JP2002505849A - ビルレンス関連核酸配列およびその使用 - Google Patents

ビルレンス関連核酸配列およびその使用

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フレデリック オズベル
ハワード エム． グッドマン
ローレンス ジー． ラーム
シャリナ マハジャーン−ミクロス
マン−ワー タン
フイ カオ
エリアナ ドレンカード
ジョン サンガリス
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ザ ジュネラル ホスピタル コーポレーション
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Abstract

(57)【要約】 細菌ビルレンスポリペプチドおよび該ポリペプチドをコードする核酸配列、ならびに組換え技術によって該ポリペプチドを製造する方法について開示する。同様に抗菌または静菌化合物をスクリーニングするために該ポリペプチドを使用する方法も提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 発明の背景 本発明は、微生物の病原性に関連する核酸分子、遺伝子およびポリペプチドに
関する。
【０００２】 病原体は感染症を引き起こすため、および時にその宿主に疾患を引き起こすた
めに多くの遺伝子戦略を用いる。微生物の病原性の発現は複雑な遺伝子調節回路
に依存する。微生物の病原性における話題を知ることは、病原体のビルレンス作
用機序を理解するために、そして感染症および疾患に対抗するために必要な新規
「抗ビルレンスまたは抗病原性」薬剤を開発するために必要である。
【０００３】 一つの特定の例において、ヒトの日和見病原体である緑膿菌（Pseudomonas ae
ruginosa）は、土壌、水および植物から単離される広く存在するグラム陰性菌で
ある（パレロニ（Palleroni, J. N.）、「ベルゲイの系統細菌学マニュアル（Be
rgey's Manual of Systematic Bacteriology）」、ホルト（J. G. Holt）編、ウ
ィリアム＆ウィルキンス、バルチモア、メリーランド州、141〜172頁、1984）。
多様な緑膿菌（P. aeruginosa）ビルレンス因子が記述されており、これらの大 部分はエンドトキシンA、エラスターゼ、およびホスホリパーゼCのように、当初
その細胞障害活性に基づいて生化学的に検出された（フィンク（Fink, R. B.） 、「日和見感染菌緑膿菌：発病と疾患（Pseudomonas aeruginosa the Opportuni
st：Pathogenesis and Disease）」、Boca Raton, CRCプレスインク、1993）。 その後、これらの因子に対応する遺伝子またはこれらの因子の発現を調節する遺
伝子が同定された。一般に、哺乳類細菌病原体において最も病原性に関連してい
る遺伝子は、当初バイオアッセイを用いて検出された。哺乳類の病原体とは対照
的に、植物病原体では病原性関連遺伝子を同定するために単純な系統的遺伝子戦
略をルーチンとして用いている。無作為トランスポゾン媒介変異誘発後、植物病
原体の何千もの変異クローンを個々の植物に個別に接種して、それらが宿主との
病原性相互作用に影響を及ぼす変異を含むか否かを決定する（バウチャー（Bouc
her）ら、J. Bacteriol. 168：5626〜5623、1987；コマイ＆コスゲ（Comai and
Kosuge）、J. Bacteriol. 149：40〜46、1982；リンドグレン（Lindgern）ら、J
. Bactteriol. 168：512〜522、1986；ラーム（Rahme）ら、J. Bacteriol. 173 ：575〜586、1991；ウィリス（Willis）ら、Mol. Plant-Microbe Interact.3：1
49〜156、1990）。動物全身の哺乳類病原性モデルを用いた比較実験は、病原体 の攻撃に供されなければならない動物が莫大な数であるため、実現可能でない。
【０００４】 発明の概要 本発明者らは、病原体に病原性およびビルレンスを付与することに関係する多
くの核酸分子、ポリペプチド、および小分子（例えば、フェナジン）を同定して
特徴を調べた。したがって、この発見は、例えば病原性遺伝子発現のスイッチを
選択的に入れるもしくは切ることによって病原体の病原性およびビルレンスを遮
断することができる、または微生物の病原性に関係するポリペプチドの活性を不
活化もしくは阻害する、「抗ビルレンス」剤の評価および同定をねらいとした薬
物スクリーニングアッセイの基礎となる。これらの分子をターゲティングする薬
剤は、そのような抗ビルレンス剤として有用である。
【０００５】 一つの局面において、本発明は以下のいずれか１つと実質的に同一である配列
を含む単離核酸分子を特徴とする： B148 (配列番号:1)、ORF2 (配列番号:2)、ORF3 (配列番号:4)、ORF602c (配列番
号:6)、ORF214 (配列番号:8)、ORF1242c (配列番号:10)、ORF594 (配列番号:12)
、ORF1O40 (配列番号:14)、ORF1640c (配列番号:16)、ORF2228c (配列番号:18) 、ORF2068c (配列番号:20)、ORF1997 (配列番号:22)、ORF2558c (配列番号:24) 、ORF2929c (配列番号:26)、ORF3965c (配列番号:28)、ORF3218 (配列番号:30) 、ORF3568 (配列番号:32)、ORF4506c (配列番号:34)、ORF3973 (配列番号:36)、
ORF4271 (配列番号:38)、ORF4698 (配列番号:40)、ORF5O28 (配列番号:42)、ORF
5O80 (配列番号:44)、ORF6479c (配列番号:46)、ORF5496 (配列番号:48)、ORF58
40 (配列番号:50)、ORF5899 (配列番号:52)、ORF6325 (配列番号:54)、ORF7567c
(配列番号:56)、ORF7180 (配列番号:58)、ORF7501 (配列番号:60)、ORF7584 ( 配列番号:62)、ORF8208c (配列番号:64)、ORF8109 (配列番号:66)、ORF9005c ( 配列番号:68)、ORF8222 (配列番号:70)、ORF8755c (配列番号:72)、ORF9431c ( 配列番号:74)、ORF9158 (配列番号:76)、ORF1O125c (配列番号:78)、ORF9770 ( 配列番号:80)、ORF9991 (配列番号:82)、ORF1O765c (配列番号:84)、ORF1O475 (
配列番号:86)、ORF11095c (配列番号:88)、ORF11264 (配列番号:90)、ORF11738
(配列番号:92)、ORF12348c (配列番号:94)、ORF12314c (配列番号:96)、ORF1315
6c (配列番号:98)、ORF12795 (配列番号:100)、ORF13755c (配列番号:210)、ORF
13795c (配列番号:212)、ORF14727c (配列番号:214)、ORF13779 (配列番号:216)
、ORF14293c (配列番号:218)、ORF14155 (配列番号:220)、ORF14360 (配列番号:
222)、ORF15342c (配列番号:224)、ORF15260c (配列番号:226)、ORF14991 (配列
番号:228)、ORF15590c (配列番号:230)、ORF15675c (配列番号:232)、ORF16405
(配列番号:234)、ORF16925 (配列番号:236)、ORF17793c (配列番号:238)、ORF18
548c (配列番号:240)、ORF17875 (配列番号:242)、ORF18479 (配列番号:244)、O
RF19027c (配列番号:246)、ORF19305 (配列番号:248)、ORF19519 (配列番号:250
)、ORF19544 (配列番号:252)、ORF20008 (配列番号:254)、ORF20623c (配列番号
:256)、ORF21210c (配列番号:258)、ORF21493c (配列番号:260)、ORF21333 (配 列番号:262)、ORF22074c (配列番号:264)、ORF21421 (配列番号:266)、ORF22608
c (配列番号:268)、ORF22626 (配列番号:270)、ORF23228 (配列番号:272)、ORF2
3367 (配列番号:274)、ORF25103c (配列番号:276)、ORF23556 (配列番号:278)、
ORF26191c (配列番号:280)、ORF23751 (配列番号:282)、ORF24222 (配列番号:28
4)、ORF24368 (配列番号:286)、ORF24888c (配列番号:288)、ORF25398c (配列番
号:290)、ORF25892c (配列番号:292)、ORF25110 (配列番号:294)、ORF25510 (配
列番号:296)、ORF26762c (配列番号:298); ORF26257 (配列番号:300)、ORF26844
c (配列番号:302)、ORF26486 (配列番号:304)、ORF26857c (配列番号:306)、ORF
27314c (配列番号:308)、ORF27730c (配列番号:310)、ORF26983 (配列番号:312)
、ORF28068c (配列番号:314)、ORF27522 (配列番号:316)、ORF28033c (配列番号
:318)、ORF29701c (配列番号:320)、ORF28118 (配列番号:322)、ORF28129 (配列
番号:324)、ORF29709c (配列番号:326)、ORF29189 (配列番号:328)、ORF29382 (
配列番号:330)、ORF30590c (配列番号:332)、ORF29729 (配列番号:334)、ORF302
21 (配列番号:336)、ORF30736c (配列番号:338)、ORF30539 (配列番号:340)、OR
F31247c (配列番号:342)、ORF31539c (配列番号:346)、ORF31222 (配列番号:348
)、ORF31266 (配列番号:350)、ORF31661c (配列番号:352)、ORF32061c (配列番 号:354)、ORF32072c (配列番号:356)、ORF31784 (配列番号:358)、ORF32568c ( 配列番号:360)、ORF33157c (配列番号:362)、ORF32539 (配列番号:364)、ORF337
05c (配列番号:366)、ORF32832 (配列番号:368)、ORF33547c (配列番号:370)、O
RF33205 (配列番号:372)、ORF33512 (配列番号:374)、ORF33771 (配列番号:376)
、ORF34385c (配列番号:378)、ORF33988 (配列番号:380)、ORF34274 (配列番号:
382)、ORF34726c (配列番号:384)、ORF34916 (配列番号:386)、ORF35464c (配列
番号:388)、ORF35289 (配列番号:390)、ORF35410 (配列番号:392)、ORF35907c (
配列番号:394)、ORF35534 (配列番号:396)、ORF35930 (配列番号:398)、ORF3624
6 (配列番号:400)、ORF26640c (配列番号:402)、ORF36739 (配列番号:404)、ORF
37932c (配列番号:406)、ORF38640c (配列番号:408)、ORF39309c (配列番号:410
)、ORF38768 (配列番号:412)、ORF40047c (配列番号:414)、ORF40560c (配列番 号:416)、ORF40238 (配列番号:418)、ORF40329 (配列番号:420)、ORF40709c (配
列番号:422)、ORF40507 (配列番号:424)、ORF41275c (配列番号:426)、ORF42234
c (配列番号:428)、ORF41764c (配列番号:430)、ORF41284 (配列番号:432)、ORF
41598 (配列番号:434)、ORF42172c (配列番号:436)、ORF42233c (配列番号:438)
、33A9 (配列番号:102、189、190、191、192、193、194、195、196、197、およ び198)、34B12 (配列番号:104)、34B12-ORF1 (配列番号:105)、34B12-ORF2 (配 列番号:106)、36A4 (配列番号:109)、36A4 contig (配列番号:111)、23A2 (配列
番号:112)、3E8 phn(-)(配列番号:114)、3E8 contigPAO1 (配列番号:115)、34H4
(配列番号:118)、33C7 (配列番号:119)、25a12.3 (配列番号:120)、8C12 (配列
番号:121)、2A8 (配列番号:122)、41A5 (配列番号:123)、50E12 (配列番号:124)
、35A9 (配列番号:125)、pho23 (配列番号:126)、16G12 (配列番号:127)、25F1
(配列番号:128)、PA14 degP (配列番号:131)、1126 contig (配列番号:135)、co
ntig 1344 (配列番号:136)、ORFA (配列番号:440)、ORFB (配列番号:441)、ORFC
(配列番号:442)、phzR (配列番号:164)、および1G2 (配列番号:137)。 好まし くは、単離核酸分子は上記配列またはその断片のいずれかを含み、しかも病原体
（例えば、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）のような細菌病原体）に由来する
。さらに、本発明は、そのそれぞれが本発明の単離核酸分子の少なくとも１つを
含むベクターおよび細胞；ならびに細胞において発現される位置に存在する本発
明の核酸分子によって形質転換した細胞を提供する段階、形質転換した細胞を核
酸分子を発現させる条件で培養する段階、および組換え型ポリペプチドを単離す
る段階を含む、組換え型ポリペプチドを産生する方法を含む。本発明はさらに、
本発明の単離核酸分子のそのような発現によって産生された組換え型ポリペプチ
ド、およびそのような組換え型ポリペプチドを特異的に認識して結合する実質的
に純粋な抗体を特徴とする。
【０００６】 もう一つの局面において、本発明は以下のいずれか１つのアミノ酸配列と実質
的に同一であるアミノ酸配列を含む実質的に純粋なポリペプチドを特徴とする：
ORF2 (配列番号:3)、ORF3 (配列番号:5)、ORF602c (配列番号:7)、ORF214 (配列
番号:9)、ORF1242c (配列番号:11)、ORF594 (配列番号:13)、ORF1O40 (配列番号
:15)、ORF1640c (配列番号:17)、ORF2228c (配列番号:19)、ORF2068c (配列番号
:21)、ORF1997 (配列番号:23)、ORF2558c (配列番号:25)、ORF2929c (配列番号:
27)、ORF3965c (配列番号:29)、ORF3218 (配列番号:31)、ORF3568 (配列番号:33
)、ORF4506c (配列番号:35)、ORF3973 (配列番号:37)、ORF4271 (配列番号:39) 、ORF4698 (配列番号:41)、ORF5O28 (配列番号:43)、ORF5O80 (配列番号:45)、O
RF6479c (配列番号:47)、ORF5496 (配列番号:49)、ORF5840 (配列番号:51)、ORF
5899 (配列番号:53)、ORF6325 (配列番号:55)、ORF7567c (配列番号:57)、ORF71
80 (配列番号:59)、ORF7501 (配列番号:61)、ORF7584 (配列番号:63)、ORF8208c
(配列番号:65)、ORF8109 (配列番号:67)、ORF9005c (配列番号:69)、ORF8222 (
配列番号:71)、ORF8755c (配列番号:73)、ORF9431c (配列番号:75)、ORF9158 ( 配列番号:77)、ORF10125c (配列番号:79)、ORF9770 (配列番号:81)、ORF9991 ( 配列番号:83)、ORF1O765c (配列番号:85)、ORF10475 (配列番号:87)、ORF11095c
(配列番号:89)、ORF11264 (配列番号:91)、ORF11738 (配列番号:93)、ORF12348
c (配列番号:95)、ORF12314c (配列番号:97)、ORF13156c (配列番号:99)、ORF12
795 (配列番号:101)、ORF13755c (配列番号:211)、ORF13795c (配列番号:213)、
ORF14727c (配列番号:215)、ORF13779 (配列番号:217)、ORF14293c (配列番号:2
19)、ORF14155 (配列番号:221)、ORF14360 (配列番号:223)、ORF15342c (配列番
号:225)、ORF15260c (配列番号:227)、ORF14991 (配列番号:229)、ORF15590c ( 配列番号:231)、ORF15675c (配列番号:233)、ORF16405 (配列番号:235)、ORF169
25 (配列番号:237)、ORF17793c (配列番号:239)、ORF18548c (配列番号:241)、O
RF17875 (配列番号:243)、ORF18479 (配列番号:245)、ORF19027c (配列番号:247
)、ORF19305 (配列番号:249)、ORF19519 (配列番号:251)、ORF19544 (配列番号:
253)、ORF20008 (配列番号:255)、ORF20623c (配列番号:257)、ORF21210c (配列
番号:259)、ORF21493c (配列番号:261)、ORF21333 (配列番号:263)、ORF22074c
(配列番号:265)、ORF21421 (配列番号:267)、ORF22608c (配列番号:269)、ORF22
626 (配列番号:271)、ORF23228 (配列番号:273)、ORF23367 (配列番号:275)、OR
F25103c (配列番号:277)、ORF23556 (配列番号:279)、ORF26191c (配列番号:281
)、ORF23751 (配列番号:283)、ORF24222 (配列番号:285)、ORF24368 (配列番号:
287)、ORF24888c (配列番号:289)、ORF25398c (配列番号:291)、ORF25892c (配 列番号:293)、ORF25110 (配列番号:295)、ORF25510 (配列番号:297)、ORF26762c
(配列番号:299)、ORF26257 (配列番号:301)、ORF26844c (配列番号:303)、ORF2
6486 (配列番号:305)、ORF26857c (配列番号:307)、ORF27314c (配列番号:309) 、ORF27730c (配列番号:311)、ORF26983 (配列番号:313)、ORF28068c (配列番号
:315)、ORF27522 (配列番号:317)、ORF28033c (配列番号:319)、ORF29701c (配 列番号:321)、ORF28118 (配列番号:323)、ORF28129 (配列番号:325)、ORF29709c
(配列番号:327)、ORF29189 (配列番号:329)、ORF29382 (配列番号:331)、ORF30
590c (配列番号:333)、ORF29729 (配列番号:335)、ORF30221 (配列番号:337)、O
RF30736c (配列番号:339)、ORF30539 (配列番号:341)、ORF31247c (配列番号:34
3)、ORF30963c (配列番号:345)、ORF31539c (配列番号:347)、ORF31222 (配列番
号:349)、ORF31266 (配列番号:351)、ORF31661c (配列番号:353)、ORF32061c ( 配列番号:355)、ORF32072c (配列番号:357)、ORF31784 (配列番号:359)、ORF325
68c (配列番号:361)、ORF33157c (配列番号:363)、ORF32530 (配列番号:365)、O
RF33705c (配列番号:367)、ORF32832 (配列番号:369)、ORF33547c (配列番号:37
1)、ORF33205 (配列番号:373)、ORF33512 (配列番号:375)、ORF33771 (配列番号
:377)、ORF34385c (配列番号:379)、ORF33988 (配列番号:381)、ORF34274 (配列
番号:383)、ORF34726c (配列番号:385)、ORF34916 (配列番号:387)、ORF35464c
(配列番号:389)、ORF35289 (配列番号:391)、ORF35410 (配列番号:393)、ORF359
07c (配列番号:395)、ORF35534 (配列番号:397)、ORF35930 (配列番号:399)、OR
F36246 (配列番号:401)、ORF26640c (配列番号:403)、ORF36769 (配列番号:405)
、ORF37932c (配列番号:407)、ORF38640c (配列番号:409)、ORF39309c (配列番 号:411)、ORF38768 (配列番号:413)、ORF40047c (配列番号:415)、ORF40560c ( 配列番号:417)、ORF40238 (配列番号:419)、ORF40329 (配列番号:421)、ORF4070
9c (配列番号:423)、ORF40507 (配列番号:425)、ORF41275c (配列番号:427)、OR
F42234c (配列番号:429)、ORF41764c (配列番号:431)、ORF41284 (配列番号:433
)、ORF41598 (配列番号:435)、ORF42172c (配列番号:437)、ORF42233c (配列番 号:439)、33A9 (配列番号:103、199、200、201、202、203、204、205、206、207
、および208)、34B12-ORF1 (配列番号:107)、34B12-ORF2 (配列番号:108)、36A4
(配列番号:11O)、3E8phzA (配列番号:116)、3E8phzB (配列番号:117)、PhzR ( 配列番号:165)、ORFA (配列番号:443)、ORFB (配列番号:444)、ORFC (配列番号:
445)、およびPA14 degP (配列番号:132)。好ましくは、実質的に純粋なポリペプ
チドは、上記配列またはその断片のいずれかを含み、しかも病原体（例えば、緑
膿菌（Pseudomonas aeruginosa）のような細菌病原体）に由来する。
【０００７】 さらに別の関連する局面において、本発明は、（a）本発明の単離核酸分子の いずれか１つを発現する病原性細胞を提供する段階；および（b）候補化合物と の接触後に核酸分子の発現が減少すれば病原性ビルレンス因子の発現を減少させ
る化合物であることが同定される、病原性細胞を候補化合物と接触させる段階を
含む、病原性ビルレンス因子の発現を減少させることができる（例えば、転写ま
たは転写後レベルで）化合物を同定する方法を特徴とする。好ましい態様におい
て、病原性細胞は哺乳類（例えば、ヒト）または植物に感染する。
【０００８】 さらにもう一つの関連する局面において、本発明は、（a）候補化合物を、本 発明のアミノ酸配列のいずれかを含む実質的に純粋なポリペプチドと、結合を可
能にする条件下で接触させる段階；および（b）候補化合物とポリペプチドとの 結合を検出する段階を含む、ポリペプチドに結合する化合物を同定する方法を特
徴とする。
【０００９】 さらに、本発明は（a）病原体感染を有する哺乳類を同定する段階；および（b
）本発明の核酸分子のいずれか１つによってコードされるポリペプチドの発現ま
たは活性を阻害する組成物の治療的有効量を哺乳類に投与する段階を含む、哺乳
類における病原体感染症を治療する方法を特徴とする。好ましい態様において、
、病原体は緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）である。
【００１０】 さらにもう一つの局面において、本発明は、（a）病原体感染症を有する哺乳 類を同定する段階；および（b）本発明のアミノ酸配列のいずれか１つによって コードされるポリペプチドに結合してこれを阻害する組成物の治療的有効量を哺
乳類に投与する段階を含む、哺乳類における病原体感染症を治療する方法を特徴
とする。好ましい態様において、病原体感染症は緑膿菌（Pseudomonas aerugino
sa）によって引き起こされる。
【００１１】 その上、本発明は、（a）シュードモナス（Pseudomonas）細胞を提供する段階
；（b）細胞を候補化合物に接触させる段階；および（c）無処置対照培養と比較
してフェナジンが減少すれば、本化合物がシュードモナス（Pseudomonas）細胞 のビルレンスを阻害することが示される、フェナジンの存在を検出する段階を含
む、シュードモナス（Pseudomonas）細胞のビルレンスを阻害する化合物を同定 する方法を特徴とする。好ましい態様において、細胞は緑膿菌（Pseudomonas ae
ruginosa）であり；細胞は細胞培養中に存在し；およびフェナジンは分光法によ
って検出される（例えば、吸光度520 nmでピオシアニンを検出する）。ピオシア
ニンは標準的な方法、例えば本明細書に記述の方法に従って一般的に検出される
。
【００１２】 「単離核酸分子」とは、本発明の核酸分子がそれに由来する生物に本来存在す
るゲノムにおいてその遺伝子に隣接する遺伝子を含まない核酸（例えばDNA）を 意味する。従って、この用語には、例えば、ベクター；自律的に複製するプラス
ミドもしくはウイルス；または原核生物もしくは真核生物のゲノムDNA、に組み 入れられた組換え型DNA；または他の配列とは無関係な異なる分子（例えば、cDN
A、ゲノムDNA、またはPCRもしくは制限エンドヌクレアーゼ消化によって生じたc
DNA断片）として存在する組換え型DNAが含まれる。さらに、この用語には、DNA 分子から転写されたRNA分子と共に、さらなるポリペプチド配列をコードするハ イブリッド遺伝子の一部である組換え型DNAが含まれる。
【００１３】 「ポリペプチド」とは、長さまたは翻訳後改変（例えばグリコシル化、または
燐酸化）によらず、アミノ酸のいかなる鎖も意味する。
【００１４】 「実質的に純粋なポリペプチド」とは、それが本来伴う化合物から分離されて
いる本発明のポリペプチドを意味する。典型的に、ポリペプチドはそれが本来会
合している蛋白質および天然に存在する有機分子を重量で少なくとも60％含まな
い場合に、実質的に純粋である。好ましくは、調製物は本発明のポリペプチドが
重量で少なくとも75％、より好ましくは少なくとも90％、および最も好ましくは
少なくとも99％である。本発明の実質的に純粋なポリペプチドは、例えば天然源
（例えば病原体）からの抽出；そのようなポリペプチドをコードする組換え型核
酸の発現；または蛋白質の化学合成によって得てもよい。純度は如何なる適当な
方法、例えばカラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、ま
たはHPLC分析によっても測定することができる。
【００１５】 「実質的に同一」とは、基準アミノ酸配列（例えば本明細書に記述のアミノ酸
配列のいずれか１つ）または核酸配列（例えば、本明細書に記述の核酸配列のい
ずれか１つ）と少なくとも25％同一性を示すポリペプチドまたは核酸分子を意味
する。好ましくは、そのような配列は比較のために用いられる配列に対してアミ
ノ酸レベルまたは核酸レベルで少なくとも30％、40％、50％、60％、より好まし
くは80％、および最も好ましくは90％、または95％でさえ同一である。
【００１６】 配列同一性は典型的に、配列分析ソフトウェア（例えば、ウィスコンシン州53
705マディソン、ユニバーシティアベニュー1710にある、ウィスコンシン大学バ イオテクノロジーセンターの配列分析ソフトウェアパッケージ、BLAST、BESTFIT
、GAP、またはPILEUP/PRETTYBOXプログラム）を用いて測定する。そのようなソ フトウェアは、様々な置換、欠失、および／またはその他の改変に相同性の程度
を割付することによって同一または類似の配列をマッチさせる。保存的置換は典
型的に以下のグループ内での置換を含む：グリシン、アラニン；バリン、イソロ
イシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン
；セリン、トレオニン；リジン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシ
ン。同一性の程度を決定するための一例としてのアプローチでは、BLASTプログ ラムを用い、確率スコアがe3〜e-100であれば、密接に関連した化合物であるこ とが示される。
【００１７】 「形質転換細胞」とは、本発明のポリペプチドをコードするDNA分子（本明細 書において用いられるように）が組換え型DNA技法によって導入された（または その祖先の中に導入された）細胞を意味する。
【００１８】 「発現される位置に存在する」とは、配列の転写および翻訳を指示するDNA配 列（すなわち、例えば本発明の組換え型ポリペプチド、またはRNA分子の産生を 促進する）に隣接してDNA分子が存在することを意味する。
【００１９】 「精製抗体」とは、それが本来会合している蛋白質および天然に存在する有機
分子を重量で少なくとも60％含まない抗体を意味する。好ましくは調製物は抗体
の重量が少なくとも75％、より好ましくは90％、および最も好ましくは少なくと
も99％である。本発明の精製抗体は、例えば、本発明の組換え型産生ポリペプチ
ドおよび標準的な技法を用いたアフィニティクロマトグラフィーによって得ても
よい。
【００２０】 「特異的に結合する」とは、本発明のポリペプチドを認識して結合するが、試
料中、例えば本発明のポリペプチドを本来含む生体試料中において、他の分子を
実質的に認識せず、しかも結合しない化合物または抗体を意味する。
【００２１】 「由来する」とは、天然に存在する配列の配列から単離されたこと、またはそ
の配列を有することを意味する（例えば、cDNA、ゲノムDNA、合成、またはその 組合せ）。
【００２２】 「病原体を阻害する」とは、候補化合物が、病原体媒介疾患の発症もしくは進
行または真核宿主生物における感染症を、減少、抑制、減弱、減少または停止さ
せることができることを意味する。好ましくは、そのような阻害は、適当な病原
性アッセイ（例えば、本明細書に記述のアッセイ））において候補化合物の非存
在下での症状と比較して、病原性を少なくとも５％、より好ましくは少なくとも
25％、および最も好ましくは少なくとも50％減少させる。一つの特定の例におい
て、阻害は候補化合物または抽出物に暴露した宿主生物における病原性症状をモ
ニターし、化合物に暴露されていない宿主生物における病原性症状のレベルと比
較して、症状レベルが減少すれば、病原体の化合物媒介阻害が示されることによ
って測定してもよい。
【００２３】 「病原性ビルレンス因子」とは、それがなければ病原体が真核宿主生物におい
て疾患または感染症を引き起こすことができない細胞成分（転写因子のような蛋
白質と共に、そのような蛋白質をコードする遺伝子）を意味する。
【００２４】 本発明は、微生物の病原性を特異的に遮断する薬剤を開発するために有用な多
数の標的を提供する。さらに、本発明の方法は、真核宿主生物に用いて安全で（
すなわち、生物の通常の発達および生理に有害な影響を及ぼさない化合物）、し
かも病原性微生物に対して有効である（すなわち、病原体のビルレンスを抑制す
ることによって）化合物を同定する容易な手段を提供する。さらに、本発明の方
法は、大量に処理でき、高感度で、しかも複雑でない、抗ビルレンス作用に関し
て実質的に如何なる数の化合物も分析する経路を提供する。方法はまた、比較的
安価に行うことができ、精製型または粗抽出型のいずれかにおいて認められる少
量の活性物質の分析を行うことができる。
【００２５】 本発明のその他の特徴および利点は詳細な説明および特許請求の範囲から明ら
かとなると思われる。
【００２６】詳細な説明 ビルレンス因子の同定と特徴付け 本明細書に記述するように、ヒト日和見病原菌である緑膿菌（Pseudomonas ae
ruginosa）のビルレンス因子を同定するインビボ病原性モデルとして植物を用い
た。病原性が低い変異体に関して、植物の葉アッセイにおいて同定された緑膿菌
（P. aeruginosa）株UCBPP-PA14のTnphoA変異体誘導体９個中９個が、マウス火 傷アッセイにおいても病原性の有意な減少を示し、このことは緑膿菌（P. aerug
inosa）が両宿主を感染させるために多くの共通した戦略を利用していることを 示唆している。これらの変異体９個中７個はこれまで未知の遺伝子にTnphoA挿入
部を含んだ。これらの結果は、哺乳類の病原性に関係する新規細菌ビルレンス因
子を同定するインビボ高処理スクリーニングに、代用としてヒト細菌病原体の非
脊椎動物宿主を用いることができることを示している。これらの実験の例は説明
する目的であって、請求の範囲に示す本発明の範囲を制限すると解釈されない。
【００２７】 これらの実験は以下の技法を用いて実施した。
【００２８】 株、増殖条件およびプラスミド 緑膿菌（P. aeruginosa）株UCBPP-PA14はヒ ト臨床単離菌であり、これを新規ビルレンス関連遺伝子の同定のためにこれらの
実験において用い（アウスユベール（Ausubel）ら、「感染症または病原性の予 防に有用な化合物のスクリーニング法（Methods of Screening Compounds Usefu
l for Prevention of Infection or Pathogenicity）」、1995年３月25日、1997
年５月７日、および1997年11月３日にそれぞれ提出されたUSSN第 08/411,560号 、第08/852,927号、および第08/962,750号；ラーム（Rahme）ら、Science 268：
1899〜1902、1995）、および緑膿菌（P. aeruginosa）株PAK（イシモト＆ローリ
ー（Ishimoto and Lory）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86：1954〜1957、1989
）およびPAO1（ホロウェイ（Holloway）ら、Microbiol. Rev. 43：73〜102、197
9）は、多くの研究室において広く研究されている。緑膿菌（P. aeruginosa）お
よび大腸菌株の37℃での増殖には、ルリア・ベルタニブロスおよび寒天を用いた
。緑膿菌（P. aeruginosa）の増殖には最小培地（M9）も用いた。
【００２９】 トランスポゾン変異誘発 UCBPP-PA14のトランスポゾン媒介変異誘発は、大腸
菌株SM10λpirにおいて自殺プラスミドpRT731上に存在するTnphoAを用いて実施 した。この培地で増殖したドナーおよびレシピエント細胞をルリアベルタニ寒天
プレート上に播種して、37℃で８〜10時間インキュベートし、その後リファンピ
シン（100 μg/ml）（大腸菌ドナー細胞を選択するため）およびカナマイシン（
200 μg/ml）（TnphoAを含む緑膿菌（P. aeruginosa）細胞を選択するため）を 含むルリア・ベルタニプレート上に播種した。リファンピシンおよびカナマイシ
ン培地上で増殖したコロニーをアンピシリン（300 μg/ml）を含むルリア・ベル
タニで複製させた；アンピシリン耐性コロニーはUCBPP-PA14ゲノムへのpRT731組
み込みを示し、これを廃棄した。
【００３０】 アルカリフォスファターゼ活性 原栄養菌UCBPP-PA14 TnphoA変異体2500個を 、40 μg/ml 5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルホスフェート（XP）を含むペプト
ングルコース寒天プレート上でスクリーニングした。ペプトン培地は、内因性の
青-緑色素ピオシアニンおよび蛍光黄色色素であるピオベルジンの産生を抑制し て、PhoA+変異体によって生じたペリプラスムアルカリフォスファターゼによるX
Pの脱燐酸化から生成された青色の可視化を可能にすることから、選択された。
【００３１】 増殖条件および変異体単離戦略 L-ブロス中で37℃で飽和になるまで増殖させ
た緑膿菌（P. aeruginosa）株を10 mM MgSO4中で洗浄し、10 mM MgSO4中で吸光 度0.2（OD600＝0.2）となるように再浮遊させ、100倍および1000倍希釈した（そ
れぞれ約106および105 cfu/mlの細菌密度に対応する）。温室（26℃）のメトロ ミックス鉢植え用土で生育させた約12週齢のレタス植物（ロマイン種またはグレ
ートレイク種）の茎に、希釈した細胞約10 mlをピペットマンで接種した。茎を0
.1％漂白剤で洗浄して、10 mM MgSO4をしみ込ませたホワットマン濾紙（ホワッ トマン#1）１個を含む直径15 cmのペトリ皿に置いた。それぞれのレタスの葉の 中央脈に、試験する異なる３つのTnphoA産生緑膿菌（P. aeruginosa）変異体お よび対照として野生型UCBPP-PA14株を接種した。プレートを実験の間28〜30℃お
よび相対湿度90〜100％の生育チャンバーに置いた。症状を５日間毎日モニター した。
【００３２】 シロイヌナズナ（Arabidopsis）の葉浸潤モデルでは、上記のように増殖して 洗浄した緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）株を10 mM MgSO4で100倍に希釈し（
細菌密度103/cm2葉片面積に相当する）、シュードモナス・シリンゲ（Pseudomon
as syringae）の浸潤に関して記述したように（アウスユベール（Ausubel）ら、
「感染症または病原性の予防に有用な化合物のスクリーニング法（Methods of S
creening Compounds Useful for Prevention of Infection or Pathogenicity）
」、1995年３月25日、1997年５月７日、および1997年11月３日にそれぞれ提出さ
れたUSSN第 08/411,560号、第08/852,927号、および第08/962,750号；ラーム（R
ahm）ら、Science 268：1899〜1902、1995；ドン（Dong）ら、Plant Cell 3：61
〜72、1991）６週齢のシロイヌナズナ（Arabidopsis）植物の葉に注射した。イ ンキュベート条件および症状のモニタリングはレタスの実験の場合と同じであっ
た。細菌を含む葉の細胞間液を回収して、細菌数を記述のように決定した（ラー
ム（Rahm）ら、Science 268：1899〜1902、1995；ドン（Dong）ら、Plant Cell
3：61〜72、1991）。１試料あたり２枚の葉片を用いて４つの異なる試料を採取 した。10 mM MgSO4を接種した対照植物は症状の発症を示さなかった。
【００３３】 マウス死亡率試験 先に記述したように（アウスユベール（Ausubel）ら、「 感染症または病原性の予防に有用な化合物のスクリーニング法（Methods of Scr
eening Compounds Useful for Prevention of Infection or Pathogenicity）」
、1995年３月25日、1997年５月７日、および1997年11月３日にそれぞれ提出され
たUSSN第 08/411,560号、第08/852,927号、および第08/962,750号；ラーム（Rah
m）ら、Science 268：1899〜1902、1995；スティーブンス（Stevens）、J. Burn
Care Rehabil. 15：232〜235、1994）、体重25〜30 gmの６週齢のAKR/Jマウス （ジャクソン・ラボラトリーズ）の広げて伸ばした（outstreach）腹部皮膚に、
５％総表面積の火傷を形成した。火傷の直後にマウスに、緑膿菌（P. aeruginos
a）細胞５×103または５×105個を注射して、敗血症のために死亡した動物数を1
0日間毎日モニターした。動物試験プロトコールは、マサチューセッツ総合病院 の動物試験に関する小委員会によって審査され、承認された。死亡率データの統
計学的有意性は、エイトの補正を用いたカイ二乗検定またはフィッシャーのイグ
ザクト検定を用いて決定した。群による差はP≦0.05であれば統計学的に有意で あると見なされた。
【００３４】 TnphoA変異体のDNA操作、分子クローニング、および配列分析 緑膿菌（P. ae
ruginosa）染色体DNAをフェノール抽出（ストローム＆ローリー（Strom and Lor
y）、J. Bacteriol. 165：367〜372、1986）によって単離し、ならびにDNAブロ ッティングおよびハイブリダイゼーション試験はアウスユベール（Ausubel、「 分子生物学の現行プロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）」
、ウィリー、ニューヨーク、1996）に記述のように実施した。
【００３５】 オリゴヌクレオチド5'-AATATCGCCCTGAGCAGC-3'（LGR1）（配列番号：138）お よび5'-AATACACTCACTATGCGCTG-3'（LGR2）（配列番号：139）は、TnphoAの5'末 端で相対する鎖上の配列に対応した。オリゴヌクレオチド5'-CCATCTCATCAGAGGGT
A-3'（LGR3）（配列番号：140）および5'-CGTTACCATGTTAGGAGGTC-3'（LGR4）（ 配列番号：141）は、TnphoAの3'末端で相対する鎖上の配列に対応した。LGR1＋L
GR2またはLGR3＋LGR4を用いて、記述のように（オクマン（Ochman）ら、1993、 「方法と応用ガイド（A Guide to Methods and Applications）」、イニス、ス テイツ（Innis, M.A., States, D. J.）編、1990）、TnphoA挿入部位に隣接する
DNA配列を逆PCR（IPCR）によって増幅した。大きさが350〜650塩基対の範囲であ
る増幅したDNA断片を、pBluescript SK+/-のEcoRV部位にサブクローニングする 前にIPCR産物の末端を塞ぐことによって、pBluescript SK+/-にクローニングし た。IPCR増幅産物の配列を決定するために、シーケナーゼ2.0キット（U.S.バイ オケミカルインク）を用いて二本鎖DNAシークエンシングを行った。得られた配 列を、BLASTXプログラム（ギッシュ＆ステイツ（Gish and States）、Nat. Gene
t. 3：266〜272、1993）を用いて国立バイオテクノロジー情報センター（NCBI）
の非重複ペプチド配列データベースと比較した。
【００３６】 UCBPP-PA14ゲノムライブラリからのpho34B12変異に対応する遺伝子を含む野生 型クローンの単離およびDNA操作 UCBPP-PA14 TnphoA変異体pho34B12変異体から
作製したIPCR産物を、ランダムプライミングしたDNA標識キット（ベーリンガー マンハイム、インディアナポリス、インディアナ州）を用いて標識し、これをプ
ローブとして用いて、pho34B12変異に対応する遺伝子を含むクローンの有無に関
してpJSR1におけるUCBPP-PA14染色体DNAのゲノムライブラリを調べた。pho34B12
変異に対応するコスミドクローンpLGR34B12において同定された3.7 kb EcoRI断 片を、両ベクターおよび断片の末端を塞いだ後にpPR54のEcoRI部位にサブクロー
ニングして（ロバーツ（Roberts）ら、J. Bacteriol. 172：6204〜6216、1990）
、pLGRE34B12を構築した。同じ断片（平滑末端にした）をpCVDのSmaI部位にサブ
クローニングして（ドネンベルグ＆ケイパー（Donnenberg and Kaper）、Infect
. Immun. 59：4310〜4317、1991）pLGR34を構築した。pLGR34を用いて、記述の ように（ドネンベルグ＆ケイパー（Donnenberg and Kaper）、Infect. Immun. 5
9：4310〜4317、1991）変異pho34B12遺伝子を野生型コピーに置換した。3.7 kb
EcoRI断片はまた、pBluescript SK+/-のEcoRI部位にもサブクローニングして、p
BSR34B12を構築し、DNA配列分析に用いた。
【００３７】 重なり合う２つのオープンリーディングフレーム（ORF1およびORF2）を相対す
る鎖に含むpho34B12挿入部に対応する1,659塩基対配列をゲンバンクに提出して 、寄託番号AF031571を与えられた。ORF1は1,148 bp（ヌクレオチド361〜1509位 ）であり、ORF2は1,022 bp（ヌクレオチド1458〜436位）である。２つのORFのオ
ーバーラップ部分はヌクレオチド436〜1458位である。ORF1は、758 bpのコード 領域に対応する、ヌクレオチド751位で第二の推定の翻訳開始部位を含む。オリ ゴヌクレオチドプライマー5'-CGCATCGTCGAAACGCTGGCGGCC-3'（配列番号：142） および5'-GCCGATGGCGAGATCATGGCGATG-3'（配列番号：143）を用いてORF1を含むp
BSR34B12から1100 bp断片を増幅した。ORF1に２つの推定の開始部位が存在する ことから、オリゴヌクレオチドプライマー5'-TGCGCAACGATACGCCGTTGCCGACGATC-3
'（配列番号：144）および5'-GATTCCACCTTCGCAGCGCAGCCC-3'（Reg3）（配列番号
：145）もまた用いて、ORF1を含むpBSR34B12から1659 bpを増幅した。オリゴヌ クレオチドプライマー5'-GATTCCACCTTCGCAGCGCAGCCC-3'（配列番号：146）およ び5'-GCCGATGGCGAGATCATGGCGATG-3'（配列番号：147）を用いて、ORF2を含むpBS
R34B12から1302 bp断片を増幅した。全てのプライマーの組合せはそれぞれのORF
の推定の上流の調節エレメントを含むようにデザインされた。得られたPCR産物 （1100、1659、および1302 bp）はpCR2.1（インビトロゲン、インク）にクロー ニングして、それぞれpLE15、pLE1、およびpLE2を構築した。３つのPCR産物を全
てpRR54にサブクローニングして、それぞれpRRLE15、pRRLE1、およびpRRLE2を構
築した。
【００３８】 TnphoA変異体の酵素活性 LB培地で18時間増殖した緑膿菌（P. aeruginosa） 株を酵素活性のアッセイに用いた。蛋白質溶解活性およびエラスチン溶解活性は
、これまでに記述のように測定した（トダー（Toder）ら、Mol. Microbiol. 5：
2003〜2010、1991）。ピオシアニンの定量は記述のように行った（エッサー（Es
sar）ら、J. Bac. 172：884〜900、1990）。血液溶解活性は、５％ヒツジ赤血球
を加えたトリプチカーゼ大豆寒天（BBL）を含むプレート上でインキュベートし た後に検出した（オストロフ＆バジル（Ostroff and Vasil）、J. Bacteriol. 1
69：4957〜4601、1987）。
【００３９】 非極性GacA変異の作製 UC BPP-PA14における非極性gacA変異は、BamHIリンカ
ーを用いて自殺ベクターpEGBR（アカレー（Akerley）ら、Cell 80：611〜620、1
995）の独自のBamHI制限部位に、コスミドpLGR43からのgacA遺伝子を含む3.5 kb
PstI断片をクローニングすることによって構築した。pUC18Kからのカナマイシ ン抵抗性遺伝子カセット（メナード（Menard）ら、J. Bacteriol. 175：5899〜5
906、1993）を含む950 bp EcoRI-Hinc IIクレノウ末端を塞いだ断片を、転写が 維持され、gacAの下流部分の翻訳がカナマイシンカセットの3'末端で再開される
ように、gacAにおける独自のBamHI制限部位にクローニングした。gacA遺伝子内 およびその転写方向にカナマイシン遺伝子カセットを含む、得られた構築物SW7-
4を用いて、破壊されたgacA遺伝子の野生型UCBPP-PA14ゲノムへの相同的組換え によってマーカー交換を行った。
【００４０】 緑膿菌（P. aeruginosa）ビルレンス因子の単離および特徴付け 上記の方法 を用いて、緑膿菌（P. aeruginosa）UCBPP-PA14ゲノムをトランスポゾンTnphoA によって変異体にし、原栄養性変異体2,500個をレタス茎アッセイにおける病原 性損傷の有無に関してスクリーニングした。このレタスアッセイによって、一つ
のレタス茎において幾つかの変異体を試験することが可能となった。興味深いこ
とに、レタスはUCBPP-PA14による感染症に罹りやすいのみならず、よく特徴付け
のなされた緑膿菌（P. aeruginosa）株PAK（イシモト＆ローリー（Ishimoto and
Lory）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86：1954〜1957、1989）およびPAO1（ホ
ロウェイ（Halloway）ら、Microbiol. Rev. 43：73、1979）に対しても感受性が
あることが判明した。これらの後者の株はいずれもレタスの葉で増殖し、感染の
４〜５日後に水に浸されたような症状を起こし、その後腐敗病が起こることを特
徴とする、UCBPP-PA14によって誘発された症状と類似の疾患症状を誘発した。感
染の後期では、緑膿菌（P. aeruginosa）３株が全てレタスの葉の中央脈全体に 浸潤して、その結果組織の完全な液浸軟化および崩壊が起こった。
【００４１】 表１に要約するように、本発明者らは、原栄養株2,500株をスクリーニングし たところ、野生型株と比較してレタスの茎にゼロ、弱い、または中等度の腐敗病
症状を誘発したUCBPP-PA14のTnphoA産生変異体９株を同定した。
【表１】 a 異なる４つの試料を２枚の葉片／試料を用いて採取した。10 mM MgSO4を接種
した対照植物は、実験の過程において症状を示さなかった。異なる３つの実験か
ら類似の結果が得られた。 b 症状は感染の４〜５日後に認めた。なし、症状なし；萎黄病、接種部位周辺 の萎黄病；弱い、局所的な液浸軟化および接種部位周辺組織の萎黄病；中等度、
中等度の液浸軟化および接種部位周囲の組織のほとんどが軟化した萎黄病；重度
、感染後２、３日での液浸軟化反応領域と接種部位周辺の萎黄病を特徴とする葉
全体の重度腐敗病。 c 動物実験は全て、１実験あたり動物８〜10匹を用いて少なくとも２回実施し た。独立した実験から類似の百分率死亡率が示された。マウスには〜５×103ま たは５×105個を注射した。 d BLASTX分析により、有意な相同性を有するコードされた蛋白質は得られなか った。
【００４２】 葉の重度の液浸軟化はいずれの変異体でも認めなかった。DNAブロット分析か ら、TnphoAのカナマイシン抵抗性付与遺伝子（タイラー（Taylor）ら、K. Bact.
171 ：1870〜1878、1989）を含む1542塩基対BgII-BamHI断片をプローブとして 用いると、変異体９個のそれぞれが単一のTnphoA挿入部を含むことが示された。
UCBPP-PA14 TnphoA変異体９個中２個、すなわちpho34BIおよびphoI5は、アルカ リフォスファターゼ活性を発現し、このことはこれらのTnphoA挿入部を含む遺伝
子が、膜貫通または分泌型蛋白質をコードすることを示唆した（タイラー（Tayl
or）ら、J. Bact. 171：1870〜1878、1989；マノイル＆ベックウィズ（Manoil a
nd Beckwith）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82：5117、1985）。
【００４３】 病原性の定量的測定として、シロイヌナズナ（Arabidopsis）の葉における４ 日間の生育速度を測定することによって、TnphoA変異体９個をさらに調べた（ラ
ーム（Rahm）ら、Science 268：1899〜1902；ドン（Dong）ら、Plant Cell 3：6
1〜72、1991）。変異体はいずれも、栄養に富む培地および最小培地のいずれに おいても野生型株と比較してその生育速度に有意な差を示さなかったが、シロイ
ヌナズナ（Arabidopsis）の葉における変異体９個全ての経時的生育速度は、野 生型株より遅かった。表１は感染後４日目でそれぞれの変異体が達した生育の最
大レベルを記載している。変異体９個全ての場合、あまり重症でない症状の発症
は、葉における細菌数が減少したことを反映した。33C7を除く変異体は全て、弱
いまたは中等度の腐敗病症状および程度の異なる萎黄病（黄化）を伴う液浸軟化
症状のいずれかを誘発した（表１）。しかし、興味深いことに表１に要約するよ
うに、個々の変異体の増殖レベルはそれらが誘発した症状の重症度と正比例しな
かった。例えば、変異体25A12（図21）は変異体33A9（図５および6A-B）、pho34
B12（図７、８および９）および34H4（図19）と類似のレベルまで増殖したが、 野生型UCBPP-PA14より10倍低く、変異体25A12による症状の誘発は非常に弱かっ た。同様に、変異体33C7（図20）、pho15（図24B）、および25F1（図24A）は全 て、類似の最高増殖レベルに達した（野生型増殖より約103倍弱い）；しかし、 変異体33C7のみが如何なる疾患症状も引き起こすことができなかった（表１）。
変異体10個において症状の程度および生育レベルに認められた差から、これらの
変異体が植物感染プロセスの様々な段階に関係している遺伝子に挿入を有する可
能性があることが示唆された。
【００４４】 植物の葉のアッセイにおいて病原性が低いTnphoA産生変異体９個のそれぞれの
病原性を、完全な厚みの皮膚火傷マウスモデルにおいて測定した（ラーム（Rahm
e）ら、Science 268：1899〜1902、1995；スティーブンス（Stevens）ら、J. of
Burn Care and Rehabil. 15：232〜235、1994）。表１に示すように、変異体９
個は全て24A12および16G12を除いていずれの接種量でもP≦0.05で野生型とは有 意に異なり（図24A）、これは５×105個のより接種量では野生型と有意差を示さ
なかった。表１に示すデータのほかに、変異体33A9はまた、高接種量の５×106 個でも死亡を引き起こさなかった。
【００４５】 本発明者らは、DNAブロット分析およびDNA配列分析を用いて、病原性がより低
い変異体におけるTnphoAが既知の遺伝子に挿入されたか否かを明らかにした。DN
Aドットブロット分析から、変異体1D7がgacA遺伝子においてTnphoA挿入部を含む
ことが明らかとなった（ラビル（Laville）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89
：1562〜1566；ギャフネイ（Gaffney）ら、Mol. Plant-Microbe Interact 7：45
5〜463、1994）が、本発明者らはこれが既に植物および動物の双方において緑膿
菌（P. aeruginosa）に関する重要な病原性因子であることを示していた（アウ スユベール（Ausubel）ら、「感染症または病原性の予防に有用な化合物のスク リーニング法（Methods of Screening Compounds Useful for Prevention of In
fection or Pathogenicity）」、1995年３月25日、1997年５月７日、および1997
年11月３日にそれぞれ提出されたUSSN第 08/411,560号、第08/852,927号、およ び第08/962,750号；ラーム（Rahm）ら、Science 268：1899〜1902、1995）。そ の他の変異体８個に関して、本発明者らは逆ポリメラーゼ連鎖反応（IPCR）を用
いて、TnphoA挿入部位に隣接するDNA配列に対応する増幅産物を産生した（オク マン（Ochman）ら、1993、「方法と応用ガイド（A Guide to Methods and Appli
cations）」、イニス、ステイツ（Innis, M.A., States, D. J.）編、1990）。I
PCR産物をクローニングして、DNA配列分析を行った。変異体pho15は、既にゲン バンク（寄託番号#U84726）に寄託された緑膿菌（P. aeruginosa）遺伝子（株PA
01から）に挿入されたTnphoAを含み、これはアゾトバクター・ビネランディ（Az
otobacter vinelandii）dsbA遺伝子と高度の類似性を示し、ペリプラスムジスル
フィド結合形成酵素をコードする（バードウェル（Bardwell）ら、Cell 67：581
〜589、1991）。細菌の植物病原体であるエルウィニア・クリサンテミ（Erwinia
chrysanthemi）およびヒト病原体フレクスナー赤痢菌（Shigella flexneri）お
よびビブリオコレラ菌（Vibrio cholera）におけるdsbAの相同体は、病原性に必
要である（シェブチック（Shevchik）ら、Mol. Microbiol. 16：745〜753、1995
；ピーク＆タイラー（Peek and Taypor）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89：62
10〜6214、1992；ワタライ（Watarai）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92：49
27〜4931、1995）。プログラムBLASTXを用いたコンピューター分析から、残りの
７個のTnphoA挿入部に相当するDNA配列を考えられるリーディングフレーム全て において翻訳しても、既知の如何なる遺伝子に対する有意な類似性も認められな
いことが示された（表１）。
【００４６】 本発明者らは、多様な生化学検査を行ってより病原性が低いUCBPP-PA14変異体
９個を、それらがこれまでに記述された主なビルレンス因子および／または代謝
経路に欠損を有するか否かに基づいて分類した。変異体は全て、プロテアーゼ、
エラスラーゼ、およびホスホリパーゼ活性および二次代謝物であるピオシアニン
の分泌能に関してアッセイした（トダー（Toder）ら、Mol. Microbiol. 5：2003
〜2010、1991；エッサー（Essar）ら、J. Bac. 172：884〜900、1990；オストロ
フ＆バジル（Ostroff and Vasil）、J. Bacteriol. 169：4957〜4601、1987）。
ピオシアニンは、反応性酸素中間体の産生を通じて哺乳類および細菌細胞を殺す
、緑膿菌（P. aeruginosa）のほとんどの臨床株によって分泌される酸化還元活 性フェナジン化合物であり、これは緑膿菌（P. aeruginosa）のビルレンス因子 として関与すると思われている（ハセット（Hassett）ら、Infect. Immun. 60：
328〜336、1992；カンタクマール（Kanthakumar）ら、Infect. Immun. 61：2848
〜2853、1993；ミラー（Miller）ら、Infect. Immun. 64：182、1996）。変異体
33C7、33A9、34H4、25F1、および16GI2は用いた生化学アッセイのいずれにおい ても欠損を示さなかった。変異体pho34BI2は、血液寒天プレート上で血液溶解活
性の減少を示し、エラスターゼ活性が減少し（〜50％）、検出可能なピオシアニ
ン産生を示さなかった。変異体pho15はごく痕跡量のエラスターゼ活性を示し、 蛋白質溶解活性は野生型と比較して減少した（60〜70％）。変異体25AI2は、エ ラスチン溶解活性の50％減少を示した。最後に、gacAにおいて挿入部を含む変異
体1D7は、野生型と比較してピオシアニン（〜50％）のレベルの減少を示した。 変異体1D7のほかに、第二の独立したgacA::TnphoA変異体が本発明者らの植物ス クリーニングから同定され、これは変異体33A11であった。この後者の変異体は また、植物およびマウスの双方においてピオシアニン産生が同様に減少し、ビル
レンスの減少を示した。
【００４７】 変異体のDNA配列分析および生化学試験に基づいて、変異体1D7およびpho34B12
におけるTnphoA挿入部によってターゲティングされた遺伝子をさらなる分析に選
択した。上記のように、1D7は本発明者らが既に緑膿菌（P. aeruginosa）におけ
るビルレンス因子をコードすることを示したgacAにおいて挿入部を含んだ（ラー
ム（Rahme）ら、Science 268：1899〜1902、1995）。最近、gacA様遺伝子はまた
、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）の重要なビルレンス因子であるこ
とが示された（ジョンストン（Johnston）ら、Mol. Microbiol. 22：715、1996 ）。しかし、２つのgacA::TnphoA挿入部（1D7および33D11）、本発明者らが既に
構築したgacA挿入部変異体（アウスユベール（Ausubel）ら、「感染症または病 原性の予防に有用な化合物のスクリーニング法（Methods of Screening Compoun
ds Useful for Prevention of Infection or Pathogenicity）」、1995年３月25
日、1997年５月７日、および1997年11月３日にそれぞれ提出されたUSSN第 08/41
1,560号、第08/852,927号、および第08/962,750号；ラーム（Rahm）ら、Science
268：1899〜1902、1995）、および幾つかの既知のビルレンス因子の産生に影響
を及ぼす、独立して構築された緑膿菌（P. aeruginosa）のgacA変異（ハセット （Hassett）ら、Infect. Immun. 60：328〜336、1992）は全て、少なくとも１つ
の遺伝子、すなわちgacAのすぐ下流に存在する大腸菌uvrC遺伝子の相同体に極性
効果を及ぼした（ラーム（Rahme）ら、Science 268：1899〜1902、1995；ラビル
（Laville）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89：1562〜1566、1992；ライマン
（Reimmann）ら、Mol. Microbiol. 24：309〜319、1997）。本明細書に記述のga
cA変異体の病原性表現型の喪失が、gacAの下流の遺伝子に及ぼす極性効果ではな
くて、gacAオープンリーディングフレームそのものの破壊が原因であるという明
確な証拠を提供するために、本発明者らは、カナマイシン抵抗性を付与する遺伝
子をコードするDNAカセットを用いてUCBPP-PA14における非極性gacA変異を構築 した。重要なことは、非極性gacA変異体はマウスアッセイ（死亡率50％）および
シロイヌナズナ（Arabidopsis）アッセイ（４日後に３×105 cfu/cm2まで生育）
において、gacA::TnphoA変異体（1D7）と同じ減少した病原性レベルを示した。1
D7と同様に、非極性gacA変異体はまた、野生型と比較してより低いレベルのピオ
シアニン（50％）を分泌した。
【００４８】 以下の理由から、変異体pho34B12をさらなる分析に選択した。まずpho34B12に
おける挿入部は、緑膿菌（P. aeruginosa）ゲノムのこれまでに特徴付けされて いない領域において、緑膿菌（P. aeruginosa）ピオシアニン生合成遺伝子phnA およびphnBのすぐ下流に存在した（エッサー（Essar）ら、J. Bact. 172：884〜
900、1990）。第二に、pho34B12挿入部は減少したエラスターゼおよび血液溶解 活性を含む、多形質発現性を引き起こし、このことはpho34B12 TnphoA挿入部が 存在する遺伝子が多様な病原性因子の調節物質をコードする可能性があることを
示唆している。
【００４９】 pho34B12における第二の変異がTnphoA挿入部ではなくて病原性表現型の喪失が
原因である可能性を除外するために、本発明者らは、対応する野生型遺伝子との
相同的組換えによってpho34B12::TnphoA変異を置換した。この結果、植物および
動物の双方において病原性欠損が回復すると共に、血液溶解およびエラスチン溶
解活性の回復が起こり、ピオシアニン産生は野生型レベルまで回復した（表２、
下記）。
【表２】* * 表の見出しの説明に関しては表１を参照のこと。
【００５０】 表２におけるこれらの結果は、pho34B12におけるTnphoA挿入が、病原性表現型
の喪失を含む、この株の多形質発現表現型の原因であることを示している。pho3
4B12::TnphoA挿入部の後の停止コドンに続く500 bp下流に推定のORFは存在しな いという事実から、TnphoAが変異体pho34B12の表現型の原因である下流の遺伝子
に極性効果を及ぼす可能性は低い。pho34BI2の、pho34BI2およびphnAB領域の一 部を含む3.7 kbインサートを含むプラスミド（pLGRE34B12）との遺伝子相補性分
析を行ったところ、エラスターゼおよび血液溶解活性が野生型レベルへと回復し
、ピオシアニンは10倍以上過剰産生された（表２）。しかし、シロイヌナズナ（
Arabidopsis）およびマウスの双方においてpho34BI2の病原性が損なわれている 表現型は、pLGRE34BI2によって補足されず（表２）、pho34B12に対応する野生型
遺伝子の多数のコピーが存在する可能性が非常に高い。
【００５１】 さらなるDNA配列分析から、pho34B12変異を含む領域が、反対方向に転写され るほぼ完全に重なり合う２つのオープンリーディングフレーム（ORFs）（ORF1お
よびORF2）をコードすることが示された。その上、ORF1は２つの考えられるメチ
オニン開始コドン（ORF1-SおよびORF1-Lと命名）を有した。phnA、phnB、および
phoA遺伝子と同じ方向に転写されるORF1-SおよびORF1-Lによってコードされる予
想される蛋白質は、多様な原核生物膜リポ蛋白質に認められる脂質接着部位に対
応するコンセンサスモチーフを含んだ（ハヤシ＆ウ（Hayashi and Wu）、J. Bio
energ. Biomembr. 22：451〜471、1990）。これらの膜脂質蛋白質は前駆体シグ ナルペプチドと共に合成され、pho34B12挿入がPho+表現型を表すことの説明とな
る（ハヤシ＆ウ（Hayashi and Wu）、J. Bioenerg. Biomembr. 22：451〜471、1
990）。ORF2によってコードされる予想されるい蛋白質は、転写調節物質のLysR ファミリーに認められる「ヘリックス・ターン・ヘリックス」モチーフと類似の
、N-末端の「ヘリックス・ターン・ヘリックス」DNA結合モチーフを含んだ（ヘ ニコフ（Henikoff）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85：6602〜6606、1988； ビアレ（Viale）ら、J. Bacteriol. 173：5224〜5229、1991）。このクラスの蛋
白質には哺乳類および植物病原性に関係する調節物質が含まれる（フィンレー＆
ファルコウ（Finley and Falkow）、Microbiol. and Mol. Biol. Rev. 61：136 〜169、1997）。２つの機能的なほぼ完全な重なり合うORFの存在は細菌のゲノム
では珍しい。
【００５２】 pho34B12領域においてコードされるどのORFが機能的であるかを調べるために 、ORF1-S、ORF1-L、およびORF2に対応するPCR産物を含むプラスミドを用いてさ らなる相補実験を行った（図７）。ピオシアニンおよびエラスチン溶解活性の双
方の産生は、ORF2によってコードされる蛋白質を合成するプラスミド（pRRLE2）
によって野生型の20〜40％に回復した。同様に、この補足された株の血液溶解活
性は部分的に回復した。pho34B12を、ORF1-SおよびORF1-Lにそれぞれ対応するプ
ラスミドpRRLE1およびPPPLE15によって補足すると、血液溶解、ピオシアニン、 およびエラスチン溶解活性もまた回復した。しかし、興味深いことに、プラスミ
ドpRRLE1およびpRRLE15が存在すると、ピオシアニンの産生が10倍増加してして エラスターゼ活性が２倍増加した。pRRLE1、pRRLE15、またはpRRLE2も、植物ま たは動物のいずれにおいても変異体pho34B12の病原性表現型の喪失を補足しなか
った（表２）。特定部位変異誘発を含むこの領域のさらなる特徴付けを行えば、
３つのORFのいずれが植物および動物における病原性にとって必要であるかがさ らに解明されるであろう。
【００５３】 上記に示すデータから、哺乳類の病原性において重要な役割を果たすこれまで
未知の緑膿菌（P. aeruginosa）ビルレンス因子（遺伝子）は、植物において病 原性症状の減弱を示す変異体に関して無作為の緑膿菌（P. aeruginosa）変異体 をスクリーニングすることによって容易に同定することができることが証明され
た。これは緑膿菌（P. aeruginosa）遺伝子少なくとも３個が植物および動物の 発病の双方に関係しているビルレンス因子をコードすることを示した（アウスユ
ベール（Ausubel）ら、「感染症または病原性の予防のために有用な化合物をス クリーニングする方法（Methods of Screening Compounds Useful for Preventi
on of Infection or Pathogenicity）」、1995年３月25日、1997年５月７日、お
よび1997年11月３日にそれぞれ提出されたUSSN第 08/411,560号、第08/852,927 号、および第08/962,750号；ラーム（Rahme）ら、Science 268：1899〜1902、19
95）本発明者らの先の研究と一致する。一方、植物においてより病原性が低い、
本発明者らが単離した変異体９個中９個がマウスにおいても病原性が弱いことを
発見するとは予測しなかった。この結果を最も単純に解釈すれば、植物および動
物における緑膿菌（P. aeruginosa）の病原性が、基本的なビルレンス遺伝子で あると思われる実質的に重なり合う一組の遺伝子を利用しているということであ
る。もう一つの考えられる解釈は、同定された遺伝子の幾つかが、そのサブセッ
トが植物または動物のいずれかに特異的である異なるイフェクター分子を制御す
る調節蛋白質（すなわちpho34B12）をコードする可能性があるということである
。本発明者らは同様に、本試験において同定された変異体の大部分（９個中７個
）が、これまで未知の遺伝子に対応するとは予想しなかった。ポアソン分布、5.
9 Mbの緑膿菌（P. aeruginosa）のゲノムサイズ、および平均遺伝子サイズ1.1 k
bを用いて、本発明者らは調べた変異体2,500個が、アッセイにおいて各遺伝子を
試験する際に約95％の確率を生じるために、試験する必要がある総数の25％とな
ると計算した。したがって、緑膿菌（P. aeruginosa）ビルレンス変異体に関す る本発明者らのスクリーニングはほぼ飽和ではないが、病原性に重要な役割を有
する多くのさらなる緑膿菌（P. aeruginosa）遺伝子がまだ発見されていない可 能性がある。
【００５４】 重要なことは、本発明者らのモデルにおいて植物病原性に重要であると同定さ
れたこれまでに既知のビルレンス因子（遺伝子）の少なくとも２つは、マウス火
傷モデルにおいても緑膿菌（P. aeruginosa）の重要なビルレンス因子であるの みならず、他のグラム陰性病原菌における重要なビルレンス因子として記述され
ている。これらの後者の病原性因子（遺伝子）には、dsbAおよびgacA（シェブチ
ック（Shevchik）ら、Mol. Microbiol. 16：745〜753、1995；ピーク＆タイラー
（Peek and Taypor）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89：6210〜6214、1992；ワ
タライ（Watarai）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92：4927〜4931、1995；ジ
ョンストン（Johnston）ら、Mol. Microbiol. 22：715、1996）が含まれる。こ のため、これまで緑膿菌（P. aeruginosa）において同定された未知の因子の多 くがグラム陰性病原性に一般的に関係している可能性がある。
【００５５】 本試験のもう一つの重要な結論は、本発明者らが開発した高処理能インビボス
クリーニング法によって、明白な生化学欠損とは相関しない病原性因子を同定す
ることができるという点である。変異体33C7、33A9、34H4、25F1、および16G12 は、幾つかの既知の緑膿菌（P. aeruginosa）病原性因子に検出可能な欠損を示 さず、重要なことは、変異体33C7および33A9はマウスモデルにおいて最も弱い変
異体であったことである。その上、変異体pho34B12および25A12は、既知のビル レンス因子産生の減少を示さないが、これらの変異体に対応する遺伝子はこれま
で同定されておらず、これらの変異体における生化学欠損が単純な高処理能スク
リーニングでは効率よく容易に同定できないためである可能性が高い。これは病
原性表現型の喪失に関して本発明者らのスクリーニングの感度を証明する。
【００５６】 ここ数年の間に、細菌の病原性因子を同定する他の高処理能スクリーニングが
記述されている。IVET（インビボ発現技術）は、発病の際に特異的に活性化され
るプロモーターを同定している（ワン（Wang）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA
93：10434〜10439、1996；マハン（Mahan）ら、Science 259：686〜688、1993 ）、STM（シグナチュアタグ・トランスポゾン法）は宿主において生存するため に必要な遺伝子を同定し（ヘンセル（Hensel）、Science 268：400〜403、1995 ）、およびDFI（識別蛍光誘導）は緑色蛍光蛋白質および蛍光活性化細胞ソーテ ィングを利用して、特定の条件下または特定の宿主細胞タイプにおいて活性化さ
れる遺伝子を同定する（バルディビア＆ファルコウ（Valcivia and Falkow）、M
ol. Microbiol. 22：367〜378、1996）。これらのアプローチは本発明者らが本 出願において記述したものに補足的であり、それぞれのアプローチは長所および
短所を有する。非脊椎動物宿主における本発明者らのスクリーニング法の一つの
長所は、病原性を直接測定することであるのに対し、IVETおよびDFI法は病原性 に関連した遺伝子発現を測定している。接種に用いた細菌変異体の混合集団によ
ってその機能がトランスで補足できない遺伝子を同定するSTM法とは異なり、非 脊椎動物における本スクリーニングはそれぞれの変異体クローンを個別に試験す
ることを含む。
【００５７】その他のビルレンス標的 33A9核酸配列（図5および6A〜B）は、BI48と命名されたコスミドクローン（図
1）中にも同定された。このコスミド全体のシークエンシングを行い、その核酸 配列を図2に示した。標準的なデータベース解析により、さらにいくつかのオー プンリーディングフレームのヌクレオチド配列および予想されるアミノ酸配列を
同定した（図3および4）。本解析の概要を表3に提示する。上記の配列と同じく 、図3および4に示した配列はいずれも、病原体のビルレンスを低下させる化合物
の（例えば、本明細書に記載される方法を用いる）スクリーニングに用いうる。
【００５８】 PA14株のpBI48コスミドから得られた配列により、33A9が線毛遺伝子クラスタ ーのほぼ5kb上流に位置することが判明した（図1、表3）。このクラスターは、 線毛形成の調節に関与することが知られているpilS／pilR遺伝子を含む。さらに
、33A9の上流の配列の解析ではこれまでに同定された配列との相同性は認められ
ず、このことから33A9周囲の領域全体が病原性アイランド（pathogenic island ）を規定している可能性が示唆された。図3（orf 19544）、図4（orf 19544）、
図5、図6Aおよび図6Bは、33A9のヌクレオチド配列、ならびに同定されたORFを示
す。
【００５９】 さらに、pBI48コスミドクローンから得た配列の解析により、tRNA配列との強 い相同性が認められる配列が33A9のほぼ2kb下流に存在することが示された（ORF
22626、図1）。tRNA配列の上流に位置する領域の解析ではデータベース中に存 在する配列との相同性は認められなかった上、tRNA配列はDNA挿入の「ホットス ポット」でもあるため、本発明者らは、このtRNA配列が、PA14中に存在する病原
性アイランドが挿入された右側境界を表すという仮説を立てた。図1から見てと れる通り、挿入された外来性DNAの断片と考えられる領域のサイズはほぼ25kbで あった。病原性アイランドと推定されるものの上流に位置する境界を同定するこ
とは、挿入されたDNA断片の正確なサイズを確認する一助になると思われる。さ らに、33A9領域の解析により、インテグラーゼおよびトランスポザーゼ（それぞ
れORF21421、ORF8109）と蛋白質レベルで相同な配列が複数存在することが示さ れた。また、本発明者らのデータからは、33A9遺伝子座が、病原性の強いいくつ
かの緑膿菌（P. aeruginosa）分離株には存在するが、比較的病原性の弱い緑膿 菌株であるPAO1には存在しないことが示された。
【００６０】 pBI48コスミドから得られた配列データの解析により、細胞接着に関与する認 識モチーフを含む2つの配列が33A9遺伝子に隣接して存在することも示された。3
3A9のそれぞれ上流および下流に位置するORF11738（2436bp）およびORF23228（2
565bp）の配列解析により（図1）、これらの2つのオープンリーディングフレー ム中にRGDモチーフが存在することが示された。RGDトリペプチド配列は、宿主細
胞表面のインテグリンと結合する特徴的な真核細胞認識モチーフであり、細菌の
接着に関与することが明らかになっている。これらのRGDモチーフを含む細菌の アドヘシンは、宿主分子を模倣することにより、細胞-細胞接着の促進に必要な 応答を宿主に生じさせることができる。
【００６１】 これらの2つのRGD含有性ORFの発現を、33A9および野生株PA14の両方で評価し た。転写物のレベルを、ORF11738およびORF23228の内部領域に対応する放射標識
DNAプローブとのハイブリダイゼーションによって測定した。変異株33A9におけ る2つのORFに関して得られたデータからは野生株PA14と比べて転写物のレベルが
低いことが示され、このことからORF11738およびORF23228によってコードされる
遺伝子はいずれも33A9によって調節されることが示された。これらのデータは、
33A9が、細菌の宿主細胞表面との接着に関与する遺伝子の発現調節をもたらす多
重遺伝子調節因子としての役割を果たすことを示している。
【表３】
【００６２】 さらに、アウスユーベル（Ausubel）ら（感染または病原性の予防のために有 用な化合物のスクリーニングの方法（Methods of Screening Compounds Useful
for Prevention of Infection and Pathogenicity）、それぞれ1995年3月15日、
1997年5月7日および1997年11月3日に提出されたUSSN第08／411,560号、第08／85
2,927号および第08／962,750号）に記載された植物および線虫のスクリーニング
アッセイ（緩徐または急速致死アッセイ）を用いることにより、他にいくつかの
緑膿菌変異株がビルレンスの弱いものとして同定された。これらの試験に用いた
緩徐または急速致死アッセイについては以下に説明する。
【００６３】 緩徐致死アッセイ（slow-killing assay） 緩徐致死アッセイのためには、一
晩培養した細菌培養物10μlをNGプレート（SulstonおよびHodgkin（線虫セノラ ブディティス・エレガンス（The Nematode Caenorhabditis elegans）、W.B.Woo
d編、Cold Spring Harbor、NY：Cold Spring Harbor Laboratory、188、pp.587 〜606）に記載されたNGM寒天培地を改変）：（0.25％ペプトンの代わりに0.35％
を使用）上に播き、37℃で24時間インキュベートした。室温（23〜25℃）に8〜2
4時間おいた後、各プレート（直径3.5cm）にC.エレガンス（C.elegans） ブリス
トル株のL4両性体40〜50匹を播き、統計上の目的から1つの試験毎に同じアッセ イを3〜4回行った。プレートを25℃でインキュベートし、死亡した線虫の数を4 〜6時間後に数えた。睫毛で触れても動かず、咽頭ポンプ活動も認められない場 合に線虫は死んだと判断した。アッセイした変異株の各バッチに対して、PA14お
よび大腸菌OP50株を陽性および陰性対照として用いた。プレート壁に固定された
ために死んだ線虫は分析から除外した。LT５０を決定するために、データをグラ
フ上にプロットした（線虫の死亡率を被験株に対する曝露後期間（時間）に対し
てプロットした）。SYSTAT 5.2.1コンピュータプログラムを用いて、死亡率＝A ＋(1−A)／(1＋exp(B−G×log(曝露後の時間)))の形式の曲線をデータに対して 適合化させたが、ここでAはOP50対照実験での線虫の死亡率を表し、BおよびGは 曲線の適合化のために変化させるパラメーターを表す。BおよびGが決定されれば
、LT50＝exp(B／G)×(1−2×A)^(1／G)という公式によってLT５０が算出される 。
【００６４】 スクリーニング法の開発に際して、本発明者らは2つの観察結果を利用した。 第1に、線虫が死亡するまでに要する時間が長くなるほど、生まれる子孫の数が 増える。第2に、初期の幼生期の方が緑膿菌による致死作用に対する耐性は明ら かに高い。これにより、本発明者らは、病原性の低下がわずかに過ぎないTnphoA
変異株を同定するための簡便かつ極めて高感度のアッセイを得た。これらの弱毒
変異株が線虫を死亡させる作用は弱いと考えられ、生存体による子孫の出生によ
り、わずかな欠陥も容易に観察しうる表現型へと効率的に「増幅」される。この
ようにして、弱毒PA14::TnphoA変異株を含むプレート上では、最初に播いた両性
体から数百匹の虫体が得られた。非病原性変異株とともに播いたプレート上では
、第5日までに数千匹もの虫体が生じ、細菌の下地は完全に消費されたが、野生 株とともに播いたプレート上では、生存している虫体はほとんどまたは全く認め
られなかった。予備スクリーニングにおいて非病原性または弱毒性と推定される
ものとして同定された変異株の再試験を行い、C.エレガンスの致死動態を決定す
るためのビルレンスアッセイを行った。
【００６５】 急速致死アッセイ 急速致死アッセイ（fast-killing assay）は、緩徐致死ア
ッセイと同じく、疾患の原因となる細菌ビルレンス因子を同定するために有用で
ある。さらに、本アッセイは、病原性を抑制する能力、または生物体の病原体に
対する抵抗性を増強させる能力をもつ治療薬を同定するためにも有用である。好
ましい態様において、急速致死アッセイは、例えばコルヒチンのような毒素など
の化合物に対する透過性が高い線虫系統を用いて行われる。このように透過性の
高い線虫の例には、PGP-1、PGP-3またはMRP-1などのP-糖蛋白質に変異のある虫 体が非制限的に含まれる。このような変異型の線虫は、膜透過性が高いために毒
素に対する感受性が高いことから、急速致死アッセイにおいて有用である。この
特徴から、毒性化合物に対する完全な感受性と完全な耐性との間の格差が大きい
アッセイが得られる。以下に説明する通り、急速致死アッセイを、培地の浸透圧
を高めることによって行うこともできる。
【００６６】 本明細書で用いる急速致死アッセイの条件は以下の通りである：キングスB培 地中で一晩増殖させたPA14培養物5μlを、ペプトン-グルコース培地（PG）（1％
Bacto-Peptone、1％NaCl、1％グルコース、1.7％Bacto-Agar）を含むプレート（
直径3.5cm）上に播いた。急速致死効果は浸透圧に依存することが明らかになっ ているため、0.15Mソルビトールの添加によってPG培地を改変した。細菌培養物 を広げた後、プレートを37℃で24時間インキュベートし、続いて室温に8〜12時 間おいた。アッセイ用プレートに線虫15〜20匹を播き、続いて25℃でインキュベ
ートした。個々の独立したアッセイは3〜4回の繰り返しからなる。線虫の死亡率
を経時的に評価したが、この際には、上記の通り、接触しても反応しない場合に
線虫は死んだものと判断した。急速致死アッセイに関しては大腸菌DH5α株を対 照として用いた。
【００６７】 これらの菌株を、上記の通りに同定された菌株とともに分析することにより、
それらが以下のものを含むいくつかの異なるクラスに分類されることが示された
：変異株の中には植物および線虫の両方に対して病原性が弱いものもあり、植物
または線虫の両方ではなく一方に対して病原性が弱いものもあった。植物におけ
る病原性が弱い細菌変異株は、侵入4日後（4 DPI）の時点での（葉5枚の試料の ）平均最大力価が、同一セットの実験において野生型よりも2標準偏差低いもの と定義した。成長条件のわずかな違いが植物の防御応答に及ぼす影響のため、野
生型が4DPIの時点で到達する最大レベルには実験間で1桁もの差が生じうること から、野生型対照が必要であった。同じく、線虫における病原性が弱い変異株と
は、それを摂食した線虫の50％が死亡するまでに要する平均時間（3回の反復に よるLT５０）が同じ実験における野生型PA14のLT５０よりも2標準偏差低いもの とした。
【００６８】 一般に、植物における病原性が弱い変異株には16G12、25A12、33A9および33C7
が含まれ、線虫における病原性が弱い変異株には35A9、44B1、1G2、8C12および2
A8が含まれ、植物、線虫ともに病原性が弱い変異株には25F1、41A5、50E12、pho
15、12A1、pho23、34B12、34H4、3E8、23A2および36A4が含まれる。これらの変 異株の病原性表現型を表4および5（下記）にまとめた。挿入変異誘発によってビ
ルレンスが低下したこれらの菌株のそれぞれに関して配列解析を行った。表4お よび5に概要を示したDNA配列解析により、本発明者らのスクリーニングアッセイ
では新規遺伝子および既知の遺伝子が両方とも同定された。50E12から41C1まで の配列はそれぞれ、大腸菌で以前に記載された機能不明のオープンリーディング
フレーム（ORF）と強い相同性が認められた。変異体35A9では淋菌（N. gonorrho
eae）（SwissProt P39897）のmtrR相同体が同定された。変異体25F1では、C.テ ピジウム（C. tepidium）のorjT、MPKおよびDj1AＥＣと同一な3つの蛋白質をコ ードするオペロンが同定された。48D9、35H7および12A1からの配列はそれぞれle
mA、gacAおよびlasR遺伝子に対応した。変異体41A5および44B1で破壊されていた
配列には、ジェンバンク（GenBank）に寄託されているどの配列とも明らかな相 同性は認められなかった（44B1配列タグは148bpに過ぎないため、PAO1データベ ース中には44B1挿入物に対応する配列は同定されなかった）。したがって、これ
らの配列はさらに別のビルレンス因子を特定するものである。これらの実験から
得られたヌクレオチドおよびアミノ酸配列を、図10、11、12、13、14A、14B、15
、16、16A、16B、17、18A、18B、18C、18Dおよび18E、ならびに図22、23、24A、
24B、24C、24D、24E、25、26、27および28に示す。
【００６９】 本発明者らは、TnphoA変異株41A5、50E12、41C1、35A9、48D9、12A1、44B1お よび35HZに関して、哺乳動物での病原性に重要な既知の緑膿菌ビルレンス因子に
損傷が含まれているか否かを評価するために、一連の標準的な生化学検査を行っ
た。これらの検査には以下のものが含まれる：H２O２感受性に関する標準的なプ
レートアッセイ、ならびに細胞外プロテアーゼ、エラスターゼ、ホスホリパーゼ
Cおよびピオシアニンの標準的定量アッセイ。以下のものを除き、PA14 TnphoA変
異株の大半は生化学的にはPA14親株と区別不能であった。変異株12A1では弾性組
織分解（elastolytic）活性および蛋白質分解活性の低下が認められたが、ピオ シアニンは過剰産生された。変異株50E12によるピオシアニンの産生レベルはPA1
4の3倍であった。変異株41A5の蛋白質分解活性は野生型のレベルの約70％に過ぎ
なかった。
【００７０】 ここで、緩徐致死アッセイを用いて同定されたこれらの変異株のそれぞれに関
するDNA配列分析および生化学的分析の詳細な説明を以下のセクションで行う。
【００７１】 変異株12A1 12A1におけるTnphoA挿入物は、緑膿菌PA01株の以前に記載された
lasR遺伝子のコドン154内に挿入されていた。12A1の表現型は他の既知のlasR変 異株と同じく多面発現性であり、これにはエラスターゼおよびプロテアーゼの産
生低下が含まれる。また、12A1の定常期でのピオシアニン産生量はPA14親株の2 〜3倍であった。さらに、GFPを発現するlasR変異株（PA14lasR::GFP19-1）は線 虫の腸に定着できず、摂食48時間後にC.エレガンス腸内に検出された蛍光は極め
てわずかであった。
【００７２】 図34Aは、緑膿菌PAO1 lasR遺伝子を12A1株における構成性lacZプロモーター（
pKDT17）の制御下でトランス性に発現させると、線虫を緩徐に死亡させる12A1の
欠損性表現型が完全に修復されることを示している。12A1（pKLDT17）ではエラ スターゼの産生も野生型のレベルに回復することが示されたが、ピオシアニンの
過剰産生は修復されなかった。ピオシアニン過剰産生性の表現型は予想外であっ
たため、本発明者らは、PA14ゲノム中でlarR遺伝子がゲンタマイシンカセットに
よって分断されるようなマーカー交換を行うことにより、新たなlasR変異株であ
るlasR::Gmを作製した。lasR::Gm変異株は12A1と同じく非病原性であったが（図
34A）、ピオシアニンの産生レベルは正常であり、このことから12A1にはピオシ アニン産生のアップレギュレーションをもたらす第2の変異があるという可能性 が示唆された。この結果から、定常期におけるピオシアニン産生のアップレギュ
レーションが病原性の弱い表現型とは関係しないことも示された。
【００７３】 変異株pho15 pho15におけるdsbA遺伝子の破壊は、非病原性表現型の原因であ
ることが明らかになった。図24Bは、PA14pho15のヌクレオチド配列（配列番号：
166）および予想されるアミノ酸配列（配列番号：167）を示している。pho15バ ックグラウンドにおけるトランス性の大腸菌dsbAＥＣ遺伝子またはPA14dsbAＥＣ 遺伝子の構成性発現により、C.エレガンスにおけるpho15の病原性欠損表現型が 完全に修復されることも明らかになった（図34B）。これらの実験に関しては、 大腸菌dsbAＥＣ遺伝子を以下の通りにpUCP18中にクローニングした。PCRで増幅 した大腸菌dsbAをpBAD18のKpnIおよびXbaI部位にクローニングし、pCH3を得た。
これにより、大腸菌dsbAは大腸菌アラビノースプロモーターの下流に置かれた。
大腸菌dsbAを含む700bpのKpnI／SphI断片をpUCP18のKpnI／SphI部位にクローニ ングして、構成性大腸菌lacZプロモーターの下流に大腸菌dsbAが置かれたpEcdsb
Aを作製した。続いてpEcdsbAをPA14およびpho15の形質転換に用い、それぞれPA1
4（pEcdsbA）株およびpho15（pEcdsbA）株を作製した。
【００７４】 PA14d5bApaは以下の通りに作製した。 PA01（GenBankアクセッション番号U847
26）のdsbA配列に基づき、プライマーTMW8（5'-GCACTGATCGCTGCGTAGCACGGC-3'；
配列番号：177）およびTMW9（5'-TGACGTAGCCGGAACGCAGGCTGC-3'；配列番号：178
）を用いて、dsbA遺伝子およびPA14のゲノムDNAからのdsbA遺伝子の翻訳開始部 の上流176bpを含む1126bp断片を増幅した。TAクローニングキット（Invitrogen ）を用いてこの断片をpCR2.1ベクター中にクローニングし、pCRdsbAを作製した 。SacI／XbaI断片を含むdsbAを、SacI／XbaIで消化したpUCP18中にクローニング
し、dsbAの転写が構成性lacZプロモーターの制御下にあるpPAdsbAを作製した。p
ho15にpPAdsbApaによる形質転換を行うことにより、pho15（PAdsbA）株を作製し
た。
【００７５】 変異株25F1 25F1においてTnphoAは、3遺伝子オペロンと推定されるものの最 初の遺伝子である、338アミノ酸の蛋白質をコードする推定上の遺伝子（orf338 ）のコドン100内に挿入されたことが明らかになった。予想される下流遺伝子（o
rf224およびorf252）は、それぞれ224および252アミノ酸の蛋白質をコードする 。GAP分析により、orf338とC.テピジウムのoriT（GenBankアクセッション番号U5
8313）との一致率は28.5％（類似度37.7％）であることが示された。ORF224のBL
ASTPにより、真核生物、古細菌、ラン藻およびミコバクテリア由来のマンノース
-1-リン酸グアニリルトランスフェラーゼ（MPG；EC 2.7.7.13）が同定されたが 、緑膿菌の近縁種であるプロテオバクテリアでは同定されなかった。既知のMPG はすべて359〜388アミノ酸残基からなるが、ORF224は224アミノ酸残基のみから なるため、ORF224が機能的MPGであるか否かは不明である。ORF252は大腸菌DjlA ＥＣ と相同である。DjlAＥＣは、2成分性ヒスチジンキナーゼシグナル伝達系を 含む、多くの膜蛋白質の集合、活性および／または維持の補正に一定の役割を果
たすと考えられている。
【００７６】 orf338が線虫における病原性低下の原因となる遺伝子であるか否かを検証する
ために、本発明者らは、orf338のみを有する菌株である25F1（pORF338）の致死 動態を、野生型PA14およびベクターのみを有する25F1と比較した。25F1（pORF33
8）は以下の通りに作製した。
【００７７】 482bpの上流プロモーター配列、orf338全体および切断型orf224を含む1.8kbの
PCR断片を、プライマーF2327（5'-CGAGGAATCCAGTCGAGGTG-3'；配列番号：179） およびR4180（5'-GCAAGATGCAGCCGAGAGTAG-3'；配列番号：180）を用いて、PA14 ゲノムDNAから増幅した（ExpandTM High Fidelity System、Boehringer Mannhei
m）。この産物をベクターpCR2.1（TA Cloning、Invitrogen）中にクローニング し、プラスミドpMT4O3C-Rを作製した。PCR産物を含むpMT4O3C-RからのSacI／Xba
I断片をpUCP18のSacI／XbaI部位にクローニングし、orf338が本来のプロモータ ーの制御下にあるpORF338を作製した。25F1にpORF338による形質転換を行い、25
F1（pORF338）株を作製した。
【００７８】 さらに、オペロン全体（orf338、orf224およびdjlAＰａ）を含む菌株を以下の
通りに作製した。orf338、orf224およびdjlAＰａならびにそれらの上流転写配列
を含む3.6kbゲノム断片を、プライマーRIF3115（5'-GTCAGAATTCTCAGCTTGACGTTGT
TGCCC-3'；配列番号：181）およびRIR6757（5'-GTCAGAATTCGACTTCTATTACCGCGACG
CC-3'；配列番号：182）を用いるPCR法によって増幅した。EcoRI部位（下線部）
はプライマーには存在するが、ゲノム配列には存在しない。PA14株におけるorf3
38、orf224およびdjlAＰａの配列を決定するために、PCR産物の両ストランドの シークエンシングを行った。EcoRIで消化したPCR産物をpUCP18のEcoRI部位にク ローニングし、制限消化によって挿入物の配向を決定した。続いて、orf338、or
f224およびdjlAＰａが本来のプロモーターの制御下にあるプラスミドp3-ORFを用
いて25F1の形質転換を行い、25F1（p3-ORFs）を作製した。
【００７９】 図34Cに示されている通り、25F1（pORF338）株は緩徐致死性表現型を完全に補
完することはできなかった。オペロン全体（orf338、orf224およびdjlAＰａ）を
含む25F1（p3-ORFs）株も、この変異型表現型の一部を補完したのみであった。 この結果から、TnphoAが病原性表現型の原因であることが示された。一部が補完
されたのは遺伝子用量効果の結果であったと思われる。さらに、25F1（p3-ORFs ）株によって得られた死亡率が25F1（pORF338）株よりも高かったことから、下 流遺伝子であるORF224および／またはDjlAPaもPA14のビルレンスに一定の役割を
果たしているという可能性が示唆された。
【００８０】 図24Eは、ORFT（配列番号：174）、ORFU（配列番号：175）およびDjlAＰａ（ 配列番号：176）をコードするPA14 25F1のヌクレオチド配列（配列番号：173） を示している。
【００８１】 変異株50E12 50E12では、TnphoA挿入物は大腸菌のPtsPＥｃ蛋白質との一致率
が43％（類似度54％）である推定759アミノ酸の蛋白質のコドン39内に挿入され ていた。配列解析に基づき、ptsPＥｃはN末端のNif-AドメインおよびC末端の酵 素Iドメインを含む738アミノ酸の蛋白質である酵素INtrをコードすると予想され
た。このうち後者はホスホエノールピルビン酸依存性ホスホトランスフェラーゼ
系において働く。Nif-Aドメインは、低分子シグナルの直接的な感知またはNifL 様蛋白質からのシグナルの受容のいずれかにより、シグナル伝達機能を果たす。
いずれの機序も酵素Iドメインの触媒活性を調節すると考えられ、これが続いてN
Pr（窒素関連HPr）をリン酸化し、それによってRpoN依存性オペロンの転写を調 節するという仮説が提唱されている。PA14 PtsPＰａ相同体のすぐ上流には、pts
PPaとともに同時転写されると思われる159アミノ酸の蛋白質をコードすると予想
されるオープンリーディングフレーム（orf159）がある。図24Cは、YgdPPa（配 列番号：169）およびPtsPPa（配列番号：170）をコードするPA14 50E12のヌクレ
オチド配列（配列番号：168）を示している。ORF159は、インフルエンザ菌（H.
influenzae）（GenBankアクセッション番号Q57045）および大腸菌（GenBankアク
セッション番号Q46930）で認められる機能不明のYgdP蛋白質との一致率が62.3〜
64.8％である。これらの蛋白質は、ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pyl
ori）およびバルトネラ・バシリホルミス（Bartonella bacilliformis）におけ る侵入蛋白質A（invasion protein A）と密接な関係にある。B.バシリホルミス の侵入蛋白質A（SwissProtアクセッション番号P35640）はailAによってコードさ
れ、この遺伝子はそれと隣接しているが独立して転写される遺伝子であるailBと
共存する場合に、大腸菌に対してヒト赤血球への侵入能を付与する。
【００８２】 50E12の補完に関して、50E12（pMT206-lac）および50E12（pMT206-nat）とい う2つの菌株を検討した。50E12（pMT206-lac）株は、orf159およびptsPＰａの転
写が構成性lacZプロモーターの制御下に置かれているプラスミドpMT206-lacを有
する。50E12（pMT206-nat）株の場合、orf159およびptsPＰａはそれらの本来の プロモーターのみによって制御される。これらの菌株のそれぞれは以下の通りに
作製した。
【００８３】 両端にEcoRI部位を含む4.3kbのPCR断片を、以下のプライマーを用いて緑膿菌P
A14株のゲノムDNAから増幅した：RIF1698（5'-GTCAGAATTCGATGTTCCAGTCCCAGATCC
C-3'；配列番号：183）およびRIR6002（5'-GTCAGAATTCCAGTAGACCACCGCCGAGAG-3'
：配列番号：184）。この断片をpUCP18のEcoRI部位にクローニングしてpMT206-l
acおよびpMT206-natを作製し、それらの実体を制限消化によって確認した。pMT2
06-lacでは、orf159およびptsPPaの転写は構成性lacZプロモーターおよびそれら
の本来のプロモーターの両方の制御下にある。pMT206-natでは、orf159およびpt
sPPaの転写を制御するのはそれらの本来のプロモーターのみである。
【００８４】 図34Dに示されている通り、いずれの菌株も変異型表現型の一部を補完したが 、これらの補完された菌株が線虫の100％を死亡させるまでに要した時間は野生 株よりも長かった。熱傷マウスアッセイでも部分的な補完が認められ、50E12（p
MT206-nat）株の細菌5×10５個に感染した後のマウスの死亡率は39％であり、こ
れに対して、野生株および50E12に感染した場合の死亡率はそれぞれ100％および
0％であった。これらの結果から、線虫およびマウスにおける緑膿菌の病原性に 、orf259-ptsPＰａオペロンと推定されるものが関与することが示された。
【００８５】 変異株35A9 35A9におけるTnphoA挿入物は、ヘリックス-ターン-ヘリックスを
含む細菌転写調節蛋白質のTetRファミリーに属する淋菌（N. gonorrhoeae）MtrR
Ng蛋白質と最も密接に関連する、推定210アミノ酸の蛋白質（orf210によってコ ードされる）内に位置する。ORF210は、緑膿菌におけるエネルギー依存性流出（
EDE）系の構成要素と相同な3つの遺伝子と隣接し、それらから分岐転写を受ける
。PA01からの配列の解析により、これらの4つの遺伝子が合わさって緑膿菌にお ける新規なエネルギー依存性流出（EDE）系を規定することが示された。緑膿菌 において以前に記載されている他のEDE系は、mexR、mexA-mexB-oprK系、nfxB、m
exC-mexD-oprJ系およびnfxC、mexE-mexF-oprN系である。図24Dは、mtrRＰａ（配
列番号：172）をコードするPA14 35A9のヌクレオチド配列（配列番号：171）を 示している。
【００８６】 変異株37H7および1D7 変異株37H7からのIPCR産物の分析により、214アミノ酸
のGacA蛋白質のコドン188内にTnphoA挿入物があることが示された。DNAブロット
分析により、1D7がgacA遺伝子中にも挿入物を含むことが示された。
【００８７】 変異株48D9 TnphoAは、細菌の2成分調節因子の一ファミリーに属するセンサ ーキナーゼである925アミノ酸からなるLemA相同体のコドン491と492との間に挿 入されている。P.シリンガエ（P. syringae）におけるLemAのコグネイト応答調 節因子はGacAであり、GacA＋LemAは種々のビルレンス因子の発現に影響を及ぼす
ことが示されている。
【００８８】 変異株41C1 変異株41C1において、TnphoAは、大腸菌の内在性膜蛋白質（Swis
sProt P77338）と推定されるもののAefA相同体中に挿入されている。これは30〜
40kDのUPFOOO3蛋白質ファミリー（PROSITE PDOC00959）のメンバーである。これ
は大腸菌のほか、ラン藻（Synechocystis）PCC 6803株およびメタン生成古細菌 （Methanococcus jannaschii）にも存在する。
【００８９】 また、pho34B12、3E8、8C12、1G2、35A9および23A2株もフェナジン(-)表現型 をもつことが明らかになった。さらに、pho34B12、3E8、8C12および1G2変異株で
は色素産生が低下していることが判明した。色素の減少は別の変異株である6A6 でも同定された。緑膿菌株の特徴的な色調は、まとめてフェナジン類として知ら
れる一群の三環系二次代謝産物に起因し、そのうち最も詳細に特徴が判明してい
るものが青緑色の色素であるピオシアニン（1-ヒドロキシ-5-メチルフェナジン ）である。細菌変異株における色素沈着減少の少なくとも一部がピオシアニンの
減少に起因するか否かを検討するために、野生型PA14ならびに急速致死アッセイ
を用いて得られたすべての変異体において、この色素の量を定量化した。この分
析の結果、色素減少性の表現型を有するpho34B12、3E8、8C12、1G2および6A6変 異株ではピオシアニン産生も低下しており、その程度は野性株の10〜50％の範囲
であることが示された。他の変異株である13C9、23A2および36A4におけるピオシ
アニンの量は野生株と同程度であった。
【００９０】 さらに、3E8においてTnphoA変異によって分断された配列から、二次代謝産物 であるフェナジンの産生に関与するオペロンの一部である、蛍光菌（Pseudomona
s fluorescens）のphzB遺伝子（GenBankアクセッション番号：L48616）と相同な
蛋白質が予想されることが明らかになった。phzB遺伝子には、シュードモナス・
オーレオファシエンス（Psuedomonas aureofaciens）にもphzY（GenBankアクセ ッション番号AF007801）と呼ばれる相同体がある。この配列タグを用いることに
より、この領域を含むコスミド（1G2503）が緑膿菌データベース中に同定された
が、これはphzAおよびphzB遺伝子の両方を含むほか、フェナジン生合成に関与す
ると考えられている他の遺伝子であるpcnCおよびD遺伝子（GenBankアクセッショ
ン番号AF005404）も含んでいた。これらの菌株のうち34B12、3E8、23A12および3
5A9の4つをマウス熱傷アッセイにおいて病原性に関して検討した。驚くべきこと
に、これらの実験によってフェナジン欠損株は病原性が弱いことが示され、この
ことからTnphoA挿入物によって分断された遺伝子が哺乳動物ビルレンス因子であ
ることが示された。これらの菌株に関するヌクレオチドおよび予想されるアミノ
酸配列を、配列タグを含め、図7〜9、13、14A、14B、15、16A、16B、17、18A、1
8B、18C、18D、18E、22、24A、24B、24C、24D、24Eおよび33に示す。さらに、図
25および26にはそれぞれ、緑膿菌のphnAおよびphnB遺伝子のヌクレオチド配列、
ならびにPHNAの予想されるアミノ酸配列を示す。
【００９１】 ここで、急速致死アッセイを用いて同定された変異株のそれぞれに関するDNA 配列および生化学的分析の詳細な説明を以下のセクションで行う。
【００９２】 変異株36A4、23A2および13C9 野生型レベルのピオシアニンを産生した3種の 変異株から得られたDNA配列タグはいずれも、シュードモナスにおける既知の遺 伝子と相同であった。変異株36A4は、植物病原体シュードモナス・シリンガエ（
Pseudomonas syringae）において病原性を制御する遺伝子座として以前に同定さ
れたhrpM（MillsおよびMukhopadhyay、シュードモナス：バイオトランスフォー メーション、病原性および技術進展（Pseudomonas：biotransformations、patho
genesis and evolving technology）、S. Silver、A.M. Chakrabarty、B. Iglew
iskiおよびS. Kaplan編、American Society for Microbiology、1990、pp.47〜5
7、Mukhopadhyayら、J. Bacteriol. 170：5479〜5488、1988）；GenBankアクセ ッション番号140793）と相同な遺伝子中に挿入された形でTnphoAを含んでいた。
この遺伝子座は、周辺質グルカンの生合成に関与する酵素をコードする大腸菌md
oH遺伝子（Loubensら、Mol. Microbiol. 10：329〜340、1993；GenBankアクセッ
ション番号X64197）とも相同である。変異株23A2では、TnphoA挿入物は、緑膿菌
PAO1株においてmexA（Pooleら、Mol. Microbiol. 10：529〜544、1993；GenBank
アクセッション番号L11616）として以前に同定された遺伝子中に挿入されていた
。細胞質-膜関連リポ蛋白質と予想されるmexAの産物は、同じオペロン内にある 他の2つの遺伝子であるmexBおよびoprMの産物とともに、広範な基質特異性をも つ非ATPアーゼ性流出ポンプとして働く可能性が高い（Liら、Antimicrob. Agent
s. Chemother. 39：1948〜1953、1995）。色素産生に関して野生型である3つ目 の変異株13C9に隣接するDNAの分析からは、これが緑膿菌PAO1株におけるもう1つ
の既知の遺伝子であるorp（GenBankアクセッション番号U54794）に対応すること
が示された。Orp、すなわちホスホリパーゼCの浸透圧保護因子（osmoprotectant
）依存性調節因子は、緑膿菌によって産生されるホスホリパーゼCの2つのアイソ
フォームのうちの1つである病原性因子PlcHの発現を制御する因子として同定さ れた（Sageら、Mol. Microbiol. 23：43〜56、1997）。
【００９３】 変異株1G2および8C12 1G2および8C12という2つの非色素性変異株の分子的解 析により、1G2挿入物に隣接するDNAはヒスチジン感受性キナーゼに特徴的なモチ
ーフを含むものの、それらは新規遺伝子中に挿入物を含むことが示された。この
遺伝子はPAO1ゲノムデータベース中には存在しなかた。8C12配列タグにはPAO1デ
ータベース中に相同遺伝子が同定されたが、この遺伝子内に明らかなモチーフは
認められなかった。
【００９４】 変異株3E8および6A6 3E8および6A6という2つの変異株は、以前に同定された 蛍光菌2-79株におけるphzB遺伝子（GenBankアクセッション番号AF007801）およ びP.オーレオファシエンス（P. aureofaciens）30-84株におけるphzY（GenBank アクセッション番号L48616）と相同な同じ遺伝子中にTnphoA挿入物を含んでいた
。しかし、これらの2つの変異株は全く同じ位置にTnphoA挿入物を含んでいたが 、それらは2つの異なる変異株ライブラリーから得られたため、それらは独立し た分離株であった。phzBおよびphzYは同定しうる配列モチーフを含んでいなかっ
たが、それらは蛍光菌およびP.オーレオファシエンスの両方でフェナジン-1-カ ルボキシレート（PCA）の産生を調節することが知られたオペロン中に存在して いた（Mavrodiら、J. Bacteriol. 180：2541〜2548、1998）。
【００９５】 変異株pho34A12 最後の非色素性変異株pho34B12におけるTnphoA挿入物に隣接
するDNAは以前にクローニングされており、以下に説明する新規遺伝子座である ことが示されている。興味深いことに、この挿入物は、緑膿菌PAO1株において同
定されたフェナジン生合成遺伝子であるphnAおよびphnBのすぐ下流にある（Essa
rら、J. Bacteriol. 172：884〜900、1990）。
【００９６】 フェナジンはC.エレガンスの急速致死に必要である 急速致死スクリーニングにおいて色素性および非色素性変異株がいずれも分離
されたことから、急速致死過程には複数の因子が関与することが示された。しか
し、3E8および6A6変異株（フェナジン産生を調節することが知られたオペロン中
に挿入物を含む）の分子的解析からは、フェナジン類が急速致死を媒介する一群
の毒素であることが示唆された。この仮説を直接検証するために、別の変異であ
るAphnA phnBを以下の通りに作製し、検討した。
【００９７】 フェナジン生合成遺伝子であるphnAおよびphnB（Essarら、J. Bacteriol. 172
：884〜900、1990）遺伝子は、以前に特徴が明らかにされたPA14におけるpho34B
12 TnphoA挿入物の上流に位置する；GenBankアクセッション番号AF031571）。こ
の領域の野生型配列に対応する3.7kbのEcoRI断片（プラスミドpLGR34由来）をpB
luescript SK/+中にサブクローニングし、Bs34B12を得た。このプラスミドは、p
hnA（完全長1591bp）の944bp、phnB遺伝子全体（600bp）遺伝子および1.7kbの下
流配列を含んでいた。phnAの欠失した605bpおよび405bpの上流配列を、オリゴヌ
クレオチドプライマーPHNA3（5'-GGTCTAGACGAACTGAGCGAGGAG-3'；配列番号：185
）およびPHNA2（5'-GCCTGCAGGCGTTCTACCTG-3'；配列番号：186）を用いるPCRに より、PA14ゲノムDNAから増幅した。以上のプライマーは、緑膿菌PAO1株から以 前にクローニングされたphnAおよびphnB遺伝子（Essarら、J. Bacteriol. 172：
884〜900、1990、GenBankアクセッション番号M33811）に基づく。増幅された101
0bpの配列をBs34B12のPstI部位にサブクローニングし、作製物pBs34B12phnAを得
た。phnA、phnB内部のインフレーム欠失は、遺伝子の2.6kbの野生型配列を、プ ライマーPHNDEL1（5'-GGCTGCAGTGATTGACTGAGCGTCTGCTGGAGAACG-3'；配列番号：1
87）およびPHNDEL2（5'-GGGAAGCTTCGTCTAGAATCACGTGAACATGTTCC-3'：配列番号：
188）を用いるPCRによって増幅した1kb断片（図35）によって置換することによ って作製し、これによってプラスミドpBs34bl2phndelを得た。phnAphnBインフレ
ーム欠失を含む1.8kbのXbaI断片を、スクロース陽性選択性自殺ベクター（posit
ive-sucrose-selection suicide vector）pCVD442（DonnenbergおよびKaper、In
fect. Immun. 59：4310〜4317、1991）中にサブクローニングした。この結果得 られた作製物pCVD34B12phndelを用いて、破壊されたphnA、phnB遺伝子を野生型P
A14ゲノム中に相同組換えによって導入し、変異株PA14ΔphnAphnBを得た。この 変異株が望ましい欠失を含むことを確認するために、PA14親株および誘導物PA14
ΔphnAphnB株からのDNAを用いるDNA制限およびDNAブロット分析を行っ
【００９８】 緑膿菌および近縁のシュードモナスにおいてフェナジンの形成を触媒する酵素
の性質についてはほとんど知られていないが、コリスミ酸のアントラニル酸への
変換が本経路における重要な段階であると考えられている。（図35A）。緑膿菌P
AO1株では、この段階はphnAおよびphnB遺伝子によってコードされるアントラニ ル酸シンターゼによって触媒される可能性が高いと考えられるが、これはこれら
の遺伝子における変異によってフェナジンの一つであるピオシアニンの産生が低
下するためである（Essarら、J. Bacteriol. 172：884〜900、1990）。phnAおよ
びphnB遺伝子をPA14からクローニングし、これらの遺伝子中に1602bpの欠失を含
むΔphnAphnB変異株を作製した（図35B）。重要な点は、この変異は非極性とな るように設計したため、phnAおよびphnBのすぐ下流にあることが示されている2 つのORF（下記）に影響しないことである。ΔphnAphnB変異株でのピオシアニン 測定により、それが産生するのは野生型レベルの10％に過ぎないことが示され、
このことからPA14株ではPAO1株と全く同じようにピオシアニン産生にphnAおよび
phnBが関与することが確認された。ΔphnAphnBを用いて行ったアッセイにより、
この菌株の急速致死作用は大きく低下していることが明らかになった。図35Cに 示す通り、ΔphnAphnB曝露から3時間後に死んだ線虫は5％未満であったが、これ
に対して、野性株に曝露された線虫はほぼ100％が死んだ。ΔphnAphnB株の挙動 は、本実験において弱毒変異株に関する対照として用いた別のフェナジン変異株
3E8と類似した様式であった。これらの結果は、C.エレガンスの急速致死にはフ ェナジンが必要であることを示している。
【００９９】 急速致死を媒介する細菌因子が他の宿主における病原性と関連するか否かを明
らかにするために、急速致死変異株を、アラビドプシス（Arabidopsis）葉侵入 モデルならびにマウス全層皮膚熱傷モデル（下記）におけるビルレンスに関して
検討した。5つの急速致死変異株を、それらの病原性に関する定量的指標として のアラビドプシス葉における4日間の増殖に関して検討し、同じくマウス全層皮 膚熱傷モデルでも検討した。表4および5に示す通り、感染4日後のアラビドプシ ス葉における最大増殖レベルはフェナジン変異株3E8および8C12で有意に低かっ た。マウスモデルでは、細胞5×10５個を接種に用いた場合、これらの2つの変異
株による死亡率は野性株よりも有意に低く、P＜0.05であった。第3のフェナジン
変異株である1G2は、植物モデル、マウスモデルのいずれにおいても野性株との 間に有意差は認められなかった。
【０１００】 hrpM変異株36A4およびmexA変異株23A2はいずれもアラビドプシス葉における増
殖が大きく低下しており、本モデルにおける病原性に大きな欠陥があることが示
された。マウスモデルにおいて、変異株36A4には劇的な影響がみられ、試験用量
では死亡は全く引き起こさなかった。これに対して、mexA変異株である23A2での
影響はわずかであった。これらの結果は、植物およびマウスの双方における病原
性に必要な遺伝子を同定する上で急速致死アッセイが極めて有効であることを示
しており、さらに、これらの2つの宿主における病原性にフェナジンが必要であ ることを初めてインビボで示したものである。
【０１０１】 本発明者らは、phzオペロンの調節因子であるphzRを本発明者らが同定したこ とにも特に言及する。図18Eは、PA14 phzRのヌクレオチド配列（配列番号：164 ）および予想される部分アミノ酸配列（配列番号：165）を示している。
【０１０２】 フェナジンおよび病原性 急速致死作用が低いPA14変異株は、色素合成にも影響を受けていた。本発明者
らの分子的解析により、色素産生と病原性との関連は、調節因子による色素沈着
および毒素産生の協調的調節に単に起因するものではないことが明らかになった
。実際には、本発明者らはフェナジン生合成遺伝子に変異があるとビルレンスが
低下していることを見いだしたが、このことはフェナジンが急速致死過程におけ
る毒素であることを強く示している。シュードモナスに特徴的な色調を与える三
環系色素化合物であるフェナジン（TurnerおよびMessenger、Adv. Microb. Phys
iol. 27：211〜273、1986）は、競合的条件下でのこの微生物の生存性を高める と考えられている二次代謝産物である（Maplestoneら、Gene 115：151〜157、19
92）。PA14によって産生されるフェナジンの種類は不明であるが、緑膿菌PAO1株
は、特徴が詳細に示されている青緑色の色素であるピオシアニンを含め、少なく
とも6種類の異なるフェナジンを産生する。ピオシアニンを含むフェナジンは、 細菌、真菌および原生動物のいくつかの種に対する抗生作用を示し、その特性は
それらの酸化還元作用に起因することが示されている。フェナジンは極めて反応
性の強い還元状態では、種々の還元剤または分子状酸素の存在下において周期的
酸化還元を生じ、スーパーオキシドおよび過酸化水素の生成をもたらすことが記
載されている（HassanおよびFridovich、J. Bacteriol. 141：1556〜163、1980 ）。インビトロでは、中程度の細胞傷害性をもつこれらの酸素ラジカルは鉄触媒
によって細胞傷害性の強いヒドロキシルラジカルへと変換されうる（Britiganら
、J. Clin. Invest. 90：2187〜2196、1992）。フェナジンによる反応性酸素種 の形成も、インビトロで真核細胞に認められているそれらの細胞傷害作用の一因
と考えられている。これらの作用には、哺乳動物細胞の呼吸の阻害、繊毛運動の
破壊、ならびに炎症反応の刺激、リンパ球増殖の阻害および抗原に対するTリン パ球応答の変化などの免疫調節作用が含まれる。
【０１０３】 緑膿菌におけるフェナジン産生に至る生合成経路はほとんど明らかになってい
ないため、フェナジン産生に欠陥のあるPA14変異株でブロックされている経路中
の段階を同定することは困難である。しかし、3E8および6A6という2つの変異株 ではトランスポゾン挿入により、近縁のシュードモナスである蛍光菌（P. fluor
escens）およびP.オーレオファシエンス（P. aureofaciens）においてフェナジ ン産生に関与することが以前に明らかにされているphzBと相同な遺伝子が破壊さ
れている。蛍光菌では、phzBはフェナジン-1-カルボン酸の産生に関与する7遺伝
子オペロン（phzA-G）の一部であることが示されている。蛍光菌およびP.オーレ
オファシエンスにおけるこのオペロンの比較により、この2つは非常に相同性が 高いことが示され、このことからフェナジン産生に至る経路が蛍光性シュードモ
ナスでは保存されていることが示唆された（Mavrodiら、J. Bacteriol. 180：25
41〜2548、1998）。緑膿菌PA14株において、phzAおよびphzB遺伝子に隣接するDN
Aのシークエンシングは一部しか行われていないが、本発明者らの分析により、 この領域が蛍光菌phzA-Fオペロンの保存的構造を共有することが示唆された。PA
14および蛍光菌由来のphzAおよびphzB遺伝子の予想される翻訳産物の一致率はそ
れぞれ68および74％である。さらに、緑膿菌PAO1株にはphzA-F様遺伝子を含む領
域が存在し、これらの遺伝子の予想される翻訳産物の蛍光菌相同体（GenBankア クセッション番号AF005404）との一致率は69〜85％の範囲であった。蛍光菌およ
びP.オーレオファシエンスにおけるphzオペロンの役割からの外挿により、急速 致死作用に欠陥のあるPA14phzB変異株が分離されたことから、この過程にフェナ
ジンが関与することが強く示唆された。ピオシアニンを含むフェナジンが急速致
死作用の伝達因子の一つであるという仮説を、緑膿菌PAO1株におけるフェナジン
合成に特異的に関与することが以前に示されているアントラニル酸シンターゼの
2つのサブユニットをコードする遺伝子であるphnAおよびphnB（Essarら、J. Bac
teriol. 172：884〜990、1990）の非極性破壊によってさらに検証した。フェナ ジン生合成における役割と一致する形で、PA14におけるphnAおよびphnB遺伝子の
欠失は、ピオシアニン産生を著しく低下させた。さらに、ΔphnAphnB変異株は急
速致死作用に欠陥があり、このことからこの過程にフェナジンが決定的な役割を
果たすことが示された。
【０１０４】 病原性におけるフェナジンの役割を、アラビドプシスおよびマウスでも検討し
た。phzB遺伝子の内部に挿入物を含む2つの独立した変異株である3E8および6A6 は、アラビドプシス葉侵入モデル、マウス全層皮膚熱傷モデルともに病原性が劇
的に低下しており（表4および5）、フェナジンが多宿主病原性因子であることが
示唆された。興味深いことに、本発明者らの今回の検討およびこれまでの検討で
同定された他の多宿主病原性因子の多くは、エフェクター、または宿主と直接相
互作用する分子ではなく（下記）、いくつかの他のビルレンス因子の産生に関与
する可能性が高い。したがって、フェナジンは、本発明者らが同定した唯一の既
知のクラスの多宿主病原性エフェクターである。フェナジンに関する詳細なイン
ビトロ分析がなされているにもかかわらず、緑膿菌感染におけるそれらの産生の
生理的意義およびそれらの役割には現在も議論があり、今回の検討の以前にはそ
れらのインビボでの役割は示されていなかったことからも、これらの所見には意
味がある。
【０１０５】 急速致死は多因子性である 野生型レベルの色素を産生する急速致死性変異株の分析により、フェナジンは
急速致死の必須な伝達物質であるものの、この過程には他の因子も関与すること
が示された。このような変異株の1つである23A2の分子的解析から、3遺伝子オペ
ロンMexA、B、OprMの一部であり、緑膿菌PAO1株において以前にMexAとして同定 された遺伝子（Pooleら、Mol. Microbiol. 10：529〜544、1993）中にトランス ポゾンが挿入されたことが明らかになった。これらの遺伝子の産物は細胞質（Me
xA、MexB）および外膜（OprM）に局在し、それらはそこで非ATPアーゼ性の広範 な特異性をもつ流出ポンプとして働くという仮説が提唱されている（Liら、Anti
microb. Agents Chemother. 39：1948〜1953、1995）。このポンプは当初、緑膿
菌における多剤耐性過程に寄与することから同定され、二次代謝産物の流出に一
般的な役割を果たすと考えられているが、その天然の基質は不明であった（Pool
e、Antimicrob. Agents Chemother. 34：453〜456、1994）。mexA変異株におけ る、拡散性毒素を介する過程である急速致死の欠陥は、この過程に関与する1つ または複数の因子の流出が起こらないことが原因である可能性が高い。mexA変異
株は色素性であることから、フェナジンがこのポンプの基質である可能性は低い
。mexA変異株は、急速致死に欠陥があることに加えて、マウスモデルにおける病
原性がわずかに低下しており、アラビドプシス葉侵入モデルでは大きく低下して
いた。特定のビルレンス因子のエキスポートが起こらないことによってこれらの
欠陥は説明可能であるが、mexA変異株は細菌感染に反応して産生される宿主防御
因子から自らを防御することができないという別のモデルも考えられる。このよ
うな防御機能は、ATP結合カセット（ABC）輸送体に関連する蛋白質をコードし、
ヒト病原体であるネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）ならびに植物病原
体であるエルウィニア・クリサンテミ（Erwinia chrysanthemi）（Taylor、Plan
t Cell 10：873〜875、1998）における宿主抗菌ペプチドに対する耐性を媒介す るsap遺伝子に関して示されている（Taylor、Plant Cell 10：873〜875、1998）
。
【０１０６】 スクリーニングで同定された第2の変異株である36A4は、mdoGHオペロンの一部
である大腸菌MdoHと相同な遺伝子中にトランスポゾン挿入物を含んでいた。大腸
菌では、このこのオペロンは膜由来オリゴ糖（MDO）または線状の周辺質グルカ ンの合成に関与する（Loubensら、Mol. Microbiol. 10：329〜340、1993）。植 物病原体シュードモナス・シリンガエ.pv.シリンガエ（Pseudomonas syringae p
v. syringae）に存在する、hrpMisと命名された類似の遺伝子座（Mukhopadhyay ら、J. Bacteriol. 170：5479〜5488、1988）は、当初、この遺伝子座における 変異によって宿主植物での疾患症状の発生ならびに非宿主植物における過敏反応
がいずれも消失することから同定された（AndersonおよびMills、Phytopath. 75
：104〜108、1985）。周辺質グルカンは広範なグラム陰性菌でも認められており
、それらに多様な機能を付与するが、それらはほとんど解明されていない。P.シ
リンガエ（P. syringae）における必須なビルレンス因子であることに加えて、 他の機能には低浸透圧環境に対する適応、ならびに根粒菌およびアグロバクテリ
ウムの種による真核宿主の認識につながる細胞シグナル伝達が含まれる（Kenned
y、エシェリヒアおよびサルモネラ（Escherichia and Salmonella）、F.C. Neid
ardt編、American Society for Microbiology Press、Washington、D.C.、pp. 1
064〜1071、1996）。しかし、サルモネラおよびクレブシエラなどのいくつかの 動物病原体の周辺質に存在するにもかかわらず、mdoH様遺伝子座に変異のある緑
膿菌でマウスモデルにおける病原性が大きく低下していることを示した本研究の
以前には、周辺質グルカンが動物宿主の感染に関与することは示されていなかっ
た。
【０１０７】
【表４】 ｂ細菌103個の接種4日後の時点でのCFU／cm２葉面積の細菌数：4〜5個の試料の 平均。細菌数の平均CFU／葉面積cm２が、同一設定の実験において野生型よりも2
標準偏差少ない場合に、変異株の病原性は弱いと定義した。ｃ 線虫における病原性が弱い(-)変異株は、それを摂食した線虫の50％が死亡す るまでに要する平均時間（3回の反復によるLT５０）が同じ実験における親UCBPP
-PA14のLT５０よりも2標準偏差短いものとした。LT５０の算出については材料お
よび方法を参照のこと。ｄ 体重20〜30gmの6週齡雄ARJ／J近交系マウス（Jackson Laboratoriesから入手 ）に対して、スティーブンス（Stevens）ら、J. of Burn Care and Rehabil. 15
：232〜235、1994による記載の通りに細胞5×10５個を注入した。敗血症で死亡 したマウスの数を10日間にわたり毎日観測した。ｅ 他に独立して分離されたgacA変異株は1D7（rpn9）および33D11（rpn10）の2つ
である。変異株rpn9のマウスに対する検討では、死亡率は50％であった。ｆ 線虫のみでの検討ｇ フェナジン欠損変異株ｈ 急速致死には欠陥があるが、緩徐致死には影響のない変異株 dst*＝下流
【０１０８】
【表５】 植物およびマウスにおけるPA145急速致死変異株の病原性 ａ 細菌10３個の接種5日後の時点での細菌数のCFU／cm２葉面積。各値は4〜5個 の試料の平均を表す。細菌数の平均値が、同一セットの実験において野生型より
も2標準偏差少ない場合に、変異株の病原性は弱いと定義した。ｂ 体重20〜30gmの6週齡雄ARJ／J近交系マウス（Jackson Laboratoriesから入手
）に細菌細胞5×10５個を注入した。(n)は注入マウスの総数である。敗血症で死
亡したマウスの数を7日間にわたり毎日観測した。ｃ 3E8および6A6は、全く同じ位置に挿入された形でTnphoAを含む、独立に生じ た変異株である。6A6でも同様の結果が得られた（非提示データ）。
【０１０９】付加的なビルレンス遺伝子の単離 本明細書に記載されたヌクレオチドおよびアミノ酸配列に基づき、当技術分野
で周知の標準的な戦略および技法を用いてビルレンス因子のほかのコード配列を
単離することが可能となった。このようなビルレンス遺伝子およびこれらの配列
の分子クローニングのための核酸供給源として役立つ病原性細胞は、病原性に関
連した構造、特性または活性を示す蛋白質をコードするものとして同定される。
【０１１０】 このような単離法の1つの特定の実施例では、核酸ハイブリダイゼーションス クリーニングの従来のスクリーニング法とともに、本明細書に記載されるヌクレ
オチド配列の任意の1つを用いうる。このようなスクリーニング法およびスクリ ーニング手順は当業者には周知であり、例えば、ベントン（Benton）およびデー
ビス（Davis）（Science 196：180、1977）、グルンスタイン（Grunstein）およ
びホグネス（Hogness）（Proc. Natl. Acad. Sci.、USA 72：3961、1975）、ア ウスユーベル（Ausubel）ら（Current Protocols in Molecular Biology、Wiley
Interscience、New York、1997）、ベルガー（Berger）およびキンメル（Kimme
l）（前記）、ならびにサムブルック（Sambrook）ら、分子クローニング、実験 室マニュアル（Molecular Cloning. A Laboratory Manual）、Cold Spring Harb
or Laboratory Press、New Yorkに記載されている。1つの特定の実施例では、33
A9配列の全体または一部（本明細書に記載されたもの）を、33A9遺伝子と同一な
配列を有する遺伝子に関する組換え植物DNAライブラリーのスクリーニングのた めのプローブとして用いることができる（図5および6A〜B）。ハイブリダイズす
る配列は、標準的な方法に従うプラークまたはコロニーハイブリダイゼーション
によって検出される。
【０１１１】 または、33A9ポリペプチドのアミノ酸配列の全体または一部を用いて、縮重オ
リゴヌクレオチドプローブ（すなわち、任意のアミノ酸配列に関するすべての可
能なコード配列の混合物）を含む、33A9特異的オリゴヌクレオチドプローブを容
易に設計することもできる。これらのオリゴヌクレオチドは、33A9蛋白質の33A9
配列のいずれかのDNA鎖および任意の適切な部分（図5および6A〜B；それぞれ配 列番号：102および103）の配列に基づくものでよい。このようなプロモーターの
設計および調製のための一般的な方法は、例えば、アウスユーベルら（前記）、
ならびにベルガーおよびキンメル、分子クローニング技法への手引き（Guide to
Molecular Cloning Techniques）、1987、Academic Press、New Yorkに提示さ れている。これらのオリゴヌクレオチドは、33A9相補配列とハイブリダイズしう
るプローブとして、またはポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によるクローニング法 などの種々の増幅法のためのプライマーとして用いることにより、33A9遺伝子の
単離に有用である。必要に応じて、検出可能な標識がなされた異なるオリゴヌク
レオチドプローブの組み合わせを、組換えDNAライブラリーのスクリーニングの ために用いてもよい。このようなライブラリーは、例えばアウスユーベルら（前
記）に記載されたものなどの当技術分野で周知の方法に従って調製されるが、市
販の材料を用いてもよい。
【０１１２】 上記の通り、配列特異的オリゴヌクレオチドを、例えばPCRを用いる増幅クロ ーニング法におけるプライマーとして用いることもできる。PCR法は当技術分野 で周知であり、例えば、PCR技術（PCR Technology）、エールリッヒ（Erlich） 編、Stockton Press、London、1989、PCRの手順：方法および応用のための手引 き（PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications）、イニス（Innis ）ら編、Academic Press, Inc.、New York、1990、およびアウスユーベル（Ausu
bel）ら（前記）に記載されている。プライマーは、選択的には、例えば増幅断 片の5'および3'末端に適切な制限部位を含めることにより（本明細書に記載され
る通りに）、適したベクター中への増幅産物のクローニングを可能とするように
設計される。必要に応じて、PCR「RACE」法、またはcDNA末端の迅速増幅（例え ば、Innisら（前記）を参照のこと）を用いて、ヌクレオチド配列を単離するこ ともできる。この方法によれば、望ましい配列に基づくオリゴヌクレオチドプラ
イマーを3'および5'方向に配向させ、重複するPCR断片の生成に用いる。これら の重複する3'-および5'末端をもつRACE産物を組み合わせることで、無傷の完全 長cDNAが得られる。この方法は、イニスら（前記）、およびフローマン（Frohma
n）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85：8998、1988に記載されている。
【０１１３】 部分的なビルレンス配列、例えば配列タグは、完全長配列の同定のため、なら
びにこれまで同定されていない関連したビルレンス遺伝子の同定を目的とするデ
ータベースのスクリーニングのためのハイブリダイゼーションプローブとしても
有用である。例えば、36A4、25A12および33C7の配列は、それぞれコンティグ250
7、1126および1344により包含されるものへと拡張された。
【０１１４】 ある配列の病原性ポリペプチドとの関連性の確認は、機能的相補アッセイおよ
び遺伝子とその発現産物との配列の比較を非制限的に含む、従来のさまざまな方
法によって行いうる。さらに、遺伝子産物の活性は、そのコードされる産物の機
能的または免疫学的特性などの、本明細書に記載される任意の技法に従って評価
しうる。
【０１１５】 適切な配列がいったん同定されれば、それを標準的な方法に従ってクローニン
グし、例えば、病原体のビルレンスを低下させる化合物のスクリーニングなどに
用いることができる。
【０１１６】ポリペプチドの発現 一般に、本発明のポリペプチドは、適した発現媒体中にあるポリペプチドをコ
ードする核酸分子の全体もしくは一部またはその断片により、適した宿主細胞の
形質転換を行うことによって産生させうる。
【０１１７】 分子生物学の分野の当業者は、組換え蛋白質を提供するためには、さまざまな
発現系の任意のものを用いうることを理解すると考えられる。用いる宿主細胞の
厳密な種類は本発明にとって決定的ではない。本発明のポリペプチドは、原核生
物宿主（例えば、大腸菌）または真核生物宿主（例えば、サッカロミセス・セレ
ビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、Sf21細胞などの昆虫細胞、またはNIH 3T
3、HeLaもしくは好ましくはCOS細胞などの哺乳動物細胞）内で産生させることが
できる。このような細胞は、広範な供給源から入手可能である（例えば、Americ
an Type Culture Collection、Rockland、MD；Ausubelら、前記なども参照され たい）。形質転換またはトランスフェクションの方法、および発現媒体の選択は
、例えばアウスユーベルら（前記）に記載されており、発現媒体は例えばクロー
ニングベクター：実験室マニュアル（Cloning Vectors: A Laboratory Manual）
（P.H. Pouwelsら、1985、補遺1987）に提示されているものから選択しうる。
【０１１８】 ポリペプチド産生のための特定の細菌発現系の1つに、大腸菌pET発現系がある
（Novagen, Inc.、Madison、WI）。この発現系によれば、ポリペプチドをコード
するDNAが、発現が可能となるように設計された配向でpETベクター中に挿入され
る。このようなポリペプチドをコードする遺伝子はT7調節シグナルの制御下にあ
るため、宿主細胞内でT7 RNAポリメラーゼの発現を誘導することにより、ポリペ
プチドの発現が達成される。これは典型的には、IPTG誘導に反応してT7 RNAポリ
メラーゼを発現する宿主系統を用いて達成される。いったん組換えポリペプチド
が産生されれば、続いて、例えば本明細書に記載されるものなどの当技術分野で
知られた標準的な方法に従って、それを単離する。
【０１１９】 ポリペプチド産生のためのもう1つの細菌発現系に、pGEX発現系（Pharmacia）
がある。この系では、機能的遺伝子産物が迅速に精製および回収される融合蛋白
質としての遺伝子または遺伝子断片の高レベル発現のために設計されたGST遺伝 子融合系を用いる。関心対象の蛋白質を、日本住血吸虫（Schistosoma japonicu
m）由来のグルタチオンS-トランスフェラーゼ蛋白質と融合させ、グルタチオン セファロース4B（Glutathione Sepharose 4B）を用いるアフィニティークロマト
グラフィーによって細菌可溶化物から直ちに精製する。穏和な条件下でグルタチ
オンで溶出させることにより、融合蛋白質を回収しうる。融合蛋白質からのグル
タチオンS-トランスフェラーゼドメインの切断は、このドメインの上流に位置特
異的プロテアーゼの認識部位が存在することによって促進される。例えば、pGEX
-2Tプラスミド中で発現される蛋白質はトロンビンで切断でき、pGEX-3X中で発現
される蛋白質は第Xa因子で切断できる。
【０１２０】 本発明の組換えポリペプチドがいったん発現されれば、アフィニティークロマ
トグラフィーなどを用いてそれを単離する。1つの実施例では、本発明のポリペ プチドに対して産生させた抗体（例えば、本明細書の記載の通りに産生させたも
の）をカラムに付着させ、組換えポリペプチドの単離に用いる。アフィニティー
クロマトグラフィーを行う前のポリペプチド含有細胞の溶解および分画は、標準
的方法によって実施しうる（例えば、アウスユーベルら、前記を参照のこと）。
【０１２１】 組換え蛋白質がいったん単離されれば、必要に応じて、例えば高速液体クロマ
トグラフィーにより、それをさらに精製することができる（例えば、Fisher、生
化学および分子生物学における実験技法（Laboratory Techniques In Biochemis
try and Molecular Biology）、WorkおよびBurdon編、Elsevier、1980を参照さ れたい）。
【０１２２】 本発明のポリペプチド、特に短いペプチド断片は、化学合成による製造も可能
である（例えば、固相ペプチド合成（Solid Phase Peptide Synthesis）、第2版
、1984 The Pierce Chemical Co.、Rockford、ILに記載された方法による）。
【０１２３】 ポリペプチドの発現および精製に関するこれらの一般的技法を、有用なペプチ
ド断片または類似体（本明細書で記載するもの）の生成および単離のために用い
ることもできる。
【０１２４】抗体 抗体を作製するために、本発明のポリペプチドに関するコード配列を、グルタ
チオンS-トランスフェラーゼ（GST）とのC末端融合物として発現させることが可
能である（Smithら、Gene 67：31〜40、1988）。この融合蛋白質をグルタチオン
-セファロースビーズ上で精製し、グルタチオンで溶出させ、トロンビンで切断 した上で（組換え操作を行った切断部位で）、ウサギの免疫化に必要な程度に精
製する。一次免疫処置はフロイント完全アジュバントを用いて行い、以降の免疫
処置はフロイント不完全アジュバントを用いて行う。抗体価は、GST融合蛋白質 のトロンビン切断後の蛋白質断片を用いるウエスタンブロット法および免疫沈降
分析によって測定した。免疫血清にはCNBr-セファロース結合蛋白質を用いるア フィニティー精製を行った。抗血清の特異性は一連の無関係なGST蛋白質を用い て決定した。
【０１２５】 GST融合蛋白質の代替物または補助的免疫原として、本発明のポリペプチド中 の相対的にユニークな免疫原領域に対応するペプチドを作製し、導入したC末端 リジンを介してキーホールリンペットヘモシアニン（KLH）と結合させてもよい 。これらのペプチドのそれぞれに対する抗血清を、BSAと結合させたペプチド上 で同様にアフィニティー精製し、ペプチド結合物を用いるELISAおよびウエスタ ンブロット法、ならびにGST融合蛋白質として発現されたポリペプチドを用いる ウエスタンブロット法および免疫沈降法によって特異性を検討する。
【０１２６】 または、本発明のポリペプチドの任意の1つと特異的に結合するモノクローナ ル抗体を標準的なハイブリドーマ作製技術に従って調製する（例えば、Kohlerら
、Nature 256：495、1975；Kohlerら、Eur. J. Immunol. 6：511、1976；Kohler
ら、Eur. J. Immunol. 6：292、1976；Hammerlingら、モノクローナル抗体およ びT細胞ハイブリドーマ（Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas）、El
sevier、NY、1981；Ausubelら、前記を参照されたい）。モノクローナル抗体が いったん産生されれば、ウエスタンブロット法または免疫沈降分析により（アウ
スユーベルら、前記に記載された方法による）、それらも特異的認識に関して検
討する。本発明のポリペプチドを特異的に認識する抗体は本発明において有用と
考えられ、このような抗体は例えばイムノアッセイに用いうる。または、上記の
本発明のポリペプチドおよびファージディスプレイライブラリーを用いてモノク
ローナル抗体を調製することもできる（Vaughanら、Nature Biotech 14：309〜3
14、1996）。
【０１２７】 好ましくは、本発明の抗体は、概ね保存されている領域の外側に位置していて
、荷電残基の頻度が高いなどの基準により抗原性である可能性が高いと思われる
本発明のポリペプチドの断片を用いて作製する。1つの特定の実施例では、この ような断片をPCRの標準的技法によって生成し、pGEX発現ベクター中にクローニ ングする（Ausubelら、前記）。アウスユーベルら（前記）に記載された通りに 、融合蛋白質を大腸菌で発現させ、グルタチオンアガロースアフィニティー基質
を用いて精製する。抗血清の親和性または特異性が低いという問題が起こる可能
性をできるだけ低くするための試みとしては、各蛋白質に対してこのような融合
物を2〜3種類ずつ作製し、各融合物を少なくとも2匹のウサギに注入する。抗血 清は、好ましくは少なくとも3回の追加免疫注射を含む、一連の注射によって産 生させる。
【０１２８】 本明細書に記載されるポリペプチドの任意のものに対する抗体を、細菌感染症
の治療のために用いてもよい。
【０１２９】スクリーニングアッセイ 上記の通り、本発明者らは、病原性に関与しており、そのために緑膿菌ならび
に他の微生物病原体のビルレンスを低下させる化合物のスクリーニングに用いる
ことができる、緑膿菌の多数のビルレンス因子を同定した。例えば、本発明は、
本発明のポリペプチドの作用または核酸配列の遺伝子発現を増強（アゴニスト）
または遮断（アンタゴニスト）する化合物を同定するための、化合物のスクリー
ニング法を提供する。このスクリーニングの方法は高スループット法を含みうる
。
【０１３０】 このようなスクリーニングアッセイを行うために用いうる方法は数多くある。
1つのアプローチによれば、本発明の核酸配列の1つを発現する病原性細胞の培地
に対して、候補化合物を種々の濃度で添加する。続いて、例えば、その核酸分子
から調整した任意の適切な断片をハイブリダイゼーションプローブとして用いる
標準的なノーザンブロット分析（アウスユーベルら、前記）により、遺伝子発現
を測定する。候補化合物の存在下における遺伝子発現レベルを、候補化合物を含
まない対照培地における測定レベルと比較する。病原性因子の発現低下を促す化
合物は本発明において有用と考えられ、このような分子は例えば、感染性微生物
の病原性を抑えるための治療薬として用いることができる。
【０１３１】 または、必要に応じて、候補化合物の効果を、同じ一般的な手法および病原性
因子に対して特異的な抗体を用いるウエスタンブロット法または免疫沈降法など
の標準的な免疫学的技法を用いて、ポリペプチドの産生レベルで評価してもよい
。例えば、イムノアッセイを用いて、病原性微生物における本発明のポリペプチ
ドの少なくとも1つの発現を検出または観測することができる。このようなポリ ペプチドと結合しうるポリクローナルまたはモノクローナル抗体（上記の通りに
作製したもの）を任意の標準的な形式のイムノアッセイ（例、ELISA、ウエスタ ンブロット法またはRIAアッセイ）に用い、病原性ポリペプチドのレベルを測定 することも可能である。病原性ポリペプチドの発現低下を促す化合物は特に有用
と考えられる。同じく、このような分子を、例えば、感染性微生物の病原性を抑
えるための治療薬として用いてもよい。
【０１３２】 代替的または付加的に、候補化合物を、本発明のポリペプチドとの特異的な結
合、またはその阻害に関してスクリーニングすることもできる。このような候補
化合物の効力は、それが病原性ポリペプチドと相互作用する能力に依存する。こ
のような相互作用は、多くの標準的な結合技法および機能的アッセイの任意のも
の（例えば、アウスユーベルら、前記に記載されたもの）を用いて、容易にアッ
セイしうる。例えば、任意の標準的なアッセイ（例えば、本明細書に記載された
もの）により、候補化合物を本発明のポリペプチドとのインビトロでの相互作用
および結合を関して検討することもでき、それが病原性を調節する能力をアッセ
イすることもできる。
【０１３３】 1つの特定の実施例では、クロマトグラフィーに基づく技法を用いて、病原性 ポリペプチドと結合する候補化合物を同定しうる。例えば、本発明の組換えポリ
ペプチドを、そのポリペプチドを発現するように操作した細胞から標準的な技法
（例えば、本明細書に記載されたもの）によって精製し、カラムに固定すること
ができる。続いて、候補化合物の溶液をカラムに通過させ、病原性ポリペプチド
に対して特異的な化合物を、病原性ポリペプチドと結合してカラムに固定される
能力に基づいて同定する。化合物を単離するためには、非特異的に結合した分子
を除去するためにカラムを洗浄し、続いて関心対象の化合物をカラムから遊離さ
せ、回収する。この方法（または他の任意の適切な方法）によって単離された化
合物を、必要に応じてさらに精製してもよい（例えば、高速液体クロマトグラフ
ィーにより）。さらに、病原性のビルレンスを低下させる能力に関してこれらの
候補化合物を検討してもよい（例えば、本明細書の記載の通りに）。このアプロ
ーチによって単離された化合物を、例えば、病原体による感染症、疾患またはそ
の両方の治療またはその発症予防のための治療薬として用いることもできる。病
原性ポリペプチドと10mM以下の親和定数で結合するものとして同定された化合物
は、本発明において特に有用と考えられる。
【０１３４】 さらにもう1つのアプローチでは、フェナジン（例、ピオシアニン）産生に対 する化合物の作用を観測することにより、シュードモナス細胞のビルレンスを阻
害する能力に関して候補化合物をスクリーニングする。1つのアプローチによれ ば、病原性細胞の培地に対して、候補化合物を種々の濃度で添加する。続いて、
任意の標準的な方法、例えば酸性溶液における520nmでの吸光度を観測すること によって（Essarら、J. Bacteriol. 172：884、1990）、ピオシアニンを測定す る。定量化を行うための液体培養物におけるピオシアニンの産生を最大にするた
めに、100μM FeCl3の添加により改変したKA培地（Kingら、J. Lab. Clin. Med.
44：301、1954）中で細胞を培養してもよい。候補化合物の存在下におけるピオ
シアニンの産生レベルを、候補化合物を含まない対照培地における測定レベルと
比較する。ピオシアニンの発現低下を促す化合物は本発明において有用と考えら
れ、このような分子は例えば、感染性微生物の病原性を抑えるための治療薬とし
て用いることができる。同様の技法を、ピオルビン（pyorubin）、アエルギノシ
ンA（aeruginosin A）、ミキシン（myxin）およびツベルマイシン（tubermycin
A）を非制限的に含む他の適切なフェナジン類に関するスクリーニングのために 用いることもできる。ターナー（Turner）およびメッセンジャー（Messenger） （Advances In Microbial Physiology 27：211〜1275、1986）、ソーレンセン（
Sorensen）およびジョセフ（Joseph）（日和見病原体としての緑膿菌（Pseudomo
nas aeruginosa as an Opportunistic Pathogen）、Campa, M.編、Plenum Press
、N.Y.、1993）、イングラム（Ingram）およびブラックウッド（Blackwood）（A
dvances in Applied Microbiology 13：267、1970）ならびにガーバー（Gerber ）（CRC微生物学ハンドブック（CRC Handbook of Microbiology）、Laskin, A.I
.およびLechevalier編、第2版、第5巻、Chemical Rubber Co.、Cleveland、Ohio
、1984、pp.573〜576）に記載されている。
【０１３５】 アンタゴニストの可能性のあるものには、本発明の核酸配列またはポリペプチ
ドと結合し、それによってその活性を阻害または消失させる有機分子、ペプチド
、ペプチド模倣薬、ポリペプチドおよび抗体が含まれる。また、ポリペプチドと
結合してその結合部位を占有し、それによって細胞結合分子との結合を阻止し、
正常な生物活動が阻止されるようにする低分子もアンタゴニストの可能性のある
ものに含まれる。可能性のあるその他のアンタゴニストには、アンチセンス分子
が含まれる。
【０１３６】 また、本明細書で提供されるDNA配列のそれぞれを、抗病原性化合物（例、抗 体）の発見または開発に用いることもできる。コードされる蛋白質が発現される
と、抗菌薬のスクリーニング用の標的として用いうる。さらに、コードされる蛋
白質のアミノ末端領域をコードするDNA配列、それぞれのmRNAのシャイン-デルガ
ーノ配列（Shine-Delgarno）もしくは他の翻訳促進配列を用いて、関心対象のコ
ード配列の発現制御を目的とするアンチセンス配列を作製することもできる。
【０１３７】 本発明は、感染の原因となる、病原体と哺乳動物宿主との間の初期の物理的相
互作用を妨げることを目的とする、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドま
たは阻害薬の使用も提供する。特に本発明の分子は、細菌の哺乳動物細胞外マト
リックス蛋白質への接着および定着の防止に、創傷における細胞外マトリックス
に対するそれに、または病原性の通常の進行を阻止するために用いうる。
【０１３８】 本発明のアンタゴニストおよびアゴニストは、例えば、種々の細菌感染症の抑
制および治療のために用いることができる。
【０１３９】 選択的には、上記のアッセイのいずれかにおいて同定された化合物を、任意の
標準的な動物モデル（例えば、本明細書に記載したマウス熱傷アッセイ）におい
て、病原性感染の発症に対する防御の付与に有用なものとして確認することもで
き、首尾よくいけば、抗病原体治療薬（例えば、抗生物質）として用いることも
できる。
【０１４０】被験化合物および抽出物 一般に、病原性ビルレンスを低下させうる化合物は、天然産物および合成（ま
たは半合成）抽出物の両方からなる大規模ライブラリー、または化学物質ライブ
ラリーから、当技術分野で知られた方法に従って同定される。薬物探索および開
発の分野の当業者は、被験抽出物または化合物の正確な由来は本発明のスクリー
ニング手順にとって決定的ではないことを理解すると考えられる。したがって、
本明細書に記載される方法を用いて、事実上あらゆる数の化学的抽出物または化
合物をスクリーニングすることが可能である。このような抽出物または化合物の
例には、植物、真菌、原核生物または動物に基づく抽出物、発酵培地および合成
化合物、ならびに既存の化合物の改変物が非制限的に含まれる。糖類、脂質、ペ
プチドおよび核酸に基づく化合物を非制限的に含む、任意の数の化合物の無作為
的または定方向的な合成（例えば、半合成または全合成）を行うために用いるこ
ともできる。合成化合物ライブラリーはブランドンアソシエーツ（Brandon Asso
ciates）社（Merrimack、NH）およびアルドリッチケミカル（Aldrich Chemical ）社（Milwaukee、WI）から市販されている。または、細菌、真菌、植物および 動物抽出物の形態にある天然化合物のライブラリーが、バイオティクス（Biotic
s）社（Sussex、UK）、ゼノバ（Xenova）社（Slough、UK）、ハーバーブランチ オーシャングラフィクスインスティテュート（Harbor Branch Oceangraphics In
stitute）（Ft. Pierce、FL）およびファーママーUSA（PharmaMar, U.S.A.）社 （Cambridge、MA）から市販されている。また、必要に応じて、当技術分野で知 られた方法に従い、例えば標準的な抽出および分画法により、天然性または合成
的に作製したライブラリーが作製される。さらに必要に応じて、標準的な化学的
、物理的または生化学的方法を用いて、任意のライブラリーまたは化合物が容易
に改変される。
【０１４１】 さらに、薬剤探索および開発の分野の当業者は、抗病原性活性がすでに知られ
ている材料の反復除去（dereplication）（例えば、分類学的反復除去、生物学 的反復除去および化学的反復除去、またはそれらの任意の組み合わせ）または複
製物もしくは反復物の除去のための方法を、可能であれば常に用いる必要がある
ことを容易に理解する。
【０１４２】 粗抽出物が抗病原性活性もしくは抗ビルレンス活性または結合活性をもつこと
が明らかになった場合には、観察された効果の原因となった化学成分を単離する
ために陽性リード抽出物をさらに分画することが必要である。したがって、抽出
、分画および精製過程の目標は、抗病原性活性をもつ粗抽出物中の化学的実体の
特徴決定および同定を慎重に行うことである。このような不均質な抽出物の分画
および精製の方法は当技術分野で知られている。必要に応じて、病原性の治療の
ために有用な薬剤であることが示された化合物は、当技術分野で知られた方法に
従って化学的に修飾される。
【０１４３】薬学的治療薬および植物保護剤 本発明は、病原体の病原性またはビルレンスを抑制しうる化合物（ペプチド、
低分子阻害薬および模倣薬を含む）を同定するための簡単な手段を提供する。し
たがって、本発明に記載される方法を用いて薬用上または農業上の価値があるこ
とが見いだされた化学的実体は、薬物、植物保護剤として、または例えば理論的
薬物設計による既存の抗病原性化合物の構造改変のための情報として有用である
。このような方法は、細菌、ウイルス、真菌、環形動物、線形動物、扁形動物お
よび原生動物を非制限的に含む種々の病原体に対する効果を有する化合物のスク
リーニングのために有用である。病原性細菌の例には、アエロバクター属、アエ
ロモナス属、アシネトバクター属、アグロバクテリウム属、バシラス属、バクテ
ロイデス属、バルトネラ属、ボルテラ属、ブルセラ属、カリマトバクテリウム属
、カンピロバクター属、シトロバクター属、クロストリジウム属、コルニエバク
テリウム属、エンテロバクター属、エシェリヒア属、フランシセラ属、ヘモフィ
ルス属、ハフニア属、ヘリコバクター属、クレブシエラ属、レジオネラ属、リス
テリア属、モルガネラ属、モラクセラ属、プロテウス属、プロビデンシア属、シ
ュードモナス属、サルモネラ属、セラチア属、シゲラ属、ブドウ球菌属、連鎖球
菌属、トレポネーマ属、ザントモナス属、ビブリオ属およびエルシニア属が非制
限的に含まれる。
【０１４４】 治療的使用のためには、本明細書に開示される方法を用いて同定された組成物
または薬剤を、生理的食塩水などの薬学的に許容しうる緩衝液中に製剤化し、全
身投与することができる。治療は、例えば、病原性ポリペプチドに関連する生物
学的イベントを破壊、抑制、減弱または中和するアンタゴニストを動物に投与す
ることにより、直接的に行うことができる。好ましい投与経路には、例えば、連
続的で持続的な濃度の薬物を患者にもたらす皮下、静脈内、腹腔内、筋肉内また
は皮内注射が含まれる。ヒト患者または他の動物の治療は、生理的に許容しうる
担体中にある治療的有効量の抗病原性薬剤を用いて実施しうると考えられる。適
した担体およびそれらの剤形は、例えば、E.W.マーチン（Martin）によるレミン
トン薬学（Reminton's Pharmaceutical Sciences）に記載されている。投与する
抗病原性薬剤（例えば抗生物質）の量は、投与様式、患者の年齢および体重、な
らびに疾患の種類および疾患の範囲に応じて異なる。一般に、その量は、他の微
生物性疾患の治療に用いられる他の薬剤に関して用いられる範囲にあると考えら
れるが、特定の状況下では化合物の特異性が高いためにより少ない量を要すると
考えられる。化合物は微生物の増殖を阻害する用量で投与される。例えば、全身
投与の場合には、化合物を典型的には0.1ng〜10g／kg体重の範囲で投与する。
【０１４５】 農業的使用のためには、本明細書に開示される方法を用いて同定された組成物
または薬剤を、植物の葉に噴霧剤または粉剤として適用する化学物質として用い
ることができる。典型的には、このような薬剤は、感染を予防するために病原体
よりも前に植物の表面に投与する必要がある。種子、球根、根、塊茎および球茎
にも、それらに付着しているか、または植え付け部の土壌に存在する病原体の駆
除によって植え付け後の病原体の攻撃を予防するための処置を行う。野菜、装飾
植物、低木または樹木を植え付ける予定の土壌を、種々の微生物病原体を駆除す
るための化学燻蒸剤による処置を行うことができる。処置は植え付けの数日前ま
たは数週間前に行うことが好ましい。化学物質は、トラクターなどの機械化され
た経路、または徒手的適用のいずれかによって適用しうる。さらに、アッセイ法
を用いて同定された化学物質を消毒剤として用いることもできる。
【０１４６】その他の態様 一般に、本発明は、本明細書の記載の通りに単離しうる、または本発明の核酸
配列を用いる相同性スクリーニングもしくはPCR増幅にょって容易に単離される 任意の核酸配列を含む。病原性活性（例えば、本明細書に記載された通りにアッ
セイされるもの）を消失させないやり方で改変されたポリペプチドも本発明の範
囲に含まれる。このような変更にはある種の変異、欠失、挿入または翻訳後修飾
が含まれ、または本発明の任意のポリペプチドをより大きな融合蛋白質の1つの 構成要素として含めることも含まれる。また、病原性を失ったポリペプチドも本
発明に含まれる。
【０１４７】 したがって、その他の態様において、本発明は、本発明のポリペプチドと実質
的に同一な任意の蛋白質を含む。このような相同体には、その他の実質的に純粋
な天然型のポリペプチドおよび対立遺伝子変異体、天然の変異体、誘導変異体、
高ストリンジェンシー条件下で、または好ましさの程度は落ちるが低ストリンジ
ェンシー条件下（例えば、長さが少なくとも40ヌクレオチドのプローブを用い、
2×SSC、40℃で洗浄）で本発明の核酸配列の任意の1つとハイブリダイズするDNA
によってコードされる蛋白質、ならびに本発明の抗血清が特異的に結合する蛋白
質が含まれる。
【０１４８】 本発明はさらに、本発明の任意の天然型ポリペプチドの類似体を含む。類似体
は、アミノ酸配列の違いの点で、翻訳後修飾の点で、またはその両方の点で、本
発明の天然型ポリペプチドと異なりうる。一般に、本発明の類似体と本発明の天
然型アミノ酸配列の全体または一部との一致率は、少なくとも85％、より好まし
くは90％、最も好ましくは95％、さらには99％である。比較する配列の長さは少
なくとも15アミノ酸残基、好ましくは少なくとも25アミノ酸残基、より好ましく
は35アミノ酸残基を上回る。また、一致率の程度を決定するための一例となる手
法において、BLASTプログラムを、密接に関連した配列を示すe-3からe-100の間 の確率スコアで用いることもできる。修飾にはアセチル化、カルボキシル化、リ
ン酸化またはグリコシル化などのインビボおよびインビトロでの化学的誘導体化
が含まれ、このような修飾はペプチド合成もしくはプロセシングの最中または単
離された修飾酵素による処理の後に生じうる。また、類似体は一次配列の変化の
点で本発明の天然型ポリペプチドと異なってもよい。これらには、天然型および
誘導性（例えば、Sambrook、FritschおよびManiatis、分子クローニング：実験 室マニュアル（Molecular Cloning： A Laboratory Manual）（第2版）、CSH Pr
ess、1989またはAusubelら、前記に記載された照射もしくはエタンメチルスルフ
ェートへの曝露によるランダム変異誘発、または部位特異的変異誘発によって生
じたもの）の遺伝的変異体がともに含まれる。D-アミノ酸、またはβもしくはγ
アミノ酸のような非天然型もしくは合成アミノ酸などのL-アミノ酸以外の残基を
含む環状ペプチド、分子および類似体も含まれる。
【０１４９】 完全長ポリペプチドに加えて、本発明のポリペプチドの任意の1つの断片も本 発明に含まれる。本明細書で用いる「断片」という用語は、少なくとも5個、好 ましくは少なくとも20個の連続したアミノ酸、好ましくは少なくとも30個の連続
したアミノ酸、より好ましくは少なくとも50個の連続したアミノ酸、最も好まし
くは少なくとも60〜80個またはそれよりも長い連続したアミノ酸を意味する。本
発明の断片は当技術分野で知られた方法を用いて作製することができるが、また
は通常の蛋白質プロセシング（例えば、新生ポリペプチドからの生物活性に必要
でないアミノ酸の除去、または選択的mRNAスプライシングもしくは選択的蛋白質
プロセシングのイベントによるアミノ酸の除去）によって生じたものでもよい。
【０１５０】 さらに、本発明には、本発明の任意の核酸配列の特異的な検出を容易にするヌ
クレオチド配列が含まれる。したがって、例えば、本発明に記載された核酸配列
またはそれらの断片を、従来の条件下での標準的なハイブリダイゼーション法に
よってヌクレオチド配列とハイブリダイズさせるためのプローブとして用いるこ
とができる。核酸配列のコード配列またはその相補物とハイブリダイズする配列
は、本発明において有用と考えられる。本発明の核酸配列のコード配列またはそ
の相補物とハイブリダイズし、本発明のポリペプチドをコードする配列も本発明
において有用と考えられる。本明細書で用いる「断片」という用語は、少なくと
も5個、好ましくは少なくとも20個の連続したアミノ酸、好ましくは少なくとも3
0個の連続したアミノ酸、より好ましくは少なくとも50個の連続したアミノ酸、 最も好ましくは少なくとも60〜80個またはそれよりも長い連続したアミノ酸を意
味する。核酸配列の断片は当業者に知られた方法によって作製しうる。
【０１５１】 本発明はさらに、個体、特にヒトにおいて免疫学的応答を誘導するための方法
であって、その個体を感染、特に細菌感染（例えば、緑膿菌感染）から防御する
ために抗体および／またはT細胞免疫応答が生じるように、例えば、本発明の任 意のポリペプチド（またはその断片もしくは類似体または融合蛋白質）を個体に
接種することを含む方法を提供する。本発明はさらに、免疫学的応答を誘発させ
ることを目的として本明細書に記載されたポリペプチド（または断片もしくはそ
の融合物）の発現を指向する核酸ベクターを個体に送達することを含む、個体に
おいて免疫学的応答を誘導する方法を含む。
【０１５２】 また、本発明は、本発明のポリペプチドまたは核酸配列を含むワクチン組成物
も含む。例えば、本発明のポリペプチドを、フェナジンの産生をブロックするこ
となどによって細菌の侵襲から防御する特異抗体を産生するように宿主にワクチ
ン接種を行うための抗原として用いることができる。したがって、本発明は、本
発明の免疫原性組換えポリペプチドを適した担体とともに含むワクチン製剤を含
む。
【０１５３】 本発明はさらに、病原性状態を診断するための組成物（例、核酸プローブ）、
ポリペプチド、抗体および方法を含む。
【０１５４】 本明細書に記述したすべての刊行物および特許出願は、それぞれの独立した刊
行物または特許出願が参照として組み込まれることが特定的および個々に示され
ている場合と同程度に参照として本明細書に組み込まれる。
【０１５５】 その他の態様は特許請求の範囲に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 コスミドBI48（配列番号：１）の物理的マップおよび同定された
オープンリーディングフレーム（ORFs）の方向を示す概略図である。
【図２】 コスミドBI48（配列番号：１）のヌクレオチド配列を示す。
【図３】 以下のORFのヌクレオチド配列を示す。 ORF2 (配列番号:2)、ORF3 (配列番号:4)、ORF602c (配列番号:6)、ORF214 (配列
番号:8)、ORF1242c (配列番号:10)、ORF594 (配列番号:12)、ORF1O40 (配列番号
:14)、ORF1640c (配列番号:16)、ORF2228c (配列番号:18)、ORF2068c (配列番号
:20)、ORF1997 (配列番号:22)、ORF2558c (配列番号:24)、ORF2929c (配列番号:
26)、ORF3965c (配列番号:28)、ORF3218 (配列番号:30)、ORF3568 (配列番号:32
)、ORF4506c (配列番号:34)、ORF3973 (配列番号:36)、ORF4271 (配列番号:38) 、ORF4698 (配列番号:40)、ORF5O28 (配列番号:42)、ORF5O80 (配列番号:44)、O
RF6479c (配列番号:46)、ORF5496 (配列番号:48)、ORF5840 (配列番号:50)、ORF
5899 (配列番号:52)、ORF6325 (配列番号:54)、ORF7567c (配列番号:56)、ORF71
80 (配列番号:58)、ORF7501 (配列番号:60)、ORF7584 (配列番号:62)、ORF8208c
(配列番号:64)、ORF8109 (配列番号:66)、ORF9005c (配列番号:68)、ORF8222 (
配列番号:70)、ORF8755c (配列番号:72)、ORF9431c (配列番号:74)、ORF9158 ( 配列番号:76)、ORF1O125c (配列番号:78)、ORF9770 (配列番号:80)、ORF9991 ( 配列番号:82)、ORF10765c (配列番号:84)、ORF1O475 (配列番号:86)、ORF11095c
(配列番号:88)、ORF11264 (配列番号:90)、ORF11738 (配列番号:92)、ORF12348
c (配列番号:94)、ORF12314c (配列番号:96)、ORF13156c (配列番号:98)、ORF12
795 (配列番号:100)、ORF13755c (配列番号:210)、ORF13795c (配列番号:212)、
ORF14727c (配列番号:214)、ORF13779 (配列番号:216)、ORF14293c (配列番号:2
18)、ORF14155 (配列番号:220)、ORF14360 (配列番号:222)、ORF15342c (配列番
号:224)、ORF15260c (配列番号:226)、ORF14991 (配列番号:228)、ORF15590c ( 配列番号:230)、ORF15675c (配列番号:232)、ORF16405 (配列番号:234)、ORF169
25 (配列番号:236)、ORF17793c (配列番号:238)、ORF18548c (配列番号:240)、O
RF17875 (配列番号:242)、ORF18479 (配列番号:244)、ORF19027c (配列番号:246
)、ORF19305 (配列番号:248)、ORF19519 (配列番号:250)、ORF19544 (配列番号:
252)、ORF20008 (配列番号:254)、ORF20623c (配列番号:256)、ORF21210c (配列
番号:258)、ORF21493c (配列番号:260)、ORF21333 (配列番号:262)、ORF22074c
(配列番号:264)、ORF21421 (配列番号:266)、ORF22608c (配列番号:268)、ORF22
626 (配列番号:270)、ORF23228 (配列番号:272)、ORF23367 (配列番号:274)、OR
F25103c (配列番号:276)、ORF23556 (配列番号:278)、ORF26191c (配列番号:280
)、ORF23751 (配列番号:282)、ORF24222 (配列番号:284)、ORF24368 (配列番号:
286)、ORF24888c (配列番号:288)、ORF25398c (配列番号:290)、ORF25892c (配 列番号:292)、ORF25110 (配列番号:294)、ORF25510 (配列番号:296)、ORF26762c
(配列番号:298)、ORF26257 (配列番号:300)、ORF26844c (配列番号:302)、ORF2
6486 (配列番号:304)、ORF26857c (配列番号:306)、ORF27314c (配列番号:308) 、ORF27730c (配列番号:310)、ORF26983 (配列番号:312)、ORF28068c (配列番号
:314)、ORF27522 (配列番号:316)、ORF28033c (配列番号:318)、ORF29701c (配 列番号:320)、ORF28118 (配列番号:322)、ORF28129 (配列番号:324)、ORF29709c
(配列番号:326)、ORF29189 (配列番号:328)、ORF29382 (配列番号:330)、ORF30
590c (配列番号:332)、ORF29729 (配列番号:334)、ORF30221 (配列番号:336)、O
RF30736c (配列番号:338)、ORF30539 (配列番号:340)、ORF31247c (配列番号:34
2)、ORF31539c (配列番号:346)、ORF31222 (配列番号:348)、ORF31266 (配列番 号:350)、ORF31661c (配列番号:352)、ORF32061c (配列番号:354)、ORF32072c (
配列番号:356)、ORF31784 (配列番号:358)、ORF32568c (配列番号:360)、ORF331
57c (配列番号:362)、ORF32539 (配列番号:364)、ORF33705c (配列番号:366)、O
RF32832 (配列番号:368)、ORF33547c (配列番号:370)、ORF33205 (配列番号:372
)、ORF33512 (配列番号:374)、ORF33771 (配列番号:376)、ORF34385c (配列番号
:378)、ORF33988 (配列番号:380)、ORF34274 (配列番号:382)、ORF34726c (配列
番号:384)、ORF34916 (配列番号:386)、ORF35464c (配列番号:388)、ORF35289 (
配列番号:390)、ORF35410 (配列番号:392)、ORF35907c (配列番号:394)、ORF355
34 (配列番号:396)、ORF35930 (配列番号:398)、ORF36246 (配列番号:400)、ORF
26640c (配列番号:402)、ORF36739 (配列番号:404)、ORF37932c (配列番号:406)
、ORF38640c (配列番号:408)、ORF39309c (配列番号:410)、ORF38768 (配列番号
:412)、ORF40047c (配列番号:414)、ORF40560c (配列番号:416)、ORF40238 (配 列番号:418)、ORF40329 (配列番号:420)、ORF40709c (配列番号:422)、ORF40507
(配列番号:424)、ORF41275c (配列番号:426)、ORF42234c (配列番号:428)、ORF
41764c (配列番号:430)、ORF41284 (配列番号:432)、ORF41598 (配列番号:434) 、ORF42172c (配列番号:436)、およびORF42233c (配列番号:438)。
【図４】 以下のORFの推定アミノ酸配列を示す。 ORF2 (配列番号:3)、ORF3 (配列番号:5)、ORF602c (配列番号:7)、ORF214 (配列
番号:9)、ORF1242c (配列番号:11)、ORF594 (配列番号:13)、ORF1040 (配列番号
:15)、ORF1640c (配列番号:17)、ORF2228c (配列番号:19)、ORF2068c (配列番号
:21)、ORF1997 (配列番号:23)、ORF2558c (配列番号:25)、ORF2929c (配列番号:
27)、ORF3965c (配列番号:29)、ORF3218 (配列番号:31)、ORF3568 (配列番号:33
)、ORF4506c (配列番号:35)、ORF3973 (配列番号:37)、ORF4271 (配列番号:39) 、ORF4698 (配列番号:41)、ORF5O28 (配列番号:43)、ORF5O80 (配列番号:45)、O
RF6479c (配列番号:47)、ORF5496 (配列番号:49)、ORF5840 (配列番号:51)、ORF
5899 (配列番号:53)、ORF6325 (配列番号:55)、ORF7567c (配列番号:57)、ORF71
80 (配列番号:59)、ORF7501 (配列番号:61)、ORF7584 (配列番号:63)、ORF8208c
(配列番号:65)、ORF8109 (配列番号:67)、ORF9005c (配列番号:69)、ORF8222 (
配列番号:71)、ORF8755c (配列番号:73)、ORF9431c (配列番号:75)、ORF9158 ( 配列番号:77)、ORF1O125c (配列番号:79)、ORF9770 (配列番号:81)、ORF9991 ( 配列番号:83)、ORF1O765c (配列番号:85)、ORF1O475 (配列番号:87)、ORF11O95c
(配列番号:89)、ORF11264 (配列番号:91)、ORF11738 (配列番号:93)、ORF12348
c (配列番号:95)、ORF12314c (配列番号:97)、ORF13156c (配列番号:99)、ORF12
795 (配列番号:101)、ORF13755c (配列番号:211)、ORF13795c (配列番号:213)、
ORF14727c (配列番号:215)、ORF13779 (配列番号:217)、ORF14293c (配列番号:2
19)、ORF14155 (配列番号:221)、ORF14360 (配列番号:223)、ORF15342c (配列番
号:225)、ORF15260c (配列番号:227)、ORF14991 (配列番号:229)、ORF15590c ( 配列番号:231)、ORF15675c (配列番号:233)、ORF16405 (配列番号:235)、ORF169
25 (配列番号:237)、ORF17793c (配列番号:239)、ORF18548c (配列番号:241)、O
RF17875 (配列番号:243)、ORF18479 (配列番号:245)、ORF19027c (配列番号:247
)、ORF19305 (配列番号:249)、ORF19519 (配列番号:251)、ORF19544 (配列番号:
253)、ORF20008 (配列番号:255)、ORF20623c (配列番号:257)、ORF21210c (配列
番号:259)、ORF21493c (配列番号:261)、ORF21333 (配列番号:263)、ORF22074c
(配列番号:265)、ORF21421 (配列番号:267)、ORF22608c (配列番号:269)、ORF22
626 (配列番号:271)、ORF23228 (配列番号:273)、ORF23367 (配列番号:275)、OR
F25103c (配列番号:277)、ORF23556 (配列番号:279)、ORF26191c (配列番号:281
)、ORF23751 (配列番号:283)、ORF24222 (配列番号:285)、ORF24368 (配列番号:
287)、ORF24888c (配列番号:289)、ORF25398c (配列番号:291)、ORF25892c (配 列番号:293)、ORF25110 (配列番号:295)、ORF25510 (配列番号:297)、ORF26762c
(配列番号:299)、ORF26257 (配列番号:301)、ORF26844c (配列番号:303)、ORF2
6486 (配列番号:305)、ORF26857c (配列番号:307)、ORF27314c (配列番号:309) 、ORF27730c (配列番号:311)、ORF26983 (配列番号:313)、ORF28068c (配列番号
:315)、ORF27522 (配列番号:317)、ORF28033c (配列番号:319)、ORF29701c (配 列番号:321)、ORF28118 (配列番号:323)、ORF28129 (配列番号:325)、ORF29709c
(配列番号:327)、ORF29189 (配列番号:329)、ORF29382 (配列番号:331)、ORF30
590c (配列番号:333)、ORF29729 (配列番号:335)、ORF30221 (配列番号:337)、O
RF30736c (配列番号:339)、ORF30539 (配列番号:341)、ORF31247c (配列番号:34
3)、ORF30963c (配列番号:345)、ORF31539c (配列番号:347)、ORF31222 (配列番
号:349)、ORF31266 (配列番号:351)、ORF31661c (配列番号:353)、ORF32061c ( 配列番号:355)、ORF32072c (配列番号:357)、ORF31784 (配列番号:359)、ORF325
68c (配列番号:361)、ORF33157c (配列番号:363)、ORF32530 (配列番号:365)、O
RF33705c (配列番号:367)、ORF32832 (配列番号:369)、ORF33547c (配列番号:37
1)、ORF33205 (配列番号:373)、ORF33512 (配列番号:375)、ORF33771 (配列番号
:377)、ORF34385c (配列番号:379)、ORF33988 (配列番号:381)、ORF34274 (配列
番号:383)、ORF34726c (配列番号:385)、ORF34916 (配列番号:387)、ORF35464c
(配列番号:389)、ORF35289 (配列番号:391)、ORF35410 (配列番号:393)、ORF359
07c (配列番号:395)、ORF35534 (配列番号:397)、ORF35930 (配列番号:399)、OR
F36246 (配列番号:401)、ORF26640c (配列番号:403)、ORF36769 (配列番号:405)
、ORF37932c (配列番号:407)、ORF38640c (配列番号:409)、ORF39309c (配列番 号:411)、ORF38768 (配列番号:413)、ORF40047c (配列番号:415)、ORF40560c ( 配列番号:417)、ORF40238 (配列番号:419)、ORF40329 (配列番号:421)、ORF4070
9c (配列番号:423)、ORF40507 (配列番号:425)、ORF41275c (配列番号:427)、OR
F42234c (配列番号:429)、ORF41764c (配列番号:431)、ORF41284 (配列番号:433
)、ORF41598 (配列番号:435)、ORF42172c (配列番号:437)、およびORF42233c ( 配列番号:439)。
【図５】 33A9配列によってコードされる蛋白質をコードするヌクレオチド
配列（配列番号：102）を示す。
【図6A】 33A9配列によってコードされる蛋白質である推定アミノ酸配列（
配列番号：103）を示す。
【図6B】 33A9配列において同定されたいくつかのORFs1-10（配列番号：18
9、190、191、192、193、194、195、196、197、および198）のヌクレオチド配列
およびそれぞれのアミノ酸配列（ORFs1-10；配列番号：199、200、201、202、20
3、204、205、206、207、および208）を示す。
【図７】 ３つのORF：ORF1（L-S）、ORF2およびORF1Sの位置を同定する34B
12 EcoRI断片マップの物理的マップを示す。ORF1（L-S）（配列番号：105および
107）、ORF2（配列番号：106および108）、ならびにORF-S（配列番号：208およ び209）を含むpho34B12挿入部（配列番号：104）に対応するヌクレオチド配列も
示す。
【図８】 図７に示すORF1（L-S）（配列番号：107）の推定アミノ酸配列を
示す。
【図９】 図７に示すORF2（配列番号：108）の推定アミノ酸配列を示す。
【図10】 36A4挿入部に対応するヌクレオチド配列（配列番号：109）を示 す。
【図11】 36A4配列によってコードされるペプチドの推定アミノ酸配列（配
列番号：110）を示す。36A4配列によってコードされる予想されるペプチドはシ ュードモナス・シリンゲ（Pseudomonas syringae）のhrpM遺伝子（ルーベンス（
Loubens）ら、Mol. Microbiol. 10：329〜340、1993）と相同性を有する。
【図12】 36A4ヌクレオチド配列を用いて同定されたコンティグ2507のヌク
レオチド配列（配列番号：111）を示す。
【図13】 23A2挿入部に対応するヌクレオチド配列（配列番号：112）を示 す。
【図14A】 23A2配列によってコードされるペプチド（配列番号：113）の推
定アミノ酸配列を示す。23A2配列によって予想されるペプチドは緑膿菌（Pseudo
monas aeruginosa）（株CD10）：mexA遺伝子における既知の蛋白質と相同である
。この遺伝子は他の２つの遺伝子；mexBおよびoprM（プール（Poole）ら、Mol.
Microbiol. 10：529〜544、1993）；ゲンバンク提出番号：L11616、も同様に含 むオペロンの一部である。
【図14B】 PA14 mexAおよびmexBのヌクレオチド配列（配列番号：148）お よび予想される部分的アミノ酸配列（それぞれ配列番号：149および150）を示す
。
【図15】 3E8配列タグを用いて同定されたPAO1フェナジンオペロンのヌク レオチド配列（配列番号：114）を示す。
【図16A】 3E8配列タグのヌクレオチド配列（配列番号：115）を示す。
【図16B】 3E8配列タグに隣接するヌクレオチド配列（配列番号：160）を 示す。
【図17】 推定3E8 PHZAアミノ酸配列（配列番号：116）を示す。
【図18A】 推定3E8 PHZBアミノ酸配列（配列番号：117）を示す。
【図18B】 推定3E8 PHZA部分アミノ酸配列（配列番号：161）を示す。
【図18C】 推定3E8 PHZB部分アミノ酸配列（配列番号：162）を示す。
【図18D】 推定3E8 PHZC部分アミノ酸配列（配列番号：163）を示す。
【図18E】 PA14 phzRのヌクレオチド配列（配列番号：164）および予想さ れる部分アミノ酸配列（配列番号：165）を示す。
【図19】 34H4配列タグのヌクレオチド配列（配列番号：118）を示す。
【図20】 33C7配列タグのヌクレオチド配列（配列番号：119）を示す。
【図21】 25a12.3配列タグのヌクレオチド配列（配列番号：120）を示す。
【図22】 8C12配列タグのヌクレオチド配列（配列番号：121）を示す。
【図23】 2A8配列タグのヌクレオチド配列（配列番号：122）を示す。
【図24A】 41A5、50E12、35A9、pho23、16G12、および25F1 TnphoA配列タ グのヌクレオチド配列（配列番号：123、124、125、126、127および128）をそれ
ぞれ示す。
【図24B】 PA14pho15のヌクレオチド配列（配列番号：166）および予想さ れるアミノ酸配列（配列番号：167）を示す。
【図24C】 YgdPPa（配列番号：169）およびPtsPP2（配列番号：170）をコ ードするPA14 50E12のヌクレオチド配列を示す。
【図24D】 mtrPPa（配列番号：172）をコードするPA14 35A9のヌクレオチ ド配列（配列番号：171）を示す。
【図24E】 ORFT（配列番号：174）、ORFU（配列番号：175）、およびDjlAP a （配列番号：176）をコードするPA14 25F1のヌクレオチド配列（配列番号：173
）を示す。
【図25】 PAO1およびPA14の緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）のphnAおよ
びphnB遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号：129）をそれぞれ示す。
【図26】 PHNAの推定アミノ酸配列（配列番号：130）を示す。
【図27】 PA14 degP遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号：131）を示す。
【図28】 PA14 degP遺伝子の推定アミノ酸配列（配列番号：132）を示す。
【図29】 緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）株8830のalgD遺伝子のヌクレ
オチド配列（配列番号：133）を示す。
【図30】 緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）株8830のalgD遺伝子の推定ア
ミノ酸配列（配列番号：134）を示す。
【図31】 25A12を用いて同定された1126 コンティグのヌクレオチド配列（
配列番号：135）を示す。
【図32】 同定された３つのORFs：ORFA（配列番号：440）、ORFB（配列番 号：441）、およびORFC（配列番号：442）を示す、33C7を用いて同定された1344
（配列番号：136）コンティグの物理的マップを示す。それぞれのORFによってコ
ードされたORFA（配列番号：443）、ORFB（配列番号：444）、およびORFC（配列
番号：445）のアミノ酸配列も同様に示す。
【図33】 1G2配列タグのヌクレオチド配列（配列番号：137）を示す。
【図34A-D】 シーエレガンス（C. elegans）の遅延型殺虫アッセイを用い て4 TnpphoA変異体の虫病原性表現型の相補性を示すグラフである。
【図34A】 変異体12A1（白い菱形）の非病原性表現型が、株12A1において トランスで構成的lacZプロモーターの制御下で（pKDT17）、PAO1からのlasR遺伝
子によって（白丸）野生型PA14レベル（黒四角）まで完全に補足されうることを
示すグラフである。再構成されたlasR変異体であるPA14 lasR-G（白四角）は、1
2A1（白い菱形）と同程度に非病原性である。１日齢の成虫を用いた実験からの 結果を示す。
【図34B】 pho15の遅延型殺虫表現型の補足を示すグラフである。株pho15 （pEcdsbA）（白い菱形）およびpho15（pPAdsbA）はそれぞれ、大腸菌および緑 膿菌（Pseudomonas aeruginosa）からのdsbA遺伝子を構成的lacZプロモーターの
制御下でトランスで有する。
【図34C】 25F1の遅延型殺虫表現型が、orf338およびorf338-orf224-dilAP a をそれぞれ含むプラスミドを有する株25FI（pORF338）および25FI（p3-ORFs） によってごく部分的に回復したことを示すグラフである。
【図34D】 orf159-ptsPPaオペロンによる50E12の補足を示すグラフである 。株50e12（pUCP18）は、変異体12A1と同様に、63時間後であっても虫を殺さな い。推定のorf159-ptsPPaオペロンを発現する株50E12（pMT205-lac）および50E1
2（pMT206-nat）の株はいずれも、C.エレガンス（C. elegans）を殺すことがで きた。50E12（pMT205-lac）では、orf159-ptsPPaの転写は構成的lacZプロモータ
ーの制御下にあるが、50E12（pMT206-nat）では、オペロンはその本来のプロモ ーターによって制御される。それぞれのデータポイントは３〜４回の平均値±SD
を表す。特に明記していない限り、同調したL4虫を実験に用いた。それぞれの補
足分析に関して、少なくとも２回の異なる実験を行った。
【図35A】 コリスミ酸のアントラニル酸への変換を触媒するphnAおよびphn
B遺伝子によってコードされるアントラニル酸シンターゼ複合体を示す概略図で ある。アントラニル酸は、緑膿菌（P. aeruginosa）株PAO1においてピオシアニ ン産生の前駆物質として作用する（エッサー（Essar）ら、J. Bacteriol. 172：
884〜900、1990）。二本の矢印は、多数の定義していない段階が関与しているこ
とを示し、これによってアントラニル酸からピオシアニンへの変換が起こる。
【図35B】 phnAおよびphnB遺伝子内での1602 bpのインフレーム欠失による
△phnAphnB変異体の作製を示す概略図である。
【図35C】 C.エレガンス（C. elegans）の迅速な殺虫に及ぼす△phnAphnB の作用を示すグラフである。迅速な殺虫アッセイは野生型PA14株、TnphoA変異体
3E8または△phnAphnB株を用いて実施した。細菌に初めて暴露した３時間後に虫 の運動性をモニターして、△phnAphnBに関して迅速な殺虫が認められなかったこ
とは、もう一つのフェナジン変異体である3E8と同等であった。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ ４Ｈ０４５ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/50 Ｚ 33/50 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ // Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:385） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:385） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｚ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ラーム ローレンス ジー． アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 ブ ルックリン ウィンチェスター アベニュ ー 184 (72)発明者 マハジャーン−ミクロス シャリナ アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 ウ ェスト ロックスバリー オリオール ス トリート 61 (72)発明者 タン マン−ワー アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 ソ マービル モーガン ストリート ５ ア パートメント ２ (72)発明者 カオ フイ アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 モ ルデン フェリー ストリート 179 ア パートメント 12 (72)発明者 ドレンカード エリアナ アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 ケ ンブリッジ マサチューセッツ アベニュ ー 50 ＃105 (72)発明者 サンガリス ジョン アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 ソ マービル グラント ストリート 77 ア パートメント ２ Ｆターム(参考） 2G045 AA29 AA34 AA35 CB01 DA13 DA36 FB02 GC10 4B024 AA01 AA11 AA13 CA01 DA02 HA11 4B063 QA01 QA19 QQ03 QQ04 QQ52 QQ79 QR32 QR48 QS03 QS32 QS34 QX01 QX02 4B064 AG21 AG30 CA02 CA19 CC24 DA01 DA15 4C084 AA02 AA03 AA07 AA13 AA17 BA01 NA14 ZB322 4H045 AA10 BA10 CA11 DA55 DA83 DA89 EA29 EA52 FA74

Claims (43)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 配列番号：252と実質的に同一な配列を含む単離核酸分子。
  2. 【請求項２】 配列番号：252に示す配列を含む、請求項１記載の単離核酸 分子。
  3. 【請求項３】 配列番号：105と実質的に同一な配列を含む単離核酸分子。
  4. 【請求項４】 配列番号：105に示す配列を含む、請求項３記載の単離核酸 分子。
  5. 【請求項５】 配列番号：106と実質的に同一な配列を含む単離核酸分子。
  6. 【請求項６】 配列番号：106に示す配列を含む、請求項５記載の単離核酸 分子。
  7. 【請求項７】 配列番号：253のアミノ酸配列と実質的に同一であるアミノ 酸配列を含む、実質的に純粋なポリペプチド。
  8. 【請求項８】 アミノ酸配列が配列番号：253に示す配列を含む、請求項７ 記載の実質的に純粋なポリペプチド。
  9. 【請求項９】 配列番号：107のアミノ酸配列と実質的に同一であるアミノ 酸配列を含む、実質的に純粋なポリペプチド。
  10. 【請求項10】 アミノ酸配列が配列番号：107に示す配列を含む、請求項９ 記載の実質的に純粋なポリペプチド。
  11. 【請求項11】 配列番号：108のアミノ酸配列と実質的に同一であるアミノ 酸配列を含む実質的に純粋なポリペプチド。
  12. 【請求項12】 アミノ酸配列が配列番号：108に示す配列を含む、請求項11 記載の実質的に純粋なポリペプチド。
  13. 【請求項13】 病原性ビルレンス因子の発現を減少させることができる化合
    物を同定する方法であって、以下の段階を含む方法： （a） 請求項１記載の核酸分子を発現する病原性細胞を提供する段階；および （b） 候補化合物との接触後に核酸分子の発現が減少すれば、病原性ビルレンス
    因子の発現を減少させる化合物であることが示される、病原性細胞を候補化合物
    と接触させる段階。
  14. 【請求項14】 病原性細胞が哺乳類に感染する、請求項13記載の方法。
  15. 【請求項15】 病原性細胞が植物に感染する、請求項13記載の方法。
  16. 【請求項16】 病原性ビルレンス因子の発現を減少させることができる化合
    物を同定する方法であって、以下の段階を含む方法： （a） 請求項３記載の核酸分子を発現する病原性細胞を提供する段階；および （b） 候補化合物との接触後に核酸分子の発現が減少すれば、病原性ビルレンス
    因子の発現を減少させる化合物であることが示される、病原性細胞を候補化合物
    と接触させる段階。
  17. 【請求項17】 病原性細胞が哺乳類に感染する、請求項16記載の方法。
  18. 【請求項18】 病原性細胞が植物に感染する、請求項16記載の方法。
  19. 【請求項19】 病原性ビルレンス因子の発現を減少させることができる化合
    物を同定する方法であって、以下の段階を含む方法： （a） 請求項５記載の核酸分子を発現する病原性細胞を提供する段階；および （b） 候補化合物との接触後に核酸分子の発現が減少すれば、病原性ビルレンス
    因子の発現を減少させる化合物であることが示される、病原性細胞を候補化合物
    と接触させる段階。
  20. 【請求項20】 病原性細胞が哺乳類に感染する、請求項19記載の方法。
  21. 【請求項21】 病原性細胞が植物に感染する、請求項19記載の方法。
  22. 【請求項22】 ポリペプチドに結合する化合物を同定する方法であって、以
    下の段階を含む方法： （a） 結合を可能にする条件下で、請求項７記載のアミノ酸配列を含む実質的に
    純粋なポリペプチドに候補化合物を接触させる段階；および （b） 候補化合物とポリペプチドとの結合を検出する段階。
  23. 【請求項23】 ポリペプチドに結合する化合物を同定する方法であって、以
    下の段階を含む方法： （a） 結合を可能にする条件下で、請求項９記載のアミノ酸配列を含む実質的に
    純粋なポリペプチドに候補化合物を接触させる段階；および （b） 候補化合物とポリペプチドとの結合を検出する段階。
  24. 【請求項24】 ポリペプチドに結合する化合物を同定する方法であって、以
    下の段階を含む方法： （a） 結合を可能にする条件下で、請求項11記載のアミノ酸配列を含む実質的に
    純粋なポリペプチドに候補化合物を接触させる段階；および （b） 候補化合物とポリペプチドとの結合を検出する段階。
  25. 【請求項25】 哺乳類において病原性感染症を治療する方法であって、以下
    の段階を含む方法： （a） 病原性感染症を有する哺乳動物を同定する段階；および （b） 病原体において請求項１記載の核酸分子によってコードされるポリペプチ
    ドの発現または活性を阻害する組成物の治療的有効量を該哺乳動物に投与する段
    階。
  26. 【請求項26】 哺乳類において病原性感染症を治療する方法であって、以下
    の段階を含む方法： （a） 病原性感染症を有する哺乳動物を同定する段階；および （b） 病原体において請求項３記載の核酸分子によってコードされるポリペプチ
    ドの発現または活性を阻害する組成物の治療的有効量を該哺乳動物に投与する段
    階。
  27. 【請求項27】 病原体が緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）である、請求項
    26記載の方法。
  28. 【請求項28】 哺乳類における病原性感染症を治療する方法であって、以下
    の段階を含む方法： （a） 病原性感染症を有する哺乳動物を同定する段階；および （b） 病原体において請求項５記載の核酸分子によってコードされるポリペプチ
    ドの発現または活性を阻害する組成物の治療的有効量を該哺乳動物に投与する段
    階。
  29. 【請求項29】 病原体が緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）である、請求項
    28記載の方法。
  30. 【請求項30】 哺乳類において病原性感染症を治療する方法であって、以下
    の段階を含む方法： （a） 病原性感染症を有する哺乳動物を同定する段階；および （b） 請求項５記載のアミノ酸配列によってコードされるポリペプチドに結合し
    阻害する組成物の治療的有効量を該哺乳動物に投与する段階。
  31. 【請求項31】 病原体が緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）である、請求項
    30記載の方法。
  32. 【請求項32】 哺乳類における病原性感染症を治療する方法であって、以下
    の段階を含む方法： （a） 病原性感染症を有する哺乳動物を同定する段階；および （b） 請求項７記載のアミノ酸配列によってコードされるポリペプチドに結合し
    阻害する組成物の治療的有効量を該哺乳動物に投与する段階。
  33. 【請求項33】 病原体感染症が緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）によって
    引き起こされる、請求項32記載の方法。
  34. 【請求項34】 哺乳類における病原性感染症を治療する方法であって、以下
    の段階を含む方法： （a） 病原性感染症を有する哺乳動物を同定する段階；および （b） 請求項９記載のアミノ酸配列によってコードされるポリペプチドに結合し
    阻害する組成物の治療的有効量を該哺乳動物に投与する段階。
  35. 【請求項35】 病原体感染症が緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）によって
    引き起こされる、請求項34記載の方法。
  36. 【請求項36】 哺乳類において病原性感染症を治療する方法であって、以下
    の段階を含む方法： （a） 病原性感染症を有する哺乳動物を同定する段階；および （b） 請求項11記載のアミノ酸配列を含む実質的に純粋なポリペプチドに結合し
    阻害する組成物の治療的有効量を該哺乳動物に投与する段階。
  37. 【請求項37】 病原体感染症が緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）によって
    引き起こされる、請求項36記載の方法。
  38. 【請求項38】 シュードモナス（Pseudomonas）細胞のビルレンスを阻害す る化合物を同定する方法であって、以下の段階を含む方法： （a）シュードモナス（Pseudomonas）細胞を提供する段階； （b）細胞を候補化合物に接触させる段階；および （c）無処置対照細胞と比較してフェナジンが減少すれば、化合物が該シュード モナス（Pseudomonas）細胞のビルレンスを阻害することが示される、フェナジ ンの存在を検出する段階。
  39. 【請求項39】 細胞が緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）である、請求項38
    記載の方法。
  40. 【請求項40】 フェナジンが分光法によって検出される、請求項38記載の方
    法。
  41. 【請求項41】 フェナジンがピオシアニンである、請求項38記載の方法。
  42. 【請求項42】 ピオシアニンが520 nmでの吸光度を測定することによって検
    出される、請求項41記載の方法。
  43. 【請求項43】 細胞が細胞培養物として存在する、請求項38記載の方法。
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