CN115820560B

CN115820560B - 一种复发性呼吸道乳头状瘤病类器官的构建方法及其应用

Info

Publication number: CN115820560B
Application number: CN202310025357.4A
Authority: CN
Inventors: 朱栋元; 刘增军; 肖洋; 邵思源
Original assignee: Cancer Hospital of Shandong First Medical University
Current assignee: Cancer Hospital of Shandong First Medical University
Priority date: 2023-01-09
Filing date: 2023-01-09
Publication date: 2023-06-09
Anticipated expiration: 2043-01-09
Also published as: CN115820560A

Abstract

本发明涉及类器官领域，尤其涉及一种复发性呼吸道乳头状瘤病类器官的构建方法及其应用。构建方法，步骤至少包括以下几步：（1）类器官系统的构建；（2）类器官系统的检测验证；（3）类器官系统的药物敏感性测试。本发明提供的一种复发性呼吸道乳头状瘤病类器官的构建方法，能够有效地实现RRP类器官的快速培育，且类器官的培养成功率高，能够实现类器官的单细胞和组织的多形式培养，实现肿瘤的快速成型，极大地加速了肿瘤相关实验以及相关测试的进程时间，适宜在医学领域推广，具有广阔的发展前景。

Description

一种复发性呼吸道乳头状瘤病类器官的构建方法及其应用

技术领域

本发明涉及类器官领域，尤其涉及一种复发性呼吸道乳头状瘤病类器官的构建方法及其应用。

背景技术

复发性呼吸道乳头状瘤病（RRP）是一种由HPV感染引起的呼吸道疾病。该疾病虽为良性罕见病，但仍有可能发生恶性病变，造成入睡和吞咽困难、呼吸道狭窄、麻醉意外、声音嘶哑等不良后果，影响患者生活质量。该病发生恶性转移的可能性在儿童中为30%，成人中为16%，死亡率为1~2%。即使手术切除肿瘤，RRP有明显复发趋势，若不进行及时治疗，疾病发展至肺部时，患者可能会出现复发性肺炎、支气管扩张等慢性肺部疾病，最终导致进行性肺衰竭。由于该病需要反复进行手术治疗、联合药物治疗和随访观察，对患者及其家庭造成严重的心理和精神负担。

传统的二维肿瘤细胞系模型和患者来源肿瘤异种移植模型（PDTX）长期以来被用作肿瘤研究模型。然而，以上两种肿瘤模型均具有缺点：肿瘤细胞系模型多次传代后，原始肿瘤细胞缺乏遗传异质性，无法模拟肿瘤微环境和器官特异性功能；而PDTX模型虽能较好保持肿瘤异质性，但其造模成功率低，动物培养周期长，不利于高通量大规模科学研究。近年来新兴的类器官技术，结合了传统二维细胞培养和动物模型的优势，较好弥补了现有肿瘤模型的不足，为肿瘤研究提供了更合适的临床前模型。通过将RRP患者组织培养成类器官，为探索RRP的发病机制和治疗方案提供了新的思路。

本申请提供了一种复发性呼吸道乳头状瘤病类器官的构建方法。本发明构建的RRP类器官模型，具有与原发组织相似的组织学特征及病理生理学功能，维持了肿瘤细胞基质与干细胞组成成分，具有培养方法简便，培养周期短，实验费用低，可大规模培养及反复获取的优点。其治疗反应与原发RRP高度相似，为患者个体化药物治疗提供了全新验证模型。

发明内容

为了解决上述问题，本发明第一方面提供了一种复发性呼吸道乳头状瘤病类器官的构建方法，步骤至少包括以下几步：（1）类器官系统的构建；（2）类器官系统的检测验证；（3）类器官系统的药物敏感性测试。

作为一种优选的方案，所述类器官系统的构建包括复发性呼吸道乳头状瘤病类器官的培养和复发性呼吸道乳头状瘤病类器官的传代步骤。

作为一种优选的方案，所述类器官系统的构建的步骤包括：（1）组织样本的消化；（2）终止消化；（3）内源性DNA去除；（4）红细胞裂解；（5）单细胞悬液的制备；（6）类器官接种培养；（7）类器官传代培养。

作为一种优选的方案，所述类器官系统的构建的具体步骤包括：（1）消化RRP组织样本：RRP手术或活检组织样本，用清洗液洗涤2-3遍，用组织剪将其剪成肉糜状，根据组织块大小加入适量消化液，37℃摇床消化20~60分钟。显微镜下观察出现3-10个细胞成团时停止消化。每隔10分钟上下颠倒摇晃离心管，保证样本消化彻底；（2）终止消化：加入与消化液等体积的终止液终止消化，1500rpm，4℃，离心10分钟，弃上清；（3）去除内源性DNA：加入1~2mL的DNase I，水浴2分钟后加入终止液终止，1500rpm，4℃，离心10分钟，弃上清；（4）裂解红细胞：加入1~2mL红细胞裂解液重悬细胞沉淀，冰上放置1~2分钟。随后加入等体积清洗液进行清洗，1500rpm，4℃，离心10分钟，弃上液；（5）制备单细胞悬液：用清洗液重悬细胞沉淀后，用70~100μm滤器过滤得到单细胞悬液，1500rpm，4℃，离心10min，弃上清得到细胞沉淀；（6）接种培养RRP类器官：细胞沉淀用1~1.5 mL清洗液重悬后转移至新的1.5mL EP管内，1500rpm，离心5分钟；该步骤进行两次后进行细胞计数，之后48孔板中，按每孔1x10²~1x10⁶个细胞密度进行类器官接种，在冰上用每孔5~15μL基质胶混匀细胞沉淀，接种于孔中央，避免气泡产生，将48孔板放入CO₂培养箱中静置5~10分钟，待基质胶完全凝固后取出48孔板，每孔加入200~250μL类器官培养液，放入培养箱进行培养；（7）3~4天更换新鲜类器官培养液，并于7~14天进行传代。

作为一种优选的方案，所述类器官系统的检测验证包括复发性呼吸道乳头状瘤病类器官的免疫组化验证，复发性呼吸道乳头状瘤病类器官的WES/WGS/RNA-seq测序以及复发性呼吸道乳头状瘤病类器官的单细胞测序和质谱流式验证。

作为一种优选的方案，所述复发性呼吸道乳头状瘤病类器官的免疫组化验证的步骤包括以下几步：（1）取RRP类器官样本进行脱水包埋；（2）进行石蜡切片，烤片之后进行二甲苯脱蜡；经过无水乙醇，单蒸水和PBST清洗之后进行抗原修复，之后清洗，加动物非免疫血清进行封闭；（3）之后进行一抗，二抗处理，清洗完毕之后进行DAB显色处理；（4）进行苏木素复染，用水进行冲洗，之后经过脱水，做成中性树胶封片；（5）最后进行拍照，读片。

作为一种优选的方案，所述类器官系统的药物敏感性测试为复发性呼吸道乳头状瘤病类器官的药物敏感性测试。

作为一种优选的方案，所述组织样本的消化中消化液的成分包括：100~200U/mL青霉素，50~200μg/mL链霉素，0.5~2mg/mL胶原蛋白酶，0.01~0.2mg/mL透明质酸酶以及基础液。

作为一种优选的方案，所述终止消化中的终止液的成分包括：3~6% FBS，50~120U/mL青霉素，50~100μg/mL链霉素以及基础液。

作为一种优选的方案，所述类器官接种培养中培养液的成分包括：0.5~2% HEPES，0.5~2% GlutaMAX，50× B27，1~10μM A83-01，20~80ng/mL EGF，5~20% Noggin，5~20% R-spondin1，1~100nM Gastrin，100~500nM FGF10，1~100mM Nicotinamide，10mM Y-27632以及基础液。

作为一种优选的方案，所述清洗液为1×无菌PBS。

作为一种优选的方案，所述基础液为Advanced DMEM/F12基质液。

本发明第二方面提供了一种上述复发性呼吸道乳头状瘤病类器官的构建方法的应用，包括该构建方法在传代制备类器官方法中的应用。

有益效果：

1、本申请中提供的一种复发性呼吸道乳头状瘤病类器官的构建方法，其能够有效实现RRP类器官的快速培育，且培养成功率较高，能够实现类器官的单细胞和组织的多形式培养，实现RRP体外的快速成型，从而极大加速了RRP相关实验及相关研究进展。

2、本申请中提供的一种复发性呼吸道乳头状瘤病类器官的构建方法，其通过特定复配含量的类器官细胞培养液和传代培养液的使用，有效地提高了类器官培养的成功率，尤其是在使用单细胞培养时，采用的上述培养液除了能够进一步的为单细胞提供培养和传代所需的各营养物质，还能够有效抑制培养液中的各异源性物质的滋生。

3、本申请中提供的一种复发性呼吸道乳头状瘤病类器官的构建方法，其能够在类器官的培养和传代过程中，进一步探究RRP在免疫功能正常的机体中的发展机制及相关成型过程中具有突出表现的标志性物质，能够有效的应用于新的疾病标志物的探索。

附图说明

图1为本申请中实施例1所制备的RRP类器官P0代第五天生长状态显微镜观察图。

图2为本申请中实施例1所制备的RRP类器官P1代第五天生长状态显微镜观察图。

图3为本申请中实施例1所制备的RRP类器官P2代第七天生长状态显微镜观察图。

图4为本申请中实施例1所制备的RRP类器官P3代第五天生长状态显微镜观察图。

图5为本申请中实施例1所制备的RRP类器官P4代第五天生长状态显微镜观察图。

图6为本申请中实施例1所制备的RRP类器官的CK5，CK6和IHC染色结果示意图。

图7为本申请中实施例1所制备的RRP类器官的P16的IHC染色结果示意图。

图8为本申请中实施例1所制备的RRP类器官的P63的IHC染色结果示意图。

具体实施方式

实施例1

实施例1第一方面提供了一种复发性呼吸道乳头状瘤病类器官的构建方法，其特征在于：步骤至少包括以下几步：（1）类器官系统的构建；（2）类器官系统的检测验证；（3）类器官系统的药物敏感性测试。

类器官系统的构建包括复发性呼吸道乳头状瘤病类器官的培养和复发性呼吸道乳头状瘤病类器官的传代步骤。

类器官系统的构建的步骤包括：（1）组织样本的消化；（2）终止消化；（3）内源性DNA去除；（4）红细胞裂解；（5）单细胞悬液的制备；（6）类器官接种培养；（7）类器官传代培养。

类器官系统的构建的具体步骤包括：（1）消化RRP组织样本：RRP手术或活检组织样本，用清洗液洗涤3遍，用组织剪将其剪成肉糜状，根据组织块大小加入适量消化液，37℃摇床消化40分钟。显微镜下观察出现10个细胞成团时停止消化。每隔10分钟上下颠倒摇晃离心管，保证样本消化彻底；（2）终止消化：加入与消化液等体积的终止液终止消化，1500rpm，4℃，离心10分钟，弃上清；（3）去除内源性DNA：加入1mL的DNase I，水浴2分钟后加入终止液终止，1500rpm，4℃，离心10分钟，弃上清；（4）裂解红细胞：加入1mL红细胞裂解液重悬细胞沉淀，冰上放置1分钟。随后加入等体积清洗液进行清洗，1500rpm，4℃，离心10分钟，弃上液；（5）制备单细胞悬液：用清洗液重悬细胞沉淀后，用80μm滤器过滤得到单细胞悬液，1500rpm，4℃，离心10min，弃上清得到细胞沉淀；（6）接种培养RRP类器官：细胞沉淀用1.5mL清洗液重悬后转移至新的1.5mL EP管内，1500rpm，离心5分钟；该步骤进行两次后进行细胞计数，之后48孔板中，按每孔1x10⁵个细胞密度进行类器官接种，在冰上用每孔10μL基质胶混匀细胞沉淀，接种于孔中央，避免气泡产生，将48孔板放入CO₂培养箱中静置10分钟，待基质胶完全凝固后取出48孔板，每孔加入250μL类器官培养液，放入培养箱进行培养；（7）3天更换新鲜类器官培养液，并于10天进行传代。

如图1~5所示，根据上述传代步骤，图1~5分别为本实施例制得RRP类器官从P0代~P4代的第五天生长状态显微镜观察图。

类器官系统的检测验证包括复发性呼吸道乳头状瘤病类器官的免疫组化验证，复发性呼吸道乳头状瘤病类器官的WES/WGS/RNA-seq测序以及复发性呼吸道乳头状瘤病类器官的单细胞测序和质谱流式验证。

复发性呼吸道乳头状瘤病类器官的免疫组化验证的步骤包括以下几步：（1）取RRP类器官样本进行脱水包埋；（2）进行石蜡切片，烤片之后进行二甲苯脱蜡；经过无水乙醇，单蒸水和PBST清洗之后进行抗原修复，之后清洗，加动物非免疫血清进行封闭；（3）之后进行一抗，二抗处理，清洗完毕之后进行DAB显色处理；（4）进行苏木素复染，用水进行冲洗，之后经过脱水，做成中性树胶封片；（5）最后进行拍照，读片。

类器官系统的药物敏感性测试为复发性呼吸道乳头状瘤病类器官的药物敏感性测试。

组织样本的消化中消化液的成分包括：150U/mL青霉素，100μg/mL链霉素，1mg/mL胶原蛋白酶，0.1mg/mL透明质酸酶以及基础液。

终止消化中的终止液的成分包括：5% FBS，80U/mL青霉素，60μg/mL链霉素以及基础液。

类器官接种培养中培养液的成分包括：1% HEPES，1% GlutaMAX，50× B27，5μMA83-01，50ng/mL EGF，10% Noggin，10% R-spondin1，50nM Gastrin，250nM FGF10，60mMNicotinamide，10mM Y-27632以及基础液。

清洗液为1×无菌PBS；基础液为Advanced DMEM/F12基质液。

实施例2

本实施例的具体实施方式同实施例1，不同之处在于：类器官接种培养中培养液的成分包括：1.5% HEPES，1.5% GlutaMAX，50× B27，3μM A83-01，30ng/mL EGF，12% Noggin，12% R-spondin1，40nM Gastrin，200nM FGF10，40mM Nicotinamide，10mM Y-27632以及基础液。

实施例3

本实施例的具体实施方式同实施例1，不同之处在于：类器官接种培养中培养液的成分包括：1.5% HEPES，1.5% GlutaMAX，50× B27，3μM A83-01，30ng/mL EGF，12% Noggin，12% R-spondin1，40nM Gastrin，10mM Y-27632以及基础液。

实施例4

本实施例的具体实施方式同实施例1，不同之处在于：1% HEPES，1% GlutaMAX，50× B27，5μM A83-01， 10% Noggin，10% R-spondin1，50nM Gastrin，250nM FGF10，60mMNicotinamide，10mM Y-27632以及基础液。

性能评价

类器官培育成功率：采用实施例供的方法进行模型的构建，并且在构建完成后通过显微镜观察成像，进行染色鉴定，如图6~8所示，图6~8分别为本申请实施例中方案所制得RRP类器官的CK5，CK6和IHC染色结果示意图（图6），P16的IHC染色结果示意图（图7），P63的IHC染色结果示意图（图8）；若PDOX瘤块结果同类器官及来源组织保持一致，则说明PDOX构建成功，每个实施例进行20次模型构建测试，测得的构建结果记入表1。

成功率：计算构建结构的成功率。

表1

通过实施例和表格可以得知，本发明提供的一种类器官的构建方法，能够有效地实现RRP类器官的快速培育，且类器官的培养成功率高，能够实现类器官的单细胞和组织的多形式培养，实现肿瘤的快速成型，极大地加速了肿瘤相关实验以及相关测试的进程时间，适宜在医学领域推广，具有广阔的发展前景。

Claims

1.一种复发性呼吸道乳头状瘤病类器官的构建方法，其特征在于：步骤至少包括以下几步：（1）类器官系统的构建；（2）类器官系统的检测验证；（3）类器官系统的药物敏感性测试；

所述类器官系统的构建包括复发性呼吸道乳头状瘤病类器官的培养和复发性呼吸道乳头状瘤病类器官的传代步骤；

所述类器官系统的构建的具体步骤包括：（1）消化RRP组织样本：RRP手术或活检组织样本，用清洗液洗涤2-3遍，用组织剪将其剪成肉糜状，根据组织块大小加入适量消化液，37℃摇床消化20~60分钟；显微镜下观察出现3-10个细胞成团时停止消化；每隔10分钟上下颠倒摇晃离心管，保证样本消化彻底；（2）终止消化：加入与消化液等体积的终止液终止消化，1500rpm，4℃，离心10分钟，弃上清；（3）去除内源性DNA：加入1~2mL的DNase I，水浴2分钟后加入终止液终止，1500rpm，4℃，离心10分钟，弃上清；（4）裂解红细胞：加入1~2mL红细胞裂解液重悬细胞沉淀，冰上放置1~2分钟；随后加入等体积清洗液进行清洗，1500rpm，4℃，离心10分钟，弃上液；（5）制备单细胞悬液：用清洗液重悬细胞沉淀后，用70~100μm滤器过滤得到单细胞悬液，1500rpm，4℃，离心10min，弃上清得到细胞沉淀；（6）接种培养RRP类器官：细胞沉淀用1~1.5 mL清洗液重悬后转移至新的1.5mL EP管内，1500rpm，离心5分钟；该步骤进行两次后进行细胞计数，之后48孔板中，按每孔1x10²~1x10⁶个细胞密度进行类器官接种，在冰上用每孔5~15μL基质胶混匀细胞沉淀，接种于孔中央，避免气泡产生，将48孔板放入CO₂培养箱中静置5~10分钟，待基质胶完全凝固后取出48孔板，每孔加入200~250μL类器官培养液，放入培养箱进行培养；（7）3~4天更换新鲜类器官培养液，并于7~14天进行传代；

所述组织样本的消化中消化液的成分包括：100~200U/mL青霉素，50~200μg/mL链霉素，0.5~2mg/mL胶原蛋白酶II，0.01~0.2mg/mL透明质酸酶以及基础液；

所述终止消化中的终止液的成分包括：3~6% FBS，50~120U/mL青霉素，50~100μg/mL链霉素以及基础液；

所述类器官接种培养中培养液的成分包括：0.5~2% HEPES，0.5~2% GlutaMAX，50×B27，1~10μM A83-01，20~80ng/mL EGF，5~20% Noggin，5~20% R-spondin1，1~100nMGastrin，100~500nM FGF10，1~100mM Nicotinamide，10mM Y-27632以及基础液；

所述基础液为Advanced DMEM/F12基质液。

2.根据权利要求1所述的复发性呼吸道乳头状瘤病类器官的构建方法，其特征在于：所述类器官系统的检测验证包括复发性呼吸道乳头状瘤病类器官的免疫组化验证，复发性呼吸道乳头状瘤病类器官的WES/WGS/RNA-seq测序以及复发性呼吸道乳头状瘤病类器官的单细胞测序和质谱流式验证。

3.根据权利要求2所述的复发性呼吸道乳头状瘤病类器官的构建方法，其特征在于：所述类器官系统的药物敏感性测试为复发性呼吸道乳头状瘤病类器官的药物敏感性测试。

4.一种根据权利要求1~3任一项所述的复发性呼吸道乳头状瘤病类器官的构建方法的应用，其特征在于：包括该构建方法在传代制备类器官方法中的应用。