KR100661760B1 - 바이러스 검출 또는 검정 방법 - Google Patents

바이러스 검출 또는 검정 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은, (1) 음이온성 계면활성제와 (2) 양쪽성 계면활성제, 비이온성 계면활성제 또는 단백질 변성제를 함유한 처리 용액으로 바이러스-함유 샘플을 처리함을 특징으로 하는 바이러스-함유 샘플의 처리 방법; 이 처리 방법을 사용하여 바이러스를 검정하는 방법; (1) 카오트로픽 이온과 (2) 산성화제를 함유한 처리 용액으로 바이러스-함유 샘플을 처리함을 특징으로 하는 바이러스-함유 샘플의 처리 방법; 탄소수 10 이상의 알킬기와 2급, 3급 또는 4급 아민을 갖는 계면활성제 및/또는 비이온성 계면활성제의 존재하에 프로브에 대한 항체의 결합을 기초로 하여 바이러스 항원과 바이러스 항체를 검정함을 특징으로 하는 바이러스의 검정 방법; 및 이 방법을 실시하기 위한 모노클로날 항체 및 이를 생성하는 하이브리도마에 관한 것이다.
바이러스-함유 샘플, 음이온성 계면활성제, 양쪽성 계면활성제, 비이온성 계면활성제, 카오트로픽 이온, 바이러스의 검정 방법

Description

바이러스 검출 또는 검정 방법{Methods for detecting or assaying virus}
본 발명은 바이러스의 검출 또는 검정 방법 및 이를 위한 시약에 관한 것이다.
현재, 혈액 또는 혈액 산물중에서 감염 바이러스를 검출하고 질환자로부터 바이러스의 존재를 확인하기 위해 다양한 바이러스 검출 방법이 사용되고 있다. 그러나, 이들 방법은 검출 대상 바이러스의 유형에 따라 민감성과 특이성이 다양할 수 있으나 항상 고도의 민감성과 특이성을 나타내는 것은 아니다. 게다가 이들 방법이 충분한 민감성과 특이성을 나타낼때는 바이러스를 배양하고 분리하는 경우에서 처럼 많은 비용과 복잡한 절차를 동반한다. 본 발명의 배경과 관련하여 이하에서는 C형 간염에 대하여 상세히 언급될 것이다.
C형 간염의 원인균은 오랜 기간동안 밝혀지지 않다가 C형 간염 바이러스의 유전자가 클로닝되고(Science 244: 359-362, 1989) 이 유전자를 기초로 만든 재조합 항원을 이용한 항체 측정에 의한 진단 방법이 개발되면서(Science 244: 362-364, 1989; 일본 특허 공고 (교화)2(1990)-500880), C형 간염은 주된 감염 경로로서 혈액 및 혈액 산물을 통해 전염되는 C형 바이러스(HCV)가 원인균인 감염성 질환인 것으로 밝혀졌다. 재조합 코어 항원과 재조합 NS3 항원이 부가되는 것으로서 소위 2세대 항체 시험 방법이 개발되면서, 현재 혈청을 시험함으로써 모든 HCV 환자를 실질적으로 식별할 수 있게 되었다. 이 방법으로 일본에서 수혈을 통해 전염된 거의 모든 HCV 감염은 근절될 수 있었다.
그러나, 사람 면역결핍 바이러스(HIV)에 의한 것과 같은 다른 바이러스 감염의 경우는 감염후 항체가 출현할때까지 일정 기간 즉, 기존 시험 방법에 의해 바이러스가 동정되지 않는 소위 잠복기가 있다. 이것은 혈액의 판매가 법적으로 허용되는 지역이나 일본의 일부 지방에서 항체 시험 방법에 의해 동정될 수 없는 혈액-유래 성분으로 인한 2차 감염의 위험이 여전히 도사리고 있음을 의미한다. 또한, 항체 시험 방법은 이의 시험 원리때문에 감염으로부터 회복된 사람과 감염의 활동기에 있는 사람을 구별할 수 없다는 결점을 갖고 있다.
현재 C형 간염의 치료를 위해 인터페론(IFN)이 사용되고 있다. 그러나, 일부 연구가 HCV가 IFN에 의해 제거된 후 6개월이 경과하여 항체 역가가 감소하기 때문에 그 요법의 효능은 단지 HCV의 항체 역가를 측정함으로써만이 평가될 수 있다고 주장한다. 그러나, 항체 역가는 항원 자극의 감소후 또는 항원의 제거후 수개월이 경과된 후에 항체 역가가 떨어지기 시작하기 때문에 IFN 투여로 원하는 시간과 정확성으로 HCV가 제거되었는지를 항체 시험만으로 결정하는 것은 불가능하다. 따라서, 그 요법을 모니터링하기 위해서 HCV 항체이외에 HCV 그 자체를 검출하는 것이 필요하다.
HCV의 혈중 수준은 B형 간염 바이러스(HBV)와 같은 다른 바이러스와 비교하여 매우 낮으며 HCV는 시험관을 통해서나 또는 숙주로서 동물 등을 이용하여 증식될 수 없기 때문에 HCV의 바이러스 입자(바이러스 항원)를 직접 검출하는 방법을 설정하는 것이 어려웠다. 그러므로, 바이러스 항원을 검출하는 대신에, 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 방법(Sceienc 230: 1350-1354, 1985) 및 측쇄 DNA 프로브 방법과 같이 게놈 RNA를 검출하는 방법이 개발되었다. 그러나, 바이러스 게놈을 검출하는 방법은 바이러스 항원을 검출하는 방법에 비하여 몇가지 문제점을 안고 있다.
첫째, 검출 대상 물질이 저장 동안에 아주 불안정한 RNA이기 때문에 혈청을 동결 및 해동하는 절차가 측정치의 감소를 일으킬 수 있음이 지적되어 왔다. 따라서, 시험될 혈청 샘플은 이들이 다른 검정 방법에서 사용될때 보다 더욱 주의깊게 저장되어야 한다. 또한, 샘플을 운송하는데도 대단한 주의를 기울여야 한다.
비록 PCR 방법의 사용을 포함한 시험 방법은 유전자 단편을 검출하는데 가장 민감할지라고 이들 방법은 게놈 RNA로부터 주형 DNA로의 역전사는 흔히 손실을 동반하며 따라서 정확한 정량치를 얻는데 상당한 기술을 요구하며 증폭은 이들 방법에 있어서 중요한 근본이기 때문에 오염의 경우에 높은 가양성(false-positive)이 발생할 수 있기 때문에 한번에 다량의 샘플을 다루는 것은 불가능하다는 점에서 문제가 있다. 게다가, 간단한 절차로 이루어지는 방법들 조차도 샘플을 다루는데 2시간 이상이 걸리며 원심분리와 같은 반복된 절차가 필요하기 때문에 복잡하다. 또한, 그러한 복잡한 절차는 오염의 기회를 증가시키는 결과를 초래하며 그럼으로써 가양성 결과를 얻을 확율이 증가한다. 한편, 측쇄 DNA 프로브 방법은 검출 민감도가 낮으며 게다가 시험 결과를 얻는데 약 20시간이 걸려(Igaku to Yakugaku [Medicine and Pharmacology] 31:961-970, 1994) 민감성 및 진행 시간의 관점에서 개선해야할 점을 많이 안고 있다.
바이러스 게놈을 검출하는 방법과 관련된 상기 문제점을 해결하기 위하여 바이러스 항원의 직접 검출을 포함한 방법이 개발되었다. 일본 미심사 특허공개 제1996-29427호에 기술된 바와 같이 코어 항원에 특이적인 모노클로날 항체를 사용하여 혈청에서 HCV의 코어 항원을 검출하는 방법이 개발되었다. 문헌(Tanaka et al., Journal of Hepatology 23:742-745, 1995, 및 Fujino et al., Igaku to Yakugaku [Medicine and Pharmacology] 36: 1065-1070, 1996)이 보고하는 바와 같이, 혈청에서 코어 항원을 검출하는 방법은 바이러스 게놈을 검출하는 상기 방법과 마찬가지로 임상적으로 유용한 것으로 제시되어 왔다. 그러나, 바이러스 게놈을 검출하는 방법에서와 같이 해결이 필요한 몇 가지 주요 문제점이 여전히 남아 있다.
한가지 그와 같은 문제점은 혈청 스크리닝의 최종 시험 방법으로서 사용될 수 없을 만큼 PCR 방법에 비하여 민감성이 낮다는 것이다. 문헌[Tanaka et al., Journal of Hepatology 23: 742-745, 1995]은 검출 한계가 HCV RNA의 ㎖당 104 - 105 복제수임을 보여주고 있다. 문헌(Fujino et al., Igaku to Yakugaku [Medicine and Pharmacology] 36: 1065-1070, 1996)에 따르면 본 방법은 가장 민감한 CRT(경쟁 역 전사)-PCR 방법에 의해 RNA 양성으로 판명된 만성 C형 간염 환자의 102개 혈청에 대해 67%의 양성율을 보여준 것으로 나타났다. 요컨데, 민감성의 관점에서 본 방법은 가장 민감한 CRT-PCR 방법보다 뒤쳐져 있다.
게다가, 측정시 샘플을 처리하기 위해 복잡하고 많은 시간을 요하는 절차는 이 방법이 스크리닝에 사용될때 문제점으로 지적되고 있다. 따라서, 본 방법은 바이러스 입자의 농축 및 혈청 성분의 제거를 위한 폴리에틸렌 글리콜 처리(4℃, 1시간), 원심분리(15분간), 상등물의 제거, 요소 처리, 알카리 처리(37℃, 30분), 중화제 첨가 등을 포함한 다단계 샘플(혈청) 처리 절차를 요한다. 또한, PEG 처리로 인해 점도가 증가된 침전물을 요소로 분산시키는 과정은 상당한 기술을 요구한다. 따라서, 재연성 결과를 얻기 위하여 상당한 기술이 필요함은 물론 적어도 2시간의 처리 시간이 필요하다. 게다가, 원심분리, 상등물 제거 등과 같은 과정은 자동화할 수 없으며 많은 샘플을 동시에 처리하는 것은 어렵다. 따라서, 취급의 관점에서 본 방법은 스크리닝 시험에서와 같이 많은 용량의 샘플을 처리해야 하는 응용부분에는 적합하지 않다.
한편, 바이러스 항원 검출 시스템은 하기 관점에서 고도로 민감한 PCR 방법보다 우수하다. 따라서, 이 시스템은 검출 단계에서 과다한 증폭 절차가 없기 때문에 거의 오염되지 않는다. 게다가, 이 시스템은 불안정한 RNA 대신에 비교적 안정한 항원 단백질을 검출하는 것이기 때문에 샘플을 저장하는데 특별한 주의나 PCR에 의해 검출된 샘플을 위해 필요한 냉동기와 같은 특별한 장치가 필요 없으며 또한 샘플의 운송이 보다 쉽다.
이러한 특징은 혈액 사업 및 건강검진 시험에서와 같이 다수의 샘플을 측정하는 분야에 적합하다. 그러나, 상기 지적한 바와 같이 코어 항원을 검출하는 공개된 방법은 자동화할 수 없고 민감성이 낮기 때문에 혈액 산업에서와 같이 높은 민감성을 요하는 분야에서 표준이 될 수 없으며 스크리닝과 같이 다수의 샘플을 취급하는 시험에 적용될 수 없고 PCR 방법보다 이로운 특징을 최적으로 이용할 수 없다. 게다가, 임상적으로 유용한 검정 방법은 민감성, 특이성, 재연성, 취급 간편성 및 저렴한 비용을 위해 항상 도전되어야 하며 이러한 도전으로 부터 가능한 많은 만족을 얻기 위하여 지속된 노력이 필요하다. 특히 다수의 샘플을 스크리닝하는데 사용하기 위해 HCV외 다른 바이러스 항원의 검출에 관하여 PCR 방법에 비하여 민감성이 낮거나, 원하는 항원이 완전하게 노출될 수 없기때문에 실용화되지 못하는 방법이 많이 있다.
본 발명의 목적은 혈액 사업 및 건강 진단에서 실시하는 스크리닝에서처럼 다수의 샘플을 처리하는데 적합한 HCV 항원의 검출방법을 포함한 여러 바이러스 항원을 검출하는 방법을 제공하는데 있다. 달리 표현한다면, 본 발명의 목적은 간단한 전처리를 허용하는 PCR 방법과 대등한 민감성과 특이성을 나타내거나 전처리 없이 쉽게 자동화할 수 있는 HCV 항원의 검출방법을 포함한 여러 바이러스 항원의 검출 시스템을 제공하는데 있다. 본 발명의 바람직한 양태는 이하에서 HCV를 주된 예로하여 설명될 것이다.
본 발명의 첫번째 양태(1)에 따르면, HCV 입자를 분쇄하고, 이 바이러스 항원을 완전히 노출시키고, 존재한다면 그 바이러스 항원에 대한 항체를 분쇄하고, 그 바이러스 항원을 검출 또는 측정함으로써 HCV를 검출 또는 측정하는 수단이 제공된다.
따라서, 본 발명은 바이러스-함유 샘플을 (1) 음이온성 계면활성제와 (2) 양 쪽성 계면활성제, 비이온성 계면활성제 또는 단백질 변성제를 함유한 처리 용액으로 처리함을 특징으로 하여 바이러스-함유 샘플을 처리하는 방법(I)을 제공한다.
또한, 본 발명은 바이러스-함유 샘플을 (1) 음이온성 계면활성제, (2) 양쪽성 계면활성제와 (3) 비이온성 계면활성제 또는 단백질 변성제를 함유한 처리 용액으로 처리함을 특징으로 하여 바이러스-함유 샘플을 처리하는 방법(II)을 제공한다.
또한, 본 발명은 바이러스-함유 샘플을 (1) 음이온성 계면활성제, (2) 양쪽성 계면활성제, (3) 비이온성 계면활성제와 (4) 단백질 변성제를 함유한 처리 용액으로 처리함을 특징으로 하여 바이러스-함유 샘플을 처리하는 방법(III)을 제공한다.
또한, 본 발명은 바이러스 항원의 존재를 검출하거나 정량하기 위해 상기 방법(I) 내지 (III) 중의 어느 한 샘플 처리 방법을 사용하고 샘플을 바이러스 항원을 특이적으로 인지하는 프로브와 반응시킴을 특징으로 하는 바이러스 검정 방법(IV)을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 면역검정 방법(IV)에 사용하고 음이온성 계면활성제를 포함하는 것으로서, 샘플중의 바이러스의 유무를 결정하기위한 키트, 검정 키트 또는 진단 시약을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 면역검정 방법(IV)에 사용하고 하기된 모노클로날 항체를 포함하는 것으로서, 샘플중의 바이러스의 유무를 결정하기위한 키트, 검정 키트 또는 진단 시약을 제공한다.
본 발명의 첫번째 양태(2)에 따르면, 바이러스 입자를 분쇄하고, 이 바이러스 항원을 완전히 노출시키고, 존재한다면 그 바이러스 항원에 대한 항체를 분쇄하고, 그 바이러스 항원을 검출 또는 측정함으로써 바이러스를 검출 또는 측정하는 수단이 제공된다.
따라서, 본 발명은 바이러스-함유 샘플을 (1) 카오트로픽 이온과 (2) 산성화제를 함유한 처리 용액으로 처리함을 특징으로 하는 바이러스-함유 샘플의 처리 방법(V)을 제공한다.
또한, 본 발명은 바이러스-함유 샘플을 (1) 카오트로픽 이온, (2) 산성화제와 (3) 비이온성 계면활성제를 함유한 처리 용액으로 처리함으로 특징으로 하는 바이러스-함유 샘플의 처리 방법(VI)을 제공한다.
또한, 본 발명은 바이러스 항원의 존재를 검출하거나 정량하기 위해 상기 방법(V) 내지 (VI)에 따른 샘플 처리 방법을 사용하고 샘플을 바이러스 항원을 특이적으로 인지하는 프로브와 반응시킴을 특징으로 하는 바이러스 검정 방법(VII)을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 면역검정 방법(VII)에 사용하고 카오트로픽제를 포함하는 것으로서, 샘플중의 바이러스의 유무를 결정하기 위한 키트, 검정 키트 또는 진단 시약을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 면역검정 방법(VII)에 사용하고 하이브리도마 HCll-14 (FERM BP-6006), HCll-10 (FERM BP-6004) 또는 HC11-11 (FERM BP-6005)에 의해 생성된 모노클로날 항체를 포함하는 것으로서, 샘플중의 바이러스의 유무를 결정하기 위한 키트, 검정 키트 또는 진단 시약을 제공한다.
본 발명의 두번째 양태에 따르면, 바이러스에 대한 항체가 아직 형성되지 않은 잠복기 동안에 바이러스 항원을 검출 또는 측정하는 방법이 제공된다. 이 방법에서는 바이러스 입자를 분쇄하여 바이러스 항원을 노출시키는 것으로 충분하며 혈중의 바이러스 항원에 대한 항체를 분쇄할 필요가 없다.
따라서, 본 발명은 탄소수 10 이상의 알킬기 및 2급, 3급 또는 4급 아민을 갖는 계면활성제, 또는 친수성/친유성 평형(HLB)이 12 내지 14인 비이온성 계면활성제 또는 이들 모두의 존재하에서 바이러스 항원을 프로브와 결합시키는 것을 기초로 하여 바이러스 항원을 측정함을 특징으로 하는 바이러스 검정방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 HCll-11 (FERM BP-6005), HCll-14 (FERM BP-6006), HCll-10 (FERM BP-6004), HCll-3 (FERM BP-6002) 및 HC11-7 (FERM BP-6003)으로 이루어진 그룹중에서 선택된 하이브리도마 세포주를 제공한다.
또한, 본 발명은 HCll-11 (FERM BP-6005), HCll-14 (FERM BP-6006), HCll-10 (FERM BP-6004), HCll-3 (FERM BP-6002) 및 HC11-7 (FERM BP-6003)으로 이루어진 그룹중에서 선택된 하이브리도마 세포주에 의해 생성된 모노클로날 항체를 제공한다.
RNA 바이러스인 HCV 및 DNA 바이러스인 HBV는 구조 단백질로 캡슐화된 게놈 RNA 또는 DNA와 이를 에워싸고 있는 막단백질 또는 지질 단백질을 포함하는 구조의 바이러스 입자를 형성하는 바이러스이다. 어느 양태에서든 본 발명의 처리 방법을 사용함으로써, HCV 또는 HBV는 물론 이들과 구조가 유사한 바이러스의 바이러스 입 자를 분쇄하고 바이러스 항원을 완전히 노출시키고 그 바이러스 항원을 검출 또는 측정함을 특징으로 하는 바이러스의 검출 또는 측정이 제공된다.
도 1은 첨가된 SDS의 농도가 샘플 처리에 미치는 영향을 보여주는 그래프이다. 건강한 정상인으로부터 채취된 혈청(정상) 및 HCV-RNA-양성 패널 혈청 13 및 50이 사용되었다.
도 2는 첨가된 CHAMPS의 농도가 샘플 처리에 미치는 영향을 보여주는 그래프이다. 건강한 정상인으로부터 채취된 혈청(정상) 및 HCV-RNA-양성 패널 혈청 13 및 50이 사용되었다.
도 3은 첨가된 요소의 농도가 샘플 처리에 미치는 영향을 보여주는 그래프이다. 건강한 정상인으로부터 채취된 혈청(정상) 및 HCV-RNA-양성 패널 혈청 13, 44 및 50이 사용되었다.
도 4는 첨가된 트리톤 X100의 온도가 샘플 처리에 미치는 영향을 보여주는 그래프이다. 건강한 정상인으로부터 채취된 혈청(정상) 및 HCV-RNA-양성 패널 혈청 13, 44 및 50이 사용되었다.
도 5는 샘플 처리 동안의 온도 영향을 보여주는 그래프이다. 건강한 정상인으로부터 채취된 혈청(정상) 및 HCV-RNA-양성 패널 혈청 13, 44 및 50이 사용되었다.
도 6은 1 U/㎖로서 정의된 표준 패널 혈청 50을 연속 희석하여 샘플 처리 방 법에 적용한 다음 본 발명의 모노클로날 항체를 사용하여 측정한 샌드위치 검정 시스템의 희석 표준 곡선 및 검출 한계를 보여주는 그래프이다.
도 7은 1 U/㎖로서 정의된 표준 패널 혈청 50을 연속 희석하여 샘플 처리 방법에 적용한 다음 측정한 샌드위치 면역검정 시스템의 희석 표준 곡선 및 검출 한계를 보여주는 그래프이다.
도 8은 샘플 처리 방법에 적용한 패널 혈청 13의 겔 여과 컬럼으로 분별하여 얻은 분획내의 코어 항원의 면역 활성을 보여준다. IgG 및 알부민의 분자량은 각각 약 150KD 및 약 68KD이다.
도 9는 본 발명의 샘플 처리 방법에 적용한 PCR-양성 샘플에 대해 앰플리코어 HCV 모니터(PCR 방법)를 사용하여 측정한 HCV-RNA의 양과 추출된 코어 항원의 활성사이의 상관관계를 보여주는 그래프이다.
도 10은 첨가된 구아니딘 클로라이드의 농도가 샘플 처리에 미치는 영향을 보여주는 그래프이다. 건강한 정상인으로부터 채취된 혈청(정상)과 HCV-RNA-양성 패널 혈청 13 및 50이 사용되었다.
도 11은 첨가된 트리톤 X100의 농도가 샘플 처리에 미치는 영향을 보여주는 그래프이다. 건강한 정상인으로부터 채취된 혈청(정상)과 HCV-RNA-양성 패널 혈청 13 및 50이 사용되었다.
도 12는 첨가된 트윈 20의 농도가 샘플 처리에 미치는 영향을 보여주는 그래프이다. 건강한 정상인으로부터 채취된 혈청(정상)과 HCV-RNA-양성 패널 혈청 13 및 50이 사용되었다.
도 13은 샘플 처리 동안에 온도가 미치는 영향을 보여주는 그래프이다. 건강한 정상인으로부터 채취된 혈청(정상)과 HCV-RNA-양성 패널 혈청 13 및 50이 사용되었다.
도 14는 1U/㎖로서 정의된 표준 패널 혈청 50을 연속 희석하여 샘플 처리 방법에 적용한 다음 측정한 샌드위치 면역검정 시스템의 희석 표준 곡선 및 검출 한계를 보여주는 그래프이다.
도 15는 샘플 처리 방법에 적용한 패널 혈청 13의 겔 여과 컬럼으로 분별하여 얻은 분획내의 코어 항원의 면역 활성을 보여준다. IgG 및 알부민의 분자량은 각각 약 150kD 및 약 68kD이다.
도 16는 본 발명의 샘플 처리 방법에 적용되고 앰플리코어 HCV 모니터(PCR 방법)에 의해 양성으로 시험된 샘플에 대해 앰플리코어 HCV 모니터(PCR 방법)를 사용하여 측정한 HCV-RNA의 양과 추출된 코어 항원의 활성사이의 상관관계를 보여주는 그래프이다.
도 17은 본 발명에 따른 재조합 B형 간염 바이러스(HBV) 코어 항원의 측정에 의해 얻은 표준 곡선을 보여준다.
본 발명의 실시를 위한 최적 방식
본 발명의 당해 바이러스는 구조 단백질로 캡슐화된 게놈 RNA 또는 DNA와 이를 에워싸고 있는 막 단백질 또는 지질 막을 포함하는 구조의 바이러스 입자를 형성하는 바이러스이다.
게놈으로서 RNA를 갖는 상기 바이러스의 대표적인 예로는 C형 간염 바이러스(HCV) 및 HCV-연관된 바이러스가 포함된다.
HCV-연관된 바이러스에는 D형 간염 바이러스, E형 간염 바이러스, G형 간염 바이러스, 수족구 질환 바이러스, 플라비바이러스 (황열 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 일본뇌염 바이러스, 뎅그열 바이러스), 토가바이러스 (알파바이러스, 루비바이러스, 아테리바이러스, 루벨라바이러스), 페스티바이러스 (돼지 콜레라 바이러스, 소 이질 바이러스), 파라믹소바이러스 (파라인플루엔자 바이러스 1, 2, 3, 4, 개 질병 바이러스, 뉴캐슬병 바이러스, RS 바이러스, 우역 바이러스, 원숭이 파라인플루엔자 바이러스, 홍역 바이러스, 유행성 이하선염 바이러스), 오르토믹소바이러스 (사람 인플루엔자 바이러스, 조류 인플루엔자 바이러스, 말 인플루엔자 바이러스, 돼지 인플루엔자 바이러스), 라브도바이러스 (광견병 바이러스, 소수포성구내염 바이러스), 피코나바이러스 (폴리오바이러스, 콕사키바이러스, 에코바이러스, 소 엔테로바이러스, 돼지 엔테로바이러스, 원숭이 엔테로바이러스, 마우스 뇌염 바이러스, 사람 리노바이러스, 소 리노바이러스, 말 리노바이러스, 족구 질병 바이러스, A형 간염 바이러스), 코로나바이러스 (사람 코로나바이러스, 조류 감염성 기관지염 바이러스, 마우스 간염 바이러스, 돼지 전파성 위장염 바이러스), 아레나바이러스 (임파구성 맥락수막염, 라사 바이러스, 한국 유행성출혈열 바이러스), 레트로바이러스 (HTLV: 사람 성인 백혈병 바이러스, HIV: AIDS 바이러스, 고양이 백혈병 육종 바이러스, 소 백혈병 바이러스, 로우스 육종 바이러스), 레오바이러스 (로타바이러스), 칼시바이러스 (노르월크 바이러스), 번야바이러스 (신장 증후군 유행성 출혈열 바이러스), 필로바이러스 (에볼라 바이러스, 마르부르그 바이러스) 등이 포함된다.
게놈으로서 DNA를 갖는 상기 바이러스의 대표적인 예로는 B형 간염 바이러스 HBV 및 HBV-연관된 바이러스가 포함된다. HBV-연관된 바이러스는 천연두 바이러스 (백시니아 바이러스, 알라스트리움 바이러스, 우두 바이러스, 두창 바이러스), 파르보바이러스 (사람 파르보바이러스, 돼지 파르보바이러스, 소 파르보바이러스, 개 파르보바이러스, 고양이 백혈구감소증 바이러스, 알루시안 밍크 질병 바이러스), 파포바바이러스 (유두종 바이러스, 폴리오마 바이러스), 아데노바이러스, 헤르페스 바이러스 (헤르페스 심플렉스 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 수두 헤르페스 조스터 바이러스, EB 바이러스, 말 헤르페스 바이러스, 고양이 헤르페스 바이러스, 마렉 질병 바이러스), 아프리카 돼지 콜레라 바이러스 등을 포함한다.
상기외에도 많은 병원성 바이러스가 알려져 있으며 또한 존재하나 동정되지 않은 바이러스도 많이 있다. 이러한 바이러스들이 상기한 바와 같이 구조 단백질이 게놈 RNA 또는 DNA를 캡슐화하고 이를 막 단백질 또는 지질 막이 에워싸고 있는 구조를 하고 있다면 이들은 본 발명의 샘플 처리 방법을 사용하여 면역검정에 적합한 형태로 추출될 수 있음이 명백하다.
본 발명을 실시하는 양태는 이하에서 HCV를 참고로 하여 설명될 것이다. HCV의 혈중 수준이 HBV(109 복제수/㎖) 보다 낮은 102 복제수/㎖ 내지 106 복제수/㎖이기 때문에 그 바이러스 항원을 검출하는 검정은 아주 고도의 민감성을 요구한다.
일반적으로, 프로브로서 항체를 사용하는 면역학적 방법에 의해 대표되는 검출 방법에 있어서, 검출 민감성을 향상시킬 수 있는 가능한 방법은 검출될 항원 분자의 수를 증가시키는 것(I), 항원과 결합하는 프로브 분자(예, 항체)의 수를 증가시키는 것(II), 항원이외의 다른 물질과 프로브(예, 항체)와의 결합에 의해 발생된 검출 민감성을 한정하는 비특이적 반응을 감소시키는 것(III) 및 검출에 사용하는 표지의 검출 한계를 증가시키는 것(IV)을 포함한다. 또한, 이들 방법의 적당한 조합도 민감성을 높일 수 있을 것이다.
항원 분자의 수를 증가시키는 방법으로서, 샘플의 양을 증가시키는 것(I-1)이 가장 쉽게 실시될 수 있다. 그러나, 흔히 사용되는 반응 시스템(예, 96-웰 면역평판)에 첨가되는 최대량은 약 300㎕를 초과할 수 없기때문에, 반응시스템에 첨가될 분자의 수를 증가시키는 농축 방법이 사용되었다.
항원과 결합하는 프로브(예, 항체 분자)의 수를 증가시키기 위하여, 가장 쉽게 실시되는 수단은 복수 프로브(예, 항체)를 사용하여 인지될 에피토프의 수를 증가시키는 것(II-1) 및 항원과 프로브(예, 항체)의 친화성(친화성 및 결합성)을 높임으로써 단위 시간당 결합된 항체의 수를 증가시키는 것(II-2)을 포함함다. 덧붙여서 언급하면, 예를 들어 항체의 친화성을 증대시킬 수 있는 방법으로는 반응계에서 완충액의 조성물을 변화시키는 방법, 프로브를 변경하는 방법 및 이들 양 방법을 조합하는 것이 포함된다. 또한, 다수의 항체를 비드, 자성 입자 등과 같이 표면적이 넓은 캐리어에 결합시켜 한정된 양의 항원과 반응하는 면적을 확장함으로써 많은 항원을 포획하는 방법이 고려된다(II-3).
감염성 질환의 경우에 항원과의 높은 결합 친화성을 갖는 사람 항체가 샘플에 존재하는 것으로 기대된다. 따라서, 이들 항체의 에피토프는 검출에서 사용되는 프로브(예, 항체)의 에피토프와 중복하여 경쟁적 반응이 일어나고 결국 검출에 사용되는 항체의 수를 감소시키는 것으로 기대된다. 따라서, 샘플내에 그러한 방해 항체가 감소되는 것은 항원과 결합하는 검출용 항체 분자의 수를 증가시키는 결과로 이어진다(II-3).
사실, 비특이적 반응을 감소시키는 방법을 보편화하는 것은 어려우나, 완충액의 조성을 변화시킴으로써 항원과 프로브(예, 항체)와의 친화성(친화성 및 결합성)을 증대시켜 비특이적 반응을 줄이거나(III-1) 비특이적 반응의 원인물을 제거하거나(III-2) 하여 비특이적 반응을 줄이는 전략이 실시된다.
검출 민감성을 향상시킬 수 있는 방법으로는 고도의 검출 민감성을 갖는 표지(방사성동위원소 등)을 사용하는 것(IV-1), 표지로서 효소 또는 촉매를 사용함으로써 시그날을 증폭시키는 것(IV-2), 효소 기질을 좀더 고도의 민감성을 갖는 것으로 변화시키는 것(IV-3), 전기적 또는 기계적 수단에 의해 효소반응 또는 화학반응으로부터 시그날을 증폭하는 것(IV-4), 항체당 표지의 수를 증가시키는 것(IV-5), 시그날 검출에 사용된 기기의 민감성을 강화하는 것(IV-6) 등이 포함된다.
HCV 코어 항원을 검출하기 위해 공개된 방법에서 전처리 단계를 분석한 결과 그 방법은 샘플에 폴리에틸렌 글리콜을 첨가함으로써 항원을 농축시킨 다음 원심분리하여 침전물로서 HCV를 회수하고(I-2) 동시에 혈청 성분의 일부를 제거하는(II-2) 단계를 포함하고 이 단계에 이어서 침전물을 요소와 알카리제가 함유된 용액에 재현탁시켜 그에 존재하는 사람 항체를 불활성화시킴으로써 HCV로부터 코어 항원을 추출시키는 단계(II-3), 모노클로날 항체와 반응하게 될 용액을 제조하기 위하여 비이온성 계면활성제(트리톤 X100)과 중화제를 함유한 용액을 첨가하는 단계를 포함하는 것으로 드러났다.
상기된 바와 같은 침전물의 원심분리 및 재현탁은 절차상 복잡한 단계이고 상당한 기술을 요구한다. 따라서, 본 발명의 목적은 절차에 관한 상기 문제점을 해결하는 코어 항원 검출 시스템에 있다.
HCV 자체의 실체는 아직도 밝혀지지 않고 있다. 그러나, 게놈 구조, 관련된 바이러스 입자의 구조 및 바이러스에 대한 일반적인 정보를 기초로 하여 볼때, HCV 입자는 게놈 RNA가 코어 항원내에 패킹되어 있고 이것은 E1 및 E2/NS1 항원을 포함한 피복 단백질에 의해 캡슐화되어 있으며 이들 항원은 상기 패킹을 에워싼 지질막에 고정되어 있는 것으로 추정하고 있다.
따라서, 코어 항원을 검출하기 위하여 코어 항원의 검출에 사용되는 프로브(예, 항체)의 결합이 가능하도록 피복을 제거하는 것이 필요하다. 게다가, 혈중의 바이러스 입자는 입자가 LDL(저밀도 지단백질)에 의해 둘러싸인 복잡한 구조를 하고 있는 것으로 보고되어 있으며, 또한 피복 단백질에 대한 항체가 존재하기 때문에, 바이러스 입자는 항-피복 단백질 항체와의 면역 복합체로서 존재할 수 있는 것으로 추정된다. 따라서, 검출될 항원 분자의 수를 증가시키기 위하여 바이러스 입자로부터 피복물과 바이러스 입자 주변의 오염물을 효율적으로 제거하고 코어 항원 분자를 효율적으로 추출시키는 것이 중요하다.
위 사실 내용은 HCV 외에 다른 바이러스에 대해서도 마찬가지로 적용되며 바이러스들의 구조 단백질은 효율적으로 추출되어야 한다.
따라서, 본 발명은 원심분리와 같은 복잡한 절차에 의해 항원을 농축시키지 않고서도 샘플(혈청)내 바이러스 항원이 프로브를 사용하여 검출하는데 적합한 상태가 되도록 항원을 처리하는 방법에 관한 것이다.
또한, 사람 항체는 상기한 바와 같이 고 역가로 존재하여 결합에 있어서 프로브와 경쟁할 수 있기 때문에 항체를 제거하는 절차는 민감성을 향상시키는데 있어서 중요하다.
따라서, 본 발명의 한 가지 양태는 샘플내 바이러스 항원을 쉽게 추출하면서 동시에 샘플에 존재할 수 있는 사람 항체를 불활성화하는 처리 방법에 관한 것이다.
본 발명의 처리 방법을 사용함으로써, 샘플내 바이러스 항원은 항체와 같은 프로브와 면역 복합체를 형성하기에 적합한 형태로 바이러스 입자 또는 면역 복합체로부터 추출되며 동시에 샘플내에 존재하여 검출 반응을 방해하는 사람 항체를 불활성화시킴으로써, 항체와 같은 프로브를 사용한 면역검정에 의해 고도로 민감한 검출을 용이하게 얻을 수 있다.
본 발명의 제1 양태(1)에 따르면, 검출에 사용하기 위한 항체와 같은 프로브는 이 프로브가 특정 방식으로 바이러스 항원과 결합하고 특정의 높은 친화성을 지니며 반응계에 첨가되었을때 비특이적 반응을 유도하지 않는다면 어떠한 것도 가능하다. 예를 들면, HCV 코어 항원의 검출시 실시예 4에 기술된 바와 같이 1차 반응에 사용된 프로브중 하나는 HCV 코어 항원의 C-말단을 인지하고 이에 결합할 수 있는 프로브를 함유하는 것이 바람직하다. 본원에 사용된 용어 코어 항원의 C-말단은 서열 2에 기술된 서열의 81번 내지 160번에 해당하는 서열 또는 이의 일부를 의미한다. 이것은 또한 HCV 코어 항원의 N-말단에 대한 프로브를 함유할 수 있다. 본원에 사용된 용어 코어 항원의 C-말단은 서열 2에 기술된 서열의 10번 내지 70번에 해당하는 서열 또는 이의 일부를 의미한다.
본 발명의 제2 양태(2)에 따르면, 검출에 사용하기 위한 항체와 같은 프로브는 이 프로브가 특정 방식으로 바이러스 항원과 결합하고 특정의 높은 친화성을 지니며 반응계에 첨가되었을때 비특이적 반응을 유도하지 않는다면 어떠한 것도 가능하다. 예를 들면, HCV 코어 항원의 검출시, 1차 반응에 사용된 프로브중 하나는 HCV 코어 항원의 N-말단을 인지하고 이에 결합할 수 있는 프로브를 함유하는 것이 바람직하다. 본원에 사용된 용어 코어 항원의 N-말단은 서열 2에 기술된 서열의 10번 내지 70번에 해당하는 서열 또는 이의 일부를 의미한다. 이것은 또한 HCV 코어 항원의 C-말단에 대한 프로브를 함유할 수 있다. 본원에 사용된 용어 코어 항원의 C-말단은 서열 2에 기술된 서열의 81번 내지 160번에 해당하는 서열 또는 이의 일부를 의미한다.
상기 모든 양태에 있어서, 코어 항원에 대해 고도의 특이성 및 친화성을 나타내는 어떠한 분자도 프로브로서 사용될 수 있으며 이 가운데 마우스, 토끼, 닭, 염소, 양, 소 등과 같은 실험동물을 면역화함으로써 얻은 모노클로날 항체, 골수종 세포를 면역화된 개체로부터 분리된 비장 세포와 융합하여 얻은 하이브리도마에 의해 생성된 모노클로날 항체, EB 바이러스에 의해 불멸화된 비장 세포 또는 혈중 백혈구에 의해 생성된 모노클로날 항체, 및 HCV로 감염된 사람 또는 침팬치에 의해 생성된 항체, 마우스, 사람 등의 면역글로불린의 cDNA 또는 염색체 DNA로부터 얻은 가변 영역의 유전자 단편, 면역글로불린의 cDNA 또는 염색체 DNA의 일부를 인공적으로 조작된 서열과 조합하여 작제된 가변 영역의 유전자 단편, 인공적 유전자 서열을 사용하여 작제된 가변 영역의 유전자 단편 또는 상기한 것을 빌딩 블록으로서 사용하여 유전자 재조합 기술에 의해 작제된 가변 영역의 유전자 단편을 면역글로불린 불변 영역의 유전자 단편과 조합하여 형성된 재조합 항체 유전자로 형질전환된 세포에 의해 생성된 재조합 항체, 상기 가변 영역의 유전자 단편을 예를 들면 박테리오파아지의 구조 단백질과 융합시켜 생성된 파아지 항체, 상기 가변 영역의 유전자 단편을 예를 들면 myc 유전자와 같이 다른 적합한 유전자 단편의 일부와 조합하여 형성된 재조합 항체 유전자로 형질전환된 세포에 의해 생성된 재조합 항체, 가변 영역을 트립신 유전자내로 인공적으로 도입하여 생성된 프로브, 수용체와 같은 단백질에 특이적으로 결합하는 분자를 인공적으로 변형시켜 얻은 프로브, 조합된 화학기술에 의해 작제된 프로브 등이 포함된다.
또한, 본 발명은 바이러스 항원을 함유한 샘플로부터 바이러스 항원과 이의 프로브(예, 항체)의 면역 복합체를 형성하기에 적합한 상태를 형성하기 위하여 바이러스 입자 또는 면역 복합체로부터 바이러스 항원을 추출할 수 있고 동시에 샘플에 존재하여 검출반응을 방해하는 사람 항체 조차도 불활성화할 수 있는 처리 용액으로 샘플을 처리하는 단계, 및 항체와 같은 프로브를 사용하여 면역검정에 의해 추출된 코어 항원을 검출 및 정량하기 위한 검정 방법 및 검정 키트를 제공한다.
본 발명에 의해 제공된 샘플 처리 용액 및 샘플 처리 방법
본 발명에 사용된 샘플은 전혈, 혈장, 혈청, 뇨, 타액, 뇌척수액, 간조직 등과 같은 생물학적 유액을 포함한다.
본 발명에 있어서, 가장 중요한 요건은 샘플을 복잡한 과정을 통해 처리하지 않고서도 모노클로날 항체와 같은 프로브와의 결합 반응에 적합한 상태를 형성하도록 샘플내 코어 항원과 같은 바이러스 항원을 처리하는 방법이다. 따라서, 항원 분자의 수를 증가시키기 위하여 바이러스 입자내에 함유된 코어 항원과 같은 바이러스 항원을 효율적으로 추출시키는 것이 중요하다.
이미 나트륨 도데실 설페이트(SDS) 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)에 대하여 알려져 있는 바와 같이, 대부분의 단백질은 SDS의 존재하에 열처리에 의해 변성되며 그럼으로써 공유결합된 것 외의 다른 분자는 단량체로 전환된다. 따라서, SDS와 같은 음이온성 계면활성제를 포함한 처리제를 첨가하면 바이러스가 분쇄될 뿐만 아니라 샘플내 코어 항원과 같은 바이러스 항원에 대한 항체가 변성되어 샘플내 코어 항원과 같은 바이러스 항원의 추출이 일어난다. 이것은 실시예 7에서 보는 바와 같이 HCV 코어 항원으로부터 검증되었다. 즉, SDS가 함유된 처리제로 처리된 HCV-감염된 샘플내 코어 항원의 분자량을 겔 여과로서 분석하였을때 코어 항원은 이론상 단량체의 위치인 것으로 추정되는 위치에서 검출되었다.
문헌[Kashiwakuma et al., J. Immunological Methods 190: 79-89, 1996]에 보고된 바와 같이, 재조합 HCV를 발현하는 세포의 추출물을 포함한 샘플로부터 SDS-PAGE에 의해 분리된 코어 항원을 웨스턴 블롯 분석을 이용하여 검출할때, 면역학적 활성은 단량체의 것으로 사료되는 위치에서 검출된다. 샘플에 SDS를 포함한 변성제를 첨가하면 항원이 효율적으로 추출되고 항원 분자의 수가 증가된다는 것은 당업자는 쉽게 이해할 것이다.
그러나, 잘 알려져 있는 바로서 SDS와 같은 음이온성 계면활성제는 아주 강한 단백질-변성 효과를 나타내므로 항체와의 면역 복합체 형성 반응에 첨가될때 항체도 또한 변성시키며 그럼으로써 그 기능을 붕괴시켜 결과적으로 민감성의 감소를 초래한다. 또한, 음이온성 계면활성제의 처리에 의해 에피토프의 구조가 파괴되며 결국 항체와의 결합이 약화되어 이는 민감성의 감소로 이어지는 것으로 알려져 있다. 민감성의 감소를 초래하는 원인 인자를 제거하기 위하여 SDS 처리에 따른 변성 효과는 어떤 수단에 의해서든 약화시킬 필요가 있는 것으로 알려져 있다.
음이온성 계면활성제를 포함한 계면활성제는 투석, 한외여과, 겔여과, 전기영동, 이온교환, 침강, 막전이 등과 같은 수단에 의해 제거될 수 있는 것으로 알려져 있다. 상기된 바와 같이 항원이 웨스턴 블롯 방법 또는 겔 여과 방법에 의해 검출될 수 있다는 사실은 SDS 처리후 특정 절차를 사용하여 항원-항체 반응이 달성될 수 있음을 가리킨다. 그러나, 이들 방법은 시간과 복잡한 절차를 필요로 하며, 본 발명의 목적에 적합하지 않다.
과량의 반응 용액으로 희석시킴으로써, 반응에 영향을 미치지 않는 미미한 수준으로 변성 효과를 줄이는 것은 가능하다. 그러나, 이 방법은 첨가되는 샘플의 양이 제한되어 있는 미소역가 웰을 사용하는 면역검정과 같은 방법에 적용할 수는 없다. 이러한 관점에서, 상기 방법은 본 발명의 목적에 적합하지 않음이 명백하다.
따라서, 본 발명자들은 본 발명의 첫번째 양태로서 음이온성 계면활성제와 일부 첨가제를 포함한 처리제의 처리가 음이온성 변성제에 의한 변성 효과를 항체와 같은 프로브가 영향을 받지 않는 수준으로 감소시킬 수 있음과 동시에 음이온성 계면활성제에 의한 코어 항원의 추출 효과를 증대시킬 수 있는지를 연구하였다.
본 발명자들은 SDS와 같은 음이온성 계면활성제외에 다른 계면활성제를 함유한 처리제의 첨가가 고정화된 항체에 미치는 SDS의 변성 효과를 약화시킬 수 있으며 결과적으로 SDS를 단독으로 함유한 처리제의 첨가에 비교하여 민감성을 향상시킬 수 있음을 발견하였다. 또한, 본 발명자들은 SDS이외의 다른 계면활성제와 같이 수소이온 결합을 약화시키는 물질과 요소가 SDS와 같은 음이온성 계면활성제를 함유한 처리제에 첨가될때 유사한 효과가 관찰되며 바이러스 입자로부터 코어 항원의 추출 및 샘플내 항-코어 항원 항체의 불활성화가 증가되고 더불어 코어 항원의 추출이 증대된다는 것을 발견하였다. 또한, 본 발명자들은 SDS와 다른 계면활성제를 함유한 처리제의 첨가후 열처리에 의해 좀더 고도의 민감성으로 코어 항원의 검출이 달성됨을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
샘플의 처리를 위해 사용될 수 있는 SDS외의 다른 음이온성 계면활성제로는 나트륨 세틸 설페이트 또는 다른 알킬 설페이트 에스테르, 알킬 설포네이트, 예컨데, 나트륨 도데실 설포네이트, 알킬 알릴 설포네이트 등이 포함된다. 첨가될 수 있는 음이온성 계면활성제외 다른 계면활성제로는 양쪽성 계면활성제, 예를 들면 CHAPS (3-[(3-콜라미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판설포네이트), CHAPSO (3-[(콜라미도프로필)디메틸암모니오]-2-하이드록시-1-프로판설포네이트), 도데실-N-베타인, 3-(도데실디메틸암모니오)-1-프로판설포네이트; 비이온성 계면활성제, 예를 들면 폴리옥시에틸렌 이소옥틸페닐 에테르(예, 트리톤 X100), 폴리옥시에틸렌 노닐페닐 에테르(예, NP 40), 폴리옥시에틸렌 솔비톨 에스테르(예, 트윈 80), 폴리옥시에틸렌 도데실 에테르(예, Brij 58) 및 옥틸 글루코시드가 포함된다. 바람직한 것은 CHAPS와 같은 양쪽성 계면활성제와 트리톤 X100과 같은 비이온성 계면활성제이다. 또한, 요소, 티오우레아 등과 같이 고도의 단백질 구조를 파괴하는 물질(단백질 변성제)를 첨가하는 것이 유리하다.
처리시 사용되는 바람직한 농도는 SDS의 경우 0.5% 이상, CHAPS의 경우 0.1% 이상, 요소의 경우 1M 이상, 트리톤 X100의 경우 0.75% 이하이다.
샘플의 처리시 사용되는 온도는 실험실에서 통상 사용되는 온도 즉 4℃ 내지 100℃일 수 있다. 그러나, 음이온성 계면활성제가 첨가될때 그의 흐림점에 대해 주의가 요구된다. 바람직하게는 37℃ 이상의 온도가 사용되며 혈청의 불활성을 위해 흔히 사용되는 50℃ 내지 60℃의 온도에서 처리가 보다 효과적이다.
헤모글로빈에 의한 장해의 제거
측정을 위한 샘플로서 혈청 등이 사용될때, 그 샘플에 함유된 적혈구 세포는 상기 전처리동안에 용혈되고 헤모글로빈은 추출되며 변성된 헤모글로빈은 HCV 코어와 같은 바이러스 항원에 결합하여 측정을 방해할 수 있다. 따라서, 본 발명의 첫번째 양태로서, 헤모글로빈내의 헴을 포획함으로써 측정의 방해를 제거하는 것이 바람직하다. 이 목적을 위한 첨가제로서 본 발명자들은 요소와 이미다졸 환 함유 화합물중 하나 이상을 첨가하는 것이 바람직하다는 것을 발견하였다.
이미다졸 환-함유 화합물로서, 이미다졸, 히스티딘, 이미다졸아크릴산, 이미다졸카르복시알데하이드, 이미다졸카르복스아미드, 이미다졸디온, 이미다졸디티오카르복실산, 이미다졸디카르복실산, 이미다졸메탄올, 이미다졸리딘티온, 이미다졸리돈, 히스타민, 이미다조피리미딘 등이 언급될 수 있다.
인돌 환-함유 화합물로서 트립토판, 인돌아크릴산, 인돌, 인돌아세트산, 인돌아세트 하이드라자이드, 인돌아세트 메틸 에스테르, 인돌부티르산, 인돌아세토니트릴, 인돌카르비놀, 인돌카르복스알데하이드, 인돌카르복실산, 인돌에탄올, 인돌아세트산, 인돌메탄올, 인돌프로피온산, 인돌피루브산, 인돌릴 메틸 케톤, 인도마이신, 인돌아세톤, 인도메타신, 인도프로펜, 인도라민, 등이 언급될 수 있다.
첨가량은 요소의 경우 0.5M 내지 5M, 인돌아크릴산의 경우 5mM 내지 50mM, 기타 첨가제의 경우 0.05M 내지 0.5M이다.
한편, HCV 외피 단백질과 같은 막 단백질은 이들이 궁극적으로 처리되지 않는다면 자발적으로 용해되지 않는다. 소수성 부분을 가진 단백질을 수중에 용해시키기 위해서 소수성 부분을 계면활성제로 친수성 부분으로 전환시키는 방법이 잘 알려져 있다. 그러나, 구아니딘 클로라이드와 같은 특정 염은 무반응성 단백질을 수용성으로 만들어 주는 성질을 갖고 있는 것으로 알려져 있다. 이러한 특성을 갖고 있는 염(카오트로픽제: chaotropic agents)으로부터 생성된 이온을 카오트로픽 이온이라하며 음이온성 이온으로서 구아니딘 이온, 티오시아네이트 이온, 요오드 이온, 과요오드산 이온, 과염소산 이온 등이 알려져 있다. 이들 이온을 형성하는 염이 무반응성 단백질의 가용화를 위해 사용되었다. 카오트로픽 이온은 바이러스 입자로부터 항원을 효율적으로 추출하는 작용을 하는 것으로 기대되었다.
그러나, 카오트로픽 이온이 첨가될때, 단백질의 이차 구조가 붕괴되며 결국 에피토프 구조가 파괴된다. 따라서, 항체와 같은 프로브가 카오트로픽 이온의 존재하에서 면역 복합체 형성 반응을 위해 첨가될때 항체와의 결합은 약화되고 민감성은 감소되어 심각한 문제를 야기하는 것으로 생각된다.
한편, 카오트로픽 이온의 변성 효과는 대부분 가역적이며 따라서 투석 또는 희석에 의해 이온 세기를 약화시킬때 변성된 구조는 본래의 구조로 일시 회복된다. 이것은 카오트로픽 이온과 같은 처리제의 사용과 관련하여 또 다른 문제를 초래한다. 즉, 본 발명의 목적하는 처리 방법에 따르면, 샘플에 존재하는 바이러스 입자는 효율적으로 추출될 뿐만 아니라 샘플에 존재하는 항원에 결합하는 고 친화성 항체가 동시에 불활성화되어야 한다. 그러므로, 카오트로픽 이온으로의 가용화는 샘플에 존재하는 고 친화성 항체의 적절한 불활성화를 제공하지 못하며 항체는 민감성을 저해하는 것으로 믿어진다.
따라서, 카오트로픽 이온을 사용하는 처리 방법은 두가지 문제에 직면해 있다. 카오트로픽 이온이 구조를 파괴할 수 있는 조건에서 항원-항체 반응이 억제되는 한편 카오트로픽 이온 단독에 의한 효과는 샘플에서의 반응을 방해하는 항체를 불활성화하기에 충분하지 않으며, 항원-항체 반응이 억제되지 않는 조건에서는 항체의 오염이 반응을 억제할 수 있다.
이러한 당면 문제를 해결하기 위하여 항원의 에피토프가 가역적으로 파괴되고 샘플내 오염 항체의 기능이 비가역적으로 파괴되는 조건을 찾는 것이 필요하다.
항체가 불활성화되는 조건에 대하여 알카리 처리, 산 처리 등이 알려져 있다. 혈청의 산 처리는 가양성 결과를 발생할 수 있는데 그 이유는 그 처리가 혈청 단백질의 일부를 비가역적으로 변성시켜 샘플의 처리후 대부분의 경우 피펫팅을 방해하는 침전물을 형성하고 변성된 단백질을 함입하고 있는 침전물이 측정시에 고체 상에 흡수되어 밀도로서 검출될 수 있기 때문이다. 또 다른 문제로서, 해당 항원이 비특이적으로 침전물에 함입될때 프로브와 반응하는 항원의 양은 감소하며 결국 민감성의 감소가 초래된다.
본 발명자들은 구아니딘 처리와 혼용된 산 처리로서 침전물 형성과 같은 산 처리와 관련된 문제점과 구아니딘 처리와 연관된 당면 문제를 해결할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하였다. 또한, 본 발명자들은 구아니딘과 같은 카오트로픽 이온과 산성화제를 포함한 처리제에 계면활성제를 첨가하는 것이 바람직함을 발견하였다. 산성화제로서는 염산, 황산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 트리클로로아세트산 등이 바람직하다.
계면활성제로서는 양쪽성 계면활성제, 예를 들면 CHAPS (3-[(3-콜라미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판설포네이트), CHAPSO (3-[(콜라미도프로필)디메틸암모니오]-2-하이드록시-1-프로판설포네이트), 도데실-N-베타인, 3-(도데실디메틸암모니오)-1-프로판설포네이트 등, 및 비이온성 계면활성제, 예를 들면 폴리옥시에틸렌 이소옥틸페닐 에테르(예, 트리톤 X100), 폴리옥시에틸렌 노닐페닐 에테르(예, NP 40), 폴리옥시에틸렌 솔비톨 에스테르(예, 트윈 20), 폴리옥시에틸렌 도데실 에테르(예, Brij 58) 및 옥틸 글루코시드 등이 바람직하다. 또한, 고도의 단백질 구조를 수소 이온 결합을 약화시킴으로써 부분적으로 파괴하는 요소와 같은 물질이 첨가될 수 있다.
특히, 2M 이상의 구아니딘 하이드로클로라이드, 2% 이상의 트리톤 X100 및 0.02% 이상의 트윈 20을 4℃ 내지 45℃의 온도에서 사용하는 것이 더욱 바람직하다.
어떠한 양태에서든, 바이러스 항원은 본 발명의 처리 방법을 사용함으로써 HCV 또는 HBV와 유사한 구조를 갖는 바이러스 입자를 함유한 샘플로부터 프로브의 형태, 즉 프로브로서 항체를 사용하는 소위 면역검정에 적합한 상태로 추출시킬 수 있음이 명백하다. 본원에서 사용된 HCV 또는 HBV와 구조가 유사한 바이러스는 게놈 RNA 또는 DNA가 단백질로 팩킹되어 있고 이를 막 단백질 또는 지질 막이 에워싸고 있는 구조를 갖는 바이러스 입자를 형성하는 바이러스이다. 이러한 바이러스의 예로는 HCV와 연관된 플라비바이러스, 사람 면역결핍바이러스(HIV)와 같은 레트로바이러스 등이 포함된다. 또한, HBV와 같이 게놈으로서 DNA를 갖는 바이러스가 구조적으로 유사할때 그에 포함된다.
바이러스 항원의 노출
잠복기 동안에 수거된 샘플에서 바이러스 항원을 검출하는 방법에 관한 본 발명의 두번째 양태에 따르면, 바이러스 항원에 대한 항체가 형성되어 있지 않으며 그럼으로써 바이러스 항원을 노출시키기 위해 바이러스 입자를 분쇄하는 것으로 충분하며 샘플에 존재하는 항체를 파괴할 필요가 없다. 따라서, 상기된 샘플의 전처리는 필요치 않으며 바이러스 입자를 노출시키는 바이러스 입자-분쇄 물질의 존재로 충분하다. 특히, 바이러스 입자-분쇄 물질은 바이러스 입자에 존재하는 바이러스 항원을 위해 필수적이다.
바이러스 입자는 일반적으로 게놈으로서 핵산과 코어 항원이 복합체를 형성하여 입자를 형성하고 입자는 지질 막과 외막 단백질을 포함한 외피에 의해 코팅되어 있는 구조를 하고 있는 것으로 믿어진다. 또한, 혈중에서 바이러스 입자는 저밀도 지단백질, 바이러스에 대한 항체 등과의 복합체 형태로 존재하는 것으로 믿고 있다. 따라서, 프로브는 바이러스 항원, 특히 혈중에 존재하는 입자내 항원을 인지하거나 그에 결합할 수 없다. 그러므로, 바이러스 항원을 검출하기 위하여 예를 들면 바이러스 입자가 프로브에 의해 인지될 수 있도록 바이러스 입자를 처리하여 바이러스 입자를 에워싸고 있는 구조를 제거해야 한다.
따라서, 본 발명은 또한 바이러스 입자를 인지하는 프로브에 의해 인지되도록 샘플에 함유된 바이러스 입자내 바이러스 항원을 노출시켜 주는 반응 조건, 그 반응을 수행하는 시스템을 포함한 반응의 방법 및 그 반응을 수행하는 시스템을 함유한 시약을 제공한다.
본 발명에 의해 제공된 시스템에서 항원 검출을 위해 적합한 반응계는 바이러스 항원의 에피토프에 대한 항체의 기능을 유지하기에 충분할 만큼 온화하고 샘플에 존재하는 복잡한 구조인 바이러스 입자로부터 바이러스 항원-인지 프로브인 항체에 의해 인지된 면적을 완전히 노출시킬 수 있는 조건을 포함한다.
HCV의 경우, 코어 항원은 초원심분리에 의해 분리된 바이러스 입자를 처리함으로써 검출할 수 있으며(Takahashi et al., 1992, J. Gen. Virol, 73: 667-672) HCV 입자는 트윈 80 또는 트리톤 X100과 같은 비이온성 계면활성제를 사용하여 폴리에틸렌 글리콜로 응집시켜 침전시킬 수 있음이 이미 입증되었다(Kashiwakuma et al., 1996, J. Immunological Methods, 190: 79-89). 그러나, 전자의 경우, 검출 민감성이 충분치 않으며 항원이 완전히 노출되는지에 관한 의문이 남아있다. 후자의 경우엔, 다른 처리제의 첨가에 의해 항체가 불활성화되었고 계면활성제 자체의 영향에 대하여는 어떠한 언급도 없다.
본 발명에 따라 우선적으로 계면활성제를 중심으로 조건이 연구되었다. 그 결과 계면활성제를 기본으로한 조성물을 사용함으로써 원심분리나 가열과 같은 전처리의 절차를 실시하지 않고서 단지 반응용액에 샘플을 희석시킴으로써 바이러스 입자내 항원의 효율적인 검출을 얻을 수 있음을 발견하였다.
바이러스 입자로부터 바이러스 항원을 효과적으로 추출하고 혈청내 다양한 물질과의 상호작용을 억제하며 그럼으로써 프로브가 항원과 효율적으로 반응할 수 있는 조건을 제공하는 것이 필요하다. 이 경우에 사용된 효과적인 계면활성제로서 한 분자내에 10개 이상의 탄소를 갖는 알킬 라디칼과 2급, 3급 또는 4급 아민을 갖는 계면활성제 또는 음이온성 계면활성제가 언급될 수 있다.
알킬 라디칼과 2급, 3급 또는 4급 아민을 갖는 계면활성제에 있어서, 알킬기는 직쇄 알킬기가 바람직하고 탄소원자 수는 10 이상이 바람직하고 더욱 바람직하게는 10 내지 20이다. 아민으로서는 3급 또는 4급 아민(암모늄)이 바람직하다.
특정 계면활성제로는 도데실-N-사르코신산, 도데실 트리메틸 암모늄, 세틸트리메틸 암모늄, 3-(도데실디메틸암모니오)-1-프로판 설포네이트, 3-(테트라데실디메틸암모니오)-1-프로판 설포네이트, 도데실 피리디늄, 세틸 피리디늄, 데카노일-N-메틸 글루카미드 (MEGA-10), 도데실-N-베타인 등이 포함된다. 바람직한 것은 도데실-N-사르코신 산 및 도데실 트리메틸 암모늄이다.
상기 언급된 비이온성 계면활성제로서, 친수친유성 평형이 12 내지 14인 것이 바람직하며 트리톤 X100 및 트리톤 X114와 같은 폴리옥시에틸렌 이소옥틸페닐에테르 또는 노니데트 P40, 트리톤 N101 및 니콜 NP와 같은 폴리옥시에틸렌 노닐페닐에테르가 바람직하다.
본 발명에 따르면 상기 두 유형의 계면활성제는 단독으로 사용될 수 있으나 이들을 혼합하여 사용하는 것은 더욱 바람직하며 상승 효과도 얻을 수 있다.
요소와 같이 수성 환경을 변화시키는 추가의 성분이 첨가될 수 있다.
본 발명에서 프로브로서의 모노클로날 항체
본원에 사용된 HCV의 구조 단백질의 유전자 단편은 적어도 HCV의 N-말단으로부터 1 내지 160번의 아미노산 서열을 함유한 폴리펩타이드의 암호화 염기 서열 하나 이상을 갖는 DNA 단편과 HCV의 구조 단백질의 코어 영역을 함유한 유전자 단편을 의미한다. 특정적으로, 본 단편은 서열 2의 아미노산 서열을 암호화한 염기서열을 포함한 유전자 단편이다.
본원에 사용된 HCV 항원의 활성을 갖는 폴리펩타이드는 항-HCV 항체와 면역학적으로 반응하는 융합 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드를 의미하며 하이브리도마를 작제하고 이로부터 얻은 본 발명의 모노클로날 항체를 위한 항원으로서 사용될 수 있다. 구체적으로, 본 폴리펩타이드는 서열 1의 아미노산 서열을 포함한 HCV 항원의 활성을 갖는 폴리펩타이드 또는 서열 1의 아미노산 서열의 일부를 포함한 HCV 항원의 활성을 갖는 폴리펩타이드 또는 N-말단 또는 C-말단에 연결된 추가의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드이다.
서열 3 내지 6에 기술된 아미노산 서열을 갖는 상기 융합 폴리펩타이드 및 폴리펩타이드에 대한 본 발명의 모노클로날 항체는 당업자에 의해 용이하게 제조될 수 있다. 하이브리도마에 의한 모노클로날 항체의 제조는 잘 알려져 있다. 예를 들면, 상기 언급된 융합 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 (이하, 본 발명의 항원이라 한다)을 단독 항원으로서 또는 BSA, KLH 등과 혼합된 항원으로서 단독으로 또는 보조제(예, 프로인트 완성 보조제)와의 혼합물로 복강내 또는 피하로 투여하여 BALB/c 마우스를 주기적으로 면역화할 수 있다. 혈청내 항체 역가가 증가했을때 본 발명의 항원을 부스터로서 꼬리 정맥에 투여한다. 비장을 무균적으로 분리한 후 이를 적합한 골수종 세포주와 융합시켜 하이브리도마를 얻는다. 이 방법은 켈러와 밀스타인의 방법(Nature 256: 495-497, 1975)에 따라 수행할 수 있다.
상기 방법에 의해 수득된 하이브리도마 세포주는 적당한 배양액에서 배양할 수 있으며 본 발명의 항원에 대해 특이적인 반응을 나타내는 항체를 생성하는 하이브리도마 세포주를 선별하고 클로닝한다. 항체-생성 하이브리도마의 클로닝을 위해 제한 희석 방법외에 연질 한천 방법(Eur. J. Immunol. 6: 511-5198, 1976)을 사용할 수 있다. 이에 따라 생성된 모노클로날 항체는 단백질 A를 사용한 컬럼 크로마토그래피와 같은 방법으로 정제한다.
상기 모노클로날 항체이외에 프로브로서 사용된 분자를 형성할 수 있다. 예를 들면, 재조합 항체가 후겐분에 의해 상세히 기술되었다(Trends in Biotechnology, 15: 62-70, 1997).
프로브를 사용한 검출 시스템
본 발명에 따라 생성된 모노클로날 항체는 효소-연결된 면역흡착 검정, 효소면역검정, 효소면역도트 검정, 방사성면역검정, 응집-기본 검정 또는 기타 널리 알려진 면역검정에서 HCV 구조 단백질의 검출 및 정량을 위한 시약으로서 사용한다. 표지 항체를 검출을 위해 사용할때, 형광 화합물, 화학발광 화합물, 효소, 발색물질 등이 표지 화합물로서 사용할 수 있다.
예를 들면, 샘플내 바이러스 항원을 검출하기 위해 샌드위치 반응계-기본 방법을 사용한 경우, 사용될 진단 키트는 고체 지지체(예, 미소역가 웰의 내부벽)상에 피복된 하나 이상의 모노클로날 항체 또는 표지 물질에 결합된 하나 이상의 모노클로날 항체 또는 이의 단편을 포함한다. 고체 지지체상에 고정화된 모노클로날 항체와 표지 모노클로날 항체를 조합하여 사용할 수 있으며 고도의 민감성을 제공하는 조합이 선택될 수 있다.
사용될 수 있는 고체 지지체로는 예를 들면 폴리스티렌, 폴리카보네이트, 폴리프로필렌 또는 폴리비닐로 만든 미소역가 평판, 시험관 및 모세관, 비드(라텍스 비드, 적혈구 세포, 금속 화합물 등), 막(리포좀 등), 필터 등이 포함된다.
발명의 효과
본 발명의 방법에 따르면, 프로브로서 항체를 사용하여 검출하는 면역검정에 적합한 상태에서 바이러스 입자로부터 바이러스 항원을 용이하게 추출할 수 있다. 또한, 본 발명에 따라 바이러스 입자를 함유한 샘플을 처리함으로써, 프로브로서 항체 등을 사용하여 항원을 검출하는 면역검정에 의해 바이러스 항원의 간단하고 민감한 검출 및 정량을 달성할 수 있다. 또한, 본 발명의 샘플 처리 방법을 사용하는 면역검정을 이용하여 샘플내 바이러스의 유무를 결정하고 바이러스를 정량하는 키트, 검정 키트 및 진단시약을 만들 수 있다.
하기 실시예는 본 발명을 예시한다. 그러나, 이들 실시예가 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예 1. HCV-유도된 폴리펩타이드의 발현 및 정제
(A) 발현 플라스미드의 작제
HCV의 코어 영역에 상응하는 플라스미드를 다음과 같이 작제하였다. pUC 119내로 C11-C21 클론 및 C10-E12 클론(일본 미심사 특허 공개 번호 1994-38765)을 도입하여 각각 얻은 플라스미드 pUC·C11-C21 및 pUC·C10-E12의 DNA 각 1μg 20㎕의 제한효소 반응용액[50mM 트리스-HCl, pH 7.5, 10mM MgCl2, 1mM 디티오쓰레이톨, 100mM NaCl, 15 유니트의 EcoRI 및 15 유니트의 ClaI 효소] 및 제한효소 반응용액[10mM 트리스-HCl, pH 7.5, 10mM MgCl2, 1mM 디티오쓰레이톨, 50mM NaCl, 15 유니트의 ClaI 및 15 유니트의 KpnI 효소]으로 각각 1시간 동안 37℃에서 분해시킨 다음 0.8% 아가로즈 겔 전기영동하여 약 380 bp의 EcoRI-ClaI 단편과 약 920bp의 ClaI-KpnI 단편을 정제하였다.
pUC119를 EcoRI과 KpnI으로 분해시켜 얻은 두개의 DNA 단편과 벡터에 5㎕의 10 x 리가제 완충용액[660mM 트리스-HCl, pH 7.5, 66mM MgCl2, 100mM 디티오쓰레이톨, 1mM ATP], 1㎕의 T4 리가제(350 유니트/㎕) 및 물을 첨가하여 총 용량을 50㎕로 만든 다음 16℃에서 밤새 배양하여 연결반응을 실시하였다. 이 플라스미드로 이. 콜라이 JM109를 형질전환시켜 플라스미드 pUC C21-E12를 수득하였다.
플라스미드 pUC C21-E12 DNA 1 나노그램에 대해 다음의 두 프라미머를 사용하여 PCR을 실시하였다: 5'-GAATTCATGGGCACGAATCCTAAA-3'(서열 7) 및 5'-TTAGTCCTCCAGAACCCGGAC-3'(서열 8). PCR은 GeneAmpTM(퍼킨 엘머 세투스사 제품 DNA 증폭 시약 키트)을 사용하여 95℃에서 1.5분 동안의 DNA 변성, 50℃에서 2분 동안의 어닐링, 70℃에서 3분 동안의 DNA 합성 조건하에서 실시하였다. 이에 따라 수득된 DNA 단편은 0.8% 아가로즈 겔 전기영동하여 분리하고 글래스 파우더 방법(Gene Clean)으로 정제하였다.
한편, pUC 19를 SmaI으로 분해시키고 PCR에 의해 수득된 DNA 단편을 5㎕의 10 x 리가제 완충용액[660mM 트리스-HCl, pH 7.5, 66mM MgCl2, 100mM 디티오쓰레이톨, 1mM ATP], 1㎕의 T4 리가제(350 유니트/㎕) 및 물에 첨가하여 총 용량을 50㎕로 만든다음 16℃에서 밤새 배양하여 연결반응을 실시하였다. 이 플라스미드로 이. 콜라이 JM109를 형질전환시켜 플라스미드 pUC·C21-E12·SmaI을 수득하였다. 이 플라스미드 DNA 1㎍을 20㎕의 제한효소 반응용액[150mM NaCl, 6mM 트리스-HCl, pH 7.5, 6mM MgCl2, 15 유니트의 EcoRI 및 15 유니트의 BamHI 효소]에서 분해시킨 다음 0.8% 아가로즈 겔 전기영동하여 약 490bp의 EcoRI-BamHI 단편을 분리하고 이를 글래스 파우더 방법으로 정제하였다.
이어서, 1㎍의 발현 벡터 Trp·TrpE의 DNA(일본 미심사 특허 공개번호 1993-84085)를 20㎕의 제한효소 반응용액[150mM NaCl, 6mM 트리스-HCl, pH 7.5, 6mM MgCl2, 15 유니트의 EcoRI 및 15 유니트의 BamHI 효소]으로 37℃에서 1시간 동안 분해시켰다. 반응용액에 39㎕의 물을 첨가한 다음 70℃로 5분 동안 가열하였다. 그런후 1㎕의 세균성 알카리성 포스파타제(BAP)를 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 배양하였다.
페놀 추출을 위해 반응 혼합물에 페놀을 첨가하였다. 이에 따라 수득된 수 성 층을 에탄올로 침전시키고 형성된 침전물을 건조시켰다. 수득된 EcoRI-BamHI-처리된 벡터 DNA 1㎍과 상기 코어 140 단편을 5㎕의 10 x 리가제 완충용액[660mM 트리스-HCl, pH 7.5, 66mM MgCl2, 100mM 디티오쓰레이톨, 1mM ATP], 1㎕의 T4 리가제(350 유니트/㎕) 및 물에 첨가하여 총 용량을 50㎕로 만든 다음 16℃에서 밤새 배양하여 연결반응을 실시하였다.
상기 반응 혼합물 10㎕를 사용하여 이. 콜라이 HB101을 형질전환하였다. 형질전환을 위해 사용된 민감성 이. 콜라이 균주는 염화칼슘 방법[Mandel, M. and Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159-162 (1970)]에 의해 작제할 수 있다. 형질전환된 이. 콜라이를 25㎍/ml 앰피실린이 함유된 LB 평판(1% 트립토판, 0.5% NaCl, 1.5% 한천)상에 도말하고 37℃에서 밤새 배양하였다. 배양 루프를 사용하여 평판상에 형성된 세균 콜로니 1 루프를 25㎍/ml 앰피실린이 함유된 LB 배양배지로 옮기고 37℃에서 밤새 배양하였다. 1.5㎖의 세균 배양물을 원심분리하여 세포를 수거한 다음 플라스미드 DNA를 알카리 방법[Manniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982)]으로 소제조에 적용하였다.
그런후 상기 제조된 플라스미드 DNA 1㎍을 20㎕의 제한효소 반응용액[150mM NaCl, 6mM 트리스-HCl, pH 7.5, 6mM MgCl2, 15 유니트의 EcoRI 및 15 유니트의 BamHI 효소]으로 37℃에서 1시간 동안 분해시킨 다음 아가로즈 겔 전기영동을 하였다. 약 490bp의 EcoRI-BamHI 단편을 생성한 TrpㆍTrpE 코어 160 발현 플라스미드를 선별하였다.
(B) 클론 코어 160에 암호화된 폴리펩타이드의 발현 및 정제
발현 플라스미드 TrpㆍTrpE 코어 160을 가진 이. 콜라이 HB101을 50㎍/㎖의 앰피실린이 함유된 3㎖의 2YT 배지(1.6% 트립톤, 1% 효모추출물, 0.5% NaCl)에 접종하고 37℃에서 9시간 동안 배양하였다. 1㎖의 배양물을 50㎍/㎖의 앰피실린이 함유된 100㎖의 M9-CA 배지(0.6% Na2HPO4, 0.5% KH2PO4, 0.5% NaCl, 0.1% NH4Cl, 0.1 mM CaCl2, 2mM MgSO4, 0.5% 카사미노산, 0.2% 글루코즈)에 계대하고 37℃에서 배양하였다. 인돌 아크릴레이트를 OD600 = 0.3에서 40mg/ℓ의 최종 농도로 첨가하고 16시간 이상 배양하였다. 배양물을 원심분리하여 세포를 수거하였다.
세포에 20㎖의 완충액 A[50mM 트리스-HCl, pH 8.0, 1mM EDTA, 30mM NaCl]를 첨가하여 현탁시켰다. 이 현탁액을 원심분리하여 2.6g의 발현세포를 수득하였다. 이에 따라 얻은 세포를 10㎖의 완충액 A에 현탁시켰다. 이. 콜라이의 막을 음파로 분쇄시킨 후 원심분리하여 HCV cDNA와 TrpE에 의해 암호화된 융합 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드를 함유한 불용성 분획을 수득하였다. 분획에 6M 요소가 함유된 완충액 A 10㎖를 첨가하여 융합 폴리펩타이드를 용해시키고 추출하였다. 용해된 추출물을 S-세파로즈를 사용하여 이온 교환 컬럼 크로마토그래피하여 융합 폴리펩타이드를 정제하였다.
실시예 2. 하이브리도마의 작제방법
상기 방법에 의해 제조된 융합 폴리펩타이드(TrpC11)를 6M 요소중에 용해시 킨다음 0.15M NaCl이 함유된 10mM 인산염 완충액(pH 7.3)중에 희석시켜 최종 농도 0.2 내지 1.0㎎/㎖로 만들고 동량의 부형제(Titermax)와 혼합하여 TrpC11 현탁액을 만들었다. TrpC11의 0.1 내지 0.5㎎/㎖로 제조된 이 현탁액을 생후 4 내지 6주된 BALB/c 마우스에 복강내 투여하였다. 유사한 면역화를 2주마다 실시하고 추가로 약 2주가 지나서 생리 식염수중에 용해된 10㎍의 TrpC11을 꼬리 정맥으로 투여하였다.
마지막 접종후 3일 경과하여, 비장을 면역화 동물로부터 무균적으로 분리하고 가위로 세편한 다음 개개의 세포로 분쇄하고 RPMI-1640 배지로 3회 세척하였다. 세척후, 2.56 x 107 세포의 대수성장기에 있는 마우스 골수종 세포주 SP2/0Ag14와 1.64 x 108 비장세포를 50㎖ 원심분리관에서 혼합하였다. 혼합물을 200 x g로 5분 동안 원심분리하고 상등물을 제거한 다음 침전물에 50% 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 4000(머크사 제품)이 함유된 RPMI-1640 배지 1㎖를 첨가하고 추가로 10㎖의 RPMI-1640 배지를 첨가하여 세포 융합을 실시하였다.
PEG를 원심분리(200 x g, 5분)하여 제거한 후, 융합된 세포를 96-웰 평판에 10% 소혈청, 하이포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘(이하 HAT라 한다)이 함유된 RPMI1640에서 약 10일간 배양하여 단지 하이브리도마만을 성장시켰다. 그런후, 원하는 항체를 생성하는 클론을 ELISA 방법으로 검출하여 본 발명의 목적하는 반응 특이성을 갖는 모노클로날 항체를 생성하는 하이브리도마를 수득하였다.
이에 따라 수득된 하이브리도마를 통상적인 제한 희석 방법에 따라 모노클로 닝하고 수득된 하이브리도마를 HC11-11, HC11-14, HC11-10, HC11-3 및 HC11-7로 명명하였다. 이들 4종의 하이브도마는 통상산업성공업기술원생명공학연구소(the National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology)에 1997년 7월 4일에 기탁되었으며 각각 기탁번호 FERM BP-6005, FERM BP-6006, FERM BP-6004, FERM BP-6002 및 FERM BP-6003을 부여받았다.
실시예 3. 모노클로날 항체의 작제
실시예 2의 방법에서 수득된 하이브리도마를 프리스탄 등으로 처리된 마우스의 복강에 접종하고 복수액에 생성된 모노클로날 항체를 수거하였다. 단백질 A-결합된 세파로즈 컬럼을 사용하여 모노클로날 항체를 정제하여 IgG 분획을 분리하였다.
토끼 항-마우스 Ig 이소타입 항체(지메드사 제품)를 사용한 면역검정에 의해 상기 5종 하이브리도마로부터 생성된 모노클로날 항체 C11-14, C11-11, C11-10, C11-7 및 C11-3 각각의 이소타입은 C11-10 및 C11-7의 경우 IgG2이고 CH11-11, C11-14 및 C11-3의 경우 IgG1인 것으로 밝혀졌다. 수득된 5종 모노클로날 항체에 대해, HCV 코어 영역으로부터 유래된 서열에 따라 합성된 20개 아미노산으로 구성된 합성 펩타이드를 사용하여 에피토프 분석을 실시하였다. 하기 표 1에 나타낸 이의 결과는 그들이 코어 영역의 일부를 특이적으로 인지하는 모노클로날 항체임을 가리킨다.
Figure 111999003005503-pct00030
실시예 4. 샘플 처리 조건에 대한 연구
1) SDS 농도
100㎕의 정상인 혈청과 HCV-RNA-양성 혈청에 상이한 농도의 SDS와 0.6% CHAPS가 함유된 처리용액 100㎕을 첨가하였다. 이어서, 혼합물을 56℃의 배양기 세트에 넣고 30분간 처리한 다음 각 80㎕의 처리된 혼합물을 샘플로서 사용하였다. 하기된 검정 방법을 사용하여 수득된 결과는 처리 시간에서의 SDS 농도를 가로좌표로 하여 도 1에 나타나 있다.
2) CHAPS 농도
100㎕의 정상인 혈청과 HCV-RNA-양성 혈청에 상이한 농도의 CHAPS와 5% SDS가 함유된 처리용액 100㎕을 첨가하였다. 이어서, 혼합물을 56℃의 배양기 세트에 넣고 30분간 처리한 다음 각 80㎕의 처리된 혼합물을 샘플로서 사용하였다. 하기된 검정 방법을 사용하여 수득된 결과는 처리 시간에서의 CHAPS 농도를 가로좌표로 하여 도 2에 나타나 있다.
3) 요소 농도
100㎕의 정상인 혈청과 HCV-RNA-양성 혈청에 상이한 농도의 요소가 함유된 처리용액(5% SDS, 0.6% CHAPS) 100㎕을 첨가하였다. 이어서, 혼합물을 56℃의 배양기 세트에 넣고 30분간 처리한 다음 각 80㎕의 처리된 혼합물을 샘플로서 사용하였다. 하기된 검정 방법을 사용하여 수득된 결과는 처리 시간에서의 요소 농도를 가로좌표로 하여 도 3에 나타나 있다.
4) 트리톤 X100 농도
100㎕의 정상인 혈청과 HCV-RNA-양성 혈청에 상이한 농도의 트리톤 X100이 함유된 처리용액(5% SDS, 0.6% CHAPS, 6M 요소) 100㎕을 첨가하였다. 이어서, 혼합물을 56℃의 배양기 세트에 넣고 30분간 처리한 다음 각 80㎕의 처리된 혼합물을 샘플로서 사용하였다. 하기된 검정 방법을 사용하여 수득된 결과는 처리 시간에서의 트리톤 X100 농도를 가로좌표로 하여 도 4에 나타나 있다.
5) 반응 온도
100㎕의 정상인 혈청과 HCV-RNA-양성 혈청에 100㎕의 처리용액(5% SDS, 0.6% CHAPS, 6M 요소, 0.75% 트리톤 X100)을 첨가하였다. 혼합물을 4℃, 실온(23℃), 37℃, 45℃, 56℃ 및 70℃에서 30분 동안 처리하고 각각 80㎕의 처리된 혼합물을 샘플로서 사용하였다. 하기된 검정 방법을 사용하여 수득된 결과는 도 5에 나타나 있다.
검정 방법
혈청 처리의 조건에 대한 연구에서 얻은 샘플을 하기된 개개의 검정 방법을 사용하여 평가하였다. 따라서, 항-HCV 코어 항원 모노클로날 항체(동량의 항체 C11-3 및 C11-7의 혼합물)를 0.1M 탄산염 완충액(pH 9.6)중에 6㎍/㎖의 최종 총 농도로 희석하고 100㎕의 각 희석액을 96-웰 미소역가 평판(눈크사 제품)의 각 웰에 분배하였다. 평판을 4℃에서 밤새 배양한 후 0.15M NaCl이 함유된 10mM 인산나트륨 완충액(pH 7.3) 0.35㎖로 2회 세척하였다. 그런다음, 0.5% 카세인-Na이 함유된 10mM 인산나트륨 완충액(pH 7.35) 0.35㎖(이하 차단용액이라 한다)를 첨가하고 평판을 실온에서 2시간 더 배양하였다.
차단용액을 제거한 후, 0.15M NaCl, 1% BSA, 0.5% 카세인-Na 및 0.05% 트윈 20이 함유된 100mM 인산나트륨 완충액(pH 7.3) 160㎕와 혈청 처리 방법에 의해 얻은 측정을 위한 샘플을 개개의 웰에 첨가하였다. 이어서, 평판을 실온에서 2시간 동안 배양하고 300㎕의 세척액으로 5회 세척하였다. 계속해서, 100㎕의 퍼옥시다제(POD)-표지된 모노클로날 항체(동량의 C11-10과 C11-14의 혼합물)를 첨가하고 실온에서 30분 동안 배양하였다. 배양이 종료된 후, 평판을 300㎕의 상기 세척액으로 5회 세척하였다. 평판에 100㎕의 기질(오르토-페닐렌디아민, 이하 OPD라 한다) 용액을 첨가하고 평판을 실온에서 30분 동안 배양한 후 100㎕의 2N 황산 용액을 첨 가하였다. 630nm에서의 흡광도를 참조로 하여 흡광도를 492nm(OD492)의 파장에서 측정하였다.
도 1 내지 도 4에서 보는 바와 같이 각각의 처리 조건은 최적화되었다. 미처리된 샘플에서 코어 항원을 검출하는 것은 어려웠으나 이러한 간단한 처리는 코어 항원의 검출을 가능하게 하였다. 특히, 0.5% 이상의 SDS, 0.1% 이상의 CHAPS, 1M 이상의 요소 및 0.1% 내지 0.75%의 트리톤 X100과 4℃ 내지 70℃의 온도 범위를 사용함으로써 코어 항원을 만족스럽게 검출할 수 있는 것으로 나타났다.
실시예 5. 구조 영역에서 코어 항원의 검출 및 검정 방법(1)
100㎕의 혈청에 100㎕의 처리용액(5% SDS, 0.6% CHAPS, 6M 요소, 0.75% 트리톤 X100)을 첨가하였다. 이것을 56℃의 배양기 세트에 넣은 후 30분 동안 처리하고 120㎕의 처리 혼합물을 샘플로서 사용하였다.
항-HCV 코어 항원 모노클로날 항체(동량의 C11-3과 C11-7의 혼합물)을 0.1M 탄산염 완충액(pH 9.6)중에 6㎍/㎖의 최종 총 농도로 희석하고 100㎕의 각 희석된 혼합물을 96-웰 미소역가 평판(눈크사 제품)의 각 웰에 분배하였다. 평판을 4℃에서 밤새 배양하고 0.15M NaCl이 함유된 10nM 인산나트륨 완충액(pH 7.3) 0.35㎖로 2회 세척하였다. 이어서, 0.35㎖의 차단용액을 첨가하고 평판을 실온에서 2시간 배양하였다.
차단용액을 제거한 후 120㎕의 반응 완충액과 상기 처리방법에서 얻은 측정을 위한 샘플을 개개의 웰내로 첨가하고 실온에서 2시간 동안 배양하였다. 평판을 300㎕의 세척액으로 5회 세척한 다음 100㎕의 퍼옥시다제(POD)-표지된 모노클로날 항체(동량의 C11-10와 C11-14의 혼합물)를 평판에 첨가하고 평판을 실온에서 30분 동안 배양하였다. 평판을 300㎕의 세척액으로 5회 세척하고 100㎕의 기질(OPD) 용액을 첨가한 다음 실온에서 45분 동안 배양한 후 100㎕의 2N 황산용액을 첨가하였다. 630nm에서의 흡광도를 참조로 하여 흡광도를 492nm(OD492)의 파장에서 측정하였다. 표준 혈청으로서 1U/㎖로서 정의된 패널 혈청 50을 1% BSA가 함유된 10mM 인산나트륨 완충액(pH 7.3)에 연속적으로 희석한 후 유사하게 처리하고 측정하였다.
도 6은 표준 혈청으로서 사용된 패널 혈청 50의 희석 라인을 보여준다. 샘플내 코어 항원은 용량-의존 방식으로 측정되었으며 약 0.5mU/㎖의 수준으로 검출될 수 있었다. 따라서, 아주 간단한 샘플 처리 방법을 본 발명의 모노클로날 항체와 조합함으로써 HCV 코어 항원을 검출 또는 정량할 수 있음이 입증되었다.
실시예 6. HCV 코어 항원의 검출 및 정량(2)
알카리성 포스파타제-표지 모노클로날 항체를 사용한 방법
고체 캐리어로서 96-웰 블랙 미소역가 평판(눈크사 제품)를, 표지 항체로서 알카리성 포스파타제-표지 모노클로날 항체를, 기질로서 CDPstar(감작제로서 에메랄드 II)를 사용하였다. 표준 혈청으로서 사용된 패널 혈청 50의 희석 라인이 도 7에 나타나 있다. 샘플내 코어 항원은 용량-의존적 방식으로 측정되었고 약 0.5mU/㎖의 수준으로 검출될 수 있었다. 따라서, 알카리성 포스파타제-표지 모노 클로날 항체를 사용한 방법이 HCV 코어 항원도 검출 또는 정량할 수 있음이 입증되었다.
실시예 7. 용혈된 혈청의 민감성 감소를 억제하기 위한 첨가제에 관한 연구
혈청 성분이 민감성에 미치는 영향을 시험하였을때 헤모글로빈의 첨가가 민감성을 현저히 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 이 감소는 SDS, CHAPS 또는 트리톤 X100가 함유된 전처리제를 사용한 전처리에 의해 생성된 변성된 헤모글로빈으로부터 추출된 헴에 의해 야기된 것으로 여겨졌다. 따라서, 변성된 헤모글로빈의 효과를 감소시킬 수 있었던 첨가제는 이들을 전처리제에 첨가함으로써 시험되었다.
요소 첨가의 영향은 HCV 코어 항원 양성 혈청(패널 혈청 3번)에 고농도의 헤모글로빈(고쿠사이 시야쿠사 제품)을 첨가하여 형성된 모델 샘플에 요소를 첨가함으로써 및 실시예 6에 따라 코어 항원을 측정함으로써 연구하였다. 대조군으로서 사용된 헤모글로빈 무첨가 그룹의 100%에 대한 상대비율로서 430㎎/dl 헤모글로빈 첨가 그룹에서의 코어 항원의 활성 수준이 표 2에 나타나 있다. 요소가 첨가되지 않은 경우 헤모글로빈 첨가 그룹에서 코어 항원의 활성 수준은 30%까지 감소하였으나 요소의 첨가량을 증가시킴으로써 헤모글로빈 첨가 그룹에서의 코어 항원의 활성 수준은 증가하고 헤모글로빈에 의한 저해는 감소하였다.
Figure 111999003005503-pct00002
한편, 헴과 각 아미노산과의 상호작용 가능성과 아미노기와 카르복실기에 의한 완충효과가 있기 때문에 여러가지 아미노산을 첨가하고 이들의 효과 정도를 검사하였다. 이의 결과는 표 3에 나타나 있다.
Figure 111999003005503-pct00003
트립토판과 히스티딘은 저해에 가장 강력한 억제 효과를 나타냈다. 저해에 대한 억제 효과의 용량-의존성을 연구하였으며 이의 결과는 표 4에 나타나 있다.
Figure 111999003005503-pct00004
헴이 헤모글로빈내 측쇄에 의해 결합되어 헤모글로빈내에 유지되기 때문에 이 효과는 측쇄에 기인하는 것으로 제안되었다. 따라서, 이미다졸, 히스티딘내 측쇄, 인돌 환를 함유한 인돌아크릴산 및 트립토판내 측쇄의 효과가 연구되었고 이의 결과는 표 5에 나타나 있다.
Figure 111999003005503-pct00005
인돌 또는 인돌아크릴산이 반응에 첨가되었을때 헤모글로빈에 의한 저해의 용량-의존성 억제 효과가 아미노산의 첨가에서와 마찬가지로 관찰되었다. 이것은 이미다졸 환를 함유한 물질(예, 히스티딘) 또는 인돌 환를 함유한 물질(예, 트립토판)을 반응에 첨가함으로써 헤모글로빈을 함유한 샘플에 대해서 조차도 코어 항원 의 민감한 검출을 얻을 수 있음을 가리킨다.
상기 첨가제의 배합의 효과가 연구되었다. 이의 결과는 하기 표 6에 나타나 있다. 히스티딘과 트립토판을 배합함으로써 90% 이상의 회수를 얻었으며 요소의 첨가는 추가로 검출 민감성을 증가시켰다.
Figure 111999003005503-pct00006
실시예 8. 혈청 처리 및 검정 방법에서 인지된 분자 형태의 분석
각 혈청 처리 방법을 사용하여 0.25㎖의 패널 혈청 13을 처리하였다. 처리된 혈청을 겔 여과 컬럼(Superdex 200HR, 1 x 30)에서 분별하고 분획내 항-코어 면역학적 활성을 측정하였다. 이 결과는 도 8에 나타나 있다. 본 도는 분자량이 약 20 내지 30kDa인 분자가 인지되고 있고 바이러스내 코어 항원이 상기 전처리에 의한 혈청내 항-코어 항체의 불활성화 및 바이러스의 분쇄를 통해 추출되었음을 제시하였다.
실시예 9. 혈청에서 HCV 구조 영역내 코어 항원의 검정 방법
앰플리코어 HCV 모니터 키트(로슈사 제품)을 사용하여 103 내지 107 복제수/㎖의 HCV-RNA를 갖는 것으로 측정된 혈청, PCR 방법 및 정상인 혈청을 사용하여 상 기된 방법에 따라 혈청내 HCV 코어 항원을 정량하였다. 표준 혈청으로서 패널 혈청 50(1U/㎖로서 정의됨)을 1% BSA가 함유된 10mM 인산나트륨 완충액(pH 7.3)중에 연속적으로 희석하고 유사한 방식으로 처리하였다. 이의 결과는 표 7에 나타나 있다. 시험된 샘플중에서 모든 정상인 혈청내의 코어 항원은 검출 한계 이하였으며 모든 PCR-양성 샘플에서 검출될 수 있었다. 상호관계는 도 9에 나타나 있으며, PCR 방법과의 상호관계는 또한 0.8 이상인 것으로 나타났다.
Figure 111999003005503-pct00007
실시예 10. 샘플 처리 조건에 대한 연구
1) 구아니딘 하이드로클로라이드 농도
100㎕의 정상인 혈청과 HCV-RNA-양성 혈청에 상이한 농도의 구아니딘 하이드로클로라이드와 0.5N HCl이 함유된 처리용액 100㎕을 첨가하였다. 이어서, 혼합물을 실온에서 30분간 처리한 다음 각 80㎕의 처리된 혼합물을 샘플로서 사용하였다. 하기된 검정 방법을 사용하여 수득된 결과는 처리 시간에서의 구아니딘 하이드로클로라이드 농도를 가로좌표로 하여 도 10에 나타나 있다.
2) 트리톤 X100 농도
100㎕의 정상인 혈청과 HCV-RNA-양성 혈청에 상이한 농도의 트리톤 X100(6M 구아니딘 하이드로클로라이드, 0.5N HCl)이 함유된 처리용액 100㎕을 첨가하였다. 이어서, 혼합물을 실온에서 30분간 처리한 다음 각 80㎕의 처리된 혼합물을 샘플로서 사용하였다. 하기된 검정 방법을 사용하여 수득된 결과는 처리 시간에서의 트리톤 X100 농도를 가로좌표로 하여 도 11에 나타나 있다.
3) 트윈 20 농도
100㎕의 정상인 혈청과 HCV-RNA-양성 혈청에 상이한 농도의 트윈 20(6M 구아니딘 하이드로클로라이드, 0.5N HCl, 12.5% 트리톤 X100)이 함유된 처리용액 100㎕을 첨가하였다. 이어서, 혼합물을 실온에서 30분간 처리한 다음 각 80㎕의 처리된 혼합물을 샘플로서 사용하였다. 하기된 검정 방법을 사용하여 수득된 결과는 처리 시간에서의 트윈 20 농도를 가로좌표로 하여 도 12에 나타나 있다.
4) 반응 온도
100㎕의 정상인 혈청과 HCV-RNA-양성 혈청에 100㎕의 처리용액(6M 구아니딘 하이드로클로라이드, 0.5N HCl, 12.5% 트리톤 X100, 0.75% 트윈 20)을 첨가하였다. 혼합물을 4℃, 실온(23℃), 37℃ 및 45℃에서 30분 동안 처리하고 각각 80㎕의 처리된 혼합물을 샘플로서 사용하였다. 하기된 검정 방법을 사용하여 수득된 결과는 도 13에 나타나 있다.
검정 방법
혈청 처리의 조건에 대한 연구에서 얻은 샘플을 하기된 개개의 검정 방법을 사용하여 평가하였다. 따라서, 항-HCV 코어 항원 모노클로날 항체(동량의 항체 C11-14와 C11-11의 혼합물)를 0.1M 탄산염 완충액(pH 9.6)중에 6㎍/㎖의 최종 총 농도로 희석하고 100㎕의 각 희석액을 96-웰 미소역가 평판(눈크사 제품)의 각 웰에 분배하였다. 평판을 4℃에서 밤새 배양한 후 0.15M NaCl이 함유된 10mM 인산나트륨 완충액(pH 7.3) 0.35㎖로 2회 세척하였다. 그런다음, 0.5% 카세인-Na이 함유된 10mM 인산나트륨 완충액(pH 7.35) 0.35㎖(이하 차단용액이라 한다)를 첨가하고 평판을 실온에서 2시간 더 배양하였다.
차단용액을 제거한 후, 0.15M NaCl, 1% BSA, 0.5% 카세인-Na 및 0.05% 트윈 20이 함유된 100mM 인산나트륨 완충액(pH 7.3; 이하 반응 완충액이라 한다) 140㎕와 상기된 혈청 처리 방법에 의해 얻은 측정을 위한 샘플의 혼합물 160㎕를 개개의 웰에 첨가하였다. 이어서, 평판을 실온에서 2시간 동안 배양하고 300㎕의 세척액으로 5회 세척하였다. 계속해서, 100㎕의 퍼옥시다제(POD)-표지된 모노클로날 항체(C11-10)를 첨가하고 실온에서 30분 동안 배양하였다. 배양이 종료된 후, 평판을 300㎕의 상기 세척액으로 5회 세척하였다. 평판에 100㎕의 기질(오르토-페닐렌디아민, 이하 OPD라 한다) 용액을 첨가하고 평판을 실온에서 30분 동안 배양한 후 100㎕의 2N 황산 용액을 첨가하였다. 630nm에서의 흡광도를 참조로 하여 흡광도를 492nm(OD492)의 파장에서 측정하였다.
도 10 내지 도 13에서 보는 바와 같이 각각의 처리 조건은 최적화되었다. 미처리된 샘플에서 코어 항원을 검출하는 것은 어려웠으나 이러한 간단한 처리는 코어 항원의 검출을 가능하게 하였다. 어떤 경우에서든 시그날의 증가는 건강한 사람에서는 관찰되지 않았다. 또한, 2M 이상의 구아니딘 하이드로클로라이드 및 0.2% 이상의 트리톤 X100과 4℃ 내지 45℃의 온도 범위를 사용함으로써 코어 항원을 만족스럽게 검출할 수 있는 것으로 나타났다.
실시예 11. 코어 항원의 검출 및 검정 방법
100㎕의 혈청에 100㎕의 처리용액(6M 구아니딘 하이드로클로라이드, 0.5N HCl, 12.5% 트리톤 X100, 0.75% 트윈 20)을 첨가하였다. 이것을 실온에서 30분 동안 처리하고 100㎕의 처리 혼합물을 샘플로서 사용하였다.
항-HCV 코어 항원 모노클로날 항체(동량의 C11-14와 C11-11의 혼합물)을 0.1M 탄산염 완충액(pH 9.6)중에 6㎍/㎖의 최종 총 농도로 희석하고 100㎕의 각 희석된 혼합물을 96-웰 미소역가 평판(눈크사 제품)의 각 웰에 분배하였다.
평판을 4℃에서 밤새 배양하고 0.15M NaCl이 함유된 10nM 인산나트륨 완충액(pH 7.3) 0.35㎖로 2회 세척하였다. 이어서, 0.35㎖의 차단용액을 첨가하고 평판을 실온에서 2시간 동안 정치해 두었다. 차단용액을 제거한 후 150㎕의 반응 완충액과 상기 처리방법에서 얻은 측정을 위한 샘플을 개개의 웰내로 첨가하고 실온에서 2시간 동안 배양하였다.
평판을 300㎕의 세척액으로 5회 세척한 다음 100㎕의 퍼옥시다제(POD)-표지된 모노클로날 항체(C11-10)를 평판에 첨가하고 평판을 실온에서 30분 동안 배양하였다. 평판을 300㎕의 세척액으로 5회 세척하고 100㎕의 기질(OPD) 용액을 첨가한 다음 실온에서 45분 동안 배양한 후 100㎕의 2N 황산용액을 첨가하였다. 630nm에서의 흡광도를 참조로 하여 흡광도를 492nm(OD492)의 파장에서 측정하였다. 표준 혈청으로서 1U/㎖로서 정의된 패널 혈청 50을 1% BSA가 함유된 10mM 인산나트륨 완충액(pH 7.3)에 연속적으로 희석한 후 유사하게 처리하고 측정하였다.
도 14는 표준 혈청으로서 사용된 패널 혈청 50의 희석 라인을 보여준다. 샘플내 코어 항원은 용량-의존 방식으로 측정되었으며 약 0.5mU/㎖ 이하의 수준으로 검출될 수 있었다. 따라서, 아주 간단한 샘플 처리 방법을 본 발명의 모노클로날 항체와 조합함으로써 HCV 코어 항원을 검출 또는 정량할 수 있음이 입증되었다.
실시예 12. 혈청 처리 및 검정 방법에서 인지된 분자 형태의 분석
각 혈청 처리 방법을 사용하여 0.25㎖의 패널 혈청 13을 처리하였다. 처리된 혈청을 겔 여과 컬럼(Superdex 200HR, 1 x 30)에서 분별하고 분획내 항-코어 면역학적 활성을 측정하였다. 이 결과는 도 15에 나타나 있다. 본 도는 분자량이 약 20 내지 30kDa인 분자가 인지되고 있고 바이러스내 코어 항원이 상기 전처리에 의한 혈청내 항-코어 항체의 불활성화 및 바이러스의 분쇄를 통해 추출되었음을 제시하였다.
실시예 13. 혈청에서 코어 항원의 검정 방법
앰플리코어 HCV 모니터 키트(로슈사 제품)을 사용하여 103 내지 107 복제수/㎖의 HCV-RNA를 갖는 것으로 측정된 혈청, PCR 방법 및 정상인 혈청을 사용하여 상기된 방법에 따라 혈청내 HCV 코어 항원을 정량하였다.
표준 혈청으로서 패널 혈청 50(1U/㎖로서 정의됨)을 1% BSA가 함유된 10mM 인산나트륨 완충액(pH 7.3)중에 연속적으로 희석하고 유사한 방식으로 처리하였다. 이의 결과는 표 8에 나타나 있다. 시험된 샘플중에서 모든 정상인 혈청내의 코어 항원은 검출 한계 이하였으며 모든 PCR-양성 샘플에서 검출될 수 있었다. 상호관계는 도 16에 나타나 있으며, PCR 방법과의 상호관계는 또한 0.8 이상인 것으로 나타났다.
Figure 111999003005503-pct00008
실시예 14. B형 간염 바이러스(HBV) 코어 항원의 검출
지금까지 HCV 코어 항원의 검출을 설명하였고 본 발명자들은 이러한 처리 방법이 다른 바이러스의 구조 단백질을 검출하는데 응용될 수 있는지를 연구하였다.
HBV 코어 항원에 대한 모노클로날 항체(Tokushu Menneki Kenkyuusho [Special Immunology Research Institute])를 0.1M 탄산염 완충액(pH 9.6)에 3㎍/㎖의 농도로 희석하고 100㎕의 분취액에 분산시켰다. 평판을 밤새 4℃에서 배양한 후 인산염 완충액으로 세척하고 1% BSA 용액의 350㎕ 분취액을 평판에 분산시켰다. 실온에서 2시간 동안 정치시킨 후 1% BSA 용액을 빨아내고 200㎕의 반응 용액을 첨가하였다.
재조합 HBV 코어 항원을 표준물로서 사용하고 HBe 항원에 대해 양성으로 판정되고 항-HBe 항체에 대해 음성으로 판정된 5명의 환자 혈청과 10명의 정상인 혈청을 샘플로서 사용하였다. 100㎕의 샘플에 50㎕의 처리시약(7.5% SDS, 0.75% CHAPS, 0.15% 트리톤 X100, 2M 요소, 0.1M 히스티딘, 0.1M 트립토판)을 첨가하고 56℃로 30분 동안 처리하였다. 처리후 50㎕를 반응용액이 채워진 웰에 첨가하고 실온에서 90분 동안 배양하였다.
대조용으로서(전처리하지 않음), 100㎕의 각 샘플을 50㎕의 정제수로 희석하고 50㎕의 희석된 샘플을 반응에 사용하였다. 세척액으로 5회 세척한 후 바이오틴-표지 항-HBV 코어 모노클로날 항체(동량의 HBc-2, HBc-5와 HBc-14의 혼합물)를 첨가하고 실온에서 30분 동안 항온처리하였다. 세척액으로 5회 세척한 후 아비딘-표지 알카리성 포스포타제를 첨가하고 혼합물을 실온에서 30분 동안 반응시켰다.
세척액으로 5회 세척한 후 CDPstar(감작제로서의 에머랄드 II)를 첨가하고 실온에서 15분 동안 반응시킨다음 이의 상대적 화학발광을 측정하였다. 연속적으로 희석된 재조합 HBV 코어 항원에 대한 표준 곡선이 도 17에 나타나 있고 측정된 샘플내 코어 항원의 양은 표 9에 나타나 있다. 검출 한계는 21ng/㎖이었다. 코어 항원 양성을 코어 항원 음성과 구별짓는 컷오프 값을 60ng/㎖로 정의하였을때 10명의 모든 정상인 혈청은 전처리를 하든 하지않던 코어 항원에 대해 음성으로 판정되었고 B형 간염 바이러스를 보유한 환자의 혈청에서는 전처리되지 않은 경우 코어 항원은 검출할 수 없었으나 전처리한 경우의 모든 혈청은 코어 항원에 대해 양성으로 판정되었다.
B형 간염 바이러스를 보유한 환자의 혈청에 있어서 전처리는 바이러스 입자를 분쇄시키고 항-HBc 항체를 불활성화시킴으로써 코어 항원의 검출을 가능하게 한 것으로 여겨진다. 상기로부터, 본 샘플 처리 방법은 HCV외에 게놈으로서 DNA를 갖는 HBV와 같은 바이러스의 구조 단백질을 검출하는데 유용한 것으로 확인되었다. 물론 이것은 플라비바이러스와 레트로바이러스(예, HIV)와 같은 HCV-연관된 바이러스에 대해서도 마찬가지로 적용된다.
Figure 111999003005503-pct00032
실시예 15. 항원을 전처리하지 않고서 효과적으로 검출하는 방법
HCV 입자-함유 샘플을 계면활성제-첨가된 반응 용액에 희석하고 HCV 항원의 검출 효율을 연구하였다.
HCV 코어 항원에 대한 모노클로날 항체를 사용한 샌드위치 효소면역검정(EIA)에 의해 HCV 코어 항원의 검출을 실시하였다. 실시예 3에서 얻은 모노클로날 항체가운데 C11-3 및 C11-7을 코어 항원을 포획하기 위한 항체로서 사용하였고 C11-10 및 C11-14를 포획된 코어 항원을 검출하기 위한 항체로서 사용하였다.
EIA는 다음의 필수 조건을 사용하여 실시하였다. 아세테이트 완충액중에 4㎍/㎖으로 각각 희석된 모노클로날 항체 C11-3 및 C11-7의 용액을 미소역가 평판에 첨가하고 4℃에서 밤새 배양하였다. 인산염 완충액으로 세척한 후 1% BSA가 함유된 인산염 완충액을 가하여 차단시켰다. 평판에 100㎕의 반응용액과 100㎕의 샘플을 첨가하였다. 이어서, 평판을 교반시키고 실온에서 1.5시간 동안 배양하였다. 저농도의 계면활성제가 첨가된 인산염 완충액으로 세척하여 미반응된 물질을 제거하였다. 그런후 알카리성 포스파타제-표지 모노클로날 항체 C11-10과 C11-14를 첨가하고 실온에서 30분 동안 반응시켰다. 반응이 종료된 후 저농도의 계면활성제가 첨가된 인산염 완충액으로 세척하여 미반응된 물질을 제거하였다. 이어서, 기질 용액(CDPstar/에머랄드 II)를 첨가하고 실온에서 20분 동안 반응시켰다. 발광의 양을 측정하였다.
상기 반응액에 여러가지 계면활성제를 첨가하여 이들의 효과를 연구하였다. HCV에 대한 항체의 역가가 검출 한계이하이고 실제로 HCV에 대한 항체가 전혀 함유되어 있지 않은 HCV-양성 혈청을 사용함으로써, 발광의 양을 기준으로한 코어 항원의 활성을 1.0으로서 정의한 정상인 혈청의 발광 양에 대한 상대적인 반응비로서 표시하였다. 이의 결과는 표 10 및 표 11에 나타나 있다.
Figure 111999003005503-pct00010
Figure 111999003005503-pct00011
상기 결과로부터 트리톤 X100으로 예시된 12 내지 14의 HLB를 갖는 음이온성 계면활성제의 첨가는 발광 양의 증가를 일으키며 그럼으로써 정상인 혈청에 비하여 HCV-양성 혈청에서 검출 민감성을 증가시키는 것으로 나타났다. 또한, 유사하게, 나트륨 도데실-N-사르코시네이트와 도데실 트리메틸암모늄으로 예시된 바로서, 탄소수 10 이상인 직쇄 알킬기와 2급, 3급 또는 4급 아민을 갖는 계면활성제의 첨가는 HCV-양성 혈청에서 검출 민감성을 증가시켜 주는 것이 명백하였다. 이와 같은 민감성의 증가는 탄소수가 8이하인 알킬기를 갖는 계면활성제(n-옥틸 트리메틸암모늄 클로라이드)로는 관찰되지 않았다. 또한, 이들 두 계면활성제를 혼합하고 첨가함으로써(표 11에서 2% 나트륨 도데실-N-사르코시네이트와 2% 트리톤 X100이 혼합되었다), HCV-양성 혈청에서의 검출 민감성은 좀더 증가시킬 수 있는 것으로 밝혀졌다.
실시예 16. HCV 감염후와 항-HCV 항체의 출현전사이의 기간(잠복기)동안에 샘플내 코어 항원의 검출
1차 반응 용액에 2% 트리톤 X100과 2% 나트륨 도데실-N-사르코시네이트를 첨가하여 시판되고 있는 혈청전환 패널 PHV905(B.B.I. Inc.)을 실시예 15에 따라 측정하였다. 사용된 PHV905 패널은 항-HCV 항체 시험(오르토 EIA 3.0)으로 측정하였을때 관찰개시후 21일째 양성으로 전환하였다(혈청 번호 PHV905-7). 이 시험에서, 항체역가는 컷오프 지수(S/CO)로 표시되며 1.0 이상의 값은 양성으로 판명된다. HCV 코어 항원의 활성(발광의 양)을 1.0으로 정의한 정상인 혈청의 활성에 대한 상대적인 반응성(S/N)으로 표시되었다.
표 12에서 보는 바와 같이 코어 항원의 활성은 항-HCV 항체가 출현하기전에 관찰된다. 계면활성제의 첨가는 고정화된 모노클로날 항체와 반응한 바이러스 입자로부터 코어 항원을 노출시켰고 그럼으로써 코어 항원의 검출을 확인시켜 주었다.
Figure 111999003005503-pct00012
특허협력조약 규칙 13-2에서 규정한 미생물 참조
기탁기관명: 통상산업성공업기술원생명공학연구소(the National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology)
기탁기관주소: 일본국 이바라끼현 츠쿠바시 히가시 1-쪼메 1-3(우편번호 305)
(1) 미생물 표시: HC11-3
기탁일: 1997년 7월 4일
기탁번호: FERM BP-6002
(2) 미생물 표시: HC11-7
기탁일: 1997년 7월 4일
기탁번호: FERM BP-6003
(3) 미생물 표시: HC11-10
기탁일: 1997년 7월 4일
기탁번호: FERM BP-6004
(4) 미생물 표시: HC11-11
기탁일: 1997년 7월 4일
기탁번호: FERM BP-6005
(5) 미생물 표시: HC11-14
기탁일: 1997년 7월 4일
기탁번호: FERM BP-6006
<110> Advanced Life Science Institute, INC. <120> Methods for detecting or assaying virus <130> 5-1999-052777-6 <150> JP-P-1997-00209515 <151> 1997-08-04 <150> JP-P-1997-00209522 <151> 1997-08-04 <150> JP-P-1998-00218136 <151> 1998-07-31 <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 177 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 1 Met Lys Ala Ile Phe Val Leu Lys Gly Ser Leu Asp Arg Asp Pro Glu 1 5 10 15 Phe Met Gly Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr 20 25 30 Asn Arg Arg Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val 35 40 45 Gly Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg 50 55 60 Ala Thr Arg Lys Thr Ser Lys Arg Ser Gln Pro Arg Gly Gly Arg Arg 65 70 75 80 Pro Ile Pro Lys Asp Arg Arg Ser Thr Gly Lys Ser Trp Gly Lys Pro 85 90 95 Gly Tyr Pro Trp Pro Leu Tyr Gly Asn Glu Gly Leu Gly Trp Ala Gly 100 105 110 Trp Leu Leu Ser Pro Arg Gly Ser Arg Pro Ser Trp Gly Pro Thr Asp 115 120 125 Pro Arg His Arg Ser Arg Asn Val Gly Lys Val Ile Asp Thr Leu Thr 130 135 140 Cys Gly Phe Ala Asp Leu Met Gly Tyr Ile Phe Arg Val Gly Ala Phe 145 150 155 160 Leu Gly Gly Ala Ala Arg Ala Leu Ala His Gly Val Arg Val Leu Glu 165 170 175 Asp <210> 2 <211> 160 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 2 Met Gly Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn 1 5 10 15 Arg Arg Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly 20 25 30 Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala 35 40 45 Thr Arg Lys Thr Ser Lys Arg Ser Gln Pro Arg Gly Gly Arg Arg Pro 50 55 60 Ile Pro Lys Asp Arg Arg Ser Thr Gly Lys Ser Trp Gly Lys Pro Gly 65 70 75 80 Tyr Pro Trp Pro Leu Tyr Gly Asn Glu Gly Leu Gly Trp Ala Gly Trp 85 90 95 Leu Leu Ser Pro Arg Gly Ser Arg Pro Ser Trp Gly Pro Thr Asp Pro 100 105 110 Arg His Arg Ser Arg Asn Val Gly Lys Val Ile Asp Thr Leu Thr Cys 115 120 125 Gly Phe Ala Asp Leu Met Gly Tyr Ile Phe Arg Val Gly Ala Phe Leu 130 135 140 Gly Gly Ala Ala Arg Ala Leu Ala His Gly Val Arg Val Leu Glu Asp 145 150 155 160 <210> 3 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 3 Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly Gly Val Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Pro Arg Arg 20 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 4 Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala Thr Arg 1 5 10 <210> 5 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 5 Pro Arg Gly Ser Arg Pro Ser Trp Gly Pro Thr Asp Pro Arg His Arg 1 5 10 15 Ser Arg Asn Val Gly 20 <210> 6 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 6 Asp Pro Arg His Arg Ser Arg Asn Val Gly Lys Val Ile Asp Thr Leu 1 5 10 15 Thr Cys Gly Phe 20 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe, synthetic DNA <400> 7 gaattcatgg gcacgaatcc taaa 24 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe, synthetic DNA <400> 8 ttagtcctcc agaacccgga c 21

Claims (35)

  1. (1) 음이온성 계면활성제 및 (2) 양쪽성 계면활성제, 비이온성 계면활성제 또는 단백질 변성제를 함유한 처리 용액으로 C형 간염 바이러스(HCV) 또는 B형 간염 바이러스(HBV)-함유 샘플을 처리함으로써, 바이러스 항원의 노출 또는 유리와 바이러스 항원에 대한 항체의 파괴를 동시에 실시하는 것을 특징으로 하는 당해 바이러스-함유 샘플의 처리 방법.
  2. (1) 음이온성 계면활성제, (2) 양쪽성 계면활성제 및 (3) 비이온성 계면활성제 또는 단백질 변성제를 함유한 처리 용액으로 HCV 또는 HBV-함유 샘플을 처리함으로써, 바이러스 항원의 노출 또는 유리와 바이러스 항원에 대한 항체의 파괴를 동시에 실시하는 것을 특징으로 하는 당해 바이러스-함유 샘플의 처리 방법.
  3. (1) 음이온성 계면활성제, (2) 양쪽성 계면활성제, (3) 비이온성 계면활성제 및 (4) 단백질 변성제를 함유한 처리 용액으로 HCV 또는 HBV-함유 샘플을 처리함으로써, 바이러스 항원의 노출 또는 유리와 바이러스 항원에 대한 항체의 파괴를 동시에 실시하는 것을 특징으로 하는 당해 바이러스-함유 샘플의 처리 방법.
  4. 제1항 내지 제3항중 어느 한 항에 있어서, 처리 용액이 요소, 이미다졸 환-함유 화합물 또는 인돌 환-함유 화합물을 추가로 함유하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 이미다졸 환-함유 화합물이 이미다졸, 히스티딘, 이미다졸아크릴산, 이미다졸카르복시알데하이드, 이미다졸카르복스아미드, 이미다졸디온, 이미다졸디티오카르복실산, 이미다졸디카르복실산, 이미다졸메탄올, 이미다졸리딘 티온, 이미다졸리돈, 히스타민 또는 이미다조피리미딘인 방법.
  6. 제4항에 있어서, 인돌 환-함유 화합물이 트립토판, 인돌아크릴산, 인돌, 인돌아세트산, 인돌아세트 하이드라자이드, 메틸 인돌아세테이트, 인돌부티르산, 인돌아세토니트릴, 인돌카르비놀, 인돌카르복시알데하이드, 인돌카르복실산, 인돌에탄올, 인돌락트산, 인돌메탄올, 인돌프로피온산, 인돌피루브산, 인돌릴 메틸 케톤, 인도마이신, 인돌아세톤, 인도메타신, 인도프로펜 또는 인돌아민인 방법.
  7. (1) 카오트로픽(chaotropic) 이온 및 (2) 산성화제를 함유한 처리 용액으로 HCV 또는 HBV-함유 샘플을 처리함으로써, 바이러스 항원의 노출 또는 유리와 바이러스 항원에 대한 항체의 파괴를 동시에 실시하는 것을 특징으로 하는 당해 바이러스-함유 샘플의 처리 방법.
  8. (1) 카오트로픽 이온, (2) 산성화제 및 (3) 비이온성 계면활성제를 함유한 처리 용액으로 HCV 또는 HBV-함유 샘플을 처리함으로써, 바이러스 항원의 노출 또는 유리와 바이러스 항원에 대한 항체의 파괴를 동시에 실시하는 것을 특징으로 하는 당해 바이러스-함유 샘플의 처리 방법.
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 바이러스 항원의 존재를 검출 또는 정량하기 위하여 제1항 내지 제3항, 제7항 및 제8항중 어느 한 항에 따른 샘플 처리 방법을 사용하고 HCV 또는 HBV 항원을 특이적으로 인지하는 프로브와 샘플을 반응시킴을 특징으로 하는 바이러스 검정 방법.
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 제12항의 면역검정 방법에 사용하고 음이온성 계면활성제를 포함하며 샘플내 HCV 또는 HBV의 유무를 측정하기 위한 키트.
  16. 제12항의 면역검정 방법에 사용하고 HC11-11(FERM BP-6005), HC11-14(FERM BP-6006), HC11-10(FERM BP-6004), HC11-3(FERM BP-6002) 및 HC11-7(FERM BP-6003)으로 이루어진 그룹중에서 선택되는 하이브리도마에 의해 생성된 모노클로날 항체를 포함하며 샘플내 HCV의 유무를 측정하기 위한 키트.
  17. 제12항의 면역검정 방법에 사용하고 카오트로픽제를 포함하며 샘플내 HCV 또는 HBV의 유무를 측정하기 위한 키트.
  18. 제12항의 면역검정 방법에 사용하고 하이브리도마 HC11-14(FERM BP-6006), HC11-10(FERM BP-6004) 또는 HC11-11(FERM BP-6005)에 의해 생성된 모노클로날 항체를 포함하며 샘플내 HCV의 유무를 측정하기 위한 키트.
  19. 제15항 내지 제17항중 어느 한 항에 있어서, 요소, 이미다졸 환-함유 화합물 또는 인돌 환-함유 화합물을 추가로 함유하는 키트.
  20. 제19항에 있어서, 이미다졸 환-함유 화합물이 이미다졸, 히스티딘, 이미다졸아크릴산, 이미다졸카르복시알데하이드, 이미다졸카르복스아미드, 이미다졸디온, 이미다졸디티오카르복실산, 이미다졸디카르복실산, 이미다졸메탄올, 이미다졸리딘티온, 이미다졸리돈, 히스타민 또는 이미다조피리딘인 키트.
  21. 제19항에 있어서, 인돌 환-함유 화합물이 트립토판, 인돌아크릴산, 인돌, 인돌아세트산, 인돌아세트 하이드라자이드, 메틸 인돌아세테이트, 인돌부티르산, 인돌아세토니트릴, 인돌카르비놀, 인돌카르복시알데하이드, 인돌카르복실산, 인돌에탄올, 인돌락트산, 인돌메탄올, 인돌프로피온산, 인돌피루브산, 인돌릴 메틸 케톤, 인도마이신, 인돌아세톤, 인도메타신, 인도프로펜 또는 인돌아민인 키트.
  22. 탄소수 10 이상의 알킬기와 2급, 3급 또는 4급 아민을 갖는 계면활성제 또는 친수성/친유성 평형(HLB)이 12 내지 14인 비이온성 계면활성제의 존재하에서 프로브와의 결합을 기준으로 HCV 항원을 전처리 없이 측정함을 특징으로 하는 바이러스 검정 방법.
  23. 제22항에 있어서, 탄소수 10 이상의 알킬기와 2급, 3급 또는 4급 아민을 갖는 계면활성제가 탄소수 10 내지 20의 알킬기와 3급 또는 4급 아민을 갖는 계면활성제인 방법.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서, 3급 또는 4급 아민 계면활성제가 도데실-N-사르코신산, 세틸 또는 도데실트리메틸암모늄 염, 3-(도데실디메틸암모니오)-1-프로판설폰산, 도데실피리미듐 염 또는 데카노일-N-메틸글루카미드(MEGA-10)인 방법.
  25. 제22항에 있어서, 비이온성 계면활성제가 폴리옥시에틸렌 이소옥틸 페닐 에테르 또는 폴리옥시에틸렌 노닐 페닐 에테르인 방법.
  26. 제22항에 있어서, 바이러스 항원 프로브가 바이러스 항원에 대한 항체인 방법.
  27. 삭제
  28. 삭제
  29. 삭제
  30. HCV 코어 영역의 100번 내지 120번 아미노산 또는 111번 내지 130번의 아미노산 서열을 인지하는 항체를, HCV 코어 영역의 당해 아미노산 서열의 부분을 노출시킬 수 있는 계면활성제의 존재하에 사용함을 특징으로 하는, 샘플내 HCV를 검출하거나 측정하는 방법.
  31. (1) HCV 코어 영역의 100번 내지 120번 아미노산 서열 또는 111번 내지 130번 아미노산 서열을 인지하는 항체 및
    (2) HCV 코어 영역의 당해 아미노산 서열부분을 노출시킬 수 있는 계면활성제를 포함하는, 제30항에 따른 방법에 사용하기 위한 키트.
  32. 제30항에 있어서, 계면활성제가,
    (1) (a) 음이온성 계면활성제 및 (b) 양쪽성 계면활성제, 비이온성 계면활성제 또는 단백질 변성제의 배합물,
    (2) 탄소수 10이상의 알킬 그룹 및 2급, 3급 또는 4급 아민을 갖는 계면활성제 및
    (3) 친수성/친유성 평형(HLB)이 12 내지 14인 비이온성 계면활성제로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  33. 제31항에 있어서, 계면활성제가,
    (1) (a) 음이온성 계면활성제 및 (b) 양쪽성 계면활성제, 비이온성 계면활성제 또는 단백질 변성제의 배합물,
    (2) 탄소수 10이상의 알킬 그룹 및 2급, 3급 또는 4급 아민을 갖는 계면활성제 및
    (3) 친수성/친유성 평형(HLB)이 12 내지 14인 비이온성 계면활성제로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 키트.
  34. HCV 코어 영역의 100번 내지 120번 아미노산 또는 111번 내지 130번의 아미노산 서열을 인지하는 항체를, HCV 코어 영역의 당해 아미노산 서열부분을 노출시킬 수 있는 카오트로픽 이온 및 산성화제의 존재하에 사용함을 특징으로 하는, 샘플내 HCV를 검출하거나 측정하는 방법.
  35. (1) HCV 코어 영역의 100번 내지 120번 아미노산 서열 또는 111번 내지 130번 아미노산 서열을 인지하는 항체 및
    (2) HCV 코어 영역의 당해 아미노산 서열부분을 노출시킬 수 있는 카오트로픽 이온 및 산성화제를 포함하는, 제34항에 따른 방법에 사용하기 위한 키트.
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