RU2691123C1 - Способ получения материала с высоким титром вируса гепатита Е и анализ титрования вируса гепатита Е - Google Patents
Способ получения материала с высоким титром вируса гепатита Е и анализ титрования вируса гепатита Е Download PDFInfo
- Publication number
- RU2691123C1 RU2691123C1 RU2016127546A RU2016127546A RU2691123C1 RU 2691123 C1 RU2691123 C1 RU 2691123C1 RU 2016127546 A RU2016127546 A RU 2016127546A RU 2016127546 A RU2016127546 A RU 2016127546A RU 2691123 C1 RU2691123 C1 RU 2691123C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- hev
- copies
- hepg2
- reaction mixture
- virus
- Prior art date
Links
- 241000724675 Hepatitis E virus Species 0.000 title claims abstract description 141
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 64
- 239000000463 material Substances 0.000 title description 15
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 title description 13
- 238000002941 microtiter virus yield reduction assay Methods 0.000 title description 2
- 229920000209 Hexadimethrine bromide Polymers 0.000 claims abstract description 44
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 16
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims abstract description 15
- 238000004448 titration Methods 0.000 claims abstract description 13
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 8
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 25
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 22
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 claims description 13
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 13
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 12
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 12
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 12
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 12
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 10
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 6
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 9
- 238000012258 culturing Methods 0.000 abstract 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 99
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 34
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 21
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 18
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 16
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 16
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 14
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 11
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 10
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 9
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 8
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 7
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 7
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 7
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 6
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 6
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 6
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 6
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 5
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 4
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 238000012606 in vitro cell culture Methods 0.000 description 4
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 4
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 4
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 4
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 3
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 3
- APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N amphotericin B Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 3
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 3
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 3
- 244000309715 mini pig Species 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 3
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 2
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 229920006317 cationic polymer Polymers 0.000 description 2
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 2
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 2
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 2
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000005265 lung cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 229920000729 poly(L-lysine) polymer Polymers 0.000 description 2
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- OGHAROSJZRTIOK-KQYNXXCUSA-O 7-methylguanosine Chemical compound C1=2N=C(N)NC(=O)C=2[N+](C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OGHAROSJZRTIOK-KQYNXXCUSA-O 0.000 description 1
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M Bromide Chemical compound [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 description 1
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 241001122120 Hepeviridae Species 0.000 description 1
- 241001112094 Hepevirus Species 0.000 description 1
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108010000605 Ribosomal Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000035508 accumulation Effects 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000002550 fecal effect Effects 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 201000010284 hepatitis E Diseases 0.000 description 1
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 description 1
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000012340 reverse transcriptase PCR Methods 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 210000002435 tendon Anatomy 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56983—Viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
- C12N7/02—Recovery or purification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/067—Hepatocytes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
- C12Q1/706—Specific hybridization probes for hepatitis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
- C12Q1/706—Specific hybridization probes for hepatitis
- C12Q1/707—Specific hybridization probes for hepatitis non-A, non-B Hepatitis, excluding hepatitis D
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/576—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/05—Adjuvants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/28011—Hepeviridae
- C12N2770/28111—Hepevirus, e.g. hepatitis E virus
- C12N2770/28121—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/28011—Hepeviridae
- C12N2770/28111—Hepevirus, e.g. hepatitis E virus
- C12N2770/28151—Methods of production or purification of viral material
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Virology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Abstract
Группа изобретений относится к медицине и касается способа получения высокого титра вируса гепатита E (HEV), включающего a) культивирование клеточной линии, где клеточная линия представляет собой HepG2 (номер HB-8065 в Американской коллекции типовых культур (ATCC)) или HepG2/C3A (номер CRL-10741 в ATCC), в среде, содержащей полибрен в концентрации от 1 мкг/мл до 5 мкг/мл, и б) инфицирование этой клеточной линии вирусом HEV. Группа изобретений также касается способа определения присутствия и/или уровня HEV в образце; культуральной среды для получения высокого титра HEV, содержащей полибрен в диапазоне от 1 мкг/мл до 5 мкг/мл; способа исследования титрования HEV, включающего использование клеточной линии, представляющей собой HepG2 (номер HB-8065 в ATCC) или HepG2/C3A (номер CRL-10741 в ATCC), и полибрена в диапазоне от 1 мкг/мл до 5 мкг/мл. Группа изобретений обеспечивает получение высокого титра вируса HEV. 4 н. и 12 з.п. ф-лы, 5 пр., 5 ил., 2 табл.
Description
ПРИОРИТЕТ И ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
В данной заявке испрашивается приоритет по предварительной заявке на патент США 62/195936, поданной 23 июля 2015 года, которая включена в данное описание посредством ссылки во всей ее полноте.
ССЫЛКА НА ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
Настоящая заявка подается вместе с перечнем последовательностей в машиночитаемом формате. Перечень последовательностей представлен в виде файла DURC6_006AUS_SEQLIST.txt размером 1093 байт, созданного 31 мая 2016 года и окончательно измененного 31 мая 2016 года. Информация в перечне последовательностей в машиночитаемом формате включена в данное описание посредством ссылки во всей ее полноте.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Область техники
Настоящее изобретение относится к области вирусологии, более конкретно к способам получения материала вируса гепатита Е (далее HEV). В частности, в настоящем изобретении раскрыты способы размножения и титрования материала с высоким титром HEV.
Описание родственного уровня техники
HEV (род Hepevirus, семейство Hepeviridae) представляет собой небольшой вирус без оболочки/с псевдооболочкой, с одноцепочечной положительно-полярной нитью полиаденилированного РНК-генома приблизительно 7,2 т.п.о. Существует четыре генотипа HEV, которые были идентифицированы, но только один серотип. Генотипы 1 и 2 ответственны главным образом за инфекции, передаваемые через зараженную воду, в развивающихся странах и вызывают заболевание преимущественно у людей и высших приматов. Инфекции, как правило, являются саморазрешающимися и острыми, продолжительностью максимум от 2 до 7 недель, однако они могут быть фатальными, особенно для беременных женщин. Генотипы 3 и 4 ассоциированы с эндемическими (аутохтонными) инфекциями в промышленно развитых странах. Эти два генотипа вызывают заболевание большей частью у свиней, однако у людей могут становиться случайными хозяевами в результате пищевого или зоонозного воздействия. Клинически заболевание является, как правило, бессимптомным, с легким течением у молодых людей, но клинически проявляется у пожилых людей. Кроме того, инфекции генотипов 3 и 4 могут стать хроническими у людей с иммунодефицитом, таких как пациентов с трансплантацией органов или СПИДом.
В настоящее время гепатит Е классифицируется как передаваемое при переливании крови инфекционное заболевание. В виду распространения HEV в мире за последние годы возникла озабоченность, связанная с безопасностью продуктов, имеющих происхождение из крови и плазмы. Профиль вирусной безопасности продуктов, имеющих происхождение из крови и плазмы, может быть обеспечен путем осуществления исследований элиминации, демонстрирующих эффективность ослабления и/или элиминации вируса в процессе их производства. Во время этих исследований элиминации известное количество вируса преднамеренно вводится в промежуточный продукт крови или плазмы, и затем этот введенный материал подвергается обработке с использованием лабораторной модели производственного процесса. Ослабление и/или элиминация вируса за стадию определяется сравнением количества вируса до и после обработки.
Исследования элиминации вирусов требуют больших количеств вируса с высоким титром, и отсутствие эффективной клеточной культуральной системы для HEV препятствовало возможности осуществления таких исследований для HEV. Несколько клеточных культуральных HEV систем разрабатывается в настоящее время для решения этой проблемы.
Штаммы с генотипом 3 и генотипом 4 были адаптированы Okamoto и коллегами для выращивания в человеческих клетках легких А549 с достижением РНК-титров HEV 3,9×108 копий/мл. Кроме того, указанный штамм с генотипом 4 также был культивирован в клетках PLC/PRF/5 (клетки человеческой гепатомы), но с низкими титрами.
Второй генотип 3 (штамм Kernow-C1) был адаптирован Emerson и коллегами для выращивания в клетках человеческой гепатомы HepG2/C3A с получением титра 4,61×108 геномов/мл после 6 пассажей. Исследования показали, что адаптация для роста in vitro была достигнута после приобретения 174 рибонуклеотидов S17 человеческого рибосомального белкового гена.
Поскольку геномы с такой же инсерцией были обнаружены в первоначальном вирусном инокулюме, фекальной суспензии от хронически инфицированного HIV-1 пациента, случай рекомбинации/инсерции имел место в природе и не являлся артефактом клеточной культуры. Попытки вырастить указанный штамм в клетках PLC/PRF/5 и А549 не были успешными или приводили к низким титрам, однако вирус заражал и реплицировался в клетках почек от свиней, являющихся главным зоонозным хозяином для вирусов генотипа 3.
Клетки человеческой гепатомы сложны для выращивания и могут требовать специальных методов выращивания клеток, включая использование покрытий, таких как коллаген, фибронектин, желатин и/или поли-L-лизин, для облегчения прикрепления клеток и/или клеточного роста. Помимо этого, не все из этих покрытий хорошо работают для любых типов клеток.
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В некоторых воплощениях предложен способ получения высокого титра вируса гепатита Е, включающий: культивирование клеточной линии in vitro в среде, содержащей концентрацию полибрена, и инфицирование этой клеточной линии вирусом HEV. В некоторых воплощениях способа используемая клеточная линия представляет собой HepG2 (номер НВ-8065 в Американской коллекции типовых культур (АТСС)) или HepG2/C3A (номер CRL-10741 в АТСС). В некоторых воплощениях способа концентрация полибрена составляет от примерно 1 мкг/мл до примерно 5 мкг/мл. В некоторых воплощениях способа высокий титр составляет от примерно 108 копий/мл до примерно 1010 копий/мл. В некоторых воплощениях способа высокий титр составляет от примерно 107 копий/мл до примерно 1010 копий/мл. В некоторых воплощениях способ дополнительно включает стадии добавления концентрации полибрена к среде; пассирование HEV-инфицированной клеточной линии в среде, содержащей полибрен; и сбор среды и/или инфицированных клеток. В некоторых воплощениях способа концентрация полибрена составляет от примерно 1 мкг/мл до примерно 5 мкг/мл. В некоторых воплощениях способа высокий титр HEV, полученный в среде и/или инфицированных клетках, составляет от примерно 108 копий/мл до примерно 1010 копий/мл. В некоторых воплощениях способа высокий титр HEV, полученный в среде и/или инфицированных клетках, составляет от примерно 107 копий/мл до примерно 1010 копий/мл.
В некоторых воплощениях предложен способ определения присутствия и/или уровня HEV в образце, включающий стадии: внесения образца в смесь, содержащую клеточную линию и культуральную среду, содержащую полибрен; инкубирования смеси, содержащей образец, с предыдущей стадии для обеспечения размножения HEV в случае его присутствия в образце; сбора порции с предыдущей стадии, содержащей HEV в случае его присутствия и размножения во время осуществления предыдущей стадии; и измерения присутствия и/или уровня биологического вещества, ассоциированного с HEV, в собранной порции. В некоторых воплощениях способа клеточная линия выбрана из группы, состоящей из клеточных линий HepG2 (номер НВ-8065 в АТСС) и HepG2/C3A (номер CRL-10741 в АТСС). В некоторых воплощениях способа биологическое вещество содержит полинуклеотидную и/или полипептидную последовательность HEV. В некоторых воплощениях способа указанное измерение включает стадии: получения первой реакционной смеси путем смешивания собранной порции с первым раствором для обеспечения воздействия на полинуклеотид HEV в случае присутствия HEV в собранной порции, где полинуклеотид представляет собой РНК HEV; получения второй реакционной смеси путем добавления к первой реакционной смеси первого реагента для получения комплементарной дезоксирибонуклеиновой кислоты (кДНК), которая по меньшей мере частично комплементарна указанной РНК HEV; получения третьей реакционной смеси путем добавления к второй реакционной смеси второго реагента, содержащего пару полинуклеотидов для амплификации последовательности кДНК, которая по меньшей мере частично комплементарна каждому из указанной пары полинуклеотидов; получения четвертой реакционной смеси путем амплификации указанной последовательности; и определения концентрации амплифицированной последовательности в указанной четвертой реакционной смеси. В некоторых воплощениях способа указанное определение концентрации включает: получение четвертой реакционной смеси; получение одного или более контролей, содержащих предварительно определенное количество кДНК HEV; добавление к указанной четвертой реакционной смеси и указанному(ым) одному или более контролям агента, где указанный агент является по меньшей мере частично специфичным к указанной амплифицированной последовательности в четвертой реакционной смеси и к кДНК HEV, содержащейся в указанном предварительно определенном количестве в указанном(ых) одном или более контролях; и расчет уровня распознавания HEV указанным агентом в данной четвертой реакционной смеси относительно указанного(ых) одного или более контролей. В некоторых воплощениях способа указанная пара полинуклеотидов включает:
а) 5'-CGGCTATCGGCCAGAAGTT-3' (SEQ ID NO: 1)
б) 5'-CCGTGGCTATAACTGTGGTCT-3' (SEQ ID NO: 2).
В некоторых воплощениях способа указанный агент включает:
5'-FAM-TTTTTACGC-ZEN-AGGCTGCCAAGGCC-3IABkFQ-3' (SEQ ID NO: 3).
В некоторых воплощениях предложена культуральная среда для получения HEV с высоким титром, содержащая полибрен в диапазоне от примерно 1 мкг/мл до примерно 5 мкг/мл. В некоторых воплощениях высокий титр HEV составляет от примерно 108 копий/мл до примерно 1010 копий/мл. В некоторых воплощениях высокий титр HEV составляет от примерно 107 копий/мл до примерно 1010 копий/мл.
В некоторых воплощениях предложен анализ титрования HEV, включающий использование полибрена. В некоторых воплощениях анализа концентрация используемого полибрена находится в диапазоне от примерно 1 мкг/мл до примерно 5 мкг/мл.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
На Фиг. 1А-1С показаны изображения, полученные при 20-кратном увеличении HepG2/C3A клеток, культивированных в течение 1 суток с использованием различных клеточных культуральных сред согласно некоторым воплощениям раскрытого здесь изобретения.
На Фиг. 1А показаны HepG2/C3A клетки, культивированные с использованием среды DMEM плюс 10% FBS плюс заменимые аминокислоты, фунгизон, HEPES, гентамицин (NHG).
На Фиг. 1В показаны HepG2/C3A клетки, культивированные с использованием DMEM плюс 10% FBS плюс NHG плюс пируват.
На Фиг. 1С показаны HepG2/C3A клетки, культивированные с использованием DMEM плюс 10% FBS плюс NHG плюс пируват плюс полибрен.
На Фиг. 2А-2С показаны изображения, полученные при 10-кратном увеличении (слева) или 20-кратном увеличении (справа) HepG2/C3A клеток, культивированных в течение 3 суток.
На Фиг. 2А показаны HepG2/C3A клетки, культивированные с использованием DMEM плюс 10% FBS плюс NHG.
На Фиг. 2В показаны HepG2/C3A клетки, культивированные с использованием DMEM плюс 10% FBS плюс NHG плюс пируват.
На Фиг. 2С показаны HepG2/C3A клетки, культивированные с использованием DMEM плюс 10% FBS плюс NHG плюс пируват плюс полибрен.
На Фиг. 3 показано сравнение РНК-титров HEV в хронически инфицированных HepG2 (человеческих) в MPK (свиных) клетках, как измерено посредством ПЦР-анализа HEV согласно некоторым воплощениям раскрытого здесь изобретения. Полибрен не использовали для MPK клеток, поскольку прикрепление MPK клетки к поверхностям выращивания очень эффективное.
На Фиг. 4 показаны нуклеотидные последовательности праймеров и зондов, используемых для ПЦР-анализа HEV, и их расположение в геноме HEV, согласно некоторым воплощениям раскрытого здесь изобретения.
На Фиг. 5 показана стандартная кривая для ПЦР-анализа HEV согласно некоторым воплощениям раскрытого здесь изобретения.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к способу получения материала с высоким титром вируса гепатита Е (HEV), подходящего для использования в исследованиях элиминации вируса и способе определения инфекционных титров HEV. Настоящее изобретение включает простой способ размножения HEV с высоким титром в клеточной культуре для использования в исследованиях по оценке эффективности элиминации HEV в процессах производства продуктов, имеющих происхождение из крови и плазмы.
Как обсуждалось выше, HEV был адаптирован для выращивания в клеточной культуре Okamoto и коллегами с использованием клеток человеческой гепатомы PLC/PRF/5 и человеческих клеток легкого А549 и Emerson и коллегами с использованием клеток человеческой гепатомы HepG2/C3A. Клетки человеческой гепатомы сложны для выращивания и могут требовать специальных методов выращивания клеток. Лаборатория Emerson's покрывает чашки коллагеном I из сухожилий крысиного хвоста перед высеванием клеток, в то время как лаборатория Okamoto's использует чашки, приобретенные в IWAKI, некоторые из которых покрыты коллагеном. В Таблице 1 приведено сравнение титров HEV из разных клеточных культуральных систем, и перечислены способы, используемые различными лабораториями для улучшения выращивания клеток. Коллаген и другие покрытия, такие как фибронектин, желатин и поли-L-лизин, облегчают прикрепление клеток и/или клеточный рост, так что сложные для выращивания клетки могут достичь более высоких плотностей и тем самым получения высокого титра вируса.
В некоторых воплощениях настоящего изобретения, вместо использования покрытия, такого как коллаген или другие покрытия, для облегчения прикрепления клеток и/или клеточного роста, предложен способ культивирования HEV, включающий использование полибрена (также известного как бромид гексадиметрина и 1,5-диметил-1,5-диазаундека-метилен-полимето-бромид).
Полибрен представляет собой недорогой катионный полимер, обычно используемый в клеточной культуре для повышения инфицирующей способности ретровирусов посредством снижения отталкивания зарядов между вирусом и клетками. Способность полибрена теснее сближать различные объекты использована в данном изобретении для облегчения прикрепления клеток человеческой гепатомы к поверхностям культивирования и HEV к клеткам. Полибрен просто добавляют к клеточным культуральным средам, которые используют для клетки и размножения вируса. В настоящем изобретении избегают необходимости приобретать дорогостоящие чашки, предварительно покрытые коллагеном или другими покрывающими агентами, или наносить предварительное покрытие коллагеном или другими покрывающими агентами до высевания клеток и инфицирования вирусом.
HEV обычно реплицируется с низкими титрами in vivo, так что рост in vitro затруднен. Способы культивирования HEV для получения материала с высоким титром, подходящего для использования в исследованиях элиминации вируса, ранее не были доступны.
В одном аспекте раскрытого здесь изобретения размножение HEV с высоким титром в клеточной культуре возможно при использовании сред, обогащенных полибреном.
Полибрен представляет собой недорогой катионный полимер, используемый в клеточной культуре для повышения инфицирующей способности ретровирусов (оболочечных вирусов) посредством снижения отталкивания зарядов между вирусом и клетками. В некоторых воплощениях изобретения полибрен добавляют к клеточной культуральной среде для облегчения прикрепления HEV, вируса без оболочки/с псевдооболочкой, к клеткам. Кроме того, присутствие полибрена улучшает прикрепление клетки и пролиферацию, тем самым усиливая общую продукцию HEV в инфицированных клетках.
Таким образом, в первом воплощении настоящего изобретения предложен способ получения высокого титра HEV в культурах in vitro, основанный на добавлении полибрена к клеточной культуральной среде.
HEV не вызывает цитопатических эффектов (СРЕ) в клеточной культуре, поэтому детектирование HEV основано на ПЦР. Таким образом, в некоторых воплощениях детектирование HEV при низких концентрациях возможно посредством ПЦР-анализа по настоящему изобретению. ПЦР-анализ может быть использован для разработки, например, анализа инфекционной способности HEV, который является точным, надежным и достоверным.
ПЦР-анализ, изначально разработанный Национальным Институтом Здоровья (National Institutes of Health, NIH), был модифицирован для повышения чувствительности. Обратный праймер был изменен, и был разработан полностью новый зонд. В способах, использующих ПЦР-анализ по настоящему изобретению, соответственно оценивают образцы должным образом как положительные или отрицательные, и эти способы являются полезными в расчетах титров. Таким образом, в дополнительном воплощении настоящего изобретения раскрыты способы титрования HEV на основе ПЦР, включающие использование полибрена или культуральной среды (предпочтительно, клеточной культуральной среды), содержащей указанный полибрен.
В одном воплощении изобретение относится к способу, включающему: размножение HEV с высоким титром в клеточной культуре посредством использования сред, обогащенных полибреном; и детектирование HEV посредством чувствительного ПЦР-анализа.
Способ может быть специфичным к HEV, однако методики размножения вируса могут быть применимы к другим вирусам без оболочки. Например, в некоторых воплощениях настоящего изобретения был протестирован HEV генотип 3 штамм Kernow-C1 пассаж 6, полученный из лаборатории Emerson.
Подразумевается, что в некоторых воплощениях способ получения высокого титра HEV, упомянутый выше, осуществляют в культурах in vitro, предпочтительно в органе, ткани или клеточных культурах in vitro. В наиболее предпочтительном воплощении способ получения высокого титра HEV по настоящему изобретению осуществляют в клеточной культуре in vitro.
Как первичные клеточные культуральные линии, так и устойчивые клеточные культуральные линии могут быть использованы в способе по настоящему изобретению. Используемые клеточные культуральные линии могут иметь происхождение из любого организма. Например, подразумевается использование клеток насекомых или клеток млекопитающих. Предпочтительно, используемые линии клеточных культур имеют происхождение от свиней (или минипигов) и людей.
Кроме того, предпочтительно, когда используемые линии клеток имеют происхождение из печени или почек. Указанные печень или почка, из которых имеют происхождение линии клеток, могут быть здоровыми, или больными, или включать злокачественный или доброкачественный рост. В наиболее предпочтительном воплощении используют стабильные клеточные линии HepG2 (номер НВ-8065 в АТСС) или HepG2/C3A (номер CRL-10741 в АТСС).
В некоторых воплощениях концентрация полибрена составляет в диапазоне от примерно 1 мкг/мл до примерно 5 мкг/мл. В некоторых воплощениях концентрация полибрена составляет примерно 1, 2, 3, 4 или 5 мкг/мл. В предпочтительном воплощении концентрация полибрена составляет примерно 4 мкг/мл.
Способ по настоящему изобретению в некоторых воплощениях обеспечил титры HEV в диапазоне от примерно 108 копий/мл до примерно 1010 копий/мл. Способ по настоящему изобретению в некоторых воплощениях обеспечил титры HEV в диапазоне от примерно 107 копий/мл до примерно 1010 копий/мл. В предпочтительном воплощении способ по настоящему изобретению обеспечил титры HEV примерно 109 копий/мл.
В еще одном воплощении настоящее изобретение относится к способу получения высокого титра HEV, включающему стадии: а) выращивания клеток в культуральной среде, содержащей полибрен, и б) инфицирование культуры in vitro вирусом HEV. В некоторых воплощениях клеточную культуральную среду из культур in vitro собирают для получения высокого титра HEV.
После указанной выше стадии б) культивированные клетки могут быть собраны любыми средствами, известными в данной области техники (предпочтительно, посредством трипсинизации), и аликвота может быть подвергнута анализу на содержание HEV. Указанное содержание HEV предпочтительно определяют посредством ПЦР, еще более предпочтительно с использованием ПЦР-анализа по настоящему изобретению и как описано ниже. См. Фиг. 5. В альтернативных воплощениях содержание HEV может быть определено путем анализа на основе иммунофлуоресценции (IF). См. Фиг. 5.
Кроме того, после указанной стадии б) культивированные клетки могут быть получены любыми средствами, известными в данной области техники (предпочтительно трипсинизацией), и материал с HEV может быть получен любой методикой, известной в данной области техники. В предпочтительном воплощении материал с HEV получают замораживанием-оттаиванием клеток несколько раз, предпочтительно 1 или 2 раза. Полученный материал с HEV хранят предпочтительно при -65°C или холоднее.
Предусматривается, что в некоторых воплощениях способ, описанный выше, также включает стадии: в) добавления полибрена к клеточной культуральной среде; и г) дополнительного пассирования клеток, инфицированных вирусом HEV.
Стадии в) и г) можно повторять, например, для увеличения количества клеток, продуцирующих HEV, и для максимизации распространения вируса и инфицирования в культуре. Специалист в данной области техники может легко определить, сколько раз можно осуществлять повторение стадий в) и г), то есть число пассажей, которые инфицированная клетка может перенести, на основании, например, внешнего вида клеток и их кривых роста.
После стадии г) каждого пассажа культивированные клетки могут быть получены любыми средствами, известными в данной области техники (предпочтительно трипсинизацией), и аликвота может быть проанализирована на содержание HEV. Указанное содержание HEV предпочтительно определяют посредством ПЦР, еще более предпочтительно посредством ПЦР-анализа по настоящему изобретению и как описано ниже. См. Фиг. 5.
Кроме того, после указанной стадии г) каждого пассажа культивированные клетки могут быть получены любыми средствами, известными в данной области техники (предпочтительно трипсинизацией), и материал с HEV может быть получен любой методикой, известной в данной области техники. В предпочтительном воплощении материал с HEV получают замораживанием-оттаиванием клеток несколько раз, предпочтительно 1 или 2 раза. Полученный материал с HEV хранят предпочтительно при -65°C или холоднее.
Альтернативно, среду также можно собрать только после осуществления желаемого или требуемого числа пассажей с инфицированной клеточной линией (то есть, после повторений стадий в) и г) желаемое или требуемое количество раз).
Стадия г) пассирования клеток, инфицированных HEV, как это известно специалисту в данной области техники, подразумевает получение клеток любыми средствами, известными в данной области техники. В случае если клетки растут прикрепленными к поверхности (например, из колбы или чашки), клеткам может потребоваться открепление любыми средствами, известными в данной области техники, предпочтительно трипсинизацией. Когда ферменты (например трипсин) используют для открепления клеток, обычно указанные ферменты должны быть инактивированы. Как правило, в данной области техники указанную инактивацию осуществляют путем разбавления раствором, обогащенным белками, предпочтительно клеточной культуральной средой с FBS.
Принимая во внимание тот факт, что полибрен и культуральные среды, содержащие указанный реагент (предпочтительно, клеточная культуральная среда) обеспечивают эффективное инфицирование и получение HEV в культурах in vitro (предпочтительно, клеточных культурах in vitro), они также могут быть использованы в анализах титрования HEV.
Таким образом, в дополнительном воплощении настоящего изобретения раскрытые анализы титрования HEV характеризуются тем, что они включают использование полибрена или культуральной среды (предпочтительно клеточной культуральной среды), содержащей указанный полибрен.
Культура in vitro предпочтительно представляет собой орган, ткань или клеточную культуру in vitro. В наиболее предпочтительном воплощении культура in vitro представляет собой клеточную культуру in vitro.
Могут быть использованы как линии первичной клеточной культуры, так и линии стабильной клеточной культуры. Используемые линии клеточных культур могут иметь происхождение из любого организма. Например, предусматривается использование клеток насекомых или клеток млекопитающих. Предпочтительно, используемые линии клеточных культур имеют происхождение от свиней (или минипигов) и людей.
Кроме того, предпочтительно, когда используемые линии клеток имеют происхождение из печени или почек. Указанные печень или почка, из которых имеют происхождение линии клеток, могут быть здоровыми, или больными, или включать злокачественный или доброкачественный рост. В наиболее предпочтительном воплощении используют стабильные клеточные линии HepG2 (номер НВ-8065 в АТСС) или HepG2/C3A (номер CRL-10741 в АТСС).
Предпочтительно, анализ титрования HEV по настоящему изобретению представляет собой анализ дозы заражения 50% культуры ткани (TCID50), осуществляемый как известно специалисту в данной области техники, за исключением того, что на присутствие вируса указывает положительный ПЦР-сигнал, а не вирусная цитопатология.
В указанных анализах титрования полибрен или клеточную культуральную среду, содержащую полибрен, используют для культуры клеток, в которых будут титровать образцы HEV.
В другом воплощении предложен способ детектирования HEV в исходных культурах HEV.
Указанное детектирование может быть осуществлено любыми методами или средствами, известными в данной области техники. Тем не менее, в предпочтительном воплощении детектирование осуществляют посредством ПЦР.
В предпочтительном воплощении, ПЦР, используемая для детектирования HEV, представляет собой ПЦР с обратной транскриптазой в режиме реального времени, которая включает первую стадию обратной транскрипции вирусной РНК с комплементарной ДНК (кДНК) и вторую стадию ПЦР в режиме реального времени, которую осуществляют предпочтительно с использованием зонда двойного гашения.
В наиболее предпочтительном воплощении на второй стадии следующие олигонуклеотиды используют в качестве праймеров и зондов (Фиг. 4):
a) прямой праймер: 5'-CGGCTATCGGCCAGAAGTT-3' (SEQ ID NO: 1)
b) обратный праймер: 5'-CCGTGGCTATAACTGTGGTCT-3' (SEQ ID NO: 2)
c) зонд: 5'-FAM-TTTTTACGC-ZEN-AGGCTGCCAAGGCC-3IABkFQ-3' (SEQ ID NO: 3).
Данные от исследований по оценке эффективности анализа инфекционной способности HEV на основе ПЦР сведены в Таблицу 2.
В предпочтительном воплощении клетки титруют в 96-луночном планшете и РНК HEV экстрагируют с помощью магнитных шариков Bioclone или магнитных Dynabeads, более предпочтительно используют Dynabeads.
Для лучшего понимания некоторые воплощения настоящего изобретения описаны более подробно, со ссылкой на прилагаемые фигуры, которые даны в качестве примера, и со ссылкой на иллюстративные примеры, которые не являются ограничением объема настоящего изобретения.
ПРИМЕРЫ
Пример 1. Картины клеточного роста HepG2/C3A клеток в различных средах для роста
HepG2/C3A (106) клетки высевали в колбы емкостью 25 см2 и культивировали на одной из следующих клеточных культуральных сред:
- DMEM +10% FBS + NHG (заменимые аминокислоты, фунгизон, HEPES, гентамицин);
- DMEM +10% FBS + NHG + 1MM пируват; или
- DMEM +10% FBS + NHG + 1 мМ пируват + 4 мкг/мл полибрена.
Изображения, снятые при 20-кратном увеличении через 1 сутки, показаны на Фиг. 1. HepG2/C3A клетки, культивированные в среде DMEM+10% FBS+NHG (А) или DMEM + 10% FBS + NHG + пируват (В), росли в виде скоплений, которые будут сильно затруднять инфицирование вирусом (например HEV). С другой стороны, когда HepG2/C3A клетки культивировали в среде DMEM + 10% FBS + NHG + пируват + полибрен (С), клетки прилипали и росли разряженно вплоть до монослоя, который будет легко инфицироваться вирусом (например HEV).
Изображения, снятые при 10- и 20-кратном увеличении через 3 суток, показаны Фиг. 2. Подобно 1-суточным клеткам, HepG2/C3A клетки, культивированные в среде DMEM + 10% FBS + NHG (А) или DMEM + 10% FBS + NHG + пируват (В), росли в виде скоплений, однако клетки, выращенные в среде DMEM + 10% FBS + NHG + пируват + полибрен (С), росли разряженно вплоть до монослоя. Поскольку скопления клеток будут затруднять равномерное инфицирование вирусами, эффективность HEV-инфекции будет по всей вероятности выше в клетке, выращенной в присутствии полибрена.
Пример 2. Получение стабильных HEV-инфициоованных клеток
Колбы для клеточных культур засевали для инфицирования следующим образом: HepG2 или HepG2/C3A клетки трипсинизировали согласно протоколам или методикам, известным в данной области техники. Десять мл среды для роста (основная среда в соответствии с потребностями используемой клеточной линии плюс полибрен в концентрации от примерно 1 мкг/мл до примерно 5 мкг/мл) добавляли для нейтрализации трипсина и суспензию пипетировали вверх-вниз, для того чтобы разбить скопления клеток. Клетки затем высевали с плотностью приблизительно 106 клеток на колбу емкостью 150 см2 и оставляли на ночь в инкубаторе при 37°С.
Клетки инфицировали вирусом HEV путем удаления среды из колбы и добавления исходной культуры HEV (осветленного вирус-инфицированного клеточного лизата) при множественности заражения (MOI) 0,1-1,0 и в общем объеме 5-10 мл. Клетки инкубировали при 37°С в течение по меньшей мере 1 часа, во время которого колбу периодически качали взад-вперед для предупреждения высыхания клеток и для распределения вирусного инокулюма равномерно по всей поверхности клеток. Добавляли дополнительно среду для роста (10-20 мл на колбу) и колбу выдерживали при 37°С до конфлюэнтности клеточного монослоя (приблизительно 1 неделя).
Пример 3. Размножение НЕV-инфицированных клеток Инфицированные клетки (HepG2 или HepG2/C3A) в колбе емкостью 150 см2 трипсинизировали в соответствии с Примером 1 до конфлюэнтности клеточного монослоя. Если трипсинизацию проводили в нескольких колбах, клеточные суспензии объединяли вместе перед обработкой.
Аликвоту объемом не менее 1 мл трипсинизированной клеточной суспензии брали для анализа на РНК HEV посредством ПЦР. Оставшуюся клеточную суспензию отбрасывали или распределяли в другие колбы емкостью 150 см2 с плотностью, эквивалентной числу клеток в 1/6 от конфлюэнтного монослоя (деление 1:6). Среду для роста добавляли в каждую колбу емкостью 150 см2 до достижения конечного объема 20-25 мл, и эти колбы инкубировали до достижения клетками конфлюэнтности (приблизительно 1 неделя).
Эту процедуру повторяли каждую неделю до тех пор, пока количество РНК HEV в образце объемом 1 мл, который извлекали для проведения ПЦР-анализа, не достигло высоких титров. В некоторых воплощениях высокий титр находился в диапазоне от примерно 108 копий/мл до примерно 1010 копий/мл. В некоторых воплощениях высокий титр находился в диапазоне от примерно 107 копий/мл до примерно 1010 копий/мл. Некоторые колбы затем подвергали трипсинизации и разделению для последующего пассирования HEV-инфицированных клеток, в то время как остальные колбы подвергали обработке в качестве материала с HEV.
Колбы с материалом с HEV подвергали замораживанию и оттаиванию 1-2 раза для разрушения инфицированных клеток и высвобождения вируса. Инфицированные лизаты затем объединяли вместе, разделяли на аликвоты в подходящие контейнеры и хранили при температуре не выше -65°С.
Пример 4. Анализ инфекционной способности HEV на основе ПЦР
В данном примере описано титрование HEV в 96-луночном формате планшета, однако анализ может быть легко адаптирован к многолуночным планшетам других размеров.
Проводили серийные разведения исходных культур HEV и добавляли в лунки, засеянные клетками HepG2 или HepG2/C3A. Вирусу давали возможность адсорбироваться в течение не менее 1 часа при 37°С и добавляли среду для роста. Планшеты инкубировали при 37°С в течение не менее 2 суток, а затем отсасывали среду из лунок и осуществляли промывку/отсасывание клеток не менее 2 раз с использованием буфера (например PBS). Планшеты затем подвергали экстрагированию для ПЦР или хранили при температуре не выше -65°С до готовности к экстрагированию.
Использовали набор Dynabeads® mRNA DIRECT™ Micro Kit (Life Technologies) для экстрагирования полиаденилированной РНК (например РНК HEV) из клеток в каждой лунке титационного планшета, следуя инструкциям производителя. Полученный элюат (поли А РНК) сразу же подвергали ПЦР-амплификации или хранили при температуре не выше -65°С до готовности к ПЦР-амплификации.
Одностадийную ОТ-ПЦР использовали для детектирования РНК HEV в образцах, используя праймеры и зонды как обсуждалось ранее. Условия для анализа в каждой реакции были следующими:
a) реагенты: 5,0 мкл 4х TaqMan® Fast Virus 1-Step Master Mix (Life Technologies), 0,08 мкл 100 мМ праймера F+R, 0,04 мкл 100 мМ зонда, 0,4 мкл SUPERase In (Life Technologies), 4,4 мкл воды и 10 мкл матрицы (всего 20 мкл)
b) реакция: 52°C 10 минут, 95°C 30 секунд и 40 циклов при 95°C 15 секунд, 56°C 45 секунд,
ПЦР и расчет значений порогового цикла (Ct) осуществляли с использованием системы АВ 7500 Real Time PGR System (Applied Biosystems, Foster City, CA) и сопровождающего программного обеспечения согласно инструкциям производителя.
ПЦР проводили в формате количественного и качественного определения. Для количественной ПЦР, плазмидную кДНК, полученную из NIH, линеаризовали с помощью Mlul и транскрибировали с использованием набора mMESSAGE mMACHINE® (Life Technologies) с получением РНК-транскриптов по 7,2 т.п.о. с 7-метилгуанозиновым кэпом и поли-А хвостом. Транскрипты очищали с использованием набора Ambion MegaClear (Life Technologies), подвергали количественному определению с использованием Quant-iT™ RiboGreen® RNA Reagent and Kit (Invitrogen) и использовали в качестве стандартов для построения стандартных калибровочных кривых РНК.
Стандартные кривые РНК генерировали с помощью системы программного обеспечения АВ7500 путем откладывания значений Ct против логарифмов рассчитанных количеств копий для стандартов.
На Фиг. 5 (правая панель) показана типичная стандартная кривая. Все кривые имели широкий динамический диапазон в интервале от 100 до 107 копий на реакцию и были линейными с поправочным коэффициентом r2>0,99. Процент эффективности амплификаций рассчитывали в виде %Е=[10(-1/угловой коэффициент)-1]*100. Исходя из n=22 стандартных кривых HEV qPCR, эффективность количественной ПЦР для HEV составила 100,4% (данные не показаны).
Для качественной ПЦР, лунки помечали как положительные или отрицательные на основании наличия положительного ПЦР-сигнала. Титры вируса рассчитывали в виде TCID50/мл с использованием подходящих статистических методов: Spearman-Karber, IVIPN или Poisson.
Пример 5. Оценка эффективности анализа инфекционной способности HEV на основе ПЦР
Исследования по качеству анализов осуществляли для оценки операционных характеристик анализа инфекционной способности HEV. Оцениваемые параметры представляли собой точность, воспроизводимость, линейность, предел количественного обнаружения и динамический диапазон.
Критерии принятия были такими же, как типично используемые для других анализов титрования вирусов.
Результаты сведены в Таблицу 2 и показывают, что данные анализы прошли все тесты.
ОПРЕДЕЛЕНИЯ
HepG2: клетки гепатоцеллюлярной карциномы, полученные из Американской коллекции типовых культур (номер НВ-8065 в АТСС)
MPK: клетки почек минипигов, полученные из Американской коллекции типовых культур (номер CCL-66 в АТСС)
DMEM: среда Игла, модифицированная по Дульбекко
FBS: фетальная бычья сыворотка
НЕРЕS: N-2-гидроксиэтилпиперазин-N'-2-этансульфоновая кислота
NEAA: заменимые аминокислоты
NHG: смесь следующих компонентов: заменимые аминокислоты, фунгизон, HEPES и гентамицин
Титрование: процесс серийного разведения образца до установления ожидаемого вирусного титра и перенос этого разбавленного образца в чашку для определения значения TCID50/мл
Титр: концентрация вещества (вируса) в растворе или эффективность такого вещества, определенная титрованием
SK: метод Спермана-Кербера представляет собой статистический метод подсчета вирусных титров в образцах с относительно высокими концентрациями вируса. Данный метод используют, когда доля положительных лунок при любом разведении составляет более 25%.
MPN: наиболее вероятное количество представляет собой статистический метод подсчета вирусных титров в образцах с относительно низкими концентрациями вируса. MPN используют, когда доля положительных лунок при всех разведениях составляет менее 25%.
Poisson: пуассоново распределение представляет собой статистический метод подсчета вирусных титров в образцах с экстремально низкими концентрациями вируса. Данный метод используют, когда не наблюдается никаких положительных лунок.
АТСС: Американская коллекция типовых культур
TCID50: соответствует 50%-ной инфекционной дозе культуры ткани (конечная точка разведения). Она является мерой инфекционного вирусного титра, которая выражает количество вируса, необходимое для умерщвления 50% инфицированных клеток-хозяев или для вызывания цитопатического эффекта в 50% инокулированных клеток культуры ткани.
ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ
1. Okamoto Н (2011) Hepatitis Е virus cell culture models. Virus Research 161: 65-77.
2. Tanaka T, et al (2007) Development and evaluation of an efficient cell-culture system for Hepatitis E virus. J Gen Virol 88: 903-911.
3. Tanaka T, et al (2009) Development and Characterization of a Genotype 4 Hepatitis E Virus Cell Culture System Using a HE-JF5/15F Strain Recovered from a Fulminant Hepatitis Patient. J Clin Microbiol 47: 1906-1910.
4. Shukla P, et al (2011) Cross-species infections of cultured cells by hepatitis E virus and discovery of an infectious virus-host recombinant. PNAS. 108 (6): 2438-2443.
5. Shukla P, et al (2012) Adaptation of a Genotype 3 Hepatitis E Virus to Efficient Growth in Cell Culture Depends on an Inserted Human Gene Segment Acquired by Recombination. J Virol 86 (10): 5697-5707
6. Предварительная заявка на патент США No 61/431377
7. Предварительная заявка на патент США No 61/554323
8. Заявка на патент США No. 13/978839
9. Международная РСТ заявка No. PCT/US2012/020830
Claims (34)
1. Способ получения высокого титра вируса гепатита E (HEV), включающий:
a) культивирование клеточной линии in vitro, где клеточная линия представляет собой HepG2 (номер HB-8065 в Американской коллекции типовых культур (ATCC)) или HepG2/C3A (номер CRL-10741 в ATCC), в среде, содержащей полибрен в концентрации от 1 мкг/мл до 5 мкг/мл, и
б) инфицирование этой клеточной линии вирусом HEV.
2. Способ по п. 1, где высокий титр HEV составляет от 108 копий/мл до 1010 копий/мл.
3. Способ по п. 1, где высокий титр HEV составляет от 107 копий/мл до 1010 копий/мл.
4. Способ по п. 1, дополнительно включающий стадии:
в) добавления полибрена к клеточной культуральной среде в концентрации от 1 мкг/мл до 5 мкг/мл; и
г) дополнительное пассирование HEV-инфицированной клеточной линии в среде, содержащей полибрен.
5. Способ по п. 4, где высокий титр HEV, полученный в среде и/или инфицированных клетках, составляет от 108 копий/мл до 1010 копий/мл.
6. Способ по п. 4, где высокий титр HEV, полученный в среде и/или инфицированных клетках, составляет от 107 копий/мл до 1010 копий/мл.
7. Способ определения присутствия и/или уровня HEV в образце, включающий стадии:
а) внесения образца в смесь, содержащую клеточную линию, где клеточная линия выбрана из группы, состоящей из HepG2 (номер HB-8065 в ATCC) и HepG2/C3A (номер CRL-10741 в ATCC), и культуральную среду, содержащую полибрен в концентрации от 1 мкг/мл до 5 мкг/мл;
б) инкубирования смеси, содержащей образец, со стадии (а), для обеспечения размножения HEV в случае его присутствия в образце;
в) сбора порции со стадии (б), содержащей HEV в случае его присутствия и размножения во время осуществления стадии (б); и
г) измерения присутствия и/или уровня биологического вещества, ассоциированного с HEV, в собранной порции.
8. Способ по п. 7, где биологическое вещество содержит полинуклеотидную и/или полипептидную последовательность HEV.
9. Способ по п. 7, где измерение присутствия и/или уровня биологического вещества включает стадии:
а) получения первой реакционной смеси путем смешивания собранной порции с первым раствором для обеспечения воздействия на полинуклеотид HEV в случае присутствия HEV в собранной порции, где полинуклеотид представляет собой РНК HEV;
б) получения второй реакционной смеси путем добавления к первой реакционной смеси первого реагента для получения комплементарной дезоксирибонуклеиновой кислоты (кДНК), которая по меньшей мере частично комплементарна указанной РНК HEV;
в) получения третьей реакционной смеси путем добавления к второй реакционной смеси второго реагента, содержащего пару полинуклеотидов для амплификации последовательности кДНК, которая по меньшей мере частично комплементарна каждому из указанной пары полинуклеотидов;
г) получения четвертой реакционной смеси путем амплификации указанной последовательности; и
д) определения концентрации амплифицированной последовательности в указанной четвертой реакционной смеси.
10. Способ по п. 9, где указанное определение концентрации включает:
а) получение четвертой реакционной смеси;
б) получение одного или более контролей, содержащих предварительно определенное количество кДНК HEV;
в) добавление к указанной четвертой реакционной смеси и указанному(ым) одному или более контролям агента, где указанный агент является по меньшей мере частично специфичным к указанной амплифицированной последовательности в четвертой реакционной смеси и к кДНК HEV, содержащейся в указанном предварительно определенном количестве в указанном(ых) одном или более контролях; и г) расчет уровня распознавания HEV указанным агентом в данной четвертой реакционной смеси относительно указанного(ых) одного или более контролей.
11. Способ по п. 9, где указанная пара полинуклеотидов включает:
а) 5’-CGGCTATCGGCCAGAAGTT-3’ (SEQ ID NO: 1),
б) 5’-CCGTGGCTATAACTGTGGTCT-3’ (SEQ ID NO: 2).
12. Способ по п. 10, где указанный агент включает: 5’-FAM-TTTTTACGC-ZEN-AGGCTGCCAAGGCC-3IABkFQ-3’ (SEQ ID NO: 3).
13. Культуральная среда для получения высокого титра HEV, содержащая полибрен в диапазоне от 1 мкг/мл до 5 мкг/мл.
14. Культуральная среда по п. 13, где высокий титр HEV составляет от 108 копий/мл до 1010 копий/мл.
15. Культуральная среда по п. 13, где высокий титр HEV составляет от 107 копий/мл до 1010 копий/мл.
16. Способ исследования титрования HEV, включающий использование клеточной линии, представляющей собой HepG2 (номер HB-8065 в ATCC) или HepG2/C3A (номер CRL-10741 в ATCC), и полибрена в диапазоне от 1 мкг/мл до 5 мкг/мл.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201562195936P | 2015-07-23 | 2015-07-23 | |
US62/195,936 | 2015-07-23 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2691123C1 true RU2691123C1 (ru) | 2019-06-11 |
Family
ID=56409494
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2016127546A RU2691123C1 (ru) | 2015-07-23 | 2016-07-08 | Способ получения материала с высоким титром вируса гепатита Е и анализ титрования вируса гепатита Е |
Country Status (22)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US10208291B2 (ru) |
EP (1) | EP3121267B1 (ru) |
JP (1) | JP6588397B2 (ru) |
KR (1) | KR102154380B1 (ru) |
CN (1) | CN106367397B (ru) |
AR (1) | AR106015A1 (ru) |
AU (1) | AU2016204734B2 (ru) |
BR (1) | BR102016016677A2 (ru) |
CA (1) | CA2937088C (ru) |
CL (1) | CL2016001768A1 (ru) |
ES (1) | ES2669021T3 (ru) |
HU (1) | HUE036699T2 (ru) |
IL (1) | IL246634B (ru) |
MX (1) | MX2016009048A (ru) |
MY (1) | MY176204A (ru) |
NZ (1) | NZ722213A (ru) |
PL (1) | PL3121267T3 (ru) |
PT (1) | PT3121267T (ru) |
RU (1) | RU2691123C1 (ru) |
SG (1) | SG10201605867UA (ru) |
TW (1) | TWI666322B (ru) |
UY (1) | UY36778A (ru) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR102158641B1 (ko) * | 2019-03-06 | 2020-09-22 | 대한민국 | 야누스 인산화효소 저해제 및 헥사디메트린 브로마이드를 포함하는 바이러스 배양용 조성물 및 이를 이용한 바이러스 배양 방법 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2003001198A1 (en) * | 2001-06-21 | 2003-01-03 | Regents Of The University Of California | Immortalization of human cells by the ectopic expression of human telomerase reverse transcriptase |
US7252991B2 (en) * | 1993-06-11 | 2007-08-07 | Cell Genesys, Inc. | Method for production of high titer virus and high efficiency retroviral mediated transduction of mammalian cells |
US20130004471A1 (en) * | 2011-06-10 | 2013-01-03 | Bluebird Bio, Inc. | Gene therapy vectors for adrenoleukodystrophy and adrenomyeloneuropathy |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2007046962A2 (en) * | 2005-09-02 | 2007-04-26 | The University Of Maryland, Baltimore | Cell lines harboring hepatitis virus and methods for using thereof |
EP2663328B1 (en) * | 2011-01-10 | 2018-09-19 | The Government of The United States of America, as represented by The Secretary, Department of Health and Human Services | Infectious hepatitis e virus genotype 3 or 1 recombinants |
-
2016
- 2016-07-06 IL IL246634A patent/IL246634B/en active IP Right Grant
- 2016-07-07 UY UY0001036778A patent/UY36778A/es not_active Application Discontinuation
- 2016-07-08 MX MX2016009048A patent/MX2016009048A/es active IP Right Grant
- 2016-07-08 AU AU2016204734A patent/AU2016204734B2/en active Active
- 2016-07-08 RU RU2016127546A patent/RU2691123C1/ru active
- 2016-07-11 EP EP16178844.3A patent/EP3121267B1/en active Active
- 2016-07-11 HU HUE16178844A patent/HUE036699T2/hu unknown
- 2016-07-11 PL PL16178844T patent/PL3121267T3/pl unknown
- 2016-07-11 PT PT161788443T patent/PT3121267T/pt unknown
- 2016-07-11 ES ES16178844.3T patent/ES2669021T3/es active Active
- 2016-07-11 CL CL2016001768A patent/CL2016001768A1/es unknown
- 2016-07-12 MY MYPI2016702506A patent/MY176204A/en unknown
- 2016-07-15 NZ NZ722213A patent/NZ722213A/en not_active IP Right Cessation
- 2016-07-18 SG SG10201605867UA patent/SG10201605867UA/en unknown
- 2016-07-18 CN CN201610566601.8A patent/CN106367397B/zh active Active
- 2016-07-19 BR BR102016016677-2A patent/BR102016016677A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2016-07-19 US US15/213,766 patent/US10208291B2/en active Active
- 2016-07-20 TW TW105122892A patent/TWI666322B/zh not_active IP Right Cessation
- 2016-07-21 AR ARP160102202A patent/AR106015A1/es unknown
- 2016-07-22 KR KR1020160093629A patent/KR102154380B1/ko active IP Right Grant
- 2016-07-22 CA CA2937088A patent/CA2937088C/en active Active
- 2016-07-22 JP JP2016144065A patent/JP6588397B2/ja active Active
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7252991B2 (en) * | 1993-06-11 | 2007-08-07 | Cell Genesys, Inc. | Method for production of high titer virus and high efficiency retroviral mediated transduction of mammalian cells |
WO2003001198A1 (en) * | 2001-06-21 | 2003-01-03 | Regents Of The University Of California | Immortalization of human cells by the ectopic expression of human telomerase reverse transcriptase |
US20130004471A1 (en) * | 2011-06-10 | 2013-01-03 | Bluebird Bio, Inc. | Gene therapy vectors for adrenoleukodystrophy and adrenomyeloneuropathy |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
DEL VECCHIO MA., et al., Approaches to enhancing the retroviral transduction of human synoviocytes.Arthritis Res. 2001;3(4):259-63. Epub 2001 May 18. * |
YANG F., et al., [The establishment of high-throughput neutralization titer evaluation model for hepatitis E virus (HEV)].[Article in Chinese], Bing Du Xue Bao. 2015 Jan;31(1):1-6. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20170022481A1 (en) | 2017-01-26 |
PL3121267T3 (pl) | 2018-07-31 |
US10208291B2 (en) | 2019-02-19 |
NZ722213A (en) | 2019-04-26 |
TW201704468A (zh) | 2017-02-01 |
EP3121267A1 (en) | 2017-01-25 |
CN106367397B (zh) | 2021-07-20 |
TWI666322B (zh) | 2019-07-21 |
UY36778A (es) | 2016-09-30 |
CL2016001768A1 (es) | 2017-05-12 |
BR102016016677A2 (pt) | 2019-02-12 |
AR106015A1 (es) | 2017-12-06 |
CA2937088A1 (en) | 2017-01-23 |
ES2669021T3 (es) | 2018-05-23 |
AU2016204734A1 (en) | 2017-02-09 |
CA2937088C (en) | 2022-06-21 |
HUE036699T2 (hu) | 2018-07-30 |
JP6588397B2 (ja) | 2019-10-09 |
PT3121267T (pt) | 2018-04-26 |
JP2017023143A (ja) | 2017-02-02 |
CN106367397A (zh) | 2017-02-01 |
KR102154380B1 (ko) | 2020-09-10 |
IL246634A0 (en) | 2016-12-29 |
MX2016009048A (es) | 2017-01-23 |
IL246634B (en) | 2020-08-31 |
MY176204A (en) | 2020-07-24 |
KR20170012140A (ko) | 2017-02-02 |
EP3121267B1 (en) | 2018-03-28 |
AU2016204734B2 (en) | 2019-11-21 |
SG10201605867UA (en) | 2017-02-27 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Rahimi et al. | Genetics and genomics of SARS-CoV-2: A review of the literature with the special focus on genetic diversity and SARS-CoV-2 genome detection | |
de Deus et al. | Detection of hepatitis E virus in liver, mesenteric lymph node, serum, bile and faeces of naturally infected pigs affected by different pathological conditions | |
Oka et al. | Cell culture isolation and sequence analysis of genetically diverse US porcine epidemic diarrhea virus strains including a novel strain with a large deletion in the spike gene | |
Guillaume et al. | Specific detection of Nipah virus using real-time RT-PCR (TaqMan) | |
Sridhar et al. | A systematic approach to novel virus discovery in emerging infectious disease outbreaks | |
EP2954055B1 (en) | Cell lines for virus production and methods of use | |
Chan et al. | Persistent infection of SARS coronavirus in colonic cells in vitro | |
Gillim-Ross et al. | Discovery of novel human and animal cells infected by the severe acute respiratory syndrome coronavirus by replication-specific multiplex reverse transcription-PCR | |
Jirintai et al. | Rat hepatitis E virus derived from wild rats (Rattus rattus) propagates efficiently in human hepatoma cell lines | |
Goebel et al. | Isolation of avian paramyxovirus 1 from a patient with a lethal case of pneumonia | |
Takahashi et al. | Prevalence and genotype/subtype distribution of hepatitis E virus (HEV) among wild boars in Japan: Identification of a genotype 5 HEV strain | |
Pacciarini et al. | Persistent replication of severe acute respiratory syndrome coronavirus in human tubular kidney cells selects for adaptive mutations in the membrane protein | |
Nagashima et al. | Characteristics of SARS-CoV-2 isolated from asymptomatic carriers in Tokyo | |
Roth et al. | Isolation of influenza viruses in MDCK 33016PF cells and clearance of contaminating respiratory viruses | |
KR102205026B1 (ko) | 시험관내에서 생성된 바이러스의 정제 방법 및 그 바이러스에 대한 제거 분석 방법 | |
RU2691123C1 (ru) | Способ получения материала с высоким титром вируса гепатита Е и анализ титрования вируса гепатита Е | |
McClenahan et al. | Optimization of virus detection in cells using massively parallel sequencing | |
Felt et al. | Accumulation of copy-back viral genomes during respiratory syncytial virus infection is preceded by diversification of the copy-back viral genome population followed by selection | |
Gong et al. | Genetic characterization of hepatitis E virus from wild boar in China | |
Xia et al. | Isolation and characterization of a pangolin-borne HKU4-related coronavirus that potentially infects human-DPP4-transgenic mice | |
Rajalakshmy et al. | Serum‐derived hepatitis C virus 1a infection of human astrocyte cell line SVG | |
Widera et al. | Generation of a Sleeping Beauty transposon-based cellular system for rapid and sensitive identification of SARS-CoV-2 host dependency and restriction factors | |
CN117925540B (zh) | 一种cv2117-hav-htlv-2多基因假病毒及其制备方法和应用 | |
KR101122244B1 (ko) | 효율적으로 복제할 수 있는 변이 c형 간염 바이러스, 리포터 유전자를 포함하는 변이 c형 간염 바이러스, 상기 변이 c형 간염 바이러스를 이용한 c형 간염 바이러스 백신 제조방법 및 상기 변이 c형 간염 바이러스를 이용한 항c형 간염 바이러스 조성물의 스크리닝 방법 | |
Trende et al. | Barcoded SARS-CoV-2 viruses define the impact of time and route of transmission on the transmission bottleneck in a Syrian hamster model. |