KR20200127455A

KR20200127455A - hPL 함유 배지에서 배양된 중간엽 줄기세포의 배양액을 포함하는 화장료 조성물

Info

Publication number: KR20200127455A
Application number: KR1020190051596A
Authority: KR
Inventors: 송순욱; 김시나; 이찬주
Original assignee: 에스씨엠생명과학 주식회사
Priority date: 2019-05-02
Filing date: 2019-05-02
Publication date: 2020-11-11
Also published as: KR102323056B9; JP2022531356A; US20220204939A1; EP3940062A1; EP3940062A4; KR102323056B1; CN113728094A; WO2020222472A1; JP7291427B2

Abstract

본 발명은 인간 혈소판 용해물(human platelet lysate; hPL) 함유 배지에서 배양된 중간엽 줄기세포를 무혈청 배지에서 배양하여 얻은 성장인자(growth factor) 및 사이토카인를 함유하는 줄기세포 배양액 제조방법 및 상기 줄기세포 배양액을 이용한 화장료 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 hPL 함유 배지에 중간엽 줄기세포를 배양한 중간엽 줄기세포 배양액의 제조 방법을 이용하면, FBS 함유 배지에 중간엽 줄기세포를 배양한 중간엽 줄기세포 배양액보다 사이토카인 및 성장인자 함량이 높고, 인간진피섬유아세포 증식 촉진능, 콜라겐 합성능, 엘라스틴 합성능, 멜라닌 합성 억제능 및 발모 효능이 우수한 중간엽 줄기세포 배양액을 수득할 수 있고, 상기 중간엽 줄기세포 배양액을 이용하여 피부 재생, 주름 개선, 피부 탄력 증진, 피부 미백 및 발모 효과가 있는 화장료를 제작할 수 있어, 화장품 분야 및 의약업계에서 널리 사용할 수 있다.

Description

hPL 함유 배지에서 배양된 중간엽 줄기세포의 배양액을 포함하는 화장료 조성물 {A cosmetic composition comprising a culture medium of mesenchymal stem cells cultured in a hPL containing medium}

본 발명은 인간 혈소판 용해물(human platelet lysate; hPL) 함유 배지에서 배양된 중간엽 줄기세포를 무혈청 배지에서 배양하여 얻은 성장인자(growth factor) 및 사이토카인을 함유하는 줄기세포 배양액 제조방법 및 상기 줄기세포 배양액을 이용한 화장료 조성물에 관한 것이다.

피부노화는 크게 두 가지로 나뉘어 연구되고 있는데 하나는 '내적노화'로써 연령의 증가에 따른 노화현상이고 다른 하나는 '외적노화'로써 외부환경 즉 자외선이나 공해 등으로 인한 노화현상을 말한다. 피부노화에 관하여서는 지금까지 여러 이론이 제시되고 있으나 그 중 피부 노화에 가장 과학적으로 접근된 이론은 산화에 의한 피부노화 이론이다. 사람의 피부는 각질층을 포함하는 표피와 진피, 그리고 결합조직으로 구성되어 있는데 그 중 각질층은 표피(epidermis)의 기저세포인 케라티노사이트(keratinocyte)의 분화과정을 통해 형성되는 죽은 세포층으로 구성되어 있고 인체를 외부환경의 영향으로부터 보호해주는 역할을 담당하고 있다. 또한 피부의 내부에 존재하는 진피층은 콜라겐(collagen)과 엘라스틴(elastin)으로 구성되어 있어 피부의 탄력을 주어 피부가 처지지 않도록 지켜주는 역할을 담당하고 있다. 항산화이론은 콜라겐과 엘라스틴이 외부의 자외선 등의 인자들에 의해 생성된 자유 라디칼(free radical)에 의해 손상 받게 되고 이에 따라 피부의 탄력이 감소 되어 주름이 생성된다는 이론이다.

지금까지는 이와 같은 피부의 노화, 특히 주름을 방지하기 위해 레티놀과 같은 물질이나 식물추출물 등을 사용해 왔었다. 그러나 이 물질들은 그 효과가 낮거나 피부자극, 발적, 염증을 유발시켜 피부에 대한 부작용이 심각한 단점을 갖고 있다.

사람의 피부색은 피부 내부의 멜라닌(melanin) 농도와 분포에 따라 결정되는데, 유전적인 요인 외에도, 태양 자외선이나 피로, 스트레스 등의 환경적 또는 생리적 조건에 의해서도 영향을 받는다. 멜라닌은 아미노산의 일종인 티로신(tyrosine)에 티로시나제(tyrosinase)라는 효소가 작용하여 도파(DOPA), 도파퀴논(dopaquinone)으로 바뀐 후 비효소적인 산화반응을 거쳐 만들어진다. 이와 같은 멜라닌의 합성이 피부 내에서 과도하게 일어나면, 피부 톤을 어둡게 하고, 기미, 주근깨 등을 발생시키기도 한다. 따라서, 피부 내의 멜라닌 색소의 합성을 저해시키면, 피부 톤을 밝게 하여 피부 미백을 실현할 수 있을 뿐만 아니라 자외선, 호르몬 및 유전적인 원인에 기인하여 발생하는 기미, 주근깨등의 피부 과색소 침착증을 개선시킬 수 있다. 종래에는 하이드로퀴논(hydroquinone)이나 아스코르브산(ascorbic acid), 코지산(kojic acid), 글루타치온(glutathione)과 같은 티로시나제에 저해 활성을 갖는 물질을 연고나 화장료에 배합하여, 피부 미백이나 기미, 주근깨 개선의 목적으로 사용하여 왔었다. 그 중 하이드로퀴논이 색소침착에 대해서 수 십년 동안 가장 효과적인 성분으로 사용되어 왔었으나, 장기간 사용에 대하여 알러지 반응 등 부작용(흰반점, 검은 반점)이 발생할 수 있다는 보고가 있어, 여러 나라에서 사용의 제약을 받는 추세이다. 글루타치온, 시스테인 등의 티올(thiol)계 화합물은 특유의 불쾌한 냄새와 경피 흡수에 문제가 있어 사용되기에 문제가 있다. 또한 이들의 배당체 및 유도체들은 극성이 높아 화장료의 배합 성분으로 사용되기에는 문제가 있다. 미백용 피부 외용 조성물에 관한 특허에는 엠블리카 추출물 및 상지 추출물을 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물 특허(대한민국 등록특허 제449345호), 신규한 크로만 유도체 및 이의 제조방법 및 이를 함유하는 피부 외용제 조성물(대한민국 등록특허 제456974호), 프로토카테큐익 알데히드를 유효성분으로 하는 피부미백용 조성물(대한민국 등록특허 제336180호) 등이 있다.

또한 티로시나제 효소의 활성을 저해하여 미백 효과를 나타내는 아스코르브산은 산화되기 쉬워 이를 배합한 화장료는 변색, 변취되는 등의 문제를 야기하며, 그 불안정성을 극복하기 위해 아스코르빌 팔미테이트(Ascorbylpalmitate), 아스코르빌 디팔미테이트(Ascorbyl-dipalmitate), 아스코르빌 스테아레이트(Ascorbyl stearate), 아스코르빌 마그네슘 포스페이트(Ascorbyl magnesium phosphate) 등의 유도체가 개발되어 사용되고 있으나 특수한 기술을 사용하지 않으면 피부 속으로 침투시키기 어렵고 티로시나제 저해 활성이 낮다는 단점을 가지고 있다. 따라서, 소량으로도 티로시네이즈 저해 활성을 나타내며, 멜라닌 생합성을 저해할 수 있는 저해제의 개발이 요구되고 있다.

이에 본 발명자는 주름개선 효과, 미백효과 및 발모 효과가 우수한 화장료를 개발하고자 예의 노력한 결과, hPL를 포함하는 배지에 줄기세포를 배양하여 수득한 줄기 세포 배양액이 FBS를 포함하는 배지에 줄기세포를 배양하여 수득한 줄기 세포 배양액보다, 사이토카인 및 성장인자가 풍부하고, 인간진피섬유아세포 증식 촉진능, 콜라겐 합성능, 엘라스틴 합성능, 멜라닌 합성 억제능 및 발모 촉진능이 우수한 것을 확인하여, 기능성 화장료로서 탁월한 효과가 있음을 밝혀내고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

따라서 본 발명의 목적은 성장인자 및 사이토카인이 풍부한 중간엽 줄기세포 배양액의 제조 방법, 상기 방법으로 제조한 중간엽 줄기세포 배양액 및 상기 중간엽 줄기세포 배양액을 포함하는 피부 재생용 화장료 조성물, 상기 중간엽 줄기세포 배양액을 포함하는 주름 개선 및 피부 탄력 증진용 화장료 조성물, 상기 중간엽 줄기세포 배양액을 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물 및 상기 중간엽 줄기세포 배양액을 포함하는 발모 또는 육모 촉진용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 1) 중간엽 줄기세포를 인간 혈소판 용해물 (human platelet lysate, hPL) 이 포함된 배지에서 배양하는 단계; 2) 배양된 줄기세포를 수득하여 무혈청 배지에서 배양하는 단계; 및 3) 중간엽 줄기세포 유래 배양액을 수거하고 여과하여 줄기세포 배양액을 수득하는 단계; 를 포함하는 성장인자 및 사이토카인이 풍부한 중간엽 줄기세포 배양액의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 1) 중간엽 줄기세포를 인간 혈소판 용해물 (human platelet lysate, hPL) 이 포함된 배지에서 배양하는 단계; 2) 배양된 줄기세포를 수득하여 무혈청 배지에서 배양하는 단계; 및 3) 중간엽 줄기세포 유래 배양액을 수거하고 여과하여 줄기세포 배양액을 수득하는 단계; 를 포함하는 성장인자 및 사이토카인이 풍부한 피부 재생, 주름 개선, 피부 미백, 발모용 화장료 조성물 제조용 중간엽 줄기세포 배양액의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 제조 방법으로 제조된 성장인자 및 사이토카인이 풍부한 중간엽 줄기세포 배양액을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 중간엽 줄기세포 배양액을 포함하는 피부 재생용 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 중간엽 줄기세포 배양액을 포함하는 주름 개선 및 피부 탄력 증진용 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 중간엽 줄기세포 배양액을 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 중간엽 줄기세포 배양액을 포함하는 발모 또는 육모 촉진용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 hPL 함유 배지에 중간엽 줄기세포를 배양한 중간엽 줄기세포 배양액의 제조 방법을 이용하면, FBS 함유 배지에 중간엽 줄기세포를 배양한 중간엽 줄기세포 배양액보다 사이토카인 및 성장인자 함량이 높고, 인간진피섬유아세포 증식 촉진능, 콜라겐 합성능, 엘라스틴 합성능, 멜라닌 합성 억제능 및 발모 효능이 우수한 중간엽 줄기세포 배양액을 수득할 수 있고, 상기 중간엽 줄기세포 배양액을 이용하여 피부 재생, 주름 개선, 피부 탄력 증진, 피부 미백 및 발모 효과가 있는 화장료를 제작할 수 있어, 화장품 분야 및 의약업계에서 널리 사용할 수 있다.

도 1은 상업적으로 입수 가능한 분석키트(proteome profiler human XL cytokine array kit, R&D)의 어레이 맵을 나타낸 도이다.
도 2a는 배양조건에 따른 줄기세포 배양액내에 존재하는 단백질 및 성장인자를 분석한 결과이다. Con-media는 세포가 없는 조건에서 배양된 무혈청 배지 (serum-free DMEM)을 의미하며, FBS-CM은 10% FBS 조건에서 배양된 중간엽 줄기세포배양액, hPL-CM은 4% hPL 조건에서 배양된 중간엽 줄기세포배양액을 의미한다. 붉은 실선의 네모박스는 실험 컨트롤을 나타내며, 녹색 네모박스는 hPL 조건에서만 검출되는 단백질을 나타낸다.
도 2b는 hPL 배양조건에서만 발현되는 단백질을 나타낸 도이다.
도 2c는 줄기세포 배양액 내 성장인자의 발현을 확인한 도이다.
도 2d는 줄기세포 배양액 내 피부 회춘효과가 있는 단백질의 발현을 확인한 도이다.
도 2e는 줄기세포 효능마커, 이동 또는 재생 관련 단백질의 발현을 확인한 도이다.
도 2f는 도 2b 내지 도 2e에서 분류되지 않았으나 hPL 배양조건에서 발현되는 단백질을 확인한 도이다.
도 3은 배양조건에 따른 줄기세포 배양액내에 존재하는 대표적인 주요 성장인자인 VEGF, TGF-beta1, HGF, FGF의 함량을 비교 분석한 것을 나타낸 도이다.
도 4는 인간진피섬유아세포의 증식촉진효과를 배양조건에 따라 비교한 것을 나타낸 도이다.
도 5는 콜라겐 합성 효과를 배양조건에 따라 비교한 것을 나타낸 도이다.
도 6은 엘라스틴 합성 효과를 배양조건에 따라 비교한 비교한 것을 나타낸 도이다.
도 7은 3D 인공피부를 이용하여 피부 미백 효과를 배양조건에 따라 비교한 것을 나타낸 도이다.
도 8는 인간모유두세포에서의 증식촉진효과를 배양조건에 따라 비교한 것을 나타낸 도이다.
도 9는 인간진피섬유아세포의 증식촉진효과를 배양조건과 분리방법에 따라 비교한 것을 나타낸 도이다.
도 10는 VEGF의 함량을 배양조건과 분리방법에 따라 비교한 것을 나타낸 도이다.

본 발명은 1) 중간엽 줄기세포를 인간 혈소판 용해물 (human platelet lysate, hPL) 이 포함된 배지에서 배양하는 단계; 2) 배양된 줄기세포를 수득하여 무혈청 배지에서 배양하는 단계; 및 3) 중간엽 줄기세포 유래 배양액을 수거하고 여과하여 줄기세포 배양액을 수득하는 단계; 를 포함하는 성장인자 및 사이토카인이 풍부한 중간엽 줄기세포 배양액의 제조 방법을 제공한다.

본 발명에서의 '인간 혈소판 용해물 (human platelet lysate, hPL)'은 인간의 혈소판 동결(freeze)/해동(thaw) 후 얻어지는 탁한 담황색의 액체이다. 혈소판 동결/해동은 혈소판을 용해시켜 세포 확장에 필요한 많은 양의 성장 인자를 방출한다.

본 발명에서 '줄기세포 배양액'이란 줄기세포를 배양하여 얻은 배지에 포함된 구성 성분을 포함하는 물질로서, 상기 배양액을 제조하기 위한 중간엽 줄기세포는 그 종류에 제한을 받지 않는다. 연골, 골조직, 지방조직 및 골수 유래의 줄기세포일 수 있으며, 바람직하게는 골수 유래의 중간엽 줄기세포이다.

본 발명의 상기 중간엽 줄기세포 배양액의 제조방법에서는 상기 '1) 단계'의 배양시 hPL이 포함된 배지에서 배양하며, 상기 '2) 단계' 배양시 무혈청 배지에서 배양하고, 이 후 수득된 줄기세포 배양액을 쓰는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 2 단계의 공정을 거침으로써, 수득된 줄기세포 배양액 내에 혈청과 항생제가 포함되지 않아 화장료 조성물에 적합한 줄기세포 배양액을 수득할 수 있다.

본 발명에서 줄기세포 배양을 위한 배지는 당업계에 알려진 기본 배지를 제한 없이 사용할 수 있다. 기본 배지는 인위적으로 합성하여 제조할 수 있으며, 상업적으로 제조된 배지를 사용할 수도 있다. 상업적으로 제조되는 배지의 예를 들면, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal Essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10, F-12, α-MEM(α-Minimal essential Medium), G-MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium) 및 Isocove's Modified Dulbecco's Medium 등이 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 사용되는 배지는 항산화제를 포함하지 않는 배지, 상기 배지에 항산화제가 추가된 배지 또는 항산화제를 포함하는 배지를 모두 포함할 수 있다.

항산화제를 포함하지 않는 배지로는 이에 제한되는 것은 아니나 DMEM 배지를 사용할 수 있으며, 필요에 따라 상기 배지에 항산화제를 더 추가하여 배양을 수행할 수 있다. 또한 필요에 따라 항산화제가 포함된 α-MEM 배지를 이용하여 배양을 수행할 수 있다.

본 발명의 항산화제는 세포 배양에 사용될 수 있는 항산화제를 제한 없이 포함할 수 있으며, 글루타리온, 시스테인, 시스테아민, 유비퀴놀, 베타-머캅토에탄올 및 아스코르브산으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 항산화제가 배지에 추가되는 경우, 상기 항산화제는 10 내지 50, 바람직하게는 10 내지 30, 더욱 바람직하게는 25μg/ml의 농도로 추가될 수 있다.

본 발명의 일 예에서는 항산화제를 포함하지 않는 배지로 DMEM, 더욱 바람직하게는 LG-DMEM 배지를 사용하며, 항산화제로 아스코르브산을 포함하는 배지로 α-MEM 배지를 사용한다.

본 발명에서 상기 '1) 단계의 중간엽 줄기세포'는 농도구배 원심분리법(Gradient centrifugation method, GCM) 분리방법으로 분리된 중간엽 줄기세포 또는 층분리 배양 방법(한국 출원번호 10-2006-0075676, subfractionation culturing method, SCM)으로 분리된 중간엽 줄기세포일 수 있다.

본 발명에서 상기 '1) 단계의 중간엽 줄기세포'를 층분리 배양 방법으로 분리한 중간엽 줄기세포로 하여 제조한 중간엽 줄기세포 배양액은 상기 '1) 단계의 중간엽 줄기세포'를 농도구배 원심분리법(Gradient centrifugation method, GCM)으로 분리한 중간엽 줄기세포로 하여 제조한 중간엽 줄기세포 배양액보다 성장인자 및 사이토카인 함량이 높으며, 피부 재생, 주름 개선, 피부 미백, 발모 또는 육모 효과가 우수하다.

상기 '층분리 배양 방법'은 줄기세포를 비중에 따라 분리하는 방법을 의미하며, 먼저 개체로부터 골수를 추출하여 세포배양액에 배양한 후, 상층액만 수득하여 이를 코팅제가 처리되거나 처리되지 않은 배양용기로 옮겨 배양한 후, 동일 과정을 몇 차례 반복하는 공정일 수 있으며, 바람직하게는 1) 개체로부터 분리된 골수를 배양하는 단계; 2) 상기 1) 단계의 상층액만 새로운 용기로 이동시켜 배양하는 단계; 3) 상기 2) 단계의 상층액만을 분리하여 배양용기에서 35℃내지 39℃에서 1시간 내지 3시간 배양 후 35℃내지 39℃에서 12 내지 36 시간 배양을 2 내지 3회 반복하고 이어서 35℃내지 39℃에서 24 내지 72 시간으로 배양하며, 매번 상층액을 새로운 배양용기로 이동시켜 반복 배양하는 단계; 4) 최종 배양 용기에서 단일 클로날 줄기세포를 얻는 단계; 를 포함하는 방법일 수 있다.

본 발명에서 상기 '1) 단계'의 배양은 중간엽 줄기세포를 10 내지 10000 세포/cm²(cells/cm²)의 세포 밀도로 hPL이 포함된 배지에 접종하여 배양하는 단계;를 포함하는 방법일 수 있으며, 바람직하게는 중간엽 줄기세포를 50 내지 1000 세포/cm²(cells/cm²)의 세포 밀도로 배지에 접종하여 배양하는 단계;를 포함하는 방법일 수 있다.

본 발명에서 상기 '1) 단계'의 배지에는 0.1% 내지 20%(w/w)의 인간 혈소판 용해물 (human platelet lysate, hPL)를 함유할 수 있으며, 바람직하게는 1% 내지 10%(w/w)의 hPL을 함유할 수 있다.

본 발명에서 상기 '1) 단계'의 배지를 hPL을 함유한 배지로 하여 제조한 중간엽 줄기세포 배양액은 상기 '1) 단계'의 배지를 FBS를 함유한 배지로 하여 제조한 중간엽 줄기세포 배양액보다 성장인자 및 사이토카인 함량이 높으며, 피부 재생, 주름 개선, 피부 미백, 발모 또는 육모 효과가 우수하다.

본 발명에서 상기 '성장인자 및 사이토카인'은 중간엽 줄기세포가 발현하는 임의의 성장인자, 사이토카인 또는 단백질일 수 있으며, 바람직하게는 아포리포프로테인-A-1(apolipoprotein-A-1), 케모카인(C-X-C 모티프) 리간드-4(chemokine(C-X-C motif) ligand-4, CXCL-4), 케모카인(C-C 모티프) 리간드-5 (chemokine(C-C motif) ligand-5, CCL-5), 레티놀 바인딩 단백질-4(Retinol binding protein-4, RBP-4), 유로키네이즈 수용체(Urokinase receptor, uPAR), 비타민 D-BP(Vitamin D-BP), 혈관 내피 성장 인자(Vascular endothelial growth factor, VEGF), 섬유아세포 성장 인자 2(Fibroblast growth factor 2, FGF2), 간세포 성장 인자(Hepatocyte growth factor, HGF), 섬유아세포 성장 인자 7(Fibroblast growth factor 7, FGF7), 섬유아세포 성장 인자 19(Fibroblast growth factor 19, FGF19), 안지오제닌(Angiogenin), 안지오포이에틴-1(Angiopoietin-1), 안지오포이에틴-2(Angiopoietin-2), 딕코프 관련 단백질 1(Dickkopf related protein 1, DKK-1), 인슐린 유사 성장인자 결합 단백질-2 (insulin like growth factor binding protein-2, IGFBP-2), 인터루킨-6(IL-6), 인터루킨-8(IL-8), 혈소판 유래 성장인자-AA(platelet derived growth factor-AA, PDGF-AA), 대식세포 집락 자극 인자(macrophage colony stimulating factor, M-CSF), 인슐린 유사 성장인자 결합 단백질-3(insulin like growth factor binding protein-3, IGFBP-3), 혈관 세포 부착 분자-1(Vascular cell adhesion molecule-1, VCAM-1), 백혈병 억제 인자(Leukemia inhibitory factor, LIF), 케모카인(C-X-C 모티프) 리간드-12(chemokine(C-X-C motif) ligand-12, CXCL-12), 케모카인(C-C 모티프) 리간드-2 (chemokine(C-C motif) ligand-2, CCL-2), 펜트라신-3(Pentraxin-3), 케모카인(C-C 모티프) 리간드-7 (chemokine(C-C motif) ligand-7, CCL-7), 아디포넥틴(Adiponectin), 파스 리간드(TNF SF6)(Fas ligand(TNF SF6)), 대식세포 이주 억제 인자(macrophage migration inhibitory factor, MIF), 인터루킨-22(IL-22), 인터루킨-4(IL-4), 인터루킨-17A(IL-17A), 보체 성분 5/보체 성분 5a(C5/C5a), 분화클러스터 14(Cluster of differentiation 14, CD14), 키티네이즈 3-like 1(Chitinase 3-like 1), 아딥신(adipsin), C-반응성 단백질(C-reactive protein), 디펩티딜 펩티데이즈 IV(Dipeptidyl peptidase IV, DPP IV), 시스타틴 C(Cystatin C), 엠프린(Emmprin), 성장/분화 인자 15(Growth/differentiation factor 15, GDF15), 오스테오폰틴(Osteopontin), 세르핀(Serpin) E1(nexin), 트롬보스폰딘(Thrombospondin)-1(TSP-1), 레시스틴(Resistin), 뇌유래 신경 성장 인자(Brain derived neurotrophic factor, BDNF) 및 엔도글린(Endoglin)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다. 더 바람직하게는 중간엽 줄기세포를 hPL를 포함하는 배지에서 배양 후 수득하고, 수득한 줄기세포를 무혈청 배지에 다시 배양하여 수득한 중간엽 줄기세포 배양액 내에 특이적으로 존재하는 아포리포프로테인-A-1(apolipoprotein-A-1), 케모카인(C-X-C 모티프) 리간드-4(chemokine(C-X-C motif) ligand-4, CXCL-4), 케모카인(C-C 모티프) 리간드-5 (chemokine(C-C motif) ligand-5, CCL-5), 레티놀 바인딩 단백질-4(Retinol binding protein-4, RBP-4), 비타민 D-BP(Vitamin D-BP), 아디포넥틴(Adiponectin), 뇌유래 신경 성장 인자(Brain derived neurotrophic factor, BDNF), 보체 성분 5/보체 성분 5a(C5/C5a), 분화클러스터 14(Cluster of differentiation 14, CD14), 파스 리간드(TNF SF6)(Fas ligand(TNF SF6)), 성장/분화 인자 15(Growth/differentiation factor 15, GDF15), 인터루킨-6(IL-6), 인터루킨-8(IL-8), 혈소판 유래 성장인자-AA(platelet derived growth factor-AA, PDGF-AA), 대식세포 집락 자극 인자(macrophage colony stimulating factor, M-CSF) 및 백혈병 억제 인자(Leukemia inhibitory factor, LIF)를 포함할 수 있으며, 더 바람직하게는 중간엽 줄기세포를 FBS를 포함하는 배지에서 배양 후 수득하고, 수득한 줄기세포를 무혈청 배지에 다시 배양하여 수득한 중간엽 줄기세포 배양액과 비교하여 중간엽 줄기세포를 hPL을 포함하는 배지에서 배양 후 수득하고, 수득한 줄기세포를 무혈청 배지에 다시 배양하여 수득한 중간엽 줄기세포 배양액 내에 현저하게 함량이 증대된 혈관 내피 성장 인자(Vascular endothelial growth factor, VEGF), 섬유아세포 성장 인자 2(Fibroblast growth factor 2, FGF2), 간세포 성장 인자(Hepatocyte growth factor, HGF), 섬유아세포 성장 인자 7(Fibroblast growth factor 7, FGF7), 섬유아세포 성장 인자 19(Fibroblast growth factor 19, FGF19), 안지오제닌(Angiogenin), 안지오포이에틴-1(Angiopoietin-1), 안지오포이에틴-2(Angiopoietin-2), 딕코프 관련 단백질 1(Dickkopf related protein 1, DKK-1), 인슐린 유사 성장인자 결합 단백질-2 (insulin like growth factor binding protein-2, IGFBP-2), 인슐린 유사 성장인자 결합 단백질-3 (insulin like growth factor binding protein-3, IGFBP-3), 혈관 세포 부착 분자-1(Vascular cell adhesion molecule-1, VCAM-1), 리간드-12(chemokine(C-X-C motif) ligand-12, CXCL-12), 케모카인(C-C 모티프) 리간드-2 (chemokine(C-C motif) ligand-2, CCL-2), 펜트라신-3(Pentraxin-3), 케모카인(C-C 모티프) 리간드-7 (chemokine(C-C motif) ligand-7, CCL-7), 대식세포 이주 억제 인자(macrophage migration inhibitory factor, MIF), 인터루킨-22(IL-22), 인터루킨-4(IL-4), 인터루킨-17A(IL-17A), 키티네이즈 3-like 1(Chitinase 3-like 1), 아딥신(adipsin), C-반응성 단백질(C-reactive protein), 디펩티딜 펩티데이즈 IV(Dipeptidyl peptidase IV, DPP IV), 시스타틴 C(Cystatin C), 엠프린(Emmprin), 오스테오폰틴(Osteopontin), 세르핀(Serpin) E1(nexin), 트롬보스폰딘(Thrombospondin)-1(TSP-1), 레시스틴(Resistin), 유로키네이즈 수용체(Urokinase receptor, uPAR) 및 엔도글린(Endoglin)을 더 포함하는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 1) 중간엽 줄기세포를 인간 혈소판 용해물 (human platelet lysate, hPL) 이 포함된 배지에서 배양하는 단계; 2) 배양된 줄기세포를 수득하여 무혈청 배지에서 배양하는 단계; 및 3) 중간엽 줄기세포 유래 배양액을 수거하고 여과하여 줄기세포 배양액을 수득하는 단계; 를 포함하는 성장인자 및 사이토카인이 풍부한 피부 재생, 주름 개선, 피부 미백, 발모 또는 육모용 화장료 조성물 제조용 중간엽 줄기세포 배양액의 제조 방법을 제공한다.

본 발명에서 상기 '피부 재생'은 피부의 일부분이 소실되었을 경우 그 부분을 보충하거나 피부 세포의 증식을 증진시키는 모든 작용을 의미할 수 있으며, 진피섬유아세포의 증식이 촉진되는 경우 피부 재생 효과가 나타날 수 있다. 본 발명의 상기 화장료 조성물 제조용 중간엽 줄기세포 배양액은 인간진피섬유아세포에 대한 증식 촉진 효과가 우수하여, 피부 재생효과가 우수하다.

본 발명에서 상기 '주름개선'은 피부의 주름 및 탄력과 관련된 능력을 유지 또는 강화시키는 것을 의미한다. 피부의 구조 중에서 진피층에 존재하는 교원섬유(collagen: 콜라겐)와 탄력섬유(elastin: 엘라스틴)가 그 역할을 하는 주요 단백질로서 피부 탄력을 주관하는데, 콜라겐의 생합성은 피부의 내, 외적 영향을 받게 된다. 본 발명의 상기 화장료 조성물 제조용 중간엽 줄기세포 배양액은 콜라겐 합성 능력과 엘라스틴 합성 능력이 우수하여, 주름개선 효과가 우수하다.

본 발명에서 상기 '미백'은 피부의 색을 밝게 하는 효과를 의미한다. 피부의 색은 멜라노사이트(melanocyte)에서 합성되는 멜라닌 색소의 양에 의해 결정된다. 본 발명의 상기 화장료 조성물 제조용 중간엽 줄기세포 배양액은 멜라닌 색소의 합성을 감소시켜 피부 미백효과가 우수하다.

본 발명에서 '발모'는 두피에서 모발이 나는 것을 의미하고, '육모'는 모발의 길이가 길어지는 것(즉, 모발 성장)을 의미하며 당업계에서 이용하는 또 다른 용어인 '양모'와 동일한 의미로 사용된다. 발모 또는 육모 효과는 진피 모유두 세포의 생성 또는 증식에 의해 촉진되며, 본 발명의 상기 화장료 조성물 제조용 중간엽 줄기세포 배양액은 진피 모유두 세포의 증식을 촉진하여 발모 및 육모 효과가 우수하다.

본 발명의 중간엽 줄기세포 배양액은 진피섬유아세포의 증식을 촉진시켜 피부 재생효과가 있고, 콜라겐과 엘라스틴의 합성을 촉진시켜 주름 개선효과가 있으며, 멜라노사이트에서 멜라닌 색소의 합성을 억제하여 미백 효과가 있고, 진피 모유두 세포의 증식을 촉진하여 발모 또는 육모 효과가 있다.

본 발명에서 상기 '화장료 조성물'은 상기 줄기세포 배양액을 포함하는 조성물로서 그 제형은 어떠한 형태라도 가능하다. 이러한 제형의 예를 들면 상기 화장료 조성물을 이용하여 제조된 화장료는 크림류, 팩류, 로션류, 에센스류, 화장수류, 파운데이션류 및 메이크업 베이스류 등이고, 본 발명의 목적을 달성하기 위하여 이러한 제형 중 어떠한 형태로도 제조되어 상용화 될 수 있으며, 상기 예들에 한정되지 않는다.

본 발명에서 상기 화장료 조성물은 정제수, 다가 알코올, 계면활성제, 점도 조절제, 킬레이트제, 유화제, pH 조절제, 산알칼리제, 산화방지제, 보습제, 광택제, 방부제, 착향제, 향료, 겔화제, 안정화제, 착색제 및 색소로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 이상의 첨가물을 추가로 포함할 수 있다.

본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. FBS 또는 hPL 함유 배지에서 중간엽 줄기세포 세포 배양 및 배양액 수집

1.1 층분리 배양 방법(subfractionation culturing method, SCM)에 의해 분리된 골수 유래 단일 클로날 중간엽 줄기세포의 수득

35세 남성 골수제공자의 엉덩이부분을 국소마취제로 마취시킨 후, 엉덩이뼈에 주사바늘을 찔러 골수를 채취하였다.　 100 mm 배양용기에 20% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 10 ml DMEM(Dulbecco`s modified Eagle`s Medium, GIBCO-BRL, Life-technologies, MD, USA), 사람 골수 3 ml를 넣어 37℃, 5% CO₂ 세포배양기에서 2시간 배양하였다.　 배양 후, 배양용기를 한쪽으로 살짝 기울여 바닥에 붙은 세포들이 되도록 떨어지지 않도록 최대한 배양용기의 상층 배양액만 새로운 용기로 옮겼다. 동일한 과정을 한 번 더 반복 한 후 수득한 배양액을 바닥에 교원질(collagen)이 코팅된 배양용기(Becton Dickinson)로 옮긴 후 37℃에서 2시간 배양하였다.　 배양액을 다시 새로운 교원질이 코팅된 용기로 옮기고 24시간 후 다시 새로운 용기로 옮기고 24시간 후 또 새로운 용기로 옮겨주었다.　 마지막으로 48시간 후 새로운 용기로 옮겨 준 후 남아있는 세포들이 배양용기 바닥에 붙어 자라는 것을 육안으로 확인하였다. 약 3 내지 5일의 시간이 지나면 세포들이 단일성 세포군(single clone)을 형성하는데, 이 단일성 세포군들을 트립신을 처리하여 분리하여, 층분리 배양 방법(한국 출원번호 10-2006-0075676, subfractionation culturing method, SCM)에 의해 분리된 골수 유래 단일 클로날 중간엽 줄기세포를 수득하였다.

1.2 FBS 또는 hPL 함유 배지에서 중간엽 줄기세포 세포 배양 및 배양액 수집

실시예 1.1과 같이 층분리 배양 방법에 의해 분리된 골수 유래 단일 클로날 중간엽 줄기세포를 1000 cells/cm²의 세포 밀도로 Low glucose DMEM 배지에 접종하여 37℃ 및 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. 이 때 10% (w/w) 소태아혈청(Fetal Bovine Serum; FBS) 또는 4% (w/w) 인간 혈소판 용해물 (human platelet lysate; hPL)를 함유하는 배지에서 세포의 증식 정도(confluency)가 80%가 될 때까지 37℃ 및 5% CO₂ 세포배양기에서 각각 배양하였다. 인간 혈소판 용해물 (hPL)은 Mill Creek Life Sciences, LLC로부터 구입하였다.

그 후, PBS(phosphate buffered saline)로 3회 세척하고 항생제(젠타마이신 또는 페니실린), 페놀 레드(phenol red)가 첨가되지 않은 무혈청 배지(serum free media)로 배양된 줄기세포를 옮겨 72시간 배양한 후, 줄기세포 유래 배양액을 수거하였고, 수거한 배양액은 3000rpm에서 원심분리 후, 필터링(Top filter system, Nunc)하여, FBS-CM(FBS-conditioned medium) 및 hPL-CM(hPL-conditioned medium)을 완성하였고, 냉장 및 냉동 보관하여 사용하였다. 대조군으로는 세포없이 같은 조건에서 배양된 무혈청 배지를 사용하였다.

실시예 2. 단백질 어레이 방법을 통한 FBS-CM 또는 hPL-CM에 존재하는 성장인자 분석

실시예 1과 같이 제조한 FBS-CM 및 hPL-CM 내에 존재하는 사이토카인을 분석하였다. 분석방법은 상업적으로 입수 가능한 분석키트(proteome profiler human XL cytokine array kit, R&D)를 이용하여 키트와 함께 제공되는 메뉴얼에 따랐으며 발색 후 관찰은 LAS4000(후지, 일본)을 이용하였다.

세포없이 같은 조건에서 배양된 무혈청 배지 (serum-free DMEM Media)을 대조군으로 하고, 실시예 1과 같이 제조한 FBS-CM 및 hPL-CM을 실험군으로 하여 비교하였다. 각각의 줄기세포 배양액 내 함유 성분을 확인할 수 있는 어레이 맵 (ARRAY MAP)을 도 1과 표 1에 나타내었다. 이미지 J 기기 (Image J)를 통해 스팟(spot)을 비교 분석하여 각 성장인자들의 상대적인 함유량을 확인하였으며, 실험에 의하여 얻어진 어레이 결과는 도 2에 나타내었다.

도 2a에 나타낸 바와 같이, 줄기세포 유래 무혈청 배양액 내에 다양한 사이토카인 및 성장인자가 존재하고 있음을 확인하였다. FBS-CM과 hPL-CM을 비교해보면, FBS-CM에서 32종, hPL-CM에서 48종의 단백질이 검출되는 것을 확인할 수 있었다. hPL-CM에서 검출되는 48종의 단백질은 아포리포프로테인-A-1(apolipoprotein-A-1), 케모카인(C-X-C 모티프) 리간드-4(chemokine(C-X-C motif) ligand-4, CXCL-4), 케모카인(C-C 모티프) 리간드-5 (chemokine(C-C motif) ligand-5, CCL-5), 레티놀 바인딩 단백질-4(Retinol binding protein-4, RBP-4), 유로키네이즈 수용체(Urokinase receptor, uPAR), 비타민 D-BP(Vitamin D-BP), 혈관 내피 성장 인자(Vascular endothelial growth factor, VEGF), 섬유아세포 성장 인자 2(Fibroblast growth factor 2, FGF2), 간세포 성장 인자(Hepatocyte growth factor, HGF), 섬유아세포 성장 인자 7(Fibroblast growth factor 7, FGF7), 섬유아세포 성장 인자 19(Fibroblast growth factor 19, FGF19), 안지오제닌(Angiogenin), 안지오포이에틴-1(Angiopoietin-1), 안지오포이에틴-2(Angiopoietin-2), 딕코프 관련 단백질 1(Dickkopf related protein 1, DKK-1), 인슐린 유사 성장인자 결합 단백질-2 (insulin like growth factor binding protein-2, IGFBP-2), 인터루킨-6(IL-6), 인터루킨-8(IL-8), 혈소판 유래 성장인자-AA(platelet derived growth factor-AA, PDGF-AA), 대식세포 집락 자극 인자(macrophage colony stimulating factor, M-CSF), 인슐린 유사 성장인자 결합 단백질-3(insulin like growth factor binding protein-3, IGFBP-3), 혈관 세포 부착 분자-1(Vascular cell adhesion molecule-1, VCAM-1), 백혈병 억제 인자(Leukemia inhibitory factor, LIF), 케모카인(C-X-C 모티프) 리간드-12(chemokine(C-X-C motif) ligand-12, CXCL-12), 케모카인(C-C 모티프) 리간드-2 (chemokine(C-C motif) ligand-2, CCL-2), 펜트라신-3(Pentraxin-3), 케모카인(C-C 모티프) 리간드-7 (chemokine(C-C motif) ligand-7, CCL-7), 아디포넥틴(Adiponectin), 파스 리간드(TNF SF6)(Fas ligand(TNF SF6)), 대식세포 이주 억제 인자(macrophage migration inhibitory factor, MIF), 인터루킨-22(IL-22), 인터루킨-4(IL-4), 인터루킨-17A(IL-17A), 보체 성분 5/보체 성분 5a(C5/C5a), 분화클러스터 14(Cluster of differentiation 14, CD14), 키티네이즈 3-like 1(Chitinase 3-like 1), 아딥신(adipsin), C-반응성 단백질(C-reactive protein), 디펩티딜 펩티데이즈 IV(Dipeptidyl peptidase IV, DPP IV), 시스타틴 C(Cystatin C), 엠프린(Emmprin), 성장/분화 인자 15(Growth/differentiation factor 15, GDF15), 오스테오폰틴(Osteopontin), 세르핀(Serpin) E1(nexin), 트롬보스폰딘(Thrombospondin)-1(TSP-1), 레시스틴(Resistin), 뇌유래 신경 성장 인자(Brain derived neurotrophic factor, BDNF) 및 엔도글린(Endoglin)인 것으로 확인하였다. 상기 48종의 단백질 중 FBS-CM 대비 hPL-CM에만 발현되는 대표적인 단백질은 도 2b에, 성장인자 관련 단백질은 도 2c에, 피부 회춘(rejuvenation)관련 단백질은 도 2d에, 줄기세포 효능 마커, 이동 또는 재생 관련 단백질은 도 2e에 나타내었으며, 이 이외에 발현되는 단백질은 도 2f에 나타내었다.

실시예 3. FBS-CM 또는 hPL-CM의 성장인자 함량 비교

상기 실시예 2를 통해, 본 발명의 hPL-CM에서 더 많은 종류의 성장인자 및 단백질을 포함하는 것을 확인함에 따라 좀 더 정확한 비교를 위해 상기 실시예 1과 같은 방법으로 제조한 FBS-CM 또는 hPL-CM 내 존재하는 대표적인 성장인자들의 함량을 비교하였으며 그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타낸 바와 같이, FBS-CM보다 hPL-CM에서 VEGF, TGF-beta1, HGF, FGF의 함유량이 증가되는 것을 확인하였다. 구체적으로 VEGF의 경우 hPL-CM에서 FBS-CM보다 3.5배 이상 함유되어 있고, TGF-beta1의 경우 hPL-CM에서 FBS-CM보다 2.2배 이상 함유되어 있으며, HGF의 경우 hPL-CM에서 FBS-CM보다 1.7배 이상 함유되어 있고, FGF의 경우 hPL-CM에서 FBS-CM보다 1.6배 이상 함유되어 있는 것을 확인하였다.즉, hPL를 함유하는 배지에서 중간엽 줄기세포를 배양하는 것으로 인해 줄기세포 배양액내 존재하는 성장인자 함량을 증가시킬 수 있음을 다시 한번 확인하였다.

실시예 4. FBS-CM 또는 hPL-CM의 인간진피섬유아세포 증식효과 비교

상기 실시예 2, 3을 통해, 본 발명의 hPL-CM이 더 많은 종류와 고농도의 성장인자 및 단백질을 포함하는 것을 확인하였으며 이의 따라 피부 개선 효능에도 차이가 있는지를 확인하고자 하였다. 구체적으로 인간진피섬유아세포(human dermal fibroblast, HDF, Lonza사 구입)에 무혈청 배지를 24시간 동안 처리한 군을 대조군으로 하였다. 실시예 1과 같은 방법으로 제조한 100% FBS-CM 원액, 상기 FBS-CM 원액을 무혈청 배지로 50% 희석한 50% FBS-CM 희석액, 실시예 1과 같은 방법으로 제조한 100% hPL-CM 원액, 및 상기 hPL-CM 원액을 무혈청 배지로 50% 희석한 50% hPL-CM 희석액을 인간진피섬유아세포에 24시간동안 처리한 군을 각각 실험군으로 하였고, 각 대조군과 실험군의 인간진피아세포의 증식 촉진 효과를 CCK-8을 통해 확인하였으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타낸 바와 같이, hPL-CM 처리군에서 대조군 대비 인간진피섬유아세포의 증식 촉진 효과가 100% 이상 증가하는 것을 확인하였고, hPL-CM 처리군에서 FBS-CM 처리군보다 인간진피섬유아세포의 증식 촉진 효과가 높게 나타나는 경향을 확인하여 hPL-CM의 피부 재생 효과를 확인하였다.

실시예 5. FBS-CM 또는 hPL-CM의 콜라겐 합성 효과

본 실시예에서는 줄기세포 배양액의 피부 노화 억제제로서의 유효성을 확인하기 위하여 콜라겐 합성율을 인간유래의 피부섬유아세포를 이용하여 확인하였다. 구체적으로 인간진피섬유아세포를 6-웰 플레이트에 24시간 배양한 후, 상기 실시예 1과 같은 방법으로 제조한 FBS-CM, hPL-CM 또는 대조군 배양액(세포없이 같은 조건에서 배양된 serum-free DMEM media)을 1000㎕ 처리한 후, 72시간동안 배양하였다. 인간진피섬유아세포가 새롭게 합성 분비한 콜라겐의 양을 콜라겐 키트(Sircol TM collagen assay kit)를 이용하여 측정하였으며 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타낸 바와 같이, FBS-CM 처리군에서 143.6 ug/ml 그리고 hPL-CM 처리군에서 170.0 ug/ml로 hPL-CM 처리군에서 약 18%정도 콜라겐의 합성양이 더 높게 측정됨을 확인하였다. 즉, 피부탄력, 피부재생 및 피부 주름개선에 도움을 주는 콜라겐 합성에 FBS-CM 보다 hPL-CM이 우수한 것을 확인할 수 있었다.

실시예 6. FBS-CM 또는 hPL-CM의 엘라스틴 합성 효과

피부 탄력은 진피층에 존재하는 엘라스틴으로 구성된 탄력섬유에 의해 나타나는데, 이러한 탄력섬유는 콜라겐과 함께 존재하며 엘라스틴과 콜라겐이 충분히 존재하는 상태에서 피부의 탄력유지가 가능하다. FBS-CM 또는 hPL-CM의 엘라스틴 합성 촉진 효과를 확인하기 위한 실험을 실시하였다. 구체적으로, 24 웰 플레이트에 인간진피섬유아세포를 seeding한 후, 24시간후, 세포가 모두 붙으면, 모든 배양배지를 제거한 후, 상기 실시예 1과 같은 방법으로 제조한 FBS-CM, hPL-CM 또는 무혈청 배지(대조군)를 500㎕씩 각 웰에 넣어준 후, 72시간동안 배양하고, 엘라스틴의 양을 측정하였으며, 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타낸 바와 같이, 엘라스틴 합성 양을 비교해 본 결과, FBS-CM 처리군 및 hPL-CM 처리군에서 각각 38.3ug/ml 및 46.0ug/ml의 엘라스틴이 합성된 것으로 측정되었고, hPL-CM 처리군에서 약 20%정도 엘라스틴의 합성양이 더 높게 측정됨을 확인하였다. 즉, 피부탄력, 피부재생 및 피부 주름개선에 도움을 주는 엘라스틴 합성에 hPL-CM이 더 효과적임을 확인할 수 있었다.

실시예 7. 3D인공피부를 이용한 피부 미백 효과

줄기세포 배양액의 피부미백효과를 확인하기 위해 인공피부를 이용하여 멜라닌 양의 감소를 확인하였다. 3D 인공피부는 MEL-300-Melanoderm tissues(MarTek Co. Kr)를 사용하고 37℃ 및 5% CO₂인큐베이터 조건에서 배양하며 그 결과를 관찰하였다. 구체적으로, 대조군으로 무혈청 배양액 처리군, 실험군으로 1000㎍/ml 농도의 알부틴 200㎕ 처리군, 실시예 1에서 제조한 FBS-CM 200㎕ 처리군, 1000㎍/ml 농도의 알부틴 100㎕ 및 실시예 1에서 제조한 FBS-CM 100㎕ 혼합 처리군, 실시예 1에서 제조한 hPL-CM 200㎕ 처리군, 1000㎍/ml 농도의 알부틴 100㎕및 실시예 1에서 제조한 hPL-CM 100㎕ 혼합 처리군을 설정하였다. 트랜스웰 위에 올려진 인공피부에 2일에 한번씩 상기 설정한 바와 같이, FBS-CM, hPL-CM 또는 알부틴을 반복 처리하여 21일간 배양한 후, 멜라닌 합성량을 측정하였으며, 측정 결과를 도 7에 나타내었다.

도 7에 나타낸 바와 같이, 대조군의 멜라닌 합성양을 100%로 기준하였을 때, 양성대조군인 알부틴(Arbutin)에서는 74.1%로 멜라닌 합성양이 감소하였으며, FBS-CM처리군 및 hPL-CM처리군은 각각 94.6% 및 85.6%로 감소하였다. 양성대조군인 알부틴(Arbutin)과 FBS-CM 및 hPL-CM을 혼합(combination) 처리한 경우, 알부틴/FBS-CM은 82.5%, 알부틴/hPL-CM은 76.7%로 멜라닌 합성양이 더욱 감소함을 확인하였다. 즉, 피부 미백 효과를 나타내는 3D 인공피부의 멜라닌 합성양을 통해 FBS-CM에 비해 hPL-CM이 더 높은 미백 효과를 나타냄을 확인하였다.

실시예 8. FBS-CM 또는 hPL-CM의 발모 효능 확인

발모는 진피 모유두 세포(dermal papilla)의 생성 및 증식을 통해 가능하다. 따라서, 배양조건에 따른 줄기세포 배양액의 발모 효능을 확인하기 위해 인간모유두세포(primary human dermal papilla cell)를 이용하여 성장, 즉, 증식에 영향을 주는지 확인하였다. 구체적으로, 실시예 1과 같은 방법으로 제조한 FBS-CM 처리군 또는 실시예 1과 같은 방법으로 제조 hPL-CM 처리군을 실험군으로 하고 무혈청 배지 처리군을 대조군으로 설정하였다. 96 웰 플레이트에 인간모유두세포(PromoCell사 구입)를 seeding하고 24시간 후 세포가 모두 붙으면, 각 웰에 FBS-CM, hPL-CM 또는 무혈청배지를 200㎕씩 넣어준 후, 48시간동안 배양하고, 인간 모유두세포에 대한 증식 촉진 효과를 CCK-8을 통해 확인하였으며, 그 결과를 도 8에 나타내었다.

도 8에 나타낸 바와 같이, 줄기세포배양액을 처리하였을 때, hPL-CM처리군이 대조군 대비 증식 촉진 효과가 2.6배 이상 증가 하는 것을 확인하였고, hPL-CM 처리군이 FBS-CM 처리군보다 증식 촉진 효과가 약 20%정도 높게 나타나는 것을 확인하여 hPL-CM의 발모 효과를 확인하였다.

실시예 9. 배양조건과 분리방법에 따른 인간진피섬유아세포 증식효과 비교

농도 구배 원심분리법(Gradient centrifugation method, GCM) 분리방법으로 분리된 골수 유래 단일 클로날 중간엽 줄기세포를 실시예 1.2에서 실시한 방법과 동일한 방법으로 제작한 중간엽 줄기세포 배양액(이하, GCM conditioned medium, GCM-CM)과 실시예 1의 층분리 배양 방법으로 분리된 줄기세포 배양액(이하, SCM-CM)의 효능비교를 실시하였다.

9.1 실험군 및 대조군 설정

실험군으로 GCM 분리방법으로 분리된 중간엽 줄기세포를 실시예 1.2와 같은 방법으로 FBS 또는 hPL 포함 배지에서 배양 후, 무혈청 배지에 옮겨 배양하여 수득한 중간엽 줄기세포 배양액(이하, GCM-FBS-CM 또는 GCM-hPL-CM으로 명명)을 처리한, GCM-FBS-CM 처리군 및 GCM-hPL-CM 처리군을 설정하고, 실시예 1과 같이 층분리 배양 방법으로 분리한 골수 유래 단일 클로날 중간엽 줄기세포를 FBS 또는 hPL 포함 배지에서 배양 후, 무혈청 배지에 옮겨 배양하여 수득한 중간엽 줄기세포 배양액(이하, SCM-FBS-CM 또는 SCM-hPL-CM으로 명명)을 처리한 SCM-FBS-CM 처리군 및 SCM-hPL-CM 처리군을 설정하였다. 대조군으로 무혈청 배지 처리군을 설정하였다.

9.2 인간진피섬유아세포 증식효과 측정

96 웰 플레이트에 인간진피섬유아세포를 seeding한 후, 24시간후, 세포가 모두 붙으면, 모든 배양 배지를 제거한 후, 상기 실시예 9.1에서 설정한 바와 같이 줄기세포 배양액 또는 무혈청 배지를 200㎕씩 각 웰에 넣어준 후, 48시간동안 배양하고, 인간진피섬유아세포의 증식 촉진 효과를 CCK-8을 통해 확인하였으며, 그 결과를 도 9에 나타내었다.

도 9에 나타낸 바와 같이, 동일한 세포주에서 FBS 배양조건보다 hPL 배양조건의 경우 인간진피섬유아세포의 증식효과가 높은 것을 확인하였으며 GCM 분리방법으로 배양된 경우보다 SCM분리방법으로 배양된 두개의 세포주에서 증식율이 더 높은 것을 확인하였다.

실시예 10. 배양조건과 분리방법에 따른 VEGF함량 비교

GCM 분리방법으로 분리된 중간엽 줄기세포의 배양액과 실시예1의 층분리 배양 방법으로 분리된 줄기세포 배양액의 효능비교를 추가로 실시하였다. 구체적으로, 실시예 9.1에서 제작한 대조군과 실험군인 GCM-FBS-CM군, GCM-hPL-CM군, SCM-FBS-CM군 및 SCM-hPL-CM군을 대상으로 실시예 2와 동일한 방법으로 대표적인 성장인자인 VEGF의 함량을 비교하였으며, 그 결과를 도 10에 나타내었다.

도 10에 나타낸 바와 같이, 줄기세포 배양액 내 VEGF의 함량을 비교한 결과, 동일한 방식으로 분리한 중간엽 줄기세포 세포주에서 FBS을 첨가한 배지에서 배양한 중간엽 줄기세포 배양액보다 hPL을 첨가한 배지에서 배양한 중간엽 줄기세포 배양액에서 VEGF의 함량이 높은 것을 확인할 수 있으며, GCM 분리방법으로 배양된 경우보다 SCM 분리방법으로 배양된 두개의 세포주에서 함량이 높음을 확인하였다.

이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.

본 발명에 따른 조성물은 목적에 따라 여러 형태로 제제화가 가능하다. 하기는 본 발명에 따른 조성물을 활성성분으로 함유시킨 몇몇 제형화 방법을 예시한 것으로 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

제형예 1: 화장수

본 발명의 중간엽 줄기세포 배양액을 함유한 화장료 중 화장수의 제형예는 아래와 같다.

성분 (함량, 단위:중량%)

본 발명의 중간엽 줄기세포 배양액 2.0

글리세린 5.0

1.3-부틸렌글리콜 3.0

피이지1500 1.0

알란토인 0.1

DL-판테놀 0.3

EDTA-2Na 0.02

벤조페논-9 0.04

소듐 히아루로네이트 5.0

에탄올 10.0

옥틱도데세스-16 0.2

폴리솔베이트20 0.2

방부제, 향, 색소 미량

증류수 잔량

합계 100

제형예 2: 크림

본 발명의 중간엽 줄기세포 배양액을 함유한 화장료 중 크림의 처방예는 아래와 같다.

성분 (함량, 단위:중량%)

본 발명의 중간엽 줄기세포 배양액 2.0

친유형 모노스테아린산글리세린 2.0

세테아릴알콜 2.2

스테아린산 1.5

밀납 1.0

폴리솔베이트60 1.6

솔비탄스테아레이트 0.6

경화식물유 1.0

스쿠알란 3.0

광물유 5.0

트리옥타노인 5.0

디메치콘 1.0

소듐마그네슘실리케이트 0.1

글리세린 5.0

베타인 3.0

트리에타올아민 1.0

소듐히아루로네이트 4.0

방부제, 향, 색소 미량

증류수 잔량

합계 100

제형예 3: 에센스

본 발명의 중간엽 줄기세포 배양액을 함유한 화장료 중 에센스의 처방예는 아래와 같다.

성분 (함량, 단위:중량%)

본 발명의 중간엽 줄기세포 배양액 2.0

글리세린 10.0

베타인 5.0

피이지1500 2.0

알란토인 0.1

DL-판테놀 0.3

EDTA-2Na 0.02

벤조페논-9 0.04

히드록시에칠 셀룰로오스 0.1

소듐히아루로네이트 8.0

카르복시비닐폴리머 0.2

트리에탄올아민 0.18

옥틸도데칸올 0.3

옥틸도데세스 -16 0.4

에탄올 6.0

방부제, 향, 색소 미량

증류수 잔량

합계 100

Claims

1) 중간엽 줄기세포를 인간 혈소판 용해물 (human platelet lysate, hPL) 이 포함된 배지에서 배양하는 단계;
2) 배양된 줄기세포를 수득하여 무혈청 배지에서 배양하는 단계; 및
3) 중간엽 줄기세포 유래 배양액을 수거하고 여과하여 줄기세포 배양액을 수득하는 단계; 를 포함하는
성장인자 및 사이토카인이 풍부한 중간엽 줄기세포 배양액의 제조 방법.

제1항에 있어서, 상기 hPL이 포함된 배지는 1% 내지 10%(w/w)의 hPL이 포함된 배지인 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포 배양액의 제조 방법.

제1항에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는
1) 개체로부터 분리된 골수를 배양하는 단계;
2) 상기 1) 단계의 상층액만 새로운 용기로 이동시켜 배양하는 단계;
3) 상기 2) 단계의 상층액만을 분리하여 배양용기에서 35℃내지 39℃에서 1시간 내지 3시간 배양 후 35℃내지 39℃에서 12 내지 36 시간 배양을 2 내지 3회 반복하고 이어서 35℃내지 39℃에서 24 내지 72 시간으로 배양하며, 매번 상층액을 새로운 배양용기로 이동시켜 반복 배양하는 단계; 및
4) 최종 배양 용기에서 단일 클로날 줄기세포를 얻는 단계; 를 포함하는 줄기세포의 층분리 배양 방법(subfractionation culturing method, SCM)에 의해 분리된 골수 유래 단일 클로날 중간엽 줄기세포인 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포 배양액의 제조 방법.

제1항에 있어서, 상기 1) 단계의 중간엽 줄기세포는 50세포/cm² 내지 1000세포/cm²의 밀도로 접종하는 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포 배양액의 제조 방법.

제1항에 있어서, 상기 성장인자 및 사이토카인은 아포리포프로테인-A-1(apolipoprotein-A-1), 케모카인(C-X-C 모티프) 리간드-4(chemokine(C-X-C motif) ligand-4, CXCL-4), 케모카인(C-C 모티프) 리간드-5 (chemokine(C-C motif) ligand-5, CCL-5), 레티놀 바인딩 단백질-4(Retinol binding protein-4, RBP-4), 비타민 D-BP(Vitamin D-BP), 아디포넥틴(Adiponectin), 뇌유래 신경 성장 인자(Brain derived neurotrophic factor, BDNF), 보체 성분 5/보체 성분 5a(C5/C5a), 분화클러스터 14(Cluster of differentiation 14, CD14), 파스 리간드(TNF SF6)(Fas ligand(TNF SF6)), 성장/분화 인자 15(Growth/differentiation factor 15, GDF15), 인터루킨-6(IL-6), 인터루킨-8(IL-8), 혈소판 유래 성장인자-AA(platelet derived growth factor-AA, PDGF-AA), 대식세포 집락 자극 인자(macrophage colony stimulating factor, M-CSF) 및 백혈병 억제 인자(Leukemia inhibitory factor, LIF)를 포함하는 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포 배양액의 제조 방법.

제5항에 있어서, 상기 성장인자 및 사이토카인은 혈관 내피 성장 인자(Vascular endothelial growth factor, VEGF), 섬유아세포 성장 인자 2(Fibroblast growth factor 2, FGF2), 간세포 성장 인자(Hepatocyte growth factor, HGF), 섬유아세포 성장 인자 7(Fibroblast growth factor 7, FGF7), 섬유아세포 성장 인자 19(Fibroblast growth factor 19, FGF19), 안지오제닌(Angiogenin), 안지오포이에틴-1(Angiopoietin-1), 안지오포이에틴-2(Angiopoietin-2), 딕코프 관련 단백질 1(Dickkopf related protein 1, DKK-1), 인슐린 유사 성장인자 결합 단백질-2 (insulin like growth factor binding protein-2, IGFBP-2), 인슐린 유사 성장인자 결합 단백질-3 (insulin like growth factor binding protein-3, IGFBP-3), 혈관 세포 부착 분자-1(Vascular cell adhesion molecule-1, VCAM-1), 리간드-12(chemokine(C-X-C motif) ligand-12, CXCL-12), 케모카인(C-C 모티프) 리간드-2 (chemokine(C-C motif) ligand-2, CCL-2), 펜트라신-3(Pentraxin-3), 케모카인(C-C 모티프) 리간드-7 (chemokine(C-C motif) ligand-7, CCL-7), 대식세포 이주 억제 인자(macrophage migration inhibitory factor, MIF), 인터루킨-22(IL-22), 인터루킨-4(IL-4), 인터루킨-17A(IL-17A), 키티네이즈 3-like 1(Chitinase 3-like 1), 아딥신(adipsin), C-반응성 단백질(C-reactive protein), 디펩티딜 펩티데이즈 IV(Dipeptidyl peptidase IV, DPP IV), 시스타틴 C(Cystatin C), 엠프린(Emmprin), 오스테오폰틴(Osteopontin), 세르핀(Serpin) E1(nexin), 트롬보스폰딘(Thrombospondin)-1(TSP-1), 레시스틴(Resistin), 유로키네이즈 수용체(Urokinase receptor, uPAR) 및 엔도글린(Endoglin)을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포 배양액의 제조 방법.

1) 중간엽 줄기세포를 인간 혈소판 용해물 (human platelet lysate, hPL) 이 포함된 배지에서 배양하는 단계;
2) 배양된 줄기세포를 수득하여 무혈청 배지에서 배양하는 단계; 및
3) 중간엽 줄기세포 유래 배양액을 수거하고 여과하여 줄기세포 배양액을 수득하는 단계; 를 포함하는
성장인자 및 사이토카인이 풍부한 피부 재생, 주름 개선, 피부 미백, 발모 또는 육모용 화장료 조성물 제조용 중간엽 줄기세포 배양액의 제조 방법.

제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된 성장인자 및 사이토카인이 풍부한 중간엽 줄기세포 배양액.

제8항의 중간엽 줄기세포 배양액을 포함하는 피부 재생용 화장료 조성물.

제8항의 중간엽 줄기세포 배양액을 포함하는 주름 개선 및 피부 탄력 증진용 화장료 조성물.

제8항의 중간엽 줄기세포 배양액을 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물.

제8항의 중간엽 줄기세포 배양액을 포함하는 발모 또는 육모 촉진용 화장료 조성물.