ES2391451T3 - Péptidos de fusión que comprenden los polipéptidos E7 y E6 de virus del papiloma humano y composiciones inmunogénicas de los mismos - Google Patents

Abstract

Un polipéptido que comprende polipéptidos E6 y E7 del virus del papiloma humano, en el que el polipéptido E7precede al polipéptido E6 y tiene mutaciones en los aminoácidos correspondientes a los aminoácidos 24 y 26 de laSEC ID Nº: 14 y el polipéptido E6 tiene mutaciones en los aminoácidos correspondientes a los aminoácidos 63 y 106de la SEC ID Nº: 13.

Description

Péptidos de fusión que comprenden los polipéptidos E7 y E6 de virus del papiloma humano y composiciones inmunogénicas de los mismos

Campo de la invención

La presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas e inmunogénicas usadas para tratar o prevenir cáncer cervical y otros cánceres causados por virus del papiloma humano (VPH). En particular, la presente invención se refiere a proteínas de fusión y los ácidos nucleicos que codifican estas proteínas de fusión, usadas para generar respuestas inmunes frente a VPH. Estas proteínas y polinucleótidos de fusión se usan en el tratamiento y prevención de cánceres inducidos por VPH.

Antecedentes de la invención

El cáncer de cuello uterino es la segunda causa principal de muertes relacionadas con tumores en mujeres, representando 250.000 muertes por año en todo el mundo. Se sabe que más del 99 % de todos los cánceres cervicales están asociados con infección por virus del papiloma humano (VPH), de los que el 50 % están ligados directamente con VPH de tipo 16 (VPH16) (Walboomers y col., J. Path. 1999,189: 12-19). Aunque la mayoría de las infecciones por VPH16 son sintomáticas y transitorias, un cierto porcentaje de ellas se hace persistente. Aproximadamente el 1 % de individuos infectados de forma persistente progresan a lesiones cervicales crecientemente graves conocidas como neoplasia intraepitelial cervical (CIN), y con el tiempo a carcinoma cervical invasivo.

Las proteínas de VPH tempranas conocidas como E6 y E7 son necesarias para mantener el fenotipo maligno (Von Knebel y col., Int J Cancer 1992, 51: 831-4; Crook y col, Embo J 1989,8: 513-9; He y Huang, Cancer Res. 1997,57: 3993-9). Estas proteínas se expresan uniformemente en lesiones de CIN y cánceres (Smotkin y Wettstein, Proc Natl Acad Sci USA 1986, 83:4680-4; Durst y col, Virology 1992, 189: 132-40). Estas proteínas inducen proliferación del epitelio interrumpiendo la regulación del ciclo celular. Específicamente E7 se une a e inactiva la proteína del retinoblastoma (Rb) supresora de tumores celulares (Dyson y col., Science 1989, 243: 934-7), lo que da como resultado progresión de la célula a la fase S del ciclo celular (Cobrinik y col., Trends Biochem Sci 1992, 17: 312-5). La proteína E6 de VPH16 induce degradación de la proteína supresora de tumores p53 (Scheffner y col., Cell 1990,

63: 1129-36), evitando que la célula experimente apoptosis.

Debido a que las células tumorales expresan de forma constitutiva las proteínas E6 y E7, y estas proteínas no están presentes en células normales, estas proteínas virales son dianas muy atractivas para inmunoterapia de cáncer. Muchas líneas de pruebas sugieren que una respuesta inmune mediada por células contra E6 y E7 en seres humanos se correlaciona con la regresión natural de lesiones de VPH y eliminación de ADN viral (Nakagawa y col., J Infect Dis 1997, 175: 927-31; Kadish y col., J Natl Cancer Inst 1997, 89: 1285-93). Además se ha mostrado que una respuesta de CTL contra E7 protege a los ratones contra tumores positivos contra tumores positivos para VPH16 en diferentes modelos murinos (Feltkamp y col., Eur J Immunol 1995, 25: 2638-42; Lin y col., Cancer Res 1996, 56: 216).

Puesto que la inmunidad mediada por células (CMI) parece ser importante en el combate de infección por VPH y enfermedad (Eiben, G.L. y col., Adv Can Res 2002, 86: 113-148), una vacuna terapéutica debería generar respuesta de linfocitos T óptimas frente a numerosos péptidos antigénicos E6 y E7 de VPH para una cobertura eficaz en poblaciones diversas de antígenos de leucocitos humanos (HLA).

Un vector de vacuna prometedor para suministrar antígenos E6/E7 es un vector de alfavirus recombinante (AV) derivado de la cepa 3014 atenuada de virus de la encefalitis equina venezolana (VEE; Velders M.P. y col., Cancer Res 2001, 61: 7861-7867). Se ha demostrado que partículas de replicón de VEE (VRP) incompetentes para replicación son vacunas altamente eficaces en varios modelos de tumor y enfermedad infecciosa preclínicos (Rayner, J.O. et al., Rev Med Virol 2002, 12: 279-296). Los vectores de replicón derivado de AV tales como VEE codifica genes heterólogos en forma de ARN, no se expanden más allá de infección inicial e inducen apoptosis de células infectadas (Griffith, D.E. y col., Annu. Rev. Microbiol. 1997, 51: 565-592). Estos atributos limitan las oportunidades de expresión prolongada de proteínas o integración en el ADN huésped que son características de tumores malignos inducidos por VPH después de infección natural. La baja prevalencia de inmunidad anti-VEE preexistente y las posibilidades de inmunización repetida con VRP (Pushko, P. y col., Virology 1997,239: 389-401) son ventajas frente a otros vectores virales recombinantes tales como virus vaccinia o adenovirus.

Boursnell M. y col. (Vaccine, 1996, vol. 14, número 16, páginas 1485-1494) desvelan virus vaccinia recombinantes que codifican proteínas de fusión E6-E7 de VPH16 y VPH18 con mutaciones de aminoácidos en los restos 24 y 26 de E7.

Borysiewicz LK y col. (Lancet, 1996, vol. 347, número 9014, páginas 1523-1527), desvelan para su uso como inmunoterapia para cáncer cervical virus vaccinia recombinante que codifica proteínas de fusión E6-E7 de VPH16 y VPH18 con mutaciones de aminoácidos en los restos 24 y 26 de E7.

El documento WO99/10375 desvela una vacuna que comprende una proteína de fusión E6-E7 de VPH con mutaciones de aminoácidos en los restos 24 y 26 de E7 unida con un compañero de fusión.

El documento US 6.004.557 desvela una vacuna que comprende una proteína de fusión E6-E7 de VPH16 en la que una o ambas de E7 y E6 puede tener una mutación de deleción.

Dalal S y col. (Journal of Virology, 1996, vol. 70, número 2, páginas 683-688) desvela VPH16 con mutaciones de aminoácidos en diversos restos, incluyendo los restos 63 y 106 de E6.

Edmonds C y col. (Journal of virology, 1989, vol. 63, número 6, 1989, páginas 2650-2656) desvelan VPH16 con mutaciones de aminoácidos en diversos restos, incluyendo los restos 24, 26 y 91 de E7.

Velders MP y col. (Cancer Research, 2001, vol. 61, número 21, páginas 7861-867) desvelan vacunación con vector de encefalitis equina venezolana recombinante que codifica la proteína E7 de VPH16 (sin mutaciones).

Kast W y col. (Journal of Immunology, 1994, vol. 152, número 8, 1994, páginas 3904-3912) desvela la afinidad de unión de cinco alelos de HLA-A de un conjunto de todos los péptidos monoméricos posibles de proteínas E6 y E7 de VPH 16 para seleccionar candidatos a vacuna.

Murakami M y col. (Cancer Research, 1999, vol. 59, número 6, páginas 1184-187), desvela la inducción de respuestas de CTL a proteínas E6 y E7 de VPH usando una proteína de fusión E6-E7 recombinante (sin mutaciones) y células dendríticas humanas autólogas.

Offringa y col. (Current Opinion in Immunology, 2000, vol. 12, número 5, páginas 576-582), desvela vacunas que comprenden proteínas E6 y E7 de VPH que pueden mutarse para carecer de capacidad de transformación, como parte de un artículo de revisión sobre estrategias de vacuna contra el cáncer.

Aunque son dianas atractivas para inmunoterapia de cáncer, E6 y E7 tienen actividad transformante. En consecuencia, los procedimientos de inmunoterapia que usan E6 y E7 que se contemplan en la actualidad en la técnica son potencialmente arriesgados debido a que estas proteínas pueden inducir transformación e inmortalización de las células.

Sigue habiendo una necesidad no satisfecha de composiciones eficaces para el tratamiento y prevención de CIN y carcinoma cervical. Más específicamente, existe la necesidad de composiciones inmunogénicas incluyendo composición basada en E6 y/o E7, que son tanto seguras como eficaces para tratar y/o prevenir CIN, carcinoma cervical, carcinoma anal y otros trastornos tales.

Los estudios anteriores de composiciones inmunogénicas de VPH se han limitado por la falta de modelos tumorales que expresaran HLA de clase 1 en ratones. Se describe en el presente documento un modelo positivo de E6/E7 de VPH16; este modelo forma tumores de crecimiento progresivo en ratones transgénicos HLA-A*0201.

Sumario de la invención

La presente invención satisface las necesidades anteriormente descritas y otras proporcionando composiciones farmacéuticas y polipéptidos que comprenden fusiones de polipéptidos E6 y E7 que portan mutaciones y un orden de fusión (E7E6) que reduce la actividad biológica y por lo tanto el potencial de actividad transformadora de E6 y E7.

En particular, la presente invención proporciona nuevos polipéptidos de fusión de E7E6 y los polinucleótidos que los codifican. En realizaciones específicas, la invención proporciona polipéptidos que comprenden los polipéptidos E6 y E7 del virus del papiloma humano en los que el polipéptido E7 tiene mutaciones en los aminoácidos correspondientes a los aminoácidos 24, 26 y 91 de la SEC ID Nº 14 y el polipéptido E6 tiene mutaciones en los aminoácidos correspondientes a los aminoácidos 63 y 106 de la SEC ID Nº 13. En una realización específica, el polipéptido de fusión comprende un polipéptido E7 en el que ambos de los aminoácidos correspondientes a los aminoácidos 24 y 26 de la SEC ID Nº 14 están mutados. Estos polipéptidos mutados pueden tener un resto de glicina en cualquiera de estas posiciones mutadas y E6 está carboxilo terminal de E7.

La presente invención también proporciona ácidos nucleicos aislados que codifican estos polipéptidos. Por ejemplo, en una realización de la invención el ácido nucleico aislado comprende secuencias de E6 y E7 de virus del papiloma humano en las que la secuencia de nucleótidos E6 tiene mutaciones en cualquier nucleótido o nucleótidos correspondientes a los nucleótidos 187-189 y 316-318 del gen E6 de VPH 16, y la secuencia de nucleótidos de E7 tiene mutaciones en cualquier nucleótido o nucleótidos correspondientes a los nucleótidos 70-72, 76-78 y 271-273 del gen E7 de VPH 16, y en las que la mutación o mutaciones dan como resultado que se codifique un aminoácido diferente. La presente invención también proporciona composiciones farmacéuticas e inmunogénicas que comprenden estos polipéptidos y polinucleótidos.

La presente invención también proporciona polipéptidos aislados que tienen la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID Nº 9 o SEC ID Nº 11. En otras realizaciones, la invención proporciona ácidos nucleicos aislados que codifican tales polipéptidos, incluyendo ácidos nucleicos que tienen la secuencia de nucleótidos SEC ID Nº 10 o SEC ID Nº 12.

También se proporcionan vectores de expresión que comprenden las secuencias de ácido nucleico que codifican fusiones E7E6. Por ejemplo, en una realización específica, la invención proporciona vectores de expresión que comprenden SEC ID Nº 10 o SEC ID Nº 12 asociados operativamente con (por ejemplo, bajo el control de) una secuencia de control de la expresión.

También se proporcionan células huésped que comprenden ácidos nucleicos que codifican fusiones E7E6, así como células huésped que expresan o contienen los polipéptidos de fusión E7E6.

En otra realización más, la invención también proporciona composiciones inmunogénicas que comprenden un ácido nucleico o polipéptido de la invención y son útiles, por ejemplo, para tratar o prevenir cáncer cervical. Tales composiciones inmunogénicas pueden comprender (a) un polipéptido de la invención (por ejemplo, un polipéptido que comprende los polipéptidos E6 y E7 de virus del papiloma humano en los que el polipéptido E7 tiene mutaciones en los aminoácidos correspondientes a los aminoácidos 24, 26 y 91 de la SEC ID Nº 14 y el polipéptido E6 tiene mutaciones en los aminoácidos correspondientes a los aminoácidos 63 y 106 de la SEC ID Nº 13) y (b) un vehículo farmacéuticamente aceptable. Opcionalmente, una composición inmunogénica de la invención también puede contener un adyuvante.

También se proporcionan virus recombinantes que contienen uno o más ácidos nucleicos de la invención y/o codifican uno o más de los polipéptidos de la invención. Por lo tanto, por ejemplo, un virus recombinante de la invención comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido como se expone en las SEC ID Nº 9 u 11, y más particularmente que tiene la secuencia expuesta en cualquiera de las SEC ID Nº 10 ó 12. En una realización particularmente preferida, un virus recombinante de la invención es un virus de encefalitis equina venezolana (VEEV) modificado.

Se proporcionan adicionalmente procedimientos para usar las composiciones anteriormente mencionadas. Por lo tanto, se proporciona también un procedimiento para producir una respuesta inmune en un individuo administrando a ese individuo cantidades inmunológicamente eficaces de un polipéptido de la invención (por ejemplo, uno que tenga la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEC ID Nº 9 u 11) y un vehículo farmacéuticamente eficaz.

También se proporcionan procedimientos para tratar y/o prevenir cáncer cervical. Por ejemplo, procedimientos para tratar cáncer cervical en los que se administra a un paciente al que se le ha diagnosticado cáncer cervical un polipéptido de la invención (por ejemplo, uno que tenga la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEC ID Nº 9 u 11) y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Se proporcionan además procedimientos para evitar cáncer cervical en los que se administran un polipéptido de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable a un individuo. La presente divulgación proporciona procedimientos para tratar y/o prevenir cáncer cervical en un paciente administrando al paciente una cantidad inmunológicamente eficaz de un ácido nucleico de la invención (por ejemplo, uno que tenga una secuencia de ácido nucleico que codifique un polipéptido que tenga una secuencia de aminoácidos de las SEC ID Nº 9 u 11, particularmente expuesta en cualquiera de las SEC ID Nº 10 ó 12.

Breve descripción de los dibujos

Las Figuras 1A y 1B son diagramas esquemáticos que muestran la localización de las mutaciones puntuales introducidas en proteínas E6 y E7 de VPH16 en relación con epítopos potenciales para los alelos de HLA-A de Clase I principales. La Figura 1A muestra los aminoácidos de origen natural en B6, 63C y 106C, que se mutaron cada uno a glicina. La Figura 1B muestra los aminoácidos de origen natural en E7, 24C, 26E y 91C, que se mutaron cada uno a glicina. Se muestran epítopos de clase I definidos previamente capaces de unirse a alelos HLA-A1, A2, A3, A11 y A24 en cajas punteadas (Kast, W.M. y col., J Immunol 1994,152: 3904-3912).

Las Figuras 2A-E son esquemas que muestran el alineamiento y la secuencia consenso de las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos E6 de virus del papiloma humano 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 y 68 (SEC ID Nº 15-26, respectivamente). La secuencia consenso (SEC ID Nº 39) se muestra bajo el alineamiento. Las letras en mayúscula en la secuencia consenso indican consenso completo y las letras en minúscula en la secuencia consenso indican alta frecuencia pero no consenso completo.

Las Figuras 3A-C son esquemas que muestran el alineamiento y la secuencia consenso de las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos E7 de virus del papiloma humano 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 y 68 (SEC ID Nº 27-38, respectivamente). La secuencia consenso (SEC ID Nº 40) se muestra bajo el alineamiento. Las letras en mayúsculas en la secuencia consenso indican consenso completo y las letras en minúsculas en la secuencia consenso indican alta frecuencia, pero no consenso completo.

Las Figuras 4A y 4B son gráficas que muestran porcentaje de lisis específica frente a relación de célula efectora y diana (E:T), que representa las respuestas CTL después de inmunización con VRP. Los ratones C57BL/6 se inmunizaron por vía subcutánea con 3 x 105 UI de la VRP indicada, y se realizaron ensayos CTL un mes después. La citotoxicidad se midió mediante liberación de Europio de células diana MC57G infectadas con MVA-E7 (A) o E6-MVA (B). Estos resultados se reprodujeron en dos experimentos adicionales (datos no mostrados).

Las Figuras 5A y 5B son gráficas que demuestran el porcentaje de ratones sin tumores frente al número de días después de la exposición a tumor. Los ratones C57BL/6 (n = 8/gp) se sensibilizaron y reforzaron con 3 x 105 UI de la composición inmunogénica de VRP indicada los días -21 y -7 y se expusieron el día 0 a 5 x 105 células tumorales C3 (A) o 5 x 104 células tumorales TC-1 (B) en el flanco. Los tumores se supervisaron cada 3 días.

La Figura 6 es una gráfica que demuestra el porcentaje de ratones sin tumores frente al número de días después de la exposición a tumor. Los ratones C57BL16 (n = 8-16/gp) recibieron 5 x 105 células tumorales C3 el día 0 y se inmunizaron con la VRP indicada los días 7, 14 y 21. Los tumores se supervisaron durante 3 días durante 45 días.

La Figura 7 es una gráfica que demuestra el porcentaje de ratones sin tumores frente al número de días después de la exposición a tumor. Los ratones transgénicos HLA-A*0201 (n = 10/gp) recibieron 2 x 106 células tumorales HLF16 el día 0 y se inmunizaron con la VRP indicada los días 5, 10 y 15. Los tumores se supervisaron cada 5 días.

Las Figuras 8A y 8B son transferencias de Western que detectan expresión de p53 (A) y Rb (B) en células epiteliales mamarias (MEC) humanas primarias infectadas con diferentes preparaciones de VRP. Veinticuatro horas después de la infección con la VRP indicada (MOI = 10); se procesaron 25 !g de cada lisado de células MEC en SDS-PAGE, se transfirieron y se exploraron con respeto a niveles de p53 (A) y Rb (B). La carga proteica equivalente se verificó explorando con anticuerpo anti-tubulina. La presencia de proteínas E7 se verificó explorando los carriles indicados con un anticuerpo anti-E7.

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona fusiones de proteínas E6 y E7 de VPH, las secuencias de nucleótidos que codifican ejemplos de tales fusiones y formas mutantes de las mismas. Aunque cada una de las mutaciones específicas de VPH16 identificada en el presente documento (con la excepción de E6 C106G, que sólo se había mutado previamente a C106R (Dalal y col., J Virol 1996, 70: 683-8)) se ha desvelado previamente, no se han realizado combinaciones de estas mutaciones y no se han ensayado combinaciones de estas mutaciones con respecto a su capacidad para conservar inmunogenicidad careciendo a la vez de capacidad de transformación o inmortalización. Por ejemplo, no se supo si cualquier otra combinación de dos o más mutaciones daría como resultado polipéptidos que mantuvieran su eficacia inmunogénica. La presente invención desvela fusiones de proteínas E7E6 que contienen combinaciones únicas de estas mutaciones y el sorprendente hallazgo de que proteínas de fusión E7E6 que contenían cuatro o cinco mutaciones definidas mantienen su eficacia inmunogénica. Este hallazgo es particularmente importante debido a que una composición inmunogénica terapéutica debería generar respuestas celulares óptimas frente a numerosos péptidos antigénicos E6 y E7 de VPH para cobertura eficaz en poblaciones diversas de LHA. La presente invención desvela también que estas fusiones E7E6 que portan múltiples mutaciones, manteniendo a la vez su eficacia inmunológica, no mantienen las funciones necesarias para capacidad de transformación de E6 y E7, concretamente degradación de p53 y pRB. Específicamente, las fusiones de la presente invención no inducen degradación de p53 o Rb y, por lo tanto, son más seguras que sus homólogos no mutantes para suministro o expresión en un paciente.

La presente invención también desvela el sorprendente hallazgo de que las fusiones E7E6, que son fusiones en las que E6 está carboxilo terminal de E7, tiene actividad inmunológica aumentada en comparación con sus homólogos E6E7.

En ejemplos específicos, se produjeron proteínas de fusión E6E7 y E7E6 de VPH16 y se ensayaron con respecto a inmunogenicidad y respuestas antitumorales. Se introdujeron varias mutaciones puntuales en los genes de E6 y E7 para inactivar su potencial oncogénico, conservando a la vez epítopos de HLA conocidos. Se observaron respuestas de CTL comparables al epítopo E749-57 restringido con H-2Db entre ratones inmunizados con 3 x 105 unidades infecciosas de VRP que codifican proteínas de fusión mutantes o de tipo silvestre. Todas las composiciones inmunogénicas de VRP que expresan proteína de fusión mutante y wt erradicaron tumores C3 establecidos durante 7 días en 90 % o más de los ratones. Además, las construcciones de fusión E6E7 demostraron eficacia antitumoral en otros dos modelos de tumores positivos para E6E7. Específicamente, las VRP de E7E6 TetM confirieron rechazo tumoral completo en el modelo de tumor HLF16. Las células epiteliales mamarias humanas primarias infectadas con VRP que expresaban genes de E6 y B7 mutantes, pero no de tipo silvestre, demostraron niveles normales de proteínas tanto p53 como retinoblastoma.

Las fusiones E7E6 de la invención

La presente invención proporciona polipéptidos de fusión E7E6 que comprenden las mutaciones múltiples C24G, E26G y C91G en E7 y C63G y C106G en E6 (véase Figuras 1A y B). Por ejemplo, los polipéptidos de fusión E7E6TetM comprenden las mutaciones C24G y E26G de E7 y las mutaciones C63G y C106G de E6, mientras que los polipéptidos de fusión E7E6PentM comprenden la mutación C91G de E7 además de las cuatro mutaciones presentes en los mutantes TetM. Estos polipéptidos de fusión mutados, entre otros, pueden ser inestables. Los expertos habituales en la materia aprecian que las proteínas inestables, en comparación con proteínas estables, tiene una capacidad aumentada para desarrollar respuestas de CTL. Los expertos en la materia también apreciaran que las proteínas de fusión tienden a no plegarse de forma apropiada y por lo tanto son menos estables que sus homólogos no fusionados. Por lo tanto, las propiedades de fusión tales como las desveladas en la presente invención, están mejor adaptadas para la producción de respuestas inmunes mediadas por células que sus homólogos no fusionados.

Se produjeron proteínas de fusión E6E7 y E7E6 de VPH16 y se ensayaron con respecto a inmunogenicidad y respuestas antitumorales. Se introdujeron varias mutaciones puntuales en los genes E6 y E7 para inactivar su potencial oncogénico, conservando a la vez epítopos de HLA conocidos. Antes de la presente invención no se sabía si las combinaciones de las mutaciones ensayadas en el presente documento destruirían la inmunogenicidad de los polipéptidos o si tales polipéptidos mutados conservarían su inmunogenicidad. Se observaron respuestas de CTL comparables al epítopo E749-57 restringido con H-2Db entre ratones inmunizados con 3 x 105 unidades infecciosas de VRP que codifican proteínas de fusión mutantes o de tipo silvestre. Todas las composiciones inmunogénicas de VRP que expresan proteína de fusión mutante y de tipo silvestre erradicaron tumores C3 establecidos durante 7 días en 90 % o más de los ratones. Además, las construcciones de fusión E6/E7 demostraron eficacia antitumoral en otros dos modelos de tumores positivos para E6E7.

La presente invención proporciona polipéptidos de fusión que comprenden E6 y E7, en los que E6 está en el extremo carboxilo terminal. Los expertos en la materia reconocerán a partir de la presente divulgación que las fusiones en las que E6 está carboxilo terminal de E7 (fusiones E7E6), es decir E6 sigue a E7, tales como E7E6TetM y E7E6PentM, tendrán eficacia inmunológica aumentada en comparación con fusiones en las que E6 está amino terminal de E7 (fusiones E6E7, tales como B6E7TetM y E6E7PentM). Además, reconocerán los expertos en la materia que las fusiones E7E6, es decir, fusiones en las que E6 es carboxilo terminal de E7, tendrán actividad E6 reducida en comparación con fusiones E6E7. Por lo tanto, se espera en general que las fusiones E7E6 sean más seguras. En consecuencia, las fusiones en las que E6 está carboxilo terminal de E7 son una realización de la presente invención.

La presente invención proporciona ejemplos de mutaciones de nucleótidos y aminoácidos particulares en posiciones correspondientes a C24, E26 y en C91 de E7 de VPH16 y C63 y C106 de E6 de VPH16. Por ejemplo, la presente invención proporciona cisteína 24 para mutar a glicina (la mutación correspondiente en la secuencia de nucleótidos es CTG a CGG). Estos ejemplos no son limitantes. Por ejemplo, pueden usarse mutaciones que dieron como resultado de forma similar interrupción de los dedos de zinc o unión de Rb. Por ejemplo, las mutaciones en restos de cisteína importantes para formación de dedos de zinc pueden cambiarse a cualquier otro aminoácido. Las mutaciones preferidas dan como resultado una desestabilización de la proteína y, por lo tanto, un aumento de la inmunogenicidad de la proteína.

En una realización específica de la invención, los polipéptidos son fusiones de E6 y E7 de VPH16 en los que el polipéptido E7 tiene mutaciones en el aminoácido o los aminoácidos correspondientes a las posiciones 24, 26 y 91 de la SEC ID Nº 14 y el polipéptido E6 tiene mutaciones en uno o más aminoácidos correspondientes a las posiciones 63 y 106 de la SEC ID Nº 13. En una realización preferida de la invención, los polipéptidos son fusiones de E6 y E7 de VPH16 en las que el polipéptido E7 tiene mutaciones en aminoácidos correspondientes a las posiciones 24 y 26 de la SEC ID Nº 14 y el polipéptido E6 tiene mutaciones en los aminoácidos correspondientes a las posiciones 63 y 106 de la SEC ID Nº 13.

Se entiende en la técnica que el número de aminoácidos se determina contando metionina como el primer aminoácido, incluso en caso de que la primera metionina se haya suprimido en la segunda de las proteínas de fusión. Por ejemplo, se considera que la mutación G24 de E6E7TetM (SEC ID Nº 3) está en el resto 24 del polipéptido E7m.

En otra realización preferida de la presente invención, los polinucleótidos son fusiones de polinucleótidos E6 y E7 de VPH16 en las que el polinucleótido E6 tiene mutaciones en cualquiera de los nucleótidos 187-189 (que corresponde a los nucleótidos 290-292 del genoma de VPH16 (número de acceso de GenBank K02718)) y 1316-318 (que corresponde a los nucleótidos 419-421 del genoma de VPH16) y la secuencia de nucleótidos de E7 tiene mutaciones en cualquiera de los nucleótidos 70-72 (que corresponde a los nucleótidos 631-633 del genoma de VPH16), 76-78 (que corresponde a los nucleótidos 637-639 del genoma de VPH1-6) y 271-273 (que corresponde a los nucleótidos 832-834 del genoma de VPH16). Estos cambios de nucleótidos dan como resultado mutaciones de sentido erróneo, no mutaciones sin sentido. En otras palabras, estas mutaciones dan como resultado que se codifique un aminoácido diferente.

La presente invención proporciona polipéptidos, y composiciones inmunogénicas y farmacéuticas que comprenden estos polipéptidos, o que comprenden nucleótidos que codifican estos polipéptidos. Como se describe más adelante estos polipéptidos y polinucleótidos se describen en las secuencias proporcionadas en el presente documento. Por ejemplo, el polipéptido E6E7TetM se describe en SEC ID Nº 3. Los expertos en la materia apreciarán que las secuencias polipeptídicas y polinucleotídicas de la presente divulgación no están limitadas a las secuencias exactas desveladas en la presente solicitud. Por ejemplo, las secuencias E6 y E7 se obtuvieron realizando PCR a partir del clon de ATCC Nº 45113 de VPH16. Las secuencias de E6 y E7 de este clon de ATCC varían ligeramente de las de la secuencia de VPH16 de GenBank, K02718. Por lo tanto, los expertos en la materia apreciarán que la presente divulgación también comprende secuencias de aminoácidos y nucleótidos sustancialmente similares o sustancialmente homólogas de las desveladas en el presente documento y que la combinación de mutaciones descritas puede producirse en el fondo de cualquier secuencia de E6 o E7. Por ejemplo, estas mutaciones y cualquier número de combinaciones de estas mutaciones pueden estar en el contexto de las secuencias de E6 y E7 desveladas en K02718.

Los expertos en la materia apreciarán que la presente divulgación también puede aplicarse a los otros miembros de la familia del virus de papiloma además de VPH16. Otros genotipos de virus de papiloma asociado con cáncer, en particular, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 y 68 tienen motivos conservados en sus proteínas E6 y E7 que son probablemente centrales para su capacidad oncogénica (véase Fields Virology cuarta edición, 2001, C. 65 y 66, 2197-2265, Knipe & Howley Eds., Lippincott Williams y Wilkins). Resulta notable que estas proteínas E6 y E7 tienen motivos de dedos de zinc C-X-X-C y, para E7, un motivo de unión a Rb potencial L-X-C-X-E. Por lo tanto, una realización de la presente divulgación comprende polipéptidos de fusión E6 y E7 y polinucleótidos de otros miembros de la familia del virus del papiloma humano, que tienen mutaciones que corresponden con las mutaciones desveladas en la presente invención.

Pueden determinarse aminoácidos y nucleótidos que corresponden a las posiciones de los aminoácidos y nucleótidos particulares desvelados en las SEC ID Nº 1-12 realizando un alineamiento de secuencias. Se muestran ejemplos de tales alineamientos de secuencias en las Figuras 2A-E y 3A-C. En estas figuras, los aminoácidos de los polipéptidos E6 y E7 de los VPH 18, 31, 33, 35, 39, 45; 51, 52, 56; 58, 59 y 68 se han alineado, y se presentan secuencias consenso. La secuencia de aminoácidos consenso de E6 se representa en la SEQ ID Nº 39 y la secuencia de aminoácidos consenso de E7 se representa en la SEC ID Nº 40.

Estos alineamientos demuestran que cada una de las mutaciones ensayadas en la presente invención se conserva en cada uno de estos virus VPH y, por lo tanto, también pueden mutarse para suprimir su potencial oncogénico, manteniendo a la vez su capacidad para inducir una respuesta inmune. Se conservan con frecuencia aminoácidos que están implicados en la formación de estructuras tales como dedos de zinc y motivos de unión. Se pueden, por ejemplo, identificar y mutar los aminoácidos o nucleótidos conservados que corresponden a los aminoácidos 24, 26 y 91 de B7 de VPH16 y a los aminoácidos 63 ó 106 de E6 de VPH16 en cada uno de los miembros de los genotipos de VPH. Por ejemplo, el alineamiento mostrado en las Figuras 2A-E demuestra que el aminoácido de E6 de VPH18 que corresponde al aminoácido 63 de E6 de VPH16 (63C) también es un resto de cisteína y que está en la posición 65 de E6 de HPV18. En consecuencia, 66C de E6 de HPV18, además de otros restos que corresponden a los aminoácidos 24, 26 y 91 de E7 de VPH16 y el aminoácido 106 de E6 de VPH16, pueden mutarse en la presente invención. De forma similar, pueden realizarse mutaciones en cualquier polipéptido E6 de VPH correspondiente a los aminoácidos 65 ó 108 de la secuencia consenso de E6 (SEC ID Nº 39) o en cualquier polipéptido E7 de VPH correspondiente a los aminoácidos 25, 27 ó 97 de la secuencia consenso de E7 (SEC ID Nº 40) en la presente invención.

En una realización de la presente invención, los polipéptidos de fusión comprenden cuatro de estas mutaciones. En otra realización más, estos polipéptidos de fusión comprenden las cinco de estas mutaciones.

Definiciones de Biología Molecular. De acuerdo con la presente invención, pueden emplearse técnicas de biología molecular, microbiología y ADN recombinante convencionales dentro de la experiencia de la materia. Tales técnicas se explican completamente en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Sambrook, Fitsch y Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda edición (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York (denominado en el presente documento “Sambrook y col., 1989”); DNA Cloning: A Practical Approach, Volúmenes I y II (D.N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames y

S.J. Higgins, eds. 1984); Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. 1986); immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, 1986); B.E. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); F.M. Ausubel y col. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994).

Los polinucleótidos del presente documento pueden flanquearse por secuencias reguladoras naturales, o pueden asociarse con secuencias heterólogas, incluyendo promotores, potenciadores, elementos de respuesta, secuencias señal, secuencias de poliadenilación, intrones, regiones no codificantes 5’ y 3’ y similares. Los ácidos nucleicos también pueden modificarse por muchos medios conocidos en la técnica. Los ejemplos no limitantes de tales modificaciones incluyen metilación, “recubrimientos”, sustitución de uno o más de los nucleótidos de origen natural (es decir, optimización de codones de la base “oscilante” inicial o tercera), y modificaciones internucleotídicas tales como, por ejemplo, los que tienen enlaces no cargados (por ejemplo, metil fosfonatos, fosfotriésteres, fosforoamidatos, carbamatos, etc.) y enlaces cargados (por ejemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.). Los polinucleótidos pueden contener uno o más restos unidos covalentemente adicionales, tales como proteínas (por ejemplo, nucleasas, toxinas, anticuerpos, péptidos señal, poli-L-lisina, etc.), intercaladores (por ejemplo, acridina, psoraleno, etc.), quelantes (por ejemplo, metales, metales radiactivos, de hierro, metales oxidantes, etc.) y alquilantes por nombrar algunos. Los polinucleótidos pueden derivatizarse mediante formación de un enlace metil o etil fosfotriéster o uno alquil fosforamidita. Además, los polinucleótidos del presente documento también pueden modificarse con un marcador capaz de proporcionar una señal detectable, directa o indirectamente. Los marcadores ejemplares incluyen radioisótopos, moléculas fluorescentes, biotina y similares. Otros ejemplos no limitantes de modificación que puede realizarse se proporcionan, más adelante, en la descripción de la presente invención.

El término gen, también denominado un “gen estructural” significa una secuencia de ADN que codifica o corresponde a una secuencia particular de aminoácidos que comprende toda o parte de una o más proteínas o enzimas, y puede incluir o no secuencias de ADN reguladoras, tales como secuencias promotoras, que determinan por ejemplo las condiciones en las que se expresa el gen. Algunos genes, que no son genes estructurales, pueden transcribirse de ADN a ARN, pero no se traducen en una secuencia de aminoácidos. Otros genes pueden actuar como reguladores de genes estructurales o como reguladores de la transcripción de ADN.

Una “secuencia codificante” o una secuencia que “codifica” un polipéptido, proteína o enzima es una secuencia de nucleótidos que, cuando se expresa, da como resultado la producción de ese polipéptido, proteína o enzima, es decir, la secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos para ese polipéptido, proteína o enzima. Preferentemente, la secuencia codificante es una secuencia de ARN que se traduce a un polipéptido en una célula in vitro o in vivo cuando se sitúa bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas. Los límites de la secuencia codificante se determinan por un codón de inicio cerca del extremo 5’ terminal y un codón de parada de traducción cadena abajo. Una secuencia codificante puede incluir, pero sin limitación, secuencias procarióticas, ADNc de ARNm eucariota, secuencias de ADN genómico de ADN eucariota (por ejemplo, de mamífero) e incluso secuencias de ADN sintético. Si la secuencia codificante se pretende para expresión en una célula eucariota, se localizarán habitualmente una señal de poliadenilación y secuencia de terminación de la transcripción 3’ de la secuencia codificante.

Son secuencias de control de la transcripción y de la traducción secuencias reguladoras de ADN, tales como promotores, potenciadores, terminadores y similares, que proporcionan la expresión de una secuencia codificante en una célula huésped. En células eucariotas, las señales de poliadenilación son secuencias de control. Las “secuencias de control de la expresión” son las secuencias de control de la transcripción implicadas en el inicio de la transcripción, tales como promotores y potenciadores.

Una “secuencia promotora” es una región reguladora de ADN capaz de unirse a ARN polimerasa en una célula e iniciar la transcripción de una secuencia codificante cadena abajo (dirección 3’). Para fines de definir la presente invención, la secuencia promotora se une en su extremo 3’ terminal con el sitio de inicio de la transcripción y se extiende cadena arriba (dirección 5’) para incluir el número mínimo de bases o elementos necesario para iniciar la transcripción a niveles detectables por encima del fondo. Como se ha descrito anteriormente, el ADN promotor es una secuencia de ADN que inicia, regula o media o controla de otro modo la expresión del ADN codificante.

La amplificación de un polinucleótido, como se usa en el presente documento, indica el uso de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para aumentar la concentración de una secuencia de ADN particular dentro de una mezcla de secuencias de ADN. Para una descripción de PCR véase Saiki y col., Science 1988, 239:487.

Los términos “expresar” y “expresión” significan permitir o provocar que la información en un gen o secuencia de ADN se manifieste, por ejemplo, produciendo una proteína por activación de las funciones celulares implicadas en transcripción y traducción de una secuencia de ADN o gen correspondiente. Una secuencia de ADN se expresa en o por una célula para formar un “producto de expresión” tal como una proteína. También puede decirse que el producto expresión en sí mismo, por ejemplo, la proteína resultante, se “expresa” por la célula. Un polinucleótido o polipéptido se expresa de forma recombinante, por ejemplo, cuando se expresa o produce en una célula huésped ajena bajo el control de un promotor ajeno o nativo, o en una célula huésped nativa bajo el control de un promotor ajeno.

El término “transfección” significa la introducción de un ácido nucleico ajeno en una célula. El término “transformación” significa la introducción de un gen “ajeno” (es decir, extrínseco o extracelular), secuencia de ADN o ARN a una célula huésped, de modo que la célula huésped exprese el gen o secuencia introducido para producir una sustancia deseada, normalmente una proteína o enzima codificada por el gen o secuencia introducido. El gen o secuencia introducido, que también puede llamarse gen o secuencia “clonado” o “ajeno”, puede incluir secuencias reguladoras o de control, tales como secuencias de inicio, parada, promotora, señal, de secreción u otras usadas por la maquinaria genética de una célula. El gen o secuencia puede incluir secuencias no funcionales o secuencias sin función conocida. Una célula huésped que recibe y expresa ADN o ARN introducido se ha “transformado” y es un “transformante” o un “clon”. El ADN o ARN introducido en una célula huésped puede venir de cualquier fuente, incluyendo células del mismo género o especie que la célula huésped, o células de un género o especie diferente.

Los términos “vector” y “vector de expresión” significan el vehículo por el que una secuencia de ADN o ARN (por ejemplo, un gen ajeno) puede introducirse en una célula huésped, para transformar el huésped y promover la expresión de un polipéptido (por ejemplo transcripción y traducción) de la secuencia introducida.

Los vectores normalmente comprenden el ADN de un agente transmisible, en el que se inserta ADN ajeno. Un modo común para insertar un segmento de ADN en otro segmento de ADN implica el uso de enzimas llamadas enzimas de restricción que escinden ADN en sitios específicos (grupos específicos de nucleótidos) denominados sitios de restricción. Generalmente, se inserta ADN ajeno en uno o más sitios de restricción del ADN de vector, y después se lleva por el vector a una célula huésped junto con el ADN de vector transmisible. En un segmento o secuencia de ADN que tenga ADN insertado o añadido, tal como un vector de expresión, también puede denominarse una “construcción de ADN”.

Un tipo de vector común es un “plásmido”, que generalmente es una molécula autocontenida de ADN bicatenario. Un plásmido puede aceptar fácilmente ADN adicional (ajeno) y que puede introducirse fácilmente en una célula huésped adecuada. Un vector plasmídico con frecuencia contiene ADN codificante y ADN promotor y tiene uno o más sitios de restricción adecuados para insertar ADN ajeno. El ADN promotor y ADN codificante pueden ser del mismo gen o de diferentes genes, y pueden ser del mismo o diferentes organismos. Se ha descrito una gran variedad de vectores, incluyendo vectores plasmídicos y fúngicos para replicación y/o expresión en una diversidad de huéspedes eucariotas y procariotas. Los ejemplos no limitantes incluyen plásmidos pKK (Clontech), plásmidos pUC, plásmidos pET (Novagen, Inc., Madison, WI), plásmidos pRSET o pREP (Invitrogen, San Diego, CA), o plásmidos pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) y muchas células huésped apropiadas, usando procedimientos desvelados o citados en el presente documento o conocidos de otro modo por los expertos en la materia relevante. Los vectores de clonación recombinantes con frecuencia incluirán uno o más sistemas de replicación para clonación o expresión, uno o más marcadores para selección en el huésped, por ejemplo, resistencia a antibióticos y uno o más casetes de expresión. La experimentación rutinaria en biotecnología puede usarse para determinar qué vectores de clonación son más adecuados para su uso con la invención. En general, la selección de vector de clonación depende del tamaño de la secuencia polinucleotídica y las células huésped para usar.

Un “polipéptido” es una cadena de componentes básicos químicos denominados aminoácidos que se unen entre sí por enlaces químicos llamados “enlaces peptídicos”. El término “proteína” se refiere a polipéptidos que contienen los restos de aminoácidos codificados por un gen o por una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, un ARNm o un ADNc) transcritos de ese gen directa o indirectamente. Opcionalmente, una proteína puede carecer de ciertos restos de aminoácidos que están codificados por un gen o por un ARNm. Una proteína o polipéptido, incluyendo una enzima, puede ser “nativa” o “de tipo silvestre”, lo que significa que aparece en la naturaleza; o puede ser un “mutante”, “variante” o “modificado”, lo que significa que se ha preparado, alterado, derivado o es de alguna forma diferente o se ha cambiado de una proteína nativa o de otro mutante.

“Mutación” significa cualquier procedimiento o mecanismo que dé como resultado una proteína, enzima, polipéptido, polinucleótido, gen o célula mutante. Esta incluye cualquier mutación en la que se altere una proteína, enzima, polinucleótido o secuencia génica y cualquier cambio detectable en una célula que surja de una mutación tal. La proteína, enzima, polipéptido, polinucleótido alterado es un “mutante”, también denominado una “variante”. Normalmente, una mutación se produce en una secuencia génica o polinucleotídica, por mutaciones puntuales (sustituciones), deleciones o inserciones de restos de nucleótidos múltiples o sencillos. Una mutación incluye alteraciones polinucleotídicas que surgen dentro de una región que codifica una proteína de un gen así como alteraciones en regiones fuera de una secuencia codificante de proteína, tal como, pero sin limitación, secuencias reguladoras o promotoras. Una mutación en un gen puede ser “silenciosa”, es decir, no se refleja en una alteración de aminoácidos tras su expresión, lo que conduce a una variante “conservativa para secuencia” del gen. Esta surge generalmente cuando un aminoácido corresponde a más de un codón. La Tabla 1 perfila qué aminoácidos corresponden a qué codones.

Por lo tanto, debido a la degeneración del código genético, cualquier codón de tres nucleótidos que codifique un resto de aminoácido mutado de un polipéptido de fusión E6/E7 descrito en el presente documento está dentro del alcance de la invención.

Los términos “mutante” y “variante” también pueden usarse para indicar un gen modificado o alterado, secuencia de ADN o ARN, enzima, célula, etc., es decir, cualquier tipo de mutante. Tales cambios también incluyen cambios en el promotor, sitio de unión a ribosomas, etc.

La expresión “secuencias de aminoácidos variantes” se refiere a otros polipéptidos de fusión de E6 y E7 adecuados que pueden diferir de los polipéptidos de fusión de E6 y E7 ejemplificados específicamente por modificaciones que no reduzcan la inmunogenicidad. En la preparación de tales cambios, puede considerarse el índice hidropático de los aminoácidos. La importancia del índice hidropático de aminoácidos para conferir función biológica interactiva en un polipéptido generalmente se entiende en la técnica (Kyte y Doolittle, 1982). Se sabe que ciertos aminoácidos pueden sustituirse por otros aminoácidos que tienen un índice hidropático o puntuación similar y da como resultado aún un polipéptido con actividad biológica similar. A cada aminoácido se le ha asignado un índice hidropático basándose en sus características de hidrofobicidad y carga. Esos índices son: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína/cistina (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (0,7); serina (-0,8); triptófano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9); y arginina (-4,5).

Se cree que el relativo carácter hidropático del resto de aminoácido determina la estructura secundaria y terciaria del polipéptido resultante, que a su vez define la interacción del polipéptido con otras moléculas, tales como enzimas, sustratos, receptores, anticuerpos, antígenos y similares. Se sabe en la técnica que un aminoácido puede sustituirse por otro aminoácido que tenga un índice hidropático similar y obtener aún un polipéptido funcionalmente equivalente. En tales cambios, se prefiere la sustitución de aminoácidos cuyos índices hidropáticos están dentro de +/-2, se prefieren particularmente los de +/-1, y se prefieren más particularmente los de +/-0,5.

También puede realizarse sustitución de aminoácidos similares basándose en la hidrofilia, particularmente cuando el polipéptido o péptido biológicamente funcional equivalente creado de este modo se pretende para su uso en realización inmunológica. La patente de Estados Unidos Nº 4.554.101, indica que la mayor hidrofilia media local de un polipéptido, regida por la hidrofilia de sus aminoácidos adyacentes, se correlaciona con su inmunogenicidad y antigenicidad, es decir, con una propiedad biológica del polipéptido.

5 Como se detalla en la patente de Estados Unidos Nº 4.554.101, los siguientes valores de hidrofilia se han asignado a restos de aminoácidos: arginina (+3,0); lisina (+3,0); aspartato (+3,0 +/-1), glutamato (+3,0 +/-1); serina (+0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0); prolina (-0,5, +/-1); treonina (-0,4); alanina (-0,5); histidina (-0,5); cisteína (-1,0), metionina (-1,3); valina (-1,5); leucina (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (-2.5); triptófano (-3,4). Se entiende que un aminoácido puede sustituir a otro que tenga un valor de hidrofilia similar y

10 obtener aún un polipéptido biológicamente equivalente y, en particular, uno inmunológicamente equivalente. En tales cambios, se prefiere la sustitución de aminoácidos cuyos valores de hidrofilia están dentro de +/-2; se prefieren particularmente los que están dentro de +/-1; y se prefieren aún más particularmente los que están dentro de +/-0,5.

Como se ha perfilado anteriormente, las sustituciones de aminoácidos se basan en general en la similitud relativa de los sustituyentes de cadena lateral de aminoácidos, por ejemplo, su hidrofobicidad, hidrofilia, carga, tamaño y

15 similares. Se conocen bien por los expertos en la materia sustituciones ejemplares que tienen en consideración varias de las características anteriores e incluyen: arginina y lisina; glutamato y aspartato, serina y treonina; glutamina y asparagina; y valina, leucina e isoleucina.

Las “variantes conservativas de función” son proteínas o enzimas en las que se ha cambiado un resto de aminoácido dado sin alterar la conformación estructural global y función específica de la proteína o enzima. Esto

20 incluye pero sin limitación, reemplazo de un aminoácido con uno que tenga propiedades físicas o estructurales similares, incluyendo carácter polar o no polar, tamaño, forma y carga (véase, por ejemplo, Tabla 1).

TABLA 1

Aminoácidos, Codones Correspondientes y Funcionalidad/Propiedad

Aminoácido

CUL Codones de ADN Propiedad de Cadena Lateral

Isoleucina

I ATT, ATC, ATA Hidrófobo

Leucina

L CTT, CTC, CTA, CTG, TTA, TTG Hidrófobo

Valina

V GTT, GTC, GTA, GTG Hidrófobo

Fenilalanina

F TTT, TTC Cadena lateral aromática

Metionina

M ATG Grupo de azufre

Cisteína

C TGT, TGC Grupo de azufre

Alanina

A GCT, GCC, GCA, GCG Hidrófobo

Glicina

G GGT, GGC, GGA, GGG Hidrófobo

Prolina

P CCT, CCC, CCA, CCG Amina secundaria

Treonina

T ACT, ACC, ACA, ACG Hidroxilo alifático

Serina

S TCT, TCC, TCA, TCG, AGT, AGC Hidroxilo alifático

Tirosina

T TAT, TAC Cadena lateral aromática

Triptófano

W TGG Cadena lateral aromática

Glutamina

Q CAA, CAG Grupo amida

Asparagina

N AAT, AAC Grupo amida

Histidina

H CAT, CAC Cadena lateral básica

Ácido glutámico

E GAA, GAG Cadena lateral ácida

Ácido aspártico

D GAT, GAC Cadena lateral ácida

Lisina

K AAA, AAG Cadena lateral básica

Arginina

R CGT, CGC, CGA, CGG, AGA, AGG Cadena lateral básica

Codones de parada

Parada TAA, TAG, TGA -

Como se denomina en el presente documento, “similitud de secuencia” significa el grado en que están relacionadas

25 las secuencias de nucleótidos o proteínas. El alcance de similitud entre dos secuencias puede basarse en el porcentaje de identidad de secuencia y/o conservación. Los aminoácidos distintos de los indicados como conservados pueden diferir en una proteína o enzima de modo que el porcentaje de similitud de secuencia de aminoácidos o proteína entre dos proteínas cualesquiera de función similar puede variar y puede ser, por ejemplo, al menos el 70 %, aún más preferentemente el 80 %, y más preferentemente al menos el 90 %, como se determina de

30 acuerdo con un esquema de alineamiento.

“Identidad de secuencia” en el presente documento significa el grado en que dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos son invariantes.

Dos secuencias de ADN son sustancialmente homólogas o sustancialmente similares cuando al menos aproximadamente el 80 %, y más preferentemente al menos aproximadamente el 90 o 95 % de los nucleótidos coinciden sobre la longitud definida de las secuencias de ADN, como se determina por algoritmos de comparación de secuencia, tales como BLAST, FASTA, DNA Strider, etc. Un ejemplo de una secuencia tal es una variante alélica

o de especie de los genes específicos de la invención. Las secuencias que son sustancialmente homólogas pueden identificarse comparando las secuencias usando software convencional disponible en bancos de datos de secuencias, o en un experimento de hibridación de Southern en, por ejemplo, condiciones rigurosas como se definen para ese sistema particular.

De forma similar, dos secuencias de aminoácidos son sustancialmente homólogas o sustancialmente similares cuando más del 80 % de los aminoácidos son idénticos, o más de aproximadamente el 90 % son similares. Preferentemente, las secuencias similares u homólogas se identifican por alineamiento de secuencias.

Son variantes conservativas de secuencia de una secuencia polinucleotídica en las que un cambio de uno o más nucleótidos dentro de un codón dado no da como resultado alteración en el aminoácido codificado por ese codón.

“Alineamiento de secuencias” significa el procedimiento de alinear dos o más secuencias para conseguir niveles máximos de identidad de secuencia (y, en el caso de secuencias de aminoácidos, conservación), por ejemplo, para el fin de evaluar el grado de similitud de secuencia. Se conocen numerosos procedimientos para alinear secuencias y evaluar la similitud y/o identidad en la técnica tales como, por ejemplo, el Procedimiento de Agrupamiento, en el que la similitud se basa en el algoritmo MEGALIGN, así como BLASTN, BLASTP y FASTA (Lipman y Pearson, 1985; Pearson y Lipman, 1988). Cuando se usan todos estos programas, los ajustes preferidos son los que dan como resultado la mayor similitud de secuencia.

El término “heterólogo” se refiere a una combinación de elementos no de origen natural. Por ejemplo, ADN heterólogo se refiere a ADN que no se localiza de forma natural en la célula, o en un sitio cromosómico de la célula. Preferentemente, el ADN heterólogo incluye un gen ajeno a la célula. Un elemento regulador de la expresión heterólogo es un elemento regulador asociado operativamente con un gen diferente del gen con el que se asocia operativamente en la naturaleza.

Las modificaciones, que normalmente no alteran la secuencia primaria de los polipéptidos de fusión de E6 y E7, incluyen derivatización química in vivo o in vitro de polipéptidos, por ejemplo, acetilación, metilación o carboxilación. También se incluyen como polipéptidos variantes de la presente invención estos polipéptidos modificados por glucosilación, por ejemplo, los preparados modificando los patrones de glucosilación de un polipéptido durante su síntesis y procesamiento o en etapas de procesamiento adicionales; o exponiendo el polipéptido a enzimas que afectan a la glucosilación, tales como enzimas de glucosilación o desglucosilación de mamíferos. También se abarcan como polipéptidos variantes las secuencias mutadas anteriormente identificadas, que tienen restos de aminoácidos fosforilados, por ejemplo, fosfotirosina, fosfoserina o fosfotreonina.

La expresión “célula huésped” significa cualquier célula de cualquier organismo que se seleccione, modifique, transforme, cultive o use o manipule de cualquier modo, para la producción de una sustancia por la célula, por ejemplo la expresión por la célula de un gen, una secuencia de ADN o ARN, una proteína o una enzima.

Como se usa en el presente documento, el término aislado significa que el material referido se retira del ambiente en el que normalmente se encuentra. Por lo tanto, un material biológico aislado puede estar sin componentes celulares, es decir, componentes de las células en los que el material se encuentra o produce. En el caso de moléculas de ácido nucleico, un ácido nucleico aislado incluye un producto de PCR, un ARNm aislado, un ADNc, o un fragmento de restricción. En otra realización, se escinde preferentemente un ácido nucleico aislado del cromosoma en el que puede encontrarse, y más preferentemente no se une ya a regiones no reguladoras, no codificantes, o a otros genes, localizados cadena arriba o cadena abajo del gen contenido por la molécula de ácido nucleico aislada cuando se encuentran en el cromosoma. En otra realización más, el ácido nucleico aislado carece de uno o más intrones. Las moléculas de ácido nucleico aisladas incluyen secuencias insertadas en plásmidos, cósmidos, cromosomas artificiales y similares. Por lo tanto, en una realización específica, un ácido nucleico recombinante es un ácido nucleico aislado. Una proteína aislada puede asociarse con otras proteínas o ácidos nucleicos, o ambas, con las que se asocia en la célula, o con membranas celulares si es una proteína asociada a membrana. Un orgánulo, célula o tejido aislado se retira del sitio anatómico en el que se encuentra en un organismo. Un material aislado puede ser, pero no necesita ser, purificado.

El término “purificado” como se usa en el presente documento se refiere a un material que se ha aislado en condiciones que reducen o eliminan la presencia de materiales no relacionados, es decir, contaminantes, incluyendo materiales nativos de los que se obtiene el material. Por ejemplo, una proteína purificada está sustancialmente sin otras proteínas o ácidos nucleicos con los que se asocia en una célula; una molécula de ácido nucleico purificada está preferentemente sustancialmente sin proteínas u otras moléculas de ácido nucleico no relacionadas con las que puede encontrarse dentro de una célula. Como se usa en el presente documento, la expresión “sustancialmente sin” se usa de forma operativa, en el contexto de ensayos analíticos del material. Preferentemente, el material purificado sustancialmente sin contaminantes es al menos el 50 % puro; más preferentemente, al menos el 90 % puro y más preferentemente aún al menos el 99 % puro. La pureza puede evaluarse por cromatografía, electroforesis en gel, inmunoensayo, análisis de composición, ensayo biológico y otros procedimientos conocidos en la técnica.

Los procedimientos para purificación son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, pueden purificarse ácido nucleicos por precipitación, cromatografía (incluyendo cromatografía de fase sólida preparatoria, hibridación de oligonucleótidos, y cromatografía de triple hélice), ultracentrifugación y otros medios. Los polipéptidos y proteínas pueden purificarse por diversos procedimientos incluyendo, sin limitación, electroforesis en gel de disco preparatorio, isoelectroenfoque, HPLC, HPLC de fase inversa, filtración en gel, cromatografía de intercambio iónico y partición, cromatografía de precipitación e insolubilización por salado, extracción y distribución contra corriente. Para algunos fines, es preferible producir el polipéptido en un sistema recombinante en el que la proteína contiene un marcador de secuencia adicional que facilita la purificación, tal como, pero sin limitación, una secuencia de polihistidina, o una secuencia que se une específicamente a un anticuerpo, tal como FLAG y GST. El polipéptido puede después purificarse a partir de un lisado en bruto de las células huésped por cromatografía en una matriz de fase sólida apropiada. Como alternativa, los anticuerpos producidos contra la proteína o contra péptidos derivados de la misma pueden usarse como reactivos de purificación. Las células pueden purificarse por diversas técnicas, incluyendo centrifugación, separación en matriz (por ejemplo, separación en lana de nylon), selección y otras técnicas de inmunoselección, empobrecimiento (por ejemplo, empobrecimiento del complemento de células contaminantes), y separación de células (por ejemplo, separación de células activadas por fluorescencia [FACS]). Son posibles otros procedimientos de purificación. Un material purificado puede contener menos de aproximadamente el 50 %, preferentemente menos de aproximadamente el 75 %, y más preferentemente menos de aproximadamente el 90 %, de los componentes celulares con los que se asoció originalmente. El “sustancialmente puro” indica el mayor grado de pureza que puede conseguirse usando técnicas de purificación convencionales conocidas en la materia.

Los polinucleótidos son “hibridables” entre sí cuando al menos una hebra de un polinucleótido puede hibridar con otros polinucleótido en condiciones de rigurosidad definida. La rigurosidad de hibridación se determina, por ejemplo, por la temperatura a la que se realiza la hibridación y/o el lavado, y b) la fuerza iónica y polaridad (por ejemplo, formamida) de las soluciones de hibridación y lavado, así como otros parámetros. La hibridación requiere que los dos polinucleótidos contengan secuencias sustancialmente complementarias; dependiendo de la rigurosidad de hibridación, sin embargo, pueden tolerase emparejamientos erróneos. Normalmente, la hibridación de dos secuencias a alta rigurosidad (tal como, por ejemplo, en una solución acuosa de 0,5 x SSC a 65 ºC) requiere que las secuencias muestren algún grado alto de complementariedad sobre su secuencia completa. Las condiciones de rigurosidad intermedia (tales como, por ejemplo, una solución acuosa de 2 X SSC a 65 ºC) y rigurosidad baja (tales como, por ejemplo, una solución acuosa de 2 X SSC a 55 ºC), requieren complementariedad menos global correspondiente entre las secuencias hibridantes (1 X SSC es NaCl 0,15 M, citrato de Na 0,015 M). Los polinucleótidos que “hibridan” con los polinucleótidos en el presente documento pueden ser de cualquier longitud. En una realización, tales polinucleótidos son de al menos 10, preferentemente al menos 15 y más preferentemente al menos 20 nucleótidos de longitud. En otra realización, los polinucleótidos que hibridan son de aproximadamente la misma longitud. En otra realización, los polinucleótidos que hibridan incluyen los que hibridan en condiciones de rigurosidad adecuadas y que codifican polipéptidos o enzimas que tienen la misma función, tal como la capacidad para unirse a p53 (en el caso de E6) o de unirse a Rb (en el caso de E7).

Las técnicas y herramientas de ingeniería genética generales analizadas en el presente documento, incluyendo transformación y expresión, el uso de células huésped, vectores, sistemas de expresión, etc. se conocen bien en la materia.

Como se usa en el presente documento, el término “aproximadamente” o “alrededor de” significa dentro del 50 % de un valor dado, preferentemente dentro del 20 %, más preferentemente dentro del 10 %, más preferentemente aún dentro del 5 % y más preferentemente dentro del 1 % de un valor dado. Como alternativa, el término “aproximadamente” o “alrededor de” significa que un valor puede quedar dentro de un intervalo de error científicamente aceptable para este tipo de valor, que dependerá de lo cualitativa que pueda ser una medición dadas las herramientas disponibles. “Aproximadamente” o “alrededor de” puede definir una distribución en torno a un valor medio, en lugar de un valor sencillo.

Las composiciones inmunogénicas y farmacéuticas de la invención

La presente invención proporciona composiciones inmunogénicas y farmacéuticas que comprenden polipéptidos y polinucleótidos de fusión de E6 y E7 del virus del papiloma humano. Estas composiciones pueden usarse para tratar y/o prevenir cánceres inducidos por virus del papiloma, tales como cáncer cervical, y lesiones cervicales tales como CIN. Estas composiciones pueden usarse también para tratar cánceres del tracto gastrointestinal inferior, tales como cáncer anal, y otros cánceres del sistema reproductor, tales como cáncer de pene y vulva.

En una realización adicional, la presente invención proporciona composiciones inmunogénicas y farmacéuticas que comprenden fusiones de polipéptidos y fusiones de polinucleótidos de múltiples virus del papiloma. Por ejemplo, la presente divulgación proporciona composiciones inmunogénicas y farmacéuticas que comprenden fusiones de proteínas E6 y E7 de múltiples miembros de la familia de VPH tales como VPH 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 y 68. Se muestran ejemplos de polipéptidos E6 de VPH en las Figuras 2A-E y las secuencias de aminoácidos de E6 de VPH 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 y 68 se exponen en SEC ID Nº: 15-26, respectivamente. Las secuencias de nucleótidos que codifican estos polipéptidos E6 de VPH se exponen en SEC ID Nº: 42-53, respectivamente. Los ejemplos de polipéptidos E7 de VPH se muestran en las Figuras 3A-C y las secuencias de aminoácidos de E7 de VPH 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 y 68 se exponen en SEC ID Nº: 27-38, respectivamente. Las secuencias de nucleótidos que codifican estos polipéptidos E7 de VPH se exponen en SEC ID Nº: 54-65, respectivamente. Estas fusiones contienen mutaciones en los restos identificados por alineamiento que corresponden a los restos mutados en VPH16 descritos en el presente documento o que corresponden a las secuencias conservadas como se muestra en las secuencias consenso de E6 y E7 (SEC ID Nº: 39 y 40, respectivamente) que interfieren con la característica oncogénica de la proteína sin interferir con su capacidad para inducir una respuesta inmune. La presente divulgación proporciona composiciones inmunogénicas y farmacéuticas que comprenden una fusión que comprende polipéptidos E6 y E7 de diferentes miembros de la familia del virus del papiloma. Por ejemplo, una fusión puede comprender en una construcción sencilla cualquier combinación posible de E6 y E7 de VPH 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 y 68.

El número de polipéptidos E7E6 presentes en una fusión están limitados solamente por las limitaciones de tamaño del mecanismo de suministro o vector en el que se suministren estas composiciones. Por ejemplo, los virus, restringidos por limitaciones estructurales, pueden empaquetar solamente una cantidad particular de ácido nucleico. Los expertos habituales en la materia apreciarán la capacidad de diferentes virus para empaquetar ácido nucleico y apreciarán que es rutinario explorar con respecto a ácidos nucleicos que son de tamaño apropiado para empaquetamiento.

Como alternativa, las composiciones inmunogénicas y farmacéuticas de la presente divulgación pueden comprender múltiples fusiones diferentes de E7E6. Por ejemplo, la composición inmunogénica o farmacéutica puede comprender múltiples partículas virales, conteniendo cada una diferentes fusiones de secuencias E6 y E7 de diferentes virus del papiloma.

Las composiciones inmunogénicas y farmacéuticas que comprenden fusiones de E7E6 de múltiples virus del papiloma son particularmente ventajosas porque generan una respuesta inmune a múltiples proteínas E6 y E7 y de este modo previenen cánceres y neoplasias provocados por cada uno de estos virus. Por ejemplo, cada uno de VPH 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 y 68 se ha asociado con carcinoma cervical y/o neoplasias intraepiteliales (Harrison’s Principles of Internal Medicine Décima Quinta Edición, 2001, 1119; Braunwald y col., Eds., McGraw-Hill). Por lo tanto, una fusión de, por ejemplo, polipéptidos E6 y E7 de VPH16 y 18 proporcionaría prevención y tratamiento de cánceres de dos etiologías diferentes. Las composiciones que comprenden polipéptidos E6 y E7 de múltiples virus diferentes son un medio particularmente potente para tratar y/o prevenir una amplia serie de cánceres inducidos por virus del papiloma, tales como cáncer cervical, lesiones cervicales tales como CIN, cánceres del tracto gastrointestinal inferior, tales como cáncer anal, y otros cánceres del sistema reproductor, tales como cáncer de pene y vulva.

El experto en la materia apreciará procedimientos para determinar la seguridad de composiciones inmunogénicas. Los procedimientos ejemplares para determinar si, por ejemplo, las fusiones E7E6 tienen capacidad de transformación e inmortalización reducida o anulada incluyen: determinar los niveles de p53 y/o Rb mediante, por ejemplo, transferencia de Western, ensayos de agar blando, transfección de queratinocitos primarios, o células epiteliales de mamífero e identificación de pérdida de senescencia, y transfección de células e identificación de cambios en morfología celular. Además de estos ensayos funcionales, pueden usarse ensayos bioquímicos. Por ejemplo, puede medirse la unión de E6 y E7 con proteínas celulares tales como p53, E6 TP-1, telomerasa y Rb.

La evaluación de los niveles de p53 y Rb es un procedimiento para determinar la seguridad de partículas virales recombinantes, tales como VEE, que comprenden fusiones E7E6. Los niveles de estado estacionario de p53 y Rb en MEC humanas primarias se evaluaron después de infección con E6 y E7 de VPH16 de tipo silvestre que expresaba VRP, como proteínas de fusión o individuales, proteína de fusión E7E6 TetM o GFP como un control negativo. La infección por VRP de MEC reveló niveles reducidos en gran medida de p53 y Rb en cultivos que contienen formas de tipo silvestre de E6 y E7, respectivamente; la mera fusión de E7 con E6 no fue suficiente para alterar la actividad de ninguna de las proteínas (Figura 8A y B). Por el contrario, las MEC infectadas con VRP E7E6 TetM que contenían mutaciones de E6 (63C y 106C) y E7 (24C y 26E) contenían niveles normales de p53 y Rb (Figura 8A y B), lo que indica que estas cuatro mutaciones extinguieron la actividad oncogénica primaria de estas proteínas.

Debido a que la erradicación de tumores establecidos requiere la inducción de una respuesta inmune mediada por linfocitos T fuerte contra los antígenos virales específicos de tumor E6 y E7, se seleccionaron replicones de encefalitis equina venezolana (VEE) como el vector de composición inmunogénica. Sin embargo, puede usarse cualquier procedimiento de suministro de genes o proteínas para suministrar y empaquetar las composiciones inmunogénicas de la presente invención. Por ejemplo, pueden usarse otros vectores virales conocidos por los expertos en la materia o los nucleótidos que codifican los polipéptidos de fusión mutantes pueden suministrarse directamente por un plásmido.

Los vectores AV recombinantes, de los que VEE es un miembro, son particularmente versátiles porque pueden lanzarse como ARN desnudo, ADN plasmídico desnudo o como partículas, siendo esta última la formulación más eficaz para su uso en composiciones inmunogénicas. Una propiedad distintiva de VRP a diferencia de los otros replicones de AV es su tropismo para células dendríticas (MacDonald, G. H. y col., J Virol 2000, 74: 914-922). Las células dendríticas dirigidas por VRP pueden ser vehículos altamente eficaces para transportar antígeno a ganglios linfáticos y puede ser una estrategia moderadora de dosis eficaz.

Las composiciones inmunogénicas, particularmente los ácidos nucleicos, de la presente invención pueden suministrarse mediante vectores virales, tales como lentivirus, retrovirus, virus del herpes, adenovirus, virus adenoasociados, virus vaccinia, baculovirus, alfavirus y otros virus recombinantes con tropismo celular deseable. Puede usarse una amplia diversidad de alfavirus como vectores virales, incluyendo, por ejemplo, vectores de virus Sindbis, virus del bosque de Semliki (ATCC VR 67; ATCC VR 1247), virus del Río Ross (ATCC VR 373; ATCC VR 1246) y virus de encefalitis equina Venezolana (ATCC VR 923; ATCC VR 1250; ATCC VR 1249; ATCC VR 532). Los ejemplos representativos de tales sistemas de vector incluyen los descritos en las Patentes de Estados Unidos Nº 5.091.309; 5.217.879; y 5.185.440; y Publicaciones de Patente Internacional Nº WO 92/10578; WO 94/21792; WO 95/27069; WO 95/27044; y WO 95/07994. La dirección a región específica de células también se proporciona, por ejemplo, dirigiendo de modo que el polipéptido de fusión se localice en la membrana celular, como se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 6.228.621.

Por lo tanto, un gen que codifique una fusión de polipéptidos E7E6 puede introducirse in vivo, ex vivo, o in vitro usando un vector viral o a través de introducción directa de un ácido nucleico, tal como un ADN o ARN de replicón. La expresión en tejidos diana puede efectuarse dirigiendo el vector recombinante a células específicas, tales como con un vector viral o ligando del receptor, o usando un promotor específico de tejido, o ambos. Se describe el suministro de genes dirigido en la Publicación de Patente Internacional WO 95/28494.

Son vectores virales habitualmente usados para procedimientos de dirección y terapia in vivo o ex vivo los vectores basados en ADN y vectores retrovirales. Se conocen en la técnica procedimientos para construir y usar vectores virales (véase, por ejemplo Miller y Rosman, BioTechniques 1992, 7: 980-990). Preferentemente, los vectores virales son defectuosos en replicación, es decir, son incapaces de replicar de forma autónoma en la célula diana. En general, los genomas de los vectores virales defectuosos en replicación que se usan dentro del alcance de la presente invención carecen de al menos una región que es necesaria para la replicación del virus en la célula infectada. Estas regiones pueden eliminarse (completas o en parte), o hacerse no funcionales por cualquier técnica conocida por un experto en la materia. Estas técnicas incluyen la deleción total, sustitución (por otras secuencias, en particular por el ácido nucleico insertado), deleción parcial o adición de una o más bases a una región esencial (para replicación) (para provocar un desplazamiento de fase). Tales técnicas pueden realizarse in vitro (en el ADN aislado)

o in situ, usando las técnicas de manipulación genética o mediante tratamiento con agentes mutagénicos. Preferentemente, el virus defectuoso en replicación conserva las secuencias de su genoma que son necesarias para encapsulación de las partículas virales.

Los vectores virales incluyen un virus de ADN o ARN atenuado o defectuoso, tal como, pero sin limitación, virus del herpes simple (VHS), virus de Epstein Barr (VEB), adenovirus, virus adenoasociado (VAA), VEE y similares. Se prefieren virus defectuosos, que carezcan completamente o casi completamente de genes virales. Los virus defectuosos no generan descendencia después de su introducción en la célula. El uso de vectores virales defectuosos permite la administración de células en un área específica, localizada, sin peligro de que el vector viral prolifere e infecte otras células. Por lo tanto, puede dirigirse específicamente a un tejido particular. Los ejemplos de vectores particulares incluyen, pero sin limitación, el sistema de VEE defectuoso en replicación como se describe por Pushko y col. (Virology 1997, 239: 389-401), y un vector de adenovirus atenuado, tal como el vector descrito por Stratford-Perricaudet y col. (J. Clin. Invest. 1992, 90: 626-630; véase también La Salle y col., Science 1993, 259: 988-990), y un vector de virus adenoasociado defectuoso (Samulski y col., J. Virol. 1987, 61: 3096-3101; Samulski y col., J. Virol. 1989, 63: 3822-3828; Lebkowski y col., Mol. Cell. Biol. 1988, 8: 3988-3996).

Diversas compañías producen vectores virales de forma comercial, incluyendo pero sin limitación en absoluto Avigen, Inc. (Alameda, CA; vectores AAV), Cell Genesys (Foster City, CA; vectores retrovirales, adenovirales, AAV y vectores lentivirales), Clontech (vectores retrovirales y baculovirales), Genovo, Inc. (Sharon Hill, PA; vectores adenovirales y AAV), Genvec (vectores adenovirales), IntroGene (Leiden, Países Bajos; vectores adenovirales), Molecular Medicine (vectores retrovirales, adenovirales y AAV), Norgen (vectores adenovirales), Oxford BioMedica (Oxford, Reino Unido; vectores lentivirales), Transgene (Estrasburgo, Francia; vectores adenovirales, retrovirales, lentivirales y de vaccinia), AlphaVax (vectores alfavirales tales como vectores VEE) e Invitrogen (Carlsbad, California).

En otra realización, el vector puede introducirse in vivo por lipofección, como ADN desnudo, o con otros agentes facilitadores de transfección (péptidos, polímeros, bupivacaína, etc.). Pueden usarse lípidos catiónicos sintéticos para preparar liposomas para transfección in vivo de un gen que codifica un marcador (Felgner y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1987; 84: 7413-7417; Felgner y Ringold, Science 1989, 337: 387-388; Mackey y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1988, 85: 8027-8031; Ulmer y col., Science 1993, 259: 1754-1748). Se describen compuestos lipídicos útiles y composiciones para transferencia de ácidos nucleicos en las Publicaciones de Patente Internacionales WO 95/18863 y WO 96/17823, y en la Patente de Estados Unidos Nº 5.459.127. Los lípidos pueden acoplarse químicamente a otras moléculas con el fin de dirigir (véase, Mackey y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1988, 85: 8027-8031). Los péptidos diana, por ejemplo, hormonas o neurotransmisores, y proteínas tales como anticuerpos o moléculas no peptídicas podrían acoplarse a liposomas químicamente. Otras moléculas también son útiles para facilitar la transfección de un ácido nucleico in vivo, tal como un oligopéptido catiónico (por ejemplo, Publicación de Patente Internacional WO 95/21931), péptidos derivados de proteínas de unión de ADN (por ejemplo, Publicación de Patente Internacional WO 96/25508) o un polímero catiónico (por ejemplo, Publicación de Patente Internacional WO 95/21931).

También es posible introducir el vector in vivo como un plásmido de ADN desnudo. Los vectores de ADN desnudo para terapia génica pueden introducirse en las células huésped deseadas por procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo, electroporación, microinyección, fusión celular, DEAE dextrano, precipitación con fosfato cálcico, uso de una pistola génica (por ejemplo, el sistema de pistola génica Helios (Bio-Rad; Hércules, CA) puede usarse para suministro génico epidérmico), o uso de un transportador de vector de ADN (véase, por ejemplo, Wu y col., J. Biol. Chem. 1992, 267: 963-967; Wu y Wu, J. Biol. Chem. 1988, 263: 14621-14624; Hartmut y col., Solicitud de Patente Canadiense Nº 2.012.311, presentada el 15 de marzo de 1990; Williams y col., Proc. Natl. Acad. Sci.

U.S.A. 1991, 88: 2726-2730). También pueden usarse enfoques de suministro de ADN mediados por receptor (Curiel y col., Hum. Gene Ther. 1992, 3: 147-154; Wu y Wu, J. Biol. Chem. 1987, 262: 4429-4432). Las Patentes de Estados Unidos Nº 5.580.859 y 5.589.466 desvelan el suministro de secuencias de ADN exógeno, sin agentes facilitadores de la transfección, en un mamífero. Como alternativa, el ADN se formula en composiciones con agentes facilitadores de la transfección, que facilitan la inmunización, tales como bupivacaína y otros anestésicos locales (Patente de Estados Unidos Nº 6.127.170). Recientemente, se ha descrito una técnica de transferencia de ADN in vivo de alta eficacia a tensión relativamente baja, denominada electrotransferencia (Mir y col., C.P. Acad. Sci. 1998,

321: 893; documentos WO 99/01157; WO 99/01158; WO 99/01175).

La expresión “composición inmunogénica”, como se usa en el presente documento, se refiere en general a cualquier composición que pueda administrarse para inducir una respuesta inmune en el receptor. Una composición inmunogénica generalmente comprende una dosis inmunológicamente eficaz de un inmunógeno (por ejemplo, un antígeno de un agente infeccioso) y un vehículo farmacéuticamente aceptable y, opcionalmente, un adyuvante. El vehículo farmacéuticamente aceptable puede ser agua estéril o solución salina isotónica estéril, así como todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes retardantes de la absorción e isotónicos, y similares, compatibles con administración a seres humanos. El vehículo apropiado resultará evidente para los expertos en la materia y dependerá en gran parte de la vía de administración.

Puede administrarse una composición inmunogénica a un organismo, por ejemplo, por inhalación o insuflación (a través de la boca o la nariz), o por administración oral, bucal, vaginal, rectal o parenteral (por ejemplo, por inyección subcutánea, intradérmica, intramuscular, intraorbital, intracapsular, intraespinal, intraesternal, intraperitoneal o intravenosa y similares). También puede administrarse una composición inmunogénica por transferencia mediada por partículas (por ejemplo, usando una “pistola de partículas”). Véase, por ejemplo, Gainer y col., J. Neurooncol 2000, 47: 23-30; Koide y col., Jpn J. Pharmacol 2000, 83: 167-174; Kuriyama y col., Gene Ther. 2000, 7: 1132-1136; y Yamauchi y col., J. Exp. Zool. 2000, 287: 285-293. Tales procedimientos de transferencia de partículas se prefieren particularmente para composiciones inmunogénicas de vector o ADN, por ejemplo, usando una “pistola génica”. La vía de administración apropiada se selecciona dependiendo de la naturaleza de la composición inmunogénica usada, y una evaluación de la edad, peso, sexo y salud general del paciente y los antígenos presentes en la composición inmunogénica, y factores similares por un médico a cargo.

Una composición inmunogénica puede comprender, por ejemplo, una suspensión de un agente infeccioso atenuado

o destruido (por ejemplo, un microorganismo tal como una bacteria o un virus, un parásito u otro patógeno, etc.) que provoca una enfermedad infecciosa. Como alternativa, una composición inmunogénica de la invención puede ser una composición inmunogénica polipeptídica o una composición inmunogénica de ADN. La expresión “composición inmunogénica polipeptídica” se refiere a una composición inmunogénica que comprende un polipéptido inmunogénico, por ejemplo un polipéptido derivado de un agente infeccioso que puede ser un antígeno, y por lo tanto activa una respuesta inmune en un organismo. La expresión “composición inmunogénica de ADN” se usa en el presente documento para referirse a composiciones inmunogénicas suministradas por medio de un vector recombinante. Una expresión alternativa usada en el presente documento es “composición inmunogénica de vector” (puesto que algunos vectores potenciales, por ejemplo alfavirus, son virus de ARN y puesto que en algunos casos puede suministrarse ARN no viral en lugar de ADN a las células).

La expresión “dosis inmunológicamente eficaz” se refiere a la cantidad de un compuesto o composiciones que es suficiente para dar como resultado una actividad deseada. Por lo tanto, como se usa para describir una composición inmunogénica, una dosis inmunológicamente eficaz se refiere a la cantidad de un compuesto o composiciones (por ejemplo, un antígeno) que es suficiente para producir una respuesta inmune eficaz. En general, la selección de la cantidad o dosificación inmunológicamente eficaz apropiada para las composiciones inmunogénicas de la presente invención también se basará en la composición inmunogénica particular empleada, así como la condición física del sujeto, más especialmente incluyendo la salud general y peso del sujeto inmunizado. Dicha selección y ajuste hacia arriba o hacia abajo de la dosis eficaz está dentro de la experiencia de la técnica. La cantidad de componente activo requerida para inducir una respuesta inmune sin efectos secundarios significativos varía dependiendo de la composición empleada.

Para virus recombinantes, preferentemente defectuosos en replicación, que contengan el ADN que codifica los polipéptidos de fusión E6/E7 mutantes de la presente invención, la cantidad inmunológicamente eficaz es una cantidad de virus recombinante que es eficaz en una vía de administración para transfectar las células deseadas del sujeto y proporcionar suficientes niveles de expresión del gen seleccionado para proporcionar el efecto deseado. Los niveles de inmunidad pueden supervisarse para determinar la necesidad, si la hubiera, de refuerzos.

El término “adyuvante” se refiere a un compuesto o mezcla que potencia la respuesta inmune a un antígeno. Un adyuvante puede actuar, por ejemplo, como un depósito tisular que libera lentamente el antígeno, y también como un activador del sistema linfoide que potencia la respuesta inmune (véase, Hood y col., Immunology, Segunda Ed., 1984, Benjamin/Cummings: Menlo Park, California, pág. 384). Tales adyuvantes también incluyen, entre otros, MPL™ (monofosforil lípido 3-O-desacilado; Corixa, Hamilton, MT), que se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 4.912.094. También son adecuados para su uso como adyuvantes los compuestos de aminoalquil glucosamino fosfato (AGP), o derivados o análogos de los mismos, que están disponibles de Corixa (Hamilton, MT) y que se describen en la Patente de Estados Unidos Nº 6.113.918. Un AGP tal es 2-[(R)-3-Tetradecanoiloxitetradecanoilamino] etil 2-Desoxi-4-O-fosfono-3-O-[(R)-3-tetradecanoioxitetradecanoil]-2-[(R)-3tetradecanoioxitetradecanoilamino]-b-D-glucopiranósido, que también se conoce como 529 (anteriormente conocido como RC529). Este adyuvante 529 se formula como una forma acuosa o como una emulsión estable.

Otros adyuvantes incluyen emulsiones de aceite mineral y agua, sales de aluminio (alumbre), tales como hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, etc., Amphigen, Avridine, L121/escualeno, D-lactida-polilactida/glicósido, dipéptido de muramilo, Bordetella destruida, saponinas, tales como Quil A o Stimulon™ QS-21 (Antigenics, Framingham, MA.), descrito en la Patente de Estados Unidos Nº 5.057.540, y partículas generadas de los mismos tales como ISCOMS (complejos inmunoestimuladores), Mycobacterium tuberculosis, lipopolisacáridos bacterianos, polinucleótidos sintéticos tales como oligonucleótidos que contienen un motivo CpG (Patente de Estados Unidos Nº 6.207.646, toxina del cólera (en una forma de tipo silvestre o mutante, por ejemplo, en la que el ácido glutámico en la posición de aminoácido 29 se reemplaza por otro aminoácido, preferentemente una histidina, de acuerdo con la Publicación de Patente Internacional Nº WO 00/18434), una toxina pertussis (PT) o una toxina lábil por calor de E. coli (LT), particularmente LT-K63, LT-R72, CT-S109, PT-K9/G129; véase, por ejemplo, Publicaciones de Patente Internacional Nº WO 93/13302 y WO 92/19265. Diversas citocinas y linfocinas son adecuadas para su uso como adyuvantes. Un adyuvante tal es el factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), que tiene una secuencia de nucleótidos como se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 5.078.996. Un plásmido que contiene ADNc de GM-CSF se ha transformado en E. coli y se ha depositado en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, con el Número de Acceso 39900. La citocina Interleucina12 (IL-12) es otro adyuvante que se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 5.723.127. Se ha mostrado que otras citocinas o linfocinas tienen actividad inmunomoduladora, incluyendo, pero sin limitación, las interleucinas 1alfa, 1-beta, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 13, 18, 15, 16, 17 y 18, los interferones alfa, beta y gamma, factor estimulante de colonias de granulocitos y los factores de necrosis tumoral alfa y beta, y son adecuadas para su uso como adyuvantes.

Otros adyuvantes adecuados incluyen, pero sin limitación: sustancias tensioactivas (por ejemplo, hexadecilamina, octadecilamina, ésteres de aminoácidos de octadecilo, lisolecitina, bromuro de dimetil-dioctadecilamonio), metoxihexadecilglicerol y polioles de pluronic; poliaminas, por ejemplo, pirano, dextransulfato, poli IC, carbopol; péptidos, por ejemplo, dipéptido de muramilo, dimetilglicina, tuftsina; emulsiones de aceite; y geles minerales, por ejemplo, fosfato de aluminio, etc., y complejos inmunoestimulantes. El inmunógeno también puede incorporarse en liposomas, o conjugarse con polisacáridos, lipopolisacáridos y/u otros polímeros para su uso en una composición inmunogénica.

Adyuvantes a modo de ejemplo incluyen, pero sin limitación, adyuvante incompleto de Freund, sustancias tensioactivas, (por ejemplo, lisolecitina), polioles de pluronic, polianiones, péptidos, emulsiones de aceite o hidrocarburos. Los adyuvantes ejemplares también incluyen adyuvantes humanos potencialmente útiles tales como BCG bacilo de Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum. Además, pueden proporcionarse proteínas inmunoestimuladoras, tales como quimiocinas, o secuencias de ácidos nucleicos que codifican quimiocinas, como un adyuvante para aumentar la respuesta inmune a una composición inmunogénica.

La frase “farmacéuticamente aceptable” se refiere a entidades moleculares y composiciones que son fisiológicamente tolerables y no producen normalmente una reacción alérgica o desafortunada similar (por ejemplo, trastorno gástrico, mareo y similares) cuando se administran a un individuo. Preferentemente, y particularmente cuando se usa una composición inmunogénica en seres humanos, la expresión “farmacéuticamente aceptable” puede significar aprobado por una agencia reguladora (por ejemplo, la Agencia de Fármacos y Alimentos de los Estados Unidos) o enumerada en una farmacopea reconocida en general para su uso en animales (por ejemplo, la Farmacopea de Estados Unidos).

El término “transportador” se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o vehículo con el que se administra un compuesto. Se emplean preferentemente agua estéril o soluciones salinas acuosas y soluciones acuosas de dextrosa y glicerol como transportadores, particularmente para soluciones inyectables. Se describen transportadores farmacéuticas ejemplares adecuados en “Remington’s Pharmaceutical Sciences” por F.W. Martin.

La toxicidad y la eficacia terapéutica de los compuestos puede determinarse por procedimientos farmacéuticos convencionales, por ejemplo, en ensayos de cultivo celular o usando animales experimentales para determinar la DL50 y la DE50. Los parámetros de DL50 y DE50 se conocen bien en la técnica, y se refieren a las dosis de un compuesto que son letales para el 50 % de una población y terapéuticamente eficaces en el 50 % de una población, respectivamente. La relación de dosis entre efectos terapéuticos y tóxicos se denomina el índice terapéutico y puede expresarse como la relación de DL50/DE50. Se prefieren compuestos que muestren índices terapéuticos grandes, aunque pueden usarse compuestos que muestren efectos secundarios tóxicos. Sin embargo, en tales casos es particularmente preferible usar sistemas de suministro que dirijan específicamente tales compuestos al sitio de tejido afectado para minimizar el daño potencial a otras células, tejidos u órganos y para reducir efectos secundarios.

Pueden usarse datos obtenidos de ensayo de cultivo celular o estudios animales para formular un intervalo de dosificaciones para su uso en seres humanos. La dosificación de compuestos usados en procedimientos terapéuticos de la presente invención preferentemente queda dentro de un intervalo de concentraciones en circulación que incluye la concentración de DE50 pero con poca o sin toxicidad (por ejemplo, por debajo de la concentración DL50). La dosificación particular usada en cualquier aplicación puede variar dentro de este intervalo, dependiendo de factores tales como la forma de dosificación particular empleada, la vía de administración usada, las condiciones del individuo (por ejemplo, paciente), y así sucesivamente.

Los animales no humanos incluyen, sin limitación, animales de laboratorio tales como ratones, ratas, conejos, hámsteres, cobayas, etc.; animales domésticos tales como perros y gatos; animales de granja tales como ovejas, cabras, cerdos, caballos y vacas; y primates no humanos.

Una dosis terapéuticamente eficaz puede estimarse inicialmente a partir de ensayos de cultivo celular y formularse en modelos animales para conseguir un intervalo de concentración en circulación que incluya la CI50. La concentración CI50 de un compuesto es la concentración que consigue una inhibición semimáxima de los síntomas (por ejemplo, como se determina a partir de los ensayos de cultivo celular). Las dosificaciones apropiadas para su uso en un individuo particular, por ejemplo en pacientes humanos, puede determinarse después de forma más precisa usando dicha información.

El término “tratar” significa intentar inducir una respuesta antitumoral contra células del tumor, es decir, el cáncer. Una respuesta antitumoral incluye, pero sin limitación, aumento del tiempo de supervivencia, inhibición de metástasis tumoral, inhibición de crecimiento tumoral, regresión tumoral y desarrollo de una respuesta de hipersensibilidad de tipo retardada (DTH) a células tumorales no modificadas.

Pueden medirse de forma rutinaria medidas de compuestos en plasma en un individuo tal como un paciente con técnicas tales como cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) o cromatografía de gases.

Las composiciones farmacéuticas para su uso de acuerdo con la presente invención pueden formularse de manera convencional usando uno o más vehículos o excipientes fisiológicamente aceptables.

Por lo tanto, los compuestos y sus sales y solvatos fisiológicamente aceptables pueden formularse para administración por las vías descritas anteriormente.

Para administración oral, las composiciones farmacéuticas pueden tomar la forma de, por ejemplo, comprimidos o cápsulas preparadas por medios convencionales con excipientes farmacéuticamente aceptables tales como agentes de unión (por ejemplo, almidón de maíz pregelatinizado, polivinilpirrolidona o hidroxipropil metilcelulosa); cargas (por ejemplo, lactosa, celulosa microcristalina o hidrógeno fosfato cálcico); lubricantes (por ejemplo, estearato de magnesio, talco o sílice); disgregantes (por ejemplo, almidón de patata o glicolato de almidón sódico); o agentes humectantes (por ejemplo, lauril sulfato sódico). Los comprimidos pueden revertirse por procedimientos bien conocidos en la técnica. Las preparaciones líquidas para administración oral pueden tomar la forma de, por ejemplo, soluciones, jarabes o suspensiones o pueden presentarse como producto seco para constitución con agua u otro vehículo adecuado antes de su uso. Tales preparaciones líquidas pueden prepararse por medios convencionales con aditivos farmacéuticamente aceptables tales como agentes de suspensión (por ejemplo, jarabe de sorbitol, derivados de celulosa o grasas comestibles hidrogenadas); agentes emulsionantes (por ejemplo, lecitina o goma arábiga); vehículos no acuosos (por ejemplo, aceite de almendras, ésteres oleosos, alcohol etílico o aceites vegetales fraccionados); y conservantes (por ejemplo, metil o propil-p-hidroxibenzoatos o ácido sórbico). Las preparaciones también pueden contener sales de tampón, agentes saporíferos, colorantes y edulcorantes según sea apropiado.

Las preparaciones para administrar oral pueden formularse de forma adecuada para proporcionar liberación controlada del compuesto activo. Para administración bucal las composiciones pueden tomar la forma de comprimidos o pastillas para chupar formuladas de manera convencional.

Para administración por inhalación, los compuestos para su uso de acuerdo con la presente invención se suministran convenientemente en forma de una presentación de pulverización en aerosol a partir de envases presurizados o un nebulizador, con el uso de un propulsor adecuado, por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presurizado la unidad de dosificación puede determinarse proporcionando una válvula para suministrar una cantidad medida. Pueden formularse cápsulas y cartuchos de, por ejemplo, gelatina para su uso en un inhalador o insuflador que contienen una mezcla de polvo del compuesto y una base de polvo adecuada tal como lactosa o almidón.

Los compuestos pueden formularse para administración parenteral por inyección, por ejemplo, por inyección de embolada o infusión continua. Pueden presentarse formulaciones para inyección en forma farmacéutica unitaria, por ejemplo, en ampollas o en recipientes multidosis, con un conservante añadido. Las composiciones pueden tomar tales formas como suspensiones, soluciones o emulsiones o en vehículos oleosos o acuosos, y pueden contener agentes formuladores tales como agentes de suspensión, estabilización y/o dispersión. Como alternativa, el principio activo puede estar en forma de polvo para constitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua sin pirógenos estéril, antes de su uso.

Los compuestos también pueden formularse en composiciones rectales tales como supositorios o enemas de retención, por ejemplo, que contienen bases de supositorio convencionales tales como manteca de cacao u otros glicéridos.

Además de las formulaciones descritas anteriormente, los compuestos también pueden formularse como una preparación de liberación prolongada. Tales formulaciones de actuación larga pueden administrarse por implantación (por ejemplo, por vía subcutánea o por vía intramuscular) o por inyección intramuscular. Por lo tanto, por ejemplo, los compuestos pueden formularse con materiales poliméricos o hidrófobos adecuados (por ejemplo como una emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico, o como derivados poco solubles, por ejemplo, como una sal poco soluble.

Las composiciones pueden, si se desea, presentarse en un envase o dispositivo dispensador que puede contener una o más formas farmacéuticas unitarias que contienen el principio activo. El envase puede por ejemplo comprender hoja metálica o plástica, tal como un envase de blíster. El envase o dispositivo dispensador puede estar acompañado de instrucciones para administración.

Los términos usados en la presente memoria descriptiva generalmente tienen sus significados ordinarios en la técnica, dentro del contexto de la presente invención y en el contexto específico en el que se usa cada término. Ciertos términos se analizan en la memoria descriptiva, para proporcionar orientación adicional al facultativo en la descripción de las composiciones y procedimientos de la invención y cómo prepararlas y usarlas.

EJEMPLOS

La presente invención se describe mediante los siguientes ejemplos.

Ejemplo 1. DISEÑO Y GENERACIÓN DE CONSTRUCCIONES DE COMPOSICIONES INMUNOGÉNICAS DE VPH16.

Materiales y procedimientos

Generación de construcciones de replicón de VEE. Los genes E6 y E7 de VPH16 se obtuvieron de pHPV-16 (ATCC Nº 45113) por procedimientos de PCR (Horton y col., Gene 1989, 77: 61-8), y se fusionaron en dos orientaciones diferentes para generar fases abiertas de lectura (ORF) de 744 pares de bases (pb) que codifican 248 aminoácidos para todas las construcciones. El codón de inicio de metionina de cada ORF cadena abajo se retiró para eliminar cualquier posibilidad de inicio interno. Se mutaron nucleótidos específicos de las ORF fusionadas usando el Kit de Mutagénesis Dirigida QuikChang® (Stratagene, La Jolla, CA). Los genes fusionados de tipo silvestre (wt) y mutados (mut) se subclonaron en el vector pVR200 (Alpha Vax; Durham, NC), un plásmido derivado del ADNc de un mutante no neurotrófico altamente atenuado (V3014) de la cepa Trinidad Donkey de encefalitis equina venezolana (VEE) (Grieder, F.B. y col., Virology 1995, 206: 994-1006). El plásmido pVR200 se describe en Pushko y col., (Virology 1997, 239: 389-401, en particular véase pág. 390-391 “Cell lines and plasmids” y pág. 393 Figura 1b). Brevemente, este plásmido tiene el promotor T7 seguido de genes no estructurales de VEE, el promotor subgenómico 26S, el sitio de clonación para el gen o los genes de interés (en la presente invención, las fusiones E6/E7), y un sitio de linealización Notl.

Se prepararon partículas de replicón de VEE incompetentes para replicación (VRP) por el procedimiento de auxiliar dividido y se valoraron como se describe (Pushko y col., Virology 1997, 239: 389-401). Brevemente, el plásmido pVR200 (con las fusiones de interés clonadas en él) se cotransfectó en células junto con: (1) una construcción auxiliar codificante de cápsida y (2) una construcción auxiliar codificante de glicoproteína. Ninguna de estas construcciones auxiliares tuvo secuencias de empaquetamiento y por lo tanto no se incorporaron en VRP. De este modo, las VRP resultantes fueron defectuosas para replicación. La potencia de cada preparación de VRP, expresada como unidades infecciosas/mililitro (UI/ml), se definió por el número de partículas positivas E7 como se determinó por titulación en células de riñón de cría de hámster (BHK)-21. Las titulaciones de todas las preparaciones de VRP excedieron 109 UI por electroporación; se usó una dosis eficaz de 3 x 105 UI por inmunización a lo largo de estos estudios y como se ha descrito previamente (Velders M.P. y col., Cancer Res 2001, 61: 7861-7867).

Transferencias de Western e inmunofluorescencia. Se infectaron células BHK-21 con las VRP indicadas. Veinticuatro horas después de la infección las células se recogieron en tampón de muestra de SDS para análisis de transferencia de Western o se fijaron con metanolacetona para inmunofluorescencia. Para detectar la expresión de proteínas por transferencia de Western, las proteínas en el lisado celular se separaron por SDS-PAGE, se transfirieron a una membrana de Polivinildeno (PVD) y se analizaron con el sistema de detección Western Breeze (Invitrogen; Carlsbad, CA) usando un anticuerpo monoclonal anti-E7 de VPH16 (Zymed; San Franscisco, CA). Para análisis de inmunofluorescencia, las células fijadas se incubaron con un anticuerpo anti-E7 primario seguido de anticuerpo secundario anti-ratón de cabra marcado con FITC (nº 554001, Pharmingen; San Diego, CA). Los núcleos de las células se tiñeron usando Viaprobe (nº 555815, Pharmingen).

Resultados

Para diseñar composiciones inmunogénicas eficaces y seguras contra cáncer cervical inducido por VPH16, se aumentó la diversidad antigénica expresando los antígenos específicos de tumor tanto E6 como E7. La inclusión de genes E6 y E7 de longitud completa en una composición inmunogénica de VRP es deseable para maximizar la probabilidad de expresar todos los epítopos posibles para estimular linfocitos T CD8+ y CD4+ en poblaciones humanas diversas de HLA de Clase I y Clase II. Se consiguieron fusiones de las ORF de E6 y E7 en dos orientaciones diferentes por PCR y se mutaron hasta cinco aminoácidos (Figuras 1A y B) para obtener construcciones de expresión para producir polipéptidos de fusión de E6/E7 particulares.

Se ha mostrado que una sustitución de aminoácido sencillo en la posición 63C destruye varias funciones de E6 de VPH16: degradación de p53, degradación de E6TP-1, activación de telomerasa y, en consecuencia, inmortalización de células epiteliales primarias (Gao, Q. y col., J Virol 2001, 75: 4459-4466). E6 de VPH16 que contiene una mutación puntual sencilla en 106C no une ni facilita la degradación de p53 y es incapaz de inmortalizar MEC humanas, un fenotipo dependiente de degradación de p53 (Dalal y col., J Virol 1996, 70: 683-688). La proteína E7 de VPH16 de 98 aminoácidos se une a Rb a través de un motivo L-X-C-X-E; mutaciones en las posiciones 24C y 26E de este motivo destruyen unión con Rb y degradación (Munger, K, y col., Oncogene 2001, 20: 7888-7898). Además, de estas dos mutaciones puntuales en E7, se mutó un tercer aminoácido, 91C, para destruir el dedo de cinc sencillo en E7.

Una primera proteína de fusión, denominada en el presente documento E6E7wt comprende la secuencia de aminoácidos de una secuencia de polipéptido E6 de tipo silvestre (SEC ID Nº: 13) en el extremo amino terminal y la secuencia de aminoácidos de una secuencia de polipéptido E7 de tipo silvestre (SEC ID Nº: 14) en el extremo carboxilo terminal. Una secuencia de aminoácidos representativa de un polipéptido de fusión tal se proporciona en la SEC ID Nº: 1. Se expone una secuencia de nucleótidos ejemplar que codifica un polipéptido de fusión E6E7 de tipo silvestre tal en la SEC ID Nº: 2.

También se preparó un segundo polipéptido de fusión, denominado E6E7TetM. Como el polipéptido de fusión E6E7wt, E6E7TetM comprenden una secuencia de polipéptido E6 en el extremo amino terminal y una secuencia de polipéptido E7 en el extremo carboxilo terminal. Sin embargo, la secuencia del polipéptido E6 de esta construcción contiene aminoácidos glicina en los restos 63 y 106 del polipéptido E6 en lugar de los aminoácidos cisteína hallados en la secuencia de aminoácidos de E6 de tipo silvestre (SEC ID Nº: 13). Además, la secuencia de polipéptido E7 de esta construcción contiene aminoácidos glicina en los restos 24 y 26 del polipéptido E7 en lugar de los aminoácidos cisteína (24) y glutamato (26) hallados en la secuencia de aminoácidos de E7 de tipo silvestre (SEC ID Nº: 14). Se proporciona una secuencia de aminoácidos representativa para un polipéptido de fusión tal en la SEC ID Nº: 3. Se expone una secuencia de nucleótidos ejemplar que codifica un polipéptido de fusión E6E7TetM tal en la SEC ID Nº:

4.

También se preparó un tercer polipéptido de fusión, denominado E6E7PentM. Como el polipéptido de fusión E6E7TetM, E6E7PentM comprende una secuencia de polipéptido E6, que comprende aminoácidos glicina en los restos 63 y 106, en su extremo amino terminal y una secuencia de polipéptido E7 que comprende aminoácidos glicina en los restos 24 y 26, en su extremo carboxilo terminal. Sin embargo, la secuencia de polipéptido E7 de esta proteína de fusión también contiene un aminoácido glicina en el resto 91 de la secuencia de polipéptido E7 en lugar del aminoácido cisteína hallado en la secuencia de aminoácidos E7 de tipo silvestre (SEC ID Nº: 14). Se proporciona una secuencia de aminoácidos representativa para un polipéptido de fusión tal en la SEC ID Nº: 5. Se expone una secuencia de nucleótidos ejemplar que codifica un polipéptido de fusión E6E7PentM tal en la SEC ID Nº: 6.

Un cuarto polipéptido de fusión, denominado E7E6wt, comprende la secuencia de aminoácidos de una secuencia de polipéptido E7 de tipo silvestre (SEC ID Nº: 14) en el extremo amino terminal y la secuencia de aminoácidos de una secuencia de polipéptido E6 de tipo silvestre (SEC ID Nº: 13) en el extremo carboxilo terminal. Una secuencia de aminoácidos representativa para un polipéptido de fusión tal se proporciona en la SEC ID Nº: 7. Se expone una secuencia de nucleótidos ejemplar que codifica un polipéptido de fusión E7E6wt tal en la SEC ID Nº: 8.

También se preparó un quinto polipéptido de fusión, denominado E7E6TetM. Como el polipéptido de fusión E7E6wt, E7E6TetM comprende una secuencia de polipéptido E7 en el extremo amino terminal y una secuencia de polipéptido E6 en el extremo carboxilo terminal. Sin embargo, el polipéptido E7 de esta construcción contiene un resto de glicina en los aminoácidos 24 y 26 del polipéptido E7, en lugar de los aminoácidos cisteína (24) y glutamato (26) hallados en la secuencia de aminoácidos E7 de tipo silvestre (SEC ID Nº: 14). Además, el polipéptido E6 de esta construcción contiene un resto de glicina en los aminoácidos 63 y 106 del polipéptido E6, en lugar del aminoácido cisteína hallado en la secuencia de aminoácidos E6 de tipo silvestre (SEC ID Nº: 13). Se proporciona una secuencia de aminoácidos representativa de un polipéptido de fusión tal en la SEC ID Nº: 9. Se expone una secuencia de nucleótidos ejemplar que codifica un polipéptido de fusión E7E6TetM tal en la SEC ID Nº: 10.

También se preparó un sexto polipéptido de fusión, denominado E7E6PentM. Como E7E6TetM, E7E6PentM comprende un polipéptido E7 que comprende aminoácidos glicina en los restos 24 y 26 del polipéptido E7, en su extremo amino terminal y un polipéptido E6, que comprende aminoácidos glicina en los restos 63 y 106 del polipéptido E6, en su extremo carboxilo terminal. Sin embargo, la secuencia de polipéptido E7 de esta construcción también contiene un aminoácido glicina en el resto 91 del polipéptido E7, en lugar del aminoácido cisteína hallado en la secuencia de aminoácidos E7 de tipo silvestre (SEC ID Nº: 14). Se proporciona una secuencia de aminoácidos representativa para una fusión tal en la SEC ID Nº: 11. Se expone una secuencia de nucleótidos ejemplar que codifica un polipéptido de fusión E7E6TetM tal en la SEC ID Nº: 12.

Las mutaciones en E6 y E7 se diseñaron para 1) interrumpir tres dedos de cinc, desestabilizando de este modo la proteína y acelerando la degradación (y de este modo aumentar la inmunogenicidad) (63C y 106C de E6; 91C de E7 (Dalal y col., J Virol 1996, 70: 683-8; Shi y col., J Virol 1999, 73: 7877-81)); 2) perturbar la degradación inducida por E6 de p53 (106C; (Dalal y col., J Virol 1996, 70: 683-8)) y unión de E6-TP1 (Gao y col., J Virol 2001, 75: 4459-66); y 3) interrumpir la unión de Rb y degradación por E7 (24C y 26E; (Edmonds y Vousden, J Virol 1989, 63: 2650-6)). Estas mutaciones se seleccionaron cuidadosamente para quedar fuera de epítopos de HLA conocidos, con la excepción de 91C. Aunque se sabe que 91C es parte de un epítopo de HLA A2 que abarca los aminoácidos 86-93 de E7 (Ressing y col., J Immunol 1995, 154: 5934-43; Ressing y col., Cancer Res 1996, 56: 582-8; Evans y col., Cancer Res 1997, 57: 2943-50), se decidió mutar este aminoácido para conseguir seguridad de composición inmunogénica máxima, puesto que esta mutación rompe un dedo de cinc de E7 que se sabe que se requiere para su actividad inmortalizadora (Jewers y col., J. Virol 1992, 66: 1329-1335). Puesto que esta mutación no se localiza en la región de anclaje del aminoácido P2 de péptidos con propiedades de unión de HLA-A*0201 conocidas (Rammensee y col., Annu Rev Immunol 1993,11: 213-44), es posible que los polipéptidos mutados C91G puedan conservar su capacidad para unir la molécula de HLA-A*0201. Además, es posible que la mutación C91 pudiera afectar a la escisión de otro epítopo de HLA que abarca los aminoácidos 82-90 de E7. Las construcciones de fusión que contienen esas cinco mutaciones de aminoácidos se nombraron PentM.

Aunque se han desvelado previamente de forma individual mutaciones en cada uno de estos sitios de E6 y E7 de VPH16, no se supo qué combinaciones de estas mutaciones, si las hubiera, mantendrían su inmunogenicidad.

Para desarrollar una composición inmunogénica de cáncer cervical terapéutico que induzca una respuesta mediada por células robusta contra los productos de encogen viral E6 y E7, estas fusiones se clonaron en el sistema basado en replicón de virus de encefalitis equina venezolana (VEE). Las ventajas de composiciones inmunogénicas de VEE recombinantes incluyen altos niveles de expresión de genes heterólogos, tropismo de células dendríticas (dirigiendo de este modo la expresión a tejidos linfoides, un sitio importante para inducir inmunidad), inducción de apoptosis y respuestas inmunes humorales y celulares robustas e inmunización repetida eficaz, puesto que no hay inmunidad existente generalizada a VEE en seres humanos. Además, alfavirus tales como VEE replican el ARN de interés en el citosol celular y son citopáticos, reduciendo de este modo significativamente el riesgo de integración de E6 y E7 en el genoma celular.

Para evaluar la expresión de estas construcciones fusionadas, se infectaron células BHK con las VRP recombinantes y se analizaron posteriormente por transferencia de Western e inmunofluorescencia. El análisis de transferencia de Western reveló que las proteínas de fusión E6E7 migraron generalmente a un peso molecular de aproximadamente 30 kDa en SDS-PAGE. Aunque el nivel de expresión de las construcciones de tipo silvestre y mutadas era comparable, su localización intracelular fue drásticamente diferente. La tinción con inmunofluorescencia de estas proteínas de fusión reveló un patrón de tinción punteado solapante con los núcleos de VRP tanto E6 como E7 de tipo silvestre, mientras que se observó una tinción perinuclear más difusa para todas las VRP TetM y PenTM (datos no mostrados). Una localización perinuclear difusa tal sugiere plegamiento erróneo/agregación de proteínas. Dicho plegamiento erróneo sugiere inestabilidad proteica, apoyando adicionalmente que estas fusiones tengan una capacidad aumentada de inducir respuestas de CTL.

Ejemplo 2: RESPUESTAS INMUNES CELULARES INDUCIDAS POR DIFERENTES CONSTRUCCIONES DE COMPOSICIONES INMUNOGÉNICAS

Materiales y procedimientos

Ratones y líneas celulares. Se obtuvieron ratones C57BL/6 hembra de 6-12 semanas de edad sin patógenos específicos de Taconic Farms (Germantown, NY). Los ratones se albergaron en las instalaciones animales de Wyeth y la Universidad de Loyola (Chicago) en condiciones de filtro superior, con agua y alimento a voluntad. Se obtuvieron ratones HLA-A*0201 hembra de 6-12 semanas de edad sin patógenos específicos de Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME). Se usaron células MC57G y EL4 para ensayos de citotoxicidad. Se usaron células BHK-21 para expresión de ARN de VEE, empaquetamiento de partículas de replicón VEE (VRP) y valoración (ensayos de potencia). Se analizaron estudios de exposición a tumores usando las líneas de tumores positivos para E6E7 C3 (Feltkamp, M.C.W. y col., Eur J Immun 1993, 23: 2242-2249), TC-1 (Lin, K.Y., y col., Cancer Res 1996, 56: 21-26) y HLF16. Todas las líneas celulares (excepto células HLF16, C3 y TC-1) se obtuvieron de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC; Manassas, VA).

Ensayo de citotoxicidad (CTL). Se inmunizaron ratones C57BL/6 por vía subcutánea con 3 x 105 unidades infecciosas de VRP. Se realizaron ensayos de citotoxicidad 4 semanas después de inmunizar los ratones con una dosis sencilla de 3 x 105 de las VRP indicadas administradas en las almohadillas plantares posteriores. Se volvieron a estimular suspensiones de esplenocitos de células sencillas (20:1) con células MC57G tratadas con mitomicina-C infectadas con vectores de Virus Vaccinia Ankara (MVA) modificado recombinante que codifican E7 o E6 (E7-MVA o E6-MVA) a una multiplicidad de infección (MOI) de 5. La actividad de CTL se midió 5 días después. Las células MC57G infectadas con MVA E7 o E6 y células EL-4 pulsadas con péptido restringido por E749-57 H-2Db de VPH16 (RAHYNIVTF (SEC ID Nº: 41, que corresponde a los aminoácidos 49-57 de SEC ID Nº: 14); Lin y col., Cancer Res 1996, 56, 21-6) (ATCC) actuaron como dianas. Se infectaron células MC57G durante 1 h con E7-MVA o E6-MVA a una MOI de 5. Se incubaron células EL-4 (1 x 107) con péptido (20 !g/ml) durante 1 h. Se marcaron después células diana 3 h más tarde con Europio (Eu+3; Sigma Chemical, Co., St. Louis, MO) por electroporación. Se incubaron células efectoras y diana a las relaciones indicadas durante 3 h, después de lo cual se recogieron los sobrenadantes y se mezclaron con solución potenciadora (Wallac; Turku, Finlandia). Se cuantificó la liberación de Eu+3 por fluorescencia resuelta en el tiempo usando un fluorímetro 1234 Delfia (Wallac). El porcentaje de lisis específica se calculó como (liberación espontánea experimental/liberación espontánea máxima) x 100. El porcentaje de liberaciones espontáneas varió del 5 al 10 %.

Resultados

Para caracterizar respuestas inmunes inducidas por las diferentes construcciones de composiciones inmunogénicas, se inmunizaron ratones C57BL/6 por vía subcutánea en las almohadillas plantares posteriores con 3 x 105 unidades infecciosas de las construcciones de VRP wt y PentM. Un mes después de la inmunización, se midió la lisis mediada por CTL por ensayo de liberación de Europio usando dianas MC57G infectadas con MVA que codifica E6 o E7. La Figura 4A revela que CTL de ratones inmunizados con VRP de tipo silvestre o PentM destruyeron dianas que expresaban E7. Se encontraron resultados idénticos con dianas EL-4 pulsadas con péptido E749-57 (datos no mostrados). La lisis mediada por CTL también fue evidente contra dianas E6 de ratones inmunizados con todas las formas de VRP, aunque la lisis se redujo sustancialmente en receptores de VRP mutantes (Figura 4B). Estos resultados para lisis específica de E7 y E6 se reprodujeron en dos experimentos adicionales y también se observaron usando ratones inmunizados con VRP TetM (datos no mostrados).

Estos resultados muestran que la inmunización con VRP que codifican proteínas de fusión mutantes y de tipo silvestre generó respuestas CTL similares al epítopo E749-57 inmunodominante que es importante en el rechazo de tumores. Aunque las respuestas CTL eran claramente detectable contra dianas E6 de animales inmunizados con genes de tipo silvestre que expresaban VRP, se observaron respuestas de CTL reducidas en ratones que recibieron una forma mutante de E6, lo que sugiere que 63C y/o 106C es un componente importante de un epítopo restringido por H-2b.

Ejemplo 3: PROTECCIÓN TUMORAL Y EFICACIA TERAPÉUTICA DE CONSTRUCCIONES DE COMPOSICIONES INMUNOGÉNICAS EN MODELOS DE TUMOR C3 Y TC1.

Materiales y procedimientos

Experimentos terapéuticos y de protección tumoral. Se anestesiaron grupos de 14 ratones C57BL/6 por inyección intraperitoneal de xilazina 10 mg/kg (Sigma, St. Louis, MO) y ketamina 100 mg/kg (Abbott Laboratories, Chicago, IL) y se inmunizaron por inyección de 3 x 105 VRP en las almohadillas plantares posteriores los días -21 y

7. Los ratones de control negativo recibieron 3 x 105 UI de proteína verde fluorescente (GFP) VRP. Una semana después, se expuso la mitad de los ratones de cada grupo por inyecciones subcutáneas en el flanco a 5 x 105 células C3 (Feltkamp y col., Eur J Immunol 1995, 25: 2638-42) y se expuso la mitad a 5 x 104 células TC-1 (Lin y col., Cancer Res 1996, 56: 21-6). El crecimiento tumoral se supervisó cada tres días. Para experimentos terapéuticos de C3 se expusieron en primer lugar los ratones a 5 x 105 células tumorales C3 en el flanco seguido 7, 14 y 21 días después de la VRP indicada a 3 x 105 dosis por inmunización. Para el experimento terapéutico de fibroblastos de pulmón humano (HLF) se expusieron ratones transgénicos HLA-A*0201 a 2 x 106 células HLF16 por inyección subcutánea en el flanco izquierdo el día 0. Los días 5, 10 y 15 después de la exposición, los ratones se anestesiaron como se ha descrito anteriormente y se inmunizaron por inyección de 2 x 105 VRP en las almohadillas plantares posteriores. El crecimiento se controló cada 5 días.

Véase también: Ratones y líneas celulares (anteriormente).

Resultados

Se compararon las VRP que codificaban proteínas de fusión E7E6 de tipo silvestre y E7E6PentM en comparación con eficacia antitumoral profiláctica in vivo. Los ratones en todos los grupos se inmunizaron los días 0 y 21 con 3 x 105 de la VRP indicada y posteriormente se expusieron a células tumorales C3 o TC-1. Todos los ratones que recibieron GFP-VRP como control negativo desarrollaron tumores en un periodo de aproximadamente 7 días después de la exposición al tumor (Figuras 5A y B). Por el contrario, todos los ratones que recibieron E7E6 de tipo silvestre o PentM se protegieron de exposición al tumor independientemente de si recibieron células tumorales C3 (5 x 105) (Figura 5A) o TC-1 (5 x 104) (Figura 5B). Estos datos sugieren que la protección no se limitó a un modelo de exposición a tumor murino específico y que la protección dependía de forma crítica de productos génicos E6 y E7 codificados por VRP.

Como una medida más rigurosa de eficacia antitumoral, en el siguiente experimento se expusieron los ratones a células tumorales C3 antes de inmunización con VRP de E7E6 de tipo silvestre, PentM o TetM los días 7, 14 y 21. La Figura 6 muestra que el 85 %-100 % de los ratones que recibieron cualquiera de las VRP que expresaban proteínas de fusión E6 y E7 mutantes o de tipo silvestre rechazaron los tumores C3 a diferencia del 0 %-12 % de los ratones del control negativo. Como se ha mostrado previamente por Velders y col. (Cancer res 2001, 61: 7861-7) y en la Figura 6, una composición inmunogénica de VRP que expresaba E7 solamente promovió el rechazo en solamente el 65 %-75 % de los ratones.

En conclusión, la inclusión del gen que codifica E6 como un compañero de fusión con eficacia antitumoral terapéutica potenciada de forma reproducible por E7 (85 %-100 %, Figura 6) en comparación con E7 solamente (67 %-75 %, Figura 6) independientemente de si E6 era de tipo silvestre o mutada. Por lo tanto, las mutaciones en E6, cuando se expresaban como una fusión con E7, no daban como resultado un efecto antitumoral reducido en estos modelos tumorales. Sin embargo, los resultados ilustran que las respuestas de CTL óptimas para epítopos que contenían aminoácidos mutantes pueden no inducirse en algunos individuos inmunizados con VRP mutante. En seres humanos esto puede no ser causa de preocupación dada la diversidad de alelos de HLA de Clase I y Clase II en comparación con el número limitado de alelos H-2 expresados por ratones C57BL/6.

Ejemplo 4: EFICACIA TERAPÉUTICA DE CONSTRUCCIONES DE COMPOSICIONES INMUNOGÉNICAS EN EL MODELO DE TUMOR HLF16

Aunque los resultados de los Ejemplos 2 y 3 muestran resultados alentadores, el reconocimiento por linfocitos T restringidos con H-2b de antígenos de VPH en ratones C57BL/6 proporciona valor predictivo limitado para respuestas antitumorales restringidas por HLA. Por lo tanto, la demostración de que las mismas composiciones inmunogénicas pueden inducir respuestas restringidas por HLA-A*0201 frente a E6 y E7 de VPH16 en ratones transgénicos HLA-A*0201 es particularmente importante (Ressing y col., J Immunol 1995, 154: 5934-5943).

Se ha mostrado que los linfocitos T CD8+ de ratones transgénicos HLA-A*0201 reconocen los mismos antígenos restringido por HLA-A*0201 que los reconocidos por CTL humanos restringidos por HLA-A*0201 (Engelhard y col., J Immunol 1991, 146: 1226-1232; Shirai y col., J Immunol 1995, 154: 2733-2742). El uso de ratones transgénicos para HLA por lo tanto supera las limitaciones de rechazo de tumor restringido por H-2. Sin embargo, no ha estado disponible ningún modelo de tumor de VPH para ensayar respuesta antitumoral restringida por HLA-A*0201. En el presente documento, se presenta el primer modelo de tumor de VPH16 para ratones transgénicos HLA-A*0201 (también descrito en Eiben GL y col., Cancer Research, 15 oct. 2002, 62, Nº 20). La inmunogenicidad de las fusiones E6/E7 se ensayó en este modelo.

Este modelo de tumor se desarrolló transfectando fibroblastos de ratones C57BL/6 transgénicos HLA-A 0201 con E6 y E7 de VPH16 y Ras V12, generando una línea celular (HLF16) que es tumorigénica en ratones HLA-A 0201. El epítopo de H-2Db dominante se retiró del gen E7 para asegurar que las respuestas antitumorales fueran independientes del epítopo 49-57 y estuvieran probablemente mediadas a través del HLA-A*0201.

El conjunto de construcciones TetM se usó en el modelo de tumor HLF. Estas construcciones contenían solamente cuatro mutaciones: C63G y C106G en E6; C24G y E26G en E7. La mutación C91 G en E7 (presente en las construcciones PentM) se eliminó debido a que se sabía que era parte de epítopo HLA-A*0201 que abarca los aminoácidos 86-93 de E7 (Ressing y col., J Immunol 1995, 154: 5934-43; Ressing y col., Cancer Res 1996, 56: 5828; Evans y col., Cancer Res 1997, 57: 2943-50). Usando un algoritmo de unión de clase II (www.imtech.res.in/raghava/propred), también se determinó que hay un epítopo predicho promiscuo para varios haplotipos de clase II entre los aminoácidos 87 y 95 de E7. Puesto que se descubrió que las respuestas inmunes mediadas por clase II eran necesarias para la eficacia terapéutica de la composición inmunogénica de VRP en el modelo de tumor C3, la hipótesis fue que la mutación C91G presente en las construcciones de composición inmunogénica PentM podría interrumpir los epítopos de clase II humanos.

Materiales y procedimientos

Construcción y caracterización del modelo de tumor HLF16. La línea celular de tumor HLF16 derivó de tejido cardiaco pulmonar de ratones C57BL/6 transgénicos HLA-A2 Dd. Después de varias semanas en cultivo, se transformaron fibroblastos adherentes con un vector bicistrónico pIRES que contenía E6/E7 y H-ras activada confiriendo a la vez resistencia a geneticina. El único epítopo restringido por H-2b Clase I conocido del producto génico E749-57 de VPH16 (Velders y col. Cancer res 1997, 61: 7861-7867) se retiró para asegurar que el tumor no presentara este epítopo E7 de VPH16 inmunodominante. Se seleccionaron transfectantes en G418 y se expandieron de forma clonal. Se ensayaron después clones individuales con respecto a expresión de HLA-A*0201 por análisis de FACS. Los clones que mostraban la expresión de HLA-A*0201 más alta se ensayaron posteriormente con respecto a su capacidad para formar colonias en agar blando. El clon de fibroblastos cardiacos pulmonares 16 (HLF16) mostró crecimiento independiente de anclaje en agar blando y se seleccionó para estudios adicionales. La expresión de E7 fue evidente en el citoplasma y núcleo de HLF16 después de tinción con inmunofluorescencia con un anticuerpo monoclonal anti-E7. Para determinar si la línea HLF16 formaría de hecho tumores en ratones, se inyectaron a ratones transgénicos HLA-A*0201 diferentes concentraciones de células tumorales y se supervisaron durante 35 días. Todos los ratones desarrollaron tumores pero solamente los que se expusieron a la dosis más alta, 2 x 106 células HLF16, mantuvieron un tumor durante el ciclo temporal. El tumor HLF16 surgió aproximadamente el día 5 y continuó creciendo progresivamente hasta que se hizo de aproximadamente 12x12x12 mm el día 35 momento en el cual los ratones se sacrificaron. También se describen construcción y características de la línea celular tumoral HLF16 en Eiben GL y col. (Cancer Research, 15 oct. 2002, 62, Nº 20).

Ensayo de agar blando. Se determinó la capacidad de crecimiento independiente del anclaje evaluando la eficacia de formación de colonias de células suspendidas en agar blando. Se sembraron células transformadas y de control (0,5 x 106, 0,25 x 106 y 0,1 x 106) en 5 ml de agar de recubrimiento 0,3 % y se añadieron a placas de 10 mm revestidas con 20 ml de agar subyacente 0,6 %. Se permitió que las placas se secaran y se incubaran a 37ºC. Las colonias se contaron 3 semanas después de la siembra en placas.

Véase también: Ratones y líneas celulares, experimentos terapéuticos y de protección tumoral y transferencias de Western e inmunofluorescencia (anteriormente).

Resultados

Las construcciones de TetM se comprobaron con respecto a expresión por transferencia de Western e inmunofluorescencia de células infectadas por BHK. Las proteínas TetM tanto E6E7 como E7E6 migraron a aproximadamente 30 kDa en SDS-PAGE y tuvieron una localización perinuclear difusa de forma muy similar a las construcciones PentM.

Se analizaron construcciones de composición inmunogénica tanto PentM como TetM con respecto a su eficacia terapéutica tumoral en el modelo de tumor de HLF (Figura 7). Se expusieron los ratones transgénicos a 2 x 106 células HLF16 por vía subcutánea y los días 5, 10 y 15 después de la exposición, los ratones se inmunizaron con VRP GFP. VRP TetM o VRP PentM. El rechazo de tumor completo siguió a la inmunización con VRP E7E6 TetM, mientras que las VRP E7E6 PentM y VRP E6E7 PentM indujeron regresión tumoral del 90 % de los ratones, excepto E6E7 TetM (Figura 7). Estos resultados demuestran que la inmunización terapéutica con varias de las VRP ensayadas en el presente documento dio como resultado un alto grado de eficacia antitumoral independiente de contribuciones por linfocitos T específicos para E749-57. Además, estos resultados demuestran que las fusiones en las que E7 está carboxilo terminal de E7 (fusiones E7E6) proporcionan mayor protección inmune que sus homólogos en los que E6 está en el extremo amino terminal (fusiones E6E7).

A partir de los datos de eficacia terapéutica colectiva (Figuras 6 y 7) entre modelos de tumor C3 y HLF16, los inventores pueden concluir que las VRP que codifican formas mutantes de E6 y E7 de VPH16, sin ninguna proteína auxiliar, citocina o adyuvante, son altamente eficaces en la erradicación de tumores murinos establecidos.

Ejemplo 5: LAS VRP QUE EXPRESAN E6 Y E7 MUTANTE NO INDUCEN DEGRADACIÓN DE P53 Y RB.

Los niveles de estado estacionario de p53 y Rb en MEC humanas primarias se evaluó después de infección con VRP que expresaban E6 y E7 de VPH16 de tipo silvestre, como proteínas de fusión o individuales, proteína de fusión E7E6 TetM o GFP como un control negativo.

Materiales y procedimientos

Detección de p53 y Rb. Se infectaron células epiteliales de mamífero humanas primarias (MEC, Clonetics, San Diego, CA) con VRP que codificaban formas de tipo silvestre o mutantes de E6 y E7 a MOI = 10 y se recogieron proteínas celulares totales 16-20 horas después. Para potenciar la detección de p53, las células se trataron con actinomicina D 1,0 nM (Sigma, St. Louis, MO). Se cargaron veinticinco microgramos de proteína total por carril, se sometieron a electroforesis por SDS-PAGE, y se transfirieron a membranas de PVDF. Las transferencias de Western se exploraron usando anticuerpo anti-p53 (FL-393, Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA) o anticuerpo anti-Rb (Catálogo nº 554136, BD Phanningen, San Diego, CA). Los niveles de tubulina se supervisaron como controles de carga explorando con un anticuerpo anti-tubulina (H-235, Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA).

Resultados

Se determinó si una forma mutante de proteína de fusión de E6 y E7, cuando se expresó en el contexto de infección por VRP, inactivaría funcionalmente p53 y Rb en comparación con versiones de tipo silvestre de estas proteínas. La E7E6 TetM se seleccionó debido a que demostró alta eficacia antitumoral (Figuras 6 y 7) y contenía un número mínimo de mutaciones.

Se infectaron células epiteliales de mamífero humanas primarias (MEC) con VRP que codificaban E6 de VPH16 solamente, E7 solamente, E7E6 de tipo silvestre o E7E6 TetM. Aproximadamente veinte horas después de infección con una MOI = 10 de cada una de estas VRP, los lisados celulares que contenían cantidades equivalentes de proteína celular total se sometieron a electroforesis por SDS-PAGE, se transfirieron a membranas de PVDF y se exploraron con anticuerpos específicos para p53 (Figura 8A), Rb (Figura 8B) y tubulina como un control de carga. Los resultados de estas transferencias de Western se muestran en las Figuras 8A y 8B son representativas de dos experimentos independientes.

Las MEC infectadas con VRP que codificaban E6 solamente o proteína de fusión E7E6 de tipo silvestre contenían niveles indetectables de p53 a diferencia de MEC infectadas con E7E6 TetM que contenía niveles de p53 comparables a muestras infectadas con GFP-VRP de control negativo (Figura 8A). Las MEC infectadas con VRP que codificaban E7 solamente o proteína de fusión E7E6 de tipo silvestre contenían niveles indetectables de Rb a diferencia de MEC infectada con VRP de E7E6 TetM o GFP-VRP (Figura 8B). La presencia de proteína de fusión que contiene E7 en las muestras infectadas por VRP de E7E6 de tipo silvestre y E7E6 TetM se verificó explorando esos carriles con un anticuerpo monoclonal anti-E7 (Figuras 8A y B). Los resultados muestran que los niveles de p53 y Rb están reducidos en gran medida en MEC primarias que expresan versiones de tipo silvestre de E6 y E7 en el contexto de una infección de VRP pero son normales en MEC que expresan E7E6 TetM después de infección por VRP.

En resumen, la infección por VRP de MEC reveló niveles reducidos en gran medida de p53 y Rb en cultivos que contenían formas de tipo silvestre de E6 y E7, respectivamente; la mera fusión de E7 con E6 no fue suficiente para alterar la actividad de ninguna de las proteínas (Figuras 8A y B). Por el contrario, las MEC infectadas con VRP de E7E6 TetM que contenían mutaciones E6 (63C y 106C) y E7 (24C y 26E) contenían niveles normales de p53 y Rb (Figuras 8A y B), lo que indica que estas cuatro mutaciones extinguieron la actividad oncogénica primaria de estas proteínas. Una evaluación del potencial de inmortalización de VRP de E7E6 TetM reveló que las MEC murieron después de la infección, lo que es una consecuencia esperada de la expresión de las proteínas no estructurales AV expresadas por replicones (Griffith y col., Annu. Rev. Microbiol. 1997, 51: 565-592) y apoya adicionalmente la seguridad de este vector.

Se citan numerosas referencias, incluyendo patentes, solicitudes de patentes y diversas publicaciones y se analizan en la descripción de la presente invención. La cita y/o análisis de tales referencias se proporciona únicamente para clarificar la descripción de la presente invención y no es una admisión de que ninguna referencia tal sea “técnica anterior” para la invención descrita en el presente documento.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Wyeth Cassetti, Maria C. Smith, Larry

<120> POLIPÉPTIDOS DE VIRUS DEL PAPILOMA HUMANO Y COMPOSICIONES INMUNOGÉNICAS

<130> 00630/200M137-WO0

<150> US 60/415.929

<151>

<160> 65

<170> PatentIn versión 3.1

<210> 1

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<212> PRT

<213> Virus del papiloma humano de tipo 16

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PRT 15 <213> Virus del papiloma humano de tipo 56

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10 10 10

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(152) 20 <223> donde Xaa es cualquier aminoácido

<400> 39 <210> 40

<213> Virus del papiloma humano

<220>

<221> MISC_FEATURE 10 <222> (1)..(104)

<223> donde Xaa es cualquier aminoácido

<400> 40

<210> 41

<211> 9

<212> PRT

<213> Virus del papiloma humano de tipo 16

<400> 41

<210> 42

<211> 477

<212> ADN 15 <213> Virus del papiloma humano de tipo 18

<400> 42

<210> 43

<211> 474

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano de tipo 31 25

<400> 43 <210> 44

<213> Virus del papiloma humano de tipo 33

<400> 44

<210> 45

<211> 450

<212> ADN 15 <213> Virus del papiloma humano de tipo 35

<400> 45

<210> 46

<211> 477

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano de tipo 39

<400> 46

<210> 47

<211> 477

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano de tipo 45 10

<400> 47

15 <210> 48

<211> 456

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano de tipo 51

20 <400> 48

<210> 49

<211> 447

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano de tipo 52

<400> 49

<210> 50

<211> 465

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano de tipo 56

<400> 50

<210> 51

<211> 450

<212> ADN 20 <213> Virus del papiloma humano de tipo 58

<400> 51

<210> 52

<211> 483

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano de tipo 59

<400> 52

<210> 53

<211> 477

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano de tipo 68 15

<400> 53

20 <210> 54

<211> 318

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano de tipo 18

25 <400> 54

<210> 55

<211> 297

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano de tipo 31

<400> 55

<210> 56

<211> 294

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano de tipo 33 15

<400> 56

20 <210> 57

<211> 300

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano de tipo 35

25 <400> 57

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano de tipo 39

<400> 58 35

<210> 59

<211> 321

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano de tipo 45

<400> 59

<210> 60

<211> 306

<212> ADN 15 <213> Virus del papiloma humano de tipo 51

<400> 60

<210> 61

<211> 300

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano de tipo 52 25

<400> 61 <210> 62

<213> Virus del papiloma humano de tipo 56

<400> 62

<210> 63

<211> 297

<212> ADN 15 <213> Virus del papiloma humano de tipo 58

<400> 63

<210> 64

<211> 324

<212> ADN

<213> Virus del papiloma humano de tipo 59 25

<400> 64 <210> 65

<213> Virus del papiloma humano de tipo 68

<400> 65

Claims (16)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Un polipéptido que comprende polipéptidos E6 y E7 del virus del papiloma humano, en el que el polipéptido E7 precede al polipéptido E6 y tiene mutaciones en los aminoácidos correspondientes a los aminoácidos 24 y 26 de la SEC ID Nº: 14 y el polipéptido E6 tiene mutaciones en los aminoácidos correspondientes a los aminoácidos 63 y 106 de la SEC ID Nº: 13.

2. 2.

   El polipéptido de la reivindicación 1, en el que el E7 tiene mutaciones en los aminoácidos correspondientes a los aminoácidos 24, 26 y 91 de la SEC ID Nº: 14 y el polipéptido E6 tiene mutaciones en los aminoácidos correspondientes a los aminoácidos 63 y 106 de la SEC ID Nº: 13.

3. 3.

   El polipéptido de la reivindicación 1 ó 2 en el que los aminoácidos mutados están mutados a glicina.

4. 4.

   Un ácido nucleico aislado que codifica el polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

5. 5.

   Una célula huésped aislada que expresa el polipéptido de la reivindicación 1.

6. 6.

   Una composición inmunogénica que comprende:

   (a)

   el polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y un vehículo farmacéuticamente aceptable o;

   (b)

   el ácido nucleico de la reivindicación 4.

7. 7.

   La composición inmunogénica de la reivindicación 6 que comprende adicionalmente adyuvante.

8. 8.

   Un virus recombinante que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 4.

9. 9.

   El virus recombinante de la reivindicación 8, en el que el virus es un virus de la encefalitis equina venezolana modificado.

10. 10.

    Un polipéptido aislado de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 9 o en la SEC ID Nº: 11.

11. 11.

    Un ácido nucleico aislado de acuerdo con la reivindicación 4, que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 9 o en la SEC ID Nº: 11.

12. 12.

    El ácido nucleico aislado de la reivindicación 11 que tiene la secuencia de nucleótidos como se expone en la SEC ID Nº: 10 o en la SEC ID Nº: 12.

13. 13.

    Un vector de expresión que comprende la secuencia de ácidos nucleicos de la reivindicación 4, 11 ó 12 bajo el control de una secuencia de control de la expresión.

14. 14.

    Una célula huésped aislada que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 4 o el vector de expresión de la reivindicación 13.

15. 15.

    Uso de la composición inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 6 o el vector de expresión de la reivindicación 13 en la fabricación de un medicamento para tratar cáncer cervical.

16. 16.

    Uso de la composición inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 6 o el vector de expresión de la reivindicación 13 en la fabricación de un medicamento para prevenir cáncer cervical.