BR122021021381B1 - Método de aprimoramento de uma propriedade de uma proteína biologicamente ativa - Google Patents

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protein
bpxten
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Volker Schellenberger
Joshua Silverman
Chia-Wei Wang
Benjamin Spink
Willem P. Stemmer
Nathan Geething
Wayne To
Jeffrey L. Cleland
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Amunix Pharmaceuticals, Inc
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Abstract

POLIPEPTÍDEOS RECOMBINANTES ESTENDIDOS E COMPOSIÇÕES COMPREENDENDO OS MESMOS. A presente invenção refere-se a composições compreendendo proteínas biologicamente ativas ligadas a um polipeptídeo recombinante estendido (XTEN), ácidos nucleicos isolados que codificam as composições e os vetores e células hospedeiras compreendendo as mesmas e métodos de uso de tais composições no tratamento de doenças relacionadas à glicose, doenças metabólicas, distúrbios de coagulação e distúrbios e condições relacionados ao hormônio de crescimento.

Description

DECLARAÇÃO REFERENTE À PESQUISA CUSTEADA PELO GOVERNO
[001] A presente invenção foi feita com suporte do governo sob a concessão SBIR 2R44GM079873-02 outorgada pelo National Institutes de Health. O governo tem determinados direitos na invenção.
REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
[002] O presente pedido reivindica o benefício de prioridade dos Pedidos Provisórios U.S. Nos. de Série 61/149.669, depositado em 3 de Fevereiro de 2009; 61/268.193, depositado em 8 de Junho de 2009; 61/185.112, depositado em 8 de Junho de 2009; 61/236.493, depositado em 24 de Agosto de 2009; 61/236.836, depositado em 25 de Agosto de 2009; 61/243.707, depositado em 18 de Setembro de 2009; 61/245.490, depositado em 24 de Setembro de 2009; 61/280.955, depositado em 10 de Novembro de 2009; 61/280.956, depositado em 10 de Novembro de 2009; e 61/281.109, depositado em 12 de Novembro de 2009, todos pendentes, os quais são aqui incorporados por referência na íntegra.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[003] Proteínas biologicamente ativas, incluindo aquelas como produtos terapêuticos são, tipicamente, moléculas sensíveis que exibem meia-vida curta, particularmente quando formuladas em soluções aquosas. Além disso, muitos peptídeos e proteínas biologicamente ativos têm solubilidade limitada ou se tornam degradados durante produções recombinantes, requerendo procedimentos complexos de solubilização e re-enovelamento. Vários polímeros químicos podem ser presos para tais proteínas a fim de modificar suas propriedades. De interesse particular são polímeros hidrofílicos que têm conformações flexíveis e são bem hidratados em soluções aquosas. Um polímero frequentemente usado é polietileno glicol (PEG). Esses polímeros tendem a ter grandes raios hidrodinâmicos com relação a seu peso molecular (Kubetzko, S. et al. (2005) Mol. Pharmacol., 68: 1439-54) e podem resultar em propriedades farmacocinéticas intensificadas. Dependendo dos pontos de fixação, os polímeros tendem a ter interações limitadas com a proteína à qual eles foram presos, de modo que a proteína polimericamente modificada retenha suas funções relevantes. Contudo, a conjugação química de polímeros à proteínas requer processos complexos com múltiplas etapas. Tipicamente, o componente de proteína precisa ser produzido e purificado antes da etapa de conjugação química. Além disso, a etapa de conjugação pode resultar na formação de misturas de produto heterogêneas que precisam ser separadas, levando à perda significativa de produto. Alternativamente, tais misturas podem ser usadas como o produto farmacêutico final, mas são difíceis de padronizar. Alguns exemplos são produtos de Interferon-alfa PEGuilado atualmente comercializados que são usados como misturas (Wang, B. L. et al. (1998) J Submicrosc Cytol Pathol, 30: 503-9; Dhalluin, C. et al. (2005) Bioconjug Chem, 16: 504-17). Tais misturas são difíceis de fabricar e caracterizar de modo reproduzível, uma vez que elas contêm isômeros com atividade terapêutica reduzida ou nenhuma.
[004] Albumina e fragmentos de imunoglobulina, tais como regiões Fc, têm sido usados para conjugar outras proteínas biologicamente ativas, com resultados imprevisíveis com relação aos aumentos na meia-vida ou imunogenicidade. Infelizmente, o domínio Fc não se duplica eficientemente durante expressão recombinante e tende a formar precipitados insolúveis conhecidos como corpos de inclusão. Esses corpos de inclusão devem ser solubilizados e a proteína funcional deve ser renaturada. Esse é um processo que consome tempo, ineficiente e caro que requer etapas adicionais de fabricação e, frequentemente, procedimentos de purificação complexos.
[005] Assim, permanece uma necessidade significativa por composições e métodos que aprimorem as propriedades biológicas, farmacológicas, segurança e/ou farmacêuticas de uma proteína biologicamente ativa.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[006] A presente divulgação é dirigida a composições e a métodos que podem ser úteis para intensificação das propriedades biológicas, farmacêuticas, segurança e/ou terapêuticas de proteínas biologicamente ativas. As composições e métodos são particularmente úteis para intensificação das propriedades farmacocinéticas, tal como meia-vida e aumento do tempo consumido dentro da janela terapêutica de uma proteína biologicamente ativa, bem como simplificação do processo de produção e propriedades farmacêuticas, tal como solubilidade de tal proteína biologicamente ativa.
[007] Em parte, a presente divulgação é dirigida a composições farmacêuticas compreendendo proteínas de fusão e aos usos das mesmas para o tratamento de doenças, distúrbios ou condições. A doença a ser tratada em particular dependerá da escolha das proteínas biologicamente ativas. Em algumas modalidades, as composições e métodos são úteis para o tratamento de doenças metabólicas e cardiovasculares (incluindo, mas não limitado a, doenças relacionadas à glicose ou à insulina), distúrbios de coagulação e sangramento e distúrbios relacionados ao hormônio do crescimento.
[008] Em um aspecto, a presente invenção proporciona composições de polipeptídeos recombinantes estendidos (XTENs) que, quando ligados a uma proteína biologicamente ativa intensificam as propriedades farmacocinéticas e/ou aumentam a solubilidade e estabilidade da proteína de fusão resultante, ao mesmo tempo em que retêm ou intensificam a atividade biológica e/ou terapêutica global da proteína biologicamente ativa. Tais composições podem ter utilidade para tratar determinadas doenças, distúrbios ou condições, conforme descrito aqui. A proteína de fusão resultante pode exibir um melhor perfil de segurança e permitir dosagem menos frequente o que, por sua vez, pode levar à melhor conformidade do paciente. A presente invenção também proporciona polinucleotídeos que codificam o XTEN e as proteínas de fusão de proteínas biologicamente ativas ligadas com o XTEN, bem como polinucleotídeos complementares a polinucleotídeos que codificam o XTEN e as proteínas de fusão de proteínas biologicamente ativas ligadas com o XTEN.
[009] Em outro aspecto, a presente invenção proporciona composições de polipeptídeos recombinantes estendidos (XTEN) que são úteis como parceiros de fusão que podem ser ligados a proteínas biologicamente ativas (BPs), resultando em proteínas de fusão BPXTEN monoméricas.
[0010] Em outra modalidade, a invenção proporciona um polipeptídeo recombinante estendido (XTEN) isolado compreendendo mais de cerca de 400 a cerca de 3000 resíduos de aminoácido, em que o XTEN é caracterizado pelo fato de que a soma de resíduos de glicina (G), alanina (A), serina (S), treonina (T), glutamato (E) e prolina (P) constitui mais de cerca de 80% ou cerca de 85% ou cerca de 90% ou cerca de 95% ou cerca de 96% ou cerca de 97% ou cerca de 98% ou cerca de 99% da sequência de aminoácido total do XTEN, a sequência do XTEN é substancialmente não repetitiva, a sequência do XTEN carece de um epitopo de célula T previsto quando analisada por meio do algoritmo TEPITOPE, em que a previsão pelo algoritmo TEPITOPE quanto a epitopos dentro da sequência do XTEN é baseada em um escore de -5 ou -6 ou -7 ou -8 ou -9 ou maior, a sequência do XTEN tem mais de 90% ou mais de 91% ou mais de 92% ou mais de 93% ou mais de 94% ou mais de 95% ou mais de 96% ou mais de 96% ou mais de 98% ou mais de 99% de conformação em espiral aleatória, conforme determinado pelo algoritmo GOR e a sequência do XTEN tem menos de 2% de alfa hélices e 2% de beta-folhas, conforme determinado pelo algoritmo de Chou-Fasman.
[0011] Em outra modalidade, a invenção proporciona um XTEN compreendendo mais de cerca de 400 a cerca de 3000 resíduos de aminoácido, em que o XTEN é caracterizado pelo fato de que a soma de resíduos de asparagina e glutamina é menos de 10% da sequência de aminoácido total do XTEN, a soma de resíduos de metionina e triptofano é menos de 2% da sequência de aminoácido total do XTEN, a sequência do XTEN tem menos de 5% de resíduos de aminoácido com uma carga positiva, a sequência do XTEN tem mais de 90% de conformação em espiral aleatória conforme determinado pelo algoritmo GOR e a sequência do XTEN tem menos de 2% de alfa hélices e 2% de beta-folhas conforme determinado pelo algoritmo de Chou-Fasman.
[0012] Em outra modalidade, a invenção proporciona XTEN compreendendo mais de cerca de 400 a cerca de 3000 resíduos de aminoácido, em que o XTEN é caracterizado pelo fato de que pelo menos cerca de 80% ou pelo menos cerca de 90% ou pelo menos cerca de 91% ou pelo menos cerca de 92% ou pelo menos cerca de 93% ou pelo menos cerca de 94% ou pelo menos cerca de 95% ou pelo menos cerca de 96% ou pelo menos cerca de 97% ou pelo menos cerca de 98% ou pelo menos cerca de 99% da sequência do XTEN consistem em motivos de sequência sem sobreposição, em que cada um dos motivos de sequência tem cerca de 9 a cerca de 14 resíduos de aminoácido e em que a sequência de qualquer dois resíduos de aminoácido contíguos não ocorre mais de duas vezes em cada um dos motivos de sequência, os motivos de sequência consistem em quatro a seis tipos de aminoácidos selecionados de glicina (G), alanina (A), serina (S), treonina (T), glutamato (E) e prolina (P) e o XTEN intensifica as propriedades farmacocinéticas de uma proteína biologicamente ativa quando ligado à proteína biologicamente ativa, em que as propriedades farmacocinéticas são determinadas medindo-se a meia-vida terminal da proteína biologicamente ativa administrada a um indivíduo em comparação com o XTEN ligado à proteína biologicamente ativa e administrado a um indivíduo em uma dose comparável.
[0013] Em alguns casos das modalidades precedentes, nenhum tipo de aminoácido constitui mais de 30% da sequência do XTEN. Em outros casos das modalidades precedentes, o XTEN pode ter uma sequência na qual três aminoácidos contíguos não são idênticos, a menos que o aminoácido seja serina, caso no qual não mais de três aminoácidos contíguos são resíduos de serina. Em outros casos das modalidades precedentes, a sequência do XTEN tem um escore de subsequência de menos de 10 ou 9 ou 8 ou 7 ou 6. Em ainda outros casos das modalidades precedentes, pelo menos cerca de 80% ou cerca de 90% ou cerca de 95% ou cerca de 96% ou cerca de 97% ou cerca de 98% ou cerca de 99% ou 100% da sequência do XTEN consistem em motivos de sequência sem sobreposição, em que cada um dos motivos de sequência tem 12 resíduos de aminoácido. Em uma modalidade, a sequência do XTEN consiste em motivos de sequência sem sobreposição, em que os motivos de sequência são de uma ou mais sequências da Tabela 1.
[0014] Em algumas modalidades, a propriedade farmacocinética intensificada da proteína de fusão resultante abrange um aumento na meia-vida terminal de pelo menos cerca de duas vezes ou pelo menos cerca de três vezes ou pelo menos cerca de quatro vezes ou pelo menos cerca de cinco vezes ou pelo menos cerca de seis vezes ou pelo menos cerca de oito vezes ou pelo menos cerca de dez vezes. Em alguns casos, a propriedade farmacocinética intensificada é refletida pelo fato de que as concentrações sanguíneas que permanecem dentro da janela terapêutica para a proteína de fusão durante um determinado período são pelo menos cerca de duas vezes ou pelo menos cerca de três vezes ou pelo menos cerca de quatro vezes ou pelo menos cerca de cinco vezes ou pelo menos cerca de seis vezes ou pelo menos cerca de oito vezes ou pelo menos cerca de dez vezes mais longas comparada com a BP correspondente não ligada ao XTEN. O aumento na meia-vida e tempo consumido dentro da janela terapêutica pode permitir dosagem menos frequente e quantidades diminuídas da proteína de fusão (em equivalentes molares) que são administradas a um indivíduo, comparadas com uma BP correspondente não ligada ao XTEN. Em uma modalidade, o regime de dose terapeuticamente eficaz resulta em um ganho de tempo de pelo menos duas vezes ou pelo menos três vezes ou pelo menos quatro vezes ou pelo menos cinco vezes ou pelo menos seis vezes ou pelo menos oito vezes ou pelo menos dez vezes entre pelo menos dois picos Cmax consecutivos e/ou níveis séricos Cmin para os níveis sanguíneos da proteína de fusão, comparado com uma BP correspondente não ligada à proteína de fusão e administrada usando um regime de dose comparável a um indivíduo.
[0015] Em uma modalidade, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95% ou cerca de 99% do XTEN compreendem motivos selecionados de uma ou mais sequências da Tabela 1. Em outra modalidade, um XTEN exibe pelo menos cerca de 80% ou pelo menos cerca de 90% ou pelo menos cerca de 91% ou pelo menos cerca de 92% ou pelo menos cerca de 93% ou pelo menos cerca de 94% ou pelo menos cerca de 95% ou pelo menos cerca de 96% ou pelo menos cerca de 97% ou pelo menos cerca de 98% ou pelo menos cerca de 99% ou 100% de identidade de sequência a uma sequência selecionada da Tabela 2.
[0016] Em alguns casos, o XTEN intensifica a termoestabilidade de uma proteína biologicamente ativa quando ligado à proteína biologicamente ativa, em que a termoestabilidade é determinada medindo-se a retenção de atividade biológica após exposição a uma temperatura de cerca de 37°C durante pelo menos cerca de 7 dias da proteína biologicamente ativa em comparação com o XTEN ligado à proteína biologicamente ativa. Em uma modalidade do precedente, a retenção de atividade biológica é aumentada em pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 100% ou cerca de 150%, pelo menos cerca de 200%, pelo menos cerca de 300% ou cerca de 500% mais longa, comparada com a BP não ligada ao XTEN.
[0017] Em outro aspecto, a invenção proporciona uma proteína de fusão isolada compreendendo um XTEN de qualquer uma das modalidades precedentes ligada a uma proteína biologicamente ativa (BP). Em algumas modalidades, a BP da proteína de fusão exibe pelo menos cerca de 80% ou pelo menos cerca de 90% ou pelo menos cerca de 91% ou pelo menos cerca de 92% ou pelo menos cerca de 93% ou pelo menos cerca de 94% ou pelo menos cerca de 95% ou pelo menos cerca de 96% ou pelo menos cerca de 97% ou pelo menos cerca de 98% ou pelo menos cerca de 99% ou 100% de identidade de sequência a uma sequência selecionada da Tabela 3, Tabela 4, Tabela 5, Tabela 6, Tabela 7 e Tabela 8. Em outra modalidade do precedente, a proteína de fusão isolada ainda compreende uma segunda sequência de XTEN, em que o total cumulativo de resíduos de aminoácido nas sequências do XTEN é mais de cerca de 400 a cerca de 3000 resíduos.
[0018] Em alguns casos, a proteína de fusão isolada com um XTEN de uma das modalidades precedentes compreende uma BP em que a BP é um peptídeo de regulação de glicose. Em uma modalidade do precedente, o peptídeo de regulação de glicose é exendina-4. Em outra modalidade do precedente, o peptídeo de regulação de glicose é glucagon.
[0019] Em outros casos, a proteína de fusão isolada compreende uma BP, em que a BP é uma proteína metabólica. Em uma modalidade do precedente, a proteína metabólica é IL-1ra.
[0020] Em ainda outros casos, a proteína de fusão isolada compreende uma BP, em que a BP é um fator de coagulação. Em uma modalidade do precedente, o fator de coagulação é factor IX. Em outra modalidade do precedente, o fator de coagulação é fator VII.
[0021] Em outros casos, a proteína de fusão isolada compreende uma BP, em que a BP é um hormônio de crescimento.
[0022] Em uma modalidade, a proteína de fusão isolada pode ser menos imunogênica comparada à proteína biologicamente ativa não ligada ao XTEN, em que a imunogenicidade é determinada medindo-se a produção de anticorpos IgG que se ligam seletivamente à proteína biologicamente ativa, após administração de doses comparáveis a um indivíduo.
[0023] A proteína de fusão compreendendo XTEN e BP das modalidades precedentes pode compreender uma sequência espaçadora entre a BP e XTEN, em que a sequência espaçadora compreende entre cerca de 1 a cerca de 50 resíduos de aminoácido que compreende, opcionalmente, uma sequência de clivagem. Em uma modalidade, a sequência de clivagem é suscetível à clivagem por uma protease. Exemplos não limitativos de tais proteases incluem FXIa, FXIIa, calicreína, FVIIa, FIXa, FXa, trombina, elastase-2, granzima B, MMP- 12, MMP- 13, MMP- 17 ou MMP-20, TEV, enteroquinase, protease de rinovírus 3C e sortase A.
[0024] Em alguns casos, a proteína de fusão isolada é configurada para ter afinidade de ligação reduzida por um receptor alvo de uma BP correspondente, quando comparada com uma BP correspondente não ligada à proteína de fusão. Em uma modalidade, a proteína de fusão exibe capacidade de ligação a um receptor alvo da BP na faixa de cerca de 0,01%-30% ou cerca de 0,1% a cerca de 20% ou cerca de 1% a cerca de 15% ou cerca de 2% a cerca de 10% da capacidade de ligação de uma BP correspondente que não está ligada à proteína de fusão. Em uma modalidade relacionada, uma proteína de fusão com afinidade reduzida pode ter depuração mediada por receptor reduzida e um aumento correspondente na meia-vida de pelo menos cerca de 50% ou pelo menos cerca de 60% ou pelo menos cerca de 70% ou pelo menos cerca de 80% ou pelo menos cerca de 90% ou pelo menos cerca de 100% ou pelo menos cerca de 150% ou pelo menos cerca de 200% ou pelo menos cerca de 300% ou pelo menos cerca de 500%, comparados com uma BP correspondente que não está ligada à proteína de fusão.
[0025] Em uma modalidade, a invenção proporciona uma proteína de fusão isolada que exibe pelo menos cerca de 80% ou pelo menos cerca de 90% ou pelo menos cerca de 91% ou pelo menos cerca de 92% ou pelo menos cerca de 93% ou pelo menos cerca de 94% ou pelo menos cerca de 95% ou pelo menos cerca de 96% ou pelo menos cerca de 97% ou pelo menos cerca de 98% ou pelo menos cerca de 99% ou 100% de identidade de sequência a uma sequência selecionada da Tabela 40, Tabela 41, Tabela 42, Tabela 43 e Tabela 44.
[0026] Em uma modalidade, a invenção proporciona composições compreendendo uma proteína de fusão, em que a proteína de fusão compreende pelo menos uma primeira BP compreendendo uma sequência que exibe pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência ou 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência a uma sequência de qualquer uma das Tabelas 3-8, em que a BP é ligada a um ou mais polipeptídeos recombinantes estendidos (XTEN), cada um compreendendo mais de cerca de 100 a cerca de 3000 resíduos de aminoácido, mais preferivelmente mais de cerca de 400 a cerca de 3000 resíduos de aminoácido, com uma sequência substancialmente não repetitiva, em que a soma de resíduos de glicina (G), alanina (A), serina (S), treonina (T), glutamato (E) e prolina (P) constitui mais de cerca de 80% ou cerca de 85% ou cerca de 90% ou cerca de 95% ou cerca de 96% ou cerca de 97% ou cerca de 98% ou cerca de 99% da sequência de aminoácido total do XTEN. O componente XTEN da BPXTEN pode carecer de um epitopo de célula T quando analisado pelo algoritmo TEPITOPE, em que a previsão pelo algoritmo TEPITOPE quanto a epitopos dentro da sequência do XTEN é baseada em um escore de -7 ou maior ou -8 ou maior ou -9 ou maior. O componente XTEN da BPXTEN pode ter uma sequência com mais de 80% ou cerca de 85% ou cerca de 90% ou cerca de 91% ou cerca de 92% ou cerca de 93% ou cerca de 94% ou cerca de 95% ou cerca de 96% ou cerca de 97% ou cerca de 98% ou cerca de 99% de conformação em espiral aleatória conforme determinado pelo algoritmo GOR; e a sequência do XTEN pode ter menos de 2% de alfa hélices e 2% de beta-folhas conforme determinado pelo algoritmo de Chou- Fasman.
[0027] Em algumas modalidades, a invenção proporciona proteínas de fusão BPXTEN, em que a BPXTEN administrada a um indivíduo exibe um aumento na meia-vida terminal para a BPXTEN, comparado com uma BP correspondente não ligada à proteína de fusão, de pelo menos cerca de duas vezes maior ou pelo menos cerca de três vezes ou pelo menos cerca de quatro vezes ou pelo menos cerca de cinco vezes ou pelo menos cerca de seis vezes ou pelo menos cerca de sete vezes ou pelo menos cerca de oito vezes ou pelo menos cerca de nove vezes ou pelo menos cerca de dez vezes ou pelo menos cerca de 15 vezes ou pelo menos a 20 vezes ou um aumento maior na meia-vida terminal, comparado com a BP não ligada à proteína de fusão.
[0028] Em algumas modalidades, a invenção proporciona proteínas de fusão BPXTEN, em que a BPXTEN exibe solubilidade aumentada de pelo menos três vezes ou pelo menos cerca de quatro vezes ou pelo menos cerca de cinco vezes ou pelo menos cerca de seis vezes ou pelo menos cerca de sete vezes ou pelo menos cerca de oito vezes ou pelo menos cerca de nove vezes ou pelo menos cerca de dez vezes ou pelo menos cerca de 15 vezes ou pelo menos a 20 vezes ou pelo menos 40 vezes ou pelo menos 60 vezes em condições fisiológicas, comparada com a BP não ligada à proteína de fusão.
[0029] Em algumas modalidades, proteínas de fusão BPXTEN exibem um peso molecular aparente aumentado conforme determinado através de cromatografia por exclusão de tamanho, comparado com o peso molecular real, em que o peso molecular aparente é pelo menos cerca de 100 kD ou pelo menos cerca de 150 kD ou pelo menos cerca de 200 kD ou pelo menos cerca de 300 kD ou pelo menos cerca de 400 kD ou pelo menos cerca de 500 kD ou pelo menos cerca de 60OkD ou pelo menos cerca de 700 kD, enquanto que o peso molecular real de cada componente BP da proteína de fusão é menos de cerca de 25 kD. Consequentemente, as proteínas de fusão BPXTEN podem ter um peso molecular aparente que é cerca de 4 vezes maior ou cerca de 5 vezes maior ou cerca de 6 vezes maior ou cerca de 7 vezes maior ou cerca de 8 vezes maior do que o peso molecular real da proteína de fusão. Em alguns casos, a proteína de fusão isolada das modalidades precedentes exibe um fator de peso molecular aparente, sob condições fisiológicas, que é mais de cerca de 4 ou cerca de 5 ou cerca de 6 ou cerca de 7 ou cerca de 8.
[0030] A invenção proporciona BPXTEN em várias configurações, em que a BP retém pelo menos uma parte da atividade biológica de uma BP correspondente não ligada ao XTEN. Em uma modalidade, a BPXTEN compreende uma BP ligada a um XTEN na configuração da fórmula I: (BP)-(S)x-(XTEN) I
[0031] em que, independentemente para cada ocorrência, BP é uma proteína biologicamente ativa conforme descrito aqui acima; S é uma sequência espaçadora tendo entre 1 a cerca de 50 resíduos de aminoácido que pode incluir opcionalmente uma sequência de clivagem (conforme descrito acima); x é 0 ou 1; e XTEN é um polipeptídeo recombinante estendido (conforme descrito aqui). A modalidade tem utilidade particular onde a BP requer um N-término livre para a atividade biológica desejada ou onde ligação do C-término da BP à proteína de fusão reduz a atividade biológica e se deseja reduzir a atividade biológica e/ou efeitos colaterais da BPXTEN administrada.
[0032] Em outra modalidade de configuração da BPXTEN, a invenção proporciona uma proteína de fusão na configuração da fórmula II (componentes conforme descrito acima): (XTEN)-(S)x-(BP) II
[0033] A modalidade é particularmente útil onde a BP requer um C- término livre para a atividade biológica desejada ou onde a ligação do N-término da BP à proteína de fusão reduz a atividade biológica e se deseja reduzir a atividade biológica e/ou efeitos colaterais da BPXTEN administrada.
[0034] Em outro aspecto, a invenção proporciona proteínas de fusão BPXTEN isoladas compreendendo duas moléculas de BP e compreendendo opcionalmente um segundo XTEN e/ou uma sequência espaçadora, em que a proteína de fusão tem uma configuração selecionada da fórmula III, fórmula IV e fórmula V: (BP)-(SV(XTEN)-(S)x-(BP)-(SV(XTEN)2 III (XTEN)-(S)w-(BP)-(S)x-(XTEN)57-(BP) IV (BP)-(S)x-(BP)-(S)y-(XTEN) V em que, independentemente para cada ocorrência, BP é uma proteína biologicamente ativa conforme descrito aqui acima, S é uma sequência espaçadora tendo entre 1 a cerca de 50 resíduos de aminoácido que compreende, opcionalmente, uma sequência de clivagem; w é 0 ou 1; x é 0 ou 1; y é 0 ou 1; z é 0 ou 1; e XTEN é um polipeptídeo recombinante estendido (conforme descrito aqui), em que o total cumulativo de resíduos de aminoácido de XTEN é mais de 400 a cerca de 3000.
[0035] Em outro aspecto, a invenção proporciona proteínas de fusão isoladas compreendendo uma molécula de BP e duas moléculas de XTEN e opcionalmente uma ou duas sequências espaçadoras, em que a proteína de fusão é da fórmula VI: (XTEN)-(S)x-(BP)-(S)y-(XTEN) VI
[0036] em que, independentemente para cada ocorrência, BP é uma proteína biologicamente ativa, S é uma sequência espaçadora tendo entre 1 a cerca de 50 resíduos de aminoácido que compreende, opcionalmente, uma sequência de clivagem; w é 0 ou 1; x é 0 ou 1; y é 0 ou 1; z é 0 ou 1; e XTEN é um polipeptídeo recombinante estendido (conforme descrito aqui), em que o total cumulativo de resíduos de aminoácido de XTEN é mais de 400 a cerca de 3000.
[0037] Assim, as proteínas de fusão podem ser projetadas para ter diferentes configurações, N- para C-término de uma BP, XTEN e sequências espaçadoras opcionais incluindo, mas não limitado a, XTEN-BP, BP-XTEN, XTEN-S-BP, BP-S-XTEN, XTEN-BP-XTEN, BP- BP-XTEN, XTEN-BP-BP, BP-S-BP-XTEN e XTEN-BP- S-BP. A escolha da configuração pode, conforme divulgado aqui, conferir propriedades farmacocinéticas, físico/químicas ou farmacológicas particulares.
[0038] Em uma modalidade, as proteínas de fusão BPXTEN da fórmulas I, II, III, IV ou V ou VI descritas acima exibem uma atividade biológica de pelo menos cerca de 40% ou pelo menos cerca de 50% ou pelo menos cerca de 60% ou pelo menos cerca de 70% ou pelo menos cerca de 80% ou pelo menos cerca de 90% ou pelo menos cerca de 95% da atividade biológica, comparada com a BP não ligada à proteína de fusão. Em outra modalidade, as proteínas de fusão BPXTEN da fórmula I, II, III, IV ou V se ligam aos mesmos receptores ou ligantes que a proteína biologicamente ativa parental correspondente que não está covalentemente ligada à proteína de fusão.
[0039] A invenção proporciona ácidos nucleicos isolados compreendendo uma sequência de polinucleotídeo selecionada de (a) um polinucleotídeo que codifica a proteína de fusão de qualquer uma das modalidades precedentes ou (b) o complemento do polinucleotídeo de (a). Em uma modalidade do precedente, o ácido nucleico isolado compreende uma sequência de polinucleotídeo que tem pelo menos 80% de identidade de sequência ou cerca de 85% ou pelo menos cerca de 90% ou cerca de 91% ou cerca de 92% ou cerca de 93% ou cerca de 94% ou cerca de 95% ou cerca de 96% ou cerca de 97% ou cerca de 98% ou cerca de 99% a cerca de 100% de identidade de sequência a (a) uma sequência de polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo selecionado da Tabela 40, Tabela 41, Tabela 42, Tabela 43 e Tabela 44; ou (b) o complemento do polinucleotídeo de (a). A invenção proporciona vetores de expressão compreendendo o ácido nucleico de qualquer uma das modalidades descritas aqui acima nesse parágrafo. Em uma modalidade, o vetor de expressão do precedente ainda compreende uma sequência regulatória recombinante operavelmente ligada à sequência de polinucleotídeo. Em outra modalidade, a sequência de polinucleotídeo dos vetores de expressão do precedente é fundida, in-frame, a um polinucleotídeo que codifica uma sequência de sinal de secreção, a qual pode ser uma sequência sinalizadora procariota. Em uma modalidade, a sequência de sinal de secreção é selecionada de sequências sinalizadoras OmpA, DsbA e PhoA.
[0040] A invenção proporciona uma célula hospedeira, a qual pode compreender um vetor de expressão divulgado no parágrafo precedente. Em uma modalidade, a célula hospedeira é uma célula procariota. Em outra modalidade, a célula hospedeira é E. coli.
[0041] Em uma modalidade, a invenção proporciona composições farmacêuticas compreendendo a proteína de fusão de qualquer uma das modalidades precedentes e pelo menos um veículo farmaceuticamente aceitável. Em outra modalidade, a invenção proporciona kits, compreendendo material de embalagem e pelo menos um primeiro recipiente compreendendo a composição farmacêutica da modalidade precedente e um rótulo para identificação da composição farmacêutica e condições de armazenamento e manipulação e uma folha de instruções para a reconstituição e/ou administração das composições farmacêuticas a um indivíduo.
[0042] A invenção ainda proporciona o uso das composições farmacêuticas compreendendo a proteína de fusão de qualquer uma das modalidades precedentes no preparo de um medicamento para tratamento de uma doença ou condição em um indivíduo que precisa do mesmo. Em uma modalidade do precedente, o tratamento da doença, distúrbio ou condição compreende administração da composição farmacêutica descrita acima a um indivíduo que precisa da mesma. Em uma modalidade do precedente, a doença, distúrbio ou condição é selecionada de diabetes do tipo 1, diabetes do tipo 2, obesidade, hiperglicemia, hiperinsulinemia, produção diminuída de insulina, resistência à insulina, síndrome X, miocárdio em hibernação ou cardiomiopatia diabética, apetite excessivo, saciedade insuficiente, distúrbio metabólico, glucagonomas, síndrome do ovário policístico, dislipidemia, miocárdio em hibernação, excreção insuficiente de sódio na urina, concentração excessiva de potássio na urina, condições ou distúrbios associados à hipervolemia tóxica, cardiomiopatia diabética e processos neurodegenerativos retinais. Em alguns casos, a composição farmacêutica pode ser administrada subcutaneamente, intramuscularmente ou intravenosamente. Em uma modalidade, a composição farmacêutica é administrada em uma dose terapeuticamente eficaz. Em alguns casos do precedente, a dose terapeuticamente eficaz resulta em um ganho no tempo consumido dentro de uma janela terapêutica para a proteína de fusão, comparado com uma BP correspondente da proteína de fusão não ligada à proteína de fusão e administrada em uma dose comparável a um indivíduo. O ganho no tempo consumido dentro da janela terapêutica pode ser pelo menos três vezes maior do que uma BP correspondente não ligada à proteína de fusão ou, alternativamente, pelo menos quatro vezes ou cinco vezes ou seis vezes ou sete vezes ou oito vezes ou nove vezes ou pelo menos dez vezes ou pelo menos 20 vezes maior do que uma BP correspondente não ligada à proteína de fusão.
[0043] Em outra modalidade, a invenção proporciona um método de tratamento de uma doença, distúrbio ou condição compreendendo administração da composição farmacêutica descrita acima a um indivíduo usando múltiplas doses consecutivas da composição farmacêutica administrada usando um regime de dose terapeuticamente eficaz. Em uma modalidade do precedente, o regime de dose terapeuticamente eficaz pode resultar em um ganho de tempo de pelo menos três vezes ou, alternativamente, pelo menos quatro vezes ou cinco vezes ou seis vezes ou sete vezes ou oito vezes ou nove vezes ou pelo menos dez vezes ou pelo menos 20 vezes entre pelo menos dois picos Cmax consecutivos e/ou níveis séricos Cmin para os níveis sanguíneos da proteína de fusão, comparado com uma BP correspondente da proteína de fusão não ligada à proteína de fusão e administrada em um regime de dose comparável a um indivíduo. Em outra modalidade do precedente, a administração da proteína de fusão resulta em um aprimoramento comparável em pelo menos um parâmetro medido usando dosagem menos frequente ou uma menor dosagem total em moles da proteína de fusão da composição farmacêutica, comparado com o(s) componente(s) de proteína biologicamente ativa correspondente(s) não ligado(s) à proteína de fusão e administrado(s) a um indivíduo d usando um regime terapeuticamente eficaz a um indivíduo. O parâmetro pode ser selecionado de nível de glicose em jejum, resposta ao teste de tolerância à glicose oral, alteração de pico de glicose pós-prandial a partir da linha de base, HAtc, ingestão calórica, saciedade, taxa de esvaziamento gástrico, secreção de insulina, sensibilidade à insulina periférica, resposta ao estímulo com insulina, massa de beta célula, peso corporal, tempo de pró-trombina, tempo de sangramento, complexo de trombina-antitrombina III (TAT), dímero D, incidência de episódios de sangramento, taxa de sedimentação de eritrócito (ESR), proteína C reativa, densidade óssea, massa muscular, pressão sanguínea, triglicerídeos no plasma, HDL, colesterol, LDL colesterol, incidência de angina e débito cardíaco.
[0044] Em outro aspecto, a invenção proporciona um método de aprimoramento de uma propriedade de uma proteína biologicamente ativa compreendendo a etapa de ligação de uma proteína biologicamente ativa ao XTEN de qualquer uma das modalidades precedentes para obter uma propriedade caracterizada pelo fato de que (a) a meia-vida terminal da proteína biologicamente ativa ligada ao XTEN é maior quando comparada com a meia-vida terminal da proteína biologicamente ativa que não está ligada ao XTEN; (b) a vida útil da proteína biologicamente ativa ligada ao XTEN é maior quando comparada com a vida útil da proteína biologicamente ativa que não está ligada ao XTEN, em que vida útil é determinada pela retenção de atividade biológica após um intervalo, comparada com uma amostra de linha de base; (c) a solubilidade, sob condições fisiológicas, da proteína biologicamente ativa ligada ao XTEN é aumentada quando comparada com a solubilidade da proteína biologicamente ativa que não está ligada ao XTEN; (d) a produção de anticorpos IgG que se ligam seletivamente à proteína biologicamente ativa ligada ao XTEN, quando administrada a um indivíduo, é reduzida quando comparada com a produção da IgG quando a proteína biologicamente ativa não ligada ao XTEN é administrada a um indivíduo em uma dose comparável; e/ou (e) o tempo consumido dentro da janela terapêutica da proteína biologicamente ativa ligada ao XTEN, quando administrada a um indivíduo, é maior quando comparado com a proteína biologicamente ativa que não está ligada ao XTEN quando administrada a um indivíduo.
INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA
[0045] Todas as publicações, patentes e pedidos de patente mencionados no presente relatório descrito são aqui incorporados por referência até o mesmo ponto como se cada publicação, patente ou pedido de patente individual fosse específico e individualmente incorporado por referência.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0046] As características e vantagens da invenção podem ser adicionalmente explicadas por meio de referência à descrição detalhada a seguir e desenhos em anexo que apresentam modalidades ilustrativas.
[0047] A figura 1 mostra representações esquemáticas de proteínas de fusão BPXTEN exemplificativas (FIGS. 1A-G), todas representadas em uma orientação N- para C-término. A figura 1A mostra duas diferentes configurações de proteínas de fusão BPXTEN (100), cada uma compreendendo uma única proteína biologicamente ativa (BP) e um XTEN, a primeira dos quais tem uma molécula de XTEN (102) presa ao C-término de uma BP (103) e o segundo dos quais tem uma molécula de XTEN presa ao N-término de uma BP (103). A figura 1B mostra duas diferentes configurações de proteínas de fusão BPXTEN (100), cada uma compreendendo uma única BP, uma sequência espaçadora e um XTEN, a primeira dos quais tem uma molécula de XTEN (102) presa ao C-término de uma sequência espaçadora (104) e a sequência espaçadora presa ao C-término de uma BP (103) e o segundo dos quais tem uma molécula de XTEN presa ao N-término de uma sequência espaçadora (104) e a sequência espaçadora presa ao N-término de uma BP (103). A figura 1C mostra duas diferentes configurações de proteínas de fusão BPXTEN (101), cada uma compreendendo duas moléculas de uma única BP e uma molécula de um XTEN, a primeira dos quais tem um XTEN ligado ao C-término de uma primeira BP e essa BP é ligada ao C-término de uma segunda BP e o segundo dos quais está na orientação oposta na qual o XTEN é ligado ao N-término de uma primeira BP e essa BP é ligada ao N-término de uma segunda BP. A figura 1D mostra duas diferentes configurações de proteínas de fusão BPXTEN (101), cada uma compreendendo duas moléculas de uma única BP, uma sequência espaçadora e uma molécula de um XTEN, a primeira dos quais tem um XTEN ligado ao C- término de uma sequência espaçadora e a sequência espaçadora ligada ao C-término de uma primeira BP, a qual está ligada ao C-término de uma segunda BP e o segundo dos quais está na orientação oposta na qual o XTEN é ligado ao N-término de uma sequência espaçadora e a sequência espaçadora é ligada ao N-término de uma primeira BP em que essa BP é ligada ao N-término de uma segunda BP. A figura 1E mostra duas diferentes configurações de proteínas de fusão BPXTEN (101), cada uma compreendendo duas moléculas de uma única BP, uma sequência espaçadora e uma molécula de um XTEN, a primeira dos quais tem um XTEN ligado ao C- término de uma primeira BP e a primeira BP ligada ao C-término de uma sequência espaçadora a qual é ligada ao C- término de uma segunda molécula de BP e o segundo dos quais está na configuração oposta do XTEN ligado ao N-término de uma primeira BP, a qual está ligada ao N-término de uma sequência espaçadora a qual, por sua vez, está ligada ao N-término de uma segunda molécula de BP. A figura 1F mostra duas diferentes configurações de proteínas de fusão BPXTEN (105), cada uma compreendendo duas moléculas de uma única BP e duas moléculas de um XTEN, a primeira das quais tem um primeiro XTEN ligado ao C-término de uma primeira BP, a qual está ligada ao C-término de um segundo XTEN que é ligado ao C-término de uma segunda molécula de BP e o segundo dos quais está na configuração oposta do XTEN ligado ao N-término de uma primeira BP ligada ao N-término de um segundo XTEN ligado ao N-término de uma segunda BP. A figura 1G mostra uma configuração (106) de uma única BP ligada a dois XTENs no N- e C-términos da BP.
[0048] A figura 2 é uma ilustração esquemática de construtos de polinucleotídeo exemplificativos (FIGS. 2A-G) de genes de BPXTEN que codificam os polipeptídeo de BPXTEN correspondentes da figura 1; todos representados em uma orientação 5' para 3'. Nesses exemplos ilustrativos, os genes codificam proteínas de fusão BPXTEN com uma BP e XTEN (100); ou duas BPs, uma sequência espaçadora e um XTEN (201); duas BPs e dois XTENs (205); ou uma BP e dois XTENs (206). Nessas representações, os polinucleotídeos codificam os seguintes componentes: XTEN (202), BP (203) e aminoácidos espaçadores que podem incluir uma sequência de clivagem (204), com todas as sequências ligadas in-frame.
[0049] A figura 3 é uma ilustração esquemática de uma BPXTEN monomérica exemplificativa acionada por uma protease endogenamente disponível e pela capacidade da proteína de fusão monomérica ou dos produtos de reação de se ligar a um receptor alvo sobre uma superfície celular, com subsequente sinalização celular. A figura 3A mostra uma proteína de fusão BPXTEN (101) na qual uma BP (103) e um XTEN (102) são ligados por sequências espaçadoras que contêm uma sequência clivável (104), a última sendo suscetível à protease MMP-13 (105). A figura 3B mostra os produtos de reação de uma BP livre, sequência espaçadora e XTEN. A figura 3 C mostra a interação do produto de reação de BP livre (103) ou proteína de fusão BPXTEN (101) com receptores alvo (106) à BP sobre uma superfície celular (107). Nesse caso, a ligação desejada ao receptor é exibida quando a BP tem um C-término livre, conforme evidenciado pela ligação de BP livre (103) ao receptor, enquanto que a proteína de fusão não clivada não se liga firmemente ao receptor. A figura 3D mostra que a BP livre (103), com alta afinidade de ligação, permanece ligada ao receptor (106), enquanto que uma BPXTEN intacta (101) é liberada do receptor. A figura 3E mostra a BP ligada que foi internalizada no endossoma (108) dentro da célula (107), ilustrando a depuração mediada por receptor da BP ligada e disparo de sinalização celular (109), representado como citoplasma fragmentado.
[0050] A figura 4 é um fluxograma esquemático de etapas representativas na montagem, produção e avaliação de um XTEN.
[0051] A figura 5 é um fluxograma esquemático de etapas representativas na montagem de um construto de polinucleotídeo de BP-XTEN que codifica uma proteína de fusão. Oligonucleotídeos individuais 501 são anelados em motivos de sequência 502, tal como um motivo de 12 aminoácidos ("12-meros"), o qual é subsequentemente ligado a um oligo contendo sítios de restrição BbsI e KpnI 503. Motivos de sequência adicionais de uma biblioteca são anelados ao 12-meros até que o comprimento desejado do gene de XTEN 504 seja obtido. O gene de XTEN é clonado em um vetor "stuffer". O vetor codifica uma sequência Flag 506, seguido por uma sequência terminadora que é flanqueada por Sítios BsaI, BbsI e KpnI 507 e um gene de exendina-4 508, resultando no gene 500 que codifica uma fusão BP-XTEN para incorporação em uma combinação de BPXTEN. A figura 6 é um fluxograma esquemático de etapas representativas na montagem de um gene que codifica uma proteína de fusão compreendendo uma proteína biologicamente ativa (BP) e XTEN, sua expressão e recuperação como uma proteína de fusão e sua avaliação como um produto de BPXTEN candidato.
[0052] A figura 7 é uma representação esquemática do design de vetores de expressão IL-1raXTEN com diferentes estratégias de processamento. A figura 7A mostra um vetor de expressão que codifica um XTEN fundido à extremidade 3' da sequência que codifica a proteína biologicamente ativa IL-1ra. Note que nenhuma sequência líder adicional é requerida nesse vetor. A figura 7B representa um vetor de expressão que codifica um XTEN fundido à extremidade 5' da sequência que codifica IL-1ra com uma sequência líder CBD e um sítio de protease TEV. A figura 7C representa um vetor de expressão conforme na figura 7B onde os sítios de processamento CBD e TEV foram substituídos por uma sequência líder N-terminal otimizada (NTS). A figura 7D representa um vetor de expressão que codifica uma sequência NTS, um XTEN, uma sequência que codifica IL-1ra e, então, uma segunda sequência que codifica um XTEN.
[0053] A figura 8 mostra resultados de ensaios de expressão para os construtos indicados compreendendo sequências de GFP e XTEN. As culturas de expressão foram ensaiadas usando um leitor de lâmina por fluorescência (excitação a 395 nm, emissão a 510 nm) para determinar a quantidade de repórter GFP presente. Os resultados, representados como bloxplot indicam que, enquanto os níveis médios de expressão eram aproximadamente metade dos níveis de expressão comparado com o domínio auxiliar N-terminal "padrão" CBD, os melhores clones das bibliotecas estavam muito mais próximos dos padrões, indicando que otimização adicional em torno dessas sequências era assegurada. Os resultados também mostram que as bibliotecas começando com aminoácidos MA tinham melhores níveis de expressão do que aquelas começando com ME (vide Exemplo 14).
[0054] A figura 9 mostra três bibliotecas aleatórias usadas para os terceiro e quarto códons nas sequências N-terminais de clones de LCW546, LCW547 e LCW552. As bibliotecas foram criadas com os terceiro e quarto resíduos modificados, de modo que todas as combinações de códons de XTEN permissíveis estivessem presentes nessas posições, conforme mostrado. De forma a incluir todos os códons de XTEN permissíveis para cada biblioteca, nove pares de oligonucleotídeos que codificam 12 aminoácidos com diversidades de códon dos terceiro e quarto resíduos foram criados, anelados e ligados no vetor "stuffer" pCW0551 digerido com enzimas de restrição NdeI/BsaI (Stuffer-XTEN_AM875-GFP) e transformados em células de E. coli competentes BL21Gold(DE3) para obter colônias das três bibliotecas LCW0569 (SEQ ID NOS 1.708 e 1.709), LCW0570 (SEQ ID NOS 1.710 e 1.711) e LCW0571 (SEQ ID NOS 1.712 e 1.713).
[0055] A figura 10 mostra um histograma de um re-teste dos 75 clones superiores após a etapa de otimização, conforme descrito no Exemplo 15, quanto ao sinal de fluorescência de GFP com relação ao construto padrão CBD AM875. Os resultados indicam que vários clones eram superiores aos clones padrões, conforme observado na figura 10.
[0056] A figura 11 é um esquema de uma abordagem combinatorial empreendida para a união de preferências de otimização de códon para duas regiões dos 48 aminoácidos N-terminais. A abordagem criou novos 48 meros no N-término da proteína XTEN para avaliação da otimização da expressão que resultou em sequências líderes que podem ser uma solução para expressão de proteínas de XTEN onde o XTEN é N- terminal à BP.
[0057] A figura 12 mostra um gel de SDS-PAGE confirmando a expressão de clones preferidos obtidos a partir dos experimentos de otimização de códon N-terminal de XTEN, em comparação com clones de XTEN padrões compreendendo sequências líderes CBD no N- término das sequências do construto.
[0058] A figura 13 mostra um gel de SDS-PAGE de amostras de um estudo de estabilidade da proteína de fusão de XTEN AE864 fundida ao N-término de GFP (vide Exemplo 21). A GFP-XTEN foi incubada em plasma de cynomolgus e lisato de rim de rato até 7 dias a 37°C. Além disso, GFP-XTEN administrada a macacos cynomolgus foi também ensaiada. As amostras foram coletadas a 0, 1 e 7 dias e analisada através de SDS PAGE, seguido por detecção usando análise de Western e detecção com anticorpos contra GFP.
[0059] A figura 14 mostra duas amostras de 2 e 10 mcg de proteína purificada final de IL-1ra ligado a XTEN AE864 submetido à SDS-PAGE de não redução, conforme descrito no Exemplo 23. Os resultados mostram que a composição IL-1raXTEN foi recuperada pelo processo, com um MW aproximado de cerca de 160 kDa.
[0060] A figura 15 mostra o produto de uma análise por cromatografia por exclusão de tamanho representativa realizada conforme descrito no Exemplo 23. Os padrões de calibração, mostrados na linha tracejada, incluem os marcadores tiroglobulina (670 kDa), gama-globulina bovina (158 kDa), ovalbumina de galinha (44 kDa), mioglobulina de equino (17 kDa) e vitamina B12 (1,35 kDa). Uma proteína de fusão BPXTEN competente de IL-1ra ligado a XTEN AM875 é mostrada como a linha sólida. Os dados mostram que o peso molecular aparente do construto BPXTEN é significativamente maior do que aquele esperado para uma proteína globular (conforme mostrado em comparação com as proteínas padrões utilizadas no mesmo ensaio) e tem um peso molecular aparente significativamente maior do que aquele determinado através de SDS-PAGE (dados não mostrados).
[0061] A figura 16 mostra a análise em fase reversa C18 de IL- 1ra_XTEN_AM875 purificado. O produto, em absorbância versus o tempo, demonstra a pureza da proteína de fusão resultante final.
[0062] A figura 17 mostra os resultados do ensaio de ligação a receptor de IL-1, plotados como uma função da concentração de IL-1ra- XTEN AM875 ou IL-1ra para produzir um isoterma de ligação. Para estimar a afinidade de ligação de cada proteína de fusão pelo receptor de IL-1, os dados de ligação foram adaptados a uma curva de dose- resposta sigmoidal. A partir da adaptação dos dados, uma EC50 (a concentração de IL-1ra ou IL-1ra-XTEN na qual o sinal é metade do máximo) para cada construto foi determinada, conforme descrito no Exemplo 23. O construto de controle negativo, XTEN_AM875-hGH, não mostrou ligação sob as condições experimentais.
[0063] A figura 18 mostra um SDS-PAGE de um estudo de estabilidade térmica comparando IL-1ra com uma BPXTEN de IL-1ra ligado a XTEN AM875, conforme descrito no Exemplo 23. Amostras de IL-1ra e IL-1ra ligado a XTEN foram incubadas a 25°C e 85°C durante 15 min, tempo no qual qualquer proteína insolúvel foi rapidamente removida através de centrifugação. A fração solúvel foi, então, analisada através de SDS-PAGE, conforme mostrado na figura 18 e mostra que apenas IL-1ra-XTEN permaneceu solúvel após aquecimento enquanto que, em contraste, IL-1ra recombinante (sem XTEN como um parceiro de fusão) foi completamente precipitado após aquecimento.
[0064] A figura 19 mostra os resultados de um ensaio de ligação ao receptor de IL-1ra realizado sobre as amostras mostradas na figura 19. Conforme descrito no Exemplo 23, o IL-1ra recombinante, o qual foi totalmente desnaturado através de tratamento térmico, reteve menos de 0,1% de sua atividade de ligação a receptor após tratamento térmico. Contudo, IL-1ra ligado a XTEN reteve aproximadamente 40% de sua atividade de ligação a receptor.
[0065] A figura 20 mostra o perfil farmacocinético (concentrações plasmáticas) após doses subcutâneas únicas de três diferentes composições de BPXTEN de IL-1ra ligado a diferentes sequências de XTEN, separadamente administradas a macacos cynomolgus, conforme descrito no Exemplo 24.
[0066] A figura 21 mostra os resultados de peso corporal de um estudo farmacodinâmico e metabólico usando uma combinação de duas proteínas de fusão; isto é, eficácia da combinação de glucagon ligado a Y288 (Gcg-XTEN) e exendina-4 ligada a AE864 (Ex4-XTEN) em um modelo de obesidade induzida por dieta em camundongos (vide Exemplo 26 para detalhes experimentais). O gráfico mostra a alteração no peso corporal em camundongos Obesos Induzidos por Dieta durante o curso de 28 dias contínuos de administração do fármaco. Os valores mostrados são a média +/- SEM de 10 animais por grupo (20 animais no grupo com placebo).
[0067] A figura 22 mostra a alteração no nível de glicose em jejum a partir de um estudo farmacodinâmico e metabólico usando combinações únicas e de duas proteínas de fusão BPXTEN, isto é, glucagon ligado a Y288 (Gcg- XTEN) e exendina-4 ligada a AE864 (Ex4- XTEN) em um modelo de obesidade induzida por dieta em camundongos (vide Exemplo 26 para detalhes experimentais). Os grupos são como segue: Gr. 1 Veículo de Tris; Gr. 2 Ex4-AE576, 10 mg/kg; Gr. 3 Ex4-AE576, 20 mg/kg; Gr. 4 Veículo, DMSO a 50%; Gr. 5 Exenatida, 30 μg/kg/dia; Gr. 6 Exenatida, 30 uL/kg/dia + Gcg-Y288 20 μg/kg; Gr. 7 Gcg-Y288, 20 μg/kg; Gr. 8 Gcg-Y288, 40 μg/kg; Gr. 9 Ex4- AE576 10 mg/kg + Gcg-Y288 20 μg/kg; Gr. 10 Gcg-Y288 40 μg/kg + Ex4-AE576 20 mg/kg. O gráfico mostra a alteração nos níveis de glicose em jejum em camundongos Obesos Induzidos por Dieta durante o curso de 28 dias contínuos de administração de fármaco. Os valores mostrados são a média +/- SEM de 10 animais por grupo (20 animais no grupo com placebo).
[0068] A figura 23 mostra o perfil farmacocinético (concentrações plasmáticas) em macacos cynomolgus após doses únicas de diferentes composições de GFP ligadas a polipeptídeos não estruturados de comprimento variado, administradas subcutaneamente ou intravenosamente, conforme descrito no Exemplo 20. As composições foram GFP-L288, GFP-L576, GFP-XTEN AF576, GFP-Y576 e XTEN AD 836- GFP. Amostras de sangue foram analisadas em vários tempos após injeção e a concentração de GFP no plasma foi medida por meio de ELISA usando um anticorpo policlonal contra GFP para captura e um preparado biotinilado do mesmo anticorpo policlonal para detecção. Os resultados são apresentados como a concentração plasmática versus o tempo (h) após dosagem e mostram, em particular, um aumento considerável na meia-vida para XTEN AD836-GFP, a composição com o comprimento de sequência de XTEN mais longo. O construto com o comprimento de sequência mais curto, GFP-L288, tinha a meia-vida mais curta.
[0069] A figura 24 mostra o espectro de dicroísmo circular próximo de UV de Ex4-XTEN_AE864, realizado conforme descrito in Exemplo 30.
[0070] A figura 25 mostra os resultados farmacocinéticos de Ex4- AE864 administrada a macacos cynomolgus através das vias subcutânea e intravenosa (vide Exemplo 27 para detalhes experimentais).
[0071] A figura 26 ilustra os resultados de escalonamento alométrico para a resposta humana prevista à Ex4-XTEN AE864 baseado nos resultados medidos de quatro espécies animais, isto é, camundongos, ratos, macacos cynomolgus e cães. A figura 26A mostra a meia-vida terminal medida versus a massa corporal, com uma T1/2 prevista em seres humanos de 139 h. A figura 26B mostra a depuração de fármaco medida versus a massa corporal, com um valor de taxa de depuração previsto de 30 ml/h em seres humanos. A figura 26C mostra o volume de distribuição medido versus a massa corporal, com um valor previsto de 5970 ml em seres humanos.
[0072] A figura 27 mostra os resultados de um ensaio celular in vitro quanto à atividade de glucagon, comparando o glucagon com o glucagon ligado a Y288 (vide Exemplo 31 para detalhes experimentais).
[0073] A figura 28 mostra os resultados de um ensaio celular in vitro quanto à atividade de GLP-I, comparando a exendina-4 de duas fontes comerciais (triângulos fechados) com a exendina-4 ligada a Y288 (quadrados fechados), com células não tratadas (diamantes fechados) usadas como um controle negativo (vide Exemplo 31 para detalhes experimentais). A EC50 é indicada pela linha tracejada.
[0074] A figura 29 mostra os efeitos de tratamento térmico sobre a estabilidade de hGH e AM864-hGH. A figura 29A é um gel de SDS- PAGE dos dois preparados tratados a 25°C e 80°C durante 15 minutos, enquanto que a figura 29B mostra o percentual correspondente de atividade de ligação ao receptor da amostra a 80°C com relação ao tratamento a 25°C.
[0075] A figura 30 mostra os resultados do ensaio de afinidade de ligação in vitro de hGH-AM864 (círculos) e AM864-hGH (triângulos invertidos) ao hGHR-Fc. hGH recombinante não modificado (quadrados) é mostrado para comparação.
[0076] A figura 31 mostra os resultados do ensaio de afinidade de ligação in vitro de uma proteína de fusão de hormônio de crescimento com sequências de XTEN ligadas ao N- e C-términos do hGH, comparado com hGH não modificado, ligação ao hGHR-Fc. Os valores de EC50 aparentes para cada composto são listados para AE912_hGH_AE144 (círculos) e hGH recombinante não modificado (quadrados).
[0077] A figura 32 mostra os resultados farmacocinéticos de quatro proteínas de fusão hGH BTXEN administradas a ratos através da via subcutânea, comparado com hGH recombinante não modificado.
[0078] A figura 33 mostra os perfis de concentração de três construtos de hGH XTEN após administração subcutânea a macacos cynomolgus.
[0079] A figura 34 mostra os efeitos de administração de hGH ou AM864-hGH nas doses indicadas sobre o peso corporal em um modelo de rato hypox. Os resultados mostram a retenção de atividade biológica por um construto de BPXTEN que tem potência equivalente ao hGH, ainda que com dosagem menos frequente.
[0080] A figura 35 mostra os efeitos comparativos de administração de placebo, hGH e AM864-hGH sobre o crescimento de cartilagem no platô tibial epifaseal em ratos hypox, mostrado em seções transversais histológicas da tíbia após 9 dias de tratamento (os grupos foram aqueles conforme usado para a figura 34).
[0081] A figura 36 mostra uma representação esquemática de FIX e proteínas de fusão FIX-XTEN exemplificativas. A figura 36A mostra a arquitetura de domínio de FIX nativo, com o domínio gama-carbóxi glutamato, os domínios EGF 1 e EGF2, o peptídeo de ativação e o domínio de protease. As setas indicam os sítios de clivagem para o domínio do peptídeo de ativação. A figura 36B mostra uma molécula de FIX com um polipeptídeo XTEN preso ao C-término e indica um sítio para clivagem proteolítica para liberar o XTEN.
[0082] A figura 37 ilustra vários exemplos de configurações de FIX- XTEN e sítios de clivagem de protease associados. A figura 37A mostra um FIX-XTEN com dois sítios de clivagem proteolítica (setas) dentro do XTEN, proximais à porção FIX da proteína de fusão. A figura 37B mostra um FIX-XTEN que pode ser autocataliticamente ativado, com liberação do XTEN. A figura 37C mostra quatro configurações de FIX-XTEN, com o XTEN integrado entre os vários domínios de FIX. A figura 37D mostra um FIX-XTEN com a porção XTEN inserida no peptídeo de ativação, o que liberaria o XTEN quando da ativação proteolítica de FIX. A figura 37E ilustra FIX-XTEN que contêm múltiplas sequências de XTEN inseridas entre diferentes domínios. A figura 37F ilustra FIX-XTEN onde o XTEN foi inserido dentro de um domínio de FIX. A FIG 37G ilustra FIX- XTEN onde o XTEN é ligado ao C-término de FIX e contém múltiplos sítios de clivagem próximo do N-término do XTEN.
[0083] A figura 38 é uma ilustração esquemática da liberação de XTEN de FIX-XTEN. FIX-XTEN, com o XTEN associado, tem meia-vida aumentada, mas está grandemente em uma forma de pró-fármaco inativa. Após clivagem proteolítica aos sítios de liberação de XTEN (setas), a porção FIX pode ser ativada pela cascata de coagulação, mas tem uma meia-vida curta.
[0084] A figura 39 é um esquema da cascata de coagulação, mostrando as vias intrínsecas e extrínsecas.
[0085] A figura 40 ilustra uma estratégia para abordagem de design de FIX-XTEN usando localização de éxon sem gene que codifica FIX, com sítios exemplificativos para inserção de XTEN entre limites de éxon indicados pelas setas.
[0086] Figura 41. A figura 41A é um esquema de três construtos de FIX-XTEN representativos AC296, AC299 e AC300. Duas setas na sequência do FIX indicam o sítio de ativação de FXI. A seta adicional em AC299 e AC300 ilustra o sítio de liberação de XTEN. A figura 41B é um Western blot de proteínas AC296, AC299 e AC300 tratadas com trombina a qual mostra, no círculo, que FIX foi liberado da porção XTEN, em um local similar ao controle positivo de FIX sobre o lado esquerdo do Western blot.
[0087] A figura 42 é uma representação esquemática do design do vetor de expressão de FIX-XTEN, pCW0590, contendo FIX-gene de XTEN.
[0088] Figura 43. A figura 43A é um esquema de uma cadeia de polipeptídeo de FIX não processado o qual é o produto expresso e a cadeia de polipeptídeo FIX madura que inclui a clivagem pós-traducional no N-término que ocorre durante secreção de FIX. A figura 43B é um esquema correspondente de FIXa mostrando os números de resíduo do peptídeo de ativação removido nas formas não processada e madura.
[0089] A figura 44 é um gráfico mostrando a sequência de construtos de FIX-XTEN, FIX-CFXIa- AG864 (SEQ ID NO: 1819), pré- clivagem de FXIa e os fragmentos 1, 2, 3 e 4 resultantes (SEQ ID NOS 1820-1823, respectivamente, em ordem de aparecimento) após clivagem proteolítica e ativação ao FIXa.
[0090] A figura 45 mostra um gráfico dos resultados de um ensaio de FVII, com perfis de reação para várias concentrações de padrões de FVII e o perfil de reação de um FVII-XTEN. Resultados do ensaio para FVII-XTEN são mostrados na Tabela abaixo do gráfico.
[0091] A figura 46 é um mapa de plasmídeo do vetor de expressão pCW0590 contendo FVII-gene de XTEN.
[0092] A figura 47 mostra resultados de uma análise por cromatografia por exclusão de tamanho de amostras do construto glucagon-XTEN medido contra padrões de proteína de peso molecular conhecido, com o produto do gráfico como a absorbância versus volume de retenção. Os construtos de glucagon-XTEN são 1) glucagon-Y288; 2) glucagon-Y144; 3) glucagon-Y72; e 4) glucagon-Y36. Os resultados indicam um aumento no peso molecular aparente com aumento de comprimento da porção XTEN.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0093] Antes que modalidades da invenção sejam descritas, deve ser entendido que tais modalidades são fornecidas à guisa de exemplo apenas e que várias alternativas às modalidades da invenção descrita aqui podem ser empregadas na prática da invenção. Numerosas variações, alterações e substituições ocorrerão agora para aqueles versados no campo sem se desviar da invenção.
[0094] A menos que de outro modo definido, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado conforme comumente entendido por aqueles versados no campo ao qual a presente invenção pertence. Embora métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos aqui possam ser usados na prática ou no teste da presente invenção, métodos e materiais adequados são descritos abaixo. Em caso de conflito, o relatório descritivo, incluindo definições, será controlado. Além disso, os materiais, métodos e exemplos são ilustrativos apenas e não se destinam a ser limitativos. Numerosas variações, alterações e substituições ocorrerão agora para aqueles versados no campo sem se desviar da invenção.
DEFINIÇÕES
[0095] Conforme usado aqui, os termos a seguir têm os significados atribuídos aos mesmos, a menos que de outro modo especificado.
[0096] Conforme usado no relatório descritivo e reivindicações, as formas no singular, "um", "uma", "o" e "a" incluem os referentes no plural, a menos que o contexto oriente claramente de outro modo. Por exemplo, o termo "uma célula" inclui uma pluralidade de células, incluindo misturas das mesmas.
[0097] Os termos "polipeptídeo", "peptídeo" e "proteína" são usados permutavelmente aqui para referir-se a polímeros de aminoácidos de qualquer comprimento. O polímero pode ser linear ou ramificado, pode compreender aminoácidos modificados e pode ser interrompido por não aminoácidos. Os termos também abrangem um polímero de aminoácido que tenha sido modificado, por exemplo, por meio de formação de ligação de dissulfeto, glicosilação, lipidação, acetilação, fosforilação ou qualquer outra manipulação, tal como conjugação com um componente de rotulação.
[0098] Conforme usado aqui, o termo "aminoácido" refere-se a aminoácidos naturais e/ou não naturais ou sintéticos incluindo, mas não limitado a, glicina e os isômeros ópticos D ou L e análogos de aminoácido e peptidomiméticos. Códigos-padrão com uma única ou três letras são usados para designar aminoácidos.
[0099] O termo "L-aminoácido natural" significa as formas de isômero óptico L de glicina (G), prolina (P), alanina (A), valina (V), leucina (L), isoleucina (I), metionina (M), cisteína (C), fenilalanina (F), tirosina (Y), triptofano (W), histidina (H), lisina (K), arginina (R), glutamina (Q), asparagina (N), ácido glutâmico (E), ácido aspártico (D), serina (S) e treonina (T).
[00100] O termo "não ocorre naturalmente", conforme aplicado a sequências e conforme usado aqui, significa sequências de polipeptídeo ou polinucleotídeo que não têm uma contraparte a, não são complementares a ou não têm um alto grau de homologia com uma sequência do tipo silvestre ou que ocorre naturalmente encontrada em um mamífero. Por exemplo, um polipeptídeo que ocorre naturalmente pode compartilhar não mais do que 99%, 98%, 95%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50% ou mesmo menos identidade de sequência de aminoácido quando comparado com uma sequência natural quando adequadamente alinhada.
[00101] Os termos "hidrofílico" e "hidrofóbico" referem-se ao grau de afinidade que uma substância tem pela água. Uma substância hidrofílica tem uma forte afinidade pela água, tendendo a dissolver, misturar ou ser umedecida pela água, enquanto que uma substância hidrofóbica carece substancialmente de afinidade pela água, tendendo a repelir e não absorver água e tendendo a não dissolver ou misturar com ou ser umedecida pela água. Aminoácidos podem ser caracterizados com base em sua hidrofobicidade. Uma série de escalas foi desenvolvida. Um exemplo é uma escala desenvolvida por Levitt, M. et al., J Mol Biol (1976) 104: 59, a qual é listada em Hopp, T.P. et al., Proc Natl Acad Sci U S A (1981) 78: 3824. Exemplos de "aminoácidos hidrofílicos" são arginina, lisina, treonina, alanina, asparagina e glutamina. De interesse particular são os aminoácidos hidrofílicos aspartato, glutamato e serina e glicina. Exemplos de "aminoácidos hidrofóbicos" são triptofano, tirosina, fenilalanina, metionina, leucina, isoleucina e valina.
[00102] Um "fragmento" é uma forma truncada de uma proteína biologicamente ativa nativa que retém pelo menos uma parte da atividade terapêutica e/ou biológica. Uma "variante" é uma proteína com homologia de sequência à proteína biologicamente ativa nativa que retém pelo menos uma parte da atividade terapêutica e/ou biológica da proteína biologicamente ativa. Por exemplo, uma proteína variante pode compartilhar pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência de aminoácido com a proteína biologicamente ativa de referência. Conforme usado aqui, o termo "porção de proteína biologicamente ativa" inclui proteínas deliberadamente modificadas como, por exemplo, por meio de mutagênese sítio dirigida, inserções ou acidentalmente através de mutações.
[00103] Uma "célula hospedeira" inclui uma célula individual ou cultura de célula a qual pode ser ou ter sido um recipiente para os vetores em questão. Células hospedeiras incluem a prole de uma única célula hospedeira. A prole pode não ser necessariamente idêntica completamente (quanto à morfologia ou genoma do complemento de DNA total) à célula parental original em virtude de mutação natural, acidental ou deliberada. Uma célula hospedeira inclui células transfectadas in vivo com um vetor da presente invenção.
[00104] "Isolado", quando usado para descrever os vários polipeptídeos divulgados aqui, significa um polipeptídeo que tenha sido identificado e separado e/ou recuperado de um componente de seu ambiente natural. Componentes contaminantes de seu ambiente natural são materiais que, tipicamente, interferirão com os usos diagnósticos ou terapêuticos para o polipeptídeo e podem incluir enzimas, hormônios e outros solutos proteináceos ou não proteináceos. Conforme é evidente para aqueles versados no campo, um polinucleotídeo, peptídeo, polipeptídeo, proteína, anticorpo ou fragmentos do mesmo que não ocorrem naturalmente não requerem "isolamento" para distingui-los de sua contraparte que ocorre naturalmente. Além disso, um polinucleotídeo, peptídeo, polipeptídeo, proteína, anticorpo ou fragmentos do mesmo "concentrado", "separado" ou "diluído" é distinguível de sua contraparte que ocorre naturalmente pelo fato de que a concentração ou número de moléculas por volume é, em geral, maior do que aquele de sua contraparte que ocorre naturalmente. Em geral, um polipeptídeo feito através de meios recombinantes e expresso em uma célula hospedeira é considerado como sendo "isolado".
[00105] Um polinucleotídeo “isolado” ou ácido nucleico de codificação de polipeptídeo ou outro ácido nucleico de codificação de polipeptídeo é uma molécula de ácido nucleico que é identificada e separada de pelo menos uma molécula de ácido nucleico contaminante com a qual ele está comumente associado na fonte natural do ácido nucleico de codificação de polipeptídeo. Uma molécula de ácido nucleico de codificação de polipeptídeo isolada é outra que não na forma ou ambiente no qual ela é encontrada na natureza. Moléculas de ácido nucleico de codificação de polipeptídeo isoladas são, portanto, distinguidas da molécula de ácido nucleico de codificação de polipeptídeo específica uma vez que elas existem em células naturais. Contudo, uma molécula de ácido nucleico de codificação de polipeptídeo isolada inclui moléculas de ácido nucleico de codificação de polipeptídeo contidas em células que expressam comumente o polipeptídeo onde, por exemplo, a molécula de ácido nucleico está em uma localização cromossômica ou extracromossômica diferente daquela de células naturais.
[00106] Uma proteína "quimérica" contém pelo menos um polipeptídeo de fusão compreendendo regiões em uma posição, na sequência, diferente daquela a qual ocorre na natureza. As regiões podem, normalmente, existir em proteínas distintas e são mantidas juntas no polipeptídeo de fusão; ou elas podem, normalmente, existir na mesma proteína, mas são colocadas em uma nova disposição no polipeptídeo de fusão. Uma proteína quimérica pode ser criada, por exemplo, através de síntese química ou criação e tradução de um polinucleotídeo no qual as regiões peptídicas são codificadas na relação desejada.
[00107] "Conjugado", "ligado", "fundido" e "fusão" são usados permutavelmente aqui. Esses termos referem-se à união de dois ou mais elementos ou componentes químicos, qualquer que seja o meio, incluindo conjugação química ou meios recombinantes. Por exemplo, um promotor ou intensificador é operavelmente ligado a uma sequência de codificação se ele afeta a transcrição da sequência. Geralmente, "operavelmente ligada" significa que as sequências de DNA que estão sendo ligadas são contíguas e estão em fase de leitura ou in-frame. Uma "fusão in-frame" refere-se à união de dois ou mais quadros de leitura aberta (ORFs) para formar um ORF maior contínuo, de maneira a manter o quadro de leitura correto dos ORFs originais. Assim, a proteína de fusão recombinante resultante é uma proteína única contendo dois ou mais segmentos que correspondem a polipeptídeos codificados pelos ORFs originais (segmentos os quais normalmente não são unidos assim na natureza).
[00108] No contexto de polipeptídeos, uma "sequência linear" ou uma "sequência" é uma ordem de aminoácidos em um polipeptídeo, em uma direção amino para carboxila término, na qual resíduos que são vizinhos uns aos outros na sequência são contíguos na estrutura primária do polipeptídeo. Uma "sequência parcial" é uma sequência linear de parte de um polipeptídeo que se sabe compreender resíduos adicionais em uma ou ambas as direções.
[00109] "Heterólogo" significa derivado de uma entidade genotipicamente distinta do resto da entidade com a qual ela está sendo comparada. Por exemplo, uma sequência rica em glicina removida de sua sequência de codificação nativa e operativamente ligada a uma outra sequência de codificação que não a sequência nativa é uma sequência rica em glicina heteróloga. O termo "heterólogo", conforme aplicado a um polinucleotídeo ou um polipeptídeo, significa que o polinucleotídeo ou polipeptídeo é derivado de uma entidade genotipicamente distinta daquela do resto da entidade com a qual ele está sendo comparado.
[00110] Os termos "polinucleotídeos", "ácidos nucleicos", "nucleotídeos" e "oligonucleotídeos" são usados permutavelmente. Eles referem-se a uma forma polimérica de nucleotídeos de qualquer comprimento, desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos ou análogos dos mesmos. Polinucleotídeos podem ter qualquer estrutura tridimensional e podem desempenhar qualquer função, conhecida ou desconhecida. Os seguintes são exemplos não limitativos de polinucleotídeos: regiões de codificação ou não codificação de um gene ou fragmento gênico, loci (locus) definidos a partir de análise de ligação, éxons, íntrons, RNA mensageiro (mRNA), RNA de transferência, RNA ribossômico, ribozimas, cDNA, polinucleotídeos recombinantes, polinucleotídeos ramificados, plasmídeos, vetores, DNA isolado de qualquer sequência, RNA isolado de qualquer sequência, sondas e iniciadores de ácido nucleico. Um polinucleotídeo pode compreender nucleotídeos modificados, tais como nucleotídeos metilados e análogos de nucleotídeo. Se presentes, modificações na estrutura do nucleotídeo podem ser conferidas antes ou após montagem do polímero. A sequência de nucleotídeos pode ser interrompida por componentes de não nucleotídeo. Um polinucleotídeo pode ainda ser modificado após polimerização, tal como por meio de conjugação com um componente de rotulação.
[00111] O termo "complemento de um polinucleotídeo" denota uma molécula de polinucleotídeo tendo uma sequência de base complementar e orientação inversa quando comparado com uma sequência de referência, de modo que ela poderia se hibridizar com uma sequência de referência com fidelidade completa.
[00112] "Recombinante", conforme aplicado a um polinucleotídeo, significa que o polinucleotídeo é o produto de várias combinações de etapas de clonagem in vitro, restrição e/ou ligação e outros procedimentos que resultam em um construto que pode ser potencialmente expresso em uma célula hospedeira.
[00113] Os termos "gene" ou "fragmento gênico" são usados permutavelmente aqui. Eles referem-se a um polinucleotídeo contendo pelo menos um quadro de leitura aberta que é capaz de codificar uma proteína em particular após ser transcrito e traduzido. Um gene ou fragmento gênico pode ser genômico ou cDNA, contanto que o polinucleotídeo contenha pelo menos um quadro de leitura aberta, o qual pode abranger toda a região de codificação ou um segmento da mesma. Um "gene de fusão" é um gene composto de pelo menos dois polinucleotídeos heterólogos que são ligados juntos.
[00114] "Homologia" ou "homólogo" refere-se à similaridade de sequência ou capacidade de permuta entre duas ou mais sequências de polinucleotídeo ou duas ou mais sequências polipeptídicas. Quando usando um programa, tal como BestFit, para determinar a identidade de sequência, similaridade ou homologia entre duas sequências de aminoácido diferentes, as configurações de default podem ser usadas ou uma matriz de escore apropriada, tal como blosum45 ou blosum80, pode ser selecionada para otimizar os escores de identidade, similaridade ou homologia. De preferência, polinucleotídeos que são homólogos são aqueles os quais hibridizam sob condições estringentes, conforme definido aqui, e têm pelo menos 70%, de preferência pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente 95%, mais preferivelmente 97%, mais preferivelmente 98% e, ainda mais preferivelmente, 99% de identidade de sequência a essas sequências.
[00115] Os termos "condições estringentes" ou "condições de hibridização estringente" incluem referência a condições sob as quais um polinucleotídeo se hibridizará à sua sequência-alvo, em um grau detectavelmente maior do que outras sequências (por exemplo, pelo menos 2 vezes com relação à base). Em geral, a estringência de hibridização é expressa, em parte, com referência à temperatura e concentração de sal sob as quais a etapa de lavagem é realizada. Tipicamente, condições estringentes serão aquelas nas quais a concentração de sal é íons de Na a menos de cerca de 1,5 M, tipicamente uma concentração de íons de Na de cerca de 0,01 a 1,0 M (ou outros sais) em um pH de 7,0 a 8,3 e a temperatura é pelo menos cerca de 30°C para polinucleotídeos curtos (por exemplo, 10 a 50 nucleotídeos) e pelo menos cerca de 60°C para polinucleotídeos longos (por exemplo, mais de 50 nucleotídeos) - por exemplo, "condições estringentes" podem incluir hibridização em formamida a 50%, NaCl a 1 M, SDS a 1% a 37°C e três lavagens durante 15 min cada em 0,1 X SSC/SDS a 1% a 60 a 65°C. Alternativamente, temperaturas de cerca de 65°C, 60°C, 55°C ou 42°C podem ser usadas. A concentração de SSC pode ser variada de cerca de 0,1 a 2 X SSC, com SDS estando presente em torno de 0,1%. Tais temperaturas de lavagem são, tipicamente, selecionadas para ser cerca de 5°C a 20°C menor do que o ponto de fusão térmica para a sequência específica em uma resistência iônica e pH definidos. A Tm é a temperatura (sob resistência iônica e pH definidos) na qual 50% da sequência-alvo se hibridiza a uma sonda perfeitamente correspondente. Uma equação para cálculo da Tm e condições para hibridização de ácido nucleico são bem conhecidas e podem ser encontradas em Sambrook, J. et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Press, Plainview N.Y.; vide, especificamente, volume 2 e capítulo 9. Tipicamente, reagentes de bloqueio são usados para bloquear hibridização não específica. Tais reagentes de bloqueio incluem, por exemplo, DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado a cerca de 100-200 μg/ml. Solvente orgânico, tal como formamida, em uma concentração de cerca de 35-50% em v/v, pode também ser usado sob circunstâncias particulares, tal como para hibridizações de RNA:DNA. Variações úteis sobre essas condições de lavagem serão prontamente evidentes para aqueles versados na técnica.
[00116] Os termos "identidade percentual" e "identidade %", conforme aplicado a sequências de polinucleotídeo, referem-se ao percentual de combinações de resíduo entre pelo menos duas sequências de polinucleotídeo alinhadas usando um algoritmo padronizado. Tal algoritmo pode inserir, de uma forma padronizada e reproduzível, espaços nas sequências que estão sendo comparadas de forma a otimizar o alinhamento entre duas sequências e, portanto, obter uma comparação mais significativa das duas sequências. A identidade percentual pode ser medida sobre o comprimento de toda uma sequência de polinucleotídeo definida, por exemplo, conforme definido por um número SEQ ID particular ou pode ser medida sobre o comprimento mais curto, por exemplo, sobre o comprimento de um fragmento tomado de uma sequência de polinucleotídeo definida maior, por exemplo, um fragmento de pelo menos 45, pelo menos 60, pelo menos 90, pelo menos 120, pelo menos 150, pelo menos 210 ou pelo menos 450 resíduos contíguos. Tais comprimentos são exemplificativos apenas e deve ser entendido que qualquer comprimento de fragmento suportado pelas sequências mostradas aqui, nas tabelas, figuras ou Listagem de Sequência, podem ser usados para descrever um comprimento sobre o qual a identidade percentual pode ser medida.
[00117] "Identidade percentual (%) de sequência de aminoácido", com relação às sequências polipeptídicas identificadas aqui, é definida como o percentual de resíduos de aminoácido em uma sequência query que são idênticos aos resíduos de aminoácido de uma segunda sequência polipeptídica de referência ou uma parte da mesma, após alinhamento das sequências e introdução de espaços, se necessário, para obter a identidade percentual de sequência máxima e não considerando quaisquer substituições conservativas como parte da identidade de sequência. Alinhamento, para fins de determinação da identidade de sequência de aminoácido percentual, pode ser obtido de várias formas que estão dentro da capacidade da técnica, por exemplo, usando um software de computador publicamente disponível, tal como os softwares BLAST, BLAST-2, ALIGN ou Megalign (DNASTAR). Aqueles versados na técnica podem determinar parâmetros apropriados para medição de alinhamento, incluindo quaisquer algoritmos necessários para obter alinhamento máximo sobre todo o comprimento das sequências que estão sendo comparadas. A identidade percentual pode ser medida sobre o comprimento de toda uma sequência polipeptídica definida, por exemplo, conforme definido por um número SEQ ID em particular ou pode ser medida sobre um comprimento mais curto, por exemplo, sobre o comprimento de um fragmento tomado de uma sequência polipeptídica definida maior, por exemplo, um fragmento de pelo menos 15, pelo menos 20, pelo menos 30, pelo menos 40, pelo menos 50, pelo menos 70 ou pelo menos 150 resíduos contíguos. Tais comprimentos são exemplificativos apenas e deve ser entendido que qualquer comprimento de fragmento suportado pelas sequências mostradas aqui, nas tabelas, figuras ou Listagem de sequência, pode m ser usados para descrever um comprimento sobre o qual a identidade percentual pode ser medida.
[00118] O termo "não repetitividade", conforme usado aqui no contexto de um polipeptídeo, refere-se a uma falta ou grau limitado de homologia interna em uma sequência peptídica ou polipeptídica. O termo "substancialmente não repetitivo" pode significar, por exemplo, que existem poucos ou nenhum caso de quatro aminoácidos contiguos em uma sequência que são tipos idênticos de aminoácido ou que o polipeptídeo tem um escore de subsequência (definido infra) de 10 ou menos ou que não há um padrão na ordem, do N- para o C-término, dos motivos de sequência que constituem a sequência polipeptídica. O termo "repetitividade", conforme usado aqui no contexto de um polipeptídeo, refere-se ao grau de homologia interna em uma sequência peptídica ou polipeptídica. Em contraste, uma sequência "repetitiva" pode conter múltiplas cópias idênticas de sequências de aminoácido curtas. Por exemplo, uma sequência polipeptídica de interesse pode ser dividida em sequências n-meros e o número de sequências idênticas pode ser contado. Sequências altamente repetitivas contêm uma grande fração de sequências idênticas, enquanto que sequências não repetitivas contêm poucas sequências idênticas. No contexto de um polipeptídeo, uma sequência pode conter múltiplas cópias de sequências mais curtas de comprimento ou motivos definidos ou variáveis, nas quais os motivos em si têm sequências não repetitivas, tornando o polipeptídeo de comprimento total substancialmente não repetitivo. O comprimento do polipeptídeo no qual a não repetitividade é medida pode variar de 3 aminoácidos a cerca de 200 aminoácidos, cerca de 6 a cerca de 50 aminoácidos ou de cerca de 9 a cerca de 14 aminoácidos. "Repetitividade", usada no contexto de sequências de polinucleotídeo, refere-se ao grau de homologia interna em uma sequência tal como, por exemplo, a frequência de sequências de nucleotídeo idênticas de um determinado comprimento. Repetitividade pode, por exemplo, ser medida analisando a frequência de sequências idênticas.
[00119] Um "vetor" é uma molécula de ácido nucleico, de preferência de autorreplicação em um hospedeiro apropriado, a qual transfere uma molécula de ácido nucleico inserida para e/ou entre células hospedeiras. O termo inclui vetores que funcionam primariamente para inserção de DNA ou RNA em uma célula, replicação de vetores que funcionam primariamente para a replicação de DNA ou RNA e vetores de expressão que funcionam para transcrição e/ou tradução do DNA ou RNA. Também incluídos são vetores que conferem mais de uma das funções acima. Um "vetor de expressão" é um polinucleotídeo o qual, quando introduzido em uma célula hospedeira apropriada, pode ser transcrito e traduzido em (um) polipeptídeo(s). Um "sistema de expressão" usualmente conota uma célula hospedeira adequada compreendida de um vetor de expressão que pode funcionar para proporcionar um produto de expressão desejado.
[00120] "Resistência à degradação no soro", conforme aplicado a um polipeptídeo, refere-se à capacidade dos polipeptídeos de suportar a degradação no sangue ou componentes do mesmo a qual envolve, tipicamente, proteases no soro ou plasma. A resistência à degradação no soro pode ser medida combinando a proteína com soro ou plasma humano (ou de camundongo, rato, macaco, conforme apropriado), tipicamente durante uma série de dias (por exemplo, 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 8, 16 dias), tipicamente em torno de 37°C. As amostras para esses pontos de tempo podem ser passadas sobre um ensaio Western blot e a proteína é detectada com um anticorpo. O anticorpo pode ser a um tag na proteína. Se a proteína mostra uma única banda quando de Western blot, onde o tamanho da proteína é idêntico àquele da proteína injetada, então, nenhuma degradação ocorreu. Nesse método exemplificativo, o ponto de tempo onde 50% da proteína são degradados, conforme julgado por Western blots ou técnicas equivalentes, é a meia-vida de degradação no soro ou "meia-vida no soro" da proteína.
[00121] O termo "t1/2", conforme usado aqui, significa a meia-vida terminal calculada como In(2)/Kcl. Kcl é a constante de taxa de eliminação terminal calculada pela regressão linear da porção linear terminal da curva de concentração log versus tempo. Meia-vida refere- se, tipicamente, ao tempo requerido para que metade da quantidade de uma substância administrada depositada em um organismo vivo seja metabolizada ou eliminada através de processos biológicos normais. Os termos "t1/2", "meia-vida terminal", "meia-vida de eliminação" e "meia- vida em circulação" são usados permutavelmente aqui.
[00122] "Fator de Peso Molecular Aparente" ou "Peso Molecular Aparente" são termos relacionados que referem-se a uma medida do aumento ou diminuição relativa no peso molecular aparente exibido por uma sequência de aminoácido em particular. O Peso Molecular Aparente é determinado usando cromatografia por exclusão de tamanho (SEC) e métodos similares, comparado com padrões de proteína globular e é medido em unidades de "kD aparente". O fator de peso molecular aparente é a proporção entre o peso molecular aparente e o peso molecular real; o último previsto através da adição, baseado na composição de aminoácido, do peso molecular calculado de cada tipo de aminoácido na composição.
[00123] O "raio hidrodinâmico" ou "raio de Stokes" é o raio eficaz (Rh em nm) de uma molécula em uma solução medido admitindo-se que há um corpo em movimento através da solução e resistido pela viscosidade da solução. Em modalidades da invenção, as medições do raio hidrodinâmico de proteínas de fusão XTEN se correlacionam com o "Fator de Peso Molecular Aparente", o qual é uma medida mais intuitiva. O "raio hidrodinâmico" de uma proteína afeta sua taxa de difusão em solução aquosa, bem como sua capacidade de migrar em géis de macromoléculas. O raio hidrodinâmico de uma proteína é determinado por seu peso molecular, bem como por sua estrutura, incluindo formato e compactação. Métodos para determinação do raio hidrodinâmico são bem conhecidos no campo, tal como mediante o uso de cromatografia por exclusão de tamanho (Size Exclusion Chromatography - SEC), conforme descrito nas Patentes U.S. Nos. 6.406.632 e 7.294.513. A maioria das proteínas tem uma estrutura globular, a qual é a estrutura tridimensional mais compacta que uma proteína pode ter com o menor raio hidrodinâmico. Algumas proteínas adotam uma conformação aleatória e aberta, não estruturada ou "linear" e, como um resultado, podem ter um raio hidrodinâmico muito maior, comparado com proteínas globulares típicas de peso molecular similar.
[00124] "Condições fisiológicas" refere-se a um conjunto de condições em um hospedeiro vivo, bem como condições in vitro, incluindo temperatura, concentração de sal, pH, que imitam aquelas condições de um indivíduo vivo. Uma série de condições fisiologicamente relevantes para uso em ensaios in vitro foi estabelecida. Em geral, um tampão fisiológico contém uma concentração fisiológica de sal e é ajustado para um pH neutro oscilando de cerca de 6,5 a cerca de 7,8 e, de preferência, de cerca de 7,0 a cerca de 7,5. Uma variedade de tampões fisiológicos são listados em Sambrook et al. (1989). Temperaturas fisiologicamente relevantes oscilam de cerca de 25°C a cerca de 38°C e, de preferência, de cerca de 35°C a cerca de 37°C.
[00125] Um "grupo reativo" é uma estrutura química que pode ser acoplada a um segundo grupo reativo. Exemplos de grupos reativos são grupos amino, grupos carboxila, grupos sulfidrila, grupos hidroxila, grupos aldeído, grupos azida. Alguns grupos reativos podem ser ativados para facilitar o acoplamento a um segundo grupo reativo. Exemplos de ativação são a reação de um grupo carboxila com carbodi- imida, a conversão de um grupo carboxila em um éster ativado ou a conversão de um grupo carboxila em uma função azida.
[00126] "Agente de liberação controlada", "agente de liberação lenta", "formulação de depósito" ou "agente de liberação sustentada" são usados permutavelmente para referir-se a um agente capaz de prolongar a duração de liberação de um polipeptídeo da invenção com relação à duração de liberação quando o polipeptídeo é administrado na ausência de agente. Diferentes modalidades da presente invenção podem ter diferentes taxas de liberação, resultando em quantidades terapêuticas diferentes.
[00127] Os termos "antígeno", "antígeno-alvo" ou "imunogênio" são usados permutavelmente aqui para referir-se à estrutura ou determinante de ligação à qual um fragmento de anticorpo ou produto terapêutico baseado em fragmento de anticorpo se liga ou tem especificidade contra.
[00128] O termo "payload", conforme usado aqui, refere-se a uma sequência de proteína ou peptídeo que tem atividade biológica ou terapêutica; a contraparte ao farmacóforo de pequenas moléculas. Exemplos de "payloads" incluem, mas não estão limitados a, citocinas, enzimas, hormônios e sangue e fatores de crescimento. Payloads podem ainda compreender porções quimicamente conjugadas ou geneticamente fundidas, tais como agentes quimioterapêuticos, compostos antivirais, toxinas ou agentes de contraste. Essas porções conjugadas podem ser unidas ao resto do polipeptídeo via um ligante, o qual pode ser clivável ou não clivável.
[00129] O termo "antagonista", conforme usado aqui, inclui qualquer molécula que bloqueia, inibe ou neutraliza parcial ou completamente a atividade biológica de um polipeptídeo nativo divulgado aqui. Métodos para identificação de antagonistas de um polipeptídeo podem compreender contato de um polipeptídeo nativo com uma molécula antagonista candidata e medição de uma alteração detectável em uma ou mais atividades biológicas normalmente associadas ao polipeptídeo nativo. No contexto da presente invenção, antagonistas podem incluir proteínas, ácidos nucleicos, carboidratos, anticorpos ou quaisquer outras moléculas que diminuem o efeito de uma proteína biologicamente ativa.
[00130] O termo "agonista" é usado no sentido mais amplo e inclui qualquer molécula que imita a atividade biológica de um polipeptídeo nativo divulgado aqui. Moléculas agonistas adequadas incluem especificamente anticorpos ou fragmentos de anticorpo agonistas, fragmentos ou variantes de sequência de aminoácido de polipeptídeos nativos, peptídeos, pequenas moléculas orgânicas, etc. Métodos para identificação de agonistas de um polipeptídeo nativo podem compreender contato de um polipeptídeo nativo com uma molécula agonista candidata e medição de uma alteração detectável em uma ou mais atividades biológicas normalmente associadas ao polipeptídeo nativo.
[00131] "Atividade", para as finalidades aqui, refere-se a uma ação ou efeito de um componente de uma proteína de fusão consistente com aquele da proteína biologicamente ativa nativa correspondente, em que "atividade biológica" refere-se a uma função ou efeito in vivo ou in vitro incluindo, mas não limitado a, ligação a receptor, atividade antagonista, atividade agonista ou uma resposta celular ou fisiológica.
[00132] Conforme usado aqui, "tratamento" ou "tratar de" ou "paliação" ou "alívio" são usados permutavelmente aqui. Esses termos referem-se a uma abordagem para obtenção de resultados benéficos ou desejados incluindo, mas não limitado a, um benefício terapêutico e/ou um benefício profilático. Por benefício terapêutico entenda-se erradicação ou alívio do distúrbio subjacente que está sendo tratado. Também, um benefício terapêutico é obtido com a erradicação ou alívio de um ou mais dos sintomas fisiológicos associados ao distúrbio subjacente, de modo que uma melhora seja observada no indivíduo, não obstante esse indivíduo possa ainda estar afetado pelo distúrbio subjacente. Para benefício profilático, as composições podem ser administradas a um indivíduo em risco de desenvolver uma doença em particular ou um indivíduo que reporta um ou mais dos sintomas fisiológicos de uma doença, mesmo embora um diagnóstico dessa doença possa ainda não ter sido feito.
[00133] Um "efeito terapêutico", conforme usado aqui, refere-se a um efeito fisiológico incluindo, mas não limitado a, cura, alívio, paliação ou prevenção de doenças em seres humanos ou outros animais ou, de outro modo, intensificação do bem-estar físico ou mental de seres humanos ou animais, causada por um outro polipeptídeo de fusão da invenção que não a capacidade de induzir à produção de um anticorpo contra um epitopo antigênico possuído por uma proteína biologicamente ativa. Determinação de uma quantidade terapeuticamente eficaz está bem dentro da capacidade daqueles versados no campo, especialmente à luz da divulgação detalhada fornecida aqui.
[00134] Os termos "quantidade terapeuticamente eficaz" e "dose terapeuticamente eficaz", conforme usado aqui, referem-se a uma quantidade de uma proteína biologicamente ativa, isoladamente ou como parte de uma composição de proteína de fusão, que é capaz de ter qualquer efeito benefício detectável sobre qualquer sintoma, aspecto, parâmetro medido ou características de um estado doentio ou condição quanto administrada em uma ou mais doses repetidas a um indivíduo. Tal efeito não precisa ser absoluto para ser benéfico.
[00135] O termo "regime de dose terapeuticamente eficaz", conforme usado aqui, refere-se a um esquema para doses consecutivamente administradas de uma proteína biologicamente ativa, isoladamente ou como parte de uma composição de proteína de fusão, em que as doses são fornecidas em quantidades terapeuticamente eficazes para resultar em um efeito benéfico sustentado sobre qualquer sintoma, aspecto, parâmetro medido ou características de um estado doentio ou condição.
I). TÉCNICAS GERAIS
[00136] A prática da presente invenção emprega, a menos que de outro modo indicado, técnicas convencionais de imunologia, bioquímica, química, biologia molecular, microbiologia, biologia celular, genômica e DNA recombinante, as quais estão dentro da capacidade no campo. Vide Sambrook, J. et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 3a edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001; "Current protocols in molecular biology", F. M. Ausubel et al. eds.,1987; a série "Methods in Enzymology", Academic Press, San Diego, CA.; "PCR 2: a practical approach", M.J. MacPherson, B.D. Hames e G.R. Taylor eds., Oxford University Press, 1995; "Antibodies, a laboratory manual" Harlow, E. e Lane, D. eds., Cold Spring Harbor Laboratory, 1988; "Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics," 11a Edição, McGraw-Hill, 2005; e Freshney, R.I., "Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique", 4a edição, John Wiley & Sons, Somerset, NJ, 2000, os conteúdos dos quais são incorporados aqui por referência na íntegra.
II). POLIPEPTÍDEOS RECOMBINANTES ESTENDIDOS
[00137] A presente invenção proporciona composições compreendendo polipeptídeos recombinantes estendidos ("XTEN" ou "XTENs"). Em algumas modalidades, XTENs são, em geral, polipeptídeos de comprimento estendido com sequências que não ocorrem naturalmente, substancialmente não repetitivas que são compostas principalmente de pequenos aminoácidos hidrofílicos, com a sequência tendo um baixo grau ou nenhuma estrutura secundária ou terciária sob condições fisiológicas.
[00138] Em um aspecto da invenção, são divulgadas composições de polipeptídeo XTEN que são úteis como parceiros de fusão que podem ser ligados a proteínas biologicamente ativas ("BP"), resultando em proteínas de fusão BPXTEN (por exemplo, fusões monoméricas). XTENs podem ter utilidade como parceiros de proteína de fusão pelo fato de que eles podem conferir determinadas propriedades químicas e farmacêuticas quando ligados a uma proteína biologicamente ativa para criar uma proteína de fusão. Tais propriedades desejáveis incluem, mas não estão limitadas a, parâmetros farmacocinéticos e características de solubilidade intensificados, dentre outras propriedades descritas abaixo. Tais composições de proteína de fusão podem ter utilidade para tratar determinadas doenças, distúrbios ou condições, conforme descrito aqui. Conforme usado aqui, "XTEN" exclui especificamente anticorpos ou fragmentos de anticorpo, tais como anticorpos com uma única cadeia, fragmentos Fc de uma cadeia leve ou uma cadeia pesada.
[00139] Em algumas modalidades, XTENs são polipeptídeos longos tendo mais de cerca de 100 a cerca de 3000 resíduos de aminoácido, de preferência mais de 400 a cerca de 3000 resíduos quando usado como uma única sequência e têm, cumulativamente, mais de cerca de 400 a cerca de 3000 resíduos de aminoácido quando mais de uma unidade XTEN é usada em uma única proteína de fusão ou conjugado. Em outros casos, onde um aumento na meia-vida da proteína de fusão não é necessário, mas onde um aumento na solubilidade ou outra propriedade físico/química de um parceiro de fusão de proteína biologicamente ativa é desejado, uma sequência XTEN mais curta do que 100 resíduos de aminoácido, tal como cerca de 96 ou cerca de 84 ou cerca de 72 ou cerca de 60 ou cerca de 48 ou cerca de 36 resíduos de aminoácido, pode ser incorporada em uma composição de proteína de fusão com uma BP para obter a propriedade.
[00140] Os critérios de seleção para que o XTEN seja ligado a proteínas biologicamente ativas para criar as proteínas de fusão da invenção referem-se, em geral, aos atributos de propriedades físico/químicas e estrutura conformacional do XTEN a qual, por sua vez, pode ser usada para conferir propriedades farmacêuticas e farmacocinéticas intensificadas às proteínas de fusão. O XTEN da presente invenção pode exibir uma ou mais das seguintes propriedades vantajosas: flexibilidade conformacional, solubilidade aquosa intensificada, alto grau de resistência à protease, baixa imunogenicidade, baixa ligação a receptores de mamífero e raio hidrodinâmico (ou de Stokes) aumentado; propriedades que podem tornar o mesmo particularmente como parceiros de proteína de fusão. Exemplos não limitativos de propriedades das proteínas de fusão compreendendo BP que podem ser intensificadas pelo XTEN incluem aumentos na solubilidade global e/ou estabilidade metabólica, suscetibilidade reduzida à proteólise, imunogenicidade reduzida, taxa de absorção reduzida quando administradas subcutânea ou intramuscularmente e propriedades farmacocinéticas intensificadas, tais como meia-vida terminal e área sob a curva (AUC), absorção mais lenta após injeção subcutânea ou intramuscular (comparado com BP não ligada ao XTEN), de modo que a Cmax seja menor a qual, por sua vez, pode resultar em reduções nos efeitos adversos da BP que, coletivamente, podem resultar em um período de tempo aumentado que uma proteína de fusão de uma composição BPXTEN administrada a um indivíduo permanece dentro de uma janela terapêutica, comparado com um componente BP correspondente não ligada ao XTEN.
[00141] Uma variedade de métodos e ensaios é conhecida na técnica para determinação das propriedades físico/químicas de proteínas, tais como composições de proteína de fusão compreendendo o XTEN da invenção; propriedades tais como estrutura secundária ou terciária, solubilidade, agregação de proteína, propriedades de fusão, contaminação e teor de água. Tais métodos incluem centrifugação analítica, EPR, troca de íons-HPLC, HPLC-exclusão de tamanho, HPLC-fase reversa, dispersão de luz, eletroforese capilar, dicroísmo circular, calorimetria de varredura diferencial, fluorescência, HPLC-troca de íons, HPLC-exclusão de tamanho, IR, RMN, espectroscopia Raman, refractometria e espectroscopia UV/Visível. Métodos adicionais são divulgados em Arnau et al., Prot Expr and Purif (2006) 48, 1-13. Aplicação desses métodos à invenção estará dentro da capacidade daqueles versados na técnica.
[00142] Tipicamente, o componente XTEN das proteínas de fusão é criado para se comportar como sequências peptídicas desnaturadas sob condições fisiológicas, a despeito do comprimento estendido do polímero. Desnaturadas descreve o estado de um peptídeo em solução que é caracterizado por uma grande liberdade conformacional da parte principal peptídica. A maioria dos peptídeos e proteínas adota uma conformação desnaturada na presença de altas concentrações de desnaturantes ou em temperatura ambiente. Peptídeos na conformação desnaturada têm, por exemplo, espectros de dicroísmo circular (CD) característicos e são caracterizados por uma falta de interações de longa faixa, conforme determinado através de RMN. "Conformação desnaturada" e "conformação não estruturada" são usadas como sinônimo aqui. Em alguns casos, a invenção proporciona sequências de XTEN que, sob condições fisiológicas, podem se assemelhar a sequências desnaturadas grandemente desprovidas de estrutura secundária. Em outros casos, as sequências do XTEN podem ser substancialmente desprovidas de estrutura secundária sob condições fisiológicas. "Grandemente desprovidas", conforme usado nesse contexto, significa que 50% dos resíduos de aminoácido de XTEN da sequência do XTEN contribuem para a estrutura secundária, conforme medido ou determinado através dos meios descritos aqui. "Substancialmente desprovidas", conforme usado nesse contexto, significa que pelo menos cerca de 60% ou cerca de 70% ou cerca de 80% ou cerca de 90% ou cerca de 95% ou pelo menos cerca de 99% do resíduos de aminoácido de XTEN da sequência do XTEN não contribuem para a estrutura secundária, conforme medido ou determinado através dos meios descritos aqui.
[00143] Uma variedade de métodos foi estabelecida na técnica para discernir a presença ou ausência de estruturas secundárias e terciárias em um determinado polipeptídeo. Em particular, a estrutura secundária pode ser medida espectrofotometricamente, por exemplo, através de espectroscopia de dicroísmo circular na região espectral "distante-UV" (190-250 nm). Elementos de estrutura secundária, tais como alfa-hélice e beta-folha dão, cada um, origem a um formato característico e magnitude de espectros de CD. A estrutura secundária pode também ser prevista para uma sequência polipeptídica via determinados programas de computador ou algoritmos, tal como o algoritmo de Chou- Fasman bem conhecido (Chou, P. Y. et al. (1974) Biochemistry, 13: 22245) e o algoritmo de Garnier-Osguthorpe-Robson ("GOR") (Gamier J, Gibrat JF, Robson B. (1996), GOR Method For Predicting Protein Secondary Structure From Aminoacid Sequência. Methods Enzymol 266: 540-553), conforme descrito na Publicação de Pedido de Patente US N° 20030228309A1. Para uma determinada sequência, os algoritmos podem prever se há alguma estrutura secundária ou não em geral, expresso como o total e/ou percentual de resíduos da sequência que foram, por exemplo, alfa-hélices ou beta-folhas ou o percentual de resíduos da sequência previstos como resultando em uma conformação em espiral aleatória (a qual carece de estrutura secundária).
[00144] Em alguns casos, as sequências de XTEN usadas nas composições de proteína de fusão da invenção podem ter um percentual de alfa-hélice oscilando de 0% a menos de cerca de 5% conforme determinado pelo algoritmo de Chou-Fasman. Em outros casos, as sequências de XTEN das composições de proteína de fusão podem ter um percentual de beta-folha oscilando de 0% a menos de cerca de 5% conforme determinado pelo algoritmo de Chou-Fasman. Em alguns casos, as sequências de XTEN das composições de proteína de fusão podem ter um percentual de alfa-hélice oscilando de 0% a menos de cerca de 5% e um percentual de beta-folha oscilando de 0% a menos de cerca de 5% conforme determinado pelo algoritmo de Chou- Fasman. Em modalidades preferidas, as sequências de XTEN das composições de proteína de fusão terão um percentual de alfa-hélice menos de cerca de 2% e um percentual de beta-folha menos de cerca de 2%. Em outros casos, as sequências de XTEN das composições de proteína de fusão podem ter um alto grau de percentual de espiral aleatória, conforme determinado pelo algoritmo GOR. Em algumas modalidades, uma sequência de XTEN pode ter pelo menos cerca de 80%, mais preferivelmente pelo menos cerca de 90%, mais preferivelmente pelo menos cerca de 91%, mais preferivelmente pelo menos cerca de 92%, mais preferivelmente pelo menos cerca de 93%, mais preferivelmente pelo menos cerca de 94%, mais preferivelmente pelo menos cerca de 95%, mais preferivelmente pelo menos cerca de 96%, mais preferivelmente pelo menos cerca de 97%, mais preferivelmente pelo menos cerca de 98% e, ainda mais preferivelmente, pelo menos cerca de 99% de espiral aleatória, conforme determinado pelo algoritmo GOR.
1. Sequências Não Repetitivas
[00145] Sequências de XTEN das presentes composições podem ser substancialmente não repetitivas. Em geral, sequências de aminoácido repetitivas têm uma tendência a agregar ou formar estruturas de ordem superior, conforme exemplificado por sequências repetitivas naturais, tais como colágenos e zíperes de leucina ou formam contatos que resultam em estruturas cristalinas ou pseudocristalinas. Em contraste, a baixa tendência de sequências não repetitivas de agregar permite o design de XTENs de sequência longa com uma frequência relativamente baixa de aminoácidos carregados que provavelmente agregariam se as sequências fossem, de outro modo, repetitivas. Tipicamente, as proteínas de fusão BPXTEN compreendem sequências de XTEN de mais de cerca de 100 a cerca de 3000 resíduos de aminoácido, de preferência mais de 400 a cerca de 3000 resíduos, em que as sequências são substancialmente não repetitivas. Em uma modalidade, as sequências de XTEN podem ter mais de cerca de 100 a cerca de 3000 resíduos de aminoácido, de preferência mais de 400 a cerca de 3000 resíduos de aminoácido, na qual três aminoácidos contíguos na sequência não são tipos de aminoácido idênticos, a menos que o aminoácido seja serina, caso no qual não mais de três aminoácidos contíguos sejam resíduos de serina. Na modalidade precedente, a sequência do XTEN seria substancialmente não repetitiva.
[00146] O grau de repetitividade de um polipeptídeo ou um gene pode ser medido por programas de computador ou algoritmos ou através de outros meios conhecidos na técnica. A repetitividade, em uma sequência polipeptídica pode, por exemplo, ser ensaiada determinando-se o número de vezes em que sequências mais curtas de um determinado comprimento ocorrem dentro do polipeptídeo. Por exemplo, um polipeptídeo de 200 resíduos de aminoácido tem 192 sequências de 9 aminoácidos em sobreposição (ou "quadros" de 9- meros) e 198 quadros de 3-meros, mas o número de sequências únicas de 9-meros ou 3-meros dependerá da quantidade de repetitividade dentro da sequência. Um escore pode ser gerado (aqui depois "escore de subsequência") que reflete o grau de repetitividade das subseqüências na sequência polipeptídica global. No contexto da presente invenção, "escore de subsequência" significa a soma de ocorrência de cada quadro de 3-meros único através de uma sequência de 200 aminoácidos consecutivos do polipeptídeo dividido pelo número absoluto de subsequências de 3-meros únicas dentro da sequência de 200 aminoácidos. Exemplos de tais escores de subsequência derivados dos primeiros 200 aminoácidos de polipeptídeos repetitivos e não repetitivos são apresentados no Exemplo 73. Em algumas modalidades, a presente invenção proporciona BPXTEN, cada uma compreendendo XTEN, na qual o XTEN pode ter um escore de subsequência menor do que 12, mais preferivelmente menor do que 10, mais preferivelmente menor do que 9, mais preferivelmente menor do que 8, mais preferivelmente menor do que 7, mais preferivelmente menor do que 6 e, ainda mais preferivelmente, menor do que 5. Nas modalidades descritas aqui acima nesse parágrafo, um XTEN com um escore de subsequência menor do que cerca de 10 (isto é, 9, 8, 7, etc.) seria "substancialmente não repetitivo".
[00147] A característica não repetitiva do XTEN pode conferir às proteínas de fusão com BP(s) um maior grau de solubilidade e menos tendência a agregar, comparado com polipeptídeos tendo sequências repetitivas. Essas propriedades podem facilitar a formulação de preparados farmacêuticos compreendendo XTEN contendo concentrações de fármaco extremamente altas, em alguns casos excedendo a 100 mg/ml.
[00148] Além disso, as sequências polipeptídicas de XTEN das modalidades são projetadas para ter um menor grau de repetitividade interna de forma a reduzir ou eliminar substancialmente a imunogenicidade quando administradas a um mamífero. Sequências polipeptídicas compostas de motivos repetidos curtos grandemente limitados a três aminoácidos, tais como glicina, serina e glutamato, podem resultar em titulações de anticorpo relativamente altas quando administradas a um mamífero, a despeito da ausência de epitopos de células T previstos nessas sequências. Isso pode ser causado pela natureza repetitiva dos polipeptídeos, uma vez que foi mostrado que imunogênios com epitopos repetidos, incluindo agregados de proteína, imunogênios com ligação cruzada e carboidratos repetitivos são altamente imunogênicos e podem, por exemplo, resultar na ligação cruzada de receptores de células B, causando ativação de células B (Johansson, J. et al. (2007) Vaccine, 25: 1676-82; Yankai, Z. et al. (2006) Biochem Biophys Res Commun, 345: 1365-71; Hsu, C. T. et al. (2000) Cancer Res, 60: 3701-5); Bachmann M.F. et al., Eur J Immunol. (1995) 25(12): 3445-3451).
2. Motivos de Sequência Exemplificativos
[00149] A presente invenção abrange XTENs que podem compreender múltiplas unidades de sequências ou motivos mais curtos, nos quais as sequências de aminoácido dos motivos são não repetitivas. Na criação de sequências de XTEN, descobriu-se que o critério não repetitivo pode ser reunido, a despeito do uso de uma abordagem de "bloco de construção" usando uma biblioteca de motivos de sequência que são multimerizados para criar as sequências de XTEN. Assim, embora uma sequência de XTEN possa consistir em múltiplas unidades de tão pouco quanto quatro tipos diferentes de motivos de sequência, em virtude do fato de os motivos consistirem, em si, de sequências de aminoácido não repetitivas em geral, a sequência do XTEN global se torna substancialmente não repetitiva.
[00150] Em uma modalidade, o XTEN pode ter uma sequência não repetitiva de mais de cerca de 100 a cerca de 3000 resíduos de aminoácido, de preferência mais de 400 a cerca de 3000 resíduos, em que pelo menos cerca de 80% ou pelo menos cerca de 85% ou pelo menos cerca de 90% ou pelo menos cerca de 95% ou pelo menos cerca de 97% ou cerca de 100% da sequência do XTEN consistem em motivos de sequência sem sobreposição, em que cada um dos motivos tem cerca de 9 a 36 resíduos de aminoácido. Em outras modalidades, pelo menos cerca de 80% ou pelo menos cerca de 85% ou pelo menos cerca de 90% ou pelo menos cerca de 95% ou pelo menos cerca de 97% ou cerca de 100% da sequência do XTEN consistem em motivos de sequência sem sobreposição, em que cada um dos motivos tem 9 a 14 resíduos de aminoácido. Em ainda outras modalidades, pelo menos cerca de 80% ou pelo menos cerca de 85% ou pelo menos cerca de 90% ou pelo menos cerca de 95% ou pelo menos cerca de 97% ou cerca de 100% do componente de sequência XTEN consistem em motivos de sequência sem sobreposição, em que cada um dos motivos tem 12 resíduos de aminoácido. Nessas modalidades, é preferido que os motivos de sequência sejam compostos principalmente de pequenos aminoácidos hidrofílicos, de modo que a sequência global tenha uma característica flexível, não estruturada. Exemplos de aminoácidos que podem ser incluídos no XTEN são, por exemplo, arginina, lisina, treonina, alanina, asparagina, glutamina, aspartato, glutamato, serina e glicina. Como um resultado de teste de variáveis, tais como otimização de códon, montagem de polinucleotídeos que codificam motivos de sequência, expressão de proteína, distribuição de carga e solubilidade da proteína expressa e estrutura terciária, descobriu-se que composições de XTEN com características intensificadas incluem principalmente resíduos de glicina (G), alanina (A), serina (S), treonina (T), glutamato (E) e prolina (P), em que as sequências são projetadas para ser substancialmente não repetitivas. Em uma modalidade preferida, sequências de XTEN têm predominantemente quatro a seis tipos de aminoácidos selecionados de glicina (G), alanina (A), serina (S), treonina (T), glutamato (E) ou prolina (P) que são dispostos em uma sequência substancialmente não repetitiva que tem mais de cerca de 100 a cerca de 3000 resíduos de aminoácido, de preferência mais de 400 a cerca de 3000 resíduos de comprimento. Em algumas modalidades, o XTEN pode ter sequências de mais de cerca de 100 a cerca de 3000 resíduos de aminoácido, de preferência mais de 400 a cerca de 3000 resíduos, em que pelo menos cerca de 80% da sequência consistem em motivos de sequência sem sobreposição, em que cada um dos motivos tem 9 a 36 resíduos de aminoácido, em que cada um dos motivos consiste em 4 a 6 tipos de aminoácidos selecionados de glicina (G), alanina (A), serina (S), treonina (T), glutamato (E) e prolina (P) e em que o teor de qualquer tipo de aminoácido no XTEN de comprimento total não excede a 30%. Em outras modalidades, pelo menos cerca de 90% da sequência do XTEN consistem em motivos de sequência sem sobreposição, em que cada um dos motivos tem 9 a 36 resíduos de aminoácido, em que os motivos consistem em 4 a 6 tipos de aminoácidos selecionados de glicina (G), alanina (A), serina (S), treonina (T), glutamato (E) e prolina (P) e em que o teor de qualquer tipo de aminoácido no XTEN de comprimento total não excede a 30%. Em outras modalidades, pelo menos cerca de 90% da sequência do XTEN consistem em motivos de sequência sem sobreposição, em que cada um dos motivos tem 12 resíduos de aminoácido consistindo em 4 a 6 tipos de aminoácidos selecionados de glicina (G), alanina (A), serina (S), treonina (T), glutamato (E) e prolina (P) e em que o teor de qualquer tipo de aminoácido no XTEN de comprimento total não excede a 30%. Em ainda outras modalidades, pelo menos cerca de 90% ou cerca de 91% ou cerca de 92% ou cerca de 93% ou cerca de 94% ou cerca de 95% ou cerca de 96% ou cerca de 97% ou cerca de 98% ou cerca de 99%, a cerca de 100% da sequência do XTEN consistem em motivos de sequência sem sobreposição, em que cada um dos motivos tem 12 resíduos de aminoácido consistindo de glicina (G), alanina (A), serina (S), treonina (T), glutamato (E) e prolina (P) e em que o teor de qualquer tipo de aminoácido no XTEN de comprimento total não excede a 30%.
[00151] Em ainda outras modalidades, XTENs compreendem sequências não repetitivas de mais de cerca de 100 a cerca de 3000 resíduos de aminoácido, de preferência mais de 400 a cerca de 3000 resíduos de aminoácido, em que pelo menos cerca de 80% ou pelo menos cerca de 90% ou cerca de 91% ou cerca de 92% ou cerca de 93% ou cerca de 94% ou cerca de 95% ou cerca de 96% ou cerca de 97% ou cerca de 98% ou cerca de 99% da sequência consistem em motivos de sequência sem sobreposição de 9 a 14 resíduos de aminoácido, em que os motivos consistem em 4 a 6 tipos de aminoácidos selecionados de glicina (G), alanina (A), serina (S), treonina (T), glutamato (E) e prolina (P) e em que a sequência de quaisquer dois resíduos de aminoácido contíguos em qualquer motivo não é repetida mais de duas vezes em um motivo de sequência. Em outras modalidades, pelo menos cerca de 90% ou cerca de 91% ou cerca de 92% ou cerca de 93% ou cerca de 94% ou cerca de 95% ou cerca de 96% ou cerca de 97% ou cerca de 98% ou cerca de 99% de uma sequência de XTEN consistem em motivos de sequência sem sobreposição de 12 resíduos de aminoácido, em que os motivos consistem em 4 a 6 tipos de aminoácidos selecionados de glicina (G), alanina (A), serina (S), treonina (T), glutamato (E) e prolina (P) e em que a sequência de quaisquer dois resíduos de aminoácido contíguos em qualquer motivo de sequência não é repetida mais de duas vezes em um motivo de sequência. Em outras modalidades, pelo menos cerca de 90% ou cerca de 91% ou cerca de 92% ou cerca de 93% ou cerca de 94% ou cerca de 95% ou cerca de 96% ou cerca de 97% ou cerca de 98% ou cerca de 99% de uma sequência de XTEN consistem em motivos de sequência sem sobreposição de 12 resíduos de aminoácido, em que os motivos consistem em glicina (G), alanina (A), serina (S), treonina (T), glutamato (E) e prolina (P) e em que a sequência de quaisquer dois resíduos de aminoácido contíguos em qualquer motivo de sequência não é repetida mais de duas vezes em um motivo de sequência. Em ainda outras modalidades, XTENs consistem em motivos de sequência de 12 aminoácidos, em que os aminoácidos são selecionados de glicina (G), alanina (A), serina (S), treonina (T), glutamato (E) e prolina (P) e em que a sequência de quaisquer dois resíduos de aminoácido contíguos em qualquer motivo de sequência não é repetida mais de duas vezes em um motivo de sequência e em que o teor de qualquer tipo de aminoácido no XTEN de comprimento total não excede a 30%. Nas modalidades precedentes descritas aqui acima nesse parágrafo, as sequências de XTEN seriam substancialmente não repetitivas.
[00152] Em alguns casos, a invenção proporciona composições compreendendo uma sequência de XTEN não repetitiva de mais de cerca de 100 a cerca de 3000 resíduos de aminoácido, de preferência mais de 400 a cerca de 3000 resíduos, em que pelo menos cerca de 80% ou pelo menos cerca de 90% ou cerca de 91% ou cerca de 92% ou cerca de 93% ou cerca de 94% ou cerca de 95% ou cerca de 96% ou cerca de 97% ou cerca de 98% ou cerca de 99% a cerca de 100% da sequência consistem em múltiplas unidades de dois ou mais motivos de sequência sem sobreposição selecionados das sequências de aminoácido da Tabela 1. Em alguns casos, o XTEN compreende motivos de sequência sem sobreposição nos quais cerca de 80% ou pelo menos cerca de 90% ou cerca de 91% ou cerca de 92% ou cerca de 93% ou cerca de 94% ou cerca de 95% ou cerca de 96% ou cerca de 97% ou cerca de 98% ou cerca de 99% a cerca de 100% da sequência consistem em duas ou mais sequências sem sobreposição selecionadas de uma família com motivo único da Tabela 1, resultando uma sequência de "família" na qual a sequência global permanece substancialmente não repetitiva. Consequentemente, nessas modalidades, uma sequência de XTEN pode compreender múltiplas unidades de motivos de sequência sem sobreposição da família de motivo AD ou da família de motivo AE ou da família de motivo AF ou da família de motivo AG ou da família de motivo AM ou da família de motivo AQ ou da família de motivo BC ou da família de motivo BD de sequências da Tabela 1. Em outros casos, o XTEN compreende sequências de motivo de duas ou mais das famílias de motivo da Tabela 1. Tabela 1: Motivos de Sequência de XTEN de 12 Aminoácidos e Famílias de Motivo
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*Denota sequências de motivo individuais que, quando usadas juntas em várias permutações, resultam em uma "sequência de família"
[00153] Em outros casos, uma composição de BPXTEN pode compreender uma sequência de XTEN não repetitiva de mais de cerca de 100 a cerca de 3000 resíduos de aminoácido, de preferência mais de 400 a cerca de 3000 resíduos, em que pelo menos cerca de 80% ou pelo menos cerca de 90% ou cerca de 91% ou cerca de 92% ou cerca de 93% ou cerca de 94% ou cerca de 95% ou cerca de 96% ou cerca de 97% ou cerca de 98% ou cerca de 99% a cerca de 100% da sequência consistem em motivos de sequência de 36 aminoácidos sem sobreposição selecionados de uma ou mais das sequências polipeptídicas da Tabelas 12-15.
[00154] Naquelas modalidades em que o componente XTEN da proteína de fusão BPXTEN tem menos de 100% de seus aminoácidos consistindo em quatro a seis aminoácidos selecionados de glicina (G), alanina (A), serina (S), treonina (T), glutamato (E) e prolina (P) ou menos de 100% da sequência consistindo nos motivos de sequência da Tabela 1 ou nas sequências polipeptídicas das Tabelas 12-15 ou menos de 100% de identidade de sequência com um XTEN da Tabela 2, os outros resíduos de aminoácido podem ser selecionados de qualquer um dos outros 14 L-aminoácidos naturais. Os outros aminoácidos podem ser interpostos por toda a sequência do XTEN, podem estar localizados dentro ou entre os motivos de sequência ou podem estar concentrados em um ou mais trechos curtos da sequência do XTEN. Em tais casos onde o componente XTEN da BPXTEN compreende outros aminoácidos que não glicina (G), alanina (A), serina (S), treonina (T), glutamato (E) e prolina (P), é preferido que os aminoácidos não sejam resíduos hidrofóbicos e não confiram substancialmente estrutura secundária do componente XTEN. Assim, em uma modalidade preferida do precedente, o componente XTEN da proteína de fusão BPXTEN compreendendo outros aminoácidos além de glicina (G), alanina (A), serina (S), treonina (T), glutamato (E) e prolina (P), teria uma sequência com menos de 5% dos resíduos contribuindo para alfa-hélices e beta- folhas, conforme medido pelo algoritmo de Chou-Fasman e teria pelo menos 90% de conformação em espiral aleatória, conforme medido pelo algoritmo GOR.
3. Comprimento de Sequência
[00155] Em uma característica particular, a invenção abrange composições de BPXTEN compreendendo polipeptídeos XTEN com sequências de comprimento estendido. A presente invenção faz uso da descoberta de que aumento do comprimento de polipeptídeos não estruturados, não repetitivos intensifica a natureza não estruturada dos XTENs e as propriedades biológicas e farmacocinéticas de proteínas de fusão compreendendo o XTEN. Conforme descrito mais completamente nos Exemplos, aumentos proporcionais no comprimento do XTEN, mesmo se criados por uma ordem repetida fixa de motivos de sequência de uma única família (por exemplo, os quatro motivos AE da Tabela 1), podem resultar em uma sequência com um maior percentual de formação de espiral aleatória, conforme determinado pelo algoritmo GOR, comparado com comprimentos de XTEN mais curtos. Além disso, descobriu-se que aumento do comprimento do polipeptídeo não estruturado parceiro de fusão pode, conforme descrito nos Exemplos, resultar em uma proteína de fusão com um aumento desproporcional na meia-vida terminal, comparado com proteínas de fusão com parceiros polipeptídicos não estruturados com comprimentos de sequência mais curtos.
[00156] Exemplos não limitativos de XTEN considerados para inclusão em uma BPXTEN da invenção são apresentados na Tabela 2. Consequentemente, a invenção proporciona composições de BPXTEN, em que o comprimento de sequência do XTEN da(s) proteína(s) de fusão é maior do que cerca de 100 a cerca de 3000 resíduos de aminoácido e, em alguns casos, é maior do que 400 a cerca de 3000 resíduos de aminoácido, em que o XTEN confere propriedades farmacocinéticas intensificadas a uma BPXTEN em comparação com "payloads" não ligados ao XTEN. Em alguns casos, as sequências de XTEN das composições de BPXTEN da presente invenção podem ter cerca de 100 ou cerca de 144 ou cerca de 288 ou cerca de 401 ou cerca de 500 ou cerca de 600 ou cerca de 700 ou cerca de 800 ou cerca de 900 ou cerca de 1000 ou cerca de 1500 ou cerca de 2000 ou cerca de 2500 ou até cerca de 3000 resíduos de aminoácido de comprimento. Em outros casos, as sequências de XTEN podem ter cerca de 100 a 150, cerca de 150 a 250, cerca de 250 a 400, 401 a cerca de 500, cerca de 500 a 900, cerca de 900 a 1500, cerca de 1500 a 2000 ou cerca de 2000 a cerca de 3000 resíduos de aminoácido de comprimento. Em uma modalidade, a BPXTEN pode compreender uma sequência de XTEN, em que a sequência exibe pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência ou, alternativamente, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência a um XTEN selecionado da Tabela 2. Em alguns casos, a sequência do XTEN é projetada para expressão otimizada como o componente N-terminal da BPXTEN. Em uma modalidade do precedente, a sequência do XTEN tem pelo menos 90% de identidade de sequência à sequência de AE912 ou AM923. Em outra modalidade do precedente, o XTEN tem os resíduos N-terminais descritos nos Exemplos 14-17.
[00157] Em outros casos, a proteína de fusão BPXTEN pode compreender uma primeira e uma segunda sequências de XTEN, em que o total cumulativo dos resíduos nas sequências do XTEN é mais de cerca de 400 a cerca de 3000 resíduos de aminoácido. Em modalidades do precedente, a proteína de fusão BPXTEN pode compreender uma primeira e uma segunda sequência de XTEN, em que as sequências exibem, cada uma, pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência ou, alternativamente, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência a pelo menos um primeiro ou, adicionalmente, um segundo XTEN selecionado da Tabela 2. Exemplos onde mais de um XTEN é usado em uma composição de BPXTEN incluem, mas não estão limitados a, construtos com um XTEN ligado aos N- e C-términos de pelo menos uma BP.
[00158] Conforme descrito mais completamente abaixo, a invenção proporciona métodos nos quais a BPXTEN é projetada selecionando o comprimento do XTEN para conferir uma meia-vida alvo a uma proteína de fusão administrada a um indivíduo. Em geral, XTENs de maiores comprimentos incorporados nas composições de BPXTEN resultam em maior meia-vida, comparado com um XTEN mais curto. Contudo, em outra modalidade, proteínas de fusão BPXTEN podem ser projetadas para compreender um XTEN com um maior comprimento de sequência que é selecionado para conferir taxas de absorção sistêmica mais lentas após administração subcutânea ou intramuscular a um indivíduo. Em tais casos, a Cmax é reduzida em comparação com uma dose comparável de uma BP não ligada ao XTEN, desse modo, contribuindo para a capacidade de manter a BPXTEN dentro da janela terapêutica para a composição. Assim, o XTEN confere a propriedade de depositar a BPXTEN administrada, além de outras propriedades físico/químicas descritas aqui. Tabela 2: Polipeptídeos XTEN
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4. Carga Líquida
[00159] Em outros casos, os polipeptídeos XTEN podem ter uma característica não estruturada conferida por meio de incorporação de resíduos de aminoácido com uma carga líquida e/ou reduzindo a proporção de aminoácidos hidrofóbicos na sequência do XTEN. A carga líquida global e a densidade de carga líquida podem ser controladas modificando-se o teor de aminoácidos carregados nas sequências do XTEN. Em alguns casos, a densidade de carga líquida do XTEN das composições pode estar acima de +0,1 ou abaixo de -0,1 carga/resíduo. Em outros casos, a carga líquida de um XTEN pode ser cerca de 0%, cerca de 1%, cerca de 2%, cerca de 3%, cerca de 4%, cerca de 5%, cerca de 6%, cerca de 7%, cerca de 8%, cerca de 9%, cerca de 10% cerca de 11%, cerca de 12%, cerca de 13%, cerca de 14%, cerca de 15%, cerca de 16%, cerca de 17%, cerca de 18%, cerca de 19% ou cerca de 20% ou mais.
[00160] Uma vez que a maioria dos tecidos e superfícies em um ser humano ou animal têm uma carga líquida negativa, as sequências de XTEN podem ser projetadas para ter uma carga líquida negativa para minimizar interações não específicas entre composições contendo o XTEN e várias superfícies, tais como vasos sanguíneos, tecidos saudáveis ou vários receptores. Não estando preso a uma teoria em particular, o XTEN pode adotar conformações abertas em virtude da repulsão eletrostática entre aminoácidos individuais do polipeptídeo XTEN que trazem individualmente uma alta carga líquida negativa e que são distribuídos através da sequência do polipeptídeo XTEN. Tal distribuição de carga líquida negativa nos comprimentos estendidos de sequência de XTEN pode levar a uma conformação não estruturada a qual, por sua vez, pode resultar em um aumento eficaz no raio hidrodinâmico. Consequentemente, em uma modalidade, a invenção proporciona um XTEN no qual as sequências de XTEN contêm cerca de 8, 10, 15, 20, 25 ou mesmo cerca de 30% de ácido glutâmico. O XTEN das composições da presente invenção tem, em geral, nenhum ou um baixo teor de aminoácidos positivamente carregados. Em alguns casos, o XTEN pode ter menos de cerca de 10% de resíduos de aminoácido com uma carga positiva ou menos de cerca de 7% ou menos de cerca de 5% ou menos de cerca de 2% de resíduos de aminoácido com uma carga positiva. Contudo, a invenção considera construtos onde um número limitado de aminoácidos com uma carga positiva, tal como lisina, pode ser incorporado no XTEN para permitir conjugação entre a epsilon amina da lisina e um grupo reativo sobre um peptídeo, uma ligação em ponte com ligante ou um grupo reativo sobre um fármaco ou pequena molécula a ser conjugada à parte principal do XTEN. No precedente, podem ser construídas proteínas de fusão as quais compreendem XTEN, uma proteína biologicamente ativa, mais um agente quimioterapêutico útil no tratamento de doenças ou distúrbios metabólicos, em que o número máximo de moléculas do agente incorporado no componente XTEN é determinado pelos números de lisinas ou outros aminoácidos com cadeias laterais reativas (por exemplo, cisteína) incorporadas no XTEN.
[00161] Em alguns casos, uma sequência de XTEN pode compreender resíduos carregados separados por outros resíduos, tais como serina ou glicina, os quais podem levar a um melhor comportamento de expressão ou purificação. Baseado na carga líquida, XTENs das presentes composições podem ter um ponto isoelétrico (pi) de 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0 ou mesmo 6,5. Em modalidades preferidas, o XTEN terá um ponto isoelétrico entre 1,5 e 4,5. Nessas modalidades, o XTEN incorporado nas composições de proteína de fusão BPXTEN da presente invenção terá uma carga líquida negativa sob condições fisiológicas que pode contribuir para a conformação não estruturada e ligação reduzida do componente XTEN a proteínas e tecidos de mamífero.
[00162] Uma vez que aminoácidos hidrofóbicos podem conferir estrutura a um polipeptídeo, a invenção estabelece que o teor de aminoácidos hidrofóbicos no XTEN será, tipicamente, um teor de menos de 5% ou menos de 2% ou menos de 1% de aminoácido hidrofóbico. Em uma modalidade, o teor de aminoácido metionina e triptofano no componente XTEN de uma proteína de fusão BPXTEN é, tipicamente, menos de 5% ou menos de 2% e, ainda mais preferivelmente, menos de 1%. Em outra modalidade, o XTEN terá uma sequência que tem menos de 10% de resíduos de aminoácido com uma carga positiva ou menos de cerca de 7% ou menos de cerca de 5% ou menos de cerca de 2% de resíduos de aminoácido com uma carga positiva, a soma de resíduos metionina e triptofano será menos de 2% e a soma de resíduos de asparagina e glutamina será menos de 10% da sequência total do XTEN.
5. Baixa Imunogenicidade
[00163] Em outro aspecto, a invenção proporciona composições nas quais as sequências de XTEN têm um menor grau de imunogenicidade ou são substancialmente não imunogênicas. Vários fatores podem contribuir para a baixa imunogenicidade do XTEN, por exemplo, a sequência não repetitiva, a conformação não estruturada, o alto grau de solubilidade, o baixo grau ou falta de autoagregação, o baixo grau ou falta de sítios proteolíticos dentro da sequência e o baixo grau ou falta de epitopos na sequência do XTEN.
[00164] Epitopos conformacionais são formados por regiões da superfície da proteína que são compostos de múltiplas sequências de aminoácido descontinuas do antígeno de proteína. A duplicação precisa da proteína mantém essas sequências em uma configuração espacial adequada ou epitopos bem definidos, que podem ser reconhecidos como "estranhos" pelo sistema imune humoral, resultando na produção de anticorpos à proteína ou disparo de uma resposta imune mediada por célula. No último caso, a resposta imune a uma proteína em um indivíduo é grandemente influenciada pelo reconhecimento de epitopo de célula T que é uma função da especificidade de ligação peptídica desse alotipo de HLA-DR individual. Conexão de um complexo peptídico da Classe II do MHC com um receptor de célula T cognato sobre a superfície da célula T, junto com a ligação cruzada de alguns outros correceptores, tal como a molécula CD4, pode induzir a um estado ativado dentro da célula T. Ativação leva à liberação de citocinas, ativando adicionalmente outros linfócitos, tais como células B, para produzir anticorpos ou ativando células T assassinas, como uma resposta imune celular completa.
[00165] A capacidade de um peptídeo de se ligar a uma determinada molécula da Classe II do MHC para apresentação sobre a superfície de uma APC (Célula Apresentando Antígeno) é dependente do número de fatores; mais notavelmente, sua sequência primária. Em uma modalidade, um menor grau de imunogenicidade pode ser obtido projetando sequências de XTEN que resistem ao processamento de antígeno em células apresentando antígeno e/ou escolhendo sequências que não se ligam a receptores do MHC também. A invenção proporciona proteínas de fusão BPXTEN substancialmente com polipeptídeos XTEN não repetitivos criados para reduzir a ligação a receptores do MHC II, bem como evitar a formação de epitopos para ligação a anticorpo ou receptores de células T, resultando em um menor grau de imunogenicidade. Evitar a imunogenicidade é, em parte, um resultado direto da flexibilidade conformacional de sequências de XTEN; isto é, a falta de estrutura secundária em virtude da seleção e ordem de resíduos de aminoácido. Por exemplo, de interesse particular são sequências tendo uma baixa tendência a se adaptar a conformações compactamente dobradas em solução aquosa ou sob condições fisiológicas que poderiam resultar em epitopos conformacionais. A administração de proteínas de fusão compreendendo XTEN usando práticas e dosagens terapêuticas convencionais geralmente não resulta na formação de anticorpos de neutralização a uma sequência de XTEN e pode também reduzir a imunogenicidade de um parceiro de fusão BP nas composições BPXTEN.
[00166] Em uma modalidade, as sequências de XTEN utilizadas nas proteínas de fusão em questão podem ser substancialmente isentas de epitopos reconhecidos por células T humanas. A eliminação de tais epitopos para fins de geração de proteínas menos imunogênicas foi anteriormente divulgada; vide, por exemplo, documentos WO 98/52976, WO 02/079232 e WO 00/3317, os quais são incorporados por referência aqui. Ensaios para epitopos de células T humanos foram descritos (Stickler, M. et al. (2003) J Immunol Methods, 281: 95-108). De interesse particular são sequências peptídicas que podem ser oligomerizadas sem geração de epitopos de células T ou sequências não humanas. Isso pode ser obtido testando repetições diretas dessas sequências quanto à presença de epitopos de células T e a ocorrência de sequências de 6 a 15-meros e, em particular, 9-meros que não são humanas e, então, alterando o design da sequência do XTEN para eliminar ou romper a sequência de epitopo. Em alguns casos, as sequências de XTEN são substancialmente não imunogênicas mediante a restrição dos números de epitopos do XTEN previstos como se ligando aos receptores do MHC. Com uma redução nos números de epitopos capazes de ligação a receptores do MHC, há uma redução concomitante no potencial de ativação de células T, bem como função de células T auxiliares, ativação ou super-regulação reduzida de células B e produção reduzida de anticorpos. O baixo grau de epitopos de células T previstos pode ser determinado por algoritmos de previsão de epitopo tal como, por exemplo, TEPITOPE (Sturniolo, T. et al. (1999) Nat Biotechnol, 17: 555-61), conforme mostrado no Exemplo 74. O escore TEPITOPE de uma determinada estrutura peptídica dentro de uma proteína é o log da Kd (constante de dissociação, afinidade, taxa de dissociação) da ligação dessa estrutura peptídica a múltiplos dos alelos do MHC humano mais comuns, conforme divulgado em Sturniolo, T. et al. (1999) Nature Biotechnology 17: 555). O escore oscila sobre pelo menos 20 logs, de cerca de 10 a cerca de -10 (correspondendo a restrições de ligação de 10e1° Kd a 10e-1° Kd) e pode ser reduzido evitando aminoácidos hidrofóbicos que podem servir como resíduos âncora durante visualização de peptídeos sobre o MHC, tal como M, I, L, V, F. Em algumas modalidades, um componente XTEN incorporado em uma BPXTEN não tem um epitopo de célula T em um escore TEPITOPE de cerca de -5 ou maior ou -6 ou maior ou -7 ou maior ou -8 ou maior ou em um escore TEPITOPE de -9 ou maior. Conforme usado aqui, um escore de "-9 ou maior" abrangeria escores TEPITOPE de 10 a -9 inclusive, mas não abrange um escore de -10, uma vez que -10 é menos de -9.
[00167] Em outra modalidade, as sequências de XTEN da invenção, incluindo aquelas incorporadas nas presentes proteínas de fusão BPXTEN, podem ser tornadas substancialmente não imunogênicas restringindo os sítios proteolíticos conhecidos da sequência do XTEN, reduzindo o processamento de XTEN em pequenos peptídeos que podem se ligar a receptores do MHC II. Em outra modalidade, a sequência do XTEN pode ser tornada substancialmente não imunogênica mediante o uso de uma sequência que é substancialmente desprovida de estrutura secundária, conferindo resistência a muitas proteases em virtude da alta entropia da estrutura. Consequentemente, o escore TEPITOPE reduzido e eliminação de sítios proteolíticos conhecidos do XTEN podem tornar as composições de XTEN, incluindo as composições de XTEN de proteína de fusão BPXTEN, substancialmente incapazes de serem ligadas por receptores de mamífero, incluindo aqueles do sistema imune. Em uma modalidade, um XTEN de uma proteína de fusão BPXTEN pode ter uma ligação Kd >100 nM a um receptor de mamífero ou Kd de mais de 500 nM ou Kd de mais de 1 μM com relação à superfície celular ou receptor polipeptídico de mamífero em circulação.
[00168] Adicionalmente, a sequência não repetitiva e falta correspondente de epitopos de XTEN podem limitar a capacidade de células B de se ligar a ou ser ativadas pelo XTEN. A sequência repetitiva é reconhecida e pode formar contatos multivalentes com umas poucas células B e, como uma consequência da ligação cruzada de múltiplos receptores de células T independentes, pode estimular a proliferação de células B e produção de anticorpos. Em contraste, enquanto um XTEN pode fazer contato com muitas células B diferentes sobre sua sequência estendida, cada célula B individual pode fazer apenas um ou um pequeno número de contatos com um XTEN individual em virtude da falta de repetitividade da sequência. Como um resultado, XTENs podem, tipicamente, ter uma tendência muito menor a estimular a proliferação de células B e, assim, a resposta imune. Em uma modalidade, a BPXTEN pode ter imunogenicidade reduzida quando comparado com uma BP correspondente que não é fundida. Em uma modalidade, a administração de até três doses parenterais de uma BPXTEN a um mamífero pode resultar em IgG anti-BPXTEN detectável em uma diluição no soro de 1: 100, mas não em uma diluição de 1: 1000. Em outra modalidade, a administração de até três doses parenterais de uma BPXTEN a um mamífero pode resultar em IgG anti-BP detectável em uma diluição no soro de 1: 100, mas não uma diluição de 1: 1000. Em outra modalidade, a administração de até três doses parenterais de uma BPXTEN a um mamífero pode resultar em IgG anti-XTEN detectável em uma diluição no soro de 1: 100, mas não em uma diluição de 1: 1000. Nas modalidades precedentes, o mamífero pode ser um camundongo, um rato, um coelho ou um macaco cynomolgus.
[00169] Uma característica adicional de XTENs com sequências não repetitivas com relação a sequências com um alto grau de repetitividade pode ser que XTENs não repetitivos formam contatos mais fracos com anticorpos. Anticorpos são moléculas multivalentes. Por exemplo, IgGs têm dois sítios de ligação idênticos e IgMs contêm 10 sítios de ligação idênticos. Assim, anticorpos contra sequências repetitivas podem formar contatos multivalentes com tais sequências repetitivas com alta avidez, o que pode afetar a potência e/ou eliminação de tais sequências repetitivas. Em contraste, anticorpos contra XTENs não repetitivos podem proporcionar interações monovalentes, resultando em menos probabilidade de depuração imune, de modo que as composições de BPXTEN possam permanecer em circulação durante um período de tempo aumentado.
6. Raio Hidrodinâmico Aumentado
[00170] Em outro aspecto, a presente invenção proporciona um XTEN no qual os polipeptídeos XTEN podem ter um alto raio hidrodinâmico que confere um Peso Molecular Aparente correspondentemente aumentado a uma proteína de fusão BPXTEN incorporando o XTEN. Conforme detalhado no Exemplo 19, a ligação de XTEN a sequências de BP pode resultar em composições de BPXTEN que podem ter raios hidrodinâmicos aumentados, Peso Molecular Aparente aumentado e Fator de Peso Molecular Aparente aumentado comparado com uma BP não ligada a um XTEN. Por exemplo, em aplicações terapêuticas nas quais meia-vida prolongada é desejada, composições nas quais um XTEN com um alto raio hidrodinâmico são incorporadas em uma proteína de fusão compreendendo uma ou mais BPs pode ampliar eficazmente o raio hidrodinâmico da composição além do tamanho de poro glomerular de aproximadamente 3-5 nm (correspondendo a um peso molecular aparente de cerca de 70 kDA) (Caliceti. 2003. Pharmacokinetic and Biodistribution Properties of Poly(Ethylene Glycol)-Protein Conjugates. Adv Drug Deliv Rev 55: 1261-1277), resultando em depuração renal reduzida de proteínas em circulação. O raio hidrodinâmico de uma proteína é determinado por seu peso molecular, bem como por sua estrutura, incluindo formato e compactação. Não estando preso por uma teoria em particular, o XTEN pode adotar conformações abertas em virtude de repulsão eletrostática entre cargas individuais do peptídeo ou a flexibilidade inerente conferida pelos aminoácidos particulares em uma sequência que carece de potencial para conferir estrutura secundária. A conformação aberta, estendida e não estruturada do polipeptídeo XTEN pode ter um maior raio hidrodinâmico proporcional comparado com polipeptídeos de um comprimento de sequência e/ou peso molecular comparável que têm estrutura secundária e/ou terciária, tais como proteínas globulares típicas. Métodos para determinação do raio hidrodinâmico são bem conhecidos no campo, tal como mediante o uso de cromatografia por exclusão de tamanho (Size Exclusion Chromatography - SEC), conforme descrito nas Patentes U.S. Nos. 6.406.632 e 7.294.513. Conforme os resultados do Exemplo 19 demonstram, a adição de comprimentos crescentes de XTEN resulta em aumentos proporcionais nos parâmetros de raio hidrodinâmico, Peso Molecular Aparente e Fator de Peso Molecular Aparente, permitindo a configuração de BPXTEN aos cortes característicos desejados de Peso Molecular Aparente ou raios hidrodinâmicos. Consequentemente, em determinadas modalidades, a proteína de fusão BPXTEN pode ser configurada com um XTEN de modo que a proteína de fusão possa ter um raio hidrodinâmico de pelo menos cerca de 5 nm ou pelo menos cerca de 8 nm ou pelo menos cerca de 10 nm ou 12 nm ou pelo menos cerca de 15 nm. Nas modalidades precedentes, o maior raio hidrodinâmico conferido pelo XTEN em uma proteína de fusão BPXTEN pode levar a uma depuração renal reduzida da proteína de fusão resultante, levando a um aumento correspondente na meia-vida terminal, um aumento no tempo médio de resistência e/ou uma diminuição na taxa de depuração renal.
[00171] Em outra modalidade, um XTEN de um comprimento e sequência escolhidos pode ser seletivamente incorporado em uma BPXTEN para criar uma proteína de fusão que terá, sob condições fisiológicas, um peso molecular aparente de pelo menos cerca de 150 kDa ou pelo menos cerca de 300 kDa ou pelo menos cerca de 400 kDa ou pelo menos cerca de 500 kDA ou pelo menos cerca de 600 kDa ou pelo menos cerca de 700 kDA ou pelo menos cerca de 800 kDa ou pelo menos cerca de 900 kDa ou pelo menos cerca de 1000 kDa ou pelo menos cerca de 1200 kDa ou pelo menos cerca de 1500 kDa ou pelo menos cerca de 1800 kDa ou pelo menos cerca de 2000 kDa ou pelo menos cerca de 2300 kDa ou mais. Em outra modalidade, um XTEN de um comprimento e sequência escolhidos pode ser seletivamente ligado a uma BP para resultar em uma proteína de fusão BPXTEN que tem, sob condições fisiológicas, um fator de peso molecular aparente de pelo menos três, alternativamente de pelo menos quatro, alternativamente de pelo menos cinco, alternativamente de pelo menos seis, alternativamente de pelo menos oito, alternativamente de pelo menos 10, alternativamente de pelo menos 15 ou um fator de peso molecular aparente de pelo menos 20 ou maior. Em outra modalidade, a proteína de fusão BPXTEN tem, sob condições fisiológicas, um fator de peso molecular aparente que é cerca de 4 a cerca de 20 ou é cerca de 6 a cerca de 15 ou é cerca de 8 a cerca de 12 ou é cerca de 9 a cerca de 10 com relação ao peso molecular real da proteína de fusão.
III). PROTEÍNAS BIOLOGICAMENTE ATIVAS DAS COMPOSIÇÕES DE PROTEÍNA DE FUSÃO BXTEN
[00172] A presente invenção refere-se, em parte, a composições de proteína de fusão compreendendo proteínas biologicamente ativas e XTEN e aos usos das mesmas para o tratamento de doenças, distúrbios ou condições de um indivíduo.
[00173] Em um aspecto, a invenção proporciona pelo menos uma primeira proteína biologicamente ativa (aqui depois "BP") covalentemente ligada a uma proteína de fusão compreendendo um ou mais polipeptídeos recombinantes estendidos ("XTEN"), resultando em uma composição de proteína de fusão XTEN (aqui depois "BPXTEN"). Conforme descrito mais completamente abaixo, as proteínas de fusão podem incluir, opcionalmente, sequências espaçadoras que podem ainda compreender sequências de clivagem para liberar a BP da proteína de fusão quando estimuladas por uma protease.
[00174] O termo "BPXTEN", conforme usado aqui, se destina a abranger polipeptídeos de fusão que compreendem uma ou duas regiões de "payload", cada uma compreendendo uma proteína biologicamente ativa que media uma ou mais atividades biológicas ou terapêuticas e pelo menos uma outra região compreendendo pelo menos um polipeptídeo XTEN.
[00175] A BP das presentes composições, particularmente aquelas divulgadas nas Tabelas 3-8, junto com suas sequências de ácido nucleico e aminoácido correspondentes, são bem conhecidas na técnica e descrições e sequências estão disponíveis em bancos de dados públicos, tais como Chemical Abstracts Services Databases (por exemplo, o Registro CAS), GenBank, The Universal Protein Resource (UniProt) e bancos de dados que fornecem subscrição, tal como GenSeq (por exemplo, Derwent). Sequências de polinucleotídeo podem ser uma sequência de polinucleotídeo do tipo silvestre que codifica uma determinada BP (por exemplo, comprimento total ou maduro) ou, em alguns casos, a sequência pode ser uma variante da sequência de polinucleotídeo do tipo silvestre (por exemplo, um polinucleotídeo o qual codifica a proteína biologicamente ativa do tipo silvestre, em que a sequência de DNA do polinucleotídeo tenha sido otimizada, para expressão em uma espécie em particular; ou um polinucleotídeo que codifica uma variante da proteína do tipo silvestre, tal como um mutante sítio-dirigido ou uma variante alélica. Está bem dentro da capacidade daqueles versados usar uma sequência de cDNA do tipo silvestre ou de consenso ou uma variante códon-otimizada de uma BP para criar construtos de BPXTEN considerados pela invenção usando métodos conhecidos na técnica e/ou em conjunto com a orientação e métodos proporcionados aqui e descritos mais completamente nos Exemplos.
[00176] A BP para inclusão em uma BPXTEN da invenção pode incluir qualquer proteína de função ou interesse biológico, terapêutico, profilático ou diagnóstico ou que é útil para mediação da atividade biológica ou prevenção ou alívio de uma doença, distúrbio ou condições quando administrada a um indivíduo. De interesse particular são BPs para as quais um aumento em um parâmetro farmacocinético, solubilidade aumentada, estabilidade aumentada ou alguma outra propriedade farmacêutica intensificada é considerado ou aquelas BPs para as quais um aumento na meia-vida terminal viria a aprimorar a eficácia, segurança ou resultar na redução da frequência de dosagem e/ou aprimorar a conformidade do paciente. Assim, composições de proteína de fusão BPXTEN são preparadas com vários objetivos em mente, incluindo aprimoramento da eficácia terapêutica do composto bioativo, por exemplo, mediante aumento da exposição em vivo ou do comprimento que a BPXTEN mantém dentro da janela terapêutica quando administrada a um indivíduo, comparado com uma BP não ligada ao XTEN.
[00177] Uma BP da invenção pode ser uma proteína nativa, de comprimento total ou pode ser um fragmento ou uma sequência variante de uma proteína biologicamente ativa que retém pelo menos uma parte da atividade biológica da proteína nativa.
[00178] Em uma modalidade, a BP incorporada nas presentes composições pode ser um polipeptídeo recombinante com uma sequência correspondendo a uma proteína encontrada na natureza. Em outra modalidade, a BP pode ser variantes de sequência, fragmentos, homólogos e miméticos de uma sequência natural que retém pelo menos uma parte da atividade biológica da BP nativa. Nos exemplos não limitativos, uma BP pode ser uma sequência que exibe pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência ou, alternativamente, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência à sequência de proteína selecionada da Tabelas 3-8. Em uma modalidade, uma proteína de fusão BPXTEN pode compreender uma única molécula de BP ligada a um XTEN (conforme descrito mais completamente abaixo). Em outra modalidade, a BPXTEN pode compreender uma primeira BP e uma segunda molécula da mesma BP, resultando em uma proteína de fusão compreendendo as duas BPs ligadas a um ou mais XTENs (por exemplo, duas moléculas de glucagon ou duas moléculas de hGH).
[00179] Em geral, BPs exibirão uma especificidade de ligação a um determinado alvo ou outra característica biológica desejada quando usadas in vivo ou quando utilizadas em um ensaio in vitro. Por exemplo, a BP pode ser um agonista, a receptor, um ligante, um antagonista, uma enzima ou um hormônio. De interesse particular são BPs usadas ou conhecidas como sendo úteis para uma doença ou um distúrbio, em que a BP nativa tem uma meia-vida terminal relativamente curta e para a qual uma intensificação de um parâmetro farmacocinético (a qual poderia ser opcionalmente liberada da proteína de fusão por meio de clivagem de uma sequência espaçadora) permitiria dosagem menos frequente ou um efeito farmacológico intensificado. Também de interesse são BPs que têm uma janela terapêutica estreita entre a dose ou concentração sanguínea eficaz mínima (Cmin) e a dose ou concentração sanguínea máxima tolerada (Cmax). Em tais casos, ligação da BP a uma proteína de fusão compreendendo uma sequência de XTEN selecionada pode resultar em um aprimoramento nessas propriedades, tornando a mesma mais útil como agentes terapêuticos ou preventivos comparado com uma BP não ligada ao XTEN.
[00180] A BP abrangida pelas composições da invenção pode ter utilidade no tratamento de várias categorias de doenças ou terapêuticas incluindo, mas não limitado a, distúrbios de glicose e insulina, distúrbio metabólicos, doenças cardiovasculares, distúrbios de coagulação/sangramento, distúrbios ou condições do crescimento, condições tumorigênicas, condições inflamatórias, condições autoimunes, etc.
(a) Peptídeos de regulação de glicose
[00181] Doenças ou distúrbios endócrinos e relacionados à obesidade têm atingido proporções epidêmicas na maioria das nações desenvolvidas e representam uma carga para a saúde pública substancial e crescente na maioria das nações desenvolvidas, os quais incluem uma grande variedade de condições que afetam os órgãos, tecidos e sistema circulatório do corpo. De preocupação particular são doenças e distúrbios endócrinos e relacionados à obesidade. O principal dentre esses é o diabetes; uma das causas principais de morte nos Estados Unidos. O diabetes é dividido em duas grandes subclasses: Tipo I, também conhecido como diabetes juvenil ou Diabetes Mellitus Dependente de Insulina (IDDM) e Tipo II, também conhecido como diabetes com início na fase adulta ou Diabetes Mellitus Não Dependente de Insulina (NIDDM). O diabetes do Tipo I é uma forma de doença autoimune que destrói, completa ou parcialmente, as células que produzem insulina do pâncreas em tais indivíduos e requer o uso de insulina exógena durante sua expectativa de vida. Mesmo em indivíduos bem tratados, complicações episódicas podem ocorrer, algumas das quais ameaçam a vida.
[00182] Em diabéticos do Tipo II, elevação dos níveis de glicose no sangue após as refeições não estimulam apropriadamente a produção de insulina pelo pâncreas. Adicionalmente, tecidos periféricos são, em geral, resistentes aos efeitos da insulina e tais indivíduos têm, com frequência, níveis plasmáticos de insulina maiores do que o normal (hiperinsulinemia), uma vez que o corpo tenta superar sua resistência à insulina. Em estados avançados da doença, a secreção de insulina também é deficiente.
[00183] A resistência à insulina e hiperinsulinemia também foram relacionadas a dois outros distúrbios metabólicos que impõem riscos consideráveis à saúde: tolerância deficiente à glicose e obesidade metabólica. Tolerância deficiente à glicose é caracterizada por níveis normais de glicose antes de comer, com uma tendência a níveis elevados (hiperglicemia) após uma refeição. Esses indivíduos são considerados como estando em um maior risco de diabetes e doença da artéria coronária. A obesidade é também um fator de risco para o grupo de condições denominado síndrome de resistência à insulina ou "Síndrome X", assim como a hipertensão, doença da artéria coronária (arteriosclerose) e acidose láctica, bem como estados doentios relacionados. Acredita-se que a patogênese de obesidade seja multifatorial, mas um problema subjacente é que, no obeso, a disponibilidade de nutriente e gasto de energia não estão em equilíbrio até que haja excesso de tecido adiposo. Outras doenças ou distúrbios relacionados incluem, mas não estão limitados a, diabetes gestacional, diabetes juvenil, obesidade, apetite excessivo, saciedade insuficiente, distúrbio metabólico, glucagonomas, processos neurodegenerativos retinais e o "período de lua-de-mel" de diabetes do Tipo I.
[00184] A dislipidemia é uma ocorrência frequente entre diabéticos; tipicamente caracterizada por triglicerídeos elevados no plasma, baixo HDL colesterol (lipoproteína de alta densidade), níveis normais a elevados de LDL colesterol (lipoproteína de baixa densidade) e níveis aumentados de pequenas partículas densas de LDL no sangue. A dislipidemia é um principal contribuinte para a incidência aumentada de eventos coronarianos e mortes entre indivíduos diabéticos.
[00185] A maioria dos processos metabólicos em homeostase de glicose e resposta à insulina são regulados por múltiplos peptídeos e hormônios e muitos de tais peptídeos e hormônios, bem como análogos dos mesmos, têm encontrado utilidade no tratamento de doenças e distúrbios metabólicos. Muitos desses peptídeos tendem a ser altamente homólogos uns aos outros, mesmo quando eles possuem funções biológicas opostas. Peptídeos que aumentam a glicose são exemplificados pelo hormônio peptídico glucagon, enquanto que peptídeos que diminuem a glicose incluem exendina-4, peptídeo 1 semelhante ao glucagon e amilina. Contudo, o uso de peptídeos e/ou hormônios terapêuticos, mesmo quando aumentado pelo uso de fármacos de pequena molécula, tem obtido sucesso limitado no tratamento de tais doenças e distúrbios. Em particular, otimização de dose é importante para fármacos e produtos biológicos usados no tratamento de doenças metabólicas, especialmente aquelas com uma janela terapêutica estreita. Hormônios em geral e peptídeos envolvidos em homeostase de glicose requerem dosagem frequente de forma a obter um benefício clínico, resultando em dificuldades no tratamento de tais pacientes. Embora modificações químicas em uma proteína terapêutica, tal como peguilação, possam modificar sua taxa de depuração in vivo e subsequentemente meia-vida no soro, isso requer etapas de fabricação adicionais e resultam em um produto final heterogêneo. Além disso, efeitos colaterais inaceitáveis pela administração crônica têm sido reportados. Alternativamente, modificação genética por meio de fusão de um domínio Fc à proteína ou peptídeo terapêutico aumenta o tamanho da proteína terapêutica, reduzindo a taxa de depuração através dos rins e promovendo a reciclagem de lisossomos pelo receptor FcRn. Infelizmente, o domínio Fc não se duplica eficientemente durante expressão recombinante e tende a formar precipitados insolúveis conhecidos como corpos de inclusão. Esses corpos de inclusão devem ser solubilizados e a proteína funcional deve ser renaturada; um processo que consome tempo é ineficiente e caro.
[00186] Assim, um aspecto da presente invenção é a incorporação de peptídeos envolvidos em homeostase de glicose, resistência à insulina e obesidade (coletivamente "peptídeos de regulação de glicose") em proteínas de fusão BPXTEN para criar composições com utilidade no tratamento de distúrbios, doenças e condições relacionadas à glicose, insulina e obesidade. Peptídeos de regulação de glicose podem incluir qualquer proteína de interesse ou função biológica, terapêutica ou profilática que é útil para prevenção, tratamento, mediação ou alívio de uma doença, distúrbio ou condição da homeostase de glicose ou resistência à insulina ou obesidade. Peptídeos de regulação de glicose adequados que podem ser ligados ao XTEN para criar BPXTEN incluem todos os polipeptídeos biologicamente ativos que aumentam a secreção de insulina glicose- dependente por beta-células pancreáticas ou potencializam a ação da insulina. Peptídeos de regulação de glicose também podem incluir todos os polipeptídeos biologicamente ativos que estimulam a transcrição de gene pró-insulina nas beta-células pancreáticas. Além disso, peptídeos de regulação de glicose também incluem todos os polipeptídeos biologicamente ativos que mostram redução do tempo de esvaziamento gástrico e reduzem a ingestão de alimento. Peptídeos de regulação de glicose também podem incluir todos os polipeptídeos biologicamente ativos que inibem a liberação de glucagon das alfa células das Ilhotas de Langerhans. A Tabela 3 proporciona uma lista não limitativa de sequências de peptídeos de regulação de glicoses que são abrangidos pelas proteínas de fusão BPXTEN da invenção. Peptídeos de regulação de glicose das composições BPXTEN da invenção podem ser um peptídeo que exibe pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência ou, alternativamente, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência a uma sequência de proteína selecionada da Tabela 3. Tabela 3: Peptídeos de regulação de glicose e sequências de aminoácido correspondentes
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[00187] "Adrenomedulina" ou "ADM" significa o hormônio peptídico adrenomedulina humano e espécies e variantes de sequência tendo pelo menos uma parte da atividade biológica da ADM madura. A ADM é gerada a partir de um pré-pró-hormônio de 185 aminoácidos através de clivagem enzimática e amidação consecutivas, resultando em um peptídeo bioativo de 52 aminoácidos com uma meia-vida plasmática medida de 22 min. Proteínas de fusão da invenção contendo ADM podem encontrar uso particular em diabetes pelos efeitos estimulatórios sobre a secreção de insulina de células de ilhota para regulação de glicose ou em indivíduos com hipotensão sustentada. A infraestrutura genômica completa para AM humana foi reportada (Ishimitsu et al., Biochem. Biophys. Res. Commun 203: 631-639 (1994)) e análogos de peptídeos ADM foram clonados, conforme descrito na Patente U.S. N° 6.320.022.
[00188] "Amilina" significa o hormônio peptídico humano referido como amilina, pranlintida e variações de espécies da mesma, conforme descrito na Patente U.S. N° 5.234.906, tendo pelo menos uma parte da atividade biológica da amilina madura.
[00189] A amilina é um hormônio polipeptídico de 37 aminoácidos co- secretado com a insulina por beta células pancreáticas em resposta à ingestão de nutrientes (Koda et al., Lancet 339: 1179- 1180, 1992) e foi reportada como modulando várias vias chave do metabolismo de carboidrato, incluindo incorporação de glicose em glicogênio. Proteínas de fusão da invenção contendo amilina podem encontrar uso em diabetes e obesidade para regulação de esvaziamento gástrico, supressão da secreção de glucagon e ingestão de alimento, desse modo, afetando a taxa de aparecimento de glicose em circulação. Assim, as proteínas de fusão podem complementar a ação da insulina, a qual regula a taxa de desaparecimento de glicose da circulação e sua reabsorção por tecidos periféricos. Análogos de amilina foram clonados, conforme descrito nas Patentes U.S. Nos. 5.686.411 e 7.271.238. Podem ser criados miméticos de amilina que retêm atividade biológica. Por exemplo, a pranlintida tem a sequência KCNTATCATNRLANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTY (SEQ ID NO: 43), em que aminoácidos da sequência de amilina de rato são substituídos por aminoácidos na sequência de amilina humana. Em uma modalidade, a invenção considera proteínas de fusão compreendendo miméticos de amilina da sequência KCNTATCATX1RLANFLVHSSNNFGX2ILX2X2TNVGSNTY (SEQ ID NO: 44), em que X1 é independentemente N ou Q e X2 é independentemente S, P ou G. Em uma modalidade, o mimético de amilina incorporado em uma BPXTEN pode ter a sequência KCNTATCATNRLANFLVHSSNNFGGILGGTNVGSNTY (SEQ ID NO: 45). Em outra modalidade, em que o mimético de amilina é usado no C- término da BPXTEN, o mimético pode ter a sequência KCNTATCATNRLANFLVHSSNNFGGILGGTNVGSNTY(NH2) (SEQ ID NO: 46).
[00190] "Calcitonina" (CT) significa a proteína calcitonina humana e espécies e variantes de sequência da mesma, incluindo calcitonina de salmão ("sCT"), tendo pelo menos uma parte da atividade biológica da CT madura. A CT é um peptídeo de 32 aminoácidos clivado de um pró- hormônio maior da tiróide que parece funcionar nos sistemas nervoso e vascular, mas também foi reportada como sendo um mediador hormonal potente do reflexo de saciedade. CT é mencionada por sua secreção em resposta à hipercalcemia induzida e seu rápido efeito hipocalcêmico. Ela é produzida e secretada de células neuroendócrinas na tiroide denominadas células C. A CT tem efeitos sobre o osteoclasto e a inibição de funções de osteoclasto pela CT resulta em uma diminuição na reabsorção óssea. Efeitos in vitro da CT incluem a rápida perda de bordas plissadas e diminuem a liberação de enzimas lisossômicas. Uma função principal da CT (1 -32) é combater a hipercalcemia aguda em situações de emergência e/ou proteger o esqueleto durante períodos de "estresse pelo cálcio", tais como crescimento, gravidez e lactação (Revisto em Becker, JCEM, 89(4): 1512-1525 (2004) e Sexton, Current Medicinal Chemistry 6: 1067-1093 (1999)). Proteínas de fusão da invenção contendo calcitonina podem encontrar uso particular para o tratamento de osteoporose e como uma terapia para a doença óssea de Paget. Peptídeos sintéticos de calcitonina foram criados, conforme descrito em Patente U.S. Nos.. 5.175.146 e 5.364.840.
[00191] "Peptídeo relacionado ao gene de calcitonina" ou "CGRP" significa o peptídeo de CGRP humano e espécies e variantes de sequência do mesmo tendo pelo menos uma parte da atividade biológica do CGRP maduro. O peptídeo relacionado ao gene de calcitonina é um membro da família de peptídeos de calcitonina o qual, em seres humanos, existe em duas formas, α-CGRP (um peptídeo de 37 aminoácidos) e β-CGRP. O CGRP tem 43-46% de identidade de sequência com a amilina humana. Proteínas de fusão da invenção contendo CGRP podem encontrar uso particular na diminuição de morbidade associada ao diabetes, alívio de hiperglicemia e deficiência de insulina, inibição de infiltração de linfócitos nas ilhotas e proteção de beta-células contra destruição autoimune. Métodos para a produção de CGRP sintético e recombinante são descritos na Patente U.S. N° 5.374.618.
[00192] "Colecistoquinina" ou "CCK" significa o peptídeo de CCK humano e espécies e variantes de sequência do mesmo tendo pelo menos uma parte da atividade biológica da CCK madura. CCK-58 é a sequência madura, embora a primeira sequência de aminoácidos de CCK-33 identificada em seres humanos seja a principal forma em circulação do peptídeo. A família CCK também inclui um fragmento C- terminal de 8 aminoácidos in vivo ("CCK-8"), pentagastrina ou CCK-5 sendo o peptídeo de CCK(29-33) C-terminal e CCK-4 sendo o tetrapeptídeo C-terminal CCK(30-33). CCK é um hormônio peptídico do sistema gastrointestinal responsável pela estimulação da digestão de gordura e proteína. Proteínas de fusão da invenção contendo CCK-33 e CCK-8 podem encontrar uso particular na redução do aumento de glicose em circulação após ingestão de uma refeição e potencialização do aumento de insulina em circulação. Análogos de CCK-8 foram preparados, conforme descrito na Patente U.S. N° 5.631.230.
[00193] "Exendina-3" significa um peptídeo de regulação de glicose isolado de Heloderma horridum e variantes de sequência do mesmo tendo pelo menos uma parte da atividade biológica da exendina-3 madura. Amida de exendina-3 é um antagonista do receptor de exendina específico que media um aumento no cAMP pancreático e liberação de insulina e amilase. Proteínas de fusão da invenção contendo exendina-3 podem encontrar uso particular no tratamento de diabetes e distúrbios de resistência à insulina. A sequência e métodos para seu ensaio são descritos na Patente dos Estados Unidos 5.424.286.
[00194] "Exendina-4" significa um peptídeo de regulação de glicose encontrado na saliva do Gila-monster Heloderma suspectum, bem como espécies e variantes de sequência do mesmo e incluem a sequência nativa de 39 aminoácidos His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu- Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg- Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu- Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser (SEQ ID NO: 47) e sequências homólogas e miméticos peptídicos e variantes da mesma; sequências naturais, tais como de primatas e não naturais tendo pelo menos uma parte da atividade biológica da exendina-4 madura. Exendina-4 é um hormônio polipeptídico de incretina que diminui a glicose no sangue, promove a secreção de insulina, diminui o esvaziamento gástrico e melhora a saciedade, conferindo um aprimoramento acentuado na hiperglicemia pós-prandial. As exendinas têm alguma similaridade de sequência a membros da família do peptídeo semelhante ao glucagon, com a maior identidade sendo pelo GLP-1 (Goke et al., J. Biol. Chem., 268: 19650-55 (1993)). Uma variedade de sequências homólogas podem ser funcionalmente equivalentes à exendina-4 nativa e GLP- 1. Conservação de sequências de GLP-1 de diferentes espécies é apresentada em Regulatory Peptides, 2001, 98, páginas 1-12. A Tabela 4 mostra as sequências de uma variedade de espécies, enquanto que a Tabela 5 mostra uma lista de análogos sintéticos de GLP-1; todos os quais são considerados para uso em uma BPXTEN descrita aqui. A exendina-4 se liga a receptores de GLP-1 sobre células βTC 1 que secretam insulina e também estimula a liberação de somatostatina e inibe a liberação de gastrina em estômagos isolados (Goke et al., J. Biol. Chem. 268: 19650-55, 1993). Como um mimético de GLP-1, a exendina-4 mostra uma ampla faixa similar de atividades biológicas, ainda que com uma meia-vida maior do que o GLP-1, com uma meia-vida terminal média de 2,4 h. Exenatida é uma versão sintética da exendina-4, comercializada como Byetta. Contudo, em virtude de sua meia-vida curta, a exenatida é atualmente dosada duas vezes ao dia, limitando sua utilidade. Proteínas de fusão da invenção contendo exendina-4 podem encontrar uso particular no tratamento de diabetes e distúrbios de resistência à insulina.
[00195] "Fator de crescimento de fibroblasto 21" ou "FGF-21" significa a proteína humana codificada pelo gene de FGF21 ou espécies e variantes de sequência do mesmo tendo pelo menos uma parte da atividade biológica do FGF21 maduro. O FGF-21 estimula a reabsorção de glicose em adipócitos, mas não em outros tipos de célula; o efeito é aditivo à atividade da insulina. Injeção de FGF-21 em camundongos ob/ob resulta em um aumento na Glut1 em tecido adiposo. FGF21 também protege animais de obesidade induzida pela dieta quando superexpresso em camundongos transgênicos e diminui os níveis de glicose e triglicerídeo no sangue quando administrado a roedores diabéticos (Kharitonenkov A. et al., (2005). "FGF-21 as a Novel Metabolic Regulator", J. Clin. Invest. 115: 1627- 35). Proteínas de fusão da invenção contendo FGF-21 podem encontrar uso particular no tratamento de diabetes, incluindo causando gasto de energia, utilização de gordura e excreção de lipídios aumentados. O FGF-21 foi clonado, conforme divulgado na Patente U.S. N° 6.716.626.
[00196] "FGF- 19" ou "fator de crescimento de fibroblasto 19" significa a proteína humana codificada pelo gene de FGF 19 ou espécies e variantes de sequência do mesmo tendo pelo menos uma parte da atividade biológica do FGF-19 maduro. O FGF-19 é um elemento proteináceo da família do fator de crescimento de fibroblasto (FGF). Membros da família FGF possuem amplas atividades mitogênicas e sobrevivência celular e estão envolvidos em uma variedade de processos biológicos. O FGF-19 aumenta a expressão hepática do receptor de leptina, taxa metabólica, estimula a reabsorção de glicose em adipócitos e leva a uma perda de peso em um modelo de camundongo obeso (Fu, L. et al.). Proteínas de fusão da invenção contendo FGF-19 podem encontrar uso particular no aumento da taxa metabólica e reversão de diabetes deficiente em leptina e dietético. O FGF- 19 foi clonado e expresso, conforme descrito no Pedido de Patente US N° 20020042367.
[00197] "Gastrina" significa o peptídeo de gastrina humana, versões truncadas e espécies e variantes de sequência do mesmo tendo pelo menos uma parte da atividade biológica da gastrina madura. A gastrina é um hormônio peptídico linear produzido por células G do duodeno e no antro pilórico do estômago e é secretado na corrente sanguínea. A gastrina é encontrada primariamente em três formas: gastrina-34 ("gastrina grande"); gastrina-17 ("gastrina pequena"); e gastrina-14 ("minigastrina"). Ela compartilha homologia de sequência com a CCK. Proteínas de fusão da invenção contendo gastrina podem encontrar uso particular no tratamento de obesidade e diabetes para regulação de glicose. A gastrina foi sintetizada, conforme descrito na Patente U.S. N° 5.843.446.
[00198] "Grelina" significa o hormônio humano que induz à saciedade ou espécies e variantes de sequência do mesmo, incluindo a sequência de aminoácido nativa, processada de 27 ou 28 aminoácidos e sequências homólogas. A grelina é produzida principalmente por células P/D1 que revestem o fundo do estômago humano e epsilon células do pâncreas que estimulam a fome e é considerada o hormônio contraparte da leptina. Os níveis de grelina aumentam antes das refeições e diminuem após as refeições e podem resultar em ingestão aumentada de alimento e aumento da massa de gordura pela ação exercida a nível do hipotálamo. A grelina também estimula a liberação de hormônio de crescimento. A grelina é acilada no resíduo serina pelo ácido n-octanoico; essa acilação é essencial para ligação ao receptor de GHS 1a e para a capacidade de liberação de GH da grelina. Proteínas de fusão da invenção contendo grelina podem encontrar uso particular como agonistas; por exemplo, para estimular seletivamente a motilidade do trato GI no distúrbio de motilidade gastrointestinal, acelerar o esvaziamento gástrico ou estimular a liberação de hormônio de crescimento. Análogos de grelina com substituições de sequência ou variantes truncadas, tal como descrito na Pat. U.S. N° 7.385.026 podem encontrar uso particular como parceiros de fusão ao XTEN para uso como antagonistas para homeostase aprimorada de glicose, tratamento de resistência à insulina e tratamento de obesidade. O isolamento e caracterização de grelina foram reportados (Kojima M. et al., Ghrelin is a Growth-Hormone-Releasing Acylated Peptide From Stomach. Nature. 1999; 402(6762): 656-660) e análogos sintéticos foram preparados por meio de síntese peptídica, conforme descrito na Pat. U.S. N° 6.967.237.
[00199] "Glucagon" significa o peptídeo de regulação de glicose glucagon humano ou espécies e variantes de sequência do mesmo, incluindo a sequência nativa de 29 aminoácidos e sequências homólogas naturais, tal como de primatas e variantes de sequência não naturais tendo pelo menos uma parte da atividade biológica do glucagon maduro. O termo "glucagon", conforme usado aqui, também inclui miméticos peptídicos de glucagon. O glucagon nativo é produzido pelo pâncreas, liberado quando os níveis de glicose no sangue começam a cair, fazendo com que o fígado converta o glicogênio armazenado em glicose e libera a mesma na corrente sanguínea. Embora a ação do glucagon seja oposta àquela da insulina, a qual sinaliza às células do corpo para captar a glicose do sangue, o glucagon também estimula a liberação de insulina, de modo que glicose recentemente disponível na corrente sanguínea pode ser captada e usada por tecidos dependentes de insulina. Proteínas de fusão da invenção contendo glucagon podem encontrar uso particular no aumento dos níveis de glicose no sangue em indivíduos com reservas de glicogênio hepático esgotadas e manutenção da homeostase de glicose em diabetes. O glucagon foi clonado, conforme divulgado na Pat. U.S. N° 4.826.763.
[00200] "GLP-1" significa peptídeo-1 semelhante ao glucagon humano e variantes de sequência do mesmo tendo pelo menos uma parte da atividade biológica do GLP-1 maduro. O termo "GLP-1" inclui GLP-1(1-37), GLP-1(7-37) e GLP-1(7-36)amida humanos. O GLP-1 estimula a secreção de insulina, mas apenas durante períodos de hiperglicemia. A segurança do GLP-1, comparado com a insulina, é intensificada por essa propriedade e pela observação de que a quantidade de insulina secretada é proporcional à magnitude da hiperglicemia. A meia-vida biológica do GLP-1 (7-37)OH é de meros 3 a 5 minutos (Pat. U.S. N° 5.118.666). Proteínas de fusão da invenção contendo GLP-1 podem encontrar uso particular no tratamento de diabetes e distúrbios de resistência à insulina para regulação de glicose. O GLP-1 foi clonado e derivado preparado, conforme descrito na Pat. U.S. N° 5.118.666. Exemplos não limitativos de sequências de GLP-1 de uma ampla variedade de espécies são mostrados na Tabela 4, enquanto que a Tabela 5 mostra as sequências de uma série de análogos sintéticos de GLP-1; todos os quais são considerados para uso nas composições de BPXTEN descritas aqui. Tabela 4: Homólogos Naturais de GLP-1
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[00201] Sequências nativas de GLP podem ser descritas por vários motivos de sequência, os quais são apresentados abaixo. As letras entre colchetes representam aminoácidos aceitáveis em cada posição na sequência: [HVY] [AGISTV] [DEHQ] [AG] [ILMPSTV] [FLY] [DINST] [ADEKNST] [ADENSTV] [LMVY] [ANRSTY] [EHIKNQRST] [AHILMQVY] [LMRT] [ADEGKQS] [ADEGKNQSY] [AEIKLMQR] [AKQRSVY] [AILMQSTV] [GKQR] [DEKLQR] [FHLVWY] [ILV] [ADEGHIKNQRST] [ADEGNRSTW] [GILVW] [AIKLMQSV] [ADGIKNQRST] [GKRSY]. Além disso, análogos sintéticos de GLP-1 podem ser úteis como parceiros de fusão ao XTEN para criar uma BPXTEN com atividade biológica útil no tratamento de distúrbios relacionados à glicose. Outras sequências homólogas à exendina-4 ou GLP-1 podem ser encontradas por meio de técnicas padrão de busca por homologia. Tabela 5: Análogos Sintéticos de GLP-1
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[00202] "GLP-2" significa peptídeo-2 semelhante ao glucagon humano e variantes de sequência do mesmo tendo pelo menos uma parte da atividade biológica do GLP-2 maduro. Mais particularmente, o GLP-2 é um peptídeo de 33 aminoácidos, cossecretado com GLP-1 das células endócrinas intestinais no intestino delgado e grosso.
[00203] "IGF-1" ou "fator 1 de crescimento semelhante à insulina" significa a proteína IGF-1 humana e espécies e variantes de sequência da mesma tendo pelo menos uma parte da atividade biológica do IGF-1 maduro. O IGF-1, o qual foi uma vez denominado somatomedina C, é um hormônio de proteína polipeptídica anabólico similar, quanto à estrutura molecular, à insulina e que modula a ação do hormônio de crescimento. O IGF-1 consiste em 70 aminoácidos e é produzido primariamente pelo fígado como um hormônio endócrino, bem como em tecidos alvo de um modo parácrino/autócrino. Proteínas de fusão da invenção contendo IGF-1 podem encontrar uso particular no tratamento de diabetes e distúrbios de resistência à insulina para regulação de glicose. O IGF-1 foi clonado e expresso em E. coli e levedura, conforme descrito na Patente dos Estados Unidos N° 5.324.639.
[00204] "IGF-2" ou "fator 2 de crescimento semelhante à insulina" significa a proteína IGF-2 humana e espécies e variantes de sequência da mesma tendo pelo menos uma parte da atividade biológica do IGF-2 humano. O IGF-2 é um hormônio de proteína polipeptídica similar, quanto à estrutura molecular, à insulina, com um papel primário como um hormônio de promoção de crescimento durante gestação. O IGF-2 foi clonado, conforme descrito em Bell, G.I. et al. Isolation of the Human Insulin-like Growth Factor Genes: Insulin-Like Growth Factor II and Insulin Genes Are Contiguous. Proc Natl Acad Sci U S A. 1985, 82(19): 6450-4.
[00205] "INGAP" ou "proteína associada à neogênese de ilhota" ou "fator de crescimento de beta célula pancreática" significa o peptídeo de INGAP humano e espécies e variantes de sequência do mesmo tendo pelo menos uma parte da atividade biológica da INGAP madura. A INGAP é capaz de iniciar a proliferação de duto celular, um pré-requisito para a neogênese de ilhota. Proteínas de fusão da invenção contendo INGAP podem encontrar uso particular no tratamento ou prevenção de diabetes e distúrbios de resistência à insulina. A INGAP foi clonada e expressa, conforme descrito em Rafaeloff, R. et al., Cloning and Sequencing of the Pancreatic Islet Neogenesis Associated Protein (INGAP) Gene and Their Expression in Islet Neogenesis in Hamsters. J Clin Invest. 1997, 99(9): 2100-2109.
[00206] "Intermedina" ou "AFP-6" significa o peptídeo de intermedina humana e espécies e variantes de sequência do mesmo tendo pelo menos uma parte da atividade biológica da intermedina madura. A intermedina é um ligante para o receptor semelhante ao receptor de calcitonina. Tratamento com intermedina leva a uma redução da pressão sanguínea em indivíduos normais e hipertensos, bem como à supressão de atividade de esvaziamento gástrico e está envolvido em homeostase de glicose. Proteínas de fusão da invenção contendo intermedina podem encontrar uso particular no tratamento de diabetes, distúrbios de resistência à insulina e obesidade. Peptídeos e variantes de intermedina foram clonados, conforme descrito na Pat. U.S. N° 6.965.013.
[00207] "Leptina" significa leptina que ocorre naturalmente de qualquer espécie, bem como D-isoformas biologicamente ativas ou fragmentos e variantes de sequência dos mesmos. A leptina exerce um papel chave na regulação de energia e gasto de energia, incluindo apetite e metabolismo. Proteínas de fusão da invenção contendo leptina podem encontrar uso particular no tratamento de diabetes para regulação de glicose, distúrbios de resistência à insulina e obesidade. A leptina é o produto polipeptídico do gene ob, conforme descrito na Pub. de Patente Internacional N° WO 96/05309. A leptina foi clonada, conforme descrito em na Pat. U.S. N° 7.112.659 e análogos e fragmentos de leptina na Pat. U.S. N° 5.521.283, Pat. U.S. N° 5.532.336, PCT/US96/22308 e PCT/US96/01471.
[00208] "Neuromedina" significa a família de peptídeos de neuromedina, incluindo peptídeos de neuromedina U e S e variantes de sequência dos mesmos. O hormônio peptídico neuromedina U humana ativa nativo é neuromedina-U25, particularmente sua forma de amida. De interesse particular são seus hormônios peptídicos ativos processados e análogos, derivados e fragmentos dos mesmos. Incluídos na família de neuromedina U são diversas variantes truncadas ou com junção, por exemplo, FLFHYSKTQKLGKSNVVEELQSPFASQSRGYFLFRPRN (SEQ ID NO: 180). Exemplificativa da família de neuromedina S é a neuromedina S humana com a sequência ILQRGSGTAAVDFTKKDHTATWGRPFFLFRPRN (SEQ ID NO: 181), particularmente sua forma de amida. Proteínas de fusão contendo neuromedina da invenção podem encontrar uso particular no tratamento de obesidade, diabetes, redução da ingestão de alimento e outras condições e distúrbios relacionados conforme descrito aqui. De interesse particular são módulos de neuromedina combinados com um peptídeo da família amilina, um peptídeo da família exendina ou um módulo da família dos peptídeos de GLP 1.
[00209] "Oxintomodulina" ou "OXM" significa oxintomodulina humana e espécies e variantes de sequência da mesma tendo pelo menos uma parte da atividade biológica da OXM madura. A OXM é um peptídeo de 37 aminoácidos produzido no cólon que contém a sequência do glucagon de 29 aminoácidos, seguido por uma extensão carbóxi-terminal de 8 aminoácidos. Descobriu-se que a OXM suprime o apetite. Proteínas de fusão da invenção contendo OXM podem encontrar uso particular no tratamento de diabetes para regulação de glicose, distúrbios de resistência à insulina, obesidade e podem ser usadas como um tratamento para perda de peso.
[00210] "PYY" significa polipeptídeo do peptídeo YY e espécies e variantes de sequência do mesmo tendo pelo menos uma parte da atividade biológica do PYY maduro. PYY inclui o peptídeo de 36 aminoácidos humano de comprimento total, PYY1_36 e PYY3_36, o qual tem um motivo estrutural duplo PP. O PYY inibe a motilidade gástrica e aumenta a absorção de água e eletrólito no cólon. PYY também pode suprimir a secreção pancreática. Proteínas de fusão da invenção contendo PPY podem encontrar uso particular no tratamento de diabetes para a regulação de glicose, distúrbios de resistência à insulina e obesidade. Análogos de PYY foram preparados, conforme descrito nas Pats. U.S. Nos 5.604.203, 5.574.010 e 7.166.575.
[00211] "Urocortina" significa um hormônio peptídico urocortina humano e variantes de sequência do mesmo tendo pelo menos uma parte da atividade biológica da urocortina. Existem três urocortinas humanas: Ucn-1, Ucn-2 e Ucn-3. Outras urocortinas e análogos foram descritos na Pat. U.S. N° 6.214.797. Urocortinas Ucn-2 e Ucn-3 têm propriedades de supressão da ingestão de alimento, anti-hipertensivas, cardioprotetoras e inotrópicas. Ucn-2 e Ucn-3 têm a capacidade de suprimir a ativação crônica de HPA após um estímulo estressante, tal como dieta/jejum e são específicas para o receptor CRF do tipo 2 e não ativam CRF-R1, o qual media a liberação de ACTH. BPXTEN compreendendo urocortina, por exemplo, Ucn-2 ou Ucn-3, pode ser útil para vasodilatação e, assim, para usos cardiovasculares, tal como insuficiência cardíaca crônica. Proteínas de fusão da invenção contendo urocortina também encontram uso particular no tratamento ou prevenção de condições associadas à estimulação da liberação de ACTH, hipertensão em virtude de efeitos de vasodilatação, inflamação mediada por outras vias que não elevação de ACTH, hipertermia, distúrbio do apetite, insuficiência cardíaca congestiva, estresse, ansiedade e psoríase. Proteínas de fusão contendo urocortina também podem ser combinadas com um módulo peptídico natriurético, um módulo da família amilina e da família exendina ou da família GLP 1 para conferir um benefício cardiovascular intensificado, por exemplo, tratamento de CHF, bem como conferir um efeito de vasodilatação benéfico.
(b) Doenças Metabólicas e Proteínas Cardiovasculares
[00212] Doenças metabólicas e cardiovasculares representam uma carga substancial para a saúde pública na maioria das nações desenvolvidas, com doenças cardiovasculares permanecendo a causa número um de morte e incapacidade nos Estados Unidos e na maioria dos países Europeus. Doenças e distúrbios metabólicos incluem uma grande variedade de condições que afetam os órgãos, tecidos e sistema circulatório do corpo. Principal dentre essas é o diabetes, uma das causadas principais de morte nos Estados Unidos, uma vez que ele resulta em patologia e disfunção metabólica na vasculatura, sistema nervoso central, principais órgãos e tecidos periféricos. Resistência à insulina e hiperinsulinemia também foram relacionadas a dois outros distúrbios metabólicos que impõem riscos consideráveis para a saúde: tolerância deficiente à glicose e obesidade metabólica. A tolerância deficiente à glicose é caracterizada por níveis normais de glicose antes de comer, com uma tendência a níveis elevados (hiperglicemia) após uma refeição. Esses indivíduos são considerados como estando em risco maior de diabetes e doença da artéria coronária. A obesidade é também um fator de risco para o grupo de condições denominado síndrome de resistência à insulina ou "Síndrome X," assim como a hipertensão, doença da artéria coronária (arteriosclerose) e acidose láctica, bem como estados doentios relacionados. Acredita-se que a patogênese de obesidade seja multifatorial, mas um problema subjacente é que, no obeso, a disponibilidade de nutriente e gasto de energia estão em equilíbrio, até que haja tecido adiposo em excesso.
[00213] Dislipidemia é uma ocorrência frequente entre diabéticos e indivíduos com doença cardiovascular, tipicamente caracterizada por parâmetros tais como triglicerídeos elevados no plasma, baixo HDL (High Density Lipoprotein - lipoproteína de alta densidade) colesterol, níveis normais a elevados de LDL (Low Density Lipoprotein - lipoproteína de baixa densidade) colesterol e níveis aumentados de pequenas partículas densas de LDL no sangue. A dislipidemia e hipertensão são um principal contribuinte para uma incidência aumentada de eventos coronarianos, doença renal e morte entre indivíduos com doenças metabólicas, tais como diabetes e doença cardiovascular.
[00214] Doença cardiovascular pode se manifestar por muitos distúrbios, sintomas e alterações em parâmetros clínicos envolvendo o coração, vasculatura e sistemas de órgãos por todo o corpo, incluindo aneurismas, angina, aterosclerose, acidente cerebrovascular (derrame), doença cerebrovascular, insuficiência cardíaca congestiva, doença da artéria coronária, infarto do miocárdio, débito cardíaco reduzido e doença vascular periférica, hipertensão, hipotensão, marcadores sanguíneos (por exemplo, proteína C reativa, BNP e enzimas, tais como CPK, LDH, SGPT, SGOT), dentre outros.
[00215] A maioria dos processos metabólicos e muitos parâmetros cardiovasculares são regulados por múltiplos peptídeos e hormônios ("proteínas metabólicas") e muitos de tais peptídeos e hormônios, bem como análogos dos mesmos, têm encontrado utilidade no tratamento de tais doenças e distúrbios. Contudo, o uso de peptídeos e/ou hormônios terapêuticos, mesmo quando aumentado pelo uso de fármacos de pequena molécula, tem obtido sucesso limitado no tratamento de tais doenças e distúrbios. Em particular, otimização de dose é importante para fármacos e produtos biológicos usados no tratamento de doenças metabólicas, especialmente aquelas com janela terapêutica estreita. Hormônios em geral e peptídeos envolvidos em homeostase de glicose têm, frequentemente, uma janela terapêutica estreita. A janela terapêutica estreita, associada ao fato de que tais hormônios e peptídeos têm, tipicamente, uma meia-vida curta, a qual requer dosagem frequente de forma a obter um benefício clínico, resulta em dificuldades no tratamento de tais pacientes. Portanto, permanece uma necessidade por produtos terapêuticos com eficácia e segurança aumentadas no tratamento de doenças metabólicas.
[00216] Assim, um aspecto da presente invenção é a incorporação de proteína metabólicas biologicamente ativas e envolvidas ou usadas no tratamento de doenças e distúrbios metabólicos e cardiovasculares em proteínas de fusão BPXTEN para criar composições com utilidade no tratamento de tais distúrbios, doenças e condições relacionadas. As proteínas metabólicas podem incluir qualquer proteína de interesse ou função biológica, terapêutica ou profilática que é útil na prevenção, tratamento, mediação ou alívio de uma doença, distúrbio ou condição metabólica ou cardiovascular. A Tabela 6 fornece uma lista não limitativa de tais sequências de BPs metabólicas que são abrangidas pelas proteínas de fusão BPXTEN da invenção. Proteínas metabólicas das composições de BPXTEN da invenção podem ser uma proteína que exibe pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência ou, alternativamente, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência a uma sequência de proteína selecionada da Tabela 6. Tabela 6: Proteínas biologicamente ativas para distúrbios metabólicos e cardiologia
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[00217] "Anti-CD3" significa o anticorpo monoclonal contra a proteína na superfície de células T CD3, espécies e variantes de sequência e fragmentos do mesmo, incluindo OKT3 (também denominado muromonab) e anticorpo monoclonal anti-CD3 humanizado (hOKT31 (Ala-Ala))(KC Herold et al., New England Journal of Medicine 346: 16921698. 2002). Anticorpos anti-CD3 impedem a ativação e proliferação de células T por meio da ligação do complexo receptor de células T presente sobre todas as células T diferenciadas. Proteínas de fusão da invenção contendo anti-CD3 podem encontrar uso particular para diminuir o diabetes do Tipo 1 de início recente lento, incluindo o uso de anti-CD3 como um efetuador terapêutico, bem como porção de objetivação para uma segunda BP terapêutica em uma composição de BPXTEN. As sequências para a região variável e a criação de anti-CD3 foram descritas nas Patentes U.S. Nos 5.885.573 e 6.491.916.
[00218] "IL-1ra" significa a proteína antagonista de receptor de IL-1 humana e espécies e variantes de sequência da mesma, incluindo a variante de sequência anakinra (Kineret®), tendo pelo menos uma parte da atividade biológica da IL-1ra madura. IL-1ra humana é uma glicoproteína madura de 152 resíduos de aminoácido. A ação inibitória da IL-1ra resulta de sua ligação ao receptor de IL-1 do tipo I. A proteína tem um peso molecular nativo de 25 kDa e a molécula mostra homologia de sequência limitada à IL-1α (19%) e IL-1β (26%). Anakinra é uma IL- 1ra humana recombinante, não glicosilada e difere da IL-1ra endógena pela adição de uma metionina N-terminal. Uma versão comercializada da anakinra é comercializada como Kineret®. Ela se liga com a mesma avidez ao receptor de IL-1 que a IL-1ra e IL-1β nativa, mas não resulta em ativação de receptor (transdução de sinal), um efeito atribuído à presença de apenas um motivo de ligação a receptor sobre a IL-1ra versus dois de tais motivos sobre IL-1α e IL-1β. Anakinra tem 153 aminoácidos e um tamanho de 17,3 kD e tem uma meia-vida reportada de aproximadamente 4-6 horas.
[00219] Produção aumentada de IL-1 foi reportada em pacientes em várias infecções virais, bacterianas, fúngicas e parasíticas; coagulação intravascular; terapia com alta dose de IL-2; tumores sólidos; leucemias; mal de Alzheimer; infecção pelo HIV-1; distúrbios autoimunes; trauma (cirurgia); hemodiálise; doenças isquêmicas (infarto do miocárdio); hepatite não infecciosa; asma; radiação UV; trauma fechado na cabeça; pancreatite; peritonite; doença enxerto-versus-hospedeiro; rejeição a transplante; e em indivíduos saudáveis após exercício extenuante. Há uma associação da produção aumentada de IL-1b em pacientes com mal de Alzheimer e um possível papel para IL-1 na liberação da proteína precursora amiloide. IL-1 foi também associada à doenças tais como diabetes do tipo 2, obesidade, hiperglicemia, hiperinsulinemia, diabetes do tipo 1, resistência à insulina, processos neurodegenerativos retinais, estados doentios e condições caracterizadas por resistência à insulina, infarto agudo do miocárdio (Acute Myocardial Infarction - AMI), síndrome coronariana aguda (Acute Coronary Syndrome - ACS), aterosclerose, distúrbios inflamatórios crônicos, artrite reumatoide, doença degenerativa do disco intervertebral, sarcoidose, doença de Crohn, colite ulcerativa, diabetes gestacional, apetite excessivo, saciedade insuficiente, distúrbios metabólicos, glucagonomas, distúrbios secretórios das vias aéreas, osteoporose, doença do sistema nervoso central, restenose, doença neurodegenerativa, insuficiência renal, insuficiência cardíaca congestiva, síndrome nefrótica, cirrose, edema pulmonar, hipertensão, distúrbios nos quais redução da ingestão de alimento é desejada, síndrome do intestino irritável, infarto do miocárdio, derrame, alterações catabólicas pós-cirúrgicas, miocárdio em hibernação, cardiomiopatia diabética, excreção insuficiente de sódio na urina, concentração excessiva de potássio na urina, condições ou distúrbios associados à hipervolemia tóxica, síndrome do ovário policístico, dificuldade respiratória, úlceras crônicas da pele, nefropatia, disfunção sistólica ventricular esquerda, diarreia gastrointestinal, síndrome de "Dumping" pós-operatória, síndrome do intestino irritável, polineuropatia por enfermidade crítica (Critical Illness Polyneuropathy - CIPN), síndrome de resposta inflamatória sistêmica (Systemic Inflammatory Response Syndrome - SIRS), dislipidemia, lesão por reperfusão após isquemia e síndrome de fator de risco por doença cardíaca coronariana (Coronary Heart Disease Risk Factor - CHDRF) síndrome. Proteínas de fusão da invenção contendo IL-1ra podem encontrar uso particular no tratamento de qualquer uma das doenças e distúrbios precedentes. IL-1ra foi clonada, conforme descrito nas Patentes. U.S. Nos 5.075.222 e 6.858.409.
[00220] "Peptídeos natriuréticos" significa peptídeo natriurético atrial (ANP), peptídeo natriurético cerebral (BNP ou peptídeo natriurético do tipo B) e peptídeo natriurético do tipo C (CNP); espécies humanas e não humanas e variantes de sequência dos mesmos tendo pelo menos uma parte da atividade biológica dos peptídeos natriuréticos contra-parte maduros. Peptídeo natriurético alfa atrial (aANP) ou (ANP) e peptídeo natriurético cerebral (BNP) e peptídeo natriurético do tipo C (CNP) são hormônios polipeptídeos homólogos envolvidos na regulação de homeostase de fluido e eletrólitos. Sequências de formas úteis de peptídeos natriuréticos são divulgadas na Publicação de Patente U.S. 20010027181. Exemplos de ANPs incluem ANP humano (Kangawa et al., BBRC 118: 131 (1984)) ou aquele de várias espécies, incluindo ANP de porco e rato (Kangawa et al., BBRC 121: 585 (1984)). Análise de sequência revela que pré-pró-BNP consiste em 134 resíduos e é clivada em uma ProBNP de 108 aminoácidos. Clivagem de uma sequência de 32 aminoácidos a partir da extremidade C-terminal da ProBNP resulta em BNP (77-108) humana, a qual é a forma fisiologicamente ativa em circulação. A BNP humana de 32 aminoácidos envolve a formação de uma ligação de dissulfeto (Sudoh et al., BBRC 159: 1420 (1989)) e Pats. U.S. Nos. 5.114.923, 5.674.710, 5.674.710 e 5.948.761. BPXTEN contendo uma ou mais funções natriuréticas podem ser úteis no tratamento de hipertensão, indução de diurese, indução de natriurese, dilatação ou relaxamento do conduto vascular, ligação a receptores de peptídeo natriurético (tal como NPR-A), supressão de secreção de ácido dos rins, supressão de secreção de aldosterona da glândula adrenal, tratamento de doenças e distúrbios cardiovasculares, redução, término e reversão de remodelamento cardíaco após um evento cardíaco ou como um resultado de insuficiência cardíaca congestiva, tratamento de doenças e distúrbios renais; tratamento ou prevenção de derrame isquêmico e tratamento de asma.
[00221] "FGF-2" ou fator 2 de crescimento de ligação à heparina significa a proteína FGF-2 humana e variantes de sequência da mesma tendo pelo menos uma parte da atividade biológica da contraparte madura. Foi mostrado que o FGF-2 estimula a proliferação de células tronco neurais diferenciadas em neurônios semelhantes aos estriatais e protege os neurônios estriatais em modelos de doença de Huntington induzida por toxina e também podem ter utilidade no tratamento de lesão por reperfusão cardíaca e pode ter propriedades de crescimento de células endoteliais, antiangiogênica e supressiva de tumor, cicatrização de feridas, bem como promoção de cicatrização de fraturas em ossos. O FGF-2 foi clonado, conforme descrito em Burgess, W. H. e Maciag, T., Ann. Rev. Biochem., 58: 575-606 (1989); Coulier, F. et al., 1994, Prog. Growth Factor Res. 5: 1; e a Publicação PCT WO 87/01728.
[00222] "Receptor de TNF" significa o receptor para TNF e espécies e variantes de sequência do mesmo tendo pelo menos uma parte da atividade biológica do receptor maduro, TNFR. A molécula P75 receptora de TNF é o domínio extracelular do receptor de TNF p75, o qual é de uma família de receptores estruturalmente homólogos a qual inclui o receptor de TNF p55. TNF α e TNF β (ligantes de TNF) competem pela ligação aos receptores de TNF p55 e p75. A estrutura de cristal por raio X do complexo formado pelo domínio extracelular do receptor de TNF humano p55 e TNF β foi determinada (Banner et al. Cell 73: 431, 1993, incorporado aqui por referência).
(c) Fatores de coagulação
[00223] Em hemofilia, a coagulação sanguínea é alterada por uma falta de determinados fatores plasmáticos de coagulação sanguínea. Fator IX humano (FIX) é um zimogênio de uma protease de serina que é um componente importante da via intrínseca da cascata de coagulação sanguínea. Em indivíduos que não têm deficiência de FIX, a meia-vida média do FIX é curta; aproximadamente 18-24 horas. Uma deficiência de FIX funcional, em virtude de um distúrbio X-relacionado que ocorre em cerca de um em 30.000 homens, resulta em hemofilia B, também conhecida como doença de Christmas. Mais de 100 mutações do fator IX foram descritas; algumas não causam sintomas, mas muitas levam a um distúrbio de sangramento significativo. Quando não tratada, a hemofilia B está associada a um sangramento descontrolado nos músculos, articulações e cavidades corporais após ferimento e pode resultar em morte. Anteriormente, tratamentos para a doença incluíam administração de FIX preparado a partir de plasma humano derivado de reservas de doadores, o que trazia riscos associados de infecção por vírus trazidos no sangue, incluindo vírus da imunodeficiência humana (Human Immunodeficiency Virus - HIV) e vírus da hepatite C (Hepatitis C Virus - HCV). Mais recentemente, produtos de FIX recombinantes se tornaram comercialmente disponíveis. A atividade in vivo de fator IX exogenamente fornecido é limitada pela meia-vida da proteína e inibidores de coagulação, incluindo antitrombina III. Composições de Fator IX têm, tipicamente, meia-vida curta, requerendo injeções frequentes. Também, produtos terapêuticos baseados em FIX atuais requerem administração intravenosa em virtude da pobre biodisponibilidade. Assim, há uma necessidade por composições de fator IX com meia-vida prolongada e retenção de atividade quando administradas como parte de um regime de tratamento preventivo e/ou terapêutico para hemofilia B.
[00224] O disparo fisiológico de coagulação é a formação de um complexo entre Fator Tecidual (Tissue Factor - TF) e Fator VIIa (FVIIa) sobre a superfície de células expressando TF, as quais estão normalmente localizadas fora da vasculatura. Isso leva à ativação de Fator IX e Fator X, por fim, gerando alguma trombina. Por sua vez, a trombina ativa o Fator VIII e Fator IX, o assim denominado braço "intrínseco" da cascata de coagulação sanguínea, assim, amplificando a geração de Fator Xa, o qual é necessário para a geração de explosão total de trombina para obter hemóstase completa. Subsequentemente, foi mostrado que, mediante a administração de altas concentrações de Fator VIIa, a hemostase pode ser obtida, superando a necessidade de Fator VIIIa e Fator IXa em determinados distúrbios de sangramento. Distúrbios de coagulação e sangramento podem resultar em alterações em parâmetros tais como tempo de pró-trombina, tempo parcial de pró- trombina, tempo de sangramento, tempo de coagulação, contagem de plaquetas, fragmento 1+2 de pró-trombina (F1+2), complexo de trombina-antitrombina III (TAT), dímero D, incidência de episódios de sangramento, taxa de sedimentação de eritrócito (Erythrocyte Sedimentation Rate - ESR), proteína C reativa e concentração sanguínea de fatores de coagulação.
[00225] Assim, proteínas Fator VIIa (FVIIa) têm encontrado utilidade para o tratamento de episódios de sangramento em pacientes com hemofilia A ou B como inibidores ao FVIII ou FIX e em pacientes com hemofilia adquirida, bem como prevenção de sangramento em intervenções cirúrgicas ou procedimentos invasivos em pacientes com hemofilia A ou B com inibidores ao FVIII ou FIX. Além disso, fator VIIa pode ser utilizado no tratamento de episódios de sangramento em pacientes com deficiência de Fator VII congênito e prevenção de sangramento em intervenções cirúrgicas ou procedimentos invasivos em pacientes com deficiência de FVII congênito. Contudo, a administração intravenosa de produtos contendo FVIIa pode levar a efeitos colaterais, incluindo eventos trombóticos, febre e reações no local de injeção. Além disso, a meia-vida curta do Fator VIIa de aproximadamente 2 horas, limita sua aplicação e pode requerer injeções repetidas a cada 2-4 horas para obter hemostase. Assim, permanece uma necessidade por composições de fator IX e fator VIIa com meia- vida prolongada e retenção de atividade quando administradas como parte de um regime preventivo e/ou terapêutico para hemofilia B, bem como formulações que reduzem efeitos colaterais e podem ser administradas através da vias intravenosa e subcutânea.
[00226] Os fatores de coagulação para inclusão em uma BPXTEN da invenção podem incluir proteínas de interesse ou função biológica, terapêutica ou profilática que são úteis para a prevenção, tratamento, mediação ou alívio de distúrbios, doenças ou deficiências de coagulação sanguínea. Proteínas de coagulação adequadas incluem polipeptídeos biologicamente ativos que estão envolvidos na cascata de coagulação como substratos, enzimas ou co-fatores.
[00227] A Tabela 7 fornece uma lista não limitativa de sequências de fatores de coagulação que são abrangidas pelas proteínas de fusão BPXTEN da invenção. Fatores de coagulação para inclusão em uma BPXTEN da invenção podem ser uma proteína que exibe pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência ou, alternativamente, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência a uma sequência de proteína selecionada da Tabela 7. Tabela 7: Sequências polipeptídicas de fator de coagulação
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[00228] "Fator IX" ("FIX") inclui a proteína Fator IX humana e espécies e variantes de sequência do mesmo tendo pelo menos uma parte da atividade biológica do receptor de Fator IX maduro. FIX será qualquer forma de molécula de fator IX com as características típicas do fator de coagulação sanguínea IX. FIX incluirá FIX do plasma e qualquer forma de FIX recombinante a qual é capaz de curar distúrbios de sangramento em um paciente; por exemplo, causados por deficiência no FIX (por exemplo, hemofilia B). Em algumas modalidades, o peptídeo de FIX é um análogo estrutural ou mimético peptídico de qualquer um dos peptídeos de FIX descritos aqui, incluindo as sequências da Tabela 7. Deleções, adições e/ou substituições mínimas de aminoácidos da sequência polipeptídica de FIX que não elimina, a atividade biológica do polipeptídeo (isto é, reduzem a atividade para abaixo de 10% ou mesmo abaixo de 5% da forma do tipo silvestre (=100%)) são também incluídos no presente pedido como derivados biologicamente ativos, especialmente aqueles com atividade específica aprimorada (atividade acima de 100% da forma do tipo silvestre). O FIX de acordo com a presente invenção pode ser derivado de qualquer vertebrado, por exemplo, um mamífero.
[00229] Em algumas modalidades, o peptídeo de FIX é um análogo estrutural ou mimético peptídico de qualquer um dos peptídeos de FIX descritos aqui, incluindo as sequências da Tabela 7. Deleções, adições e/ou substituições mínimas de aminoácidos da sequência polipeptídica de FIX que não eliminam a atividade biológica do polipeptídeo (isto é, redução de atividade para abaixo de 10% ou mesmo abaixo de 5% da forma do tipo silvestre (=100%)) são também incluídos no presente pedido como derivados biologicamente ativos, especialmente aqueles com atividade específica aprimorada (atividade acima de 100% da forma do tipo silvestre). O FIX de acordo com presente invenção pode ser derivado de qualquer vertebrado, por exemplo, um mamífero. Em um exemplo específico da presente invenção, o FIX é FIX humano. Em outra modalidade, o FIX é uma sequência polipeptídica da Tabela 7.
[00230] Fator IX (FIX) humano é codificado por um gene de cópia única que reside sobre o cromossomo X em q27.1. O mRNA de FIX humano é composto de 205 bases para a região não traduzida 5', 1383 bases para o pré-pró fator IX, um códon terminal e 1392 bases para a região 3' não traduzida. O polipeptídeo de FIX tem 55 kDa, sintetizado como uma cadeia de pré-pró-polipeptídeo composta de três regiões: um peptídeo sinalizador de 28 aminoácidos, um pró-peptídeo de 18 aminoácidos, o qual é requerido para gama-carboxilação de resíduos de ácido glutâmico e um fator IX maduro de 415 aminoácidos. O fator IX maduro é composto de domínios. Os domínios, em uma configuração do N- para o C-término, são domínio G1a, um domínio EGF 1, um domínio EGF2, um domínio de peptídeo de ativação e um domínio de protease (ou catalítico). O domínio de protease proporciona, quando de ativação de FIX em FIXa, a atividade catalítica de FIX. Após ativação, o FIX com uma única cadeia se torna uma molécula com 2 cadeias na qual as duas cadeias são ligadas por uma ligação de dissulfeto que prende a enzima ao domínio G1a. Fator VIII ativado (FVIIIa) é o co-fator específico para a expressão total de atividade do FIXa. Conforme usado aqui "fator IX" e "FIX" se destinam a abranger polipeptídeos que compreendem os domínios G1a, EGF1, EGF2, peptídeo de ativação e protease ou sinônimos desses domínios conhecidos na técnica.
[00231] FIX é expresso como um polipeptídeo precursor que requer processamento pós-traducional para proporcionar o FIX ativo. Em particular, o polipeptídeo precursor de FIX requer gama carboxilação de determinados resíduos de ácido glutâmico no assim denominado domínio de gama-carbooxiglutamato e clivagem do pró-peptídeo. O pró- peptídeo é uma sequência de 18 resíduos de aminoácido N-terminal ao domínio de gama-carboxiglutamato. O pró-peptídeo se liga à gama carboxilase dependente de vitamina K e é, então, clivado a partir do polipeptídeo precursor de FIX por uma protease endógena, mais provavelmente PACE (enzima de clivagem de aminoácido emparelhada básica - Paired Basic Aminoácido Cleaving Enzyme), também conhecida como furina ou PCSK3. Sem a gama carboxilação, o domínio G1a é incapaz de se ligar ao cálcio para assumir a conformação correta necessária para ancorar a proteína à superfícies fosfolipídicas negativamente carregadas, tornando o Fator IX não funcional. Mesmo se ele é carboxilado, o domínio G1a também depende de clivagem do pró-peptídeo para função apropriada, uma vez que o pró-peptídeo retido interfere com as alterações conformacionais do domínio G1a necessárias para ligação ótima ao cálcio e fosfolipídio. O Fator IX maduro resultante é uma proteína de cadeia única de 415 resíduos de aminoácido que contém aproximadamente 17% em peso de carboidrato (Schmidt, A. E. et al. (2003) Trends Cardiovasc Med, 13: 39).
[00232] FIX maduro deve ser ativado pelo Fator XI ativado para proporcionar Fator IXa. Na via intrínseca a cascata de coagulação, o FIX se associa com um complexo de Fator VIII ativado, Fator X, cálcio e fosfolipídio. No complexo, FIX é ativado pelo Fator XIa. A ativação de Fator IX é obtida através de uma remoção em duas etapas do peptídeo de ativação (Ala 146 -Arg 180) da molécula (Bajaj et al.,"Human factor IX and factor IXa," em METHODS IN ENZYMOLOGY. 1993). A primeira clivagem é feita no sítio Arg 145 -Ala 146 pelo Fator XIa ou Fator VIIa/fator tecidual. A segunda e clivagem limitativa de taxa é feita em Arg 180 -Val 181. A ativação remove 35 resíduos. Fator IX humano ativado existe como um heterodímero dissulfeto ligado da cadeia pesada e cadeia leve. Fator IXa, por sua vez, ativa o Fator X em conjunto com Fator VIII ativado. Alternativamente, Fatores IX e X podem ambos ser ativados pelo Fator VIIa em complexo com Fator Tecidual ativado, gerado através da via extrínseca. Fator Xa, então, participa na via em comum final pela qual a protrombina é convertida em trombina e a trombina, por sua vez, converte fibrinogênio em fibrina para formar o coágulo.
[00233] Em alguns casos, o fator de coagulação é Fator IX, uma variante de sequência de Fator IX ou uma porção de Fator IX, tal como as sequências exemplificativas da Tabela 7, bem como qualquer proteína ou polipeptídeo substancialmente homólogo aos mesmos cujas propriedades biológicas resultam na atividade de Fator IX. Conforme usado aqui, o termo "porção de Fator IX" inclui proteínas deliberadamente modificadas, como por exemplo, através de mutagênese sítio dirigida ou acidentalmente através de mutações que resultam em uma sequência de fator IX que retém pelo menos um pouco da atividade de fator IX. O termo "porção de Fator IX" também inclui derivados tendo pelo menos um aminoácido adicional nas extremidades N- ou carbóxi terminais da proteína ou interno à sequência da porção de Fator IX. Exemplos não limitativos de porções de Fator IX incluem os seguintes: Fator IX; Fator IXa; versões truncadas de Fator IX; proteínas híbridas e miméticos peptídicos tendo atividade de Fator IX. Fragmentos biologicamente ativos, variantes com deleção, variantes com substituição ou variantes com adição de qualquer um dos precedentes que mantêm pelo menos algum grau de atividade do Fator IX ou o potencial de ativação também podem servir como sequência de Fator IX.
[00234] "Fator VII" (FVII) significa a proteína humana e espécies e variantes de sequência da mesma tendo pelo menos uma parte da atividade biológica do Fator VII ativado. O Fator VII e FVIIa humano recombinante foi introduzido para uso em sangramento descontrolado em pacientes com hemofilia (com deficiência de Fator VIII ou IX) que desenvolveram inibidores contra reposição de coagulação. Fator VII pode ser ativado pela trombina, fator IXa, fator Xa ou fator XIIa em FVIIa. FVII é convertido em sua forma ativa, Fator VIIa, através de proteólise da ligação peptídica única em Arg152-Ile153, levando à formação de duas cadeias polipeptídicas, uma cadeia leve N-terminal (24 kDa) e uma cadeia pesada C-terminal (28 kDa), as quais são mantidas juntas por uma ligação em ponte de dissulfeto. Em contraste a outros fatores de coagulação dependentes de vitamina K, nenhum peptídeo de ativação, o qual é clivado durante ativação desses outros fatores de coagulação dependentes de vitamina K, foi descrito para FVII. O sítio de clivagem Arg152-Ile153 e alguns aminoácidos a jusante mostram homologia ao sítio de clivagem de outros polipeptídeos dependentes de vitamina K. Fator VIIa humano recombinante tem utilidade no tratamento de sangramento descontrolado em pacientes com hemofilia (com deficiência de Fator VIII ou IX), incluindo aqueles que desenvolveram inibidores contra reposição de fator de coagulação. FVII será qualquer forma de molécula de fator VII com as características típicas do fator de coagulação sanguínea VII. FVII incluirá FVII a partir do plasma e qualquer forma de FVII recombinante a qual é capaz de aliviar distúrbios de sangramento em um paciente; por exemplo, causada por deficiências em FVII/FVIIa. Em algumas modalidades, o peptídeo de FVII é a forma ativada (FVIIa), um análogo estrutural ou mimético peptídico de qualquer um dos peptídeos FVII descritos aqui, incluindo sequências da Tabela 7. Fator VII e VIIA foram clonados, conforme descrito na Patente US N° 6.806.063 e Pedido de Patente US N° 20080261886.
[00235] Em um aspecto, a invenção proporciona proteínas de fusão BPXTEN de FIX monoméricas compreendendo a sequência de comprimento total ou fragmentos ativos ou variantes de sequência ou qualquer derivado biologicamente ativo de FIX, incluindo as sequências de FIX da Tabela 7, covalentemente ligadas a um XTEN, para criar uma molécula quimérica. Em alguns casos, as proteínas de fusão compreendendo um fator de coagulação, tal como FIX, ainda compreendem uma ou mais sequências de sítio de clivagem proteolítica. Em outra modalidade, a proteína de fusão compreende uma primeira e uma segunda sequência de clivagem diferentes. Em uma modalidade do precedente, a(s) sequência(s) de clivagem é (são) selecionada(s) da Tabela 10, naqueles casos onde a presença do XTEN inibe a ativação de FIX à forma ativada de FIX (aqui depois "FIXa") (por exemplo, em que o XTEN é preso ao C-término do FIX), o um ou mais sítios de clivagem proteolítica permite a liberação da sequência do XTEN quando acionada por uma protease, conforme descrito mais completamente abaixo. Em uma característica precedente, a composição de FIX-XTEN intacta serve como um profármaco e a liberação do XTEN da molécula de FIX-XTEN através de proteólise permite que a sequência do FIX liberada seja convertida em FIXa. Em uma modalidade, a uma ou mais sequências de clivagem podem ser uma sequência tendo pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência a uma sequência da Tabela 10 ou pelo menos cerca de 85% ou pelo menos cerca de 90% ou pelo menos cerca de 95% ou pelo menos cerca de 96% ou pelo menos cerca de 97% ou pelo menos cerca de 98% ou pelo menos cerca de 99% ou 100% de identidade de sequência a uma sequência da Tabela 10.
[00236] Proteínas de fusão FIX-XTEN podem ser projetadas em diferentes configurações. Em uma modalidade, conforme ilustrado na figura 37A, as proteínas de fusão compreendem componentes na seguinte ordem (N- para C- término): FIX; e XTEN, em que o XTEN pode compreender uma sequência de clivagem interna à sequência do XTEN. Em outra modalidade, conforme ilustrado na figura 37B, as proteínas de fusão compreendem componentes na seguinte ordem (N- para C- término): FIX; sequência de clivagem; e XTEN. Em alguns casos, conforme ilustrado nas figuras 37C e 37D, as proteínas de fusão compreendem componentes em que o XTEN está localizado interno ao polipeptídeo de FIX, inserido entre domínios FIX. Em uma modalidade, o N-término do XTEN é ligado ao C-término do domínio G1a do FIX e o C-término do XTEN é ligado ao N-término do domínio EGF1 do FIX, resultando em uma FIX-XTEN onde nenhuma sequência de clivagem adicional é introduzida, conforme mostrado na FIG 37C. Em outra modalidade, o N-término do XTEN é ligado ao C-término do domínio EGF1 do FIX e o C-término do XTEN é ligado ao N-término do domínio EGF2 do FIX, resultando em uma FIX-XTEN onde nenhuma sequência de clivagem adicional é introduzida, conforme mostrado na figura 37C. Em outra modalidade em que a sequência do fator IX compreende um domínio de peptídeo de ativação compreendendo uma sequência PDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDF (SEQ ID NO: 1748), os N- e C- términos da sequência do XTEN podem ser inseridos entre e ligados a quaisquer dois aminoácidos contínuos ou descontínuos da sequência do domínio de peptídeo de ativação e o XTEN compreende opcionalmente uma primeira e uma segunda sequência de clivagem, as quais podem ser idênticas ou diferentes. Em outra modalidade do precedente, o XTEN pode ser inserido entre os aminoácidos contíguos T e I da sequência precedente, em que o N-término do XTEN é ligado ao C- término do aminoácido T e o C-término do XTEN é ligado ao N- término do aminoácido I.
[00237] Em outra modalidade, conforme ilustrado na figura 37E, as proteínas de fusão compreendem duas moléculas de XTEN: uma primeira localizada entre dois domínios do FIX conforme descrito acima e um segundo XTEN, em que o N-término do XTEN é ligado ao C- término do FIX ou em que o N-término do segundo XTEN é ligado ao C- término de uma sequência de clivagem que é ligada ao C-término do FIX.
[00238] Em outros casos, conforme ilustrado na figura 37F, as proteínas de fusão FIX-XTEN compreendem componentes em que o XTEN está localizado dentro de uma sequência de um domínio de FIX, inserido como parte de um loop estrutural existente no domínio ou criação de um loop externo à estrutura do domínio. Em uma modalidade em que o FIX compreende um domínio EGF2, em que o domínio EGF2 compreende um loop KNSADNK (SEQ ID NO: 1749), a sequência do XTEN pode ser inserida entre os aminoácidos S e A da sequência do loop, em que o N-término do XTEN é ligado ao C-término de S e o C- término do XTEN é ligado ao N-término de A, resultando em uma sequência de loop com o polipeptídeo XTEN se estendendo fora da proteína de coagulação globular e, em que o XTEN pode (opcionalmente) compreender uma primeira e uma segunda sequência de clivagem, as quais podem ser idênticas ou diferentes. Em outra modalidade, o XTEN pode ser inserido entre quaisquer dois aminoácidos contíguos ou descontínuos da sequência de loop KNSADNK. Em outra modalidade, em que o FIX compreende um domínio EGF2, em que o domínio EGF2 compreende um loop LAEN, a sequência do XTEN pode ser inserida entre os aminoácidos contíguos A e E do loop LAEN, em que o N-término do XTEN é ligado ao C-término de A e o C-término do XTEN é ligado ao N-término de E, resultando em uma sequência de loop LA-XTEN-EN e o XTEN pode (opcionalmente) compreender uma primeira e uma segunda sequência de clivagem, as quais podem ser idênticas ou diferentes. Em outra modalidade, em que o FIX compreende um domínio G1a, o XTEN pode ser inserido e ligado entre dois aminoácidos contíguos da sequência de G1a, em que o XTEN forma uma estrutura de loop, em que a estrutura de loop é substancialmente externa à estrutura do G1a e o XTEN pode (opcionalmente) compreender uma primeira e uma segunda sequência de clivagem, as quais podem ser idênticas ou diferentes. Em outra modalidade em que o FIX compreende um domínio EGF 1, o XTEN pode ser inserido e ligado entre dois aminoácidos contíguos da sequência do EGF1, em que o XTEN forma uma estrutura de loop, em que a estrutura de loop é substancialmente externa à estrutura do EGF 1 e o XTEN pode (opcionalmente) compreender uma primeira e uma segunda sequência de clivagem, as quais podem ser idênticas ou diferentes.
[00239] Em outra modalidade, conforme ilustrado na figura 37G, as proteínas de fusão compreendem componentes na ordem FIX; e XTEN, em que o XTEN compreende múltiplas sequências de clivagem próximo do N- término do XTEN, de preferência dentro dos primeiros 144 resíduos de aminoácido do XTEN, mais preferivelmente dentro de cerca dos primeiros 80 aminoácidos, mais preferivelmente dentro de cerca dos primeiros 42 aminoácidos, mais preferivelmente dentro de cerca dos primeiros 18 aminoácidos e, ainda mais preferivelmente, dentro dos primeiros 12 aminoácidos do N-término da sequência do XTEN.
[00240] Em outras modalidades, a FIX-XTEN pode existir na configuração (N- para C-terminal) XTEN-FIX, alternativamente XTEN- FIX-XTEN, alternativamente XTEN-CS-FIX, alternativamente FIX- XTEN-FIX, alternativamente FIX-CS-XTEN-CS-XTEN ou multímeros dos precedentes.
[00241] Em uma modalidade, a FIX-XTEN é configurada de modo que o FIX da composição de FIX-XTEN possa ser ativado em um FIXa através de uma protease de coagulação sem a liberação de uma parte ou todo um XTEN. Em outra modalidade em que a FIX-XTEN compreende pelo menos dois XTENs, a FIX-XTEN é configurada de modo que o FIX da composição de FIX-XTEN possa ser ativado em FIXa através de uma protease de coagulação sem a liberação de um dos XTENs. Em outra modalidade em que o XTEN tem de ser liberado da FIX-XTEN antes de ativação do FIX em FIXa ou concomitante com a ativação do FIX em FIXa, as sequências de clivagem estão localizadas suficientemente próximo das extremidades do XTEN ligado à qualquer porção do FIX, de modo que qualquer XTEN ou resíduos de sequência de clivagem restantes não interfiram apreciavelmente com a ativação do FIX, ao mesmo tempo em que conferem acesso suficiente à protease para realizar clivagem da sequência de clivagem correspondente. Em uma modalidade em que um XTEN é ligado ao C-término do FIX (conforme descrito acima), o um ou mais sítios de clivagem podem estar localizados dentro de cerca dos primeiros 100 aminoácidos do N- término do XTEN, mais preferivelmente dentro dos primeiros 80 aminoácidos, mais preferivelmente dentro dos primeiros 54 aminoácidos, mais preferivelmente dentro dos primeiros 42 aminoácidos, mais preferivelmente dentro dos primeiros 30 aminoácidos, mais preferivelmente dentro dos primeiros 18 aminoácidos e, ainda mais preferivelmente, dentro dos primeiros 6 aminoácidos do N-término do XTEN. Em outra modalidade em que um XTEN é ligado interno à sequência do FIX (conforme descrito acima), entre dois domínios de FIX ou dentro de um loop externo de um domínio de FIX ou interno a uma sequência de domínio, o XTEN pode compreender duas ou mais sequências de clivagem nas quais pelo menos um sítio de clivagem pode estar localizado dentro de cerca de dos primeiros 100 aminoácidos do N-término do XTEN, dentro de 80, dentro de 54, dentro de 42, dentro de 30, dentro de 18 ou dentro de 6 aminoácidos do N-término e o XTEN pode compreender pelo menos um segundo sítio de clivagem localizado dentro dos últimos 100 aminoácidos do C-término do XTEN, dentro de 80, dentro de 54, dentro de 42, dentro de 30, dentro de 18 ou dentro de 6 aminoácidos do C- término do XTEN.
[00242] Em alguns casos, clivagem da proteína de fusão pela protease libera o XTEN da sequência do FIX em um indivíduo, de modo que a sequência do FIX possa ser subsequentemente ativada. Em outros casos, clivagem da proteína de fusão pela protease é um resultado da ação das proteases da cascata de coagulação, de modo que o XTEN seja liberado concorrentemente com o processamento e ativação de FIX ao FIXa. Assim, em uma característica particular de algumas modalidades, o XTEN e sítio(s) de clivagem associado(s) da proteína de fusão FIX-XTEN podem estar localizados de modo que a sequência do FIX não possa ser ativada até que o XTEN seja liberado da proteína de fusão através de clivagem proteolítica. Em tais modalidades, a FIX-XTEN pode ser usada como um profármaco que pode ser ativado uma vez que ela seja administrada ao indivíduo. Em uma modalidade, os polipeptídeos de FIX liberados podem conter todo ou parte de um XTEN, particularmente quando a FIX-XTEN compreende duas sequências de XTEN. Alternativamente, os polipeptídeos de FIX liberados podem ser liberados do XTEN ou substancialmente todo o XTEN.
[00243] Em outras modalidades, o sítio de clivagem é usado durante o procedimento de síntese da proteína de fusão. Por exemplo, a proteína de fusão pode ainda conter uma tag de afinidade para isolamento da proteína de fusão após produção recombinante. A protease que reconhece o sítio de clivagem na proteína de fusão pode remover a tag, ao mesmo tempo em que deixa um produto final que liga o FIX ao XTEN.
[00244] Assim, a proteína de fusão pode ter um sítio de clivagem, o qual pode ser clivado antes de injeção, após injeção (na circulação sanguínea ou tecidos por proteases) e pode estar localizado de modo que o XTEN permaneça com o produto terapêutico até que ele seja liberado por uma protease endógena, permitindo que o produto terapêutico seja ativado pela cascata de coagulação ou o XTEN seja liberado por uma protease da cascata de coagulação.
[00245] Em algumas modalidades, uma proteína de fusão de FIX é convertida de uma proteína inativa para uma proteína ativa (por exemplo, FIXa) por uma protease sítio-específica, na circulação ou dentro de um tecido ou cavidade corporal. Essa clivagem pode disparar um aumento na potência do domínio farmaceuticamente ativo (ativação de profármaco) ou pode intensificar a ligação do produto de clivagem a seu alvo. Assim, por exemplo, proteínas de FIX- XTEN podem ser clivadas no sangue de um indivíduo e a sequência do FIX pode ser ativada pela cascata de coagulação ou por outra protease divulgada aqui. A forma ativa da proteína de fusão FIX pode ou não conter pelo menos um fragmento de XTEN. Em uma característica das modalidades de profármaco de FIX-XTEN, uma maior dosagem da composição de FIX-XTEN pode ser administrada, comparado com produtos terapêuticos de FIX convencionais porque a liberação do FIX capaz de ser ativado pode ser controlada pela seleção de sequências de clivagem ou variação dos números de sítios de clivagem que requerem clivagem antes que uma forma de FIX seja liberada, a qual pode ser ativada. Conforme aqueles versados no campo apreciarão, a sequência de qualquer um dos sítios de clivagem divulgados aqui pode ser modificada introduzindo variações de aminoácido nas sequências de clivagem de forma a modificar a cinética de clivagem proteolítica, desse modo, afetando a cinética de liberação de FIX e subsequente ativação.
[00246] A invenção proporciona proteínas de fusão BPXTEN compreendendo uma proteína de coagulação e XTEN. Em alguns casos, a BPXTEN compreende uma proteína de coagulação que exibe pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência ou, alternativamente, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência a uma proteína de coagulação selecionada da Tabela 7. Em uma modalidade do precedente, a BPXTEN ainda compreende uma sequência de XTEN com pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência ou, alternativamente, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência a um XTEN selecionado da Tabela 2. Em outra modalidade, a BPXTEN compreende uma sequência com pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência ou, alternativamente, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência a uma sequência selecionada da Tabela 43. A invenção também considera a substituição de qualquer sequência de FIX da Tabela 7, qualquer XTEN da Tabela 2 e qualquer sequência de clivagem da Tabela 10 pelos respectivos componentes da Tabela 43 ou sequências com pelo menos 90% de identidade de sequência a uma das precedentes.
[00247] Em outra modalidade, uma proteína de coagulação em BPXTEN é a sequência do FVII da Tabela 7 e o XTEN é selecionado de AE864 e AM875. Em uma modalidade do precedente, a BPXTEN compreende, em uma configuração N- para C-término, FVII-AE864. Em outra modalidade, a BPXTEN é configurada, N- para C-término, como FVII-AM875. Em outra modalidade, a BPXTEN configurada compreende um FVII que está pelo menos cerca de 70% ou 80% ou 90% ou pelo menos cerca de 95% ou mais na forma de FVIIa ativado. Em outra modalidade, a BPXTEN compreendendo FVII e um XTEN pode ainda compreender uma sequência de clivagem, a qual pode incluir uma sequência selecionada da Tabela 10.
(d) Proteínas de hormônio de crescimento
[00248] "Hormônio de crescimento" ou "GH" significa a proteína hormônio de crescimento humano e espécies e variantes de sequência da mesma e inclui, mas não está limitado a, sequência de GH humano com uma única cadeia de 191 aminoácidos. Assim, GH pode ser a proteína nativa, de comprimento total ou pode ser um fragmento truncado ou uma variante de sequência que retém pelo menos uma parte da atividade biológica da proteína nativa. Efeitos do GH sobre os tecidos do corpo podem, em geral, ser descritos como anabólicos. Assim como a maioria dos outros hormônios de proteína, o GH atua por meio de interação com um receptor específicos na membrana plasmática, referido como receptor de hormônio de crescimento. Existem dois tipos conhecidos de GH humano (aqui depois "hGH") derivado da glândula pituitária: um tendo um peso molecular de cerca de 22.000 daltons (hGH de 22kD) e o outro tendo um peso molecular de cerca de 20.000 daltons (hGH de 20 kD). O hGH de 20 kD tem uma sequência de aminoácido que corresponde àquela do hGH de 22 kD consistindo em 191 aminoácidos, exceto que 15 resíduos de aminoácido do 32° ao 46° do hGH de 22 kD estão faltando. Alguns relatos mostraram que o hGH de 20 kD exibe menores riscos e maior atividade do que o hGH de 22 kD. A invenção também considera o uso de hGH de 20 kD como sendo apropriado para uso como um polipeptídeo biologicamente ativo para composições de BPXTEN aqui.
[00249] A invenção considera a inclusão, em uma BPXTEN, de quaisquer sequências homólogas de GH, fragmentos de sequência que são naturais, tais como de primatas, mamíferos (incluindo animais domésticos) e variantes de sequência não natural as quais retêm pelo menos uma parte da atividade biológica ou função biológica do GH e/ou que são úteis para prevenção, tratamento, mediação ou alívio de uma doença, deficiência, distúrbio ou condição relacionada ao GH. Sequências de GH que não são de mamífero são bem descritas na literatura. Por exemplo, um alinhamento de sequência de GHs de peixe pode ser encontrado em Genetics and Molecular Biology 2003, 26, páginas295-300. Uma análise da evolução de sequências de GH de ave é apresentada em Journal of Evolutionary Biology 2006, 19, páginas 844-854. Além disso, sequências nativas homólogas ao GH humano podem ser encontradas através de técnicas padrão de busca por homologia, tal como NCBI BLAST.
[00250] Em uma modalidade, o GH incorporado nas presentes composições pode ser um polipeptídeo recombinante com uma sequência correspondendo a uma proteína encontrada na natureza. Em outra modalidade, o GH pode ser uma variante de sequência, fragmento, homólogo ou um mimético de uma sequência natural que retém pelo menos uma parte da atividade biológica do GH nativo. A Tabela 8 fornece uma lista não limitativa de sequências de GHs de uma ampla variedade de espécies de mamífero que são abrangidas pelas proteínas de fusão BPXTEN da invenção. Qualquer uma dessas sequências de GH ou sequências ou derivados homólogos construídos através de embaralhamento de mutações individuais entre espécies ou famílias pode ser útil para as proteínas de fusão da presente invenção. GH que pode ser incorporado em uma proteína de fusão BPXTEN pode incluir uma proteína que exibe pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência ou, alternativamente, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência a uma proteína selecionada da Tabela 8. Tabela 8: Sequências de aminoácido de hormônio de crescimento de espécies animais
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IV). Configurações Estruturais e Propriedades de BPXTEN
[00251] A BP das presentes composições não está limitada a polipeptídeos nativos, de comprimento total, mas também inclui versões recombinantes, bem como variantes biológicas e/ou farmacologicamente ativas e fragmentos dos mesmos. Por exemplo, será apreciado que várias substituições de aminoácido podem ser feitas na BP para criar variantes sem se desviar do espírito da invenção com relação à atividade biológica ou propriedades farmacológicas da BP. Exemplos de substituições conservativas para aminoácidos em sequências polipeptídicas são mostrados na Tabela 9. Contudo, em modalidades da BPXTEN nas quais a identidade de sequência da BP é menos de 100%, comparado com uma sequência específica divulgada aqui, a invenção considera substituição de qualquer um dos outros 19 L-aminoácidos naturais por um determinado resíduo de aminoácido da determinada BP, o qual pode estar em qualquer posição dentro da sequência da BP, incluindo resíduos de aminoácido adjacentes. Se qualquer substituição resulta em uma alteração indesejável na atividade biológica, então, um dos aminoácidos alternativos pode ser empregado e o construto avaliado através dos métodos descritos aqui ou usando qualquer uma das técnicas e diretrizes para mutações conservativas e não conservativas apresentadas, por exemplo, na Pat. U.S. N° 5.364.934, os conteúdos da qual são incorporados por referência em sua totalidade ou usando métodos geralmente conhecidos por aqueles versados no campo. Além disso, variantes também podem incluir, por exemplo, polipeptídeos em que um ou mais resíduos de aminoácido são adicionados ou deletados no N- ou C-término da sequência de aminoácido nativa de comprimento total de uma BP que retém pelo menos uma parte da atividade biológica do peptídeo nativo. Tabela 9: Substituições conservativas de aminoácido exemplificativas
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(a) Configurações de Proteína de fusão BPXTEN
[00252] A invenção proporciona composições de proteína de fusão BPXTEN compreendendo BP ligada a um ou mais polipeptídeos XTEN úteis para prevenção, tratamento, mediação ou alívio de uma doença, distúrbio ou condição relacionada à homeostase de glicose, resistência à insulina ou obesidade. Em alguns casos, a BPXTEN é uma proteína de fusão monomérica com uma BP ligada a um ou mais polipeptídeos XTEN. Em outros casos, a composição de BPXTEN pode incluir duas moléculas de BP ligadas a um ou mais polipeptídeos XTEN. A invenção considera BPXTEN compreendendo, mas não limitado a, uma BP selecionada das Tabelas 3-8 (ou fragmentos ou variantes de sequência da mesma) e um XTEN selecionado da Tabela 2 ou variantes de sequência do mesmo. Em alguns casos, pelo menos uma parte da atividade biológica da respectiva BP é retida pela BPXTEN intacta. Em outros casos, o componente BP se torna biologicamente ativa ou tem um aumento na atividade quando se sua liberação do XTEN através de clivagem de uma sequência de clivagem opcional incorporada dentro de sequências espaçadoras na BPXTEN, descrita mais completamente abaixo.
[00253] Em uma modalidade da composição de BPXTEN, a invenção proporciona uma proteína de fusão da fórmula I: (BP)-(S)x-(XTEN) I
[00254] em que, independentemente para cada ocorrência, BP é a proteína biologicamente ativa conforme descrito aqui acima; S é uma sequência espaçadora tendo entre 1 a cerca de 50 resíduos de aminoácido que pode incluir opcionalmente uma sequência de clivagem (conforme descrito mais completamente abaixo); x é 0 ou 1; e XTEN é um polipeptídeo recombinante estendido conforme descrito aqui acima. A modalidade tem utilidade particular onde a BP requer um N-término livre para a atividade biológica desejada ou onde ligação do C-término da BP à proteína de fusão reduz a atividade biológica e se deseja reduzir a atividade biológica e/ou efeitos colaterais da BPXTEN administrada.
[00255] Em outra modalidade da composição de BPXTEN, a invenção proporciona uma proteína de fusão da fórmula II (componentes conforme descrito acima): (XTEN)-(S)x-(BP) II
[00256] em que, independentemente para cada ocorrência, BP é uma proteína biologicamente ativa conforme descrito aqui acima; S em uma sequência espaçadora tendo entre 1 a cerca de 50 resíduos de aminoácido que pode incluir opcionalmente uma sequência de clivagem conforme descrito mais completamente abaixo); x é 0 ou 1; e XTEN é um polipeptídeo recombinante estendido conforme descrito aqui acima. A modalidade tem utilidade particular onde a BP requer um C-término livre para a atividade biológica desejada ou onde ligação do N-término da BP à proteína de fusão reduz a atividade biológica e se deseja reduzir a atividade biológica e/ou efeitos colaterais da BPXTEN administrada.
[00257] Assim, uma BPXTEN tendo uma única BP e um único XTEN pode ter pelo menos as seguintes permutações de configurações, cada uma listada em uma orientação N- para C-término: BP-XTEN; XTEN- BP; BP-S-XTEN; ou XTEN-S-BP.
[00258] Em outra modalidade, a invenção proporciona uma proteína de fusão isolada, em que a proteína de fusão é da fórmula III: (BP)-(S)x-(XTEN)-(SV(BP)-(SMXTEN)2 III em que, independentemente para cada ocorrência, BP é uma proteína biologicamente ativa conforme descrito aqui acima; S é uma sequência espaçadora tendo entre 1 a cerca de 50 resíduos de aminoácido que pode incluir opcionalmente uma sequência de clivagem (conforme descrito mais completamente abaixo); x é 0 ou 1; y é 0 ou 1; z é 0 ou 1; e XTEN é um polipeptídeo recombinante estendido conforme descrito aqui acima.
[00259] Em outra modalidade, a invenção proporciona uma proteína de fusão isolada, em que a proteína de fusão é da fórmula IV (componentes conforme descrito acima): (XTEN)x-(S)y-(BP)-(S)z-(XTEN)-(BP) IV
[00260] Em outra modalidade, a invenção proporciona uma proteína de fusão isolada, em que a proteína de fusão é da fórmula V (componentes conforme descrito acima): (BP)x-(S)x-(BP)-(S)y-(XTEN) V
[00261] Em outra modalidade, a invenção proporciona uma proteína de fusão isolada, em que a proteína de fusão é da fórmula VI (componentes conforme descrito acima): (XTEN)-(S)x-(BP)-(SV(BP) VI
[00262] Em outra modalidade, a invenção proporciona uma proteína de fusão isolada, em que a proteína de fusão é da fórmula VII (componentes conforme descrito acima): (XTEN)-(S)x-(BP)-(S)y-(BP)-(XTEN) VII
[00263] Nas modalidades precedentes de proteínas de fusão das fórmulas I- VII, administração de uma dose terapeuticamente eficaz de uma proteína de fusão de uma modalidade a um indivíduo que precisa da mesma pode resultar em um ganho de tempo de pelo menos duas vezes ou pelo menos três vezes ou pelo menos quatro vezes ou pelo menos cinco vezes ou mais consumido dentro de uma janela terapêutica para a proteína de fusão, comparado com uma BP correspondente não ligada ao XTEN e administrada em uma dose comparável a um indivíduo.
[00264] Qualquer grupo de sequência espaçadora é opcional nas proteínas de fusão abrangidas pela invenção. O espaçador pode ser proporcionado para intensificar a expressão da proteína de fusão de uma célula hospedeira ou diminuir o estéreo-impedimento, de modo que um componente BP pode assumir sua estrutura terciária e/ou interagir apropriadamente com sua molécula alvo. Para espaçadores e métodos de identificação de espaçadores desejáveis vide, por exemplo, George et al. (2003) Protein Engineering 15: 871-879, especificamente incorporado aqui por referência. Em uma modalidade, o espaçador compreende uma ou mais sequências peptídicas que têm entre 1-50 resíduos de aminoácido de comprimento ou cerca de 1-25 resíduos ou cerca de 1-10 resíduos de comprimento. Sequências espaçadoras, exclusive de sítios de clivagem, podem compreender qualquer um dos 20 L aminoácidos naturais e, de preferência, compreenderá aminoácidos hidrofílicos que são estericamente desimpedidos que podem incluir, mas não estão limitados a, glicina (G), alanina (A), serina (S), treonina (T), glutamato (E) e prolina (P). Em alguns casos, o espaçador pode ser poliglicinas ou polialaninas ou é predominantemente uma mistura de combinações de resíduos de glicina e alanina. O polipeptídeo espaçador, excluindo a sequência de clivagem, é grandemente desprovido substancialmente de estrutura secundária. Em uma modalidade, uma ou ambas as sequências espaçadoras em uma proteína de fusão composição de BPXTEN podem, cada uma, ainda conter uma sequência de clivagem, as quais podem ser idênticas ou podem ser diferentes, em que a sequência de clivagem pode ser estimulada por uma protease para liberar a BP da proteína de fusão.
[00265] Em alguns casos, a incorporação da sequência de clivagem em uma BPXTEN é projetada para permitir liberação de uma BP que se torna ativa ou mais ativa quando de sua liberação do XTEN. As sequências de clivagem estão localizadas suficientemente próximas de sequências de BP, geralmente dentro de 18 ou dentro de 12 ou dentro de 6 ou dentro de 2 aminoácidos do término da sequência de BP, de modo que quaisquer resíduos restantes presos à BP após clivagem não interferem apreciavelmente com a atividade (por exemplo, tal como ligação a um receptor) da BP, ao mesmo tempo em que fornece acesso à protease para ser capaz de realizar clivagem da sequência de clivagem. Em algumas modalidades, o sítio de clivagem em uma sequência que pode ser clivada por uma protease endógena a um mamífero, de modo que a BPXTEN pode ser clivada após administração a um indivíduo. Em tais casos, a BPXTEX pode servir como um profármaco ou um depósito em circulação para a BP. Exemplos de sítios de clivagem considerados pela invenção incluem, mas não estão limitados a, uma sequência polipeptídica clivável por uma protease endógena de mamífero selecionada de FXIa, FXIIa, calicreína, FVIIa, FIXa, FXa, FIIa (trombina), Elastase-2, granzima B, MMP- 12, MMP- 13, MMP- 17 ou MMP-20 ou por proteases que não são de mamífero, tais como TEV, enteroquinase, protease PreScission® (protease de rinovírus 3C) e sortase A. Sequências conhecidas como sendo clivadas pelas proteases precedentes são conhecidas no campo. Sequências de clivagem exemplificativas e sítios de corte dentro das sequências são apresentadas na Tabela 10, bem como variante de sequência. Por exemplo, trombina (fator II de coagulação ativado) atua sobre a sequência LTPRSLLV (SEQ ID NO: 222) [Rawlings N.D., et al. (2008) Nucleic Acids Res., 36: D320], a qual será cortada após a arginina na posição 4 na sequência. FIIa ativo é produzido por meio de clivagem de FII por FXa na presença de fosfolipídio e cálcio e está a jusante do fator IX na via de coagulação. Uma vez ativado, seu papel natural na coagulação é clivar o fibrinogênio o qual, então, por sua vez, começa a formação de coágulo. Atividade de FIIa é hermeticamente controlada e ocorre apenas quando a coagulação é necessária para hemostase apropriada. Contudo, uma vez que a coagulação é um processo em andamento em mamíferos, mediante a incorporação da sequência LTPRSLLV (SEQ ID NO: 223) em uma BPXTEN entre a BP e o XTEN, o domínio XTEN será removido da BP de união concorrente com a ativação das vias de coagulação extrínsecas ou intrínsecas quando a coagulação é requerida fisiologicamente, desse modo, liberando a BP com o tempo. Similarmente, incorporação de outras sequências na BPXTEN que são acionadas por proteases endógenas permitiria a liberação sustentada de BP que pode, em determinados casos, conferir um alto grau de atividade para a BP a partir da forma de "profármaco" da BPXTEN.
[00266] Em alguns casos, apenas dois ou três aminoácidos que flanqueiam ambos os lados do sítio de corte (quatro a seis aminoácidos no total) serão incorporados na sequência de clivagem. Em outros casos, a sequência de clivagem conhecida pode ter uma ou mais deleções ou inserções ou uma ou duas ou três substituições de aminoácido para qualquer um ou dois ou três aminoácidos na sequência conhecida, em que as deleções, inserções ou substituições resultam em suscetibilidade reduzida ou intensificada à protease, resultando em uma capacidade de configurar a taxa de liberação da BP do XTEN. Substituições exemplificativas são mostradas na Tabela 10. Tabela 10: Sequências de clivagem de protease
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↓ Indica sítio de clivagem NA: não aplicável * a listagem de múltiplos aminoácidos antes, entre ou após uma barra indica aminoácidos alternativos que podem ser substituídos na posição; "-" indica que qualquer aminoácido pode ser substituído pelo aminoácido correspondente na coluna do meio
[00267] Em uma modalidade, uma BP incorporada em uma proteína de fusão BPXTEN pode ter uma sequência que exibe pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência a uma sequência das Tabelas 3-8, alternativamente pelo menos cerca de 81% ou cerca de 82% ou cerca de 83% ou cerca de 84% ou cerca de 85% ou cerca de 86% ou cerca de 87% ou cerca de 88% ou cerca de 89% ou cerca de 90% ou cerca de 91% ou cerca de 92% ou cerca de 93% ou cerca de 94% ou cerca de 95% ou cerca de 96% ou cerca de 97% ou cerca de 98% ou cerca de 99% ou cerca de 100% de identidade de sequência quando comparado com uma sequência das Tabelas 3-8. A BP da modalidade precedente pode ser avaliada quanto à atividade usando ensaios ou parâmetros medidos ou determinados conforme descrito aqui e aquelas sequências que retêm pelo menos cerca de 40% ou cerca de 50% ou cerca de 55% ou cerca de 60% ou cerca de 70% ou cerca de 80% ou cerca de 90% ou cerca de 95% ou mais de atividade, comparado com a sequência de BP nativa correspondente serão consideradas adequadas para inclusão na BPXTEN em questão. Uma BP que retém um nível adequado de atividade pode ser ligada a um ou mais polipeptídeos XTEN descritos aqui acima. Em uma modalidade, uma BP que retém um nível adequado de atividade pode ser ligada a um ou mais polipeptídeos XTEN tendo pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência a uma sequência da Tabela 2, alternativamente pelo menos cerca de 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou cerca de 100% de identidade de sequência quando comparado com uma sequência da Tabela 2, resultando em uma proteína de fusão quimérica.
[00268] Exemplos não limitativos de sequências de proteínas de fusão contendo uma única BP ligada a um único XTEN são apresentados nas Tabelas 40, 42, 43 e 44. Em uma modalidade, uma composição de BPXTEN compreenderia uma proteína de fusão tendo pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência a uma BPXTEN da Tabela 40, 42, 43 ou 44, alternativamente pelo menos cerca de 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou cerca de 100% de identidade de sequência quando comparado com uma BPXTEN da Tabela 40, 42, 43 ou 44. Exemplos não limitativos de sequências de proteínas de fusão contendo duas moléculas da mesma BP ligada a um ou mais XTENs são apresentados na Tabela 41, mas a invenção também considera substituição de outras BPs selecionadas das Tabelas 3-8 ligadas a um ou dois XTENs, os quais podem ser os mesmos ou diferentes, selecionados da Tabela 2. Nas proteínas de fusão precedentes descritas aqui acima nesse parágrafo, a proteína de fusão BPXTEN pode ainda compreender uma sequência de clivagem da Tabela 10; a sequência de clivagem estando localizada entre a BP e o XTEN ou entre BPs adjacentes. Em alguns casos, a BPXTEN compreendendo as sequências de clivagem também têm uma ou mais sequências de aminoácido espaçadoras entre a BP e a sequência de clivagem ou o XTEN e a sequência de clivagem para facilitar acesso da protease; os aminoácidos espaçadores compreendem qualquer aminoácido natural, incluindo glicina e alanina como aminoácidos preferidos. Exemplos não limitativos de BPXTEN compreendendo BP, XTEN, sequência(s) de clivagem e aminoácidos espaçadores são apresentados nas Tabelas 42 e 43. Contudo, a invenção também considera substituição de qualquer uma das sequências de BP das Tabelas 3-8 por uma sequência de BP das Tabelas 42 ou 43, substituição de qualquer sequência de XTEN da Tabela 2 por uma sequência de XTEN das Tabelas 42 ou 43 e substituição de qualquer sequência de clivagem da Tabela 10 por uma sequência de clivagem das Tabelas 42 ou 43.
(b) Propriedades farmacocinéticas de BPXTEN
[00269] A invenção proporciona proteínas de fusão BPXTEN com farmacocinética intensificada comparado com a BP não ligada ao XTEN que, quando usadas na dose determinada para a composição através dos métodos descritos aqui, podem obter uma concentração em circulação que resulta em um efeito farmacológico, ao mesmo tempo em que permanece dentro da faixa de segurança para o componente biologicamente ativo da composição durante um período de tempo prolongado, comparado com uma dose comparável da BP não ligada ao XTEN. Em tais casos, a BPXTEN permanece dentro da janela terapêutica para a composição de proteína de fusão durante o período de tempo prolongado. Conforme usado aqui, uma "dose comparável" significa uma dose com uma proporção equivalente de moles/kg para o farmacóforo BP ativa que é administrado a um indivíduo de um modo comparável. Será entendido na técnica que uma "dosagem comparável" de proteína de fusão BPXTEN representaria um maior peso do agente, mas teria essencialmente o mesmo equivalente molar de BP na dose da proteína de fusão e/ou teria a mesma concentração molar aproximada com relação à BP.
[00270] As propriedades farmacocinéticas de uma BP que podem ser intensificadas pela ligação de um determinado XTEN a uma BP incluem meia-vida terminal, área sob a curva (Area Under the Curve - AUC), Cmax, volume de distribuição e biodisponibilidade.
[00271] Conforme descrito mais completamente nos Exemplos referentes às características farmacocinéticas de proteínas de fusão compreendendo XTEN descobriu-se, surpreendentemente, que aumento do comprimento da sequência do XTEN poderia conferir um aumento desproporcional na meia-vida terminal de uma proteína de fusão compreendendo o XTEN. Consequentemente, a invenção proporciona proteínas de fusão BPXTEN compreendendo XTEN, em que o XTEN pode ser selecionado para proporcionar uma meia-vida alvo para a composição de BPXTEN administrada a um indivíduo. Em algumas modalidades, a invenção proporciona proteínas de fusão monoméricas compreendendo XTEN, em que o XTEN é selecionado para conferir um aumento na meia-vida terminal para a BPXTEN administrada comparado com uma BP correspondente não ligada à proteína de fusão, de pelo menos cerca de duas vezes maior ou pelo menos cerca de três vezes ou pelo menos cerca de quatro vezes ou pelo menos cerca de cinco vezes ou pelo menos cerca de seis vezes ou pelo menos cerca de sete vezes ou pelo menos cerca de oito vezes ou pelo menos cerca de nove vezes ou pelo menos cerca de dez vezes ou pelo menos cerca de 15 vezes ou pelo menos a 20 vezes ou maior um aumento na meia-vida terminal, comparado com a BP não ligada à proteína de fusão. Similarmente, as proteínas de fusão BPXTEN podem ter um aumento na AUC de pelo menos cerca de 50% ou pelo menos cerca de 60% ou pelo menos cerca de 70% ou pelo menos cerca de 80% ou pelo menos cerca de 90% ou pelo menos cerca de 100% ou pelo menos cerca de 150% ou pelo menos cerca de 200% ou um aumento na AUC de pelo menos cerca de 300% comparado com uma BP correspondente não ligada à proteína de fusão. Os parâmetros farmacocinéticos de uma BPXTEN podem ser determinados através de métodos padrão envolvendo dosagem, coletando amostras de sangue em intervalos de tempo e ensaiando a proteína usando ELISA, HPLC, radioensaio ou outros métodos conhecidos na técnica ou conforme descrito aqui, seguido por cálculos padrões dos dados para derivar a meia-vida e outros parâmetros PK.
[00272] A invenção ainda proporciona BPXTEN compreendendo uma primeira e uma segunda molécula de BP, opcionalmente separadas por uma sequência espaçadora que pode ainda compreender uma sequência de clivagem ou separadas por uma segunda sequência de XTEN. Em uma modalidade, a BP tem menos atividade quando ligada à proteína de fusão, comparado com uma BP correspondente não ligada à proteína de fusão. Em tal caso, conforme ilustrado na figura 38, a BPXTEN pode ser projetada de modo que, quando de administração a um indivíduo, o componente BP seja gradualmente liberado por meio de clivagem da(s) sequência(s) de clivagem, quando do que ela reobtém atividade ou a capacidade de se ligar a seu receptor ou ligante-alvo. Consequentemente, a BPXTEN do precedente serve como um profármaco ou um depósito em circulação, resultando em uma maior meia-vida terminal comparado com BP não ligada à proteína de fusão.
(c) Farmacologia e Propriedades Farmacêuticas da BPXTEN
[00273] A presente invenção proporciona composições de BPXTEN compreendendo BP covalentemente ligada a um XTEN que pode ter propriedades intensificadas comparado com uma BP não ligada ao XTEN, bem como métodos para intensificar o efeito ou atividade biológica e/ou terapêutica dos respectivos dois componentes BP das composições. Além disso, a invenção proporciona composições de BPXTEN com propriedades intensificadas comparado com aquelas proteínas de fusão conhecidas na técnica contendo parceiros polipeptídicos de imunoglobulina, polipeptídeos de comprimento mais curto e/ou parceiros polipeptídicos com sequências repetitivas. Além disso, as proteínas de fusão BPXTEN conferem vantagens significativas com relação a conjugados químicos, tais como construtos peguilados, principalmente em virtude do fato de que as proteínas de fusão BPXTEN recombinantes podem ser feitas em sistemas de expressão de célula bacteriana, o que pode reduzir o tempo e custo de pesquisa e desenvolvimento e estágios de fabricação de um produto, bem como resultar em um produto definido, mais homogêneo com menos toxicidade para o produto e metabólitos da BPXTEN, comparado com conjugados peguilados.
[00274] Como agentes terapêuticos, a BPXTEN pode possuir uma série de vantagens com relação a produtos terapêuticos compreendendo XTEN incluindo, por exemplo, solubilidade aumentada, estabilidade térmica aumentada, imunogenicidade reduzida, peso molecular aparente aumentado, depuração renal reduzida, proteólise reduzida, metabolismo reduzido, eficiência terapêutica intensificada, uma menor dose terapêutica eficaz, biodisponibilidade aumentada, tempo aumentado entre as dosagens para manter os níveis sanguíneos dentro da janela terapêutica para a BP, uma taxa de absorção "configurada", estabilidade de liofilização intensificada, estabilidade no soro/plasma intensificada, meia-vida terminal aumentada, solubilidade aumentada na corrente sanguínea, ligação diminuída por anticorpos de neutralização, depuração receptor-mediada diminuída, efeitos colaterais reduzidos, retenção de afinidade de ligação a receptor/ligante ou ativação de receptor/ligante, estabilidade à degradação, estabilidade do congelamento-descongelamento, estabilidade à proteases, estabilidade à ubiquitinação, facilidade de administração, compatibilidade com outros excipientes ou veículos farmacêuticos, persistência no indivíduo, estabilidade aumentada ao armazenamento (por exemplo, vida útil aumentada), toxicidade reduzida em um organismo ou ambiente e semelhantes. O efeito líquido das propriedades intensificadas é que a BPXTEN pode resultar em um efeito terapêutico e/ou biológico intensificado quando administrada a um indivíduo com uma doença ou distúrbio metabólico.
[00275] Em outros casos onde intensificação das propriedades farmacêuticas ou físico-químicas da BP é desejável (tal como o grau de solubilidade aquosa ou estabilidade), o comprimento e/ou a composição de família de motivo das primeira e segunda sequências de XTEN das primeira e segunda proteínas de fusão podem, cada um, ser selecionados para conferir um grau diferente de solubilidade e/ou estabilidade às respectivas proteínas de fusão, de modo que as propriedades farmacêuticas globais da composição de BPXTEN sejam intensificadas. As proteínas de fusão BPXTEN podem ser construídas e ensaiadas usando métodos descritos aqui para confirmar as propriedades físico-químicas e o XTEN ajustado, conforme necessário, para resultar nas propriedades desejadas. Em uma modalidade, a sequência do XTEN da BPXTEN é selecionada de modo que a proteína de fusão tenha uma solubilidade aquosa que é pelo menos cerca de 25% maior comparado com uma BP não ligada à proteína de fusão ou pelo menos cerca de 30% ou pelo menos cerca de 40% ou pelo menos cerca de 50% ou pelo menos cerca de 75% ou pelo menos cerca de 100% ou pelo menos cerca de 200% ou pelo menos cerca de 300% ou pelo menos cerca de 400% ou pelo menos cerca de 500% ou pelo menos cerca de 1000% maior do que uma BP correspondente não ligada à proteína de fusão. Nas modalidades descritas aqui acima nesse parágrafo, o XTEN das proteínas de fusão pode ter pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência ou cerca de 90% ou cerca de 91% ou cerca de 92% ou cerca de 93% ou cerca de 94% ou cerca de 95% ou cerca de 96% ou cerca de 97% ou cerca de 98% ou cerca de 99%, a cerca de 100% de identidade de sequência a um XTEN selecionado da Tabela 2.
[00276] Em uma modalidade, a invenção proporciona composições de BPXTEN que podem manter um componente BP dentro de uma janela terapêutica durante um maior período de tempo comparado com dosagens comparáveis de uma BP correspondente não ligada ao XTEN. Será entendido no campo que uma "dosagem comparável" de proteína de fusão BPXTEN representaria um maior peso de agente, mas teria o mesmo equivalente molar aproximado de BP na dose da proteína de fusão e/ou teria a mesma concentração molar aproximada com relação à BP.
[00277] A invenção também proporciona métodos para selecionar o XTEN apropriado para conjugação a fim de conferir as propriedades farmacocinéticas desejadas que, quando combinadas com a seleção de dose, permitem eficácia aumentada da composição administrada ao manter as concentrações de BP em circulação dentro da janela terapêutica durante um período de tempo intensificado. Conforme usado aqui, "janela terapêutica" significa aquela quantidade de fármaco ou produto biológico, como uma faixa de concentração sanguínea ou plasmática, que confere eficácia ou um efeito farmacológico desejado com o tempo para uma doença ou condição sem toxicidade inaceitável; a faixa das concentrações sanguíneas em circulação entre a quantidade mínima para obter qualquer efeito terapêutico positivo e a quantidade máxima a qual resulta em uma resposta que é a resposta imediatamente antes de toxicidade para o indivíduo (em uma dose ou concentração maior). Adicionalmente, a janela terapêutica abrange, em geral, um aspecto de tempo; as concentrações máxima e mínima que resultam em um efeito farmacológico desejado com o tempo que não resultam em toxicidade ou eventos adversos inaceitáveis. Uma composição dosada que permanece dentro da janela terapêutica para o indivíduo também seria referida como estando dentro da "faixa de segurança".
[00278] Otimização de dose é importante para todos os fármacos, especialmente para aqueles com uma janela terapêutica estreita. Por exemplo, muitos peptídeos envolvidos em homeostase de glicose têm uma janela terapêutica estreita. Para uma BP com uma janela terapêutica estreita, tal como glucagon ou um análogo de glucagon, uma dose única padronizada para todos os pacientes que apresentam uma variedade de sintomas pode nem sempre ser eficaz. Uma vez que diferentes peptídeos de regulação de glicose são usados juntos no tratamento de indivíduos diabéticos, a potência de cada um e os efeitos interativos obtidos por meio de combinação e dosagem dos mesmos juntos também devem ser levados em conta. Uma consideração desses fatores está bem dentro da visão do médico para fins de determinação da quantidade terapêutica ou farmacologicamente eficaz da BPXTEN versus aquela quantidade que resultaria em toxicidade inaceitável e a colocaria fora da faixa de segurança.
[00279] Em muitos casos, a janela terapêutica para componentes BP das presentes composições foi estabelecida e está disponível na literatura publicada ou é estabelecida sobre o rótulo do fármaco para produtos aprovados contendo a BP. Em outros casos, a janela terapêutica pode ser estabelecida. Os métodos para estabelecimento da janela terapêutica para uma determinada componente são conhecidos por aqueles versados no campo (vide, por exemplo, Goodman & Gilman's, The Pharmacological Basis of Therapeutics, 11a Edição, McGraw-Hill (2005)). Por exemplo, usando estudos de escalonamento de dose em indivíduos com a doença ou distúrbio alvo para determinar a eficácia ou um efeito farmacológico desejável, o aparecimento de eventos adversos e determinação dos níveis sanguíneos em circulação, a janela terapêutica para um determinado indivíduo ou população de indivíduos pode ser determinada para um determinado fármaco ou produto biológico ou combinações de produtos biológicos ou fármacos. Os estudos de escalonamento de dose podem avaliar a atividade de uma BPXTEN através de estudos metabólicos em um indivíduo ou grupo de indivíduos que monitoram parâmetros fisiológicos ou bioquímicos, conforme conhecido no campo ou conforme descrito aqui para um ou mais parâmetros associados à doença ou distúrbio metabólico ou parâmetros clínicos associados a um resultado benéfico para a indicação particular, junto com observações e/ou parâmetros medidos para determinar a dose sem efeito, eventos adversos, dose máxima tolerada e semelhantes, junto com medição de parâmetros farmacocinéticos que estabelecem os níveis sanguíneos em circulação determinados ou derivados. Os resultados podem, então, ser correlacionados com a dose administrada e as concentrações sanguíneas do produto terapêutico que são coincidentes com os parâmetros ou níveis de efeito determinados precedentes. Por meio desses métodos, uma faixa de doses e concentrações sanguíneas pode ser correlacionada à dose mínima eficaz, bem como à dose e concentração sanguínea máximas nas quais um efeito desejado ocorre e acima das quais toxicidade ocorre, desse modo, estabelecendo a janela terapêutica para a dose terapêutica. Concentrações sanguíneas da proteína de fusão (ou conforme medido por um componente BP) acima do máximo seriam consideradas fora da janela terapêutica ou faixa de segurança. Assim, através dos métodos precedentes, um nível sanguíneo Cmax seria estabelecido, abaixo do qual a proteína de fusão BPXTEN não teria o efeito farmacológico desejado e um nível sanguíneo Cmin seria estabelecido, o qual representaria a maior concentração em circulação antes de atingir uma concentração que estimularia efeitos colaterais inaceitáveis, toxicidade ou eventos adversos, colocando-a fora da faixa de segurança para uma BPXTEN. Com tais concentrações estabelecidas, a frequência de dosagem e a dosagem podem ser ainda refinadas medindo-se a Cmax e Cmin para proporcionar a dose e frequência de dose apropriadas para manter a(s) proteína(s) de fusão dentro da janela terapêutica. Aqueles versados no campo podem, através dos meios divulgados aqui ou outros métodos conhecidos no campo, confirmar se a BPXTEN administrada permanece na janela terapêutica durante o intervalo desejado ou requer ajusta na dose ou comprimento ou sequência do XTEN. Ainda, a determinação da dose e frequência de dose apropriadas para manter uma BPXTEN dentro da janela terapêutica estabelece o regime de dose terapeuticamente eficaz; o esquema para administração de múltiplas doses consecutivas usando uma dose terapeuticamente eficaz da proteína de fusão a um indivíduo que precisa da mesma, resultando em picos Cmax consecutivos e/ou níveis séricos Cmin que permanecem dentro da janela terapêutica e resultam em um aprimoramento em pelo menos um parâmetro medido relevante para a doença, distúrbio ou condição alvo. Em alguns casos, a BPXTEN administrada em uma dose apropriada a um indivíduo pode resultar em concentrações sanguíneas da proteína de fusão BPXTEN que permanecem dentro da janela terapêutica durante um período de pelo menos cerca de duas vezes mais longo quando comparado com uma BP correspondente não ligada ao XTEN e administrada em uma dose comparável; alternativamente pelo menos cerca de três vezes maior; alternativamente pelo menos cerca de quatro vezes maior; alternativamente pelo menos cerca de cinco vezes maior; alternativamente pelo menos cerca de seis vezes maior; alternativamente pelo menos cerca de sete vezes maior; alternativamente pelo menos cerca de oito vezes maior; alternativamente pelo menos cerca de nove vezes maior ou pelo menos cerca de dez vezes maior ou maior, comparado com uma BP correspondente não ligada ao XTEN e administrada em uma dose comparável. Conforme usado aqui, uma "dose apropriada" significa uma dose de um fármaco ou produto biológico que, quando administrada a um indivíduo, resultará em um efeito terapêutico ou farmacológico desejável e uma concentração sanguínea dentro da janela terapêutica.
[00280] Em uma modalidade, a BPXTEN administrada em um regime de dose terapeuticamente eficaz resulta em um ganho de tempo de pelo menos cerca de três vezes maior; alternativamente pelo menos cerca de quatro vezes maior; alternativamente pelo menos cerca de cinco vezes maior; alternativamente pelo menos cerca de seis vezes maior; alternativamente pelo menos cerca de sete vezes maior; alternativamente pelo menos cerca de oito vezes maior; alternativamente pelo menos cerca de nove vezes maior ou pelo menos cerca de dez vezes maior entre pelo menos dois picos Cmax consecutivos e/ou níveis séricos Cmin para os níveis sanguíneos da proteína de fusão, comparado com a proteína biologicamente ativa da proteína de fusão correspondente não ligada à proteína de fusão e administrada em um regime de dose comparável a um indivíduo. Em outra modalidade, a BPXTEN administrada em um regime de dose terapeuticamente eficaz resulta em um aprimoramento comparável em um ou dois ou três ou mais parâmetros medidos usando dosagem menos frequente ou uma menor dosagem total em moles da proteína de fusão da composição farmacêutica, comparado com o(s) componente(s) de proteína biologicamente ativa correspondente(s) não ligada à proteína de fusão e administrada a um indivíduo usando um regime de dose terapeuticamente eficaz para uma BP. Os parâmetros medidos podem incluir qualquer um dos parâmetros clínicos, bioquímicos ou fisiológicos divulgados aqui ou outros conhecidos no campo para avaliação de indivíduos com distúrbios relacionados à glicose ou insulina, doenças e distúrbios metabólicos, distúrbios de coagulação ou sangramento ou distúrbios relacionados ao hormônio de crescimento.
[00281] A atividade das composições de BPXTEN da invenção, incluindo características funcionais ou atividades biológicas e farmacológicas e parâmetros resultantes, pode ser determinada por meio de qualquer ensaio de triagem adequado conhecido no campo para medição da característica desejada. A atividade e estrutura de polipeptídeos de BPXTEN compreendendo componentes BP pode ser medida através dos ensaios descritos aqui; por exemplo, um ou mais ensaios selecionados da Tabela 39, ensaios dos Exemplos ou através de métodos conhecidos no campo para determinar o grau de solubilidade, estrutura e retenção de atividade biológica. Podem ser conduzidos ensaios que permitem a determinação de características de ligação da BPXTEN por receptores ou um ligante de BP, incluindo constante de ligação (Kd), valores de EC50, bem como sua meia-vida de dissociação do complexo ligante-receptor (T1/2). A afinidade de ligação pode ser medida, por exemplo, através de um ensaio de ligação do tipo competitivo que detecta alterações na capacidade de se ligar especificamente a um receptor ou ligante. Adicionalmente, técnicas tais como citometria de fluxo ou ressonância de plasmônio em superfície podem ser usadas para detectar eventos de ligação. Os ensaios podem compreender moléculas de receptor solúvel ou podem determinar a ligação a receptores expressos em célula. Tais ensaios podem incluir ensaios baseados em célula, incluindo ensaios de proliferação, morte celular, apoptose e migração celular. Outros possíveis ensaios podem determinar a ligação a receptor de polipeptídeos expressos, em que o ensaio pode compreender moléculas de receptor solúvel ou pode determinar a ligação a receptores expressos em célula. A afinidade de ligação de uma BPXTEN pelos receptores alvo ou ligantes de uma BP correspondente pode ser ensaiada usando ensaios de ligação ou ligação competitiva, tal como ensaios Biacore com receptores ligados a um chip ou proteínas de ligação ou ensaios ELISA, conforme descrito na Patente U.S. 5.534.617, ensaios descritos nos Exemplos aqui, ensaios de radio-receptor ou outros ensaios conhecidos no campo. Além disso, variantes de sequência de BP (ensaiadas como componentes únicos ou como proteínas de fusão BPXTEN) podem ser comparadas com a BP nativa usando um ensaio de ligação ELISA competitivo para determinar se elas têm a mesma especificidade e afinidade de ligação que a BP nativa ou alguma fração da mesma, de modo que elas sejam adequadas para inclusão em BPXTEN.
[00282] A invenção proporciona uma BPXTEN isolada na qual a afinidade de ligação por receptores alvo de BP ou ligantes por uma BPXTEN pode ser pelo menos cerca de 10% ou pelo menos cerca de 20% ou pelo menos cerca de 30% ou pelo menos cerca de 40% ou pelo menos cerca de 50% ou pelo menos cerca de 60% ou pelo menos cerca de 70% ou pelo menos cerca de 80% ou pelo menos cerca de 90% ou pelo menos cerca de 95% ou pelo menos cerca de 99% ou pelo menos cerca de 100% ou mais da afinidade de uma BP nativa não ligada ao XTEN pelo receptor-alvo ou ligante. Em alguns casos, a afinidade de ligação Kd entre a BPXTEN em questão e um receptor ou ligante nativo da BPXTEN é pelo menos cerca de 104 M, alternativamente pelo menos cerca de 105 M, alternativamente pelo menos cerca de 106 M ou pelo menos cerca de 107 M da afinidade entre a BPXTEN e um receptor ou ligante nativo.
[00283] Em outros casos, a invenção proporciona uma BPXTEN isolada na qual a proteína de fusão é projetada se ligar com alta afinidade a um receptor-alvo, desse modo, resultando em atividade antagonística para o ligante nativo. Um exemplo não limitativo de tal BPXTEN é IL-1raXTEN, a qual é configurada para se ligar a um receptor de IL-1, de modo que a composição ligada interfira substancialmente com a ligação de IL-1 α e/ou IL-1 β ao receptor de IL-1. Em determinados casos, a interferência, por uma BPXTEN antagonista (tal como, mas não limitado a, IL-1raXTEN), com a ligação do ligante nativo ao receptor-alvo pode ser pelo menos cerca de 1% ou cerca de 10% ou cerca de 20% ou cerca de 30% ou cerca de 40% ou cerca de 50% ou cerca de 60% ou cerca de 70% ou cerca de 80% ou cerca de 90% ou cerca de 95% ou cerca de 99% ou cerca de 100%. Em outras modalidades, a invenção proporciona proteínas de fusão BPXTEN isoladas (tal como, mas não limitado a, IL-1raXTEN), em que a ligação da proteína de fusão isolada a um receptor celular estimula menos de 20% ou menos de 10% ou menos de 5% de ativação das vias de sinalização da célula com a BPXTEN antagonista ligada em comparação com aquela estimulada pelo ligante nativo. Em outros casos, as composições de BPXTEN antagonísticas se ligam ao receptor-alvo com uma constante de dissociação de cerca de 10 nM ou menos, cerca de 5 nM ou menos, cerca de 1 nM ou menos, cerca de 500 pM ou menos, cerca de 250 pM ou menos, cerca de 100 pM ou menos, cerca de 50 pM ou menos ou cerca de 25 pM ou menos. Exemplos não limitativos de construtos específicos de BPXTEN antagonística podem incluir IL-1ra-AM875, IL-1ra-AE864 ou IL-1ra-AM 1296.
[00284] Em alguns casos, as proteínas de fusão BPXTEN da invenção retêm pelo menos cerca de 10% ou cerca de 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% ou 99% da atividade biológica de uma BP correspondente não ligada à proteína de fusão com relação a uma atividade biológica ou efeito farmacológico in vitro conhecido ou associado ao uso da BP nativa no tratamento e prevenção de condições e distúrbios metabólicos. Em alguns casos da modalidade precedente, a atividade do componente BP pode se manifestar pela proteína de fusão BPXTEN intacta enquanto que, em outros casos, a atividade do componente BP se manifestaria primariamente quando de clivagem e liberação da BP da proteína de fusão mediante a ação de uma protease que atua sobre uma sequência de clivagem incorporada na proteína de fusão BPXTEN. No precedente, conforme ilustrado na figura 3, a BPXTEN pode ser projetada para reduzir a afinidade de ligação do componente BP pelo receptor ou ligante quando ligado ao XTEN, mas ter afinidade aumentada quando liberado do XTEN através da clivagem de sequência(s) de clivagem incorporada(s) em uma sequência de BPXTEN, conforme descrito mais completamente acima.
[00285] Em outros casos, a BPXTEN é projetada para reduzir a afinidade de ligação de um componente BP quando ligada ao XTEN para, por exemplo, aumentar a meia-vida terminal da BPXTEN administrada a um indivíduo mediante redução da depuração receptor- mediada ou reduzir a toxicidade ou efeitos colaterais em virtude da composição administrada. Onde a dose ou concentração sanguínea sem efeito toxicológico de uma BP não ligada a um XTEN é baixa (significando que o peptídeo nativo tem um alto potencial de resultar em efeitos colaterais), a invenção proporciona proteínas de fusão BPXTEN nas quais a proteína de fusão é configurada para reduzir a potência ou atividade biológica do componente BP.
[00286] Em alguns casos, descobriu-se que uma BPXTEN pode ser configurada para ter a substancialmente afinidade de ligação reduzida (expressa como Kd) e uma bioatividade correspondente reduzida comparado com a atividade de uma BPXTEN, em que a configuração não resulta em afinidade de ligação reduzida de um componente BP correspondente e que tal configuração é vantajosa em termos de ter uma composição que mostra uma meia-vida terminal longa e retém um grau de bioatividade suficiente. Em um exemplo, descobriu-se que, embora ligação um único XTEN ao C-término de glucagon resulte em retenção de afinidade de ligação significativa a seu receptor-alvo (vide Exemplo 31), ligação de um XTEN ao N-término diminui sua afinidade de ligação e atividade biológica correspondente, comparado com construtos onde o XTEN é ligado ao C-término. Em outro exemplo, descobriu-se que, conforme descrito nos Exemplos, embora ligação de hormônio de crescimento humano (hGH) ao C-término de uma molécula de XTEN não interfira substancialmente com a ligação a receptores de hGH, a adição de um segundo XTEN ao C-término da mesma molécula (colocando o segundo XTEN ao C-término de hGH) reduziu a afinidade da molécula pelo receptor de hGH e também resultou em um aumento na meia-vida terminal da configuração XTEN-hGH-XTEN, comparado com a configuração XTEN-hGH. A capacidade de reduzir a afinidade de ligação da BP por seu receptor-alvo pode ser dependente do requisito de ter um N- ou C-término livre para a BP em particular. Consequentemente, a invenção proporciona um método para aumento da meia-vida terminal de uma BPXTEN por meio de produção de um construto de proteína de fusão com uma única cadeia com uma configuração N- para C-término específica dos componentes compreendendo pelo menos uma primeira proteína biologicamente ativa e um ou mais XTENs em que a proteína de fusão, em uma primeira configuração N- para C-término da proteína biologicamente ativa e componentes XTEN, tem depuração receptor-mediada (RMC) reduzida e um aumento correspondente na meia-vida terminal, comparado com uma BPXTEN em uma segunda configuração N- para C-término. Em uma modalidade do precedente, a BPXTEN é configurada, N- para C- término, como BP-XTEN. Em outra modalidade do precedente, a BPXTEN é configurada como XTEN-BP. Em outra modalidade do precedente, a BPXTEN é configurada como XTEN-BP-XTEN. Em uma última modalidade, as duas moléculas de XTEN podem ser idênticas ou elas podem ter uma composição ou comprimento de sequência diferente. Exemplos não limitativos da modalidade precedente com dois XTENs ligados a uma única BP incluem os construtos AE921-hGH- AE144 (SEQ ID NO: 1817), AE921-hGH-AE288 (SEQ ID NO: 1818), AE864- hGH-AE144, AM875-hGH-AE144 e AM875-hGH-AE288. Exemplos não limitativos da modalidade precedente com uma BP ligada a um XTEN incluem AE144-glucagon (SEQ ID NO: 827), AE288- glucagon (SEQ ID NO: 828), AD576-glucagon (SEQ ID NO: 831), AM923 -glucagon (SEQ ID NO: 840), Y72-glucagon (SEQ ID NO: 823), AM875-IL-1ra ou AE864-IL-1ra. A invenção considera outros de tais construtos nos quais uma BP das Tabelas 3-8 e XTENs da Tabela 2 são substituídos pelos respectivos componentes dos exemplos precedentes e configurados de modo que o construto tenha depuração receptor- mediada reduzida comparado com uma configuração alternativa dos respectivos componentes.
[00287] Em alguns casos, o método proporciona uma BPXTEN configurada na qual a depuração receptor-mediada reduzida pode resultar em um aumento na meia-vida terminal de pelo menos duas vezes ou pelo menos três vezes ou pelo menos quatro vezes ou pelo menos cinco vezes, comparado com a meia-vida de uma BPXTEN em uma segunda configuração onde RMC não é reduzida. A invenção tira vantagem de ligantes de BP em que afinidade de ligação reduzida a um receptor, como um resultado de uma taxa de ligação (on-rate) diminuída ou uma taxa de dissociação (off-rate) aumentada, pode ser afetada pela obstrução do N- ou C-término e uso desse término como a ligação a outros polipeptídeo da composição, quer outra BP, um XTEN ou uma sequência espaçadora. A escolha da configuração particular da proteína de fusão BPXTEN pode reduzir o grau de afinidade de ligação ao receptor, de modo que uma taxa reduzida de depuração receptor- mediada possa ser obtida. Em geral, ativação do receptor está associada à RMC, de modo que ligação de um polipeptídeo a seu receptor sem ativação não leva à RMC, enquanto que ativação do receptor leva à RMC. Contudo, em alguns casos, particularmente onde o ligante tem uma taxa de dissociação (off-rate) aumentada, o ligante pode, todavia, ser capaz de se ligar suficientemente para iniciar a sinalização celular sem disparar a depuração receptor-mediada, com o resultado líquido de que a BPXTEN permanece biodisponível. Em tais casos, a BPXTEN configurada tem uma meia-vida aumentada, comparado com aquelas configurações que levam a um maior grau de RMC.
[00288] Em casos onde uma redução na afinidade de ligação é desejada de forma a reduzir a depuração receptor-mediada, mas retenção de pelo menos uma parte da atividade biológica é desejado, será claro que afinidade de ligação suficiente para obter a ativação de receptor desejada deve, todavia, ser mantida. Assim, em uma modalidade, a invenção proporciona uma BPXTEN configurada de modo que a afinidade de ligação da BPXTEN por um receptor-alvo esteja na faixa de cerca de 0,01%-40% ou cerca de 0,1%-30% ou cerca de 1%- 20% de a afinidade de ligação, comparado com uma BPXTEN correspondente em uma configuração, em que a afinidade de ligação não é reduzida. A afinidade de ligação da BPXTEN configurada é, assim, de preferência, reduzida em pelo menos cerca de 80% ou pelo menos cerca de 85% ou pelo menos cerca de 90% ou pelo menos cerca de 95% ou pelo menos cerca de 99% ou pelo menos cerca de 99,9% ou pelo menos cerca de 99,99% quando comparado com a afinidade de ligação de uma BPXTEN correspondente em uma configuração, em que a afinidade de ligação dum componente BP pelo receptor-alvo não é reduzida ou, comparado com a BP não ligada à proteína de fusão, determinada sob condições comparáveis. Expresso de modo diferente, o componente BP da BPXTEN configurada pode ter uma afinidade de ligação que é tão pequena quanto cerca de 0,01% ou pelo menos cerca de 0,1% ou pelo menos cerca de 1% ou pelo menos cerca de 2% ou pelo menos cerca de 3% ou pelo menos cerca de 4% ou pelo menos cerca de 5% ou pelo menos cerca de 10% ou pelo menos cerca de 20% daquela de um componente BP correspondente de uma BPXTEN em uma configuração, em que a afinidade de ligação dum componente BP não é reduzida. Nas modalidades precedentes descritas aqui acima nesse parágrafo, a afinidade de ligação da BPXTEN configurada pelo receptor-alvo seria "substancialmente reduzida", comparado com uma BP nativa correspondente BP ou uma BPXTEN com uma configuração na qual a afinidade de ligação de um componente BP correspondente não é reduzida. Consequentemente, a presente invenção proporciona composições e métodos para produzir composições com RMC reduzida configurando a BPXTEN de modo a ser capaz de se ligar e ativar um número suficiente de receptores para obter uma resposta biológica in vivo desejada, ao mesmo tempo em que evita ativação de mais receptores do que é requerido para obtenção de tal resposta. Em uma modalidade, a BPXTEN é configurada de modo que a BP em questão esteja no N- término da BPXTEN, em que a RMC da BPXTEN administrada é reduzida, comparado com uma BPXTEN configurada com a BP em questão ligada ao C-término de um XTEN e pelo menos uma parte da atividade biológica da BP nativa é retida. Em outra modalidade, a BPXTEN é configurada de modo que a BP em questão esteja no C-término da BPXTEN, em que a RMC da BPXTEN administrada é reduzida, comparado com uma BPXTEN configurada com a BP em questão está no N-término da BPXTEN e pelo menos uma parte da atividade biológica da BP nativa é retida. Em outra modalidade, a BPXTEN é configurada, N- para C-término, como XTEN-BP-XTEN, em que a RMC da BPXTEN administrada é reduzida, comparado com uma BPXTEN configurada com um XTEN e pelo menos uma parte da atividade biológica da BP nativa é retida. Será evidente para aqueles versados no campo que outras configurações para obter essa propriedade são consideradas pela invenção; por exemplo, adição de uma segunda molécula da BP ou uma sequência espaçadora. Nas modalidades precedentes descritas aqui acima nesse parágrafo, a meia-vida da BPXTEN pode ser aumentada pelo menos cerca de 50% ou pelo menos cerca de 75% ou pelo menos cerca de 100% ou pelo menos cerca de 150% ou pelo menos cerca de 200% ou pelo menos cerca de 300%, comparado com uma BPXTEN configurada, em que a afinidade de ligação e RMC do componente BP não são reduzidas. Nas modalidades precedentes descritas aqui acima nesse parágrafo, a meia-vida aumentada pode permitir maiores dosagens e frequência de dosagem reduzida comparado com a BP não ligada ao XTEN ou, comparado com configurações de BPXTEN em que um componente BP retém uma afinidade de ligação ao receptor comparável à BP nativa.
[00289] Ensaios biológicos específicos in vivo e ex vivo podem também ser usados para avaliar a atividade biológica de cada BPXTEN configurada e/ou componente BP a ser incorporado na BPXTEN. Por exemplo, o aumento de secreção de insulina e/ou transcrição a partir das beta células pancreáticas pode ser medido através de métodos conhecidos no campo. A captação de glicose pelos tecidos pode também ser ensaiada através de métodos tal como o ensaio de "clamp" de glicose e semelhantes. Outros parâmetros in vivo e ex vivo adequados para avaliar a atividade das proteínas de fusão BPXTEN administradas no tratamento de doenças e distúrbios metabólicos incluem nível de glicose em jejum, nível de pico de glicose pós-prandial, homeostase de glicose, resposta ao teste de tolerância à glicose oral, resposta ao estímulo com insulina, HA1c, ingestão calórica, saciedade, taxa de esvaziamento gástrico, secreção pancreática, secreção de insulina, sensibilidade à insulina de tecidos periféricos, massa de beta célula, destruição de beta célula, níveis ou perfil lipídicos no sangue, índice de massa corporal ou peso corporal. Baseado nos resultados desses ensaios ou outros ensaios conhecidos no campo, uma configuração ou composição de BPXTEN pode ser confirmada ou, se necessário, ajustada e re-ensaiada para confirmar a afinidade de ligação pelo alvo ou atividade biológica.
[00290] Ensaios e métodos específicos para medição das propriedades físicas e estruturais de proteínas expressas são conhecidos no campo, incluindo métodos para determinação de propriedades tais como agregação de proteína, solubilidade, estrutura secundária e terciária, propriedades de fusão, contaminação e teor de água, etc. Tais métodos incluem centrifugação analítica, EPR, HPLC- troca de íons, HPLC-exclusão de tamanho, HPLC-fase reversa, dispersão de luz, eletroforese em capilar, dicroísmo circular, calorimetria de varredura diferencial, fluorescência, HPLC-troca de íons, HPLC- exclusão de tamanho, IV, RMN, espectroscopia Raman, refractometria e espectroscopia visível/UV. Métodos adicionais são divulgados em Arnau et al., Prot Expr and Purif (2006) 48, 1-13. Aplicação desses métodos à invenção estará dentro da capacidade daqueles versados no campo.
V) . Usos das Composições da Presente Invenção
[00291] Em outro aspecto, a invenção proporciona um método para obtenção de um efeito benéfico em uma doença, distúrbio ou condição mediada pela BP. A presente invenção se dirige às desvantagens e/ou limitações de BPs que têm uma meia-vida terminal relativamente curta e/ou uma janela terapêutica estreita entre a dose eficaz mínima e a dose máxima tolerada.
[00292] Em uma modalidade, a invenção proporciona um método para obtenção de um efeito benéfico em um indivíduo compreendendo a etapa de administração, ao indivíduo, de uma quantidade terapêutica ou profilaticamente eficaz de uma BPXTEN. A quantidade eficaz pode produzir um efeito benéfico para ajudar a tratar uma doença ou distúrbio. Em alguns casos, o método para obtenção de um efeito benéfico pode incluir a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição de proteína de fusão BPXTEN para tratar um indivíduo com uma doença, distúrbio ou condição relacionada à glicose ou metabolismo incluindo, mas não limitado a, Diabetes do tipo 1, Diabetes do tipo 2, Síndrome X, resistência à insulina, hiperinsulinemia, aterosclerose, neuropatia diabética, dislipidemia, obesidade, distúrbios de alimentação, diabetes gestacional, hipercolesterolemia, hipertensão, massa de beta célula pancreática insuficiente, hipertensão pulmonar ou processos neurodegenerativos retinais. Outros exemplos de doenças ou distúrbios clínicos relacionados à glicose ou metabolismo que podem se beneficiar de tratamento com as composições de BPXTEN da presente invenção incluem, mas não estão limitados a, o "período de lua-de-mel" de diabetes do Tipo I, diabetes juvenil, apetite excessivo, saciedade insuficiente, distúrbio metabólico, glucagonomas, doença de Crohn, colite ulcerativa, insuficiência renal, insuficiência cardíaca congestiva, síndrome nefrótica, distúrbios em que a redução de ingestão de alimento é desejada, alterações catabólicas pós-cirúrgicas, miocárdio em hibernação ou cardiomiopatia diabética, excreção insuficiente de sódio na urina, concentração excessiva de potássio na urina, condições ou distúrbios associados à hipervolemia tóxica, síndrome do ovário policístico, nefropatia, distúrbios gastrintestinais, tais como diarreia, síndrome de "dumping" pós-operatório, síndrome do intestino irritável, polineuropatia por enfermidade crítica (Critical Illness Polyneuropathy - CIPN), síndrome de resposta inflamatória sistêmica (Systemic Inflammatory Response Syndrome - SIRS), dislipidemia, derrame, lesão por reperfusão após isquemia e síndrome de fator de risco por doença cardíaca coronariana (Coronary Heart Doença Risk Factor - CHDRF) ou distúrbios em que a redução de ingestão de alimento é desejada.
[00293] Em alguns casos, o método para obtenção de um efeito benéfico pode incluir administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição de proteína de fusão BPXTEN para tratar um indivíduo com deficiência de proteína de coagulação ou um distúrbio de sangramento incluindo, mas não limitado a, deficiência de Fator VII, deficiência de Fator X, deficiência de Fator XII, hemofilia A, hemofilia B (doença de Christmas), hemofilia C, púrpura trombocitopênica idiopática (Idiopathic Thrombocytopenic Purpura - ITP), doença de Von Willebrand (tipo I e tipo II), sangramento associado a trauma ou sangramento cirúrgico.
[00294] Em outros casos, o método para obtenção de um efeito benéfico pode incluir administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição de proteína de fusão BPXTEN para tratar um indivíduo com um distúrbio ou condição relacionada ao hormônio de crescimento que pode incluir, mas não está limitada a, deficiência de GH em adultos e crianças, síndrome de Turner, síndrome de Prader-Willi, insuficiência renal crônica, retardo de crescimento intrauterino, estatura curta idiopática, complexo da AIDS, obesidade, esclerose múltipla, envelhecimento, doença de Crohn, colite ulcerativa, distrofia muscular ou baixa massa muscular (por exemplo, fisiculturismo), baixa densidade óssea ou qualquer outra indicação para a qual GH é utilizado.
[00295] Em uma modalidade, o método compreende administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica compreendendo uma proteína de fusão composição de BPXTEN compreendendo uma BP ligada a uma sequência de XTEN e pelo menos um veículo farmaceuticamente aceitável a um indivíduo que precisa da mesma que resulta em maior aprimoramento em pelo menos um parâmetro, condição fisiológica ou resultado clínico mediado por um componente BP, comparado com o efeito mediado por administração de uma composição farmacêutica compreendendo uma BP não ligada ao XTEN e administrada em uma dose comparável. Em uma modalidade, a composição farmacêutica é administrada em uma dose terapeuticamente eficaz. Em outra modalidade, a composição farmacêutica é administrada usando múltiplas doses consecutivas usando um regime de dose terapeuticamente eficaz (conforme definido aqui) durante o decorrer do período de dosagem.
[00296] Como um resultado dos parâmetros PK intensificados da BPXTEN, conforme descrito aqui, a BP pode ser administrada usando maiores intervalos entre doses, comparado com uma BP correspondente não ligada ao XTEN para prevenir, tratar, aliviar, reverter ou aliviar sintomas ou anormalidades clínicas da doença, distúrbio ou condição metabólica ou prolongam a sobrevivência do indivíduo que está sendo tratado.
[00297] Os métodos da invenção podem incluir administração de doses consecutivas de uma quantidade terapeuticamente eficaz da BPXTEN durante um período de tempo suficiente para obter e/ou manter o parâmetro ou efeito clínico desejado e tais doses consecutivas de uma quantidade terapeuticamente eficaz estabelece o regime de dose terapeuticamente eficaz para uma BPXTEN; isto é, o esquema para doses consecutivamente administradas da composição de proteína de fusão, em que as doses são fornecidas em quantidade terapeuticamente eficaz para resultar em um efeito benéfico sustentado sobre qualquer sinal ou sintoma clínico, aspecto, parâmetro medido ou característica de um estado doentio ou condição metabólica incluindo, mas não limitado, aqueles descritos aqui.
[00298] Uma quantidade terapeuticamente eficaz da BPXTEN pode variar de acordo com fatores tais como o estado da doença, idade, sexo e peso do indivíduo e a capacidade do anticorpo ou porção de anticorpo de estimular uma resposta desejada no indivíduo. Uma quantidade terapeuticamente eficaz é também uma na qual quaisquer efeitos tóxicos ou prejudiciais BPXTEN são superados pelos efeitos terapeuticamente benéficos. Uma quantidade profilaticamente eficaz refere-se a uma quantidade de BPXTEN requerida durante o período de tempo necessário para obter o resultado profilático desejado.
[00299] Para os métodos da invenção, composições de BPXTEN de maior ação são preferidas, de modo a aprimorar a conveniência para o paciente, a fim de aumentar o intervalo entre doses e reduzir a quantidade de fármaco requerida para obter um efeito sustentado. Em uma modalidade, um método de tratamento compreende administração de uma dose terapeuticamente eficaz de uma BPXTEN a um indivíduo que precisa da mesma que resulta em um ganho no tempo consumido dentro de uma janela terapêutica estabelecida para a proteína de fusão da composição, comparado com um componente BP correspondente não ligada à proteína de fusão e administrada em uma dose comparável a um indivíduo. Em alguns casos, o ganho no tempo consumido dentro da janela terapêutica é pelo menos cerca de três vezes ou pelo menos cerca de quatro vezes ou pelo menos cerca de cinco vezes ou pelo menos cerca de seis vezes ou pelo menos cerca de oito vezes ou pelo menos cerca de dez vezes ou pelo menos cerca de 20 vezes ou pelo menos cerca de 40 vezes, comparado com um componente BP correspondente não ligada à proteína de fusão e administrada em uma dose comparável a um indivíduo. O método ainda estabelece que administração de múltiplas doses consecutivas de uma BPXTEN administrada usando um regime de dose terapeuticamente eficaz a um indivíduo que precisa da mesma pode resultar em um ganho de tempo entre picos Cmax consecutivos e/ou níveis séricos Cmin para os níveis sanguíneos da proteína de fusão, comparado com uma BP correspondente(s) não ligada à proteína de fusão e administrada usando um regime de dosagem estabelecido para essa BP. Na modalidade precedente, o ganho no tempo consumido entre picos Cmax consecutivos e/ou níveis séricos Cmin pode ser pelo menos cerca de três vezes ou pelo menos cerca de quatro vezes ou pelo menos cerca de cinco vezes ou pelo menos cerca de seis vezes ou pelo menos cerca de oito vezes ou pelo menos cerca de dez vezes ou pelo menos cerca de 20 vezes ou pelo menos cerca de 40 vezes, comparado com um componente BP correspondente não ligada à proteína de fusão e administrada usando um regime de dose estabelecido para essa BP. Nas modalidades descritas aqui acima nesse parágrafo, a administração da proteína de fusão pode resultar em um aprimoramento em pelo menos um dos parâmetros (divulgados aqui como sendo úteis para avaliação das doenças, condições ou distúrbios em questão) usando uma menor dose unitária em moles de proteína de fusão, comparado com um componente BP correspondente não ligada à proteína de fusão e administrada em uma dose unitária ou regime de dose comparável a um indivíduo.
[00300] Em uma modalidade, a BPXTEN pode ter atividade que resulta em um aprimoramento em um dos parâmetros clínicos, bioquímicos ou fisiológicos que é maior do que a atividade de um componente BP não ligada ao XTEN, determinado usando o mesmo ensaio ou baseado em um parâmetro clínico medido. Em outra modalidade, a BPXTEN pode ter atividade em dois ou mais parâmetros clínicos ou relacionados ao metabolismo (por exemplo, homeostase de glicose e controle de peso em um indivíduo diabético ou tempos de pró- trombina e sangramento reduzidos em um indivíduo hemofílico ou massa muscular e densidade óssea aumentada em um indivíduo deficiente em hormônio do crescimento), cada um mediado por uma das diferentes BPs que resulta, coletivamente, em um efeito intensificado comparado com um componente BP não ligada ao XTEN, determinado usando os mesmos ensaios ou baseado em parâmetros clínicos medidos. Em outra modalidade, administração da BPXTEN pode resultar em atividade em um ou mais dos parâmetros clínicos ou bioquímicos ou fisiológicos que é de maior duração do que a atividade de um único componente BP não ligada ao XTEN, determinado usando os mesmos ensaios ou baseado em um parâmetro clínico medido.
[00301] Em uma modalidade, o método de tratamento compreende administração de uma BPXTEN usando um regime de dose terapeuticamente eficaz para obter aprimoramentos em um ou mais parâmetros associados ao diabetes ou resistência à insulina. Na modalidade precedente, os aprimoramentos podem ser ensaiados por um ponto de extremidade clínico ou de eficácia primária, por exemplo, um aprimoramento na hemoglobina A1c (HbA1c, vide, por exemplo Reynolds et al., BMJ, 333(7568): 586-589, 2006). Aprimoramentos na HbA1c que são indicativos da eficácia terapêutica podem variar, dependendo da medição de linha de base inicial em um paciente, com uma maior diminuição frequentemente correspondendo a uma maior linha de base inicial e uma menor diminuição frequentemente correspondendo a uma menor linha de base inicial. Em algumas modalidades, o método pode resultar em uma diminuição na HbA1c de pelo menos cerca de 0,5% ou, alternativamente, pelo menos cerca de 1% ou, alternativamente, pelo menos cerca de 1,5% ou, alternativamente, pelo menos cerca de 2% ou, alternativamente, pelo menos cerca de 2,5% ou, alternativamente, pelo menos cerca de 3% ou, alternativamente, pelo menos cerca de 3,5% ou pelo menos cerca de 4% ou mais comparado com os níveis pré-dose. Em outras modalidades, o método de tratamento pode resultar em níveis de açúcar em jejum no sangue (por exemplo, glicose) de menos de 130 mg/dL, alternativamente menos de 125 mg/dL, alternativamente menos de 120 mg/dL, alternativamente menos de 115 mg/dL, alternativamente menos de 110 mg/dL, alternativamente menos de 105 mg/dL ou níveis de açúcar em jejum no sangue de menos de 100 mg/dL. Em outras modalidades, o método pode resultar em reduções nos níveis de açúcar em jejum no sangue (por exemplo, glicose) de mais de cerca de 20%, mais preferivelmente mais de cerca de 30%, mais preferivelmente mais de cerca de 40%, mais preferivelmente mais de cerca de 50%, mais preferivelmente mais de cerca de 60%, mais preferivelmente mais de cerca de 70%, mais preferivelmente mais de cerca de 80% e, ainda mais preferivelmente, mais de cerca de 90%, comparado com níveis pré- dose. Em outras modalidades, o método pode resultar em 120 minutos níveis de glicose em um teste de tolerância oral à glicose (Oral Glucose Tolerance Test - OGTT) de menos de cerca de 200 mg/dL, mais preferivelmente menos de cerca de 190 mg/dL, mais preferivelmente menos de cerca de 180 mg/dL, mais preferivelmente menos de cerca de 170 mg/dL, mais preferivelmente menos de cerca de 160 mg/dL, mais preferivelmente menos de cerca de 150 mg/dL e, ainda mais preferivelmente, menos de cerca de 140 mg/dL. Outros exemplos de métodos de tratamento que estão sendo avaliados por um parâmetro incluem aprimoramento dos tempos de pró-trombina em um indivíduo com hemofilia; por exemplo, administração de uma BPXTEN compreendendo um FIX pode resultar em um tempo de pró-trombina que é pelo menos cerca de 40%, mais preferivelmente pelo menos cerca de 50%, mais preferivelmente pelo menos cerca de 60%, mais preferivelmente pelo menos cerca de 70%, mais preferivelmente pelo menos cerca de 80%, mais preferivelmente pelo menos cerca de 90% ou mais preferivelmente pelo menos cerca de 95%, comparado com um indivíduo normal.
[00302] A invenção ainda considera que a BPXTEN usada de acordo com os métodos proporcionados aqui podem ser administrados em conjunto com outros métodos de tratamento e composições farmacêuticas úteis para tratamento de diabetes, resistência à insulina, distúrbio metabólicos, distúrbios de sangramento ou distúrbios de crescimento. Tais composições podem incluir, por exemplo, inibidores de DPP-IV, insulina, análogos de insulina, agonistas de PPAR gama, agonistas de PPAR de ação dupla, agonistas ou análogos de GLP-1, inibidores de PTP1B, inibidores de SGLT, secretagogos de insulina, agonistas de RXR, inibidores de 3-quinase de sintase de glicogênio, sensibilizantes de insulina, moduladores imunes, agonistas do receptor beta-3 adrenérgico, agonistas Pan-PPAR, inibidores de Ilbeta-HSD1, biguanidas, inibidores de alfa-glucosidase, meglitinidas, tiazolidinadionas, sulfonilureias e outros medicamentos para o diabetes conhecidos na técnica ou fármacos anti-hipertensivos, bloqueadores do canal de cálcio ou fatores de coagulação e produtos relacionados. Em alguns casos, a administração de uma BPXTEN pode permitir o uso de menores dosagens da composição farmacêutica coadministrada para obter um efeito clínico comparável ou parâmetro medido para a doença, distúrbio ou condição no indivíduo.
[00303] O precedente, todavia, em determinadas modalidades, a BPXTEN usada de acordo com os métodos da presente invenção pode prevenir ou retardar a necessidade de métodos de tratamento adicional ou uso de fármaco ou outras composições farmacêuticas em indivíduos com doenças relacionadas à glicose, doenças ou distúrbios metabólicos, distúrbios de coagulação ou distúrbio de deficiência de hormônio de crescimento ou crescimento. Em outras modalidades, a BPXTEN pode reduzir a quantidade, frequência ou duração de métodos de tratamento adicionais ou fármacos ou outras composições farmacêuticas requeridas para tratar a doença, distúrbio ou condição em questão.
[00304] Em outro aspecto, a invenção proporciona um método de design de composições de BPXTEN com propriedades farmacológicas ou farmacêuticas desejadas. As proteínas de fusão BPXTEN são projetadas e preparadas com vários objetivos em mente (comparado com um componente BP não ligado à proteína de fusão), incluindo aprimoramento da eficácia terapêutica para o tratamento de doenças ou distúrbios metabólicos, intensificação das características farmacocinéticas das proteínas de fusão comparado com a BP, diminuição da dose ou frequência de dosagem requerida para obter um efeito farmacológico, intensificação das propriedades farmacêuticas e intensificar a capacidade de componentes BPs de permanecer dentro da janela terapêutica durante um período de tempo prolongado.
[00305] Em geral, as etapas no design e produção das proteínas de fusão e as composições da invenção podem, conforme ilustrado nas FIGS. 4-6, incluem: (1) a seleção de BPs (por exemplo, proteínas nativas, hormônios peptídicos, análogos peptídicos ou derivados com atividade, fragmentos peptídicos, etc.) para tratar a doença, distúrbio ou condição em particular; (2) seleção do XTEN que conferirá a PK desejada e características físico-químicas à BPXTEN resultante (por exemplo, a administração da composição a um indivíduo resulta em uma proteína de fusão sendo mantida dentro da janela terapêutica durante um período maior, comparado com BP não ligada ao XTEN); (3) estabelecimento de uma configuração N- para C-término desejada da BPXTEN para obter a eficácia ou parâmetros PK desejados; (4) estabelecimento do design do vetor de expressão que codifica a BPXTEN configurada; (5) transformação de um hospedeiro adequado com o vetor de expressão; e (6) expressão e recuperação da proteína de fusão resultante. Para aquelas BPXTENs para as quais um aumento na meia-vida (mais de 16 h) ou um período de tempo consumido dentro de uma janela terapêutica aumentado é desejado, o XTEN escolhido para incorporação geralmente terá pelo menos cerca de 500 ou cerca de 576 ou cerca de 864 ou cerca de 875 ou cerca de 913 ou cerca de 924 resíduos de aminoácido onde um único XTEN tem de ser incorporado em uma BPXTEN. Em outra modalidade, a BPXTEN pode compreender um primeiro XTEN do comprimento precedente e um segundo XTEN de cerca de 144 ou cerca de 288 ou cerca de 576 ou cerca de 864 ou cerca de 875 ou cerca de 913 ou cerca de 924 resíduos de aminoácido.
[00306] Em outros casos, onde um aumento na meia-vida não é requerido, mas um aumento em uma propriedade farmacêutica (por exemplo, solubilidade) é desejado, uma BPXTEN pode ser projetada para incluir XTEN de comprimentos mais curtas. Em algumas modalidades do precedente, a BPXTEN pode compreender uma BP ligada a um XTEN tendo pelo menos cerca de 24 ou cerca de 36 ou cerca de 48 ou cerca de 60 ou cerca de 72 ou cerca de 84 ou cerca de 96 resíduos de aminoácido, na qual a solubilidade da proteína de fusão sob condições fisiológicas é pelo menos três vezes maior do que uma BP correspondente não ligada ao XTEN ou, alternativamente, pelo menos quatro vezes ou cinco vezes ou seis vezes ou sete vezes ou oito vezes ou nove vezes ou pelo menos dez vezes ou pelo menos 20 vezes ou pelo menos 30 vezes ou pelo menos 50 vezes ou pelo menos 60 vezes ou mais de glucagon não ligada ao XTEN. Em uma modalidade do precedente, a BP é glucagon. Em outra modalidade do precedente, uma BPXTEN pode compreender glucagon e um polipeptídeo sequência selecionada da Tabelas 12-15. Em ainda outros casos, onde uma meia-vida de 2-6 horas para uma proteína de fusão BPXTEN contendo glucagon é desejada (por exemplo, no tratamento de hipoglicemia noturna), uma proteína de fusão pode ser projetada com XTEN de comprimentos intermediários, tal como cerca de 100 aminoácidos ou cerca de 144 aminoácidos ou cerca de 156 aminoácidos ou cerca de 168 aminoácidos ou cerca de 180 aminoácidos ou cerca de 196 aminoácidos no componente XTEN da BPXTEN contendo glucagon.
[00307] Em outro aspecto, a invenção proporciona métodos de produção de composições de BPXTEN para aprimorar a facilidade de fabricação, resultar em estabilidade aumentada, solubilidade aumentada em água e/ou facilidade de formulação, quando comparado com as BPs nativas. Em uma modalidade, a invenção inclui um método de aumento da solubilidade de uma BP compreendendo a etapa de ligação a BP a um ou mais XTENs, de modo que uma maior concentração na forma solúvel da BPXTEN resultante pode ser obtida, sob condições fisiológicas, quando comparado com a BP em um estado não fundido. Fatores que contribuem para a propriedade de XTEN para conferir solubilidade aumentada em água das BPs quando incorporadas em uma proteína de fusão incluem a alta solubilidade do parceiro de fusão XTEN e o baixo grau de autoagregação entre moléculas de XTEN em solução. Em algumas modalidades, o método resulta em uma proteína de fusão BPXTEN, em que a solubilidade em água é pelo menos cerca de 50% ou pelo menos cerca de 60% maior ou pelo menos cerca de 70% maior ou pelo menos cerca de 80% maior ou pelo menos cerca de 90% maior ou pelo menos cerca de 100% maior ou pelo menos cerca de 150% maior ou pelo menos cerca de 200% maior ou pelo menos cerca de 400% maior ou pelo menos cerca de 600% maior ou pelo menos cerca de 800% maior ou pelo menos cerca de 1000% maior ou pelo menos cerca de 2000% maior ou pelo menos cerca de 4000% maior ou pelo menos cerca de 6000% maior sob condições fisiológicas quando comparado com a BP não fundida.
[00308] Em outra modalidade, a invenção inclui um método para intensificação da vida útil de uma BP compreendendo a etapa de ligação a BP com um ou mais XTENs selecionados, de modo que a vida útil da BPXTEN resultante seja prolongada, comparado com a BP em um estado não fundido. Conforme usado aqui, vida útil refere-se ao período de tempo durante o qual a atividade funcional de uma BP ou BPXTEN que está em solução ou em alguma outra formulação de armazenamento permanece adequada sem perda indevida de atividade. Conforme usado aqui, "atividade funcional" refere-se a um efeito farmacológico ou atividade biológica, tal como a capacidade de se ligar a um receptor ou ligante ou uma atividade enzimática ou mostrar uma ou mais atividades funcionais conhecidas associadas a uma BP, conforme conhecido no campo. Uma BP que degrada ou agrega tem, em geral, atividade funcional reduzida ou biodisponibilidade reduzida comparado com uma que permanece em solução. Fatores que contribuem para a capacidade do método de prolongar a vida útil de BPs quando incorporadas em uma proteína de fusão incluem solubilidade aumentada em água, autoagregação reduzida em solução e estabilidade térmica aumentada do parceiro de fusão XTEN. Em particular, a baixa tendência do XTEN de agregar facilita métodos de formulação de preparados farmacêuticos contendo maiores concentrações de fármaco de BP e a estabilidade térmica do XTEN contribui para a propriedade das proteínas de fusão BPXTEN de permaneceram solúveis e funcionalmente ativas durante períodos prolongados. Em uma modalidade, o método resulta em proteínas de fusão BPXTEN com vida útil "prolongada" ou "estendida" que exibem maior atividade com relação a um padrão que foi submetido às mesmas condições de armazenamento e manipulação. O padrão pode ser BP de comprimento total não fundida. Em uma modalidade, o método inclui a etapa de formulação da BPXTEN isolada com um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis que intensificam a capacidade do XTEN de reter sua conformação não estruturada e para que a BPXTEN permaneça solúvel na formulação durante um tempo que é maior do que aquele da BP não fundida correspondente. Em uma modalidade, o método abrange ligação de uma BP a um XTEN para criar uma proteína de fusão BPXTEN resultante em solução que retém mais de cerca de 100% da atividade funcional ou mais de cerca de 105%, 110%, 120%, 130%, 150% ou 200% da atividade funcional de um padrão quando comparado ao padrão em um determinado ponto de tempo e quando submetida às mesmas condições de armazenamento e manipulação, desse modo, intensificando sua vida útil.
[00309] A vida útil pode também ser ensaiada em termos de atividade funcional após armazenamento, normalizada para a atividade funcional quando armazenamento começa. Proteínas de fusão BPXTEN da invenção com vida útil prolongada ou estendida, conforme exibido por atividade funcional prolongada ou estendida, podem reter cerca de 50% mais da atividade funcional ou cerca de 60%, 70%, 80% ou 90% mais da atividade funcional da BP equivalente não ligada ao XTEN quando submetida às mesmas condições durante o mesmo período de tempo. Por exemplo, uma proteína de fusão BPXTEN da invenção compreendendo exendina-4 ou glucagon fundido a uma sequência de XTEN pode reter cerca de 80% ou mais de sua atividade original em solução durante períodos de até 5 semanas ou mais sob várias condições de temperatura. Em algumas modalidades, a BPXTEN retém pelo menos cerca de 50% ou cerca de 60% ou pelo menos cerca de 70% ou pelo menos cerca de 80% e, ainda mais preferivelmente, pelo menos cerca de 90% ou mais de sua atividade original em solução quando aquecida a 80°C durante 10 min. Em outras modalidades, a BPXTEN retém pelo menos cerca de 50%, de preferência pelo menos cerca de 60% ou pelo menos cerca de 70% ou pelo menos cerca de 80% ou, alternativamente, pelo menos cerca de 90% ou mais de sua atividade original em solução quando aquecida ou mantida a 37°C durante cerca de 7 dias. Em outra modalidade, proteína de fusão BPXTEN retém pelo menos cerca de 80% ou mais de sua atividade funcional após exposição a uma temperatura de cerca de 30°C a cerca de 70°C durante a período de tempo de cerca de uma hora a cerca de 18 horas. Nas modalidades precedentes descritas aqui acima nesse parágrafo, a atividade retida da BPXTEN seria pelo menos cerca de duas vezes ou pelo menos cerca de três vezes ou pelo menos cerca de quatro vezes ou pelo menos cerca de cinco vezes ou pelo menos cerca de seis vezes maior, em um determinado ponto, do que aquela de uma BP correspondente não ligada à proteína de fusão.
VI) . AS SEQUÊNCIAS DE DNA DA INVENÇÃO
[00310] A presente invenção proporciona ácidos nucleicos isolados que codificam polipeptídeos quiméricos BPXTEN e sequências complementares às moléculas de ácido nucleico que codificam polipeptídeos quiméricos BPXTEN, incluindo variantes homólogas. Em outro aspecto, a invenção abrange métodos para produzir ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos quiméricos BPXTEN e sequências complementares à moléculas de ácido nucleico que codificam polipeptídeos quiméricos BPXTEN, incluindo variantes homólogas. Em geral e conforme ilustrado nas FIGS. 4-6, os métodos de produção de uma sequência de polinucleotídeo que codifica uma proteína de fusão BPXTEN e expressão do produto gênico resultante incluem montagem de nucleotídeos que codificam BP e XTEN, ligação dos componentes ”in frame”, incorporação do gene de codificação em um vetor de expressão apropriado, transformação de uma célula hospedeira apropriada com o vetor de expressão e fazer com que a proteína de fusão seja expressa na célula hospedeira transformada, desse modo, produzindo o polipeptídeo BPXTEN biologicamente ativo. Técnicas recombinantes padrões em biologia molecular podem ser usadas para produzir os polinucleotídeos e vetores de expressão da presente invenção.
[00311] De acordo com a invenção, sequências de ácido nucleico que codificam BPXTEN podem ser usadas para gerar moléculas de DNA recombinantes que dirigem a expressão de proteínas de fusão BPXTEN em células hospedeiras apropriadas. Várias estratégias de clonagem são consideradas como sendo adequadas para realização da presente invenção, muitas das quais podem ser usadas para gerar um construto que compreende um gene que codifica uma composição de proteína de fusão BPXTEN da presente invenção ou seu complemento. Em uma modalidade, a estratégia de clonagem poderia ser usada para criar um gene que codifica uma BPXTEN monomérica que compreende pelo menos uma primeira BP e pelo menos um primeiro polipeptídeo XTEN ou seu complemento. Em outra modalidade, a estratégia de clonagem seria usada para criar um gene que codifica uma BPXTEN monomérica que compreende uma primeira e uma segunda molécula de uma BP e pelo menos um primeiro XTEN (ou seu complemento) que seria usado para transformar uma célula hospedeira para expressão da proteína de fusão usada para formular uma composição de BPXTEN. Nas modalidades precedentes descritas aqui acima nesse parágrafo, o gene pode ainda compreender nucleotídeos que codificam sequências espaçadoras que podem também codificar sequência(s) de clivagem.
[00312] Na criação de sequências de XTEN desejadas, descobriu-se que a natureza não repetitiva do XTEN das composições da invenção pode ser obtida a despeito do uso de uma abordagem molecular de "bloco de construção" na criação das sequências que codificam XTEN. Isso foi obtido mediante o uso de uma biblioteca de polinucleotídeos que codifica motivos de sequência que são, então, multimerizados para criar os genes que codificam as sequências de XTEN (vide FIGS. 4 e 5). Assim, embora o XTEN expresso possa consistir de múltiplas unidades de tão pouco quanto quatro motivos de sequência diferentes, em virtude do fato de os motivos em si consistirem de sequências de aminoácido não repetitivas, a sequência do XTEN em geral se torna não repetitiva. Consequentemente, em uma modalidade, os polinucleotídeos que codificam XTEN compreendem múltiplos polinucleotídeos que codificam sequências ou motivos não repetitivos, operavelmente ligados in frame e nos quais as sequências de aminoácido de XTEN expressas resultantes são não repetitivas.
[00313] Em uma abordagem, um construto é primeiro preparado contendo uma sequência de DNA correspondendo à proteína de fusão BPXTEN. DNA que codifica a BP das composições pode ser obtido de uma biblioteca de cDNA preparada usando métodos padrão a partir de tecido ou células isoladas que se acredita possuírem mRNA de BP e expressão do mesmo em um nível detectável. Se necessário, a sequência de codificação pode ser obtida usando procedimentos de extensão de iniciador convencionais, conforme descrito em Sambrook et al., supra, para detectar precursores e intermediários de processamento do mRNA que possam não ter sido transcritos inversamente em cDNA. Consequentemente, DNA pode ser convenientemente obtido de uma biblioteca de cDNA preparada a partir de tais fontes. Um gene que codifica BP pode também ser obtido de uma biblioteca genômica ou criado através de procedimentos sintéticos padrão conhecidos na técnica (por exemplo, síntese de ácido nucleico automática) usando sequências de DNA obtidas de bancos de dados publicamente disponíveis, patentes ou referências da literatura. Tais procedimentos são bem conhecidos na técnica e bem descritos na literatura científica e de patente. Por exemplo, sequências podem ser obtidas de Identificadores de Proteína Modelo pelos Números de Registro no Chemical Abstracts Services (CAS) (publicados pela American Chemical Society) e/ou Números de Acesso ao GenBank (por exemplo, Locus ID, NP XXXXX e XP XXXXX) disponíveis na página da web do National Center for Biotechnology Information (NCBI), disponível na world wide web em ncbi.nlm.nih.gov, que corresponde às entradas no Registro CAS ou banco de dados GenBank que contêm uma sequência de aminoácido da BAP ou de um fragmento ou variante da BAP. Para tais identificadores de sequência fornecidos aqui, uma página extra-associada a cada um desses CAS e Números de Acesso ao GenBank e GenSeq, bem como publicações em jornal citadas (por exemplo, número de ID PubMed (PMID)) são, cada um, incorporados por referência na íntegra, particularmente com relação às sequências de aminoácido descritas aqui. Em uma modalidade, um gene que codifica BP codifica uma proteína de qualquer uma das Tabelas 3-8 ou um fragmento ou variante das mesmas.
[00314] Um gene ou polinucleotídeo que codifica a porção BP da proteína BPXTEN em questão, no caso de uma proteína de fusão expressa que compreenderá uma única BP pode ser, então, clonada em um construto, o qual pode ser um plasmídeo ou outro vetor sob o controle de sequências de transcrição e tradução apropriadas para alto nível de expressão de proteína em um sistema biológico. Em uma etapa posterior, um segundo gene ou polinucleotídeo que codifica o XTEN é geneticamente fundido aos nucleotídeos que codificam o N- e/ou C- término do gene de BP clonando o mesmo construto adjacente e in frame com o(s) gene(s) que codifica(m) a BP. Essa segunda etapa pode ocorrer através de uma etapa de ligação ou multimerização. Nas modalidades precedentes descritas aqui acima nesse parágrafo, deve ser entendido que os construtos gênicos são criados podem, alternativamente, ser o complemento dos respectivos genes que codificam as respectivas proteínas de fusão.
[00315] O gene que codifica o XTEN pode ser feito em uma ou mais etapas, de modo totalmente sintético ou através de síntese combinada com processos enzimáticos, tal como clonagem mediada por enzima de restrição, PCR e extensão por sobreposição. Polipeptídeos XTEN podem ser construídos de modo que o gene que codifica XTEN tenha baixa repetitividade, enquanto que a sequência de aminoácido codificada tenha um grau de repetitividade. Genes que codificam um XTEN com sequências não repetitivas podem ser montados a partir de oligonucleotídeos usando técnicas padrão de síntese gênica. O design do gene pode ser feito usando algoritmos que otimizam o uso de códon e composição de aminoácido. Em um método da invenção, uma biblioteca de construtos de polinucleotídeo que codifica XTEN relativamente curto é criada e, então, montada, conforme ilustrado nas FIGS. 4 e 5. Essa pode ser uma biblioteca de códon pura, de modo que cada membro da biblioteca tenha a mesma sequência de aminoácido, mas muitas sequências de codificação diferentes são possíveis. Tais bibliotecas podem ser montadas a partir de oligonucleotídeos parcialmente randomizados e usadas para gerar grandes bibliotecas de segmentos de XTEN compreendendo os motivos de sequência. O esquema de randomização pode ser otimizado para controlar as escolhas de aminoácido para cada posição, bem como uso de códon.
Bibliotecas de polinucleotídeo
[00316] Em outro aspecto, a invenção proporciona bibliotecas de polinucleotídeos que codificam sequências de XTEN que podem ser usadas para montar genes que codificam XTEN de um comprimento e sequência desejados.
[00317] Em determinadas modalidades, os construtos de biblioteca que codificam XTENs compreendem polinucleotídeos que codificam segmentos polipeptídicos de um comprimento fixo. Como uma etapa inicial, uma biblioteca de oligonucleotídeos que codificam motivos de 914 resíduos de aminoácido pode ser montada. Em uma modalidade preferida, bibliotecas de oligonucleotídeos que codificam motivos de 12 aminoácidos são montadas.
[00318] Os segmentos de sequência que codificam XTEN podem ser dimerizados ou multimerizados em sequências de codificação maiores. Dimerização ou multimerização pode ser realizada através de ligação, extensão por sobreposição, montagem por PCR ou técnicas de clonagem similares conhecidas no campo. Esse processo pode ser repetido múltiplas vezes, até que as sequências de codificação de XTEN resultantes tenham atingido a organização de sequência e comprimento desejados, proporcionando os genes que codificam XTEN. Conforme será apreciado, uma biblioteca de polinucleotídeos que codificam 36 aminoácidos pode ser serialmente dimerizada em uma biblioteca contendo comprimentos sucessivamente maiores de polinucleotídeos que codificam sequências de XTEN. Em algumas modalidades, podem ser montadas bibliotecas de polinucleotídeos que codificam aminoácidos que são limitados às famílias de sequências de XTEN específicas; por exemplo, sequências AD, AE, AF, AG, AM ou AQ da Tabela 1. Em outras modalidades, as bibliotecas podem compreender sequências que codificam duas ou mais sequências da família de motivos da Tabela 1. Os nomes e sequências de sequências de polinucleotídeo representativas, não limitativas de bibliotecas que codificam 36mers são apresentados nas Tabelas 12-15 e os métodos usados para criar as mesmas são descritos mais completamente nos Exemplos. As bibliotecas podem ser usadas, por sua vez, para dimerização serial ou ligação para obter bibliotecas de sequências de polinucleotídeo que codificam sequências de XTEN, por exemplo, de 72, 144, 288, 576, 864, 912, 923, 1296 aminoácidos ou até um comprimento total de cerca de 3000 aminoácidos, bem como comprimentos intermediários. Em alguns casos, as bibliotecas de sequências de polinucleotídeo podem também incluir bases adicionais usadas como "ilhas de sequenciamento", descritas mais completamente abaixo.
[00319] A figura 5 é um fluxograma esquemático de etapas representativas, não limitativas na montagem de um construto de polinucleotídeo XTEN e um construto de polinucleotídeo BPXTEN nas modalidades da invenção. Oligonucleotídeos individuais 501 podem ser anelados em motivos de sequência 502, tal como um motivo de 12 aminoácidos ("12-meros"), o qual é subsequentemente ligado a um oligo contendo Sítios de restrição BbsI e KpnI 503. Motivos de sequência adicionais de uma biblioteca são anelados ao 12-meros até que o comprimento desejado do gene de XTEN 504 seja obtido. O gene de XTEN é clonado em um vetor "stuffer". O vetor pode, opcionalmente, codificar uma sequência Flag 506, seguido por uma sequência "stuffer" que é flanqueada por sítios BsaI, BbsI e KpnI 507 e, nesse caso, um único gene de BP (que codifica exendina-4 nesse exemplo) 508, resultando no gene que codifica uma BPXTEN compreendendo uma única BP 500. Uma lista não exaustiva dos nomes de XTEN e SEQ ID NOS. para polinucleotídeos que codificam um XTEN e sequências precursoras é fornecida na Tabela 11. Tabela 11: Sequências de DNA de XTEN e sequências precursoras
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[00320] Pode-se clonar a biblioteca de genes que codificam XTEN em um ou mais vetores de expressão conhecidos na técnica. Para facilitar a identificação de membros da biblioteca de expressão, pode- se construir a biblioteca como fusão a uma proteína repórter. Exemplos não limitativos de genes repórteres adequados são proteína fluorescente verde, luciferase, fosfatase alcalina e beta-galactosidase. Por meio de triagem, pode-se identificar sequências curtas de XTEN que podem ser expressas em alta concentração no organismo hospedeiro de escolha. Subsequentemente, pode-se gerar uma biblioteca de dímeros de XTEN aleatória e repetir a triagem com relação a alto nível de expressão. Subsequentemente, pode-se realizar triagem dos construtos resultantes com relação a uma série de propriedades, tais como nível de expressão, estabilidade à protease ou ligação a antissoro.
[00321] Um aspecto da invenção é proporcionar sequências de polinucleotídeo que codificam os componentes da proteína de fusão, em que a criação da sequência tenha sofrido otimização de códon. De interesse particular é a otimização de códon com o objetivo de aprimoramento de expressão das composições de polipeptídeo e aprimorar a estabilidade genética do gene de codificação nos hospedeiros de produção. Por exemplo, otimização de códon é de importância particular para sequências de XTEN que são ricas em glicina ou que têm sequências de aminoácido muito repetitivas. Otimização de códon pode ser realizada usando programas de computador (Gustafsson, C. et al. (2004) Trends Biotechnol, 22: 34653), alguns dos quais minimizam a interferência ribossômica (Coda Genomics Inc.). Em uma modalidade, pode-se realizar otimização de códon construindo bibliotecas de códon onde todos os membros da biblioteca codificam a mesma sequência de aminoácido, mas onde uso de códon é variado. Tais bibliotecas podem sofrer triagem por membros altamente expressos e geneticamente adequados que são particularmente apropriados para a produção em larga escala de produtos contendo XTEN. Quando de design de sequências de XTEN, pode-se considerar uma série de propriedades. Pode-se minimizar a repetitividade nas sequências de codificação de DNA. Além disso, pode- se evitar ou minimizar o uso de códons que raramente são usados pelo hospedeiro de produção (por exemplo, os códons de arginina AGG e AGA e um códon de leucina em E. coli). No caso de E. coli, dois códons de glicina, GGA e GGG, raramente são usados em proteínas altamente expressas. Assim, otimização de códon do gene que codifica uma sequência de XTEN pode ser muito desejável. Sequências de DNA que têm um alto nível de glicina tendem a ter um alto teor de GC que pode levar à instabilidade ou baixos níveis de expressão. Assim, quando possível, é preferido escolher códons de modo que o teor de GC da sequência que codifica XTEN seja adequado para o organismo de produção que será usado para produzir o XTEN.
[00322] Opcionalmente, o gene que codifica XTEN de comprimento total pode compreender uma ou mais ilhas de sequenciamento. Nesse contexto, ilhas de sequenciamento são sequências de trecho curto que são distintas das sequências do construto de biblioteca de XTEN e que incluem um sítio de restrição não presente ou que se espera estar presente no gene que codifica XTEN de comprimento total. Em uma modalidade, uma ilha de sequenciamento é a sequência 5'- AGGTGCAAGCGCAAGCGGCGCGCCA AGCACGGGAGGT-S' (SEQ ID NO: 261). Em outra modalidade, uma ilha de sequenciamento é a sequência 5'-AGGTCCAGAACCAACGGGGCCGGC CCCAAGCGGAGGT-S' (SEQ ID NO: 262).
[00323] Como uma alternativa, podem-se construir bibliotecas de códon onde todos os membros da biblioteca codificam a mesma sequência de aminoácido, mas onde o uso de códon é variado. Tais bibliotecas podem sofrer triagem por membros altamente expressos e geneticamente adequados que são particularmente adequados para produção em larga escala de produtos contendo XTEN.
[00324] Opcionalmente, podem-se clonar sequências na biblioteca para eliminar isolados que contêm sequências indesejáveis. A biblioteca inicial de sequências de XTEN curtas pode permitir alguma variação na sequência de aminoácido. Por exemplo, podem-se randomizar alguns códons, de modo que uma série de aminoácidos hidrofílicos possa ocorre em uma posição em particular.
[00325] Durante o processo de multimerização iterativa, pode-se realizar triagem dos membros da biblioteca resultante com relação às outras características, tais como solubilidade ou resistência à protease, além de uma triagem com relação à expressão em alto nível.
[00326] Uma vez que o gene que codifica o XTEN de comprimento e propriedades desejadas é selecionado, ele é geneticamente fundido aos nucleotídeos que codificam N- /ou o C-término do(s) gene(s) de BP por meio de clonagem do mesmo no construto adjacente e in frame com o gene que codifica uma BP ou adjacente a uma sequência espaçadora. A invenção proporciona várias permutações do precedente, dependendo da BPXTEN a ser codificada. Por exemplo, um gene que codifica uma proteína de fusão BPXTEN compreendendo duas BP, tal como concretizado pela fórmula III ou IV, conforme representado acima, o gene teria polinucleotídeos que codificam duas BPs, pelo menos um primeiro XTEN e opcionalmente um segundo XTEN e/ou sequências espaçadoras. A etapa de clonagem de genes de BP em um construto de XTEN pode ocorrer através de ligação ou uma etapa de multimerização. Conforme mostrado na figura 2, os construtos que codificam proteínas de fusão BPXTEN podem ser projetados em diferentes configurações dos componentes XTEN 202, BP 203 e sequências espaçadoras 204. Em uma modalidade, conforme ilustrado na figura 2A, o construto compreende sequências de polinucleotídeo complementares a ou aquelas que codificam um polipeptídeo monomérico de componentes na seguinte ordem (5' para 3') BP 203 e XTEN 202 ou a ordem inversa. Em outra modalidade, conforme ilustrado na figura 2B, o construto compreende sequências de polinucleotídeo complementares a ou aquelas que codificam um polipeptídeo monomérico de componentes na seguinte ordem (5' para 3') BP 203, sequência espaçadora 204 e XTEN 202 ou a ordem inversa. Em outra modalidade, conforme ilustrado na figura 2C, o construto 201 codifica uma BPXTEN monomérica compreendendo sequências de polinucleotídeo complementares a ou aquelas que codificam componentes na seguinte ordem (5' para 3'): duas moléculas de BP 203 e XTEN 202 ou a ordem inversa. Em outra modalidade, conforme ilustrado na figura 2D, o construto compreende sequências de polinucleotídeo complementares a ou aquelas que codificam um polipeptídeo monomérico de componentes na seguinte ordem (5' para 3'): duas moléculas de BP 203, sequência espaçadora 204 e XTEN 202 ou a ordem inversa. Em outra modalidade, conforme ilustrado na figura 2E, o construto compreende sequências de polinucleotídeo complementares a ou aquelas que codificam um polipeptídeo monomérico de componentes na seguinte ordem (5' para 3'): BP 203, sequência espaçadora 204, uma segunda molécula de BP 203 e XTEN 202 ou a ordem inversa. Em outra modalidade, conforme ilustrado na figura 2F, o construto compreende sequências de polinucleotídeo complementares a ou aquelas que codificam um polipeptídeo monomérico de componentes na seguinte ordem (5' para 3'): BP 203, XTEN 202, BP 203 e um segundo XTEN 202 ou a sequência inversa. Os polinucleotídeos espaçadores podem, opcionalmente, compreender sequências que codificam sequências de clivagem. Conforme será evidente para aqueles versados no campo, outras permutações do precedente são possíveis.
[00327] A invenção também abrange polinucleotídeos compreendendo variantes de polinucleotídeo que codificam XTEN que têm um alto percentual de identidade de sequência a (a) uma sequência de polinucleotídeo da Tabela 11 ou (b) sequências que são complementares aos polinucleotídeos de (a). Um polinucleotídeo com um alto percentual de identidade de sequência é um que tem uma identidade de sequência de ácido nucleico de pelo menos cerca de 80%, alternativamente pelo menos cerca de 81%, alternativamente pelo menos cerca de 82%, alternativamente pelo menos cerca de 83%, alternativamente pelo menos cerca de 84%, alternativamente pelo menos cerca de 85%, alternativamente pelo menos cerca de 86%, alternativamente pelo menos cerca de 87%, alternativamente pelo menos cerca de 88%, alternativamente pelo menos cerca de 89%, alternativamente pelo menos cerca de 90%, alternativamente pelo menos cerca de 91%, alternativamente pelo menos cerca de 92%, alternativamente pelo menos cerca de 93%, alternativamente pelo menos cerca de 94%, alternativamente pelo menos cerca de 95%, alternativamente pelo menos cerca de 96%, alternativamente pelo menos cerca de 97%, alternativamente pelo menos cerca de 98% e alternativamente pelo menos cerca de 99% de identidade de sequência de ácido nucleico a (a) ou (b) do precedente ou que pode se hibridizar ao polinucleotídeo alvo ou seu complemento sob condições estringentes.
[00328] Homologia, similaridade de sequência ou identidade de sequência de sequências de nucleotídeo ou aminoácido pode também ser determinada convencionalmente usando software ou programas de computador conhecidos, tais como os programas de comparação aos pares BestFit ou Gap (GCG Wisconsin Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis. 53711). O BestFit usa o algoritmo de homologia local de Smith e Waterman (Advances in Applied Mathematics. 1981. 2: 482-489) para descobrir o melhor segmento de identidade ou similaridade entre duas sequências. O Gap realiza alinhamentos globais: todas, com exceção de uma sequência com todas as outras sequências similares usando o método de Needleman e Wunsch, (Journal of Molecular Biology. 1970, 48: 443- 453).Quando usando um programa de alinhamento de sequência, tal como BestFit, para determinar o grau de homologia, similaridade ou identidade de sequência, a configuração de default pode ser usada ou uma matriz de escore apropriada pode ser selecionada para otimizar os escores de identidade, similaridade ou homologia.
EXEMPLOS Exemplo 1: Construção de segmentos de motivo XTEN_AD36
[00329] O exemplo a seguir descreve a construção de uma coleção de genes códon-otimizado que codificam sequências de motivo de 36 aminoácidos. Como uma primeira etapa, um vetor "stuffer" pCW0359 foi construído baseado em um vetor pETe que inclui um promotor T7. O pCW0359 codifica um domínio de ligação à celulose (Cellulose Binding Domain - CBD) e um sítio de reconhecimento de protease TEV, seguido por uma sequência "stuffer"que é flanqueada por Sítios BsaI, BbsI e KpnI. Os sítios BsaI e BbsI foram inseridos de modo que eles geram saliências compatíveis após digestão. A sequência "stuffer" é seguida por uma versão truncada do gene de GFP e uma His tag. A sequência "stuffer" contém códons terminais e, assim, células de E. coli trazendo o plasmídeo "stuffer" pCW0359 formam colônias não fluorescentes. O vetor "stuffer" pCW0359 foi digerido com BsaI e KpnI para remover o segmento "Stuffer" e o fragmento de vetor resultante foi isolado através de purificação em gel de agarose. As sequências foram designadas XTEN_AD36, refletindo a família de motivos AD. Seus segmentos têm a sequência de aminoácido [X]3 onde X é um peptídeo de 12mer com as sequências: GESPGGSSGSES (SEQ ID NO: 270), GSEGSSGPGESS (SEQ ID NO: 271), GSSESGSSEGGP (SEQ ID NO: 272) ou GSGGEPSESGSS (SEQ ID NO: 273). O inserto foi obtido através de anelamento dos seguintes pares de oligonucleotídeos sintéticos fosforilados: AD1for: AGGTGAATCTCCDGGTGGYTCYAGCGGTTCYGARTC (SEQ ID NO: 274) AD1rev: ACCTGAYTCRGAACCGCTRGARCCACCHGGAGATTC (SEQ ID NO: 275) AD2for: AGGTAGCGAAGGTTCTTCYGGTCCDGGYGARTCYTC (SEQ ID NO: 276) AD2rev: ACCTGARGAYTCRCCHGGACCRGAAGAACCTTCGCT (SEQ ID NO: 277) AD3for: AGGTTCYTCYGAAAGCGGTTCTTCYGARGGYGGTCC (SEQ ID NO: 278) AD3rev: ACCTGGACCRCCYTCRGAAGAACCGCTTTCRGARGA (SEQ ID NO: 279) AD4for: AGGTTCYGGTGGYGAACCDTCYGARTCTGGTAGCTC (SEQ ID NO: 280)
[00330] Nós também Nós também anelamos o oligonucleotídeo fosforilado 3KpnIstopperFor: AGGTTCGTCTTCACTCGAGGGTAC (SEQ ID NO: 281) e o oligonucleotídeo não fosforilado pr_3KpnIstopperRev: CCTCGAGTGAAGACGA (SEQ ID NO: 282). Os pares de oligonucleotídeo anelados foram ligados, o que resultou em uma mistura de produtos com um comprimento variável que representa o número variável de repetições de 12mer ligadas a um segmento BbsI/KpnI. Os produtos correspondendo ao comprimento de 36 aminoácidos foram isolados da mistura através de eletroforese em gel de agarose preparativa e ligados no vetor "stuffer" pCW0359 digerido com BsaI/KpnI. A maioria dos clones na biblioteca resultante, designada LCW0401, mostrou fluorescência verde após indução, o que mostra que a sequência de XTEN_AD36 tinha sido ligada in-frame com o gene de GFP e que a maioria das sequências de XTEN_AD36 tinha bons níveis de expressão.
[00331] Nós realizamos triagem de 96 isolados da biblioteca LCW0401 quanto ao alto nível de fluorescência colocando a mesma sobre uma lâmina de ágar contendo IPTG. Os mesmos isolados foram avaliados através de PCR e 48 isolados foram identificados, os quais continham segmentos com 36 aminoácidos, bem como forte fluorescência. Esses isolados foram sequenciados e 39 clones foram identificados, os quais continham segmentos XTEN_AD36 corretos. Os nomes de depósito dos construtos de nucleotídeo e aminoácido e as SEQ ID NOS para esses segmentos são listadas na Tabela 12. Tabela 12: Sequências de DNA e Aminoácido para motivos de 36-meros
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Exemplo 2: Construção de segmentos XTEN AE36
[00332] Uma biblioteca de códon que codifica uma sequência de XTEN de 36 aminoácido comprimento foi construída. A sequência do XTEN foi designada XTEN AE36. Seus segmentos têm a sequência de aminoácido [X]3 onde X é um peptídeo de 12meros com a sequência: GSPAGSPTSTEE (SEQ ID NO: 359), GSEPATSGSE TP (SEQ ID NO: 360), GTSESA TPESGP (SEQ ID NO: 361) ou GTSTEPSEGSAP (SEQ ID NO: 362). O inserto foi obtido através de anelamento dos seguintes pares de oligonucleotídeos sintéticos fosforilados: AE1for: AGGTAGCCCDGCWGGYT CTCCDACYTCYACYGARGA (SEQ ID NO: 363) AE1rev: ACCTTCYTCRGTRGARGTHGGAGARCCWGCHGGGCT (SEQ ID NO: 364) AE2for: AGGTAGCGAACCKGCWACYTCYGGYTCTGARACYCC (SEQ ID NO: 365) AE2rev: ACCTGGRGTYTCAGARCCRGARGTWGCMGGTTCGCT (SEQ ID NO: 366) AE3for: AGGTACYTCTGAAAGCGCWACYCCKGARTCYGGYCC (SEQ ID NO: 367) AE3rev: ACCTGGRCCRGAYTCMGGRGTWGCGCTTTCAGARGT (SEQ ID NO: 368) AE4for: AGGTACYTCTACYGAACCKTCYGARGGYAGCGCWCC (SEQ ID NO: 369) AE4rev: ACCTGGWGCGCTRCCYTCRGAMGGTTCRGTAGARGT (SEQ ID NO: 370)
[00333] Também anelou-se o oligonucleotídeo fosforilado 3KpnIstopperFor: AGGTTCGTCTTCACTCGAGGGTAC (SEQ ID NO: 371) e o oligonucleotídeo não fosforilado pr_3KpnIstopperRev: CCTCGAGTGAAG ACGA (SEQ ID NO: 372). Os pares de oligonucleotídeo anelados foram ligados, o que resultou em uma mistura de produtos com um comprimento variável que representa o número variável de repetições de 12mer ligadas a um segmento BbsI/KpnI. Os produtos correspondendo ao comprimento de 36 aminoácidos foram isolados da mistura através de eletroforese em gel de agarose preparativa e ligados no vetor "stuffer" pCW0359 digerido com BsaI/KpnI. A maioria dos clones na biblioteca resultante, designada LCW0402 mostrou fluorescência verde após indução, o que mostra que a sequência de XTEN AE36 had tinha sido ligada in-frame com o gene de GFP e a maioria das sequências de XTEN AE36 mostra boa expressão.
[00334] Realizou-se triagem de 96 isolados da biblioteca LCW0402 quanto ao alto nível de fluorescência colocando a mesma sobre uma lâmina de ágar contendo IPTG. Os mesmos isolados foram avaliados através de PCR e 48 isolados foram identificados, os quais continham segmentos com 36 aminoácidos, bem como forte fluorescência. Esses isolados foram sequenciados e 37 clones foram identificados, os quais continham segmentos XTEN AE36 corretos. Os nomes de depósito dos construtos de nucleotídeo e aminoácido e as SEQ ID NOS para esses segmentos são listadas na Tabela 13. Tabela 13: Sequências de DNA e Aminoácido motivos de 36-meros
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Exemplo 3: Construção de segmentos XTEN_AF36
[00335] Uma biblioteca de códon que codifica sequências de 36 aminoácidos comprimento foi construída. As sequências foram designadas XTEN AF36. Seus segmentos têm a sequência de aminoácido [X]3 onde X é um peptídeo de 12mer com a sequência: GSTSESPSGTAP (SEQ ID NO: 447), GTSTPESGSASP (SEQ ID NO: 448), GTSPSGESSTAP (SEQ ID NO: 449) ou GSTSSTAESPGP (SEQ ID NO: 450). O inserto foi obtido através de anelamento dos seguintes pares de oligonucleotídeos sintéticos fosforilados: AF1for: AGGTTCTACYAGCGAATCYCCKTCTGGYACYGC WCC (SEQ ID NO: 451) AF1rev: ACCTGGWGCRGTRCCAGAMGGRGATTCGCTRGTAGA (SEQ ID NO: 452) AF2for: AGGTACYTCTACYCCKGAAAGCGGYTCYGCWTCTCC (SEQ ID NO: 453) AF2rev: ACCTGGAGAWGCRGARCCGCTTTCMGGRGTAGARGT (SEQ ID NO: 454) AF3for: AGGTACYTCYCCKAGCGGYGAATCTTCTACYGCWCC (SEQ ID NO: 455) AF3rev: ACCTGGWGCRGTAGAAGATTCRCCGCTMGGRGARGT (SEQ ID NO: 456) AF4for: AGGTTCYACYAGCTCTACYGCWGAATCTCCKGGYCC (SEQ ID NO: 457) AF4rev: ACCTGGRCCMGGAGATTCWGCRGTAGAGCTRGTRGA (SEQ ID NO: 458)
[00336] Também anelou-se o oligonucleotídeo fosforilado 3KpnIstopperFor: AGGTTCGTCTTCACTCGAGGGTAC (SEQ ID NO: 459) e o oligonucleotídeo não fosforilado pr_3KpnIstopperRev: CCTCGAGTGAAGACGA (SEQ ID NO: 460). Os pares de oligonucleotídeo anelados foram ligados, o que resultou em uma mistura de produtos com um comprimento variável que representa o número variável de repetições de 12mer ligadas a um segmento BbsI/KpnI. Os produtos correspondendo ao comprimento de 36 aminoácidos foram isolados da mistura através de eletroforese em gel de agarose preparativa e ligados no vetor "stuffer" pCW0359 digerido com BsaI/KpnI. A maioria dos clones na biblioteca resultante, designada LCW0403 mostrou fluorescência verde após indução, o que mostra que a sequência de XTEN AF36 tinha sido ligada in-frame com o gene de GFP e a maioria das sequências de XTEN AF36 mostra boa expressão.
[00337] Realizou-se triagem de 96 isolados da biblioteca LCW0403 quanto ao alto nível de fluorescência colocando a mesma sobre uma lâmina de ágar contendo IPTG. Os mesmos isolados foram avaliados através de PCR e 48 isolados foram identificados, os quais continham segmentos com 36 aminoácidos, bem como forte fluorescência. Esses isolados foram sequenciados e 44 clones foram identificados, os quais continham segmentos XTEN AF36 corretos. Os nomes de depósito dos construtos de nucleotídeo e aminoácido e as SEQ ID NOS para esses segmentos são listadas na Tabela 14. Tabela 14: Sequências de DNA e Aminoácido para motivos de 36-meros
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Exemplo 4: Construção de segmentos XTEN_AG36
[00338] Uma biblioteca de códon que codifica sequências de 36 aminoácidos de comprimento foi construída. As sequências foram designadas XTEN_AG36. Seus segmentos têm a sequência de aminoácido [X]3 onde X é um peptídeo de 12mer com a sequência: GTPGSGTASSSP (SEQ ID NO: 549), GSSTPSGATGSP (SEQ ID NO: 550), GSSPSASTGTGP (SEQ ID NO: 551) ou GASPGTSSTGSP (SEQ ID NO: 552). O inserto foi obtido através de anelamento dos seguintes pares de oligonucleotídeos sintéticos fosforilados: AG1for: AGGTACYCCKGGYAGCGGTACYGCWTCTTCYTCTCC (SEQ ID NO: 553) AG1rev: ACCTGGAGARGAAGAWGCRGTACCGCTRCCMGGRGT (SEQ ID NO: 554) AG2for: AGGTAGCTCTACYCCKTCTGGTGCWACYGGYTCYCC (SEQ ID NO: 555) AG2rev: ACCTGGRGARCCRGTWGCACCAGAMGGRGTAGAGCT (SEQ ID NO: 556) AG3for: AGGTTCTAGCCCKTCTGCWTCYACYGGTACYGGYCC (SEQ ID NO: 557) AG3rev: ACCTGGRCCRGTACCRGTRGAWGCAGAMGGGCTAGA (SEQ ID NO: 558) AG4for: AGGTGCWTCYCCKGGYACYAGCTCTACYGGTTCTCC (SEQ ID NO: 559) AG4rev: ACCTGGAGAACCRGTAGAGCTRGTRCCMGGRGAWGC (SEQ ID NO: 560)
[00339] Anelou-se o oligonucleotídeo fosforilado 3KpnIstopperFor: AGGTTCGTCTTCACTCGAGGGTAC (SEQ ID NO: 561) e o oligonucleotídeo não fosforilado pr_3KpnIstopperRev: CCTCGAGTGAAGACGA (SEQ ID NO: 562). Os pares de oligonucleotídeo anelados foram ligados, o que resultou em uma mistura de produtos com um comprimento variável que representa o número variável de repetições de 12 meros ligadas a um segmento BbsI/KpnI. Os produtos correspondendo ao comprimento de 36 aminoácidos foram isolados da mistura através de eletroforese em gel de agarose preparativa e ligados no vetor "stuffer" pCW0359 digerido com BsaI/KpnI. A maioria dos clones na biblioteca resultante, designada LCW0404 mostrou fluorescência verde após indução, o que mostra que a sequência de XTEN_AG36 tinha sido ligada in-frame com o gene de GFP e a maioria das sequências de XTEN_AG36 mostra boa expressão.
[00340] Realizou-se triagem de 96 isolados da biblioteca LCW0404 quanto ao alto nível de fluorescência colocando a mesma sobre uma lâmina de ágar contendo IPTG. Os mesmos isolados foram avaliados através de PCR e 48 isolados foram identificados, os quais continham segmentos com 36 aminoácidos, bem como forte fluorescência. Esses isolados foram sequenciados e 44 clones foram identificados, os quais continham segmentos XTEN_AG36 corretos. Os nomes de depósito dos construtos de nucleotídeo e aminoácido e as SEQ ID NOS para esses segmentos são listadas na Tabela 15. Tabela 15: Sequências de DNA e Aminoácido para motivos de 36 meros
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Exemplo 5: Construção de XTEN_AE864
[00341] XTEN_AE864 foi construído a partir de dimerização serial de XTEN AE36 em AE72, 144, 288, 576 e 864. Uma coleção de segmentos XTEN AE72 foi construída a partir de 37 diferentes segmentos de XTEN AE36. Culturas de E. coli abrigando todos os 37 diferentes segmentos de 36 aminoácidos foram misturadas e plasmídeo foi isolado. Esse pool de plasmídeo foi digerido com BsaI/NcoI para gerar o pequeno fragmento como o inserto. O mesmo pool de plasmídeo foi digerido com BbsI/NcoI para gerar o grande fragmento como o vetor. O inserto e os fragmentos de vetor foram ligados, resultando em uma duplicação do comprimento e a mistura de ligação foi transformada em células BL21Gold(DE3) para obter colônias de XTEN_AE72.
[00342] Essa biblioteca de segmentos XTEN_AE72 foi designada LCW0406. Todos os clones de LCW0406 foram combinados e dimerizados novamente usando o mesmo processo conforme descrito acima, proporcionando a biblioteca LCW0410 de XTEN_AE144. Todos os clones da LCW0410 foram combinados e dimerizados novamente usando o mesmo processo conforme descrito acima, proporcionando a biblioteca LCW0414 de XTEN_AE288. Dois isolados, LCW0414.001 e LCW0414.002, foram aleatoriamente selecionados da biblioteca e sequenciados para verificar as identidades. Todos os clones da LCW0414 foram combinados e dimerizados novamente usando o mesmo processo conforme descrito acima, proporcionando a biblioteca LCW0418 de XTEN_AE576. Realizou-se triagem de 96 isolados da biblioteca LCW0418 com relação ao alto nível de fluorescência de GFP. 8 isolados com tamanhos corretos de inserto através de PCR e forte fluorescência foram sequenciados e 2 isolados (LCW0418.018 e LCW0418.052) foram escolhidos para futuro uso baseado nos dados de sequenciamento e expressão.
[00343] O clones específico pCW0432 de XTEN_AE864 foi construído combinando LCW0418.018 de XTEN_AE576 e LCW0414.002 de XTEN_AE288 usando o mesmo processo de dimerização conforme descrito acima.
Exemplo 6: Construção de XTEN_AM 144
[00344] Uma coleção de segmentos XTEN_AM144 foi construída começando a partir de 37 diferentes segmentos de XTEN_AE36, 44 segmentos de XTEN_AF36 e 44 segmentos de XTEN_AG36.
[00345] Culturas de E. coli que abrigavam todos os 125 diferentes segmentos de 36 aminoácidos foram misturadas e o plasmídeo foi isolado. Esse pool de plasmídeo foi digerido com BsaI/NcoI para gerar o pequeno fragmento como o inserto. O mesmo pool de plasmídeo foi digerido com BbsI/NcoI para gerar o grande fragmento como o vetor. Os fragmentos de inserto e de vetor foram ligados, resultando em uma duplicação do comprimento e a mistura de ligação foi transformada em células BL21Gold(DE3) para obter colônias de XTEN_AM72.
[00346] Essa biblioteca de segmentos XTEN_AM72 foi designada LC W0461. Todos os clones da LCW0461 foram combinados e dimerizados novamente usando o mesmo processo conforme descrito acima, proporcionando a biblioteca LCW0462. 1512 Isolados da biblioteca LCW0462 sofreram triagem com relação à expressão de proteína. Colônias individuais foram transferidas para lâminas com 96 cavidades e cultivadas durante a noite como culturas iniciais. Essas culturas iniciais foram diluídas em meio de autoindução fresco e cultivadas durante 20-30h. Expressão foi medida usando um leitor de placa de fluorescência com excitação a 395 nm e emissão a 510 nm. 192 isolados mostraram alto nível de expressão e foram submetidos a sequenciamento de DNA. A maioria dos clones na biblioteca LCW0462 mostrou boa expressão e propriedades físico-químicas similares, sugerindo que a maioria das combinações de segmentos XTEN_AM36 proporcionou sequências de XTEN úteis. 30 isolados de LCW0462 foram escolhidos como uma coleção preferida de segmentos XTEN_AM144 para a construção de proteínas multifuncionais que contêm múltiplos segmentos XTEN. Os nomes de depósito dos construtos de nucleotídeo e aminoácido e as SEQ ID NOS para esses segmentos são listadas na Tabela 16. Tabela 16: Sequências de DNA e Aminoácido para segmentos AM144
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Exemp o 7: Construção de XTEN AM288
[00347] Toda a biblioteca LCW0462 foi dimerizada, conforme descrito no Exemplo 6, resultando em uma biblioteca de clones de XTEN_AM288 designada isolados de LCW0463. 1512 da biblioteca LCW0463 sofreram triagem usando o protocolo descrito no Exemplo 6. 176 clones de alta expressão foram sequenciados e 40 segmentos XTEN_AM288 preferidos foram escolhidos para a construção de proteínas multifuncionais que contêm múltiplos segmentos XTEN com 288 resíduos de aminoácido.
Exemplo 8: Construção de XTEN_AM432
[00348] Gerou-se uma biblioteca de segmentos XTEN_AM432 através de recombinação de segmentos da biblioteca LCW0462 de segmentos XTEN_AM144 e segmentos da biblioteca LCW0463 de segmentos XTEN_AM288. Essa nova biblioteca de segmentos XTEN_AM432 foi designada LCW0464. Plasmídeo foi isolado de culturas de E. coli abrigando LCW0462 e LCW0463, respectivamente. 1512 isolados da biblioteca LCW0464 sofreram triagem usando o protocolo descrito no Exemplo 6. 176 clones de alta expressão foram sequenciados e 39 segmentos XTEN_AM432 preferidos foram escolhidos para a construção de XTENs maiores e para a construção de proteínas multifuncionais que contêm múltiplos segmentos de XTEN com 432 resíduos de aminoácido.
[00349] Em paralelo, construiu-se a biblioteca LMSO 100 de segmentos XTEN_AM432 usando segmentos preferidos de XTEN_AM144 e XTEN_AM288. Triagem dessa biblioteca proporcionou 4 isolados que foram selecionados para outra construção.
Exemplo 9: Construção de XTEN_AM875
[00350] O vetor "stuffer" pCW0359 foi digerido com BsaI e KpnI para remover o segmento "stuffer" e o fragmento de vetor resultante foi isolado por meio de purificação em gel de agarose.
Anelou-se o oligonucleotídeo fosforilado BsaI-AscI-KpnIforP:
[00351] AGGTGCAAGCGCAAGCGGCGCGCCAAGCACGGGAGG TTCGTCTTCACTCGAGGGTAC (SEQ ID NO: 717) e o oligonucleotídeo não fosforilado BsaI-AscI-KpnIrev: CCTCGAGTGAAGACGAACCTCCCGTGCTTGGCGCGCCG CTTGCGCTTGC (SEQ ID NO: 718) para introdução da ilha de sequenciamento A (SI-A) a qual codifica os aminoácidos GASASGAPSTG (SEQ ID NO: 719) e tem a sequência de nucleotídeo de reconhecimento de enzima de restrição AscI, GGCGCGCC, internamente. Os pares de oligonucleotídeo anelados foram ligados com o vetor "stuffer" pCW0359 digerido com BsaI e KpnI preparado acima para proporcionar o pCW0466 contendo SI-A. Então, gerou-se uma biblioteca de segmentos XTEN_AM443 através de recombinação de 43 segmentos XTEN_AM432 preferidos do Exemplo 8 e segmentos SI-A do pCW0466 no C-término usando o mesmo processo de dimerização descrito no Exemplo 5. Essa nova biblioteca de segmentos XTEN_AM443 foi designada LCW0479.
[00352] Gerou-se uma biblioteca de segmentos XTEN_AM875 através de recombinação de segmentos da biblioteca LCW0479 de segmentos XTEN_AM443 e 43 segmentos XTEN_AM432 preferidos do Exemplo 8 usando o mesmo processo de dimerização descrito no Exemplo 5. Essa nova biblioteca de segmentos XTEN_AM875 foi designada LCW0481.
Exemplo 10: Construção de XTEN_AM1318
[00353] Anelou-se o oligonucleotídeo fosforilado BsaI-FseI-KpnIforP:
[00354] AGGTCCAGAACCAACGGGGCCGGCCCCAAGCGGAGG TTCGTCTTCACTCGAGGGTAC (SEQ ID NO: 720) e
[00355] o oligonucleotídeo não fosforilado BsaI-FseI-KpnIrev:
[00356] CCTCGAGTGAAGACGAACCTCCGCTTGGGGCCGGCCC CGTTGGTTCTGG (SEQ ID NO: 721) para introdução de ilha de sequenciamento B (SI-B) a qual codifica aminoácidos GPEPTGP APSG (SEQ ID NO: 722) e tem sequência de nucleotídeo de reconhecimento de enzima de restrição FseI, GGCCGGCC, internamente. Os pares de oligonucleotídeo anelados foram ligados com vetor "stuffer" pCW0359 digerido com BsaI e KpnI usado no Exemplo 9 para proporcionar o pCW0467 contendo SI-B. Então, gerou-se uma biblioteca de segmentos de XTEN_AM443 através de recombinação de 43 segmentos XTEN_AM432 preferidos do Exemplo 8 e segmentos SI-B do pCW0467 no C-término usando o mesmo processo de dimerização descrito no Exemplo 5. Essa nova biblioteca de segmentos XTEN_AM443 foi designada LCW0480.
[00357] Gerou-se uma biblioteca de segmentos XTEN_AM1318 através de recombinação de segmentos a partir da biblioteca LCW0480 de segmentos XTEN_AM443 e segmentos da biblioteca LCW0481 de segmentos XTEN_AM875 usando o mesmo processo de dimerização conforme no Exemplo 5. Essa nova biblioteca de segmentos XTEN_AM1318 foi designada LCW0487.
Exemplo 11: Construção de XTEN_AD864
[00358] Usando os vários ciclos consecutivos de dimerização, foi montada uma coleção de sequências de XTEN_AD864 começando a partir de segmentos de XTEN_AD36 listados no Exemplo 1. Essas sequências foram montadas conforme descrito no Exemplo 5. Vários isolados de XTEN_AD864 foram avaliados e mostraram boa expressão e excelente solubilidade sob condições fisiológicas. Um construto intermediário de XTEN_AD576 foi sequenciado. Esse clone foi avaliado em um experimento de PK em macacos cynomolgus e uma meia-vida de cerca de 20h foi medida.
Exemplo 12: Construção de XTEN_AF864
[00359] Usando os vários ciclos consecutivos de dimerização, montou-se uma coleção de sequências de XTEN_ AF864 começando a partir de segmentos de XTEN AF36 listados no Exemplo 3. Essas sequências foram montadas conforme descrito no Exemplo 5. Vários isolados de XTEN AF864 foram avaliados e mostraram boa expressão e excelente solubilidade sob condições fisiológicas. Um construto intermediário de XTEN AF540 foi sequenciado. Esse clone foi avaliado em um experimento PK em macacos cynomolgus e uma meia-vida de cerca de 20h foi medida. Um clone de comprimento total de XTEN_AF864 tinha excelente solubilidade e mostrou meia-vida excedendo a 60h em macacos cynomolgus. Um segundo conjunto de sequências XTEN_AF foi montado, incluindo uma ilha de sequenciamento, conforme descrito no Exemplo 9.
[00360] Exemplo 13: Construção de XTEN_AG864
[00361] Usando os vários ciclos consecutivos de dimerização, montou-se uma coleção de sequências de XTEN_AG864 começando a partir de XTEN_AD36 listadas no Exemplo 1. Essas sequências foram montadas conforme descrito no Exemplo 5. Vários isolados de XTEN_AG864 foram avaliados e mostraram boa expressão e excelente solubilidade sob condições fisiológicas. Um clone de XTEN_AG864 de comprimento total tinha excelente solubilidade e mostrou meia-vida excedendo 60h em macacos cynomolgus.
Exemplo 14: Construção de extensões N-terminais de XTEN- Construção e triagem de bibliotecas com adição de 12 meros
[00362] Esse exemplo detalha uma etapa na otimização do N- término da proteína XTEN para promover o início de tradução a fim de permitir expressão de fusões de XTEN no N-término de proteínas de fusão sem a presença de um domínio auxiliar. Para criar diversidade a nível de códon, sete sequências de aminoácido foram selecionadas e preparadas com uma diversidade de códon. Sete pares de oligonucleotídeos que codificam 12 aminoácidos com diversidades de códon foram projetados, anelados e ligados no Vetor "stuffer" pCW0551 digerido com enzima de restrição NdeI/BsaI (Stuffer-XTEN_AM875- GFP) e transformados em células competentes de E. coli BL21Gold(DE3) para obter colônias de sete bibliotecas. Os clones resultantes têm 12 meros de XTEN N-terminais fundidos in-frame ao XTEN_AM875-GFP para permitir uso de fluorescência de GFP para triagem de expressão. Colônias individuais das sete bibliotecas criadas foram selecionadas e crescidas durante a noite até saturação em 500 μl de meio super broth em uma lâmina com 96 cavidades profundas. O número de colônias selecionadas oscilava de aproximadamente metade a um terço da diversidade teórica da biblioteca (vide Tabela 17). Tabela 17: Diversidade teórica e números de amostragem para bibliotecas de adição de 12 meros Biblioteca, Família do motivo, Similar a CBD, Sequência de aminoácido, Diversidade teórica, Número selecionado, Placas, Placa
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[00363] As culturas saturadas durante a noite foram usadas para inocular 500 μl fresco em meio de autoindução, no qual elas foram crescidas durante a noite a 26°C. Essas culturas de expressão foram, então, ensaiadas usando um leitor de placa de fluorescência (excitação a 395 nm, emissão a 510 nm) para determinar a quantidade de repórter GFP presente. Os resultados indicam que níveis de expressão médios são aproximadamente metade dos níveis de expressão com o domínio auxiliar CBD N-terminal. Contudo, os melhores clones das bibliotecas estavam muito mais próximos dos padrões e indicam que otimização adicional em torno dessas sequências era assegurada. Também estava claro que as bibliotecas começando com aminoácidos MA produziam melhor expressão do que aquelas com ME. Isso era mais evidente quando observando os melhores clones, os quais estavam mais próximos dos padrões, uma vez que eles começavam principalmente com MA. Dos 176 clones dentro de 33% do padrão CBD-AM875, 87% começam com MA, comparado com apenas 75% das sequências nas bibliotecas começando com MA, uma representação clara dos clones começando com MA no maior nível de expressão. 96 dos melhores clones foram sequenciados para confirmar a identidade e doze sequências (vide Tabela 18), 4 de LCW546, 4 de LCW547 e 4 de LCW552 foram selecionadas para otimização adicional. Tabela 18: Sequências de DNA de 12 meros avançadas
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Exemplo 15: Construção de extensões N-terminais de XTEN- Construção e triagem de Bibliotecas com otimização dos códons 3 e 4
[00364] Esse exemplo detalha uma etapa na otimização do N- término da proteína XTEN para promover o início de tradução a fim de permitir expressão das fusões de XTEN no N-término de proteínas sem a presença de um domínio auxiliar. Com preferências pelos primeiros dois códons estabelecidos (vide Exemplo supra), os terceiro e quarto códons foram randomizados para determinar preferências. Três bibliotecas, baseadas nos melhores clones de LCW546, LCW547 e LCW552, foram projetadas com os terceiro e quarto resíduos modificados, de modo que todas as combinações de códons de XTEN permissíveis estivessem presentes nessas posições. De forma a incluir todos os códons de XTEN permissíveis para cada biblioteca, nove pares de oligonucleotídeos que codificam 12 aminoácidos com diversidades de códon dos terceiro e quarto resíduos foram projetados, anelados e ligados no Vetor "stuffer" pCW0551 digerido com enzima de restrição NdeI/BsaI (Stuffer-XTEN_AM875-GFP) e transformados em células competentes de E. coli BL21Gold(DE3) para obter colônias de três bibliotecas LCW0569-571. Com 24 Códons de XTEN, a diversidade teórica de cada biblioteca é 576 clones únicos. Um total de 504 colônias individuais das três bibliotecas criadas foi selecionado e crescido durante a noite até saturação em 500μl de meio super broth em uma lâmina com 96 cavidades profundas. Isso forneceu cobertura suficiente para entender o desempenho relativo da biblioteca e preferências de sequência. As culturas saturadas durante a noite foram usadas para inocular novas culturas de 500 μl em meio de autoindução as quais foram crescidas durante a noite a 26°C. Essas culturas de expressão foram, então, ensaiadas usando um leitor de placa de fluorescência (excitação a 395 nm, emissão a 510 nm) para determinar a quantidade de repórter GFP presente. Os 75 clones superiores da triagem foram sequenciados e testados novamente com relação à expressão do repórter GFP versus as amostras-padrão. 52 clones forneceram dados de sequenciamento utilizáveis e foram usados para subsequente análise. Os resultados foram depreendidos pela biblioteca e indicam que LCW546 era a biblioteca superior. Os resultados são apresentados na Tabela 19. Tabela 19: Comparação de biblioteca com otimização dos terceiro e quarto codons
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[00365] Outras tendências foram observadas nos dados mostrando preferência por códons particulares nas terceira e quarta posições. Dentro da biblioteca LCW569, o códon de glutamato GAA na terceira posição e o códon de treonina ACT estavam associados a uma maior expressão, conforme visto na Tabela 20. Tabela 20: Terceiro e Quarto códons preferidos em LCW569
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[00366] Adicionalmente, o novo teste dos 75 clones superiores indicou que vários eram agora superiores aos clones-padrão.
Exemplo 16: Construção de extensões N-terminais de XTEN- Construção e Triagem de Bibliotecas Combinatoriais de 12 meros e 36 meros
[00367] Esse exemplo detalha uma etapa na otimização do N- término da proteína XTEN para promover o início de tradução para permitir expressão de fusões de XTEN no N-término de proteínas sem a presença de um domínio auxiliar. Com preferências pelos primeiros dois códons estabelecidos (vide Exemplo supra), o N-término foi examinado em um contexto mais amplo combinando as 12 sequências de 12 meros selecionadas (vide Exemplo supra) no N-término, seguido por 125 segmentos de 36 meros previamente construídos (vide exemplo supra) de uma maneira combinatorial. Isso criou novos 48 meros no N- término da proteína XTEN e permitiu a avaliação do impacto de interações de maiores faixa no N-término sobre a expressão de sequências maiores (figura 11). Similar aos procedimentos de dimerização usados para montar 36 meros (vide Exemplo infra), os plasmídeos contendo os 125 segmentos de 36 meros selecionados foram digeridos com enzimas de restrição BbsI/NcoI e o fragmento apropriado foi purificado em gel. O plasmídeo do clone AC94 (CBD- XTEN_AM875-GFP) foi também digerido com BsaI/NcoI e os fragmentos apropriados foram purificados em gel. Esses fragmentos foram ligados juntos e transformados em células competentes de E. coli BL21Gold(DE3) para obter colônias da biblioteca LCW0579, a qual também serviu como o vetor para clonagem adicional de 12 12mers selecionados no N-término. Os plasmídeos de LCW0579 foram digeridos com NdeI/EcoRI/BsaI e os fragmentos apropriados foram purificados em gel. 12 pares de oligonucleotídeos que codificam 12 sequências de 12 meros selecionadas foram projetados, anelados e ligados com o vetor LCW0579 digerido com NdeI/EcoRI/BsaI e transformados em células competentes de E. coli BL21Gold(DE3) para obter colônias da biblioteca LCW0580. Com uma diversidade teórica de 1500 clones únicos, um total de 1512 colônias individuas da biblioteca criada foram selecionadas e crescidas durante a noite até saturação em 500 μl de meio super broth em uma lâmina com 96 cavidades profundas. Isso forneceu cobertura suficiente para entender o desempenho relativo da biblioteca e preferências de sequência. As culturas saturadas durante a noite foram usadas para inocular novas culturas de 500 μl em meio de autoindução que foram crescidas durante a noite a 26°C. Essas culturas de expressão foram, então, ensaiadas usando um leitor de placa de fluorescência (excitação a 395 nm, emissão a 510 nm) para determinar a quantidade de repórter GFP presente. Os 90 clones superiores foram sequenciados e testados novamente com relação à expressão do repórter GFP. 83 clones proporcionaram dados de sequenciamento utilizáveis e foram usados para subsequente análise. Os dados de sequenciamento foram usados para determinar os 12 meros líder que estavam presentes em cada clone e o impacto de cada 12 meros sobre a expressão foi avaliado. Clones LCW546 06 e LCW546 09 continuaram sendo o melhor N-término (vide Tabela 21). Tabela 21: Desempenho Relativo de Clones Começando com LCW546 06 e LCW459 09
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[00368] O sequenciamento e novo teste também revelaram diversos casos de réplicas independentes da mesma sequência nos dados, produzindo resultados similares e, assim, aumentando a confiança no ensaio. Adicionalmente, 10 clones com 6 sequências únicas eram superiores ao clone-padrão. Eles são apresentados na Tabela 22. Foi notado que esses eram as únicas ocorrências dessas sequências e, em nenhum caso, uma dessas sequências ocorria e falhava em se comparar ao clone-padrão. Essas seis sequências foram levadas à otimização adicional. Tabela 22: Clones combinatoriais de 12 meros e 36 meros superiores ao clone-padrão Nome do clone, Primeiros 60 clones, Nome de 12 meros, Nome de 36 meros
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Exemplo 17: Construção de extensões N-terminais de XTEN- Construção e triagem de bibliotecas combinatoriais de 12 meros e 36 meros para XTEN-AM875 e XTEN-AE864
[00369] Esse exemplo detalha uma etapa na otimização do N- término da proteína XTEN para promover o início de tradução a fim de permitir expressão de fusões de XTEN no N-término de proteínas sem a presença de um domínio auxiliar. Com preferências pelos primeiros quatro códons (vide Exemplos supra) e o melhor emparelhamento 12 meros e 36 meros N-terminais (vide Exemplo supra) estabelecidos, uma abordagem combinatorial foi empreendida para examinar a união dessas preferências. Isso criou novos 48 meros no N-término da proteína XTEN e permitiu o teste da confluência de conclusões anteriores. Adicionalmente, a capacidade dessas sequências líderes de ser uma solução universal para todas as proteínas XTEN foi avaliada colocando os novos 48 meros na frente de XTEN-AE864 e XTEN- AM875. Ao invés de usar todos os 125 clones do segmento de 36 meros, os plasmídeos de 6 clones de segmentos de 36 meros selecionados com melhor expressão de GFP na biblioteca combinatorial foram digeridos com Ndel/EcoRI/BsaI e os fragmentos apropriados foram purificados em gel. Os plasmídeos dos clones AC94 (CBD- XTEN_AM875- GFP) e AC 104 (CBD-XTEN_AE864-GFP) foram digeridos com Ndel/EcoRI/BsaI e os fragmentos apropriados foram purificados em gel. Esses fragmentos foram ligados juntos e transformados em células competentes de E. coli BL21Gold(DE3) para obter colônias das bibliotecas LCW0585 (-XTEN_AM875- GFP) e LCW0586 (-XTEN_AE864-GFP), as quais poderiam também servir como os vetores para clonagem adicional de 8 sequências de 12 meros selecionadas no N-término. Os plasmídeos de LCW0585 e LCW0586 foram digeridos com Ndel/EcoRI/BsaI e os fragmentos apropriados foram purificados em gel. 8 pares de oligonucleotídeos que codificam 8 sequências de 12 meros selecionadas com melhor expressão de GFP na triagem anterior (Geração 2) foram projetados, anelados e ligados com os LCW0585 e LCW0586 digeridos com vetores Ndel/EcoRI/BsaI e transformados em células competentes de E. coli BL21Gold(DE3) para obter colônias das bibliotecas LCW0587 (XTEN_AM923-GFP) e LCW0588 (XTEN AE912-GFP) finais. Com uma diversidade teórica de 48 clones únicos, um total de 252 colônias individuais das bibliotecas criadas foi selecionado e crescidas durante a noite até saturação em 500 μl de meio super broth em uma lâmina com 96 cavidades profundas. Isso forneceu cobertura suficiente para entender o desempenho relativo da biblioteca e preferências de sequência. As culturas saturadas durante a noite foram usadas para inocular novas culturas de 500 μl em meio de autoindução as quais foram crescidas durante a noite a 26°C. Essas culturas de expressão foram, então, ensaiadas usando um leitor de placa de fluorescência (excitação a 395 nm, emissão a 510 nm) para determinar a quantidade de repórter GFP presente. Os 36 clones foram sequenciados e testados novamente com relação à expressão do repórter GFP. 36 clones forneceram dados de sequenciamento utilizáveis e esses 36 foram usados para a subsequente análise. Os dados de sequenciamento determinaram os 12 meros, o terceiro códon, o quarto códon e os 36 meros presentes no clone e revelaram que muitos dos clones eram réplicas independentes da mesma sequência. Adicionalmente, os resultados do novo teste para esses clones são de valor próximo, indicando que o processo de triagem era robusto. Preferências para determinadas combinações no N-término foram observadas e proporcionaram consistentemente maiores valores de fluorescência do que os controles-padrão (vide Tabelas 23 e 24). Tabela 23: Combinações N-terminais preferidas para XTEN-AM875
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Tabela 24: Combinações N-terminais prel feridas para XTEN-AE864
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[00370] Notavelmente, a combinação preferida do N-terminal para XTEN-AM875 e a combinação preferida para XTEN- AE864 não são as mesmas (Tabelas 23 e 24), indicando interações ainda mais complexas do que 150 bases a partir do sítio inicial influenciam os níveis de expressão. As sequências para as sequências de nucleotídeo preferidas são listadas na Tabela 25 e os clones preferidos foram analisados através de SDS-PAGE para confirmar independentemente a expressão. As sequências de XTEN_AM923 e XTEN_AE912 completas foram selecionadas para análise adicional. Tabela 25: Sequências de DNA preferidas para os primeiros 48 Resíduos de aminoácido de XTEN-AM875 e XTEN-AE864 N-terminais
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Exemplo 18: Métodos de produção e avaliação de BPXTEN; XTEN-Ex4 como exemplo
[00371] O esquema geral para produção e avaliação de composições de BPXTEN é apresentado na figura 6 e forma a base para a descrição geral desse Exemplo. Usando os métodos divulgados e aqueles conhecidos por aqueles versados no campo, junto com a orientação fornecida nos exemplos ilustrativos, aqueles versados no campo podem criar e avaliar uma série de proteínas de fusão BPXTEN compreendendo XTENs, BP e variantes de BP conhecidos no campo. O Exemplo, portanto, deve ser construído como meramente ilustrativo e não limitativo dos métodos de maneira alguma; numerosas variações serão evidentes para aqueles versados no campo. Nesse Exemplo, uma BPXTEN de exendina-4 ("Ex4") ligada a um XTEN da família AE de motivos seria criada.
[00372] O esquema geral para produção de polinucleotídeos que codificam um XTEN é apresentado nas figuras 4 e 5. A figura 5 é um fluxograma esquemático de etapas representativas na montagem de um construto de polinucleotídeo de XTEN em uma das modalidades da invenção. Oligonucleotídeos individuais 501 são anelados em motivos de sequência 502 tal como um motivo de 12 aminoácidos ("12 meros"), o qual é subsequentemente ligado a um oligo contendo sítios de restrição BbsI e KpnI 503. As bibliotecas de motivo podem ser limitadas às famílias de sequências de XTEN específicas; por exemplo, sequências AD, AE, AF, AG, AM ou AQ da Tabela 1. Nesse caso, os motivos da família AE (SEQ ID NOS: 186-189) seriam usados como a biblioteca de motivos, os quais são anelados aos 12 meros para criar um comprimento do "bloco de construção"; por exemplo, um segmento que codifica 36 aminoácidos. O gene que codifica a sequência do XTEN pode ser montado através de ligação e multimerização dos "blocos de construção", até que o comprimento desejado do gene de XTEN 504 seja obtido. Conforme ilustrado na figura 5, o comprimento do XTEN, nesse caso, é de 48 resíduos de aminoácido, mais comprimentos maiores podem ser obtidos através desse processo. Por exemplo, multimerização pode ser realizada através de ligação, extensão por sobreposição, montagem por PCR ou técnicas de clonagem similares conhecidas no campo. O gene de XTEN pode ser clonado em um vetor "stuffer". No exemplo ilustrado na figura 5, o vetor pode codificar uma sequência Flag 506, seguido por uma sequência "stuffer" que é flanqueada por Sítios BsaI, BbsI e KpnI 507 e um gene de BP (por exemplo, exendina-4) 508, resultando no gene que codifica a BPXTEN 500 o qual, nesse caso codifica a proteína de fusão na configuração, N- para C- término, XTEN-Ex4.
[00373] Sequências de DNA que codificam Ex4 (ou outra BP candidata) podem ser convenientemente obtidas através de procedimentos-padrão conhecidos na técnica a partir de uma biblioteca de cDNA preparada a partir de uma fonte celular apropriada, a partir de uma biblioteca genômica ou podem ser criadas sinteticamente (por exemplo, síntese de ácido nucleico automática) usando sequências de DNA obtidas a partir de bancos de dados publicamente disponíveis, patentes ou referências na literatura. Um gene ou polinucleotídeo que codifica a porção Ex4 da proteína pode, então, ser clonado em um construto, tal como aquele descrito aqui, o qual pode ser um plasmídeo ou outro vetor sob o controle de sequências de transcrição e tradução apropriadas quanto à expressão de proteína em alto nível em um sistema biológico. Um segundo gene ou polinucleotídeo que codifica a porção XTEN (no caso da figura 5 ilustrada como um AE com 48 resíduos de aminoácido) pode ser geneticamente fundido aos nucleotídeos que codificam o N- término do gene de Ex4 por meio de clonagem do mesmo no construto adjacente e in-frame com o gene que codifica a Ex4, através de uma etapa de ligação ou multimerização. Dessa maneira, uma molécula de DNA quimérica que codifica (ou é complementar) à proteína de fusão BPXTEN XTEN-Ex4 será gerada dentro do construto. O construto pode ser projetado em diferentes configurações para codificar as várias permutações dos parceiros de fusão como um polipeptídeo monomérico. Por exemplo, o gene pode ser criado para codificar a proteína de fusão na ordem (N- para C- término): Ex4-XTEN; XTEN-Ex4; Ex4-XTEN- Ex4; XTEN- Ex4-XTEN; bem como multímeros do precedente. Opcionalmente, essa molécula de DNA quimérica pode ser transferida ou clonada em outro construto que é um vetor de expressão mais apropriado. Nesse ponto, uma célula hospedeira capaz de expressão da molécula de DNA quimérica seria transformada com a molécula de DNA quimérica. Os vetores contendo os segmentos de DNA de interesse podem ser transferidos para uma célula hospedeira apropriada através de métodos bem conhecidos, dependendo do tipo de hospedeiro celular, conforme descrito supra.
[00374] Células hospedeiras contendo o vetor de expressão XTEN- Ex4 serão cultivadas em meio nutriente convencional modificado conforme apropriado para ativação do promotor. As condições de cultura, tais como temperatura, pH e similares, são aquelas previamente usadas com a célula hospedeira selecionada para expressão e serão evidentes para aqueles versados no campo. Após expressão da proteína de fusão, as células serão coletadas através de centrifugação, rompidas através de meios físicos ou químicos e o extrato bruto resultante retido para purificação da proteína de fusão, conforme descrito abaixo. Para composições de BPXTEN secretadas por células hospedeiras, o sobrenadante da centrifugação será separado e retido para purificação adicional.
[00375] Expressão gênica será medida em uma amostra diretamente, por exemplo, através de Southern blotting convencional, Northern blotting para quantificar a transcrição de mRNA [Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 5201-5205 (1980)], dot blotting (análise de DNA) ou hibridização in situ, usando uma sonda apropriadamente rotulada, baseado nas sequências fornecidas aqui. Alternativamente, expressão gênica será medida através de métodos fluorescentes imunológicos, tal como coloração imuno-histoquímica de células, para quantificar diretamente a expressão de produto gênico. Anticorpos úteis para coloração imuno-histoquímica e/ou ensaios de fluidos de amostra podem ser monoclonais ou policlonais e podem ser preparados em qualquer mamífero. Convenientemente, os anticorpos podem ser preparados contra a sequência polipeptídica de Ex4 usando um peptídeo sintético baseado nas sequências fornecidas aqui ou contra sequências exógenas fundidas a Ex4 que codificam um epitopo de anticorpo específico. Exemplos de marcadores selecionáveis são bem conhecidos por aqueles versados no campo e incluem repórteres tais como proteína fluorescente verde intensificada (EGFP), beta-galactosidase (β- gal) ou acetiltransferase de cloranfenicol (CAT).
[00376] O produto polipeptídico XTEN-Ex4 será purificado via métodos conhecidos na técnica. Procedimentos tais como filtração em gel, purificação por afinidade, fracionamento de sal, cromatografia de troca de íon, cromatografia por exclusão de tamanho, cromatografia por adsorção de hidroxiapatita, cromatografia de interação hidrofóbica ou eletroforese em gel são todas técnicas que podem ser usadas na purificação. Métodos específicos de purificação são descritos em Robert K. Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Charles R. Castor, ed., Springer-Verlag 1994 e Sambrook et al., supra. Separações por purificação com múltiplas etapas são também descritas em Baron et al., Crit. Rev. Biotechnol. 10: 179-90 (1990) e Bellow et al., J. Chromatogr. A. 679: 67-83 (1994).
[00377] Conforme ilustrado na figura 6, proteínas de fusão XTEN- Ex4 isoladas serão, então, caracterizadas com relação às suas propriedades químicas e atividade. A proteína de fusão isolada poderia ser caracterizada, por exemplo, pela sequência, pureza, peso molecular aparente, solubilidade e estabilidade usando métodos-padrão conhecidos na técnica. Proteínas de fusão reunindo os requisitos esperados são, então, avaliadas com relação à atividade, a qual pode ser medida in vitro ou in vivo, usando um ou mais ensaios divulgados aqui; por exemplo, os ensaios dos Exemplos ou Tabela 39.
[00378] Além disso, a proteína de fusão XTEN-Ex4 seria administrada a uma ou mais espécies animais para determinar parâmetros farmacocinéticos padrão, conforme descrito no Exemplo 25.
[00379] Através do processo iterativo de produção, expressão e recuperação de construtos XTEN-Ex4, seguido por sua caracterização usando métodos divulgados aqui ou outros conhecidos na técnica, as composições de BPXTEN compreendendo Ex4 e um XTEN podem ser produzidas e avaliadas por aqueles versados na técnica para confirmar as propriedades esperadas, tais como solubilidade intensificada, estabilidade intensificada, farmacocinética aprimorada e imunogenicidade reduzida, levando a uma atividade terapêutica global intensificada, comparada com a Ex4 não fundida correspondente. Para aquelas proteínas de fusão não possuindo as propriedades desejadas, uma sequência diferente pode ser construída, expressa, isolada e avaliada através desses métodos de forma a obter uma composição de tais propriedades.
Exemplo 19: Cromatografia por exclusão de tamanho analítica das proteínas de fusão XTEN
[00380] Análise através de cromatografia por exclusão de tamanho foi realizada sobre proteínas de fusão contendo várias proteínas terapêuticas e proteínas recombinantes não estruturadas de comprimento crescente. Um ensaio exemplificativo usou uma coluna TSKGel-G4000 SWXL (7,8 mm x 30 cm) na qual 40 μg de proteína de fusão de glucagon purificada, em uma concentração de 1 mg/ml, foi separada em uma taxa de fluxo de 0,6 ml/min em fosfato a 20 mM, pH de 6,8, NaCl a 114 mM. Perfis de cromatograma foram monitorados usando OD214nm e OD280nm. Calibrações de coluna para todos os ensaios foram realizadas usando um padrão de calibração por exclusão de tamanho da BioRad; os marcadores incluem tiroglobulina (670 kDa), gama-globulina bovina (158 kDa), ovalbumina de galinha (44 kDa), mioglobulina de equino (17 kDa) e vitamina B12 (1.35 kDa). Perfis cromatográficos representativos de Glucagon_Y288, Glucagon_Y144, Glucagon_Y72, Glucagon_ Y36 são mostrados como uma sobreposição na figura 15. Os dados mostram que o peso molecular aparente de cada composto é proporcional ao comprimento da sequência rPEG presa. Contudo, os dados também mostram que o peso molecular aparente de cada construto é significativamente maior do que o esperado para uma proteína globular (conforme mostrado por comparação com as proteínas-padrão utilizadas no mesmo ensaio). Baseado nas análises por SEC para todos os construtos avaliados, os pesos moleculares aparentes, o Fator de Peso Molecular Aparente (expresso como a proporção de Peso Molecular Aparente para o peso molecular calculado) e o raio hidrodinâmico (RH em nM) são mostrados na Tabela 26. Os resultados indicam que a incorporação de diferentes XTENs de 576 aminoácidos ou mais confere um peso molecular aparente à proteína de fusão de aproximadamente 339 kDa a 760 e que XTEN de 864 aminoácidos ou mais confere um peso molecular aparente maior de aproximadamente 800 kDA. Os resultados de aumentos proporcionais no peso molecular aparente para o peso molécula real eram consistentes para proteínas de fusão criadas com XTENs de várias famílias de motivo diferentes; isto é, AD, AE, AF, AG e AM, com aumentos de pelo menos quatro vezes e proporções tão altas quanto cerca de 17 vezes. Adicionalmente, a incorporação de parceiros de fusão XTEN com 576 aminoácidos ou mais nas proteínas de fusão com peptídeos de regulação de glicose resultou em um raio hidrodinâmico de 7 nm ou maior; bem além do tamanho de poro glomerular de aproximadamente 3-5 nm. Consequentemente, conclui-se que proteínas de fusão compreendendo peptídeos de regulação de glicose e XTEN teriam depuração renal reduzida, contribuindo para uma meia- vida terminal aumentada e aprimoramento do efeito terapêutico ou biológico com relação a uma proteína biologicamente ativa não fundida correspondente. Tabela 26: Análise por SEC de vários polipeptídeos
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Exemplo 20: Farmacocinética de polipeptídeos estendidos fundidos a GFP em macacos cynomolgus
[00381] A farmacocinética de GFP-L288, GFP-L576, GFP- XTEN_AF576, GFP-XTEN_Y576 e XTEN_AD836-GFP foi testada em macacos cynomolgus para determinar o efeito da composição e comprimento dos polipeptídeos não estruturados sobre os parâmetros PK. Amostras de sangue foram analisadas em vários tempos após injeção e a concentração de GFP no plasma foi medida através de ELISA usando um anticorpo policlonal contra GFP para captura e um preparado biotinilado do mesmo anticorpo policlonal para detecção. Os resultados são resumidos na figura 23. Eles mostram um aumento surpreendente na meia-vida com aumento do comprimento da sequência do XTEN. Por exemplo, uma meia-vida de 10 h foi determinada para GFP- XTEN_L288 (com 288 resíduos de aminoácido no XTEN). Duplicação do comprimento o parceiro de fusão polipeptídico não estruturado para 576 aminoácidos aumentou a meia-vida para 2022 h para múltiplos construtos de proteínas de fusão; isto é, GFP- XTEN_L576, GFP-XTEN_AF576, GFP-XTEN_Y576. Um aumento adicional do comprimento do parceiro de fusão polipeptídico não estruturado para 836 resíduos resultou em uma meia-vida de 72-75 h para XTEN_AD836-GFP. Assim, aumento de comprimento do polímero em 288 resíduos, de 288 para 576 resíduos, aumentou a meia-vida in vivo em cerca de 10 h. Contudo, aumento de comprimento do polipeptídeo em 260 resíduos, de 576 resíduos para 836 resíduos, aumentou a meia-vida em mais de 50 h. Esses resultados mostram que há um limiar surpreendente de comprimento de polipeptídeo não estruturado que resulta em um maior ganho proporcional na meia-vida in vivo. Assim, espera-se que proteínas de fusão compreendendo polipeptídeos não estruturados estendidos tenham a propriedade de intensificar a farmacocinética, comparado com polipeptídeos de comprimentos mais curtos.
Exemplo 21: Estabilidade no soro de XTEN
[00382] Uma proteína de fusão contendo XTEN_AE864 fundido ao N-término de GFP foi incubada em plasma de macaco e lisato de rim de rato durante até 7 dias a 37°C. As amostras foram retiradas no tempo 0, Dia 1 e Dia 7 e analisadas através de SDS PAGE, seguido por detecção usando análise de Western e detecção com anticorpos contra GFP, conforme mostrado na figura 13. A sequência de XTEN_AE864 mostrou sinais negligenciáveis de degradação durante 7 dias no plasma. Contudo, XTEN_AE864 foi rapidamente degradado no lisato de rim de rato durante 3 dias. A estabilidade da proteína de fusão in vivo foi testada em amostras de plasma, em que a GFP_AE864 foi imunoprecipitada e analisada através de SDS-PAGE, conforme descrito acima. Amostras que foram extraídas até 7 dias após injeção mostraram muitos poucos sinais de degradação. Os resultados demonstram a resistência da BPXTEN à degradação em virtude de proteases no soro; um fator na intensificação de propriedades farmacocinéticas das proteínas de fusão BPXTEN.
Exemplo 22: Construção de genes e vetores XTEN_IL-1ra de componentes de BPXTEN
[00383] O gene que codifica IL-1ra humana de 153aa foi amplificado através de reação em cadeia de polimerase (PCR) com iniciadores 5 '- ATAAAGGGTCTCCAGGTCGTCCGTCCGGTCGTAAATC (SEQ ID NO: 756) e 5 '-AACTCGAAGCTTTTATTCGTCCTCCTGGAAGTAAAA (SEQ ID NO: 757), os quais introduziram sítios de restrição BsaI e HindIII (sublinhados) que são compatíveis com os sítios BbsI e HindIII que flanqueiam o "stuffer" no vetor de destino XTEN (figura 7C). O vetor de destino XTEN contém o gene de resistência à canamicina e é derivado de pET30 da Novagen no formato de Domínio de Ligação à Celulose (CBD) -XTEN-Proteína Fluorescente Verde (GFP), onde GFP é o "stuffer" para clonagem de "payloads" no C-término. Construtos foram gerados substituindo GFP nos vetores de destino XTEN pelo fragmento que codifica IL-1ra (figura 7). O vetor de destino XTEN se caracteriza por um promotor T7 a montante do CBD, seguido por uma sequência de XTEN fundida in-frame a montante da sequência "stuffer" de GFP. As sequências de XTEN empregadas são AM875, AM1318, AF875 e AE864, as quais têm comprimentos de 875, 1318, 875 e 864 aminoácidos, respectivamente. O fragmento de GFP "stuffer" foi removido através de digestão por restrição usando endonucleases BbsI e HindIII. O fragmento de DNA de IL-1ra digerido com BsaI e HindIII foi ligado no vetor de destino XTEN digerido com BbsI e HindIII usando DNA ligase T4 e a mistura de ligação foi transformada na cepa BL21 (DE3) Gold (Stratagene) de E. coli por meio de eletroporação. Os transformantes foram identificados pela capacidade de crescer sobre lâminas LB contendo o antibiótico canamicina. DNAs de plasmídeo foram isolados de clones selecionados e confirmados através de análise por restrição e sequenciamento de DNA. O vetor final proporciona o gene de CBD_XTEN_IL-1ra sob o controle de um promotor T7 e o CBD é clivado por um sítio de clivagem TEV manipulado na extremidade para gerar XTEN_IL_1-ra. Vários construtos com IL-1ra fundida no C-término a diferentes XTENs incluem AC1723 (CBD-XTEN_AM875-IL-1ra), AC175 (CBD-XTEN_AM1318-IL-1ra), AC180 (CBD-XTEN_AF875-IL- 1ra) e AC182 (CBD-XTEN_AE864-IL-1ra).
Exemplo 23: Expressão, purificação e caracterização de agonista de receptor de interleucina-1 humana (IL-1ra) fundida a XTEN_AM875 e XTEN_AE864 Produção de cultura de célula
[00384] Uma cultura inicial foi preparada através de inoculação de estoques em glicerol de E. coli trazendo um plasmídeo que codifica IL- 1ra fundida a AE864, AM875 ou AM 1296 em 100 mL de 2x meio YT contendo 40 ug/mL de canamicina. A cultura foi, então, agitada durante a noite a 37°C. 100 mL da cultura inicial foram usados para inocular 25 litros de 2xYT contendo 40 μg/mL de canamicina e agitados até que a OD600 atingisse cerca de 1,0 (durante 5 horas) a 37°C. A temperatura foi, então, reduzida para 26°C e expressão de proteína foi induzida com IPTG em uma concentração final de 1,0 mM. A cultura foi, então, agitada durante a noite a 26°C. As células foram coletadas através de centrifugação, proporcionando um total de 200 gramas de pasta de célula. A pasta foi armazenada congelada a -80°C até uso.
Purificação de BPXTEN compreendendo IL-1ra-XTEN AE864 ou IL-1ra- AM875
[00385] Pasta de células foi suspensa em Tris a 20 mM, pH de 6,8, NaCl a 50 mM em uma proporção de 4 ml de tampão por grama de pasta de célula. A pasta de célula foi, então, homogeneizada usando um agitador superior. Lise de célula foi obtida passando a amostra uma vez através de um microfluidificador a 139,9 mPa (20000 psi). O lisato foi clarificado através de centrifugação a 12000 rpm em um rotor Sorvall G3A durante 20 minutos.
[00386] Lisato clarificado foi diretamente aplicado a 800 ml de resina de troca de ânions Macrocap Q (GE Life Sciences) que tinha sido equilibrada com Tris a 20 mM, pH de 6,8, NaCl a 50 mM. A coluna foi sequencialmente lavada com tampão de Tris, pH de 6,8 contendo NaCl a 50 mM, 100 mM e 150 mM. O produto foi eluído com Tris a 20 mM, pH de 6,8, NaCl a 250 mM.
[00387] Uma coluna Octil Sepharose FF de 250 mL foi equilibrada com tampão de equilíbrio (Tris a 20 mM, pH de 6,8, Na2SO4 a 1,0 M). Na2SO4 sólido foi adicionado ao pool de eluato Macrocap Q para obter uma concentração final de 1,0 M. A solução resultante foi filtrada (0,22 mícron) e carregada sobre a coluna de HIC. A coluna foi, então, lavada com tampão de equilíbrio para 10 CV a fim de remover a proteína não ligada e DNA de célula hospedeira. O produto foi, então, eluído com Tris a 20 mM, pH de 6,8, Na2SO4 a 0,5 M.
[00388] As frações de eluato de HIC agrupadas foram, então, diluídas com Tris a 20 mM, pH de 7,5 para obter uma condutividade de menos de 5,0 mOhms. O produto diluído foi carregado sobre uma coluna de troca de ânions Q Sepharose FF de 300 ml que tinha sido equilibrada com Tris a 20 mM, pH de7,5, NaCl a 50 mM.
[00389] As proteínas com tampão trocado foram, então, concentradas através de ultrafiltração/diafiltração (UF/DF), usando um cartucho Pellicon XL Biomax de 30000, para mais de 30 mg/ml. O concentrado foi filtrado estéril usando um filtro com seringa de 0,22 mícron. A solução final foi transformada em alíquotas e armazenada a - 80°C e foi usada para os experimentos que seguem, infra.
Análise por SDS-PAGE
[00390] 2 e 10 mcg de proteína purificada final foram submetidos a SDS-PAGE de não redução usando gel NuPAGE de Bis-Tris a 4-12% da Invitrogen de acordo com as especificações do fabricante. Os resultados (figura 14) mostram que a composição de IL-1ra- XTEN_AE864 foi recuperada por meio do processo detalhado acima, com um MW aproximado de cerca de 160 kDa.
Cromatografia por exclusão de tamanho analítica
[00391] Análise através de cromatografia por exclusão de tamanho foi realizada usando uma coluna Phenomenex BioSEP SEC S4000 (7,8 x 300 mm). 20 μg da proteína purificada em uma concentração de 1 mg/ml foram separados em uma taxa de fluxo de 0,5 ml/min em Tris-Cl a 20 mM, pH de 7,5, NaCl a 300 mM. Perfis de cromatograma foram monitorados através da absorbância a 214 e 280 nm. Calibração de coluna foi realizada usando um padrão de calibração por exclusão de tamanho da BioRad, os marcadores incluindo tiroglobulina (670 kDa), gama-globulina bovina (158 kDa), ovalbumina de galinha (44 kDa), mioglobulina de equino (17 kDa) e vitamina B12 (1.35 kDa). Um perfil cromatográfico representativo de IL-1ra-XTEN_AM875 é mostrado na figura 15, onde os padrões de calibração são mostrados na linha tracejada e IL-1ra-XTEN_AM875 é mostrada como a linha sólida. Os dados mostram que o peso molecular aparente de cada construto é significativamente maior do que aquele esperado para uma proteína globular (conforme mostrado pela comparação com as proteínas- padrão utilizadas no mesmo ensaio) e têm um peso molecular aparente significativamente maior do que aquele determinado através de SDS- PAGE, descrito acima.
RP-HPLC Analítica
[00392] Análise por cromatografia RP-HPLC analítica foi realizada usando uma coluna Vydac Protein C4 (4,6 x 150 mm). A coluna foi equilibrada com ácido trifluoroacético a 0,1% em água com grau para HPLC em uma taxa de fluxo de 1 ml/min. Dez microgramas da proteína purificada em uma concentração de 0,2 mg/ml foram injetados separadamente. A proteína foi eluída com um gradiente linear de acetonitrila a 5% a 90% em TFA a 0,1%. Perfis de cromatograma foram monitorados usando OD214nm e OD280nm. Um cromatograma de um lote representativo de IL-1ra-XTEN_AM875 é mostrado na figura 16.
Ligação ao Receptor de IL-1
[00393] Para avaliar a atividade de proteínas de fusão de XTEN contendo IL-1ra, um ensaio de ligação a receptor baseado em ELISA foi usado. Aqui, as cavidades de uma lâmina de ensaio Costar 3690 foram revestidas durante a noite com 50 ng por cavidade de receptor de IL-1 de camundongo fundido ao domínio Fc de IgG humana (IL-1R/Fc, R&D Systems). Subsequentemente, as cavidades foram bloqueadas com BSA a 3% para impedir interações não específicas com a fase sólida. Após lavar totalmente as cavidades, uma série de diluições de IL-1ra- XTEN_AM875, XTEN_AM875-IL-1ra ou IL-1ra (anakinra) foi aplicada às cavidades. A reação de ligação foi deixada processar durante 2 horas em temperatura ambiente. IL-1ra não ligada foi removida através de lavagem repetida. IL-1ra e fusões IL-1ra-XTE ligadas foram detectadas com um anticorpo anti-IL-1ra humano biotinilado e estreptavidina conjugada à peroxidase de rábano silvestre. A reação foi revelada com substrato TMB durante 20 minutos em temperatura ambiente. Desenvolvimento de cor foi cessado com a adição de ácido sulfúrico a 0,2 N. A absorbância de cada cavidade a 450 nm e 570 nm foi registrada sobre um espectrofotômetro SpectrMax 384Plus. O sinal de absorbância corrigido (Abscorr = AbS450nm-Abs570nm) foi plotado como uma função da concentração de IL-1ra-XTEN ou IL-1ra para produzir um isoterma de ligação, conforme mostrado na figura 17.
[00394] Para estimar a afinidade de ligação de cada proteína de fusão pelo receptor de IL-1, os dados de ligação foram adaptados a uma curva de dose-resposta sigmoidal. A partir da adaptação dos dados, uma EC50 (a concentração de IL-1ra ou IL-1ra-XTEN na qual o sinal é metade do máximo) para cada construto foi determinada. Conforme mostrado na figura 17, a EC50 de IL-1ra-XTEN_AM875, onde o "payload" foi preso ao N-término do XTEN, era comparável a IL-1ra não modificada (anakinra EC50 = 0,013 nM, IL-1ra-XTEN_AM875 EC50 = 0,019 nM). XTEN_AM875-IL-1ra, onde o "payload" foi preso ao C- término do XTEN, exibiu ligação mais fraca, com uma EC50 (0,204 nM) que era aproximadamente 15 vezes maior do que IL-1ra. O controle negativo, construto XTEN_hGH, não mostrou ligação sob as condições experimental.
Estabilização térmica de IL-1ra pelo XTEN
[00395] Além da meia-vida prolongada no soro de produtos terapêuticos de proteína, polipeptídeos XTEN têm a propriedade de aprimoramento da estabilidade térmica de um "payload" ao qual ele é fundido. Por exemplo, a natureza hidrofílica do polipeptídeo XTEN pode reduzir ou prevenir a agregação e, assim, favorecer o re-enovelamento da proteína "payload". Essa característica do XTEN pode auxiliar no desenvolvimento de formulações estáveis em temperatura ambiente para uma variedade de produtos terapêuticos de proteína.
[00396] De forma a demonstrar a estabilização térmica de IL-1ra conferida pela conjugação ao XTEN, IL- 1ra-XTEN e IL-1ra recombinante, 200 micromoles por litro, foram incubados a 25°C e 85°C durante 15 min, tempo no qual qualquer proteína insolúvel foi rapidamente removida através de centrifugação. A fração solúvel foi, então, analisada por meio de SDS-PAGE, conforme mostrado na figura 18. Note que apenas IL-1ra-XTEN permaneceu solúvel após aquecimento enquanto que, em contraste, IL-1ra recombinante (sem XTEN como um parceiro de fusão) foi completamente precipitada após aquecimento.
[00397] A atividade de ligação do receptor de IL-I de IL-1ra-XTEN foi avaliada após o tratamento térmico descrito acima. A ligação ao receptor foi realizada conforme descrito acima. IL-1ra recombinante, a qual foi completamente desnaturada através de tratamento térmico, reteve menos de 0,1% de sua atividade de ligação a receptor após tratamento térmico. Contudo, IL-1ra-XTEN reteve aproximadamente 40% de sua atividade de ligação a receptor (figura 19). Juntos, esses dados demonstram que o polipeptídeo XTEN pode prevenir desnaturação termicamente induzida de seu parceiro de fusão "payload" e sustentam a conclusão de que XTENs têm propriedades de estabilização.
Exemplo 24: Análise PK de Proteínas de fusão compreendendo IL-1ra e XTEN
[00398] As proteínas de fusão BPXTEN IL-1ra_AE864, IL- 1ra_AM875 e IL-1ra_AM1296 foram avaliadas em macacos cynomolgus de forma a determinar os parâmetros farmacocinéticos in vivo das respectivas proteínas de fusão. Todas as composições foram fornecidas em um tampão aquoso e foram administradas através da via subcutânea (SC) em animais distintos (n = 4/grupo) usando doses únicas de 1 mg/kg e/ou 10 mg/kg. Amostras de plasma foram coletadas em vários pontos de tempo após administração e analisadas com relação às concentrações dos artigos de teste. Análise foi realizada usando um formato de ELISA em sanduíche. Anticorpos policlonais de coelho anti-XTEN foram revestidos sobre cavidades de uma lâmina para ELISA. As cavidades foram bloqueadas, lavadas e amostras de plasma foram, então, incubadas nas cavidades em diluições variadas para permitir a captura do composto pelos anticorpos revestidos. As cavidades foram lavadas extensivamente e a proteína ligada foi detectada usando um preparado biotinilado do anticorpo policlonal anti IL-1ra e estreptavidina/HRP. As concentrações do artigo de teste foram calculadas em cada ponto de tempo comparando a resposta colorimétrica em cada diluição no soro com uma curva-padrão. Os parâmetros farmacocinéticos foram calculados usando o pacote de software WinNonLin.
[00399] A figura 20 mostra os perfis de concentração dos quatro construtos contendo IL-1ra e os parâmetros PK calculados são mostrados na Tabela 27. Após administração subcutânea, a meia-vida terminal foi calculada como sendo de aproximadamente 15-28 horas para os vários preparados durante o período de 336 h. Por referência, a meia-vida publicada de IL-1ra não modificada é bem descrita na literatura como 4-6 h em seres humanos adultos.
[00400] Conclusões: A incorporação de diferentes sequências de XTEN em proteínas de fusão BPXTEN compreendendo IL-1ra resulta em intensificação significativa dos parâmetros farmacocinéticos para todas as três composições, conforme demonstrado no modelo com primatas, demonstrando a utilidade de tais composições de proteína de fusão. Tabela 27: Parâmetros PK de composições de BPXTEN compreendendo IL-1ra e XTEN
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Exemplo 25: Análise PK de Proteínas de fusão compreendendo exendina-4 e XTEN
[00401] A proteína de fusão BPXTEN Ex4_AE864 foi avaliada em macacos cynomolgus de forma a determinar parâmetros farmacocinéticos in vivo das proteínas de fusão após uma única dose subcutânea. Métodos: A proteína de fusão BPXTEN foi formulada em Tris a 20 mM, pH de 7,5, NaCl a 135 mM em duas concentrações diferentes: 8 mg/mL e 40 mg/mL. Três grupos de quatro macacos (2 machos e 2 fêmeas, 26 kg) foram, cada um, dosados a 1 mg/kg (Grupo 1, 0,125 mL/kg), 1 mg/kg (Grupo 2, 0,025 mL/kg) ou 5 mg/kg (Grupo 3, 0,125 mL/kg) via injeção de bolo entre a pele e as camadas subjacentes de tecido na região escapular sobre as costas de cada animal. Amostras de sangue seriais (1 ml ± 0,5 ml) foram tiradas durante catorze dias da veia ou artéria femoral de animais previamente habituados através de uma seringa sem anestesia utilizando uma restrição em cadeira. Se necessária, a restrição em cadeira foi utilizada durante um máximo de 30 minutos. Todos os animais foram submetidos a jejum durante a noite e através das primeiras 4 horas de coleta da amostra de sangue (alimento foi retornado dentro de 30 minutos após coleta da última amostra de sangue no intervalo de coleta de 4 horas, onde aplicável). Cada amostra de sangue foi coletada em um separador de plasma com heparina e mantida sobre gelo (2°C a 8°C) durante aproximadamente 5 minutos, dependendo de centrifugação. As amostras de sangue foram centrifugadas (8.000 x g durante 5 min) e o plasma foi transferido para um tubo de polipropileno. As amostras de plasma foram congeladas e armazenadas a aproximadamente -70°C até ensaiadas. Análise foi realizada usando um formato de ELISA em sanduíche. Resultados: Os parâmetros farmacocinéticos foram calculados para os macacos e os resultados são mostrados na Tabela 28. Os parâmetros farmacocinéticos foram analisados usando um pool puro de todos os animais e usando uma análise-padrão em dois estágios. Os resultados mostram uma diferença na absorção da proteína de fusão, baseado no volume de dose administrado no Grupo 1 versus Grupo 2, conforme evidenciado pelos valores de Tmax, C max, AUC e volume de distribuição (Vz). Contudo, os valores calculados de meia-vida são comparáveis através dos três Grupos e excediam grandemente a meia-vida terminal reportada da exenatida de 2,4 h. Tabela 28: Parâmetros farmacocinéticos calculados a partir da média do grupo para BPXTEN administrada
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Conclusões: A ligação de exendina-4 a XTEN para criar uma fusão BPXTEN resulta em intensificação significativa dos parâmetros farmacocinéticos para todas as três formulações, conforme demonstrado no modelo com primatas, com um aumento de pelo menos 30 vezes na meia-vida, demonstrando a utilidade de tais composições de proteína de fusão.
Exemplo 26: Uso de BPXTEN no modelo de camundongos obesos induzidos por dieta
[00402] Os efeitos da terapia combinada de peptídeos de regulação de glicose ligados ao XTEN foram avaliados em um modelo com camundongos de obesidade induzida por dieta para confirmar a utilidade de combinações fixas de proteínas de fusão monoméricas como uma única composição de BPXTEN. Métodos: Os efeitos de terapia combinada de glucagon ligado a Y-288- XTEN ("Gcg-XTEN") e exenatida ligada a AE576-XTEN ("Ex4-XTEN") ou exenatida isoladamente foram testados em camundongos machos C57BL/6J Obesos Induzidospor Dieta (DIO), com idade de 10 semanas. Camundongos crescidos sob uma dieta com um alto teor de gordura de 60% foram aleatoriamente distribuídos nos grupos de tratamento (n = 10 por grupo) com Ex4-XTEN864 (10 mg/kg IP Q2D), Ex4-XTEN864 (20 mg/kg IP Q4D), Ex4-XTEN864 (10 mg/kg IP Q2D) mais Gcg-XTEN288 (20 μg/kg IP BID) e Ex4-XTEN864 (20 mg/kg IP Q4D) mais Gcg- XTEN288 (40 μg/kg IP Q1D). Um grupo com placebo (n = 10) tratado com Tris a 20 mM, pH de 7,5, NaCl a 135 mM, IP Q1D, foi testado em paralelo. Todos os grupos foram dosados continuamente durante 28 dias. O peso corporal foi monitorado em intervalos regulares por todo o estudo e a glicose em jejum no sangue foi medida antes e após o período de tratamento. Os grupos foram dosados continuamente durante um período de tratamento de 28 dias. O peso corporal foi monitorado continuamente por todo o estudo e a glicose em jejum no sangue foi medida antes e após o período de tratamento e os níveis de lipídio foram determinados após o período de tratamento. Resultados: Os resultados são mostrados nas figuras 21-22. Os dados indicam que dosagem contínua durante um mês proporcionou uma redução significativa no ganho de peso nos animais tratados com Gcg- XTEN isoladamente e Ex4-XTEN isoladamente com relação ao placebo durante o curso do estudo. Além disso, animais dosados com Ex4-XTEN ou Gcg-XTEN e Ex4-XTEN concorrentemente mostraram uma perda de peso estatisticamente significativa maior comparada com Gcg-XTEN administrada isoladamente e comparada com placebo. Os efeitos tóxicos de administração de glucagon são bem documentados. A dose máxima sem efeito para o glucagon em ratos e cães beagle foi recentemente reportada como 1 mg/kg/dia, considerada como um nível sem efeito tóxico claro em ambas as espécies (Eistrup C, Glucagon Produced by Recombinant DNA Technology: Repeated Dose Toxicity Studies, Intravenous Administration to CD Rats and Beagle Dogs For Four Weeks. Pharmacol Toxicol. Agosto de 1993; 73(2): 103-108).
[00403] Os dados também mostram que dosagem contínua durante um mês proporcionou uma redução significativa na glicose em jejum no sangue para os animais tratados com Ex4-XTEN isoladamente com relação ao placebo, mas nem todos os animais tratados com Gcg-XTEN isoladamente. Contudo, animais dosados com Gcg-XTEN e exenatida mostraram, concorrentemente, uma redução estatisticamente significativa maior nos níveis de glicose em jejum no sangue comparado com peptídeo de regulação de glicose administrado isoladamente. De nota, as doses de composição Gcg-XTEN que resultaram nos efeitos benéficos em combinação com Ex4-XTEN foram de 20 e 40 μg/kg (peso da proteína de fusão completa); pelo menos 25 vezes menor do que a dose sem efeito reportada para o glucagon isoladamente em uma espécie de roedor. Conclusões: Os dados sustentam a conclusão de que terapia combinada com duas proteínas de fusão de peptídeos de regulação de glicose ligados ao XTEN pode resultar em um efeito benéfico sinergístico com relação àquele observado com um único peptídeo de regulação de glicose, de modo que administração de uma composição combinada pode ser configurada para reduzir a frequência de dosagem ou a dosagem, comparada com administração de um único produto biológico de forma a reduzir a ameaça de toxicidade ou efeitos colaterais inaceitáveis.
Exemplo 27: Análise PK de BPXTEN Ex4-XTEN em macacos cynomolgus
[00404] A farmacocinética de BPXTEN Ex4-AE864 foi determinada em macacos cynomolgus (três por grupo) com uma BPXTEN_AD administrada através de injeções subcutâneas e intravenosas de BPXTEN a 0,5 mg/kg durante um período de 1 minuto. Amostras de plasma foram coletadas em vários pontos de tempo até 14 dias após injeção e analisadas através de ELISA para determinação da concentração no soro de artigo de teste e imunogenicidade. Nenhuma resposta de anticorpo de artigo antiteste foi observada para Ex4-AE864 em qualquer animal após administração. ELISA em sanduíche foi realizado através de >12 h de imobilizações de 100 ng de anticorpo de captura (anticorpo de coelho anti-exenatida, Peninsula Laboratories, San Carlos, CA) a cada cavidade em uma lâmina de microtitulação de poliestireno (Costar 3690, Corning Inc, Corning, N.Y.), seguido por bloqueio com albumina de soro bovino a 3% (BSA). Após 3 lavagens com PBS, amostras de plasma sofreram titulação serial através da lâmina em PBS contendo BSA a 1% e Tween 20 a 0,5%. Após uma incubação de 2 horas e lavagem, as amostras foram hibridizadas mediante a adição de IgG biotinilada (anticorpo de coelho antiexenatida biotinilado "in house", Peninsula Laboratories, San Carlos, CA) a cada cavidade. Após incubação e lavagem, as lâminas foram reveladas por meio de incubação com estreptavidina conjugada à peroxidase de rábano silvestre (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL), seguido por substrato tetrametilbenzidina (Neogen Corporation, Lexington, KY), então, dissipada H2SO4 a 0,2 N e lida a 450 nm. Parâmetros farmacocinéticos não compartimentais foram calculados usando o programa WinNonLin, Versão 2.1 (Pharsight Corporation, Mt. View, CA).
[00405] Os resultados são representados na figura 25. A meia-vida terminal dessa formulação do construto foi de 60 horas, com biodisponibilidade de 80% a partir de uma injeção subcutânea. Isso se compara à meia-vida reportada de 2,4 h para Byetta®, uma versão comercial de exendina-4. De modo importante, uma fase de absorção lenta, a qual parece ser característica de proteínas de fusão XTEN, foi notada após injeção subcutânea. A fase de absorção resultou em uma Cmax entre 24-48 horas após injeção e um perfil de concentração sérica essencialmente plano durante ~100 horas antes de atingir uma fase de eliminação linear. Conclusões: Pode ser concluído, a partir dos resultados, que a adição de um XTEN a um peptídeo de regulação de glicose, tal como exendina- 4, pode aumentar grandemente a meia-vida terminal, comparado com o peptídeo não ligado ao XTEN e intensifica outros parâmetros farmacocinéticos também.
Exemplo 28: Análise PK de BPXTEN Ex4-XTEN em múltiplas espécies e meia-vida prevista em seres humanos
[00406] Para determinar o perfil farmacocinético previsto em seres humanos de uma proteína terapêutica fundida ao XTEN, estudos foram realizados usando exendina-4 fundida ao AE864_XTEN como um único polipeptídeo de fusão. O construto Ex4-XTEN foi administrado a quatro espécies animais diferentes a 0,5-1,0 mg/kg, subcutânea e intravenosamente. Amostras de soro foram coletadas em intervalos após administração, com as concentrações séricas determinadas usando métodos-padrão. A meia-vida para cada espécie foi determinada e é mostrada na Tabela 29. Os resultados foram usados para prever a meia-vida em seres humanos usando escalonamento alométrico da meia-vida terminal, volume de distribuição e taxas de depuração baseados na massa corporal média. A figura 26A mostra uma plotagem da meia-vida terminal medida versus massa corporal nas espécies animais, com uma T1/2 prevista, em um ser humano de 75 kg, de 140 h, comparado com a meia-vida reportada da exenatida de 2,4 h (Bond, A. Proc (Bayl Univ Med Cent) 19(3): 281-284. (2006)). A figura 26B mostra a depuração de fármaco medida versus massa corporal, com um valor de taxa de depuração previsto de 30 ml/h em um ser humano de 75 kg. A figura 26C mostra o volume de distribuição medido versus massa corporal, com um valor previsto de 5970 ml em um ser humano de 75 kg. Conclusões: Pode ser concluído, a partir dos resultados, que a adição de um XTEN a um peptídeo de regulação de glicose, tal como exendina- 4, pode aumentar grandemente a meia-vida terminal, comparada com o peptídeo não ligado ao XTEN e que uma formulação de BPXTEN com meia-vida comparável permitiria dosagem consideravelmente menos frequente do que é atualmente empregada com produtos comerciais de peptídeos de regulação de glicose, com dosagem em intervalos semanais, semana sim semana não ou mesmo mensais. Tabela 29: Meia-vida de Ex4-XTEN
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* Valor previsto baseado em escalonamento alométrico
Exemplo 29: Aumento de solubilidade e estabilidade de BP através de ligação ao XTEN
[00407] De forma a avaliar a capacidade do XTEN de intensificar as propriedades físico/químicas de solubilidade e estabilidade, proteínas de fusão de glucagon mais XTENs de comprimento mais curtos foram preparadas e avaliadas. Os artigos de teste foram preparados em solução salina tamponada com Tris em um pH neutro e caracterização da solução de Gcg-XTEN foi através de HPLC de fase reversa e cromatografia por exclusão de tamanho para confirmar se a proteína era homogênea e não agregada em solução. Os dados são apresentados na Tabela 30. Para fins comparativos, um limite de solubilidade de glucagon não modificado no mesmo tampão foi medido a 60 μM (0,2 mg/mL) e o resultado demonstra que, para todos os comprimentos de XTEN adicionados, um aumento substancial na solubilidade foi obtido. De modo importante, na maioria dos casos, as proteínas de fusão glucagon-XTEN foram preparadas para obter concentrações alvo e não foram avaliadas para determinar os limites de solubilidade máxima para o determinado construto. Contudo, no caso de glucagon ligado ao AF- 144 XTEN, o limite de solubilidade foi determinado, com o resultado de que um aumento de 60 vezes na solubilidade foi obtido, comparado com glucagon não ligado ao XTEN. Além disso, a BPXTEN glucagon-AF144 foi avaliada com relação à estabilidade e descobriu-se que era estável em formulação líquida durante pelo menos 6 meses sob condições refrigeradas e durante aproximadamente um mês a 37°C (dados não mostrados). Conclusões: Os dados sustentam a conclusão de que a ligação de polipeptídeos XTEN de comprimento curto a uma proteína biologicamente ativa, tal como glucagon, pode intensificar acentuadamente as propriedades de solubilidade da proteína para a proteína de fusão resultante, bem como conferir estabilidade nas maiores concentrações de proteína. Tabela 30: Solubilidade de construtos de Glucagon-XTEN
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Exemplo 30: Caracterização de estrutura secundária de BPXTEN
[00408] A BPXTEN Ex4-AE864 foi avaliada com relação ao grau de estrutura secundária através de espectroscopia de dicroísmo circular. Espectroscopia CD foi realizada sobre um espectropolarímetro Jasco J- 715 (Jasco Corporation, Tóquio, Japão) equipado com um controlador de temperatura Jasco Peltier (TPC-348WI). A concentração de proteína foi ajustada para 0,2 mg/mL em fosfato de sódio a 20 mM, pH de 7,0, NaCl a 50 mM. Os experimentos foram realizados usando células de quartzo HELLMA com um comprimento de trajeto óptico de 0,1 cm. Os espectros de CD foram adquiridos a 5°, 25°, 45° e 65°C e processados usando o software J-700 versão 1.08.01 (Build 1) da Jasco para Windows. As amostras foram equilibradas em cada temperatura durante 5 min antes de realização de medições de CD. Todos os espectros foram registrados em duplicata de 300 nm a 185 nm usando uma largura de banda de 1 nm e uma constante de tempo de 2 s, em uma velocidade de varredura de 100 nm/min. O espectro de CD mostrado na figura 24 não mostra evidência de estrutura secundária adequada e é consistente com um polipeptídeo não estruturado.
Exemplo 31: Atividade biológica de construtos de glucagon e Ex4 BPXTEN
[00409] Glucagon e exendina-3 purificados, cada um ligado a Y288 como uma proteína de fusão BPXTEN, foram ensaiados com relação à atividade biológica usando um ensaio celular in vitro. Resumidamente, uma linhagem de células receptoras de glucagon otimizada estável ao cálcio foi usada para cada ensaio de mobilização de cálcio em tempo real para o glucagon e construtos de glucagon-XTEN, enquanto que uma linhagem de célula receptora de exendina-4 otimizada expressando receptor de GLP- 1 nativo foi usada para exendina-4 e os construtos Ex4. Nesse sistema, as células expressam os receptores nativos e ativação desse receptor resulta em fluxo de cálcio dentro da célula que pode ser detectado usando um aparelho de FLIPR. Conforme mostrado na figura 27, o glucagon nativo resulta em um aumento no sinal de uma maneira dose-dependente. Descobriu-se que a EC50 para o glucagon nativo nesse sistema era de 4,1 nM. Titulação do construto glucagon-Y288 proporcionou uma curva de resposta comparável, com uma EC50 de 72 nM. Conforme mostrado na figura 28, exendina-4 nativa de duas fontes comerciais diferentes (Anaspec e Tocris) resulta em um aumento nos sinal de uma maneira dose-dependente, com EC50s (indicadas por uma linha tracejada) de 75 pM e 110 pM, respectivamente. Titulação do construto exendina-4-Y576 proporcionou uma curva de resposta comparável, com uma EC50 de 98 pM, indicando que a fusão da proteína acessória retém atividade biológica total. Conclusões: Os resultados indicam que a fusão dos peptídeos de regulação de glicose a uma proteína recombinante não estruturada resulta em composições que retêm a atividade biológica.
Exemplo 32: Construção de genes e vetores de hGH, XTEN-AE e hGH_XTEN-AM
[00410] O gene que codifica hGH foi amplificado de reação em cadeia de polimerase (PCR), a qual introduziu sítios de restrição NdeI e BbsI que são compatíveis com os sítios Ndel e Bsal que flanqueiam o "stuffer" no vetor de destino XTEN. O plasmídeo pXTEN é um derivado de pET30 da Novagen no formato Stuffer-XTEN, onde "Stuffer" pode ser proteína fluorescente verde (GFP) ou CBD e XTEN pode ter qualquer comprimento, de 36 a 576 ou maior. Construtos foram gerados substituindo uma sequência "stuffer" no pXTEN pelo fragmento que codifica hGH. O pXTEN se caracteriza por um promotor T7 a montante da sequência "stuffer" e uma sequência de XTEN fundida in-frame a jusante da sequência "stuffer". As sequências de XTEN empregadas pertencem à família XTEN AE ou XTEN AM e codificam comprimentos que incluem 36, 72, 144, 288, 576, 864, 875 e 1296 aminoácidos. O fragmento foi removido através de digestão por restrição usando endonucleases NdeI e BsaI. O fragmento de DNA de hGH digerido por restrição foi ligado no vetor pXTEN clivado usando DNA ligase T4 e eletroporado em BL21(DE3) Gold (Stratagene). Transformantes sofreram triagem através de DNA miniprep e o construto desejado foi confirmado por meio de sequenciamento de DNA. O vetor final proporciona o XTEN-gene de hGH sob o controle de um promotor T7.
Exemplo 33: Construção de genes e vetores de XTEN-AE_hGH e XTEN-AM_Hgh
[00411] O gene que codifica hGH foi amplificado de reação em cadeia de polimerase (PCR), a qual introduziu sítios de restrição BbsI e HindIII que são compatíveis com os sítios de BbsI e HindIII que flanqueiam o "stuffer" no vetor de destino XTEN. O plasmídeo pCBD- XTEN é um derivado de pET30 da Novagen no formato de Domínio de Ligação à Celulose (CBD) -XTEN- Stuffer, onde "Stuffer" é proteína fluorescente verde (GFP) e XTEN pode ter qualquer comprimento, de 36 a 576 ou maior. Construtos foram gerados substituindo a sequência "stuffer" no pCBD-XTEN pelo fragmento que codifica hGH. O pCBD- XTEN se caracteriza por um promotor T7 a montante de CBD, seguido por uma sequência de XTEN fundida in-frame a montante da sequência "stuffer". As sequências de XTEN empregadas pertencem à família XTEN AE e XTEN AM e codificam comprimentos que incluem 36, 72, 144, 288, 576, 864, 875 e 1296 aminoácidos. O fragmento "stuffer" foi removido através de digestão por restrição usando endonucleases BbsI e HindIII. O fragmento de DNA de hGH digerido por restrição foi ligado no vetor clivado pCBD-XTEN usando DNA ligase T4 e eletroporado no BL21(DE3) Gold (Stratagene). Transformantes sofreram triagem através de DNA miniprep e o construto desejado foi confirmado por meio de sequenciamento de DNA. O vetor final proporciona o CBD XTEN gene de hGH sob o controle de um promotor T7.
Exemplo 34: Construção de genes e vetores de XTEN-AE_ hGH _XTEN-AE hGH
[00412] O gene que codifica hGH foi amplificado através de reação em cadeia de polimerase (PCR), a qual introduziu sítios de restrição BbsI e BsaI que são compatíveis com os sítios BbsI e BsaI que flanqueiam o "stuffer" no vetor de destino de XTEN. O plasmídeo pNTS- XTEN é um derivado de pET30 da Novagen no formato de uma sequência de expressão de XTEN N-terminal de 48 aminoácidos, onde o "stuffer" é proteína fluorescente verde (GFP) e XTEN pode ter qualquer comprimento, de 36 a 576 ou maior. Construtos foram gerados substituindo a sequência "stuffer" no pCBD-XTEN pelo fragmento que codifica hGH. O pNTS-XTEN se caracteriza por um promotor T7 a montante de NTS, seguido por uma sequência de XTEN fundida inframe a montante da sequência "stuffer". As sequências de XTEN empregadas pertencem à família XTEN_AE e codificam comprimentos que incluem 36, 72, 144, 288, 576, 864 e 1296 aminoácidos. O fragmento "stuffer" foi removido através de digestão por restrição usando endonucleases BbsI e BsaI. O fragmento de DNA de hGH digerido por restrição foi ligado no vetor clivado pNTS-XTEN usando DNA ligase T4 e eletroporado no BL21(DE3) Gold (Stratagene). Em alguns casos, uma segunda sequência de XTEN AE de 144 ou 288 aminoácidos foi ligada ao C-término do gene de hGH. Transformantes sofreram triagem através de DNA miniprep e o construto desejado foi confirmado por meio de sequenciamento de DNA. O vetor final proporciona o NTS_ XTEN_hGH ou gene de NTS_XTEN_hGH_XTEN sob o controle de um promotor T7.
Exemplo 35: Purificação de construtos GH_XTEN Expressão de proteína
[00413] Os plasmídeos descritos acima foram transformados na cepa de E. coli BL21(DE3)-Gold (Novagen) e colocados sobre uma lâmina de LB-ágar com os antibióticos apropriados e crescidos durante a noite a 37°C. Uma única colônia foi inoculada em 5 ml de meio TB 125 e crescida durante a noite a 37°C. No dia seguinte, o inóculo foi transformado em um vaso de 2L com 500 ml de TB125 e crescido até que uma OD=0,6 fosse atingida, seguido por crescimento contínuo a 26°C durante 16 horas com IPTG a 0,1 mM.
[00414] As células foram coletadas por meio de centrifugação e pelotão pélete de células foi ressuspenso em 50 ml de tampão contendo Tris a 5 mM, pH = 8,0, NaCl a 100 mM. As células foram rompidas usando um interruptor de célula de sonicator ultrassônico e os resíduos celulares foram removidos através de centrifugação a 15000 RPM a 4°C. O pH do lisato foi, então, ajustado para um pH de 4,5 com ácido acético para precipitar as proteínas de célula hospedeira contaminantes e foi subsequentemente clarificado por meio de centrifugação. O lisato clarificado tratado com ácido foi, então, aplicado a uma coluna de cromatografia de troca de ânions DE52 e eluído com NaCl. A fração eluída foi, então, adicionalmente acidificada para um pH de 4,0 e aplicada a uma coluna de cromatografia de troca de cátions MacroCapSP. O produto foi eluído usando eluição sequencial com NaCl.
[00415] A pureza da proteína foi estimada como estando acima de 98%. A quantidade de proteína de fusão eluída foi determinada através de análise SDS-PAGE e medindo-se a concentração de proteína total. Uma alta quantidade de proteína de fusão eluída reflete a maior solubilidade da proteína de fusão com relação ao hGH isoladamente.
Formulação Final e armazenamento
[00416] As proteínas com tampão trocado foram, então, concentradas usando um aparelho de concentração 10K MWCO Ultrafree até um volume final de 2 mL. O concentrado foi filtrado estéril usando um filtro para seringa de 0,22 μm. A solução final foi transformada em alíquotas e armazenada a -80°C.
Exemplo 36: Ensaios de ligação baseados em ELISA
[00417] Fusões de XTEN ao GH foram testadas em um ensaio- padrão baseado em ELISA para avaliar sua capacidade de se ligar ao receptor de GH. Ensaios foram realizados usando um formato de ELISA em sanduíche no qual um receptor de hGH recombinante (hGHR-Fc) é revestido sobre cavidades de uma lâmina para ELISA. As cavidades foram, então, bloqueadas, lavadas e amostras de BPXTEN são, então, incubadas nas cavidades em diluições variadas para permitir captura da BPXTEN. As cavidades foram lavadas extensivamente e a proteína ligada foi detectada usando um preparado biotinilado de um anticorpo policlonal ou monoclonal anti-GH ou anti-XTEN e estreptavidina-HRP. A fração de proteína ligada pode ser calculada comparando a resposta colorimétrica em cada diluição no soro com uma curva-padrão de GH não modificado. Os resultados, mostrados na figura 30, indicam valores EC50 aparentes para hGH nativo de 0,0701 nM, AM864_hGH de 0,3905 e hGH_AM864 de 2.733. Conclusões: Os resultados mostram que as fusões de XTEN retêm uma quantidade significativa de atividade de ligação ao receptor após fusão, com a proteína de fusão BPXTEN tendo o hGH sobre o C-término retendo mais afinidade de ligação, comparado com a proteína de fusão tendo o hGH sobre o N-término.
Exemplo 37: Análise PK de polipeptídeos de fusão hGH XTEN em ratos
[00418] As proteínas de fusão BPXTEN AE912-hGH, AM864-hGH (sinônimo ao AM875-hGH para esse e os Exemplos a seguir), AE912- hGH-AE144 e AE912-hGH-AE288 foram avaliados em ratos de forma a determinar parâmetros farmacocinéticos in vivo dos polipeptídeos hGH- XTEN. Todas as composições foram fornecidas em um tampão aquoso e foram administradas através da via subcutânea (SC) em animais distintos usando doses únicas de 1,5 mg/kg. Amostras de plasma foram coletadas em vários pontos de tempo após administração e analisadas com relação às concentrações dos artigos de teste. Análise foi realizada usando um formato de ELISA em sanduíche. hGHR-Fc recombinante foi revestido sobre cavidades de uma lâmina ELISA. As cavidades foram bloqueadas, lavadas e amostras de plasma foram, então, incubadas nas cavidades em diluições variadas para permitir a captura do composto pelos anticorpos revestidos. As cavidades foram lavadas extensivamente e a proteína ligada foi detectada usando um preparado biotinilado do anticorpo policlonal anti-hGH e estreptavidina-HRP. As concentrações de artigo de teste foram calculadas em cada ponto de tempo comparando a resposta colorimétrica em cada diluição no soro com uma curva-padrão. Parâmetros farmacocinéticos foram calculados usando o pacote de software WinNonLin.
[00419] A figura 32 mostra os perfis de concentração dos quatro construtos hGH-XTEN após administração subcutânea. A meia-vida terminal calculada para AE912-hGH foi de 7,5 h, 6,8 h para AM864-hGH (igual ao AM875-hGH), 12,4 h para AE912-hGH-AE 144 e 13,1 h para AE912-hGH-AE288. Por comparação, hGH não modificado foi passado em paralelo no mesmo experimento e mostrou uma meia-vida plasmática dramaticamente mais curta. Conclusões: A incorporação de diferentes sequências de XTEN em proteínas de fusão compreendendo hGH resulta em intensificação significativa de parâmetros farmacocinéticos para todas as quatro composições, comparado com hGH não modificado, conforme demonstrado no modelo com roedores, demonstrando a utilidade de tais composições de proteína de fusão. A adição de uma segunda proteína XTEN ao C-término dos construtos AE-hGH resulta em uma intensificação adicional da meia-vida terminal, comparado com os construtos com um único XTEN; provavelmente em virtude da depuração receptor-mediada reduzida.
Exemplo 38: Análise PK de polipeptídeos de fusão hGH XTEN em cynomolgus
[00420] Proteínas de fusão BPXTEN contendo uma ou duas moléculas de XTEN (AE912-hGH, AM864- hGH e AE912-hGH-AE144) foram avaliadas em macacos cynomolgus de forma a determinar o efeito da inclusão de um segundo XTEN sobre os parâmetros farmacocinéticos in vivo de polipeptídeos hGH-XTEN. Todas as composições foram fornecidas em um tampão aquoso e foram administradas através da via subcutânea (SC) em animais distintos usando doses únicas de 1,5 mg/kg. Amostras de plasma foram coletadas em vários pontos de tempo após administração e analisadas com relação às concentrações dos artigos de teste. Análise foi realizada usando um formato de ELISA em sanduíche. hGHR-Fc recombinante foi revestido sobre as cavidades de uma lâmina para ELISA. As cavidades foram bloqueadas, lavadas e amostras de plasma foram, então, incubadas nas cavidades em diluições variadas para permitir captura do composto pelos anticorpos revestidos. As cavidades foram extensivamente lavadas e a proteína ligada foi detectada usando um preparado biotinilado do anticorpo policlonal anti-hGH e estreptavidina- HRP. As concentrações de artigo de teste foram calculadas em cada ponto de tempo comparando a resposta colorimétrica em cada diluição no soro com uma curva-padrão. Os parâmetros farmacocinéticos foram calculados usando o pacote de software WinNonLin. A meia-vida terminal média para as proteínas de fusão foi de 33 h para AM864-hGH, 44 h para AE912-hGH e 110 h para AE912-hGH-AE144 (contendo dois XTENs ligados aos N-e C-términos de hGH).
[00421] A figura 33 mostra os perfis de concentração dos três construtos hGH XTEN após administração subcutânea e parâmetros PK calculados são mostrados. Após administração subcutânea, a meia-vida terminal foi calculada como sendo de aproximadamente 33-110 horas para os vários preparados durante o período de 336 h. Conclusões: A incorporação de diferentes sequências de XTEN em proteínas de fusão compreendendo hGH resulta em intensificação significativa de parâmetros farmacocinéticos para todas as três composições, conforme demonstrado pelo modelo cyno, demonstrando a utilidade de tais composições de proteína de fusão, com o construto contendo um segundo XTEN ligado ao C-término do hGH mostrando uma intensificação de duas vezes da meia-vida terminal.
Exemplo 39: Efeitos comparativos de hGH e AM864-hGH sobre o ganho de peso corporal
[00422] A capacidade da BPXTEN AM864-hGH de reter a potência farmacológica foi avaliada usando o parâmetro ganho de peso corporal em um rato hypox em resposta ao composto administrado. A figura 34 mostra os efeitos de administração de hGH ou AM864-hGH nas doses e frequência de dose indicadas sobre o peso corporal em ratos hypox. Os resultados mostram retenção de atividade biológica por um construto BPXTEN que tem potência equivalente a uma dosagem comparável de hGH, ainda que com dosagem menos frequente. Níveis de dose aumentados AM864-hGH levaram a aumentos nos ganhos de peso corporal durante o período do experimento.
Exemplo 40: Efeitos comparativos de hGH e AM864-hGH sobre a cartilagem óssea
[00423] A capacidade de uma BPXTEN de AM864 ligada ao hGH de reter a potência farmacológica foi avaliada usando o parâmetro medido de aumento da largura da placa epifaseal tibial em ratos hypox. A figura 35 mostra os efeitos comparativos de administração de placebo, hGH e AM864-hGH, mostrados em secções transversais histológicas da tíbia de ratos após 9 dias de tratamento, com as margens denotadas com linhas tracejadas. Os grupos são os mesmos conforme mostrado na figura 35. A figura 35A mostra que o grupo com placebo tinha uma largura de seção transversal média de 344 ± 38,6 μm da placa após 9 dias. A figura 35B mostra que o grupo com hGH (10μg ao dia) tinha uma largura de seção transversal média de 598 ± 8,5 μm após 9 dias. A figura 35C mostra que o grupo com AM864-hGH (15 mg/kg q3d) tinha uma seção transversal média de 944 ± 8,5 μm após 9 dias. Os resultados mostram atividade intensificada pelo construto GHUPR, a despeito de ser dosado em intervalos menos frequentes.
Exemplo 41: XTEN C-terminal liberável por FXIa
[00424] Uma proteína de fusão FIX-XTEN consistindo em uma proteína XTEN fundida ao C-término de FIX pode ser criada com uma sequência de clivagem de sítio de liberação de XTEN colocada entre os componentes FIX e XTEN, conforme representado na figura 36B. Sequências exemplificativas são fornecidas na Tabela 43. Nesse caso, o sítio de liberação sequência de clivagem pode ser incorporado na FIX- XTEN que contém uma sequência de aminoácido que é reconhecida e clivada pela protease FXIa (EC 3.4.21.27, Uniprot P03951). Especificamente, a sequência de aminoácido KLTRVVGG (SEQ ID NO: 224) [Rawlings N.D. et al. (2008) Nucleic Acids Res., 36: D320], deverá ser cortada após a arginina da sequência pela protease FXIa. FXI é a protease pró-coagulante localizada imediatamente antes de FIX na via de coagulação intrínseca ou ativada por contato. FXIa ativo é produzido a partir de FXI por meio de clivagem proteolítica do zimogênio por FXIIa. Uma vez ativado, seu papel natural em coagulação é ativar FIX por meio de excisão de um peptídeo do zimogênio cortando a proteína nas posições R191 e R226 de FIX a qual, então, perpetua a via de coagulação. Produção de FXIa é hermeticamente controlada e ocorre apenas quando a coagulação é necessária para hemostase apropriada. Portanto, por meio de incorporação da sequência de clivagem, o domínio XTEN será removido do FIX apenas concorrente com a ativação da via de coagulação intrínseca e quando a coagulação é requerida fisiologicamente. Isso cria uma situação onde a proteína de fusão FIX-XTEN será processada de uma maneira adicional durante a ativação da via intrínseca. Além das clivagens naturais que ocorrem em R191 e R226 do domínio FIX por FXIa, uma terceira clivagem ocorrerá no sítio de liberação de XTEN, a qual irá desacoplar o novo FIXa ativado da proteína XTEN. Em uma característica desejável da composição da invenção, isso cria uma situação onde FIX- XTEN permaneceria intacta como um profármaco até ativação de coagulação, momento no qual a molécula será processada para produzir FIXa livre, o qual reconstitui ou aumenta a função de coagulação em um indivíduo que precisa da mesma.
Exemplo 42: XTEN C-terminal liberável por FXIIa
[00425] Uma proteína de fusão FIX-XTEN consistindo em uma proteína XTEN fundida ao C-término de FIX pode ser criada com uma sequência de clivagem de sítio de liberação de XTEN colocada entre os componentes FIX e XTEN, conforme representado na figura 36B. Sequências exemplificativas são fornecidas na Tabela 43. Nesse caso, a sequência de sítio de liberação de XTEN pode conter uma sequência de aminoácido que é reconhecida e clivada pela protease FXIIa (EC 3.4.21.38, Uniprot P00748). Especificamente, a sequência TMTRAIVGG (SEQ ID NO: 225) deverá ser cortada após a arginina na posição 4 de a sequência. FXII é uma protease pró-coagulante localizada antes de FIX na via de coagulação intrínseca ou ativada por contato. FXIIa ativo é produzido a partir de FXII por meio de contato sem autossuperfícies e clivagem pela calicreína. Uma vez ativado, seu papel natural em coagulação é ativar FXI por meio de clivagem proteolítica do zimogênio o qual, por sua vez, então, perpetua a via de coagulação. Produção de FXIIa é hermeticamente controlada e ocorre apenas quando a coagulação é necessária para hemostase apropriada. Portanto, por meio de incorporação da sequência de clivagem, o domínio XTEN será removido do FIX apenas concorrente com a ativação da via de coagulação intrínseca e quando a coagulação é requerida fisiologicamente. Isso cria uma situação onde a fusão FIX-XTEN será processada de uma maneira adicional durante a ativação da via intrínseca. Além das clivagens naturais que ocorrem em R191 e R226 do domínio FIX por FXIa, uma terceira clivagem ocorrerá no sítio de liberação de XTEN que irá desacoplar o novo FIXa ativado da proteína XTEN. Em uma característica desejável da composição da invenção, isso cria uma situação onde FIX- XTEN permaneceria intacta como um profármaco até ativação de coagulação, momento no qual a molécula será processada para produzir FIXa livre, o qual reconstitui ou aumenta a função de coagulação em um indivíduo que precisa da mesma.
Exemplo 43: XTEN C-terminal liberável por Calicreína
[00426] Uma proteína de fusão FIX-XTEN consistindo em uma proteína XTEN fundida ao C-término de FIX pode ser criada com uma sequência de clivagem de sítio de liberação de XTEN colocada entre os componentes FIX e XTEN, conforme representado na figura 36B. Sequências exemplificativas são fornecidas na Tabela 43. Nesse caso, a sequência de sítio de liberação de XTEN pode ser uma sequência de aminoácido que é reconhecida e clivada pela protease calicreína (EC 3.4.21.34, Uniprot P03952). Especificamente, a sequência SPFR;STGG (SEQ ID NO: 226) [Rawlings N.D. et al. (2008) Nucleic Acids Res., 36: D320], deverá ser cortada após a arginina na posição 4 de a sequência. Calicreína é uma protease pró-coagulante localizada antes do FIX na via de coagulação intrínseca ou ativada por contato. Calicreína ativa é produzida a partir de Calicreína plasmática sem autossuperfícies. Uma vez ativada, seu papel natural em coagulação é ativar FXII (figura 39) por meio de clivagem proteolítica do zimogênio o qual, por sua vez, então, perpetua a via de coagulação. Produção de calicreína é hermeticamente controlada e ocorre apenas quando a coagulação é necessária para hemostase apropriada. Portanto, por meio de incorporação da sequência de clivagem o domínio XTEN será removido do FIX apenas concorrente com a ativação da via de coagulação intrínseca e quando a coagulação é requerida fisiologicamente. Isso cria uma situação onde a fusão FIX-XTEN será processada de uma maneira adicional durante a ativação da via intrínseca. Além das clivagens naturais que ocorrem em R191 e R226 do domínio FIX por FXIa, uma terceira clivagem ocorrerá no sítio de liberação de XTEN que irá desacoplar o novo FIXa ativado da proteína XTEN. Em uma característica desejável da composição da invenção, isso cria uma situação onde a FIX-XTEN permaneceria intacta como um profármaco até ativação de coagulação, momento no qual a molécula será processada para produzir FIXa livre, o qual reconstitui ou aumenta a função de coagulação em um indivíduo que precisa da mesma.
Exemplo 44: XTEN C-terminal liberável por FVIIa
[00427] Uma proteína de fusão FIX-XTEN consistindo em uma proteína XTEN fundida ao C-término de FIX pode ser criada com uma sequência de clivagem de sítio de liberação de XTEN colocada entre os componentes FIX e XTEN, conforme representado na figura 36B. Sequências exemplificativas são fornecidas na Tabela 43. Nesse caso, o sítio de liberação sequência contém uma sequência de aminoácido que é reconhecida e clivada pela FVIIa protease (EC 3.4.21.21, Uniprot P08709). Especificamente, a sequência LQVRAIVGG (SEQ ID NO: 227) [Rawlings N.D. et al. (2008) Nucleic Acids Res., 36: D320], deverá ser cortada após a arginina na posição 4 na sequência. FVIIa é uma protease pró-coagulante localizada antes do FIX na via de coagulação extrínseca ou ativada por lesão celular. FVIIa ativo é produzido a partir de FVII em um processo autocatalítico auxiliado pela ligação ao fator tecidual, fosfolipídios e cálcio. Uma vez ativado, seu papel natural em coagulação é ativar FIX e FX (figura 39) por meio de clivagem proteolítica do zimogênio o qual, por sua vez, então, perpetua a via de coagulação. Atividade de FVIIa é hermeticamente controlada e ocorre apenas quando a coagulação é necessária para hemostase apropriada. Portanto, por meio de incorporação da sequência de clivagem o domínio XTEN será removido do FIX apenas concorrente com a ativação da via de coagulação intrínseca e quando a coagulação é requerida fisiologicamente. Isso cria uma situação onde a fusão FIX-XTEN será processada de uma maneira adicional durante a ativação da via intrínseca. Além das clivagens naturais que ocorrerão em R191 e R226 do domínio FIX por FVIIa, uma terceira clivagem ocorrerá no sítio de liberação de XTEN, a qual irá desacoplar o novo FIXa ativado da proteína XTEN. Em uma característica desejável da composição da invenção, isso cria uma situação onde a FIX-XTEN permaneceria intacta como um profármaco até ativação de coagulação, momento no qual a molécula será processada para produzir FIXa livre, o qual reconstitui ou aumenta a função de coagulação em um indivíduo que precisa da mesma.
Exemplo 45: XTEN C-terminal liberável por FIXa
[00428] Uma proteína de fusão FIX-XTEN consistindo em uma proteína XTEN fundida ao C-término de FIX pode ser criada com uma sequência de clivagem de sítio de liberação de XTEN colocada entre os componentes FIX e XTEN, conforme representado na figura 36B. Sequências exemplificativas são fornecidas na Tabela 43. Nesse caso, o sítio de liberação sequência de clivagem contém uma sequência de aminoácido que é reconhecida e clivada pela FIXa protease (EC 3.4.21.22, Uniprot P00740). Especificamente, a sequência PLGRjIVGG (SEQ ID NO: 228) [Rawlings N.D. et al. (2008) Nucleic Acids Res., 36: D320], deverá ser cortada após a arginina na posição 4 da sequência. FIXa ativo é produzido por meio de clivagem de FIX por FXIa ou FVIIa na presença de fosfolipídios e cálcio. Uma vez ativado, seu papel natural em coagulação é ativar FX (figura 39) por meio de clivagem proteolítica do zimogênio o qual, por sua vez, então, perpetua a via de coagulação. Atividade de FIXa é hermeticamente controlada e ocorre apenas quando a coagulação é necessária para hemostase apropriada. Portanto, por meio de incorporação da sequência de clivagem, o domínio XTEN será removido do FIX apenas concorrente com a ativação das vias de coagulação extrínsecas ou intrínsecas e quando a coagulação é requerida fisiologicamente. Isso cria uma situação onde a fusão FIX- XTEN será processada de uma maneira adicional durante a ativação da via intrínseca. Além das clivagens naturais que ocorrerão em R191 e R226 do domínio FIX por FVIIa ou FXIa, uma terceira clivagem ocorrerá no sítio de liberação de XTEN, a qual irá desacoplar o novo FIXa ativado da proteína XTEN. Em uma característica desejável da composição da invenção, isso cria uma situação onde FIX- XTEN permaneceria intacta como um profármaco até ativação de coagulação, momento no qual a molécula será processada para produzir FIXa livre, o qual reconstitui ou aumenta a função de coagulação em um indivíduo que precisa da mesma.
Exemplo 46: XTEN C-terminal liberável por FXa
[00429] Uma proteína de fusão FIX-XTEN consistindo em uma proteína XTEN fundida ao C-término de FIX pode ser criada com uma sequência de clivagem de sítio de liberação de XTEN colocada entre os componentes FIX e XTEN, conforme representado na figura 36B. Sequências exemplificativas são fornecidas na Tabela 43. Nesse caso, o sítio de liberação contém uma sequência de aminoácido que é reconhecida e clivada pela protease FXa (EC 3.4.21.6, Uniprot P00742). Especificamente, a sequência IEGR;TVGG (SEQ ID NO: 229) [Rawlings N.D. et al. (2008) Nucleic Acids Res., 36: D320], deverá ser cortada após a arginina na posição 4 na sequência. FXa ativo é produzido por meio de clivagem de FX por FIXa na presença de fosfolipídios e cálcio e é a etapa imediatamente a jusante do fator IX na via de coagulação. Uma vez ativado, seu papel natural em coagulação é ativar FII (figura 39) por meio de clivagem proteolítica do zimogênio o qual, por sua vez, então, perpetua a via de coagulação. Atividade de FXa é hermeticamente controlada e ocorre apenas quando a coagulação é necessária para hemostase apropriada. Portanto, por meio de incorporação da sequência de clivagem, o domínio XTEN será removido do FIX apenas concorrente com a ativação das vias de coagulação extrínsecas ou intrínsecas e quando a coagulação é requerida fisiologicamente. Isso cria uma situação onde a fusão FIX- XTEN será processada de uma maneira adicional durante a ativação de coagulação. Além das clivagens naturais que ocorrerão em R191 e R226 do domínio FIX por FVIIa ou FXIa, uma terceira clivagem ocorrerá no sítio de liberação de XTEN, a qual irá desacoplar o novo FIXa ativado da proteína XTEN. Em uma característica desejável da composição da invenção, isso cria uma situação onde a FIX-XTEN permaneceria intacta como um profármaco até ativação de coagulação, momento no qual a molécula será processada para produzir FIXa livre, o qual reconstitui ou aumenta a função de coagulação em um indivíduo que precisa da mesma.
Exemplo 47: XTEN C-terminal liberável por FIIa (trombina)
[00430] Uma proteína de fusão FIX-XTEN consistindo em uma proteína XTEN fundida ao C-término de FIX pode ser criada com uma sequência de clivagem de sítio de liberação de XTEN colocada entre os componentes FIX e XTEN, conforme representado na figura 36B. Sequências exemplificativas são fornecidas na Tabela 43. Nesse caso, o sítio de liberação contém uma sequência de aminoácido que é reconhecida e clivada pela protease FIIa (EC 3.4.21.5, Uniprot P00734). Especificamente, a sequência LTPRjSLLV (SEQ ID NO: 230) [Rawlings N.D. et al. (2008) Nucleic Acids Res., 36: D320], deverá ser cortada após a arginina na posição 4 na sequência. FIIa ativo é produzido por meio de clivagem de FII por FXa na presença de fosfolipídios e cálcio e está a jusante do fator IX na via de coagulação. Uma vez ativado, seu papel natural em coagulação é clivar fibrinogênio (figura 39) a qual, por sua vez, começa a formação de coágulo. Atividade de FIIa é hermeticamente controlada e ocorre apenas quando a coagulação é necessária para hemostase apropriada. Portanto, por meio de incorporação da sequência de clivagem, o domínio XTEN será removido do FIX apenas concorrente com a ativação das vias de coagulação extrínsecas ou intrínsecas e quando a coagulação é requerida fisiologicamente. Isso cria uma situação onde a fusão FIX-XTEN será processada de uma maneira adicional durante a ativação de coagulação. Além das clivagens naturais que ocorrerão em R191 e R226 do domínio FIX por FVIIa ou FXIa, uma terceira clivagem ocorrerá no sítio de liberação de XTEN, a qual irá desacoplar o novo FIXa ativado da proteína XTEN. Em uma característica desejável da composição da invenção, isso cria uma situação onde a FIX-XTEN permaneceria intacta como um profármaco até ativação de coagulação, momento no qual a molécula será processada para produzir FIXa livre, o qual reconstitui ou aumenta a função de coagulação em um indivíduo que precisa da mesma.
Exemplo 48: XTEN C-terminal liberável por Elastase-2
[00431] Uma proteína de fusão FIX-XTEN consistindo em uma proteína XTEN fundida ao C-término de FIX pode ser criada com uma sequência de clivagem de sítio de liberação de XTEN colocada entre os componentes FIX e XTEN, conforme representado na figura 36B. Sequências exemplificativas são fornecidas na Tabela 43. Nesse caso, o sítio de liberação contém uma sequência de aminoácido que é reconhecida e clivada pela elastase-2 protease (EC 3.4.21.37, Uniprot P08246). Especificamente, a sequência LGPV^SGVP (SEQ ID NO: 231) [Rawlings N.D. et al. (2008) Nucleic Acids Res., 36: D320], deverá ser cortada após a posição 4 na sequência. Elastase é constitutivamente expressa por neutrófilos e está presente a todo momento na circulação. Sua atividade é hermeticamente controlada por serpinas e, portanto, é minimamente ativa a maior parte do tempo. Portanto, à medida que a FIX-XTEN de vida longa circula, uma fração da mesma será clivada, criando um pool de FIX de vida mais curta a ser usado em coagulação. Em uma característica desejável da composição da invenção, isso cria um depósito de profármaco em circulação que libera constantemente uma quantidade profilática de FIX.
Exemplo 49: XTEN C-terminal liberável por MMP-12
[00432] Uma proteína de fusão FIX-XTEN consistindo em uma proteína XTEN fundida ao C-término de FIX pode ser criada com uma sequência de clivagem de sítio de liberação de XTEN colocada entre os componentes FIX e XTEN, conforme representado na figura 36B. Sequências exemplificativas são fornecidas na Tabela 43. Nesse caso, o sítio de liberação contém uma sequência de aminoácido que é reconhecida e clivada pela MMP-12 protease (EC 3.4.24.65, Uniprot P39900). Especificamente, a sequência GPAG^LGGA (SEQ ID NO: 233) [Rawlings N.D. et al. (2008) Nucleic Acids Res., 36: D320], deverá ser cortada após a posição 4 da sequência. MMP- 12 é constitutivamente expressa em sangue íntegro. Portanto, à medida que a FIX-XTEN de vida longa circula, uma fração da mesma será clivada, criando um pool de FIX de vida mais curta a ser usado em coagulação. Em uma característica desejável da composição da invenção, isso cria um depósito de profármaco em circulação que libera constantemente uma quantidade profilática de FIX.
Exemplo 50: XTEN C-terminal liberável por MMP-13
[00433] Uma proteína de fusão FIX-XTEN consistindo em uma proteína XTEN fundida ao C-término de FIX pode ser criada com uma sequência de clivagem de sítio de liberação de XTEN colocada entre os componentes FIX e XTEN, conforme representado na figura 36B. Sequências exemplificativas são fornecidas na Tabela 43. Nesse caso, o sítio de liberação contém uma sequência de aminoácido que é reconhecida e clivada pela MMP-13 protease (EC 3.4.24.-, Uniprot P45452). Especificamente, a sequência GPAGjLRGA (SEQ ID NO: 234) [Rawlings N.D. et al. (2008) Nucleic Acids Res., 36: D320], deverá ser cortada após a posição 4 (representada pela seta). MMP- 13 é constitutivamente expressa em sangue íntegro. Portanto, à medida que a FIX-XTEN de vida longa circula, uma fração da mesma será clivada, criando um pool de FIX de vida mais curta a ser usado em coagulação. Em uma característica desejável da composição da invenção, isso cria um depósito de profármaco em circulação que libera constantemente uma quantidade profilática de FIX.
Exemplo 51: XTEN C-terminal liberável por MMP-17
[00434] Uma proteína de fusão FIX-XTEN consistindo em uma proteína XTEN fundida ao C-término de FIX pode ser criada com uma sequência de clivagem de sítio de liberação de XTEN colocada entre os componentes FIX e XTEN, conforme representado na figura 36B. Sequências exemplificativas são fornecidas na Tabela 43. Nesse caso, o sítio de liberação contém uma sequência de aminoácido que é reconhecida e clivada pela protease MMP-17 (EC.3.4.24.-, Uniprot Q9ULZ9). Especificamente, a sequência APLG^LRLR (SEQ ID NO: 235) [Rawlings N.D. et al. (2008) Nucleic Acids Res., 36: D320], deverá ser cortada após a posição 4 na sequência. MMP- 17 é constitutivamente expressa em sangue íntegro. Portanto, à medida que a FIX-XTEN de vida longa circula, uma fração da mesma será clivada, criando um pool de FIX de vida mais curta a ser usado em coagulação. Em uma característica desejável da composição da invenção, isso cria um depósito de profármaco em circulação que libera constantemente uma quantidade profilática de FIX.
Exemplo 52: XTEN C-terminal liberável por MMP-20
[00435] Uma proteína de fusão FIX-XTEN consistindo em uma proteína XTEN fundida ao C-término de FIX pode ser criada com uma sequência de clivagem de sítio de liberação de XTEN colocada entre os componentes FIX e XTEN, conforme representado na figura 36B. Sequências exemplificativas são fornecidas na Tabela 43. Nesse caso, o sítio de liberação contém uma sequência de aminoácido que é reconhecida e clivada pela protease MMP-20 (EC.3.4.24.-, Uniprot 060882). Especificamente, a sequência PALPjLVAQ (SEQ ID NO: 236) [Rawlings N.D. et al. (2008) Nucleic Acids Res., 36: D320], deverá ser cortada após a posição 4 (representada pela seta). MMP-20 é constitutivamente expressa em sangue íntegro. Portanto, à medida que a FIX-XTEN de vida longa circula, uma fração da mesma será clivada, criando um pool de FIX de vida mais curta a ser usado em coagulação. Em uma característica desejável da composição da invenção, isso cria um depósito de profármaco em circulação que libera constantemente uma quantidade profilática de FIX.
Exemplo 53: Fusão interna de XTEN no loop KSADK
[00436] Uma proteína de fusão FIX-XTEN consistindo de uma proteína XTEN inserida em um loop de FIX pode ser criada, conforme representado na FIG, 37F. Especificamente, a sequência do XTEN deverá ser inserida como uma fusão no loop KNSADNK (SEQ ID NO: 1749) do domínio EGF2 (resíduos 146-152), o qual não tem mutações conhecidas de hemofilia B e não é altamente estruturado na estrutura de cristal do FIX. Nesse caso, a inserção seria feita dividindo-se a sequência nativa na ligação SA da sequência de loop e fundindo a sequência do XTEN no espaço. Isso daria origem a uma sequência de loop em que o XTEN seria interno à sequência do FIX, mas externo à proteína globular. Em uma característica desejável da composição da invenção, isso cria uma situação onde FIX- permaneceria intacta como um profármaco até ativação de coagulação, momento no qual a molécula seria processada para produzir FIXa-XTEN, a qual reconstitui ou aumenta a função de coagulação em um indivíduo que precisa da mesma.
Exemplo 54: Fusão interna de XTEN no loop LAEN
[00437] Uma proteína de fusão FIX-XTEN consistindo em uma proteína XTEN inserida em um loop de FIX pode ser criada, conforme representado na figura 37F. Especificamente, a sequência do XTEN deverá ser inserida como uma fusão no loop LAEN (SEQ ID NO: 1778) do domínio EGF2 (resíduos 163-166), o qual não tem mutações conhecidas de hemofilia B e não é altamente estruturado na estrutura de cristal do FIX. Nesse caso, a inserção seria feita dividindo-se a sequência nativa na ligação AE da sequência de loop e fundindo a sequência do XTEN no espaço. Isso daria origem a uma sequência de loop LA-XTEN-EN. Em uma característica desejável da composição da invenção, isso cria uma situação onde a FIX-XTEN permaneceria intacta como um profármaco até ativação de coagulação, momento no qual a molécula seria processada para produzir FIXa-XTEN, a qual reconstitui ou aumenta a função de coagulação em um indivíduo que precisa da mesma.
Exemplo 55: Fusão interna de XTEN no peptídeo de ativação
[00438] Uma proteína de fusão FIX-XTEN consistindo em uma proteína XTEN inserida em um loop de FIX pode ser criada, conforme representado na figura 37D. Especificamente, a fusão de XTEN deverá ser colocada no peptídeo de ativação (resíduos 192-226), de modo que n dos dois sítios de clivagem de FXIa nativos sejam rompidos. A inserção deverá ser feita dividindo-se a sequência nativa na ligação T209-I210 (indicada por | da sequência e fundindo a sequência do XTEN no espaço. Isso dá origem a uma sequência com XTEN inserido começando no resíduo 188 do peptídeo de ativação. FXI é a protease pró-coagulante localizada imediatamente antes de FIX na via de coagulação intrínseca ou ativada por contato. FXIa ativo é produzido a partir de FXI por meio de clivagem proteolítica do zimogênio por FXIIa. Uma vez ativado, seu papel natural em coagulação é ativar o FIX (figura 39) excisando o peptídeo de ativação do zimogênio FIX por meio de corte da proteína nas posições R191 e R226. Esses sítios cortados são representados por setas e as sequências são projetadas para deixar sítios P4-P4' inalterados para atividade de clivagem natural durante a cascata de coagulação. Portanto, o domínio XTEN será removido do FIX apenas como parte do processo de ativação normal dentro da via de coagulação intrínseca.
Exemplo 56: Fusão interna de XTEN entre os domínios EGF de FIX
[00439] Uma proteína de fusão FIX-XTEN consistindo em uma proteína XTEN inserida em um loop de FIX pode ser criada, conforme representado na figura 37C. Especificamente, a fusão de XTEN deverá ser colocada entre os dois domínios semelhantes a EGF do FIX (a junção é entre os resíduos 129 e 130). A inserção deverá ser feita dividindo-se a sequência nativa na ligação E129-L130 e fundindo a sequência do XTEN no espaço. Isso daria origem a uma sequência com XTEN inserido começando no resíduo 121. Praticamente, isso cria uma situação onde a FIX-XTEN circularia intacta até ativação de coagulação, momento no qual a molécula seria processada para produzir FIXa- XTEN, a qual reconstitui ou aumenta a função de coagulação em um indivíduo.
Exemplo 57: Otimização da taxa de liberação de XTEN C-terminal
[00440] Variantes dos Exemplos 41-57 precedentes podem ser criadas, nas quais a taxa de liberação de XTEN C-terminal é alterada. Uma vez que a taxa de liberação de XTEN por uma protease de liberação de XTEN é dependente da sequência do sítio de liberação de XTEN, variação da sequência de aminoácido no sítio de liberação de XTEN pode controlar a taxa de liberação de XTEN. A especificidade de sequência de muitas proteases é bem conhecida na técnica e é documentada em vários bancos de dados. Nesse caso, a especificidade de aminoácido das proteases seria mapeada usando bibliotecas combinatoriais de substratos [Harris, J. L. et al. (2000) Proc Natl Acad Sci USA, 97: 7754] ou acompanhando a clivagem de misturas de substrato, conforme ilustrado [Schellenberger, V. et al. (1993) Biochemistry, 32: 4344]. Uma alternativa é a identificação de sequências de clivagem de protease desejadas através da exibição de fago [Matthews, D. et al. (1993) Science, 260: 1113]. Construtos seriam feitos com sequências variantes e ensaiados com relação à liberação de XTEN usando ensaios padrão para detecção dos polipeptídeos XTEN.
Exemplo 58: Ativação de trombina de FIX-XTEN
[00441] Um sítio de liberação de XTEN específico para FXI foi inserido em FIX-XTEN_AE864, resultando no construto AC299. Um sítio de liberação de XTEN específico para trombina foi inserido em FIX- XTEN AE864, resultando no construto AC300. O construto AC296, que carece de um sítio de liberação de XTEN, foi usado como um controle. Plasmídeos de expressão foram transfectados usando reagente de transfecção FuGene6 (Roche) em células BHK-21 (1,2 x 10e6 células em 10 ml de meio OptiMEM da Invitrogen). Meio foi coletado após 4 dias e concentrado 40 vezes usando um aparelho de concentração com filtro Amicon Ultra Centrifugal (Ultracel_30K, Millipore). 67 μl de meio concentrado foram diluídos em 10x tampão de trombina e incubados com 25 μl de trombina imobilizada (Thrombin CleanCleave Kit, RECOM- T, Sigma) durante 8 horas em temperatura ambiente. A concentração de FIX em todas as amostras foi determinada por meio de ELISA usando anticorpos (cat N° FIX-EIA, Affinity Biologicals Inc., Canadá). A atividade de coagulação foi determinada usando um ensaio aPPT (Thermo Scientific Pacific Hemostasis, Fisher) e as atividades foram convertidas em concentrações de FIX, admitindo que 1 mU de FIX é equivalente a 4,5 ng/ml. Os resultados são compilados na Tabela 31 abaixo. Os dados mostram que incubação de trombina não teve efeito significativo sobre o sinal de ELISA e atividade de coagulação de AC296 e AC299, a qual é consistente com o fato de que ambos os construtos carecem de um sítio de trombina. Em contraste, tratamento com trombina resultou em um aumento de 27 vezes na atividade de coagulação para AC300. Tratamento com trombina restaurou a atividade de coagulação de AC300 para 80% do FIX livre. Esses dados demonstram que a fusão de XTEN ao C- término de FIX resultou em uma redução de 50 a 100 vezes na atividade de coagulação. Sustentando o conceito das propriedades de profármaco desses construtos de FIX-XTEN C-terminais, a liberação proteolítica de XTEN restaurou a maior parte da atividade de coagulação. Tabela 31: ELISA e atividade de coagulação de proteína de fusão FIX- XTEN sem trombina, com trombina, sem trombina, com trombina, mudar ponto para vírgula
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Exemplo 59: Inserção de XTEN em FIX baseado na estrutura de éxon
[00442] A estrutura de éxon de proteínas fornece informação valiosa a respeito dos limites de domínio que pode orientar a inserção de XTEN em proteínas de mamífero [Kolkman, J. A. et al. (2001) Nat Biotechnol, 19: 423]. A figura 40 ilustra vários exemplos de como essa abordagem se aplica à criação de composições de FIX-XTEN, com sítios exemplificativos para inserção de XTEN entre os limites de éxon indicados.
Exemplo 60: FIX-XTEN baseado em sequências de FIX manipuladas
[00443] Muitos mutantes de FIX foram manipulados para atividade aprimorada. De utilidade particular são mutantes com atividade aumentada de protease. Contudo, mutantes com aprimoramentos nos domínios G1a e/ou EGF podem ser úteis também para o tratamento de hemofilia B de modo que, após avaliação experimental ou clínica, eles possam ser usados ao invés da sequência de FIX nativa. Exemplos de mutantes de FIX úteis são apresentados na Tabela 7.
Exemplo 61: Produção de FIX-XTEN
[00444] Proteínas de fusão FIX-XTEN podem ser expressas em uma variedade de vetores de expressão de mamífero. Um vetor exemplificativo, pCW05090, baseado no pSecTag2 (Invitrogen) é ilustrado na figura 42. O construto de expressão contém um cassete de expressão compreendendo o promotor de CMV, o peptídeo sinalizador de FIX, o pró-peptídeo de FIX, o gene de FIX maduro fundido ao gene que codifica um XTEN_AE864, seguido por um sítio de poliadenilação. O vetor contém um marcador de zeocina para seleção em células de mamífero, uma origem de replicação pUC para E. coli e um marcador de ampicilina para seleção em E. coli. O vetor de expressão pode ser transfectado em células CHO, células PER.C6 ou células ou BHK para expressão. A expressão pode ser monitorada através de ELISA ou um ensaio de coagulação. Proteínas de fusão FIX-XTEN podem ser purificadas por meio de troca de íons, em particular troca de ânions. Para fins desse experimento, ela foi transfectada em células CHO.
Processo inicial de captura através de cromatografia de troca de ânions
[00445] Meio de cultura de células das células transfectadas foi diretamente aplicado a 800 ml de resina de troca de ânions Macrocap Q (GE Life Sciences) que tinha sido equilibrada com Tris a 20 mM, pH de 6,8, NaCl a 50 mM. A coluna foi sequencialmente lavada com tampão de Tris, pH de 6,8 contendo NaCl a 50 mM, 100 mM e 150 mM. O produto foi eluído com Tris a 20 mM, pH 6,8, NaCl a 250 mM.
Cromatografia de interação hidrofóbica (HIC) usando Octil Sepharose FF
[00446] Uma coluna Octil Sepharose FF de 250 mL foi equilibrada com tampão de equilíbrio (Tris a 20 mM, pH de 6,8, Na2SO4 a 1,0 M). Na2SO4 sólido foi adicionado ao pool do eluato de Macrocap Q para obter uma concentração final de 1,0 M. A solução resultante foi filtrada (0,22 mícrons) e carregada sobre a coluna de HIC. A coluna foi, então, lavada com tampão de equilíbrio para 10 CV a fim de remover a proteína não ligada e DNA de célula hospedeira. O produto foi, então, eluído com Tris a 20 mM, pH de 6,8, Na2SO4 a 0,5 M.
Acabamento de produto através de cromatografia de troca de ânions
[00447] As frações de eluato de HIC agrupadas foram, então, diluídas com Tris a 20 mM, pH de 7,5 para obter uma condutividade de menos de 5,0 mOhms. O produto diluído foi carregado sobre uma coluna de troca de ânions Q Sepharose FF de 300 ml que tinha sido equilibrada com Tris a 20 mM, pH de 7,5, NaCl a 50 mM.
Formulação final e armazenamento
[00448] As proteínas com tampão trocado foram, então, concentradas através de ultrafiltração/diafiltração (UF/DF), usando um cartucho Pellicon XL Biomax de 30000 mwco para mais de 30 mg/ml. O concentrado foi filtrado estéril usando um filtro para seringa de 0,22 mícron. A solução final foi transformada em alíquotas e armazenada a - 80°C.
Exemplo 62: Otimização de códon de FIX-XTEN
[00449] Otimização de códon pode ser aplicada para aumentar a expressão de FIX-XTEN. Isso pode ser realizado usando algoritmos de computador que consideram a preferência de códon em genes humanos, previsão de estrutura de RNA, bem como a previsão de repetições internas.
Exemplo 63: Formulações de Depósito de FIX-XTEN
[00450] XTEN pode ser escolhido com propriedades particulares para formulação a fim de formar depósitos no local de injeção. Isso resultaria em liberação lenta de FIX-XTEN do local de injeção e aumentaria o tempo entre os intervalos de dosagem. A formação de depósitos pode ser facilitada pela formulação de FIX-XTEN com excipientes que interagem com FIX-XTEN e resultam em formação de complexo ou agregado. Exemplos de excipientes úteis são zinco, protamina, PEG, policátions, polímeros, poliarginina, polilisina. Depósitos podem também ser formados carregando FIX-XTEN em partículas, tais como alginato, quitina, ácido poliláctico, PLGA, ácido hialurônico, hidroxiapatita ou outros polímeros conhecidos por aqueles versados no campo.
Exemplo 64: FIX-XTEN com estabilidade aumentada
[00451] FIX livre é propenso à agregação, o que complica a formulação da proteína. Essa característica também impede o desenvolvimento de formulações em alta concentração que permitam pequenos volumes de injeção requeridos para injeção sc. Em virtude das propriedades do XTEN reduzirem a agregação dos parceiros de fusão, podem ser criadas composições de FIX-XTEN que 1) impedem a agregação de FIX; e 2) permitem administração subcutânea ou intramuscular.
Exemplo 65: FVII-XTEN_AE864
[00452] O gene que codifica fator VII ("FVII") foi fundido, in-frame, a um XTEN_AE864 e inserido no vetor de expressão pCW0590. Células CHO-K1 foram transfectadas com o vetor de expressão e pools adequados foram selecionadoas usando zeocina e a proteína expressa foi recuperada. A sequência de aminoácido para o Fator VII- XTEN_AE864 expresso é listada na Tabela 43. Níveis de expressão de 159 ng/ml de equivalentes de FVII foram detectados por meio de ELISA e 214 ng/ml de equivalentes de FVII foram detectados usando um ensaio de coagulação PPT (Thermo Scientific Pacific Hemostasis, Fisher). Isso demonstra que fusão de XTEN AE864 com FVII para criar uma BPXTEN resulta em uma proteína de fusão que retém a atividade de coagulação do FVII.
Exemplo 66: Produção de FVIIa-XTEN
[00453] FVIIa-XTEN pode ser produzida essencialmente conforme descrito no Exemplo 61 para FIX-XTEN. Uma etapa de ativação deverá ser adicionada para converter FVII-XTEN em FVIIa-XTEN. Alternativamente, um vetor bicistrônico poderia ser utilizado, de modo que ambas as cadeias de proteína do FVIIa sejam separadamente expressas e montadas diretamente em FVIIa-XTEN ativada.
Exemplo 67: Fator VII - Avaliação de atividade de polipeptídeos de fusão FVII-XTEN
[00454] Uma curva-padrão foi preparada por meio de diluição de plasma de controle normal (Pacific Hemostasis 100595) dez vezes com plasma deficiente de FVII (100070) e, então, conduzindo diluições seriais 4, 5 vezes novamente com plasma deficiente em fator VII. Isso criou uma curva-padrão com pontos a 100, 20, 4, 0,8 e 0,16 mUnidades/ml de atividade, onde uma unidade de atividade é definida como a quantidade de atividade de FVII em 1 ml de plasma humano normal. Um plasma deficiente em FVII foi também incluído para determinar o nível de base de atividade no plasma nulo. A amostra foi preparada por meio da adição de FVII-XTEN secretado por células HEK293 que foram transitoriamente transfectadas com um vetor contendo sequência de codificação de FVII-XTEN em meio condicionado a partir do crescimento celular, ao plasma deficiente em FVII em uma proporção de 1:10 em volume. Para compensar a possível interferência a partir do meio condicionado, meio condicionado a partir de uma transfecção de células HEK293 com um vetor vazio foi adicionado em uma proporção de 1:10 em volume às amostras de curva-padrão. As amostras foram testadas usando um ensaio de tempo de protrombina como segue. As amostras foram incubadas a 37°C em um espectrofotômetro de leitor de placa de dispositivos moleculares durante 3 minutos, ponto no qual a reação de coagulação foi iniciada por meio da adição de 2 volumes de tromboplastina (Dade Innovin, B4212-50) por um volume de amostra. A turbidez foi monitorada a 405 nm durante 5 minutos para criar perfis de reação. O tempo de PT ou tempo até início de atividade de coagulação foi definido como o primeiro tempo onde a OD405nm aumentou em 0,06 com relação à linha de base. Uma curva-padrão log-linear foi criada com o log de atividade relacionada linearmente ao tempo de PT. A partir disso, a atividade da amostra na cavidade da lâmina foi determinada e, então, a atividade na amostra determinada multiplicando-se por 11 para levar em conta a diluição no plasma deficiente em FVII. Baseado em medições duplas, a atividade da fusão FVII-XTEN era de 203 mUnidades/ml. Os perfis de reação são apresentados na Figura 9, onde o plasma deficiente em FVII é mostrado como uma linha tracejada em negrito, três amostras do padrão são mostradas como linhas tracejadas e a amostra de FVII- XTEN é mostrada como uma linha em negrito.
Exemplo 68: Purificação de Proteína de Fusão Fator VII-XTEN
[00455] A proteína de fusão FVII-XTEN pode ser expressa em uma variedade de vetores de expressão de mamífero. O vetor pCW05090 que é baseado no pSecTag2 (Invitrogen) é ilustrado na figura 46. O construto de expressão contém um cassete de expressão compreendendo o promotor de CMV, o peptídeo sinalizador de FVII, o pró-peptídeo de FVII, o gene de FVII maduro fundido ao gene que codifica um XTEN AE864, seguido por um sítio de poliadenilação. O vetor contém um marcador de zeocina para seleção em células de mamífero, uma origem de replicação pUC para E. coli e um marcador de ampicilina para seleção em E. coli. O vetor de expressão pode ser transfectado em células CHO, células HEK293, PER.C6 ou células BHK para expressão. A expressão pode ser monitorada através de ELISA ou um ensaio de coagulação. Proteínas de fusão FVII-XTEN podem ser purificadas por meio de troca de íons, em particular troca de ânions.
[00456] O processo inicial de captura através de cromatografia de troca de ânions. Meio de cultura celular foi aplicado diretamente a 800 ml de resina de troca de ânions Macrocap Q (GE Life Sciences) que tinha sido equilibrada com Tris a 20 mM, pH de 6,8, NaCl a 50 mM. A coluna foi sequencialmente lavada com tampão de Tris, pH de 6,8 contendo NaCl a 50 mM, 100 mM e 150 mM. O produto foi eluído com Tris a 20 mM, pH de 6,8, NaCl a 250 mM e verificado usando os métodos do Exemplo 67.
Exemplo 69: Ensaios aPTT para Determinação de Atividade de FIX
[00457] Fator IX está na via de coagulação intrínseca ou ativada por contato. A atividade dessa via de coagulação é usada para avaliar a atividade de FIX-XTEN e subprodutos proteolíticos usando um ensaio de tempo de tromboplastina parcial ativada (aPTT). A atividade de FIX foi especificamente medida como segue, uma curva-padrão foi preparada diluindo-se plasma de controle normal (Pacific Hemostasis catNo. 100595) duas vezes com plasma deficiente em FIX (catNo. 100900) e, então, conduzindo diluições seriais 6, 4 vezes novamente com plasma deficiente de fator IX. Isso criou uma curva-padrão com pontos a 500, 130, 31, 7,8, 2,0, 0,5 e 0,1 mUnidades/ml de atividade, onde uma unidade da atividade é definida como a quantidade de atividade de FIX em 1 ml de plasma humano normal. Plasma deficiente em FIX foi também incluído para determinar o nível de base da atividade no plasma nulo. A amostra foi preparada por meio da adição de FIX- XTEN secretado por células CHO que foram transitoriamente transfectadas com um vetor contendo sequência de codificação de FIX- XTEN em meio condicionado a partir do crescimento celular, ao plasma deficiente em FIX em uma proporção de 1: 10 em volume. Para compensar possível interferência do meio condicionado, meio condicionado de uma transfecção de células CHO com um vetor vazio foi adicionado em uma proporção de 1:10 em volume às amostras de curva-padrão. As amostras foram testadas usando um ensaio aPTT como segue. As amostras foram incubadas a 37 °C em um espectrofotômetro de leitor de placa de dispositivos moleculares durante 2 minutos, ponto no qual um volume igual de reagente aPTT (Pacific Hemostasis catNo. 100402) foi adicionado e uma incubação de mais 3 minutos a 37°C realizada. Após a incubação, o ensaio foi ativado por meio da adição de um volume de cloreto de cálcio (Pacific Hemostasis catNo. 100304). A turbidez foi monitorada a 450 nm durante 5 minutos para criar perfis de reação. O tempo no aPTT ou tempo até início de atividade de coagulação foi definido como o primeiro tempo onde a OD450nm aumentou em 0,06 com relação à linha de base. Uma curva- padrão log-linear foi criada com o log de atividade relacionada linearmente ao tempo no aPTT. A partir disso, a atividade da amostra na cavidade da lâmina foi determinada e, então, a atividade na amostra foi determinada multiplicando-se por 11 para levar em conta a diluição no plasma deficiente em FIX.
Exemplo 70: Ensaios ELISA para Determinação da Concentração de FIX
[00458] As concentrações de Fator IX para as várias composições de FIX-XTEN e subprodutos proteolíticos foram determinadas usando um ensaio ELISA com um par correspondente específico de anticorpos, onde o anticorpo de detecção foi conjugado a HRP para simplificar a detecção (Affinity Biologicals catNo. FIX-EIA). O anticorpo de captura foi revestido a 4°C durante a noite sobre uma lâmina de ensaio com 96 cavidades de alta ligação (Corning 3690). A lâmina foi bloqueada com BSA a 3% em PBS durante 1 hora em temperatura ambiente. A lâmina foi lavada 6 vezes em PBST com um lavador de lâminas. Amostras ou padrões, diluídos em PBST, foram, então, ligados às cavidades apropriadas durante 2 horas em temperatura ambiente. A curva-padrão oscilava de 25 ng/ml a <1 pg/ml e foi preparada através de diluição serial de FIX comercial em uma baixa concentração (Abeam CatNo. ab62544) em PBST. A lâmina foi novamente lavada 6 vezes com PBST usando um lavador de lâminas. O FIX foi, então, detectado usando o anticorpo de detecção, o qual foi ligado durante 1 hora a 37°C. A lâmina foi lavada novamente 6 vezes com PBST usando um lavador de lâmina e lavada mais uma vez com água. O sinal foi, então, revelado com substrato TMB e quantificado por meio de leitura a 405 nm sobre um espectrofotômetro de leitor de placa de dispositivos moleculares. Uma adaptação de quatro parâmetros é, então, realizada sobre os padrões e a concentração das amostras determinada comparando-se com a curva-padrão.
Exemplo 71: Designs de Ensaios Clínicos Humanos para Avaliação de BPXTEN
[00459] Ensaios clínicos podem ser projetados, de modo que a eficácia e vantagens das composições de BPXTEN, com relação a produtos biológicos únicos, possam ser verificadas em seres humanos. Por exemplo, os construtos de fusão BPXTEN compreendendo glucagon e exenatida, conforme descrito nos Exemplos acima, podem ser usados em ensaios clínicos para caracterização da eficácia das composições. Os ensaios poderiam ser conduzidos em uma ou mais doenças, distúrbio ou condições metabólicas que são melhoradas, aliviadas ou inibidas pela administração de glucagon e exenatida. Tais estudos em pacientes adultos compreendem três fases. Primeiro, um estudo de Fase I de segurança e farmacocinética em pacientes adultos seria conduzido para determinar a dose máxima tolerada e farmacocinética e farmacodinâmica em seres humanos (indivíduos normais ou pacientes com uma doença ou condição metabólica), bem como definir potenciais toxicidades e eventos adversos a serem rastreados em futuros estudos. Seria conduzido um estudo no qual doses únicas crescentes de composições de proteínas de fusão de XTEN ligado ao glucagon e exenatida seriam administradas e parâmetros bioquímicos, PK e clínicos serão medidos. Isso permitiria a determinação da dose máxima tolerada e estabeleceria o limiar e concentrações máximas do fármaco em circulação e dosagem que constituem a janela terapêutica para os respectivos componentes. Após o que, ensaios clínicos serão conduzidos em pacientes com uma doença, um distúrbio ou uma condição.
Ensaios clínicos em diabetes
[00460] Um estudo de dosagem em fase II seria conduzido em pacientes diabéticos onde a farmacodinâmica da glicose no soro e outros parâmetros clínicos, fisiológicos, PK e segurança (tal como listado abaixo) apropriados para diabetes, resistência à insulina e condições de obesidade serão medidos como uma função da dosagem das proteínas de fusão compreendendo XTEN ligado ao glucagon e exenatida, fornecendo informação de faixa de dose sobre doses apropriadas para um ensaio em Fase III, além de coleta de dados de segurança relacionados a eventos adversos. Os parâmetros PK seriam correlacionados aos dados de parâmetros fisiológicos, clínicos e de segurança para estabelecer a janela terapêutica para cada componente da composição de BPXTEN, permitindo que o médico estabeleça a proporção apropriada das duas proteínas de fusão componentes, cada uma compreendendo um peptídeo de regulação de glicose ou determinar a dose única para uma BPXTEN monomérica compreendendo dois peptídeos de regulação de glicose. Finalmente, um estudo de eficácia em fase III seria conduzido no qual será administrada, a pacientes diabéticos, a composição de BPXTEN, um controle positivo ou um placebo diariamente, bissemanalmente ou semanalmente (ou outro esquema de dosagem considerado apropriado dadas as propriedades farmacocinéticas e farmacodinâmicas da composição de BPXTEN) durante um período de tempo prolongado. Medidas de resultados primários de eficácia poderiam incluir concentrações de HbA1c, enquanto que medidas de resultados secundários poderiam incluir requisito de insulina durante o estudo, concentrações de insulina e peptídeo C estimulado, glicose em jejum no plasma (FPG), níveis de citocina no soro, níveis de CRP e índice de secreção de insulina e sensibilidade à insulina a partir de um OGTT com medições de insulina e glicose, bem como peso corporal, consumo de alimento e outros marcadores diabéticos aceitáveis que serão rastreados com relação ao grupo com controle positivo ou placebo. Resultados de eficácia seriam determinados usando métodos estatísticos padrão. Marcadores de toxicidade e eventos adversos também seriam acompanhados nesse estudo para verificar se o composto é seguro quando usado da maneira descrita.
Ensaio clínico em artrite
[00461] Um estudo clínico em fase II de pacientes humanos seria conduzido em pacientes com artrite aos quais foi administrada BPXTEN compreendendo XTEN ligado a IL-1ra e/ou anti-IL-2, anti-CD3 ou uma proteína anti-inflamatória adequada para determinar uma dose apropriada para aliviar pelo menos um sintoma associado à artrite reumatoide, incluindo redução de edema articular, flacidez articular, inflamação, rigidez pela manhã e dor ou pelo menos um marcador substituto biológico associado à artrite reumatoide, incluindo taxas reduzidas de sedimentação de eritrócito e níveis séricos de proteína C reativa e/ou receptor de IL2. Além disso, dados de segurança relacionados a eventos adversos seriam coletados. Um estudo de eficácia em fase III seria conduzido, em que serão administrados, a pacientes com artrite, a BPXTEN, um controle positivo ou um placebo diariamente, bissemanalmente ou semanalmente (ou outros esquema de dosagem considerado apropriado dadas as propriedades farmacocinéticas e farmacodinâmicas do composto) durante um período de tempo prolongado. Os pacientes serão avaliados com relação aos sintomas de linha de base de atividade da doença antes de recebimento de quaisquer tratamentos, incluindo edema articular, flacidez articular, inflamação, rigidez pela manhã, atividade da doença avaliada pelo paciente e médico, bem como incapacidade avaliada, por exemplo, por um Questionário de Avaliação de Saúde (Health Questionnaire Assessment -HAQ) padrão e dor. Avaliações de linha de base adicionais poderiam incluir taxas de sedimentação de eritrócito (ESR), níveis de proteína C reativa no soro (CRP) e receptor de IL-2 solúvel (IL-2r). A resposta clínica ao tratamento poderia ser ensaiada usando os critérios estabelecidos pela American College of Rheumatology (ACR), tal como o critério ACR20; isto é, se houve um aprimoramento de 20 porcento nas contagens de flacidez e edema articular e aprimoramento de 20 porcento em três dos cincos sintomas medidos, tal como alterações globais na doença pelo paciente e médico, dor, incapacidade e um reagente em fase aguda (Felson, D. T. et al., 1993 Arthritis and Rheumatism 36: 729-740; Felson, D. T. et al., 1995 Arthritis and Rheumatism 38: 1-9). Similarmente, um indivíduo satisfará o critério ACR70, se houve um aprimoramento de 50 ou 70 porcento, respectivamente, nas contagens de flacidez e edema articular e aprimoramento de 50 ou 70 porcento, respectivamente, em três dos cinco sintomas medidos, tais como alterações globais na doença pelo paciente e médico, dor, incapacidade física e um reagente de fase aguda, tal como CRP ou ESR. Além disso, biomarcadores potenciais de atividade da doença poderiam ser medidos, incluindo fator reumatoide, CRP, ESR, IL-2R solúvel, ICAM-I solúvel, E-selectina solúvel e MMP-3. Resultados de eficácia seriam determinados usando métodos estatísticos padrão. Marcadores de toxicidade e eventos adversos também seriam acompanhados nesse estudo para verificar se o composto é seguro quando usado da maneira descrita.
Ensaio clínico em síndrome coronariana aguda e infarto do miocárdio agudo
[00462] Um ensaio em fase III em síndrome coronariana aguda (ACS) e/ou infarto do miocárdio agudo (AMI) foi conduzido em pacientes diagnosticados com ACS e/ou AMI a ser administrada uma proteína de fusão BPXTEN compreendendo, por exemplo, IL-1ra e BNP, um controle positivo, a combinação da proteína de fusão BPXTEN mais uma substância de controle positivo ou um placebo diariamente, bissemanalmente ou semanalmente (ou outro esquema de dosagem considerado apropriado dadas as propriedades farmacocinéticas e farmacodinâmicas do composto) durante um período prolongado de tempo. O estudo seria conduzido para determinar se a BPXTEN é superior aos outros regimes de tratamento para prevenção de morte cardiovascular, infarto do miocárdio não fatal ou derrame isquêmico em indivíduos com uma síndrome coronariana aguda recente. Os pacientes foram avaliados com relação aos sintomas de linha de base de atividade da doença antes de receberem quaisquer tratamentos, incluindo sinais ou sintomas de angina instável, dor no peito experimentada como aperto em torno do peito irradiando para o braço esquerdo e o ângulo esquerdo da mandíbula, diaforese (sudorese), náusea e vômito, respiração curta, bem como evidência no eletrocardiograma (ECG) de infarto do miocárdio sem ondas Q e infarto do miocárdio com ondas Q. Avaliações de linha de base adicionais poderiam incluir medição de biomarcadores, incluindo albumina isquemia-modificada (IMA), mieloperoxidase (MPO), isoenzima BB de fosforilase de glicogênio (GPBB), troponina, peptídeo natriurético (peptídeo natriurético do tipo B (BBNP) e Pro BNP N- terminal) e proteína quimioatrativa de monócito (MCP)-1. A resposta clínica ao tratamento pôde ser ensaiada usando o tempo até primeira ocorrência de morte cardiovascular, infarto do miocárdio ou derrame isquêmico como medidas de resultados primários, enquanto que ocorrências ou o tempo até primeira angina instável, derrame hemorrágico ou sangramento fatal poderia servir como medidas de resultados secundários. Resultados de eficácia seriam determinados usando métodos estatísticos padrão. Marcadores de toxicidade e eventos adversos também seriam acompanhados nesse estudo para verificar se o composto é seguro quando usado da maneira descrita.
Exemplo 72: Análise de sequências quanto à estrutura secundária por meio de algoritmos de previsão
[00463] Sequências de aminoácido podem ser avaliadas quanto à estrutura secundária via determinados programas de computador ou algoritmo, tais como o algoritmo de Chou-Fasman bem conhecido (Chou, P. Y. et al. (1974) Biochemistry, 13: 222-45) e o método de Garnier-Osguthorpe-Robson ou "GOR" (Gamier J, Gibrat JF, Robson B. (1996). GOR Method For Predicting Protein Secondary Structure From Aminoacid Sequence. Methods Enzymol 266: 540-553). Para uma determinada sequência, os algoritmos podem prever se há alguma ou nenhuma estrutura secundária em geral, expressa como total e/ou percentual de resíduos da sequência que forma, por exemplo, alfa- hélices ou beta-folhas ou o percentual de resíduos da sequência previsto como resultando em formação de espiral aleatória.
[00464] Várias sequências representativas de "famílias" de XTEN foram avaliadas usando duas ferramentas de algoritmo para os métodos de Chou-Fasman e GOR a fim de avaliar o grau de estrutura secundária nessas sequências. A ferramenta de Chou-Fasman foi fornecida por William R. Pearson e a University of Virginia, no site da internet "Biosupport", URL localizada na World Wide Web em.fasta.bioch.Virginia. edu/fasta_www2/fasta_www.cgi?rm=miscl, conforme ela existia em 19 de Junho de 2009. A ferramenta GOR foi fornecida pelo Pole Informatique Lyonnais no site na internet Network Protein Sequence Analysis, URL localizada na World Wide Web em.npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_gor4.pl, conforme ela existia em 19 de Junho de 2008.
[00465] Como uma primeira etapa nas análises, uma única sequência de XTEN foi analisada pelos dois algoritmos. A composição AE864 é um XTEN com 864 resíduos de aminoácido criado a partir de múltiplas cópias de quatro motivos de sequência de 12 aminoácidos consistindo dos aminoácidos G, S, T, E, P e A. Os motivos de sequência são caracterizados pelo fato de que há repetitividade limitada dentro dos motivos e dentro da sequência global, em que a sequência de quaisquer dois aminoácidos consecutivos não é repetida mais de duas vezes em qualquer um dos motivos de 12 aminoácidos e que três aminoácidos não contíguos do XTEN de comprimento total são idênticos. Porções sucessivamente maiores da sequência AF 864 a partir do N-término foram analisadas através dos algoritmos de Chou-Fasman e GOR (o último requer um comprimento mínimo de 17 aminoácidos). As sequências foram analisadas inserindo as sequências no formato FASTA nas ferramentas de previsão e realizando a análise. Os resultados das análises são apresentados na Tabela 32.
[00466] Os resultados indicam que, através dos cálculos de Chou- Fasman, os quatro motivos da família AE (Tabela 1) não têm alfa-hélices ou beta folhas. Similarmente, descobriu-se que a sequência de até 288 resíduos não tem alfa-hélices ou beta-folhas. A sequência de 432 resíduos é prevista como tendo uma pequena quantidade de estrutura secundária, com apenas 2 aminoácidos contribuindo para uma alfa- hélice para um percentual global de 0,5%. O polipeptídeo AF864 de comprimento total tem os mesmos dois aminoácidos que contribuem para uma alfa-hélice, para um percentual global de 0,2%. Cálculos para formação de espiral aleatória revelaram que, com aumento do comprimento, o percentual de formação de espiral aleatória aumenta. Os primeiros 24 aminoácidos da sequência tinham 91% de conformação em espiral aleatória, a qual aumentou com aumento do comprimento até o valor de 99,77% para a sequência de comprimento total.
[00467] Numerosas sequências de XTEN de 500 aminoácidos ou mais de outras famílias de motivo foram também analisadas e revelaram que a maioria tinha mais de 95% de conformação em espiral aleatória. As exceções eram aquelas sequências com um ou mais casos de três resíduos de serina contíguos, as quais resultaram em formação prevista de beta-folha. Contudo, mesmo essas sequências ainda tinham aproximadamente 99% de conformação em espiral aleatória.
[00468] Em contraste, uma sequência polipeptídica de 84 resíduos limitados a aminoácidos A, S e P foi avaliada por meio do algoritmo de Chou-Fasman, o qual previu um alto grau de alfa-hélices previstas. A sequência, a qual tinha múltiplas sequências "AA" e "AAA" repetidas, tinha um percentual previsto global de estrutura de alfa-hélice de 69%. O algoritmo GOR previu 78,57% de conformação em espiral aleatória; muito menos do que qualquer sequência consistindo de motivos de sequência de 12 aminoácidos consistindo dos aminoácidos G, S, T, E, P, analisadas no presente Exemplo. Conclusões: A análise sustenta a conclusão de que: 1) XTENs criados a partir de múltiplos motivos de sequência de G, S, T, E, P e A que têm repetitividade limitada quanto a aminoácidos contíguos são previstos como tendo quantidades muito baixas de alfa-hélices e beta-folhas; 2) que o aumento no comprimento do XTEN não aumenta apreciavelmente a probabilidade de formação de alfa-hélice ou beta-folha; e 3) que aumento progressivo do comprimento da sequência do XTEN mediante a adição de 12 meros não repetitivos consistindo nos aminoácidos G, S, T, E, P e A resulta em um percentual aumentado de formação de espiral aleatória. Em contraste, polipeptídeos criados a partir de aminoácidos limitados a A, S e P que têm um maior grau de repetitividade interna são previstos como tendo um alto percentual de alfa-hélices, conforme determinado pelo algoritmo de Chou-Fasman, bem como formação de espiral aleatória. Baseado nas numerosas sequências avaliadas através desses métodos, geralmente ocorre que é esperado que o XTEN criado a partir dos motivos de sequência de G, S, T, E, P e A que têm repetitividade limitada (definida como não mais de dois aminoácidos idênticos contíguos em qualquer motivo) de mais de cerca de 400 resíduos de aminoácido de comprimento, têm estrutura secundária muito limitada. Com a exceção de motivos contendo três serinas contíguas, acredita-se que qualquer ordem ou combinação de motivos de sequência da Tabela 1 pode ser usada para criar um polipeptídeo XTEN de um comprimento maior do que cerca de 400 resíduos que resultará em uma sequência de XTEN que é substancialmente desprovida de estrutura secundária. Espera-se que tais sequências tenham as características descritas nas modalidades de BPXTEN da invenção divulgadas aqui. Tabela 32: Cálculos de previsão pelo CHOU-FASMAN e GOR de sequências polipeptídicas Porcento, mudar ponto para virgule
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* H: al fa-hélice E: beta-folha
Exemplo 73: Análise de sequências polipeptídicas quanto à repetitividade
[00469] Sequências de aminoácido polipeptídicas podem ser ensaidas quanto à repetitividade quantificando-se o número de vezes que uma subsequência mais curta aparece dentro do polipeptídeo global. Por exemplo, um polipeptídeo de 200 resíduos de aminoácido tem 192 subsequências de 9 aminoácidos em sobreposição (ou "estruturas" de 9 meros), mas o número de subsequências de 9 meros únicas dependerá da quantidade de repetitividade dentro da sequência. Na presente análise, diferentes sequências foram ensaiadas quanto à repetitividade somando a ocorrência de todas as subsequências de 3 meros únicas para cada "estrutura" de 3 aminoácidos através dos primeiros 200 aminoácidos da porção polimérica dividido pelo número absoluto de subsequências de 3 meros únicos dentro da sequência de 200 aminoácidos. O escore de subsequência resultante é um reflexo do grau de repetitividade dentro do polipeptídeo.
[00470] Os resultados, mostrados na Tabela 33, indicam que os polipeptídeos não estruturados consistindo em 2 ou 3 tipos de aminoácido têm altos escores de subsequência, enquanto que aqueles consistindo em motivos de 12 aminoácidos dos seis aminoácidos G, S, T, E, P e A com um menor grau de repetitividade interna, têm escores de subsequência de menos de 10 e, em alguns casos, menos de 5. Por exemplo, a sequência L288 tem dois tipos de aminoácido e tem sequências altamente repetitivas curtas, resultando em um escore de subsequência de 50,0. O polipeptídeo J288 tem três tipos de aminoácido, mas também tem sequências repetitivas curtas, resultando em um escore de subsequência de 33,3. Y576 também tem três tipos de aminoácido, mas não é feito de repetições internas, refletido no escore de subsequência de 15,7 sobre os primeiros 200 aminoácidos. W576 consiste em quatro tipos de aminoácidos, mas tem um maior grau de repetitividade interna, por exemplo, "GGSG" (SEQ ID NO: 782), resultando em um escore de subsequência de 23,4. AD576 consiste em quatro tipos de motivos de 12 aminoácidos, cada um consistindo em quatro tipos de aminoácidos. Em virtude do baixo grau de repetitividade interna dos motivos individuais, o escore de subsequência global sobre os primeiros 200 aminoácidos é 13,6. Em contraste, XTEN' s consistindo em quatro motivos contêm seis tipos de aminoácidos, cada um com um menor grau de repetitividade interna tendo menores escores de subsequência; isto é, AE864 (6,1), AF864 (7,5) e AM875 (4,5). Conclusões: Os resultados indicam que a combinação de motivos de subsequências de 12 aminoácidos, cada um consistindo em quatro a seis tipos de aminoácido que são essencialmente não repetitivos, em um polipeptídeo XTEN maior, resulta em uma sequência global que é não repetitiva. Isso é a despeito do fato de que cada motivo de subsequência pode ser usado múltiplas vezes através de uma sequência. Em contraste, polímeros criados a partir de números menores de tipos de aminoácido resultaram em maiores escores de subsequência, embora a sequência real possa ser configurada para reduzir e o grau de repetitividade a fim de resultar em menores escores de subsequência. Tabela 33: Cálculos de escore de subsequência de sequências polipeptídicas
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Exemplo 74: Cá culo de escores TEPITOPE
[00471] Escores TEPITOPE de sequências peptídicas de 9 meros podem ser calculados adicionando potenciais de bolsa, conforme descrito por Sturniolo [Sturniolo, T. et al. (1999) Nat Biotechnol, 17: 555]. No presente Exemplo, escores Tepitope distintos foram calculados para alelos de HLA individuais. A Tabela 34 mostra, como um exemplo, os potenciais de bolsa para o alelo HLA*0101B, o qual ocorre em alta frequência na população Caucasiana. Para calcular o escore TEPITOPE de um peptídeo com sequência P1-P2-P3-P4-P5-P6-P7-P8- P9, os potenciais de bolsa individuais correspondentes na Tabela 34 foram adicionados. O escore para HLA*0101B de um peptídeo de 9 meros com a sequência FDKLPRTSG (SEQ ID NO: 800) seria a soma de 0, -1,3, 0, 0,9, 0, -1,8, 0,09, 0, 0.
[00472] Para avaliar os escores TEPITOPE para peptídeos longos, pode-se repetir o processo para todas as subsequências de 9 meros das sequências. Esse processo pode ser repetido para as proteínas codificadas por outros alelos de HLA. As Tabelas 35-38 fornecem os potenciais de bolsa para os produtos de proteína de alelos de HLA que ocorrem com alta frequência na população Caucasiana.
[00473] Escores TEPITOPE calculados através dessa faixa de método de aproximadamente - 10 a + 10. Contudo, peptídeos de 9 meros que carecem de um aminoácido hidrofóbico (FKLMVWY (SEQ ID NO: 801)) na posição P1 têm escores TEPITOPE calculados na faixa de -1009 a -989. Esse valor é biologicamente significativo e reflete o fato de que um aminoácido hidrofóbico serve como um resíduo âncora para ligação ao HLA e peptídeos carecendo de um resíduo hidrofóbico em P1 não são considerados ligantes ao HLA. Em virtude do fato de a maioria das sequências de XTEN carecerem de resíduos hidrofóbicos, todas as combinações de subsequências de 9mer terão TEPITOPEs na faixa de -1009 a -989. Esse método confirma que polipeptídeos XTEN podem ter poucos ou nenhum epitopo de célula T previsto. Tabela 34: Potencial de bolsa para alelo HLA*0101B.
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Tabela 35: Potencial de bolsa para alelo HLA*0301B.
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Tabela 36: Potencial de bolsa para alelo HLA*0401B. Aminoácido, mudar ponto para vírgula
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Tabela 37: Potencial de bolsa para alelo HLA*0701B.
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Tabela 38: Potencia de bo sa para alelo HLA*1 501B.
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Tabela 39: Atividade biológica exemplificativa, ensaios exemplificativos e indicações preferidas para BP
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Tabela 40: BPXTEN exemplificativa de um único peptídeo de regulação de glicose ou proteína metabólica ligada ao XTEN
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*Nome da sequência reflete a configuração N- para C-término de componentes BP e XTEN Tabela 41: Proteínas de fusão BPXTEN exemplificativas compreendendo dois peptídeos de regulação de glicose ligados a um ou dois XTEN
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*Gastrina*Nome da sequência reflete a configuração N- para C-término de BP e componentes XTEN Tabela 42: BPXTEN exemplificativa compreendendo peptídeos de regulação de glicose, XTEN e sequências de clivagem
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*Nome da sequência reflete a configuração N- para C-término de BP, XTEN e componentes de sequência de clivagem (designados como a protease que cliva essa sequência) e Tabela 43: BPXTEN exemplificativa compreendendo proteínas de Coagulação
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* Nome da sequência reflete a configuração N- para C-término do fator de coagulação, sequência de clivagem (se houver, designada como a protease que cliva essa sequência) e componentes XTEN Tabela 44: BPXTEN exemplificativa compreendendo hormônios de crescimento e XTEN
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*Nome da sequência reflete a configuração N- para C-término do fator de crescimento, sequência de clivagem e componentes XTEN

Claims (12)

1. Método de aprimoramento de uma propriedade de uma proteína biologicamente ativa, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de expressar um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo recombinante estendido (XTEN) isolado compreendendo uma sequência não repetitiva com mais de 400 a 3.000 resíduos de aminoácidos, em que pelo menos 95% da sequência consiste em várias unidades de dois ou mais motivos de sequência não sobrepostos selecionados a partir das sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 182-203 ou SEQ ID NOs: 1715-1722 em que a sequência de quaisquer dois resíduos de aminoácidos contíguos em qualquer motivo não é repetida mais de duas vezes no motivo da sequência.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os dois ou mais motivos de sequência são selecionados a partir das sequências da família de motivos AE SEQ ID NO:186, SEQ ID NO:187 e SEQ ID NO:188.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que tem a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 204-221.
4. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 204, 206, 210, 213, 217, 218 e 219.
5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo codifica um proteína de fusão isolada compreendendo o XTEN isolado e uma proteína biologicamente ativa, em que o XTEN está ligado à proteína biologicamente ativa e em que a proteína de fusão retém pelo menos uma porção da atividade biológica da proteína biologicamente ativa correspondente.
6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que a proteína biologicamente ativa é um peptídeo regulador de glicose, uma proteína metabólica ou um fator de coagulação.
7. Método, de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracterizado pelo fato de que a proteína de fusão tem uma meia-vida terminal que é pelo menos duas vezes mais longa em comparação com a proteína biologicamente ativa não ligada ao XTEN.
8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5-7, caracterizado pelo fato de que a proteína de fusão apresenta um fator de peso molecular aparente sob condições fisiológicas que é maior que 6.
9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5-8, caracterizado pelo fato de que a proteína de fusão requer dosagem menos frequente ou dosagem comparável reduzida para atingir ou manter um nível sanguíneo circulante em um sujeito em comparação com a proteína biologicamente ativa não ligada ao XTEN que é administrado a um sujeito de forma comparável.
10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5-9, caracterizado pelo fato de que a proteína biologicamente ativa tem identidade de sequência com um peptídeo regulador de glicose selecionado do grupo que consiste em GLP-1 (SEQ ID NO:20), GLP-2 (SEQ ID NO:24), exendina-4 (SEQ ID NO:12) e glucagon (SEQ ID NO:19).
11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5-9, caracterizada pelo fato de que a proteína biologicamente ativa tem identidade de sequência com um fator de coagulação selecionado do grupo que consiste em fator IX (SEQ ID NOS:1735-1746), fator Vlla ou fator VII (SEQ ID NO:1747).
12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5-9, caracterizado pelo fato de que a proteína biologicamente ativa tem identidade de sequência com uma proteína metabólica selecionada do grupo que consiste em IL-1 ra humana (SEQ ID NO: 1723), peptídeo α- natriurético (SEQ ID NO:1729), peptídeo β-natriuretico (SEQ ID NO:1730), peptídeo natriurético tipo C (SEQ ID NO:1732), fator de crescimento de fibroblastos 2 (SEQ ID NO:1733) e receptor de TNF (SEQ ID NO: 1734).
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