CN1968713A - 通过抑制具有毛囊形成抑制能力的基因或通过活化具有毛囊形成诱导能力的基因而再生毛囊的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了通过使选自S100a6、Ctgf、Gsto1、Gas6、Klf2、Thbs1和Thbd的具有毛囊形成抑制能力的一个或多个基因的表达受到抑制,或通过使选自Tgfbi、Gas1、Thbs2、Ifi202A、Bmp7、Efna1、Efna3、Cidea、Serping1、MS1、Irf6、Fmod和Fxyd4的具有毛囊形成诱导能力的一个或多个基因的表达受到增强而再生毛囊的方法。
Description
技术领域
本发明涉及策划抑制具有毛囊形成抑制能力的基因的表达而再生和形成毛囊的方法,并涉及特征在于使所述基因的表达受到抑制的毛乳头细胞的培养方法。进一步地,本发明涉及策划增强具有毛囊形成诱导能力的基因的表达而再生和形成毛囊的方法,并涉及特征在于使所述基因的表达受到增强的毛乳头细胞的培养方法。
背景技术
为了补救随着年龄增长等的头发减少,高度需要的通常不仅是使用育毛料,而且也在进行植毛等在医疗机构等中实施手术。一方面,随着近年干细胞研究的进展带来的技术上的突破,以及以组织适合性等问题为原因的深刻的供体不足和脑死亡判定问题等来自伦理方面的要求,可以说高度期待代替现有器官移植的作为先端医疗的再生医疗技术,对作为再生医疗的模型器官的毛囊再生研究也受到了前所未有的关注。
对发育阶段的毛囊形成机制进行了比较好的研究,了解到通过上皮系细胞(表皮细胞)和紧邻其下的间叶系细胞(毛乳头细胞或DPC)之间的信号转导等复杂相互作用的结果,形成了毛囊(R.Pause等人,N.Engl.J.Med.341,491-497,1999;K.S.Stenn等人,Physiol.Rev.81,449-494,2001;S.E.Miller等人,J.Invest.Dermatol.118,216-225,2002)。此外,虽然明白了一旦所形成的毛囊为进行重复的生长期、退化期、静止期的周期性再生的器官,许多生长因子、细胞因子、激素、神经肽等生理活性物质参与其调节,但这些生理活性物质作为参与发育阶段的毛囊形成机制的物质不一定一致。
通过使用裸小鼠的小鼠毛囊重建实验,了解到上皮系细胞和间叶系细胞这两者为毛囊再生所必需,并且如果没有一定量或以上的细胞数,则不能诱导毛囊再生(J.Kishimoto等人,Proc.Natl.Acad.Sci.96,7336-7341,1999)。进一步地,虽然已公开了可再生包含小鼠DPC和人上皮细胞的嵌合毛囊(特愿2004-048322;江浜等人,第26届日本分子生物学年会演讲要旨集2PC-024,2003),但还没有再生完全的人毛囊。其原因之一是得到充分量的可用来移植的具有毛囊诱导能力的人DPC是困难的。
已公开了在特定条件下,如表达多功能蛋白聚糖的DP等细胞能特异性地诱导毛囊(J.Kishimoto等人,Proc.Natl.Acad.Sci.96,7336-7341,1999),但在分子水平上对诱导毛囊形成的现象尚有诸多不明白的地方。
发明公开
本发明旨在确定通过控制调节毛囊形成或毛囊再生的分子的作用,从而促进人毛囊再生的方法,为了探索能活化人DPC的因子,将鉴定已知具有毛囊诱导能力的小鼠DPC中调节毛囊诱导的因子为目的。
本发明者们发现在培养毛乳头细胞时,其毛囊诱导能力消失,而当在一定或以上的高密度培养时,其倾向于保留其诱导能力;在高密度(具体地为3~7×105个/cm2)和低密度(具体地为5~9×104个/cm2)条件下培养毛乳头细胞,研究表达的基因时,发现由于在低密度条件下培养而不能形成毛囊的毛乳头细胞中,以下的特定基因的表达被特异性增强,又由于在高密度条件下培养而形成毛囊的毛乳头细胞中,以下的特定基因的表达被特异性增强。
(1)由于在低密度条件下培养而不能形成毛囊的毛乳头细胞中,表达被特异性增强的基因:
·S100钙结合蛋白A6基因(S100a6)
·结缔组织生长因子基因(Ctgf)
.谷胱甘肽S转移酶ω1基因(Gsto1)
·生长停滞特异性基因6(Gas6)
·克鲁佩尔样因子2(Klf2)
·血小板结合蛋白1基因(Thbs1)
·凝血调节蛋白基因(Thbd)
因此,得出这类特定基因与抑制毛囊的形成和再生密切相关,为具有毛囊形成抑制能力的基因的结论,从而完成了本发明。
因此,在本发明的第一方面,提供了通过使选自S100a6、Ctgf、Gsto1、Gas6、Klf2、Thbs1和Thbd的具有毛囊形成抑制能力的一个或多个基因的表达受到抑制而再生毛囊的方法。
在该第一方面的其他实施方案中,本发明提供了培养毛乳头细胞的方法,其特征在于:使选自S100a6、Ctgf、Gsto1、Gas6、Klf2、Thbs1和Thbd的具有毛囊形成抑制能力的一个或多个基因的表达受到抑制。由此培养的毛乳头细胞可有利地用于通过向头皮进行细胞移植的毛发再生手术或植毛。
(2)由于在高密度条件下培养而形成毛囊的毛乳头细胞中,表达被特异性增强的基因:
·转化生长因子β诱导型68kDa基因(Tgfbi)
·生长停滞特异性基因1(Gas1)
·血小板结合蛋白2基因(Thbs2)
·干扰素活化的基因202A(Ifi202A)
·骨形态发生蛋白7基因(Bmp7)
·肝配蛋白A1基因(Efna1)
·肝配蛋白A3基因(Efna3)
·诱导细胞死亡的DNA片断化因子,α亚基样效应子A基因(Cidea)
·丝氨酸或半胱氨酸蛋白酶抑制物,分化体G(C1抑制物),成员1基因(Serping1)
·半胱氨酸蛋白酶抑制物1基因(MS1)
·干扰素调节因子6基因(Irf6)
·纤调蛋白聚糖基因(Fmod)
·含有FXYD结构域的离子转运调节物4基因(Fxyd4)
因此,得出这类特定基因与诱导毛囊的形成和再生密切相关,为具有毛囊形成诱导能力的基因的结论,从而完成了本发明。
因此,在本发明的第二方面,提供了通过使选自Tgfbi、Gas1、Thbs2、Ifi202A、Bmp7、Efna1、Efna3、Cidea、Serping1、MS1、Irf6、Fmod和Fxyd4的具有毛囊形成诱导能力的一个或多个基因的表达受到增强而再生毛囊的方法。
在该第二方面的其他实施方案中,本发明提供了培养毛乳头细胞的方法,其特征在于:使选自Tgfbi、Gas1、Thbs2、Ifi202A、Bmp7、Efna1、Efna3、Cidea、Serping1、MS1、Irf6、Fmod和Fxyd4的具有毛囊形成诱导能力的一个或多个基因的表达受到增强。由此培养的毛乳头细胞可有利地用于通过向头皮进行细胞移植的毛发再生手术或植毛。
另外,在本发明的第三方面,提供了通过使选自S100钙结合蛋白A6基因(S100a6)、结缔组织生长因子基因(Ctgf)、谷胱甘肽S转移酶ω1基因(Gsto1)、生长停滞特异性基因6(Gas6)、克鲁佩尔样因子2(Klf2)、血小板结合蛋白1基因(Thbs1)和凝血调节蛋白基因(Thbd)的具有毛囊形成抑制能力的一个或多个基因的表达受到抑制并通过使选自转化生长因子β诱导型68kDa基因(Tgfbi)、生长停滞特异性基因1(Gas1)、血小板结合蛋白2基因(Thbs2)、干扰素活化的基因202A(Ifi202A)、骨形态发生蛋白7基因(Bmp7)、肝配蛋白A1基因(Efna1)、肝配蛋白A3基因(Efna3)、诱导细胞死亡的DNA片断化因子,α亚基样效应子A基因(Cidea)、丝氨酸或半胱氨酸蛋白酶抑制物,分化体G(C1抑制物),成员1基因(Serping1)、半胱氨酸蛋白酶抑制物1基因(MS1)、干扰素调节因子6基因(Irf6)、纤调蛋白聚糖基因(Fmod)和含有FXYD结构域的离子转运调节物4基因(Fxyd4)的具有毛囊形成诱导能力的一个或多个基因的表达受到增强而再生毛囊的方法。
在该第三方面的其他实施方案中,本发明提供了培养毛乳头细胞的方法,其特征在于:使选自S100a6、Ctgf、Gsto1、Gas6、Klf2、Thbs1和Thbd的具有毛囊形成抑制能力的一个或多个基因的表达受到抑制并使选自Tgfbi、Gas1、Thbs2、Ifi202A、Bmp7、Efna1、Efna3、Cidea、Serping1、MS1、Irf6、Fmod和Fxyd4的具有毛囊形成诱导能力的一个或多个基因的表达受到增强。由此培养的毛乳头细胞可有利地用于通过向头皮进行细胞移植的毛发再生手术或植毛。
附图简述:
图1显示移植了高密度(a)和低密度(b)培养的毛乳头细胞的小鼠毛囊形成的比较。
图2显示Ctgf皮内注射对小鼠发毛的影响。(a)第+8天;(b)第+7天。
实施发明的最佳方案:
本发明者发现下述基因在毛囊形成和再生诱导能力消失的毛乳头细胞中特异性表达,正如由后述实施例的结果可明确的那样。
·S100a6(S100钙结合蛋白A6,别名“钙细胞周期蛋白”)
S100a6是一种作为钙结合蛋白的S100蛋白或钙应答蛋白、钙感应蛋白,在核膜上表达,认为其调节细胞周期且有助于细胞增殖(A.Tomas等人,J.Biol.Chem.,278,20210-20216,2003;E.C.Breen等人,J CellBiochem.,88,848-854,2003)。
·Ctgf(结缔组织生长因子)
据报导Ctgf作为液体生长因子分泌至细胞外基质中,具有促进细胞接合的作用,是由TGFβ引起的纤维化诱导的靶基因(A.Leask等人,J.Biol.Chem.,278,13008-13015,2003)
·Gsto1(谷胱甘肽S转移酶ω1)
已暗示了Gsto1具有谷胱甘肽依赖性硫醇转移酶活性、二氢抗坏血酸还原酶活性,是应激防御基因(R.Kodym等人,J.Biol.Chem.,274,5131-5137,1999)。
·Gas6(生长停滞特异性6)
Gas6为间叶系细胞的细胞生长因子,也报导了其具有β连环蛋白稳定作用(S.Goruppi等人,Mol.Cell Biol.,21,902-915,2001;K.Nagai等人,J.Biol.Chem.,278,18229-18234,2003)。
·Klf2(克鲁佩尔样因子2)
Klf2属于Sp1家族的转录因子,据报导对脂肪细胞等具有分化抑制功能(S.S.Banerjee等人,J.Biol.Chem.,278,2581-2584,2003;J.Kaczynski等人,Genome Biology,4,206.1-206.8,2003)。
·Thbs1(血小板结合蛋白1)
Thbs1为接合性的糖蛋白,调节细胞间和细胞-细胞外基质间的相互作用,特别是已知其为内源性抗血管新生物质。另外,据报导在毛周期中,Thbs1在退化期被特异地诱导(K.Yano,J.Invest Dermatol.,120,14-9,2003)。
·Thbd(凝血调节蛋白)
Thbd与凝血酶形成1∶1的复合体,显示通过C蛋白活化的抗凝固作用和通过羧肽酶原B活化的抗纤维化作用。另据报导通过抑制炎性细胞与血管内皮细胞的接合而具有抗炎效果(E.M.Conway等人,J.Exp.Med.,196:565-577,2002)。
因此,尝试通过抑制上述基因的表达,从而诱导毛囊形成和再生并对头部等育毛成为可能。可通过向头部等施用具有抑制所述基因表达的作用的药物达到抑制所述基因的表达。因此,预期包含以这样的药物作为活性成分的组合物,特别是皮肤外用药,对以人为代表的哺乳动物具有良好的育毛和发毛促进作用,作为头发护理用医药品、准医药品或化妆品是有用的。
通过多种基因工程学技术,如RNA干涉法、反义RNA和反义DNA法、肽和RNA或DNA适体、位点特异性缺失、同源重组、显性失活对立基因、胞内抗体等多种技术可实现对毛乳头细胞中上述基因表达的抑制。
另一方面,本发明者进一步发现下述基因在具有毛囊形成和再生诱导能力的毛乳头细胞中特异性表达,正如由后述实施例的结果可明确的那样。
·Tgfbi(转化生长因子β诱导的,681Da)
也以别名βig-h3(TGF-β-induced gene-human,clone 3;转化生长因子β诱导的基因-人类,克隆3)、big-h3称呼Tgfbi,是分泌蛋白,暗示了其通过整合蛋白与微原纤维和细胞表面的胶原蛋白等细胞外基质(ECM)结合,调节细胞间的接合等的同时,也参与细胞间的信号转导(JMFerguson等人,Mech Dev.120,851-64,2003)。虽然已报导其在包含皮肤和血管等的结缔组织中广泛表达(RG LeBaron等人,J.Invest Dermatol.,104,844-849,1995以外),但本发明首次显示其在毛囊细胞中表达。
·Gas1(生长停滞特异性1)
作为在饥饿状态或接触抑制的3T3细胞中表达提高的一系列基因(gas)之一的gas1,其为在细胞膜上表达的GPI(糖基磷脂酰肌醇)固着性膜糖蛋白,抑制细胞周期的进行(G.Del Sal等人,Cell,70,595-607,1992)。另外,也报导了其对参与四肢形态形成等的FGF10的表达调节功能(Y.Liu等人,Development 129,5289-5300,2002)以及通过与ECM的相互作用参与软骨形成(K.K.Lee等人,Dev.Biol.,234,188-203,2001)。
·Thbs2(血小板结合蛋白2)
已知Thbs2为结合纤维蛋白原、纤连蛋白、层粘连蛋白、V型胶原蛋白等的糖蛋白,参与细胞间或细胞-基质间的相互作用,也已知其具有细胞增殖调节功能(N Lopes等人,Mol.Cell.Biol.,23,5401-5408,2003)。
·Ifi202A(干扰素活化的基因202A,干扰素诱导性p202a)
已知Ifi202A为由干扰素诱导的一系列p200相关蛋白质中的一种,在细胞质内表达并移向核内,抑制MyoD等转录因子并诱导分化(H.Xin等人,Oncogene,22,4775-4785,2003;C.Liu等人,Mol.Cell.Biol.,20,7024-7036,2000)。
·Bmp7(骨形态发生蛋白7)
通常已知Bmp7属于调节骨形成外的形态形成的TGF-β家族的分泌蛋白,虽然已确认其在毛囊发育阶段表达,但并未公开其与毛囊诱导能力的直接关系。通过BMP受体及其多种内源性拮伉剂调节细胞增殖和细胞分化(V.A.Botchkarev,J.Invest.Dermatol.,120,36-47,2003)。
·Efna1(肝配蛋白A1)
Efna1为受体酪氨酸激酶EphA(特别是EphA2)的配体,为在细胞膜上表达的GPI固着性蛋白,调节细胞接合和细胞形态(C.Deroanne等人,J.Cell Sci.,116,1367-1376;N.Carter等人,Nat.Cell Biol.,4,565-73,2002)。
·Efna3(肝配蛋白A3)
Efna3为属于肝配蛋白类的GPI固着性蛋白,是受体酪氨酸激酶EphA2、EphA4的配体。据报导参与脊柱形态形成(KK Murai等人,Nat.Neurosci.,6,153-60,2003)。
·Cidea(诱导细胞死亡的DNA片断化因子,α亚基样效应子A)
Cidea在作为已分化的脂肪细胞即棕脂肪组织(BAT)的线粒体膜上等表达,调节脂质代谢和能量平衡(Z.Zhou等人,Nat.Genet.,35,49-56,2003)。显示在基因工程化的高表达Cidea的小鼠中,诱导天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶非依赖性的细胞死亡(N.Inohara等人,EMBO J.,17,2526-2533,1998)。
·Serping1(丝氨酸或半胱氨酸蛋白酶抑制物,分化体G(C1抑制物),成员1)
Serping1为丝氨酸蛋白酶抑制物超家族的Serping中的一种,为分泌性蛋白质。与C1r和C1s蛋白酶形成复合体,抑制所述的蛋白酶活性。另外,认为其在活化补体、凝血、纤维蛋白溶解、激肽诱导中也发挥重要作用(M.Lener等人,Eur.J.Biochem.,254,117-122,1998)。
·MS1(半胱氨酸蛋白酶抑制物)
别名为StefinA1,是半胱氨酸蛋白酶抑制物A亚型中的一种,具有半胱氨酸蛋白酶抑制功能(特别是组织蛋白酶B、H、L),在表皮和淋巴组织中稳定表达(F.W.Inohara等人,Genomics,15,507-514,1993;T.A.Korolenko等人,Bull.Exp.Biol.Med.,136,46-48,2003)。
·Irf6(干扰素调节因子6)
Irf6为DNA结合区很保守的核内转录因子家族中的一员,对其详细功能尚不明确。在上颚中表达最高,也在皮肤和毛囊中表达。显示表现出上颚畸形和皮肤等异常的范德沃德综合征、腘翼状胬肉症是Irf6基因的DNA结合部位或蛋白质结合部位的SMIR结构域(Smad-干扰素调节因子结合结构域)变异引起的,暗示了Smad-TGF-β信号转导的调节功能。
·Fmod(纤调蛋白聚糖)
为非胶原蛋白性分泌蛋白,是ECM构成物质。已知其作用于I和II型胶原蛋白,调节适当的纤维化定向,以及通过TGF-β抑制纤维化作用(S.Chakravarti,Glycoconj.J.,19,287-293,2003;C.Soo等人,Am.J.Pathol.,157,423-433,2000)。
·Fxyd4(含有FXYD结构域的离子转运调节物4)
Fxyd4在肾脏上皮细胞的细胞膜上特异性表达,在调节Na+、K+离子转运,维持电解质稳定方面发挥作用(R.Aizman等人,Am.J.Pathol.,283,F569-77,2002)。
因此,尝试通过增强上述基因的表达,从而诱导毛囊形成和再生,并对头部等育毛成为可能。可通过向头部等施用具有增强所述基因表达的作用的药物达到增强所述基因的表达。因此,预期包含以这样的药物作为活性成分的组合物,特别是皮肤外用药,对以人为代表的哺乳动物具有良好的育毛和发毛促进作用,作为头发护理用医药品、准医药品或化妆品是有用的。
通过多种基因工程学技术均可实现对毛乳头细胞中上述基因表达的增强。例如,上述基因在毛乳头细胞中缺失、存在缺陷时,可以策划通过将上述基因本身导入毛乳头细胞中,增强其表达。另外,在毛乳头细胞中虽然存在上述基因,但由于处于非活性状态或沉默状态而致上述基因处于缺陷状态时,可以设计通过使上述基因的表达增强的调节序列如启动子和增强子置于对这些基因可作用的位置。
作为将上述基因以及启动子、增强子导入细胞内的方法,可使用利用病毒载体的基因导入方法、或非病毒性的基因导入方法(日経サイエンス,1994年4月号,20-45页;实验医学增刊,12(15)(1994);实验医学别册“基因治疗的基础技术”,羊土社(1996))中的任一方法。作为通过病毒载体的基因导入方法,可例举将上述基因整合入DNA病毒或RNA病毒而导入的方法,其中所述DNA病毒或RNA病毒为例如逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒、痘苗病毒、痘病毒、脊髓灰质炎病毒、辛德比斯病毒等。其中特别优选使用逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、痘苗病毒的方法。作为非病毒性基因导入方法,可例举直接施与表达质粒的方法(DNA疫苗法)、脂质体法、脂转染法、显微注射法、磷酸钙法、电穿孔法等,特别优选DNA疫苗法、脂质体法。另外,为了使上述基因实际上作为药物发挥作用,有将DNA直接导入毛乳头细胞的直接体内(invivo)法和从人体取出毛乳头细胞,在体外将DNA导入所述细胞,再将所述细胞返回体内的间接体内(ex vivo)法(日経サイエンス,1994年4月号,20-45页;月刊药事,36(1),23-48(1994);实验医学增刊,12(15)(1994))。更优选直接体内法。通过直接体内法施与时,施用部位可以是例如直接施与期望促进毛发的部位。施与可以是例如皮下、皮内施与等。通过直接体内法施与时,一般使用注射剂等,根据需要也可加入常用的载体。此外,在采用脂质体或膜融合脂质体(仙台病毒(HVJ)-脂质体等)的方案时,可使用悬浮剂、冷冻剂、离心分离浓缩冷冻剂等的脂质体制剂。
可通过例如自细胞提取mRNA并测定其量来确定细胞中具有毛囊形成抑制能力的基因或具有毛囊形成诱导能力的基因的表达。mRNA的提取、测定方法为本领域众所周知,例如RNA的定量使用定量聚合酶链反应法(PCR)进行。另外,可通过直接测定毛乳头细胞中上述基因的表达产物的量而确定上述基因的表达。例如,所述测定可使用对上述基因的表达产物特异的抗体,通过本领域公知的方法如利用荧光物质、色素、酶等的免疫染色法、Western印迹法、免疫测定法如ELISA法、RIA法等多种方法实施。此外,除以上所述方法之外,还可通过测定上述基因表达产物的已知生物活性而测定上述基因的表达量。另外,可通过原位(in situ)杂交法和测定其生物活性而确定上述基因的表达。
本发明进一步地提供了培养毛乳头细胞的方法。所述方法的特征在于将毛乳头细胞在使上述具有毛囊形成抑制能力的基因的表达受到抑制或在使上述具有毛囊形成诱导能力的基因的表达受到增强的条件下培养,由于如此培养的毛乳头细胞的毛囊再生和形成能力增强,所以可以有利地用于通过细胞移植的毛囊和毛发再生以及植毛。如开头所述,在现有技术中获得充分量的能用于移植的具有毛囊诱导能力的人毛乳头细胞是困难的,但是如果培养根据本发明的毛乳头细胞,即使从少量的毛乳头细胞开始,也可制备充分量的用于移植的具有毛囊诱导能力的毛乳头细胞。抑制具有毛囊形成抑制能力的上述基因的表达可如上所述,例如在抑制上述基因表达的药物的存在下培养而实施,或者培养通过上述的基因工程转化而使上述基因的表达受到抑制的毛乳头细胞。此外,提高具有毛囊形成诱导能力的上述基因的表达可如上所述,例如在提高上述基因表达的药物的存在下培养而实施,或者培养通过上述的基因工程转化而使上述基因的表达受到提高的毛乳头细胞。培养在合适的培养基如DMEM中,优选地在CO2环境下,于常温~约37℃,优选地于约37℃进行1~7天。
“毛乳头细胞”是指作为间叶系细胞位于毛囊内毛球部内部的、构成毛乳头的主要细胞,是为了毛囊自我再生而向毛囊上皮细胞等递送活化信号的可以说是起到司令塔作用的细胞(特愿2003-346937)。仅含有活性化毛乳头细胞的毛乳头细胞制品可例如根据Kishimoto等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1999),96卷,7336-7341页所述,使用转基因小鼠而制备。但是,从收获量等点来看,优选地可通过例如自皮肤组织去除表皮组织,用胶原处理所得到的真皮组织部分而制备细胞悬浮物,然后将该细胞悬浮物冷冻保存以杀死毛囊上皮细胞而制备。
上述冷冻保存的方法具体而言可例如如下实施。
1.准备哺乳动物的表皮。
2.将所述表皮根据需要于蛋白质分解酶溶液如胰蛋白酶溶液中静置合适的时间如一晚,然后将表皮部分使用镊子等去除,留下的真皮使用胶原酶处理,制备细胞悬浮液。
3.根据需要,使用细胞滤过器过滤悬浮液,通过静置去除沉淀物。
4.记数细胞数,使用冷冻保护液以合适的细胞密度,优选地以1×105至1×108个/ml进行重悬,根据需要分装为小份,并按照常规的细胞保存方法进行冷冻保存。
5.经适当的保存期间后,融解并使用。
对冷冻方法没有特定的限制,在-20℃或以下,优选地在-50℃或以下,更优选地在-80℃或以下的超低温冷冻库中或在液氮中保存。对冷冻保存期间也没有特定的限制,为了杀死上皮细胞,冷冻保存期间可为例如1天或更长,优选地为3天或更长,更优选地为1周或更长的时间期间。而且,经证实即使在液氮中保存4个月,毛乳头细胞可继续生存。作为冷冻保护液,可使用在细胞保存中使用的常规保护液,例如セルバンカ-2细胞冷冻保存液(目录号BLC-2)(日本全药工业制)。
本发明的毛乳头细胞可来自所有哺乳动物例如人、黑猩猩、其它灵长类、家畜动物如狗、猫、兔子、马、绵羊、山羊、牛、猪、实验用动物如大鼠、小鼠、豚鼠,更优选地为裸小鼠、SCID小鼠、裸大鼠的表皮。
由此获得的毛乳头细胞,根据本发明,在抑制具有毛囊形成抑制能力的上述基因表达的条件下,或在提高具有毛囊形成诱导能力的上述基因表达的条件下培养,然后与合适的上皮细胞混合,该培养毛乳头细胞-上皮细胞混合物可用于植毛。
“上皮系细胞”是指构成皮肤的表皮或上皮的大部分的细胞,其自挨着真皮的1层基底细胞产生。以小鼠为例,作为上皮系细胞可优选使用来自新生仔(或胎儿)的上皮系细胞,但也可使用虽然是来自成熟的皮肤表皮的细胞,但具有角质形成细胞的形态的细胞培养物。这样的细胞,可通过技术人员公知的方法自目的供体动物的皮肤制备。
在合适的方案中,上皮系细胞可如下制备。
1.准备哺乳动物的表皮。
2.将所述表皮根据需要于0.25%胰蛋白酶/PBS中4℃静置一晚,由此进行胰蛋白酶处理。
3.通过镊子等仅剥离表皮部分,细切后,于合适的培养液(如角质形成细胞用培养液)中4℃约1小时悬浮处理。
4.将该悬浮物通过具有合适孔径的细胞滤过器,然后通过离心分离机回收上皮系细胞。
5.将该细胞制品在KGM或SFM培养基中以目的细胞密度悬浮,直至使用前于冰上静置。
本发明的上皮系细胞与毛乳头细胞同样地可来源于所有哺乳动物例如人、黑猩猩、其它灵长类、家畜动物如狗、猫、兔子、马、绵羊、山羊、牛、猪、实验用动物如大鼠、小鼠、豚鼠,更优选地为裸小鼠、SCID小鼠、裸大鼠的表皮。此外,所述表皮部位可为有毛部位如头皮,也可为无毛部位如周皮。
当欲形成毛囊时,培养毛乳头细胞与上皮系细胞的细胞数之比为1∶3至10∶1,更优选地为1∶1至10∶1,进一步更优选地为1∶1至3∶1,最优选地为1∶1。
毛乳头细胞与上皮系细胞的组合可为同种系和异种系。例如毛乳头细胞制品为来自小鼠时,上皮系细胞可为小鼠来源(同种系)或者为其它种如大鼠、人来源(异种系)。因此,植毛用组合物可为例如培养毛乳头细胞与上皮系细胞均来自小鼠的组合、均来自大鼠的组合、或均来自人的组合(上述的同种);此外,培养毛乳头细胞来自小鼠且上皮系细胞来自大鼠的组合、培养毛乳头细胞来自大鼠且上皮系细胞来自小鼠的组合、培养毛乳头细胞来自小鼠且上皮系细胞来自人的组合、培养毛乳头细胞来自大鼠且上皮系细胞来自人的组合、培养毛乳头细胞来自人且上皮系细胞来自小鼠的组合、培养毛乳头细胞来自人且上皮系细胞来自大鼠的组合(上述的异种)等也可以。
下面例举实施例进一步详细说明本发明。
实施例
制备毛乳头细胞
将新生ICR品系小鼠用乙醇和磷酸缓冲生理盐水(下文中称为PBS)洗净后,切下背部皮肤,取出全层皮肤。于胰蛋白酶溶液上4℃漂浮静置一晚后,通过镊子去除表皮部分,将得到的真皮使用胶原酶处理,制备细胞悬浮液。使用细胞滤过器过滤上述悬浮液,然后通过静置去除沉淀物,获得DP部分。使用冻结保护液以1×105~1×108/ml的细胞密度进行重悬,分装于冷冻管中,并按照常规的细胞保存方法于液氮中保存1周或以上。将细胞冷冻管于DMEM(10%FBS)中融解,在高密度(3~7×105个/cm2)或低密度(5~9×104个/cm2)下于37℃、CO2中,于DMEM中培养1~4天。
制备上皮细胞部分
新生ICR品系小鼠用乙醇、PBS洗净后,切下背部皮肤,取出全层皮肤。于胰蛋白酶溶液上4℃漂浮静置一晚后,通过镊子剥离表皮部分并细切,于角质形成细胞用培养液(以下表示为SFM)中,4℃搅拌悬浮约1小时。使用细胞滤过器去除固形物后,将通过离心机(×900g,10分钟)得到的沉淀重悬于SFM培养基中,得到上皮细胞部分。直至使用之前于冰上静置。
通过向裸小鼠背部皮肤的细胞移植的毛囊再生评价体系
通过如上所述的4天培养而制备的DP部分(高密度培养或低密度培养5~10×106个)和上皮部分(2只,约1×107个)轻轻混合并离心,将除去了上清的沉淀物播种至预先外科埋入裸小鼠的硅制小室内的筋膜上。一周后切除硅制小室的上部,两周后去除硅制小室。细胞移植后,通过3~4周后的外观观察和组织观察判断毛囊形成。其结果示于图1。
如图1明确显示的那样,证实使用高密度条件下培养的毛乳头细胞进行移植时,可观察到发毛和毛囊形成,但使用低密度条件下培养的毛乳头细胞进行移植时,不能观察到发毛,也无毛囊形成。因此明确了:为了移植培养毛乳头细胞并使毛囊形成,必须在一定或以上的高细胞密度条件下培养毛乳头细胞。
微阵列实验
向通过上述培养1天或4天制备的DP部分(高密度培养或低密度培养5~10×106个)加入1ml ISOGEN(Nippongene),根据操作手册提取50~100μg总RNA。接下来,根据RNeasyMini(QIAGEN)的RNA纯化方法,纯化得到的总RNA,通过Bioanalyzer 2100体系(Agilent)确认不能观察到分解物的混入。将得到的总RNA 500ng通过Low RNA ImputFluorescent Linear Amplification(Agilent),按照操作手册使用Cy5-CTP或Cy3-CTP(均来自Perkin-Elm er)制备分别的荧光色素标记化cRNA(如来自高密度培养DP的RNA用Cy5标记,来自低高密度培养DP的RNA用Cy3标记)。将分别的荧光色素标记cRNA各1μg使用杂交试剂盒Plus(Agilent),按照操作手册在小鼠发育Oligo(Agilent G4120A)或小鼠Oligo(Agilent G4121A)微阵列载玻片上于60℃进行17小时竞争性杂交。洗净干燥后立即通过微阵列扫描仪(Agilent G2565AA)对微阵列进行图像化。将得到的图像通过Feature Extraction软件(Agilent G2566AA)进行各点的荧光强度数值化,用于解析。各基因的表达量如下表所示。
表1
基因 | 培养1天 | 培养4天 | |||||||
低密度 | 高密度 | 高/低比 | 阵列 | 低密度 | 高密度 | 高/低比 | 阵列 | ||
S100a6 | 第1次 | 488337 | 307137 | 0.63 | ① | 145980 | 87903 | 0.60 | ② |
第2次 | 329059 | 220925 | 0.67 | ① | 317877 | 125517 | 0.39 | ① | |
216505 | 121178 | 0.56 | ② | ||||||
Ctgf | 第1次 | 86260 | 9880 | 0.11 | ① | 79019 | 45124 | 0.57 | ② |
第2次 | 74757 | 21760 | 0.29 | ① | 65201 | 19354 | 0.30 | ① | |
155952 | 83250 | 0.53 | ② | ||||||
Gsto1 | 第1次 | 34031 | 27582 | *0.81 | ① | 61350 | 29866 | 0.49 | ② |
第2次 | 24630 | 12764 | 0.52 | ① | 21169 | 18076 | 0.85 | ① | |
38542 | 21886 | 0.57 | ② | ||||||
Gas6 | 第1次 | 5148 | 8136 | 1.58 | ① | 33250 | 12622 | 0.38 | ② |
第2次 | 10344 | 23361 | 2.26 | ① | 13552 | 6920 | 0.51 | ① | |
22655 | 9511 | 0.42 | ② | ||||||
Klf2 | 第1次 | 23433 | 8251 | 0.35 | ① | 8931 | 3487 | 0.39 | ② |
第2次 | 15628 | 5425 | 0.35 | ① | 5417 | 4010 | 0.74 | ① | |
2861 | 1762 | 0.62 | ② | ||||||
Thbs1 | 第1次 | 4298 | 2794 | 0.65 | ① | 3274 | 3094 | 0.94 | ② |
第2次 | 6817 | 3063 | 0.45 | ① | 6598 | 4081 | 0.62 | ① | |
6186 | 5665 | 0.92 | ② | ||||||
Thdb | 第1次 | 1287 | 907 | 0.70 | ① | 1386 | 1793 | 1.29 | ② |
第2次 | 690 | 272 | 0.39 | ① | 592 | 317 | 0.53 | ① | |
2840 | 1415 | 0.50 | ② |
①使用小鼠发育Oligo微阵列
②使用小鼠Oligo微阵列
*无显著性差异
表2
基因 | 培养1天 | 培养4天 | |||||||
低密度 | 高密度 | 高/低比 | 阵列 | 低密度 | 高密度 | 高/低比 | 阵列 | ||
Tgfbi | 第1次 | 2825 | 6673 | 2.36 | ① | 17533 | 43006 | 2.45 | ② |
第2次 | 4589 | 11397 | 2.48 | ① | 4087 | 8434 | 2.06 | ① | |
8671 | 23863 | 2.75 | ② | ||||||
Gas1 | 第1次 | 6407 | 32952 | 5.14 | ① | 4792 | 7182 | 1.50 | ② |
第2次 | 8852 | 30016 | 3.39 | ① | 10524 | 21235 | 2.02 | ① | |
3152 | 5020 | 1.59 | ② | ||||||
Thbs2 | 第1次 | 11672 | 34827 | 2.98 | ① | 27763 | 28831 | *1.04 | ② |
2819 | 14396 | 5.11 | |||||||
第2次 | 23664 | 65034 | 2.75 | ① | 12554 | 21480 | 1.71 | ① | |
2986 | 6287 | 2.12 | 3296 | 6698 | 2.03 | ||||
8931 | 16898 | 1.89 | ② | ||||||
Ifi202a | 第1次 | 2409 | 41216 | 17.11 | ① | 16867 | 23814 | 1.41 | ② |
第2次 | 4162 | 17194 | 4.13 | ① | 2376 | 3594 | 1.51 | ① | |
5853 | 7684 | *1.31 | ② |
①使用小鼠发育Oligo微阵列
②使用小鼠Oligo微阵列
*无显著性差异
表3
基因 | 培养1天 | 培养4天 | |||||||
低密度 | 高密度 | 高/低比 | 阵列 | 低密度 | 高密度 | 高/低比 | 阵列 | ||
Bmp7 | 第1次 | 1362 | 4916 | 3.61 | ① | 1224 | 3238 | 2.65 | ② |
第2次 | 1307 | 4134 | 3.16 | ① | 624 | 1325 | 2.12 | ① | |
645 | 1239 | 1.92 | ② | ||||||
Efna1 | 第1次 | 3577 | 9031 | 2.52 | ① | 808 | 1511 | 1.87 | ② |
第2次 | 2978 | 8976 | 3.01 | ① | 1295 | 3610 | 2.79 | ① | |
461 | 844 | 1.83 | ② | ||||||
Efna3 | 第1次 | 446 | 821 | 1.84 | ② | ||||
第2次 | 279 | 533 | 1.91 | ② | |||||
dea | 第1次 | 405 | 1229 | 3.04 | ① | 1271 | 6124 | 4.82 | ② |
第2次 | 564 | 1308 | 2.32 | ① | 186 | 551 | 2.96 | ① | |
393 | 1386 | 3.53 | ② | ||||||
Serpingl | 第1次 | 3495 | 17368 | 4.97 | ① | 723 | 1943 | 2.69 | ② |
第2次 | 5187 | 31137 | 6.00 | ① | 2818 | 3907 | 1.39 | ① | |
471 | 738 | 1.57 | ② | ||||||
MS1 | 第1次 | 542 | 5597 | 10.32 | ① | 1136 | 3507 | 3.09 | ② |
第2次 | 834 | 5326 | 6.39 | ① | 173 | 374 | 2.16 | ① | |
604 | 998 | 1.65 | ② | ||||||
Irf6 | 第1次 | 664 | 789 | *1.19 | ① | 5282 | 9098 | 1.72 | ② |
第2次 | 517 | 903 | 1.75 | ① | 583 | 690 | 1.18 | ① | |
2230 | 3264 | 1.46 | ② | ||||||
Fmod | 第1次 | 317 | 433 | *1.37 | ① | 2979 | 3127 | *1.05 | ② |
第2次 | 1144 | 2521 | 2.20 | ① | 16660 | 24305 | 1.46 | ① | |
3303 | 4853 | 1.47 | ② | ||||||
Fxyd4 | 第1次 | 252 | 654 | 2.59 | ① | 412 | 1023 | 2.48 | ② |
第2次 | 192 | 395 | 2.06 | ① | 512 | 674 | *1.32 | ① | |
462 | 650 | 1.41 | ② |
①使用小鼠发育Oligo微阵列
②使用小鼠Oligo微阵列
*无显著性差异
由以上结果可见,将毛乳头细胞在可形成毛囊的高密度条件下培养时,以及在不能形成毛囊的低密度条件下培养时,特定基因的表达量会产生变化。即,明确了在不能形成毛囊的低密度条件下培养毛乳头细胞时,与高密度条件下相比较,基因S100a6、Ctgf、Gsto1、Gas6、Klf2、Thbs和Thbd中每一基因的表达量提高,认为这些基因为具有抑制毛囊形成功能的基因。此外,明确了在能形成毛囊的高密度条件下培养毛乳头细胞时,与低密度条件下相比较,基因Tgfbi、Gas1、Thbs2、Ifi202A、Bmp7、Efna1、Efna3、Cidea、Serping1、MS1、Irf6、Fmod和Fxyd4中每一基因的表达量提高,认为这些基因密切参与毛囊的形成和再生、为具有毛囊形成诱导能力的基因。
定量PCR实验
将制备的用于上述微阵列实验用的纯化总RNA经DNase处理(DNA-free RNA KitTM,ZymoResearch)去除基因组DNA后,使用随机引物(Pharmacia),通过SuperScript II(Invitrogen)合成cDNA。以该cDNA为模板,通过LightCycler使用LightCycle-FastStart DNA MasterSYBR Green I Kit(均来自Roche),按照操作手册使用CyberGreen,通过实时PCR进行定量(Mg2+终浓度为3mM,其它反应条件如下)。
GAPDH(PCR产物大小:201bp),终浓度0.25μM
正向引物:5’-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3’(NM002046:95-104)(序列号1)
反向引物:5’-TGGGATTTCCATTGATGACA-3’(NM002046:295-276)(序列号2)
变性:95℃15秒,退火:55℃10秒,延伸:10秒;进行40个循环
Serping1(PCR产物大小:439bp,Lener M等人,1998),终浓度0.5μM
正向引物:5’-GAATTCTTTGACTTCACTTA-3’(NM_009776:1327-1346)(序列号3)
反向引物:5’-ATTTGTAGAGTTTGATAGGT-3’(NM_009776:1765-1746)(序列号4)
变性:95℃15秒,退火:55℃10秒,延伸:72℃20秒;进行40个循环
Efna1(PCR产物大小:133bp,Pickles JO等人,2003),终浓度0.5μM
正向引物:5’-TCTGGGCAGTATTGCTCCTAC-3’(NM_010107:672-692)(序列号5)
反向引物:5’-CTTGTGGGTGTAGTGGGAGAG-3’(NM_010107:804-784)(序列号6)
变性:95℃15秒,退火:55℃10秒,延伸:72℃10秒;进行40个循环
Efna3(PCR产物大小:171bp,Pickles JO等人,2003),终浓度0.5μM
正向引物:5’-TATTTGTCCGCACTACAACAG-3’(MMU90666:8-28)(序列号7)
反向引物:5’-AATTTTTCGGAGAACTTGATG-3’(MMU90666:178-158)(序列号8)
变性:95℃15秒,退火:58℃5秒,延伸:72℃10秒;进行40个循环
Gas1(PCR产物大小:205bp),终浓度0.5μM
正向引物:5’-GGGGTCTTTCAAGTTCCAAT-3’(NM_008086:1868-1887)(序列号9)
反向引物:5’-TCGGTAAGGGGAACTTTTCT-3’(NM_008086:2072-2053)(序列号10)
变性:95℃15秒,退火:55℃10秒,延伸:72℃10秒;进行40个循环
用GAPDH校正的目的基因量的换算:
将PCR循环的延伸反应时测定的SYBR Green的荧光光度值对循环数进行单对数绘图,设定阈值水平,与各样本的对数直线扩增区域的交点定义为信号的开始循环数(crossing point),使用采取FitPoint法的定量法。
设定PCR产物量(即荧光光度)为Y,起始模板量为A,PCR效率相关的因子为B(条件是0.5<B≤1),循环数为X,
则Y=A×(B×2)X
右项取对数时,
则表示为
Y=log10[A(B×2)X]=log10A+log10(B×2)X
=X×log10(B×2)+log10A
PCR在理论上进行的区域即对数绘图为直线的区域中,B=1,即使以不同的样本为模板进行的PCR,斜率均为一定的,设定荧光值的阈值(噪声带(noise band))(设Y=C),求与该直线的交点(crossing point),即可得到开始的循环数。
交点(X)=(C-log10A)/log102
A=10(C-Xlog102)
这反映了初始模板量。因此,如果PCR效率相同,不同样本的模板量如何可这样求得:以一个样本的模板量A0为基准,相对值A/A0自分别的开始循环数(X、X0)求得
X0-X=(C-log10A0)/log102-(C-log10A)/log102
log102×(X0-X)=(C-log10A0)-(C-log10A)=log10A-log10A0
由此求得的目的基因(Fabp4、Fmod、Serg1、Efna1、Efna3)的起始模板量(A/A0)用各样本的GAPDH的起始模板量(AG/AG0)标准化后的值:
在各反应条件(高密度或低密度条件下培养1天或4天)下分别比较,结果如下所示:
表4定量PCR结果总结(高密度培养/低密度培养的比)
基因 | 培养1天(第1次) | 培养1天(第2次) | 培养4天(第1次) | 培养4天(第2次) |
Serg1 | 12.91 | 43.87 | 4.21 | 1.38 |
Efna1 | 1.81 | 5.92 | 2.41 | 3.81 |
Efna3 | 3.20 | 6.57 | 3.11 | 6.34 |
Gas1 | 7.44 | 8.46 | 1.60 | 2.41 |
研究具有毛囊形成抑制能力的因子对小鼠发毛的影响
将通过以上实验认为具有抑制毛囊形成能力的Ctgf注入小鼠皮肤,证实了对发毛的抑制。
实验方法:
[第-2天]
将8周龄C57BL/6小鼠12只(4只一组,共3组)的背部去毛,在背部中央周围作上标记(入墨)。在标记部位皮内注射入溶解于0.1%BSA-PBS的结缔组织生长因子(Ctgf)(Biovendor Laboratory Medicine,Inc.)0(对照)、100或333ng/100μl。
[第-1天]
与第-2天同样,向上述小鼠的标记部位皮内注射入溶解于0.1%BSA-PBS的Ctgf0(对照)、100或333ng/100μl。
[第0天]
向上述小鼠的标记部位实施蜡脱毛,然后与第-1天同样,皮内注射入溶解于0.1%BSA-PBS的Ctgf0(对照)、100或333ng/100μl。
[第+1天]
在上述实施蜡脱毛的部位,与第+1天同样,皮内注射入溶解于0.1%BSA-PBS的Ctgf0(对照)、100或333ng/100μl。
[第+4~+8天]
目视观察上述蜡脱毛部位的发毛状态,另外,通过Mexameter(窄谱反射分光光度计(Mexameter160,COURAGE+KHAZAKA electricGmbH,德国科隆))测定背部皮肤的黑度而评价毛囊形成度。
实验结果
通过向实施蜡脱毛处理的小鼠背部直接皮内注射Ctgf,目视和Mexameter观察到以注射量依赖性地显著延迟发毛和毛囊形成。第+7天和第+8天的结果如图2所示。因此,证实Ctgf具有毛囊形成抑制能力。
产业上的可利用性
通过本发明,可提供新颖且与现有技术相比有利的育毛方法、植毛方法。
序列表
<110>株式会社资生堂
<120>通过抑制具有毛囊形成抑制能力的基因或通过活化具有毛囊形成诱导能力的基因而再生毛囊的方法
<130>R748
<150>JP 2004-175407
<151>2004-06-14
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<151>2004-06-14
<160>10
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Claims (6)
1.再生毛囊的方法,其是通过使选自S100钙结合蛋白A6基因(S100a6)、结缔组织生长因子基因(Ctgf)、谷胱甘肽S转移酶ω1基因(Gsto1)、生长停滞特异性基因6(Gas6)、克鲁佩尔样因子2(Klf2)、血小板结合蛋白1基因(Thbs1)和凝血调节蛋白基因(Thbd)的具有毛囊形成抑制能力的一个或多个基因的表达受到抑制而再生毛囊的方法。
2.培养毛乳头细胞的方法,其特征在于:使选自S100a6、Ctgf、Gsto1、Gas6、Klf2、Thbs1和Thbd的具有毛囊形成抑制能力的一个或多个基因的表达受到抑制。
3.再生毛囊的方法,其是通过使选自转化生长因子β诱导型68kDa基因(Tgfbi)、生长停滞特异性基因1(Gas1)、血小板结合蛋白2基因(Thbs2)、干扰素活化的基因202A(Ifi202A)、骨形态发生蛋白7基因(Bmp7)、肝配蛋白A1基因(Efna1)、肝配蛋白A3基因(Efna3)、诱导细胞死亡的DNA片断化因子,α亚基样效应子A基因(Cidea)、丝氨酸或半胱氨酸蛋白酶抑制物,分化体G(C1抑制物),成员1基因(Serping1)、半胱氨酸蛋白酶抑制物1基因(MS1)、干扰素调节因子6基因(Irf6)、纤调蛋白聚糖基因(Fmod)和含有FXYD结构域的离子转运调节物4基因(Fxyd4)的具有毛囊形成诱导能力的一个或多个基因的表达受到增强而再生毛囊的方法。
4.培养毛乳头细胞的方法,其特征在于:使选自Tgfbi、Gas1、Thbs2、Ifi202A、Bmp7、Efna1、Efna3、Cidea、Serping1、MS1、Irf6、Fmod和Fxyd4的具有毛囊形成诱导能力的一个或多个基因的表达受到增强。
5.再生毛囊的方法,其是通过使S100钙结合蛋白A6基因(S100a6)、结缔组织生长因子基因(Ctgf)、谷胱甘肽S转移酶ω1基因(Gsto1)、生长停滞特异性基因6(Gas6)、克鲁佩尔样因子2(Klf2)、血小板结合蛋白1基因(Thbs1)和凝血调节蛋白基因(Thbd)的具有毛囊形成抑制能力的一个或多个基因的表达受到抑制并通过使选自转化生长因子β诱导型68kDa基因(Tgfbi)、生长停滞特异性基因1(Gas1)、血小板结合蛋白2基因(Thbs2)、干扰素活化的基因202A(Ifi202A)、骨形态发生蛋白7基因(Bmp7)、肝配蛋白A1基因(Efna1)、肝配蛋白A3基因(Efna3)、诱导细胞死亡的DNA片断化因子,α亚基样效应子A基因(Cidea)、丝氨酸或半胱氨酸蛋白酶抑制物,分化体G(C1抑制物),成员1基因(Serping1)、半胱氨酸蛋白酶抑制物1基因(MS1)、干扰素调节因子6基因(Irf6)、纤调蛋白聚糖基因(Fmod)和含有FXYD结构域的离子转运调节物4基因(Fxyd4)的具有毛囊形成诱导能力的一个或多个基因的表达受到增强而再生毛囊的方法。
6.培养毛乳头细胞的方法,其特征在于:使选自S100a6、Ctgf、Gsto1、Gas6、Klf2、Thbs1和Thbd的具有毛囊形成抑制能力的一个或多个基因的表达受到抑制并使选自Tgfbi、Gas1、Thbs2、Ifi202A、Bmp7、Efna1、Efna3、Cidea、Serping1、MS1、Irf6、Fmod和Fxyd4的具有毛囊形成诱导能力的一个或多个基因的表达受到增强。
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