JP2002355073A - Ｈａｒａポリペプチドおよび核酸、並びに関連する方法およびその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 その発現が生物における抗生物質耐性を導
く可能性がある遺伝子を同定するため、輸送体およびそ
の基質抗細菌化合物を同定する。 【解決手段】 本発明は、エンテロコッカス・フェカ
リスおよび枯草菌由来のｈａｒＡポリペプチドおよびｈ
ａｒＡポリペプチドをコードする核酸、並びにそれらの
突然変異体と共に、スクリーニングおよび診断法におけ
る該ポリペプチドおよび核酸の使用法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、エンテロコッカス
・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａ
ｌｉｓ）および枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉ
ｌｉｓ）由来のｈａｒＡポリペプチドおよびｈａｒＡポ
リペプチドをコードする核酸、並びにそれらの突然変異
体と共に、化合物スクリーニングおよび診断法における
該ポリペプチドおよび核酸の使用法に関する。

【０００２】

【従来の技術】しばしば多剤措置に対する耐性を含む、
一般的に用いられる抗生物質剤に対する細菌耐性の発生
は、世界的に増大しつつある問題である。多くの細菌生
物は、おそらくこうした耐性を与える内因性遺伝子産物
の発現のため、内因的に、または他のすでに耐性である
生物から獲得された耐性として、いくつかの天然産物
（および関連する）抗細菌剤に耐性を示す。いくつかの
抗細菌剤に耐性であることが知られる生物の中に、エン
テロコッカス・フェカリス（「Ｅ．フェカリス」）があ
る。Ｅ．フェカリス感染は、最も一般的な院内（病院で
獲得する）および医原性（治療、例えば針穿刺から生じ
る）感染の１つであり、これは、回復を損なうのに加
え、敗血症、敗血症ショックまたは死さえも導く可能性
がある。Ｅ．フェカリスはまた、前立腺炎症例と共に、
尿管、骨盤、腹部および新生児感染のかなりの割合にも
責任があり、そしてしばしば、細菌心内膜炎の原因病原
体である。

【０００３】抗細菌剤に対する細菌感受性の内因性のレ
ベルは、該剤が細胞区画内に集積する能力および該剤の
その特定の標的への親和性両方に依存すると理解されて
いる。多くの薬剤耐性細菌は、抗生物質薬剤を細菌の外
の細胞外培地に再び輸送し、薬剤の集積を防ぎそして薬
剤に対する細菌の感受性を減少させるタンパク質を発現
する。これらの薬剤輸送タンパク質は２種類に分けるこ
とが可能である：薬剤の追放（ｅｘｔｒｕｓｉｏｎ）を
イオン交換とカップリングさせる二次輸送体、およびＡ
ＴＰ加水分解の際、リン酸結合のエネルギーを利用し、
薬剤を追放するＡＴＰ結合カセット（「ＡＢＣ」）輸送
体である。ある輸送体は非常に特異的であり、１つの薬
剤種しか認識しないが、多様な薬剤種と共に他の分子、
例えば界面活性剤および色素を追放する多剤輸送体もま
た存在する。Ｙｏｕｎｇ， Ｊ．およびＨｏｌｌａｎ
ｄ， Ｉ．Ｂ．“ＡＢＣ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ：
ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｅｘｐｏｒｔｅｒｓ−ｒｅｖｉ
ｓｉｔｅｄ ｆｉｖｅ ｙｅａｒｓ ｏｎ，” ＢＢＡ
１４６１：１７７−２００（１９９９）を参照された
い。耐性の他の機構には、例えば細胞表面でのまたは細
胞内部での酵素による薬剤不活性化、および例えばリボ
ソーム構造の天然変動による、または薬剤の細胞への進
入に必要とされる輸送系の非存在による標的改変が含ま
れる。

【０００４】存在するゲノム供給源を解析し、ＡＢＣ含
有タンパク質を理解する試みが行われてきている。例え
ばＱｕｅｎｔｉｎ， Ｙ．， Ｆｉｃｈａｎｔ， Ｇ．
およびＤｅｎｉｚｏｔ， Ｆ．“Ｉｎｖｅｎｔｏｒｙ，
Ａｓｓｅｍｂｌｙ ａｎｄＡｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＡＢＣ Ｔｒａ
ｎｓｐｏｒｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ” Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂ
ｉｏｌ ２８７：４６７−４８４（１９９９）を参照さ
れたい。Ｑｕｅｎｔｉｎらは、枯草菌の解析を行い、そ
して７８のＡＢＣ含有遺伝子を同定し、このうち８つ
は、それ以前にＡＴＰ結合タンパク質と注釈をつけられ
ていなかった。これらの模式図において、輸送体は、１
つまたはそれ以上のポリペプチドとして発現される３つ
のサブユニット−ヌクレオチド結合ドメイン、膜貫通ド
メインおよび溶質結合タンパク質−のゲノム関連によ
り、特徴付けられる。しかし、「輸出体（ｅｘｐｏｒｔ
ｅｒ）」群の５つのＡＴＰアーゼの１つの群（「サブフ
ァミリー３」と称される）は、ゲノムにおいて、いかな
る膜貫通ドメインとも関連していなかったが、マクロラ
イド耐性またはタンパク質翻訳の制御に関連するタンパ
ク質にある程度の配列類似性を示した。そのうち１つが
出願者らにより本明細書に記載される遺伝子「ｅｘｐ
Ｚ」である、サブファミリー３の遺伝子の機能は、現在
まで同定されていない。

【０００５】他の生物中のＡＢＣ配列は、公的にアクセ
ス可能な遺伝子データベース、例えばＧｅｎｂａｎｋに
おいて同定することが可能であり、例えば、ＹＥＲ０３
６ｃ、ＹＦＲ００９ｗ、ＹＰＬ２２６ｗ、ＹＬＲ２４９
ｗ、ＹＮＬ０１４ｗ、ＹＤＲ０９１ｃ、ＹＫＬ２０９
ｃ、ＹＬＬ０１５ｗ、ＹＯＬ０７５ｃ、ＹＣＲ０１１ｃ
およびＹＨＬ０３５ｃと称される遺伝子がある。Ｌｉｎ
ｔｏｎ， Ｋ．Ｊ．およびＨｉｇｇｉｎｓ， Ｃ．
Ｆ．， “Ｔｈｅ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
ＡＴＰ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｃａｓｓｅｔｔｅ（ＡＢ
Ｃ） ｐｒｏｔｅｉｎｓ，” Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ２８（１）：５−１３（１９
９８）を参照されたい。ＡＢＣタンパク質に関する情報
の有用なデータベースは、ｈｔｔｐ：／／ｉｒ２ｌｃ
ｂ．ｃｎｒｓ−ｍｒｓ．ｆｒ／ＡＢＣｄｂ／で入手可能
である。Ｅ．フェカリス・ゲノムは、現在、配列決定さ
れており、そして多くの配列が、その実際のまたはあり
うる機能に関し、注釈をつけられている。Ｅ．フェカリ
ス・ゲノムの解析のための公的に利用可能なサイトは、
ｈｔｔｐ：／／ｐｅｄａｎｔ．ｍｉｐｓ．ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．ｍｐｇ．ｄｅ．である。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】ＡＢＣ含有配列を、Ａ
ＴＰ結合領域間に共通の配列特徴に基づき、増大しつつ
あるゲノム供給源内で同定することが可能である一方、
どのＡＢＣ含有遺伝子が薬剤抵抗性を与えるかをどのよ
うに同定するかも、またはどの薬剤が特定のＡＢＣ含有
遺伝子を発現する生物に対し無効であろうかをどのよう
に同定するかも知られていない。出願者らが追求した、
抗生物質耐性の増大する問題に取り掛かる１つの方法
は、その発現が生物における抗生物質耐性を導く可能性
がある遺伝子を同定するため、輸送体およびその基質抗
細菌化合物を同定するのを試みることである。他者によ
る研究の例は、「ＭＸＲ１」と呼ばれるＡＢＣタンパク
質を開示し、そして該タンパク質の過剰発現が、ミトザ
ントロンなどのいくつかの化学療法剤の細胞傷害効果に
対する耐性を与えることを言及する、ＰＣＴ国際特許出
願ＷＯ ００／３６１０１に見ることが可能である。別
の研究は、アルカエグロブス・ファルギドゥス（Ａｒｃ
ｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ）ＡＢＣ輸送
体に相同性を有する黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏ
ｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）ポリペプチドをコードす
る核酸を開示する、ＰＣＴ国際特許出願ＷＯ ９９／３
１１３３に開示される。

【０００７】

【課題を解決するための手段】出願者らは、ハイグロマ
イシンＡ類似体（ａｎａｌｏｇｕｅｓ）に耐性である
Ｅ．フェカリスおよび枯草菌の株を発見し、そして以前
は性質決定されていなかった、その耐性と共に他の抗細
菌剤に対する耐性を与える内因性遺伝子産物を同定し
た。用語「ｈａｒＡ」（すなわちハイグロマイシンＡ耐
性（ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ Ａ ｒｅｓｉｓｔａｎｃ
ｅ））は、本明細書において、一般的に、ハイグロマイ
シンＡ耐性を与える、いかなるポリペプチド、こうした
ポリペプチドをコードする核酸、あるいはこうしたポリ
ペプチドまたは核酸の断片または誘導体も指すよう用い
られる。

【０００８】本発明は、Ｅ．フェカリスおよび枯草菌由
来のｈａｒＡポリペプチドおよびｈａｒＡポリペプチド
をコードする核酸、並びにそれらの突然変異体と共に、
ｈａｒＡポリペプチドおよびｈａｒＡ核酸を産生する方
法、並びに該ポリペプチドおよび核酸を含む組成物に関
する。本発明はまた、診断法およびワクチン接種におけ
るｈａｒＡポリペプチドおよびｈａｒＡ核酸の使用法と
共に、ｈａｒＡポリペプチドに結合し、ｈａｒＡポリペ
プチドのＡＴＰアーゼ活性を含むｈａｒＡポリペプチド
の活性を調節するかまたは阻害する化合物を同定するた
め、ｈａｒＡポリペプチドおよびｈａｒＡ核酸を用いる
方法および過程にも関する。

【０００９】本発明は、図２（配列番号２）に示される
アミノ酸配列に少なくとも７５％同一であるアミノ酸配
列を含む、単離ｈａｒＡポリペプチドに関する。１つの
態様において、該ポリペプチドは、Ｅ．フェカリスｈａ
ｒＡポリペプチドである。別の態様において、該ポリペ
プチドは、実質的に純粋な形である。別の態様におい
て、該ポリペプチドは、図２（配列番号２）に示される
アミノ酸配列を含む。本発明はまた、図２（配列番号
２）に示されるアミノ酸配列から本質的になる単離ｈａ
ｒＡポリペプチドも提供する。本発明はまた、図４（配
列番号４）に示されるアミノ酸配列に少なくとも７５％
同一であるアミノ酸配列を含む、単離ｈａｒＡポリペプ
チドにも関する。１つの態様において、該ポリペプチド
は、枯草菌ｈａｒＡポリペプチドである。別の態様にお
いて、該ポリペプチドは、実質的に純粋な形である。別
の態様において、該ポリペプチドは、図４（配列番号
４）に示されるアミノ酸配列を含む。本発明はまた、図
４（配列番号４）に示されるアミノ酸配列から本質的に
なる単離ｈａｒＡポリペプチドも提供する。本発明はま
た、プラスミドｐＧＥＭ−Ｔ／ｈａｒＡ（ＡＴＣＣ寄託
番号第ＰＴＡ−２５５２号）に含まれる核酸にコードさ
れるアミノ酸配列から本質的になるアミノ酸配列を有す
るｈａｒＡポリペプチドにも関する。本発明はまた、プ
ラスミドｐＭＰ−ｂａｃＡ１−１（ＡＴＣＣ寄託番号第
ＰＴＡ−２５５１号）に含まれる核酸にコードされるア
ミノ酸配列から本質的になるアミノ酸配列を有するｈａ
ｒＡポリペプチドにも関する。

【００１０】用語「単離された」は、人の手により、天
然状態から改変されたことを意味し、すなわち天然に存
在するものである場合、天然に存在する状態から変化さ
せられたかまたは除去されたかあるいはその両方である
ことを意味する。例えば、原核または真核細胞、細菌、
ビリオンまたはウイルスに天然に存在する核酸またはポ
リペプチドは、「単離され」ていないが、天然状態で共
に存在する成分から分離された同じ核酸またはポリペプ
チドは、本明細書において、「単離され」ている。用語
「単離された」の意味にやはり含まれるのは、例えば、
いかなるものでもよい組換え核酸、クローニングされた
遺伝子、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写または翻訳産物、外因性
または異種核酸またはその転写および翻訳産物、並びに
放射標識および修飾されたまたはそうでなければ非天然
存在核酸またはアミノ酸の置換を含む、化学的、酵素
的、または生体内変換手段によりプロセシングされた、
いかなるものでもよい核酸またはポリペプチドである。

【００１１】「ポリペプチド類」は、ペプチド結合また
は修飾ペプチド結合により、互いに連結された２つまた
はそれ以上のアミノ酸を含む、いかなるペプチドまたは
タンパク質も指す。「ポリペプチド類」は、通常ペプチ
ド、オリゴペプチドおよびオリゴマーと称される短鎖
も、そして一般的にタンパク質と称されるより長い鎖も
両方指す。「ポリペプチド類」には、天然過程により、
例えばプロセシングおよび他の翻訳後修飾により修飾さ
れたものだけでなく、化学的修飾技術により修飾された
ものも含まれる。こうした修飾は、基本的な教科書、よ
り詳細なモノグラフ、および研究刊行物に記載され、そ
して当該技術分野に公知である。同じ種類の修飾が、既
定のポリペプチドのいくつかの部位で、同じかまたは異
なる度合いで存在する可能性があることを理解すべきで
ある。また、既定のポリペプチドが、多くの種類の修飾
を含む可能性もある。修飾は、ペプチド主鎖、アミノ酸
側鎖、およびアミノまたはカルボキシル末端を含む、ポ
リペプチドのどこで起こってもよい。修飾には、例え
ば、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド
化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレ
オチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質また
は脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトール
の共有結合、架橋、環状化、ジスルフィド結合形成、脱
メチル化、共有架橋の形成、システインの形成、ピログ
ルタミン酸の形成、ホルミル化、ガンマ−カルボキシル
化、糖鎖形成、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化
（例えばヒドロキシプロリンまたはヒドロキシリジンの
形成）、ヨウ化、メチル化（例えばｅ−Ｎ−メチルリジ
ン、３−メチル−ヒスチジンの形成）、ミリストイル
化、酸化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プ
レニル化、ラセミ化、糖鎖形成、脂質付着、硫酸化、グ
ルタミン酸残基のガンマ−カルボキシル化、ヒドロキシ
ル化およびＡＤＰリボシル化、セレノイル化、硫酸化、
タンパク質へのアミノ酸のトランスファーＲＮＡ仲介付
加、例えばアルギニル化、およびユビキチン化が含まれ
る。例えば、ＰＲＯＴＥＩＮＳ――ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ
ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＰＲＯＰＥＲＴＩＥ
Ｓ， 第２版， Ｔ．Ｅ． Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ監修，
Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎ
ｙ， ニューヨーク（１９９３）およびＷｏｌｄ，
Ｆ．， Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏ
ｔｅｉｎ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ： Ｐｅｒｓｐ
ｅｃｔｉｖｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ， １−
１２ページ， ＰＯＳＴＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮＡＬ
ＣＯＶＡＬＥＮＴ ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＯＦ
ＰＲＯＴＥＩＮＳ，中， Ｂ．Ｃ． Ｊｏｈｎｓｏｎ監
修， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク
（１９８３）； Ｓｅｉｆｔｅｒら， Ｍｅｔｈ． Ｅ
ｎｚｙｍｏｌ． １８２：６２６−６４６（１９９０）
およびＲａｔｔａｎら，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｙｎｔｈｅ
ｓｉｓ： Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｏ
ｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ａｇｉｎｇ， Ａｎ
ｎ． Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ６６３：４８−
６２（１９９２）を参照されたい。ポリペプチドは、分
枝していても、あるいは分枝を含むまたは含まない環状
であってもよい。環状、分枝および分枝環状ポリペプチ
ドは、翻訳後天然過程から生じてもよく、そしてまた完
全に合成法により、作成してもよい。ポリペプチドは、
２０の天然コードアミノ酸以外のアミノ酸、例えば当該
技術分野に公知のβ−、γ−、またはδ−アミノ酸、あ
るいはＤ−アミノ酸を含んでもよい。

【００１２】本出願において、「単離ポリペプチド」の
意味にはまた、界面活性剤を含む天然または外因性脂
質、ｈａｒＡポリペプチドを発現する細胞由来の膜調製
と共に、ｈａｒＡポリペプチドを含む小胞または閉鎖膜
性調製が含まれる。

【００１３】本出願において交換可能に用いられる「に
同一」または「同一性」は、配列を比較することにより
決定されるような、２つまたはそれ以上のポリペプチド
配列、あるいは２つまたはそれ以上のポリヌクレオチド
配列の間の関係である。本出願において、「に類似」ま
たは「類似性」は、場合によって、こうした一連の配列
間の一致により決定されるような、ポリペプチドまたは
ポリヌクレオチド配列間の配列関連性の度合いを意味す
る。「同一性」および「類似性」は、限定されるわけで
はないが、例えば：Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ， Ｌｅｓｋ， Ａ．
Ｍ．監修， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐ
ｒｅｓｓ， ニューヨーク， １９８８； Ｂｉｏｃｏ
ｍｐｕｔｉｎｇ： Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ
Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ， Ｓｍｉｔｈ，
Ｄ．Ｗ．監修， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， ニ
ューヨーク， １９９３； Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａ
ｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ， Ｐ
ａｒｔ Ｉ， Ｇｒｉｆｆｉｎ， Ａ．Ｍ．およびＧｒ
ｉｆｆｉｎ， Ｈ．Ｇ．監修， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅ
ｓｓ， ニュージャージー， １９９４； Ｓｅｑｕｅ
ｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ， ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ， Ｇ．，
Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９８７；および
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＡｎａｌｙｓｉｓＰｒｉｍｅｒ，
Ｇｒｉｂｓｋｏｖ， Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，
Ｊ．監修， Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ， ニ
ューヨーク， １９９１；およびＣａｒｉｌｌｏ，
Ｈ．およびＬｉｐｍａｎ， Ｄ．， ＳＩＡＭ Ｊ．
Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．， ４８：１０７３（１９
８８）に記載されるものを含む、既知の方法により、容
易に計算することが可能である。同一性を決定するため
の好ましい方法は、試験される配列間の最大の一致を与
えるよう設計される。同一性および類似性を決定する方
法は、公的に利用可能なコンピュータープログラムに集
大成されている。２つの配列間の同一性および類似性を
決定するための好ましいコンピュータープログラム法に
は、限定されるわけではないが、ＧＣＧプログラムパッ
ケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ， Ｊ．ら， Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２（１）：３８
７（１９８４））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およ
びＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ．Ｆ．ら，
Ｊ． Ｍｏｌｅｃ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３−４
１０（１９９０））が含まれる。ＢＬＡＳＴ Ｘプログ
ラムはNＣＢＩおよび他の供給源から公的に入手可能で
ある（ＢＬＡＳＴマニュアル， Ａｌｔｓｃｈｕｌ，
Ｓ．ら， ＮＣＢＩＮＬＭ ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄ
ａ， Ｍｄ． ２０８９４； Ａｌｔｓｃｈｕｌ，
Ｓ．ら， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０
３−４１０（１９９０））。公知のＳｍｉｔｈ−Ｗａｔ
ｅｒｍａｎアルゴリズムもまた、同一性を決定するのに
用いてもよい。

【００１４】ポリペプチド配列比較に特に好ましいパラ
メーターには以下が含まれる：アルゴリズム： Ｎｅｅ
ｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ， Ｊ． Ｍｏｌ Ｂ
ｉｏｌ． ４８：４４３−４５３（１９７０）；比較マ
トリックス： ＨｅｎｔｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｔｉｋ
ｏｆｆ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃ
ｉ． ＵＳＡ． ８９：１０９１５−１０９１９（１９
９２）由来のＢＬＯＳＳＵＭ６２；ギャップペナルテ
ィ：１２；およびギャップ長ペナルティ：４。これらの
パラメーターを用いる有用なプログラムは、Ｇｅｎｅｔ
ｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、ウィスコンシ
ン州マディソンから「ｇａｐ」プログラムとして公的に
入手可能である。前述のパラメーターは、ペプチド比較
のデフォルトパラメーターである（末端ギャップに関す
るペナルティなし）。

【００１５】本発明はまた、ポリペプチド参照配列に少
なくとも７５、８０、８５、９０、９５、９７または１
００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むｈａｒＡポ
リペプチドにも関する。１つの態様において、ｈａｒＡ
ポリペプチドは、参照配列に同一でもよいし、または参
照配列に比較し、特定の整数までのアミノ酸改変を含ん
でもよく、前記改変は、少なくとも１つのアミノ酸欠
失、保存的および非保存的置換を含む置換、または挿入
からなる群より選択され、そして前記改変は、参照配列
中のアミノ酸の中に個々に、あるいは参照配列内の１つ
またはそれ以上の隣接する基で点在し、参照配列のアミ
ノまたはカルボキシ末端位で、あるいはこれらの末端位
の間のどこかで起こってもよい。好ましい態様におい
て、参照配列は、配列番号２に示されるアミノ酸配列で
ある。別の好ましい態様において、参照配列は、配列番
号４に示されるアミノ酸配列である。

【００１６】本発明はまた、参照配列を含むアミノ酸の
１０％を越えない保存的置換を有するアミノ酸配列を含
むｈａｒＡポリペプチドにも関する。１つの態様におい
て、参照配列は、配列番号２に示されるアミノ酸配列で
ある。別の態様において、参照配列は、配列番号４に示
されるアミノ酸配列である。好ましい態様において、ｈ
ａｒＡポリペプチドは、ポリペプチドのＡＢＣドメイン
のいずれか１つまたはそれ以上に、保存的アミノ酸置換
を含む。本出願において、用語「ＡＢＣドメイン」は、
少なくとも１つのＷａｌｋｅｒ Ａボックスおよび少な
くとも１つのＷａｌｋｅｒＢボックスを含むいかなるも
のでもよい配列を含む。より好ましい態様において、図
２（配列番号２）に同定されるような、１つまたはそれ
以上のＷａｌｋｅｒ Ａ、Ｗａｌｋｅｒ Ｂ、サインモ
チーフまたは下流モチーフ配列が保存される。別のより
好ましい態様において、図４（配列番号４）に同定され
るような、１つまたはそれ以上のＷａｌｋｅｒ Ａ、Ｗ
ａｌｋｅｒ Ｂ、サインモチーフまたは下流モチーフ配
列が保存される。別のより好ましい態様において、ｈａ
ｒＡポリペプチドは、ＡＢＣドメイン、Ｗａｌｋｅｒ
Ａ、ＷａｌｋｅｒＢ、サインモチーフまたは下流モチー
フ配列のいずれか１つまたはそれ以上の外側のｈａｒＡ
ポリペプチド領域に保存的アミノ酸置換を含む。

【００１７】「保存的」アミノ酸置換は、当該技術分野
に公知である。こうした置換を作成する規則は、とりわ
け、Ｄａｙｈｏｆ， Ｍ．Ｄ．， １９７８， Ｎａ
ｔ．Ｂｉｏｍｅｄ． Ｒｅｓ． Ｆｏｕｎｄ．， ワシ
ントンＤ．Ｃ．， Ｖｏｌ．５， Ｓｕｐ．３に記載さ
れるものを含む。より具体的には、保存的アミノ酸置換
は、一般的に、酸性度、極性または側鎖の大きさ（ｂｕ
ｌｋｉｎｅｓｓ）において関連する、アミノ酸ファミリ
ー内で行われるものである。遺伝的にコードされるアミ
ノ酸は、一般的に４つの群に分けられる：（１）酸性＝
アスパラギン酸、グルタミン酸；（２）塩基性＝リジ
ン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性＝アラニ
ン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェ
ニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および
（４）非荷電極性＝グリシン、アスパラギン、グルタミ
ン、システイン、セリン、スレオニン、およびチロシン
である。フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロ
シンはまた、芳香族アミノ酸として一緒に分類される。
いずれかの特定の群内での１つまたはそれ以上の置換、
例えばイソロイシンもしくはバリンでのロイシンの置
換、またはグルタミン酸でのアスパラギン酸の置換、ま
たはセリンでのスレオニンの置換、あるいは構造的に関
連するアミノ酸残基、例えば、類似の酸性度、極性、側
鎖の大きさ、またはそれらのいくつかの組み合わせでの
類似性を持つアミノ酸残基でのいずれかの他のアミノ酸
の置換は、一般的に、ポリペプチドの機能または免疫原
性に重要でない影響を有するであろう。好ましい態様に
おいて、保存的置換ポリペプチドは、配列番号２または
配列番号４に、少なくとも約７５％、より好ましくは少
なくとも約８５％、そしてさらにより好ましくは少なく
とも約９０％の配列同一性、そして最も好ましくは少な
くとも９５％の配列同一性を有する。

【００１８】別の態様において、ポリペプチドは、それ
らの組み合わせを含め、挿入、欠失、または置換された
１および１０の間、そしてより好ましくは１および５の
間のアミノ酸を有するｈａｒＡポリペプチドからなる。
より好ましい態様において、単離ポリペプチドは、ｈａ
ｒＡポリペプチドのアミノ酸配列中に１および５の間の
保存的置換アミノ酸を有する。

【００１９】本発明はさらに、本発明の前述のポリペプ
チドのいずれか１つの実質的な部分からなるｈａｒＡポ
リペプチドに関する。本明細書において、本発明のポリ
ペプチドの「実質的な部分」、または「ペプチド断片」
は、対応する全長ポリペプチドの完全なアミノ酸配列以
下からなるが、そのアミノ酸配列の少なくとも約７５
％、より好ましくは少なくとも約８０％、さらにより好
ましくは少なくとも約９０％、そして最も好ましくは少
なくとも約９５％を含む、ポリペプチドを意味する。

【００２０】本発明は、実質的に純粋な形の単離ｈａｒ
Ａポリペプチドに関する。１つの態様において、単離ｈ
ａｒＡポリペプチドは、可溶性型で回収される。別の態
様において、単離ｈａｒＡポリペプチドは、不溶性型で
回収される。

【００２１】本出願において、「実質的に純粋」は、単
一の物質の少なくとも重量９０％、好ましくは少なくと
も重量９５％、そしてより好ましくは少なくとも重量９
９％を含むことを意味し、物質は、天然存在であっても
または非天然存在であっても、いかなる化学化合物であ
ってもよい。

【００２２】用語「可溶性型で回収される」は、タンパ
ク質またはポリペプチドが、前記タンパク質またはポリ
ペプチドを発現する細胞の細胞質から回収されることを
示す。乳化物、界面活性剤、または膜性調製中で回収さ
れるタンパク質またはポリペプチドもまた、本発明にお
いて、可溶性型とみなされる。

【００２３】用語「不溶性型で回収される」は、タンパ
ク質またはポリペプチドが、前記タンパク質またはポリ
ペプチドを発現する細胞に存在する封入体から回収され
ることを示す。

【００２４】本発明はさらに、本明細書に記載されるポ
リペプチドのいずれかを調製する方法であって、本明細
書に記載される組換え発現ベクターのいずれかで形質転
換された宿主細胞を培養し、そして可溶性または不溶性
型いずれかで、細胞培養から発現されたポリペプチドを
回収することを含む、前記方法に関する。培養は、本明
細書にさらに記載されるように、そして選択された宿主
細胞にしたがって、特に好ましいように、ポリペプチド
の発現を行うことが可能な条件下で行われ、その条件は
当該技術分野に公知である。

【００２５】本発明は、ｈａｒＡポリペプチドおよび薬
学的に許容しうるキャリアーを含む、免疫学的組成物に
関する。本発明はまた、ｈａｒＡポリペプチドをコード
する核酸であって、動物における該ポリペプチドの発現
を指示するのに有効なベクターと機能的に関連している
前記核酸、および薬学的に許容しうるキャリアーを含
む、免疫学的組成物にも関する。

【００２６】上述の組成物のいずれかの態様において、
キャリアーはさらに、アジュバントまたはｈａｒＡポリ
ペプチドに対する動物の免疫反応を刺激するかまたは亢
進するのに有効な他の調節剤を含む。免疫刺激剤として
およびワクチンにおいて使用するためのアジュバント
は、当該技術分野に公知であり、例えば、フロイントの
アジュバント、Ａｍｐｈｉｇｅｎ、および他の商業的に
入手可能なアジュバントがあり、そして確立された臨床
的指針を参照することにより、選択された動物、哺乳動
物またはヒトにおける使用のため、適応される。

【００２７】他の態様において、組成物は、錠剤、カプ
セル、丸剤、粉末、持続放出処方、溶液、懸濁物として
経口投与に、無菌溶液、懸濁物または乳剤として非経口
注射に、軟膏またはクリームとして局所投与に、あるい
は座薬として直腸投与に、適した形である。その好まし
い態様において、組成物は、正確な投薬量の単回投与に
適した、単位投薬型である。

【００２８】本発明は、動物において、薬剤耐性感染を
治療する方法であって、該動物に、上述の組成物のいず
れかを、薬剤に対する感受性の増加を引き出すのに十分
な量で投与することを含む、前記方法に関する。１つの
態様において、薬剤耐性は、ｈａｒＡポリペプチドによ
り、またはｈａｒＡ核酸の発現により、仲介される。別
の態様において、薬剤は、ハイグロマイシンＡまたは関
連類似体、バージニアマイシン、ランカシジンまたはＳ
ｙｎｅｒｃｉｄ（登録商標）である。本出願において、
用語「類似体（類）」は、化学化合物いずれかに適用さ
れた場合、指定された化合物だけでなく、同じ化学構造
種の化合物およびそれに由来する化合物も含む。したが
って、「ハイグロマイシンＡ」（または同様に、「ラン
カシジン」、「バージニアマイシン」、「ストレプトグ
ラミン」）という句の使用は、その化学構造種にある、
単数または複数の化合物を指す。用語「ハイグロマイシ
ン（類）」は、本明細書において、ハイグロマイシンＡ
を意味する。１つの態様において、感染は細菌感染であ
り、そしてその好ましい態様において、細菌感染は、
Ｅ．フェカリス、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃ
ｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅ
ｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、インフ
ルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎ
ｚａｅ）またはエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔ
ｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）感染である。そ
のより好ましい態様において、細菌感染は、エンテロコ
ッカス・フェシウムまたはＥ．フェカリス感染である。
別のより好ましい態様において、細菌感染は、化膿連鎖
球菌または肺炎連鎖球菌感染である。別のより好ましい
態様において、細菌感染は、インフルエンザ菌感染であ
る。別の態様において、感染は、原生動物感染である。
その好ましい態様において、原生動物感染は、セルピュ
リナ（トレポネーマ）・ヒオジセンテリエ（Ｓｅｒｐｕ
ｌｉｎａ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅ
ｒｉａｅ）感染である。その別の態様において、感染
は、ハイグロマイシンＡでの治療に服しやすいと同定さ
れるいずれかの感染性病原体によるものである。別の態
様において、感染は、ハイグロマイシンＡ耐性、バージ
ニアマイシン耐性、ランカシジン耐性またはＳｙｎｅｒ
ｃｉｄ（登録商標）耐性感染のいずれか１つである。さ
らに別の態様において、感染は、ハイグロマイシンＡ類
似体に耐性である。別の態様において、感染は、バンコ
マイシン耐性である。他の態様において、方法は、動物
に、上述の組成物のいずれかを、例えばエンテロコッカ
ス属、連鎖球菌属またはヘモフィルス属感染を治療する
別の抗菌化合物または組成物と組み合わせて投与するこ
とを含む。１つの態様において、他の抗菌化合物は、マ
クロライド（例えばエリスロマイシン、クラリスロマイ
シン、アジスロマイシン）、ベータ−ラクタム（例えば
ペニシリン類、セファロスポリン類）、アミノ配糖体、
スルホンアミド、テトラサイクリン、キノロン、ストレ
プトグラミン、オキサゾリジノンまたは糖ペプチド（例
えばバンコマイシン）である。上述の例は、例示のみで
あり、そして本発明において、特定の抗菌剤が用いられ
ると限定されることを意図しないことを理解すべきであ
る。

【００２９】上述の組成物または方法のいずれかの態様
において、動物は哺乳動物である。そのより好ましい態
様において、哺乳動物はヒトである。他のより好ましい
態様において、哺乳動物は、イヌまたはネコを含む、ヒ
トのコンパニオン動物であるか、あるいは哺乳動物は、
ウマ、ウシ、またはブタ動物を含む、家畜動物である。
他の態様において、動物は、トリ・コンパニオン動物ま
たは家禽動物である。

【００３０】上述の組成物または方法のいずれかの態様
において、ポリペプチドは、図２（配列番号２）に示さ
れるアミノ酸配列に少なくとも７５％同一であるアミノ
酸配列を含むｈａｒＡポリペプチドである。別の態様に
おいて、ポリペプチドは、図４（配列番号４）に示され
るアミノ酸配列に少なくとも７５％同一であるアミノ酸
配列を含むｈａｒＡポリペプチドである。別の態様にお
いて、ポリペプチドは、図２（配列番号２）に示される
アミノ酸配列、または図４（配列番号４）に示されるア
ミノ酸配列を含むｈａｒＡポリペプチドである。別の態
様において、ポリペプチドは、図２（配列番号２）また
は図４（配列番号４）に示されるポリペプチドなどのｈ
ａｒＡポリペプチドの断片または変異体である。上述の
組成物または方法のいずれかの態様において、動物は哺
乳動物である。より好ましい態様において、哺乳動物は
ヒトである。別のより好ましい態様において、哺乳動物
は、ブタ、ウシ、ウマ、イヌおよびネコ哺乳動物の中か
ら選択される。

【００３１】「免疫学的組成物」は、動物において、ポ
リペプチドまたはタンパク質に対して特異的に向けられ
る免疫反応を引き出すことが可能なものである。用語
「免疫原性の」または「免疫原性」は、ポリペプチドが
該ポリペプチドに対して特異的に向けられる免疫反応を
引き出す能力を指す。用語「抗原性の」および「抗原
性」は、タンパク質またはポリペプチドが、抗体によ
り、該タンパク質またはポリペプチドに対して特異的に
結合される能力を指す。

【００３２】用語「薬学的に許容しうるキャリアー」
は、活性成分、例えば薬剤物質、ポリペプチドまたは核
酸の搬送および吸収を可能にし、そして活性成分の生物
学的活性の有効性に干渉せず、化学的に不活性であり、
そして投与される被験者に毒性でない、物質を指す。

【００３３】適切な薬学的キャリアーには、不活性希釈
剤または充填剤、水および多様な有機溶媒が含まれる。
薬学的に許容しうるキャリアーは、望ましい場合、さら
なる成分、例えばフレーバー剤、結合剤、賦形剤および
それらに匹敵するものを含んでもよい。したがって、経
口投与のため、多様な賦形剤、例えばクエン酸を含む錠
剤を、多様な崩壊剤、例えばデンプン、アルギン酸およ
び特定の複合ケイ酸塩と、そして結合剤、例えばスクロ
ース、ゼラチンおよびアラビアゴム（ａｃａｃｉａ）と
共に使用してもよい。さらに、滑沢剤、例えばステアリ
ン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウムおよびタル
クが、錠剤目的にしばしば有用である。同様の種類の固
体組成物はまた、軟および硬充填ゼラチンカプセルに使
用してもよい。そのための好ましい成分には、ラクトー
スまたは乳糖および高分子量ポリエチレングリコール類
が含まれる。水性懸濁物またはエリキシル剤が経口投与
に望ましい場合、キャリアーは、多様な甘味料またはフ
レーバー剤、着色物質または色素、および望ましい場
合、乳化剤または懸濁剤を、希釈剤、例えば水、エタノ
ール、プロピレングリコール、グリセリン、水性プロピ
レングリコールまたはデキストロース溶液あるいはそれ
らの組み合わせと共に、含んでもよい。キャリアーおよ
び活性成分は、好ましくは無菌である。投薬型は、望ま
しい場合、適切に緩衝されていてもよい。

【００３４】特定の量の活性化合物を含む多様な薬剤組
成物を調製する方法は、当業者に知られるかまたは明ら
かであるだろう。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐ
ｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｍ
ａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， ペ
ンシルバニア州イースター， 第１５版（１９７５）を
参照されたい。

【００３５】用語「細菌感染を治療するまたは予防す
る」は、細菌の複製を阻害するか、感染の伝播を阻害す
るか、または生物が自身を宿主内に確立することを妨げ
るか、または感染により引き起こされる疾患の症状を軽
減することを意味する。好ましい態様において、該方法
を用い、Ｅ．フェカリス感染を治療する。他の好ましい
態様において、該方法を用い、化膿連鎖球菌、肺炎連鎖
球菌、インフルエンザ菌またはエンテロコッカス・フェ
シウム感染の１つまたはそれ以上を治療する。治療は、
細菌負荷、感染の減少（すなわち減少した伝播）並びに
／あるいは食物摂取および／または成長の増加がある場
合、療法的に有効とみなされる。

【００３６】本発明は、本明細書に記載されるようなｈ
ａｒＡポリペプチドに対して免疫反応性である抗体に関
する。１つの態様において、抗体はモノクローナル抗体
である。別の態様において、抗体はヒト化抗体である。
好ましい態様において、抗体はヒト化モノクローナル抗
体である。さらに別の態様において、抗体は、ｈａｒＡ
ポリペプチドに機能的に同等であるポリペプチドに対し
て免疫反応性である。本発明のポリペプチドおよび抗体
は、ハイグロマイシンＡ類似体、バージニアマイシン
類、ランカシジンおよびＳｙｎｅｒｃｉｄ（登録商標）
に耐性である生物の監視および検出に有用である。

【００３７】本発明は、動物において、ｈａｒＡ仲介抗
生物質耐性の存在を同定するための方法であって、該動
物から、そこに存在するいかなる細菌も単離し、該細菌
に発現されるポリペプチドを単離し、そして該細菌から
単離されたタンパク質への、ｈａｒＡポリペプチドに対
して免疫反応性である抗体の結合を検出することによ
り、ｈａｒＡポリペプチドの存在を同定することを含
む、前記方法に関する。１つの態様において、動物は、
抗生物質耐性感染を患う。別の態様において、動物は、
抗生物質耐性感染を患わない。したがって、本発明の抗
体は、感染動物の治療を指示するのにも、そして抗生物
質耐性感染に感染する可能性がある動物または動物集団
の監視のためにも、どちらにも有用である。１つの態様
において、抗生物質は、ハイグロマイシンＡ、バージニ
アマイシン、ランカシジン、またはＳｙｎｅｒｃｉｄ
（登録商標）である。

【００３８】用語「抗体」は、本明細書において、抗原
に結合することが可能な免疫グロブリン分子を指す。抗
体は、ポリクローナル混合物でもまたはモノクローナル
でもよい。抗体は、天然供給源由来の、または組換え供
給源由来の損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）免疫グロ
ブリンでもよいし、そして損なわれていない免疫グロブ
リンの免疫反応性部分であってもよい。１つの態様にお
いて、エピトープは、好ましくはポリペプチド配列の８
以上、より好ましくは１２以上、そして最も好ましくは
２０以上のアミノ酸を含む。用語「抗体」は、例えばＦ
ｖ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）₂と共に一本鎖を含む完全
な範囲の型を含む。重鎖および軽鎖の遺伝子が、単一の
コード配列に組み合わされている一本鎖抗体もまた、用
語「抗体」に含まれる。

【００３９】用語「免疫反応性」は、本出願において、
ポリペプチドまたはタンパク質に特異的に結合すること
が可能であることを意味する。用語「ヒト化」は、例え
ば、Ｊｏｎｅｓ， Ｐら， Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５
２−５２５（１９８６）またはＴｅｍｐｅｓｔら， Ｂ
ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：２６６−２７３（１９
９１）に記載されるように、抗体の相補性決定領域が、
ヒトモノクローナル抗体に転移されていることを意味す
る。用語「ヒト化」はまた、ヒト重鎖およびヒト軽鎖を
両方含む抗体、例えばＪ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔ
ｈ． ２３１：１１−２３（１９９９）に記載されるよ
うに、任意のヒトまたは非ヒト抗原に対するヒト抗体を
発現するよう操作されたトランスジェニックマウスによ
り産生される抗体などを意味する。

【００４０】用語「機能的に同等」は、本明細書におい
て、ｈａｒＡに特異的な抗体に認識されることが可能な
タンパク質、すなわち野生型ｈａｒＡタンパク質と実質
的に類似の免疫学的反応を引き出すことが可能なタンパ
ク質を指す。したがって、機能的に同等のタンパク質に
対して作成された抗体はまた、ｈａｒＡも認識するであ
ろう。

【００４１】用語「防御」または「防御すること」は、
本明細書において、ワクチンに関し、該ワクチンが、ワ
クチンに使用された抗原（類）が由来する生物により引
き起こされる疾患を予防するまたはその症状を減少させ
ることを意味する。

【００４２】用語「有効量」は、投与される被験者にお
いて、免疫反応を引き出すのに十分なｈａｒＡ核酸また
はｈａｒＡポリペプチドの量を指す。免疫反応は、制限
なしに、細胞性および／または体液性免疫の誘導を含む
可能性がある。

【００４３】用語「療法剤」は、好ましくは抗細菌であ
る、いかなる分子、化合物または治療も指し、細菌感染
またはそれにより引き起こされる疾患の治療を補助す
る。用語としての「変異体（類）」は本明細書におい
て、それぞれ参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチド
とは異なるが、本質的な特性を保持するポリヌクレオチ
ドまたはポリペプチドである。ポリヌクレオチドの典型
的な変異体は、別の参照ポリヌクレオチドとヌクレオチ
ド配列が異なる。変異体のヌクレオチド配列の変化は、
参照ポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドの配
列を改変してもよいし、または改変しなくてもよい。ヌ
クレオチド変化は、以下に論じられるように、参照配列
にコードされるポリペプチドにおいて、アミノ酸置換、
付加、欠失、融合および一部切除（ｔｒｕｎｃａｔｉｏ
ｎ）を生じる可能性がある。ポリペプチドの典型的な変
異体は、別の参照ポリペプチドとアミノ酸配列が異な
る。一般的に、参照ポリペプチドおよび変異体の配列
が、全体的に非常に類似であり、そして多くの領域で同
一であるように、相違は制限される。変異体および参照
ポリペプチドは、いずれかの組み合わせの、１つまたは
それ以上の置換、付加、欠失により、アミノ酸配列が異
なる。置換または挿入アミノ酸残基は、遺伝暗号にコー
ドされるものであっても、またはなくてもよい。ポリヌ
クレオチドまたはポリペプチドの変異体は、天然に存在
するもの、例えば対立遺伝子変異体でもよいし、または
天然に存在することが知られていない変異体であっても
よい。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの非天然存
在変異体は、突然変異誘発技術により、直接合成によ
り、そして当業者に知られる他の組換え法により、作成
してもよい。

【００４４】本発明のポリペプチドおよび核酸を用い、
単離ｈａｒＡポリペプチド、例えば細胞、細胞不含調
製、膜性調製、または本明細書に記載されるような結合
および機能アッセイに適したいずれかの他の調製中のｈ
ａｒＡポリペプチドへの化合物の結合を評価してもよ
い。

【００４５】本発明は、ｈａｒＡポリペプチドを発現す
る生物による感染に対し、動物にワクチン接種するため
の、ｈａｒＡポリペプチドの使用に関する。本発明はま
た、ｈａｒＡポリペプチドに結合する化合物を同定する
ためのｈａｒＡポリペプチドの使用にも関する。本発明
はまた、ｈａｒＡポリペプチドの活性を阻害する化合物
を同定するためのｈａｒＡポリペプチドの使用にも関す
る。１つの態様において、ｈａｒＡポリペプチドの活性
は、ＡＴＰ加水分解であり、すなわちｈａｒＡポリペプ
チドは、少なくともＡＴＰアーゼとして機能する。他の
活性は、さらに以下に記載される。

【００４６】本発明は、ｈａｒＡポリペプチドに結合す
るものを同定するための、化合物のスクリーニング法に
関する。本発明において、ｈａｒＡポリペプチドに結合
するかまたはその活性に影響を与えるか、あるいはｈａ
ｒＡポリペプチドを発現する細胞と相互作用するかまた
は影響を与えるかどうか決定するためにスクリーニング
される化合物は、「候補」と称される可能性がある。本
発明において、いずれかの化合物が、ｈａｒＡポリペプ
チドに結合するかまたはその活性に影響を与えるか、あ
るいはｈａｒＡポリペプチドを発現する細胞と相互作用
するかまたは影響を与えるかどうか決定するため、スク
リーニングされる複数の化合物（または候補）は、「化
合物ライブラリー」と称される可能性がある。化合物、
候補、または化合物ライブラリーは、当該技術分野に公
知であるように、生合成的に、または化学的合成法によ
り、天然または合成産生化合物の生体内変換により、あ
るいはこうした方法の組み合わせにより、産生してもよ
い。用語「結合」または「結合すること」は、本明細書
において、特定のアッセイに関連し、当該技術分野に理
解されるような、「特異的結合」を指す。同様に、ポリ
ペプチドまたは核酸の「活性」は、恒常的活性または他
の細胞構成要素による検出可能シグナルの生成と対照的
に、目的の特定のポリペプチドまたは核酸の活性に依存
し、そして該活性から生じる活性を意味する。

【００４７】本発明は、化合物がｈａｒＡポリペプチド
に結合するかどうか決定するための、化合物のスクリー
ニング法であって、ｈａｒＡポリペプチドと化合物を、
結合に適した条件下で接触させ、そして化合物がｈａｒ
Ａポリペプチドに結合するかどうかを決定することを含
む、前記方法に関する。１つの態様において、結合は、
直接検出され、すなわち検出可能シグナルが該化合物に
取り込まれている。その１つの態様において、シグナル
は、原子（類）の放射性同位体により置換されている化
合物の１つまたはそれ以上の原子により、放出される放
射線である。別の態様において、結合は、ｈａｒＡポリ
ペプチドの測定により、検出される；その態様におい
て、ｈａｒＡポリペプチドは放射標識されていてもよい
し、または化学的に修飾されたアミノ酸を含んでもよい
し、またはアミノ酸の抗原性配列（類）を含んでもよい
し、または融合パートナー、例えばＦＬＡＧエピトープ
を用いてｈａｒＡポリペプチドを検出することが可能な
融合タンパク質を含んでもよい。別の態様において、結
合は間接的に検出され、すなわち、シグナルは、化合物
がｈａｒＡポリペプチドに結合する際、該化合物または
ｈａｒＡポリペプチド以外の分子により生成される。そ
の態様において、シグナルは、別のポリペプチドの産生
により、または例えばレポーター遺伝子系におけるよう
に、核酸の発現により、提供されてもよい。

【００４８】本発明は、ライブラリー由来の少なくとも
１つの化合物が、ｈａｒＡポリペプチドに結合するかど
うか決定するための、ライブラリースクリーニング法で
あって、（ａ）ｈａｒＡポリペプチドとライブラリー
を、結合に適した条件下で接触させ、（ｂ）ライブラリ
ー由来の少なくとも1つの化合物が、ｈａｒＡポリペプ
チドに結合するかどうか検出し、そして少なくとも１つ
の化合物の結合が検出された場合、（ｃ）ｈａｒＡポリ
ペプチドに結合する各化合物を同定することを含む、前
記方法に関する。同定される化合物は、以前から知られ
る化合物である可能性もあるし、あるいは化合物ライブ
ラリーの場合、また、先に単離されていないが、その合
成様式、部位、または化合物もしくは化合物ライブラリ
ーが作成された方法に特定の単数もしくは複数の特徴に
より、または公知の化学的技術を用いた単離により、ｈ
ａｒＡポリペプチドまたはその断片と関連しまたは分離
して、同定することが可能である化合物も含まれる可能
性もある。本発明は、当該技術分野に公知である高処理
スクリーニング法を含みそして包含する。１つの態様に
おいて、工程（ｂ）および工程（ｃ）は、共に行い、す
なわちライブラリー由来の化合物の結合の検出およびこ
うした化合物の同定は、カップリングされているかまた
は分離不能である。別の態様において、工程（ｃ）、同
定は、ライブラリー中の各化合物を単離し、そして各々
のこうした化合物に関し、該化合物がｈａｒＡポリペプ
チドに結合するかどうか別個に決定することにより、行
う。高処理スクリーニング法を用いた、化合物同定のた
めの多くの形態が当該技術分野に公知であり、そしてこ
れは、その排他的な目録であることを意図しない。

【００４９】本発明は、化合物がｈａｒＡ活性を阻害す
るかどうか決定するための、化合物のスクリーニング法
であって：ｈａｒＡポリペプチドの活性を、（ｉ）化合
物の非存在下および（ｉｉ）存在下で、ｈａｒＡ活性を
測定するのに適した条件下で測定することを含み；化合
物の非存在下のｈａｒＡ活性に比較した化合物の存在下
のｈａｒＡ活性の減少は、化合物がｈａｒＡ活性を阻害
することを確認し、ｈａｒＡポリペプチドが（ａ）図２
（配列番号２）に示されるアミノ酸配列または（ｂ）図
４（配列番号４）に示されるアミノ酸配列に少なくとも
７５％同一であるアミノ酸配列を含む、前記方法に関す
る。好ましい態様において、さらに以下に記載されるよ
うに、測定されるｈａｒＡ活性は、ＮＴＰアーゼ活性で
ある。

【００５０】本発明は、ｈａｒＡポリペプチドのヌクレ
オチドトリホスファターゼ（「ＮＴＰアーゼ」）活性を
阻害する化合物を同定するための、化合物のスクリーニ
ング法に関する。本発明は、化合物がｈａｒＡ ＮＴＰ
アーゼ活性を阻害するかどうか決定するための、化合物
のスクリーニング法であって、ｈａｒＡ ＮＴＰアーゼ
活性を測定するのに適した条件下で、（ｉ）化合物の非
存在下および（ｉｉ）存在下で、別個にｈａｒＡポリペ
プチドのＮＴＰアーゼ活性を測定し、そして化合物の非
存在下のｈａｒＡ ＮＴＰアーゼ活性に比較し、化合物
の存在下のｈａｒＡ ＮＴＰアーゼ活性の減少を検出す
ることを含む、前記方法に関する。ＮＴＰアーゼ活性を
測定する方法は、当該技術分野に公知である。例えば、
ＮＴＰアーゼ活性は、Ｈｗａｎｇ， Ｋ．Ｙ．， Ｃｈ
ｕｎｇ， Ｊ．Ｈ．， Ｋｉｍ，Ｓ．−Ｈ．， Ｈａ
ｎ， Ｙ．Ｓ．およびＣｈｏ， Ｙ．， “Ｓｔｒｕｃ
ｔｕｒｅ−ｂａｓｅｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌＮＴＰａｓｅ ｆｒｏｍ Ｍｅ
ｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ，”
Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ
６（７）：６９１−６９６（１９９９）に記載される
ように測定してもよい。１つの態様において、ＮＴＰア
ーゼ活性は、ＡＴＰアーゼ活性であり、すなわちヌクレ
オチドはアデノシンである。ＡＴＰアーゼ活性を測定す
る方法は、当該技術分野に公知である。例えば、ＡＴＰ
アーゼ活性は、Ｚａｒｅｍｂｉｎｓｋｉ， Ｔ．Ｉ．
ら，“Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｂａｓｅｄ ａｓｓｉｇｎ
ｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｆ
ｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ
ｐｒｏｔｅｉｎ： ａ ｔｅｓｔ ｃａｓｅ ｏｆ
ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｇｅｎｏｍｉｃｓ，” ＰＮＡＳ
（ＵＳＡ） ９５：１５１８９−１５１９３（１９９
８）に記載されるように、または例えばＫｉｅｌ，
Ｍ．Ｃ． Ｈｉｒｏｙｕｋｉ， Ａ．， Ｇａｎｏｚ
ａ， Ｍ．Ｃ．， “Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ｏｆ ａ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＡＴＰａｓｅ ｉｎ
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｃｅｌｌｓ，”
Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ ８１：１０９７−１１０８（１９
９９）に記載されるように測定してもよい。上述の刊行
物はすべて、本明細書に援用される。別の態様におい
て、ＡＴＰアーゼ活性は、ｈａｒＡポリペプチドを発現
する細胞を用いて測定される。その態様において、細胞
は、プラスミドｐＭＰ−ｂａｃＡ１−１（ＡＴＣＣ寄託
番号第ＰＴＡ−２５５１号）を含む。その別の態様にお
いて、細胞は、プラスミドｐＧＥＭ−Ｔ／ｈａｒＡ（Ａ
ＴＣＣ寄託番号第ＰＴＡ−２５５２号）を含む。別の態
様において、ＡＴＰアーゼ活性は、単離ｈａｒＡポリペ
プチドを用いて測定される。別の態様において、ＡＴＰ
アーゼ活性は、ＡＴＰ依存タンパク質合成により示され
る。

【００５１】本発明はまた、当該技術分野に公知である
ように、転写または翻訳に関連するｈａｒＡ活性に関す
るアッセイを伴う、化合物のスクリーニング法にも関す
る。例えば、Ｚｕｂａｙ， Ｇ． Ａｎｎ． Ｒｅｖ．
Ｇｅｎｅｔ． ７：２６７−２８７（１９７３）；ま
た、Ｐｒａｔｔ， Ｊ．Ｍ．， “ｃｏｕｐｌｅｄｔｒ
ａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｉ
ｎ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ ｓ
ｙｓｔｅｍｓ， ｐ．１７９−２０９， Ｂ．Ｄ． Ｈ
ａｍｅｓおよびＳ．Ｊ． Ｈｉｇｇｉｎｓ（監修） Ｔ
ｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔ
ｉｏｎ， Ａ ＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ
中， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， オックスフォード（１９
８４）；およびＳｈｉｎａｂａｒｇｅｒら， “Ｍｅｃ
ｈａｎｉｓｍ ｏｆ Ａｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｘａｚｏ
ｌｉｄｉｎｏｎｅｓ： Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｌｉｎ
ｅｚｏｌｉｄ ａｎｄ Ｅｐｅｒｅｚｏｌｉｄ ｏｎ
ＴｒａｎｓｌａｔｉｏｎＲｅａｃｔｉｏｎｓ，” Ａｎ
ｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈ
ｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ４１（１０）：２１３２−２１
３６（１９９７）と共に、やはりポリ（Ｕ）プログラム
化ポリフェニルアラニン合成を記載するＫｉｅｌら（上
記）、Ｍｕｒｒａｙら， Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ
Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ
４２（４）：９４７（１９９８）， Ｍａｈｍｏｏｄ
ら， Ｇｅｎｅ １０６：２９−３４（１９９１）、お
よびＭａｏ， Ｊ．Ｃ．−Ｈ． Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌ． ９４：８０−８６（１９６７）を参照された
い。ＡＢＣ含有タンパク質に関しては、例えば、ＴＮＦ
−アルファ刺激に反応した滑膜細胞におけるＡＢＣ５０
ｍＲＮＡの上昇と共に、刺激に反応したＴ−リンパ球
における翻訳機構、例えば伸長因子ｅＩＦ２のレベルの
増加を記載する、Ｔｙｚａｃｋらを参照されたい。Ｔｙ
ｚａｃｋ， Ｊ．Ｋ．， Ｗａｎｇ， Ｘ．， Ｂｅｌ
ｓｈａｍ， Ｇ．Ｊ．およびＰｒｏｕｄ，Ｃ．Ｇ．
“ＡＢＣ５０ Ｉｎｔｅｒａｃｔｓ ｗｉｔｈ Ｅｕｋ
ａｒｙｏｔｉｃ Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ
２ ａｎｄ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ｗｉｔｈ ｔｈ
ｅ Ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｉｎ ａｎ ＡＴＰ−ｄｅｐｅ
ｎｄｅｎｔ ｍａｎｎｅｒ” Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈ
ｅｍ． ２７５（４４）：３４１３１−３４１３９（２
０００）。出願者らは、上述の刊行物すべてを本明細書
に援用する。本発明は、上述のいかなるものでもよい化
合物または化合物ライブラリースクリーニング法にも関
し、ここで化合物の結合は、ｈａｒＡ核酸のｍＲＮＡレ
ベルの変化により、１つまたはそれ以上の翻訳因子のリ
ボソームまたはポリソームとの関連における変化によ
り、あるいはいずれかの検出可能開始因子のレベルの変
化により、検出される。１つの態様において、ｈａｒＡ
核酸のｍＲＮＡレベルの変化は、上述のような、当該技
術分野に公知のものなどのｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳アッセ
イにより、検出される。

【００５２】上述のスクリーニング法のいずれかの態様
において、ｈａｒＡポリペプチドへの化合物の結合、ま
たはｈａｒＡポリペプチドの活性、例えばＡＴＰアーゼ
活性に対する化合物の影響または翻訳に対するその影響
は、レポーター系を用いることにより、検出してもよ
い。１つの態様において、レポーター系は、レポーター
遺伝子系である。レポーター遺伝子系は当該技術分野に
公知である。例えば、Ｓｃｈｅｎｂｏｒｎ Ｅ．および
Ｇｒｏｓｋｒｅｕｔｚ， Ｄ． “Ｒｅｐｏｒｔｅｒ
ｇｅｎｅ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ ａｓｓａｙｓ，”
Ｍｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １３（１）：２
９−４４（１９９９）を参照されたい。その好ましい態
様において、レポーター遺伝子系はＡＴＰアーゼ活性と
カップリングされる。より好ましい態様において、レポ
ーター遺伝子系は、ＡＴＰ加水分解に反応性である。別
の態様において、化合物または化合物群の結合は、ＥＬ
ＩＳＡにより検出される。その１つの態様において、Ｅ
ＬＩＳＡアッセイは、ｈａｒＡポリペプチドに特異的な
抗体を利用する。別の態様において、ｈａｒＡポリペプ
チドは、ｈａｒＡポリペプチドを発現する細胞由来の調
製、例えば細胞区画、細胞エンベロープ、細胞壁または
膜性調製中にあるか、あるいはｈａｒＡポリペプチドを
産生するｉｎ ｖｉｔｒｏ発現系由来であってもよい。
他の態様において、ｈａｒＡポリペプチドと化合物の相
互作用は、ｈａｒＡを欠く、あるいは破壊されているか
または非機能性であるｈａｒＡポリペプチドを発現する
細胞における化合物の量に比較した、ｈａｒＡポリペプ
チドを発現する細胞における化合物の増加した量によ
り、測定され、例えば、さらなる態様において、こうし
た細胞はＪＨ６４２ ｅｘｐＺ：：ＣＡＴ（ＡＴＣＣ寄
託番号第ＰＴＡ−２４８０号）またはＯＧ１Ｘ ｈａｒ
Ａ：：ＥＲＭ（ＡＴＣＣ寄託番号第ＰＴＡ−２５５０
号）であってもよい。化合物の量を測定する方法の例
は、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ，Ｊ．， Ｔａｉｔ−Ｋａｍｒ
ａｄｔ， Ａ．およびＷｏｎｄｒａｃｋ， Ｌ．，
“Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ
ａｎｄ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎ
ｅｓ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｔｏ Ｍａｃｒｏｌｉｄｅ
ｓ ｂｕｔ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｔｏ Ｃｌｉｎｄａ
ｍｙｃｉｎ：ａ Ｃｏｍｍｏｎ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ
Ｐａｔｔｅｒｎ Ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ａｎ Ｅ
ｆｆｌｕｘ Ｓｙｓｔｅｍ，” Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ
ｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｒａｐ
ｙ， ４０（６）：１８１７−１８２４（１９９６）に
見ることが可能である。

【００５３】本発明はまた、抗細菌剤、例えばハイグロ
マイシンＡ、ランカシジン、バージニアマイシン、スト
レプトグラミンまたはストレプトグラミン併用、例えば
Ｓｙｎｅｒｃｉｄ、あるいは本明細書に記載されるいか
なるものでもよい他の抗細菌剤（類）に対する生物の耐
性を減少させる化合物を同定するための、化合物のスク
リーニング法であって、ｈａｒＡポリペプチドの発現に
より、剤に耐性である生物を、化合物と、剤に対する生
物の耐性を測定するのに適した条件下で接触させ、そし
て該化合物が剤に対する生物の耐性を減少させるかどう
か検出することを含む、前記方法にも関する。

【００５４】１つの態様において、生物を化合物ライブ
ラリーと接触させ、そして生物の耐性の減少が検出され
たら、剤に対する生物の耐性を減少させる、ライブラリ
ー中の各化合物を同定することをさらに含む。同定され
る化合物は、先に知られる化合物である可能性もある
し、あるいは化合物ライブラリーの場合、また、先に単
離されていないが、その合成様式、部位、または化合物
もしくは化合物ライブラリーが作成された方法に特定の
単数もしくは複数の特徴により、または公知の化学的技
術を用いた単離により、ｈａｒＡポリペプチドまたはそ
の断片と関連しまたは分離して、同定することが可能で
ある化合物も含まれる可能性もある。

【００５５】上述のスクリーニング法のいずれかの１つ
の態様において、減少した耐性は、化合物の非存在下で
のＭＩＣに比較した、生物に対する剤のＭＩＣの減少に
より測定される。その好ましい態様において、ＭＩＣ
は、ブロス微量希釈アッセイを用いて測定される。好ま
しい態様において、ＭＩＣの減少は、少なくとも４倍で
ある。そのより好ましい態様において、ＭＩＣの減少
は、少なくとも約８倍である。さらにより好ましい態様
において、ＭＩＣの減少は、少なくとも約１６倍、また
は少なくとも約３２倍、または少なくとも約５０倍、ま
たは少なくとも約１００倍、または少なくとも約５００
倍である。ＭＩＣ、または「最小阻害濃度（ｍｉｎｉｍ
ｕｍ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉ
ｏｎ）」は、本出願において、増殖を完全に阻害する抗
生物質の最低濃度である。

【００５６】「耐性である」または「薬剤耐性である」
（またはそれぞれ「耐性」または「薬剤耐性」）は、本
出願において、薬剤（交換可能に「化合物」または
「剤」）が生物の特定の株を殺すのに失敗することを意
味し、そして本明細書に特に記載されない限り、いかな
る定量的測定を伴うことも意図しない（以下を参照され
たい）。耐性は、薬剤の存在下で生物の反復される細胞
分裂周期に渡り、生物の下位集団（類）の生存として明
らかになる可能性があり、すなわち、集団の少なくとも
大部分の細胞は殺されるが、ある程度の比率（下位集団
（類））が生き残り、そして各細胞分裂周期で数が増加
する。耐性はまた、薬剤への生物の最初の曝露の際の、
または他の生物またはその株において、薬剤に対する耐
性を与えることが知られる遺伝子の生物の感受性株への
意図的な導入の際の、生物に対する薬剤のＭＩＣに比較
した、薬剤のＭＩＣの増加として明らかになる可能性も
ある。好ましくは、ＭＩＣの変化は、少なくとも約４
倍、または少なくとも約８倍、または約１６倍、または
約３２倍、または約５０倍、または約１００倍、または
約５００倍である。耐性はまた、特定の抗細菌剤および
特定の試験生物を用いたディスク拡散アッセイにおける
阻害ゾーンの非存在により、明らかになる可能性もあ
る。耐性は、特定の生物、またはその株に固有であり、
そしてスクリーニング実験において、他の関連生物また
はその株との比較により、生物またはその株の増加した
生存によってのみ、同定される可能性がある。

【００５７】これらの方法のいずれかの態様において、
ｈａｒＡ破壊技術、例えば本明細書に以下に記載される
もの、または当該技術分野に知られる他のものを用い、
耐性生物から対照（感受性）生物を産生してもよく、こ
こで耐性はｈａｒＡにより仲介される。同様に、本明細
書に開示される破壊技術の一般的な適用可能性は、薬剤
耐性がｈａｒＡ遺伝子の発現により仲介される、いかな
る生物を用いて、スクリーニングを行うことも可能にす
る。

【００５８】本発明はまた、ハイグロマイシンＡ、バー
ジニアマイシン、ランカシジンまたはストレプトグラミ
ンもしくはストレプトグラミン併用、例えばＳｙｎｅｒ
ｃｉｄに耐性である生物または生物団におけるｈａｒＡ
仲介耐性の同定のための方法であって、薬剤に耐性であ
る生物を単離し、該生物においてｈａｒＡ遺伝子を破壊
するのに適したプラスミドを産生し、該生物を該プラス
ミドで形質転換し、形質転換生物を薬剤と接触させ、そ
して形質転換生物において、対照生物に比較した、薬剤
に対する感受性の増加を測定し、それにより、該生物が
ｈａｒＡ仲介薬剤耐性を示すことを確認することを含
む、前記方法にも関する。本明細書において、句「感受
性の増加」は本明細書に用いられるように、「耐性の減
少」と同等である。１つの態様において、ｈａｒＡ遺伝
子を破壊するのに適したプラスミドは、ＥｃｏＲＶおよ
びＥｃｏＲＩを用いて切除された、枯草菌ｈａｒＡ遺伝
子の内部断片を含む。別の態様において、ｈａｒＡ遺伝
子を破壊するのに適したプラスミドは、それぞれ配列番
号５および配列番号６のセンスおよびアンチセンスプラ
イマーを用いたＰＣＲにより生成されたＥ．フェカリス
ｈａｒＡ遺伝子の内部断片を含む。その好ましい態様に
おいて、プラスミドは、大腸菌およびＥ．フェカリスに
おいて発現するｅｒｍ決定基を持つ大腸菌ベクターｐＶ
Ａ８９１を含む。１つの態様において、対照は耐性生物
である（すなわち破壊プラスミドで形質転換されていな
い）。別の態様において、対照は破壊構築物を欠くプラ
スミドで形質転換された耐性生物である。

【００５９】本発明は、抗細菌剤が、ｈａｒＡ仲介薬剤
耐性を示す生物を治療するのに有効であるか決定するた
めの、Ｅ．フェカリスのハイグロマイシンＡ耐性株の使
用に関する。１つの態様において、Ｅ．フェカリスのハ
イグロマイシンＡ耐性株は、株ＯＧ１Ｘ（ＡＴＣＣ寄託
番号第ＰＴＡ−３２７２号）である。

【００６０】本発明はまた、抗細菌剤が、ｈａｒＡ仲介
薬剤耐性を示す生物を治療するのに有効であるか決定す
るための、枯草菌のハイグロマイシンＡ耐性株の使用に
も関する。１つの態様において、枯草菌のハイグロマイ
シンＡ耐性株は、株ＪＨ６４２（ＡＴＣＣ寄託番号第Ｐ
ＴＡ−３２７１号）である。

【００６１】本発明はまた、剤がｈａｒＡ仲介薬剤耐性
を示す第一の生物に対して有効であるか決定するため
の、抗細菌剤のスクリーニング法であって、（ａ）ＭＩ
Ｃ₁およびＭＩＣ₂を測定し、そして（ｂ）比ＭＩＣ₁／
ＭＩＣ₂を計算することを含み、約４未満の比は、剤が
第一の生物に対して有効であることを確認し；ＭＩＣ₁
はｈａｒＡ仲介薬剤耐性を示す第二の生物に対する剤の
ＭＩＣであり；そしてＭＩＣ₂はｈａｒＡ仲介薬剤耐性
を示さない第三の生物に対する剤のＭＩＣである、前記
方法にも関する。該方法の１つの態様において、第一の
生物は、Ｅ．フェカリス、Ｅ．フェシウム、黄色ブドウ
球菌、化膿連鎖球菌、肺炎連鎖球菌、インフルエンザ
菌、またはセルピュリナ・ヒオジセンテリエである。耐
性生物は、例えば、ヒトを含む動物集団を感染させる株
の監視、または実験室株のスクリーニングにより同定す
ることが可能であり；ｈａｒＡ仲介耐性は、例えば、耐
性生物におけるｈａｒＡ遺伝子の破壊による感受性の授
与により、本明細書に記載されるように同定される。別
の態様において、薬剤は、ハイグロマイシンＡ、バージ
ニアマイシン、ランカシジン、ストレプトグラミンまた
はストレプトグラミン併用、例えばＳｙｎｅｒｃｉｄで
ある。該方法の別の態様において、第一の生物および第
二の生物は、同じ生物である。該方法の別の態様におい
て、第二の生物は、Ｅ．フェカリス株ＯＧ１Ｘ（ＡＴＣ
Ｃ寄託番号第ＰＴＡ−３２７２号）または枯草菌株ＪＨ
６４２（ＡＴＣＣ寄託番号第ＰＴＡ−３２７１号）であ
る。別の態様において、第二の生物は、破壊されたｈａ
ｒＡ遺伝子を含む生物の復帰突然変異体である。その別
の態様において、第二の生物は、Ｅ．フェカリス株ＯＧ
１ＸｈａｒＡ：：ＥＲＭ（ＡＴＣＣ寄託番号第ＰＴＡ−
２５５０号）または枯草菌株ＪＨ６４２ ｅｘｐＺ：：
ＣＡＴ（ＡＴＣＣ寄託番号第ＰＴＡ−２４８０号）の復
帰突然変異体である。該方法の別の態様において、第三
の生物は、ｈａｒＡ発現が破壊された第二の生物の株で
あり；その好ましい態様において、第一の生物および第
二の生物は同じ生物である。別の態様において、第三の
生物は、Ｅ．フェカリス株ＯＧ１Ｘ ｈａｒＡ：：ＥＲ
Ｍ（ＡＴＣＣ寄託番号第ＰＴＡ−２５５０号）または枯
草菌株ＪＨ６４２ ｅｘｐＺ：：ＣＡＴ（ＡＴＣＣ寄託
番号第ＰＴＡ−２４８０号）である。さらに別の態様に
おいて、第二の生物は、Ｅ．フェカリス株ＯＧ１Ｘ（Ａ
ＴＣＣ寄託番号第ＰＴＡ−３２７２号）であり、そして
第三の生物は、ＯＧ１Ｘ ｈａｒＡ：：ＥＲＭ（ＡＴＣ
Ｃ寄託番号第ＰＴＡ−２５５０号）である。さらに別の
好ましい態様において、第二の生物は、枯草菌株ＪＨ６
４２（ＡＴＣＣ寄託番号第ＰＴＡ−３２７１号）であ
り、そして第三の生物は、ＪＨ６４２ ｅｘｐＺ：：Ｃ
ＡＴ（ＡＴＣＣ寄託番号第ＰＴＡ−２４８０号）であ
る。他の態様において、例えば、第二および第三の生物
は、それぞれ、生物の選択された耐性および感受性株で
あってもよく、これは抗細菌剤をスクリーニングするの
に特に適しており、一方、第一の生物は、関連するが、
例えば感染した動物集団から単離された生物の耐性株で
あってもよい。他の態様において、例えば、第三の生物
は、第一の生物の天然感受性株、あるいは第一の生物の
ノックアウトまたは破壊突然変異体である。他の態様に
おいて、比ＭＩＣ₁／ＭＩＣ₂は約１０未満である。

【００６２】上述の方法のいずれかの態様において、ｈ
ａｒＡポリペプチドは、限定されるわけではないが、配
列番号２または配列番号４に示される配列に少なくとも
７５％同一、あるいは配列番号２または配列番号４に示
されるアミノ酸配列に少なくとも９５％同一または１０
０％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチド、または本
明細書に記載される変異体、断片のいずれかを含む、上
に同定されるｈａｒＡポリペプチドのいずれかである。

【００６３】本発明は、ｈａｒＡポリペプチドをコード
する単離核酸に関する。１つの態様において、核酸は
Ｅ．フェカリスから単離され、そして好ましくはＥ．フ
ェカリス株ＯＧ１Ｘ（ＡＴＣＣ寄託番号第ＰＴＡ−３２
７２号）から単離される。別の態様において、核酸は枯
草菌から単離され、そして好ましくは枯草菌株ＪＨ６４
２（ＡＴＣＣ寄託番号第ＰＴＡ−３２７１号）から単離
される。

【００６４】本発明は、ｈａｒＡポリペプチドをコード
する単離核酸であって：（ａ）図１（配列番号１）に示
されるヌクレオチド配列に少なくとも７５％同一である
ヌクレオチド配列；（ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列に
相補的であるヌクレオチド配列；および（ｃ）（ａ）ま
たは（ｂ）のヌクレオチド配列に縮重しているヌクレオ
チド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列を
含む、前記核酸に関する。１つの態様において、核酸
は、図１（配列番号１）に示されるヌクレオチド配列に
少なくとも８５％同一であるヌクレオチド配列を含む。
好ましい態様において、ヌクレオチド配列は、図１（配
列番号１）に示されるヌクレオチド配列から本質的にな
る。別の態様において、核酸は、図２（配列番号２）に
示されるアミノ酸配列から本質的になるアミノ酸配列を
含むｈａｒＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配
列を含む。さらに別の態様において、ヌクレオチド配列
は、図２（配列番号２）に示されるアミノ酸配列をコー
ドする。さらに別の態様において、ヌクレオチド配列
は、図１（配列番号１）に示されるヌクレオチド配列に
少なくとも７５％同一であるが、１００％未満同一であ
る。さらに別の態様において、ヌクレオチド配列は、図
１（配列番号１）に示されるヌクレオチド配列である。

【００６５】本発明は、ｈａｒＡポリペプチドをコード
する単離核酸であって：（ａ）図３（配列番号３）に示
されるヌクレオチド配列に少なくとも７５％同一である
ヌクレオチド配列；（ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列に
相補的であるヌクレオチド配列；および（ｃ）（ａ）ま
たは（ｂ）のヌクレオチド配列に縮重しているヌクレオ
チド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列を
含む、前記核酸に関する。１つの態様において、核酸
は、図３（配列番号３）に示されるヌクレオチド配列に
少なくとも８５％同一であるヌクレオチド配列を含む。
好ましい態様において、ヌクレオチド配列は、図３（配
列番号３）に示されるヌクレオチド配列から本質的にな
る。別の態様において、核酸は、図４（配列番号４）に
示されるアミノ酸配列から本質的になるアミノ酸配列を
含むｈａｒＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配
列を含む。さらに別の態様において、ヌクレオチド配列
は、図４（配列番号４）に示されるアミノ酸配列をコー
ドする。さらに別の態様において、ヌクレオチド配列
は、図３（配列番号３）に示されるヌクレオチド配列に
少なくとも７５％同一であるが、１００％未満同一であ
る。さらに別の態様において、ヌクレオチド配列は、図
３（配列番号３）に示されるヌクレオチド配列である。

【００６６】本出願において、用語「核酸」は、一般的
にポリヌクレオチドを含み、これは、ゲノムＤＮＡおよ
びｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、およびＲＮＡを含んでもよ
く、このいずれも必要に応じ、転写または翻訳前に除去
され、あるいは選択的スプライシングされあるいは別の
方式でプロセシングされるイントロン、または他の核酸
を含んでもよく、そして本明細書に言及されるすべての
核酸は、合成ポリヌクレオチドあるいは１つまたはそれ
以上の非天然存在ヌクレオチドを含むポリヌクレオチド
を含んでもよく、これらはすべて当該技術分野に公知で
ある。

【００６７】本出願において、核酸は、１つまたはそれ
以上のヌクレオチド置換または代替コドンの含有によ
り、参照核酸と異なるが、参照核酸にコードされるポリ
ペプチドと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドをコ
ードする場合、参照核酸に関し、「縮重」している。本
発明はさらに、本明細書に開示されるものに縮重してい
るすべての配列に関する。一般の当業者は、コドン使用
表が公共に広く入手可能であるため、特定の生物に好ま
しい置換および代替コドンを日常的に決定することが可
能であると期待される。用語「縮重」が、代替翻訳開始
および終結コドン、並びに当該技術分野に公知であり、
そして本明細書にさらに記載される、異なる生物で起こ
ることが知られるような、一般的な代替コドン使用を含
む、代替コドン使用を含むとさらに理解されるべきであ
る。

【００６８】用語「核酸」は、本明細書において、本発
明のポリペプチド、特に細菌ポリペプチド、そしてさら
に特に図２（配列番号２）に示されるアミノ酸配列を有
するＥ．フェカリスｈａｒＡのポリペプチドをコードす
る配列を含むポリヌクレオチドを含む。該用語はまた、
該ポリペプチドをコードする単一の連続する領域または
断続する領域（例えば組込みファージまたは挿入配列ま
たは編集により中断されるもの）を、やはりコードおよ
び／または非コード配列を含んでもよいさらなる領域と
共に含むポリヌクレオチドも含む。

【００６９】２つのヌクレオチド配列の同一性の度合い
（％）は、本明細書に記載されるとおりであり、ポリヌ
クレオチド比較の好ましいパラメーターは以下を含む：
比較マトリックス：一致＝＋１０、ミスマッチ＝０；ギ
ャップペナルティ：５０；およびギャップ長ペナルテ
ィ：３を用いた、アルゴリズム： Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ
およびＷｕｎｓｃｈ， Ｊ． Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ４
８：４４３−４５３（１９７０）。このアルゴリズム
は、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕ
ｐ、ウィスコンシン州マディソンから「ｇａｐ」プログ
ラムとして入手可能である。これらは、核酸比較のデフ
ォルトパラメーターである。

【００７０】好ましいポリヌクレオチド態様は、さら
に、参照配列に少なくとも７５、８０、８５、９０、９
５、９７または１００％の同一性を有するヌクレオチド
配列を含む単離核酸を含む。１つの態様において、参照
配列は配列番号１である。別の態様において、参照配列
は配列番号３である。１つの態様において、核酸は、配
列番号１の配列に同一の配列を含む。別の態様におい
て、核酸は、配列番号３の配列に同一の配列を含む。さ
らに別の態様において、核酸は、参照配列に比較した
際、特定の整数までのヌクレオチド改変を含み、前記改
変は、少なくとも１つのヌクレオチド欠失、移行および
塩基転換を含む置換、または挿入からなる群より選択さ
れ、そして前記改変は、参照配列中のヌクレオチドの中
に個々に、あるいは参照配列内の１つまたはそれ以上の
隣接する基で点在し、参照ヌクレオチド配列の５’また
は３’末端位で、あるいはこれらの末端位の間のどこか
で起こってもよい。好ましい態様において、整数は５０
未満である。より好ましい態様において、整数は４０未
満、３０未満、または１０未満である。配列番号２のポ
リペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の改変
は、このコード配列にナンセンス、ミスセンスまたはフ
レームシフト突然変異を生成し、そしてそれによりこう
した改変後、ポリヌクレオチドにコードされるポリペプ
チドを改変してもよい。

【００７１】用語としての「変異体（類）」核酸は、本
明細書において、参照核酸と異なるが、本質的な特性を
保持する核酸である。核酸の典型的な変異体は、別の参
照核酸とヌクレオチド配列が異なる。変異体のヌクレオ
チド配列における変化は、参照ポリヌクレオチドにコー
ドされるアミノ酸配列を改変してもよいし、または改変
しなくてもよい。ヌクレオチド変化は、参照配列にコー
ドされるポリペプチドにおいて、アミノ酸置換、付加、
欠失、融合および一部切除を生じる可能性がある。一般
的に、参照ポリペプチドおよび変異体の配列が、全体的
に非常に類似であり、そして多くの領域で同一であるよ
うに、相違は制限される。核酸の変異体は、天然に存在
するもの、例えば対立遺伝子変異体でもよいし、または
天然に存在することが知られていない変異体であっても
よい。核酸の非天然存在変異体は、突然変異誘発技術に
より、直接合成により、そして当業者に知られる他の組
換え法により、作成してもよい。変異体は、マーカー配
列、例えばｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ， Ｉｎ
ｃ．）に提供され、そしてＧｅｎｔｚら， Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．，（ＵＳＡ） ８
６：８２１−８２４（１９８９）に記載されるようなヘ
キサヒスチジンペプチド、またはＨＡタグ（Ｗｉｌｓｏ
ｎら， Ｃｅｌｌ ３７：７６７（１９８４））をコー
ドする配列を含んでもよい。

【００７２】本発明はまた、ｈａｒＡ核酸コード誘導
体、ｈａｒＡコードタンパク質の類似体および変異体、
並びにｈａｒＡアンチセンス核酸にも関する。容易に明
らかであるように、本明細書において、「ｈａｒＡコー
ドタンパク質の断片または部分をコードする核酸」は、
ｈａｒＡコードタンパク質の列挙される断片または部分
のみをコードする核酸を指すと解釈すべきであり、そし
てｈａｒＡコードタンパク質の他の近接する部分を連続
する配列と解釈すべきではない。

【００７３】本発明は、異種プロモーターと機能的な関
連にある、本明細書に記載されるようないかなるｈａｒ
Ａ核酸にも関する。その１つの態様において、核酸はさ
らに、原核細胞で活性である複製起点を含む。その好ま
しい態様において、核酸はさらに、本明細書に記載され
るｈａｒＡ核酸のいずれかを含む組換えベクターを含
む。より好ましい態様において、ベクターは、ｐＭＰ、
ｐＧＥＭ−Ｔ、ｐＶＡ８９１、ｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐ
ＢＲ３２２、ｐＢＲ３２９、ｐＰＬ、ｐＫＫ２２３およ
びｐＱＥ５０より選択される。本発明はまた、上述のベ
クターのいずれかを含む細胞にも関する。

【００７４】本発明は、ｐＭＰ−ｂａｃＡ１−１（ＡＴ
ＣＣ寄託番号第ＰＴＡ−２５５１号、２０００年９月２
６日寄託）であるベクターに関する。本発明はまた、ｐ
ＧＥＭ−Ｔ／ｈａｒＡ（ＡＴＣＣ寄託番号第ＰＴＡ−２
５５２号、２０００年９月２６日寄託）であるベクター
にも関する。

【００７５】本発明は、真核細胞で活性な複製起点をさ
らに含む、本明細書に記載されるいかなる核酸にも関す
る。その１つの態様において、核酸はさらに、組換えベ
クターを含む。その好ましい態様において、ベクター
は、ｐｃＤＮＡ−３、ｐｃＥＸＶ、酵母ベクター、例え
ばＹｅｐ１３、Ｙｉｐ５、ｐＹＡＣ、例えばｐＹＡＣ
３、および融合タンパク質ベクター、例えばｐＭａｌ、
ｐＴｒｘＦｕｓ、およびｐＧＥＸであり、これらのすべ
ては当該技術分野に公知である。その好ましい態様にお
いて、本発明はベクターを含む真核細胞に関する。より
好ましい態様において、真核細胞は、ＣＨＯ、ＣＯＳ、
ＣＯＳ−７、ＮＩＨ−３Ｔ３、ＨＥＫ−２９３、ＭＤＣ
ＫまたはＬＭ（ｔｋ−）細胞、または昆虫細胞、例えば
Ｓｆ−９またはＳｆ−２１細胞、またはアフリカツメガ
エル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）細胞、例えば卵母細胞またはア
フリカツメガエル細胞株であり、これらのすべては当該
技術分野に公知である。

【００７６】本発明は、ｈａｒＡポリペプチドをコード
し、そしてさらにクロラムフェニコール耐性挿入物を含
むヌクレオチド配列を含む、単離核酸に関する。その１
つの態様において、核酸はさらに、組換えベクターを含
む。その好ましい態様において、本発明は、組換えベク
ターを含む細胞に関する。本発明はさらに、クロラムフ
ェニコール耐性挿入物を含む、枯草菌株ＪＨ６４２ ｅ
ｘｐＺ：：ＣＡＴ（ＡＴＣＣ寄託番号第ＰＴＡ−２４８
０号、２０００年９月２６日寄託）である細胞に関す
る。

【００７７】本発明は、ｈａｒＡポリペプチドをコード
し、そしてさらにエリスロマイシン耐性挿入物を含むヌ
クレオチド配列を含む、単離核酸に関する。その１つの
態様において、核酸はさらに、組換えベクターを含む。
その好ましい態様において、本発明は、組換えベクター
を含む細胞に関する。本発明はさらに、エリスロマイシ
ン耐性挿入物を含む、エンテロコッカス・フェカリス株
ＯＧ１Ｘ ｈａｒＡ：：ＥＲＭ（ＡＴＣＣ寄託番号第Ｐ
ＴＡ−２５５０号、２０００年９月２６日寄託）である
細胞に関する。

【００７８】本明細書に記載されるアメリカン・タイプ
・カルチャー・コレクション（「ＡＴＣＣ」）における
寄託は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関
するブダペスト条約の条件下に行われた。本明細書に記
載される寄託は、請求される核酸、ベクター、プラスミ
ドおよび細胞が容易に入手可能であり、そして関連する
その過程、方法および使用がすべて、本明細書に開示さ
れるヌクレオチドおよびアミノ酸配列、並びに当該技術
分野に公知の方法を用いて、容易に行われるように、単
に当業者に対する便宜として提供される。

【００７９】エンテロコッカス・フェカリス株ＯＧ１Ｘ
は、オクラホマ大学（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ＠ｏｕ
ｈｓｃ．ｅｄｕに連絡されたい）， Ｂｉｏｍｅｄｉｃ
ａｌＲｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ Ｂｕｉｌｄｉｎ
ｇ， Ｒｍ． ３５６，Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
ｏｆ Ｏｋｌａｈｏｍａ， ９７５ ＮＥ １０ｔｈ
Ｓｔｒｅｅｔ， Ｏｋｌａｈｏｍａ Ｃｉｔｙ， Ｏ
Ｋ ７３１０４，ＵＳＡより公的に入手可能である。株
ＯＧ１Ｘは、２００１年４月１２日にＡＴＣＣに寄託さ
れ、そしてＡＴＣＣ寄託番号第ＰＴＡ−３２７２号を与
えられている。枯草菌株ＪＨ６４２は、オハイオ州立大
学のバチルス遺伝子ストックセンター（ＢＧＳＣ）より
公的に入手可能である。ｚｅｉｇｌｅｒ．１＠ｏｓｕ．
ｅｄｕまたはＤｒ． Ｄ．Ｒ． Ｚｅｉｇｌｅｒ， Ｄ
ｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，
Ｔｈｅ Ｏｈｉｏ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔ
ｙ， ４８４ Ｗｅｓｔ Ｔｗｅｌｆｔｈ Ａｖｅｎｕ
ｅ， Ｃｏｌｕｍｂｕｓ， ＯＨ ４３２１０， ＵＳ
Ａに連絡されたい。株ＪＨ６４２もまた、２００１年４
月１２日にＡＴＣＣに寄託され、そしてＡＴＣＣ寄託番
号第ＰＴＡ−３２７１号を与えられている。

【００８０】本発明の核酸は、成熟タンパク質、リーダ
ー配列を加えた成熟タンパク質（プレタンパク質と称し
てもよい）、プレタンパク質のリーダー配列でない、１
つまたはそれ以上のプロ配列を有する成熟タンパク質の
前駆体、またはリーダー配列およびポリペプチドの活性
および成熟型を産生するプロセシング工程中、一般的に
除去される、１つまたはそれ以上のプロ配列を有するプ
ロタンパク質の前駆体であるプレプロタンパク質をコー
ドしていてもよい。本発明の核酸はまた、ｈａｒＡポリ
ペプチドの同定、単離または検出に有用な融合タンパク
質パートナーを加えた成熟タンパク質をコードしていて
もよい。融合タンパク質パートナーは、当該技術分野に
公知である。

【００８１】本発明は、本明細書に記載されるようなｈ
ａｒＡ核酸であって、核酸の発現が、融合パートナーお
よびｈａｒＡポリペプチドを含む融合ポリペプチドを生
じるように、融合パートナーをコードするヌクレオチド
配列をさらに含む、前記核酸に関する。

【００８２】本発明は、ｈａｒＡ遺伝子を含む生物を同
定するための、ｈａｒＡポリペプチドをコードする核酸
の使用に関する。こうした使用は、ｈａｒＡ遺伝子を含
むかまたは発現する生物、特に本明細書に記載されるよ
うなエンテロコッカス属、連鎖球菌属またはヘモフィル
ス属生物による感染を患うまたは該感染を受けやすい個
体または集団を同定し、単離しそして治療するための、
動物、特に哺乳動物、そしてさらに特にヒトの個々の動
物および集団の監視のための方法を提供する。

【００８３】本発明は、薬剤耐性感染性生物を同定する
ための方法であって、該生物から核酸を単離し、そして
中程度または非常にストリンジェントな条件下で、ｈａ
ｒＡ核酸が該生物由来の核酸にハイブリダイズするかど
うか決定することを含む、前記方法に関する。１つの態
様において、感染性生物は、感染した動物から単離され
る。別の態様において、ｈａｒＡ核酸は、少なくとも１
５ヌクレオチド、好ましくは約１５から約５０ヌクレオ
チドを含む。別の態様において、ハイブリダイゼーショ
ンアッセイに用いられるｈａｒＡ核酸は、約５０から約
１５０ヌクレオチドである。その好ましい態様におい
て、核酸は、約９０から約１２０ヌクレオチドである。
本発明は、ｈａｒＡ核酸および関連核酸を同定するのに
必要とされるような、ハイブリダイゼーションアッセ
イ、例えばＦＩＳＨ（蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイ
ゼーション）および増幅アッセイ、例えばＰＣＲ両方に
用いられるプローブを含む。これらは、当該技術分野に
公知である、核酸プローブを用いる多くの方法のわずか
２つの例である。

【００８４】本発明は、中程度にストリンジェントな条
件下で、図１（配列番号１）に示されるヌクレオチド配
列を含む核酸にハイブリダイズする単離核酸を提供す
る。１つの態様において、核酸は、約１５から約４０ヌ
クレオチドを含む。

【００８５】本発明は、中程度にストリンジェントな条
件下で、図３（配列番号３）に示されるヌクレオチド配
列を含む核酸にハイブリダイズする単離核酸を提供す
る。１つの態様において、核酸は、約１５から約５０ヌ
クレオチドを含む。別の好ましい態様において、核酸
は、少なくとも約３０ヌクレオチドを含む。別の好まし
い態様において、核酸は、約５０ヌクレオチド未満を含
む。１つの態様において、上述の核酸は、少なくとも３
０ヌクレオチドを含む。

【００８６】「ストリンジェントな条件」および「スト
リンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、ハイ
ブリダイゼーションが、配列間に少なくとも９５％そし
て好ましくは少なくとも９７％の同一性がある場合にの
み起こるであろうことを意味する。本発明の実施に有用
なハイブリダイゼーション条件の例は、本明細書に以下
に記載される。

【００８７】配列番号１および／または３の配列由来の
オリゴヌクレオチドである、本発明の核酸は、本明細書
に同定される核酸が、全体としてまたは部分的に、感染
した組織の細菌中で転写されているかどうか決定するた
め、本明細書に記載されるような方法および過程で用い
てもよいが、好ましくはＰＣＲのため、用いられる。こ
うした配列はまた、感染の種類および病原体が達成した
感染の段階の診断に有用性を有するであろうことが認識
される。細菌および／または感染組織のｈａｒＡ核酸配
列の検出は、薬剤耐性の診断に有用性を有することがさ
らに認識される。

【００８８】上に論じられるような本発明の核酸は、Ｒ
ＮＡ、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡのためのハイブリダ
イゼーションプローブとして使用し、ｈａｒＡポリペプ
チドをコードする全長ｃＤＮＡおよびゲノムクローンを
単離し、そしてｈａｒＡ遺伝子に高い配列類似性を有す
る他の遺伝子のｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離し
てもよい。こうしたプローブは、一般的に、少なくとも
１５塩基を含むであろう。好ましくは、こうしたプロー
ブは、少なくとも３０塩基を有するであろうし、そして
少なくとも５０塩基を有してもよい。特に好ましいプロ
ーブは、少なくとも３０塩基を有するであろうし、そし
て５０塩基以下を有するであろう。

【００８９】本発明はまた、配列番号１（または配列番
号３）に示されるヌクレオチド配列の完全遺伝子を含む
適切なゲノム、ｃＤＮＡまたは他のライブラリーを、配
列番号１（または配列番号３）に示される前記ポリヌク
レオチド配列またはその断片の配列を有するプローブを
用いて、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条
件下でスクリーニングし；そして前記ＤＮＡ配列を単離
することにより、得ることが可能なポリヌクレオチド配
列から本質的になる核酸も提供する。こうしたポリヌク
レオチドを得るのに有用な断片には、例えば、本明細書
の他の場所に記載されるプローブおよびプライマーが含
まれる。

【００９０】例えば、ｈａｒＡ遺伝子のコード領域を、
配列番号１に提供されるＤＮＡ配列を用いてスクリーニ
ングすることにより単離し、オリゴヌクレオチドプロー
ブを合成してもよい。本発明の遺伝子のものに相補的な
配列を有する標識オリゴヌクレオチドをその後、ｃＤＮ
Ａ、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡのライブラリーをスク
リーニングするのに用い、プローブがライブラリーのど
のメンバーにハイブリダイズするかを決定する。相同性
クローニングまたは発現クローニングに有用なｃＤＮＡ
およびゲノムＤＮＡライブラリーを含む、病原性生物由
来の核酸を含むライブラリーは、当該技術分野に公知の
方法により、容易に調製される。

【００９１】本発明はまた、Ｅ．フェカリス、ｈａｒＡ
耐性Ｅ．フェカリス、Ｅ．フェカリス特異的アミノ酸ま
たはヌクレオチド配列、あるいは抗Ｅ．フェカリス抗体
の検出のためのキットであって、少なくとも本発明のポ
リペプチド、核酸、または抗体を有する容器を含む、前
記キットにも関する。１つの態様において、容器は、図
１（配列番号１）に示されるヌクレオチド配列を含む核
酸に、非常にストリンジェントな条件下でハイブリダイ
ズする核酸を少なくとも含む。その好ましい態様におい
て、核酸は、１５−４０ヌクレオチドを含む。別の態様
において、容器は、図３（配列番号３）に示されるヌク
レオチド配列を含む核酸に、非常にストリンジェントな
条件下でハイブリダイズする核酸を少なくとも含む。そ
の好ましい態様において、核酸は、１５−４０ヌクレオ
チドを含む。

【００９２】用語「オープンリーディングフレーム」ま
たは「ＯＲＦ」は、核酸のコード領域を意味し、すなわ
ち開始および停止コドン、並びに複数の介在する天然に
存在するアミノ酸をコードするヌクレオチド３つ組また
は「コドン」を含む。

【００９３】「宿主細胞」は、外因性ポリヌクレオチド
配列で形質転換またはトランスフェクションされてい
る、あるいは形質転換またはトランスフェクションが可
能である細胞である。

【００９４】以下の例は、例示のみであり、そして本発
明の範囲を制限することを意図しない。

【００９５】

【実施例】出願者らは、抗細菌剤ハイグロマイシンＡお
よび他の構造的に関連しない剤に耐性であるＥ．フェカ
リスおよび枯草菌の株を発見し、そしてその耐性を与え
る「ｈａｒＡ」と称される、先に性質決定されていなか
った内因性遺伝子産物を同定した。ｈａｒＡ核酸および
ポリペプチドの単離および性質決定を以下に記載する。
本明細書に引用されるすべての特許、特許出願、および
刊行物は、完全に本明細書に援用される。

【００９６】ｈａｒＡ核酸の単離 出願者らは、枯草菌株ＪＨ６４２が、非極性ハイグロマ
イシンＡ類似体に天然に耐性であることを観察した。ハ
イグロマイシンＡ類似体は、当該技術分野に公知であ
る；が、耐性スクリーニングに適したハイグロマイシン
の例は、例えば、ＰＣＴ国際出願ＷＯ００／３２６１
６、ＷＯ９９／５７１２５およびＷＯ９９／５７１２７
に見出すことが可能である。潜在的な耐性決定基を同定
する試みの中で、出願者らは、枯草菌ゲノムプラスミド
ライブラリーを用いた異種機能的クローニング戦略を用
い、マルチコピープラスミドに対して増幅した際、感受
性黄色ブドウ球菌株において、ハイグロマイシン耐性表
現型を生じさせるであろう遺伝子を同定した。以下によ
り詳細に記載されるこの選択は、先に性質決定されてい
なかった遺伝子ｅｘｐＺの同定を導き、該遺伝子の産物
は、それぞれバージニアマイシンおよびエリスロマイシ
ンの細胞内集積を妨げる、オルソロガスなブドウ球菌タ
ンパク質、ｖｇａおよびｍｓｒＡに類似性を持つＡＴＰ
結合カセット（ＡＢＣ）タンパク質をコードすると予測
された。ｅｘｐＺの過剰発現は、黄色ブドウ球菌におい
て、いくつかの構造的に関連しない剤への高レベルの耐
性を与えるのに十分である。本明細書に記載される本発
明に関し、限定することを意図しない詳細な方法が、以
下に提供される。

【００９７】プラスミドライブラリーの構築および枯草
菌ｅｘｐＺ遺伝子のクローニング その産物が、ハイグロマイシン類に対するあるレベルの
内因性の耐性を確立する際に重要である可能性がある遺
伝子を同定するため、出願者らは、以下のように、ハイ
グロマイシン類似体への増加したレベルの耐性を持つ黄
色ブドウ球菌形質転換体に関し、大腸菌−黄色ブドウ球
菌シャトルベクターｐＭＰ２０にクローニングされた枯
草菌染色体ＤＮＡ部分の組換えライブラリーをスクリー
ニングした。

【００９８】染色体ＤＮＡを、Ｌブロス中で増殖させた
枯草菌株ＪＨ６４２の１００ ｍｌ培養から抽出し、Ｓ
ａｕ３Ａで部分的に消化し、そして１％アガロースゲル
中での電気泳動により、分画した。２−４ ｋｂまでの
サイズに対応する分画を精製し、そしてＢａｍＨＩで消
化し、そしてアルカリホスファターゼで脱リン酸化して
おいたｐＭＰ２０との連結に用いた。連結されたＤＮＡ
を用い、アンピシリン耐性に関する選択を用い、エレク
トロポレーションにより、大腸菌ＤＨ５αを形質転換し
た。形質転換体コロニーをプールし；プラスミドＤＮＡ
混合物を抽出し、そしてエリスロマイシン（２μｇ／ｍ
ｌ）および２μｇ／ｍｌのＷＯ ００／３２６１６の実
施例６８であり、そして本明細書において「化合物１」
と称される非極性ハイグロマイシンＡ類似体、３−（４
−（（２Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）−５−（３−（２，４−ジク
ロロ−フェノキシ）−１−メチル）−（１Ｅ）−プロペ
ニル）−４−ヒドロキシ−テトラヒドロ−フラン−２−
イルオキシ）−３−ヒドロキシ−フェニル）−２−メチ
ル−Ｎ−（（３ａＳ，４Ｒ，５Ｒ，６Ｓ，７Ｒ，７ａ
Ｒ）−４，６，７−トリヒドロキシ−ヘキサヒドロ−ベ
ンゾ（１，３）ジオキソール−５−イル）−（２Ｅ）−
アクリルアミドを含むプレート上の選択を用い、エレク
トロポレーションにより黄色ブドウ球菌ＲＮ４２２０を
形質転換するのに用いた。

【００９９】ベクターで形質転換された黄色ブドウ球菌
細胞は、化合物１のこのレベルに感受性であった。プラ
スミド分離および戻し交雑実験により、枯草菌染色体由
来のＤＮＡ部分を宿するプラスミドが、黄色ブドウ球菌
において、ハイグロマイシンＡ耐性を与えたことが確認
された。化合物１のＭＩＣは、これらの株において、ｐ
ＭＰ２０形質転換体の０．２μｇ／ｍｌ以下から、組換
えプラスミドで形質転換された細胞の５０μｇ／ｍｌに
増加した。耐性の同様の増加は、ランカシジン、バージ
ニアマイシンおよびＳｙｎｅｒｃｉｄ（登録商標）に関
してもまた観察された。

【０１００】いくつかのクローニングされた挿入物の末
端のＤＮＡ配列解析およびそれに続く枯草菌ゲノム配列
データベース（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｌｉｓｔ．ｐａ
ｓｔｅｕｒ．ｆｒ／ＳｕｂｔｉＬｉｓｔ／）の検索は、
耐性表現型が、各プラスミド上の「ｅｘｐＺ」遺伝子の
存在と関連することを明らかにした。枯草菌遺伝子ｅｘ
ｐＺは、黄色ブドウ球菌Ｖｇａおよび表皮ブドウ球菌Ｍ
ｓｒＡタンパク質を含むＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）
タンパク質ファミリーのメンバーに類似性を持つ、先に
性質決定されていなかったＯＲＦである。ｅｘｐＺ、ｖ
ｇａおよびｍｓｒＡはすべて、膜貫通ドメインを欠くか
または膜貫通パートナーと関連し、そして各々、タンデ
ムに配置された２つのＡＢＣサブユニットからなり、Ａ
ＢＣ−ＡＢＣ共有結合二量体を形成する。類似性は、推
定上のヌクレオチド結合ドメインを含む領域で最高であ
る。しかし、いくつかの酵母ＡＢＣタンパク質との相同
性により、ｅｘｐＺがｍＲＮＡの翻訳に関与する新規リ
ボソームタンパク質をコードする可能性があることが示
唆される。ｅｘｐＺおよび他のタンパク質の間は低レベ
ルの配列類似性しかなく、そしてＡＢＣを含む多様なタ
ンパク質中には低い類似性しかないため、ｅｘｐＺタン
パク質の内因性の活性は、その配列に基づいて決定する
ことが不可能である。しかし、出願者らは、ｈａｒＡ遺
伝子の発現が、ハイグロマイシンＡおよび他の化合物、
例えばバージニアマイシン、ランカシジンおよびＳｙｎ
ｅｒｃｉｄ（登録商標）に耐性を与えることを立証し、
そして該遺伝子のｈａｒＡ特異的破壊が、ハイグロマイ
シンＡに対する感受性を再確立することを示した（以下
を参照されたい）。したがって、出願者らは、該遺伝子
を、「ハイグロマイシンＡ耐性（Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ
Ａ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）」を表す「ｈａｒＡ」と
改名することを提唱する。

【０１０１】突然変異ｈａｒＡ核酸 枯草菌ｈａｒＡ：：ＣＡＴ挿入突然変異体の生成 ｈａｒＡ：：ＣＡＴ挿入突然変異体を発現する枯草菌株
は、統合プラスミドｐＪＰＭ１を用いた単回クロスオー
バー組換えにより、産生された。プラスミドｐＪＰＭ１
は、枯草菌において、クロラムフェニコール耐性を与え
る黄色ブドウ球菌プラスミドｐＣ１９４のｃａｔ遺伝子
を持つｐＳＫ^-誘導体である。プラスミドｐＪＰＭ１
は、枯草菌の複製起点を含まず、そして該宿主で複製す
ることが不可能である。しかし、枯草菌染色体と相同な
領域を提供するいずれかのＤＮＡ断片がこのプラスミド
に挿入されると、該プラスミドは、枯草菌コンピテント
細胞を、高頻度でｃａｔ耐性に形質転換する能力を獲得
する。組込みは、キャンベル型（単回クロスオーバー）
組換え事象を介して起こり、これは、ベクターのどちら
かの端にクローニングされた領域の複製を生じる。組込
み事象の逆転は、プラスミドの正確な切除および染色体
上の遺伝子構造の回復を導く。枯草菌ｈａｒＡ遺伝子の
内部断片を、ＥｃｏＲＶおよびＥｃｏＲＩを用いて切除
し、そしてｐＪＰＭ１生成プラスミドｐＪＰＭ１−ｅｘ
ｐＺ１の適合する部位にサブクローニングした。プラス
ミドｐＪＰＭ１−ｅｘｐＺ１を用い、天然コンピテント
枯草菌株ＪＨ６４２（ハイグロマイシン耐性）を形質転
換し、そして形質転換体を、クロラムフェニコール（５
μｇ／ｍｌ）を用いて選択した。ｈａｒＡ：：ＣＡＴ挿
入突然変異体は、ＰＣＲにより確認し、そして該株を
「ＪＨ６４２ ｅｘｐＺ：：ＣＡＴ」と名づけた。株Ｊ
Ｈ６４２ ｅｘｐＺ：：ＣＡＴは、ハイグロマイシン類
似体、並びにランカシジンおよびバージニアマイシンを
含む他の関連しない抗生物質に高感受性であった。株Ｊ
Ｈ６４２ ｅｘｐＺ：：ＣＡＴは、２０００年９月２６
日にＡＴＣＣに寄託され、そして寄託番号第ＰＴＡ−２
４８０号を与えられた。

【０１０２】エンテロコッカス・フェカリスｈａｒ
Ａ：：ＥＲＭ挿入突然変異体の生成 Ｅ．フェカリスｈａｒＡ遺伝子の内部部分に対応するＰ
ＣＲ産物を生成し、大腸菌およびＥ．フェカリスにおい
て発現するｅｒｍ決定基を持つ大腸菌ベクターｐＶＡ８
９１を用いることにより、ｐＶＡ８９１−ｅｘｐＺを得
た。簡潔には、内部ｈａｒＡプライマー（センス：５’
−ＴＣＴＡＧＡＴＡＴＣＡＣＧＡＴＧＧＡＴＡＣＣ−
３’−配列番号５）；（アンチセンス：５’−ＴＣＴＡ
ＧＡＴＴＧＣＣＧＴＡＣＴＴＡＴＣＡＣＣ−３’−配列
番号６）を、Ｅ．フェカリス・ゲノムテンプレートＤＮ
Ａと共に用い、６５５ ｂｐのＰＣＲ産物を生成した。
ＰＣＲ生成断片を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キッ
トを用いて精製し、そしてＴ−Ａクローニングプラスミ
ドｐＧｅｍ−Ｔ Ｅａｓｙにクローニングした。続いて
ＥｃｏＲＩを用いて断片を切除し、Ｓ ＆ Ｓ Ｅｌｕ
−Ｑｕｉｋキットを用いてゲル精製し、そしてｐＶＡ８
９１のＥｃｏＲＩ部位にクローニングした。連結物を、
エリスロマイシン耐性（２００μｇ／ｍｌ）に関する選
択を用いて、大腸菌ＤＨ５αに形質転換し；ｐＶＡ８９
１−ｅｘｐＺを生じた。プラスミドｐＶＡ８９１−ｅｘ
ｐＺを、エレクトロポレーションにより、Ｅ．フェカリ
スＯＧ１Ｘ（ハイグロマイシン耐性）に導入し、ここで
相同組換えを介して発生した組込み体を、エリスロマイ
シン（２０μｇ／ｍｌ）を用いて選択した。ｈａｒ
Ａ：：ｅｒｍノックアウト株は、ＰＣＲにより確認し、
そして該株を「ＯＧ１Ｘ ｈａｒＡ：：ｅｒｍ」と名づ
けた。株ＯＧ１Ｘ ｈａｒＡ：：ｅｒｍは、非極性ハイ
グロマイシンＡ類似体、ランカシジン、バージニアマイ
シン、およびＳｙｎｅｒｃｉｄ（登録商標）に高感受性
であった。復帰突然変異体（すなわち耐性株）は、エリ
スロマイシンの非存在下で、数世代増殖させることによ
り得て、そしてハイグロマイシンＡへの耐性およびエリ
スロマイシンへの感受性に関しスクリーニングすること
により同定することが可能であった。ＯＧ１Ｘ ｈａｒ
Ａ：：ｅｒｍは、２０００年９月２６日にＡＴＣＣに寄
託され、そして寄託番号第ＰＴＡ−２５５０号を与えら
れた。

【０１０３】大腸菌における組換え産生タンパク質の精
製 有効な組換えタンパク質産生のためには、遺伝子はプロ
モーター配列に連結されていなければならない。細菌系
で使用するためのプロモーターはまた、望ましいポリペ
プチドをコードするＤＮＡに機能可能であるように連結
されたシャイン−ダルガーノ配列を含むであろう。タン
パク質精製の好ましい方法において、遺伝子は、コード
されるタンパク質がいくつかのヒスチジン残基（つまり
「ヒスチジンタグ」）を取り込むように、５’端または
いくつかの他の位で修飾される。このヒスチジンタグ
は、米国特許第４，５６９，７９４号に記載される単一
工程タンパク質精製法である固定化金属イオンアフィニ
ティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）の使用を可能に
する。ＩＭＡＣ法は、未精製細胞抽出物から出発した、
実質的に純粋なタンパク質の単離を可能にする。

【０１０４】大腸菌においてＥ．フェカリスおよび枯草
菌ｈａｒＡタンパク質を発現するベクターの産生 大腸菌においてｈａｒＡタンパク質を発現するのに適し
た発現ベクターを調製した。枯草菌ｈａｒＡコード配列
は、テンプレートとして枯草菌株ＪＨ６４２ゲノムＤＮ
Ａを用い、順方向プライマーＢ−ＥＸＰＺ−ＥＦ２
（５’−ＣＡＴＡＴＧＡＡＡＧＡＧＡＴＣＧＴＡＡＣＡ
ＴＴＡＡＣＡＡＡＣＧ−３’；配列番号７）および逆方
向プライマーＢ−ＥＸＰＺ−ＥＲ２（５’−ＧＧＡＴＣ
ＣＴＴＡＧＴＣＴＴＴＴＴＴＧＴＣＴＴＧＡＴＧＡＴＣ
Ｃ−３’；配列番号８）を用い、ＰＣＲクローニングし
た。Ｅ．フェカリスｈａｒＡコード領域は、プライマー
Ｅ−ＥＸＰＺ−ＥＦ１（５’−ＣＡＴＡＴＧＴＣＧＡＡ
ＡＡＴＴＧＡＡＣ−３’；配列番号９）およびＥ−ＥＸ
ＰＺ−ＥＲ１（５’−ＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＧＡＴＴＴ
ＣＡＡＧＡＣ−３’；配列番号１０）並びにテンプレー
トとしてのＥ．フェカリス株ＯＧ１ＸゲノムＤＮＡを用
いて増幅した。生じたＰＣＲ産物を、製造者に記載され
るように、ｐＧＥＭ−Ｔ ＥＡＳＹ（登録商標）（Ｐｒ
ｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マディソン）にクローニ
ングした。生じたプラスミド挿入物は、ＤＮＡ配列解析
により確認し、そして続いて、以下に記載されるように
タンパク質産生に関し評価した。「ｐＧＥＭ−Ｔ／ｈａ
ｒＡ」と称されるこのプラスミドは、２０００年９月２
６日にＡＴＣＣに寄託され、そしてＡＴＣＣ寄託番号第
ＰＴＡ−２５５２号を与えられた。

【０１０５】正しいＤＮＡ配列を含むコード領域を、酵
素ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩを用いてｐＧＥＭ−Ｔ Ｅ
ＡＳＹ（登録商標）から切除し、そしてｐＥＴ１６ｂ
（Ｎｏｖａｇｅｎ、ウィスコンシン州マディソン）の対
応する部位にクローニングした。プラスミドｐＥＴ１６
ｂは、複製起点（Ｏｒｉ）、形質転換過程後にベクター
を取り込んでいる細胞を選択するのに有用なアンピシリ
ン耐性遺伝子（Ａｍｐ）を含む。発現プラスミドを同定
し、そして大腸菌発現株ＢＬ−２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖ
ａｇｅｎ）に形質転換する。ｐＥＴ１６ｂ−ｈａｒＡ発
現構築物は、ｈａｒＡコード領域に機能可能であるよう
に連結されたバクテリオファージＴ７プロモーターおよ
びＴ７ターミネーター配列を含む。各構築物から発現さ
れるｈａｒＡタンパク質は、コードされるタンパク質産
物の精製を単純にするため、６−１０のヒスチジン残基
を含むよう、アミノ末端で修飾される。コードされるタ
ンパク質のアミノ末端にヒスチジン残基を配置すると、
ＩＭＡＣ一工程タンパク質精製が可能になる。

【０１０６】Ｅ．フェカリスｈａｒＡおよび枯草菌ｈａ
ｒＡ遺伝子にコードされるタンパク質の組換え発現およ
び精製 本明細書に開示されるような枯草菌またはＥ．フェカリ
ス・ゲノム由来のｈａｒＡを持ち、ｈａｒＡが発現プロ
モーターおよびバクテリオファージＴ７ ｇ１０リボソ
ーム結合部位に機能可能であるように連結されている発
現ベクターで、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｈｓｄＳ
ｇａｌ λｃｌｔｓ８５７ ｉｎｄλＳａｍ７ｎｉｎ５
ｌａｃＵＶ５−Ｔ７ ｇｅｎｅ １）を、標準的な方
法を用い、形質転換した。アンピシリンへの耐性に関し
選択した形質転換体を、無作為に選択し、そして迅速プ
ラスミド調製またはプラスミド特異的ＰＣＲ解析を用
い、アガロースゲル電気泳動により、ベクターの存在に
関し、試験した。発現プラスミドを含むコロニーをＬブ
ロス中で増殖させ、そして本質的に米国特許第４，５６
９，７９４号に記載されるように、プラスミドが持つＯ
ＲＦをＩＭＡＣにより精製した。

【０１０７】ｈａｒＡタンパク質を以下のように発現さ
せそして精製した。ｈａｒＡ発現プラスミドを含む新鮮
に形質転換されたＢＬ−２１（ＤＥ３）細胞を、１００
μｇ／ｍｌ アンピシリンを含むＬプレート上で、室温
で一晩増殖させた。翌朝、５ｍｌのＬブロスを各プレー
トに添加し、プレートを擦り落とし、そして生じた細胞
懸濁物を用いて、およそ０．１のＯＤ６００まで、１０
０μｇ／ｍｌ アンピシリンを含む１００ ｍｌのＬブ
ロスに接種した。培養を、激しく震蘯しながら３７℃
で、〜０．６のＯＤ６００まで増殖させた。この時点
で、培養を３０℃に移し、そしてさらに３時間、１．０
ｍＭ ＩＰＴＧで異種タンパク質産生を誘導した。５
０００ ｘ ｇ、１５分間の遠心分離により細胞を採取
し、そして精製まで−７０℃で凍結させた。細胞を迅速
に３７℃で融解し、そして１０ ｍｌの溶解緩衝液（２
５ ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ ８．０）、２５０
ｍＭＮａＣｌ、１０％ グリセロール、５ ｍＭ イミ
ダゾール）に再懸濁した。リゾチーム（Ｓｉｇｍａ、１
００μｇ／ｍｌ）および完全ＥＤＴＡ不含プロテアーゼ
阻害剤（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ、１Ｘまで）を添加し、
そして懸濁物を氷上で１時間インキュベーションした。
細胞は、１６，０００ ｐｓｉでフレンチプレッシャー
セルにおける破壊により溶解した。溶解物を遠心分離に
より収集し、そして０．４５μＭフィルターを通過させ
ることにより、上清を清澄にした。溶解緩衝液で平衡化
した２ミリリットルの５０％ Ｎｉ²⁺アガローススラリ
ー（Ｑｉａｇｅｎ；ウィスコンシン州マディソン）を抽
出物に添加し、そして穏やかに震蘯しながら、４℃で一
晩インキュベーションした。翌朝、抽出物／ビーズ混合
物を、１０ ｍｌ（０．８ ｘ ４．０ ｃｍ）Ｂｉｏ
−Ｒａｄ使い捨てカラムに充填した。未結合タンパク質
および他の成分は、カラムを洗浄緩衝液（２５ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ ８．０）、２５０ ｍＭ ＮａＣ
ｌ、１０％ グリセロール、４０ ｍＭ イミダゾー
ル）で洗浄することにより除去した。ｈａｒＡタンパク
質は、３カラム体積の溶出緩衝液（２５ ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−Ｃｌ（ｐＨ ８．０）、２５０ ｍＭ ＮａＣｌ、
１０％ グリセロール、２５０ ｍＭ イミダゾール）
で溶出させ、保存緩衝液（２５ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ（ｐＨ ８．０）、２５０ ｍＭ ＮａＣｌ、１０％
グリセロール）に対して長時間透析し、そして−７０
℃に保存した。

【０１０８】抗生物質感受性試験 耐性の定量的評価は、濃度が２倍の増分で異なる抗生物
質を含む、陽イオン補充Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ
ブロスを用いたブロス微量希釈法により、行った。増殖
を完全に阻害する抗生物質の最低濃度を、ＭＩＣまたは
最低阻害濃度と称した。

【０１０９】好ましくは、微量希釈アッセイは、本明細
書に援用されるＮＣＣＬＳ（米国臨床実験室基準委員会
（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｆｏｒ Ｃ
ｌｉｎｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔａｎｄａ
ｒｄｓ））指針Ｍ３１−Ａ，Ｖｏｌ．１９， Ｎｏ．１
１， “Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｓｔａｎｄａｒｄｓ
ｆｏｒ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｄｉｓｋ ａ
ｎｄ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔ
ｙ ｔｅｓｔｓ ｆｏｒ ｂａｃｔｅｒｉａｉｓｏｌａ
ｔｅｄ ｆｒｏｍ ａｎｉｍａｌｓ，” １９９９年６
月（ＩＳＢＮ １−５６２３８−３７７−９）にしたが
った陽イオン調整Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎブロス
を用いて行う。

【０１１０】ハイグロマイシンＡ類似体および他の化合
物への耐性を与える際のｅｘｐＺの役割を確かめるた
め、出願者らは、抗生物質耐性パターンに対する枯草菌
およびＥ．フェカリスｅｘｐＺ発現および破壊の影響を
調べた。表１に示されるように、ｅｘｐＺ破壊は、ｅｘ
ｐＺ⁺またはｈａｒＡ⁺（すなわち非修飾、耐性）枯草菌
およびＥ．フェカリス株のものと比較し、ハイグロマイ
シンＡ高感受性表現型を与えた。やはり表１に示される
のは、枯草菌ｈａｒＡを含むｐＭＰプラスミドでの形質
転換による、通常は薬剤感受性の黄色ブドウ球菌ＲＮ４
２２０株への「ｈａｒＡ」表現型の授与である。

【０１１１】「感受性」から「耐性」へのＭＩＣの期待
される変化は、試験された抗細菌剤中で、かなり異なる
ことに注目することが重要である。例えば、ｈａｒＡで
形質転換されそしてｈａｒＡを発現する同じ株に比較し
た「感受性」黄色ブドウ球菌株に対する試験された剤の
ＭＩＣの増加は、ハイグロマイシンＡに関する約８倍か
ら、Ｓｙｎｅｒｃｉｄに関する約１５倍、化合物1に関
する約５００倍の相違まで多様である。これらの変化は
すべて、特定の抗細菌剤への生物の特定の株を用いたス
クリーニング法において、有意とみなされるべきであ
る。同様に、天然耐性枯草菌およびＥ．フェカリス株に
対する剤の試験は、ｈａｒＡ遺伝子が破壊されている場
合、ＭＩＣの減少は、４倍以上（化合物２対Ｅ．フェカ
リスＯＧ１Ｘ）から約１６倍（ハイグロマイシンＡ対枯
草菌ＪＨ６４２）、１００倍以上（ランカシジン対Ｅ．
フェカリスＯＧ１Ｘ、化合物１および２対枯草菌ＪＨ６
４２）まで多様であったことを示す。再び、これらの相
違はすべて、特定の抗細菌剤への生物の特定の株を用い
たスクリーニング法において、有意とみなされるべきで
ある。特に、微量希釈法において、この方法に典型的な
実験的不明確さのため、少なくとも４倍の相違が観察さ
れるべきである。化合物２、５−デオキシ−５［４−
［（２，６−ジデオキシ−β−Ｄ−エリスロ−ヘキソフ
ラノス−５−ウロス−１−イル）オキシ］−３−ヒドロ
キシフェニル］−２−メチル−１−オキソ−２−（Ｅ）
−プロペニル］アミノ］−１，２−Ｏ−メチレン−Ｄ−
ネオ−イノシトール、（Ｅ）−Ｏ−［（３−クロロフェ
ニル）メチル］オキシムは、ＰＣＴ国際出願ＷＯ９９／
５７１２７（１７ページ、２８−３０行）に記載される
ハイグロマイシンＡ類似体である。化合物３、５−デオ
キシ−５−［［３−［４−［（６−デオキシ−β−Ｄ−
アラビノ−ヘキソフラノス−５−ウロス−１−イル）オ
キシ］３−ヒドロキシフェニル］−２−メチル−１−オ
キソ−２−（Ｅ）−プロペニル］アミノ］−１，２−Ｏ
−メチレン−Ｄ−ネオ−イノシトール、（Ｅ）−Ｏ−
［（３−クロロフェニル）メチル］オキシムは、ＰＣＴ
国際出願ＷＯ ９９／５７１２５、６５ページ、実施例
９２に記載されるハイグロマイシンＡ類似体である。

【０１１２】したがって、表１に示されるような一団の
抗細菌剤の適切な選択により、多様な生物をスクリーニ
ングし、薬剤耐性を診断し、そしてその機構がｈａｒＡ
仲介であるかどうか決定することが可能である。一団の
抗細菌剤および生物は、臨床的実施において、より広範
であることが期待され、そして本明細書に示される方法
の拡大は、当業者の一般的な専門的技術の範囲内である
と理解されるべきである。これらの結果は、ｅｘｐＺ遺
伝子がハイグロマイシンＡ類似体、並びにランカシジ
ン、バージニアマイシンおよびＳｙｎｅｒｃｉｄ（登録
商標）を含む他の構造的に関連しない抗生物質に対する
枯草菌およびＥ．フェカリスの内因性の耐性に責任があ
ることを確認した。したがって、本明細書において「ｈ
ａｒＡ」と記載されるｅｘｐＺ遺伝子は、細菌病原体に
対する、ハイグロマイシンＡ関連抗生物質、および本明
細書に示されるような他の剤の活性を評価するための、
内因性の遺伝子型として、有用な標的を代表する。

【０１１３】表１．野生型および同質遺伝子ｈａｒＡ破
壊突然変異体のＭＩＣ

【０１１４】

【表１】 ^aブロス微量希釈法による^b すべての株は、２つ組で評価した 本発明の単離ポリヌクレオチド分子は、Ｅ．フェカリス
のいかなる株由来のヌクレオチド配列を有してもよい
が、好ましくは株ＯＧ１Ｘ由来である。本発明の実施に
おいて使用するためのＥ．フェカリスの病原性株は、以
下に記載されるような単離技術を用い、感染動物の器
官、組織または体液から単離してもよい。

【０１１５】本明細書に開示されるポリヌクレオチド分
子およびオリゴヌクレオチド分子の産生および操作は、
当該技術分野の技術の範囲内であり、そしてとりわけ、
Ｍａｎｉａｔｉｓら， １９８９， Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａ
ｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク州
コールドスプリングハーバー； Ａｕｓｕｂｅｌら，
１９８９， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉ
ｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅ
ｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ
＆ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， ニュー
ヨーク； Ｓａｍｂｒｏｏｋら， １９８９， Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， 第２版， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅ
ｓｓ， ニューヨーク州コールドスプリングハーバー；
Ｉｎｎｉｓら（監修）， １９９５， ＰＣＲ Ｓｔ
ｒａｔｅｇｉｅｓ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，
Ｉｎｃ．， サンディエゴ；およびＥｒｌｉｃｈ（監
修）， １９９２， ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｇｙ，
Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，
ニューヨークおよびこれらの参考文献のすべての改訂に
記載される組換え技術にしたがい、行うことが可能であ
る。本発明を実施するのに有用なＰＣＲ技術の別の有用
な記載は、Ｊ． Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら， “Ｄｅｔｅ
ｃｔｉｏｎ Ｏｆ Ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ−Ｒｅｓ
ｉｓｔａｎｔ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ Ｂｙ ＰＣ
Ｒ，” Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓａ
ｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ， ４０（１１），
２５６２−２５６６（１９９６）に記載される。該アッ
セイは、好ましくはマイクロタイタープレートで行われ
る。

【０１１６】配列番号１に示されるヌクレオチド配列お
よびその実質的な部分への本明細書における言及は、例
えばＥ．フェカリス株ＯＧ１Ｘ由来のＥ．フェカリスｈ
ａｒＡ遺伝子および５’上流プロモーター領域を含むプ
ラスミド「ｐＧＥＭ−Ｔ／ｈａｒＡ」に存在するよう
な、それぞれ、対応するヌクレオチド配列およびその実
質的な部分へも言及することが意図される。プラスミド
ｐＧＥＭ−Ｔ／ｈａｒＡは、２０００年９月２６日にＡ
ＴＣＣに寄託され、そして寄託番号第ＰＴＡ−２５５２
号を与えられた。

【０１１７】さらに、配列番号１および配列番号３に示
されるヌクレオチド配列およびその実質的な部分への本
明細書における言及は、例えば枯草菌株ＪＨ６４２由来
の枯草菌ｈａｒＡ遺伝子および５’上流プロモーター領
域を含むプラスミド「ｐＭＰ−ｂａｃ Ａ１−１」に存
在するような、それぞれ、対応するヌクレオチド配列お
よびその実質的な部分へも言及することが意図される。
プラスミドｐＭＰ−ｂａｃ Ａ１−１は、２０００年９
月２６日にＡＴＣＣに寄託され、そして寄託番号第ＰＴ
Ａ−２５５１号を与えられた。

【０１１８】ハイブリダイゼーションアッセイ 核酸プローブハイブリダイゼーションアッセイは、当該
技術分野に公知であり；本明細書に記載される条件は例
示目的のみのためである。「中程度にストリンジェント
な条件」下でのハイブリダイゼーションは、本明細書に
おいて、例えば６５℃での０．５ Ｍ ＮａＨＰＯ₄、
７％ ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１ ｍＭ
ＥＤＴＡ中でのフィルター結合ＤＮＡへのハイブリダイ
ゼーション、および４２℃での０．２ｘＳＳＣ／０．１
％ ＳＤＳ中での洗浄を意味する（Ａｕｓｕｂｅｌら
（上記）， １９８９， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏ
ｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ， Ｖｏｌ．１， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉ
ｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ， Ｉｎｃ．， ａｎｄＪ
ｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， ｉｎｃ．， ニ
ューヨーク， ｐ．２．１０．３）。「非常にストリン
ジェントな条件」下でのハイブリダイゼーションは、本
明細書において、例えば、約２３ヌクレオチドを含む核
酸に関し、約６０℃での、約２０ヌクレオチドを含む核
酸に関し、約５５℃での、そして約１７ヌクレオチドを
含む核酸に関し、約４８℃での、０．５ Ｍ ＮａＨＰ
Ｏ₄、７％ ＳＤＳ、１ ｍＭ ＥＤＴＡ中でのフィル
ター結合ＤＮＡへのハイブリダイゼーションと共に、６
８℃での０．１ｘＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳ中での洗浄
を意味する（Ａｕｓｕｂｅｌら， １９８９， 上
記）。本発明のより長いオリゴヌクレオチド分子に関す
る他のハイブリダイゼーション条件は、標準的技術を用
い、当業者により決定することが可能である。

【０１１９】適切に設計されたプライマーを用い、脳組
織、肺組織、腸組織、胎盤組織、血液、脳脊髄液、糞
便、粘液、尿、羊水などを含む、動物組織または体液の
試料中のｈａｒＡ特異的核酸の存在を検出することが可
能である。特定の増幅産物の産生は、ｈａｒＡ仲介耐性
の診断を支持することが可能であり、一方、増幅産物の
欠如は、ｈａｒＡ仲介耐性の欠如を示すことが可能であ
る。増幅を行うための方法、例えばポリメラーゼ連鎖反
応（ＰＣＲ）は、当該技術分野に公知である。当該技術
分野に知られる他の増幅技術、例えばリガーゼ連鎖反応
を代わりに用いてもよい。また、本明細書に開示される
核酸の配列を用い、Ｅ．フェカリスの他の種または株あ
るいは他の細菌細胞から相同遺伝子を単離する際に用い
るためのプライマーを設計してもよい。

【０１２０】組換え発現系 本発明の組換えベクター、特に発現ベクターは、好まし
くは、本発明のポリヌクレオチド分子のコード配列が、
ポリペプチドを産生するため、該コード配列の転写およ
び翻訳に必要な１つまたはそれ以上の制御要素と機能的
な関連にあるように、構築される。本明細書において、
用語「制御要素」は、限定されるわけではないが、誘導
性および非誘導性プロモーター、エンハンサー、オペレ
ーター、リボソーム結合部位、およびポリヌクレオチド
コード配列の発現をドライブするおよび／または制御す
るよう働くことが当該技術分野に知られる他の要素をコ
ードするヌクレオチド配列を含む。また、本明細書にお
いて、ヌクレオチド配列、好ましくはコード配列または
オープンリーディングフレームは、１つまたはそれ以上
の制御要素と「機能可能に関連する」「機能可能に連結
される」または「機能可能な連結にある」かまたは「機
能的関連」または「機能可能関連」にあり、制御要素が
コード配列の転写またはそのｍＲＮＡの翻訳、あるいは
その両方を効果的に制御し、そして可能にする。

【０１２１】適切な要素と機能的関連にある特定のコー
ド配列を含む組換えベクターを構築するための方法は、
当該技術分野に公知であり、そしてこれらを用いて本発
明を実施することが可能である。これらの方法には、ｉ
ｎ ｖｉｔｒｏ組換え技術、合成技術、およびｉｎ ｖ
ｉｖｏ遺伝子組換えが含まれる。例えば、Ｍａｎｉａｔ
ｉｓら， １９８９， 上記； Ａｕｓｕｂｅｌら，
１９８９， 上記；Ｓａｍｂｒｏｏｋら， １９８９，
上記； Ｉｎｎｉｓら， １９９５， 上記；および
Ｅｒｌｉｃｈ， １９９２， 上記に記載される技術を
参照されたい。

【０１２２】本発明のｈａｒＡコード配列を発現するの
に利用することが可能な多様な発現ベクターが当該技術
分野に知られ、特定のコード配列を含む組換えバクテリ
オファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、およびコスミド
ＤＮＡ発現ベクターが含まれる。本発明のポリヌクレオ
チド分子を含むよう操作することが可能な典型的な原核
発現ベクタープラスミドには、とりわけ、ｐＵＣ８、ｐ
ＵＣ９、ｐＢＲ３２２およびｐＢＲ３２９（Ｂｉｏｒａ
ｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カリフォルニア州リッ
チモンド）、ｐＰＬおよびｐＫＫ２２３（Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）、ｐＱＥ
５０（Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州チャツワー
ス）、およびｐＧＥＭ−Ｔ ＥＡＳＹ（Ｐｒｏｍｅｇ
ａ、ウィスコンシン州マディソン）が含まれる。本発明
の核酸分子を含むよう操作することが可能な典型的な真
核発現ベクターには、とりわけ、エクジソン誘導性哺乳
動物発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州
カールスバッド）、サイトメガロウイルス−プロモータ
ー−エンハンサーに基づく系（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィス
コンシン州マディソン； Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリ
フォルニア州ラホヤ； Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およ
びバキュロウイルスに基づく発現系（Ｐｒｏｍｅｇａ）
が含まれる。他の真核ベクターには、ｐｃＤＮＡ−３、
ｐｃＥＸＶ、および融合タンパク質ベクター、例えばｐ
ＧＥＸ、ｐＭａｌおよびｐＴｒｘＦｕｓが含まれる。用
いてもよい酵母ベクターには、例えばＹＥｐ１３、Ｙｉ
ｐ５およびＹＡＣベクター、例えばｐＹＡＣ３が含まれ
る。

【０１２３】これらのベクターおよび他のベクターの制
御要素は、その強度および特性において多様であっても
よい。利用する宿主／ベクター系に応じ、いかなる数の
適切な転写および翻訳要素を用いてもよい。例えば、哺
乳動物細胞系にクローニングする場合、哺乳動物細胞の
ゲノムから単離したプロモーター、例えばマウスメタロ
チオネインプロモーター、またはこれらの細胞で増殖す
るウイルスから単離したプロモーター、例えばワクシニ
アウイルス７．５Ｋプロモーターまたはモロニーネズミ
肉腫ウイルス末端反復配列、を用いてもよい。組換えＤ
ＮＡまたは合成技術により得たプロモーターもまた、挿
入配列の転写を提供するのに用いてもよい。さらに、特
定のプロモーターからの発現は、特定の誘導因子、例え
ばメタロチオネインプロモーターのための亜鉛およびカ
ドミウムイオンの存在下で上昇する可能性がある。転写
制御領域またはプロモーターの制限されない例には、と
りわけ、細菌に関し、β−ｇａｌプロモーター、Ｔ７プ
ロモーター、ＴＡＣプロモーター、λ左および右プロモ
ーター、ｔｒｐおよびｌａｃプロモーター、ｔｒｐ−ｌ
ａｃ融合プロモーターなど；酵母に関し、解糖酵素プロ
モーター、例えばＡＤＨ−ＩおよびＩＩプロモーター、
ＧＰＫプロモーター、ＰＧＩプロモーター、ＴＲＰプロ
モーターなど；そして哺乳動物細胞に関し、ＳＶ４０初
期および後期プロモーター、アデノウイルス主要後期プ
ロモーターが含まれる。本発明は、大腸菌または他の適
切な宿主における本発明のいずれかのコード配列を発現
するのに用いることが可能な、プラスミドｐＧＥＭ−Ｔ
／ｈａｒＡに含まれる、Ｅ．フェカリスｈａｒＡ遺伝子
プロモーターのヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチ
ド分子をさらに提供する。

【０１２４】特定の開始シグナルもまた、挿入されたコ
ード配列の効率的な翻訳に必要とされる。これらのシグ
ナルは、典型的にはＡＴＰ開始コドンおよび隣接配列を
含む。それ自体の開始コドンおよび隣接配列を含む、本
発明のポリヌクレオチド分子が適切な発現ベクターに挿
入される場合、さらなる翻訳調節シグナルは必要とされ
ない可能性がある。しかし、コード配列部分のみが挿入
された場合、ＡＴＧ開始コドンを含む外因性翻訳調節シ
グナルが必要とされる可能性がある。これらの外因性翻
訳調節シグナルおよび開始コドンは、天然および合成の
多様な供給源から得ることが可能である。さらに、開始
コドンは、全挿入物のインフレーム翻訳を確実にするた
め、コード領域の読み枠と一致していなければならな
い。

【０１２５】ポリペプチドまたは本発明のポリペプチド
を含む融合ポリペプチドを発現するであろう発現ベクタ
ーもまた構築してもよい。こうした融合ポリペプチド
は、例えばＥ．フェカリスｈａｒＡポリペプチドに対す
る抗血清を作成するため、Ｅ．フェカリスｈａｒＡポリ
ペプチドの生化学的特性を研究するため、異なる免疫学
的または機能的特性を示すＥ．フェカリスｈａｒＡポリ
ペプチドを設計するため、あるいは組換え発現Ｅ．フェ
カリスｈａｒＡポリペプチドの同定もしくは精製を補助
するため、または該ポリペプチドの安定性を改善するた
め、用いてもよい。ありうる融合ポリペプチド発現ベク
ターには、限定されるわけではないが、β−ガラクトシ
ダーゼおよびｔｒｐＥ融合体、マルトース結合ポリペプ
チド融合体（ｐＭａｌシリーズ； Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａ
ｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、グルタチオン−Ｓ−トランス
フェラーゼ融合体（ｐＧＥＸシリーズ； Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ）、ポリヒスチジン融合体（ｐＥＴシリーズ；
Ｎｏｖａｇｅｎ， Ｉｎｃ．、ウィスコンシン州マディ
ソン）、およびチオレドキシン融合体（ｐＴｒｘＦｕ
ｓ； Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カール
スバッド）およびＦＬＡＧエピトープ融合パートナー
（以下を参照されたい）をコードする配列を取り込むベ
クターが含まれる。これらの融合ポリペプチドおよび他
の融合ポリペプチドをコードする発現ベクターを構築す
るための方法が、当該技術分野に公知である。

【０１２６】融合ポリペプチドは、発現されたポリペプ
チドの精製を補助するのに有用である可能性がある。限
定されない態様において、例えば、ｈａｒＡ−マルトー
ス結合融合ポリペプチドは、アミロース樹脂を用いて精
製することが可能であり；ＨｔａＡ−グルタチオン−Ｓ
−トランスフェラーゼ融合ポリペプチドは、グルタチオ
ン−アガロースビーズを用いて精製することが可能であ
り；そしてｈａｒＡ−ポリヒスチジン融合ポリペプチド
は、二価ニッケル樹脂を用いて精製することが可能であ
る。あるいは、キャリアーポリペプチドまたはペプチド
に対する抗体を、融合ポリペプチドのアフィニティーク
ロマトグラフィー精製のため用いてもよい。例えば、モ
ノクローナル抗体の標的エピトープをコードするヌクレ
オチド配列を、制御要素と機能的な関連で発現ベクター
内に設計し、そして発現されるエピトープが本発明の
Ｅ．フェカリスポリペプチドに融合されているように配
置してもよい。限定されない態様において、親水性マー
カーペプチドであるＦＬＡＧ ^TMエピトープタグ（Ｉｎｔ
ｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ
ｓ Ｉｎｃ．）をコードするヌクレオチド配列を、標準
的な技術により、ｈａｒＡポリペプチドのアミノまたは
カルボキシル末端に対応する点で、発現ベクターに挿入
してもよい。その後、発現されたｈａｒＡポリペプチド
−ＦＬＡＧ^TMエピトープ融合産物を、商業的に入手可能
な抗ＦＬＡＧ^TM抗体を用いて検出し、そしてアフィニテ
ィー精製してもよい。

【０１２７】発現ベクターはまた、発現されたＥ．フェ
カリスポリペプチドが特定のプロテアーゼでの処理によ
り、キャリアー領域または融合パートナーから放出され
ることが可能であるように、特定のプロテアーゼ切断部
位をコードするポリリンカー配列を含むよう、設計して
もよい。例えば、融合ポリペプチドベクターは、とりわ
け、トロンビンまたは因子Ｘａ切断部位をコードするヌ
クレオチド配列を含んでもよい。

【０１２８】Ｅ．フェカリスコード配列から上流でそし
て該配列と同じ読み枠のシグナル配列を、既知の方法に
より、発現ベクター中に設計し、発現されるポリペプチ
ドの輸送および分泌を指示してもよい。シグナル配列の
限定されない例には、とりわけ、α−因子、免疫グロブ
リン、外膜ポリペプチド、ペニシリナーゼ、およびＴ細
胞受容体由来のものが含まれる。

【０１２９】本発明の組換えベクターで形質転換される
かまたはトランスフェクションされた宿主細胞の選択を
補助するため、レポーター遺伝子産物または他の選択可
能マーカーのコード配列を含むよう、ベクターを操作し
てもよい。こうしたコード配列は、好ましくは、上述の
ように、制御要素と機能的関連にある。本発明を実施す
るのに有用なレポーター遺伝子は、当該技術分野に公知
であり、そしてとりわけ、クロラムフェニコールアセチ
ルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、緑色蛍光ポリペプチ
ド、蛍（ｆｉｒｅｆｌｙ）ルシフェラーゼ、およびヒト
成長ホルモンをコードするものが含まれる。選択可能マ
ーカーをコードするヌクレオチド配列は、当該技術分野
に公知であり、そして抗生物質または代謝拮抗剤への耐
性を与える遺伝子産物をコードするもの、あるいは栄養
要求必要条件を供給するものが含まれる。こうした配列
の例には、とりわけ、チミジンキナーゼ活性、あるいは
メトトレキセート、アンピシリン、カナマイシン、クロ
ラムフェニコール、ゼオシン、ピリメタミン、アミノ配
糖体類、またはハイグロマイシンへの耐性をコードする
ものが含まれる。

【０１３０】本発明は、本発明のポリヌクレオチド分子
または組換えベクターを含む形質転換宿主細胞、および
それに由来する細胞株をさらに提供する。本発明を実施
するのに有用な宿主細胞は、真核であってもまたは原核
細胞であってもよい。こうした形質転換宿主細胞には、
限定されるわけではないが、とりわけ、微生物、例えば
組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡま
たはコスミドＤＮＡベクターで形質転換された細菌、あ
るいは組換えベクターで形質転換された酵母、あるいは
動物細胞、例えば組換えウイルスベクター、例えばバキ
ュロウイルスに感染した昆虫細胞、または組換えウイル
スベクター、例えばアデノウイルスもしくはワクシニア
ウイルスに感染した哺乳動物細胞が含まれる。例えば、
ＡＴＣＣ、米国メリーランド州ロックビル（寄託番号第
３１３４３号）より、またはＧＩＢＣＯ ＢＲＬ、メリ
ーランド州ガイザーズバーグより入手可能なＤＨ５αな
どの大腸菌株を用いてもよい。適切な宿主の別の例は、
黄色ブドウ球菌である。真核宿主細胞には、酵母細胞が
含まれるが、哺乳動物細胞、例えばとりわけ、マウス、
ハムスター、ウシ、サル、またはヒト細胞株由来のもの
もまた、有効に利用することが可能である。本発明の組
換えポリペプチドを発現するのに用いることが可能な真
核宿主細胞の例には、チャイニーズハムスター卵巣（Ｃ
ＨＯ）細胞（例えばＡＴＣＣ寄託番号第ＣＣＬ−６１
号）、ＮＩＨスイスマウス胚細胞ＮＩＨ／３Ｔ３（例え
ばＡＴＣＣ寄託番号第ＣＲＬ−１６５８号）、およびＭ
ａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙウシ腎臓（ＭＤＢＫ）細胞（ＡＴ
ＣＣ寄託番号第ＣＣＬ−２２号）と共にＳｆ−９細胞が
含まれる。トランスフェクション細胞は、染色体組込み
により、またはエピソームで、本発明の核酸を発現する
可能性がある。

【０１３１】本発明の組換えベクターは、好ましくは、
実質的に均質な細胞培養の１つまたはそれ以上の宿主細
胞に形質転換またはトランスフェクションされる。ベク
ターは、一般的に、既知の技術にしたがい、例えば、と
りわけ、プロトプラスト形質転換、リン酸カルシウム沈
殿、塩化カルシウム処理、マイクロインジェクション、
エレクトロポレーション、組換えウイルスとの接触によ
るトランスフェクション、リポソーム仲介トランスフェ
クション、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクショ
ン、形質導入、コンジュゲート化、または微粒子銃によ
り、宿主細胞に導入される。形質転換体の選択は、標準
法により、例えば組換え発現ベクターに関連する選択可
能マーカーを発現する細胞に関する選択、例えば抗生物
質耐性により、行うことが可能である。

【０１３２】発現ベクターが宿主細胞に導入されたら、
宿主細胞ゲノムまたはエピソームいずれかにおける本発
明のポリヌクレオチド分子の組込みおよび維持は、標準
的技術により、例えばサザンハイブリダイゼーション解
析、制限酵素解析、逆転写酵素ＰＣＲ（ｒｔ−ＰＣＲ）
を含むＰＣＲ解析により、または期待されるポリペプチ
ド産物を検出する免疫学的アッセイにより、確認するこ
とが可能である。本発明のポリヌクレオチド分子を含む
および／または発現する宿主細胞は、当該技術分野に知
られるように：（ｉ）ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮ
Ａ、またはＲＮＡ−アンチセンスＲＮＡハイブリダイゼ
ーション；（ｉｉ）「マーカー」遺伝子機能の存在の検
出；（ｉｉｉ）宿主細胞における特定のｍＲＮＡ転写物
の発現により測定されるような、転写レベルの評価；ま
たは（ｉｖ）例えばイムノアッセイによる成熟ポリペプ
チド産物の存在の検出を含む、当該技術分野に公知の少
なくとも４つの一般的なアプローチのいずれにより同定
してもよい。

【０１３３】組換えポリペプチドの発現および精製 本発明の核酸が、適切な宿主細胞に安定して導入された
ら、形質転換宿主細胞をクローン的に増殖させ、そして
生じた細胞を、コードされるポリペプチドの最大産生を
行うことが可能な条件下で増殖させる。こうした条件に
は、典型的には、形質転換細胞を高密度に増殖させるこ
とが含まれる。発現ベクターが誘導性プロモーターを含
む場合、適切な誘導条件、例えば温度シフト、栄養素の
枯渇、無償性の（ｇｒａｔｕｉｔｏｕｓ）誘導因子（例
えば炭水化物類似体、例えばイソプロピル−β−Ｄ−チ
オガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ））の添加、過剰な代
謝副産物の集積、またはそれらの匹敵するものを、必要
に応じて使用し、発現を誘導する。

【０１３４】ポリペプチドが宿主細胞の内部に保持され
る場合、細胞を採取し、そして溶解し、そして４℃、ま
たはプロテアーゼ阻害剤の存在下、あるいは両方など
の、ポリペプチド分解を最小にすることが当該技術分野
に知られる抽出条件下で、溶解物から産物を実質的に精
製するかまたは単離する。ポリペプチドが宿主細胞から
分泌される場合、枯渇栄養培地を単に収集し、そしてポ
リペプチドをそこから実質的に精製するかまたは単離す
る。

【０１３５】ポリペプチドは、必要に応じ、限定される
わけではないが、１つまたはそれ以上の以下の方法：硫
酸アンモニウム沈殿、サイズ分画、イオン交換クロマト
グラフィー、ＨＰＬＣ、密度遠心分離、およびアフィニ
ティークロマトグラフィーを含む標準的な方法を用い、
細胞溶解物または培地から実質的に精製するかまたは単
離する。ポリペプチドが生物学的活性を欠く場合、大き
さ、またはポリペプチド特異的抗体との反応性に基づ
き、あるいは融合タグの存在により、検出することが可
能である。本発明の実施に用いるため、ポリペプチド
は、培養液体中に分泌されるような、または細胞溶解物
中に存在するような、未精製状態であってもよいが、好
ましくは、そこから実質的に精製されるかまたは単離さ
れる。本発明の１つの態様において、ポリペプチドは、
その天然対応物が、Ｅ．フェカリス細胞溶解物の調製中
に通常見られるより、少なくとも約１０００ｘ高い濃度
で調製中に存在する。

【０１３６】ポリペプチド 本発明は、上述のポリペプチドのいずれかを調製する方
法であって、特定のポリペプチドをコードする、１つま
たはそれ以上の制御要素と機能的関連にあるヌクレオチ
ド配列を含むポリヌクレオチド分子を含む組換え発現ベ
クターで形質転換された宿主細胞を、該ポリペプチドの
発現を行うことが可能な条件下で培養し、そして細胞培
養から発現されたポリペプチドを回収することを含む、
前記方法を提供する。

【０１３７】十分な純度の本発明のポリペプチドが得ら
れたら、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、サイズ排除クロマトグラフ
ィー、アミノ酸配列解析、免疫学的活性、生物学的活性
などを含む、標準的な方法により、性質決定してもよ
い。ポリペプチドはさらに、親水性解析（例えばＨｏｐ
ｐおよびＷｏｏｄｓ， １９８１， Ｐｒｏｃ． Ｎａ
ｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７８：３８２
４）、または類似のソフトウェアアルゴリズムを用いて
性質決定し、疎水性および親水性領域を同定してもよ
い。構造解析を行い、特定の二次構造を仮定するポリペ
プチドの領域を同定してもよい。生物物理学的方法、例
えばＸ線結晶学（Ｅｎｇｓｔｒｏｍ， １９７４， Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ． Ｅｘｐ． Ｂｉｏｌ． １１：７−１
３）、コンピューターモデリング（Ｆｌｅｔｔｅｒｉｃ
ｋおよびＺｏｌｌｅｒ（監修）， １９８６： Ｃｕｒ
ｒｅｎｔ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ中， Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， ニ
ューヨーク州コールドスプリングハーバー）、および核
磁気共鳴（ＮＭＲ）を用い、ポリペプチドおよび他の推
定上の相互作用ポリペプチド／受容体／分子間の相互作
用の潜在的な部位をマッピングし、そして研究してもよ
い。これらの研究から得られた情報を用い、欠失突然変
異体およびワクチン組成物を設計し、そして該ポリペプ
チドの生物学的機能をｉｎ ｖｉｖｏで特異的に遮断す
ることが可能な療法的または薬理学的化合物を設計する
かまたは選択してもよい。

【０１３８】本発明のポリペプチドは、動物由来の血液
または血清試料におけるＥ．フェカリス特異的抗体に関
しスクリーニングするための、例えばＥＬＩＳＡアッセ
イなどの標準的技術を用いた診断試薬として；または動
物由来の細胞、組織または体液試料におけるＥ．フェカ
リス特異的ポリペプチドに関しスクリーニングするため
の、例えばウェスタンブロットアッセイなどの標準的技
術を用いた、以下に記載されるような、診断試薬に有用
なポリクローナルまたはモノクローナル抗体を作成する
ための抗原としてを含む、多様な目的に有用である。

【０１３９】本発明のポリペプチドは、例えばエンテロ
コッカス感染と共にブドウ球菌および肺炎球菌感染の治
療において、ｈａｒＡ活性の調節因子を同定する化合物
のスクリーニングに、特に有用である。

【０１４０】ポリペプチドへの化合物の結合を決定する
ための方法は、当該技術分野に公知であり、そして直接
結合を測定するアッセイ、または競合的結合アッセイが
含まれる。こうした結合アッセイは、化合物の検出を容
易にするように、標識された化合物を利用し、例えば³
Ｈ、¹⁴Ｃ、³²Ｐを用いた化合物の放射標識により、ある
いはポリペプチドに結合した化合物の化学的変換によ
り、あるいはＥＬＩＳＡまたは化合物もしくはポリペプ
チドいずれかの固定を伴う他の方法を用いてもよい。

【０１４１】ポリペプチドの類似体および誘導体 限定されるわけではないが、以下のいずれか：例えばカ
ルバジド酸エステルまたは三次中心を産生するためのポ
リペプチドの１つまたはそれ以上のＬ−アミノ酸の対応
するＤ−アミノ酸、アミノ酸類似体、またはアミノ酸模
倣体での置換；または特定の化学的修飾、例えばトリプ
シン、キモトリプシン、パパインまたはＶ８プロテアー
ゼでのタンパク質分解切断、あるいはＮａＢＨ₄または
臭化シアンでの処理、あるいはアセチル化、ホルミル
化、酸化または還元などを含む、ポリペプチドの１つま
たはそれ以上の化学的修飾を、既知の技術を用いて行
い、類似体を調製してもよい。あるいは、またはさら
に、本発明のポリペプチドを、遺伝子組換え技術によ
り、修飾してもよい。

【０１４２】本発明のポリペプチドは、限定されるわけ
ではないが、アセチル基、硫黄架橋基、グリコシル基、
脂質、およびリン酸を含む、１つまたはそれ以上の化学
基のコンジュゲート化により、および／または本発明の
第二のポリペプチド、または別のポリペプチド、例えば
とりわけ、血清アルブミン、テンガイ（ｋｅｙｈｏｌｅ
ｌｉｍｐｅｔ）ヘモシアニン、または商業的に活性化
されたＢＳＡ、またはポリアミノ酸（例えばポリリジ
ン）、または多糖（例えばセファロース、アガロース、
または修飾もしくは未修飾セルロース）へのコンジュゲ
ート化により、誘導体化してもよい。こうしたコンジュ
ゲート化は、好ましくは、ポリペプチドのアミノ酸側鎖
および／またはＮ末端またはＣ末端での共有結合によ
る。こうしたコンジュゲート化反応を行うための方法
は、ポリペプチド化学反応の分野に公知である。

【０１４３】請求される発明を実施するのに有用な誘導
体にはまた、水可溶性ポリマー、例えばポリエチレング
リコールが本発明のポリペプチド、あるいはその類似体
または誘導体にコンジュゲート化され、それにより少な
くとも部分的に該ポリペプチドの免疫原性を保持しなが
ら、さらなる望ましい特性を提供するものも含まれる。
これらのさらなる望ましい特性には、例えば、水性溶液
中の増加した可溶性、保存中の増加した安定性、タンパ
ク質分解脱水への増加した耐性、および増加したｉｎ
ｖｉｖｏ半減期が含まれる。本発明のポリペプチドへの
コンジュゲート化に適した水可溶性ポリマーには、限定
されるわけではないが、ポリエチレングリコールホモポ
リマー、ポリプロピレングリコールホモポリマー、エチ
レングリコールとプロピレングリコールのコポリマーで
あって、１つの端で、アルキル基、ポリオキシエチル化
ポリオール類、ポリビニルアルコール、多糖類、ポリビ
ニルエチルエーテル類、およびα，β−ポリ［２−ヒド
ロキシエチル］−ＤＬ−アスパルトアミドで置換されて
いないかまたは置換されている前記ホモポリマーおよび
コポリマーが含まれる。ポリエチレングリコールが特に
好ましい。ポリペプチドの水可溶性ポリマーコンジュゲ
ートを作成するための方法は、当該技術分野に公知であ
り、そしてとりわけ、本明細書に援用される米国特許
３，７８８，９４８；米国特許３，９６０，８３０；米
国特許４，００２，５３１；米国特許４，０５５，６３
５；米国特許４，１７９，３３７；米国特許４，２６
１，９７３；米国特許４，４１２，９８９；米国特許
４，４１４，１４７；米国特許４，４１５，６６５；米
国特許４，６０９，５４６；米国特許４，７３２，８６
３；米国特許４，７４５，１８０；欧州特許（ＥＰ）１
５２，８４７； ＥＰ ９８，１１０；および日本特許
５，７９２，４３５に記載される。

【０１４４】抗体 本発明は、本発明のポリペプチドに対して向けられる単
離抗体をさらに提供する。好ましい態様において、抗体
は、既知の方法を用い、Ｅ．フェカリスまたは枯草菌由
来のｈａｒＡポリペプチドに対して作成してもよい。ブ
タ、ウシ、ウマ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ラットまたは
マウスより選択される多様な宿主動物を、部分的にまた
は実質的に精製されたまたは単離されたＥ．フェカリス
ポリペプチドで、または上述されるようなその相同体、
融合ポリペプチド、実質的な部分、類似体または誘導体
で免疫感作してもよい。以下に記載されるようなアジュ
バントを用い、抗体産生を亢進してもよい。

【０１４５】ポリクローナル抗体を、免疫感作動物の血
清から得て、そして単離し、そして標準的技術を用い、
抗原に対する特異性に関し、試験してもよい。あるい
は、培養中の連続する細胞株による抗体分子の産生を提
供するいかなる技術を用い、モノクローナル抗体を調製
し、そして単離してもよい。これらには、限定されるわ
けではないが、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ
（Ｎａｔｕｒｅ， １９７５， ２５６：４９５−４９
７）に元来記載されたハイブリドーマ技術；ヒトＢ細胞
ハイブリドーマ技術（Ｋｏｓｂｏｒら， １９８３，
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４：７２； Ｃｏ
ｔｅら， １９８３， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃ
ａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８０：２０２６−２０３
０）；およびＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら，
１９８５， ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉ
ｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ａｌ
ａｎＲ． Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．， ｐｐ．７７−９
６）が含まれる。あるいは、一本鎖抗体（例えば米国特
許４，９４６，７７８を参照されたい）を適応させ、ｈ
ａｒＡ抗原特異的一本鎖抗体を産生してもよい。これら
の刊行物は本明細書に援用される。

【０１４６】ヒト化抗体の産生は、現在、当該技術分野
に公知である。ヒト化抗体を産生することが可能な１つ
の方式は、例えばＪｏｎｅｓ， Ｐ．ら， Ｎａｔｕｒ
ｅ３２１：５２−５２５（１９８６）またはＴｅｍｐｅ
ｓｔら， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：２６６
−２７３（１９９１）に記載されるような、ヒトモノク
ローナル抗体への抗体の相補性決定領域の転移による。
ヒト化抗体はまた、例えばＪ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍ
ｅｔｈ． ２３１：１１−２３（１９９９）に記載され
るように、抗原に反応し、ヒト重鎖および軽鎖を発現す
るよう操作されたトランスジェニックマウスにより、作
成してもよい。

【０１４７】本発明のポリペプチドの特異的結合部位を
含む抗体断片もまた、本発明に含まれ、そして既知の技
術により、生成することが可能である。こうした断片に
は、限定されるわけではないが、損なわれていない抗体
分子のペプシン消化により生成することが可能なＦ（ａ
ｂ’）₂断片、およびＦ（ａｂ’）₂断片のジスルフィド
架橋を還元することにより生成することが可能なＦａｂ
断片が含まれる。あるいは、Ｆａｂ発現ライブラリーを
構築し（Ｈｕｓｅら， １９８９， Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４６：１２７５−１２８１）、Ｅ．フェカリスポリペ
プチドに望ましい特異性を有するＦａｂ断片の迅速な同
定を可能にしてもよい。

【０１４８】モノクローナル抗体および抗体断片の産生
および単離のための技術は、当該技術分野に公知であ
り、そしてとりわけ、本明細書に援用されるＨａｒｌｏ
ｗおよびＬａｎｅ， １９８８， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅ
ｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙに、そしてＪ．Ｗ． Ｇｏｄｉｎｇ， １９８
６， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：
Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，
Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， ロンドンにさらに
記載される。

【０１４９】Ｅ．フェカリス遺伝子の標的化突然変異 本発明の核酸の開示に基づき、ｈａｒＡ遺伝子を無力に
するかまたは別の方式で突然変異させるのに用いるため
の遺伝子構築物を調製してもよい（この遺伝子は、本明
細書において、以後、「ｈａｒＡ遺伝子」と称され
る）。ｈａｒＡ遺伝子は、適切に設計された遺伝子構築
物を用いて、突然変異させることが可能である。例え
ば、ｈａｒＡ遺伝子を：（ａ）ｈａｒＡ遺伝子のコード
配列または制御配列のすべてまたは一部を欠失させる；
または（ｂ）ｈａｒＡ遺伝子のコード配列または制御配
列のすべてまたは一部を異なるヌクレオチド配列で置き
換える；または（ｃ）ｈａｒＡ遺伝子のコード配列また
は制御配列に、ｈａｒＡ由来のまたは異種供給源由来の
ヌクレオチド配列を含んでもよい１つまたはそれ以上の
ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド分子、またはポリヌ
クレオチド分子を挿入する；または（ｄ）（ａ）、
（ｂ）および（ｃ）のある組み合わせを行うよう機能す
る、本発明の遺伝子構築物を用いて突然変異させてもよ
い。あるいは、構築物を使用し、ｈａｒＡ遺伝子の発現
またはそのコードされるポリペプチドの安定性を改変し
てもよい。

【０１５０】ｈａｒＡ遺伝子が突然変異されている細胞
は、例えば、無力な遺伝子を持つ細胞をワクチン組成
物、特に修飾生ワクチン中で用い、動物において、防御
反応を誘導するまたは防御反応の誘導に貢献することが
可能である場合、本発明を実施するのに有用である。本
発明はまた、細胞が恒常的突然変異体である場合、ポリ
ペプチドおよび本発明のポリペプチドを発現する細胞も
含む。

【０１５１】限定されない態様において、本発明の遺伝
子構築物を用い、野生型遺伝子のコード配列あるいはそ
のプロモーターまたは他の制御領域、あるいはそれらの
部分を、異なるヌクレオチド配列、例えば突然変異コー
ド配列または突然変異制御領域、またはそれらの部分で
置き換えることにより、野生型ｈａｒＡ遺伝子を突然変
異させる。こうした遺伝子構築物で用いるための突然変
異ｈａｒＡ遺伝子配列は、エラー傾向ＰＣＲの使用によ
る、またはカセット突然変異誘発によるものを含む、多
様な既知の方法のいずれにより、産生してもよい。例え
ば、オリゴヌクレオチド指示突然変異誘発を使用し、明
示される方式で、野生型ｈａｒＡ遺伝子のコード配列ま
たはプロモーター配列を改変し、例えば、配列内の特定
の点にフレームシフトまたは終結コドンを導入してもよ
い。あるいはまたはさらに、本発明の遺伝子構築物で用
いるための突然変異ヌクレオチド配列は、１つまたはそ
れ以上のヌクレオチド、オリゴヌクレオチド分子または
ポリヌクレオチド分子のコード配列またはプロモーター
配列の挿入または欠失により、あるいはコード配列また
はプロモーター配列の部分の、１つまたはそれ以上の異
なるヌクレオチド、オリゴヌクレオチド分子またはポリ
ヌクレオチド分子での置換により、調製してもよい。こ
うしたオリゴヌクレオチド分子またはポリヌクレオチド
分子は、いかなる天然存在供給源から得てもよいし、ま
たは合成であってもよい。挿入または欠失配列は、単に
ｈａｒＡ遺伝子の読み枠を破壊するよう働いてもよい
し、または選択可能マーカーなどの異種遺伝子産物をさ
らにコードしてもよい。

【０１５２】あるいはまたはさらに、ランダム突然変異
誘発を用い、本発明の遺伝子構築物で用いるための突然
変異ｈａｒＡ遺伝子配列を産生してもよい。ランダム突
然変異誘発は、いかなる適切な技術により、例えばｈａ
ｒＡ遺伝子を持つ細胞を、紫外線照射またはｘ線に、あ
るいは化学的突然変異誘発剤、例えばＮ−メチル−Ｎ’
−ニトロソグアニジン、スルホン酸エチルメタン、亜硝
酸またはナイトロジェンマスタードに曝露し、そしてそ
の後、特定の遺伝子に突然変異を持つ細胞に関し選択す
ることにより、行ってもよい。例えば突然変異誘発技術
の概説には、Ａｕｓｕｂｅｌ， １９８９， 上記を参
照されたい。

【０１５３】本発明を実施するのに有用な修飾ｈａｒＡ
ポリペプチドを産生する突然変異は、ＯＲＦ、またはプ
ロモーターもしくは他の制御領域、あるいは遺伝子もし
くはＯＲＦを天然に含む、または遺伝子の発現もしくは
そのコードされるポリペプチドの安定性を改変するいか
なる他の配列も含む、ｈａｒＡ遺伝子のどこで起こって
もよい。

【０１５４】あるいは、本発明の遺伝子構築物は、ｉｎ
ｓｉｔｕでｈａｒＡ遺伝子またはＯＲＦに天然に隣接
し、該遺伝子自体のコード領域由来のヌクレオチド配列
を一部しかまたはまったく含まないヌクレオチド配列を
含んでもよい。こうした遺伝子構築物は、例えば全ｈａ
ｒＡ遺伝子またはＯＲＦを欠失させるのに有用であるだ
ろう。

【０１５５】相同組換えを通じた標的化遺伝子突然変異
のため、遺伝子構築物は、好ましくは、上述のような突
然変異ヌクレオチド配列を含む、環状または直線化いず
れかのプラスミドである。限定されない態様において、
突然変異配列の少なくとも約２００ヌクレオチドを用
い、本発明の遺伝子構築物を、相同組換えのため、ｈａ
ｒＡ遺伝子に特異的に向けるが、より短い長さのヌクレ
オチドもまた、有効である可能性がある。さらに、プラ
スミドは、好ましくは、ｈａｒＡ遺伝子に機能的に関連
するよう挿入され、天然ｈａｒＡ遺伝子の制御要素配列
が破壊されるであろうように構築された、レポーター遺
伝子産物または他の選択可能マーカーをコードするさら
なるヌクレオチド配列を含む。本発明を実施するのに用
いてもよいレポーター遺伝子は、当該技術分野に公知で
あり、そしてとりわけ、ＣＡＴ、緑色蛍光ポリペプチ
ド、およびβ−ガラクトシダーゼをコードするものが含
まれる。選択可能マーカーをコードするヌクレオチド配
列は、当該技術分野に公知であり、そして抗生物質また
は代謝拮抗剤への耐性を与える遺伝子産物をコードする
もの、あるいは栄養要求必要条件を供給するものが含ま
れる。こうした配列の例には、ピリメタミン耐性、また
はネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（アミノ配糖
体への耐性を与える）をコードするものが含まれる。

【０１５６】本発明の遺伝子構築物を生成するのに用い
てもよい方法は、当該技術分野に公知であり、そしてと
りわけ、Ｍａｎｉａｔｉｓら， １９８９， 上記；
Ａｕｓｕｂｅｌら， １９８９， 上記； Ｓａｍｂｒ
ｏｏｋら， １９８９， 上記； Ｉｎｎｉｓら， １
９９５， 上記；およびＥｒｌｉｃｈ， １９９２，上
記に記載されるような、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換え技術、
合成技術、およびｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子組換えが含まれ
る。

【０１５７】細胞は、既知の技術にしたがい、例えばエ
レクトロポレーションにより、本発明の遺伝子構築物で
形質転換またはトランスフェクションしてもよい。形質
転換体の選択は、標準的技術を用い、例えば構築物に関
連し、選択可能マーカーを発現する細胞に関する選択に
より、行うことが可能である。組換え事象が成功して起
こり、そして特定の標的遺伝子が改変された形質転換体
の同定は、遺伝子解析により、例えばサザンブロット解
析により、または特定のポリペプチドをコードするｍＲ
ＮＡ転写物の欠失を検出するため、ノーザン解析によ
り、あるいは、例えば免疫学的解析により、減少した病
原性のような新規表現型の出現により、ＰＣＲアッセイ
により、またはそれらのある組み合わせにより決定され
るような、特定のポリペプチドを欠く細胞を検出するこ
とにより、行うことが可能である。

【０１５８】さらなる限定されない態様において、本発
明の遺伝子構築物は、Ｅ．フェカリス由来、または動物
を感染させる、異なる病原体由来の異なる遺伝子または
コード領域であって、本発明の修飾生存細胞でのワクチ
ン接種に際し、動物における別個の防御免疫反応を誘導
するまたは該反応の誘導に貢献する抗原をコードする前
記遺伝子またはコード領域をさらに含んでもよい。この
さらなる遺伝子またはコード領域は、修飾生存細胞から
のコードされる抗原の分泌を導き、それによりワクチン
接種された動物の免疫系に抗原が提示されることを可能
にするシグナル配列を含むよう、さらに操作してもよ
い。

【０１５９】本発明はしたがって、ｈａｒＡ遺伝子が突
然変異されている修飾生存Ｅ．フェカリス細胞を提供す
る。さらに、本発明は、ｈａｒＡを発現する修飾生存細
胞を調製する方法であって：（ａ）本発明の遺伝子構築
物で細胞を形質転換し；（ｂ）該遺伝子構築物によりｈ
ａｒＡ遺伝子が突然変異されている形質転換細胞を選択
し；そして（ｃ）感受性動物を防御するワクチンにおい
て用いることが可能な細胞を、工程（ｂ）の細胞の中か
ら選択することを含む、前記方法を提供する。本発明は
また、こうした修飾細胞から調製された、死んだ細胞組
成物も含む。

【０１６０】本発明はまた、ｈａｒＡ特異的アミノ酸ま
たはヌクレオチド配列、あるいは抗ｈａｒＡ抗体の存在
を検出するためのキットにも関する。該キットはまた、
例えばポリペプチド、ポリヌクレオチド、または抗体に
付着した、あるいはポリペプチド、ポリヌクレオチド、
または抗体に結合する部分に付着した酵素、蛍光物質、
または放射能標識を含む、本発明のポリペプチド、ポリ
ヌクレオチド、または抗体を検出するための手段も含ん
でもよい。

【０１６１】例えばｈａｒＡ遺伝子を含むかまたは発現
する生物における、ハイブリダイゼーションのため、ま
たは同等に標的配列のＰＣＲ増幅のためのプローブを含
む本発明の核酸は、好ましくは、１５−５０ヌクレオチ
ドの断片を含む単離ＤＮＡを含む。こうしたｈａｒＡ特
異的核酸は、当該技術分野に公知であり、そして例示的
方式で以下に記載されるようなハイブリダイゼーション
アッセイを用いて、検出することが可能である。

【０１６２】例示のためであって限定ではなく、高スト
リンジェンシー条件は、例えば：６ｘ ＳＳＣ、５０
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）、１ ｍＭ
ＥＤＴＡ、０．０２％ ＰＶＰ、０．０２％ Ｆｉｃｏ
ｌｌ、０．０２％ ＢＳＡ、および５００μｇ／ｍｌ
変性サケ精子ＤＮＡで構成される緩衝液中の６５℃で８
時間から一晩行われる、ＤＮＡを含むフィルターのプレ
ハイブリダイゼーション、その後、ここでは１００μｇ
／ｍｌ 変性サケ精子ＤＮＡおよび５−２０ｘ １０⁶
ｃｐｍの³²Ｐ標識プローブを含むプレハイブリダイゼ
ーション混合物中の６５℃で４８時間のハイブリダイゼ
ーション、その後、２ ｘ ＳＳＣ、０．０１％ ＰＶ
Ｐ、０．０１％ Ｆｉｃｏｌｌ、および０．０１％ Ｂ
ＳＡを含む溶液中での３７℃で１時間の洗浄を含む。こ
れに続き、オートラジオグラフィー前に０．１ ｘ Ｓ
ＳＣ中での５０℃で４５分間の洗浄がある。

【０１６３】核酸の性質（例えば長さ、ＧＣ含量など）
およびハイブリダイゼーションの目的（検出、増幅な
ど）の性質に応じ、用いてもよい高ストリンジェンシー
の他の条件は、当該技術分野に公知である。例えば、ポ
リメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）における相補的配列への
およそ１５−４０塩基のオリゴヌクレオチドのストリン
ジェントなハイブリダイゼーションは、以下の条件下で
行われる：５０ ｍＭＫＣｌの塩濃度、１０ ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌの緩衝剤濃度、１．５ ｍＭのＭｇ²⁺濃
度、７−７．５のｐＨおよび５５−６０℃のアニーリン
グ温度。ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は公知
であり、そしてＳａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍ
ａｎｕａｌ， 第２版， ニューヨーク州コールドスプ
リングハーバー（１９８９）、特に第１１章に例示され
る。

【０１６４】別の特定の態様において、ｈａｒＡ核酸、
またはその相補体に中程度のストリンジェンシーの条件
下でハイブリダイズ可能な核酸が提供される。こうした
ストリンジェンシーに適した条件の選択は、当該技術分
野に公知である（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら， １９８
９， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， ＡＬａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， 第２版， Ｃｏｌ
ｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク州コールドスプリングハ
ーバーを参照されたい；また、Ａｕｓｕｂｅｌら監修，
実験室技術マニュアルのＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏ
ｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ
シリーズ中， （版権）１９８７−１９９７， Ｃｕｒ
ｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， （版権）１９９４−
１９９７ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，
Ｉｎｃ．も参照されたい）。中程度のストリンジェン
シーのハイブリダイゼーションには、膜をさらに、４０
ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐＨ ７．２、１％ ＳＤ
Ｓ、１ ｍＭ ＥＤＴＡ中の５５℃で各３０分間の４回
の洗浄に供する。

【０１６５】例示のためであって限定ではなく、９０ヌ
クレオチドを越えるハイブリダイゼーション領域のため
の低ストリンジェンシー条件を用いた方法は、以下のと
おりである（ＳｈｉｌｏおよびＷｅｉｎｂｅｒｇ， １
９８１， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃ
ｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ７８， ６７８９−６７９２もま
た参照されたい）。ＤＮＡを含むフィルターを、３５％
ホルムアミド、５ｘ ＳＳＣ、５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）、５ ｍＭ ＥＤＴＡ、０．
１％ ＰＶＰ、０．１％ Ｆｉｃｏｌｌ、１％ ＢＳ
Ａ、および５００μｇ／ｍｌ 変性サケ精子ＤＮＡを含
む溶液中で、４０℃で６時間前処理する。ハイブリダイ
ゼーションは、以下の修飾を含む同一溶液中で行う：
０．０２％ＰＶＰ、０．０２％ Ｆｉｃｏｌｌ、０．２
％ ＢＳＡ、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ、１０％
（重量／体積）デキストラン硫酸、および５−２０ ｘ
１０⁶ ｃｐｍ ³²Ｐ標識プローブを用いる。フィルタ
ーをハイブリダイゼーション混合物中で、４０℃で１８
−２０時間インキュベーションし、そしてその後、２
ｘ ＳＳＣ、２５ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
７．４）、５ ｍＭ ＥＤＴＡ、および０．１％ ＳＤ
Ｓを含む溶液中で、５５℃で１．５時間洗浄する。洗浄
溶液を新鮮な溶液に置き換え、そして６０℃でさらに
１．５時間インキュベーションする。フィルターをふき
取って乾燥し、そしてオートラジオグラフィーのため曝
露する。必要であれば、フィルターを６５−６８℃で三
度目に洗浄し、そしてフィルムに再曝露する。用いても
よい低ストリンジェンシーの他の条件は、当該技術分野
に公知である（例えば種間ハイブリダイゼーションに使
用されるようなもの）。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、ｈａｒＡをコードするオープンリー
ディングフレームを含むＥ．フェカリスのヌクレオチド
配列（配列番号１）を示す。開始（ＡＴＧ）および停止
（ＴＡＡ）コドンを下線で示し、そして推定上のＡＢＣ
ドメインもまた、下線で示す。

【図２】 図２は、図１に示されるｈａｒＡ核酸にコー
ドされるｈａｒＡポリペプチドのアミノ酸配列（配列番
号２）を示す。一重下線（例えばＧｌｙＡｒｇ）または
二重下線（例えばＡｓｐＧｌｕ）の配列は、それぞれ
「ＷａｌｋｅｒＡボックス」および「Ｗａｌｋｅｒ Ｂ
ボックス」ＡＢＣタンパク質モチーフを表す。Ｗａｌｋ
ｅｒ Ｊ．Ｅ．ら， ＥＭＢＯ Ｊ． １：９４５−９
５１（１９８２）を参照されたい。点線の配列（例えば
ＬｅｕＳｅｒ）はＡＢＣ「サインモチーフ」を表し、そ
して破線の配列（例えばＶａｌＳｅｒ）はＡＢＣ「下流
モチーフ」を表す。Ｑｕｅｎｔｉｎら， Ｊ． Ｍｏ
ｌ． Ｂｉｏｌ． ２８７：４６７−４８４（１９９
９）を参照されたい。

【図３】 図３は、ｅｘｐＺ（ｈａｒＡ）をコードする
オープンリーディングフレームを含む枯草菌のヌクレオ
チド配列（配列番号３）を示す。開始（ＡＴＧ）および
停止（ＴＡＡ）コドンを下線で示す。

【図４】 図４は、図３に示されるｅｘｐＺ（ｈａｒ
Ａ）核酸にコードされるｈａｒＡポリペプチドのアミノ
酸配列（配列番号４）を示す。ＷａｌｋｅｒＡ、Ｗａｌ
ｋｅｒ Ｂ、重要および下流モチーフは、図２における
のと同じ方式で示される。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 14/32 Ｃ１２Ｎ 1/21 ４Ｈ０４５ Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/10 Ｃ１２Ｑ 1/10 1/34 1/34 1/68 Ａ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/50 Ｚ 33/50 33/53 Ｄ 33/53 Ｍ 33/566 33/566 33/569 Ｂ 33/569 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者 エリック・トッド・バイマ アメリカ合衆国コネチカット州06340，グ ロトン，イースタン・ポイント・ロード, ファイザー・グローバル・リサーチ・アン ド・ディベロプメント Ｆターム(参考） 2G045 AA28 AA40 BA11 BB50 DA12 DA13 DA36 FB02 4B024 AA01 BA11 CA02 DA06 GA14 4B063 QA01 QA13 QA18 QQ06 QQ08 QQ30 QQ43 QR10 QR32 QR41 QR55 QR75 QR77 QS34 QX01 4B065 AA01X AA19X AB01 AC10 BD36 CA24 CA44 4C085 AA03 AA38 BA08 BB11 CC07 DD22 DD23 DD62 EE01 EE06 FF24 GG01 GG08 4H045 AA10 BA10 CA11 DA89 EA29 FA74

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 化合物がｈａｒＡポリペプチドに結合
   するかどうか決定するための、化合物のスクリーニング
   法であって：ｈａｒＡポリペプチドと化合物を、結合に
   適した条件下で接触させ；そして化合物がｈａｒＡポリ
   ペプチドに結合するかどうか決定することを含み、ｈａ
   ｒＡポリペプチドが（ａ）図２（配列番号２）に示され
   るアミノ酸配列または（ｂ）図４（配列番号４）に示さ
   れるアミノ酸配列に少なくとも７５％同一であるアミノ
   酸配列を含む、前記方法。
2. 【請求項２】 化合物がｈａｒＡ活性を阻害するかど
   うか決定するための、化合物のスクリーニング法であっ
   て：ｈａｒＡポリペプチドの活性を、（ｉ）化合物の非
   存在下および（ｉｉ）存在下で、ｈａｒＡ活性を測定す
   るのに適した条件下で測定することを含み；化合物の非
   存在下のｈａｒＡ活性に比較した化合物の存在下のｈａ
   ｒＡ活性の減少は、化合物がｈａｒＡ活性を阻害するこ
   とを確認し、ｈａｒＡポリペプチドが（ａ）図２（配列
   番号２）に示されるアミノ酸配列または（ｂ）図４（配
   列番号４）に示されるアミノ酸配列に少なくとも７５％
   同一であるアミノ酸配列を含む、前記方法。
3. 【請求項３】 測定されるｈａｒＡ活性が、ＮＴＰア
   ーゼ活性である、請求項２の方法。
4. 【請求項４】 抗細菌剤がｈａｒＡ仲介薬剤耐性を示
   す生物を治療するのに有効であるかどうか決定するため
   の、Ｅ．フェカリスまたは枯草菌のハイグロマイシンＡ
   耐性株の使用。
5. 【請求項５】 ｈａｒＡ遺伝子を含む生物を同定する
   ための、ｈａｒＡポリペプチドをコードする核酸の使用
   であって、該核酸が： （ａ）（ｉ）図１（配列番号１）に示されるヌクレオチ
   ド配列または（ｉｉ）図３（配列番号３）に示されるヌ
   クレオチド配列に少なくとも７５％同一であるヌクレオ
   チド配列； （ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレ
   オチド配列；および （ｃ）（ａ）または（ｂ）のヌクレオチド配列に縮重し
   ているヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌク
   レオチド配列を含む、前記使用。
6. 【請求項６】 ｈａｒＡポリペプチドをコードする核
   酸を含む組換えベクターであって、該核酸が： （ａ）（ｉ）図１（配列番号１）に示されるヌクレオチ
   ド配列または（ｉｉ）図３（配列番号３）に示されるヌ
   クレオチド配列に少なくとも７５％同一であるヌクレオ
   チド配列； （ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレ
   オチド配列；および （ｃ）（ａ）または（ｂ）のヌクレオチド配列に縮重し
   ているヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌク
   レオチド配列を含む、前記ベクター。
7. 【請求項７】 ｐＭＰ、ｐＪＰＭ１、ｐＧＥＭ−Ｔ、
   ｐＶＡ８９１、ｐＳＫ^-、ｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＢＲ
   ３２２、ｐＢＲ３２９、ｐＰＬ、ｐＫＫ２２３およびｐ
   ＱＥ５０より選択される、請求項６のベクター。
8. 【請求項８】 ｐＭＰ−ｂａｃ−Ａ１−１（ＡＴＣＣ
   寄託番号第ＰＴＡ−２５５１号）またはｐＧＥＭ−Ｔ／
   ｈａｒＡ（ＡＴＣＣ寄託番号第ＰＴＡ−２５５２号）で
   ある、請求項７のベクター。
9. 【請求項９】 ｈａｒＡポリペプチドをコードする核
   酸を含む組換えベクターであって、ｈａｒＡポリペプチ
   ドをコードする該核酸がクロラムフェニコール耐性挿入
   物またはエリスロマイシン耐性挿入物を含むヌクレオチ
   ド配列を含む、前記ベクター。
10. 【請求項１０】 請求項６−９のいずれか１つのベク
    ターを含む細胞。
11. 【請求項１１】 枯草菌株ＪＨ６４２ ｅｘｐＺ：：
    ＣＡＴ（ＡＴＣＣ寄託番号第ＰＴＡ−２４８０号）また
    はエンテロコッカス・フェカリス株ＯＧ１Ｘｈａｒ
    Ａ：：ＥＲＭ（ＡＴＣＣ寄託番号第ＰＴＡ−２５５０
    号）である、請求項１０の細胞。
12. 【請求項１２】 （ｉ）図２（配列番号２）に示され
    るアミノ酸配列または（ｉｉ）図４（配列番号４）に示
    されるアミノ酸配列に少なくとも７５％同一であるアミ
    ノ酸配列を含む、組換えｈａｒＡポリペプチド。
13. 【請求項１３】 請求項１２のｈａｒＡポリペプチド
    および薬学的に許容しうるキャリアーを含む、免疫学的
    組成物。
14. 【請求項１４】 さらにアジュバントを含む、請求項
    １３の免疫学的組成物。