TWI666322B - 產生高滴度的ｅ型肝炎病毒（ｈｅｖ）的方法、確定樣品中ｅ型肝炎病毒（ｈｅｖ）的存在及／或含量的方法、及ｅ型肝炎病毒（ｈｅｖ）滴定測定方法 - Google Patents

產生高滴度的ｅ型肝炎病毒（ｈｅｖ）的方法、確定樣品中ｅ型肝炎病毒（ｈｅｖ）的存在及／或含量的方法、及ｅ型肝炎病毒（ｈｅｖ）滴定測定方法 Download PDF

Info

Publication number
TWI666322B
TWI666322B TW105122892A TW105122892A TWI666322B TW I666322 B TWI666322 B TW I666322B TW 105122892 A TW105122892 A TW 105122892A TW 105122892 A TW105122892 A TW 105122892A TW I666322 B TWI666322 B TW I666322B
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
hev
virus
hepatitis
high titer
sample
Prior art date
Application number
TW105122892A
Other languages
English (en)
Other versions
TW201704468A (zh
Inventor
布萊特 布諾
特瑞 爵尼甘
喬安 荷達
麥可 柏迪克
Original Assignee
西班牙商格利佛勞斯公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 西班牙商格利佛勞斯公司 filed Critical 西班牙商格利佛勞斯公司
Publication of TW201704468A publication Critical patent/TW201704468A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI666322B publication Critical patent/TWI666322B/zh

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C12N7/02—Recovery or purification
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/067—Hepatocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/706—Specific hybridization probes for hepatitis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/706—Specific hybridization probes for hepatitis
    • C12Q1/707—Specific hybridization probes for hepatitis non-A, non-B Hepatitis, excluding hepatitis D
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/576—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/05—Adjuvants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/28011—Hepeviridae
    • C12N2770/28111—Hepevirus, e.g. hepatitis E virus
    • C12N2770/28121—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/28011—Hepeviridae
    • C12N2770/28111—Hepevirus, e.g. hepatitis E virus
    • C12N2770/28151—Methods of production or purification of viral material

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

本發明提供一種聚凝胺作為細胞培養基中的添加劑在用於產生高滴度E型肝炎病毒(HEV)儲備物的方法和用於滴定E型肝炎病毒的測定中使用的用途。本發明亦提供一種用於高滴度HEV產生的包含聚凝胺的細胞培養基、一種用於確定樣品中HEV的存在及/或含量的方法、以及一種使用聚凝胺的HEV滴定測定。

Description

產生高滴度的E型肝炎病毒(HEV)的方法、確定樣品中E型肝炎病毒(HEV)的存在及/或含量的方法、及E型肝炎病毒(HEV)滴定測定方法 【交叉參考相關申請案】
本申請主張於2015年7月23日提交的美國臨時申請案62/195,936的優先權的權益，其在此通過引用以其整體被明確併入。
序列表的引用
本申請與電子格式的序列表一起提交。序列表作為題為DURC6_006AUS_SEQLIST.txt的檔被提供，該序列表大小為1,093位元組，創建日期為2016年5月31日且最後修改日期為2016年5月31日。該電子格式的序列表中的資訊通過引用以其整體併入本文。
本發明為病毒學領域，更確切地關於一種用於產生E型肝炎病毒(下文稱為HEV)儲備物的方法。具體地，本發明揭露一種用於繁殖和滴定高滴度HEV儲備物的方法。
HEV(E型肝炎病毒屬(Hepevirus)，肝炎病毒科(Hepeviridae))是具有約7.2kb的單鏈正向的(positive-sense)、聚腺苷酸化核醣核酸(RNA)基因組的小的無包膜病毒/假包膜病毒(pseudo-enveloped virus)。存在已被鑒定的HEV的四種基因型，但僅存在一種血清型。基因型1和基因型2是不發達國家水源性感染的主要原因，並主要在人和高等靈長類中引起疾病。感染通常是自消退(self-resolving)的且急性的，持續至多2至7周，但特別是在孕婦中可能是致命的。基因型3和基因型4與工業化國家的地方性(本土)感染相關。這兩種基因型主要在豬中引起疾病，但人類可由於食物或動物傳染病暴露成為偶然的宿主。臨床疾病在青年人中通常是無症狀且溫和的，但在老年人中可變成臨床上明顯的。另外，基因型3和基因型4感染在免疫抑制者，諸如器官移植患者或AIDS患者中可變成慢性病。
最近，E型肝炎已被歸類為輸血可傳播的傳染病。鑒於近年來HEV的全世界傳播，關於血液來源的產品和血漿來源的產品的安全性的關注已被提高。血液來源的產品和血漿來源的產品的病毒安全性譜可通過進行證明它們的製造過程的病毒減少及/或清除能力的清除研究來保證。在這些清除研究期間，已知量的病毒被有意地摻入血液或血漿產品的中間體中，並然後被摻入的材料使用實驗室規模模式的製造過程來處理。跨步驟的病毒減少及/或清除通過比 較處理之前和之後的病毒的量來確定。
病毒清除研究要求大量的高滴度病毒，且用於HEV的有效細胞培養系統的缺乏已經阻礙了進行對於HEV的此類研究的能力。最近已開發了數種HEV細胞培養系統來解決這個問題。
基因型3和基因型4毒株被Okamoto和同事調適為在A549人類肺細胞中生長，達到3.9 x 108拷貝(copies)/mL的HEV RNA滴度。另外，該基因型4毒株還被培養在PLC/PRF/5細胞(人類肝癌細胞)中但具有較低的滴度。
第二種基因型3(毒株Kernow-C1)被Emerson和同事調適為在HepG2/C3A人類肝癌細胞中生長，在6次傳代之後獲得4.61 x 108基因組/mL的滴度。研究顯示，用於體外生長的調適導致之後獲得S17人類核糖體蛋白基因的174個核苷酸。由於具有相同插入的基因組在原始病毒接種物(來自HIV-1慢性感染的患者的糞便懸液)中被檢測到，因此重組/插入事件已自然發生而不是細胞培養的人為現象。雖然使該毒株在PLC/PRF/5和A549細胞中生長的嘗試是不成功的，或導致較低的滴度，但該病毒在來自豬，基因型3病毒的主要動物傳染病宿主的腎細胞中感染並複製。
人類肝癌細胞難以培養，並且可能要求特殊的細胞鋪板方法，該特殊的細胞鋪板方法包括使用塗層諸如膠原、纖網蛋白、明膠及/或聚L-賴氨酸以促進細胞附著及/或細胞生長。另外，並非所有這些塗層對於所有的細胞類型良好地工作。
在一些實施方案中，提供一種產生高滴度的E型肝炎病毒的方法，該方法包括：在包含一濃度的聚凝胺的培養基中體外培養細胞系、以及用HEV感染該細胞系。在該方法的一些實施方案中，使用的細胞系是HepG2(ATCC寄存編號HB-8065)或HepG2/C3A(ATCC寄存編號CRL-10741)。在該方法的一些實施方案中，聚凝胺的濃度為約1μg/ml至約5μg/ml。在該方法的一些實施方案中，高滴度為約108拷貝/mL至約1010拷貝/mL。在該方法的一些實施方案中，高滴度為約107拷貝/mL至約1010拷貝/mL。在一些實施方案中，該方法還包括以下的步驟：將一濃度的聚凝胺添加至培養基；在包含聚凝胺的培養基中對HEV感染的細胞系傳代；以及收集培養基及/或感染的細胞。在該方法的一些實施方案中，聚凝胺的濃度為約1μg/ml至約5μg/ml。在該方法的一些實施方案中，在培養基及/或感染的細胞中獲得的HEV的高滴度為約108拷貝/mL至約1010拷貝/mL。在該方法的一些實施方案中，在培養基及/或感染的細胞中獲得的HEV的高滴度為約107拷貝/mL至約1010拷貝/mL。
在一些實施方案中，提供一種確定樣品中HEV的存在及/或含量(level)的方法，該方法包括以下的步驟：向包含細胞系和培養基的混合物提供樣品，其中該培養基包含聚凝胺；培養來自先前步驟的包含樣品的混合物，以允許HEV的繁殖，如果HEV存在於樣品中的話；收集先前步 驟的部分，該部分包含HEV，如果HEV存在並在先前步驟期間繁殖的話；以及測量所收集的部分中與HEV相關的生物物質的存在及/或含量。在該方法的一些實施方案中，細胞系選自由HepG2(ATCC寄存編號HB-8065)和HepG2/C3A(ATCC寄存編號CRL-10741)的細胞系組成的組。在該方法的一些實施方案中，該生物物質包括HEV的多核苷酸及/或多肽序列。在該方法的一些實施方案中，該測量包括以下的步驟：通過將所收集的部分與第一溶液混合來提供第一反應混合物，以便使HEV的多核苷酸暴露，如果HEV存在於所收集的部分中的話，其中該多核苷酸是HEV的RNA；通過將第一試劑添加至該第一反應混合物來提供第二反應混合物，以便產生與該HEV的RNA至少部分互補的互補去氧核糖核酸(cDNA)；通過將第二試劑添加至該第二反應混合物來提供第三反應混合物，該第二試劑包含多核苷酸對，以擴增與該多核苷酸對中的每一個至少部分互補的cDNA的序列；通過擴增該序列來提供第四反應混合物；以及確定該第四反應混合物中擴增的序列的濃度。在該方法的一些實施方案中，該確定濃度包括：提供第四反應混合物；提供包含預定量的HEV的cDNA的一個或複數個對照；將試劑添加至該第四反應混合物和該一個或複數個對照，其中該試劑對該第四反應混合物中的擴增的序列和該一個或複數個對照中的預定量的HEV的cDNA至少部分地特異；以及計算相對於該一個或複數個對照該第四反應混合物中由該試劑識別的HEV的含量。在該方法 的一些實施方案中，該多核苷酸對包含：a)5’-CGGCTATCGGCCAGAAGTT-3’(SEQ ID NO：1)；b)5’-CCGTGGCTATAACTGTGGTCT-3’(SEQ ID NO：2)。
在該方法的一些實施方案中，試劑包括：5’-FAM-TTTTTACGC-ZEN-AGGCTGCCAAGGCC-3IABkFQ-3’(SEQ ID NO：3)。
在一些實施方案中，提供一種用於產生高滴度HEV的培養基，該培養基包含在約1μg/ml至約5μg/ml的範圍內的聚凝胺。在一些實施方案中，高滴度HEV為約108拷貝/mL至約1010拷貝/mL。在一些實施方案中，高滴度HEV為約107拷貝/mL至約1010拷貝/mL。
在一些實施方案中，提供一種包括使用聚凝胺的HEV滴定測定。在該測定的一些實施方案中，所使用的聚凝胺的濃度在約1μg/ml至約5μg/ml的範圍內。
圖1A至圖1C示出了根據本發明的一些實施方案，用不同的細胞培養基培養1天的HepG2/C3A細胞的以20x放大率拍攝的圖像。
圖1A示出了用DMEM+10% FBS+非必需氨基酸、兩性黴素B、HEPES、正大黴素(NHG)培養的HepG2/C3A細胞。
圖1B示出了用DMEM+10% FBS+NHG+丙酮酸鹽培養的HepG2/C3A細胞。
圖1C示出了用DMEM+10% FBS+NHG+丙酮酸鹽 +聚凝胺培養的HepG2/C3A細胞。
圖2A至圖2C示出了培養3天的HepG2/C3A細胞的以10x放大率(左)或20x放大率(右)拍攝的圖像。
圖2A示出了用DMEM+10% FBS+NHG培養的HepG2/C3A細胞。
圖2B示出了用DMEM+10% FBS+NHG+丙酮酸鹽培養的HepG2/C3A細胞。
圖2C示出了用DMEM+10% FBS+NHG+丙酮酸鹽+聚凝胺培養的HepG2/C3A細胞。
圖3示出了根據本發明的一些實施方案，對通過HEV PCR測定評估的慢性感染的HepG2(人類)細胞與MPK(豬)細胞中的HEV RNA滴度的比較。由於MPK細胞對鋪板表面的附著是非常有效的，聚凝胺未被用於MPK細胞。
圖4示出了根據本發明的一些實施方案的用於HEV PCR測定使用的引物和探針的核苷酸序列以及它們在HEV基因組上的位置。
圖5示出了根據本發明的一些實施方案的用於HEV PCR測定的標準曲線，其中基於歷史數據，閥值被手動設定成0.1，以便它通過所有標準曲線的指數期，並確保每rxn 1RNA拷貝的檢測，斜率=+3.3，R2=0.997。
本發明關於一種用於產生適合於在病毒清除研究中使用的E型肝炎病毒(HEV)的高滴度儲備物的方法、以及一種用於確定感染性HEV滴度的方法。本發明包括一種用於 在評價血液來源的產品和血漿來源的產品的製造過程的HEV清除能力的研究中使用的在細胞培養物中繁殖高滴度HEV的簡單方法。
如先前討論的，HEV已被Okamoto和同事使用PLC/PRF/5人類肝癌細胞和A549人類肺細胞以及被Emerson和同事使用HepG2/C3A人類肝癌細胞調適以在細胞培養物中生長。人類肝癌細胞難以培養，並且可能需要特殊的細胞鋪板方法。Emerson的實驗室在接種細胞之前用鼠尾膠原I塗覆板，而Okamoto的實驗室使用購自IWAKI的板，該板的一些是膠原塗覆的。表1比較了來自多種細胞培養系統的HEV滴度並列出了被不同實驗室使用的增強細胞鋪板方法。膠原和其他塗層，諸如纖網蛋白、明膠和聚-L-賴氨酸促進細胞附著及/或細胞生長，所以難以培養的細胞可達到較高的密度，並且從而產生高滴度病毒。
在本發明的一些實施方案中，提供一種針對HEV的培養方法，該培養方法包括使用聚凝胺(還稱為海地美溴銨(hexadimethrine bromide)和1,5-二甲基-1,5-二氮雜十一-亞甲基-聚甲氧溴化物(1,5-dimethyl-1,5-diazaundeca-methylene polymetho-bromide))，代替使用塗層諸如膠原或其他塗層來促進細胞附著及/或細胞生長。
聚凝胺是通常在細胞培養中被用來通過減少病毒和細胞之間的電荷排斥增加逆轉錄病毒的感染效率的廉價陽離子聚合物。聚凝胺使不同的物件更近地靠在一起的能力在本發明中被用來促進人類肝癌細胞對鋪板表面以及HEV對細胞的附著。聚凝胺被簡單地添加至被用於細胞和病毒繁殖的細胞培養基。本發明避免了購買用膠原或其他塗層試劑預塗覆的昂貴的板或者在細胞接種及病毒感染之前用膠原或其他塗層試劑預塗覆板的需要。
HEV通常在體內複製至低滴度，所以在體外生長是困難的。用於培養HEV以產生適合於在病毒清除研究中使用的高滴度儲備物的方法在之前是不可得的。
在本文公開的發明的一個方面，通過使用補充有聚凝胺的培養基，在細胞培養物中繁殖高滴度HEV是可能的。
通過減少病毒和細胞之間的電荷排斥，聚凝胺是在細胞培養中用來增加逆轉錄病毒(包膜病毒)的感染效率的廉價陽離子聚合物。在本發明的一些實施方案中，將聚凝胺添加至細胞培養基以促進HEV(一種無包膜/假包膜病毒) 對細胞的附著。另外，聚凝胺的存在改進細胞附著和增殖，從而增強HEV在被感染的細胞中的總體產生。
因此，在第一實施方案中，本發明關於一種基於向細胞培養基添加聚凝胺，在體外培養物中產生高滴度的HEV的方法。
HEV在細胞培養物中不產生致細胞病變效應(CPE)，所以HEV檢測是基於PCR。因此，在一些實施方案中，通過本發明的PCR測定，檢測低濃度的HEV是可能的。PCR測定可被用來開發，例如，精確的、準確的且可靠的對於HEV的感染性測定。
最初由國立衛生研究院(National Institutes of Health)(NIH)開發的PCR測定被改良以增加靈敏度。改變了反向引物被並設計了全新的探針。使用本發明的PCR測定的方法始終正確地將樣品評分為陽性的或陰性的，並且在滴度計算中是有用的。因此，在一個另外的實施方案中，本發明公開了基於PCR的HEV滴度測定，該基於PCR的HEV滴度測定包括使用聚凝胺或包含該聚凝胺的培養基(較佳地，細胞培養基)。
在一個實施方案中，本發明關於一種包括以下的方法：通過使用補充有聚凝胺的培養基，在細胞培養物中繁殖高滴度HEV；以及通過靈敏PCR測定檢測HEV。
該方法對HEV可以是特異性的，但用於病毒繁殖的方法可應用於其他無包膜病毒。例如，在一些實施方案中，本發明用從Emerson實驗室獲得的第6代HEV基因型3 毒株Kernow-C1來測試。
設想了，在一些實施方案中，在體外培養物，較佳地在體外器官、組織或細胞培養物中進行以上提及的產生高滴度HEV的方法。在最佳的實施方案中，本發明的產生高滴度HEV的方法在體外細胞培養物中進行。
原代培養細胞系和建立的培養細胞系兩者可在本發明的方法中使用。所使用的培養細胞系可來源於任何生物體。例如，設想到昆蟲細胞或哺乳動物細胞的使用。較佳地，所使用的培養細胞系來源於豬(或小型豬)和人類。
此外，較佳地，所使用的細胞系來源於肝或腎。細胞系來源於其的該肝或腎可以是健康的、或患病的，或者包括惡性或良性生長物。在最佳的實施方案中，使用了已建立的細胞系HepG2(ATCC寄存編號HB-8065)或HepG2/C3A(ATCC寄存編號CRL-10741)。
在一些實施方案中，聚凝胺的濃度在約1μg/ml至約5μg/ml的範圍內。在一些實施方案中，聚凝胺的濃度為約1μg/ml、2μg/ml、3μg/ml、4μg/ml或5μg/ml。在一個較佳的實施方案中，聚凝胺的濃度為約4μg/ml。
在一些實施方案中，本發明的方法產生了在約108拷貝/mL至約1010拷貝/mL的範圍內的HEV滴度。在一些實施方案中，本發明的方法產生了在約107拷貝/mL至約1010拷貝/mL的範圍內的HEV滴度。在一個較佳的實施方案中，本發明的方法產生了約109拷貝/mL的HEV滴度。
在一個另外的實施方案中，本發明關於一種產生高滴 度HEV的方法，該方法包括以下的步驟：a)在包含聚凝胺的培養基中鋪板細胞、以及b)用HEV感染體外培養物。在一些實施方案中，收集來自體外培養物的細胞培養基以獲得高滴度HEV。
在以上步驟b)之後，培養的細胞可通過本領域的先前技術中已知的任何方法(較佳地，通過胰蛋白酶消化)來收集，且可測定等分試樣的HEV的含量。該HEV的含量較佳地通過PCR，甚至更佳地用本發明的和如下描述的PCR測定來確定。參見圖5。在替代性實施方案中，HEV的含量可通過基於免疫螢光(IF)的測定來確定。參見圖5。
此外，在該步驟b)之後，培養的細胞可通過本領域的先前技術中已知的任何方法(較佳地，通過胰蛋白酶消化)來獲得，且HEV儲備物可通過本領域的先前技術中已知的任何方法來獲得。在一個較佳的實施方案中，HEV儲備物通過幾次，較佳地1次或2次凍融細胞來產生。產生的HEV儲備物較佳地被儲存在-65℃或更冷溫度下。
設想了，在一些實施方案中，以上描述的方法還包括以下的步驟：c)將聚凝胺添加至細胞培養基；以及d)進一步傳代被HEV感染的細胞。
可重複步驟c)和d)，例如以增加產生HEV的細胞的數目，並使病毒在培養物中的傳播和感染最大化。本領域技術人員可基於例如，細胞的外觀及其生長曲線容易地確定步驟c)和d)可被重複的次數，這是被感染的細胞系可忍受的傳代數目。
在各次傳代的步驟d)之後，培養的細胞可通過本領域的先前技術中已知的任何方法(較佳地，通過胰蛋白酶消化)來獲得，且可測定等分試樣的HEV的含量。該HEV的含量較佳地通過PCR，甚至更佳地用本發明的和如下描述的PCR測定來確定。參見圖5。
此外，在各次傳代的該步驟d)之後，培養的細胞可通過本領域的先前技術中已知的任何方法(較佳地，通過胰蛋白酶消化)來獲得，且HEV儲備物可通過本領域的現有技術中已知的任何方法來獲得。在一個較佳的實施方案中，HEV儲備物通過幾次，較佳地1次或2次凍融細胞來產生。產生的HEV儲備物較佳地被儲存在-65℃或更冷溫度下。
可選地，還可僅在已用感染的細胞系進行期望的或要求數目的傳代之後(亦即，在步驟c)和和d)已被重複期望的或要求的次數之後)，收集培養基。
如本領域技術人員已知的，傳代被HEV感染的細胞的步驟d)意味著通過本領域的先前技術中已知的任何方法獲得細胞。假使細胞生長為附著至表面(例如，來自瓶或板)，可能需要通過本領域的現有技術中已知的任何方法，較佳地通過胰蛋白酶消化使細胞脫離。當酶(例如，胰蛋白酶)被用來脫離細胞時，通常該酶需要被滅活。通常，在本領域的先前技術中，該滅活通過用富含蛋白的溶液，較佳地用具有FBS的細胞培養基稀釋來進行。
鑒於聚凝胺和包含該試劑的培養基(較佳地，細胞培養 基)允許HEV在體外培養物(較佳地，體外細胞培養物)中的有效感染和產生的事實，它們還可用在HEV滴度測定中。
因此，在一個另外的實施方案中，本發明公開了HEV滴度測定，該HEV滴度的特徵為它們包括聚凝胺或包含該聚凝胺的培養基(較佳地，細胞培養基)的使用。
體外培養物較佳地是體外器官、組織或細胞培養物。在最佳的實施方案中，體外培養物是體外細胞培養物。
可使用原代培養細胞系和建立的培養細胞系兩者。所使用的培養細胞系可來源於任何生物體。例如，設想了昆蟲細胞或哺乳動物細胞的使用。較佳地，所使用的培養細胞系來源於豬(或小型豬)和人類。
此外，較佳地，所使用的細胞系來源於肝或腎。細胞系來源於其的該肝或腎可以是健康的、或患病的，或者包括惡性或良性生長物。在最佳的實施方案中，使用已建立的細胞系HepG2(ATCC寄存編號HB-8065)或HepG2/C3A(ATCC寄存編號CRL-10741)。
較佳地，本發明的HEV滴度測定是按本領域技術人員已知的來進行的50%組織培養感染劑量(50% Tissue Culture Infective Dose)(TCID50)測定，例外是病毒的存在通過陽性PCR訊號而不通過病毒細胞病理學來指示。
在該滴定測定中，聚凝胺或包含該聚凝胺的細胞培養基被用於細胞培養，HEV樣品將在該聚凝胺或包含該聚凝胺的細胞培養基中被滴定。
在另一個實施方案中，提供了一種用於檢測HEV儲備物中的HEV的方法。
該檢測可通過本領域的先前技術中已知的任何方法或手段(means)來進行。然而，在一個較佳的實施方案中，檢測通過PCR進行。
在一個較佳的實施方案中，用於檢測HEV使用的PCR是即時逆轉錄酶PCR，其包括將病毒RNA逆轉錄為互補DNA(cDNA)的第一步驟，以及較佳地使用雙猝滅探針(double quenched probe)進行的即時PCR的第二步驟。
在最佳的實施方案中，在第二步驟中，以下寡核苷酸被用作引物和探針(圖4)。
a)正向引物：5’-CGGCTATCGGCCAGAAGTT-3’(SEQ ID NO：1)。
b)反向引物：5’-CCGTGGCTATAACTGTGGTCT-3’(SEQ ID NO：2)。
c)探針：5’-FAM-TTTTTACGC-ZEN-AGGCTGCCAAGGCC-3IABkFQ-3’(SEQ ID NO：3)。
來自評估基於PCR的HEV感染性測定的性能的研究的資料被總結於表2中。
在一個較佳的實施方案中，在96孔板中滴定細胞，且 用磁性Bioclone珠或磁性Dynabeads來提取HEV RNA，更較佳地使用Dynabeads。
為了更好地理解，本發明的某些實施方案參考通過舉例的方式呈現的圖式並參考不是對本發明的限制的例示性實施例來更詳細地描述。
實施例
實施例1.HepG2/C3A細胞在不同的生長培養基中的細胞生長模式
HepG2/C3A(106個)細胞被接種在25cm2瓶中並被培養在以下細胞培養基的一種中。
- DMEM+10% FBS+NHG(非必需氨基酸、兩性黴素B、HEPES、正大黴素)。
- DMEM+10% FBS+NHG+1mM丙酮酸鹽。
- DMEM+10% FBS+NHG+1mM丙酮酸鹽+4ug/mL聚凝胺。
在1天之後以20x放大率拍攝的圖像示於圖1中。在培養基DMEM+10% FBS+NHG(A)或DMEM+10% FBS+NHG+丙酮酸鹽(B)中培養的HepG2/C3A細胞以團塊生長，這將使得用病毒(例如HEV)感染非常困難。另一方面，當HepG2/C3A細胞被培養在DMEM+10% FBS+NHG+丙酮酸鹽+聚凝胺(C)中時，細胞附著並以平面甚至單層生長，這應該容易被病毒(例如HEV)感染。
在3天之後以10x和20x放大率拍攝的圖像示於圖2中。類似於第1天的細胞，在DMEM+10% FBS+NHG(A) 或DMEM+10% FBS+NHG+丙酮酸鹽(B)中培養的HepG2/C3A細胞以團塊生長，但在DMEM+10% FBS+NHG+丙酮酸鹽+聚凝胺(C)中生長的細胞以平面甚至單層生長。由於細胞團塊將阻礙病毒的均勻感染，在聚凝胺的存在下生長的細胞中HEV感染的效率將是最有可能較高的。
實施例2.HEV感染的細胞的建立
接種細胞培養瓶以便如下感染：根據本領域的先前技術中已知的方案或程式胰蛋白酶消化HepG2或HepG2/C3A細胞。添加十毫升生長培養基(根據所使用的細胞系的要求的基礎培養基加在約1μg/mL至約5μg/mL濃度的聚凝胺)以中和胰蛋白酶，並用移液管上下吸取懸液以打碎細胞團塊。然後以每150cm2瓶約106個細胞的密度接種細胞並在37℃培養箱中放置過夜。
通過從瓶去除培養基並添加HEV儲備物(澄清的病毒感染的細胞裂解物)，以0.1-1.0的感染複數(MOI)並在5-10mL的總體積中用HEV感染細胞。細胞在37℃培養至少1小時，在該時間期間，週期性地來回搖動瓶，以防止細胞變乾燥並使病毒接種物均勻地跨過細胞。添加另外的生長培養基(每瓶10-20mL)，並將瓶保持在37℃直到細胞單層匯合(約1周)。
實施例3.HEV感染的細胞的繁殖
當細胞單層變得匯合時，根據實施例1胰蛋白酶消化150cm2瓶中的感染的細胞(HepG2或HepG2/C3A)。如果多 個瓶待被胰蛋白酶消化，在繼續進行之前，將細胞懸液彙集在一起。
取不少於1mL的胰蛋白酶消化的細胞懸液的等分試樣以通過PCR分析HEV RNA。將剩餘細胞懸液丟棄或以等於匯合單層的1/6的細胞數目分進其他150cm2瓶中(1：6分配)。添加生長培養基，以使每個150cm2瓶中的終體積達到20mL-25mL，並將瓶培養直到細胞達到匯合(約1周)。
每週重複該程式，直到被取出用於PCR分析的1mL樣品中HEV RNA的量達到高滴度。在一些實施方案中，高滴度在約108拷貝/mL至約1010拷貝/mL的範圍內。在一些實施方案中，高滴度在約107拷貝/mL至約1010拷貝/mL的範圍內。然後一些瓶被胰蛋白酶消化，並被分配以便HEV感染的細胞的繼續傳代，而剩餘的瓶作為HEV儲備物處理。
將HEV儲備物的瓶冷凍和解凍1-2次，以破裂感染的細胞並釋放病毒。然後彙集被感染的裂解物、等分進適當的容器中並儲存在不高於-65℃下。
實施例4.基於PCR的HEV感染性測定
雖然在該實施例中，HEV滴定在96孔板格式中被描述，但該測定可容易地被調整為適應其他尺寸的多孔板。
製備HEV儲備物的系列稀釋液並添加至接種有HepG2或HepG2/C3A細胞的孔。允許病毒在37℃吸收不少於1小時，並添加生長培養基。在37℃培養板不少於2 天，然後從孔吸出培養基，並用緩衝液(例如PBS)洗滌/吸出細胞不少於2x。然後板被提取用於PCR或被儲存在不高於-65℃下直到準備用於提取。
使用Dynabeads® mRNA DIRECTTM微型試劑盒(Life Technologies)遵循製造商的說明書從滴定板的每個孔中的細胞提取聚腺苷酸化RNA(例如HEV RNA)。所得的洗脫液(聚A RNA)被立即處理用於PCR擴增或儲存在不高於-65℃下直到準備用於PCR擴增。
使用如先前討論的引物和探針，使用一步RT-PCR檢測樣品中的HEV RNA。用於每個反應的測定條件如下。
a)試劑：5.0μl 4x TaqMan® Fast Virus 1-Step Master Mix(Life Technologies)、0.08μL 100mM引物F+R、0.04μL 100mM探針、0.4μL SUPERase In(Life Technologies)、4.4μL水和10μL模板(總計20μl)。
b)反應：52℃ 10分鐘、95℃ 30秒，以及95℃ 15秒、56℃ 45秒的40個循環。
PCR和循環閾值(Ct)確定根據製造商的說明書使用AB 7500即時PCR系統(Applied Biosystems,Foster City,CA)和附帶軟體來進行。
PCR是定量的或定性的。對於定量PCR，從NIH獲得的HEV cDNA質粒用MluI被線性化，並使用mMESSAGE mMACHINE®試劑盒(Life Technologies)轉錄，以產生具有7-甲基鳥苷帽和聚A尾的7.2kb RNA轉錄物。將該轉錄物用Ambion MegaClear試劑盒(Life Technologies)純化，用 定量-iTTM RiboGreen® RNA試劑和試劑盒(Invitrogen)定量並用作構建RNA標準校正曲線的標準品。
RNA標準曲線由AB7500軟體系統通過對Ct值相對於對標準品計算的拷貝數目的對數作圖來產生。
圖5(右圖)顯示典型的標準曲線。所有的曲線具有寬的動態範圍，範圍從每反應100至107拷貝，並且是線性的，具有r2>0.99的相關係數。擴增的效率百分比被計算為% E=[10(-1/斜率)-1]* 100。基於n=22 HEV qPCR標準曲線，HEV定量PCR的效率為100.4%(資料未圖示)。
對於定性PCR，基於陽性PCR訊號的存在，孔被評分為陽性或陰性。病毒滴度使用適當的統計學方法：Spearman-Kärber、MPN或泊松(Poisson)被計算為TCID50/mL。
實施例5.基於PCR的HEV感染性測定性能的評估
進行測定資格研究，以評估HEV感染性測定的運行特徵。評價的參數是精確度、準確度、線性度、定量和檢測的限值及動態範圍。
接受標準與對於其他病毒滴定測定通常使用的那些相同。
結果總結於表2中，並表明該測定通過所有測試。
定義
HepG2：從美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection)獲得的肝細胞癌細胞(ATCC寄存編號HB-8065)。
MPK：從美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection)獲得的小型豬腎細胞(ATCC寄存編號CCL-66)。
DMEM：Dulbecco氏改良的Eagle培養基。
FBS：胎牛血清。
HEPES：N-2-羥乙基呱嗪-N'-2-乙磺酸。
NEAA：非必需氨基酸。
NHG：以下的混合物：非必需氨基酸、兩性黴素B、HEPES和正大黴素。
滴定：連續稀釋樣品以包括期望的病毒滴度並將稀釋的樣品轉移至板以確定TCID50/mL的過程。
滴度：通過滴定確定的溶液中物質(病毒)的濃度或此類物質的強度。
SK：Spearman-Karber是計算具有相對高濃度病毒的樣品中的病毒滴度的統計學方法。當陽性孔在任何稀釋度下的比例>25%時，使用該方法。
MPN：最大概率數是計算具有相對低濃度病毒的樣品中的病毒滴度的統計學方法。當陽性孔在所有稀釋度下的比例<25%時，使用MPN。
泊松：泊松是計算具有極低濃度病毒的樣品中的病毒滴度的統計學方法。當未觀察到陽性孔時，使用該方法。
ATCC：美國典型培養物保藏中心。
TCID50：對應於50%組織培養感染劑量(終點稀釋測定)。它是感染性病毒滴度的測量值，其定量了殺死50%的 被感染的宿主或在50%的接種的組織培養細胞中產生細胞病變效應所需的病毒的量。
參考文獻
1. Okamoto H (2011) Hepatitis E virus cell culture models. Virus Research 161:65- 77.
2. Tanaka T，等(2007) Development and evaluation of an efficient cell-culture system for Hepatitis E virus. J Gen Virol 88:903-911.
3. Tanaka T，等(2009) Development and Characterization of a Genotype 4 Hepatitis E Virus Cell Culture System Using a HE-JF5/15F Strain Recovered from a Fulminant Hepatitis Patient. J Clin Microbiol 47:1906-1910.
4. Shukla P，等(2011) Cross-species infections of cultured cells by hepatitis E virus and discovery of an infectious virus-host recombinant. PNAS.108 (6):2438-2443.
5. Shukla P，等(2012) Adaptation of a Genotype 3 Hepatitis E Virus to Efficient Growth in Cell Culture Depends on an Inserted Human Gene Segment Acquired by Recombination. J Virol 86 (10):5697-5707
6.美國臨時專利申請號61/431,377
7.美國臨時專利申請號61/554,323
8.美國專利申請號13/978,839
9.國際PCT申請號PCT/US2012/020830
【生物材料寄存】
無須寄存生物材料者[所屬技術領域中具有通常知識者易於獲得]
1. Hep G2[HEPG2](ATCC寄存編號HB-8065)。
2. C3A[HepG2/C3A，衍生自Hep G2(ATCC寄存編號HB-8065)](ATCC寄存編號CRL-10741)。
<110> 格利佛勞斯公司
<120> 產生高滴度的E型肝炎病毒(HEV)的方法確定樣品中E型肝炎病毒(HEV)的存在及/或含量的方法、用於產生高滴度E型肝炎病毒(HEV)的培養基、及E型肝炎病毒(HEV)滴定測定
<130> DURC6.006AUS
<140> 105122892
<150> US 62/195,936
<151> 2015-07-23
<160> 3
<170> PatentIn 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的；HEV來源的引子
<400> 1
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的；HEV反向引子
<400> 2
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的；HEV探針
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> n=Fam
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> n=Zen
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(26)
<223> n=3IABkFQ
<400> 3

Claims (13)

  1. 一種產生高滴度的E型肝炎病毒(HEV)的方法，包括以下的步驟：步驟a)在包含濃度為約1μg/ml至約5μg/ml的聚凝胺的培養基中體外培養細胞系，其中該細胞系是HepG2(ATCC寄存編號HB-8065)或HepG2/C3A(ATCC寄存編號CRL-10741)；以及步驟b)用E型肝炎病毒(HEV)感染該細胞系。
  2. 如請求項1所記載之產生高滴度的E型肝炎病毒(HEV)的方法，其中該E型肝炎病毒(HEV)的高滴度為約108copies/ml至約1010copies/ml。
  3. 如請求項1所記載之產生高滴度的E型肝炎病毒(HEV)的方法，其中該E型肝炎病毒(HEV)的高滴度為約107copies/ml至約1010copies/ml。
  4. 如請求項1所記載之產生高滴度的E型肝炎病毒(HEV)的方法，其中該方法進一步包括以下的步驟：在步驟b)中包含濃度為約1μg/ml至約5μg/ml的聚凝胺的該培養基中對E型肝炎病毒(HEV)感染的細胞系傳代。
  5. 如請求項4所記載之產生高滴度的E型肝炎病毒(HEV)的方法，其中在該培養基及/或該感染的細胞中獲得的E型肝炎病毒(HEV)的高滴度為約108copies/ml至約1010copies/ml。
  6. 如請求項4所記載之產生高滴度的E型肝炎病毒(HEV)的方法，其中在該培養基及/或該感染的細胞中獲得的E型肝炎病毒(HEV)的高滴度為約107copies/ml至約1010copies/ml。
  7. 一種確定樣品中E型肝炎病毒(HEV)的存在及/或含量的方法，包括以下的步驟：步驟a)向包含細胞系和培養基的混合物提供該樣品，其中該細胞系是HepG2(ATCC寄存編號HB-8065)或HepG2/C3A(ATCC寄存編號CRL-10741)，該培養基包含濃度為約1μg/ml至約5μg/ml的聚凝胺；步驟b)培養來自步驟a)的包含該樣品的混合物，以允許E型肝炎病毒(HEV)的繁殖，如果E型肝炎病毒(HEV)存在於該樣品中；步驟c)收集步驟b)的部分，該部分包含E型肝炎病毒(HEV)，如果E型肝炎病毒(HEV)存在並在步驟b)期間被繁殖；以及步驟d)測量所收集的該部分中與E型肝炎病毒(HEV)相關的生物物質的存在及/或含量。
  8. 如請求項7所記載之確定樣品中E型肝炎病毒(HEV)的存在及/或含量的方法，其中該生物物質包括E型肝炎病毒(HEV)的多核苷酸及/或多肽序列。
  9. 如請求項7所記載之確定樣品中E型肝炎病毒(HEV)的存在及/或含量的方法，其中測量該生物物質的存在及/或含量包括以下的步驟：步驟a)藉由將所收集的部分與第一溶液混合來提供第一反應混合物，以便使E型肝炎病毒(HEV)的多核苷酸暴露，如果E型肝炎病毒(HEV)存在於所收集的部分中，其中該多核苷酸是E型肝炎病毒(HEV)的核糖核酸(RNA)；步驟b)藉由將第一試劑添加至該第一反應混合物來提供第二反應混合物，以便產生與該E型肝炎病毒(HEV)的核糖核酸(RNA)至少部分互補的互補去氧核糖核酸(cDNA)；步驟c)藉由將第二試劑添加至該第二反應混合物來提供第三反應混合物，該第二試劑包含多核苷酸對以擴增與該多核苷酸對中的每一個至少部分互補的互補去氧核糖核酸(cDNA)的序列；步驟d)藉由擴增該序列來提供第四反應混合物；以及步驟e)確定該第四反應混合物中所擴增的序列的濃度。
  10. 如請求項9所記載之確定樣品中E型肝炎病毒(HEV)的存在及/或含量的方法，其中該確定濃度包括：a)提供該第四反應混合物；b)提供包含一預定量的E型肝炎病毒(HEV)的互補去氧核糖核酸(cDNA)的一個或複數個對照；c)將一試劑添加至該第四反應混合物和該一個或複數個對照，其中該試劑對該第四反應混合物中的擴增的序列和該一個或複數個對照中的預定量的E型肝炎病毒(HEV)的互補去氧核糖核酸(cDNA)至少部分地特異；以及d)計算相對於該一個或複數個對照該第四反應混合物中由該試劑識別的E型肝炎病毒(HEV)的含量。
  11. 如請求項9所記載之確定樣品中E型肝炎病毒(HEV)的存在及/或含量的方法，其中該多核苷酸對包含：a)5’-CGGCTATCGGCCAGAAGTT-3’(SEQ ID NO：1)；b)5’-CCGTGGCTATAACTGTGGTCT-3’(SEQ ID NO：2)。
  12. 如請求項10所記載之確定樣品中E型肝炎病毒(HEV)的存在及/或含量的方法，其中該試劑包括：5’-FAM-TTTTTACGC-ZEN-AGGCTGCCAAGGCC-3IABkFQ-3’(SEQ ID NO：3)。
  13. 一種E型肝炎病毒(HEV)滴定測定方法，包括：使用在約1μg/ml至約5μg/ml的範圍內的聚凝胺的培養基以及細胞系之步驟，其中該細胞系是HepG2(ATCC寄存編號HB-8065)或HepG2/C3A(ATCC寄存編號CRL-10741)。
TW105122892A 2015-07-23 2016-07-20 產生高滴度的ｅ型肝炎病毒（ｈｅｖ）的方法、確定樣品中ｅ型肝炎病毒（ｈｅｖ）的存在及／或含量的方法、及ｅ型肝炎病毒（ｈｅｖ）滴定測定方法 TWI666322B (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562195936P 2015-07-23 2015-07-23
US62/195,936 2015-07-23

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW201704468A TW201704468A (zh) 2017-02-01
TWI666322B true TWI666322B (zh) 2019-07-21

Family

ID=56409494

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW105122892A TWI666322B (zh) 2015-07-23 2016-07-20 產生高滴度的ｅ型肝炎病毒（ｈｅｖ）的方法、確定樣品中ｅ型肝炎病毒（ｈｅｖ）的存在及／或含量的方法、及ｅ型肝炎病毒（ｈｅｖ）滴定測定方法

Country Status (22)

Country Link
US (1) US10208291B2 (zh)
EP (1) EP3121267B1 (zh)
JP (1) JP6588397B2 (zh)
KR (1) KR102154380B1 (zh)
CN (1) CN106367397B (zh)
AR (1) AR106015A1 (zh)
AU (1) AU2016204734B2 (zh)
BR (1) BR102016016677A2 (zh)
CA (1) CA2937088C (zh)
CL (1) CL2016001768A1 (zh)
ES (1) ES2669021T3 (zh)
HU (1) HUE036699T2 (zh)
IL (1) IL246634B (zh)
MX (1) MX2016009048A (zh)
MY (1) MY176204A (zh)
NZ (1) NZ722213A (zh)
PL (1) PL3121267T3 (zh)
PT (1) PT3121267T (zh)
RU (1) RU2691123C1 (zh)
SG (1) SG10201605867UA (zh)
TW (1) TWI666322B (zh)
UY (1) UY36778A (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102158641B1 (ko) * 2019-03-06 2020-09-22 대한민국 야누스 인산화효소 저해제 및 헥사디메트린 브로마이드를 포함하는 바이러스 배양용 조성물 및 이를 이용한 바이러스 배양 방법

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007046962A2 (en) * 2005-09-02 2007-04-26 The University Of Maryland, Baltimore Cell lines harboring hepatitis virus and methods for using thereof
US20130302790A1 (en) * 2011-01-10 2013-11-14 Royal Cornwall Hospital Trust Infectious hepatitis e virus genotype 3 recombinants

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6506604B2 (en) * 1993-06-11 2003-01-14 Cell Genesys, Inc. Method for production of high titer virus and high efficiency retroviral mediated transduction of mammalian cells
WO2003001198A1 (en) * 2001-06-21 2003-01-03 Regents Of The University Of California Immortalization of human cells by the ectopic expression of human telomerase reverse transcriptase
WO2012170911A2 (en) * 2011-06-10 2012-12-13 Bluebird Bio, Inc. Gene therapy vectors for adrenoleukodystrophy and adrenomyeloneuropathy

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007046962A2 (en) * 2005-09-02 2007-04-26 The University Of Maryland, Baltimore Cell lines harboring hepatitis virus and methods for using thereof
US20130302790A1 (en) * 2011-01-10 2013-11-14 Royal Cornwall Hospital Trust Infectious hepatitis e virus genotype 3 recombinants

Also Published As

Publication number Publication date
KR20170012140A (ko) 2017-02-02
SG10201605867UA (en) 2017-02-27
NZ722213A (en) 2019-04-26
CA2937088A1 (en) 2017-01-23
EP3121267B1 (en) 2018-03-28
KR102154380B1 (ko) 2020-09-10
AU2016204734A1 (en) 2017-02-09
CA2937088C (en) 2022-06-21
US20170022481A1 (en) 2017-01-26
EP3121267A1 (en) 2017-01-25
MY176204A (en) 2020-07-24
ES2669021T3 (es) 2018-05-23
RU2691123C1 (ru) 2019-06-11
CN106367397A (zh) 2017-02-01
CL2016001768A1 (es) 2017-05-12
MX2016009048A (es) 2017-01-23
UY36778A (es) 2016-09-30
US10208291B2 (en) 2019-02-19
PL3121267T3 (pl) 2018-07-31
PT3121267T (pt) 2018-04-26
JP2017023143A (ja) 2017-02-02
JP6588397B2 (ja) 2019-10-09
BR102016016677A2 (pt) 2019-02-12
TW201704468A (zh) 2017-02-01
CN106367397B (zh) 2021-07-20
IL246634B (en) 2020-08-31
HUE036699T2 (hu) 2018-07-30
AR106015A1 (es) 2017-12-06
IL246634A0 (en) 2016-12-29
AU2016204734B2 (en) 2019-11-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Dimitrov et al. A robust and cost-effective approach to sequence and analyze complete genomes of small RNA viruses
Shirato et al. Detection of Middle East respiratory syndrome coronavirus using reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP)
Saito et al. SARS-CoV-2 spike P681R mutation, a hallmark of the Delta variant, enhances viral fusogenicity and pathogenicity
Marsh et al. Cedar virus: a novel Henipavirus isolated from Australian bats
Sridhar et al. A systematic approach to novel virus discovery in emerging infectious disease outbreaks
Dovas et al. Detection and quantification of infectious avian influenza A (H5N1) virus in environmental water by using real-time reverse transcription-PCR
US20080261198A1 (en) Diagnostic Primers and Method for Detecting Avian Influenza Virus Subtype H5 and H5n1
Goebel et al. Isolation of avian paramyxovirus 1 from a patient with a lethal case of pneumonia
US20240117451A1 (en) Spike-in reference standard for use in detecting sample target from dna or rna organism
Guionie et al. Laboratory evaluation of a quantitative real-time reverse transcription PCR assay for the detection and identification of the four subgroups of avian metapneumovirus
Brussel et al. Use of a new RNA next generation sequencing approach for the specific detection of virus infection in cells
Janowski et al. Infection and propagation of astrovirus VA1 in cell culture
Wang et al. The establishment of infectious clone and single round infectious particles for coxsackievirus A10
Chana et al. Improved molecular diagnosis of COVID-19 by the novel, highly sensitive and specific 2 COVID-19-RdRp/Hel realtime reverse transcription-polymerase chain reaction assay validated 3 in vitro and with clinical specimens
Alvarado et al. Detection of Massachusetts and Arkansas serotypes of infectious bronchitis virus in broilers
CN113186226B (zh) Rna病毒核酸检测参照标准品及其用途
TWI666322B (zh) 產生高滴度的ｅ型肝炎病毒（ｈｅｖ）的方法、確定樣品中ｅ型肝炎病毒（ｈｅｖ）的存在及／或含量的方法、及ｅ型肝炎病毒（ｈｅｖ）滴定測定方法
McClenahan et al. Optimization of virus detection in cells using massively parallel sequencing
Zoccola et al. A newly developed BVDV-1 RT-qPCR Taqman assay based on Italian isolates: evaluation as a diagnostic tool
Rivera-Benitez et al. Efficacy of quantitative RT-PCR for detection of the nucleoprotein gene from different porcine rubulavirus strains
KR102260264B1 (ko) 코로나바이러스 질병 2019(COVID-19)의 SARS-CoV-2에 대한 실험실-안전 및 저비용 검출 프로토콜
CN103215386A (zh) 一种肠道病毒ev核酸恒温扩增方法
Fukumoto et al. Evaluation of Vero-cell-derived simian endogenous retrovirus infection in humans by detection of viral genome in clinicopathological samples and commercialized vaccines and by serology of Japanese general population
Gong et al. Genetic characterization of hepatitis E virus from wild boar in China
Xia et al. Isolation and characterization of a pangolin-borne HKU4-related coronavirus that potentially infects human-DPP4-transgenic mice

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Annulment or lapse of patent due to non-payment of fees