DE69532498T2

DE69532498T2 - Test zur erkennung einer hcv rezeptor-bindung

Info

Publication number: DE69532498T2
Application number: DE69532498T
Authority: DE
Inventors: Sergio Abrignani
Original assignee: CHIRON Srl SIENA; Chiron SRL
Current assignee: GSK Vaccines SRL
Priority date: 1994-08-17
Filing date: 1995-08-17
Publication date: 2004-12-02
Anticipated expiration: 2015-08-18
Also published as: AU3189495A; JP4117230B2; US20100203501A1; US20080176219A1; CA2174212A1; JP2006133233A; DE69532498D1; US20070298410A1; GB9416671D0; JP3629546B2; EP0723665A1; DE69532498T3; CA2174212C; JPH09504377A; JP3886518B2; WO1996005513A1; EP0723665B2; JP2004004113A; ATE258687T1; EP0723665B1

Description

Fachgebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft einen Test zur Messung der Bindung eines Hepatitis-C-Virus-(HCV-)Rezeptor-Bindungsliganden, z. B. von HCV-Proteinen, an einen Zielzellen-Rezeptor. Der Test kann eingesetzt werden, um Kandidaten für eine Vakzine zu ermitteln und um HCV-neutralisierende Antikörper zu identifizieren und zu messen, dies kann sowohl der Forschung als auch klinischen Anwendungen dienen, bei denen die Diagnose des Vorliegens von neutralisierenden Antikörpern möglicherweise dazu genutzt werden kann, die geeignete klinische Vorgehensweise vorauszusagen.
Die Erfindung betrifft außerdem das Identifizieren und Charakterisieren des Rezeptors für das HCV, so dass es möglich wird, antivirale Mittel, die in die Rezeptor-Wechselwirkung eingreifen, zu identifizieren und durchzumustern.
Kurze Beschreibung des Stands der Technik
Das Hepatitis-C-Virus (HCV, früher bekannt als Non-A-Non-B-Hepatitis, NANBV) hat sich weltweit zu einem ersten Gesundheitsproblem entwickelt, da schon 1 bis 2% der Bevölkerung chronisch mit HCV infiziert sind (1). Die Infektion verläuft meist asymptomatisch, und nur bei einer Minderheit der Fälle kommt es zu einer Heilung, so dass 80 bis 100% der infizierten Personen zu lebenslänglichen Trägern werden (2), wobei sich in der Mehrzahl dieser Fälle eine chronische Hepatitis entwickelt (3).
Das HCV ist ein Positiv-Sense-RNA-Virus aus etwa 10000 Nucleotiden mit einem einzelnen offenen Leseraster, das ein aus etwa 3000 Aminosäuren bestehendes Polyprotein codiert. Obwohl die Struktur des Virus durch DNA-Rekombinations-Techniken aufgeklärt wurde (17, 18), wurde das Virus selbst noch nicht isoliert, dabei konnten die Funktionen der verschiedenen Virusproteine, die durch Proteolyse des Polyproteins erzeugt werden, nur aus der Analogie zu anderen ähnlichen Viren hergeleitet werden, die eine vergleichbare genomische Organisation besitzen.
Die Virusproteine sind alle in rekombinanter Form verfügbar, wobei sie in einer Vielzahl von Zellen und Zelltypen exprimiert werden, einschließlich Hefen, Bakterien, Insekten- und Säugerzellen (5, 10).
Von zwei Proteinen, die E1 und E2 genannt werden (und die den Aminosäuren 192 bis 383 bzw. 384 bis 750 entsprechen), wurde angenommen, dass sie äußere Proteine der Virushülle sind (5), die für die Bindung des Virus an die Zielzellen verantwortlich sind.
Wir haben ein Verfahren zum Identifizieren von Zellen, die einen mutmaßlichen HCV-Rezeptor enthalten, und Testverfahren zum Nachweisen und quantitativen Bestimmen der Bindung von HCV-Rezeptor-Bindungsliganden an den Rezeptor entwickelt. Das Verfahren bietet einen breites Spektrum von Anwendungs- und Nutzungsmöglichkeiten.
Ein erster Schritt bei der Entwicklung einer HCV-Vakzine besteht in der Identifizierung der Komponenten, die an der schützenden Immunität beteiligt sind. Zurzeit ist noch wenig über die Rolle bekannt, die die Immunantwort im Verlauf einer HCV-Infektion spielt.
Die Identifizierung von HCV-Rezeptor-Zielzellen trägt zur Charakterisierung des HCV-Rezeptors selbst bei und stellt eine wichtige Komponente in der Entwicklung von Tests auf die Bindung von HCV-Rezeptor-Bindungsliganden an die HCV-Rezeptor-Zielzellen bereit. Solche Tests können eingesetzt werden für die Diagnose von neutralisierenden Antikörpern in Individuen, für die schnelle Durchmusterung von antiviralen Verbindungen, welche mit der Rezeptorbindung interagieren, und für die Entwicklung von Vakzinen.
In einer Studie über die passive Immunisierung von Schimpansen wurde eine HCV-Infektion verhindert, nachdem eine in vitro-Neutralisierung mit Plasma eines chronisch infizierten Patienten erfolgt war (6). Jedoch wurde der Nachweis von schützenden Antikörperantworten gegen das HCV bisher dadurch erschwert, dass es keinen in vitro-Neutralisierungtest gab. Da das HCV in Zellkulturen nicht effizient wächst, wurden Versuche unternommen (7, 8), Neutralisierungstests zu entwickeln, mit denen die Bindung des HCV an die Zielzellen bestimmt werden kann. Jedoch beruhen die verfügbaren Tests auf dem Nachweis des gebundenen Virus durch PCR, wobei es offensichtliche Mängel gibt, etwa die Schwierigkeiten beim quantitativen Bestimmen von neutralisierenden Antikörpern und die Probleme, ein genau reproduzierbares Ergebnis des RT-PCR-Tests zu erhalten.
In einer dieser Studien setzten Shimizu et al. (1994, J. Virol. 68 (3). 1494–1500) eine Reverse-Transkriptase-Polymerasekettenreaktion (RT-PCR) ein, um das Vorliegen einer HCV-RNA in infizierten Zellen nachzuweisen. Dieser diagnostische Test wurde als ein Test vorgeschlagen, mit dem die Infektiosität des Virus bestimmt werden kann.
Verschiedene Veröffentlichungen beschreiben in vitro-Tests zur Messung der Bindung bestimmter Viren an ihre Zielzellen, dies ist jedoch nur in den Fällen möglich, in denen bereits spezifische Rezeptoren für diese Viren identifiziert worden waren. Beispiele umfassen Kadan et al. (1992, J. Virol. 66 (4): 2281–2287); Schols et al. (1989, Journal of Acquired Immune Deficiency Systems 2: 10–15); Li et al., (1992, Nature 356: 347–350); und Naniche (1993, J. Virol. 67 (10): 6025–6032). Minutello et al. (1993, J. Exp. Med. 178: 17–25) beschreiben eine Studie, in der die Wechselwirkung zwischen dem Nicht-Struktur-4-(NS4-)HCV-Protein und CD4+-T-Zellen, isoliert aus Leberbiopsien, bestimmt wird, und sie maßen die Bindung von NS4 an die T-Zellen anhand eines T-Zellen-Proliferationstests. Jedoch ist in diesem Dokument kein Hinweis zu finden, dass dieser Mechanismus über einen HCV-spezifischen Rezeptor erfolgt.
Die Erfindung betrifft außerdem einen quantitativen Test (der Neutralisierung der Bindung („neutralisation of binding") oder NOB genannt wird), mit dem HCV-neutralisierende Antikörper bestimmt werden können, wobei der Test auf der cytofluorimetrischen Bestimmung von solchen Seren beruht, welche die Bindung von HCV-Hüllproteinen an menschliche Zellen neutralisieren.
Zusammenfassung der Erfindung
Gemäß einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Test/Verfahren zur Messung der Bindung eines HCV-Rezeptor-Bindungsliganden an eine Zielzelle bereitgestellt, der/das den Schritt umfasst:

a) Inkontaktbringen eines mutmaßlichen HCV-Rezeptor-Bindungsliganden oder eines kompetitiven Bindungsanalogons davon mit einer HCV-Rezeptor-Zielzelle; und
b) Nachweisen der Bindung des Liganden oder des kompetitiven Bindungsanalogons an die HCV-Rezeptor-Zielzelle unter Verwendung eines nachweisbaren Antikörpers, der in der Lage ist, an den HCV-Rezeptor-Bindungsliganden zu binden;

Vorzugsweise wird die Bindung des HCV-Rezeptor-Bindungsliganden oder des HCV-Rezeptor-Bindungsligand-Analogons nachgewiesen, indem gebundene Vertreter markiert und ein Nachweissystem eingesetzt wird, das in der Lage ist, zwischen freien HCV-Rezeptor-Zielzellen und gebundenen HCV-Rezeptor-Zielzellen zu unterscheiden.
Vorzugsweise ist das Nachweissystem eine Durchflusscytometrie, stärker bevorzugt eine Durchflusscytofluorimetrie. In diesem Fall tragen die gebundenen Vertreter eine fluoreszierende Markierung, und die physikalische Trennung der Zellen erfolgt zwischen den markierten und den nicht-markierten Zellen.
Der erste Aspekt der Erfindung stellt einen empfindlichen und schnellen Test auf die Fähigkeit eines möglichen HCV-Rezeptor-Bindungsliganden bereit, an eine HCV-Rezeptor-Zielzelle zu binden, und macht eine einfache Durchmusterung potentieller HCV-Rezeptor-Bindungsliganden möglich. Solche möglichen HCV-Rezeptor-Bindungsliganden können als antivirale Mittel, als Kandidaten für eine mögliche Vakzine oder als Kandidaten für Testreagenzien geeignet sein.
Der Test kann ein direkter Bindungstest sein, wobei die Bindung eines HCV-Rezeptor-Bindungsliganden an eine HCV-Rezeptor-Zielzelle direkt gemessen wird, oder er kann ein kompetitiver Test sein, in dem der HCV-Rezeptor-Bindungsligand, der in einer Probe gemessen werden soll, mit einem HCV-Rezeptor-Bindungsligand-Analogon um die Bindung kompetiert, sodann wird die Menge des HCV-Rezeptor-Bindungsligand-Analogons gemessen.
In einem direkten Bindungstest umfasst der Test/das Verfahren die folgenden Schritte:

i) Mischen von HCV-Rezeptor-Zielzellen und einer Probe, die auf das Vorliegen des HCV-Rezeptor-Bindungsliganden getestet werden soll, wodurch die Bindung eines beliebigen HCV-Rezeptor-Bindungsliganden an die HCV-Rezeptor-Zielzellen zugelassen wird;
ii) Entfernen des ungebundenen HCV-Rezeptor-Bindungsliganden;
iii) Mischen mit einem nachweisbaren Antikörper, der in der Lage ist, an den HCV-Rezeptor-Bindungsliganden zu binden, wodurch diejenigen HCV-Rezeptor-Zielzellen markiert werden, die einen HCV-Rezeptor-Bindungsliganden gebunden haben; und
iv) Nachweisen der Menge der markierten HCV-Rezeptor-Zielzellen.

Der nachweisbare Antikörper kann direkt markiert sein, oder er kann nachgewiesen werden, indem ein markierter Ligand zugegeben wird, z. B. ein Antikörper, am günstigsten ein solcher, der für die fixierte Region des nachweisbaren Antikörpers spezifisch ist.
Die Markierung kann eine beliebige Markierung sein, die in der Lage ist, das Vorliegen der Markierung direkt oder indirekt anzuzeigen. Vorzugsweise ist die Markierung jedoch ein Fluorochrom, das für die Verwendung in der Durchflusscytometrie geeignet ist. Solche geeigneten Markierungen umfassen Fluoresceinisothiocyanat (FITC), Phycoeriphrin (PE) und Texas Red.
Der markierte Ligand kann ein beliebiger anderer Ligand sein, der in der Lage ist, spezifisch an den nachweisbaren Antikörper zu binden. Z. B. könnte der nachweisbare Antikörper selbst ein kovalent gebundenes Biotin aufweisen, und der markierte Ligand könnte Streptavidin sein.
Der nachweisbare Antikörper kann z. B. ein Immunglobulin des Menschen, des Kaninchens oder der Maus, wie IgG, sein, und der markierte Antikörper kann ein markierter Anti-Mensch-, Anti-Kaninchen- oder Anti-Maus-Antikörper sein.
Der nachweisbare Antikörper oder der zweite markierte Antikörper kann ein polyclonaler oder ein monoclonaler Antikörper sein. In beiden Fällen kann der Antikörper ein bindendes Fragment eines Antikörpers sein, z. B. ein F(ab')-Fragment. Der monoclonale Antikörper kann durch eine Zellfusionstechnik oder durch eine DNA-Rekombinationstechnik hergestellt werden, z. B. durch Humanisierung oder CDR-Grafting.
In dem beschriebenen Beispiel ist der nachweisbare Antikörper ein polyclonaler Antikörper (z. B. Kaninchenserum), der in einem immunisierten tierischen Wirt gegen den HCV-Rezeptor-Bindungsliganden hervorgerufen wurde, und der zweite, markierte Antikörper ist ein gegen den tierischen Wirt gerichteter Antikörper (z. B. Anti-Kaninchen-IgG), der mit FITC markiert ist. Vorzugsweise ist der nachweisbare Antikörper jedoch ein monoclonaler Antikörper.
Als Kontrolle kann in einem Parallelexperiment eine Kontrollmenge eines Antikörpers des gleichen Typs als der nachweisbare Antikörper zugegeben werden. Die Kontrollmenge kann z. B. ein Präimmunserum sein.
In einem indirekten Bindungstest umfasst der Test/das Verfahren die folgenden Schritte:

i) Mischen von HCV-Rezeptor-Zielzellen, einer Probe, die auf das Vorliegen eines HCV-Rezeptor-Bindungsliganden getestet werden soll, und einer begrenzten Menge eines HCV-Rezeptor-Bindungsligand-Analogons, wodurch die Kompetition um die Bindung an die HCV-Rezeptor-Zielzellen zugelassen wird;
ii) Entfernen des ungebundenen HCV-Rezeptor-Bindungsliganden;
iii) Mischen mit einem nachweisbaren Antikörper, der in der Lage ist, an den HCV-Rezeptor-Bindungsliganden zu binden, wodurch diejenigen HCV-Rezeptor-Zielzellen markiert werden, die einen HCV-Rezeptor-Bindungsliganden gebunden haben; und
iv) Nachweisen der Menge der HCV-Rezeptor-Zielzellen, die an das HCV-Rezeptor-Bindungsligand-Analogon gebunden sind.

In beiden Fällen kann die Menge der markierten HCV-Rezeptor-Zielzellen nachgewiesen werden, indem eine fluoreszierende Markierung bereitgestellt wird und die Zelltrennung unter Verwendung einer Durchflusscytometrie erfolgt.
Gemäß einem zweiten Aspekt der Erfindung wird ein Test/ein Verfahren bereitgestellt, mit dem die Neutralisierung eines HCV-Rezeptor-Bindungsliganden gemessen wird, die durch die Bindung eines neutralisierenden Antikörpers an einen HCV-Rezeptor-Bindungsliganden zustande kommt (der vorstehend als ein NOB-Test bezeichnet wird), wobei der Test die folgenden Schritte umfasst:

i) Mischen von HCV-Rezeptor-Zielzellen, eines HCV-Rezeptor-Bindungsliganden und einer Probe, die auf das Vorliegen eines HCV-neutralisierenden Antikörpers getestet werden soll;
ii) Entfernen des ungebundenen HCV-Rezeptor-Bindungsliganden;
iii) Mischen mit einem nachweisbaren Antikörper, der in der Lage ist, an den HCV-Rezeptor-Bindungsliganden zu binden, wodurch diejenigen HCV-Rezeptor-Zielzellen markiert werden, die einen HCV-Rezeptor-Bindungsliganden gebunden haben; und
iv) Nachweisen der Menge der HCV-Rezeptor-Zielzellen, die an den HCV-Rezeptor-Bindungsliganden gebunden sind.

In diesem Test kompetieren HCV-Rezeptor-Zielzellen und HCV-neutralisierende Antikörper um die Bindung an den HCV-Rezeptor-Bindungsliganden.
Der zweite Aspekt der Erfindung stellt einen empfindlichen und schnellen Test zum Identifizieren von Antikörpern bereit, die in der Lage sind, die Bindung von HCV an HCV-Rezeptoren zu beeinträchtigen. Bei solchen Antikörpern ist es wahrscheinlich, dass sie das Virus neutralisieren und dass sie eine der wirksamen Antworten des Immunsystems darstellen, die durch eine erfolgreiche Immunisierung zustande kommen. Deshalb zeigt der Spiegel der neutralisierenden Antikörper den Erfolgsgrad eines Immunisierungsprotokolls an, außerdem können neutralisierende Antikörper selbst möglicherweise als Wirkprinzip in Arzneimittelpräparaten für die passive Immunisierung eingesetzt werden.
Der Test/das Verfahren des zweiten Aspekts der Erfindung kann auch einen empfindlichen Test zum Nachweisen von HCV-Antikörpern in einer Probe bereitstellen, wobei der Test als ein Verfahren zur Diagnose einer vorliegenden oder einer früheren HCV-Infektion eingesetzt werden kann. Vorzugsweise ist die Probe deshalb eine Probe aus einem Patienten, und die Erfindung stellt ein Verfahren zur Diagnose einer vorliegenden oder früheren Infektion mit HCV bereit, umfassend das Durchführen des Tests des zweiten Aspekts der Erfindung mit einer Probe, die aus dem Patienten entnommen wurde.
In Schimpansen, die mit dem in HeLa-Zellen produzierten E1/E2-Präparat immunisiert worden waren, haben wir entdeckt, dass es eine perfekte Korrelation gibt zwischen dem Vorliegen von neutralisierenden Antikörpern und dem Schutz vor einer anschließenden Provokation mit einem homologen HCV. Da die Tiere mit dem höchsten Titer vollständig frei von Virus blieben, nehmen wir an, dass es sich bei den Antikörpern um neutralisierende Antikörper handelt, die durch die Impfung induziert wurden. Wirksame Neutralisierungstiter liegen noch ein Jahr nach der dritten Boosterung vor. Niedrige Tier haben eine schwache Infektion zur Folge, die, anders als bei den Kontrollen, durch eine Impfung geheilt wurde.
Die Fähigkeit zum Messen der neutralisierenden Antikörper macht somit die Diagnose einer früheren oder einer vorliegenden HCV-Infektion möglich und kann dazu genutzt werden, für infizierte Patienten die geeignete Behandlung vorauszusagen.
Der vorliegende Test erlaubt die Charakterisierung von neutralisierenden Antikörpern und kann direkt als ein Test an Proben von Patienten eingesetzt werden, oder er kann verwendet werden, um Reagenzien für die Entwicklung empfindlicher Tests zu überprüfen und zu testen, die für die routinemäßige Verwendung in der Klinik geeignet sind. Solche Tests würden z. B. Enzym-markierte Tests, insbesondere ELISA, umfassen.
Der Test des zweiten Aspekts der Erfindung kann auch eingesetzt werden, um eine Reihe von Antikörpern zu identifizieren, die in der Lage sind, an den HCV-Rezeptor zu binden, wodurch die Kartierung des Rezeptors auf HCV-Rezeptor-Zielzellen ermöglicht wird.
Schließlich kann der Test des zweiten Aspekts der Erfindung eingesetzt werden, um eine Kreuzreaktivität zwischen Antikörpern gegen die äußeren HCV-Proteine aus unterschiedlichen HCV-Genotypen zu bestimmen.
Im zweiten Aspekt der Erfindung können die im ersten Aspekt der Erfindung beschriebenen Reagenzien eingesetzt werden, wobei die Protokolle mit den entsprechenden Änderungen verwendet werden können.
Gemäß einem dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Identifizieren von HCV-Rezeptor-Zielzellen in einer Probe von Zellen bereitgestellt, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:

i) Mischen der Probe von Zellen und eines HCV-Rezeptor-Bindungsliganden, wodurch die Bindung eines beliebigen HCV-Rezeptor-Bindungsliganden mit beliebigen HCV-Rezeptor-Zielzellen in der Probe zugelassen wird;
ii) Entfernen des ungebundenen HCV-Rezeptor-Bindungsliganden;
iii) Mischen mit einem nachweisbaren Antikörper, der in der Lage ist, an den HCV-Rezeptor-Bindungsliganden zu binden, wodurch diejenigen HCV-Rezeptor-Zielzellen markiert werden, die einen HCV-Rezeptor-Bindungsliganden gebunden haben; und
iv) Nachweisen der Menge der markierten HCV-Rezeptor-Zielzellen.

Hierfür können die im ersten Aspekt der Erfindung beschriebenen Reagenzien verwendet werden, wobei die Protokolle mit den entsprechenden Änderungen eingesetzt werden können.
Das Verfahren des dritten Aspekts der Erfindung stellt eine schnelle Durchmusterungstechnik für Zellen bereit, die einen HCV-Rezeptor tragen. Das Verfahren kann somit eingesetzt werden, um die HCV-Rezeptor-Zielzelle des ersten und des zweiten Aspekts der Erfindung herzustellen oder um Populationen von HCV-Rezeptor-Zielzellen für eine anschließende Analyse und insbesondere Charakterisierung der Art und Form des HCV-Rezeptors zu produzieren, mit dem Zweck, verfügbare HCV-Rezeptor-Bindungsliganden noch weiter zu verfeinern und zu verbessern.
Außerdem umfasst die Erfindung Produkte, die unter Verwendung der Tests und Verfahren der Erfindung hergestellt oder identifiziert wurden, einschließlich HCV-Rezeptor-Bindungsliganden, die unter Verwendung der Tests der Erfindung identifiziert wurden, und Impfstoffzusammensetzungen, die solche enthalten. Jedes beliebige Entwicklungsprogramm, das einen Test oder ein Verfahren der vorliegenden Erfindung umfasst, fällt in den Schutzbereich dieser Anmeldung.
Der hier verwendete Begriff „HCV-Rezeptor-Zielzelle" bezieht sich auf eine Zelle oder eine Zellpopulation, die in der Lage ist, mindestens an ein HCV-Protein zu binden. Am günstigsten enthält die HCV-Rezeptor-Zielzelle mindestens einen HCV-Protein-Rezeptor.
Der hier verwendete Begriff „HCV-Rezeptor-Bindungsligand" bezieht sich auf einen beliebigen Liganden, der in der Lage ist, an einen HCV-Rezeptor zu binden. Der HCV-Rezeptor-Bindungsligand umfasst vorzugsweise ein oder mehrere HCV-Polypeptide und/oder ein oder mehrere Fragmente eines HCV-Polypeptids, das/die in der Lage ist/sind, an einen HCV-Rezeptor zu binden. Der HCV-Rezeptor-Bindungsligand kann ein Polypeptid sein, das mit HCV nicht verwandt ist, das jedoch trotzdem in der Lage ist, an einen HCV-Rezeptor zu binden. Am günstigsten ist der HCV-Rezeptor-Bindungsligand ein rekombinantes HCV-Protein oder ein Fragment davon. Solche HCV-Rezeptor-Bindungsliganden sind in den Europäischen Patentanmeldungen EP-A-0318216 und EP-A-0388232 beschrieben. Am stärksten bevorzugt sind die äußeren HCV-Proteine E1 und E2 oder funktionelle Äquivalente und Fragmente davon, bei welchen die Fähigkeit erhalten blieb, an eine HCV-Rezeptor-Zielzelle zu binden.
Andererseits kann der HCV-Rezeptor-Bindungsligand eine chemische Verbindung sein, die kein Polypeptid ist, wobei die Verbindung in der Lage ist, an einen HCV-Rezeptor zu binden. Die chemische Verbindung, die kein Polypeptid ist, kann ein chemisches Analogon eines Rezeptor-bindenden Polypeptids sein, bei dem das Rezeptor-bindenden Epitop erhalten geblieben ist.
Der hier verwendete Begriff „HCV-Rezeptor-Bindungsligand-Analogon" bezieht sich auf ein Analogon eines HCV-Rezeptor-Bindungsliganden, das in der Lage ist, mit dem HCV-Rezeptor-Bindungsliganden um die Bindung an die HCV-Rezeptor-Zielzelle zu kreuzreagieren, das jedoch von dem HCV-Rezeptor-Bindungsliganden nicht zu unterscheiden ist, wenn das Test-Nachweissystem verwendet wird. Deshalb ist es günstig, wenn das HCV-Rezeptor-Bindungsligand-Analogon markiert ist, vorzugsweise mit einer fluoreszierenden Markierung, entweder direkt oder durch die weitere Bindung eines markierten Liganden, z. B. eines Antikörpers.
Der hier verwendete Begriff „Polypeptid" bezieht sich auf eine Sequenz von zwei oder mehreren Aminosäuren, wobei mindestens eine Peptidbindung enthalten ist. Die Aminosäuren in der Sequenz können natürlich vorkommende Aminosäuren sein, oder sie können synthetische Analoga oder vollständig synthetische Aminosäuren in jedem beliebigen Gemisch oder Verhältnis sein. Der Begriff „Polypeptid" umfasst generische Proteine und modifizierte Polypeptide, z. B. natürlich oder chemisch modifizierte Polypeptide, einschließlich Glykoproteine.
Der hier verwendete Begriff „HCV-neutralisierender Antikörper" bezieht sich auf einen Antikörper, der in der Lage ist, die Wechselwirkung zwischen einem HCV-Rezeptor-Bindungsliganden und einer HCV-Rezeptor-Zielzelle zu reduzieren. Vorzugsweise ist der HCV-Rezeptor-Bindungsligand ein natives HCV-Protein. Vorzugsweise verhindert der HCV-neutralisierende Antikörper vollständig die Bindung eines nativen HCV-Proteins an HCV-Rezeptor-Zielzellen. HCV-neutralisierende Antikörper können monoclonale Antikörper sein (die z. B. durch das Verfahren von Köhler und Milstein der Zellfusion oder durch DNA-Rekombinationstechniken, wie Humanisierung und CDR-Grafting, hergestellt wurden), sie sind jedoch vorzugsweise polyclonale Antikörper, am stärksten bevorzugt Antikörper, die durch das Immunsystem eines immunisierten Wirts erzeugt wurden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist eine schematische Darstellung, die den ersten Aspekt der Erfindung erläutert, wobei HCV-Rezeptor-Bindungsliganden an Rezeptoren auf HCV-Rezeptor-Zielzellen binden, diese werden gemessen, indem zuerst ein Anti-HCV-Antikörper des Kaninchens gebunden wird und anschließend ein markierter Anti-Kaninchen-IgG-FITC-F(ab')-Fragment gebunden wird, worauf eine Zelltrennung durch FACScan-Analyse folgt (vgl. Seite 12).
In 2 sind die Ergebnisse eines durchflusscytometrischen Experimentes dargestellt, wobei die unterschiedliche Bindung der in verschiedenen Systemen exprimierten rekombinanten HCV-Hüllen an menschliche Zellen gezeigt wird. Molt-4-Zellen, die mit Medium alleine inkubiert wurden, sind als schraffierte Kurven dargestellt, die leeren Kurven stellen Zellen dar, die mit 5 μg/ml der angegebenen rekombinanten HCV-Hüllen inkubiert wurden (vgl. Seite 13).
3 zeigt die Bindung des in CHO-Zellen exprimierten E2 an menschliche Zellen (vgl. Seite 14).
4 ist eine schematische Darstellung, die den zweiten Aspekt der Erfindung erläutert, in dem ein neutralisierender Antikörper die Bindung eines HCV-Rezeptor-Bindungsliganden an den Rezeptor auf einer HCV-Rezeptor-Zielzelle verhindert (vgl. Seite 14).
5 zeigt die Neutralisierung der Bindung von E2 an Zielzellen durch Antikörper gegen die hypervariable Region 1 von HCV-E2 (vgl. Seite 16).
6 zeigt die Neutralisierung der Bindung von E2 durch HCV-Zielzellen durch Seren von geimpften Schimpansen, dies macht deutlich, dass ein direkter Zusammenhang besteht zwischen dem Schutz und dem Vorliegen von neutralisierenden Antikörpern (vgl. Seite 16).
Genaue Beschreibung der Erfindung
Die Durchführung der vorliegenden Erfindung umfasst, sofern nichts anderes angegeben ist, die Verwendung herkömmlicher Techniken der Immunologie, Cytofluorimetrie und Molekularbiologie, die dem Fachmann bekannt sind. Solche Techniken werden in der Literatur ausführlich erklärt (19).
Der Fachmann wird die allgemeinen Verfahren und Techniken zum Entwickeln und Durchführen eines Tests verstehen und sie kennen. Die Erfindung wird hier ausreichend ausführlich beschrieben, so dass der Fachmann die offenbarten Experimente verstehen und wiederholen kann.
Für den Fachmann wird es klar sein, dass Änderungen der Bedingungen erforderlich sein können, um den Test auf bestimmte HCV-Rezeptor-Bindungsliganden, HCV-Rezeptor-Zielzellen und Antikörper zu optimieren.
In dieser Beschreibung werden die herkömmlichen Abkürzungen für Viren und Proteine verwendet. Hülle 1 („Envelope 1", E1) und Hülle 2 („Envelope 2", E2) von HCV beziehen sich auf die Proteine und auf Fragmente davon, deren Nucleotidsequenzen veröffentlicht sind (17, 18). Die Nucleotide des E1- und des E2-Gens und der codierten Proteine variieren in unterschiedlichen HCV-Isolaten.
Deshalb lassen sich E1 und E2 für beliebige HCV-Isolate identifizieren, da sie in den Aminosäuresequenzen 192 bis 383 bzw. 384 bis 750 enthalten sind.
E1 und E2 wurden durch DNA-Rekombinationstechniken produziert, wobei unterschiedliche Expressionssysteme eingesetzt wurden (5, 10).
Material und Methoden im Allgemeinen
Zellen: Die menschliche T-Zell-Lymphom-Zelllinie Molt-4 wurde von der ATCC (Rockville, MD) erhalten. Die Zellen wurden mit dem Medium RPMI 1640 (Gibco Laboratories, Grand Island, NY) expandiert, das mit 2 mM L-Glutamin, 1% nicht-essentiellen Aminosäuren, 1 mM Natriumpyruvat, Penicillin (100 Einheiten/ml), Streptomycin (100 μg/ml) und 10% (Vol./Vol.) fetalem Kälberserum (FCS, Gibco) angereichert war.
Rekombinante Hüllproteine: Die Glykoproteine E1/E2_199–745 wurden in HeLa- oder CHO-Zellen exprimiert, extrahiert und gereinigt wie beschrieben (5, 9). E2_384–715 wurde in rekombinanten CHO-Zellen exprimiert und daraus ausgeschieden, wie für das verkürzte E2₆₆₁ beschrieben (5). Für die Reinigung von CHO/E2 wurden die konditionierten Medien der CHO-Zellen durch Ultrafiltration 15-fach eingeengt, hierauf folgte eine weitere zehnfache Volumenreduktion durch Fällung mit Ammoniumsulfat bei einer Sättigung von 75% und eine erneute Lösung in 25 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA, pH 7,5; der monoclonale Antikörper 5E5/H7 (spezifisch für CHO/E2) wurde gereinigt und an CNBr-aktivierte Sepharose^TM gekoppelt. Die Antikörper-Säule wurde in 25 mM Tris-Cl, 0,15 M NaCl, pH 7,5, äquilibriert. Das durch Ammoniumsulfat gefällte E2 wurde in 25 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA, pH 7,5, gelöst und auf die Säule aufgetragen. Die Säule wurde mit PBS plus 1 M NaCl gewaschen und danach mit drei bis vier Säulenvolumina von Actisep (Sterogene Inc., Arcadia, CA) eluiert. Alle Fraktionen, die das gelb gefärbte Actisep enthielten, wurden vereinigt, in einer Ultrafiltrations-Rührzelle eingeengt und in PBS-Puffer diafiltriert. E2_384–715 wurde durch die mit einem rekombinanten Baculovirus (BV) infizierten Zellen exprimiert und hieraus ausgeschieden wie beschrieben (10). Für die Reinigung von BV/E2 wurde das konditionierte Medium von den Insektenzellen auf eine Säule mit GNA-Lectin-Agarose (Vector Laboratories, Burlingame, CA) aufgetragen. Danach wurde die Säule mit PBS plus 0,9 M NaCl gewaschen und mit 1 M Methyl-D-mannosid in PBS plus 0,9 M NaCl eluiert. Das Eluat wurde bei 4°C gegen 20 mM Kaliumphosphat, pH 6, dialysiert. Der Niederschlag, der hauptsächlich Verunreinigungen enthielt, wurde abzentrifugiert und der Überstand auf eine Säule mit S-Sepharose Fast Flow^TM (Pharmacia, Uppsala, Schweden) aufgetragen, die in 20 mM Kaliumphosphat, pH 6, äquilibriert worden war. Das Protein E2 wurde mit einem Gradienten bis zu 0,25 M NaCl in 20 mM Kaliumphosphat, pH 6, eluiert. Für die Expression und Sekretion von E2_384–715 aus Hefe verwendeten wir den Stamm S150-2B von Saccharomyces cerevisiae und den Sekretionsvektor YEpsec1 (11). E2 wird als ein Kern-glykosyliertes Peptid von 55 KDa ausgeschieden. Das Hefe-E2 wurde durch Affinitäts-Chromatographie gereinigt, wobei eine Lectin-Säule und das gleiche Verfahren eingesetzt wurden, das für die Reinigung von BV/E2 verwendet wurde (10). Nach der Reinigung waren alle HCV-Hüllproteine zu mehr als 80% rein. Für alle Antigene wurden ELISA gemäß der veröffentlichten Verfahren durchgeführt.
Seren und monoclonale Antikörper (mAbs): Ein polyclonales Antiserum des Kaninchens, das für alle vorstehend beschriebenen Hüllproteine spezifisch war, und Seren von Schimpansen, die mit HeLa-E1/E2 oder mit einer Kombination von Hefe/E1_199–330 und BV/E2_404–661 immunisiert worden waren (9), wurden gewonnen. Der monoclonale Antikörper 291 (IgG1) wurde aus Mäusen erhalten, die mit CHO/E2 immunisiert worden waren, und auf die Fähigkeit durchgemustert, das an Zielzellen gebundene E2 zu erkennen. Ein synthetisches Peptid, das aus den HCV-1-Aminosäuren 384–414 bestand (hypervariable Region 1 von E2, HVR1), wurde über den aminoterminalen Rest an das Diphtherietoxoid gekoppelt und zum Immunisieren von Mäusen eingesetzt. Die aus der Fusion resultierenden mAbs wurden durch einen ELISA mit überlappenden biotinylierten 8-Mer-Peptiden von den Aminosäuren 288 bis 487 auf Streptavidin-beschichteten Platten durchgemustert. Ein IgG1-mAb (1G2A7) wurde isoliert, der im ELISA das Epitop 384–414 erkennt.
Beispiel 1 – Bindungstest
Eine schematische Darstellung des Bindungsexperiments findet sich in 1, wobei die durch eine durchflusscytometrische Analyse erreichte Trennung gezeigt wird.
Ein Experiment wurde durchgeführt, wobei die Fähigkeit des HCV-Proteins gemessen werden sollte, an verschiedene Zelltypen zu binden, die den mutmaßlichen HCV-Rezeptor aufweisen sollten.
Versuchsprotokoll
Experimente mit einer indirekten Immunfluoreszenz wurden durchgeführt, um die Fähigkeit von HCV-Hüllproteinen zu bestimmen, an Molt-4-Zellen zu binden, wobei es sich um ein menschliches T-Zell-Lymphom handelt, von dem berichtet wurde, dass es in vitro eine HCV-Replikation auf niedrigem Niveau erlaubt (13).
Die Molt-4-Zellen (10⁵/Vertiefung) wurden in Mikroplatten mit 96 Vertiefungen mit U-Boden durch Zentrifugation bei 200 × g 5 Min. bei 4°C sedimentiert. 20 μl der HCV-Proteine, die in PBS auf unterschiedliche Konzentrationen verdünnt worden waren (von 10 μg/ml bis 0,001 μg/ml), wurden mit dem Pellet der Molt-4-Zellen gemischt und eine Stunde bei 4°C inkubiert. Die nicht-gebundenen HCV-Proteine wurden durch zwei Zentrifugationen in PBS bei 200 × g, 5 Minuten, bei 4°C entfernt. Anschließend wurden die Zellen mit verschiedenen Verdünnungen von Seren aus Menschen, Schimpansen oder Kaninchen, die entweder mit HCV infiziert oder mit rekombinanten HCV-Proteinen immunisiert worden waren, 30 Minuten bei 4°C inkubiert; wenn möglich wurden die entsprechenden Präimmunseren als Kontrolle verwendet. Die Zellen wurden zweimal in PBS gewaschen und 30 Minuten mit der geeigneten Verdünnung eines Fluoresceinisothiocyanat-konjugierten Antiserums (entweder gegen das menschliche IgG oder das Kaninchen-IgG) inkubiert.
Danach wurden die Zellen bei 4°C in PBS gewaschen, in 100 μl PBS resuspendiert und die zellgebundene Fluoreszenz mit einem FACScan^TM Durchflusscytometer analysiert (Becton Dickinson, Mountain View, CA). Das Gerät wird unter Verwendung der Dot-Plot-Darstellung einer Vorwärts- oder Seitwärtsstreuung so gesteuert, dass es lebensfähige Einzelzellen durchlässt und Zelltrümmer und Zellklumpen ausschließt. Insgesamt 5000 Ereignisse werden gesammelt, wobei die Analyse der Daten anhand des Lysis II Software-Programms von Becton Dickinson durchgeführt wird. Dieses Programm erzeugt Histogramme von jeder Zellprobe und berechnet die durchschnittliche Kanal-Fluoreszenz der Zellpopulation, die in einem direkten Zusammenhang mit der Oberflächendichte der fluoreszierend markierten HCV-Proteinen steht, die an die Zellen gebunden sind. Die durchschnittlichen Fluoreszenzwerte (durchschnittliche Kanal-Zahl) der Zellen, die mit oder ohne HCV-Proteine und mit Immun- oder Präimmunseren inkubiert wurden, wurden miteinander verglichen. Die Schwelle für ein positives Ergebnis wird für jedes Experiment mittels durchflusscytometrischer Analyse derjenigen Zellen ohne gebundene HCV-Proteine festgelegt, die mit Antiseren gegen HCV-Proteine und dem FITC-markierten zweiten Antikörper inkubiert worden waren.
Das vorstehend beschriebene Experiment zeigt, dass die Bindung von E2 an die Zielzellen messbar ist und eine hohe Affinität aufweist.
Ein Experiment wurde durchgeführt, um die Fähigkeiten verschiedener HCV-Proteine, die in unterschiedlichen Systemen exprimiert wurden, an verschiedene Zelltypen zu binden, welche einen HCV-Rezeptor besitzen, miteinander zu vergleichen.
Die Zellen wurden mit rekombinanten HCV-Hüllen (E1/E2 oder E2) inkubiert, die entweder in Hefe, Insektenzellen oder in Säugerzellen (HeLa oder CHO) exprimiert worden waren, und anschließend wurden sie mit polyclonalen Seren von Kaninchen inkubiert, die mit den entsprechenden rekombinanten Proteinen immunisiert worden waren. Nach der Inkubation mit einem FITC-konjugierten Antiserum gegen das Kaninchen-IgG wurde die Bindung der HCV-Proteine indirekt durch Durchflusscytometrie als zellgebundene Fluoreszenz nachgewiesen.
Die repräsentativen Experimente in 2 zeigen, dass das rekombinante E1/E2 oder E2, das in Säugerzellen exprimiert wurde, nicht jedoch das, das in Hefe exprimiert wurde, an menschliche Zellen binden kann, wohingegen E2, das in Insektenzellen exprimiert wurde, eine geringe, jedoch nachweisbare Bindung zeigt. Identische Ergebnisse wurden auch erhalten, wenn man als Zielzellen Leberkarzinom-Zelllinien oder frisch gereinigte menschliche B-Zellen verwendete.
Nach Inkubation der Molt-4-Zielzellen mit steigenden Konzentrationen von E1/E2 oder E2 wurde gefunden (3A), dass die Bindung von E2, das in Säugerzellen exprimiert wurde, bei einer Konzentration von 10 μg/ml ein Plateau ausbildete.
Da diese Bindung stättigbar ist, konnte die Affinität des rekombinanten E2 für seinen mutmaßlichen Rezeptor bestimmt werden, indem das doppelt-reziproke Darstellungsverfahren eingesetzt wurde, das früher schon für die Berechnung der Affinität einer Hapten-Antikörper-Wechselwirkung beschrieben wurde (14). In 3B ist die ermittelte Affinität als Kd-Wert angegeben und entspricht dem reziproken Wert der Konzentration des freien E2, bei der die Hälfte der Konzentration von E2 an seinen mutmaßlichen Rezeptor gebunden ist. Auf der y-Achse wurden die reinen durchschnittlichen Fluoreszenzintensität-Werte für jede Konzentration von E2 berechnet, indem die durchschnittliche Fluoreszenz, die mit Kaninchen-Anti-E2-Serum und FITC-Ziegen-Anti-Kaninchen in Abwesenheit von E2 erhalten wurde, von der Fluoreszenz abgezogen wurde, die in Gegenwart von E2 erhalten wurde. Die reine durchschnittliche Fluoreszenzintensität (y-Achse) und die E2-Konzentration (x-Achse) wurden als reziproke Werte aufgetragen.
Der Kd-Wert von E2 für Zielzellen beträgt etwa 10^–8 M, dies legt den Schluss nahe, dass E2 möglicherweise das Protein ist, das für die spezifische Bindung der E1/E2-Komplexe an die Zielzellen verantwortlich ist.
Beispiel 2 – Neutralisierungstest
Eine schematische Darstellung eines Neutralisierungstests gemäß der Erfindung ist in 4 dargestellt.
Versuchsprotokoll
Die Zellen (10⁵ pro Vertiefung) aus wurden in Mikroplatten mit 96 Vertiefungen mit U-Boden durch Zentrifugation bei 200 × g, 5 Minuten, bei 4°C sedimentiert. 20 μl von CHO/E2₇₁₅ (0,5 μg/ml PBS) wurden mit verschiedenen Verdünnungen von Seren aus Menschen, Schimpansen oder Kaninchen gemischt, die entweder mit HCV infiziert waren oder die mit rekombinanten HCV-Proteinen immunisiert worden waren. Nach einer Stunde Inkubation bei 4°C wurden die Molt-4-Zellen zugegeben und eine Stunde bei 4°C inkubiert. Nicht-gebundene HCV-Proteine und Antikörper wurden durch zwei Zentrifugationen in PBS bei 200 × g, 5 Minuten, bei 4°C entfernt. Anschließend wurden die Zellen 30 Minuten bei 4°C inkubiert mit einer 1/100-Verdünnung von Seren, die aus der gleichen Art wie das neutralisierende Serum stammten, die aus Tieren stammten, die mit rekombinanten HCV-Hüllproteinen immunisiert worden waren, oder mit den entsprechenden Präimmunseren als Kontrolle. Wenn man die Bindung mit Antikörpern aus der gleichen Art des neutralisierenden Serums nachweist, ist dies kritisch, da möglicherweise nicht-neutralisierende Anti-E2-Antikörper das E2 abdecken könnten, nachdem es an die Zielzellen gebunden wurde, und deshalb die Bestimmung der Neutralisierung stören könnten, wenn der Nachweis der Bindung mit einem Anti-E2-Serum aus einer anderen Art erfolgte. Die Zellen wurden zweimal in PBS gewaschen und 30 Minuten mit den geeigneten Verdünnungen des FITC-konjugierten Antiserums gegen das IgG inkubiert. Die zellgebundene Fluoreszenz wird wie im vorstehenden Bindungstest beschrieben nachgewiesen.
Diese Technik ist sehr hilfreich, um die Kreuz-Neutralisierung von Antikörpern gegen HCV-Hüllproteine aus verschiedenen HCV-Genotypen zu messen. Z. B. können die Antikörper, die gegen Hüllproteine aus dem HCV-Genotyp 1A hervorgerufen wurden, auf ihre Fähigkeit getestet werden, die Bindung von Hüllproteinen aus dem HCV-Genotyp 1b, 2, 3 usw. zu neutralisieren.
Antikörper gegen die hypervariable Region von E2 neutralisieren die Bindung
Ein Experiment wurde durchgeführt, um zu testen, ob die gemäß Beispiel 1 gemessene Bindung mit einem Antikörper gegen E2 neutralisiert werden kann. Polyclonale Antiseren von Kaninchen, die für das in CHO-Zellen exprimierte, rekombinante E2 spezifisch waren, wurden auf die Fähigkeit getestet, die Bindung von E2 zu neutralisieren.
E2 (bei der Konzentration von 0,5 μg/ml, d. h. dem Kd-Wert) wurde mit seriellen Verdünnungen der Kaninchen-Antiseren gemischt. Danach wurde das E2-Antikörper-Gemisch mit den Zielzellen inkubiert und anschließend die Bindung von E2 nachgewiesen. Dabei wurde gezeigt, dass Seren aus Kaninchen, die mit dem in Säugerzellen exprimierten E2 immunisiert worden waren, die Bindung von E2 an die Zielzellen neutralisieren können.
Da für andere Viren Epitope, die in der Lage sind, neutralisierende Antikörper zu induzieren, in Regionen lokalisiert wurden, die einen hohen Grad an Variabilität aufweisen, wurden weitere Experimente durchgeführt, um zu klären, ob ein mAb gegen die hypervariable Region 1 von HCV-E2 (As 384 bis 414) die Bindung von E2 neutralisieren würde.
CHO/E2 wurde mit den angegebenen Konzentrationen des gereinigten mAb (1G2A7) vorinkubiert, der für die hypervariable Region 1 (HVR1) von HCV-E2 spezifisch war. Danach wurde das Antikörper-E2-Gemisch mit Molt-4-Zellen inkubiert und die Bindung unter Verwendung des monoclonalen Antikörpers 291 nachgewiesen, der das an die Zielzellen gebundene E2 erkennt. Die Werte der durchschnittlichen Fluoreszenzintensität (MFI) wurden in Abwesenheit eines neutralisierenden mAb (positive Kontrolle), in Abwesenheit von E2 (negative Kontrolle) und in Gegenwart von E2-Antikörper-Komplexen (Werte des Versuchs) gemessen und die spezifische Neutralisierung gemäß der folgenden Gleichung bestimmt: Spezifische Neutralisierung = × 100 [(MFI der positiven Kontrolle – MFI des Versuchs)/(MFI der positiven Kontrolle – MFI der negativen Kontrolle)]. Die Ergebnisse sind in 5 dargestellt.
5 macht deutlich, dass der HVR1-spezifische mAb die Bindung von E2 neutralisieren kann, wenn auch nicht vollständig, dies zeigt, dass die Bindung von E2 mindestens zum Teil durch hypervariable Regionen vermittelt wird.
Antikörper, die die Bindung der HCV-Hülle neutralisieren, stehen in einem direkten Zusammenhang mit dem Schutz vor einer Infektion
Es wurde gezeigt, dass eine Impfung mit rekombinanten Hüllproteinen, die in Säugerzellen (HeLa) exprimiert wurden, nicht jedoch mit solchen, die in Hefe oder Insektenzellen exprimiert wurden, Schimpansen vor einer primären Infektion durch ein homologes HCV-Isolat schützen konnte (9).
Um zu klären, ob die Bindung und die anschließende Neutralisierung von E2 für die Bindung von HCV an die Zielzellen relevant waren, wurden die neutralisierenden Titer, die in den Seren der geimpften und vor einer anschließenden Provokation geschützten Schimpansen vorlagen, mit denen in Seren von Schimpansen verglichen, die zwar immunisiert worden waren, die jedoch für eine HCV-Provokation empfänglich waren.

Die Ergebnisse sind in 6 dargestellt, wobei die Ergebnisse für jeden Schimpansen wie folgt waren:

Schimpanse:	559
Vakzine:	HeLa E1/E2
Ergebnis:	Geschützt
ELISA-Titer von Anti-E1/E2:	1/37900
ELISA-Titer von Anti-E2 HV:	1/49
50% Neutralisierungstiter:	1/3500
Schimpanse:	357
Vakzine:	HeLa E1/E2
Ergebnis:	Geschützt
ELISA-Titer von Anti-E1/E2:	1/25900
ELISA-Titer von Anti-E2 HV:	1/30
50% Neutralisierungstiter:	1/2500

Schimpanse:	534
Vakzine:	HeLa E1/E2
Ergebnis:	Geschützt
ELISA-Titer von Anti-E1/E2:	1/22300
ELISA-Titer von Anti-E2 HV:	1/64
50% Neutralisierungstiter:	1/600
Schimpanse:	653
Vakzine:	HeLa E1/E2
Ergebnis:	Geschützt
ELISA-Titer von Anti-E1/E2:	1/8700
ELISA-Titer von Anti-E2 HV:	ND
50% Neutralisierungstiter:	1/1500
Schimpanse:	470
Vakzine:	HeLa E1/E2
Ergebnis:	Infiziert, jedoch geheilt
ELISA-Titer von Anti-E1/E2:	1/5300
ELISA-Titer von Anti-E2 HV:	1/95
50% Neutralisierungstiter:	1/250
Schimpanse:	WS181
Vakzine:	HeLa E1/E2
Ergebnis:	Infiziert, jedoch geheilt
ELISA-Titer von Anti-E1/E2:	1/2600
ELISA-Titer von Anti-E2 HV:	1/ND
50% Neutralisierungstiter:	1/300
Schimpanse:	590
Vakzine:	Hefe E1/BV E2
Ergebnis:	Infiziert
ELISA-Titer von Anti-E1/E2:	1/4300
ELISA-Titer von Anti-E2 HV:	ND
50% Neutralisierungstiter:	1/0

Schimpanse:	635
Vakzine:	Hefe E1/BV E2
Ergebnis:	Infiziert
ELISA-Titer von Anti-E1/E2:	1/2800
ELISA-Titer von Anti-E2 HV:	1/42
50% Neutralisierungstiter:	1/0

6 und die vorstehenden Ergebnisse zeigen, dass alle Schimpansen, die neutralisierende NOB-Titer von mindestens 1/600 hatten, vor einer Infektion geschützt waren, dass Schimpansen mit NOB-Titern von etwa 1/300 eine leichte Infektion entwickelten und geheilt wurden, wohingegen Schimpansen ohne NOB-Antikörper nicht geschützt waren (9).
Serielle Verdünnungen von Seren aus Schimpansen, die mit rekombinanten Hüllproteinen geimpft worden waren (9), wurden auf ihre Fähigkeit getestet, die Bindung von E2 zu neutralisieren. In jedem Abschnitt ist Folgendes angegeben: die als Vakzine verwendeten Hüllproteine, das Ergebnis der Provokation mit einem HCV-1-enthaltenden Plasma, die ELISA-Titer gegen HeLa E1/E2 und gegen das Peptid, das dem E2-HVR1 entspricht, sowie die 50% Neutralisierungstiter, die wie in 5 berechnet wurden.
6 zeigt außerdem, dass ELISA-Titer gegen die hypervariable Region 1 von E2 in geschützten und in nicht-geschützten Schimpansen vergleichbar waren, dies macht deutlich, dass die E2-bindenden neutralisierenden Antikörper mit dem Schutz vor einer Infektion in einem direkten Zusammenhang stehen und dass die durch eine Impfung induzierte Neutralisierung nicht von Antikörpern gegen das HVR1 abhängt.
Parallel dazu können Seren aus Menschen, die mit einem bestimmten HCV-Genotyp infiziert waren, auf ihre Fähigkeit getestet werden, die Bindung von Hüllproteinen aus HCV-Genotypen zu neutralisieren, die sich von dem infizierenden Genotyp unterschieden.
Es ist so zu verstehen, dass die Erfindung vorstehend als Beispiel beschrieben ist und dass Modifikationen durchgeführt werden können, ohne dass ein übermäßiges Experimentieren oder der Einsatz einer erfinderischer Genialität erforderlich wären.
Referenzen

1. Van der Poel, C. L. et al (1994) Lancet 344, 1475–1479.
2. Alter, M. J., et al (1992) N. Engl. J. Med. 327 1899–1905.
3. Alter, H. J., et al (1989) in Current Perspectives in Hepatology, Hrsg., Seef, L. B. et al (Plenum, New York) 83–97.
4. Choo, Q.-L. et al (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 2451–2455.
5. Spaete, R. R. et al (1992) Virology 188, 829–830.
6. Farci, P. et al (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 7792–7796.
7. Shimizu, Y. K. et al (1994) J. Virol. 68, 1494–1500.
8. Zibert, A. et al (1995) Virol. 208, 653–661.
9. Choo, Q.-L. et al (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 1294–1298.
10. Chien, D. Y. et al (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10021–10015.
11. Baldari, C. et al (1987) EMBO J. 6, 229–234.
12. Lau, J. Y. N. et al (1995) J. Infect. Dis. 171, 282–289.
13. Shimizu, Y. K. et al (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 5477–5481.
14. Celada, F. et al (1973) Immunochemistry 10 797–804.
15. Weiner, A. J. et al (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 3468–3472.
16. Botarelli, P. et al (1993) Gastroenterology 104 580–587
17. Europäische Patentanmeldung EP-A-0318215
18. Europäische Patentanmeldung EP-A-0388232
19. Virology, Hrsg., Dulbecco R. et al Harper & Row Philadelphia 1980.

Claims

Verfahren zur Messung der Bindung eines HCV-Rezeptorbindungsliganden an eine Zielzelle, das den Schritt umfasst: a) Inkontaktbringen eines putativen HCV-Rezeptorbindungsliganden oder eines kompetitiven Bindungsanalogons davon mit einer HCV-Rezeptorzielzelle; und b) Nachweisen der Bindung des Liganden oder des kompetitiven Bindungsanalogons an die HCV-Rezeptorzielzelle unter Verwendung eines nachweisbaren Antikörpers, der in der Lage ist, an den HCV-Rezeptorbindungsliganden zu binden, wobei die Bindung des nachweisbaren Antikörpers an die Zielzelle auf eine Messung der Bindung eines HCV-Rezeptorbindungsliganden oder kompetitiven Bindungsanalogons davon an die Zielzelle hinweist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Verfahrensschritte umfassen: i) Mischen von HCV-Rezeptorzielzellen und einer Probe, die auf die Anwesenheit von HCV-Rezeptorbindungsliganden getestet werden soll, um das Binden eines beliebigen HCV-Rezeptorbindungsliganden mit den HCV-Rezeptorzielzellen zu ermöglichen; ii) Entfernen von ungebundenem HCV-Rezeptorbindungsliganden; iii) Mischen mit einem nachweisbaren Antikörper, der in der Lage ist, an den HCV-Rezeptorbindungsliganden zu binden, um die HCV-Rezeptorzielzellen, die einen HCV-Rezeptorbindungsliganden gebunden haben, zu markieren; und iv) Feststellen der Menge an markierten HCV-Rezeptorzielzellen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Verfahrensschritte umfassen: i) Mischen von HCV-Rezeptorzielzellen, einer Probe, die auf die Anwesenheit von HCV-Rezeptorbindungsliganden getestet werden soll, und einer begrenzten Menge eines HCV-Rezeptorbindungsligandenanalogons, um Bindungskompetition an die HCV-Rezeptorzielzellen zu ermöglichen; ii) Entfernen von ungebundenem HCV-Rezeptorbindungsliganden; iii) Mischen mit einem nachweisbaren Antikörper, der in der Lage ist, an den HCV-Rezeptorbindungsliganden zu binden, um die HCV- Rezeptorzielzellen, die einen HCV-Rezeptorbindungsliganden gebunden haben, zu markieren; und iv) Feststellen der Menge an HCV-Rezeptorzielzellen, die an das HCV-Rezeptorbindungsligandenanalogon gebunden sind.
Verfahren zur Messung der Neutralisation eines HCV-Rezeptorbindungsliganden, die aus der Bindung eines neutralisierenden Antikörpers an einen HCV-Rezeptorbindungsliganden hervorgeht, das die Schritte umfasst: i) Mischen von HCV-Rezeptorzielzellen, eines HCV-Rezeptorbindungsliganden und einer Probe, die auf die Anwesenheit eines HCV neutralisierenden Antikörpern getestet werden soll; ii) Entfernen von ungebundenem HCV-Rezeptorbindungsliganden; iii) Mischen mit einem nachweisbaren Antikörper, der in der Lage ist, an den HCV-Rezeptorbindungsliganden zu binden, um die HCV-Rezeptorzielzellen, die einen HCV-Rezeptorbindungsliganden gebunden haben, zu markieren; und iv) Feststellen der Menge an HCV-Rezeptorzielzellen, die an den HCV-Rezeptorbindungsliganden gebunden sind.
Verfahren zur Identifizierung von HCV-Rezeptorzielzellen in einer Zellprobe, das die Schritte umfasst: i) Mischen der Zellprobe und eines HCV-Rezeptorbindungsliganden, um das Binden eines beliebigen HCV-Rezeptorbindungsliganden mit einer HCV-Rezeptorzielzelle in der Probe zu ermöglichen; ii) Entfernen von ungebundenem HCV-Rezeptorbindungsliganden; iii) Mischen mit einem nachweisbaren Antikörper, der in der Lage ist, an den HCV-Rezeptorbindungsliganden zu binden, um die HCV-Rezeptorzielzellen, die einen HCV-Rezeptorbindungsliganden gebunden haben, zu markieren; und iv) Feststellen der Menge an markierten HCV-Rezeptorzielzellen.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Menge an HCV-Rezeptorzielzellen, die an die HCV-Rezeptorbindungsliganden gebunden sind, mittels Durchflusszytometrie festgestellt wird.
Verfahren zur Identifizierung neutralisierender Bindungsantikörper zu einem HCV-Rezeptor, das den Schritt der Ausführung eines Verfahrens, wie in Anspruch 4 definiert, umfasst.