TR201902201T4 - İn vi̇tro üreti̇len bi̇r vi̇rüsün saflaştirilmasina yöneli̇k yöntemler ve vi̇rüse yöneli̇k klerens anali̇zi̇. - Google Patents

Abstract

Mevcut buluş kapsamında, en az bir temizlik maddesi içeren bir bileşim kullanılarak in vitro üretilen kılıfsız veya psödo-kılıflı virüsün saflaştırılması için bir yöntem açıklanmaktadır. Ayrıca, birden çok temizlik maddesi kullanabilen saflaştırmaya ait bir yöntem ve bir numunede kılıfsız veya psödo-kılıflı bir virüsün varlığı ve/veya seviyesinin belirlenmesi için bir yöntem sunulmaktadır.

Description

Tarifname iN VITRO ÜRETILEN BIR VIRÜSÜN SAFLASTIRILMASINA YÖNELIK YÖNTEMLER VE ARKAPLAN Teknik Alan Mevcut bulus, viroloji alanina, daha açik olarak hepatit B virüsü (HEV), hepatit A virüsü parvovirüsünün [PPV] saflastirilmasinin ve virüs klerens çalismalarina yönelik yöntemlere yöneliktir.

Tüm kan ve plazmadan türetilen ürünlerin klinik kullanimi, kan yoluyla bulasan patojenlerin iletiminin potansiyel riskini tasir. Riskin azaltilmasi, kan ve plazmadan türetilen ürünlerin üretim proseslerinde patojen azaltma adimlarinin uygulanmasi araciligiyla gerçeklestirilebilir. Bu tür azaltma adimlarinin etkililiklerini gelistirmek ve göstermek üzere, Virüs klerens çalismalari gerçeklestirilir. Bu çalismalar sirasinda bilinen bir miktarda virüs, bir kan veya plazma ürünü ara maddesi içine sokulur ve akabinde sokulan numune, bir patojen azaltma adimi içeren imalat prosesinin bir laboratuvar ölçekli modeli [ölçegi küçültülmüs model) kullanilarak islenir. Bir patojen azaltma adimi sirasinda Virüs azalmasi ve/veya klerens, adimdan önce ve sonra virüs miktarinin karsilastirilmasi araciligiyla belirlenir.

Virüs klerens verisinin geçerliligini kesinlestirmek üzere, ölçegi küçültülmüs model, genis ölçekli bir birimi dogru bir sekilde göstermelidir ve virüs spayki, potansiyel bir kontaminantin temsilcisi olmalidir. Örnegin, bir virüs spaykinin in vitro kültivasyonu, serum gerektirebilir ve virüs spaykinda serum olmasi, serumsuz ürün ara maddelerini içeren klerens çalismalarini etkileyebilir. Distan gelen konakçi hücre membranlari, proteinler ve nükleik asitler gibi Viral olmayan kontaminantlarin varligi, ayrica ürün ara maddelerinin büyük olasilikla yüksek derecede saflastirildigi bir asagi akis adimi boyunca Virüs klerensinin dogru degerlendirilmesine müdahale edebilir. Bu nedenle, performansi ve ölçegi küçültülmüs modellerin iliskisini etkileyebilen virüs spayk kontaminantlarini uzaklastirmak için önemlidir.

KISA AÇIKLAMA Mevcut bulus, bir temizlik maddesi ile kilifsiz veya psödo-kilifli virüsü içeren bir numunenin tedavisinin bir yöntemine bagli olarak, hücre kültüründe çogalan kilifsiz veya psödo-kilifli virüsün saflastirilmasinin bir yöntemini içerir, burada temizlik maddesi, karisimindan olusan gruptan seçilir. Yöntemin bazi düzenlemelerinde, hücre kültüründe çogalan virüs, hepatit A virüsüdür (HAV). Yöntemin bazi düzenlemelerinde, hücre kültüründe çogalan virüs, domuz parvovirüsüdür (PPV). Yöntemin bazi tercih edilen düzenlemelerinde, hücre kültüründe çogalan Virüs, hepatit E virüsüdür (HEV). Yöntemin bazi düzenlemelerinde, virüs, bir in vitro kültür ortaminda üretilir. Yöntemin bazi düzenlemelerinde, in vitro hücre kültürü, belirlenmis bir hücre hattini içerir. Yöntemin bazi düzenlemelerinde, belirlenmis hücre hatti, HepGZ [ATCC numarasi HB-8065) ve HepG2/C3A'dan (ATCC numarasi CRL-10741] olusan bir gruptan seçilir. Yöntemin bazi düzenlemelerinde, tedavi adimi, 1 saat boyunca gerçeklestirilir. Yöntemin bazi düzenlemelerinde, numune, temizlenen virüs-enfekte hücre lizat süspansiyonunun ultra- santrifüjlenmesinden elde edilen bir üst fazdir. Yöntemin bazi düzenlemelerinde, istege bagli olarak, numune, temizlenen virüs-enfekte hücre lizat süspansiyonunun karsi akim yikamali filtrasyondan türetilen bir retentattir.

Bir numune içindeki kilifsiz veya psödo-kilifli virüsün bir seviyesinin ölçülmesinin bir yöntemidir, yöntem, asagidaki adimlari içerir: a) numunenin, bir hücre hatti ve bir hücre ortami içeren bir karisima saglanmasi; b) inkübe edilmis bir parça elde etmek üzere, numunede mevcut olmasi halinde, kilifsiz veya psödo-kilifli virüsün çogalmasina olanak saglamak üzere inkübe edilmesi; c) muamele edilmis bir parça elde etmek üzere en az bir temizlik maddesi ile muamele edilmesi; burada temizlik maddesi, %0.5'te Triton X-100 ve seçilir d) toplanmis bir parça elde etmek üzere muamele edilen parçanin bir kisminin toplanmasi; ve e] toplanan parçada kilifsiz veya psödo-kilifli virüsün seviyesinin ölçülmesi.

Yöntemin bazi düzenlemelerinde, numune, bir memeliden elde edilir. Yöntemin bazi düzenlemelerinde, numune, plazma veya kan içerir. Yöntemin bazi düzenlemelerinde, kilifsiz veya psödo-kilifli virüs, HAV'dir. Yöntemin bazi düzenlemelerinde, kilifsiz veya psödo-kilifli virüs, PPV'dir. Yöntemin bazi tercih edilen düzenlemelerinde, kilifsiz veya psödo-kilifli virüs, HEV'dir. Yöntemin bazi düzenlemelerinde, virüs, belirlenmis bir hücre hattini içeren in vitro hücre kültüründe çogalir. Yöntemin bazi düzenlemelerinde, hücre hatti, HepGZ (ATCC numarasi HB- olusan bir gruptan seçilir. Yöntemin bazi düzenlemelerinde, numune, bir membrandan inkübe edilmis parçanin bir kisminin karsi akim yikamali filtrelenmesi araciligiyla elde edilen bir birinci retentati içerir. Yöntemin bazi düzenlemelerinde, istege bagli olarak, numune, bir birinci retentati elde etmek üzere bir membrandan inkübe edilmis parçanin bir kisminin karsi akim yikamali filtrelenmesi ve birinci retentatin santrifüjlenmesi araciligiyla elde edilen bir birinci üst fazi içerir. Yöntemin bazi düzenlemelerinde, numune, bir birinci solüsyonu elde etmek üzere, bir temizlik maddesi veya %0.5'te Triton X-100 ve seçilen temizlik maddelerinin bir karisimi ile muamele edilir, yöntem ayrica asagidaki adimlari içerir: a) birinci solüsyonun santrifüjlenmesi araciligiyla elde edilen bir birinci pelletin saglanmasi; b) PBS (Fosfat Tamponlu Salin) içindeki birinci pelletin tekrar süspanse edilmesi araciligiyla elde edilen ikinci bir solüsyonun saglanmasi; c) ikinci solüsyonun temizlenmesi araciligiyla elde edilen üçüncü bir solüsyonun saglanmasi; ve d) birinci filtratin ultra filtrasyonu araciligiyla elde edilen ikinci bir retentatin saglanmasi, burada ikinci retentat, muamele edilmis parçayi içerir. Yöntemin bazi düzenlemelerinde, kilifsiz veya psödo-kilifli virüsün seviyesinin ölçülmesi, biyolojik bir maddenin saptanmasini içerir, burada biyolojik madde, bir virüsün bir polinükleotid dizisi ve/veya bir polipeptit dizisini içerir ve burada biyolojik madde, bir HEV ribonükleik asittir.

Yöntemin bazi düzenlemelerinde, biyolojik maddenin ölçümünün yapilmasi, asagidaki adimlari içerir: 3) muamele edilen parçanin bir kisminin, bir liziz solüsyonu ile karistirilmasi araciligiyla elde edilen HEV ribonükleik asidi içeren bir birinci reaksiyon karisiminin saglanmasi; b) birinci reaksiyon karisimina bir birinci reaktifin eklenmesi araciligiyla elde edilen ikinci bir reaksiyon karisiminin saglanmasi, burada ikinci reaksiyon karisimi, HEV ribonükleik asidi tamamlayan bir deoksiribonükleik asit içerir; c] ikinci bir reaksiyon karisimina, deoksiribonükleik asit içindeki bir diziyi en azindan kismen tamamlayan ikinci bir reaktif eklenmesi; (1) ikinci reaksiyon karisimina, deoksiribonükleik asit içindeki bir diziyi en azindan kismen tamamlayan üçüncü bir reaktifin eklenmesi; e] deoksiribonükleik asit içindeki ikinci ve üçüncü reaktifler ile çevrelenen dizinin genisletilmesi; ve f) genisletilen dizinin bir konsantrasyonunun ölçülmesi. Yöntemin bazi düzenlemelerinde, ikinci reaktifve üçüncü reaktif, asagidakilerden olusan gruptan seçilen bir oligonükleotid dizisini içerir: a) 5'-CGGCTATCGGCCAGAAGTT-3` [SEQ ID NO: 1); b] 5'-CCGTGGCTATAACTGTGGTCT-3' (SEQ lD NO: 2) ve c] 5`-FAM-TTTTTACGC-ZEN-AGGCTGCCAAGGCC-3lABkFQ-S' (SEQ lD NO: 3).

Bazi düzenlemelerde, mevcut bulus, klerens çalismalarindaki davranisi, yüksek derecede saflastirilmis proses akislarinda potansiyel olarak mevcut olabilenler ile tahminen ayni veya neredeyse ayni olan bir virüs elde edilmesine olanak saglanarak, bir temizlik maddesi karisimindan olusan gruptan seçilen temizlik maddelerinin bir karisimi ile kilifsiz veya psödo-kilifli virüsü içeren bir numunenin tedavisinin bir yöntemine bagli olarak, hücre kültüründe çogalan kilifsiz veya psödo-kiliili virüsün saflastirilmasinin bir yöntemini içerir. Bazi düzenlemelerde, yukarida açiklanan yöntemin birkaç düzenlemesi ile olusturulan virüs, kan ve/veya plazmadan türetilen proteinlere yönelik üretim proseslerinde virüs azalmasina ve/veya asagi akis yönündeki adimlarin klerens kapasitesine uygun bir spayk olacaktir.

Bazi düzenlemelerde, muamele yöntemine bagli olarak hücre kültüründe üretilen bir virüsün saflastirilmasinin yöntemi, asagidaki adimlari içerir: bir virüs-enfekte materyalin temizlenmesi; bir birinci retentati elde etmek üzere bir membrandan karisimin en azindan bir kisminin karsi akim yikamali filtrelenmesi; ve bir birinci üst fazi elde etmek üzere birinci retentatin santrifüjlenmesi. Muamele yöntemi, asagidaki adimlari içerir: birinci üst fazin, bir birinci solüsyonu elde etmek üzere en az bir temizlik maddesi ile muamele edilmesi; burada yöntem ayrica asagidaki adimlari içerir: söz konusu muameleden sonra, bir birinci pelleti elde etmek üzere birinci solüsyonun santrifüjlenmesi; ikinci bir solüsyonu elde etmek üzere birinci pelletin tekrar süspanse edilmesi; üçüncü bir solüsyonu elde etmek üzere ikinci solüsyonun temizlenmesi; bir birinci filtrati elde etmek üzere bir membran kullanilarak üçüncü solüsyonun filtrelenmesi; ve muamele edilmis parçanin en azindan bir kisminin toplanmasini saglayan ikinci bir retentat elde etmek üzere birinci filtratin ultra filtrelenmesi; burada söz konusu en az bir temizlik maddesi, karisimindan olusan gruptan seçilir; burada söz konusu en az bir temizlik maddesi ile birinci üst fazin muamele edilmesi, 1 saat boyunca gerçeklestirilir.

Bazi düzenlemelerde, muamele yöntemine bagli olarak hücre kültüründe üretilen bir virüsün saflastirilmasinin yöntemi, asagidaki adimlari içerir: bir Virüs-enfekte materyalin temizlenmesi; bir birinci retentati elde etmek üzere bir membrandan karisimin en azindan bir kisminin karsi akim yikamali filtrelenmesi. Muamele yöntemi, asagidaki adimlari içerir: birinci retentatin, bir birinci solüsyonu elde etmek üzere en az bir temizlik maddesi ile muamele edilmesi; burada yöntem ayrica asagidaki adimlari içerir: söz konusu muameleden sonra, bir birinci pelleti elde etmek üzere birinci solüsyonun santrifüjlenmesi; ikinci bir solüsyonu elde etmek üzere birinci pelletin tekrar süspanse edilmesi; üçüncü bir solüsyonu elde etmek üzere ikinci solüsyonun temizlenmesi; bir birinci filtrati elde etmek üzere bir membran kullanilarak üçüncü solüsyonun filtrelenmesi; ve muamele edilmis parçanin en azindan bir kisminin toplanmasini saglayan ikinci bir retentat elde etmek üzere birinci filtratin ultra filtrelenmesi; burada söz konusu Lityum Dodesil Sülfatin bir karisimindan olusan gruptan seçilir; burada söz konusu en az bir temizlik maddesi ile birinci retentatin muamele edilmesi, 1 saat boyunca gerçeklestirilir.

SEKILLERIN KISA AÇIKLAMASI Sekil 1, burada açiklanan bazi düzenlemelere göre Karsi Akim Yikamali Filtrasyon HEV [TFF HEV) ve TFF Üst Faz (Supe) HEV virüs spayklarinin hazirlanmasini gösterir.

Sekil 2, burada açiklanan bazi düzenlemelere göre hazirlanan, TFF HEV ve TFF Supe HEV virüsü spayklarinin iliskili safligini gösterir.

Sekil 3, burada açiklanan bazi düzenlemelere göre TFF HEV, Triton TFF HEV ve Triton/LDS TFF HEV virüs spayklarinin hazirlanmasini gösterir.

Sekil 4, primerler ve problarin nükleotid dizilerini gösterir.

DETAYLI AÇIKLAMA Kilifsiz Virüs HEV'nin üretilmesine yönelik etkili hücre kültürü sistemleri, yakin zamanda kurulmustur ve veriler, her ikisi de lipidler ile baglantili olan hücre kültüründen türetilen HEV'nin, kanda bulunan HEV'ye benzer oldugunu gösterir. Böylece, islenmemis temizlenen hücre kültürü lizatlari veya kültür üst fazlari, nispeten ham ürün ara maddeleri ile yukari akis yönünde adimlarin klerens çalismalarinda virüs spayklari olarak kullanilabilir. Bununla birlikte, virüs spayklari, proses akislarinin nispeten yüksek safliga sahip oldugu asagi akis yönünde adimlar sirasinda HEV klerensinin degerlendirilmesine uygun olmayabilir.

Bulus, asagi akis yönünde üretim prosesi adimlarina yönelik olarak virüs klerens çalismalarinda kullanima uygun olan nispeten yüksek saflik ve yüksek titreye sahip HEV spayklarinin hazirlanmasina yönelik bir proses ile ilgilidir.

HEV'nin in vitro kültürlenmesindeki zorluklardan dolayi, hücre kültürü bazli HEV infektivite analizleri, önceden kolayca mevcut olmamistir. Burada açiklanan bazi düzenlemelerde, hücre kültürü içinde yüksek titreli HEV'nin çogalimi, polibren ile takviye edilen ortam kullanilarak mümkündür.

HEV'nin, teknik olarak, kilifsiz bir virüs olarak düsünülmesine ragmen, hücre kültüründe çogalan HEV, genel olarak hücrelerden salindigindan membran fragmentleri/lipidleri içerir. Bu membranöz bilesenler, virüsü, liyofilize keklerin sivi isitilmasi veya kuru isitilmasi gibi virüsidal islemlerden koruyabilir. HEV, membranöz birikintiyi uzaklastirmak üzere Tween gibi temizlik maddeleri ile muamele edilebilir ancak, islem gören virüs, isitma araciligiyla inaktivasyona dirençli kalir.

Bazi düzenlemelerde, hücre kültürü HEV ile baglantili lipidler, %0.5'te triton X-100 ile muamele araciligiyla uzaklastirilabilir. Bazi düzenlemelerde, hücre kültürü HEV ile baglantili lipidler, % ile muamele araciligiyla uzaklastirilabilir. Bazi düzenlemelerde, ortaya çikan virüs preparasyonu, yine enfektözdür. Bazi düzenlemelerde, disaridan gelen viral olmayan kirletici maddelerin konsantrasyonlari, virüs preparasyonunda azaltilir. Bazi düzenlemelerde, virüs, ayrica isitma gibi virüsidal islemler ile inaktivasyona karsi daha duyarlidir.

HEV, hücre kültüründe sitopatik etkiler [CPE] üretmez. Bu nedenle, HEV saptamasi, orijinal olarak Ulusal Saglik Enstitüleri (NIH) tarafindan gelistirilen bir PCR analizine baglidir. Bazi düzenlemelerde, PCR analizi, duyarliligi artirmak üzere modifiye edilmistir.

Bazi düzenlemelerde, PCR analizinde kullanilan primerlerden biri degistirilmistir. Bazi düzenlemelerde, PCR analizinde kullanilan ters primer degistirilmistir. Bazi düzenlemelerde, PCR analizinde kullanilan bir prob yeniden tasarlanmistir. Tamamen yeni bir prob, PCR analizi Için tasarlanmistir. Bazi düzenlemelerde, PCR analizi, Virüs titrelerinin belirlenmesine yönelik olarak pozitif veya negatif olarak skor numuneleri için kullanilmistir.

Bazi düzenlemelerde, bulus, asagidaki durumlari içeren bir proses ile ilgilidir: polibren ile desteklenen ortam kullanilarak hücre kültüründe yüksek titre HEV'nin çogalmasi; membranöz lipidler/birikintiyi uzaklastirmak üzere triton X-lOO/LDS ile hücre kültürü HEV'nin muamele edilmesi; ve duyarli bir PCR analizi ile HEV'nin saptanmasi.

Bazi düzenlemelerde, proses, HEV'ye özgü olabilir. Bazi düzenlemelerde, virüs çogalmasi ve saflastirilmasina yönelik yöntemler, diger kilifsiz virüslere uygulanabilir. Bazi düzenlemelerde, virüs çogalmasi ve saflastirilmasina yönelik yöntemler, diger kilifsiz virüslere uygulanabilir. Bazi düzenlemelerde, virüs çogalmasi ve saflastirilmasina yönelik yöntemler, HAV'ye uygulanabilir. Bazi düzenlemelerde, virüs çogalmasi ve saflastirilmasina yönelik yöntemler, PPV'ye uygulanabilir. Bazi tercih edilen düzenlemelerde, virüs çogalmasi ve saflastirilmasina yönelik yöntemler, HEV'ye uygulanabilir.

Bazi düzenlemelerde, bulus, çesitli üretim adimlari ve ara madde ve nihai ürünlerin HEV uzaklastirma/inaktivasyon kapasitesini degerlendirmek üzere çalismalar gerçeklestirmek için kullanilabilir. Bazi düzenlemelerde, bulus, diger virüsler için çesitli üretim adimlari ve ara madde ve nihai ürünlerin uzak]astirma/inaktivasyon kapasitesini degerlendirmek üzere çalismalar gerçeklestirmek için kullanilabilir. Bazi düzenlemelerde, diger Virüsler, kilifsiz virüslerdir. Bazi düzenlemelerde, diger virüsler, psödo-kilifli virüslerdir. Bazi düzenlemelerde, diger virüsler, HAV ve PPV'dir.

Bazi düzenlemelerde, bulus, kan ve/veya HEV'den plazma gibi çesitli tibbi veya klinik ürünlerin güvenliginde teminat saglayabilir. Bazi düzenlemelerde, bulus, kan ve/veya diger virüslerden plazma gibi çesitli tibbi veya klinik ürünlerin güvenliginde teminat saglayabilir. Bazi düzenlemelerde, diger virüsler, HAV ve PPV'dir.

Bazi düzenlemelerde, mevcut bulus, in vitro üretilen kilifsiz veya psödo-kilifli virüsün saflastirilmasinin bir yöntemi ile ilgilidir. Bazi düzenlemelerde, mevcut bulus, in vitro üretilen HEV'nin saflastirilmasinin bir yöntemi ile ilgilidir. Bazi düzenlemelerde, saflastirma, en az bir anyonik ve/veya bir non-iyonik temizlik maddesi içeren bir bilesime ile temizlik maddesinin muamele edilmesi adimini içerir, burada temizlik maddesi, karisimindan olusan gruptan seçilir.

Bazi düzenlemelerde, bir veya daha fazla temizlik maddesi içeren bilesim ile muamele, gerektigi kadar bir süre boyunca gerçeklestirilir ve teknikte uzman bir kisi tarafindan belirlenir. Bazi düzenlemelerde, muamele, 5 dakika ila 1 gün gerçeklestirilir. Bazi tercih edilen düzenlemelerde, muamele, 10 dakika ila 3 saat gerçeklestirilir. Bazi tercih edilen düzenlemelerde, muamele, 1 saat gerçeklestirilir.

En çök tercih edilen bir düzenlemede, %0.5 Triton X-100 ve %0.1 LDS içeren bir bilesim kullanilir ve bilesim ile muamelenin bir adimi, 1 saat boyunca gerçeklestirilir. Bazi düzenlemelerde, inkübasyon, 1 saat boyunca 37°C'de gerçeklestirilir.

Bazi düzenlemelerde, baslangiç materyali, mevcut bulusun saflastirilmasinin bir yöntemini gerçeklestirdiginden, her ikisi de hücre kültürlerinden türetilen virüs-enfekte hücre kültürü ortami veya temizlenmis virüs-enfekte hücre lizat süspansiyonunun ultrasantrifüjlenmesinden elde edilen bir üst faz kullanilir. Tercih edilen bir düzenlemede, temizlenmis virüs-enfekte hücre lizat süspansiyonunun ultrasantrifüjlenmesinden elde edilen üst faz kullanilir.

Bazi düzenlemelerde, baslangiç materyali, mevcut bulusun saflastirilmasinin bir yöntemini gerçeklestirdiginden, her ikisi de Viral olarak enfekte hücre kültürlerinden türetilen virüs- enfekte hücre kültürü ortami veya temizlenmis virüs-enfekte hücre lizat süspansiyonunun karsi akim yikamali filtrasyonundan sonra elde edilen bir retentat kullanilir. Tercih edilen bir düzenlemede, temizlenmis virüs-enfekte hücre lizat süspansiyonunun karsi akim yikamali filtrasyonundan sonra elde edilen retentat kullanilir.

Bir birinci düzenlemede, saflastirma yöntemi asagidaki adimlari içerebilir: a) baslangiç materyalinin temizlenmesi; b] karsilik gelen bir retentat elde etmek üzere uygun bir membrandan, a] adiminin solüsyonunun karsi akim yikamali filtrelenmesi; c] karsilik gelen bir üst faz elde etmek üzere b] adiminin retentatinin ultrasantrifüjlenmesi; d) karsilik gelen bir solüsyon elde etmek üzere temizlik maddesi veya temizlik maddelerinin karisimi ile c) adiminin söz konusu üst fazinin muamele edilmesi; e) %30 sükroz tamponu üzerinde (1] adiminin solüsyonunun serilmesi karsilik gelen pelleti elde etmek üzere uygun hiz ve zamanda ultrasantrifüjleme gerçeklestirilmesi; f] karsilik gelen solüsyonu elde etmek üzere PBS'nin uygun hacminde e) adiminin pelletinin tekrar süspanse edilmesi; g) karsilik gelen solüsyonu elde etmek üzere t] adiminin solüsyonunun temizlenmesi; h) karsilik gelen retentati elde etmek üzere uygun bir membran kullanilarak g] adiminda elde edilen solüsyonun ultrafiltre edilmesi; ve i) h) adiminin retentatinin filtrelenmesi.

Tercih edilen bir birinci düzenlemede, a) adiminda, baslangiç materyali, 0.45 um gözenek boyutuna sahip bir filtreden temizlenir.

Tercih edilen bir birinci düzenlemede, b) adiminda, karsi akim yikamali filtrasyonu gerçeklestirmek üzere kullanilan membran, 300 kDa'lik bir membrandir.

Tercih edilen bir birinci düzenlemede, c) adiminda, ultrasantrifüjleme, 1.5 saat boyunca 85,0 00 xg'de gerçeklestirilir.

Tercih edilen bir birinci düzenlemede, d] adiminda, temizlik maddelerinin bir karisiminin kullanilmasi durumunda, temizlik maddelerinin karisimi, %0.5 Triton X-100 ve %0.1 LDS Tercih edilen bir birinci düzenlemede, e) adiminda, ultrasantrifüjleme, 8 saat boyunca 100,000 xg'de gerçeklestirilir.

Tercih edilen bir birinci düzenlemede, f) adiminda pelletin, PBS içinde tekrar süspanse edildigi üzerinde düsünülür.

Tercih edilen bir birinci düzenlemede, g) adiminda, f) adiminin solüsyonu, 0.2 um gözenek boyutuna sahip bir filtreden temizlenir.

Tercih edilen bir birinci düzenlemede, h) adiminda, ultrafiltrasyonda kullanilan membran, 100 kDa'lik bir membrandir.

Tercih edilen bir birinci düzenlemede, i) adiminda filtrasyon, 0.2 um gözenek boyutuna sahip bir filtreden temizlenir.

Ikinci bir düzenlemede, saflastirma yöntemi asagidaki adimlari içerebilir: a) baslangiç materyalinin temizlenmesi; b] karsilik gelen bir retentat elde etmek üzere uygun bir membrandan, a] adiminin solüsyonunun karsi akim yikamali filtrelenmesi; c] karsilik gelen bir solüsyon elde etmek üzere temizlik maddesi veya temizlik maddelerinin karisimi ile b) adiminin söz konusu retentatinin muamele edilmesi; d) karsilik gelen pelleti elde etmek üzere uygun bir hizda ve uygun bir zaman için temizlik maddesi ile muamele edilen solüsyonun ultrasantrifüjlenmesi; e) karsilik gelen solüsyonu elde etmek üzere PBS'nin uygun hacminde d) adiminin pelletinin tekrar süspanse edilmesi; I] karsilik gelen solüsyonu elde etmek üzere e) adiminin solüsyonunun temizlenmesi; g) karsilik gelen retentati elde etmek üzere uygun bir membran kullanilarak i) adiminda elde edilen solüsyonun ultrafiltre edilmesi; ve h) g) adiminin retentatinin filtrelenmesi.

Tercih edilen ikinci bir düzenlemede, a] adiminda, baslangiç materyali, 0.45 um gözenek boyutuna sahip bir filtreden temizlenir.

Tercih edilen ikinci bir düzenlemede, b) adiminda, karsi akim yikamali filtrasyonu gerçeklestirmek üzere kullanilan membran, 300 kDa'lik bir membrandir.

Tercih edilen ikinci bir düzenlemede, c] adiminda, temizlik maddelerinin bir karisiminin kullanilmasi durumunda, söz konusu temizlik maddelerinin karisimi, %05 Triton X-100 ve %0.1 LDS'dir.

Tercih edilen ikinci bir düzenlemede, cl) adiminda, ultrasantrifüjleme, 1.5 saat boyunca Tercih edilen ikinci bir düzenlemede, e) adiminda pellet, PBS içinde tekrar süspanse edilir.

Tercih edilen ikinci bir düzenlemede, f] adiminda, e] adiminin solüsyonu, 0.2 um gözenek boyutuna sahip bir filtreden temizlenir.

Tercih edilen ikinci bir düzenlemede, g] adiminda, ultrafiltrasyonda kullanilan membran, 100 kDa'lik bir membrandir.

Tercih edilen ikinci bir düzenlemede, h) adiminda filtrasyon, 0.2 um gözenek boyutuna sahip bir filtre araciligiyla gerçeklestirilir.

Mevcut bulus, in vitro üretilen kilifsiz veya psödo-kilifli bir virüsün saflastirilmasina yönelik bir yöntemde LDS ve/veya Triton X-100 kullanimi ile ilgilidir. Bazi düzenlemelerde, virüs kilifsizdir. Bazi düzenlemelerde, virüs psödo-kiliflidir.

Tercih edilen bir düzenlemede, in vitro üretilen virüs, HEV'dir. Bazi düzenlemelerde, in vitro üretilen virüs, HEV'den farkli bir virüs olabilir. Bazi düzenlemelerde, in vitro üretilen virüs, HAV'dir. Bazi düzenlemelerde, in vitro üretilen virüs, PPV'dir. En çok tercih edilen düzenlemede, in vitro üretilen virüs, HEV'dir.

Bazi düzenlemelerde, yukarida açiklanan in vitro üretim, bir in vitro kültürde gerçeklestirilir. Bazi düzenlemelerde, in vitro kültür, bir in vitro organ, doku veya hücre kültürüdür. Tercih edilen bir düzenlemede, in vitro üretim, bir in vitro hücre kültüründe gerçeklestirilir.

Bazi düzenlemelerde, primer hücre kültürü kullanilir. Bazi düzenlemelerde, bir hücre kültürü hatti kullanilir. Primer hücreler ve hücre kültürü hatlari, herhangi bir organizmadan türetilebilir. Örnegin, bazi düzenlemelerde, insekt hücrelerinin kullanilmasi düsünülür. Bazi düzenlemelerde, memeli hücrelerinin kullanilmasi düsünülür. Tercih edilen bir düzenlemelerde, bir insan hücre kültürü hatti kullanilir.

Tercih edilen bir düzenlemede, HEV üretimi ve saflastirilmasina yönelik olarak bir karaciger hücresi hatti kullanilir. Tercih edilen bir baska düzenlemede, HEV üretimi ve saflastirilmasina yönelik olarak bir böbrek hücresi hatti kullanilir. Bazi düzenlemelerde, karaciger hücre hatti, saglikli veya hastalikli bir karacigerden türetilebilir. Bazi düzenlemelerde, karaciger hücre hatti, malignan veya tehlikesiz bir hücre hatti olabilir.

Bazi düzenlemelerde, böbrek hücre hatti, saglikli veya hastalikli bir karacigerden türetilebilir. Bazi düzenlemelerde, böbrek hücre hatti, malignan veya tehlikesiz bir hücre hatti olabilir. Tercih edilen bir düzenlemede, bir belirlenmis hücre hatti kullanilir. Bazi düzenlemelerde, hücre, HepGZ'dir (ATCC numarasi HB-8065). Bazi düzenlemelerde, hücre, HepG2/C3A'dir (ATCC numarasi CRL-10741).

Bazi düzenlemelerde, bir HEV infektivite analizi kullanilir. Bazi düzenlemelerde, ~8 logig infektivite titrelerine sahip virüs spayklari hazirlanabilir. Analiz, nispeten kisa bir süredir [3-7 günlük analiz). Az veya hiç PCR altyapisi gözlemlenmemistir ve 4 logw üzerinde azalma gösterilebilir. Böylece, bazi düzenlemelerde, bir PCR bazli virüs saptama analizi kullanilir. Bazi düzenlemelerde, bir PCR bazli HEV saptama analizi kullanilir.

Ilave tercih edilen düzenlemeler - 1 Bazi düzenlemelerde, hücre kültüründe çogalan bir kilifsiz veya psödo-kilifli virüsün saflastirilmasinin bir yöntemidir, yöntem asagidaki adimlari içerir: kilifsiz veya psödo- fazla temizlik maddesini içeren bir bilesim ile muamele edilmesinin bir adimi.

Yöntemin bazi düzenlemelerinde, hücre kültüründe çogalan virüs, HAV'dir. Yöntemin bazi düzenlemelerinde, hücre kültüründe çogalan Virüs, PPV'dir. Yöntemin bazi tercih edilen düzenlemelerinde, hücre kültüründe çogalan virüs, HEV'dir. Yöntemin bazi düzenlemelerinde, virüs, bir in vitro kültür ortaminda üretilir. Yöntemin bazi düzenlemelerinde, in vitro hücre kültürü, belirlenmis bir hücre hattini içerir. Yöntemin bazi düzenlemelerinde, belirlenmis hücre hatti, HepG2 (ATCC numarasi HB-8065) ve HepG2/C3A'dan (ATCC numarasi CRL-10741] olusan bir gruptan seçilir. Yöntemin bazi düzenlemelerinde, tedavi adimi, 1 saat boyunca gerçeklestirilir. Yöntemin bazi düzenlemelerinde, numune, temizlenen Virüs-enfekte hücre lizat süspansiyonunun ultra- santrifüjlenmasinden elde edilen bir üst fazdir. Yöntemin bazi düzenlemelerinde istege bagli olarak, numune, temizlenen virüs-enfekte hücre lizat süspansiyoiiunun karsi akim yikamali filtrasyondan türetilen bir retentattir.

Ilave tercih edilen düzenlemeler - 2 Bazi düzenlemelerde, bir numune içindeki kilifsiz veya psödo-kilifli virüsün bir seviyesinin ölçülmesinin bir yöntemidir, yöntem, asagidaki adimlari içerir: a) numunenin, bir hücre ve bir hücre ortami içeren bir karisima saglanmasi; b] inkübe edilmis bir parça elde etmek üzere, numunede mevcut olmasi halinde, kilifsiz veya psödo-kilifli virüsün çogalmasina olanak saglamak üzere inkübe edilmesi; C] muamele edilmis bir parça elde etmek üzere en azindan bir birinci temizlik maddesi ile muamele edilmesi; burada temizlik maddesi, %0.5'te Triton X-100 ve gruptan seçilir. d) toplanmis bir parça elde etmek üzere muamele edilen parçanin bir kisminin toplanmasi; ve e) toplanan parçada kilifsiz veya psödo-kilifli virüsün seviyesinin ölçülmesi.

Yöntemin bazi düzenlemelerinde, numune, bir memeliden elde edilir. Yöntemin bazi düzenlemelerinde, numune, plazma veya kan içerir. Yöntemin bazi düzenlemelerinde, kilifsiz veya psödo-kilifli virüs, HAV'dir. Yöntemin bazi düzenlemelerinde, kilifsiz veya psödo-kilifli virüs, PPV'dir. Yöntemin bazi tercih edilen düzenlemelerinde, kilifsiz veya psödo-kilifli Virüs, HEV'dir. Yöntemin bazi düzenlemelerinde, virüs, bir kültür ortaminda üretilir. Yöntemin bazi düzenlemelerinde, hücre, HepG2 (ATCC numarasi HB-8065] ve HepGZ/C3A'dan (ATCC numarasi CRL-10741] olusan bir gruptan seçilir. Yöntemin bazi düzenlemelerinde, numune, bir membrandan inkübe edilmis parçanin bir kisminin karsi akim yikamali filtrelenmesi araciligiyla elde edilen bir birinci retentati içerir. Yöntemin bazi düzenlemelerinde istege bagli olarak, numune, bir birinci retentati elde etmek üzere bir membrandan inkübe edilmis parçanin bir kisminin karsi akim yikamali filtrelenmesi ve birinci retentatin santrifüjlenmesi araciligiyla elde edilen bir birinci üst fazi istege içerir.

Yöntemin bazi düzenlemelerinde, numune, bir birinci solüsyonu elde etmek üzere en azindan birinci temizlik maddesi veya istege bagli olarak %0.5'te Triton X-100 ve %0.5'te Triton X-100 ile %0.1'de Lityum Dodesil Sülfattan olusan gruptan seçilen temizlik maddelerinin bir karisimi ile muamele edilir. Bazi düzenlemelerde, yöntem ayrica asagidaki adimlari içerir: a) birinci solüsyonun santrifüjlenmesi araciligiyla elde edilen bir birinci pelletin saglanmasi; b] PBS içinde birinci pelletin tekrar süspanse edilmesi araciligiyla elde edilen ikinci bir solüsyonun saglanmasi; c] ikinci solüsyonun temizlenmesi araciligiyla elde edilen üçüncü bir solüsyon saglanmasi; d) bir membran kullanilarak üçüncü solüsyonun filtrelenmesi araciligiyla elde edilen bir birinci filtratin saglanmasi; ve e) birinci filtratin ultrafiltrelenmesi araciligiyla elde edilen ikinci bir retentatin saglanmasi, burada ikinci retentat, muamele edilen parçayi içerir.

Yöntemin bazi düzenlemelerinde, kilifsiz veya psödo-kilifli virüsün seviyesinin ölçülmesi, bir biyolojik maddenin saptanmasini içerir. Yöntemin bazi düzenlemelerinde, biyolojik madde, bir virüsün bir polinükleotit dizisi ve/veya bir polipeptit dizisini içerir. Yöntemin bazi düzenlemelerinde, biyolojik madde, bir HEV ribonükleik asittir. Yöntemin bazi düzenlemelerinde biyolojik maddenin ölçülmesi, asagidaki adimlari içerir: a) muamele edilen parçanin bir kisminin bir liziz solüsyonu ile karistirilmasi araciligiyla elde edilen viral ribonükleik asit içeren bir birinci reaksiyon karisiminin saglanmasi; b] birinci reaksiyon karisimina bir birinci reaktifin eklenmesi araciligiyla elde edilen ikinci bir reaksiyon karisiminin saglanmasi, burada ikinci reaksiyon karisimi, viral RNA'yi tamamlayan bir deoksiribonükleik asit içerir; c] reaksiyon karisimina, deoksiribonükleik asit içindeki bir diziyi tamamlayan ikinci bir reaktifin eklenmesi; d) reaksiyon karisimina, deoksiribonükleik asit içindeki bir diziyi tamamlayan üçüncü bir reaktifin eklenmesi; e) deoksiribonükleik asit içindeki ikinci ve üçüncü reaktifler ile çevrelenen dizinin genisletilmesi; ve I] genisletilen dizinin bir konsantrasyonunun ölçülmesi.

Yöntemin bazi düzenlemelerinde, ikinci reaktif ve üçüncü reaktif, asagidakilerden olusan gruptan seçilen bir oligonükleotid dizisini içerir: a) 5'-CGGCTATCGGCCAGAAGTT-3` [SEQ ID NO: 1); b] 5'-CCGTGGCTATAACTGTGGTCT-3' (SEQ lD NO: 2) ve C] 5`-FAM-TTTTTACGC-ZEN-AGGCTGCCAAGGCC-3lABkFQ-3` (SEQ [D NO: 3).

Ilave tercih edilen düzenlemeler - 3 Bazi düzenlemelerde, virüsün temizlenmesi için dondurulmus bir ham virüs stogu kullanilir. Bazi düzenlemelerde, konsantre edilmis ve saflastirilmis kilifsiz virüs stogu hazirlanirken, %05 Triton X-100 ve %0.1 LDS, erimis ham Virüs stoguna eklenmistir ve 1 saat 37°C'de inkübe edilmistir.

Bazi düzenlemelerde, eritilmis ham Virüs stogunun temizlenmesi, 2°C ila 8°C'de 15 ila 30 dakika 3000 ila 8000 x g'de bir hizda santrifüjleme ile gerçeklestirilir. Bazi düzenlemelerde, üst faz uzaklastirilir ve sürdürülür ve pellet çikarilir. Bazi düzenlemelerde, üst faz, 300k Da'lik bir membrandan karsi akim yikamali filtrasyondan önce 0.45 um'lik bir filtre araciligiyla filtrelenir ve bir TFF retentati toplanir.

Bazi düzenlemelerde, ultrasantrifüjlemeye yönelik olarak, TFF retentati, yaklasik olarak 85000 x g'de 1.5 saat boyunca 2°C ila 8°C'de bir salincak kovali rotordaki ultrasantrifüj tüpleri içinde ultrasantrifüjlenir. Bazi düzenlemelerde, ultrasantrifüjlemeden üst faz bosaltilir ve sivi atik olarak atilir.

Bazi düzenlemelerde, ultrafiltrasyona yönelik olarak, ultrasantrifüjleme pelleti, PBS gibi 5 mL'den az olmayan tamponda tekrar süspanse edilir. Bazi düzenlemelerde, pellet düzenlemelerde, üst faz uzaklastirilir ve konsantre etmek üzere bir Amic0n® UF filtre cihazina yerlestirilir. Bazi düzenlemelerde, gerekli olmasi halinde, PBS gibi tampon, yaklasik olarak 15 mL'ye kadar [filtre kapasitesi 15 mL'dir] nihai hacme getirmek üzere eklenir.

Bazi düzenlemelerde, filtre cihazi, tutulan numune (konsantre edilmis ve safiastirilmis virüs stogu] nihai hacmi 1 mL'den fazla olmayana kadar 2°C ila 8°C'de yaklasik olarak 5000 x g'de santrifüjlenir. Bazi düzenlemelerde, ortalama santrifüj süresi, yaklasik 15 ila yaklasik 60 dakikadir.

Bazi düzenlemelerde, konsantre edilmis ve saflastirilmis virüs stogu bölünür ve en fazla - 65°C'de dondurulur. ÖRNEKLER Örnek 1. TFF-HEV snavklarinin hazirlanmasi Teget akim yikamali filtrasyon (TFF), biyomoleküllerin ayrilmasi ve konsantrasyonuna yönelik olarak iyi bilinen bir prosedürdür. TFF ile ilgili ek bilgi, örnegin Larry Schwartz V.d.'ye ait "Introduction to Tangential Flow Filtration for Laboratory and Process Development Applications” içinde kolayca temin edilebilir HEV-enfekte HepGZ veya HepGZ/C3A hücreleri dondurulmustur ve iki defa eritilmistir ve düsük hizda santrifüjleme ve 0.45 um'lik bir filtreden geçis ile temizlenmistir. Temizlenen solüsyon (~1 L), 300 kDa'lik iki membran araciligiyla TFF'nin on kati konsantre edilmistir ve ortaya çikan TFF retentati (~, virüsü pelletlemek üzere 4°C'de 90 dakika yaklasik olarak 85,000xg'de çekilmistir. Ultrasantrifüj üst fazi [~ toplanmistir ve pellet, PBS içinde tekrar süspanse edilirken TFF-Supe HEV'ye [Örnek 2] islenmesi için korunmustur. Tekrar süspanse edilen pellet, daha sonra 0.2 mm gözenekli bir filtreden filtrelenmistir ve yaklasik olarak 2 mL'lik nihai hacme 100 kDa'lik bir membrandan ultrafiltrelenmistir. Solüsyon, 0.2 um veya 0.1 um'lik bir filtre araciligiyla sterilize edilmistir ve bir TFF-HEV spayk preparasyonu olarak kullanima hazir olana kadar 5°C'de saklanmistir.

Ornek 2. TFF-Üst Faz HEV (TFF-Supe HEyi Spayklarinin Preparasyonu Hücre kültüründen türetilen HEV ile baglantili lipidler, virüs canliligini artirir ve böylece ultrasantrifüjleme araciligiyla virüs pelletlemenin etkililigini azaltir. Böylece, mevcut bulusun bazi düzenlemelerinde, Triton X- içeren bir temizlik maddesi karisimi, baglantili lipidleri uzaklastirmak üzere ve virüs geri kazanimlarini artirmak üzere HEV içeren sivilara eklenir.

TFF'den ve Örnek 1'deki temizlenen HEV-enfekte hücre lizatlarinin [~1 L) ultrasantrifüjlenmesinden kaynaklanan yaklasik olarak 100 mL ultrasantrifüj üst fazi, Ortaya çikan pellet, PBS'de tekrar süspanse edilmistir, 0.2 mm gözenekli bir filtre araciligiyla filtrelenmistir ve yaklasik olarak 1 mL'lik bir nihai hacme 100 kDa'lik bir membrandan ultrafiltrelenmistir. Solüsyon, daha sonra 0.2 um veya 0.1 um'lik bir filtreden geçirilmistir ve bir TFF-Supe HEV spayk preparasyonu olarak kullanima hazir olana kadar °C'de saklanmistir. Örnek 3. Örnekler 1 ve Z'nin vöntemlerine göre olusturulan viral snavklarin saHigmin karsilastirilmasi.

SDS-PAGE, Örnekler 1 ve 2'nin yöntemlerine göre olusturulan virüs spayklarinin göreceli safligini karsilastirmak üzere kullanilmistir. Sekil 2'de gösterildigi üzere asagidaki numunelerin alikuotlari, A280 ve kantitatif PCR için çikarilmistir: Bastaki Ham HEV, TFF Retentati, Ultrasantrifüj Üst Fazi, TFF-HEV ve TFF-Supe HEV. TFF Retentati ve Ultrasantrifüj Üst Fazi, A280 ile ölçüldügü üzere, Bastaki Ham HEV ve TFF-HEV'den 10 kat daha fazla ve TFF-Supe HEV'den 40 kat daha fazla proteine sahiptir [Sekil 2). Protein konsantrasyonlarinin farkli olmasina ragmen, Bastaki Ham Madde disinda tüm numunelerdeki HEV RNA'nin konsantrasyonlari, yaklasik olarak 9 logio kopya/mL'dir üzere, TFF-Supe HEV ve TFF-HEV'de, Ultrasantrifüj Üst Fazi ve TFF Retentatindan çok daha yüksektir.

Numunelerin göreceli safligi, SDS-PAGE ile görsellestirilebilir (Sekil 2). Numuneler, DTT içeren numune tamponda isitilmadan ve %4-20 gradyan jeller üzerine yüklenmeden önce yaklasik olarak 4 AU'ya seyreltilmis ve konsantre edilmistir. Hücre kültür ortami ayrica bir altyapi kontrolü olarak yüklenmistir. SDS-PAGE'den sonra, jeller uzaklastirilmistir ve yüksek safsizlik seviyelerinin gösterilmesinde A280 ve PCR ile uyumludur. En verimli protein, yaklasik olarak 70 kDa'da bantlanmistir. Hücre kültür ortaminda ayrica mevcut olmasi nedeniyle, büyük olasilikla fetal bovin serumunda bulunan bir protein, hücre ve virüs çogalmasi için gerekli bir ortam takviyesi ve asagi akis yönünde klerens çalismalarina müdahale edebilecek viral olmayan bir kirletici maddedir. Kirletici maddenin çogu, Örnek 1 ve 2'de tarif edilen saflastirma yöntemi sirasinda çikarilmistir ve relatif konsantrasyonlari, TFF Supe HEV'de, ardindan TFF HEV'de düsüktür.

Ornek 4. Örnekler 1 ve 2'nin yöntemlerine göre olusturulan viral spayklarin termal stabilitesinin karsilastirilmasi.

Deneyler, Örnekler 1 veya Z'ye göre hazirlanmis TFF-HEV ve TFF-Supe HEV spayklarinin termal stabilitesini karsilastirmak üzere yürütülmüstür. Her iki Virüs preparasyonu, PBS içine sokulmustur ve 5°C, 60°C, 70°C veya 80°C'de 4 saat inkübe edilmistir. Alikuotlar, her bir test solüsyonundan çikarilmistir ve asagidaki gibi titre edilmistir. Bir numunenin seri seyreltileri yapilmistir ve HepGZ veya HepGZ/C3A hücreleri ile tohumlanan gözlere eklenmistir. Virüsün, 37°C'de 1 saatten az olmayacak sekilde adsorbe edilmesine olanak saglanmistir ve Büyüme Ortami eklenmistir. Plakalar, ortamin gözlerden emilmesinden ve tampon (örnegin PBS] ile 2X'den daha az hücrelerin yikanmasindan/emilmesinden önce 2 günden daha az olmayacak sekilde 37°C'de inkübe edilmistir. Plakalar, daha sonra Dynabeads® mRNA DIRECTTM Micro Kit [Life Technologies] kullanilarak viral RNA'ya yönelik olarak özütlenmistir veya özütlemeye hazir olana kadar en fazla -65°C'de depolanmistir. Özütlendikten sonra eluatlar [poli A RNA), PCR amplifikasyonuna yönelik olarak hemen islenmistir veya PCR amplifikasyonuna yönelik hazir olana kadar en fazla - 65°C'de saklanmistir.

Bir adimli RT-PCR, önceden açiklandigi üzere asagidaki primerler ve problar kullanilarak numuneler Içinde HEV RNA'yi saptamak üzere kullanilmistir. Her bir reaksiyona yönelik analiz kosullari asagidaki gibi olmustur: a) Reaktifler; 5.0 ul 4x TaqMan® Fast Virus 1-Step Master Mix [Life Technologies), Technologies), saniye, 45 saniye için 56°C PCR ve döngü esik (Ct) deger belirlemeleri, bir AB 7500 Gerçek Zamanli PCR Sistem kullanilarak gerçeklestirilmistir. Geçmis verilere dayanarak, esik manuel olarak 0.1'e ayarlanmistir, böylece tüm standart egrilerin üssel fazindan geçmistir ve reaksiyon basina 1 RNA kopyasinin tespit edilmesi saglanmistir. HEV RNA varligini gösteren pozitif bir PCR sinyali, esigin geçildigi herhangi bir zamanda kaydedilmistir.

HEV titrasyon plakasindaki tüm gözler, pozitif bir PCR sinyalinin varligi veya yokluguna bagli olarak pozitif veya negatif skorlanmistir. Virüs titreler, daha sonra uygun istatiksel yöntem kullanilarak TCIDso/mL olarak hesaplanmistir. Spearman-Kârber, MPN veya Tablo 1. PBS'deki virüs spayklarinin termal stabilitesi karsilastirilarak deneylerden elde edilen sonuçlar Logio HEV Titresi Logio Azalma Degeri Virüs Spayki * Log Azalma Degeri [LRV), 5°C'de logio HEV titresinden 60°C, 70°C veya 80°C'de logioHEV titresinin çikarilmasi ile hesaplanmistir NT Test Edilmemis NA Uygulanabilir Degil Tablo 1'de gösterildigi üzere, Virüs inaktivasyonu, mevcut bulusun yönteminin bir düzenlemesine göre viral çiviler hazirlandiginda 60°C, 70°C ve 80°C'de tespit sinirina kadar olmustur (Örnek 2). Diger taraftan, Örnek 1'e göre elde edilen spayklar [en geliskin teknoloji yöntemi, temizlik maddesi islemi yok] kullanildiginda, virüs 70°C veya 80°C'de 4 saat isitildiktan sonra hala mevcuttur.

Yayinlanan raporlardan elde edilen veriler, Örnek 1'e göre üretilen virüs spayklarinin termal stabilitesinin, dogada bulunan HEV'in davranisindan farkli oldugunu ileri sürer. Örnegin, insan enterik virüsleri bilinen en fazla isiya dirençli virüslerden bazilaridir ve sokulan, hepatit A virüsü, poliovirüs ve kedi kalisivirüsünün %90'inin inaktivasyonunu saat, insan HEV'si ile yakindan iliskili olan yaban domuzu HEV'si içeren bir karaciger süspansiyonunun 60°C isitilmasi, 4.42 logio virüs azalmasi ile sonuçlanmistir (Schielke A, HEV'nin klinik izolatlarinin azalmasini dogru bir sekilde degerlendirmeyebilir.

Diger taraftan mevcut bulusun yöntemine göre üretilen virüs spayklari [Örnek 2), dogada bulunan HEV'de görülene benzer sekilde, isil islem araciligiyla tamamen etkisiz hale getirilmistir. Bu nedenle, mevcut bulusun yöntemine göre hazirlanan virüs, virüs klerens çalismalarinda kullanilmak üzere daha uygun bir spayk olabilir. Böylece, bazi düzenlemelerde, bir virüs spayki, Örnek 2'nin yöntemine göre hazirlanir.

Ornek 5. HEV hazirlama yöntemlerinin uygulanmasi ve kiri isi deneylerinde analiz Prensip olarak, TFF-HEV ve TFF-Supe HEV spayklari, Örnekler 1 ve 2'de açiklandigi gibi hazirlanmistir ve Faktör VIII konsantresi üretim prosesinin dondurarak kurutma/kuru isitma [FD/DH) sirasinda virüs azalmasini ve/veya klerensini degerlendirmek üzere deneylerde test edilmistir. FD/DH adimi, üretim prosesinin son adimidir ve solvent/temizlik maddesi (S/D] isleminin asagi akis yönündedir.

FD/DH deneyleri için, TFF-HEV veya TFF-Supe HEV preparasyonu ile sokulan Faktör Vlll konsantresi, siselere bölünmüstür ve üretim ölçegindeki ile ayni dondurarak kurutma döngüsü kullanilarak bir laboratuvar ölçekli dondurarak kurutucuda dondurularak kurutulmustur. Dondurularak kurutulan siseler, daha sonra 80°C'lik bir firina yerlestirilmistir ve 75 saate kadar kuru isitilmistir.

Titrasyona yönelik olarak virüs katilan ürünün siseleri, (Baslangiçta) ve dondurularak kurutulmasindan önce ve sonra ve herhangi bir kuru isitma (FD/DH 0 HR] olmadan, dondurarak kurutulduktan sonra, akabinde 24 saat kuru isitma [FD/DH 24 saat] ile ve dondurarak kurutulduktan sonra, akabinde 75 saat kuru isitma (FD/DH 75 saat] ile uzaklastirilmistir. Virüs katilan FD/HD ürünü, yüksek saflikta su ile orijinal hacmine yeniden düzenlenmistir, seri bir sekilde seyreltilmistir ve 96 gözlü plakada tohumlandirilan HepGZ veya HepGZ/C3A hücrelerine asilanmistir. Virüs absorbe edilmistir, nihai kaplama ortami eklenmistir ve plakalar, en az 3 gün 37°C inkübatör içine yerlestirilmistir. Titrasyon plakalari, daha sonra uzaklastirilmistir, aspirasyon islemi gerçeklestirilmistir ve viral RNA için özütlenmistir veya ekstraksiyona yönelik olarak hazir olana kadar -80°C'de saklanmistir. Her bir gözden özütlenen RNA, Örnek 3'te açiklandigi üzere PCR araciligiyla HEV'ye yönelik olarak analiz edilmistir. Titrasyon gözleri, HEV için pozitif veya negatif skorlanmistir ve virüs titreleri belirlenmistir. Adim boyunca LogioHEV azalmasi, baslangiç ve bitis (FD/DH 75 saat) siselerinde logm virüs titrelerinin karsilastirilmasi araciligiyla hesaplanmistir.

Tablo 2. Kuru isil islem araciligiyla TFF-HEV ile TFF-Supe HEV azalmasi karsilastirilarak deneylerden elde edilen sonuçlar Logio HEV Titresi Virüs Spayki LRV Baslangiç FD/DH Oh FD/DH 24h FD/DH 75h * Log Azalma Degeri (LRV), Baslangiç logio HEV titresinden 75 saatlik FD/DH islemi logio HEV titresinin çikarilmasi Ile hesaplanmistir.

Tablo 2'de gösterildigi üzere, her iki spayk preparasyonunun titreleri, dondurarak kurutulmanin öncesi ve sonrasinda benzerdir ve dondurarak kurutma araciligiyla azalma belirgin [1 logio'dan az) degildir. Tersine, 80°C kuru isil islem araciligiyla virüs inaktivasyonu belirgin [1 logio'dan fazla] ve TFF-Supe HEV (LRV = 4.6] için TFF HEV'den seviyelerde kirletici madde bulunmasi, virüsü isi ile etkisizlestirmeden koruyabilir veya kapsüllenmis HEV RNA'nin etkin bir sekilde tahrip edilmesine neden olabilir.

FD/DH isleminin son adimina yönelik baslangiç materyalinin, sondan bir önceki adimda muamele edilen S/D olmasi nedeniyle, Faktör lll konsantresi üretim prosesinde mevcut olabilen herhangi bir potansiyel virüs kirletici maddesi, tahrip edilecektir ve muhtemelen hazirlanan) TFF-HEV'den daha fazla benzerdir. Böylece TFF-Supe HEV için LRV, muhtemelen FD/DH islem adiminin HEV azaltma kapasitesinin daha dogru bir degerlendirmesidir.

Ornek 6. Temizlik maddesi ile muamele edilen TFF HEV spayklarinin hazirlanmasi.

TFF-Supe HEV hazirlanmasina yönelik proses, nispeten zaman alicidir. Bu nedenle, temizlik maddesi islemine yönelik ilave yöntemler, TFF HEV spayk preparasyonu için gelistirilmistir. Sekil 3'te gösterildigi üzere, TFF-HEV'nin hazirlanmasina yönelik ayni proses, mevcut bulusun bazi düzenlemelerine göre çesitli temizlik maddeleri ile TFF Retentatini muamele etmek üzere adimlarin, 85,000xg, 1.5 saat, 5°C'de ultrasantrifüjlenmesinden önce dahil edilmesi disinda Örnek 1'deki gibi takip edilmistir.

Triton TFF-HEV preparasyonlari, 1.5 saat 37°C'de %05 Triton X-100 ile inkübe edilirken, kullanilmistir. Ultrasantrifüjlemeden sonra, sadece pelletler, virüs spayklari haline getirilmistir. TFF-HEV ve temizlik maddesi ile muamele edilmis TFF-HEV'yi hazirlama yöntemleri, ara ürün fraksiyonlari saflastirma islemlerinden çikartilarak ve daha önce Örnek 3'te açiklandigi gibi virüs titrasyonu yapilarak karsilastirilmistir. Sonuçlar Tablo 3'te gösterilir.

Tablo 3. TFF-HEV ve temizlik maddesi ile muamele edilen TFF HEV'yi hazirlamak üzere yöntemlerin karsilastirmasi Logio Toplam HEV Virüs SpaYkI TFF Ultrasantrifüj Üst Nihai TFF-HEV Baslangiç Retentati Fazi Prep Triton/LDS TFF- 8.9 8.1 8.3 Virüs geri kazanimlari, TFF-HEV ve Triton/LDS TFF-HEV islemleri için ve yaklasik olarak 8.3 logio HEV içeren nihai spayk preparasyonlari ile karsilastirilabilir. Triton TFF-HEV islemi, giris virüsünün çogunun Ultrasantrifüj Üst Fazi fraksiyonunda kaybedilmesi nedeniyle pelletleme virüsünde daha az etkili olmustur ve 7 logio HEV'den daha az spayk vermistir. Örnek 7. HEV hazirlama yöntemlerinin uygulanmasi ve sivi isi deneylerinde analiz.

Pastörizasyon, albümin üretim prosesindeki son adimdir ve 60°C'de 10 saatten daha az olmayan bir süre boyunca yüksek derecede saflastirilmis ürünün siselerinin isitilmasini içerir. Virüs, Örnek 6'da açiklandigi gibi hazirlanmistir ve 7 saat 5°C ila 60°C'de inkübasyondan önce %25 albümine katilmistir. Numuneler, daha sonra virüs titrasyonu için çikarilmistir ve sonuçlar, Tablo 4'te gösterilir. Bir karsilastirici olarak, [Örnek 2'nin yöntemine göre hazirlanan] TFF-Supe HEV ile katilan %25 albümin pastörizasyonundan Tablo 4. Sivi isitma araciligiyla TFF-HEV ve temizlik maddesi ile muamele edilen TFF-HEV azalmasi karsilastirilarak deneylerden elde edilen sonuçlar Logiu HEV Titresi Virüs Spayki Örnek Numarasi 7 saat 10 saat LRV °C 60°C 5°C 60°C TFF-HEV, isiya en dirençli test virüsü olmustur ve isil islemden sonra titrede sadece 2.3 logio azalma göstermistir. Triton TFF-HEV için LRV, baslangiç titresi TFF-HEV'den yaklasik olarak 1 logio düsük olmasina ragmen, yaklasik olarak 1 logm daha yüksektir. Triton/LDS ile muamele edilmis TFF-HEV için LRV, üç TFF-HEV preparasyonu içinde en yüksek seviyededir ve Triton/LDS ile ayrica muamele edilmis bir virüs preparasyonu olan TFF Supe HEV katilmis albüminin pastörizasyonundan sonra elde edilen azalmadan hafif oranda daha düsüktür. Örnek 8. Virüsün TFF. ultrasantrifüileme ve ultrafiltrasvon araciligivla konsantrasyonu ve saflastirilmasi.

Virüsün temizlenmesine yönelik olarak, dondurulmus ham virüs stogu eritilmistir.

Konsantre edilmis ve saflastirilmis kilifsiz virüs stogu hazirlanirken, %05 Triton X-100 ve gerçeklestirilmistir. Üst faz uzaklastirilmis ve sürdürülmüstür ve pellet çikarilmistir. Üst faz, 0.45 um'lik bir filtreden filtrelenmistir.

TFF için, TFF sistemi temizlenmistir ve filtrasyon için hazirlanmistir. Filtrelenen virüs stogu temizlenmistir.

Ultrasantrifüjlemeye yönelik olarak, TFF retentati, ultrasantrifüj tüplerine yerlestirilmistir. Tüpler, agirliklar birbirinden ± 0.05 g olana kadar dengelenir. Tüpler sallanan bir kova rotoruna yüklenir ve yaklasik 85000 x g*de 1.5 saat boyunca 2°C ila 8°C'de santrifüjlenir. Ultrasantrifüj isleminin sonunda, santrifüj tüplerinin her birinden üst faz dikkatlice dökülmüs ve sivi atik olarak atilmistir. Tüpler ters çevrilmis ve yaklasik olarak 5 dakika oda sicakliginda emici bir havlu üzerinde akmasi saglanmistir. Bosaldiktan sonra havlu, kirletici maddelerden arindirilmis ve atilmistir.

Ultrafiltrasyona yönelik olarak, ultrasantrifüjleme pelleti, en az 5mL PBS'de tekrar g'de temizlenmistir. Üst faz uzaklastirilmis ve konsantre etmek üzere bir Amic0n® UF filtre cihazina yerlestirilmistir. Gerekli olmasi halinde, PBS, yaklasik olarak 15 mL'ye kadar santrifüj rotoruna yerlestirilmistir ve rotor, bir karsi agirlik ile dengelenmistir.

Santrifüjleme, tutulan numune (konsantre edilmis ve saflastirilmis virüs stogu) nihai hacmi 1 mL'den fazla olmayana kadar (yaklasik santrifüj süresi 15 ila 60 dakika) 2°C ila 8°C'de yaklasik olarak 5000 x g'de gerçeklestirilmistir.

TANIMLAR HepGZ: Amerikan Tipi Koleksiyondan [ATCC numarasi HB-8065] elde edilen hepatoselüler karsinom hücreleri DMEM: Dulbecco Modifiye Eagle Ortami FBS: Fetal Bovin Serumu Titre: Solüsyon içinde bir maddenin (virüs) konsantrasyonu ve titrasyon ile belirlenen bu tür bir maddenin kuvveti SK: Spearman-Karber, virüsün oldukça yüksek konsantrasyonu ile numuneler içinde virüs titresini hesaplamak üzere istatiksel bir yöntemdir. Bu yöntem, pozitif gözlerin orani, herhangi bir seyreltide >%25 oldugunda kullanilir [Sekil 1).

MPN: En Çok Olasi Sayi, virüsün oldukça düsük konsantrasyonu ile numuneler içinde virüs titresini hesaplamak üzere istatiksel bir yöntemdir. MPN, pozitif gözlerin orani, herhangi bir seyreltide >%25 oldugunda kullanilir.

Poisson: Poisson, virüsün son derece düsük konsantrasyonu ile numuneler içinde Virüs titresini hesaplamak üzere istatiksel bir yöntemdir. Bu yöntem, hiçbir pozitif gözün gözlemlenmemesi durumunda kullanilir.

Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu HEV TFF Retentat: Temizlenen HEV-hücre lizati, bir 300 kD TFF membran kullanilarak konsantre edildikten sonra geriye kalan materyaldir. HEV TFF Retentat, TFF HEV spayklarini hazirlamak üzere kullanilir.

HEV TFF: Üst faz, yaklasik olarak 84780 xg'de HEV TFF Retentati santrifüjlendikten sonra geriye kalan atik maddedir. HEV TFF Üst fazi, TFF Supe HEV spayklarini hazirlamak üzere kullanilir.

TClDsu: %50 Doku Kültür Infektif Doza Karsilik Gelir [Endpoint seyreltme analizi). Enfekte konakçilarin %50'sini öldürmek üzere veya inoküle doku kültür hücrelerinin %50'sinde sitopatik etki üretmek üzere gereken virüsün miktarini ölçen bulasici virüs titresinin bir ölçümüdür.

A230: Protein konsantrasyonu ve/veya miktarinin göstergesi olan 280 nm'de ölçülen absorbans.

AU: Absorbans Birimleri.

Virüs spayki: bilinen viral içerige sahip virüs numunesi.

Claims (1)

1. ISTEMLER Hücre kültüründe çogalan kilifsiz veya psödo-kilifli bir virüsün saflastirilmasi için bir yöntem olup, özelligi söz konusu yöntemin, kilifsiz veya psödo-kilifli bir virüsü ihtiva eden numunenin bir temizlik maddesi ile muamele edilmesi adimini ihtiva etmesidir, burada temizlik maddesi %0.5'lik Triton X-100 ve %0.5'lik Triton X-IOO ve %0.1'lik Lityum Dodesil Sülfatin bir karisimindan olusan gruptan seçilir. lstem 1'e göre yöntem olup, özelligi hücre kültüründe çogalan virüsün, Hepatit E Virüsü [HEV] olmasidir. Istem 1'e göre yöntem olup, özelligi hücre kültüründe çogalan virüsün, Hepatit A Virüsü (HAV) veya Domuz Parvovirüsü (PPV) olmasidir. lstem 1'e göre yöntem olup, özelligi virüsün, in vitro bir hücre kültüründe üretilmesidir. lstem 4'e göre yöntem olup, özelligi in vitro hücre kültürünün, belirlenmis bir hücre hattini içermesidir. lstem 5'e göre yöntem olup, Özelligi belirlenmis hücre hattinin, HepGZ (ATCC numarasi HB- olusan bir gruptan seçilmesidir. istem l'e göre yöntem olup, özelligi muamele adiminin, 1 saat boyunca gerçeklestirilmesidir. lstem 1'e göre yöntem olup, özelligi numunenin, temizlenen virüs-enfekte hücre lizat süspansiyonunun ultra-santrifüjlenmasinden elde edilen bir üst faz olmasidir. lstem 1'e göre yöntem olup, özelligi numunenin, temizlenen virüs-enfekte hücre lizat süspansiyonunun karsi akim yikamali filtrasyondan türetilen bir retentat olmasidir. Numunenin, bir memeliden olan plazma veya kan içerdigi bir numune içinde kilifsiz veya psödo-kilifli bir virüsün bir seviyesinin ölçülmesi için bir yöntem olup, özelligi yöntemin, asagidaki adimlari ihtiva etmesidir: a] numunenin, bir hücre hatti ve bir hücre ortami ihtiva eden bir karisima saglanmasi; b] inkübe edilmis bir parça elde etmek üzere, numunede mevcut olmasi halinde, kilifsiz veya psödo-kilifli virüsün çogalmasina olanak saglamak üzere inkübasyon yapilmasi; c] muamele edilmis bir parça elde etmek üzere en az bir temizlik maddesi ile muamele yapilmasi; burada temizlik maddesi, %0.5'lik Triton X-100 ve olusan gruptan seçilir, d) toplanmis bir parça elde etmek üzere muamele edilen parçanin bir kisminin toplanmasi; ve e] toplanan parçada kilifsiz veya psödo-kilifli virüsün seviyesinin ölçülmesi. Istem 10'a göre yöntem olup, özelligi kilifsiz veya psödo-kilifli virüsün, HEV olmasidir. lstem 10'a göre yöntem olup, özelligi kilifsiz veya psödo-kilifli virüsün, HAV veya PPV olmasidir. lstem 10'a göre yöntem olup, özelligi in vitro hücre kültüründe çogalan virüsün, belirlenmis bir hücre hattini ihtiva etmesidir. Istem 10'a göre yöntem olup, özelligi hücre hattinin, HepGZ (ATCC numarasi HB- olusan bir gruptan seçilmesidir. lstem 10'a göre yöntem olup, özelligi numunenin, bir membran vasitasiyla inkübe edilmis parçanin bir kisminin karsi akim yikamali filtrelenmesi araciligiyla elde edilen bir birinci retentati ihtiva etmesidir. lstem 10'a göre yöntem olup, Özelligi numunenin, bir birinci retentati elde etmek üzere bir membran vasitasiyla inkübe edilmis parçanin bir kisminin karsi akim yikamali filtrelenmesi ve birinci retentatin santrifüjlenmesi araciligiyla elde edilen bir birinci üst fazi ihtiva etmesidir. Istem 10'a göre yöntem olup, özelligi numunenin, bir birinci solüsyonu elde etmek üzere en az bir temizlik maddesi veya temizlik maddelerinin bir karisimi ile muamele edilmesidir. Istem 17'ye göre yöntem olup, özelligi ayrica asagidaki adimlari ihtiva etmesidir: a] birinci solüsyonun santrifüjlenmesi araciligiyla elde edilen bir birinci pelletin saglanmasi; b] PBS içinde birinci pelletin tekrar süspanse edilmesi araciligiyla elde edilen ikinci bir solüsyonun saglanmasi; c] ikinci solüsyonun temizlenmesi araciligiyla elde edilen üçüncü bir solüsyon saglanmasi; d) bir membran kullanilarak üçüncü solüsyonun filtrelenmesi araciligiyla elde edilen bir birinci filtratin saglanmasi; ve e] birinci filtratin ultrafiltrelenmesi araciligiyla elde edilen ikinci bir retentatin saglanmasi, burada ikinci retentat, muamele edilen parçayi ihtiva eder. Istem 10'a göre yöntem olup, özelligi kilifsiz veya psödo-kilifli virüsün seviyesinin ölçülmesinin, bir biyolojik maddenin saptanmasini ihtiva etmesidir. Istem 19'a göre yöntem olup, özelligi biyolojik maddenin, virüsün bir polinükleotit dizisi ve/veya bir polipeptit dizisini ihtiva etmesidir. Istem 20'ye göre yöntem olup, özelligi biyolojik maddenin bir HEV ribonükleik asit olmasidir. lstem 21'e göre yöntem olup, özelligi biyolojik maddenin ölçülmesinin, asagidaki adimlari ihtiva etmesidir: a] muamele edilen parçanin bir kisminin bir liziz solüsyonu ile karistirilmasi araciligiyla elde edilen HEV ribonükleik asit ihtiva eden bir birinci reaksiyon karisiminin saglanmasi; b] birinci reaksiyon karisimina bir birinci reaktifin eklenmesi araciligiyla elde edilen ikinci bir reaksiyon karisiminin saglanmasi, burada ikinci reaksiyon karisimi, HEV ribonükleik asidini tamamlayan bir deoksiribonükleik asit ihtiva C] ikinci reaksiyon karisimina, deoksiribonükleik asit içindeki bir diziyi en azindan kismen tamamlayan ikinci bir reaktifin eklenmesi; 5 d) ikinci reaksiyon karisimina, deoksiribonükleik asit içindeki bir diziyi en azindan kismen tamamlayan üçüncü bir reaktifin eklenmesi; e] deoksiribonükleik asit içindeki ikinci ve üçüncü reaktifler ile çevrelenen dizinin genisletilmesi; ve f] genisletilen dizinin bir konsantrasyonunun ölçülmesi.23. istem 22'ye göre yöntem olup, özelligi ikinci reaktif ve üçüncü reaktifin, asagidakilerden olusan gruptan seçilen bir oligonükleotid dizisini ihtiva etmesidir: a) 5'-CGGCTATCGGCCAGAAGTT-3' [SEQ ID NO: 1); b) 5'-CCGTGGCTATAACTGTGGTCT-3' (SEQ [D NO: 2) ve 15 c] 5'-FAM-TTTTTACGC-ZEN-AGGCTGCCAAGGCC-SlABkFQ-3` [SEQ ID NO: 3).