TW201704467A - 用於純化體外產生的病毒的方法及對於病毒的清除測定 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種使用具有至少一種去垢劑的組合物純化體外產生的無包膜病毒或假包膜病毒(pseudo-enveloped virus)的方法。本發明亦提供一種可使用多種去垢劑的純化方法、以及一種確定樣品中無包膜病毒或假包膜病毒的存在或含量的方法。

Description

用於純化體外產生的病毒的方法及對於病毒的清除測定 【交叉參考相關申請案】
本申請主張於2015年7月23日提交的美國臨時申請案62/196,004的優先權的權益，其在此通過引用以其整體明確併入。
序列表的引用
本申請與電子格式的序列表一起提交。序列表作為命名為DURC6_007AUS_SEQLIST.txt的檔提供，該序列表大小為1,081位元組，創建日期為2016年5月31日且最後修改日期為2016年5月31日。該電子格式的序列表中的資訊通過引用以其整體併入本文。
本發明為病毒學領域，更確切地，關於一種純化在細胞培養物中繁殖的及一種用於在病毒清除研究中使用的無包膜病毒或假包膜病毒諸如，E型肝炎病毒(HEV)、A型肝炎病毒(HAV)和豬小病毒(PPV)的方法。
所有的血液來源的產品和血漿來源的產品的臨床使用 攜帶感染性血源性病原體傳播的潛在風險。風險的緩解可通過在血液來源的產品和血漿來源的產品的製造過程中實施病原體減少步驟來實現。為了開發和證明此類病原體減少步驟的效力，進行了病毒清除研究。在這些研究期間，已知量的病毒被摻入血液或血漿產品的中間體中，然後被摻入的樣品使用實驗室規模模式(按比例縮小的模式)的包括病原體減少步驟的製造過程來處理。在病原體減少步驟期間的病毒減少及/或清除通過比較在該步驟之前和之後的病毒的量來確定。
為了保證病毒清除資料的有效性，按比例縮小的模式必須準確地代表大規模單元操作，且病毒摻入物(virus spike)應該代表潛在的污染物。例如，病毒摻入物在體外的培養可能需要血清，且病毒摻入物中血清的存在可影響牽涉無血清產物中間體的清除研究。非病毒污染物，諸如外來宿主細胞膜、蛋白和核酸的存在也可能干擾下游步驟(其中產物中間體假定被高度純化)期間病毒清除的準確評估。因此，去除可影響按比例縮小的模式的性能和相關性的病毒摻入物污染物是重要的。
在一些實施方案中，本發明包括一種基於用去垢劑處理包含無包膜病毒或假包膜病毒的樣品的方法、一種純化在細胞培養物中繁殖的無包膜或假包膜病毒的方法。在該方法的一些實施方案中，在細胞培養物中繁殖的病毒是A型肝炎病毒(HAV)。在該方法的一些實施方案中，在細胞 培養物中繁殖的病毒是豬小病毒(PPV)。在該方法的一些較佳實施方案中，在細胞培養物中繁殖的病毒是E型肝炎病毒(HEV)。在該方法的一些實施方案中，病毒在體外細胞培養物中產生。在該方法的一些實施方案中，體外細胞培養物包括建立的細胞系。在該方法的一些實施方案中，建立的細胞系選自由HepG2(ATCC寄存編號HB-8065)和HepG2/C3A(ATCC寄存編號CRL-10741)組成的組。在該方法的一些實施方案中，去垢劑選自由十二烷基硫酸鋰、Triton X-100及其混合物組成的組。在該方法的一些實施方案中，Triton X-100的濃度為0.5%且十二烷基硫酸鋰的濃度為0.1%。在該方法的一些實施方案中，處理的步驟進行1小時。在該方法的一些實施方案中，樣品是從澄清的病毒感染的細胞裂解物懸液的超速離心獲得的上清液。在該方法的一些實施方案中，任選地，樣品是來源於澄清的病毒感染的細胞裂解物懸液的橫向流過濾(transflow filtration)的滯留物。
提供一種測量樣品中無包膜病毒或假包膜病毒的含量的方法，該方法包括以下的步驟：a)向包含細胞系和培養基的混合物提供樣品；b)培養以允許該無包膜病毒或假包膜病毒的繁殖以獲得培養的部分，如果該無包膜病毒或假包膜病毒存在於樣品中的話；c)用至少一種去垢劑處理以獲得處理的部分；d)收集所處理的部分的一部分以獲得收集的部分；以及e)測量所收集的部分中該無包膜病毒或假包膜病毒的含量。在該方法的一些實施方案中，樣品從哺 乳動物中獲得。在該方法的一些實施方案中，樣品包括血漿或血液。在該方法的一些實施方案中，該無包膜病毒或假包膜病毒是HAV。在該方法的一些實施方案中，該無包膜病毒或假包膜病毒是PPV。在該方法的一些較佳的實施方案中，該無包膜病毒或假包膜病毒是HEV。在該方法的一些實施方案中，病毒在包含建立的細胞系的體外細胞培養物中繁殖。在該方法的一些實施方案中，細胞系選自由HepG2(ATCC寄存編號HB-8065)和HepG2/C3A(ATCC寄存編號CRL-10741)組成的組。在該方法的一些實施方案中，樣品包括由通過膜橫向流過濾所培養的部分的一部分獲得的第一滯留物。在該方法的一些實施方案中，任選地，樣品包括由通過膜橫向流過濾所培養的部分的一部分以獲得第一滯留物並離心該第一滯留物獲得的第一上清液。在該方法的一些實施方案中，樣品用至少一種去垢劑或任選地去垢劑的混合物來處理以獲得第一溶液，該方法還包括：a)提供通過離心第一溶液獲得的第一沉澱(pellet)；b)提供通過將該第一沉澱重懸於PBS(磷酸鹽緩衝鹽水)中獲得的第二溶液；c)提供通過將第二溶液澄清獲得的第三溶液；d)提供通過使用膜過濾第三溶液獲得的第一濾液；以及e)提供通過超濾第一濾液獲得的第二滯留物，其中該第二滯留物包含所處理的部分。在該方法的一些實施方案中，測量無包膜病毒或假包膜病毒的含量包括檢測生物物質，其中該生物物質包括病毒的多核苷酸序列及/或多肽序列，並且其中該生物物質是HEV核糖核酸。在該方法的一些實施 方案中，測量生物物質包括：a)提供通過將所處理的部分的一部分與裂解溶液混合獲得的包含HEV核糖核酸的第一反應混合物；b)提供通過將第一試劑添加至第一反應混合物獲得的第二反應混合物，其中該第二反應混合物包含與HEV核糖核酸互補的去氧核糖核酸；c)將第二試劑添加至第二反應混合物，該第二試劑至少部分地與在該去氧核糖核酸內的序列互補；d)將第三試劑添加至第二反應混合物，該第三試劑至少部分地與在該去氧核糖核酸內的序列互補；e)擴增在該去氧核糖核酸內被第二試劑和第三試劑包含的序列；以及f)測量所擴增的序列的濃度。在該方法的一些實施方案中，第二試劑和第三試劑包含選自由以下組成的組的寡核苷酸序列。
a)5’-CGGCTATCGGCCAGAAGTT-3’(SEQ ID NO：1)。
b)5’-CCGTGGCTATAACTGTGGTCT-3’(SEQ ID NO：2)。
c)5’-FAM-TTTTTACGC-ZEN-AGGCTGCCAAGGCC-3IABkFQ-3’(SEQ ID NO：3)。
在一些實施方案中，本發明包括一種基於用至少一種陰離子去垢劑諸如十二烷基硫酸鋰(LDS)、或至少一種非離子去垢劑諸如Triton X-100或兩者的組合處理包含無包膜病毒或假包膜病毒的樣品的方法、一種純化在細胞培養物中繁殖的無包膜病毒或假包膜病毒的方法，允許獲得在 清除研究中其表現與可能潛在地存在於高度純化的製程流中的那些病毒的表現大概相同或接近相同的病毒。在一些實施方案中，通過該方法的以上描述的一些實施方案產生的病毒將是在血液來源的蛋白及/或血漿來源的蛋白的製造過程中測試下游步驟的病毒減少及/或清除能力的合適的摻入物。
在一些實施方案中，基於一種處理方法純化在細胞培養物中產生的病毒的方法包括：澄清病毒感染的材料；通過膜橫向流過濾混合物的至少一部分，以獲得第一滯留物；以及離心該第一滯留物以獲得第一上清液。該處理方法包括：用至少一種去垢劑處理第一上清液以獲得第一溶液；其中該方法進一步包括：在該處理之後，離心該第一溶液以獲得第一沉澱；重懸該第一沉澱以獲得第二溶液；使第二溶液澄清以獲得第三溶液；使用膜過濾第三溶液以獲得第一濾液；以及超濾第一濾液以獲得第二滯留物，該第二滯留物提供待收集的所處理的部分的至少一部分；其中該至少一種去垢劑選自由十二烷基硫酸鋰、Triton X-100及其混合物組成的組；其中Triton X-100的濃度為0.5%且LDS的濃度為0.1%；其中該用至少一種去垢劑處理第一上清液進行1小時。
在一些實施方案中，基於一種處理方法純化在細胞培養物中產生的病毒的方法包括：澄清病毒感染的材料；通過膜橫向流過濾混合物的至少一部分，以獲得第一滯留物。該處理方法包括：用至少一種去垢劑處理第一滯留物 以獲得第一溶液；其中該方法進一步包括：在該處理之後，離心該第一溶液以獲得第一沉澱；重懸該第一沉澱以獲得第二溶液；將第二溶液澄清以獲得第三溶液；使用膜過濾第三溶液以獲得第一濾液；以及超濾第一濾液以獲得第二滯留物，該第二滯留物提供待收集的所處理的部分的至少一部分；其中該至少一種去垢劑選自由十二烷基硫酸鋰、Triton X-100及其混合物組成的組；其中Triton X-100的濃度為0.5%且LDS的濃度為0.1%；其中該用至少一種去垢劑處理第一滯留物進行1小時。
圖1示出了根據本發明的一些實施方案，橫向流過濾HEV(TFF HEV)和TFF上清液(Supe)HEV病毒摻入物的製備。
圖2示出了根據本發明的一些實施方案製備的TFF HEV和TFF Supe HEV病毒摻入物的相對純度。
圖3示出了根據本發明的一些實施方案的TFF HEV、Triton TFF HEV和Triton/LDS TFF HEV病毒摻入物的製備。
圖4示出了引子(primer)和探針的核苷酸序列。
用於產生無包膜病毒HEV的有效的細胞培養系統最近已被建立，且資料指示，細胞培養物來源的HEV類似於在血液中發現的HEV，在於它們兩者均與脂類締合。因此，未處理的澄清的細胞培養物裂解物或培養物上清液可 以被用作以相對粗製產物中間體的上游步驟的清除研究中的病毒摻入物。然而，未處理的病毒摻入物的使用可能不適合於評價下游步驟(其中製程流呈相對高的純度)期間的HEV清除。
本發明關於一種用於製備適合在用於下游製造過程步驟的病毒清除研究中使用的相對高純度和高滴度的HEV摻入物的方法。
由於體外培養HEV中的困難，基於細胞培養物的HEV感染性測定在先前是不可容易地獲得的。在本文揭露的一些實施方案中，高滴度HEV在細胞培養物中的繁殖通過使用補充有聚凝胺的培養基是可能的。
儘管HEV在技術上被認為是無包膜病毒，在細胞培養物中繁殖的HEV當它從細胞釋放時通常包含膜片段/脂類。這些膜組分可保護病毒免於殺病毒處理，諸如凍乾的餅狀物的液體加熱或乾燥加熱。HEV可用去垢劑諸如吐溫(Tween)處理以去除膜碎片，但所處理的病毒通常保持對通過加熱滅活的耐受性。
在一些實施方案中，與細胞培養物HEV締合的脂類可通過用triton X-100的處理來去除。在一些實施方案中，與細胞培養物HEV締合的脂類可通過用十二烷基硫酸鋰(LDS)處理來去除。在一些實施方案中，與細胞培養物HEV締合的脂類可通過用triton X-100和十二烷基硫酸鋰(LDS)的組合處理來去除。在一些實施方案中，所得的病毒製品仍然是感染性的。在一些實施方案中，外來的非病毒污染 物的濃度在病毒製品中被降低。在一些實施方案中，病毒也更易於被殺病毒處理諸如加熱滅活。
HEV在細胞培養物中不產生細胞病變效應(CPE)。因此，HEV檢測是基於最初由國家衛生研究院(National Institutes of Health)(NIH)開發的PCR測定。在一些實施方案中，該PCR測定被改良以增加靈敏度。在一些實施方案中，在該PCR測定中使用的引子中的一個被改變。在一些實施方案中，在該PCR測定中使用的反向引子被改變。在一些實施方案中，在該PCR測定中使用的探針被重新設計。一種全新的探針被設計以用於該PCR測定。在一些實施方案中，對於病毒滴度的確定，該PCR測定被用來將樣品評分為陽性的或陰性的。
在一些實施方案中，本發明關於包括以下的方法：通過使用補充有聚凝胺的培養基，在細胞培養物中繁殖高滴度HEV；用triton X-100/LDS處理細胞培養物HEV以去除膜脂類/碎片；以及通過靈敏PCR測定檢測HEV。
在一些實施方案中，該方法可以是對HEV特異的。在一些實施方案中，用於病毒繁殖和純化的方法可被應用於其他無包膜病毒。在一些實施方案中，用於病毒繁殖和純化的方法可被應用於其他假包膜病毒。在一些實施方案中，用於病毒繁殖和純化的方法可被應用於HAV。在一些實施方案中，用於病毒繁殖和純化的方法可被應用於PPV。在一些較佳的實施方案中，用於病毒繁殖和純化的方法可被應用於HEV。
在一些實施方案中，本發明可用來進行評價多種製造步驟以及中間產品和最終產品的HEV去除/滅活能力的研究。在一些實施方案中，本發明可用來進行評價多種製造步驟以及中間產品和最終產品對於其他病毒的去除/滅活能力的研究。在一些實施方案中，其他病毒是無包膜病毒。在一些實施方案中，其他病毒是假包膜病毒。在一些實施方案中，其他病毒是HAV和PPV。
在一些實施方案中，本發明可提供對多種醫學或臨床產品諸如血液及/或血漿的來自HEV的安全性的保證。在一些實施方案中，本發明可提供對多種醫學或臨床產品諸如血液及/或血漿的來自其他病毒的安全性的保證。在一些實施方案中，其他病毒是HAV和PPV。
在一些實施方案中，本發明關於一種純化體外產生的無包膜病毒或假包膜病毒的方法。在一些實施方案中，本發明關於一種純化體外產生的HEV的方法。在一些實施方案中，純化包括用包含至少一種陰離子去垢劑及/或一種非離子去垢劑，諸如十二烷基硫酸鋰及/或triton X-100的組合物的去垢劑處理步驟。
在一些實施方案中，設想了在包含至少一種去垢劑的組合物中，該去垢劑是非離子去垢劑。在一些實施方案中，設想了在包含去垢劑的組合的組合物中，一種去垢劑是非離子的，且另一種去垢劑是陰離子的。在一些實施方案中，設想了在包含至少一種陰離子去垢劑的組合物中，該去垢劑是LDS。在一些實施方案中，設想了在包含至少一種非 離子去垢劑的組合物中，該去垢劑是Triton X-100。在一個較佳的實施方案中，組合物包含多於一種去垢劑。在一個較佳的實施方案中，組合物包含至少兩種去垢劑。在一個較佳的實施方案中，組合物包含一種陰離子去垢劑和一種非離子去垢劑。在一個較佳的實施方案中，陰離子去垢劑是LDS且非離子去垢劑是Triton X-100。
在一些實施方案中，至少一種去垢劑以足夠使其發揮在本發明的純化的方法中的功能的濃度來使用。在一些實施方案中，兩種去垢劑各自以足夠使其發揮在本發明的純化的方法中的功能的濃度來使用。在一些實施方案中，Triton X-100的濃度在0.1% v/v至2.5% v/v的範圍內。在一些較佳的實施方案中，Triton X-100的濃度為0.5% v/v。在一些實施方案中，LDS的濃度在0.02% v/v至0.5% v/v的範圍內。在一些較佳的實施方案中，LDS的濃度為0.1% v/v。
在一些實施方案中，用包含一種或更多種去垢劑的組合物的處理被進行本案所屬技術領域中具有通常知識者所需要和確定的持續時間。在一些實施方案中，該處理進行5分鐘至1天。在一些較佳的實施方案中，該處理進行10分鐘至3小時。在一些較佳的實施方案中，該處理進行1小時。
在一個最較佳的實施方案中，使用包含0.5% Triton X-100和0.1% LDS的組合物，且用該組合物的處理步驟進行1小時。在一些實施方案中，培養在37℃進行1小時。
在一些實施方案中，作為進行本發明的純化方法的起始材料，使用從病毒感染的細胞培養基或澄清的病毒感染的細胞裂解物懸液(兩者均來源於病毒感染的細胞培養物)的超速離心獲得的上清液。在一個較佳的實施方案中，使用從澄清的病毒感染的細胞裂解物懸液的超速離心獲得的上清液。
在一些實施方案中，作為進行本發明的純化方法的起始材料，使用在橫向流過濾病毒感染的細胞培養基或澄清的病毒感染的細胞裂解物懸液(兩者均來源於病毒感染的細胞培養物)之後獲得的滯留物。在一個較佳的實施方案中，使用在橫向流過濾澄清的病毒感染的細胞裂解物懸液之後獲得的滯留物。
在第一實施方案中，純化方法可包括以下步驟。
a)將起始材料澄清。
b)通過適當的膜橫向流過濾步驟a)的溶液，以獲得對應的滯留物。
c)超速離心步驟b)的滯留物，以獲得對應的上清液。
d)用去垢劑或去垢劑的混合物處理該步驟c)的上清液，以獲得對應的溶液。
e)將步驟d)的溶液放置在30%蔗糖墊上，並以適當的速度和時間進行超速離心，以獲得對應的沉澱。
f)將步驟e)的沉澱重懸於適當體積的PBS中，以獲得對應的溶液。
g)將步驟f)的溶液澄清，以獲得對應的溶液。
h)使用適當的膜超濾在步驟g)獲得的溶液，以獲得對應的滯留物。
i)過濾步驟h)的滯留物。
在一個較佳的第一實施方案中，在步驟a)中，起始材料通過具有0.45μm孔徑的過濾器來澄清。
在一個較佳的第一實施方案中，在步驟b)中，用來進行橫向流過濾的膜為300kDa膜。
在一個較佳的第一實施方案中，在步驟c)中，超速離心以85,000 xg進行1.5小時。
在一個較佳的第一實施方案中，在步驟d)中，當使用去垢劑的混合物時，去垢劑的混合物包含0.5% Triton X-100和0.1% LDS。
在一個較佳的第一實施方案中，在步驟e)中，超速離心以100,000 xg進行8小時。
在一個較佳的第一實施方案中，設想了，在步驟f)中，將沉澱重懸於PBS中。
在一個較佳的第一實施方案中，在步驟g)中，步驟f)的溶液通過具有0.2μm孔徑的過濾器來澄清。
在一個較佳的第一實施方案中，在步驟h)中，在超濾中使用的膜為100kDa膜。
在一個較佳的第一實施方案中，在步驟i)中，過濾通過0.2μm孔徑的過濾器來進行。
在第二實施方案中，純化方法可包括以下步驟。
a)將起始材料澄清。
b)通過適當的膜橫向流過濾步驟a)的溶液，以獲得對應的滯留物。
c)用去垢劑或去垢劑的混合物處理該步驟b)的滯留物，以獲得對應的溶液。
d)以適當的速度超速離心去垢劑處理的溶液並持續適當的時間，以獲得對應的沉澱。
e)將步驟d)的沉澱重懸於適當體積的PBS中，以獲得對應的溶液。
f)將步驟e)的溶液澄清，以獲得對應的溶液。
g)使用適當的膜超濾在步驟f)獲得的溶液，以獲得對應的滯留物。
h)過濾步驟g)的滯留物。
在一個較佳的第二實施方案中，在步驟a)中，起始材料通過具有0.45μm孔徑的過濾器來澄清。
在一個較佳的第二實施方案中，在步驟b)中，用來進行橫向流過濾的膜為300kDa膜。
在一個較佳的第二實施方案中，在步驟c)中，當使用去垢劑的混合物時，該去垢劑的混合物為0.5% Triton X-100和0.1% LDS。
在一個較佳的第二實施方案中，在步驟d)中，超速離心以85,000 xg進行1.5小時。
在一個較佳的第二實施方案中，在步驟e)中，沉澱被重懸於PBS中。
在一個較佳的第二實施方案中，在步驟f)中，步驟e) 的溶液通過具有0.2μm孔徑的過濾器來澄清。
在一個較佳的第二實施方案中，在步驟g)中，在超濾中使用的膜為100kDa膜。
在一個較佳的第二實施方案中，在步驟h)中，過濾通過0.2μm孔徑的過濾器來進行。
本發明關於LDS及/或Triton X-100在用於純化體外產生的無包膜病毒或假包膜病毒的方法中的使用。在一些實施方案中，病毒是無包膜的。在一些實施方案中，病毒是假包膜的。
在一個較佳的實施方案中，體外產生的病毒是HEV。在一些實施方案中，體外產生的病毒可以是除了HEV以外的病毒。在一些實施方案中，體外產生的病毒是HAV。在一些實施方案中，體外產生的病毒是PPV。在最佳的實施方案中，體外產生的病毒是HEV。
在一些實施方案中，以上描述的體外產生在體外培養物中進行。在一些實施方案中，體外培養物是體外器官、組織或細胞培養物。在一個較佳的實施方案中，體外產生在體外細胞培養物中進行。
在一些實施方案中，使用原代細胞培養物。在一些實施方案中，使用培養細胞系。原代細胞和培養細胞系可來源於任何生物體。例如，在一些實施方案中，設想了昆蟲細胞的使用。在一些實施方案中，設想了哺乳動物細胞的使用。在一個較佳的實施方案中，使用人類培養細胞系。
在一個較佳的實施方案中，肝細胞系被用於HEV產生 和純化。在另一個較佳的實施方案中，腎細胞系被用於HEV產生和純化。在一些實施方案中，肝細胞系可來源於健康的或患病的肝臟。在一些實施方案中，肝細胞系可以是惡性或良性細胞系。在一些實施方案中，腎細胞系可來源於健康的或患病的腎臟。在一些實施方案中，腎細胞系可以是惡性或良性細胞系。在一個較佳的實施方案中，使用建立的細胞系。在一些實施方案中，該細胞是HepG2(ATCC寄存編號HB-8065)。在一些實施方案中，細胞是HepG2/C3A(ATCC寄存編號CRL-10741)。
在一些實施方案中，使用HEV感染性測定。在一些實施方案中，可製備具有~8 log10感染性滴度的病毒摻入物。該測定呈相對短的持續時間(3-7天測定)。很少觀察到或未觀察到PCR背景，且可證明超過4 log10的減少。因此，在一些實施方案中，使用基於PCR的病毒檢測測定。在一些實施方案中，使用基於PCR的HEV檢測測定。
另外的較佳的實施方案-1
在一些實施方案中，提供一種製備在細胞培養物中繁殖的無包膜病毒或假包膜病毒的方法，該方法包括：用包含一種或更多種去垢劑的組合物處理包含無包膜病毒或假包膜病毒的樣品的步驟。在該方法的一些實施方案中，在細胞培養物中繁殖的病毒是HAV。在該方法的一些實施方案中，在細胞培養物中繁殖的病毒是PPV。在該方法的一些較佳的實施方案中，在細胞培養物中繁殖的病毒是HEV。在該方法的一些實施方案中，病毒在體外細胞培養 物中產生。在該方法的一些實施方案中，體外細胞培養物包括建立的細胞系。在該方法的一些實施方案中，建立的細胞系選自由HepG2(ATCC寄存編號HB-8065)和HepG2/C3A(ATCC寄存編號CRL-10741)組成的組。在該方法的一些實施方案中，去垢劑處理是用十二烷基硫酸鋰及/或Triton X-100。在該方法的一些實施方案中，Triton X-100的濃度為0.5%且LDS的濃度為0.1%。在該方法的一些實施方案中，處理的步驟進行1小時。在該方法的一些實施方案中，樣品是從澄清的病毒感染的細胞裂解物懸液的超速離心獲得的上清液。在該方法的一些實施方案中，樣品任選地是來源於澄清的病毒感染的細胞裂解物懸液的橫向流過濾的滯留物。
另外的較佳的實施方案-2
在一些實施方案中，提供一種測量樣品中無包膜病毒或假包膜病毒的含量的方法，該方法包括以下的步驟。
a)向包含細胞和培養基的混合物提供樣品。
b)培養以允許該無包膜病毒或假包膜病毒的繁殖以獲得培養的部分，如果該無包膜或假包膜病毒存在於樣品中的話。
c)用至少第一去垢劑處理以獲得處理的部分。
d)收集所處理的部分的一部分以獲得收集的部分。
e)測量所收集的部分中該無包膜病毒或假包膜病毒的含量。
在該方法的一些實施方案中，樣品從哺乳動物獲得。 在該方法的一些實施方案中，樣品包括血漿或血液。在該方法的一些實施方案中，無包膜病毒或假包膜病毒是HAV。在該方法的一些實施方案中，無包膜病毒或假包膜病毒是PPV。在該方法的一些較佳的實施方案中，無包膜病毒或假包膜病毒是HEV。在該方法的一些實施方案中，病毒在細胞培養物中產生。在該方法的一些實施方案中，細胞選自由HepG2(ATCC寄存編號HB-8065)和HepG2/C3A(ATCC寄存編號CRL-10741)組成的組。在該方法的一些實施方案中，樣品包括由通過膜橫向流過濾培養的部分的一部分獲得的第一滯留物。在該方法的一些實施方案中，樣品任選地包括由通過膜橫向流過濾培養的部分的一部分以獲得第一滯留物並離心該第一滯留物獲得的第一上清液。在該方法的一些實施方案中，樣品用至少第一去垢劑或任選地用去垢劑的混合物來處理，以獲得第一溶液。在一些實施方案中，該方法進一步包括以下的步驟。
a)提供通過離心第一溶液獲得的第一沉澱。
b)提供通過將該第一沉澱重懸於PBS中獲得的第二溶液。
c)提供通過將第二溶液澄清獲得的第三溶液。
d)提供通過使用膜過濾第三溶液獲得的第一濾液。
e)提供通過超濾第一濾液獲得的第二滯留物，其中該第二滯留物包含所處理的部分。
在該方法的一些實施方案中，測量無包膜病毒或假包膜病毒的含量包括檢測生物物質。在該方法的一些實施方 案中，生物物質包括病毒的多核苷酸序列及/或多肽序列。在該方法的一些實施方案中，生物物質是HEV核糖核酸。在該方法的一些實施方案中，測量生物物質包括以下的步驟。
a)提供通過將所處理的部分的一部分與裂解溶液混合獲得的包含病毒核糖核酸的第一反應混合物。
b)提供通過將第一試劑添加至第一反應混合物獲得的第二反應混合物，其中該第二反應混合物包含與病毒RNA互補的去氧核糖核酸。
c)將第二試劑添加至第二反應混合物，該第二試劑與在該去氧核糖核酸內的序列互補。
d)將第三試劑添加至第二反應混合物，該第三試劑與在該去氧核糖核酸內的序列互補。
e)擴增在該去氧核糖核酸內被第二試劑和第三試劑包含的序列。
f)測量所擴增的序列的濃度。
在該方法的一些實施方案中，第二試劑和第三試劑包含選自由以下組成的組的寡核苷酸序列。
a)5’-CGGCTATCGGCCAGAAGTT-3’(SEQ ID NO：1)。
b)5’-CCGTGGCTATAACTGTGGTCT-3’(SEQ ID NO：2)。
c)5’-FAM-TTTTTACGC-ZEN-AGGCTGCCAAGGCC-3IABkFQ-3’(SEQ ID NO：3)。
另外的較佳的實施方案-3
在一些實施方案中，對於病毒的澄清，使用冷凍的粗製病毒儲備物。在一些實施方案中，當製備濃縮的和純化的無包膜病毒儲備物時，將0.5% Triton X-100和0.1% LDS添加至解凍的粗製病毒儲備物並在37℃培養1小時。
在一些實施方案中，解凍的粗製病毒儲備物的澄清通過在2℃至8℃下以3000 x g至8000 x g的速度離心15分鐘至30分鐘來進行。在一些實施方案中，上清液被取出並保留，且沉澱被棄去。在一些實施方案中，上清液通過0.45μm過濾器來過濾，然後通過300kDa膜橫向流過濾，並收集TFF滯留物。
在一些實施方案中，對於超速離心，TFF滯留物在2℃至8℃下以約85000 x g在浮桶式轉頭中在超速離心管中超速離心1.5小時。在一些實施方案中，來自超速離心的上清液被傾出並作為液體廢棄物棄去。
在一些實施方案中，對於超濾，超速離心沉澱被重懸於不少於5mL的緩衝液，諸如PBS中。在一些實施方案中，沉澱懸液在2℃至8℃下以3000 x g至4200 x g澄清15分鐘。在一些實施方案中，上清液被取出並放置進Amicon® UF過濾裝置中以濃縮。在一些實施方案中，如需要，添加緩衝液諸如PBS以使終體積為約15mL(過濾器容量為15mL)。
在一些實施方案中，過濾裝置在2℃至8℃下以約5000 x g離心直到被保留的樣品(濃縮和純化的病毒儲備物)終 體積不超過1mL。在一些實施方案中，大致的離心時間為約15分鐘至約60分鐘。
在一些實施方案中，濃縮和純化的病毒儲備物被分成等份並冷凍在不高於-65℃下。
實施例
實施例1. TFF-HEV摻入物的製備。
切向流過濾(TFF)是用於分離和濃縮生物分子的熟知程式。關於TFF的另外的資訊在，例如Larry Schwartz等人的“Introduction to Tangential Flow Filtration for Laboratory and Process Development Applications”(pall.com/main/laboratory/literature-library-d etails.page？id=34212)中是容易可得的，其被通過引用以其整體併入本文。
HEV感染的HepG2或HepG2/C3A細胞被冷凍和解凍兩次，並通過低速離心澄清，且通過0.45μm過濾器。澄清的溶液(~1L)通過兩個300kDa膜通過TFF濃縮十倍，並且所得TFF滯留物(~100mL)在4℃以約85,000xg離心90分鐘以沉澱病毒。收集超速離心上清液(~100mL)並保存以便處理為TFF-Supe HEV(實施例2)，同時將沉澱重懸於PBS中。重懸的沉澱然後通過0.2μm孔的過濾器過濾並通過100kDa膜超濾至約2mL的終體積。使該溶液通過0.2μm或0.1μm過濾器過濾滅菌，並儲存在5℃直到準備用作TFF-HEV摻入物製品。
實施例2. TFF-上清液HEV(TFF-Supe HEV)摻入物的 製備。
與細胞培養物來源的HEV締合的脂類增加病毒浮力並從而降低通過超速離心沉澱病毒的效率。因此，在本發明的一些實施方案中，包含Triton X-100和十二烷基硫酸鋰(LDS)的去垢劑混合物被添加至包含HEV的流體，以去除締合的脂類並增加病毒回收率。
在37℃用0.5% Triton X-100和0.1% LDS處理約100mL由實施例1的澄清的HEV感染的細胞裂解物(~1L)的TFF和超速離心產生的超速離心上清液不少於30分鐘，然後在5℃以100,000xg通過30%蔗糖墊超速離心8小時。所得的沉澱被重懸於PBS中，通過0.2μm孔過濾器過濾並通過100kDa膜超濾至約1mL的終體積。然後使該溶液通過0.2μm或0.1μm過濾器，並儲存在5℃直到準備用作TFF-Supe HEV摻入物製品。
實施例3. 比較根據實施例1和實施例2的方法產生的病毒摻入物的純度。
SDS-PAGE被用來比較根據實施例1和實施例2的方法產生的病毒摻入物的相對純度。如圖2中所示，將以下樣品的等分試樣取出用於A280和定量PCR：初始粗製HEV、TFF滯留物、超速離心上清液、TFF-HEV和TFF-Supe HEV。如通過A280測量的，TFF滯留物和超速離心上清液具有比初始粗製HEV和TFF-HEV多10倍和比TFF-Supe HEV多40倍的蛋白(圖2)。儘管蛋白濃度是不同的，HEV RNA在除了初始粗製樣品以外的所有樣品中的濃度為約9 log10拷貝(copies)/mL(圖2)。因此，由病毒(HEV RNA)與蛋白(A280)的比指示的相對純度在TFF-Supe HEV和TFF-HEV中比在超速離心上清液和TFF滯留物中高得多。
樣品的相對純度可通過SDS-PAGE觀察(圖2)。將樣品稀釋或濃縮至約4 AU，然後在包含DTT的樣品緩衝液中加熱，並上樣到4%-20%梯度凝膠上。細胞培養基也被作為背景對照上樣。在SDS-PAGE之後，將凝膠取出並用Instant Blue染色。結果與A280和PCR資料一致，示出了在TFF滯留物和超速離心上清液中最高的雜質含量。最豐富的蛋白在約70kDa處呈條帶。由於它也存在於細胞培養基中，因此它最可能是胎牛血清(細胞和病毒繁殖必需的培養基補充劑以及可干擾下游清除研究的非病毒污染物)中存在的蛋白。在實施例1和實施例2描述的純化方法期間，污染物的大部分被去除，且它的相對濃度在TFF Supe HEV中是最低的，隨後是TFF HEV。
實施例4. 比較根據實施例1和實施例2的方法產生的病毒摻入物的熱穩定性。
進行了比較已根據實施例1或實施例2製備的TFF-HEV和TFF-Supe HEV摻入物的熱穩定性的實驗。將兩種病毒製品摻入進PBS並在5℃、60℃、70℃或80℃培養4小時。從每種測試溶液取出等分試樣並如下滴定。製備樣品的系列稀釋液並添加至用HepG2或HepG2/C3A細胞接種的孔。病毒被允許在37℃吸附不少於1小時，並添加生長培養基。將板在37℃培養不少於2天，然後從孔中 吸出培養基，並用緩衝液(例如PBS)洗滌/吸打細胞不少於2x。板然後被使用Dynabeads® mRNA DIRECTTM微型試劑盒(Life Technologies)提取病毒RNA，或被儲存在不高於-65℃下直到準備用於提取。在提取之後，洗脫液(聚A RNA)被立即處理用於PCR擴增或儲存在不高於-65℃直到準備用於PCR擴增。
使用如先前討論的以下引子和探針，使用一步RT-PCR來檢測樣品中的HEV RNA。用於每個反應的測定條件如下。
a)試劑：5.0μl 4x TaqMan® Fast Virus 1-Step Master Mix(Life Technologies)、0.08μL 100mM引子F+R、0.04μL 100mM探針、0.4μL SUPERase In(Life Technologies)、4.4μL水和10μL模板(總計20μl)。
b)反應：52℃持續10分鐘、95℃持續30秒，以及95℃持續15秒、56℃持續45秒的40個循環。
PCR和循環閾值(Ct)值確定根據製造商的說明書使用AB 7500即時PCR系統(Applied Biosystems,Foster City,CA)和附帶軟體來進行。基於歷史資料，閾值被手動設置在0.1，使得它通過所有標準曲線的指數期並確保每反應1RNA拷貝的檢測。指示HEV RNA的存在的陽性PCR訊號在與閾值相交的任何時間被記錄。
在HEV滴定板中的所有的孔基於陽性PCR訊號的存在或不存在被評分為陽性或陰性。然後使用適當的統計學方法：Spearman-Kärber、MPN或泊松(Poisson)將病毒滴度 被計算為TCID50/mL。
如表1中所示，當病毒摻入物根據本發明的方法的實施方案(實施例2)來製備時，病毒滅活達到60℃、70℃和80℃下的檢測限值。另一方面，當使用根據實施例1(本領域的先前技術的方法，無去垢劑處理)獲得的摻入物時，病毒在70℃或80℃加熱4小時之後仍然存在。
來自公佈的報告的資料表明，根據實施例1產生的病毒摻入物的熱穩定性不同於自然界中發現的HEV的表現。例如，人類腸道病毒是已知的最耐熱病毒中的一些，且研究已顯示被摻入進PBS的A型肝炎病毒、脊髓灰質炎病毒和貓杯狀病毒，在72℃加熱18.35秒、5.44秒和7.39秒之後，90%被滅活(Suphachai N,Cliver DO.2002.J Virol Methods 104：217-225)。另外，60℃加熱包含與人類HEV密切相關的野豬HEV的肝懸液1小時，導致4.42 log10病毒減少(Schielke A，等2011.Virol Jol 8：487-495)。因此，根據實施例1的方法(本領域的先前技術的方法，無去垢劑處理)產生的HEV摻入物不可以準確評估病毒清除研究中 HEV的臨床分離物的減少。
另一方面，根據本發明的方法(實施例2)產生的病毒摻入物被熱處理完全失活，類似於在自然界中發現的HEV中觀察到的。因此，根據本發明的方法製備的病毒可能是更適合在病毒清除研究中使用的摻入物。因此，在一些實施方案中，病毒摻入物根據實施例2的方法來製備。
實施例5. HEV製備方法和測定在乾燥加熱實驗中的應用。
作為原理論證，TFF-HEV和TFF-Supe HEV摻入物按在實施例1和實施例2中所述來製備並在評價在因子VIII濃縮物製造過程的冷凍乾燥/乾燥加熱(FD/DH)步驟期間的病毒減少及/或清除的實驗中測試。FD/DH步驟是製造過程的最後步驟並在溶劑/去垢劑(S/D)處理步驟的下游。
對於FD/DH實驗，摻有TFF-HEV或TFF-Supe HEV製品的因子VIII濃縮物被等分到小瓶中，並使用與在製造規模相同的冷凍乾燥週期在實驗室規模的凍乾機中冷凍乾燥。冷凍乾燥的小瓶然後被放置於80℃烘箱中，並乾燥加熱持續多達75小時。
用於滴定的摻入病毒的產品的小瓶在冷凍乾燥之前(初始)和之後且無乾燥加熱(FD/DH 0小時)、，在冷凍乾燥隨後乾燥加熱24小時(FD/DH 24h)之後和在冷凍乾燥隨後乾燥加熱75小時(FD/DH 75小時)之後取出。病毒摻入的FD/DH產品用高純度水重構至其原始體積，連續稀釋，並 接種在被接種在96孔板內的HepG2或HepG2/C3A細胞上。病毒被吸附，添加最終的覆蓋培養基，並將板放置在37℃培養箱中持續不少於3天。然後取出滴定板，吸出並提取病毒RNA或儲存在-80℃下直到準備用於提取。從各個孔提取的RNA通過如在實施例3描述的PCR分析HEV。滴定孔被評分為HEV陽性或陰性，並確定病毒滴度。在該步驟期間，Log10 HEV減少通過比較在初始和最終(FD/DH 75小時)小瓶中的log10病毒滴度來計算。
如表2中所示，兩種摻入物製品的滴度在冷凍乾燥之前和之後是相似的，且通過冷凍乾燥的減少是不顯著的(小於1 log10)。相比之下，通過80℃乾燥加熱處理的病毒滅活是顯著的(大於1 log10)且對於TFF-Supe HEV(LRV=4.6)，比TFF HEV(LRV=3.4)更大。根據實施例1的方法製備的TFF-HEV摻入物中高含量污染物的可能存在可保護病毒免於被加熱滅活或可妨礙對衣殼化HEV RNA的有效破壞。
由於用於FD/DH處理的最後步驟的起始材料在倒數第二個步驟中被S/D處理，可能存在於因子VIII濃縮物製 造製程流中的任何潛在的病毒污染物將被脫脂化並可能比TFF-HEV(根據實施例1的方法製備的)更類似於TFF-Supe HEV(根據實施例2的方法製備的)。因此，對於TFF-Supe HEV的LRV最可能是對FD/DH處理步驟的HEV減少能力的更準確評估。
實施例6. 去垢劑處理的TFF HEV摻入物的製備。
用於製備TFF-Supe HEV的過程相對耗時。因此，用於去垢劑處理的另外的方法被開發，用於TFF HEV摻入物製備。如在圖3中所示，遵循與實施例1中相同的用於製備TFF-HEV的過程，例外是根據本發明的一些實施方案，用多種去垢劑處理TFF滯留物的步驟插入在5℃下以85,000xg超速離心1.5小時之前。將Triton TFF-HEV製品與0.5% Triton X-100在37℃培養1.5小時，同時使用0.5% Triton X-100+0.1% LDS處理Triton/LDS TFF-HEV摻入物。在超速離心之後，僅沉澱被進一步加工成病毒摻入物。製備TFF-HEV和去垢劑處理的TFF-HEV的方法通過從純化過程去除中間級分並如之前在實施例3中描述的滴定病毒來比較。結果示於表3中。
TFF-HEV和Triton/LDS TFF-HEV過程的病毒回收率是相當的，最終摻入物製品包含約8.3 log10 HEV。Triton TFF-HEV方法在沉澱病毒方面不太有效，因為輸入病毒的大部分在超速離心上清液級分中丟失，並產生具有小於7 log10 HEV的摻入物。
實施例7. HEV製備方法和測定在液體加熱實驗中的應用。
巴氏消毒法是白蛋白製造過程中的最後步驟，並包括在60℃加熱高度純化的產品的小瓶不少於10小時。病毒如在實施例6中描述的來製備，並被摻入進25%白蛋白中，然後在5℃或60℃培養7小時。然後取出樣品用於病毒滴定，並且結果示於表4中。作為比較物，也展示了來自用摻入有TFF-Supe HEV(根據實施例2的方法製備的)的25%白蛋白的巴氏消毒法(10小時、60℃)的資料。
TFF-HEV是最耐熱的測試病毒，且在熱處理之後顯示僅2.3 log10的滴度減少。儘管Triton TFF-HEV的起始滴度 比TFF-HEV低約一個log10，對於Triton TFF-HEV的LRV比對於TFF-HEV的高約一個log10。對於用Triton/LDS處理的TFF-HEV的LRV是三種TFF-HEV製品中最高的，並略微低於在用TFF Supe HEV(也是用Triton/LDS處理的一種病毒製品)摻入的白蛋白的巴氏消毒法之後實現的減少量。
實施例8. 通過TFF、超速離心和超濾的病毒濃縮和純化。
對於病毒的澄清，解凍冷凍的粗製病毒儲備物。當製備濃縮的和純化的無包膜病毒儲備物時，將0.5% Triton X-100和0.1% LDS添加至解凍的粗製病毒儲備物並在37℃培養1小時。澄清通過在2℃下至8℃以3000 x g至8000 x g的速度離心15分鐘至30分鐘來進行。取出並保留上清液，並棄去沉澱。上清液通過0.45μm過濾器過濾。
對於TFF，TFF系統被清洗並準備用於過濾。將過濾的病毒儲備物澄清。
對於超速離心，將TFF滯留物放置於超速離心管中。將管平衡直到重量在彼此的±0.05g內。將管裝載進浮桶式轉頭並在2℃至8℃下以約85000 x g離心1.5小時。在超速離心運行結束時，來自每個離心管的上清液被小心地傾出並作為液體廢棄物棄去。將管倒置並允許在室溫下在吸收巾上排水約5分鐘。在排水之後，淨化和處置巾。
對於超濾，超速離心沉澱被重懸於不小於5mL的PBS中。將沉澱懸液在2℃至8℃下以3000 x g至4200 x g 澄清15分鐘。取出上清液並放置進Amicon® UF過濾裝置中以濃縮。如果需要，添加PBS以使終體積達到約15mL(過濾器容量為15mL)。將蓋帽的過濾裝置放置進離心機轉頭中並用平衡物(counterweight)平衡該轉子。離心在2℃至8℃下以約5000 x g來進行，直到被保留的樣品(濃縮和純化的病毒儲備物)終體積不超過1mL(大致離心時間為15分鐘至60分鐘)。
定義
HepG2：從美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection)獲得的肝細胞癌細胞(ATCC寄存編號HB-8065)。
DMEM：Dulbecco氏改良的Eagle培養基。
FBS：胎牛血清。
滴度：通過滴定確定的溶液中一種物質(病毒)的濃度或此類物質的強度。
SK：Spearman-Karber是計算具有相對高濃度病毒的樣品中的病毒滴度的統計學方法。當陽性孔在任何稀釋度下的比例>25%時，使用該方法(圖1)。
MPN：最大概率數是計算具有相對低濃度病毒的樣品中的病毒滴度的統計學方法。當陽性孔在所有稀釋度下的比例<25%時，使用MPN。
泊松：泊松是計算具有極低濃度病毒的樣品中的病毒滴度的統計學方法。當未觀察到陽性孔時，使用該方法。
ATCC：美國典型培養物保藏中心。
HEV TFF滯留物：是已使用300kD TFF膜濃縮澄清的HEV細胞裂解物之後剩餘的材料。HEV TFF滯留物被用來製備TFF HEV摻入物。
HEV TFF上清液是在將HEV TFF滯留物以約84780 xg離心之後剩餘的流出物。HEV TFF上清液被用來製備TFF Supe HEV摻入物。
TCID50對應於50%組織培養感染劑量(終點稀釋測定)。它是對感染性病毒滴度的量度，定量出殺死50%的被感染的宿主或在50%的接種的組織培養細胞中產生細胞病變效應所需的病毒的量。
A280：在280nm處測量的吸光度，其指示蛋白濃度及/或量。
AU：吸光度單位。
病毒摻入物：具有已知病毒含量的病毒樣品。
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<223> 合成的；HEV反向引子
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 合成的；HEV探针
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<223> n=3IABkFQ
<400> 3

Claims (27)

  1. 一種純化在細胞培養物中繁殖的無包膜病毒或假包膜病毒的方法，該方法包括用去垢劑處理包含該無包膜病毒或該假包膜病毒的樣品的步驟。
  2. 如請求項1所記載之純化在細胞培養物中繁殖的無包膜病毒或假包膜病毒的方法，其中該在細胞培養物中繁殖的無包膜病毒或假包膜病毒是E型肝炎病毒(HEV)。
  3. 如請求項1所記載之純化在細胞培養物中繁殖的無包膜病毒或假包膜病毒的方法，其中該在細胞培養物中繁殖的無包膜病毒或假包膜病毒是A型肝炎病毒(HAV)或豬小病毒(PPV)。
  4. 如請求項1所記載之純化在細胞培養物中繁殖的無包膜病毒或假包膜病毒的方法，其中該無包膜病毒或該假包膜病毒在體外細胞培養物中產生。
  5. 如請求項4所記載之純化在細胞培養物中繁殖的無包膜病毒或假包膜病毒的方法，其中該體外細胞培養物包含建立的細胞系。
  6. 如請求項5所記載之純化在細胞培養物中繁殖的無包膜病毒或假包膜病毒的方法，其中該建立的細胞系選自由HepG2(ATCC寄存編號HB-8065)和HepG2/C3A(ATCC寄存編號CRL-10741)組成的組。
  7. 如請求項1所記載之純化在細胞培養物中繁殖的無包 膜病毒或假包膜病毒的方法，其中該去垢劑選自由十二烷基硫酸鋰、Triton X-100及其混合物組成的組。
  8. 如請求項7所記載之純化在細胞培養物中繁殖的無包膜病毒或假包膜病毒的方法，其中該Triton X-100的濃度為0.5%且該十二烷基硫酸鋰的濃度為0.1%。
  9. 如請求項1所記載之純化在細胞培養物中繁殖的無包膜病毒或假包膜病毒的方法，其中該處理的步驟進行1小時。
  10. 如請求項1所記載之純化在細胞培養物中繁殖的無包膜病毒或假包膜病毒的方法，其中該樣品是從澄清的病毒感染的細胞裂解物懸液的超速離心獲得的上清液。
  11. 如請求項1所記載之純化在細胞培養物中繁殖的無包膜病毒或假包膜病毒的方法，其中該樣品是來源於澄清的病毒感染的細胞裂解物懸液的橫向流過濾的滯留物。
  12. 一種測量樣品中無包膜病毒或假包膜病毒的含量的方法，包括以下的步驟：步驟a)向包含細胞系和培養基的混合物提供該樣品；步驟b)培養以允許該無包膜病毒或該假包膜病毒的繁殖以獲得培養的部分，如果該無包膜病毒或該假包膜病毒存在於該樣品中；步驟c)用至少一種去垢劑處理以獲得處理的部 分；步驟d)收集所處理的部分的一部分以獲得收集的部分；以及步驟e)測量所收集的部分中該無包膜病毒或該假包膜病毒的含量。
  13. 如請求項12所記載之測量樣品中無包膜病毒或假包膜病毒的含量的方法，其中該樣品從哺乳動物獲得。
  14. 如請求項13所記載之測量樣品中無包膜病毒或假包膜病毒的含量的方法，其中該樣品包括血漿或血液。
  15. 如請求項12所記載之測量樣品中無包膜病毒或假包膜病毒的含量的方法，其中該無包膜病毒或該假包膜病毒是E型肝炎病毒(HEV)。
  16. 如請求項12所記載之測量樣品中無包膜病毒或假包膜病毒的含量的方法，其中該無包膜病毒或該假包膜病毒是A型肝炎病毒(HAV)或豬小病毒(PPV)。
  17. 如請求項12所記載之測量樣品中無包膜病毒或假包膜病毒的含量的方法，其中該無包膜病毒或該假包膜病毒在包含建立的細胞系的體外細胞培養物中繁殖。
  18. 如請求項12所記載之測量樣品中無包膜病毒或假包膜病毒的含量的方法，其中該細胞系選自由HepG2(ATCC寄存編號HB-8065)和HepG2/C3A(ATCC寄存編號CRL-10741)組成的組。
  19. 如請求項12所記載之測量樣品中無包膜病毒或假包膜病毒的含量的方法，其中該樣品包括由通過膜橫向流 過濾所培養的部分的一部分獲得的第一滯留物。
  20. 如請求項12所記載之測量樣品中無包膜病毒或假包膜病毒的含量的方法，其中該樣品包括通過膜橫向流過濾所培養的部分的一部分以獲得第一滯留物並離心該第一滯留物獲得的第一上清液。
  21. 如請求項12所記載之測量樣品中無包膜病毒或假包膜病毒的含量的方法，其中該樣品用至少一種去垢劑或去垢劑的混合物來處理，以獲得第一溶液。
  22. 如請求項21所記載之測量樣品中無包膜病毒或假包膜病毒的含量的方法，其中該方法進一步包括以下的步驟：步驟a)提供通過離心該第一溶液獲得的第一沉澱；步驟b)提供通過將該第一沉澱重懸於磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中獲得的第二溶液；步驟c)提供通過將該第二溶液澄清獲得的第三溶液；步驟d)提供通過使用膜過濾該第三溶液獲得的第一濾液；以及步驟e)提供通過超濾該第一濾液獲得的第二滯留物，該第二滯留物包含所處理的部分。
  23. 如請求項12所記載之測量樣品中無包膜病毒或假包膜病毒的含量的方法，其中測量該無包膜病毒或該假包膜病毒的含量包括檢測生物物質。
  24. 如請求項23所記載之測量樣品中無包膜病毒或假包膜病毒的含量的方法，其中該生物物質包括病毒的多核苷酸序列及/或多肽序列。
  25. 如請求項24所記載之測量樣品中無包膜病毒或假包膜病毒的含量的方法，其中該生物物質是E型肝炎病毒(HEV)核糖核酸。
  26. 如請求項25所記載之測量樣品中無包膜病毒或假包膜病毒的含量的方法，其中測量該生物物質包括以下的步驟：步驟a)提供通過將所處理的部分的一部分與裂解溶液混合獲得的包含該E型肝炎病毒(HEV)核糖核酸的第一反應混合物；步驟b)提供通過將第一試劑添加至該第一反應混合物獲得的第二反應混合物，該第二反應混合物包含與該E型肝炎病毒(HEV)核糖核酸互補的去氧核糖核酸；步驟c)將第二試劑添加至該第二反應混合物，該第二試劑至少部分地與在該去氧核糖核酸內的序列互補；步驟d)將第三試劑添加至該第二反應混合物，該第三試劑至少部分地與在該去氧核糖核酸內的序列互補；步驟e)擴增在該去氧核糖核酸內被該第二試劑和該第三試劑包含的序列；以及 步驟f)測量所擴增的序列的濃度。
  27. 如請求項26所記載之測量樣品中無包膜病毒或假包膜病毒的含量的方法，其中該第二試劑和該第三試劑包含選自由以下組成的組的寡核苷酸序列：a)5’-CGGCTATCGGCCAGAAGTT-3’(SEQ ID NO：1)；b)5’-CCGTGGCTATAACTGTGGTCT-3’(SEQ ID NO：2)以及c)5’-FAM-TTTTTACGC-ZEN-AGGCTGCCAAGGCC-3IABkFQ-3’(SEQ ID NO：3)。
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