ES2712664T3 - Procedimientos de purificación de un virus producido in vitro y ensayo de eliminación del virus - Google Patents
Procedimientos de purificación de un virus producido in vitro y ensayo de eliminación del virus Download PDFInfo
- Publication number
- ES2712664T3 ES2712664T3 ES16179299T ES16179299T ES2712664T3 ES 2712664 T3 ES2712664 T3 ES 2712664T3 ES 16179299 T ES16179299 T ES 16179299T ES 16179299 T ES16179299 T ES 16179299T ES 2712664 T3 ES2712664 T3 ES 2712664T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- virus
- enveloped
- fraction
- sample
- pseudo
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims abstract description 181
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 139
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 title claims description 20
- 238000000746 purification Methods 0.000 title abstract description 24
- 230000008030 elimination Effects 0.000 title description 12
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 title description 12
- 238000003556 assay Methods 0.000 title description 3
- 239000003599 detergent Substances 0.000 claims abstract description 51
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 claims abstract description 40
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 claims abstract description 40
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims abstract description 39
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 35
- YFVGRULMIQXYNE-UHFFFAOYSA-M lithium;dodecyl sulfate Chemical compound [Li+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O YFVGRULMIQXYNE-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 34
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 claims abstract description 17
- 238000009295 crossflow filtration Methods 0.000 claims description 71
- 241000724675 Hepatitis E virus Species 0.000 claims description 67
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 claims description 46
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 31
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 31
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 28
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 26
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 22
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 claims description 20
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 19
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 18
- 241000709721 Hepatovirus A Species 0.000 claims description 15
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 14
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 13
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 12
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 12
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 12
- 244000309711 non-enveloped viruses Species 0.000 claims description 12
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 11
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 11
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 claims description 11
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 10
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims description 10
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 claims description 8
- 238000012606 in vitro cell culture Methods 0.000 claims description 6
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 6
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 3
- 241000702619 Porcine parvovirus Species 0.000 claims description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 claims description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 3
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 3
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 3
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 abstract description 10
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 53
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 46
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 32
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 25
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 21
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 18
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 15
- 238000002944 PCR assay Methods 0.000 description 8
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 8
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 7
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 7
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 6
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- FGUUSXIOTUKUDN-IBGZPJMESA-N C1(=CC=CC=C1)N1C2=C(NC([C@H](C1)NC=1OC(=NN=1)C1=CC=CC=C1)=O)C=CC=C2 Chemical compound C1(=CC=CC=C1)N1C2=C(NC([C@H](C1)NC=1OC(=NN=1)C1=CC=CC=C1)=O)C=CC=C2 FGUUSXIOTUKUDN-IBGZPJMESA-N 0.000 description 5
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 5
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 5
- GNFTZDOKVXKIBK-UHFFFAOYSA-N 3-(2-methoxyethoxy)benzohydrazide Chemical compound COCCOC1=CC=CC(C(=O)NN)=C1 GNFTZDOKVXKIBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 4
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 4
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 4
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 4
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 description 3
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 description 3
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 description 3
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 3
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 238000009928 pasteurization Methods 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 229920000209 Hexadimethrine bromide Polymers 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000010808 liquid waste Substances 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 2
- 238000002941 microtiter virus yield reduction assay Methods 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 239000012465 retentate Substances 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 230000003253 viricidal effect Effects 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 241000991587 Enterovirus C Species 0.000 description 1
- 241000714201 Feline calicivirus Species 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 description 1
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000005188 flotation Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 238000000464 low-speed centrifugation Methods 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 238000011165 process development Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 238000013349 risk mitigation Methods 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000012109 statistical procedure Methods 0.000 description 1
- 239000012085 test solution Substances 0.000 description 1
- 238000012956 testing procedure Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
- C12N7/02—Recovery or purification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/29—Hepatitis virus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
- C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
- C11D7/00—Compositions of detergents based essentially on non-surface-active compounds
- C11D7/22—Organic compounds
- C11D7/26—Organic compounds containing oxygen
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
- C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
- C11D7/00—Compositions of detergents based essentially on non-surface-active compounds
- C11D7/22—Organic compounds
- C11D7/34—Organic compounds containing sulfur
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
- C12Q1/706—Specific hybridization probes for hepatitis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
- C12Q1/706—Specific hybridization probes for hepatitis
- C12Q1/707—Specific hybridization probes for hepatitis non-A, non-B Hepatitis, excluding hepatitis D
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/576—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/576—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis
- G01N33/5768—Hepatitis A
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
- C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
- C11D2111/00—Cleaning compositions characterised by the objects to be cleaned; Cleaning compositions characterised by non-standard cleaning or washing processes
- C11D2111/10—Objects to be cleaned
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14051—Methods of production or purification of viral material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14311—Parvovirus, e.g. minute virus of mice
- C12N2750/14351—Methods of production or purification of viral material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/28011—Hepeviridae
- C12N2770/28111—Hepevirus, e.g. hepatitis E virus
- C12N2770/28151—Methods of production or purification of viral material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/32011—Picornaviridae
- C12N2770/32411—Hepatovirus, i.e. hepatitis A virus
- C12N2770/32451—Methods of production or purification of viral material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/32011—Picornaviridae
- C12N2770/32511—Parechovirus, e.g. human parechovirus
- C12N2770/32551—Methods of production or purification of viral material
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Mycology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Procedimiento de purificación de un virus no envuelto o pseudoenvuelto propagado en un cultivo celular, comprendiendo el procedimiento una etapa de tratar una muestra que comprende el virus no envuelto o pseudoenvuelto con un detergente, caracterizado por que el detergente se selecciona del grupo que consiste en Tritón X-100 al 0,5% y una mezcla de Tritón X-100 al 0,5% y dodecil sulfato de litio al 0,1%.
Description
DESCRIPCION
Procedimientos de purificacion de un virus producido in vitro y ensayo de eliminacion del virus ANTECEDENTES DE LA INVENCION
Sector de la invencion
La presente invencion se refiere al campo de la virologia, de manera mas precisa a procedimientos de purificacion de virus no envueltos o pseudoenvueltos, tales como el virus de la hepatitis E (VHE) el virus de la hepatitis A (VHA) y el parvovirus porcino (PVP) propagado en un cultivo celular y para utilizar en estudios de eliminacion de virus. Descripcion de la tecnica relacionada
El uso clinico de todos los productos derivados de la sangre y el plasma conlleva el riesgo potencial de transmision de patogenos infecciosos transmitidos por la sangre. La mitigacion del riesgo se puede lograr mediante la aplicacion de etapas de reduccion de patogenos en los procedimientos de fabricacion de productos derivados de la sangre y el plasma. Para desarrollar y demostrar la eficacia de las etapas de reduccion de patogenos, se realizan estudios de eliminacion de virus. Durante estos estudios, una cantidad conocida de virus es anadida a un producto intermedio de sangre o plasma y, a continuacion, la muestra a la que se le ha anadido el virus se procesa utilizando un modelo a escala de laboratorio (un modelo a escala reducida) del procedimiento de fabricacion que comprende una etapa de reduccion de patogenos. La reduccion y/o eliminacion de virus durante una etapa de reduccion de patogenos se determina comparando la cantidad de virus antes y despues de la etapa.
Para asegurar la validez de los datos de eliminacion de virus, el modelo a escala reducida debe representar con precision una operacion unitaria a gran escala y el concentrado de virus debe ser representativo de un potencial contaminante. Por ejemplo, el cultivo de un concentrado de virus in vitro puede requerir suero y la presencia de suero en el concentrado de virus podria afectar los estudios de eliminacion que implican productos intermedios libres de suero. La presencia de contaminantes no virales, tales como membranas de celulas huesped, proteinas y acidos nucleicos extranos, tambien podrian interferir en la evaluacion precisa de la eliminacion del virus durante una etapa aguas abajo, en la que los productos intermedios estan presumiblemente altamente purificados. Por lo tanto, es importante eliminar los contaminantes del concentrado de virus que podrian afectar el rendimiento y la relevancia de los modelos a escala reducida.
DESCRIPCION RESUMIDA DE LA INVENCION
La presente invencion comprende un procedimiento de purificacion de un virus no envuelto o pseudoenvuelto propagado en un cultivo celular, basado en un procedimiento de tratamiento de una muestra que comprende el virus no envuelto o pseudoenvuelto con un detergente, en el que el detergente se selecciona del grupo que consiste en Triton X-100 al 0,5% y una mezcla de Triton X-100 al 0,5% y dodecil sulfato de litio al 0,1%. En algunas realizaciones del procedimiento, el virus propagado en el cultivo celular es el virus de la Hepatitis A (VHA). En algunas realizaciones del procedimiento, el virus propagado en el cultivo celular es el parvovirus porcino (PVP). En algunas realizaciones preferentes del procedimiento, el virus propagado es el cultivo celular es el virus de la Hepatitis E (VHE). En algunas realizaciones del procedimiento, el virus se produce en un cultivo celular in vitro. En algunas realizaciones del procedimiento, el cultivo celular in vitro comprende una linea celular establecida. En algunas realizaciones del procedimiento, la linea celular establecida se selecciona de un grupo que comprende HepG2 (numero ATCC HB-8065) y HepG2/C3A (numero ATCC CRL-10741). En algunas realizaciones del procedimiento, la etapa de tratamiento se lleva a cabo durante 1 hora. En algunas realizaciones del procedimiento, la muestra es un sobrenadante obtenido a partir de ultracentrifugacion de una suspension clarificada de lisado celular infectado con virus. En algunas realizaciones del procedimiento, de manera opcional, la muestra es una fraccion retenida derivada de la filtracion de flujo tangencial (“trans-flow”) de una suspension clarificada de lisado celular infectado con virus.
Un procedimiento para medir el nivel de un virus no envuelto o un virus pseudoenvuelto en una muestra, comprendiendo el procedimiento las etapas de: a) proporcionar la muestra a una mezcla que comprende una linea celular y un medio de cultivo; b) incubar para permitir la propagacion del virus no envuelto o el virus pseudoenvuelto, si esta presente en la muestra, para obtener una fraccion incubada; c) tratar con al menos un detergente para obtener una fraccion tratada; en el que el detergente se selecciona del grupo que consiste en Triton X-100 al 0,5% y una mezcla de Triton X-100 al 0,5% y dodecil sulfato de litio al 0,1%; d) recoger una parte de la fraccion tratada para obtener una fraccion recogida; y e) medir el nivel del virus no envuelto o el virus pseudoenvuelto en la fraccion recogida. En algunas realizaciones del procedimiento, la muestra se obtiene de un mamifero. En algunas realizaciones del procedimiento, la muestra comprende plasma o sangre. En algunas realizaciones del procedimiento, el virus no envuelto o el virus pseudoenvuelto es el VHA. En algunas realizaciones del procedimiento, el virus no envuelto o el virus pseudoenvuelto es el PVP. En algunas realizaciones preferentes del procedimiento, el virus no envuelto o pseudoenvuelto es el VHE. En algunas realizaciones del procedimiento, el virus se propaga en
un cultivo celular in vitro que comprende una linea celular establecida. En algunas realizaciones del procedimiento, la linea celular se selecciona del grupo que consiste en HepG2 (numero ATCC HB-8065) y HepG2/C3A (numero ATCC CRL-10741). En algunas realizaciones del procedimiento, la muestra comprende una primera fraccion retenida obtenida mediante la filtracion de flujo tangencial de una parte de la fraccion incubada a traves de una membrana. En algunas realizaciones del procedimiento, la muestra comprende, de manera opcional, un primer sobrenadante obtenido mediante la filtracion de flujo tangencial de una parte de la fraccion incubada a traves de una membrana para obtener una primera fraccion retenida y la centrifugacion de la primera fraccion retenida. En algunas realizaciones del procedimiento, la muestra se trata con al menos un detergente o, de manera opcional, una mezcla de detergentes seleccionados del grupo que consiste en Triton X-100 al 0,5% y una mezcla de Triton X-100 al 0,5% y dodecil sulfato de litio al 0,1% para obtener una primera solucion, comprendiendo el procedimiento ademas: a) proporcionar un primer precipitado obtenido mediante la centrifugacion de la primera solucion; b) proporcionar una segunda solucion obtenida mediante la resuspension del primer precipitado en PBS (por sus siglas en ingles, Tampon Fosfato Salino); c) proporcionar una tercera solucion obtenida mediante la clarificacion de la segunda solucion; d) proporcionar un primer filtrado obtenido mediante la filtracion de la tercera solucion utilizando una membrana; y e) proporcionar una segunda fraccion retenida obtenida mediante la ultrafiltracion del primer filtrado, en el que la segunda fraccion retenida comprende la fraccion tratada. En algunas realizaciones del procedimiento, la medicion del nivel de virus no envuelto o pseudoenvuelto comprende detectar una sustancia biologica, en el que la sustancia biologica comprende una secuencia de polinucleotido y/o una secuencia de polipeptido de un virus, y en el que la sustancia biologica es un acido ribonucleico del VHE. En algunas realizaciones del procedimiento, la medicion de la sustancia biologica comprende: a) proporcionar una primera mezcla de reaccion que comprende el acido ribonucleico del VHE obtenido mediante la mezcla de una parte de la fraccion tratada con una solucion de lisis; b) proporcionar una segunda mezcla de reaccion obtenida mediante la adicion de un primer reactivo a la primera mezcla de reaccion, en el que la segunda mezcla de reaccion comprende un acido desoxirribonucleico que es complementario al acido ribonucleico del VHE; c) anadir, a la segunda mezcla de reaccion, un segundo reactivo que es, como minimo, parcialmente complementario a una secuencia dentro del acido desoxirribonucleico; d) anadir, a la segunda mezcla de reaccion, un tercer reactivo que es, como minimo, parcialmente complementario a una secuencia dentro del acido desoxirribonucleico; e) amplificar la secuencia comprendida por el segundo y el tercer reactivos dentro del acido desoxirribonucleico; y f) medir la concentracion de la secuencia amplificada. En algunas realizaciones del procedimiento, el segundo reactivo y el tercero reactivo comprenden una secuencia de oligonucleotidos seleccionada del grupo que consiste en:
a) 5'-CGGCTATCGGCCAGAAGTT-3' (SEQ ID NO:1);
b) 5'-CCGTGGCTATAACTGTGGTCT-3' (SEQ ID NO:2) y
c) 5'-FAM-TTTTTACGC-ZEN-AGGCTGCCAAGGCC-3IABkFQ-3' (SEQ ID NO:3).
En algunas realizaciones, la presente invencion comprende un procedimiento de purificacion de un virus no envuelto o pseudoenvuelto propagado en un cultivo celular, basado en un procedimiento de tratamiento de una muestra que comprende el virus no envuelto o pseudoenvuelto con un detergente o una mezcla de detergentes seleccionados del grupo que consiste en Triton X-100 al 0,5% y una mezcla de Triton X-100 al 0,5% y dodecil sulfato de litio al 0,1%, lo que permite obtener un virus cuyo comportamiento en los estudios de eliminacion es presumiblemente el mismo o casi el mismo que los que potencialmente podrian estar presente en las corrientes de procedimiento altamente purificadas. En algunas realizaciones, el virus generado mediante algunas realizaciones del procedimiento descrito anteriormente seria un anadido adecuado para probar la capacidad de reduccion y/o eliminacion del virus de las etapas aguas abajo en los procedimientos de fabricacion de proteinas derivadas de la sangre y/o el plasma.
En algunas realizaciones, el procedimiento de purificacion de un virus producido en un cultivo celular, basado en un procedimiento de tratamiento, comprende: clarificacion de un material infectado por virus; filtracion de flujo tangencial, como minimo, de parte de la mezcla a traves de una membrana para obtener una primera fraccion retenida; y centrifugar la primera fraccion retenida para obtener un primer sobrenadante. El procedimiento de tratamiento comprende: tratar el primer sobrenadante con al menos un detergente para obtener una primera solucion; en el que el procedimiento comprende ademas: despues de dicho tratamiento, centrifugar la primera solucion para obtener un primer precipitado; resuspender el primer precipitado para obtener una segunda solucion; clarificar la segunda solucion para obtener una tercera solucion; filtrar la tercera solucion utilizando una membrana para obtener un primer filtrado; y ultrafiltrar el primer filtrado para obtener una segunda fraccion retenida que proporciona, como minimo, parte de la fraccion tratada a recoger; en el que dicho al menos un detergente se selecciona del grupo que consiste en Triton X-100 al 0,5% y una mezcla de Triton X-100 al 0,5% y dodecil sulfato de litio al 0,1%; en el que dicho tratamiento del primer sobrenadante con dicho al menos un detergente se lleva a cabo durante 1 hora.
En algunas realizaciones, el procedimiento de purificacion de un virus producido en un cultivo celular, basado en un procedimiento de tratamiento, comprende: clarificacion del material infectado por virus; filtracion de flujo tangencial, como minimo, de parte de la mezcla a traves de una membrana para obtener una primera fraccion retenida. El procedimiento de tratamiento comprende: tratar la primera fraccion retenida con al menos un detergente para obtener una primera solucion; en el que el procedimiento comprende ademas: despues de dicho tratamiento, centrifugar la primera solucion para obtener un primer precipitado; resuspender el primer precipitado para obtener una segunda solucion; clarificar la segunda solucion para obtener una tercera solucion; filtrar la tercera solucion
utilizando una membrana para obtener un primer filtrado; y ultrafiltrar el primer filtrado para obtener una segunda fraccion retenida que proporciona, como mmimo, parte de la fraccion tratada a recoger; en el que dicho al menos un detergente se selecciona del grupo que consiste en Triton X-100 al 0,5% y una mezcla de Triton X-100 al 0,5% y dodecil sulfato de litio al 0,1%; en el que dicho tratamiento de la primera fraccion retenida con dicho al menos un detergente se lleva a cabo durante 1 hora.
DESCRIPCION BREVE DE LOS DIBUJOS
La figura 1 muestra la preparacion de los concentrados de virus VHE por filtracion de flujo tangencial (VHE por TFF) y VHE sobrenadante (Supe) por TFF segun algunas realizaciones descritas en el presente documento.
La figura 2 muestra la pureza relativa de los concentrados de VHE por TFF y VHE Supe por TFF que se prepararon segun algunas realizaciones descritas en el presente documento.
La figura 3 muestra la preparacion de los concentrados de virus VHE por TFF, VHE por TFF con Triton y VHE por TFF con Triton/LDS segun algunas realizaciones descritas en el presente documento.
La figura 4 muestra la secuencia de nucleotidos de cebadores y sondas.
DESCRIPCION DETALLADA
Los sistemas de cultivo celular eficaces para producir el virus no envuelto de VHE se han establecido recientemente y los datos indican que el VHE derivado de un cultivo celular VHE es similar al VHE que se encuentra en la sangre, en el hecho de que ambos estan asociados con li'pidos. Por lo tanto, se podrfan utilizar lisados de cultivos celulares clarificados sin procesar o sobrenadantes de cultivos como concentrados de virus en estudios de eliminacion relativos a etapas aguas arriba con intermedios de productos relativamente brutos. Sin embargo, la utilizacion de concentrados de virus sin procesar puede no ser apropiado para la evaluacion de la eliminacion del VHE durante las etapas aguas abajo, en las que las corrientes del procedimiento son de pureza relativamente elevada.
La presente invencion se refiere a un procedimiento para la preparacion de concentrados de VHE de pureza relativamente elevada y titulo elevado que son adecuados para utilizar en estudios de purificacion de virus para las etapas aguas debajo de un procedimiento de fabricacion.
Debido a las dificultades en el cultivo del VHE in vitro, los ensayos de infectividad del VHE basadas en cultivos celulares no estaban facilmente disponibles previamente. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, la propagacion de VHE de titulo elevado en un cultivo celular es posible mediante la utilizacion de medios suplementados con polibreno.
A pesar de que el VHE se considera tecnicamente un virus no envuelto, el VHE propagado en cultivo celular a menudo comprende fragmentos lfpidos de membrana, ya que se libera de las celulas. Estos componentes membranosos pueden proteger al virus de tratamientos viricidas, tales como el calentamiento en liquido o calentamiento en seco de tortas liofilizadas. El VHE se puede tratar con detergentes, tales como Tween, para eliminar los residuos membranosos, pero el virus tratado a menudo sigue siendo resistente a la inactivacion por calentamiento.
En algunas realizaciones, los li'pidos asociados con el VHE del cultivo celular se pueden eliminar mediante tratamiento con Triton X-100 al 0,5%. En algunas realizaciones, los lfpidos asociados con el VHE del cultivo celular se pueden eliminar mediante tratamiento con dodecil sulfato de litio (LDS, por sus siglas en ingles). En algunas realizaciones, los lfpidos asociados con el VHE del cultivo celular se pueden eliminar mediante tratamiento con una combinacion de Triton X-100 al 0,5% y dodecil sulfato de litio (LDS, por sus siglas en ingles) al 0,1%. En algunas realizaciones, la preparacion de virus resultante es todavfa infecciosa. En algunas realizaciones, las concentraciones de los contaminantes no vfricos extranos se reducen en la preparacion del virus. En algunas realizaciones, el virus tambien es mas susceptible a la inactivacion mediante tratamientos viricidas, tales como el calentamiento.
El VHE no produce efectos citopaticos (CPE) en el cultivo celular. Por lo tanto, la deteccion del VHE se basa en un ensayo de PCR (por sus siglas en ingles, Reaccion en Cadena de la Polimerasa) desarrollado originalmente por el Instituto Nacional de Salud (NIH, por sus siglas en ingles). En algunas realizaciones, el ensayo de PCR se modifico para aumentar la sensibilidad. En algunas realizaciones, se altero uno de los cebadores utilizados en el ensayo de PCR. En algunas realizaciones, se altero el cebador inverso utilizado en el ensayo de PCR. En algunas realizaciones, se rediseno una sonda utilizada en el ensayo de PCR. Se diseno una sonda totalmente nueva para el ensayo de PCR. En algunas realizaciones, el ensayo de PCR se utilizo para marcar muestras como positivas o negativas para la determinacion de los tftulos de virus.
En algunas realizaciones, la presente invencion se refiere a un procedimiento que implica: propagacion de VHE de titulo elevado en un cultivo celular mediante la utilizacion de medios suplementados con polibreno; tratamiento de VHE de un cultivo celular con Triton X-100/LDS para eliminar los lfpidos/restos membranosos; y deteccion de VHE
mediante un ensayo de PCR sensible.
En algunas realizaciones, el procedimiento puede ser especfico de VHE. En algunas realizaciones, los procedimientos para la propagacion del virus y la purificacion se pueden aplicar a otros virus no envueltos. En algunas realizaciones, los procedimientos para la propagacion del virus y la purificacion se pueden aplicar a otros virus pseudoenvueltos. En algunas realizaciones, los procedimientos para la propagacion y purificacion del virus se pueden aplicar al VHA. En algunas realizaciones, los procedimientos para la propagacion y purificacion del virus se pueden aplicar al PVP. En algunas realizaciones preferentes los procedimientos para la propagacion y purificacion del virus se pueden aplicar al VHE.
En algunas realizaciones, la presente invencion se puede utilizar para llevar a cabo estudios para evaluar la capacidad de eliminacion/inactivacion del VHE de varias etapas de fabricacion y de productos intermedios y finales. En algunas realizaciones, la presente invencion se puede utilizar para llevar a cabo estudios para evaluar la capacidad de eliminacion/ inactivacion de varias etapas de fabricacion y de productos intermedios y finales para otros virus. En algunas realizaciones, los otros virus son virus no envueltos. En algunas realizaciones, los otros virus son virus pseudoenvueltos. En algunas realizaciones, los otros virus son el VHA y el PVP.
En algunas realizaciones, la presente invencion puede proporcionar una garantfa de seguridad de diversos productos medicos o clmicos, tales como sangre y/o plasma, frente al VHE. En algunas realizaciones, la presente invencion puede proporcionar una garantfa de seguridad de diversos productos medicos o clmicos, tales como sangre y/o plasma frente a otros virus. En algunas realizaciones, los otros virus son el VHA y el PVP.
En algunas realizaciones, la presente invencion se refiere a un procedimiento de purificacion de virus no envueltos o pseudoenvueltos producidos in vitro. En algunas realizaciones, la presente invencion se refiere a un procedimiento de purificacion del VHE producido in vitro. En algunas realizaciones, la purificacion comprende una etapa de tratamiento con detergente con una composicion que comprende al menos un detergente anionico y/o un detergente no ionico, en el que el detergente se selecciona del grupo que consiste en Triton X-100 al 0,5% y una mezcla de Triton X-100 al 0,5% y dodecil sulfato de litio al 0,1%.
En algunas realizaciones, el tratamiento con la composicion que comprende uno o mas detergentes se lleva a cabo durante una duracion de tiempo segun sea necesario y se determine por un experto en la materia. En algunas realizaciones, el tratamiento se lleva a cabo durante 5 minutos hasta 1 dfa. En algunas realizaciones preferentes, el tratamiento se lleva a cabo durante 10 minutos hasta 3 horas. En algunas realizaciones preferentes, el tratamiento se lleva a cabo durante 1 hora.
En la realizacion mas preferente, se utiliza una composicion que comprende Triton X-100 al 0,5% y LDS al 0,1% y se lleva a cabo una etapa de tratamiento con la composicion durante 1 hora. En algunas realizaciones, la incubacion se lleva a cabo a 37°C durante 1 hora.
En algunas realizaciones, como material de partida para llevar a cabo un procedimiento de purificacion de la presente invencion, se utiliza un sobrenadante obtenido a partir de la ultracentrifugacion de un medio de cultivo celular infectado por virus o una suspension de lisado celular infectado por virus clarificado, ambos derivados de cultivos celulares infectados por virus. En una realizacion preferente, se utiliza el sobrenadante obtenido a partir de la ultracentrifugacion de una suspension de lisado celular infectado por virus clarificado.
En algunas realizaciones, como material de partida para llevar a cabo un procedimiento de purificacion de la presente invencion, se utiliza una fraccion retenida obtenida despues de la filtracion de flujo tangencial de un medio de cultivo celular infectado por virus o una suspension de lisado celular infectado por virus clarificado, ambos derivados de cultivos celulares infectados por virus. En una realizacion preferente, se utiliza la fraccion retenida obtenida despues de la filtracion de flujo tangencial de una suspension de lisado celular infectado por virus clarificado.
En una primera realizacion, el procedimiento de purificacion puede comprender las siguientes etapas:
a) clarificar el material de partida;
b) filtrar por flujo tangencial la solucion de la etapa a) a traves de una membrana apropiada para obtener la fraccion retenida correspondiente;
c) ultracentrifugar la fraccion retenida de la etapa b) para obtener el sobrenadante correspondiente;
d) tratar dicho sobrenadante de la etapa c) con un detergente o una mezcla de detergentes para obtener la solucion correspondiente;
e) colocar la solucion de la etapa d) sobre una almohadilla de sacarosa al 30% y llevar a cabo la ultracentrifugacion a la velocidad y el tiempo apropiados para obtener el precipitado correspondiente;
f) resuspender el precipitado de la etapa e) en el volumen apropiado de PBS para obtener la solucion correspondiente;
g) clarificar la solucion de la etapa f) para obtener la solucion correspondiente;
h) ultrafiltrar la solucion obtenida en la etapa g) utilizando una membrana apropiada para obtener la fraccion
retenida correspondiente; y
i) filtrar la fraccion retenida de la etapa h).
En una primera realizacion preferente, en la etapa a), el material de partida se clarifica a traves de un filtro con un tamano de poro de 0,45 pmi.
En una primera realizacion preferente, en la etapa b), la membrana utilizada para realizar la filtracion de flujo tangencial es una membrana de 300 kDa.
En una primera realizacion preferente, en la etapa c), la ultracentrifugacion se lleva a cabo a 85.000 xg durante 1,5 horas.
En una primera realizacion preferente, en la etapa d), cuando se utiliza una mezcla de detergentes, la mezcla de detergentes comprende Triton X-100 al 0,5% y l Ds al 0,1%.
En una primera realizacion preferente, en la etapa e) la ultracentrifugacion se lleva a cabo a 100.000 xg durante 8 horas.
En una primera realizacion preferente, se contempla que, en la etapa f), el precipitado se resuspende en PBS. En una primera realizacion preferente, en la etapa g), la solucion de la etapa f) se clarifica a traves de un filtro con un tamano de poro de 0,2 pmi.
En una primera realizacion preferente, en la etapa h), la membrana utilizada en la ultrafiltracion es una membrana de 100 kDa.
En una primera realizacion preferente, en la etapa i), la filtracion se realiza a traves de un filtro con un tamano de poro de 0,2 pmi.
En una segunda realizacion, un procedimiento de purificacion puede comprender las siguientes etapas:
a) clarificar el material de partida;
b) filtrar por flujo tangencial la solucion de la etapa a) a traves de una membrana apropiada para obtener la fraccion retenida correspondiente;
c) tratar dicha fraccion retenida de la etapa b) con un detergente o una mezcla de detergentes para obtener la solucion correspondiente;
d) ultracentrifugar la solucion tratada con detergente a una velocidad y durante un tiempo apropiados para obtener el precipitado correspondiente;
e) resuspender el precipitado de la etapa d) en el volumen apropiado de PBS para obtener la solucion correspondiente;
f) clarificar la solucion de la etapa e) para obtener la solucion correspondiente;
g) ultrafiltrar la solucion obtenida en la etapa f) utilizando una membrana apropiada para obtener la fraccion retenida correspondiente; y
h) filtrar la fraccion retenida de la etapa g).
En una segunda realizacion preferente, en la etapa a), el material de partida se clarifica a traves de un filtro con un tamano de poro de 0,45 pmi.
En una segunda realizacion preferente, en la etapa b), la membrana utilizada para realizar la filtracion de flujo tangencial es una membrana de 300 kDa.
En una segunda realizacion preferente, en la etapa c), cuando se utiliza una mezcla de detergentes, dicha mezcla de detergentes es Triton X-100 al 0,5% y LDS al 0,1%.
En una segunda realizacion preferente, en la etapa d), la ultracentrifugacion se lleva a cabo a 85.000 xg durante 1,5 horas.
En una segunda realizacion preferente, en la etapa e), el precipitado se resuspende en PBS.
En una segunda realizacion preferente, en la etapa f), la solucion de la etapa e) se clarifica a traves de un filtro con un tamano de poro de 0,2 pmi.
En una segunda realizacion preferente, en la etapa g), la membrana utilizada en la ultrafiltracion es una membrana de 100 kDa.
En una segunda realizacion preferente, en la etapa h), la filtracion se realiza a traves de un filtro con un tamano de poro de 0,2 pm.
La presente invencion se refiere a la utilizacion de LDS y/o Triton X-100 en un procedimiento para la purificacion de un virus no envuelto o pseudoenvuelto producido in vitro. En algunas realizaciones, el virus es no envuelto. En algunas realizaciones, el virus es pseudoenvuelto.
En una realizacion preferente, el virus producido in vitro es el VHE. En algunas realizaciones, el virus producido in vitro puede ser un virus distinto del VHE. En algunas realizaciones, el virus producido in vitro es el VHA. En algunas realizaciones, el virus producido in vitro es el PVP En la realizacion mas preferente, el virus producido in vitro es el virus de la hepatitis E.
En algunas realizaciones, la produccion in vitro descrita anteriormente se lleva a cabo en un cultivo in vitro. En algunas realizaciones, el cultivo in vitro es un cultivo de organos, tejidos o celulas in vitro. En una realizacion preferente, la produccion in vitro se lleva a cabo en un cultivo de celulas in vitro.
En algunas realizaciones, se utiliza un cultivo celular primario. En algunas realizaciones, se utiliza una linea de cultivo celular. Las celulas primarias y las lineas de cultivo celular pueden derivar de cualquier organismo. Por ejemplo, en algunas realizaciones, se contempla la utilizacion de celulas de insecto. En algunas realizaciones, se contempla la utilizacion de celulas de mamifero. En una realizacion preferente, se utiliza una linea de cultivo celular humana.
En una realizacion preferente, se utiliza una linea celular de higado para la produccion y purificacion del VHE. En otra realizacion preferente, se utiliza una linea celular de rinon para la produccion y purificacion de VHE. En algunas realizaciones, la linea celular de higado puede derivar de un higado sano o enfermo. En algunas realizaciones, la linea celular de higado puede ser una linea de celulas malignas o benignas. En algunas realizaciones, la linea celular de rinon puede derivar de un rinon sano o enfermo. En algunas realizaciones, la linea celular de rinon puede ser una linea de celulas malignas o benignas. En una realizacion preferente, se utiliza una linea celular establecida. En algunas realizaciones, la celula es HepG2 (numero ATCC Hb -8065). En algunas realizaciones, la celula es HepG2/C3A (numero ATCC CRL-10741).
En algunas realizaciones, se utiliza un ensayo de infectividad del VHE. En algunas realizaciones, se pueden preparar concentrado del virus con titulos de infectividad de ~ 8 log10. El ensayo tiene una duracion relativamente corta (ensayo de 3-7 dias). Se observo poco o ningun ruido de fondo de la PCR y se puede demostrar una reduccion de mas de 4 log10. Por lo tanto, en algunas realizaciones, se utiliza un ensayo de deteccion del virus basado en PCR. En algunas realizaciones, se utiliza un ensayo de deteccion del VHE basado en PCR.
Realizaciones preferentes adicionales - 1
En algunas realizaciones, un procedimiento de preparacion de un virus no envuelto o pseudoenvuelto propagado en un cultivo celular comprende: una etapa de tratamiento de una muestra que comprende el virus no envuelto o pseudoenvuelto con una composicion que comprende uno o mas detergentes seleccionados del grupo que consiste en Triton X-100 al 0,5% y una mezcla de Triton X-100 al 0,5% y dodecil sulfato de litio al 0,1%.
En algunas realizaciones del procedimiento, el virus propagado en el cultivo celular es el VHA. En algunas realizaciones del procedimiento, el virus propagado en el cultivo celular es el PVP. En algunas realizaciones preferentes del procedimiento, el virus propagado en el cultivo celular es el VHE. En algunas realizaciones del procedimiento, el virus se produce en un cultivo celular in vitro. En algunas realizaciones del procedimiento, el cultivo celular in vitro comprende una linea celular establecida. En algunas realizaciones del procedimiento, la linea celular establecida se selecciona de un grupo que consiste en HepG2 (numero ATCC HB-8065) y HepG2/C3A (numero ATCC CRL-10741). En algunas realizaciones del procedimiento, el tratamiento con detergente es con dodecil sulfato de litio y/o Triton X-100. En algunas realizaciones del procedimiento, la concentracion de Triton X-100 es del 0,5% y la concentracion de LDS es del 0,1%. En algunas realizaciones del procedimiento, la etapa de tratamiento se lleva a cabo durante 1 hora. En algunas realizaciones del procedimiento, la muestra es un sobrenadante obtenido a partir de la ultracentrifugacion de una suspension de lisado celular infectado con virus clarificado. En algunas realizaciones del procedimiento, de manera opcional, la muestra es una fraccion retenida derivada de la filtracion de flujo tangencial de una suspension de lisado celular infectado con virus clarificado.
Realizaciones preferentes adicionales - 2
En algunas realizaciones, un procedimiento para medir el nivel de un virus no envuelto o pseudoenvuelto en una muestra comprende las etapas de:
a) proporcionar la muestra a una mezcla que comprende una celula y un medio de cultivo;
b) incubar para permitir la propagacion del virus no envuelto o el virus pseudoenvuelto, si esta presente en la muestra, para obtener una fraccion incubada;
c) tratar con al menos un detergente para obtener una fraccion tratada; en el que el detergente se selecciona del grupo que consiste en Triton X-100 al 0,5% y una mezcla de Triton X-100 al 0,5% y dodecil sulfato de litio al 0,1%
d) recoger una parte de la fraccion tratada para obtener una fraccion recogida; y
e) medir el nivel del virus no envuelto o el virus pseudoenvuelto en la fraccion recogida.
En algunas realizaciones del procedimiento, la muestra se obtiene de un mamifero. En algunas realizaciones del procedimiento, la muestra comprende plasma o sangre. En algunas realizaciones del procedimiento, el virus no envuelto o pseudoenvuelto es el VHA. En algunas realizaciones del procedimiento, el virus no envuelto o pseudoenvuelto es el PVP. En algunas realizaciones preferentes del procedimiento, el virus no envuelto o pseudoenvuelto es el VHE. En algunas realizaciones del procedimiento, el virus se produce en un cultivo celular. En algunas realizaciones del procedimiento, la celula se selecciona del grupo que consiste en HepG2 (numero ATCC HB-8065) y HepG2/C3A (numero ATCC CRL-10741). En algunas realizaciones del procedimiento, la muestra comprende una primera fraccion retenida obtenida mediante la filtracion de flujo tangencial de una parte de la fraccion incubada a traves de una membrana. En algunas realizaciones del procedimiento, la muestra comprende, de manera opcional, un primer sobrenadante obtenido mediante la filtracion de flujo tangencial de una parte de la fraccion incubada a traves de una membrana para obtener una primera fraccion retenida y la centrifugacion de la primera fraccion retenida. En algunas realizaciones del procedimiento, la muestra se trata con al menos el primer detergente o, de manera opcional, una mezcla de detergentes seleccionados del grupo que consiste en Triton X-100 al 0,5% y una mezcla de Triton X-100 al 0,5% y dodecil sulfato de litio al 0,1% para obtener una primera solucion. En algunas realizaciones, el procedimiento comprende ademas:
a) proporcionar un primer precipitado obtenido mediante la centrifugacion de la primera solucion;
b) proporcionar una segunda solucion obtenida mediante la resuspension del primer precipitado en PBS; c) proporcionar una tercera solucion obtenida mediante la clarificacion de la segunda solucion;
d) proporcionar un primer filtrado obtenido mediante la filtracion de la tercera solucion utilizando una membrana; y
e) proporcionar una segunda fraccion retenida obtenida mediante la ultrafiltracion del primer filtrado, en el que la segunda fraccion retenida comprende la fraccion tratada.
En algunas realizaciones del procedimiento, la medicion del nivel de virus no envuelto o pseudoenvuelto comprende detectar una sustancia biologica. En algunas realizaciones del procedimiento, la sustancia biologica comprende una secuencia de polinucleotido y/o una secuencia de polipeptido de un virus. En algunas realizaciones del procedimiento, la sustancia biologica es un acido ribonucleico del VHE. En algunas realizaciones del procedimiento, la medicion de la sustancia biologica comprende:
a) proporcionar una primera mezcla de reaccion que comprende el acido ribonucleico viral obtenido mediante la mezcla de una parte de la fraccion tratada con una solucion de lisis;
b) proporcionar una segunda mezcla de reaccion obtenida mediante la adicion de un primer reactivo a la primera mezcla de reaccion, en el que la segunda mezcla de reaccion comprende un acido desoxirribonucleico que es complementario al ARN viral;
c) anadir, a la segunda mezcla de reaccion, un segundo reactivo que es complementario a una secuencia dentro del acido desoxirribonucleico;
d) anadir, a la segunda mezcla de reaccion, un tercer reactivo que es complementario a una secuencia dentro del acido desoxirribonucleico;
e) amplificar la secuencia comprendida por el segundo y el tercer reactivos dentro del acido desoxirribonucleico; y
f) medir la concentracion de la secuencia amplificada.
En algunas realizaciones del procedimiento, el segundo reactivo y el tercero reactivo comprenden una secuencia de oligonucleotidos seleccionada del grupo que consiste en:
a) 5'-CGGCTATCGGCCAGAAGTT-3' (SEQ ID NO:1);
b) 5'-CCGTGGCTATAACTGTGGTCT-3' (SEQ ID NO:2) y
c) 5'-FAM-TTTTTACGC-ZEN-AGGCTGCCAAGGCC-3IABkFQ-3' (SEQ ID NO:3).
Realizaciones preferentes adicionales - 3
En algunas realizaciones, para la clarificacion del virus, se utiliza un concentrado de virus en crudo congelado. En algunas realizaciones, cuando se prepara un concentrado de virus no envuelto concentrado y purificado, se anaden Triton X-100 al 0,5% y LDS al 0,1% al concentrado de virus en crudo descongelado y se incuba a 37°C durante 1 hora.
En algunas realizaciones, la clarificacion del concentrado de virus en crudo descongelado se lleva a cabo mediante centrifugacion a una velocidad de 3.000 a 8.000 xg durante 15 a 30 minutos a entre 2°C y 8aC. En algunas realizaciones, se retira y conserva el sobrenadante y el precipitado se descarta. En algunas realizaciones, el
sobrenadante se filtra a traves de un filtro de 0,45 p.m, antes de la filtracion de flujo tangencial a traves de una membrana de 300 kDa y se recoge una fraccion retenida TFF.
En algunas realizaciones, para la ultracentrifugacion, la fraccion retenida TFF se ultracentrifuga en tubos de ultracentrifuga en un robot basculante a entre 2aC y 82C durante 1,5 horas a aproximadamente 85.000 xg. En algunas realizaciones, el sobrenadante de la ultracongelacion se decanta y descarta como deshecho liquido.
En algunas realizaciones, para la ultracongelacion, el precipitado de la ultracongelacion se resuspende en no menos de 5 ml de tampon, tal como PBS. En algunas realizaciones, la suspension de precipitado se clarifica a entre 3.000 y 4.200 xg durante 15 minutos a entre 2°C y 8°C. En algunas realizaciones, el sobrenadante se retira y coloca en el dispositivo de Filtrado Amicon® UF para concentrar. En algunas realizaciones, si es necesario, se anade tampon, tal como PBS, para llevar el volumen final a aproximadamente 15 ml (la capacidad del filtro es de 15 ml).
En algunas realizaciones, el dispositivo de filtrado se centrifuga a aproximadamente 5.000 xg a entre 2°C y 8°C hasta que el volumen final de la muestra retenida (concentrado de virus concentrado y purificado) no es superior a 1 ml. En algunas realizaciones, el tiempo aproximado de centrifugacion es de aproximadamente 15 a aproximadamente 60 minutos.
En algunas realizaciones, el concentrado de virus concentrado y purificado se alicuota y se congela a no mas de -65°C.
EJEMPLOS
Ejemplo 1. Preparacion de concentrados de VHE por TFF.
La filtracion de flujo tangencial (TFF, por sus siglas en ingles) es un procedimiento bien conocido para la separacion y concentracion de biomoleculas. Existe informacion adicional relativa a TFF facilmente disponible, por ejemplo, en “Introduction to Tangential Flow Filtration for Laboratory and Process Development Applications” (“Introduccion a la filtracion de flujo tangencial para laboratorio y aplicaciones en el desarrollo de procedimientos”), de Larry Schwartz y otros (pall.com/main/laboratory/literature-library-details.page?id=34212).
Se congelaron y descongelaron dos veces celulas HepG2 o HepG2/C3A infectadas con VHE y se clarificaron mediante centrifugacion a baja velocidad y el paso a traves de un filtro de 0,45 pmi. La solucion clarificada (~ 1 l) se concentro diez veces mediante TFF a traves de dos membranas de 300 kDa y la fraccion retenida por TFF resultante (~ 100 ml) se centrifugo a aproximadamente 85,000xg, 90 minutos, 4°C para precipitar el virus. Se recogio el sobrenadante de la ultracentrifuga (~ 100 ml) y se guardo para el procesamiento Supe t Ff del VHE (ejemplo 2), mientras que el precipitado se resuspendio en pBs . A continuacion, el precipitado resuspendido se filtro a traves de un filtro con un poro de 0,2 pmi y se ultrafiltro a traves de una membrana de 100 kDa hasta un volumen final de aproximadamente 2 ml. La solucion se esterilizo por filtracion a traves de filtro de 0,2 pmi o 0,1 pmi y se almaceno a 5°C hasta su utilizacion como preparacion de concentrado de VHE por TFF.
Ejemplo 2. Preparacion de concentrados de VHE de sobrenadante TTF (VHE de Supe TFF).
Los lipidos asociados con los VHE derivados de cultivo celular aumentan la flotacion del virus y, de este modo, disminuyen la eficacia de la precipitacion del virus mediante ultracentrifugacion. De este modo, en algunas realizaciones de la presente invencion, se anade una mezcla de detergentes que comprende Triton X-100 y dodecil sulfato de litio (LDS, por sus siglas en ingles) a fluidos que comprenden VHE para eliminar los lipidos asociados y para aumentar la recuperacion de los virus.
Se trataron aproximadamente 100 ml del sobrenadante de la ultracentrifuga, que resulto de la TFF y la ultracentrifugacion de los lisados celulares infectados con VHE clarificados (~ 1 l) del ejemplo 1, con Triton X-100 al 0,5% y LDS al 0,1% durante no menos de 30 minutos, 37°C, antes de la ultracentrifugacion a traves de una almohadilla de sacarosa al 30% a 100.000xg, durante 8 horas, 5°C. El precipitado resultante se resuspendio en PBS, se filtro a traves de un filtro con un poro de 0,2 pmi y se ultrafiltro a traves de una membrana de 100 kDa hasta un volumen final de aproximadamente 1 ml. La solucion se paso entonces a traves de un filtro de 0,2 pmi o 0,1 pmi y se almaceno a 5°C hasta su utilizacion como preparacion de concentrado de VHE de Supe TFF.
Ejemplo 3. Comparacion de la pureza de los concentrados de virus generados segun los procedimientos de los ejemplos 1 y 2.
Se utilizo SDS-PAGE para comparar la pureza relativa de los concentrados de virus generados segun los procedimientos de los ejemplos 1 y 2. Tal como se muestra en la figura 2, se extrajeron alicuotas de las siguientes muestras para A280 y PCR cuantitativa: VHE inicial en crudo, fraccion retenida por TFF, sobrenadante de la ultracentrifuga, VHE por TFF y VHE de Supe TFF. La fraccion retenida por TFF y el sobrenadante de la ultracentrifuga tenian 10 veces mas proteina, medida mediante A280, que VHE inicial en crudo y VHE por TFF, y 40
veces mas que VHE de Supe TFF (figura 2). Aunque las concentraciones de proteina eran diferentes, las concentraciones de ARN de VHE en todas las muestras, excepto VHE inicial en crudo, eran aproximadamente 9 logi0
La pureza relativa de las muestras pudo visualizarse mediante SDS-PAGE (figura 2). Las muestras se diluyeron o concentraron hasta aproximadamente 4 UA antes del calentamiento en tampon de muestra que contenia DTT y la carga en geles con un gradiente del 4-20%. Tambien se cargaron medios de cultivo celular como control de fondo. Despues del SDS-PAGE, se extrajeron los geles y se tineron con Instant Blue. Los resultados fueron consistentes con los datos de A280 y de la PCR, mostrando los niveles de impurezas mas altos en la fraccion retenida por TFF y el sobrenadante de la ultracentrifuga. La proteina mas abundante presento una banda a aproximadamente 70 kDa. Dado que tambien estaba presente en los medios de cultivo celular, era probablemente una proteina que se encuentra en el suero bovino fetal, un complemento del medio necesario para la propagacion celular y del virus y un contaminante no viral que podria interferir en los estudios de purificacion aguas abajo. La mayor parte del contaminante se elimino durante el procedimiento de purificacion descrito en los ejemplos 1 y 2 y sus concentraciones relativas eran las mas bajas en VHE de Supe TFF, seguido por VHE por TFF.
Ejemplo 4. Comparacion de la estabilidad termica de los concentrados de virus generados segun los procedimientos de los ejemplos 1 y 2.
Se realizaron experimentos para comparar la estabilidad termica de los concentrados de VHE por TFF y VHE de Supe TFF que habian sido preparadas segun los ejemplos 1 o 2. Ambas preparaciones de virus se anadieron en PBS y se incubaron durante 4 horas a 5°C, 60°C, 70°C u 80°C. Se extrajeron alicuotas de cada solucion de prueba y se titularon de la siguiente manera. Se realizaron diluciones en serie de una muestra y se anadieron a pocillos sembrados con celulas HepG2 o HepG2/C3A. Los virus se dejaron adsorber durante no menos de 1 hora a 37°C y se anadio medio de crecimiento. Las placas se incubaron a 37°C durante no menos de 2 dias antes de aspirar el medio de los pocillos y de lavar/aspirar las celulas no menos de 2 veces con tampon (por ejemplo, PBS). Las placas se extrajeron a continuacion para el ARN viral, utilizando el microkit de Dynabeads® mRNA Direct® (Life Technologies), o se almacenaron a no mas de -65°C hasta la extraccion. Despues de la extraccion, las fracciones eluidas (poli A ARN) se procesaron inmediatamente para la amplificacion por PCR o se almacenaron a no mas de -65°C hasta la amplificacion por PCR.
Se utilizo una RT-PCR de una etapa para detectar el ARN del VHE en las muestras, utilizando los siguientes cebadores y sondas tal como se han descrito anteriormente. Las condiciones del ensayo para cada reaccion fueron las siguientes:
a) Reactivos: 5.0 p.l 4x mezcla maestra TaqMan® Fast Virus 1-Step (Life Technologies), 0,08 p.l de cebadores F R (por sus siglas en ingles, directo inverso) 100 mM, 0,04 p.l de sonda 100 mM, 0,4 p.l de SUPERase In (Life Technologies), 4,4 p.l de agua y 10 p.l de plantilla (en total 20 p.l)
b) Reaccion: 52°C durante 10 minutos, 95°C durante 30 segundos y 40 ciclos de 95°C durante 15 segundos, 56°C durante 45 segundos
Las determinaciones de los valores de la PCR y de los umbrales de ciclo (Ct) se realizaron utilizando un sistema PCR a tiempo real AB 7500 (Applied Biosystems, Foster City, CA) y con el software que lo acompana segun las instrucciones del fabricante. En base a los datos historicos, el umbral se fijo manualmente a 0,1, por lo que paso a traves de la fase exponencial de todas las curvas estandar, y se aseguro la deteccion de 1 copia de a Rn por reaccion. Se registro una senal positiva de PCR, que indica la presencia de ARN del VHE, cada vez que se cruzo el umbral.
Todos los pocillos en una placa de titulacion de VHE se puntuaron como positivos o negativos en base a en la presencia o ausencia de una senal PCR positiva. Los titulos de virus se calcularon a continuacion como DICT50/ml utilizando los procedimientos estadisticos apropiados: Spearman-Karber, NMP o Poisson.
Tabla 1. Resultados obtenidos a partir de experimentos que comparan
la estabilidad termica de concentrados de virus en PBS
Tal como se muestra en la Tabla 1, la inactivacion de virus era hacia el limite de deteccion a 602C, 70°C y 802C cuando se prepararon concentrados de virus segun una realizacion del procedimiento de la presente invencion (ejemplo 2). Por otra parte, cuando se utilizaron concentrados obtenidos segun el ejemplo 1 (procedimiento del estado de la tecnica, sin tratamiento con detergente), los virus estaban todavia presentes despues de calentar durante 4 horas a 70°C o 80°C.
Los datos de los informes publicados sugieren que la estabilidad termica de los concentrados de virus generados segun el ejemplo 1 difiere del comportamiento del VHE que se encuentra en la naturaleza. Por ejemplo, los virus entericos humanos son algunos de los virus conocidos mas resistentes al calor y los estudios han demostrado un 90% de inactivacion del virus de hepatitis A, virus de la polio y calicivirus felino, anadidos en PBS, despues de calentar a 72°C durante 18,35, 5,44, y 7,39 segundos (Suphachai N, Cliver DO. 2002. J Virol Methods 104: 217-225). Ademas de 1 hora, el calentamiento a 60°C de una suspension del higado que contiene VHE de jabali, que esta estrechamente relacionado con el VHE humano, dio lugar a 4,42 log10 de reduccion del virus (Schielke A, y otros 2011. Virol Jol 8: 487-495). De este modo, los concentrados de VHE generados segun el procedimiento de ejemplo 1 (procedimiento del estado de la tecnica, sin tratamiento con detergente) pueden no evaluar con precision la reduccion de los aislados clinicos de VHE en estudios de eliminacion de virus.
Por otra parte, los concentrados de virus generados segun el procedimiento de la presente invencion (ejemplo 2) se inactivaron completamente mediante tratamiento termico, de manera similar a lo observado en el VHE que se encuentra en la naturaleza. Por lo tanto, el virus preparado, segun el procedimiento de la presente invencion, puede ser un concentrado mas apropiado para utilizar en estudios de eliminacion de virus. De este modo, en algunas realizaciones, se prepara un concentrado de virus segun el procedimiento del ejemplo 2.
Ejemplo 5. Aplicacion de los procedimientos de preparacion y ensayos de VHE en experimentos de calentamiento en seco
Como prueba de concepto, se prepararon concentrados de VHE por TFF y VHE de Supe TFF tal como se ha descrito en los ejemplos 1 y 2 y se probaron en experimentos para evaluar la reduccion y/o eliminacion del virus durante la etapa de liofilizacion/calentamiento en seco (FD/DH, por sus siglas en ingles) de un procedimiento de fabricacion de concentrado de Factor VIII. La etapa FD/DH es la ultima etapa del procedimiento de fabricacion y aguas abajo de una etapa de tratamiento con disolvente/detergente (S/D, por sus siglas en ingles).
Para los experimentos de FD/DH, se colocaron en viales alicuotas de concentrado de factor VIII al que se le anadio VHE por t Ff o VHE de Supe TFF y se liofilizaron en un liofilizador a escala de laboratorio utilizando el mismo ciclo de liofilizacion que a escala de fabricacion. Los viales liofilizados se colocaron a continuacion en un horno a 80°C y se calentaron en seco durante hasta 75 horas.
Los viales de producto al que se le ha anadido el virus para titulacion se extrajeron antes (inicial) y despues de la liofilizacion y sin calentamiento en seco (FD/DH 0 h), despues de la liofilizacion, seguida de calentamiento en seco durante 24 horas (FD/DH 24 h), y despues de la liofilizacion, seguida de calentamiento en seco durante 75 horas (FD/DH 75 horas). El producto al que se le ha anadido el virus FD/DH se reconstituyo con agua de pureza elevada hasta su volumen original, se diluyo en serie y se inoculo en celulas HepG2 o HepG2/C3A que se sembraron en una placa de 96 pocillos. El virus se adsorbio, se anadio un medio de recubrimiento final y las placas se colocaron en una incubadora a 37°C durante no menos de 3 dias. A continuacion, se extrajeron las placas de titulacion, se aspiraron y se extrajo el ARN viral o se almacenaron a -80°C hasta la extraccion. El ARN extraido de cada pocillo se analizo para determinar el VHE mediante PCR tal como se ha descrito en el ejemplo 3. Los pocillos de titulacion se puntuaron como positivos o negativos para VHE y se determinaron los titulos de virus. Se calculo el log10 de reduccion de VHE durante la etapa mediante la comparacion los log10 de los titulos de virus en los viales iniciales y finales (FD/DH 75 horas).
Tabla 2. Resultados obtenidos a partir de experimentos que comparan la reduccion de VHE r TFF HE TFF m i n n r mi n l n mi n n
Tal como se muestra en la tabla 2, los titulos de ambos preparaciones de concentrado fueron similares antes y despues de la liofilizacion y la reduccion mediante liofilizacion no fue significativa (menos de 1 log10). Por el contrario, la inactivacion de virus mediante tratamiento termico en seco a 80°C fue significativa (mas de 1 log10) y superior para VHE de Supe TFF (LRV = 4,6) que VHE por TFF (LRV = 3,4). La presencia probable de niveles elevados de
contaminantes en el concentrado de VHE por TFF preparada segun el procedimiento del ejemplo 1 puede haber protegido el virus de la inactivacion por calor o puede haber impedido la destruccion eficaz del ARN encapsidado del VHE.
Dado que el material de partida para la ultimo etapa del tratamiento con FD/DH es tratado con S/D en la penultima etapa, cualquier contaminante potencial del virus que podria estar presente en la corriente del procedimiento de fabricacion de concentrado de Factor VIII se deslipidaria y presumiblemente seria mas similar a VHE de Supe TFF (preparado segun el procedimiento del ejemplo 2) que el VHE por TFF (preparado segun el procedimiento del ejemplo 1). De este modo, el LRV para el VHE de Supe TFF es mas probablemente una evaluacion mas precisa de la capacidad de reduccion de VHE de la etapa de tratamiento con FD/DH.
Ejemplo 6. Preparacion de concentrados de VHE por TFF tratados con detergente.
El procedimiento para la preparacion de VHE de Supe TFF es relativamente largo. Por lo tanto, se desarrollaron procedimientos adicionales para el tratamiento con detergente para la preparacion de concentrados de VHE por TFF. Tal como se muestra en la figura 3, se siguio el mismo procedimiento para la preparacion de VHE por TFF que en el ejemplo 1, excepto que, segun algunas realizaciones de la presente invencion, se insertaron etapas para el tratamiento de la fraccion retenida por TFF con varios detergentes antes de la ultracentrifugacion a 85.000xg, 1,5 horas, 5°C. Se incubaron preparaciones VHE por TFF con Triton con Triton X-100 al 0,5% durante 1,5 horas, 37°C, mientras que se utilizo Triton X-100 al 0,5% LDS al 0,1% para tratar los concentrados de VHE por TFF con Triton/LDS. Despues de la ultracentrifugacion, solo los precipitados se procesaron posteriormente en los concentrados de virus. Los procedimientos para preparar el VHE por TFF y el VHE por TFF tratado con detergente se compararon mediante la extraccion de fracciones intermedias de los procedimientos de purificacion y la titulacion de virus tal como se ha descrito previamente en el ejemplo 3. Los resultados se muestran en la tabla 3.
Tabla 3. Comparacion de los procedimientos para preparar el VHE
r TFF l HE r TFF r n r n
Las recuperaciones de los virus fueron comparables para los procedimientos de VHE por TFF y de VHE por TFF con Triton/LDS, conteniendo las preparaciones finales de los concentrados aproximadamente 8,3 log10 de VHE. El procedimiento del VHE por t Ff con Triton fue menos eficaz en la precipitacion del virus, ya que la mayoria de los virus de entrada se perdieron en la fraccion del sobrenadante de la ultracentrifuga, y se produjo un concentrado con menos de 7 log10 de VHE.
Ejemplo 7. Aplicacion de los procedimientos de preparacion y ensayo de VHE en experimentos de calentamiento en lfquido
La pasteurizacion es la ultima etapa en el procedimiento de fabricacion de albumina e implica calentar viales de producto muy purificado a 60°C durante no menos de 10 horas. El virus se preparo tal como se ha descrito en el ejemplo 6 y se anadio en albumina al 25% antes de la incubacion a 5°C o 60°C durante 7 horas. A continuacion, se extrajeron las muestras para la titulacion del virus y los resultados se muestran en la tabla 4. Como comparador, tambien se presentan datos de la pasteurizacion (10 horas, 60°C) de albumina al 25% a la que se le ha anadido VHE de Supe TFF (preparado segun el procedimiento del ejemplo 2).
Tabla 4. Resultados obtenidos a partir de experimentos para comparar la reduccion del VHE r TFF l HE^ r TFF r n r n m i n l n mi n n li i
El VHE por TFF fue el virus de prueba mas resistente al calor y mostro solo una reduccion de 2,3 logi0 en el titulo despues del tratamiento termico. El LRV para VHE por TFF con Triton fue de aproximadamente un logi0 superior, aun cuando su titulo de partida era de aproximadamente un logi0 menor que v He por TFF. El LRV para v He por TFF tratado con Triton/LDS fue el mas elevado entre las tres preparaciones de VHE por TFF y ligeramente inferior que la reduccion conseguida despues de la pasteurizacion de la albumina a la que se le habia anadido VHE de Supe TFF, una preparacion de virus tambien tratada con Triton/LDS.
Ejemplo 8. Concentracion y purificacion de virus mediante TFF, ultracentrifugacion y ultrafiltracion.
Para la clarificacion de virus, se descongelo concentrado de virus en crudo congelado. Para preparar un concentrado de virus concentrado y purificado de virus no envueltos se anadio Triton X-100 al 0,5% y LDS al 0,1% al concentrado de virus en crudo descongelado y se incubo a 37°C durante 1 hora. La clarificacion se llevo a cabo por centrifugacion a una velocidad entre 3.000 a 8.000 xg durante de 15 a 30 minutos a entre 2°C y 8°C. Se extrajo y se conservo el sobrenadante y el precipitado se descarto. Se filtro el sobrenadante a traves de un filtro de 0,45 pmi. Para la TFF, el sistema de TFF se limpio y preparo para la filtracion. El concentrado de virus filtrado se clarifico. Para la ultracentrifugacion, la fraccion retenida de TFF se coloco en tubos de ultracentrifuga. Los tubos se equilibraron hasta que los pesos estuvieron dentro de ±0,05g el uno del otro. Los tubos se cargaron en el rotor basculante y se centrifugaron a entre 2°C y 8°C durante 1,5 horas a aproximadamente 85.000 xg. Al final de la ultracentrifugacion, el sobrenadante de cada uno de los tubos de centrifuga se decanto con cuidado y se descarto como deshecho liquido. Los tubos se invirtieron y se dejaron escurrir en una toalla absorbente durante aproximadamente 5 minutos a temperatura ambiente. Tras el escurrido, la toalla se descontamino y se deshecho. Para la ultracentrifugacion, el precipitado de la ultracentrifugacion se resuspendio en no menos de 5 ml de PBS. La suspension de precipitado se clarifico a entre 3.000 y 4.200 xg durante 15 minutos a entre 2°C y 8°C. Se extrajo el sobrenadante y se coloco en un dispositivo de filtracion Amicon® UF para concentrar. En caso necesario, se anadio PBS para llevar el volumen final a aproximadamente 15 ml (la capacidad del filtro es de 15 ml). El dispositivo de filtro tapado se coloco en el rotor de la centrifuga y el rotor se equilibro con un contrapeso. La centrifugacion se llevo a cabo a aproximadamente 5.000 xg a entre 2°C y 8°C hasta que el volumen final de la muestra retenida (concentrado de virus concentrado y purificado) no fue mas de 1 ml (el tiempo aproximado de centrifugacion fue de 15 a 60 minutos).
DEFINICIONES
HepG2: Celulas de carcinoma hepatocelular obtenidas de la American Type Culture Collection (numero ATCC HB-8065)
DMEM: Medio Eagle modificado por Dulbecco
FBS: Suero bovino fetal
Titulo: Concentracion de una sustancia (virus) en solucion o la fuerza de dicha sustancia determinada mediante titulacion
SK: Spearman-Karber es un metodo estadistico para el calculo de titulos de virus en muestras con concentraciones relativamente elevadas de virus. Este metodo se utiliza cuando la proporcion de pocillos positivos en cualquier dilucion es superior al 25% (figura 1).
MPN: Numero Mas Probable es un metodo estadistico para el calculo de titulos de virus en muestras con concentraciones relativamente bajas de virus. MPN se utiliza cuando la proporcion de pocillos positivos en todas las diluciones es inferior al 25%.
Poisson: Poisson es un metodo estadistico para el calculo de titulos de virus en muestras con concentraciones extremadamente bajas de virus. Este metodo se utiliza cuando no se observan pocillos positivos. ATCC: American Type Culture Collection (Coleccion americana de cultivos tipo)
Fraccion retenida de VHE por TFF: Es el material que permanece despues de que se haya concentrado el lisado de celulas de VHE clarificado utilizando una membrana de TFF de 300 kDa. La fraccion retenida de VHE por TFF se utiliza para preparar concentrados de VHE por TFF.
Sobrenadante de VHE por TFF es el efluente que permanece despues de la centrifugacion de la fraccion retenida de
Claims (23)
1. Procedimiento de purificacion de un virus no envuelto o pseudoenvuelto propagado en un cultivo celular, comprendiendo el procedimiento una etapa de tratar una muestra que comprende el virus no envuelto o pseudoenvuelto con un detergente, caracterizado por que el detergente se selecciona del grupo que consiste en Triton X-100 al 0,5% y una mezcla de Triton X-100 al 0,5% y dodecil sulfato de litio al 0,1%.
2. Procedimiento, segun la reivindicacion 1, caracterizado por que el virus propagado en un cultivo celular es el virus de la hepatitis E (VHE).
3. Procedimiento, segun la reivindicacion 1, caracterizado por que el virus propagado en un cultivo celular es, o bien el virus de la hepatitis A (VHA) o bien el parvovirus porcino (PVp).
4. Procedimiento, segun la reivindicacion 1, caracterizado por que el virus se produce en un cultivo celular in vitro.
5. Procedimiento, segun la reivindicacion 4, caracterizado por que el cultivo celular in vitro comprende una linea celular establecida.
6. Procedimiento, segun la reivindicacion 5, caracterizado por que la linea celular establecida se selecciona de un grupo que consiste en HepG2 (numero ATCC HB-8065) y HepG2/C3A (numero ATCC CRL-10741).
7. Procedimiento, segun la reivindicacion 1, caracterizado por que la etapa de tratamiento se lleva a cabo durante 1 hora.
8. Procedimiento, segun la reivindicacion 1, caracterizado por que la muestra es un sobrenadante obtenido a partir de la ultracentrifugacion de una suspension de lisado celular infectado con virus clarificado.
9. Procedimiento, segun la reivindicacion 1, caracterizado por que la muestra es una fraccion retenida derivada de la filtracion de flujo tangencial de una suspension de lisado celular infectado con virus clarificado.
10. Procedimiento para medir el nivel de un virus no envuelto o pseudoenvuelto en una muestra, caracterizado por que la muestra comprende plasma o sangre de un mamifero, comprendiendo el procedimiento las etapas de: a) proporcionar la muestra a una mezcla que comprende una linea celular y un medio de cultivo;
b) incubar para permitir la propagacion del virus no envuelto o el virus pseudoenvuelto, si esta presente en la muestra, para obtener una fraccion incubada;
c) tratar con al menos un detergente para obtener una fraccion tratada; en el que el detergente se selecciona del grupo que consiste en Triton X-100 al 0,5% y una mezcla de Triton X-100 al 0,5% y dodecil sulfato de litio al 0,1%
d) recoger una parte de la fraccion tratada para obtener una fraccion recogida; y
e) medir el nivel del virus no envuelto o pseudoenvuelto en la fraccion recogida.
11. Procedimiento, segun la reivindicacion 10, caracterizado por que el virus no envuelto o pseudoenvuelto es VHE.
12. Procedimiento, segun la reivindicacion 10, caracterizado por que el virus no envuelto o pseudoenvuelto es, o bien VHA o bien PVP.
13. Procedimiento, segun la reivindicacion 10, caracterizado por que el virus se propaga en un cultivo celular in vitro que comprende una linea celular establecida.
14. Procedimiento, segun la reivindicacion 10, caracterizado por que la linea celular se selecciona del grupo que consiste en HepG2 (numero ATCC HB-8065) y HepG2/C3A (numero ATCC CRL-10741).
15. Procedimiento, segun la reivindicacion 10, caracterizado por que la muestra comprende una primera fraccion retenida obtenida mediante la filtracion de flujo tangencial de una parte de la fraccion incubada a traves de una membrana.
16. Procedimiento, segun la reivindicacion 10, caracterizado por que la muestra comprende un primer sobrenadante obtenido mediante la filtracion de flujo tangencial de una parte de la fraccion incubada a traves de una membrana para obtener una primera fraccion retenida y la centrifugacion de la primera fraccion retenida.
17. Procedimiento, segun la reivindicacion 10, caracterizado por que la muestra se trata con al menos un detergente o una mezcla de detergentes para obtener una primera solucion.
18. Procedimiento, segun la reivindicacion 17, caracterizado por que el procedimiento comprende ademas:
a) proporcionar un primer precipitado obtenido mediante la centrifugacion de la primera solucion; b) proporcionar una segunda solucion obtenida mediante la resuspension del primer precipitado en PBS; c) proporcionar una tercera solucion obtenida mediante la clarificacion de la segunda solucion;
d) proporcionar un primer filtrado obtenido mediante la filtracion de la tercera solucion utilizando una membrana; y
e) proporcionar una segunda fraccion retenida obtenida mediante la ultrafiltracion del primer filtrado, en el que la segunda fraccion retenida comprende la fraccion tratada.
19. Procedimiento, segun la reivindicacion 10, caracterizado por que la medicion del nivel de virus no envuelto o pseudoenvuelto comprende detectar una sustancia biologica.
20. Procedimiento, segun la reivindicacion 19, caracterizado por que la sustancia biologica comprende una secuencia de polinucleotido y/o una secuencia de polipeptido de un virus.
21. Procedimiento, segun la reivindicacion 20, caracterizado por que la sustancia biologica es un acido ribonucleico de VHE.
22. Procedimiento, segun la reivindicacion 21, caracterizado por que la medicion de la sustancia biologica comprende:
a) proporcionar una primera mezcla de reaccion que comprende el acido ribonucleico de VHE obtenido mediante la mezcla de una parte de la fraccion tratada con una solucion de lisis;
b) proporcionar una segunda mezcla de reaccion obtenida mediante la adicion de un primer reactivo a la primera mezcla de reaccion, en el que la segunda mezcla de reaccion comprende un acido desoxirribonucleico que es complementario al acido ribonucleico del VHE;
c) anadir, a la segunda mezcla de reaccion, un segundo reactivo que es, como minimo, parcialmente complementario a una secuencia dentro del acido desoxirribonucleico;
d) anadir, a la segunda mezcla de reaccion, un tercer reactivo que es, como minimo, parcialmente complementario a una secuencia dentro del acido desoxirribonucleico;
e) amplificar la secuencia comprendida por el segundo y el tercer reactivos dentro del acido desoxirribonucleico; y
f) medir la concentracion de la secuencia amplificada.
23. Procedimiento, segun la reivindicacion 22, caracterizado por que el segundo reactivo y el tercero reactivo comprenden una secuencia de oligonucleotidos seleccionada del grupo que consiste en:
a) 5'-CGGCTATCGGCCAGAAGTT-3' (SEQ ID NO:1);
b) 5'-CCGTGGCTATAACTGTGGTCT-3' (SEQ ID NO:2) y
c) 5'-FAM-TTTTTACGC-ZEN-AGGCTGCCAAGGCC-3IABkFQ-3' (SEQ ID NO:3).
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201562196004P | 2015-07-23 | 2015-07-23 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2712664T3 true ES2712664T3 (es) | 2019-05-14 |
Family
ID=56418394
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES16179299T Active ES2712664T3 (es) | 2015-07-23 | 2016-07-13 | Procedimientos de purificación de un virus producido in vitro y ensayo de eliminación del virus |
Country Status (21)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US10336988B2 (es) |
| EP (1) | EP3121268B1 (es) |
| JP (1) | JP6734137B2 (es) |
| KR (1) | KR102205026B1 (es) |
| CN (1) | CN106367402B (es) |
| AR (1) | AR105439A1 (es) |
| AU (1) | AU2016206243B2 (es) |
| BR (1) | BR102016016678A2 (es) |
| CA (1) | CA2937089C (es) |
| ES (1) | ES2712664T3 (es) |
| IL (1) | IL246769B (es) |
| MX (1) | MX2016009266A (es) |
| MY (1) | MY179359A (es) |
| PL (1) | PL3121268T3 (es) |
| PT (1) | PT3121268T (es) |
| RU (1) | RU2691026C1 (es) |
| SG (1) | SG10201605869QA (es) |
| TR (1) | TR201902201T4 (es) |
| TW (1) | TW201704467A (es) |
| UY (1) | UY36795A (es) |
| ZA (1) | ZA201604895B (es) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA3087766A1 (en) | 2018-01-29 | 2019-08-01 | Grifols Diagnostic Solutions Inc. | A method to determine parvovirus b19 in clinical samples |
| KR20210079543A (ko) | 2019-12-20 | 2021-06-30 | 삼성전자주식회사 | 고대역폭 메모리 및 이를 포함하는 시스템 |
| JP2023141423A (ja) * | 2022-03-24 | 2023-10-05 | 国立大学法人 東京大学 | ウイルスの精製方法 |
| CN115181816B (zh) * | 2022-08-10 | 2023-01-06 | 杭州纽创生物检测有限公司 | 一种超低病毒滴度体系中病毒滴度的检测方法及其应用 |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4721675A (en) * | 1982-02-01 | 1988-01-26 | Abbott Laboratories | Production of hepatitis A virus in vitro utilizing a persistently virus infected cell culture system |
| DZ1706A1 (fr) | 1992-08-07 | 2002-02-17 | Merck & Co Inc | Vaccin contre le virus de l'hepatite a. |
| FR2696748B1 (fr) * | 1992-10-14 | 1994-12-30 | Pasteur Merieux Serums Vacc | Procédé de préparation d'antigènes et de vaccins de l'hépatite A (HAV). |
| CN101397335A (zh) * | 1998-06-24 | 2009-04-01 | 基因创新有限公司 | Hcv包膜蛋白颗粒:用于疫苗接种的用途 |
| US6942965B2 (en) * | 2001-10-12 | 2005-09-13 | Chiron Corporation | Hepatitis A virus nucleotide sequences, recombinant proteins and uses thereof |
| US20090042274A1 (en) | 2004-07-27 | 2009-02-12 | Genomidea Inc. | Method of Purifying Virus Envelope |
| US7944468B2 (en) * | 2005-07-05 | 2011-05-17 | Northrop Grumman Systems Corporation | Automated asymmetric threat detection using backward tracking and behavioral analysis |
| JP5034040B2 (ja) * | 2006-07-13 | 2012-09-26 | 国立大学法人鳥取大学 | 肝炎の診断キット及び診断マーカー |
| US9682133B2 (en) * | 2010-03-17 | 2017-06-20 | Cornell University | Disrupted adenovirus-based vaccine against drugs of abuse |
-
2016
- 2016-07-13 PL PL16179299T patent/PL3121268T3/pl unknown
- 2016-07-13 ES ES16179299T patent/ES2712664T3/es active Active
- 2016-07-13 EP EP16179299.9A patent/EP3121268B1/en active Active
- 2016-07-13 PT PT16179299T patent/PT3121268T/pt unknown
- 2016-07-13 TR TR2019/02201T patent/TR201902201T4/tr unknown
- 2016-07-13 IL IL246769A patent/IL246769B/en active IP Right Grant
- 2016-07-15 UY UY0001036795A patent/UY36795A/es unknown
- 2016-07-15 ZA ZA2016/04895A patent/ZA201604895B/en unknown
- 2016-07-15 MX MX2016009266A patent/MX2016009266A/es active IP Right Grant
- 2016-07-15 RU RU2016128956A patent/RU2691026C1/ru active
- 2016-07-18 SG SG10201605869QA patent/SG10201605869QA/en unknown
- 2016-07-18 MY MYPI2016702601A patent/MY179359A/en unknown
- 2016-07-19 AU AU2016206243A patent/AU2016206243B2/en active Active
- 2016-07-19 BR BR102016016678-0A patent/BR102016016678A2/pt active Search and Examination
- 2016-07-19 US US15/213,740 patent/US10336988B2/en active Active
- 2016-07-20 CN CN201610576006.2A patent/CN106367402B/zh active Active
- 2016-07-20 TW TW105122891A patent/TW201704467A/zh unknown
- 2016-07-22 CA CA2937089A patent/CA2937089C/en active Active
- 2016-07-22 AR ARP160102226A patent/AR105439A1/es unknown
- 2016-07-22 JP JP2016144066A patent/JP6734137B2/ja active Active
- 2016-07-22 KR KR1020160093643A patent/KR102205026B1/ko active IP Right Grant
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| SG10201605869QA (en) | 2017-02-27 |
| IL246769A0 (en) | 2016-12-29 |
| RU2691026C1 (ru) | 2019-06-07 |
| BR102016016678A2 (pt) | 2019-02-12 |
| EP3121268A1 (en) | 2017-01-25 |
| PT3121268T (pt) | 2019-02-26 |
| PL3121268T3 (pl) | 2019-06-28 |
| UY36795A (es) | 2016-09-30 |
| ZA201604895B (en) | 2021-04-28 |
| MY179359A (en) | 2020-11-05 |
| EP3121268B1 (en) | 2018-12-26 |
| KR102205026B1 (ko) | 2021-01-19 |
| AU2016206243B2 (en) | 2021-04-01 |
| US20170022480A1 (en) | 2017-01-26 |
| JP2017023144A (ja) | 2017-02-02 |
| CA2937089C (en) | 2024-02-06 |
| AU2016206243A1 (en) | 2017-02-09 |
| KR20170012141A (ko) | 2017-02-02 |
| IL246769B (en) | 2020-09-30 |
| US10336988B2 (en) | 2019-07-02 |
| TW201704467A (zh) | 2017-02-01 |
| CN106367402A (zh) | 2017-02-01 |
| CN106367402B (zh) | 2022-03-08 |
| MX2016009266A (es) | 2017-01-23 |
| JP6734137B2 (ja) | 2020-08-05 |
| CA2937089A1 (en) | 2017-01-23 |
| TR201902201T4 (tr) | 2019-03-21 |
| AR105439A1 (es) | 2017-10-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2712664T3 (es) | Procedimientos de purificación de un virus producido in vitro y ensayo de eliminación del virus | |
| Albariño et al. | Novel paramyxovirus associated with severe acute febrile disease, South Sudan and Uganda, 2012 | |
| Sadeghi et al. | Virome of US bovine calf serum | |
| Maggi et al. | Human gyrovirus DNA in human blood, Italy | |
| Liu | Molecular detection of human viral pathogens | |
| Oglesby et al. | Biochemical and biophysical properties of vesicular exanthema of swine virus | |
| WO2021172573A1 (ja) | ウイルスクリアランス性能の評価方法 | |
| ES2203688T3 (es) | Medicamento que contienen derivados plasmaticos de calidad garantizada y procedimiento de preparacion de tales derivados plasmaticos. | |
| CN102242173B (zh) | 一种石斑鱼虹彩病毒囊膜蛋白的提取方法 | |
| US20230078548A1 (en) | Method for evaluation of viability of viruses with lymphotropism properties | |
| Terry et al. | Rubella virus RNA: effect of high multiplicity passage | |
| CN104623701B (zh) | 一种有效灭活凝血酶原复合物中细小病毒方法及获得的制剂 | |
| KR20080109687A (ko) | 감염성 혈액으로부터 바이러스를 순수 분리정제하는 방법 | |
| BR102020016668A2 (pt) | Processo de produção de um antígeno, correspondente aos vírus sars-cov-2 inativado e seus usos | |
| Mesquita et al. | Hepatitis E Virus in Individuals Undergoing Heparin Therapy: An Observational Serological and Molecular Study | |
| Ummate et al. | Prevalence of Hepatitis C virus infection among haemodialysis patients in North-Eastern Nigeria | |
| Otsuki et al. | Analysis of the Effect of Sphingomyelinase on Rubella Virus Infectivity in Two Cell Lines | |
| JP2000351799A (ja) | フィブロネクチン溶液の製造方法 | |
| Rezvan et al. | A Preliminary Report on Prevalence of Antibody Response to GBV-C, E2 Protein in Iranian Blood Donors and Multitrans-fused Patients | |
| William et al. | Prevalence and detection of genotype of hepatitis C virus in chronic renal disease patients undergoing haemodialysis in tertiary care hospital in Punjab | |
| Al-Bayti et al. | Detection of Torque Teno virus in IRAQI hemodialysis patients | |
| Polley et al. | PREPARATION OF A STABLE NONINFECTIVE GROUP-SPECIFIC ADENOVIRUS DIAGNOSTIC ANTIGEN |