DE4120281C2 - Immunchemisches Verfahren zum gleichzeitigen Nachweis von mehreren verschiedenen Antikörperspezifitäten, Peptidmischungen und Test dazu - Google Patents
Immunchemisches Verfahren zum gleichzeitigen Nachweis von mehreren verschiedenen Antikörperspezifitäten, Peptidmischungen und Test dazuInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein immunchemisches Verfahren zum
gleichzeitigen Nachweis und/oder zur gleichzeitigen
Bestimmung von mehreren verschiedenen Antikörperspezifi
täten gegen jeweils unterschiedliche Pathogene in einem
einzigen Test.
Unter einem immunchemischen Nachweis werden im allgemei
nen Verfahren zusammengefaßt, die als homogene (in
Lösung) oder heterogene (mit fester Phase) Methoden die
Bestimmung von Antigenen und/oder Antikörpern der Immun
globulinklassen A, D, E, G oder M (IgA, IgD, IgE, IgG
oder IgM) in Körperflüssigkeiten wie Serum, Plasma,
Speichel, Liquor oder Urin erlauben. Beispiele für diese
auch sogenannten Immunoassays sind Enzymimmunoassay
(ELISA oder EIA), Radioimmunoassay (RIA), Immunfluores
zenzassay (IFA), Radioimmunopräzipitationsassay (RIPA)
oder Agar Gel-Diffusionsassay usw.
Im Hinblick auf die Virussicherheit im Blutspendewesen
einerseits sowie aus Kostengründen andererseits, wurden
sogenannte Kombinationstests entwickelt, die seit 1989
verfügbar einen gleichzeitigen nicht-differenzierenden
Nachweis von Anti HIV 1 und/oder Anti HIV 2 gestatten
(K. Körner et al., Lab. Med. 14, 159-161, 1990). Möglich
war diese Entwicklung durch die hohe Ähnlichkeit, die
beide HIV-Subtypen zueinander aufweisen, die zudem der
gleichen Virus-Klasse angehören. Damit stützt sich die
Anti HIV 1-Bestimmung in derartigen Anti HIV 1/2-Kombi
nationstesten auch auf eine Kreuzreaktivität von Anti HIV
1 mit HIV 2-Antigenen (M. Busch et al., Transfusion 30/2,
184-187, 1990), wie auch umgekehrt der Anti HIV 2-Nach
weis durch die stattfindenden Reaktionen von Anti HIV 2
mit HIV 1-Antigenen verstärkt wird. Mit dieser Grundlage
stellt sich die Etablierung eines kombinierten Nachweises
zweier Antikörper-Spezifitäten dann als verhältnismäßig
einfach dar, wenn verwandte bzw. strukturanaloge Antigene
verwendet werden.
Der Nachweis eines Erregers der Non A Non B Hepatitis,
das sogenannte Hepatitis C Virus (HCV), war die Voraus
setzung für die Etablierung einer Anti HCV-Bestimmung in
1989. Die Weiterentwicklung führte zu 2. Generations
tests, die neben Nichtstrukturproteinen, z. B. dem sog. C
100, (WO 89/04669) auch ein Strukturprotein, das sog. C
22c (WO 90/11089) enthalten. Trotz der damit verbundenen
Verbesserung der Leistungsmerkmale von Screeningtests der
2. Generation (Bassetti et al., Lancet 337, 912, 1991 und
von der Poel et al., Lancet 337, 317-320, 1991) stellt
sich auch mit modernen Anti HCV-Tests erneut die Frage
nach erheblichen Mehrkosten und Aufwand bei der Testung
von Einzelspendern mit Anti HIV-Kombinationstests einer
seits und zusätzlich mit Anti HCV-Einzeltests.
Allen bisherigen kommerziellen Ausführungen der Anti
HCV-Bestimmung sowie der Mehrzahl der Anti HIV-Kombina
tionstests liegen gentechnologisch hergestellte HCV- bzw.
HIV-Polypeptide zugrunde. Es ist jedoch bisher nicht ge
lungen, mehrere verschiedene Antikörper-Spezifitäten in
nur einem Testansatz, enthaltend mehrere verschiedene
Antigene, gleichzeitig in einem immunchemischen Nachweis
zu bestimmen, wenn keine ähnlichen Antigene verwendet
werden können, da wie bei HCV (Flavivirus) und HIV (Re
trovirus) unterschiedliche Virus-Klassen-Zugehörigkeiten
vorliegen. Als verschiedene Antikörper-Spezifitäten
werden im Sinne der Erfindung Antikörper verstanden, die
keine oder eine sehr geringe Kreuzreaktivität untereinan
der besitzen. Man ging davon aus, daß ein derartiger Test
zum Nachweis von insgesamt drei Antikörper-Spezifitäten
gegen mehrere verschiedene virale Antigene hinsichtlich
der Empfindlichkeit (Sensitivität) und bezüglich der
Störanfälligkeit (Spezifität) infolge gegenseitiger
störender Wechselwirkungen eher schlechter ist als die
entsprechenden Eigenschaften der jeweiligen Einzeltests.
Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß mehrere
verschiedene Antikörper bzw. Antikörperspezifitäten gegen
jeweils verschiedene Pathogene immunchemisch in einem
einzigen Test nachgewiesen werden können, wenn verschie
dene Epitope von jeweils verschiedenen Pathogenen an
einem Träger fixiert sind.
Ferner wurden mit dem erfindungsgemäßen Verfahren Sensi
vitäten gefunden, die mindestens den Sensivitäten von
Einzeltests entsprechen. So wurden z. B. für Anti HIV 1/2
und Anti HCV für das erfindungsgemäße Verfahren Empfind
lichkeitsunterschiede bestimmt, die denen von Einzeltests
mindestens entsprechen.
Es war daher auch völlig überraschend, daß mit dem er
findungsgemäßen Verfahren die Störanfälligkeit durch
unerwünschte falsch positive Reaktionen verringert wurde.
So wurde beispielsweise bei der Spezifitätsprüfung eines
erfindungsgemäßen Anti HIV/Anti HCV-Tests eine höhere
Spezifität erhalten als die Summe beider Einzeltests
ergeben würde mit der Folge, daß insgesamt weniger
Blutspenden fälschlicherweise verworfen werden müssen.
Ein Gegenstand der Erfindung ist daher ein immunchemi
sches Verfahren zum Nachweis und/oder zur Bestimmung von
mehreren verschiedenen Antikörperspezifitäten gegen
jeweils unterschiedliche Pathogene, dadurch gekennzeich
net, daß ein oder mehrere Epitope der jeweiligen Patho
gene an einen Träger fixiert werden und der Nachweis
und/oder die Bestimmung der genannten Pathogene in einem
einzigen Test durchgeführt wird.
Für gewisse Fragestellungen, wie z. B. Reihenuntersu
chungen, ist es möglicherweise wünschenswert, die gleich
zeitige Bestimmung von verschiedenen Pathogenen nicht-
differenzierend vorzunehmen. Das bedeutet, daß zwischen
den verschiedenen Antikörpern nicht unterschieden wird,
sondern nur eine Ja-Antwort oder Nein-Antwort (negativ
für alle Antikörperspezifitäten) erhalten wird. Gegebe
nenfalls ist es auch wünschenswert, den gleichzeitigen
Antikörper-Nachweis differenzierend zu bestimmen. Dies
ist im Rahmen der Erfindung ohne weiteres möglich, indem
z. B. in einem immunometrischen Test die verwendeten An
tigene Virus-spezifisch unterschiedlich markiert werden,
wie z. B. HIV 1-Antigene mit Peroxidase, HIV 2-Antigene
mit alkalischer Phosphatase und HCV-Antigene mit β-Galak
tosidase. Dann können mit verschiedenen Enzym-Substraten
die gleichzeitig gebundenen Antikörper-Spezifitäten nach
einander oder gleichzeitig bestimmt werden.
Eine alternative Form der Differenzierung ist die Inhi
bition einer Antikörper-Spezifität durch den gezielten
Zusatz des korrespondierenden Antigens zur Probe.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist daher ein
immunchemisches Verfahren zum gleichzeitigen Nachweis
und/oder gleichzeitigen Bestimmung verschiedener Anti
körperspezifitäten, wobei der Nachweis und/oder die
Bestimmung differenziert oder nicht-differenziert,
vorzugsweise nicht-differenziert durchgeführt wird.
Als unterschiedliche Pathogene werden gemäß dem erfin
dungsgemäßen Verfahren Pathogene verstanden, gegen die
Antikörper von unterschiedlicher Spezifität und im all
gemeinen mit keiner oder einer sehr geringen Kreuzre
aktivität gerichtet sind. Beispielsweise sind dies HIV 1,
HCV, HTLV 1, HBV oder Trepanoma pallidum, vorzugsweise
HIV und HCV.
Es ist besonders vorteilhaft, Antigene der genannten
Pathogene, insbesondere von HIV 1, HIV 2 und HCV, die
eine hohe Dichte bzw. Konzentration an Bindungsstellungen
(Epitope) der entsprechenden Antikörper besitzen an einen
Träger zu fixieren. Dadurch können beispielsweise Sero
konversionen erfaßt werden, eine Diskriminierung von
positiven und negativen Proben mit einer im allgemeinen
hohen Trennschärfe ist möglich, eine Interferenz durch
das für eine gentechnologische Proteindarstellung erfor
derliche Expressionssystem kann im allgemeinen nicht ein
treten, andere bei Viruszucht unvermeidliche Wirtszell-
Kontaminationen liegen im allgemeinen nicht vor, in
Seren, Citrat-, Heparin-, und EDTA-Plasmen humanen Ur
sprungs ist im allgemeinen eine sichere Bestimmung von
HIV- und HCV-spezifischen Antikörpern mit unterschied
licher Spezifität gewährleistet und eine Inaktivierung
der Proben über 60 min. bei 56°C führt normalerweise zu
keinen Falschpositiven Resultaten.
Vorzugsweise werden einzelne Epitope und/oder Kombinatio
nen davon, insbesondere von Polypeptiden des HIV 1 und/
oder HIV 2 und HCV, die für einen hochsensitiven Anti
HIV/Anti HCV-Nachweis geeignet sind, verwendet und ferner
geeignete Polypeptid-Mischungen als Basis für einen
Screeningtest für einen kombinierten Antikörper-Nachweis.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind daher Poly
peptidgemische von HIV 1 und/oder HIV 2 und HCV.
Besonders bevorzugt sind folgende Polypeptide:
- 1. HIV 1 (Numerierungssystem nach Ratner et al.,
Nature 1985, 313, 277-284):
- A) Transmembranprotein (gp 41): AS 580-AS 630
- B) envelope protein (gp 120): AS 490-AS 540
- C) core protein (p 24): AS 240-AS 390
- 2. HIV 2 (Numerierungssystem nach Gyader et al.,
Nature 1987, 326, 662-669):
- A) Transmembranprotein (gp 36): AS 570-AS 620
- B) envelope protein (gp 110): AS 480-AS 530
- C) core protein (p 26): AS 230-AS 380
- 3. HCV (Numerierungssystem nach WO 89/04669 und
WO 90/11089):
- A) Nichtstrukturprotein 4 (NSP 4): AS 121-AS 175
- B) Nichtstrukturprotein 3 (NSP 3): AS 1-AS 266
- C) Strukturprotein (core): AS 1-AS 80
Vor allem bevorzugt sind Mischungen der genannten Poly
peptide, insbesondere für einen nicht-differenzierenden
Anti HIV/Anti HCV Screeningtest wobei einige beispielhaft
beschrieben werden, ohne die vorstellbaren Möglichkeiten
darauf zu beschränken:
Im allgemeinen werden mit den genannten Peptid-Mischungen
bessere immunologische Eigenschaften für einen diagnosti
schen Einsatz erreicht.
Als besonders geeignet haben sich folgende Peptide von
HIV 1, HIV 2 und HCV erwiesen:
oder Teile davon, beispielsweise
Es ist ebenso möglich, weitere Peptide aus anderen Pro
teinbereichen von HIV 1, HIV 2 oder HCV zu integrieren,
sofern diese Polypeptide immunrelevant sind. Umgekehrt
kann es auch, z. B. für epidemiologische Fragestellungen
vorteilhaft sein, einen spezifischen Antikörper bei dem
nicht-differenzierenden Nachweis durch Weglassen ent
sprechender Peptide auszuschließen, um z. B. mit einer
Mischung aus HIV 1- und HCV-Peptiden nur Anti HIV 1/Anti-
HCV gleichzeitig zu bestimmen und nicht beispielsweise
Anti HBV/Anti HIV 1/Anti HCV.
Die Ausdrücke Peptide und Polypeptide werden im Sinne der
Erfindung als gleichwertig für Peptide mit bis zu etwa 80
AS verwendet. Unter die gentechnologisch hergestellten
Polypeptide fallen auch Fusionsproteine, deren Fusions
anteil nachträglich abgespalten wurde. Auch fallen Poly
peptide darunter, die gegebenenfalls beispielsweise durch
Glykosilierung, Acetylierung oder Phosphorylierung modi
fiziert wurden.
Die Aminosäuren sind als Ein-Buchstaben-Code nach folgen
dem Schlüssel wiedergegeben:
Ala = A, Arg = R, Asn = N, Asp = D, Cys = C, Gln = Q, Glu = E, Gly = G, His = H, Ile = I, Leu = L, Lys = K, Met = M, Phe = F, Pro = P, Ser = S. Thr = T, Trp = W, Tyr = Y und Val = V.
Ala = A, Arg = R, Asn = N, Asp = D, Cys = C, Gln = Q, Glu = E, Gly = G, His = H, Ile = I, Leu = L, Lys = K, Met = M, Phe = F, Pro = P, Ser = S. Thr = T, Trp = W, Tyr = Y und Val = V.
Die genannten immunoreaktiven Peptide können synthetisch
oder gentechnologisch, vorzugsweise synthetisch nach dem
Fachmann bekannten Verfahren hergestellt werden. Die
chemische Synthese der Peptide kann beispielsweise nach
BARANI, G. und MERRIFIELD, R. B. in "The Peptides, Analy
sis, Synthesis and Biology", Vol. 2, Academic Press 1980,
Ed. Erhard Gross, Johannes Meyenhofer, insbesondere als
ein Polypeptid oder als Mischung mehrerer kleiner Peptide
mit überlappender oder nicht überlappender Aminosäure-
Sequenz hergestellt werden.
Dem Fachmann ist auch bekannt, daß Peptide vielfältig
derivatisiert werden können, wie z. B. durch Amino-ter
minale Angliederung, Thioglykolsäure-Amidierung, Carboxy
terminale Amidierung, wie z. B. mit Ammonium oder Methyl
amin. Derartige Modifikationen verändern die Nettoladung
des Polypeptids und können physikochemische Eigenschaften
verbessern oder die kovalente Bindung des Peptids an
einem festen Träger, Carrier-Proteine oder ein anderes
Peptid erleichtern. Für den Fachmann ist es naheliegend,
daß Peptide der Struktur I bis IX auch untereinander bzw.
mit sich selbst gentechnologisch oder synthetisch derart
hergestellt werden, daß mehrere immunrelevante Epitope in
Form eines Moleküls vorliegen.
Im allgemeinen führen solche Modifikationen nicht zu
direkten Veränderungen der Immunreaktivität eines Pepti
des, allerdings können durchaus verbesserte immunolo
gische Eigenschaften der Peptide erzielt werden. So neigt
z. B. Methionin zu spontaner Oxidation, was durch Aus
tausch gegen Norleucin verhindert werden kann, ohne daß
sich die antigenen Eigenschaften des Polypeptides im
wesentlichen ändern.
Es ist dem Fachmann bekannt, daß gegebene Aminosäure-Se
quenzen den verschiedensten Veränderungen unterworfen
werden können, wie z. B. Deletionen, Insertionen oder
Substitutionen, womit verschiedene Vorteile verbunden
sein können. Solche Modifikationen betreffen z. B. Kombi
nationen wie Gly, Ala; Val, Ile, Leu; Asp, Glu; Asn, Gln;
Ser, Thr; Lys, Arg; Phe, Tyr; Ala, Ser; Ala, Thr; Ala,
Val; Ala, Pro; Ala, Glu; Leu, Gln; Gly, Phe; Ile, Ser und
Ile, Met.
Ebenfalls kann es vorteilhaft sein, in Form des Zusatzes
einer hydrophoben Sequenz, umfassend etwa 2 bis 20 hydro
phobe Aminosäuren wie z. B. Phe Ala Phe Ala Phe, die Ad
sorptionseigenschaften des Polypeptides zu verbessern.
Ferner ist dem Fachmann bekannt, daß verschiedene immun
reaktive Peptide direkt oder über einen Carrier bzw.
Brücke verbunden werden können. So eignen sich besonders
als Carrier bzw. Brücke beispielsweise humanes Serumal
bumin und/oder Polylysin.
Unter dem Begriff immunchemisches Nachweisverfahren sind
zahlreiche, sehr verschiedene Methoden bekannt, die sich
in speziellen Ausführungsformen, dem zur Detektion ver
wendeten Marker oder Meßprinzip (z. B. photometrisch,
radiometrisch, visuell bzw. per Aggregations-, Streu
licht- oder Präzipitations-Verhalten) und Festphasen
unterscheiden. Dem Fachmann ist es bekannt, daß eine
Trennung von gebundenen und freien Proben-Antikörpern
oder -Antigen zwar weit verbreitet aber nicht unbedingt
erforderlich ist, wie z. B. bei sogenannten homogenen
Assays. Bevorzugt sind heterogene Immunoassays, insbeson
dere heterogene ELISA-Verfahren.
Ebenso ist dem Fachmann bekannt, daß der Begriff "Bestä
tigungstest" nur die Anwendung eines Immunoassays be
schreibt ähnlich wie die als Dot-Verfahren bezeichneten
Tests per Name nur beschreiben, auf welche Art das
Antigen immobilisiert wird.
Bei dem Antikörper-Nachweis setzt ein immunchemisches
Nachweisverfahren während des Ablaufes den Kontakt der
Probe mit Peptidsequenzen, beispielsweise aus der Formel
I bis XX, voraus, um in einem bestimmten Schritt des
jeweiligen Verfahrens einen Antigen- Antikörperkomplex
auszubilden oder bei Kompetitions- und Inhibitionstests
die Bildung desselben durch Zusatz von geeigneten mar
kierten Reagenzien zu verhindern.
In den direkten Verfahren können die Antikörper mit fest
phasengebundenen Peptiden oder mit markierten Peptiden
oder mit beiden in Kontakt gebracht werden, wobei es un
erheblich ist, ob das zugrundeliegende Verfahren als 1-,
2- oder Mehr-Schritt-Methode auf dem Prinzip des 2. Anti
körpertests oder dem immunometrischen Testaufbau (Doppel-
Antigen-Sandwich) entweder mit gleichen oder unterschied
lichen Peptiden (bzw. Peptidmischungen) auf der Festphase
und als Flüssigreagenz für die Detektion sowie in Ver
bindung mit spezifischen sogenannten Capture-Antikörpern
(z. B. Anti IgM) oder Affinitätsreagenzien (z. B. Protein
A) beruht.
Die Bindung der Peptide an die Festphase kann kovalent,
adsorptiv oder mittels spezifischer Antikörper oder ähn
lich affiner Methoden, z. B. über den Biotin/Avidin-
Komplex stattfinden, vorzugsweise jedoch adsorptiv.
Als Trägermaterial für die Festphase sind Kunststoffe wie
Polystyrol, Polyvinylchlorid, Polyamid und andere syn
thetische Polymere, natürliche Polymere wie Zellulose
sowie derivatisierte natürliche Polymere wie Zellulose
acetat und Nitrozellulose als auch Glas, insbesondere als
Glasfaser, geeignet.
Bevorzugt ist als Trägermaterial Polystyrol.
Die Träger können die Form von Kugeln, Stäben, Röhrchen
und Mikrotiterplatten haben oder in Form von Suspensionen
wie z. B. Latexpartikel vorliegen. Flächenförmige Gebilde
wie Streifenpapiere, Plättchen und Membranen sind eben
falls geeignet. Die Oberfläche der Träger kann sowohl für
wässrige Lösungen durchlässig als auch undurchlässig
sein.
Bevorzugte Träger sind Kugeln, Röhrchen, Näpfchen, Mikro
partikel, Streifenpapiere und Membranen. Besonders bevor
zugte Träger sind Mikrotiterplatten, Latexpartikel, Poly
styrol-Kugeln oder magnetisch anziehbare Teilchen.
Die Peptidkonzentration bei der Beschichtung des Trägers
beträgt im allgemeinen ca. 0,01-20 µg/ml, vorzugsweise
0,01-10 µg/ml, besonders bevorzugt von 2-10 µg/ml.
Besonders vorteilhaft ist die Verwendung von synthetisch
hergestellten Polypeptiden, deren hohe Reinheit und star
ke Antigenität die Verwendung kleinster Mengen von bei
spielsweise 0,01-2,0 µg/ml gestattet. Die Bindekapazi
tät des Trägers, insbesondere bei Verwendung von Polysty
rol, ist im allgemeinen nicht gesättigt, so daß normaler
weise mit mehreren verschiedenen Polypeptiden, insbeson
dere mit 2-5, vor allem mit 3-4 verschiedenen Poly
peptiden, beschichtet werden kann, was von besonderem
Vorteil ist.
Bei Verwendung der Peptide als markierte Derivate zur
Detektion kommen alle dem Fachmann bekannten Kopplungs
techniken in Frage. Auch mehrstufige Verfahren wie z. B.
präformierte Peptid-Antikörper-Komplexe, in denen der
Antikörper die Markierung trägt, oder hochaffine Systeme,
wie z. B. Biotin/Avidin mit Markierung eines dieser
Reaktionspartner, können angeordnet werden.
Als Marker können beispielsweise radioaktive Isotope,
fluoreszierende oder chemilumineszierende Farbstoffe ver
wendet werden. Auch Enzyme, die z. B. durch chromogene,
luminogene oder fluorogene Substratsysteme oder durch
nachgeschaltete Verstärkersysteme mit einem zweiten
Enzym, das durch das erste aktiviert wird nachgewiesen
werden, können als Marker verwendet werden.
Vorzugsweise werden als Marker Enzyme, insbesondere die
alkalische Phosphatase und/oder die Meerrettich Peroxi
dase verwendet.
Die Markierung erfolgt nach Verfahren, die für die ge
nannten Marker als Stand der Technik beschrieben sind.
Im Falle der Markierung der Antikörper mit Peroxidase
kann die Periodat Technik nach NAKANE et al., 1974, J.
Histochem. Cytochem. 22, 1084-1090, angewendet werden
oder ein Verfahren gemäß ISHIKAWA et al., 1983, J.
Immunoassay 4, 209-327, in dem die Partner mit einem
heterobifunktionellen Reagenz verknüpft werden.
Neben diesen Verfahren können die Peptide zur Sensibili
sierung von geeigneten Oberflächen wie z. B. Latex oder
Erythrozyten verwendet werden, um durch Peptid-spezifi
sche Antikörper induzierte, physikochemische Verände
rungen wie z. B. Präzipitationen, Aggregation oder
Lichtstreuung automatisch oder visuell zu messen. Es ist
bekannt, daß die Peptide auch nicht derivatisiert zur
Inhibition dieser Meßprinzipien wie auch der zuvor
genannten Methoden eingesetzt werden können.
Für den Nachweis insbesondere von HIV- und HCV-Antigen
können immundiagnostische Verfahren verwendet werden, die
sich polyklonaler oder monoklonaler Antikörper bedienen,
welche mit Hilfe der erfindungsgemäßen Peptide oder Deri
vaten davon hergestellt werden. Die für das Nachweisver
fahren in Frage kommenden Ausführungsformen sind dem
Fachmann bekannt und dadurch gekennzeichnet, daß in einem
bestimmten Schritt Antikörper-Antigen-Komplexe gebildet
werden oder die Komplexbildung in Kompetitionsverfahren
durch Zusatz eines markierten Antigens inhibiert wird.
Für die Etablierung beispielsweise eines HIV/HCV-Antigen
tests kommen als Festphasen, Marker oder Meßprinzip alle
bei der entsprechenden Antikörper-Bestimmung erläuterten
Möglichkeiten in Frage, wobei das Kompetitionsprinzip und
die Doppelantikörper-Sandwich Technik als immunchemische
Methode besonders bevorzugt sind. Dabei ist es unerheb
lich, ob die Verfahren als 1-, 2- oder 3-Schritt-Verfah
ren ausgelegt sind. So können Mehrschrittverfahren mit
unmarkierten Nachweisantikörpern durchgeführt werden, die
mit Hilfe eines weiteren dagegen gerichteten Antikörpers
bestimmt werden, der entsprechend markiert ist. Für die
Erzeugung der HIV/HCV-Antikörper ist es vorteilhaft, die
Peptide derart zu modifizieren, daß deren immunogene an
tigene Eigenschaft verbessert wird, wie dies z. B. durch
Kopplung am Serumalbumin oder keyhole limpet hemocyanin
möglich ist (B. S. Schaffhausen in Hybridoma Technologie
in the Biosciences and Medicine, ed. T. A. Springer,
Plenum Press NY, London, 1985).
Schließlich kann die vorliegende Erfindung auch angewen
det werden bei Verwendung eines immundiagnostischen Ele
ments, das die Festphase und in trockener Form einen Teil
oder auch alle erforderlichen Reagenzien enthält, wobei
auch hier die neuen Peptide entweder Festphasenseitig
oder im Detektionsreagenz oder in beiden enthalten sind
und eine Antikörper-Bestimmung, einen Antigen-Nachweis
oder Kombinationen mit anderen Analyten durchgeführt
wird.
Ein wesentlicher Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens
ist, daß mehrere Antikörper gegen verschiedene Pathogene
in einem einzigen Test nachgewiesen werden können und
dabei noch eine so hohe Spezifität bzw. Sensitivität
erreicht wird wie mit Einzeltests erreicht werden kann.
Die nachfolgend beschriebenen Beispiele stellen Ausfüh
rungsformen der Erfindung dar, ohne sie jedoch darauf zu
beschränken.
Die Polypeptide SPH 9 (Formel XV), SPH 20 (Formel XVI),
4083 (Formel XVII) und SP 10 (Formel XIX) wurden in einer
Konzentration von 6 mg/ml in 50% (v/v) Essigsäure ge
löst.
Diese 4 Stammlösungen wurden auf Volumenbasis in unter
schiedlichen Verhältnissen wie in Beispiel 4 beschrieben
gemischt und in 0,10 M Natriumbicarbonat (pH 9,6) so ver
dünnt, daß die Gesamtkonzentration der Polypeptide
zwischen 0,2 und 8 µg/ml betrug.
Jeweils 100 µl der verdünnten Lösungen wurde in jeweils
16 Vertiefungen von Mikrotiterplatten, Typ B der Firma
Nung, Roskilde, Dänemark gegeben. Die gefüllten Test
platten wurden 18 Stunden bei 20°C inkubiert. Anschlie
ßend wurden die Lösungen abgesaugt und die Vertiefungen 3
-4mal mit 300 µl einer Lösung von 10 g/l Rinderserum
albumin in phosphatgepufferter physiologischer Kochsalz
lösung, (PBS, pH 7,4) gespült und die Testplatten an
schließend über Kieselgel bei 20°C getrocknet.
Monoklonale Antikörper gegen h-IgG wurden gemäß der Me
thode von KOEHLER und MILSTEIN hergestellt (Nature 256,
495, 1975), wobei verschiedene monoklonale Antikörper mit
der gleichen Antigen-Spezifität mit der von STÄHLI et al.
(J. of Immunological Methods 32, 297-304, 1980) be
schriebenen Methode identifiziert wurden.
Nach gelchromatographischer Reinigung und Dialyse gegen
PBS-Puffer pH 7,4) wurde die monoklonale Antikörper-Frak
tion (4 mg Protein/ml) mit N-gamma-Maleimidobutyllyloxy
succinimid (GMBS), nach TANAMORI et al. (J. Immunol. Meth.
62, 123-131, 1983) umgesetzt. Parallel dazu wurde
2-Iminothiolanhydrochlorid (Fa. Sigma, Kat. Nr. I 6256)
mit Meerrettich-Peroxidase (POD, Fa. Boehringer Mannheim,
Kat. Nr. 413470) nach KING et al. (Biochem. 17, 1499-
1506, 1978) umgesetzt. Aus dem GMBS-Antikörper Konjugat
und dem Iminothiolan-POD Konjugat wurde ein Antikörper-
POD Konjugat, wie von TANAMORI et al. (supra) beschrie
ben, hergestellt.
Die erhaltene Lösung des IgG-POD-Konjugats hatte einen
Proteingehalt von 360 µg/ml. Das Verhältnis von POD zu
IgG ergab 2.8. Die Lösung wurde anschließend auf 500
ng/ml IgG-POD mit einer Lösung von 50 ml/l foetalem
Kälberserum (FKS, Fa. Biochrom KG, Berlin), 5 g/l Poly
oxiethylen-(20)sorbitan Monolaureat (®Tween 20) in PBS
verdünnt und erhielt die Bezeichnung Anti IgG/POD-Kon
jugat. Für die Verwendung im ELISA wurde das Anti IgG/-
POD-Konjugat mit Tris-Puffer (pH 7,4, enthaltend 0,5%
®Tween 20) 1 : 100- bis 1 : 20.000 verdünnt, um einheit
lich eine 1 : 26-Endverdünnung in Konjugat-Puffer (0,1 M
2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propandiol (Tris), 0,1 M
Kochsalz (NaCl) sowie 0,1% ®Tween 20 pH 8.4 herzustellen.
Zum Nachweis von Anti-Human IgG-POD wurde ein Substrat
system oder eine Substratzubereitung aus Wasserstoffper
oxid und Tetramethylbenzidin (TMB) verwendet, welche aus
zwei Stammlösungen wie folgt hergestellt wurde.
Stammlösung 1: TMB-Dihydrochlorid wurde unter Rühren in
einer Konzentration von 5 g/l, (16 mmol/l) in bidestil
liertem Wasser gelöst und mit 5 N Salzsäure auf pH 1,5
eingestellt. Zu dieser Lösung wurde Penicillin G unter
Rühren bis zu einer Endkonzentration von 200 mg/l (0,56
mmol/l) zugesetzt.
Stammlösung 2: Zu 900 ml bidestilliertem Wasser wurde 1,4
ml Eisessig, 1,5 ml 1 N NaOH und 250 mg (3 mmol) H2O2 als
Harnstoff-Wasserstoffperoxid-Addukt zugesetzt. Nach voll
ständigem Lösen wurde mit bidestilliertem Wasser auf 1 l
aufgefüllt.
TMB-Substratzubereitung: Ein Volumenteil der Stammlösung
1 und 10 Volumenteile der Stammlösung 2 wurden mitein
ander vermischt.
50 µl Serum oder Plasma wurden zu 50 µl Probenpuffer,
enthaltend 0,3 M Tris, 0,3 M NaCl, 20% Rinderserum und
0,1% ®Tween 20 in Vertiefungen von beschichteten Mikro
titerplatten hergestellt nach Beispiel 1 gegeben. Nach
30minütiger Inkubation bei 37°C wurden die Testlösungen
abgesaugt und die Vertiefungen jeweils fünfmal mit
Waschpuffer enthaltend 1 g/l ®Tween 20 in PBS gewaschen.
Danach gab man jeweils 100 µl Konjugat in die Vertie
fungen, wobei bevorzugt eine Vorverdünnung von 1 : 3000
in Tris-Puffer (pH 7,4, 0,5% ®Tween 20 und eine Endver
dünnung von 1 : 26 in Konjugatpuffer gewählt wurde. Nach
einer Inkubation über 30 Minuten bei 37°C wurde der
Inhalt der Vertiefungen abgesaugt und wiederum jeweils
fünfmal gewaschen. Anschließend wurden in jede Vertie
fung 100 µl TMB-Substratzubereitung gegeben, 30 Minuten
bei 20-22°C inkubiert und die Reaktion durch Zugabe
von 100 µl 1 normaler Schwefelsäure gestoppt. Die Ex
tinktion der gefärbten Lösung wurde bei einer Wellenlänge
von 450 nm (E450) gegen einen Leerwert von PBS gemessen.
Beginnend mit einem Volumenverhältnis der in Beispiel 1
beschriebenen vier Stammlösungen von 1 : 1 : 1 : 1 (V/V)
wurden alle vier veränderlichen Anteile unabhängig von
einander, aber unter Konstanthaltung der jeweils drei
anderen variiert, um in der Beschichtungslösung folgende
Endkonzentrationen der Einzelpeptide von HIV 1, HIV 2 und
HCV zu erhalten (in µg/ml):
Diese Mischungen wurden wie in Beispiel 1 beschrieben auf
Mikrotitrationsplatten fixiert und wie in Beispiel 3
beschrieben im ELISA bewertet, wobei die Konzentration
des Peroxidase-markierten Antikörpers gegen humanes
Immunglobulin G wie in Beispiel 2 beschrieben ebenfalls
optimiert wurde.
Die Proben, mit denen die Optimierung bewertet wurde,
bestanden aus niedrigtitrigen Anti HIV 1-, Anti HIV 2-
und Anti HCV-Proben, die durch serielle Verdünnungen von
entsprechenden positiven Humanseren in negativem Human
serum hergestellt wurden. Daneben wurden mehrere Anti HIV
und Anti HCV-negative Proben ebenfalls getestet, um die
Hintergrundreaktion (d. h. die unspezifische Bindung bei
einer gegebenen beschichteten Mikrotitrationsplatte)
definieren zu können.
Als Auswahlkriterium wurde ein möglichst hohes spezifi
sches Signal, d. h. hohe Grenzempfindlichkeit in der
Bestimmung der Titrationsreihen humaner Anti HIV- bzw.
Anti HCV-positiver Proben bei gleichzeitigem niedrigem
Hintergrund bei der Prüfung von Anti HIV- und Anti HCV-
negativer Proben angelegt.
Nach diesen Kriterien wurden in der Regel günstige Be
schichtungsmischungen gefunden, von denen folgende
Mischung ausgewählt wurde:
Als günstig wurde eine Konjugat-Konzentration des Bei
spiels 2 von 1 : 3000 bei einer einheitlichen zusätz
lichen Endverdünnung von 1 : 26 ermittelt, wobei die
Testdurchführung nach Beispiel 3 erfolgte.
Unter diesen Bedingungen wurden Proben als Anti HIV-
und/oder Anti HCV-positiv eingestuft, die eine Extinktion
bei 450 nm aufwiesen, die größer ist als der Mittelwert
der Negativ-Kontrollen zuzüglich eines Zuschlags von
0,250 O.D. (Grenzwert-Festlegung).
Diese Festlegungen wurden auf die folgenden Beispiele 5
bis 9 einheitlich und unverändert angewendet.
Die in Tab. 1-3 dargestellten Proben wurden wie im Bei
spiel 3 beschrieben unter optimierten Bedingungen des
Beispiels 4 mit der Peptid-Mischung der Formel XXI bzw.
XI getestet. Im Hinblick auf Anti HIV 1 oder 2 wurden die
Reaktivitäten des erfindungsgemäßen Verfahrens verglichen
mit einem Anti HIV 1/2-Kombinationstest (Enzygnost® Anti
HIV 1/2, Fa. Behringwerke AG). Zur Kontrolle wurden
kommerziell erhältliche Western blots (Anti HIV 1 und
Anti HIV 2) der Fa. DuPont angewendet. HCV wurde mit
Hilfe von zwei verschiedenen ELISA-Verfahren (der Firmen
Abbott und Ortho) nachgewiesen und mit Hilfe eines
Immunodot-Verfahrens überprüft (sog. Recombinant Immuno
Blot Assay, RIBA der Fa. Ortho).
Wie die Daten der Tab. 1 bis 3 deutlich machen, werden
Anti HIV 1 und Anti HIV 2 sowie Anti HCV in Proben
humanen Ursprungs mit dem erfindungsgemäßen Verfahren
sicher und zuverlässig nachgewiesen.
Für die Beurteilung der analytischen Sensitivität des
erfindungsgemäßen ELISAs wurden modellhaft Titrationen
von positiven Proben hergestellt und in dem in Beispiel 3
beschriebenen ELISA getestet. Insgesamt wurden Verdün
nungen von je drei Anti HIV 1- bzw. Anti HIV 2-positiven
Human-Seren in Anti HIV- und Anti HCV- negativem Serum
hergestellt und die Grenzempfindlichkeit als letzte im
jeweiligen Testsystem noch reaktive Vorverdünnung de
finiert unter Verwendung von Grenzwerten (cut off), die
in Beispiel 3 definiert wurden (Tab. 4 und 5).
Analog wurde bei Anti HCV Verfahren, indem von vier Anti
HCV-positiven Proben Verdünnungsreihen wie in Tab. 6
beschrieben hergestellt, getestet und analog zu Anti HIV
ausgewertet wurden.
Zusätzlich wurden in den Einzeltests auch die Spezifität
der Reaktivitäten von Einzelspenden geprüft, indem die
Anti HIV 1- und Anti HIV 2-positiven Proben auch unver
dünnt im Anti HCV-Test sowie umgekehrt die Anti HCV-posi
tiven Proben in Anti HIV 1/2-Kombinationstests (Enzy
gnost® Anti HIV 1/2) untersucht wurden.
Die in Tab. 4 bis 6 zusammengefaßten Ergebnisse machen
deutlich, daß die Grenzempfindlichkeit des erfindungs
gemäßen ELISA sowohl bezüglich Anti HIV 1 als auch Anti
HIV 2 der Grenzempfindlichkeit des Anti HIV 1/2- Kombina
tionstests entspricht. Auch entsprach die HCV-Grenzem
pfindlichkeit des erfindungsgemäßen ELISA der Grenzem
pfindlichkeit kommerziell erhältlicher Anti-HCV ELISA.
Während jedoch für den Nachweis dieser drei Antikörper-
Spezifitäten nach dem Stand der Technik insgesamt min
destens zwei Tests (Anti HIV 1/2-Kombinationstest sowie
mindestens ein Anti HCV-Test) erforderlich sind, gelingt
dieser Nachweis mit dem erfindungsgemäßen Verfahren
ebenso zuverlässig und vergleichbar sensitiv mit nur
einem Testansatz.
Ferner wird aus den Daten der Tab. 4 bis 6 ersichtlich,
daß die starke Reaktivität der Anti HIV- und Anti HCV-
positiven Proben im neuen ELISA besonders vorteilhaft
ist, da die Anti HIV Proben negativ im spezifischen Anti
HCV-Test und die Anti HCV-positiven Proben negativ im
spezifischen Anti HIV-Test reagierten.
Getestet wurden insgesamt 3 Patienten, von denen im Ver
lauf sehr früher Phasen einer HIV 1-Infektion wiederholt
sequentielle Blutentnahmen zu definierten Zeitpunkten ge
wonnen wurden. Diese Serumpanel sind kommerziell erhält
lich (Boston Biomedica Inc., USA). In Tab. 7 wurden die
Ergebnisse wiedergegeben, die mit dem erfindungsgemäßen
ELISA im Vergleich zu einem Anti HIV 1/2 Kombinationstest
erhalten wurden.
Alle Angaben stellen Extinktionswerte dar (E450 nm) wobei
Werte oberhalb des jeweiligen Grenzwertes als positiv zu
betrachten sind.
Die Ergebnisse der Tab. 7 machen deutlich, daß der erfin
dungsgemäße ELISA niedrig-titrige Anti HIV 1-positive
Proben ebenso zuverlässig nachweist, wie der Anti HIV
1/2 Kombinationstest (Enzygnost® Anti HIV 1/2). Ebenso
wird aus dem Vergleich mit den Daten der Tab. 7 ersicht
lich, daß auch der früheste Zeitpunkt, an dem mit dem
neuen Peptid-ELISA der erste Nachweis von HIV 1-spezi
fischen Antikörpern gelingt, mindestens so früh möglich
ist, wie mit spezifischen singulären Anti HIV 1-Tests als
Stand der Technik.
In Tab. 8 sind die Ergebnisse zusammengefaßt, die bei der
Testung eines kommerziell erhältlichen "Anti HIV low
titre - Panel" mit dem neuen HIV/HCV-Peptid ELISA erhal
ten wurden im Vergleich zu einem Anti HIV 1/2-Kombina
tionstest (Enzygnost® Anti HIV 1/2).
Das Proben-Panel der Fa. Boston Biomedica, USA umfaßt
insgesamt 15 Proben, die mit Hilfe von Anti HIV 1-Be
stimmungsmethoden als niedrig-titrig Anti HIV 1 positiv
klassifiziert wurden.
Ergebnisse der Testung des "low titre Anti HIV 1-
Panel" der Fa. Boston Biomedica Inc., USA
Alle Angaben stellen Extinktionswerte bei einer Wellen
länge von 450 nm dar. Werte über den angegebenen Grenz
werten sind positiv.
Wie die Ergebnisse der Tab. 8 erkennen lassen, werden im
Vergleich zu dem Anti HIV 1/2-Kombinationstest (Enzy
gnost® Anti HIV 1/2) mit dem erfindungsgemäßen HIV/HCV-
Peptid ELISA alle Proben vergleichbar stark reaktiv
ermittelt.
Interessanterweise werden vier Proben des Panels mit dem
neuen Peptid-ELISA sogar stärker reaktiv ermittelt als
mit dem Anti HIV 1/2-Kombinationstest (Enzygnost® Anti
HIV 1/2) (No. 1, 2, 12 und 15). Zusätzliche Prüfungen
dieser Proben ergaben gleichzeitig vorliegende HCV-Anti
körper, was die Zuverlässigkeit eines nicht-differenzie
renden Nachweis von Anti-HIV 1/-HIV 2 und -HCV nach dem
erfindungsgemäßen Verfahren erneut bestätigt.
Tab. 9 enthält die Ergebnisse, die mit dem neuen HIV 1-/
HIV 2- und HCV-Peptid ELISA und dem low titre Anti
HCV-Panel der Firma Boston Biomedica Inc., USA, erhalten
wurden. In dieser Tab. 9 sind auch Daten enthalten, die
am gleichen Panel mit einem modernen Anti HCV ELISA
erhoben wurden.
Die Angaben zu dem erfindungsgemäßen und kommerziellen
ELISA stellen sogenannte Endpunkt-Titer dar, mit denen
die höchste Vorverdünnung eines Serums in Anti HCV-nega
tivem Serum definiert wird, die in einem gegebenen Test
reproduzierbar positiv ermittelt wurde.
Die Ergebnisse der Tab. 9 machen deutlich, daß mit dem
erfindungsgemäßen ELISA alle 14 positiven Proben zuver
lässig eindeutig positiv ermittelt wurden. Dabei fällt
auf, daß die Signalstärke sehr hoch ist, was auf eine
große Reaktivität zurückzuführen ist.
Diese hohe Reaktivität spiegelt sich auch wieder in den
ermittelten Grenzempfindlichkeiten der Tab. 9. Diese
Nachweisgrenzen wurden definiert, indem die nativen
Humanproben in Zweier-Schritten in Anti HCV-negativem
Serum vorverdünnt und dann gemäß Beispiel 3 geprüft
wurden, wobei die letzte noch reaktiv ermittelte Vor
verdünnungsstufe den sogenannten Endtiter darstellt.
Auf dieser Basis lassen die Daten der Tab. 9 erkennen,
daß der neue HIV 1-/HIV 2-/HCV-Peptid ELISA in dem Panel
PHV 101 bezüglich Anti HCV sogar bessere Nachweisgrenzen
aufweist als der Stand der Technik.
Für die Ermittlung der Häufigkeit von unspezifischen
Reaktionen, die im ELISA zu falsch positiven Ergebnissen
führen, wurden insgesamt n = 512 gesunde Blutspender
herangezogen. Von diesen Spendern wurde gleichzeitig
Serum und Plasma gewonnen, um auch einen möglichen Stör
einfluß des Gerinnungssystems auf das Verfahren unter
suchen zu können.
Proben, die in einem dieser drei Tests reaktiv waren
(sog. Initial-Testung) wurden im gleichen Test wiederholt
(sog. Retesting) und bei reproduzierbarer Reaktivität im
Anti HIV 1 Western blot und Anti HCV-RIBA als Bestäti
gungsverfahren untersucht.
Keine der in diesem Screening als reaktiv in einem der
drei ELISAs aufgefallenen Proben konnte mit Hilfe dieser
Bestätigungsverfahren als Anti HIV 1- oder als Anti HCV-
positiv bestätigt werden. So wurden alle Proben, die im
Screening aussortiert wurden, folgerichtig als falsch
positiv in den jeweiligen Verfahren klassifiziert.
Tab. 10:
Screening von n = 512 gesunden Blutspendern, von denen gleichzeitig 512 Sera und 512 sog. "paired plasma" ge wonnen wurden. Angegeben sind die Befunde nach Ini tial-Testung; zu Retest-Ergebnissen siehe Tab. 10.
Tab. 10:
Screening von n = 512 gesunden Blutspendern, von denen gleichzeitig 512 Sera und 512 sog. "paired plasma" ge wonnen wurden. Angegeben sind die Befunde nach Ini tial-Testung; zu Retest-Ergebnissen siehe Tab. 10.
Die Ergebnisse der ersten Versuchsreihe (Initial-Ergeb
nisse) sind in Tab. 10 zusammengefaßt. Während nach dem
erfindungsgemäßen Verfahren drei Seren (und zwei korres
pondierende Plasmen) reaktiv waren, wurden mit einem Anti
HIV 1/2-ELISA 1 Serum (und ein korrespondierendes Plasma)
und dem Anti HCV-ELISA fünf Seren (und vier korrespon
dierende Plasmen) reaktiv ermittelt. Die in dem jeweili
gen ELISA reaktiven Spender waren nicht identisch.
Nach wiederholter Versuchsdurchführung dieser neun reak
tiven Seren ergab sich das in Tab. 11 dargestellte Bild
von zwei Seren (zwei paired Plasmen), die im erfindungs
gemäßen Peptid-ELISA "retest-reaktiv" waren, ein Serum
(ein "paired" Plasma), das reaktiv in einem Anti HIV
1/2-ELISA war sowie vier Seren (vier paired Plasmen), die
im Anti HCV-ELISA reaktiv waren.
Unter Zugrundelegung, daß sich keine dieser Proben als
Anti HIV- und/oder Anti HCV-positiv bestätigen ließ,
wurden die in Tab. 11 dargestellten Spezifitätsdaten für
jeden der untersuchten ELISAs sowie für Seren und Plasmen
ermittelt, indem der prozentuale Anteil der richtig ne
gativ ermittelten Proben (insgesamt je 512 Seren und
Plasmen) errechnet wurde.
Basierend auf den Daten der Tab. 11 hätten gemäß dem
Stand der Technik - obligatorische Prüfung jeder Spende
auf Anti HIV und Anti HCV - insgesamt fünf Spender ausge
schlossen werden müssen:
Ein Spender wiederholbar falsch positiv im Anti HIV 1/2-
Test und vier Spender wiederholbar falsch positiv im Anti
HCV-Test. Demgegenüber ist die Zahl der falsch reaktiv
ermittelbaren Spender im erfindungsgemäßen ELISA nur
zwei.
Zusammenfassend läßt sich sagen, daß der neue Peptid-
ELISA zum gleichzeitigen nicht-differenzierenden Nachweis
von Anti HIV 1, Anti HIV 2 und Anti HCV bezüglich den z.
Z. gültigen Kriterien der Sensitivität den jeweils opti
malen Leistungsmerkmalen der zwei Einzeltests Anti HIV
1/2 einerseits und Anti HCV andererseits mindestens ent
spricht: die Daten der Testung von Panels, d. h. nativen
Proben enthaltend Anti HIV 1 und/oder Anti HIV 2 und/oder
Anti HCV verweisen ebenso auf vergleichbare Effizienz wie
die Prüfung der Grenzempfindlichkeiten und Zeitpunkt der
frühesten Erkennung niedrig-titriger Anti HIV 1- oder
Anti HIV 2- oder Anti HCV-Proben. Während der Nachweis
dieser drei Antikörper-Spezifitäten gemäß dem Stand der
Technik in dieser Weise nur mit drei verschiedenen oder
im Hinblick auf die Anti HIV 1/2 Kombinationstests mit
zwei verschiedenen Test möglich ist, bietet der erfin
dungsgemäße ELISA den Vorteil, bei gleicher Effizienz nur
ein Test durchführen zu müssen. Gerade für die Blutban
ken, die zu einer Testung auf Anti HIV 1, Anti HIV 2 und
Anti HCV verpflichtet sind, bedeutet der neue Peptid-
ELISA eine erhebliche Reduktion von Aufwand und Kosten
bei mindestens gleicher Zuverlässigkeit und Sicherheit
bei der Bestimmung von Anti HIV 1, Anti HIV 2 und Anti
HCV.
Völlig überraschend wurde außerdem bei der Ermittlung der
Störanfälligkeit dieses neuen Tests gefunden, daß auf
grund der sehr guten Spezifität, d. h. nur geringe Zahl
falsch positiver Befunde, weniger Nachtestungen sowie
weniger Bestätigungstests erforderlich sind und auch
weniger Spenden ausgeschlossen werden müssen, als bei dem
herkömmlichen Screening-Vorgehen der Verwendung eines
Anti HIV 1/2-Tests und getrennt davon eines Anti HCV-
Tests. Damit bietet das erfindungsgemäße Verfahren wirt
schaftliche und fachliche Vorteile, die auch andere
Konstellationen von HIV- und HCV-Peptiden der Formeln I
bis IX bzw. X bis XIV bieten.
Auch für andere Fragestellungen, in denen maximal opti
mierte Grenzempfindlichkeit die wichtigste Rolle spielt,
ist das erfindungsgemäße Verfahren bestens geeignet. So
kann unter anderen Testbedingungen oder z. B. rechnerisch
in den Beispielen 5 bis 9 gezeigt werden, daß es durchaus
möglich ist, Sensitivitätsmerkmale des erfindungsgemäßen
Verfahrens zu erzeugen, die signifikant besser sind als
die des Stands der Technik, wenn etwas ungünstigere Spe
zifitätsdaten in Kauf genommen werden, die aber dann
immer noch dem Stand der Technik entsprechen.
Würde man beispielsweise den Grenzwert (Beispiel 4) auf
0,1 Extinktion erniedrigen, wären alle Grenzempfindlich
keiten für Anti HIV 1, Anti HIV 2 und Anti HCV um den
Faktor von mindestens 2 erheblich verbessert. Für die
Quote der unspezifisch, d. h. falsch positiv reagierenden
Proben im Screening der gesunden Blutspender (Beispiel 9)
würden insgesamt fünf Spender resultieren, die wiederhol
bar reaktiv ermittelt wurden, was dem Ergebnis aus beiden
Einzeltests absolut entspricht.
Claims (27)
1. Immunchemisches Verfahren zum Nachweis und/oder zur
Bestimmung von mehreren verschiedenen
Antikörperspezifitäten gegen jeweils unterschiedliche
Pathogene, dadurch gekennzeichnet, daß ein oder
mehrere Epitope der jeweiligen Pathogene an einen
Träger fixiert werden und der Nachweis und/oder die
Bestimmung der genannten Pathogene in einem einzigen
Test durchgeführt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß der Nachweis und/oder die Bestimmung
differenzierend oder nicht-differenzierend
durchgeführt wird.
3. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1-2,
dadurch gekennzeichnet, daß die unterschiedlichen
Pathogene ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend
aus HIV, HCV, HTLV, HBV und Trepanoma pallidum.
4. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1-3,
dadurch gekennzeichnet, daß die unterschiedlichen
Pathogene HIV und HCV sind.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet,
daß die Epitope aus mindestens zwei
speziesverschiedenen Polypeptiden von HIV 1 und/oder
HIV 2 und HCV ausgewählt werden, wobei
- 1. HIV 1:
- A) Transmembranprotein (gp 41): AS 580-AS 630,
- B) envelope protein (gp 120): AS 490-AS 540 oder
- C) core protein (p 24): AS 240-AS 390
- 2. HIV 2:
- A) Transmembranprotein (gp 36): AS 570-AS 620,
- B) envelope protein (gp 110): AS 480-AS 530 oder
- C) core protein (p 26): AS 230-AS 380
- 3. HCV:
- A) Nichtstrukturprotein 4 (NSP 4): AS 121-AS 175,
- B) Nichtstrukturprotein 3 (NSP 3): AS 1-AS 266 oder
- C) Strukturprotein (core): AS 1-AS 80 ist.
6. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, dadurch
gekennzeichnet, daß die Epitope aus mindestens zwei
speziesverschiedenen Polypeptiden von HIV 1 und/oder
HIV 2 und HCV ausgewählt werden der Formel:
7. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 4-6,
dadurch gekennzeichnet, daß die Epitope
Epitopmischungen darstellen und ausgewählt werden
aus:
8. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 4-7,
dadurch gekennzeichnet, daß die Epitope Epitop
mischungen darstellen und aus mindestens zwei
speziesverschiedenen Polypeptiden ausgewählt werden
der Formel:
9. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1-8,
dadurch gekennzeichnet, daß die Aminosäuresequez
der Epitope gegenüber der natürlich vorkommenden
Sequenz durch Ersatz, Hinzufügen oder Weglassen von
einer oder mehreren Aminosäuren dergestalt
modifiziert ist, daß ihre Immunreaktivität im
wesentlichen erhalten oder verbessert wird.
10. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis
9, dadurch gekennzeichnet, daß die Epitope unterein
ander direkt oder über einen Carrier verknüpft sind.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet,
daß der Carrier humanes Serumalbumin und/oder
Polylysin ist.
12. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1-
11, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger
ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus
Polystyrol, Polyvinylchlorid, Polyamid und anderen
synthetischen Polymeren, natürlichen Polymeren insbesondere
Zellulose sowie derivatisierten natürlichen
Polymeren insbesondere Zelluloseacetat und Nitrozellulose als
auch Glas, insbesondere als Glasfaser.
13. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1-
12, dadurch gekennzeichnet, daß der Nachweis
und/oder die Bestimmung des epitopgebundenen
Antikörpers mit Hilfe von enzym-markierten,
fluoreszenzmarkierten, chemilumineszenzmarkierten,
biotinmarkierten oder radioaktiv markierten
Antikörpern gegen die epitopgebundenen Antikörper
erfolgt.
14. Peptidmischungen aus mindestens zwei
speziesverschiedenen Polypeptiden von HIV 1 und/oder
HIV 2 und HCV enthaltend:
- 1. HIV 1:
- 2. Transmembranprotein (gp 41): AS 580-AS 630,
- 3. envelope protein (gp 120): AS 490-AS 540 oder
- 4. core protein (p 24): AS 240-AS 390
(2) HIV 2:
- A) Transmembranprotein (gp 36): AS 570-AS 620,
- B) envelope protein (gp 110): AS 480-AS 530 oder
- C) core protein (p 26): AS 230-AS 380
(3) HCV:
- A) Nichtstrukturprotein 4 (NSP 4): AS 121-AS 175,
- B) Nichtstrukturprotein 3 (NSP 3): AS 1-AS 266 oder
- C) Strukturprotein (core): AS 1-AS 80 ist.
15. Peptidmischungen nach Anspruch 14 enthaltend:
16. Peptidmischungen enthaltend:
17. Peptidmischungen nach Anspruch 16 enthaltend:
18. Peptidmischungen nach mindestens einem der Ansprüche
14-17, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminosäure
sequenz der Peptide gegenüber der natürlich vorkom
menden Sequenz durch Ersatz, Hinzufügen oder
Weglassen von einer oder mehreren Aminosäuren
dergestalt modifiziert ist, daß ihre
Immunreaktivität im wesentlichen erhalten oder
verbessert wird.
19. Peptidmischungen nach mindestens einem der Ansprüche
13-18, dadurch gekennzeichnet, daß die Peptide un
tereinander direkt oder über einen Carrier verknüpft
sind.
20. Immunologischer Test zum gleichzeitigen Nachweis
und/oder gleichzeitiger Bestimmung von mehreren ver
schiedenen Antikörperspezifitäten gegen jeweils
unterschiedliche Pathogene, wobei der Test einen
Träger enthält, an dem ein oder mehrere Epitope der
jeweiligen Pathogene fixiert sind.
21. Test nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß
der Träger ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend
aus Polystyrol, Polyvinylchlorid, Polyamid und
anderen synthetischen Polymeren, natürlichen
Polymeren insbesondere Zellulose sowie derivatisierten
natürlichen Polymeren insbesondere Zelluloseacetat und
Nitrozellulose als auch Glas, insbesondere als Glas
faser.
22. Test nach mindestens einem der Ansprüche 19-21,
dadurch gekennzeichnet, daß der gleichzeitige
Nachweis und/oder die gleichzeitige Bestimmung mit
Hilfe von enzym-markierten, fluoreszenzmarkierten,
chemilumi-neszenz-markierten, biotinmarkierten
oder radioaktiv-markierten Antikörpern gegen die
epitopgebundenen Antikörper erfolgt.
23. Test nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß
als enzym-markierte Antikörper die Enzyme alkalische
Phosphatase und/oder Meerrettich Peroxidase
verwendet werden.
24. Test nach mindestens einem der Ansprüche 19-23,
dadurch gekennzeichnet, daß die unterschiedlichen
Pathogene ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend
aus HIV, HCV, HTLV, HPV und Trepanoma pallidum.
25. Test nach mindestens einem der Ansprüche 19-24
dadurch gekennzeichnet, daß Antikörper gegen HIV 1,
HIV 2 und HCV nachgewiesen werden.
Priority Applications (15)
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|---|---|---|---|
| DE4120281A DE4120281C2 (de) | 1991-06-19 | 1991-06-19 | Immunchemisches Verfahren zum gleichzeitigen Nachweis von mehreren verschiedenen Antikörperspezifitäten, Peptidmischungen und Test dazu |
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Families Citing this family (1)
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|---|---|---|---|---|
| GB9624750D0 (en) * | 1996-11-28 | 1997-01-15 | Univ London | Capture assays |
Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
| WO1989004669A1 (en) * | 1987-11-18 | 1989-06-01 | Chiron Corporation | Nanbv diagnostics and vaccines |
-
1991
- 1991-06-19 DE DE4120281A patent/DE4120281C2/de not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| DE4120281A1 (de) | 1992-12-24 |
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