CH649385A5 - Verfahren zur herstellung eines stabilen praeparates mit immunoglobulin-bindungseigenschaften. - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines und Äthanol, die einen chemischen Unterschied zwischen stabilen Präparats mit Immunoglobulin-Bindungseigen- dem freien (markierten) Antigen und den Antigen-Antikör-

schaften. per-Komplexen bedingt, und das bereits klassische doppelte

In den meisten Stämmen von Staphylococcus aureus ist Antikörperverfahren, bei dem der spezifische Antikörper, beiein Protein, das als Protein A bezeichnet wird, zum Teil in 45 spielsweise aus einem Kaninchen, immunologisch ausgefällt Form einer Substanz, die an das Innere der Zellwand gebun- wird nach der Zugabe eines Antiserums, das auf das Kanin-den ist, zum Teil in Form einer löslichen Substanz, die an das chen-Immunoglobulin gerichtet ist. Probleme, die bei dem zu-Wachstumsmedium der Bakterien abgegeben wird, vorhan- letztgenannten Verfahren auftreten, sind z.B. die für die Aus-den. Ursprünglich wurde Protein A in löslicher Form gewon- fällung erforderliche lange Zeitdauer, die manchmal 24 Stun-nen nach anfänglicher Wärmeextraktion aus gewaschenen 50 den beträgt, die relative Empfindlichkeit gegenüber irrelevan-Bakterien. Durch das Erhitzen von suspendierten Staphylo- ten störenden Faktoren und die Tatsache, dass die Trennung kokken nahe bis zum Siedepunkt wurde das Zellwand-Pro- - beendet durch Zentrifugieren und Eliminieren der überste-tein A solubilisiert. In der Mitte der 60-er Jahre wurde auf henden Flüssigkeit - unvollständig sein kann.

mehreren verschiedenen Wegen gezeigt, dass Antikörper von Es hat sich jedoch gezeigt, dass Protein A enthaltende Sta-Menschen und vielen Säugetieren, die, wie gezeigt werden 55 phylokokken, die in Form einer feindispergierten Suspension kann, mit löslichem Protein A in der Weise reagieren, dass zugegeben werden, den Endpunkt in ihrer Reaktion mit lineine Ausfallung (ein Niederschlag) auftritt, an der Reaktion munoglobulin innerhalb einer Minute erreichen. Dann wird teilnehmen, nicht weil eine vorausgegangene Immunisierung die Zentrifugierung durchgeführt, die überstehende Flüssig-zu Antikörpern führt, die auf Strukturen von Protein A ge- keit wird dekantiert und das Röhrchen wird in einen Gam-richtet sind - eine Begründung, die vernünftig scheint, wenn 60 mastrahlen-Zähler eingeführt zur Bestimmung der an den man das generelle Vorkommen von Staphylococcus aureus in Antikörper gebundenen Fraktion des markierten Antigens, der Umwelt berücksichtigt -sondern weil Protein A minde- assoziiert mit den Bakterien auf dem Boden des Röhrchens, stens einen Rezeptor für eine Struktur aufweist, die an dem Die Staphylokokken-Präparate, die zuerst für die obenge-Fc-Teil einer grossen Fraktion der Antikörpermoleküle (Im- nannten Zwecke verwendet wurden, stammten in der Regel munoglobulin) bei Menschen und allen Säugetieren vorhan- 65 aus einer Kulturbrühe, wobei die Bakterien durch wiederholden ist, unabhängig davon, worauf diese mit Protein A reak- tes Waschen in einer Zentrifuge behandelt, in einer 0,5 Vol/ tionsfahigen Antikörper gerichtet sind aufgrund der Antigen- Vol%-igen Formalinlösung in einem neutralen Puffer, in dem Bindungsstrukturen ihrer Fab-Teile. die Staphylokokken drei Stunden lang unter konstantem Mi-

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sehen inkubiert wurden, und schliesslich wiederholt in einer pungstests bestimmt sind. Obwohl Staphylococcus aureus geZentrifuge gewaschen wurden. Die dabei erhaltene Suspen- mäss der schwedischen Patentanmeldung durch Erhitzen ab-sion wurde in einer neutralen, mit einem Phosphat gepuffer- getötet werden und die Suspension der abgetöteten Bakterien ten Salzlösung mit einem zugesetzten Konservierungsmittel, lyophilisiert wird, wird in dieser Patentanmeldung weder eine wie Natriumazid (NaN3), in einer Menge von 1 g pro Liter s Immunoglobulin-Bindung noch die Herstellung eines stabilen aufbewahrt. Die zuerst von Lind und Mansa beschriebene Präparates mit Immunoglobulin-Bindungseigenschaften Formalinbehandlung der Staphylokokken diente dazu, die erwähnt.

das Protein A enthaltenden Oberflächenschichten der Bakterien «zu fixieren» und auf diese Weise wurde die spontane Ab- Auch in Am. J. Clin. Path., Bd. 55, April 1971, Seiten gäbe des Proteins A an das umgebende Suspensionsmedium io 452-453 wird kein stabiles Präparat mit Immunoglobulin-hinausgezögert. Die Bakterien wurden jedoch nicht abgetötet Bindungseigenschaften erwähnt. Dieses Dokument bezieht und nach zweiwöchiger Aufbewahrung in einem Kühl- sich auf ein Verfahren zum Messen von Fibrinogen-Spaltpro-schrank neigten die Bakterien zur Autolyse. Ausserdem dukten in Verklumpungstests.

musste die erforderliche Reagensmenge unmittelbar vor der Ziel der vorligenden Erfindung ist es daher, die Herstel-

Verwendung erneut gewaschen werden. is lung von Präparaten mit Immunoglobulin-Bindungseigen-Die obengenannten Nachteile und auch die Tatsache, dass schaften (Immunoglobulin bindenden Eigenschaften) auf potentiell pathogene lebende Bakterien verwendet wurden, drastische Weise zu vereinfachen und ein solches Präparat stimulierte die Entwicklungsarbeit, die initiiert worden war herzustellen, das stabil, leicht zu transportieren und leicht zu durch G. Kronvall und die in erster Linie basierte auf der of- verteilen ist und das auch für eine praktisch unbegrenzte Zeit-

fensichtlichen Wärmebeständigkeit des Proteins A, die durch 20 dauer aufbewahrt bzw. gelagert werden kann, ohne dass eine das Wärmeextraktionsverfahren demonstriert worden ist, das signifikante Zerstörung auftritt.

früher zur Herstellung von löslichem Protein A angewendet Das obengenannte Ziel wird erreicht mit dem erfmdungs-wurde, die aber auch basierte auf der Möglichkeit der Fixie- gemässen Verfahren, das gekennzeichnet ist durch die im An-rung von Protein A mit Formalin an der Zellwand während spruch 1 angegebenen Verfahrensschritte. Bevorzugte Weiter-der Wärmebehandlung, die dazu neigte, Protein A freizuset- 25 bildungen des Verfahrens ergeben sich aus den abhängigen zen. Das Ergebnis ist in dem Hauptartikel der beiden Autoren Ansprüchen. Ein auf diese Weise hergestelltes Präparat kann S. Jonsson und G. Kronvall über den ersten Radioimmuno- zu jedem beliebigen Zeitpunkt während einer Zeitspanne von assay mit Staphylokokken als Trennreagens beschrieben: wahrscheinlich mehreren Jahren wieder in eine Suspension «The use of protein A-containing Staphylococcus aureus as a von abgetöteten Bakterien überführt werden, die ohne weitesolid phase anti-IgG reagent in radio-immunoassays as exem- 30 res Waschen direkt verwendet werden kann, beispielsweise bei plified in the quantitation of alpha-foetoprotein in normal der Anwendung von Staphylokokken in einem Radioimmu-human serum», Eur. J. Immunology 4:29,1974. In diesem noassay, wie weiter oben angegeben.

Artikel wird die Wärmebehandlung beschrieben die bezüglich Nachfolgend wird das erfindungsgemässe Verfahren zur der Temperatur und der Zeit reproduzierbar ist und die dazu Herstellung von Präparaten von Immunoglobulin bindenden dienen soll, die mit Formalin behandelten Staphylokokken 35 Bakterien, die zu den Spezies Staphylococcus aureus gehören, (Staphylococcus aureus) vom Stamm Cowan I auf wirksame anhand eines Beispiels, auf das die Erfindung jedoch nicht beweise abzutöten, und dieses Verfahren wurde durchgeführt schränkt ist, näher beschrieben.

durch Hindurchpumpen einer solchen Suspension in einer ge- Die für die hier angegebenen Zwecke verwendeten Sta-gebenen Geschwindigkeit durch ein verhältnismässig enges phylokokken werden am besten in einem flüssigen Substrat Metallrohr, das in ein Wasserbad einer Temperatur von 80 °C40 gezüchtet, das auch als Nährmedium oder Kulturbrühe beeingetaucht war, und anschliessendes direktes Einpumpen in zeichnet wird, da es häufig aus einem Extrakt besteht, der ein ähnliches Metallrohr, das in ein Eiswasserbad oder in ein durch Kochen aus Fleisch gewonnen worden ist. Im Laborgekühltes Wasserbad eingetaucht war. Bei dieser Anordnung masstab werden Schüttelflaschen mit einem Volumen von bestimmten das Volumen des gesamten Rohrsystems, in dem etwa 11 und sogenannte Fermentatoren mit einem Volumen die Suspension bei 80 °C gehalten wurde, und die Pumpge- 45 von etwa 101, d.h. Gefässe verwendet, in denen es möglich ist, schwindigkeit die sogenannte Haltezeit, wobei 4 bis 6 Minu- durch wirksames Mischen, Belüften, Neutralisieren mit pH-ten als bei dieser speziellen Temperatur geeignet gefunden Kontrollmitteln und dgl., die Wachstums- bzw. Züchtungsbe-wurden. Auf diese Weise erhielt man eine Suspension von ab- dingungen zu optimieren. Entsprechende Möglichkeiten gibt getöteten Staphylokokken, die eine IgG-Bindungskapazität es bei der Durchführung im industriellen Massstab durch von etwa 80% der Bindungskapazität der Staphylokokken 50 Verwendung von Tanks mit einer Grösse von bis zu mehreren hatte, die nur mit Formalin behandelt worden waren. m3. Das Verfahren wurde mit Erfolg angewendet auf ein aus Es zeigte sich, dass diese Suspension bezüglich der Immu- 2501 Nährmedium gewonnenes Material in einem Standard-noglobulin-Bindungskapazität stabil war bei der Aufbewah- Fermantator im Department of Bacteriology im Karolinska rung bei der Kühlschranktemperatur über einen Zeitraum Institute in Stockholm, Schweden. Nach einer Fermentation, von mehr als einem Jahr, dass jedoch die Neigung bestand, 55 die sich über etwa 8 Stunden nach der Inoculation erstreckte, dass ein Teil der Bakterien zerbrach, die Protein A freisetzen hatte die Masse der Bakterien in dem Substrat Gehalte von und das Suspensionsmedium gelb verfärbten. Auch bei dieser etwa 25 g/1 (Nassgewicht) erreicht; wenn kein technisches Herstellung des Staphylokokken-Reagens ist es zweifellos er- Versagen auftritt, sind in der Regel Ausbeuten von minde-forderlich, die gewünschte Staphylokokkenmenge vor der stens 15g pro 1 zu erwarten.

Verwendung zu waschen. Bei der Aufbewahrung in einem 60 In Versuchen wurde gezeigt, dass frisch gezüchtete Sta-Kühlschrank für einen Zeitraum von mehr als drei Jahren bil- phylokokken direkt nach dem Waschen nach dem gleichen den die Bakterien eine schleimige Masse, deren erneute Sus- pasteurisierungsartigen Verfahren, wie es in dem obenge-pendierung vor der Verwendung schwierig oder unmöglich nannten Artikel beschrieben worden ist und das auf mit Forist. malin behandelte Bakterien angewendet wurde, direkt abge-Die schwedische Patentanmeldung Nr. 760 2866-1 bezieht 65 tötet werden können. Überraschenderweise hat es sich dabei sich auf eine Zusammensetzung und ein Verfahren zum Fest- als eine falsche Annahme herausgestellt - obgleich diese für stellen von Fibrinogen, Spaltprodukten von Fibrinogen und einen langen Zeitraum die Gedanken und Handlungen be-Spaltprodukten von Fibrin, die zur Verwendung in Verklum- stimmt hatte - dass die vor dem Abtöten durch Wärme durch-

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geführte FormalinheVianrlliing eine notwendige Vorausset- der Wärme-Abtötung in dem verwendeten Wachstumsme-

zung zur Vermeidung der Wärmeextraktion des Proteins A dium bei etwa 60 °C. Das zuletzt genannte Verfahren ist be-

ist; tatsächlich haben Bakterien, die direkt nach der Züchtung vorzugt, da es eine geringere Bearbeitung der Bakterien er-

(dem Wachstum) durch Wärme abgetötet worden sind, gros- fordert.

senteils die gleiche Bindungskapazität wie mit Formahn und s Die durch Wärme auf eine der vorstehend erwähnten Ar-

durch wärmebehandelte Staphylokokken aus der gleichen ten ohne vorherige Formahnbehandlung abgetöteten Bakte-

Kultur oder mindestens 90 % der Bindungskapazität der rien wurden gewaschen und in Form von Suspensionen in ei-

letzteren. nem neutralen Puffer bei Kühlschranktemperaturen aufbe-

Ausserdem haben die Versuche gezeigt, dass die chemi- wahrt. Es wurde jedoch der ganz signifikante Nachteil festge-sche Zusammensetzung des Substrats während der nachfol- 10 stellt, dass solche Bakterien-suspensionen, beispielsweise von genden Behandlung des Materials von Einfluss sein kann. So Staphylokokken, die zum Zwecke der Abtötung der Bakte-wurde gezeigt, dass das sogenannte CCY-Medium, ein beson- rien nur mit Wärme behandelt worden sind, bzw. dass bei solders reiches Substrat für das Züchten (Wachsen) von Staphy- chen Suspensionen schon nach einer Aufbewahrung im Kühl-lokokken, nachteilig ist, wenn man versucht, die Bakterien di- schrank von wenigen Wochen, selbst wenn sie ein chemisches rekt nach der Züchtung durch Wärme abzutöten, während sie 15 Konservierungsmittel in dem Puffer enthielten, abgebaut noch in diesem Substrat suspendiert sind, in dem man die wurden durch Zerbrechen der die abgetöteten Bakterien aufBakterien etwa 4 Minuten lang bei 80 °C hält; offensichtlich bauenden Teilchen. Das gleiche Problem wurde beobachtet enthält das Substrat eine oder mehrere Substanzen, welche die bei mit Formahn und Wärme behandelten Staphylokokken, Neigung haben, auszufallen und/oder eine Aggregation der insbesondere dann, wenn sie unter Bedingungen gezüchtet Bakterien selbst bei 80 °C aufrechtzuerhalten, wie z.B. Pro- 20 worden waren, die optimale Ausbeuten ergeben, beispielsteine, die bei dieser Temperatur denaturiert werden. Es gibt weise unter maximaler Belüftung und maximalem Mischen, jedoch einige alternative Medien, die zum Züchten von Sta- Eine mögliche Erklärung dieser unerwarteten Probleme ist phylokokken verwendet werden können, wie z.B. das söge- möglicherweise die, dass die absolute Menge (nicht die Konnannte TSB-Medium, das bereits mit Vorteil verwendet wor- zentration) des den gewonnenen Bakterien zugesetzten Forden ist, gerade weil es die Abtötung durch Wärme der darin 25 malins für die Erzielung eines ausreichenden Effektes auf die bei 80 °C suspendierten Bakterien erlaubt ohne eine signifi- grosse Bakterienmasse möglicherweise zu gering war.

kante Ausfällung oder Aggregation. Aus verschiedenen Gründen scheint es in einigen Fällen Andererseits wurde auch gefunden, dass die Abtötung vorteilhaft zu sein, die Bakterienmasse von ihrem Substrat von Staphylococcus aureus durch Wärme auch nach der vor den nachfolgenden Stufen auf wirksame Weise zu tren-Züchtung in einem CCY-Medium durchgeführt werden kann 30 nen; ein bereits erwähnter Grund ist die Möglichkeit des Aufunter Vermeidung des Phänomens der Ausfällung und/oder tretens von negativen Effekten des Substrats auf die Bakterien Aggregation, die beim Abtöten durch Wärme bei 80 °C wie während der Wärmebehandlung und ein anderer Grund kann oben angegeben beobachtet wurde, d.h. wenn die Abtötung der Wunsch sein, aus dem Substrat eine oder eine Reihe von durch Wärme beispielsweise, worauf die Erfindung jedoch Substanzen zu gewinnen, die durch das Wärmeabtötungsver-nicht beschränkt ist, bei 60 °C während einer entsprechend 35 fahren zerstört würde(n). Zum Waschen der Bakterienmasse längeren Inkubationszeit, nach Erfahrung der Anmelderin können Zentrifugier- oder Filtrierverfahren angewendet wer-etwa 30 Minuten, durchgeführt wird. Der Übergang zu der den. In einer anderen Situation kann es ausreichend und er-Abtötungstemperatur sollte jedoch vorzugsweise schnell er- wünscht sein, das Volumen der Bakteriensuspension, die wärfolgen, beispielsweise in einem Wärmeaustauscher, der in ei- mebehandelt werden soll, etwas herabzusetzen, ohne dass die nem Wasserbad mit der gewünschten Temperatur angeordnet40 Zusammensetzung des Substrats geändert werden muss. ist, und sie sollte nicht angerechnet werden als Teil der söge- Nach dem Abtöten durch Wärme ist es vorteilhaft, die nannten Haltezeit (Inkubationszeit) von etwa 30 Minuten, die Bakterien von ihrem vorhandenen Substrat zu trennen, insbe-für die vollständige Abtötung erforderlich ist. Es wurde auch sondere deshalb, weil letzteres oft eine bestimmte Menge einer gezeigt, dass es möglich ist, Staphylococcus aureus bei 56 DC Immunoglobulin bindenen Substanz gelöst enthält. Auch in durch Wärme abzutöten ohne das Auftreten der Ausfällungs- 45 diesem Falle können Zentrifugier- oder Filtrierverfahren an-oder Aggregationsphänomene, die vollständige Abtötung er- gewendet werden. Danach liegen die gewaschenen Bakterien fordert jedoch eine etwa dreistündige Inkubation bei dieser in Form einer konzentrierten Suspension oder in Form eines Temperatur und offenbar bietet die Abtötung der Bakterien verdichteten feuchten Sediments vor.

für die erfindungsgemässen Zwecke bei dieser niedrigeren Suspensionen von durch Wärme abgetöteten - jedoch

Temperatur keine zusätzlichen Vorteile. 50 nicht spezifisch mit Formalin behandelten - Staphylokokken

Es wurden auch veschiedene Immunoglobulin bindende und Streptokokken wurden gefriergetrocknet (lyophilisiert),

Stämme von Streptococcus pyogenes in einer sogenannten in erster Linie zur Aufbewahrung der durch Wärme abgetöte-

Todd-Hewitt-Brühe, einem anerkannten flüssigen Medium ten Bakterien, die als solche nicht in Suspension aufbewahrt für gute Ausbeuten an Streptokokken, gezüchtet und sie wur- werden können, und mit dem Ziel, mittels eines geeigneten den nach den gleichen Prinzipien wie für Staphylococcus au- 55 Puffers aus diesen Materialien wieder Bakteriensuspensionen reus in dem obengenannten Artikel von Jonsson und Krön- herzustellen. Im vorliegenden Falle wurden die lyophilisierten vali angegeben bei 80 °C durch Wärme abgetötet. Auch im Materialien nach der im Vakuum durchgeführten Lyophili-

Falle der Streptokokken behielten diese nach dem direkten sierung mit trockener Luft in Kontakt gebracht. Nach der

Abtöten durch Wärme, d.h. ohne vorherige Formalinbehand- Wiederherstellung der Suspensionen wären Suspensionen mit lung, einen Grossteil der Immunoglobulin-Bindungskapazi- 60 reproduzierbaren Eigenschaften einschliesslich der früheren tät der lebenden Stämme. Ausserdem bildeten Streptokok- Neigung zur Autolyse der Bakterienteilchen innerhalb einiger ken, die in dem reichen Todd-Hewitt-Medium gezüchtet und weniger Wochen wie in den entsprechenden Suspensionen der aufbewahrt worden waren, während des Abtötens durch nicht-lyophilisierten Bakterien zu erwarten gewesen. Diese

Wärme bei 80 °C ähnlich wie die Staphylokokken Aggregate. Erwartungen wurden bestätigt bezüglich der Immunoglobu-

Diese Effekte können ebenso wie im Falle der Streptokokken 65 lin-Bindungseigenschaften und der Verwendbarkeit dieser minimal gehalten werden, entweder durch Austausch des wiederhergestellten Bakteriensuspensionen für verschiedene

Todd-Hewitt-Mediums gegen einen frischen Puffer vor dem Zwecke. Es fehlte jedoch die Neigung zur Autolyse, eine Be-

Abtöten durch Wärme bei 80 °C oder durch Durchführung obachtung, die völlig überraschend, unerwartet und bisher

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nicht beschrieben worden ist, die potentiell eine grosse prakti- genannten Raumtemperatur nicht abtöten kann - einen signische Bedeutung haben kann. fikaten Fortschritt bei der Bearbeitung von Immunoglobulin Der Einfluss der Einwirkungen von trockener Luft auf bindenden Bakterien dar, eine Stufe, auf die die Lyophilisie-das lyophilisierte Material wurde bisher nicht in einem sol- rung folgen soll zur Ausnutzung des zusätzlichen Stabilisieren Ausmass untersucht, dass daraus geschlossen werden 5 rungseffektes dieser Behandlung.

kann, dass die eine oder andere Komponente der trockenen Erfindungsgemäss hergestellte Präparate wurden als Rea-Luft zu der Suspensionsstabilität beiträgt, die ein Charakteri- gens in verschiedenen Radioimmunoassays getestet, beispiels-stikum des erfindungsgemäss hergestellten Präparats ist. Das weise für das Hepatitis B-Antigen, den Antikörper zu diesem Präparat aus abgetötetem Staphylococcus aureus, gezüchtet Antigen und Aminoglycosid-Antibiotika, wie Gentamicin. In in einem TSP-Medium und behandelt nach dem vorstehend io diesen Tests wurde eine Suspension von Staphylokokken verbeschriebenen Verfahren einschliesslich der Wärmeabtötung wendet, die aus lyophilisierten Staphylokokken stammten, bei 80 °C für einen Zeitraum von ca. 4 Minuten, hat, wie wie- die in einer neutralen, mit einem Phosphat abgepufferten derholt gezeigt wurde, eine Bindungskapazität gegenüber Salzlösung aufgeschlämmt worden waren unter Zugabe eines menschlichem IgG von mehr als 1,5 mg IgG pro ml einer sogenannten nicht-ionischen Detergens (Tween®20) bis zu ei-10 Vol/Vol%-igen Suspension, entsprechend mindestens 15 ner Endkonzentration von 0,1 Vol/Vol%, die sich als vorteil-0,75 mg auf 20 mg der lyophilisierten Staphylokokken, in der haft erwiesen hatte bei solchen Präparaten von Reagens-Sta-Regel etwa 2 mg bzw. 1 mg. Diese Werte sollten mit den Da- phylokokken (Jonsson und Kronvall 1974), wie sie früher ten verglichen werden, die in dem genannten Artikel (Jonnson verfügbar waren. Es wurde gefunden, dass die wiederherge-und Kronvall 1974) für mit Formalin und Wärme behandelte stellte Suspension ohne weiteres Waschen für die obenge-Staphylokokken angegeben worden sind, deren Bindungska- 20 nannten Zwecke direkt verwendet werden kann. Für spezielle pazität mit etwa 1 mg pro ml einer 10 Vol/Vol%-igen Suspen- Anwendungszwecke ist jedoch eine einzige Stufe der Zentrifu-sion angegeben wurde. In diesem Zusammenhang sei jedoch gierung und erneuten Suspendierung in einem frischen Puffer betont, dass die Wachstumgsbedingungen von denjenigen, zu empfehlen für die Eliminierung von Spuren von löslichem wie sie in dem genannten Artikel angegeben sind, ziemlich Protein A oder von Protein A, das auf minimalen Fragmen-verschieden waren. Es wurde ein anderes Substrat verwendet 25 ten von Zellbruchstücken getragen wird, die aus den abgetö-und es wurde eine verbesserte Vorrichtung zur Sauerstoffbe- teten Bakterien freigesetzt werden, beispielsweise als Folge handlung unter Zugabe des pH-Wertkontrollmittels ver- des Einfrierens vor dem Gefriergetrocknen (der Lyophili-wendet. sierung).

Entsprechende Versuche haben gezeigt, dass äquivalente Das Reagens aus erneut suspendierten Staphylokokken Präparate von Immunoglobulin bindenden Staphylokokken 30 wurde erfolgreich getestet in einem anerkannten Verfahren und Streptokokken auch nach Abänderungen der Bedingun- zur Klassifizierung von spezifischen Antikörpern, die auf Ingen für die Wärmebehandlung (die Abtötung) der Bakterien fektionsagentien, wie z.B. Rubella-Virus oder Toxoplasma-erhalten werden können, wobei die erste Abänderung die Parasiten, gerichtet sind. Infektionen mit einem dieser Agen-Wärmebehandlung der Bakterien bei niedrigeren Temperato- tien während der Schwangerschaft stellen ein beträchtliches ren als 80 °C darstellt. Es wurde gefunden, dass Staphylococ- 35 Risiko für die Infektion und Missbildung des Fötus dar. Des-cus aureus des Stammes Cowan I nach einer 30-minütigen In- halb wurden verschiedene Routineverfahren zur Untersu-kubation bei 60 °C abgetötet wird, unabhängig davon, ob chung der Immunansprechempfindlichkeit gegenüber diesen dieser Mikroorganismus in einer Nährbrühe suspendiert oder Antigenen und vielen anderen entwickelt. Es ist allgemein an-in einem Puffer erneut suspendiert worden ist und grossenteils erkannt, dass die primäre Antikörper-Ansprechempfindlich-unabhängig von der Dichte der Suspension. Entsprechend 40 keit von Säugetieren gegenüber Fremdsubstanzen (Antige-wurde einer der beiden im Labor untersuchten Immunoglo- nen) mit der Bildung von spezifischen Antikörpern der IgM-bulin bindenden Stämme der Streptokokken nach 30 Minu- Klasse beginnt, woran sich die Bildung von spezifischen Anti-ten bei 56 °C abgetötet, während für die Abtötung des ande- körpern (d.h. Antikörpern, die auf das gleiche fragliche Andren 60 Minuten bei 56 °C erforderlich waren. gen gerichtet sind), die zu der IgA-Klasse gehören, und späte-

Darüber hinaus wurde gezeigt, dass die Wärmeabtötung 45 ren Antikörpern der IgG-Klasse anschliesst. Letztere haben bei wesentlich niedrigeren Temperaturen, beispielsweise bei die Neigung, in dem Serum/Plasma für einen langen Zeit-37 "C, durchgeführt werden kann, wenn man Formaldehyd in räum nachweisbar zu verbleiben und bei nachfolgenden Ein-einer Endkonzentration zugibt, die weit unterhalb der Form- Wirkungen des Antigens permanent anzusteigen. IgG-Anti-aldehydkonzentration liegt, die erforderlich wäre zum Abtö- körper stellen die Langzeitschutz-Antikörperimmunität ge-ten mit Formaldehyd bei Raumtemperatur. Aus den Versu- 50 genüber Infektionsagentien dar, die häufig durch mehrere Indien geht hervor, dass die Formaldehydbehandlung (Forma- jektionen von Impfstoffen, wo dies möglich ist, verstärkt linbehandlung) eine sehr strenge Kontrolle der Parameter, wird. Andererseits haben IgM- und IgA-Antikörper die Nei-wie Temperatur, pH-Wert, Konzentration der abzutötenden gung, innerhalb weniger Wochen nach ihrem ersten Auftreten Bakterien, des mit dem Aldehyd reagierenden Materials in zu verschwinden. Umgekehrt wird die Gegenwart von spezifi-dem Puffer (insbesondere der primären Amine, d.h. der Pro- 55 sehen IgM-Antikörpern - und bis zu einem gewissen Grade teine, Aminosäuren und dgl., die in den Substraten vorliegen) auch die Gegenwart von spezifischen IgA-Antikörpern - all-und natürlich der Menge des zugegebenen aktiven Formalde- gemein als Anzeichen für eine neue Infektion angesehen, die hyds (unter Berücksichtigung der Neigung des Formalde- durch das Infektionsagens, welches das fragliche Antigen bil-hyds, während der Lagerung zu polymerisieren oder ander- det, hervorgerufen wurde. Wie mehrere Forscher unabhängig weitig zu reagieren) erforderlich macht. Da die Formalinbe- 60 voneinander festgestellt haben, können mit Formalin und handlung von Immunoglobulin bindenden Bakterien vor der Wärme behandelte, Protein A enthaltende Staphylokokken Wärmebehandlung bisher nicht mit einem grossen Ausmass diesbezüglich mit Vorteil verwendet werden für die Charakte-von Kontrolle durchgeführt wurde mit Ausnahme der berech- risierung von spezifischen Antikörpern. Dies ist darauf zu-neten Endkonzentration an Formaldehyd, d.h. ohne gebüh- rückzuführen, dass mehr als 90% des Serum-IgG und nicht rende Berücksichtigung der Bakterienkonzentration, der Puf- mehr als etwa 25% des IgM und 25% des IgA von Protein A ferbedingungen und der Temperatur, stellt die erfindungsge- absorbiert werden und dass in dem verbleibenden IgG, das zu mässe Stufe, die Wärmebehandlung durch Zugabe einer ge- der Unterklasse IgG 3 gehört, die Anwesenheit von Antikör-ringen Menge Formaldehyd - welche die Bakterien bei der so- pern gegenüber Rubella-Virus nicht nachgewiesen werden

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konnte. Die Erfahrung hat jedoch gezeigt, dass bei einigen derart, dass sie die leichte Verteilung und Aufbewahrung (La-Staphylokokken-Präparaten unspezifische Reaktionen auf- gerung) erlauben bei gleichzeitiger Aufrechterhaltung ihrer treten können, offensichtlich zum Teil als Folge der Fragmen- Eigenschaften für sehr lange Zeiträume - wahrscheinlich für tierung von Staphylokokken beim Altern von Suspensionen, Jahre nach der derzeitigen Beurteilung - welche die Absicht die als solche in einem Kühlschrank aufbewahrt werden. 5 erfüllen, durch gewöhnliche Wiederaufschlämmung bzw. er-Diese Fragmente scheinen sich während des Zentrifugierens neute Suspendierung ein erstklassiges Präparat für die Ander Serum-Reagens-Mischung nicht in normaler Weise abzu- wendung in immunologischen Testverfahren zu ergeben. In setzen und beispielsweise die Sedimentation der roten Blutzel- diesem Zusammenhang sei insbesondere betont, dass gemäss len in sogenannten Mikrotiter-Platten in dem sogenannten der vorliegenden Erfindung eine Suspension von erneut sus-Hämagglutinations-Inhibierungstest für Rubella-Virus-Anti- io pendierten, Immunoglobulin bindenden Bakterien erhalten körper zu stören. Ausnahmslos lieferten die erfindungsge- wird, die in bezug auf ihre Eigenschaften als Teilchen bemer-mäss hergestellten Staphylokokken-Präparate in diesen sero- kenswert stabil sind. Das Lyophilisierungsverfahren scheint, logischen Untersuchungen auf Rubella-Antikörper zuverläs- entsprechend dem, was aus den angegebenen Fakten ge-sige Ergebnisse und sie stimmten im allgemeinen sehr gut schlössen werden kann, diese Teilchenstabilität zu erklären, überein, wie erwartet, mit den Ergebnissen, die mit davon un- 15 die niemals zuvor erzielt worden war bei der Abtötung mit abhängigen Kontrollsystemen, beispielsweise der teuren und Wärme oder bei der klassischen Formalinbehandlung vor der umständlichen Ultrazentrifugierungstechnik, erhalten Abtötung mit Wärme. Der Teilchenstabilisierungseffekt der wurden. Formalinbehandlung vor der Wärmeabtötung kann somit -Zusammenfassend kann gesagt werden, dass es mit dem obgleich er allgemein anerkannt ist - erfindungsgemäss nicht erfindungsgemässen Verfahren erstmals möglich ist, Präpa- 20 nur in bezug auf seine Wirksamkeit ersetzt, sondern auch berate mit Immunoglobulin bindenden Eigenschaften auf eine trächtlich übertroffen werden durch den Effekt der Lyophili-radikal vereinfachte Weise herzustellen. Diese Präparate sind sierung der gerade durch Wärme abgetöteten Bakterien.

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Claims (6)

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   PATENTANSPRÜCHE Beim Menschen und bei bestimmten Säugetieren, wie z.B.

   1. Verfahren zur Herstellung eines stabilen Präparates mit beim Kaninchen, Meerschweinchen, Schwein, Hund und Af-Immunoglobulin-Bindungseigenschaften, dadurch gekenn- fen, sind mehr als 90% des Immunoglobulins G reaktionsfä-zeichet, dass eine eine Immunoglobulin-Bindungskapazität hig mit Protein A.

   aufweisende, aus der von Staphylococcus aureus und Strepto- s Es wurde gezeigt, dass Protein A enthaltende Stabhylo-coccus pyogenes gebildeten Gruppe gewählte und Rezeptoren kokken, die auf geeignete Weise hergestellt bzw. behandelt für eine bei Menschen und Säugetieren auf dem Fc-Teil eines worden sind, auf verschiedenen Wegen in einer Reihe von imgrossen Prozentualanteils von Immunoglobulin-Molekülen munologischen Laborverfahren als Immunoglobulin-Bin-vorhandene Struktur aufweisende Spezies von Bakterien in dungsreagens (Immunoglobulin bindendes Reagens) verwen-Gegenwart eines Nährmediums gezüchtet werden, wobei die io det werden können, welches den ihm eigenen Vorteil hat, dass genannten Rezeptoren verschieden sind von den Antigene ge- es eine natürliche feindispergierte feste Phase darstellt und nannten Rezeptoren, auf welche die Antigen bindenden auch die Fähigkeit hat, sehr schnell Antikörpermoleküle zu Strukturen des Fab-Teils eines geringen Prozentualanteils binden, unabhängig davon, ob diese bereits an Antigen ge-von Antikörper-Molekülen zufolge einer Immunisierung spe- bunden sind oder nicht. Es sei darauf hingewiesen, dass ein zifisch gerichtet sind; dass die genannten Bakterien geerntet 15 IgG-Antikörper-Molekül, selbst wenn es durch seinen Fc-Teil werden; dass die die genannten Imminoglobulin bindende Ei- an Protein A gebunden ist, auf wirksame Weise ein Antigen genschaft aufweisenden Bakterien durch Erhitzen abgetötet binden kann durch einen oder beide seiner Fab-Teile. Eine werden; und dass die abgetöteten Bakterien lyophilisiert wer- besonders anschauliche Art der Verwendung von Protein A den zur Herstellung eines Bakterienpräparates, aus dem mit- enthaltenden Staphylokokken als Reagens in immunologi-tels einer wässrigen Flüssigkeit eine stabile Bakteriensuspen- 20 sehen Laborverfahren ist die, sie als sogenanntes Trennrea-sion wiederhergestellt werden kann. gens in Radioimmunoassays (RIA) (radioimmunologischen
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, Nachweisverfahren) zu verwenden.

   dass die Bakterien in Gegenwart einer Substanz mit Bakte- Radioimmunoassay ist die Bezeichnung für ein heute rienabtötungseigenschaften abgetötet werden. klassisches radioimmunologisches Nachweisverfahren, mit
3. 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, 25 dessen Hilfe es möglich ist, eine gegebene Substanz (Antigen) dass diese Substanz enthält oder besteht aus Formaldehyd. quantitativ zu bestimmen, auch wenn diese in sehr geringen
4. 4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch Mengen vorhanden ist, durch Anwendung einer konkurrie-gekennzeichnet, dass die Bakterien, beispielsweise durch Zen- renden Inhibierung der Reaktion zwischen fixierten Mengen trifugieren oder Filtrieren, zu einer höheren Konzentration des gleichen Antigens, das gereinigt und mit einer radioakti-angereichert werden, bevor sie abgetötet werden. 30 ven Substanz, wie z.B. radioaktivem Jod, markiert worden
5. 5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch ist, und von Antikörpern, wie z.B. solchen aus Kaninchen gekennzeichnet, dass die Bakterienmasse vor dem Abtöten oder Meerschweinchen, die auf die gleiche Substanz gerichtet gewaschen wird, so dass sie praktisch frei von Substrat ist. sind. Wenn diese Reaktion sich dem Gleichgewicht nähert
6. 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch oder schon eine Zeit lang abglaufen ist, die erfahrungsgemäss gekennzeichnet, dass das Bakterienpräparat nach der Lyophi-35 ausreicht - sie variiert von 4 Tagen bis zu weniger als 15 Mi-lisierung einem Gemisch aus trockenen Gasen, wie z.B. Luft, nuten - wird das markierte Antigen jeweils in eine freie und in ausgesetzt wird. eine an den Antikörper gebundene Fraktion aufgetrennt.

   Zur Durchführung dieser Trennungsstufe wurde bereits eine grosse Anzahl von Verfahren angewendet, beispielsweise

   40 die chemische Fällung mit Reagentien, wie Ammoniumsulfat