MXPA05003395A

MXPA05003395A - Polipeptidos de virus de papiloma humano y composiciones inmunogenas.

Info

Publication number: MXPA05003395A
Application number: MXPA05003395A
Authority: MX
Inventors: Smith Larry
Original assignee: Wyeth Corp
Priority date: 2002-10-03
Filing date: 2003-10-02
Publication date: 2005-06-22
Also published as: EP1553966B1; CO5700784A2; AU2003282731A1; ZA200502618B; EP1553966A2; CA2499837A1; US20070275003A1; JP2006501825A; WO2004030636A2; WO2004030636A3; NZ556544A; PT1553966E; BR0314529A; CN1720060A; US7378099B2; ES2391451T3; CA2499837C; KR101145190B1; DK1553966T3; KR20050053732A

Abstract

La presente invencion proporciona composiciones inmunogenas y farmaceuticas para el tratamiento y prevencion de canceres asociados con el virus de papiloma humano (HPV) y, en particular, el cancer cervical. En particular, esta invencion se refiere a proteinas de fusion, y los acidos nucleicos que codifican para estas proteinas de fusion, utilizadas para generar respuestas inmunes contra el HPV. Especificamente, esta invencion proporciona fusiones de las proteinas E6 y E7 de HPV en las cuales la proteina E6 y/o E7 contiene una o mas mutaciones. Estas mutaciones anulan la actividad de transformacion de estas proteinas oncogenicas y, de esta manera, confieren seguridad a las fusiones de E6/E7. Ademas, estas fusiones mantienen o incrementan la eficacia inmunogena de E6 y E7. se puede utilizar cualquier metodo de suministro de genes o proteinas para suministrar o empacar las composiciones inmunogenas de la presente invencion.

Description

POLIPEPTIDOS DE VIRUS DE PAPILOMA HUMANO Y COMPOSICIONES INMÜNOGENAS CAMPO DE LA INVENCION Esta invención se refiere a composiciones f rmacéuticas e inmunógenas utilizadas para tratar o prevenir el cáncer cervical y otros cánceres causados por los virus de papiloma humano (HPV, por sus siglas en inglés) . En particular, esta invención se refiere a proteínas de fusión, y los ácidos nucleicos que codifican para estas proteínas de fusión, utilizadas para generar respuestas inmunes contra el HPV. Estas proteínas de fusión y polinucleótidos se utilizan en el tratamiento y prevención de cánceres inducidos por KPV. ANTECEDENTES DE LA INVENCION El cáncer de la cerviz uterina es la segunda causa principal de muertes relacionadas con tumores en las mujeres, que da cuenta de 250,000 muertes al año en todo el mundo. Se sabe que más de 99% de todos los cánceres cervicales están asociados con la infección con virus de papiloma humano (HPV) , de los cuales 50% están vinculados directamente con el HPV tipo 16 (HPV16) (Walboomers y colaboradores, J. Path. 1999, 189:12-19). Mientras que la mayoría de infecciones con HPV16 son asintomáticas y pasajeras, un cierto porcentaje de éstas se vuelven persistentes. Aproximadamente 1% de individuos infectados persistentemente progresa a través de lesiones REF: 162915 cervicales cada vez más graves conocidas como neoplasia intraepitelial , cervical (CIN, por sus siglas en inglés) y eventualmente a carcinoma cervical, invasivo. Las primeras proteínas de HPV conocidas como E6 y E7 son requeridas para mantener el fenotipo maligno (Von Knebel y colaboradores, Int J Cáncer 1992, 51:831-4; Crook y colaboradores, Embo J 1989, 8:513-9; He y Huang, Cáncer Res. 1997, 57:3993-9). Estas proteínas son expresadas consistentemente en lesiones y cánceres de CIN (Smotkin y Wettstein, Proc Nati Acad Sci EUA 1986, 83:4680-4; Durst y colaboradores, Virology 1992, 189:132-40). Estas proteínas inducen la proliferación del epitelio por la interrupción de la regulación del ciclo celular. Específicamente, la proteína E7 se une e inactiva a la proteína de retinoblastoma supresora de tumores celulares (Rb) (Dyson y colaboradores, Science 1989, 243:934-7) , lo cual da por resultado el progreso de la célula en la fase S del ciclo celular (Cobrinik y colaboradores, Trends Biochem Sci 1992, 17:312-5). La proteína E6 de HPV16 induce la degradación de la proteína de supresión de tumores p53 (Scheffner y colaboradores, Cell 1990, 63:1129-36) , impidiendo que la célula se someta a la apoptosis. Debido a que las células tumorales expresan constitutivamente las proteínas E6 y E7 y estas proteínas no están presentes en las células normales, estas proteínas virales son objetivos muy atractivos para la terapia inmune del cáncer. Muchas líneas de evidencia sugieren que una respuesta inmune mediada por células contra E6 y E7 en humanos se correlaciona con la regresión natural de lesiones de HPV y la evacuación de ADN viral (Nakagawa y colaboradores, J Infect Dis 1997, 175:927-31; Kadish y colaboradores, J Nati Cáncer Inst 1997, 89:1285-93) . También se ha mostrado que una respuesta de CTL contra E7 protege a los ratones contra tumores positivos en HPV16 en diferentes modelos de murino (Feltkamp y colaboradores, Eur J Immunol 1995, 25:2638-42; Lin y colaboradores, Cáncer Res 1996, 56:21-6). Puesto que la inmunidad mediada por células (CMI, por sus siglas en inglés) parece importante en el control de la infección y enfermedad de HPV (Eiben, G. L. y colaboradores, Adv Can Res 2002, 86:113-148), una vacuna terapéutica debería generar respuestas óptimas de células T contra numerosos péptidos antigénicos de E6 y E7 de HPV para la cobertura efectiva en diversas poblaciones de antígenos de leucocitos humanos (HLA, por sus siglas en inglés) . Un vector de vacuna prometedor para suministrar antígenos de E6/E7 es un vector de alfavirus recombinante (AV, por sus siglas en. inglés) derivado de la cepa 3014 atenuada de virus de encefalitis equina de Venezuela (VEE; Velders M. P. y colaboradores, Cáncer Res 2001, 61:7861-7867). Las partículas de replicón de VEE incompetentes para la réplica (VRP, por sus siglas en inglés) han probado ser vacunas altamente efectivas en una variedad de enfermedades infecciosas, preclínicas y modelos tumorales (Rayner, J. 0. y colaboradores, Rev ed Virol 2002, 12:279-296). Los vectores de replicones derivados de AV, tales como VEE, codifican para genes heterólogos en forma de AR , no se extienden más allá de la infección inicial e inducen la apoptosis de las células infectadas (Griffith, D. E. y colaboradores, Annu. Rev. Microbiol . 1997, 51:565-592) . Estos atributos limitan las oportunidades ya sea para la expresión prolongada de proteínas o para la integración en el ADN del hospedante que son características de las malignidades inducidas por HPV después de la infección natural. La b ja prevalecencia de la inmunidad anti-VEE previamente existente y los prospectos para la inmunización repetida con VRPs (Pushko, P. y colaboradores, Virology 1997, 239:389-401) son ventajas sobre otros factores virales, recombinantes , tales como virus de vaccinia o adenovirus . A pesar de que son objetivos atractivos para la terapia inmune del cáncer, las proteínas E6 y E7 tienen actividad transformante. Consecuentemente, los métodos de inmunoterapia que utilizan las proteínas E6 y E7 que están actualmente contemplados en el campo son potencíalmente peligrosos debido a que estas proteínas pueden inducir la transformación e inmortalización de las células. Permanece una necesidad insatisfecha por composiciones eficaces para el tratamiento y prevención de la CIN y el carcinoma cervical. Más específicamente, existe la necesidad por composiciones inmunógenas, que incluyen composiciones a base de las proteínas E6 y/o E7 , que sean tanto seguras cerno efectivas para el tratamiento y/o prevención de CIN, carcinoma cervical, carcinoma anal y otros trastornos . Los estudios previos de composiciones inmunógenas para HPV han sido limitados por la falta de modelos de tumores que expresen el HLA clase I en ratones. Un modelo positivo en la proteína de fusión E6/E7 de HPV16 se describe en este texto; este modelo forma tumores progresivamente crecientes en ratones transgénicos por HLA-A*0201. BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención satisface las necesidades descritas anteriormente y otras necesidades al proporcionar composiciones f rmacéuticas y polipéptidos que comprenden fusiones de polipéptidos de E6 y E7 que llevan mutaciones y/o un orden de fusión (E7E6) que disminuye la actividad biológica y, por lo tanto, la actividad transformante, potencial de las proteínas E6 y E7. En particular, la presente invención proporciona los polipéptidos de fusión novedosos de E6/E7 y los polinucleótidos que los codifican para. En las modalidades específicas, la invención proporciona polipéptidos que comprenden los polipéptidos de E6 y E7 del virus de papiloma humano en donde el polipéptido de E7 tiene mutaciones en cualquiera de uno o más de los aminoácidos que corresponden a los aminoácidos 24, 26 o 91 de la SEC ID NO: 14 y el polipéptido de E6 no tiene mutaciones o tiene mutaciones en cualquiera de uno o más aminoácidos que corresponden a los aminoácidos 63 o 106 de la SEC ID NO: 13. En una modalidad específica, el polipéptido de fusión comprende un polipéptido de E7 en el cual uno, o pre eriblemente ambos, de los aminoácidos que corresponden a los aminoácidos 24 y 26 de la SEC ID NO: 14 son mutados . Estos polipéptidos mutados pueden tener un residuo de glicina en cualquiera de esas posiciones mutadas y E6 puede ser terminal carboxi o terminal amino para E7. La presente invención también proporciona ácidos nucleicos aislados que codifican para estos polipéptidos. Por ejemplo, en una modalidad de la invención, los ácidos nucleicos aislados comprenden las secuencias de E6 y E7 del virus de papiloma humano en donde la secuencia de nucleótidos de E6 tiene mutaciones en cualquier nucleótido que corresponde a los nucleótidos 187-189 o 316-318 del gen de E6 de HPV16 y la secuencia de nucleótidos de E7 tiene mutaciones en cualquier nucleótido que corresponde a los nucleótidos 70-72, 76-78 o 271-273 del gen de E7 de HPV16 y en donde la mutación o mutaciones dan por resultado que un aminoácido diferente sea codificado. La presente invención también proporciona composiciones farmacéuticas e inmunógenas que comprenden estos polipéptidos y polinucleótidos . La presente invención también proporciona polipéptidos aislados que tienen la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 5, SEC ID NO : 9, o SEC ID NO: 11. En otras modalidades, la invención proporciona ácidos nucleicos, aislados que codifican para estos polipéptidos, que incluyen ácidos nucleicos que tienen la secuencia de nucleótidos SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 10 o SEC ID NO: 12. También se proporcionan los vectores de expresión que comprenden las secuencias de ácidos nucleicos que codifican para las fusiones de E6/E7. Por ejemplo, en una modalidad específica, la invención proporciona vectores de expresión que comprenden las SEC ID NOS: 4, 6, 10 o 12 asociadas de manera operativa con (por ejemplo, bajo el control de) una secuencia de control de expresión. También se proporcionan células hospedantes que comprenden ácidos nucleicos que codifican para las fusiones de E6/E7, así como también células hospedantes que expresan o contienen los polipéptidos de fusión de E6/E7. Todavía en otras . modalidades, la invención también proporciona composiciones inmunógenas que comprenden un ácido nucleico o polipéptido de la invención y son útiles, por ejemplo, para tratar o prevenir el cáncer cervical. Estas composiciones inmunógenas pueden comprender (a) un polipéptido de la invención (por ejemplo, un polipéptido que comprende los polipéptidos de E6 y E7 del virus de papiloma humano, en donde el polipéptido de E7 tiene mutaciones en cualquiera de uno o más de los aminoácidos que corresponden a los aminoácidos 24, 26 o 91 de la SEC ID NO: 14 y el polipéptido de E6 no tiene mutaciones o tiene mutaciones en cualquier de uno o más aminoácidos que corresponden a los aminoácidos 63 o 106 de la SEC ID NO: 13), y (b) un portador farmacéuticamente aceptable. Opcionalmenne , una composición inmunógena de la invención también puede contener un adyuvante. También se proporcionan virus recombinantes que contienen uno o más ácidos nucleicos de la invención, y/o que codifican para uno o más de los polipéptidos de la invención. De esta manera, por ejemplo, un virus recombinante de -la invención puede comprender un ácido nucleico que codifica un polipéptido expuesto en las SEC ID NOS: 3, 5, 9 u 11, y más particularmente que tienen la secuencia expuesta en cualquiera de las SEC ID NOS: 4, 6, 10 o 12. En una modalidad particularmente preferida, un virus recombinante de la invención es un virus de encefalitis equina de Venezuela modificado (VEEV) . Los métodos para utilizar las composiciones mencionadas anteriormente se proporcionan adicionalmente y estos métodos también se consideran parte de la presente invención. De esta manera, la invención también proporciona un método para producir una respuesta inmune en un individuo al administrar a ese individuo cantidades inmunogénicamente efectivas de un polipéptido de la invención (por ejemplo, uno que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEC ID NOS: 3, 5, 9 u 11) y un portador farmacéuticamente efectivo. También se proporcionan los métodos para tratar y/o prevenir el cáncer cervical. Por ejemplo, en una modalidad de la invención se proporcionan métodos para tratar el cáncer cervical en los cuales a un paciente diagnosticado con cáncer cervical se le administra un polipéptido de la invención (por ejemplo, uno que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEC ID NOS: 3, 5, 9 u 11) y un portador farmacéuticamente aceptable. En otras modalidades, la invención proporciona métodos para prevenir el cáncer cervical en los cuales un polipéptido de la invención y un portador farmacéuticamente aceptable son administrados a un individuo. En todavía otras modalidades, la invención proporciona métodos para tratar y/o prevenir el cáncer cervical en un paciente al administrar al paciente una cantidad inmunológicamente efectiva de un ácido nucleido de la invención (por ejemplo, uno que tiene una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de las SEC ID NOS: 3, 5, 9 u 11, particularmente expuestas en cualquiera de las SEC ID NOS: 4, 6, 10 o 12) . BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS Las figuras 1A y IB son diagramas esquemáticos que muestran la ubicación de las mutaciones puntuales introducidas en las proteínas E6 y E7 de HPV16 con relación a epítopos putativos para los alelos principales de HLA-A Clase I . La figura 1A muestra los aminoácidos de origen natural en E6, 63C y 106C, que fueron mutados cada uno a glicina. La figura IB muestra los aminoácidos de origen natural en E7, 2C, 26E y 91C, que fueron mutados cada uno a glicina. Los epítopos clase I definidos previamente capaces de unirse a los alelos de HLA-Al, A2 , A3 , All y A24 se muestran en cuadros punteados (Kast, W. M. y colaboradores, J Immunol 1994, 152:3904-3912). Las figuras 2A-2E son diagramas esquemáticos que muestran la secuencia de alineamiento y de consenso de las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos de E6 de los virus de papiloma humano 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 y 68 (SEC ID NOS: 15-26, respectivamente) . La secuencia de consenso (SEC ID NO: 39) se muestra abajo del alineamiento. Las letras mayúsculas en la secuencia de consenso indican el consenso completo y las letras minúsculas en la secuencia de consenso indican un consenso de alta frecuencia, pero no completo . Las figuras 3A-3C son diagramas esquemáticos que muestran la secuencia de alineamiento y de consenso de las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos de E7 de los virus de papiloma humano 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 y 68 (SEC ID NOS: 27-38, respectivamente) . La secuencia de consenso (SEC ID NO: 40) se muestra abajo del alineamiento. Las letras mayúsculas en la secuencia de consenso indican el consenso completo y las letras minúsculas en la secuencia de consenso indican un consenso de alta frecuencia, pero no completo . Las figures 4A y 4B son gráficas que muestran el porcentaje específico de lisis contra la relación de células efectoras con células objetivo (E:T), lo cual representa las respuestas de CTL después de la inmunización con VRP . Los ratones C57BL/6 fueron inmunizados por la ruta subcutánea con 3 x 105 UI de la VRP indicada y los ensayos de CTL se realizaron 1 mes después. La citotoxicidad se midió por la liberación de Europio de células objetivo MC57G infectadas con E7- VA (FIG. 4A) o E6-MVA (FIG. 4B) . Estos resultados se reprodujeron en dos experimentos adicionales (no se muestran los datos) . Las figuras 5A y 5B son gráficas que demuestran el porcentaje de ratones libres de tumores contra el número de días después de la prueba del tumor. Los ratones C57BL/6 (n = 8/gp) fueron cebados y reforzados con 3 x 105 UI de la composición inmunógena de VRP indicada en los días -21 y -7 y sometidos a prueba en los días 0 con ya sea 5 x 105 células tumorales C3 (figura 5A) o 5 x 104 células tumorales TC-1 (figura 5B) en el costado. Los tumores se supervisaron cada 3 días . La figura 6 es una gráfica que demuestra el porcentaje de ratones libres de tumores contra el número de días después de la prueba del tumor. Los ratones C57BL/6 (n = 8-16/gp) recibieron 5 x 105 células tumorales C3 en el día 0 y se inmunizaron con la V P indicada en los días 7, 14 y 21. Los tumores se supervisaron cada 3 días durante 45 días. La figura 7 es una gráfica que demuestra el porcentaje de ratones libres de tumores contra el número de días después de la prueba del tumor. Los ratones transgénicos por HLA-A*0201 (n = 10/gp) recibieron 2 x 106 células tumorales HLF16 en el día 0 y se inmunizaron con la VRP indicada en los días 5, 10 y 15. Los tumores se supervisaron cada 5 días . Las figura 8A y 8B son análisis de inmunotransferencia Western que detectan la expresión de p53 (figura 8A) y Rb (figura 8B) en células epiteliales, primarias de mama de humano (MECs, por sus siglas en inglés) infectadas con difex'entes preparaciones de VRP. Veinticuatro horas después de la infección con la VRP indicada (en MOI = 10) , 25 ug de cada lisado de células MEC se condujeron en SDS-PAGE, se inmunotransfirieron y se sondearon por los niveles de p53 (figura 8A) y Rb (figura 8B) . La carga equivalente de proteína se verificó mediante el sondeo con un anticuerpo antitubul ina . La presencia de la proteína E7 se verificó mediante el sondeo de las líneas indicadas con un anticuerpo anti-E7. DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION La presente invención proporciona fusiones de las proteínas E6 y E7 de HPV, las secuencias de nucleótidos que codifican para ejemplos de estas fusiones y formas mutantes de las mismas. Aunque cada una de las mutaciones específicas de HPV16 identificadas con la presente (con la excepción de E6 C106G, la cual solo ha sido mutada previamente a C106R (Dalal y colaboradores, J Virol 1996, 70:683-8)) se han descrito previamente, no se han hecho combinaciones de estas mutaciones y las combinaciones de estas mutaciones no se han sometido a prueba por su capacidad para retener la inmunogenicidad mientras que carecen de la capacidad transformante o de inmortilización . Por ejemplo, no se sabe si cualquier otra combinación de dos o más mutaciones daría por resultado polipéptidos que mantendrían su eficacia inmunógena. La presente invención describe fusiones de las proteínas E6/E7 (el término "E6/E7" se utiliza en este texto para indicar fusiones en el orden E6E7, E7E6 o ambos) que contienen combinaciones únicas de estas mutaciones y el descubrimiento sorprendente que las proteínas de fusión E6/E7 contienen cuatro o cinco mutaciones definidas que mantienen su eficacia inmunógena. Este descubrimiento es particularmente importante debido a que una composición inmunógena; terapéutica debe generar respuestas celulares, óptimas contra numerosos péptidos antigénicos de E6 y E7 de HPV para la cobertura efectiva en diversas poblaciones de HLA. La presente invención también describe que estas fusiones de E6/E7 que llevan mutaciones múltiples, mientras que mantienen su eficacia inmunológica, no mantienen las funciones necesarias para la capacidad trans ormante de E6 y E7, específicamente la degradación de p53 y pRB . Específicamente, las fusiones de la presente invención no incluyen la degradación de p53 o Rb y, de esta manera, son más seguras que sus contrapartes no imitantes para el suministro a o la expresión en un paciente. La presente invención también describe el descubrimiento sorprendente que las fusiones de E7E6, esto es las fusiones en las cuales E6 es terminal carboxi para E7, tienen actividad inmunológica, incrementada en comparación con sus contrapartes de E6E7. En los ejemplos específicos, las proteínas de fusión E6E7 y ?7?6 de HPV16 se produjeron y se sometieron a prueba por su inmunogenicidad y respuestas anti - tumorales . Varias mutaciones puntuales se introdujeron en los genes de E6 y E7 para inactivar su potencial oncogénico, mientras que conservaban los epítopos de HLA conocidos. Las respuestas de CTL comparables para el epítopo de E749_57 restringido por H-2Db se observaron entre ratones inmunizados con 3 x 105 unidades infecciosas de VRPs que codifican para proteínas de fusión de tipo silvestre (wt, por sus siglas en inglés) o mutante. Todas las composiciones inmunógenas de VRP que expresan proteínas de fusión wt y mutantes erradicaron tumores de C3 establecidos en 7 días en 90% o más de los ratones. Además, las construcciones de fusión de E6E7 demostraron eficacia anti-tumoral en otros dos modelos de tumores positivos en E6E7. Específicamente, las VRPs de E7E6 TetM confirieron un rechazo completo del tumor en el modelo de tumor de HLF16. Las células epiteliales, primarias de mama de humano infectadas con VRPs que expresan genes de E6 y E7 mutantes, pero no de tipo silvestre, demostraron niveles normales tanto de proteínas p53 como de retinoblastoma . Las fusiones de E6E7 y E7E6 de la invención La presente invención proporciona polipéptidos de fusión de E6/E7 que comprenden múltiples mutaciones, tales como C24G, E26G y C91G en E7 y C63G y C106G en E6 (véase figuras 1A y IB) . Por ejemplo, los polipéptidos de fusión E6E7Tet y E7E6Tet comprenden las mutaciones C24G y E26G de E7 y las mutaciones C63G y C106G de E6, mientras que los polipéptidos de fusión E6E7PentM y E7E6PentM comprenden la mutación C91G de E7 además de las cuatro mutaciones presentes en los mutantes TetM. Estos polipéptidos de fusión mutados, ínter alia, pueden ser inestables. Aquellas personas expertas en el campo aprecian que las proteínas inestables, en comparación con las proteínas estables, tienen una capacidad incrementada para desarrollar respuestas de CTL. Aquellas personas expertas en el campo también apreciarán que las proteínas de fusión tienden a no plegarse apropiadamente y de esta manera son menos estables que sus contrapartes no fusionadas. De esta manera, las proteínas de fusión, tales como aquellas descritas en la presente invención, son más adecuadas para la producción de respuestas inmunes mediadas por células que sus contrapartes no fusionadas. Las proteínas de fusión E6E7 y E7E6 de HPV16 se produjeron y se sometieron a prueba por la inmunogenicidad y respuestas anti - tumorales . Diversas mutaciones puntuales se introdu eron en los genes de E6 y E7 para inactivar su potencial oncogénico, mientras que conservaban los epítopos de HLA conocidos. Antes de la presente invención no se sabía si las combinaciones ce las mutaciones sometidas a prueba en este texto destruirían la inmunogenicidad de los polipéptidos o. si estos polipéptidos mutados retendrían su inmunogenicidad. Las respuestas de CTL comprables para el epítopo de E749_57 restringido por H-2Db se observaron entre ratones inmunizados con 3 x 105 unidades infecciosas de VRPs que codifican para proteínas de fusión de tipo silvestre o mutantes . Todas las composiciones inmunógenas de VRP que expresan proteínas de fusión de tipo silvestre y mutante erradicaron los tumores de C3 establecidos en 7 días en 90% o más de los ratones. Además, las construcciones de fusión de E6/E7 demostraron eficacia anti-tumoral en otros dos modelos de tumores positivos en E6E7. La presente invención proporciona polipéptidos de fusión que comprenden E6 y E7, en los cuales E6 está ya sea en la terminación amino o en la terminación carboxi . Sin embargo, aquellas personas expertas en el campo reconocerán a partir de la presente descripción que las fusiones en las cuales E6 está en la terminal carboxi para E7 (fusiones de E7E6) , esto es E6 sigue a E7, tal como E7E6TetM y E7E6PentM, tendrán eficacia inmunológica, incrementada en comparación con las fusiones en las cuales E6 está en la terminal amino para E7 (fusiones de E6E7, tal como E6E7TetM y E6E7PentM) . Además, aquellas personas expertas en el campo reconocerán que las fusiones de E7E6, esto es las fusiones en las cuales E6 está en la terminal carboxi para E7, tendrán una actividad de E6 disminuida en comparación con las fusiones de E6E7. De esta manera, se esperará generalmente que las fusiones de E7E6 sean más seguras. Por consiguiente, las fusiones en las cuales E6 está en la terminal carboxi para E7 son una modalidad más preferida de la presente invención. La presente invención proporciona ejemplos de mutaciones particulares de nucleótidos y aminoácidos en posiciones que corresponden a C24, E26 y C91 de E7 de HPV16 y C63 y C106 de E6 de HPV16. Por ejemplo, la presente invención proporciona la cisteína 24 que es mutada a glicina (la mutación correspondiente de la secuencia de nucleótidos es CTG a CGG) . Estos ejemplos no son limitantes. Por ejemplo, se pueden utilizar mutaciones que den por resultado similarmente una interrupción de los dedos de zinc o la unión de Rb. Por ejemplo, las mutaciones en los residuos de cisteína que son importantes para la formación de dedos de zinc se pueden cambiar a cualquier otro aminoácido. Las mutaciones preferidas dan por resultado una desestabilización de la proteína y, de esta manera, un incremento en la inmunogenicidad de la proteín . En una modalidad específica de la invención, los polipéptidos son fusiones de E6 y E7 de HPV16 en las cuales el polipeptido de E7 tiene mutaciones en cualquier aminoácido que corresponde a las posiciones 24, 26 o 91 de la SEC ID NO: 14 y el polipéptido de E6 ya sea no tiene mutaciones o tiene mutaciones en uno o más de los aminoácidos correspondientes a las posiciones 63 o 106 de la SEC ID NO: 13. En una modalidad preferida de la invención, los polipéptidos son fusiones de E6 y E7 de HPV16 en las cuales el polipéptido de E7 tiene mutaciones en los aminoácidos que corresponden a las posiciones 24 y 26 de la SEC ID NO: 14 y el polipéptido de E6 tiene mutaciones seleccionadas del grupo que consiste de los aminoácidos que corresponden a las posiciones 63 o 106 de la SEC ID NO: 13 o ambos.

Se entiende en el campo que el número de aminoácidos es determinado al contar la metionina como el primer aminoácido, aun en el caso donde la primera metionina ha sido suprimida en la segunda de las proteínas de fusión. Por ejemplo, la mutación G24 de E6E7TetM (SEC ID NO: 3) se considera que está en el residuo 24 de E7 en el polipéptido. En otra modalidad preferida de la presente invención, los polinucleotidos son fusiones de los polinucleotidos de E6 y E7 de HPV16 en los cuales el polinucleótido de E6 tiene mutaciones en cualquiera de los nucleótidos 187-189 (lo cual corresponde a los nucleótidos 290-292 del genoma de HPV16 (número de acceso de GenBank K02718)) o 316-318 (lo cual corresponde los nucleótidos 419-421 del genoma de HPV16) y la secuencia de nucleótidos de E7 tiene mutaciones en cualquiera de los nucleótidos 70-72 (lo cual corresponde a los nucleótidos 631-633 del genoma de HPV16) , 76-78 (lo cual corresponde a los nucleótidos 637-639 del genoma de HPV16) o 271-273 (lo cual corresponde a los nucleótidos 832-834 del genoma de HPV16) . Estos cambios de nucleótidos dan por resultado mutaciones sin sentido contrarias, no mutaciones sin sentido. En otras palabras, estas mutaciones dan por resultado un aminoácido diferente que es codificado. La presente invención proporciona polipéptidos y composiciones inmunógenas y farmacéuticas que comprenden estos polipéptidos o que comprenden nucleótidos que codifican para estos polipéptidos. Como se describiera infra, estos polipéptidos y polinucleótidos se describen en las secuencias proporcionadas en este texto. Por ejemplo, el polipéptido E6E7TetM se describe en la SEC ID NO: 3. Aquellas personas expertas en el campo apreciarán que las secuencias de polipéptidos y polinucleótidos de esta invención no están limitadas a las secuencias exactas descritas en esta solicitud. Por ejemplo, las secuencias de E6 y E7 se obtuvieron para realizar la PCR del clon de ATCC #45113 de HPV16. Las secuencias de E6 y E7 de este clon de ATCC varían ligeramente de aquellas en la secuencia de HPV16 de GenBank, K02718. De esta manera, aquellas personas expertas en el campo apreciarán que la invención también comprende secuencias de aminoácidos y nucleótidos sustancialmente homologas o sustancialmente similares a aquellas descritas con la presente y que la combinación de las mutaciones descritas puede ocurrir en el fondo de cualquier secuencia de E6 o E7. Por ejemplo, estas mutaciones y cualquier número de combinaciones de estas mutaciones pueden estar en el contexto de las secuencias de E6 y E7 descritas en K02718. Aquellas personas expertas en el campo apreciarán que esta invención también se puede formular para los otros miembros de la familia del virus de papiloma además de HPV16. Otros genotipos del virus de papiloma asociados con el cáncer, en particular, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 y 68 tienen configuraciones conservadas en sus proteínas E6 y E7 que son probablemente centrales para su capacidad oncogénica (véase Fields Virology Cuarta Edición, 2001, C. 65 y 66, 2197-2265, Knipe & Howley Eds . , Lippincott Williams and Wilkins) . Notablemente, estas proteínas E6 y E7 tienen las configuraciones de dedos de zinc C-X-X-C y, para E7, una configuración de unión de Rb putativa L-X-C-X-E. De esta manera, una modalidad de la presente invención comprende polipéptidos de fusión de E6 y E7 y polinucleótidos de otros miembros de la familia del virus de papiloma, los cuales tienen mutaciones que corresponden a las mutaciones descritas en la presente invención. Los aminoácidos y nucleotidos que corresponden a las posiciones de los aminoácidos y nucleotidos particulares descritos en las SEC ID NOS: 1-12 se pueden determinar al realizar un alineamiento de secuencias. Los ejemplos de estos alineamientos de secuencias se muestran en las figuras 2A-E y 3A-C. En estas figuras, los aminoácidos de los polipéptidos de E6 y E7 de los HPVs 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 y 68 han sido alineados y se presentan las secuencias de consenso. La secuencia de aminoácidos de consenso de E6 es representada en la SEC ID NO: 39 y la secuencia de aminoácidos de consenso de E7 es representada en la SEC ID NO: 40. Estos alineamientos demuestran que cada una de las mutaciones sometidas a prueba en la presente invención son conservadas en cada uno de los virus HPV y, de esta manera, también pueden ser mutadas a fin de hacer deficiente su potencial oncogénico, mientras que se mantiene su capacidad para producir una respuesta inmune. Los aminoácidos que están involucrados en la formación de estructuras, tales como dedos de zinc y configuraciones de unión, se conservan frecuentemente. Por ejemplo, uno puede identificar y mutar los aminoácidos o nucleótidos conservados que corresponden a los aminoácidos 24, 26, y 91 de E7 de HPV16 y a los aminoácidos 63 o 106 de E6 de HPV16 en cada uno de los miembros de los genotipos de HPV. Por ejemplo, el alineamiento mostrado en las figuras 2A-E demuestra que el aminoácido de E6 de HPV18 que corresponde al aminoácido 63 de E6 de HPV16 (63C) también es un residuo de cisteína y que está en la posición 65 de E6 de HPV18. Por consiguiente, 66C de E6 de HPV18, además de otros residuos que corresponden a los aminoácidos 24, 26, y 91 de E7 de HPV16 y al aminoácido 106 de E6 de HPV16, puede ser mutado en la presente invención. De manera similar, las mutaciones en cualquier polipéptido de E6 de HPV que corresponda a los aminoácidos 65 o 108 de la secuencia de consenso de E6 (SEC ID NO: 39) o en cualquier polipéptido de E7 de HPV que corresponda a los aminoácidos 25, 27 o 97 de la secuencia de consenso de E7 (SEC ID NO: 40) se pueden hacer en la presente invención.

En una modalidad de la presente invención, los polipéptidos de fusión comprenden dos de estas mutaciones. En una modalidad adicional, estos polipéptidos de fusión comprenden tres de estas mutaciones. En otra modalidad, estos polipéptidos de fusión comprenden cuatro de estas mutaciones. En todavía otra modalidad, estos polipéptidos de fusión comprenden todas estas cinco mutaciones. Definiciones de Biología Molecular. De acuerdo con la presente invención, se pueden emplear técnicas convencionales de biología molecular, microbiología y ADN recombinante dentro de la experiencia en el campo. Estas técnicas son ejemplificadas completamente en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Sambrook, Fitsch and Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York (referida en este texto como "Sambrook y colaboradores, 1989") ; ADN Cloning: A Practical Approach, Volúmenes I y II (D. N. Glover ed. 1985) ; Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed. 1984) ; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames and S. J. Higgins, eds . 1984); Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed. 1986) ; Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, 1986) ; B. E. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); F. M. Ausubel y colaboradores (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994) . Los pol inucleótidos en este texto pueden ser flanqueados por secuencias reguladoras, naturales o se pueden asociar con secuencias heterólogas, inclusive promotores, intensificadores , elementos de respuesta, secuencias de señales, secuencias de poliadenilación, intrones, regiones no codificadoras 5' y 3' y similares. Los ácidos nucleicos también se pueden modificar por cualquier medio conocido en el campo. Los ejemplos no limitantes de estas modificaciones incluyen la mutilación, "extremos", sustitución de uno o más de los nucleótidos de origen natural (es decir, la optimización de codones de la base "oscilante" tercera o inicial) y modificaciones internucleótidos tales como, por ejemplo, aquellas con enlaces sin carga (por ejemplo, fosfonatos de metilo, fosfotriésteres , fosforoamidatos , carbamatos, etcétera) y con enlaces cargados (por ejemplo, fosforotioatos , fosforoditioatos , etcétera). Los polinucleotidos pueden contener una o más porciones enlazadas covalentemente , adicionales, tales como proteínas (por ejemplo, nucleasas, toxinas, anticuerpos, péptidos de señal, poli-L-lisina , etcétera), intercaladores (por ejemplo, acridina, psoralen, etcétera) formadores de quelatos (por ejemplo, metales, metales radioactivos, hierro, metales oxidantes, etcétera) y alquiladores por nombrar algunos. Los polinucléotidos se pueden derivatizar mediante la formación de un enlace de fosforotriéster de metilo o etilo o un enlace de fosforamidita de alquilo. Además, los polinucleotidos descritos en este texto también se pueden modificar con una etiqueta capaz de proporcionar una señal detectable, ya sea directa o indirectamente. Las etiquetas ejemplares incluyen radioisótopos, moléculas fluorescentes, biotina y similares. Otros ejemplos no limitantes de modificación que se pueden hacer se proporcionan, posteriormente, en la descripción de la presente invención. El término "gen", también llamado un "gen estructural", significa una secuencia de ADN que codifica o corresponde a una secuencia particular de aminoácidos que comprende todas o parte de una o más proteínas o enzimas y puede incluir o no secuencias de ADN regulador, tal como secuencias promotoras, las cuales determinan, por ejemplo, las condiciones bajo las cuales es expresado el gen. Algunos genes, los cuales no son genes estructurales, se pueden transcribir de ADN o ARN, pero no se pueden traducir en una secuencia de aminoácidos. Otros genes pueden funcionar como reguladores de genes estructurales o como reguladores de la transcripción de ADN. Una "secuencia de codificación" o una secuencia "que codifica" un polipéptido, proteína o enzima es una secuencia de nucleótidos que, cuando es expresada, da por resultado la producción de ese polipéptido, proteína o enzima, es decir, la secuencia de nucleótidos codifica una secuencia de aminoácidos para ese polipéptido, proteína o enzima. Preferiblemente, la secuencia de codificación es una secuencia de ARN que es traducida en un polipéptido dentro de una célula in vitro e in vivo cuando se coloca bajo el control de secuencias reguladoras, apropiadas. Los límites de la secuencia de codificación son determinados por un codón de inicio cerca de la terminación 5' y un codón de detención de traducción corriente abajo. Una secuencia de codificación puede incluir, pero no está limitada a, secuencias procarióticas , ADNc de ARNm eucariótico, secuencias de ADN genómico de ADN eucariótico (por ejemplo, de mamífero) y aun secuencias de ADN sintético. Si la secuencia de codificación está propuesta para la expresión en una célula eucariótica, una secuencia de señal de poliadenilación y terminación de transcripción se ubicará usualmente en la dirección 3' con respecto a la secuencia de codificación. Las secuencias de control de transcripción y traducción son secuencias reguladoras de ADN, tal como promotores, intensificadores , terminadores y similares, que proporcionan la expresión de una secuencia de codificación en una célula .hospedera. En células eucarióticas , las señales de poliadenilación son secuencias de control. Las "secuencias de control de expresión" son las secuencias de control de transcripción involucradas en el inicio de la transcripción, tal como promotores e intensificadores . Una "secuencia promotora" es una región reguladora de ADN capaz de unir la polimerasa de AR en una célula e iniciar la transcripción de una secuencia de codificación corriente abajo (dirección 3') . Para propósitos de definición de esta invención, la secuencia promotora está unida en su terminación 3' por el sitio de iniciación de la transcripción y se extiende corriente arriba (dirección 5') para incluir el número mínimo de bases o elementos necesarios para iniciar la transcripción a niveles detectables sobre el fondo. Como se describiera anteriormente, el ADN promotor es una secuencia de ADN que inicia, regula o de otra manera media o controla la expresión del ADN codifican párate. La "amplificación" de un polinucleótido, como se utiliza en este texto, representa el uso de la reacción en cadena de polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) para incrementar la concentración de una secuencia de ADN particular dentro de una mezcla de secuencias de ADN. Para una descripción de la PCR véase Saiki y colaboradores, Science 1988, 239:487. Los términos "expresar" y "expresión" significan permitir o causar que se manifieste la información en un gen o secuencia de ADN, por ejemplo produciendo una proteína al activar las funciones celulares involucradas en la transcripción y traducción de un gen o secuencia de ADN correspondiente. Una secuencia de ADN es expresada en o por medio de una célula para formar un "producto de expresión" , tal como una proteína. También se puede decir que el producto de expresión mismo, por ejemplo la proteína resultante, es "expresado" por la célula. Un polinucleótido o polipéptido es expresado recombinantemente , por ejemplo, cuando es expresado o producido en una célula hospedera, extraña bajo el control de un promotor extraño o nativo, o en una célula hospedera, nativa bajo el control de un promotor extraño. El término "transíección" significa la introducción de un ácido nucleico extraño dentro de una célula. El término "transformación" significa la introducción de un gen, secuencia de ADN o ARN, "extraño" (es decir extrínseco o extracelular) a una célula hospedera, de manera que la célula hospedera expresará el gen o secuencia introducido para producir una sustancia deseada, típicamente una proteína o enzima codificada por el gen o secuencia introducido. El gen o secuencia introducido, el cual también puede ser llamado un gen o secuencia "clonado" o "extraño" , puede incluir secuencias reguladoras o de control, tales como secuencias de inicio, de detención, promotoras, de señal, de secreción u otras secuencias utilizadas por la maquinaria genética de la célula. El gen o secuencia puede incluir secuencias no funcionales o secuencias sin función conocida. Una célula hospedera que recibe y expresa el ADN o ARN introducido ha sido "transformada" y es un "trans ormante" o un "clon" . El ADN o ARN introducido a una célula hospedera puede venir de cualquier fuente, inclusive células del mismo género o especie como la célula hospedera, o células de diferente género o especie . Los términos "vector" y "vector de expresión" significan el vehículo mediante el cual se puede introducir una secuencia de ADN o ARN (por ejemplo, un gen extraño) en una célula hospedera, para transformar el hospedante y promover la expresión de un polipéptido (por ejemplo, transcripción y traducción) de la secuencia introducida. Los vectores comprenden típicamente el ADN de un agente transmisible, dentro del cual se inserta el ADN extraño. Una manera común para insertar un segmento de ADN dentro de otro segmento de ADN involucra el uso de enzimas llamadas enzimas de restricción para escindir el ADN en sitios específicos (grupos específicos de nucleótidos) llamados sitios de restricción. Generalmente, el ADN extraño es insertado en uno o más sitios de restricción del vector de ADN y, entonces, es llevado por el vector dentro de una célula hospedera junto con el ADN del vector transmisible. Un segmento o secuencia de ADN que tiene insertado o adicionado el ADN, tal como un vector de expresión, también puede ser llamado una "construcción de ADN" . Un tipo común de vector es un "plásmido", el cual es generalmente una molécula autónoma del ADN de doble cadena. Un plásmido puede aceptar fácilmente el ADN adicional (extraño) y el cual puede introducirse fácilmente en una célula hospedera, adecuada. Un vector de plásmido contiene frecuentemente ADN codifican párate y ADN promotor y tiene uno o más sitios de restricción adecuados para la inserción de ADN extraño. El ADN promotor y el ADN codifican párate pueden ser del mismo género o de diferentes géneros y pueden ser de los mismos o diferentes organismos. Un gran número de vectores, inclusive vectores de plásmidos y fúngales, se han descrito para la réplica y/o expresión en una variedad de hospedantes eucarióticos y procarióticos . Los ejemplos no limitantes incluyen plásmidos pKK (Clontech) , plásmidos pUC, plásmidos pET (Novagen, Inc., Madison, WI) , plásmidos pRSET o pREP (Invitrogen, San Diego, CA) o plásmidos pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) y muchas células hospedantes, apropiadas, utilizando métodos descritos o citados en este texto o de otra manera conocidos para aquellas personas expertas en el campo relevante. Los vectores de clonación recombinantes incluirán frecuentemente uno o más sistemas de réplica para la clonación o expresión, uno o más marcadores para la selección en el hospedante, por ejemplo resistencia a antibióticos y uno o más casetes de expresión. La experimentación de rutina en la biotecnología se puede utilizar para determinar que vectores de clonación son más adecuados para el uso con la invención. En general, la selección del vector de clonación depende del tamaño de la secuencia de polinucleotidos y las células hospedantes que se utilicen. Un "polipéptido" es una cadena de bloques de construcción química llamados aminoácidos que son enlazados conjuntamente por uniones químicas llamadas "uniones peptídicas" . El término "proteína" se refiere a polipéptidos que contienen los residuos de aminoácidos codificados por un gen o por una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, un ARMm o un ADNc) transcrita de ese gen ya sea directa o indirectamente. Opcionalmente, una proteína puede carecer de ciertos residuos de aminoácidos que son codificados por un gen o por un AR m. Una proteína o polipéptido, inclusive una enzima, puede ser "nativa" o "de tipo silvestre", lo que significa que se encuentra en la naturaleza; o puede ser "mutante" , "variante" o "modificada", lo que significa que se ha hecho, alterado o derivado o es diferente de alguna manera o está cambiada de una proteína nativa o de otra mutante. La "mutación" significa cualquier proceso o mecanismo que da por resultado una proteína, enzima, polipéptido, polinucleótido, gen o célula mutante. Esto incluye cualquier mutación en la cual una secuencia de proteína, enzima, polinucleótido o gen es alterada y cualquier cambio detectable en una célula que surge de esta mutación. La proteína, enzima, polipéptido o polinucleótido alterado es un "mutante", también llamado "variante". Típicamente, una mutación ocurre en una secuencia de pol inucleótido o gen, mediante mutaciones puntuales (sustituciones) , supresiones o inserciones de residuos de nucleotidos individuales o múltiples. Una mutación incluye alteraciones de polinucleótidos que surgen dentro de una región de codificación de proteínas de un gen así como también alteraciones en regiones fuera de una secuencia de codificación de proteínas, tal como, pero no limitado a, secuencias reguladoras o promotoras. Una mutación en un gen puede ser "taciturna", es decir no reflejada en la alteración de aminoácidos con la expresión, lo que conduce a una variante "conservadora de la secuencia" del gen. Esto surge generalmente cuando un aminoácido corresponde a más de un codón. La tabla 1 resume que aminoácidos corresponden a que codon ( es ) . De esta manera, debido a la degeneración del código genético, cualquier codón de tres nucleotidos que codifique un residuo de aminoácido mutado de un polipéptido de fusión de E6/E7 descrito en este texto está dentro del alcance de la invención . Los términos "mutante" y "variante" también se pueden utilizar para indicar un gen, secuencia de ADN o AR , enzima, célula, etcétera, modificado o alterado, es decir, cualquier clase de mutante. Estos cambios también incluyen cambios en el promotor, sitio de unión de ribosoma, etcétera.

El término "secuencias de aminoácidos variantes" se refiere a otros polipéptidos de fusión de E6 y E7 adecuados los cuales pueden diferir de los polipéptidos de fusión de E6 y E7 e emplificados específicamente por modificaciones que no disminuyen la imunogenicidad. En la elaboración de estos ¦ cambios, se puede considerar el índice hidropático de los aminoácidos. La importancia del índice hidropático de los aminoácidos en conferir una función biológica, interactiva sobre un polipéptido es entendida generalmente en el campo (Kyte y Doolittle, 1982). Se sabe que ciertos aminoácidos pueden ser sustituidos por otros aminoácidos que tienen un índice hidropático similar o estimación y aún dan por resultado un polipéptido con actividad biológica similar. A cada aminoácido se ha asignado un índice hidropático en base a su hidrofobicidad y características de carga. Estos índices son: isoleucina (+4.5); valina (+4.2); leucina (+3.8); fenilalanina (+2.8); cisteína/cistina (+2.5); metionina (+1.9); alanina (+1.8); glicina (-0.4); treonina (-0.7); serina (-0.8); triptófano (-0.9); tirosina (-1.3); prolina (- 1.6); histidina (-3.2); glutamato (-3.5); glutamina (-3.5); aspartato (-3.5) ; asparagina (-3.5) ; lisina (-3.9) ; y arginina (-4.5) . Se cree que el carácter hidropático, relativo del residuo de aminoácido determina la estructura secundaria y terciaria del polipéptido resultante, lo cual a su vez define la interacción del polipéptido con otras moléculas, tales como enzimas, substratos, receptores, anticuerpos, antígenos y similares. Se sabe en el campo que un aminoácido puede ser sustituido por otro aminoácido que tenga un índice hidropático, similar y todavía obtener un polipéptido funcionalmente equivalente. En .estos cambios, se prefiere la sustitución de aminoácidos cuyo índice hidropático está dentro de +/-2, aquellos dentro de +/-1 son particularmente preferidos y aquellos dentro de +/-0.5 son aún más particularmente preferidos. La sustitución de aminoácidos similares también se puede hacer en base a la hidrofilicidad, particularmente donde el polipéptido o péptido equivalente, biológicamente funcional creado con lo cual está propuesto para el uso en las modalidades imunológicas . La patente norteamericana No. 4,554,101, incorporada en este texto a manera de referencia, establece que la hidrofilicidad promedio, local, más grande de un polipéptido, gobernada por la hidrofilicidad de sus aminoácidos adyacentes, se correlaciona con su imunogenicidad y antigenicidad, es decir con una propiedad biológica del pol ipépt ido . Como se detalla en la patente norteamericana No. 4,554,101, lo siguientes valores de hidrofilicidad han sido asignados a residuos de aminoácidos: arginina (+3.0); lisina (+3.0); aspartato (+3.0+/-1); glutamato (+3.0+/-1); serina (+0.3); asparagina (+0.2); glutamina (+0.2); glicina (0); prolina (-0.5+/-1); treonina (-0.4); alanina (-0.5); histidina (-0.5); cisteína (-1.0); metionina (-1.3); valina (-1.5); leucina (-1.8); isoleucina (-1.8); tirosina (-2.3); fenilalanina (-2.5); triptófano (-3.4). Se entiende que un aminoácido puede ser sustituido por otro que tenga que un valor de hidrofilicidad similar y todavía se puede obtener un polipéptido biológicamente equivalente, y en particular, un polipéptido imunológicamente equivalente. En estos cambios, se prefiere la sustitución de los aminoácidos cuyos valores de hidrofilicidad están dentro de +/-2; aquellos dentro de +/-1 son particularmente preferidos; y aquellos dentro de +/-0.5 son aún más particularmente preferidos. Como se resume anteriormente, las sustituciones de aminoácidos se basan generalmente en la similitud relativa de los sustituyentes de cadena lateral de aminoácidos, por ejemplo, su hidrofobicidad, hidrofilicidad, carga, tamaño y similares. Las sustituciones ejemplares que toman en consideración varias de las características anteriores son bien conocidas para aquellas personas expertas en el campo e incluyen: arginina y lisina; glutamato y aspartato; serina y treonina; glutamina y asparagina; y valina, leucina e isoleucina . Las "variantes conservadoras de la función" son proteínas o enzimas en las cuales un residuo de aminoácido dado ha sido cambiado sin alterar la conformación estructural, total y la función especificada de la proteina o enzima. Esto incluye, pero no está limitado a, el reemplazo de un aminoácido con uno que tenga propiedades estructurales o físicas, similares, que incluyen un carácter polar o no polar, tamaño, forma y carga (véase, por ejemplo, la tabla 1) . TABLA 1 Aminoácidos, Codones Correspondientes y Funcionalidad/Propiedad Aminoácido SLC Codones de ADN Propiedad de la cadena lateral Isoleucina 1 ATT, ATC, ATA Hidrófoba Leucina L CTT, CTC, CTA, CTG, TTA, TTG Hidrófoba Valina V GTT, GTC, GTA, GTG Hidrófoba Fenilalanina F TTT, TTC Cadena lateral aromática Metionina M ATG Grupo azufre Cisteína C TGT, TGC Grupo azufre Alanina A GCT, GCC, GCA, GCG Hidrófoba Glicina G GGT, GGC, GGA, GGG Hidrófoba Prolina P CCT, CCC, CCA, CCG Amina secundaria Treonina T ACT, ACC, ACA, ACG Hidroxilo alifático Serina s TCT, TCC, TCA, TCG, AGT, AGC Hidroxilo alifático Tirosina T TAT, TAC Cadena lateral aromática Triptófano w TGG Cadena lateral aromática Glutamina Q CAA, CAG Grupo amida Asparagina N AAT, AAC Grupo amida Histidina H CAT, CAC Cadena lateral básica Acido glutámico E GAA, GAG Cadena lateral acida Acido aspártico D GAT, GAC Cadena lateral acida Lisina K AAA, AAG Cadena lateral básica Arginina R CGT, CGC, CGA, CGG, AGA, AGG Cadena lateral básica Codones de DetenTAA.TAG.TGA - detención ción Como es referido en este texto, la "similitud de secuencias" significa el grado al cual están relacionadas las secuencias de nucleótidos o proteínas. El grado de similitud entre dos secuencias se puede basar en el porcentaje de identidad de secuencia y/o la conservación. Los aminoácidos diferentes de aquellos indicados como conservados pueden diferir en una proteína o enzima de manera que el porcentaje de similitud de secuencias de proteínas o aminoácidos entre cualquier de par de proteínas de función similar puede variar y puede ser, por ejemplo, al menos 70%, aún más preferiblemente 80% y mucho más preferiblemente al menos 90%, determinado de acuerdo con un esquema de alineamiento. La "identidad de secuencias" significa en este texto el grado al cual dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos son invariantes. Dos secuencias de ADN son sustancialmente homologas o sustancialmente similares cuando al menos aproximadamente 80%, y mucho más preferiblemente al menos 90 o 95%, de los nucleótidos son iguales sobre la longitud definida de las secuencias de ADN, determinado por algoritmos de comparación de secuencias, tales como 3LAST, FASTA, ADN Strider, etcétera.

Un ejemplo de esta secuencia es una variante alélica o de especie de los genes específicos de la invención. Las secuencias que son sustancialmente homologas se pueden identificar al comparar las secuencias utilizando un equipo para computadora estándar que está disponible en bancos de datos de secuencias o en un experimento de hibridación Southern bajo, por ejemplo, condiciones severas que son definidas para ese sistema particular. De manera similar, dos secuencias de aminoácidos son sustancialmente homologas o sustancialmente similares cuando más de 80% de los aminoácidos son idénticos o más de aproximadamente 90% son similares. Preferiblemente, las secuencias similares u homologas son identificadas mediante el alineamiento de secuencias. Las "variantes conservadoras de secuencias" de una secuencia de pol inucleótido son aquellas en las cuales un cambio de uno o más nucleótidos dentro de un codón dado da por resultado la no alteración en el aminoácido codificado por ese codón . El "alineamiento de secuencias" significa el proceso de alinear dos o más secuencias para lograr niveles máximos de identidad de secuencia (y, en el caso de las secuencias de aminoácidos, la conservación) , por ejemplo, con el propósito de valorar el grado de similitud de secuencias. Los numerosos métodos para alinear secuencias y para valorar la similitud y/o identidad son conocidos en el campo, tales como, por ejemplo, el método Cluster, en donde la similitud se basa en el algoritmo MEGALIGN, así como también BLASTN, BLASTP y FASTA (Lipman y Pearson, 1985; Pearson and Lipman, 1988) . Cuando se utilizan todos estos programas, los ajustes preferidos son aquellos que dan por resultado la similitud de secuencias más alta . El término "heterólogo" se refiere a una combinación de elementos de origen no natural. Por ejemplo, el ADN heterólogo se refiere al ADN que no está localizado naturalmente en la célula o en un sitio cromosómico de la célula. Preferiblemente, el ADN heterólogo incluye un gen extraño para la célula. Un elemento regulador de expresión, heterólogo es un elemento regulador que está asociado de manera operativa con un gen diferente de aquel que está asociado operativamente en la naturaleza. Las modificaciones, que no alteran normalmente la secuencia primaria de los polipéptidos de fusión de E6 y E7, incluyen la derivación química in vivo o in vitro de polipéptidos, por ejemplo, acetilación, metilación o carboxilación . También están incluidos como polipéptidos variantes de esta invención aquellos polipéptidos modificados por glicosilación, por ejemplo, aquellos hechos al modificar los patrones de glicosilación de un polipéptido durante su síntesis y procesamiento o en pasos de procesamiento adicionales; o al exponer el polipeptido a enzimas que afectan la glicosilación, tales como las enzimas de glicosilación o desglicosilación de mamíferos. También están incluidas como polipéptidos variantes las secuencias mutagenizadas que se identificaron anteriormente, las cuales tienen residuos de aminoácidos fosforilados , por ejemplo, fosfotirosin , fosfoserina o fosfotreonina . El término "célula hospedera" significa cualquier célula de cualquier organismo que se selecciona, modifica, transforma, desarrolla o utiliza o manipula de alguna manera, para la producción de una sustancia por la célula, por ejemplo, la expresión por la célula de un gen, una secuencia de ADN o ARN, una proteína o una enzima. Como se utiliza en este texto, el término "aislado" significa que el material referido es removido del ambiente en el cual se encuentra normalmente. De esta manera, un material biológico, aislado puede estar libre de componentes celulares, es decir, componentes de las células en los cuales se encuentra o produce el material. En el caso de moléculas de ácido nucleico, un ácido nucleico aislado incluye un producto de PCR, un AR m aislado, un ADNc o un fragmento de restricción. En otra modalidad, un ácido nucleico aislado es escindido preferiblemente del cromosoma en el cual se puede encontrar y más preferiblemente no está unido más tiempo a regiones no codificadoras, no reguladoras u otros genes, localizados corriente arriba o corriente abajo del gen contenido por la molécula de ácido nucleico aislado cuando se encuentra en el cromosoma. En todavía otra modalidad, el ácido nucleico aislado carece de uno o más intrones. Las moléculas de ácido nucleico aislado incluyen secuencias insertadas en plásmidos, cósmidos, cromosomas artificiales y similares. De esta manera, en una modalidad específica, un ácido nucleico, recombinante es un ácido nucleico, aislado. Una proteína aislada puede estar asociada con otras proteínas o ácidos nucleicos, o ambos, con los cuales se asocia en la célula, o con membranas celulares si es una proteína asociada con la membrana. Un organelo, célula o tejido aislado es removido del sitio anatómico en el cual se encuentra en un organismo. Un material aislado se puede purificar, pero no es necesario. El término "purificado" utilizado en este texto se refiere a un material que ha sido aislado bajo condiciones que reducen o eliminan la presencia de materiales no relacionados, es decir contaminantes que incluyen materiales nativos de los cuales se obtiene el material. Por ejemplo, una proteína purificada está sustancialmente libre de manera preferible de otras proteínas o ácidos nucleicos con los cuales está asociada en una célula; una molécula de ácido nucleico purificada está sustancialmente libre de manera preferible de proteínas u otras moléculas de ácido nucleico no relacionadas con las cuales se puede encontrar dentro de una célula. Como se utiliza en este texto, el término "sustancialmente libre" se utiliza operacionalmente , en el contexto de la prueba analítica del material. Preferiblemente, el material purificado sustancialmente libre de contaminantes es al menos 50% puro; más preferiblemente, al menos 90% puro, y más preferiblemente todavía al menos 99% puro. La pureza se puede evaluar mediante la cromatografía, electrofóresis de gel, imunoensayo, análisis de composición, ensayo biológico y otros métodos conocidos en el campo. Los métodos para la purificación son conocidos en el campo. Por ejemplo, los ácidos nucleicos se pueden purificar mediante la precipitación, cromatografía (que incluye la cromatografía de fase sólida, preparativa, hibridización de oligonucleótidos y cromatografía de triple hélice) , ultracentrifugación y otros medios. Los polipéptidos y proteínas se pueden purificar por diversos métodos que incluyen, sin limitación, la electrofóresis de disco de gel preparativa, el enfoque isoeléctrico, CLA , CLAR de fase inversa, de permeación sobre gel, intercambio iónico y cromatografía de partición, cromatografía de precipitación y salificación, extracción y distribución en contracorriente. Para algunos propósitos, es preferible producir el polipéptido en un sistema recombinante en el cual la proteína contiene una etiqueta de secuencia adicional que facilita la purificación, tal como, pero no limitado a, una secuencia de polihistidina o una secuencia que se une específ camente a un anticuerpo, tal como FLAG y GST . El polipéptido entonces se puede purificar de un lisado crudo de la célula hospedera mediante la cromatografía en una matriz de fase sólida, apropiada. Alternativamente, los anticuerpos producidos contra la proteína o contra péptidos derivados de la misma se pueden utilizar como reactivos de purificación. Las células se pueden purificar mediante varias técnicas que incluyen la centrifugación, separación de matriz (por ejemplo, separación de nilón-lana), técnicas de selección y aislamiento y otras técnicas de inmunoselección, depleción (por ejemplo, depleción de complementos de células contaminantes) y clasificación de células (por ejemplo, clasificación de células activadas con fluorescencia [FACS, por sus siglas en inglés] ) . Otros métodos de purificación son posibles. Un material purificado puede contener menos de aproximadamente 50%, preferiblemente menos de aproximadamente 75% y mucho más preferiblemente menos de aproximadamente 90%, de los componentes celulares con los cuales se asoció originalmente. El término "sustancialmente puro" indica el grado más alto de pureza que se puede lograr utilizando las técnicas de purificación convencionales que son conocidas en el campo. Los polinucleótidos son "hibridizables" entre sí cuando al menos una cadena de un polinucleótido se puede hibridizar a otro polinucleótido bajo condiciones de severidad definidas. La severidad de la hibridización se determina, por ejemplo, por la temperatura a la cual se realiza la hibridización y/o lavado y b) la intensidad iónica y polaridad (por ejemplo formamida) de la hibridización y soluciones de lavado, así como también otros parámetros. La hibridización requiere que los dos polinucleótidos contengan secuencias sustancialmente complementarias; sin embargo, dependiendo de la severidad de la hibridización, se pueden tolerar desigualdades. Típicamente, la hibridización de dos secuencias a una severidad alta (tal como, por ejemplo, en una solución acuosa de 0.5xSSC a 65°C) requiere que las secuencias exhiban algún grado de complementariedad sobre su secuencia completa. Las condiciones de severidad intermedia (tal como, por ejemplo, una solución acuosa de 2xSSC a 65°C) y baja severidad (tal como, por ejemplo, una solución acuosa de 2xSSC a 55°C) , requieren correspondientemente menos complementariedad total entre las secuencias hibridizantes . (1XSSC es NaCl 0.15 M, citrato de Na 0.015 M) . Los polinucleótidos que "se hibridizan" con los polinucleótidos de este texto pueden ser de cualquier longitud. En una modalidad, estos polinucleótidos tienen una longitud de la menos 10, preferiblemente al menos 15 y mucho más preferiblemente al menos 20 nucleótidos . En otra modalidad, los polinucleótidos que se hibridizan son de aproximadamente la misma longitud. En otra modalidad, los polinucleótidos que se hibridizan incluyen aquellos que se hibridizan bajo condiciones de severidad adecuadas y los cuales codifican para polipéptidos o enzimas que tienen la misma función, tal como la capacidad para unirse a p53 (en el caso de E6) o unirse a Rb (en el caso de E7) . Las herramientas de ingeniería genética generales y las técnicas descritas en este texto, inclusive la transformación y expresión, el uso de células hospedantes, vectores, sistemas de expresión, etcétera, son bien conocidos en el campo. Como se utiliza en este texto, el término "alrededor de" o "aproximadamente" significa dentro de 50% de un valor dado, preferiblemente dentro de 20%, más preferiblemente dentro de 10%, más preferiblemente todavía dentro de 5% y mucho más preferiblemente dentro de 1% de un valor dado. Alternativamente, el término "alrededor de" o "aproximadamente" significa que un valor puede encontrarse dentro de un rango de error científicamente aceptable para ese tipo de valor, el cual dependerá de que cualitativa se pueda dar una medida por las herramientas disponibles. "Alrededor de" o "aproximadamente" pueden definir una distribución alrededor de un valor promedio, preferiblemente que un valor individual . Las composiciones inmunógenas y farmacéuticas de invención La presente invención proporciona composiciones inmunógenas y farmacéuticas que comprenden polipéptidos de fusión y pol inucleotidos' de las proteínas E6 y E7 del virus de papiloma humano. Estas composiciones se pueden utilizar para tratar y/o prevenir canceres inducidos por el virus de papiloma, tales como cáncer cervical y lesiones cervicales tales como CIN. Estas composiciones también se pueden utilizar para tratar canceres del tracto gastrointestinal inferior, tales como cáncer de ano, y otros canceres del sistema reproductivo, tal como cáncer peneal y vulvar. En una modalidad adicional, la presente invención proporciona composiciones inmunógenas y farmacéuticas que comprenden fusiones de polipéptidos y fusiones de pol inucleotidos de múltiples virus de papiloma. Por ejemplo, la presente invención proporciona composiciones inmunógenas y farmacéuticas que comprenden fusiones de las proteínas E6 y E7 de múltiples miembros de la familia de HPV, tales como HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 y 68. Los ejemplos de polipéptidos de E6 de HPV se muestran en las figuras 2A-E y las secuencias de aminoácidos de E6 de HPV 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 y 68 se exponen en las SEC ID NOS: 15-26, respectivamente. Las secuencias de nucleótidos que codifican para estos polipéptidos de E6 de HPV se exponen en las SEC ID NOS: 42-53, respectivamente. Los ejemplos de polipéptidos de E7 de HPV se muestran en las figuras 3A-C y las secuencias de aminoácidos de E7 de HPV 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 y 68 se exponen en las SEC ID NOS: 27-38, respectivamente. Las secuencias de nucleótidos que codifican para estos polipéptidos de E7 de HPV se exponen en las SEC ID NOS : 54-65, respectivamente. Estas fusiones contienen mutaciones en los residuos identificados mediante el alineamiento para corresponder a los residuos matados en HPV 16 descrito en este texto y que corresponden a las secuencias conservadas que se muestran en las secuencias de consenso de E6 y E7 (SEC ID NOS: 39 y 40, respectivamente) que interfieren con las características oncogénicas de la proteína sin interferir con su capacidad para inducir una respuesta inmune. En una modalidad de la presente invención, las composiciones inmunógenas y farmacéuticas comprenden una fusión que comprende los polipéptidos de E6 y E7 de diferentes miembros de la familia del virus de papiloma. Por ejemplo, una fusión puede comprender una construcción individual de cualquier combinación posible de E6 y E7 de HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 y 68. El número de polipéptidos de ?6/?7 presentes en una fusión es limitado únicamente por las limitaciones de tamaño del mecanismo de suministro o vector en el cual se suministran estas composiciones. Por ejemplo, los virus, restringidos por limitaciones estructurales, solo puede empacar una cantidad particular de ácido nucleico. Aquellas personas de experiencia ordinaria en el campo apreciarán la capacidad de diferentes virus para empacar ácido nucleico y apreciarán que es una rutina el examinar los ácidos nucleicos que son de tamaño apropiado para el empaque. Alternativamente, las composiciones inmunógenas y farmacéuticas de la presente invención pueden comprender múltiples funciones diferentes de E6/E7. Por ejemplo,- la composición inmunógena o farmacéutica puede comprender múltiples partículas virales, cada una que contiene diferentes funciones de las secuencias de E6 y E7 de diferentes virus de papiloma . Las composiciones inmunógenas y farmacéuticas que comprenden fusiones de E6/E7 de múltiples virus de papiloma son particularmente ventajosas debido a que generan una respuesta inmune a múltiples proteínas E6 y E7 y, de esta manera, impiden canceres y neoplasias causados por cada uno de estos virus. Por ejemplo, cada uno de HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 y 68 ha sido asociado con el carcinoma cervical y/o neoplasias intraepiteliales (Harrison's Principies of Infernal Medicine Fifteenth Edition, 2001, 1119; Braunwald y colaboradores, Eds . , McGraw-Hill) . De esta manera, una fusión de, por ejemplo, los polipéptidos de E6 y E7 de HPV 16 y 18 proporcionarían la prevención y tratamiento de canceres de dos diferentes etiologías. Las composiciones que comprenden polipéptidos de E6 y E7 de múltiples virus diferentes son un medio particularmente poderoso para tratar y/o prevenir un amplio rango de canceres inducidos el virus de papiloma, tales como cáncer cervical, lesiones cervicales tales como CIN, canceres del tracto gastrointestinal inferior, tal como cáncer anal y otros canceres del sistema reproductivo, tal como cáncer peneal y vulvar. El artífice experto apreciará los métodos para determinar la seguridad de las composiciones inmunógenas . Los métodos ejemplares para determinar si, por ejemplo, las fusiones de E6/E7 han disminuido o anulado la capacidad de transformación e inmortalización incluyen: determinar los niveles de p53 y/o Rb mediante, por ejemplo, el análisis de inmunotransferencia Western, ensayos de agar suave, la transfección de queratinocitos primarios o células epiteliales de mama e identificación de la pérdida de secuencia y la transfección de células e identificación de los cambios en la morfología de las células. Además de estos ensayos funcionales, se pueden utilizar ensayos bioquímicos. Por ejemplo, se puede medir la unión de E6 y E7 a proteínas celulares, tales como p53, TP-1 de E6, telomerasa y Rb. La valoración de los niveles de p53 y Rb es un método para determinar la seguridad de las partículas virales, recombinantes , tales como VEE, que comprenden de fusiones de E6/E7. Los niveles ya establecidos de p53 y Rb en MSCs primarias de humano se valoró si después de la infección con las proteínas E6 y E7 de HPV16 de tipo silvestre que expresan VRP, como proteínas de fusión o individuales, proteína de fusión E7E6 TetM o GFP como un control negativo. La infección con VRP de MECs reveló niveles excesivamente reducidos de p53 y Rb en cultivos que contenían formas de tipo silvestre de E6 y E7, respectivamente; la fusión simple de E7 a E6 no fue suficiente para deteriorar la actividad de cualquier proteína (figuras 8A y B) . En contraste, las MECs infectadas con VRPs de E7E6 TetM que contenían mutaciones de E6 (63C y 1CSC) y E7 (24C y 26E) contuvieron niveles normales de p53 y Rb (figuras 8A y B) , lo que indica que estas cuatro mutaciones extinguieron la actividad oncogénica, primaria de estas proteínas . Debido a que la erradicación de los tumores establecidos requiere la inducción de una respuesta inmune, fuerte mediada por células T contra los antígenos virales específicos para tumores E6 y E7, los replicones de encefalitis equina de Venezuela (VEE) se seleccionaron como el vector de la composición inmunógena. Sin embargo, se puede utilizar cualquier método de suministro de genes o proteínas para suministrar y empacar las composiciones inmunógenas de la presente invención. Por ejemplo, se pueden utilizar otros vectores virales que son conocidos para aquellas personas expertas en el campo o los nucleótidos que codifican para los polipéptidos de fusión mutantes se pueden suministrar directamente por un plásmido. Los vectores de AV recombinantes , de los cuales el vector de VEE es un miembro, son particularmente versátiles debido a que se pueden lanzar como ARN desnudo, ADN de plásmido desnudo o como partículas, con las últimas que son la formulación más efectiva para el uso en composiciones inmunógenas. Una propiedad distintiva de VRPs en contraste con los otros replicones de AV es su tropismo para células dendríticas (Macdonald, G. H. y colaboradores, "J Virol 2000, 74:914-922). Las células dendríticas fijadas como objetivo por VRP pueden ser vehículos altamente efectivos para transportar un antígeno en los nodos linfáticos y pueden ser una estrategia efectiva para el ahorro de dosis. Las composiciones inmunógenas, particularmente los ácidos nucleicos, de la presente invención se pueden suministrar por vía de vectores virales, tales como lentivirus, retrovirus, virus de herpes, adenovirus, virus adeno-asociados , virus vaccinia, baculovirus, alfavirus y otros virus recombinantes con un tropismo celular, deseable. Una amplia variedad de alfavirus se pueden utilizar como vectores virales, que incluyen, por ejemplo, vectores de virus Sindbis, virus del bosque Semliki (ATCC VR 67; ATCC VR 1247) , virus del río Ross (ATCC VR 373; ATCC VR 1246) y virus de encefalitis de equino de Venezuela (ATCC VR 923; ATCC VR 1250; ATCC VR 1249; ATCC VR 532) . Los ejemplos representativos de estos sistemas de vectores incluyen aquellos descritos en las patentes norteamericanas Nos. 5,091,309; 5,217,879; y 5,185,440; y las publicaciones de patente internacionales Nos. WO 92/10578; WO 94/21792; WO 95/27069; WO 95/27044; y WO 95/07994. La fijación de objetivos en regiones específicas de las células también se proporciona, por ejemplo, la fijación como objetivo de manera que el pclipéptido de fusión esté localizado en la membrana celular, como se describe en la patente norteamericana No. 6,228,621. De esta manera, un gen que codifica una fusión de polipéptidos de E6/E7 se puede introducir in vivo, ex vivo o in vitro utilizando un vector viral o a través de la introducción directa de un ácido nucleico, tal como un ADN o ARN de replicón. La expresión en tejidos fijados como objetivo se puede efectuar al fijar como objetivo el vector recombinante en células específicas, tal como con un vector viral o un ligando de receptor o mediante el uso de un promotor específico del tejido, o ambos. El suministro de genes fijados como objetivo se describe en la publicación de patente internacional WO 95/28494. Los vectores virales utilizados comúnmente para la fijación como objetivo in vivo o ex vivo y los procedimientos de terapia son vectores a base ADN y vectores retrovirales . Los métodos para construir y utilizar vectores virales son conocidos en el campo (véase, por ejemplo, Miller y Rosman, BioTechniques 1992, 7:980-990). Preferiblemente, los vectores virales son defectuosos para la réplica, esto es, no son estables para duplicarse de manera autónoma en la célula objetivo. En general, los genomas de los vectores virales defectuosos para la réplica que se utilizan dentro del alcance de la presente invención carecen de al menos una región que es necesaria para la réplica del virus en la célula infectada. Estas regiones pueden ser ya sea eliminadas (por completo o en parte) o se pueden volver no funcionales por cualquier técnica conocida para una persona experta en el campo. Estas técnicas incluyen la supresión total, sustitución (por otras secuencias, en particular por el ácido nucleico insertado) , supresión parcial o adición de una o más bases a una región esencial (para la réplica) (para causar un cambio de estructura). Estas técnicas se pueden realizar in vitro (en el ADN aislado) o in situ, utilizando las técnicas de manipulación genética o mediante el tratamiento con agentes mutagénicos. Preferiblemente, el virus defectuoso para la réplica retiene las secuencias de su genoma que son necesarias para la encapsidacion de las partículas virales. Los vectores virales incluyen un virus de ADN o ARN atenuado o defectuoso, tal como, pero no limitado a, virus de herpes simple (HSV, por sus siglas en inglés) , virus Epstein Barr (EBV, por sus siglas en inglés) , adenovirus, virus adeno-asociado (AAV, por sus siglas en inglés)), VEE y similares. Se prefieren los virus defectuosos, los cuales carecen completamente o casi completamente de genes virales. Los virus defectuosos no generan progenie después de la introducción en la célula. El uso de vectores virales, defectuosos permite la administración a células en un área localizada, específica, sin el problema que el vector viral se extenderá e infectará otras células. De esta manera, un tejido particular puede ser fijado como objetivo específicamente. Los ejemplos de vectores particulares incluyen, pero no están limitados a, el sistema de VEE defectuoso para la réplica como se describe por Pushko y colaboradores (Virology 1997, 239:389-401) y un vector de adenovirus atenuado, tal como el vector descrito por Stratford-Perricaudet y colaboradores, (J. Clin. Invest. 1992, 90:626-630; Véase también La Salle y colaboradores, Science 1993, 259:988-990), y un vector de virus adeno-asociado defectuoso (Samulski y colaboradores, J. Virol . 1987, 61:3096-3101; Samulski y colaboradores, J. Virol. 1989, 63:3822-3828; Lebkowski y colaboradores, Mol. Cell. Biol . 1988, 8:3988-3996) . Varias compañías producen comercialmente vectores virales que incluyen, pero no significa que estén limitados a, Avigen, Inc. (Alameda, CA; vectores de AAV) , Cell Genesys (Foster City, CA; vectores retrovirales , adenovirales , vectores de AAV y vectores lentivirales) , Clontech (vectores retrovirales y baculovirales) , Genovo, Inc. (Sharon Hill, PA; vectores adenovirales y de AAV) , Genvec (vectores adenovirales) , IntroGene (Leiden, Países Bajos; vectores adenovirales), Molecular Medicine (vectores retrovirales , adenovirales y de AAV) , Norgen (vectores adenovirales) , Oxford BioMedica (Oxford, Reino Unido; vectores lentivirales) , Transgene (Strasbourg, Francia; vectores adenovirales, de vaccinia, retrovirales y lentivirales) , AlphaVax (vectores alfavirales tales como vectores de VEE) e Invitrogen (Carlsbad, California) . En otra modalidad, el vector se puede introducir in vivo mediante la lipofección, como ADN desnudo, o con otros agentes que facilitan la transfeccion (péptidos, polímeros, bupivacaína, etcétera) . Los lípidos catiónicos, sintéticos se puede utilizar para preparar liposomas para la transfeccion in vivo de un gen que codifica un marcador (Felgner y colaboradores , Proc . Nati. Acad. Sci . E.U.A. 19£ J7, 84:7413-7417; Felgner y Ringold, Science 1989, 337 : 387-3e ¡8; Mackey y colaboradore , Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A 196 ¡8, 85:8027- 8031; Ulmer y colaboradores, Science 1993, 259:1745-1748). Los compuestos de lípidos útiles y las composiciones para la transferencia de ácidos nucleicos se describen en las publicaciones de patente internacionales WO 95/18863 y WO 96/17823 y en la patente norteamericana No. 5,459,127. Los lípidos se pueden acoplar químicamente a otras moléculas con el propósito de la fijación como objetivo (véase, Mackey y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A. 1988, 85:8027-8031) . Los péptidos fijados como objetivo, por ejemplo, hormonas o neurotransmisores , y las proteínas tales como anticuerpos, o moléculas no peptídicas, se podrían acoplar químicamente a los liposomas. Otras moléculas también son útiles para facilitar la transfección de un ácido nucleico in vivo tal como un oligopéptido catiónico (por ejemplo, publicación de patente internacional WO 95/21931), péptidos derivados de proteínas de unión de ADN (por ejemplo, la publicación de patente internacional WO 96/25508), o un polímero catiónico (por ejemplo, publicación de patente internacional WO 95/21931) . También es posible introducir el vector in vivo como un plásmido de ADN desnudo. Los vectores de ADN desnudo para la terapia génica se pueden introducir en las células hospedantes, deseadas por medio de métodos conocidos en el campo, por ejemplo, la electroporación, microinyección, fusión celular, dextrano de DEAE, precipitación de fosfato de calcio, uso de una pistola de genes (por ejemplo, el sistema de pistola de genes Helios (Bio-Rad; Hercules, CA) se puede utilizar para el suministro epidérmico de genes) o el uso de un transportador de vectores de ADN (Véase, por ejemplo, Wu y colaboradores, J. Biol . Chem. 1992, 267:963-967; Wu y Wu, J. Biol. Chem. 1988, 263:14621-14624; Hartmut y colaboradores, Solicitud de patente canadiense No. 2,012,311, expedida el 15 de Marzo de 1990; Williams y colaboradores, Proc . Nati. Acad. Sci. E.U.A. 1991, 88:2726-2730) . También se pueden utilizar planteamientos para el suministro de ADN mediado por receptores (Curiel y colaboradores, Hum. Gene Ther. 1992, 3:147-154; Wu y Wu, J. Biol . Chem. 1987, 262:4429-4432). Las patentes norteamericanas Nos. 5,580,859 y 5,589,466 describen el suministro de secuencias de ADN exógeno, libres de agentes que facilitan la transfección, en un mamífero. Alternativamente, el ADN es formulado en composiciones con agentes que facilitan la transfección, los cuales pueden facilitar la inmunización, tales como bupivicaína y otros anestésicos locales (patente norteamericana No. 6,127,170). Recientemente, se ha descrito una técnica de transferencia de ADN in vivo de alta eficacia de voltaje relativamente bajo, denominada electrotransferencia (Mir y colaboradores, C. P. Acad. Sci . 1998, 321:893; WO 99/01157; WO 99/01158; WO 99/01175) . El término "composición inmunogena", utilizado en este texto, se refiere ampliamente a cualquier composición que se puede administrar para producir una respuesta inmunogena en el receptor. Una composición inmunogena comprende generalmente una dosis inmunológicamente efectiva de un inmunógeno (por ejemplo, un antígeno de un agente infeccioso) y un portador farmacéuticamente aceptable y, opcionalmente , un adyuvante. El portador farmacéuticamente aceptable puede ser agua estéril o solución salina, isotónica, estéril, así como también cualquiera y todos los solventes, medios de dispersión, reves imientos, agentes antibacterianos y antifungales , agentes isotónicos y retardadores de la absorción y similares, compatibles con la administración a humanos. El portador apropiado será evidente para aquellas personas expertas en el campo y dependerá en gran parte de la ruta de administración. Una composición inmunógena se puede administrar a un organismo, por ejemplo, mediante la inhalación o insuflación (ya sea a través de la boca o la nariz) mediante la administración oral, bucal, vaginal, rectal o parenteral (por ejemplo, mediante la inyección subcutánea, transdérmica , intramuscular, intraorbital , intracapsular , intraespinal , intraesternal , intraperitoneal o intravenosa y similares). Una composición inmunógena también se puede administrar mediante la transferencia mediada por partículas (por ejemplo, utilizando una "pistola de partículas"). Véase, por ejemplo, Gainer y colaboradores, J. Neurooncol 20C0, 47:23-30; Koide y colaboradores, Jpn J. Pharmacol 2000, 83:167-174; Kuriyama y colaboradores, Gene Ther. 2000, 7:1132-1136; y Yamauchi y colaboradores, J. Exp . Zool . 2000, 287:285-293. Estos métodos de transferencia de partículas son particularmente preferidos para las composiciones inmunógenas de ADN o vectores, por ejemplo, utilizando una "pistola de genes". La ruta de administración apropiada se selecciona dependiendo de la naturaleza de la composición inmunógena utilizada y una evaluación de la edad, peso, sexo y salud general del paciente y los antígenos presentes en la composición inmunógena y factores similares por el médico que atiende el caso. Una composición inmunógena puede comprender, por ejemplo, una suspensión de un agente infeccioso atenuado o eliminado (por ejemplo, un microorganismo, tal como una bacteria o virus, un parásito u otro agente patógeno, etcétera) que cause una enfermedad infecciosa. Alternativamente, una composición inmunógena de la invención puede ser una composición inmunógena de polipéptidos o una composición inmunógena de ADN. El término "composición inmunógena de polipéptidos" se refiere a una composición inmunógena que comprende un polipéptido inmunógeno, por ejemplo un polipéptido derivado de un agente infeccioso que puede ser un antígeno y, por lo tanto, activa una respuesta inmune en un organismo. El término "composición inmunógena de ADN" se utiliza en este texto para referirse a composiciones inmunógenas suministradas por medio de un vector recombinante . Un término alternativo utilizado en este texto es "composición inmunógena de vectores" (puesto que algunos vectores potenciales, por ejemplo alfavirus, son virus de ARN y puesto que en algunos casos el ARN no viral en lugar del ADN se puede suministrar a las células) . El término "dosis inmunológicamente efectiva" se refiere a aquella cantidad de un compuesto o composición que es suficiente para dar por resultado una actividad deseada. De esta manera, como se utiliza para describir una composición inmunógena, una dosis inmunológicamente efectiva se refiere a la cantidad de un compuesto o composiciones (por ejemplo, un antígeno) que es suficiente para producir una respuesta inmune, efectiva. En general, la selección de la cantidad o dosificación inmunológicamente efectiva, apropiada para las composiciones inmunógenas de la presente invención también será en base a la composición inmunógena, particular que se emplea, así como también la condición física del sujeto, más especialmente incluyendo la salud general y peso del sujeto inmunizado. Esta selección y ajuste hacia arriba o hacia abajo de la dosis efectiva está dentro de la experiencia en el campo. La cantidad de componente activo requerido para inducir una respuesta inmune sin efectos secundarios, adversos, significantes varía dependiendo de la composición que se emple . Para virus recombinantes, preferiblemente defectuosos para la réplica, que contienen el ADN que codifica los polipéptidos mutantes de fusión de E6/E7 de esta invención, la cantidad inmunológicamente efectiva es una cantidad de virus recombinante que es efectiva en un ruta de administración para transfectar las células deseadas del sujeto y proporcionar niveles de expresión suficientes del gen seleccionado para proporcionar el efecto deseado. Los niveles de inmunidad se pueden supervisar para determinar la necesidad, si existe, de refuerzos. El término "adyuvante" se refiere a un compuesto o una mezcla que intensifica la respuesta inmune a un antígeno. Un adyuvante puede servir, por ejemplo, como un depósito en el tejido que libera lentamente el antígeno y también como un activador del sistema linfoide que mejora la respuesta inmune (véase, Hood y colaboradores, Immunology, segunda edición, 1984, Ben amin/Cummings : enlo Park, California, página 384). Estos adyuvantes también incluyen, entre otros, MPLMR (lípido A de monofosforilo 3 -O-desacilado Corixa, Hamilton, MT) , el cual se describe en la patente norteamericana No. 4,912,094, la cual se incorpora en este texto a manera de referencia. También son adecuados para el uso como adyuvantes los compuestos de fosfato de aminoalquilglucosamina (AGP) , o derivados o análogos de los mismos, los cuales son disponibles de Corixa (Hamilton, MT) , y los cuales se describen en la patente norteamericana No. 6,113,918, la cual se incorpora en este texto a manera de referencia. Uno de estos AGP es 2-desoxi-4-0-fosfono-3 -O- [ (R) -3 -tetradecanoioxitetradecanoil] -2- [ (R) -3-tetradecanoioxitetradecanoilamino] -b-D-glucopiranosida de 2- [ (R) -3-tetradecanoiloxitetradecanoilamino] etilo, la cual también es conocida como 529 (anteriormente conocida como RC529) . Este adyuvante 529 se formula como una forma acuosa o como una emulsión estable. otros adyuvantes incluyen emulsiones de aceite mineral y agua, sales de aluminio (alum) , tal como hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, etcétera, Anfigen, Avridina, L121/escualeno, D-lactida-polilactida/glicosido, dipéptido de muramilo, Bordetella eliminada, saponinas, tal como Quil A o StimulonMR QS-21 (Antigenics, Framingham, MA.), descritos en la patente norteamericana No. 5,057,540, la cual se incorpora en este texto a manera de referencia, y partículas generadas a partir de los mismos, tales como ISCOMS (complejos inmunoestimuladores) , tuberculosis de Mycobacterium, lipopolisacáridos bacterianos, polinucleótidos sintéticos, tales como oligonucleótidos que contienen una configuración CpG (patente norteamericana No. 6,207,646, la cual se incorpora en este texto a manera de referencia) , toxina de cólera (ya sea en una forma de tipo silvestre o mutante, por ejemplo, en donde el ácido glutámico en la posición de aminoácido 29 es reemplazado por otro aminoácido, preferiblemente una histidina, de acuerdo con la publicación de patente internacional WO 00/18434, incorporada en este texto a manera de referencia) , una toxina pertussis (PT, por sus siglas en inglés), o una toxina térmicamente lábil de E. coli (LT, por sus siglas en inglés) particularmente LT-K63, LT-R72, CT-S109, PT-K9/G129; véase, por ejemplo, las solicitudes de patente internacionales Nos. WO 93/13302 y WO 92/19265, incorporadas en este texto a manera de referencia. Varias citocinas y linfocinas son adecuadas para el uso como adyuvantes. Uno de estos adyuvantes es el factor de simulación de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF, por sus siglas en inglés) , el cual tiene una secuencia de nucleótidos como se describe en la patente norteamericana No. 5,078,996, la cual se incorpora en este texto a manera de referencia. Un ADNc de GM-CSF que contiene plásmidos ha sido transformado en E. coli y se ha depositado en the American Type Culture Collection (ATCC) , 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, bajo el número de acceso 39900. La citocina Interleucina- 12 (IL-12) es otro adyuvante que se describe en la patente norteamericana No. 5,723,127, la cual se incorpora en este texto a manera de referencia. Se ha mostrado que otras citoncinas o linfocinas tiene actividad moduladora, inmune, que incluyen, pero no están limitadas a, las interleucinas 1-alfa, 1-beta, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 13, 14, 15, 16, 17 y 18, los interferones-alfa, beta y gamma, el factor de estimulación de colonias de granulocitos y los factores de necrosis tumoral alfa y beta, y son adecuados para el uso como adyuvantes. Otros adyuvantes adecuados incluyen, pero no están limitados a: sustancias tensoactivas (por ejemplo, hexadecilamin , octadecilamina , esteres de aminoácidos de actadecilo, lisolecitina, bromuro de dimetil-dioctadecilamonio) , metoxihexadecilglicerol y polioles plurónicos; poliaminas, por ejemplo pirano, sulfato de dextrano, poli IC, carbopol ,- péptidos, por ejemplo, dipéptido de muramilo, dimetilglicina, tuftsina; emulsiones oleosas; y geles minerales, por ejemplo, fosfato de aluminio, etcétera y complejos estimuladores, inmunes. El inmunógeno también puede incorporarse en liposomas o puede conjugarse con polisacáridos , lipopolisacáridos y/u otros polímeros para el uso en una composición inmunógena. Los adyuvantes ejemplares incluyen, pero no están limitados a, adyuvante incompleto de Freund sustancias tensoactivas (por ejemplo, lisolecitina) , polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones oleosas o de hidrocarburos. Los adyuvantes ejemplares también incluyen adyuvantes de humano potencialmente útiles, tales como BCG (bacilo Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum. Además, las proteínas inmunoestimuladoras, tales como citocinas, o secuencias de ácido nucleico que codifican para las quimiocinas, se pueden proporcionar como un adyuvante para incrementar la respuesta inmune a una composición inmunógena. La frase "farmacéuticamente aceptable" se refiere a entidades y composiciones moleculares que son fisiológicamente tolerables y no producen típicamente una reacción alérgica o desfavorable, similar (por ejemplo, malestar gástrico, desvanecimiento y similares) cuando se administran a un individuo. Preferiblemente, y en particular donde se utiliza una composición inmunógena en humanos, el término "farmacéuticamente aceptable" puede significar aprobado por un agencia reguladora (por ejemplo, the U.S. Food and Drug Agency) o puede estar listado en una farmacopea generalmente reconocida para el uso en animales (por ejemplo, la Farmacopea norteamericana) . El término "portador" se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o vehículo con el cual se administra un compuesto. El agua estéril o soluciones salinas, acuosas y soluciones acuosas de dextrosa y glicerol se emplean preferiblemente como portadores, particularmente para soluciones inyectables. Los portadores farmacéuticos, adecuados, ejemplares se describen en "Reminington ' s Pharmaceutical Sciences" por E. W. Martin. La toxicidad y eficacia terapéutica de los compuestos se puede determinar por medio de procedimientos farmacéuticos, estándar, por ejemplo en ensayos de cultivos celulares o utilizando animales experimentales para determinar los valores LD50 y ED50. Los parámetros LD50 y ED50 son bien conocidos en el campo y se refieren a las dosis de un compuesto que son letales para el 50% de una población y terapéuticamente efectivas en 50% de una población, respectivamente. La relación de dosis entre efectos tóxicos y terapéuticos es referida como el índice terapéutico y se puede expresar como la relación: LD50/ED50. Se prefieren los compuestos que exhiben grandes índices terapéuticos. Mientras que se pueden utilizar compuestos que exhiban efectos secundarios, tóxicos. Sin embargo, en estos casos es particularmente preferible utilizar sistemas de suministro que fijen como objetivo específicamente estos compuestos al sitio del tejido afectado para minimizar el daño potencial a otras células, tejidos y órganos y para reducir los efectos secundarios . Los datos obtenidos del ensayo de cultivo celular o estudios en animales se pueden utilizar para formular un rango de dosificaciones para el uso en humanos. La dosificación de los compuestos utilizados en los métodos terapéuticos de la presente invención se encuentra preferiblemente dentro de un rango de concentraciones circulantes que incluye la concentración ED50 pero con poco o nada de toxicidad (por ejemplo, inferior a la concentración LD50) . La dosificación particular utilizada en cualquier aplicación puede variar dentro de este rango, dependiendo de factores tales como la forma de dosificación particular que se emplea, la ruta de administración utilizada, las condiciones del individuo (por ejemplo, paciente) y así sucesivamente. Los animales no humanos incluyen, sin limitación, animales de laboratorio, tales como ratones, ratas, conejos, hámsteres, cobayos, etcétera; animales domésticos, tales como perros y gatos; animales de granja, tales como ovejas, cabras, cerdos, caballos y vacas; y primates no humanos. Una dosis terapéuticamente efectiva se puede estimar inicialmente a partir de ensayos de cultivos celulares y se puede formular en modelos animales para lograr un rango de concentración circulante que incluya el valor IC50. La concentración IC50 de un compuesto es la concentración que logra una inhibición semi -máxima de los síntomas (por ejemplo, determinada a partir de los ensayos de cultivo celulares) . Las dosificaciones apropiadas para el uso en un individuo particular, por ejemplo en pacientes humanos, entonces se puede determinar de manera más precisa utilizando esta información. El término "tratar" significa intentar producir una respuesta antitumoral contra células del tumor, es decir, el cáncer. Una respuesta antitumoral incluye, pero no está limitada a, un tiempo incrementado de supervivencia, inhibición de la metástasis tumoral, inhibición del crecimiento del tumor, regresión del tumor y desarrollo de una respuesta de hipersensibilidad de tipo retardada (DTH, por sus siglas en inglés) a células tumorales no modificadas. Las medidas de los compuestos en el plasma se pueden realizar de manera rutinaria en un individuo, tal como un paciente, por medio de técnicas tales como la cromatografía líquida de alta resolución (CLAR) o cromatografía de gas. Las composiciones farmacéuticas para el uso de acuerdo con la presente invención se pueden formular de manera convencional utilizando uno o más portadores o excipientes fisiológicamente aceptables. De esta manera, los compuestos y sus sales y solvatos fisiológicamente aceptables se pueden formular para la administración mediante las rutas descritas anteriormente. Para la administración oral, las composiciones farmacéuticas pueden tomar la forma de, por ejemplo, tabletas o cápsulas preparadas por medios convencionales con excipientes farmacéuticamente aceptables, tales como agentes de unión (por ejemplo, almidón de maíz pregelatinizado , polivinilpirrolidona o hidroxipropilmetilcelulosa) materiales de relleno (por ejemplo, lactosa, celulosa microcristal ina o fosfato ácido de calcio); lubricantes (por ejemplo, estearato de magnesio, talco o sílice) ; desintegrantes (por ejemplo, almidón de papá o glicolato de almidón sódico) ; o agentes humectantes (por ejemplo, lauril -sulfato de sodio) . Las tabletas pueden ser revestidas por métodos bien conocidos en el campo. Las preparaciones líquidas para la administración oral pueden tomar la forma de, por ejemplo, soluciones, jarabes o suspensiones o pueden presentarse como un producto seco para la constitución con agua u otro vehículo adecuado antes del uso. Estas preparaciones líquidas se pueden realizar por medios convencionales con aditivos farmacéuticamente aceptables, tales como agentes de suspensión (por ejemplo, jarabe de sorbitol, derivados de celulosa o grasas comestibles, hidrogenadas) ; agentes emulsionantes (por ejemplo, lecitina o goma acacia) ; vehículos no acuosos (por ejemplo, aceite de almendra, ésteres oleosos, alcohol etílico o aceites vegetales, fraccionados) ; y conservadores (por ejemplo, metil- o propil -p-hidroxibenzoatos o ácido sórbico) . Las preparaciones también pueden contener sales amor iguadoras, agentes saborizantes , colorantes y endulzantes, como sea apropiado. Las preparaciones para la administración oral pueden formularse adecuadamente para proporcionar una liberación controlada del compuesto activo. Para la administración bucal, las composiciones pueden tomar la forma de tabletas o pastillas formuladas de manera convencional. Para la administración mediante la inhalación, los compuestos para el uso de acuerdo con la presente invención son suministrados convenientemente en la forma de una presentación de pulverización en aerosol de empaques presurizados o un nebulizador, con el uso de un impelente adecuado, por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano , diclorotetrafluoroetano , dióxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosificación se puede determinar al proporcionar una válvula para suministrar una cantidad medida. Las cápsulas y cartuchos de, por ejemplo, gelatina para el uso en un inhalador o insuflador pueden formularse para contener una mezcla en polvo del compuesto y una base en polvo, adecuada, tal como lactosa o almidón. Los compuestos se pueden formular para la administración parenteral por medio de inyección, por ejemplo mediante la inyección de bolos o la infusión continua. Las formulaciones para inyección se pueden presentar en forma de dosificación unitaria, por ejemplo, en ampolletas o en recipientes de múltiples dosis, con un conservador adicionado. Las composiciones pueden tomar formas, tales como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos y pueden contener agentes de formulación, tales como agentes de suspensión, estabilización y/o dispersión. Alternativamente, el ingrediente activo puede estar en la forma de polvo para la constitución con un vehículo adecuado, por ejemplo agua estéril libre de pirógenos, antes del uso. Los compuestos también se pueden formular en composiciones rectales, tales como supositorios o enemas de retención, por ejemplo, que contienen bases para supositorio convencionales, tales como manteca de cacao u otros glicéridos . Además de las formulaciones descritas previamente, los compuestos también se pueden formular como una preparación de depósito. Estas formulaciones de acción prolongada se pueden administrar mediante el implante (por ejemplo por la ruta subcutánea o intramuscular) o mediante la inyección intramuscular. De esta manera, por ejemplo, los compuestos se pueden formular con materiales poliméricos o hidrófobos, adecuados (por ejemplo, como una emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico, o como derivados escasamente solubles, por ejemplo, como una sal escasamente soluble . Las composiciones se pueden presentar, si se desea, en un empaque o dispositivo de suministro que puede contener una o más formas de dosificación unitarias que contienen el ingrediente activo. El empaque puede comprender, por ejemplo, una hoja delgada de metal o plástico, tal como un empaque tipo ampolla. El empaque o sistema de suministro puede estar acompañado por instrucciones para la administración. Los términos utilizados en esta especificación tienen generalmente sus significados ordinarios en el campo, dentro del contexto de esta invención y en el contexto específico donde se utiliza cada término. Ciertos términos se describen en la especificación, para proporcionar una guía adicional al prácticamente en la descripción de las composiciones y métodos de la invención y como elaborarlas y utilizarlas. EJEMPLOS La presente invención se describe por medio de los siguientes ejemplos. Sin embargo, el uso de estos y otros ejemplos en cualquier parte en la especificación es ilustrativo únicamente y no limita de ninguna manera el alcance y el significado de la invención o cualquier término ejemplificado. De igual manera, la invención no está limitada a ninguna modalidad preferida que se describe en este texto. En realidad, muchas modificaciones y variaciones de la invención pueden ser aparentes para aquellas personas expertas en el campo con la lectura de esta especificación y se pueden hacer sin apartarse de su espíritu y alcance. Ejemplo 1. DISEÑO Y GENERACION DE CONSTRUCCIONES DE COMPOSICIONES INMUNOGENAS DE HPV16 Materiales y Métodos Generación de construcciones de réplica de VEE. Los genes de E6 y E7 de HPV16 se obtuvieron de PHPV-16 (ATCC, #45113) por medio de métodos de PCR (Horton y colaboradores, Gene 1989, 77:61-8), y se fusionaron en dos orientaciones diferentes para generar marcos de lectura abierta (ORFs, por sus siglas en inglés) de 744 pares de bases (pb) que codifican para 248 aminoácidos para todas las construcciones. El codón de inicio de metionina de cada ORF corriente abajo se removió para eliminar cualquier posibilidad de iniciación interna. Los nucleótidos específicos de los ORFs fusionados fueron mutagenizados utilizando el equipo de mutagénesis dirigida al sitio QuikChangeMR (Stratagene; La Jolla, CA) . Los genes fusionados de tipo silvestre (wt) y mutados (mut) fueron subclonados en el vector pVR200 (AlphaVax; Durham, NC) , un plásmido derivado del ADNc de un mutante no neurotrófico , altamente atenuado (V3014) de la cepa Trinidad Donkey de encefalitis equina de Venezuela (VEE) (Grieder, F. B. y colaboradores, Virology 1995, 206:994-1006). El plásmido pVR200 se describe Pushko y colaboradores, (Virology 1997, 239:389-401, en particular véase las páginas 390-391 "Cell lines and plasmids" y página 393, figura IB) . En resumen, este plásmido tiene el promotor T7 seguido por genes no estructurales de VEE, el promotor subgenómico 26S, el sitio de clonación para el (los) gen(es) de interés (en la presente invención, las fusiones de E6/E7) y un sitio de linealización NotJ. Las partículas de replicón de VEE incompetentes para la réplica (VRPs) se prepararon por medio del método de auxiliares separados y se titularon como se describe (Pushko y colaboradores, Virology 1997, 239:389-401) . En resumen, el plásmido pVR200 (con las fusiones de interés clonadas) se co-transfecto en las células junto con: (1) una construcción auxiliar de codificación de cápside y (2) una construcción auxiliar de codificación de glicoproteínas . Ninguna de estas construcciones auxiliares tuvieron secuencias de empaque y, por lo tanto, no fueron incorporadas en las VRPs. De esta manera, las VRPs resultantes fueron defectuosas para la réplica. La potencia de cada preparación de VRPs, expresada en unidades infecciosas/mililitro (Ul/ml) , se definió por el número de partículas positivas en E7 determinado mediante la titulación en células de riñon de hámster bebé (BHK)-21. Los títulos de todas las preparaciones de VRPs excedieron 109 UI por electroporación; una dosis efectiva de 3 xlO3 UI por inmunización se utilizó por todos estos estudios y como se describiera previamente (Velders M. P. y colaboradores, Cáncer Res 2001, 61:7861-7867) . Análisis de inmuno ransferencia Western e Inmunofluorescencia . Las células BHK-21 se infectaron con las VRPs indicadas. Veinticuatro horas después de infección, las células ya sea se recolectaron en un amortiguador de muestras de SDS para el análisis de inmunotransferencia Western o se fijaron con metanol -acetona para la inmunofluorescencia . Para detectar la expresión de proteínas mediante el análisis de inmunotransferencia Western, las proteínas en el lisado de células se separaron mediante SDS-PAGE, se transfirieron a una membrana de pol ivinil ideno (PVD) y se analizaron con el sistema de detención Western Breeze ( Invitrogen; Carlsbad, CA) utilizando un anticuerpo monoclonal anti-E7 de HPV16 (Zymed; San Francisco, CA) . Para el análisis de inmunofluorescencia , las células fijadas se incubaron con un anticuerpo primario anti-E7 seguido por un anticuerpo secundario antiratón de cabra etiquetado con FITC (# 554001, Pharmingen; San Diego, CA) . Los núcleos de las células se tiñeron utilizando ViaprobeMR (#555815, Pharmingen) .

Resultados A fin de diseñar composiciones inmunógenas, efectivas y seguras contra el cáncer cervical inducido por HPV16, la diversidad antigénica se incrementó al expresar antígenos específicos para tumores tanto de E6 como E7. La inclusión de los genes de longitud completa de E6 y E7 en una composición inmunógena de VRP se deseable para maximizar la probabilidad de expresar todos los epítopos posibles para la estimulación de células T CD8+ y CD4+ en diversas poblaciones humanas de HLA clase I y clase II. Las fusiones de los ORFs de E6 y E7 se realizaron en dos diferentes orientaciones mediante la PCR y hasta cinco aminoácidos se mutagenizaron (figuras 1A y B) para obtener construcciones de expresión para producir polipéptidos de fusión de E6/E7 particulares. Se ha mostrado que una sustitución de aminoácido individual en la posición 63C destruye varias funciones de E6 de HPV16: degradación de p53, degradación de E6TP-1, activación de telomerasa y, consecuentemente, inmortalización de células epiteliales primarias (Gao, Q. y colaboradores, J Virol 2001, 75:4459-4466). La proteína E6 de HPV16 que contiene una sola mutación puntual en 106C ni se une ni facilita la degradación de p53 y es incapaz de inmortalizar las MECs de humano, un fenotipo dependiente de la degradación de p53 (Dalal y colaboradores, J Virol 1996, 70:683-688) . La proteína E7 de HPV16 de 98 aminoácidos se une a Rb a través de una configuración L-X-C-X-E las mutaciones en las posiciones 24C y 2SE de esta configuración destruyen la unión y la degradación de Rb (Munger, K y colaboradores, Oncogene 2001, 20:7888-7898) . Además de estas dos mutaciones puntuales en E7, un tercer aminoácido, 91C, fue mutado para destruir el único dedo de zinc en E7. Una primera proteína de fusión, referida en este texto como E6E7wt, comprende la secuencia de aminoácidos de una secuencia de polipéptido de E6 de tipo silvestre (SEC ID NO: 13) en la terminación amino y la secuencia de aminoácidos de una secuencia de polipéptido de E7 de tipo silvestre (SEC ID NO: 14) en la terminación carboxi . Una secuencia de aminoácidos representativa para este polipéptido de fusión se proporciona en la SEC ID NO: 1. Una secuencia de nucleótidos ejemplar que codifica este polipéptido de fusión de E6E7 de tipo silvestre se expone en la SEC ID NO: 2. Un segundo polipéptido de fusión, referido como E6E7TetM, también se preparó. Como el polipéptido de fusión E6E7wt, E6E7TetM comprende una secuencia de polipéptido de E6 en la terminación amino y una secuencia de polipéptido de E7 en la terminación carboxi. Sin embargo, la secuencia de polipéptido de E6 de esta construcción contiene aminoácidos de glicina en los residuos 63 y 106 del polipéptido de E6 preferiblemente que los aminoácidos de cisteína encontrados en la secuencia de aminoácidos de E6 de tipo silvestre (SEC ID NO: 13) . Además, la secuencia de polipéptido de E7 de esta construcción contiene aminoácidos de glicina en los residuos 24 y 26 de polipéptido de E7 preferiblemente que los aminoácidos cisteína (24) y glutamato (26) encontrados en la secuencia de aminoácidos de E7 de tipo silvestre (SEC ID NO: 14) . Una secuencia de aminoácidos representativa para este polipéptido de fusión se proporciona en la SEC ID NO: 3. Una secuencia de nucleótidos ejemplar que codifica este polipéptido de fusión E6E7TetM se expone en la SEC ID NO: 4. Un tercer polipéptido de fusión, referido como E6E7PentM, también se preparó. Como el polipéptido de fusión E6E7TetM, E6E7PentM comprende una secuencia de polipéptido de E6, la cual comprende aminoácidos de glicina en los residuos 63 y 106, en su terminación amino y una secuencia de polipéptido de E7, la cual comprende aminoácidos de glicina en los residuos 24 y 26, en su terminación carboxi . Sin embargo, la secuencia de polipéptido de E7 de esta proteína de fusión también contiene un aminoácido de glicina en el residuo 91 de la secuencia de polipéptido de E7, preferiblemente que el aminoácido de cisteína encontrado en la secuencia de aminoácidos de E7 de tipo silvestre (SEC ID NO: 14) . Una secuencia de aminoácidos representativa para este polipéptido de fusión se encuentra en la SEC ID NO: 5. Una secuencia de nucleótidos ejemplar que codifica este polipéptido de fusión E6E7PentM se expone en la SEC ID NO: 6.

Un cuarto polipéptido de fusión, referido como E7E6wt, comprende la secuencia de aminoácidos de una secuencia de polipéptido de E7 de tipo silvestre (SEC ID NO: 14) en la terminación amino y la secuencia de aminoácidos de una secuencia de polipéptido de E6 de tipo silvestre (SEC ID NO: 13) en la terminación carboxi. Una secuencia de aminoácidos representativa para este polipéptido de fusión se proporciona en la SEC ID NO: 7. Una secuencia de nucleótidos ejemplar que codifica este polipéptido de fusión E7E6wt se expone en la SEC ID NO: 8. Un quinto polipéptido de fusión, referido como E7E6TentM, también se preparó. Como el polipéptido de fusión E7E6wt, E7E6TentM comprende una secuencia de polipéptido de E7 en la terminación amino y una secuencia de polipéptido de E6 en la terminación carboxi. Sin embargo, el polipéptido de E7 de esta construcción contiene un residuo de glicina en los aminoácidos 24 y 26 del polipéptido de E7, preferiblemente que los aminoácidos cisteína (24) y glutamato (26) encontrados en la secuencia de aminoácidos de E7 de tipo silvestre (SEC ID NO: 14) . Además, el- polipéptido de E6 de esta construcción contiene un residuo de glicina en los aminoácidos 63 y 106 del polipéptido de E6, preferiblemente que el aminoácido de cisteína encontrado en la secuencia de aminoácidos de E6 de tipo silvestre (SEC ID NO: 13) . Una secuencia de aminoácidos representativa para este polipéptido de fusión se proporciona en la SEC ID NO: 9. Una secuencia de nucleótidos ejemplar que codifica este polipéptido de fusión E7E6Tet se expone en la SEC ID NO: 10. Un sexto polipéptido de fusión, referido como E7E6PentM, también se preparó. Como E7E6TetM, E7E6PentM comprende un polipéptido de E7, el cual comprende aminoácidos de glicina en los residuos 24 y 26 del polipéptido de E7, en su terminación amino y un polipéptido de E7, el cual comprende aminoácidos de glicina en los residuos 63 y 106 del polipéptido de ?6, en su terminación carboxi . Sin embargo, la secuencia del polipéptido de E7 de esta construcción también contiene un aminoácido de glicina en el residuo 91 del polipéptido de E7, preferiblemente que el aminoácido de cisteína encontrado en la secuencia de aminoácidos de E7 de tipo silvestre (SEC ID NO: 14) . Una secuencia de aminoácidos representativa para este polipéptido de fusión se proporciona en la SEC ID NO: 11. Una secuencia de nucleótidos ejemplar que codifica este polipéptido de fusión E7E6TetM se expone en la SEC ID NO: 12. Las mutaciones en E6 y E7 se diseñaron para 1) interrumpir tres dedos de zinc, desestabilizando por lo tanto la proteína y acelerando la degradación (y, de esta manera, incrementar la inmunogenicidad) (S3C y 10SC de E6; 91C de E7 (Dalal y colaboradores, J Virol 1996, 70:683-8; Shi y colaboradores, J Virol 1999, 73:7877-81)) ; 2) alterar la degradación inducida por E6 de p53 (10SC; (Dalal y colaboradores, J Virol 1996, 70:683-8)) y la unión de E6-TP1 (Gao y colaboradores, J Virol 2001, 75:4459-66); y 3) interrumpir la unión y la degradación de Rb por E7 (24C y 26E; (Edmonds y Vousden, J Virol 1989, 63:2650-6)). Estas mutaciones se seleccionaron cuidadosamente para encontrarse fuera de los epítopos de HLA conocidos, con la excepción de 91C. Aunque se sabe que 9lC es parte de un epitopo de HLA A2 que abarca los aminoácidos 86-93 de E7 (Ressing y colaboradores, J Immunol 1995, 154:5934-43; Ressing y colaboradores, Cáncer Res 1996, 56:582-8; Evans y colaboradores, Cáncer Res 1997, 57:2943-50), se decidió mutar este aminoácido para lograr una seguridad máxima de la composición inmunógena, puesto que esta mutación interrumpe un dedo de zinc de E7 que se sabe que es requerido por su actividad de inmortalización (Jewers y colaboradores, J. Virol 1992, 66:1329-1335). Puesto que esta mutación no está localizada en la región de ancla de aminoácido P2 de los péptidos con propiedades de unión de HLA-A*0201 conocidas (Rammensee y colaboradores, Annu Rev Immunol 1993, 11:213-44), es posible que los polipéptidos mutados C91G puedan retener sus capacidad para unir la molécula HLA-A*0201. También, es posible que la mutación C91 pudiera afectar la escisión de otro epitopo de HLA que abarca los aminoácidos 82-90 de E7. Las construcciones de fusión que contienen estas cinco mutaciones de aminoácidos se denominaron PentM. Aunque las mutaciones en cada uno de estos sitios de E6 y E7 de HPV16 se ha descrito con anterioridad individualmente, no se sabía que combinaciones de estas mutaciones, si existieran, mantendrían su inmunogenicidad . A fin de desarrollar una composición inmunógena, terapéutica para el cáncer cervical que produjera una respuesta fuerte mediada por células contra los productos de oncogenes virales E6 y E7, estas fusiones se clonaron en sistemas a base de replicones de virus de encefalitis equina de Venezuela (VEE) . Las ventajas de las composiciones inmunógenas de VEE, recombinantes incluyen altos niveles de expresión de genes heterólogos, tropismo de células dendríticas (fijando como objetivo con lo cual la expresión para tejidos linfoides, un sitio importante para inducir la inmunidad) , inducción de la apoptosis y respuestas inmunes, fuertes, celulares y humorales e inmunización repetida, eficiente, puesto que no hay una inmunidad existente, difundida en VEE en humanos. Además, los alfavirus tales como VEE, duplican el ARN de interés en el citosol de la célula y son citopáticos, reduciendo significantemente con lo cual el riesgo de integración de E6 y E7 en el genoma celular. Para valorar la expresión de estas construcciones fusionadas, las células BHK se infectaron con las V Ps recombinantes y se analizaron subsecuentemente mediante el análisis de inmunotransferencia Western y la inmunofluorescencia . El análisis de inmunotransferencia Western reveló que las proteínas de fusión de E6E7 migraron generalmente a un peso molecular de aproximadamente 30 kDa en SDS-PAGE. Aunque el nivel de expresión de las construcciones de tipo silvestre y mutadas fue comparable, su ubicación intracelular fue dramáticamente diferente. La tinción de inmunofluorescencia de estas proteínas de fusión reveló un patrón de tinción intermitente que traslapa los núcleos para las VRPs tanto de E6 como de E7 de tipo silvestre, mientras que se observó una tinción perinuclear, más difusa para todas las VRPs TetM y PentM (no se muestran los datos) . Esta ubicación perinuclear, difusa es sugestiva de la agregación/pliegue erróneo de proteínas. Este pliegue erróneo es sugestivo de la inestabilidad de las proteínas, además soportar que estas fusiones tienen una capacidad incrementada para producir respuestas de CTL. Ejemplo 2: RESPUESTAS INMUNES , CELULARES INDUCIDAS POR DIFERENTES CONSTRUCCIONES DE COMPOSICIONES INMUNOGENAS Materiales y Métodos Ratones y líneas celulares. Los ratones hembras C57BL/6 de 6-12 semanas de edad libres de agentes patógenos, específicas se obtuvieron de Taconic Farms (Germantown, NY) . Los ratones hembras se alojaron en instalaciones para animales de the Wyeth and Loyola University (Chicago) bajo condiciones de filtro superior, con agua y acomida ad libituiu. Los ratones hembras HLA-A*0201 de 6-12 semanas de edad libres de agentes patógenos, específicas se adquirieron de Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) . Las células MC57G y EL4 se utilizaron para ensayos de citotoxicidad. Las células BHK-21 se utilizaron para la expresión de ARN de VEE, el empaque de partículas de replicones de VEE (VRP) y la titulación (ensayos de potencia) . Los estudios de la prueba de tumores se realizaron utilizando las líneas de tumor positivas en E6E7 C3 (Feltkamp, M. C. W. y colaboradores, Eur J Immun 1993, 23:2242-2249) , TC-1 (Lin, K. Y. y colaboradores, Cáncer Res 1996, 56:21-26), y HLF16. Todas las líneas de células (excepto las células HLF16, C3 y TC-1) se obtuvieron de the American Type Culture Collection (ATCC; Manassas , VA) . Ensayo de citotoxicidad (CTL) . Las ratones C57BL/6 se inmunizaron por la ruta subcutánea con 3 x 105 unidades infecciosas de VRPs . Los ensayos de citotoxicidad se realizaron 4 semanas después de inmunizar los ratones con una dosis individual de 3 x 105 de la VRP indicada que se administró en las almohadillas de las patas posteriores.. Las suspensiones de esplenocitos de células individuales se reestimularon (20:1) con células MC57G tratadas con mitomicina C infectadas con vectores de Virus Vaccinia de Ankara (MVA) modificados, recombinantes que codifican para la proteína E7 o E6 (E7--MVA o E6-MVA) en una multiplicidad de infección (MOI) de 5. La actividad de CTL se midió 5 días después. Las células MC57G infectadas con E7- o E6-MVA y las células EL-4 pulsadas con el péptido restringido por H-2Db de E749_57 de HPV16 (RAHYNIVTF (SEC ID NO : 41, que corresponde a los aminoácidos 49-57 de la SEC ID NO: 14) ; Lin y colaboradores, Cáncer Res 1996, 56, 21-6) (ATCC) sirvieron como objetivos. Las células MC57G se infectaron durante 1 hora ya sea con E7- VA o E6- VA a una MOI de 5. Las células EL-4 (1 x 107) se incubaron con un péptido (20 ug/ml) durante 1 hora. Las células objetivo entonces se etiquetaron 3 horas después con Europio (Eu+3; Sigma Chemical Co . , St . Louis, MO) mediante la electroporación . Las células efectoras y objetivo se incubaron en las relaciones indicadas durante 3 horas, después de lo cual los sobrenadantes se recolectaron y se mezclaron son una solución intensificadora (Wallac; Turku, Finlandia). La liberación de Eu+3 se cuantificó mediante la fluorescencia resuelta a través del tiempo utilizando un fluorómetro 1234 Delfia (Wallac) . El porcentaje de lisis específica se calculó como (liberación experimental-espontánea/liberación máxima-espontánea) x 100. El porcentaje de liberaciones espontáneas varió de 5 a 10%. Resultados Para caracterizar las respuestas inmunes inducidas por diferentes construcciones de composiciones inmunógenas, los ratones C57BL/6 se inmunizaron subcutáneamente en las almohadillas de las patas posteriores con 3 x 105 unidades infecciosas de construcciones de VRP Wt y PentM. Un mes después de la inmunización, la lisis mediada por CTL se midió mediante el ensayo de liberación de Europio utilizando objetivos de MC57G infectados con MVA que codifica ?ß o E7. La figura 4A revela que la CTL de ratones inmunizados con VRPs ya sea de tipo silvestre o PentM eliminó los objetivos que expresaban E7. Los resultados idénticos se encontraron con objetivos EL-4 pulsados con péptidos ?749_57 (no se muestran los datos) . La lisis mediada por CTL también fue evidente contra objetivos de E6 de ratones inmunizados con todas las formas de VRPs, aunque la lisis se redujo sustancialmente en receptores de VRPs mutantes (figura 4B) . Estos resultados para la lisis específica de E6 y E7 se reprodujeron en dos experimentos adicionales y también se observaron utilizando ratones inmunizados con VRPs TetM (no se muestran los datos) . Estos resultados muestran que la inmunización con VRPs que codifican para las proteínas de fusión mutantes y de tipo silvestre generaron respuestas de CTL similares al epítopo E749_57 inmunodominante que es importante en el rechazo del tumor. Mientras que las respuestas de CTL se detectaron claramente contra objetivos de E6 de animales inmunizados con VRPs que expresan genes de tipo silvestre, las respuestas disminuidas de CTL se observaron en ratones que recibieron una forma mutante de E6 , lo que sugiere que 63C y/o 106C es un componente importante de un epítopo restringido por H-2b. Ejemplo 3: PROTECCION DE TUMORES Y EFICACIA TERAPEUTICA DE CONSTRUCCIONES DE COMPOSICIONES INMUNÓGENAS EN MODELOS DE UMOR C3 Y TC1 Materiales Y Métodos Protección de tumores y experimentos terapéuticos. Los grupos de 14 ratones C57BL/6 se anestesiaron mediante la inyección intraperitoneal de 10 mg/kg de xilazina (Sigma, St. Louis, MO) y 100 mg/kg de quetamina (Abbott Laboratories, Chicago, IL) y se inmunizaron mediante la inyección de 3 x 105 VRPs en las almohadillas de las patas posteriores en los días -21 y -7. Los ratones de control negativo recibieron 3 x 105 UI de proteína verde fluorescente (GFP) VRP . Una semana después, la mitad de los ratones en cada grupo se probaron mediante inyecciones subcutáneas en el costado con 5 x 105 células C3 (Feltkamp y colaboradores, Eur J Immunol 1995, 25:2638-42) y la mitad se probaron con 5 x 104 células TC-1 (Lin y colaboradores, Cáncer Res 1996, 56:21-6) . El crecimiento del tumor se supervisó cada tres días. Para los experimentos terapéuticos de C3 , los ratones se probaron primero con 5 x 105 células tumorales C3 en el costado después de 7, 14 y 21 días posteriores con la VRP indicada a 3 x 105 dosis por inmunización. Para el experimento terapéutico de fibroblastos de pulmón humano (HLF, por sus siglas en inglés) , los ratones transgénicos por HLA-A*0201 se probaron con 2 x 106 células HLF16 mediante la inyección subcutánea en el costado izquierdo en el día 0. En los días 5, 10 y 15 después de la prueba, los ratones se anestesiaron como se describiera anteriormente y se inmunizaron mediante la inyección de 3 x 105 VRPs en las almohadillas de las patas posteriores. El crecimiento del tumor se supervisó cada 5 días. Véase también: Ratones y Líneas Celulares (anteriormente) . Resultados Las VRPs que codifican para las proteínas de fusión E7E6 y E7E6PentM de tipo silvestre se compararon por la eficacia antitumoral, profiláctica in vivo. Los ratones en todos los grupos se inmunizaron en los días 0 y 21 con 3 x 105 de la VRP indicada y se probaron subsecuentemente con células tumorales C3 o TC-1. Todos los ratones que recibieron GFP-VRP como control negativo desarrollaron tumores dentro de aproximadamente 7 días posteriores a la prueba del tumor (figura 5A y B) . En contraste, todos los ratones que recibieron E6E7 ya sea de tipo silvestre o PentM estuvieron protegidos de la prueba del tumor sin importar si recibieron las células tumorales C3 (5xl05) (figura 5A) o TC-1 (5xl04) (figura 5B) . Estos datos sugieren que la protección no estuvo limitada a un modelo de prueba del tumor de murino específico y que la protección fue dependiente críticamente de los productos de genes de E6 y E7 codificados por VRP.

Como una medida más severa de la eficacia antitumoral, en el siguiente experimento, los ratones se probaron con células tumorales C3 antes de la inmunización con VRPs de tipo silvestre, PentM o TetM de E7E7 en los días 7, 14 y 21. La figura 6 muestra que 85%-100% de los ratones que recibieron cualquiera de las VRPs que expresaban proteínas de fusión de E6 y E7 nutantes o de tipo silvestre rechazaron los tumores de C3 en contraste con 0%-12% de los ratones de control negativo. Como se muestra previamente por Velders y colaboradores (Cáncer Res 2001, 61:7861-7) y en la figura 6, una composición inmunógena de VRP que expresa la proteína E7 sola promovió el rechazo en únicamente 65%-75% de los ratones. En conclusión, la inclusión del gen que codifica la proteína E6 como un compañero de fusión con E7 mejoró reproduciblemente la eficacia antitumoral, terapéutica (85%-100%, figura 6) en comparación con la proteína E7 sola (67%-75%, figura 6) sin importar si la proteína E6 fue de tipo silvestre o mutada. Por lo tanto, las mutaciones en E6, cuando se expresa como una fusión con E7, no dieron por resultado un efecto antitumoral, disminuido en estos modelos de ratón. Sin embargo, los resultados ilustran que las respuestas óptimas de CTL a los epítopos que contenían aminoácidos mutantes no se pueden producir en algunos individuos inmunizados con VRP mutante. En humanos, esto puede no ser una causa para el problema dada la diversidad alelos de HLA clase I y clase II en comparación con el número limitado de alelos H-2 expresados por ratones C57BL/6. Ejemplo 4: EFICACIA TERAPEUTICA DE CONSTRUCCIONES DE COMPOSICIONES INMUNOGENAS EN EL MODELO DE TUMOR HLF16. Aunque los resultados de los ejemplos 2 y 3 muestran resultados alentadores, el reconocimiento de células T restringidas por H-2b de antígenos de HPV en ratones C57BL/6 proporciona un valor predictivo, limitado para respuestas antitumorales restringidas por HLA. Por lo tanto, la demostración que las mismas composiciones inmunógenas puedan inducir respuestas restringidas por HLA-A*0201 contra E6 y E7 de HPV16 en ratones transgénicos por HLA-A*0201 es particularmente importante (Ressing y colaboradores, J Immunol 1995, 154:5934-5943; . Se ha mostrado que las células T CD8+ de ratones transgénicos por HLA-A*0201 reconocen los mismos antígenos restringidos por HLA-A*0201 como aquellos reconocidos por CTLs de humano restringidos por HLA-A*C201 (Engelhard y colaboradores, J Immunol 1991, 146:1226-1232; Shirai y colaboradores, J Immunol 1995, 154:2733-2742). El uso de ratones transgénicos por HLA podría superar, por lo tanto, las limitaciones del rechazo de tumores restringido por H-2. Sin embargo, no ha habido disponible un modelo de tumor de HPV para someter a prueba la respuesta antitumoral restringida por HLA-A*0201. En este texto, se presenta el primer modelo de tumor de HPV16 para ratones transgénicos por HLA-A*0201 (también se describe en Eiben GL y colaboradores, Cáncer Research, 15 de octubre de 2002, 62, No. 20). La inmunogenicidad de las funciones de E6/E7 se sometió a prueba en este modelo. Este modelo de tumor se desarrolló al transfectar fibroblastos de ratones C57BL/6 transgénicos por HLA-A 0201 con las proteínas E6 y E7 de HPV16 y Ras V12, generando una línea de células (HLF16) que es tumorígena en los ratones HLA-A 0201. El epítopo dominante H-2Db se removió del gen E7 para asegurar que las respuestas antitumorales serían independientes del epítopo 49-57 y serían mediadas probablemente a través del epítopo HLA-A*0201. El conjunto de construcciones TetM se utilizó en el modelo de tumor de HLF. Estas construcciones contuvieron solo cuatro mutaciones: C63G y C106G en E6 ; C24G y E26G en E7. La mutación C91G en E7 (presente en las construcciones PentM) se eliminó debido a que se sabe que es parte del epítopo HLA-A*0201 que abarca los aminoácidos 86-93 de E7 (Ressing y colaboradores, J Immunol 1995, 154:5934-43; Ressing y colaboradores, Cáncer Res 1996, 56:582-8; Evans y colaboradores, Cáncer Res 1997, 57:2943-50). Mediante el uso de un algoritmo de unión de clase II (www.imtech.res.in/raghava/propred), también se determinó que existe un epítopo predicho que es promiscuo para varios alotipos de clase II entre los aminoácidos 87 y 95 de E7. Puesto que se encontró que las respuestas inmunes mediadas por la clase II eran necesarias para la eficacia terapéutica de la composición inmunógena de VRP en el modelo de tumor de C3 , la hipótesis fue que la mutación C91G presente en las construcciones de composiciones inmunógenas PentM podría interrumpir los epítopos de humano de la clase II. Materiales y Métodos Construcción y caracterización del modelo de tumor de HLF16. La línea de células tumorales HLF16 se derivó de te ido de corazón y pulmón disecado de ratones C57BL/6 transgénicos con HLA-2 Dd. Después de varias semanas en el cultivo, los fibroblastos adherentes se transformaron con un vector bicistrónico pIRES que contenía E6/E7 y H-ras activado mientras que se confería resistencia a la geneticina. El único epítopo restringido por H-2b clase I conocido del producto del gen E749-57 de HPV16 (Velders y colaboradores, Cáncer Res 1997, 61:7861-7867) se removió para asegurar que el tumor no presentaría este epítopo de E7 de HPV16 inmunodominante . Los transíectantes se seleccionaron en G418 y se expandieron de manera clonada. Los clones individuales entonces se sometieron a prueba por la expresión de HLA-A*0201 mediante el análisis FACS . Los clones que mostraron la expresión más alta de HLA-A*0201 se sometieron a prueba subsecuentemente por su capacidad para formar colonias en agar suave. El clon 16 de fibroblastos de corazón y pulmón (HLF16) mostró un crecimiento independiente del anclaje en agar suave y se seleccionó para estudios adicionales. La expresión de E7 fue evidente en el citoplasma y el núcleo de HLF16 después de la tinción inmunofluorescente con un anticuerpo monoclonal anti-E7. Para determinar si de hecho la línea HLF16 formaría tumores en ratones, los ratones transgénicos por HLA-A*0201 se inyectaron con diferentes concentraciones de células tumorales y se supervisaron durante 35 días. Todos los ratones desarrollaron tumores pero solo aquellos sometidos a prueba con la dosis más alta, 2 x 106 células HLF16, mantuvieron un tumor durante el curso de tiempo. El tumor de HLF16 surgió aproximadamente el día 5 y continuó creciendo progresivamente hasta que fue de aproximadamente 12 x 2 x 12 mm en el día 35, punto en el cual se sacrificaron los ratones. La construcción y características de la línea de células tumorales HLF16 también se describe en Eiben GL y colaboradores, (Cáncer Research, 15 de Octubre de 2002, 62, No. 20) . Ensayo en Agar Suave. La capacidad de crecimiento independiente del anclaje se determinó al valorar la eficacia de formación de colonias de las células suspendidas en agar suave. Las células transformadas y de control (0.5 x 10s, 0.25 x 10s y 0.1 x 106) se sembraron en 5 mi de agar de cubierta al 0.3% y se adicionaron a placas de 10 mm revestidas con 20 mi de agar de soporte al 0.6%. Las placas se dejaron secar y se incubaron a 37°C. Las colonias se contaron 3 semanas después de la colocación en placas. Véase también: Ratones y Líneas Celulares, Protección de Tumores y Experimentos Terapéuticos y Análisis de Inmunotransferencia Western e Inmunofluorescencia (anteriormente) . Resultados Las construcciones TetM se verificaron por la expresión mediante el análisis de inmunotransferencia Western y la inmunofluorescencia de células infectadas con BHK. Las proteínas tanto E6E7 como E7E6TetM migraron en aproximadamente 30 kDa en SDS-PAGE y tuvieron una ubicación perinuclear, difusa muy similar a las construcciones PentM. Las construcciones de composiciones inmunógenas tanto PentM como ¦ TetM se analizaron por su eficacia terapéutica para tumores en el modelo de tumor de HLF (figura 7) . Los ratones transgénicos se probaron con 2 x 106 células HLF16 por la ruta subcutánea y en los días 5, 10 y 15 después de la prueba, los ratones se inmunizaron ya sea con VRPs de GFP , VRPs de TetM o VRPs de PentM. El rechazo completo de tumores siguió a la inmunización con VRPs de E7E6TetM, mientras que las VRPs de E7E6PentM y VRPs de E6E7PentM indujeron la regresión de tumor de 90% de los ratones, excepto E6E7TetM (figura 7) . Estos resultados demuestran que la inmunización terapéutica con varias de las VRPs sometidas a prueba en este texto dio por resultado un alto grado de eficacia antitumoral dependiente de contribuciones por células T específicas para E749_57. Además, estos resultados demuestran que las funciones en las cuales E6 está en la terminal carboxi para E7 (fusiones E7E6) proporcionan una mayor protección inmune que sus contrapartes en las cuales E6 está en la terminación amino (fusiones E6E7) . A partir de los datos de eficacia terapéutica, colectiva (figuras 6 y 7) a través de los modelos de tumores de C3 y HLF16, se puede concluir que las VRPs que codifican para formas mutantes de las proteínas E6 y E7 de HPV16, sin ninguna proteína auxiliar, citocina o adyuvante, son altamente efectivas en la erradicación de tumores establecidos en murinos . Ejemplo 5: LAS VRPS QUE EXPRESAN E6 Y E7 MUTANTES NO INDUCEN LA DEGRADACIÓN DE P53 Y RB. Los niveles en régimen permanente de p53 y Rb en MECs primarias de humano se valoró después de la infección con VRPs que expresan las proteínas E6 y E7 de HPV16 de tipo silvestre, como proteínas de fusión o individuales, proteína de fusión E7E6TetM o GFP como un control negativo. Materiales y Métodos Detección de p53 y Rb. Las células epiteliales, primarias de mama de humano (MEC, Clonetics, San Diego, CA) se infectaron con VRPs que codifican para las formas de tipo silvestre o mutante de E6 y E7 en una MOI = 10 y las proteína celulares, totales se recolectaron 16-20 horas después. Para intensificar la detección p53, las células se trataron con actinomicina D 1.0 nM (Sigma, St . Louis, MO) . Veinticinco microgratnos de la proteína total se cargaron por línea, se sujetaron a la electrofóresis mediante SDS-PAGE y se inmunotransfirieron a membranas PVDF. Los análisis de inmunotransferencia Western se sondearon utilizando un anticuerpo anti-p53 (FL-393, Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA) o un anticuerpo anti-Rb (Catalogo # 554136, BD Pharmingen, San Diego, CA) . Los niveles de tubulina se supervisaron como controles de carga mediante el sondeo con un anticuerpo antitubulina (H-235, Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA) . Resultados Se determinó si una forma mutante de la proteína de fusión de E6 y E7, cuando se expresa en el contexto de la infección con VRP, inactivaría funcionalmente a p53 y Rb en comparación con las versiones de tipo silvestre de estas proteínas. La forma E7E6TetM se seleccionó debido a que demostró una alta eficacia antitumoral (figuras 6 y 7) y contuvo un número mínimo de mutaciones. Las células epiteliales, primarias de mama de humano (MEC) se infectaron con VRPs que codifican para la proteína E6 de HPV16 sola, la proteína E7 sola, E7E6 de tipo silvestre o E7E6TetM. Aproximadamente veinte horas después de la infección con una MOI = 10 de cada una de estas VRPs, los lisados de celular que contenían cantidades equivalentes de proteína células, total se sometieron a la electrofóresis mediante SDS-PAGE, se transfirieron a membranas PVDF y se sondearon con anticuerpos específicos para p53 (figura 8A) , Rb (figura 8B) y tubulina como un control de carga. Los resultados de estos análisis de inmunctransferencia Western se muestran en las figuras 8A y 8B y son representativos de experimentos independientes . Las MEC infectadas con VRPs que codifica la proteína E6 sola o la proteína de fusión E7E6 de tipo silvestre contuvieron niveles indetectables de p53 en contraste con las MEC infectadas con E7E6TetM, las cuales contuvieron niveles de p53 comparables con las muestras infectadas con GFP-VRP de control negativo (figura 8A) . Las MEC infectadas con VRPs que codifican para la proteína E7 sola o la proteína de fusión E7E6 de tipo silvestre contuvieron niveles indetectables de Rb en contraste con las MEC infectadas con VRPs de E7E6TetM o GFP-VRPs (figura 8B) . La presencia de una proteína de fusión que contiene E7 en las muestras infectadas con VRP de E7E6 de tipo silvestre y E7E6TetM se verificó mediante el sondeo de esas líneas con un anticuerpo monoclonal anti-E7 (figuras 8A y B) . Los resultados muestran que los niveles de p53 y Rb son excesivamente disminuidos en las MEC primarias que expresan las versiones de tipo silvestre de .E6 y E7 en el contexto de una infección con VRP pero son normales en las MEC que expresan E7E6TetM después de la infección con VRP. En resumen, la infección con VRP de MEC reveló niveles excesivamente reducidos de P53 y Rb en cultivos que contenían las formas de tipo silvestre de E6 y E7 , respectivamente; la fusión simple de E7 a E6 no fue suficiente para proporcionar la actividad de cualquier proteína (figuras 8A y B) . En contraste, las MEC infectadas con VRPs de E7E6TetM que contenían las mutaciones de E6 (63C y 106C) y E7 (24C y 26E) contuvieron niveles normales de p53 y Rb (figuras 8A y B) , lo que indica que estas cuatro mutaciones extinguieron la actividad oncogénica, primaria de estas proteínas. Una valoración del potencial de inmortalización de las VRPs de E7E6TetM reveló que las MEC murieron después de la infección, lo cual es una consecuencia esperada de la expresión de proteínas no estructurales de AV expresadas por replicones (Griffith y colaboradores, Annu. Rev. Microbiol . 1997, 51:565- 592) y soporta además la seguridad de este vector. * * * * * La presente invención no está limitada en cuanto a su alcance por las modalidades específicas que se describen en este texto. En realidad, varias modificaciones de la invención además de aquellas descritas en este texto llegarán a ser aparentes para aquellas personas expertas en el campo a partir de la descripción anterior y las figuras que la acompañan. Se propone que estas modificaciones se encuentren dentro del alcance de las reivindicaciones anexas. Numerosas referencias, inclusive patentes, solicitudes de patente y diversas publicaciones, se citan y se discuten en la descripción de esta invención. La citación y/o discusión de estas referencias se proporciona únicamente para clarificar la descripción de la presente invención y no es una admisión que alguna de estas referencias sea "la técnica anterior" para la invención descrita en este texto. Todas las referencias citadas y/o discutidas en esta especificación son incorporadas en este texto a manera de referencia en su totalidad y al mismo grado como si cada referencia fuera incorporada individualmente a manera de referencia. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES
Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Un polipéptido que comprende los polipéptidos de E6 y E7 del virus de papiloma humano, caracterizado porque el polipéptido de E7 tiene mutaciones en cualquiera de uno o más de los aminoácidos correspondientes a los aminoácidos 24, 26 o 91 de la SEC ID NO: 14 y el polipéptido de E6 no tiene mutaciones o tiene mutaciones en cualquiera de uno o más de los aminoácidos correspondientes a los aminoácidos 63 o 106 de la SEC ID NO: 13. 2. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque los aminoácidos mutados son mutados a glicina.
3. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido de E7 precede al polipéptido de E6.
4. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el polipéptido de E7 precede al polipéptido de E6.
5. Un ácido nucleico, aislado, caracterizado porque codifica el polipéptido de conformidad con la reivindicación 1.
6. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la secuencia de nucleótidos de E7 precede a la secuencia de nucleótidos de E6.
7. Un vector de expresión, caracterizado porque comprende la secuencia de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 5, bajo el control de una secuencia de control de expresión.
8. Una célula hospedera, caracterizada porque comprende el ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 5.
9. Una célula hospedera, caracterizada porque expresa el polipéptido de conformidad con la reivindicación 1.
10. Una célula hospedera, caracterizada porque comprende el vector de expresión de conformidad con la reivindicación 7.
11. Una composición inrnunógena, caracterizada porque comprende : (a) el polipéptido de conformidad con la reivindicación 1; y (b) un portador farmacéuticamente aceptable.
12. La composición inrnunógena de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque además comprende un adyuvante .
13. Una composición inrnunógena, caracterizada porque comprende el ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 5.
14. Un virus recombinan e , caracterizado porque comprende el ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 5.
15. El virus recombinante de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el virus es un virus de encefalitis equina de Venezuela modificado.
16. Un método para producir una respuesta inmune en un individuo, caracterizado porque comprende administrar al individuo la composición inmunógena de conformidad con la reivindicación 11 en una cantidad suficiente para producir la respuesta inmune.
17. Un método para tratar el cáncer cervical, caracterizado porque comprende administrar a un paciente diagnosticado con cáncer cervical la composición inmunógena de conformidad con la reivindicación 11 en una cantidad suficiente para producir una respuesta inmune, protectora.
18. Un método para prevenir el cáncer cervical, caracterizado porque comprende administrar a un individuo la composición inmunógena de conformidad con la reivindicación 11 en una cantidad suficiente para producir una respuesta inmune, protectora .
19. Un método para prevenir el cáncer cervical, caracterizado porque comprende administrar a un individuo el vector de expresión de conformidad con la reivindicación 7 en una cantidad suficiente para producir una respuesta inmune, protectora.
20. Un método para tratar el cáncer cervical, caracterizado porque comprende administrar a un paciente diagnosticado con cáncer cervical el vector de expresión de conformidad con la reivindicación 7 en una cantidad suficiente para producir una respuesta inmune, protectora.
21. El polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido de E7 tiene mutaciones en al menos dos de los aminoácidos correspondientes a los aminoácidos 24, 25 y 91 de la SEC ID NO: 14 y el polipéptido de E6 tiene una o más mutaciones en los aminoácidos correspondientes a los aminoácidos 63 y 106 de la SEC ID NO: 13.
22. Un polipéptido aislado, caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 5, SEC ID NO : 9 O SEC ID NO: 11.
23. Un ácido nucleico, aislado caracterizado porque codifica para un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 9 o SEC ID NO: 11.
24. El ácido nucleico, aislado, de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque tiene la secuencia de nucleotidos expuesta en las SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 10 o SEC ID NO: 12.
25. Un vector de expresión, caracterizado porque comprende la secuencia de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 23 bajo el control de una secuencia de control de expresión.
26. Un vector de expresión, caracterizado porque comprende la secuencia de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 24 bajo el control de una secuencia de control de expresión.