WO2012020871A1 - 사람 파필로마바이러스 변형체 및 면역 증강제를 포함하는 자궁경부암 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

사람 파필로마바이러스 변형체 및 면역 증강제를 포함하는 자궁경부암 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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서상환
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Definitions

  • the present invention relates to a composition for preventing or treating cervical cancer comprising human papillomavirus variants and immune enhancers, and more specifically, E6 and antigens of types 16 and 18 of human papillomavirus (HPV); Fusion proteins comprising recombinant fusion polypeptides to modify the three-dimensional structure of E7, signal peptides for secreting them extracellularly, and immune enhancing peptides in individuals can induce HPV type 16 and 18 antigen-specific immune responses to be induced by HPV.
  • the tumor that is caused can be treated.
  • Cervical cancer is known to be caused by infection of high-risk human papillomaviruses, such as types 16 and 18 of human papillomavirus (HPV) (zur Hausen, H et al. Biochem Biophys Acta) 1996, 1288; F55-F78, Mark H et al. J Natl Cancer Inst 1993, 85; 958-964).
  • HPV human papillomavirus
  • E6 and E7 proteins play a key role in cervical cancer, and is found to be 99% expressed in tumor tissue of patients with cervical cancer is a major target substance for preparing a cervical cancer therapeutic and preventive vaccines (von Knebel Doeberitz et al Int. J. Cancer 1992, 51; 831-834).
  • E6 binds to p53, a tumor suppressor protein, promotes the breakdown of p53, which interferes with the progression of the cell cycle through the apoptosis pathway, and E7 binds to and inactivates the tumor suppressor retinoblastoma protein pRb. And promote degradation to allow the cell cycle to proceed to S phase (Cobrinik et al., Trends Biochem Sci 1992, 17: 312-5).
  • An object of the present invention is to provide a novel fusion protein and a polynucleotide encoding the same, which have enhanced immunogenicity while inhibiting the carcinogenic ability of HPV's E6 and E7 proteins in preventing or treating a disease caused by HPV. .
  • Another object of the present invention is to provide a recombinant vector expressing the fusion protein, a host cell comprising the vector, and a method of expressing a protein using the host cell.
  • Still another object of the present invention is to provide a composition for preventing or treating a disease caused by HPV using the fusion protein.
  • Another object of the present invention is to provide a method for preventing or treating a disease caused by HPV using the composition.
  • Fusion polypeptides in which the three-dimensional structure of E6 and E7 having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 from human papillomavirus types 16 and 18 has been modified;
  • fusion proteins comprising immune enhancing peptides.
  • the invention also provides a polynucleotide encoding a fusion protein of the invention.
  • the invention also provides a recombinant vector comprising the polynucleotide according to the invention.
  • the invention also provides a host cell transformed with the vector of the invention.
  • the present invention also provides a method of expressing the fusion protein of the present invention by culturing the transgenic host cell of the present invention.
  • the present invention also provides a fusion protein of the present invention, a host cell transformed with a recombinant vector expressing the protein and one or more selected from the group consisting of lysates thereof as an active ingredient, caused by human papillomavirus in an individual
  • a composition for preventing or treating a disease is provided.
  • the invention also provides a method of preventing or treating a disease caused by human papillomavirus in a subject, comprising administering to the subject an effective amount of a composition of the invention.
  • the fusion protein prepared to include a recombinant fusion protein to modify the three-dimensional structure of the E6 and E7 proteins derived from HPV types 16 and 18 of the present invention, a signal peptide for secreting it extracellularly, and an immune enhancing peptide in a subject are highly HPV.
  • Type 16 and 18 antigen specific immune responses can be induced to treat tumors caused by HPV.
  • FIG. 1 is a graph showing HPV16 E6 specific CD8 + T cell responses seen through the treatment of GX-188E after subcutaneous injection of tumor cell line TC-1 into rat C57BL / 6 in an anticancer treatment model.
  • Figure 2 is a graph showing the HPV16 E7 specific CD8 + T cell response shown through the treatment of GX-188E of the present invention after subcutaneous injection of TC-1, a tumor cell line, to rat C57BL / 6 in an anticancer treatment model.
  • Figure 3 is a graph showing the HPV18 E6 specific CD8 + T cell response seen through the treatment of GX-188E of the present invention after subcutaneous injection of TC-1, a tumor cell line, to rat C57BL / 6 in an anticancer treatment model.
  • Figure 4 is a graph showing the HPV18 E7 specific CD8 + T cell response shown through the treatment of GX-188E of the present invention after subcutaneous injection of tumor cell line TC-1 to rat C57BL / 6 in an anticancer treatment model.
  • FIG. 5 is a graph showing the anticancer effect of the GX-188E treatment of the present invention after subcutaneous injection of TC-1, a tumor cell line, to rat C57BL / 6 in an anticancer treatment model.
  • the present invention is a.
  • Fusion polypeptides in which the three-dimensional structure of E6 and E7 having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 from human papillomavirus types 16 and 18 has been modified;
  • a fusion protein comprising an immune enhancing peptide.
  • the fusion protein of the present invention may comprise a recombinant fusion polypeptide such that the three-dimensional structure of E6 and E7 from human papillomavirus types 16 and 18 is modified. More specifically, the fusion polypeptide is amino acid 1 to 85 of the E6 protein derived from human papillomavirus type 16, amino acids 1 to 65 of the E7 protein, amino acids 70 to 158 of the E6 protein, Amino acids 50 to 98, amino acids 1 to 85 of E6 protein derived from human papillomavirus type 18, amino acids 1 to 65 of E7 protein, amino acids 70 to 158 of E6 protein, amino acid 50 of E7 protein Is a fusion polypeptide to which 105 is bound.
  • the fusion polypeptide may have an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
  • the signal peptide is a peptide containing about 20 to 30 amino acids, and refers to a peptide that secretes into the cell extracellularly expressed proteins, especially proteins including E6 and E7 fusion polypeptides.
  • the nucleic acid sequence encoding it is also referred to as a "secretory signal sequence".
  • E6 and E7 fusion polypeptides of the present invention is a protein (nucleus protein) expressed in the nucleus of a cell infected with the virus, so its immunity is weak.
  • the signal peptide expressed by the secretory signal sequence induces the extracellular secretion of E6 and E7 antigens with altered three-dimensional structure, resulting in antigen-specific humoral immune responses and cellular immune responses. It can lead to an increase in cellular immune response.
  • the signal peptide may be a signal peptide used in higher eukaryotic cells, including mammals, and the like, for example, tPA, HSV gDs, or a secretion signal sequence of growth hormone may be used. More preferably, tissue plasminogen activation (TPA) can be used. Most preferably, they may have the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2.
  • immune enhancing peptides refer to peptides that increase an immune response by activating cells (eg, dendritic cells, etc.) involved in the immune response.
  • CD40 ligand Flt3 ligand (fms-like tyrosine kinase 3 ligand), Flagellin (Flagellin), or OX40 may be used as the immune enhancing peptide. More preferably, Flt3 ligand can be used.
  • the Flt3 ligand is a factor that induces proliferation and maturation of dendritic cells (DCs), which increases the immune response by the antigen and has an excellent tumor reduction effect in the state of fusion with the tumor antigen. Can be represented.
  • the Flt3 ligand may have an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3.
  • the invention also relates to a polynucleotide encoding a fusion protein of the invention.
  • the polynucleotide encodes a fusion protein of the present invention
  • the fusion polypeptides of E6 and E7 may be encoded from the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 4, but are not particularly limited thereto.
  • the signal peptide may be encoded from the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 5, but is not particularly limited thereto.
  • the immune enhancing peptide may be encoded from the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 6, but is not particularly limited thereto.
  • polynucleotides of the present invention can be prepared by chemical synthesis or genetic engineering techniques. Chemical synthesis methods are well known to those skilled in the art, and any method may be used. It can also be purchased by commercial nucleic acid synthesis and provider. When prepared by genetic engineering techniques, for example, nucleic acid fragments encoding the known fusion polypeptides, signal peptides and immune enhancing peptides of E6 and E7 can be obtained, respectively, and produced by linking these fragments in a frame. . Methods for obtaining such nucleic acid fragments are well known in the art, and those skilled in the art can easily connect using appropriate restriction enzymes. In a specific embodiment of the present invention, a method for producing by chemical synthesis is disclosed.
  • the invention also relates to a recombinant vector comprising the polynucleotide of the invention.
  • vector refers to a gene construct comprising foreign DNA inserted into the genome encoding a polypeptide.
  • a vector related to the present invention is a vector in which a secretory signal sequence, a nucleic acid sequence encoding E6 and E7 fusion polypeptides modified with a three-dimensional structure of human papillomavirus, and a nucleic acid sequence encoding an immune enhancing peptide are inserted into the genome,
  • vectors include, for example, plasmid vectors, cosmid vectors, bacteriophage vectors, yeast vectors, or viral vectors such as adenovirus vectors, retrovirus vectors, adeno-associated virus vectors.
  • the secretion signal sequence is a nucleic acid sequence encoding a peptide that secretes tumor antigen expressed in the cell to the outside of cells to be recognized by the immune cells, for example, tPA, HSV gDs, or a growth hormone secretion signal sequence, etc.
  • secretory signal sequences used in higher eukaryotic cells, including mammals may be used, and more preferably, tPA (tissue plasminogen activation) may be used. Most preferably, it may have a nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 5.
  • the secretion signal sequence of the present invention can be used by replacing the codon with high expression frequency in the host cell.
  • nucleic acid sequence encoding the immune enhancing peptide refers to a nucleic acid sequence encoding a peptide that increases the immune response by activating a cell (eg, dendritic cells, etc.) involved in the immune response.
  • CD40 ligand, Flt3 ligand, Flagellin (Flagellin), or OX40 may be used as the immune enhancing peptide. More preferably, Flt3 ligand can be used as an immune enhancing peptide.
  • nucleic acid sequence encoding the immune enhancing peptide of the present invention can be used by replacing with a codon having a high expression frequency in the host cell.
  • polynucleotides included in the recombinant vector of the present invention may be substituted with codons with high expression frequency in the host cell.
  • substituted with high-expression codons in host cells or “codon optimization” refers to codons that command amino acids when DNA is transcribed and translated into proteins in host cells. Depending on the host, codons with high affinity exist, and substitution with these high affinity codons increases the expression efficiency of the amino acid or protein encoded by the nucleic acid.
  • host cell includes prokaryotic or eukaryotic cells
  • eukaryotic cells include higher eukaryotic cells, including mammals, as well as lower eukaryotic cells, including fungi, yeast, and the like.
  • the recombinant vector of the present invention may include a nucleic acid encoding the fusion protein in a form suitable for expression of the nucleic acid encoding the fusion protein of the present invention in a host cell. That is, the recombinant vector of the present invention contains one or more regulatory sequences selected based on the host cell to be used for expression, and these are operably linked with the nucleic acid sequence to be expressed.
  • “Operably linked” means that the nucleotide sequence of interest (eg, in an in vitro transcription / translation system or in a host cell) is linked to the regulatory sequence in such a way that its expression can be achieved. do.
  • regulatory sequence is meant to include promoters, enhancers and other regulatory elements (eg, polyadenylation signals). Regulatory sequences include directing the constitutive expression of a desired nucleic acid in many host cells and directing the desired nucleic acid to be expressed only in a particular host cell (eg, tissue specific regulatory sequences). do. It will be appreciated by those skilled in the art that the design of the expression vector may vary depending on factors such as the choice of host cell to be transformed and the level of protein expression desired.
  • the expression vector of the present invention can be introduced into a host cell to express the fusion protein.
  • the vectors of the present invention can be prepared, for example, by standard recombinant DNA techniques, which include, for example, blunt- and adhesive-terminal ligation, restriction enzyme treatment to provide appropriate ends, and inappropriate. Phosphoric acid group removal by alkaline phosphatase treatment and enzymatic linkage by T4 DNA ligase are included to prevent binding.
  • DNA encoding a signal peptide obtained by chemical synthesis or genetic recombination technology, DNA encoding a fusion polypeptide of human papillomavirus E6 and E7, and DNA encoding an immune enhancing peptide are recombined into a vector containing appropriate regulatory sequences Thereby the vector of the present invention can be produced.
  • the vector containing the control sequence can be purchased or produced commercially, in the present invention, pGX27, a vector for preparing a DNA vaccine, was prepared and used.
  • the recombinant vector of the present invention can be used as a pharmaceutically active ingredient administered in an individual as a vector for gene delivery in gene therapy or as a vector for gene delivery in gene therapy. have.
  • the invention also relates to a host cell transformed with the vector of the invention.
  • the type of the host cell is as described above.
  • Transformation may use known methods for introducing nucleic acids into organisms, cells, tissues or organs, and may be carried out by selecting appropriate available techniques according to the host cell to the extent understood by those skilled in the art. These methods include electroporation, plasma fusion, calcium phosphate (CaPO 4 ) precipitation, calcium chloride (CaCl 2 ) precipitation, agitation with silicon carbide fibers, agrobacterial mediated transformation, PEG, dextran sulfate, Lipofectamine and the like, but is not limited thereto.
  • the invention also relates to a method of expressing the fusion protein of the invention by culturing the transformed host cell of the invention.
  • the fusion protein of the present invention can be easily expressed and mass-produced by culturing the transformed host cell in an appropriate medium or by introducing the transformed host cell into any animal and then culturing in vivo.
  • the present invention also provides a fusion protein of the present invention, a host cell transformed with a recombinant vector expressing the protein and one or more selected from the group consisting of lysates thereof as an active ingredient, caused by human papillomavirus in an individual It relates to a composition for preventing or treating a disease.
  • mammals in the present invention, is human, monkey. Mammals such as mice, pigs, cattle and rabbits, but are not limited to these examples.
  • diseases caused by the virus may include cervical cancer, gojirom, warts and the like.
  • composition of the present invention may further comprise a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the carrier includes lactose, glucose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, gum acacia, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzo Ate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearade and mineral oil.
  • the composition may also further include lubricants, wetting agents, flavoring agents, emulsifiers, and preservatives.
  • compositions of the present invention are administered directly to the subject by any means, such as, for example, intravenous, intramuscular, oral, transdermal, mucosal, intranasal, intratracheal or subcutaneous administration. It may be, but is not limited to these methods.
  • the composition of the present invention can be administered to cells cultured in vitro and indirectly administered to the subject by administering the cultured cells in the body.
  • the compositions of the present invention can be administered systemically or locally.
  • composition of the present invention can be formulated into parenteral formulations such as granules, powders, solutions, tablets, capsules, or dry or syrups or injections, but is not limited to such formulations.
  • parenteral formulations such as granules, powders, solutions, tablets, capsules, or dry or syrups or injections, but is not limited to such formulations.
  • the composition of the present invention may be in the form of a liquid or injection.
  • An effective amount of the fusion protein of the invention, or recombinant expression vector, as an active ingredient may be about 0.05 to 500 mg / kg body weight, preferably 0.5 to 50 mg / kg body weight, and may be considered as a single dose and a distributed dose.
  • the amount of the active ingredient to be administered is not limited to the above range because it must be determined in consideration of various factors such as the condition to be treated, the age and weight of the patient, the severity of the symptoms.
  • the invention also relates to a method of preventing or treating a disease caused by human papillomavirus in a subject, comprising administering to the subject an effective amount of a composition of the invention.
  • composition of the present invention is as described above.
  • the subject includes, but is not limited to, mammals such as humans, monkeys, mice, pigs, cattle and rabbits.
  • the disease caused by the virus may include cervical cancer, gojirom, warts and the like.
  • Optimized nucleic acid sequence means secretory signal sequence of tissue plasminogen activator, "F” or “Flt3L” means fms-like tyrosine kinase 3 ligand do.
  • Codon optimized tPa secretion signal sequence having the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 5 and codon optimized Flt3L having the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 6 were chemically synthesized in linked form. Kpn I (5 ′), Nhe I (3 ′) sites were added at the ends to facilitate insertion into the vector. After treating the DNA vaccine vector for producing the pGX10 (Republic of Korea Patent Publication No. 2003-0047667 No.) by Kpn I and Nhe I restriction enzyme was prepared pGX10 / tF by connecting a tPa-Flt3L synthesized with ligase.
  • Codon optimized nucleic acid sequences encoding amino acids 1 to 85 of HPV16 E6, Codon optimized nucleic acid sequences encoding amino acids 1 to 65 of HPV16 E7, HPV16 E6 amino acids encoding amino acids 70 to 158 Codon optimized nucleic acid sequence, HPV16 E7 Codon optimized nucleic acid sequence encoding amino acids 50 to 98, Codon optimized nucleic acid sequence encoding amino acids 1 to 85 of HPV18 E6, starting with amino acid 1 of HPV18 E7 Codon optimized nucleic acid sequence encoding amino acid 65, HPV18 E6 Codon optimized nucleic acid sequence encoding amino acids 70 to 158, HPV18 E7 Codon optimized nucleic acid sequence encoding amino acid amino acids 50 to 105 Chemical synthesis (hereinafter, 16E6N16E7N16E6C16E7C18E6N18E7N18E6C18E7C: SEQ ID NO: 4).
  • NheI (5 '), XbaI (3') sites were added at the ends to facilitate insertion into the vector.
  • pGX10 / tF was treated with Nhe I and Xba I enzymes to synthesize 16E6N16E7N16E6C16E7C18E6N18E7N18E6C18E7C by ligase to prepare pGX10 / tF16E6N16E7N16E6C16E7C18E6N18E7N18C6C18.
  • mice were injected subcutaneously with TC-1 tumor cells 5 ⁇ 10 5 cells in C57BL / 6 and injected with 50 ⁇ g and 100 ⁇ g of muscle at 3 and 8 days. Electroporation was performed.
  • mice treated with TC-1 tumor cells with GX-188E a significant decrease in tumor volume was observed compared to mice injected with the control group pGX27 (see FIG. 5).
  • the fusion protein of the present invention can be used as a therapeutic agent for tumors caused by HPV.

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Abstract

본 발명은 사람 파필로마바이러스 변형체 및 면역 증강제를 포함하는 자궁경부암 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 사람 파필로마바이러스 (human papillomavirus; HPV)의 타입 16 및 18의 항원인 E6 및 E7의 3차원 구조가 변형되도록 재조합 한 융합 폴리펩타이드, 이를 세포외로 분비시키기 위한 신호 펩타이드 및 개체 내 면역 증강 펩타이드를 포함하는 융합 단백질은 HPV 타입 16 및 18 항원 특이적 면역반응을 유도하여 HPV에 의해 유발되는 종양을 치료할 수 있다.

Description

사람 파필로마바이러스 변형체 및 면역 증강제를 포함하는 자궁경부암 예방 또는 치료용 조성물
본 발명은 사람 파필로마바이러스 변형체 및 면역 증강제를 포함하는 자궁경부암 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 사람 파필로마바이러스 (human papillomavirus; HPV)의 타입 16 및 18의 항원인 E6 및 E7의 3차원 구조가 변형되도록 재조합 한 융합 폴리펩타이드, 이를 세포외로 분비시키기 위한 신호 펩타이드 및 개체 내 면역 증강 펩타이드를 포함하는 융합 단백질은 HPV 타입 16 및 18 항원 특이적 면역반응을 유도하여 HPV에 의해 유발되는 종양을 치료할 수 있다.
자궁경부암 (cervical cancer)은 사람 파필로마바이러스 (human papillomavirus; HPV) 중 타입 16과 18 등 고위험성 사람 파필로마바이러스의 감염에 의해 발생하는 질환으로 알려져 있다 (zur Hausen, H et al. Biochem Biophys Acta 1996, 1288; F55-F78, Mark H et al. J Natl Cancer Inst 1993, 85; 958-964). HPV 단백질 중에서 E6와 E7 단백질이 자궁경부암 발생에 주요한 역할을 하며, 자궁경부암 환자의 종양 조직에서 99% 발현되는 것이 확인되어 자궁경부암 치료 및 예방 백신을 제조하는 주요한 목표물질이다 (von Knebel Doeberitz et al. Int. J. Cancer 1992, 51; 831-834). E6의 경우 종양 억제 단백질로 알려진 p53과 결합하여 p53의 분해를 촉진시켜 세포사멸 (apoptosis) 경로로 세포주기가 진행되는 것을 방해하고, E7은 종양 억제인자 망막모세포종 단백질인 pRb 에 결합하여 이를 불활성화 시키고 분해를 촉진시켜 세포주기가 S기로 진행되도록 한다 (Cobrinik et al., Trends Biochem Sci 1992, 17:312-5).
그러나, 자궁경부암 치료를 위해 HPV16 E6와 E7 단백질을 동시 발현하는 핵산 염기서열 조성물을 사용한 임상실험에서 그 치료효과가 미미하였다 (Garcia F et al. Obstet Gynecol 2004, 103; 317-326). 이 결과는 단순히 HPV 항원 만을 투여하는 것으로는 자궁경부암을 치료 또는 억제할 정도의 항원 특이적 면역반응이 생성되지 못함을 의미한다.
따라서, 자궁경부암 치료를 위해서는 E6 및 E7의 면역원성을 증강시키고, 상기 단백질 자체의 발암생성 능력을 제거하는 전략이 필수적이다.
본 발명의 목적은 HPV에 의해 야기되는 질환을 예방 또는 치료함에 있어서, HPV의 E6 및 E7 단백질 자체의 발암 능력을 억제하면서도 면역원성이 증강된 신규한 융합 단백질 및 이를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 융합 단백질을 발현하는 재조합 벡터, 상기 벡터를 포함하는 숙주세포 및 상기 숙주세포를 이용하여 단백질을 발현하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 융합 단백질을 이용한 HPV에 의해 야기되는 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 이용하여 HPV에 의해 야기되는 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
사람 파필로마바이러스 타입 16 및 18 유래의, 서열목록 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 E6 및 E7의 3차원 구조가 변형된 융합 폴리펩타이드;
상기 폴리펩타이드의 분비를 위한 신호 펩타이드; 및
면역 증강 펩타이드를 포함하는 융합 단백질을 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 형질전환 숙주세포를 배양하여 본 발명의 융합 단백질을 발현하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 융합 단백질, 상기 단백질을 발현하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포 및 이의 파쇄물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는, 개체에서 사람 파필로마바이러스에 의하여 야기되는 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 유효량의 본 발명의 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 사람 파필로마바이러스에 의하여 야기되는 질환의 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 HPV 타입 16 및 18 유래의 E6 및 E7 단백질의 3차원 구조가 변형되도록 재조합 한 융합 단백질, 이를 세포 외로 분비하기 위한 신호 펩타이드 및 개체 내 면역 증강 펩타이드를 포함하도록 제조된 융합 단백질은 높은 HPV 타입 16 및 18 항원 특이적 면역 반응을 유도하여 HPV에 의해 유발되는 종양을 치료할 수 있다.
도 1은 항암 치료모델에서 쥐 C57BL/6 에 종양세포주인 TC-1을 피하 주입한 후 본 발명의 GX-188E의 치료를 통해 나타나는 HPV16 E6 특이적 CD8+ T 세포 반응을 나타낸 그래프이다.
도 2는 항암 치료모델에서 쥐 C57BL/6 에 종양세포주인 TC-1을 피하 주입한 후 본 발명의 GX-188E의 치료를 통해 나타나는 HPV16 E7 특이적 CD8+ T 세포 반응을 나타낸 그래프이다.
도 3은 항암 치료모델에서 쥐 C57BL/6 에 종양세포주인 TC-1을 피하 주입한 후 본 발명의 GX-188E의 치료를 통해 나타나는 HPV18 E6 특이적 CD8+ T 세포 반응을 나타낸 그래프이다.
도 4는 항암 치료모델에서 쥐 C57BL/6 에 종양세포주인 TC-1을 피하 주입한 후 본 발명의 GX-188E의 치료를 통해 나타나는 HPV18 E7 특이적 CD8+ T 세포 반응을 나타낸 그래프이다.
도 5는 항암 치료모델에서 쥐 C57BL/6 에 종양세포주인 TC-1을 피하 주입한 후 본 발명의 GX-188E의 치료를 통해 나타나는 항암효과를 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.
본 발명은
사람 파필로마바이러스 타입 16 및 18 유래의, 서열목록 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 E6 및 E7의 3차원 구조가 변형된 융합 폴리펩타이드;
상기 폴리펩타이드의 분비를 위한 신호 펩타이드; 및
면역 증강 펩타이드를 포함하는 융합 단백질에 관한 것이다.
본 발명의 융합 단백질은 사람 파필로마바이러스 타입 16 및 18 유래의 E6 및 E7의 3차원 구조가 변형되도록 재조합 한 융합 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 융합 폴리펩타이드는 사람 파필로마바이러스 타입 16 유래의 E6 단백질의 아미노산 1번부터 85번, E7 단백질의 아미노산 1번부터 65번, E6 단백질의 아미노산 70번부터 158번, E7 단백질의 아미노산 50번부터 98번, 사람 파필로마바이러스 타입 18 유래의 E6 단백질의 아미노산 1번부터 85번, E7 단백질의 아미노산 1번부터 65번, E6 단백질의 아미노산 70번부터 158번, E7 단백질의 아미노산 50번부터 105번이 결합된 융합 폴리펩타이드이다.
가장 구체적으로는, 융합 폴리펩타이드는 서열목록 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 가질 수 있다.
또한, 상기 신호 펩타이드는 약 20 내지 30개의 아미노산을 포함하는 펩타이드로서, 세포 내에서 발현된 단백질, 특히 E6과 E7 융합 폴리펩타이드를 포함하는 단백질을 세포 외로 분비시키는 펩타이드를 말한다. 또한 이를 코딩하는 핵산 서열을 "분비 신호 서열"이라 한다. 본 발명의 E6 및 E7 융합 폴리펩타이드는 바이러스에 감염된 세포의 핵 내에서 발현되는 단백질 (nucleus protein)이므로 자체적인 면역성이 약하다. 이에 분비 신호 서열에 의해 발현된 신호 펩타이드 (signal peptide)는 3차원 구조가 변형된 E6 및 E7 항원의 세포 외로의 분비를 유도함으로써 항원 특이적 체액성 면역반응 (humoral immune response) 및 세포성 면역 반응 (cellular immune response)의 증가를 가져올 수 있다.
상기 신호 펩타이드는 포유동물 등을 포함하는 고등 진핵세포에서 사용되는 신호 펩타이드를 사용할 수 있으며, 예를 들어, tPA, HSV gDs, 또는 성장 호르몬의 분비 신호 서열 등을 사용할 수 있다. 보다 바람직하게는, TPA (tissue plasminogen activation)를 사용할 수 있다. 가장 바람직하게는, 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 가질 수 있다.
또한, 면역 증강 펩타이드는 면역 반응에 관계하는 세포 (예를 들어, 수지상 세포 등)를 활성화시켜 면역 반응을 증가시키는 펩타이드를 말한다.
상기 면역 증강 펩타이드로 CD40 리간드, Flt3 리간드(fms-like tyrosine kinase 3 ligand), 플라젤린(Flagellin), 또는 OX40 등을 사용할 수 있다. 보다 바람직하게는, Flt3 리간드를 사용할 수 있다. 상기 Flt3 리간드는 수지상 세포 (dendritic cell, DC)의 증식 (proliferation)과 성숙 (maturation)을 유도하는 인자 (factor)로서, 항원에 의한 면역반응을 증가시키고 종양 항원과 융합된 상태에서 우수한 종양 감소 효과를 나타낼 수 있다. 가장 바람직하게는, 상기 Flt3 리간드는 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 가질 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다.
상기 폴리뉴클레오타이드는 본 발명의 융합 단백질을 코딩하는 것으로, 상기 E6 및 E7의 융합 폴리펩타이드는 서열번호 4에 기재된 염기서열로부터 코딩될 수 있으나, 이에 특별히 제한하지는 않는다. 또한, 상기 신호 펩타이드는 서열번호 5에 기재된 염기서열로부터 코딩될 수 있으나, 이에 특별히 제한하지는 않는다. 상기 면역 증강 펩타이드는 서열번호 6에 기재된 염기서열로부터 코딩될 수 있으나, 이에 특별히 제한하지는 않는다.
또한, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 화학적 합성법 또는 유전자 조작 기술에 의하여 제조될 수 있다. 화학적 합성법은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 임의의 방법이 사용될 수 있다. 또한, 상업적 핵산 합성 및 제공사에 의하여 의뢰하여 구입할 수도 있다. 유전자 조작 기술에 의하여 제조하는 경우, 예를 들면, 종래에 알려진 E6 및 E7의 융합 폴리펩타이드, 신호 펩타이드 및 면역 증강 펩타이드를 코딩하는 핵산 단편을 각각 얻고, 이들 단편을 프레임에 맞게 연결함으로써 제작할 수 있다. 상기 핵산 단편을 얻는 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 당업자라면 적절한 제한 효소를 이용하여 용이하게 연결할 수 있다. 본 발명의 구체적 실시에서는 화학적 합성법에 의하여 제조하는 방법이 개시되어 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, "벡터"란 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈 내로 삽입된 외부 DNA를 포함하는 유전자 작제물을 말한다. 본 발명과 관련된 벡터는 분비 신호 서열, 인간 파필로마바이러스의 3차원 구조가 변형된 E6과 E7 융합 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열 및 면역 증강 펩타이드를 코딩하는 핵산 서열 등이 게놈 내로 삽입된 벡터로서, 이들 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터, 효모 벡터, 또는 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터 같은 바이러스 벡터를 예로 들 수 있다.
상기 분비 신호 서열은 세포 내에서 발현된 종양 항원을 세포 외로 분비하여 면역 세포들이 인식할 수 있도록 하는 펩타이드를 암호화하고 있는 핵산 서열로서, 예를 들면 tPA, HSV gDs, 또는 성장 호르몬의 분비 신호 서열 등이 있다. 바람직하게는 포유동물 등을 포함하는 고등 진핵세포에서 사용되는 분비 신호 서열을 사용할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 tPA (tissue plasminogen activation)를 사용할 수 있다. 가장 바람직하게는, 서열번호 5에 기재된 염기서열을 가질 수 있다. 또한 본 발명의 분비 신호 서열은 숙주세포에서 발현 빈도가 높은 코돈으로 치환하여 사용할 수 있다.
또한, 상기 면역 증강 펩타이드를 코딩하는 핵산 서열은 면역 반응 에 관계하는 세포 (예를 들어, 수지상 세포 등)를 활성화시켜 면역 반응을 증가시키는 펩타이드를 코딩하는 핵산 서열을 말한다. 상기 면역 증강 펩타이드로 CD40 리간드, Flt3 리간드, 플라젤린(Flagellin), 또는 OX40 등을 사용할 수 있다. 보다 바람직하게는, 면역 증강 펩타이드로 Flt3 리간드를 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 면역 증강 펩타이드를 코딩하는 핵산 서열은 숙주세포에서 발현 빈도가 높은 코돈으로 치환하여 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 재조합 벡터에 포함되는 상기 폴리뉴클레오타이드는 숙주세포에서 발현 빈도가 높은 코돈으로 치환될 수 있다. 본 발명에서 사용된 "숙주세포에서 발현 빈도가 높은 코돈으로 치환된 것" 또는 "코돈 최적화"란 숙주세포 내에서 DNA가 단백질로 전사 (transcription) 및 번역 (translation)될 때 아미노산을 지령하는 코돈 사이에 숙주에 따라 선호도가 높은 코돈이 존재하는데, 이들 선호도가 높은 코돈으로 치환함으로써 그 핵산이 암호화하는 아미노산 또는 단백질의 발현 효율을 증가시키는 것을 말한다.
여기서, "숙주세포"란 원핵 또는 진핵 세포를 포함하며, 진핵세포는 진균, 효모 등을 포함하는 하등 진핵 세포뿐만 아니라 포유동물 등을 포함하는 고등 진핵 세포를 포함한다.
본 발명의 재조합 벡터는 숙주세포에서 본 발명의 융합 단백질을 코딩하는 핵산의 발현에 적합한 형태로 상기 융합 단백질을 코딩하는 핵산을 포함할 수 있다. 즉, 본 발명의 재조합 벡터는 발현에 사용될 숙주세포에 근거하여 선택되는 하나 이상의 조절 서열을 포함하고, 이들은 발현될 핵산 서열과 작동 가능하게 연결되어 있다.
"작동 가능하게 연결되어 있는"이란 목적으로 하는 뉴클레오타이드 서열 (예를 들면, 인 비트로 전사/번역 시스템에서 또는 숙주 세포에서)이 그의 발현이 이루어질 수 있도록 하는 방식으로 상기 조절서열에 연결되어 있다는 것을 의미한다.
"조절 서열"이란 용어는 프로모터, 인핸서 및 다른 조절 요소(예, 폴리아데닐화 신호)를 포함하는 의미이다. 조절 서열에는 많은 숙주 세포에서 목적으로 하는 핵산이 구성적으로 발현될 수 있도록 지시하는 것 및 특정한 숙주 세포에서만 목적으로 하는 핵산이 발현될 수 있도록 지시하는 것(예, 조직특이적 조절 서열)이 포함된다. 발현벡터의 설계는 형질전환될 숙주세포의 선택 및 원하는 단백질 발현의 수준 등과 같은 인자에 따라 달라질 수 있다는 것은 당업자라면 이해할 수 있다. 본 발명의 발현 벡터는 숙주 세포에 도입되어 상기 융합 단백질을 발현할 수 있다.
또한, 본 발명의 벡터는 예를 들면, 표준 재조합 DNA 기술에 의하여 제조될 수 있으며, 표준 재조합 DNA 기술에는 예를 들면, 평활말단 및 접착말단 라이게이션, 적절한 말단을 제공하기 위한 제한 효소 처리, 부적합한 결합을 방지하기 위하여 알칼리 포스파타제 처리에 의한 인산기 제거 및 T4 DNA 라이게이즈에 의한 효소적 연결 등이 포함된다. 화학적 합성 또는 유전자 재조합 기술에 의하여 얻어진 신호 펩타이드를 코딩하는 DNA, 사람 파필로마바이러스 E6 및 E7의 융합 폴리펩타이드를 코딩하는 DNA 및 면역 증강 펩타이드를 코딩하는 DNA를 적절한 조절 서열이 포함되어 있는 벡터에 재조합 함으로써 본 발명의 벡터가 제조될 수 있다. 상기 조절 서열이 포함되어 있는 벡터는 상업적으로 구입 또는 제조할 수 있으며, 본 발명에서는 DNA 백신 제조용 벡터인 pGX27을 제조하여 사용하였다.
하나의 양태로서, 본 발명의 재조합 벡터는 본 발명의 융합 단백질을 생산하기 위한 세포를 제조하는 용도, 유전자 치료에 있어서 유전자 전달을 위한 벡터 또는 그 자체로서 개체 내에 투여되는 약제학적 활성 성분으로서 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 벡터로 형질전환된 숙주세포에 관한 것이다.
상기 숙주세포의 종류는 전술한 바와 같다.
형질전환은 핵산을 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 공지의 방법을 사용할 수 있으며, 당업자 수준에서 이해될 수 있는 범위 내에서 숙주세포에 따라 적합한 사용가능한 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 전기충격유전자전달법(electroporation), 원형질 융합, 인산 칼슘(CaPO4) 침전, 염화 칼슘(CaCl2) 침전, 실리콘 카바이드 섬유 이용한 교반, 아그로박테리아 매개된 형질전환, PEG, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 등이 포함되나 이로 제한되지 않는다.
본 발명은 또한 본 발명의 형질전환된 숙주세포를 배양하여 본 발명의 융합 단백질을 발현하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 융합 단백질은 형질전환 숙주세포를 적절한 배지에서 배양하거나, 또는 상기 형질전환 숙주세포를 임의의 동물에 도입한 후 생체내에서 배양함으로써 용이하게 발현 및 대량 생산할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 융합 단백질, 상기 단백질을 발현하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포 및 이의 파쇄물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는, 개체에서 사람 파필로마바이러스에 의하여 야기되는 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 "개체"는 인간, 원숭이. 생쥐, 돼지, 소 및 토끼 등의 포유동물을 포함하나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 바이러스에 의하여 유발되는 질환은 자궁경부암, 곤지롬, 사마귀 등이 포함될 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있다. 상기 담체에는 유당, 포도당, 자당, 소르비톨, 마니톨, 전분, 검 아카시아, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미세결정 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이드 및 미네랄 오일 등이 포함된다. 상기 조성물에는 또한, 윤활제, 웨팅제, 풍미제, 유화제 및 방부제 등이 더 포함될 수 있다.
본 발명의 조성물은 예를 들면, 정맥내, 근육내, 경구, 경피(transdermal), 점막, 코안(intranasal), 기관내(intratracheal) 또는 피하 투여와 같은, 임의의 수단에 의하여 개체로 직접적으로 투여될 수 있으나, 이들 방법에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 조성물은 인 비트로에서 배양된 세포에 투여되고, 상기 배양된 세포를 체내에 투여함으로써 간접적으로 개체 내에 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물은 전신적으로 또는 국부적으로 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물은 과립제, 산제, 액제, 정제, 캅셀제, 또는 건조시럽제 등의 경구용 제제 또는 주사제 등의 비경구용 제형으로 제제화할 수 있으나, 이러한 제형에 한정되는것은 아니다. 바람직하게는 본 발명의 조성물은 액제 또는 주사제의 형태일 수 있다.
활성 성분으로서 본 발명의 융합 단백질, 또는 재조합 발현 벡터의 효과적인 양은 약 0.05 내지 500mg/kg 체중, 바람직하게는 0.5 내지 50mg/kg 체중일 수 있으며, 단일 투여량 및 배분된 투여량으로 고려될 수 있다. 그러나, 투여되는 활성 성분의 양은 치료될 조건, 환자의 나이 및 체중, 증상의 경중과 같은 다양한 인자를 고려하여 결정하여야 하기 때문에 상기한 범위에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 또한 유효량의 본 발명의 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 사람 파필로마바이러스에 의하여 야기되는 질환의 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 약제학적 조성물, 그의 효능, 투여방법 및 투여량 등에 관한 내용은 상기한 바와 같다.
본 발명의 방법에 있어서, 개체는 인간, 원숭이, 생쥐, 돼지, 소 및 토끼 등의 포유동물을 포함하나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 바이러스에 의하여 유발되는 질환은 자궁경부암, 곤지롬, 사마귀 등을 포함할 수 있다.
이하, 본 발명에 따르는 실시예 및 본 발명에 따르지 않는 비교예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
<실시예 1> GX-188E DNA의 구성
본 발명의 실시예에서 사용된 약어는 다음과 같이 정의한다. 최적화된 핵산서열, "tPa" 또는 "t"는 조직 플라스미노겐 활성제 (tissue plasminogen activator)의 분비 신호 서열(secretory signal sequence), "F" 또는 "Flt3L"는 fms-like tyrosine kinase 3 ligand를 의미한다.
서열번호 5의 핵산 서열을 가지는 코돈 최적화된 tPa 분비 신호 서열과 서열번호 6의 핵산서열을 가지는 코돈 최적화된 Flt3L는 연결된 형태로 화학적으로 합성하였다. 벡터에 삽입하기 용이하게 하기 위해 말단에 KpnI (5'), NheI(3') 사이트를 첨가하였다. DNA 백신 제조용 벡터인 pGX10 (대한민국 공개특허 제2003-0047667호)을 Kpn I 과 NheI 제한효소로 처리한 후 합성한 tPa-Flt3L를 리가아제로 연결하여 pGX10/tF를 제작하였다.
HPV16 E6의 1번 아미노산부터 85번 아미노산을 암호화하는 코돈 최적화된 핵산서열, HPV16 E7의 1번 아미노산부터 65번 아미노산을 암호화하는 코돈 최적화된 핵산서열, HPV16 E6 70번 아미노산부터 158번 아미노산을 암호화하는 코돈 최적화된 핵산서열, HPV16 E7 50번 아미노산부터 98번 아미노산을 암호화하는 코돈 최적화된 핵산서열, HPV18 E6의 1번 아미노산부터 85번 아미노산을 암호화하는 코돈 최적화된 핵산서열, HPV18 E7의 1번 아미노산부터 65번 아미노산을 암호화하는 코돈 최적화된 핵산서열, HPV18 E6 70번 아미노산부터 158번 아미노산을 암호화하는 코돈 최적화된 핵산서열, HPV18 E7 50번 아미노산부터 105번 아미노산을 암호화하는 코돈 최적화된 핵산서열을 연결된 형태로 화학적으로 합성하였다 (이하, 16E6N16E7N16E6C16E7C18E6N18E7N18E6C18E7C: 서열번호 4). 벡터에 삽입하기 용이하게 하기 위해 말단에 NheI(5'), XbaI(3') 사이트를 첨가하였다. pGX10/tF를 NheI과 XbaI 효소로 처리한 후 합성한 16E6N16E7N16E6C16E7C18E6N18E7N18E6C18E7C를 리가아제로 연결하여 pGX10/tF16E6N16E7N16E6C16E7C18E6N18E7N18E6C18E7C를 제작하였다. pGX10/tF16E6N16E7N16E6C16E7C18E6N18E7N18E6C18E7C을 KpnI 과 XbaI 효소 (enzyme)로 처리하여 tF16E6N16E7N16E6C16E7C18E6N18E7N18E6C18E7C를 분리하고 pGX10을 KpnI 과 XbaI 효소로 처리한 후 리가아제로 연결하여 pGX27/tF16E6N16E7N16E6C16E7C18E6N18E7N18E6C18E7C (이하, "GX-188E" 라 함)를 제조하였다.
<실시예 2> GX-188E의 자궁경부암 치료 효과 확인
GX-188E의 자궁경부암 치료 효과를 확인하기 위해 쥐 C57BL/6에 TC-1 종양세포 5×105 cells을 피하주사하고 3일째, 8일째 되는 날 50 ㎍ 및 100 ㎍의 양으로 근육 주사한 후 일렉트로포레이션 (electroporation)을 실시하였다. 종양세포를 주사한 날로부터 27일째 되는 날까지 종양세포의 부피변화를 관찰하고 36일째 되는 날 쥐의 비장을 꺼내어 5 ㎍/mL의 anti-mouse IFN-g 항체 (BD Pharmigen, Sandiego, CA) 50 ㎕로 코팅된 플레이트에 1×106 cells을 IL-2와 HPV16 E6 CD8 T 세포 항원결정기 (epitope) (E648-57; EVYDFAFRDL, Peptron, Korea) 또는 HPV18 E7 CD8 T 세포 항원결정기 (E749-57; RAHYNIVTF, Peptron, Korea) 또는 HPV18 E6 펩타이드 풀(peptide pool) 또는 HPV18 E7 펩타이드 풀(peptide pool)을 함께 넣고 37℃ 5% CO2 배양기 (Froma, Minnesota, USA)에서 24시간 배양하였다. 플레이트를 PBST로 세척 후 비오틴이 달려있는 IFN-g 탐지 항체 (BD Pharmigen, Sandiego, CA) 2 ㎍/mL을 50 ㎕씩 넣고 약 3시간 정도 상온에서 배양하였다. 이후 PBST로 세척하고 streptavidin-AKP(alkaline phosphate)을 1:2000으로 희석하여 50 ㎕씩 넣고 상온에서 1시간 배양하였다. PBST로 세척 후 10 mL의 알칼리성 인산염 완충액 (alkaline phosphate buffer)당 66 ㎕의 NBT (Promega, Madison, WT)와 33 ㎕의 BCIP (Promega, Madison, WT)를 첨가하여 50 ㎕씩 넣고 반응시켰다. 반응에 의한 색이 잘 나타나도록 37℃ 배양기에서 약 30분간 넣어둔 후 멸균된 물 (distilled water, D.W.)로 세척하고 생성된 점의 개수를 판독기로 읽었다.
HPV16 E6 CD8 T 세포 항원결정기 (epitope), HPV16 E7 CD8 T 세포 항원결정기 (epitope), HPV18 E6 펩타이드 풀, HPV18 E7 펩타이드 풀을 사용하여 HPV16 E6, E7 및 HPV18 E6, E7에 대한 특이적인 T 세포 면역반응을 ELISPOT으로 측정한 결과 GX-188E는 높은 항원 특이적 면역반응을 유도하였으며, HPV16 과 HPV18 의 E6 및 E7에 대한 특이적 면역반응을 동시에 유도하는 것을 확인할 수 있었다 (도 1, 도 2, 도 3, 및 도 4 참조).
GX-188E로 TC-1 종양세포에 대한 면역치료를 한 쥐에서는 대조군인 pGX27을 주입한 쥐에 비하여 현격한 종양 부피의 감소를 확인할 수 있었다(도 5 참조).
본 발명의 융합 단백질은 HPV에 의해 유발되는 종양 치료제로 사용할 수 있다.

Claims (17)

  1. 사람 파필로마바이러스 타입 16 및 18 유래의, 서열목록 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 E6 및 E7의 3차원 구조가 변형된 융합 폴리펩타이드;
    상기 폴리펩타이드의 분비를 위한 신호 펩타이드; 및
    면역 증강 펩타이드를 포함하는 융합 단백질.
  2. 제1항에 있어서,
    신호 펩타이드는 tPa, HSV gDs 및 성장 호르몬 분비 신호 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 융합 단백질.
  3. 제1항에 있어서,
    신호 펩타이드는 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 갖는 융합 단백질.
  4. 제1항에 있어서,
    면역 증강 펩타이드가 CD40 리간드, Flt3 리간드(fms-like tyrosine kinase 3 ligand), 플라젤린(Flagellin) 및 OX40로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 융합 단백질.
  5. 제1항에 있어서,
    면역 증강 펩타이드는 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 갖는 융합 단백질.
  6. 제1항의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
  7. 제6항에 있어서,
    사람 파필로마바이러스 E6 및 E7의 융합 폴리펩타이드를 코딩하는 서열번호 4에 기재된 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
  8. 제6항에 있어서,
    신호 펩타이드를 코딩하는 서열번호 5에 기재된 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
  9. 제6항에 있어서,
    면역 증강 펩타이드를 코딩하는 서열번호 6에 기재된 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
  10. 제6항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터.
  11. 제10항의 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포.
  12. 제11항의 숙주세포를 배양하여 제1항의 융합 단백질을 발현하는 방법.
  13. 제1항의 융합 단백질, 상기 단백질을 발현하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포 및 이의 파쇄물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는, 개체에서 사람 파필로마바이러스에 의하여 야기되는 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
  14. 제13항에 있어서,
    질환이 자궁경부암인 조성물.
  15. 제13항에 있어서,
    약제학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함하는 조성물.
  16. 유효량의 제13항에 따른 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 사람 파필로마바이러스에 의하여 야기되는 질환의 예방 또는 치료하는 방법.
  17. 제16항에 있어서,
    질환이 자궁경부암인 방법.
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