ES2703751T3 - Formulación y método de pase y recolección de células madre pluripotentes - Google Patents

Abstract

Un método para la recolección y el pase subsiguiente de células madre pluripotentes humanas sin raspado y sin pérdida sustancial de viabilidad, que comprende: incubar dichas células madre pluripotentes humanas en una formulación, comprendiendo dicha formulación: citrato de sodio, y una sal, seleccionándose la sal entre el grupo consistente en NaCl, KCl, Na2HPO3, NAH2PO3, K2HPO3, KH2PO3 y NaHCO3, teniendo dicha formulación una osmolaridad de 150 -1.500 mOsmol/litro.

Description

DESCRIPCIÓN

Formulación y método de pase y recolección de células madre pluripotentes

Campo de la invención

La presente invención se refiere a una formulación y a un método para la recolección/pase de células madre pluripotentes. Específicamente, la presente invención se refiere a un método para utilizar formulaciones que incluyen citrato de sodio.

Antecedentes de la invención

Las células madre pluripotentes humanas (hPSC), incluyendo las células madre embrionarias humanas (hESC) y las células madre pluripotentes inducidas (iPSC), pueden proliferar en cultivo por tiempo indefinido manteniendo al mismo tiempo la capacidad de diferenciarse en múltiples tipos de células somáticas. Estas células son muy valoradas, dado que proporcionan una fuente ilimitada de células para la terapia celular y la medicina regenerativa. Tal como demuestra la reciente aprobación de la FDA para la realización de ensayos clínicos, las terapias celulares a base de células madre embrionarias humanas (hESC) están progresando del laboratorio a la clínica. Sin embargo, las plataformas de cultivo basadas en placa y matraz en T actualmente disponibles limitan seriamente la escalabilidad de la producción de hPSC a tamaños de lote comercialmente pertinentes. Para desencadenar el potencial de las hPSC en la terapia celular y la medicina regenerativa se ha de desarrollar un proceso de producción de hPSC escalable. El aumento de la escala de los procesos basados en matraz existentes es un paso crítico para traducir la investigación actual de las hPSC en aplicación clínica. Uno de los mayores retos consiste en establecer un método de pase escalable para recipientes multicapa a gran escala y que mantenga un alto rendimiento, el fenotipo pluripotente y la estabilidad cariotípica.

Tradicionalmente, las hPSC se recolectan y se pasan como fragmentos de colonias mediante raspado mecánico con o sin tratamiento previo con enzimas (tales como colagenasa o Dispase®). Este proceso requiere mucho trabajo y no puede ser aplicado en el cultivo de hPSC en recipientes de cultivo celular multicapa, la plataforma ampliamente utilizada en la producción de células adherentes a escala comercial. Las células desarrolladas en recipientes de cultivo celular multicapa no son accesibles para el raspado. Además, el raspado mecánico daña las células. Sin raspado, la viabilidad de las células puede aumentar hasta un 90 por ciento. Los métodos conocidos relacionados con el pase y la recolección de células individuales no son deseables, por ejemplo, debido a asuntos relacionados con una baja recuperación después del pase y la criopreservación y con un cariotipo anómalo, asociados con una baja eficiencia de clonación de hPSC.

Aunque se ha informado de inhibidores de RHO-quinasa (inhibidores de ROCK) capaces de mejorar la eficiencia de clonación de hPSC, el mecanismo no se comprende por completo y el efecto de los inhibidores de ROCK en el cultivo de hPSC todavía ha de ser evaluado. Por lo tanto, el pase de hPSC como células individuales en presencia de inhibidores de ROCK no goza de amplia aceptación.

Recientemente, algunos laboratorios de hESC han adoptado el pase de hESC con soluciones de desprendimiento de células, principalmente soluciones de EDTA (ácido etilendiamino tetraacético), y este procedimiento está pasando de los laboratorios académicos a la industria. Una de las soluciones que contienen EDTA para disociación celular comercialmente disponibles es Versene® EDTA, que contiene EDTA 0,55 mM y ha sido utilizada para la recolección y el pase de hPSC. El procedimiento típico para el pase de hESC con Versene® EDTA comienza con el lavado del cultivo con tampón libre de Ca2+/Mg2+ (por ejemplo, solución salina tampón de fosfatos de Dulbecco; DPBS), seguido por la incubación del cultivo en Versene® EDTA durante 4-9 minutos. Después se retira el Versene® EDTA y las células se retiran físicamente de la superficie en forma de racimos mediante chorreo manual de las células con medio de cultivo por pipeteo. En comparación con el método convencional de tratamiento enzimático seguido por raspado (véase la Tabla 1), la ventaja de este método consiste en que (1) utiliza una solución no enzimática - por lo tanto, no hay necesidad de un lavado o centrifugación posterior al desprendimiento para eliminar la enzima, y (2) no requiere raspado - las células tratadas con Versene® EDTA se pueden desprender de la superficie por lavado. Tal como se describe en la Tabla 1 y se describe en la FIGURA 1, en comparación con hESC tratadas con enzima y raspadas de la superficie de cultivo, las hESC tratadas con Versene® EDTA y desprendidas sin raspado tienen una mayor viabilidad después del desprendimiento y se unen a la nueva superficie de cultivo mucho más rápidamente (minutos en lugar de horas) cuando son sometidas a pase.

Tabla 1. Métodos de recolección/pase de hESC

Sin embargo, cuando se utiliza para expandir hESC en recipientes multicapa, el método de pase/recolección con Versene® EDTA no es ideal. El Versene® EDTA parece descomponer la asociación célula-célula más rápidamente de lo que rompe la unión célula-superficie. Si el cultivo de hESC se trata en exceso con Versene® EDTA (> 9 minutos), un porcentaje mayor de las células se desprende de la superficie en forma de células individuales más que en forma de racimos o agrupaciones. Para evitar obtener demasiadas células individuales, el tiempo de tratamiento se controla normalmente entre siete y nueve minutos. Después de retirar el Versene® EDTA, en un formato de cultivo en placa de seis pocillos o matraz en T, para desalojar las células de la superficie se requiere una fuerza de cizalladura fluídica generada por chorreo con medio de cultivo a través de pipeteo manual. Sin embargo, el cultivo de hESC en recipientes multicapa no puede ser sometido manualmente a cizalladura con medio de cultivo, ya que no se pueden introducir pipetas en los recipientes. En lugar de ello, en este formato de cultivo, después de sustituir el Versene® EDTA con medio de cultivo se aplica un golpeteo vigoroso para desalojar las células. La fuerza mecánica (golpeteo) ha de seguir inmediatamente a la sustitución de Versene® EDTA con medio de cultivo, ya que las hESC tratadas con Versene® EDTA se unen rápidamente de nuevo a la superficie una vez que entran en contacto con medio de cultivo. De hecho, con el estado actual de la técnica solo es posible recolectar un 40-70% del cultivo completo en fábricas celulares multicapa, lo que repercute drásticamente en el rendimiento de estas costosísimas células. Una posible solución para aumentar el rendimiento consiste en no sustituir el Versene® EDTA con medio de cultivo y en lugar de ello desalojar las células en Versene® EDTA. Sin embargo, en este caso se incrementa el tiempo de exposición de las células al Versene® EDTA, lo que aumenta el riesgo de obtener demasiadas células individuales y colonias con inestabilidad cariotípica. Además, después del desprendimiento se han de realizar etapas adicionales de procesamiento para retirar o neutralizar el Versene<®> EDTA de la recolección final, lo que no solo aumentará el trabajo, sino también la disociación de los pequeños racimos de hESC.

Por lo tanto, existe una necesidad de una formulación y un método de pase y recolección escalable y de alto rendimiento para hPSC que elimine o reduzca las desventajas de métodos conocidos en la técnica.

Compendio de la invención

La presente invención proporciona una formulación de reactivo no enzimático y un método de recolección y pase subsiguiente de células madre pluripotentes en forma de racimos con alto rendimiento y alta viabilidad de las células después del desprendimiento.

Un objeto de la invención consiste en proporcionar una formulación y un método de pase y recolección escalable y de alto rendimiento para hPSC que eliminen o reduzcan las desventajas de métodos conocidos en la técnica.

Además, se describe la provisión de una formulación que comprende citrato de sodio.

Otro objeto de la invención consiste en proporcionar una formulación y un método para la recolección y el pase de hPSC optimizados en relación con parámetros de hPSC tales como alta viabilidad, alto rendimiento, tamaño grande de racimos después del desprendimiento, capacidad de pase en serie y mantenimiento del fenotipo pluripotente (por ejemplo, expresión de marcadores normalmente asociados con células madre, tales como o Ct 4, Sox2, Nanog, SS^eA4, T^rA-1-60 y TRA-1-81) y estabilidad cariotípica.

Otro objeto de la invención consiste en proporcionar una formulación y un método que puedan ser utilizados en cualquier laboratorio de hPSC como una práctica de laboratorio rutinaria para expandir cultivos de hPSC con una cantidad de trabajo y un tiempo de proceso reducidos.

Otro objeto de la invención consiste en proporcionar una formulación y un método relacionado que no requiera un raspado mecánico para retirar células de la superficie del recipiente de cultivo.

Otro objeto de la invención consiste en proporcionar una formulación y un método relacionado con los que no sea necesario lavar y centrifugar las células recolectadas con el fin de retirar los agentes utilizados para desprender las células de la superficie del recipiente de cultivo.

Otro objeto de la invención consiste en proporcionar una formulación y un método con los que se pueda recolectar más de un 90% de las hPSC desarrolladas en recipientes de cultivo celular multicapa con una viabilidad superior al 90%.

Además, se describe la provisión de un proceso de producción de hPSC cerrado y escalable a través del cultivo de hPSC en recipientes de cultivo celular multicapa y mediante lavado, concentración, introducción en viales y criopreservación de recolección celular con tecnología automática de procesamiento aguas abajo.

Además, se describe la provisión de un proceso para expandir y pasar hPSC desde matraces en T a fábricas celulares multicapapa con un nuevo método de recolección y pase no enzimáticos, seguido por un procesamiento aguas abajo con tecnología de centrifugación a contracorriente continua (por ejemplo, tecnología kSep®).

Otro objeto de la invención consiste en proporcionar un método de desarrollo de una solución de desprendimiento de células para hPSC, en el que la distribución de tamaños de los racimos desprendidos y el porcentaje del cultivo desprendido después de un tiempo de tratamiento dado se pueden controlar con la osmolalidad y la concentración de quelante de Ca2+.

Otro objeto de la invención consiste en proporcionar un método para la recolección y el pase subsiguiente de hPSC desarrolladas en suspensión en forma de agregados o sobre microsoportes, que comprende la incubación de los agregados de hPSC o las hPSC sobre microsoportes bien en una formulación descrita en la presente memoria, bien en una formulación identificada mediante un método descrito en la presente memoria, en recipientes de cultivo celular durante dos a veinte minutos permitiendo que los agregados de hPSC se desintegren o para permitir que las hPSC se desprendan de los microsoportes, siendo la viabilidad de las células de entre aproximadamente un 85 y un 100 por cien.

Otro objeto de la invención consiste en proporcionar un método para la recolección y el pase subsiguiente de hPSC, en el que se pasan hPSC con una alta relación de división (desde 1:10 hasta 1:60; o densidad de células en la siembra de aproximadamente 30E3/cm2 hasta una densidad tan baja como 5E3/cm2) y el cultivo alcanza la confluencia en un plazo de siete días después de la división.

Otro objeto de la invención consiste en proporcionar un método para la recolección y el pase subsiguiente de hPSC, con los que las hPSC mantienen la pluripotencia y el cariotipo de bandas G normal en más de 50 pases.

Otro objeto de la invención consiste en proporcionar formulaciones, y un método de uso de las mismas, que permitan desprender y pasar selectivamente hPSC indiferenciadas.

Además, se describe la provisión de un medio para la recolección y la criopreservación subsiguiente de hPSC con una alta recuperación posterior a la descongelación y alta eficiencia de la disposición en nuevas placas.

Otro objeto de la invención consiste en proporcionar un método de procesamiento aguas abajo de racimos de hPSC recolectados en un sistema cerrado, que incluye contracorriente continua, centrifugación, formulación, introducción automática en viales y criopreservación con congelador de velocidad controlada.

Por consiguiente, en una realización se proporciona una formulación para la recolección y el pase subsiguiente de células madre pluripotentes humanas sin raspado y sin pérdida sustancial de viabilidad. En un aspecto de la realización, la formulación incluye, por ejemplo, citrato de sodio, una sal y una solución salina tampón de fosfatos, con una osmolalidad de aproximadamente 250-1.050 mOsmol/litro. En un aspecto alternativo, la osmolaridad es de 311-1.014 mOsmol/litro. En otro aspecto de la realización, la formulación se utiliza para la recolección y el pase de células madre embrionarias y células madre pluripotentes inducidas. La concentración de citrato es, por ejemplo, de aproximadamente 0,15 a 150 mMol/litro. La sal es, por ejemplo, NaCl, KCl, Na2HPO3, NaH2PO3, K2HPO3 o KH2PO3. Cuando la sal es KCl, la concentración es, por ejemplo, de aproximadamente 1,00-1.400 mMol/litro. Alternativamente, cuando la sal es KCl, la concentración es de aproximadamente 1,35-1.350 mMol/litro. En un aspecto de la realización, la osmolaridad de la formulación es, por ejemplo, de aproximadamente 400-700 mOsmol/litro. En otro aspecto de la realización, la osmolaridad de la formulación es, por ejemplo, de aproximadamente 418-570 mOsmol/litro. En otro aspecto de la realización, la formulación tiene un pH tamponado con, por ejemplo, bicarbonato, fosfato, etanolamina, trietanolamina o trometamol. El pH de la formulación es, por ejemplo, de aproximadamente 7-8. En una realización alternativa, el pH es de aproximadamente 7,2-7,8. En un aspecto, la solución salina tampón de fosfatos es, por ejemplo, solución salina tampón de fosfatos de Dulbecco (DPBS) libre de Ca2+/Mg2+. En algunos aspectos de la realización, el tratamiento de las células con la formulación resulta en la recolección de, por ejemplo, al menos un 90% de las células de la superficie del recipiente de cultivo y en una viabilidad de las células de, por ejemplo, al menos un 90%.

En otra realización se proporciona un método para producir una formulación para la recolección y el pase subsiguiente de células madre pluripotentes humanas sin raspado ni pérdida sustancial de viabilidad.

En otra realización se proporciona un método para la recolección y el pase subsiguiente de hPSC, que comprende la incubación de las hPSC en una de las formulaciones descritas en los párrafos precedentes y en recipientes de cultivo celular durante un período de tiempo para permitir que las hPSC se desprendan de los recipientes de cultivo en racimos con alto rendimiento y alta viabilidad de las células después del desprendimiento de, por ejemplo, aproximadamente 85-100%. En un aspecto de la realización, las placa o recipientes de cultivo son, por ejemplo, placas de Petri, placas de cultivo celular de múltiples pocillos, aparatos de cultivo celular apilados, fábricas de cultivo celular multicapa, y recipientes similares conocidos en la técnica capaces de soportar el cultivo de hPSC. En algunos aspectos de la realización, las células se tratan con la formulación durante aproximadamente 2-20 minutos. En una realización, el tiempo de tratamiento es de 5-15 minutos para hPSC cultivadas en mTeSRI®. En otra realización, el tiempo de tratamiento es de 8-20 minutos para hPSC cultivadas en StemPro®. (StemPro® y mTeSRI® son ejemplos de medios comercialmente disponibles determinados para cultivo de hPSC.) En aspectos de la realización, las células se recolectan en racimos con tamaños dentro del intervalo de, por ejemplo, aproximadamente 10-1.000 |ii^. Más particularmente, el tamaño de los racimos es, por ejemplo, de aproximadamente 40-500 |ii^. En algunos aspectos de la realización, el método resulta en la recolección de, por ejemplo, al menos un 90% de las células de la superficie del recipiente de cultivo y en una viabilidad de las células de al menos un 90%.

En otra realización se proporcionan formulaciones de pase y recolección adicionales, incluyendo formulaciones que contienen EDTA y EGTa , otros quelantes de Ca2+ aparte de citrato de sodio, o combinaciones de varios quelantes de Ca2+. Hay dos factores identificados relacionados con el desprendimiento de las células, la concentración de quelante de Ca2+ y la osmolaridad.

En otra realización se proporciona un método para desarrollar una solución de desprendimiento de células para hPSC, en el que la distribución de tamaños de los racimos desprendidos y el porcentaje del cultivo desprendido con un tiempo de tratamiento dado se pueden controlar con la osmolaridad y la concentración de quelante de Ca2+. Estos y otros objetos se consiguen en la presente invención.

Hasta ahora se han perfilado, en líneas bastante generales, las características más importantes de la invención para que se pueda comprender mejor la siguiente descripción detallada de la misma y para que se pueda apreciar mejor la presente contribución a la técnica. Evidentemente, existen características adicionales de la invención que se describirán con mayor detalle más abajo.

A este respecto, antes de explicar en detalle al menos una realización de la invención, se ha de entender que la invención no está limitada en su aplicación a los detalles de construcción y a las disposiciones de los componentes expuestos en la siguiente descripción o ilustrados en los dibujos. La invención permite otras realizaciones y puede ser puesta en práctica y llevada a cabo de diversos modos. Además, se ha de entender que la fraseología y la terminología empleadas en la presente memoria tienen una finalidad descriptiva y no han de ser consideradas como limitativas.

Como tales, los expertos en la técnica comprenderán que la idea en la que se basa esta descripción puede ser utilizada perfectamente como una base para el diseño de otras estructuras, métodos y sistemas con el fin de llevar a cabo los diversos objetivos de la presente invención.

Para un mejor entendimiento de la invención, de sus ventajas operativas y de los objetos específicos logrados mediante sus usos, se han de tomar como referencia los dibujos adjuntos y la descripción, que ilustran realizaciones preferentes de la invención.

Breve descripción de los dibujos y las figuras

La FIGURA 1 ilustra la viabilidad porcentual de hESC desprendidas de una superficie de cultivo después de tratamiento enzimático y raspado frente a tratamiento no enzimático y sin raspado.

La FIGURA 2 ilustra el desprendimiento con EDTA/EGTA frente al desprendimiento con citrato de sodio.

La FIGURA 3 ilustra hESC sometidas a pase de forma continua con citrato de sodio, que muestran la morfología de colonias y el crecimiento típicos de las hESC.

La FIGURA 4 ilustra el cariotipo normal de hESC sometidas a pase cinco veces después de recolección con citrato de sodio.

Las FIGURAS 5a-e ilustran la recolección de cultivo de hESC en pilas de células multicapa de dos capas (citrato de sodio frente a EDTA).

La FIGURA 6 ilustra la optimización de la formulación de citrato de sodio para desprendimiento de hESC.

La FIGURA 7 ilustra el aumento de densidad de hESC viables después de procesamiento con KSep (reducción de volumen) y el cambio de viabilidad antes y después de la aplicación de tecnología de centrifugación a contracorriente continua (kSep®).

La FIGURA 8 ilustra la recuperación de células después de criopreservación.

La FIGURA 9 ilustra la disposición en nuevas placas de hESC después de tecnología de centrifugación a contracorriente continua (kSep®) y después de criopreservación.

La FIGURA 10 ilustra la tendencia de aumento del desprendimiento con el aumento del tiempo de tratamiento con diversas diluciones de formulación de citrato de sodio en MEF-CM.

La FIGURA 11 ilustra la tendencia de aumento del desprendimiento con el aumento del tiempo de tratamiento con diversas diluciones de formulación de citrato de sodio en mTeSRI®.

La FIGURA 12 ilustra los efectos de la osmolaridad y la concentración de potasio en la capacidad de formulaciones de citrato de sodio para promover el desprendimiento de hESC.

La FIGURA 13 ilustra la osmolaridad y las concentraciones finales de citrato de sodio y KCl de diversas soluciones de formulación utilizadas en los experimentos descritos en las FIGURAS 14A-C.

Las FIGURAS 14A-C ilustran en efecto de la osmolaridad y la capacidad de formulaciones de citrato de sodio para promover el desprendimiento de hESC y mantener un tamaño de racimos grande.

Las FIGURAS 15A-C ilustran los efectos de la concentración de citrato de sodio en el desprendimiento de hESC y en el tamaño de los racimos desprendidos.

Las FIGURAS 16A-B ilustran los efectos de EDTA, EGTA y citrato de sodio en el desprendimiento de hESC.

La FIGURA 17 ilustra formulaciones utilizadas en estudios de evolución temporal.

La FIGURA 18A ilustra el efecto del tiempo de tratamiento con diversas soluciones de formulación en el desprendimiento de hESC.

La FIGURA 18B ilustra la distribución de tamaños de los racimos de hESC desprendidos mediante tratamiento de diversas formulaciones de citrato de sodio, y el efecto del tiempo de tratamiento en la distribución de tamaños de racimo.

La FIGURA 19 ilustra la eficiencia de la disposición en placas de racimos de hESC generados utilizando Versene® EDTA y diversas formulaciones de citrato de sodio, y el efecto del tiempo de tratamiento en la eficiencia de la disposición en placas.

Las FIGURAS 20A-B ilustran la determinación de la ventana operativa (es decir, el intervalo de tiempo de tratamiento) para obtener una recolección y un tamaño de racimo óptimos utilizando soluciones de desprendimiento de células.

Las FIGURAS 21A-B ilustran la ventana operativa y la eficiencia de la disposición en placas de racimos de hESC desprendidos utilizando formulación de citrato de sodio en comparación con las de los racimos desprendidos utilizando EDTA y EGTA en altas concentraciones.

La FIGURA 22 ilustra el procedimiento experimental para recolectar hESC de placas de 6 pocillos utilizando bien Versene® EDTA, bien solución de citrato de sodio, cuando el EDTA o el citrato de sodio se retiran durante la incubación (metodología de "Pase en Seco").

La FIGURA 23 ilustra las composiciones químicas, las características de rendimiento y las aplicaciones potenciales de tres soluciones de formulación de citrato de sodio.

La FIGURA 24 ilustra la metodología de "pase conservado".

La FIGURA 25 ilustra la cantidad de células viables recolectadas y la viabilidad posterior al desprendimiento de hESC después de "pase conservado" con soluciones de formulación de citrato de sodio.

La FIGURA 26 ilustra la distribución de tamaños de racimo, la eficiencia de la disposición en placas y la morfología de colonias de hESC dispuestas en nuevas placas después de "pase conservado" con soluciones de formulación de citrato de sodio.

La FIGURA 27 ilustra los efectos del Versene® EDTA y de diversas soluciones de formulación de citrato de sodio en el pase de células madre mesenquimales (MSC).

Las FIGURAS 28A-C ilustran la optimización de formulaciones de citrato de sodio en relación con una alta eficiencia de la disposición en placas después de un tratamiento prolongado.

La FIGURA 29 ilustra la inmunocitoquímica de marcadores de hESC, como evaluación de la autorrenovación de las hESC después de pase de larga duración con formulación de citrato de sodio.

La FIGURA 30 ilustra la inmunocitoquímica de diferenciación de cuerpos embrioides de hESC, como evaluación de la capacidad de diferenciación de hESC sometidas a pase de larga duración con formulación de citrato de sodio. La FIGURA 31 ilustra la histología de teratomas generados en ratones inmunodeficientes a los que se les inyectaron hESC sometidas a pase de larga duración con formulación de citrato de sodio, como otra confirmación de la capacidad de diferenciación del cultivo de hESC de larga duración.

Descripción detallada de la invención

Ejemplo de referencia 1

Selección preliminar y caracterización de diversas soluciones de formulación y métodos de desprendimiento no enzimático de células

En la presente memoria se describe una formulación de reactivo no enzimático y un método de recolección/pase de células madre pluripotentes en forma de racimos con alto rendimiento y alta viabilidad de las células después del desprendimiento (> 90). Estas células se pueden procesar después como recolección final o sembrar en nuevos recipientes de cultivo para continuar su expansión. En una realización, la formulación descrita incluye citrato de sodio, que rompe la unión célula-superficie y la asociación célula-célula mediante quelación/secuestración de Ca2+, el catión divalente necesario para la unión célula-superficie y célula-célula. Esta formulación y el proceso a base de citrato de sodio están especialmente diseñados y desarrollados para abordar los retos únicos en procesos rutinarios de cultivo y fabricación de hPSC o en el aumento de la escala de éstos. Normalmente, las hPSC se someten a pase en forma de racimos/agregados multicelulares, y el pase de hPSC en forma de células individuales se ha de evitar debido a la baja eficiencia de clonación de las hPSC y el alto riesgo de anomalía cariotípica. Esta formulación y el método están optimizados adicionalmente para la recolección y el pase de hPSC en relación con los parámetros de calidad clave de las hPSC, por ejemplo, viabilidad, rendimiento, tamaño de racimo después del desprendimiento, capacidad de pase, y mantenimiento de un fenotipo pluripotente. Esta formulación y el proceso pueden ser utilizados en cualquier laboratorio de hPSC como práctica de laboratorio rutinaria para expandir cultivos de hPSC con una cantidad de trabajo y un tiempo de proceso reducidos. Por ejemplo, esta formulación y el proceso no requieren raspado mecánico para desprender las células de la superficie, y no es necesario lavar y centrifugar la recolección celular con el fin de retirar los agentes utilizados para desprender el cultivo. Esta formulación y el proceso son especialmente beneficiosos para la producción de hPSC a gran escala, cuando las células crecen en recipientes de cultivo celular multicapa en los que no se puede aplicar el raspado. Utilizando esta formulación y el método se puede recolectar más de un 90% de las hPSC desarrolladas en recipientes de cultivo celular multicapa con una viabilidad de más de un 90%.

Se seleccionaron varias soluciones de desprendimiento no enzimático de células en diversas concentraciones, consistiendo un objetivo en mejorar el rendimiento de las hESC recolectadas de recipientes de cultivo multicapa, manteniendo al mismo tiempo la sencillez del método de recolección/pase con Versene® EDTA. Esta selección incluía, por ejemplo, soluciones de Versene® EDTA 0,1, 0,55, 1, 3 y 10 mM, soluciones de ácido etilenglicol tetraacético (EGTA) a base de Versene® 0,1, 0,55, 1, 3 y 10 mM, y solución 1 X de citrato de sodio (solución 10 X: citrato de sodio 0,15 M, cloruro de potasio (KCl) 1,35 M, diluida a 1 X en DPBS libre de Ca2+/Mg2+).

Todos estos reactivos (EDTA, EGTA y citrato de sodio) son quelantes de Ca2+ y han sido utilizados tradicionalmente para desprender células adherentes en cultivo. Como ya se ha mencionado anteriormente, en algunos laboratorios se ha utilizado rutinariamente Versene® EDTA para la recolección/pase de hESC; en un estudio publicado por Thomson et al. en el Roslin Institute en Escocia en 2008 (Thomson et al. (2008), "Human Embryonic Stem Cells Passaged Using Enzymatic Methods Retain a Normal Karyotype and Express CD30", Cloning and Stem Cells, 10 (1), 1-17.) se utilizaron tanto EDTA como EGTA (en combinación con tripsina) para el pase de hESC.

Unas hESC cultivadas en medio acondicionado con Fibroblastos Embrionarios Múridos (MEF-CM) se trataron con soluciones, incluyendo las arriba descritas, de la siguiente manera: (1) retirar el medio de cultivo; (2) lavar una vez con tampón libre de Ca2+/Mg2+ (por ejemplo DPBS); incubar en solución a temperatura ambiente; (4) retirar la solución; y (5) empapar las colonias en MEF-CM durante 0,5-1 minutos para darles una oportunidad de adherirse de nuevo sobre la superficie. Después, las colonias se chorrearon con medio de cultivo para comprobar si se podían desprender de la superficie. En relación con la etapa de incubación n° 3 arriba indicada, se ha de señalar que la norma para Versene® EDTA es de 4-9 minutos. Por regla general es más larga con un cultivo desarrollado en suero indefinido o en un medio que contiene sustitución de suero (por ejemplo, MEF-CM), y más corta en un medio libre de suero definido, tal como mTeSRI®. Por lo tanto, se contempla una ventana de incubación de 2-12 minutos. Un tratamiento durante más de 9 minutos puede resultar en la generación de demasiadas células individuales. Un tratamiento durante menos de 2 minutos puede ser un intervalo de tiempo demasiado corto que resulta en un desprendimiento parcial. Una solución de citrato de sodio (1 X) puede desprender las células desarrolladas en mTeSRI® en 2-3 minutos, y desprender las células desarrolladas en MEF-CM en 3-4 minutos.

En relación con la etapa n° 5, esta etapa se ejecutó en el estudio de selección inicial de soluciones de desprendimiento para ver si las células se adhieren de nuevo sobre la superficie en medio de cultivo. Para recolectar células desarrolladas en una plataforma abierta, tal como en placas de 6 pocillos, las células se desprenden de la superficie por chorreo justo después de retirar la solución de desprendimiento de células. Sin embargo, en caso de recipientes de cultivo celular multicapa, después de drenar la solución de desprendimiento, primero se vierte el medio de cultivo dentro del recipiente, el medio se nivela en todas las capas, y después el recipiente se somete a golpeteo para desalojar las células en el medio de cultivo. En una realización, el vertido y la nivelación tardan 0,5-1 minutos en un recipiente de diez capas. En el marco cGMP puede ser necesario un tiempo adicional. Una parte del cultivo se empapa inevitablemente en el medio de cultivo durante estas etapas y puede adherirse de nuevo sobre la superficie. Tal como ya se ha mencionado anteriormente, existe una dificultad con el uso de Versene® EDTA, que resulta en el desprendimiento/recolección incompletos del cultivo en recipientes de cultivo celular multicapa. Por lo tanto, las colonias se empaparon en medio de cultivo durante 0,5-1 minutos para evaluar la nueva adhesión de las células sobre la superficie.

Tal como ilustra la FIGURA 2, después de este procedimiento, un 85% del cultivo tratado con Versene® (EDTA 0,55 mM) permaneció sobre la superficie (FIGURA 2a), mientras que prácticamente todas las células se desprendieron de la superficie en cultivo tratado con citrato de sodio 1 X (formulación de citrato de sodio) (FIGURA 2b). La FIGURA 2c muestra un gráfico de la evaluación visual del porcentaje del cultivo que permanece sobre la superficie después del tratamiento. Por medio de este experimento, la solución de citrato de sodio se identifica sorprendentemente como un reactivo superior en comparación con el Versene® EDTA para la recolección de cultivos de hESC. La formulación de citrato de sodio rompe la unión célula-superficie en mayor medida que el Versene® EDTA, y las hESC tratadas con la formulación de citrato de sodio no se adhieren de nuevo a la superficie en medio de cultivo tan rápida y fácilmente como las hESC tratadas con Versene® EDTA o con formulación de EGTA.

Se ensayaron dos soluciones comercialmente disponibles como solución potencial para recolectar hPSC desde recipientes de cultivo celular multicapa. Una era de Millipore, la "PBS Based Enzyme-Free Cell Dissociation Solution" (Solución de Disociación Celular libre de Enzimas Basada en PBS), la otra era "Hank's Based Enzyme-Free Cell Dissociation Solution" (Solución de Disociación Celular libre de Enzimas Basada en Hank). Las dos soluciones contienen EDTA, glicerol y citrato de sodio. Al ser utilizadas en hESC H9 cultivadas en MEF-CM, ninguna de las soluciones fue capaz de desprender las células eficazmente.

También se llevó a cabo experimentación adicional para determinar si se puede utilizar formulación de citrato de sodio para el pase de cultivos de hESC; es decir, si las hESC desprendidas mediante formulación de citrato de sodio se pueden disponer en placas sobre una superficie fresca para iniciar un nuevo cultivo. En un experimento ejemplar, las hESC tratadas con formulación de citrato de sodio se sometieron a pase continuo seis veces en MEF-CM y tres veces en mTeSRI®. La FIGURA 3 muestra que las hESC sometidas a pase con formulación de citrato de sodio seis veces en MEF-CM conservan la morfología de hESC típica. Tal como ilustra la FIGURA 4, el cariotipo de este cultivo se evaluó como normal después de cinco pases con formulación de citrato de sodio. Otros ensayos han confirmado el cariotipo normal después de 10 pases en MEF-CM, 29 pases en mTeSRI®, y 25 pases en StemPro®. Se considera que después de más de 50 pases habrá un cariotipo normal.

La solución de citrato de sodio se ensayó para la recolección de hESC en pilas de células de dos capas. Esta recolección con citrato de sodio se comparó con la recolección utilizando Versene® EDTA. La FIGURA 5 proporciona imágenes de las células que permanecen sobre la superficie después de la recolección. Los cultivos de las FIGURAS 5a y 5b fueron recolectados en ambos casos utilizando Versene® EDTA, pero fueron manipulados por operadores diferentes (variando la fuerza aplicada al golpeteo de pilas para desalojar las células entre un operador y otro). El operador con un golpeteo más fuerte recolectó menos de un 70% del cultivo completo, mientras que el operador con un golpeteo más débil solo recolectó menos de un 45% del cultivo. Sin embargo, los dos operadores recolectaron más de un 90% del cultivo completo de la superficie cuando se utilizó formulación de citrato de sodio para la recolección (FIGURA 5c). La FIGURA 5d muestra un gráfico del porcentaje del cultivo desprendido de cada pila de dos capas. Se recontó la cantidad de células recolectadas de cada recipiente y se calculó la viabilidad de la recolección (FIGURA 5e). En comparación con el Versene® EDTA, los recuentos de las células recolectadas con solución de citrato de sodio IX tienen una distribución mucho más estrecha (2,64E8+5,1E7 con Versene® EDTA frente a 3,46E8+1,81E7 con citrato de sodio) (véase la FIGURA 5e), lo que contribuye a un proceso de producción más robusto y uniforme. El rendimiento del cultivo de hESC recolectado con formulación de citrato de sodio era un 31% mayor que el del cultivo recolectado con Versene® EDTA. Cuando se utilizaba formulación de citrato de sodio había menos variación entre un operador y otro. Esto se puede deber a que la formulación de citrato de sodio rompe la unión célula-superficie en mayor medida que el Versene® EDTA y se requería mucho menos esfuerzo de golpeteo para desalojar las células.

Se llevaron a cabo estudios adicionales para optimizar más la formulación y el método. En una realización, el intervalo óptimo para la concentración de citrato de sodio para el desprendimiento de hESC era de 0,1X-3X (véanse en la Tabla 2 las concentraciones de citrato de sodio y KCl), o más. Sorprendentemente, las formulaciones de citrato de sodio con concentraciones más altas de citrato de sodio no desprendían las células necesariamente con mayor rapidez ni disociaban las colonias en células individuales en mayor medida que concentraciones más bajas (FIGURA 6b). De hecho, al trabajar en hESC desarrolladas en MEF-CM, el citrato de sodio en concentraciones más altas (1X-3X y más) tendía a levantar las colonias de hESC como láminas completas. El tamaño de la agrupación de hESC desprendida dependía de la dilución de la formulación de citrato de sodio más que del tiempo de tratamiento (ensayos de 1-11 minutos). Esto aumenta la ventaja de la formulación de citrato de sodio en comparación con el Versene® EDTA, que en caso de un tratamiento prolongado (> 9 minutos) rompe las colonias de hESC en células individuales no deseables. El tamaño de las agrupaciones de las hESC desprendidas desarrolladas en mTeSRI® era, en general, más pequeño que el de las desarrolladas en MEF-CM. El efecto de la formulación de desprendimiento de células en el tamaño de los racimos desprendidos (agrupaciones) de hESC se investigó más a fondo. Tal como se describe más abajo, la osmolaridad de la formulación afecta al tamaño de los racimos. En determinadas realizaciones es preferible un tamaño de agrupaciones de 10-1.000 |jm. En realizaciones alternativas es deseable un tamaño de agrupaciones de 40-500 jm. La ventana de tiempo operativa para el tratamiento de hESC con formulación de citrato de sodio era más amplia que la del tratamiento de hESC con Versene® EDTA, lo que resulta particularmente beneficioso en la producción conforme a cGMP, cuando la uniformidad de calidad de producto está regulada y se han de minimizar las desviaciones. La ventana de tiempo operativa se describe con mayor detalle más abajo.

En la experimentación ejemplar presentada en esta memoria, la solución incluía: citrato de sodio y KCl diluidos en DPBS libre de Ca2+/Mg2+. No obstante, razonablemente se considera que quelantes de calcio alternativos en concentraciones optimizadas en formulaciones con osmolalidad óptima proporcionarán resultados atractivos. De modo similar, también se contemplan formulaciones de citrato que contienen una sal diferente al KCl. Estas sales incluyen, por ejemplo, NaCl, Na2HPO3, NaH2PO3, K2HPO3, KH2PO3 y similares.

En una realización, la concentración de citrato de sodio tiene un intervalo de trabajo preferente de 0,15-150 mM. En una realización para la recolección de células desarrolladas en medio de cultivo tal como MEF-CM (Medio Acondicionado con Fibroblastos Embrionarios Múridos), la concentración de citrato de sodio tiene un intervalo de trabajo de 1,0-50 mM. En una realización alternativa, tal como se ilustra en la FIGURA 6, la concentración de citrato de sodio tiene un intervalo de trabajo de 1,5-45 mM. En una realización, la concentración de citrato de sodio para el pase de células desarrolladas en MEF-CM está dentro de un intervalo de trabajo de 1,5-15 mM. En una realización, la concentración de citrato de sodio para recolectar células desarrolladas en medio de cultivo tal como mTeSRI® está dentro de un intervalo de trabajo de 1,5-30 mM. Los excipientes en la formulación incluyen, pero no se limitan a DPBS libre de Ca2+/Mg2+, y KCl (1,35-1.350 mM). La osmolaridad de trabajo de esta formulación está entre 31,1 y 2.050 mOsmol/l. En una realización, el intervalo de trabajo es de 290-1.015 mOsmol/l. En otra realización, el intervalo de trabajo es de 299-781 mOsmol/l. En otra realización más, el intervalo es de 548-781 mOsmol/l. En la Tabla 2, la solución de citrato de sodio de 10X contiene KCl 1.350 mM y citrato de sodio 150 mM en agua. Se realizó una serie de diluciones diluyendo la solución 10X en DPBS (sin Ca2+ o Mg2+).

Se midió la osmolalidad de las soluciones de desprendimiento de células seleccionadas (Tabla 3). En general, la solución de citrato de sodio tiene una osmolalidad mayor que la de todas las soluciones de EDTA y EGTA a base de Versene® (soluciones seleccionadas en la FIGURA 2). Esto se puede deber a la alta concentración de KCl y otros excipientes en las soluciones. La alta osmolaridad de la formulación de citrato de sodio está identificada en la presente memoria como un atributo que contribuye al comportamiento de desprendimiento de células único de la solución, que se describe con mayor detalle más abajo. La Tabla 3 ilustra la osmolaridad de diversas soluciones.

Tabla 3. Osmolaridad de soluciones de desprendimiento no enzimático

Para concentrar y lavar la recolección de hESC se puede utilizar tecnología de centrifugación a contracorriente continua. Tal como se ilustra en la FIGURA 7, la recolección de hESC (desarrolladas en MEF-CM) se concentra cinco veces con una caída de un 10% de la viabilidad después de procesamiento con kSep®. Las hESC procesadas con kSep® se mantienen en forma de racimos y se disponen bien en placas con una disminución de un 10% en la eficiencia de la disposición en placas, en comparación con la recolección fresca previa al procesamiento con kSep® (FIGURA 9). Las hESC formuladas e introducidas en viales con máquina rellenadora M-1 se criopreservan eficientemente en CryoStor10 con una recuperación de células viables de más de un 90% y una eficiencia de la disposición en placas después de la descongelación de un 50% (FIGURAS 8-9).

Tal como se describe adicionalmente en el EJEMPLO 11, en una realización, el proceso de expansión y pase de hESC desarrolladas en mTeSR1® desde matraces en T al interior de fábricas celulares multicapa se optimiza con un nuevo método de pase no enzimático, seguido por un procesamiento aguas abajo con tecnología de centrifugación a contracorriente continua.

En otra realización, el cultivo de hESC en MEF-CM se expande, con pase mediante Versene® EDTA, desde placas de seis pocillos al interior de matraces en T, y después al interior de recipientes de cultivo celular multicapa. La recolección final desde fábricas celulares multicapa se caracterizó con citometría de flujo y más de un 90% de estas células expresaban marcadores de pluripotencia, incluyendo OCT4, SSEA4, Tra-1-60, y Tra-1-81. La recolección celular final se concentró más de 14 veces después de un procesamiento aguas abajo automatizado, con una disminución de únicamente un 2% en la viabilidad celular.

También se llevaron a cabo otros estudios relacionados con el tiempo de tratamiento y su correlación con las diluciones de la formulación de citrato, que están definidos más abajo con mayor detalle en la Tabla 4. Las FIGURAS 10 y 11 demuestran el efecto de la dilución de formulación de citrato de sodio en la tendencia al aumento de la recolección de cultivo con el aumento del tiempo de tratamiento. El estudio ilustrado en la FIGURA 10 se llevó a cabo en cultivo de hESC desarrollado en MEF-CM, y el estudio ilustrado en la FIGURA 11 se llevó a cabo en cultivo de hESC desarrollado en mTeSR1®.

Tabla 4

Está previsto que, con las formulaciones de citrato de sodio, las células puedan ser recolectadas de una variedad de superficies, que incluyen, pero no se limitan a superficie revestida con Matrigel, superficie revestida con gelatina y superficie chapada con MEF, y/o superficies definidas químicamente. Algunos ejemplos incluyen, por ejemplo, superficies de plástico sintéticas o unidas con péptido (superficies Corning Synthemax y Nunclon (Nunc) Vita), superficies revestidas con proteínas nativas o recombinantes definidas (por ejemplo vitronectina, fibronectina, laminina y colágeno). Existen dos superficies de uso generalizado para hPSC: la superficie sembrada con MEF (sobre una superficie previamente revestida con gelatina se siembran Fibroblastos Embrionarios Múridos), y superficie revestida con Matrigel (Matrigel es una matriz extracelular derivada de tumor de ratón). Tanto Synthemax como Nunc Vita son superficies definidas disponibles en el mercado y comercializadas como una superficie que puede ser utilizada para cultivo de hPSC. Las formulaciones de citrato de sodio pueden ser utilizadas para recolectar hPSC desarrolladas en diversos tipos de medio de cultivo, que incluyen, pero no se limitan a medio de cultivo regular utilizado para cultivar hPSC sobre superficies sembradas con MEF, MEF-CM, mTeSRI® y StemPro®.

Ejemplo de referencia 2 (todos los estudios del Ejemplo 2 se llevaron a cabo en cultivos hESC en mTeSR1®) Determinación de la formulación de citrato de sodio óptima

Efectos comparativos de la osmolaridad, el potasio y el sodio en la capacidad del citrato de sodio para promover el desprendimiento de células

La formulación de citrato de sodio 1 X arriba descrita consiste en citrato de sodio 15 mM, KCl 135 mM, pH 7,31, y 499 mOsmol/l en DPBS. Se llevaron a cabo otros estudios para determinar los efectos de la osmolaridad y el KCl en la capacidad de la formulación de citrato de sodio para promover el desprendimiento de células. La FIGURA 12 muestra el porcentaje de desprendimiento de hESC en cultivos tratados con diversas soluciones de citrato de sodio. Los resultados indican que la osmolaridad de la solución y la concentración de citrato de sodio son factores importantes para lograr un desprendimiento de células óptimo. Además, con una osmolaridad prácticamente normal, la adición de potasio (KCl) a la formulación de citrato de sodio provocó un mayor porcentaje de desprendimiento que la adición de sodio (NaCl) (compárese la solución n° 4 con la solución n° 5), lo que sugiere que el KCl puede ser una mejor opción de sal en esta formulación que el NaCl. Sin limitarse a la teoría, una posible explicación de este hallazgo consiste en que el sodio adicional (Na<+>) inhibe la electrólisis de citrato de sodio y en consecuencia disminuye la capacidad de los iones de citrato quelantes de Ca2+.

Efecto de la osmolaridad en la capacidad del citrato de sodio para promover el desprendimiento de células y mantener la viabilidad

Se llevaron a cabo estudios para determinar el efecto de la osmolalidad en la capacidad del citrato de sodio para promover el desprendimiento de hESC. Se prepararon soluciones/formulaciones de citrato de sodio con diversas osmolaridades ajustando la concentración de KCl y manteniendo una concentración constante de citrato de sodio (véase la FIGURA 13). Tal como se muestra en la FIGURA 14A, con todas las soluciones se observó una viabilidad alta (y aproximadamente igual), mientras que la recolección máxima de células se logró después de tratar células durante 5 minutos con soluciones de citrato de sodio (citrato 15 mM) con una osmolaridad entre 299 y 781 mOsmol/l. Al utilizar una solución de citrato de sodio con una osmolaridad de 169 mOsmol/l y una osmolaridad de 1.016 mOsmol/l se observó una recolección sustancialmente reducida, lo que sugiere que existe un umbral entre aproximadamente 299 y 781 mOsmol/l en el que se pudo recolectar un alto porcentaje del cultivo. De hecho, las imágenes microscópicas (FIGURA 14B) revelaron racimos sustancialmente más grandes de células recolectadas de cultivos tratados con 781-1.016 en comparación con 169-548 mOsmol/l de citrato de sodio. Las imágenes de los racimos desprendidos se analizaron, y se cuantificaron los tamaños de los racimos. La FIGURA 14C muestra la distribución de los tamaños de racimo. Tal como se demuestra en las imágenes y en el gráfico de distribución de tamaños, el porcentaje del cultivo recolectado en forma de racimos celulares aumentaba con el aumento de la osmolaridad. Existía un aumento sustancial en los tamaños medidos de los racimos desprendidos obtenidos de cultivos tratados con soluciones 781-1.016 mOsmol/l en comparación con soluciones 169-548 mOsmol/l (racimos en su mayor parte con tamaños equidiámetro 250-900 frente a racimos en su mayor parte con tamaños equidiámetro 40-150, respectivamente).

Efecto de la concentración de citrato de sodio en el desprendimiento y la viabilidad de células

Se llevaron a cabo estudios para determinar el efecto de la concentración de citrato en el desprendimiento y la viabilidad de hESC. Se prepararon soluciones de citrato de sodio con diversas concentraciones a aproximadamente 265 mOsmol/l y un pH de aproximadamente 7,2. Tal como se muestra en la FIGURA 15A, con todas las soluciones se observó una viabilidad alta (y aproximadamente igual), mientras que el porcentaje de células recolectadas aumentaba con concentraciones crecientes de citrato de sodio de hasta aproximadamente 30-45 mM. Utilizando citrato de sodio 75 mM solo se logró una recolección ligeramente mejorada. Sin embargo, parecía haber un umbral de citrato de sodio entre aproximadamente 30-75 mM, en el que se producía "recolección en láminas" (colonias de hESC desprendidas como racimos grandes o láminas de células). De hecho, las imágenes microscópicas revelaron racimos sustancialmente más grandes de células recolectadas de cultivos tratados con soluciones de citrato de sodio 30-75 mM de citrato de sodio (FIGURA 15B). Existía un aumento correspondiente en los tamaños medidos de racimos obtenidos de cultivos tratados con soluciones de citrato de sodio 30-75 mM en comparación con soluciones de citrato de sodio 1,5-15 mM (racimos en su mayor parte con tamaños equidiámetro 250-900 frente a racimos en su mayor parte con tamaños equidiámetro 40-150, respectivamente) (FIGURA 15C).

Efectos comparativos de EDTA, EGTA y citrato de sodio en el desprendimiento de células

Se llevaron a cabo estudios para determinar los efectos comparativos de quelantes en el desprendimiento de hESC. La capacidad de quelación de Ca2+ del citrato, el EDTA y el EGTA es de 1:1,5, 1:1 y 1:1, respectivamente, basado en la estequiometría. El EDTA también se une a Mg<2+> y otros metales, mientras que el EGTA es más específico en cuanto a la unión de Ca2+. El desprendimiento de células logrado mediante una solución de citrato de sodio (citrato de sodio 15 mM a 400 mOsmol/l (obtenido con adición de KCl) y un pH de 7,8) se comparó con el logrado mediante soluciones de EDTA y EGTA 22,5 mM y 45 mM a 400 mOsmol/l y un pH de 7,8. Tal como se muestra en la FIGURA 16A, el EDTA y el EGTA en concentraciones mayores de 22,5 mM desprendían colonias de hESC tan eficazmente como el citrato de sodio. Los tamaños medidos de racimos redistribuidos obtenidos de cultivos tratados con las diversas soluciones eran similares (racimos en su mayor parte con tamaños equidiámetro 40-200) (FIGURA 16B).

Ejemplo de referencia 3

Estudios de evolución temporal

Versene® EDTA frente a citrato de sodio

Se llevaron a cabo estudios para determinar la ventana de tiempo operativa que proporciona un buen porcentaje de desprendimiento y distribución de tamaños de racimo. Los desprendimientos en los estudios arriba descritos se evaluaron después de cinco minutos de tratamiento con formulaciones de desprendimiento de células. En este caso, el tiempo de tratamiento se prolonga hasta 20 minutos, y el desprendimiento y el tamaño de racimo se examinan en diversos puntos temporales (2, 5, 8, 10, 15 y 20 minutos). Se seleccionan formulaciones de osmolalidad y pH moderados de estudios anteriores y se determina el intervalo de tiempo (ventana operativa) del tratamiento de cultivos de hESC con estas formulaciones que proporcionaría un porcentaje de desprendimiento y una distribución de tamaños de racimo después del desprendimiento deseables. Los cultivos celulares se trataron con las soluciones de la FIGURA 17 durante 2, 5, 8, 10, 15 o 20 minutos y después se golpetearon dos veces para desalojar las células. En cada punto temporal del tratamiento, los cultivos se evaluaron en cuanto al porcentaje de desprendimiento de células y al tamaño de racimo con el fin de determinar la ventana operativa óptima. En los puntos temporales de 5, 10 y 20 minutos se evaluaron la viabilidad celular y la eficiencia de la disposición en placas de células deprendidas. La FIGURA 18A muestra los efectos del Versene® EDTA y de diversas soluciones de citrato de sodio en el porcentaje de desprendimiento de hESC en cada punto temporal del tratamiento. La FIGURA 18B muestra los efectos del Versene® EDTA y de diversas soluciones de citrato de sodio en la distribución de tamaños de racimo en cada punto temporal del tratamiento. La FIGURA 19 muestra los efectos del Versene® EDTA y de diversas soluciones de citrato de sodio en la eficiencia de la disposición en placas de células desprendidas en cada uno de los puntos temporales de 5, 10 y 20 minutos del tratamiento.

Sobre la base de los resultados obtenidos de este estudio, y sin limitarse a la teoría, se puede establecer una ventana operativa similar a la representada en la FIGURA 20A y se pueden seleccionar parámetros apropiados para lograr un porcentaje de desprendimiento de células y un tamaño de racimo (equidiámetro) deseados. Por ejemplo, tal como se muestra en la FIGURA 20B, los criterios utilizados para determinar la ventana operativa son (1) el porcentaje de cultivo desprendido es mayor de un 70% y (2) el porcentaje de cultivo desprendido en forma de racimos de 40-500 um es mayor de un 90%. Tal como indican los datos experimentales, en general, el porcentaje de desprendimiento aumenta con el aumento del tiempo de tratamiento y el tamaño de racimo disminuye con el aumento del tiempo de tratamiento. Sobre la base de estos gráficos, el tratamiento de un cultivo de hESC con formulación de citrato Dis2#3 durante 3,5 a 7 minutos (ventana operativa) resultaría en un desprendimiento de > 70% del cultivo en su mayor parte (> 90%) en forma de racimos de 40-500 um. Las ventanas operativas determinadas bajos los mismos criterios para otras formulaciones de citrato y Versene® EDTA eran más estrechas. De hecho, sobre la base del gráfico, para cumplir los mismos criterios con Versene® EDTA, el cultivo ha de ser tratado durante exactamente 10 minutos (duración 0). Es más deseable, en especial en la producción cGMP, una ventana operativa más amplia, que proporciona más flexibilidad operativa sin influir en la uniformidad de las características del producto. Sobre la base de la FIGURA 19, la eficiencia de la disposición en placas disminuye con el aumento del tiempo de tratamiento y, por ello, no es deseable un tiempo de tratamiento de más de 10 minutos. Por consiguiente, la mejor práctica (basada en un alto porcentaje de desprendimiento, un intervalo de tamaños de racimo deseable y una alta eficiencia de la disposición en placas) para desprender hESC sería de 5-7 minutos de tratamiento con formulación de citrato Dis2#3, y de 10 minutos de tratamiento con Versene® EDTA. En sus tiempos de tratamiento óptimos respectivos, el Versene® EDTA recolectó por encima de un 20% de células menos que el citrato de sodio.

Alta concentración de EDTA y EGTA

Siguiendo la misma estrategia básica arriba utilizada para determinar las ventanas operativas para diversas formulaciones de citrato de sodio y Versene® EDTA, se llevaron a cabo experimentos para determinar las ventanas operativas y la eficiencia de la disposición en placas para formulaciones de Versene® EDTA 22,5 mM y de EGTA 22,5 mM descritas en el EJEMPLO 2, en comparación con Versene® EDTA y citrato de sodio (formulación Dis2#3). Las ventanas operativas se determinaron sobre la base de los criterios de "se recolecta > 70% del cultivo y > 90% de las células recolectadas está en forma de racimos de 40-500 |ii^". Tal como se muestra en la FIGURA 21A, las duraciones de las ventanas operativas de formulaciones de EGTA y de Versene® EDTA 22,5 mM son similares a las de la formulación de citrato Dis2#3, y son mucho más amplias que las del Versene® EDTA. Los puntos temporales iniciales de las ventanas operativas de formulaciones de EGT^a y de EDTA 22,5 mM son iguales, y son más tempranos que el de la formulación de citrato Dis2#3. Sin embargo, tal como se muestra en la FIGURA 21B, las hESC desprendidas con formulaciones de EGTA y de EDTA 22,5 mM no se disponen bien en nuevas placas (examinado en los puntos temporales de 5, 15 y 20 minutos de tratamiento), y el citrato de sodio (solución Dis2#3) sustancialmente superó a las formulaciones de EDTA y de EGTA en alta concentración (22,5 mM) en términos de eficiencia de la disposición en placas después de la recolección (el gráfico muestra las eficiencias de la disposición en placas en el punto temporal de 5 minutos de tratamiento normalizadas con la de la formulación de citrato Dis2#3). Aquí se demuestra que las formulaciones de citrato de sodio superan a las formulaciones que contienen EDTA y que contienen EGTA en lo que respecta al pase de hPSC. Además, otra ventaja del citrato de sodio sobre el EDTA y el EGTA consiste en que el citrato de sodio sobrante debería tener efectos menos perjudiciales en los cultivos celulares que el EDTA o el EGTA. (El citrato de sodio se utiliza a veces como un componente normal en diversos medios de cultivo de diversos tipos de células.) Por ejemplo, tal como se puede ver en el EJEMPLO 6, las soluciones de formulación de citrato de sodio no han de ser necesariamente retiradas después de tratar las células. No obstante, en la presente memoria están previstas formulaciones de pase y recolección adicionales, incluyendo formulaciones que contienen EDTA y EGTA, otros quelantes de Ca2+ aparte de citrato de sodio, o combinaciones de varios quelantes de Ca2+. Hay dos factores identificados relacionados con el desprendimiento de las células, la concentración de quelante de Ca2+ y la osmolaridad. Cuando la concentración es demasiado baja, la unión entre las células y la matriz no se rompe eficazmente y la formulación no puede desprender las células eficazmente. Cuando la concentración es demasiado alta, la unión entre las células se rompe en exceso, el tamaño de los racimos desprendidos disminuye, y los racimos desprendidos pueden ser frágiles y se pueden desintegrar con facilidad al ser manipulados posteriormente.

Sin limitarse a la teoría, el encogimiento de las células o las colonias provocado por una alta osmolaridad puede conducir a un desprendimiento de células, en especial en el borde de las colonias. Sin embargo, las células también podrían resultar dañadas si la osmolaridad es demasiado alta. Tal como se ilustra en la presente memoria, cuando la osmolaridad es demasiado alta, las células no se desprenden eficazmente de la superficie. El EJEMPLO 4 proporciona estudios dirigidos a una mayor optimización. Mediante el uso del diseño experimental descrito en la presente memoria se pueden desarrollar otras formulaciones de desprendimiento/pase de células que contienen diversos quelantes de Ca2+, y éstas se consideran incluidas dentro del alcance de la presente invención.

Ejemplo de referencia 4

Optimización de formulaciones de citrato de sodio en relación con una alta eficiencia de la disposición en placas después de un tratamiento prolongado

Se llevaron a cabo estudios con el fin de determinar la formulación de citrato de sodio óptima que ha de ser utilizada para lograr una alta eficiencia de la disposición en placas de los racimos de hESC desprendidos después de un tratamiento prolongado con solución de citrato de sodio. Un cultivo de hESC se trató con soluciones de diversas concentraciones de citrato de sodio (1, 5 y 10 mM) y osmolaridades (400, 500, 600, 700 y 800 mOsmol/l, obtenidas ajustando la concentración de KCl) durante 5, 10, 15 y 20 minutos. En los puntos temporales de tratamiento indicados se compararon el porcentaje de recolección, el tamaño de racimo y la eficiencia de la disposición en nuevas placas de cada solución de citrato de sodio. Para cuantificar la eficiencia de la disposición en nuevas placas, 2 x 105 células viables desprendidas de la superficie se dispusieron de nuevo en un pocillo de una placa de seis pocillos revestida con Matrigel, y las células unidas se recolectaron y se recontaron el día siguiente. Después, suponiendo que las células nuevamente unidas crecen al doble de su población en un día, la eficiencia de la disposición en nuevas placas se calculó como la cantidad de células recolectadas el día siguiente dividida por 4 x 105. Tal como se muestra en la FIGURA 28A: 1/ el tamaño de racimo disminuye con el aumento del tiempo de tratamiento; 2/ el tamaño de racimo disminuye con el aumento de la concentración de citrato de sodio; y 3/ el tamaño de racimo aumenta con el aumento de la osmolaridad. Los resultados indicaban que, en comparación con todas las soluciones ensayadas, la solución con baja concentración de citrato de sodio (1 mM) con alta osmolaridad (600-700 mOsmol/l) producía un buen desprendimiento de células, racimos grandes y una alta eficiencia de la disposición en placas incluso después de un tratamiento prolongado (FIGURAS 28A-C). Sin embargo, una osmolaridad alta (> 700 mOsmol/l) parecía causar un enrollamiento de los racimos de hESC en el momento del desprendimiento, lo que puede resultar en una morfología no deseada de las colonias dispuestas en nuevas placas y en muerte o diferenciación celular en los centros de estas colonias.

Ejemplo de referencia 5

Uso de citrato de sodio en pase en seco

Durante el tratamiento con soluciones de desprendimiento de células se pueden producir pérdidas de las células. Esto se debe a que el cultivo se empapa en la solución durante el tratamiento y la solución se retira antes de desprender el cultivo con medio de cultivo celular. Con el fin de eliminar esta pérdida, se llevaron a cabo estudios para averiguar si la solución se puede añadir y retirar inmediatamente al comienzo del tratamiento, y si el cultivo se puede desprender únicamente con el residuo de la solución sobre la superficie de cultivo ("pase en seco"). El nuevo procedimiento propuesto está representado en la FIGURA 22. Tal como se indica también en la FIGURA 22, en dos puntos temporales de tratamiento (5, 10 minutos) se compararon dos condiciones de incubación (temperatura ambiente, 37 °C incubador), y para este procedimiento de pase en seco se ensayaron tanto Versene® EDTA como formulación de citrato Dis2#3. Sobre la base de las distribuciones de tamaños de racimo y de las imágenes de células dispuestas en nuevas placas, se determinó que el procedimiento de "pase en seco" funciona tanto para Versene® EDTA como para formulación de citrato, y las mejores condiciones sobre la base de este experimento fueron de 5 minutos de incubación a temperatura ambiente. El "pase en seco" se podría adoptar para evitar la pérdida de recolección en soluciones de desprendimiento. Aunque una persona con una experiencia común en la técnica puede determinar una optimización adicional de la formulación de citrato para la aplicación en "pase en seco" con el fin de obtener un alto desprendimiento, así como una distribución de tamaños de racimo y una eficiencia de la disposición en nuevas placas deseables, una formulación ejemplar es Dis2#3.

Ejemplo de referencia 6

Uso de citrato de sodio en pase conservado

Como otra estrategia alternativa para racionalizar el procedimiento de desprendimiento y pase y para evitar la pérdida de células al retirar las soluciones de desprendimiento de células, se evaluó el procedimiento de "pase conservado". La FIGURA 24 representa la metodología utilizada en el "pase conservado". Básicamente, después de empapar el cultivo con la solución de desprendimiento de células durante un determinado tiempo de tratamiento, la solución no se retira del cultivo; en lugar de ello, se deja en el cultivo y se neutraliza con medio de cultivo. Después, las células se desalojan de la superficie mediante un movimiento de agitación circular, y posteriormente se siembran sobre una superficie fresca. La solución de desprendimiento de células se deja en la recolección celular final y después se transfiere al siguiente pase del cultivo cuando la recolección celular se siembra sobre la superficie fresca. Dado que a veces se utiliza citrato como un componente normal de algunos medios de cultivo celular, el citrato restante no debería tener efectos perjudiciales en cultivos celulares. Un protocolo de este tipo aumenta la facilidad de uso y la escalabilidad de las formulaciones de citrato de sodio para el desprendimiento de células. Por ejemplo, no es necesario retirar las soluciones del recipiente de cultivo y no se utiliza golpeteo del recipiente para desalojar las células. El protocolo se podría aplicar en un formato de cultivo en placas de cultivo de laboratorio a pequeña escala; también se podría aplicar, por ejemplo, en la recolección de células desarrolladas en recipientes de cultivo de 10 capas, o incluso de 40 capas, que han de ser manipulados por robots (por ejemplo, Automatic Cell Factory Manipulator).

El estudio descrito en la FIGURA 24 se llevó a cabo en cultivo de hESC desarrollado en medio StemPro®. El cultivo se trató con dos formulaciones de citrato de sodio, las soluciones n° 3 y n° 13 descritas en el EJEMPLO 4, en un volumen de 0,5 ml y 0,75 ml. La FIGURA 25 muestra la cantidad de células viables después del desprendimiento y el porcentaje de viabilidad logrado utilizando pase conservado con las dos formulaciones de citrato de sodio. La FIGURA 26 muestra la distribución de tamaños de racimo después del desprendimiento y la eficiencia de la disposición en placas, logradas utilizando pase conservado con las dos formulaciones de citrato de sodio. Los datos indican que las dos formulaciones de citrato de sodio funcionaron bien y produjeron resultados comparables; el desprendimiento completo se produjo en un plazo de 7-10 minutos, la viabilidad celular después del desprendimiento era de > 95, los racimos eran fundamentalmente grandes (un 20-75% de células después del desprendimiento estaban en forma de racimos de > 200 |im equidiámetro; < 8% eran < 40 |im), y la eficiencia de la disposición en placas después del desprendimiento alcanzaba valores tan altos como aproximadamente un 80%. Además, los datos también indican que 0,5 ml de solución de citrato de desprendimiento de células eran suficientes para desprender las células, y que el tamaño de los racimos de hESC después del desprendimiento era relativamente menor cuando se utilizaban 0,75 ml de solución.

Ejemplo 7

Pase de células madre mesenquimales

Se llevaron a cabo estudios para evaluar el efecto de formulaciones de citrato de sodio, que se optimizaron en relación con el desprendimiento de hESC, en el desprendimiento y pase de MSC. Se utilizaron y compararon cuatro formulaciones: Versene® EDTA, citrato Dis2#3, citrato n° 3 y citrato n° 13 (indicados como citrato 2-3, 3 y 13 en la FIGURA 27). Tal como se muestra en la FIGURA 27, la solución de citrato de sodio n° 3 dio resultados óptimos. El tratamiento de MSC con citrato n° 13 durante 10 minutos seguido de golpeteo del recipiente fue suficiente para desprender un 80% de las células, y resultó en un 90% de viabilidad después del desprendimiento y en la mejor disposición en nuevas placas después del desprendimiento, en comparación con las otras tres formulaciones.

Ejemplo de referencia 8

Evaluación de formulaciones de citrato de sodio como soluciones de desprendimiento y pase de células en cultivo de hESC de larga duración

Las formulaciones de citrato arriba descritas se identificaron inicialmente y se optimizaron para aplicaciones de recolección y pase de hESC desarrolladas en recipientes de cultivo cerrados a gran escala. Para desalojar las células después del tratamiento con soluciones de desprendimiento de células, los recipientes de cultivo se agitaron por golpeteo, agitación circular o sacudida en los experimentos para simular el proceso de desprendimiento de células en recipientes de cultivo cerrados. En el cultivo de hPSC en laboratorio a pequeña escala, frecuentemente se utilizan plataformas de cultivo abiertas, por ejemplo, placas de seis pocillos o matraces en T, y las células están accesibles para desalojarlas por chorreo con una corriente de medio de cultivo, tal como se describe en la Tabla 1 bajo "método con EDT^a ". Con el fin de evaluar el uso de soluciones de citrato de sodio en las aplicaciones de laboratorio a pequeña escala, se llevó a cabo un estudio preliminar para ensayar las soluciones de citrato n° 3 y n° 13 en cultivo de hESC en placa de seis pocilios, y su rendimiento se comparó con el de Versene® EDTA. El cultivo se desarrolló en medio mTeSR1® y se sometió a tratamiento con las formulaciones durante 5-8 minutos seguido por chorreo (obsérvese que para una aplicación a gran escala puede ser necesario un tratamiento más largo, de alrededor de 10 minutos). El tratamiento de cultivos de hESC con cualquiera de las dos soluciones durante 5 minutos seguido de chorreo con una pipeta funciona bien y logra un 95% de recolección y aproximadamente un 70-85% de eficiencia de la disposición en nuevas placas. La eficiencia de la disposición en nuevas placas de la solución de citrato n° 13 era aproximadamente un 15% mayor que la del Versene® EDTA.

Se iniciaron cultivos de hESC de larga duración en StemPro® y mTeSR1® y se mantuvieron durante más de 50 pases (aproximadamente 8 meses) mediante pase continuo con formulaciones de citrato. Se evaluaron las soluciones de citrato de sodio Dis2#3, n° 3 y n° 13 y en este estudio se incluyó Versene® EDTA como una comparación con las formulaciones de citrato. Tal como se muestra en la FIGURA 29, las hESC sometidas a pase con solución de citrato n° 13 durante 31 pases en medio StemPro® y 34 pases en mTeSR1®, respectivamente, produjeron tinción positiva para marcadores de hESC, incluyendo OCT4, Sox2, Nanog, SSEA4, TRA-1-60 y TRA-1-81). Las expresiones de marcadores se cuantificaron adicionalmente con citometría de flujo. Un 80-100% de las hESC sometidas a pase con la solución de citrato durante 36 pases en StemPro® y 30 pases en mTeSR1®, respectivamente, produjeron tinción positiva para OCT4, SSEA4, TRA-1-60 y TRA-1-81, y los porcentajes de células positivas eran comparables a los de células descongeladas directamente desde el banco de células (las células iniciales para el cultivo de larga duración). Los resultados de caracterización tanto de la inmunocitoquímica como de la citometría de flujo muestran que el pase de larga duración con formulación de citrato de sodio soporta un cultivo sostenible, o la autorrenovación de hESC.

La pluripotencia de estas hESC se evaluó adicionalmente en cuanto a la capacidad de diferenciación. Tal como se muestra en la FIGURA 30, las hESC sometidas a pase con solución de citrato durante 40 pases en StemPro® y 35 pases en mTeSR1®, respectivamente, pudieron generar cuerpos embrioides (EB) y diferenciarse en las tres hojas embrionarias, endodermo, mesodermo y ectodermo. La capacidad de diferenciación del cultivo de hESC de larga duración en StemPro® se confirmó adicionalmente mediante la generación de teratomas de estas células en ratones SCID inmunodeficientes (FIGURA 31). Los resultados de la diferenciación de EB y la generación de teratomas demostraron que las hESC sometidas a pase con solución de citrato durante numerosos pases y un tiempo prolongado siguen siendo pluripotentes y conservan la capacidad de diferenciarse en todos los tipos de células somáticas.

El cariotipo de bandas G del cultivo de hESC de larga duración sometido a pase con citrato de sodio se examinó en cuanto a anomalías. Tres muestras de hESC cultivadas en medio StemPro® presentaban un cariotipo normal después de someterlas a 10 y 25 pases con la solución de citrato de sodio n° 13; en cambio, mientras que tres muestras de hESC eran normales después de 10 pases con Versene® EDTA, una de tres muestras era anómala y una muestra presentaba anomalía emergente después de 25 pases con Versene® EDTA. Las hESC cultivadas en medio mTeSR1® también presentaban un cariotipo normal después de 29 pases con la solución de citrato n° 13. La relación de división utilizada para el pase de los cultivos de hESC de larga duración era de 1:15 a 1:40 (es decir, por ejemplo, las células recolectadas de un pocillo se podrían dividir entre 15 a 40 pocillos frescos; en el contexto del cultivo de hPSC, 1:40 se considera una relación de división mayor que 1:15), tanto en mTeSRI® como en StemPro®. Los cultivos alcanzan la confluencia normalmente el día 4 o el día 5 después de la división. En el cultivo de hPSC tradicional, en el que se utilizan tratamiento enzimático y raspado para el pase de las células, la relación de división es normalmente de 1:2 a 1:6, y el cultivo alcanza la confluencia normalmente entre el día 5 y el día 7. En comparación con el método de pase tradicional, el método de pase descrito en la presente memoria resulta en una expansión del cultivo mucho más rápida. Esto no solo favorece la fabricación de células a gran escala, sino que también acorta el tiempo de espera entre experimentos en estudios de laboratorio. Una preocupación con respecto a una alta relación de división y una expansión rápida consiste en la aparición de cariotipos anómalos. Sin embargo, tal como se ha descrito más arriba, tanto los cultivos en mTeSRI® como los cultivos en StemPro® mantenían un cariotipo normal después de un cultivo prolongado utilizando formulación de citrato de sodio como solución de pase. Ejemplo de referencia 9

Determinación de la ventana operativa para la formulación de citrato de sodio seleccionada

Para determinar la ventana operativa para la solución de citrato n° 13 se aplicó el estudio de evolución temporal descrito en el EJEMPLO 3. En este estudio se utilizó Versene® EDTA como un control. El método experimental se modificó ligeramente con respecto al estudio del EJEMPLO 3; el porcentaje de recolección se cuantificó a base de recuentos celulares en lugar de evaluación visual. En comparación con el Versene® EDTA, la solución de citrato de sodio n° 13 recolectó más células en un tiempo de tratamiento más corto. De acuerdo con el gráfico "Tamaño de Racimo", cuando se utilizó solución de citrato había una población mayor de células en la categoría de "> 200 um". Como resultado de ello, la solución de citrato n° 13 tenía una ventana operativa más amplia (8-11,5 minutos) que el Versene® EDTA. De hecho, la "Ventana Operativa" de Versene no presentaba ninguna superposición en el intervalo de tiempo para satisfacer los dos requisitos ("recolección" > 70, y "racimos mayores de 40 um" > 90). Las células desprendidas con citrato n° 13 tenían una eficiencia de la disposición en placas comparable a la de las células desprendidas con Versene® EDTA (datos no mostrados). En conjunto, la solución de citrato de sodio n° 13 supera al Versene® EDTA.

Ejemplo de referencia 10

Desprendimiento y pase de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) humanas y líneas múltiples de células madre embrionarias humanas con formulaciones de citrato de sodio

En este EJEMPLO 10 se ensayaron formulaciones de citrato de sodio en otras líneas de hESC (además de H9) e iPSC humanas. La solución de citrato de sodio n° 13 se utilizó para el pase de hESC H7 y H14 desarrolladas en mTeSRI®. A diferencia de los cultivos de H9 utilizados en los otros estudios, los cultivos iniciales de H7 y H14 tenían mucho estroma o células diferenciadas. La solución de citrato desprendió y pasó selectivamente la mayor parte de las hESC no diferenciadas y dejó el estroma y las células diferenciadas sobre la superficie. Después de tres pases consecutivos con la solución, la morfología de los dos cultivos de H7 y H14 mejoró enormemente sin que se observaran estroma o células diferenciadas obvios. De ello se deduce que las formulaciones de citrato de sodio pueden ser utilizadas para desprender y pasar diversas líneas de hESC.

La solución de citrato n° 13 puede ser utilizada para desprender y pasar iPSC. Incluso cuando las células fueron transferidas desde alimentadores de MEF hasta una superficie de Matrigel, la unión fue buena cuando las células desprendidas se dispusieron en nuevas placas, y la mayoría de los alimentadores de MEF no se desprendió y por lo tanto no se transfirió posteriormente a la superficie de Matrigel fresca. En este experimento, el cultivo de iPSC humanas también se adaptó gradualmente en un medio definido (StemPro®) en cinco días en el pase 1. Por lo tanto, de ello se deduce que las formulaciones de citrato pueden ser aplicadas sobre varias líneas de iPSC humanas para el pase y el mantenimiento del cultivo establecido. La formulación puede ser utilizada además para transferir las células hPSC, incluyendo hESC e iPSC humanas, desde alimentadores de MEF a superficies libres de alimentadores, como Matrigel, con un tiempo reducido para limpiar los MEF restantes (en comparación con métodos de pase mecánicos que implican raspado). La aplicación de formulaciones de citrato en la fase inicial de la generación de iPSC humanas puede ayudar a acelerar el proceso de establecimiento del cultivo en condiciones libres de alimentadores y/o definidas.

Ejemplo de referencia 11

Cultivo a gran escala y procesamiento aguas abajo de hESC utilizando soluciones de citrato de sodio

El estudio descrito en el EJEMPLO 1, en el que se recolectaron hESC de recipientes de cultivo celular de dos capas (por ejemplo, Corning Cell Stacks) utilizando una formulación de citrato de sodio, se aplicó a células cultivadas en M^e F-C^m , y la formulación estaba compuesta por citrato de sodio 15 mM, KCl 135 mM en DPBS. El presente ejemplo describe el estudio en el que se utilizó la solución de citrato n° 13 para recolectar hESC desarrolladas en mTeSR1®. Antes de escalar el cultivo desde una placa de seis pocillos hasta fábricas celulares multicapa, las soluciones de citrato n° 3 y n° 13 se evaluaron y se compararon con Versene® EDTA en relación con el desprendimiento de hESC de recipientes de cultivo más grandes, es decir, matraces T225 en lugar de placas de 6 pocillos. Se utilizaron dos líneas de hESC, H9 y H14. Los cultivos se trataron con soluciones de citrato durante 10 minutos y después se incubaron en medio de cultivo durante 2 minutos antes de golpetear los matraces para desalojar las células. Los resultados indicaban que las dos soluciones son buenas para la recolección a gran escala y proporcionan una mayor recolección que el Versene® EDTA (por ejemplo, un 30% mayor que el Versene® EDTA en el caso de las células H9 y un 15-20% mayor que el Versene® EDT^a en el caso de las células H14), con distribuciones de tamaños de racimo similares (principalmente 40-200 |ii^) entre las dos soluciones y el Versene® EDTA para las dos líneas celulares (datos no mostrados). En el desprendimiento de células H14, la solución n° 13 parecía ser ligeramente superior a la solución n° 3 (5% más de recolección y racimos más grandes con la n° 13). Por lo tanto, en el estudio para escalar cultivos de hESC a recipientes de cultivo celular multicapa se utilizó la solución de citrato n° 13.

Independientemente del método utilizado para obtener hESC, también se requieren tecnologías de procesamiento aguas abajo compatibles para concentrar y purificar las células en la recolección final. Tal como se ha mencionado previamente, la técnica terapéutica actual de purificación y reducción del volumen celular utilizando tecnología de centrifugación abierta requiere mucho tiempo, incorpora un alto riesgo de proceso y tiene un costo prohibitivo para lotes de gran volumen. Después del procesamiento con KSep, la distribución de tamaños de los racimos de hESC recolectados mediante la solución de citrato de sodio n° 13 no cambió de forma significativa, lo que indicaba que el procesamiento con KSep no rompía los racimos de forma significativa. La viabilidad de las células después del KSep alcanzaba más de un 80%, y la eficiencia de la disposición en placas era superior a un 60%, solo un 13% más baja que la eficiencia de la disposición en placas antes del KSep. Las imágenes de los cultivos dispuestos en nuevas placas el Día 1 también indicaban que los racimos de hESC recolectados con la solución de citrato no se desintegraban por completo en células individuales o en racimos más pequeños por el procesamiento con KSep. En conjunto, la solución de citrato de sodio n° 13 es capaz de generar racimos robustos que sobreviven a kSep®, introducción automática en viales y criopreservación con congelador de velocidad controlada, mantienen una alta viabilidad y eficiencia de la disposición en placas, y presentan un cariotipo normal después del escalado.

Habiendo descrito ahora algunas realizaciones de la invención, para los expertos en la técnica debería ser evidente que lo anterior es meramente ilustrativo y no limitativo, y que se ha presentado únicamente a modo de ejemplo.

Claims (17)

REIVINDICACIONES

1. Un método para la recolección y el pase subsiguiente de células madre pluripotentes humanas sin raspado y sin pérdida sustancial de viabilidad, que comprende:

incubar dichas células madre pluripotentes humanas en una formulación, comprendiendo dicha formulación: citrato de sodio, y una sal, seleccionándose la sal entre el grupo consistente en NaCl, KCl, Na²HPO³, NAH²PO³, K²HPO³, KH²PO³ y NaHCO³, teniendo dicha formulación una osmolaridad de 150 -1.500 mOsmol/litro.

2. El método según la reivindicación 1, en el que dicho citrato está en una concentración de 0,15 a 150 mMol/litro.

3. El método según la reivindicación 1 o 2, en el que el citrato de sodio está en una concentración de 1-30 mMol/litro; preferiblemente en una concentración de 1-15 mMol/litro.

4. El método según la reivindicación 1, en el que la osmolaridad es de 500-700 mOsmol/litro, preferiblemente de 418-570 mOsmol/litro.

5. El método según la reivindicación 1, en el que las células madre pluripotentes humanas se seleccionan entre el grupo consistente en células madre embrionarias y células madre pluripotentes inducidas.

6. El método según la reivindicación 1, en el que la sal es KCl y en el que el KCl está en una concentración de 1,35-1.350 mMol/litro, preferiblemente en una concentración de 203-316 mMol/litro.

7. El método según la reivindicación 1, en el que el pH de la formulación se tampona con bicarbonato, fosfato, etanolamina, trietanolamina o trometamol.

8. El método según la reivindicación 1, en el que la formulación tiene un pH entre 7 y 8.

9. El método según la reivindicación 1, que adicionalmente comprende una solución salina tampón de fosfatos, que consiste en solución salina tampón de fosfatos de Dulbecco (DPBS) libre de Ca²⁺/Mg²⁺.

10. Un método para producir una formulación para la recolección y el pase subsiguiente de células madre pluripotentes humanas, que comprende:

combinar citrato de sodio y al menos una sal con un líquido de tal modo que la osmolaridad sea de 150-1.500 mOsmol/litro y la concentración de citrato de sodio sea de 0,15 a 150 mMol/litro, seleccionándose la sal entre el grupo consistente en NaCl, KCl, Na²HPO³, NAH²PO³, K²HPO³, KH²PO³ y NaHCO³.

11. El método para la recolección y el pase subsiguiente de células madre pluripotentes humanas de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende:

incubar las células madre pluripotentes humanas en la formulación que comprende:

citrato de sodio, y una sal, seleccionándose la sal entre el grupo consistente en NaCl, KCl, Na²HPO³, NAH²PO³, K²HPO³, KH²PO³ y NaHCO³ , teniendo dicha formulación una osmolaridad de 150-1.500 mOsmol/litro, en placas o recipientes de cultivo celular durante 2-20 minutos, desprendiéndose dichas células madre pluripotentes humanas de las placas o recipientes de cultivo celular en racimos que tienen una viabilidad celular entre un 85 y un 100%, y siendo el tamaño medio de racimo de 10-1.000 |im.

12. El método según la reivindicación 11, en el que las placas o recipientes de cultivo celular se seleccionan entre el grupo consistente en placas de Petri, placas de cultivo celular de múltiples pocillos, aparatos de cultivo celular apilados, fábricas de cultivo celular multicapa.

13. El método según la reivindicación 11, en el que el tamaño medio de racimo es de 40-500 |im.

14. El método según la reivindicación 11, que adicionalmente comprende:

procesar racimos aguas abajo, seleccionándose el procesamiento aguas abajo entre el grupo consistente en tecnología de centrifugación a contracorriente continua, formulación, introducción automática en viales y criopreservación.

15. El método para la recolección y el pase subsiguiente de células madre pluripotentes humanas de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende:

someter a pase las células madre pluripotentes humanas con la formulación que comprende citrato de sodio, y una sal, seleccionándose la sal entre el grupo consistente en NaCl, KCl, Na²HPO³, NAH²PO³, K²HPO³, KH²PO³ y NaHCO³ , teniendo dicha formulación una osmolaridad de 150 -1.500 mOsmol/litro, en una relación de división de 1:10 a 1:60, alcanzando el cultivo la confluencia en un plazo de siete días después de la división.

16. El método para la recolección y el pase subsiguiente de células madre pluripotentes humanas de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende:

disponer en placas las células madre pluripotentes humanas en un medio,

aspirar el medio usado,

lavar con DPBS,

añadir la formulación que comprende citrato de sodio, y una sal, seleccionándose la sal entre el grupo consistente en NaCl, KCl, Na²HPO³, NAH²PO³, K²HPO³, KH²PO³ y NaHCO³ , teniendo dicha formulación una osmolaridad de 150 -1.500 mOsmol/litro,

retirar la formulación, incubar,

añadir medio de cultivo, y

recolectar los racimos desprendidos.

17. El método según la reivindicación 11, en el que la formulación no se retira.