DE69837703T2

DE69837703T2 - Methoden zum nachweis und zur analyse von virus

Info

Publication number: DE69837703T2
Application number: DE69837703T
Authority: DE
Inventors: Katsumi Truma-gun AOYAGI; Chiharu Iruma-gun OHUE; Kumiko Iruma-gun IIDA; Tatsuji Iruma-gun KIMURA; Shintaro Iruma-gun Yagi
Original assignee: Advanced Life Science Institute Inc
Current assignee: Advanced Life Science Institute Inc
Priority date: 1997-08-04
Filing date: 1998-08-04
Publication date: 2008-01-10
Anticipated expiration: 2018-08-05
Also published as: CN1239548A; EP0967484B1; WO1999006836A1; KR100523685B1; EP1801591B1; KR100661760B1; US7776542B1; CN1287154C; EP1801591A2; EP0967484A4; CA2267207A1; CN1207569C; CN1492231A; EP0967484A1; KR20030070138A; EP1801591A3; DE69837703D1; US20110262892A1; ES2286852T3; KR20000068705A

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren des Nachweisens oder Messens von Viren und Reagenzien dafür.
Stand der Technik
Derzeit werden verschiedene Verfahren des Nachweisens von Viren verwendet, um das Vorliegen von infektiösen Viren in Blut oder Blutprodukten nachzuweisen und um das Vorliegen von Viren in Patienten mit Erkrankungen zu identifizieren. Jedoch sind diese Verfahren nicht immer in hohem Maße empfindlich oder spezifisch, wenn auch die Empfindlichkeit und die Spezifität mit dem Typ des Virus, das nachgewiesen werden soll, variieren kann. Selbst wenn sie empfindlich und spezifisch genug sind, sind sie oft teuer und erfordern lange Prozeduren wie z. B. bei der Kultivierung und Isolation eines Virus. Als Hintergrund für die vorliegende Erfindung wird Hepatitis Typ C (Hepatitis C) nachstehend im Detail angeführt werden.
Der Verursacher von Hepatitis C war lange unbekannt, als aber das Gen des Virus kloniert wurde (Science 244: 359-362, 1989) und ein diagnostisches Verfahren über eine Antikörpermessung unter Verwendung eines rekombinanten Antigens, das auf der Grundlage dieses Gens erzeugt wurde, entwickelt wurde (Science 244: 362-364, 1989; Japanische Patentschrift (Kohyo) 2 (1990)-500880), wurde gefunden, dass Hepatitis C eine Infektionskrankheit ist, deren Verursacher das Hepatitis C-Virus (HCV) ist, das über das Blut und Blutprodukte als dessen Hauptinfektionsweg übertragen wird. Mit der Entwicklung der so genannten zweiten Generation von Antikörpertestverfahren, bei welchen ein rekombinantes Kernantigen und ein rekombinantes NS3-Antigen zugegeben wurden, ist es nun möglich, praktisch alle HCV-Patienten durch ein Testen ihres Serums zu identifizieren. Dieses hat es möglich gemacht, in Japan praktisch alle HCV-Infektionen, die über Blutspenden übertragen werden, auszurotten.
Was jedoch andere häufige Virusinfektionen wie z. B. durch das menschliche Immundefizienzvirus (HIV) betrifft, gibt es einen Zeitraum bis zum Erscheinen von Antikörpern nach der Infektion oder die so genannte Fensterperiode, in welcher ein Virus durch die bestehenden Testverfahren nicht identifizierbar ist. Dieses bedeutet, dass das Risiko einer sekundären Infektion aufgrund von im Blut vorhandenen Komponenten, die durch Antikörpertestverfahren nicht identifiziert werden können, in Bereichen, wo der Verkauf von Blut legal ist oder in gewissen Bereichen von Japan immer noch vorhanden ist. Das Antikörpertestverfahren weist ebenfalls einen Nachteil darin auf, dass es aufgrund seines Testprinzips nicht zwischen einer Person, die sich von einer Infektion erholt hat, und einer Person, die sich in dem aktiven Stadium der Infektion befindet, unterscheiden kann.
Interferon (IFN) wird derzeit für die Behandlung von Hepatitis C verwendet. Einige Forscher betonen jedoch nachdrücklich, dass die Wirksamkeit der Therapie nur ausgewertet werden kann, indem der Antikörpertiter von HCV gemessen wird, da der Titer 6 Monate nach der Eliminierung von HCV durch IFN absinkt. Da jedoch der Antikörpertiter nur nach der Verringerung der Antigenstimulation oder mehrere Monate nach der Eliminierung des Antigens abzusinken beginnt, ist es zu einem gewünschten Zeitpunkt und mit einer gewünschten Genauigkeit unmöglich, durch den Antikörpertest allein zu bestimmen, ob die Verabreichung von IFN zur Eliminierung von HCV führte. Folglich ist es, um die Therapie zu überwachen, notwendig, HCV per se zusätzlich zu dem HCV-Antikörper nachzuweisen.
Es war schwierig ein Verfahren zum direkten Nachweisen des Viruspartikels (Virusantigens) von HCV zu etablieren, da die Blutspiegel des Virus im Vergleich zu anderen Viren, wie z. B. Hepatitis B-Virus (HBV), sehr niedrig sind, und da das Virus nicht in vitro oder unter Verwendung eines Tieres usw. als einem Wirt vermehrt werden kann. Daher wurden an Stelle des Nachweisens des Virusantigens Verfahren des Nachweisens der genomischen RNA des Virus wie z. B. das Polymerase-Kettenreaktions-(PCR)-Verfahren (Science 230: 1350-1354, 1985) und das Verfahren mit einer verzweigtkettigen DNA-Sonde entwickelt. Das Verfahren des Nachweisens viraler Genome weist aber mehrere Probleme auf, wenn es mit dem Verfahren des Nachweisens von Virusantigenen verglichen wird.
Zuerst wurde darauf hingewiesen, dass, da die nachzuweisende Substanz RNA ist, die während der Lagerung nicht sehr stabil ist, der Vorgang des Einfrierens und Auftauens von Serum eine Verringerung bei dem gemessenen Wert verursachen kann. Somit müssen die zu testenden Serumproben sorgfältiger gelagert werden als wenn diese in anderen Testverfahren verwendet werden. Äußerste Sorgfalt muss ebenfalls beim Transport der Proben angewendet werden.
Obwohl die Testverfahren, welche die Verwendung eines PCR-Verfahrens beinhalten, zum Nachweisen von Genfragmenten am empfindlichsten sind, weisen sie Probleme darin auf, dass: die reverse Transkription von einer genomischen RNA zu einer Matritzen-DNA oft von Verlusten begleitet ist, was daher eine große Geschicklichkeit erfordert, um einen genauen quantitativen Wert zu erhalten, und dass: da die Amplifikation ein wichtiges Prinzip bei den Verfahren ist, ein hohes Vorkommen von falschen Positiven im Fall einer Kontamination auftreten kann, und somit die Bearbeitung eines großen Volumens an Proben gleichzeitig unmöglich ist. Weiterhin benötigen selbst jene Verfahren, von denen postuliert wird, dass sie eine einfache Prozedur sind, 2 Stunden oder mehr für die Vorbehandlung der Proben, und sie sind kompliziert, da wiederholte Vorgänge von Zentrifugation und dergleichen erforderlich sind. Zusätzlich führen solche komplizierten Prozeduren zu erhöhten Risiken der Kontamination und dadurch erhöhten Risiken, falsche positive Ergebnisse zu erhalten. Andererseits weist das Verfahren mit verzweigter DNA-Sonde eine niedrige Nachweisempfindlichkeit auf und dauert daneben ca. 20 Stunden, bevor Testergebnisse erhalten werden (Igaku to Yakugaku [Medicine and Pharmacology] 31: 961-970, 1994), und somit lässt das Verfahren im Hinblick auf Empfindlichkeit und Bearbeitungszeit viel zu wünschen übrig.
Um die oben erwähnten Probleme zu lösen, die mit den Verfahren des Nachweisens viraler Genome verbunden sind, wurden Verfahren entwickelt, welche den direkten Nachweis eines Virusantigens beinhalten. Wie in der japanischen ungeprüften Patentschrift (Kokai) Nr. 8 (1996)-29427 gezeigt ist, wurde ein Verfahren entwickelt, welches das Kernantigen von HCV in dem Serum unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers, der für das Kernantigen spezifisch ist, nachweist. Wie in Tanaka et al., Journal of Hepatology 23: 742-745, 1995 und Fujino et al., Igaku to Yakugaku [Medicine and Pharmacology] 36: 1065-1070, 1996 berichtet wurde, wurde von Verfahren des Nachweisens des Kernantigens in dem Serum gezeigt, dass diese einen klinischen Nutzen aufweisen, wie ihn auch die oben erwähnten Verfahren des Nachweisens des viralen Genoms haben. Jedoch gibt es immer noch mehrere größere Probleme, die gelöst werden müssen, wie bei den Verfahren des Nachweisens des viralen Genoms.
Ein solches Problem ist, dass die Empfindlichkeit im Vergleich mit dem PCR-Verfahren so niedrig ist, dass dieses nicht als ein endgültiges Testverfahren des Serumscreenings verwendet werden kann. Tanaka et al., Journal of Hepatology 23: 742-745, 1995 zeigten, dass die Nachweisgrenze 10⁴–10⁵ Kopien/ml an HCV-RNA beträgt. Fujino et al., Igaku to Yakugaku [Medicine and Pharmacology] 36: 1065-1070, 1996 berichteten, dass das Verfahren bei 102 Seren von Patienten vor der Behandlung mit chronischer Hepatitis C, bei denen über das empfindlichste Nachweisverfahren des CRT (kompetitive reverse Transkription)-PCR-Verfahrens gefunden wurde, dass sie RNA-positiv waren, eine positive Rate von 67% gezeigt hat. Das heißt im Hinblick auf die Empfindlichkeit bleibt das Verfahren weit hinter dem empfindlichsten CRT-PCR-Verfahren zurück.
Weiterhin wirft die komplizierte Prozedur der Behandlung der Proben zur Messung und die lange Zeit, die dieses dauert, Probleme auf, wenn diese beim Screenen verwendet wird. So erfordert das Verfahren eine mehrschnittige Prozedur zur Proben (Serum)-Behandlung, die umfasst: eine Polyethylenglycolbehandlung (4°C, 1 h) für die Konzentration der Viruspartikel und die Entfernung der Serumkomponenten; Zentrifugation (15 min); die Entfernung des Überstands; Harnstoffbehandlung; die Alkalibehandlung (37°C, 30 min); die Zugabe des Neutralisierungsmittels und dergleichen. Zusätzlich erfordert der Prozess des Dispergierens, mit Harnstoff, des Niederschlags mit einer erhöhten Viskosität aufgrund der PEG-Behandlung große Geschicklichkeit. Um ein reproduzierbares Ergebnis zu erhalten ist daher eine große Geschicklichkeit erforderlich, und daneben ist ein Minimum von 2 Stunden Behandlung notwendig. Weiterhin sind derartige Prozesse wie Zentrifugation, Entfernung des Überstands usw. keiner Automatisierung zugänglich und machen die gleichzeitige Behandlung einer großen Anzahl von Proben sehr schwierig. Somit ist ebenfalls unter dem Gesichtspunkt der Leichtigkeit der Handhabung das Verfahren nicht für Anwendungen geeignet, welche die Behandlung eines großen Volumens an Proben erfordern, wie bei Screeningtests.
Andererseits ist das Virusantigen-Nachweissystem dem hochempfindlichen PCR-Verfahren in den folgenden Punkten überlegen. So ist es sehr tolerant gegenüber einer Kontamination, da es keine Prozedur einer übermäßigen Amplifikation in dem Nachweisschritt beinhaltet. Weiterhin erfordert es, da es beabsichtigt ist, Antigenprotein nachzuweisen, das an Stelle von wenig stabiler RNA relativ stabil ist, keine übermäßige Sorgfalt bei der Lagerung der Proben, es erfordert keine spezielle Ausrüstung wie z. B. das Gerät zum Tieffrieren, das für Proben benötigt wird, die durch PCR bestimmt werden sollen, und der Transport der Proben ist ebenfalls einfacher.
Diese Merkmale sind für Anwendungen geeignet, bei welchen eine große Anzahl von Proben gemessen wird, wie in der Blutindustrie oder bei Gesundheitsvorsorgeuntersuchungen. Da jedoch das offenbarte Verfahren des Nachweisens des Kernantigens, wie es oben angegeben ist, keiner Automatisierung zugänglich ist und eine geringe Empfindlichkeit aufweist, so dass es kein guter Standard (gold standard) bei Anwendungen sein kann, die eine hohe Empfindlichkeit erfordern, wie beispielsweise in der Blutindustrie, kann es nicht auf Tests angewendet werden, die eine große Anzahl von Proben handhaben, wie beispielsweise ein Screening, und es kann seine vorteilhaften Merkmale gegenüber dem PCR-Verfahren nicht optimal ausnutzen. Weiterhin müssen klinisch nützliche Testsverfahren immer den Anforderungen an Empfindlichkeit, Spezifität, Reproduzierbarkeit, Einfachheit der Handhabung und geringe Kosten entsprechen, und es werden anhaltende Anstrengungen benötigt, um diese Anforderungen soweit wie möglich zu erfüllen. In Bezug auf den Nachweis von Virusantigenen außer HCV, insbesondere zur Verwendung beim Screening, bei welchen eine große Anzahl von Proben gehandhabt wird, gibt es viele Verfahren, die in der Praxis nicht angewendet werden, da sie eine geringe Empfindlichkeit im Vergleich zu dem PCR-Verfahren aufweisen oder das gewünschte Antigen nicht vollständig exponiert werden konnte.
Offenbarung der Erfindung
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zum Nachweisen verschiedener Virusantigene, einschließlich eines Verfahrens zum Nachweisen des HCV-Antigens, bereit zu stellen, das zur Behandlung einer großen Anzahl von Proben wie beim Screenen in der Blutindustrie und bei Gesundheitsvorsorgeuntersuchungen geeignet ist. In anderen Worten ist es die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Nachweissystem für verschiedene Virusantigene bereitzustellen, welches ein Verfahren des Nachweisens des HCV-Antigens beinhaltet, das eine Empfindlichkeit und Spezifität aufweist, die äquivalent ist zu denen des PCR-Verfahrens, das eine einfache Vorbehandlung erlaubt oder das leicht ohne Vorbehandlung automatisiert werden kann. Bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden nun im Folgenden mit einem Hauptbezug auf HCV erläutert.
Gemäß der ersten Ausführungsform (1) der vorliegenden Erfindung wird ein Mittel bereitgestellt, um HCV nachzuweisen oder zu bestimmen, indem der Viruspartikel aufgebrochen wird, das Virusantigen vollständig exponiert wird, Antikörper, wenn sie vorliegen, gegen das Virusantigen aufgebrochen werden und das Virusantigen nachgewiesen oder bestimmt wird.
Somit stellt die vorliegende Erfindung (I) ein Verfahren zur Behandlung einer virushaltigen Probe bereit, das gekennzeichnet ist durch die Behandlung einer virushaltigen Probe mit einer Behandlungslösung, welche (1) ein anionisches Tensid und (2) ein amphoteres Tensid, ein nichtionisches Tensid oder ein Proteindenaturierungsmittel enthält.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls (II) ein Verfahren zur Behandlung einer virushaltigen Probe bereit, das gekennzeichnet ist durch die Behandlung einer virushaltigen Probe mit einer Behandlungslösung, die (1) ein anionisches Tensid, (2) ein amphoteres Tensid und (3) ein nichtionisches Tensid oder ein Proteindenaturierungsmittel enthält.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls (III) ein Verfahren zur Behandlung einer virushaltigen Probe bereit, das gekennzeichnet ist durch die Behandlung einer virushaltigen Probe mit einer Behandlungslösung, die (1) ein anionisches Tensid, (2) ein amphoteres Tensid, (3) ein nichtionisches Tensid und (4) ein Proteindenaturierungsmittel enthält.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls (IV) ein Virustestverfahren bereit, das gekennzeichnet ist durch die Verwendung eines Probenbehandlungsverfahrens gemäß irgendeinem von (I) bis (III) und das Umsetzen einer Probe mit einer Sonde, welche spezifisch ein Virusantigen erkennt, zum Nachweis oder zur Quantifizierung des Vorliegens des Virusantigens.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls ein Kit, ein Testkit oder ein diagnostisches Reagens zur Bestimmung des Vorliegens oder Fehlens eines Virus in einer Probe bereit, welches zur Verwendung in dem obigen (IV) Immuntestverfahren gedacht ist und ein anionisches Tensid umfasst.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls ein Kit, ein Testkit oder ein diagnostisches Reagens bereit, um das Vorliegen oder Fehlen eines Virus in einer Probe zu bestimmen, welches zur Verwendung in dem obigen (IV) Immuntestverfahren gedacht ist und einen monoklonalen Antikörper, der im Folgenden beschrieben wird, umfasst.
Gemäß der ersten Ausführungsform (2) der vorliegenden Erfindung wird ein Mittel bereitgestellt, um ein Virus nachzuweisen oder zu bestimmen, indem der Viruspartikel aufgebrochen wird, das Virusantigen vollständig exponiert wird, Antikörper, wenn sie vorliegen, gegen das Virusantigen aufgebrochen werden und das Virusantigen nachgewiesen oder bestimmt wird.
So stellt die vorliegende Erfindung (V) ein Verfahren zur Behandlung einer virushaltigen Probe bereit, das durch die Behandlung einer virushaltigen Probe mit einer Behandlungslösung, die (1) ein chaotropes Ion und (2) ein Ansäuerungsmittel enthält, gekennzeichnet ist.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin (VI) ein Verfahren zur Behandlung einer virushaltigen Probe bereit, das durch die Behandlung einer virushaltigen Probe mit einer Behandlungslösung, die (1) ein chaotropes Ion, (2) ein Ansäuerungsmittel und (3) ein nichtionisches Tensid enthält, gekennzeichnet ist.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin (VII) ein Virustestverfahren bereit, das durch die Verwendung eines Probenbehandlungsverfahrens gemäß den obigen (V) und (VI) und das Umsetzen einer Probe mit einer Sonde, welche ein Virusantigen spezifisch erkennt, zum Nachweis oder zur Quantifizierung des Vorliegens des Virusantigens gekennzeichnet ist.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin ein Kit, ein Testkit oder ein diagnostisches Reagens zur Bestimmung des Vorliegens oder Fehlens eines Virus in einer Probe bereit, welches zur Verwendung in dem obigen (VII) Verfahren bestimmt ist und ein chaotropes Mittel umfasst.
Gemäß der zweiten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt, um ein Virusantigen während der Fensterperiode, in welcher Antikörper gegen das Virus noch nicht erzeugt wurden, nachzuweisen oder zu bestimmen. Bei diesem Verfahren ist das Aufbrechen des Viruspartikels, um das Virusantigen zu exponieren, ausreichend, und es besteht kein Bedarf, Antikörper gegen das Virusantigen im Blut aufzubrechen.
So stellt die vorliegende Erfindung ein Virustestverfahren bereit, das durch die Messung eines Virusantigens auf der Grundlage seiner Bindung mit einer Sonde in der Gegenwart eines Tensids mit einer Alkylgruppe von 10 oder mehr Kohlenstoffatomen und eines sekundären, tertiären oder quaternären Amins, oder eines nichtionischen Tensids mit einem hydrophil/lipophil-Gleichgewicht (HLB) von 12-14, oder von beiden von diesen gekennzeichnet ist.
Weiterhin sind HCV, welches ein RNA-Virus ist, und HBV, welches ein DNA-Virus ist, Viren, welche Viruspartikel mit einer Struktur bilden, die ein Strukturprotein, das genomische RNA oder DNA einkapselt, und ein Membranprotein oder eine Lipidmembran, welche dieses umgibt, umfasst. In jeder der Ausführungsformen wird durch Verwendung eines Behandlungsverfahrens der vorliegenden Erfindung ein Nachweis oder eine Bestimmung eines Virus geliefert, der/die gekennzeichnet ist durch das Aufbrechen eines Viruspartikels von nicht nur HCV oder HBV sondern ebenfalls eines Virus, das eine ähnliche Struktur wie diese aufweist, durch das vollständige Exponieren des Virusantigens und durch das Nachweisen oder Bestimmen des Antigens.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist eine grafische Darstellung, welche die Wirkung der Konzentration von zugegebenem SDS auf die Probenbehandlung zeigt. Seren von normalen gesunden menschlichen Patienten (normal) und Seren der HCV-RNA-positiven Gruppen (panel) 13 und 50 wurden verwendet.
2 ist eine grafische Darstellung, welche die Wirkung der Konzentration von zugegebenem CHAMPS auf die Probenbehandlung zeigt. Seren von normalen gesunden menschli chen Patienten (normal) und Seren der HCV-RNA-positiven Gruppen 13 und 50 wurden verwendet.
3 ist eine grafische Darstellung, welche die Wirkung der Konzentration von zugegebenem Harnstoff auf die Probenbehandlung zeigt. Seren von normalen gesunden menschlichen Patienten (normal) und Seren der HCV-RNA-positiven Gruppen 13, 44 und 50 wurden verwendet.
4 ist eine grafische Darstellung, welche die Wirkung der Temperatur von zugegebenem Triton X100 auf die Probenbehandlung zeigt. Seren von normalen gesunden menschlichen Patienten (normal) und Seren der HCV-RNA-positiven Gruppen 13, 44 und 50 wurden verwendet.
5 ist eine grafische Darstellung, welche die Wirkung der Temperatur während der Probenbehandlung zeigt. Seren von normalen gesunden menschlichen Patienten (normal) und Seren der HCV-RNA-positiven Gruppen 13, 44 und 50 wurden verwendet.
6 ist eine grafische Darstellung, welche die Verdünnungsstandardkurve und die Nachweisgrenze eines Sandwich-Testsystems zeigt, bei welchem ein Serum der Standardgruppe 50, definiert als 1 U/ml, in Reihe verdünnt und einem Probenbehandlungsverfahren unterzogen wurde und dann unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers der vorliegenden Erfindung gemessen wurde.
7 ist eine grafische Darstellung, welche die Verdünnungsstandardkurve und die Nachweisgrenze eines Sandwich-Immuntestsystems zeigt, bei welchem ein Serum der Standardgruppe 50, definiert als 1 U/ml, in Reihe verdünnt und einem Probenbehandlungsverfahren unterzogen wurde und dann gemessen wurde.
8 zeigt eine immunologische Aktivität des Kernantigens in Fraktionen, die durch Fraktionierung mit einer Gelfiltrationssäule des Serums der Gruppe 13 erhalten wurden, das einem Probenbehandlungsverfahren unterzogen wurde. Das Molekulargewicht beträgt ca. 150 kD und ca. 68 kD für IgG bzw. Albumin.
9 ist eine grafische Darstellung, welche eine Korrelation zwischen der Aktivität des freigesetzten Kernantigen und der Menge an HCV-RNA zeigt, die unter Verwendung eines Amplicore HCV Monitors (PCR-Verfahren) einer PCR-positiven Probe bestimmt wurde, welche einem Probenbehandlungsverfahren der vorliegenden Erfindung unterzogen wurde.
10 ist eine grafische Darstellung, welche die Wirkung der Konzentration an zugegebenem Guanidinchlorid auf die Probenbehandlung zeigt. Seren aus normalen gesunden menschlichen Patienten (normal) und Seren der HCV-RNA-positiven Gruppen 13 und 50 wurden verwendet.
11 ist eine grafische Darstellung, welche die Wirkung der Konzentration von zugegebenem Triton X100 auf die Probenbehandlung zeigt. Seren von normalen gesunden menschlichen Patienten (normal) und Seren der HCV-RNA-positiven Gruppen 13 und 50 wurden verwendet.
12 ist eine grafische Darstellung, welche die Wirkung der Konzentration von zugegebenem Tween 20 auf die Probenbehandlung zeigt. Seren von normalen gesunden menschlichen Patienten (normal) und Seren der HCV-RNA-positiven Gruppen 13 und 50 wurden verwendet.
13 ist eine grafische Darstellung, welche die Wirkung der Temperatur während der Probenbehandlung zeigt. Seren von normalen gesunden menschlichen Patienten (normal) und Seren der HCV-RNA-positiven Gruppen 13 und 50 wurden verwendet.
14 ist eine grafische Darstellung, welche die Verdünnungsstandardkurve und die Nachweisgrenze eines Sandwich-Immuntestsystems zeigt, bei welchem ein Serum der Standardgruppe 50, definiert als 1 U/ml, in Reihe verdünnt und einem Probenbehandlungsverfahren unterzogen wurde und dann gemessen wurde.
15 zeigt eine immunologische Aktivität des Kernantigens in Fraktionen, die durch Fraktionierung mit einer Gelfiltrationssäule des Serums der Gruppe 13, das einem Probenbehandlungsverfahren unterzogen wurde, erhalten wurden. Das Molekulargewicht beträgt ca. 150 kD und ca. 68 kD für IgG bzw. Albumin.
16 ist eine grafische Darstellung, welche eine Korrelation zwischen der Aktivität des freigesetzten Kernantigens und der Menge an HCV-RNA, die unter Verwendung eines Amplicore HCV Monitors (PCR-Verfahren) bestimmt wurde, einer Probe zeigt, welche einem Probenbehandlungsverfahren der vorliegenden Erfindung unterzogen wurde und welche durch den Amplicore HCV Monitor (PCR-Verfahren) positiv getestet wurde.
17 zeigt eine Standardkurve, die durch die Bestimmung des Kernantigens von rekombinantem Hepatitis B-Virus (HBV) gemäß der vorliegenden Erfindung erhalten wurde.
Beste Art zur Durchführung der Erfindung
Die betroffenen Viren der vorliegenden Erfindung sind Viren, welche Viruspartikel mit einer Struktur bilden, die ein Strukturprotein, das genomische RNA oder DNA einkapselt, und ein Membranprotein oder eine Lipidmembran, welche dieses umgibt, umfasst.
Repräsentative Beispiele der obigen Viren mit RNA als einem Genom beinhalten Hepatitis C-Virus (HCV) und HCV-verwandte Viren.
HCV-verwandte Viren beinhalten Hepatitis D-Virus, Hepatitis E-Virus, Hepatitis G-Virus, Hand-Fuß-Mund-Exanthem-Virus, ein Flavivirus (Gelbfiebervirus, Westnilvirus, Japanisches Enzephalitisvirus, Denguevirus), ein Togavirus (Alphavirus, Rubivirus, Arterivirus, Rubellavirus), ein Pestivirus (Schweinepestvirus, Rinderdiarrhövirus), ein Paramyxovirus (Parainfluenzavirus 1, 2, 3, 4, Staupevirus, Newcastle-Disease-Virus, RS-Virus, Rinderpestvirus, Affenparainfluenzavirus, Masernvirus, Mumpsvirus), ein Orthomyxovirus (menschliches Influenzavirus, Vogelinfluenzavirus, Perdeinfluenzavirus, Schweineinfluenzavirus), ein Rhabdovirus (Tollwutvirus, vesikuläres Stomatitisvirus), ein Picornavirus (Poliovirus, Coxsackievirus, Echovirus, Rinderenterovirus, Schweineenterovirus, Affenenterovirus, Mausenzephalitisvirus, menschliches Rhinovirus, Rinderrhinovirus, Pferderhinovirus, Maul- und Klauenseuchevirus, Hepatitis A-Virus), ein Coronavirus (menschliches Coronavirus, aviäres infektiöses Bronchitisvirus, Maushepatitisvirus, porzines transmissibles Gastroenteritisvirus), ein Arenavirus (lymphozytisches Choriomeningitisvirus, Lassavirus, hämorrhagisches Koreafiebervirus), ein Retrovirus (HTLV: menschliches adulte Leukämie-Virus, HIV: AIDS-Virus, Katzenleukämie-Sarkomvirus, Rinderleukämievirus, Rous-Sarkomvirus), ein Reovirus (Rotavirus), ein Calcivirus (Norwalkvirus), ein Bunyavirus (hämorrhagisches Fieber mit renalem Syndromvirus, ein Phyllovirus (Ebolavirus, Marburgvirus) und dergleichen.
Repräsentative Beispiele der obigen Viren mit DNA als einem Genom beinhalten Hepatitis B-Virus (HBV) und HBV-verwandte Viren. HBV-verwandte Viren beinhalten ein Pockenvirus (pox virus) (Vacciniavirus, Alastriumvirus, Kuhpockenvirus, Pockenvirus (smallpox virus)), ein Parvovirus (menschliches Parvovirus, Schweineparvovirus, Rinderparvovirus, Hundeparvovirus, Katzenleukopenievirus, Aleuten-Nerzvirus), ein Papovavirus (Papillomvirus, Polyomvirus), Adenovirus, ein Herpesvirus (Herpes simplex-Virus, Cytomegalovirus, Hühnerpocken- Herpes zoster-Virus, EG-Virus, Pferdehepesvirus, Katzenherpesvirus, Marek's-Krankheitsvirus), Afrikanisches Schweinecholeravirus und dergleichen.
Zusätzlich zu den obigen sind viele pathogene Viren bekannt, und es gibt viele unidentifizierte Viren. Es ist klar, dass, wenn solche Viren eine Struktur, wie sie oben beschrieben ist, aufweisen, welche ein Strukturprotein, das genomische RNA oder DNA einkapselt, und ein Membranprotein oder eine Lipidmembran, welche dieses umgibt, umfasst, diese in einer Form freigesetzt werden können, die für einen Immuntest geeignet ist, indem das Probenbehandlungsverfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird.
Ausführungsformen zur Durchführung der vorliegenden Erfindung werden nun nachstehend in Bezug auf HCV erläutert. Da die Blutspiegel von HCV 10² Kopien/ml bis 10⁶ Kopien/ml sind, welche niedriger sind als jene von HBV (10⁹ Kopien/ml), ist eine sehr hohe Empfindlichkeit für einen Test erforderlich, um das Virusantigen nachzuweisen.
Im Allgemeinen beinhalten bei einem Nachweisverfahren, das durch ein immunologisches Verfahren repräsentiert wird, welches einen Antikörper als eine Sonde verwendet, mögliche Verfahren, um die Nachweisempfindlichkeit zu erhöhen, I) eine Zunahme bei der Anzahl der Antigenmoleküle, die nachgewiesen werden sollen, II) eine Zunahme bei der Anzahl von Molekülen der Sonde, z. B. des Antikörpers, die an das Antigen binden, 111) eine Verringerung der nicht spezifischen Reaktionen, welche die Nachweisempfindlichkeit definieren, die durch die Bindung der Sonde, z. B. des Antikörpers, mit einer Substanz, die von dem Antigen verschieden ist, verursacht wird, und IV) eine Zunahme bei der Nachweisgrenze einer Markierung zur Verwendung bei dem Nachweis, und eine geeignete Kombination dieser Verfahren würde eine Zunahme der Empfindlichkeit ermöglichen.
Als ein Verfahren, um die Anzahl an Antigenmolekülen zu erhöhen I-1), kann man sich am leichtesten eine Zunahme bei der Menge der Probe vorstellen. Da jedoch die maximale Menge, die in einem üblicherweise verwendeten Reaktionssystem (z. B. einer Immunplatte mit 96 Vertiefungen) zugegeben werden kann, ca. 300 μl nicht überschreiten kann, ist I-1) ein Konzentrierungsverfahren, um die Anzahl an Molekülen, die zu dem Reaktionssystem zugegeben werden sollen, zu erhöhen, verwendet worden.
Um die Anzahl an Sonden, z. B. Antikörpermolekülen, die an das Antigen binden, zu erhöhen, beinhaltet die Maßnahme, die man sich am leichtesten vorstellen kann, II-1) eine Zunahme bei der Anzahl an Epitopen, die erkannt werden können, indem multiple Sonden, z. B. Antikörper, verwendet werden, und II-2) eine Zunahme bei der Anzahl an Antikörpern, die pro Zeiteinheit gebunden werden, durch ein Erhöhen der Affinität (Affinität und Avidität) der Sonde, z. B. des Antikörpers, zu dem Antigen. Nebenbei beinhalten mögliche Verfahren, um die Affinität von z. B. einem Antikörper zu erhöhen, ein Verfahren der Veränderung der Zusammensetzung des Puffers in dem Reaktionssystem, ein Verfahren der Veränderung der Sonde und ein Verfahren der Kombination von diesen. II-3) Es sind ebenfalls Verfahren vorstellbar, bei welchen viele Antigene eingefangen werden, indem eine große Anzahl von Antikörpern an einen Träger mit einem großen Oberflächenbereich wie z. B. Kügelchen, magnetische Partikel usw. gebunden werden, um die Reaktionsfläche mit einer begrenzten Menge an Antigen auszudehnen.
In dem Fall von Infektionskrankheiten wird erwartet, dass menschliche Antikörper mit einer hohen Bindungsaffinität für das Antigen in der Probe vorliegen. Demgemäß wird erwartet, dass die Epitope dieser Antikörper mit jenen der Sonden, z. B. Antikörper, die bei dem Nachweis verwendet werden sollen, überlappen, was zu einer Wettbewerbsreaktion führt, die eine Verringerung bei der Anzahl an Antikörpern, die zum Nachweis verwendet werden sollen, verursacht. Es wird daher erwartet, dass eine Verringerung dieser störenden Antikörper in der Probe zu einer Zunahme bei der Anzahl von Antikörpermolekülen zur Verwendung beim Nachweis, die an das Antigen binden, führt (II-3).
Es ist in der Tat schwierig, die Verfahren der Verringerung nicht spezifischer Reaktionen zu verallgemeinern, aber es werden Strategien entwickelt, die nicht spezifische Reaktionen verringern, III-1) um nicht spezifische Reaktionen durch ein Erhöhen der Affinität (Affinität und Avidität) der Sonde, z. B. des Antikörpers, zu dem Antigen durch ein Verändern der Zusammensetzung der Pufferlösung zu verringern, III-2) um den Verursacher der nicht spezifischen Reaktionen zu entfernen, und dergleichen.
Mögliche Verfahren, um die Nachweisempfindlichkeit zu erhöhen, beinhalten: IV-1) eine Markierung (ein Radioisotop usw.) mit einer hohen Nachweisempfindlichkeit einzusetzen; IV-2) Signale durch Einsetzen eines Enzyms oder eines Katalysators als einer Markierung zu amplifizieren; IV-3) ein Enzymsubstrat in ein solches mit einer höheren Empfindlichkeit zu ändern; IV-4) Signale aus einer enzymatischen Reaktion oder einer chemischen Reaktion durch ein elektrisches oder ein mechanisches Mittel zu amplifizieren; IV-5) die Anzahl an Markierungen pro Antikörper zu erhöhen; IV-6) die Empfindlichkeit des Instruments, das zum Signalnachweis verwendet wird, zu erhöhen, und dergleichen.
Eine Analyse der Schritte der Vorbehandlung in dem offenbarten Verfahren zum Nachweisen des HCV-Kernantigens zeigte, dass das Verfahren den Schritt der Konzentrierung des Anti gens durch Zugabe von Polyethylenglycol zu der Probe, welche dann zentrifugiert wird, um HCV als einen Niederschlag zu gewinnen (I-2), und des gleichzeitigen Entfernens eines Teils der Serumkomponenten (II-2), gefolgt von dem Schritt der Resuspendierung des Niederschlags in einer Lösung, die Harnstoff und das alkalische Mittel enthält, um menschlichen Antikörper, der darin vorliegt, zu inaktivieren, wodurch Kernantigen aus HCV freigesetzt wird (II-3), und den Schritt der Zugabe einer Lösung, die ein nichtionisches Tensid (Triton X100) und ein neutralisierendes Mittel enthält, um eine Lösung herzustellen, die mit dem monoklonalen Antikörper umgesetzt werden soll, umfasst.
Wie oben beschrieben wurde, sind die Zentrifugation und Resuspendierung des Niederschlags was das Verfahren betrifft komplizierte Schritte und erfordern große Geschicklichkeit. Somit ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung ein Nachweissystem für das Kernantigen, das die obigen Probleme in Bezug auf die Verfahren löst.
Die Identität von HCV per se ist bisher nicht aufgeklärt worden. Auf der Grundlage der genomischen Struktur, der Strukturen von verwandten Viruspartikeln und der allgemeinen Information über Viren wird aber angenommen, dass ein HCV-Partikel eine genomische RNA aufweist, die innerhalb des Kernantigens verpackt ist, welche wiederum von einem Hüllprotein eingekapselt ist, welches E1- und E2/NS1-Antigene umfasst, die in einer Lipidmembran verankert sind, welche die obige Packung umgibt.
Es ist daher notwendig, die Umhüllung zu entfernen, um dadurch das Binden einer Sonde, z. B. eines Antikörpers, der zum Nachweis des Kernantigens verwendet werden soll, zu erlauben, um das Kernantigen nachzuweisen. Weiterhin ist berichtet worden, dass der Viruspartikel im Blut eine komplexe Struktur aufweist, in welcher der Partikel von LDL (Lipoprotein mit geringer Dichte) usw. umgeben ist, und da Antikörper gegen das Hüllprotein ebenfalls vorliegen, wird angenommen, dass der Viruspartikel als ein Immunkomplex mit einem anti-Hüllprotein-Antikörper vorliegen kann. Somit ist es, um die Anzahl der Antigenmoleküle, die nachgewiesen werden sollen, zu erhöhen, wichtig, von dem Viruspartikel die Hülle und Verunreinigungen, welche den Viruspartikel umgeben, effizient zu entfernen und die Moleküle des Kernantigens effizient freizusetzen.
Dasselbe gilt für Viren außer HCV, und die Strukturproteine der Viren müssen effizient freigesetzt werden.
Somit betrifft die vorliegende Erfindung ein Behandlungsverfahren, das ein Virusantigen in einer Probe (Serum) in einen Zustand bringt, der zum Nachweis unter Verwendung einer Sonde geeignet ist, ohne das Antigen durch ein kompliziertes Verfahren wie z. B. Zentrifugation zu konzentrieren.
Da weiterhin, wie oben beschrieben wurde, ein menschlicher Antikörper mit einem hohen Titer vorliegen kann, der mit einer Sonde, z. B. einem Antikörper, um die Bindung konkurriert, ist ein Verfahren zur Entfernung des Antikörpers wichtig, um die Empfindlichkeit zu erhöhen.
Somit betrifft eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein Behandlungsverfahren, das leicht Virusantigene in einer Probe freisetzt, wobei gleichzeitig ein menschlicher Antikörper, der in der Probe vorliegen kann, inaktiviert wird.
Durch die Verwendung des Behandlungsverfahrens der vorliegenden Erfindung werden Virusantigene in einer Probe aus einem Viruspartikel oder einem Immunkomplex in einer Form freigesetzt, die zur Bildung eines Immunkomplexes mit einer Sonde wie z. B. einem Antikörper geeignet ist, und durch ein gleichzeitiges Inaktivieren eines menschlichen Antikörpers, der in der Probe vorliegt, der die Nachweisreaktion stört, kann ein hochempfindlicher Nachweis leicht durch einen Immuntest unter Verwendung einer Sonde wie z. B. eines Antikörpers erreicht werden.
Gemäß der ersten Ausführungsform (1) der vorliegenden Erfindung kann eine Sonde wie z. B. ein Antikörper zur Verwendung beim Nachweis irgendeine Sonde sein, solange diese in einer spezifischen Weise an das Virusantigen bindet, eine gewisse hohe Affinität aufweist und keine nicht spezifischen Reaktionen induziert, wenn sie zu dem Reaktionssystem zugegeben wird. Beispielsweise enthält bei dem Nachweis eines HCV-Kernantigens, wie in Beispiel 4 beschrieben wird, eine der Sonden, die in der primären Reaktion verwendet werden, vorzugsweise eine Sonde, die den C-Terminus des HCV-Kernantigens erkennen kann und daran bindet. Der C-Terminus des Kernantigens bedeutet, wie hierin verwendet, eine Sequenz von 81 bis 160 der Sequenz, die in SEQ ID NO: 2 gezeigt ist, oder einen Teil von dieser. Sie kann ebenfalls eine Sonde für den N-Terminus des HCV-Kernantigens enthalten. Der N-Terminus des Kernantigens bedeutet, wie hierin verwendet, eine Sequenz von 10 bis 70 der Sequenz, die in SEQ ID NO: 2 gezeigt ist, oder einen Teil von dieser.
Gemäß der zweiten Ausführungsform (2) der vorliegenden Erfindung kann eine Sonde wie z. B. ein Antikörper zur Verwendung bei dem Nachweis irgendeine Sonde sein, solange diese in einer spezifischen Weise an das Virusantigen bindet, eine gewisse hohe Affinität aufweist und keine nicht spezifischen Reaktionen induziert, wenn sie zu dem Reaktionssystem zuge geben wird. Beispielsweise enthält bei dem Nachweis des HCV-Kernantigens eine der Sonden, die in der primären Reaktion verwendet werden, vorzugsweise eine Sonde, die den N-Terminus des HCV-Kernantigens erkennen kann und daran bindet. Der N-Terminus des Kernantigens bedeutet, wie hierin verwendet, eine Sequenz von 10 bis 70 der Sequenz, die in SEQ ID NO: 2 gezeigt ist, oder einen Teil von diesen Sie kann ebenfalls eine Sonde für den C-Terminus des HCV-Kernantigens enthalten. Der C-Terminus des Kernantigens bedeutet, wie hierin verwendet, eine Sequenz von 81 bis 160 der Sequenz, die in SEQ ID NO: 2 gezeigt ist, oder einen Teil von dieser.
In jeder der obigen Ausführungsformen kann irgendein Molekül, das eine hohe Spezifität und Affinität für das Kernantigen aufweist, als eine Sonde verwendet werden, einschließlich: eines monoklonalen Antikörpers, der durch Immunisieren eines Versuchstieres, wie z. B. einer Maus, eines Kaninchens, eines Huhns, einer Ziege, eines Schafs, eines Rinds usw. erhalten wird, eines monoklonalen Antikörpers, der durch ein Hybridom erzeugt wird, das durch die Fusion einer Myelomzelle mit einer Milzzelle, die aus einem immunisierten Individuum isoliert wurde, erhalten wird, eines monoklonalen Antikörpers, der durch eine Milzzelle oder eine Leukozyte in dem Blut erzeugt wurde, die durch das EG-Virus immortalisiert wurde, und eines Antikörpers, welcher von einem Menschen oder einem Schimpansen erzeugt wurde, der mit HCV infiziert war; eines rekombinanten Antikörpers, der von einer Zelle erzeugt wurde, die mit einem rekombinanten Antikörpergen transformiert war, das durch ein Kombinieren eines Genfragments einer variablen Region, das aus der cDNA oder chromosomalen DNA des Immunglobulins einer Maus, eines Menschen usw. erhalten wurde, eines Genfragments der variablen Region, das durch Kombinieren eines Teils der cDNA oder chromosomalen DNA eines Immunglobulins mit einer künstlich konstruierten Sequenz konstruiert wurde, eines Genfragments der variablen Region, das unter Verwendung einer künstlichen Gensequenz konstruiert wurde, oder eines Genfragments der variablen Region, das durch eine rekombinante Gentechnologie unter Verwendung der Obigen als Baueinheiten konstruiert wurde, mit einem Genfragment der konstanten Region des Immunglobulins erhalten wurde; eines Phagen-Antikörpers, der durch die Fusion eines Genfragments, das oben beschrieben wurde, der variablen Region mit einem Strukturprotein von beispielsweise einem Bakteriophagen erzeugt wurde, eines rekombinanten Antikörpers, der durch eine Zelle erzeugt wurde, die mit einem rekombinanten Antikörpergen transformiert war, das durch Kombinieren eines oben beschriebenen Genfragments der variablen Region mit einem Teil eines anderen geeigneten Genfragments, z. B. des myc-Gens, erzeugt wurde, einer Sonde, die erzeugt wurde, indem künstlich eine variable Region in das Trypsin-Gen eingeführt wurde, einer Sonde, die erhalten wurde, indem künstlich ein Molekül, das spezifisch an das Protein, wie z. B. einen Rezeptor bindet, verändert wurde, einer Sonde, die durch kombinatorische chemische Technologie konstruiert wurde, und dergleichen.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin den Schritt des Behandelns einer Probe mit einer Behandlungslösung, die in der Lage ist, ein Virusantigen aus einem Viruspartikel oder einem Immunkomplex freizusetzen und gleichzeitig sogar einen menschlichen Antikörper, der in der Probe vorliegt, welcher die Nachweisreaktion stört, zu inaktivieren, um einen Zustand zu erzeugen, der geeignet ist, um einen Immunkomplex des obigen Virusantigens und einer Sonde dafür wie beispielsweise einem Antikörper aus einer Probe, die das Virusantigen enthält, zu bilden, sowie ein Testverfahren und ein Testkit zum Nachweis und zur Quantifizierung des freigesetzten Kernantigens durch einen Immuntest unter Verwendung einer Sonde wie z. B. einem Antikörper bereit.
Die Probenbehandlungslösung und das Probenbehandlungsverfahren, die durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt werden
Proben, wie hierin verwendet, beinhalten biologische Flüssigkeiten wie z. B. Vollblut, Plasma, Serum, Urin, Speichel, Cerebrospinalflüssigkeit, Lebergewebe und dergleichen.
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist der wichtigste Bedarf ein Verfahren der Behandlung eines Virusantigens, wie beispielsweise des Kernantigens in einer Probe, um so einen Zustand zu erzeugen, der für eine Bindungsreaktion mit der Sonde wie z. B. dem monoklonalen Antikörper geeignet ist, ohne die komplizierte Bearbeitung einer Probe. So ist es, um die Anzahl an Antigenmolekülen zu erhöhen, wichtig, das Virusantigen wie beispielsweise das Kernantigen, das in einem Viruspartikel enthalten ist, effizient freizusetzen.
Wie bereits für die Natriumdodecylsulfat (SDS)-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) bekannt war, werden die meisten Proteine durch Wärmebehandlung in der Gegenwart von SDS denaturiert, und dadurch werden Moleküle, die von den kovalent gebundenen verschieden sind, in Monomere umgewandelt. Somit verursacht die Zugabe eines Behandlungsmittels, das ein anionisches Tensid wie z. B. SDS umfasst, ein Aufbrechen der Viren wie auch die Denaturierung von Antikörpern gegen das Virusantigen wie z. B. das Kernantigen in der Probe, was die Freisetzung des Virusantigens wie z. B. des Kernantigens in der Probe ermöglicht. Dieses wurde ebenfalls für das HCV-Kernantigen bestätigt, wie in Beispiel 7 gezeigt ist; das heißt, wenn das Kernantigen in einer HCV-infizierten Probe, die mit einem Behandlungsmittel behandelt wurde, das SDS enthielt, einer Molekulargewichtsanalyse unter Verwendung einer Gelfiltration unterzogen wurde, wurde dieses an einer Position nachgewiesen, die theoretisch als die Position des Monomers vorhergesagt wird.
Wie von Kashiwakuma et al., J. Immunological Methods 190: 79-89, 1996 berichtet wird, wird, wenn das Kernantigen, das durch SDS-PAGE aus einer Probe isoliert wurde, die einen Extrakt einer Zelle umfasst, die rekombinantes HCV exprimiert, unter Verwendung einer Western-Blot-Analyse nachgewiesen wird, die immunologische Aktivität an einer Position nachgewiesen, von der angenommen wird, dass sie die des Monomers ist. Es wird von einem Fachmann leicht verstanden, dass die Zugabe eines Denaturierungsmittels, das SDS umfasst, zu einer Probe die effiziente Freisetzung von Antigenen und eine Zunahme bei der Anzahl von Antigenmolekülen verursacht.
Wie wohl bekannt ist, weisen jedoch anionische Tenside wie z. B. SDS eine sehr starke proteindenaturierende Wirkung auf, so dass, wenn diese zu einer Reaktion einer Immunkomplexbildung mit dem Antikörper zugegeben werden, sie ebenfalls den Antikörper denaturieren und dadurch die Funktion stören, was zu der Verringerung der Empfindlichkeit führt. Es ist ebenfalls bekannt, dass die Struktur von Epitopen durch die Behandlung mit einem anionischen Tensid zerstört wird, was eine geschwächte Bindung mit dem Antikörper und eine verminderte Empfindlichkeit verursacht. Um die Faktoren zu entfernen, die für die Verringerung der Empfindlichkeit verantwortlich sind, muss die denaturierende Wirkung, welche der SDS-Behandlung folgt, durch gewisse andere Maßnahmen abgeschwächt werden.
Es ist bekannt, dass Tenside, die anionische Tenside umfassen, durch Mittel wie Dialyse, Ultrafiltration, Gelfiltration, Elektrophorese, Ionenaustausch, Ausfällung, Membrantransfer usw. entfernt werden können. Die Tatsache, dass Antigene, wie oben beschrieben, durch ein Western-Blot-Verfahren oder ein Gelfiltrationsverfahren nachgewiesen werden können, zeigt, dass eine Antigen-Antikörper-Reaktion unter Verwendung einer gewissen Prozedur nach der SDS-Behandlung bewirkt werden kann. Diese Verfahren erfordern jedoch sowohl Zeit als auch komplexe Prozeduren, was für den Zweck der vorliegenden Erfindung nicht geeignet ist.
Durch das Verdünnen mit einer überschüssigen Menge der Reaktionslösung ist es in der Tat möglich, die denaturierende Wirkung auf ein vernachlässigbares Niveau, das die Reaktion nicht beeinträchtigt, zu verringern, das Verfahren kann aber nicht auf die Verfahren wie beispielsweise einen Immuntest angewendet werden, welcher die Verwendung von Mikrotitervertiefungen beinhaltet, in welchen die Menge der Proben, die zugegeben wird, begrenzt ist.
In dieser Hinsicht ist es klar, dass diese Verfahren für den Zweck der vorliegenden Erfindung nicht geeignet sind.
Somit haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung in der ersten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung untersucht, ob die Zugabe eines Behandlungsmittels, das ein anionisches Tensid und einen gewissen Zusatz umfasst, die denaturierende Wirkung durch das anionische Tensid auf ein Niveau verringern könnte, bei welchem die Sonde wie z. B. der Antikörper nicht beeinträchtigt wird und gleichzeitig die Feisetzungswirkung des Kernantigens durch das anionische Tensid verstärkt wird.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben gefunden, dass die Zugabe eines Behandlungsmittels, das ein Tensid außer einem anionischen Tensid wie z. B. SDS enthält, die denaturierende Wirkung von SDS auf den immobilisierten Antikörper abschwächen kann, und als eine Folge die Empfindlichkeit im Vergleich zu der Zugabe eines Behandlungsmittels, das SDS allein enthält, verstärken kann. Die Erfinder haben ebenfalls gefunden, dass, wenn die Mittel, welche die Wasserstoffionenbindung schwächen, wie z. B. ein Tensid außer SDS und Harnstoff, zu dem Behandlungsmittel zugegeben werden, welches ein anionisches Tensid wie z. B. SDS enthält, ähnliche Wirkungen beobachtet wurden und dass die Freisetzung der Kernantigene aus den Viruspartikeln und die Inaktivierung des anti-Kernantigen-Antikörpers in der Probe verstärkt wurden, mit dem Ergebnis, dass die Freisetzung der Kernantigene weiter verstärkt wurde. Die Erfinder haben ebenfalls gefunden, dass der Nachweis des Kernantigens mit einer höheren Empfindlichkeit durch eine Wärmebehandlung nach der Zugabe eines Behandlungsmittels, das SDS und andere Tenside enthielt, erreicht wurde, und haben die vorliegende Erfindung vollendet.
Die anionischen Tenside außer SDS, die zur Behandlung von Proben verwendet werden können, beinhalten Natriumcetylsulfat oder andere Alkylsulfatester, Alkylsulfonate wie z. B. Natriumdodecylsulfonat, Alkylallylsulfonate und dergleichen. Die Tenside außer den anionischen Tensiden, die zugegeben werden können, beinhalten amphotere Tenside, z. B. CHAPS (3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propansulfonat), CHAPSO (3-[(Cholamidopropyl)dimethylammonio]-2-hydroxy-1-propansulfonat), Dodecyl-N-betain, 3-Dodecyldimethylammonio)-1-propansulfonat; nichtionische Tenside, z. B. Polyoxyethylen-isooctylphenylether wie z. B. Triton X100, Polyoxyethylennonylphenylether wie z. B. NP 40, Polyoxyethylensorbitolester wie z. B. Tween 80, Polyoxyethylendodecylether wie z. B. Brij 58 und Octylglucoside, wobei ein amphoteres Tensid wie z. B. CHAPS und ein nichtionisches Tensid wie z. B. Triton X100 bevorzugt sind. Es ist ebenfalls vorteilhaft, ein Mittel (Proteindenatu rierungsmittel), welches höhere Strukturen von Proteinen aufbricht, wie z. B. Harnstoff, Thioharnstoff und dergleichen zuzugeben.
Konzentrationen, die vorzugsweise bei der Behandlung verwendet werden, sind: 0,5% oder größer für SDS; 0,1% oder größer für CHAPS; 1 M oder größer für Harnstoff; 0,1% oder größer und 0,75% oder kleiner für Triton X100.
Die Temperatur, die zur Behandlung von Proben verwendet wird, kann irgendeine Temperatur sein, die üblicherweise im Labor verwendet wird, d. h. zwischen 4°C und 100°C; wenn aber ein nichtionisches Tensid zugegeben wird, sollte auf dessen Trübungspunkt geachtet werden. Vorzugsweise wird eine Temperatur von 37°C oder größer eingesetzt, und die Behandlung bei einer Temperatur von 50–60°C, die üblicherweise für die Inaktivierung des Serums verwendet wird, ist effektiver.
Entfernen der Störung durch Hämoglobin
Wenn Serum usw. als eine Probe zur Messung verwendet wird, machen rote Blutzellen, die in der Probe enthalten sind, während der obigen Vorbehandlung eine Hämolyse durch, und Hämoglobin wird freigesetzt, und das denaturierte Hämoglobin kann die Messung stören, indem es an das Virusantigen wie z. B. den HCV-Kern bindet. Somit ist es bei der ersten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bevorzugt, die Störung bei der Messung zu entfernen, indem das Häm in dem Hämoglobin abgefangen wird. Wir haben gefunden, dass als ein Zusatz zu diesem Zweck die Zugabe von wenigstens einem von Harnstoff und einer Verbindung, die einen Imidazolring enthält, bevorzugt ist.
Als die einen Imidazolring enthaltenden Verbindungen können Imidazol, Histidin, Imidazolacrylsäure, Imidazolcarboxyaldehyd, Imidazolcarboxamid, Imidazoldion, Imidazoldithiocarbonsäure, Imidazoldicarbonsäure, Imidazolmethanol, Imidazolidinthion, Imidazolidon, Histamin, Imidazopyridin und dergleichen erwähnt werden.
Als die einen Indolring enthaltenden Verbindungen können Tryptophan, Indolacrylsäure, Indol, Indolessigsäure, Indolessigsäurehydrazid, Indolessigsäuremethylester, Indolbuttersäure, Indolacetonitril, Indolcarbinol, Indolcarboxaldehyd, Indolcarbonsäure, Indolethanol, Indolmilchsäure, Indolmethanol, Indolpropionsäure, Indolbrenztraubensäure, Indolmethylketon, Indolmycin, Indolaceton, Indomethacin, Indoprofen, Indoramin und dergleichen erwähnt werden.
Die zugegebene Menge beträgt vorzugsweise 0,5 M bis 5 M für Harnstoff, 5 mM bis 50 mM für Indolacrylsäure und 0,05 M bis 0,5 M für die anderen Zusätze.
Andererseits lösen sich Membranproteine wie z. B. das HCV-Hüllprotein nicht spontan, wenn sie nicht im Hinblick darauf behandelt werden. Um ein Protein mit einem hydrophoben Anteil in Wasser zu lösen, ist das Verfahren der Umwandlung eines hydrophoben Anteils in einen hydrophilen Anteil mit einem Tensid wohl bekannt. Es ist jedoch bekannt, dass gewisse Salze, wie z. B. Guanidinchlorid, die Eigenschaft aufweisen, refraktäre Proteine wasserlöslich zu machen. Ionen, die aus Salzen (chaotropen Mitteln) erzeugt werden, die eine solche Eigenschaft aufweisen, werden chaotrope Ionen genannt, und als die anionischen Ionen sind Guanidinionen, -Thiocyanationen, Iodionen, Periodationen, Perchlorationen und dergleichen bekannt. Salze, die diese Ionen erzeugen, sind zur Solubilisierung von refraktären Proteinen verwendet worden. Es wurde angenommen, dass chaotrope Ionen die Funktion haben, die Antigene aus den Viruspartikeln effizient freizusetzen.
Wenn ein chaotropes Ion zugegeben wird, wird jedoch die Sekundärstruktur der Proteine aufgebrochen, was die Zerstörung der Epitopstruktur verursacht. Wenn somit eine Sonde wie z. B. ein Antikörper für die Reaktion der Immunkomplexbildung in der Gegenwart eines chaotropen Ions wie es ist zugegeben wird, wird die Bindung des Antikörpers geschwächt und die Empfindlichkeit sinkt, wovon angenommen wird, dass dieses ein ernstes Problem aufwirft.
Andererseits ist die denaturierende Wirkung von chaotropen Ionen größtenteils reversibel, so dass durch ein Abschwächen der Ionenstärke durch Dialyse oder Verdünnung die denaturierte Struktur vorübergehend zu der ursprünglichen Struktur zurückkehrt. Dieses wirft ein anderes Problem auf, das mit der Verwendung eines Behandlungsmittels wie z. B. eines chaotropen Ions verbunden ist. Das heißt, nach dem gewünschten Behandlungsverfahren der vorliegenden Erfindung werden nicht nur die Viruspartikel, die in der Probe vorliegen, effizient freigesetzt, sondern der Hochaffinitätsantikörper, der an das Antigen bindet, das in der Probe vorliegt, muss gleichzeitig inaktiviert werden. Somit liefert die Solubilisierung mit einem chaotropen Ion keine angemessene Inaktivierung des Hochaffinitätsantikörpers, der in der Probe vorliegt, und es wird angenommen, dass der Antikörper die Empfindlichkeit nachteilig beeinflusst.
Somit weisen die Behandlungsverfahren, die chaotrope Ionen einsetzen, zwei gegensätzliche Probleme auf: In dem Zustand, in welchem ein chaotropes Ion eine Struktur zerstören kann, werden die Antigen-Antikörper-Reaktionen gehemmt, und andererseits ist die Wirkung eines chaotropen Ions allein nicht ausreichend, um Antikörper zu inaktivieren, welche die Reaktionen in der Probe stören, und in dem Zustand, in welchem die Antigen-Antikörper-, Reaktionen nicht gehemmt werden, können kontaminierende Antikörper die Reaktionen hemmen.
Um diese gegensätzlichen Probleme zu lösen, ist es notwendig, einen Zustand zu finden, in welchem die Epitope des Antigens reversibel zerstört werden und die Funktionen der kontaminierenden Antikörper in der Probe irreversibel zerstört werden.
Was die Bedingungen betrifft, unter welchen ein Antikörper inaktiviert wird, sind eine Alkalibehandlung, eine Säurebehandlung und dergleichen bekannt. Die Säurebehandlung von Serum kann falsche positive Ergebnisse verursachen, da die Behandlung einige der Serumproteine irreversibel denaturiert, was zu der Bildung von Niederschlägen führt, die in den meisten Fällen ein Pipettieren nach der Behandlung der Proben behindern, und Niederschläge, welche die denaturierten Proteine einhüllen, werden zur Zeit der Messung an der festen Phase adsorbiert und können dadurch als Dichte nachgewiesen werden. Zusätzlich entsteht ein anderes Problem, da, wenn das Antigen von Interesse nicht spezifisch in dem Niederschlag eingehüllt wird, die Menge des Antigens, das mit der Sonde reagiert, sinkt, was zu einer Abnahme der Empfindlichkeit führt.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben gefunden, dass die Säurebehandlung kombiniert mit der Guanidinbehandlung die Probleme, die mit der Säurebehandlung verbunden sind, wie z. B. die Niederschlagsbildung, sowie die gegensätzlichen Probleme, die mit der Guanidinbehandlung verbunden sind, lösen kann und haben dadurch die vorliegende Erfindung vollendet. Wir haben ebenfalls gefunden, dass es weiter bevorzugt ist, ein Tensid zu dem Behandlungsmittel zuzugeben, welches ein chaotropes Ion wie z. B. Guanidin und ein Ansäuerungsmittel umfasst. Als das Ansäuerungsmittel sind Salzsäure, Schwefelsäure, Essigsäure, Trifluoressigsäure, Trichloressigsäure und dergleichen bevorzugt.
Als das Tensid ist ein amphoteres Tensid wie z. B. CHAPS (3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propansulfonat), CHAPSO (3-[Cholamidopropyl)dimethylammonio]-2-hydoxy-1-propansulfonat), Dodecyl-N-betain, 3-(Dodecyldimethylammonio)-1-propansulfonat oder dergleichen und ein nichtionisches Tensid wie z. B. ein Polyoxyethylenisooctylphenylether, z. B. Triton X100; ein Polyoxyethylennonylphenylether, z. B. NP 40; ein Polyoxyethylensorbitolester, z. B. Tween 20; ein Polyoxyethylendodecylether, z. B. Brij 58; Octylglucosid oder dergleichen bevorzugt. Weiterhin kann ein Mittel wie z. B. Harnstoff, das teilweise eine höhere Struktur von Proteinen durch Abschwächen der Wasserstoffionenbindung zerstört, dazu zugegeben werden.
Insbesondere ist es stärker bevorzugt, Guanidinhydrochlorid bei 2 M oder größer, Triton X100 bei 2% oder größer und Tween 20 bei 0,02% oder größer bei einer Temperatur von 4°C bis 45°C zu verwenden.
In jeder der Ausführungsformen ist es klar, dass ein Virusantigen in der Form einer Sonde, d.h. in einem Zustand, der für den so genannten Immuntest geeignet ist, der einen Antikörper als eine Sonde verwendet, aus der Probe, welche Viruspartikel mit einer Struktur, die ähnlich ist zu der von HCV oder HBV, enthält, freigesetzt werden kann, indem das Behandlungsverfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird. Viren mit einer Struktur, die zu der von HCV oder HBV ähnlich ist, sind, wie hierin verwendet, Viren, die Viruspartikel mit einer Struktur bilden, die aus Proteinen, in welchen die genomische RNA oder DNA verpackt wurde, und dem Membranprotein oder der Lipidmembran, welche diese umgibt, zusammengesetzt ist. Die Viren beinhalten z. B. Flaviviren, die mit HCV verwandt sind, Retroviren wie z. B. das menschliche Immundefizienzvirus (HIV) und dergleichen. Weiterhin sind jene, die DNA als das Genom aufweisen, wie HBV ebenfalls umfasst, wenn sie eine ähnliche Struktur aufweisen.
Exposition des Virusantigens
Gemäß der zweiten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, welche ein Verfahren des Nachweisens des Virusantigens in einer Probe, die während der Fensterperiode gesammelt wurde, betrifft, ist noch kein Antikörper gegen das Virusantigen gebildet worden, und so ist das Aufbrechen des Viruspartikels, um das Virusantigen freizusetzen, ausreichend, und es besteht kein Bedarf, Antikörper, die in der Probe vorliegen, zu zerstören. Somit ist eine Vorbehandlung von Proben, die oben beschrieben wurde, nicht notwendig, und das Vorliegen eines den Viruspartikel aufbrechenden Mittels, um den Viruspartikel zu exponieren, ist ausreichend. Insbesondere ist das den Viruspartikel aufbrechende Mittel für die Virusantigene, die in dem Viruspartikel vorliegen, essentiell.
Es wird angenommen, dass Viruspartikel im Allgemeinen eine Struktur aufweisen, in welcher eine Nukleinsäure als das Genom und ein Kernantigen einen Komplex bilden, welcher einen Partikel bildet, und dieser Partikel von einer Hülle umhüllt wird, welche eine Lipidmembran und ein Hüllprotein umfasst. Es wird ebenfalls angenommen, dass sie im Blut in der Form eines Komplexes mit einem Lipoprotein geringer Dichte, einem Antikörper gegen das Virus und dergleichen vorliegen. So kann eine Sonde die Virusantigene, insbesondere die Antigene in dem Viruspartikel, bei den Partikeln wie sie im Blut vorliegen nicht erkennen oder daran binden. Um die Virusantigene nachzuweisen, müssen sie daher behandelt werden, indem beispielsweise diese Strukturen, welche den Viruspartikel umgeben, entfernt werden, so dass der Viruspartikel von einer Sonde erkannt werden kann.
Somit stellt die vorliegende Erfindung ebenfalls eine Reaktionsbedingung, unter welcher das Virusantigen in dem Viruspartikel, der in der Probe enthalten ist, exponiert wird, so dass dieses von der Sonde zur Erkennung des Viruspartikels erkannt wird, ein Verfahren der Reaktion, welches das System zur Durchführung der Reaktion umfasst, und ein Reagens, welches das System zur Durchführung der Reaktion enthält, bereit.
Ein Reaktionssystem, das zum Antigennachweis in dem System, das von der vorliegenden Erfindung bereitgestellt wird, geeignet ist, umfasst eine Bedingung, die schonend genug ist, um die Funktion des Antikörpers gegenüber den Epitopen des Virusantigens beizubehalten, welche aber die Fläche, die von dem Antikörper, einer das Virusantigen erkennenden Sonde, erkannt wird, aus dem Viruspartikel, welcher eine komplizierte Struktur ist, die in der Probe vorliegt, vollständig exponieren kann.
Für HCV ist bereits gezeigt worden, dass das Kernantigen nachgewiesen werden kann, indem die Viruspartikel, die durch Ultrazentrifugation isoliert wurden (Takahashi et al., 1992, J. Gen. Virol, 73: 667-672), behandelt werden und HCV-Partikel durch Aggregation mit Polyethylenglycol unter Verwendung eines nichtionischen Tensids wie z. B. Tween 80 oder Triton X100 ausgefällt werden (Kashiwakuma et al., 1996, J. Immunological Methods, 190: 79-89). Bei dem Ersteren ist jedoch die Nachweisempfindlichkeit nicht hoch genug, und es bleibt eine Frage, ob das Antigen vollständig exponiert wurde. Bei dem Letzteren wurde ebenfalls der Antikörper durch die Zugabe eines anderen Behandlungsmittels inaktiviert, und es gibt keine Erwähnung der Wirkung des Tensids per se.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wurden die Bedingungen zuerst untersucht, indem man sich auf das Tensid konzentriert hat. Demgemäß wurde gefunden, dass durch die Verwendung einer Zusammensetzung, die auf dem Tensid basierte, ein wirksamer Nachweis des Antigens in dem Viruspartikel, ohne irgendein Verfahren der Vorbehandlung wie z. B. Zentrifugation oder Erwärmen einzusetzen, nur durch Verdünnen der Probe in der Reaktionslösung erreicht wurde.
Es ist notwendig, die Virusantigene effektiv aus den Viruspartikeln zu extrahieren und Wechselwirkungen mit einer Vielzahl von Substanzen im Serum zu unterdrücken, um dadurch einen Zustand bereitzustellen, bei welchem die Sonde wirksam mit dem Antigen reagieren kann. Als ein effektives Tensid, das in diesem Fall verwendet wird, kann ein Tensid mit sowohl einer Alkylgruppe von 10 oder mehr Kohlenstoffen und einem sekundären, tertiären oder einem quaternären Amin in einem Molekül, oder ein nichtionisches Tensid erwähnt werden.
Bei dem obigen Tensid mit einer Alkylgruppe und einem sekundären, tertiären oder einem quaternären Amin ist die Alkylgruppe vorzugsweise eine geradkettige Alkylgruppe, und die Anzahl an Kohlenstoffatomen darin beträgt vorzugsweise 10 oder mehr und noch bevorzugter 10 bis 20. Als das Amin ist ein tertiäres oder quaternäres Amin (Ammonium) bevorzugt. Die spezifischen Tenside beinhalten Dodecyl-N-sarcosinsäure, Dodecyltrimethylammonium, Cetyltrimethylammonium, 3-(Dodecyldimethylammonio)-1-propansulfonat, 3-(Tetradecyldimethylammonio)-1-propansulfonat, Dodecylpyridinium, Cetylpyridinium, Decanoyl-N-methylglucamid (MEGA-10), Dodecyl-N-betain und dergleichen. Dodecyl-N-sarcosinsäure und Dodecyltrimethylammonium sind bevorzugt.
Als das nichtionische Tensid, das oben erwähnt wurde, sind jene mit einem hydrophil-lipophil-Gleichgewicht von 12 bis 14 bevorzugt, und Polyoxyethylenisooctylphenylether wie z. B. Triton X100 und Triton X114 oder Polyoxyethylennonylphenylether wie z. B. Nonidet P40, Triton N101 und Nikkol NP sind bevorzugt.
Gemäß der vorliegenden Erfindung können die obigen zwei Typen von Tensiden allein verwendet werden, aber eine kombinierte Verwendung von diesen ist stärker bevorzugt, und es kann eine synergistische Wirkung durch die kombinierte Verwendung erhalten werden.
Zusätzliche Komponenten, welche die wässrige Umgebung verändern, wie z. B. Harnstoff, können zugegeben werden.
Monoklonaler Antikörper als eine Sonde bei der vorliegenden Erfindung
Das Genfragment des Strukturproteins von HCV bedeutet, wie hierin verwendet, ein Genfragment, welches den Kernbereich des Strukturproteins von HCV enthält, und ein DNA-Fragment, das wenigstens eine Basensequenz aufweist, die ein Polypeptid codiert, das eine Aminosäuresequenz von 1 bis 160 ausgehend von dem N-Terminus von HCV enthält. Ins besondere ist es ein Genfragment, das eine Basensequenz umfasst, welche die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 2 codiert.
Das Polypeptid mit der Aktivität des HCV-Antigens bedeutet, wie hierin verwendet, ein Fusionspolypeptid oder ein Polypeptid, das immunologisch mit dem anti-HCV-Antikörper reagiert, und kann als ein Antigen zur Konstruktion eines Hybridoms und eines daraus erhaltenen monoklonalen Antikörpers der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Insbesondere ist es ein Polypeptid mit der Aktivität des HCV-Antigens, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1 umfasst, oder ein Polypeptid mit der Aktivität des HCV-Antigens, welches einen Teil der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1 umfasst, oder ein Polypeptid mit einer zusätzlichen Aminosäuresequenz, die am N-Terminus oder C-Terminus von diesem befestigt ist.
Der monoklonale Antikörper der vorliegenden Erfindung gegen das obige Fusionspolypeptid und das Polypeptid mit Aminosäuresequenzen, wie sie in SEQ ID NO: 3–6 gezeigt sind, kann von einem Fachmann leicht konstruiert werden. Die Produktion eines monoklonalen Antikörpers durch ein Hybridom ist wohl bekannt. Beispielsweise können BALB/c-Mäuse periodisch intraperitoneal oder subkutan mit einem oben erwähnten Fusionspolypeptid oder Polypeptid (im Folgenden als das vorliegende Antigen bezeichnet) als ein einzelnes Antigen oder als ein Antigen kombiniert mit BSA, KLH oder dergleichen, einzeln oder in einer Mischung mit einem Adjuvans wie z. B. Freund's vollständigem Adjuvans immunisiert werden. Wenn der Antikörpertiter im Serum angestiegen ist, wird das vorliegende Antigen als Booster in die Schwanzvene verabreicht. Nachdem die Milz aseptisch isoliert wurde, wird sie mit einer geeigneten Myelomzelllinie fusioniert, um ein Hybridom zu erhalten. Dieses Verfahren kann gemäß dem Verfahren von Köhler und Milstein (Nature 256: 495-497, 1975) durchgeführt werden.
Die Hybridomzelllinie, die durch das obige Verfahren erhalten wurde, kann in einer geeigneten Kulturflüssigkeit kultiviert werden, und die Hybridomzelllinien, welche die Antikörper produzieren, die spezifische Reaktionen mit dem vorliegenden Antigen zeigen, werden selektiert und kloniert. Zum Klonieren der Antikörper erzeugenden Hybridome kann das Soft-Agar-Verfahren (Eur. J. Immunol. 6: 511-5198, 1976) neben dem Grenzverdünnungsverfahren eingesetzt werden. Die so erzeugten monoklonalen Antikörper werden durch solche Verfahren wie Säulenchromatographie unter Verwendung von Protein A gereinigt.
Zusätzlich zu den obigen monoklonalen Antikörpern können Moleküle, die als eine Sonde verwendet werden, erzeugt werden. Beispielsweise ist ein rekombinanter Antikörper im Detail in einer Übersicht von Hoogenboon (Trends in Biotechnology, 15: 62-70, 1997) beschrieben worden.
Nachweissystem unter Verwendung einer Sonde
Die monoklonalen Antikörper, die gemäß der vorliegenden Erfindung produziert wurden, werden als Testreagenzien zum Nachweis und zur Quantifizierung von HCV-Strukturproteinen in einem enzymverknüpften Immunsorbenstest, einem Enzymimmuntest, einem Enzymimmunodottest, einem Radioimmuntest, einem auf Aggregation basierenden Test oder einem anderen wohlbekannten Immuntest verwendet. Wenn markierte Antikörper zum Nachweis verwendet werden, können fluoreszierende Verbindungen, chemilumineszierende Verbindungen, Enzyme, chromogene Substanzen und dergleichen als die markierten Verbindungen verwendet werden.
Wenn beispielsweise ein auf dem Sandwich-Reaktionssystem basierendes Verfahren verwendet wird, um das Virusantigen in einer Probe (Serum) nachzuweisen, umfasst das diagnostische Kit, das verwendet werden soll, einen oder mehrere monoklonale Antikörper, die auf dem festen Träger (z. B. einer Innenwand einer Mikrotitervertiefung) beschichtet sind, [und] einen oder mehrere monoklonale Antikörper oder ein Fragment von diesen, die an die markierte Substanz gebunden sind. Jede Kombination eines monoklonalen Antikörpers, der an dem festen Träger immobilisiert ist, und eines markierten monoklonalen Antikörpers kann verwendet werden, und die Kombinationen, die eine hohe Empfindlichkeit liefern, können ausgewählt werden.
Feste Träger, die verwendet werden können, beinhalten z. B. Mikrotiterplatten, Teströhrchen und Kapillaren, die aus Polystyrol, Polycarbonat, Polypropylen oder Polyvinyl gefertigt sind, Kügelchen (Latexkügelchen, rote Blutzellen, Metallverbindungen usw.), Membranen (Liposomen usw.), Filter und dergleichen.
Wirkungen der Erfindung
Nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung können Virusantigene bequem aus dem Viruspartikel in einem Zustand freigesetzt werden, der für einen Immuntest geeignet ist, der den Nachweis unter Verwendung eines Antikörpers als einer Sonde bewirkt. Weiterhin kann durch ein Behandeln einer Probe, welche den Viruspartikel enthält, gemäß der vorliegenden Erfindung ein einfacher und empfindlicher Nachweis und eine Quantifizierung der Virusantigene durch einen Immuntest bewirkt werden, in welchem das Antigen unter Verwendung eines Antikörpers usw. als einer Sonde nachgewiesen wird. Es ist ebenfalls möglich, ein Kit, ein Testkit und ein diagnostisches Reagens zu erzeugen, welches das Vorliegen oder Fehlen von Viren feststellt und Viren in der Probe quantifiziert, indem ein Immuntest verwendet wird, der das Probenbehandlungsverfahren der vorliegenden Erfindung einsetzt.
Beispiele
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die vorliegende Erfindung, sie sollen aber nicht so ausgelegt werden, dass sie den Umfang der vorliegenden Erfindung beschränken.
Beispiel 1. Expression und Reinigung eines von HCV abgeleiteten Polypeptids
(A) Konstruktion eines Expressionsplasmids
Ein Plasmid, welches dem Kernbereich von HCV entspricht, wurde wie folgt konstruiert:
Jeweils ein Mikrogramm an DNA der Plasmide pUC·C11-C21 und pUC·C10-E12, welche durch Integration des Klons C11-C21 bzw. des Klons C10-E12 (Japanische ungeprüfte Patentschrift (Kokai) Nr. 6 (1994)-38765) in pUC119 erhalten wurden, wurde in 20 μl einer Restriktionsenzymreaktionslösung [50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl₂, 1 mM Dithiothreitol, 100 mM NaCl, 15 Einheiten EcoRI- und 15 Einheiten ClaI-Enzym] und der Restriktionsenzymreaktionslösung [10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl₂, 1 mM Dithiothreitol, 50 mM NaCl, 15 Einheiten ClaI- und 15 Einheiten KpnI-Enzym] bei 37°C für jeweils 1 Stunde verdaut und wurde dann einer Elektrophorese auf 0,8% Agarosegel unterzogen, um ein EcoRI-ClaI-Fragment mit ca. 380 bp und ein ClaI-KpnI-Fragment mit ca. 920 bp zu reinigen.
Zu den zwei DNA-Fragmenten und einem Vektor, welcher durch Verdauen von pUC119 mit EcoRI und KpnI erhalten wurde, wurden 5 μl einer 10 × Ligase-Pufferlösung [660 mM Tris-HCl, pH 7,5, 66 mM MgCl₂, 100 mM Dithiothreitol, 1 mM ATP], 1 μl T4-Ligase (350 Einheiten/μl) und Wasser zugegeben, um ein Gesamtvolumen von 50 μl zu erhalten, und dieses wurde dann bei 16°C über Nacht inkubiert, um eine Ligationsreaktion durchzuführen. Unter Verwendung dieses Plasmids wurde E. coli JM109 transformiert, um das Plasmid pUC·C21-E12 zu erhalten.
Ein Nanogramm der DNA dieses Plasmids, pUC·C21-E12, wurde einer PCR unterzogen, wobei zwei Primer verwendet wurden: 5'-GAATTCATGGGCACGAATCCTAAA-3' (SEQ ID NO: 7) und 5'-TTAGTCCTCCAGAACCCGGAC-3' (SEQ ID NO: 8). Eine PCR wurde durchgeführt, indem das GeneAmpTM (DNA-Amplifizierungsreagenskit, hergestellt von Perkin Elmer Cetus) unter den Bedingungen einer DNA-Denaturierung bei 95°C für 1,5 min, Annealen bei 50°C für 2 min und DNA-Synthese bei 70°C für 3 min verwendet wurde. Die so erhaltenen DNA-Fragmente wurden bei einer Elektrophorese auf 0,8% Agarosegel getrennt und wurden durch das Glaspulververfahren (Gene Clean) gereinigt.
Andererseits wurde pUC19 mit SmaI verdaut, und das durch PCR erhaltene DNA-Fragment wurde zu 5 μl 10 × Ligase-Pufferlösung [660 mM Tris-HCl, pH 7,5, 66 mM MgCl₂, 100 mM Dithiothreitol, 1 mM ATP], 1 μl T4-Ligase (350 Einheiten/μl) und Wasser zugegeben, um ein Gesamtvolumen von 50 μl zu erhalten, und wurde dann bei 16°C über Nacht inkubiert, um eine Ligationsreaktion durchzuführen. Unter Verwendung dieses Plasmids wurde E. coli JM109 transformiert, um das Plasmid pUC·C21-E12·SmaI zu erhalten. Ein Mikrogramm dieser Plasmid-DNA wurde in 20 μl der Restriktionsenzymreaktionslösung [150 mM NaCl, 6 mM Tris-HCl, pH 7,5, 6 mM MgCl₂, 15 Einheiten EcoRI- und 15 Einheiten BamHI-Enzym] verdaut und wurde dann einer Elektrophorese auf 0,8%, Agarosegel unterzogen, um ein EcoRI-BamHI-Fragment mit ca. 490 bp abzutrennen, welches durch das Glaspulververfahren gereinigt wurde.
Dann wurde 1 μg der DNA des Expressionsvektors Trp·TrpE (Japanische ungeprüfte Patentschrift (Kokai) Nr. 5 (1993)-84085) in 20 μl der Restriktionsenzymreaktionslösung [150 mM NaCl, 6 mM Tris-HCl, pH 7,5, 6 mM MgCl₂, 15 Einheiten Eco RI- und 15 Einheiten BamHI-Enzym] bei 37°C für 1 Stunde verdaut. Zu der Reaktionsmischung wurden 39 μl Wasser zugegeben, und dann wurde bei 70°C für 5 Min erwärmt. Danach wurde 1 μl einer bakteriellen alkalischen Phosphatase (BAP) zugegeben und bei 37°C für 1 Stunde inkubiert.
Phenol wurde zu der Reaktionsmischung zur Phenolextraktion zugegeben. Die so erhaltene wässrige Schicht wurde mit Ethanol ausgefällt, und der erhaltene Niederschlag wurde getrocknet. Ein Mikrogramm DNA des erhaltenen EcoRI-BamHI-behandelten Vektors und das obige Kern-140-Fragment wurden zu 5 μl 10 × Ligase-Pufferlösung [660 mM Tris-HCl, pH 7,5, 66 mM MgCl₂, 100 mM Dithiothreitol, 1 mM ATP], 1 μl T4-Ligase (350 Einheiten/μl) und Wasser zugegeben, um ein Gesamtvolumen von 50 μl zu erhalten, und wurden über Nacht bei 16°C inkubiert, um eine Ligationsreaktion durchzuführen.
Unter Verwendung von 10 μl dieser Reaktionsmischung wurde der E. coli-Stamm HB101 transformiert. Der empfindliche E. coli-Stamm, der zur Transformation verwendet wurde, kann durch das Calciumchlorid-Verfahren konstruiert werden [Mandel, M. und Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159-162 (1970)]. Der transformierte E. coli wurde auf einer LG-Platte (1% Tryptophan, 0,5% NaCl, 1,5% Agar), die 25 μg/ml Ampicillin enthielt, plattiert und wurde über Nacht bei 37°C inkubiert. Unter Verwendung einer Impföse wurde die Menge einer Öse einer Bakterienkolonie, die sich auf der Platte gebildet hatte, auf ein LB-Kulturmedium überführt, das 25 μg/ml Ampicillin enthielt, und über Nacht bei 37°C inkubiert. Eineinhalb Milliliter der Bakterienkultur wurden zentrifugiert, um die Zellen zu sammeln, und dann wurde die Plasmid-DNA einer Minipräparation unter Verwendung des Alkaliverfahrens unterzogen [Manniatis et al., Molceular Cloning: A Laboratory Manual (1982)].
Dann wurde 1 μg der DNA der so erhaltenen Plasmid-DNA in 20 μl der Restriktionsenzymreaktionslösung [150 mM NaCl, 6 mM Tris-HCl, pH 7,5, 6 mM MgCl₂, 15 Einheiten Eco RI- und 15 Einheiten BamHI-Enzym] bei 37°C für 1 Stunde verdaut, und wurde dann einer Agarosegelelektrophorese unterzogen. Das Trp·TrpE-Kern 160-Expressionsplasmid, welches ein EcoRI-BamHI-Fragment mit ca. 490 bp erzeugte, wurde selektiert.
(B) Expression und Reinigung eines Polypeptids, das von dem Klon Kern 160 codiert wird
Der E. coli-Stamm HB101 mit einem Expressionsplasmid Trp·TrpE-Kern 160 wurde in 3 ml 2YT-Medium (1,6% Trypton, 1% Hefeextrakte, 0,5% NaCl), das 50 μg/ml Ampicillin enthielt, inokuliert und wurde bei 37°C für 9 Stunden kultiviert. Ein Milliliter der Kultur wurde auf 100 ml M9-CA-Medium (0,6% Na₂HPO₄, 0,5% KH₂PO₄, 0,5% NaCl, 0,1% NH₄Cl, 0,1 mM CaCl₂, 2 mM MgSO₄, 0,5% Casaminosäure, 0,2% Glucose), das 50 μg/ml Ampicillin enthielt, überführt (passaged) und bei 37°C kultiviert. Indolacrylat wurde bis zu einer Endkonzentration von 40 mg/l bei OD600 = 0,3 zugegeben und wurde für mehr als 16 Stunden kultiviert. Die Kultur wurde zentrifugiert, um die Zellen zu sammeln.
Zu den Zellen wurden 20 ml des Puffers A [50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA, 30 mM NaCl] zugegeben, um diese zu suspendieren. Die Suspension wurde wieder zentrifugiert, um 2,6 g an Expressionszellen zu erhalten. Die so erhaltenen Zellen wurden in 10 ml des Puffers A suspendiert. Nach Aufbrechen der Membran des E. coli durch Beschallung wurde zentrifugiert, um eine unlösliche Fraktion zu erhalten, welche ein Fusionspolypeptid aus einem Polypeptid, das von der HCV-cDNA codiert wurde, und TrpE enthielt. Zu der Fraktion wurden 10 ml des Puffers A, der 6 M Harnstoff enthielt, zugegeben, um das Fusionspolypeptid zu solubilisieren und zu extrahieren. Der solubilisierte Extrakt wurde einer Ionenaustauschsäulenchromatographie unter Verwendung von S-Sepharose unterzogen, um das Fusionspolypeptid zu reinigen.
Beispiel 2. Verfahren der Konstruktion eines Hybridoms
Das Fusionspolypeptid (TrpC11), das durch das oben beschriebene Verfahren hergestellt wurde, wurde in 6 M Harnstoff gelöst und dann in 10 mM Phosphatpuffer, pH 7,3, der 0,15 M NaCl enthielt, auf eine Endkonzentration von 0,2 bis 1,0 mg/ml verdünnt und mit einer gleichen Menge eines Adjuvans (Titermax) gemischt, um eine TrpC11-Suspension zu erzeugen. Diese Suspension, die mit 0,1 bis 0,5 mg/ml TrpC11 hergestellt wurde, wurde 4 bis 6 Wochen alten BALB/c-Mausen intraperitoneal gegeben. Eine ähnliche Immunisierung wurde alle zwei Wochen durchgeführt, und nach ca. zwei weiteren Wochen wurden 10 μg an TrpC11, gelöst in physiologischer Salzlösung, über die Schwanzvene verabreicht.
Drei Tage nach dem letzten Booster wurde die Milz aseptisch aus dem immunisierten Tier isoliert und wurde unter Verwendung von Scheren in Stücke geschnitten, welche dann zu einzelnen Zellen zerkrümelt wurden und dreimal mit dem RPMI-1640-Medium gewaschen wurden. Nach dem Waschen wurden eine Maus-Myelomzelllinie SP2/0Ag14 in der logarithmischen Wachstumsphase wie oben beschrieben, 2,56 × 10⁷ dieser Zellen und 1,64 × 10⁸ Milzzellen in einem 50 ml-Zentrifugenröhrchen gemischt. Die Mischung wurde bei 200 × g für 5 Minuten zentrifugiert, der Überstand wurde entfernt, und 1 ml des RPMI-1640-Mediums, das 50% Polyethylenglycol (PEG) 4000 (hergestellt von Merck) enthielt, wurde zu dem Niederschlag zugegeben, und 10 ml des RPMI-1640-Mediums wurden weiterhin zugegeben, um eine Zellfusion durchzuführen.
Nachdem PEG durch Zentrifugation (200 × g, 5 Minuten) entfernt worden war, wurden die fusionierten Zellen in einem RPMI 1640-Medium, das 10% Rinderserum, Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin enthielt (im Folgenden als HAT bezeichnet), in einer Platte mit 96 Vertiefungen für ca. 10 Tage kultiviert, um nur Hybridome wachsen zu lassen. Dann wurden die Klone, welche den Antikörper von Interesse erzeugten, durch das ELISA-Verfahren nachgewiesen, um die Hybridome zu erhalten, die einen monoklonalen Antikörper mit der gewünschten Reaktionsspezifität der vorliegenden Erfindung produzierten.
Die so erhaltenen Hybridome wurden nach dem herkömmlichen Grenzverdünnungsverfahren monokloniert, und die erhaltenen Hybridome wurden mit HC11-11, HC11-14, HC11-10 und HC11-3 und HC11-7 bezeichnet. Diese vier Hybridome wurden bei dem National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, am 4. Juli 1997 als FERM 6P-6005, FERM BP-6006, FERM 6P-6004, FERM 6P-6002 bzw. FERM 6P-6003 hinterlegt.
Beispiel 3. Konstruktion eines monoklonalen Antikörpers
Die bei dem Verfahren von Beispiel 2 erhaltenen Hybridome wurden in der Bauchhöhle von Mäusen, die mit Pristan usw. behandelt worden waren, inokuliert, und die monoklonalen Antikörper, die in der Aszitesflüssigkeit produziert wurden, wurden gesammelt. Die monoklonalen Antikörper wurden gereinigt, indem die mit Protein A gebundene Sepharosesäule verwendet wurde, um IgG-Fraktionen zu trennen.

Durch einen Immuntest, welcher einen Kaninchen-anti-Maus-Antikörper des Isotyps Ig (hergestellt von Zymed) verwendete, wurde gefunden, dass der Isotyp von jedem der monoklonalen Antikörper C11-14, C11-11, C11-10, C11-7 bzw. C11-3, die von den obigen fünf Hybridomen erzeugt wurden, bei C11-10 und C11-7 IgG2 und bei CH11-11, C11-14 und C11-3 IgG1 war. Für die fünf erhaltenen monoklonalen Antikörper wurde eine Epitopanalyse durchgeführt, indem die synthetischen Peptide, die aus 20 Aminosäuren zusammengesetzt waren, die nach der Sequenz synthetisiert wurden, die von dem HCV-Kernbereich abgeleitet wurde, verwendet wurden. Das Ergebnis zeigte, wie in Tabelle 1 gezeigt ist, dass dieses die monoklonalen Antikörper waren, die spezifisch einen Teil des Kernbereichs erkennen. Tabelle 1

Antikörper	Erkennungsstelle
C11-14	⁴¹Gly-⁵⁰Arg (SEQ ID NO: 4)
C11-10	²¹Asp-⁴⁰Arg (SEQ ID NO: 3)
C11-3	¹⁰⁰Pro-¹²⁰Gly (SEQ ID NO: 5)
C11-7	¹¹¹Asp-¹³⁰Phe (SEQ ID NO: 6)
C11-11	¹⁰⁰Pro-¹²⁰Gly (SEQ ID NO: 5)

Beispiel 4. Untersuchung über die Bedingungen der Probenbehandlung
1) SDS-Konzentration
Zu 100 μl eines normalen menschlichen Serums und HCV-RNA-positiven Seren wurden 100 μl der Behandlungslösung, die eine unterschiedliche Konzentration an SDS und 0,6% CHAPS enthielt, zugegeben. Die Mischungen wurden dann in einen Inkubator gestellt, der auf 56°C eingestellt war, und wurden für 30 Minuten behandelt, und 80 μl von jeder der behandelten Mischungen wurden als eine Probe verwendet. Das Ergebnis, das unter Verwendung des nachstehend beschriebenen Testverfahrens erhalten wurde, ist in 1 gezeigt, wobei die SDS-Konzentration zu der Zeit der Behandlung als Abszisse genommen wird.
2) CHAPS-Konzentration
Zu 100 μl eines normalen menschlichen Serums und HCV-RNA-positiven Seren wurden 100 μl der Behandlungslösung, die eine unterschiedliche Konzentration an CHAPS und 5% SDS enthielt, zugegeben. Die Mischungen wurden dann in einen Inkubator gestellt, der auf 56°C eingestellt war, und wurden für 30 Minuten behandelt, und 80 μl von jeder der behandelten Mischungen wurden als eine Probe verwendet. Das Ergebnis, das unter Verwendung des nachstehend beschriebenen Testverfahrens erhalten wurde, ist in 2 gezeigt, wobei die CHAPS-Konzentration zu der Zeit der Behandlung als Abszisse genommen wird.
3) Harnstoffkonzentration
Zu 100 μl eines normalen menschlichen Serums und HCV-RNA-positiven Seren wurden 100 μl der Behandlungslösung (5% SDS, 0,6% CHAPS), die eine unterschiedliche Konzentration an Harnstoff enthielt, zugegeben. Die Mischungen wurden dann in einen Inkubator gestellt, der auf 56°C eingestellt war, und für 30 Minuten behandelt, und 80 μl von jeder der behandelten Mischungen wurden als eine Probe verwendet. Das Ergebnis, das unter Verwendung des nachstehend beschriebenen Testverfahrens erhalten wurde, ist in 3 gezeigt, wobei die Harnstoffkonzentration zu der Zeit der Behandlung als Abszisse genommen wird.
4) Triton X100-Konzentration
Zu 100 μl eines normalen menschlichen Serums und HCV-RNA-positiven Seren wurden 100 μl der Behandlungslösung (5% SDS, 0,6% CHAPS, 6 M Harnstoff), die eine unterschiedliche Konzentration an Triton X100 enthielt, zugegeben. Die Mischungen wurden dann in einen Inkubator gestellt, der auf 56°C eingestellt war, und wurden für 30 Minuten behandelt, und 80 μl von jeder der behandelten Mischungen wurden als eine Probe verwendet. Das Ergebnis, das unter Verwendung des nachstehend beschriebenen Testverfahrens erhalten wurde, ist in 4 gezeigt, wobei die Triton X100-Konzentration zu der Zeit der Behandlung als die Abszisse genommen wird.
5) Reaktionstemperatur
Zu 100 μl eines normalen menschlichen Serums und HCV-RNA-positiven Seren wurden 100 μl der Behandlungslösung (5% SDS, 0,6% CHAPS, 6 M Harnstoff, 0,75% Triton X100) zugegeben. Die Mischungen wurden bei 4°C, Raumtemperatur (23°C), 37°C, 45°C, 56°C und 70°C für 30 Minuten behandelt, und 80 μl von jeder der behandelten Mischungen wurden als eine Probe verwendet. Das Ergebnis, das unter Verwendung des nachstehend beschriebenen Testverfahrens erhalten wurde, ist in 5 gezeigt.
Testverfahren
Proben, die bei der Untersuchung über die Bedingungen der Serumbehandlung erhalten wurden, wurden jeweils ausgewertet, indem das entsprechende nachstehend beschriebene Testverfahren verwendet wurde. So wurde ein monoklonaler anti-HCV-Kernantigen-Antikörper (eine Mischung von gleichen Mengen an Antikörper C11-3 und C11-7) auf eine Endgesamtkonzentration von 6 μg/ml in 0,1 M Carbonatpuffer, pH 9,6, verdünnt, und 100 μl von jeder der Verdünnungen wurden pro Vertiefung einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen (hergestellt von Nunc) abgegeben. Nachdem die Platte über Nacht bei 4°C inkubiert worden war, wurde sie zweimal mit 0,35 ml 10 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,3, der 0,15 M NaCl enthielt, gewaschen. Dann wurden 0,35 ml 10 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,35, der 0,5% Casein-Na enthielt (im Folgenden als die Blockierungslösung bezeichnet), zugegeben, und die Platte wurde weiter bei Raumtemperatur für 2 Stunden inkubiert.
Nachdem die Blockierungslösung entfernt worden war, wurden 160 μl 100 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,3, welcher 0,15 M NaCl, 1% BSA, 0,5% Casein-Na und 0,05% Tween 20 enthielt, und Proben zur Messung, die durch das Serumbehandlungsverfahren erhalten wurden, in entsprechende Vertiefungen zugegeben. Die Platte wurde dann bei Raumtemperatur für 2 Stunden inkubiert und fünfmal mit 300 μl der Waschlösung gewaschen. Dann wurden 100 μl eines mit Peroxidase (POD) markierten monoklonalen Antikörpers (eine Mischung von gleichen Mengen an C11-10 und C11-14) zugegeben und wurden bei Raumtemperatur für 30 Minuten inkubiert. Nachdem die Inkubation vorüber war, wurde die Platte fünfmal mit 300 μl der obigen Waschlösung gewaschen. 100 μl der Substrat (ortho-Phenylendiamin, im Folgenden als OPD bezeichnet)-Lösung wurden zu der Platte zugegeben, und die Platte wurde bei Raumtemperatur für 30 Minuten inkubiert, worauf die Zugabe von 100 μl 2 N Schwefelsäurelösung folgte. Die Extinktion wurde bei einer Wellenlänge von 492 nm (OD492) gemessen, wobei die Extinktion bei 630 nm als eine Referenz diente.
Jede Behandlungsbedingung wurde optimiert, wie in den 1 bis 4 gezeigt ist. Es war schwierig, das Kernantigen in den unbehandelten Proben nachzuweisen, aber eine so einfache Behandlung ermöglichte den Nachweis des Kernantigens. Insbesondere wurde gezeigt, dass das Kernantigen zufriedenstellend nachgewiesen werden kann, indem die Bedingung von SDS mit 0,5% oder größer, CHAPS mit 0,1% oder größer, Harnstoff mit 1 M oder größer und Triton X100 mit 0,1 bis 0,75% und einem Temperaturbereich von 4°C bis 70°C eingesetzt wird.
Beispiel 5. Das Nachweis- und Testverfahren des Kernantigens in dem Strukturbereich (1)
Zu 100 μl Serum wurden 100 μl der Behandlungslösung (5% SDS, 0,6% CHAPS, 6 M Harnstoff, 0,75% Triton X100) zugegeben. Dieses wurde dann in einen Inkubator gestellt, der auf 56°C eingestellt war, und wurde für 30 Minuten behandelt, und 120 μl der behandelten Mischung wurden als eine Probe verwendet.
Ein monoklonaler anti-HCV-Kernantigen-Antikörper (eine Mischung von gleichen Mengen an C11-3 und C11-7) wurde bis auf eine Endgesamtkonzentration von 6 μg/ml in 0,1 M Carbonatpuffer, pH 9,6, verdünnt, und 100 μl der verdünnten Mischung wurden pro Vertiefung einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen (hergestellt von Nunc) abgegeben. Nachdem die Platte über Nacht bei 4°C inkubiert worden war, wurde sie zweimal mit 0,35 ml 10 nM Natriumphosphatpuffer, pH 7,3, welcher 0,15 M NaCl enthielt, gewaschen. Dann wurden 0,35 ml der Blockierungslösung zugegeben, und die Platte wurde weiter bei Raumtemperatur für 2 Stunden inkubiert.
Nachdem die Blockierungslösung entfernt worden war, wurden 120 μl des Reaktionspuffers und der Proben zur Messung, die in dem obigen Behandlungsverfahren erhalten wurden, zu entsprechenden Vertiefungen zugegeben und bei Raumtemperatur für 2 Stunden inkubiert. Die Platte wurde fünfmal mit 300 μl der Waschlösung gewaschen, und dann wurden 100 μl eines mit Peroxidase (POD) markierten monoklonalen Antikörpers (eine Mischung von gleichen Mengen an C11-10 und C11-14) zu der Platte zugegeben, und die Platte wurde bei Raumtemperatur für 30 Minuten inkubiert. Die Platte wurde fünfmal mit 300 μl der Waschlösung gewaschen, und 100 μl der Substrat (OPD)-Losung wurden zugegeben und bei Raumtemperatur für 45 Minuten inkubiert, worauf die Zugabe von 100 μl 2 N Schwefelsäurelösung folgte. Die Extinktion wurde bei einer Wellenlänge von 492 nm (OD492) gemessen, mit der Extinktion bei 630 nm als einer Referenz. Als ein Standardserum wurde das Serum der Gruppe 50, definiert als 1 U/ml, in Reihe in 10 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,3, welcher 1 % BSA enthielt, verdünnt, welches ähnlich behandelt und gemessen wurde.
6 zeigt eine Verdünnungslinie des Serums der Gruppe 50, das als einem Standardserum verwendet wurde. Das Kernantigen in der Probe wurde in einer dosisabhängigen Weise bestimmt und konnte bis auf ein Niveau von ca. 0,5 mU/ml nachgewiesen werden. Es wurde daher gezeigt, dass durch ein Kombinieren eines sehr einfachen Verfahrens der Probenbehandlung und des monoklonalen Antikörpers der vorliegenden Erfindung das HCV-Kernantigen nachgewiesen oder quantifiziert werden kann.
Beispiel 6. Nachweis und Quantifizierung des HCV-Kernantigens (2)
Ein Verfahren unter Verwendung eines mit alkalischer Phosphatase markierten monoklonalen Antikörpers
Eine schwarze Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen (Nunc) als der feste Träger, ein mit alkalischer Phosphatase markierter monoklonaler Antikörper als der markierte Antikörper und CDPstar (Emerald II als der Sensibilisator) als das Substrat wurden verwendet. Eine Verdünnungslinie des Serums der Gruppe 50, welches als ein Standardserum verwendet wurde, ist in 7 gezeigt, in welcher das Kernantigen in der Probe in einer dosisabhängigen Weise bestimmt wurde und bis zu einem Niveau von ca. 0,5 mU/ml nachgewiesen werden konnte. Es wurde daher gezeigt, dass das Verfahren unter Verwendung eines mit alkalischer Phosphatase markierten monoklonalen Antikörpers ebenfalls das HCV-Kernantigen nachweisen oder quantifizieren kann.
Beispiel 7. Untersuchung über Zusätze zur Unterdrückung der Empfindlichkeitsverminderung in dem hämolysierten Serum
Wenn Serumkomponenten auf die Wirkung auf die Empfindlichkeit getestet wurden, wurde gefunden, dass die Zugabe von Hämoglobin die Empfindlichkeit drastisch verringerte. Es wurde angenommen, dass die Verringerung durch das Häm verursacht wurde, das aus dem denaturierten Hämoglobin freigesetzt wurde, das durch Vorbehandlung unter Verwendung eines Vorbehandlungsmittels, das SDS, CHAPS oder Triton X100 enthielt, erzeugt wurde. So wurden Zusätze, welche die Wirkung des denaturierten Hämoglobins verringern konnten, getestet, indem diese zu dem Vorbehandlungsmittel zugegeben wurden.
Die Wirkung der Harnstoffzugabe wurde untersucht, indem Harnstoff zu den Modellproben zugegeben wurde, die erzeugt wurden, indem eine hohe Konzentration an Hämoglobin (hergestellt von Kokusai Shiyaku: Kansho Check) zu einem HCV-Kernantigen-positiven Serum (Serum der Gruppe Nr. 3) zugegeben wurde und indem das Kernantigen gemäß Beispiel 6 bestimmt wurde. Das Niveau der Aktivität des Kernantigens in der Gruppe mit 430 mg/dl Hämoglobinzugabe bezogen auf 100% der Gruppe ohne Zugabe von Hämoglobin, welche als die Kontrolle verwendet wurde, ist in Tabelle 2 gezeigt. Es wurde bestätigt, dass, wenn kein Harnstoff zugegeben wird, das Niveau der Aktivität des Kernantigens in der Gruppe mit Hämoglobinzugabe um 30% sank, aber durch eine Erhöhen der Menge an zugegebenem Harnstoff das Niveau der Aktivität des Kernantigens in der Gruppe mit Hämoglobinzugabe anstieg und eine Störung durch Hämoglobin vermindert wurde. Tabelle 2. Unterdrückende Wirkung von Harnstoff auf die Störung durch Hämoglobin

Zusatz % bezogen auf die Kontrolle

keine Zugabe 30,0

0,5 M Harnstoff 36,3

1 M Harnstoff 39,7

2 M Harnstoff 43,0

3 M Harnstoff 48,8

4 M Harnstoff 53,7
Da es andererseits eine Möglichkeit der Wechselwirkung von jeder Aminosäure mit dem Häm und der Pufferwirkung durch die Aminogruppe und die Carboxylgruppe gibt, wurden verschiedene Aminosäuren zugegeben, und das Ausmaß der Wirkung wurde untersucht.

Das Ergebnis ist in Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3. Unterdrückende Wirkung von verschiedenen Aminosäuren auf die Störung durch Hämoglobin

Zusatz	% bezogen auf die Kontrolle
keine Zugabe	22,7
0,1 M Histidin	53,7
0,1 M Tryptophan	70,8
0,1 M Phenylalanin	45,8
0,1 M Leucin	25,9
0,1 M Glutamin	36,1
0,1 M Lysin	42,1
0,1 M Arginin	31,4
0,1 M Glutaminsäure	49,8
0,1 M Glycin	39,1
0,1 M Prolin	31,2
0,1 M Serin	32,5

Tryptophan und Histidin zeigten die stärkste unterdrückende Wirkung auf die Störung. Die Dosisabhängigkeit der unterdrückenden Wirkung auf die Störung wurde untersucht, und das Ergebnis ist in Tabelle 4 gezeigt. Tabelle 4. Unterdrückende Wirkung von Histidin und Tryptophan auf die Störung durch Hämoglobin

Zusatz	% bezogen auf die Kontrolle
keine Zugabe	24,2
0,05 M Histidin	49,3
0,1 M Histidin	59,4
0,15 M Histidin	74,5
0,2 M Histidin	77,0
0,05 M Tryptophan	58,7
0,1 M Tryptophan	71,5
0,15 M Tryptophan	77,9
0,2 M Tryptophan	89,0

Da das Häm von einer Seitenkette in Hämoglobin koordiniert wird und im Hämoglobin zurückgehalten wird, wurde vorgeschlagen, dass die Wirkung der Seitenkette zuzuschreiben ist. Demgemäß wurden die Wirkung von Imidazol, einer Seitenkette im Histidin, und Indolacrylsäure, welche einen Indolring, eine Seitenkette im Tryptophan, enthält, untersucht, und das Ergebnis ist in Tabelle 5 gezeigt. Tabelle 5. Unterdrückende Wirkung von Imidazol und Indolacrylsäure auf die Störung durch Hämoglobin

Zusatz	% bezogen auf die Kontrolle
keine Zugabe	22,1
0,05 M Imidazol	35,2
0,1 M Imidazol	42,0
0,15 M Imidazol	58,8
0,2 M Imidazol	70,7
5 mM Indolacrylsäure	50,4
10 mM Indolacrylsäure	69,0
20 mM Indolacrylsäure	90,3
30 mM Indolacrylsäure	96,8

Wenn Indol oder Indolacrylsäure zu der Reaktion zugegeben wurden, wurde eine dosisabhängige, unterdrückende Wirkung der Störung durch Hämoglobin wie bei der Zugabe von Aminosäuren beobachtet. Dieses zeigte, dass durch Zugeben einer Substanz zu der Reaktion, die einen Imidazolring, z. B. Histidin, oder einen Indolring, z. B. Tryptophan, enthält, der empfindliche Nachweis des Kernantigens selbst für die Proben, die Hämoglobin enthalten, erreicht werden kann.
Die Wirkung der Kombination der obigen Zusätze wurde untersucht. Das Ergebnis ist in Tabelle 8 gezeigt. Durch ein Kombinieren von Histidin und Tryptophan wurde eine Wiederherstellung von 90% oder mehr erhalten, und die Zugabe von Harnstoff erhöhte die Nachweisempfindlichkeit weiter. Tabelle 6.

Zusatz % bezogen auf die Kontrolle

0,1 M Histidin/0,1 M Tryptophan 91,1

4 M Harnstoff/0,1 M Tris/0,1 M Histidin 112,6
Beispiel 8. Analyse der molekularen Form, die bei der Serumbehandlung und bei dem Testverfahren erkannt wird
Jedes Verfahren der Serumbehandlung wurde verwendet, um 0,25 ml des Serums der Gruppe 13 zu behandeln. Das behandelte Serum wurde auf einer Gelfiltrationssäule (Superdex 200HR, 1 × 30) fraktioniert, und die immunologische Antikernaktivität in den Fraktionen wurde gemessen. Das Ergebnis ist in Tabelle [Figur] 8 gezeigt. Die Figur legte nahe, dass die Moleküle, welche ein Molekulargewicht von ca. 20 bis 30 kDa aufweisen, erkannt werden und dass das Kernantigen in dem Virus durch das Aufbrechen des Virus und die Inaktivierung des anti-Kern-Antikörpers in dem Serum durch die oben erwähnte Vorbehandlung freigesetzt wurde.
Beispiel 9. Testverfahren des Kernantigens in dem HCV-Strukturbereich im Serum
Seren, von denen unter Verwendung des AmpliCore-HCV-Monitorkits (Roche), ein PCR-Verfahren, bestimmt wurde, dass sie 10³ bis 10⁷ Kopien/ml HCV-RNA aufwiesen, und normale menschliche Seren wurden verwendet, um das HCV-Kernantigen in den Seren zu quantifizieren, indem das oben beschriebene Verfahren verwendet wurde.

Als ein Standardserum wurde das Serum der Gruppe 50 (definiert als 1 U/ml) in Reihe in 10 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,3, welcher 1% BSA enthielt, verdünnt und in einer ähnlichen Weise behandelt. Das Ergebnis ist in Tabelle 7 gezeigt. Bei den getesteten Proben lag das Kernantigen in allen normalen menschlichen Seren unterhalb der Nachweisgrenze und konnte bei allen PCR-positiven Proben nachgewiesen werden. Die Korrelation ist in 9 gezeigt, welche zeigte, dass die Korrelation mit dem PCR-Verfahren ebenfalls so hoch wie 0,8 oder größer war. Tabelle 7. Spiegel der HCV-RNA und des Kernantigens

Probe Nr.			RNA (K Kopien/ml)	Kernantigen (mU/ml)
Normales menschliches Serum	1	–	N.D.
	2	–	N.D.
	3	–	N.D.
	4	–	N.D.
	5	–	N.D.
Gruppenserum	81	1,6	2,1
	80	8	2,1
	82	8	8,5
	33	16	3,7
	31	30	37,0
	26	87	266,7
	39	97	63,8
	41	170	116,1
	16	400	133,7
	50	1000	1000
	45	1300	277,3
	13	1600	1806

N.D.: nicht nachgewiesen

Beispiel 10. Untersuchung über die Bedingungen der Probenbehandlung Untersuchung über die Behandlungsbedingungen
1) Guanidinhydrochloridkonzentration
Zu 100 μl eines normalen menschlichen Serums und HCV-RNA-positiven Seren wurden 100 μl der Behandlungslösung zugegeben, welche eine unterschiedliche Konzentration an Guanidinhydrochlorid und 0,5 N HCl enthielt. Die Mischungen wurden bei Raumtemperatur für 30 Minuten behandelt, und 80 μl von jeder der behandelten Mischungen wurden als eine Probe verwendet. Das Ergebnis, das unter Verwendung des nachstehend beschriebenen Testverfahrens erhalten wurde, ist in 10 gezeigt, wobei die Guanidinhydrochloridkonzentration zu der Zeit der Behandlung als Abszisse genommen wird.
2) Triton X100-Konzentration
Zu 100 μl eines normalen menschlichen Serums und HCV-RNA-positiven Seren wurden 100 μl der Behandlungslösung zugegeben, die eine unterschiedliche Konzentrationen an Triton X100 enthielt (6 M Guadininhydrochlorid, 0,5 N HCl). Die Mischungen wurden bei Raumtemperatur für 30 Minuten behandelt, und 80 μl von jeder der behandelten Mischungen wurden als eine Probe verwendet. Das Ergebnis, das unter Verwendung des nachstehend beschriebenen Testverfahrens erhalten wurde, ist in 11 gezeigt, wobei die Triton X100-Konzentration zu der Zeit der Behandlung als Abszisse genommen wird.
3) Tween 20-Konzentration
Zu 100 μl eines normalen menschlichen Serums und HCV-RNA-positiven Seren wurden 100 μl der Behandlungslösung zugegeben, die eine unterschiedliche Konzentration an Triton X100 enthielt (6 M Guanidinhydrochlorid, 0,5 N HCl, 12,5% Triton X100). Die Mischungen wurden bei Raumtemperatur für 30 Minuten behandelt, und 80 μl von jeder der behandelten Mischungen wurden als eine Probe verwendet. Das Ergebnis, das unter Verwendung des nachstehend beschriebenen Testverfahrens erhalten wurde, ist in 12 gezeigt, wobei die Tween 20-Konzentration zu der Zeit der Behandlung als Abszisse genommen wird.
4) Reaktionstemperatur
Zu 100 μl eines normalen menschlichen Serums und HCV-RNA-positiven Seren wurden 100 μl der Behandlungslösung (6 M Guanidinhydrochlorid, 0,5 N HCl, 12,5% Triton X, 0,75% Tween 20) zugegeben. Die Mischungen wurden bei 4°C, Raumtemperatur (23°C), 37°C und 45°C für 30 Minuten behandelt, und 80 μl von jeder der behandelten Mischungen wurden als eine Probe verwendet. Das Ergebnis, das unter Verwendung des nachstehend beschriebenen Testverfahrens erhalten wurde, ist in 13 gezeigt.
Testverfahren
Proben, die bei der Untersuchung über die Bedingungen der Serumbehandlung erhalten wurden, wurden jeweils ausgewertet, indem das entsprechende nachstehend beschriebene Testverfahren verwendet wurde. So wurde ein monoklonaler anti-HCV-Kernantigen-Antikörper (eine Mischung von gleichen Mengen an Antikörper C11-14 und C11-11) auf eine Endgesamtkonzentration von 6 μg/ml in 0,1 M Carbonatpuffer, pH 9,6, verdünnt, und 100 μl von jeder der Verdünnungen wurden pro Vertiefung einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen (hergestellt von Nunc) abgegeben. Nachdem die Platte über Nacht bei 4°C inkubiert worden war, wurde sie zweimal mit 0,35 ml 10 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,3, welcher 0,15 M NaCl enthielt, gewaschen. Dann wurden 0,35 ml 10 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,35, welcher 0,5% Casein-Na enthielt (im Folgenden als die Blockierungslösung bezeichnet), zugegeben, und die Platte wurde weiter bei Raumtemperatur für 2 Stunden inkubiert.
Nachdem die Blockierungslösung entfernt worden war, wurden 160 μl der Mischung von 140 μl 100 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,3, welcher 0,15 M NaCl, 1% BSA, 0,5% Casein-Na und 0,05% Tween 20 enthielt, und 20 μl 1 M Tris (im Folgenden als der Reaktionspuffer bezeichnet) und Proben zur Messung, die durch das oben erwähnte Serumbehandlungsverfahren erhalten wurden, zu entsprechenden Vertiefungen zugegeben, für 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert, fünfmal mit 300 μl der Waschlösung gewaschen, und dann wurden 100 μl des mit Peroxidase (POD) markierten monoklonalen Antikörpers (C11-10) zugegeben und bei Raumtemperatur für 30 Minuten inkubiert. Nachdem die Inkubation vorbei war, wurde die Platte fünfmal mit 300 μl der obigen Waschlösung gewaschen. 100 μl der Substrat (Orthophenylendiamin, im Folgenden als OPD bezeichnet)-Lösung wurden zu der Platte zugegeben, und die Platte wurde bei Raumtemperatur für 30 Minuten inkubiert, worauf die Zugabe von 100 μl 2 N Schwefelsäurelösung folgte. Die Extinktion wurde bei einer Wellenlänge von 492 nm (OD492), mit der Extinktion bei 630 nm als einer Referenz, gemessen.
Jede Behandlungsbedingung wurde optimiert, wie in den 10 bis 13 gezeigt ist. Es war schwierig, das Kernantigen in den unbehandelten Proben nachzuweisen, aber eine so einfache Behandlung ermöglichte in drastischer Weise den Nachweis des Kernantigens. In keinem Fall wurde bei den gesunden Menschen eine Verstärkung bei den Signalen beobachtet. Es wurde ebenfalls gezeigt, dass das Kernantigen zufriedenstellend nachgewiesen werden kann, indem die Bedingung von Guanidinhydrochlorid bei 2 M oder mehr und Triton X100 bei 0,2% oder mehr und einem Temperaturbereich von 4°C bis 45°C eingesetzt werden.
Beispiel 11. Das Nachweis- und Testverfahren des Kernantigens
Zu 100 μl Serum wurden 100 μl einer Behandlungslösung (6 M Guanidinhydrochlorid, 0,5 N HCl, 12,5% Triton X100, 0,75% Tween 20) zugegeben. Dieses wurde bei Raumtemperatur für 30 Minuten behandelt, und 100 μl der behandelten Mischung wurden als eine Probe verwendet.
Ein monoklonaler anti-HCV-Kernantigen-Antikörper (eine Mischung von gleichen Mengen an C11-14 und C11-11) wurde bis zu einer Endgesamtkonzentration von 6 μg/ml in 0,1 M Carbonatpuffer, pH 9,6, verdünnt, und jeweils 100 μl der verdünnten Mischung wurden pro Vertiefung einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen (hergestellt von Nunc) abgegeben.
Nachdem die Platte über Nacht bei 4°C inkubiert worden war, wurde sie zweimal mit 0,35 ml 10 nM Natriumphosphatpuffer, pH 7,3, welcher 0,15 M NaCl enthielt, gewaschen. Dann wurden 0,35 ml der Blockierungslösung zugegeben, und die Platte wurde weiter bei Raumtemperatur für 2 Stunden stehen gelassen. Nachdem die Blockierungslösung entfernt worden war, wurden 150 μl des Reaktionspuffers und der Proben zur Messung, die in dem obigen Behandlungsverfahren erhalten wurden, zu entsprechenden Vertiefungen zugegeben und bei Raumtemperatur für 2 Stunden inkubiert.
Die Platte wurde fünfmal mit 300 μl der Waschlösung gewaschen, und dann wurden 100 μl eines mit Peroxidase (POD) markierten monoklonalen Antikörpers (C11-10) zu der Platte zugegeben. Die Platte wurde bei Raumtemperatur für 30 Minuten inkubiert. Dann wurde die Platte fünfmal mit 300 μl der Waschlösung gewaschen, und 100 μl der Substrat (OPD)-Lösung wurden zugegeben. Nach Inkubieren der Platte bei Raumtemperatur für 45 Minuten wurden 100 μl 2 N Schwefelsäurelösung zugegeben. Die Extinktion wurde bei einer Wellenlänge von 492 nm (OD492), mit der Extinktion bei 630 nm als einer Referenz, gemessen. Als ein Standardserum wurde das Serum der Gruppe 50, definiert als 1 U/ml, in Reihe in 10 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,3, welcher 1% BSA enthielt, verdünnt, welches in ähnlicher Weise behandelt und gemessen wurde.
14 zeigt eine Verdünnungslinie des Serums der Gruppe 50, das als ein Standardserum verwendet wurde. Das Kernantigen in der Probe wurde in einer dosisabhängigen Weise bestimmt und konnte bis auf ein Niveau nachgewiesen werden, das so niedrig wie ca. 0,5 mU/ml war. Es wurde daher gezeigt, dass durch ein Kombinieren eines sehr einfachen Verfahrens der Probenbehandlung und des monoklonalen Antikörpers der vorliegenden Erfindung das HCV-Kernantigen nachgewiesen oder quantifiziert werden kann.
Beispiel 12. Analyse der molekularen Form, die bei der Serumbehandlung und bei dem Testverfahren erkannt wird
Jedes Verfahren der Serumbehandlung wurde verwendet, um 0,25 ml des Serums der Gruppe 13 zu behandeln. Das behandelte Serum wurde durch eine Gelfiltrationssäule (Superdex 200HR, 1 × 30) fraktioniert, und die immunologische Antikernaktivität in den Frak tionen wurde gemessen. Das Ergebnis ist in Tabelle [Figur] 15 gezeigt. Die Figur legte nahe, dass Moleküle mit einem Molekulargewicht von ca. 20 bis 30 kDa erkannt werden und dass das Kernantigen in dem Virus aus verschiedenen Wechselwirkungen durch das Aufbrechen des Virus und die Inaktivierung des anti-Kern-Antikörpers in dem Serum durch die oben erwähnte Vorbehandlung freigesetzt wurde.
Beispiel 13. Testverfahren des Kernantigens im Serum
Seren, von denen unter Verwendung des AmpliCore HCV-Monitorkits (Roche), ein PCR-Verfahren, bestimmt wurde, dass sie 10³ bis 10⁷ Kopien/ml HCV-RNA aufwiesen, und normale menschliche Seren wurden verwendet, um das HCV-Kernantigen in Seren unter Verwendung des oben beschriebenen Verfahrens zu quantifizieren.

Als ein Standardserum wurde das Serum der Gruppe 50 (definiert als 1 U/ml) in Reihe in 10 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,3, welcher 1% BSA enthielt, verdünnt und in einer ähnlichen Weise behandelt. Das Ergebnis ist in Tabelle 8 gezeigt. Bei den getesteten Proben lag das Kernantigen in allen normalen menschlichen Seren unterhalb der Nachweisgrenze und konnte in allen PCR-positiven Proben nachgewiesen werden. Die Korrelation ist in 16 gezeigt, welche zeigte, dass die Korrelation mit dem PCR-Verfahren ebenfalls so hoch wie 0,8 oder größer war. Tabelle 8. Spiegel der HCV-RNA und des Kernantigens

Probe Nr.			RNA (K Kopien/ml)	Kernantigen (mU/ml)
Normales menschliches Serum	1	–	N.D.
	2	–	N.D.
	3	–	N.D.
	4	–	N.D.
	5	–	N.D.
	6	–	N.D.
	7	–	N.D.
Gruppenserum	1	50	166,4
	7	830	471,1
	8	26	61,5
	11	240	107,4
	13	1600	1426
	15	25	40,1
	16	400	240,3
	19	840	1369
	26	87	1093
	31	30	45,8
	33	16	58,5
	39	97	89,0
	41	170	43,9
	44	180	57,5
	49	33	47,7
	50	1000	1005
	84	8,7	63,5

N.D.: nicht nachgewiesen

Beispiel 14. Nachweis des Hepatitis B-Virus (HBV)-Kernantigens
Wir haben bisher den Nachweis des HCV-Kernantigens erklärt. Wir haben erforscht, ob dieses Behandlungsverfahren auf den Nachweis von Strukturproteinen in anderen Viren anwendbar ist.
Ein monoklonaler Antikörper (Tokushu Menneki Kenkyuusho [Special Immunology Research Institute]) gegen das HBV-Kernantigen wurde auf eine Konzentration von 3 μg/ml in 0,1 M Carbonatpuffer, pH 9,6, verdünnt und wurde in einem Aliquot von 100 μl abgegeben. Nach Inkubieren über Nacht bei 4°C wurde die Platte mit einem Phosphatpuffer gewaschen, und ein 350 μl-Aliquot einer 1% BSA-Lösung wurde auf die Platte abgegeben. Nachdem man sie für 2 Stunden bei Raumtemperatur stehen ließ, wurde die 1% BSA-Lösung abgesaugt, und 200 μl der Reaktionslösung wurden zugegeben.
Ein rekombinantes HBV-Kernantigen wurde als ein Standard verwendet, und fünf Patientenseren, die positiv auf das HBe-Antigen und negativ auf anti-HBe-Antikörper getestet waren, und zehn normale menschliche Seren wurden als Proben verwendet. Zu 100 μl einer Probe wurden 50 μl eines Behandlungsreagenzes (7,5% SDS, 0,75% CHAPS, 0,15% Triton X100, 2 M Harnstoff, 0,1 M Histidin, 0,1 M Tryptophan) zugegeben und bei 56°C für 30 Minuten behandelt. Nach der Behandlung wurden 50 μl davon zu einer Vertiefung zugegeben, die mit der Reaktionslösung gefüllt war, und wurden bei Raumtemperatur für 90 Minuten inkubiert.
Als ein Vergleich (ohne Vorbehandlung) wurden 100 μl von jeder Probe mit 50 μl gereinigtem Wasser verdünnt, und 50 μl der verdünnten Probe wurden für die Reaktion verwendet. Nach fünfmal Waschen mit der Waschlösung wurde ein mit Biotin markierter monoklonaler anti-HBV-Kern-Antikörper (eine Mischung von gleichen Mengen an HBc-2, HBc-5, HBc-14) zugegeben und bei Raumtemperatur bei 30 Minuten inkubiert. Nach fünfmal Waschen mit der Waschlösung wurde die mit Avidin markierte alkalische Phosphatase zugegeben, und die Mischung wurde bei Raumtemperatur für 30 Minuten umgesetzt.
Nach fünfmal Waschen mit der Waschlösung wurde CDPstar (Emerald II als der Sensibilisator) zugegeben, bei Raumtemperatur für 15 Minuten umgesetzt, und die relative Chemilumineszenz von diesem wurde gemessen. Eine Standardkurve für ein in Reihe verdünntes rekombinantes HBV-Kernantigen ist in 17 gezeigt, und die Menge des Kernantigens in den gemessenen Proben ist in Tabelle 9 gezeigt. Die Nachweisgrenze betrug 21 ng/ml. Wenn ein Grenzwert, der Kernantigen-positiv von -negativ unterscheidet, bei 60 ng/ml definiert wurde, wurden alle 10 normalen menschlichen Seren, mit oder ohne Vorbehandlung, im Hinblick auf das Kernantigen negativ getestet, und in den Seren von Patienten mit Hepatitis B-Virus konnte das Kernantigen in dem Fall ohne Vorbehandlung nicht nachgewiesen werden, aber mit Vorbehandlung wurden alle Seren im Hinblick auf das Kernantigen positiv getestet.

Es wird angenommen, dass in den Seren von Patienten mit dem Hepatitis B-Virus die Vorbehandlung den Viruspartikel aufbrach und den anti-HBc-Antikörper inaktivierte, wodurch der Nachweis des Kernantigens ermöglicht wurde. Anhand des Vorstehenden wurde bestätigt, dass dieses Verfahren der Probenbehandlung zum Nachweis der Strukturproteine von Viren außer HCV, wie z. B. HBV, welche DNA als das Genom aufweisen, nützlich ist. Es versteht sich von selbst, dass dieses für HCV-verwandte Viren wie z. B. Flaviviren und Retroviren, z. B. HIV, gilt. Tabelle 9.

Probe Nr.	nicht behandelt		vorbehandelt
Probe Nr.	HBV-Kern-Ag (ng/ml)	Urteil	HBV-Kern-Ag (ng/ml)	Urteil
Normale menschliche Probe	1	< 21	Neg.	< 21	Neg.
	2	< 21	Neg.	< 21	Neg.
	3	< 21	Neg.	< 21	Neg.
	4	< 21	Neg.	< 21	Neg.
	5	< 21	Neg.	46	Neg.
	6	< 21	Neg.	< 21	Neg.
	7	< 21	Neg.	47	Neg.
	8	< 21	Neg.	< 21	Neg.
	9	< 21	Neg.	26	Neg.
	10	< 21	Neg.	56	Neg.
HBV-Probe	11	< 21	Neg.	98	Pos.
	15	< 21	Neg.	94	Pos.
	20	< 21	Neg.	780	Pos.
	21	< 21	Neg.	270	Pos.
	46	< 21	Neg.	630	Pos.

Beispiel 15. Verfahren zum effektiven Nachweis ohne Vorbehandlung des Antigens
HCV-Partikel enthaltene Proben wurden in einer Reaktionslösung, der ein Tensid zugegeben wurde, verdünnt, und die Effizienz des Nachweises des HCV-Antigens wurde erforscht.
Der Nachweis des HCV-Kernantigens wurde durch einen Sandwich-Enzymimmuntest (EIA) durchgeführt, welcher einen monoklonalen Antikörper gegen das HCV-Kernantigen verwendete. Von den monoklonalen Antikörpern, die in Beispiel 3 erhalten wurden, wurden C11-3 und C11-7 als der Antikörper zum Einfangen des Kernantigens verwendet, und C11-10 und C11-14 wurden als der Antikörper zum Nachweisen des eingefangenen Kernantigens verwendet.
Der EIA wurde im Wesentlichen unter Verwendung der folgenden Bedingungen durchgeführt. Lösungen der monoklonalen Antikörper C11-3 und C11-7, die jeweils auf 4 μg/ml in einem Acetatpuffer verdünnt wurden, wurden zu einer Mikrotiterplatte zugegeben und wurden über Nacht bei 4°C inkubiert. Nach Waschen mit dem Phosphatpuffer wurde ein Phosphatpuffer, der 1% BSA enthielt, zugegeben, um eine Blockierung zu bewirken. Zu der Platte wurden 100 μl der Reaktionslösung und 100 μl der Probe zugegeben. Die Platte wurde dann geschüttelt und bei Raumtemperatur für 1,5 Stunden inkubiert. Nicht umgesetzte Substanzen wurden durch Waschen mit dem Phosphatpuffer entfernt, zu welchem eine niedrige Konzentration eines Tensids zugegeben worden war. Dann wurden die mit alkalischer Phosphatase markierten monoklonalen Antikörper C11-10 und C11-14 zugegeben und bei Raumtempe ratur für 30 Minuten umgesetzt. Nachdem die Reaktion vorbei war, wurden nicht umgesetzte Substanzen durch Waschen mit dem Phosphatpuffer, zu welchem eine niedrige Konzentration eines Tensids zugegeben worden war, entfernt. Dann wurde eine Substratlösung (CDP-Star/Emerald11) zugegeben und bei Raumtemperatur für 20 Minuten umgesetzt. Die Menge der Lumineszenz wurde gemessen.
Zu der obigen Reaktion wurden verschiedene Tenside zugegeben, um deren Wirkungen zu erforschen. Durch Verwendung von HCV-positiven Seren, in welchen der Titer des Antikörpers gegen HCV unterhalb der Nachweisgrenze liegt und praktisch kein Antikörper gegen HCV enthalten ist, wurde die Aktivität des Kernantigens auf der Grundlage der Menge der Lumineszenz im Hinblick auf ein Reaktionsverhältnis in Bezug auf die Menge der Lumineszenz des normalen menschlichen Serums, welche als 1,0 definiert wurde, ausgedrückt. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 10 und 11 gezeigt.
Die Ergebnisse zeigten, dass die Zugabe eines nichtionischen Tensids mit einem HLB von 12 bis 14, wie es durch Triton X100 repräsentiert wird, eine Zunahme bei der Menge der Lumineszenz verursachte, wodurch die Nachweisempfindlichkeit in HCV-positiven Seren im Vergleich zu den normalen menschlichen Seren erhöht wurde. Es wurde ebenfalls klargestellt, dass in ähnlicher Weise, wie durch Natriumdodecyl-N-sarcosinat und Dodecyltrimethylammonium veranschaulicht wird, die Zugabe eines Tensids, das in seiner Struktur eine geradkettige Alkylgruppe mit gleichzeitig 10 oder mehr Kohlenstoffatomen und einem sekundären, tertiären oder quaternären Amin aufweist, eine Zunahme bei der Nachweisempfindlichkeit in HCV-positiven Seren verursacht. Keine solche Zunahme bei der Empfindlichkeit wurde mit dem obigen Tensid mit einer Alkylgruppe mit nicht mehr als 8 Kohlenstoffen (N-Octyltrimethylammoniumchlorid) beobachtet. Es wurde ebenfalls gefunden, dass durch Mischen und Zugeben dieser zwei Tenside (in Tabelle 11, 2% Natriumdodecyl-N-sarcosinat und 2% Triton X100 wurden gemischt) die Nachweisempfindlichkeit in HCV-positiven Seren weiter erhöht werden kann.
Beispiel 16. Nachweis des Kernantigens in den Proben während eines Zeitraums nach der HCV-Infektion und vor dem Erscheinen von anti-HCV-Antikörpern (Fensterperiode)
Durch Zugeben von 2% Triton X100 und 2% Natriumdodecyl-N-sarcosinat zu der primären Reaktionslösung wurde eine im Handel erhältliche Serokonversionsgruppe PHV905 (B.B.I. inc.) gemäß Beispiel 15 gemessen. Die verwendete PHV905-Gruppe wurde am Tag 21 nach dem Beginn der Beobachtung positiv (Serum Nr. PHV905-7), wenn sie durch den anti-HCV-Antikörpertest (Ortho EIA 3.0) gemessen wurde. In dem Test wird der Antikörpertiter in einem Grenzwertindex (S/CO) ausgedrückt, wobei ein Wert von 1,0 oder größer als positiv beurteilt wird. Die Aktivität des HCV-Kernantigens (die Menge der Lumineszenz) wurde anhand der Reaktivität (S/N) bezogen auf die des normalen menschlichen Serums, die als 1,0 definiert wurde, ausgedrückt.

Wie in Figur [Tabelle] 12 gezeigt ist, wird die Aktivität des Kernantigens beobachtet bevor der anti-HCV-Antikörper erscheint, die Zugabe eines Tensids exponierte das Kernantigen aus dem Viruspartikel, welches mit dem immobilisierten monoklonalen Antikörper reagierte, wodurch der Nachweis des Kernantigens bestätigt wurde. Tabelle 12

Serum Nr.	Tage nach dem Beginn der Beobachtung	HCV-Kern-Ag-Aktivität (S/N)	Anti-HCV-Ab-Titer (S/CO)
PHV905-1	0	5,32	0,000
905-2	4	8,30	0,000
905-3	7	15,63	0,000
905-4	11	4,37	0,300
905-5	14	14,75	0,700
905-6	18	7,57	0,700
905-7	21	4,82	2,500
905-8	25	3,31	5,000
905-9	28	1,61	5,000

Verweis auf Mikroorganismen, die in Regel 136-2 der auf dem Patentzusammenarbeitsvertrag basierenden Vorschrift definiert sind
Name der Hinterlegungsstelle: the National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology
Adresse des Hinterlegers: 1-3, Higashi 1-chrome, Tsukuba city, Ibalaki pref., Japan (Zip code 305)

(1)	Bezeichnung des Mikroorganismus:	HC11-3
	Hinterlegungsdatum:	4. Juli 1997
	Hinterlegungsnummer:	FERM 6P-6002
(2)	Bezeichnung des Mikroorganismus:	HC11-7
	Hinterlegungsdatum:	4. Juli 1997
	Hinterlegungsnummer:	FERM 6P-6003
(3)	Bezeichnung des Mikroorganismus:	HC11-10
	Hinterlegungsdatum:	4. Juli 1997
	Hinterlegungsnummer:	FERM 6P-6004
(4)	Bezeichnung des Mikroorganismus:	HC11-11
	Hinterlegungsdatum:	4. Juli 1997
	Hinterlegungsnummer:	FERM 6P-6005
(5)	Bezeichnung des Mikroorganismus:	HC11-14
	Hinterlegungsdatum:	4. Juli 1997
	Hinterlegungsnummer:	FERM BP-6006

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Ein Verfahren zur Messung eines Hepatitis C-Virus (HCV) oder Hepatitis B-Virus (HBV) oder eines mit HCV oder HBV verwandten Virus in einer Probe über das Erhalten einer Probe, die zum Nachweis eines Virus geeignet ist, umfassend den Schritt des (1) Behandelns einer virushaltigen Probe mit einer Behandlungslösung, die (a) ein anionisches Tensid und (b) wenigstens ein Mittel, das ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus einem amphoteren Tensid, einem nichtionischen Tensid und einem Proteindenaturierungsmittel, enthält; so dass der Viruspartikel aufgebrochen wird, das Virusantigen exponiert oder freigesetzt wird; und Antikörper gegen das Virusantigen, wenn sie in der Probe vorliegen, inaktiviert werden; und des (2) Nachweisens des Virusantigens durch einen Immuntest.
Ein Verfahren zur Messung eines Hepatitis C-Virus (HCV) oder Hepatitis B-Virus (HBV) oder eines mit HCV oder HBV verwandten Virus in einer Probe über das Erhalten einer Probe, die zum Nachweis eines Virus geeignet ist, umfassend den Schritt des (1) Behandelns einer virushaltigen Probe mit einer Behandlungslösung, die (a) ein anionisches Tensid, (b) ein amphoteres Tensid, (c) wenigstens ein Mittel, das ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus einem nichtionischen Tensid und einem Proteindenaturierungsmittel, enthält; so dass der Viruspartikel aufgebrochen wird, das Virusantigen exponiert oder freigesetzt wird; und Antikörper gegen das Virusantigen, wenn sie in der Probe vorliegen, inaktiviert werden; und des (2) Nachweisens des Virusantigens durch einen Immuntest.
Ein Verfahren zur Messung eines Hepatitis C-Virus (HCV) oder Hepatitis B-Virus (HBV) oder eines mit HCV oder HBV verwandten Virus in einer Probe über das Erhalten einer Probe, die zum Nachweis eines Virus geeignet ist, umfassend den Schritt des (1) Behandelns einer virushaltigen Probe mit einer Behandlungslösung, die (a) ein anionisches Tensid, (b) ein amphoteres Tensid, (c) ein nichtionisches Tensid und (d) ein Proteindenaturierungsmittel enthält; so dass der Viruspartikel aufgebrochen wird, das Virusantigen exponiert oder freigesetzt wird; und Antikörper gegen das Virusantigen, wenn sie in der Probe vorliegen, inaktiviert werden; und des (2) Nachweisens des Virusantigens durch einen Immuntest.
Ein Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Behandlungslösung weiterhin Harnstoff, eine einen Imidazolring enthaltende Verbindung oder eine einen Indolring enthaltende Verbindung enthält.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei die einen Imidazolring enthaltende Verbindung Imidazol, Histidin, Imidazolacrylsäure, Imidazolcarboxyaldehyd, Imidazolcarboxamid, Imidazoldion, Imidazoldithiocarbonsäure, Imidazoldicarbonsäure, Imidazolmethanol, Imidazolidinthion, Imidazolidon, Histamin oder Imidazopyridin ist.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei die einen Indolring enthaltende Verbindung Tryptophan, Indolacrylsäure, Indol, Indolessigsäure, Indolacethydrazid, Methylindolacetat, Indolbuttersäure, Indolacetonitril, Indolcarbinol, Indolcarboxyaldehyd, Indolcarbonsäure, Indolethanol, Indolmilchsäure, Indolmethanol, Indolpropionsäure, Indolbrenztraubensäure, Indolmethylketon, Indomycin, Indolaceton, Indomethacin, Indoprofen oder Indolamin ist.
Ein Verfahren zur Messung eines Hepatitis C-Virus (HCV) oder Hepatitis B-Virus (HBV) oder eines mit HCV oder HBV verwandten Virus in einer Probe über das Erhalten einer Probe, die zum Nachweis eines Virus geeignet ist, umfassend den Schritt des (1) Behandelns einer virushaltigen Probe mit einer Behandlungslösung, die (a) ein chaotropes Ion und (b) ein Ansäuerungsmittel enthält; so dass der Viruspartikel aufgebrochen wird, das Virusantigen exponiert oder freigesetzt wird; und Antikörper gegen das Virusantigen, wenn sie in der Probe vorliegen, inaktiviert werden; und des (2) Nachweisens des Virusantigens durch einen Immuntest.
Ein Verfahren zur Messung eines Hepatitis C-Virus (HCV) oder Hepatitis B-Virus (HBV) oder eines mit HCV oder HBV verwandten Virus in einer Probe über das Erhalten einer Probe, die zum Nachweis eines Virus geeignet ist, umfassend den Schritt des (1) Behandelns einer virushaltigen Probe mit einer Behandlungslösung, die (a) ein chaotropes Ion, (b) ein Ansäuerungsmittel und (c) ein nichtionisches Tensid enthält; so dass der Viruspartikel aufgebrochen wird, das Virusantigen exponiert oder freigesetzt wird; und Antikörper gegen das Virusantigen, wenn sie in der Probe vorliegen, inaktiviert werden; und des (2) Nachweisens des Virusantigens durch einen Immuntest.
Ein Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8, wobei der Immuntest ein Immuntest unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers ist.
Ein Diagnosekit zur Bestimmung des Vorliegens oder Fehlens eines Hepatitis C-Virus (HCV) oder Hepatitis B-Virus (HBV) oder eines mit HCV oder HBV verwandten Virus in einer Probe, das zur Verwendung in einem Immuntestverfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 1-9 bestimmt ist, umfassend (1) (a) ein anionisches Tensid und (b) wenigstens ein Mittel, das ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einem amphoteren Tensid, einem nichtionischen Tensid und einem Proteindenaturierungsmittel, oder (2) (a) ein chaotropes Mittel und (b) ein Ansäuerungsmittel und ein nichtionisches Tensid.
Ein Diagnosekit gemäß Anspruch 10, welches weiterhin Harnstoff, eine einen Imidazolring enthaltende Verbindung oder eine einen Indolring enthaltende Verbindung einschließt.
Ein Diagnosekit gemäß Anspruch 11, wobei die einen Imidazolring enthaltende Verbindung Imidazol, Histidin, Imidazolacrylsäure, Imidazolcarboxyaldehyd, Imidazolcarboxamid, Imidazoldion, Imidazoldithiocarbonsäure, Imidazoldicarbonsäure, Imidazolmethanol, Imidazolidinthion, Imidazolidon, Histamin oder Imidazopyridin ist.
Ein Diagnosekit gemäß Anspruch 11, wobei die einen Indolring enthaltende Verbindung Tryptophan, Indolacrylsäure, Idol, Indolessigsäure, Indolacethydrazid, Methylindolacetat, Indolbuttersäure, Indolacetonitril, Indolcarbinol, Indolcarboxyaldehyd, Indolcarbonsäure, Indolethanol, Indolmilchsäure, Indolmethanol, Indolpropionsäure, Indolbrenztraubensäure, Indolmethylketon, Indomycin, Indolaceton, Indomethacin, Indoprofen oder Indolamin ist.