KR101595234B1 - 면역원성 폴리펩타이드 및 단일클론 항체 - Google Patents

면역원성 폴리펩타이드 및 단일클론 항체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 스트렙토코쿠스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae)에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 더욱 구체적으로, 당해 조성물 및 방법은 PhtD 단편 및 이의 변이체를 포함하는 면역원성 폴리펩타이드, 및 당해 폴리펩타이드를 암호화하거나 발현하는 핵산, 벡터 및 감염 세포에 관한 것이다. 면역원성 폴리펩타이드의 제조 방법 및 사용 방법도 또한 개시된다.

Description

면역원성 폴리펩타이드 및 단일클론 항체{Immunogenic polypeptides and monoclonal antibodies}
관련 출원
본원은 2007년 7월 23일자로 출원된 미국 임시출원 제60/961,723호에 대한 우선권을 주장하며, 당해 임시출원은 그 전문이 본원에 참조로서 인용된다.
기술 분야
본 발명은 면역학에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는 세균에 대한 면역 반응을 유도하는 것에 관한 것이다.
스트렙토코쿠스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae)는 상당히 아주 흔한 인간 병원체이며, 이는 폐, 중추신경계(CNS), 중이 및 비강을 포함하는 몇몇 장기를 감염시킬 수 있다. 감염은 기관지염, 폐렴, 수막염, 부비동염 및 패혈증과 같은 각종 증상을 유발한다. 스트렙토코쿠스 뉴모니애는 인간의 세균성 수막염의 주요 원인이며, 항생제 치료에도 불구하고 상당한 사망률 및 이환율과 관련된다[문헌 참조: Quagliarello et al., (1992) N. Eng. J. Med. 327:869-872].
현재 시판중인 폐렴구균 백신은 2종이다. 하나는 폐렴구균성 감염을 일으키는 균주의 약 90%가 협막 유형을 함께 나타내는 23개의 상이한 협막 다당류로 이루어진 성인용 백신이다. 그러나, 당해 백신은 폐렴구균성 감염에 매우 걸리기 쉬운 연령대인 아동에게는 면역원성이 아니다. 성인에서, 상기 백신은 세균혈증성 폐렴에 대하여 약 60% 효과적이지만, 연령 또는 근본적인 의료 조건으로 인하여 고위험의 폐렴구균성 감염의 성인에서는 덜 효과적이다[문헌 참조: Fedson, and Musher. 2004. "Pneumococcal Polysaccharide Vaccine", pp. 529-588. In Vaccines, S. A. Plotkin and W. A. Orenstein (eds.), W. B. Saunders and Co., Philadelphia, PA; Shapiro et al., N. Engl. J. Med. 325: 1453-1460 (1991)]. 상기 백신은 감염이 가장 흔한 형태인 비세균혈증성 폐렴구균 폐렴에 대하여 효과적인 것으로 알려지지 않았다.
시판중인 제2의 백신은 2세 미만의 아동에서 세균혈증성 폐렴구균성 감염에 대하여 효과적인 7가 결합 백신이다. 이는 또한 폐렴에 대하여 효능이 입증되었다[문헌 참조: Black et al., Arch. Pediatr. 11(7):485-489 (2004)]. 당해 백신의 생산은 7개의 상이한 결합을 제조할 필요로 인하여 복잡해지고, 이는 백신을 고가로 만든다(약 200달러/아동). 더욱이, 상기 백신은 스트렙토코쿠스 뉴모니애의 비백신 유형이 매우 흔한 개발도상국가에서 감염을 잘 치료하지 못한다[문헌 참조: Di Fabio et al., Pediatr. Infect. Dis. J. 20:959-967 (2001); Mulholland, Trop. Med. Int. Health. 10:497-500 (2005)]. 상기 백신은 중이염 및 전이증식뿐만 아니라 침투성 질병에 대해서도 작용하지 않는다. 또한, 7가 결합 백신을 사용하는 경우, 백신에 포함된 7개의 다당류에 의해 나타나지 않는 협막 유형의 균주에 의해 전이증식 및 질병이 증가하는 것으로 알려져 있다[문헌 참조: Bogaert et al., Lancet Infect. Dis. 4:144-154 (2004); Eskola et al., N. Engl J. Med. 344:403-409 (2001); Mbelle et al., J. Infect Dis. 180: 1171-1176 (1999)]. 그러므로, 스트렙토코쿠스 뉴모니애에 대한 효과적인 치료법이 여전히 요구된다.
발명의 요약
스트렙토코쿠스 뉴모니애에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 조성물 및 방법이 개시된다. 면역원성 PhtD 폴리펩타이드, 특히 단편, 유도체 및 이의 변이체뿐만 아니라 이를 암호화하는 핵산이 제공된다. 또한, 상기 폴리펩타이드, 단편, 유도체 또는 변이체에 대하여 특이성을 갖는 단일클론 항체(및 이를 생산하는 하이브리도마)가 제공된다. 면역원성 폴리펩타이드, 유도체, 변이체 및 단일클론 항체의 제조 방법 및 사용 방법도 추가로 제공된다.
본 발명은 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택된, 분리된 핵산을 제공한다: (a) 서열번호 2와 90% 이상의 동일성을 갖는 스트렙토코쿠스 뉴모니애 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산; (b) 서열번호 2와 90% 이상의 동일성을 갖는 스트렙토코쿠스 뉴모니애 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산과 완전히 상보적인 핵산; 및 (c) T가 U로 치환된 상기 (a) 또는 (b)의 RNA.
본 발명의 바람직한 양태에 따라, 서열 동일성은 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95 내지 100%이다.
또한, 본 발명은 서열번호 2와 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 분리된 폴리펩타이드, 및 서열번호 2와 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩타이드와 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따라, 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택된, 분리된 핵산이 제공된다: (a) 서열번호 3과 80% 이상의 동일성을 갖는 스트렙토코쿠스 뉴모니애 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산; (b) 서열번호 3과 80% 이상의 동일성을 갖는 스트렙토코쿠스 뉴모니애 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산과 완전히 상보적인 핵산; 및 (c) T가 U로 치환된 상기 (a) 또는 (b)의 RNA.
본 발명의 바람직한 양태에 따라, 서열 동일성은 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95 내지 100%이다.
또한, 본 발명은 서열번호 3과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 분리된 폴리펩타이드, 및 서열번호 3과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩타이드와 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따라, 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택된, 분리된 핵산이 제공된다: (a) 서열번호 4와 80% 이상의 동일성을 갖는 스트렙토코쿠스 뉴모니애 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산; (b) 서열번호 4와 80% 이상의 동일성을 갖는 스트렙토코쿠스 뉴모니애 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산과 완전히 상보적인 핵산; 및 (c) T가 U로 치환된 상기 (a) 또는 (b)의 RNA.
본 발명의 바람직한 양태에 따라, 서열 동일성은 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95 내지 100%이다.
또한, 본 발명은 서열번호 4와 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 분리된 폴리펩타이드, 및 서열번호 4와 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩타이드와 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 제공한다.
본 발명의 추가의 양태에 따라, 서열번호 4에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 펩타이드의 항원 결정기와 특이적으로 결합하는 단일클론 항체가 제공된다.
본 발명의 바람직한 양태에 따라, 단일클론 항체가 특이적으로 결합하는 항원 결정기는 서열번호 4에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 펩타이드에서 아미노산 1과 아미노산 101에 이르는(spanning) 영역에 위치한다.
또한, 본 발명은 서열번호 2, 서열번호 3 및 서열번호 4로 이루어진 그룹으로부터 선택된 면역원성 단편, 또는 서열번호 15, 서열번호 16 및 서열번호 17로 이루어진 그룹으로부터 선택된 이의 변이체를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따라, 서열번호 2, 서열번호 3 및 서열번호 4로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1개 이상의 PhtD의 폴리펩타이드, 또는 서열번호 15, 서열번호 16 및 서열번호 17로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1개 이상의 이의 변이체를 숙주에 투여함을 포함하는, 스트렙토코쿠스 종(Streptococcus sp.) 세균에 의한 감염에 대하여 숙주를 면역시키는 방법 및 스트렙토코쿠스 종 세균에 의한 감염을 치료하는 방법이 제공된다.
본 발명의 추가의 양태에 따라, ATCC 수탁번호 제XXXX호의 하이브리도마에 의해 생산된 항체와 동일한 항원 결합 특이성을 갖는 단일클론 항체가 제공된다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 상기 단일클론 항체는 ATCC 수탁번호 제XXXX호의 마우스 하이브리도마에 의해 생산된 1B12, ATCC 수탁번호 제XXXX호의 마우스 하이브리도마에 의해 생산된 4D5, 및 ATCC 수탁번호 제XXXX호의 마우스 하이브리도마에 의해 생산된 9E11로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
또한, 본 발명은 ATCC 수탁번호 제XXXX호의 마우스 하이브리도마에 의해 생산된 1B12, ATCC 수탁번호 제XXXX호의 마우스 하이브리도마에 의해 생산된 4D5, 및 ATCC 수탁번호 제XXXX호의 마우스 하이브리도마에 의해 생산된 9E11로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1개 이상의 단일클론 항체를 숙주에 투여함을 포함하는, 숙주에서 스트렙토코쿠스 종 세균에 의한 감염을 예방하는 방법 및 이에 의한 감염을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 2개 이상의 단일클론 항체는 스트렙토코쿠스 종 세균에 의한 감염을 예방 및/또는 치료하기 위해 투여된다.
본 발명의 또 다른 양태에 따라, ATCC 수탁번호 제XXXX호의 마우스 하이브리도마에 의해 생산된 1B12, ATCC 수탁번호 제XXXX호의 마우스 하이브리도마에 의해 생산된 4D5, 및 ATCC 수탁번호 제XXXX호의 마우스 하이브리도마에 의해 생산된 9E11로 이루어진 그룹으로부터 선택된 단일클론 항체 또는 이의 유도체에 시험 생물학적 시료를 노출시키는 단계, 상기 시험 생물학적 시료와 결합한 항체 또는 유도체의 양을 측정하는 단계, 및 상기 시험 생물학적 시료에서 관찰된 결합의 양을 대조군 생물학적 시료에서 관찰된 결합의 양과 비교하는 단계를 포함하는, 상기 시험 생물학적 시료에서 단백질의 양을 측정하는 방법이 제공되며, 상기 대조군 생물학적 시료에 대한 상기 시험 생물학적 시료에서의 결합 증가는 내부에 단백질의 존재를 나타낸다.
본 발명의 추가의 양태에 따라, 다음 단계를 포함하는, 생물학적 시료에서 스트렙토코쿠스 종 세균 또는 이의 단백질을 검출하는 방법이 제공되며, 상기 대조군 생물학적 시료와 비교하여 상기 시험 생물학적 시료의 성분에 대한 항체의 양의 상당한 결합 증가는 상기 생물학적 시료에서 스트렙토코쿠스 종 또는 이의 단백질의 존재를 나타낸다:
(a) 특이성을 갖는 시험 생물학적 시료의 성분에 하기 항체를 허용하는 조건하에, ATCC 수탁번호 제XXXX호의 마우스 하이브리도마에 의해 생산된 1B12, ATCC 수탁번호 제XXXX호의 마우스 하이브리도마에 의해 생산된 4D5, 및 ATCC 수탁번호 제XXXX호의 마우스 하이브리도마에 의해 생산된 9E11로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1개 이상의 단일클론 항체 또는 이의 유도체에 상기 시험 생물학적 시료를 노출시키는 단계;
(b) 상기 시험 생물학적 시료의 성분과 결합한 항체의 양을 측정하는 단계; 및
(c) 상기 시험 생물학적 시료와 결합한 항체의 양을 대조군 시료와 결합한 양과 비교하는 단계.
또한, 본 발명은 ATCC 수탁번호 제XXXX호의 마우스 하이브리도마에 의해 생산된 1B12, ATCC 수탁번호 제XXXX호의 마우스 하이브리도마에 의해 생산된 4D5, 및 ATCC 수탁번호 제XXXX호의 마우스 하이브리도마에 의해 생산된 9E11로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1개 이상의 단일클론 항체 또는 이의 유도체 및 사용 설명서를 포함하는, 생물학적 시료에서 스트렙토코쿠스 종 세균 또는 이의 단백질을 검출하기 위한 키트를 제공한다.
상술한 양상 및 양태의 예 이외에도, 추가의 양상 및 양태는 하기 상세한 설명의 연구에 대한 참조로서 명백해질 것이다.
단일클론 항체에 대한 결합 부위를 확인하고, 다클론 혈청으로부터의 교차 반응성 항체를 흡수하고, 방어 항원결정기를 포함하는 PhtD의 영역을 정의하고, 전체 길이의 단백질에 의해 제공되는 것보다 높은 분해능에서 인간의 면역 반응을 특성화하여(임상 실험에서), 제조공정 동안 이점을 제공할 수 있는 면역학적 제제로서 유용한 폴리펩타이드 및 핵산이 본원에 개시된다. 시험 시약으로서, 이러한 일부 절단 단백질의 수거는 PhtD의 다가 백신에 대한 개별적인 기여의 특성을 고려한다.
하나의 양태에서, PhtD에 대한 면역 반응을 자극하여 스트렙토코쿠스 종 세균과 같은 PhtD 발현 유기체를 처리함으로써 당해 유기체의 존재와 관련된 질환을 치료 및/또는 예방하기에 유용한 조성물 및 방법이 개시된다. 상기 면역 반응은 PhtD, 이의 면역원성 단편 또는 이의 변이체, 또는 이들의 어느 하나를 암호화하는 핵산을 투여한 후 발생하는 것으로 보여진다. 이러한 경우에, PhtD, 이의 면역원성 단편, 또는 이의 변이체는 면역원으로서 작용한다. 본원에서 사용된 "면역원"은 폴리펩타이드, 펩타이드, 단편 또는 이들의 변이체이며, 각각은 면역원이 투여된 숙주에서 면역 반응을 생성하는 PhtD로부터 유도된다. 이 면역 반응은 면역원의 1개 이상의 항원결정기와 결합하는 항체의 생성, 및/또는 면역원의 항원결정기를 발현하는 세포에 대한 세포성 면역 반응의 발생을 포함할 수도 있다. 상기 면역 반응은, 예를 들어, 항체 반응 증가(즉, 항체의 양, 친화력/항원항체결합력 증가) 또는 세포 반응 증가(즉, 활성화 T 세포의 수 증가, T 세포 수용체의 친화력/항원항체결합력 증가)를 검출함으로써, 예를 들어, 면역원에 대한 기존 면역 반응의 증강으로서 검출될 수도 있다. 면역 반응의 기타 측정법은 당업계에 공지되어 있으며, 숙주에서 면역 반응의 존재를 측정하는데 이용될 수 있다. 표준 방법은 상기 측정을 수행하기 위해 당업계에서 이용가능하다. 특정 양태에서, 상기 면역 반응은 검출가능하나 반드시 방어적이지 않다. 이러한 경우에서, 면역원을 포함하는 조성물은 면역학적 조성물로서 간주될 수도 있다. 특정 양태에서, 상기 면역 반응은 방어적이며, 이는 면역 반응이 PhtD 발현 유기체(즉, 스트렙토코쿠스 종)의 생장을 예방하거나 이를 숙주로부터 제거할 수 있음을 의미한다. 이러한 경우에서, 면역원을 포함하면서 여전히 면역학적 조성물로 간주되는 조성물은 백신으로서 추가로 언급될 수도 있다. 특정 양태에서, 다중 면역원은 단일 조성물에 이용된다.
PhtD의 면역원성 단편(즉, 면역원)은 단편의 제조 방법 및 사용 방법과 함께 본원에 기재되어 있다. 본원에 기재된 면역원은 전체 길이의 PhtD(신호 서열이 있거나 없음), 이의 PhtD 단편 및 이의 변이체를 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다. 이용되는 아미노산 서열은 하기에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 스트렙토코쿠스 뉴모니애 PhtD[GenBank Accession No. AF318955; 문헌 참조: Adamou, et al., Infect. Immun. 69(2), 949-958 (2001)]로부터 유도되는 것이 바람직하다:
Figure 112010010902018-pct00001
바람직한 면역원성 조성물은, 예를 들어, 서열번호 2, 3, 4, 15, 16 또는 17의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 1개 이상 포함한다. 이러한 폴리펩타이드는 1개 이상의 보존적 아미노산 치환 및/또는 신호 서열 및/또는 검출가능한 "태그", 예를 들어, His[즉, MGHHHHHH(서열번호 18); 예를 들어, 서열번호 15 내지 17 참조]를 포함한다. 예시적으로, 바람직한 면역원성 단편은 다음을 포함한다.
절단체 1
Figure 112010010902018-pct00002
절단체 2
Figure 112010010902018-pct00003
절단체 3
Figure 112010010902018-pct00004
상술한 바와 같이, 본원에 제공된 면역원성 폴리펩타이드는 면역원성 PhtD(즉, 서열번호 2, 3 및/또는 4)에 대한 1개 이상의 보존적 아미노산 치환을 포함할 수도 있다. 예를 들어, 본원에 제공된 면역원은 천연 PhtD와 약 60 내지 약 99%의 서열 동일성 또는 유사성이 유지되도록 아미노산 서열을 1개 이상 변형시킨 천연 PhtD의 C 말단 부분을 포함할 수도 있다. 변이체의 예는 서열번호 2, 3, 4, 15, 16 및/또는 17, 및/또는 임의의 단편 또는 이의 유도체와 약 60 내지 약 99%, 약 60 내지 약 65%, 약 65 내지 약 70%, 약 70 내지 약 75%, 약 80 내지 약 85%, 약 85 내지 약 90%, 약 90 내지 약 99% 또는 약 95 내지 약 99%의 유사하거나 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 변이체는 바람직하게는 본원에 교시된 방법 또는 당업계에서 이용가능한 방법을 사용하여 면역원으로서 작용하는 능력을 위해 선택된다.
적합한 아미노산 서열 변형은 본원에 논의된 임의의 PhtD 폴리펩타이드의 아미노산에 대한 치환, 삽입, 결실 또는 기타 변형을 포함한다. 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 임의의 조합은, 변이체가 면역원성 폴리펩타이드인 한, 단일 변이체에서 혼합될 수도 있다. 삽입은 아미노 및/또는 카복실 말단 융합뿐만 아니라 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 내부 서열 삽입을 포함한다. 삽입은 통상적으로 아미노 또는 카복실 말단 융합, 예를 들어, 약 1 내지 4개의 잔기의 삽입보다 작은 삽입일 것이다. 결실은 단백질 서열로부터의 1개 이상의 아미노산 잔기의 제거를 특징으로 한다. 통상적으로, 단지 약 2 내지 6개의 잔기만이 단백질 분자 내의 어느 한 부위에서 결실된다. 이러한 변이체는 통상적으로 단백질을 암호화하는 DNA에서 뉴클레오타이드의 부위 특이적인 돌연변이를 생성시켜, 변이체를 암호화하는 DNA를 생산한 후, 재조합 세포 배양에서 DNA를 발현함으로써 제조된다. 공지의 서열을 갖는 DNA의 예정된 부위에서 치환 돌연변이를 생성시키는 기술은 널리 공지되어 있으며, M13 프라이머 돌연변이 생성 및 PCR 돌연변이 생성을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 아미노산 치환은 통상적으로 단일 잔기에서 일어나지만, 한번에 다수의 상이한 위치에서 일어날 수 있다. 치환 변이체는 1개 이상의 잔기가 제거되고 상이한 잔기가 그 위치에 삽입된 변이체이다. 이러한 치환은 일반적으로 하기 표 1에 따라 이루어지고, 보존적 치환으로 언급되며, 일반적으로 그 위치에서 아미노산 잔기의 크기, 극성, 전하, 소수성 또는 친수성에 영향을 적게 미치거나 미치지 않으며, 특히 면역원성을 감소시키지 않는다. 그러나, 다른 것들은 당업자에게 널리 공지되어 있다.
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또한, 본원에 사용된 변이체는 상동성 PhtD 유전자 내에 1개 이상의 부위에서 다형태를 나타내는 다른 스트렙토코쿠스 균주로부터의 천연 PhtD 대립유전자를 포함할 수도 있다. 변이체는 통상적인 분자 생물학 기술에 의해 제조될 수 있다. 변이체는 천연 유전자와 비교한 서열 유사성 또는 동일성에 관하여 본원에 기재된다. 당업자는 2개의 폴리펩타이드 또는 핵산의 서열 유사성 및 동일성을 측정하는 방법을 용이하게 이해한다. 예를 들어, 서열 유사성은 동일성의 수준이 높도록 2개의 서열을 정렬한 후 계산될 수 있다. 정렬은 정렬 프로그램에서 특이적인 알고리즘의 사용에 어느 정도까지는 의존하고 있다. 이는, 예를 들어, 스미스 및 워터만의 국소 상동성 알고리즘[문헌 참조: Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)], 니들만 및 운쉬의 상동성 정렬 알고리즘[문헌 참조: Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)], 피어슨 및 리프만의 유사성 방법에 대한 연구[문헌 참조: Pearson and Lipman, PNAS USA 85:2444 (1988)], 이들 알고리즘의 전산화 실시(GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA (Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI)) 및 블라스트(BLAST) 및 블라스트 2.0 및 알고리즘[문헌 참조: Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1977; Altschul, et al, J. Mol Biol. 215:403-410, 1990; Zuker, M. Science. 244:48-52, 1989; Jaeger et al. PNAS USA 86:7706-7710, 1989; 및 Jaeger et al. Methods Enzymol. 183:281-306, 1989]을 포함한다. 다중 서열 정렬 방법의 최근 검토는 문헌[참조: Nuin et al., BMC Bioinformatics 7:471, 206]에 의해 제공된다. 이들 문헌 각각은 적어도 서열 유사성의 정렬 및 계산에 관한 자료를 위해 참조로 인용된다. 서열 유사성 또는 동일성의 측정 방법 중의 어느 하나가 통상적으로 사용될 수 있고 특정의 경우에서는 이러한 각종 방법의 결과가 상이할 수도 있음은 이해된다. 서열 유사성이, 예를 들어, 95%로서 제공되는 경우, 이러한 유사성은 1개 이상의 허용된 계산 방법으로 검출가능해야 한다.
본원에 기재된 면역원성 폴리펩타이드는 1개 이상의 아미노산 유사체 또는 인공 입체이성체를 포함할 수도 있다. 이러한 아미노산 유사체 및 입체이성체는 tRNA 분자를 선택된 아미노산으로 충전하고, 부위 특이적인 방식으로 유사체 아미노산을 펩타이드 쇄에 삽입시키기 위해, 예를 들어, 앰버(amber) 코돈을 이용하는 유전자 구조물을 조작함으로써 폴리펩타이드 쇄에 용이하게 혼입될 수 있다[문헌 참조: Thorson et al., Methods in Molec. Biol. 77:43-73 (1991), Zoller, Current Opinion in Biotechnology, 3:348-354 (1992); Ibba, Biotechnology & Genetic Engineering Reviews 13:197-216 (1995), Cahill et al., TIBS, 14(10):400-403 (1989); Benner, TIB Tech, 12: 158-163 (1994); Ibba and Hermecke, Bio/technology, 12:678-682 (1994); 상기 문헌 모두는 적어도 아미노산 유사체와 관련된 자료를 위해 참조로 본원에 인용된다]. 펩타이드와 유사하지만 천연 펩타이드 결합을 통해 연결되지 않은 면역원성 단편이 생산될 수 있다. 예를 들어, 아미노산 또는 아미노산 유사체에 대한 결합은 -CH2NH-, -CH2S-, -CH2-CH2-, -CH=CH-(시스 및 트랜스), -COCH2-, -CH(OH)CH2- 및 -CHH2SO-를 포함할 수 있으며, 상기 결합 및 기타 결합은 문헌에서 발견될 수 있다[문헌 참조: Spatola, A. F. "Peptide backbone modifications: A structure-activity analysis of peptides containing amide bond surrogates, conformational constraints, and related backbone modification." In Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides, and Proteins, pp. 267-357. Weinstein, B. editor, Marcel Dekker, New York, N.Y. (1983); Morley, Trends in Pharm. Sci. 1(2):463-468 (1980); Hudson, et al, Int J Pept Prot Res 14:177-185 (1979) (-CH2NH-, -CH2CH2-); Spatola et al. Life Sci 38:1243-1249 (1986) (-CHH2S-); Hann, Journal of the Chemical Society; Perkin Transactions. pp.307-314 (1982) (-CH-CH-, 시스 및 트랜스); Almquist et al., J. Med. Chem. 23: 1392-1398 (1980) (-COCH2-); Jennings-White et al., Tetrahedron Lett 23:2533 (1982) (-COCH2-); 유럽 특허 공개 공보 제EP0045665호[Szelke, et al. (1982)](-CH(OH)CH2-); Holladay et al., Tetrahedron. Lett. 24:4401-4404 (1983)(-C(OH)CH2-); 및 Hruby Life Sci 31:189-199 (1982)(-CH2-S-); 상기 문헌 각각은 적어도 결합과 관련된 자료를 위해 참조로 본원에 인용된다].
아미노산 유사체 및 입체이성체는 종종 증강되거나 바람직한 특성, 예를 들어, 보다 경제적인 생산성, 탁월한 화학적 안정성, 증강된 약제학적 특성(반감기, 흡수, 잠재능, 효능 등), 변형된 특이성(예를 들어, 광범위한 생물학적 활성) 및 기타 특성을 가질 수 있다. 예를 들어, D-아미노산은 보다 안정한 펩타이드를 생성하는데 사용될 수 있는데, 이는 D-아미노산이 천연 펩티다제에 의해 인식되지 않기 때문이다. 공통 서열의 1개 이상의 아미노산을 동일한 유형의 D-아미노산으로 체계적으로 치환하는 방법(예를 들어, L-리신 대신 D-리신으로 치환)은 보다 안정한 펩타이드를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 시스테인 잔기는 2개 이상의 펩타이드를 함께 폐환시키거나 결합시키는데 사용될 수 있다. 이는 펩타이드를 특정 형태로 만들기에 유리할 수 있다[문헌 참조: Rizo and Gierasch, Ann. Rev. Biochem. 61:387 (1992), 당해 문헌은 본원에 참조로 인용된다].
기타 변이체는 1개 이상의 면역 표적 서열[즉, GYGRKKRRQRRR(TAT; 서열번호 19), RQIKIWFQNRRMKWKK(AntP; 서열번호 20), SRRHHCRSKAKRSRHH(PER1-1; 서열번호 21) 또는 GRRHHRRSKAKRSR(PER1-2; 서열번호 22)]이 면역원성 PhtD 폴리펩타이드에 결합된 변이체를 포함한다.
하나의 양태에서, PhtD 폴리펩타이드, 예를 들어, 서열번호 2, 3 또는 4, 또는 이들의 변이체 중의 어느 하나를 암호화하는 핵산이 제공된다(즉, 서열번호 5 내지 10). 또한, 이러한 서열의 변이체(이들의 축퇴성 변이체 포함)도 제공된다. 특정 양태에서, 펩타이드 서열을 암호화하는 핵산 분자는 더욱 상세히 하기에 논의된 바와 같이 발현 백터에 삽입될 수도 있다. 이러한 양태에서, 펩타이드 서열은 아미노산 서열에 상응하는 뉴클레오타이드에 의해 암호화된다. 각종 아미노산을 암호화하는 뉴클레오타이드의 특정 조합은, 하기 표 2에 나타낸 바와 같이, 당업자에 의해 이용되는 각종 문헌[참조: Lewin, B. Genes V, Oxford University Press, 1994]에 기재된 바와 같이, 당업계에 널리 공지되어 있다. 핵산 변이체는 관심 대상의 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드의 임의의 조합을 사용할 수도 있다.
Figure 112010010902018-pct00006
서열번호 2, 3, 4, 15, 16 및 17의 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산의 예(즉, His 태그가 있거나 없음)는 하기에 나타낸다:
절단체 1(His 태그 없음)
Figure 112010010902018-pct00007
Figure 112010010902018-pct00008
절단체 1(His 태그 있음)
Figure 112010010902018-pct00009
절단체 2(His 태그 없음)
Figure 112010010902018-pct00010
절단체 2(His 태그 있음)
Figure 112010010902018-pct00011
절단체 3(His 태그 없음)
Figure 112010010902018-pct00012
절단체 3(His 태그 있음)
Figure 112010010902018-pct00013
또한, 매우 엄격한 조건하에, 서열번호 2, 3, 4, 15, 16 및/또는 17의 어느 하나를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 상응하는 하이브리드화 프로브의 임의의 부분에, 또는 서열번호 5 내지 10의 어느 하나에 하이브리드화되는, 분리된 핵산이 제공된다. 상기 하이브리드화되는 핵산의 하이브리드화되는 부분은 통상적으로 15개 이상(예를 들어, 15, 20, 25, 30, 40개 또는 그 이상)의 뉴클레오타이드 길이이다. 하이브리드화되는 부분은 하이브리드화되는 서열의 부분과 65% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 99% 이상 동일하다. 하이브리드화되는 핵산은, 예를 들어, 클로닝 프로브, 프라이머(예를 들어, PCR 프라이머) 또는 진단 프로브로서 유용하다. 핵산의 듀플렉스(duplex) 또는 하이브리드 안정성은 해리 온도(melting temperature) 또는 Tm으로 표현되는데, 이 온도는 표적 DNA로부터 프로브가 해리되는 온도이다. 이 해리 온도는 요구되는 엄격한 조건을 정의하기 위해 사용된다. 서열이 동일하기보다는 프로브와 관련되고 실질적으로 동일한 것으로 확인되는 경우, 이어서 염의 특정 농도(예를 들어, 각종 농도의 SSC 또는 SSPE 완충액을 사용함)에서 상동성 하이브리드화만이 일어나는 최저 온도를 먼저 확립시키는 것이 유용하다. 1% 불일치(mismatching)가 Tm의 1℃ 감소를 초래하는 것으로 가정하면, 그에 따라 하이브리드화 반응에서의 최종 세척 온도는 감소한다(예를 들어, 95% 이상의 동일성을 갖는 서열을 추구하는 경우, 최종 세척 온도는 5℃ 감소한다). 실제로, Tm의 변화는 1% 불일치에 대하여 0.5 내지 1.5℃일 수 있다. 매우 엄격한 조건은 68℃에서 5X SSC/5X 덴하르트(Denhardt) 용액/1.0% SDS 중의 하이브리드화 단계, 및 실온에서 0.2X SSC/0.1% SDS 중의 세척 단계를 포함한다. 온화하게 엄격한 조건은 42℃에서 3X SSC 중의 세척 단계를 포함한다. 염 농도 및 온도는 프로브와 표적 핵산 사이에 최적 수준의 동일성을 달성하기 위해 변할 수 있다. 이러한 엄격한 조건에 관한 추가 지침은 당업계, 예를 들어, 문헌[참조: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition by Sambrook et al., Cold Spring Harbor Press, 2001]에서 용이하게 이용할 수 있다.
또한, 발현 벡터도 본 발명을 실시하는데 사용하기 위해 적합할 수 있다. 발현 벡터는 통상적으로 폴리펩타이드("암호화 서열")를 암호화하는 이종 핵산 서열과 작동가능하게 연결한 인접 서열로 이루어진다. 다른 양태에서 또는 이러한 양태와의 조합에서, 인접 서열은 바람직하게는 암호화 서열의 복제, 전사 및/또는 번역에 영향을 미칠 수 있고, 암호화 서열과 작동가능하게 연결한다. "작동가능하게 연결한"이란 핵산 서열이 통상의 기능을 수행하기 위해 배치함을 나타낸다. 예를 들어, 프로모터는 암호화 서열의 전사를 명령할 수 있는 경우에 암호화 서열과 작동가능하게 연결한다. 인접 서열은 정확하게 기능하는 한 암호화 서열과 근접할 필요는 없다. 따라서, 예를 들어, 번역되지 않으나 전사되는 개재 서열은 프로모터 서열과 암호화 서열 사이에 존재할 수 있으며, 당해 프로모터 서열은 당해 암호화 서열에 실시 가능하게 결합되도록 여전히 고려될 수 있다. 인접 서열은 동종(즉, 숙주 세포와 동일한 종 및/또는 균주로부터), 이종(즉, 숙주 세포 종 또는 균주와 상이한 종으로부터), 하이브리드(즉, 하나의 이상의 소스로부터의 인접 서열들의 조합) 또는 합성일 수 있다. 또한, 인접 서열은 숙주의 게놈에서 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 발현을 조절하기 위해 정상적으로 기능하는 서열일 수 있다.
특정 양태에서, 당해 인접 서열은 표적 세포에서 유전자 발현을 높은 수준으로 유도하는 전사 조절 영역인 것이 바람직하다. 당해 전사 조절 영역은, 예를 들어, 프로모터, 인핸서(enhancer), 사일런서(silencer), 억제 요소 또는 이들의 조합을 포함할 수도 있다. 당해 전사 조절 영역은 구성적일 수 있거나 조직 또는 세포 유형 특이적일 수 있다(즉, 당해 영역은 다른 유형과 비교시 조직 또는 세포 유형에서 전사를 높은 수준으로 유도한다). 이러한 것으로서, 전사 조절 영역의 소스는 임의의 원핵세포 또는 진핵세포 유기체, 임의의 척추 또는 무척추 유기체, 또는 임의의 식물일 수도 있지만, 인접 서열은 숙주 세포 기구에서 기능적이고 당해 기구에 의해 활성화될 수 있다. 광범위한 전사 조절 영역이 본 발명을 실시하는데 이용될 수도 있다.
적합한 전사 조절 영역은, 다른 것들 중에서도, CMV 프로모터(즉, CMV 최조기 프로모터); 진핵세포 유전자로부터의 프로모터(즉, 에스트로겐 유도성 닭 난백 알부민 유전자, 인터페론 유전자, 글루코코르티코이드 유도성 티로신 아미노 트랜스퍼라제 유전자 및 티미딘 키나제 유전자); 주요 조기 및 지연 아데노바이러스 유전자 프로모터; SV40 조기 프로모터 영역[문헌 참조: Bernoist and Chambon, 1981, Nature 290:304-310]; 라우스 육종 바이러스(RSV)의 3' 말단의 긴 반복서열(LTR)에 포함된 프로모터[문헌 참조: Yamamoto, et al., 1980, Cell 22:787-797]; 단순 포진 바이러스 티미민 키나제 유전자(HSV-TK) 프로모터[문헌 참조: Wagner et al., 1981 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 78:1444-1445]; 메탈로티오닌 유전자의 조절 서열[문헌 참조: Brinster et al., 1982, Nature 296:39-42]; 또는 원핵세포 발현 벡터에서 발견되는 조절 서열, 예를 들어, 베타 락타마제 프로모터[문헌 참조: Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 75:3727-3731], tac 프로모터[문헌 참조: DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80:21-25], T7 RNA 폴리머라제 프로모터, pBAD 아라비노오스 프로모터 또는 pTrc 프로모터를 포함한다. 조직 및/또는 세포 유형 특이적인 전사 조절 영역은, 예를 들어, 췌장 외분비 세포에서 활성인 엘라스타제 I 유전자 조절 영역[문헌 참조: Swift et al., 1984, Cell 38:639-646; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409 (1986); MacDonald, 1987, Hepatology 7:425-515]; 췌장 베타 세포에서 활성인 인슐린 유전자 조절 영역[문헌 참조: Hanahan, 1985, Nature 315:115-122]; 림프계 세포에서 활성인 면역글로불린 유전자 조절 영역[문헌 참조: Grosschedl et al., 1984, Cell 38:647-658; Adames et al., 1985, Nature 318:533-538; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol., 7:1436-1444]; 고환, 유방, 림프계 및 비만 세포에서의 마우스 유방암 바이러스 조절 영역[문헌 참조: Leder et al., 1986, Cell 45:485-495]; 간에서의 알부민 유전자 조절 영역[문헌 참조: Pinkert et al., 1987, Genes and Devel. 1:268-276]; 간에서의 알파 태아 단백질 유전자 조절 영역[문헌 참조: Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol., 5:1639-1648; Hammer et al., 1987, Science 235:53-58]; 간에서의 알파 1 항트립신 유전자 조절 영역[문헌 참조: Kelsey et al., 1987, Genes and Devel. 1:161-171]; 골수 세포에서의 베타 글로빈 유전자 조절 영역[문헌 참조: Mogram et al., 1985, Nature 315:338-340; Kollias et al., 1986, Cell 46:89-94]; 뇌의 희돌기아교세포에서의 미엘린계 단백질 유전자 조절 영역[문헌 참조: Readhead et al., 1987, Cell 48:703-712]; 골격근에서의 미오신 경쇄 2 유전자 조절 영역[문헌 참조: Sani, 1985, Nature 314:283-286]; 및 시상하부에서의 성선자극 분비 호르몬 유전자 조절 영역[문헌 참조: Mason et al., 1986, Science 234:1372-1378] 및 흑색종 세포에서의 티로시나제 프로모터[문헌 참조: Hart, I. Semin Oncol 1996 February; 23(1):154-158; Siders, et al. Cancer Gene Ther 1998 September-October; 5(5):281-291]. 기타 적합한 프로모터는 당업계에 공지되어 있다.
표적 면역원을 암호화하는 핵산 분자는 바이러스 또는 비바이러스 벡터의 일부로서 투여될 수도 있다. 하나의 양태에서, DNA 벡터는 표적 면역원 및/또는 관련 분자(예를 들어, 공동 자극 분자, 사이토카인 또는 케모카인)를 암호화하는 핵산을 피검체에 전달하는데 이용된다. 그렇게 함에 있어, 각종 전략은, 예를 들어, 자기복제 바이러스 레플리콘의 사용[문헌 참조: Caley, et al. 1999. Vaccine, 17: 3124-2135; Dubensky, et al. 2000. Mol. Med. 6: 723-732; Leitner, et al. 2000. Cancer Res. 60: 51-55], 코돈 최적화[문헌 참조: Liu, et al. 2000. Mol. Ther., 1: 497-500; Dubensky, supra; Huang, et al. 2001. J. Virol. 75: 4947-4951], 생체내 전기 천공[문헌 참조: Widera, et al. 2000. J. Immunol. 164: 4635-3640], 공동 자극 분자, 사이토카인 및/또는 케모카인을 암호화하는 핵산의 삽입[문헌 참조: Xiang, et al. 1995. Immunity, 2: 129-135; Kim, et al. 1998. Eur. J. Immunol., 28: 1089-1103; Iwasaki, et al. 1997. J. Immunol. 158: 4591-4601; Sheerlinck, et al. 2001. Vaccine, 19: 2647-2656], 자극 모티프, 예를 들어, CpG의 삽입[문헌 참조: Gurunathan, 상기 기재; Leitner, 상기 기재], 엔도시토시스 또는 유비퀴틴 처리 경로의 표적 서열[문헌 참조: Thomson, et al. 1998. J. Virol. 72: 2246-2252; Velders, et al. 2001. J. Immunol. 166: 5366-5373], 프라임 부스트 요법[문헌 참조: Gurunathan, 상기 기재; Sullivan, et al. 2000. Nature, 408: 605-609; Hanke, et al. 1998. Vaccine, 16: 439-445; Amara, et al. 2001. Science, 292: 69-74], 프로테아좀 민감성 분해 부위, 및 점막 전달 벡터, 예를 들어, 살모넬라(Salmonella)의 사용[문헌 참조: Darji, et al. 1997. Cell, 91: 765-775; Woo, et al. 2001. Vaccine, 19: 2945-2954]을 포함하는 기작의 효율성을 개선하는데 이용될 수도 있다. 기타 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 이들의 일부는 하기에 기재된다.
핵산을 숙주에 도입하는데 성공적으로 이용된 각종 바이러스 벡터는, 다른 것들 중에서도, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스(AAV), 포진 바이러스 및 수두 바이러스를 포함한다. 다수의 바이러스 벡터는 당업계에 이용가능한 것으로 당업계에서 이해된다. 본 발명의 벡터는 당업자에게 널리 이용가능한 표준 재조합 기술을 사용하여 제조될 수도 있다. 이러한 기술은 일반적인 분자 생물학 문헌[참조: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook, et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Gene Expression Technology, Methods in Enzymology, Vol. 185, edited by D. Goeddel, 1991. Academic Press, San Diego, CA; 및 PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis, et al. 1990. Academic Press, San Diego, CA]에서 발견될 수도 있다.
바람직한 레트로바이러스 벡터는 렌티바이러스 유도체뿐만 아니라 마우스 또는 조류 레트로바이러스 유도체이다. 적합한 레트로바이러스 벡터의 예로는, 예를 들어, 몰로니 마우스 백혈병 바이러스(MoMuLV), 하베이 마우스 육종 바이러스(HaMuSV), 마우스 유방암 바이러스(MuMTV), SIV, BIV, HIV 및 라우스 육종 바이러스(RSV)가 포함된다. 다수의 레트로바이러스 벡터는 다중 외인성 핵산 서열을 삽입할 수 있다. 재조합 레트로바이러스가 결함이 있기 때문에, 이들은 감염성 벡터 입자를 제조하기 위해 도움을 필요로 한다. 이러한 도움은, 예를 들어, 레트로바이러스 구조 유전자를 암호화하는 보조 세포주에 의해 제공될 수 있다. 적합한 보조 세포주는, 다른 것들 중에서도, Ψ2, PA317 및 PA12를 포함한다. 이러한 세포주를 사용하여 제조한 벡터 비리온은 다량의 키메라 레트로바이러스 비리온을 제조하기 위해 조직 세포주, 예를 들어, NIH 3T3 세포를 감염시키는데 사용될 수도 있다. 레트로바이러스 벡터는 전통적인 방법(예를 들어, 주입) 또는 표적 세포 집단과 근접한 "생산자 세포주"의 이식에 의해 투여될 수도 있다[문헌 참조: Culver, K., et al., 1994, Hum. Gene Ther., 5 (3): 343-379; Culver, K., et al., Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol., 59: 685-690); Oldfield, E., 1993, Hum. Gene Ther., 4 (1): 39-69]. 생산자 세포주는 바이러스 벡터를 제조하기 위해 조작되고 표적 세포 근처에 바이러스 입자를 방출한다. 방출된 바이러스 입자의 일부는 표적 세포와 접촉하여 당해 표적 세포를 감염시킴으로써 본 발명의 핵산을 당해 표적 세포에 전달한다. 표적 세포를 감염시킨 후, 벡터의 핵산이 발현된다.
아데노바이러스 벡터는 진핵세포로의 유전자 전달[문헌 참조: Rosenfeld, M., et al., 1991, Science, 252 (5004): 431-434; Crystal, R., et al., 1994, Nat. Genet., 8 (1): 42-51], 진핵세포 유전자 발현의 연구[문헌 참조: Levrero, M., et al., 1991, Gene, 101 (2): 195-202], 백신 개발[문헌 참조: Graham, F. and Prevec, L., 1992, Biotechnology, 20: 363-390] 및 동물 모델[문헌 참조: Stratford-Perricaudet, L., et al., 1992, Bone Marrow Transplant., 9 (Suppl. 1): 151-152; Rich, D., et al., 1993, Hum. Gene Ther., 4 (4): 461-476]에 특히 유용한 것으로 밝혀졌다. 재조합 Ad를 생체내 다른 조직에 투여하기 위한 실험적 경로는, 다른 것들 중에서도, 기관내 점적 주입[문헌 참조: Rosenfeld, M., et al., 1992, Cell, 68 (1): 143-155], 근육내 주사[문헌 참조: Quantin, B., et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 89(7): 2581-2583], 말초 정맥내 주사[문헌 참조: Herz, J., and Gerard, R., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90(7): 2812-2816] 및 뇌에 대한 정위 접종[문헌 참조: Le Gal La Salle, G., et al., 1993, Science, 259 (5097): 988-990]을 포함한다.
아데노 관련 바이러스(AAV)는 숙주 세포 게놈 내로 삽입하는데 고수준의 감염성, 넓은 숙주 범위 및 특이성을 입증하고 있다[문헌 참조: Hermonat, P., et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81(20): 6466-6470]. 단순 포진 바이러스 1형(HSV-1)은 신경친화성으로 인해 특히 신경계에 사용하기 위한 또 다른 매력적인 벡터 시스템이다[문헌 참조: Geller, A., et al., 1991, Trends Neurosci., 14(10): 428-32; Glorioso, et al., 1995, Mol. Biotechnol., 4(1): 87-99; Glorioso, et al., 1995, Annu. Rev. Microbiol., 49: 675-710].
수두 바이러스는 또 다른 유용한 발현 벡터이다[문헌 참조: Smith, et al. 1983, Gene, 25(1): 21-28; Moss, et al, 1992, Biotechnology, 20: 345-362; Moss, et al, 1992, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158: 25-38; Moss, et al. 1991. Science, 252: 1662-1667]. 유용한 것으로 밝혀진 수두 바이러스로는 우두, NYVAC, 조류 수두(avipox), 계두(fowlpox), 카나리폭스(canarypox), ALVAC 및 ALVAC(2)이 포함된다.
NYVAC(vP866)는, 공지된 또는 잠재적 발병 인자를 암호화하는 게놈의 6개의 비필수 영역을 제거함으로써 우두 바이러스의 코펜하겐 백신 종으로부터 유래된다[문헌 참조: 미국 특허 제5,364,773호 및 제5,494,807호]. 또한, 결실 유전자좌는 외래 유전자의 삽입을 위해 수용자 유전자좌로서 조작된다. 결실 영역은 티미딘 키나제 유전자 (TK; J2R) vP410; 출혈 영역(u; B13R+B14R) vP553; A형 봉입체 영역(ATI; A26L) vP618; 적혈구응집소 유전자(HA; A56R) vP723; 숙주 범위 유전자 영역(C7L-K1L) vP804; 및 거대 아단위, 리보뉴클레오타이드 리덕타제(I4L) vP866이다. NYVAC는, 발병 및 숙주 범위와 관련된 유전자 산물을 암호화하는 18개의 개방 판독 프레임의 특이적 결실에 의해 생성된 유전자 조작 우두 바이러스 종이다. NYVAC는 TA를 발현시키는데 유용한 것으로 밝혀졌다[문헌 참조: 미국 특허 제6,265,189호]. 또한, NYVAC(vP866), vP994, vCP205, vCP1433, placZH6H4Lreverse, pMPC6H6K3E3 및 pC3H6FHVB는 부다페스트 조약의 조건하에 ATCC에 수탁번호 제VR-2559호, 제VR-2558호, 제VR-2557호, 제VR-2556호, 제ATCC-97913호, 제ATCC-97912호 및 제ATCC-97914호로 각각 기탁되었다.
또한, ALVAC계 재조합 바이러스(즉, ALVAC-1 및 ALVAC-2)는 본 발명을 실시하는데 사용하기에 적합하다[문헌 참조: 미국 특허 제5,756,103호]. ALVAC(2)는 ALVAC(1)과 동일하지만, 단 ALVAC(2) 게놈은 우두 프로모터의 조절하에 우두 E3L 및 K3L 유전자를 포함한다[문헌 참조: 미국 특허 제6,130,066호; Beattie et al., 1995a, 1995b, 1991; Chang et al., 1992; Davies et al., 1993]. ALVAC(1) 및 ALVAC(2)는 둘다 모두 외래 DNA 서열, 예를 들어, TA를 발현하는데 유용한 것으로 입증되었다[문헌 참조: Tartaglia et al., 1993 a,b; 미국 특허 제5,833,975호]. ALVAC는 부다페스트 조약의 조건하에 미국 버지니아주 20110-2209 마나사스 유니버시티 블러바드 10801에 소재하는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC)에 ATCC 수탁번호 제VR-2547호로 기탁되었다.
또 다른 유용한 수두 바이러스 벡터는 TROVAC이다. TROVAC는, 1일령의 닭의 백신접종에 인가된 계두 바이러스의 FP-1 백신 종으로부터 유래된 플라크 클로닝된 분리물인 약독화 계두를 의미한다. TROVAC는 마찬가지로 부다페스트 조약의 조건하에 ATCC에 수탁번호 제2553호로 기탁되었다.
"비-바이러스" 플라스미드 벡터도 또한 특정 양태에서 적합할 수 있다. 바람직한 플라스미드 벡터는 세균, 곤충 및/또는 포유동물 숙주 세포에 적합할 수 있다. 이러한 벡터로는, 예를 들어, PCR-II, pCR3 및 pcDNA3.1(Invitrogen, SanDiego, CA), pBSII(Stratagene, La Jolla, CA), pET15(Novagen, Madison, WI), pGEX(Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ), pEGFP-N2(Clontech, Palo Alto, CA), pETL(BlueBacII, Invitrogen), pDSR-알파(PCT 공보 제WO 90/14363호) 및 pFastBacDual(Gibco-BRL, Grand Island, NY)뿐만 아니라 블루스크립트®(Bluescript®) 플라스미드 유도체(높은 복제수 COLE1계 파아지미드, Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA), Taq 증폭된 PCR 생성물을 클로닝하기 위해 설계된 PCR 클로닝 플라스미드(예를 들어, TOPOTM TA 클로닝® 키트, PCR2.1® 플라스미드 유도체, Invitrogen, Carlsbad, CA)가 포함된다. 세균 벡터도 또한 본 발명에 사용될 수 있다. 이들 벡터로는, 예를 들어, 시겔라(Shigella), 살모넬라, 비브리오 콜레라애(Vibrio cholerae), 락토바실러스(Lactobacillus), 바실 칼메테 구에린(Bacille calmette guerin)(BCG) 및 스트렙토코쿠스(Streptococcus)가 포함된다[문헌 참조: 국제 공개공보 제WO 88/6626호; 제WO 90/0594호; 제WO 91/13157호; 제WO 92/1796호; 및 제WO 92/21376호]. 다수의 다른 비-바이러스 플라스미드 발현 벡터 및 시스템은 당업계에 공지되어 있으며 본 발명에 사용될 수 있다.
예를 들어, DNA-리간드 복합체, 아데노바이러스-리간드-DNA 복합체, DNA의 직접 주사, CaPO4 침전, 유전자 총 기법, 전기 천공 및 콜로이드 분산 시스템을 포함하는 다른 전달 기법도 본 발명을 실시하는데 적합하다. 콜로이드 분산 시스템으로는 거대분자 복합체, 나노캡슐, 미소구, 비드, 및 수중유 유제, 미셀, 혼합 미셀 및 리포좀을 포함하는 지질계 시스템이 포함된다. 본 발명의 바람직한 콜로이드 시스템은 시험관내 및 생체내 전달 비히클로서 유용한 인공 막 소낭인 리포좀이다. RNA, DNA 및 온전한 비리온은 수성 내부 내에서 캡슐화되어, 생물학적 활성 형으로 세포에 전달될 수 있다[문헌 참조: Fraley, R., et al., 1981, Trends Biochem. Sci., 6: 77]. 리포좀의 조성물은 통상적으로 스테로이드, 특히 콜레스테롤과 배합된 인지질, 특히 높은 상전이 온도 인지질의 배합물이다. 다른 인지질 또는 다른 지질도 또한 사용될 수 있다. 리포좀의 물리적 특징은 pH, 이온 강도 및 2가 양이온의 존재에 의존한다. 리포좀 생성에 유용한 지질의 예로는 포스파티딜 화합물, 예를 들어, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜콜린, 포스파티딜세린, 포스파티딜에탄올아민, 스핀고지질, 세레브로시드 및 강글리오시드가 포함된다. 지질 잔기가 14 내지 18개의 탄소 원자, 특히 16 내지 18개의 탄소 원자를 함유하며, 포화된 디아실포스파티딜글리세롤이 특히 유용하다. 인지질의 예로는 난(egg) 포스파티딜콜린, 디팔미토일포스파티딜콜린 및 디스테아로일포스파티딜콜린이 포함된다.
벡터를 포함하는 배양 세포도 또한 제공된다. 배양 세포는 벡터로 감염된 배양 세포이거나 면역원성 펩타이드를 발현하는 배양 세포의 자손일 수 있다. 적합한 세포주는 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들어, 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC)을 통해 시판중이다. 감염 세포는 면역원성 펩타이드의 생산 방법에서 사용될 수 있다. 당해 생산 방법은 면역원성 펩타이드를 발현할 수 있는 조건 및 임의로 발현 서열의 조절 하에 벡터를 포함하는 세포를 배양시킴을 포함한다. 면역원성 펩타이드는 표준 단백질 정제 방법을 사용하여 세포 또는 배양 배지로부터 분리될 수 있다.
면역원성 펩타이드는 거대 폴리펩타이드 또는 단백질의 표준 효소 분해법을 사용하여 제조되거나 단백질 화학 기법으로 2개 이상의 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 함께 결합시켜 생성될 수 있다. 예를 들어, 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 Fmoc(9-플루오레닐메틸옥시카보닐) 또는 Boc(3급 부틸옥시카보노일) 화학을 사용하는 현재 이용가능한 실험실 장비를 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다(Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA). 펩타이드 축합 반응, 천연 화학적 라이게이션(ligation), 고체상 화학 또는 효소 라이게이션에 의해, 2개의 단편은 카복실 및 아미노 말단에서 펩타이드 결합을 통해 공유결합되어 면역원성 PhtD 폴리펩타이드를 형성할 수 있다[문헌 참조: Synthetic Peptide: A User Guide., Grant, ed., W.H. Freeman and Co., New York, N.Y. (1992); Principles of Peptide Synthesis., Bodansky and Trost, eds. Springer-Verlag Inc., New York, N.Y. (1993); Abrahmsen L et al., Biochemistry 30:4151 (1991); Dawson et al. Science, 266:776-779 (1994); Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd Edition, Stewart, ed., Pierce Chemical Company, Rockford, IL, (1984); 상기 문헌 모두는 본원에 기재된 방법을 위해 본원에 참조로 인용된다].
하나 이상의 폴리펩타이드를 포함하는 조성물 및 면역원성 폴리펩타이드는 항체를 생성하는데 사용될 수도 있다. 따라서, 피검체의 PhtD에 특이적인 항체를 생성하는 방법은 본원에 기재된 면역원성 PhtD 단편을 피검체에 투여함을 포함한다. PhtD 폴리펩타이드를 결합시키는 항체(또는 단편 또는 이의 유도체)가 본원에 또한 제공된다.
항체는 다클론 또는 단일클론일 수도 있으며, 완전한 인간 또는 인간화될 수도 있으며, 천연 항체 및 단일 쇄 항체를 포함한다. 항체는 면역원성 PhtD 폴리펩타이드 또는 단편 또는 이들의 유도체를 피검체에 투여함으로써 생체내에서 제조될 수 있다. 생체내 항체 생산은 하이브리도마 방법을 사용하여 단일클론 항체를 제조함을 포함한다. 하이브리도마 방법은 당업계에 널리 공지되어 있으며, 문헌[참조: Kohler and Milstein, Nature, 256:495 (1975) 및 Harlow and Lane. Antibodies, A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Publications, New York, (1988)]에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 본원에 기재된 방법을 위해 그 전문이 참조로 인용된다.
단일 쇄 항체의 제조 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있다[문헌 참조: 미국 특허 제5,359,046호, 그 전문이 이러한 방법을 위해 본원에 참조로 인용된다]. 단일 쇄 항체는 짧은 펩타이드 링커(linker)를 사용하여 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인을 함께 융합시켜 단일 분자 상의 항체 결합 부위를 재구성함으로써 제조된다. 항원 결합 또는 결합의 특이성을 거의 방해하지 않고 한 가변 도메인의 C 말단이 15 내지 25개의 아미노산 펩타이드 또는 링커를 통해 다른 가변 도메인의 N 말단에 연결되는 단일 쇄 항체 가변 단편(scFv)이 개발되었다. 링커는 중쇄와 경쇄가 적합한 입체형태적 배향으로 함께 결합할 수 있도록 선택된다[문헌 참조: Huston, J. S., et al., Methods in Enzym. 203:46-121 (1991); 당해 문헌은 링커에 관한 자료를 위해 본원에 참조로 인용된다].
PhtD 폴리펩타이드에 대한 완전한 인간 항체 및 인간화 항체가 본원에 기재된 방법에 사용될 수 있다. 인간화 항체는 인간 면역글로불린(수용자 항체)을 포함하는데, 상기 수용자의 상보성 결정 영역(CDR)으로부터의 잔기는 목적하는 특이성, 친화력 및 능력을 갖는 비인간 종(공여자 항체), 예를 들어, 마우스, 래트 또는 래빗의 CDR로부터의 잔기로 대체된다. 일부 경우에서, 인간 면역글로불린의 Fv 골격부(framework) 잔기는 상응하는 비인간 잔기로 대체된다. 예방접종시에 완전한 목록의 인간 항체(즉, 완전한 인간 항체)를 생산할 수 있는 유전자 삽입(transgenic) 동물이 이용될 수도 있다. 키메라 및 생식선(germ-line) 돌연변이 마우스에서 항체 중쇄 결합 영역(J(H)) 유전자의 동형접합성(homozygous) 결실은 내인성(endogenous) 항체 생산의 완전한 억제를 유도한다. 이러한 생식선 돌연변이 마우스에서 인간 생식선 면역글로불린 유전자 배열의 전달은 결과적으로 항원 공격시 인간 항체의 생산을 유도한다[문헌 참조: Jakobovits et al., PNAS USA, 90:2551-2555 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993)]. 인간 항체는 또한 파지 디스플레이 라이브러리에서 생산될 수 있다[문헌 참조: Hoogenboom et al., J. Mol, Biol, 227:381 (1991); Marks et al., J, Mol. Biol, 222:581 (1991)]. 또한, 코트 등 및 보너 등의 기술은 인간 단일클론 항체의 제조 방법을 개시하고 있다[문헌 참조: Cole, et al., "The EBV-hybridoma technique and its application to human lung cancer." In, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Volume 27, Reisfeld and Sell, eds., pp. 77-96, Alan R. Liss, Inc., New York, N.Y., (1985); Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991)]. 이들 문헌들은 그 전문이 본원에 기재된 방법을 위해 참조로 인용된다.
본원에 사용된 항체 단편은 하이브리드 단편을 포함하여, F(ab')2, Fab' 및 Fab 단편을 포함한다. 이러한 항체 단편은 특이적인 PhtD 폴리펩타이드에 결합하는 능력을 보유한다. PhtD 폴리펩타이드에 대하여 목적하는 특이성을 갖는 단일클론 F(ab) 단편을 신속하고 효과적으로 식별할 수 있게 하는 방법은 (ab) 발현 라이브러리[문헌 참조: Huse, et al., 1989 Science 246: 1275-1281]를 구축하는데 사용된다. 폴리펩타이드에 대한 유전형을 포함하는 항체 단편은 (i) 항체 분자의 펩신 분해에 의해 생산된 F(ab')2 단편; (ii) F(ab')2 단편의 이황화 브릿지를 환원시켜 생성된 Fab 단편; (iii) 파파인 및 환원제로 항체 분자를 처리하여 생성된 F(ab) 단편; 및 (iv) F(v) 단편을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는 당업계에 공지된 기술에 의해 생산될 수 있다.
PhtD의 면역원성 폴리펩타이드 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물은 본원에 기재되어 있다. 임의로, 조성물은 보조제를 추가로 포함한다. 면역원성 폴리펩타이드를 포함하는 조성물은, 예를 들어, 면역원성 스트렙토코쿠스 폴리펩타이드, 또는 PspA, NanA, PsaA, 뉴몰리신, PspC의 면역원성 단편, 또는 이들의 임의의 배합물을 포함하여 다른 면역원성 폴리펩타이드의 배합물을 포함할 수도 있다.
임의로, 본원에 기재된 조성물은 점막 표면에 투여하기에 적합하다. 조성물은 비강내 분무기 용액, 연무기 용액 또는 에어로졸 흡입제일 수 있다. 따라서, 조성물은 용기에 존재할 수도 있으며, 당해 용기는 비강내 분무기, 연무기 또는 흡입기일 수도 있다.
약제학적으로 허용되는 담체란 임의의 바람직하지 못한 생물학적 효과를 일으키거나 약제학적 조성물에 포함된 임의의 다른 성분과 해로운 방식으로 상호작용하지 않는 생물학적으로 바람직한 물질, 즉 PhtD의 면역원성 단편과 함께 피검체에 투여될 수도 있다. 담체는 당업자에게 널리 공지된 바와 같이 물론 환자에서 활성 성분의 임의의 분해를 최소화하고 임의의 부작용을 최소화하도록 선택된다.
적합한 담체 및 이들의 제형은 문헌[참조: Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, David B. Troy, ed., Lippicott Williams & Wilkins (2005)]에 기재되어 있다. 전형적으로, 적절한 양의 약제학적으로 허용되는 염은 제형에 사용되어 상기 제형을 등장성이 되도록 한다. 약제학적으로 허용되는 담체의 예는 멸균수, 식염수, 링거액과 같은 완충용액 및 덱스트로스 용액을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 용액의 pH는 일반적으로 약 5 내지 약 8, 또는 약 7 내지 약 7.5이다. 기타 담체는 면역원성 PhtD 폴리펩타이드를 함유하는 서방형 제제, 예를 들어, 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함한다. 매트릭스는 성형품, 예를 들어, 필름, 리포좀 또는 미세입자의 형태이다. 특정 담체는, 예를 들어, 투여 대상 조성물의 투여 경로 및 농도에 따라 더욱 선호될 수도 있음은 당업자에게 자명할 것이다. 담체는 인간 또는 다른 피검체에 PhtD 면역원성 단편을 투여하기에 적합한 것이다.
약제학적 조성물은 면역원성 폴리펩타이드 이외에, 담체, 증점제, 희석제, 완충제, 보존제, 표면 활성제, 보조제, 면역자극제를 포함할 수도 있다. 또한, 약제학적 조성물은 활성 성분, 예를 들어, 항생제, 항염증제 및 마취제를 하나 이상 포함할 수도 있다. 보조제는 또한 PhtD에 대한 면역 반응을 자극하거나 증강하도록 포함될 수도 있다. 보조제의 적합한 그룹의 비제한적인 예는 다른 것들 중에서도 겔형 보조제, 즉 수산화알루미늄/포스페이트("알루미늄 보조제"), 인산칼슘, 미생물 기원[뮤라밀 디펩타이드(MDP)], 세균 외독소[콜레라 독소(CT), 토종 콜레라 톡신 아단위 B(CTB), 이.콜라이(E. coli) 불안정 독소(LT), 백일해 독소(PT), CpG 올리고뉴클레오타이드, BCG 서열, 파상풍 톡소이드, 예를 들어, 이.콜라이, 살모넬라 미네소타(Salmonella minnesota), 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium) 또는 시겔라 엑스세리(Shigella exseri)의 모노포스포릴 지질 A(MPL)], 미립자 보조제(생분해성, 중합체 미세구), 면역자극성 복합체(ISCOM), 유성 에멀젼 및 계면활성제계 보조제[프로인트(Freund) 불완전 면역보강제(FIA), 미세유동화 에멀젼(MF59, SAF), 사포닌(QS-21)], 합성[뮤라밀 펩타이드 유도체(뮤라뷰타이드, 트레오니-MDP), 비이온성 블록 공중합체(L121), 폴리포스파젠(PCCP), 합성 폴리뉴클레오타이드(폴리 A:U, 폴리 I:C), 탈리도마이드 유도체(CC-4407/ACTIMID)], RH3-리간드 또는 폴리락티드 글리콜라이드(PLGA) 미세구를 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 또한, 상기 독소들의 임의의 절편, 동족체, 유도체 및 융합물도 보조제 활성을 유지하고 있는 한 적합하다. 보조제의 적합한 돌연변이체 또는 변이체는, 예를 들어, 국제 공개공보 제WO 95/17211호(Arg-7-Lys CT 돌연변이체), 제WO 96/6627호(Arg-192-Gly LT 돌연변이체) 및 제WO 95/34323호(Arg-9-Lys 및 Glu-129-Gly PT 돌연변이체)에 개시되어 있다. 본 발명의 방법 및 조성물에서 사용될 수 있는 추가의 LT 돌연변이체는, 예를 들어, Ser-63-Lys, Ala-69-Gly, Glu-110-Asp 및 Glu-112-Asp 돌연변이체를 포함한다.
금속염 보조제, 예를 들어, 알루미늄 보조제는 보조제 활성을 갖는 안정한 부형제를 제공하는 것으로 당업계에 널리 공지되어 있다. 이러한 보조제의 작용 기작은 항원이 투여 후 3주 동안 주입 부위에 머무를 수 있도록 항원 데포(depot)를 형성하고, 또한 항원 제시 세포에 의해 더욱 용이하게 수용되는 항원/금속염 복합체를 형성하는 것을 포함하는 것으로 생각된다. 알루미늄 이외에, 아연, 칼슘, 세륨, 크롬, 철 및 베릴륨의 염을 포함하여, 다른 금속성 염은 항원을 흡착시키는데 사용되어 왔다. 알루미늄의 수산화물 및 인산염이 가장 일반적이다. 알루미늄 염, 항원 및 추가의 면역자극제를 함유하는 제형 또는 조성물은 당업계에 공지되어 있다. 면역자극제의 예는 3-데-O-아실화 모노포스포릴 지질 A(3D-MPL)이다.
하나 이상의 사이토카인은 또한 본 발명의 조성물 내에 함유된 폴리펩타이드 또는 핵산에 의해 암호화된 것으로서 본 발명을 실시하는데 적합한 공동 자극 성분일 수 있다[문헌 참조: Parmiani, et al. Immunol Lett 2000 Sep 15; 74(1): 41-43; Berzofsky, et al. Nature Immunol. 1: 209-219]. 적합 사이토카인은, 예를 들어, 인터루킨-2(IL-2)[문헌 참조: Rosenberg, et al. Nature Med. 4: 321-327 (1998)], IL-4, IL-7, IL-12[문헌 참조: Pardoll, 1992; Harries, et al. J. Gene Med. 2000 Jul-Aug; 2(4): 243-249; Rao, et al. J. Immunol. 156: 3357-3365 (1996)], IL-15[문헌 참조: Xin, et al. Vaccine, 17: 858-866, 1999], IL-16[문헌 참조: Cruikshank, et al. J. Leuk Biol. 67(6): 757-766, 2000], IL-18[문헌 참조: J. Cancer Res. Clin. Oncol. 2001. 127(12): 718-726], GM-CSF[CSF (Disis, et al. Blood, 88: 202-210 (1996))], 종양 괴사 인자 알파(TNF-α) 또는 인터페론 감마(INF-γ)를 포함한다. 당업계에 공지된 기타 사이토카인도 또한 본 발명을 실시하는데 적합할 수 있다.
케모카인은 또한 면역 반응을 유도하거나 증강시키는데 보조로서 사용될 수도 있다. 예를 들어, 종양 자가 항원에 융합된 CXCL10 (IP-10) 및 CCL7 (MCP-3)을 포함하는 융합 단백질은 항종양 면역성을 유도하는 것으로 밝혀졌다[문헌 참조: Biragyn, et al. Nature Biotech. 1999, 17: 253-258]. 케모카인 CCL3 (MIP-1α) 및 CCL5 (RANTES)[문헌 참조: Boyer, et al. Vaccine, 1999, 17. (Supp. 2): S53-S64]는 또한 본 발명을 실시하는데 사용될 수도 있다. 기타 적합한 케모카인은 당업계에 공지되어 있다.
특정 태양에서, 표적 면역원은 핵산 분자 단독으로, 또는 전달 비히클, 예를 들어, 바이러스 벡터의 일부로서 이용될 수도 있다. 이러한 경우, 본 발명의 조성물에서 표적 면역원을 하나 이상의 공동 자극 성분(들), 예를 들어, 세포 표면 단백질, 사이토카인 또는 케모카인과 배합하는 것이 유리할 수도 있다. 공동 자극 성분은, 예를 들어, 폴리펩타이드 또는 당해 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산으로서 조성물 내에 포함될 수도 있다. 적합한 공동 자극 분자는, 예를 들어, CD28 계열의 일원[즉, CD28, ICOS; 문헌 참조: Hutloff, et al. Nature 1999, 397: 263-265; Peach, et al. J Exp Med 1994, 180: 2049-2058]에 결합하는 폴리펩타이드, 예를 들어, CD28 결합 폴리펩타이드 B7.1[CD80; 문헌 참조: Schwarz, 1992; Chen et al, 1992; Ellis, et al. J. Immunol., 156 (8): 2700-2709], B7.2[CD86; 문헌 참조: Ellis, et al. J. Immunol., 156 (8): 2700-2709]; ICAM 계열의 일원(즉, ICAM-1, -2 또는 -3)을 포함하여, 인테그린 계열의 일원[즉, LFA-1(CD1la/CD18); 문헌 참조: Sedwick, et al. J Immunol 1999, 162: 1367-1375; Wulfing, et al. Science 1998, 282: 2266-2269; Lub, et al. Immunol Today 1995, 16: 479-483]에 결합하는 폴리펩타이드; CD2 계열의 일원[즉, CD2, 시그널전달 림프구 활성화 분자 (CDw150 또는 "SLAM"; 문헌 참조: Aversa, et al. J Immunol 1997, 158: 4036-4044)]에 결합하는 폴리펩타이드, 예를 들어, CD58 [LFA-3; CD2 리간드; 문헌 참조: Davis, et al. Immunol Today 1996, 17: 177-187] 또는 SLAM 리간드[문헌 참조: Sayos, et al. Nature 1998, 395: 462-469]; 열 안정성 항원[HSA 또는 CD24; 문헌 참조: Zhou, et al. Eur J Immunol 1997, 27: 2524-2528]에 결합하는 폴리펩타이드; TNF 수용체 (TNFR) 계열의 일원[즉, 4-1BB (CD137; 문헌 참조: Vinay, et al. Semin Immunol 1998, 10: 481-489), OX40 (CD134; 문헌 참조: Weinberg, et al. Semin Immunol 1998, 10: 471-480; Higgins, et al. J Immunol 1999, 162: 486-493) 및 CD27[문헌 참조: Lens, et al. Semin Immunol 1998, 10: 491-499)], 예를 들어, 4-1BBL[4-1BB 리간드; 문헌 참조: Vinay, et al. Semin Immunol 1998, 10: 481-48; DeBenedette, et al. J Immunol 1997, 158: 551-559), TNFR 관련 인자-1[TRAF-1; 4-1BB 리간드; 문헌 참조: Saoulli, et al. J Exp Med 1998, 187: 1849-1862, Arch, et al. Mol Cell Biol 1998, 18: 558-565], TRAF-2[4-1BB 및 OX40 리간드; 문헌 참조: Saoulli, et al. J Exp Med 1998, 187: 1849-1862; Oshima, et al. Int Immunol 1998, 10: 517-526, Kawamata, et al. J Biol Chem 1998, 273: 5808-5814], TRAF-3[4-1BB 및 OX40 리간드; 문헌 참조: Arch, et al. Mol Cell Biol 1998, 18: 558-565; Jang, et al. Biochem Biophys Res Commun 1998, 242: 613-620; Kawamata S, et al. J Biol Chem 1998, 273: 5808-5814], OX40L[OX40 리간드; 문헌 참조: Gramaglia, et al. J Immunol 1998, 161: 6510-6517], TRAF-5[OX40 리간드; 문헌 참조: Arch, et al. Mol Cell Biol 1998, 18: 558-565; Kawamata, et al. J Biol Chem 1998, 273: 5808-5814] 및 CD70[CD27 리간드; 문헌 참조: Couderc, et al. Cancer Gene Ther., 5(3): 163-75]을 포함한다. CD 154[CD40 리간드 또는 "CD40L"; 문헌 참조: Gurunathan, et al. J. Immunol., 1998, 161: 4563-4571; Sine, et al. Hum. Gene Ther., 2001, 12: 1091-1102]도 또한 적합할 수 있다. 공동 자극 분자 이외의 자극 모티프는 그 자체로 CpG 모티프와 같은 TA를 암호화하는 핵산으로 도입될 수도 있다[문헌 참조: Gurunathan, et al. Ann. Rev. Immunol., 2000, 18: 927-974]. 이들 시약, 방법 및 당업자에 의해 공지된 것들은 본 발명을 실시하는데 이용될 수도 있다.
본 발명의 실질적으로 무독성의 생물학적 활성 보조제의 다른 예는, 호르몬, 효소, 성장 인자 또는 이의 생물학적 활성 부분을 포함한다. 이러한 호르몬, 효소, 성장 인자 또는 이의 생물학적 활성 부분은, 예를 들어, 인간, 소, 돼지, 양, 개, 고양이, 말 또는 조류로부터 기원할 수 있으며, 종양 괴사 인자(TNF), 프롤락틴, 상피 성장 인자(EGF), 과립구 집락 자극 인자(GCSF), 인슐린 유사 성장 인자(IGF-1), 소마토트로핀(성장 호르몬) 또는 인슐린, 또는 수용체가 면역계 세포에서 발현되는 임의의 다른 호르몬 또는 성장 인자일 수 있다.
본원에 기재된 면역원성 폴리펩타이드의 제조 방법 및 사용 방법, 및 당해 방법에 유용한 조성물이 제공된다. 폴리펩타이드는 표준 분자 생물학 기술 및 발현 시스템을 이용하여 생산될 수 있다[문헌 참조: Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Third Edition by Sambrook et al., Cold Spring Harbor Press, 2001]. 예를 들어, 면역원성 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자의 단편은 분리될 수도 있고, 면역원성 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 시판중인 임의의 발현 벡터[예를 들어, pBR322 및 pUC 벡터(New England Biolabs, Inc., Ipswich, MA)] 또는 발현/정제 벡터[예를 들어, GST 융합 벡터(Pfizer, Inc., Piscataway, N.J.)]내로 클로닝된 후, 적합한 원핵세포, 바이러스 또는 진핵세포 숙주내에서 발현될 수 있다. 이어서, 정제는 통상의 수단에 의해 또는 제조업자의 사용 설명서(상업적 발현/정제 시스템의 경우)에 따라 이루어질 수 있다.
폐렴구균성 폐렴과 다른 형태의 폐렴을 구별하는 PhtD 발현의 검출 방법이 제공된다. 이 세상에서 뉴모코쿠스의 주요 병원소는 인간 비강내 캐리지에 존재한다. 감염 획득은 일반적으로 담체로부터 이루어지고, 비강내 캐리지는 항상 감염에 선행한다. 비강인두의 집락형성은 하기도, 부비강 및 중이에 뉴모코쿠스의 확산을 위한 필요조건으로 간주된다.
뉴모코쿠스 백신의 효능을 측정하기 위해, 어떤 피검체가 폐렴구균성 폐렴을 갖는지를 아는 것이 필요하다. 폐렴 진단의 표준 절차는 X 레이 또는 스트렙토코쿠스 뉴모니애에 대한 기타 진단성 양성 혈액 배양에 의해 이루어진다. 이러한 기준을 만족하는 피검체는 폐렴구균성 폐렴을 갖는 것으로 추정한다. 불행하게도, 폐렴에 걸린 환자의 15 내지 25%만이 세균혈증을 갖는 것으로 추정되기 때문에, 이러한 방법은 폐렴구균성 폐렴에 걸린 환자의 75 내지 85%를 배제한다[문헌 참조: Fedson, et al., Vaccine 17:Suppl. 1:S11-18 (1999); Ostergaard and Andersen, Chest 104:1400-1407 (1993)]. 이러한 문제를 해결하는 하나의 접근법은 소변에서 세포벽 다당류를 검출하는 항원 검출 검정법을 사용하는 것이다. 이러한 검정법은 훨씬 더욱 민감하지만 불행하게도 성인의 12% 및 아동의 60% 이하에서 거짓 양성을 나타낸다. 이는 검정법의 표적이 폐 또는 혈액에서 폐렴구균성 질병에 걸리지 않은 환자에서 뉴모코쿠스의 비강내 군락형성으로 인해 소변에서 종종 존재하기 때문이다. 따라서, 피검체 유래의 시료에서 PhtD의 존재를 검출하는 단계를 포함하는, 피검체에서 폐렴구균성 폐렴을 검출하는 방법도 또한 본원에서 제공되며, 당해 PhtD의 존재는 피검체에서 폐렴구균성 세균을 나타낸다. PhtD의 농도는 당업자에게 공지된 방법에 의해 생물학적 시료, 예를 들어, 체액으로 검정할 수 있다. 당해 방법에 사용하기 위한 적합한 체액은 혈액, 혈청, 점액 및 소변을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다.
PhtD의 면역원성 단편, 또는 이의 유도체 또는 변이체를 피검체에 투여하는 단계를 포함하는, 피검체에서 폐렴구균성 감염의 위험을 감소시키는 방법도 또한 본원에 기재된다. 폐렴구균성 감염증은, 예를 들어, 수막염, 중이염, 폐렴, 패혈증 또는 용혈성 요독증을 포함한다. 따라서, 이러한 감염증의 임의의 하나 이상의 위험은 본원에 기재된 방법에 의해 감소될 수도 있다.
PhtD 폴리펩타이드를 포함하는 조성물은 비강내 투여 또는 호흡계의 임의의 부분에 대한 투여를 포함하여, 경구, 비경구(예를 들어, 정맥내), 근육내, 복강내, 경피 또는 국소로 투여될 수 있다. 본원에 사용된 호흡계에 대한 투여는 분무 주입법 또는 삽관법을 통해 분무 기작 또는 점적 기작에 의한 전달을 포함하여, 한쪽 또는 양쪽의 비강 또는 구강을 통해 코 및 비강내로의 조성물의 전달을 의미한다.
조성물 및 PhtD 폴리펩타이드의 정확한 요구량은 종, 연령, 체중 및 피검체의 전반적인 상태, 사용되는 폴리펩타이드 및 이의 투여 양상에 따라, 피검체마다 달라진다. 따라서, 모든 조성물에 대하여 정확한 양을 특정하는 것은 불가능하다. 그러나, 적합한 양은 본원의 상세한 설명에 따라 당업자에 의해 결정될 수 있다. 또한, 예를 들어, 초회 투여 및 추가 투여를 포함하는 PhtD 폴리펩타이드의 다중 투여가 사용될 수 있다.
용어 "항체" 또는 "항체들"은 정제되지 않거나 부분 정제된 형태(즉, 하이브리도마 상청액, 복수, 다클론 항혈청) 또는 정제된 형태로 항체 전체 또는 단편을 포함한다. "정제된" 항체는 초기에 함께 발견된(즉, 하이브리도마 상청액 또는 복수 제제의 부분으로서) 단백질의 약 50% 이상으로부터 분리된 항체이다. 바람직하게는, 정제된 항체는 초기에 함께 발견된 단백질의 약 60% 이상, 약 75% 이상, 약 90% 이상 또는 약 95% 이상으로부터 분리된 항체이다. 적합한 유도체는 당업계에 공지된 단편[즉, Fab, Fab2 또는 단일 쇄 항체(예를 들어, Fv)]을 포함할 수도 있다. 당해 항체들은, 예를 들어, 쥐(즉, 마우스 하이브리도마 세포에 의해 생산)를 포함하거나 인간화 항체, 키메라 항체, 인간 항체 등으로서 발현된 임의의 적합한 기원 또는 형태일 수도 있다.
각종 유형의 항체의 제조 방법 및 사용 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있으며, 본 발명을 실시하는데 적합하다[문헌 참조: Harlow, et al. Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988; Harlow, et al. Using Antibodies: A Laboratory Manual, Portable Protocol No. 1, 1998; Kohler and Milstein, Nature, 256: 495 (1975); Jones et al. Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al. Nature, 332: 323-329 (1988); Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596 (1992); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988); Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 227: 381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991); Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol., 147(1): 86-95 (1991); Marks et al., Bio/Technology 10, 779-783(1992); Lonberg et al., Nature 368, 856-859 (1994); Morrison, Nature 368, 812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13, 65-93 (1995); 및 미국 특허 제4,816,567호; 제5,545,807호; 제5,545,806호; 제5,569,825호; 제5,625,126호; 제5,633,425호; 및 제5,661,016호]. 특정 용도에서, 당해 항체들은 하이브리도마 상청액 또는 복수 내에 포함될 수 있으며, 표준 기술을 사용하여 그 자체로 직접 또는 하기 농도로 사용될 수 있다. 기타 용도에서, 당해 항체들은, 예를 들어, 염 분획화 및 이온 교환 크로마토그래피, 또는 고체 지지체, 예를 들어, 아가로스 비드에 공유결합된 단백질 A, 단백질 G, 단백질 A/G 및/또는 단백질 L 리간드를 사용하는 친화성 크로마토그래피, 또는 이들 기술의 조합을 사용하여 추가로 정제될 수도 있다. 항체는 냉동 제제(즉, -20℃ 또는 -70℃), 동결건조 형태 또는 통상의 냉장 상태(즉, 4℃)를 포함하여 임의의 적합한 형식으로 저장될 수도 있다. 액체 형태로 저장되는 경우, 적합한 완충액, 예를 들어, 트리스 완충된 식염수(TBS) 또는 포스페이트 완충된 식염수(PBS)를 사용하는 것이 바람직하다.
항체의 예로는 특허 절차 목적의 미생물 기탁의 국제적 승인을 위한 부다페스트 조약의 조건하에 미국 버지니아주 20110-2209 마나사스 유니버시티 블러바드 10801에 소재하는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC)에 XXXXX자로 기탁되고, 특허 기탁 지정 XXXXX을 부여받은 마우스 하이브리도마에 의해 제조된 단일클론 항체 1B12; 특허 절차 목적의 미생물 기탁의 국제적 승인을 위한 부다페스트 조약의 조건하에 미국 버지니아주 20110-2209 마나사스 유니버시티 블러바드 10801에 소재하는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC)에 XXXXX자로 기탁되고, 특허 기탁 지정 XXXXX을 부여받은 마우스 하이브리도마에 의해 제조된 4D5; 및 특허 절차 목적의 미생물 기탁의 국제적 승인을 위한 부다페스트 조약의 조건하에 미국 버지니아주 20110-2209 마나사스 유니버시티 블러바드 10801에 소재하는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC)에 XXXXX자로 기탁되고, 특허 기탁 지정 XXXXX을 부여받은 마우스 하이브리도마에 의해 제조된 9E11이 포함된다. 복수, 다클론 항혈청 또는 이들 항체를 함유하는 기타 제제를 포함하여, 기타 항체들도 또한 고려된다.
상기 항체들을 포함하는 제제는 하이브리도마 상청액 또는 복수 제제와 같은 정제되지 않은 항체, 부분 정제된 제제 또는 정제된 제제를 포함할 수도 있다. 따라서, 순도 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 75% 이상, 약 90% 이상 또는 약 95% 이상으로 정제된 항체를 포함하는 항체 제제도 본원에 제공된다. 통상적으로, 이러한 제제는 완충액, 예를 들어, 포스페이트 또는 트리스 완충된 식염수(각각 PBS 또는 TBS)를 포함한다. 단편[Fab, Fab2 또는 단일 쇄 항체(예를 들어, Fv)], 인간화 항체, 키메라 항체, 인간 항체 등을 포함하는 이들 항체의 유도체도 또한 제공된다. 항체의 가변 및 과가변 부위를 암호화하는 유전자는 또한 특정 항체 제제(즉, 인간화 항체)를 생산하기 위해 발현 벡터 내로 클로닝된 당해 유전자를 발현하는 하이브리도마로부터 분리될 수 있다. 이러한 제제의 제조 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다.
당업자는 항체에 결합하는 단백질을 함유하는 생물학적 시료를 확인하기 위해 본원에 기재된 항체를 사용하기 위한 다수의 적합한 기술을 가지고 있다. 예를 들어, 당해 항체들은, 예를 들어, 면역 침전법 또는 기타 포획 유형 검정법을 사용하여 PhtD 단백질을 분리하는데 이용될 수도 있다. 이러한 널리 공지된 기술은 항체를 고체 지지체 또는 크로마토그래피 재료(즉, 단백질 A, 단백질 G 및/또는 단백질 L로 피복된 비드)에 부착시킴으로써 수행된다. 이어서, 부착된 항체는 PhtD 단백질을 함유하거나 함유하는 것으로 생각되는 용액에 도입된다. 이어서, PhtD 단백질은 항체에 결합하고, 비결합성 물질은 PhtD 단백질이 항체에 결합을 유지하는 조건하에 씻겨 내려간다. 이어서, 결합된 단백질은 항체로부터 분리될 수도 있고, 경우에 따라 분석될 수도 있다. 항체를 사용하여 단백질을 분리하는 유사한 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다.
당해 항체는 생물학적 시료 내에서 PhtD 단백질을 검출하는데 이용될 수도 있다. 예를 들어, 당해 항체는 검정법, 예를 들어, 유동 세포 분석법, ELISA, 면역 블롯법(즉, 웨스턴 블롯), 동일 반응계에서의 검출, 면역 세포 화학 및/또는 면역 조직 화학에서 사용될 수도 있다.
항체의 사용에서 당업자를 보조하기 위해, 당해 항체는 키트 형식으로 제공될 수도 있다. 1B12, 4D5 및/또는 9E11을 함유하고, PhtD를 발현하는 세포를 검출하는 항체를 사용하는데 필요한 기타 성분을 임의로 포함하는 키트가 제공된다. 키트의 항체는 냉동, 동결건조 또는 약제학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어, TBS 또는 PBS를 포함하는 임의의 적합한 형태로 제공될 수도 있다. 키트는 시험관내 또는 생체내의 항체를 이용하는데 필요한 기타 시약, 예를 들어, 완충액(즉, TBS 또는 PBS), 차단제(탈지분유, 정상 혈청, 트윈 20 계면 활성제, BSA 또는 카제인을 포함하는 용액) 및/또는 검출 시약[즉, 염소 항마우스 IgG 비오틴, 스트렙트아비딘-HRP 결합체, 알로피코시아닌, B-피코에리트린, R-피코에리트린, 퍼옥시다제, 플루오(fluor)(즉, DyLight Cy3, Cy5, FITC, HiLyte Fluor 555, HiLyte Fluor 647) 및/또는 염색 키트(즉, ABC 염색 키트, Pierce)]을 포함할 수도 있다. 당해 키트는 기타 시약 및/또는 상기 기재된 일반적으로 이용되는 검정법, 예를 들어, 유동 세포 분석법, ELISA, 면역 블롯법(즉, 웨스턴 블롯), 동일 반응계에서의 검출, 면역 세포 화학 및 면역 조직 화학에서 항체를 사용하기 위한 사용 설명서를 포함할 수도 있다.
하나의 양태에서, 당해 키트는 항체를 정제 형태로 제공한다. 또 다른 양태에서, 항체들은 단독으로 또는 아비딘 결합 검출 시약(즉, 항체)과 함께 비오틴화 형태로 제공된다. 또 다른 양태에서, 당해 키트는 PhtD 단백질을 직접 검출하는데 사용될 수도 있는 형광 표지 항체를 포함한다. 이들 시스템 중의 어느 하나를 사용하는데 필요한 완충액 등은 당업계에 널리 공지되어 있으며, 최종 사용자에 의해 제조되거나 당해 키트의 성분으로서 제공될 수도 있다. 당해 키트는 양성 및 음성 대조군 단백질 및/또는 조직 시료를 포함하는 고체 지지체를 포함할 수도 있다. 예를 들어, 스폿팅 또는 웨스턴 블롯 유형 검정법을 수행하기 위한 키트는 예비 고정된 대조군 시료와 실험 시료용 추가 공간을 함유하는 SDS-PAGE 또는 나일론 또는 기타 막에서 사용하기 위한 대조군 세포 또는 조직 용해물을 포함할 수도 있다. 슬라이드 상의 세포에서 PhtD의 시각화용 키트는 대조군 세포 또는 조직 시료와 실험 시료용 추가 공간을 포함하는 예비 형식화된 슬라이드를 포함할 수도 있다.
당해 항체 및/또는 이의 유도체는 시험관내 또는 생체내에서 사용하기 위해 본 발명의 조성물 내에 혼입될 수도 있다. 당해 항체 및/또는 이의 유도체는 다른 것들 중에서도 관능성 잔기, 예를 들어, 세포독성 약물 또는 독소, 또는 이의 활성 단편, 예를 들어, 디프테리아 A 쇄, 외독소 A 쇄, 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 쿠르신, 크로틴, 페노마이신, 에노마이신에 결합될 수도 있다. 관능성 잔기는 방사성 시약을 포함할 수도 있다.
본원에 기재된 항체는 약물 스크리닝 검정법에서 시약으로서 사용할 수도 있다. 당해 시약은 환자의 생물학적 시료에서 스트렙토코쿠스 종 세균의 존재에 대한 약물 후보자의 효과를 확인하는데 사용될 수도 있다. 발현 프로파일링 기술은 유용한 화합물을 신속하게 확인하고 약물 후보자에 의한 처리의 유효성을 모니터링하기 위해 고처리율의 스크리닝 기술과 혼용될 수도 있다[문헌 참조: Zlokarnik, et al., Science 279, 84-88 (1998)]. 약물 후보자는 천연 또는 합성에 의한 화학적 화합물, 핵산, 단백질, 항체 또는 이의 유도체일 수 있다. 이렇게 확인된 약물 후보자는 다른 용도 중에서도 환자에 투여하거나 추가의 스크리닝 검정법에 사용하기 위한 약제학적 조성물로서 이용될 수도 있다.
본원에 기재된 항체들은 주사용 제제, 예를 들어, 비경구적으로 허용되는 무독성의 희석제 또는 용매 중의 현탁액으로 제조될 수도 있다. 사용될 수 있는 적합한 비히클 및 용매는 다른 것들 중에서도 물, 링거액 및 등장성 염화나트륨 용액, TBS 및 PBS를 포함한다. 특정 용도에서, 당해 항체들은 시험관내에 사용하기에 적합하다. 다른 용도에서, 당해 항체들은 싱체내에 사용하기에 적합하다. 어느 경우에나 사용하기에 적합한 제제는 당업계에 널리 공지되어 있으며, 특정 용도에 따라 다양하다.
본 명세서 및 첨부된 특허청구의 범위에 사용된 단수형은 문맥이 명백하게 달리 명시하지 않는 한 복수형을 포함하는 것으로 유의하여야 한다. 따라서, 예를 들어, 항원 단편에 대한 언급은 항원 단편들의 혼합물을 포함하며, 약제학적 담체 또는 보조제에 대한 언급은 2개 이상의 당해 담체 또는 보조제의 혼합물을 포함한다.
본원에 사용된 피검체 또는 숙주는 개체를 의미한다. 피검체는 길들여진 동물, 예를 들어, 고양이와 개, 가축(예를 들어, 소, 말, 돼지, 양 및 염소), 실험실 동물(예를 들어, 마우스, 래빗, 래트, 기니아 피그) 및 새를 포함할 수 있다. 하나의 양태에서, 피검체는 포유동물, 예를 들어, 영장류 또는 인간이다.
용어 "임의의" 또는 "임의로"는 후속적으로 기재된 현상 또는 상황이 발생하거나 발생하지 않음을 의미하며, 이러한 기재는 당해 현상 또는 상황이 발생하는 경우 및 발생하지 않는 경우를 포함함을 의미한다. 예를 들어, "조성물은 배합물을 임의로 포함할 수 있다"는 당해 기재가 배합물(즉, 배합물의 개별 구성성분들)의 존재 및 부재 둘 모두를 포함하도록 당해 조성물이 상이한 분자들의 배합물을 포함하거나 배합물을 포함하지 않을 수도 있음을 의미한다.
범위는 본원에서 한 특정 값의 대략치로부터 및/또는 또 다른 특정 값의 대략치까지로 표현될 수도 있다. 이러한 범위가 표기되는 경우, 또 다른 양태는 한 특정 값으로부터 및/또는 다른 특정 값까지 포함한다. 유사하게, 값을 선행된 "약"의 사용에 의해 대략치로 표기하는 경우, 특정 값은 또 다른 양태를 형성하는 것으로 이해된다. 상기 범위 각각의 종결점은 다른 종결점과 관련되어, 그리고 다른 종결점과 독립적으로, 유의한 것으로 추가로 이해된다.
용어 "예방하다", "예방하는" 및 "예방"이 소정의 질환에 대한 소정의 치료와 관련하여 사용되는 경우(예를 들어, 스트렙토코쿠스 종에 의한 감염을 예방하는), 이러한 용어들은 치료된 환자가 당해 질환을 임상적으로 관찰가능한 수준으로 전혀 발전시키지 않거나, 치료를 받지 않은 경우에 비해 당해 질환을 서서히 발전시키고/거나 더욱 적은 정도로 발전시킨다는 것을 의미한다. 이러한 용어들은 환자가 아무런 질환의 양태를 경험하지 못한 임의의 상황에만 한정되지 아니한다. 예를 들어, 소정의 질환 증상을 일으킬 것으로 기대되는 자극에 환자가 노출되는 동안 치료가 주어지고, 그 결과 환자가 예상한 것과는 달리 더욱 적고/적거나 더욱 경증의 질환을 경험하게 되는 경우, 당해 치료는 당해 질환을 예방하는 것으로 언급된다. 치료는 환자가 오직 감염의 현시 경증만을 나타내도록 함으로써 감염을 "예방"할 수 있다; 이는 감염 미생물에 의한 임의의 세포 침투가 존재하지 않아야 한다는 것을 의미하지는 않는다.
유사하게, 소정의 치료와 함께 감염의 위험과 관련하여 본원에 사용된 용어 "감소시키다", "감소시키는" 및 "감소"(예를 들어, 폐렴구균성 감염의 위험을 감소시키는)는 치료(예를 들어, 면역원성 폴리펩타이드의 투여)의 부재시 감염증을 발전시키는 대조군 또는 기저 수준과 비교하여 피검체가 감염증을 더욱 서서히 또는 더욱 적은 수준으로 발전시킨다는 것을 의미한다. 감염의 위험 감소는 환자가 오직 감염의 현시 경증만을 나타내거나 감염의 증상 지연을 나타낼 수 있다; 이는 감염 미생물에 의한 임의의 세포 침투가 존재하지 않아야 한다는 것을 의미하지는 않는다.
본 발명의 추가적인 양태 및 특징은 하기 비제한적인 실시예에서 제공된다.
실시예
상기 개시내용은 일반적으로 본 발명을 기술한다. 하기 특정 실시예를 참조하면, 더욱 완전한 이해가 달성될 것이다. 이들 실시예는 예시의 목적으로만 기재되며, 본 발명의 범위를 한정하도록 의도되지 않는다. 형태의 변환 및 등가물의 치환은 상황들이 방책을 제안하거나 제공할 수도 있기 때문에 예상된다. 특정 용어가 본원에 사용되지만, 이러한 용어는 기술적인 의미로 의도되며, 한정의 목적으로 의도되지는 않는다.
본 발명의 한 양태에서, ATCC 수탁번호 제55987호로서 1997년 6월 27일자로 기탁된 스트렙토코쿠스 뉴모니애 혈청형 6 균주 14453으로부터 유래되고/되거나 서열번호 1로 설명되는 서열을 갖는 분리 절단 PhtD 폴리펩타이드가 본원에 제공된다. 본 발명에 기재된 PhtD 절단체는 PhtB 영역과 유사한 단백질 영역 및 상이한 단백질 영역을 모두 포함함으로써 잠재적인 교차 반응성 항원결정기 및 독특한 항원결정기를 각각 함유한다. 절단 단백질은 정제를 용이하게 하기 위해 His 태그된 재조합 유도체로서 에세리키아 콜라이(Escherichia coli)에서 발현되며, Ni2+-NTA 친화성 크로마토그래피를 사용하여 후속적으로 정제될 수 있다.
실시예 1
재조합 PhtD 절단 단백질의 클로닝 및 생산
본 실시예는 발현된 생성물이 N 말단 6x His 태그를 갖도록 스트렙토코쿠스 뉴모니애 혈청형 6 균주 14453으로부터 유래된 phtD의 절단 버젼을 플라스미드 pET28a(+)에 클로닝시키는 것을 기술한다. PhtD의 절단 형태는 서열번호 2, 3 및 4(단백질)는 물론 서열번호 5, 7 및 9(DNA)에 도시된 바와 같이 N 말단 6x His 태그 없이 발현될 수도 있다.
본원에 기재된 서열을 증폭시키는데 사용된 프라이머는 하기 표 3에 나타낸다.
Figure 112010010902018-pct00014
절단체 #1
간단히, phtD T1 유전자는 하이 피델리티 어드밴티지(High Fidelity Advatage) 2 폴리머라제(BD)를 사용하여 스트렙토코쿠스 뉴모니애 혈청형 6 균주 14453 게놈으로부터 증폭된 PCR이다. PCR 프라이머 Spn0215 및 Spn0176은 NcoI 및 XhoI 제한 부위를 5' 및 3' 말단 내에 각각 도입하였다(표 3 참조). 5' 프라이머 Spn0215도 N 말단 His 태그를 도입하였다. QIA퀵(quick) PCR 정제 키트(Qiagen)를 사용하여 PCR 생성물을 정제하고, QIAEX 겔 추출 키트(Qiagen)를 사용하여 아가로스 겔로부터 후속적으로 정제하였다. PCR 생성물 및 pET28a(+) 벡터(Novagen)를 NcoI 및 XhoI로 분해시키고, QIAEX 겔 추출 키트(Qiagen)를 사용하여 아가로스 겔로부터 후속적으로 정제하였다. 이어서, T4 DNA 리가제(Invitrogen)를 사용하여 분해된 벡터와 유전자를 결합시켰다. 결합 혼합물을 화학 적격 이.콜라이 DH5α 내로 형질전환시키고, 50μg/ml 카나마이신을 함유하는 루리아 한천 상에 플레이팅함으로써 양성 클론을 선택하였다. 구성물당 4개의 콜로니를 선택하고, QIA프렙 스핀 미니프렙(QIAprep Spin Miniprep) 키트(Qiagen)를 사용하여 플라스미드 DNA를 분리하였다. 클론이 정확한 크기의 단편을 갖는지를 측정하기 위해 NcoI 및 XhoI 분해를 실시하였다. 4개의 클론 모두는 제한 분석에 따라 정확하였고, 이어서, QIA 필터 플라스미드 미디 키트(Qiagen)를 사용하여 하나의 양성 클론(#1)으로부터 미디프렙(Midiprep) DNA를 분리하여, 클로닝 인공물이 도입되지 않았음을 보장하기 위해 서열을 분석하였다. 당해 클론을 pBAC30으로 표기하였다.
PhtD T1은 SDS-PAGE 겔에서 약 56.1kDa의 정확한 크기의 강한 밴드로 보이는 바와 같이 이.콜라이 BL21(DE3)에서 높은 수준으로 발현되었다. 단백질 발현은 1mM IPTG에 의해 2시간 동안 유도되었다.
절단체 #2
phtD T2 유전자도 또한 하이 피델리티 어드밴티지 2 폴리머라제(BD)를 사용하여 스트렙토코쿠스 뉴모니애 혈청형 6 균주 14453 게놈으로부터 증폭된 PCR이다. PCR 프라이머 Spn0216 및 Spn0176은 NcoI 및 XhoI 제한 부위를 5' 및 3' 말단 내에 각각 도입하였다(표 3 참조). 5' 프라이머 Spn0216도 N 말단 His 태그를 도입하였다. QIA 퀵 PCR 정제 키트(Qiagen)를 사용하여 PCR 생성물을 정제하고, QIAEX 겔 추출 키트(Qiagen)를 사용하여 정제용 아가로스 겔 상에 후속적으로 정제하였다. PCR 생성물 및 pET28a(+) 벡터(Novagen)를 NcoI 및 XhoI로 분해시키고, QIAEX 겔 추출 키트(Qiagen)를 사용하여 아가로스 겔로부터 후속적으로 정제하였다. 이어서, T4 DNA 리가제(Invitrogen)를 사용하여 분해된 벡터와 유전자를 결합시켰다. 결합 혼합물을 화학 적격 이.콜라이 DH5α 내로 형질전환시키고, 50μg/ml 카나마이신을 함유하는 루리아 한천 상에 플레이팅함으로써 양성 클론을 선택하였다. QIA 프렙 스핀 미니프렙 키트(Qiagen)를 사용하여 선택된 클론으로부터 플라스미드 DNA를 분리하였다. 클론이 정확한 크기의 단편을 갖는지를 측정하기 위해 NcoI/XhoI 분해를 실시하였다. 이어서, QIA 필터 플라스미드 미디 키트(Qiagen)를 사용하여 하나의 양성 클론으로부터 미디프렙 DNA를 분리하여, 클로닝 인공물이 도입되지 않았음을 보장하기 위해 서열을 분석하였다. 당해 클론을 pBAC31로 표기하였다.
PhtD T2 단백질은 SDS-PAGE 겔에서 약 19.3kDa의 강한 밴드로 보이는 바와 같이 이.콜라이 BL21(DE3)에서 높은 수준으로 발현되었다. 단백질 발현은 1mM IPTG에 의해 2시간 동안 유도되었다.
절단체 #3
phtD T3 유전자도 또한 하이 피델리티 어드밴티지 2 폴리머라제(BD)를 사용하여 스트렙토코쿠스 뉴모니애 혈청형 6 균주 14453 게놈으로부터 증폭된 PCR이다. Spn0217 및 Spn0176은 NcoI 및 XhoI 제한 부위를 5' 및 3' 말단 내에 각각 도입하였다(표 3 참조). 5' 프라이머 Spn0217도 N 말단 His 태그를 도입하였다. QIA 퀵 PCR 정제 키트(Qiagen)를 사용하여 PCR 생성물을 정제하고, QIAEX 겔 추출 키트(Qiagen)를 사용하여 정제용 아가로스 겔 상에 후속적으로 정제하였다. PCR 생성물 및 pET28a(+) 벡터(Novagen)를 NcoI 및 XhoI로 분해시키고, QIAEX 겔 추출 키트(Qiagen)를 사용하여 아가로스 겔로부터 후속적으로 정제하였다. 이어서, T4 DNA 리가제(Invitrogen)를 사용하여 분해된 벡터와 유전자를 결합시켰다. 결합 혼합물을 화학 적격 이.콜라이 DH5α 내로 형질전환시키고, 50μg/ml 카나마이신을 함유하는 루리아 한천 상에 플레이팅함으로써 양성 클론을 선택하였다. 클론을 선택하고, QIA 프렙 스핀 미니프렙 키트(Qiagen)를 사용하여 플라스미드 DNA를 분리하였다. 클론이 정확한 크기의 단편을 갖는지를 측정하기 위해 NcoI/XhoI 분해를 실시하였다. 이어서, QIA 필터 플라스미드 미디 키트(Qiagen)를 사용하여 하나의 양성 클론으로부터 미디프렙 DNA를 분리하여, 클로닝 인공물이 도입되지 않았음을 보장하기 위해 서열을 분석하였다. 당해 클론을 pBAC32로 표기하였다.
PhtD T3 단백질은 SDS-PAGE 겔에서 약 16.7kDa의 강한 밴드로 보이는 바와 같이 이.콜라이 BL21(DE3)에서 높은 수준으로 발현되었다. 단백질 발현은 1mM IPTG에 의해 2시간 동안 유도되었다.
절단 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 하기와 같이 나타난다:
pBAC30으로부터 발현된 His 태그(밑줄)를 포함하는 PhtD 절단체 1
Figure 112010010902018-pct00015
pBAC31로부터 발현된 His 태그(밑줄)를 포함하는 PhtD 절단체 2
Figure 112010010902018-pct00016
pBAC32로부터 발현된 His 태그(밑줄)를 포함하는 PhtD 절단체 3
Figure 112010010902018-pct00017

PhtD 절단체의 구조적 특성화 및 전체 길이의 PhtD와의 비교
정제된 PhtD 절단체 1, 2 및 3은 각각 생화학적 및 생물리학적 수단에 의해 특성분석되었으며, 수득된 결과를 전체 길이의 PhtD 단백질(신호 서열 결핍) 로트의 분석으로부터 수득된 특성분석 자료와 비교하였다. 원형 광이색성(CD) 분광법, 고유 형광 분광법, 분석용 초원심분리법(AUC), 멀티 앵글 광 산란 검출기를 구비한 크기 배제 크로마토그래피(SEC-MALS) 및 시차주사 열량 측정법(DSC)의 검정법을 수행하였다. 이러한 분석으로부터의 결과를 하기 표 4에 요약하였다.
PhtD 및 PhtD 절단에 대한 특성화 결과의 요약
시험 전체 길이의 PhtD PhtD 절단체 1 PhtD 절단체 2 PhtD 절단체 3
CD 분광법 α-헬릭스/β-시트 2차 구조의 혼합 α-헬릭스/β-시트 2차 구조의 혼합 주로 α-헬릭스 2차 구조 주로 α-헬릭스 2차 구조
형광 분광법 방출 최대:
347 내지 349nm* 		방출 최대:
349nm* 		낮은 신호로 인해 측정되지 않음 낮은 신호로 인해 측정되지 않음
AUC 단량체성
고도 신장 용액 구조		 단량체성
신장 용액 구조		 단량체성
조밀 용액 구조		 단량체성
조밀 용액 구조
SEC-MALS 단량체성 단량체성 단량체성 단량체성
DSC 3개의 전이
Tm: 58.0℃,
72.1℃,
89.0℃~		 2개의 전이
Tm: 62.1℃,
82.8℃
 1개의 전이
Tm: 85.3℃		 1개의 전이
Tm: 85.5℃
*280nm 및 295nm 여기 진동수에서
~Tm, 열 전이 중간점
표 4에서 요약된 특성화 결과에 근거하면, PhtD 절단체 1은 전체 길이의 PhtD와, 동일하지는 않지만 유사한 전반적인 용액 구조를 갖는 반면, PhtD 절단체 2 및 3은 상이하다. PhtD의 DSC 분석에서 관찰된 복수 열 전이는 복수(즉, 3개) 도메인의 존재를 나타낸다. PhtD 절단체 1에 대한 DSC 결과는 2개의 전이를 나타내며, 당해 절단체가 상기 도메인 중의 1개를 제거하였음을 나타낸다. PhtD 절단체 2 및 3은 유사한 전반적인 구조를 가지며, DSC 결과는 고도로 열에 안정한 단일 도메인의 존재를 나타낸다. 이러한 결과는 절단체들이 접혀진 형태(folded conformation)로 존재함을 나타낸다.
실시예 2
단일클론 항체
표준 절차를 사용하여 이뮤노프리사이스(ImmunoPrecise)(Victoria, BC, Canada)에 의해 다수의 Pht 단백질(즉, PhtD, PhtA, PhtB, PhtE)에 대한 단일클론 항체를 생산하였다. 단일클론을 생산하기 위해, 마우스를 각종 단백질로 면역화하고, 표준 절차를 사용하여 특이성을 갖는 항체를 분비하는 하이브리도마를 분리하였다. PhtD, PhtA, PhtB 및 PhtE 각각에 대하여 다수의 하이브리도마 클론을 생산하였다.
PhtD와 관련하여, 마우스를 재조합으로 생성된 전체 길이의 PhtD 단백질(His 태그 존재 및 신호 서열 부재)로 면역화하였다. 재조합으로 생성된 PhtD 단백질은 스트렙토코쿠스 뉴모니애 균주 TIGR4(아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션에 ATCC 수탁번호 제BAA-334호로 기탁)로부터 유도되었다. 마우스를 면역화하기 위해 사용된 PhtD 단백질의 아미노산 서열, 즉 서열번호 24는 하기에 나타내며, 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 23이다.
재조합 PhtD 단백질 서열:
Figure 112010010902018-pct00018

a. 교차 반응성
하이브리도마 유래의 상청액을 사용하여, 상이한 Pht 단백질에 대하여 생성된 단일클론 항체 각각의 교차 반응성을 ELISA에 의해 평가하였다. ELISA의 결과를 하기 표 5에 정리하였다. 항체가 형성되는 특정 Pht 단백질(표 4에서 "자신"으로 확인된다) 및 Pht 단백질의 조합(예를 들어, PhtA 및 PhtE, 이들은 표 5에서 "A, E"로서 확인된다)에 대한 반응성에 대하여, 생성된 각각의 단일클론 항체(예를 들어, PhtD)를 ELISA로 스크리닝하였다. 각각의 Pht 단백질에 대하여 생성된 하이브리도마 클론의 총수를 표 5의 "면역 단백질" 칼럼에서 해당 Pht 단백질 아래의 괄호에 나타냈다(예를 들어, 14개의 하이브리도마 클론이 PhtD에 대해 생성되었다). 스크리닝에 사용된 Pht 단백질은 재조합 전체 단백질이었다.
면역 단백질
 상이한 Pht 단백질에 대하여 특이적인 클론의 수
자신 A, E B, D B, E D, E A, B, D A, B, E B, D, E A, B, D, E
PhtD
(총 14개)		 4 - 3 0 0 6 - 0 1
PhtB
(총 69개)		 9 - 37 0 - 15 0 2 6
PhtA
(총 48개)		 19 - - - - 5 0 - 24
PhtE
(총 72개)		 50 6 - 1 7 - 2 0 6
교차 반응성 스크리닝(ELISA에 의함)으로부터의 결과에 근거하면, 하이브리도마 클론 9E11, 4D5 및 1B12를 포함하는 다수의 항체를 추가의 분석을 위해 선택하였다. PhtD에 대하여 각각의 클론 9E11, 4D5 및 1B12를 생성하면서, 클론 9E11은 교차 반응성 스크리닝으로 측정한 경우 PhtD에 대해서만 특이성을 갖는 반면, 클론 4D5 및 1B12 각각은 PhtA, B 및 D에 대하여 특이성을 갖는 것으로 나타났다.
b. 항원결정기 지도화
변성 SDS-PAGE/웨스턴 블롯을 사용하여 항원결정기 지도화를 실시하였다. 클론 4D5 및 9E11 각각은 PhtD의 절단체 3 단편의 선형 항원결정기와 결합하는 mAb를 생산하는 것으로 측정되었다. PhtD의 절단체 3 단편의 단백질 분해 후에 웨스턴 블롯을 한 결과, mAb 9E11에 의해 인식된 선형 항원결정기는 절단체 3 단편 (및 전체 길이의 PhtD 단백질의 상응하는 아미노산 서열)의 아미노산 1 내지 101(서열번호 26)에 상응하는 서열 내에 존재하는 것으로 나타났다. PhtD의 절단체 1, 2 및 3을 사용하여 각각의 클론(즉, 클론 9E11, 4D5 및 1B12)의 mAb를 ELISA에 의해 추가로 시험한 결과, 웨스턴 블롯에 의해 각각의 클론에 대하여 확인된 특이성이 확인되었고, mAb 클론(1B12)이 T3 절단체에 대하여 특이성을 갖는 것으로 확인되었다.
c. 수동적 보호
본 발명의 추가의 양태에서, 스트렙토코쿠스 뉴모니애에 의한 공격으로부터 동물을 보호하는 능력에 대하여, 각각의 클론 9E11, 4D5 및 1B12에 의해 생산된 mAb를 평가하였다.
스트렙토코쿠스 뉴모니애 감염에 대하여 수동적인 보호를 제공하기 위해, 전체 길이의 PspA, PhtB 또는 PhtD에 대하여 래빗에서 각각 형성된 항체의 능력을 시험하는 초기 실험을 수행하였다. 이러한 연구에서, 50cfu의 스트렙토코쿠스 뉴모니애 균주 A66.1을 정맥 투여하기 1시간 전에, CBA/n 마우스의 그룹에 래빗 항-PspA, 항-phtB 또는 항-PhtD 혈청(1:10으로 희석)을 복막내 투여하여 미리 처리하였다. 항체(즉, PspA, PhtB 또는 PhtD)로 미리 처리한 각 그룹의 경우, 동물의 100%가 생존하였다. 이와 대조적으로, 미리 채혈된 래빗 PspA 혈청으로 미리 처리한 동물의 1/20은 생존하였고, 미리 채혈된 래빗 PhtB 혈청으로 미리 처리한 동물의 0/10은 생존하였고, 미리 채혈된 래빗 PhtD 혈청으로 미리 처리한 동물의 1/25은 생존하였다.
기존에 개발된 수동적 보호 모델을 이용하여 수동적 보호 연구를 수행하였다. 당해 모델은 스트렙토코쿠스 뉴모니애에 의해 매우 감염되기 쉬운 것으로 공지되어 있는 CBA/CaHN-Btkxid/J 마우스를 사용하며, 50cfu의 스트렙토코쿠스 뉴모니애 균주 A66.1을 정맥 투여하기 1시간 전에, 연구 중인 항체를 복막내 투여함을 포함한다. 투여되는 부하량을 부하 전 및 후에 확인한다. 14일 동안 사망률을 모니터링하고, 세균 생존 마우스로부터의 혈액을 플레이팅하여 세균 제거율을 확인한다.
하나의 양태에서, 수동적 면역화 모델을 사용하여 클론 4D5 및 9E11에 의해 생산된 mAb를 각각 시험하였다. 5마리의 마우스로 이루어진 그룹을 사용하였다. 포스페이트 완충된 식염수(PBS) 중의 4D5 mAb, 또는 PBS 중의 9E11 mAb, 또는 PBS(즉, 음성 대조군 그룹) 400μg을 3개의 그룹에 복막내 투여하였다. 양성 대조군 그룹에 래빗 항-PhtD를 투여한다. 스트렙토코쿠스 뉴모니애 균주 A66.1의 부하량 50cfu를 각각의 그룹에 투여하였다. 클론 4D5에 의해 생산된 mAb로 상기 부하량으로 면역화된 동물의 80%가 생존하였고, mAb 9E11로 상기 부하량으로 면역화된 동물의 100%가 생존하였다. PBS로 "면역화"된 동물은 전혀 생존하지 못한 반면, 래빗 항-PhtD로 상기 부하량으로 면역화된 동물의 100%는 생존하였다.
별도의 실험에서, 수동적 면역화 모델을 사용하여 mAb 1B12를 시험하였다. PBS 중의 1B12 mAb 400μg을 복막내 투여한 후, 스트렙토코쿠스 뉴모니애 균주 A66.1의 부하량 50cfu를 투여하였다. mAb 1B12로 면역화된 그룹과 관련하여, 상기 부하량 후 3일 지나 동물의 100%가 생존하였고, 상기 부하량 후 14일(즉, 시험 한계) 지나 동물의 80%가 생존하였다. PBS로 "면역화된" 그룹의 동물은 1일 지나 전혀 생존하지 않은 반면, 양성 대조군 그룹(즉, 래빗 항-PhtD 혈청으로 면역화)의 동물 각각은 상기 부하량 후 14일 지나 생존하였다.
투여량 연구도 또한 수행하였다. 동일한 부하 모델을 사용하여, 스트렙토코쿠스 뉴모니애 균주 A66.1의 부하량 50cfu를 투여하기 1시간 전에, 동물을 PBS 중의 mAb 9E11 400μg, 200μg, 100μg 또는 50μg으로 면역화하였다. 부하하기 전에 음성 대조군 그룹에 PBS를 투여하고, 부하하기 전에 양성 대조군 그룹에 항-PhtD 혈청(1:10 희석으로)을 투여하였다. 14일 후, 400μg 투여량에 따른 마우스의 60%가 생존하였고, 200μg 투여량에 따른 마우스의 20%가 생존하였고, 100μg 또는 50μg 투여량에 따른 마우스는 전혀 생존하지 않았다. 400μg 투여량을 투여한 그룹과 관련하여, 생존율은 6일에 80%, 9일에 60%로 떨어졌다. 200μg 투여량을 투여한 그룹과 관련하여, 생존율은 3일에 60%, 5일에 20%로 떨어졌다. 100μg 투여량을 투여한 그룹과 관련하여, 생존율은 2일에 20%, 3일에 0%로 떨어졌다. 따라서, 14일 생존율에서의 증가는 400μg 투여량(생존율 60%)을 투여한 그룹과 200μg 투여량(생존율 20%)을 투여한 그룹 모두 대하여 관찰되었다.
mAb 4D5를 사용하여 유사한 투여량 연구를 수행하였다. 스트렙토코쿠스 뉴모니애 균주 A66.1의 부하량 50cfu를 투여하기 1시간 전에, 동물을 PBS 중의 mAb 4D5 400μg, 200μg, 100μg 또는 50μg으로 면역화하였다. 14일 후, 400μg 투여량에 따른 마우스의 100%가 생존하였고, 이하 투여량 또는 대조군(PBS)에 따른 마우스는 전혀 생존하지 않았다. 200μg 투여량에 따른 동물의 100%가 2일까지 생존하였고, 60%가 2일까지 생존하였고, 20%가 3일까지 생존하였다. 따라서, 14일 생존율에서의 증가는 400μg 투여량(생존율 100%)을 투여한 그룹과 200μg 투여량(3일까지 생존율 20%)을 투여한 그룹 모두에서 관찰되었다.
d. mAb 의 시너지 효과
상승적으로 작용하는 mAb의 능력을 시험하기 위한 연구를 수행하였다. 동일한 수동적인 보호 모델을 기존 연구와 동일하게 사용하였다. 마우스의 8개 그룹(각각 5마리)을 사용하였고, 4D5 mAb 100μg, 4D5 mAb 200μg, 9E11 mAb 100μg, 9E11 mAb 200μg, 9E11 100μg과 4D5 100μg으로 이루어진 풀 200μg, PBS(즉, 음성 대조군), 래빗 항-PspA 혈청(즉, 양성 대조군) 또는 1B12 mAb 400μg을 부하 투여량 전에 투여하였다. 4D5 항체 100μg과 9E11 항체 100μg을 함유하는 총 투여량 200μg은 14일(즉, 시험 한계)까지 100%의 보호를 제공하였다. 이와 대조적으로, mAb 4D5 또는 9E11 단독의 200μg은 각각 14일에서 단지 20% 및 40%의 생존율을 제공하였다. 4D5의 100μg 투여량은 1일 지나 100%의 생존율(PBS로 하였다)을 제공하였고, 2일 지나 60%의 생존율, 3일에서 20%의 생존율(14일 지나 유지되었다)로 떨어졌다. mAb 9E11의 100μg 투여량은 1일 지나 100%의 생존율(PBS로 하였다)을 제공하였고, 2일 지나 80%의 생존율, 3일지나 60%의 생존율, 4 내지 6일에서 20%의 생존율, 이후 0으로 떨어졌다. 하기 표 6에서 나타낸 자료의 후속적인 실험은 이러한 시너지 효과를 확인하였다. 이러한 연구에서, 동물 그룹에 mAb 풀(즉, 동량의 9E11과 4D5 mAb의 풀)의 농도를 변화시킨 투여량을 투여하였다.
일 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
PBS 100 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
PspA 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
200P 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
100P 100 100 100 80 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60
50P 100 100 80 60 40 20 0 0 0 0 0 0 0 0
25P 100 60 20 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
*PBS: 포스페이트 완충된 식염수; PspA: 전체 길이의 항-PspA; 200P: 4D5와 9E11의 풀 200μg; 100P: 4D5와 9E11의 풀 100μg; 50P: 4D5와 9E11의 풀 50μg; 25P: 4D5와 9E11의 풀 25μg
표 6에서 나타낸 바와 같이, 각각의 투여량에 대하여 시너지 효과를 관찰하였다. 25μg의 투여량을 이전에 시험하지 않았지만, 풀에 대한 25μg의 투여량은 3일까지 20%의 생존율을 제공하였다. 이전 실험에서, mAb 4D5 또는 9E11에 대한 50μg의 투여량은 본질적으로 PBS 투여량(즉, 음성 대조군)과 동일하였다.
이러한 실험은 4D5 및 9E11 mAb 각각이 스트렙토코쿠스 뉴모니애에 의한 감염으로부터 보호를 제공하는데 사용될 수도 있음을 증명한다. 이러한 실험은 또한 mAb 4D5와 9E11의 배합 투여가 각각의 항체를 합하여 예상되는 첨가 효과에 비하여 놀라운 시너지 효과를 야기함을 증명한다. 본원에 기재된 단일클론 항체를 단독 또는 조합하여 사용할 수도 있다.
본 발명은 바람직한 양태의 관점에서 기재되었지만, 변형 및 수정이 당업자에게 일어나는 것으로 이해된다. 그러므로, 첨부된 특허청구의 범위는 청구된 바와 같이 본 발명의 범위 내에 있는 이러한 모든 등가 변형을 포함하는 것으로 의도된다.
참고문헌
Figure 112010010902018-pct00019
Figure 112010010902018-pct00020
<110> Sanofi Pasteur Limited <120> Immunogenic polypeptides and monoclonal antibodies <130> API-07-01 PCT <150> US 60/961,723 <151> 2007-07-23 <160> 26 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 839 <212> PRT <213> Streptococcus pneumoniae <400> 1 Met Lys Ile Asn Lys Lys Tyr Leu Ala Gly Ser Val Ala Val Leu Ala 1 5 10 15 Leu Ser Val Cys Ser Tyr Glu Leu Gly Arg His Gln Ala Gly Gln Val 20 25 30 Lys Lys Glu Ser Asn Arg Val Ser Tyr Ile Asp Gly Asp Gln Ala Gly 35 40 45 Gln Lys Ala Glu Asn Leu Thr Pro Asp Glu Val Ser Lys Arg Glu Gly 50 55 60 Ile Asn Ala Glu Gln Ile Val Ile Lys Ile Thr Asp Gln Gly Tyr Val 65 70 75 80 Thr Ser His Gly Asp His Tyr His Tyr Tyr Asn Gly Lys Val Pro Tyr 85 90 95 Asp Ala Ile Ile Ser Glu Glu Leu Leu Met Lys Asp Pro Asn Tyr Gln 100 105 110 Leu Lys Asp Ser Asp Ile Val Asn Glu Ile Lys Gly Gly Tyr Val Ile 115 120 125 Lys Val Asp Gly Lys Tyr Tyr Val Tyr Leu Lys Asp Ala Ala His Ala 130 135 140 Asp Asn Ile Arg Thr Lys Glu Glu Ile Lys Arg Gln Lys Gln Glu His 145 150 155 160 Ser His Asn His Gly Gly Gly Ser Asn Asp Gln Ala Val Val Ala Ala 165 170 175 Arg Ala Gln Gly Arg Tyr Thr Thr Asp Asp Gly Tyr Ile Phe Asn Ala 180 185 190 Ser Asp Ile Ile Glu Asp Thr Gly Asp Ala Tyr Ile Val Pro His Gly 195 200 205 Asp His Tyr His Tyr Ile Pro Lys Asn Glu Leu Ser Ala Ser Glu Leu 210 215 220 Ala Ala Ala Glu Ala Tyr Trp Asn Gly Lys Gln Gly Ser Arg Pro Ser 225 230 235 240 Ser Ser Ser Ser Tyr Asn Ala Asn Pro Ala Gln Pro Arg Leu Ser Glu 245 250 255 Asn His Asn Leu Thr Val Thr Pro Thr Tyr His Gln Asn Gln Gly Glu 260 265 270 Asn Ile Ser Ser Leu Leu Arg Glu Leu Tyr Ala Lys Pro Leu Ser Glu 275 280 285 Arg His Val Glu Ser Asp Gly Leu Ile Phe Asp Pro Ala Gln Ile Thr 290 295 300 Ser Arg Thr Ala Arg Gly Val Ala Val Pro His Gly Asn His Tyr His 305 310 315 320 Phe Ile Pro Tyr Glu Gln Met Ser Glu Leu Glu Lys Arg Ile Ala Arg 325 330 335 Ile Ile Pro Leu Arg Tyr Arg Ser Asn His Trp Val Pro Asp Ser Arg 340 345 350 Pro Glu Gln Pro Ser Pro Gln Ser Thr Pro Glu Pro Ser Pro Ser Pro 355 360 365 Gln Pro Ala Pro Asn Pro Gln Pro Ala Pro Ser Asn Pro Ile Asp Glu 370 375 380 Lys Leu Val Lys Glu Ala Val Arg Lys Val Gly Asp Gly Tyr Val Phe 385 390 395 400 Glu Glu Asn Gly Val Ser Arg Tyr Ile Pro Ala Lys Asp Leu Ser Ala 405 410 415 Glu Thr Ala Ala Gly Ile Asp Ser Lys Leu Ala Lys Gln Glu Ser Leu 420 425 430 Ser His Lys Leu Gly Ala Lys Lys Thr Asp Leu Pro Ser Ser Asp Arg 435 440 445 Glu Phe Tyr Asn Lys Ala Tyr Asp Leu Leu Ala Arg Ile His Gln Asp 450 455 460 Leu Leu Asp Asn Lys Gly Arg Gln Val Asp Phe Glu Ala Leu Asp Asn 465 470 475 480 Leu Leu Glu Arg Leu Lys Asp Val Pro Ser Asp Lys Val Lys Leu Val 485 490 495 Asp Asp Ile Leu Ala Phe Leu Ala Pro Ile Arg His Pro Glu Arg Leu 500 505 510 Gly Lys Pro Asn Ala Gln Ile Thr Tyr Thr Asp Asp Glu Ile Gln Val 515 520 525 Ala Lys Leu Ala Gly Lys Tyr Thr Thr Glu Asp Gly Tyr Ile Phe Asp 530 535 540 Pro Arg Asp Ile Thr Ser Asp Glu Gly Asp Ala Tyr Val Thr Pro His 545 550 555 560 Met Thr His Ser His Trp Ile Lys Lys Asp Ser Leu Ser Glu Ala Glu 565 570 575 Arg Ala Ala Ala Gln Ala Tyr Ala Lys Glu Lys Gly Leu Thr Pro Pro 580 585 590 Ser Thr Asp His Gln Asp Ser Gly Asn Thr Glu Ala Lys Gly Ala Glu 595 600 605 Ala Ile Tyr Asn Arg Val Lys Ala Ala Lys Lys Val Pro Leu Asp Arg 610 615 620 Met Pro Tyr Asn Leu Gln Tyr Thr Val Glu Val Lys Asn Gly Ser Leu 625 630 635 640 Ile Ile Pro His Tyr Asp His Tyr His Asn Ile Lys Phe Glu Trp Phe 645 650 655 Asp Glu Gly Leu Tyr Glu Ala Pro Lys Gly Tyr Thr Leu Glu Asp Leu 660 665 670 Leu Ala Thr Val Lys Tyr Tyr Val Glu His Pro Asn Glu Arg Pro His 675 680 685 Ser Asp Asn Gly Phe Gly Asn Ala Ser Asp His Val Arg Lys Asn Lys 690 695 700 Val Asp Gln Asp Ser Lys Pro Asp Glu Asp Lys Glu His Asp Glu Val 705 710 715 720 Ser Glu Pro Thr His Pro Glu Ser Asp Glu Lys Glu Asn His Ala Gly 725 730 735 Leu Asn Pro Ser Ala Asp Asn Leu Tyr Lys Pro Ser Thr Asp Thr Glu 740 745 750 Glu Thr Glu Glu Glu Ala Glu Asp Thr Thr Asp Glu Ala Glu Ile Pro 755 760 765 Gln Val Glu Asn Ser Val Ile Asn Ala Lys Ile Ala Asp Ala Glu Ala 770 775 780 Leu Leu Glu Lys Val Thr Asp Pro Ser Ile Arg Gln Asn Ala Met Glu 785 790 795 800 Thr Leu Thr Gly Leu Lys Ser Ser Leu Leu Leu Gly Thr Lys Asp Asn 805 810 815 Asn Thr Ile Ser Ala Glu Val Asp Ser Leu Leu Ala Leu Leu Lys Glu 820 825 830 Ser Gln Pro Ala Pro Ile Gln 835 <210> 2 <211> 493 <212> PRT <213> Streptococcus pneumoniae <400> 2 Trp Val Pro Asp Ser Arg Pro Glu Gln Pro Ser Pro Gln Ser Thr Pro 1 5 10 15 Glu Pro Ser Pro Ser Pro Gln Pro Ala Pro Asn Pro Gln Pro Ala Pro 20 25 30 Ser Asn Pro Ile Asp Glu Lys Leu Val Lys Glu Ala Val Arg Lys Val 35 40 45 Gly Asp Gly Tyr Val Phe Glu Glu Asn Gly Val Ser Arg Tyr Ile Pro 50 55 60 Ala Lys Asp Leu Ser Ala Glu Thr Ala Ala Gly Ile Asp Ser Lys Leu 65 70 75 80 Ala Lys Gln Glu Ser Leu Ser His Lys Leu Gly Ala Lys Lys Thr Asp 85 90 95 Leu Pro Ser Ser Asp Arg Glu Phe Tyr Asn Lys Ala Tyr Asp Leu Leu 100 105 110 Ala Arg Ile His Gln Asp Leu Leu Asp Asn Lys Gly Arg Gln Val Asp 115 120 125 Phe Glu Ala Leu Asp Asn Leu Leu Glu Arg Leu Lys Asp Val Pro Ser 130 135 140 Asp Lys Val Lys Leu Val Asp Asp Ile Leu Ala Phe Leu Ala Pro Ile 145 150 155 160 Arg His Pro Glu Arg Leu Gly Lys Pro Asn Ala Gln Ile Thr Tyr Thr 165 170 175 Asp Asp Glu Ile Gln Val Ala Lys Leu Ala Gly Lys Tyr Thr Thr Glu 180 185 190 Asp Gly Tyr Ile Phe Asp Pro Arg Asp Ile Thr Ser Asp Glu Gly Asp 195 200 205 Ala Tyr Val Thr Pro His Met Thr His Ser His Trp Ile Lys Lys Asp 210 215 220 Ser Leu Ser Glu Ala Glu Arg Ala Ala Ala Gln Ala Tyr Ala Lys Glu 225 230 235 240 Lys Gly Leu Thr Pro Pro Ser Thr Asp His Gln Asp Ser Gly Asn Thr 245 250 255 Glu Ala Lys Gly Ala Glu Ala Ile Tyr Asn Arg Val Lys Ala Ala Lys 260 265 270 Lys Val Pro Leu Asp Arg Met Pro Tyr Asn Leu Gln Tyr Thr Val Glu 275 280 285 Val Lys Asn Gly Ser Leu Ile Ile Pro His Tyr Asp His Tyr His Asn 290 295 300 Ile Lys Phe Glu Trp Phe Asp Glu Gly Leu Tyr Glu Ala Pro Lys Gly 305 310 315 320 Tyr Thr Leu Glu Asp Leu Leu Ala Thr Val Lys Tyr Tyr Val Glu His 325 330 335 Pro Asn Glu Arg Pro His Ser Asp Asn Gly Phe Gly Asn Ala Ser Asp 340 345 350 His Val Arg Lys Asn Lys Val Asp Gln Asp Ser Lys Pro Asp Glu Asp 355 360 365 Lys Glu His Asp Glu Val Ser Glu Pro Thr His Pro Glu Ser Asp Glu 370 375 380 Lys Glu Asn His Ala Gly Leu Asn Pro Ser Ala Asp Asn Leu Tyr Lys 385 390 395 400 Pro Ser Thr Asp Thr Glu Glu Thr Glu Glu Glu Ala Glu Asp Thr Thr 405 410 415 Asp Glu Ala Glu Ile Pro Gln Val Glu Asn Ser Val Ile Asn Ala Lys 420 425 430 Ile Ala Asp Ala Glu Ala Leu Leu Glu Lys Val Thr Asp Pro Ser Ile 435 440 445 Arg Gln Asn Ala Met Glu Thr Leu Thr Gly Leu Lys Ser Ser Leu Leu 450 455 460 Leu Gly Thr Lys Asp Asn Asn Thr Ile Ser Ala Glu Val Asp Ser Leu 465 470 475 480 Leu Ala Leu Leu Lys Glu Ser Gln Pro Ala Pro Ile Gln 485 490 <210> 3 <211> 164 <212> PRT <213> Streptococcus pneumoniae <400> 3 Val Lys Tyr Tyr Val Glu His Pro Asn Glu Arg Pro His Ser Asp Asn 1 5 10 15 Gly Phe Gly Asn Ala Ser Asp His Val Arg Lys Asn Lys Val Asp Gln 20 25 30 Asp Ser Lys Pro Asp Glu Asp Lys Glu His Asp Glu Val Ser Glu Pro 35 40 45 Thr His Pro Glu Ser Asp Glu Lys Glu Asn His Ala Gly 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Glu Arg His 290 295 300 Val Glu Ser Asp Gly Leu Ile Phe Asp Pro Ala Gln Ile Thr Ser Arg 305 310 315 320 Thr Ala Arg Gly Val Ala Val Pro His Gly Asn His Tyr His Phe Ile 325 330 335 Pro Tyr Glu Gln Met Ser Glu Leu Glu Lys Arg Ile Ala Arg Ile Ile 340 345 350 Pro Leu Arg Tyr Arg Ser Asn His Trp Val Pro Asp Ser Arg Pro Glu 355 360 365 Gln Pro Ser Pro Gln Ser Thr Pro Glu Pro Ser Pro Ser Pro Gln Pro 370 375 380 Ala Pro Asn Pro Gln Pro Ala Pro Ser Asn Pro Ile Asp Glu Lys Leu 385 390 395 400 Val Lys Glu Ala Val Arg Lys Val Gly Asp Gly Tyr Val Phe Glu Glu 405 410 415 Asn Gly Val Ser Arg Tyr Ile Pro Ala Lys Asp Leu Ser Ala Glu Thr 420 425 430 Ala Ala Gly Ile Asp Ser Lys Leu Ala Lys Gln Glu Ser Leu Ser His 435 440 445 Lys Leu Gly Ala Lys Lys Thr Asp Leu Pro Ser Ser Asp Arg Glu Phe 450 455 460 Tyr Asn Lys Ala Tyr Asp Leu Leu Ala Arg Ile His Gln Asp Leu Leu 465 470 475 480 Asp Asn Lys Gly Arg Gln Val Asp Phe Glu Ala Leu Asp Asn Leu Leu 485 490 495 Glu Arg Leu Lys Asp Val Pro Ser Asp Lys Val Lys Leu Val Asp Asp 500 505 510 Ile Leu Ala Phe Leu Ala Pro Ile Arg His Pro Glu Arg Leu Gly Lys 515 520 525 Pro Asn Ala Gln Ile Thr Tyr Thr Asp Asp Glu Ile Gln Val Ala Lys 530 535 540 Leu Ala Gly Lys Tyr Thr Thr Glu Asp Gly Tyr Ile Phe Asp Pro Arg 545 550 555 560 Asp Ile Thr Ser Asp Glu Gly Asp Ala Tyr Val Thr Pro His Met Thr 565 570 575 His Ser His Trp Ile Lys Lys Asp Ser Leu Ser Glu Ala Glu Arg Ala 580 585 590 Ala Ala Gln Ala Tyr Ala Lys Glu Lys Gly Leu Thr Pro Pro Ser Thr 595 600 605 Asp His Gln Asp Ser Gly Asn Thr Glu Ala Lys Gly Ala Glu Ala Ile 610 615 620 Tyr Asn Arg Val Lys Ala Ala Lys Lys Val Pro Leu Asp Arg Met Pro 625 630 635 640 Tyr Asn Leu Gln Tyr Thr Val Glu Val Lys Asn Gly Ser Leu Ile Ile 645 650 655 Pro His Tyr Asp His Tyr His Asn Ile Lys Phe Glu Trp Phe Asp Glu 660 665 670 Gly Leu Tyr Glu Ala Pro Lys Gly Tyr Thr Leu Glu Asp Leu Leu Ala 675 680 685 Thr Val Lys Tyr Tyr Val Glu His Pro Asn Glu Arg Pro His Ser Asp 690 695 700 Asn Gly Phe Gly Asn Ala Ser Asp His Val Arg Lys Asn Lys Val Asp 705 710 715 720 Gln Asp Ser Lys Pro Asp Glu Asp Lys Glu His Asp Glu Val Ser Glu 725 730 735 Pro Thr His Pro Glu Ser Asp Glu Lys Glu Asn His Ala Gly Leu Asn 740 745 750 Pro Ser Ala Asp Asn Leu Tyr Lys Pro Ser Thr Asp Thr Glu Glu Thr 755 760 765 Glu Glu Glu Ala Glu Asp Thr Thr Asp Glu Ala Glu Ile Pro Gln Val 770 775 780 Glu Asn Ser Val Ile Asn Ala Lys Ile Ala Asp Ala Glu Ala Leu Leu 785 790 795 800 Glu Lys Val Thr Asp Pro Ser Ile Arg Gln Asn Ala Met Glu Thr Leu 805 810 815 Thr Gly Leu Lys Ser Ser Leu Leu Leu Gly Thr Lys Asp Asn Asn Thr 820 825 830 Ile Ser Ala Glu Val Asp Ser Leu Leu Ala Leu Leu Lys Glu Ser Gln 835 840 845 Pro Ala Pro Ile Gln 850 <210> 25 <211> 843 <212> PRT <213> Streptococcus pneumoniae <400> 25 Ser Ser Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser His Met Ala Ser Met Thr Gly 1 5 10 15 Gly Gln Gln Met Gly Arg Gly Ser Ser Tyr Glu Leu Gly Arg His Gln 20 25 30 Ala Gly Gln Val Lys Lys Glu Ser Asn Arg Val Ser Tyr Ile Asp Gly 35 40 45 Asp Gln Ala Gly Gln Lys Ala Glu Asn Leu Thr Pro Asp 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Gln 260 265 270 Asn Gln Gly Glu Asn Ile Ser Ser Leu Leu Arg Glu Leu Tyr Ala Lys 275 280 285 Pro Leu Ser Glu Arg His Val Glu Ser Asp Gly Leu Ile Phe Asp Pro 290 295 300 Ala Gln Ile Thr Ser Arg Thr Ala Arg Gly Val Ala Val Pro His Gly 305 310 315 320 Asn His Tyr His Phe Ile Pro Tyr Glu Gln Met Ser Glu Leu Glu Lys 325 330 335 Arg Ile Ala Arg Ile Ile Pro Leu Arg Tyr Arg Ser Asn His Trp Val 340 345 350 Pro Asp Ser Arg Pro Glu Gln Pro Ser Pro Gln Ser Thr Pro Glu Pro 355 360 365 Ser Pro Ser Pro Gln Pro Ala Pro Asn Pro Gln Pro Ala Pro Ser Asn 370 375 380 Pro Ile Asp Glu Lys Leu Val Lys Glu Ala Val Arg Lys Val Gly Asp 385 390 395 400 Gly Tyr Val Phe Glu Glu Asn Gly Val Ser Arg Tyr Ile Pro Ala Lys 405 410 415 Asp Leu Ser Ala Glu Thr Ala Ala Gly Ile Asp Ser Lys Leu Ala Lys 420 425 430 Gln Glu Ser Leu Ser His Lys Leu Gly Ala Lys Lys Thr Asp Leu Pro 435 440 445 Ser Ser Asp Arg Glu Phe Tyr Asn Lys Ala Tyr Asp Leu Leu Ala Arg 450 455 460 Ile His Gln Asp Leu Leu Asp Asn Lys Gly Arg Gln Val Asp Phe Glu 465 470 475 480 Ala Leu Asp Asn Leu Leu Glu Arg Leu Lys Asp Val Pro Ser Asp Lys 485 490 495 Val Lys Leu Val Asp Asp Ile Leu Ala Phe Leu Ala Pro Ile Arg His 500 505 510 Pro Glu Arg Leu Gly Lys Pro Asn Ala Gln Ile Thr Tyr Thr Asp Asp 515 520 525 Glu Ile Gln Val Ala Lys Leu Ala Gly Lys Tyr Thr Thr Glu Asp Gly 530 535 540 Tyr Ile Phe Asp Pro Arg Asp Ile Thr Ser Asp Glu Gly Asp Ala Tyr 545 550 555 560 Val Thr Pro His Met Thr His Ser His Trp Ile Lys Lys Asp Ser Leu 565 570 575 Ser Glu Ala Glu Arg Ala Ala Ala Gln Ala Tyr Ala Lys Glu Lys Gly 580 585 590 Leu Thr Pro Pro Ser Thr Asp His Gln Asp Ser Gly Asn Thr Glu Ala 595 600 605 Lys Gly Ala Glu Ala Ile Tyr Asn Arg Val Lys Ala Ala Lys Lys Val 610 615 620 Pro Leu Asp Arg Met Pro Tyr Asn Leu Gln Tyr Thr Val Glu Val Lys 625 630 635 640 Asn Gly Ser Leu Ile Ile Pro His Tyr Asp His Tyr His Asn Ile Lys 645 650 655 Phe Glu Trp Phe Asp Glu Gly Leu Tyr Glu Ala Pro Lys Gly Tyr Thr 660 665 670 Leu Glu Asp Leu Leu Ala Thr Val Lys Tyr Tyr Val Glu His Pro Asn 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Asn Pro Ser Ala Asp Asn Leu Tyr Lys 35 40 45 Pro Ser Thr Asp Thr Glu Glu Thr Glu Glu Glu Ala Glu Asp Thr Thr 50 55 60 Asp Glu Ala Glu Ile Pro Gln Val Glu Asn Ser Val Ile Asn Ala Lys 65 70 75 80 Ile Ala Asp Ala Glu Ala Leu Leu Glu Lys Val Thr Asp Pro Ser Ile 85 90 95 Arg Gln Asn Ala Met 100

Claims (83)

  1. (a) 서열번호 4에 제시된 서열로 이루어진 스트렙토코쿠스 뉴모니애 (Streptococcus pneumoniae) 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산;
    (b) 1개 이상의 보존적 치환에 기인한 것만이 상이한, 서열번호 26과 90% 이상 동일성인 아미노산 서열로 이루어진 스트렙토코쿠스 뉴모니애 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산;
    (c) (a) 또는 (b)의 스트렙토코쿠스 뉴모니애 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산과 완전히 상보적인 핵산; 및
    (d) T가 U로 치환된 상기 (a) 또는 (b)의 RNA로 이루어진 그룹으로부터 선택된, 분리된 핵산.
  2. 전사 조절 요소와 작동가능하게 연결된 제1항에 따른 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터.
  3. 제2항에 따른 재조합 발현 벡터를 포함하는 세포.
  4. 제1항에 따른 분리된 핵산 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 스트렙토코쿠스 뉴모니애 (Streptococcus pneumoniae)에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 약제학적 조성물.
  5. (i) 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열 또는
    (ii) 1개 이상의 보존적 치환에 기인한 것만이 상이한, 서열번호 26과 90% 이상 동일성인 아미노산 서열
    로 이루어진, 분리된 폴리펩타이드.
  6. 서열번호 4 및 서열번호 26으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 분리된 폴리펩타이드.
  7. 제5항에 따른 하나 이상의 폴리펩타이드 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 대상체의 폐렴구균성 감염의 위험을 감소시키는데 사용하기 위한 약제학적 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 하나 이상의 보조제, 하나 이상의 다른 면역원성 스트렙토코쿠스성 단백질 또는 이들 모두를 추가로 포함하는 약제학적 조성물.
  9. 제7항에 있어서, 점막 표면에 투여하기에 적합한 약제학적 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 비강내 스프레이, 연무기 용액 또는 에어로졸 흡입제인 약제학적 조성물.
  11. (i) 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드;
    (ii) 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 내에 위치한 항원 결정기;
    (iii) 1개 이상의 보존적 치환에 기인한 것만이 상이한, 서열번호 24와 90% 이상 동일성인 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드;
    (iv) 서열번호 26으로 이루어진 펩타이드; 또는
    (v) 1개 이상의 보존적 치환에 기인한 것만이 상이한, 서열번호 26과 90% 이상 동일성인 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드
    와 특이적으로 결합하는 단일클론 항체.
  12. 제11항에 따른 하나 이상의 단일클론 항체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 숙주의 스트렙토코쿠스(Streptococcus) 종의 감염을 억제하거나 치료하기 위한 약제학적 조성물.
  13. 제5항 또는 제6항에 따른 폴리펩타이드 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 대상체의 스트렙토코쿠스(Streptococcus) 종의 폐렴구균성 비강내 캐리지(carriage)를 감소시키기 위한 약제학적 조성물.
  14. 제7항에 있어서, (i) 상기 폐렴구균성 감염이 수막염, 중이염, 폐렴 또는 용혈성 요독증이거나, (ii) 폐렴구균성 비강내 캐리지를 제거하지 않는 것인, 약제학적 조성물.
  15. 서열번호 26의 항원 결정기에 특이적으로 결합하는 제1 단일클론 항체 및 서열번호 26에는 발견되지 않는 서열번호 4의 항원 결정기에 특이적으로 결합하는 적어도 제2 단일클론 항체를 포함하는, 숙주 내에서 스트렙토코쿠스 (Streptococcus) 종의 감염을 억제하거나 치료하기 위한 약제학적 조성물.
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