JP4353793B2 - Hcv抗原とhcv抗体との同時検出のための方法 - Google Patents
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Description
本発明は、試験サンプル中の少なくとも1つのC型肝炎ウイルス(HCV)抗原と少なくとも1つのHCV抗体とを同時に検出する方法であって、a)該試験サンプルを、1)抗体/抗原複合体の形成に十分な時間にわたり及び条件下、固相(例えば、微粒子)上にコートされた、少なくとも1つのHCVウイルス抗原またはその一部と、および2)抗原/抗体複合体の形成に十分な時間にわたり及び条件下、該固相上にコートされた、HCVに対する少なくとも1つの抗体またはその一部と接触させる段階、b)該抗体/抗原複合体を検出する段階(該複合体の存在は、該試験サンプル中の少なくとも1つのHCV抗原の存在を示す)、およびc)該抗原/抗体複合体を検出する段階(該複合体の存在は、該試験サンプル中の少なくとも1つのHCV抗体の存在を示す)を含んでなる方法を含む。該固相上にコートされた少なくとも1つのHCV抗原は、例えば、コア抗原、NS3、NS4、NS5およびそれらの一部(または断片)でありうる。該固相上にコートされた少なくとも1つの抗体は、例えば、13−959−270、14−1269−281、14−1287−252、14−153−234、14−153−462、14−1705−225、14−1708−269、14−1708−403、14−178−125、14−188−104、14−283−112、14−635−225、14−726−217、14−886−216、14−947−104、14−945−218、107−35−54、110−81−17、13−975−157、14−1350−210、C11−3、C11−7、C11−10、C11−14およびC11−15よりなる群から選ばれるモノクローナル抗体でありうる。さらに、該固相上にコートされた少なくとも1つのモノクローナル抗体は、好ましくは、該固相上にコートされた少なくとも1つの抗原に対して反応性ではない。特に、前記の少なくとも1つのモノクローナル抗体はHCV抗コアモノクローナル抗体であることが可能であり、前記の少なくとも1つの抗原は組換えHCVコアタンパク質であることが可能である。該組換えコアタンパク質は、該抗コアモノクローナル抗体が結合するエピトープを含有しない。
本発明は、生物学的サンプル中のHCVの抗原およびHCVに対する抗体を同時に検出するために使用しうる種々の方法に関する。したがって、個体が、被検生物学的サンプル中に、HCVに対する特異的抗体を産生している、および/または、HCV特異的抗原を有する場合、本発明の方法は陽性結果を与える。そのような結果は、例えば、感染(すなわち、急性または慢性)の存在および状態に関して患者を診断するために並びに輸血のための献血または血液製剤サンプルの適合性を判定するために用いることができる。
モノクローナル抗体により認識されるHCVコアエピトープのマッピング
各モノクローナル抗体が結合するHCVコアタンパク質内の領域を決定するために、一連の重複するビオチン化ペプチドを合成した(表I)。これらのペプチドは、後記のとおり、EIAを行うために使用した。後記のものに類似したEIA法を用いて、すべてのモノクローナル抗体が組換えHCVコア融合タンパク質を検出し得たことに注目すべきである(データ非表示)。
0.25インチのポリスチレンビーズを、ペプチドEIAの固相として使用した。コーティングに先だって、ビーズを、攪拌することなく、15% イソプロパノール(水中)で室温で30分間洗浄した。イソプロパノールを除去し、該ビーズを脱イオン水で1回すすいだ。ついで、洗浄したビーズを、0.1M リン酸ナトリウムバッファー(pH7.5)で5μg/mlに希釈した該ペプチドを含有するバイアルに加えた(0.233ml/ビーズ)。ビーズを、回転させて混合しながら56℃で2時間インキュベートした。ついでビーズをPBSで3回洗浄し、ついで、0.1%Triton X−100を含有するPBS中、回転させて混合しながら40℃で1時間インキュベートした。ビーズを再びPBS中で3回洗浄し、ついで5% BSA/PBS中、回転させて混合しながら40℃で1時間インキュベートした。ビーズをPBSで4回洗浄し、ついで、5% スクロースを含有するPBS中、混合せずに室温で20分間インキュベートした。スクロースバッファーを除去し、ビーズを風乾させた。コートされたビーズを、乾燥した状態で4℃で保存した。
該ビオチン化ペプチドが実際に該ビーズ上にコートされたかどうかを確認するために、アッセイを行った。該アッセイにおいては、ホースラディッシュペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン(200〜400ng/ml)を含有するバッファー中でビーズをインキュベートした。ついで該ビーズを脱イオン水で洗浄し、基質を加えた。生成物は、492nmの吸光度によって検出された。このアッセイにより、表Iのすべてのペプチドが該ポリスチレンビーズ上にコートされたことが示された(データ非表示)。
組換えHCVコアタンパク質に対して産生させたモノクローナル抗体(実施例Iを参照されたい)を、以下のとおりに、ペプチドコート化ビーズのそれぞれに結合するそれらの能力について試験した。モノクローナル抗体をサンプル希釈バッファー(20% ヤギ血清、10% 仔ウシ血清、0.2% Triton X−100およびアジ化ナトリウムを含有するTrisバッファー)で50ng/mlに希釈し、その0.2mlを、該ペプチドコート化ビーズを含有する反応ウェルに加え、混合しながら室温で2時間インキュベートした。ついでビーズを脱イオン水で洗浄し、ついで、0.2mlのペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスIgG(0.3μg/ml)を加えた。ビーズを、混合しながら室温で60分間インキュベートした。ビーズを脱イオン水で洗浄し、0.3mlのOPD(0.02% H2O2を含有するクエン酸バッファー中の0.3% O−フェニレンジアミン−2HCl)基質を加えたプラスチックチューブへ移し、混合せずに暗室中、室温で30分間インキュベートした。1mlの1N H2SO4を加えて反応をクエンチし、492nmでのODを測定した。該吸光度は、該ビーズに結合した抗体の量に正比例する。
前記のアッセイを用いて、該モノクローナル抗体のそれぞれを、該HCVコア由来ペプチドコート化ビーズのそれぞれに結合するそれらの能力についてアッセイした。モノクローナル抗体が特定のペプチドコート化ビーズに結合することが判明した場合には、該モノクローナル抗体の10倍系列希釈を行い、ついでそれらを、同じペプチドへの結合についてアッセイした。これにより、各モノクローナル抗体の結合特異性の決定が可能となった。表IIに示す結果は、結合(バックグラウンドの少なくとも3倍の吸光度)を示したモノクローナル抗体の最低希釈度を示す。
モノクローナル抗体のエピトープマッピング
A.HCV遺伝子断片ライブラリーの調製
ランダムなエピトープコード化断片を得るために、HCVのH系統(Ogataら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:3392−3396(1991))のヌクレオチド14−5295をpGEM−9Zf(−)(Promega Corp.,Madison,WI)中に含有するプラスミドを、以下の方法によりDNアーゼIを使用して部分消化した。
バイオパンニングに使用する各モノクローナル抗体(20μg)を、300μlのブロッキングバッファー(2% BSA、3% 脱脂粉乳、0.2% Tween 20、0.02% アジ化ナトリウムを含有するリン酸緩衝食塩水)中、回転振とう機上で4℃で4時間インキュベートした。該モノクローナル抗体のインキュベート中に、約1011個のファージを含有する増幅されたHCV遺伝子断片ライブラリー(前掲)のアリコートを以下のとおりに沈殿させた。1/10容量の5M NaClを該ファージに加え、よく混合し、ついで1/6容量のポリエチレングリコール(MW 8000)を加え、再びよく混合し、氷上で1〜2時間インキュベートした。該ファージを室温で6000×gで10分間遠心分離をし、全上清を除去し、該ファージペレットを1M NaCl、10mM Tris−HCl(pH8.0)、1mM EDTAを含有するバッファー120μlに激しく再懸濁した。該ファージを、プレインキュベートされたモノクローナル抗体に加え、回転振とう機上で4℃で一晩インキュベートした。
HCVヌクレオキャプシドタンパク質のアミノ酸1−173をコードするHCVゲノムの領域を含有するDNA断片を、ハイブリダイゼーションプローブとして利用した。この領域を選択したのは、該バイオパンニング実験で分析したモノクローナル抗体のすべてが該HCVコアタンパク質内のエピトープを認識するからである。バイオパンニングおよび増幅の2〜3ラウンドから得られたファージを大腸菌(E.coli)BLT5403上にプレーティングし、プラークが形成されるまで37℃でインキュベートした。DNAをHybond−N+メンブレン(Amersham Life Sciences,Inc.,Arlington Heights,IL)上にトランスファーし、変性させ、中和し、UV架橋した(これらは該製造業者の指示通りに行った)。該メンブレンを、当技術分野において記載され公知である方法により、HCVヌクレオキャプシド遺伝子32P標識プローブとプレハイブリズさせ、ハイブリダイズさせ、洗浄し、露光した。個々のハイブリダイズしたプラークを単離し、該インサートを、T7SelectUPおよびT7SelectDOWNプライマー(Novagen,Inc.,Madison,WI)をT7 Select System Manualの指示通りに使用するPCRにより増幅した。各モノクローナル抗体について、独立した30〜50個のハイブリダイズしたプラークを増幅し、ついでQIAquickPCR精製キット(Qiagen,Inc.,Chatsworth,CA)を用いて精製した。精製されたPCR産物を、ABI Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reactionキット(Perkin−Elmer)およびT7SelectUPプライマーを用いて、ABI Model 377 DNA Sequencerで、直接的に配列決定した。特定のモノクローナル抗体を用いたバイオパンニングにより得られた配列のすべてを、HCVヌクレオキャプシド遺伝子配列と共に整列させ、すべてのクローンにおける重複の最小領域を同定した。この重複領域は、該モノクローナル抗体により認識されるエピトープを決定した。この方法を用いて同定したいくつかのモノクローナル抗体により認識されるエピトープを、表IIIに示す。
HCVコア抗体/抗原組合せアッセイに使用する組換え抗原の構築
A.背景
C型肝炎ウイルス(HCV)コアに対するヒトの免疫応答は、ほとんどの場合、専ら該天然タンパク質のN末端半分に対するものである。複数のエピトープ(一定数のアミノ酸(通常<10)を含む領域)が、該天然タンパク質の最初の115アミノ酸中に同定されている(Sallbergら)。したがって、感染個体の血清中に存在するヒト抗コア抗体の検出のためのアッセイに利用される組換え抗原は、該天然タンパク質のこの部分を含有していれば十分である。逆に、HCVコアタンパク質の検出のためのインビトロアッセイは、感染個体の血清中に同様に存在する天然コアタンパク質を捕捉し検出するためにマウスモノクローナル抗体を利用する。コア抗原とヒト抗コア抗体との両方を単一のアッセイで同時に検出するための組合せアッセイは、それらの2つのアッセイ形態を兼ね備えたものである。この場合、該血清中に存在するヒト抗コア抗体によって認識されるが、該血清中に同様に存在する天然コア抗原の捕捉および検出に使用するマウスモノクローナル抗体による認識を免れる組換えコア抗原が必要である。該コア抗原内の小領域(1〜30またはそれ以上のアミノ酸)を除去して、該マウスモノクローナル抗体により認識されるエピトープを破壊または除去し、一方同時に、ヒト抗コア抗体検出を可能にする多数の他のエピトープを無傷のまま残すことにより、そのような組換え体を構築することが可能である。
構築したこれらの抗原の最初のものは、該組換え体からアミノ酸32−50が除去されたHCVアミノ酸8−100を含有していた。この場合、それぞれアミノ酸32−36および45−50にあるエピトープに結合する抗体C11−10およびC11−14(実施例II)は、生じた組換え抗原には結合しないであろう。HCVのH系統(Ogata、前掲(1991))からのヌクレオチド342−791の細菌コドン最適化形態を含有するプラスミドを、PCRの鋳型として用いた。この配列用に設計されたオリゴヌクレオチドプライマーを、HCVコア抗原の別々の2つの断片(1=配列番号1および配列番号2;2=配列番号3および配列番号4)(一方は該欠失の上流、もう一方は該欠失の下流)を増幅するために使用した。さらに、各断片上の欠失に隣接するオリゴヌクレオチドプライマー(配列番号2および3)は、互いに重複する領域を含有していた。PE−9600サーモサイクラー内で、0.5μMの各オリゴヌクレオチドプライマーおよび3〜5pgのプラスミド鋳型の存在下、TaKaRa LA Taq PCR Kit(Pan Vera,Corp.,Madison,WI)を該製造業者の指示に従い使用して、PCRを行った(50μl容量)。94℃で1分間のプレインキュベーションについで35サイクルのPCR(94℃で20秒間の変性、50℃で30秒間のアニーリング、72℃で30秒間の伸長)を行い、ついで72℃で10分間の最終伸長を行った。それらの2つの断片の独立した増幅の後、QIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN,Inc.,Valencia,CA)を用いて、それぞれを精製し、25μlの水中に溶出した。ついで、それらの2つの精製断片(20μlの容量の反応液中のそれぞれ1μl)を該オリゴヌクレオチドプライマー(配列番号2および配列番号3)内の重複領域において互いに連結するために、PCRの第2ラウンドを前記のとおりに10サイクル行った。最後に、該第2PCRの産物を、0.5μMの隣接オリゴヌクレオチドプライマー(配列番号1および配列番号4)および前記の条件(100μl容量)を用いる35サイクルの第3PCRにおいて増幅した。
該第3PCRの産物を、QIAquick PCR Purification Kitを用いて精製し、ついで制限酵素EcoRIおよびBamHIで、隣接オリゴヌクレオチドプライマー(配列番号1および配列番号4)中に取り込まれた該消化部位を消化した。該組換え体をコードする断片を、pGEM−T Easy Ligation Kit(Promega,Madison,WI)を用いて、EcoRIおよびBamHIで同様に消化された細菌発現ベクターpJO200に連結し、ついでXL1−Blueコンピテント細胞(Stratagene,La Jolla,CA)中に形質転換した。適当な大きさにされたインサートを含有するクローンの選択の後に、該組換え体のヌクレオチド配列が確認され(配列番号5)、その推定アミノ酸配列(配列番号6)が示されている(組換えタンパク質の発現の記載については、米国特許第5,322,769号および米国特許第6,172,189号を参照されたい)。
いくつかの他のHCVコア組換え体を前記と同じ方法で構築し、クローニングし、発現した。これらの最初のもの(ヌクレオチド配列配列番号7および対応アミノ酸配列配列番号8を参照されたい)は、アミノ酸33−35および46−49が欠失したHCVアミノ酸8−100を含有する。第1 PCRにおいて2つの断片を増幅するために使用したオリゴヌクレオチドプライマーは、それぞれ配列番号1および配列番号9、ならびに配列番号10および配列番号4であった。ついで第3 PCRにおいて、配列番号1および配列番号4を用いて最終増幅を行った。これらの組換え体の第2のもの(ヌクレオチド配列配列番号11および対応アミノ酸配列配列番号12を参照されたい)は、アミノ酸36のロイシン残基がバリンで置換されアミノ酸47のアルギニン残基がロイシンで置換されたHCVアミノ酸8−100をコードする。第1 PCRにおいて2つの断片を増幅するために使用したオリゴヌクレオチドプライマーは、それぞれ配列番号1および配列番号13、ならびに配列番号14および配列番号4であった。ついで配列番号1および配列番号4を用いて第3 PCRで最終増幅を行った。最終的に、HCVアミノ酸8−100をコードする組換え体(ヌクレオチド配列配列番号15および対応アミノ酸配列配列番号16を参照されたい)が、単一のPCR反応において、オリゴヌクレオチドプライマー配列番号1および配列番号4を用いて構築された。
HCVコア抗体/抗原組合せアッセイにおいて使用する追加的組換え抗原の構築
A.背景
HCV抗原/抗体組合せアッセイにおいて使用するために構築した追加的組換え抗原は、該ウイルスのコア領域へ連結されたHCVの33c領域(アミノ酸1192−1457)を含有する抗原を含んでいた。そのような構築のために用いた鋳型は、アミノ酸1192−1457の細菌コドン最適化配列およびそれに続くHCVのH系統(Ogata,1991)由来のアミノ酸1−150を、それらの2つの配列を分離する2つの非HCVコード化アミノ酸と共に含有するプラスミドであった。この組換え体(HC−43)は、HCVの検出のための多数の商業的アッセイにおいて常套的に使用される。HC43組換え体は、バクテリオファージλのpLプロモーターから非融合タンパク質として発現される(HC43の考察には、米国特許第5,705,330号、米国特許第5,616,460号および米国特許第5,773,212号を、λpLベクター系の考察には、米国特許第6,153,377号および米国特許第5,859,193号を参照されたい)。該追加的組換え体は、2つの方法のうちの1つにより構築した。まず、別々の関連した組換え体をコードする既存クローンをDNAライゲーションにより連結して、第3の特有の組換え体を形成させるか、あるいは実施例III、B部に記載の連結PCRにより新規の特有のクローンを構築した。
構築した、より新しい抗原の最初のもの(p9MB−18)は、アミノ酸32−50が欠失したアミノ酸1−100(コアタンパク質のセグメントを表す)に連結されたHCVアミノ酸1192−1457(NS3のセグメントを表す)を含有していた。この組換え体は、エンドヌクレアーゼXmaIおよびBamHIでプラスミドpHC43を制限消化することにより構築した。XmaIはpHC43を該コアコード化領域のアミノ酸24の近傍で切断し、一方、BamHIは翻訳終止コドンの下流で切断する。pHC43のこの領域を、pGEM−T Easy Ligation Kit(Promega Corp.,Madison,WI)を使用するDNAライゲーションにより、実施例IIIに記載の32−50が欠失したHCVコアアミノ酸8−100をコードするpJO200ベクター(配列番号5および配列番号6)から得たXmaI−BamHI断片で置換した。ついで、その新たなプラスミドを、XL1−Blueコンピテント細胞(Stratagene,La Jolla,CA)を形質転換するために使用した。適当な大きさにされたインサートを含有するクローンの選択後、該組換え体のヌクレオチド配列が確認され(配列番号17)、その推定アミノ酸配列が配列番号18に示されている。
連結PCRにより作製される組換え抗原を、実施例III、B部に詳細に記載されているとおりに構築した。これらの組換え体の最初のものであるp9MB−19(配列番号19(ヌクレオチド配列)および配列番号20(アミノ酸配列))は、HCVアミノ酸1192−1457、およびそれに続く、アミノ酸32−50が欠失したアミノ酸8−100を含有する。第1 PCRにおいて最初の2つの断片を増幅するために使用したオリゴヌクレオチドプライマーは、それぞれ配列番号21および配列番号22、ならびに配列番号23および配列番号4であった。第3 PCRにおける最終増幅では、配列番号21および配列番号4のオリゴヌクレオチドプライマーを使用した。
組換え体p9MB−24(配列番号35および配列番号36)は、HCVアミノ酸1192−1457、ならびにそれに続く、該組換え体からアミノ酸33−35および46−49が欠失したHCVアミノ酸1−100を含有する。この組換え体は、プラスミドpHC43をエンドヌクレアーゼXmaIおよびBamHIで制限消化し、該断片を、配列番号7から得られたXmaI−BamHI断片でDNAライゲーションにより置換することにより構築した。
微粒子の調製
いくつかのモノクローナル抗体でコートされた微粒子を、HCVコアタンパク質内の種々の領域を認識するHCVモノクローナル抗体で微粒子のいくつかの分離した集団をコートすることにより調製した。同様に、HCVのNS3およびNS4領域からクローニングされた組換え抗原で微粒子をコートした。微粒子のコーティングに使用したペプチドは、HCVのコア領域由来であった。
以下の組換えタンパク質およびペプチドを、抗体アッセイ用の微粒子をコートするために使用した。
i.HCV HC43抗原HCV
HC43組換え抗原を、Chiron Corporation、Emeryville,CA.より入手した。それは、HCV−1(前記のとおり、GenBank(登録商標)より入手可能なアミノ酸配列)のアミノ酸配列1−150(コアタンパク質に相当する)および1192−1457(NS3中のアミノ酸残基に相当する)を含有していた。
HCV C―100組換え抗原を、Chiron Corporation、Emeryville,Calif.より入手した。それは、HCV−1(前記のとおり、GenBank(登録商標)より入手可能)のアミノ酸配列1569−1961(NS4のアミノ酸残基に相当する)を含有していた。
HCV NS5組換え抗原を、Chiron Corporation、Emeryville,Calif.より入手した。それは、HCV(前記のとおり、GenBank(登録商標)より入手可能)のアミノ酸配列2054−2995を含有していた。
HCV HC31組換え抗原を、Chiron Corporation、Emeryville,Calif.より入手した。それは、HCVのアミノ酸配列1192−1457、およびNS4領域のアミノ酸配列1676−1931を含有していた。さらに、それは、CKS(前記のとおり、GenBank(登録商標)より入手可能)の239アミノ酸よりなる。
i.HCV HC43/C100微粒子の調製
HC43およびc−100の両方でコートされた微粒子を、以下の方法で調製した。簡潔に説明すると、微粒子(10% 重量/容量、0.7〜0.9ミクロン、Seradyn,Indianapolis,Ind.より入手可能)の500μl アリコートを962μlのコーティングバッファー(Tween−20を含有するリン酸バッファー(pH5.0))と室温で約1分間混合した。ついで、154μlのHCV C100−3抗原溶液(0.65mg/ml)および308μlのHC43抗原溶液(650μg/ml)を該微粒子溶液に加え、室温で16時間、回転させて混合した。該微粒子をエッペンドルフ(Eppendorf)ミクロ遠心機(microfuge)で12,000×gで10分間ペレット化した。該懸濁液を除去し、該微粒子を洗浄バッファー(リン酸塩、NaCl、ジチオトレイトール−DTT、EDTA、ドデシル硫酸ナトリウム−SDS、pH6.5)で洗浄し、56℃で20時間、熱ストレスに付した。ついで該微粒子を、2.0%の最終濃度で、2.5mlの微粒子希釈剤(リン酸バッファー(pH6.5)、EDTA、DTT、NaClおよびSDS、スクロース、アジ化物)に再懸濁させた。
530μlのHCV NS5コーティングバッファー(炭酸塩(pH10)、SDS)および200μlの10% 重量/容量、0.7〜0.9ミクロンの微粒子(Seradyn,Indianapolis,Indより入手可能)を270μlのHCV NS5抗原溶液(650μg/mlの濃度)に加えた。該微粒子を、室温で16時間、回転させて混合した。該微粒子をエッペンドルフ ミクロ遠心機で12,000×gで10分間のペレット化した。該懸濁液を除去し、該微粒子を洗浄バッファー(リン酸塩、NaCl、DTT、EDTA、SDS、pH6.5)で洗浄し、56℃で20時間、熱ストレスに付した。ついで、その洗浄した微粒子を、0.4%の最終濃度で、2.5mlの微粒子希釈剤(リン酸バッファー(pH6.5)、EDTA、DTT,NaClおよびSDS、スクロース、アジ化物)に再懸濁させた。
微粒子の100μl アリコート(10% 重量/容量、0.7〜0.9ミクロン、Seradyn,Indianapolis,Indより入手可能)を452μlのコーティングバッファー(Tween−20を含有するリン酸バッファー(pH5.0))と室温で約10分間混合した。ついで、200μgのCKS−33C−BCD Agを加え、室温で16時間混合した。
実施例(IV)(A1)(i)に記載のとおりに調製した220μlのHCV HC43/C100微粒子と、実施例(IV)(A1)(ii)に記載のとおりに調製した330μlのHCV NS5微粒子とを混合した。この混合物を室温で15分間インキュベートし、微粒子希釈剤(リン酸バッファー(pH6.5)、EDTA、DTT、NaCl、スクロースおよびSDS、スクロース)で50mlに希釈した。。
自動化ペプチドシンセサイザーを使用する合成中に、HCVコアペプチド aa11−28がN末端において>90%の純度でビオチン化された。
カルボキシル化微粒子(10% 重量/容量、0.227ミクロン、Seradyn,Indianapolis,Ind)の4ml アリコートを2486μlのカップリングバッファー(MES(2−(N−モルホリノ)エタンスルホン酸)pH6.7)と室温で10分間混合した。ついで114.4μlのEDAC溶液(カップリングバッファー中10mg/ml)を該微粒子溶液に加え、室温で15分間混合した。続いて、1mlのストレプトアビジン溶液(PBS中、1mg/ml)を該活性化微粒子に加え、室温で16時間回転させた。ついで、調製された微粒子を、エッペンドルフ・ミクロ遠心機で12,000×gで3分間ペレット化した。該上清を除去し、該微粒子を4mlのPBSに再懸濁させた。該遠心分離過程をもう1回繰り返し、微粒子を4mlのPBS中に保存して、約1%の最終濃度を得た。
実施例(IV)(A1)(vi)から得た1mlのコート化微粒子に、実施例(V)(A1)(v)から得た375μlのHCVコアペプチドとPBSバッファー中の1mg/mlの11−28aaとを加えた。ついで該混合物を室温で2時間インキュベートした。調製された微粒子を洗浄バッファー(DTT、EDTA、SDSを含有するPBS、pH6.5)で洗浄し、該微粒子を1mlの微粒子希釈剤(仔ウシ血清、ウマIgG、TWEEN 20、BSA、カゼイン、EDTA、スクロースおよびプロクリン(Proclin)、pH6.5)に、1%の固体最終濃度になるよう再懸濁した。
B.モノクローナル抗体の調製
モノクローナル抗体の製造方法は米国特許番号5,753,430に記載されている。簡潔に説明すると、pHCV34(HCV−コア、a.a.1−150)と称される、HCV配列によりコードされる大腸菌(E.coli)由来組換え抗原を、コアに対する抗体用の免疫原として使用した。pHCV34のクローニングについての詳細な情報は、参照により本明細書に組み入れる米国特許出願第07/572,822号に開示されている。当業者により行われるとおり、該タンパク質は、精製後、適当なアジュバントととの免疫化用に調製した。
i.HCV C11−14微粒子の調製
簡潔に説明すると、カルボキシル化微粒子(10% 重量/容量、0.227ミクロン、Seradyn,Indianapolis,Indより入手可能)の1ml アリコートを9mlのカップリングバッファー(MES(2−(N−モルホリノ)エタンスルホン酸)pH6.7)と室温で約10分間混合した。ついで150μlの1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDAC、カップリングバッファー中、10mg/ml、Sigma Chemical Company)を該微粒子溶液に加え、室温で15分間混合した。1822μlのC11−14モノクローナル抗体溶液(2.13mg/ml)を該活性化微粒子に加え、室温で16時間、回転させて混合した。ついで該微粒子をエッペンドルフ・ミクロ遠心機で12,000×gで3分間ペレット化した。該上清を除去し、該微粒子を微粒子洗浄バッファー(リン酸緩衝食塩水(PBS)、Tween20(pH7.2))で洗浄し、ついで微粒子コーティングバッファー(Tris緩衝食塩水(TBS)、ウシ血清アルブミン(BSA)、pH7.2)で洗浄し、微粒子最終交換バッファー(PBS、Tween 20(pH7.2))で最終洗浄した。該微粒子を5mlの最終交換バッファーに再懸濁させ、45℃で72時間の熱ストレスに付した。熱ストレスに付した後、5mlの微粒子希釈剤(仔ウシ血清、ウマIgG、Tween 20、BSA、カゼイン、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、スクロースおよびプロクリン(Proclin)(pH6.5))を、約1.0%の最終濃度が得られるように加えた。
微粒子上のコーティングに、C11−14 Mabの代わりにA5(14−635−225)Mabを使用する以外は、実施例(V)(B1)(i)に記載されているのと同様の方法を用いた。
pHを2.5にするために、6.6μlの1N HClを300μl(1.45mg/ml)のC11−3モノクローナル抗体に加えた。ついで該モノクローナル抗体を、このpHで5分間インキュベートした。ついで、50mM MESバッファーを加えることにより、該pHを6.5にした。ついでカルボキシル化微粒子(10% 重量/容量、0.227ミクロン、Seradyn,Indianapolis,IN)の100μl アリコートを333μlのカップリングバッファー(MES,pH6.7)と室温で10分間混合した。ついで15μlのEDAC溶液(カップリングバッファー中、10mg/ml)を該微粒子溶液に加え、室温で5分間混合した。552μlのpHショック化C11−3モノクローナル抗体溶液(0.725mg/ml)を該活性化微粒子に加え、室温で16時間、回転させて混合した。ついで該粒子をエッペンドルフ・ミクロ遠心機で12,000×gで3分間ペレット化した。該上清を除去し、該微粒子を微粒子洗浄バッファー(リン酸緩衝食塩水(PBS)、Tween20(pH7.2))で洗浄し、ついで微粒子コーティングバッファー(Tris緩衝食塩水(TBS)、ウシ血清アルブミン(BSA)、pH7.2)で洗浄し、微粒子最終交換バッファー(PBS、Tween 20(pH7.2))で最終洗浄した。該微粒子を0.5mlの最終交換バッファーに再懸濁させ、45℃で72時間の熱ストレスに付した。熱ストレスに付した後、0.5mlの微粒子希釈剤(仔ウシ血清、ウマIgG、Tween 20、BSA、カゼイン、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、スクロースおよびプロクリン(ProClin)、pH6.5)を、約1%の最終濃度が得られるように加えた。
実施例(V)(B1)(iii)に記載のとおりに調製された36μlのHCV C11−3微粒子(1% 固形物)および実施例(V)(B1)(i)に記載のとおりに調製された84μlのHCV C11−14微粒子(1% 固形物)を、880μlの微粒子希釈剤(仔ウシ血清、ウマIgG、Tween 20、BSA、カゼイン、EDTA、スクロースおよびプロクリン(Proclin)、pH6.5)と混合した。
該二重アッセイのために、2つの別々のPRISM(登録商標)チャンネルを、その一方はHCV抗体アッセイに、もう一方はHCV抗原アッセイに使用した。コンボアッセイでは、該抗体アッセイおよび抗原アッセイの両方を、抗原アッセイおよび抗体アッセイの両方の試薬が1つのキット中で組合されている1つのチャネル上で行った。
実施例(V)(A1)(vii)に記載のとおりに調製された350μlのコアペプチドコート化微粒子(1% 固体ストック)および実施例(V)(A1)(iii)に記載のとおりに調製された700μlのHCV NS3 NS4大腸菌(E.coli)構築物CKS−33C−BCD Agコート化微粒子(1% 固体ストック)および実施例(V)(B1)(i)に記載のとおりに調製された319μlのHCV C11−14微粒子(1.0099% 固体ストック)を、5631μlの微粒子希釈剤(仔ウシ血清、ウマIgG、Tween 20、BSA、カゼイン、EDTA、スクロースおよびプロクリン(Proclin)、pH6.5)と混合した。
i.HCV C−200抗原
HCV C−200組換え抗原をChiron Corporation,Emeryville,Calif.より得た。特に、該抗原はHCV(前記のとおり、GenBankより入手可能)のアミノ酸配列1192−1932を含み、NS3およびNS4領域に由来する。c200抗原は、ヒトスーパーオキシドジスムターゼ(hSOD)の154アミノ酸を有するキメラ融合タンパク質である。
微粒子(10% 重量/容量、0.7〜0.9ミクロン、Seradyn,Indianapolis,Indより入手可能)の100μl アリコートを830.6μlのコーティングバッファー(SDSを含有するMESバッファー(pH6.5))と室温で約10分間混合した。ついで69.4μlのc200抗原溶液(0.72mg/ml)を該微粒子溶液に加え、室温で16時間、回転させて混合した。該微粒子をエッペンドルフ・ミクロ遠心機で12,000×gで10分間ペレット化した。該懸濁液を除去し、該微粒子を洗浄バッファー(リン酸塩、NaCl、EDTA、SDS、pH6.5)で洗浄し、56℃で16〜20時間の熱ストレスに付した。ついで該微粒子を2.0%の最終濃度で500μlの微粒子希釈剤(リン酸塩バッファー(pH6.5)、EDTA、NaCl、スクロース、SDS,アジ化物)に再懸濁させた。
微粒子(10% 重量/容量、0.7〜0.9ミクロン、(Seradyn,Indianapolis,Indより入手可能))の100μl アリコートを788μlのコーティングバッファー(SDSを含有するMESバッファー(pH6.5))と室温で約10分間混合した。ついで112μlのHCV p9MB−18抗原溶液(0.89mg/ml)を該微粒子溶液に加え、室温で16時間、回転させて混合した。該微粒子をエッペンドルフ・ミクロ遠心機で12,000×gで10分間ペレット化した。該懸濁液を除去し、該微粒子を洗浄バッファー(リン酸塩、NaCl、EDTA、SDS、pH6.5)で洗浄し、56℃で16〜20時間の熱ストレスに付した。ついで該微粒子を2.0%の最終濃度で500μlの微粒子希釈剤(リン酸塩バッファー(pH6.5)、EDTA、NaCl、スクロース、SDS,アジ化物)に再懸濁させた。
実施例(V)(D)(iii)のとおりに調製された50μlのp9MB−18コート化微粒子(2% 固体ストック)、実施例(V)(D)(ii)に記載のとおりに調製された62.5μlのHCV c200Agコート化微粒子(2% 固体ストック)および実施例(V)(B1)(i)に記載のとおりに調製された125μlのHCV C11−14微粒子(2% 固体ストック)を、4762.5μlの微粒子希釈剤(EDTA、SDS、スクロース、およびプロクリン、PBS、pH6.5)と混合した。
核酸試験データと比較して、セロコンバージョン感度は95.8%であった。PRISM(登録商標)HCV Ag/Ab Real Comboアッセイは、24個中23個の陽性採血液を、反応性のものとして検出した。データを、後記の表Vに要約する。全体的に見て、表IVに示すセロコンバージョンパネルに関する感度は、図3に記載のアッセイ形態を用いた場合には、実施例(V)(C)(i)に記載のとおりに調製された混合微粒子および実施例(V)(C)(iv)に記載のとおりに調製された微粒子の間で、比較しうるものである。一方、抗HCVコアに関しては、特異的サンプルP9MB18コート化微粒子は、コンボアッセイ形態において組合せて用いた場合(表VI)には、コア特異的ペプチド(11−28aa、表VIを参照されたい)に対する有意な改善を示した。
i.微粒子(10% 重量/容量、0.7〜0.9ミクロン、(Seradyn,Indianapolis,Ind.より入手可能)の100μlアリコートを788μlのコーティングバッファー(SDSを含有するMESバッファー、pH6.5)と室温で約10分間混合した。ついで112μlのHCV p9MB−31抗原溶液(0.89mg/ml)を該微粒子溶液に加え、室温で16時間、回転させて混合した。該微粒子をエッペンドルフ・ミクロ遠心機で12,000×gで10分間ペレット化した。該懸濁液を除去し、該微粒子を洗浄バッファー(リン酸塩、NaCl、EDTA、SDS、pH6.5)で洗浄し、56℃で16〜20時間の熱ストレスに付した。ついで該微粒子を2.0%の最終濃度で500μlの微粒子希釈剤(リン酸塩バッファー(pH6.5)、EDTA、NaCl、スクロース、SDS,アジ化物)に再懸濁させた。
HCVパネルの感受性を、図1に記載のアッセイ形態を用いて、p9MB−18およびp9MB−31 r−抗原でコートされた微粒子の間で比較した。全体的に見て、これらのr−抗原の両方に対する感度は、表IVに示すとおり、比較しうるものである。
アクリジニウム標識コンジュゲートの調製
A.抗体アッセイのためのコンジュゲート:
抗体アッセイのために、アクリジニウムで直接標識されたマウス抗ヒトIgG、またはビオチン化抗ヒトF(ab’)2とアクリジニウム抗ビオチンコンジュゲートとのプレ複合体のどちらかを使用した。
該標識抗ビオチン抗体は、米国特許第5,705,330号に開示されているとおりに調製した。ビオチン化抗ヒトF(ab’)2とアクリジニウム抗ビオチンコンジュゲートとのプレ複合体も、米国特許第5,705,330号に開示されているとおりに調製した。
リン酸ナトリウム、NaCl、3−(3−コラミドプロピル)−ジメチルアンモニオ−1−プロパン−スルホナート(CHAPS,Sigma Chemical Company,Saont Louis,Mo)、pH8.0を含有する結合(conjugation)バッファー(CB)53.6μl、および10−(3−スルホプロピル)−N−トシル―N−(2−カルボキシエチル)−9−アクリジニウムカルボキシアミドのN−ヒドロキシスクシンイミドエステル 7.2μl(ジメチルホルムアミド中、4mg/ml)を、131μlのマウス抗ヒトIgG(4.59mg/ml)および601μlのPBSに室温で加えた。該反応混合物をローテーターで室温で20分間混合した。該反応混合物をHPLC上にローディングすることにより、該反応をクエンチした。これを、CHAPS、NaClおよびリン酸ナトリウムを含有するバッファー(pH6.3)で平衡化された300×7.8mm Bio−Sil SEC−250ゲルろ過カラム(Bio−Rad,Richmond,California)に適用した。114M型ポンプを備えたBeckman 421Aコントローラーを使用して、同じバッファーで1.0ml/分で該カラムを溶出した。1mlの幾つかの画分を集め、Beckman DU−7分光光度計で280nmおよび370nmでの吸光度を測定した。アクリジニウムの取り込みの度合を、米国特許第5,705,330号に記載のとおりに計算した。得られた、IgGに対するアクリジニウムの比率(モル/モル)は約2.5であった。該コンジュゲートは4℃で保存した。
i.c11−10コンジュゲートのアクリジン化
以下の変更以外は、実施例(V)(A)(ii)に記載されているのと同様の方法を用いた。700μlのコンジュゲートバッファー、300μl(1mg/ml)のC11−10 Mabおよび2.9μl(4mg/ml)のアクリジニウム誘導体を室温で10分間混合した。得られた、IgGに対するアクリジニウムの比率(モル/モル)は約2.0であった。該コンジュゲートは4℃で保存した。
アクリジン化マウス抗ヒトIgGおよびアクリジン化C11−10Mabコンジュゲートの混合:
14μlのアクリジン化マウス抗ヒトIgG(1μg/ml)を390μlのアクリジン化C11−10Mab(1.79μg/ml)コンジュゲートと混合して、2ng/mlマウス抗ヒトIgGと共に100ng/ml C11−10を得、2時間インキュベートし、使用前にろ過した。マウス抗ヒトIgGおよびアクリジン化C11−10 Mabコンジュゲートの調製は、それぞれ、実施例(V)(A)(ii)および(VI)(B)に記載されている。
モノクローナル抗体によるHCVコアタンパク質の検出
抗原検出アッセイの開発には非常に多数の抗HCVコアモノクローナル抗体が利用可能であるため、モノクローナル抗体のどのような組合せが最大の感度を与えるかを決定することが必要であった。固相上(すなわち、捕捉のため)および液相中(すなわち、検出のため)で2以上のモノクローナル抗体を使用する場合に可能な組合せの数は厖大なものとなるため、最も効果を発揮するモノクローナル抗体のペアを同定するために、単純化された「スクリーニング」方法を用いた。最も高感度なペアを同定したら、必要に応じて、アッセイ感度を向上させるために他のモノクローナル抗体を加えることが可能であろう。
HCVコア抗原アッセイサンプル希釈バッファー
実施例XIに記載のとおり、PRISM(登録商標)でのHCVコア抗原アッセイでは、試験するヒト血清または血漿サンプルの希釈にサンプル希釈バッファー(SDB)を使用する。ついでモノクローナル抗体コート化微粒子を加えて反応混合物を得る。該抗原検出アッセイの感度および特異性は、SDBの成分およびそれらの濃度の点でSDBの組成により影響される可能性がある。
PRISM(登録商標)HCV Ab、PRISM(登録商標)HCV Ag、およびPRISM(登録商標)HCV Ab/Agコンボアッセイ
PRISM(登録商標)抗体アッセイは、参照により本明細書に組み入れる米国特許第5,705,330号に記載されており、PRISM(登録商標)抗原および抗体アッセイは、同様に参照により本明細書に組み入れるShahおよびStewart,The Immunoassay Handbook、第2版,David Wild編,p297−303(2001)に記載されている。
アッセイ形態を図1に示す。
セロコンバージョン感度は、選択された被検セロコンバージョンパネルの分析データの専門業者証明書に記載されているHCV RNAデータと比較して、100%であった。データを表XVに要約する。
反復反応率(repeat reactive rates)に基づけば、該HCV Abアッセイの特異性は被検集団において>99%であった(表XVII)。
アッセイ形態を図2に示す。
一般には、ステーション1において、100μlの対照またはサンプル、50μlの試料希釈バッファー(SDB、リン酸ナトリウム、EDTA、Triton X−100、尿素およびアジ化ナトリウム)、および50μlのHCV Mabコート化微粒子(実施例(V)(B1)(i)に記載のとおりに調製)を各インキュベーションウェルに分注し、アッセイの計時を開始した。これらを、外的攪拌または振とうを行うことなく他の成分への各成分の相互拡散により混合して、反応混合物を得た。ステーション4において、該反応混合物を、繊維状マトリックスを含有する検出ウェルに移し、室温で18分間インキュベートした後、300μlのトランスファー洗浄液(TW)(MES、NaCl、TritonX−100、PEG、消泡剤、プロクリン(Proclin)300、pH5.6)で2回洗浄した。ステーション5において、50μlのアクリジン化C11−10 Mabコンジュゲート(実施例(VI)(B)に記載のとおり)を該検出ウェルのマトリックスに分注した。該ウェルの内容物を23分間インキュベートし、該反応混液を含有する繊維状マトリックスを200μlの最終洗浄液(FW)(LiClおよびLDSを含有するTrisバッファー)で1回洗浄し、ついで100μlのFWで3回洗浄した。ステーション9において、該CLシグナルを誘発させ、測定した。結果は、表XVにS/CO(シグナル対カットオフ)として表されている。該カットオフ値は、陰性対照(n=5)の平均化学発光計数の2.2倍である。
HCVに対する抗体を産生する個体から順次集められたサンプルを含有する商業的に入手可能なセロコンバージョンパネルの2群を、原型PRISM(登録商標)HCV抗原試験およびPRISM(登録商標)HCV抗体試験において試験した。セロコンバージョンサンプルの第1群では、最初の入手可能な採血の日には、HCV RNAに関して陰性であった。後の採血日においては、1以上の採血日においてHCV RNAが検出され、ついですべての場合において、HCVに対する抗体が検出された。セロコンバージョンパネルの第2群では、最初の採血日に既にHCV RNAに関して陽性であり、後の採血日において、HCVに対する抗体が検出された。それらの2つの群では、セロコンバージョン感度は、HCV RNA試験により得られたデータと比較して98.5%であった。PRISM(登録商標)HCV Agは、68個中67個のHCV RNA陽性採血液を、反応性のものとして検出した。データを表XVIに要約する。これらのデータは、抗体応答が未だ上昇していない個体において、HCV Ag試験がHCV感染を検出することを示している。
反復反応率(repeat reactive rates)に基づけば、該HCV Abアッセイの特異性は被検集団において>99%であった(表XVIII)。
C11−14/C11−10に関して記載したものに類似したアッセイ方法を用いた。唯一の相違は、該試験が、Mab C11−14コート化微粒子の代わりにAbbott A5(14−635−225)Mabコート化微粒子を使用したことであった。
合計4個のセロコンバージョンパネルを評価し、感度を、C11−14/C11−10ペアを使用して得られたデータと比較した。これらのペアは共に、同数の陽性採血液を検出した。A5(14−635−225)/C11−10ペアに関する感度データを表XVIに要約する。
反復反応率(repeat reactive rates)に基づけば、該HCV Agアッセイの特異性は被検小集団(n=100)において100%であった(表XIX)。
C11−14/C11−10に関して記載したものに類似したアッセイ方法を用いた。唯一の相違は、Mab C11−14コート化微粒子の代わりに、C11−14およびC11−3混合微粒子(実施例(IV)(B1)(iv))を使用したことであった。
HCVコア抗原に関して陽性である再石灰化(recalcified)ヒト血漿(「PC」と称する)とHCV抗原および抗体に関して陰性であるヒト血漿(「NC」と称する)とよりなるパネルに対してS/N比を比較することにより、このペアの性能を評価した(表XX)。該S/N値は、式:
S/N=PCの平均/NCの平均
から求めた。
4つの試料の平均化学発光計数を用いて、各平均を求めた。
2つの異なる形態(すなわち、二重コンボアッセイおよびリアルコンボアッセイ)を、以下のとおりにPRISM(登録商標)HCV Ag/Abアッセイに関して評価した。
HCV Ag/Ab二重コンボアッセイは、2つの異なるチャネルを用いてPRISM(登録商標)上で同時に行う。PRISM(登録商標)内の合計6個のチャネルを同時に使用して、いくつかのアッセイ(HIV、HBコア、HBsAg、HTLV、およびHCVAb)を行う。それらのチャンネルのうちの5つは現在使用されているが、1つのチャネルは、新たなマーカー(例えば、HCV Agアッセイ)用に空けてあるか、またはそれらのチャネルのうちの1つに問題が生じた場合に備えて予備的に確保されているかもしれない。したがって、1つのチャネルをHCV Agアッセイに、そして5つの他のチャネルを5つの他のアッセイに使用すると、予備チャネルを、使用のために確保することはできない。
PRISM(登録商標)HCV AgアッセイとHCV Abアッセイとを組合せ、PRISM(登録商標)チャネルの1つにおいて単一のアッセイとして行った。
感度:
HCV Ag/Ab二重コンボアッセイのセロコンバージョン感度は98.5%であった。データを表XVに要約する。
反復反応率(repeat reactive rates)に基づけば、該HCV Ab/Ag二重コンボアッセイの特異性は被検集団において>99%であった(表XXI)。
アッセイ形態を図3に示す。以下の変更以外はHCV AbまたはAgアッセイに関して前記で示されているとおりに、2工程のPRISM(登録商標)HCVコンボアッセイを行った。ステーション1において、100μlの対照またはサンプル、50μlの試料希釈バッファー(Tween 20、新生仔ウシ血清、NaCl、Tween−20、スーパーオキシドジスムターゼ(SOD)、大腸菌(E.coli)溶菌液およびアジ化物を含有するリン酸バッファー(pH7.0))、ならびに50μlのHCV抗原およびMab混合微粒子(前記実施例(V)(C)(i)に記載のとおりに調製)を各インキュベーションウェルに分注し、アッセイの計時を開始した。ステーション4において、該反応混合物を、繊維状マトリックスを含有する検出ウェルに移し、300μlのトランスファー洗浄液(TW)(MES、NaCl、TritonX−100、PEG、消泡剤、プロクリン(Proclin)300、pH5.6)で2回洗浄した。37℃で18分間インキュベートした後、50μlの混合コンジュゲートアクリジン化C11−10およびアクリジン化マウス抗ヒトIgG(実施例(VI)(C)に記載のとおりに調製)をステーション5の検出ウェルのマトリックスに分注した。該ウェルを23分間インキュベートし、該反応混液を含有する繊維状マトリックスを100μlの最終洗浄液(LiClおよびLDSを含有するTrisバッファー)で3回洗浄した。ステーション9において、該CLシグナルを誘発させ、測定した。結果は、後記表XVにS/CO(シグナル対カットオフ)として表されている。該カットオフ値は、陰性対照(n=3)の平均化学発光計数の2.2倍である。
セロコンバージョン感度は、PCRデータと比較して95.8%であった。PRISM(登録商標)HCV Ag/Abリアルコンボアッセイは、24個中23個の陽性採血液を、反応性のものとして検出した。データを表XVIに要約する。
反復反応率(repeat reactive rates)に基づけば、HCV Ag/Abリアルコンボアッセイの特異性は被検集団において100%であった(表XX)。
3つのペプチドへのモノクローナル抗体の結合
3つの新たなペプチドを合成した。そのうちの2つはHCV Ab/Agコンボ形態に適合し、1つは対照としての使用に適している。各ペプチドは、固相での製造中の追跡を容易にするために、N末端ビオチンを伴って合成された。ペプチドaa10−53(ALAM−17)(KTKRNTNRRPQDVKFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRLGVRATRKTS)(配列番号42)は、介在性欠失を伴わないHCVコアアミノ酸10−53を含有する。ペプチドaa10−53^32−50(ALAM−18)(KTKRNTNRRPQDVKFPGGGQIVKTS)(配列番号43)は、aa32−50を含む19アミノ酸の欠失を伴うHCVコアアミノ酸10−53を含有する。ペプチドaa10−53^31−33^47−48は、アミノ酸31−33および47−48が欠失しているHCVコアアミノ酸10−53を含有する(ALAM16)(KTKRNTNRRPQDVKFPGGGQIVYLLPRRGPRLGVTRKTS)(配列番号41)。ペプチドALAM16およびALAM18は共に、HCV Ab/Agコンボ形態に適合する。ALAM16の場合、アミノ酸31−33の欠失は、モノクローナル抗体c11−10(エピトープ32−36)が該抗原に結合するのを妨げ、アミノ酸47および48の欠失はc11−14モノクローナル抗体(エピトープ45−50)の結合を妨げる。ALAM18は、c11−10およびc11−14の結合領域の両方を含む欠失を含有する。モノクローナル抗体c11−10およびc11−14によるALAM16およびALAM18への結合の欠如を示すデータを、以下の表に示す。
Claims (2)
- 試験サンプル中の少なくとも1つのHCV抗原および少なくとも1つのHCV抗体の存在を同時に検出するための方法であって、
a)該試験サンプルを、1)抗体/抗原複合体の形成に十分な時間にわたり及び条件下、固相上にコートされた少なくとも1つのHCV抗原またはその一部と、および2)抗原/抗体複合体の形成に十分な時間にわたり及び条件下、該固相上にコートされた少なくとも1つのHCV抗体と接触させる段階、但し、前記の固相上にコートされた少なくとも1つの抗体はC11−14であり、前記の固相上にコートされた少なくとも1つのHCV抗原またはその一部はアミノ酸32−50を含まず、
b)(a)(1)で生じた抗体/抗原複合体に、コンジュゲート(該コンジュゲートは、検出可能なシグナルを生成しうる化学発光性化合物に結合した第2抗体を含む)を、該コンジュゲートが(a)(1)における結合抗体に結合するのに十分な時間にわたり及び条件下で加え、同時に、(a)(2)で生じた抗原/抗体複合体に、第2コンジュゲート(該コンジュゲートは、検出可能なシグナルを生成しうる化学発光性化合物に結合した第3抗体を含む)を、該コンジュゲートが(a)(2)における結合抗原に結合するのに十分な時間にわたり及び条件下で加える段階、但し、第3抗体はC11−10であり、および、
c)生成した単一のシグナルを検出する段階
を含んでなり、
該シグナルの存在が、該試験サンプル中の少なくとも1つのHCV抗原、少なくとも1つのHCV抗体またはその両者の存在を示す、前記方法。 - 該固相上にコートされた少なくとも1つのHCV抗原が、コア抗原、NS3、NS4、NS5およびそれらの一部よりなる群から選ばれる、請求項1記載の方法。
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