BR102020016668A2 - Processo de produção de um antígeno, correspondente aos vírus sars-cov-2 inativado e seus usos - Google Patents

Abstract

A presente invenção se refere a técnicas e processos para a produção, purificação, inativação e análise de SARS-CoV-2. A presente invenção se refere ao processo de produção de um antígeno, correspondente aos vírus SARS-COV-2 inativado por irradiação gama. O processo de produção de um antígeno, correspondente aos vírus SARS-COV-2 inativado por irradiação gama é para ser utilizado na produção de uma nova vacina, antígeno para a produção de plasma hiperimune em cavalos para soroterapia, e, em diferentes espécies animais para produção de anticorpos/insumos à pesquisa e estabelecimento de técnicas de sorodiagnóstico.

Description

PROCESSO DE PRODUÇÃO DE UM ANTÍGENO, CORRESPONDENTE AOS VÍRUS SARS-COV-2 INATIVADO E SEUS USOS CAMPO DA INVENÇÃO:

[001] A presente invenção se refere a técnicas e processos para a produção, purificação, inativação e análise de SARS-CoV-2. A presente invenção se refere ao processo de produção de um antígeno, correspondente aos vírus SARS-COV-2 inativado por irradiação gama. O processo de produção de um antígeno, correspondente aos vírus SARS-COV-2 inativado por irradiação gama é para ser utilizado na produção de uma nova vacina, antígeno para a produção de plasma hiperimune em cavalos para soroterapia, e, em diferentes espécies animais para produção de anticorpos/insumos à pesquisa e estabelecimento de técnicas de sorodiagnóstico.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO SARS-CoV-2

[002] O SARS-CoV-2 pertence a uma grande família de vírus denominada coronavírus. É um vírus RNA de cadeia simples positiva (+ssRNA). Os coronavírus têm a capacidade de causar várias doenças em seres humanos, desde a simples constipação até doenças mais graves como a síndrome respiratória do Médio Oriente (MERS). O SARS-CoV-2 é o sétimo coronavírus conhecido a poder infetar seres humanos, sendo os restantes o 229E, NL63, OC43, HKU1, MERS-CoV e o SARS-CoV original.

[003] Tal como a cepa que causou o surto de SARS em 2003, o SARS-CoV-2 é um membro do sub-gênero Sarbecovirus (betacoronavírus linhagem B) . A sua sequência de RNA tem o comprimento de aproximadamente 3 0 000 nucleobases. No entanto, o SARS-CoV-2 é o único dos coronavírus a incorporar um local de clivagem polibásico, uma característica que se sabe aumentar a patogenicidade e ritmo reprodutivo de outros vírus.

[004] A partir de um número suficiente de genomas sequenciados, é possível reconstruir a árvore filogenética do historial de mutações de uma família de vírus. Em 12 de janeiro de 2020 foram isolados em Wuhan cinco genomas de SARS-CoV-2. Em 30 de janeiro de 2020 eram conhecidos 42 genomas. Uma análise filogenética dessas amostras revelou estarem relacionados até sete mutações com um ancestral comum, o que significa que a primeira infeção em seres humanos ocorreu em novembro ou dezembro de 2019. Em 13 de março de 2020 estavam já amostrados e disponíveis publicamente 410 genomas de SARS-CoV-2.

[005] Em 11 de fevereiro de 2020, o Comité Internacional de Taxonomia de Vírus anunciou que, de acordo com as regras vigentes que determinam as relações hierárquicas entre os coronavírus com base nas sequência conservadas dos ácidos nucleicos, as diferenças entre o SARS-CoV-2 e o SARS-CoV responsável pelo surto de SARS eram insuficientes para serem classificados como duas espécies virais diferentes. Desta forma, o SARS-CoV-2 foi classificado como cepa dos coronavírus associados à síndrome respiratória aguda (SARS-CoV).

[006] Cada virion de SARS-CoV-2 mede aproximadamente 50-200 nanômetros de diâmetro. Tal como outros coronavírus, o SARS-CoV-2 tem quatro proteínas estruturais, conhecidas como proteínas S (spike), E (envelope), M (membrana) e N (nucleocapsídeo). A proteína N contém o genoma RNA e em conjunto as proteínas S, E e M criam o envelope viral. A proteína S é a proteína que permite ao vírus ligar-se à membrana celular de uma célula hospedeira.

Radiação gama

[007] A energia radiante para esterilizações vem sendo aplicada com sucesso nestes últimos anos. Produtos alimentícios, cosméticos, materiais cirúrgicos descartáveis, vacinas, soros e produtos do sangue e outros, são descontaminados por radiações.

[008] A energia eletromagnética derivada de cobalto é a que se utiliza com maior frequência na esterilização dos materiais mencionados. Este tipo de energia, como a radiação gama, não aquece o produto, podendo, assim, ser também aplicada a produtos biológicos que, na maioria das vezes, são susceptíveis a temperaturas relativamente elevadas.

[009] A esterilização de soros terapêuticos e de algumas vacinas não adicionadas de adjuvantes particulados é feita geralmente pela filtração. Na dependência do tipo de produto e dos filtros esterilizantes usados, o processo é relativamente demorado e, invariavelmente, ocorrem perdas de volumes que são, às vezes, consideráveis. Devido a falhas humanas ou outras causas, após a filtração observam-se contaminações relativamente frequentes que, ou condenam o produto definitivamente ou, pelo menos, obrigam a uma nova filtração e, consequentemente, aumenta a perda em volume. Tratando-se de vacinas adicionadas de adjuvantes particulados, todo o trabalho é executado sob condições estéreis. Neste caso, quando ocorre contaminação, o produto não tem condições de ser recuperado.

[0010] A radiação gama, devido ao seu elevado poder de penetração, esteriliza os produtos após o envasamento e, inclusive, após ter sido acondicionado em embalagens habituais.

[0011] O estado da técnica não traz informações suficientes quanto a utilização deste tipo de energia na esterilização de produto de natureza biológica, tais como soros hiperimunes ou vacinas. Não há, praticamente, dúvidas quanto à ação dos raios gama esterilizantes, mas, sim, quanto a redução de atividade biológica, por destruição de princípios ativos destes produtos.

[0012] Como pode ser observado nenhum documento do estado da técnica descreve ou sugere processo de produção de um antígeno, correspondente aos vírus SARS-COV-2 inativado por inativação por raio gama

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0013] Para solucionar os problemas acima mencionados, a presente invenção propiciará vantagens significativas em relação aos processos de produção de um antígeno, correspondente aos vírus SARS-COV-2 inativado, utilizando inativação por raio gama, possibilitando um aumento do seu desempenho e apresentando uma relação custo/benefício mais favorável.

[0014] A presente invenção se refere a um processo de produção de um antígeno, correspondente aos vírus SARS-COV-2 inativado compreendendo as etapas de cultivar e multiplicar o vírus SARS-CoV-2 em células de mamíferos; coletar; purificação do vírus; estabilização viral, e inativação viral, em que a inativação viral é por irradiação gama.

[0015] Em uma segunda concretização, a presente invenção se refere a testes para detecção do vírus ativo e verificação da inativação em amostras de vacina, kits, sobrenadantes de cultura, lisados celulares ou células íntegras.

[0016] Em uma terceira concretização, a presente invenção se refere ao uso do antígeno, correspondente aos vírus SARS-COV-2 inativado obtido pelo processo da presente invenção para a preparação de uma nova vacina.

[0017] Em uma quarta concretização, a presente invenção se refere ao uso do antígeno, correspondente aos vírus SARS-COV-2 inativado obtido pelo processo da presente invenção para a produção de plasma hiperimune em cavalos para soroterapia.

[0018] Em uma quinta concretização, a presente invenção se refere ao uso do antígeno, correspondente aos vírus SARS-COV-2 inativado obtido pelo processo da presente invenção em diferentes espécies animais para produção de anticorpos/insumos à pesquisa e kits de sorodiagnóstico.

[0019] Em uma sexta concretização, a presente invenção se refere ao uso do antígeno, correspondente aos vírus SARS-COV-2 inativado obtido pelo processo da presente invenção para a preparação de uma composição destinada à imunização para a proteção do indivíduo ou animal imunizado.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0020] A estrutura e operação da presente invenção, juntamente com vantagens adicionais da mesma podem ser mais bem entendidas mediante referência aos desenhos em anexo e a seguinte descrição:

[0021] A Figura 1 mostra a Produção de vírus com diferentes MOI (0,1, 0,05 e 0,01) e diferentes tempos após infecção;

[0022] A Figura 2 mostra a ultracentrifugação em gradiente de sacarose realizada em rotor zonal. Fração 12* corresponde às frações 12 a 24 (sacarose 55 a 35%) contendo o pico de vírus.

[0023] A figura 3 mostra um fluxograma detelhado das etapas do processo de produção de um antígeno, correspondente aos vírus SARS-COV-2 inativado;

[0024] A figura 4 mostra a determinação do D10 (dose necessária para inativar 1 log da população microbiológica), em que a concentração viral: lote 1 quarta passagem ~ 107, Doses de irradiação (sete amostras) prevendo um D10 entre 2 e 2,5 kGy: não irradiado; 1 kGy; 2,5 kGy; 5 kGy; 7,5 kGy; 10 kGy e 15 kGy; Irradiação feita na GammaCell com início no dia 30 de abril e término dia 1° de maio de 2020.

[0025] A figura 5 mostra um fragmento de DNA contendo a sequência da proteína E (alvo prot Charité) e região do fragmento correspondente ao RNA subgenômico que foi sintetizado;

[0026] A figura 6 mostra a inativação do soro 450. Soro 761 e soro humano 861;

[0027] A Figura 7 mostra o resultado do tempo de protrombina, onde o plasma pobre em plaquetas (100 μL) foi exposto a diferentes doses de radiação ionizante (5 a 25 kGy). Após incubação, 100 μL de tromboplastina foram adicionados e o tempo de coagulação medido. As colunas representam a média das triplicatas ± DP. (- %) = percentual de atividade das enzimas da coagulação;

[0028] A Figura 8 mostra o tempo de tromboplastina parcialmente ativada, onde o plasma pobre em plaquetas (100 μL) foi exposto a diferentes doses de radiação ionizante (5 a 25 kGy) . Após incubação do PPP com cefalina e ácido elágico, 100 μL de CaCl2 foram adicionados. As colunas representam a média das triplicatas ± DP. (- %) = percentual de atividade das enzimas da coagulação; e

[0029] A Figura 9 mostra a quantificação de citocinas inflamatórias utilizando kits de Multiplex (Merck) no equipamento Luminex em sobrenadantes de células THP-1 após irradiação com doses de 10kGy, 15kGy e 25kGy. Foram dosadas as citocinas IL-6, Il-8, IL-Ιβ, IL-4, IL-10 e TNFα.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO:

[0030] A produção de vírus SARS-CoV-2 pode ser realizada em células de mamíferos. Em um contexto, as células preferencialmente usadas são as VERO CCL-86 ou VERO E6 (Cercopithecus aethiops) qualificadas para a produção de imunobiológicos.

[0031] As células de mamíferos são cultivadas em meios de cultura específicos, preferencialmente, adaptadas ao crescimento em meio livre de soro fetal bovino. Em um contexto preferencial esses meios de cultura são os meios VP SFM (Thermo Scientific) e OptiPro (Thermo Scientific).

[0032] As células são cultivadas em aderência a superfícies ou cultivadas em suspensão.

[0033] As superfícies usadas podem ser bidimensionais ou tridimensionais, compostas de plástico ou resinas, sendo frascos, microcarregadores porosos ou não porosos, compostos de fibras sintéticas ou naturais, ou derivados da indústria petroquímica. Os frascos de cultivo podem ser do tipo T, garrafas tipo "roller", biorreatores de leito fixo ou fluidizado, equipamentos de uso único ou não, verticais ou horizontais, sistemas de cultivo de células em altas densidades, frascos multicamadas, placas de petri, discos de plástico dentre outros métodos e materiais conhecidos pelo estado da técnica. Em um contexto preferencial, essas superfícies são compostas de plástico especialmente tratado para a aderência celular, em frascos T 22 5 cm2.

[0034] O vírus SARS-CoV-2 utilizado nos experimentos pode tratar-se de um isolado humano ou animal, produto de isolamento primário ou de procedimento de separação de clone ou subclone, ou ainda de ser reconstruído parcial ou totalmente por técnicas de engenharia genética, produzindo variantes mais produtivas ou vírus atenuados. Em um contexto preferencial, o isolado viral trata-se de SARS-CoV-2/SP02/human/2020/BRA (GeneBank MT126808.1), gentilmente cedida pelo Prof. Edison Luis Durigon, do Instituo de Ciências Biomédicas da USP, com a qual foram preparados os bancos semente e de trabalho.

[0035] Para a produção viral, uma quantidade de vírus em uma multiplicidade de infecção MOI definida é inoculada nas células em cultura. É possível utilizar diversos MOI diferentes, como 0,00001; 0,0001; 0,001; 0,01; 0,1; 1; 10; 100 e seus intermediários. Em um contexto preferencial, o MOI utilizado é de 0,1. Esse vírus é adicionado às células com ou sem troca do meio de cultura presente. Em um contexto preferencial o meio de cultura é drenado e o vírus é inoculado em um volume de 3 mL por frasco. Após a inoculação do vírus o conjunto de células é incubado por um período de 1 a 120 h. Em um contexto preferencial, as células são incubadas com o vírus por 1 h, após o que o volume de meio de cultura é completado para o volume final requerido no frasco de cultivo, preferencialmente esse volume é de 100 mL. Os frascos são então incubados por 2 a 120 h para a produção do vírus à temperatura entre 24 °C e 37 °C. Preferencialmente a produção de vírus é realizada em 48 h com incubação a 37 °C, conforme visto na Figura 1.

[0036] Após o tempo de incubação necessário o vírus é separado das células na etapa de coleta em que o conteúdo de múltiplos frascos é reunido em um frasco quando necessário, utilizando técnicas do estado da técnica, como inversão, aspiração ou bombeamento. A etapa de coleta não é necessária em produção de vírus que ocorra em frasco único.

[0037] Após a etapa de coleta, o material é preferencialmente encaminhado para a purificação. Em um contexto preferencial, a primeira etapa de purificação é a remoção de restos celulares e outras partículas microscópicas por meio de clarificação. O processo de clarificação poderá ser realizado por centrifugação convencional ou de fluxo contínuo; ultracentrifugação; remoção auxiliada por cargas iônicas ou magnetismo; sedimentação ou precipitação; filtração. No contexto preferencial a remoção das partículas é realizada por meio de filtração.

[0038] Na etapa de filtração para clarificação ou para esterilização ou redução de microrganimos do material, podem ser utilizados diferentes tipos de filtros ou técnicas de filtração. Podem ser utilizadas membranas compostas de poliéster, PVDF, celulose ou celulose regenerada, dentre outras em diferentes porosidades, incluindo a possibilidade de utilização de dispositivos com diversas porosidades de membrana combinadas. Essas membranas podem estar posicionadas em suportes para membranas, cartuchos, cápsulas, ou outros itens em que seja possível separar o lado em que o material a ser removido será retido do material filtrado. Em um contexto preferencial a filtração é realizada por meio da utilização de uma cápsula com membrana de polietersulfona e porosidade de 0,22 μm.

[0039] O material viral poderá ser purificado ativo ou inativo para a remoção de restos de meio de cultura, proteínas celulares e material genético não viral. Essa purificação poderá ser realizada por diversas técnicas tais como ultracentrifugação, cromatografia, filtração, filtração tangencial, ultrafiltração, precipitação e outras técnicas típicas da purificação de produtos biotecnológicos.

[0040] Em um contexto preferencial a amostra viral é concentrada a 1/2 até 1/10 do volume original antes da purificação. Em um contexto preferencial essa concentração é realizada por técnica de filtração tangencial em membrana de 300 kDa a 1/8 do volume original. A concentração pode ser realizada igualmente por membranas compostas de poliéster, PVDF, celulose ou celulose regenerada, dentre outras em diferentes porosidades, incluindo a possibilidade de utilização de dispositivos com diversas porosidades de membrana combinadas.

[0041] Após a concentração ou em processo combinado com ela, ou ainda a partir do volume de material coletado ou clarificado sem concentrar, o material poderá ser submetido a um processo de troca de solvente. O novo solvente será composto de solução aquosa com tamponamento de pH. A solução tampão poderá ser composta de diversos componentes, sendo os mais comuns sais de sódio e potássio, fosfatos, citratos ou carbonatos, tampões do tipo TRIS, HEPES ou outros tampões regularmente utilizados em purificação de vírus e proteínas virais. Em um contexto preferencial será realizada diafiltração em membrana de 300 kDa constituída de PES em três diavolumes para a troca do solvente da suspensão viral. A composição da membrana poderá ser variada, como explicado anteriormente. A quantidade de diavolumes utilizada também poderá ser variada, não consistindo em variação à técnica aqui descrita.

[0042] Outra etapa de purificação consiste na redução de contaminantes do material através de processos de cromatografia de diversos tipos, como mas não se limitando a troca iônica, exclusão molecular, afinidade, imunoafinidade, isoelétrica, fase reversa, etc.

[0043] Em outro contexto a purificação é realizada por ultracentrifugação em colchão de sacarose e em gradiente de sacarose. Em outro escopo o processo de ultracentrifugação pode ser realizado na presença de outros agentes formadores de fases ou gradientes, como cloreto de césio e iodixanol. Em um contexto preferencial a ultracentrifugação é realizada primeiramente com o material concentrado sendo posicionado em um gradiente de sacarose e em rotor zonal e o processo é realizado por ultracentrifugação (Zonal 1), seguido pela (Zonal 2) . O SARS-Cov-2 poderá ser recuperado de diversas fases do gradiente entre as diferentes concentrações do reagente de separação. Preferencialmente o vírus será retirado das frações 55-28% (zonal 1) e 55-35% (zonal 2).

[0044] O produto obtido a partir da purificação possui estabilidade comprovada de até 07 dias em câmara-fria (6 °C ± 2 °C) . O produto poderá ser dialisado em solução tampão ou diafiltrado em condições já descritas para a troca do tampão e retirada do reagente de formação de gradiente, ou ainda dos sais e compostos utilizados para sua eluição de colunas cromatográficas. O produto poderá ser congelado entre - 20 °C e - 196 °C para preservação do ingrediente farmacêutico ativo. Preferencialmente o produto será congelado a - 80 °C. A esterilização final do produto poderá ser realizada utilizando as mesmas condições e membranas citadas no item de "clarificação". Preferencialmente a filtração será realizada utilizando-se membrana 0,22 μm de polietersulfona.

[0045] O produto final será obtido a partir da combinação ou não do vírus purificado e inativado com adjuvantes. Os adjuvantes poderão ser compostos de sais de alumínio, esqualeno e derivados de proteínas bacterianas, em soluções aquosas ou emulsões, combinados ou não. Em um contexto preferencial o adjuvante utilizado é o hidróxido de alumínio.

[0046] O processo de inativação viral, executado logo após a etapa de coleta, clarificação ou no produto purificado poderá ser realizado pela adição de reagentes químicos ou utilização de radiação gama. Os reagentes químicos utilizados podem ser, mas não se limitam a Betapropiolactona, formaldeído, ácido ascórbico, ácido lático, etc... Poderão ser utilizados diversas concentrações e tempos de incubação para a inativação.

[0047] Preferencialmente a inativação química será realizada com betapropiolactona em concentração ativa de 0,05 % e incubação a 4 °C durante 24 horas, seguida de incubação a 37 °C por duas horas.

[0048] A inativação por radiação gama será realizada preferencialmente pela aplicação de 15 kGy (kilo Grays) por XXX minutos, tanto para amostras de vírus purificado como para amostras de vírus contidas em placas de cultura, tubos de ensaio, microtubos, frascos de vidro, polipropileno ou outros plásticos. As amostras de vírus poderão estar dentro ou fora das células, em soluções tampão ou não, tendo ou não tendo sido previamente tratadas para inativação por outra metodologia.

[0049] A figura 3 mostra um fluxograma detalhado com todas as etapas processo de produção de um antígeno, correspondente aos vírus SARS-COV-2 inativado.

Verificação da inativação

[0050] A verificação da inativação é realizada pela incubação de amostra do vírus inativado em cultura de células. Em uma abordagem a incubação poderá ser realizada de dois a quatorze dias em uma passagem ou pelo mesmo período em mais passagens até a verificação da ausência ou presença de efeito citopático ou da presença de multiplicação viral. Preferencialmente a incubação será realizada por três passagens com incubações de três ou quatro dias cada e as células serão lisadas para a análise do conteúdo de RNA viral. O RNA viral poderá ser verificado através de técnicas diversas, preferencialmente será quantificado por RT-PCR em tempo real. Preferencialmente o RNA quantificado é o RNA subgenômico viral, presente apenas em situações, em que o vírus se encontra ativo. A quantificação do RNA subgenômico em amostras de RNA extraído das células é realizada pela inoculação de quantidades específicas de RNA total extraído para a realização da transcrição reversa. Preferencialmente são utilizados 40 ng de RNA total extraído. Após a transcrição reversa são utilizados oligonucleotídeos iniciadores (primers) para a realização da amplificação na presença de sondas ou de reagente intercalante de bases. Preferencialmente os primers são sequências baseadas em trabalho científico publicado (Wölfel et al. 2020). A verificação da inativação é feita pela manutenção da quantidade de RNA subgenômico detectado (residual), sendo que se observada a amplificação de maiores quantidades de material a cada passagem da amostra viral nas células, o material deve ser considerado ativo.

[0051] A verificação do título viral ativo poderá ser realizada por titulação em placa ou utilizando amplificação em termociclador em tempo real ou equivalente. Para a titulação em placa serão realizadas diluições seriadas da amostra viral que será utilizada para a inoculação de células em placas de cultura. Preferencialmente essas células serão células VERO descritas anteriormente. As placas de cultura serão incubadas por 24 a 72 h para a observação do efeito citopático das amostras de vírus. Preferencialmente as placas contendo vírus diluídos seriadamente na base 10 e células serão incubadas por 72 h. Será removido o meio de cultura das placas e o tapete celular remanescente será observado diretamente ou fixado e corado. O tapete poderá ser fixado com reagentes diversos como formaldeído, metanol, acetona ou ácido acético e corado com corantes diversos, sendo preferencialmente fixado com ácido acético e corado com azul de Naftol. A titulação de vírus infeccioso será feita pela determinação da dose infectante em cultura de tecidos 50% (TCID50), baseado no método de Reed & Muench, 1938.

[0052] A titulação por PCR em tempo real poderá ser realizada através da detecção de qualquer segmento gênico do SARS-CoV-2. Preferencialmente será feito seguindo o protocolo da Universidade de Charité (https://www.who.int/docs/default- source/coronaviruse/protocol-v2-1.pdf?sfvrsn=a9ef618c 2) , adaptado à quantificação absoluta baseada em curva de quantificação. A curva de quantificação viral poderá ser obtida através da utilização de diluições de vírus, de lisado de células infectadas, fragmentos de DNA, diluições de vetores plasmidiais ou diluições de RNA viral sintético ou extraído ou de seus fragmentos. Preferencialmente a curva de quantificação será realizada pela diluição de fragmentos de DNA dupla fita. Uma curva de correlação entre o título de vírus infectante e a quantidade de cópias do material genético amplificado deverá ser realizada a cada diluição da curva de modo a se definir um fator de conversão entre o número inicial de cópias amplificadas e portanto, o ciclo de amplificação gerado pelo equipamento, e o título de vírus infeccioso.

[0053] A extração do material genético viral poderá ser realizada a partir de suspensão viral ou amostra de células. Preferencialmente o RNA viral será extraído de suspensões virais. Para a extração do RNA poderão ser utilizados reagentes de extração e kits de extração baseados em colunas.

[0054] O RNA extraído será submetido ao processo de transcrição reversa utilizando primers randômicos. Oligo-dTs ou específicos de forma a gerar o cDNA apto à amplificação. A transcrição reversa poderá ser realizada como parte do mesmo ciclo de amplificação (one-step) ou em um processo anterior à realização da reação em cadeia da polimerase (PCR). A PCR poderá ser realizada utilizando-se sondas fluorescentes específicas ao fragmento amplificado ou através da utilização de reagente fluorescente intercalante de bases. Preferencialmente será utilizado reagente do tipo intercalante de bases para permitir a análise de curvas de dissociação após a PCR.

[0055] Após verificação do reconhecimento dos antígenos produzidos por anticorpos específicos anti-S (gentilmente cedidos por Dr. Edison Durigon) e por soro de pacientes positivos para Covid 19 (identificados por soroneutralização), os antígenos estão sendo utilizados para imunização de camundongos para verificação da imunogenicidade. A seguir, serão utilizados para imunização de cavalos e obtenção dos soros heterólogos para tratamento.

[0056] A Verificação da inativação foi feita por 2 métodos:

Método 1: Passagem seriada em cultura de células Vero

[0057] 100 μL da amostra são incubados com células Vero (placa de 12 wells) por 72 h e posteriormente 100 μL dessa cultura são passados para uma nova placa para o mesmo período de incubação (repete-se mais uma vez, totalizando três passagens).

[0058] Ausência de efeito citopático e de TCID50 no material final indicam inativação.

[0059] Foi determinado que uma TCID50 é capaz de gerar pelo menos 100 TCID50 a cada incubação. Dessa forma 1 TCID50 / 100 μL está dentro de um limite de detecção estimado para o teste, uma vez que o ensaio de titulação é capaz de detectar até 102 TCID50 / mL.

Método 2: Amplificação do RNA subgenômico

[0060] Coronavírus possui um RNA subgenômico "exclusivo" da etapa intracelular de seu ciclo.

[0061] Foi sintetizado um fragmento de DNA contendo a sequência da proteína E (alvo prot Charité) e região do fragmento correspondente ao RNA subgenômico (Figura 5).

[0062] A amplificação do RNA subgenômico em um estudo cinético de infecção pode identificar se há vírus ativo, conforme mostrado na tabela 1.

[0063] A figura 6 mostra a inativação do soro 450. Soro 761 e soro humano 861.

[0064] A Irradiação (5-25kGreis) de plasma humano não altera testes globais de coagulação.

Coleta de sangue

[0065] O sangue humano foi obtido via punção venosa de forma consensual, de indivíduos aparentemente saudáveis e que não faziam uso de medicações, como contraceptivos e anti-inflamatórios por pelo menos 10 dias antes da coleta (Plataforma Brasil - n° - 32443020.4.0000.5501) e coletado em tubos contendo citrato de sódio 3,8% na proporção citrato: sangue (1: 9 v/v).

Preparo do Plasma Pobre em Plaquetas (PPP)

[0066] Para a obtenção do plasma pobre em plaquetas (PPP), o sangue humano foi centrifugado a 2.500 g por 20 minutos em centrífuga da marca Eppendorf (modelo 5810R a 25°C. O PPP obtido foi fracionado em alíquotas de 1 mL que foram armazenadas a - 20°C até o momento de uso.

Irradiação com fonte de Co-60 do Plasma Pobre em Plaquetas

[0067] O Plasma Pobre em Plaquetas foi submetido ou não (controle) a irradiação com fonte de Co-60 nas doses de 5 a 25 kGy (kilograys) no irradiador multipropósito do Centro de Tecnologia das Radiações (CETER) do Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares (IPEN) - CNEN/São Paulo.

Testes Globais de Coagulação

[0068] Após a irradiação ou não (controle), o PPP foi submetido a testes globais da coagulação, Tempo de Protrombina (TP) e Tempo de Tromboplastina Parcialmente ativada (TTPa), para avaliar o percentual de manutenção da atividade das enzimas da coagulação sanguínea. Os ensaios forram realizados como descrito a seguir:

• a) Determinação do tempo de protrombina (TP): Para a determinação do tempo de protrombina foi utilizado o reagente (Hyphen®) reconstituído no momento do uso, de acordo com as instruções do fabricante. Em coagulômetro semi-automático (Diagnostica Stago - França), o plasma pobre em plaquetas (100 μL) exposto a diferentes doses de radiação ionizante (5 a 25 kGy) foi incubado durante 2 minutos a 37°C. Após a incubação, 100 μL de tromboplastina foram adicionados e o cronometro acionado. Esses experimentos foram realizados no Laboratório de Desenvolvimento e Inovação e as determinações foram realizadas em triplicata.
• b) determinação do Tempo de Tromboplastina Parcialmente ativada (TTPa): A determinação do tempo de tromboplastina parcialmente ativada foi realizada em coagulômetro semi-automático (Diagnostica Stago - França). O plasma pobre em plaquetas (100 μL) exposto a diferentes doses de radiação ionizante (5 a 25 kGy) foi incubado a 37°C, durante 3 minutos com 100 μL de reagente (cefalina e ácido elágico - Hyphen®). Após a incubação, 100 μL de CaCl2 foram adicionados e o cronometro acionado. Esses experimentos foram realizados no Laboratório de Desenvolvimento e Inovação e as determinações foram realizadas em triplicata.

Resultados

[0069] A Figura 7 mostra o resultado do tempo de protombina, onde o plasma pobre em plaquetas (100 μL) foi exposto a diferentes doses de radiação ionizante (5 a 25 kGy). Após incubação, 100 μL de tromboplastina foram adicionados e o tempo de coagulação medido. As colunas representam a média das triplicatas ± DP. (- %) = percentual de atividade das enzimas da coagulação.

[0070] A Figura 8 mostra o tempo de tromboplastina parcialmente ativada, onde o plasma pobre em plaquetas (100 μL) foi exposto a diferentes doses de radiação ionizante (5 a 25 kGy) . Após incubação do PPP com cefalina e ácido elágico, 100 μL de CaCl2 foram adicionados. As colunas representam a média das triplicatas ± DP. (- %) = percentual de atividade das enzimas da coagulação.

[0071] A inativação por IRRADIAÇÃO GAMA (10-25 kGreis), de meios de cultura expostos ao vírus não altera perfil proteico dos meios, podendo serem utilizados em testes laboratoriais a serem desenvolvidos em laboratórios de análise clínicas, de pesquisa ou de produção de produtos biotecnológicos.

[0072] Inativação viral por radiação de sobrenadantes de cultura de células para utilização em laboratórios de análises clínicas, pesquisa ou laboratórios de produção de produtos biotecnológicos garante o uso seguro de amostras em Laboratórios que não possuem qualificação de níveis de segurança biológica (por exemplo NB2, NB3), para trabalhar com agentes infecciosos como vírus, tal qual o SARCS COV-2. A técnica utilizada para inativação mostrou não afetar a quantificação de proteínas presentes nos sobrenadantes de cultivo celular tornando sua medida possível.

EXEMPLOS Exemplo 1: Sobrenadantes de macrófagos derivados da linhagem monocítica THP-1 foram irradiados com 10, 15 e 25 KGreis e citocinas inflamatórias foram quantificadas. Metodologia

[0073] Obtenção dos macrófagos: Os monócitos THP-1 foram diferenciados em macrófagos utilizando protocolo descrito e caracterizado por Lund e colaboradores (2016). Brevemente as células (2x106) foram incubadas por 48h em 3 mL de meio RPMI contendo 25nM de PMA. Após este período, os macrófagos foram mantidos em descanso por 24h em meio livre de PMA.

[0074] Tratamento: Os macrófagos, após o protocolo de diferenciação, foram tratados durante 24 horas com: LPS (1 μg/mL) para indução da expressão e liberação das citocinas inflamatórias.

[0075] Análises: Os sobrenadantes dos macrófagos tratados com LPS foram coletados, submetidos à irradiação e as concentrações de IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, TNFα e IL- 1β liberadas foram avaliadas, tanto em amostras irradiadas quanto em não irradiadas, usando kits de Multiplex (Merck) no equipamento Luminex, seguindo o protocolo do fabricante.

Resultados

[0076] Sobrenadantes coletados de macrófagos derivados da linhagem monocítica THP-1, estimulados com LPS, não irradiados e irradiados com as doses de 10kGy, 15kGy e 25kGy tiveram as citocinas inflamatórias IL-6, IL-8, IL-Ιβ, IL-4, IL-10 e TNFa quantificadas (Figura 9). Os dados mostraram que nenhuma das doses de irradiação testadas afetou a quantificação das citocinas inflamatórias quando comparada à quantificação de sobrenadantes não irradiados.

[0077] A Figura 9 mostra a quantificação de citocinas inflamatórias utilizando kits de Multiplex (Merck) no equipamento Luminex em sobrenadantes de células THP-1 após irradiação com doses de 10kGy, 15kGy e 25kGy. Foram dosadas as citocinas IL-6, Il-8, IL-Ιβ, IL-4, IL-10 e TNFα.

[0078] Assim, embora tenham sido mostradas apenas algumas concretizações e exemplificações da presente invenção, será entendido que várias omissões, substituições e alterações no processo de produção de um antígeno, correspondente aos vírus sars-cov-2 inativado da presente invenção podem ser feitas por um técnico versado no assunto, sem se afastar do espírito e escopo da presente invenção.

[0079] É expressamente previsto que todas as combinações dos elementos que desempenham a mesma função substancialmente da mesma forma, para alcançar os mesmos resultados, estão dentro do escopo da invenção. Substituições de elementos de uma concretização descrita para outra são também totalmente pretendidas e contempladas.

[0080] Também é preciso entender que os desenhos não estão necessariamente em escala, mas que eles são apenas de natureza conceitual. A intenção é, portanto, ser limitada, tal como indicado pelo escopo das reivindicações anexas.

Claims (10)

1. Processo de produção de um antígeno, correspondente aos vírus SARS-COV-2 inativado compreendendo as seguintes etapas

   • a) Cultivo e multiplicação do vírus SARS-CoV-2 em células de mamíferos,
   • b) Coleta,
   • c) purificação do vírus,
   • d) estabilização viral, e
   • e) inativação viral caracterizado pelo fato de que a inativação viral é por irradiação gama.
2. Processo de produção de um antígeno, correspondente aos vírus SARS-COV-2 inativado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a inativação por radiação gama é realizada, preferencialmente, pela aplicação de 15 kGy (kilo Grays), tanto para amostras de vírus purificado como para amostras de vírus contidas em placas de cultura, tubos de ensaio, microtubos, frascos de vidro, polipropileno ou outros plásticos.
3. Processo de produção de um antígeno, correspondente aos vírus SARS-COV-2 inativado, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que as amostras de vírus poderão estar dentro ou fora das células, em soluções tampão ou não, tendo ou não tendo sido previamente tratadas para inativação.
4. Processo de produção de um antígeno, correspondente aos vírus SARS-COV-2 inativado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que uma verificação da inativação é realizada pela incubação de amostra do vírus inativado em cultura de células, preferencialmente a incubação será realizada por três passagens com incubações de três ou quatro dias cada e as células serão lisadas para a análise do conteúdo de RNA viral.
5. Processo de produção de um antígeno, correspondente aos vírus SARS-COV-2 inativado, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a verificação da inativação é feita pela manutenção da quantidade de RNA subgenômico detectado (residual), sendo que se observada à amplificação de maiores quantidades de material a cada passagem da amostra viral nas células, o material deve ser considerado ativo.
6. Processo de produção de um antígeno, correspondente aos vírus SARS-COV-2 inativado, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a verificação do título viral ativo é realizada por titulação em placa ou utilizando amplificação em termociclador em tempo real ou equivalente, em que para a titulação em placa serão realizadas diluições seriadas da amostra viral que será utilizada para a inoculação de células em placas de cultura, preferencialmente em células VERO.
7. Uso do antígeno, correspondente aos vírus SARS-COV-2 inativado obtido pelo processo conforme definido pelas reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de uma nova vacina.
8. Uso do antígeno, correspondente aos vírus SARS-COV-2 inativado obtido pelo processo conforme definido pelas reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que é para a produção de plasma hiperimune em cavalos para soroterapia,
9. Uso do antígeno, correspondente aos vírus SARS-COV-2 inativado obtido pelo processo conforme definido pelas reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que é em diferentes espécies animais para produção de anticorpos/insumos à pesquisa e kits de sorodiagnóstico.
10. Uso do antígeno, correspondente aos vírus SARS-COV-2 inativado obtido pelo processo conforme definido pelas reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de uma composição destinada à imunização para a proteção do indivíduo ou animal imunizado.

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