CN104371970B - 一种用于培养人羊膜上皮细胞的培养基 - Google Patents

一种用于培养人羊膜上皮细胞的培养基 Download PDF

Info

Publication number
CN104371970B
CN104371970B CN201310355824.6A CN201310355824A CN104371970B CN 104371970 B CN104371970 B CN 104371970B CN 201310355824 A CN201310355824 A CN 201310355824A CN 104371970 B CN104371970 B CN 104371970B
Authority
CN
China
Prior art keywords
culture medium
content
human amnion
amnion membrane
culture
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201310355824.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN104371970A (zh
Inventor
刘洋
吴明远
李建有
赵静
王翔
叶萌
张丽丽
范星洲
施洁琦
胡少青
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jilin Heze Biotechnology Co., Ltd.
Original Assignee
Eastern Union Stem Cell & Gene Engineering Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Eastern Union Stem Cell & Gene Engineering Co Ltd filed Critical Eastern Union Stem Cell & Gene Engineering Co Ltd
Priority to CN201310355824.6A priority Critical patent/CN104371970B/zh
Publication of CN104371970A publication Critical patent/CN104371970A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104371970B publication Critical patent/CN104371970B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Landscapes

  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种用于培养人羊膜上皮细胞的培养基，该培养基由DMEM、胎牛血清、丙酮酸钠、L‑谷氨酰胺、EGF、β‑巯基乙醇和非必需氨基酸组成。本发明的培养基适用于人羊膜上皮细胞的培养，尤其适用于原代人羊膜上皮细胞的分离和纯化过程中的培养，同时可以降低移植人体过程中引发免疫反应的几率。

Description

一种用于培养人羊膜上皮细胞的培养基
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体的说涉及一种用于培养人羊膜上皮细胞的培养基。
背景技术
人羊膜上皮细胞(amniotic epithelial cells,AECs)在受精后第8天由外胚层细胞发育而来，使其可能维持原肠胚形成胚胎干细胞的可塑性。人羊膜上皮细胞不表达HLA-A，B,C或DR抗原，移植后不易引起免疫排斥反应。在一定条件下，人羊膜上皮细胞可分化为成熟的神经元细胞，毛囊和皮肤上皮细胞，人羊膜上皮细胞理论上可以分化成为各种组织细胞。因此，对人羊膜上皮细胞培养方法的探索及对人羊膜上皮细胞的生长特性的研究具有重要意义，可为将来的组织工程应用奠定基础。
人羊膜上皮细胞是从人胎盘羊膜上分离得到，而人羊膜组织由来源于外胚层的羊膜上皮细胞和中胚层的羊膜间质细胞组成。传统的方法很难从羊膜中分离得到高纯度的羊膜上皮细胞。
目前人羊膜上皮细胞的体外大多采用小鼠3T3细胞作为滋养细胞，滋养细胞对羊膜上皮细胞的生长、增殖有促进作用。但3T3细胞是异种细胞，所含蛋白移植到人体内会引起免疫反应。
发明内容
本发明提供一种用于培养人羊膜上皮细胞的培养基，该培养基由DMEM、胎牛血清、丙酮酸钠、L-谷氨酰胺、EGF(表皮生长因子)、β-巯基乙醇、非必需氨基酸成分组成；
其中DMEM(Deulbecco's Modified Eagle Medium，改良Eagle培养基)，可以为低糖的，也可以为高糖，优选为低糖DMEM；DMEM的含量为10g/1000ml；
其中胎牛血清的体积含量为5～15％，优选含量为10％；
其中丙酮酸钠的含量为0.0550～0.2200g/1000ml；优选的为0.1100g/1000ml；
其中L-谷氨酰胺的含量为0.0731～0.2193g/1000ml；优选的为0.1461g/1000ml；
其中β-巯基乙醇的含量为1.9287～5.7861g/1000ml；优选的为3.8574g/1000ml；
其中EGF的含量为5～15ng/ml；优选的为10ng/ml；
其中非必需氨基酸的含量为0.5mM～2mM，优选含量为1mM，其中100mM非必需氨基酸的组成为：L-丙氨酸1500mg/L、L-天门冬酰胺890mg/L、L-天冬氨酸1330mg/L、L-谷氨酸1470mg/L、甘氨酸750mg/L、L-脯氨酸1150mg/L和L-丝氨酸1050mg/L；
本发明的用于培养人羊膜上皮细胞的培养基的PH值保持在7.0～7.4，优选PH值为7.2。
将以上组分混合，即可得到培养人羊膜上皮细胞的培养基。
本发明的培养基适用于人羊膜上皮细胞的培养，尤其适用于原代人羊膜上皮细胞的分离和纯化过程中的培养。本发明培养基能使在无3T3细胞的情况下成功得使人羊膜上皮细胞生长、扩增。相对于传统的培养人羊膜上皮细胞的培养基，本发明培养基能优先促进人羊膜上皮细胞的生长，同时抑制其他杂细胞的生长。由于不含3T3细胞，使得羊膜上皮细胞的培养变得简单、高效，同时降低了移植人体过程中引发免疫反应的几率。
附图说明
图1为实施例2获得的原代羊膜上皮细胞培养三天后的AECs的细胞动态图；
图2为实施例2获得的原代羊膜上皮细胞培养五天后的AECs的细胞动态图；
图3为实施例2获得的AECs传代培养三天后的细胞动态图；
图4为实施例2获得的AECs传代培养后的SSEA-4的流式细胞术检测结果图。
具体实施方式
下面结合实施例，对如何应用本发明的培养人羊膜上皮细胞的培养基从羊膜组织中分离得到高纯度的羊膜上皮细胞，做进一步详细说明。
实施例1：1000ml人羊膜上皮细胞的培养基的制备
890ml DMEM(gbico)培养基中加入胎牛血清(Hyclone)100ml、丙酮酸钠(sigma)0.1100g、L-谷氨酰胺(sigma)0.1461g、β-巯基乙醇(sigma)3.8574g、1μg/ml的EGF(PEPROTECH)100μl、100mM非必需氨基酸10ml、所述的100mM非必需氨基酸配方为L-丙氨酸(sigma)1500mg/L、L-天门冬酰胺(sigma)890mg/L、L-天冬氨酸(sigma)1330mg/L、L-谷氨酸(sigma)1470mg/L、甘氨酸(sigma)750mg/L、L-脯氨酸(sigma)1150mg/L和L-丝氨酸(sigma)1050mg/L，充分混匀后，调节PH值至7.2，0.22μm滤膜过滤除菌，4℃保存。
实施例2：人羊膜上皮细胞的分离及培养
首先取经家属同意的且HIV、甲肝、乙肝以及梅毒等血清学反应显示为阴性的剖宫产分娩产妇的新鲜胎盘一个，由0.4g的KCl、0.06g的KH2PO4、0.132g的Na2HPO4.12H2O、8g的NaCl、0.35g的NaHCO3、1.0g的D-葡萄糖、0.20g的链霉素、0.12g的青霉素用水定容为1L的方法制作而成基础平衡盐反复冲洗干净，去除胎盘表面残留的血液；从胎盘上分离羊膜，并将其放入基础平衡盐溶液中反复漂洗，并重复两次；将干净的羊膜组织剪碎，获得直径为1mm的羊膜组织块；在剪碎的组织块中加入30ml 0.2％IV胶原酶(gibco，批号：1177238)，并置于37℃下孵育2小时；接着将混合了胶原酶的组织块在200g下离心5分钟，吸出胶原酶消化液；再加入15ml 0.25％胰蛋白酶(sigma，批号：110M7362V)/0.02％EDTA消化液，在37℃振荡消化20分钟后，用30ml实施例1所制备的培养基终止消化；将消化后的组织块经200目滤网过滤；将滤液在200g下离心5分钟，弃上清，使用3ml实施例1所制备的培养基终重新悬浮细胞并细胞计数。按106～107cell/ml的细胞密度进行接种，并置于5％CO2、37℃培养箱内培养；48小时后换液，然后在5％CO2、37℃培养箱内继续培养，等到细胞增生到90％融合后收集细胞并鉴定。
实施例3：
细胞形态学观察：实施例2分离的原代羊膜上皮细胞培养24小时后大部分细胞贴壁，刚贴壁的细胞呈椭圆形，遮光性强，随后细胞胞质逐渐展开，折光性减弱。细胞贴壁3天后生长迅速，增殖明显，细胞数量明显增多，细胞进入指数生长期，如图1。5天左右形成单层，细胞融合成片，呈膜状生长。细胞呈扁平不规程多角形，轮廓清晰，胞浆丰富，细胞呈圆形卵圆形，如图2。传代培养8小时左右细胞贴壁，3天即可形成良好的单层，如图3。
实施例4：
用0.25％胰蛋白酶(sigma，批号：110M7362V)/0.02％EDTA消化液消化贴壁的AECs，用无钙镁PBS洗2两次后，取1×106个/ml，加入FCM管中。加入待检测的单克隆抗体SSEA-4(BD，批号：23713)5μl，4℃避光孵育30分钟，每隔10分钟摇晃一次，使细胞与抗体充分接触。用PBS洗2次，并重悬在400μl的PBS中，上流式细胞仪检测。图4为流式结果图。从图中可以看出本次实验得到SSEA-4阳性细胞达到了84.42％，最终证实本发明的方法可以得到高纯度的羊膜上皮细胞。
说明利用本发明的培养基培养原代人羊膜上皮细胞，通过多次传代后，成功抑制了羊膜间质细胞，获得高纯度的人羊膜上皮细胞。
在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述，但是，很显然仍可以做出修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，本发明的说明书和附图被认为是说明性的而非限制性的。

Claims (2)

1.一种用于培养人羊膜上皮细胞的培养基，其特征在于该培养基由低糖DMEM、胎牛血清、丙酮酸钠、L-谷氨酰胺、EGF、β-巯基乙醇和非必需氨基酸组成；
其中低糖DMEM的含量为10g/1000ml；
其中胎牛血清的体积含量为10％；
其中丙酮酸钠的含量为0.1100g/1000ml；
其中L-谷氨酰胺的含量为0.1461g/1000ml；
其中β-巯基乙醇的含量为3.8574g/1000ml；
其中EGF的含量为10ng/ml；
其中非必需氨基酸为L-丙氨酸、L-天门冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、甘氨酸、L-脯氨酸和L-丝氨酸中组成；非必需氨基酸的含量为1mM；
100mM非必需氨基酸的组成为：L-丙氨酸1500mg/L、L-天门冬酰胺890mg/L、L-天冬氨酸1330mg/L、L-谷氨酸1470mg/L、甘氨酸750mg/L、L-脯氨酸1150mg/L和L-丝氨酸1050mg/L。
2.根据权利要求1所述的用于培养人羊膜上皮细胞的培养基，其特征在于该培养基的PH值为7.0～7.4。
CN201310355824.6A 2013-08-15 2013-08-15 一种用于培养人羊膜上皮细胞的培养基 Active CN104371970B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201310355824.6A CN104371970B (zh) 2013-08-15 2013-08-15 一种用于培养人羊膜上皮细胞的培养基

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201310355824.6A CN104371970B (zh) 2013-08-15 2013-08-15 一种用于培养人羊膜上皮细胞的培养基

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104371970A CN104371970A (zh) 2015-02-25
CN104371970B true CN104371970B (zh) 2017-08-04

Family

ID=52551167

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201310355824.6A Active CN104371970B (zh) 2013-08-15 2013-08-15 一种用于培养人羊膜上皮细胞的培养基

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104371970B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105734011B (zh) * 2016-03-09 2019-05-14 成都康景生物科技有限公司 一种维持人羊膜上皮干细胞多能性的培养液
CN106834218B (zh) * 2017-01-06 2021-03-02 沈阳艾米奥生物工程技术研发中心有限公司 人羊膜上皮干细胞无血清培养基及其培养方法
CN106978389A (zh) * 2017-05-05 2017-07-25 广州市天河诺亚生物工程有限公司 一种培养羊膜上皮细胞的组合培养基

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102725399B (zh) * 2009-12-18 2015-03-11 上海赛傲生物技术有限公司 制备多能干细胞的材料和方法
KR101211913B1 (ko) * 2010-07-16 2012-12-13 주식회사 알앤엘바이오 양막유래 중간엽 줄기세포 배양을 위한 배지조성물 및 이를 이용한 양막유래 중간엽 줄기세포의 배양방법
CN102492651A (zh) * 2011-12-08 2012-06-13 遵义医学院附属医院 一种体外诱导人羊膜上皮细胞分化为胰岛素分泌细胞的方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
人羊膜上皮细胞有向心肌样细胞分化的特性;张路等;《中国组织工程研究与临床康复》;20080115;第12卷(第3期);第402页材料和方法"方法"部分第1段 *
人羊膜上皮细胞的分离、培养及鉴定;方宁等;《遵义医学院学报》;20090430;第32卷(第2期);第122页"1.3人羊膜上皮细胞的分离与培养"部分和第123页"3讨论"部分第2段 *
人羊膜上皮细胞的性质研究;冯小倩;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》;20120315(第3期);摘要，第16页1.4 主要试剂配制和第30页表2 *
人羊膜细胞表型可塑性研究进展;方宁等;《中国生物工程杂志》;20081231;第28卷(第6期);第191-195页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN104371970A (zh) 2015-02-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102127522B (zh) 人脐带间充质干细胞及其制备方法
CN106801032B (zh) 人羊膜上皮干细胞库的构建方法
KR102151588B1 (ko) hUTC 성장을 위한 영양 강화 배지
CN101942413A (zh) 出生缺陷细胞库及其构建方法
CN105112366B (zh) 一种含小檗碱的间充质干细胞无血清培养基
CN102344906B (zh) 一种毛囊干细胞的分离培养方法
CN104371971A (zh) 一种分离获得羊膜上皮细胞的方法
CN101591638A (zh) 大菱鲆肾细胞系的构建方法
CN104371970B (zh) 一种用于培养人羊膜上皮细胞的培养基
CN104130973A (zh) 用于绵羊卵母细胞体外成熟的方法及预处理液和试剂盒
ES2703751T3 (es) Formulación y método de pase y recolección de células madre pluripotentes
CN103966159A (zh) 人胎盘亚全能干细胞及其干细胞库构建方法
CN108184818A (zh) 一种人胎盘间充质干细胞悬液保护剂
CN103756952A (zh) 一种半滑舌鳎卵巢细胞系的构建与应用方法
CN104928230A (zh) 血管内皮细胞的培养方法
CN101531996B (zh) 源于成形组织的间充质干细胞的分离和纯化方法
CN102424813A (zh) 一种高纯度小鼠骨骼肌卫星细胞的简易提取方法
CN104726401A (zh) 一种利用胎盘间充质干细胞提高脐血间充质干细胞培养成功率的方法
CN101353644A (zh) 一种血管内皮细胞及其制备方法与应用
CN104513807B (zh) 从血液中分离、培养细胞的方法及进行克隆非人动物的方法
CN104877955A (zh) 一种分离纯化大鼠真皮微血管内皮细胞的方法
CN100540659C (zh) 一种培养小鼠胚胎干细胞的方法及其专用培养基
CN103893831B (zh) 一种器官型人工皮肤、其制备方法及应用
CN103923877B (zh) 一种建立dox调控的猪体细胞诱导重编程体系的方法
CN107858322B (zh) 一种海马原代细胞培养体系的建立方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB03 Change of inventor or designer information

Inventor after: Liu Yang

Inventor after: Hu Shaoqing

Inventor after: Wu Mingyuan

Inventor after: Li Jianyou

Inventor after: Zhao Jing

Inventor after: Wang Xiang

Inventor after: Ye Meng

Inventor after: Zhang Lili

Inventor after: Fan Xingzhou

Inventor after: Shi Jieqi

Inventor before: Liu Yang

Inventor before: Wu Mingyuan

Inventor before: Hu Shaoqing

Inventor before: Zhao Jing

Inventor before: Wang Xiang

Inventor before: Ye Meng

Inventor before: Zhang Lili

Inventor before: Fan Xingzhou

Inventor before: Shi Jieqi

CB03 Change of inventor or designer information
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20171122

Address after: 130000 North Lake Science Park, No. 1, A1, Changchun, Changchun City, Jilin Province

Patentee after: Jilin Heze Biotechnology Co., Ltd.

Address before: 313000 Zhejiang Province, Huzhou City Heng Road Economic Development Zone No. 988

Patentee before: Eastern Union Stem Cell & Gene Engineering Co., Ltd.

TR01 Transfer of patent right