JP2009529859A - ヒト胚盤胞からの幹細胞を増殖ための培養系および方法 - Google Patents
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Abstract
Description
例えば、Draper、Buzzard及びMitalipovaは、12および17qの染色体獲得のような染色体異常の紹介を記載している。また、Cowanは、明確に遺伝子の不安定性を指摘し、さらに定期的な染色体分析を提案している。EnverおよびAndrewsは、培養適応の細胞株または試験管内適応の細胞株への転移を解説する。それは、ヒトの胎児性癌(EC)に似て来るか、または核型的後成変化および修正多分化能を呈している。hBS細胞の酵素繁殖の間に観察されるこれらの変化はおそらく特に個体数圧力に抵抗する細胞に賛成する選択的な培養系を原因とし、それはおよそ15−20継代で起こり始める。
本発明によって提供される培養系は、ヒトの胚盤胞由来の幹(hBS)細胞を繁殖するための培養系であり、本培養系は、
i) 密度が少なくとも50,000細胞/cm2であるヒトの支持細胞、
ii) 単細胞懸濁液へhBS細胞コロニーを解離するための一つ以上の解離薬品、および
iii) 有効な培養ミディアム、
を含み、本培養系は、hBS細胞の重要な特徴を保全する拡張時間期間において各自の連続的な継代において単細胞懸濁液へhBS細胞コロニーを解離することによってhBS細胞を繁殖することを可能にする。
i) 万能細胞株から得られたhBS細胞を培養系に適応させるために調整手順を選択的に実行し、
ii) 一つ以上の解離薬品を利用して単細胞懸濁液へhBS細胞を解離し、
iii) 密度が少なくとも50,000細胞/cm2のヒト支持細胞を含む一つ以上の培養容器へ分割比が少なくとも1:4の単細胞懸濁液、たとえば分割比が少なくとも1:5の単細胞懸濁液を配分し、
iv) 通常の培養基変化において、約3日乃至約25日間にhBS細胞を培養し、
v) ステップii)をn回を繰り返し、ここでnは、少なくとも1である整数である。
i) 密度が少なくとも50,000細胞/cm2のヒトの支持細胞、
ii) 単細胞懸濁液へhBS細胞コロニーを解離するための一つ以上の解離薬品、および
iii)有効な培養基、を含み、
本培養系は、hBS細胞の重要な特徴を保全する長期間において各自の連続的な継代において単細胞懸濁液へhBS細胞群を解離することによってhBS細胞を繁殖できる。hBS細胞は、20継代以上(例えば25継代以上、又は30継代以上、又は35継代以上、又は40継代以上)に渡って本願発明に基づく培養系で繁殖され、その主な特徴を保全する。
i) 密度が少なくとも50,000細胞/cm2のヒトの支持細胞、
ii) 単細胞懸濁液へhBS細胞コロニーを解離するための一つ以上の解離薬品、および、
iii) 有効な培養基、
iv) 支持細胞に混合される磁性粒子。
ここで使用されるように、「繁殖」という用語はhBS細胞、即ち、hBS細胞の数を拡大させるために、hBS細胞が培養されることを意味する。しかも、本願明細書に記載されている繁殖のための培養系および方法は、簡単にhBS細胞株を保全するために使われることもできる。
ここで使用されているように、用語「hBS細胞の重要な特徴」は、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つまたは7つの以下の特徴を表すことを目的とする:
i) 有糸核分裂抑制の支持細胞における成長時の未分化状態の繁殖能を示す。及び/又は
ii) 安定染色体核型を呈する。すなわちhBS細胞の繁殖の間に異常はない。および/または、
iii) インビトロおよびインビボの両方の胚葉の全ての種類の派生物に進化させるための可能性を保全する。および/または、
iv) OCT−4, アルカリホスファターゼ、炭水化物エピトープSSEA−3、SSEA−4、TRA 1−60、TRA 1−81および、単クローン性抗体GCTM−2によって認識されるケラチン硫酸塩/コンドロイチン硫酸塩細胞周囲マトリックスタンパク質ケリカンのタンパクコアから少なくとも二つの分子標識を呈する。または/および、
v) 分子マーカーSSEA−1または他の解離マーカーを呈しない。および/または、
vi) 免疫不全のマウスに注入される時に多分化能を保持し、生体内で形状奇形腫を形成する。および/または、
vii) 分化可能である。
本願発明の培養系は、hBS細胞または、本願明細書で「万能細胞株」と呼ばれているものに保全される細胞株を繁殖することに使われることが可能である。ここで使用しているように、「万能細胞株」は、継代でhBS細胞コロニーの機械解離を使用する従来の培養系において保全されるhBS細胞株の親培養菌を意味し、「万能細胞株」はまたガラス化された親培養菌も指す。
支持細胞の緻密層は、hBS単細胞に十分に有効な前記システムを作るために本願発明の培養系において必要であり、クラスタのhBS細胞より、周囲環境に明らかに敏感である。したがって、本願発明に基づく培養系のヒトの支持細胞の密度は,約50,000細胞/cm2から約500,000細胞/cm2であり、例えば、約50,000細胞/cm2から約400,000細胞/cm2、約50,000細胞/cm2からの約300,000細胞/cm2まで、約50,000細胞/cm2から約200,000細胞/cm2まで、約60,000細胞/cm2から約200,000細胞/cm2まで、約70,000細胞/cm2から約200,000細胞/cm2までである。通常、支持細胞はhBS細胞が接種される前に培養容器に約1日から約10日間、例えば、約1日から5日間、約2日から4日間接種される。選択的に、培養基はhBS細胞が接種される前に少なくとも1回、例えば少なくとも2回、少なくとも3回、少なくとも4回、または少なくとも5回変化することが可能である。
本発明はhBS細胞コロニーが継代で単細胞懸濁液へ解離されることができる培養系に関するものである。ここで使用しているように、「単細胞懸濁液」は例えば本質的に10%未満の単細胞から成るhBS細胞(例えば8%未満、6%未満、4%未満、2%未満)の懸濁を意味することを目的とし、または、1%未満の細胞実体はクラスタであってもよい。残留するいかなるクラスタは細胞濾過器を用いて任意に取り除かれることができる。細胞濾過器は孔サイズ有するメッシュとして機能し、それによりクラスタが集められ、単細胞が通される。上記において言及されるように、これは単細胞状況が粗いので重要な手順であり、それは、細胞生存、生存細胞の安定性および品質に関して複雑化を意味する。
本発明の培養系の使用に適する培養基は、hBS細胞の成長に非常に有効とならなければならない。適切な培養基は、完全に周知の組成物を有する合成培地であってもよい。適切な支持培養基は、補充されたベース・メディア(例えばOMEMまたはIMDM)を含む。有効な培養基は、以下の構成要素の一つ以上により補充されることができる:哺乳類の血清、例えば、FBSまたはヒトの血清、KNOCKOUT(登録商標)血清代替物、ペニシリン、ストレプトマイシン、非必須アミノ酸、L−グルタミン、β−メルカプトエタノールおよびhrbFGF(ヒトの組み換え塩基性線維芽細胞成長因子)。
50単位/mlのペニシリン、50μg/mlストレプトマイシン、0,1mMの非必須アミノ酸、2mMのL−グルタミン、100μMのβ−メルカプトエタノール及び4ng/mlのhrbFGFにさらに補充された培養基。
1) 健康なヒトの血液を非ヘパリンの被覆袋に収集する。
2) 非ヘパリンの被覆袋を約0.5から約5時間、たとえば約0.5から約2時間揺り動かす。
3) 非ヘパリンの被覆袋を少なくとも10時間、最高で50℃の温度で培養する。
4) 凝結品質、例えば非凝固のフィブリンの欠如、液体の不透明度に基づく任意的な選択。
5) 血清を凝固された材料から解離する。
6) 血清を除菌する。
7) 少なくとも15人の提供者から血清をプールする。
8) 使用の前に血清を凍らせる。
本発明に係る好適な実施例において、培養系は、
i) 密度が少なくとも50,000細胞/cm2のヒトの新生児包皮支持細胞、
ii) 単細胞懸濁液へhBS細胞コロニーを解離するためのTrypLE(商標) Select、および
iii) 4ng/mlのhrbFGFに補充されるVitroHES(商標)、
を含み、hBS細胞の重要な特徴を保全すると共に、培養系は、各自の延長される連続的な継代において単細胞懸濁液へhBS細胞コロニーを解離することによってhBS細胞を繁殖可能である。
その他の重要な態様において、本発明は上記の培養系におけるhBS細胞を繁殖する方法に関連する。そして、細胞の重要な特徴を保全すると共に、h8S細胞を培養するために、方法は次のステップを含む:
i) 万能細胞株から得られたhBS細胞が培養系に適応するための調整処置を選択的に実行する。
ii) 一つ以上の解離薬品を使用して単細胞懸濁液にhBS細胞を解離する。
iii) 少なくとも密度が50000細胞/cm2のヒトの支持細胞を含む一つ以上の培養容器へ、例えば1:5のような、少なくとも1:4の分割比の単細胞懸濁液を配分する。
iv) 通常の培養基において約3〜約25日間hBS細胞を培養する。
v) ステップii)からn回を繰り返し、そこにおいて、nは少なくとも1の整数である。
vi) ステップiv)において得られた細胞を分析することが可能である。
vii) hBS細胞の重要な特徴が保全される場合、ステップii)から繰り返す。
hBS細胞コロニーを一つ以上の解離薬品で処理することによって、ステップii)における単細胞懸濁液へのhBS細胞の解離が実行されることができる。使用された培養基を除去した後、hBS細胞コロニーはPBSで洗われることができる。それはカルシウムおよびマグネシウムにより劣化され得る。一つ以上の解離薬品がコロニーに加えられ、適切な期間内、すなわちhBS細胞がフィーダ層からかき集め始める期間まで、例えば37℃のような適切な温度により効果を発揮される。一つ以上の解離薬品が一つ以上の酵素を含む場合に、酵素活性範囲の好ましい量は約10単位/mLから約5000単位/mL、たとえば約100単位/mLから約500単位/mLである。培養の後、ピペットを有する重複粉砕が実行され、それはhBS単細胞を得るために細胞シートを粉砕する際の1つ以上の解離薬品を援助するためである。1つ以上の解離薬品の存在がステップiii)においてヒトフィーダ細胞上へ接種されるコロニーを形成するhBS細胞の性能に影響を及ぼすことがあるので、1つ以上の解離薬品の効果は、ステップiii)の前に減弱させられる。1つ以上の解離薬品の効果は、例えばhBS細胞を一つ以上の解離薬品からの解離、1つ以上の解離薬品の希弱化、1つ以上の解離薬品に一つ以上の抑制剤の追加または過度の1つ以上の解離薬品へ一つ以上の培養基を追加するための遠心解離、濾過または沈殿のような物理的な除去によって減弱させることができる。あるいは、一つ以上の解離薬品は、自動抑制ができてもよく、すなわち、それらは特定の時間の後、自身の機能を低下させる固有の能力を有してもよく、例えばAccutase(商標)およびAccumax(商標)の場合である。1つ以上の解離薬品の除去の後、hBS細胞の単一の細胞懸濁を得るために、得られたhBS単細胞は、本発明による有効な培養基の中で再懸濁される。
上記方法のステップiii)において、単細胞懸濁液の中のhBS細胞は上記のように準備されたヒト支持細胞を含む一つ以上の培養容器の中へ分散され、すなわち、hBS細胞は、支持細胞に接種される。この接種の重要な特徴は、本方法および培養系がhBS細胞を例えば少なくとも1:4の分割比のような少なくとも1:5の分割比に分散させ、それはhBS細胞がステップii)の前に解離された面積より5倍大きいフィーダ細胞の面積上に分配されることを意味する。特定の分割比を選択するための基準は、密集度、成長率および、解離後の細胞計数および形態的点検に基づく培養容器内のhBS細胞コロニーの均質性に基づく。上記の基準、より高い分割比は安定性およびhBS細胞の品質に損害を与えることはなく、hBS細胞数の繁殖が達成可能である。適切な分割比は、約1:4または約1:5から1:5000の範囲内であり、例えば1:20から1:1000、1:50から1:500の範囲内である。ここにおいて、しばしば使用される分割比は、約1:20である。
特定の分割比でhBS細胞を接種した後に、細胞は湿っぽい空気(すなわち好ましくは約95%の湿度)の中で、約37℃の気温で、約3日〜約25日間、例えば、約4日〜約20日間、または約6日〜約12日間培養される。ステップiv)の培養期間中、培養基は1週間に約1から14回、例えば、1週間に2回から4回、1週間に3回である一定の間隔で変えられる。
単細胞懸濁液へhBS細胞コロニーを酵素解離するために、本願発明の重要な要素は、圧力と関連するhBS細胞のための大きな変化、潜在的低い粘着力および低い繁殖、自然発生の分化、さらに、潜在的な細胞死であり、それらを一つ以上の継代においてより穏やかな条件に適合させることによってhBS細胞を本願発明の培養系に適合させるのに必要である。穏やかな条件は、より小さい分割比および培養方法で定められたより長い培養時間を意味する。したがって、本発明の調整手順は、次のステップから成る:
a) 一つ以上の解離薬品を用いて単細胞懸濁液へhBS細胞コロニーを解離する。
b) 少なくとも1:3の分割比の単細胞懸濁液を密度が少なくとも50,000の細胞/cm2であるヒトの支持細胞を含む一つ以上の培養容器に分散させる。
c) 規則的な時間間隔で培養基を変えながらhBS細胞を約5日から約30日間、例えば約7日から約16日間、または約7日から約10日間培養する。
d) 均一な未分化のhBS細胞コロニーを得るために、任意に、ステップa)を最大5回繰り返す。均一なコロニーは、細胞密度を有するコロニーが蓄積構造のない面積にわたっていることを意味する。
i) 以下のステップを含んでいる調整処置を実行する。
a) 一つ以上の解離薬品を用いて単細胞懸濁液へhBS細胞コロニーを解離する。
b) 少なくとも密度が50,000細胞/cm2のヒト支持細胞を含む一つ以上の培養容器に分割比が少なくとも1:3の単細胞懸濁液を配分する。
c) 一定時間ごとの培養基の変化において、約5日から約30日間、たとえば7日から16日間又は7日から10日間、hBS細胞を培養する。
d) 均一的な未分化のhBS細胞コロニーを得るために、ステップa)から多くとも5回を繰り返す。
ii) 例えば、一つ以上の解離薬品、例えば、TrypLE(商標)Selectの使用によって単細胞懸濁液へhBS細胞を解離する。
iii) 少なくとも密度が50,000細胞/cm2のヒト支持細胞を含む一つ以上の培養容器に分割比が少なくとも1:4、例えば1:5のような単細胞懸濁液を配分する。
iv) 一定時間ごとの培養基の変化において、約3日から約25日間hBS細胞を培養する。
v) この種の細胞の重要な特徴を保全すると共に、hBS細胞を繁殖するために、ステップii)から少なくとも20回を繰り返す。
本発明に基づく支持細胞およびhBS細胞の各自解離の適切な方法は、次の工程を含むことができる:
i) 接種の前に磁気的に修復された支持細胞を得るために磁性粒子に支持細胞を感光させる。
ii) 任意の培養基の変化後に、1日以上磁気的に修正された支持細胞上にhBS細胞を接種、培養する。
iii) 支持細胞の混合細胞集団およびhBS細胞を培養容器から解離し、一つ以上の解離薬品、例えばTrypLE(商標) Selectの使用により前記細胞集団を単細胞懸濁液へ解離する。そして、
iv) 磁力を用いて、支持細胞をhBS細胞から解離する。
本発明によって得られるhBS細胞がhBS細胞の重要な特徴を保全するかどうかを調べるために、セルアーティス(Cellartis)社のhBSC株SA001およびSA121は、本発明の培養系へ転移され、本発明の方法に基づいて連続的に20−40継代培養される。20継代において、hBS細胞は、完全に特徴づけられる。個々の細胞形態およびコロニー形態は、hBS細胞及びそのコロニーの通常の形態(図1)が顕微鏡的に明かして評価される。マーカー発現は、免疫組織化学/組織化学(Oct−4、SSEA−3、SSEA−4、Tra1−60、Tra1−81、SSEA−1)(実施例7、図2および図5)を使用しているタンパク質表現レベルで分析された。染色体分析およびFISH分析によって実行された遺伝子の特徴描写は20継代以上に保全される核型を表す(実施例8、図3および図5)。多分化能は、20を超える継代(実施例9、図4および図5)の後に多能性未分化されるhBS細胞を表すSCIDマウスの奇形腫の形成によって、本発明によって得られるhBS細胞のために評価される。
i) 形成されるコロニーの数に対して重要な解離薬品の選択、および
ii) 形成されるコロニーの未分化に関する品質に重要なシード種類の選択である。分化の等級は、形態顕微鏡によって順番に分析され、周知の未分化及び実分化マーカーに表現されるマーカー発現分析に潜在的に関連づける。
未分化又は分化されたhBS細胞コロニーは全コロニーとして自動的に培養プレートから解離されることができて、PBSで洗浄され、−80℃で保管される。RNAは製造業者の指示に従い、例えばQiagen RNeasy Mini・キットを使用して、更に抽出されることができる。逆転写は、適切なキット、例えばRotorgene 3000(Corbett Research社)内で、Bio−Rad iScript First Strand Synthesis キットを用いて実行され(製造業者の指示に従って)、適切な条件の下でQPCRが実行される。全ての遺伝子は、同じ種類に定量化可能であり、可能であれば、いくつかのサンプルの分化状態は、遺伝マーカーに基づく個々のサンプルの算出数学的インデックスによって比較される。(より詳細なプロトコルは、国際公開第2006/094798号パンフレットに記載されている。)
下に記載されている本発明の更なる態様において、上の主態様で議論される詳細および特徴は準用される。
本発明によって得られたhBS細胞は、操作および/またはhBS細胞分析のために更なる工程を受ける。例えば、本発明によって得られるhBS細胞株は、分化細胞の準備のために使われることができる。さらに、発明のhBS細胞または細胞株は、凍結融解を受けることができる。特定の実施例において、本発明において得られたhBS細胞株は、凍結されることが可能で、Cellartisの国際公開第2004/098285号パンフレットによってすでに示されるガラス化方法によって融解されることも可能である。hBS細胞培養の均質性を増やすために、本発明において得られる細胞は、国際公開第2005/059116号パンフレットにて説明したように、クローン由来の対象になり得る。また、本願発明に基づいて得られたhBS細胞は国際公開第2004/099394号パンフレットにて説明したように、無支持培養系へ転換することが可能である。出願人によって他の場所で記載されているhES細胞の分化状態を判定するためのQPCR方法は、本発明で得られた例えばhBS細胞、または例えば本発明によって得られる細胞の誘導体に使用されることが可能であり、細胞分化手順に従う。このパラグラフにおいて参照される特許出願は、参照として援用される。
本願発明は、更にhBS細胞の単一細胞懸濁に関し、上記にて説明したように、この種の細胞を培養する方法に応用される場合に、その単細胞懸濁液は、例えば、25継代以上、30継代以上、35継代以上または40継代以上のような20継代以上の間でhBS細胞の重要な特徴を存続、保全することができる。
本願発明は、更にhBS細胞株に関し、上記にて説明したように、この種の細胞を培養する方法に応用される場合に、そのhBS細胞株は、例えば、25継代以上、30継代以上、35継代以上または40継代以上のような20継代以上の間でhBS細胞の重要な特徴を存続して、保全することができる。
一実施例において、本発明は本発明の培養系の一つ以上の構成要素を含む一つ以上のキットを関連づける。したがって、本発明のキットは以下の構成要素のうち一つ以上を含む。
i) 単一のhBS細胞集団
ii) hBS細胞の繁殖方法を記載しているユーザー・マニュアル。
i) 単一細胞集団および、少なくとも一つ(例えば少なくとも2または少なくとも3つ)の以下の構成要素、
ii) ヒトの支持細胞、
iii) 単細胞懸濁液へのhBS細胞コロニー解離のための一つ以上の解離薬品、および、
iv) 有効な培養基。
人体包皮線維芽細胞の培養と支持細胞層としての使用
市販で入手可能なhFFsはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション,(CRL−2429 ATCC, Manassas VA)から得られ、Iscove’s DMEM(Gibco Invitrogen Corporation, ペイズリー、スコットランド;http://www.Invitrogen.com)に培養され、10%のFBS(Invitrogen)及び1%のペニシリン−ストレプトマイシンに補充される。トリプシン−EDTA(Invitrogen)を用いて、細胞は比率が1:2から1:8の間で規則的に(毎週)継代する。hFFの融合性単層はマイトマイシン−C(シグマ)(2.5時間に10μg/ml)で処理され、4ng/mlのヒト組換え塩基性線維芽細胞成長因子(hrbFGF,Invitrogen)で補充されたVitroHES(商標)培地の濃度が70,000−80,000 細胞/cm2で、0.1%のゼラチン(シグマ)にコーティングされた体外受精膜皿に載せる。hFF細胞は継代4から継代12までのフィーダとして用いられる。
人体胎児線芽細胞の培養及び支持細胞層としての使用
市販で入手可能な人体胎児線芽細胞はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション,(CCL−110 ATCC, Manassas VA)から得られ、Iscove’s DMEM(Gibco Invitrogen Corporation, ペイズリー、スコットランド;http://www.Invitrogen.com)に培養され、10%のFBS(Invitrogen)及び1%のペニシリン−ストレプトマイシンに補充される。トリプシン−EDTA(Invitrogen)を用いて、細胞は比率が1:2から1:8までの範囲内で規則的に(毎週)継代する。人体胎児線芽細胞はマイトマイシン−C(シグマ)(2.5時間に10μg/ml)で処理され、4ng/mlのヒト組換え塩基性線維芽細胞成長因子(hrbFGF,Invitrogen)で補充されたVitroHES(商標)培地の濃度が70,000−80,000細胞/cm2で、0.1%ゼラチン(シグマ)にコーティングされた体外受精膜皿に載せる。hFF細胞は継代4から継代12までの、図8のフィーダとして用いられる。
人体包皮線維芽細胞支持細胞株の樹立(例えば細胞株hFF003)
人体の包皮サンプルは割礼された8週間の少年から2Xゲンタマイシンを含む無菌IMDM(Invitrogen)の中で無菌採取された。皮膚外植体は、IMDM培地(Invitrogen)、1%のペニシリン−ストレプトマイシン(Gibco Invitrogen Corporation)及び10%のヒト血清を含有する25cm2の一次性組織培養フラスコ(Becton Dickinson)の中に入れられる。約10日後に、融合性単層が樹立された。細胞はTrypLE Select(商標)を用いて、連続的に継代される。増殖後に、細胞は人体病原体の標準パネル(マイコプラズマ、HIVのタイプ1と2、肝炎ウィルスのタイプBとC、サイトメガロウイルス、単純疱疹ウィルスのタイプ1と2、エプスタイン・バーウイルス、人体パイロマウイルス)すべての不面結果がテストされる。
室内樹立した包皮線維芽細胞株由来の支持細胞層の調合液
異種動物由来成分不含の人体線維芽細胞フィーダを被覆する前に、組織培養処理されたウェルズが室温で最低1時間0.1%の組換え型人体ゼラチン(fibrogen)に覆われる。IMDMに培養された異種動物由来成分不含のhFF003の融合体単層(5継代から8継代)細胞、10%のヒト血清および1%のペニシリン−ストレプトマイシンがマイトマイシン−C(シグマ)で処理される(10μg/ml、2.5時間)。マイトマイシン−Cに処理されたフィーダは、10%(v/v)のヒト血清、1%のペニシリン・ストレプトマイシン、1%のグルタマックス(Glutamax)、0.5mmol/lのβ−メルカプトエタノール及び非本質アミノフェノ−ル酸(Gibco Invitrogen Corporation)に補充されたDMEM(上記のように)に基づく培養基の中のVIFウェルズ(ベクトン・ディッキンソン)の上に2.89cm2あたり200,000細胞の比例で被覆される。内側細胞塊細胞及び、それ又はhBS細胞に由来する細胞に胚盤胞を配置する前に、培養基は、DMEMに変えられ(上記のように)、代わりに、20%(v/v)のヒト血清、4ng/mLのhrbFGF、1%のペニシリン・ストレプトマイシン、1%のグルタマックス(Glutamax)、0.5mmol/lのβ−メルカプトエタノール及び非必須1%のアミノ酸で補充される(Gibco Invitrogen社)。(実施例3にて説明したとおりの同じ培養基)
酵素培養系へのhBSCの転送
hBS細胞株SA001、SA002、SA002.5、SA121、SA167、SA348、SA461及びSA502(Cellartis AB、Goteborg、スウェーデン、http://www.cellartis.com)が樹立され、前記(ハインズ、Noakssson)および国際公開第03/055992号パンフレットにて記述されたように特徴づけられる。この種の素材は、Cellartis ABから得られることができて、また、NIH幹細胞レジストリ(http://stemcells.nih.gov/research/registry/)を通して可能である。Cellartis ABは、二つのhBS細胞株(SA001およびSA002)及びNIHを通して可能なSA002(SA002.5)の1つのサブクローンを有する。それらのhBS細胞株は、本発明において多用された。使用する全てのhBS細胞株は承認されて、英国の幹細胞バンク運営委員会によって登録され、SA001、SA002およびSA002.5はMEXT(日本)に承認される。実験の前に、細胞株は、4ng/mlのhrbFGFで補充されるVitroHES(商標)培養基(Vitrolife AB、Kungsbacka、スウェーデン、http://www.vitrolife.com)のマイトマイシン−C抑制mEFフィーダ層上のIVF皿で保全され、カットおよび転送ツールとしてのミクロの毛細管を用いて手動で切られる。hBS細胞を従来の培養系から酵素解離へ移すために、使用された培養基は除去され、そして、培養皿はPBS(インビトロゲン)で一度洗われる。0.5mLのTrypLE(商標) Select(インビトロゲン)、Accutase(商標)(ケミコン)またはTrypsin/EDTA(インビトロゲン)はそれから各々のIVF皿に加えられる。hBS細胞はコロニーがフィーダ層からかき集め始まる範囲内で皿は37℃で温められる。細胞層は、次にピペットによる重複粉砕によって単一の細胞懸濁液に別々に壊され、遠心解離機管へ移されて、5分間400gで遠心解離機で解離される。上澄みは廃棄され、hBS細胞ペレットは新しいVitroHES(商標)培養基で再懸濁され、単細胞懸濁液は不活性化hFFの高密度フィーダ層を含むIVF皿に接種される。
単細胞懸濁液としての継代を使用しているhBS細胞の酵素培養
酵素培養のために、hBS細胞は、高密度のhFF支持細胞及び4ng/mlのhrbFGFで補充されるVitroHES(商標)培養基からなる培養系で保全される。酵素解離は、PBS(インビトロゲン)で培養皿を洗う培養基を除去することによって始められる。0.5mLのTrypLE(商標) Select(インビトロゲン)、Accutase(商標)(ケミコン)又はTrypsin/EDTA(インビトロゲン)は、それから各々の皿に加えられる。hBS細胞はコロニーがフィーダ層からかき集め始まる範囲内で皿は37℃で温められる。細胞層は、次にピペットによる重複粉砕によって単一の細胞懸濁液に別々に壊される。その後、細胞懸濁液は遠心解離機管へ転送され、5分間400gで遠心解離機で解離された。上澄みは廃棄され、そして、hBS細胞ペレットは新しいVitroHES(商標)培養基で再懸濁された。単細胞懸濁液は、分割比の範囲が1:4又は1:5から1:500までである不活性化hFFの高密度フィーダ層を含むIVF皿に接種される。我々が新規培養系の第1継代で調整手順期間と称する期間で低い分割比が使われる。5継代以下の後にhBS細胞株は、分割比が1:20から1:500の範囲で分割される。培養系は、37℃で95%湿度の保育器で保全される。使用された培養基は、新しいVitroHES(商標)+4ng/mlのhrbFGFに2−3日ごとに取り替えられる。個々hBS細胞株の成長速度に従い、細胞は6−12日ごとに継代される。本出願を出願する時に各株SA001およびSA121は、通常核型を保全しながら20継代以上培養され、更に従来の緩慢凍結方法に基づいて、10%DMSOで補充される通常培養基の中で、凍死され、そして、解凍される。
hBS細胞の免疫組織化学上及び組織化学上の分析
hBS細胞培養は、15分間4%のパラホルムアルデヒドにおいて固定され、0.5%のtrition溶液(シグマ−オールドリッチ)で5分間透過され、その後、PBS(インビトロゲン)中の5%FBSでブロックされる。細胞は、一晩4℃のプライマリ抗体溶液で培養される。使用するプライマリ抗体は、Oct−4、TRA−1−60、TRA−1−81、SSEA−1、SSEA−3およびSSEA−4(サンタクルーズバイオテクノロジー、サンタクルーズ、CA、http://www.southernbiotech.com)に特有である。FITC−またはCy3−共役第2の抗体(Jackson Immunoreserach Laboratories)での培養は室温で60分間実行される。細胞核はDAPI(シグマ)で対比染色剤で着色される。アルカリホスファターゼの活動は、製造業者の指示(シグマ−オールドリッチ)によるアルカリホスファターゼ活動検出キットを使用して測定される。染色は、ニコン・エクリプス TE−2000 U蛍光顕微鏡を使用して、評価され、整理される。SA001およびSA121は、20継代以上の後に、上記すべてのhBS細胞特徴を示した。
遺伝子の特徴づけ
核型分析のために、hBS細胞は、コルセミドがある場合に培養され、ガラス・スライドの上で載置、固定、トリプシン処理される。染色体は、DAPI染色によって視覚化され、適切なフィルタおよびソフトウェアを備えている倒立顕微鏡を使用して、配列され、文書化される(CytoVision; Applied Imaging;サンタクララCA(http://www.appliedimagingcorp.com))。
生体内多分化能の分析
前に記載されている[ハインズ他]ように、多分化能は免疫不全マウス(SCID)の奇形腫形成によって評価される。手短に言えば、未分化のhBS細胞コロニーが機械的に200x200−μm単片に切られ、外科的に、重症複合免疫不全SCIDマウスの腎臓カプセルの下で配置される(C.B−17/lcrCrl−scidBR;Charles River Laboratories)。マウスは8週後に殺され、腫瘍は切除されて、4%のパラホルムアルデヒドに取り付けられる。ヘマトキシリン及び、パラフィン断片に染色したエオシンは、例えば、神経外胚葉、軟骨および腸様皮覆組織のような3つの全ての胎児胚葉に由来する分化ヒト組織の存在のために組織学的に評価された。全ての3つの胚葉は、現在の培養系で20継代以上後まで培養されるSA001およびSA121からの奇形腫の中で確認された。
酵素継代培養系における追加的hBS細胞株の培養および特性解析
前述のhBS細胞株SA001およびSA121に加えて、さらにhBS細胞株SA167およびSA002が、上記の酵素継代培養系において成功的に転移、培養された。
方法の健全さ、再現性及び適用性
hBSC株の酵素培養のための発明方法の大きな利点は、幾つかのhBSC株が安定、頑丈であり、再生が容易であることが判明した。7つの異なるhBSC株は、方法の評価および樹立のために繰り返し使われた。その上、次の培養方法へのhBS細胞株樹立のための発明調整手順は、異なるいくつかのhBS細胞株に安定、急速であることが判明した。各株のために作られた設立回数は、括弧内に示され、SA001 (6)、SA002 (5)、SA002.5 (>3)、SA167 (3)、SA348 (>4)、SA461 (>10)およびSA502 (2)である。本発明に従う連続樹立は、工業細胞培養製品におけるhBS細胞株の大規模培養のために作られる。
コロニー形成分析
酵素継代および培養系の支えとなる潜在能力を試験するために、伝統的に培養されたhBS細胞(機械的継代を用いるmEFs上で)は、TrypLE(商標) Select、Accutase(商標)またはTrypsin−EDTAの何れかを用いて単細胞に解離される。hBS細胞は希釈され、hFFsまたはmEFsのどちらかの上に、密度がおよそ350および700hBS細胞/cm2になるように新規なIVF皿に接種される。
hBS細胞からhFFを解離するための磁性粒子の応用
細胞増殖を抑制するために、融合性hFF細胞を有する1つのT−75フラスコが、2−3時間マイトマイシン Cで処理される。マイトマイシン C処理の後、hFFsは、それらが1X トリプシン−EDTA又は1X TrypLE(商標) Selectを使用することによって単細胞に解離された後に1X PBSで数回洗浄される。細胞約数は、血球計算器において計数され、そして、細胞は適当な濃度に希釈された。磁性粒子(Endorem(商標))の異なる濃度が試験されることになっている場合に、細胞懸濁液は異なる管に分けられ、そして、磁性粒子の異なる量は、それから管に加えられた。懸濁液がゼラチン被覆IVF皿(ファルカン)に平板培養される前に、hFFsおよび磁性粒子はそれから管に混合される。IVF皿に約200,000hFF細胞が接種された。
・ ハインズ N、イングルンド MCO、スヨブロム C他、ヒトES細胞の起源、特徴描写、分化。STEM CELLS 2004年; 22:367−76
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Claims (61)
- ヒトの胚盤胞から幹(hBS)細胞を培養する培養系は、
i) 密度が50,000細胞/cm2以上のヒト支持細胞、
ii) 単細胞懸濁液へhBS細胞コロニーを解離するための一つ以上の解離薬品、および
iii) 有効な培養基、を含み、
hBS細胞の重要特徴を保全しながら長期間の各連続的な継代において、単一細胞懸濁液へhBS細胞コロニーを解離することによってhBS細胞を培養できる培養系。 - ヒト支持細胞の密度が約50,000乃至約500,000細胞/cm2までの範囲、例えば、約50,000乃至約400,000細胞/cm2、約50,000乃至約300,000細胞/cm2、約50,000乃至約200,000細胞/cm2、60,000乃至約200,000細胞/cm2、70,000乃至約200,000細胞/cm2である、請求項1に記載の培養系。
- ヒト支持細胞がヒト組織に由来する、請求項1または2のいずれかに記載の培養系。
- ヒト組織が胚、胎児、新生児、少年又は成体組織から由来する、請求項3に記載の培養系。
- ヒト組織が包皮、臍の緒、筋肉、肺、上皮、胎盤、卵管、腺、ストロマまたは乳房を含む皮膚に由来する、請求項3または4のいずれかに記載の培養系。
- ヒト支持細胞が例えば、hBS細胞またはhBS細胞由来の細胞から試験管に誘導される、請求項1−5のいずれかに記載の培養系。
- ヒト支持細胞がヒト線維芽細胞株維細胞、筋細胞、ケラチン生成細胞、内皮細胞および上皮細胞からなる群に属する細胞型に由来する、請求項1−6のいずれかに記載の培養系。
- ヒト支持細胞が線維芽細胞である、請求項1−7のいずれかに記載の培養系。
- 支持細胞がヒトの新生児包皮線維芽細胞に由来する、請求項8に記載の培養系。
- hBS細胞に由来する細胞が線維芽細胞であるかまたは間葉表現型を有する、請求項6に記載の培養系。
- 支持細胞が、胚線維芽細胞、胚体外内胚葉細胞、胚体外中胚葉細胞、胎児線維芽細胞および/または胎児皮膚細胞、胎児肺細胞、胎児内皮細胞、胎児上皮細胞、臍の緒間充織細胞、胎盤線維芽細胞および/または線維細胞、胎盤内皮細胞、出産後のヒト包皮線維芽細胞および/または線維細胞、出産後の筋細胞、出産後の皮膚細胞、出産後のヒト包皮線維芽細胞および/または線維細胞、出産後の筋細胞、出産後の皮膚細胞、出産後の内皮細胞、成人皮膚線維芽細胞及び/または線維細胞、成人筋細胞、成人卵管内皮細胞、成人腺子宮内膜細胞、成ヒト質子宮内膜細胞、成人乳ガン実質細胞、成人内皮細胞、成人上皮細胞または成体ケラチン生成細胞に由来する、請求項1−10のいずれかに記載の培養系。
- ヒト支持細胞が成長不活性化された請求項1−11のいずれかに記載の培養系。
- ヒト支持細胞がマイトマイシン処理によって成長不活性化された請求項12に記載の培養系。
- ヒト支持細胞が放射によって成長不活性化された請求項12に記載の培養系。
- hBS細胞の接種から、1日乃至10日、例えば1日乃至5日、2日乃至4日の前に支持細胞が接種される請求項1−14のいずれかに記載の培養系。
- hBS細胞の接種前に、培養基が1回以上、例えば2回以上、3回以上、4回以上または5回以上変わる請求項15に記載の培養系。
- 一つ以上の解離薬品が酵素である請求項1−16のいずれかに記載の培養系。
- 前記酵素がタンパク質分解酵素である請求項17に記載の培養系。
- 前記酵素がコラーゲン分解酵素である請求項17または18のいずれかに記載の培養系。
- 酵素がトリプシン、トリプシン様、ディスパーゼ、ディスパーゼ様、プロナーゼ、プロナーゼ様、コラゲナーゼ、コラゲナーゼ様およびマトリックス・メタロプロテイナーゼからなる群から選択される請求項17−19のいずれかに記載の培養系。
- 酵素が組み換え酵素である請求項17−20のいずれかに記載の培養系。
- 一つ以上の解離薬品がキレート剤である請求項1−21のいずれかに記載の培養系。
- キレート剤が二価陽イオンのキレート化剤である請求項22に記載の培養系。
- キレート剤がEDTA(エチレンジアミン四酢酸)、EGTA(エチレングリコールビス2アミノエチルエーテル四酢酸)およびHEDTA(ヒドロキシエチルエチレンジアミン3酢酸)からなる群から選択される請求項22または23のいずれかに記載の培養系。
- 前記解離薬品が二つ以上、例えば三つ以上、四つ以上、五つ以上の解離薬品の組合せである請求項1−24のいずれかに記載の培養系。
- 前記解離薬品の組合せが一つ以上の酵素および一つ以上のキレート剤を含む請求項25に記載の培養系。
- 前記解離薬品の組合せが異種動物由来成分不含である請求項25または26のいずれかに記載の培養系。
- 解離薬品の組合せがTrypLE(商標) Select、Accutase(商標)、Accumax(商標)から成る市販の組合せの群から選択される請求項25−27のいずれかに記載の培養系。
- 有効な培養基がDMEM(ダルベッコ変法イーグル培地)およびIMDM(イスコブ改変ダルベッコ培地)からなる群から選択される請求項1−28のいずれかに記載の培養系。
- 有効な培養基が、約0.5乃至約1000ng/mlのhrbFGF、例えば約1乃至約500ng/mlのhrbFGF、約2乃至約200ng/mlのhrbFGF又は約4乃至約100ng/mlのhrbFGFに補充される請求項1−29のいずれかに記載の培養系。
- 前記培養基が約1乃至約40%の血清、例えば約5乃至約20%の血清、約10%の血清に補充される請求項1−30のいずれかに記載の培養系。
- 前記血清がFBSまたはヒト血清である請求項31に記載の培養系。
- 培養系は、
i) 密度が少なくとも70,000細胞/cm2のヒト新生児包皮支持細胞、
ii) 単細胞懸濁液へhBS細胞コロニーを解離するためのTrypLE(商標) Select、
iii) 少なくとも4ng/mlのhrbFGFの有効な培養基で補充されるVitroHES(商標)、を含み、
hBS細胞の重要特徴を保全しながら長期間の各連続的な継代において、単一細胞懸濁液へhBS細胞コロニーを解離することによってhBS細胞を培養することを可能にする請求項1−32のいずれかに記載の培養系。 - 請求項1−33のいずれかに定義される培養系においてhBS細胞を培養する方法は、細胞の重要特徴を保全しながらhBS細胞を培養するために、
i) 万能細胞株から得られたhBS細胞を培養系に適合させるために任意に調整手順を実行し、
ii) 一つ以上の解離薬品を利用して単一細胞懸濁液へhBS細胞を解離し、
iii) 密度が少なくとも50,000細胞/cm2の支持細胞を含む一つ以上の培養容器に分割比が少なくとも1:4の単細胞懸濁液を分配し、
iv) 通常培養基変化において約3日乃至25日間hBS細胞を培養させ、
v) ステップii)からn回を繰り返し、nは1以上の整数である、前記ステップを含むhBS細胞を培養する方法。 - 培養方法が、さらに
vi) hBS細胞の重要特徴が保全されるかどうか確認するためにステップiv)において得られる細胞を分析し、
vii) hBS細胞の重要な特徴が保全される場合、ステップii)から繰り返し実行する請求項34に記載の培養方法。 - nが例えば少なくとも10、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも25、少なくとも30、少なくとも35または少なくとも40のように、少なくとも5である請求項34または35のいずれかに記載の培養方法。
- ステップii)の単一細胞懸濁液へのhBS細胞コロニーの解離は、hBS細胞コロニーを一つ以上の解離薬品で処理することによって実行される請求項34−36のいずれかに記載の方法。
- 一つ以上の解離薬品の効力がステップiii)の前に軽減される請求項34−37のいずれかに記載の方法。
- 一つ以上の解離薬品の物理的な除去、一つ以上の解離薬品の薄弱化、一つ以上の解離薬品の一つ以上の抑制剤の追加、過度の一つ以上の解離薬品に一つ以上の培養基の追加または一つ以上解離薬品の固有の自動抑制によって、一つ以上の解離薬品の効果を減弱させる請求項38に記載の方法。
- 分割比が約1:4乃至約1:5000の間、例えば約1:20の乃至約1:1000、約1:50の乃至約1:500の範囲内である請求項34−39のいずれかに記載の方法。
- 分割比が1:20である請求項40に記載の方法。
- ステップiii)において得られたhBS細胞が約3日乃至約25日間、例えば約4日乃至20日間、6日乃至12日間培養される請求項34−41のいずれかに記載の方法。
- ステップiv)の培養基の変化が一週間に約1回乃至約14回、例えば約2回乃至約6回、約2回乃至約4回、約3回行われる請求項34−42のいずれかに記載の方法。
- 前記調整手順が、
a) 一つ以上の解離薬品を用いて単一細胞懸濁液へhBS細胞コロニーを解離し、
b) 密度が少なくとも50,000細胞/cm2の支持細胞を含む一つ以上の培養容器に分割比が少なくとも1:3の単細胞懸濁液を分配し、
c) 通常時間間隔の培養基変化において約5日乃至30日間hBS細胞を培養させ、
d) 均一な未分化のhBS細胞コロニーを得るために、任意に、多くとも5回ステップa)から繰り返す、ステップを含む請求項34−43のいずれかに記載の方法。 - ステップc)において得られたhBS細胞が約5日から約30日間、たとえば約7日から約16日間、約7日から約10日間培養される請求項44に記載の方法。
- ステップd)が含まれる請求項44または45のいずれかに記載の方法。
- ステップa)からの繰り返しを多くて5回、例えば多くて4回、多くて3回、多くて2回実行される請求項46に記載の方法。
- ステップc)の培養基の変更が一週間に約1回から14回、例えば一週間に約2回から6回、一週間に約2回から4回、週約3回実行される請求項44−47のいずれかに記載の方法。
- 細胞の重要特徴を保全しながらhBS細胞を培養するために、前記方法が、
i) a)一つ以上の解離薬品を用いて単一細胞懸濁液へhBS細胞コロニーを解離し、b)密度が少なくとも50,000細胞/cm2の支持細胞を含む一つ以上の培養容器に分割比が少なくとも1:3の単細胞懸濁液を分配し、c)通常時間間隔の培養基変化において約5日乃至30日間、例えば約7日乃至16日または約7日乃至10日hBS細胞を培養させ、d)均一な未分化のhBS細胞コロニーを得るために、任意に、多くとも5回ステップa)から繰り返す、ステップを含む適応手順を実行し、
ii) 一つ以上の解離薬品、例えばTrypLE(商標) Selectの使用によって単一細胞懸濁液へhBS細胞を解離し、
iii) 密度が少なくとも50,000細胞/cm2の支持細胞を含む一つ以上の培養容器に分割比が少なくとも1:4の単細胞懸濁液を分配し、
iv) 通常培養基変更において約3日乃至25日間hBS細胞を培養させ、
v) ステップii)から少なくとも20回を繰り返す、ステップを含む請求項34−48のいずれかに記載の方法。 - 請求項34−49のいずれかに記載のこの種の細胞を培養するための方法において、10%未満の細胞、例えば5%未満の細胞、2%未満の細胞、1%未満の細胞が細胞群として現れ、20継代以上、例えば25継代以上、30継代以上、35継代以上、40継代以上において細胞の重要特徴を存続及び保全するhBS細胞の単細胞懸濁液。
- 請求項34−49のいずれかに記載のこの種の細胞を培養するための方法において、10%未満の細胞、例えば5%未満の細胞、2%未満の細胞、1%未満の細胞が細胞群として現れ、20継代以上、例えば25継代以上、30継代以上、35継代以上、40継代以上において細胞の重要特徴を存続及び保全するhBS細胞の異種動物由来成分不含単細胞懸濁液。
- 請求項34−49のいずれかに記載のこの種の細胞を培養するための方法において、20継代以上、例えば25継代以上、30継代以上、35継代以上、40継代以上においてhBS細胞の重要特徴を存続及び保全することができるhBS細胞からの改良細胞株。
- hBS細胞の大規模生産のための、請求項1−33のいずれかにおいて定義した培養系の応用。
- 一つ以上の解離薬品がTrypLE(商標) Select、Accutase(商標)、Accumax(商標)の少なくとも一つを含む請求項53に記載の培養系の使用。
- hBS細胞の大規模な生産のための、請求項34−49のいずれかに記載の方法の応用。
- 一つ以上の解離薬品がTrypLE(商標) Select、Accutase(商標)、Accumax(商標)の少なくとも一つを含む請求項55に記載の方法の応用。
- hBS細胞の大規模な生産のための、TrypLE(商標) Select、Accutase(商標)、Accumax(商標)のようなタンパク質分解酵素の使用。
- 構成要素である、
i) 請求項34−49のいずれかに記載の方法によって入手できる単一hBS細胞集団、
ii) hBS細胞の培養方法を記載しているユーザー・マニュアルを少なくとも一つ、例えば少なくとも二つを含むキット。 - hBS細胞の培養方法が請求項34−49のいずれかにおいて定義されたとおりである請求項58に記載のキット。
- 第1の構成要素として、
i) 請求項34−49のいずれかに記載の方法によって入手できる単一hBS細胞集団および、二つ以上または三つ以上の下記の構成要素、
ii) ヒト支持細胞、
iii) 単細胞懸濁液へhBS細胞コロニーを解離するための一つ以上の解離薬品、及び、
iv) 有効な培養基、
ii)−iv) 請求項2−33のいずれかにおいて定義したとおりである、構成要素を含むキット。 - 単細胞集団が異種動物由来成分不含のhBS細胞株に由来し、その他の構成要素ii)−iv)の何れの一つ以上が異種動物由来成分不含である請求項58−60の何れかに記載のキット。
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