CN116064395A - 构建脑胶质瘤类器官的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及类器官技术领域，公开了一种构建脑胶质瘤类器官的方法。本发明提供的方法通过利用具有特定结构的培养装置，能够实现在静置条件下进行胶质瘤类器官构建和扩培，避免了摇床等额外设备的使用，降低了对培养箱的要求，同时也降低了培养过程中微生物感染的风险。此外，本发明提供的方法能够更好地模拟人体免疫微环境，提高了采用该方法获得的胶质瘤类器官进行的实验参考价值。

Description

构建脑胶质瘤类器官的方法
技术领域
本发明涉及类器官技术领域，具体涉及一种构建脑胶质瘤类器官的方法。
背景技术
类器官是一种三维细胞培养物，其与对应的人体器官具有高度相似的组织学特征，能够在体外重现器官的部分生理功能。类器官的出现，为研究人员提供了一种新的具有独特优势的体外模型，其可复制出已分化组织的复杂空间形态，并能够表现出细胞与细胞、细胞与基质之间的相互作用。类器官去除了动物模型可能引入的混淆变量，但与均一化的2D细胞培养物相比，则提供更高度的复杂性。通过结合高水平的生理相关性与体外操作的便利性，在许多情况下，类器官具有辅助或替代体外使用原代细胞或永生化细胞系和动物实验的潜力。另外，类器官在培养中具有高度基因稳定性，维持了来源组织的基因型与表型。因此，类器官在干细胞与发育、再生医学、疾病研究、药物开发和精准医疗等多个领域拥有广泛的应用前景。
胶质瘤是最常见的原发性颅内肿瘤，为了更好地研究胶质瘤的致病机理和治疗方法，科学家构建了胶质瘤类器官。例如，Jacob等人2020年在Generation and biobankingof patient-derived glioblastoma organoids and their application in CAR T celltesting.一文中介绍了采用机械破碎法将胶质瘤组织剪切成1mm3的碎片，然后置于培养液中，在水平摇床上震荡培养。该方法中，摇床的设置是为了在培养过程中能够为类器官提供充分的空气交换，然而，通常用于培养类器官的培养箱都采用5％CO2的培养条件，在CO2中长期暴露易导致摇床损坏，而且，摇床一方面会占用培养箱中的大量空间，另一方面，这种额外设备的需求即对培养箱和摇床都有一定的要求，而且还增加了培养物染菌的风险。此外，该方法对于胶质瘤样品的体积和质量也具有较高要求，并且培养的成功率还有待进一步提高。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术存在的胶质瘤类器官构建方法中需要在培养箱中放置额外的摇床等设备，而且对样品的要求高，培养成功率不足等问题，提供一种构建脑胶质瘤类器官的方法，该方法能够实现在静置条件下进行胶质瘤类器官构建和扩培，并且具有较高的培养成功率。
为了实现上述目的，本发明一方面提供一种构建脑胶质瘤类器官的方法，其特征在于，所述方法包括将采用基质胶包被的脑胶质瘤样品置于气-液交界培养装置中进行培养，所述气-液交界培养装置中装有培养基，培养基的用量使得样品不超过50体积％浸没在其中。
本发明第二方面提供第一方面所述的方法中，用于构建脑胶质瘤类器官的培养基。
通过上述技术方案，本发明至少能够取得如下有益效果：
(1)本发明提供的方法采用气-液交界培养装置进行胶质瘤类器官的培养，通过气-液交界培养装置的作用保证胶质瘤类器官的空气交换，从而无需使用摇床等额外设备，减少了对培养箱的要求，同时也降低了培养过程中微生物感染的风险。
(2)本发明提供的方法先以基质胶包被胶质瘤组织，再将其置于培养基中培养，与现有技术中直接将类器官置于培养基中的培养方式相比，能够更好地模拟人体免疫微环境，提高了采用本发明提供的方法制备获得的胶质瘤类器官的实验参考价值。
(3)现有技术中的胶质瘤培养方法为了获得更高的培养成功率，通常需要较大体积的样本，而且通常需要高质量肿瘤实质部分，这极大限制了样品的来源。而本发明提供的方法无需太大体积的样本，对于样本的质量也要求不高，但是该方法能够以较高的成功率构建获得胶质瘤类器官。
(4)本发明提供的方法不仅降低了胶质瘤样品的用量，而且还极大节约了培养液的使用量，十分利于控制实验成本。
附图说明
图1是本发明提供的方法中所采用的气-液交界培养装置的结构示意图。
图2是实施例1中获得的脑胶质瘤类器官形态图(图例为200μm)。
图3实施例1中获得的脑胶质瘤类器官的免疫荧光染色图。
附图标记说明
图1中，1为内培养皿，2为外培养皿。
具体实施方式
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
胶质瘤类器官的构建和传代过程中，需要在培养体系中保持一定的空气含量，使得胶质瘤类器官能够充分与空气接触，从而促进其生长。因此，通常胶质瘤类器官培养时需要在培养箱中放置摇床，通过震荡培养的方式保证培养基中的空气溶解量。本发明的发明人在研究的过程中巧妙地发现，通过合理设计培养皿的结构，能够有效提高胶质瘤类器官在培养过程在于空气的接触面积，从而使其能够在静置条件下进行培养，避免了摇床的使用。这不仅可以降低对培养箱的要求(例如传统方法中必须采用体积足够大的培养箱以容纳摇床，而且放入摇床后的培养箱剩余容积也需要足够大，避免培养箱内太过拥挤导致空气不流通，对胶质瘤类器官的生长不利)，而且还降低了额外设备引入导致的微生物感染的风险。
发明人经进一步研究，设计了一种适合在静置条件下进行胶质瘤类器官培养的气-液交界培养装置(图1中示出了其结构示意图)。发明人还发现，采用该装置，配合含有特定成分的培养基进行胶质瘤类器官构建，能够有效提高胶质瘤类器官的构建成功率和质量。
基于上述发现，本发明一方面提供一种构建脑胶质瘤类器官的方法，所述方法包括将采用基质胶包被的脑胶质瘤样品置于气-液交界培养装置中进行培养，所述气-液交界培养装置中装有培养基，培养基的用量使得被基质胶包被的样品不超过50体积％浸没在其中。
任意能够用于类器官培养或3D细胞培养的基质胶均可适用于本发明。根据本发明的优选实施方式，其中，所述基质胶的pH不低于7.3(优选为7.3-7.4)。本发明可以直接采用符合前述pH条件的基质胶，也可以在使用前先对基质胶的pH值进行条件，使其满足前述要求。另外，本发明对于所述基质胶的来源也没有特别限制，其即可为自行制备获得的相关产物，也可以是直接通过商购或定制获得的相关产品(例如可以是购自Corning公司的
Figure BDA0004065858290000041
basement membrane等基质胶产品)。
优选地，所述基质胶使用前采用培养基进行稀释。优选用于稀释的培养基与基质胶的体积比为10-50∶1。
更优选地，用于包被脑胶质瘤样品的基质胶与脑胶质瘤样品的体积比为2-10∶1。
本发明提供的方法与现有技术相比，能够有效降低对胶质瘤样品的体积要求，实现采用适中或较小体积的胶质瘤样品进行类器官的构建和培养，降低对原料样品的要求，提高了胶质瘤类器官构建的普适性。根据本发明的一些优选实施方式，其中，所述脑胶质瘤样品的尺寸不超过2cm×2cm×2cm。优选为1-1.5cm×1-1.5cm×1-1.5cm。
根据本发明的优选实施方式，其中，所述培养基包括基础培养基和添加剂，所述基础培养基选自DMEM/F-12、Neurobasal和Hibernate中的至少一种，所述添加剂中包含B-27添加剂、N2添加剂、碱性成纤维细胞生长因子(FGF-2)、维生素A、维生素C、胰岛素和β-巯基乙醇中的至少一种。
优选地，所述添加剂中还含有抗生素、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、烟酰胺中的至少一种。
任意适合类器官培养过程中使用的抗生素均可适用于本发明。优选地，所述抗生素选自青霉素、链霉素和两性霉素B中的至少一种。
更优选地，所述非必需氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、门冬酰胺、门冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸和丝氨酸中的至少一种。本发明中，对于所述非必需氨基酸的来源没有特别限制，其既可以是自行配置获得的，也可以是直接通过商购或定制获得的相关产品(例如商购获得的NEAA复合添加剂等)。
根据本发明的优选实施方式，其中，所述培养基中，添加剂的用量使得其在培养基中的含量为：抗生素1-2体积％(若采用复合抗生素，则此处的含量为各抗生素的总含量)，L-谷氨酰胺1-2体积％，非必需氨基酸1-2体积％(若采用多种非必需氨基酸，则此处的含量为各非必需氨基酸的总含量)，4-羟乙基哌嗪乙磺酸1-2体积％，烟酰胺1-2体积％，B-27添加剂2-4体积％，N2添加剂1-4体积％，碱性成纤维细胞生长因子2-10nM，维生素A1-2体积％，维生素C1-2体积％，胰岛素10-50μg/mL，β-巯基乙醇0.1-0.2体积％。
优选地，所述抗生素的用量使其在培养基中的终浓度为青霉素100-200U/mL，链霉素0.1-0.2mg/mL，所述L-谷氨酰胺的用量使其在培养基中的终浓度为2-4mM，所述非必需氨基酸的用量使其在培养基中的终浓度为100-200μM(应当注意的是，若采用多种非必须氨基酸，此处的终浓度是指其中单独每种非必须氨基酸的终浓度)，所述4-羟乙基哌嗪乙磺酸的用量使其在培养基中的终浓度为10-20mM，所述烟酰胺的用量使其在培养基中的终浓度为4-8mM，B-27添加剂的用量使其在培养基中的终浓度为0.5-5×，N-2添加剂的用量使其在培养基中的终浓度为0.5-5×，维生素A的用量使其在培养基中的终浓度为200-400μM，维生素C的用量使其在培养基中的终浓度为100-200μM，β-巯基乙醇的用量使其在培养基中的终浓度为50-100μM。
更优选地，所述非必须氨基酸的用量使得培养基中：甘氨酸的终浓度为100-200μM，丙氨酸的终浓度为100-200μM，门冬酰胺的终浓度为100-200μM，门冬氨酸的终浓度为100-200μM，谷氨酸的终浓度为100-200μM，脯氨酸的终浓度为100-200μM，丝氨酸的终浓度为100-200μM。
参考图1中的结构示意图，根据本发明的优选实施方式，其中，所述气-液交界培养装置包括外培养皿和内培养皿，所述外培养皿的直径为内培养皿直径的1.5-3倍。该气-液交界培养装置中，内培养皿置于外培养皿中，在进行胶质瘤类器官培养时，将包被了脑胶质瘤样品(胶质瘤组织或胶质瘤类器官)的基质胶置于内培养皿中，在外培养皿中加入培养基(培养基通过设置在内培养皿底部的孔洞或条缝能够渗透进入内培养皿，从而与胶质瘤类器官接触)。
优选地，所述内培养皿底部含有孔洞或条缝，以使培养基能够通过所述孔洞或条缝进入内培养皿中与包被了脑胶质瘤样品的基质胶接触。所述孔径或条缝的大小能够使得培养基通过，使其中包含的成分能够与胶质瘤样品充分接触即可。优选所述孔洞的直径(或条缝的宽度)为0.2-0.8μm。
根据本发明的一种优选实施方式，其中，所述内培养皿底部采用半透膜制成，所述半透膜上含有尺寸如前所述的孔洞以供培养基进入内培养皿中。本发明对于所述半透膜的具体选择没有特别限制，能够适用于胶质瘤培养即可。优选培养基及其中所含成分(例如各种小分子添加剂等)和胶质瘤类器官在培养过程中分泌表达的代谢物均能够透过所述半透膜。
本发明对于所述气-液交界培养装置的尺寸没有特别限制，只要能够满足胶质瘤类器官培养的需要即可。优选所述外培养皿与内培养皿的直径之比为1.2-5。根据本发明的一种优选实施方式，其中，所述外培养皿的直径为60-100mm，所述内培养皿的直径为30-50mm。通过采用上述尺寸的培养装置，能够有效控制用于培养胶质瘤类器官的胶质瘤组织的体积，从而实现以适中体积的肿瘤样本进行胶质瘤类器官的构建，并且能够适当降低对用于构建类器官的胶质瘤组织的质量要求(现有技术方法通常需要采用高质量肿瘤实质部分才能以较高成功率构建胶质瘤类器官，而采用本发明的方法只要采用适中质量的胶质瘤样品即可)。
本发明提供的气-液交界培养装置能够使得胶质瘤类器官与空气充分接触，无需采用额外设备或手段提高培养基中的溶氧量。因此，优选所述气-液交界培养装置不包含摇床或振荡器。
根据本发明的优选实施方式，其中，所述方法还包括预处理的步骤，所述预处理的步骤优选包括对气-液交界培养装置的预处理和对胶质瘤样品的预处理。
根据本发明的优选实施方式，其中，所述对气-液交界培养装置的预处理包括在将胶质瘤样品置于内培养皿中之前，先在内培养皿中铺设基质胶层。
优选地，所述基质胶层的厚度不超过内培养皿高度的50％，优选不超过3mm。所述基质胶层的作用在于为之后加入的由基质胶包被的胶质瘤组织提供一个“平台”，使其能够与培养皿底部之间具有一定高度，从而使得部分由基质胶包被的胶质瘤组织能够露出培养基液面与空气充分接触。
根据本发明的优选实施方式，其中，所述对胶质瘤样品的预处理包括对胶质瘤样品的清洗和粉碎。
优选地，所述清洗包括在粉碎前对胶质瘤样品进行第一清洗和在粉碎后对粉碎的胶质瘤样品进行第二清洗的步骤。
优选地，所述清洗采用的试剂中Mg和Ca的(总)含量不超过0.1g/L。
根据本发明的优选实施方式，其中，所述培养的条件包括：温度36-38℃，培养基蒸发量达到加入量的50体积％以上时更换培养基。优选每4-7天更换一次。
本发明第二方面提供如前所述的方法中，用于构建脑胶质瘤类器官的培养基。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。应当能够理解的是，以下实施例仅用于示例性地解释和说明本发明的内容，而不用于限制本发明。
以下实施例中采用的DPBS++缓冲液为Mg2+和Ca2+总含量约为0.1g/L的PBS缓冲液。未作特殊说明的情况下，采用的试剂和材料均为购自正规化学或生物试剂/材料供应商的商购产品，试剂均为分析纯。
制备例1
(一)培养装置
参考图1中的结构示意图，制备用于培养胶质瘤类器官的气-液交界培养装置。其中，内培养皿的直径为30mm，高度为13mm，内培养皿底部采用亲水性聚四氟乙烯材质的半透膜制成，其上具有直径0.4μm的孔洞。外培养皿的直径为60mm，高度为15mm。
(二)培养基
按照表1中的配方，以DMEM/F-12培养基为基础培养基，制备用于胶质瘤类器官构建的培养基。其中，B-27添加剂购自Thermo Fisher公司，货号为12587010，N-2添加剂购自Thermo Fisher公司，货号为17502001，维生素A购自Selleck公司，货号为S1653，维生素C购自Selleck公司，货号为S3114，β-巯基乙醇购自Thermo Fisher公司，货号为21985023，青霉素-链霉素购自Thermo Fisher公司，货号为15140163，L-谷氨酰胺购自Thermo Fisher公司，货号为35050079，4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)购自Thermo Fisher公司，货号为15630130，烟酰胺购自MCE公司，货号为HY-B0150。非必须氨基酸为购自购自Thermo Fisher公司，货号为11140050的混合氨基酸补充剂，其中含有甘氨酸、丙氨酸、门冬酰胺、门冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸和丝氨酸。
表1
Figure BDA0004065858290000091
实施例1
采用如下方法进行脑胶质瘤类器官构建。其中，采用的胶质瘤样品来源于脑胶质瘤患者手术后切除的肿瘤组织，已取得相关人员知情同意。
第一清洗：将脑胶质瘤组织采用预冷(4℃)的DPBS++反复清洗3次。
样品粉碎：将清洗后的脑胶质瘤组织移至10cm无菌培养皿中，采用无菌手术刀将其切割成粒径约0.5-1mm的碎块。
第二清洗：将粉碎后的胶质瘤样品采用常温DPBS++缓冲液反复清洗3次。
红细胞裂解：将第二清洗后获得的粉碎的胶质瘤样品中加入10mL红细胞裂解缓冲液(购自Thermo Fisher公司，货号为00433357)，室温下10rpm摇床震荡10min。裂解结束后采用常温DMEM/F12培养基重复清洗3次，获得待培养的胶质瘤组织。
类器官种板：取制备例1中获得的气-液交界培养装置，在内培养皿中加入1mL基质胶(
Figure BDA0004065858290000101
basement membrane，货号为356231)，然后将其置于37℃培养箱中静置30min，使基质胶凝固形成厚度约1mm的基质胶层。
取适量待培养的胶质瘤组织与1mL基质胶混合(胶质瘤组织与基质胶的体积比约为1∶5)，然后将混合凝胶液加入到内培养皿中，将其置于37℃培养箱中静置30min，使其在基质胶层上方形成胶质瘤组织层。然后向外培养皿中加入1mL制备例1中配制的培养基(培养基加入量使得约50％的胶质瘤组织层浸没在培养基中)。
类器官培养和传代：将气-液交界培养装置置于37℃培养箱(5％CO2)中，每天观察培养基的蒸发情况，并采用显微镜观察胶质瘤类器官的培养情况。当培养基蒸发量达到50％时更换新鲜培养基(加入量为1mL)。当类器官生长到直径为1-2mm时进行胶质瘤类器官传代。
图2示出了采用上述方法所培养出的脑胶质瘤类器官的显微图片。从图中可以看出，采用上述方法获得的胶质瘤类器官均匀分布在内培养皿中，直径在1mm左右，具有光滑的边缘和致密的核心。
共计采用50例脑胶质瘤患者来源的胶质瘤样品按照上述方法进行类器官培养，均成功获得胶质瘤类器官(通过胶质瘤样品培养获得的胶质瘤类器官的形态特征与图2类似即视为培养成功)，培养成功率100％(50/50)。
对获得的胶质瘤类器官进行免疫荧光染色鉴定，发现这些类器官中均保留了脑胶质瘤的代表性标志物：星形胶质细胞。星形胶质细胞的存在通过检测星形胶质细胞活化的标志物胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)确定。免疫荧光染色结果如图3所示，图中蓝色荧光为DAPI(代表细胞核)，绿色荧光为GFAP(代表星形胶质细胞)。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种构建脑胶质瘤类器官的方法，其特征在于，所述方法包括将采用基质胶包被的脑胶质瘤样品置于气-液交界培养装置中进行培养，所述气-液交界培养装置中装有培养基，培养基的用量使得被基质胶包被的样品不超过50体积％浸没在其中。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述基质胶的pH不低于7.4；
优选地，所述基质胶使用前采用培养基进行稀释，优选用于稀释的培养基与基质胶的体积比为10-50∶1；
更优选地，用于包被脑胶质瘤样品的基质胶与脑胶质瘤样品的体积比为2-10∶1。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述脑胶质瘤样品的尺寸不超过2cm×2cm×2cm，优选为1-1.5cm×1-1.5cm×1-1.5cm。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述培养基包括基础培养基和添加剂，所述基础培养基选自DMEM/F-12、Neurobasal和Hibernate中的至少一种，所述添加剂中包含B-27添加剂、N2添加剂、碱性成纤维细胞生长因子、维生素A、维生素C、胰岛素和β-巯基乙醇中的至少一种；
优选地，所述添加剂中还含有抗生素、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、烟酰胺中的至少一种；
更优选地，所述抗生素选自青霉素、链霉素和两性霉素B中的至少一种；
更优选地，所述非必需氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、门冬酰胺、门冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸和丝氨酸中的至少一种。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述培养基中，添加剂的用量使得其在培养基中的含量为：抗生素1-2体积％，L-谷氨酰胺1-2体积％，非必需氨基酸1-2体积％，4-羟乙基哌嗪乙磺酸1-2体积％，烟酰胺1-2体积％，B-27添加剂2-4体积％，N-2添加剂1-4体积％，碱性成纤维细胞生长因子2-10nM，维生素A1-2体积％，维生素C1-2体积％，胰岛素10-50μg/mL，β-巯基乙醇0.1-0.2体积％；
优选地，所述抗生素的用量使其在培养基中的终浓度为青霉素100-200U/mL，链霉素0.1-0.2mg/mL，所述L-谷氨酰胺的用量使其在培养基中的终浓度为2-4mM，所述非必需氨基酸的用量使其在培养基中的终浓度为100-200μM，所述4-羟乙基哌嗪乙磺酸的用量使其在培养基中的终浓度为10-20mM，所述烟酰胺的用量使其在培养基中的终浓度为4-8mM，B-27添加剂的用量使其在培养基中的终浓度为0.5-5×，N-2添加剂的用量使其在培养基中的终浓度为0.5-5×，维生素A的用量使其在培养基中的终浓度为200-400μM，维生素C的用量使其在培养基中的终浓度为100-200μM，β-巯基乙醇的用量使其在培养基中的终浓度为50-100μM。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述气-液交界培养装置包括外培养皿和内培养皿，所述外培养皿的直径为内培养皿直径的1.5-3倍；
优选地，所述内培养皿底部含有孔洞或条缝，优选所述孔洞的直径为0.2-0.8μm；
更优选地，所述外培养皿的直径为60-100mm，所述内培养皿的直径为30-50mm；
更优选地，所述气-液交界培养装置不包含摇床或振荡器。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法还包括预处理的步骤，所述预处理的步骤优选包括对气-液交界培养装置的预处理和对胶质瘤样品的预处理。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述对气-液交界培养装置的预处理包括在将胶质瘤样品置于内培养皿中之前，先在内培养皿中铺设基质胶层；
优选地，所述基质胶层的厚度不超过内培养皿高度的50％，优选不超过3mm；
和/或，所述对胶质瘤样品的预处理包括对胶质瘤样品的清洗和粉碎；
优选地，所述清洗包括在粉碎前对胶质瘤样品进行第一清洗和在粉碎后对粉碎的胶质瘤样品进行第二清洗的步骤；
优选地，所述清洗采用的试剂中Mg和Ca的含量不超过0.1g/L。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述培养的条件包括：温度36-38℃，培养基蒸发量达到加入量的50体积％以上时更换培养基，优选每4-7天更换一次。
10.权利要求1-9中任意一项所述的方法中，用于构建脑胶质瘤类器官的培养基。
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