KR102453170B1

KR102453170B1 - 모유두세포를 배양하기 위한 무혈청 배지 조성물 및 이를 이용한 모유두세포의 배양 방법

Info

Publication number: KR102453170B1
Application number: KR1020220035612A
Authority: KR
Inventors: 심태진; 김지훈; 홍인기; 김종필; 이경민; 정정일; 김문정
Original assignee: 주식회사 프롬바이오
Priority date: 2022-03-22
Filing date: 2022-03-22
Publication date: 2022-10-14
Also published as: WO2023182566A1

Abstract

본 발명은 모유두세포를 배양하기 위한 무혈청 배지 조성물 및 이를 이용한 모유두세포의 배양 방법을 개시한다.
본 발명의 무혈청 배양 배지는 인간이나 동물 유래 혈청을 사용하지 않고 인간 유래 혈소판 용해물을 사용함으로써 모유두세포를 배양 시 기존 모유두세포의 배양 배지와 비교하여 세포의 증식 및 모발 관련 유전자의 발현량이 유사한 장점을 가지고 있으며, 배치마다 조성이 다른 동물 유래 성분인 혈청에 따른 실험의 재현성의 어려움, 멸균을 위해 사용되는 가열법의 제한에 따른 마이코플라즈마 또는 바이러스 등에 의한 오염 등의 단점을 극복할 수 있는 효과를 가질 수 있다.

Description

모유두세포를 배양하기 위한 무혈청 배지 조성물 및 이를 이용한 모유두세포의 배양 방법{Serum-free Medium Composition for Culturing Dermal Papilla Cells and the Culturing Method Using the Same}

본 발명은 모유두세포를 배양하기 위한 무혈청 배지 조성물 및 이를 이용한 모유두세포의 배양 방법에 관한 것이다.

모낭은 비록 작지만 외배엽(ectoderm)과 중배엽(mesoderm) 유래의 다양한 세포가 층상 구조를 이루는 복잡한 하나의 기관(organ)이다. 또한, 모낭은 풍부한 피부 줄기세포의 저장고로서 이 세포들이 증식, 이동, 분화되어 재생이나 상처의 치유에 관여한다. 특히 모유두(dermal papilla)와 모기질(matrix) 사이의 상피-진피 간 상호작용(epidermal-dermal interaction)에 의해 성장기(anagen), 퇴행기(catagen), 휴지기(telogen)로 이루어지는 세 단계의 주기(life cycle)를 거치면 서 모발의 교체가 일어나게 된다. 이와 같이 모낭의 성장과 유지를 조절하는 모유두는 태생기에 형성되어 15~20회의 주기를 거치며 점차 퇴화되는 기관으로 알려졌다(Dermatol. Clin., 14(4), 573-583, 1996). 이처럼 모유두에 존재하는 모유두세포(dermal papilla cell, DPC)는 모낭을 구성하는 세포들에게 산소와 영양을 공급하여 모발의 성장과 모낭 주기 조절을 담당한다.

따라서 모유두세포의 증식이 촉진되면 모발이 건강해지고 모발 성장이 촉진되어 탈모를 막을 수 있다. 모발의 성장은 모유두를 둘러싸고 있는 상피세포(epithelial cell)가 분열하여 모간(hair shaft)을 만들면서 진행되기 때문에 모유두세포는 상피세포의 분열을 조절하는 중요한 역할을 한다. 또한 남성형 탈모증에서 남성호르몬이 모낭에 작용하는 부위 역시 모유두로서 모유두세포는 발모에 있어 매우 중요한 역할을 하고 있다.

그러나 이러한 모발의 성장기, 퇴행기, 휴지기 주기에 관련된 정확한 분자생물학적 기작은 아직 알려져 있지 않다. 특히 탈모와 관련된 기작은 남성형 탈모에 한정되어 남성 호르몬인 테스토스테론(testosterone)이 5α-환원효소(5α-reductase)에 의해 디하이드로테스토스테론(dihydortestosterone, DHT)으로 전환되고, 이것이 안드로젠 수용체(androgen receptor)와 결합하면 모유두가 퇴화되고 모발이 탈락하게 되는 것만이 밝혀져 있다(Arch. Dermatol. Res., 290, 126-132, 1998). 따라서 발모 및 육모제 등과 같은 탈모치료제의 효능을 평가하는 데 있어 상당한 제약이 따르게 되며, 분자생물학적인 분석보다는 동물을 이용한 생체 내 실험이 주를 이룬다. 그러나 털이 많이 존재하는 동물들(설치류 등)을 이용할 경우 종(species) 차이가 심하게 발생하며, 인간과 유사한 자연적인 대머리 동물(stumptailedmacaque)의 경우에는 비용이 상당히 많이 들어 사실상 평가하기가 쉽지 않다.

따라서 이러한 평가를 위하여 인체 모낭으로부터 모유두세포의 분리 및 생체 외에서 배양하려는 많은 노력이 시도되었으며, 특히 최적의 환경을 제공하기 위하여 다양한 배지 조성들을 연구하였는데, 혈청(serum)은 부정적인 효과를 유발하는 것으로 알려져 대부분의 연구자가 무혈청 배지 조성으로 실험을 진행하고 있다. 예컨대 혈청에는 모낭 세포의 성장을 저해하는 transforming growth factor-β(TGF-β)가 포함되어 있어 생체 외에서 모낭의 조기 퇴화를 유발하는 것으로 알려졌다. 특히 혈청 농도가 높은 경우에는 혈청 내 세포부착인자로 인해 모낭으로 부터 모유두세포의 분리 시 모낭이 배양 용기 바닥에 부착되어 외측모근초에서 세포가 분리되면서 모낭 구조의 변형을 가져오기 때문에 모낭으로부터 모유두세포의 분리 시 혹은 모낭의 기관배양에 무혈청 배지가 필수적이다.

뿐만 아니라 모유두세포 배양을 위해 사용되는 배지는 미생물 배양용 배지보다 복잡하고 고가이며, 미생물 배지를 구성하는 탄소원과 에너지원, 질소원, 무기염류, 미량원소 외에도 비타민, 생장인자, 완충제(buffering agent) 등이 포함되고, 특히 5~20%의 혈청(serum)이 추가되어야 한다. 혈청은 호르몬, 생장인자, 비타민을 공급해 줌으로써 동물세포의 생장과 활성을 촉진시킨다. 혈청은 또한 호르몬, 미네랄, 지방 등을 운반하는 수송 단백질을 제공해 주는 등 필수적인 역할을 한다. 이외에도 단백질 분해효소(protease)의 활성을 억제하고, pH 조절용 완충제 역할을 하는 등의 장점이 있다.

그러나 혈청 사용의 가장 큰 문제점은 배치(batch) 마다 혈청의 조성이 달라지기 때문에 혈청을 사용한 실험은 재현성을 얻기 어렵다는 점이 있으며, 동일한 세포를 같은 성분의 배지에서 배양한다 하더라도 그 배양의 결과가 항상 다르게 나타난다. 뿐만 아니라 혈청을 멸균하기 위하여 가열법을 사용하지 못하고 여과(filtration)해야 하기 때문에 마이코플라즈마(mycoplasma) 또는 바이러스 등에 의한 오염의 가능성을 증가시킨다. 때문에 이러한 문제점을 극복하기 위해 개발된 무혈청 배지는 그 구성 물질의 조성을 분명히 알 수 있어 배지 조성이 표준화되며 실험의 재현성을 높일 수 있다. 또한 멸균이 용이하고, 생성물의 정제가 쉽고 가격이 비교적 저렴한 장점을 가지고 있다. 또한 최근 중증 탈모환자를 대상으로 모발이식술이 시도되고 있지만, 고가의 비용과 시술 후 부작용의 한계가 지적되고 있으며, 그 대안으로써 모발을 생성하는 모유두세포를 이용한 세포치료제가 주목받고 있기 때문에 모발의 재생능력이 저하되지 않으면서 증식을 유도하는 무혈청 배지의 개발이 필요하다.

본 발명은 모유두세포를 배양, 제조 및/또는 생산하는 것과 같은 배양을 위한 무혈청 배지 조성물과 그 조성물을 이용한 모유두세포의 배양 방법을 개시한다.

본 발명의 목적은 모유두세포를 배양을 위한 무혈청 배지 조성물과 그 조성물을 이용한 모유두세포의 배양 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적이나 구체적인 목적은 이하에서 제시될 것이다.

본 발명은 아래의 실시예에서 확인되는 바와 같이, 동물 유래 성분이 제거된 배지에서 인간 유래 혈소판 용해물을 첨가하여 모유두세포를 배양하였을 경우, 일반적으로 모유두세포 배양에 사용되는 동물 유래 성분이 함유된 배지, 예컨대 우태아 혈청이 포함된 DMEM 배지 및 모유두세포 전용 배지와 비교하여 유사한 세포 성장률을 보이고, 모발 관련 유전자의 경우도 상기 두 가지 대조군에 비해 증가하거나 유사한 수준으로 발현되는 것을 확인함으로써 완성된 것이다.

전술한 바를 고려할 때, 본 발명의 모유두세포 배양을 위한 무혈청 배지 조성물은 기본 배지에 혈소판 용해물(Platelet Lysate)을 포함함을 특징으로 한다.

본 발명에서, 무혈청 배지는 인간으부터 유래된 혈청이나 또는 비인간 동물로부터 유래된 혈청을 전혀 포함하지 않거나 실질적으로 포함하지 않는 세포 배양 배지를 의미한다. 여기서, 인간 또는 동물 유래 혈청을 실질적으로 포함하지 않는다는 것은, 인간 또는 동물 유래 혈청을, 통상적인 배지에서의 함유량보다 낮은 수준으로 포함하거나, 실질적으로 세포의 증식 또는 생존에 영향을 미치지 않는 함유량으로 포함하는 것을 의미한다. 구체적으로 인간 또는 동물 유래 혈청을 1 중량% 이하, 바람직하게는 0.1 중량% 이하의 함유량으로 포함하는 경우이다.

또 본 발명에서 모유두세포의 무혈청 배양을 위한 기본 배지는 특별한 제한이 없이 당업계에서 동물 세포 배양을 위하여 사용되는 모든 기본 배지가 사용될 수 있다. 기본 배지는 세포 성장, 증식 및/또는 증폭을 위한 것으로서, 기본적으로 당류, 아미노산, 무기염을 포함하고, 선택적으로 비타민, 미량원소, 항미생물제, 성장인자, 호르몬, 완충제, 등장화제 등을 포함할 수 있다.

당류는 단당류, 이당류 등이 사용될 수 있으며, 구체적으로 글루코오스, 프럭토오스, 만노오스, 갈락토오스, 리보오스, 소르보오스, 리불로오스, 락토오스, 말토오스, 수크로오스, 라피노오스 또는 이들의 1종 이상의 혼합물이 사용될 수 있다.

기본 배지에 포함되는 아미노산은 아스파르트산, 글루타민산, 아스파라긴, 세린, 글루타민, 히스티딘, 글리신, 트레오닌, 아르기닌, 알라닌, 티로신, 시스테인, 발린, 메티오닌, 노르발린, 트립토판, 페닐알라닌, 이솔루신, 루신, 리신, 하이드록시프롤린, 사르코신(sarcosine) 및/또는 프롤린을 포함한다. 아미노산은 바람직하게는 합성 아미노산이며, 그러한 합성 아미노산은 디펩티드, 트리펩티드 형태일 수 있다. 이러한 디펩티드, 트리펩티드는 세포를 포함하는 세포 배양물에서 유리 형태의 아미노산으로 전환될 수 있다.

기본 배지에는 당류, 아미노산 이외에, 삼투 균형을 유지하고 나트륨, 칼륨 및 칼슘 이온을 제공하여 막 전위를 조절하는 데 도움이 되는, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 황산마그네슘, 인산2수소나트륨 등의 무기염류가 추가로 포함될 수 있다.

또한 기본 배지에는 선택적으로 비타민이 포함될 수 있다. 비타민은 많은 것이 세포의 성장과 증식에 필수적이며, 세포에서 충분한 양으로 합성될 수 없으므로 세포 배양 배지에 충분히 보충될 필요가 있다. 비타민 A, 비타민 B군, 비타민 C, 비타민 E 등의 비타민이 기본 배지에 포함될 수 있다. 특히 티아민, 리보플라빈, 피리독신, 시아노코발라민, 비오틴, 엽산, 판토텐산, 니코틴아미드 등의 비타민 B군은 세포의 성장 촉진을 위해 첨가되는 것이 바람직하다.

또한 기본 배지에는 당류, 아미노산, 비타민 이외에도 미량원소, 항생제, 성장인자, 호르몬, 완충제, 등장화제 등이 선택적으로 포함될 수 있다.

미량원소는 적절한 세포 성장을 위해 그리고 효소의 기능 유지를 위해 기본 배지에 첨가될 수 있으며, 이러한 미량원소로서 구리, 아연, 셀레늄, 트리카르복실산 중간체 등을 들 수 있다.

항미생물제는 외부 미생물에 의한 오염을 방지를 위하여 기본 배지에 첨가될 수 있으며, 구체적으로 페니실린(penicillin), 스트렙토마이신(streptomycin), 폰지존(fungizone) 등의 항생제, 암포테리신 B 등의 항진균제, 젠타마이신, 시프로플록사신, 아지트로마이신, 타일로신 등의 마이코플라스마 억제제 등이 사용될 수 있다.

성장인자는 세포의 증식을 위하여 기본 배지에 첨가될 수 있으며, 그러한 성장인자로서는 표피 성장 인자(epidermal growth factor, EGF), 섬유아세포 성장 인자(fibroblast growth factor, FGF), 인슐린 유사 성장 인자(insulin-like growth factor, IGF), 신경 성장 인자(nerve growth factor, NGF), 혈소판 유래 성장 인자(platelet-derived growth factor, PDGF), 형질 전환 성장 인자(transforming growth factor, TGF) 혈관 내피 증식 인자( vascular endothelial growth factor, VEGF), 액티빈 A 등이 예시될 수 있다.

또 기본 배지에 첨가될 수 있는 호르몬으로서는 인슐린, 하이드로코르티손, 트리요오드타이로닌, 에스트로겐, 안드로겐, 프로게스테론, 프롤락틴, 여포 자극 호르몬, 가스트린 방출 펩티드, 덱사메타손, 에스트라디올, 글루카곤 등을 들 수 있다.

또 기본 배지에는 시트레이트, 포스페이트, 숙시네이트, 타르트레이트, 푸마레이트, 글루코네이트, 옥살레이트, 락테이트, 아세테이트, 히스티딘, 트리스 등의 완충제가 포함되거나 염화나트륨, 염화칼륨, 붕산, 붕산나트륨, 만니톨, 글리세린, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌, 글리콜, 말토스, 자당, 에리쓰리톨, 아라비톨, 자일리톨, 소르비톨 트리할로즈, 포도당 등의 등장화제가 포함될 수 있다.

또 기본 배지에는 제1형 또는 제2형 콜라겐, 피브로넥틴, 라미닌, 폴리-L-리신, 폴리-D-리신 등의 세포 접착 인자나, 염분, 유리지방산, 호르몬, 비타민과 결합하여 조직과 세포 사이에서 운반하고 pH, 삼투압을 조절하는 역할을 하는 알부민이나, 철 수송에 중요한 역할을 하는 트랜스페린 (Transferrin) 등이 추가로 포함될 수 있다.

이러한 기본 배지는 직접 조제하여 사용하거나 상업적으로 시판되는 것을 사용할 수 있는데, 상업적으로 시판되는 배지는 예컨대, DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM (Minimal Essential Medium), BME (Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10, F-12, DMEM/F12, MEM-α (Minimal Essential Medium-α), G-MEM (Glasgow's Minimal Essential Medium), IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium), MacCoy's 5A 배지, AmnioMax complete 배지, AminoMaxⅡ complete 배지, EBM (Endothelial Basal Medium) 배지, Chang's Medium, MesenCult-XF, DMEM/HG (Dulbecco's Modified Eagle's Medium high glucose)배지, 및 MCDB+DMEM/LG (MCDB +Dulbecco's Modified Eagle's Medium low glucose) 배지 등일 수 있다. 기본 배지는 바람직하게는 MEM-α 특히 모유두세포의 성장을 촉진시키기 위하여 비필수 아미노산이 첨가된 MEM-α일 수 있다. MEM-α는 MEM(Minimun Essential Medium)에 포함되어 있지 않은 다양한 첨가물질(deoxyribonucleosides, ribonucleosides, non-essential amino-acids, vitamin 등)을 이용하여 만들어진 배지로 그 구체적인 조성은 문헌[Stanners, C.P., et al., Two Types of Ribosome in Mouse-Hampster Hybrid Cells. Nature New Biology, 230, 52-54 (1971)]을 참조할 수 있으며, 본 발명자들에 의해 MEM-α에 첨가된 비필수 아미노산은 아래의 표 1과 같다.

첨가된 비필수 아미노산

Components	Concentration (mg/L)	Components	Concentration (mg/L)
Glycine	7.5	L-Alanine	8.9
L-Asparagine	13.2	L-Aspartic acid	13.3
L-Glutamic acid	14.7	L-Proline	11.5
L-Serine	10.5

또 본 발명에서, 혈소판 용해물은 혈소판의 세포막을 파괴하여 제조되는 조성물이다. 세포막의 파괴는 화학적으로 또는 기계적으로 수행될 수 있다. 화학적 파괴 방법으로는 S/D(solvent/detergent) 처리 등을 들 수 있고, 기계적인 파괴 방법으로는 액체 균질화 방법, 초음파 처리, 동결/해동 반복 처리 등을 들 수 있으며, 이들 방법은 2가지 이상의 방법이 조합되어 사용될 수 있다. 혈소판은 혈소판이 존재하는 혈장, 전혈 또는 다른 생체의 유체 등의 혈소판 공급원으로부터 원심분리, 분광분석법, 여과, 중력 침강 등의 방법에 의해 분리될 수 있으며, 혈소판의 분리 동안 혈소판의 응고를 방지하기 위하여 혈소판 공급원에 항응고제가 첨가될 수 있다. 항응고제는 응고 인자 합성의 저해제, 트롬빈의 저해제, 또는 항혈소판제 등이 사용될 수 있으며, 구체적으로 와파린, 헤파린, 레피루딘, 아스피린, 티클로피딘 (티클리드), 클로피도그렐 (플라빅스), 티로피반 (아그라스타트), 에프티피바티드 (인테그릴린) 등을 들 수 있다. 본 발명에서 혈소판은 인간 또는 동물 유래일 수 있으며, 바람직하게는 인간 유래(인간에서 분리되어 얻어진)의 것이다. 혈소판 용해물은 혈소판 공급원으로부터 분리된 혈소판을, 그 세포막을 파괴하여 얻어진, 액상의 형태이거나 감압농축 및/또는 동결건조하여 얻어진 농축 액상 또는 농축 분말 형태일 수 있다. 혈소판 용해물은 본 발명의 무혈청 배지에 0.1%(w/v) 내지 10%(w/v) 범위, 특히 1%(w/v) 내지 10%(w/v) 범위로 포함될 수 있다.

본 발명에서, 본 발명의 배지 조성물이 사용될 수 있는 모유두세포는 그것이 포유동물로부터 유래하는 한 그 기원에 특별한 제한이 없다. 예컨대 인간, 마우스, 랫트, 기니어 피그, 토끼, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 영양, 개 또는 고양이으로부터 유래한 것일 수 있다. 바람직하게는 인간 유래의 모유두세포이다.

본 발명의 모유두세포의 배양을 위한 무혈청 배지 조성물은 바람직하게는, 기본 배지가 MEM-α이고, 이 MEM-α 기본 배지에 인간 유래 혈소판 용해물이 포함되는 이외에, 알부민이나 그 대체제, 인슐린이나 그 대체제, 트렌스페린(transferrin)이나 그 대체제, 셀레늄이나 그 대체제가 포함될 수 있다.

본 발명의 일부 구현예에서 알부민은 인간 유래 알부민(인간 혈청 알부민, human serum albumin, HSA)이다. 알부민은 재조합 알부민이거나 천연 혈청 유래 알부민일 수 있다. 알부민 대체제는 소 뇌하수체 추출물, 식물 가수 분해물(예를 들어, 쌀 가수분해물), 페투인, 달걀 알부민, 병아리 추출물, 소 배아 추출물, AlbuMAX® I나 AlbuMAX® II 등일 수 있다. 본 발명의 배지 조성물에서, 알부민이나 알부민 대체제는 호르몬, 지방산 등의 화합물을 운반하고, pH 및 삼투압을 조절하기에 충분한 농도로 포함되며, 통상 1~10 mg/ml의 농도 범위로 포함될 것이다.

또 본 발명의 일부 구현예에서, 인슐린은 인간 인슐린이다. 인슐린은 재조합 인슐린이거나 혈장 또는 혈청 등의 천연에서 분리된 것일 수 있다. 인슐린이나 그 대체제는 당과 아미노산의 세포 내로의 섭취를 촉진하여 세포를 증식시키는 역할을 한다. 인슐린 대체제는 인슐린과 유사한 기능을 할 수 있는 것으로 인슐린 대신에 사용될 수 있는 아연 함유 화합물일 수 있다. 일부 구현예에서 인슐린 대체제는 염화 아연, 질산 아연, 브롬화 아연, 황산 아연일 수 있다. 본 발명의 배지 조성물에서, 인슐린이나 인슐린 대체제는 그것의 기능 발휘에 충분한 농도로 포함될 수 있으며, 통상 10~200 ug/ml 농도 범위로 포함될 것이다.

또 본 발명의 일부 구현예에서, 트랜스페린은 인간 혈청 또는 혈장 유래 트랜스페린이다. 트랜스페린은 재조합 트랜스페린이거나 천연에서 분리된 것일 수 있다. 트랜스페린 대체제는 임의의 철 킬레이트 화합물일 수 있다. 예컨대 그러한 철 킬레이트 화합물은 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 에틸렌 글리콜-비스(β-아미노에틸 에테르)-N,N,N',N'-테트라아세트산(EGTA), 데페록사민 메실레이트, 디머캅토프로판올, 디에틸렌트리아민-펜타아세트산(DTPA), 트랜스-1,2-디아미노시클로헥산-N,N,N',N'-테트라아세트산(CDTA)의 철 킬레이트제, 시트르산 제2철 킬레이트나 황산 제1철 킬레이트일 수 있다. 본 발명의 배지 조성물에서, 트랜스페린이나 그 대체제는 배지에서 철 수송에 충분한 기능을 할 수 있는 농도로 포함될 수 있으며, 통상 5~100 ug/ml 범위의 농도로 포함될 것이다.

또 본 발명의 일부 구현예에서, 셀레늄이나 그 대체제는 셀레늄 의존적인 효소들이 지방의 과산화를 감소시키도록 하는 기능을 하며 세포막을 보호해주는 역할을 한다. 셀레늄 대체제는 셀레늄 염의 형태, 예컨대 유기 또는 무기 형태인 것일 수 있다. 상기 셀레늄 염의 유기 형태는 아미노산 L(+)-셀레노메티오닌, L(+)-메틸셀레노시스테인 또는 L(+)-셀레노시스테인 것일 수 있다. 상기 셀레늄 염의 무기 형태는 아셀렌산나트륨(Sodium selenite), 아셀렌산칼슘(Calcium selenite), 아셀렌산칼륨(Kalium selenite), 셀렌산나트륨(Sodium selenate), 셀렌산칼슘(Calcium selenate), 셀렌산칼륨(Kalium selenate) 등일 수 있다. 본 발명의 배지 조성물에서 셀레늄이나 그 대체제는 지방의 과산화를 감소시키는 등의 그 기능을 충분히 발휘할 수 있는 농도로 포함될 수 있으며, 통상은 0.5~10 ug/ml의 범위로 포함될 것이다.

다른 측면에서 있어서, 본 발명은 전술한 바의 본 발명의 모유두세포의 배양용 무혈청 배지에 모유두세포를 접종하고 배양하는 단계를 포함하는 모유두세포의 배양 방법에 관한 것이다.

본 발명의 방법에서, 배양 온도는 25~40℃ 범위, 바람직하게는 35±2℃일 수 있다.

또 본 발명의 방법에서, 배양은 세포수가 의도한 만큼 증폭될 때까지 수행된다. 일부 구현예에서, 배양은 24시간, 48시간, 72시간, 96시간, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일 이상의 기간 동안 수행될 수 있다.

또 본 발명의 방법에서, 배양은 세포의 원활한 증식과 증폭을 위하여 이산화탄소(CO₂)의 양이 10 % 내지 0 % (v/v), 바람직하게는 8 % 내지 2 % (v/v), 특히 5 % (v/v)에서 수행될 수 있다.

또 본 발명의 방법에서, 배양은 폐쇄된 배양기에서, 특히 멸균된 폐쇄 배양기에서 수행될 수 있다. 본 발명에 적합한 배양기는 GE Xuri W25, GE Xuri W5, Sartorius BioSTAT RM 20 | 50, Finesse SmartRocker Bioreactor Systems, Pall XRS Bioreactor Systems 등일 수 있다.

전술한 바와 같이, 본 발명에 따르면 모유두세포를 배양을 위한 무혈청 배지 조성물과 그 조성물을 이용한 모유두세포의 배양 방법을 제공할 수 있다.

본 발명의 배지 조성물과 방법은 인간 또는 동물 유래 혈청을 포함하지 않은 배지를 이용하여 모유두세포를 배양하는 방법으로서, 혈청 사용으로 인한 고비용, 배치마다 조성이 달라지는 혈청 사용으로 인한 재현성이 어려운 점, 혈청 사용으로 인한 마이코플라즈마 또는 바이러스 등의 오염 등의 단점을 극복할 수 있는 효과를 가질 수 있다.

도 1은 5종의 기본 배지에 모유두세포를 2일 혹은 4일 동안 배양 후 측정한 성장률 그래프이다.
도 2는 5종의 기본 배지에 모유두세포를 4일 동안 배양 후 관찰한 모유두세포의 사진이다.
도 3은 3종의 증식용 배양 배지에 모유두세포를 3일 혹은 6일 동안 배양 후 측정한 성장률 그래프이다.
도 4는 3종의 증식용 배양 배지에 모유두세포를 6일 동안 배양 후 관찰한 모유두세포의 사진이다.
도 5는 3종의 증식용 배양 배지에 모유두세포를 3일 혹은 6일 동안 배양 후 모발 관련 유전자의 발현율을 측정한 그래프이다.

이하 본 발명을 실시예를 참조하여 설명한다. 그러나 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 모유두세포 배양을 위한 기본 배지 선정

10% 우태아혈청(Fetal Bovine Serum)이 포함된 DMEM(Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium) 배지에서 모유두세포(Dermal papilla cells, PromoCell)를 배양하여 Trypsin-EDTA 용액을 처리한 후 분리 계수하여 96-well plate에 2x10³ cells/well로 나누어 준비하고 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. 다음날(24h 후) 배지를 제거하고, 5종의 기본 배지(DMEM, DMEM/F12, DMEM/201, IMDM/F12, MEMα)에 10% 우태아혈청이 포함된 완전 배지들을 제작하여 200 ㎍/well 첨가하여 2일 혹은 4일간 배양하였다. 2일과 4일간 배양 후 세포의 양을 측정하는 D-Plus^TM CCK(동인LS)용액을 배지의 1/10 부피만큼 첨가하고, 37℃에서 2시간 반응하고 Multiskan FC 마이크로플레이트 포토미터(Thermo Scientific)를 사용하여 450nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 추가적으로 상기 방법과 동일하게 10% 우태아혈청이 포함된 완전 배지에서 2일 혹은 4일간 배양 후, 5% Formaldehyde로 고정하고 0.5% Crystal Violet 용액으로 염색한 후 모유두세포를 현미경으로 관찰하였다. 도 1에 5종의 기본 배지에 모유두세포를 2일 혹은 4일 동안 배양 후 성장률 결과를 나타내었으며, 도 2에는 4일 동안 배양 후 관찰한 모유두세포의 증식 양상을 현미경을 이용하여 이미지화 하였다.

5종의 기본 배지에 모유두세포를 배양 후 성장률과 증식 양상을 확인한 결과 상기 표 1의 성분과 함량으로 비필수 아미노산이 첨가된 MEMα 배지(αMEM+10%)가 DMEM 배지(DMEM+10%)와 유사한 수준으로 높은 성장 결과를 나타내어 기본 배지로 선정하였다.

<실시예 2> 동물 유래 성분이 제거된 배지 제작과 증식률 평가

상기 실시예 1에서 높은 성장 결과를 보였던 비필수아미노산이 첨가된 MEMα 배지를 기본 배지로 하여 아래 표 2에 기술한 조성으로 동물 유래 성분이 제거된 배지를 제작하였다. 이 배지의 증식률을 조사하기 위해 모유두세포를 96-well plate 에 2x10³ cells/well 로 나누어 준비한 후 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. 다음날(24h 후) 일반적으로 모유두세포 배양에 사용하는 10% 우태아혈청이 포함한 DMEM 배지와 동물 유래 성분(우태아 혈청)이 함유된 모유두세포 전용 배지(Follicle Dermal Papilla Cell Growth Medium; Fetal Calf Serum, Bovine Pituitary Extract, bFGF, Insulin 포함; PromoCell GmbH, 독일)를 대조군으로 사용하고, 표 2의 조성으로 제작된 동물 유래 성분이 제거된 배지에 모유두세포를 3일 혹은 6일간 배양하며 증식률을 비교하였다. 이를 위해 3일 혹은 6일간 배양 후 세포의 양을 측정하는 D-Plus^TM CCK(동인LS) 용액을, 첨가된 배지의 1/10 부피만큼 첨가하고, 37℃에서 2시간 반응한 후 상기 실시예 1과 동일하게 450nm 파장에서 흡광도를 측정하여 성장률 차이를 평가(3일 혹은 6일 후)하고 현미경 관찰(6일 후)을 진행하였다. 동물 유래 성분이 제거된 배지(2% 혈소판)는 2종의 대조군(10%FBS와 DPC medium)과 유사한 성장률을 보였고 그 결과는 도 3과 도 4에 나타내었다.

동물 유래 성분이 제거된 배지의 조성

성분명	농도	제조사
MEMα (Minimum Essential Medium α)	1X	Gibco
100X 비필수 아미노산 (Non-Essential Amino Acids)	1X	Gibco
인슐린 (Insulin)	100 ㎍/㎖	Gibco
트랜스페린 (Transferrin)	55 ㎍/㎖	Gibco
아셀렌산나트륨 (Sodium Selenite)	7 ㎍/㎖	Gibco
인간 혈청 알부민 (Human Serum Albumin)	5 ㎍/㎖	Sigma Aldrich
인간 혈소판 용해물 (Human Platelet Lysate)	2%(v/v)	Stemcell Technologies

<실시예 3> 모유두세포 성장 배지들 간의 모발 관련 유전자 발현량 확인

상기 실시예 2에서 사용하였던 2종의 대조군 배지(10% 우태아혈청이 포함된 DMEM 배지, 모유두세포 전용 배지)와 동물 유래 성분이 제거된 배지에서 모유두세포를 배양 후 모발 관련 유전자의 발현량을 측정하였다. 유전자 발현량의 변화 분석을 위해 모유두세포를 6-well plate에 5x10⁵ cells/well로 나누어 준비한 후 다음날(24h 후) 3종의 배지로 각각 교체하고 3일 혹은 6일간 배양하였다. 3일 혹은 6일 배양 후 세포를 회수하고, Blood/Cultured Cell Total RNA Purification Mini Kit(Favogen)에서 제시하는 방법에 따라 total RNA를 분리하고 이를 주형으로 하여 Reverse Transcription Master Premix(Elpis-Biotech)를 사용하여 cDNA를 제작하였다. 제작된 cDNA는 모발 관련 유전자의 발현량 조사를 위한 주형으로 사용하여 정량 PCR을 수행하였다. 정량 PCR은 아래 표 3에 기술한 유전자의 해당 primer 염기서열에 따라 oligomer를 제작하여 사용하였고 2X PowerUp SYBR Green Master Mix(Applied Biosystems)와 QuantStudio 3 PCR 기기(Applied Biosystems)를 사용하여 수행하였다. 분석한 유전자들은 대조군에 비해 증가하거나 비슷한 수준으로 발현되는 것을 확인할 수 있었고 도 5에 그 결과를 나타내었다. 인간 혈소판 용해물 등을 첨가하여 동물 유래 성분을 배제한 배지가 일반적인 우태아혈청을 포함한 배지(10%FBS) 못지않게 모발 관련 유전자의 발현이 동등(LEF-1, WNT5A, VCAN, CORIN)하거나 그 이상으로 증가함(ALP, α-SMA)을 확인할 수 있었다.

모발 관련 유전자의 발현량을 측정하기 위해 사용된 프라이머의 염기서열

프라이머	서열	서열번호
WNT5A-Forward	TACCGCTTTGCCAAGGAGTT	1
WNT5A-Reverse	CACTTGCAGGCCACATCAG	2
VCAN-Forward	TGGAATGATGTTCCCTGCAA	3
VCAN-Reverse	AAGGTCTTGGCATTTTCTACAACAG	4
LEF-1-Forward	ACAGATCACCCCACCTCTTG	5
LEF-1-Reverse	ATAGCTGGATGAGGGATGCC	6
CORIN-Forward	CCCTCCTTGCAGGGCATTGT	7
CORIN-Reverse	CACTGTCCTGAGCGGCACTT	8
ALP-Forward	GTACAACACCAATGCCCAGG	9
ALP-Reverse	CAGATTTCCCAGCGTCCTTG	10
α-SMA-Forward	TGCCTTGGTGTGTGACAATG	11
α-SMA-Reverse	TCACCCACGTAGCTGTCTTT	12
GAPDH-Forward	TCCAAAATCAAGTGGGGCGA	13
GAPDH-Reverse	TGATGACCCTTTTGGCTCCC	14

Claims

당류, 아미노산 및 무기염을 포함하는 기본 배지에 혈소판 용해물(Platelet Lysate)이 첨가된 것으로,
상기 기본 배지는 비필수 아미노산이 첨가된 MEM-α(Minimal Essential Medium-α)이고,
상기 비필수 아미노산은 글리신(Glycine), 엘-알라닌(L-Alanine), 엘-아스파라긴(L-Asparagine), 엘-아스파르트산(L-Aspartic acid), 엘-글루탐산(L-Glutamic acid), 엘-프롤린(L-Proline) 및 엘-세린(L-Serine)로 이루어진 혼합물인 것을 특징으로 하는 모유두세포 배양을 위한 무혈청 배지 조성물.
제1항에 있어서,
혈소판 용해물은 혈소판의 세포막을 파괴하여 제조된 조성물로서,
세포막의 파괴는 화학적으로 또는 기계적으로 수행되며,
상기 화학적 파괴 방법은 S/D(solvent/detergent) 처리이고
기계적인 파괴 방법으로는 액체 균질화 방법, 초음파 처리 또는 동결과 해동 반복 처리이며,
상기 혈소판 용해물은 1~10%(v/v) 농도 범위로 첨가되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서,
상기 배지 조성물은 알부민이나 그 대체제, 인슐린이나 그 대체제, 트렌스페린(transferrin)이나 그 대체제 및 셀레늄이나 그 대체제를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서,
상기 배지 조성물은 인간 혈청 알부민, 인간 인슐린, 인간 트렌스페린, 및 셀레늄 염을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서,
상기 배지 조성물은 1~10 mg/ml의 농도 범위의 인간 혈청 알부민, 10~200 ug/ml 농도 범위의 인간 인슐린, 5~100 ug/ml 농도 범위의 인간 트렌스페린, 및 0.5~10 ug/ml의 농도 범위의 셀레늄 염을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.