DE68907372T2

DE68907372T2 - Diagnostischer Satz und Verfahren zur schnellen Bestimmung von Antikörpern.

Info

Publication number: DE68907372T2
Application number: DE89303677T
Authority: DE
Inventors: Yihshing Shih; Margaret Jannette Smith-Lewis; Harold Chester Warren
Original assignee: Eastman Kodak Co
Current assignee: Ortho Clinical Diagnostics Inc
Priority date: 1988-04-14
Filing date: 1989-04-13
Publication date: 1994-01-27
Anticipated expiration: 2009-04-14
Also published as: KR900016759A; ATE91180T1; EP0337785B2; US5077198A; DE68907372D1; IE891182L; WO1989009939A1; EP0337785B1; FI895959A0; HK124293A; MX170088B; EP0525916A1; EP0337785A1; JPH01305357A; JPH076983B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine diagnostische Ausstattung (Kit), enthaltend Verdünnungs- und Wasch-Zusammensetzungen, die für die Bestimmung von Antikörpern, und speziell viralen Antikörpern, in biologischen Proben geeignet ist. Die Erfindung betrifft ferner ein schnelles und empfindliches Verfahren zur Bestimmung dieser Antikörper. Die Erfindung eignet sich insbesondere für die Bestimmung von retroviralen Antikörpern.
Die Immunsysteme des Menschen und der Tiere sind erstaunlich komplex und weisen Mechanismen für den Schutz des Wirtes gegenüber Krankheitseffekten auf, die durch fremde Chemikalien oder biologische Substanzen verursacht werden, die den Wirt in mancher Weise befallen. Zu derartigen Fremdsubstanzen gehören Haptene, Antigene, Viren, Mikroorganismen, Arzneimittel, Hormone, Pflanzenlectine und andere Substanzen, die dem Fachmann bekannt sind. In der folgenden Beschreibung werden solche Substanzen als "Liganden" bezeichnet. Wird ein Wirt von einem Liganden befallen, so erzeugt der Wirt normalerweise Proteine als Antwort hierauf, die eine spezielle komplexe Bindung mit dem Liganden eingehen. Derartige Proteine sind als Antikörper bekannt. Oftmals ist es wünschenswert, das Vorhandensein von Liganden zum Zwecke einer geeigneten Diagnose und Behandlung zu ermitteln.
In manchen Fällen jedoch kann der Ligand nicht leicht ermittelt werden, beispielsweise in dem Falle, in dem er durch andere Materialien in dem Wirt maskiert ist, oder wenn er in sehr geringen Konzentrationen vorliegt, die nach üblichen Bestimmungsverfahren nicht ermittelt werden können. Da Antikörper speziell mit einem entsprechenden Liganden unter Bildung immunologischer Komplexe reagieren, ist das Vorhandensein von Antikörpern oftmals feststellbar, wenn das Vorhandensein von Liganden nicht feststellbar ist. Unter Verwendung von immunologischen Reaktionen ist es dann manchmal möglich, Bestimmungsverfahren zur Bestimmung der Antikörper zu entwickeln, die das Vorliegen des Liganden anzeigen.
In anderen Fällen sind Antikörper in einem Wirtsorganismus vorhanden, aufgrund einer autoimmunen Reaktion, d. h. in einer abnormalen Situation, wenn Antikörper erzeugt werden für normale Gewebe, Zellen oder Organe des Wirts. Eine Bestimmung der Antikörper in derartigen Fällen kann dazu beitragen, pathalogische Aktivitäten im Wirt zu identifizieren.
Viren, die im Menschen und bei Tieren vorkommen, sind heutzutage ein wesentliches Gesundheitsproblem, nicht nur aufgrund des Effektes, den sie auf den Wirtsorganismus ausüben, sondern auch aufgrund einer kontinuierlichen Notwendigkeit für verbesserte Maßnahmen zur Bestimmung, Diagnose, Behandlung und Verschmutzungs-Vorbehandlung. Einige Viren beeinträchtigen den Wirtsorganismus nicht, wohingegen andere zu geringfügigen Unpäßlichkeiten oder zeitweiligen Mißhelligkeiten führen. Andere jedoch können zu schwerwiegenden Krankheiten führen, die zum Tode führen können.
Es liegen infolgedessen offensichtlich Gründe dafür vor, das Vorhandensein von Viren in Wirtsorganismen schnell zum Zwecke einer effektiven Behandlung zu bestimmen, zur Ergreifung von Gesundheits-Sicherheitsmaßnahmen oder zum Abschirmen biologischer Flüssigkeiten, Gewebe oder Organe, die bei einem anderen Menschen oder Tier verwendet werden können.
Virusteilchen und viral infizierte Zellen enthalten spezifische antigene Komponenten, die eine immunologische Reaktion zu induzieren vermögen, unter Erzeugung von Antikörpern, die spezifisch für die Komponenten sind. In manchen Fällen lassen sich die antigenen Komponenten in vitro ermitteln, unter Verwendung von hierfür spezifischen Antikörpern. In anderen Fällen jedoch ist es leichter oder angebrachter, die in den Organismen erzeugten Antikörper zu bestimmen.
Menschliche Retroviren stellen als Familie eine Gruppe von miteinander in Beziehung stehenden exogenen Retroviren dar, die einen beträchtlichen proliferativen oder zytopathischen Effekt auf die Ziel-T-Lymphocyten ausüben, die sie infizieren. Zu den entstehenden Effekten dieser Retroviren gehören die T-Zellen-Proliferations-Leukämie, die T-Zellen-Verarmung und eine Immunosuppression im Falle von Menschen, die durch diese Viren infiziert wurden. Diese Retroviren sind bekannt als die HTLV-(menschliches T-Zellen-Leukämie-Lymphoma-Virus) und als HIV-(menschliches Immundefekt-Virus)Familien der T4 tropischen Retroviren.
Der erste entdeckte menschliche Retrovirus (HTLV-I) scheint das aetiologische Mittel der vollständig entwickelten T-Zellen-Leukämie und Lymphadenomen darzustellen, typifiziert durch die Erwachsenen-T-Zellen-Leukämie (siehe z. B. Poiesz und Mitarbeiter, Proc. Nat. Acad. Sci., U.S.A., 77, 1980 sowie Yoshida und Mitarbeiter, supra, 79, 1982). Heutzutage scheinen HTLV-I und T-Zellen-Malignitäten in verstärktem Maße bei der Bevölkerung von bestimmten karibischen Inseln und im südlichen Japan aufzutreten, doch stellt HTLV-I heute ein weltweit anerkanntes medizinisches Problem dar. Menschen, die mit HTLV-I infiziert sind oder in Kontakt mit dem Virus gelangt sind, weisen im allgemeinen Antikörper für HTLV-I in ihren Körperflüssigkeiten und speziell in ihrem Blut auf. Zusätzlich weist ein beträchtlicher Anteil der Patienten, die an einer neurologischen Krankheit leidet, die bekannt ist als Tropische Spasmische Paraparese Antikörper für HTLV-I auf.
Weitere Forschungen haben gezeigt, daß es verschiedene zusätzliche Retroviren gibt, die von beträchtlicher medizinischer Bedeutung sind. Neben HTLV-II wurde ein dritter Virus entdeckt, der verschieden bezeichnet wird, als HTLV- III, Lymphadenopathy Associated Virus (LAV) und HIV-I (wie unten beschrieben).
Das erworbene Immun-Mangel-Syndrom (AIDS) ist eine erst in jüngster Zeit erkannte Krankheit, die in verschiedenen Teilen der Welt auftritt. Festgestellt wurde, daß diese Krankheit überwiegend in bestimmten risikoreichen Gruppen der Bevölkerung bestimmter Länder auftritt, einschließlich bei die Homosexualität ausübenden Männern, illegalen Benutzern von intravenösen Arzneimitteln, Blutern, Patienten, denen eine Blutübertragung verabfolgt wurde und bei Bevölkerungsgruppen mit intimer heterosexueller Beziehung zu diesen hoch-risikoreichen Gruppen. Es wurde gefunden, von U.S. sowie französischen Forschern, daß diese Krankheit durch die Übertragung des Retrovirus HIV-I verbreitet wird.
Bis heute ist noch kein Heilmittel für AIDS aufgefunden worden, und medizinische wie auch wissenschaftliche Beobachtungen deuten darauf hin, daß es unwahrscheinlich ist, daß ein Heilmittel innerhalb der nächsten Zukunft gefunden wird. Weiterhin ist bekannt, daß diejenigen, die an dieser Krankheit leiden, vermutlich zu sterben haben. Diese tragischen Konsequenzen haben die medizinische und diagnostische Forschung auf dem Gebiet dieser Krankheit zur Eile angetrieben.
Wie auch im Falle anderer viralen Erkrankungen erzeugt eine Exponierung gegenüber HIV-I oder einer Infektion durch HIV-I eine immunologische Reaktion, d. h. die Erzeugung von Antikörpern. Ganz speziell wurden Antikörper für Antigene des Virus von Forschern und Klinikern in vielen sero-epidemiologischen Studien festgestellt. Eine Anzahl von menschlichen biologischen Flüssigkeiten wird als Vektoren für HIV-I- Infektion betrachtet. Menschliches Blut ist die primäre biologische Flüssigkeit, in der der Virus oder Antikörper hierfür gefunden werden können. Obgleich Menschen mit HIV-I- Antikörpern in ihrem Blut nicht notwendigerweise auch den Virus tragen oder selbst AIDS entwickeln, bleibt doch ein schwerwiegendes Problem bezüglich der viralen Übertragung durch Kontakt mit oder durch Spenden von Blut durch solche Personen. Infolgedessen gibt es eine kontinuierliche Forschung und Entwicklung, um rasch durchzuführende und empfindliche Bestimmungsmethoden für die Ermittlung des Vorhandenseins von HIV-I-Antikörpern in Blutproben festzustellen. Blutbanken haben ein starkes Interesse darin, Spenderblut zu überprüfen, um zu gewährleisten, daß es Virus-frei ist. Ärzte und Zahnärzte in Hospitälern und Büros benötigen diagnostische Testmethoden, um andere Patienten wie auch sich selbst in adäquater Weise vor einer viralen Infektion zu schützen.
Zur Bestimmung von Antigenen oder Antikörpern, einschließlich HIV-I-Antikörpern sind viele immunologische Techniken bekannt geworden. Beispielsweise werden in den US-A- 4 520 113 und US-A-4 708 818 Radio-Immunoassays beschrieben, Western-Blot-Techniken sowie eine als ELISA-Bestimmungsverfahren bekanntgewordene Technik (Enzym-gebundene Immunosorbent-Bestimmung) für HIV-I-Antikörper-Bestimmung.
In der EP-A-196 752 wird ein Verfahren zur Bestimmung von Antikörpern für HTLV-III beschrieben. Beispiel 1 dieses Dokumentes beschreibt die Verwendung einer gepufferten Verdünnungsmittel-Zusammensetzung mit einem nicht-ionogenen oberflächenaktiven Mittel, einem Salz und zwei nicht-modifizierten Proteinen.
Obgleich eine Anzahl von geeigneten Bestimmungsverfahren bekannt ist, benötigen sie im allgemeinen Stunden zur Durchführung (siehe z. B. EP-A-234 941, Beispiel 5) und können des weiteren eine komplizierte Vorrichtung erfordern sowie komplizierte Verfahren, um genaue Ergebnisse zu erzielen. Dies führt zur Erhöhung der Kosten des Testes, abgesehen davon, daß die Wahrscheinlichkeit von Fehlern ansteigt.
Weiterhin eignen sich derartige aufwendige und zeitraubende Testverfahren nicht in den Fällen, in denen die Bestimmung des Vorhandenseins eines Retrovirus (oder irgendeines anderen Virus) schnell zu bestimmen ist. Beispielsweise benötigen Ärzte oder Kliniker in Polizeistationen, in Trauma- Centern, Unfallstationen von Hospitälern, Einwanderungsbüros sowie Zahnarzt- und Arztpraxen eine schnelle Antwort auf die Frage, ob Patienten mit einem bestimmten Virus infiziert sind. Ein schneller viraler Test würde ein großer Fortschritt in diesen Fällen sein. Weiterhin würden rasche virale Tests von großem Wert in solchen entfernten Teilen der Welt sein, wo übliche medizinische Einrichtungen oder Untersuchungseinrichtungen nicht existieren.
Infolgedessen besteht ein Bedürfnis für ein schnelles und empfindliches Bestimmungsverfahren zur Bestimmung von viralen Antikörpern in biologischen Proben.
Die Probleme bekannter Bestimmungsverfahren werden erfindungsgemäß mit einem Verfahren zur Bestimmung von Antikörpern überwunden, das die folgenden Stufen umfaßt:
A. Vermischen einer biologischen Probe, von der erwartet wird, daß sie Antikörper enthält, die spezifisch für einen Liganden sind, mit einer Verdünnungsmittelzusammensetzung, die auf einen pH-Wert von 6-10 abgepuffert ist, und enthält:
ein nicht-modifiziertes oder underivatisiertes Protein oder Carbohydrat,
ein oberflächenaktives Mittel, und
ein negativ geladenes Protein oder Carbohydrat,
B. Kontaktieren der verdünnten Probe mit dem Liganden unter Bildung eines immunologischen Komplexes des Liganden und eines Antikörpers, der in der Probe vorhanden ist,
C. Unlöslichmachen des Ligande: durch Bindung an ein festes Substrat, vor, gleichzeitig oder nach der Komplexbildung,
D. Abtrennen des Komplexes von nicht-komplexgebundenen Materialien unter Verwendung einer mikroporösen Filtrationsmembran, die den Komplex hierauf zurückhält, gleichzeitig mit oder im Anschluß an die Bindung in Stufe C,
E. Kontaktieren des Komplexes mit Enzym-markierten Antikörpern, die auf die Liganden-Antikörper gerichtet sind, unter Bildung eines mit einem Enzym markierten Liganden-Antikörper-Antikörper-Komplexes, vor, gleichzeitig mit oder im Anschluß an die Trennungsstufe,
F. Waschen des auf der Membran zurückgehaltenen Komplexes mit einer wäßrigen Waschlösung zum Zwecke der Abtrennung von nicht-komplexgebundenen Materialien von dem Komplex,
wobei die Waschlösung auf einen pH-Wert von 5 bis 10 abgepuffert ist und ein nicht-ionogenes, anionisches oder amphoteres oberflächenaktives Mittel enthält und gegebenenfalls weiterhin aufweist ein mit Wasser mischbares polares organisches Lösungsmittel sowie ein Alkalimetall- oder Ammoniumsalz, das in einer Menge vorliegt, die ausreicht, um eine Ionenstärke von mindestens 0,25 herbeizuführen, und
G. Zusatz einer Reagens-Zusammensetzung, die dazu befähigt ist, eine bestimmbare Art (Species) in Gegenwart des Enzyms zu liefern und Bestimmung der Gegenwart der Art als Anzeichen für das Vorhandensein von Antikörpern zum Antigen in der Probe.
Eine diagnostische Ausstattung (Kit), geeignet für die Bestimmung von Antikörpern in einer biologischen Probe umfaßt:
5 (a) eine Verdünnungsmittelzusammensetzung, abgepuffert auf einen pH-Wert von 6-10 und enthaltend:
ein unmodifiziertes oder underivatisiertes Protein oder Carbohydrat,
ein oberflächenaktives Mittel, und
ein negativ geladenes Protein oder Carbohydrat und
(b) eine Waschlösung, die auf einen pH-Wert von 5-10 abgepuffert ist und ein nicht-ionogenes, anionisches oder amphoteres oberflächenaktives Mittel enthält, wie ggf. ferner ein mit Wasser mischbares polares organisches Lösungsmittel sowie ein Alkalimetall- oder Ammoniumsalz in einer Menge, die ausreicht, um eine Ionenstärke von mindestens 0,25 herbeizuführen, und
(a) eine wegwerfbare Testvorrichtung eine Filtrationsmembrane umfassend.
Das erfindungsgemäße Bestimmungsverfahren ist schnell durchführbar. Dies bedeutet, daß im allgemeinen weniger als 20 min erforderlich sind, um das Verfahren durchzuführen. Ein geschulter Kliniker kann es in, weniger als 10 min durchführen. Überdies ist das Bestimmungsverfahren empfindlich, weist einen sehr niedrigen Hintergrund auf (d. h. zeigt sehr wenig falsche Positive) und ist relativ billig, im Vergleich zu den komplizierten und zeitaufwendigen Bestimmungsmethoden des Standes der Technik. Die vorliegende Erfindung eignet sich in vorteilhafter Weise zur Bestimmung von Antikörpern, die erzeugt wurden als Reaktion auf irgendeine biologische Bedingung oder einen Liganden (und insbesondere als Reaktion auf provirale Antikörper) in Situationen, in denen ein schnelles Testverfahren benötigt wird oder in den Fällen, in denen komplizierte Testverfahren nicht möglich oder nur schwer durchzuführen sind. Beispielsweise kann durch die vorliegende Erfindung eine Ausstattung oder ein diagnostischer Kit zur Verwendung in Arzt- oder Zahnarztpraxen, Hospitälern, Trauma-Centern, Polizeistationen, Einwanderungsbüros und in entfernteren Bereichen der Welt bereitgestellt werden.
Die Vorteile dem vorliegenden Erfindung werden erreicht aufgrund der Verwendung von bestimmten Verdünnungs- und Waschzusammensetzungen. Die Verdünnungsmittel-Zusammensetzung ist auf einen pH-Wert von 6-10 abgepuffert und umfaßt ein nichtmodifiziertes oder underivatisiertes Protein oder Carbohydrat, ein oberflächenaktives Mittel und ein negativ aufgeladenes Protein oder Carbohydrat. Die wäßrige Wasch-Zusammenzusetzung oder Waschlösung ist auf einen pH-Wert von 5-10 abgepuffert und weist ein oberflächenaktives Mittel auf. Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung weist das Waschmittel oder die Waschzusammensetzung auch ein mit Wasser mischbares polares organisches Lösungsmittel auf sowie ein Alkalimetall- oder Ammoniumsalz in einer Menge, die zu einer Ionenstärke von mindestens 0,25 führt. Die Verdünnungsmittel- und Waschmittel-Zusammensetzungen können in Form eines diagnostischen Kits oder einer diagnostischen Ausstattung abgepackt sein.
Die Ausstattung und das Bestimmungsverfahren der vorliegenden Erfindung können dazu angewandt werden, um das Vorhandensein von Antikörpern in einer biologischen Probe eines menschlichen oder tierischen Wirts schnell festzustellen. Zu den biologischen Proben, die untersucht werden können gehören, obwohl die Proben nicht auf die im folgenden aufgeführten beschränkt sind, ganzes Blut oder eine Komponente hiervon (Serum oder Plasma), Speichel, Tränenflüssigkeit, spinale Flüssigkeit, Fäkalien, Urin, vaginale Sekrete, Samenflüssigkeit, menschliches Gewebe oder Organextrakte sowie menschliche Milch. Die Erfindung eignet sich insbesondere zur Untersuchung von menschlichem Serum oder Plasma.
Durch die Erfindung lassen sich Antikörper für jeden chemischen oder biologischen Liganden bestimmen. Bei diesem Liganden kann es sich um eine Fremdsubstanz handeln (ein Antigen, ein Virus, ein Hapten, ein Arzneimittel, Hormon, Pflanzenlectin, Toxin, Mikroorganismus oder eine andere für den Fachmann offensichtliche Fremdsubstanz), die den Wirt befällt. Alternativ können die Antikörper durch eine Autoimmun-Reaktion im Wirt erzeugt werden.
Die Erfindung eignet sich insbesondere zur Bestimmung von Antikörpern für menschliche oder tierische Viren, einschließlich, hierauf jedoch nicht begrenzt, zur Bestimmung von Antikörpern für Retroviren oder Komponenten hiervon, Influenza-Viren, Herpes-Viren, Hepatitis-Viren, Cytomegalavirus, dem Epstein-Barr-Virus sowie Rubella. Ganz speziell lassen sich Antikörper für jeden der HTLV-I und -II, HIV-I und -II, individuell oder zusammen bestimmen, wobei Antikörper für HIV-I-Antigenen von größtem Interesse sind.
Da eine biologische Probe (wie beispielsweise Serum oder Plasma), die von einem Patienten erhalten wurde, einen Liganden enthalten kann, (z. B. ein Virus, das ein Gesundheitsproblem für die Person darstellen würde, die das Bestimmungsverfahren durchführt) wie auch Antikörper hierfür, kann es wünschenswert sein, die Probe in geeigneter Weise zu behandeln, um den Liganden zu inaktivieren, ohne die Antikörper, die es zu bestimmen gilt, zu beeinflussen. Zu geeigneten viralen Inaktivierungstechniken gehören beispielsweise eine Hitzebehandlung, eine geeignete Zeitspanne lang bei geeigneten Temperaturen, eine Beschallung oder eine Behandlung mit oberflächenaktiven Mitteln, Alkoholen, Peroxiden, Dextransulfat, eine Bleiche oder eine Behandlung mit anderen Reagenzien, die den Virus abtöten. Andere Techniken, die durchgeführt werden können, sind für den Fachmann leicht erkennbar. Der Virus kann vor Durchführung des Bestimmungsverfahrens inaktiviert werden oder während der frühen Stufen des Bestimmungsverfahrens dieser Erfindung.
Die Bestimmung von Antikörpern für einen spezifischen Liganden erfolgt dadurch, daß zunächst die Probe mit der wäßrigen Verdünnungs-Zusammensetzung vermischt wird. Zu dieser Zusammensetzung gehört ein oder gehören mehrere Proteine oder Carbohydrate, die in ihrem unmodifizierten oder underivatisierten Zustand vorliegen, im Gegensatz zu den Proteinen und Carbohydraten, die weiter unten beschrieben werden, die modifiziert wurden derart, daß sie mit zusätzlichen negativen Ladungen versehen wurden. Diese Proteine oder Carbohydrate können einzeln oder in Mischungen eingesetzt werden. Zu repräsentativen Materialien gehören, ohne daß die im folgenden aufgeführten Materialien im beschränkenden Sinne zu verstehen sind, Gummiarabicum, Dextran, Gelatine, Argot sowie menschliches oder tierisches Serum oder Komponenten hiervon (z. B. Rinderserumalbumin, fetales Kalbsserum, Kaninchenserum, menschliches Serum oder Ziegenserum). Gummiarabicum und Rinderserumalbumin werden bevorzugt eingesetzt. Dieses Protein oder Carbohydrat liegt im allgemeinen in einer Menge von mindestens 0,5 und vorzugsweise von 0,5 bis 10 Gew.-% (bezogen auf das Gewicht der gesamten Zusammensetzung) vor.
Die Probe und die Verdünnungsmittel-Zusammensetzung werden in einem geeigneten Gefäß miteinander vermischt, im allgemeinen bei einer Temperatur von 10º bis 40ºC und vorzugsweise bei einer Temperatur von 15º bis 25ºC. Die Mischdauer beträgt im allgemeinen wenige Sekunden, jedoch können auch längere Zeiten angewandt werden, wenn dies erwünscht ist.
Die Zusammensetzung weist ferner ein oder mehrere Puffersubstanzen auf, die den pH-Wert der Zusammensetzung bei 6 bis 10 halten, vorzugsweise bei 7,5 bis 8,5. Geeignete Puffersubstanzen sind bekannt und hierzu gehören beispielsweise Tris(hydroxymethyl)aminomethan, Phosphate, Glyzin, Morpholinopropansulfonsäure, Morpholinoethansulfonsäure und andere bekannte Puffersubstanzen.
Weiterhin enthält die Verdünnungsmittel-Zusammensetzung ein oder mehrere in Wasser lösliche oder in Wasser dispergierbare oberflächenaktive Mittel. Diese oberflächenaktive Mittel können nicht-ionogen, anionisch oder amphoter sein. Verwendbar ist jedes geeignete oberflächenaktive Mittel, das die Komplexbindung des viralen Antigens und entsprechender Antikörper nicht nachteilig beeinflußt oder die Fähigkeit der anderen Komponenten, in der Verdünnungsmittel-Zusammensetzung die gewünschte Empfindlichkeit zu entfalten.
Zu besonders geeigneten oberflächenaktiven Mitteln gehören nicht-ionogene oberflächenaktive Mittel, einschließlich beispielsweise Polyoxyethylenderivate, z. B. ethoxylierte Fettsäureester oder Mischungen hiervon. Zu repräsentativen Beispielen gehören Polyoxyethylensorbitanmonolaurat, Polyoxyethylensorbitanmonopalmitat, Polyoxyethylensorbitanmonostearat. Repräsentative ethoxylierte Fettsäureester werden im Handel vertrieben unter der Handelsbezeichnung Tween (ICI Americas, Inc.) und T-MAZ® (Mazer Chemicals). Tween-20 ist ein besonders geeignetes nicht-ionogenes oberflächenaktives Mittel. Das oberflächenaktive, Mittel liegt im allgemeinen in einer Menge von mindestens 0,01, und vorzugsweise von 0,1 bis 3 Gew.-% vor.
Die Verdünnungsmittel-Zusammensetzung enthält ferner ein negativ geladenes Protein oder Carbohydrat oder eine Mischung hiervon. Die Verbindung liefert eine stark negative Umgebung für die Bestimmung, so daß nicht-spezifische Zwischenreaktionen durch die Antikörper und Antigene weitestgehend reduziert werden. Diese Umgebung kann erzeugt werden durch chemisch modifizierte Proteine oder Carbohydrate mit den erforderlichen negativen Ladungen, um andere negativ geladene Materialien innerhalb des Verdünnungsmittels und der biologischen Probe wirksam abzustoßen.
Besonders geeignete negativ geladene Verbindungen sind in Wasser lösliche Proteine oder Carbohydrate, die in geeigneter Weise modifiziert worden sind, um eine Verbindung mit einem niedrigen pI-Wert zu erzeugen. Diese Verbindungen haben im allgemeinen einen pI-Wert von weniger als oder gleich 5. Eine Mischung von Proteinen oder Carbohydraten mit dem gewünschten pI-Wert kann ebenfalls verwendet werden. Der Ausdruck pI (oder isoelektrischer Punkt) ist bekannt als der pH-Wert, bei dem eine gleiche Anzahl von positiven wie auch negativen Ladungen in einem Molekül vorliegt, so daß das Molekül bezüglich seiner Ladung neutral ist. Der pI-Wert kann unter Verwendung von standardisierten Materialien und Verfahren ermittelt werden. Beispielsweise läßt sich dieser Wert messen durch isoelektrische Fokussierung unter Verwendung eines LKB-Ampholine PAG-Platte (Handelsbezeichnung, erhältlich von der Firma LKB-Produkter AG, Bromma, Schweden) mit einem pH-Wertsbereich von 3,5 bis 9,5 und standardisierten Kalibratoren.
Zu geeigneten modifizierten Proteinen gehören Caseinderivate oder andere Proteinderivate, die negativ geladen sind (z. B. Derivate, erhalten durch Acylierung, Alkylierung oder Sulfonierung von Casein, z. B. succinyliertes Casein, succinyliertes Rinderserumalbumin, Carboxymethylcasein sowie succinyliertes Collagen). Diese Materialien lassen sich leicht herstellen durch Acylierung, Alkylierung oder Sulfonierung eines Proteins mit zur Verfügung stehenden Amingruppen, unter Wahl geeigneter Bedingungen. Zu geeigneten Acylierungsmitteln gehören beispielsweise solche, die in der U.S.- Patentschrift 4 591 571 beschrieben sind, z. B. Anhydride, Acylhalogenide und Ester, die sich von Dicarbonsäuren und Polycarbonsäuren ableiten. Die Herstellung von succinyliertem Casein wird weiter unten beschrieben.
Zu geeigneten Alkylierungs- und Sulfonierungsmitteln, die zu einer Modifizierung von Proteinen geeignet sind, gehören beispielsweise Bromoessigsäure, Chloroessigsäure, Fluoronitrobenzol, m-(Chlorosulfonyl)benzoesäure, Bromomalonsäure, Bromopropionsäure sowie p-(Chlorosulfonyl)benzoesäure.
Zu geeigneten Carbohydraten mit niedrigem pI-Wert gehören wasserlösliche Cellulosederivate, wie beispielsweise Carboxymethylcellulose, Carboxyethylcellulose und andere, die für den Fachmann leicht erkennbar sind. Derartige Materialien sind im allgemeinen im Handel erhältlich.
Zu den bevorzugten Proteinen und Carbohydraten mit niedrigem pI-Wert gehören succinyliertes Casein, Carboxymethylcellulose, succinyliertes Rinderserumalbumin und succinyliertes Collagen. Am meisten bevorzugt verwendet wird succinyliertes Casein.
Das Protein oder Carbohydrat mit niedrigem pI-Wert liegt in einer Menge von mindestens 0,1, und vorzugsweise von 1-3 Gew.-% (bezogen auf das Gesamtgewicht der Zusammensetzung) vor.
Das Verdünnungsmittel kann ferner ein oder mehrere virale Inaktivierungsmittel enthalten, z. B. ein Peroxid oder Dextransulfat, die die anderen Bestandteile der Verdünnungsmittel-Zusammensetzung nicht stören oder nachteilig beeinflussen.
Nachdem die Probe mit der Verdünnungsmittel-Zusammensetzung vermischt worden ist, wird die verdünnte Probe mit dem geeigneten Liganden in Kontakt gebracht, der mit den Antikörpern in der Probe zu reagieren vermag. Liegen Antikörper vor, so führt dieser Kontakt zur Erzeugung eines immunologischen Komplexes aus Ligand und Antikörpern, die auf den Liganden gerichtet sind. Dieser Kontakt und die Formation des Komplexes erfolgen rasch, gewöhnlich innerhalb von 5 min und vorzugsweise innerhalb von 1 min. Die verdünnte Probe und die immunologischen Reagenzien werden im allgemeinen eine geeignete Zeitspanne lang miteinander vermischt und bei einer Temperatur von 15º bis 30ºC und in besonders geeigneter Weise bei 18 bis 25ºC inkubiert.
Gemäß einer Ausführungsform reagieren der Ligand und die Antikörper unter Bildung eines wasserlöslichen Komplexes, der weiterhin umgesetzt wird unter Erzeugung eines unlöslichen Komplexes. Beispielsweise kann der Ligand biotinyliert werden zur Bindung an Avidin auf einem unlöslichen Substrat. Andere Bindungsmittel sind bekannt. Der lösliche Komplex kann ferner auch umgesetzt werden mit anderen Antikörpern, die spezifisch für den Liganden sind, oder Anti- Antikörpern, die spezifisch für die Liganden-Antikörper in der Probe sind.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist der Ligand an einem unlöslichen Substrat befestigt oder an dieses gebunden, so daß der resultierende Komplex durch die Komplexbildungsreaktion unlöslich gemacht wird. Zu derartigen geeigneten Substraten gehören beispielsweise magnetische Teilchen, Glas- oder Polymerteilchen, Glas- oder Polymerfäden oder Glas- oder Polymerfasern, Membranen, die Wände von Teströhrchen, Testgeräte, sogen. Microtiter-wells und andere Substrate, die für den Fachmann offensichtlich sind. Die Anbringung oder Befestigung des Liganden an dem Substrat kann in jeder geeigneten Weise erfolgen, beispielsweise durch Absorption oder covalente Bindung durch reaktive Gruppen, Avidin-Biotin-Bindungen, durch ein Protein oder andere verbindende Verbindungen oder andere Techniken, die bekannt sind.
Vorzugsweise ist der Ligand Teil eines immunologischen Reagens mit Polymerteilchen, an die der Ligand in geeigneter Weise gebunden wird. Das Reagens kann erzeugt werden aus Polymerteilchen jeder geeigneten Zusammensetzung. Viele geeignete Teilchen sind bekannt und lassen sich herstellen aus Polyamiden, Polycarbonaten, aromatischen Polyvinylverbindungen, Polyestern oder anderen Polymeren. Die genaue Zusammensetzung kann abhängen von der Methode der Bindung des Liganden und der speziell gewünschten Ligandendichte. Im allgemeinen ist die Oberflächendichte des Liganden auf den Teilchen ausreichend, um eine akzeptable Empfindlichkeit für das Bestimmungsverfahren zu liefern. Sie variiert mit dem Liganden, der gebunden werden soll. Besteht die Methode der Ligandenbindung aus einer Adsorption, so kann der Typ von geeigneten Polymerteilchen aus bestimmten Materialien bestehen, wobei andere Materialien geeigneter für eine covalente Bindung sein können, die bevorzugt angewandt wird. Methoden der Bindung, wie oben angegeben, sind gut bekannt. Eine covalente Bindung eines Liganden wird im allgemeinen durchgeführt unter Verwendung von reaktionsfähigen Oberflächengruppen, die dazu befähigt sind, direkt mit freien Amin- oder Sulfhydrylgruppen der Liganden zu reagieren oder über Bindungen (beispielsweise Avidin-Biotin oder Proteinen. Zu derartigen reaktiven Oberflächengruppen gehören beispielsweise Carboxy-, Epoxy- und Aldehydgruppen, aktive Halogenatome, aktivierte 2-substituierte Ethylsulfonylgruppen und andere Gruppen, die bekannt sind. Die folgende Diskussion bezüglich bevorzugter Ausführungsformen erfolgt lediglich beispielsweise und ist nicht im beschränkenden Sinne zu verstehen.
Besonders geeignete Polymerteilchen sind im allgemeinen wasserunlösliche Latexpartikel mit einer durchschnittlichen Partikelgröße von größer als 0,01 Mikrometern. Sie bestehen aus Polymeren, hergestellt aus einem oder mehreren ethylenisch ungesättigten polymerisierbaren Monomeren, wovon mindestens eines ein aktives Halogenatom aufweist oder aktivierte 2-substituierte Ethylsulfonyl- oder Vinylsulfonyl gruppen.
Zu Monomeren mit einem aktiven Halogenatom gehören Vinylchloroacetat, Vinylbromoacetat, haloalkylierte vinylaromatische Verbindungen (z. B. Chloromethylstyrol oder Bromomethylstyrol), Haloalkylacryl- oder Methacrylester (z. B. Chloroethylmethacrylat, 3-Chloro-2-hydroxypropyimethacrylat und 3- Chloropropylacrylat), N-{3-[N'-(3-Chloropropionyl)ureido]propyl}methacrylamid; 4-(3-Chloropropionamido)styrol;
4-[N'-(3-Chloropropionyl)ureido]styrol;
2-(3-Chloropropionamido(ethylmethacrylat;
N-[3-(3-Chloropropionamido)propyl]methacrylamid;
N-(3-Chloroacetamidopropyl)methacrylamid;
N-(2-Chloroacetamidoethyl)methacrylat;
4-Chloroacetamidostyrol;
4-Chloroacetamidomethylstyrol;
N-[3-(N'-Chloroacetylureido)propyl)methacrylamid;
N-[3-(N'-Chloroacetylureido)ethyl]methacrylamid;
4-(N'-Chloroacetylureido)styrol;
m& p(N'-Chloroacetylureidomethyl)styrol und andere, die dem Fachmann bekannt sind. Die haloalkylierten vinylaromatischen Verbindungen, z. B. jene mit aktiven Haloalkylgruppen mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen werden bevorzugt eingesetzt, wenn das aktive Halogenatom als reaktive Gruppe eingesetzt wird. Chloromethylstyrol hat sich als besonders vorteilhaft erwiesen.
Bevorzugte aktivierte 2-substituierte Ethylsulfonyl- und Vinylsulfonylmonomere lassen sich durch die Formel (I) darstellen:
worin bedeuten:
R Wasserstoff oder substituiertes oder unsubstituiertes Alkyl (im allgemeinen mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, wie Z.B. Methyl, Ethyl, Isopropyl oder Hexyl), wobei R vorzugsweise für Wasserstoff oder Methyl steht;
R¹ gleich -CH=CHR² oder -CH&sub2;CH&sub2;X, worin X eine abspaltbare Gruppe ist, die verdrängt wird durch ein Nucleophil, oder die eliminiert wird in Form von HX durch Behandlung mit einer Base (z. B. Halo, Acetoxy, Alkylsulfonyloxy, wie z. B. Methylsulfonyloxy, Arylsulfonyloxy, wie z. B. p-Tolylsulfonyloxy, Trialkylammonium, z. B. ein Trimethylammoniumsalz oder ein Pyridiniumsalz); R² steht für Wasserstoff, substituiertes oder unsubstituiertes Alkyl (im allgemeinen mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen wie für R angegeben) oder R² steht für ein substituiertes oder unsubstituiertes Aryl (im allgemeinen mit 6 bis 12 Kernkohlenstoffatomen, wie z. B. Phenyl, Naphthyl, Xylyl oder Tolyl); vorzugsweise steht R¹ für -CH&sub2;CH&sub2;X; diese Gruppe, die eine aktivierte 2-substituierte Ethylgruppe ist, kann substituiert sein durch eine beliebige Gruppe, die die Verdrängung der abspaltenden Gruppe X nicht beeinträchtigt;
L steht für eine verbindende,Gruppe, die aus einer substituierten oder unsubstituierten Alkylengruppe bestehen kann, im allgemeinen mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen und Heteroatomen in der Kette. Diese Definition von Alkylen soll Alkylengruppen einschließen, die unterbrochen werden oder abgeschlossen werden durch Oxygruppen, Thiogruppen oder Gruppen der Formel -NR³- [worin R³ steht für Wasserstoff, substituiertes oder unsubstituiertes Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen (wie beispielsweise Methyl, Chloromethyl oder 2-Hydroxyethyl) oder substituiertes oder unsubstituiertes Aryl mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen (wie beispielsweise Phenyl, Naphthyl oder Xylyl)],
Ester-(-COO-), Amid-(-CONH), Urylen-
Sulfonyl- (-SO&sub2;-), Carbonat-, Sulfonamido-, Azo-, Phosphono- oder andere ähnliche Gruppen. Zu repräsentativen Alkylengruppen gehören Methylen, Ethylen, Isobutylen, Hexamethylen, Carbonyloxyethylenoxycarbonylethylen, Methylenbis(iminocarbonyl)ethylen, Carbonyloxydodecylencarbonyloxyethylen, Carbonyliminomethyleniminocarbonyliminoethylen, Carbonyliminomethyleniminocarbonylethylen und andere Gruppen, die bekannt sind.
L kann ferner für eine substituierte oder unsubstituierte Arylengruppe mit im allgemeinen 6 bis 12 Kernkohlenstoffatomen stehen. Zu repräsentativen Arylengruppen gehören Phenylen, Tolylen, Naphthylen und andere, die in den oben erwähnten Patentschriften angegeben sind. Die für L angegebene Definition umfaßt ferner divalente Gruppen, bei denen es sich um Kombinationen von einer oder mehreren von jeder der Alkylen- und Arylengruppen, wie oben definiert, handelt (z. B. Arylenalkylen, Alkylenarylenalkylen und andere, die für den Fachmann leicht feststellbar sind) wie auch derartige Kombinationen, die unterbrochen oder abgeschlossen sind durch eine oder mehrere Amid- oder Estergruppen (beispielsweise Carbonyliminoarylenalkylen). Vorzugsweise hat L die Bedeutung eines substituierten oder unsubstituierten Phenylenalkylens [z. B. substituiert mit einer oder mehreren Alkylgruppen (wie für R definiert), Alkoxygruppen (im allgemeinen mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, z. B. Methoxy-, Propoxy- oder Butoxygruppen) oder Halogruppen], Carbonyliminoarylenalkylen (worin Arylen und Alkylen die angegebene Bedeutung haben), oder Carbonyliminoalkyleniminocarbonylalkylen (worin Alkylen wie oben definiert ist).
Zu repräsentativen geeigneten Monomeren gehören m & p-(2- Chloroethylensulfonylmethyl)styrol, m & p-[2-(p-Tolylsulfonyloxy)ethylsulfonylmethyl)styrol, m & p-Vinylsulfonylmethylstyrol, N-[m & p-(2-Chloroethylsulfonylmethyl)phenyl]acrylamid sowie N-[2-(2-Chloroethylsulfonyl)ethylformamidomethyl]-acrylamid. Das zuerst genannte Monomer wird bevorzugt eingesetzt.
Ein oder mehrere der oben beschriebenen Monomeren können einzeln oder in Kombination miteinander unter Erzeugung von Homo- oder Copolymeren polymerisiert werden. Alternativ und vorzugsweise werden ein oder mehrere von ihnen copolymerisiert mit mindestens einem anderen ethylenisch ungesättigten polymerisierbaren Monomer. Im allgemeinen liefern derartige Monomere verschiedene wünschenswerte Eigenschaften, wie beispielsweise Hydrophobizität, Dispergierbarkeit oder andere Eigenschaften.
Zu repräsentativen geeigneten Polymeren gehören die folgenden: Poly(m & p-chloromethylstyrol), Poly(styrol-co-m & p-chloromethylstyrol-co-2-hydroxyethylacrylat) (molares Verhältnis 67 : 30 : 3), Poly(styrol-co-m & p-chloroethylsulfonylmethylstyrol) (molares Verhältnis 95,5 : 4,5), Poly{styrolco-N-[m & p-(2-chloroethylsulfonylmethyl)phenyl)acrylamid} (molares Verhältnis 99,3 : 0,7), Poly(m & p-chloromethylstyrol-co-methacrylsäure) (molares Verhältnis 95 : 5, 98 : 2 und 99,8 : 0,2), Poly(styrol-co-m & p-chloroethylsulfonylmethylstyrol-co-methacrylsäure) (molares Verhältnis 93,5 : 4,5 : 2), Poly{styrol-co-N-[m & p-(2-chloroethylsulfonylmethyl)phenyl]acrylamid-co-methacrylsäure} (molares Verhältnis 97,3 : 0,7 : 2) und Poly(styrol-co-m & p-chloromethylstyrol) (molares Verhältnis 70 : 30).
Bei der Herstellung eines immunologischen Reagens wird der Ligand (beispielsweise ein virales Antigen) im allgemeinen mit den Teilchen unter geeigneten Bedingungen, die von der Methode der Bindung abhängen (Absorption oder covalente Bindung) vermischt. Zum Zwecke der Bindung an die bevorzugten Teilchen, die oben beschrieben wurden, mit reaktiven Halogenatomen, aktivierten 2-substituierten Ethylsulfonyl- oder Vinylsulfonylgruppen, wird der Ligand im allgemeinen mit den Partikeln bis zu 24 h lang bei einer Temperatur von 20 bis 40ºC vermischt. Die Partikelsuspension wird im allgemeinen auf einen pH-Wert von 7 bis 10 abgepuffert. In der Mischung liegen die Partikel im allgemeinen in einer Menge von mindestens 0,2 Gew.-% vor und der Ligand liegt im allgemeinen in einer Menge von mindestens 1% (bezogen auf das Gesamtgewicht der Partikel) vor.
Virales Antigen, das für die Durchführung bevorzugter Ausführungsformen der Erfindung geeignet ist, läßt sich in beliebiger geeigneter Weise herstellen. Beispielsweise kann es aus biologischen Quellen isoliert werden, beispielsweise Zellkulturen oder aus infizierten tierischen oder menschlichen Wirten, oder es kann nach verschiedenen biotechnischen Methoden synthetisiert werden.
In bevorzugten Ausführungsformen kann retrovirales Antigen in beliebiger geeigneter Weise hergestellt werden. Es kann sich um natürlich vorkommende virale Substanzen oder Komponenten hiervon handeln oder um synthetische Peptide oder Polypeptide, hergestellt unter Anwendung der DNA-Rekombinationstechnologie, wie es beispielsweise beschrieben wird in den PCT-Publikationen 86/01834 und 86/02930 sowie der U.S.- Patentschrift 4 725 669. Andere technische Literaturstellen und Patentschriften, die synthetische Verfahren zur Erzeugung von HTLV-I, HTLV-II, HIV-I, HIV-II und anderen retroviralen Antigenen beschreiben, sind zu zahlreich, um hier aufgeführt zu werden.
Beispielsweise besteht ein bevorzugtes Verfahren zur Herstellung HIV-I-Antigen darin, das Virus in einer geeigneten Zellinie zu kultivieren, mit anschließender Entfernung des Virus aus der Zelle. Der entfernte Virus oder eine Komponente hiervon wird wie oben beschrieben auf den polymeren Partikeln oder Teilchen unter Erzeugung eines Reagens immobilisiert. Beispielsweise läßt sich HIV-I virales Antigen durch Detergent-Lysis von HIV-I viralen Partikeln, isoliert aus einer geeigneten Wirts-Zellinie, erhalten. Zu derartigen Zellinien, die das Wachstum von HIV-I gestatten, gehören beispielsweise Hut 78 (ATCC TIB 161), H9 (ATCC Nr. CRL 8543), Molt 3, CEM, OKT4+, Ti7,4, HT und Klone hiervon sowie andere, wie sie beispielsweise beschrieben werden in den U.S.-Patentschriften 5 647 773 und 4 652 599. Virale Partikel oder Teilchen lassen sich ebenfalls isolieren aus neuen Zellinien, eingeführt von Patienten, die AIDS haben oder "pre-AIDS" (chronische allgemeine Lymphadenopathie, die oftmals vor AIDS auftritt). Zusätzlich läßt sich antigenes Material aus mit HIV-infizierten Personen erhalten. Die Kultivierung der Zellen und die Isolierung von viralen Teilchen werden unter Anwendung bekannter Methoden durchgeführt. Die viralen Teilchen lassen sich aus den vervielfachten Zellen wie auch der überstehenden Flüssigkeit durch Lyse mit einem Waschmittel oder einer oberflächenaktiven Substanz erhalten. Die Hut 78-Zellinie, ist sie einmal mit HIV-I infiziert, ist die bevorzugte Zellinie zur Gewinnung von HIV-I-Antigenen.
Ein bevorzugtes Verfahren zur Gewinnung von HTLV-I-Antigen ist das Verfahren durch Lyse von HTLV-I viralen Teilchen, die aus einer geeigneten Wirts-Zellinie isoliert worden sind. Zu derartigen Zellinien gehören beispielsweise Hut 102 sowie MT-2 und Klone hiervon. Die Hut 102-Zellinie, die von der American Type Culture Collection (ATCC TIB 162) bezogen werden kann, wird bevorzugt eingesetzt. HTLV-I läßt sich ferner isolieren aus neuen Zellinien, erhalten von peripheralen Blut-T-Zellen oder Geweben, erhalten von Haut-T-Zellen von Leukämie/Lymphoma-Patienten. Die Kultivierung der Zellen und die Isolierung des Antigens erfolgen unter Anwendung bekannter Verfahren. HTLV-II-Antigene lassen sich in ähnlicher Weise erhalten.
Nachdem der immunologische Komplex erzeugt und unlöslich gemacht worden ist, wird er von den nicht-komplexgebundenen Materialien abgetrennt, unter Verwendung einer mikroporösen Filtrationsmembran, die Poren aufweist, die groß genug sind, daß nicht-komplexgebundene Materialien die Poren passieren können, während der Komplex zurückgehalten wird. Das Unlöslichmachen des Komplexes kann praktisch gleichzeitig mit der Abtrennung erfolgen oder vorher. Geeignete Membranen können aus beliebigen geeigneten in Wasser unlöslichen Materialien aufgebaut werden, die ihre Integrität während des Bestimmungsverfahrens beibehalten. Zu derartigen Materialien gehören beispielsweise Filterpapiere, poröse, teilchenförmige Strukturen, poröse Polymerfolien, Cellulose, Glasfasern, gewebte und nicht-gewebte textile Gebilde, Polymerfilter und andere Materialien, die bekannt sind.
Besonders geeignete Membranen sind die Polyamide, die von der Firma Pall Corp. in den Handel gebracht werden. Die für die Erfindung geeigneten Membranen können des weiteren, falls erwünscht, behandelt oder beschichtet werden (beispielsweise mit oberflächenaktiven Mitteln, Polymeren oder Proteinen), um die Trennung oder den Flüssigkeitsfluß zu steigern oder um nicht-spezifische Reaktionen zu vermindern.
Die Membran kann als separates Substrat mit geeigneten Behältern zur Durchführung des Bestimmungsverfahrens der Erfindung verwendet werden. Vorzugsweise jedoch ist sie ein fester Teil der Testvorrichtung. Es sind verschiedene Testvorrichtungen bekannt, einschließlich solche, die in den U.S.-Patentschriften 3 825 410, 3 888 629, 3 970 429 und 4 446 232 beschrieben werden. Besonders geeignete Vorrichtungen werden in den europäischen Patentanmeldungen 88308558.1 und 88311906.7 (aufgrund der U.S.S.N. 136 211 vom 18. Dezember 1987 von Smith-Lewis) beschrieben.
Genauer beschrieben umfaßt die Testvorrichtung ein in Wasser unlösliches Substrat mit einer oder mehreren Testzonen, von denen eine jede eine biologische Probe und geeignete Reagenzien aufnehmen kann.
Das Substrat kann aus einem beliebigen geeigneten wasserunlöslichen Material hergestellt werden, wie beispielsweise Glas, polymeren Materialen, fasrigen Materialien, Cellulose- Materialien und anderen bekannten Stoffen.
Im Falle einer bevorzugten Ausführungsform weist die Testvorrichtung drei Testzonen oder Behältnisse (wells) auf, die bestimmt sind, ein Testergebnis zu liefern sowie positive und negative Vergleichsergebnisse. Jedes Testbehältnis weist eine mikroporöse Membran auf, die hierin befestigt ist. Andere Variationen von geeigneten Testvorrichtungen liegen im Bereich des fachmännischen Könnens eines Fachmanns. Das immunologische Reagens, das oben beschrieben wird, kann in die Wegwerf-Testvorrichtung eingeführt werden, falls erwünscht, z. B. in Form einer Beschichtung auf der Membran. Alternativ kann das Reagens separat während des Bestimmungsverfahrens zugeführt werden.
Die Trennung des immunologischen Komplexes von den nichtkomplexgebundenen Stoffen erfolgt praktisch gleichzeitig mit dem Inkontaktbringen der Membran mit der Probe. Mit anderen Worten: benötigt werden lediglich weniger Sekunden und höchstens eine Minute oder zwei, damit die Probe durch die Membran gelangen kann, während der immunologische Komplex auf der Membran zurückgehalten wird.
Der immunologische Komplex, der aus dem Liganden und beliebigen Antikörpern in der Probe gebildet wurde, wird mit einem mit einem Enzym markierten Konjugat von Antikörpern in Kontakt gebracht, die auf die Liganden-Antikörper gerichtet sind, unter Bildung eines Komplexes von markiertem Antikörper-Antikörper-Liganden. Dieser Kontakt kann vor, gleichzeitig mit oder im Anschluß an die Trennungsstufe, wie oben beschrieben, erfolgen. Zusätzlich kann dieser Komplex wasserlöslich sein. Das heißt, er wird vor dem Unlöslichmachen des Liganden erzeugt. Im Falle bevorzugter Ausführungsformen jedoch wird der Ligand vor Bildung des Liganden-Antikörper- Antikörper-Komplexes unlöslich gemacht. Weiterhin erfolgt im Falle bevorzugter Ausführungsformen die Trennung von nichtkomplexgebundenen Stoffen von dem Liganden-Antikörper- Komplex vor der Bildung des Liganden-Antikörper-Antikörper- Komplexes. Der unlösliche Komplex wird auf der Filtrationsmembran zurückgehalten für eine nachfolgende Bestimmung.
Konjugate von Enzymen und Anti-Antikörpern werden hergestellt unter Verwendung von standardisierten Ausgangsmaterialien und nach gut bekannten Herstellungsverfahren. Einige Konjugate sind im Handel erhältlich. Zu geeigneten Enzym- Markierungen gehören beispielsweise Peroxidase, Glucoseoxidase, alkalische Phosphatase, Urease sowie β-Galactosidase. Peroxidase (in jeder ihrer Formen und aus beliebigen Quellen) wird vorzugsweise angewandt. Bei den Antikörpern kann es sich um monoklonale oder polyklonale Antikörper handeln oder ganze Antikörper oder Teile von Antikörpern solange sie nur mit den Antikörpern für den Liganden bei der Bestimmungsmethode reagieren. Beispielsweise können sie aus Ziegen- oder Mäuse-anti-menschlichen Antikörpern bestehen. Das Konjugat kann in Beimischung mit anderen Materialien, einschließlich Puffersubstanzen, oberflächenaktiven Stoffen, Proteinen und Peroxidase-Steigerungsmitteln eingesetzt werden. Eine besonders geeignete Konjugat-Zusammensetzung wird im folgenden im Detail beschrieben.
Die Bildung des Liganden-Antikörper-Antikörper-Komplexes erfolgt im allgemeinen durch Inkubierung der Materialien bis zu 5 min lang bei einer Temperatur zwischen 15ºC und 30ºC. Vorzugsweise erfolgt die Inkubation bei 15ºC bis 25ºC innerhalb von 1 min. Wird der Komplex unlöslich gemacht, so fließt jede Flüssigkeit von der Konjugat-Zusammensetzung durch die zur Filtration verwendete Membran unmittelbar ab.
Der hierbei erzeugte unlösliche Komplex wird gewaschen, um nicht-komplexgebundene Stoffe zu entfernen, unter Verwendung einer wäßrigen Wasch-Zusammensetzung, die auf einen pH-Wert von 5 bis 10 abgepuffert ist, unter Verwendung von einer oder mehreren geeigneten Puffersubstanzen und mit einem oberflächenaktiven Mittel. Im allgemeinen werden lediglich einige wenige Tropfen der Wasch-Zusammensetzung oder Waschmittel-Zusammensetzung benötigt, um die nicht-komplexgebundenen Stoffe durch die Filtrationsmembran zu entfernen. Vorzugsweise liegt der pH-Wert der Wasch-Zusammensetzung bei 6,5 bis 8,5.
Gemäß einer Ausführungsform enthält die Wasch-Zusammensetzung mindestens 0,01 Gew.-% eines oberflächenaktiven Stoffes mit einem Dodecylsulfatanion und einem Alkalimetall- oder Ammoniumcation. Im Falle einer weiteren Ausführungsform enthält die Wasch-Zusammensetzung mindestens 1,5 Gew.-% eine oberflächenaktiven Mittels mit einem kurzkettigen Alkoholsulfatanion mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen und einem Alkalimetall- oder Ammoniumcation. Besonders geeignete Wasch-Zusammensetzungen werden im folgenden beschrieben.
Im Falle einer weiteren Ausführungsform enthält eine neue Wasch-Zusammensetzung ein mit Wasser mischbares polares organisches Lösungsmittel, das im allgemeinen ein Molekulargewicht von weniger als 200 hat. Zu geeigneten Lösungsmitteln gehören Amide (z. B. 1-Methyl-2-pyrrolidinon, N,N-Dimethylformamid sowie N,N-Dimethylacetamid), Ketone (z. B. Aceton, Methylethylketon und 3-Pentanon), Alkohole (z. B. Methanol, Ethanol, t-Butanol sowie Isopropanol). Tert- Butanol sowie 1-Methyl-2-pyrrolidon werden bevorzugt eingesetzt.
Geeignete oberflächenaktive Mittel in dieser Wasch-Zusammensetzung sind nicht-ionogene, anionische oder amphotere oberflächenaktive Mittel. Zu geeigneten nicht-ionogenen oberflächenaktiven Mitteln gehören die Polyoxyethylenderivate, die oben beschrieben wurden, oberflächenaktive Mittel vom Typ Octylphenoxypolyethoxyethanol, oberflächenaktive Mittel vom Typ der Fluorokohlenwasserstoffe und andere für den Fachmann leicht erkennbare oberflächenaktive Mittel. Zu den anionischen oberflächenaktiven Mitteln gehören beispielsweise Deoxycholsäure und Derivate hiervon, Alkylsulfatester und andere, für den Fachmann leicht erkennbare Mittel.
Ein oder mehrere einfache wasserlösliche Salze sind ebenfalls in der neuen Wasch-Zusammensetzung vorhanden, einschließlich Alkalimetall- und Ammoniumsalze, z. B. Lithiumchlorid, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Natriumiodid, Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat und andere bekannte Salze. Diese Salze werden in einer Menge verwendet, die ausreicht, um eine Ionenstärke von mindestens 0,25 und vorzugsweise von 0,25 bis 1 zu erzeugen. Eine repräsentative Wasch-Zusammensetzung wird im folgenden näher beschrieben.
Der von der Membran zurückgehaltene unlösliche Komplex wird mit einer Reagens-Zusammensetzung in Kontakt gebracht, die ein oder mehrere Reagenzien aufweist, um eine bestimmbare Form bei Umsetzung mit der Enzymmarkierung zu liefern. Das Reagens hängt somit von dem verwendeten Enzym ab und für jedes Enzym gibt es viele bekannte zu diesem Zweck einsetzbare Reagenzien. Ein oder mehrere Reaktionen können erforderlich sein, um eine bestimmbare Species zu erzeugen.
Im Falle einer bevorzugten Ausführungsform, in der das Enzym aus Peroxidase besteht, umfaßt die Reagens-Zusammensetzung geeignete Reagenzien zur Bildung von bestimmbaren Species (Chromogen oder Fluorogen) in Gegenwart von Wasserstoffperoxid und Peroxidase. Diese Reagens-Zusammensetzung enthält geeignete Reagenzien, von denen eines als Substrat für Peroxidase wirkt, die dazu befähigt ist, einen bestimmbaren Farbstoff in Gegenwart von Peroxidase und Wasserstoffperoxid zu erzeugen. Das Substrat selbst kann eine einen Farbstoff liefernde Verbindung sein, wie beispielsweise Benzidin, Tetramethylbenzidin oder ein anderes Benzidinderivat, 2,2'- Azino-di-(3-ethyl-benzthiazolon-6-sulfonsäure), Phenolrot, o-Phenylendiamin, Pyrogallol, 4-Aminoantipyrin, Bromopyrogallolrot sowie eine andere bekannte Verbindung. Alternativ können ein Wasserstoffdonor und ein Elektronenakzeptor miteinander kombiniert werden, um eine bestimmbare Species zu liefern (verwiesen wird beispielsweise auf die in der U.S.- Patentschrift 4 260 679 beschriebenen Verbindungen).
Nachdem ein Farbstoff in Gegenwart des unlöslichen Komplexes gebildet wurde, kann er visuell oder unter Verwendung einer spektrophotometrischen Ausrüstung untersucht werden, um festzustellen, ob das Bestimmungsverfahren das Vorhandensein von Liganden-Antikörpern in der Probe feststellt. Sowohl positive wie auch negative Vergleichstests können in zweckmäßiger Weise mit dem Probentest durchgeführt werden. Geeignete Reagenzien werden dabei für jeden' Vergleichs- oder Kontrolltest eingesetzt, um das gewünschte Ergebnis zu erzielen.
Zu der Ausstattung (Kit) dieser Erfindung können die Verdünnungsmittel- und Wasch-Zusammensetzungen, die hier beschrieben werden, gehören, die in geeigneter Weise abgepaßt sind und enthalten sind in einem Träger des Typs, der aus Abteilungen oder Compartments bestehen, um eine oder mehrere Behälter mit den Zusammensetzungen aufzunehmen. Zusätzlich können zur Ausstattung gehören eine oder mehrere der folgenden Teile, die zur Durchführung des Verfahrens geeignet sind: eine Wegwerf-Testvorrichtung mit einer Filtrationsmembran, einer Reagens-Zusammensetzung, einer Enzym-markierten Antikörper-Zusammensetzung und einem immunologischen Reagens. Die Reagenzien können in trockener Form vorliegen oder in Form geeigneter Lösungen. Zu nichtreaktiven Komponenten der Ausstattung können gehören Instruktionen, Mischgefäße, Rührvorrichtungen, Pipetten und dgl . .
Die folgenden Zusammensetzungen wurden zur Durchführung der Bestimmungsmethode verwendet, die in dem unten folgenden Beispiel beschrieben wird. Sämtliche Prozentsätze beziehen sich auf das Gesamtgewicht der Zusammensetzung.
Immunologisches Reagens:
Zu diesem Reagens gehörten Teilchen von Poly[styrol-co-m & p-(2-Chloroethylsulfonylmethyl)styrol (molares Verhältnis 95,5 : 4,5), auf denen HIV-I-Antigen kovalent gebunden war.
HIV-I-Antigen wurde hergestellt durch Kultivierung von HIV-I in der Hut 78-Zellinie in dem Roswell Park Memorial Institute-1640 medium in Gegenwart von 10% Rinderserumalbumin sowie Gentamycin (50 µg/ml). Die Zelldichte wurde gehalten bei ungefähr 10&sup5;-10&sup6; Zellen/ml und die Zellen wurden subkultiviert durch Zugabe von frischem Medium, um diese Dichte aufrechtzuerhalten. Die viralen Teilchen wurden in einem geschlossenen System mit einer Filtrations-/Konzentrationsvorrichtung aus rostfreiem Stahl isoliert, durch Zusammenfassen der Kulturen, die geerntet werden sollten in einem Aufbewahrungstank, der es ermöglichte, daß die Zellkulturflüssigkeit durch ein Filtergehäuse gepumpt wurde, das mit einem 0,45 µm Filter ausgestattet war. Durch diese erste Filtrationsstufe wurden die ganzen Zellen und Zellfragmente entfernt. Die zellfreie überstehende Flüssigkeit wurde dann durch ein zweites Filtergehäuse gepumpt, das mit einem 0,2 µm Filter ausgerüstet war, um restliche Zellfragmente oder Zelltrümmer, die durch den 0,45 µm Filter nicht entfernt worden waren, zu eliminieren. Die zweite überstehende Flüssigkeit wurde durch eine Konzentrationskassette gepumpt, die mit einer Abtrennmembran von 100 000 Dalton ausgestattet war, um die Präparation auf ein geeignetes Volumen zu konzentrieren.
Die auf diese Weise erhaltenen rohen viralen Teilchen wurden pelletisiert, und zwar durch ein zwei Stunden langes Zentrifugieren bei 50 000 · g und Resuspendierenin 40 ml einer Pufferlösung [pH-Wert 7,8, 0,01 molar bezüglich Tris(hydroxymethyl)aminomethanchlorid, 0,01 molar bezüglich NaCl, 0,001 molar bezüglich Ethylendiamintetraessigsäure], ausgelegt über einen 1300 ml linearen 22 bis 65% Sucrosegradienten in dem Puffer mit einem üblichen Zonen-Rotor und Ultrazentrifugieren über Nacht bei 30 000 · g. Der Gradient wurde zu 110 Fraktionen frakioniert (jeweils 12 ml) und sämtliche Fraktionen mit Dichten zwischen 1,14 und 1,18 g/ml wurden zusammengefaßt, mit dem 3- bis 4-fachen mit dem Puffer verdünnt und bei 50 000 · g zwei Stunden lang zentrifugiert, um die gereinigten HIV-I viralen Teilchen zu gewinnen. Die Teilchen wurden dann in 10 ml einer Lösung suspendiert, die bezüglich KCl 0,6 molar war und 0,5% eines oberflächenaktiven Mittels auf Basis von nicht-ionogenem Octylphenoxypolyethoxyethanol enthielt, worauf mit drei 5 Sekunden langen Impulsen beschallt wurde, und worauf 1 Stunde bei 37ºC inkubiert und bei 80 000 · g 1 Stunde lang zentrifugiert wurde, um die Zelltrümmer zu entfernen. Das löslich gemachte HIV-I-Präparat wurde dann zweimal mit dem gleichen Volumen von wasserfreiem Ether extrahiert und die erhaltene wäßrige Phase wurde als Lieferant von HIV-I-Antigen in dem folgenden Beispiel verwendet.
Verdünnungsmittel-Zusammensetzung:
Es wurden zwei Verdünnungsmittel-Zusammensetzungen für diese Erfindung wie folgt hergestellt:
(1) succinyliertes Casein (1%), Gummiarabicum (1%), nichtionogenes oberflächenaktives Mittel vom Typ Tween 20 (0,05%) sowie Thimerosal-Schutzmittel (0,01%) in einem 0,1 molaren Tris-Puffer (pH-Wert = 8), und
(2) succinyliertes Casein (1%), Rinderserumalbumin (4%), nicht-ionoges oberflächenaktives Mittel vom Tween 20 (0,05%) in 0,1 molarem Tris-Puffer (pH-Wert = 8).
Waschzusammensetzungen:
Es wurden zwei Wasch-Zusammensetzungen gemäß der Erfindung wie folgt hergestellt:
(1) 1-Methyl-2-pyrrolidinon (10%), nicht-ionogenes oberflächenaktives Mittel vom Typ Tween 20 (0,25%), nicht-ionogenes oberflächenaktives Mittel vom Typ Nonidet P-40 (0,1%), Natriumchlorid (0,5 molar) in einem 0,05 molaren Natriumphosphatpuffer (pH-Wert = 7,4), und
(2) Natriumdecylsulfat (2,4%) in einem 0,1 molaren Natriumphosphatpuffer (pH-Wert = 7,2).
Es wurden ferner zwei Peroxidase-Antikörper-Zusammensetzungen hergestellt:
(1) Meerrettich-Peroxidase, konjugiert mit Kaninchen-antimenschlichen Antikörpern, verdünnt auf 1 : 3000, 4% Rinderserumalbumin und Thimerosal-Schutzmittel (0,01%) in einer 0,5 molaren mit Phosphat abgepufferten Salzlösung, und
(2) das gleiche Konjugat mit succinyliertem Casein (1%) 4'- Hydroxyacetanilid (0,15%), Rinderserumalbumin (1%) in einem 0,1 molaren Tris-Puffer (pH-Wert = 8).
Farbstoff-liefernde Reagens-Zusammensetzung:
Eine Zusammensetzung für die Erzeugung eines Farbstoffes in Gegenwart von Wasserstoffperoxid und Peroxidase wurde wie folgt hergestellt: eine Leucofarbstofflösung wurde hergestellt durch Lösen von 2-(4-Hydroxy-3,5-dimethoxyphenyl)- 4,5-bis(4-methoxyphenyl)imidazol (zur Herstellung einer 0,1%igen Lösung) in einer Lösung von 20% Poly(vinylpyrrolidon) in einem Natriumphosphatpuffer (5 mmolar). Diese Lösung wurde dann zu einer Lösung zugegeben, die enthielt: Wasserstoffperoxid (10 mmolar), 4'-Hydroxyacetanilid- Elektronenübertragungsmittel (5 mmolar) sowie Diethylentriaminpentaessigsäure-Komplexbildner (10 µmolar) in einem Natriumphosphatpuffer unter Erzeugung einer Endkonzentration von 1% Poly(vinylpyrrolidon) sowie 0,005% Leucofarbstoff.
Herstellung von succinyliertem Casein:
Succinyliertes Casein wurde hergestellt durch Umsetzung von Casein mit einer gleichen Gewichtsmenge von Bernsteinsäureanhydrid, 4 h lang bei 25ºC in einem 0,5 molaren Phosphatpuffer (pH-Wert = 8,5) und Reinigung des Produktes durch Dialyse.

Beispiel 1: Untersuchung einer Blutserumprobe auf HIV-I-Antikörper

Eine Probe menschlichen Serums wurde auf das Vorhandensein von Antikörpern für HIV-I in folgender Weise und unter Verwendung einer Wegwerf-Testvorrichtung untersucht.
Diese Testvorrichtung wies drei Test-Behältnisse auf, jeweils mit einer Filtrationsmembran vom Typ Loprodyne® (im Handel erhältlich von der Firma Pall Corp). Die Membran war mit einem oberflächenaktiven Mittel vom Typ Fluorad FC 134 beschichtet (0,05 g/m², erhältlich von der Firma 3M). Ein Test-Behältnis für einen positiven Vergleich enthielt: eine Probe (0,23 mg) des immunologischen Reagens, wie oben beschrieben, und wärmebehandeltes Serum mit inaktiviertem HIV-I. Ein Testbehältnis für einen negativen Vergleich enthielt die polymeren Teilchen, wie in dem Testbehältnis verwendet, wobei die Teilchen jedoch lediglich mit Casein beschichtet waren. Das Testbehältnis, das bestimmt war für den Empfang der Testprobe, enthielt lediglich das oben beschriebene immunologische Reagens.
Eine Probe menschlichen Serums (50 µl) wurde mit einer Probe (5 ml) der ersten Verdünnungsmittel-Zusammensetzung, wie oben beschrieben, in einer Verdünnung von 100 : 1 verdünnt. Die verdünnte Probe (100 µl) wurde dann in jedes der Testbehältnisse gegeben und bei Raumtemperatur etwa 2 min lang inkubiert, um die Bildung eines unlöslichen immunologischen Komplexes zu ermöglichen, mit anschließender Flüssigkeits- Drainage.
Die Peroxidase-markierte-anti-Antikörper-Zusammensetzung (40 µl) wurde zugegeben und der unlösliche markierte Antikörper- Antikörper-Antigen-Komplex wurde erzeugt ohne Flüssigkeits- Drainage während einer 1 min währenden Inkubationsperiode bei Raumtemperatur. Nach Abfließenlassen der Flüssigkeit wurde der erhaltene Komplex zweimal gewaschen, und zwar mit der ersten Waschmittel-Zusammensetzung, wie oben beschrieben, (zunächst mit 240 µl und mit 60 µl) zur Abtrennung von nicht-komplexgebundenen Materialien von dem Komplex.
Eine Probe (40 µl) der den Farbstoffliefernden Zusammensetzung, wie oben beschrieben, wurde nun zugegeben. Nach einer 2 min währenden Inkubation bei Raumtemperatur wurde ein roter Farbstoff in dem Proben-Testbehältnis festgestellt, was das Vorhandensein von HIV-I-Antikörpern in der Serumprobe anzeigte. Das Behältnis für den negativen Vergleich zeigte nur wenig Hintergrund und das Behältnis für den positiven Vergleich zeigte ebenfalls einen positiven Test.

Beispiel 2: Untersuchung auf HIV-I-Antikörper unter Verwendung von verschiedenen Verdünnungsmittel- und Waschmittel-Zusammensetzungen

Eine Probe menschlichen Serums wurde auf das Vorhandensein von Antikörpern für HIV-I untersucht, unter Anwendung von Untersuchungsverfahren, die ähnlich waren demjenigen des Beispieles 1 mit der Ausnahme, daß verschiedene Verdünnungsmittel- und Waschmittel-Zusammensetzungen verwendet wurden und daß eine Anzahl von anderen Veränderungen von geringer Bedeutung durchgeführt wurde. Zusätzlich wurde eine Anzahl von Vergleichsbestimmungen durchgeführt. Diese Bestimmungen lagen außerhalb des Schutzbereiches dieser Erfindung.
Jede Testvorrichtung wies drei Test-Behältnisse auf, wobei eine jede mit einer Nylon-Filtrationsmembran ausgerüstet war, die erhältlich ist von der Firma Pall Corp. Ein positives Vergleichs-Testbehältnis enthielt: eine Probe (0,15 mg) des immunologischen Reagens, wie oben beschrieben, sowie wärmebehandeltes Serum mit inaktiviertem HIV-I. Ein Testbehältnis für die Durchführung eines negativen Vergleichstests enthielt die polymeren Teilchen, wie sie in dem Testbehältnis verwendet wurden, jedoch waren die Teilchen lediglich mit Casein beschichtet. Das Testbehältnis, das für die Aufnahme der Testprobe bestimmt war, enthielt lediglich das oben beschriebene immunologische Reagens.
Eine Probe von menschlichem Serum wurde mit einer Probe der zweiten Verdünnungsmittel-Zusammensetzung vermischt (enthaltende BSA anstelle von Gummiarabicum), wie oben beschrieben, zur Erzielung einer Verdünnung von 80:1. Die verdünnte Probe (100 µl), wurde dann zu jedem der Testbehältnisse zugegeben und bei Raumtemperatur etwa 3 min lang inkubiert, um die Bildung eines unlöslichen Antikörper-Antigen-immunologischen Komplexes zu ermöglichen, mit anschließender Flüssigkeits- Drainage.
Die Peroxidase-markierte Anti-Antikörper-Zusammensetzung (50 41) wurde zugegeben und es bildete sich ein unlöslicher markierter Antikörper-Antikörper-Antigenkomplex ohne Flüssigkeits-Drainage während einer Inkubationsperiode von 1 min bei Raumtemperatur. Nach Abfließenlassen der Flüssigkeit wurde der erhaltene Komplex zweimal mit der Decylsulfat- Waschmittel-Zusammensetzung, wie oben beschrieben, gewaschen (zunächst mit 240 µl, dann mit 60 µl), um die nicht-komplexgebundenen Stoffe von dem Komplex abzutrennen.
Eine Probe (40 µl) der den Farbstoff liefernden Zusammensetzung, wie oben beschrieben, wurde zugegeben. Nach einer Inkubation von 1 min bei Raumtemperatur wurde ein roter Farbstoff in den Behältnissen beobachtet und visuell beurteilt durch Vergleich mit einer Farb-Gradientenkarte (Werte 0-10, wobei 10 die tiefste Farbe darstellt).
Test- und Vergleichszusammensetzungen sind in Tabelle I und die Ergebnisse in Tabelle 11 zusammengestellt.

TABELLE I

Test A: Verdünnungsmittel-Zusammensetzung 1, Waschmittelzusammensetzung 1 und Peroxidase-Antikörper-Zusammensetzung 1.
Test B: Verdünnungsmittel-Zusammensetzung 2, Waschmittelzusammensetzung 1 sowie Peroxidase-Antikörper-Zusammensetzung 1.
Test C: Verdünnungsmittel-Zusammensetzung 2, Waschmittelzusammensetzung 2 sowie Peroxidase-Antikörper-Zusammensetzung 2.
Vergleich A: Waschmittel-Zusammensetzung 1, Peroxidase-Antikörper-Zusammensetzung 1 sowie Verdünnungsmittel-Zusammensetzung 1 ohne Gummiarabicum, succinyliertes Casein und oberflächenaktives Mittel.
Vergleich B: Waschmittel-Zusammensetzung 1, Peroxidase-Antikörper-Zusammensetzung 1 sowie Verdünnungsmittel-Zusammensetzung 2 ohne succinyliertes Casein und oberflächenaktives Mittel.
Vergleich C: Waschmittel-Zusammensetzung 2, Peroxidase-Antikörper-Zusammensetzung 2 sowie Verdünnungsmittel-Zusammensetzung 2 ohne succinyliertes Casein und oberflächenaktives Mittel.
Vergleich D: Peroxidase-Antikörper-Zusammensetzung 1, Verdünnungsmittel-Zusammensetzung 1 sowie Waschmittel-Zusammensetzung 1 ohne oberflächen aktives Mittel und 1-Methyl-2-Pyrrolidinon.
Vergleich E: Peroxidase-Antikörper-Zusammensetzung 2 Verdünnungsmittel-Zusammensetzung 2 sowie Waschmittel-Zusammensetzung 2 ohne oberflächenaktives Mittel. TABELLE II Negatives Vergleichsbehältnis Proben-Behältnis Positives Vergleichsbehältnis Test Vergleich
Die Versuchsergebnisse zeigen, daß ein geringer Hintergrund (negatives Vergleichsbehältnis) und eine adäquate Empfindlichkeit (Unterschied von mindestens einem Punkt zwischen negativem Vergleichsbehältnis und Proben-Behältnis) erzielt wurden, wohingegen die Vergleichsversuche einen starken Hintergrund zeigten und eine schlechte Empfindlichkeit.

Claims

1. Verfahren zur Bestimmung von Antikörpern mit den Stufen:

A. Vermischen einer biologischen Probe, von der erwartet wird, daß sie Antikörper enthält, die spezifisch für einen Liganden sind, mit einer Verdünnungsmittel- Zusammensetzung, die auf einen pH-Wert von 6-10 abgepuffert ist und enthält:

ein nicht-modifiziertes oder underivatisiertes Protein oder Carbohydrat,

ein oberflächenaktives Mittel, und

ein negativ geladenes Protein oder Carbohydrat

B. Kontaktieren der verdünnten Probe mit dem Liganden unter Bildung eines immunologischen Komplexes des Liganden und eines Antikörpers, der in der Probe vorhanden ist,

C. Unlöslichmachen des Liganden durch Bindung an ein festes Substrat, vor, gleichzeitig oder nach der Komplexbildung,

D. Abtrennen des Komplexes von nicht-komplex gebundenen Materialien unter Verwendung einer mikroporösen Filtrationsmembran, die den Komplex hierauf zurückhält, gleichzeitig mit oder im Anschluß an die Bindung in Stufe C,

E. Kontaktieren des Komplexes mit Enzym-markierten Antikörpern, die auf die Liganden-Antikörper gerichtet sind, unter Bildung eines mit einem Enzym markierten Liganden-Antikörper-Antikörper-Komplex, vor, gleichzeitig mit oder im Anschluß an die Trennungsstufe,

F. Waschen des auf der Membran zurückgehaltenen Komplexes mit einer wäßrigen Waschlösung zum Zwecke der Abtrennung nicht-komplex gebundener Materialien von dem Komplex,

wobei die Waschlösung auf einen pH-Wert von 5 10 abgepuffert ist und ein nicht-ionogenes anionisches oder amphoteres oberflächenaktives Mittel enthält und ggf. weiterhin aufweist ein mit Wasser mischbares polares organisches Lösungsmittel sowie ein Alkalimetall- oder Ammoniumsalz, das in einer Menge vorliegt, die ausreicht, um eine Ionenstärke von mindestens 0,25 herbeizuführen, und

G. Zusatz einer Reagenszusammensetzung, die dazu befähigt ist, eine bestimmbare Art in Gegenwart des Enzyms zu liefern und Bestimmung der Gegenwart der Art als Anzeichen für das Vorhandensein von Antikörpern zum Antigen in der Probe.

2. Verfahren nach Anspruch 1, das unter Verwendung einer Wegwerf-Testvorrichtung mit einer hierin befestigten mikroporösen Filtrationsmembran durchgeführt wird.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, bei dem der Ligand unlöslich gemacht ist als Teil eines immunologischen Reagens mit polymeren Teilchen mit einer durchschnittlichen Teilchengröße von größer als 0,1 Mikrometern, und bestehend aus einem oder mehreren Polymeren, hergestellt aus einem oder mehreren ethylenisch ungesättigten polymerisierbaren Monomeren, von denen mindestens eines aktive Halogenatome aufweist oder aktivierte 2-substituierte Ethylsulfonyl- oder Vinylsulfonylgruppen.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Bestimmung von proviralen Antikörpern.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, zur Bestimmung von HIV-I-Antikörpern.

6. Diagnostische Ausstattung, geeignet für die Bestimmung von Antikörpern in einer biologischen Probe, mit:

(a) einer Verdünnungsmittelzusammensetzung, abgepuffert auf einen pH-Wert von 6-10 und enthaltend:

ein unmodifiziertes oder underivatisiertes Protein oder Carbohydrat,

ein oberflächenaktives Mittel, und

ein negativ geladenes Protein oder Carbohydrat und

(b) einer Waschlösung, die auf einen pH-Wert von 5- 10 abgepuffert ist und ein nicht-ionogenes, anionisches oder amphoteres oberflächenaktives Mittel enthält sowie gegebenenfalls ferner ein mit Wasser misch- bares organisches Lösungsmittel sowie ein Alkali- metall oder Ammoniumsalz in einer Menge, die ausreicht, um eine Ionenstärke von mindestens 0,25 herbeizuführen; und

eine Wegwerf-Testvorrichtung mit einer Filtrationsmembran.

7. Ausstattung nach Anspruch 6, weiter enthaltend ein immunologisches Reagens mit in Wasser unlöslichen polymeren Teilchen, an die ein Ligand gebunden ist, der bezüglich der Antikörper reaktiv ist, Enzym-markierte Antikörper, die auf die Liganden-Antikörper gerichtet sind, sowie eine Reagenszusammensetzung, die dazu in der Lage ist, eine bestimmbare Art in Gegenwart des Enzyms zu liefern.

8. Ausstattung nach einem der Ansprüche 6 oder 7, weiter enthaltend ein immunologisches Reagens mit in wasserlöslichen polymeren Teilchen, an die Liganden gebunden sind, die mit den Antikörpern reaktiv sind, wobei das Reagens in einer Wegwerf-Testvorrichtung immobilisiert ist.

9. Verfahren oder Ausstattung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, in dem bzw. in der das polare organische Lösungsmittel in der Waschzusammensetzung ein Molekulargewicht von weniger als 200 aufweist und aus einem Amid, Keton oder Alkohol besteht.

10. Verfahren oder Ausstattung nach Anspruch 9, in dem bzw. in der das polare organische Lösungsmittel t-Butanol oder 1-Methyl-2-pyrrolidinon ist.

11. Verfahren oder Ausstattung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, in dem bzw. in der das oberflächenaktive Mittel in der Waschzusammensetzung ein anionisches oberflächenaktives Mittel ist.