SK18495A3 - Method of production of hepatitis a virus, purificated virus and vaccine against hepatitis a virus - Google Patents

Description

Vynález sa týka spôsobu výroby vírusu hepatitídy A, takto získaného čisteného vírusu a tiež vakcíny proti vírusu hepatitídy A.

Doterajší stav techniky

V roku 1973 bol identifikovaný ako mikroorganizmus, vyvolávajúci infekčnú žltačku vírus, neskoršie označovaný ako vírus hepatitídy A. Na identifikáciu bol použitý elektrónový mikroskop a výsledky výskumu boli publikované v Feinstone a ďalší, Science, 182, str. 1026.

Správy o prvej kultúre vírusu hepatitídy A, HAV in vítro sú opísané v publikácii Provost a ďalší, P.S.E.B.M., 160, str. 213, 1979. Postup spočíva v tom, že pečeň z mladých svišťov, infikovaných HAV bola použitá ako očkovací materiál pre kultúry z explantátov pečene a pre kultúry z fetálnych ľadvín opíc Rhesus (FRhkó) podľa US patentového spisu č. 4 164 566. Neskoršie bolo použité priame očkovanie vírusom HAV, ktorý nebol vopred pasažovaný cez nižšie primáty na propagáciu vírusu in vit.ro podľa publikácie Provost a ďalší, P.S.E.B.M., 167, str. 201, 1981 a tiež podľa US patentového spisu č. 5 021 348.

Podľa týchto prác bolo dokázané, že pri pestovaní HAV v kultúre in vitro je možné pripraviť atenuovaný vírus. Okrem toho bolo dokázané, že po opakovanom pasažovaní in vitro sú kultúry HAV produktívnejšie a replikácia sa urýchli vzhľadom na to, že sa vírus adaptuje na bunkový materiál kultúry. Ďalší vývoj dokázal, že živý atenuovaný vírus podľa publikácie Provost a ďalší, J. Med. Viol., 20, str. 165, 1986 a tiež formalínom inaktivovaný HAV podľa US patentových spisov č. 4 164 566 a 5 021 348 a podľa publikácie Provost a ďalší, Viral Hepatitis and Liver Disease, str. 83 až 86,

1988, vydavateľ Alan R. Liss, Inc., môže poskytnúť ochranu proti infekcii u nižších primátov. Z týchto prác bolo zrejmé, že inaktivovaný alebo atenuovaný imunogénny HAV by bolo možné použiť na výrobu vakcíny. Bolo by však potrebné navrhnúť reprodukovateľný, v priemyselnom meradle uskutočniteľný postup na výrobu vysoko čisteného antigénu, aby bolo možné vyrobiť vakcínu na použitie u ludí.

Bol opísaný celý rad postupov na čiastočné čistenie celých viriónov HAV. na výskum a počiatočnú charakterizáciu. Tieto postupy sú opísané napríklad v publikácii Hornbeck C. L. a ďalší, Intervirology 6, 309 až 314, 1975, Locarnini S. A. a ďalší, Intervirology 10, 300 až 308, 1978, Siegl G. a ďalší, J. Virol. 26, 40 až 47, 1978, Siegl G. a ďalší, J. Gen. Virol. 57, 331 až 341, 1981, Siegl G. a ďalší, Intervirology 22, 218, 1984, Hughes J. V. a ďalší, J. Virol. 52, 465, 1984 a Vheeler C. M. a ďalší, J. Virol., 58, 307, 1986.

Pri všetkých týchto postupoch sa používajú zdĺhavé a velmi nákladné stupne, napríklad odstredenie za použitia sacharózového gradientu alebo gradientu chloridu cézneho. Okrem toho sú tieto postupy upravené pre prácu v pomerne malom meradle a aj napriek tomu, že sa uvádza príprava vysoko čistených produktov, pri presnej analýze je možné dokázať, že produkty nie sú celkom čisté. Lewis a ďalší v európskej patentovej prihláške č. 302 692, zverejnenej 8. februára 1989 uvádzajú postup, ktorý spočíva v tom, že sa a) rozrušia bunky, infikované HAV, materiál sa podrobí extrakcii a zahustí sa, b) materiál sa nechá prejsť chromatografickým stĺpcom s obsahom anionomeniča pri vysokej koncentrácii soli na odstránenie znečisťujúcich kyselín a c) výsledný materiál sa prefiltruje na stĺpci gélu. Neskoršie v publikácii Lewis a ďalší, európska patentová prihláška 0468702, zverejnená 18. júla 1989 sa opisuje modifikácia tohto postupu zaradením stupňa, v ktorom sa vykonáva adsorpcia na ionomenič s následnou desorpciou na odstránenie znečisťujúcich uhľohydrátov. V oboch patentových prihláškach boli pokusy vykonávané v pomerne malom meradle a nebrala sa do úvahy možnosť vykonávania postupu v priemyselnom meradle. Okrem toho bola čis tota produktu po elektroforéze na géli stanovená farbením Coomasieovou modrou alebo striebrom. Tento postup je jednou z možností stanovenia čistoty bielkovín, nejde však o kvantitatívny postup a postup tiež neposkytuje informáciu o prítomnosti iných znečistení, ako sú lipidy, uhľohydráty, nukleové kyseliny alebo organické látky s nízkou molekulovou hmotnosťou.

V oboch zverejnených európskych patentových prihláškach EP0468702A2 a EP0302692A2 sa uvádza, že v známych postupoch na izoláciu a čistenie HAV sa používa jeden alebo väčší počet stupňov, pri použití ktorých nemôže dôjsť k vydaniu povolenia na výrobu úradom Food and Drug Administration, vzhľadom na použitie zmáčadiel alebo exogénnych enzýmov. Vynález tiež navrhuje použitie zmáčadiel a exogénnych enzýmov, avšak súčasne uvádza účinné postupy na odstránenie týchto reakčných činidiel a dokazuje, že získaný produkt obsahuje nižšie množstvo týchto pridaných látok, než je vôbec možné dokázať, takže produkt je rovnako čistý alebo čistejší než HAV, získaný známymi postupmi.

V európskej patentovej prihláške č. 0339668, zverejnenej 2. novembra 1989, opisuje Moritsugu a ďalší, postup, ktorý spočíva v tom, že sa

a) solubilizuje, extrahuje a zahustí materiál za použitia DNázy/RNázy a potom sa materiál spracuje pôsobením proteinázy,

b) vykonáva sa frakcionácia za použitia sacharózy na oddelenie RNA a prázdnych kapsidov a

c) materiál sa podrobí filtrácii na géli.

Tento postup je opäť obmedzený, pokiaľ ide o množstvo získaného materiálu, najmú vzhľadom na frakcionačný stupeň za použitím sacharózy. Okrem toho nie je ľahké stanoviť čistotu produktu a táto čistota sa tiež v presnom hodnotení v publikácii nikde neuvádza.

V publikácii Lino a ďalší, Vaccine, zv. 10, str. 5 až 10, 1922 sa opisuje zlepšenie Moritsugovho postupu. Čistota produktu sa stanoví elektroforézou na SDS-polyakrylamidovom géli a denzitometriou a- je možné dokázať, že čistený HAV ob sahuje menej než 1,9 % exogénnych bielkovín. Bolo tiež dokázaných menej než 5 pg nukleových kyselín hostiteľských buniek v 0,5 mikrogramoch čisteného HAV. Avšak uskutočnenie tohto postupu vo veľkom meradle je neľahké a skutočná čistota produktu za použitia väčšieho množstva parametrov taktiež nebola uvádzaná.

V publikácii Kusov a ďalší, Vaccine, 9, 540, 1991 sa opisuje pestovanie HAV na bunkovom materiáli, podobnom Vero a čistenie vírusu extrakciou organickým .rozpúšťadlom, pôsobením DNázy a chromatografiou za použitia guľôčok z porézneho oxidu kremičitého. Ani v tomto prípade sa neuvádza absolútna čistota produktov ami možnosť uskutočnenia postupu v priemyselnom meradle.

Napriek tomu, že v literatúre dosiaľ nie je k dispozícii žiadny skutočný údaj o čistote HAV na použitie vo vakcíne, je možné porovnať produkty podľa antigenity, ako bude ďalej uvedené v tabuľke 1 v príklade 11. Uvedené sú údaje, porovnávajúce množstvo HAV v rôznych produktoch podľa údajov výrobcu, okrem toho sú uvedené aj údaje o produkte podľa vynálezu .

Vynález si kladie za úlohu získať čistý imunogénny materiál v priemyselnom meradle. Vysoká kvalita a čistota produktu by mala byť reprodukovateľná tak, aby bolo možné dosiahnuť bezpečné použitie vakcíny.

Podstata vynálezu

Podstatu vynálezu tvorí spôsob výroby vírusu hepatitídy A s možnosťou vykonania v priemyselnom meradle, pri čistote vírusu vyššej než 95 %, vztiahnuté na bielkovinu pri elektroforéze na SDS-polyakrylamidovom géli pri zafarbení striebrom, postup spočíval v tom, že sa

a) pestuje vírus hepatitídy A vo veľkom množstve na vrstve bunkového materiálu na veľkom povrchu statického reaktora SSR,

b) vírus hepatitídy A sa izoluje zo súvislej bunkovej kultúry pôsobením zmáčadla, prenikajúceho do vrstvy infiko vaných buniek za uvoľnenia vírusu hepatitídy A z bunkovej kultúry,

c) prípadne sa odstránia nukleové kyseliny, nešpecifické pre vírus hepatitídy A v tomto stupni zo získaného vírusu hepatitídy A pôsobením nukleázy,

d) vírus hepatitídy A, izolovaný z bunkovej kultúry sa zahustí pomocou membrán a diafiltráciou alebo zachytením na ionomeniči,

e) z koncentrovaného vírusu hepatitídy A zo stupňa d) sa odstránia bielkoviny, ktoré nie sú špecifické pre vírus hepatitídy A kombináciou extrakcie organickými rozpúšťadlami, zrážaním polyetylénglykolom, výmenou iónov, vrátane odstránenia volných kontaminujúcich nukleových kyselín v prípade, že tieto kyseliny neboli odstránené v stupni c) a chromatografiou na géli a

f) čistený vírus hepatitídy A zo stupňa e) sa izoluje.

Spôsob podľa vynálezu teda zahrňuje čistenie akéhokoľvek vírusu hepatitídy A, HAV, vzorka môže pochádzať z atenuovaného alebo virulentného HAV, môže byť produkovaná bunkovou líniou akéhokoľvek kmeňa alebo môže ísť o kultúru, ktorá môže byť infikovaná HAV. Vynález zahrňuje aj spracovanie všetkých kapsidov HAV a to už prázdnych bez nukleových kyselín vírusu alebo úplných s obsahom nukleových kyselín vírusu.

Na infekciu buniek MRC-5 bol podľa vynálezu použitý vírus HAV po 28 pasážach (P28CR326F’, taxonómia variantov vychádza z CR326, ide napríklad o kmene CR326F a CR326F’, vzťah tejto nomenklatúry na úroveň pasažovania je vysvetlený v publikácii Provost a ďalší, J. Med. Virol., 20, 165 až 175, 1986. Produkčný materiál bol pestovaný v pasáži P29. Kmeň P28CR326F’ je atenuovaný kmeň HAV. Vynález však zahrňuje aj iné kmene HAV, vrátane tých, ktoré môžu byť atenuované bežnými postupmi. Ďalšími bunkovými líniami, vhodnými na pestovanie HAV sú Vero, FL, VI-38, BSCI a FRhK6. Tieto a ďalšie systémy na pestovanie HAV v bunkových kultúrach sú podrobne diskutované v publikáciách Gerety R. J., Active

Immunization Against Hepatitis A, v Gerety R. J. (ed.) Hepatitis A, Academic Press 1984, str. 263 až 276 a Tucehurst J. R., Seminars in Liver Disease 6, 46 až 55, 1986. V princípe je možné použiť ako hostiteľskú bunku pre HAV akýkoľvek materiál, ktorý je možné týmto vírusom infikovať, napríklad môže ísť o bunkovú líniu ľudských diploidných fibroplastov. Výhodnou bunkovou líniou na výrobu vakcíny je MRC-5.

Spôsob podľa vynálezu, vykonávaný v priemyselnom meradle je tvorený nasledujúcimi stupňami:

a) Pestovanie veľkého množstva vírusu hepatitídy A, HAV vo vhodnej nádobe na pestovanie a vhodnom živnom prostredí

Výhodný postup spočíva v tom, že sa použije HAV, adaptovaný na rast na ľudských diploidných pľúcnych bunkách, vhodných na produkciu vakcíny. Výhodným bunkovým materiálom je línia VI38 alebo MRC-5. Uvedený bunkový materiál je možné pestovať na mikronizovaných nosičoch alebo ako súvislé vrstvy buniek vo fľašiach alebo v trepacích fľašiach. Pri vykonávaní spôsobu podľa vynálezu sa používajú veľké plochy a multilamelárne bioreaktory, ako je NUNC CELL FACTORY, COSTAR CUBE statický povrchový reaktor SSR alebo je možné použiť statický reaktor s premiešavaním prostredia, napríklad podľa US patentových spisov č. 4 296 204, 4 415 670 alebo je možné použiť zariadenie z nerezovej ocele s mriežkami a premiešavanie živného prostredia podľa množstva požadovaného produktu. Vo výhodnom uskutočnení spôsobu podľa vynálezu sa pestuje bunková línia MRC-5 vo forme súvislých vrstiev buniek za použitia COSTAR CUBE SSR s plochou 85 000 cm^ alebo za'použitia SSR s mriežkami s tou istou plochou alebo aj väčšou plochou, na .infekciu sa použijú násobky infekčných jednotiek (MOI) vírusu HAV, ktoré dostačujú na dosiahnutie účinnej infekcie kultúry. Prijateľná hodnota MOI je približne 0,01 až 10. Na infekciu kultúry sa zvyčajne použije HAV zo supernatantu frakcie z SSR po inkubácii po dobu približne 28 dní.

Vo výhodnom uskutočnení sa HAV pestuje na bunkovej línii MRC-5, rastúcej na mriežke z nerezovej ocele, ako je opísané v príklade 14. Podlá tohto uskutočnenia sa použije bioreaktor s prvkami tvaru mriežky alebo siete z akéhokoľvek vhodného, netoxického materiálu, na ktorom môže bunkový materiál rásť. Tieto mriežky alebo siete môžu byť vyrobené z nerezovej ocele, titánu, plastickej hmoty alebo podobného materiálu, ktorý môže byť vyhotovený ako trojrozmerný pravidelný prvok. Naprí-klad je možné s výhodou použiť zariadenie Sulzer Biotech Systems (zvlášť SMV, SMX, E-PACK EX, DX, BX, CY) s obsahom 316 prvkov typu mriežky alebo siete z nerezovej ocele. V každom prvku je rovnomerne usporiadaný rad vrstiev, na ktorých môžu bunkové línie rásť. Každý prvok je orientovaný v uhle 0 až 90° vzhľadom na ďalší prvok v sterilnom reaktore. Reaktor môže mať tvar valca alebo akýkoľvek iný geometrický tvar, upravený na uloženie mriežok alebo sieti pri dobrom využití objemu. Bunkový materiál je potom naočkovaný a nechá sa priľnúť na povrch, vytvorený mriežkou alebo sieťou. Hneď ako bunkový materiál v kultúre dobre rastie, je možné privádzať živné prostredie rýchlosťou, dostatočnou pre prívod živín a odvod odpadných produktov. Hneď ako sa dosiahne vhodná hustota buniek, môžu byť bunkové línie infikované HAV, ako bude ďalej opísané.

Výhoda použitia prvkov v tvare mriežky alebo siete spočíva v tom, že je k dispozícii väčšia povrchová plocha na jednotku objemu. Geometricky presná sieť dovoľuje rovnomerný rast fibroblastov po celom povrchu do známej a stálej hĺbky a dovoľuje tiež riadiť prívod živín. Rovnomernosť mriežky alebo siete môže tiež umožniť predpovedať miesta styku medzi vláknami tak, aby bunkový materiál mohol rýchlo prekryť celú sieť vláken. V konfigurácii statického miešacieho zariadenia je tiež možné riadiť blízkosť vedľa seba uložených rastových povrchov navzájom tak, aby bolo možné zachovať vhodné podmienky rastu a vyvarovať sa upchatia reaktora. Tento problém je totiž veľmi závažný v prípade niektorých reaktorov, ktoré nie sú plnené celkom pravidelne, takže môže dochádzať k miestam, kde dochádza k takému rýchlemu bunkovému rastu, že prívod živín je nedostatočný a tým aj bunkový materiál trpí nedostatočným prívodom živín.

Je zrejmé, že spôsob podľa vynálezu zahrňuje okrem pasáži 18, P18, p28, p29 , p72 kmeňa CR326F vírusu HAV akýkoľvek iný variant alebo kmeň HAV, a to atenuovaný alebo virulentný. Atenuované varianty alebo kmene je možné získať sériovým pasážovaním cez bunkové materiály, živočíchy alebo inými postupmi, tak ako bolo uvedené v publikáciách Provost P. J. a ďalší, Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 178,8 (1982, Provost P. J. a ďalší, J. Med. Virol. 20, 165, 1986, US patentové spisy č. 4 164 566 a 5 021 348. Spôsob čistenia podľa vynálezu je možné ľahko a rýchlo upraviť pre atenuované alebo virulentné kmene HAV.

HAV sa nechá replikovať v SSR až do vrcholnej produkcie vírusu. Pre kmene HAV, adaptované na bunkové kultúry v prípade atenuovaných kmeňov, ako CR326FP28 trvá tento postup 7 až 35 dní v závislosti na počiatočnej hodnote MOI a na hustote buniek, v priebehu uvedenej doby sa živné prostredie nechá stále prechádzať slučkou, v ktorej sa vykonáva výmena plynu. Ako živné prostredie je možné použiť akékoľvek prostredie, podporujúce rast buniek MRC-5 a replikáciu HAV. S výhodou sa živné prostredie odstráni a doplňuje rýchlosťou v rozmedzí 0,010 až 0,3 ml/cm /deň. Túto rýchlosť je možné meniť vzhľadom na to, že rýchlosť tvorby bunkovej hmoty je závislá na celkovom množstve živného prostredia.

Vo výhodnom uskutočnení spôsobu podľa vynálezu sa bunkový materiál MRC-5 pestuje v súvislých vrstvách v SSR na ploche 340 000 cm , napríklad za použitia štyroch prvkov s plochou 85 000 cm alebo v SSR s mriežkami pri ešte vyššej ploche, bunkový materiál sa potom infikuje HAV za použitia hodnoty MOI v rozmedzí 0,1 až 1,0, potom sa vírus nechá replikovať až do dosiahnutia vrcholnej produkcie vírusového antigénu. Tento postup trvá približne 28 dní. V priebehu tejto doby je nutné stále privádzať čerstvé živné prostredie a nechať ho obiehať nádobou, v ktorej sa bunkový materiál pestuje a slučkou, v ktorej dochádza k výmene plynom. Živné prostredie môže byť akékoľvek živné prostredie, ktoré podpo ruje rast alebo udržovanie buniek MRC-5 a replikáciu HAV. Bolo dokázané, že výhodným živným prostredím je napríklad bazálne prostredie, ako Villiamsove prostredie E, doplnené príslušnými rastovými faktormi. Ako rastový faktor je výhodné najmä sérum, doplnené železom.

b) Izolácia produkovaného HAV

Spôsob izolácie získaného HAV bude do určitej miery určovaný geometriou nádoby, v ktorej bol bunkový materiál pestovaný. Všeobecne je možné uviesť, že po pestovaní kultúry približne 28 dní pri stálom prívode živného prostredia sa živné prostredie odstráni a HAV sa izoluje. V minulosti pri pestovaní vírusu v malom meradle sa táto izolácia vykonávala mechanickým oddelením buniek, zmrazením, roztopením a potom spracovaním ultrazvukom na optimálne uvoľnenie vírusu, viazaného na bunkový materiál. Pri vykonávaní spôsobu podľa vynálezu sa vírus, viazaný na bunkový materiál, uvoľní do čo najmenšieho objemu roztoku. S výhodou obsahuje roztok, použitý na uvoľnenie vírusu zložky, ktoré robia bunkový materiál priepustným pre vírus. Takéto zložky sú napríklad zmáčadlá, ako Triton C-100, NP-40 alebo ekvivalentný materiál, ktorý sa použije v najnižšej možnej koncentrácii tak, aby ho bolo možné neskoršie ľahko odstrániť. Bolo dokázané, že použitie 0,05 až 0,5, s výhodou 0,1 % Tritonu X-100 je dostatočné na dosiahnutie účinnej extrakcie HAV z bunkového materiálu, pestovaného v kultúrach v zariadení NUNC, COSTAR alebo v akomkoľvek vhodnom zariadení. Výhoda použitia extrakcie zmáčadlom, najmä v prípade reaktorov typu SSR, ako reaktora COSTAR v tvare kocky je skutočnosť, že geometria takéhoto reaktora nedovoľuje izoláciu mechanickým spôsobom a je teda nutné HAV previesť do supernatantu kultúry, ktorý sa potom vypustí a HAV sa koncentruje a izoluje. Podiel HAV v supernatante bunkovej kultúry však predstavuje len malý podiel celkového množstva HAV, ktoré by bolo možné z bunkovej kultúry izolovať. Izolácia HAV pomocou zmáčadla je však vysoko účinná.

c) Spracovanie izolovaného HAV

Hneď ako bol vírus izolovaný v podstate v bezbunkovej .forme zo supernatantu kultúry, z bunkového materiálu alebo z oboch uvedených zložiek, je žiaduce vírus koncentrovať na uľahčenie jeho ďalšieho spracovania a čistenia. Pri skôr známom postupe na čistenie HAV bol vírus uvoľnený mechanicky a len veľmi malé množstvá materiálov boli čistené, bolo možné postupovať tak,· že vírus bol extrahovaný organickým rozpúšťadlom, ako napríklad metylénchloridom alebo zmesou metylénchloridu a izoamylalkoholu v objemovom pomere 24:1 a potom bola vodná fáza zahustená pridaním vo vode rozpustného syntetického polyméru, napríklad polyetylénglykolu. Teraz však bolo zistené, že pri vykonávaní tohto postupu vo veľkom meradle je možné použiť zmáčaďlá a exogénny enzým a pripraviť vakcínu s obsahom HAV pri odstránení cudzorodých materiálov tak, že v čistenom produkte nie je možné dokázať ani stopy činidiel, použitých na čistenie.

V jednom uskutočnení spôsobu podľa vynálezu sa použité zmáčadlo, napríklad Triton X-100, použitý na izoláciu HAV odstráni koncentráciou a diafiltráciou s následným odstránením zvyškov zmáčadla, napríklad pomocou neiónového polymérneho činidla typu Amberlit, napríklad XAD. Použiteľným postupom na odstránenie prostriedku Triton X-100 až na obsah 10 mikrogramov/ml je postup podľa publikácie Hurni V. M., a Miller V. J., Journal of Chromatography, 559, 337 až 343, 1991. Zmáčadlo, použité pri izolácii HAV potom už nie je možné analyticky dokázať vo výslednom produkte podľa tohto uskutočnenia. Okrem toho dôjde k odstráneniu ďalších nečistôt, takže sa získa čiastočne čistený HAV.

V inom uskutočnení spôsobu podľa vynálezu sa po oddelení supernatantu s obsahom zmáčadla nepoužije koncentrácia a diafiľtrácia s následným pôsobením živice XAD, ale sa pre koncentráciu vírusu použije pôsobenie nukleázy s následným použitím anionomeniča.

V tomto uskutočnení sa s výhodou použije nešpecifická, vysoko homogénna nukleáza* s vysokou špecifickou účinnosťou.

Jej nešpecifickosť zaistí rozštiepenie DNA a RNA a homogenita enzýmu zaistí, že je pridaný len jeden enzým bez ďalších nečistôt bielkovinového materiálu. Ďalej je výhodné, aby použitá nukleáza bola odolná proti pôsobeniu zmáčadiel tak, aby bolo možné ju priamo pridať do supernatantu po izolácii HAV, ktorý zmáčadlo obsahuje. Tieto požiadavky môže splniť celý rad nukleáz. Bolo dokázané, že zvlášť výhodným enzýmom na toto použitie je enzým benzonáza, ktorý bol pripravený ako rekombinantná bielkovina (Nycomed Pharma A/S, Dánsko). Tento enzým sa pridáva v množstve 0,1 až 100 mikrogramov/1 izolovaného HAV, s výhodou sa použije 10 mikrogramov/1, toto množstvo je dostatočné na odstránenie kontaminujúcich voľných nukleových kyselín.

Pridanie čo najmenšieho množstva enzýmu je dôležité na nasledujúce ľahké odstránenie tohto enzýmu v priebehu ďalšieho spracovania tak, aby bolo možné získať produkt s nezistiteľnými zvyškami enzýmu, to znamená s obsahom enzýmu menej než 10 pg/ml.

Vzhľadom na to, že na spracovanie pôsobením nukleázy dochádza v pomerne zriedenému roztoku, bolo dokázané, že je vhodné oddeliť HAV chromatografiou na anionomeniči za použitia zriedeného roztoku soli s koncentráciou 90 až 150 mM a potom HAV vymývať postupným pridávaním 1,5-násobku objemu stĺpca roztoku s vyššou iónovou silou, 0,3 M. Týmto spôsobom je možné HAV podstatným spôsobom skoncentrovať a okrem toho sa v stĺpci nezachytí zmáčadlo, enzým benzonáza a rad ďalších nečistôt, ktoré stĺpcom len prejdú. To znamená, že HAV po elúcii z tohto stĺpca je už čiastočne čistený. V tomto stupni je možné použiť celý rad ionomeničových živíc vrátane tých, ktoré boli uvedené v EP0468702 A1. Bolo dokázané, že zvlášť vhodnou živicou pre toto použitie je DEAE Toyopear’l 650M (Tosohaas) .

d) Koncentrácia HAV

Po izolácii HAV a koncentrácii a diafiltrácii a spracovaní na živici XAD alebo po spracovaní pôsobením nukleázy s následným zachytením v chromatografickom stĺpci sa vírus zahustí za použitia vo vode rozpustného syntetického polyméru, ktorým je možné účinne zahustiť bielkovinový materiál. Na tento účel je vhodný polyetylénglykol PEG s molekulovou hmotnosťou v rozmedzí 2 000 až 12 000. Typicky sa postupuje tak, že sa k čiastočne čistenému HAV pridá chlorid sodný do konečnej koncentrácie 150 až 500 mM. Potom sa pridá PEG do konečnej koncentrácie 2 až 10, s výhodou 4 g/100 ml. Vyzrážaný, čiastočne čistený HAV sa oddelí odstredením, supernatant sa odloží a usadenina sa znova uvedie do suspenzie na ďalšie spracovanie. Bolo dokázané, že hlavná nečistota je v tomto stupni odstránená vo forme supernatantu. Odstránenie proteázy zvyšuje výťažok, stálosť a čistotu získaného HAV v priebehu ďalšieho čistenia. Usadeninu po pôsobení PEG, znovu uvedenú do suspenzie je prípadne možné spracovať pôsobením ultrazvuku na uľahčenie solubilizácie pred extrakciou organickým rozpúšťadlom, ako bude ďalej uvedené.

e) Extrakcia organickým rozpúšťadlom

Usadenina po pôsobení PEG, znova uvedená do suspenzie sa extrahuje pridaním zmesi halogenovaných nižších alkánov s obsahom 1 až 6 atómov uhlíka, napríklad metylénchloridu, chloroformu, tetrachlóretánu a podobne spolu s protipenivým činidlom, napríklad izoamylalkoholom. Objemový pomer halogenovaného nižšieho alkánu a protipenivého činidla je v rozmedzí 15:1 až 50:1, s výhodou v rozmedzí 20:1 až 30:1. Bolo dokázané, že extrakcia organickým rozpúšťadlom podstatne zvyšuje čistotu výsledného HAV. V tomto stupni je chloroform pre extrakciu organickým rozpúšťadlom výhodnejší než metylénchlorid.

Touto extrakciou sa okrem ďalších nečistôt odstránia lipidy a látky, lipidom podobné. Postupuje sa tak, že sa usadenina po pridaní PEG znova uvedie do suspenzie a potom sa zriedi niektorým z celého radu použiteľných pufrov, ako je fyziologický roztok chloridu sodného s fosfátovým pufrom, tris-pufer, uhličitanový, hydrogénuhličitanový alebo acetá tový pufor. Vzhľadom na to, že kapsidy HAV sú stále v mierne kyslom prostredí, sú prijateľné pufre v slabokyslej oblasti pH. Výhodným pufrom je napríklad TNE, obsahujúci 10 mM tris-HCl s pH 7,5 so 150 mM NaCl a 1 mM EDTA. Namiesto tris-HCl je tiež možné použil fosfátový pufer.

S výhodou sa usadenina po použití PEG, znova uvedená do suspenzie extrahuje pridaním zmesi chloroformu a izoamylalkoholu v objemovom pomere 24:1, pomer organického rozpúšťadla a vody je v rozmedzí 0,5:1 až 3:1 a v priebehu extrakcie sa zmes energicky mieša. Extrakt sa potom vycerí odstredením 10 minút pri 4 000 x g pri teplote 20 °C. Vodná fáza sa uchová, rozhranie a organická fáza sa znova extrahujú rovnakým objemom TNE alebo ekvivalentným pufrom v množstve 0,3 a 0,6 pôvodného objemu vzorky, obe vodné fázy sa spoja, čím sa získa extrakt usadeniny po pôsobení PEG.

Extrakcia rozpúšťadlom je kľúčovým stupňom spôsobu čistenia vírusu hepatitídy A tým, že dochádza k vyzrážaniu bielkovinových nečistôt v hraničnej oblasti a súčasne k extrakcii lipidov do rozpúšťadla. Podstatné vyčistenie, ktoré je možné extrakciou dosiahnuť pri vykonávaní tohto postupu, je možné pozorovať z chromatogramov HPSEC na obr. 17, kde vrchol pre nečistoty v dobe 23 minút je veľmi užitočným znakom pre sledovanie odstránenia nečistôt v tomto stupni. Ako je zrejmé z obr. 18, pri vykonávaní postupu v malom meradle došlo k zachovaniu podstatného podielu tohto vrcholu v extrahovanom produkte. Bolo sledovaných niekoľko premenných veličín tak, aby bolo možné porozumieť tomuto stupňu a riadiť ho podľa množstva použitého materiálu. Bol sledovaný najmä pomer rozpúšťadla k objemu vodného roztoku, spôsob pretrepávania, doba miešania a intenzita miešania a to v niekoľkých rozmeroch skúmaviek a fliaš, ako bude opísané v príklade 15.

f) Chromatografia na ionomeniči

Extrakt z vyššie uvedeného stupňa sa podrobí chromatograf ii na ionomeniči vo forme živice, gélu alebo matrice.

Typické matrice anionomeniča zahrňujú napríklad nasledujúce materiály, bez toho aby boli na ne obmedzené:

DEAE celulóza,

DEAE agaróza,

DEAE biogél,

DEAE dextrán, DEAE Sephadex, DEAE Sepharose, aminohexyl Sepharose, ecteola celulóza,

TEAE celulóza,

QAE celulóza, mono-Q alebo benzoylovaná diétylaminoetylcelulóza.

Jednou z výhodných anionomeničových matríc je DEAE Toyopearl 650M (Tosohaas). Základné informácie, týkajúce sa chromatografie na ionomeniči je možné nájsť napríklad v publikácii E. A. Peterson, Cellulosic Ion Exchangers v Vork T. S. a ďalší, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, zv. 2, časť II, str. 223 a nasledujúce, North-Holland 1970.

Materiál, získaný extrakciou resuspendovanej usadeniny po pôsobení PEG organickým rozpúšťadlom sa v prípade potreby zriedi za použitia 10 mM Tris s 1 mM EDTA s pH 7,5 alebo ekvivalentným pufrom a pridá sa v prípade potreby chlorid sodný do koncentrácie 0,3 až 0,35 M na odstránenie kontaminujúcich voľných nukleových kyselín. Za týchto podmienok prechádza HAV stĺpcom ako filtračným materiálom. Avšak v prípade, že bol HAV vopred spracovaný pôsobením nukleázy, pridá sa k organickému extraktu 0,1 až 0,15 M, s výhodou 0,12 M chloridu sodného na začiatku nasledujúceho stupňa.

Po pridaní chloridu sodného do vopred uvedenej koncentrácie priľnú kapsidy HAV k anionomeničovej matrici, zatiaľ čo niektoré zvyšné nečistoty, napríklad uhľohydráty, touto matricou prejdú. Stĺpec sa premyje niekoľkými objemami 0,12 M chloridu sodného na odstránenie zvyšných nečistôt. Potom sa kapsidy HAV zo stĺpca anionomeniča vymývajú za použitia približne jedného objemu stĺpca a objemu pôvodnej vzorky s obsahom 0,35 M NaCl. Je tiež s výhodou možné postupovať rak, že sa HAV vymýva gradientovou elúciou až do 1 M chloridu sodného alebo ekvivalentnej soli, k vymývaniu HAV dochádza pri približne 0,3 M chloride sodnom.

g) Filtrácia na géli

Konečným stupňom je filtrácia na géli, ktorá sa vykonáva po chromatografii na anionomeniči. V typických prípadoch sa použije materiál Sepharose CL-4B (Pharmacie), je však možné použiť aj celý rad iných typov gélových matríc. Tieto materiály boli opísané napríklad v publikácii Fischer L., Gel Filtration Chromatography, v Vork T. S. a ďalší, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Elsevier, 1980. Bol zistený veľmi výhodný postup pre gélovú chromatografiu na čistenie HAV v tomto stupni. Ide o elúciu čo najmenšieho objemu frakcie s anionomeničom na za sebou zaradených stĺpcoch materiálu Toyopearl HV55S a HV65S.

Zvláštny sled chromatografických postupov, ktorý je tvorený chromatografiou na ionomeniči a potom filtráciou na géli je typický pre čistenie kapsidov HAV, je však možné ich meniť. Je napríklad možné použiť filtráciu na géli pred použitím anionomeniča. Vyššie opísaný postup je však veľmi výhodný .

h) Zrážanie HAV

V dôsledku veľkých množstiev HAV, produkovaných pri vykonávaní spôsobu podľa vynálezu došlo k neočakávaným zisteniam, ktoré sa týkajú rozpustnosti vírusu. Bolo dokázané, že pri koncentrácii 0,25 až 0,3 M soli pri elúcii HAV zo stĺpca ionomeniča dôjde k vyzrážaniu vírusu v prípade, že sa koncentrácia HAV zvýši nad 10 až 20 mikrogramov/ml.

Táto skutočnosť bola dokázaná pomocou analýzy HPSEC pre reprezentačné vzorky. Bolo totiž dokázané, že vodná fáza, extrahovaná chloroformom, AQX a produkt po filtrácii na géli

SEC boli veľmi stále pri skladovaní pri teplote 4 °C, v prípade produktu z anionomeniča IEX však došlo k. značnému úbytku vírusu hepatitídy A po skladovaní pri uvedenej teplote.

Aby bolo možné tieto skutočnosti potvrdiť, boli vykonané skúšky na stálosť s ďalšími vzorkami. Produkty AQX, IEX a SEC boli vždy v trojitom uskutočnení skúmané pomocou HPSEC okamžite po svojom získaní. Potom bola stanovená koncentrácia vírusu porovnaním výsledných vrcholov s kalibračnou krivkou pre vírus, získaný SEC. Okrem toho bol podiel produktu IEX zriedený v pomere 1:5 roztokom chloridu sodného s fosfátovým pufrom, roztok obsahoval 0,12 M chlorid sodný, 6 mM fosforečnan sodný pri pH 7,2 a potom bolo hneď vykonané kvantitatívne stanovenie. Stálosť uvedených štyroch vzoriek pri teplote 4 °C bola sledovaná niekoľko dní pomocou HPSEC.

Počiatočná koncentrácia vírusu hepatitídy A, hodnoty, získané po 4 až 5 dňoch pre niektoré vzorky po čistení sú uvedené v nasledujúcej tabuľke:

počiatočné množstvo vírusu vzorka množstvo vírusu po 4 dňoch

	pg/ml	pg/ml
AQX	23	21
produkt IEX	59	50
produkt IEX, zriedený 1:5	12	10
produkt SEC	12	12
Úplné výsledky vrátane	hodnôt v rôznych	časových obdo-
biach sú znázornené na obr.	26.
Pri prvej vzorke bolo	možné pozorovať,	že produkt IEX

vykazuje podstatný úbytok vírusu hepatitídy A, cez noc bola strata približne 25 %, koncentrácia sa znížila z 59 na 45 mikrogramov/ml.

Zriedený produkt IEX a produkt AQX, boli oveľa stálejšie, straty vírusu boli len 10 % v priebehu prvých 100 hodín

- 17 skladovania. Pri produkte SEC nedošlo k žiadnej strate vírusu, ide teda o ten istý výsledok, ktorý bol dosiahnutý v pôvodných vzorkách.

K rozdielu medzi pôvodnými vzorkami a neskoršie skúmanými vzorkami došlo v tvorbe viditeľnej straty zrazeniny, ktorá sa objavila v skupine vzoriek, ktorá bola analyzovaná neskoršie. Prítomnosť zrazeniny si vyžiadala odstredenie produktu IEX pred filtráciou na géli. Pri tomto odstredení však došlo k veľkej strate vyzrážaného vírusu a jeho koncentrácia po odstredení bola len 29 mikrogramov/ml. Tabuľka, uvádzajúca výťažky za použitia HPSEC je uvedená nižšie.

vzorka	mg vírusu celkom	výťažok v stupni	mg vírusu po získaní vzorky
produkt AQX	12,9		11-7
produkt IEX	12,3	105 %	8,7

(poč.množstvo)

odstredený produkt IEX	4,2	48 %	4,2
produkt SEC	2,0	49 %	1,4

Neočakávane nízky výťažok filtrácie na géli viedol k domnienke, že v stĺpci SEC dochádza k zhlukovaniu alebo k zrážaniu vírusu. Určité zhlukovanie bolo pozorované pri použití HPSEC. Vzorka produktu IEX, ktorá bola chromatografovaná na malej dvojici za sebou zaradených stĺpcov SEC, okamžite po skončení preparatívnej IEX preukázala výťažok vírusu 71 %, čo je v tomto stupni typickejší výsledok. Vzhľadom na to, že táto vzorka sa nezrážala a teda nedošlo k strate vírusu odstredením, je tento výťažok 71 % približne trojnásobkom výťažku, ktorý bol získaný v produkčnom meradle z produktu IEX po vykonaní SEC, to znamená filtrácii na géli . Pri vykonávaní SEC v menšom meradle však došlo k oveľa väčšiemu riedeniu, čo môže byť príčinou vyššieho výťažku.

- 18 Zrazenina, ktorá sa v priebehu čistenia v týchto vzorkách objavila a ktorá súvisela so stratou vírusu pri vykonaní HPSEC však bola, ako bolo neočakávane zistené, rozpustná vo vodných roztokoch s nízkou iónovou silou, napríklad s obsahom 6 mM fosforečnanu sodného, takže zrážanie bolo reverzibilné. Zrazenina bola znova rozpustená pridaním 6 mM fosfátu sodného, rozpustenie prebiehalo veľmi rýchlo. Na rozdiel od tohto postupu v prípade, že zrazenina v roztoku 120 mM chloridu sodného bola rozpustená pomocou 6 mM fosfátu sodného alebo v inom roztoku s vysokou iónovou silou, nedošlo k takmer žiadnej zmene. V závislosti na dobe retencie pri vykonávaní HPSEC bolo dokázané, že zrazenina, ktorá sa rozpustila v 6 mM fosfáte sodnom má ten istý rozmer ako monomérny vírus hepatitídy A, zatiaľ čo pri vykonávaní SDS-Page pri farbení striebrom sa ukázalo, že rozpustená zrazenina má tie isté viditeľné pásy pre bielkoviny, ktoré je možné pozorovať vo výslednom produkte SEC. Na základe týchto skutočností bolo čistenie vírusu hepatitídy A modifikované tak, že produkt po prechode ionomeničom sa riedi tak, aby nedošlo k strate zrážaním, ako je uvedené v príklade 16, riedenie v pomere 1:1 zníži koncentráciu soli na 0,15 M alebo pod túto hodnotu, z toto istého dôvodu je žiaduce znížiť koncentráciu HAV pod hodnotu 20 mikrogramov/ml.

i) Skúška na reprodukovateľnosť HPSEC

Vysokotlaká chromatografia na géli HPSEC bola upravená tak, že bolo možné kvantitatívne stanoviť koncentráciu vírusu a množstvo nečistôt vo vzorkách v priebehu čistenia HAV.

Vzorky HAV zo 14 šarží, pripravené spôsobom podľa vynálezu, boli podrobené analýze a výsledné údaje boli použité na stanovenie koncentrácie vírusu a nečistôt pre každý z použitých čistiacich stupňov. V príklade 17 na obr. 29 až 46 sú uvedené podmienky vykonávania HPSEC, vyhodnotenie, dokazujúce presnosť skúšky a porovnanie údajov, získaných pomocou HPSEC a EIA a výsledky analýzy HPSEC pre desať šarží.

j) Inaktivácia vírusu a spracovanie na vakcínu

Na prípravu čistených kapsidov HAV na použitie vo vakcíne môže byť potrebné upraviť vírus ešte ďalším bežným spracovaním. Je napríklad možné zaradiť pôsobenie formaldehydom, filtráciu na sterilizáciu produkte a adsorpciu na nosiče alebo pomocné prostriedky tak, ako sa tieto stupne bežne vykonávajú a ako bolo opísané v publikáciách Provost P. J. a ďalší, Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 160, 213, 1979 a Provost P. J. a ďalší, J. Med. Virol., 19, 23, 1986. HAV je možné inaktivovať pôsobením tepla, zmenami pH, ožiarením, spracovaním pomocou organických rozpúšťadiel, ako sú formaldehyd alebo paraformaldehyd. Typicky sa inaktivácia vykonáva pridaním formaldehydu v pomere 1:4000. Bolo dokázané, že táto inaktivácia prebiehala rýchlejšie a účinnejšie pri štvornásobku bežnej koncentrácie, takže po pridaní formaldehydu v pomere 1:1000 sa štyrikrát znížila doba, nutná pre inaktiváciu, bez toho, aby došlo k nepriaznivému ovplyvneniu imunogenity. Inaktivovaný HAV sa potom adsorbuje alebo sa súčasne zráža s hydroxidom hlinitým, ktorý tak môže pôsobiť ako pomocný prostriedok a ako nosič.

Vzhľadom na to, že dávka, ktorá je potrebná pre imunologickú účinnosť, je v prípade tohto produktu velmi nízka, je vhodné uviesť inaktivovaný vírus do komplexu alebo ho adsorbovať na nosič. Bolo dokázané, že na tento účel je velmi vhodný hydroxid hlinitý, ktorý tvorí s HAV tuhý komplex a bráni strate vírusu na stenách zásobníka.

Predmetom vynálezu je teda priemyselne uskutočniteľný spôsob výroby vírusu hepatitídy A pri čistote bielkoviny HAV vyššej než 95 %, tento postup spočíva v tom, že sa

a) pestuje vírus hepatitídy A na veľkom množstve bunkových vrstiev na veľkom povrchu statických reaktorov,

b) vírus hepatitídy A sa potom odstráni z bunkovej kultúry premytím vrstiev buniek zmáčadlom, dôjde k uvoľneniu vírusu hepatitídy A z bunkovej vrstvy bez podstatnejšieho odstránenia alebo rozrušenia súvislej bunkovej kultúry,

c) prípadne sa odstránia nukleové kyseliny, nešpecifické pre vírus hepatitídy A v tomto stupni pôsobením nukleázy alebo adsorpciou nukleových kyselín na ionomenič,

d) vírus hepatitídy A, získaný z bunkovej kultúry sa koncentruje za použitia membrán a diafiltráciou alebo zachytením v ionomeniči,

e) zvyšné bielkoviny, nešpecifické pre vírus hepatitídy A sa odstránia z koncentrovaného vírusu z predchádzajúceho stupňa kombináciou extrakcie organickým rozpúšťadlom, zrážania polyetylénglykolom, výmenou iónov, vrátane odstránenia kontaminujúcich nukleových kyselín v prípade, že neboli odstránené v stupni c), potom sa ako konečný stupeň vykonáva chromatografia na géli, potom sa

f) čistený vírus hepatitídy A, získaný v stupni e) izoluje.

Vy výhodnom uskutočnení tohto postupu sa pri priemyselnej produkcii inaktivovaného vírusu hepatitídy A vo forme vakcíny postupuje tak, že sa '4

a) pestuje veľké množstvo vírusu hepatitídy A, HAV, v re- * aktore Nunc Celí Factories, Costar Cubes alebo na ešte väčších plochách a iných statických bioreaktoroch s bunkovou kultúrou buniek MRC-5 vo forme spojitej vrstvy na pravidelných zostavách pevných mriežok z nerezovej ocele, titánu alebo z nerezovej ocele s titanom,

b) vzniknutý HAV sa oddelí odstránením živného prostredia a pridaním roztoku na oddelenie vírusu s obsahom 0,05 až 0,5 %, s výhodou 0,1 % prostriedku Triton X-100,

c) vírus sa potom podrobí pôsobeniu nukleázy do rozštiepenia kontaminujúcich bunkových nukleových kyselín,

d) HAV, spracovaný pôsobením nukleázy sa koncentruje zachytením na stĺpci ionomeniča s následnou elúciou roztokom približne 0,35 M chloridu sodného s následným vyzrážaním polyetylénglykolom,

e) koncentrovaný HAV sa extrahuje zmesou chloroformu a izoamylalkoholu v objemovom pomere 24:1 za energického mie sania a vodná fáza sa oddelí a uschová,

f) vodná fáza po extrakcii organickým rozpúšťadlom sa chromatografuje na ionomeniči v 0,12 M chloride sodnom a vírus sa vymýva za použitia gradientu s vyššou koncentráciou chloridu sodného, napríklad 1 Ma potom sa získaný vírus po elúcii okamžite zriedi na koncentráciu soli približne 0,15 M alebo nižšiu, koncentrácia HAV je s výhodou približne 20 mikrogramov/ml alebo nižšia,

g) HAV po elúcii z ionomeniča sa chromatografuje na géli, s výhodou na za sebou zaradených stĺpcoch materiálu Toyopearl HV55S a HV65S,

h) HAV po filtrácii na géli sa inaktivuje formaldehydom v pomere 1:1000 a potom sa sterilizuje filtráciou, zráža sa súčasne s hydroxidom hlinitým a rozdelí sa na jednotlivé dávky, ktoré sú ekvivalentné približne 25 až 100 ng inaktivovaného čisteného HAV.

HAV, získaný spôsobom podľa vynálezu je vysoko čistený a má vysokú antigénnu účinnosť. Produkt je čistený prostriedkom s obsahom vírusu hepatitídy A, čistota bielkoviny vírusu je viac než 95 % pri analýze SDS PAGE pri farbení striebrom, menej než 0,1 % prostriedku tvoria nukleové kyseliny, odlišné od kyselín vírusu, menej než 4 % tvoria lipidy. Množstvo uhľohydrátu, preukázateľného ako glukóza v hydrolyzovanej vzorke produktu je v rozmedzí 0 až 200 % hmotnosti prítomnej bielkoviny, pričom uhľohydráty, odlišné od glukózy sú prítomné v množstve nižšom než 15 %, vztiahnuté na hmotnosť bielkoviny. Vo výhodnom uskutočnení sú uhľohydráty, to znamená glukóza a ďalšie uhľohydráty, ako ribóza, prítomné v množstve nižšom než 20 %, vztiahnuté na hmotnosť bielkoviny. Po inaktivácii formaldehydom si vakcína uchováva svoju antigenitu.

Na vyvolanie ochrannej imunologickej odpovede stačí veľmi malé množstvo inaktivovaného vírusu. S výhodou sa v jednej dávke podáva 25 až 100 mg vírusu, táto dávka sa podáva raz, dvakrát alebo trikrát v priebehu niekoľkých mesiacov, ako je potrebné na dosiahnutie vysokého titra protilá tok proti HAV.

Čistená vakcína s obsahom vírusu hepatitídy A má nasledujúce zloženie, ktoré sa uvádza na 1 mikrogram bielkoviny.

V zátvorkách sú uvedené postupy, ktoré boli použité na stanovenie jednotlivých zložiek.

a)

b)

c)

d) obsah lipidov (plynová chromatografia) uhľohydráty, dokázané ako glukóza (hydrolýza kyselinou trifluóroctovou, TFA, Dionex) uhľohydráty, odlišné od glukózy (hydrolýza pomocou TFA, Dionex) bielkoviny, špecifické pre vírus hepatitídy

A (analýza aminokyselín a Vestern blot)

0,2	gg
0,2	až
2,5	gg
0,2	gg
0,95	gg

e) RNA, špecifická pre vírus hepatitídy A

f) kontaminujúca DNA

0,1 až 0,2 pg < 0,0004 pg

Prítomnosť uhľohydrátovej zložky, tvorenej prevažne glukózou sa pokladá za nevýznamnú z hľadiska znášanlivosti, imunogenity a ochrannej účinnosti inaktivovanej vakcíny s obsahom pomocného prostriedku. Je však významné, že vakcína obsahuje veľmi malé množstvo uhľohydrátov, odlišných od glukózy, pravdepodobne ide o ribózu, vzniknutú degradáciou špecifickej RNA pre HAV. Je tiež významné, že bolo konečne možné dokázať zloženie vírusu vzhľadom na to, že spôsob podľa vynálezu umožnil produkciu veľkého množstva vírusu na vykonávanie skúšok.

V špecifickej vakcíne podľa vynálezu bolo vo vzorke dokázané nasledujúce zloženie pre 0,1 až 1 ml vakcíny s obsahom 25 až 100 jednotiek:

zložka množstvo

chlorid sodný	900 - 9000	gg
hliník	50 - 500	gg
tetraboritan sodný	3,8 - 38	gg
formaldehyd	< 0,4	gg

zložka množstvo

glukóza (polymér)	0	- 1000	ng
bielkovina	25	- 100	ng
chloroform	<	44	ng
RNA vírusu HAV	2	- 20	ng
uhľohydráty, odlišné od glukózy	0	- 20	ng
mastné kyseliny	<	20	ng
neomycín .	<	4	ng
DNA z buniek MRC-5	<	0,03	ng
sérový albumín hovädzieho dobytka	<	0,1	ng
enzým benzonáza	<	0,0001	ng

V ďalšej vzorke špecifickej vakcíny s obsahom vírusu hepatitídy A bolo možné dokázať vo vzorke s objemom 0,5 ml a s obsahom 25 jednotiek nasledujúce zloženie vakcíny:

zložka množstvo

chlorid sodný	4,500	4g
hliník	250	gg
tetraboritan sodný	19	4g
formaldehyd	< 200	ng
glukóza (polymér)	< 20	ng
bielkovina	25	ng
chloroform	< 22	ng
RNA vírusu HAV	5	ng
uhľohydráty, odlišné od glukózy	4	ng
mastné kyseliny	< 1	ng
neomycín	< 0,5	ng
DNA z buniek MRC-5	< 0,005	ng
sérový albumín hovädzieho dobytka	< 0,02	ng
enzým benzonáza	< 0,00002	ng

Bolo dokázané, že inaktivovaný vírus hepatitídy A, pod ľa vynálezu je účinný a chráni infekciu v prípade, že sa podá 25 ng, čo je ekvivalentné 25 jednotkám dávky vo vyššie uvedených vakcínach, na báze analýzy EIA, vztiahnuté na referenčný štandard, charakterizovaný analýzou aminokyselín. U zdravých dospelých, mladistvých ani u detí nebolo možné pozorovať žiadne nepriaznivé účinky, ktoré by mohli byť spájané s podaním vakcíny. Dospelým boli podávané dávky 6 až 50 jednotiek, tie isté dávky boli podávané tiež mladistvým a deťom. Pri zvyšovaní dávok bolo u dospelých možné pozorovať rýchlejšiu a väčšiu tvorbu protilátok, u detí bola táto skutočnosť menej vyjadrená.

V priebehu jedného mesiaca po jedinej dávke 25 jednotiek boli vytvorené protilátky u 83 % dospelých vo veku 18 alebo viac rokov a u 97 % detí a mladistvých vo veku 2 až 17 rokov. V prípade, že boli podané dve dávky po 25 jednotkách v intervale 2 týždne, bolo možné dokázať u dospelých tvorbu protilátok v 93 %. Po siedmich mesiacoch po druhej alebo tretej dávke 25 jednotiek bolo možné pozorovať u oboch vekových skupín protilátky u 99 % osôb. Protilátky v sére je potom možné dokázať v množstve 100 % pôvodného množstva až do 12 a 36 mesiacov v prípade oboch vekových skupín. Je teda zrejmé, že jediná dávka 25 jednotiek je dostatočná pre tvorbu protilátok u aspoň 80 % očkovaných v akejkoľvej populácii v priebehu 1 mesiaca po očkovaní. Pri očkovaní vyššou dávkou dôjde k tvorbe protilátok u vyššieho percenta očkovaných.

V prípade, že sa podáva jednotlivá dávka 25 ng, je možné z jediného reaktora typu Costar Cube získať spôsobom podľa vynálezu 5000 až 10 000 jednotlivých dávok alebo ešte vyššie množstvo. Je samozrejmé možné založiť kultúry aj v niekoľkých reaktoroch uvedeného typu súčasne. Je však zrejmé, že v jedinom reaktore typu SSR s mriežkou alebo bez nej je možné dosiahnuť podstatne vyšší počet dávok vakcíny než dosiaľ.

Vynález bude vysvetlený nasledujúcimi príkladmi, ktoré by však nemali slúžiť na obmedzenie spôsobu podľa vynálezu na stupne, uvedené v jednotlivých príkladoch v určitom poradí .

Ďalej bude spôsob podľa vynálezu opísaný v súvislosti s priloženými výkresmi.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Na obr. 1 je schematicky znázornené použitie hlavných postupov pri výrobe vakcíny s obsahom vírusu hepatitídy A na klinické pokusy. V ľavej vetve schémy je uvedený predtým známy postup, použitý pre fázu I/II klinických pokusov, pri tomto postupe boli používané trepacie fľaše. V pravej vetve schémy je England, J. vynálezu je i

Na obr. 4000-stípca, tok chloridu uvedený postup podľa publikácie of Med., 327, 453 až 457, 1992 a uvedený v tretej vetve.

je opísaný postup ako elučné činidlo je . sodného s fosfátovým

Monroe, New, spôsob podľa

HPSEC TSK PV za použitia použitý fyziologický rozpufrom, PBS. Tento postup bol kalibrovaný proti štandardom molekulovej hmotnosti a je zrejmé, že existuje lineárna závislosť plochy na riedení vírusu hepatitídy A. Táto skúška je zvlášť vhodná v neskorších stupňoch čistenia. Sú uvedené štyri chromatogramy z posled ných štyroch stupňov spôsobu podľa vynálezu. Chromatografický postup bol sledovaný v ultrafialovom svetle pri 214 a 260 nm na stanovenie hornej a spodnej hranice. Za použitia tejto skúšky je najskôr možné pozorovať zodpovedajúci vrchol pre vírus hepatitídy A po znovuuvedení usadeniny v polyetylénglykole do suspenzie (obr. 2A). Po extrakcii chloroformom dochádza k odstráneniu väčšiny materiálu s vysokou molekulovou hmotnosťou, absorbujúceho ultrafialové svetlo (obr. 2B). Chromatografia na ionomeniči slúži na koncentráciu vírusu (obr. 2C) a pri preparátívnej chromatografii na géli sa získa vysoko čistený vírus (obr. 2D). Čistený vírus málo absorbuje v rozmedzí 260 alebo 280 nm, takže je možné pozorovať len vrchol pri 214 nm. Za uvedených podmienok vytvára HAV jediný symetrický vrchol a týmto spôsobom je teda možné dokázať čistotu tohoto vírusu na analýze pomocou SDS PAGE.

Na obr. 3 je znázornený rast buniek MRC-5 na skle, polystyréne a nerezovej oceli 316. Koncentrácia buniek na po vrchu tohto materiálu je znázornená ako funkcia času. Bunkový materiál bol naočkovaný na úseky uvedených materiálov pri hustote približne 10 000 buniek/cm a každý deň boli stanovené počty buniek. Bunkový materiál na krycích sklíčkach a na úsekoch nerezovej ocele 316 bol pestovaný v Petriho miskách s plochou 150 cm s obsahom 90 ml živného prostredia, to znamená 0,6 ml/cm . Pre bunkový materiál, pestovaný v T-fľašiach s plochou 25 cm bolo použitých 7,5 ml živného 9 prostredia, to znamená 0,3 ml/cm .

Na obr. 4 je znázornený rast buniek MRC-5 a reziduálna koncentrácia glukózy pri pestovaní buniek na úsekoch nerezo• 2 vej ocele 316. Koncentrácie buniek na cm a koncentrácie glukózy v mg/cm sú uvedené ako funkcie času (d) pre bunkový materiál, pestovaný na úsekoch nerezovej ocele s plochou 25 cm 2.

Na obr. 5 je vo svetelnom mikroskope znázornená mikrofotografia buniek MRC-5, rastúcich na mriežke z nerezovej ocele. Bunkový materiál bol naočkovaný v množstve 5 000 až 10 000 buniek/cm a potom bol pestovaný po dobu ďalšie dva týždne. Mikrofotografia je vo zväčšení 40 x.

Na obr. 6 je znázornené farbenie životaschopných a životaneschopných buniek MRC-5, pestovaných na mriežke z nerezovej ocele 316. Bunkový materiál bol farbený fluoresceíndiacetátom (FDA) a etidiumbromidom (EB) spôsobom, ktorý je ďalej opísaný v príklade 14 v odstavci Materiály a metódy a potom bol pozorovaný mikroskopom za použitia laseru. Radové vyšetrenie snímok bolo vykonané pri prírastkoch 57 mikrometrov. Na obr. 6A je znázornené farbenie fluoresceínom, odčítaná je fluorescencia, ktorá preukazuje prítomnosť životaschopných buniek. Na obr. 6B je znázornená fluorescencia po farbení DNA pomocou etidiumbromidu, je zrejmá takmer úplná životaschopnosť všetkých buniek. Pozitívna kontrola pre irídiumbromid je znázornená na obr. 7.

Na obr. 7 je znázornené farbenie neživotaschopných buniek MRC-5 etidiumbromidom. Bunkový materiál, pestovaný na mriežke z nerezovej ocele 316 bol usmrtený pôsobením 100% metanolu. Po dôkladnom prepláchnutí PBS a vysušení bol bun kovy materiál farbený FDA/EB ako negatívna kontrola pre FDA a pozitívna kontrola pre etidiumbromid, táto kontrola je na výkrese znázornená. Pre negatívnu kontrolu nebolo možné preukázať žiadnu fluorescenciu.

Na obr. 8 je znázornená účinnosť pestovania pre statický reaktor, opatrený mriežkou pri použití usadzovania gravitáciou alebo pri použití recirkulácie živného prostredia. Jednotlivé prvky reaktora sú číslované 1 až 5, pričom prvok 1 je prvok, uložený v hornej časti a prvky 4 alebo 5 sú uložené pri dne reaktora, za použitia sedimentácie gravitáciou boli použité štyri prvky a pri recirkulácii živného prostredia bolo použitých päť prvkov. Uvádzaná účinnosť pestovania buniek znamená percentuálny údaj zo všetkých naočkovaných buniek, celková účinnosť bola radovo 90 %. Údaje pre recirkuláciu sú uvádzané ako priemer z troch pokusov, zatiaľ čo údaj pre sedimentáciu gravitáciou je výsledkom jediného pokusu. Rýchlosť cirkulácie bola približne 6 cm za hodinu.

Na obr. 9 je znázornená rýchlosť príjmu glukózy GUR, ako funkcia času pre reaktory, obsahujúce prvky, tvorené tuhým titanom a mriežkou z nerezovej ocele 316. Na obr. 9A o O je znázornená hodnota GUR na cm (mikrogramy/cm -d) proti času (d), zatiaľ čo hodnota GUR na objem reaktora je uvedená na obr. 9B. Údaje z obr. 9A závisia na povrchu prvkov, zatiaľ čo výsledok z obr. 9B na tomto faktore nezávisí vzhľadom na to, že oba reaktory mali rovnaký objem.

Na obr. 10 je uvádzané celkové množstvo bielkoviny v percentách pre rozrušené materiály zo zariadenia s tuhou podložkou alebo mriežkou. Protokoly pre materiály 1 až 4 sú uvedené v texte. Pri pozorovaní mikroskopom boli tuhé prvky zbavené bunkovej drviny, zatiaľ čo prvky v tvare mriežky obsahovali značné množstvo bunkovej drviny po štvrtom rozrušení buniek.

Na obr. 11 je znázornená rýchlosť príjmu glukózy ako funkcia času pre statický reaktor s mriežkou z nerezovej ocele 316. Reaktor bol infikovaný za použitia MOI 1 v 7. dni a kultúra bola ukončená v 28. dni.

Na obr. 12 je uvedené celkové množstvo bielkoviny v percentách a množstvo HAV Ag v rozrušených materiáloch zo statického zariadenia, rovnakého ako na obr. 11. Protokoly pre rozrušené materiály 1 až 4 sú uvedené v texte. Celkové množstvo bielkoviny v materiáli 1 bolo príliš vysoké vzhľadom na nedostatočné premytie PBS.

Na obr. 13 je znázornený vplyv MOI na rast buniek a na spotrebu glukózy. Bunkový materiál bol infikovaný za použitia hodnoty MOI 0,1a 10 a za použitia HAV CR326F P28. V tomto systéme nebolo možné pozorovať až do ôsmich dní po infekcii žiadne rozdiely v hustote buniek (obr. 13A) ani v hodnotách pre zvyšok glukózy (obr. 13B). Po ôsmich dňoch bolo do kultúr pridané čerstvé živné prostredie.

Na obr. 14 je znázornené meranie množstva bunkových bielkovín proti štandardu BSA, vztiahnuté na počet buniek. Vzťah je možné najlepšie opísať rovnicou

Y(10⁴) = -0,09 + 0.42X, pričom r = 0,99. Je zrejmé, že krivkou je možné vyjadriť celkovú bielkovinu v bunkovom materiáli MRC-5 bez ohľadu na životaschopnosť buniek.

Na obr. 15 sú znova vynesené hodnoty z obr. 14 tak, že je označený časový údaj pre každú hodnotu.

Na obr. 16 je znázornený vzťah celkového množstva bielkovín a počtu buniek, ktorý je blízky údajom pre hustotu buniek za použitia zariadenia Coulter Counter. Je pravdepodobné, že rozdiely, ktoré je možné pozorovať, sú spôsobené malým „objemom pufra na rozrušenie buniek pri izolácii z T-flaše s plochou 25 cm (bolo použitých 2 x 0,08 ml/cm ).

Na obr. 17 je znázornený stupeň, v ktorom sa čistenie vykonáva extrakciou rozpúšťadla, sú uvedené profily HPSEC.

Na obr. 18 je znázornený postup čistenia za použitia extrakcie rozpúšťadlom, sú uvedené hlavné zložky v získaných profiloch HPSEC.

Na obr. 19 je znázornený vplyv doby miešania na pomer antigénu hepatitídy A k nečistotám.

Na obr. 20 je uvedený vplyv doby miešania na plochu pre antigén hepatitídy A a pre nečistotu (trepacie fľaše s objemom 50 ml, 6 minút).

Na obr. 21 je znázornený vplyv doby miešania na plochu pre antigén hepatitídy A a pre nečistoty (trepacie fľaše s objemom 500 ml, 2 minúty).

Na obr. 22 je znázornený vplyv doby miešania a objemu skúmavky na plochy pre antigén hepatitídy A a pre nečistoty za použitia trepacieho zariadenia.

Na obr. 23 je znázornený vplyv pomeru rozpúšťadla a vody na pomer antigénu hepatitídy A a nečistôt.

Na obr. 24 je znázornený vplyv pomeru rozpúšťadla a vody na plochy pre antigén hepatitídy A a pre nečistoty za použitia trepacieho zariadenia.

Na obr. 25 je znázornený vplyv doby miešania a typu antigénu na pomer antigénu hepatitídy A a nečistôt.

Na obr. 26 je znázornená stálosť vzorky antigénu hepatitídy A pri stanovení HPSEC.

Na obr. 27 je znázornený vplyv solí na rozpustnosť antigénu hepatitídy A pri teplote 4 ‘C.

Na obr. 28 je znázornený vplyv solí na rozpustnosť antigénu hepatitídy A pri teplote 4 °C.

Na obr. 29 je znázornená kalibračná krivka pre molekulovú hmotnosť, PV4000 x 1.

Na obr. 30 je znázornený logaritmus hlavnej oblasti pre antigén hepatitídy A, ktorý je vynesený proti logaritmu koncentrácie antigénu hepatitídy A.

Na obr. 31 je znázornená kalibračná krivka pre antigén hepatitídy A.

Na obr. 32 je znázornené porovnanie filtrátu rozrušených buniek a vzoriek rozrušených buniek po pôsobení nukleázy v ultrafialovom svetle 214 nm.

Na obr. 33 je znázornené porovnanie filtrátu rozrušených buniek a vzorky rozrušených buniek po pôsobení nukleázy v ultrafialovom svetle pri 260 nm.

Na obr. 34 je znázornená resuspendovaná vzorka usadeniny PEC po odstredení, ultrafialové svetlo pri 214 nm.

Na obr. 35 je znázornený chloroformový extrakt vzorky vodnej fázy z R x 2011008, ultrafialové svetlo pri 214 nm.

Na obr. 36 je znázornená vzorka produktu z anionomeniča z R x 2009854, ultrafialové svetlo pri 214 nrn.

Na obr. 37 je znázornený produkt po chromatografii na géli, ultrafialové svetlo pri 214 nm.

Na obr. 38 je znázornená vzorka produktu SEC z R x 2011008, ultrafialové svetlo pri 214 nm, zadržaný vrchol je viditeľný po 49 minútach.

Na obr. 39 je znázornená korelácia výsledkov EIA a HPSEC pre vzorky z jedenástich šarží.

Na obr. 40 sú znázornené v percentách plochy pre štyri vzorky z trinástich šarží antigénu hepatitídy A.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Príprava očkovacieho materiálu vírusu hepatitídy A

Príprava očkovacieho materiálu vo veľkom meradle spočíva v tom, že sa infikujú spojité jednoduché vrstvy bunkovej kultúry MRC-5 v reaktore NUNC CELL FACTORIES s plochou 6000 cm . Bunková kultúra MRC-5 sa pestuje až do vytvorenia spojitej vrstvy a táto vrstva sa potom infikuje pri hodnote MOI približne 0,1. Po infekcii sa bunkový materiál .inkubuje 28 dní, pričom sa každý týždeň mení živné prostredie, obsahujúce 10 % objemových fetálneho teľacieho séra. Bolo dokázané, že pri vyššej koncentrácii séra 2 až 10 % objemových sa zvyšuje produkcia vírusu v porovnaní s použitím menšieho množstva séra 0,5 až 2 % objemové. Na konci tohto postupu obsahuje supernatant bunkovej kultúry veľké množstvo infekčného vírusu, v tomto príklade bola dosiahnutá hodnota 10 ’ TCID^Q/ml, tento supernatant sa získa priamo z reaktora bez rozrušenia buniek a použije sa ako zdroj zásobného očkovacieho materiálu vírusu. Týmto spôsobom je možné vo veľkom meradle ľahšie a reprodukovateľnejším spôsobom než v trepacích fľašiach alebo pri mechanickom oddelení buniek získať

3i veľké množstvá infekčného vírusu, ktoré sú potrebné na produkciu veľkých množstiev vakcíny.

Príklad 2

Zvýšenie produkcie vakcíny

Aby bolo možné vykonať fázu III klinických skúšok, je nutné zvýšiť produkciu vakcíny v porovnaní s množstvom, ktoré je možné získať laboratórnymi postupmi tak, aby bolo možné mať k dispozícii veľké množstvá vakcíny s obsahom vírusu hepatitídy A. Aby bolo možné výrobu uľahčiť, bolo nutné vykonať určité modifikácie dosiaľ známych postupov pestovania a čistenia HAV. Boli použité dva hlavné postupy na pestovanie buniek, reaktor Nunc Celí Factories a reaktory so statickým povrchom, napríklad Costar Cube. V tomto príklade sa opisuje použitie prvého z uvedených typov reaktorov, príklad 3 opisuje použitie statického reaktora Costar Cube.

Použitie reaktora Nunc Celí Factories na skúšku na účinnosť postupu podľa Monroa

Bol navrhnutý postup na zvýšenie výťažkov a získanie vyššieho množstva atenuovaného vírusu hepatitídy A, než bolo až dosiaľ možné pri vykonávaní známych postupov. Pôvodné trepacie fľaše boli nahradené Nunc Celí Factories, NCF. Základná jednotka NCF je tvorená platňou s plochou 600 cm na pestovanie bunkovej kultúry. Platne, tvoriace NCF sú vyrobené z polystyrénu, spracovaného na optimálne uchytenie buniek a pre ich rast do plochy podľa publikácie Maroudas, 1976, J. Celí Physiol., zv. 90, str. 511 až 520. Jednotka v tomto prípade obsahovala desať rovnakých platní s celkovým povrchom plochy 6000 cm . V dvoch rohoch sú upravené zvláštnym spôsobom konštruované otvory, ktoré vytvárajú vertikálne trubice, spájajúce platne do viacnásobných vrstiev. Tieto vertikálne trubice končia v dvoch adaptéroch so vzdušnými filtrami a teflónovými spojovacími časťami. Všetky jednotky sa sterilizujú ožiarením a sú dodávané pripravené na použitie .

Prostredie, v ktorom je bunková kultúra MRC-5 pestovaná v reaktore NCF je veľmi podobné prostrediu v trepacích fľašiach. Bunkový materiál je pestovaný v statickej kultúre, prilnieva k tuhej podložke, je prekrytý kvapalným prostredím a živiny a kyslík sa privádzajú do buniek difúziou. Použitie NCF zvyšuje reprodukovateľnosť postupu pri podobných podmienkach ako pri pestovaní bunkových kultúr v trepacích fľašiach. Spôsob oddelenia buniek a spracovanie sú však odlišné, ako bude ďalej opísané.

Príklad 3

Statický reaktor Costar Cube a jeho použitie na produkciu vo veľkom meradle

Cieľom uvedených postupov je získať čo najvyššiu možnú plochu na pestovanie buniek v reaktore a súčasne zaistiť dobré riadenie celého postupu. Reaktor NCF predstavuje len čiastočné riešenie tohto problému. Lepšie riešenie je možné dosiahnuť použitím reaktorov so statickým povrchom, SSR a to najmä reaktora typu Costar Cube a Státie Mixér. Reaktor Costar Cube je tvorený husto uloženými doskami z polystyrénu v sterilizovanej kocke z plastickej hmoty (Costar CS2000).

o

V jedinej kocke je k dispozícii 85 000 cm plochy na rast bunkového materiálu v porovnaní so 6000 cm v prípade reaktora NCF s desiatimi platňami. V reaktore, ktorý bol opísaný v US patentových spisoch č. 4 296 204 a 4 415 670 tvoria kovové, keramické, sklenené alebo plastické prvky rastové povrchy, uložené veľmi blízko seba. Tieto prvky je možné vyrábať a usporiadať tak, že je možné dosiahnuť ešte väčšie plochy v jedinom reaktore než v prípade reaktora Costar Cube a tak dosiahnuť veľké zintenzívnenie postupu. HAV bol úspešne pestovaný v oboch typoch reaktorov. Reaktory typu SSR sú opatrené cirkulačnou slučkou, ktorá dovoľuje recirkuláciu živného prostredia a doplnenie živín za súčasného prevzduš33 nenia, je tiež možné riadiť pH živného prostredia a množstvo rozpustených plynov v prostredí tak, aby boli splnené požiadavky bunkovej kultúry na kyslík a aby bolo privádzané dostatočné množstvo živín. Táto optimalizácia nie je možná v trepacích fľašiach alebo v reaktoroch typu NCF. Okrem toho je možné celé živné prostredie vymeniť na zlepšenie dostupnosti veľkých množstiev kľúčových živných látok. V týchto reaktoroch bolo tiež nahradené fetálne teľacie sérum s úspechom teľacím sérom, doplneným železom (Cat. A-2151, Hyclone Laboratories, Inc., Logan, UT) alebo ekvivalentným materiálom.

Príklad 4

Izolácia vírusu hepatitídy A z reaktora typu NCF alebo z reaktora so statickým povrchom pomocou zmáčadla Triton

Ani v reaktore typu NCF, ani v reaktoroch so statickým povrchom nie je možné mechanicky uvoľniť vrstvu infikovanej bunkovej kultúry MRC-5. Vírus hepatitídy A, spojený s bunkovým materiálom, je možné účinne izolovať rozrušením buniek zmáčadlom Triton a potom čistiť novým postupom. Roztok, získaný použitím zmáčadla je viac zriedený než pri mechanickom oddelení buniek z trepacích fliaš. Tento roztok sa teda zahustí diafiltráciou a potom sa pomocou absorpčného prostriedku XAD odstráni zvyšný Triton. Bolo dokázané, že použitím elektroforézy s kapilárnou oblasťou je možné túto látku odstrániť až na obsah nižší než 10 mikrogramov/ml. Potom sa HAV vyzráža polyetylénglykolom PEG, potom sa extrahuje zmesou chloroformu a izoamylalkoholu. Kontaminujúca DNA sa odstráni použitím stĺpca na odfiltrovanie DNA a potom sa vykonáva chromatografia na anionomeniči a na géli. Postup, v ktorom bol použitý reaktor NCF a rozrušenie buniek Tritonom neovplyvnil nepriaznivo imunogenitu čisteného, formaldehydom inaktivovaného vírusu hepatitídy A vo vakcíne.

- 34 Príklad 5

Pôsobenie nukleázy a zachytenie vírusu v chromatografickom stĺpci

Produktivita a reprodukovateľnosť postupu bola zvýšená tak, že materiál, získaný po pôsobení Tritomi bol spracovaný pôsobením endonukleázy a vírus bol potom koncentrovaný zachytením na chromatografickom stĺpci s obsahom anionomeniča, ako je znázornené na obr. 1. Táto modifikácia odstránila nutnosť použitia koncentrácie vírusu pomocou diafiltrácie, pôsobenia XAD a použitia stĺpca na odfiltrovanie DNA.

Pre uvedený postup bola zvolená nešpecifická endonukleáza, ktorá pôsobí na RNA aj na DNA. Táto endonukleáza, ktorá bola označená ako benzonáza, bola izolovaná zo Serratia inarcescens a bola klonovaná v Escherichia colž. Tento enzým je získaný vo veľmi čistej forme ako rekombinantná bielkovina (Nycomed Pharma A/S, Dánsko). Táto endonukleáza bola sčasti zvolená tiež pre svoju vysokú špecifickú účinnosť a preto, že je možné ju pridať priamo do surového materiálu po rozrušení buniek Tritonom vo veľmi malých množstvách, napríklad 10 mikrogramov enzýmu/1 materiálu. Boli vyvinuté skúšobné postupy, za využitia metódy Vestern blot pre špecifickú bielkovinu tohto enzýmu, okrem toho bola vyvinutá kinetická skúška na enzymatickú účinnosť tak, aby bolo možné merať odstránenie enzýmu pri následnom čistení. Väčšina, viac než 90 % pridanej endonukleázy sa odstráni vymytím a prechodom frakcie chromatografickým stĺpcom s obsahom anionomeniča tak, ako bude ďalej opísané. Týmto spôsobom sa po zachytení vírusu na chromatografickom stĺpci zníži obsah enzýmu viac než stokrát.

Príklad 6

a) Zachytenie vírusu

Vírus hepatitídy A sa koncentruje z materiálu po pôso35 bení Tritonu a potom nukleázy na stĺpci s obsahom anionomeniča za použitia nízkej iónovej sily, na elúciu sa použije 0,35 až 0,5 M chlorid sodný vo fosfátovom pufri. Týmto spôsobom sa vírus hepatitídy A koncentruje 30 x a súčasne sa obsah Tritónu znižuje na nemerateľné množstvo pri stanovení pomocou CZE.

b) Zrážanie PEG a extrakcia chloroformom

Vírus hepatitídy A po koncentrácii, diafiltrácii a spracovaní XAD alebo vírus, vymytý zo stĺpca, v ktorom bol zachytený sa vyzráža po'lyetylénglykolom PEG. V prípade, že sa vhodne upravia podmienky, ide o vysoko selektívny postup, hlavné nečistoty, ktoré sú inak čistené spoločne s vírusom, zostávajú rozpustné a sú odložené spolu so supernatantom. Zrazenina s obsahom vírusu po pôsobení PEG sa znova uvedie do suspenzie a potom sa extrahuje zmesou chloroformu a izoamylalkoholu v pomere 24:1 na odstránenie rozpustných lipidov a bielkovín, denaturovaných chloroformom, ktoré zostávajú na rozhraní medzi vodnou a organickou fázou.

c) Chromatografia na anionomeniči a chromatografia na géli na odstránenie produktov s určitou molekulovou hmotnosťou

Vodný extrakt po extrakcii chloroformom sa nanesie na stĺpec anionomeniča pri nízkom obsahu soli a potom sa vymýva použitím gradientu chloridu sodného až do hodnoty 1,0 M. Konečná chromatografia na géli vedie k získaniu vysoko čisteného preparátu vírusu, ako je zrejmé z obr. 2.

d) Inaktivácia

Inaktivácia vírusu hepatitídy A formaldehydom bola predtým vykonávaná použitím 93 mikrogramov formaldehydu/ml, čo znamená pomer 1:4000, postup sa vykonáva pri teplote 37 °C pre koncentrácie antigénu v podstate také, ako sa použi vajú na imunizáciu. Za týchto podmienok prebieha inaktivácia vírusu s polčasom približne dve hodiny, čo zodpovedá strate približne 3,5 log 10 TCID^q (50% infekčná dávka pre tkanivové kultúry) za deň. Zníženie na 7 log infektivity vírusu bolo dosiahnuté po 2 dňoch, avšak doba inaktivácie bola predĺžená na 20 dní tak, aby bolo možné zaistiť široké hranice bezpečnosti použitia vakcíny a čo naj úplnejšiu inaktiváciu vírusu.

Pokusy, vykonávané v malom meradle potvrdili, že pri zvýšení koncentrácie formaldehydu sa zrýchľuje a zvyšuje inaktivácia, ako je možné merať stratou hodnoty TCID^q. Inaktivácia sa menila priamo úmerne v závislosti na koncentrácii formaldehydu, ako bolo v pokusoch ukázané. V kultúrach bolo použitých 200 ekvivalentov, bolo možné potvrdiť úplnú inaktiváciu v prípade, že vírus bol inkubovaný spolu s 370 mikrogramami/ml formaldehydu, to znamená v riedení 1: 1000 pri teplote 37 °C po dobu 5 dní. Pri modifikovaných podmienkach inaktivácie bolo týmto spôsobom možné dosiahnuť rovnaké hranice bezpečnosti ako pri použití predchádzajúceho postupu. Táto skutočnosť bola potvrdená v priebehu troch skúšok na inaktiváciu, vykonaných za identických podmienok s následnou adsorpciou na hydroxid hlinitý za získania vakcíny, vhodnej na klinické skúšky. Bola dosiahnutá približne štvornásobná rýchlosť inaktivácie v porovnaní s použitím nižšej koncentrácie formaldehydu, čo je v súlade so skúškami, ktoré boli vykonávané v malom meradle. Vzorky dvoch vakcín, adsorbovaných na hydroxid hlinitý boli skúšané u myší na imunogenitu, pričom hodnoty ED^q boli podobné ako pre predchádzajúce vakcíny, menej než 2 ng.

e) Adsorpcia na hydroxid hlinitý

Adsorpcia na hydroxid hlinitý bola uskutočnená súčasným zrážaním vírusu, inaktivovaného .farmaldehydom a hydroxidu hlinitého. Postup, ktorý bol použitý pre všetky klinické vzorky bol v podstate rovnaký, jedinou zmenou bola koncentrácia vírusu vo východiskovom roztoku, inaktivovanom form- 37 aldehydom. Priame zrážanie inaktivovaného vírusu na hydroxid hlinitý bolo vykonávané tak, že bol najskôr k východiskovému roztoku po inaktivácii formaldehydom pridaný síran hlinito-draselný. Potom bola vytvorená zrazenina pridaním hydroxidu sodného. Formaldehyd a zvyšné soli boli odstránené odobratím supernatantu zo suspenzie, objem bol nahradený fyziologickým roztokom chloridu sodného.

Príklad 7 ·

Čistota výsledného HAV

Na sledovanie postupu čistenia bola použitá vysokotlaká chromatografia na géli, HPSEC, EIA a SDS-PAGE, aby bolo možné zaistiť reprodukovateľné výťažky vysoko čistej vakcíny. HPSEC je prostriedkom, ktorým je možné sledovať stratu nukleovej kyseliny v priebehu pôsobenia nukleázy a tiež stanoviť čistotu v neskorších stupňoch postupu. Chromatogramy na obr. 2 ukazujú, že v zrazenine po pôsobení PEG je možné pozorovať vrchol, zodpovedajúci vírusu hepatitídy A. Tento vírus je koncentrovaný po extrakcii rozpúšťadlom a potom znova v stupni za použitia ionomeniča. Konečnou filtráciou na géli sa získa vysoko čistý vírus s čistotou vyššou než 95 % pri elektroforéze na SDS-PAGE pri farbení striebrom. Nezávislým meradlom pre čistotu produktu HAV je jediný symetrický vrchol pri vykonávaní HPSEC, ako je zrejmé z obr. 2, 37 a 38.

Odstránenie nečistôt

Analýza CZE na vzorkách v priebehu postupu ukazuje, že Triton je odstránený pri koncentrácii diafiltráciou podľa Monroa a pri zachytení vírusu na stĺpci. Okrem toho prechádza použitý enzým benzonáza stĺpcom, na ktorom bol vírus zachytený. Množstvo tohto enzýmu po prechode stĺpcom anionomeniča je pod hranicou detekcie (nižšie než 18 .femptogramov enzýmu a menej než 30 pg enzýmu/25 jednotiek vírusu, hranice

- 38 pri tejto skúške sú 12,5 pg).

Príklad 8

Čistenie vírusu hepatitídy A z reaktora NCF alebo zo statického reaktora pomocou zmáčadla Tritonu, sledovanie podľa Monroa

Vírus HAV bol pestovaný v podstate spôsobom podľa príkladu 2 použitím reaktora typu NCF. Bunková kultúra MRC-5 bola pestovaná po vsádzkach v 60 reaktoroch NCF s plochou vždy 6000 cm^ pri teplote 37 °C po dobu 7 dní použitím Villiamsovho prostredia E, doplneného 10 % objemovými fetálneho teľacieho séra a neomycín sulfátom. V 7. dni bolo živné prostredie vymenené za čerstvé prostredie s obsahom dostatočného množstva vírusu na infekciu kultúr použitím približne 0,1 MOI a kultúry boli prenesené do prostredia s teplotou 32 °C a pri tejto skúške boli ďalej inkubované 21 dní pri výmene prostredia raz týždenne. Vírus bol izolovaný tak, že k vrstve bol pridaný pufer na rozrušenie buniek, obsahujúci 0,1 % Tritónu X-100, 10 mM tris, 1 mM chlorid horečnatý pri pH 7,5. Výsledný materiál z reaktorov NCF bol spojený a zmrazený na neskoršie spracovanie.

litre vírusu hepatitídy A, získaného z kultúry v reaktore NCF po pôsobení zmáčadla Triton X-100 boli rozmrazené vo vodnom kúpeli s teplotou 20 “C až 30 °C v priebehu 4 hodín a potom bol materiál prefiltrovaný. Po filtrácii bol materiál desaťkrát zahustený v zariadení Pellicon použitím membrány, oddeľujúcej zlúčeniny s molekulovou hmotnosťou 300 000. Koncentrát v množstve približne 400 ml bol podrobený diafiltrácii proti 10 mM tris-HCl pufra s pH 7,5 s obsahom 150 mM NaCl a 1 mM EDTA. Triton bol odstránený použitím polymérnej živice Amberlit XAD-4 (Rohm a Haas Company) v množstve 30 mg/ml rozrušeného materiálu. Po odfiltrovaní XAD-4 bol materiál upravený na koncentráciu 510 mM NaCl a potom bol vyzrážaný pridaním polyetylénglykolu PEG 8000 (Sigma) do konečnej koncentrácie 5 % objemových. Zmes bola energicky pretrepaná, inkubovaná 1 hodinu pri teplote 4 °C a potom odstredená 10 minút pri tej istej teplote pri 1000 x g. Po odstredení bol supernatant odstránený a odložený.

Zrazenina potom bola rozpustená v pufri s obsahom 6,2 mM fosforečnanu sodného s pH 7,2 s obsahom 120 mM NaCl a 1 mM EDTA. Usadenina, znova uvedená do suspenzie potom bola extrahovaná rovnakým objemom zmesi chloroformu a izoamylalkoholu v objemovom pomere 24:1. Zmes bola energicky pretrepaná a potom odstredená 10 minút pri 3000 x g pri teplote 20 °C. Rozhranie, obsahujúce nerozpustný materiál bolo znova extrahované tou istou zmesou organického rozpúšťadla za použitia 30 % pôvodného objemu. Po odstredení boli obe vodné fázy spojené. Chloroformový extrakt bol potom upravený na koncentráciu 350 mM NaCl a chromatografovaný na stĺpci DEAE-Sepharosy CL5B (Pharmacia) na adsorpciu DNA. Frakcia, ktorá prešla stĺpcom a obsahovala HAV, bolo oddelená a trikrát zriedená pufrom s obsahom 6,2 mM fosfátu sodného s pH 7,5 a potom chromatografovaná na stĺpci Toyopearl DEAE 650M (Toso Haas) pri elúcii gradientom až do IM NaCl. Vírus hepatitídy A bol vymývaný použitím 15 až 30 % 1 M pufra, čo zodpovedá 15 až 30 mS. Frakcie z tejto oblasti boli spojené a potom chromatografované na stĺpci Sepharosv CL4B (Pharmacia) v pufri s obsahom 6,2 mM fosforečnanu sodného so 120 mM NaCl. Materiál, nanesený na tento stĺpec mal objem väčší než 1 %, avšak menší než 5 % objemu stĺpca. Produkt bol vymývaný medzi 46 a 64 % celkového objemu stĺpca.

Výsledný čistený materiál bol sterilizovaný filtráciou cez filter s otvormi s priemerom 0,22 mikrometrov a potom bol inaktivovaný formaldehydom v riedení 1:4000 (išlo o formaldehyd s obsahom 37 až 40 % hmotnostných tejto látky) pri teplote 37 °C po dobu 20 dní. Za týchto podmienok dochádza ku kinetike prvého rádu s polčasom 2 hodiny pri strate približne 3,5 log 10 TCID^q/24 hodín. Doba inaktivácie bola predĺžená na 20 dní, aby bolo možné zaistiť vysokú bezpečnosť použitia. Na inaktiváciu vírusu hepatitídy A bol pridaný síran hlinito-draselný a potom bol roztok vyzrážaný pridaním hydroxidu sodného do pH 6,6 až 6,8. Formaldehyd a zvyšné soli boli odstránené odstredenim, pri ktorom bol supernatant odstránený a nahradený fyziologickým roztokom chloridu sodného.

Príklad 9

Čistenie vírusu hepatitídy A, izolovanej z reaktora Costar Cubes za použitia Tritónu X-100 pôsobením nukleázy s následným zachytením chromatografiou, priemyselný postup

V priemyselnom meradle je možné materiál pripraviť použitím propagácie vírusu v reaktoroch typu SSR. Ako rastové prostredie boli použité reaktory Costar Cube, ktoré boli napojené na zariadenie na prevzdušnenie Costar CS2000 za použitia vonkajšej slučky a čerpadla na obeh živného prostredia, ako bolo opísané v príklade 3. Bunková kultúra MRC-5, bola naočkovaná do týchto reaktorov a pestovaná 7 dní pri teplote 37 °C. Obeh živného prostredia bol zahájený po dvoch dňoch. Reaktor bol kontinuálne premývaný Villiamsovým prostredím E, doplneným 10 % objemovými teľacieho séra s prídavkom železa a neomycínsulfátom. Súčasne bolo pH upravené na hodnotu 6,9 až 7,6 a množstvo rozpusteného kyslíka v reaktore sa pohybovalo v rozmedzí 15 až 100 % nasýtenia živného prostredia vzduchom. Bunkový materiál bol pestovaný približne 7 dní a potom bol do reaktora naočkovaný vírus v množstve približne 0,1 MOI za použitia očkovacieho materiálu, pripraveného podľa príkladu 1. Teplota v reaktore bola znížená na 32 °C a bunkový materiál bol pestovaný ešte 21 dní. Potom bolo živné prostredie vypustené a na uvoľnenie HAV bol použitý 0,1% Triton s 10 mM tris-pufra. s pH 7,5. Ako je zrejmé z príkladu 10, boli analyzované štyri šarže vírusu, získané týmto spôsobom v reaktore Costar Cube a bolo možné dokázať, že bol získaný 2,8-násobok priemerného množstva, ktoré je možné získať v reaktoroch NCF podľa Monroa. Je teda zrejmé, že použitím statických reaktorov s vysokým povrchom je možné získať vysoké množstvo vírusu.

Získaný materiál sa podrobí pôsobeniu enzýmu benzonázy na uvoľnenie vírusu od naviazaných nukleových kyselín po zachytení vírusu na stĺpci anionomeniča. Pri pôsobení enzýmu už nie je potrebné uskutočniť koncentráciu, diafiltráciu, pôsobenie XAD-4 v stĺpci a nie je potrebné zaradiť stĺpec na odfiltrovanie DNA, ako už bolo uvedené v príklade 8.

litrov materiálu z reaktora Costar Cube po pôsobení Tritonu X-100 bolo podrobených pôsobeniu 5 až 25 mikrogramov benzonázy/1 v prítomnosti 1 mM chloridu horečnatého a potom bol materiál prefiltrovaný cez filter s priemerom otvorov 0,22 mikrometrov kvôli sterilizácii. Zmes bola inkubovaná 18 hodín pri teplote 25 °C a potom bol materiál, spracovaný enzýmom naneseným na stĺpec anionomeniča Toyopearl DEAE 650M v rovnovážnom stave v pufri s fosforečnanom sodným v koncentrácii 4,7 mM s obsahom 90 mM NaCl. Približne 800 ml frakcie s obsahom vírusu hepatitídy A bolo vymytých použitím pufra s 6,2 mM fosforečnanom sodným s obsahom 0,25 M NaCl a 1 mM EDTA. Boli vyvinuté postupy na stanovenie účinnosti enzýmu na sledovanie množstva enzýmu v priebehu postupu. Výsledky týchto skúšok dokazujú, že viac než 90 % endonukleázy je možné odstrániť premytím na stĺpci, v ktorom dochádza k zachyteniu vírusu. Okrem toho došlo v priebehu postupu k zníženiu celkového množstva nukleázy vrátane pridanej benzonázy viac než 100 x v porovnaní s množstvom, ktoré bolo pôvodne prítomné v materiáli po rozrušení Tritonom X-100.

Koncentrácia chloridu sodného v produkte po prechode stĺpcom na zachytenie vírusu sa upraví na 420 mM a vírus sa vyzráža polyetylénglykolom PEG 8000 (Sigma) v konečnej koncentrácii 4,5 %. Zmes sa energicky premieša a potom sa jednu hodinu inkubuje pri teplote 4 °C. Po tejto dobe inkubácie sa zrazenina oddelí odstredením 10 minút pri 1000 x g pri tej istej teplote. Supernatant sa oddelí a odloží a zrazenina sa znova uvedie do suspenzie v pufri so 6,2 mM fosforečnanom sodným s pH 7,2 s obsahom 120 mM NaCl a 1 mM EDTA. Extrakcia zrazeniny, znovu uvedenej do suspenzie organickým rozpúšťadlom sa vykonáva pridaním 1,5 objemu chloroformu a izoamylalkoholu v objemovom pomere 24:1. Oddelenie fáz sa uľahčí odstredením 10 minút pri 3000 x g pri teplote 20 °C, horná vodná fáza sa oddelí a uschová. Rozhranie sa znovu extrahuje 30 % pôvodného objemu zmesi organických rozpúšťadiel, odstredí sa a druhá vodná fáza sa spojí s prvou vodnou fázou.

Vodný extrakt sa chromatografuje na stĺpci s náplňou Toyopearl DEAE 650M (Toso Haas), táto matrica anionomeniča sa potom podrobí elúcii za použitia gradientu do 1 M chloridu sodného. Vírus hepatitídy A sa vymýva pri 15 až 30 % tohto gradientu, čo zodpovedá 15 až 30 mS. Frakcie z tejto oblasti sa spoja a podrobia chromatografii na géli, ku ktorej sa použijú dva stĺpce, s náplňou Toyopearl HV55S a HV65S, zaradené za sebou. Za týchto podmienok sa nachádza vírus hepatitídy A v objeme pre obe matrice a zostava stĺpcov, zaradených za sebou bola použitá na oddelenie nečistôt s vyššou a nižšou molekulovou hmotnosťou. Stĺpce boli v rovnovážnom stave v pufri so 6,2 mM fosforečnanom sodným s pH 7,2 s obsahom 120 mM NaCl. Vírus hepatitídy A sa vymýval vo forme symetrického vrcholu a príslušné frakcie boli spoj ené.

Produkt po chromatografii na géli a po sterilizácii filtráciou cez filter s priemerom otvorov 0,22 mikrometrov bol inaktivovaný pri koncentrácii približne 500 jednotiek/ml (jedna jednotka zodpovedá približne 1 ng bielkoviny vírusu) za použitia 370 mikrogramov/ml formaldehydu s obsahom 37 až 40 % hmotnostných tejto látky, ide teda o riedenie 1:1000, pôsobenie tejto látky trvá 5 dní pri teplote 37 ⁹C. Inaktivovaný vírus hepatitídy A bol sterilizovaný filtráciou za použitia filtra s priemerom otvorov 22 mikrometrov. Súčasné zrážanie s hydroxidom hlinitým bolo vykonávané počiatočným pridaním síranu hlinito-draselného a potom titráciou do pH 6,6 až 6,8 hydroxidom sodným. Zvyšné soli a formaldehyd boli odstránené usadením a zliatím a potom bol supernatant odstránený a nahradený fyziologickým roztokom chloridu sodného.

- 43 Príklad 10

Produkt, získaný vyššie opísaným spôsobom bol potom podrobený analýze, bola uskutočnená analýza aminokyselín v bielkovine vírusu hydrolýzou v plynnej fáze s následným značením PITC a vysokotlakou kvapalinovou chromatografiou v reverznej fáze, antigén HAV bol stanovený enzymatickou imunologickou skúškou na tuhej fáze, ktorá bola vykonávaná tak, že bol antigén viazaný na ľudskú polyklonálnu protilátku s následnou detekciou pomocou myšej monoklonálnej protilátky a kozej protilátky proti myšacej protilátke, konjugovanej s peroxidázou. Uhľohydráty boli stanovené buď ako glukóza alebo od glukózy odlišné, ktoré boli prítomné v produkte v množstve nižšom než 0,1 mikrogramov na 1 mikrogram bielkoviny v produkte. Stanovenie bolo vykonávané chromatografiou na anionomeniči pri vysokom pH a tiež amperometrickou detekciou (HPAEC-PAD, hydrolýza v kyslom prostredí za použitia 2 N kyseliny trifluóroctovej s následnou analýzou HPLC). Analýza DNA hostiteľských buniek bola stano- • vená hybridizáciou DNA (metóda dot-blot za použitia fragmentu Alu DNA ako hybridizačnej sondy). Mastné kyseliny boli * stanovené za použitia plynovej chromatografie (bol pripravený celý rad metylesterovj mastných kyselín s následnou kapilárnou plynovou chromatografiou). RNA bola stanovená hydrolýzou s následnou analýzóu vzniknutých ribonukleotidov pomocou HPLC v reverznej fáze.

Okrem ďalej uvedených údajov, ktoré boli získané vyššie uvedenými postupmi bola vykonaná ešte analýza SDS-PAGE a detekcia bielkovín farbením striebrom alebo metódou Vestern blot za použitia protilátok proti HAV, tieto postupy preukázali len prítomnosť bielkovín, špecifických pre HAV za použitia 50 až 300 ng bielkoviny. Okrem toho bola preukázaná prítomnosť úplných kapsidov HAV analýzou RNA, špecifické pre HAV pri hybridizácii so sondami DNA, špecifickými pre HAV,

I za použitia sacharózového hustotného gradientu a HPLC v rei verznej fáze. RNA, špecifická pre HAV bola prítomná v produkte v množstve 0,1 až Oj, 2 mikrogramov na mikrogram bielkoI

I viny. Toto množstvo špecifickej RNA je v súlade s pomerom približne 1/3 úplných kapsidov a 2/3 prázdnych kapsidov HAV. Nezávislá skúška na čistotu HAV je znázornená na obr. 2, kde pri analýze HPLC bol dokázaný jediný vrchol pre HAV.

Absolútne koncentrácie bielkovín, uhľohydrátov, lipidov a DNA sú uvedené v časti A nasledujúcej tabuľky. Údaje z časti A sú v časti B premenené na mikrogramy bielkoviny a v časti C na percentá hmotnostnej bielkoviny (ide o pomer hmotnosti prítomných uhľohydrátov a hmotnosti bielkoviny, násobené 100, pre ostatné zložky je výpočet podobný).

Výsledky týchto analýz sú ďalej uvedené pre osem šarží HAV, ktoré boli pripravené spôsobom podľa vynálezu, upraveným na získanie veľkého množstva vírusu.

A. Analýza produktu

šarža č.	bielkovina gg/ml	RNA gg/ml	uhľohydráty celkom gg/ml	DNA* gg/ml	mastné kyseliny gg/ml
1	14,7	2,4	3,4	<0,0045	<0,3
2	8,0	1,1	3,7	<0,0003	<0,3
3	18,9	2,1	0,9	<0,0003	<0,3
4	17,0	1,5	2,5	<0,0003	<0,3
5	16,6	2,5	2,2	<0,0045	<0,3
6	8,4	1,5	1,1	<0,0003	<0,3
7	14,5	1,4	1,5	<0,0003	<0,3
4	14,6	1,8	1,2	<0,0003	<0,3

B. Údaje v percentách šarža č. RNA uhľohydráty DNA mastné kyseliny

1	16	23		<0,036	<2,0
2	14	46		<0,004	<3,8
3	11	5		<0,002	<1,6
4	9	15		<0,002	<1,8
5	15	13		<0,002	<1,8
6	18	13		<0,004	<3,6
7	10	10		<0,002	<2,1
8	12	8		<0,002	<2,1
*	Medza detekcie	LOD	pre	prvú vzorku bola 0,0045
	mikrogramov/ml,	u ďalších	vzoriek vzrástla	na 0,003
	mikrogramy/ml.
	Predchádzaj úce	údaj e	sú	charakteristické pre produkt
podľa vynálezu pred	inaktiváciou a pred zrážaním	s hydroxi-
dom	hlinitým, ďalej	je uvedené	zloženie HAV v mikrogramoch
na	báze bielkoviny,	pričom	HAV	obsahoval viac než	95 % biel-
kov	iny, typickej pre	vírus	pri	analýze SDS-PAGE a	pri farbe-
n í	striebrom.
Uhľohydráty-glukóza			0,1 - 2,5	Pg
uhľohydráty, odlišné	od glukózy	0,2
DNA				0,004
lip	idy			0,1 |ig
RNA	z HAV			0,1 - 0,2	Pg
	S výhodou boli	tieto	analýzy vykonávané na	čistenom

výslednom HAV podľa vynálezu v okamžiku, kedy je vírus najviac koncentrovaný pred inaktiváciou a spracovaním na vakcínu. Avšak použitím dostatočného množstva inaktivovaného vírusu alebo hotovej vakcíny by analýza pravdepodobne ukázala v podstate rovnaký výsledok. V jednom zo zvlášť výhodných uskutočnení má vakcína podľa vynálezu nasledujúce zloženie pri obsahu vírusu 25 jednotiek/O,5 ml.

zložka množstvo

chlorid sodný	4500	Mg
hydroxid hlinitý	250	Mg
tetraboritan sodný	19	Mg
farmaldehyd	<200	ng+
bielkovina	25	ngx+
glukóza (polymér)	<20	ngx+
chloroform	<22	ngx+
RNA z HAV	5	ngx+
uhľohydráty, odlišné od
glukózy	<4	ngx+
mastné kyseliny	<1	ngx+
neomycín	<1	ngx+
DNA z MRC-5	<0,005	ngx+
sérový albumín hovädzieho
dobytka	<0,02	ngx+
benzonáza	<0,00002	ngx+4=

x extrapolácia z analýzy celého produktu vírusu + z analýzy odobraných vzoriek jednotlivých šarží

4= na báze účinnosti

Príklad 11

Porovnanie rôznych produktov HAV

Čistený produkt HAV podľa vynálezu bol porovnaný s inými podobnými produktami tak, ako sú opísané svojimi výrobcami. Výsledky tohto porovnania sú uvedené v nasledujúcej tabuľke 1.

Z uvedených údajov a z informácií, ktoré boli uvedené vyššie v príklade 10 je zrejmé, že produkt podľa vynálezu je čistejší, najmä na báze pomeru antigénu HAV k celkovému množstvu bielkovín a tiež pokiaľ ide o analýzu aminokyselín, okrem toho je produkt úplnejšie charakterizovaný a pri jeho použití je potrebné najnižšie množstvo vírusovej bielkoviny na dosiahnutie tvorby protilátok a ochrany v porovnaní s akýmkoľvek skôr pripraveným produktom, pre ktorý sú známe analytické údaje.

Tabuľka 1

Porovnanie vakcín, obsahujúcich inaktivovaný vírus HAV vakcína bielkovina bielkovina čistota

	celkom ng/dávka	vírusu ng/dávka	bielkoviny
podľa vynálezu SmithKline Beecham japonská vakcína3	25b-100 2000b	25c-100 300 - 500d 1000d	>95e’f >25f >95e

a. Vakcína, vytvorená spoločnosťou prác Chemo-Sero-Therapeutic Research Inštitúte, Chiba Sérum Inštitúte a Denka Bio-Research Inštitúte.

b. Na báze analýzy aminokyselín, AAA.

c. Definované pomocou imunologickej skúšky na antigén HAV a pri tejto enzymatickej skúške bol kalibračným štandardom čistený vírus s čistotou vyššou než 90 % pri analýze SDS-PAGE pri farební striebrom, bielkovina bola definovaná pomocou AAA.

d. Definované enzymatickou imunologickou skúškou na antigén HAV, kalibračný štandard nie je definovaný.

e. Definované analýzou SDS-PAGE.

f. Definované ako pomer antigénu HAV k celkovému množstvu bielkoviny.

Príklad 12

Účinnosť vakcíny - skúška podlá Monroa

Vakcína bola pripravená tak, že bunkový materiál MRC-5, pestovaný v súvislej vrstve v reaktore typu NCF bol infikovaný HAV kmeňom CR326F. Kultúra bola udržovaná niekoľko týždňov pri pravidelnom prívode živného prostredia. V príslušnej dobe boli infikované kultúry MRC-5 v súvislej vrstve buniek podrobené pôsobeniu zmáčadla a takto získaný HAV bol čistený spôsobom podlá vynálezu, ako je pre reaktory NCF znázornené na obr. 1. Vodný roztok vírusu bol adsorbovaný na hydroxid hlinitý a uložený pri teplote 2 až 8 °C. Dávky po 0,6 ml obsahovali 25 jednotiek antigénu vírusu hepatitídy A pri stanovení rádioimunologickou skúškou proti čistenému štandardu vírusu a 300 mikrogramom hydroxidu hlinitého. Placebo obsahovalo 300 mikrogramov hydroxidu hlinitého a timerosal v riedení 1:20 000. Vakcína bola podaná zdravým, seronegatívnym osobám s vysokým rizikom infekcie HAV, bolo podaných 0,6 ml vakcíny alebo placeba, očkovanie bolo vykonané jedinou dávkou. Krvné vzorky boli odobrané v deň očkovania a po jednom mesiaci. Takmer 100 % očkovaných bolo zbavených infekcie HAV po 50 dňoch, táto skúška bola vykonaná z toho dôvodu, aby bolo možné vyradiť osoby, infikované HAV pred očkovaním. Na druhej strane sa infikoval celý rad osôb, ktorým bolo podané placebo. Tieto súbory osôb sú dostatočne velké na dôkaz štatistickej významnosti ochrany proti infekcii po podaní vakcíny.

Príklad 13

Produkcia vírusu v štatistickom reaktore s obehom prostredia

Vírus hepatitídy A bol pestovaný v statickom reaktore SSR, ktorý bol tvorený vlastným reaktorom, opatreným vonkajšou slučkou na spojenie so zariadením na prevzdušnenie a čerpadlom (Charles River Biological Systems CRBS 5300).

Vlastný reaktor mal tvar valca, vyrobeného z prvkov z kovu s obsahom titánu pri celkovom povrchu 260 000 cm , priemer valca bol približne 20 cm a jeho dĺžka 1 m. Bunková kultúra MRC-5 bola do reaktora naočkovaná a potom pestovaná 7 dní pri teplote 37 °C vo Villiamsovom prostredí E, doplnenom 10 % objemovými fetálneho teľacieho séra a neomycinsulfátom. Bunková kultúra bola pestovaná 7 dní, pričom časť prostredia bola rrikrát týždenne vymenená tak, aby boli splnené podmienky na prívod živín, tak ako sú stanovené podľa Monroa pre pestovanie v reaktore typu NCF. Potom bol na infekciu bunkovej kultúry použitý vírus pri približne 0,1 MOI a teplota v reaktore bola znížená na 32 °C a kultúra bola ďalej pestovaná 22 dní. Potom bolo použité živné prostredie z reaktora vypustené a na uvoľnenie vírusu bol použitý pufer s obsahom 0,1 % hmotnostných Tritonu. V tomto reaktore je možné získať približne o 50 % vyššie množstvo antigénu HAV, vztiahnuté na jednotku plochy než v kontrolných T-fľašiach, naočkovaných tým istým vírusom za použitia toho istého postupu ako v reaktore. Pestovanie HAV v tomto reaktore je tiež výhodnejšie v porovnaní s reaktorom NCF, tak ako bolo opísané v príklade 2.

Príklad 14

Výroba HAV v statickom reaktore za použitia mriežok z nerezovej ocele

Materiály a metódy

Bunková kultúra

Vo všetkých pokusoch bola použitá bunková kultúra MRC-5 pri PDL ž 40. Bunkový materiál bol pestovaný vo Villiamsovom prostredí E s obsahom 10 % teľacieho séra, obohateného železom, 2 mM glutamínu a 50 mg/1 neomycínu pri teplote 37 °C. K použitému prostrediu bolo pridaných 0,1 %

Pluronic F-68, bol použitý reaktor typu tanku s obehom živ ného prostredia. Na naočkovanie nových povrchov bolo použi9 tých 10 000 buniek/cm . Počet buniek bol stanovený použitím počítacieho zariadenia Coulter Counter a/alebo hematocytometrom za použitia farbenia tryptanovou modrou na stanovenie životaschopnosti buniek.

Bunková kultúra na kovových plochách

Úsek tuhého kovu alebo kovovej siete s rozmermi 5x5 cm bol uložený do sklenenej Petriho misky s plochou 150 cm a sterilizovaný. Po ochladení bolo do misky pridaných 90 ml živného prostredia a bunkový očkovací materiál. Množstvo živného prostredia bolo dostatočné na úplné prekrytie povrchu kovu. Po jednom dni pri teplote 37 °C bol úsek kovu vybraný použitím sterilných klieští a uložený do novej sterilnej misky tak, aby bolo možné odčítať bunkový materiál na povrchu skla, miska opäť obsahovala 90 ml živného prostredia. Pevné úseky kovu boli spracované pôsobením trypsínu tak, že boli dvakrát premyté fyziologickým roztokom chloridu sodného s fosfátovým pufrom, PBS a potom boli pridané 2 ml trypsínu. Hneď ako začalo dochádzať k uvoľneniu buniek, bol úsek kovu jemne obmývaný trypsínom pomocou pipety, aby došlo k úplnému uvoľneniu všetkých buniek.

Zásobná kultúra vírusu a infekcie

Zásobná kultúra vírusu hepatitídy A, CR32F P28 s titrom 10° TCID^g/ml bola použitá pre všetky skúšky. Uvádzané hodnoty MOI boli vypočítané ako TCID^g/bunka a nie ako PFU/bunka. Bunkové kultúry boli infikované pridaním zásobného vírusu k čerstvému živnému prostrediu, toto prostredie potom bolo pridané ku kultúre. Po infekcii boli bunkové kultúry inkubované pri teplote 32 C.

Farbenie na kupónoch na stanovenie životaschopnosti buniek

Životaschopnosť buniek na úsekoch alebo kupónoch kovu bola stanovená farbením fluoresceíndiacetátom FDA a etidium bromidom EB. V prípade životaschopných buniek je FDA rozštiepený esterázami z cytoplazmy, uvoľní sa voľný fluoresceín, ktorý potom fluoreskuje na zeleno. Oproti tomu RB rýchlo preniká do DNA jadier neživotaschopných buniek a fluoreskuje na červeno. Bunkové kultúry boli farbené oboma farbivami súčasne. Roztok obsahoval 100 mikrolitrov zásobného roztoku FDA s obsahom 5 mg tejto látky/ml v acetóne a 200 mikrolitrov zásobného roztoku EB, obsahujúceho 10 mg/ml tejto látky v PBS, uvedené množstvá boli pridané do 50 ml PBS. Potom bola kovová mriežka s bunkovým materiálom v tomto roztoku s objemom 5 ml inkubovaná 5 až 6 minút. Po farbení bola mriežka umytá vždy 20 ml PBS a potom uložená medzi dve sklíčka. Potom bola vzorka pozorovaná v mikroskope (BioRad MRC-600).

Statický reaktor s obehom živného prostredia

Kovové mriežky, známe ako E-pack a tuhé úseky nerezovej ocele 316 boli ako prvky pre statický reaktor SMV získané od Koch Engineering (Vichita, KS). Všetky prvky mali rozmer približne 5x5 cm a boli vyrobené z nerezovej ocele o

316 alebo z titánu. Povrch tuhých prvkov bol 1300 cm , povrch mriežok 2300 cm . Pomer povrchu k objemu kvapalného prostredia bol pre mriežky 26 cm /ml (približne 24 cm /ml na báze celkového objemu reaktora). Päť prvkov bolo zvyčajne uložených do sklenených valcov s rozmermi 5 x 26,5 cm, opatrených pomôckami na zachytenie mriežok a zakončením typu PTFE. Prvky boli uložené kolmo na smer obehu živného prostredia. Valec, naplnený týmito prvkami bol použitý ako reaktor na pestovanie buniek. Nádoba, prepojená s reaktorom a spojená s elektronickými riadiacimi prvkami bola použitá na úpravu pH na hodnotu 7,2 až 7,3a DO v rozmedzí 80 až 90 %. Prostredie obiehalo z tejto nádoby do reaktora a späť pomocou peristaltického čerpadla.

Kultúra bola zahájená pri nižšej obehovej rýchlosti tak, aby bunkový materiál mohol priľnúť k podložke. Očkovací

- 52 materiál bol do systému pridaný a potom bolo prostredie recirkulované 5 minút rýchlosťou 100 ml za minútu tak, aby došlo k premiešaniu buniek so živným prostredím. V priebehu tohto rýchleho obehu sa zachytilo len veľmi malé množstvo buniek na rastovej ploche. Potom bola rýchlosť obehu znížená na približne 2 ml za minútu, čo je rýchlosť, pri ktorej môže dôjsť k pomalému usadzovaniu buniek. Bolo dokázané, že táto rýchlosť je optimálna pre zachytenie buniek na rastových plochách za súčasnej rovnomernej distribúcie buniek v reaktore .

Rozrušenie buniek

Na rozrušenie buniek bol použitý pufer s obsahom 0,1 % Tritonu X-100, 10 mM tris a 1 mM chloridu horečnatého. T-fľaše boli dvakrát premyté množstvom 0,3 ml/cm PBS a potom boli kultúry rozrušené tak, že v priebehu 1 hodiny bol dvakrát pridaný vyššie uvedený pufer v množstve 0,1 ml/cm . Podrobnosti, týkajúce sa postupu sú uvedené v jednotlivých príkladoch.

Analytické metódy

Bunkové metabolity boli stanovené použitím analytického zariadenia (Kodak Ektachem DT60). Antigén vírusu hepatitídy A, HAV Ag, bol stanovený enzymatickou imunologickou skúškou za použitia monoklonálnej protilátky. Celkové množstvo bielkoviny z rozrušených buniek bolo stanovené kvantitatívne použitím Coomassieovej modrej (BioRad, č. katalógu 500 až 0001) proti sérovému albumínu hovädzieho dobytka ako štandardu.

Výsledky diskusie

Rast buniek MRC-5 na úsekoch tuhého kovu

Pred touto skúškou bola vykonaná predbežná skúška za

- 53 použitia kovových prvkov z titánu. Bolo žiaduce sledovať bunkový rast na povrchu rôznych zliatin, ktoré by boli menej nákladné než titán a boli by výhodné na použitie v statických reaktoroch. Boli sledované dva typy nerezovej ocele 316 a 316L a okrem toho zliatina Hastelloy B a C. Na každý . O úsek kovu bolo naočkovaných približne 10 000 buniek/cm . Po 4 dňoch bol bunkový materiál uvoľnený trypsínom a bol stanovený výsledný počet buniek:

o materiál počet buniek/cm

titán			1,4	x	10
nerezová	oceľ 316		1,6	x	10
nerezová	oceľ 316L		1,2	x	10
zliatina	Hastelloy	B	2,2	x	10
zliatina	Hastelloy	C	1,3	x	10

Rast buniek na oboch typoch nerezovej ocele bol podobný ako rast na titáne. Bunkový materiál takmer nerástol na zliatine Hastelloy B a zle rástol na zliatine Hastelloy C. Rozdiely v hustote buniek pre nerezovú oceľ a titán neukazujú, že by niektorý z týchto materiálov bol výhodnejší, ide zrejme len o variabilitu rastu v jednotlivých pokusoch.

Väčšina údajov na výrobu vírusu hepatitídy A bola získaná na bunkovom materiáli, rastúcom na podložke z plastickej hmoty, napríklad vo fľašiach z polystyrénu. Na porovnanie sú na obr. 3 uvedené rastové krivky pre bunkovú kultúru MRC-5 na polystyréne, skle a nerezovej oceli 316. Bunkový materiál rástol na všetkých typoch povrchov porovnateľným spôsobom. Maximálna špecifická rýchlosť rastu bola podobná, 0,034/h pre plastickú hmotu, 0,032/h pre sklo a 0,039/h pre nerezovú oceľ 316. Nižšia konečná hustota buniek pre plastickú hmotu bola zrejme spôsobená obmedzeným prívodom živín. Rast na plastickej hmote bol totiž sledovaný v T-fľašiach, zatiaľ čo rast na skle a na nerezovej oceli bol sledovaný v Petriho miskách. Vzhľadom na rozdiel objemu živného pro54 stredia, použitého na cm² v jednotlivých systémoch môže dôjsť k nerovnováhe v dostupných živinách. Bunkový rast a spotreba glukózy pre nerezovú ocel sú uvedené na obr. 4.

Rast buniek MRC-5 na úsekoch kovovej mriežky

Aby bolo možné čo najviac zväčšiť povrch na jednotku objemu, bolo sledované použitie kovovej mriežky alebo siete v Petriho miskách pre rast buniek MRC-5. Pre niektoré kombinácie priemeru drôtov a odstupov môže mať mriežka tú istú plochu ako tuhý úsek alebo môže mať oveľa vyššiu celkovú plochu na bunkový rast. Úseky siete alebo mriežky je potom možné upraviť do reaktora tak, aby bol pre rast buniek k dispozícii čo najväčší povrch na jednotku objemu reaktora. Aby bolo možné sledovať rast buniek na takomto povrchu, boli pestované bunkové kultúry MRC-5 tak, ako bolo uvedené vyššie v odstavci Materiály a metódy.

Bunkový materiál MRC-5 bol pestovaný na sieti z nerezovej ocele 316 alebo z titánu. Priemer drôtov bol v rozmedzí 100 až 400 mikrometrov z bola sledovaná hustota 14 x 100, 120 x 110, 40 x 200 a 107 x 59 drôtov na 2,5 cm. Bunkový materiál rástol vo väčšej alebo menšej miere na všetkých vzorkách. V počiatočnom štádiu rástol bunkový materiál na povrchu drôtu. Krátko potom začalo dochádzať k premosteniu, najmä v rohoch ôk. Postupom času vyplnil bunkový materiál všetky medzery a vytvoril vrstvy. Už pri pohľade voľným okom, je zrejmé, že hustota buniek na mriežkách je veľká, priame hodnoty nie sú k dispozícií vzhľadom na. to, že bunkový materiál, rastúci na týchto sietiach nie je možné uvolniť trypsínom. Predbežné údaje však ukazujú, že velkosť ôk je dôležitým faktorom vzhľadom na to, že bunkový materiál nemôže prerastať väčšie oká, avšak v prípade, že sú oká príliš malé má sieť podobný povrch ako hladká doska. Konštrukčný materiál neovplyvnil hustotu rastu buniek a je možné uzavrieť, že je možné použiť akýkoľvek biologicky kompatibilný materiál, z ktorého je možné vytvoriť mriežky alebo siete. Kovový materiál má tú výhodu, že je možné ho lahko čistiť

- 55 a opakovane používať pre celý rad cyklov bunkového rastu, ako bude ďalej uvedené.

Ďalej bude uvedené len použitie siete z nerezovej ocele 316 s obsahom 107 x 59 drôtov na 2,5 cm pri priemere drôtu 160 mikrometrov, to znamená, že rozmer ôk je 77 x 270 mikrometrov. Z tohto materiálu boli vyrobené ďalej uvedené prvky pre statický reaktor. Tento materiál mal k dispozícií zvýšený povrch pre rast buniek a okrem toho umožnil rast buniek vo väčšom počte vrstiev. Mikrofotografia viacvrstvového rastu buniek na tomto materiáli je znázornená na obr. 5. Bolo žiaduce sledovať, či bunky sú vo všetkých vrstvách životaschopné alebo či je bunkový materiál v strede viacvrstvového útvaru nekrotický. Na tento účel bolo použité farbenie fluoresceíndiacetátom a etidiumbromidom, ako už bolo podrobnejšie vysvetlené v odstavci Materiály a metódy. Pri radovom sledovaní priečnych rezov buniek, rastúcich na sieti použitím mikroskopu bolo zrejmé, že prevažná väčšina buniek sú životaschopné bunky vzhľadom na to, že etidiumbromid neprenikol do DNA jadra a že bol fluoresceíndiacetát rozštiepený za uvoľnenia fluoresceínu. Na obr. 6A je znázornené farbenie fluoresceínom pre celý rad priečnych rezov zo strany buniek. Na obr. 6B je znázornené farbenie etidiumbromidom pre tie isté rezy. Zvláštne vzorky buniek, usmrtené etanolom boli pozitívne kontrolou pre farbenie etidiumbromidom a negatívne kontrolou pre farbenie floresceíndiacetátom v týchto pokusoch. Výsledky týchto kontrol sú znázornené na obr. 7.

Pestovanie buniek na sietiach ako prvkov pre statický reaktor

Pre optimálnu kultúru je dôležité dosiahnutie rovnomerného naočkovania a udržanie rovnomerného množenia buniek. Na tento účel boli vytvorené prvky pre statický reaktor z vyššie uvedených sietí pri obiehajúcom živnom prostredí. Valcový reaktor bol uložený tak, že jeho dlhá os bola os vertikálna. Hoci prvé skúšky boli vykonávané s horizontálnou osou tak, aby bolo podporované ukladanie buniek na rastové po- 56 vrchy, bolo dokázané, že ukladanie na vertikálne povrchy je účinné a že tento postup je veľmi výhodný. Bunkový materiál bol pestovaný na ploche približne 10 000 cm. Bunkový materiál bol naočkovaný do reaktorov s väčším počtom prvkov, pričom osi jednotlivých prvkov a smeru prúdu živného prostredia môžu byť paralelné až v uhle 90°. Na dobré miešanie a optimálny chod reaktora je výhodný kolmý smer.

Bunkový materiál sa vo včasnom štádiu neuchytil pri rýchlosti obehu 5 cm/min. Účinnosť naočkovania sa zvýši naplnením reaktora a dvojhodinovým usadzovaním buniek sedimentáciou pomocou príťažlivosti. V tomto prípade je potom možné dosiahnuť účinnosť vyššiu než 90 %, pričom účinnosť sa vypočíta ako počet naočkovaných buniek/počet buniek v očkovacom materiáli x 100 %, avšak naočkovanie nebolo rovnomerné. Ako je zrejmé z obr. 8, došlo k naočkovaniu najväčšieho počtu buniek na spodný prvok, zatiaľ čo najmenší počet buniek sa nachádzal na hornom prvku. Z týchto údajov bola vypočítaná priemerná rýchlosť usadzovania buniek MRC-5 približne 6 cm/h. V ďalšom pokuse boli použité štyri prvky a živné prostredie obiehalo rýchlosťou, približne rovnajúcou sa rýchlosti usadzovania. V tomto prípade bolo dosiahnuté reprodukovateľné rovnomerné naočkovanie pri účinnosti vyššej než 90 %, ako je zrejmé z obr. 8. Vyššie uvedené výsledky ukazujú, že stredná rýchlosť na povrchu prvkov v celom reaktore ovplyvní rýchlosť uchytenia buniek a distribúciu buniek v celom reaktore.

Porovnanie bunkového rastu na tuhých úsekoch materiálu a na sietiach v statickom reaktore

Boli vytvorené dva reaktory, ktoré boli uvedené do činnosti súčasne tak, aby bolo možné stanoviť rozdiely medzi použitím tuhých úsekov a sietí jednotlivých materiálov. Tuhé prvky boli vytvorené z titánu, siete boli vytvorené z nereO zovej ocele. Povrchová plocha bola 1300 cm pre tuhé prvky a 2300 cm pre siete, čo znamená, že pomer povrchu siete a tuhého prvku bol 1,8. Tuhé prvky slúžili ako kontrolná hodnota pre všetky pokusy. Reaktory bolí naočkované množstvom 10 000 až 20 000 buniek/cm² a potom bol bunkový materiál pestovaný tak dlho, až koncentrácia glukózy bola znížená na 120 mg/dl, v tomto okamžiku bol zahájený obeh živného prostredia. Oba reaktory boli naočkované bunkovým materiálom MRC-5 z rovnakej očkovacej kultúry a živné prostredie do oboch reaktorov bolo privádzané zo spoločného zásobníka, aby bolo možné vylúčiť akékoľvek rozdiely v týchto hodnotách.

Rýchlosť príjmu glukózy GUR pre každý reaktor je uvedená na obr. 9. Na obr. 9A je uvedené porovnanie oboch reaktorov pokiaľ ide o plochu, tak ako bolo uvedené vyššie. Plochy sú približné. Na obr. 9B je uvedené porovnanie objemu bunkového prostredia v reaktore vzhľadom na to, že oba reaktory mali rovnaké rozmery, to znamená, že obsahovali päť prvkov s rozmerom približne 5 x cm, zásobník živného prostredia mal objem 1 liter. Obr. 9B neuvádza žiadne údaje, týkajúce sa povrchovej plochy. Rýchlosť príjmu glukózy bola použitá ako miera bunkového rastu tak, aby bolo možné stanoviť začiatok stacionárnej fázy. Posledný bod na obr. 9 označuje okamžik, kedy bol vírus z buniek uvoľnený Tritonom. Pri pohľade na použité prvky bolo možné dokázať, že tuhé povrchy boli celkom pokryté bunkovým materiálom a tiež oká siete boli takmer vyplnené, avšak na sietiach by mohlo dôjsť ešte k ďalšiemu rastu. V tomto okamžiku obiehalo živné prostredie v množstve 0,19 1/h pre tuhé prvky a koncentrácia glukózy v prostredí bola 1,6 g/1. Rýchlosť premývania pre reaktory so sieťami bola 0,26 1/h pri priemernej koncentrovanej glukózy 0,69 g/1. Výsledky ukazujú, že vyššiu účinnosť je možné získať pre reaktor, v ktorom sú uložené prvky v tvare sietí.

Potom bolo živné prostredie z reaktorov vypustené a bunkový materiál bol rozrušený pufrom so zmáčadlom na extrakciu bunkovej bielkoviny, ktorá je mierou, celkovej bunkovej hmoty v reaktore. Rozrušenie buniek v oboch reaktoroch bolo uskutočnené rovnakým spôsobom. Najskôr boli reaktory prepláchnuté 2 litrami PBS s teplotou miestnosti, premývanie trvalo 5 minút pri rýchlosti 100 ml/min, potom bol pufer vypustený. Toto premývanie na odstránenie bielkovín bolo dva58

I tkrát opakované. Potom po odstránení bielkovín z prostredia vyššie uvedeným spôsobom bol do reaktora privedený celkom 1 liter pufra na rozrušenie buniek, tak ako bol uvedený v odstavci Materiály a metódy, pufer bol privádzaný rýchlosťou 400 až 500 ml za minútu pri teplote 37 °C, premývanie trvalo jednu hodinu. Postup bol ešte raz zopakovaný a potom bol opakovaný tretíkrát po dobu 2 hodín a štvrtýkrát po dobu 4 hodiny. Percentuálne množstvo bielkovín, ktoré bolo z buniek odstránené po každom z týchto premytí buniek pufrom na rozrušenie buniek je uvedené na obr. 10. V prípade, že sa celkové množstvo bielkoviny prevedie na hustotu buniek podlá korelácie, uvedenej v doplnku 1, obsahoval reaktor s tuhými

S 9 prvkami 3 x 10⁵ buniek/cm , zatiaľ čo reaktor s obsahom c n prvkov v tvare siete obsahoval 6 x 10 buniek/cm . Udaj pre tuhé prvky je zrejme reprezentatívny vzhľadom na to, že všetky prvky boli celkom zbavené buniek a skontrolované pod mikroskopom. Ako však bolo ukázané aj mikroskopom, nebola zo siete úplne odstránená bunková júce počet buniek v reaktore nízke. Siete totiž sú schopné koncentráciu buniek v porovnaní že tieto výpočty pre povrch sú drvina, takže číslo, uvádzaso sieťami je zrejme príliš udržať približne trojnásobnú s tuhými prvkami. V prípade, správne, je údaj pre celkovú bielkovinu vyšší než pomer povrchov a je zrejme dôkazom toho, že bunkový materiál rástol vo väčšom počte vrstiev.

Produkcia HAV Ag v statickom reaktore za použitia sietí

Produkcia antigénu bola skúmaná v statickom reaktore za použitia prvkov v tvare mriežok alebo sietí. Účelom tohto pokusu bolo stanovenie, či môže dôjsť k rastu vírusu vo väčšom počte vrstiev buniek na sieti z nerezovej ocele. Neišlo o systém, optimalizovaný na produkciu tohto antigénu. V tomto prípade bolo prostredie nahradzované po určitých intervaloch a nie čiastočne. Hodnoty GUR pre tento pokus sú uvedené na obr. 11. Hodnoty sú na báze glukózy prvý deň po výmene prostredia. Bunkový materiál bol infikovaný pri hodnote MOI približne 1 v priebehu siedmeho dňa. Hustota buniek na výpočet MOI bola v dobe infekcie stanovená podlá spotreby glukózy. Ako bolo možné pozorovať napríklad v príklade 9, vyrovná sa spotreba glukózy krátko po infekcii stále na rovnakú úroveň a potom postupne klesá v súlade s postupom infekcie buniek. Pokles, ktorý je možné pozorovať na obr. 10, je miernejší než pokles v príklade 9, čo bolo zrejme spôsobené pomalejším postupom infekcie, v príklade 9 bola použitá hodnota MOI 0,1. Antigén vírusu bol izolovaný 21 dni po infekcii za použití Tritonu, spôsob rozrušenia buniek bude ďalej uvedený.

Stupeň 1: rozrušenie buniek bolo vykonané obehom pufra na rozrušenie 1 hodinu pri 37 °C, stupeň 2: bol uskutočnený rovnako ako v stupni 1, stupeň 3: bunkový materiál bol spracovaný jednu hodinu ultrazvukom (Branson) v kúpeli s obsahom 0,7 litra pufra na rozrušenie buniek, stupeň 4: materiál bol zmrazený na 12 hodín vil pufra na rozrušenie buniek a po roztopení bol 1 hodinu spracovávaný ultrazvukom.

Množstvo celkovej bielkoviny v percentách a množstvo antigénu v materiáloch z uvedených štyroch postupov je uvedené na obr. 12. Je zrejmé, že prvé dva stupne s obehom pufra boli veľmi účinné na odstránenie antigénu z buniek. Pri tomto postupe bol reaktor pred rozrušením buniek len dvakrát premytý PBS, takže tento postup nebol celkom účinný a z tohto dôvodu je tiež umelo zvýšené množstvo bielkoviny z prvého stupňa, zatiaľ čo v stupňoch 2, 3 a 4 je množstvo bielkoviny nižšie. Vzorka bola skúmaná na antigén HAV metódou EIA pred zmrazením. V závislosti na percentuálnom množstve v každom materiáli pri neskoršom stanovení, bolo toto množstvo v korelácii s dvojnásobným výťažkom antigénu na jednotku povrchu v porovnaní s príkladom 9. Cieľom tohto pokusu bolo dokázať, že ukazovateľom pre rast vírusu je výťažok antigénu. Tento pokus ukazuje aj využiteľnosť statického reaktora s prvkami v tvare siete na produkciu vírusu.

Aj napriek tomu, že bunkový materiál bol zrejme z reaktora izolovaný neskoršie podľa hodnôt GUR, sú výťažky antigénu pomerne vysoké, čo ukazuje na to, že väčší počet bunkových vrstiev môže byť infikovaný vírusom. Údaje taktiež ukazujú na dôležitosť hodnoty MOI pre produkciu HAV. Za použitia hodnoty MOI 1 by bolo možné zrejme skrátiť dobu postupu o viac než o týždeň a bunkový materiál izolovať v dvadsiatom dni. Je zrejmé, že doba infekcie a hodnota MOI sú dôležitými premennými veličinami v priebehu postupu vzhľadom na to, že vhodnou voľbou týchto parametrov je možné skrátiť dobu pestovania. Pokusy s bunkovým rastom dokazujú, že infikované bunkové kultúry ďalej rastú podobnou rýchlosťou ako neinfikované kultúry, čo platí aj v prípade, že kultúry boli infikované vysokou hodnotou MOI použitím kmeňa CR326F P28, ako je zrejmé z obr. 13. Bunkový materiál rastie navzdory infekcii a zníženiu teploty na 32 °C tak, aby mohol rásť uvedený kmeň vírusu. Maximálna špecifická rýchlosť rastu, vypočítaná z týchto kriviek je 0,015/h, čo je približne polovica rýchlosti rastu neinfikovaných buniek pri teplote 37 “C. Skutočnosť, že sa bunkový materiál chová podobným spôsobom v priebehu prvého týždňa po infekcii HAV je dôležitá pre prácu reaktora v tom zmysle, že je žiaduce dosiahnuť čo najvyššiu koncentráciu buniek bez ohľadu na dobu infekcie a na hodnotu MOI. Tento pokus ukazuje, že optimalizácia trvania bunkového rastu je závislá na dobe infekcie, trvaní infekcie a hodnote MOI.

Čistenie prvkov pre statický reaktor

Je žiaduce mať k dispozícii opakovane použiteľný povrch pre bunkový rast tak, aby bolo možné sa vyvarovať príliš veľkému odpadu, umožniť automatické vykonávanie postupu a zvýšiť reprodukovateľnosť pestovania buniek. Prvky v tvare sietí je možné opláchnuť destilovanou vodou na odstránenie solí zo živného prostredia, prvky sa premývajú jednu hodinu rýchlosťou 500 ml/min, potom sa uložia do 1 litra 5% roztoku hydroxidu sodného a sterilizujú sa 45 minút v autokláve. Po ochladení sa prvky oplachujú destilovanou vodou do úplného odstránenia hydroxidu sodného, ako je možné dokázať stanovením pH v preplachovacej kvapaline. Tento postup je veľmi účinný na odstránenie bunkovej drviny pri pozorovaní v mikroskope. Je možné, že menej náročné spracovanie by viedlo k ekvivalentnému vyčisteniu a bolo by možné ho uskutočniť uložením prvkov v reaktore. Siete, spracované uvedeným postupom boli použité aspoň desaťkrát, bez toho aby bolo možné pozorovať zmeny bunkového rastu. Prvky, na ktorých bol pestovaný vírus vyššie uvedeným spôsobom, boli čistené práve touto metódou, čo dokazuje použiteľnosť už použitých a vyčistených prvkov na pestovanie vírusu.

Závery

Tieto pokusy ukázali, že je možné v statických reaktoroch s obehom živného prostredia použiť siete z nerezovej ocele na získanie rastu buniek MRC-5 vo väčšom počte vrstiev. Tieto vrstvy boli životaschopné bez známok uhynutia buniek. Pokusy s infekciou buniek ukázali, že viacvrstvové útvary buniek je možné infikovať vírusom hepatitídy A a aj v neoptimalizovanom systéme je možné získať väčšie množstvo antigénu, ako sa bežne získa za použitia tuhých povrchov podľa príkladu 9. V niektorých kultúrach môže za použitia týchto nosičov dôjsť k tvorbe zhlukov v prípade, že viacvrstvové útvary nie sú dobre definované. K tomuto však dochádza najmä použitím mikronosičov. Použitím sietí dochádza k tvorbe veľmi dobre definovaných viacvrstvových vrstiev vzhľadom na dobre zvolenú geometriu a tým tiež nedochádza k obmedzeniu prívodu živín. Bunkový rast v okách siete uzatvorí oká, takže sa vytvoria podobné vrstvy ako na tuhom povrchu. Tento systém si teda uchová výhody statických reaktorov a vedie k reprodukovateľnej a rovnomernej výžive buniek. V tom je možné pozorovať rozdiel v porovnaní s inými typmi reaktorov, napríklad s reaktormi, vyplnenými náhodne usporiadanými vláknami alebo sklenenými guľôčkami, dutými vláknami alebo keramickými prvkami. V týchto typoch reakto rov dochádza pri raste buniek k zhoršeniu prietoku živného prostredia, takže vznikajú zhluky buniek s nedostatočným prívodom živín. Je teda zrejmé, že statický reaktor s opakovane použiteľnými prvkami v tvare siete z nerezovej ocele predstavuje podstatný pokrok pre pestovanie buniek MRC-5 a pre produkciu antigénu hepatitídy A.

Príklad 14 - doplnok 1

Súhrn

Bolo uskutočnené kvantitatívne stanovenie celkového množstva bielkoviny v rozrušenom bunkovom materiáli MRC-5 a toto množstvo bolo porovnané s priamymi údajmi o počte buniek, získanými hematocytometrom alebo použitím zariadenia Coulter Counter. Bolo možné dokázať, že množstvo celkovej bielkoviny v rozrušenej kultúre zdravých buniek v počiatočnej exponenciálnej fáze, neskorej exponenciálnej fáze a v stacionárnej fáze rastu aj v kultúre buniek 1,2a 3 týždne po infekcii je závislé na hustote buniek. Táto jednoduchá korelácia je prostriedkom na stanovenie; hustoty buniek v reaktore, ktorú nie je nutné uskutočniť priamym počítaním buniek.

Diskusia

Skúška na bielkovinu a príprava vzorky

Skúška na bielkovinu (BioRad, č. katalógu 500 - 0001) je rýchla, citlivá skúška na kvantitatívne stanovenie celkového množstva bielkovín. Prvé pokusy dokázali, že pufer, použitý na rozrušenie buniek a obsahujúci 0,1 % Tritonu

X-100, 10 mM tris-HCl a 0,1 mM chloridu horečnatého neinterferuje s použitím Coomassieovej modrej. Pre štandardné stanovenia boli všetky riedenia vrátane riedenia štandardu, ktorým bol sérový albumín hovädzieho dobytka, uskutočnené použitím pufra na rozrušenie buniek s obsahom Tritonu. Sku točnosť, že materiál po rozrušení buniek Tritonom často obsahuje vločky dokazuje, že môže byť nutné pred uskutočnením analýzy, vzorky ešte ďalej spracovávať. Väčšie vločky totiž vedú k neprimerane vysokému titru bielkovín. Avšak po dvoch cykloch rýchleho zmrazenia na -70 °C v etanole a opätovného rozmrazenia sa veľkosť vločiek znížila a bola získaná homogénna suspenzia. Okrem toho, pri sledovaní niekoľkých riedení jedinej vzorky, je možné ľahko zistiť, ktoré vzorky nie sú vhodným spôsobom upravené. Vzorky je tiež možné odstrediť a na analýzu použiť číry supernatant. Týmto spôsobom je možné získať podobné výsledky, zvyčajne však nie je odstránenie nutné. Uvádzané údaje boli získané použitím rozrušených buniek, ktoré bolí najmenej dvakrát zmrazené, potom bola vzorka pred analýzou energicky premiešaná.

Koncentrácia bielkoviny ako funkcia hustoty buniek

Pre určitú štandardnú krivku na prevádzanie celkového množstva bielkoviny na špecifický počet buniek musí bunkový materiál, použitý v priebehu postupu obsahovať vždy približne rovnaké množstvo bielkoviny. Aby bolo možné dokázať, či je tento vzťah splnený, boli T-fľaše naočkované vždy rovnakým počtom buniek. V špecifických intervaloch potom boli vždy dve fľaše analyzované. Jedna z nich bola spracovaná pôsobením trypsinu a bunkový materiál bol počítaný v hematocytometri a v zariadení Coulter Counter, v druhej fľaši bolo použité rozrušenie zmáčadlom tak, že fľaša bola premytá dvakrát použitím 0,3 ml/cm PBS a potom bol do fľaše dvakrát pridaný pufer na rozrušenie buniek v množstve 0,08 ml/cm . Kultúry boli spracované v počiatočnej exponenciálnej fáze rastu, v neskorej exponenciálnej fáze rastu, v stacionárnej fáze a 1, 2 a 3 týždne po infekcii. Údaje, získané v týchto pokusoch sú uvedené na obr. 14. Najlepšie zodpovedajúca krivka je opísaná rovnicou Y(IO^) = -0,09 + 0,42X. Z výkresu je zrejmé, že jediná krivka postačuje na stanovenie počtu buniek na základe stanovenia celkového množstva bielkoviny bez ohľadu na stav” buniek.

Bunkový materiál bol v tomto pokuse infikovaný použitím HAV, kmeňa CR326F P28 pri MOI 1. Po troch týždňoch po infekcii bolo ukázané, že pomocou trypsínu nie je možné bunkový materiál

Avšak vzhľadom na to, že hustota buniek bola la 2 týždne po infekcii približne týždni nedošlo k viditeľnému rozrušeniu buniek uvedená pre tretí týždeň rovnaká rovnaká a v treťom buniek, je hustota ako pre druhý týždeň. Údaje z obr. 14 boli použité pre ďalšiu krivku, v kto rej je naznačený čas pre špecifické údaje. V prípade, že sa odčítajú údaje pre tri týždne po infekcii, nedôjde k podstatnej zmene v tvare krivky ani v jej strmosti, ako je zrejmé z obr. 15.

Použitím vyššie uvedenej korelácie bolo, pri stanovení bielkovín pre niekoľko rozrušených kultúr, pripravených pod ľa príklade 9, získané priemerné množstvo bielkoviny 490 mikrogramov na ml. Zodpovedá to približne 3,3 x 10^ bu9 niek/cm a údaje sú súčasne v súlade s hustotou buniek, stanovenou hematocytometrom v kontrolných T-fľašiach. Je te da možné uzavrieť, že množstvo celkovej bielkoviny v bunkovom materiáli, rozrušenom Tritonom je priamo úmerné hustote buniek v období, kedy bol izolovaný vírus.

Príklad 15

Skúšky na miešanie pri extrakcii rozpúšťadlom

Súhrne informácie

V priebehu čistenia vírusu hepatitídy A je extrakcia rozpúšťadlom kritickým stupňom na odstránenie nečistôt, ktoré sú stále ešte prítomné po vyzrážaní pomocou PEG. Aby bolo možné tomuto stupňu dobre porozumieť a celkom ho riadiť, bol vykonaný celý rad pokusov na určenie dôležitých parametrov extrakcie rozpúšťadlom. Boli identifikované dve kľúčové premenné veličiny: trvanie miešania a intenzita pretrepávania, tieto parametre závisia aj na veľkosti použitých fliaš. Pomer rozpúšťadla k vode nebol významným faktorom, ani nebolo možné pozorovať rozdiely v prípade, že bolo použité mechanické miešadlo, ručné pretrepávanie alebo magnetické miešanie .

Materiály a metódy

Vzorky zrazeniny po pôsobení PEG, znovu uvedené do suspenzie, boli premiešané so zmesou chloroformu a izoamylakoholu v pomere 24: T, boli použité rôzne podiely zmesi v rozmedzí 0,5:1 až 3:1 pre pomer rozpúšťadla k vodnej fáze. Materiál bol premiešaný ručným pretrepávaním, mechanickým miešaním v skúmavkách s objemom 15 ml alebo použitím mechanického trepacieho zariadenia 3D (Glas-Col, Terre Haute, Ind) pri rýchlosti motora 100 (boli použité skúmavky s objemom 15 a 50 ml). Doba miešania bola 20 sekúnd až 1 hodina.

Po premiešaní boli vzorky odstredené na oddelenie oboch fáz. Pre skúmavky s objemom 50 ml a fľaše s objemom 500 ml bola použitá odstredivka J6-MI (Beckman) s rotorom JS 4,2 pri 3800 ot/minútu, odstredenie trvalo 10 minút. V prípade malých skúmaviek boli skúmavky 5 minút odstredené pri 1000 ot/minútu v odstredivke Dynac II a pre ďalšie pokusy boli vzorky prenesené do skúmaviek s objemom 50 ml a odstredené rovnako ako vyššie.

Vodná fáza bola odstránená sklenenou pipetou a analyzované!. vysokotlakovou chromatografiou na géli za nasledujúcich podmienok: dva stĺpce TSK P4000 x 1 (Toso Haas), zaradené za sebou, ako mobilná fáza bol použitý roztok RCM-8, uvádzaný aj ako roztok CM563 s obsahom 150 mM NaC’l v 6,2 mM fosfátovom pufri s pH 7,2, rýchlosť prietoku 0,32 ml/minútu, eluát bol sledovaný po dobu 80 minút pri 214 a 260 nm. Výsledky sú vyjadrené ako plochy pod vrcholom alebo pomery týchto plôch na báze absorpcie pri 214 nm v ultrafialovom svetle. Pre počiatočné pokusy pre materiál zo skúmaviek s objemom 15 ml bol použitý len jediný stĺpec TSK pri prietoku 40 minút. Potom boli za seba zaradené dva stĺpce, aby bolo možné dosiahnuť dokonalejšie oddelenie antigénu hepatitídy A a nečistôt.

Pokusy boli zo začiatku vykonávané v skúmavkách s obje mom 15 ml s náplňou 2 až 6 ml a vzorky boli premiešané ručným pretrepávanim alebo magnetickým miešadlom. Po získaní výsledkov z prvých vzoriek boli miešané vzorky s väčším objemom v skúmavkách s objemom 50 ml, s náplňou 24 ml na mechanickom trepacom zariadení. Boli tiež odobrané vzorky s fliaš s objemom 500 ml v priebehu spracovania materiálu. Flaše boli pretrepávané krátku dobu, napríklad 20 sekúnd a potom boli fázy oddelené usadzovaním približne 1 minútu, potom bola z hornej fázy odobraná vzorka s objemom 600 mikrolitrov. Potom bola fľaša znova vrátená do trepacieho zariadenia na ďalší časový úsek, potom bola znova odobraná vzorka. Tieto vzorky boli potom odstredené 2 minúty v mik.roodstredivke pri maximálnej rýchlosti.

Výsledky

1. Doba miešania

Podľa predbežných pokusov, vykonávaných v malom meradle v skúmavkách s objemom 15 ml je zrejmé, že doba miešania je dôležitá premenná veličina, pričom pri dlhšej dobe miešania je možné lepšie odstrániť nečistoty. Z obr. 6 je zrejmé, že sa pomer vírusu hepatitídy A k nečistotám zvyšuje s predĺžením doby miešania. Okrem toho je z obr. 20 zrejmé, že vrchol pre nečistoty sa štatisticky významne znižuje: s dobou miešania .

Použitím skúmaviek s objemom 50 ml bolo taktiež možné dokázať, že doba miešania je dôležitá, na najdokonalejšie odstránenie nečistôt bolo nutné predĺžiť miešanie na 3 minúty, ako je zrejmé z obr. 20. V tomto prípade bola kvôli lepšiemu rozdeleniu analýza vykonávaná na za sebou zaradených stĺpcoch, pričom bolo možné pozorovať len malý pokles plochy pre vírus hepatitídy A.

Doba miešania bola taktiež sledovaná v prípade produkčných fliaš s objemom 500 ml. Vzorky boli odobrané každých 20 sekúnd v priebehu celkovej doby miešania 2 minúty. Tento pokus bol vykonávaný pri dvoch rozdielnych pomerov rozpúšťadiel, 2:1 a 3:1, čo tiež zodpovedá dvom rôznym objemom vod67 neho prostredia vo fľašiach, približne 60 ml a 90 ml, celkový objem zostáva stály, 180 ml. Na obr. 21 je znázornené, že sa množstvo nečistôt znižuje s dĺžkou miešania, pričom k úplnému odstráneniu nečistôt dochádza po 1 minúte a 40 sekundách. Doba, ktorá bola použitá na miešanie produkčných kultúr, bola 2 minúty, aby bolo skutočne možné nečistoty odstrániť. Je však možné ju predĺžiť až na 3 minúty. Rozdiel v objemoch a pomeroch rozpúšťadiel mal v použitom rozmedzí len malý vplyv.

Tento pokus bol ešte opakovaný pri dlhšej dobe miešania pre skúmavky s objemom 50 ml a 15 ml. Na obr. 22 je znázornené, že rovnaká čistota bola dosiahnutá vo všetkých skúmavkách, avšak v malých skúmavkách je potrebná doba miešania 6 až 8 minút, zatiaľ čo pre fľaše s objemom 500 ml stačí doba 2 minúty. Tieto rozdiely budú ďalej bližšie opísané v odstavci 3. Aby bolo možné stanoviť, či doba miešania môže ovplyvniť vírus, bola skúmavka s objemom 50 ml pretrepávaná 1 hodinu na mechanickom trepacom zariadení. Pri vysokotlakovej analýze na géli nebol dokázaný ďalší pokles veľkosti plochy pre vírus a výsledky EIA, uvedené v tabuľke 1 dokazujú, že antigenita je rovnaká po jednej hodine aj po 2 minútach miešania. Výsledky, získané pre spracovanie EIA v rôznych stupňoch postupu pre tú istú šaržu sú podobné. Aby bolo možné dosiahnuť úplné odstránenie nečistôt, je možné minimálne doby miešania predĺžiť bez zníženia výťažku vírusu .

Tabuľka 1

Vplyv dlhšieho miešania na vírus hepatitídy A podľa výsledkov HPSEC a EIA pre skúmavky s objemom 50 ml doba miešania_______pomer HAV/nečistoty__EIA jednotky/ml

2	minúty		0,74	23	800
1	hodina		nečistotu nie je	24	500
			možné dokázať
2	minúty,	fľaša
s	obi emom	500 ml	8.6	20	000±16 %

2. Obj emové pomery

Pomery objemu rozpúšťadla k vodnej fáze boli 1,5 pre hlavné šarže, miešané v jedinej fľaši magnetickým miešadlom a v rozmedzí 2 až 3 pre demonštračné šarže, ktoré boli pretrepávané vo fľašiach s objemom 500 ml. Bol sledovaný vplyv pomeru objemu v rozmedzí 0,5 až 3 na čistotu produktu. Počiatočné pokusy v malom meradle v skúmavkách s objemom 15 ml pri dobe miešania 1 minútu boli vykonané použitím štyroch rôznych produkčných šarží a východiskovej zrazeniny po pôsobení PEG. Z obr. 23 je zrejmé, že nebolo možné pozorovať žiadnu zrejmú koreláciu medzi pomerom rozpúšťadla k vodnej fáze a odstránením nečistôt. Rozptyl údajov je zrejmé spôsobený variabilitou východiskových materiálov a nerovnomernosťou pretrepávania. Vzorka bola zväčšená na veľkosť zo skúmaviek s objemom 50 ml a bolo použité mechanické pretrepávanie po dobu 2 minúty. Skúmavky boli pritom trocha sklonené smerom k horizontálnej polohe. Výsledky sú znázornené na obr. 24. Aj v tomto prípade, aj keď existuje určitý rozptyl v údajoch, nie je možné pozorovať žiadny jasný trend pre pomer rozpúšťadla k vodnej fáze. Tieto výsledky boli potvrdené použitím fliaš s objemom 500 ml a pomeru rozpúšťadla k vodnej fáze 2:1 a 3:1, ako je zrejmé z obr. 21, je možné dokázať len veľmi malé rozdiely v odstránení nečistôt. Je teda zrejmé, že v tomto prípade nejde o dôležitú premennú veličinu a zvýšenie pomeru rozpúšťadla teda neprispieva k zvýšenému odstráneniu nečistôt.

I

I

3. Spôsob miešania a veľkosť nádob í

V prípade malých skúmaviek s objemom 15 ml nebolo možné pozorovať žiadne rozdiely medzi použitím ručného ¹pretrepávania a magnetického miešania, zrejme vzhľadom na to, že je možné pozorovať veľký rozptyl výsledkov pre rôzne produkčné šarže, ako je zrejmé z obr. 23. Jediný údaj na obr. 19 taktiež dokazuje dobrý súlad medzi výsledkami pri použití ručného pretrepávania a magnetického miešadla. Aj vo väčších skúmavkách boli tieto dva pretrepávania porovnávané. Na obr. 25 je možné pozorovať, že pri ručnom pretrepávaní je možné dosiahnuť takmer rovnaké výsledky ako pri mechanickom miešaní pri rovnakej náplni skúmaviek. V tabuľke 2 sú zhrnuté výsledky pokusu pre fľaše s objemom 500 ml. Bolo použitých 6 fliaš, z ktorých jedna bola pretrepávaná ručne a ostatné mechanickým spôsobom. Vzorky boli odobrané pre oba typy miešania a analýzou HPLC boli získané podobné výsledky, v oboch prípadoch bola čistota veľmi vysoká, čo potvrdzuje, že typ pretrepávania nie je dôležitý, avšak rozmer nádob je velmi dôležitý, pretože- výsledky pre flaše s objemom 500 ml sú oveľa priaznivejšie než pre skúmavky s objemom 50 ml za použitia trepacieho zariadenia. Tie isté výsledky vyplývajú z údajov, znázornených na obr. 22.

Tabuľka 2

Vplyv rôznych typov miešania na pomer vírusu a nečistôt pri miešaní, trvajúcom 2 minúty typ miešania mechanické trepanie ručné trepanie

2,47

2,69

Bol sledovaný aj vplyv veľkosti náplne skúmaviek. V prípade, že bolo do skúmaviek s objemom 50 ml uložených 10,5 ml náplne, boli získané približne rovnaké výsledky ako pri použití známych 21 ml náplní. Podobne flaše s objemom 500 ml s náplňou 240 alebo 275 ml obsahovali ekvivalentné množstvo nečistôt, ako je zrejmé z obr. 21. V priebehu všetkých pokusov s miešaním boli skúmavky s objemom 15 ml plnené do 0,13 alebo do 0,4 plnej kapacity. V prípade skúmaviek s objemom 50 ml bola väčšina plnená do 0,53, v jednom pokuse do 0,26 plnej kapacity s použitím fliaš s objemom 500 ml boli flaše plnené do 0,48 alebo 0,57 plnej kapacity. Vzhľadom na to, že pre všetky tri typy nádob bola použitá podobná náplň a výsledky nemohli byť uvedené do korelácie s úrovňou

- 70 náplne, nie je tento faktor pravdepodobne príliš dôležitý. Avšak v prípade, že by skúmavky boli celkom naplnené a v ich hornej časti by nezostal volný priestor, bolo by ťažké obsah premiešať, čím by došlo k zníženej účinnosti pri odstránení nečistôt.

Ďalší faktor, ktorý bol sledovaný, bol pomer šírky k výške skúmavky. Tento pomer bol 0,13 pre skúmavky s objemom 15 ml, 0,26 pre skúmavky s objemom 50 ml a 0,58 pre fľaše s objemom 500 ml. Je možné, že väčší pomer šírky k výške uľahčí miešanie vzhľadom na to, že vznikajú väčšie plochy na rozhraní oboch fáz.

Boli tiež sledované údaje z vyššie uvedených šarží s rovnakými nečistotami, prítomnými po usadení zrazeniny po pôsobení PEG. Štyri šarže boli extrahované 1 minútu v rozpúšťadle vždy v jednej fľaši, opatrenej magnetickým miešadlom. Potom bol roztok rozdelený kvôli oddeleniu fáz odstredením. Pomer rozpúšťadiel k vodnej fáze bol 1,5. Výsledné pomery vírusu k nečistotám boli v rozmedzí 0,48 až 2,7. Ďalšia šarža bola pretrepávaná 1 minútu vo fľaši pre odstredivky s objemom 250 ml s kónickým dnom použitím pomeru rozpúšťadla k vodnému prostrediu 1,0. Výsledný pomer vírusu k nečistote bol 0,87. Všetky tieto výsledky sú porovnateľné s výsledkami, získanými v skúmavkách s objemom 15 alebo 50 ml za podobných podmienok, avšak získané hodnoty sú oveľa nižšie než typické rozmedzie 4 až 21 (pre osem vzoriek), tak ako boli získané v demonštračných šaržách. To je v súlade s dlhšou dobou miešania a použitím väčších nádob pre toto miešanie pri výrobe vírusu vo veľkom meradle.

Závery

Je možné uzavrieť, že rozdiely v čistote medzi demonštračnými šaržami a skôr uvedenými šaržami sú spôsobené tým, že pri produkcii vo väčšom meradle bol materiál pretrepávaný vo väčších fľašiach s objemom 500 ml a po dlhšiu dobu 2 minúty v porovnaní s 1 minútou v skorších šaržách. Vplyv objemu je zrejmé spôsobený väčšou plochou na rozhraní oboch fáz

7ί pri pretrepávaní vo väčších fľašiach. Fľaše s objemom 500 ml boli zvyčajne plnené objemom nižším než 300 ml, takže vznikol v hornej časti velký priestor, ktorý napomáhal dobrému premiešaniu rozpúšťadla, vodnej fázy a vzduchu. Je pravdepodobné, že pri znížení tejto plochy styku jednotlivých fáz môže dôjsť k zníženiu čistoty tak, ako je to možné pozorovať v malých skúmavkách. Avšak vzhľadom na to, že doba miešania je tiež dôležitá, je možné dosiahnuť v skúmavkách s objemom 50 ml približne rovnakú čistotu ako vo fľašiach s objemom 500 ml.

Ďalšie premenné veličiny, ktoré boli sledované, to znamená pomer rozpúšťadla k vodnej fáze a typ pretrepávania nie sú zrejmé pre konečný výsledok dôležité.

Príklad 16

Rozpustnosť vírusu hepatitídy A

Ako už bolo vyššie opísané, bola analýzou HPSEC v produkčných šaržách dokázaná značná strata vírusu hepatitídy A. V priebehu čistenia bolo uvedeným spôsobom stanovené, že viac než 50 % vírusu bolo stratených cez noc po chromatografii na ionomeniči a pred čistením chromatografiou na géli. Neskoršie bolo dokázané, že táto strata súvisela so vznikom zrazeniny, ktorá bola odstránená odstredením.

Predpokladalo sa, že v zrazenine je vírus hepatitídy A a že zrazenina vznikla vyššou iónovou silou pufra, ktorý bol použitý na elúciu vírusu zo stĺpca ionomeniča. Boli preto vykonávané pokusy rozpustiť zrazeninu vo vodnom roztoku chloridu sodného a fosforečnanu sodného. V závislosti na strate vírusu za použitia kvantitatívneho stanovenia pomocou HPSEC bola predpokladaná koncentrácia v zrazenine niekoľko mg/ml. Podiely zrazeniny boli zmiešané buď so 6 mM fosforečnanom sodným alebo s 0,15 M chloridom sodným v 6 mM fosforečnane sodnom alebo s 0,3 M chloridom sodným v 6 mM fosforečnane sodnom alebo s 0,5 M chloridom sodným v 6 mM fosforečnane sodnom alebo s 1 M roztokom chloridu sodného v 6 mM

- 72 fosforečnane sodnom.

Pri premiešavaní s malým množstvom 6 mM fosforečnanu sodného došlo k rozpusteniu zrazeniny v priebehu niekoľkých sekúnd. Avšak pri zmiešaní s roztokmi s obsahom chloridu sodného nedošlo k žiadnemu velkému rozdielu vo vzhľade až na zreteľné zriedenie. Bol pripravený zásobný roztok vírusu hepatitídy A rozpustením 0,35 ml suspenzie zrazeniny v 5,65 ml 6 mM fosforečnanu sodného. Už po pridaní 0,5 ml tohto roztoku bolo možné pozorovať úplné rozpustenie viditeľných častíc zrazeniny. Vzorky zásobného roztoku boli zmiešané s rôznym množstvom 1 M chloridu sodného v 6 mM fosforečnanu sodného za vzniku konečnej koncentrácie 0,15 M, 0,3 M alebo 0,5 M chloridu sodného, tak ako je zrejmé z tabuľky 16-1.

Tabuľka

16-1 objem zásob- objem IM chloridu ného roztoku sodného vo fosforiedenie antigénu molarita chloridu sodného rečnane sodnom

1,5

1,5

0,27

0,65

1,20,15

1,430,30

20,50

Koncentrácie týchto roztokov boli stanovené kvantitatívne použitím HPSEC a potom ešte po dvoch týždňoch znova použitím HPSEC. Získané údaje sú uvedené v tabuľke 16-11 a graficky znázornené na obr. 27 a 28.

Na obr. 27 je znázornená počiatočná koncentrácia vírusu hepatitídy A, meraná v roztoku približne jeden deň po pridaní soli. Bolo dokázané, že zásobný roztok mal koncentráciu približne 100 mikrogramov/ml pri stanovení HPSEC, čo by zodpovedalo približne 1 mg/ml v zrazenine a množstvo vírusu hepatitídy A v zrazenine by potom zhruba zodpovedalo strate, zodpovedajúcej zistenému úbytku v priebehu výroby. Vzhľadom na to, že bolo pozorované, že sa zrazenina rozpustí už po

- 73 pridaní malého množstva roztoku fosforečnanu, bola rozpustnosť v roztokoch s malým množstvom chloridu sodného stanovená ako približne 1 mg/ml alebo vyššia. Koncentrácia antigénu v roztokoch s obsahom väčších množstiev chloridu sodného bola oveľa nižšia než pri riedení zásobného roztoku fyziologickým roztokom chloridu sodného. Okrem toho analýza HPSEC dokázala, že vyzrážaný materiál je vo väčšom množstve možné pozorovať práve v roztokoch s obsahom väčšieho množstva chloridu sodného, ako je tiež zrejmé z nasledujúcej tabuľky 16-11.

Tabuľka 16-11

Množstvo vírusu hepatitídy A v roztokoch chloridu sodného pri stanovení HPSEC, deň 1

koncentrácia chloridu sodného	antigén ako monomér	agregát/monomér (pomer plôch)
0 (zásobný roztok)	106 gg/ml	0
1,15 M	65	0,05
0,30 M	11	0,52
0,50 M	6,6 --	0,52

Z údajov v tabuľke je zrejmé, že sa antigén vírusu hepatitídy A zhlukuje a potom zráža v roztoku už pri koncentrácii pod 50 mikrogramov/ml chloridu sodného. Z obr. 27 je tiež zrejmé, že približné zloženie produktu, vymývaného zo stĺpca ionomeniča a predstavovaného bodmi IEP klesá s obsahom chloridu sodného. Toto množstvo je významne vyššie než množstvo antigénu, ktoré je možné v roztoku udržať v priebehu jedného dňa, takže bez podstatnej zmeny postupu na čistenie antigénu je potrebné ju okamžite po výstupe zo stĺpca ionomeniča zriediť. Aby bolo možné riediť čo najmenej a tým čo najviac znížiť objem, ktorý bude nutné v ďalšom stupni naniesť na preparatívny chromatografický stĺpec s náplňou gélu, mal by byť v riedení použitý 6 mM roztok fosforečnanu sodného tak, aby bolo možné udržať pH a súčasne znížiť iónovú silu a koncentráciu antigénu. Pri riedení 1:1 bolo dokázané, že sa koncentrácia antigénu zníži na koncentráciu, ktorá sa nachádza pod krivkou z obr. 27, ide o hodnotu IEP^X, približne 25 mikrogramov/ml pri koncentrácii chloridu sodného 150 mM vo fosfáte. Na základe týchto zistení bol spôsob čistenia doplnený uvedeným zriedením roztoku.

Na obr. 28 je znázornená koncentrácia, ktorá bola v uvedených roztokoch nameraná v 1. dni a v 14. dni. Je zrejmé, že v priebehu tejto doby koncentrácia antigénu poklesla a že teda pri riedení 1:1 predsa len nedochádza k dostatočnému zriedeniu antigénu, ale dochádza len k stabilizácii roztoku vírusu a k spomaleniu zhlukovania antigénu a jeho zrážaniu. Je možné, že ďalšia optimalizácia riedenia bude mať za následok ešte ďalšie zvýšenie výťažku výsledného produktu.

Konečne, aby bolo možné dokázať, že zásobný roztok obsahuje vírus hepatitídy A bez väčšieho množstva ďalších materiálov, ktoré by sa mohli spoločne vymývať zo stĺpca HPSEC, bol zásobný roztok analyzovaný elektroforézou na SDS-PAGE pri farbení striebrom. V prípade, že boli výsledky porovnané s výsledkami z HPSEC, bolo možné dokázať totožné pásy pre množstvo a typ bielkoviny.

Príklad 17

Vysokotlaková chromatografia na stĺpci gélu pri sledovaní čistených vzoriek antigénu vírusu hepatitídy A

Úvod

Bol vyvinutý postup na stanovenie vlastností antigénu a na sledovanie priebehu čistenia vírusu hepatitídy A. Bola použitá vysokotlaková chromatografia na géli, HPSEC, pri detekcii ultrafialovým svetlom pri 214 a 260 nm, tento postup dovoľuje preukázanie relatívnych množstiev vírusu hepatitídy

- 75 A a kľúčových nečistôt, to znamená zhlukov, adičných produktov nukleovej kyseliny a vírusu hepatitídy A a nečistôt s molekulovou hmotnosťou 660 000 v jednotlivých vzorkách. Okrem toho je týmto spôsobom možné kvantitatívne stanoviť koncentráciu vírusu vo vzorkách, čo sa vykonáva aspoň v posledných troch stupňoch, to znamená po extrakcii, po výstupe z ionomeniča a pri konečnej preparatívnej HPSEC. Táto skúška sa používa aj na stanovenie účinnosti použitého enzýmu benzonázy a na preukázanie nečistôt v každom stupni spracovania v porovnaní s referenčnými vzorkami.

Vzorky vírusu hepatitídy A z desiatich šarží boli skúmané pomocou HPSEC tak, aby bolo možné sledovať postup vo všetkých stupňoch čistenia. Údaje, získané týmto spôsobom a nasledujúce analýzy na stálosť produktu poskytujú dostatočnú informáciu na vyhodnotenie celého postupu a jasne ukazujú, že postup je vhodný na výrobu vírusu.

Ďalej sú zhrnuté údaje, získané pomocou HPSEC a celkové vyhodnotenie aj výsledky analýzy pre desať sledovaných šarži. Celá správa, týkajúca sa použitého prístroja, vykonania postupu s výsledkov je rozdelená do nasledujúcich sekcií: Sekcia I: Použité zariadenie a podmienky pre chromatografiu, opis stĺpca pre HPSEC a zariadenie pre HPLC a podmienky pri vykonávaní týchto postupov.

Sekcia II: Skúšobné a kalibračné postupy, spôsob prípravy kalibračných štandardov a vykonanie skúšok.

Sekcia III: Linearita, presnosť a reprodukovateľnosť skúšok, štatistické vyhodnotenie.

Sekcia IV: Analýza výsledkov. Je znázornená skupina chromatogramov pre jednu šaržu a sú opísané získané údaje pre každú vzorku.

Sekcia V: Podmienky uchovávania vzoriek. Tieto skúšky boli vykonávané pre každý typ spracovania na stanovenú stálosť pri teplote 4 až 6 °C.

Sekcia VI: Porovnanie výsledkov s EIA a HPSEC.

Sekcia VII: Reprodukovateľnosť získaných výsledkov.

Príloha A: Súhrn výsledkov pomocou analýzy HPSEC pre vzorky, odobrané z desiatich šarží.

Sekcia I: Použité zariadenia a podmienky pre chromatograf iu

Materiál a reakčné činidlá

Bol použitý roztok CM 80 (MMD), ide o roztok s obsahom 6 mM fosforečnanu sodného a 120 mM chloridu sodného, pH 7,2.

Zariadenie (S výnimkou stĺpca je možné použiť aj iné zariadenie)

HPLC systém: Čerpadlo RAININ Rabbit, opatrené premývacou hlavou s obsahom 10 ml roztoku soli.

Automatické odoberanie vzoriek: Zariadenie RAININ AI-I s recirkulačným chladičom na udržanie vzorky na 3 až 6 °C.

Detektor: Dvojkanálový UV-detektor RAININ UV-M.

Systém na odoberanie údajov: Dynamax HPLC Method Manager, verzia 1.1 za použitia Apple Macintosh SE.

Stĺpec: TosoHaas TSK PV4000 x 1, 7,8 x 300 mm L.

Mikronádobky pre HPLC: Sklo alebo polypropylén.

Podmienky chromatografie

Stĺpec: TosoHaas TSK PV4000 x 1, 7,8 x 300 mm L.

Mobilná fáza: CM 80 (6 mM fosforečnan sodný a 120 mM chlorid sodný, pH 7,2).

Rýchlosť prietoku: 0,32 ml/min

Detekcia: ultrafialové svetlo 214 a 260 mm, výstup z detektora IV.

Vstrekovaný objem: 60 mikrolitrov.

Doba medzi dvoma vstrekmi vzoriek: 55 minút.

Stĺpec TSK PV4000 x 1

Použitým stĺpcom bol stĺpec TSK PV4000 x 1, obsahujúci podložku s hrúbkou 5 mikrometrov na báze metakrylátu. Ďalej bude uvedená kalibračná krivka, pripravená za použitia poly etyloxidového štandardu PEO. Prerušované čiary znázorňujú dobu retencie pre tri skúmané roztoky a to pre roztok so zhlukmi antigénu hepatitídy A, pre roztok antigénu hepatitídy A a pre roztok nečistoty s molekulovou hmotnosťou 660 000 Rovnakým spôsobom sú znázornené doby retencie pre dve hydrofóbne zlúčeniny s nízkou molekulovou hmotnosťou, vitamín BI2 a acetón. Obe zlúčeniny sa nachádzajú vpravo od kalibračnej vsúvky, doby retencie týchto látok dokazujú hydrofóbnu povahu polymérneho nosiča. Zadržané vrcholy je možné pozorovať v niekoľkých vzorkách, ako je zrejmé z obr. 29. Tieto látky sa zvyčajne vymývajú v blízkosti vrcholov pre soľ a ide zrejme o zlúčeniny s nízkou molekulovou hmotnosťou.

Sekcia II: Skúšobné a kalibračné postupy

Príprava kalibračných štandardov

Bola použitá kalibračná krivka, pripravená zo šiestich úrovní koncentrácií na kvantitatívne stanovenie vírusu hepatitídy A. Kalibračné štandardy boli pripravené riedením čisteného vírusu hepatitídy A. Ako štandard bol použitý produkt čistený pomocou SEC s koncentráciou 12 mikrogramov/ml. Bolo pripravených šesť štandardných roztokov na kalibráciu v koncentračnom rozmedzí 0,75 až 12 mikrogramov/ml, koncentrovaný produkt bol riedený roztokom CM80 podľa nasledujúcej tabuľky:

kalibračný koncentrácia mikrolitre antigénu mikrolitre

štandard	Hep A	Hep A	CM80
	(μΐ/ml)
1	12	250 μΐ 9854 SECProd	0
2	9	180 μΐ 9854 SECProd	60
3	6	250 μΐ 9854 SECProd	250
4	3	250 μΐ kal.staň. 3	250
5	1,5	250 μΐ kal.staň. 4	250
6	0,75	250 μΐ kal.Stan. 5	250

Štandardy sa pripravujú pridaním roztoku vírusu hepatitídy A a roztoku CM80 priamo do mikronádobiek pre HPLC. Kalibračná krivka sa pripraví vynesením plochy pre log vírusu hepatitídy A proti log koncentrácie. Typická kalibračná krivka je znázornená na obr. 30.

Transformácia údajov z log-log kalibračnej krivky sa vykonáva na zníženie závislosti kalibračnej krivky na vysokej koncentrácii štandardu, použitého pri kalibrácii. Pri chromatografii biologických makromolekúl sa rozptyl údajov o niečo zvyšuje pri zvyšovaní koncentrácie. Pri kalibrácii HPLC sa teda strmosť čiary pre regresiu primárne stanovuje pri najvyššej koncentrácii štandardu, ktorá je tiež najvariabilnej šia.

Grafy pre 13 kalibračných kriviek pre vírus, pripravený vyššie uvedeným spôsobom v priebehu dvoch mesiacov sú znázornené na obr. 31. Na ľavej strane je lineárny graf, na pravej strane transformácia Log-log pre tie isté krivky. Lineárny graf má vyjadrený rozptyl kriviek, vychádzajúci v podstate zo spoločného začiatku, čo jasne dokazuje zvýšenú variabilitu plôch pre vírus pri stúpajúcej koncentrácii. Výsledkom je variácia v strmosti rôznych kriviek.

V prípade transformácie log-log pre tieto kalibračné krivky zostáva rozptyl RSD stály v priebehu celého rozmedzia koncentrácie. Táto skutočnosť sa prejaví zníženými rozdielmi medzi strmosťou kriviek, ako je zrejmé z obr. 31B.

Príprava vzorky

A. Vzorka vírusu hepatitídy A

Boli analyzované vzorky, ktoré boli odobrané v nasledujúcich stupňoch postupu:

1. prefiltrovaný materiál po rozrušení buniek

2. prefiltrovaný materiál po pôsobení nukleázy

3. zrazenina po pôsobení PEG, znova uvedená do suspenzie

4. vodná fáza po extrakcii chloroformom

5. produkt po prechode anionomeničom

6. produkt po prechode stĺpcom gélu.

Materiál po rozrušení buniek a filtrácii, prefiltrovaný materiál po pôsobení nukleázy a vzorka po prechode stĺpcom gélu nie je nutné pred analýzou riediť. Vzorka po zrazení PEG, znova uvedená do suspenzie by mala byť odstredená 5 minút pri 10 000 x g, aby boli odstránené zvyšné častice. Vzorka sa tiež riedi pred analýzou roztokom CM 80 v objemovom pomere 1:4. Vodné fázy po extrakcii chloroformom a produkt zo stĺpca anionomeniča sa analyzujú neriedené a potom po riedení v pomere 1:1 roztokom CM80 tak, aby koncentrácia zodpovedala rozmedziu v kalibračnej krivke. Pre všetky vzorky sa analýza vykonáva trikrát a vypočíta sa priemer z troch stanovení. Vzorky sa uložia pred vstreknutím do automatického zariadenia s teplotou 2 až 6 °C.

Triton sa len slabo zadržuje v stĺpci TSK PV4000 x 1 a na jeho odstránenie je potrebný ďalší stupeň. Z tohto dôvodu majú byť vzorky s obsahom Tritonu, to znamená filtrát po rozrušení buniek a filtrát po spracovaní nukleázou sledované porovnaním s roztokom CM80, aby bolo možné dokázať odstránenie zmáčadla pred vstreknutím ďalšej vzorky. Vzorky je možné analyzovať v obrátenom poradí tak, že ako prvý sa analyzuje produkt SEC, aby nedošlo k vzniku interferenčných vrcholov v dôsledku neskorej elúcie.

Vykonanie skúšky

1. Vstrekne sa 50 mikrolitrov každého zo šiestich kalibračných štandardov. Doba retencie pre vírus by mala byť 19,0 ± 1 minúta

2. Vzorky sa pripravujú ako je uvedené vyššie. Vstrekuje sa vždy 50 mikrolitrov, každá vzorka sa analyzuje trikrát.

Sekcia III. Linearita, presnosť a reprodukovateľnosť skúšok

V 13 rôznych dňoch bolo pripravených 13 kalibračných kriviek v koncentračnom rozmedzí 0,75 až 12,0 mikrogramov/ml, analýzy boli vykonané v rozmedzí piatich týždňov. Na výpočet koncentrácie pre každý kalibračný štandard z každej krivky bola použitá rovnica pre regresiu. Výsledky, ktoré boli z 13 kriviek vypočítané v porovnaní s nominálnou koncentráciou pre uvedených 6 kalibračných štandardov, sú zhrnuté v tabuľke 17-1.

Tabuľka 17-1

Porovnanie nameraných a nominálnych koncentrácií čistého vírusu použitím rovnice pre regresiu kalibračná nominálne koncentrácie štandardov vírusu krivka (mm/dd) hepatitídy A v mikrogramoch/ml

		12	9	6	3	1,5	0,75
č.	1 10/6	11,91	8,93	6,03	3,03	1,54	0,73
č.	2 10/7	11,88	8,88	7,00	3,04	1,52	0,74
č.	3 10/8	12,26	8,81	5,95	3,00	1,49	0,76
č.	4 10/10	11,87	9,04	6,00	3,04	1,45	0,76
č.	5 10/13	11,89	8,97	6,06	3,02	1,52	0,74
č.	6 10/14	11,75	9,08	6,07	3,06	1,47	0,75
č.	7 10/20	11,94	8,98	5,96	2,98	1,60	0,72
č.	8 10/21	11,99	8,95	5,99	3,01	1,53	0,74
č.	9 10/22	11,98	8,94	5,90	2,97	1,45	0,70
č.	10 10/26	12,08	-	6,00	2,98	1,48	0,76
č.	11 10/28	12,01	9,05	6,00	2,95	1,51	0,75
č.	12 11/18	11,48	9,23	6,14	3,00	1,52	0,73
č.	13 12/3	11,88	8,90	5,10	3,04	1,50	0,74
priemer	11,92	8,98	6,02	3,01	1,51	0,74
štand.odchýlka	0,17	0,10	0,06	0,03	0,04	0,02
RSD	0,01	0,01	0,01	0,01	0,03	0,03

-Šije zrejmé, že reprodukovateľnosť je veľmi dobrá pre všetkých šesť koncentrácii, hodnoty RSD sú menej než 3 % celého koncentračného rozmedzia. Presnosť je taktiež veľmi dobrá, pre všetky sledované koncentrácie štandardu sa namerané koncentrácie pohybovali v rozmedzí 5 vztiahnuté na nominálne koncentrácie.

Analýza vrcholu

Aby bolo možné ďalej určiť špecifickosť a presnosť analýzy HPSEC, bola vykonaná analýza vrcholov.

Produkt po prechode ariionomeničom a vodná fáza po extrakcii chloroformom boli analyzované spolu s rovnakým objemom produktu SEC z tej istej šarže. Výsledky sú uvedené v nasledujúcej tabuľke 17-2. Všetky vzorky boli analyzované trikrát.

Tabuľka 17-2

Izolácia vírusu hepatitídy A vo vrcholoch

vzorka	nameraná	teoretická	izolácia
	koncentrácia	koncentrácia	vo vrchole
	gg/ml	gg/ml	%
vodný roztok po extrak-
cii chloroformom	7,27
vzorka z anionomeniča	8,87
produkt zo SEC	5,40
analýza vrcholu
extrakt po chloroforme
k SEC 1:1	6,40	6,33	101
vzorka z anionomeniča
k SEC 1:1	7,18	7,14	101

- 82 Z výsledkov je zrejmé, že došlo k úplnej izolácii produktu vo vrcholoch, čo dokazuje presnosť a špecifickosť stanovenia pomocou HPSEC.

Sekcia IV. Analýza výsledkov

Zhrnutie

Chromatogramy typu HPSEC poskytujú dobrú informáciu o spôsobe čistenia vírusu hepatitídy A. Stanovením vo filtráte po rozrušení buniek a po pôsobení nukleázy je možné získať informáciu o účinnosti benzonázy. Pre tieto vzorky boli chromatogramy analyzované a porovnávané pri 214 a 260 nm.

Pri porovnávaní vzoriek zo štyroch posledných stupňov, to znamená po opätovnom uvedení zrazeniny po pôsobení PEG do suspenzie, po extrakcii vodnej fázy chloroformom, po prechode anionomeničom a po chromatografii na géli je možné sledovať odstránenie dvoch hlavných nečistôt a to zhlukov materiálu a kontaminujúcej bielkoviny s molekulovou hmotnosťou 660 000. Pri výpočte percentuálneho množstva vírusu v týchto vzorkách je možné dokázať odstránenie týchto nečistôt. V konečnom stupni sa použije HPSEC na vypočítanie koncentrácie vírusu v posledných troch stupňoch celého postupu.

Pomocou metódy HPSEC bolo sledovaných celkom desať šarží vírusu, spracovaného v MMD, analyzované boli filtráty po rozrušení buniek, po pôsobení nukleázy, materiál po zrážaní PEG a znova uvedení do suspenzie, vodná fáza po extrakcii chloroformom, produkt po prechode anionomeničom a produkt po SEC. Chromatografia pre všetky tieto vzorky z desiatich šarží bola dobre reprodukovateľná.

V tejto sekcii sú rozoberané chromatogramy pre každú zo šiestich vzoriek a je podrobne opísaná informácia, získaná pre každú vzorku ako typický výsledok skúšky, vykonávanej vždy s trojnásobným opakovaním.

Filtrát po rozrušení kultúry a potom po pôsobení nukleázy

Chromatogramy vzoriek v oboch uvedených stupňoch boli sledované pri 214 a 260 nm. Pre každú z týchto vzoriek je profil, získaný pri 214 nm celkom odlišný od profilu, získaného pri 260 nm. Porovnávacia analýza týchto chromatogramov odráža význam skúšky HPSEC pre tieto vzorky, cieľom je nájsť kvantifikovateľný rozdiel, ktorý by bol dôkazom úplnosti rozštiepenia pôsobením benzonázy. Z tohto dôvodu sú v tejto sekcii porovnávané profily pri chromatografii filtrátu po rozrušení buniek a filtrátu, ktorý potom bol spracovaný nukleázou. Najskôr sú uvedené profily pri 214 nm a potom to isté porovnanie pri 260 nm. Charakteristické údaje pre každú vzorku ukazujú úplnosť pôsobenia enzýmu benzonázy.

Údaje pre oba stupne pri 214 nm

Chromatogramy pre filtrát po rozrušení buniek a pre ten istý filtrát po pôsobení nukleázy sú uvedené na obr. 32. Pri 214 nm vykazujú oba vzorky celý rad čiastočne oddelených vrcholov. Vzhľadom na nízku mieru rozdelenia v týchto vzorkách je integrácia jednotlivých vrcholov do oblasti vírusu nemožná. Jedinou informáciou, ktorú je možné z týchto vzoriek získať, je celková plocha pre všetky vrcholy pri 214 nm. Výsledky trojitej analýzy tých istých vzoriek sú na obr. 32 taktiež uvedené. Táto celková plocha pri 214 nm nezahrňuje vrchol, ktorý je zadržaný po 36 minútach. Celková plocha po pôsobení nukleázy je pri 214 nm o 15 % nižšia než v predchádzajúcom stupni v dôsledku pôsobenia benzonázy. Vizuálne porovnanie oboch chromatogramov na obr. 32 dokazuje stratu absorbancie v oblasti vírusu hepatitídy A. Avšak definitívne meranie tohto štiepenia je nemožné vzhľadom na malé oddelenie vrcholov. Celková plocha pri 214 nm bola získaná pre deväť šarží, hodnoty sú uvedené v doplnku A. Tieto celkové plochy pri 214 nm neposkytujú žiadnu priamu alebo špecifickú informáciu o výkonnosti postupu, je len možné sledovať stálosť vzoriek, takže výpočet plochy pri 214 nm nie je potreb84 né bežne vykonávať.

A) Filtrát po rozrušení buniek

filtrát	celková	Dlocha	(UV)	pri	214	nm nV)
1		27	248	238
2		26	404	744
3		26	782	947
	- priemer	26	811	976
	štandardná
	odchýlka		344	966
B) Filtrát	po pôsobení nukleázy
filtrát	celková	Dlocha	(UV)	pri	214	nm u V)
1		22	728	263
2		22	841	564
3		22	784	419
	priemer	22	784	749
	štandardná
	odchýlka		46	256

Údaje pre oba stupne pri 260 nm

Chromatogramy filtrátu po rozrušení buniek a toho istého filtrátu po spracovaní nukleázou sú pri sledovaní pri 260 nm znázornené na obr. 33. Pri tejto vlnovej dĺžke má filtrát po rozrušení buniek odlišnejší profil s obsahom 5 až 6 oddelených vrcholov. Prvé dva vrcholy majú dobu retencie 17,2 a 19,1 minút a obsahujú adičný produkt vírusu hepatitídy A a nukleovej kyseliny a vírus hepatitídy A. Vzhľadom na to, že oba vrcholy obsahujú určité množstvo nukleovej kyseliny, dominujú pri analýze HPSEC pri 260 nm.

Porovnanie vzoriek filtrátu po rozrušení buniek a tej istej vzorky po pôsobení nukleázy pri 260 nm (obr. 33A a 33B) poskytuje jasnú informáciu o účinnosti benzonázy. Hlavné vrcholy, ktoré je možné pozorovať vo filtráte po roz85

-z rušení buniek sú celkom odstránené po pôsobení benzonázy. Na obr. 33B nie je možné pozorovať žiadne odlišné vrcholy po 17 až 19 minútach elúcie stĺpca.

Potvrdenie účinkov benzonázy

Analýza filtrátu po rozrušení buniek a toho istého filtrátu po pôsobení nukleázy je pre deväť šarží zhrnutá v tabuľke 17-3. Oblas-ť v ultrafialovom svetle pri 260 nm pre vrcholy po 17 a 19 minútach pre tieto vzorky ukazuje, že po pridaní benzonázy dôjde k úplnému vymiznutiu týchto vrcholov vo všetkých analyzovaných šaržách. To znamená, že pre tieto vzorky je možné túto skúšku doporučiť na potvrdenie účinku benzonázy, ktorý sa prejaví znížením vrcholu pri 260 nm po pôsobení nukleázy na menej než 10 % v porovnaní s filtrátom po rozrušení buniek.

Tabuľka 17-3

Zníženie plochy pri 260 nm (UV) pôsobením benzonázy pre deväť šarží šarža filtrát po rozrušení filtrát po pôsobení zvyšok

č. (A), plocha po 17 a nukleázy (B), plocha A260 min., vrcholy po 17 a 19 minútach B/Axl00

260 nm

948	1	240	987	0	0
985		947	988	0	0
1047	1	085	719	0	0
102		708	663	0	0
101		831	179	0	0
108	1	060	441	0	0
100		895	005	0	0
139	1	377	974	0	0
236	1	281	608	0	0
priemer	1	018	495	0	0
štan.odchvl		205	034		-

Obr. 33(A) Filtrát po rozrušení buniek filtrát plocha vrcholov po 17 a 19 min. UV pri 260 nm

	1		1	192	597		3	193	055
	2		1	259	216		3	034	891
	3		1	271	147		3	094	820
4,		priemer	1	240	987	priemer	3	107	589
		štand.				štand.
		odchýlka		34	562	odchýlka		65	198
	Obr.	33(B) Filtrát	po	pôsobení	nukleázy

filtrát plocha vrcholov po 17 a 19 min. UV pri 260 nm priemer a štand. odchýlka0

Vzorka po resuspenzii usadeniny po pôsobení PEG

Na obr. 34 je znázornený chromatogram vzorky po opätovnom uvedení usadeniny po pôsobení PEG do suspenzie, analýza bola vykonávaná pri 214 nm. Charakteristický profil tejto vzorky je tvorený niekoľkými čiastočne od seba oddelenými vrcholmi. Ide o vrcholy pre zhluky produktov, pre vírus, pre nečistotu s molekulovou hmotnosťou 660 000, ďalšie nečistoty s nízkou molekulovou hmotnosťou a vrchol pre soľ.

Pre túto vzorku bola vypočítaná plocha pre vírus v percentách ako plocha pre vrchol vírusu/celková plocha pre vrcholy x 100, celková plocha nezahrňuje vrchol pre soľ. Výsledky pre trojnásobne vykonanú analýzu vzorky s resuspendovanou usadeninou po pôsobení PEG sú zhrnuté v nasledujúcej tabuľke:

resuspendovaná usadenina Hep A, % celkovej plochy

	1		15,9
	2		27,0
	3		27,4
		priemer	26,8
-y		štand.
5.		odchýlka	0,7

Typický profil pre túto vzorku vykazuje ako hlavnú zložku nečistotu s molekulovou hmotnosťou 660 000, naj variabilnej šia zložka tejto vzorky je množstvo zhlukov produktu. Množstvo zhlukov v typickej vzorke je zvyčajne vyššie než v uvedenej vzorke. Výsledky analýzy HPSEC pre vzorky s resuspendovaným materiálom po pôsobení PEG z 10 šarží sú znázornené v tabuľke A2 v doplnku A. Plocha pre vírus hepatitídy A v percentách sa pohybuje v rozmedzí 18,5 až 32,0 %, všetky vzorky mali dobrú čistotu.

Je zrejmé, že všetky údaje pre vírus, ktoré sú vyššie než 18 %, sú prijateľné, takže je možné čistiaci postup považovať za uspokoj ivý.

Vzorka vodnej fázy po extrakcii chloroformu

Chromatogram vodnej fázy po extrakcii chloroformom je znázornený na obr. 35. Vrchol pre vírus je hlavným vrcholom v tejto vzorke s výnimkou vrcholu pre soľ a je dobre oddelený od nečistoty s molekulovou hmotnosťou 660 000 a od malého množstva zhlukov.

Pre túto vzorku bola stanovená koncentrácia vírusu hepatitídy A a plocha pre vírus bola vypočítaná v percentách. Do tejto plochy nie je zahrnutý vrchol pre soľ. Výsledky analýzy vodnej fázy v trojitom uskutočnení sú zhrnuté v nasledujúcej tabuľke.

vodný extrakt

- 88 koncentrácia vírusu plocha pre vírus pg/ml %

1		28,64		61,0
2		29,76		62,8
3		30,65		61,2
	priemer	29,68	priemer	61,7
	štand.		štand.
	odchýlka	0,82	odchýlka	0,8
Výsledky	analýzy	HPSEC pre	vodnú fázu	po ex

chloroformom pre 10 šarží sú uvedené v tabulke A2 doplnku A. Hodnoty pre plochu vírusu v % sa pre jednotlivé šarže pohybovali v rozmedzí 60,0 až 72,8 %. Výsledky pre polovičné šarže boli v podstate vyššie, hodnoty pre plochu v percentách boli 79,8 a 85,2 %. Koncentrácia vírusu bola variabilnej šia, jednotlivé hodnoty boli 14,4 až 29,7 mikrogramov/ml. Variabilita koncentrácií môže mať svoj vzťah k zmene objemu pri elúcii vzorky a môže závisieť na odbere vzorky v priebehu elúcie.

V prípade, že sa porovnávajú výsledky analýzy HPSEC pre usadenú zrazeninu po pôsobení PEG (obr. 34) a výsledky pre vodnú fázu po extrakcii chloroformom (obr. 35), je zrejmé, že tento stupeň extrakcie je velmi dôležitý na čistenie vírusu. V tomto stupni totiž dochádza k selektívnemu odstráneniu veľkého množstva nečistoty s molekulovou hmotnosťou 660 000 bez podstatnejšej straty vírusu. Hoci uvedenú nečistotu je možné odstrániť aj v nasledujúcich dvoch chromatografických stupňoch, ide o hlavnú nečistotu, pri pretrepávaní ktorej je potrebné v privádzaných roztokoch použiť odlišné vykonanie chromatografie pri znížení výťažku vírusu. Okrem toho podrobné pokusy ukázali, že účinnosť extrakcie veľmi závisí na dobe miešania, ako už bolo uvedené v príklade 15. Hodnoty plochy pre vírus v percentách vo vodnej fáze po extrakcii chloroformom sú teda kvantitatívnym overením úspešnosti extrakcie a dobrého odstránenia uvedenej nečisto- 89 ty.

Pre vzorku vodnej fázy po extrakcii chloroformom sa doporučujú hodnoty plochy v percentách vyššie než 60 %. V prípade, že sa tieto hodnoty znížia pod 60 %, došlo zrejme k poruchám, napríklad v miešacom zariadení, zvlášť v prípade, že sa takéto hodnoty vyskytujú pravidelne.

Produkt po prechode anionomeničom

Na obr. 36 je znázornená analýza vzorky produktu po prechode anionomeničom. V tejto vzorke je hlavnou zložkou vírus hepatitídy A, okrem toho vzorka obsahuje malé množstvo zhlukov a nečistoty s molekulovou hmotnosťou 660 000, okrem toho je ešte prítomné určité množstvo nečistôt s nízkou molekulovou hmotnosťou.

V tejto vzorke bola stanovená koncentrácia vírusu, plocha pre vírus v percentách s výnimkou vrcholu pre sol a zadržaný vrchol. Výsledky pre trojité vykonanie analýzy na vzorke po prechode anionomeničom R x 2009854 sú ďalej uvedené .

vzorka koncentrácia vírusu plocha pre vírus pg/ml %

31,9882,8

32,6381,4

32,3781,6 priemer32,32 štand.

odchýlka0,27 priemer81,9 štand.

odchýlka 0,6

Výsledky analýzy HPSEC pre vzorku po prechode anionomeničom pre 10 šarží sú uvedené v tabuľke A2 doplnku A. Hodnoty pre plochy v percentách sa pohybovali v rozmedzí 78,6 až 87,4 %, hodnoty pre polovičné šarže boli vyššie než 90 %. Zvýšené hodnoty pre polovičné šarže neudivujú vzhľadom na to, že tieto šarže boli čistejšie.

Hodnoty pre koncentráciu sa pre oba typy šarží od seba podstatne líšili, rozdiely tvorili viac než dvojnásobok. Tieto rozdiely sú rovnako ako rozdiely v predchádzajúcom stupni pravdepodobne spôsobené rozdielmi v odbere vzoriek z týchto šarží.

Pri spôsobe čistenia vírusu je chromatografia na ionomeniči v podstate stupňom, ktorý čistenie ukončuje. V tomto stupni sa odstráni- ešte určitý podiel nečistoty s molekulovou hmotnosťou 660 000 a niektoré nečistoty s nízkou molekulovou hmotnosťou, avšak čistota produktu po prechode anionomeničom v podstate závisí na čistote privádzaného produktu vzhľadom na to, že v tomto stupni nie je možné odstrániť veľké množstvo nečistoty s molekulovou hmotnosťou 660 000 bez zníženia výťažku vírusu. Znamená to, že v tomto stupni nie je možné vyrovnať chyby, ku ktorým došlo pri spracovaní v predchádzajúcich stupňoch. V typických prípadoch sa v priebehu chromatografie na ionomeniči zvýši plocha pod krivkou pre vírus približne o 10 až 20 %, čím vyššia je čistota privádzaného materiálu, tým vyššia je aj čistota výsledného produktu. Pre uvedenú vzorku by mala byť prípustná hodnota plochy pod krivkou pre vírus vyššia než 75 % a zvýšenie čistoty v tomto stupni by malo byť najmenej o 10 %. V prípade splnenia oboch týchto požiadaviek by bolo čistenie v priebehu celého postupu aj na anionomeniči vykonané správne. V prípade, že sa nedosiahne hodnota vyššia než 75 % pre plochu pod krivkou pre vírus, môže byť chybné vykonanie chromatografie alebo predchádzajúcich stupňov, avšak v prípade, že zvýšenie čistoty v stĺpci je nižšie než 12 %, je pravdepodobne problém špecifický pre čistenie na anionomeniči, môže isť napríklad o chybný odber frakcií alebo o chybný prietok stĺpcom.

Chromatografia produktu na géli, SEC

Produktom z tohto stupňa je vysoko čistený vírus, ako je zrejmé z výsledkov na obr. 37.

; t

- 91 Vo vzorke bola stanovená koncentrácia vírusu hepatitídy A. V nasledujúcej tabuľke sú uvedené výsledky analýzy produktu po prechode gélom, vzorky boli analyzované dvakrát.

vzorka koncentrácia vírusu gg/ml

117,34

216,34 priemer16,84 štand.

odchýlka0,50

Výsledky analýzy HPSEC pre produkt po prechode gélom pre 10 šarží sú uvedené v tabuľke A2 doplnku A. Pre tieto vzorky nebola vypočítaná plocha pod krivkou v percentách. Z obr. 37 je zrejmé, že išlo o vysoko čistý produkt, zbavený zistiteľných množstiev zhlukov a nečistôt s molekulovou hmotnosťou 660 000. Avšak analýza produktu po SEC v priebehu 60 minút ukázala prítomnosť malého zadržaného vrcholu, materiál z tohto vrcholu vychádza zo stĺpca približne po 49 minútach, ako je zrejmé z obr. 38. Rozmer tohto vrcholu sa mení u jednotlivých šarží, na obr. 38 je znázornený výsledok pri použití šárže, v ktorej bolo až dosiaľ nájdené najvyššie množstvo tejto látky. Identifikácia tohto vrcholu by mala byť uskutočnená pred výpočtom plochy v percentách pre túto vzorku, aby bolo možné skutočne určiť jeho čistotu. Pokiaľ táto identifikácia nebude vykonaná, budú hodnoty pre plochu pod krivkou pre túto vzorku zahrňovať len vrcholy v rozmedzí doby retencie 16 až 32 minút. S týmto obmedzením bola plocha pod krivkou pre všetky šarže, ktoré boli až dosiaľ sledované približne 100 %.

Sekcia V: Stálosť vzorky

Pri analýze pomocou HPSEC a EIA bolo možné dokázať, že získané vzorky sú stále až po dobu niekoľko mesiacov. Malé

- 92 straty bolo možné pozorovať pri spracovaní ionomeničom, tieto straty však boli zvyčajne nižšie než 10 % v priebehu dvoch týždňov. Po tomto počiatočnom znížení však aj tieto vzorky zostali stále. Po konečnom spracovaní SEC sú získané produkty stále po dobu najmenej jedného roka.

Sekcia VI: Porovnanie výsledkov analýzy EIA a HPSEC

Výsledky analýzy EIA a HPSEC, získané pre tri vzorky, a to pre vodnú fázu po extrakcii chloroformom, pre produkt po prechode anionomeničom a pre produkt SEC z jedenástich šarží 2 až 12 boli navzájom porovnávané.

Na obr. 45 je znázornený graf pre log koncentrácie po HPSEC proti log koncentrácie po EIA pre uvedených 33 vzoriek. Vzťah pre regresiu, zodpovedajúci týmto údajom má strmosť 0,88 a koeficient korelácie (r) 0,94. Hodnota strmosti, ktorá sa blíži hodnote 1 a hodnota r = 0,94 ukazuje na velmi dobrú koreláciu medzi oboma skúškami, zvlášť pri variabilite, ktorá je spojená s každým meraním.

Sekcia VII: Reprodukovateľnosť výsledkov

Analýza HPSEC pre šarže 2 až 14 dokazuje stálosť a reprodukovatelnosť postupu. Pri analýze pomocou HPSEC v jednotlivých fázach postupu boli vzorky odoberané zo spracovávaného materiálu a bola dosiahnutá dobrá reprodukovateľnosť pri čistení hlavných nečistôt. Na obr. 46 je znázornený vzťah plôch pod krivkami pre monomérny vírus v percentách pre jednotlivé vsádzky. V priebehu posledných štyroch stupňov čistenia je možné pozorovať vysokú reprodukovateľnosť. Šarže 10 a 11 s vyššou čistotou po extrakcii chloroformom a po prechode anionomeničom sú v oboch prípadoch polovičné šarže.

Príklad 17: Doplnok A

Tabuľka 17-A1

Zhrnutie údajov pre materiál po rozrušení buniek a po pôsobení nukleázy. Každá vzorka bola analyzovaná trikrát, uvedené sú priemery pre jednotlivé vzorky.

Filtrát po rozrušení buniek šarža celková plocha celková plocha plocha po 17 a 19

	214	nm	260	nm	min.	. , 260 nm
1	26	811	976	3	107	589	1	240	987
2	22	032	023	2	722	501		974	988
3	24	322	218	2	696	138	1	085	819
4	19	934	567	1	588	166		708	663
5	23	633	378	1	657	484		831	179
6	26	311	501	2	590	678	1	060	441
7	20	336	561	2	225	138		895	005
8	27	019	891	3	195	019	1	377	974
9	25	671	116	2	804	591	1	281	608
priemer	23	800	264	2	472	839	1	018	495
štandardná
odchýlka	2	648	361		565	612		205	034

Filtrát po pôsobení nukleázy šarža celková plocha

214 nm plocha po 17 a 19 min., 260 nm

1	22	784	749	0
2	21	417	391	0
3	22	658	768	0
4	17	766	458	0
5	17	984	377	0
6	23	280	554	0
7	17	231	064	0
8	23	218	865	0
9	21	797	999	0
priemer	20	904	469
štandardná
odchýlka	2	491	146

Doplnok A (pokračovanie)

Tabuľka 17-A2

Údaje pre resuspendovanú usadeninu po pôsobení PEG, pre vodnú fázu po extrakcii chloroformom, produkt z anionomeniča a produkt po SEC. Analýzy boli vykonané trikrát, uvedený je priemer.

	suspenzia po PEG	vodná fáza po extrak chloroformom	produkt po anionomeniči	produkt SEC
šarža	plocha o Ό	plocha %	koncent. Ajg/ml	plocha %	koncent. /ug/ml	plocha %	koncent. ťug/ml
2	29.6 ± 0.6	64.7 ± 1.7	22.25 ± 0.35	80.6 ± 0.1	28.46 ± 0.21	100	10.01 ± 0.09
3	26.8 ± 0.7	61.7 ± 0.8	29.68 ± 0.82	81.9 ±0.6	32.32 ± 0.27	100	16.84 i 0.50
4	32.0 ± 2.3	64.7 ± 0.4	23.72 ± 0.01	83.7 ± 0.9	29.12 ± 0.48	100	14.57 ± 0.18
5	31.2 ± 2.6	60.0 ± 0.2	25.89 ± 0.26	78.6 ± 0.3	35.74 ± 0.89	100	18.22 ± 0.75
6	25.9 ± 0.3	67.1 ± 1.3	15.90 ± 0.26	82.9 ± 0.3	16.39 ± 0.09	100	7.96 ±0.18
7	29.4 ± 0.9	66.7 ± 1.6	19.10 ± 0.30	84.2 ± 0.3	15.73± 0.26	100	7.80 ± 0.20
8	29.2 ± 0.7	70.8 + 1.1	16.40 ± 0.10	87.4 ± 0.5	20.01 ± 0.07	100	9.68 ± 0.12
9	20.7 ± 1.4	72.8 ± 3.4	14.32 ± 0.28	85.7 ± 0.5	14.61 ± 0.05	100	8.05 ± 0,01
10	23.7 ± 0.1	85.2 ± 1.3	10.02 ± 0.06	97.0 ± 0.3	10.24 ± 0.04	100	6.24 ± 0.06
11	18.5 ± 0.7	79.4 ± 0.5	7.32 ±0.42	90.5 ± 1.0	8.62 ± 0.10	100	5.24± 0.00

- 96 Príklad 18

Výsledky klinických skúšok

Čistená vakcína podlá vynálezu bola podávaná zdravým ľuďom. Nebolo možné pozorovať žiadne nepriaznivé účinky, ktoré by bolo možné prisúdiť pôsobeniu vakcíny.

Účinnosť jednej dávky vakcíny s obsahom 25 jednotiek bola dokázaná u detí pri skúškach podlá Monroa, výsledky boli zverejnené 13. augusta 1992 v Verzberg a ďalší, NEJM 327, č. 7, 453 až 457. Rozdiel medzi materiálom, ktorý použil

Monroe a materiálom, ktorý bol výsledkom celého postupu podľa vynálezu, je uvedený na obr. I, rozdiel spočíval v tom, že jeden z materiálov vo fáze I/II tejto skúšky bol vyrobený v trepacích fľašiach a oddelený mechanicky a druhý bol vyrobený postupom, vhodným na výrobu väčšieho množstva spôsobom podľa vynálezu, inak boli oba postupy rovnaké. 25 jednotiek, to znamená 25 ng bielkoviny HAV v čistenom materiáli podľa vynálezu bola dávka, dostatočná na tvorbu protilátok v sére u viac než 95 % detí a mladistvých vo veku 2 až 16 rokov po 4 týždňoch po očkovaní. Tá istá dávka poskytovala 100% ochranu u detí a mladistvých od 21. dňa po jedinej dávke vakcíny.

Potom boli sledované rozdiely vo výsledkoch u dospelých v závislosti na veku a na hmotnosti. V priebehu jedného mesiaca po jedinej dávke s obsahom 25 jednotiek došlo k tvorbe protilátok u 83 % dospelých s vekom vyšším než 18 rokov a u 97 % detí a mladistvých vo veku 2 až 17 rokov. Pri podaní dvoch dávok po 25 jednotkách v intervale 2 týždňov došlo k zvýšeniu tvorby protilátok látky v sére po 7 mesiacoch jednotiek bolo možné dokázať sledovaných vekových skupín.

mesiacoch a po 36 mesiac skupín. Je teda zrejmé, že u dospelých az na 93 %. Protipo druhej alebo tretej dávke 25 u viac než 99 % osôb a u oboch Seropozitivita trvá v 100 % po ch u oboch sledovaných vekových jediná dávka vakcíny s obsahom jednotiek je dostatočná na vyvolanie tvorby protilátok u aspoň 80 % akejkoľvek populácie v priebehu jedného mesiaca po očkovaní. Získané údaje sú zhrnuté v nasledujúcej tabuľke 18-1, boli podané dávky po 25 jednotkách v týždňoch 0 a 24 alebo v týždňoch 0,2a 24. Hodnota GMT = geometrický priemer titra protilátok proti vírusu HAV. Pri očkovaní väčšou dávkou dochádza k tvorbe protilátok vo vyššom percentuálnom podieli populácie.

Tabuľka 18-1

Tvorba protilátok v uvedenom týždni po počiatočnej imunizácii

očkovanie	vek	4	24	28
0 a 24	18 - 29	83 % 100/120	87 % 33/38	100 % 24/24
GMT u pozitívnych		21	41	2138
0, 2 a 24	18 - 29	98 % 115/118	100 % 33/33	100 % 24/24
GMT u pozitívnych		33	90	4379
0 a 24	30 - 89	72 % 265/370	80 % 111/138	100 % 71/71
GMT u pozitívnych		22	34	1332
0, 2 a 24	30 - 89	85 % 321/380	89 % 118/132	100 % 75/75
GMT u pozitívnych		28	59	1796

Okrem vyššie uvedených údajov bola skupina očkovaných, ktorí nemali v krvnom sére po 4 týždňoch žiadne protilátky (celkom 23 očkovaných) znovu podrobená skúškam po 24 týždňoch a po 28 týždňoch, kedy došlo k viac než 10-násobnému zvýšeniu titra protilátok. U dvoch jednotlivcov bolo možné dokázať približne šesťnásobný vzostup v titre po 6 mesiacoch. Zvyšných 21 jednotlivcov (91 %) malo anamnestickú odpoveď a vzostup protilátok. To znamená, že títo jednotlivci síce nevykázali protilátku v sére, avšak sú zrejme chránení očkovaním vakcínou podľa vynálezu, aj keď zostávajú dlhšiu dobu po očkovaní celkom seronegatívni.

Claims (22)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Spôsob výroby vírusu hepatitídy A v priemyselnom meradle s viac než 95% čistotou bielkoviny pri elektroforéze na SDS-polyakrylamidovom géli pri farbení striebrom, vy-

   1' značujúcisatým, že sa

   a) pestuje vírus hepatitídy A vo velkom množstve na vrstve bunkového materiálu na velkom povrchu statického reaktora SSR,

   b) vírus hepatitídy A sa izoluje zo súvislej bunkovej kultúry pôsobením zmáčadla, prenikajúceho do vrstvy infikovaných buniek za uvoľnenia vírusu hepatitídy A z bunkovej kultúry,

   c) prípadne sa odstránia nukleové kyseliny, nešpecifické pre vírus hepatitídy A v tomto stupni zo získaného vírusu hepatitídy A pôsobením nukleázy,

   d) vírus hepatitídy A, izolovaný z bunkovej kultúry sa zahustí pomocou membrán a diafiltráciou alebo zachytením na ionomeniči,

   e) z koncentrovaného vírusu hepatitídy A zo stupňa d) sa odstránia bielkoviny, ktoré nie sú špecifické pre vírus hepatitídy A kombináciou, extrakcie organickými rozpúšťadlami, zrážaním polyetylénglykolom, výmenou iónov, vrátane odstránenia voľných kontaminujúcich nukleových kyselín v prípade, že tieto kyseliny neboli odstránené v stupni c) a chromatografiou na géli a

   f) čistený vírus hepatitídy A zo stupňa e) sa izoluje.
2. 2. Čistený vírus hepatitídy A, získaný spôsobom podľa nároku 1.
3. 3. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že sa v stupni a) očkuje vírus hepatitídy A zo supernatantu SSR, infikovaného HAV do reaktora so statickým povrchom, v ktorom sú v súvislých vrstvách pestované bunkové kultúry MRC-5 a živné prostredie obieha reaktorom so statickým povrchom za použitia slučky na prevzdušnenie a doplnenie

   100 zložiek živného prostredia.
4. 4. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že sa v stupni b) vírus hepatitídy A izoluje spracovaním bunkových vrstiev, infikovaných týmto vírusom pôsobením 0,05% až 1% roztoku Tritonu X-100 na uvoľnenie vírusu hepatitídy A.
5. 5. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že sa v stupni c) na štiepenie použije benzonáza.
6. 6. Spôsob produkcie vakcíny s obsahom inaktivovaného vírusu hepatitídy A v priemyselnom meradle s čistotou bielkoviny HAV vyššou než 95%, vyznačujúci sa tým, že

   a) pestuje veľké množstvo vírusu hepatitídy A v reaktoroch Nunc Celí Factories, Costar Cubes alebo v reaktoroch so statickým povrchom, SSR, vrátane prvkov v tvare pravidelnej siete pre rast buniek s vysokou hustotou na jednotku objemu s vytvorenou, bunkovou vrstvou buniek MRC-5,

   b) vypestovaný HAV sa izoluje odstránením živného prostredia a pridaním roztoku s obsahom 0,1 % Tritonu X-100,

   c) na oddelený vírus sa potom pôsobí benzonázou na rozštiepenie kontaminujúcich voľných nukleových kyselín,

   d) HAV, spracovaný benzonázou sa koncentruje zachytením na stĺpci ionomeniča s následnou elúciou 0,35 M NaCl s následným vyzrážaním polyetylénglykolom,

   e) HAV, vyzrážaný PEG sa znova uvedie do suspenzie a extrahuje zmesou chloroformu a izoamylalkoholu v objemovom pomere 24:1 za energického miešania a vodná fáza sa oddelí a uschová,

   f) vodná fáza po extrakcii sa chromatografuje na ionomeniči DEAE Toyopearl 650 M v 90 až 150 mM NaCl, elúcia HAV sa vykonáva gradientom až do 1 M NaCl, frakcie s obsahom HAV sa spoja a zriedia na koncentráciu chloridu sodného pod 150 mM a koncentráciu HAV pod 20 mikrogramov/ml, takže sa minimalizuje alebo vylúči zrážanie HAV,

   101

   g) frakcie zo stupňa f) sa chromatografujú na za sebou zaradených stĺpcoch gélu Toyopearl HV55S a HV65S,

   h) po filtrácii na géli sa HAV inaktivuje pôsobením formaldehydu v koncentrácii 1:1000 po dobu 5 dní, potom sa materiál sterilizuje filtráciou, adsorbuje sa alebo sa súčasne zráža s hydroxidom hlinitým a delí sa na podiely, obsahujúce 25 až 100 ng inaktivovaného čisteného HAV v jednej dávke.
7. 7. Spôsob prevencie infekcie HAV, vyznačuj úci sa tým, že sa vykonáva očkovanie imunologický účinným množstvom produktu, získaného podľa nároku 6.
8. 8. Vakcína s obsahom HAV, pripravená spôsobom podľa nároku 6.
9. 9. Spôsob pestovania HAV, vyznačujúci sa tým, že sa vírus pestuje v reaktore typu Costar Cube alebo v reaktore so statickým povrchom, prípadne obsahujúci prvky v tvare siete z titánu alebo z nerezovej ocele.
10. 10. Spôsob podľa nároku 9, vyznačujúci sa t ý m, že sa v jednom reaktore typu Costar Cube získa 5000 až 50 000 dávok po 25 ng vakcíny s inaktivovaným HAV s čistotou vyššou než 95 %.
11. 11. Čistený vírus hepatitídy A, vyznačuj úci sa t ý m, že viac než 95 % bielkoviny je špecifických pre vírus a menej než 7 % bielkoviny je tvorených nukleovou kyselinou, odlišnou od kyselín HAV alebo lipidom a 0 až 180 % prostriedku tvorí uhľohydrát glukóza.
12. 12. Čistený vírus podľa nároku 11, vyznačuj ú ci sa tým, že je inaktivovaný formaldehydom.
13. 13. Čistený vírus podľa nároku 12, vyznačuj ú c i sa t ý m, že je spracovaný po dávkach 25 až 100 ng na

    ·.; /

    - ÍÔ2 báze bielkoviny spolu so 100 až 1000 mikrogramami hydroxidu hlinitého.
14. 14. Čistený prostriedok s obsahom vírusu hepatitídy A s nasledujúcimi vlastnosťami, vyznačujúci sa tým, že jednotlivé údaje sú vztiahnuté na mikrogramy bielkoviny a v zátvorkách sú uvedené postupy na stanovenie jednotlivých zložiek:

    a) obsah lipidov (plynová chromatografia) < 0,1 gg

    b) uhľohydrát, preukázaný ako glukóza 0,1 - 2,5 gg uhľohydrát, odlišný od glukózy < 0,1 gg (hydrolýza kyselinou trifluóroctovou, Dionex),

    c) bielkovina, špecifická pre vírus HAV > 0,95 mg (analýza aminokyselín a Vestern blot),

    d) RNA, špecifická pre vírus HAV 0,1 - 0,2 gg

    e) kontaminujúca DNA < 0,001 gg
15. 15. Čistený prostriedok podľa nároku 14, vyznačujúci sa t ý m, že obsahuje vírus hepatitídy A, inaktivovaný formaldehydom.
16. 16. Čistený prostriedok podľa nároku 15, vyznačujúci sa tým, že j e adsorbovaný na hydroxid hlinitý.
17. 17. Čistený prostriedok s obsahom inaktivovaného vírusu hepatitídy A, vyznačujúci sa tým, že obsahuje jednotlivú dávku 25 jednotiek, ekvivalentné 25 ng bielkoviny vírusu hepatitídy A na báze analýzy aminokyselín, pričom táto dávka je dostatočná na vyvolanie tvorby protilátok u aspoň 95 % detí a mladistvých vo veku 2 až 16 rokov po štyroch týždňoch po očkovaní.
18. 18. Čistený prostriedok s obsahom inaktivovaného vírusu hepatitídy A, vyznačujúci sa tým, že jedna až tri dávky po 25 až 100 jednotkách, ekvivalentné 25 až 100 ng vírusu hepatitídy A podľa analýzy aminokyselín sú dostatočné

    103 na tvorbu protilátok, dokázateľných v sére u 80 až 90 % očkovaných v priebehu 4 až 28 týždňov po imunizácii,
19. 19. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že sa vírus hepatitídy A pestuje v reaktore so statickým povrchom pri doplnení živného prostredia rýchlosťou 0,010 až 0,3 ml/cm^/deň.
20. 20. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že sa pestuje vírus hepatitídy A v reaktore so statickým povrchom a živné prostredie sa odoberá a doplňuje stálou rýchlosťou.
21. 21. Vakcína s obsahom vírusu hepatitídy A, vyzna- čujúca sa tým, že pri obsahu 25 až 100 jednotiek v dávke 0,1 až 1 ml má nasledujúce nominálne zloženie: zložka množstvo

    chlorid sodný 900-9000 Mg hliník 50-500 Mg tetraboritan sodný 3,8-38 Mg formaldehyd < 0,4 Mg glukóza (polymér) 0-1000 ⁿg bielkovina 25-100 ng chloroform < 44 ng RNA vírusu HAV 2-20 ng uhľohydráty, odlišné od glukózy 0-20 ng mastné kyseliny < 20 ng neomycin < 4 ng DNA z buniek MRC-5 < 0,03 ng sérový albumín hovädzieho dobytka < 0,1 n g enzým benzonáza < 0,0001 ng 22. Vakcína s obsahom vírusu hepatitídy A,

    čujúca sa tým, že pri obsahu 25 jednotiek v dávke

    104

    0,5 ml má nasledujúce nominálne zloženie:

    zložka množstvo

    chlorid sodný 4,500 μ g hliník 250 μ g tetraboritan sodný 19 gg formaldehyd < 200 ng glukóza (polymér) - < 20 n g bielkovina 25 ng chloroform < 22 ng RNA vírusu HAV 5 ng uhľohydráty, odlišné od glukózy 4 ng mastné kyseliny < 1 ng neomycín < 0,5 ng DNA z buniek MRC-5 < 0,005 ng sérový albumín hovädzieho dobytka < 0,02 ng enzým benzonáza < 0,00002 ng
22. 23. Čistený prostriedok s obsahom inaktivovaného vírusu hepatitídy A, vyznačujúci sa tým, že obsahuje dávku 25 jednotiek, ekvivalentnú 25 ng bielkoviny HAV podľa analýzy aminokyselín, dostatočnú na ochranu najmenej 95 % očkovaných detí a mladistvých vo veku 2 až 16 rokov 21 dní po očkovaní.