CN112760289A - 一种乳腺癌类器官专用培养基及3d培养方法 - Google Patents

一种乳腺癌类器官专用培养基及3d培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种乳腺癌类器官专用培养基及3D培养方法，该培养基包括基础培养基和特异性添加因子；所述特异性添加因子包括GSK429286A；Doramapimod；A83‑01；EGF；β‑estradiol；Cholera Toxin；FGF2；HEPES；B27；GlutaMAX；ITS；Gentamicin；Neuregulin‑1；BSA。培养方法包括：将分离的乳腺癌组织进行预处理后消化并过滤，得到细胞沉淀；将细胞沉淀裂解，然后与matrigel胶混匀并接种，待混合胶凝固后加入上述培养基，并于37℃、5％CO2浓度下培养7‑14天。本发明的培养基可实现乳腺癌类器官的快速生长，并可长期稳定培养，形成的肿瘤类器官细胞球球形规则，且大小较为均一，能在体外很好地保留患者肿瘤组织的异质性。

Description

一种乳腺癌类器官专用培养基及3D培养方法
技术领域
本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种乳腺癌类器官专用培养基及3D培养方法。
背景技术
乳腺癌是全球女性最常见的恶性肿瘤之一，也是导致女性癌症患者死亡的第二大手。近年来，随着我国经济的发展和人们生活方式的改变，我国乳腺癌的发病率逐年升高，并且患者呈现低龄化趋势。目前，学者们主要使用传统的肿瘤细胞株模型(CCL)和患者来源的肿瘤异种移植模型(PDTX)来研究乳腺癌的发生发展情况。虽然两种模型为乳腺癌的研究做出了巨大贡献，但均存在一定的局限性，如CCL模型可能会出现交污染、基因型会发生改变以及很难永久性增殖等，PDTX模型的瘤移植成功率低、建立所需的时间长、受体缺乏免疫能力以及不能进行高通量药物筛选等，这些缺点可能导致实验结果与肿瘤在人体内的实际情况出现偏差，因此迫切希望一种更加优秀的模型出现。
类器官是由多能干细胞或器官祖细胞分化，并自组装成有结构和功能的完整哺乳动物器官，类器官技术在研究广泛的对象方面潜力巨大，包括发育生物学、疾病病理学、细胞生物学、再生机制、精准医疗以及药物毒性和药效试验等。对于这些应用以及其他应用，类器官培养实现了对现有2D培养方法和动物模型系统的高信息量的互补。
发明内容
有鉴于此，本发明旨在提供一种乳腺癌类器官专用培养基及3D培养方法以解决上述问题。本发明的技术方案为：
第一个方面，本发明提供一种乳腺癌类器官专用培养基，包括基础培养基和特异性添加因子；所述特异性添加因子包括GSK429286A；Doramapimod；A83-01；EGF；β-estradiol；Cholera Toxin；FGF2；HEPES；B27；GlutaMAX；ITS；Gentamicin；Neuregulin-1；牛血清白蛋白(BSA)。
进一步地，所述特异性添加因子包括以下终浓度的组分：GSK429286A：5-20uM；Doramapimod：5-20uM；A83-01：0.5-1uM；EGF：50-500ng/ml；β-estradiol：2-10nM；CholeraToxin：10-30ng/ml；FGF2：1-5uM；HEPES：10-30mM；B27：1-5X；GlutaMAX：1-2X；ITS：0.1-1X；Gentamicin：0.5-50ug/ml；Neuregulin-1：2-10nM；牛血清白蛋白(BSA)：1-10mg/ml。
进一步地，所述培养基还包括重组蛋白。
优选地，所述重组蛋白为TN-C重组蛋白，其在所述培养基中的终浓度为50-100ng/ml。
更优选地，所述特异性添加因子包括以下终浓度的组分：GSK429286A：10-15uM；Doramapimod:6-8uM；A83-01:0.7-0.8uM；EGF:150-200ng/ml；β-estradiol:4-6nM；CholeraToxin:10-15ng/ml；FGF2:1-5uM；HEPES:15-20mM；B27:1-5X；GlutaMAX：1-2X；ITS:0.5-1X；Gentamicin:20-30ug/ml；Neuregulin-1：5-6nM；牛血清白蛋白(BSA)：4-5mg/ml；TN-C重组蛋白：70-80ng/ml。
进一步地，所述基础培养基为无血清培养基。
优选地，所述无血清培养基为DMEM/F12(1:1)减血清培养基。
进一步地，所述培养基的制备方法为：将特异性添加因子加入到基础培养基中混合均匀既得。
第二个方面，本发明提供一种乳腺癌类器官3D培养方法，包括以下步骤：
1)将分离的乳腺癌组织进行预处理后消化并过滤，得到细胞沉淀；
2)将细胞沉淀裂解，然后与matrigel胶混匀并接种，待混合胶凝固后加入上述培养基，并于37℃、5％CO2浓度下培养7-14天，每间隔2-3天更换一次培养基，即得。
第三个方面，本发明提供一种乳腺癌类器官，是采用上述培养方法获得。
本发明的有益效果是：
①本发明的培养基可实现乳腺癌类器官的快速生长，并可长期稳定培养，形成的肿瘤类器官细胞球形规则，且大小较为均一，能在体外很好地保留患者肿瘤组织的异质性。
②本发明的培养方法操作简单，人员操作影响较少，稳定性高。
附图说明
图1为本发明实施例1中培养1天的肿瘤细胞的状态图。
图2为本发明实施例1中培养4天的肿瘤细胞的状态图。
图3为本发明实施例1中培养7天的肿瘤细胞的状态图。
图4为本发明实施例1中培养10天的肿瘤细胞的状态图。
图5为本发明实施例1获得的类器官的形貌图。
图6为本发明实施例2获得的类器官的形貌图。
图7为本发明实施例3获得的类器官的形貌图。
图8为本发明实施例4获得的类器官的形貌图。
图9为本发明实施例5获得的类器官的形貌图。
图10为本发明实施例6中长期稳定培养30天的类器官的状态图。
图11为本发明实施例6中长期稳定培养60天的类器官的状态图。
图12为本发明实施例6中长期稳定培养90天的类器官的状态图。
图13为本发明对比例1中培养5天的肿瘤细胞的状态图。
图14为本发明对比例1中培养10天的肿瘤细胞的状态图。
图15为本发明对比例2中培养14天的肿瘤细胞的状态图。
图16为本发明对比例3中培养14天的肿瘤细胞的状态图。
具体实施方式
在本发明的描述中，需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面结合附图和具体的实施例对本发明做进一步详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
实施例1
本实施例提供一种乳腺癌类器官专用培养基及3D培养方法，该培养基包括基础培养基和特异性添加因子；所述特异性添加因子包括以下终浓度的组分：GSK429286A：10uM；Doramapimod:8uM；A83-01:0.8uM；EGF:150ng/ml；β-estradiol:5nM；Cholera Toxin:12ng/ml；FGF2:2uM；HEPES:20mM；B27:1X；GlutaMAX：2X；ITS:0.5X；Gentamicin:25ug/ml；Neuregulin-1：6nM；BSA：4mg/ml；TN-C重组蛋白：70ng/ml。培养方法包括：将取出的乳腺癌组织用生理盐水清洗后，在冰上剪碎，加入10ml胰酶重悬，转移至37℃，220rpm摇床消化10分钟，消化完成后加入5ml的DMEM/F12终止消化。用70um的细胞滤网过滤细胞悬液，1200rpm，离心5分钟，加入5ml的红细胞裂解液重悬沉淀，用5ml的DMEM/F12终止裂解后离心，去除上清，细胞计数，混合matrigel,20000个细胞每滴，滴于24孔板中，放置于37℃，5％的CO2培养箱中，待matrigel胶凝固后，加入上述专用培养基于37℃、5％CO2浓度下培养10天，每间隔2-3天更换一次培养基，即得。图1～5提供了培养1天～10天的细胞状态变化图以及最终获得的类器官的形貌图，可见，本实施例的培养基可实现乳腺癌类器官的快速生长，形成的肿瘤类器官细胞球形规则，且大小较为均一，能在体外很好地保留患者肿瘤组织的异质性。
实施例2
本实施例提供一种乳腺癌类器官专用培养基及3D培养方法，该培养基包括基础培养基和特异性添加因子；所述特异性添加因子包括以下终浓度的组分：GSK429286A：15uM；Doramapimod:6uM；A83-01:0.7uM；EGF:200ng/ml；β-estradiol:4nM；Cholera Toxin:15ng/ml；FGF2:5uM；HEPES:15mM；B27:5X；GlutaMAX：1X；ITS:1X；Gentamicin:30ug/ml；Neuregulin-1：5nM；BSA：5mg/ml；TN-C重组蛋白：80ng/ml。培养方法同实施例1。培养7天获得的类器官形貌图如图6所示，形成的肿瘤类器官细胞球形规则，且直径可超200um，活性较好。
实施例3
本实施例提供一种乳腺癌类器官专用培养基及3D培养方法，该培养基包括基础培养基和特异性添加因子；所述特异性添加因子包括以下终浓度的组分：GSK429286A：5uM；Doramapimod:15uM；A83-01:0.5uM；EGF:500ng/ml；β-estradiol:2nM；Cholera Toxin:25ng/ml；FGF2:3uM；HEPES:10mM；B27:3X；GlutaMAX：1X；ITS:0.1X；Gentamicin:10ug/ml；Neuregulin-1：2nM；BSA：10mg/ml；TN-C重组蛋白：100ng/ml。培养方法同实施例1。培养12天获得的类器官形貌图如图7所示，形成的肿瘤类器官细胞球形规则，且直径较大，活性较好。
实施例4
本实施例提供一种乳腺癌类器官专用培养基及3D培养方法，该培养基包括基础培养基和特异性添加因子；所述特异性添加因子包括以下终浓度的组分：GSK429286A：20uM；Doramapimod:5uM；A83-01:1uM；EGF:50ng/ml；β-estradiol:10nM；Cholera Toxin:10ng/ml；FGF2:1uM；HEPES:30mM；B27:5X；GlutaMAX：2X；ITS:0.3X；Gentamicin:50ug/ml；Neuregulin-1：10nM；BSA：1mg/ml；TN-C重组蛋白：100ng/ml。培养方法同实施例1。培养9天获得的类器官形貌图如图8所示，形成的肿瘤类器官数量较多，活性较好。
实施例5
本实施例提供一种乳腺癌类器官专用培养基及3D培养方法，该培养基与实施例1的区别在于：特异性添加因子中没有TN-C重组蛋白。培养方法同实施例1。培养14天获得的类器官形貌图如图9所示，表明在未加入TN-C重组蛋白的前提下，虽然也可以获得类器官，但细胞活性较比前几个实施例的都要差，且无直径大于50um的类器官形成。
实施例6
本实施例提供一种乳腺癌类器官的培养方法，是采用实施例1的培养基，该培养方法包括以下步骤：
1)将取出的乳腺癌组织用生理盐水清洗后，在冰上剪碎，加入10ml胰酶重悬，转移至37℃，220rpm摇床消化10分钟，消化完成后加入5ml的DMEM/F12终止消化。
2)用70um的细胞滤网过滤消化完的细胞悬液，1200rpm，离心5分钟，收集沉淀；
3)加入5ml的红细胞裂解液重悬沉淀，用5ml的DMEM/F12终止裂解后离心，去除上清，细胞计数；
4)计数完成后，将细胞沉淀混合matrigel，20000个细胞每滴，滴于24孔板中，放置于37℃，5％的CO2培养箱中，待matrigel胶凝固后，加入上述专用培养基于37℃、5％CO2浓度下培养30，60，90天，每间隔2-3天更换一次培养基，即得。图10～12提供了在30/60/90天获得的类器官的状态图，所形成的类器官结构规则，形态均匀，表明采用本发明的培养基可以对该类器官进行长期稳定培养。
对比例1
本对比例提供一种乳腺癌类器官的培养方法，该培养基与实施例1的区别在于：采用的是现有普通培养基(DMEM+10％FBS)，并且不含有TN-C重组蛋白，培养过程同实施例1。图13和14提供了培养5天和10天的细胞状态图，乳腺癌组织细胞在培养过程中细胞生长缓慢且容易附着在培养皿底部，无法形成有球形结构的、多细胞成份的类器官。
对比例2
本对比例中提供的培养基中减去GSK429286A因子，其他同实施例1。
使用上述培养基按照实施例1的方法培养14天，获得的类器官状态如图15所示，结果为：减去GSK429286A因子后，细胞团连接松散活性较差，内部脱落坏死细胞增多。
对比例3
本对比例中提供的培养基中减去Doramapimod因子，其他同实施例1。
使用上述培养基按照实施例1的方法培养14天，获得的类器官状态如图16所示，结果为：减去Doramapimod因子后，细胞团直径普遍较小，且细胞间相互作用较差。
综上，本发明的培养基可实现乳腺癌类器官的快速生长，并可长期稳定培养，形成的肿瘤类器官细胞球形规则，且类器官直径较大，活性较好，能在体外很好地保留患者肿瘤组织的异质性。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种乳腺癌类器官专用培养基，其特征在于：包括基础培养基和特异性添加因子；所述特异性添加因子包括GSK429286A；Doramapimod；A83-01；EGF；β-estradiol；CholeraToxin；FGF2；HEPES；B27；GlutaMAX；ITS；Gentamicin；Neuregulin-1；BSA。
2.根据权利要求1所述的一种乳腺癌类器官专用培养基，其特征在于：所述特异性添加因子包括以下终浓度的组分：GSK429286A：5-20uM；Doramapimod：5-20uM；A83-01：0.5-1uM；EGF：50-500ng/ml；β-estradiol：2-10nM；Cholera Toxin：10-30ng/ml；FGF2：1-5uM；HEPES：10-30mM；B27：1-5X；GlutaMAX：1-2X；ITS：0.1-1X；Gentamicin：0.5-50ug/ml；Neuregulin-1：2-10nM；BSA：1-10mg/ml。
3.根据权利要求1或2所述的一种乳腺癌类器官专用培养基，其特征在于：所述培养基还包括重组蛋白。
4.根据权利要求3所述的一种乳腺癌类器官专用培养基，其特征在于：所述重组蛋白为TN-C重组蛋白，其在所述培养基中的终浓度为50-100ng/ml。
5.根据权利要求4所述的一种乳腺癌类器官专用培养基，其特征在于：所述特异性添加因子包括以下终浓度的组分：GSK429286A：10-15uM；Doramapimod:6-8uM；A83-01:0.7-0.8uM；EGF:150-200ng/ml；β-estradiol:4-6nM；Cholera Toxin:10-15ng/ml；FGF2:1-5uM；HEPES:15-20mM；B27:1-5X；GlutaMAX：1-2X；ITS:0.5-1X；Gentamicin:20-30ug/ml；Neuregulin-1：5-6nM；BSA：4-5mg/ml；TN-C重组蛋白：70-80ng/ml。
6.根据权利要求1所述的一种乳腺癌类器官专用培养基，其特征在于：所述基础培养基为无血清培养基。
7.根据权利要求1所述的一种乳腺癌类器官专用培养基，其特征在于：所述无血清培养基为DMEM/F12(1:1)减血清培养基。
8.根据权利要求1所述的一种乳腺癌类器官专用培养基，其特征在于：所述培养基的制备方法为：将特异性添加因子加入到基础培养基中混合均匀既得。
9.一种乳腺癌类器官3D培养方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)将分离的乳腺癌组织进行预处理后消化并过滤，得到细胞沉淀；
2)将细胞沉淀裂解，然后与matrigel胶混匀并接种，待混合胶凝固后加入权利要求1～8任意一项所述的培养基，并于37℃、5％CO2浓度下培养7-14天，每间隔2-3天更换一次所述培养基，即得。
10.一种乳腺癌类器官，其特征在于：是采用权利要求9所述的培养方法获得。
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