CN104877955A - 一种分离纯化大鼠真皮微血管内皮细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种分离纯化大鼠真皮微血管内皮细胞的方法，涉及动物血管内皮细胞体外培养技术领域，具体是大鼠真皮微血管内皮细胞的体外培养方法。其特征在于：大鼠皮肤用中性蛋白酶II消化，分离获得真皮层，再用胶原酶I和II消化，获得单细胞悬液，然后利用CD31免疫磁珠分选技术获得纯化的目标细胞。通过上述方式，本发明能够简便、有效地解决微血管内皮细胞培养中杂细胞的污染，分离获得高纯度的大鼠真皮微血管内皮细胞，经20次传代培养后无显著形态学特征变化。

Description

一种分离纯化大鼠真皮微血管内皮细胞的方法

技术领域

本发明涉及哺乳动物细胞培养技术领域，具体地说，是大鼠真皮微血管内皮细胞的体外培养方法。

背景技术

微血管内皮细胞居于关键的解剖学位置，具有多种多样的生物学功能，且在不同组织或器官中有显著异质性，血小板内皮细胞黏附分子1（PECAM-1，即CD31）是其特异性表面分子。真皮是位于皮肤表皮和皮下组织之间的组织，其中含有丰富的微血管，是皮肤营养物质代谢交换的场所，真皮微血管内皮细胞功能障碍是皮肤炎症、红肿、出血等多种皮肤病变发生的关键环节，体外培养的大鼠真皮微血管内皮细胞是开展相关研究的常用模型。

微血管在各种组织器官中的分离困难，其内皮细胞难以像大血管内皮细胞一样直接从血管壁消化获得，且皮肤组织结构复杂，真皮层细胞种类多样，高纯度真皮微血管内皮细胞的体外培养不易成功。当前体外培养真皮微血管内皮细胞的报道多来源于人和小鼠，大鼠真皮微血管内皮细胞分离培养的研究较少。Murphy等报道，利用中性蛋白酶II溶液消化获得大鼠耳部真皮组织，然后用手术刀背挤压真皮组织使内皮细胞进入培养基，获得大鼠真皮微血管内皮细胞[Murphy HS, 等. Endothelial cell determinants of susceptibility to neutrophil-mediated killing. Shock, 1999, 12(2): 111-117]；我国学者曹燕卿等利用中性蛋白酶II、胶原酶I型溶液依次消化，及Percoll溶液非连续密度梯度离心分离培养原代大鼠真皮微血管内皮细胞[曹燕卿，等，低温暴露对真皮微血管内皮细胞功能的影响. 中国应用生理性杂志，2013, 29(4)：301-304]。中性蛋白酶消化分离表皮与真皮组织是常用的方法，但通过机械挤压从真皮组织获得内皮细胞的方法难以避免杂细胞的污染；密度梯度离心法对微血管内皮细胞的分离纯化亦为非特异性方法，分离细胞的纯度受分离液密度和离心等参数的影响显著，且与操作人员的熟练程度有关，不易获得高纯度的目标细胞。

本发明采用中性蛋白酶II溶液消化分离大鼠真皮组织，用胶原酶Ⅰ和胶原酶Ⅱ混合溶液进一步消化获得单细胞悬液，然后利用CD31免疫磁珠技术特异性分选，可获得高纯度的真皮微血管内皮细胞，该方法特异性强、可重复性强、易操作，能有效解决杂细胞的污染。

发明内容

本发明主要技术问题是解决现有微血管内皮细胞分离纯化技术的不足，提供一种分离培养高纯度大鼠真皮微血管内皮细胞的方法。

本发明所要解决的主要技术问题是通过如下技术方案来实现的：

取大乳鼠背部和腹部皮肤，用中性蛋白酶                                                 溶液消化分离真皮层，再用胶原酶型和 型溶液消化获得单细胞悬液，然后利用CD31免疫磁珠分选法获得纯化的目标细胞。

本发明一种分离纯化大鼠真皮微血管内皮细胞的方法，其特征在于包括如下步骤：

A. 将免疫磁珠预洗，每25 μL免疫磁珠中加入0.5 μg CD31单克隆抗体，于4oC旋转摇床孵育过夜，清洗，获得的CD31免疫磁珠重悬于等体积含0.1% BSA的0.01M PBS备用；所述的免疫磁珠预洗和孵育后清洗均用含有0.1% 牛血清白蛋白（BSA）的0.01 M PBS，在KingFisher 96磁珠纯化系统进行，程序设置为：慢速混合60 s，收集3次、每次2 s，中速释放2 s，重复3次；

B. 将3日龄SD大鼠断颈处死，75%乙醇擦拭消毒皮肤，剪取背部和腹部皮肤，放入4℃预冷Hank’s液，剪为约1cm×1cm皮片，浸入75%酒精约10 s，用含100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的Hank’s液漂洗5遍，剔除皮片上附着的皮下组织；

C. 将所述皮片置于0.2%中性蛋白酶溶液中，于37℃旋转摇床消化1 h，然后剥离并剔除表皮，将剩余的真皮组织放入含0.2%胶原酶Ⅰ和0.2%胶原酶Ⅱ的溶液中充分剪碎，于37℃旋转摇床上消化1 h，消化液过100 μm孔径细胞筛，滤液于1000 rpm离心8 min，弃上清，沉淀细胞团用含0.1% 牛血清白蛋白、2 mM EDTA的0.01 M PBS重悬至密度为1×10⁷个/mL的单细胞悬液；

D. 将所述每毫升单细胞悬液中加25 μL CD31免疫磁珠，于15~20oC旋转摇床孵育30~60 min，分选目的细胞-CD31免疫磁珠复合物于0.2 mL含5%胎牛血清、1 mM氯化钙和4 mM氯化镁的DMEM培养基；所述的目的细胞-CD31免疫磁珠复合物的分选使用KingFisher 96磁珠纯化系统，程序设置为：慢速混合30 s，收集2次，每次5 s，重复4次；

E. 将所述的每0.2 mL目的细胞-CD31免疫磁珠复合物悬液加入4 μL DNase 溶液，室温孵育15 min，释放并除去目的细胞上的CD31免疫磁珠；所述目的细胞上CD31免疫磁珠的除去使用KingFisher 96磁珠纯化系统，程序设置为：中速混合1 min，收集2次、每次1 s，中速释放3 s；重复1次；所述的目的细胞悬液于1000 rpm离心8 min，沉淀目的细胞团用DMEM完全培养基（含20%胎牛血清、2 mM L-谷氨酰胺、100 IU青霉素和100 μg/mL链霉素）重悬，调整密度为1×10⁵个/mL接种培养，每3天更换一次完全培养基；

F. 将所述获得的目的细胞即大鼠真皮微血管内皮细胞孵育培养至亚汇合状态，用含0.05%胰蛋白酶和0.005% EDTA的0.01 M PBS溶液消化脱壁，用DMEM完全培养基重悬，调整密度为1×10⁵个/mL，进行传代培养。

本发明的有益效果是，（1）0.2%胶原酶Ⅰ和0.2%胶原酶Ⅱ联合消化能更充分暴露大鼠真皮组织中的微血管内皮细胞，提高目标细胞的收取率；（2）CD31免疫磁珠分选法纯化具有特异性，不受操作者人为因素的影响，获得的大鼠真皮微血管内皮细胞纯度更高。

附图说明

图1是单细胞悬液样品与C31免疫磁珠混悬液（单箭头示样品细胞、双箭头示CD31免疫磁珠）。

图2是结合了CD31免疫磁珠的目标细胞（箭头所示）。

图3是生长至亚汇合状态的大鼠真皮微血管内皮细胞。

具体实施方式

实施例

1. 主要实验材料

（1）实验动物：3日龄SD大乳鼠5只。

（2）小鼠抗大鼠CD31单克隆抗体：购自AbD Serotec公司，货号MCA 1334G，规格为200 μL（含200 μg）。

（3）小鼠IgG磁珠试剂盒：包括5 mL包被抗小鼠IgG的免疫磁珠，3管释放缓冲液成分1（每管为15000~20000 U冻干DNase），及2 mL释放缓冲液成分2。

释放缓冲液的配制：每管释放缓冲液成分1加0.3mL释放缓冲液成分2溶解，分装冻存，使用时每毫升样品加4 μL。

（4）0.01 M PBS：取NaCl 8.0 g、Na₂HPO₄ 2.9 g、KH₂PO₄ 0.2 g、KCl 0.2 g，溶解于1000 mL超纯水中，0.22 μm过滤除菌，于4℃冰箱贮存。

（5）样品缓冲液：用0.01 M PBS配制，含有0.1% 牛血清白蛋白和2 mM EDTA，0.22 μm无菌滤器过滤除菌。

（6）磁珠清洗液：用0.01 M PBS配制，含有0.1%牛血清白蛋白，0.22 μm无菌滤器过滤除菌。

（7）0.2%中性蛋白酶溶液：购自Sigma公司，货号D4693-1G，用0.01 M PBS配制，0.22 μm无菌滤器过滤除菌，分装、-20℃冻存备用。

（8）0.2%胶原酶-0.2%胶原酶溶液：胶原酶型和胶原酶均购自Worthington公司，货号分别为LS004196和LS004176，用0.01 M PBS配制，0.22 μm无菌滤器过滤除菌，分装、-20℃冻存备用。

（9）Hank’s液：购自GIBCO公司，货号14170-112。

（10）DMEM完全培养基：DMEM基础培养基（购自GIBCO公司，货号11960-044），含20% 胎牛血清（购自GIBCO公司，货号10099-141）、2 mM L-谷氨酰胺（购自GIBCO公司，货号25030-081）、1%双抗溶液（100 IU/mL青霉素和100 μg/mL链霉素，购自GIBCO公司，货号15140-122）。

（11）0.05%胰蛋白酶-0.005% EDTA溶液：胰蛋白酶购自SIGMA公司，货号85450C；EDTA购自sigma公司，货号ED2SS。

2. 操作步骤

取250 μL免疫磁珠，用磁珠清洗液在KingFisher 96磁珠纯化系统清洗，程序设置为：慢速混合60 s，收集3次、每次2 s，中速释放2 s，重复3次。清洗后免疫磁珠重悬于250 μL磁珠清洗液，加入5 μL小鼠抗大鼠CD31单克隆抗体，于4oC旋转摇床孵育过夜，孵育结束后按照前述方法洗去未结合的CD31抗体，将结合CD31抗体的免疫磁珠重悬于250 μL磁珠清洗液备用。

取3日龄SD大鼠5只，断颈处死，75%乙醇擦拭消毒皮肤，剪取背部和腹部皮肤，放入4℃预冷Hank’s液洗去血污，剪为约1cm×1cm皮片，浸入75%酒精约10 s，用含100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的Hank’s液漂洗5遍，剔除皮片上附着的皮下组织，将其投入0.2%中性蛋白酶溶液，于37℃旋转摇床消化1 h，然后剥离并剔除表皮，将剩余的真皮组织放入含0.2%胶原酶Ⅰ和0.2%胶原酶Ⅱ的溶液中充分剪碎，于37℃旋转摇床上消化1 h。消化液过100 μm孔径细胞筛，滤液于1000 rpm离心8 min，弃上清，沉淀细胞团用样品缓冲液重悬至密度为1×10⁷个/mL的单细胞悬液。

取10 mL单细胞悬液样品，加入250 μL CD31免疫磁珠，于15oC旋转摇床孵育60 min，然后用KingFisher 96磁珠纯化系统分选目的细胞-CD31免疫磁珠复合物，程序设置为：慢速混合30 s，收集2次，每次5 s，重复4次。将目的细胞-CD31免疫磁珠复合物重悬于2 mL含5%胎牛血清、1 mM氯化钙和4 mM氯化镁的DMEM培养基，加入40 μL DNase 溶液，室温孵育15 min，用KingFisher 96磁珠纯化系统除去释放的CD31免疫磁珠，程序设置为：中速混合1 min，收集2次、每次1 s，中速释放3 s；重复1次。除去CD31免疫磁珠所得的大鼠真皮微血管内皮细胞悬液于1000 rpm离心8 min，沉淀细胞团用DMEM完全培养基重悬，调整密度为1×10⁵个/mL接种培养，每3天更换一次完全培养基。

大鼠真皮微血管内皮细胞孵育培养生长至亚汇合状态后，用含0.05%胰蛋白酶-0.005% EDTA溶液消化脱壁，用DMEM完全培养基重悬，调整密度为1×10⁵个/mL，进行传代培养。

3. 培养结果

原代培养的高纯度大鼠真皮肺微血管内皮细胞接种贴壁呈短梭形或多角形，多数细胞的边缘有1个或2个突起，大小均一，孵育培养约7天后生长至汇合状态，细胞呈“鹅卵石样”镶嵌状排列。传代培养后，5-7天再次生长至汇合状态，具有良好的生长性能。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书所采用的等效方法，或直接或间接运用在其他相关技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (2)

1.一种从大鼠真皮组织中分离、纯化微血管内皮细胞的方法，其特征在于：所述的方法主要涉及大鼠真皮组织的单细胞悬液制备和目的细胞的CD31免疫磁珠法分选，与传统真皮微血管内皮细胞分离纯化方法比较具有纯度高、可重复性强的特点。

2.根据权利要求1所述的一种从大鼠真皮组织中分离、纯化微血管内皮细胞的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

A. 将免疫磁珠预洗，每25 μL免疫磁珠中加入0.5 μg CD31单克隆抗体，于4oC旋转摇床孵育过夜，清洗，获得的CD31免疫磁珠重悬于等体积含0.1% BSA的0.01M PBS备用；所述的免疫磁珠预洗和孵育后清洗均用含有0.1% 牛血清白蛋白（BSA）的0.01 M PBS，在KingFisher 96磁珠纯化系统进行，程序设置为：慢速混合60 s，收集3次、每次2 s，中速释放2 s，重复3次；

B. 将3日龄SD大鼠断颈处死，75%乙醇擦拭消毒皮肤，剪取背部和腹部皮肤，放入4℃预冷Hank’s液，剪为约1cm×1cm皮片，浸入75%酒精约10 s，用含100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的Hank’s液漂洗5遍，剔除皮片上附着的皮下组织；

C. 将所述皮片置于0.2%中性蛋白酶                                               溶液中，于37℃旋转摇床消化1 h，然后剥离并剔除表皮，将剩余的真皮组织放入含0.2%胶原酶Ⅰ和0.2%胶原酶Ⅱ的溶液中充分剪碎，于37℃旋转摇床上消化1 h，消化液过100 μm孔径细胞筛，滤液于1000 rpm离心8 min，弃上清，沉淀细胞团用含0.1% 牛血清白蛋白、2 mM EDTA的0.01 M PBS重悬至密度为1×10⁷个/mL的单细胞悬液；

D. 将所述每毫升单细胞悬液中加25 μL CD31免疫磁珠，于15~20oC旋转摇床孵育30~60 min，分选目的细胞-CD31免疫磁珠复合物于0.2 mL含5%胎牛血清、1 mM氯化钙和4 mM氯化镁的DMEM培养基；所述的目的细胞-CD31免疫磁珠复合物的分选使用KingFisher 96磁珠纯化系统，程序设置为：慢速混合30 s，收集2次，每次5 s，重复4次；

E. 将所述的每0.2 mL目的细胞-CD31免疫磁珠复合物悬液加入4 μL DNase 溶液，室温孵育15 min，释放并除去目的细胞上的CD31免疫磁珠；所述目的细胞上CD31免疫磁珠的除去使用KingFisher 96磁珠纯化系统，程序设置为：中速混合1 min，收集2次、每次1 s，中速释放3 s；重复1次；所述的目的细胞悬液于1000 rpm离心8 min，沉淀目的细胞团用DMEM完全培养基（含20%胎牛血清、2 mM L-谷氨酰胺、100 IU青霉素和100 μg/mL链霉素）重悬，调整密度为1×10⁵个/mL接种培养，每3天更换一次完全培养基；

F. 将所述获得的目的细胞即大鼠真皮微血管内皮细胞孵育培养至亚汇合状态，用含0.05%胰蛋白酶和0.005% EDTA的0.01 M PBS溶液消化脱壁，用DMEM完全培养基重悬，调整密度为1×10⁵个/mL，进行传代培养。