CN110462402A - 防止因体液引起的抗原抗体反应阻碍的物质 - Google Patents
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Abstract
本发明旨在提供对在使用含有体液(尤其是唾液等来自生物粘膜的成分)的试样的免疫测定法中的抗原抗体反应阻碍有效的抑制剂,以及旨在抑制免疫测定法中的假阳性和假阴性。本发明提供一种免疫反应阻碍抑制剂,其特征在于,所述免疫反应阻碍抑制剂是抑制在免疫测定法中因试样中的体液引起的免疫反应阻碍作用的免疫反应阻碍抑制剂,并含有以下的(1)和(2)中的任一种化合物:(1)“R1‑SO3H”表示的磺酸化合物或其盐(式中,R1表示直链状C5至C30烷基、经具有至少一个直链状C5至C30烷基的碳环式芳香族基取代的直链状C1至C30烷基、或具有至少一个直链状C5至C30烷基的碳环式芳香族基,这些基团也可具有取代基);(2)“N+‑R2R3R4R5”表示的季铵离子或其盐(式中,R2至R5各自独立地表示直链状C1至C30烷基、或经至少一个直链状C5至C30烷基取代的碳环式芳香族基,这些基团也可具有取代基)。
Description
技术领域
本发明涉及提供一种抑制在免疫测定法中因体液成分(尤其是唾液等来自生物粘膜的成分)引起的抗原抗体反应阻碍的阻碍抑制物质,以及使用该阻碍抑制物质的迅速、简便且准确的免疫测定法。
背景技术
在人类、动物的疾病等的诊断中,现在开发有各式各样的简易检查法。简易诊断法以使用针对想要检测的对象物质(病原体等)的特异性抗体结合反应(抗原抗体反应)进行诊断的方法为主流,ELISA、免疫层析法(イムノクロマト法)、乳胶凝集法(ラテックス凝集法)等已广为人知。由于可在由患者、患畜采集样本后迅速且简便地得到结果,因此可在症状为初期状态下时就开始治疗,由此,简易检查试剂和试剂盒的重要性在医疗、畜牧业的现场中逐年提高。
现在,在人类、家畜的疾病的诊断中,对于一部分病原体,以由患者采集的咽拭液(咽頭拭い液)等作为样本而迅速诊断的方法等简易诊断法的实用化有所进展。然而,这仅限于流行性感冒的迅速诊断等一部分场景,并且能够诊断的对象还是有限。
作为其主要原因之一列举:混入样本中的来自人类·动物的唾液等体液成分会对抗原抗体反应造成不利影响(假阳性、假阴性),存在产生不能准确地得到诊断结果的现象的情况。例如,对于对家畜生产造成重大灾害的口蹄疫,由于在现场中的迅速诊断很重要,因此需要不需要使用大型机器的免疫层析,但存在由于牛唾液等来自生物粘膜的成分会混入样本中而引起免疫层析的反应异常,导致不能作出准确诊断的问题点。
已知在体液样本中,尤其是唾液等来自生物粘膜的样本的情况下,其含有大量的来自粘膜免疫系统的生物防御成分,在通过免疫分析来检测受检物质时,会成为假阴性、假阳性的原因(专利文献1、专利文献2)。
用于抑制这样的因唾液等体液成分引起的抗原抗体反应阻碍的阻碍抑制物质的研究开发也日渐活跃,主要地,使用“各种表面活性剂等具有界面活性作用的物质”或者“在分子中具有多个磺酸基、羧基或硫酸基等离子性官能团的高分子量聚合物”的技术受到关注。例如,已提出:通过非离子性或两性表面活性剂将因唾液中的粘蛋白所引起的变形链球菌(ミュータンス連鎖球菌)凝集可溶化的技术(专利文献3);使用具有磺酸基和/或羧基的阳离子交换树脂将来自咽部的样本进行前处理的技术(专利文献4)通过由具有磺酸基、羧酸基等的疏水性环式单体聚合的聚合物构成的离子性表面活性剂来抑制血清中的妨碍物质的作用的技术(专利文献5);通过含有磺酸基或其盐的共轭二烯类共聚物来抑制血液中的妨碍物质的作用的技术(专利文献6);使用具有2个以上硫酸基的平均分子量5,000至500,000的葡聚糖硫酸盐来抑制来自生物粘膜的成分中IgA等的妨碍作用的技术(专利文献1)等。此外,在使用低分子化合物的例子中,已提出:通过具有SH基的化学物质来抑制粪便、唾液等样本中的血红蛋白的免疫学测定中的妨碍物质的技术(专利文献7);在引起龋齿的细菌的测定、鉴定检查时,用十二烷基硫酸钠等阴离子表面活性剂来处理唾液等口腔内样本的方法(专利文献2)。此外,已记载了在测定来自含有HCV等病毒的血液的样本中的病毒抗原时,通过对样本使用含有阴离子性表面活性剂、两性离子表面活性剂或非离子性表面活性剂的处理液,可有效地从病毒粒子提取抗原且同时可抑制血清中成分的测定阻碍(专利文献8)。
然而,尽管上述技术都对特定的病原体等有限的对象抗原具有一定的效果,但均未能达到提供针对因唾液等体液成分引起的广泛抗原抗体反应阻碍的强力抑制剂,因此仍强烈期望提供可适用于广泛的蛋白质抗原及包含该抗原的各种病原体全体的强力的反应阻碍抑制剂。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:日本特开2014-149189号公报
专利文献2:日本特开2009-52945号公报
专利文献3:日本特开2002-357599号公报
专利文献4:日本特许第4969245号公报
专利文献5:日本特开2005-241415号公报
专利文献6:日本特开平9-304384号公报
专利文献7:日本特开2010-117244号公报
专利文献8:日本特许第3171827号公报
发明内容
发明要解决的技术问题
本发明提供在使用体液试样(尤其是唾液等来自生物粘膜的试样)时不仅可应用于特定的病原体而且还可应用于广泛的一般性蛋白质抗原的简便且准确的免疫测定法;此外,本发明提供针对在执行该免疫测定法时因所使用的唾液等体液成分引起的抗原抗体反应阻碍的抑制剂。
解决技术问题的技术手段
在本发明中,为了解决此问题,着眼于在体液成分中免疫反应阻碍作用强的唾液,认为如果是可抑制因唾液成分引起的对于广泛蛋白质抗原的强免疫反应阻碍作用的物质,则可成为可适用于广泛的病原体、过敏原的检测、测定技术的反应阻碍抑制剂。
因此,从多个个体收集大量分泌的牛唾液来调查各自的免疫反应阻碍活性,使用阻碍活性最高的唾液试样,并使用可简便地确认效果的免疫层析进行筛选实验。此时,作为检测对象抗原选择弯曲杆菌(カンピロバクター)抗原,并使用市售的弯曲杆菌检测试剂盒。
首先,尝试使用以往在唾液等体液试样中的特定的病原体等的免疫反应中确认有一定效果的各种表面活性剂,但任何一种表面活性剂的效果均不充分。其次,尝试使用各种柱树脂(カラム樹脂),虽然具有磺酸基的强酸性阳离子交换树脂的效果特别高,但其存在会因干燥而性能劣化等效果不稳定的缺点。
接着,为了研究具有磺酸基的强酸性阳离子交换树脂的效果稳定化,将树脂的杂质用免疫层析用展开液(展開液)进行清洗,使用口蹄疫抗原检测免疫层析测量相对于唾液样本的质控线(コントロールライン)的反应性。同时,为了做比较,对于清洗后的清洗液也进行同样的测量。其结果,令人惊讶的是,清洗液一方表现出清洗后的树脂近10倍的强反应性。即,在具有磺酸基的强酸性阳离子交换树脂中观察到的高免疫阻碍抑制效果理解为由作为在强酸性阳离子交换树脂制造过程中生成的杂质而混合存在的具有磺酸基的低分子化合物引起。
因此,对于作为杂质混合存在的可能性高的各种低分子磺酸盐,测定相对于唾液样本的质控线的反应性和口蹄疫病毒检测灵敏度,并评估其反应阻碍抑制效果,结果发现具有至少一个碳数5以上的直链烷基的脂肪族或芳香族的磺酸盐可以在各种蛋白质抗原的免疫测定法中表现出高反应阻碍抑制效果,防止假阳性、假阴性。
此外,搜寻与磺酸盐同样具有强离子性官能团的低分子化合物,对于各种季铵盐也确认到同样的反应阻碍抑制效果。
由上述内容可得知,具有至少一个直链状C5至C30烷基的脂肪族或芳香族磺酸或其盐以及季铵离子或其盐可以作为在免疫测定法中因唾液等体液的混入引起的免疫反应阻碍的抑制剂来使用。
通过得到以上的见识,可完成本发明。
即,本发明如下所述。
[1]一种免疫反应阻碍抑制剂,其特征在于,所述免疫反应阻碍抑制剂是抑制在免疫测定法中因试样中的体液、尤其是来自生物粘膜的体液引起的免疫反应阻碍作用的免疫反应阻碍抑制剂,并含有以下的(1)和(2)中的任一种化合物:
(1)“R1-SO3H”表示的磺酸化合物或其盐
(式中,R1表示直链状C5至C30烷基、经具有至少一个直链状C5至C30烷基的碳环式芳香族基取代的直链状C1至C30烷基、或具有至少一个直链状C5至C30烷基的碳环式芳香族基,这些基团也可具有取代基);
(2)“N+-R2R3R4R5”表示的季铵离子或其盐
(式中,R2至R5各自独立地表示直链状C1至C30烷基、或经至少一个直链状C5至C30烷基取代的碳环式芳香族基,这些基团也可具有取代基)。
在此,本发明的“免疫反应阻碍抑制剂”是指:在利用了用于检测或测定可能存在于受检试样中的目标抗原的抗原抗体反应的免疫测定法中,显著抑制因受检试样中所含有的或可能含有的体液引起的免疫反应阻碍作用的化合物、或含有该化合物作为有效成分的组合物。
[2]如前述[1]所述的免疫反应阻碍抑制剂,其中,(1)的式中,R1是未取代的直链状C5至C20烷基、经具有直链状C5至C20烷基的苯基取代的直链状C1至C20烷基、或经直链状C5至C20烷基取代的苯基。
[3]如前述[1]所述的免疫反应阻碍抑制剂,其中,(2)的式中,R2至R5各自独立地为可经碳环式芳香族基取代的直链状C1至C20烷基、或经至少一个直链状C5至C20烷基取代的碳环式芳香族基。
[4]如前述[1]所述的免疫反应阻碍抑制剂,其中,(2)的式中,R2至R5各自独立地为未取代或经苯基取代的直链状C1至C20烷基、或经直链状C5至C20烷基取代的苯基。
[5]如前述[4]所述的免疫反应阻碍抑制剂,其中,(2)的式中,R2至R5是以下(a)至(e)中的任一种情况:
(a)R2至R5中的任一个为可经苯基取代的直链状C3至C20烷基,其它三个为甲基或乙基的情况;
(b)R2至R5中的任一个为甲基或乙基,其它三个为可经苯基取代的直链状C3至C20烷基的情况;
(c)R2至R5全部为可经苯基取代的直链状C3至C20烷基的情况;
(d)R2至R5中的任一个为苄基,其它三个为可经苯基取代的直链状C3至C20烷基的情况;或者
(e)R2至R5中的任两个为甲基或乙基,其它两个为可经苯基取代的直链状C6至C20烷基的情况。
[6]如前述[5]所述的免疫反应阻碍抑制剂,其中,(2)的式中,R2至R5是以下(a)至(e)中的任一种情况:
(a)R2至R5中的任一个为直链C3至C16烷基,其它三个的R2为甲基的情况;
(b)R2至R5中的任一个为甲基,其它三个为直链C3至C12烷基的情况;
(c)R2至R5全部为直链C3至C12烷基的情况;
(d)R2至R5中的任一个为苄基,其它三个为直链C3至C12烷基的情况;或者
(e)R2至R5中的任两个为甲基,其它两个为直链C3至C12烷基的情况。
[7]如前述[1]、[3]至[6]中任一项所述的免疫反应阻碍抑制剂,其中,(2)是铵离子的盐,且为与选自于由卤化氢、硝酸、六氟磷酸、三氟化二氢(三フッ化二水素)和高氯酸组成的组中的化合物形成的盐。
[8]一种免疫测定方法,其特征在于,所述免疫测定方法使用前述[1]至[7]中任一项所述的免疫反应阻碍抑制剂,
更具体而言,所述免疫测定方法可以是这样的方法,该方法是使用目标抗原特异性抗体来检测或测定存在或可能存在于受检试样中的目标抗原的方法,并包括:
(a)添加如前述[1]至[7]中任一项所述的免疫反应阻碍抑制剂的步骤;以及
(b)使受检试样与目标抗原特异性抗体接触的步骤,
在此,前述步骤(a)与前述步骤(b)同时实施或在前述步骤(b)之前实施,当前述步骤(a)在前述步骤(b)之前实施时,前述添加步骤针对选自于由受检试样稀释液、抗体稀释液、封闭液(ブロッキング液)和反应缓冲溶液组成的组中的至少一种来实施。
[9]一种抑制假阳性和/或假阴性的免疫测定方法,所述免疫测定方法包括:在用于测定含有来自受试者的体液、尤其是来自生物粘膜的体液的试样中的受检物质的选自于ELISA、免疫层析法、蛋白质印迹法(ウエスタンブロット法)、免疫印迹法(イムノブロット法)、免疫沉淀法和乳胶凝集法中的任一种免疫测定法中,使用如前述[1]至[7]中任一项所述的免疫反应阻碍抑制剂。
更具体而言,可为以下[9a]、[9b]或[9c]的方法。
[9a]一种使用免疫层析法来检测或测定目标抗原的方法,所述方法包括:
(a)添加如前述[1]至[7]中任一项所述的免疫反应阻碍抑制剂的步骤;以及
(b)在膜上使受检试样与目标抗原检测用抗体接触的步骤,
在此,前述步骤(a)与前述步骤(b)同时实施或在前述步骤(b)之前实施,当前述步骤(a)在前述步骤(b)之前实施时,前述添加步骤针对选自于由受检试样稀释液、免疫层析展开液、抗体稀释液、封闭液、免疫层析用膜的前处理液、缀合物垫(コンジュゲートパッド)固定用溶液和试样垫(サンプルパッド)固定用溶液组成的组中的至少一种来实施。
[9b]一种使用ELISA来检测或测定目标抗原的方法,所述方法包括:
(a)添加如前述[1]至[7]中任一项所述的免疫反应阻碍抑制剂的步骤;以及
(b)使受检试样与目标抗原检测用抗体接触的步骤,
在此,前述步骤(a)与前述步骤(b)同时实施或不同时实施,当前述步骤(a)与前述步骤(b)不同时实施时,前述添加步骤针对选自于由受检试样稀释液、封闭液、一抗稀释液、二抗稀释液和清洗用缓冲液组成的组中的至少一种来实施。
[9c]一种使用选自于蛋白质印迹法、免疫印迹法、免疫沉淀法和乳胶凝集法中的任一种方法来检测或测定目标抗原的方法,所述方法包括:
(a)添加如前述[1]至[7]中任一项所述的免疫反应阻碍抑制剂的步骤;以及
(b)使受检试样与目标抗原检测用抗体接触的步骤,
在此,前述步骤(a)与前述步骤(b)同时实施或在前述步骤(b)之前实施,当前述步骤(a)在前述步骤(b)之前实施时,前述添加步骤针对选自于由受检试样稀释液、封闭液、抗体稀释液和反应缓冲溶液组成的组中的至少一种来实施。
[10]如前述[9]所述的方法,其中,含有来自受试者的体液的试样含有至少一种来自生物粘膜的体液,所述来自生物粘膜的体液选自于唾液、痰、喉拭液、鼻拭液、鼻腔抽吸液和角结膜拭液。
[11]如前述[8]至[10]中任一项所述的方法,其中,受检物质是选自于由病原体、病原微生物、激素、炎症相关物质、前列腺素和代谢综合征(メタボリックシンドローム)相关物质组成的组中的物质。
[12]如前述[11]所述的方法,其中,前述病原体或病原微生物是选自于口蹄疫病毒、流行性感冒病毒、腺病毒、RS病毒、冠状病毒、狂犬病病毒、百日咳杆菌、溶血性链球菌、大肠杆菌、食物中毒细菌(食中毒細菌)、砂眼衣原体(クラミジア·トラコマテス)和支原体(マイコプラズマ)中的病原体或病原微生物。
[13]一种免疫测定用试剂盒,其特征在于,所述试剂盒含有如前述[1]至[7]中任一项所述的免疫反应阻碍抑制剂。
[14]如前述[13]所述的试剂盒,其中,所述免疫测定用试剂盒是用于选自于ELISA、免疫层析法、蛋白质印迹法、免疫印迹法、免疫沉淀法和乳胶凝集法中的任一种免疫测定法的试剂盒。
[15]一种试剂盒,其特征在于,所述试剂盒是用于使用来自受试者的体液、尤其是来自生物粘膜的体液通过免疫反应来诊断受试者是否罹患病原性疾病的试剂盒,
并且,在受检体液试样的稀释剂、展开液、封闭液中的至少一种中添加有如前述[1]至[7]中任一项所述的免疫反应阻碍抑制剂。
[16]如前述[15]所述的试剂盒,其特征在于,病原性疾病是选自于口蹄疫病毒、流行性感冒病毒、腺病毒、RS病毒、冠状病毒、狂犬病病毒、百日咳杆菌、溶血性链球菌、大肠杆菌、食物中毒细菌、砂眼衣原体和支原体中的病原体或病原性微生物所引起的疾病。
有益效果
通过将本发明的免疫反应阻碍抑制剂在各种免疫测定方法中用于前处理液或展开液,即使对于唾液等体液试样或有可能混有唾液等的受检试样,也可有效地抑制抗原抗体反应的降低。以往,为了排除唾液等体液的影响,需要做前处理等,但根据本发明,由于在没有前处理等的情况下也可测定可能混有唾液等体液的样本,因此期待在医疗和畜牧业的现场可迅速并准确地应对,并对检查质量的提高、生产性的提高有所贡献。
尤其是在牛、猪等家畜的疾病诊断中,对于口蹄疫、流行性感冒病毒等重要疾病的诊断,即使是唾液、鼻喉拭液等免疫反应阻碍活性强的受检试样,也可使用迅速且简便的免疫层析试剂盒来准确地进行诊断。
附图说明
图1:验证牛唾液对免疫层析的阻碍活性。在作为弯曲杆菌检测免疫层析的NH免疫层析弯曲杆菌中,在测试弯曲杆菌阳性样本时对检测线的影响(使用抗弯曲杆菌抗体来检测弯曲杆菌时的反应阻碍)和对质控线的影响(使用抗IgG抗体来检测抗口蹄疫抗体时的反应阻碍)。
图2:在弯曲杆菌检测用免疫层析(NH免疫层析弯曲杆菌)中,通过稀释牛唾液样本来验证反应性的恢复可能性。
图3:使用口蹄疫抗原检测用免疫层析来验证直链烷基磺酸盐对免疫反应阻碍的抑制效果。添加有0.3(w/v)%的直链十二烷基苯磺酸钠的牛唾液49个样本中的口蹄疫病毒检测试验结果。
具体实施方式
1.本发明的免疫反应阻碍抑制剂
(1-1)作为本发明的免疫反应阻碍抑制剂使用的化合物
在本发明提及“免疫反应阻碍抑制剂”时,是指在利用了用于检测或测定可能存在于受检试样中的目标抗原的抗原抗体反应的免疫测定法中,抑制因受检试样中所含有(或可能含有)的体液、尤其是来自生物粘膜的体液引起的免疫反应阻碍作用的化合物、或含有该化合物作为有效成分的组合物。
本发明的免疫反应阻碍抑制剂之一是在分子中具有可经取代的C5以上的直链烷基的脂肪族或芳香族磺酸或它们的盐。
另外一种的特征在于,其是在分子中具有可经取代的C3以上的直链烷基的季铵离子或其盐,且任一个均是在分子内有大电荷偏移(電荷の偏り)的低分子化合物。
(1-2)含有直链烷基的磺酸化合物或其盐
本发明的免疫反应阻碍抑制剂中,含有直链烷基的磺酸化合物是在分子中具有至少一个可经取代的C5至C30直链状烷基、且由以下(式1)表示的磺酸化合物或其盐:
(式1)
“R1-SO3H”
(式中,R1表示直链状C5至C30烷基、经具有至少一个直链状C5至C30烷基的碳环式芳香族基取代的直链状C1至C30烷基、或具有至少一个直链状C5至C30烷基的碳环式芳香族基,这些基团也可具有取代基)。
即,
(a)可经取代的直链状C5至C30(优选为C7至C20,较优选为C8至C15,特别优选为C10至C12)烷基磺酸或其盐;
(b)具有可经取代的直链状C5至C30(优选为C7至C20,较优选为C8至C15,特别优选为C10至C12)烷基的碳环式芳香族(芳基)磺酸或其盐;
(c)具有“具有可经取代的直链状C5至C30(优选为C7至C20,较优选为C8至C15,特别优选为C10至C12)烷基的碳环式芳香族(芳基)基”的直链状C1至C30(优选为C1至C20,较优选为C1至C15,特别优选为C1至C12)烷基磺酸或其盐。
作为直链状C5至C30烷基,虽然发现碳数越大则反应阻碍抑制效果越高的倾向,但从制造容易度和在测定用试样中的溶解容易度来看,碳数的长度受到限制。
作为碳环式芳香族基(芳基),优选为苯基或萘基,特别优选为苯基。
这些含有直链烷基的磺酸化合物也可具有直链烷基以外的取代基,例如,只要是卤素分子、羟基、烯基、环烷基、环烯基、烷氧基、酰基、乙酰基、甲酰基、羰基、羧基、氨基、亚氨基、氰基、偶氮基、硝基、硫醇基、酮基等可取代烷基的官能团,即可为任意取代基,但优选为对含有直链烷基的磺酸化合物整体的分子内的电荷偏移不会造成损伤的官能团。具体而言,优选为具有正电荷或不具有电荷的官能团。
这些含有直链烷基的磺酸化合物的代表性例子虽可举例示出:1-戊烷磺酸、1-己烷磺酸、1-庚烷磺酸、1-辛烷磺酸、1-壬烷磺酸、1-癸烷磺酸、1-十二烷磺酸和1-十二烷基磺酸等直链烷基磺酸;以及1-十二烷基苯磺酸、对辛基苯磺酸和对甲苯磺酸等直链烷基苯磺酸,但不限定于这些化合物。
此外,作为含有直链烷基的磺酸的盐,是指将磺基(磺酸基)用碱金属化合物、碱土金属化合物、氨等碱化合物中和而来的盐。优选为钠盐、钾盐、钙盐、镁盐、铵盐等,特别优选为钠盐。
(2)季铵离子或其盐
本发明的免疫反应阻碍抑制剂中,季铵离子或其盐是在分子中具有至少一个可经取代的直链烷基或可经取代的芳基中的任一个基团、且由以下(式2)表示的总是具有正电荷的季铵阳离子或作为与卤素等阴离子形成的盐的季铵盐:
(式2)
“N+-R2R3R4R5”表示的季铵离子或其盐
(式中,R2至R5各自独立地表示直链状C1至C30烷基、或经至少一个直链状C5至C30烷基取代的碳环式芳香族基,这些基团也可具有取代基)。
在此,独立的R2至R5中的至少一个基团优选为:
(i)直链状C3至C30(优选为C3至C20,较优选为C5至C15)直链烷基;或者
(ii)具有“经直链状C3至C30(优选为C3至C20,较优选为C5至C15)烷基取代的碳环式芳香族基(芳基)”作为取代基的C1至C30(优选为C3至C20,较优选为C5至C15)直链烷基。
此外,作为碳环式芳香族基(芳基),优选为苯基或萘基,特别优选为苯基。
在本发明的理想方式中,R2至R5可表示为以下(a)至(e)中的任一种情况:
(a)R2至R5中的任一个为可经苯基取代的直链状C3至C20(优选为C3至C16)烷基,其它三个为甲基或乙基(优选为甲基)的情况;
(b)R2至R5中的任一个为甲基或乙基(优选为甲基),其它三个为可经苯基取代的直链状C3至C20(优选为C3至C12)烷基的情况;
(c)R2至R5全部为可经苯基取代的直链状C3至C20烷基(优选为未取代的直链C3至C12烷基)的情况;
(d)R2至R5中的任一个为苄基,其它三个为可经苯基取代的直链状C3至C20烷基(优选为未取代的直链C3至C12烷基)的情况;或者
(e)R2至R5中的任两个为甲基或乙基(优选为甲基),其它两个为可经苯基取代的直链状C6至C20烷基(优选为未取代的直链C3至C12烷基)的情况。
作为本发明的免疫反应阻碍抑制剂使用的季铵离子或其盐也可具有直链烷基以外的取代基,例如,只要是卤素分子、羟基、烯基、环烷基、环烯基、烷氧基、酰基、乙酰基、甲酰基、羰基、羧基、氨基、亚氨基、氰基、偶氮基、硝基、硫醇基、酮基等可取代烷基的官能团,即可为任意取代基,但优选为对季铵离子整体的分子内的电荷偏移不会造成损伤的官能团。具体而言,优选为具有负电荷或不具有电荷的官能团。
这些季铵离子的代表性例子虽可举例示出:正辛基三甲基、月桂基三甲基铵、肉豆蔻基三甲基铵、硬脂基三甲基铵、十二烷基三甲基铵;甲基三辛基铵、甲基三丁基铵;四丁基铵、四甲基铵;以及苄基三丁基铵,但不限定于这些铵离子。
作为本发明的免疫反应阻碍抑制剂使用的季铵离子由于总是具有正电荷且反应性高,因此优选作为稳定的铵盐而使用。形成稳定的铵盐的阴离子为卤素、硝酸、六氟磷酸、三氟化二氢或高氯酸等,优选为Cl、Br或I等的卤化物。
2.本发明的免疫测定法中的检测、测定对象
(2-1)检测、测定对象
本发明中的检测物质是可通过免疫分析等利用抗原抗体反应的免疫测定法来测定的抗原或抗体。作为抗原,只要可制备抗体,则可为任何抗原,但优选为蛋白质、糖蛋白或肽,也可检测含有这些物质的原生动物、真菌、细菌、支原体、立克次体(リケッチア)、衣原体(クラミジア)、病毒等。特别地,优选为适用于将口蹄疫病毒、流行性感冒病毒、腺病毒、RS病毒、冠状病毒、狂犬病病毒、百日咳杆菌、溶血性链球菌或弯曲杆菌、沙门氏菌(サルモネラ)、病原性大肠杆菌等食物中毒细菌这样的病原性病毒或细菌迅速且准确地检测或定量时的情况。
进一步地,在通过ELISA、免疫分析(EIA)等对来自唾液试样的前列腺素等类花生酸;皮质醇等压力激素;睪酮、雌二醇等性激素;褪黑激素、胰岛素等各种激素;TNF-α、IL-1β等炎症相关物质;α-淀粉酶等消化酶;脂联素等代谢综合征相关物质进行检测、测定(高知县大学纪要,看护学部编第64卷,第73~83页,2014)时也有用。
此外,在饮食品、饲料等的质量控制中,当在保存时存在可能混入人类、动物的体液的情况时,也可适用于饮食品、饲料中的过敏原蛋白质抗原的检测或定量。
只要是能与作为测定对象的抗原特异性反应并结合的抗体,用于检测前述抗原的抗体即使不是单克隆抗体,也可使用多克隆抗体、抗血清。
(2-2)受检试样
施用本发明的免疫测定法的受检试样是具有或者可能具有目标抗原或目标抗体的试样,虽不受到特别限定,但优选为能大幅发挥抑制妨碍物质的影响这样的本发明效果的生物试样(尤其是唾液等来自生物粘膜的试样),典型地为采集自人类、动物(猪、牛、鸡、山羊、绵羊等家畜;狗、猫等宠物动物等)的来自生物粘膜的体液,例如列举选自于唾液、口腔拭液、痰、咽拭液、鼻腔拭液、鼻腔抽吸液和角结膜拭液等中的样本或其稀释液等。另外,有可能混入这些体液的饮食品、饲料等也可成为受检试样。特别地,优选唾液试样,因为其为最不具侵入性的采集方法。
3.本发明的免疫测定法和本发明的免疫反应阻碍抑制剂的使用方法
(3-1)使用本发明抗原抗体反应的检测系统、测定系统
只要是使用抗原抗体反应的检测系统、测定系统,本发明的免疫反应阻碍抑制剂全部都可适用。具体而言,当应用于免疫层析、ELISA、蛋白质印迹、免疫印迹、免疫沉淀、乳胶凝集法等时,优选抑制假阴性和假阳性。尤其是当应用于容易受到唾液等来自粘膜的物质的影响的免疫层析法时,效果很好。
以下,针对各免疫测定法举例示出本发明典型的使用方法并简单地进行说明,但本发明的使用方法不限定于这些方法。
(a)在免疫层析法中的使用方法
在免疫层析法中,在硝化纤维素膜等适当的膜上预先将受检试样中的目标抗原特异性抗体(捕获抗体)固定化,利用该膜的毛细管现象使得由在样本滴下部(検体滴下部)中准备的金属胶体等标记的抗体与样本中的抗原所形成的免疫复合体移动展开。当在捕获抗体上捕获了免疫复合体时,可通过目视来定性判定标记量(检测线)。若使用免疫层析读数器(リーダー)(以下也称为IC读数器)作为读取装置,还可将反应性数值化。将识别金属胶体标记抗体的抗IgG抗体等固定在固定的捕获抗体的下游,将剩余的金属胶体标记抗体所结合的位置作为质控线,通过目视或免疫层析读数器来确认。
在免疫层析法中,虽然将受检试样用缓冲液等进行稀释而使用,但可将本发明的免疫反应阻碍抑制剂预先添加于稀释液中、或可与受检试样同时添加于稀释液中。
此时,若使用作为一般的免疫层析法的展开液而使用的Tris缓冲液(トリス緩衝液)、磷酸缓冲液等(也可根据需要添加表面活性剂;白蛋白等蛋白质)作为稀释液,则可直接作为免疫层析法的展开液而使用。
此外,也可将其添加在金属胶体标记抗体、乳胶粒子(ラテックス粒子)标记抗体等的稀释液中。其也可用于封闭乳胶粒子。
进一步地,其也可用于在免疫层析法中使用的用于封闭硝化纤维素膜等膜的膜前处理液或者用于固定缀合物垫、试样垫的溶液中。
即,本发明的免疫测定法中的使用免疫层析法来检测或测定目标抗原的方法可以是这样的方法,该方法包括:
(a)添加本发明的免疫反应阻碍抑制剂的步骤;以及
(b)在膜上使受检试样与目标抗原检测用抗体接触的步骤,
在此,前述步骤(a)与前述步骤(b)同时实施或在前述步骤(b)之前实施,当前述步骤(a)在前述步骤(b)之前实施时,前述添加步骤针对选自于由受检试样稀释液、免疫层析展开液、抗体稀释液、封闭液、免疫层析用膜的前处理液、缀合物垫固定用溶液和试样垫固定用溶液组成的组中的至少一种来实施。
在免疫层析法等免疫测定法中,在稀释液、前处理液等中添加的本发明的免疫反应阻碍抑制剂的最佳浓度范围根据免疫反应阻碍抑制剂的种类以及根据受检对象生物的种类、年龄、混入的体液的种类、作为检测对象的目标抗原的种类等而不同,但通常为0.01~10(w/v)%,优选为0.02~5.0(w/v)%,进一步优选为0.05~3.0(w/v)%,特别优选为0.1~1.0(w/v)%。
(b)ELISA
如果ELISA是直接吸附法,则使受检试样溶液吸附于微孔板(マイクロプレート)、玻璃珠(ガラスビーズ)等固相上,在利用与抗原抗体反应和酶反应无关的蛋白质(脱脂乳、白蛋白等)将固相封闭后,使目标抗原特异性抗体进行反应,引起抗原抗体反应,并将多余的抗体洗去(当抗体未经标记时,使酶标记二抗进行反应,并追加二抗的清洗步骤)。接着,添加经标记的酶的底物,检测酶反应生成物。
如果是三明治法(サンドイッチ法),则使对目标抗原具有特异性的捕获抗体吸附于固相上,在封闭步骤后,使受检试样溶液和识别与捕获抗体不同的表位的抗原特异性抗体(一抗)反应,在一抗未经标记的情况下,则再使其与标记二抗反应。
不论是直接吸附法还是三明治法,都可添加在ELISA中的受检试样稀释液、封闭用脱脂乳等的溶解液和/或目标抗原特异性抗体、二抗等的抗体用稀释液中来使用。
即,本发明的免疫测定法中的使用ELISA来检测或测定目标抗原的方法可以是这样的方法,该方法包括:
(a)添加本发明的免疫反应阻碍抑制剂的步骤;以及
(b)使受检试样与目标抗原检测用抗体接触的步骤,
在此,前述步骤(a)与前述步骤(b)同时实施或不同时实施,当前述步骤(a)与前述步骤(b)不同时实施时,前述添加步骤针对选自于由受检试样稀释液、封闭液、一抗稀释液、二抗稀释液和清洗用缓冲液组成的组中的至少一种来实施。
(c)在其它免疫测定法中的使用方法
此外,优选使用本发明的免疫反应阻碍抑制剂的免疫测定法中有免疫凝集法。免疫凝集法是一种根据由抗原抗体反应所产生的反应液的浊度、吸光度这样的光学性质的变化而检测或定量受检试样中的抗原或抗体的方法,也包括免疫比浊法和使用乳胶粒子的乳胶凝集法。在含有经标记的抗血清的反应液或悬浮有目标抗原特异性抗体包被的乳胶粒子的反应液中添加受检试样,通过形成免疫复合体而使抗血清或乳胶粒子凝集,由此观察、测定浊度、吸光度的变化。
此时,除了可添加于受检试样稀释液等中以外,也可用于乳胶粒子的封闭用溶液、反应液中。
另外,在蛋白质印迹法中,除了可添加于受检试样稀释液以外,也可添加于抗体稀释液、封闭液中;在免疫沉淀法中,也是除了可添加于受检试样稀释液以外,也可添加于抗体稀释液、反应缓冲溶液中。
即,在其它免疫测定法中,其特征也是在于,在制备受检试样稀释液、抗体稀释液、封闭液和反应缓冲溶液的步骤中的至少任一步骤和/或使受检试样与目标抗原特异性抗体进行反应的步骤中,包含添加本发明的免疫反应阻碍抑制剂的步骤。
更具体而言,可以是这样的方法,该方法是使用选自于蛋白质印迹法、免疫印迹法、免疫沉淀法和乳胶凝集法中的任一种方法来检测或测定目标抗原的方法,并包括:
(a)添加本发明的免疫反应阻碍抑制剂的步骤;以及
(b)使受检试样与目标抗原检测用抗体接触的步骤,
在此,前述步骤(a)与前述步骤(b)同时实施或在前述步骤(b)之前实施,当前述步骤(a)在前述步骤(b)之前实施时,前述添加步骤针对选自于由受检试样稀释液、封闭液、抗体稀释液和反应缓冲溶液组成的组中的至少一种来实施。
(3-2)免疫测定用试剂盒
本发明的免疫反应阻碍抑制剂可与通常的各种免疫测定法用试剂盒组合而成为本发明的免疫反应阻碍抑制剂试剂盒。此外,通过在这些各种免疫测定法用试剂盒中使用的稀释用缓冲液、展开液、反应液、封闭液等至少一种溶液中预先将本发明的免疫反应阻碍抑制剂以规定浓度溶解并装入容器,将其包含在试剂盒中,可进一步提高便利性。
实施例
以下通过实施例更详细地说明本发明,但本发明不限定于这些实施例。
本发明中的其它用语、概念是基于本领域中惯用的用语的含义;对于为了实施本发明而使用的各种技术,除了有特别明示其出处的技术之外,只要是本领域技术人员即可根据公知文献等容易且确实地实施。此外,对于各种分析等,依据所使用的分析机器或试剂、试剂盒的使用说明书、商品目录等中记载的方法来实施。
另外,在本说明书中引用的现有技术文献、专利公报及专利申请说明书中的记载内容作为本发明的记载内容而参照。
(实施例1)因唾液引起的免疫反应阻碍
(1-1)因唾液引起的弯曲杆菌抗原的检测阻碍
在本实施例中,为了观察弯曲杆菌检测免疫层析中的抗原抗体反应阻碍,向用展开液稀释牛唾液而来的样本以8×106cfu/mL的量添加弯曲杆菌(空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni);ATCC29428)死菌液并搅拌制成样本,将该样本滴加至弯曲杆菌检测免疫层析(NH免疫层析弯曲杆菌(日本火腿(株)制造),通过免疫层析读数器(滨松PHOTONICS制造,C10066)测定检测线和质控线(图1)。检测线涂布抗弯曲杆菌抗体,质控线涂布抗小鼠IgG抗体,分别与弯曲杆菌菌体、抗弯曲杆菌抗体反应。
其结果是,虽然在每个经研究的牛唾液而来的个体中,各样本的阻碍程度有所不同,但以牛唾液作为样本时,与对照的PBS作为样本时相比较,确认反应会降低。进而,观察到即使是对于完全不同组合的抗原抗体反应,所发挥的阻碍程度也是几乎不变。
因此,将在本样本中表现出强阻碍作用的唾液选择作为用于搜寻阻碍活性抑制物质的研究试样。
(1-2)因牛·猪唾液引起的对弯曲杆菌抗原的阻碍状况
在此实施例中,确认与(1-1)同样的因唾液引起的对弯曲杆菌抗原蛋白的免疫测定的阻碍状况不只发生在牛唾液中,也发生在猪唾液中。
具体而言,将牛·猪唾液用PBS稀释10倍,供于NH免疫层析弯曲杆菌(日本火腿(株)制造)进行试验。在牛唾液的情况下,20个样本中,质控线被阻碍的假阴性样本有2例,假阳性有1例;与此相对,在猪唾液的情况下,54个样本中,假阴性有0例,但成为假阳性的唾液样本也存在12例(表1)。
另外,由于在口腔内弯曲杆菌以高浓度存在的可能性低,因此在检测线表现出高测定值时将其计为假阳性。此外,对于质控线被阻碍的唾液,认为检测线也成为假阴性的可能性高。
结果的详情的一部分作为(表2)示出。
[表1]
[表2]
※结果的详情(一部分)
(1-3)因唾液引起的对各种免疫层析的反应阻碍
在本实施例中,使用实施例(1-1)中得到的阻碍活性最高的唾液试样(G),对于检测对象的抗原蛋白质不同的各种免疫层析,观察因唾液成分混入引起的免疫反应阻碍的程度。
具体而言,作为不同抗原蛋白质检测用免疫层析的模型,选择作为食品的过敏原蛋白质的蛋、牛乳、小麦蛋白质;此外,作为病原菌的检测模型,选择肠出血性大肠杆菌O157;作为病原病毒的检测模型,选择口蹄疫病毒,分别使用“FASTKIT SLIM蛋”、“FASTKITSLIM小麦”(日本火腿(株)制造)以及“NH免疫层析O157”(日本火腿(株)制造)、“口蹄疫抗原检测免疫层析”(开发品)进行实验。
在食品的过敏原蛋白质的检测实验中,制作将唾液试样(G)稀释10倍的稀释唾液试样,将向其中分别以约25ng/mL的量混合过敏原蛋白质的蛋蛋白质和小麦蛋白质而来的试样100μL供于免疫层析进行试验。
另一方面,在肠出血性大肠杆菌O157检测实验中,制作将唾液试样(G)稀释10倍的稀释唾液试样,并将把“O157”(野生株)(1×106cfu/mL)用稀释唾液试样稀释26倍而来的试样100μL供于免疫层析进行试验。在口蹄疫病毒检测试验中,使用在与实施例(1-1)不同的研究中得到的阻碍活性高的唾液试样(R)。制作将唾液试样(R)稀释10倍的稀释唾液试样,将向其中以104.75TCID50/mL的量混合口蹄疫病毒(O/JPN/2010株)而来的试样60μL供于免疫层析进行试验。
进而,在各试验中设置添加PBS来代替牛唾液的对照试验,比较其与添加牛唾液的试验的反应性的差异。
其结果是,尤其是在蛋、小麦、口蹄疫的检测用免疫层析中,观察到因唾液引起的接近约100%的反应性降低。此外,在“O157”的检测用免疫层析中,为接近约40%的反应性降低。由此可知,在实施例(1-1)中研究的牛唾液对IgG、细菌、过敏原蛋白、病毒等范围广泛的抗原均表现出反应阻碍(表3)。
[表3]
(1-4)稀释对于因唾液成分引起的反应阻碍的影响
在人类的诊断试剂盒等中,有为了避免因唾液混入样本引起的反应阻碍而推荐稀释样本的例子。
因此,使用与实施例(1-3)所用相同的唾液试样,为了研究弯曲杆菌检测免疫层析(NH免疫层析弯曲杆菌)中的检测线和质控线的消失是否会因稀释而恢复以及以几倍稀释会恢复,改变稀释率实施多次。
其结果是,尽管检测线、质控线都在5倍稀释下有一些恢复,但即使稀释到50倍,反应也未完全恢复。对于检测线,即使稀释50倍也仅恢复56%左右(图2)。
(实施例2)免疫反应阻碍抑制剂的筛选
(2-1)从表面活性剂来筛选
首先,作为免疫反应阻碍抑制剂的候选者,尝试了以往被认为对唾液等体液中的免疫反应阻碍物质有抑制效果的各种表面活性剂。
作为表面活性剂,使用在专利文献1中确认对唾液中的粘蛋白有可溶化效果的各种非离子性表面活性剂和两性表面活性剂,进行阴性试验和阳性试验。
与实施例(1-2)等相同,阴性试验和阳性试验使用唾液试样(G)在与实施例(1-1)同样的条件下使用NH免疫层析弯曲杆菌和弯曲杆菌稀释液进行。
其结果是,几乎全部的表面活性剂都无法确认到充分的效果(数据未示出)。将效果相对较高者作为下(表4)示出。
当使用阴离子表面活性剂的牛磺胆酸钠水合物(浓度2%)时,质控线虽有恢复,但检测线未恢复。当使用同样为阴离子表面活性剂的脱氧胆酸(浓度1~5%)和月桂酰基肌氨酸(浓度1~5%)时,也同样是质控线虽有恢复,但检测线的恢复不充分(表4)。在十二烷基硫酸钠(SDS)的情况下,虽然检测线有些许恢复,但若从添加在样本中的弯曲杆菌菌体量来考虑,由于线强度并不充分,判断为反应未恢复。
结论是,无法找到质控线与检测线皆恢复并且也不表现出假阳性反应的充分的表面活性剂。
[表4]
(2-2)从柱树脂来筛选
接着,从在专利文献2中用于来自咽部的样本的前处理的对流行性感冒病毒检测有效果的具有磺酸基或羧基的阳离子交换树脂等各种柱树脂中进行筛选。
针对6种强酸性阳离子交换树脂、2种弱酸性阳离子交换树脂、8种强碱性阴离子交换树脂、4种弱碱性阴离子交换树脂以及之外的2种螯合树脂和4种合成吸附剂柱(合计26种),测定各自的恢复率。此时,作为阳性对照,以悬浮在PBS中的弯曲杆菌菌液的反应性作为100%,测定其恢复率。
具体而言,准备在向牛唾液2.36mL中添加含有1%BSA的硼酸缓冲液(pH 8.0)21.24mL得到的唾液稀释液中添加弯曲杆菌死菌750μL而来的试样,对各自填充有上述各树脂约0.5mL的柱通液试验用试样500μL。
将得到的各柱通过液供于弯曲杆菌检测免疫层析(NH免疫层析弯曲杆菌(日本火腿(株)制造),测定检测线和质控线中的反应性(表5)。
此时,作为除去阻碍的阳性对照,将在PBS 23.6mL中悬浮上述弯曲杆菌死菌750μL的溶液供于NH免疫层析弯曲杆菌,以此时的反应性作为100%,从对其它柱进行通液时的检测线的值算出恢复率。
[表5]
对于由这些柱得到的第1次结果(表5),在强酸性阳离子交换树脂和强碱性阴离子交换树脂中,虽发现有多种树脂表现出恢复效果高的结果,但再度进行追加试验时缺乏实验再现性,无法得到稳定效果(数据未示出)。
在将离子交换树脂等填料于柱中后,虽然在静置状态下时间推移的同时树脂的干燥也在推进,但其进行状况依据对柱的填料方式、当时的室内环境等各种原因而不定。认为这样的柱内树脂干燥状态的波动是导致结果不稳定的原因。
(2-3)强酸性阳离子交换树脂的稳定性
在以下实验中,选择在(2-2)的实验中效果最高的具有磺酸基的强酸性阳离子交换树脂No.5(三菱化学制造PK220)作为暂定的免疫阻碍抑制剂候选者,试验其稳定性。
在强酸性阳离子交换树脂的情况下,在填料于柱中后放置时,时间推移的同时树脂干燥。由于这样的柱内树脂干燥状态的波动,导致结果有不稳定的倾向。于是,将强酸性阳离子交换树脂PK220(三菱化学公司制造)悬浮于含有0.1%BSA的硼酸缓冲液中,将0.3g填料于内径约0.8cm、长度约1.0cm的圆锥状柱中,密封或不密封地在通常的实验室环境放置1周,试验其稳定性。具体而言,制作将唾液试样(R)稀释10倍的稀释唾液试样,将向其中以104TCID50/mL的量混合口蹄疫病毒(O/JPN/2010株)而来的试样60μL供于口蹄疫抗原检测免疫层析进行试验。其结果是,如(表6)所示,表明因树脂干燥使对唾液中的口蹄疫病毒的反应性降低。
[表6]
(2-4)强酸性阳离子交换树脂的清洗液而来的阻碍抑制效果
将使得树脂干燥状态的波动均一化作为初步目的,将把强酸性阳离子交换树脂PK220(三菱化学公司制造)6g悬浮于免疫层析用的含有0.1%BSA的硼酸缓冲液18mL中并在4℃下静置一夜后的树脂作为清洗后的树脂,确认其性能。进而,回收清洗后的上清。与清洗后的树脂一起,作为比较例,测量口蹄疫抗原检测免疫层析的质控线对清洗后的上清液中的唾液样本的反应性。
其结果,令人惊讶的是,清洗后的上清液一方显示出清洗后的树脂近10倍的强反应性(表7)。
作为清洗后的上清液一方显示出高阻碍除去活性的原因,推测是由于阻碍除去物质可溶于树脂柱所含的含有0.1%BSA的硼酸缓冲液,由此,具有磺酸基的强酸性阳离子交换树脂引起的对免疫阻碍的高抑制效果很可能是由于在强酸性阳离子交换树脂制造过程中生成的作为杂质而混合存在的具有磺酸基的低分子化合物。
[表7]
(实施例3)对具有磺酸基的化合物的免疫反应阻碍抑制效果的研究
(3-1)因唾液样本引起的反应性阻碍的恢复效果
针对因实施例(2-4)的结果而期待免疫反应阻碍抑制效果高的具有直链烷基的各种含有磺酸基的低分子化合物,观察在实施例1(1-1)中使用的口蹄疫抗原检测免疫层析中因牛唾液样本引起的对质控线的反应性的阻碍是否会恢复。
其结果是,以最低浓度使质控线的反应阻碍恢复的是直链十二烷基苯磺酸盐。因此,推测直链十二烷基苯磺酸的阻碍除去效果最高(表8)。
进而,关于直链十二烷基苯磺酸盐以外的各种烷基磺酸盐,可以确认直链烷基的碳数越大则在越低浓度表现出效果,其效果更高。直链烷基磺酸钠中的碳数为5以上时,质控线恢复。当直链烷基苯磺酸钠中具有碳数8和11的烷基时,确认质控线恢复(表8)。
[表8]
(3-2)对最佳添加浓度的研究
于是,向含有直链十二烷基苯磺酸盐的免疫层析用展开液中添加以106TCID50/mL的量添加有口蹄疫病毒(O/JPN/2010株)的唾液并搅拌。将此试验液供于口蹄抗原检测用免疫层析。
使直链十二烷基苯磺酸盐的添加浓度变化来进行研究时,可知直链十二烷基苯磺酸盐的添加浓度若在0.05~1.0(w/v)%的范围即可检测牛唾液中的口蹄疫病毒,并且可知优选在0.1~0.8(w/v)%的范围(表9)。
[表9]
(实施例4)脂肪族或芳香族烷基磺酸盐的免疫反应阻碍抑制效果
(4-1)口蹄疫病毒的检测效果-1
使用阻碍活性强的牛唾液调查因本发明的磺酸钠化合物引起的阻碍抑制效果。
具体而言,在牛唾液样本10μL中以106TCID50/mL的量添加口蹄疫病毒(O/JPN/2010株)后,在通常组成(含有Triton X-100)的展开液或者添加有直链十二烷基苯磺酸钠0.3(w/v)%或辛烷磺酸钠2.5w/v%的展开液中以成为稀释10倍的方式悬浮,并通过在实施例1(1-1)中使用的口蹄疫抗原检测免疫层析进行测定。
其结果是,在仅展开液的情况下,由于因唾液引起的阻碍,无法目视检测口蹄疫病毒,且检测线的读数器测定值也显示0.0;与此相对,通过将本发明的磺酸钠化合物预先添加到唾液样本中,可抑制阻碍作用,且以目视、读数器测定值均可进行检测(表10)。
进而,在整体上不包含含有口蹄疫病毒的唾液样本的情况下,也确认不会变成假阳性(表10)。
此结果同时也表明,对于展开液中作为非离子性表面活性剂的Triton X-100,在免疫活性阻碍强的情况下几乎不能期待有抑制效果。
[表10]
(4-2)口蹄疫病毒的检测效果-2
在此实验中,增加与实施例1(1-1)同样的唾液的样本数并添加直链十二烷基苯磺酸钠来确认直链十二烷基苯磺酸钠的免疫阻碍抑制效果。
具体而言,从(株)JAPAN·BIOSERUM购入由口蹄疫阴性的49头牛采集的唾液,制成用含有0.1%BSA的硼酸缓冲液(pH 8.0)稀释10倍的展开液,添加0.3(w/v)%的直链十二烷基苯磺酸钠。接着,以104TCID50/mL的量添加口蹄疫病毒(O/JPN/2010株)并搅拌。将各140μL滴加至口蹄疫抗原检测免疫层析,并通过目视和读数器进行测定(图3)。另外,样本编号与(图1)不一致。
其结果是,可将47/49个样本准确判定为阳性,考虑到在(实施例1-1)中能准确判定的只有4/17个样本而已,可确认直链十二烷基苯磺酸钠的免疫阻碍抑制效果。
(4-3)通过烷基苯磺酸盐来改善假阳性
在本实施例中,确认了直链十二烷基苯磺酸钠的假阳性抑制效果。
具体而言,将在(4-2)中采集的牛唾液中虽为口蹄疫阴性却在口蹄疫抗原检测免疫层析中呈阳性的显示假阳性的唾液分别添加至稀释10倍的通常展开液和添加有0.3(w/v)%的直链十二烷基苯磺酸钠的该稀释液中,通过与实施例1(1-1)同样的口蹄疫抗原检测免疫层析进行测定。
其结果是,确认通过使用直链十二烷基苯磺酸钠,不仅可抑制反应阻碍,而且可抑制假阳性(表11)。
[表11]
(实施例5)过敏原蛋白抗原的检测效果
在本实施例中,使用在实施例1(1-3)中观察到因唾液样本引起几乎100%阻碍活性的小麦蛋白质检测免疫层析(FASTKIT SLIM小麦,日本火腿制造),确认直链十二烷基苯磺酸钠是否可使反应性恢复。
其结果是,通过使用直链十二烷基苯磺酸钠,目视和IC读数器的结果都恢复到可检测的程度(表12)。
[表12]
FASTKIT SLIM小麦使用多克隆抗体
(实施例6)食物中毒细菌O157的检测
在本实施例中,使用在实施例1(1-2)中观察到因唾液样本引起接近40%的阻碍活性的肠出血性大肠杆菌O157的检测免疫层析(NH免疫层析O157,日本火腿制造),确认直链十二烷基苯磺酸钠是否可使反应性恢复。
其结果是,对于食物中毒细菌O157检测用免疫层析,也是通过使用直链十二烷基苯磺酸钠而使反应恢复,可确认反应阻碍抑制效果(表13)。
[表13]
NH免疫层析O157使用多克隆抗体
(实施例7)季铵盐的筛选
由于清楚了磺酸钠可防止因唾液引起的阻碍、假阳性,因此本实施例中从与磺酸钠盐在电荷、结构方面类似的观点来看,研究所关注的季铵盐对于因唾液引起的阻碍、假阳性是否具有防止效果。
具体而言,对于以下(表14)的(1)~(14)所示的季铵盐,与实施例(3-1)同样地使用在实施例(1-1)中选出的阻碍作用最高的牛唾液,并向用含有1%BSA的硼酸缓冲液(pH8.0)稀释10倍的展开液中添加各化合物,通过弯曲杆菌检测用免疫层析(NH免疫层析弯曲杆菌)实施阴性试验和阳性试验。
[表14]
其结果是,由于(5)的月桂基三甲基氯化铵、(8)的四丁基氟化铵、(11)的三氟化二氢四丁基铵、(13)的十二烷基三甲基溴化铵和(14)的甲基三辛基氯化铵使检测线和质控线均有恢复,因此作为本发明的免疫阻碍抑制剂候选者。
接着,对恢复效果最高的(14)的甲基三辛基氯化铵的浓度条件进行研究。
其结果是,清楚了在甲基三辛基氯化铵的情况下,在2.5~5.0(v/w)%时可对弯曲杆菌进行检测(数据未示出)。
(实施例8)季铵盐的免疫反应阻碍效果
(8-1)对因牛·猪唾液引起的假阴性的消除效果
向在实施例(1-2)中质控线被阻碍、被认为是假阴性的牛唾液BS-K16中以108CFU/mL的量添加弯曲杆菌菌液(添加有弯曲杆菌的唾液)。
将添加有弯曲杆菌的唾液用将季铵盐溶解在PBS中的溶液、将直链十二烷基苯磺酸钠盐溶解在PBS中的溶液稀释10倍,供于NH免疫层析弯曲杆菌进行试验。
另外,对于各试剂溶解在PBS中的浓度,在不会阻碍对弯曲杆菌的反应性的范围内选出最高浓度。
其结果是,月桂基三甲基氯化铵、十二烷基三甲基溴化铵、肉豆蔻基三甲基溴化铵等具有C12至C14烷基链的季铵盐对因唾液引起的假阴性表现出高消除效果(表15)。
[表15]
(8-2)对因牛·猪唾液引起的假阳性的消除效果
将在(8-1)中显示假阳性的牛·猪唾液样本用将直链十二烷基苯磺酸钠盐溶解在PBS中的溶液、或将直链烷基季铵盐溶解在PBS中的溶液稀释10倍,供于NH免疫层析弯曲杆菌进行试验。
其结果是,与直链十二烷基苯磺酸钠相同,确认了月桂基三甲基氯化铵和十二烷基三甲基溴化铵都会抑制因唾液引起的假阳性(表16)。
由上述可知,对于在各种病原菌抗原的测定时成为问题的免疫阻碍,对于季铵盐也可期待与具有直链烷基的磺酸化合物同样的抑制效果。
[表16]
(实施例9)O157检测用免疫层析中的唾液阻碍抑制效果
(9-1)对因牛·猪唾液引起的假阴性的消除效果
首先,当将把直链十二烷基苯磺酸钠盐和多种季铵盐分别溶解在PBS中得到的1(w/v)%溶液供于NH免疫层析O157进行试验时,如(表17)所示,所研究的全部化合物均为阴性,因此用于以下的实验。
[表17]
使用在实施例(1-2)中经NH免疫层析弯曲杆菌研究而结果被认为是假阴性的牛唾液BS-K16,以107CFU/mL的量添加O157菌液(添加有O157的唾液)。
接着,将添加有O157的唾液用将直链十二烷基苯磺酸钠盐或各季铵盐溶解在PBS中的溶液稀释10倍,供于NH免疫层析O157进行试验。
其结果是,确认直链十二烷基苯磺酸钠以及月桂基三甲基氯化铵、十二烷基三甲基溴化铵和肉豆蔻基三甲基溴化铵均对消除因唾液引起的假阴性有效(表18)。
[表18]
(9-2)对因牛·猪唾液引起的假阳性的消除效果
将在实施例(1-2)中经NH免疫层析弯曲杆菌研究而结果显示假阳性的唾液(SS-K44)与(9-1)同样地用将直链十二烷基苯磺酸钠盐或季铵盐溶解在PBS中的溶液稀释10倍,供于NH免疫层析O157进行试验。
其结果是,确认直链十二烷基苯磺酸钠以及月桂基三甲基氯化铵、十二烷基三甲基溴化铵和肉豆蔻基三甲基溴化铵均对消除因唾液引起的假阳性有效(表19)。
[表19]
(实施例10)在花生过敏原检测用免疫层析中的假阴性消除效果
(10-1)对因牛·猪唾液引起的假阴性的消除效果
在实施例(1-2)中经NH免疫层析弯曲杆菌研究而结果被认为是假阴性的牛唾液BS-K16中以1μg/mL的量添加花生蛋白,制成添加有花生蛋白的唾液样本。
首先,预先确认将直链十二烷基苯磺酸钠盐或季铵盐溶解在PBS中的溶液在供试浓度下不会显示假阳性(表20)。
[表20]
接着,将添加有花生蛋白的唾液样本用将直链十二烷基苯磺酸钠盐或季铵盐溶解在PBS中的溶液稀释10倍,供于FASTKIT SLIM花生进行试验。
其结果是,确认通过直链十二烷基苯磺酸钠、月桂基三甲基氯化铵和肉豆蔻基三甲基溴化铵可恢复反应性,对消除因唾液引起的假阴性有效(表21)。
[表21]
(实施例11)在各种过敏原检测用免疫层析中的假阴性消除效果
由于实施例10等中显示季铵盐对消除因唾液引起的假阴性有效,因此针对各种过敏原试剂盒确认这些物质是否有效。
具体而言,对阻碍活性强的牛唾液添加各种过敏原蛋白,通过将该唾液在添加有季铵盐的展开液中稀释10倍来制作试样液,将该试样液供于各种过敏原检测用免疫层析进行试验。作为过敏原检测用免疫层析,使用蛋、小麦、花生、甲壳类(甲殻類)。
其结果是,可确认多种季铵盐的免疫反应阻碍抑制效果(表22)。
[表22]
(实施例12)弯曲杆菌检测用ELISA
在本实施例中,确认在ELISA中是否也有因唾液引起的假阳性以及该假阳性是否会与在免疫层析中同样地被本发明的季铵盐化合物消除。
具体而言,将由大阪公共卫生研究所(大阪公衆衛生研究所)分发的抗弯曲杆菌单克隆抗体(4B4:参照日本特开2009-77658号公报)以5μg/mL的浓度固定在板上,制成固相板。
接着,在固相板中添加使用PBS或含有各种季铵盐化合物的PBS稀释10倍并以107CFU/mL的量含有弯曲杆菌的唾液,孵育1小时并清洗。然后,将生物素标记的4B4作为二抗,以1.6μg/mL的浓度添加,孵育1小时并清洗。
继而,添加链霉亲和素-HRP,孵育30分钟并清洗后,添加HRP底物并孵育20分钟,添加稀硫酸液,使反应停止。
之后,测定450nm吸光度(参考波长620nm)。
其结果如(表23)所示,可确认在ELISA中也会通过添加季铵盐而将因唾液引起的免疫反应阻碍恢复。
[表23]
(实施例13)在过敏原检测ELISA试剂盒中验证对因唾液引起的阻碍的抑制效果
确认在各种过敏原检测用ELISA中是否会观察到因唾液引起的阻碍造成的假阴性以及是否会与在免疫层析中同样地可通过本发明的直链十二烷基苯磺酸钠盐或季铵盐而恢复。
具体而言,作为花生过敏原检测用ELISA试剂盒,使用“FASTKIT ELISA花生(日本火腿(株)制造)”,将50μL添加有牛唾液BS-K16或PBS 5μL的50ng/mL或25ng/mL花生过敏原蛋白用直链十二烷基苯磺酸钠盐或季铵盐的PBS溶解溶液45μL稀释,供于ELISA试剂盒进行试验。
其结果是,若添加唾液则可见反应性降低,在ELISA中也确认到因唾液引起的阻碍。接着,确认了通过在反应溶液中添加作为季铵盐的月桂基三甲基氯化铵、十二烷基三甲基溴化铵或肉豆蔻基三甲基溴化铵,反应性得以恢复(表24)。
[表24]
针对其它的过敏原蛋白质(具体而言为小麦、芝麻、大豆过敏原蛋白质),使用作为各自的过敏原检测用ELISA试剂盒的“FASTKIT ELISA小麦(日本火腿(株)制造)”、“FASTKITELISA芝麻(日本火腿(株)制造)”、“FASTKIT ELISA大豆(日本火腿(株)制造)”,进行与花生过敏原的情况同样的检查。
其结果是,对于其它的过敏原蛋白质也与花生过敏原蛋白质的情况相同,可确认多种季铵盐或直链十二烷基苯磺酸钠盐可抑制因唾液引起的免疫反应阻碍(数据未示出:表25)。
[表25]
Claims (16)
1.一种免疫反应阻碍抑制剂,其特征在于,所述免疫反应阻碍抑制剂是抑制在免疫测定法中因试样中的体液引起的免疫反应阻碍作用的免疫反应阻碍抑制剂,并含有以下的(1)和(2)中的任一种化合物:
(1)“R1-SO3H”表示的磺酸化合物或其盐
式中,R1表示直链状C5至C30烷基、经具有至少一个直链状C5至C30烷基的碳环式芳香族基取代的直链状C1至C30烷基、或具有至少一个直链状C5至C30烷基的碳环式芳香族基,这些基团也可具有取代基;
(2)“N+-R2R3R4R5”表示的季铵离子或其盐
式中,R2至R5各自独立地表示直链状C1至C30烷基、或经至少一个直链状C5至C30烷基取代的碳环式芳香族基,这些基团也可具有取代基。
2.如权利要求1所述的免疫反应阻碍抑制剂,其中,(1)的式中,R1是未取代的直链状C5至C20烷基、经具有直链状C5至C20烷基的苯基取代的直链状C1至C20烷基、或经直链状C5至C20烷基取代的苯基。
3.如权利要求1所述的免疫反应阻碍抑制剂,其中,(2)的式中,R2至R5各自独立地为可经碳环式芳香族基取代的直链状C1至C20烷基、或经至少一个直链状C5至C20烷基取代的碳环式芳香族基。
4.如权利要求1所述的免疫反应阻碍抑制剂,其中,(2)的式中,R2至R5各自独立地为未取代或经苯基取代的直链状C1至C20烷基、或经直链状C5至C20烷基取代的苯基。
5.如权利要求4所述的免疫反应阻碍抑制剂,其中,(2)的式中,R2至R5是以下(a)至(e)中的任一种情况:
(a)R2至R5中的任一个为可经苯基取代的直链状C3至C20烷基,其它三个为甲基或乙基的情况;
(b)R2至R5中的任一个为甲基或乙基,其它三个为可经苯基取代的直链状C3至C20烷基的情况;
(c)R2至R5全部为可经苯基取代的直链状C3至C20烷基的情况;
(d)R2至R5中的任一个为苄基,其它三个为可经苯基取代的直链状C3至C20烷基的情况;或者
(e)R2至R5中的任两个为甲基或乙基,其它两个为可经苯基取代的直链状C6至C20烷基的情况。
6.如权利要求5所述的免疫反应阻碍抑制剂,其中,(2)的式中,R2至R5是以下(a)至(e)中的任一种情况:
(a)R2至R5中的任一个为直链C3至C16烷基,其它三个的R2为甲基的情况;
(b)R2至R5中的任一个为甲基,其它三个为直链C3至C12烷基的情况;
(c)R2至R5全部为直链C3至C12烷基的情况;
(d)R2至R5中的任一个为苄基,其它三个为直链C3至C12烷基的情况;或者
(e)R2至R5中的任两个为甲基,其它两个为直链C3至C12烷基的情况。
7.如权利要求1和3~6中任一项所述的免疫反应阻碍抑制剂,其中,(2)是铵离子的盐,且为与选自于由卤化氢、硝酸、六氟磷酸、三氟化二氢和高氯酸组成的组中的化合物形成的盐。
8.一种免疫测定方法,其特征在于,所述免疫测定方法使用如权利要求1~7中任一项所述的免疫反应阻碍抑制剂。
9.一种抑制假阳性和/或假阴性的免疫测定方法,所述免疫测定方法包括:在用于测定含有来自受试者的体液的试样中的受检物质的选自于ELISA、免疫层析法、蛋白质印迹法、免疫印迹法、免疫沉淀法和乳胶凝集法中的任一种免疫测定法中,使用如权利要求1~7中任一项所述的免疫反应阻碍抑制剂。
10.如权利要求9所述的方法,其中,含有来自受试者的体液的试样含有至少一种来自生物粘膜的体液,所述来自生物粘膜的体液选自于唾液、痰、喉拭液、鼻拭液、鼻腔抽吸液和角结膜拭液。
11.如权利要求8~10中任一项所述的方法,其中,受检物质是选自于由病原体、病原微生物、激素、炎症相关物质、前列腺素和代谢综合征相关物质组成的组中的物质。
12.如权利要求11所述的方法,其中,所述病原体或病原微生物是选自于口蹄疫病毒、流行性感冒病毒、腺病毒、RS病毒、冠状病毒、狂犬病病毒、百日咳杆菌、溶血性链球菌、大肠杆菌、食物中毒细菌、砂眼衣原体和支原体中的病原体或病原微生物。
13.一种免疫测定用试剂盒,其特征在于,所述免疫测定用试剂盒含有如权利要求1~7中任一项所述的免疫反应阻碍抑制剂。
14.如权利要求13所述的试剂盒,其中,所述免疫测定用试剂盒是用于选自于ELISA、免疫层析法、蛋白质印迹法、免疫印迹法、免疫沉淀法和乳胶凝集法中的任一种免疫测定法的试剂盒。
15.一种试剂盒,其特征在于,所述试剂盒是用于使用来自受试者的体液通过免疫反应来诊断受试者是否罹患病原性疾病的试剂盒,
并且,在受检体液试样的稀释剂、展开液、封闭液中的至少一种中添加有如权利要求1~7中任一项所述的免疫反应阻碍抑制剂。
16.如权利要求15所述的试剂盒,其特征在于,病原性疾病是选自于口蹄疫病毒、流行性感冒病毒、腺病毒、RS病毒、冠状病毒、狂犬病病毒、百日咳杆菌、溶血性链球菌、大肠杆菌、食物中毒细菌、砂眼衣原体和支原体中的病原体或病原性微生物所引起的疾病。
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