CZ34795A3 - Process for preparing a hepatitis virus, purified virus and vaccine against a hepatitis virus - Google Patents

Description

Způsob výroby viru hepatitidy A, čištěný virus a vakcina proti viru hepatitidy A

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu výroby viru hepatitidy A, takto získaného čištěného viru a také vakciny proti viru hepatitidy A.

Dosavadní stav techniky

V roce 1973 byl identifikován jako mikroorganismus, vyvolávající infekční žloutenku virus, později označovaný jao virus hepatitidy A, K identifikaci byl použit elektronový mikroskop a výsledky výzkumu byly publikovány v Feinstone a další, Science, 182, str. 1026.

Zprávy o první kultuře viru hepatitidy A, HAV in vitro jsou popsány v publikaci Provost a další, P.S.E.B.M., 160, str. 213, 1979. Postup spočíval v tom, že játra z mladých svistů, infikovaných HAV byla užita jako očkovací materiál pro kultury z explantátů jater a pro kultury z fetálních ledvin opic Rhesus (FRhk6) podle US patentového spisu č.

164 566. Později bylo užito přímého očkování virem HAV který nebyl předem pasážován přes nižší primáty k propagaci viru in vitro podle publikace Provost a další, P.S.E.

B.M., 167, str. 201, 1981, a také podle US patentového spisu č . 5 021 348.

Podle těchto prací bylo prokázáno, Že při pěstování HAV v kultuře in vitro je možno připravit atenuovaný virus. Mimoto bylo prokázáno, že po opakovaném pasážování in vitro jsou kultury HAV produktivnější a replikace se urychlí vzhledem k tomu, že se virus adaptuje na buněčný materiál kultury. Další vývoj prokázal, že živý atenuovaný virus podle publikace Provost a další, J. Med. Viol., 20, str. 165, 1986 a také formalinem inaktivovaný HAV podle US patentových spisů č . 4 164 566, a 5 021 348 a podle publikace Provost a další, Viral Hepatitis and Liver Disease, str. 83 - 86,

1988, vydavatel Alan R. Liss, lne., může poskytnout ochranu proti infekci u nižších primátů. Z těchto prací bylo zřejmé, že inaktivovaný nebo atenuovaný imunogenní HAV by bylo možno použít pro výrobu vakciny. Bylo by však zapotřebí navrhnout reprodukovatelný, v průmyslovém měřítku proveditelný postup pro výrobu vysoce čistého antigenu, aby bylo možno vyrobit vakcinu pro použití u lidí.

Byla popsána řada postupů pro částečné čištění celých virionů HAV pro výzkum a počáteční charakterizaci. Tyto postupy jsou popsány například v publikacích Hornbeck C. L. a další, Intervirology 6, 309 - 314, 1975, Locarnini S. A. a další, Intervirology 10, 300 - 308, 1978, Siegl G. a další,

J. Virol. 26, 40 - 47, 1978, Siegl G. a další, J. Gen. Virol. 57, 331 - 341, 1981, Siegl G. a další, Interviology 22, 218, 1984, Hughes J. V. a další, J. Virol. 52, 465, 1984 a Wheeler C. M. a další, J. Virol., 58, 307, 1986.

Při všech těchto postupech se užívají zdlouhavé a velmi nákladné stupně, například odstředění při použití sacharosového gradientu nebo gradientu chloridu česného. Mimoto jsou tyto postupy upraveny pro práci v poměrně malém měřítku a přestože se uvádí příprava vysoce čistých produktů, při pečlivé analýze je možno prokázat, že produkty nejsou zcela čisté. Lewis a další v evropské patentové přihlášce č. 302 692, zveřejněné 8. února 1989 uvádějí postup, který spočívá v tom, že se a) rozruší buňky, infikované HAV, materiál se podrobí extrakci a zahustí se_f

b) materiál se nechá projít chromatografickým sloupcem s obsahem aniontoměniče při vysoké koncentraci soli k odstranění znečištujících nukleových kyselin a c) výsledný materiál se zfiltruje na sloupci gelu. Později v publikaci Lewis a další, evropská patentová přihlášky 0468702, zveřejněná 18. července 1989 se popisuje modifikace tohoto postupu zařazením stupně, v němž se provádí adsorpce na iontoměnič s následnou desorpcí k odstranění znečištujících uhlohydrátů. V obou patentových přihláškách byly pokusy prováděny v poměrně malém měřítku a nebyla brána v úvahu možnost provádění postupu v průmyslovém měřítku. Mimoto byla čistota produktu po elektroforéze na gelu stanovena barvením modří coomasie nebo stříbrem. Tento postup je jednou z možností stanovení čistoty bílkovin, nejde však o kvantitativní postup a postup také neposkytuje informaci o přítomnosti jiných znečištění, jako jsou lipidy, uhlohydráty, nukleové kyseliny nebo organické látky s nízkou molakulovou hmotností .

V obou zveřejněných evropských patentových přihláškách EP0468702A2 a EP0302692A2 se uvádí, že ve známých postupech pro izolaci a čištění HAV se užívá jednoho nebo většího počtu stupňů, při jejichž použití nemůže dojít k vydání povolení pro výrobu úžadem Food and Drug Administration vzhledem k použití smáčedel nebo exogenních enzymů. Také vynález navrhuje použití smáčedel a exogenních enzymů, avšak současně uvádí účinné postupy pro odstranění těchto reakčních činidel a prokazuje, že získaný produkt obsahuje nižší množství těchto přidaných látek, než je vůbec možno prokázat, takže produkt je stejně čistý nebo čistší než HAV, získaný známými postupy.

V evropské patentové přihlášce č. 0339668, zveřejněné 2. listopadu 1989, popisuje Moritsugu a další, postup, který spočívá v tom, že se

a) solubilizuje, extrahuje a zahustí materiál při použití DNázy/RNázy a pak se materiál zpracuje působením proteinázy,

b) provádí se frakcionace při použití sacharosy k oddělení RNA a prázdných kapsidů a

c) materiál se podrobí filtraci na gelu.

Tento postup je opět omezen, pokud jde o množství získaného materiálu, zejména vzhledem k frakcionačnímu stupni s použitím sacharosy. Mimoto není snadné stanovit čistotu produktu a tato čistota se také v přesném hodnocení v publikaci nikde neuvádí.

V publikaci Lino a další, Vaccine, sv. 10, str. 5 10, 1992 se popisuje zlepšení Moritsugova postupu. Čistota produktu se stanoví elektroforézou na SDS-polyakrylamidovém gelu a densitometrií a je možno prokázat, že čištěný HAV obsahuje méně než 1,9 % exogenních bílkovin. Bylo také prokázáno méně než 5 pg nukleových kyselin hostitelských buněk v 0,5 mikrogramech čištěného HAV. Avšak provedení tohoto postupu ve velkém měřítku je nesnadné a skutečná čistota produktu při použití většího množství parametrů rovněž nebyla uvedena.

V publikaci kusov a další, Vaccine, 9, 540, 1991 se popisuje pěstování HAV na buněčném materiálu, podobném Věro a čištění viru extrakcí organickým rozpouštědlem, působením DANázy a chromatografii při použití kuliček z porézního oxidu křemičitého. Ani v tomto případě se neuvádí absolutní čistota produktů ani možnost provedení postupu v průmyslovém měřítku.

Navzdory tomu, že v literatuře dosud není k disposici žádný skutečný údaj o čistotě HAV pro použití ve vakcině, je možno srovnávat produkty podle antigenity, jak bude dále uvedeno v tabulce 1 v příkladu 11. Uvedeny jsou údaje, srovnávající množství HAV v různých produktech podle údajů výrobce, mimoto jsou uvedeny také údaje o produktu podle vynálezu.

Vynález si klade za úkol získat čistý imunogenní materiál v průmyslovém měřítku. Vysoká kvalita a čistota produktu by měla být reprodukovatelná tak, aby bylo možno dosáhnout bezpečného použití vakciny.

Podstata vynálezu

Podstatu vynálezu tvoří způsob výroby viru hepatitidy

A s možností provedení v průmyslovém měřítku, při čistotě viru vyšší než 95 %, vztaženo na bílkovinu při elektroforéze na SDS-polyakrylamidovém gelu při barvení stříbrem, postup spočívá v tom, že se

a) pěstuje virus hepatitidy A ve velkém množství na vrstvě buněčného materiálu na velkém povrchu statického reaktoru SSR,

b) virus hepatitidy A se izoluje ze souvislé buněčné kultury působením smáčedla, pronikajícího do vrstvy infikovaných buněk za uvolnění viru hepatitidy A z buněčné kultury,

c) popřípadě se odstraní nukleové kyseliny, nespecifické pro virus hepatitidy A v tomto stupni ze získaného viru hepatitidy A působením nukleázy,

d) virus hepatitidy A, izolovaný z buněčné kultury se zahustí pomocí membrán a diafiltrací nebo zachycením na iontoměniči,

e) z koncentrovaného viru hepatitidy A ze stupně d) se odstraní bílkoviny, které nejsou specifické pro virus hepatitidy A kombinací extrakce organickými rozpouštědly, srážením polyethylenglykolem, výměnou iontů, včetně odstranění volných kontaminujících nukleových kyselin v případě, že tyto kyseliny nebyly odstraněny ve stupni c) a chromatografií na gelu a

f) čištěný virus hepatitidy A ze stupně e) se izoluje.

Dále bude způsob podle vynálezu popsán v souvislosti s přiloženými výkresy.

Přehled obrázků na výkresech

Na obr. 1 je znázorněno schematicky použití hlavních postupů při výrobě vakciny s obsahem viru hepatitidy A pro klinické pokusy. V levé větvi schématu je uveden dříve známý postup, použitý pro fázi I/II klinických pokusů, při tomto postupu byly užívány třepací lahve. V pravé větvi schématu je uveden nový postup podle publikace Monroe, New England, J. of Med., 327, 453 - 457, 1992 a způsob podle vynálezu je uveden ve střední větvi.

Na obr. 2 je popsán postup s použitím HPSEC TSK PW 4000-sloupce, jako eluční činidlo je užit fyziologický roztok chloridu sodného s fosfátovým pufrem, PBS. Tento postup byl kalibrován proti standardům molekulové hmotnosti a je zřejmé, že existuje lineární závislost plochy na ředění viru hepatitidy A. Tato zkouška je zvláště vhodná v pozdějších stupních čištění. Jsou uvedeny čtyři chromatogramy z posledních čtyř stupňů způsobu podle vynálezu. Chromatografický postup byl sledován v ultrafialovém světle při 214 a 260 nm pro stanovení horní a spodní hranice. Při použití této zkoušky je nejprve možno pozorovat odpovídající vrchol pro virus

Ί hepatitidy A po znovuuvedení usazeniny v polyethylenglykolu do suspenze (obr. 2A). Po extrakci chloroformem dochází k odstranění většiny materiálu s vysokou molekulovou hmotnost absorbujícího ultrafialové světlo (obr. 2B). Chromatografie na iontoměniči slouží ke koncentraci viru (obr. 2C) a při preparativní chromatografií na gelu se získá vysoce čištěný virus (obr. 2D). Čištěný virus málo absorbuje v rozmezí 260 nebo 280 nm, takže je možno pozorovat pouze vrchol při 214 nm. Za uvedených podmínek vytváří HAV jediný symetrický vrchol a tímto způsobem je tedy možno prokázat čistotu tohoto viru nezávisle na analýze pomocí SDS PAGE.

Na obr. 3 je znázorněn růst buněk MRC-5 na skle, póly styrenu a nerezové oceli 316. Koncentrace buněk na povrchu tohoto materiálu je znázorněna jako funkce času. Buněčný materiál byl naočkován na úseky uvedených materiálů při hustotě přibližné 10 000 buněk/cm a každý den byly stanoveny počty buněk. Buněčný materiál na krycích sklíčkách a na úsecích nerezové oceli 316 byl pěstován v Petriho mis2 kách s plochou 150 cm s obsahem 90 ml živného prostředí, to znamená 0,6 ml/cm . Pro buněčný materiál, pěstovaný v 2

T-lahvích s plochou 25 cm bylo užito 7,5 ml živného pro_w 2 středí, to znamená 0,3 ml/cm .

Na obr. 4 je znázorněn růst buněk MRC-5 a reziduální koncentrace glukosy při pěstování buněk na úsecích nerezo2 vé oceli 316. Koncentrace buněk na cm a koncentrace glukosy v mg/cm jsou uvedeny jako funkce času (d) pro buněčný materiál, pěstovaný na úsecích nerezové oceli s plochou 25 cm².

Na obr. 5 je ve světelném mikroskopu znázorněna mikro fotografie buněk MRC-5, rostoucích na mřížce z nerezové oce li. Buněčný materiál byl naočkován v množství 5 000 až

000 buněk/cm a pak byl pěstován po dobu delší než dva týdny. Mikrofotografie je ve zvětšení 40x.

Na obr. 6 je znázorněno barvení životaschopných a životaneschopných buněk MRC-5, pěstovaných na mřížce z nerezové oceli 316. Buněčný materiál byl barven fluorescein diacetátem (FDA) a ethidiumbromidem (EB) způsobem, který je dále popsán v příkladu 14 v odstavci Materiály a metody a pak byl pozorován mikroskopem s použitím laseru. Řadové vyšetření snímků bylo provedeno při přírůstcích 57 mikrometrů. Na obr. 6A je znázorněno barvení fluoresceinem, odečítána je fluorescence, která prokazuje přítomnost životaschopných buněk. Na obr. 6B je znázorněna fluorescence po barvení DNA pomocí ethidiumbromidu, je zřejmá téměř úplná životaschopnost všech buněk. Pozitivní kontrola pro ethidiumbromid je znázorněna na obr. 7.

Na obr. 7 je znázorněno barvení neživotaschopných buněk MRC-5 ethidiumbromidem. Buněčný materiál, pěstovaný na mřížce z nerezové oceli 316 byl usmrcen působením 100% methanolu. Po důkladném propláchnutí PBS a usušení byl buněčný materiál barven FDA/EB jako negativní kontrola pro FDA a positivní kontrola pro ethidiumbromid, tato kontrola je výkrese znázorněna. Pro negativní kontrolu nebylo možno prokázat žádnou fluorescenci.

Na obr. 8 je znázorněna účinnost pěstování pro statický reaktor, opatřený mřížkou při použití usazování gravitací nebo při použití recirkulace živného prostředí. Jednotlivé prvky reaktoru jsou číslovány 1 až 5, přičemž prvek 1 je prvek, uložený v horní části a prvky 4 nebo 5 jsou ulo ženy u dna reaktoru, při použití sedimentace gravitací byly užity čtyři prvky a při recirkulaci živného prostředí bylo užito pět prvků. Uváděná účinnost pěstování buněk znamená procentuální údaj ze všech naočkovaných buněk, celková účinnost byla řádu 90 %. Údaje pro recirkulaci jsou uváděny jako průměr ze tří pokusů, kdežto údaj pro sedimentaci gravitací je výsledkem jediného pokudu. Rychlost cirkulace byla přibližně 6 cm za hodinu.

Na obr. 9 je znázorněna rychlost příjmu glukosy GUR, jako funkce času pro reaktory, obsahující prvky, tvořené pevným titanem a mřížkou z nerezové oceli 316. Na obr. 9A 2 2 je znázorněna hodnota GUR na cm (mikrogramy/cm -d) proti času (d), kdežto hodnota GUR na objem reaktoru je uvedena na obr. 9B. Údaje z obr. 9A závisí na povrchu prvků, kdežto výsledek z obr. 9B na tomto faktoru nezávisí vzhledem k tomu, že oba reaktory měly stejný objem.

Na obr. 10 je uváděno celkové množství bílkoviny v procentech pro rozrušené materiály ze zařízení s pevnou podložkou nebo s mřížkou. Protokoly pro materiály 1-4 jsou uvedeny v textu. Při pozorování mikroskopem byly pevné prvky prosté buněčné drti, kdežto prvky ve tvaru mřížky obsahovaly značné množství buněčné drti po čtvrtém rozrušení buněk.

Na obr. 11 je znázorněna rychlost příjmu glukosy jako funkce času pro statický reaktor s mřížkou z nerezové oceli 316. Reaktor byl infikován při použití Μ0Ι 1 ve dni 7 a kutura byla ukončena ve dni 28.

Na obr. 12 je uvedeno celkové množství bílkoviny v procentech a množství HAV Ag v rozrušených materiálech ze statického zařízení, stejného jako na obr. 11. Protokoly pro rozrušené materiály 1-4 jsou uvedeny v textu. Celkové množství bílkoviny v materiálu 1 bylo příliš vysoké vzhledem k nedostatečnému promytí PBS.

Na obr. 13 je znázorněn vliv MOI na růst buněk a na spotřebu glukosy. Buněčný materiál byl infikován při použití hodnoty MOI 0,1 a 10 a při použití HAV CR326F P28.

V tomto systému nebylo možno pozorovat až do osmi dnů po infekci žádné rozdíly v hustotě buněk (obr·. 13A) ani v hodnotách pro zbytek glukosy (obr. 13B). Po osmi dnech bylo do kultur přidáno čerstvé živné prostředí.

Na obr. 14 je znázorněnoměření množství buněčných bílkovin proti standardu BSA, vztaženo na počet buněk. Vztah je nejlépe možno popsat rovnicí

Y(10⁴) = -0,09 + 0,42X, přičemž r = 0,99.

Je zřejmé, že jedinou křivkou je možno vyjádřit celkovou bílkovinu v buněčném materiálu MRC-5 bez ohledu na životaschopnost buněk.

Na obr. 15 jsou znovu vyneseny hodnoty z obr. 14 tak, že je označen časový údaj pro každou hodnotu.

Na obr. 16 je znázorněn vztah celkového množství bílkovin a počtu buněk, který je blízký údajům pro hustotu buněk při použití zařízení Coulter Counter. Je pravděpodobné, že rozdíly, které je možno pozorovat, jsou způsobeny malým objemem pufru pro rozrušení buněk při izolaci z T-lahví s plochou 25 cm (bylo užito 2 x 0,08 ml/cm ).

Na obr. 17 je znázorněn stupeň, v němž se čistění pro vádí extrakcí rozpouštědla, jsou uvedeny profily HPSEC.

Na obr. 18 je znázorněn postup čištění při použití extrakce rozpouštědlem, jsou uvedeny hlavní složky v získaných profilech HPSEC.

Na obr. 19 je znázorněn vliv doby míšení na poměr antigenů hepatitidy A k nečistotám.

Na obr. 20 je uveden vliv doby míšení na plochu pro antigen hepatitidy A a pro nečistotu (třepací lahve s objemem 50 ml, 6 minut).

Na obr. 21 je znázorněn vliv doby míšení na plochu pro antigen hepatitidy A a pro nečistoty (třepací lahve s objemem 500 ml, 2 minuty).

Na obr. 22 je znázorněn vliv doby míšení a objemu zkumavky na plochy pro antigen hepatitidy A a pro nečistoty při použití třepacího zařízení.

Na obr. 23 je znázorněn vliv poměru rozpouštědla a vody na poměr antigenů hepatitidy A a nečistot.

Na obr. 24 je znázorněn vliv poměru rozpouštědla a vody na plochy pro antigen hepatitidy A a pro nečistoty při použití třepacího zařízení.

Na obr. 25 je znázorněn vliv doby míšení a typu antigenu na poměr antigenů hepatitidy A a nečistot.

Na obr. 25 je znázorněna stálost vzorku antigenů hepatitidy A při stanovení HPSEC.

Na obr. 27 je znázorněn vliv solí na rozpustnost antigenu hepatitidy A při teplotě 4 °C.

Na obr. 28 je znázorněn vliv solí na rozpustnost antigenu hepatitidy A při teplotě 4 °C.

Na obr. 29 je znázorněna kalibrační křivka pro molekulovou hmotnost, PW4000 x 1.

Na obr. 30 je znázorněn logaritmus hlavní oblasti pro antigen hepatitidy A, který je vynesen proti logaritmu koncentrace antigenu hepatitidy A.

Na obr. 31 je znázorněna kalibrační křivka pro antigen hepatitidy A.

Na obr. 32 je znázorněno srovnání filtrátu rozrušených buněk a vzorků rozrušených buněk po působení nukleázy v ultrafialovém světle při 214 nm.

Na obr. 33 je znázorněno srovnání filtrátu rozrušených buněk a vzorky rozrušených buněk po působení nukleázy v ultrafialovém světle při 260 nm.

Na obr. 34 je znázorněn resuspendovaný vzorek usazeniny PEG po odstředění, ultrafialové světlo při 214 nm.

Na obr. 35 je znázorněn chloroformový extrakt vzorku vodné fáze z R x 2011008, ultrafialové světlo při 214 nm.

Na obr. 36 je znázorněn vzorek produktu z aniontoměniče z R x 2009854, ultrafialové světlo při 214 nm.

Na obr. 37 je znázorněn produkt po chromatografii na gelu, ultrafialové světlo při 214 nm.

Na obr. 38 je znázorněn vzorek produktu SEC z R x 2011008, ultrafialové světlo při 214 nm, zadržený vrchol je viditelný po 49 minutách.

Na obr. 39 je znázorněna korelace výsledků EIA a HPSEC pro vzorky z jedenácti šarží.

Na obr. 40 jsou znázorněny v procentech plochy pro čtyři vzorky z třinácti šarží antigenu hepatitidy A.

Způsob podle vynálezu tedy zahrnuje čištění jakéhokoliv viru hepatitidy A, HAV, vzorek může pocházet z atenuovaného nebo virulentního HAV, může být produkován buněčnou linií jakéhokoliv kmene nebo může jít o kulturu, která může být infikována HAV. Vynález zahrnuje také zpracování všech kapsidů HAV, a to již prázdných bez nukleových kyselin viru nebo úplných s obsahem nukleových kyselin viru.

K infekci buněk MRC-5 byl podle vynálezu užit virus HAV po 28 pasážích (P28CR326F', taxonomie variant vychází z CR326, jde například o kmeny CR326F a CR326F', vztah této nomenklatury k úrovni pasážování je vysvětlen v publikaci Provost a další, J. Med. Virol., 20, 165 - 175, 1986. Produkční materiál byl pěstován v pasáži P29. Kmen P28CR326F je atenuovaný kmen HAV. Vynález však zahrnuje i jiné kmeny HAV, včetně těch, které mohou být atenuovány běžnými postupy. Dalšími buněčnými liniemi, vhodnými pro pěstování HAV jsou Věro, FL, WI-38, BSCI a FRhK6. Tyto a další systémy pro pěstování HAV v buněčných kulturách jsou podrobně diskutovány v publikacích Gerety R. J., Active Immunization Against Hepatitis A, v Gerety R. J. (ed.) Hepatitis A, Academie Press 1984, str. 263 - 276 a Tucehurst J. R., Seminars in Liver Diseaše 6, 46 - 55, 1986. V principu je možno použít jako hostitelskou buňku pro HAV jakýkoliv materiál, který je možno tímto virem infikovat, například může jít o buněčnou linii lidských diploidních fibroblastů. Výhodnou buněčnou linií pro výrobu vakcíny je MRC-5.

Způsob podle vynálezu, prováděný v průmyslovém měřítku je tvořen následujícími stupni:

a) Pěstování velkého množství viru hepatitidy A, HAV ve vhodné nádobě pro pěstování a vhodném živném prostředí

Výhodný postup spočívá v tom, že se použije HAV, adaptovaný na růst na lidských diploidních plicních buňkách, vhodných pro produkci vakciny. Výhodným buněčným materiálem je linie WI38 nebo MRC-5. Uvedený buněčný materiál je možno pěstovat na mikronizovaných nosičích nebo jako souvislé vrstvy buněk v lahvích nebo v třepacích lahvích. Při provádění způsobu podle vynálezu se využívá velkých ploch a multilamelárních bioreaktorů, jako je NUNC CELL FACTORY, COSTAR CUBE statický povrchový reaktor SSR nebo je možno užít statický reaktor s promícháváním prostředí, například podle US patentových spisů č. 4 296 204, 4 415 670 nebo je možno použít zařízení z nerezové oceli s mřížkami a promíchávání živného prostředí podle množství požadovaného produktu. Ve výhodném provedení způsobu podle vynálezu se pěstuje buněčná linie MRC-5 ve formě souvislých vrstev buněk při použití COSTAR CUBE SSR s plochou 85 000 cm² nebo při použití SSR s mřížkami s toutéž plochou nebo i větší plochou, k infekci se užijí násobky infekčních jednotek (MOI) viru HAV, které dostačují k dosažení účinné infekce kultury. Přijatelná hodnota MOI je přibližně 0,01 až 10. K infekci kultury se obvykle užije HAV ze supernatantu frakce z SSR po inkubaci po dobu přibližně 28 dnů.

Ve výhodném provedení se HAV pěstuje na buněčné linii MRC-5, rostoucí na mřížce z nerezové oceli, jak je popsáno v příkladu 14. Podle tohoto provedení se užije bioreaktor s prvky tvaru mřížky nebo sítě z jakéhokoliv vhodného, netoxického materiálu, na němž může buněčný materiál růst.

Tyto mřížky nebo sítě mohou být vyrobeny z nerezové oceli, titanu, plastické hmoty nebo podobného materiálu, který může být proveden jako trojrozměrný pravidelný prvek. Například je možno s výhodou užít zařízení Sulzer Biotech Systems (zvláště SMV, SMX, E-PACK EX, DX, BX, CY) s obsahem 316 prvků typu mřížky nebo sítě z nerezové oceli. V každém prvku je uspořádána rovnoměrně řada vrstev, na nichž mohou buněčné linie růst. Každý prvek je orientován v úhlu O až 90° vzhledem k dalšímu prvku ve sterilním reaktoru. Reaktor může mít tvar válce nebo jakýkoliv jiný geometrický tvar, upravený pro uložení mřížek nebo sítí při dobrém využití objemu. Buněčný materiál je pak naočkován a nechá se přilnout na povrch, vytvořený mřížkou nebo sítí. Jakmile buněčný materiál v kultuře dobře roste, je možno přivádět živné prostředí rychlostí, dostatečné pro přívod živin a odvádět odpadní produkty. Jakmile se dosáhne vhodné hustoty buněk, mohou být buněčné linie infikovány HAV, jak bude dále popsáno.

Výhoda použití prvků ve tvaru mřížky nebo sítě spočívá v tom, že je k dispozici větší povrchová plocha na jednotku objemu. Geometricky přesná sít dovoluje rovnoměrný růst fibroblastů po celém povrchu do známé a stálé hloubky a dovoluje také řídit přívod živin. Rovnoměrnost mřížky nebo sítě může také umožnit předpovědět místa styku mezi vlákny tak, aby buněčný materiál mohl rychle překrýt celou sít vláken. V konfiguraci statického mísícího zařízení je také možno řídit blízkost vedle sebe uložených růstových povrchů navzájem, tak, aby bylo možno zachovat vhodné podmínky růstu a vyvarovat se ucpání reaktoru. Tento problém je totiž velmi závažný v případě některých reaktorů, které nejsou plněny zcela pravidelně, takže může docházet k místům, kde dochází k tak rychlému buněčnému růstu, že přívod živin je nedostatečný a tím i buněčný materiál trpí nedostatečným přívodem živin.

Je zřejmé, že způsob podle vynálezu zahrnuje kromě pasáží 18, P18, p28, p29, p72 kmene CR326F viru HAV jakou16 koliv jinou variantu nebo kmen HAV, a to atenuovaný nebo virulentní. Atenuované varianty nebo kmeny je možno získat sériovým pasážováním přes buněčné materiály, živočichy nebo jinými postupy, tak jak bylo uvedeno v publikacích Provost P. J. a další, Proč. Soc. Exp. Biol. Med.,

178,8 (1982, Provost P. J. a další, J. Med. Virol. 20, 165, 1986, US patentové spisy č. 4 164 566 a 5 021 348. Způsob čištění podle vynálezu lze snadno a rychle upravit pro atenuované nebo virulentní kmeny HAV.

HAV se nechá replikovat v SSR až do vrcholné produkce viru. Pro kmeny HAV, adaptované na buněčné kultury v případě atenuovaných kmenů, jako CR326FP28 trvá tento postup 7 až 35 dnů v závislosti na počáteční hodnotě Μ0Ι a na hustotě buněk, v průběhu uvedené doby se živné prostředí nechá stále procházet smyčkou, v níž se provádí výměna plynu. Jako živné prostředí je možno použít jakékoliv prostředí, podporující růst buněk MRC-5 a replikaci HAV. S výhodou se živné prostředí odstraní a doplňuje rychlostí v rozmezí 0,010 až 0,3 ml/cm /den. Tuto rychlost je možno měnit vzhledem k tomu, že rychlost tvorby buněčné hmoty je závislá na celkovém množ ství živného prostředí.

Ve výhodném provedení způsobu podle vynálezu se buněčn ý materiál MRC-5 pěstuje v souvislých vrstvách v SSR na ploše 340 000 cm , například při použití čtyř prvků s plo2 chou 85 000 cm nebo v SSR s mřížkami při ještě vyšší ploše, buněčný materiál se pak infikuje HAV při použití hodnoty Μ0Ι v rozmezí 0,1 až 1,0, načež se virus nechá replikovat až do dosažení vrcholné produkce virového antigenu. Tento postup trvá přibližně 28 dnů. V průběhu této doby je nutno stále přivádět čerstvé živné prostředí a nechat je obíhat nádobou, v níž se buněčný materiál pěstuje a smyčkou, v níž dochází k výměně plynů. Živné prostředí může být jakékoliv živné prostředí, které podporuje růst nebo udržování buněk MRC-5 a replikaci HAV. Bylo prokázáno, že výhodným živným prostředím je například bazální prostředí, jako Williamsovo prostředí E, doplněné příslušnými růstovými faktory. Jako růstový faktor je výhodné zejména telecí sérum, doplněné železem.

b) Izolace produkovaného HAV

Způsob izolace získaného HAV bude do určité míry určován geometrií nádoby, v níž byl buněčný materiál pěstován. Obecně je možno uvést, že po pěstování kultury přibližně 28 dnů při stálém přívodu živného prostředí se živné prostředí odstraní a HAV se izoluje. V minulosti při pěstování viru v malém měřítku se tato izolace prováděla mechanickým oddělením buněk, zmrazením, roztátím a pak zpracováním ultrazvukem k optimálnímu uvolnění viru, vázaného na buněčný materiál. Při provádění způsobu podle vynálezu se virus, vázaný na buněčný materiál uvolní do co nejmenšího objemu roztoku. S výhodou obsahuje roztok, užitý k uvolnění viru složky, která činí buněčný materiál prostupným pro virus. Takové složky jsou například smáčedla,jako Triton C-100, NP-40 nebo ekvivalentní materiál, který se užije v nejnižší možné koncentraci tak, aby jej bylo možno později snáze odstranit. Bylo prokázáno, že použití 0,05 až 0,5, s výhodou 0,1 % Tritonu X-100 je dostatečné k dosažení účinné extrakce HAV z buněčného materiálu, pěstovaného v kulturách v zařízení NUNC, COSTAR nebo v jakémkoliv vhodném zařízení. Výhoda použití extrakce smáčedlem, zejména v případě reaktorů typu SSR, jako reaktoru COSTAR ve tvaru krychle je skutečnost, že geometrie takového reaktoru nedovoluje izolaci mechanickým způsobem a je tedy nutno HAV převést do supernatantů kultury, který se pak vypustí a HAV se koncentruje a izoluje. Podíl HAV v supernatantů buněčné kultury však představuje pouze malý podíl celkového množství HAV, které by bylo možno z buněčné kultury izolovat. Izolace HAV pomocí smáčedla je však vysoce účinná.

c) Zpracování izolovaného HAV

Jakmile byl virus izolován v podstatě v bezbuněčné formě ze supernatantu kultury, z buněčného materiálu nebo z obou uvedených složek, je žádoucí virus koncentrovat k usnadnění jeho dalšího zpracování a čištění. Při dříve známém postupu pro Čištění HAV byl viru uvolněn mechanicky a jen velmi malá množství materiálů byla čištěna, bylo možno postupovat tak, že virus byl extrahován organickým rozpouštědlem, jako methylenchloridem nebo směsí methylenchloridu a isoamylalkoholu v objemovém poměru 24 : 1 a pak byla vodná fáze zahuštěna přidáním ve vodě rozpustného syntetického polymeru, například polyethylenglykolu. Nyní však bylo zjištěno, že při provádění tohoto postupu ve velkém měřítku je možno použít smáčedla a exogenní enzym a tak připravit vakcinu s obsahem HAV při odstranění cizorodých materiálů tak, že v čištěném produktu není možno prokázat ani stopy činidel, použitých pro čištění.

V jednom provedení způsobu podle vynálezu se použité smáčedlo, například Triton X-100, použitý k izolaci HAV odstraní koncentrací a diafiltrací s následným odstraněním zbytků smáčedla, například pomocí neiontového polymerního činidla typu Amberlit, například XAD. Použitelným postupem pro odstranění prostředku Triton X-100 až na obsah 10 mikrogramů/ml je postup podle publikace Hurni W. Μ. , a Miller W. J., Journal of Chromatography, 559, 337 - 343, 1991. Smáčedlo, použité při izolaci HAV pak již není možno analyticky prokázat ve výsledném produktu podle tohoto provedení. Mimoto dojde k odstranění dalších nečistot, takže se získá částečně čištěný HAV.

V jiném provedení způsobu podle vynálezu se po oddělení supernatantu s obsahem smáčedla neužije koncentrace a diafiltrace s následným působením pryskyřice XAD, nýbrž se pro koncentraci viru použije působení nukleázy s následným použitím aniontoměniče.

V tomto provedení se s výhodou užije nespecifická, vysoce homogenní nukleáza s vysokou specifickou účinností. Její nespecifičnost zajistí rozštěpení DNA i RNA a homogenita enzymu zajistí, že je přidán pouze jeden enzym bez dalších nečistot typu bílkovinného materiálu. Dále je výhodné, aby použitá nukleáza byla odolná proti působení smáčedel tak, aby bylo možno ji přímo přidat do supernatantu po izolaci HAV, který smáčedlo obsahuje. Tyto požadavky může splnit celá řada nukleáz. Bylo prokázáno, že zvláště výhodným enzymem pro toto použití je enzym Benzonase, který byl připraven jako rekombinantní bílkovina (Nycomed Pharma A/S, Dánsko). Tento enzym se přidává v množství 0,1 až 100 mikrogramů/litr izolovaného HAV, s výhodou se užije 10 mikrogramů/litr, toto množství je dostatečné k odstranění kontaminujících volných nukleových kyselin.

Přidání co nejmenšího množství enzymu je důležité k následujícímu snadnému odstranění tohoto enzymu v průběhu dalšího zpracování tak, aby bylo možno získat produkt s nezjistitelnými zbytky enzymu, to znamená s obsahem enzymu méně než 10 pg/ml.

Vzhledem k tomu, že ke zpracování působením nukleázy dochází v poměrně zředěném roztoku, bylo prokázáno, že je vhodné oddělit HAV chromatografií na aniontoměniči při použití zředěného roztoku solí s koncentrací 90 až 150 mM a pak HAV vymývat postupným přidáváním 1,5-násobku objemu sloupce roztoku s vyšší iontovou sílou, ² 0,3 M. Tímto způsobem je možno HAV podstatným způsobem zkoncentrovat a mimoto se ve sloupci nezachytí smáčedlo, enzym benzonáza a řada dalších nečistot, které sloupcem pouze projdou. To znamená, že HAV po eluci z tohoto sloupce je již částečně čištěn. V tomto stupni je možno použít celou řadu iontoměničových pryskyřic včetně těch, které byly uvedeny v EP0468702 A2. Bylo prokázáno, že zvláště vhodnou pryskyřicí pro toto použití je DEAE Toyopearl 650M (Tosohaas).

d) Koncentrace HAV

Po izolaci HAV a koncentraci a diafiltraci a zpracování na pryskyřici XAD nebo po zpracování působením nukleázy s následným zachycením v chromatografickém sloupci se virus zahustí při použití ve vodě rozpustného syntetického polymeru, kterým je možno účinně zahustit bílkovinný materiál.

K tomuto účelu je vhodný polyethylenglykol PEG s molekulovou hmotností v rozmezí 2 000 až 12 000. Typicky se postupuje tak, že se k částečně čištěnému HAV přidá chlorid sodný do konečné koncentrace 150 až 500 mM. Pak se přidá PEG do konečné koncentrace 2 až 10, s výhodou 4 g/100 ml. Vysrážený, částečně čištěný HAV se oddělí odstředěním, supernatant se odloží a usazenina se znovu uvede do suspenze pro další zpracování. Bylo prokázáno, že hlavní nečistota je v tomto stupni odstraněna ve formě odloženého supernatantu. Odstranění proteázy zvyšuje výtěžek, stálost a čistotu získaného HAV v průběhu dalšího čištění. Usazeninu po působení PEG, znovu uvedenou do suspenze je popřípadě možno zpracovat působením ultrazvuku k usnadnění solubilizace před extrakcí organickým rozpouštědlem, jak bude dále uvedeno.

e) Extrakce organickým rozpouštědlem

Usazenina po působení PEG, znovu uvedená do suspenze se extrahuje přidáním směsi halogenovaných nižších alkanů s obsahem 1 až 6 atomů uhlíku, například methylenchloridu, chloroformu, tetrachlorethanu a podobně spolu s protipěnivým činidlem, například isoamylalkoholem. Objemový poměr halogenovaného nižšího alkanu a protipěnivého činidla je v rozmezí 15 : 1 až 50 : 1, s výhodou v rozmezí 20 : 1 až 30 : 1. Bylo prokázáno, že extrakce organickým rozpouštědlem podstatně zvyšuje čistotu výsledného HAV. V tomto stupni je chloroform pro extrakci organickým rozpouštědlem výhodnější než methylenchlorid.

Touto extrakcí se kromě dalších nečistot odstraní lipidy a látky, lipidům podobné. Postupuje se tak, že se usazenina po přidání PEG znovu uvede do suspenze a pak se ředí některým z celé řady použitelných pufrů, jako jsou fyziologický roztok chloridu sodného s fosfátovým pufrem, tris-pufr, uhličitanový, hydrogenuhličitanový nebo acetátový pufr. Vzhledem k tomu, že kapsidy HAV jsou stálé v mírně kyselém prostředí, jsou přijatelné pufry v slabě kyselé oblasti pH. Výhodným pufrem je například TNE, obsahující 10 mM tris-HCl o pH 7,5 se 150 mM NaCl a 1 mM EDTA. Místo tris-HCl je také možno použít fosfátový pufr.

S výhodou se usazenina po použití PEG, znovu uvedená do suspenze extrahuje přidáním směsi chloroformu a isoamylalkoholu v objemovém poměru 24 : 1, poměr organického rozpouštědla a vody je v rozmezí 0,5 : 1 až 3 : 1 a v průběhu extrakce se směs energicky míchá. Extrakt se pak vyčeří odstředěním 10 minut při 4 000 g při teplotě 20 °C. Vodná fáze se uchová, rozhraní a organická fáze se znovu extrahují stejným objemem TNE nebo ekvivalentním pufrem v množství 0,3 a 0,6 původního objemu vzorku, obě vodné fáze se spojí, čímž se získá extrakt usazeniny po působení PEG.

Extrakce rozpouštědlem je klíčovým stupněm způsobu čištění viru hepatitidy A tím, že dochází k vysrážení bílkovinných nečistot v hraniční oblasti a současně k extrakci lipidů do rozpouštědla. Podstatné vyčištění, jehož je možno extrakcí dosáhnout při provádění tohoto postupu, je možno pozorovat z chromatogramů HPSEC na obr. 17, kde vrchol pro nečistoty v době 23 minut je velmi užitečným znakem pro sle dování odstranění nečistot v tomto stupni. Jak je zřejmé z obr. 18, při provádění postupu v malém měřítku došlo k zachování podstatného podílu tohoto vrcholu v extrahovaném produktu. Bylo sledováno několik proměnných veličin tak, aby bylo možno porozumět tomuto stupni a řídit jej podle množství použitého materiálu. Byl sledován zejména poměr rozpouštědla k objemu vodného roztoku, způsob protřepávání, doba míšení a intenzita míšení, a to v několika rozměrech zkumavek i lahví, jak bude popsáno v příkladu 15.

f) Chromatografie na iontoměniči

Extrakt ze svrchu uvedeného stupně se podrobí chromatografií na iontoměniči ve formě pryskyřice, gelu nebo matrice. Typické matrice aniontoměniče zahrnují například následující materiály, aniž by na ně byly omezeny:

DEAE celulosa,

DEAE agarosa ,

DEAE biogel,

DEAE dextran,

DEAE Sephadex,

DEAE Sepharose, aminohexyl Sepharose, ecteola celulosa,

TEAE celulosa,

QAE celulosa, mono-Q nebo benzoylovaná diethylaminoethylcelulosa.

Jednou z výhodných aniontoměničových matricí je DEAE Toyopearl 650M (Tosohaas). Základní informace, týkající se chromatografie na iontoměniči je možno nalézt například v publikaci E. A. Peterson, Cellulosic Ion Exchangers v Work T. S. a další, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, sv. 2, část II, str. 223 a následující, North-Holland 1970.

Materiál, získaný extrakcí resuspendované usazeniny po působení PEG organickým rozpouštědlem se v případě potřeby zředí při použití 10 mM Tris s 1 mM EDTA o pH 7,5 nebo ekvivalentním pufrem a přidá se v případě potřeby chlorid sodný do koncentrace 0,3 až 0,35 M k odstranění kontaminujících volných nukleových kyselin. Za těchto podmínek prochází HAV sloupcem jako filtračním materiálem. Avšak v případě, že byl HAV předem zpracován působením nukleázy, přidá se k organickému extraktu 0,1 až 0,15 M, s výhodou 0,12 M chloridu sodného na začátku následujícího stupně.

Po přidání chloridu sodného do uvedené koncentrace přilnou kapsidy HAV k aniontoměničové materici, kdežto některé zbývající nečistoty, například uhlohydráty, touto matricí projdou. Sloupec se promyje několika objemy 0,12 M chloridu sodného k odstranění zbývajících nečistot. Pak se kapsidy HAV ze sloupce aniontoměniče vymývají při použití přibližně jednoho objemu sloupce a objemu původního vzorku, s obsahem 0,35 M NaCl. Je také s výhodou možno postupovat tak, že se HAV vymývá gradientovou eluci až do IM chloridu sodného nebo ekvivalentní soli, k vymývání HAV dochází při přibližně 0,3 M chloridu sodného.

g) Filtrace na gelu

Konečným stupněm je filtrace na gelu, která se provádí po chromatografií na aniontoměniči. V typických případech se užije materiál Sepharose CL-4B (Pharmacia), je však možno užít i řadu jiných typů gelových matricí. Tyto materiály byly popsány například v publikaci Fischer L., Gel Filtration Chromatography, ve Work T. S. a další, Laboratory techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Elsevier, 1980. Byl zjištěm velmi výhodný postup pro gelovou chromatografii k čištění HAV v tomto stupni. Jde o eluci co nejmenšího objemu frakce s aniontoměničem na za sebou zařazených sloupcích materiálu Toyopearl HW55S a HW65S.

Zvláštní sled chromatografických postupů, který je tvořen chromatografií na iontoměniči a pak filtrací na gelu je typický pro čištění kapsidů HAV, je však možno jej měnit. Je například možno použít filtraci na gelu před použitím aniontoměniče. Svrchu popsaný postup je však velmi výhodný.

h) Srážení HAV

V důsledku velkých množství HAV, produkovaných při provádění způsobu podle vynálezu došlo k neočekávaným zjištěním, která se týkají rozpustnosti viru. Bylo prokázáno, že při koncentraci 0,25 až 0,3 M soli při eluci HAV ze sloupce iontoměniče dojde k vysrážení viru v případě, že se koncentrace HAV zvýší nad 10 až 20 mikrogramů/ml.

Tato skutečnost byla prokázána pomocí analýzy HPSEC pro representativní vzorky. Bylo totiž prokázáno, že vodná fáze, extrahovaná chloroformem, AQX a produkt po filtraci na gelu SEC byly velmi stálé při skladování při teplotě 4 °C, v případě produktu z aniontoměniče IEX však došlo ke značnému úbytku viru hepatitidy A po skladování při uvedené teplotě.

Aby bylo možno tyto skutečnosti potvrdit, byly provedeny zkoušky na stálost s dalšími vzorky. Produkty AQX, IEX a SEC byly vždy ve trojím provedení zkoumány pomocí HPSEC okamžitě po svém získání. Pak byla stanovena koncentrace viru srovnáním výsledných vrcholů s kalibrační křivkou pro virus, získaný SEC. Mimoto byl podíl produktu IEX zředěn v poměru 1 : 5 roztokem chloridu sodného s fosfátovým pufrem, roztok obsahoval 0,12 M chloridu sodného, 6 mM fosforečnanu sodného při pH 7,2 a pak bylo ihned provedeno kvantitativní stanovení. Stálost uvedených čtyř vzorků při teplotě 4 °C byla sledována několik dnů pomocí HPSEC.

Počáteční koncentrace viru hepatitidy A hodnoty, získané po 4 až 5 dnech pro některé vzorky viru po čištění jsou uvedeny v následující tabulce:

vzorek počáteční množství viru /Ug/ml množství viru po 4 dnech /Ug/ml

AQX	23	21
produkt IEX	59	50
produkt IEX, zředěný 1 : 5	12	10
produkt SEC	12	12

Úplné výsledky včetně hodnot v různých časových obdobích jsou znázorněny na obr. 26.

U prvního vzorku bylo možno pozorovat, že produkt IEX vykazuje podstatný úbytek viru hepatitidy A, přes noc činila ztráta přibližně 25 %, koncentrace se snížila.z 59 na 45 mik rogramů/ml.

Zředěný produkt IEX a produkt AQX, byly daleko stálejš ztráty viru byly pouze 10 % v průběhu prvních 100 hodin skla dování. U produktu SEC nedošlo k žádné ztrátě viru, jde tedy o tentýž výsledek, jehož bylo dosaženo u původních vzorků.

K rozdílu mezi původními vzorky a později zkoumanými vzorky došlo ve tvorbě viditelné sraženiny, která se objevila ve skupině vzorků, která byla analyzována později. Přítomnost sraženiny si vyžádala odstředění produktu IEX před filtrací na gelu. Při tomto odstředění však došlo k velké ztrátě vysráženého viru a jeho koncentrace po odstředění byl pouze 29 mikrogramů/ml. Tabulka, uvádějící výtěžky při použi tí HPSEC je dále uvedena.

vzorek mg viru výtěžek mg viru po celkem ve stupni získání vzorku

produkt AQX	12,9	11,7
produkt IEX	12,3 105 % ( poč.množství)	8,7
odstředěný produkt IEX	4,2 48 %	4,2
produkt SEC	2,0 49 %	1,4

Neočekávaně nízký výtěžek filtrace na gelu vedl k doměnce, že ve sloupci SEC dochází ke shlukování nebo ke srážení viru. Určité shlukování bylo pozorováno při užití HPSEC. Vzorek produktu IEX, který byl chromatografován na malé dvojici za sebou zařazených sloupců SEC, okamžitě po ukončení preparativní IEX prokázal výtěžek viru 71 %, což je v -tomto stupni typičtější výsledek. Vzhledem k tomu, že tento vzorek se nesrážel a tedy nedošlo ke ztrátě viru odstředěním, je tento výtěžek 71 % přibližně trojnásobkem výtěžku, který byl získán v produkčním měřítku z produktu IEX po provedení SEC, to znamená filtrace na gelu. Při provádění SEC v menším měřítku však došlo k daleko většímu ředění, což může být příčinou vyššího výtěžku.

Sraženina, která se v průběhu čištění v těchto vzorcích objevila a která souvisela se ztrátou viru při provedení HPSEC však byla, jak bylo neočekávaně zjištěno, rozpustná ve vodných roztocích s nízkou iontovou silou, například s obsahem 6 mM fosforečnanu sodného, takže srážení bylo reversibilní. Sraženina byla znovu rozpuštěna přidáním 6 mM fosfátu sodného , rozpouštění probíhalo velmi rychle. Na rozdíl od tohoto postupu v případě, že sraženina v roztoku 120 mM chloridu sodného byla rozpouštěna pomocí 6 mM fosfátu sodného nebo v jiném roztoku s vysokou iontovou silou, nedošlo k téměř žádné změně.

V závislosti na době retence při provádění HPSEC bylo prokázáno, že sraženina, která se rozpustila v 6 mM fosfátu sodném má tentýž rozměr jako monomerní virus hepatitidy A, kdežto při provádění SDS-Page při barvení stříbrem se ukázalo, že rozpuštěná sraženina má tytéž viditelné pásy pro bílkoviny, které je možno pozorovat ve výsledném produktu SEC. Na základě těchto skutečností bylo čištění viru hepatitidy A modifikováno tak, že produkt po průchodu iontoměničem se ředí, tak, aby nedošlo ke ztrátě srážením, jak je uvedeno v příkladu 16, ředění v poměru 1 : 1 sníží koncentraci soli na 0,15 M nebo pod tuto hodnotu, z téhož důvodu je také žádoucí snížit koncentraci HAV pod hodnotu 20 mikrogramů/ml.

i) Zkouška na reprodukovatelnost HPSEC

Vysokotlaká chromatografie na gelu HPSEC byla upravena tak, aby bylo možno kvantitativně stanovit koncentraci viru a množství nečistot ve vzorcích v průběhu čištění HAV.

Vzorky HAV ze 14 šarží, připravených způsobem podle vynálezu, byly podrobeny analýze a výsledné údaje byly užity ke stanovení koncentrací viru a nečistot pro každý z použitých čisticích stupňů. V příkladu 17 a na obr. 29 až 46 jsou uvedeny podmínky provádění HPSEC, vyhodnocení, prokazující přesnost zkoušky a srovnání údajů, získaných pomocí HPSEC a EIA i výsledky analýzy HPSEC pro deset šarží.

j) Inaktivace viru a zpracování na vakcinu

Pro přípravu čištěných kapsidů HAV pro použití ve vakcině může být zapotřebí upravit virus ještě dalším běžným zpracováním. Je například možno zařadit působení formaldehydem, filtraci ke sterilizaci produktu a adsorpci na nosiče nebo pomocné prostředky, tak jak se tyto stupně běžně provádějí a jak bylo popsáno v publikacích Provost P. J. a další, Proč. Soc. Exp. Biol. Med., 160, 213, 1979 a Provost P. J. a další, J. Med. Virol., 19, 23, 1986. HAV je možno inaktivovat působenmím tepla, změnami pH, ozářením, zpracováním pomocí organických rozpouštědel, jako jsou formaldehyd nebo paraformaldehyd. Typicky se inaktivace provádí přidáním formaldehydu v poměru 1 : 4000. Bylo prokázáno, že tato inaktivace probíhá rychleji a účinněji při čtyřnásobku běžné koncentrace, takže po přidání formaldehydu v poměru 1 : 1000 se čtyřikát sníží doba, nutná pro inaktivaci, aniž by došlo k nepříznivému ovlivnění imuno29 genity. Inaktivovaný HAV se pak adsorbuje nebo še současně sráží s hydroxidem hlinitým, který tak může působit jako pomocný prostředek a jako nosič.

Vzhledem k tomu, že dávka, jíž je zapotřebí pro imunologickou účinnost, je v případě tohoto produktu velmi nízká, je vhodné uvést inaktivovaný virus do komplexu nebo jej adsorbovat na nosič. Bylo prokázáno, že k tomuto účelu je velmi vhodný hydroxid hlinitý, který tvoří s HAV pevný komplex a brání ztrátě viru na stěnách zásobníku.

Předmětem vynálezu je tedy průmyslově uskutečnitelný způsob výroby viru hepatitidy A při čistotě bílkoviny HAV vyšší než 95 %, tento postup spočívá v tom, že se

a) pěstuje virus hepatitidy A na velkém množství buněčných vrstev na velkém povrchu statických reaktorů,

b) virus hepatitidy A se pak odstraní z buněčné kultury promytím vrstev buněk smáčedlem, dojde k uvolnění viru hepatitidy A z buněčné vrstvy bez podstatnějšího odstranění nebo rozrušení souvislé buněčné kultury,

c) popřípadě se odstraní nukleové kyseliny, nespecifické pro virus hepatitidy A v tomto stupni působením nukleázy nebo adsorpcí nukleových kyselin na iontoměnič,

d) virus hepatitidy A, získaný z buněčné kultury se koncentruje při použití membrán a diafiltraci nebo zachycením v iontoměnici,

e) zbývající bílkoviny, nespecifické pro virus hepatitidy

A se odstraní z koncentrovaného viru z předchozího stupně kombinací extrakce organickým rozpouštědlem, srážení polyethylenglykolem, výměnou iontů, včetně odstranění kontaminujících nukleových kyselin v případě, že nebyly odstraněny ve stupni c), načež se jako konečný stupeň provádí chromatografie na gelu, načež se

f) čištěný virus hepatitidy A, získaný ve stupni ej izoluje.

Ve výhodném provedení tohoto postupu se při průmyslové produkci inaktivovaného viru hepatitidy A ve formě vakciny postupuje tak, že se

a) pěstuje velké množství viru hepatitidy A, HAV, v reaktoru Nunc Cell Factories, Costar Cubes, nebo na ještě větších plochách v jiných statických bioreaktorech s buněčnou kulturou buněk MRC-5 ve formě spojité vrstvy na pravidelných sestavách pevných mřížek z nerezové oceli, titanu nebo z nerezové oceli s titanem,

b) vzniklý HAV se oddělí odstraněním živného prostředí a přidáním roztoku pro oddělení viru s obsahem 0,05 až 0,5 %, s výhodou 0,1 % prostředku Triton X-100,

c) virus se pak podrobí působení nukleázy k rozštěpení kontaminujících buněčných nukleových kyselin,

d) HAV, zpracovaný působením nukleázy se koncentruje zachycením ve sloupci iontoměniče s následnou elucí roztokem přibližně 0,35 M chloridu sodného s následným vysrážením polyethylenglykolem,

e) koncentrovaný HAV se extrahuje směsí chloroformu a isoamylalkoholu v objemovém poměru 24 : 1 za energického míchání a vodná fáze se oddělí a uchová,

f) vodná fáze po extrakci organickým rozpouštědlem se chromatografuje na iontoměniči v 0,12 M chloridu sodném a virus se vymývá při použití gradientu s vyšší koncentrací chloridu sodného, například 1 M a pak se získaný virus po eluci okamžitě zředí na koncentraci soli přibližně

0,15 M nebo nižší, koncentrace HAV je s výhodou přibližně 20 mikrogramů/ml nebo nižší,

g) HAV po eluci z iontoměniče se chromatografuje na gelu, s výhodou na za sebou zařazených sloupcích materiálu Toyopearl HW55S a HW65S,

h) HAV po filtraci na gelu se inaktivuje formaldehydem v poměru 1 : 1000 a pak se sterilizuje filtrací, sráží se současně s hydroxidem hlinitým a rozdělí na jednotlivé dávky, které jsou ekvivalentní přibližně 25 až 100 ng inaktivovaného čištěného HAV.

HAV, získaný způsobem podle vynálezu je vysoce čištěný a má vysokou antigenní účinnost. Produkt je čištěným prostředkem s obsahem viru hepatitidy A, čistota bílkoviny viru je více než 95 % při analýze SDS PAGE při barvení stříbrem, méně než 0,1 % prostředku tvoří nukleové kyseliny, odlišné od kyselin viru, méně než 4 % tvoří lipidy. Množství uhlohydrátu, prokazatelného jako glukosa v hydrolyzovaném vzorku produktu je v rozmezí 0 až 200 % hmotnosti přítomné bílkoviny, přičemž uhlohydráty, odlišné od glukosy jsou přítomny v množství nižším než 15 %, vztaženo na hmotnost bílkoviny. Ve výhodném provedení jsou uhlohydráty, to znamená glukosa a další uhlohydráty, jako ribosa, přítomny v množství nižším než 20 %, vztaženo na hmotnost bílkoviny. Po inaktivaci formaldehydem si vakcina uchovává svoji antigenitu.

K vyvolání ochranné imunologické odpovědi stačí velmi malé množství inaktivovaného viru. S výhodou se v jedné dávce podává 25 až 100 mg viru, tato dávka se podává jednou, dvakrát nebo třikrát v průběhu několika měsíců, jak je toho zapotřebí pro dosažení vysokého titru protilátek proti HAV.

Čištěná vakcina s obsahem viru hepatitidy A má následující složení, které se uvádí na 1 mikrogram bílkoviny.

V závorkách jsou uvedeny postupy, které byly užity pro stanovení jednotlivých složek.

a) obsah lipidů (plynová chromarografie)

b) uhlohydráty, prokázané jako glukosa (hydrolýza kyselinou trifluoroctovou,TFA Dionex)

c) uhlohydráty, odlišné od glukosy (hydrolýza pomocí TFA, Dionex)

d) bílkoviny, specifické pro virus hepatitidy A (analýza aminokyselin a Western blot)

e) RNA, specifická pro virus hepatitidy A

f) kontaminující DNA <O,1_/Ug <0,1 až 2,5/Ug <0,2/Ug >0,95/Ug

0,1 - 0,2/Ug < 0,0004/Ug

Přítomnost uhlohydrátové složky, tvořené převážně glukosou se pokládá za nevýznamnou z hlediska snášenlivosti, imunogenity a ochranné účinnosti inaktivované vakciny s obsahem pomocného prostředku. Je však významné, že vakcina obsahuje velmi malé množství uhlohydrátů, odlišných od glukosy, pravděpodobně jde o ribosu, vzniklou degradací specifické RNA pro HAV. Je také významné, že bylo konečně možno prokázat složení viru vzhledem k tomu, že způsob podle vynálezu umožnil produkci velkého množství viru k provádění zkoušek.

Ve specifické vakcině podle vynálezu bylo ve vzorku prokázáno následující složení pro 0,1 až 1 ml vakciny s obsahem 25 až 100 jednotek:

složka	množství
chlorid sodný	900-9000 /Ug
hliník	50-500 /Ug
tetraboritan sodný	3,8-38 yUg
formaldehyd	<0,4 /Ug
glukosa (polymer)	0-1000 ng
bílkovina	25-100 ng
chloroform	<44 ng
RNA viru HAV	2-20 ng
uhlohydráty, odlišné od glukosy	0-20 ng
mastné kyseliny	20 ng
neomycin	< 4 ng
DNA z buněk MRC-5	^0,03 ng
sérový albumin skotu	<0,1 ng
enzym benzonáza	< 0,0001 ng

V dalším vzorku specifické vakciny s obsahem viru hepa

titidy A bylo možno prokázat ve obsahem 25 jednotek následující	vzorku s objemem 0,5 ml a s složení vakciny:
složka	množství
chlorid sodný	4,500/Ug
hliník	250/Ug
tetraboritan sodný	19/Ug
formaldehyd	< 200 ng
glukosa (polymer)	< 20 ng

bílkovina chloroform

RNA viru HAV uhlohydráty, odlišné od mastné kyseliny neomycin

DNA z buněk MRC-5 sérový albumin skotu enzym benzonáse ng 4 22 ng ng glukosy 4 ng

Z 1 ng <0,5 ng 4 0,005 ng <0,02 ng 4.0,00002 ng

Bylo prokázáno, že inaktivovaný virus hepatitidy A podle vynálezu je účinný a chrání proti infekci v případě, že se podá 25 ng, což je ekvivalentní 25 jednotkám dávky ve svrchu uvedených vakcinách, na bázi analýzy EIA, vztaženo na referenční standard, charakterizovaný analýzou aminokyselin.

U zdravých dospělých, mladistvých ani u dětí nebylo možno pozorovat žádné nepříznivé účinky, které by mohly být spojovány s podáním vakciny. Dospělým byly podávány dávky 6 až 50 jednotek, tytéž dávky byly podávány také mladistvým a dětem. Při zvyšování dávek bylo u dospělých možno pozorovat rychlejší a větší tvorbu protilátek, u dětí byla tato skutečnost méně vyjádřena.

V průběhu jednoho měsíce po jediné dávce 25 jednotek byly vytvořeny protilátky u 83 % dospělých ve stáří 18 nebo více let a u 97 % dětí a mladistvých ve stáří 2 až 17 let.

V případě, že byly podány dvě dávky po 25 jednotkách v intervalu 2 týdny, bylo možno prokázat u dospělých tvorbu protilátek v 93 %. Po sedmi měsících po druhé nebo třetí dávce 25 jed notek bylo možno pozorovat u obou věkových skupin protilátky u 99 % osob. Protilátky v seru je pak možno prokázat v množství 100 % původního množství až do 12 a 36 měsíců v případě obou věkových skupin. Je tedy zřejmé, že jediná dávka 25 jednotek je dostatečná pro tvorbu protilátek u alespoň 80 % očkovaných v jakékoliv populaci v průběhu 1 měsíce po očkování.

Při očkování vyšší dávkou dojde k tvorbě protilátek u vyššího procenta očkovaných.

V případě, že se podává jednotlivá dávka 25 ng, je možno z jediného reaktoru typu Costar Cube získat způsobem podle vynálezu 5000 až 10 000 jednotlivých dávek nebo ještě vyšší množ štvi. Je samozřejmě možno založit kultury také v několika reaktorech uvedeného typu současně. Je však zřejmé, že v jediném reaktoru typu SSR s mřížkou nebo bez ní je možno dosáhnout pod statně vyššího počtu dávek vakcíny než až dosud.

Vynález bude osvětlen následujícími příklady, které by však neměly sloužit k omezení způsobu podle vynálezu na stupně, uvedené v jednotlivých příkladech v určitém pořadí.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Příprava očkovacího materiálu viru hepatitidy A

Příprava očkovacího materiálu ve velkém měřítku spočívá v tom, že se infikují spojité jednoduché vrstvy buněčné kultury MRC-5 v reaktoru NUNC CELL FACTORIES s plochou 6000 cm . Buněčná kultura MRC-5 se pěstuje až do vytvoření spojité vrstvy a tato vrstva se pak infikuje při použití hodnoty MOI přibližně 0,1. Po infekci se buněčný materiál inkubuje 28 dnů, přičemž se každý týden mění živné prostředí, obsahující 10 % objemových fetálního telecího séra. Bylo prokázáno, že při vyšší koncentraci séra 2 až 10 % objemových se zvyšuje produkce viru ve srovnání s použitím nižšího množství séra 0,5 až 2 % objemová. Na konci tohoto postupu obsahuje superna tant buněčné kultury velké množství infekčního viru, v tomto příkladu bylo dosaženo hodnoty 10 ’ ΤΟΙϋ^θ/πιΙ, tento supernatant se získá přímo z reaktoru bez rozrušení buněk a použij se jako zdroj zásobního očkovacího materiálu viru. Tímto způsobem je možno ve velkém měřítku snadnějším a reprodukovatelnějším způsobem než v třepacích lahvích nebo při mechanickém oddělení buněk získat velká množství infekčního viru, kterých je zapotřebí pro produkci velkých množství vakciny.

Příklad 2

Zvýšení produkce vakciny

Aby bylo možno provést fázi III klinických zkoušek, je nutno zvýšit produkci vakciny ve srovnání s množstvím, které je možno získat laboratorními postupy tak, aby bylo možno mít k dispozici velká množství vakciny s obsahem viru hepatitidy

A. Aby bylo možno výrobu usnadnit, bylo nutno provést určité modifikace dosud známých postupů pěstování a čištění HAV.

Byly použity dva hlavní postupy pro pěstování buněk, reaktor Nunc Cell Factories a reaktory se statickým povrchem, například Costar Cube. V tomto příkladu se popisuje použití prvního z uvedených typů reaktorů, příklad 3 popisuje použití statického reaktoru Costar Cube.

Použití reaktoru Nunc Cell Factories pro zkoušku na účinnost postupu podle Monroa

Byl navržen postup pro zvýšení výtěžků a získání vyššího množství atenuovaného viru hepatitidy A, než bylo až dosud možné při provádění známých postupů. Původní třepací lahve byly nahrazeny Nunc Cell Factories, NCF. Základní jednotka NCF o

je tvořena plotnou s plochou 600 cm pro pěstování buněčné kultury. Plotny, tvořící NCF jsou vyrobeny z polystyrenu, zpracovaného pro optimální uchycení buněk a pro jejich růst do plochy podle publikace Maroudas, 1976, J. Cell Physiol., sv. 90, str. 511 - 520. Jednotka v tomto případě obsahovala deset stejných ploten s celkovým povrchem plochy 6000 cm .

Ve dvou rozích jsou upraveny zvláštním způsobem konstruované otvory, které vytváří vertikální trubice, spojující plotny do vícenásobných vrstev. Tyto vertikální trubice končí ve dvou adaptérech se vzdušnými filtry a teflonovými spojovacími částmi. Všechny jednotky se sterilizují ozářením a jsou dodávány připravené pro použití.

Prostředí, v němž je buněčná kultura MRC-5 pěstována v reaktoru NCF je velmi obdobné prostředí v třepacích lahvích. Buněčný materiál je pěstován ve statické kultuře, lne k pevné podložce, je překryt kapalným prostředím a živiny a kyslík se přivádějí do buněk difúzí. Použití NCF zvyšuje reprodukovatelnost postupu při obdobných podmínkách jako při pěstování buněčných kultur v třepacích lahvích. Způsob oddělení buněk a zpracování jsou však odlišné, jak bude dále popsáno.

Příklad 3

Statický reaktor Costar Cube a jeho použití pro produkci ve velkém měřítku

Cílem uvedených postupů je získat co největší možnou plochu pro pěstování buněk v reaktoru a současně zajistit dobré řízení celého postupu. Reaktor NCF představuje pouze Částečné řešení tohoto problému. Lepšího řešení je možno dosáhnout při použití reaktorů se statickým povrchem, SSR, a to zejména reaktoru typu Costar Cube a Static Mixer. Reaktor Costar Cube je tvořen hustě uloženými deskami z polystyrenu ve sterilizované krychli z plastické hmoty (Costar CS2OOO).

V jedine krychli je k dispozici 85 000 cm plochy pro růst bunecneho materiálu ve srovnání se 6000 cm v případě reaktoru NCF s deseti plotnami. V reaktoru, který byl popsán v US patentových spisech č. 4 296 204 a 4 415 670 tvoří kovové, keramické, skleněné nebo plastické prvky růstové povrchy, uložené velmi blízko sebe. Tyto prvky je možno vyrábět a uspořádat tak, že je možno dosáhnout ještě vyšších ploch v jediném reaktoru než v případě reaktoru Costar Cube a tak dosáhnout velkého zintenzivnění postupu. HAV byl úspěšně pěstován v obou typech reaktoru. Reaktory typu SSR jsou opatřeny cirkulační smyčkou, která dovoluje recirkulaci živného prostředí a doplnění živin za současného provzdušnění, je také možno řídit pH živného prostředí a množství rozpuštěných plynů v prostředí tak, aby byly splněny požadavky buněčné kultury na kyslík a aby bylo přiváděno dostatečné množství živin. Tato optimalizace není možná v třepacích lahvích nebo v reaktorech typu NCF. Mimoto je možno celé živné prostředí vyměnit ke zlepšení dostupnosti velkých množství klíčových živných látek. V těchto reaktorech bylo také nahrazeno fetální telecí sérum s úspěchem telecím sérem, doplněným železem (Cat. A-2151, Hyclone Laboratories, lne., Logan, UT) nebo ekvivalentním materiálem.

Příklad 4

Izolace viru hepatitidy A z reaktoru typu NCF nebo z reaktoru se statickým povrchem pomocí smáčedla Triron

Ani v reaktoru typu NCF, ani v reaktorech se statickým povrchem není možno mechanicky uvolnit vrstvu infikované buněčné kultury MRC-5. Virus hepatitidy A, spojený s buněčným materiálem, je možno účinně izolovat při rozrušení buněk smáčedlem Triton a pak čistit novým postupem. Roztok, získaný při použití smáčedla je více zředěný než při mechanickém oddělení buněk z třepacích lahví. Tento roztok se tedy zahustí diafiltrací a pak se pomocí absorpčního prostředku XAD odstraní zbývající Triton. Bylo prokázáno, že při použití elektroforézy s kapilární oblastí je možno tuto látku odstranit až na obsah nižší než 10 mikrogramů/ml. Pak se HAV vysráží polyethylenglykolem PEG, načež se extrahuje směsí chloroformu a isoamylalkoholu. Kontaminující DNA se odstraní při použití sloupce pro odfiltrování DNA a pak se provádí chromatografie na aniontoměniči a na gelu. Postup, v němž bylo užito reaktoru NCF a rozrušení buněk Tritonem neovlivnil nepříznivě imunogenitu čištěného, formaldehydem inaktivovaného viru hepatitidy A ve vakcině.

Příklad 5

Působení nukleázy a zachycení viru v chromatografickém sloupci

Produktivita a reprodukovatelnost postupu byla zvýšena tak, že materiál, získaný po působení Tritonu byl zpracován působením indonukleázy a virus byl pak koncentrován zachycením v chromatografickém sloupci s obsahem antiontoměniče, jak je znázorněno na obr. 1. Tato modifikace odstranila nutnost použi40 tí koncentrace virů pomocí diafiltrace, působení XAD a použití sloupce pro odfiltrování DNA.

Pro uvedený postup byla zvolena nespecifická endonukleáza, která působí na RNA i na DNA. Tato endonukleáza, která byla označena jako Benzonáza, byla izolována ze Serratia marcescens a byla klonována v Escherichia coli. Tento enzym je získán ve velmi čisté formě jako rekombinantní bílkovina (Nycomed Pharma A/S, Dánsko). Tato endonukleáza byla zčást zvolena také pro svou vysokou specifickou účinnost a proto, že je možno ji přidat přímo do surového materiálu po rozrušení buněk Tritonem ve velmi malých množstvích, například 10 mikrogramů enzymu/1 materiálu. Byly vyvinuty zkušební postupy s využitím metody Western blot pro specifickou bílkovinu tohoto enzymu, mimoto byla vyvinuta kinetická zkouška na enzymatickou účinnost tak, aby bylo možno měřit odstranění enzymu při následném čištění. Většinu, více než 90 % přidané endonukleázy se odstraní vymytím a průchodem frakcí chromatograf ickým sloupcem s obsahem aniontoměniče, tak jak bude dále popsáno. Tímto způsobem se po zachycení viru v chromatograf ickém sloupci sníží obsah enzymu více než stokrát.

Příklad 6

Přídatné stupně postupu

a) Zachycení viru

Virus hepatitidy A se koncentruje z materiálu po působení Tritonu a pak nukleázy na sloupci s obsahem aniontoměniče při použití nízké iontové síly, k eluci se užije 0,35 až 0,5 M chlorid sodný ve fosfátovém pufru. Tímto způsobem se virus hepatitidy A koncentruje 30x a současně se obsah Tritonu snižuje na neměřitelná množství při stanovení pomocí CZE.

b) Srážení PEG a extrakce chloroformem

Virus hepatitidy A po koncentraci, diafiltraci a zpracování XAD nebo virus, vymytý ze sloupce, v němž byl zachycen se vysráží polyethylenglykolem PEG. V případě, že se vhodně upraví podmínky, jde o vysoce selektivní postup, hlavní nečistoty, které jsou jinak čištěny společně s virem, zůstávají rozpustné a jsou odloženy spolu se supernatantem. Sraženina s obsahem viru po působení PEG se znovu uvede do suspenze a pak se extrahuje směsí chloroformu a isoamylalkoholu v poměru 24 : 1 k odstranění rozpustných lipidů a bílkovin, denaturovaných chloroformem, které zůstávají na rozhraní mezi vodnou a organickou fází.

c) Chromatografie na aniontoměniči a chromatografie na gelu k odstranění produktů s určitou molekulovou hmotností

Vodný extrakt po extrakci chloroformem se nanese na sloupec aniontoměniče při nízkém obsahu soli a pak se vymývá při použití gradientu chloridu sodného až do hodnoty 1,0 M. Konečná chromatografie na gelu vede k získání vysoce čištěného preparátu viru, jak je zřejmé z obr. 2.

d) Inaktivace

Inaktivace viru hepatitidy A formaldehydem byla dříve prováděna při použití 93 mikrogramů formaldehyduu/ml, což znamená poměr 1 : 4000, postup se provádí při teplotě 37 °C pro koncentrace antigenů v podstatě tak, jak se používají k imunizaci. Za těchto podmínek probíhá inaktivace viru s poločasem přibližně dvě hodiny, což odpovídá ztrátě přibližně

3,5 log 10 TCID^q (50% infekční dávka pro tkáňové kultury) za den. Snížení na 7 log infektivity viru bylo dosaženo po 2 dnech, avšak doba inaktivace byla prodloužena na 20 dnů tak, aby bylo možno zajistit široké hranice bezpešnosti použití vakciny a co nejúplnější inaktivací viru.

Pokusy, prováděné v malém měřítku potvrdily, že při zvýšení koncentrace formaldehydu se zrychluje a zvyšuje inaktivace, jak je možno měřit ztrátou hodnotý TCID_~. Inakti□u vace se měnila přímo úměrně v závislosti na koncentraci formaldehydu, jak bylo v pokusech prokázáno. V kulturách bylo použito vždy 200 ekvivalentů, bylo možno potvrdit úplnou inaktivací v případě, že virus byl inkubován spolu s

V.

370 mikrogramy/ml formaldehydu, to znamená v ředění 1 : 1000 při teplotě 37 °C po dobu 5 dnů. Při modifikovaných podmínkách inaktivace bylo tímto způsobem možno dosáhnout stejných hranic bezpečnosti jako při použití předchozího postupu. Tato skutečnost byla potvrzena v průběhu tří zkoušek na inaktivaci, provedených za identických podmínek s následnou adsorpcí na hydroxid hlinitý za získání vakciny, vhodné pro klinické zkoušky. Bylo dosaženo přibližně čtyřnásobné rychlosti inaktivace ve srovnání s použitím nižší koncentrace formaldehydu, což je v souhlasu se zkouškami, které byly prováděny v malém měřítku. Vzorky dvou vakcin, adsorbovaných na hydroxid hlinitý byly zkoušeny u myší na imunogenitu, přičemž hodnoty byly podobné jako pro předchozí vakciny, méně než 2 ng.

e) Adsorpce na hydroxid hlinitý

Adsorpce na hydroxid hlinitý byla uskutečněna současným srážením viru, inaktivovaného formaldehydem a hydroxidu hlinitého. Postup, který byl použit pro všechny klinické vzorky byl v podstatě stejný, jedinou změnou byla koncentrace viru ve výchozím roztoku, inaktivovaném formaldehydem. Přímé srážení inaktivovaného viru na hydroxid hlinitý bylo prováděno tak, že byl nejprve k výchozímu roztoku po inaktivací formaldehydem přidán síran hlinito-draselný. Pak byla vytvořena sraženina přidáním hydroxidu sodného. Formaldehyd a zbývající soli byly odstraněny odebráním supernatantu ze suspenze, objem byl nahrazen fyziologickým roztokem chloridu sodného.

Přiklad 7

Čistota výsledného HAV

Ke sledování postupu čištění byla použita vysokotlaká chromatografie na gelu, HPSEC, EIA a SDS-PAGE tak, aby bylo možno zajistit reprodukovatelné výtěžky vysoce čisté vakciny. HPSEC je prostředkem, kterým je možno sledovat ztrátu nukleové kyseliny v průběhu působení nukleázy a také stanovit čistotu v pozdjěích stupních postupu. Cheomatogramy na obr. 2 prokazují, že ve sraženině po působení PEG je možno pozorovat vrchol, odpovídající viru hepatitidy A. Tento virus je koncentrován po extrakci rozpouštědlem apak znovu ve stupni s použitím iontoměniče. Konečnou filtrací na gelu se získá vysoce čistý virus s čistotou vyšší než 95 % při elektroforéze na SDS-PAGE při barvení stříbrem. Nezávislým měřítkem pro čistotu produktu HAV je jediný symetrický vrchol při provádění HPSEC, jak je zřejmé z obr. 2, 37 a 38.

Odstranění nečistot

Analýza CZE na vzorcích v průběhu postupu ukazuje, že Triton je odstraněn při koncentraci diafiltrací podle Monroa a při zachycení viru ve sloupci. Mimoto prochází použitý enzym benzonáza sloupcem, v němž byl virus zachycen. Množství tohoto enzymu po průchodu sloupcem aniontoměniče je pod hranicí detekce (nižší než 18 femptogramů enzymu a méně než 30 pg enzymu/25 jednotek viru, hranice detekce při této zkoušce jsou 12,5 pg).

Příklad 8

Čištění viru hepatitidy A z reaktoru NCF nebo ze statického reaktoru pomocí smáčedla Tritonu, sledování podle Monroa

Virus HAV byl pěstován v podstatě způsobem podle příkladu 2 při použití reaktoru typu NCF. Buněčná kultura MRC-5 byla pěstována po vsázkách v 60 reaktorech NCF s plochou vždy 6000 cnr při teplotě 37 °C po dobu 7 dnů při použití Williamsova prostředí E, doplněného 10 % objemovými fetálního telecího séra a neomycin sulfátem. Ve dni 7 bylo živné prostředí vyměněno za čerstvé prostředí s obsahem dostatečného množství viru pro infekci kultur při použití přibližně 0,1 MOI a kultury byly přeneseny do prostředí s teplotou 32 °C a při této teplotě byly dále inkubovány 21 dnů při výměně prostředí jednou týdně. Virus byl izolován tak, že k vrstvě buněk byl přidán pufr pro rozrušení buněk, obsahující 0,1 % Tritonu X-100, 10 mM tris, 1 mM chloridu hořečnatého při pH 7,5. Výsledný materiál z reaktorů NCF byl spojen a zmrazen pro pozdější zpracování.

litry viru hepatitidy A, získaného z kultury v reaktoru typu NCF po působení smáčedla Triton X-100 byly rozmraženy ve vodní lázná s teplotou 20 až 30 °C v průběhu 4 hodin a pak byl materiál zfiltrován. Po filtraci byl materiál desetkrát zahuštěn v zařízení Pellicon při použití membrány, oddělující sloučeniny s molekulovou hmotností 300 000. Koncentrát v množství přibližně 400 ml byl podroben diafiltraci proti 10 mM tris-HCl pufru o pH 7,5 s obsahem 150 mM NaCl a 1 mM EDTA. Triton byl odstraněn při použití polymerní pryskyřice Amberlit XAD-4 (Rohm a Haas Company) v množství 30 mg/ml rozrušeného materiálu. Po odfiltrování XAD-4 byl materiál upraven na koncentraci 510 mM NaCl a pak byl vysrážen přidáním polyethylenglykolu PEG 8000 (Sigma) do konečné koncentrace 5 % objemových. Směs byla energicky protřepána, inkubována 1 hodinu při teplotě 4 °C a pak odstředěna 10 minut při téže teplotě při 1000 g. Po odstředění byl supernatant odstraněn a odložen.

Sraženina pak byla rozpuštěna v pufru s obsahem 6,2 mM fosforečnanu sodného o pH 7,2 s obsahem 120 mM NaCl a 1 mM EDTA. Usazenina, znovu uvedená do suspenze pak byla extrahována stejným objemem směsi chloroformu a isoamylalkoholu v objemovém poměru 24 : 1. Směs byla energicky protřepána a pak odstředěna 10 minut při 3000 g při teplotě 20 °C. Rozhraní, obsahující nerozpustný materiál bylo znovu extrahováno touž směsí organického rozpouštědla při použití 30 % původního objemu. Po odstředění byly obě vodné fáze spojeny. Chloroformový extrakt byl pak upraven na koncentraci 350 mM NaCl a chromatografován na sloupci DEAE-Sepharosy CL5B (Pharmacia) k adsorpci DNA. Frakce, která prošla sloupcem a obsahovala HAV, byla oddělena a třikrát zředěna pufrem s obsahem 6,2 mM fosfátu sodného o pH 7,5 a pak chromatografována na sloupci Toyopearl DEAE 650M (Toso Haas) při eluci gradientem až do IM NaCl. Virus hepatitidy A byl vymýván při použití 15 až 30 % 1 M pufru, což odpovídá 15 až 30 mS. Frakce z této oblasti byly spojeny a pak chromatografovány na sloupci Sepharosy CL4B (Pharmacia) v pufru s obsahem 6,2 mM fosforečnanu sodného se 120 mM NaCl. Materiál, nanesený na tento sloupec měl objem větší než 1 %, avšak menší než 5 % objemu sloupce. Produkt byl vymýván mezi 46 a 64 % celkového objemu sloupce.

Výsledný čištěný materiál byl sterilizován filtrací přes filtr s otvory s průměrem 0,22 mikrometrů a pak byl inaktivován formaldehydem v ředění 1 : 4000 (šlo o formaldehyd s obsahem 37 až 40 % hmotnostních této látky) při teplotě 37 °C po dobu 20 dnů. Za těchto podmínek dochází ke kinetice prvního řádu s poločasem 2 hodiny při ztrátě přibližně

3,5 log 10 TCID^q/24 hodin. Doba inaktivace byla prodloužena na 20 dnů, aby bylo možno zajistit vysokou bezpečnost použití. K inaktivovanému viru hepatitidy A byl přidán síran hlinito-draselný a pak byl roztok vysrážen přidáním hydroxidu sodného do pH 6,6 až 6,8. Formaldehyd a zbývající soli byly odstraněny odstředěním, při němž byl supernatant odstraněn a nahrazen fyziologickým roztokem chloridu sodného.

Příklad 9

Čištění viru hepatitidy A, izolované z reaktoru Costar Cubes při použití Tritonu X-100 působením nukleázy s následným zachycením chromatografii, průmyslový postup

V průmyslovém měřítku je možno materiál připravit při použití propagace viru v reaktorech typu SSR. Jako růstové prostředí byly použity reaktory Costar Cube, které byly napojeny na zařízení pro provzdušnění Costar CS2000 při použití zevní smyčky a čerpadla pro oběh živného prostředí, jak bylo popsáno v příkladu 3. Buněčná kultura MRC-5, byla na očkována do těchto reaktorů a pěstována 7 dnů při teplotě 37 °C. Oběh živného prostředí byl zahájen po dvou dnech. Reaktor byl kontinuálně promýván Williamsovým prostředím E, doplněným 10 % objemovými telecího séra s přídavkem železa a nomycinsulfátem. Současně bylo pH upravováno na hodnotu 6,9 až 7,6 a množství rozpuštěného kyslíku v reaktoru se pohybovala v rozmezí 15 až 100 % nasycení živného prostředí vzduchem. Buněčný materiál byl pěstován přibližně 7 dnů a pak byl do reaktoru naočkován virus v množství přibližně 0,1 MOI při použití očkovacího materiálu, připraveného podle příkladu 1. Teplota v reaktoru byla snížena na 32 °C a buněčný materiál byl pěstován ještě 21 dnů. Pak bylo živné prostředí vypuštěno a k uvolnění HAV byl užit 0,1% Triton s 10 mM tris-pufru o pH 7,5. Jak je zřejmé z příkladu 10, byly analyzovány čtyři šarže viru, získané tímto způsobem v reaktoru Costar Cube a bylo možno prokázat, že byl získán 2,8-násobek průměrného množství, které je možno získat v reaktorech NCF podle Monroa. Je tedy zřejmé, že při použití statických reaktorů s vysokým povrchem je móžno získat vysoké množství viru.

Získaný materiál se podrobí působení enzymu benzonázy k uvolnění viru od navázaných nukleových kyselin po zachycení viru na sloupci aniontoměniče. Při působení enzymu již není zapotřebí uskutečnit koncentraci, diafiltrací , působení XAD-4 ve sloupci a není také zapotřebí zařadit sloupec pro odfiltrování DNA, jak již bylo uvedeno v příkladu 8.

litrů materiálu z reaktoru Costar Cube po působení Tritonu X-100 bylo podrobeno působení 5 až 25 mikrogramů benzonázy/1 v přítomnosti 1 mM chloridu hořečnatého a pak byl materiál zfiltrován přes filtr s průměrem otvorů 0,22 mikrometrů ke sterilizaci. Směs byla inkubována 18 hodin při teplotě 25 °C a pak byl materiál, zpracovaný enzymem nanesen na sloupec aniontoměniče Toyopearl DEAE 650M v rovnovážném stavu v pufru s fosforečnanem sodným v koncentraci

4,7 mM s obsahem 90 mM NaCl. Přibližně 800 ml frakce s obsahem viru hepatitidy A bylo vymyto při použití pufru s 6,2 mM fosforečnanu sodného s obsahem 0,25 M NaCl a 1 mM EDTA. Byly vyvinuty postupy na stanovení účinnosti enzymu ke sledování množství enzymu v průběhu postupu. Výsledky těchto zkoušek prokazují, že více než 90 % endonukleázy je možno odstranit promytím ve sloupci, v němž dochází k zachycení viru. Mimoto došlo v průběhu postupu ke snížení celkového množství nukleázy včetně přidané benzonázy více než lOOx ve srovnání s množstvím, které bylo původně přítomno v materiálu po rozrušení Tritonem X-100.

Koncentrace chloridu sodného v produktu po průchodu sloupcem pro zachycení viru se upraví na 420 mM a virus se vysráží polyethylenglykolem PEG 8000 (Sigma) v konečné koncentraci 4,5 %. Směs se energicky promíchá a pak se jednu hodinu inkubuje při teplotě 4 °C. Po této době inkubace se sraženina oddělí odstředěním 10 minut při 1000 g při téže teplotě. Supernatant se oddělí a odloží a sraženina se znovu uvede do suspenze v pufru s 6,2 mM fosforečnanem sodným o pH 7,2 s obsahem 120 mM NaCl a 1 mM EDTA. Extrakce sraženina, znovu uvedené do suspenze organickým rozpouštědlem se provádí přidáním 1,5 objemu směsi chloroformu a isoamylalkoholu v objemovém poměru 24 : 1. Oddělení fází se usnadní odstředěním 10 minut při 3000 g při teplotě 20 °C, horní vodná fáze se oddělí a uchová. Rozhraní se znovu extrahuje 30 % původního objemu směsi organických rozpouštědel, odstředí a druhá vodná fáze se spojí s první vodnou fází.

Vodný extrakt se chromatografuje na sloupci s náplní Toyopearl DEAE 65OM (Toso Haas), tato matrice aniontoměniče se pak podrobí eluci při použití gradientu do 1 M chloridu sodného. Virus hepatitidy A se vymývá při 15 až 30 % tohoto gradientu, což odpovídá 15 až 30 mS. Frakce z této oblasti se spojí a podrobí chromatografií na gelu, k níž se použijí dva sloupce, s náplní Toyopearl HW55S a HW65S, zařazené za sebou. Za těchto podmínek se nachází virus hepatitidy A v objemu pro obě matrice a sestava sloupců, zařazených za sebou byla použita k oddělení nečistot s vyšší a nižší molekulovou hmotností. Sloupce byly v rovnovážném stavu v pufru s 6,2 mM fosforečnanem sodným o pH 7,2 s obsahem 120 mM NaCl. Virus hepatitidy A se vymýval ve formě symetrického vrcholu a příslušné frakce byly spojeny.

Produkt po chromatografií na gelu a po sterilizaci filtrací přes filtr s průměrem otvorů 0,22 mikrometrů byl inaktivován při koncentraci přibližně 500 jednotek/ml (jedna jednotka odpovídá přibližně 1 ng bílkoviny viru) při použití 370 mikrogramů/ml formaldehydu s obsahem 37 až 40 % hmotnostních této látky, jde tedy o ředění 1 : 1000, působení této látky trvá 5 dnů při teplotě 37 °C. Inaktivovaný virus hepatitidy A byl sterilizován filtrací při použití filtru s průměrem otvorů 22 mikrometrů. Současné srážení s hydroxidem hlinitým bylo prováděno počátečním přidáním síranu hlinito-draselného a pak titrací do pH 6,6 až 6,8 hydroxidem sodným. Zbylé soli a formaldehyd byly odstraněny usazením a slitím a pak byl supernatant odstraněn a nahrazen fyziologickým roztokem chloridu sodného .

Příklad 10

Produkt, získaný svrchu popsaným způsobem byl pak podroben analýze, byla uskutečněna analýza aminokyselin v bílkovině viru hydrolýzou v plynné fázi s následným značením PITO a vysokotlakou kapalinovou chromatografií v reverzní fázi, antigen HAV byl stanoven enzymatickou imunologickou zkouškou na pevné fázi, která byla prováděna tak, že byl antigen vázán na lidskou polyklonální protilátku s následnou detekcí pomocí myší monoklonální protilátky a kozí protilátky proti myší protilátce, konjugované s peroxidázou. Uhlohydráty byly stanoveny jako glukosa a uhlohydráty, od glukosy odlišné, které byly přítomny v produktu v množství nižším než 0,1 mikrogramů na 1 mikrogram bílkoviny v produktu. Stanovení bylo prováděno chromatografií na aniontoměniči při vysokém pH a také amperometrickou detekcí (HPAEC-PAD, hydrolýza v kyselém prostředí při použití 2 N kyseliny trifluoroctové s následnou analýzou HPLC). Analýza DNA hostitelských buněk byla stanoveny hybridizací DNA (metoda dot-blot při použití fragmentu Alu DNA jako hybřidizační sondy). Mastné kyseliny byly stanoveny s použitím plynové chromatografie (byla připravena řada methylesterů mastných kyselin s následnou kapilární plynovou chromatografií). RNA byla stanovena hydrolýzou s následnou analýzou vzniklých ribonukleotidů pomocí HPLC v reverzní f ázi.

Kromě dále uvedených údajů, které byly získány svrchu uvedenými postupy byla provedena ještě analýza SDS-PAGE a detekce bílkovin barvením stříbrem nebo metodou Western blot při použití protilátek proti HAV, tyto postupy prokázaly pouze přítomnost bílkovin, specifických pro HAV při použití 50 až 300 ng bílkoviny. Mimoto byla prokázána přítomnost úplných kapsidů HAV analýzou RNA, specifické pro HAV při hybridizaci se sondami DNA, specifickými pro HAV, při použití sacharosového hustotního gradientu a HPLC v reverzní fázi. RNA, specifick pro HAV byla přítomna v produktu v množství 0,1 až 0,2 mikrogramů na mikrogram bílkoviny. Toto množství specifické RNA je v souladu s poměrem přibližně 1/3 úplných kapsidů a 2/3 prázdných kapsidů HAV. Konečně je nezávislá zkouška na čistotu HAV znázorněna na obr. 2, kde při analýze HPLC byl prokázán jediný vrchol pro HAV.

Absolutní koncentrace bílkovin, uhlohydrátů, lipidů a DNA jsou uvedeny v části A následující tabulky. Údaje z části A jsou v části B převedeny na mikrogramy bílkoviny a v části C na procenta hmotnostní bílkoviny (jde o poměr hmotnosti přítomných uhlohydrátů a hmotnosti bílkoviny, násobeny stem, pro ostatní složky je výpočet obdobný).

Výsledky těchto analýz jsou dále uvedeny pro osm šarží HAV, které byly připraveny způsobem podle vynálezu, upraveným pro získání velkého množství viru.

A. Analýza produktu

šarže c.	bílkovina /Ug/ml	RNA /Ug/ml	uhlohydráty celkem /Ug/ml	DNAX /Ug/ml	mastné kyseliny /Ug/ml
1	14,7	2,4	3,4	i- 0,0045	4 0,3
2	8,0	1,1	3,7	4 0,0003	<0,3
3	18,9	2,1	0,9	< 0,0003	Z 0/3
4	17,0	1,5	2,5	/ 0,0003	Z 0,3
5	16,6	2,5	2,2	4 0,0003	Z 0,3
5	8,4	1,5	1,1	/0,0003	<0,3
7	14,5	1,4	1,5	Z 0,0003	Z. 0,3
8	14,6	1,8	1,2	Z 0,0003	<0,3

B. šarže	Údaje c.	v procentech
RNA	uhlohydráty	DNA	mastné kyseliny
1		16	23	<0,036	<2,0
2		14	46	<0,004	< 3,8
3		11	5	t- 0,002	Z 1,6
4		9	15	<0,002	4. 1,8
5		15	13	4.0,002	4-1,8
6		18	13	<0,004	<3,6
7		10	10	<0,002	< 2,1
8		12	8	<0,002	<2,1
X Mez	detekce LOD	pro první vzorek	byla 0	,0045 mikrogramů/ml,

u dalších vzorku vzrostla na 0,003 mikrogramů/ml.

Předchozí údaje jsou charakteristické pro produkt podle vynálezu před inaktivaci a před srážením s hydroxidem hlinitým, dále je uvedeno složení HAV v mikrogramech na bázi bílkoviny, přičemž HAV obsahoval více než 95 % bílkoviny, typické pro virus při analýze SDS-PAGE a při barvení stříbrem

Uhlohydráty-glukosa uhlohydráty, odlišné od glukosy

DNA lipidy

RNA z HAV

0,1 - 2,5/Ug 0,2 /Ug

0,004/g

0,1/Ug

0,1 - 0,2/Ug

S výhodou byly tyto analýzy prováděny na čištěném výsledném HAV podle vynálezu v okamžiku, kdy je virus nejvíce koncentrován před inaktivaci a zpracováním na vakcinu. Avšak při použití dostatečného množství inaktivovaného viru nebo hotové vakciny by analýza pravděpodobně prokázala v podstatě stejný výsledek. V jednom ze zvláště výhodných provedení má vakcina podle vynálezu následující složení při obsahu viru 25 jednotek/0,5 ml.

složka množství

chlorid sodný	4500	/Ug
hydroxid hlinitý	250	/Ug
tetraboritan sodný	19	/Ug
formaldehyd	/ 200	ng+
bílkovina	25	ngx+
glukosa (polymer)	< 20	ngx+
chloroform	< 22	ngx+
RNA z HAV	5	ngx+

složka množství uhlohydráty, odlišné od glukosy 4 4 ngx+ mastné kyseliny neomycin ( 1 ngx+ 4 1 ngx+.

DNA z MRC-5 < 0,005 ngx sérový albumin Skotu benzonáza £0,02 ngx+

0,00002 ngx+^ x extrapolace z analýzy celého produktu viru.

+ z analýzy odebraných vzorků jednotlivých šarží.

/ na bázi účinnosti.

Příklad 11

Srovnávání různých produktů HAV

Čištěný produkt HAV podle vynálezu byl srovnáván s jinými obdobnými produkty tak, jak jsou popsány svými výrobci. Výsledky tohoto srovnání jsou uvedeny v následující tabulce 1,

Z uvedených údajů a z informací, které byly uvedeny svrchu v příkladu 10 je zřejmé, že produkt podle vynálezu je čistší, zejména na bázi poměru antigenů HAV k celkovému množství bílkovin a také pokud jde o analýzu aminokyselin, mimoto je produkt úplněji charakterizován a při jeho použití je zapotřebí nejnižšího množství virové bílkoviny k dosažení tvorby protilátek a ochrany ve srovnání s jakýmkoliv dříve připraveným produktem, pro nějž jsou známy analytické údaje.

T a b	u 1 k a 1
Srovnání vakcin, obsahujících	inaktivovaný	virus HAV
vakcina bílkovina	bílkovina	čistota
celkem	viru	‘ bílkoviny
ng/dávka	ng/dávka
podle vynálezu 25^-100	25C-1OO	>95®’f .
u. SmithKline Beecham 2000°	300-500d	< 25f
japonská vakcina3	ioood	> 95®

a. Vakcina, vytvořená společnou prací Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute, Chiba Sérum Institute, a Denka Bio-Research Institute.

b. Na bázi analýzy aminokyselin, AAA.

c. Definováno pomocí imunologické zkoušky na antigen HAV a při této enzymatické zkoušce byl kalibračním standardem čištěný virus s čistotou vyšší než 90 % při analýze SDS-PAGE při barvení stříbrem, bílkovina byla definována pomocí AAA.

d. Definováno enzymatickou imunologickou zkouškou na antigen HAV, kalibrační standard není definován.

e. Definováno analýzou SDS-PAGE.

f. Definováno jako poměr antigenů HAV k celkovému množství bílkoviny.

Příklad 12

Účinnost vakciny - zkouška podle Monroa

Vakcina byla připravena tak, že buněčný materiál MRC-5, pěstovaný v souvislé vrstvě v reaktoru typu NCF byl infikován HAV kmenem CR326F. Kultura byla udržována několik týdnů při pravidelném přívodu živného prostředí. V příslušné době byly infikované kultury MRC-5 v souvislé vrstvě buněk podrobeny pů sobení smáčedla a takto získaný HAV byl čištěn způsobem podle vynálezu, jak je pro reaktory NCF znázorněno na obr. 1. Vodný roztok viru byl adsorbován na hydroxid hlinitý a uložen při teplotě 2 až 8 °C. Dávky po 0,6 ml obsahovaly 25 jednotek antigenu viru hepatitidy A při stanovení radioimunologickou zkouškou proti čištěnému standardu viru a 300 mikrogramů hydroxidu hlinitého. Placebo obsahovalo 300 mikrogramů hydroxidu hlinitého a thimerosal v ředění 1 : 20 000. Vakcina byla podána zdravým, seronegativním osobám s vysokým rizikem infekce HAV, bylo podáno 0,6 ml vakciny nebo placeba, očkování bylo provedeno jedinou dávkou. Krevní vzorky byly odebrány v den očkování a po jednom měsíci. Téměř 100 % očkovaných bylo prosto infekce HAV po 50 dnech, tato zkouška byla prováděna z toho důvodu, aby bylo možno vyřadit osoby, infikované HAV před očkováním. Na druhé straně se infikovala řada osob, kterým bylo podáno placebo. Tyto soubory osob jsou dostatečně velké k průkazu statistické významnosti ochrany proti infekci po podání vakciny.

Příklad 13

Produkce viru ve statickém reaktoru s oběhem prostředí

Virus hepatitidy A byl pěstován ve statickém reaktoru SSR, který byl tvořen vlastním reaktorem, opatřeným zevní smyčkou pro spojení se zařízením pro provzdušnění a čerpadlem (Charles River Biological Systems CRBS 5300). Vlastní reaktor měl tvar válce, vyrobeného z prvků z kovu s obsahem titanu při celkovém povrchu 260 000 cm , průměr válce byl přibližné 20 cm a jeho délka 1 m. Buněčná kultura MRC-5 byla do reaktoru naočkována a pak pěstována 7 dnů při teplotě 37 °C ve Williamsově prostředí E, doplněném 10 % objemovými fetálního telecího séra a neomycinsulfátem. Buněčná kultura byla pěstována 7 dnů, přičemž část prostředí byla třikrát týdně vyměněna tak, aby byly splněny podmínky pro přívod živin, tak jak jsou stanoveny podle Monroa pro pěstování v reaktoru typu NCF. Pak byl k infekci buněčné kultury užit virus při přibližně 0,1 MOI a teplota v reaktoru byla snížena na 32 °C a kultury byla dále pěstována 22 dnů. Pak bylo živné prostředí z reaktoru vypuštěno a k uvolnění viru byl použit pufr s obsahem 0,1 % hmotnostní Tritonu. V tomto reaktoru je možno získat přibližně o 50 % vyšší množství antigenů HAV, vztaženo na jednotku plochy než v kontrolních T-lahvích, naočkovaných týmž virem při použití téhož postupu jako v reaktoru. Pěstování HAV v tomto reaktoru je také výhodnější ve srovnání s reaktorem NCF, tak jak bylo popsáno v příkladu 2.

Příklad 14

Výroba HAV ve statickém reaktoru při použití mřížek z nerezové oceli

Materiály a metody

Buněčná kultura

Ve všech pokusech byla užita buněčná kultura MRC-5 při PDL - 40. Buněčný materiál byl pěstován ve Williamsově prostředí E s obsahem 10 % telecího séra, obohaceného železem, mM glutaminu a 50 mg/litr neomycinsulfátu při teplotě 37 °C.

K použitému prostředí bylo přidáno 0,1 % Pluronic F-68, byl použit reaktor typu tanku s oběhem živného prostředí.

K naočkování nových povrchů bylo použito 10 000 buněk/cm . Počet buněk byl stanoven při použití počítacího zařízení Coulter Counter a/nebo hematocytometrem při použití barvení trypanovou modří ke stanovení životaschopnosti buněk.

Buněčná kultura na kovových plochách

Úsek pevného kovu nebo kovové sítě s rozměry 5 x 5 cm byl uložen do skleněné Petriho misky s plochou 150 cm a sterilizován. Po zchladnutí bylo do misky přidáno 90 ml živného prostředí a buněčný očkovací materiál. Množství živného prostředí bylo dostatečné pro úplné překrytí povrchu kovu. Po době jednoho dne při teplotě 37 °C byl úsek kovu vyjmut při použití sterilních kleští a uložen do nové sterilní misky tak, aby bylo možno odečíst buněčný materiál na povrchu skla, miska opět obsahovala 90 ml živného prostředí. Pevné úseky kovu byly zpracovány působením trypsinu tak, že byly dvakrát promyty fyziologickým roztokem chloridu sodného s fosfátovým pufrem, PBS a pak byly přidány 2 ml trypsinu, Jakmile začalo docházet k uvoknění buněk, byl úsek kovu jemně omýván trypsinem pomocí pipety, aby došlo k úplnému uvolnění všech buněk.

Zásobní kultura viru a infekce

Zásobní kultura viru hepatitidy A, CR326F P28 s titrem θ

TCIDg^/ml byla použita pro všechny zkoušky. Uváděné hodnoty MOI byly vypočítány jako TCID_e-/buňka a nikoliv jako PFU/buňka. Buněčné kultury byly infikovány přidáním zásobního viru k čerstvému živnému prostředí, toto prostředí pak bylo přidáno ke kultuře. Po infekci byly buněčné kultury inkubovány při teplotě 32 °C.

Barvení na kuponech ke stanovení životaschopnosti buněk

Životaschopnost buněk na úsecích nebo kuponech kovu byla stanovena barvením fluoresceindiacetátem FDA a ethidium bromidem EB. V případě životaschopných buněk je FDA rozštěpen esterázami z cytoplasmy, uvolní se volrtý fluorescein, který pak zeleně fluoreskuje. Naproti tomu RB rychle proniká do DNA jader neživotaschopných buněk a fluoreskuje červeně. Buněčné kultury byly barveny oběma barvivý současně. Roztok obsahoval 100 mikrolitrů zásobního roztoku FDA s obsahem 5 mg této látky/ml v acetonu a 200 mikrolitrů zásobního roztoku EB, obsahujícího 10 mg/ml této látky v PBS, uvedená množství byla přidána do 50 ml PBS. Pak byla kovová mřížka s buněčným materiálem v tomto roztoku s objemem 5 ml inkubována 5 až 6 minut. Po barvení byla mřížka dvakrát omyta vždy 20 ml PBS a pak uložena mezi dvě sklíčka. Pak byl vzorek pozorován v mikroskopu (BioRad MRC-600).

Statický reaktor s oběhem živného prostředí

Kovové mřížky, známé jako E-pack a pevné úseky nerezové oceli 316 byly jako prvky pro statický reaktor SMV získány od Koch Engineering (Wichita, KS). Všechny prvky měly rozměr přibližně 5 x 5 cm a byly vyrobeny z nerezové oceli

316 nebo z titanu. Povrch pevných prvků byl 1300 cm , povrch 2 mřížek 2300 cm . Poměr povrchu k objemu kapalného prostředí byl pro mřížky 26 cm /ml (přibližně 24 cm /ml na bázi celkového objemu reaktoru). Pět prvků bylo obvykle uloženo do skléněných válců s rozměry 5 x 26,5 cm, opatřených pomůckami pro zachycení mřížek a zakončením typu PTFE. Prvky byly uloženy kolmo na směr oběhu živného prostředí. Válec, naplněný těmito prvky byl použit jako reaktor pro pěstování buněk. Nádoba, propojená s reaktorem a spojená s elektronickými řídícími prvky byla použita k úpravě pH na hodnotu 7,2 až 7,3 a DO v rozmezí 80 až 90 %. Prostředí obíhalo z této nádoby do reaktoru a zpět pomocí peristaltického čerpadla.

Kultura byla zahájena při nižší oběhové rychlosti tak, aby buněčný materiál mohl přilnout k podložce. Očkovací materiál byl do systému přidán a pak bylo prostředí recirkulováno 5 minut rychlostí 100 ml za minutu tak, aby došlo k promíchání buněk s živným prostředím. V průběhu tohoto rychlého oběhu se zachytilo jen velmi malé množství buněk na růstové ploše. Pak byla rychlost oběhu snížena na přibližně 2 ml za minutu, což je rychlost, při níž může dojít k pomalému usazování buněk. Bylo prokázáno, že tato rychlost je optimální pro uchycení buněk na růstových plochách za současné rovnoměrné distribuce buněk v reaktoru.

Rozrušení buněk

K rozrušení buněk byl užit pufr s obsahem 0,1 % Tritonu X-100, 10 mM tris. a 1 mM chloridu hořečnatého. T-lahve byly dvakrát promyty množstvím 0,3 ml/cm PBS a pak byly kultury rozrušeny tak, že v průběhu 1 hodiny byl dvakrát přidán svrchu uvedený pufr v množství 0,1 ml/cm . Podrobnosti, týkající se postupu jsou uvedeny v jednotlivých příkladech.

Analytické metody

Buněčné metability byly stanoveny při použití analytického zařízení (Kodak Ektachem DT60). Antigen viru hepatitidy A, HAV Ag, byl stanoven enzymatickou imunologickou zkouškou s použitím monoklonální protilátky. Celkové množství bílkoviny z rozrušených buněk bylo stanoveno kvantitativně při použití modři Coomassie (Bio-Rad, č. katalogu 500 až 0001) proti sérovému albuminu Skotu jako standardu.

Výsledky a diskuse

Růst buněk MRC-5 na úsecích pevného kovu

Před touto zkouškou byla provedena předběžná zkouška při použití kovových prvků z titanu. Bylo žádoucí sledovat buněčný růst na povrchu různých slitin, které by byly méně nákladné než titan a byly výhodné pro použití ve statických reaktorech. Byly sledovány dva typy nerezové oceli 316 a 316L a mimoto slitina Hastelloy B a C. Na každý úsek kovu byla naočkována přibližně 10 000 buněk/cm . Po 4 dnech byl buněčný materiál uvolněn trypsinem a byl stanoven výsledný počet buněk:

materiál počet buněk/cm

titan	1,4	X	ícr
nerezová ocel 316	1,6	X	105
nerezová ocel 316L	1,2	X	105
slitina Hastelloy B	2,2	X	103
slitina Hastelloy C	1,3	X	io4

Růst buněk na obou typech nerezové oceli byl obdobný jako růst na titanu. Buněčný materiál téměř nerostl na slitině Hastelloy B a špatně rostl na slitině Hastelloy C. Rozdíly v hustotě buněk pro nerezovou ocel a titan neprokazují, že by některý z těchto materiálů byl výhodnější, jde patrně pouze o variabilitu růstu v jednotlivých pokusech.

Většina údajů pro výrobu viru hepatitidy A byla získána na buněčném materiálu, rostoucím na podložce z plastické hmoty, například v lahvích z polystyrenu. Pro srovnání jsou na obr. 3 uvedeny růstové křivky pro buněčnou kulturu MRC-5 na polystyrenu, skle a nerezové oceli 316. Buněčný materiál rostl na všech uvedených typech povrchů srovnatelným způsobem. Maximální specifická rychlost růstu byla obdobná, 0,034/h pro plastickou hmotu, 0,032/h pro sklo a 0,039/h pro nerezovou ocel 316. Nižší konečná hustota buněk pro plastickou hmotu byla patrně způsobena omezeným přívodem živin. Růst na plastické hmotě byl totiž sledován v T-lahvích, kdežto růst na skle a na nerezové oceli byl sledován v Petriho miskách. Vzhledem k rozdílu objemu živného prostředí, použitého na cm v jednotlivých systémech může dojít k nerovnováze v dostupných živinách. Buněčný růst a spotřeba glukosy pro nerezovou ocel jsou uvedeny na obr. 4.

Růst buněk MRC-5 na úsecích kovové mřížky

Aby bylo možno co nejvíce zvětšit povrch na jednotku objemu, bylo sledováno použití kovové mřížky nebo sítě v Petriho miskách pro růst buněk MRC-5. Pro některé kombinace průměru drátů a odstupy může mít mřížka tutéž plochu jako pevný úsek nebo může mít daleko vyšší celkovou plochu pro buněčný růst. Úseky sítě nebo mřížky je pak možno upravit do reaktoru tak, aby byl pro růst buněk k dispozici co nejvyšší povrch na jednotku objemu reaktoru. Aby bylo možno sledovat růst buněk na takovém povrchu, byly pěstovány buněčné kultury MRC-5 tak, jak bylo svrchu uvedeno v odstavci Materiály a metody.

Buněčný materiál MRC-5 byl pěstován na síti z nerezové oceli 316 nebo z titanu. Průměr drátu byl v rozmezí 100 až 400 mikrometrů a byla sledována hustota 14 x-100, 120 x 110 40 x 200 a 107 x 59 drátů na 2,5 cm. Buněčný materiál rostl ve větší nebo menší míře na všech vzorcích. V časném stádiu rostl buněčný materiál na povrchu drátu. Krátce potom počalo docházet k přemostění, zejména v rozích ok. Postupem času vyplnil buněčný materiál všechny mezery a vytvořil vrstvy.

Již při pohledu pouhým okem, je zřejmé, že hustota buněk na mřížkách je veliká. Přímé hodnoty nejsou k dispozici vzhledem k tomu, že buněčný materiál, rostoucí na těchto sítích nelze snadno uvolnit trypsinem. Předběžné údaje však ukazují, že velikost ok je důležitým faktorem vzhledem k tomu, že buněčný materiál nemůže přerůstat větší oka, avšak v případě, že jsou oka příliš malá, má sít obdobný povrch jako hladká deska. Konstrukční materiál neovlivnil hustotu růstu buněk a je možno uzavřít, že je možno použít jakýkoliv biologicky kompatibilní materiál, z něhož je možno vytvořit mřížky nebo sítě. Kovový materiál má tu výhodu, že je možno jej snadno čistit a opakovaně používat pro řadu cyklů buněčného růstu, jak bude dále uvedeno.

Dále bude uvedeno pouze použití sítě z nerezové oceli 316 s obsahem 107 x 59 drátů na 2,5 cm při průměru drátu 160 mikrometrů, to znamená, že rozměr ok je 77 x 270 mikrometru. Z tohoto materiálu byly vyrobeny dále uvedené prvky pro statický reaktor. Tento materiál měl k dispozici zvýšený povrch pro růst buněk a mimoto umožnil růst buněk ve větším počtu vrstev. Mikrofotografie vícevrstevného růstu buněk na tomto materiálu je znázorněna na obr. 5. Bylo žádoucí sledovat, zda buňky jsou ve všech vrstvách životaschopné nebo zda je buněčný materiál ve středu vícevrstevného útvaru nekrotický. K tomuto účelu bylo užito barvení fluoresceindiacetátem a ethidiumbromidem, jak již bylo podrobněji vysvětleno v odstavci Materiály a metody. Při řadovém sledování příčných řezů buněk, rostoucích na síti při použití mikroskopu bylo zřejmé, že převážná většina buněk jsou životaschopné buňky vzhledem k tomu, že ethodiumbromid nepronikl do DNA jádra a že byl fluoresceindiacetát rozštěpen za uvolnění fluoresceinu. Na obr. 6A je znázorněno barvení fluoresceinem pro řadu příčných řezů se strany buněk. Na obr. 6B je znázorněno barvení ethidiumbromidem pro tytéž řezy. Zvláštní vzorky buněk, usmrcené ethanolem byly pozitivní kontrolou pro barvení ethidiumbromidem a negativní kontrolou pro barvení fluoresceindiacetátem v těchto pokusech. Výsledky těchto kontrol jsou znázorněny na obr. 7.

• Pěstování' buněk na sítích jako prvcích pro statický reaktor

- Pro optimální kulturu je důležité dosažení rovnoměrného naočkování a udržení rovnoměrného množení buněk. K tomuto účelu byly vytvořeny prvky pro statický reaktor ze svrchu uvedených sítí při obíhajícím živném prostředí. Válcový reaktor byl uložen tak, že jeho dlouhá osa byla osa vertikální. Přestože první zkoušky byly prováděny s horizontální osou tak, aby bylo podporováno ukládání buněk na růstové povrchy, bylo prokázáno, že ukládání na vertikální povrchy je účinné a že tento postup je velmi výhodný. Buněčný materiál byl pěstován na ploše přibližně 10 000 cm . Buněčný materiál byl naočkován do reaktorů s větším počtem prvků, přičemž osy jednotlivých prvků a směru proudu živného prostředí mohou být paralelní až v úhlu až 90°. Pro dobré míšení a optimální chod reaktoru je výhodný kolmý směr.

Buněčný materiál se v časném stádiu neuchytil při rychlosti oběhu 5 cm/min. Účinnost naočkování se zvýší naplněním reaktoru a dvouhodinovým usazováním buněk sedimentací pomocí přitažlivosti. V tomto případě je pak možno dosáhnout účin* nosti vyšší než 90 %, přičemž účinnost se vypočítá jako počet naočkovaných buněk/počet buněk v očkovacím materiálu x 100 %, avšak naočkování nebylo rovnoměrné. Jak je zřejmé z obr. 8, došlo k naočkování největšího počtu buněk na spodní prvek, kdežto nejmenší počet buněk se nacházel na horním prvku. Z těchto údajů byla vypočítána průměrná rychlost usazování buněk MRC-5 přibližně 6 cm/h. V dalším pokusu byly užity čtyři prvky a živné prostředí obíhalo rychlostí, přibližně rovnou rychlosti usazování. V tomto případě bylo dosaženo reprodukovatelného rovnoměrného naočkování při účinnosti vyšší než 90 %, jak je zřejmé z obr. 8. Svrchu uvedené výsledky ukazují, že střední rychlost na povrchu prvků v celém reaktoru ovlivní rychlost uchycení buněk i distribuci buněk v celém reaktoru.

Srovnání buněčného růstu na pevných úsecích materiálu a na sítích ve statickém reaktoru

Byly vytvořeny dva reaktory, které byly uvedeny do činnosti současně tak, aby bylo možno stanovit rozdíly mezi použitím pevných úseků a sítí jednotlivých materiálů.

Pevné prvky byly vytvořeny z titanu, sítě byly vytvořeny 2 z nerezové oceli. Povrchová plocha byla 1300 cm pro pevné 2 prvky a 2300 cm pro sítě, což znamená, že poměr povrchu sítě a pevného prvku byl 1,8. Pevné prvky sloužily jako kontrolní hodnota pro všechny pokusy. Reaktory byly naočkovány množstvím 10 000 až 20 000 buněk/cm a pak byl buněčný materiál pěstován tak dlouho, až koncentrace glukosy byla snížena na 120 mg/dl, v tomto okamžiku byl zahájen oběh živného prostředí. Oba reaktory byly naočkovány buněčným materiálem MRC-5 ze stejné očkovací kultury a živné prostředí do obou reaktorů bylo přiváděno ze společného zásobníku, aby bylo možno vyloučit jakékoliv rozdíly v těchto hodnotách.

Rychlost příjmu glukosy GUR pro každý reaktor je uvedena na obr. 9. Na obr. 9A je uvedeno srovnání obou reaktorů pokud jde o plochu, tak jak bylo uvedeno svrchu. Plochy jsou přibližné. Na obr. 9B je uvedeno srovnání objemu buněčného prostředí v reaktoru vzhledem k tomu, že oba reaktory měly stejné rozměry, to znamená, že obsahovaly pět prvků s rozměrem přibližně 5x5 cm, zásobník živného prostředí měl objem 1 litr. Obr. 9B neuvádí žádné údaje, týkající se povrchové plochy. Rychlost příjmu glukosy byla použita jako míra buněčného růstu tak, aby bylo možno stanovit počátek stacionární fáze. Poslední bod na obr. 9 označuje okamžik, kdy byl virus z buněk uvolněn Tritonem. Při pohledu na použité prvky bylo možno prokázat, že pevné povrchy byly zcela pokryty buněčným materiálem a teké oka sítí byla téměř vyplněna, avšak na sítích by mohlo dojít ještě k dalšímu růstu.

V tomto okamžiku obíhalo živné prostředí v množství 0,19 1/h pro pevné prvky a koncentrace glukosy v prostředí byla 1,6 g/1. Rychlost promývání pro reaktory se sítěmi byla 0,26 1/h při průměrné koncentraci glukosy o,69 g/1. Výsledky prokazují, že vyšší účinnost je možno získat pro reaktor, v němž jsou uloženy prvky ve tvaru sítí.

Pak bylo živné prostředí z reaktorů vypuštěno a buněčný materiál byl rozrušen pufrem se smáčedlem k extrakci buněčné bílkoviny, která je mírou celkové buněčné hmoty v reaktoru. Rozrušení buněk v obou reaktorech bylo uskutečněno stejným způsobem. Nejprve byly reaktory propláchnuty 2 litry PBS s teplotou místnosti, promývání trvalo 5 minut při rychlosti 100 ml/min, pak byl pufr vypuštěn. Toto promytí k odstranění bílkovin bylo dvakrát opakováno. Pak po odstranění bílkovin z prostředí svrchu uvedeným způsobem byl do reaktoru přiveden celkem 1 litr pufru pro rozrušení buněk, tak jak byl uveden v odstavci Materiály a metody, pufr byl přiváděn rychlostí 400 až 500 ml za minutu při teplotě 37 °C, promývání trvalo jednu hodinu. Postup byl ještě jednou opakován, a pak byl opakován potřetí po dobu 2 hodin a po čtvrté po dobu 4 hodiny. Procentuální množství bílkovin, které bylo z buněk odstraněno po každém z těchto promytí buněk pufrem pro rozrušení buněk je uvedeno na obr. 10. V případě, že se celkové množství bílkoviny převede na hustotu buněk podle korelace, uvedené v doplňku 1, obsahoval reaktor s pevnými prvky 3 x 10 buněk/cm , kdežto reaktor s obsahem prvku ve

2 tvaru sítí obsahoval 6 x 10 biněk/cm . Údaj pro pevné prvky je patrně representativní vzhledem k tomu, že všechny prvky byly zcela zbaveny buněk a zkontrolovány pod mikroskopem. Jak však bylo rovněž prokázáno mikroskopem, nebyla ze sítí úplně odstraněna buněčná drt, takže číslo, uvádějící počet buněk v reaktoru se sítěmi je patrně příliš nízká. Sítě totiž jsou schopny udržet přibližně trojnásobnou koncentraci buněk ve srovnání s pevnými prvky. V případě, že tyto výpočty pro povrch jsou správné, je údaj pro celkovou bílkovinu vyšší než poměr povrchů a je patrně důkazem toho, že buněčný materiál rostl ve větším počtu vrstev.

Produkce HAV Ag ve statickém reaktoru při použití sítí

Produkce antigenu byla zkoumána ve statickém reaktoru při použití prvků ve tvaru mřížek nebo sítí. Účelem..tohoto pokusu bylo stanovení, zda může dojít k růstu viru ve větším počtu vrstev buněk na síti z nerezové oceli. Neběželo o systém, optimalizovaný pro produkci tohoto antigenu. V tomto případě bylo prostředí nahrazováno po určitých intervalech a nikoliv částečně. Hodnoty GUR pro tento pokus jsou uvedeny na obr. 11. Hodnoty jsou na bázi glukosy první den po výměněn prostředí. Buněčný materiál byl infikován při hodnotě MOI přibližně 1 v průběhu sedmého dne. Hustota buněk pro výočet MOI byla v době infekce stanovena podle spotřeby glukosy. Jak bylo možno pozorovat například v příkladu 9, vyrovná se spotřeba glukosy krátce po infekci stále na stejnou úroveň a pak postupně klesá v souladu s postupem infekce buněk. Pokles, který je možno pozorovat na obr. 10, je mírnější než pokles v příkladu 9, což bylo patrně způsobeno pomalejším postupem infekce, v příkladu 9 byla užita hodnota MOI 0,1. Antigen viru byl izolován 21 dnů po infekci při použití Tritonu, způsob rozrušení buněk bude dále uveden.

- 67 Stupeň 1: rozrušení buněk bylo provedeno oběhem pufru pro rozrušení 1 hodinu při 37 °C, stupeň 2: byl proveden stejně jako ve stupni 1.

stupeň 3: buněčný materiál byl zpracováván jednu hodinu ultrazvukem (Branson) v lázni s obsahem 0,7 litru pufru pro rozrušení buněk.

stupeň 4: materiál byl zmrazen na 12 hodin v 1 litru pufru pro rozrušení buněk a po roztátí byl 1 hodinu zpra cováván ultrazvukem.

Množství celkové bílkoviny v procentech a množství antigenu v materiálech z uvedených čtyř postupů je uvedeno na obr. 12. Je zřejmé, že první dva stupně s oběhem pufru byly velmi účinné pro odstranění antigenu z buněk. Při tomto postupu byl reaktor před rozrušením buněk pouze dvakrát promyt PBS, takže tento postup nebyl zcela účinný a z tohoto důvodu je také uměle zvýšeno množství bílkoviny z prvního stupně, kdežto ve stupních 2, 3 a 4 je množství bílkoviny nižší. Vzorek byl zkoumán na antigen HAV metodou EIA před zmrazením. V závislosti na procentuálním množství v každém materiálu při pozdějším stanovení bylo toto množství v korelaci s dvojnásobným výtěžkem antigenu na jednotku povrchu ve srovnání s příkladem 9. Cílem tohoto pokusu bylo prokázat, že ukazatelem pro růst viru je výtěžek antigenu. Tento pokus také ukazuje využitelnost statického reaktoru s prvky ve stvaru sítě pro produkci viru.

Přestože buněčný materiál byl patrně z reaktoru isolován opožděně podle hodnot GUR, jsou výtěžky antigenu poměrně vysoké, což ukazuje na to, že větší počet buněčných vrstev může být infikován virem. Údaje rovněž ukazují na důležitost hodnoty MOI pro produkci HAV. Při použití hodnoty

MOI 1 by bylo možno patrně zkrátit dobu postupu o více než týden a buněčný materiál izolovat ve dvacátém dnu. Je zřejmé, že doba infekce a hodnota MOI jsou důležitými proměnnými veličinami v průběhu postupu vzhledem k tomu, že vhodnou volbou těchto parametrů je možno zkrátit dobu pěstování. Pokusy s buněčným růstem prokazují, že infikované buněčné kultury dále rostou podobnou rychlostí jako neinfikované kultury, což platí i v případě, že kultury byly infikovány vysokou hodnotou MOI při použití kmene CR326F P28, jak je zřejmé z obr. 13. Buněčný materiál roste navzdory infekci a snížení teploty na 32 °C tak, aby mohl růst uvedený kmen viru. Maximální specifická rychlost růstu, vypočítaná z těchto křivek je 0,015/h, což je přibližně polovina rychlosti růstu neinfikovaných buněk při teplotě 37 °C. Skutečnost, že se buněčný materiál chová podobným způsobem v průběhu prvního týdne po infekci HAV je důležitá pro práci reaktoru v tom smyslu, že je žádoucí dosáhnout co nejvyšší koncentrace buněk bez ohledu na dobu infekce a na hodnotu MOI. Tento pokus prokazuje, že optimalizace trvání buněčného růstu je závislá na době infekce, trvání infekce a hodnotě MOI.

Čištění prvků pro statický reaktor

Je žádoucí mít k dispozici opakovaně použitelný povrch pro buněčný růst tak, aby bylo možno se vyvarovat příliš velkého odpadu, umožnit automatické provádění postupu a zvýšit reprodukovatelnost pěstování buněk. Prvky ve tvaru sítí je možno opláchnout destilovanou vodou k odstranění solí ze živného prostředí, prvky se promývají jednu hodinu rychlostí 500 ml/min, pak se uloží do 1 litru 5% roztoku hydroxidu sodného a sterilizují 45 minut v autoklávu. Po zchlazení se prvky oplachují destilovanou vodou do úplného odstranění hydroxidu sodného, jak je možno prokázat stanovením pH v proplachovací kapalině. Tento postup je velmi účinný pro odstranění buněčné drti při pozorování v mikroskopu. Je možno, že méně pracné zpracování by vedlo k ekvivalentnímu vyčištění a bylo by možno je uskutečnit při uložení prvků v reaktoru. Sítě, zpracované uvedeným postupem byly použity alespoň desetkrát, aniž by bylo možno pozorovat změny buněčného růstu. Prvky, na nichž byl pěstován virus svrchu uvedeným způsobem byly čištěny právě touto metodou, což prokazuje použitelnost již použitých a vyčištěných prvků pro pěstování viru.

Závěry

Tyto pokusy prokázaly, že je možno ve statických reaktorech s oběhem živného prostředí použít sítě z nerezové oceli k získání růstu buněk MRC-5 ve větším počtu vrstev. Tyto vrstvy byly životaschopné beze známek uhynutí buněk. Pokusy s infekcí buněk prokázaly, že vícevrstevné útvary buněk je možno infikovat virem hepatitidy A a i v neoptimalizovaném systému je možno získat větší množství antigenů, než se běžně získá při použití pevných povrchů podle příkladu 9. V některých kulturách může při použití těchto nosičů dojít ke tvorbě shluků buněk v případě, že vícevrstevné útvary nejsou dobře definovány. K tomu však dochází zejména za použití mikronosiču. Při použití sítí dochází ke tvorbě velmi dobře definovaných vícenásobných vrstev vzhledem k dobře zvolené geometrii a tím také nedochází k omezení přívodu živin. Buněčný růst v okách sítě uzavře tato oka, takže se vytvoří podobné vrstvy jako na pevném povrchu. Tento systém si tedy uchovává výhody statických reaktorů a vede k reprodukovatelné a rovnoměrné výživě buněk. V tom je možno pozorovat rozdíl ve srovnání s jinými typy reaktorů, například s reaktory, vyplněnými náhodně uspořádanými vlákny nebo skleněnými kuličkami, dutými vlákny nebo keramickými prvky.

V těchto typech reaktoru dochází při růstu buněk ke zhoršení průtoku živného prostředí, takže vznikají shluky buněk s nedostatečným přívodem živin. Je tedy zřejmé, že statický reaktor s opakovaně použitelnými prvky ve tvaru sítě z nerezové oceli představuje podstatný pokrok pro pěstování buněk MRC-5 a pro produkci antigenů hepatitidy A.

Příklad 14 - Doplněk 1

Souhrn

Bylo provedeno kvantitativní stanovení celkového množství bílkoviny v rozrušeném buněčném materiálu MRC-5 a toto množství bylo srovnáváno s přímými údaji o počtu buněk, získanými hematocytometrem nebo použitím zařízení Coulter Counter. Bylo možno prokázat, že množství celkové bílkoviny v rozrušené kultuře zdavých buněk v časné exponenciální fázi, pozdní exponenciální fázi a ve stacionární fázi růstu i v kultuře buněk 1, 2 a 3 týdny po infekci je závislé na hustotě buněk. Tato jednoduchá korelace je prostředkem pro stanovení hustoty buněk v reaktoru, které není nutno uskutečnit přímým počítáním buněk.

Diskuse

Zkouška na bílkovinu a příprava vzorku

Zkouška na bílkovinu (BioRad, č. katalogu 500 - 0001) je rychlá, citlivá zkouška pro kvantitativní stanovení celkového množství bílkovin. První pokusy prokázaly, že pufr, použitý pro rozrušení buněk a obsahující 0,1 % Tritonu X-100, mM tris-HCl a 0,1 mM chloridu hořečnatého neinterferuje s použitím modři Coomassie. Pro standardní stanovení byla všechna ředění včetně ředění standardu, kterým byl sérový albumin skotu, byla provedena při použití pufru pro rozrušení buněk s obsahem Tritonu. Skutečnost, že materiál po rozrušení buněk Tritonem často obsahuje vločky prokazuje, že může být nutné před provedením analýzy vzorky ještě dále zpracovávat. Větší vločky totiž vedou k nepřiměřeně vysokému titru bílkovin. Avšak po dvou cyklech rychlého zmrazení na -70 °C v ethanolu a opětného rozmražení se velikost vloček snížila a byla získána homogenní suspenze. Mimoto při sledování několika ředění jediného vzorku je možno snadno zjistit, které vzorky nejsou vhodným způsobem upraveny.· Vzorky je také možno odstředit a k analýze použít čirý supernatant. Tímto způsobem je možno získat obdobné výsledky, obvykle však není odstředění nutné. Uváděné údaje byly získány při použití rozrušených buněk, které byly nejméně dvakrát zmrazený, načež byl vzorek před analýzou energicky promíchán.

Koncentrace bílkoviny jako funkce hustoty buněk

Pro určitou standardní křivku pro převádění celkového množství bílkoviny na specifický počet buněk musí buněčný materiál, použitý v průběhu postupu obsahovat vždy přibližně stejné množství bílkoviny. Aby bylo možno prokázat, zda je tento vztah splněn, byly T-lahve naočkovány vždy stejným počtem buněk. Ve specifických intervalech pak byly vždy dvě lahve analyzovány. Jedna z nich byla zpracována působením trypsinu a buněčný materiál byl počítán v hematocytometru a v zařízení Coulter Counter, ve druhé lahvi bylo použito rozrušení smáčedlem tak, že láhev byla promyta dvakrát při použip tí 0,3 ml/cm PBS a pak byl do lahve dvakrat přidán pufr pro o rozrušení buněk v množství 0,08 ml/cm . Kultury byly zpracovaný v časné exponenciální fázi růstu, v pozdní exponenciální fázi růstu, ve stacionární fázi a 1, 2 a 3 týdny po infekci. Údaje, získané v těchto pokusech jsou uvedeny na obr. 14. Nejlépe odpovídající křivka je popsána rovnicí Y(10⁴)=-0,09+0,42á.

Z výkresu je zřejmé, že jediná křivka postačuje ke stanovení počtubuněk na základě stanovení celkového množství bílkoviny bez ohledu na stav buněk.

Buněčný materiál byl v tomto pokusu infikován při použití HAV, kmene CR326F P28 při použití MOI 1. Po třech týdnech po infekci bylo prokázáno, že pomocí trypsinu není možno buněčný materiál uvolnit. Avšak vzhledem k tomu, že hustota buněk byla 1 a 2 týdny po infekci přibližně stejná a ve třetím týdnu nedošlo k viditelnému rozrušení buněk, je hustota buněk , uvedená pro třetí týden stejná jako pro druhý týden. Údaje z obr. 14 byly použity pro další křivku, v níž je naznačen čas pro specifické údaje. V případě, že se odečtou údaje pro tři týdny po infekci, nedojde k podstatné změně ve tvaru křivky ani v její strmosti, jak je zřejmé z obr. 15.

Při použití svrchu uvedené korelace bylo při stanovení bílkovin pro několik rozrušených kultur, připravených podle příkladu 9 získáno průměrné množství bílkoviny 490 mikrogramů na ml. To odpovídá přibližně 3,3 x 10 buněk/cm a údaje jsou současně v souladu s hustotou buněk, stanovenou hematocytometrem v kontrolních T-lahvích. Je tedy možno uzavřít, že množství celkové bílkoviny v buněčném materiálu, rozrušeném Tritonem je přímo úměrné hustotě buněk v období, kdy byl izolován virus.

Příklad 15

Zkoušky na míšení při extrakci rozpouštědlem

Souhrnné informace

V průběhu čištění viru hepatitidy A je extrakce rozpouštědlem kritickým stupněm pro odstranění nečistot, které jsou stále ještě přítomny po vysrážení pomocí PEG. Aby bylo možno tomuto stupni dobře porozumět a zcela jej řídit, byla provedena řada pokusů pro určení důležitých parametrů extrakce rozpouštědlem. Byly identifikovány dvě klíčové proměnné veličiny: trvání míšení a intenzita protřepávání, tyto parametry závisí také na velikosti použitých lahví. Poměr rozpouštědla k vodě nebyl významným faktorem, ani nebylo možno pozorovat rozdíly v případě, že bylo použito mechanického míchadla, ručního protřepávání nebo magnetického míchání.

Materiály a metody

Vzorky sraženiny po působení PEG, znovu uvedené do suspenze, byly promíseny se směsí chloroformu a isoamylalkoholu v poměru 24 : 1, byly užity různé podíly směsi v rozmezí 0,5 : 1 až 3 : 1 pro poměr rozpouštědla k vodné fázi. Materiál byl promísen ručním protřepáváním, mechanickým mícháním ve zkumavkách s objemem 15 ml nebo při použití mechanického třepacího zařízení 3D (Glas-Col, Terre Haute, Ind) při rychlosti motoru 100 (byly užity zkumavky s objemem 15 a 50 ml. Doba míšení byla 20 sekund až 1 hodina.

Po promísení byly vzorky odstředěny k oddělení obou fází. Pro zkumavky s objemem 50 ml a lahve s objemem 500 ml byla použita odstředivka J6-MI (Beckman) s rotorem JS 4,2 při 3800 ot/min, odstředění trvalo 10 minut. V případě malých zkumavek byly zkumavky 5 minut odstředěny při 1000 ot/min v odstředivce Dynac II a pro další pokusy byly vzorky přeneseny do zkumavek s objemem 50 ml a odstředěny stejně jako svrchu.

Vodná fáze byla odstraněna skleněnou pipetou a analyzována vysokotlakou chromatografii na gelu za následujících podmínek: dva sloupce TSK P4000 χ 1 (Toso Haas), zařazené za sebou, jako mobilní fáze byl užit roztok RCM-8, uváděný také jako roztok CM563 s obsahem 150 mM NaCl v 6,2 mM fosfátovém pufru o pH 7,2, rychlost průtoku 0,32 ml/min, eluát byl sledován po dobu 80 minut při 214 a 260 nm. Výsledky jsou vyjádřeny jako plochy pod vrcholem nebo poměry těchto ploch na bázi absorpce při 214 nm v ultrafialovém světle. Pro počáteční pokusy pro materiál ze zkumavek s objemem 15 ml byl použit pouze jediný sloupec TSK při průtoku 40 minut. Pak byly za sebe zařazeny dva sloupce, aby bylo možno dosáhnout dokonalejšího oddělení antigenu hepatitidy A a nečistot.

Pokusy byly zpočátku prováděny ve zkumavkách s objemem 15 ml s náplní 2 až 6 ml a vzorky byly promíchány ručním protřepáním nebo magnetickým míchadlem. Po získání výsledků z prvních vzorků byly míšeny vzorky s větším objemem ve zkumavkách s objemem 50 ml, s náplní 24 ml na mechanickém třepacím zařízení. Byly také odebírány vzorky z lahví s objemem 500 ml v průběhu zpracování materiálu. Lahve byly protřepávány po krátkou dobu, například 20 sekund a pak byly fáze odděleny usazováním přibližně 1 minutu, načež byl z horní fáze odebrán vzorek s objemem 600 mikrolitrů. Pak byla láhev znovu vrácena do třepacího zařízení na další časový úsek, načež byl znovu odebrán vzorek. Tyto vzorky pak byly odstředěny 2 minuty v mikroodstředivce při maximální rychlosti.

Výsledky

1. Doba míšení

Podle předběžných pokusů, prováděných v malém měřítku ve zkumavkách s objemem 15 ml je zřejmé, že doba míšení je důležitá proměnná veličina, přičemž při delší době míšení je možno lépe odstranit nečistoty. Z obr. 6 je zřejmé, že se poměr viru hepatitidy A k nečistotám zvyšuje s prodloužením doby míšení. Mimoto je z obr. 20 zřejmé, že vrchol pro nečistoty se statisticky významně snižuje s dobou míšení.

Při použití zkumavek s objemem 50 ml bylo rovněž možno prokázat, že doba míšení je důležitá, k nejdokonalejšímu odstranění nečistot bylo nutno prodloužit míšení na 3 minuty, jak je zřejmé zobr. 20. V tomto případě byla pro lepší rozdělení analýza prováděna na za sebou zařazených sloupcích, přičemž bylo možno pozorovat jen malý pokles plochy pro virus hepatitidy A.

Doba míšení byla rovněž sledována v případě produkčních lahví s objemem 500 ml. Vzorky byly odebírány každých 20 sekund v průběhu celkové doby míšení 2 minuty. Tento pokus byl prováděn při použití dvou různých poměrů rozpouštědel, 2 : 1 a 3 : 1, což také odpovídá dvěma různým objemům vodného prostředí v lahvích, přibližně 60 ml a 90 ml, celkový objem zůstává stálý, 180 ml. Na obr. 21 je znázorněno, že se množství nečistot snižuje s délkou míšení, přičemž k úplnému odstranění nečistot dochází po době 1 minuta a 40 skund. Doba, která byla užita k míšení produkčních kultur, byla 2 minuty, aby bylo skutečně možno nečistoty odstranit. Je však možno ji prodloužit až na 3 minuty. Rozdíl v objemech a poměrech rozpouštědel měl v použitém rozmezí jen malý vliv.

Tento pokus byl ještě opakován při delší době míšení pro zkumavky s objemem 50 ml a 15 ml. Na obr. 22 je znázorněno, že stejné čistoty bylo dosaženo ve všech zkumavkách, avšak v malých zkumavkách je zapotřebí doby míšení 6 až 8 minut, kdežto pro lahve s objemem 500 ml stačí doba 2 minuty. Tyto rozdíly budou dále probrány v obdstavci 3. Aby bylo možno stanovit, zda doba míšení může ovlivnit virus, byla zkumavka s objemem 50 ml protřepávána 1 hodinu na mechanickém třepacím zařízení. Při vysokotlaké analýze na gelu nebyl prokázán další pokles velikosti plochy pro virus a výsledky EIA, uvedené v tabulce 1 prokazují, že antigenita je stejná po jedné hodině i po 2 minutách míchání. Výsledky, získané pro zpracování EIA v různých stupních postupu pro tutéž šarži jsou obdobné. Aby bylo možno dosáhnout úplného odstranění nečistot, je možno minimální doby míšení prodloužit bez snížení výtěžku viru.

Tabulka 1

Vliv delšího míšení na virus hepatitidy A podle výsledků HPSEC a EIA pro zkumavky s objemem 50 ml doba míšení poměr HAV/nečistoty EIA jednotky/ml

2	minuty	0,74	23	800
1	hodina	nečistotu nelze	24	500
		prokázat
2	minuty, lahve
s	objemem 500 ml	8,6	20	000±16

2. Objemové poměry

Poměry objemu rozpouštědla k vodné fázi byly 1,5 pro hlavní šarže, míchané v jediné lahvi magnetickým míchadlem a v rozmezí 2 a 3 pro demonstrační šarže, které byly protřepávány v lahvích s objemem 500 ml. Byl sledován vliv poměru objemů v rozmezí 0,5 a 3 na čistotu produktu. Počáteční pokusy v malém měřítku ve zkumavkách s objemem 15 ml při době míšení 1 minuta byly provedeny při použití čtyř různých produkčních šarží a výchozí sraženiny po působení PEG. Z obr. 23 je zřejmé, že nebylo možno pozorovat žádnou zřejmou korelaci mezi poměrem rozpouštědla k vodné fázi a odstraněním nečistot. Rozptyl údajů je patrně způsoben variabilitou výchozích materiálů a nerovnoměrností protřepávání. Vzorek byl zvětšen na velikost ze zkumavek s objemem 50 ml a bylo použito mechanického protřepávání po dobu 2 minuty. Zkumavky byly přitom poněkud skloněny směrem k horizontální poloze. Výsledky jsou znázorněny na obr. 24. I v tomto případě, přestože existuje určitý rozptyl v údajích, není možno pozorovat žádný jasný trend pro poměr rozpouštědla k vodné fázi. Tyto výsledky byly potvrzeny při použití lahví s objemem 500 ml a poměru rozpouštědla k vodné fázi 2 : 1 a 3 : 1, jak je zřejmé z obr. 21, je možno prokázat pouze velmi malé rozdíly v odstranění nečistot. Je tedy zřejmé, že v tomto případě neběží o důležitou proměnnou veličinu a zvýšení poměru rozpouštědla tedy nepřispívá ke zvýšenému odstranění nečistot.

3. Způsob míšení a velikost nádob

V případě malých zkumavek s objemem 15 ml nebylo možno pozorovat žádné rozdíly při použití ručního protřepávání a magnetického míchání, patrně také vzhledem k tomu, že je možno pozorovat velký rozptyl výsledků pro různé produkční šarže, jak je zřejmé z obr. 23. Jediný údaj na obr. 19 rovněž prokazuje dobrý soulad mezi výsledky při použití ručního protřepávání a magnetického míchadla. Také ve větších zkumavkách byly tyto dva typy protřepávání srovnávány. Na obr.

je možno pozorovat, že při ručním protřepávání je možno dosáhnout téměř stejných výsledků jako při mechanickém míchání při stejné náplni zkumavek. V tabulce 2 jsou shrnuty výsledky pokusu pro lahve s objemem 500 ml. Bylo užito šest lahví, z nichž jedna byla protřepávána ručně a ostatní mechanickým způsobem. Vzorky byly odebrány pro oba typy míchání a analýzou HPLC byly získány obdobné výsledky, v obou případech byla čistota velmi vysoká, což potvrzuje, že typ protřepávání není důležitý, avšak rozměr nádob je velmi důležitý, protože výsledky pro lahve s objemem 500 ml jsou daleko přízni78 vější než výsledky pro zkumavky s objemem 50 ml při použití téhož třepacího zařízení. Tytéž výsledky vyplývají z údajů, znázorněných na obr. 22.

Tabulka 2

Vliv různých typů míšení na poměr viru a nečistot při míchání, trvajícím 2 minuty typ míchání poměr virus/nečistota mechanické třepání 2,47 ruční třepání 2,69

Byl sledován také vliv velikosti náplně zkumavek. V případě, že bylo do zkumavek s objemem 50 ml uloženo 10,5 ml náplně, byly získány přibližně stejné výsledky jako při použití obvyklých 21 ml náplně. Obdobně lahve s objemem 500 ml s náplní 240 nebo 275 ml obsahovaly ekvivalentní množství nečistot, jak je zřejmé z obr. 21. V průběhu všech pokusů s míšením byly zkumavky s objemem 15 ml plněny do 0,13 nebo do 0,4 plné kapacity. V případě zkumavek s objemem 50 ml byla většina plněna do 0,53, v jednom pokusu do 0,26 plné kapacity a při použití lahví s objemem 500 ml byly lahve plněny do 0,48 nebo 0,57 plné kapacity. Vzhledem k tomu, že pro všechny tři typy nádob byla použita obdobná náplň a výsledky nemohly být uvedeny do korelace s úrovní náplně, není tento faktor pravděpodobně příliš důležitý. Avšak v případě, že by zkumavky byly zcela naplněny a v jejich horní části by nezůstal volný prostor, bylo by obtížné obsah promísit, čímž by došlo ke snížené účinnosti při odstranění nečistot.

Další faktor, který byl sledován, byl poměr šířky k výšce zkumavky. Tento poměr byl 0,13 pro zkumavky s objemem 15 ml, 0,25 pro zkumavky s objemem 50 ml a 0,58 pro lahve s objemem 500 ml. Je možné, že větší poměr šířky k výšce usnadní míšení vzhledem k tomu, že vznikají větší plochy na rozhraní obou fází.

Byly také sledovány údaje z dřívějších šarží se stejnými nečistotami, přítomnými po usazení sraženiny po působení PEG. Čtyři šarže byly extrahovány 1 minutu v rozpouštědle vždy v jedné lahvi, opatřené magnetickým míchadlem. Pak byl roztok rozdělen pro oddělení fází odstředěním. Poměr rozpouštědla k vodné fázi byl 1,5. Výsledné poměry viru k nečistotám byly v rozmezí 0,48 až 2,7. Další šarže byla protřepávána 1 minutu v lahvi pro odstředivky s objemem 250 ml s konickým dnem při použití poměru rozpouštědla k vodnému prostředí 1,0. Výsledný poměr viru k nečistotě byl 0,87. Všechny tyto výsledky jsou srovnatelné s výsledky, získanými ve zkumavkách s objemem 15 nebo 50 ml za obdobných podmínek, avšak získané hodnoty jsou daleko nižší než typické rozmezí 4 až 21 (pro osm vzorků), tak jak byly získány v demonstračních šaržích. To je v souladu s delší dobou míšení a s použitím větších nádob pro toto míšení při výrobě viru ve velkém měřítku.

Závěry

Je možno uzavřít, že rozdíly v čistotě mezi demnstračními šaržemi a dřívějšími šaržemi jsou způsobeny tím, že při produkci ve větším měřítku byl materiál protřepáván ve větších lahvích s objemem 500 ml a po delší dobu 2 minuty ve srovnání s 1 minutou v dřívějších šaržích. Vliv objemu je patrně způsoben větší plochou na rozhraní obou fází při protřepávání ve větších lahvích. Lahve s objemem 500 ml byly obvykle plněny objemem nižším než 300 ml, takže vznikl v horní části velký prostor, který napomáhal dobrému promíchání rozpouštědla, vodné fáze a vzduchu. Je pravděpodobné, že při snížení této plochy styku jednotlivých fází může dojít ke snížení čistoty, tak jak je to možno pozorovat v malých zkumavkách. Avšak vzhledem k tomu, že doba míšení je také důležitá, je možno dosáhnout ve zkumavkách s objemem 50 ml přibližně stejné čistoty jako v lahvích s objemem 500 ml.

Další proměnné veličiny, které byly sledovány, to znamená poměr rozpouštědla k vodné fázi a typ protřepávání nejsou patrně pro konečný výsledek důležité.

Příklad 16

Rozpustnost viru hepatitidy A

Jak již bylo svrchu popsáno, byla analýzou HPSEC v produkčních šaržích prokázána značná ztráta viru hepatitidy A.

V průběhu čištění bylo uvedeným způsobem stanoveno, že více než 50 % viru bylo ztraceno přes noc po chromatografií na iontoměniči a před čištěním chromatografií na gelu. Později bylo prokázáno, že tato ztráta souvisela se vznikem sraženiny, která byla odstraněna odstředěním.

Předpokládalo se, že ve sraženině je virus hepatitidy A a že sraženina vzniká vyšší iontovou silou pufru, který byl použit k eluci viru ze sloupce iontoměniče. Byly proto prováděny pokusy rozpustit sraženinu ve vodném roztoku chloridu sodného a fosforečnanu sodného. V závislosti na ztrátě viru při použití kvantitativního stanovení pomocí HPSEC byla předpokládána koncentrace ve sraženině několik mg/ml. Podíly sraženiny byly smíseny buď s 6 mM fosforečnanem sodným nebo 0,15N chloridu sodného v 6 mM fosforečnanu sodného nebo 0,3 N chloridu sodného v 6 mM fosforečnanu sodného nebo 0,5 N chloridu sodného v 6 mM fosforečnanu sodného nebo v 1 N roztoku chloridu sodného v 6 mM fosforečnanu sodného.

Při promísení s malým množstvím 6 mM fosforečnanu sodného došlo k rozpuštění sraženiny v průběhu několika sekund. Avšak při smísení s roztoky s obsahem chloridu sodného nedošlo k žádnému velkému rozdílu ve vzhledu až na zřetelné zředění. Byl připraven zásobní roztok viru hepatitidy A rozpuštěním 0,35 ml suspenze sraženiny v 5,65 ml 6 mM fosforečnanu sodného. Již po přidání 0,5 ml tohoto roztoku bylo možno pozorovat úplné rozpuštění viditelných částic sraženiny. Vzorky zásobního roztoku byly smíseny s různým množstvím 1 N chloridu sodného v 6 mM fosforečnanu sodného za vzniku konečné koncentrace 0,15 N, 0,3 N nebo 0,5 N chloridu sodného, tak jak je zřejmé z tabulky 16-1

Tabulka 16-1

objem ního	zásob- roztoku	objem IN chloridu sodného ve fosforečnanu sodném	ředění antigenů	molarita sodného
1,5		0,27	1,2	0,15
1,5		0,65	1,43	0,30
1		1	2	0,50

Koncentrace těchto roztoků pak byly stanoveny kvantitativně při použití HPSEC a pak ještě po dvou týdnech znovu při použití HPSEC. Získané údaje jsou uvedeny v tabulce 16-11 a graficky znázorněny na obr. 27 a 28.

Na obr. 27 je znázorněna počáteční koncentrace viru hepatitidy A, měřená v roztoku přibližně jeden den po přidání soli. Bylo prokázáno, že zásobní roztok měl koncentraci přibližně 100 mikrogramů/ml při stanovení HPSEC, což by odpovídalo přibližně 2 mg/ml ve sraženině a množství viru hepatitidy A ve sraženině by pak zhruba odpovídalo ztrátě, odpovídající zjištěnému úbytku v průběhu výroby. Vzhledem k tomu, že bylo pozorováno, že se sraženina rozpustí již po přidání malého množství roztoku fosforečnanu, byla rozpustnost v roztocích s malým množstvím chloridu sodného stanovena jako přibližně 1 mg/ml nebo vyšší. Koncentrace antigenu v roztocích s obsahem větších množství chloridu sodného byla daleko nižší než při ředění zásobního roztoku fyziologickým roztokem chloridu sodného. Mimoto analýza HPSEC prokázala, že vysrážený materiál je ve větším množství možno pozorovat právě v roztocích s obsahem většího množství chloridu sodného, jak je také zřejmé z následující tabulky 16-11.

Tabulka 16-11

Množství viru hepatitidy A při stanovení HPSEC, den 1 koncentrace chloridu sodného	v roztocích chloridu sodného
antigen jako monomer	agregát/monome: (poměr ploch)
0 (zásobní roztok)	106 /Ug/ml	0
0,15 N	65 - -	0,05
0,30 N	11 --	0,52
0,50 N	6,6 - -	0,52

Z údajů v tabulce je zřejmé, že se antigen viru hepatitidy A shlukuje a pak sráží v roztoku již při koncentraci pod 50 mikrogramů/ml chloridu sodného. Z obr. 27 je také zřejmé, že přibližné složení produktu, vymývaného ze sloupce iontoměniče a přestavovaného body IEP klesá s obsahem chloridu sodného. Toto množství je významně vyšší než množství antigenů, které je v roztoku možno udržet v průběhu jednoho dne, takže bez podstatné změny postupu pro čištění antigenů je zapotřebí jej okamžitě po výstupu ze sloupce iontoměniče zředit. Aby bylo možno ředit co jeméně a tím co nejvíce šnížit objem, který bude nutno v dalším stupni nanést na preparativní chromatografický sloupec s náplní gelu, mělo by být v ředění použito 6 mM roztoku fosforečnanu sodného tak, aby bylo možno udržet pH a současně snížit iontovou sílu a koncentraci antigenů. Při ředění 1 : 1 bylo prokázáno, že se koncentrace antigenů sníží na koncentraci, která se nachází pod křivkou z obr. 27, jde o hodnotu IEP , přibližně 25 mikrogramů/ml při koncentraci chloridu sodného 150 mM ve fosfátu. Na základě těchto zjištění byl způsob čištění doplněn uvedeným zředěním roztoku.

Na obr. 28 je znázorněna koncentrace, která byla v uvedených roztocích naměřena ve dni 1 a ve dni 14. Je zřejmé, že v průběhu této doby koncentrace antigenů poklesla a že tedy při ředění 1 : 1 přece jen nedochází k dostatečnému zředění antigenů, nýbrž dochází pouze ke stabilizaci roztoku viru a ke zpomalení shlukování antigenů a jeho srážení. Je možné, že další optimalizace ředění bude mít za následek ještě další zvý šení výtěžku výsledného produktu.

Konečně, aby bylo možno prokázat, že zásobní roztok obsahuje virus hepatitidy A bez většího množství dalších materiálů, které by se mohly společně vymývat ze sloupce HPSEC, byl zásobní roztok analyzován elektroforézou na SDS-PAGE při barvení stříbrem. V případě, že byly výsledky srovnávány s výsledky z HPSEC, bylo možno prokázat totožné pásy pro množství a typ bílkoviny.

Příklad 17

Vysokotlaká chromatografie na sloupci gelu pro sledování čištěných vzorků antigenů viru hepatitidy A

Úvod

Byl vyvinut postup pro stanoveni vlastností antigenů a pro sledování průběhu čištění viru hepatitidy A. Byla užita vysokotlaká chromatografie na gelu, HPSEC, při detekci ultrafialovým světlem při 214 a 260 nm, tento postup dovoluje průkaz relativních množství viru hepatitidy A a klíčových nečistot, to znamená shluků, adičních produktů nukleové kyseliny a viru hepatitidy A a nečistot s molekulovou hmotností 660 000 v jednotlivých vzorcích. Mimoto je tímto způsobem možno kvantitativně stanovit koncentraci viru ve vzorcích, což se provádí alespoň v posledních třech stupních, to znamená po extrakci, po výstupu z iontoměniče a při konečné preparativní HPSEC.·

Tato zkouška se užívá také- ke stanovení účinnosti použitého enzymu benzonázy a k průkězu typu nečistot v každém stupni zpracování ve srovnání s referenčními vzorky.

Vzorky viru hepatitidy A z deseti šarží byly zkoumány pomocí HPSEC tak, aby bylo možno sledovat postup ve všech stupních čištění. Údaje, získané tímto způsobem a následující analýzy na stálost produktu poskytují dostatečnou informaci pro vyhodnocení celého postupu a jasně ukazují, že postup je vhodný k výrobě viru.

Dále jsou shrnuty údaje, získané pomocí HPSEC a celkové vyhodnocení i výsledky analýzy pro deset sledovaných šarží.

Celá zpráva, týkající se použitého přístroje, provedení postupu a výsledků je rozdělena do následujících sekcí:

Sekce I: Použité zařízení a podmínky pro chromatografií, popis sloupce pro HPSEC a zařízení pro HPLC a podmínky při provádění těchto postupů.

Sekce II: Zkušební a kalibrační postupy, způsob přípravy kalibračních standardů a provedení zkoušek.

Sekce III: Linearita, přesnost a reprodukovatelnost zkoušek, statistické vyhodnocení.

Sekce IV: Analýza výsledků. Je znázorněna skupina chromatogramů pro jednu šarži a jsou popsány získané údaje pro každý vzorek.

Sekce V: Podmínky uchovávání vzorků. Tyto zkoušky byly prováděny pro každý typ zpracování ke stanovené stálosti při teplotě 4 až 6 °C.

Sekce VI: Srovnání výsledků s EIA a HPSEC.

Sekce VII: Reprodukovatelnost získaných výsledků.

Příloha A: Souhrn výsledků pomocí analýzy HPSEC pro vzorky, odebrané z deseti šarží.

Sekce I: Použité zařízení a podmínky pro chromatografií

Materiály a reakční činidla

Byl užit roztok CM 80 (MMD), jde o roztok s obsahem mM fosforečnanu sodného a 120 mM chloridu sodného, pH 7,2.

Zařízení (S výjimkou sloupce je možno použít i jiného zařízení)

HPLC systém: Čerpadlo RAININ Rabbit, opatřené promývací hlavou s obsahem 10 ml roztoku soli.

Automatické odebírání vzorků: Zařízení RAININ AI-1 s recirkulačním chladičem k udržení vzorku na 2 až 6 °C.

Detektor: Dvoukanálový UV-detektor RAININ UV-M.

Systém pro odebírání údajů: Dynamax HPLC Method Manager, verse 1.1 s použitím Apple Macintosh SE.

Sloupec: TosoHaas TSK PW4000 x 1, 7,8 x 300 mm L.

Mikronádobky pro HPLC: Sklo nebo polypropylen.

Podmínky chromatografie

Sloupec: TosoHaas TSK PW4000 x 1, 7,8 x 300 mm L.

Mobilní fáze: CM 80 (6 mM fosforečnanu sodného a 120 mM chloridu sodného, pH 7,2).

Rychlost průtoku: 0,32 ml/min

Detekce: ultrafialové světlo 214 a 260 mm, výstup z detektoru IV.

Vstřikovaný objem: 60 mikrolitrů.

Doba mezi dvěma vstřiky vzorků: 55 minut.

Sloupec TSK PW4000 x 1

Použitým sloupcem byl sloupec TSK PW4000 x 1, obsahující podložku s tlouštkou 5 mikrometrů na bázi methakrylátu. Dále bude uvedena kalibrační křivka, připravená při použití polyethyloxidového standardu PEO. Přerušované čáry znázorňují dobu retence pro tři zkoumané roztoky, a to pro roztok se shluky antigenů hepatitidy A, pro roztok antigenů hepatitidy A a pro roztok nečistoty s molekulovou hmotností 660 000. Stejným způsobem jsou znázorněny doby retence pro dvě hydrofobní sloučeniny s nízkou molekulovou hmotností, vytamin B12 a aceton.

Obě sloučeniny se nacházejí vpravo od kalibrační vsuvky, doby retence těchto látek prokazují hydrofobní povahu polymerního nosiče. Zadržené vrcholy je možno pozorovat v několika vzorcích, jak je zřejmé z obr. 29. Tyto látky se obvykle vymývají v blízkosti vrcholů pro sůl a jde patrně o sloučeniny s nízkou molekulovou hmotností.'

Sekce II Zkušební a kalibrační postupy

Příprava kalibračních standardů

Byla užita kalibrační křivky, připravená ze šesti úrovní kkoncentrací pro kvantitativní stanovení viru hepatitidy A. Kalibrační standardy byly připraveny ředěním čištěného viru hepatitidy A. Jako standard byl užit produkt čištěný pomocí SEC s koncentrací 12 mikrogramů/ml. Bylo připraveno šest standardních roztoků pro kalibraci v koncentračním rozmezí 0,75 až 12 mikrogramů/ml, koncentrovaný produkt byl ředěn roztokem CM80 podle následující tabulky:

kalibrační standard	koncentrace Hep A (yug/ml)	mikroli Hep A	Ítry	antigenu	mikrol CM80
1	12	250/Ul	9854	SECProd	0
2	9	180/Ul	9854	SECProd	60
3	6	250/Ul	9854	SECProd	250
4	3	250/Ul	kal.	stan. 3	250
5	1,5	250/Ul	kal.	stan. 4	250
6	0,75	250/Ul	kal.	stan. 5	250

Standardy se připravují přidáním roztoku viru hepatitidy A a roztoku CM80 přímo do mikronádobek pro HPLC. Kalibrační křivka se připraví vynesením plochy pro log viru hepatitidy A proti log koncentrace. Typická kalibrační křivka je znázorněna na obr. 30.

Transformace údajů z log-log kalibrační křivky se provádí ke snížení závislosti kalibrační křivky na vysoké končen traci standardu, užitého ke kalibraci. Pro chromatografii bio logických makromolekul se rozptyl údajů poněkud zvyšuje při zvyšování koncentrace. Při kalibraci HPLC se tedy strmost čáry pro regresi primárně stanovuje při nejvyšší koncentraci standardu, která je také nejvariabilnější.

Grafy pro 13 kalibračních křivek pro virus, připravený svrchu uvedeným způsobem v průběhu dvou měsíců jsou znázorněny na obr. 31. Na levé straně je lineární graf, na pravé stra ně transformace log-log pro tytéž křivky. Lineární graf má vyjádřený rozptyl křivek, vycházející v podstatě ze společného počátku, což jasně prokazuje zvýšenou variabilitu ploch pro virus při stoupající koncentraci. Výsledkem je variace ve strmosti různých křivek.

V případě transformace log-log pro tyto kalibrační křivky zůstává rozptyl RSD stálý v průběhu celého rozmezí koncentrace. Tato skutečnost se projeví sníženými rozdíly mezi strmostí křivek, jak je zřejmé z obr. 31B.

Příprava vzorku

A. Vzorku viru hepatitidy A

Byly analyzovány vzorky, které byly odebrány v následujících stupních postupu:

1. zfiltrovaný materiál po rozrušení buněk

2. zfiltrovaný materiál po působení nukleázy

3. sraženina po působení PEG, znovu uvedená do suspenze

4. vodná fáze po extrakci chloroformem

5. produkt po průchodu aniontoměničem

6. produkt po průchodu sloupcem gelu.

Materiál po rozrušení buněk a filtraci, zfiltrovaný ma teriál po působení nukleázy a vzorek po průchodu sloupcem gelu není nutno před analýzou ředit. Vzorek po srážení PEG, znovu uvedený do suspenze by měl být odstředěn 5 minut při 10 000 g, aby byly odstraněny zbývající částice. Vzorek se také ředí před analýzou roztokem CM 80 v objemovém poměru 1:4 Vodné, fáze po extrakci chloroformem a produkt ze sloupce aniontoměniče se analyzují neředěné a pak po ředění v poměru : 1 roztokem CM80 tak, aby koncentrace odpovídala rozmezí v kalibrační křivce. Pro všechny vzorky se analýza provádí třikrát a vypočítá se průměr ze tří stanovení. Vzorky se ulo ží před vstřiknutím do automatického zařízení s teplotou až 6 °C.

Triton se jen slabě zadržuje ve sloupci TSK PW4Q00 χ 1 a k jeho odstranění je zapotřebí dalšího stupně. Z tohoto důvodu mají být vzorky s obsahem Tritonu, to znamená filtrát po rozrušení buněk a filtrát po zpracování nukleázou sledovány srovnáním s roztokem CM80, aby bylo možno prokázat odstranění smáčedla před vstříknutím dalšího vzorku. Vzorky je možno analyzovat v obráceném pořadí tak, že jako první se analyzuje produkt SEC, aby nedošlo ke vzniku interferenčních vrcholů v důsledku pozdní eluce.

Provedení zkoušky

1. Vstřikne se 50 mikrolitrů každého ze šesti kalibračních standardů. Doba retence pro virus by měla být 19,0 ± minuta.

2. Vzorky se připravují jako svrchu. Vstřikuje se vždy

5o mikrolitrů, každý vzorek se analyzuje třikrát.

Sekce III: Linearita, přesnost a reprodukovatelnost zkoušek

Ve 13 různých dnech bylo připraveno 13 kalibračních křivek v koncentračním rozmezí 0,75 až 12,0 mikrogramů/ml, analýzy byly prováděny v rozmezí pěti týdnů. K výpočtu koncentrace pro každý kalibrační standard z každé křivky byla použita rovnice pro regresi. Výsledky, které byly ze 13 křivek vypočítány ve srovnání s nominální koncentrací pro uvedených 6 kalibračních standardů, jsou shrnuty v tabulce 17-1.

Tabulka 17-1

Srovnání naměřených a nominálních koncentrací čistého viru při použití rovnice pro regresi kalibrační nominální koncentrace kalibračních standardů křivka (mm/dd) viru hepatitidy A v mikrogramech/ml

	12	9	6	3	1,5	0,75
č. 1 10/6	11,91	8,93	6, o3	3,03	1,54	0,73
č. 2 10/7	11,88	8,88	7,00	3,04	1,52	0,74
č. 3 10/8	12,26	8,81	5,95	3,00	1,49	0,76
č. 4 10/10	11,87	9,04	6,00	3,04	1,45	0,76
č. 5 10/13	11,89	8,97	6,06	3,02	1,52	0,74
č. 6 10/14	11,75	9,08	6,07	3,06	1,47	0,75
č. 7 10/20	11,94	8,98	5,96	2,98	1,60	0,72
č. 8 10/21	11,99	8,95	5,99	3,01	1,53	0,74
č. 9 10/22	11,98	8,94	5,90	2,97	1,45	0,70
č. 10 10/26	12,08	-	6,00	2,98	1,48	0,76
č. 11 10/28	12,01	9,05	6,00	2,95	1,51	0,75
č. 12 11/18	11,48	9,23	6,14	3,00	1,52	0,73
č. 13 12/3	11,88	8,90	5,10	3,04	1,50	0,74
p růmě r	11,92	8,98	6,02	3,01	1,51	0,74
stand.odchylka	0,17	0,10	0,06	0,03	0,04	0,02
RSD	0,01	0,01	0,01	0,01	0,03	0,03

Je zřejmé, že reprodukovatelnost je velmi dobrá pro všech šest koncentrací, hodnoty RSD jsou méně než 3 % celého koncentračního rozmezí. Přesnost je rovněž velmi dobrá, pro všechy sledované koncentrace standardu se naměřené koncentrace pohybovaly v rozmezí 5 %, vztaženo na nominální koncentrace .

v následujitřikrát.

Analýza vrcholu

Aby bylo možno dále určit specifičnost a přesnost analýzy HPSEC, byla provedena analýza vrcholů.

Produkt po průchodu aniontoměničem a vodná fáze po extrakci chloroformem byly analyzovány spolu se stejným objemem produktu SEC z téže šarže. Výsledky jsou uvedeny cí tabulce 17-2. Všechny vzorky byly analyzovány

Tabulka 17-2

Izolace viru hepatitidy A ve vrcholech vzorek naměřená teoretická koncentrace koncentrace /Ug/ml /Ug/ml izolace ve vrcholu % vodný roztok po extrakci chloroformem 7,27 vzorek z aniontoměniče 8,87 produkt z SEC 5,40 analýza vrcholu extrakt po chloroformu k SEC 1:1 6,40 vzorek z aniontoměniče k SEC 1:1 7,18

6,33

7,14

101

101

Z výsledků v tabulce je zřejmé, že došlo k úplné izolaci produktu ve vrcholech, což prokazuje přesnost a specifičnost stanovení pomocí HPSEC.

Sekce IV. Analýza výsledků

Shrnutí

Chromatogramy typu HPSEC poskytují dobrou informaci o způsobu čištění viru hepatitidy A. Stanovením ve filtrátu po rozrušení buněk a po působení nukleázy je možno získat informaci o účinnosti benzonázy. Pro tyto vzorky byly chromatogramy analyzovány a srovnávány při 214 i 260 nm.

Při srovnávání vzorků ze čtyř posledních stupňů, to znamená po opětném uvedení sraženiny po působení PEG do suspenze, po extrakci vodné fáze chloroformem, po průchodu aniontoměničem a po chromatografií na gelu je možno sledovat odstranění dvou hlavních nečistot, a to shluků materiálu a kontaminující bílkoviny s molekulovou hmotností 660 000. Při výpočtu procentuálního množství viru v těchto vzorcích je možno prokázat odstranění těchto nečistot. V konečném stupni se užije HPSEC k vypočítání koncentrace viru v posledních třech stupních celého postupu.

Pomocí metody HPSEC bylo sledováno celkem deset šarží viru, zpracovaného v MMD, analyzovány byly filtráty po rozrušení buněk, po působení nukleázy, materiál po srážení PEG a znovu uvedení do suspenze, vodná fáze po extrakci chloroformem, produkt po průchodu aniontoměničem a produkt po SEC. Chromatografie pro všechny tyto vzorky z deseti šarží byla dobře reprodukovatelná.

V této sekci jsou rozebrány chromatogramy pro každý ze šesti vzorků a je podrobně popsána informace, získaná pro každý vzorek jako typický výsledek zkoušky, prováděné vždy s trojnásobným opakováním.

Filtrát po rozrušení kultury a pak po působéní nukleázy

Chromatogramy vzorků v obou uvedených stupních byly sledovány při 214 a 260 nm. Pro každý z těchto vzorků je profil, získaný při 214 nm zcela odlišný od profilu, získaného při 260 nm. Srovnávací analýza těchto chromatogramů odráží význam zkoušky HPSEC pro tyto vzorky, cílem je nalézt kvantifikovatelný rozdíl, který by byl průkazem úplnosti rozštěpení působením benzonázy. Z tohoto důvodu jsou v této sekci srovnávány profily při chromatografií filtrátu po rozrušení buněk a filtrátu, který pak byl zpracován nukleázou. Nejprve jsou uvedeny profily při 214 nm a pak totéž srovnání při 260 nm. Charakteristické údaje pro každý vzorek ukazují úplnost působení enzymu benzonázy.

Údaje pro oba stupně při 214 nm

Chromatogramy pro filtrát po rozrušení buněk a pro tentýž filtrát po působení nukleázy jsou uvedeny na obr. 32.

Při 214 nm vykazují oba vzorky řadu částečně oddělených vrcholů. Vzhledem k nízké míře rozdělení v těchto vzorcích je integrace jednotlivých vrcholů do oblasti viru nemožná. Jedinou informací, kterou je možno z těchto vzorků získat, je celková plocha pro všechny vrcholy při 214 nm. Výsledky trojí analýzy týchž vzorků jsou na obr. 32 rovněž uvedeny. Tato celková plocha při 214 nm nezahrnuje vrchol, který je zadržen po 36 minutách. Celková plocha po působení nukleázy je při 215 nm o 15 % nižší než v předchozím stupni v důsledku působení benzonázy. Vizuální srovnání obou chromatogramů na obr. 32 prokazuje ztrátu absorbance v oblasti viru hepatitidy A. Avšak definitivní měření rohoto štěpení je nemožné vzhledem k malému oddělení vrcholů. Celková plocha při 214 nm byla získána pro devět šarží, hodnoty jsou uvedeny v doplňku A. Tyto celkové plochy při 214 nm neposkytují žádnou přímou nebo specifickou informaci o výkonnosti postupu, je pouze možno sledovat stálost vzorků, takže výpočet plochy při 214 nm není zapotřebí běžně provádět.

A) Filtrát po rozrušení buněk filtrát celková plocha (UV) při 214 nm (/UV)

1	27	248	238
2	26	404	744
3	26	782	947

průměr	26 811	976
standardní
odchylka	344	966

B) Filtrát po působení nukleázy

1		22	728	263
2		22	841	564
3		22	784	419
	průměr	22	784	749

standardní odchylka 46 256

Údaje pro oba stupně při 260 nm

Chromatogramy filtrátu po rozrušení buněk a téhož filtrátu po zpracování nukleázou jsou při sledování při 260 nm znázorněny na obr. 33. Při této vlnové délce má filtrát po rozrušení buněk odlišnější profil s obsahem S.až 6 oddělených vrcholů. První kva vrcholy mají dobu retence 17,2 a 19,1 minuta a obsahují adiční produkt viru hepatitidy A a nukleové kyseliny a virus hepatitidy A. Vzhledem k tomu, že oba vrcholy obsahují určité množství nukleové kyseliny, dominují při analýze HPSEC při 260 nm.

Srovnání vzorků filtrátu po rozrušení buněk a téhož vzorku po působení nukleázy při 260 nm (obr. 33A a 33B) poskytuje jasnou informaci o účinnosti benzonázy. Hlavní vrcholy, které je možno pozorovat ve filtrátu po rozrušení buněk jsou zcela odstraněny pó působení benzonázy. Na obr. 33B není možno pozorovat žádné odlišitelné vrcholy po 17 až 19 minutách eluce sloupce.

Potvrzení účinku benzonázy

Analýza filtrátu po rozrušení buněk a téhož filtrátu po působení nukleázy je pro devět šarží shrnuta v tabulce 17-3. Oblast v ultrafialovém světle při 260 nm pro vrcholy po 17 a 19 minutách pro tyto vzorky ukazuje, že po přidání benzonázy dojde k úplnému vymizení těchto vrcholů ve všech analyzovaných šaržích. To znamená, že pro tyto vzorky je možno tuto zkoušku doporučit k potvrzení účinku benzonázy, který se projeví snížením vrcholu při 260 nm po působení nukleázy na méně než 10 % ve srovnání s filtrátem po roztušení buněk.

Tabulka 17-3

Snížení plochy při 260 nm (UV) působením benzonázy pro devět šarží

šarže	filtrát po rozrušení	filtrát	po působení	zbytek
č.	(A), plocha po 17 a	nukleázy	(Β), plocha	A260
	19 min, vrcholy 260nm	po 17 a	19 min.	B/AxlOO
		vrcholy	260 nm
984	1 240 987	0		0
985	947 988	0		0
1047	1 085 719	0		0
102	708 663	0		0
101	831 179	0		0
108	1 060 441	0		0
100	895 005	0		0
139	1 377 974	0		0
236	1, 281 608	0		0
průměr	1 018 495	0		0

stand.odchylka 205 034

Obr. 33(A)

Filtrát po rozrušení buněk filtrát plocha vrcholů po 17 a 19 min., UV při 260 nm

1		1	192	597		3	193	055
2		1	259	216		3	034	891
3		1	271	147		3	094	820
	průměr	1	240	987	průměr	3	107	589
	stand. odchylka		34	562	stand. odchylka		65	198

Obr. 33(B) Filtrát po působení nukleázy

Filtrát plocha vrcholů po 17 a 19 min., UV při 260 nm

0

0

0 průměr a stand.odchylka 0

Vzorek po resuspenzi usazeniny po působení PEG

Na obr. 34 je znázorněn chromatogram vzorku po opětném uvedení usazeniny po působení PEG do suspenze, analýza byla prováděna při 214 nm. Charakteristický profil tohoto vzorku je tvořen několika částečně od sebe oddělenými vrcholy.' Jde o vrcholy pro shluky produktů, pro virus, pro nečistotu s molekulovou hmotností 660 000, další nečistoty s nízkou molekulovou hmotností a vrchol pro sůl.

100

Pro tento vzorek byla vypočítána plocha pro virus v procentech jako plocha pro vrchol viru/celková plocha pro vrcholy x 100, celková plocha nezahrnuje vrchol pro sůl. Výsledky pro trojnásobně provedenou analýzu vzorku s resuspendovanou usazeninou po působení PEG jsou shrnuty v následující tabulce: . , resuspendované usazenina Hep A, % celkové plochy

25,9

27,0

27,4 průměr 26,8 stand.odchylka 0,7

Typický profil pro tento vzorek vykazuje jako hlavní složku nečistotu s molekulovou hmotností 660 000, nejvariabilnější složka tohoto vzorku je množství shluků produktu. Množství shluků v typickém vzorku je obvykle vyšší než v uvedeném vzorku. Výsledky analýzy HPSEC pro vzorky s resuspendovaným materiálem po působení PEG z 10 šarží jsou zná. zorněny v tabulce A2 v doplňku A. Plocha pro virus hepatitidy A v procentech se pohybuje v rozmezí 18,5 až 32,0 %, všechny vzorky měly dobrou čistotu.

Je zřejmé, že všechny údaje pro virus, které jsou vyšší než 18 %, jsou přijatelné, takže je možno čisticí postup považovat za uspokojivý.

101

Vzorek vodné fáze po extrakci chloroformu

Chromatogram vodné fáze po extrakci chloroformem je znázorněn na obr. 35. Vrchol pro virus je hlavním vrcholem v tomto vzorku s výjimkou vrcholu pro sůl a je dobře oddělen od nečistoty s molekulovou hmotností 660‘000 a od malého množství shluků.

Pro tento vzorek byla stanovena koncentrace viru hepatitidy A a plocha pro virus byla vypočítána v procentech.

Do této plochy není zahrnut vrchol pro sůl. Výsledky analýzy vodné fáze ve trojím provedení jsou shrnuty v následující tabulce vodný extrakt koncentrace viru plocha pro virus /Ug/ml %

1	28,64	61,0
2		29,76		62,8
2		30,65		61,2
	p růmě r	29,68	průměr	61,7
	standardní odchylka	0,82	standardní odchylka	0,8

Výsledky analýzy HPSEC pro vodnou fázi po extrakci chloroformem pro 10 šarží jsou uvedeny v tabulce A2 doplňku A. Hodnoty pro plochu viru v % se pro jednotlivé šarže pohybovaly v rozmezí 60,0 až 72,8 %. Výsledky pro poloviční šarže byly podstatně vyšší, hodnoty pro plochu v procentech byly 79,8 a 85,2 %. Koncentrace viru byla variabilnější, jednotlivé hodnoty byly 14,4 až 29,7 mikrogramů/ml. Variabilita koncentrací může

102 mít svůj vztah ke změně objemů při eluci vzorku a může záviset na době odběru vzorku v průběhu eluce.

V případě, že se srovnávají výsledky analýzy HPSEC pro usazenou sraženinu po působení PEG (obr. 34) a výsledky pro vodnou fázi po extrakci chloroformem (obr. .35), je zřejmé, že tento stupeň extrakce je velmi důležitý pro čištění viru.

V tomto stupni totiž dochází k selektivnímu odstranění velkého množství nečistoty s molekulovou hmotností 660 000 bez podstatnější ztráty viru. Přestože uvedenou nečistotu je také možno odstranit v následujících dvou chromatografických stupních, jde o hlavní nečistotu, při jejímž přetrvávání v přiváděných roztocích je zapotřebí použít odlišného provedení chromatografie při snížení výtěžku viru. Mimoto podrobné pokusy prokázaly, že účinnost extrakce velmi závisí na době míšení, jak již bylo uvedeno v příkladu 15. Hodnoty plochy pro virus v procentech ve vodné fázi po extrakci chloroformem jsou tedy kvantitativním ověřením úspěšnosti extrakce a dobrého odstranění uvedené nečistoty.

Pro vzorek vodné fáze po extrakci chloroformem se doporučují hodnoty plochy v procentech vyšší než 60 %. V případě, že se tyto hodnoty sníží pod 60 %, došlo patrně k poruchám, například v mísícím zařízení, zvláště v případě, že se takové hodnoty vyskytují pravidelně.

Produkt po průchodu aniontoměničem

Na obr. 36 je znázorněna analýza vzorku produktu po průchodu aniontoměničem. V tomto vzorku je hlavní složkou virus hepatitidy A, mimoto vzorek obsahuje malé množství shluků a nečistoty s molekulovou hmotností 660 000, mimoto je ještě přítomno určité množství nečistot s nízkou molekulovou hmotností.

103

V tomto vzorku byla stanovena koncentrace viru, plocha pro virus v procentech s výjimkou vrcholu pro sůl a zadržený vrchol. Výsledky pro trojí provedení analýzy na vzorku po průchodu aniontoměničem R x 2009854 jsou dále uvedeny.

vzorek koncentrace viru plocha pro virus /Ug/ml %

1	31,98	82,8
2		32,63		81,4
3		32,37		81,6
	průměr	32,32	průměr	81,9
	stand. odchylka	0,27	stand. odchylka	0,6

Výsledky analýzy HPSEC pro vzorek po průchodu aniontoměničem pro 10 šarží jsou uvedeny v tabulce A2 doplňku A. Hodnoty pro plochy v procentech se pohybovaly v rozmezí 78,6 až 87,4 %, hodnoty pro poloviční šarže byly vyšší než 90 %. Zvýšené hodnoty pro poloviční šarže neudivují vzhledem k tomu, že tyto šarže byly čistší.

Hodnoty pro koncentraci se pro oba typy šarží od sebe podstatně lišily, rozdíly tvořily více než dvojnásobek. Tyto rozdíly jsou stejně jako rozdíly v předchozím stupni pravděpodobně způsobeny rozdíly v odběru vzorků z těchto šarží.

Při způsobu čištění viru je chromatografie na iontoměniči v podstatě stupněm, který čištění ukončuje. V tomto stupni se odstraní ještě určitý podíl nečistoty s molekulovou hmotností 660 000 a některé nečistoty s nízkou molekulovou

104 hmotností, avšak čistota produktu po průchodu aniontoměničem v podstatě závisí na čisotě přiváděného produktu vzhledem k tomu, že v tomto stupni není možno odstranit velké množství nečistoty s molekulovou hmotností 660 000 bez snížení výtěžku viru. Znamená to, že v tomto stupni není možno vyrovnat chyby, k nimž došlo při zpracování v předchozích stupních. V typických případech se v průběhu chromatografie na iontoměniči zvýší plocha pod křivkou pro virus přibližně o 10 až 20 %, čím vyšší je čistota přiváděného materiálu, tím vyšší je také čistota výsledného produktu. Pro uvedený vzorek by měla být přípustná hodnota plochy pod křivkou pro virus vyšší než 75 % a zvýšení čistoty v tomto stupni by mělo být nejméně o 10 %. V případě splnění obou těchto požadavků bylo čištění v průběhu celého postupu i na aniontoměniči provedeno správně. V případě, že se nedosáhne hodnoty vyšší než 75 % pro plochu pod křivkou pro virus, může být chybné provedení ve chromatografií nebo v předchozích stuphích, avšak v případě, že zvýšení čistoty ve sloupci je nižší než 12 %, je pravděpodobně problém specifický pro čištění na aniontoměniči, může jít například o chybný odběr frakcí nebo o chybný průtok sloupcem.

Chromatografie produktu na gelu, SEC

Produktem z tohoto stupně je vysoce čištěný virus, jak je zřejmé z výsledků na obr. 37.

Ve vzorku byla stanovena koncentrace viru hepatitidy A. V následující tabulce jsou uvedeny výsledky analýzy produktu po průchodu gelem, vzorky byly analyzovány dvakrát.

105 vzorek koncentrace viru /Ug/ml

17,34

16,34 průměr

16,84 standardní odchylka

0,50

Výsledky analýzy HPSEC pro produkt po průchodu gelem pro 10 šarží jsou uvedeny v tabulce A2 doplňku A. Pro tyto vzorky nebyla vypočítána plocha pod křivkou v proventech.

Z obr. 37 je zřejmé, že šlo o vysoce čistý produkt, prostý zjistitelných množství shluků i nečistoty s molekulovou hmotností 660 000. Avšak analýza produktu po SEC v průběhu 60 minut prokázala přítomnost malého zadrženého vrcholu, materiál z tohoto vrcholu vychází ze sloupce přibližně po 49 minutách, jak je zřejmé z obr. 38. Rozměr tohoto vrcholu se mění u jednotlivých šarží, na obr. 38 je znázorněn výsledek při použití šarže, v níž bylo až dosud nalezeno nejvyšší množství této látky. Identifikace tohoto vrcholu by měla být uskutečněna před výpočtem plochy v procentech pro tento vzorek, aby bylo možno skutečně určit jeho čistotu. Pokud tato identifikace nebude provedena, budou hodnoty pro plochu pod křivkou pro tento vzorek zahrnovat pouze vrcholy v rozmezí doby retence 16 až 32 minut. S tímto omezením byla plocha pod křivkou pro všechny šarže, které byly až dosud sledovány přibližně 100 %.

Sekce V: Stálost vzorku

Při analýze pomocí HPSEC a EIA bylo možno prokázat, že získané vzorky jsou stálé až po dobu několika mšsíců. Malé ztráty bylo možno pozorovat při zpracování iontoměničem,

106 tyto ztráty však byly obvykle nižší než 10 % v průběhu dvou týdnů. Po tomto počátečním snížení však i tyto vzorky zůstávaly stálé. Po konečném zpracování SEC jsou získané produkty stálé po dobu nejméně jednoho roku.

Sekce VI: Srovnání výsledků analýzy EIA a HPSEC

Výsledky analýzy EIA a HPSEC, získané pro tři vzorky, a to pro vodnou fázi po extrakci chloroformem, pro produkt po průchodu aniontoměničem a pro produkt SEC z jedenácti šarží 2 až 12 byly navzájem srovnávány.

Na obr. 45 je znázorněn graf pro log koncentrace po HPSEC proti log koncentrace po EIA pro uvedených 33 vzorků. Vztah pro regresi, odpovídající těmto údajům má strmost 0,88 a koeficient korelace (r) 0,94. Hodnota strmosti, která se blíží hodnotě 1 a hodnota r = 0,94 ukazuje na velmi dobrou korelaci mezi oběma zkouškami, zvláště při variabilitě, která je spojena s každým měřením.

Sekce VII: Reprodukovatelnost výsledků

Analýza HPSEC pro šarže 2 až 14 prokazuje stálost a reprodukovatelnost postupu. Při analýze pomocí HPSEC v jednotlivých fázích postupu byly vzorky odebírány ze zpracovávaného materiálu a bylo dosaženo velmi dobré reprodukovatelnosti při čištění hlavních nečistot. Na obr. 46 je znázorněn vztah ploch pod křivkami pro monomerní virus v procentech pro jednotlivé vsázky. V průběhu posledních čtyř stupňů čištění je možno pozorovat vysokou reprodukovatelnost. Šarže 10 a 11 s vyšší čisto tou po extrakci chloroformem a po průchodu aniontoměničem jsou v obou případech poloviční šarže.

107

Příklad 17: Doplněk A

Tabulka 17-A1

Shrnutí údajů pro materiál po rozrušení buněk a po působení nukleázy. Každý vzorek byl analyzován třikrát, uvedeny jsou průměry pro jednotlivé vzorky. · ;

Filtrát po rozrušení buněk šarže celková plocha celková plocha plocha po 17 a 19

214 nm 260 nm min., 260 nm

1 2	26 22	811 976 032 023	3 2	107 722	589 501	1	240 974	987 988
3	24	322	218	2	696	138	1	085	819
4	19	934	567	1	588	166		708	663
5	23	633	378	1	657	484		831	179
6	26	311	501	2	590	678	1	060	441
7	20	336	561	2	225	138		895	005
8	27	019	891	3	195	019	1	377	974
9	25	671	116	2	804	591	1	281	608
průměr	23	800	264	2	472	839	1	018	495
standardní odchylka	2	648	361		565	612		205	034

108

Filtrát po působení nukleázy
šarže	celková plocha 214 nm	plocha po min, 260 :
1	22	784	749	' 0
2	21	417	391	0
3	22	658	768	0
4	17	766	458	0
5	17	984	377	0
6	23	280	554	0
7	17	231	064	0
8	23	218	865	0
9	21	797	999	0
průměr	20	904	469

standardní odchylka

491 146

109

Doplněk A (pokračování)

Tabulka 17-A2

Údaje pro re suspendovanou usazeninu pc· působení PEG, pro vodnou fázi po extrakci chloroformem, produkt z aniontoměniče a produkt po SEC. Analýzy byly provedeny třikrát, uveden je průměr.

suspenze vodná fáze po produkt po produkt SEC po PEG | extr.chloroformem aniontoměniči |

šarže	plocha %	plocha . %	tone. (ug/ml)	plocha %	konc. (ug/ml)	jlocha < %	onc. (ug/ml)
2	29.6 ± 0.6	64.7 ± 1.7	22.25 ± 0.35	80.6 ± 0.1	28.46 ± 0.21	100	10.01 ± 0.09
3	26.8 ± 0.7	61.7 ± 0.8	29.68 ± 0.82	81.9 ±0.6	32.32 ± 0.27	100	16.84 ± 0.50
4	32.0 ± 2.3	64.7 ± 0.4	23.72 ± 0.01	83.7 ± 0.9	29.12 ± 0.48	100	14.57 + 0.18
5	31.2 ±2.6	60.0 ± 0.2	25.89 ± 0.26	78.6 ± 0.3	35.74 ± 0.89	100	18.22 ± 0.75
6	25.9 ± 0.3	67.1 ± 1.3	15.90 ± 0.26	82.9 ± 0.3	16.39 ± 0.09	100	7.96 ±0.18
7	29.4 ± 0.9	66.7 ± 1.6	19.10 ±0.30	84.2 ± 0.3	15.73± 0.26	100	7.80 ± 0.20
8	29.2 ± 0.7	70.8 ± 1.1	16.40 ± 0.10	87.4 ± 0.5	20.01 ± 0.07	100	9.68 ± 0.12
9	20.7 ± 1.4	72.8 ± 3.4	14.32 ± 0.28	85.7 ± 0.5	14.61 ± 0.05	100	8.05 ± 0.01
10	23.7 ± 0.1	852 ± 1.3	10.02 ± 0.06	97.0 ± 0.3	10.24 ± 0.04	100	6.24 ± 0.06
11	18.5 ± 0.7	79.4 ± 0.5	7.32 ±0.42	90.5 ± 1.0	8.62 ± 0.10	100	5.24± 0.00

- 110 Příklad 18

Výsledky klinických zkoušek

Čištěná vakcina podle vynálezu byla podávána zdravým lidem. Nebylo možno pozorovat žádné nepříznivé účinky, které by bylo možno přisoudit působení vakciny.

Účinnost jediné dávky vakciny s obsahem 25 jednotek byla prokázána u dětí při zkouškách podle Monroa, výsledky byly zveřejněny 13. srpna 1992 v Werzberger a další, NEJM 327, č. 7, 453 - 457. Rozdíl mezi materiálem, který použit Monroe a materiálem, který byl výsledkem celého postupu podle vynálezu, je uveden na obr. I, rozdíl spočíval v tom, že jeden z materiálů ve fázi I/II této zkoušky byl vyroben v třepacích lahvích a oddělen mechanicky a druhý byl vyroben postupem, vhodným pro výrobu většího množství způsobem podle vynálezu, jinak byly oba postupy stejné. 25 jednotek, to znamená 25 ng bílkoviny HAV v čištěném materiálu podle vynálezu byla dávka, dostatečná ke tvorbě protilátek v séru u. více než 95 % dětí a mladistvých ve věku 2 až 16 let po 4 týdnech po očkování. Tatáž dávka poskytovala 100% ochranu u dětí i mladistvých od

21. dne po jediné dávce vakciny.

Pak byly sledovány rozdíly ve výsledcích u dospělých v závislosti na věku a na hmotnosti. V průběhu jednoho měsíce po jediné dávce s obsahem 25 jednotek došlo ke tvorbě protilátek u 83 % dospělých s věkem vyšším než 18 let a u 97 % dětí a mladistvých ve věku 2 až 17 let. Při podání dvou dávek po 25 jednotkách v intervalu 2 týdnů došlo ke zvýšení tvorby protilátek u dospělých až na 93 %. Protilátky v séru po 7 měsících po druhé nebo třetí dávce 25 jednotek bylo možno prokázat u více než 99 % osob u obou sledovaných věkových skupin. Seropositivita trvá ve 100 % po 12 měsících a po 36 měsících u obou sledovaných věkových skupin. Je tedy zřejmé,

111 že jediná dávka vakciny s obsahem 25 jednotek je dostatečná k vyvolání tvorby protilátek u alespoň 80 % jakékoliv populace v průběhu jednoho měsíce po očkování. Získané údaje jsou shrnuty v následující tabulce 18-1, byly podány dávky po 25 jednotkách v týdnech 0 a 24 nebo v týdnech 0, 2 a 24. Hodnota GMT = geometrický průměr titru protilátek proti viru HAV. Při očkování větší dávkou dochází ke tvorbě protilátek ve vyšším procentuálním podílu populace.

Tabulka 18-1

Tvorba protilátek v uvedeném týdnu po počáteční imunizaci

očkování	věk	4	24	28
0 a 24	18-29	83 % 100/120	87 % 33/38	100 % 24/24
GMT u pozitivních		21	41	2138
0, 2 a 24	18-29	98 % 115/118	100 % 33/33	100 % 24/24

GMT u positiv-

nich	33	90	4379
0 a 24 30-89	72 % 265/370	80 % 111/138	100 % 71/71
GMT u positivních	22	34	1332
0, 2 a 24 30-89	85 % 321/380	89 % 118/132	100 % 75/75
GMT u positivních	28	59	1796

112

Kromě svrchu uvedených údajů byla skupina očkovaných, kteří neměli v krevním séru po 4 týdnech žádné protilátky (celkem 23 očkovaných) znovu podrobeno zkouškám po 24 týdnech a po 28 týdnech, kdy došlo k více než 10-násobnému zvýšení titru protilátek. U dvou jednotlivců bylo možno prokázat přibližně šestinásobný vzestup v titru po 6 měsících. Zbývajících 21 jednotlivců (91 %) mělo anamnestickou odpověď a vzestup pro tilátek. To znamená, že tito jednotlivci sice nevykazují proti látky v séru, avšak jsou patrně chráněni očkováním vakcinou podle vynálezu, i když zůstávají delší dobu po očkování zcela seronegativní.

Claims (2)

PATENTOVÉ NÁROKY

1$. Způsob podle nároku 1,vyznačuj ící se tím, že se virus hepatitidy A pěstuje v reaktoru se statickým povrchem při doplnění živného prostředí rychlostí

0,010 až 0,3 ml/cm /den.

118

Způsob podle nároku 1, vyznačuj ící se t í m , že se pěstuje virus hepatitidy A v reaktoru se statickým povrchem a živné prostředí se odebírá a doplňuje stálou rychlostí.

2©. Vakcina s obsahem viru hepatitidy A, vyznačující se tím, že při obsahu 25 až 100 jednotek v dávce 0,1 až 1 ml má následující nominální složení:

složka množství

chlorid sodný 900-9000 /Ug hliník 50-500 /Ug tetraboritan sodný 3,8-38 ./Ug formaldehyd <0,4 /Ug glukosa (polymer) 0-1000 ng bílkovina 25-100 ng chloroform 4 44 ng

RNA viru HAV uhlohydráty, odlišné od glukosy mastné kyseliny neomycin

DNA z buněk MRC-5 sérový albumin skotu enzym benzonáza

2-20 ng 0-20 ng ^z20 ng < 4 ng 4 0,03 ng <0,1 ng < 0,0001 ng

119

1?. Čištěný prostředek s obsahem inaktivovaného viru hepatitidy A, vyznačující se tím, že jedna až tři dávky po 25 až 100 jednotkách, ekvivalentní 25 až 100 ng viru hepatitidy A podle analýzy aminokyselin jsou dostatečné ke tvorbě protilátek, prokazatelných v séru u 80 až 90. % očkovaných v průběhu 4 až 28 týdnů po imunizaci.

1¼. Čištěný prostředek podle nároku 14, vyznačující se tím, že obsahuje virus hepatidiy A, inaktivovaný formaldehydem.

l£~. Čištěný prostředek podle nároku 15, vyznačující se tím, že je adsorbován na hydroxid hlinitý.

íá. Čištěný prostředek s obsahem inaktivovaného viru hepatitidy A, vyznačující se tím, že obsahuje jednotlivou dávku 25 jednotek, ekvivalentní 25 ng bílkoviny viru hepatitidy A na bázi analýzy aminokyselin, přičemž tato dávka je dostatečná k vyvolání tvorby protilátek u alespoň 95 °/o dětí a mladistvých ve věku 2 až 16 let po čtyřech týdnech po očkování.

1&. Čištěný virus podle nároku 12, vyznačuj í cí se tím, že je zpracován po dávkách 25 až 100 ng na bázi bílkoviny spolu se 100 až 1000 mikrogramy hydroxidu hlinitého.

iS. Čištěný prostředek s obsahem viru hepatitidy A s následujícími vlastnostmi, vyznačující se tím, že jednotlivé údaje jsou vztaženy na mikrogramy bílkoviny a v závorkách jsou uvedeny postupy pro stanovení jednotlivých složek:

a)

b) obsah lipidů (plynová chromatografie) <0,l/Ug uhlohydrát, prokázaný jako glukosa uhlohydrát, odlišný od glukosy (hydrolýza kyselinou trifluoroctovou,

0,1 - 2,5/Ug < 0,1/Ug

Dionex),

117

c) bílkovina, specifická pro virus HAV (analýza aminokyselin a Wesern blot),

d) RNA, specifická pro virus HAV

e) kontaminující DNA i 0,95/Ug

0,1 - 0,2/Ug < 0,001/Ug.

1. Způsob výroby viru hepatitidy A v průmyslovém měřítku s více než 95% čistotou bílkoviny při elektroforéze na SDS-polyakrylamidovém gelu při barvení stříbrem, vyznačující se tím, že se

a) pěstuje virus hepatitidy A ve velkém množství na vrstvě buněčného materiálu na velkém povrchu statického reaktoru SSR,

b) virus hepatitidy A se izoluje ze souvislé buněčné kultury působením smáčedla, pronikajícího do vrstvy infikovaných buněk za uvolnění viru hepatitidy A z buněčné kultury,

c) popřípadě se odstraní nukleové kyseliny, nespecifické pro virus hepatitidy A v tomto stupni ze získaného viru hepatitidy A působením nukleázy,

d) virus hepatitidy A, izolovaný z buněčné kultury se zahustí pomocí membrán a diafiltrací nebo zachycením na iontoměniči,

e) z koncentrovaného viru hepatitidy A ze stupně d) se odstraní bílkoviny, které nejsou specifické pro virus hepatitidy A kombinací extrakce organickými rozpouštědly, srážením polyethylenglykolem, výměnou iontů, včetně odstranění volných kontaminujících nukleových kyselin v případě, že tyto kyseliny nebyly odstraněny ve stupni c) a chromatografií na gelu a

f) čištěný virus hepatitidy A ze stupně e) se izoluje.

114

2. Čištěný virus hepatitidy A, získaný způsobem podle nároku 1.

3. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že se ve stupni a) očkuje virus hepatitidy A ze supernatantu SSR, infikovaného HAV do reaktorů še statickým povrchem, v němž jsou v souvislých vrstvách pěstovány buněčné kultury MRC-5 a živné prostředí obíhá reaktorem se statickým povrchem při použití smyčky pro provzdušnění a doplnění složek živného prostředí.

4. Způsob podle nároku 1,vyznačuj ící se t i m , že se ve stupni b) virus hepatitidy A izoluje zpracováním buněčných vrstev, infikovaných tímto virem působením 0,05% až 1% roztoku Tritonu X-100 k uvolnění viru hepatitidy A.

5. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že se ve stupni c) ke štěpení užije benzoná.za.

6. Způsob produkce vakcíny s obsahem inaktivovaného viru hepatitidy A v průmyslovém měřítku s čistotou bílkoviny HAV vyšší než 95%, vyznačující se tím,že se

a) pěstuje velké množství viru hepatitidy A v reaktorech typu Nunc Cell Factories, Costar Cubes nebo v reaktorech se statickým povrchem, SSR, včetně prvků ve tvaru pravidelné sítě pro růst buněk s vysokou hustotou na jednotku objemu s vytvořenou buněčnou vrstvou buněk MRC-5,

b) vypěstovaný HAV se izoluje odstraněním živného prostředí a přidáním roztoku s obsahem 0,1 % Tritonu X-100,

c) na oddělený virus se působí benzonázou k rozštěpení kontaminujících volných nukleových kyselin,

115

d) HAV, zpracovaný benzonázou se koncentruje zachycením ve sloupci iontoměniče s následnou eluci 0,35 M NaCl s následným vysrážením polyethylenglykolem,

e) HAV, vysrážený PEG se znovu uvede do suspenze a extrahuje směsí chloroformu a isoamylslkohólu v objemovém poměru 24 : 1 za energického míchání, vodná fáze se oddělí a uchová,

f) vodná fáze po extrakci se chromatografuje na aniontoměniči DEAE Toyopearl 650 M v 90 až 150 mM NaCl, eluce HAV se provádí gradientem do až 1 M NaCl, frakce s obsahem HAV se spojí a zředí na koncentraci chloridu sodného pod 150 mM a koncentraci HAV pod 20 mikrogramů/ml, takže se minimalizuje nebo vyloučí srážení HAV,

g) frakce ze stupně f) se chromatografují na za sebou zařazených sloupcích gelu Toyopearl HW55S a HW65S,

h) po filtraci na gelu se HAV inaktivuje působením formaldehydu v koncentraci 1 : 1000 po dobu 5 dnů, pak se materiál sterilizuje filtrací, adsorbuje se nebo se současně sráží s hydroxidem hlinitým a dělí se na podíly, obsahující 25 až 100 ng inaktivovaného čištěného HAV v jedné dávce.

množstvím produktu, získaného podle nároíaT~&r———

Vakcina s obsahem HAV, připravená způsobem podle nároku 6.

116 §· Způsob pěstování HAV, vyznačující se tím, že se virus pěstuje v reaktoru typu Costar Cube nebo v reaktoru se statickým povrchem, popřípadě obsahující prvky ve tvaru sítě z titanu nebo nerezové oceli.

iq. Způsob podle nároku 9,vyznačuj ící se tím, že se v jednom reaktoru typuCostar Cube získá 5000 až 50 000 dávek po 25 ng vakciny s inaktivovaným HAV s čistotou HAV vyšší než 95 %.

10. Čištěný virus hepatitidy A, vyznačující se t í m , že více než 95 % bílkoviny je specifické pro virus a méně než 7 % bílkoviny je tvořeno nukleovou kyselinou, odlišnou od kyselin HAV nebo lipidem a 0 až 180 % prostředků tvoří uhlohydrát glukosa.

l£. Čištěný Virus podle nároku 11, vyznačuj íc í se t í m , že je inaktivován formaldehydem.

2 Η č u j ί c ce 0,5 ml

Vakcina s obsahem viru hepatitidy A, vyznáí se t í m , že při obsahu 25 jednotek v dávmá následující nominální složení:

složka množství'.

chlorid sodný 4,500/Ug hliník 250/Ug tetraboritan sodný 19 /Ug formaldehyd 4 200 ng glukosa (polymer) 4 20 ng bílkovina 25 ng chloroform < 22 ng RNA viru HAV 5 ng uhlohydráty, odlišné od glukosy 4 ng mastné kyseliny 4 1 ng neomycin 4 0,5 ng DNA z buněk MRC-5 4 0,005 ng sérový albumin skotu <0,02 ng enzym benzonáse <0,00002 ng

2i. Čištěný prostředek s obsahem inaktivovaného viru hepatitidy A, vyznačující se tím, že obsahuje dávku 2g jednotek, ekvivalentní 25 ng bílkoviny HAV podle analýzy aminokyselin, dostatečnou k ochraně nejméně 95 % očkovaných dětí a mladistvých ve věku 2 až 15 let 21 dnů po očkování.