JP7461438B2 - 延長組換えポリペプチドおよび延長組換えポリペプチドを含む組成物 - Google Patents

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Description

政府支援の研究に関する陳述
本発明は、国立衛生研究所により授与されたＳＢＩＲ助成金２Ｒ４４ＧＭ０７９８７３
－０２の下、政府支援により成された。合衆国政府は本発明に一定の権利を有する。
関連出願への相互参照
本願は、すべて係属中である、２００９年２月３日に出願された米国仮特許出願第６１
／１４９，６６９号、２００９年６月８日に出願された米国仮特許出願第６１／２６８，
１９３号、２００９年６月８日に出願された米国仮特許出願第６１／１８５，１１２号、
２００９年８月２４日に出願された米国仮特許出願第６１／２３６，４９３号、２００９
年８月２５日に出願された米国仮特許出願第６１／２３６，８３６号、２００９年９月１
８日に出願された米国仮特許出願第６１／２４３，７０７号、２００９年９月２４日に出
願された米国仮特許出願第６１／２４５，４９０号、２００９年１１月１０日に出願され
た米国仮特許出願第６１／２８０，９５５号、２００９年１１月１０日に出願された米国
仮特許出願第６１／２８０，９５６号、２００９年１１月１２日に出願された米国仮特許
出願第６１／２８１，１０９号の優先権の利益を主張する。これらの米国仮特許出願は、
それらの全体が、本明細書中に参考として援用される。
発明の分野
生物活性タンパク質は、治療薬としての生物活性タンパク質を包含して、特に水性溶液
において調合されるときに短い貯蔵寿命を示す、通例不安定な分子である。さらに多くの
生物活性ペプチドおよびタンパク質は、限定された溶解性を有するか、または組換え産生
中に凝集するようになり、複雑な可溶化および再折畳み手順が必要である。各種の化学ポ
リマーをこのようなタンパク質に付着させて、その特性を改変することができる。特に興
味深いのは、柔軟な高次構造を有し、水溶液中で十分に水和されている親水性ポリマーで
ある。頻繁に使用されるポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。これら
のポリマーは、その分子量に対して大きい流体力学半径を有する傾向があり（非特許文献
１）、薬物動態特性の増強をもたらすことができる。付着点によっては、ポリマーは、ポ
リマー改変タンパク質がその関連機能を保持するようにポリマーが付着されたタンパク質
との相互作用が制限される傾向がある。しかしポリマーのタンパク質への化学的コンジュ
ゲーションは、複雑な複数ステップのプロセスを必要とする。通例、タンパク質構成要素
は、化学的コンジュゲーションステップの前に産生および精製される必要がある。さらに
コンジュゲーションステップは、分離する必要のある異種生成物の混合物の形成をもたら
し、かなりの生成物損失につながり得る。あるいはこのような混合物は、最終的な薬学的
生成物として使用することができるが、標準化することが困難である。いくつかの例は、
最近販売されている、混合物として使用されるＰＥＧ化インターフェロン－アルファ生成
物である（非特許文献２；非特許文献３）。このような混合物は、治療活性の低下したま
たは治療活性のない異性体を含有するために、再現性の良い製造および特徴付けが困難で
ある。
アルブミンおよび免疫グロブリンフラグメント、たとえばＦｃ領域は、他の生物活性タ
ンパク質をコンジュゲートするのに使用されてきたが、貯蔵寿命または免疫原性の増加に
関する成果は予測できない。運の悪いことに、Ｆｃドメインは組換え発現の間に効率的に
折畳まれず、封入体として公知の不溶性沈殿を形成する傾向がある。これらの封入体を可
溶化する必要があり、機能性タンパク質を復元する必要がある。これは時間がかかり、非
効率的であり、費用のかかるプロセスであり、追加の製造ステップおよびしばしば複雑な
精製手順を必要とする。
それゆえ、生物活性タンパク質の生物学的、薬理学的、安全性、および／または薬学的
特性を改善する組成物および方法へのかなりの必要性が残されている。
Ｋｕｂｅｔｚｋｏ，Ｓ．ら（２００５）Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，６８：１４３９－５４ Ｗａｎｇ，Ｂ．Ｌ．ら（１９９８）Ｊ Ｓｕｂｍｉｃｒｏｓｃ Ｃｙｔｏｌ Ｐａｔｈｏｌ，３０：５０３－９ Ｄｈａｌｌｕｉｎ，Ｃ．ら（２００５）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ，１６：５０４－１７
本開示は、生物活性タンパク質の生物学的、薬学的、安全性および／または治療特性を
増強するのに有用であり得る組成物および方法に関するものである。組成物および方法は
、半減期などの薬物動態特性を増強するためおよび生物活性タンパク質の治療ウインドウ
内で費やされる時間を増加するために、ならびにこのような生物活性タンパク質の産生プ
ロセスおよび薬学的特性、たとえば溶解性を単純化するために特に有用である。
本開示は、一部は、融合タンパク質を含む薬学的組成物および疾患、障害または状態を
処置するためのその使用に関する。処置される特定の疾患は、生物活性タンパク質の選定
に依存する。いくつかの実施形態において、組成物および方法は、代謝疾患および心血管
疾患（これに限定されるわけではないが、グルコースまたはインスリン関連疾患を包含す
る）、凝固障害および出血障害、ならびに成長ホルモン関連障害を処置するのに有用であ
る。
一態様において、本発明は延長組換えポリペプチド（ＸＴＥＮ）の組成物を提供し、該
組成物は生物活性タンパク質に連結されたときに、得られた融合タンパク質の薬物動態特
性を増強し、ならびに／または得られた融合タンパク質の溶解性および安定性を増加させ
て、一方では生物活性タンパク質の全体的な生物学的活性および／または治療活性を増強
する。このような組成物は、本明細書に記載するような、特定の疾患、障害または状態を
処置する有用性を有し得る。得られた融合タンパク質は、より良好な安全性プロフィール
を示し、より頻度の低い投薬を可能にするので、今度はより良好な患者コンプライアンス
に導くことができる。本発明は、ＸＴＥＮおよびＸＴＥＮと連結された生物活性タンパク
質の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、ならびにＸＴＥＮおよびＸＴＥＮと
連結された生物活性タンパク質の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドに相補的
であるポリヌクレオチドも提供する。
別の態様において、本発明は、生物活性タンパク質（ＢＰ）に連結されて、単量体ＢＰ
ＸＴＥＮ融合タンパク質を生じることができる融合パートナーとして有用である、延長組
換えポリペプチド（ＸＴＥＮ）の組成物を提供する。
一実施形態において、本発明は約４００超～約３０００のアミノ酸残基を含む単離延長
組換えポリペプチド（ＸＴＥＮ）を提供し、該ＸＴＥＮは、グリシン（Ｇ）、アラニン（
Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）およびプロリン（Ｐ）残基
の和が該ＸＴＥＮの全アミノ酸配列の約８０％超、または約８５％、または約９０％、ま
たは約９５％、または約９６％、または約９７％、または約９８％、または約９９％を構
成することを特徴とし、該ＸＴＥＮ配列は実質的に非反復であり、該ＸＴＥＮ配列は、Ｔ
ＥＰＩＴＯＰＥアルゴリズムによって解析されたときに予測されたＴ細胞エピトープを欠
いており、該ＸＴＥＮ配列内エピトープに対する該ＴＥＰＩＴＯＰＥアルゴリズム予測は
、－５、または－６、または－７、または－８、または－９またはそれより多くのスコア
に基づき、該ＸＴＥＮ配列は、ＧＯＲアルゴリズムによって決定されたように、９０％超
の、または９１％超の、または９２％超の、または９３％超の、または９４％超の、また
は９５％超の、または９６％超の、または９６％超の、または９８％超の、または９９％
超のランダムコイル形成物を有し、ならびに該ＸＴＥＮ配列は、Ｃｈｏｕ－Ｆａｓｍａｎ
アルゴリズムによって決定されたように、２％未満のアルファらせんおよび２％のベータ
シートを有する。
別の実施形態において、本発明は約４００超～約３０００のアミノ酸残基を含むＸＴＥ
Ｎを提供し、該ＸＴＥＮは、アスパラギンおよびグルタミン残基の和が該ＸＴＥＮの全ア
ミノ酸配列の１０％未満であり、メチオニンおよびトリプトファン残基の和が該ＸＴＥＮ
の全アミノ酸配列の２％未満であることを特徴とし、該ＸＴＥＮ配列は５％未満の、正電
荷を有するアミノ酸残基を有し、該ＸＴＥＮ配列は、ＧＯＲアルゴリズムによって決定さ
れたように、９０％超のランダムコイル形成物を有し、ならびに該ＸＴＥＮ配列は、Ｃｈ
ｏｕ－Ｆａｓｍａｎアルゴリズムによって決定されたように、２％未満のアルファらせん
および２％のベータシートを有する。
別の実施形態において、本発明は約４００超～約３０００のアミノ酸残基を含むＸＴＥ
Ｎを提供し、該ＸＴＥＮは、少なくとも約８０％の、または少なくとも約９０％の、また
は少なくとも約９１％の、または少なくとも約９２％の、または少なくとも約９３％の、
または少なくとも約９４％の、または少なくとも約９５％の、または少なくとも約９６％
の、または少なくとも約９７％の、または少なくとも約９８％のまたは、少なくとも約９
９％のＸＴＥＮ配列が非重複配列モチーフから成り、該配列モチーフそれぞれが約９～約
１４個のアミノ酸残基を有し、任意の２個の連続アミノ酸残基の配列が該配列モチーフそ
れぞれにおいて３回以上出現せず、該配列モチーフがグリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、
セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）およびプロリン（Ｐ）から選択さ
れる４～６種類のアミノ酸から成り、該ＸＴＥＮは、生物活性タンパク質に連結されたと
きに生物活性タンパク質の薬物動態特性を増強して、該薬物動態特性は、生物活性タンパ
ク質に連結され、同程度の用量で被験体に投与されたＸＴＥＮと比較して、被験体に投与
された生物活性タンパク質の最終半減期を測定することによって確認される。
上述の実施形態のいくつかの場合では、いずれの１種類のアミノ酸もＸＴＥＮ配列の３
０％超を構成することはない。上述の実施形態の他の場合において、ＸＴＥＮはアミノ酸
がセリンでない限り、３個の連続アミノ酸が同一でない配列を有することができ、この場
合、３個以下の連続アミノ酸がセリン残基である。上述の実施形態の他の場合において、
ＸＴＥＮ配列は１０未満の、または９の、または８の、または７の、または６のサブ配列
スコアを有する。上述の実施形態のまた他の場合において、ＸＴＥＮ配列の少なくとも約
８０％の、または約９０％の、または約９５％の、または約９６％の、または約９７％の
、または約９８％の、または約９９％の、または１００％は非重複配列モチーフから成り
、該配列モチーフそれぞれは１２のアミノ酸残基を有する。一実施形態において、ＸＴＥ
Ｎ配列は非重複配列モチーフから成り、該配列モチーフは表１の１個以上の配列からであ
る。
いくつかの実施形態において、得られた融合タンパク質の増強された薬物動態特性は、
少なくとも約２倍の、または少なくとも約３倍の、または少なくとも約４倍の、または少
なくとも約５倍の、または少なくとも約６倍の、または少なくとも約８倍の、または少な
くとも約１０倍の最終半減期の増加を含む。いくつかの場合において、薬物動態特性の増
強は、融合タンパク質の治療ウインドウ内で所与の期間にわたって残存する血液濃度が、
ＸＴＥＮに連結されていない対応するＢＰと比較して、少なくとも約２倍、または少なく
とも約３倍の、または少なくとも約４倍の、または少なくとも約５倍の、または少なくと
も約６倍の、または少なくとも約８倍の、または少なくとも約１０倍の長さであるという
事実によって示される。半減期および治療ウインドウ内で費やされる時間の増加により、
ＸＴＥＮに連結されていない対応するＢＰと比較して、被験体に投与される融合タンパク
質のより低頻度の投薬および量の減少（モル当量で）が可能になる。一実施形態において
、治療的有効用量レジメンによって、融合タンパク質の血中濃度の少なくとも２つの連続
するＣｍａｘピーク値および／またはＣｍｉｎトラフ値の間で、融合タンパク質に連結さ
れておらず、同程度の用量のレジメンを使用して被験体に投与された対応するＢＰと比較
して、少なくとも２倍の、または少なくとも３倍の、または少なくとも４倍の、または少
なくとも５倍の、または少なくとも６倍の、または少なくとも８倍の、または少なくとも
１０倍の時間の増大がもたらされる。
一実施形態において、ＸＴＥＮの少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくと
も約９０％、少なくとも約９５％、または約９９％が表１の１個以上の配列から選択され
るモチーフを含む。別の実施形態において、ＸＴＥＮは、表２から選択された配列に対し
て、少なくとも約８０％の、または少なくとも約９０％の、または少なくとも約９１％の
、または少なくとも約９２％の、または少なくとも約９３％の、または少なくとも約９４
％の、または少なくとも約９５％の、または少なくとも約９６％の、または少なくとも約
９７％の、または少なくとも約９８％の、または少なくとも約９９％または１００％の配
列同一性を示す。
いくつかの場合において、ＸＴＥＮは、生物活性タンパク質に連結させた場合、該生物
活性タンパク質の熱安定性を増強し、ここで、該熱安定性は、生物活性タンパク質を少な
くとも約７日間にわたる約３７℃の温度への曝露した後に、生物活性タンパク質に連鎖さ
れたＸＴＥＮと比較した、生物活性の保持を測定することによって確認される。上述の一
実施形態において、生物活性の保持は、ＸＴＥＮからなるＸＴＥＮに連結されていないＢ
Ｐと比較して、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なく
とも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、または約１５０％、少なく
とも約２００％、少なくとも約３００％の、または約５００％長く増加される。
別の態様において、本発明は、生物活性タンパク質（ＢＰ）に連結された上述の実施形
態の任意のＸＴＥＮを含む、単離融合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態におい
て、融合タンパク質のＢＰは、表３、表４、表５、表６、表７、および表８から選択され
る配列に対して少なくとも約８０％の、または少なくとも約９０％の、または少なくとも
約９１％の、または少なくとも約９２％の、または少なくとも約９３％の、または少なく
とも約９４％の、または少なくとも約９５％の、または少なくとも約９６％の、または少
なくとも約９７％の、または少なくとも約９８％の、または少なくとも約９９％または１
００％配列同一性を示す。上述の別の実施形態において、単離融合タンパク質は第２のＸ
ＴＥＮ配列をさらに含み、該ＸＴＥＮ配列のアミノ酸残基の累積合計は約４００超～約３
０００残基である。
いくつかの場合において、上述の実施形態の１つのＸＴＥＮを有する単離融合タンパク
質はＢＰを含み、該ＢＰはグルコース調節ペプチドである。上述の一実施形態において、
グルコース調節ペプチドはエキセンジン－４である。上述の他の実施形態において、グル
コース調節ペプチドはグルカゴンである。
他の場合において、単離融合タンパク質はＢＰを含み、該ＢＰは代謝タンパク質である
。上述の一実施形態において、代謝タンパク質はＩＬ－１ｒａである。
なお他の場合において、単離融合タンパク質はＢＰを含み、該ＢＰは凝固因子である。
上述の一実施形態において、凝固因子は第ＩＸ因子である。上述の別の実施形態において
、凝固因子は第ＶＩＩ因子である。
他の場合において、単離融合タンパク質はＢＰを含み、該ＢＰは成長ホルモンである。
一実施形態において、単離融合タンパク質はＸＴＥＮに連結されていない生物活性タン
パク質と比較して免疫原性が低くあり得、免疫原性は、被験体に同程度の用量を投与した
後に、生物活性タンパク質に選択的に結合するＩｇＧ抗体の産生を測定することによって
確認される。
上述の実施形態のＸＴＥＮおよびＢＰを含む融合タンパク質はＢＰとＸＴＥＮとの間に
スペーサ配列を含むことができ、該スペーサ配列は、場合により切断配列を含む約１～約
５０のアミノ酸残基を含む。一実施形態において、切断配列はプロテアーゼによる切断を
受けやすい。このようなプロテアーゼの非限定的な例は、ＦＸＩａ、ＦＸＩＩａ、カリク
レイン、ＦＶＩＩａ、ＦＩＸａ、ＦＸａ、トロンビン、エラスターゼ－２、グランザイム
Ｂ、ＭＭＰ－１２、ＭＭＰ－１３、ＭＭＰ－１７またはＭＭＰ－２０、ＴＥＶ、エンテロ
キナーゼ、ライノウイルス３Ｃプロテアーゼ、およびソルターゼＡを包含する。
いくつかの場合において、単離融合タンパク質は、融合タンパク質に連結されていない
対応するＢＰと比較して、対応するＢＰの標的受容体に対する結合親和性の低下を有する
ように構成される。一実施形態において、融合タンパク質は、融合タンパク質に連結され
ていない対応するＢＰの結合能力の約０．０１％～３０％の、または約０．１％～約２０
％の、または約１％～約１５％の、または約２％～約１０％の範囲で、ＢＰの標的受容体
に対する結合を示す。関連する実施形態において、親和性が低下した融合タンパク質は、
融合タンパク質に連結されていない対応するＢＰと比較して、受容体媒介クリアランスの
低下および少なくとも約５０％の、または少なくとも約６０％の、または少なくとも約７
０％の、または少なくとも約８０％の、または少なくとも約９０％の、または少なくとも
約１００％の、または少なくとも約１５０％の、または少なくとも約２００％の、または
少なくとも約３００％の、または少なくとも約５００％の対応する半減期の増加を有する
ことができる。
一実施形態において、本発明は、表４０、表４１、表４２、表４３、および表４４から
選択される配列に対して少なくとも約８０％の、または少なくとも約９０％の、または少
なくとも約９１％の、または少なくとも約９２％の、または少なくとも約９３％の、また
は少なくとも約９４％の、または少なくとも約９５％の、または少なくとも約９６％の、
または少なくとも約９７％の、または少なくとも約９８％の、または少なくとも約９９％
の、または１００％の配列同一性を示す単離融合タンパク質を提供する。
一実施形態において、本発明は融合タンパク質を含む組成物を提供し、該融合タンパク
質は、表３～８のいずれか１つからの配列に対して少なくとも約８０％の配列同一性を、
または８１％の、８２％の、８３％の、８４％の、８５％の、８６％の、８７％の、８８
％の、８９％の、９０％の、９１％の、９２％の、９３％の、９４％の、９５％の、９６
％の、９７％の、９８％の、９９％の、または１００％の配列同一性を示す配列を含む少
なくとも第１のＢＰを含み、該ＢＰは約１００超～約３０００のアミノ酸残基、さらに好
ましくは約４００超～約３０００のアミノ酸残基をそれぞれ含む１つ以上の延長組換えポ
リペプチド（ＸＴＥＮ）に実質的に非反復の配列によって連結され、グリシン（Ｇ）、ア
ラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）およびプロリン（
Ｐ）残基の和は、該ＸＴＥＮの全アミノ酸配列の約８０％超、または約８５％、または約
９０％、または約９５％、または約９６％、または約９７％、または約９８％、または約
９９％を構成する。ＢＰＸＴＥＮのＸＴＥＮ構成要素は、ＴＥＰＩＴＯＰＥアルゴリズム
によって解析したときに予測されるＴ細胞エピトープを欠くことがあり、ＸＴＥＮ配列内
のエピトープのＴＥＰＩＴＯＰＥアルゴリズム予測は、－７以上の、または－８以上の、
または－９以上のスコアに基づく。ＢＰＸＴＥＮのＸＴＥＮ構成要素は、ＧＯＲアルゴリ
ズムによって決定されたように８０％超の、または約８５％の、または約９０％の、また
は約９１％の、または約９２％の、または約９３％の、または約９４％の、または約９５
％の、または約９６％の、または約９７％の、または約９８％の、または約９９％ランダ
ムコイル構造物を有する配列を有し得；およびＸＴＥＮ配列は、Ｃｈｏｕ－Ｆａｓｍａｎ
アルゴリズムによって決定されたように２％未満のアルファらせんおよび２％のベータシ
ートを有することができる。
いくつかの実施形態において、本発明はＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質を提供し、被験体
に投与された該ＢＰＸＴＥＮは、融合タンパク質に連結されていない対応するＢＰと比較
して、少なくとも約２倍の長さのＢＰＸＴＥＮの最終半減期の増加を、または融合タンパ
ク質に連結されていないＢＰと比較して、少なくとも約３倍の、または少なくとも約４倍
の、または少なくとも約５倍の、または少なくとも約６倍の、または少なくとも約７倍の
、または少なくとも約８倍の、または少なくとも約９倍の、または少なくとも約１０倍の
、または少なくとも約１５倍の、または少なくとも２０倍のまたはそれより多くのの最終
半減期の増加を示す。
いくつかの実施形態において、本発明はＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質を提供し、該ＢＰ
ＸＴＥＮは、融合タンパク質に連結されていないＢＰと比較して、生理的条件にて、少な
くとも３倍の、または少なくとも約４倍の、または少なくとも約５倍の、または少なくと
も約６倍の、または少なくとも約７倍の、または少なくとも約８倍の、または少なくとも
約９倍の、または少なくとも約１０倍の、または少なくとも約１５倍の、または少なくと
も２０倍の、または少なくとも４０倍の、または少なくとも６０倍の溶解度の増加を示す
。
いくつかの実施形態において、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質は、サイズ排除クロマトグ
ラフィーによって決定されるように、実際の分子量と比較して見かけの分子量の増加を示
し、該見かけの分子量は、少なくとも約１００ｋＤ、または少なくとも約１５０ｋＤ、ま
たは少なくとも約２００ｋＤ、または少なくとも約３００ｋＤ、または少なくとも約４０
０ｋＤ、または少なくとも約５００ｋＤ、または少なくとも約６００ｋＤ、または少なく
とも約７００ｋＤであるが、融合タンパク質の各ＢＰ構成要素の実際の分子量は約２５ｋ
Ｄ未満である。したがって、該ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質は、融合タンパク質の実際の
分子量よりも約４倍の大きさの、または約５倍の大きさの、または約６倍の大きさの、ま
たは約７倍の大きさの、または約８倍の大きさの見かけの分子量を有することができる。
いくつかの場合において、上述の実施形態の単離融合タンパク質は、約４を超える、また
は約５の、または約６の、または約７の、または約８の、生理的条件下での見かけの分子
量係数（ａｐｐａｒｅｎｔ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｆａｃｔｏｒ）を示す
。
本発明は、ＢＰが、ＸＴＥＮに連結されていない対応するＢＰの生物活性の少なくとも
一部を保持する、各種の配置のＢＰＸＴＥＮを提供する。一実施形態において、該ＢＰＸ
ＴＥＮは、式Ｉの配置のＸＴＥＮに連結されたＢＰを含み
（ＢＰ）－（Ｓ）ｘ－（ＸＴＥＮ） Ｉ
式中、各出現について、独立して、ＢＰは本明細書で上記のような生物活性タンパク質で
あり；Ｓは、（上記のような）切断配列を場合により包含できる１～約５０のアミノ酸残
基を有するスペーサ配列であり；ｘは０または１のどちらかであり；およびＸＴＥＮは（
本明細書に記載するような）延長組換えポリペプチドである。該実施形態は、ＢＰが所望
の生物活性のために遊離Ｎ末端を必要とする、またはＢＰのＣ末端の融合タンパク質への
連結によって生物活性が低下して、投与したＢＰＸＴＥＮの生物活性および／または副作
用を低下させることが所望される、特別の有用性を有する。
ＢＰＸＴＥＮ配置の別の実施形態において、本発明は、式ＩＩの配置（上記のような構
成要素）の融合タンパク質を提供する：
（ＸＴＥＮ）－（Ｓ）ｘ－（ＢＰ） ＩＩ
該実施形態は、ＢＰが所望の生物活性のために遊離Ｃ末端を必要とする場合に、またはＢ
ＰのＮ末端の融合タンパク質への連結によって生物活性が低下して、投与したＢＰＸＴＥ
Ｎの生物活性および／または副作用を低下させることが所望である場合に、特に有用であ
る。
別の態様において、本発明は、ＢＰの２個の分子を含み、ならびに第２のＸＴＥＮおよ
び／またはスペーサ配列を場合により含む、単離ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質を提供し、
該融合タンパク質は、式ＩＩＩ、式ＩＶ、および式Ｖから選択される配置を有する：
（ＢＰ）－（Ｓ）ｗ－（ＸＴＥＮ）－（Ｓ）ｘ－（ＢＰ）－（Ｓ）ｙ（ＸＴＥＮ）ｚ Ｉ
ＩＩ
（ＸＴＥＮ）－（Ｓ）ｗ－（ＢＰ）－（Ｓ）ｘ－（ＸＴＥＮ）ｙ－（ＢＰ） ＩＶ
（ＢＰ）－（Ｓ）ｘ－（ＢＰ）－（Ｓ）ｙ－（ＸＴＥＮ） Ｖ
式中、各出現について、独立して、ＢＰは本明細書で上記のような生物活性タンパク質で
あり、Ｓは、切断配列を場合により含む１～約５０のアミノ酸残基を有するスペーサ配列
であり；ｗは０または１のどちらかであり；ｘは０または１のどちらかであり；ｙは０ま
たは１のどちらかであり；ｚは０または１のどちらかであり；およびＸＴＥＮは、ＸＴＥ
Ｎアミノ酸残基の累積合計が４００超～約３０００残基である、（本明細書に記載するよ
うな）延長組換えポリペプチドである。
別の態様において、本発明は、１分子のＢＰおよび２分子のＸＴＥＮならびに場合によ
り１または２のスペーサ配列を含む単離融合タンパク質を提供し、該融合タンパク質は、
式ＶＩの融合タンパク質であり：
（ＸＴＥＮ）－（Ｓ）ｘ－（ＢＰ）－（Ｓ）ｙ－（ＸＴＥＮ） ＶＩ
式中、各出現について、独立して、ＢＰは生物活性タンパク質であり、Ｓは、切断配列を
場合により含む１～約５０のアミノ酸残基を有するスペーサ配列であり；ｗは０または１
のどちらかであり；ｘは０または１のどちらかであり；ｙは０または１のどちらかであり
；ｚは０または１のどちらかであり；およびＸＴＥＮは、ＸＴＥＮアミノ酸残基の累積合
計が４００超～約３０００残基である、（本明細書に記載するような）延長組換えポリペ
プチドである。
それゆえ融合タンパク質は、これに限定されるわけではないが、ＸＴＥＮ－ＢＰ、ＢＰ
－ＸＴＥＮ、ＸＴＥＮ－Ｓ－ＢＰ、ＢＰ－Ｓ－ＸＴＥＮ、ＸＴＥＮ－ＢＰ－ＸＴＥＮ、Ｂ
Ｐ－ＢＰ－ＸＴＥＮ、ＸＴＥＮ－ＢＰ－ＢＰ、ＢＰ－Ｓ－ＢＰ－ＸＴＥＮ、およびＸＴＥ
Ｎ－ＢＰ－Ｓ－ＢＰを包含して、ＢＰ、ＸＴＥＮ、および場合によりスペーサ配列の異な
る配置、Ｎ→Ｃ末端を有するように設計することができる。配置（ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔ
ｉｏｎ）の選択は、本明細書で開示するように、特別な薬物動態、物理的／化学的、また
は薬理学的特性を与えることができる。
一実施形態において、上記の式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、またはＶ、またはＶＩのＢＰ
ＸＴＥＮ融合タンパク質は、融合タンパク質に連結されていないＢＰの生物活性と比較し
て、少なくとも約４０％の、または少なくとも約５０％の、または少なくとも約６０％の
、または少なくとも約７０％の、または少なくとも約８０％の、または少なくとも約９０
％の、または少なくとも約９５％の生物活性を示す。別の実施形態において、式Ｉ、ＩＩ
、ＩＩＩ、ＩＶ、またはＶのＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質は、融合タンパク質に共有結合
的に連結されていない対応する親の生物活性タンパク質と同じ受容体またはリガンドを結
合する。
本発明は、（ａ）上述の実施形態の任意の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチ
ド、または（ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドの相補体から選択されるポリヌクレオチド配
列を含む、単離核酸を提供する。上述の一実施形態において、該単離核酸は、（ａ）表４
０、表４１、表４２、表４３、および表４４から選択されるポリペプチドをコードするポ
リヌクレオチド配列；または（ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドの相補体に対して、少なく
とも８０％の配列同一性の、または約８５％の、または少なくとも約９０％の、または約
９１％の、または約９２％の、または約９３％の、または約９４％の、または約９５％の
、または約９６％の、または約９７％の、または約９８％の、または約９９％～約１００
％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む。本発明は、本段落の上で記載した
上記の実施形態の任意の核酸を含む発現ベクターを提供する。一実施形態において、上述
の発現ベクターは、ポリヌクレオチド配列に操作可能に連結された組換え制御配列をさら
に含む。別の実施形態において、上述の発現ベクターのポリヌクレオチド配列は、原核生
物シグナル配列であることが可能な分泌シグナル配列をコードするポリヌクレオチドにイ
ンフレームで融合される。一実施形態において、分泌シグナル配列は、ＯｍｐＡ、Ｄｓｂ
Ａ、およびＰｈｏＡシグナル配列から選択される。
本発明は、上述の段落で開示された発現ベクターを含むことができる宿主細胞を提供す
る。一実施形態において、宿主細胞は原核細胞である。別の実施形態において、宿主細胞
は大腸菌である。
一実施形態において、本発明は、上述の実施形態の任意の融合タンパク質および少なく
とも１つの薬学的に許容され得るキャリアを含む薬学的組成物を提供する。別の実施形態
において、本発明は、包材と、上述の実施形態の薬学的組成物ならびに、該薬学的組成物
および保管・取扱い条件を明示したラベルを含む少なくとも第１の容器と、該薬学的組成
物の再構成および／または被験体への投与に関する説明シートとを含むキットを提供する
。
本発明は、薬学的組成物の使用であって、疾患症状の処置を必要とする被験体における
疾患症状を処置するための薬剤の調製における上述の実施形態の任意の融合タンパク質を
含む薬学的組成物の使用をさらに提供する。上述の一実施形態において、上記の薬学的組
成物を、それを必要とする被験体に投与することを含む、疾患、障害または状態。上述の
一実施形態において、疾患、障害または状態は、１型糖尿病、２型糖尿病、肥満、高血糖
、高インスリン血症、病的インスリン産生、インスリン抵抗性、シンドロームＸ、冬眠心
筋または糖尿病性心筋症、食欲亢進、不十分な飽満感（ｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ ｓａ
ｔｉｅｔｙ）、代謝性障害、グルカゴノーマ、多嚢胞性卵巣症候群、異常脂血症、冬眠心
筋、不十分な尿中ナトリウム排泄、過剰尿中カリウム濃度、毒性血液量過多（ｔｏｘｉｃ
ｈｙｐｅｒｖｏｌｅｍｉａ）に関連付けられた状態または障害、糖尿病性心筋症、およ
び網膜神経変性プロセスから選択される。いくつかの場合において、薬学的組成物は皮下
に、筋肉内に、または静脈内に投与することができる。一実施形態において、薬学的組成
物は治療的有効用量で投与される。上述のいくつかの場合において、治療的有効用量は、
融合タンパク質に連結されておらず、同程度の用量で被験体に投与された融合タンパク質
の対応するＢＰと比較して、融合タンパク質の治療ウインドウ内で費やされる時間の増大
を生じる。治療ウインドウ内で費やされる時間の増大は、融合タンパク質に連結されてい
ない対応するＢＰよりも少なくとも３倍の長さ、または、あるいは融合タンパク質に連結
されていない対応するＢＰよりも少なくとも４倍の、または５倍の、または６倍の、また
は７倍の、または８倍の、または９倍の、または少なくとも１０倍の、または少なくとも
２０倍の長さであることが可能である。
別の実施形態において、本発明は、上記の薬学的組成物を、治療的有効用量レジメンを
使用して投与される複数連続用量の薬学的組成物を使用して、被験体に投与することを含
む、疾患、障害または状態を処置する方法を提供する。上述の一実施形態において、治療
的有効用量レジメンによって、融合タンパク質の血中濃度の少なくとも２つの連続するＣ
ｍａｘピーク値および／またはＣｍｉｎトラフ値の間で、融合タンパク質に連結されてお
らず、同程度の用量のレジメンで被験体に投与された対応する融合タンパク質のＢＰと比
較して少なくとも３倍の、または少なくとも４倍の、または５倍の、または６倍の、また
は７倍の、または８倍の、または９倍の、または少なくとも１０倍の、または少なくとも
２０倍の時間の増大をもたらすことができる。上述の別の実施形態において、融合タンパ
ク質の投与により、融合タンパク質に連結されておらず、被験体に対する治療的有効レジ
メンを使用して被験体ｄに投与される対応する生物活性タンパク質構成要素（複数可）と
比較して、薬学的組成物の融合タンパク質のより低い頻度の投薬またはより少ない総投薬
量（モル数で）を使用する少なくとも１個の測定パラメータの同程度の改善が生じる。パ
ラメータは、空腹時グルコースレベル、経口グルコース負荷試験に対する応答、食後グル
コースのベースラインからのピーク変化、ＨＡ１Ｃ、カロリー摂取、飽満、胃排出速度、
インスリン分泌、末梢インスリン感受性、インスリンチャレンジに対する応答、ベータ細
胞量、体重、プロトロンビン時間、出血時間、トロンビン－抗トロンビンＩＩＩ複合体（
ＴＡＴ）、Ｄ－ダイマー、出血エピソードの生成、赤血球沈降速度（ＥＳＲ）、Ｃ反応性
タンパク質、骨密度、筋肉量、血圧、血漿トリグリセリド、ＨＤＬ、コレステロール、Ｌ
ＤＬコレステロール、アンギナの生成、および心拍出量から選択することができる。
別の態様において，本発明は、生物活性タンパク質の特性を改善する方法であって、生
物活性タンパク質を上述の実施形態の任意のＸＴＥＮに連結して（ａ）ＸＴＥＮに連結さ
れた生物活性タンパク質の最終半減期が、ＸＴＥＮに連結されていない生物活性タンパク
質の最終半減期と比較してより長いこと；（ｂ）ＸＴＥＮに連結された生物活性タンパク
質の貯蔵寿命が、ＸＴＥＮに連結されていない生物活性タンパク質の貯蔵寿命と比較して
より長く、貯蔵寿命はベースライン試料と比較したインターバル後の生物活性の保持によ
って確認されること；（ｃ）ＸＴＥＮに連結された生物活性タンパク質の生理的条件下で
の溶解度がＸＴＥＮに連結されていない生物活性タンパク質の溶解度と比較して増大する
こと；（ｄ）被験体に投与されるときに、ＸＴＥＮに連結されている生物活性タンパク質
に選択的に結合するＩｇＧ抗体の産生が、ＸＴＥＮに連結されていない生物活性タンパク
質が同程度の用量で被験体に投与されるときのＩｇＧの産生と比較して低下すること；お
よび／または（ｅ）被験体に投与されるときの、ＸＴＥＮに連結された生物活性タンパク
質の治療ウインドウ内で費やされる時間が、被験体に投与されるときの、ＸＴＥＮに連結
されていない生物活性タンパク質と比較してより長いことを特徴とする特性を達成するス
テップを含む、生物活性タンパク質の特性を改善する方法を提供する。
参照による組み入れ
本明細書に挙げるすべての刊行物、特許、および特許出願は、個々の刊行物、特許、ま
たは特許出願が参照により組み入れられることが具体的および個々に示されるのと同程度
に、参照により本明細書に組み入れられている。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
約４００超～約３０００のアミノ酸残基を含む単離延長組換えポリペプチド（ＸＴＥＮ）
であって：
（ａ）グリシン（Ｇ）残基、アラニン（Ａ）残基、セリン（Ｓ）残基、トレオニン（Ｔ
）残基、グルタメート（Ｅ）残基およびプロリン（Ｐ）残基の和が該ＸＴＥＮの全アミノ
酸配列の約８０％超を構成することと；
（ｂ）該ＸＴＥＮ配列が実質的に非反復性であることと；
（ｃ）該ＸＴＥＮ配列が、ＴＥＰＩＴＯＰＥアルゴリズムによって解析したときに予測
されるＴ細胞エピトープを欠き、ここで、該ＸＴＥＮ配列内のエピトープの該ＴＥＰＩＴ
ＯＰＥアルゴリズム予測が－９以上のスコアに基づくことと；
（ｄ）該ＸＴＥＮ配列がＧＯＲアルゴリズムによって決定されたように、９０％超のラ
ンダムコイル形成物を有することと；
（ｅ）該ＸＴＥＮ配列が、Ｃｈｏｕ－Ｆａｓｍａｎアルゴリズムによって決定されたよ
うに、２％未満のアルファらせんおよび２％のベータシートを有することと；
を特徴とするＸＴＥＮ。
（項目２）
約４００超～約３０００のアミノ酸残基を含む単離延長組換えポリペプチド（ＸＴＥＮ）
であって：
（ａ）アスパラギン残基およびグルタミン残基の和が該ＸＴＥＮの全アミノ酸配列の１
０％未満であることと；
（ｂ）メチオニン残基およびトリプトファン残基の和が該ＸＴＥＮの全アミノ酸配列の
２％未満であること；
（ｃ）該ＸＴＥＮ配列が５％未満の、正電荷を有するアミノ酸残基を有することと；
（ｄ）該ＸＴＥＮ配列がＧＯＲアルゴリズムによって決定されたように、９０％超のラ
ンダムコイル形成物を有することと；
（ｅ）該ＸＴＥＮ配列が、Ｃｈｏｕ－Ｆａｓｍａｎアルゴリズムによって決定されたよ
うに、２％未満のアルファらせんおよび２％のベータシートを有することと；
を特徴とするＸＴＥＮ。
（項目３）
約４００超～約３０００のアミノ酸残基を含む単離延長組換えポリペプチド（ＸＴＥＮ）
であって：
（ａ）該ＸＴＥＮ配列の少なくとも約８０％が非重複配列モチーフから成り、該配列モ
チーフそれぞれが約９～約１４アミノ酸残基を有し、任意の２つの連続アミノ酸残基の配
列が該配列モチーフの各々において３回以上出現しないことと；
（ｂ）該配列モチーフがグリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン
（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）およびプロリン（Ｐ）から選択される４～６種類のアミノ酸
から成ることと；
（ｃ）該ＸＴＥＮが生物活性タンパク質に連結されたときに生物活性タンパク質の薬物
動態特性を増強し、該薬物動態特性が、該生物活性タンパク質に連結された該ＸＴＥＮと
比較して、該生物活性タンパク質の最終半減期を測定することによって確認されることと
；
を特徴とするＸＴＥＮ。
（項目４）
生物活性タンパク質に連結された前記ＸＴＥＮが、同程度の条件下で投与された該生物活
性タンパク質と比較して、被験体において少なくとも約２倍長い最終半減期を有する、項
目３に記載の単離ＸＴＥＮ。
（項目５）
前記ＸＴＥＮが生物活性タンパク質に連結されたときに、該ＸＴＥＮが該生物活性タンパ
ク質の熱安定性を増強し、ここで、少なくとも約７日間にわたる約３７℃の温度への曝露
後、該生物活性タンパク質の生物活性の保持を、該生物活性タンパク質に連結された該Ｘ
ＴＥＮと比較して、測定することによって、該熱安定性が確認される、項目１から４のう
ちのいずれか１項に記載の単離ＸＴＥＮ。
（項目６）
ＸＴＥＮに連結された際に、前記生物活性タンパク質および前記ＸＴＥＮを含む得られた
融合物が、前記ＸＴＥＮに連結されていない生物活性タンパク質の前記生物活性の少なく
とも８０％を保持する、項目５に記載の単離ＸＴＥＮ。
（項目７）
グリシン（Ｇ）残基、アラニン（Ａ）残基、セリン（Ｓ）残基、トレオニン（Ｔ）残基、
グルタメート（Ｅ）残基またはプロリン（Ｐ）残基の前記和が前記ＸＴＥＮの全アミノ酸
配列の約９０％超を構成する、項目１から６のうちのいずれか１項に記載の単離ＸＴＥＮ
。
（項目８）
いずれの１種類のアミノ酸も前記ＸＴＥＮ配列の３０％超を構成しない、項目１から７の
うちのいずれか１項に記載の単離ＸＴＥＮ。
（項目９）
３個の連続アミノ酸が、該アミノ酸（単数）がセリンでない限り、同一ではない配列を含
み、この場合、３個以下の連続アミノ酸がセリン残基である、項目１から８のうちのいず
れか１項に記載の単離ＸＴＥＮ。
（項目１０）
前記ＸＴＥＮ配列が１０未満のサブ配列スコアを有する、項目１から９のうちのいずれか
１項に記載の単離ＸＴＥＮ。
（項目１１）
前記ＸＴＥＮ配列の少なくとも約８０％が非重複配列モチーフから成り、該配列モチーフ
各々が１２のアミノ酸残基を有する、項目１から１０のうちのいずれか１項に記載の単離
ＸＴＥＮ。
（項目１２）
前記ＸＴＥＮ配列が非重複配列モチーフから成り、各々の配列モチーフが１２のアミノ酸
残基を有する、項目１から１１のうちのいずれか１項に記載の単離ＸＴＥＮ。
（項目１３）
前記ＸＴＥＮ配列の少なくとも約８０％が非重複配列モチーフから成り、該配列モチーフ
が表１の１個以上の配列からのものである、項目１から１２のうちのいずれか１項に記載
の単離ＸＴＥＮ。
（項目１４）
項目１から１３のうちのいずれか１項に記載の単離ＸＴＥＮおよび生物活性タンパク質を
含み、該ＸＴＥＮが該生物活性タンパク質に連結されている、単離融合タンパク質。
（項目１５）
前記生物活性タンパク質が表３～８から選択される配列に対して少なくとも９０％の配列
同一性を示す、項目１４に記載の単離融合タンパク質。
（項目１６）
前記融合タンパク質が、前記ＸＴＥＮに連結されていない前記生物活性タンパク質と比較
して少なくとも約２倍長い最終半減期を有する、項目１４に記載の単離融合タンパク質。
（項目１７）
前記融合タンパク質が、前記ＸＴＥＮに連結されていない前記生物活性タンパク質と比較
して免疫原性が低く、免疫原性が、被験体に同程度の用量を投与した後に、該生物活性タ
ンパク質に選択的に結合するＩｇＧ抗体の産生を測定することによって確認される、項目
１４に記載の単離融合タンパク質。
（項目１８）
前記融合タンパク質が生理的条件下で約６を超える見かけの分子量係数を示す、項目１４
に記載の単離融合タンパク質。
（項目１９）
少なくとも第２の生物活性タンパク質をさらに含む、項目１４に記載の単離融合タンパク
質。
（項目２０）
少なくとも第２のＸＴＥＮポリペプチドをさらに含み、ＸＴＥＮアミノ酸残基の累積合計
が約４００超～約３０００の残基である、項目１５に記載の単離融合タンパク質。
（項目２１）
前記融合タンパク質が被験体において循環血中濃度を達成または維持するために、同程度
の様式で被験体に投与される前記ＸＴＥＮに連結されていない生物活性タンパク質と比較
して、より低い頻度の投薬または低下した同程度の投薬量を必要とする、項目１４に記載
の単離融合タンパク質。
（項目２２）
前記生物活性タンパク質がグルコース調節ペプチドである、項目１４に記載の単離融合タ
ンパク質。
（項目２３）
前記グルコース調節ペプチドがエキセンジン－４である項目２２に記載の単離融合タンパ
ク質。
（項目２４）
前記グルコース調節ペプチドがグルカゴンである、項目２２に記載の単離融合タンパク質
。
（項目２５）
前記生物活性タンパク質が代謝タンパク質である、項目１４に記載の単離融合タンパク質
。
（項目２６）
前記代謝タンパク質がＩＬ－１ｒａである、項目２５に記載の単離融合タンパク質。
（項目２７）
前記生物活性タンパク質が凝固因子である、項目１４に記載の単離融合タンパク質。
（項目２８）
前記凝固因子が第ＩＸ因子である、項目２７に記載の単離融合タンパク質。
（項目２９）
前記凝固因子が第ＶＩＩ因子である、項目２７に記載の単離融合タンパク質。
（項目３０）
前記生物活性タンパク質が成長ホルモンである、項目１４に記載の単離融合タンパク質。
（項目３１）
項目１４～３０のいずれか１項に記載の単離融合タンパク質および少なくとも１つの薬学
的に許容され得るキャリアを含む組成物。
（項目３２）
項目３１に記載の組成物の使用であって、疾患症状の処置を必要とする被験体における疾
患症状を処置するための薬剤の調製における、組成物の使用。
（項目３３）
前記疾患が１型糖尿病、２型糖尿病、肥満、高血糖、高インスリン血症、異常インスリン
産生、インスリン抵抗性、シンドロームＸ、食欲過多、不十分な飽満感、グルカゴノーマ
、脂質異常症、網膜神経変性プロセス、第ＶＩＩ因子欠損、第Ｘ因子欠損、第ＸＩＩ因子
欠損、血友病Ａ、血友病Ｂ、フォン・ウィルブラント病、高血圧、急性冠動脈症候群、関
節リウマチ、虚血後再灌流傷害、成長ホルモン欠損、ターナー症候群、プラーダー－ヴィ
リ症候群、特発性低身長、ＡＩＤＳによるるい痩、多発性硬化症、クローン病、潰瘍性大
腸炎、または筋ジストロフィーから選択される、項目３２に記載の使用。
（項目３４）
生物活性タンパク質の特性を改善する方法であって、生物活性タンパク質を項目１～１３
に記載のＸＴＥＮに連結して（ａ）該ＸＴＥＮに連結された該生物活性タンパク質の最終
半減期が、該ＸＴＥＮに連結されていない該生物活性タンパク質の該最終半減期と比較し
てより長いこと；（ｂ）該ＸＴＥＮに連結された該生物活性タンパク質の貯蔵寿命が、該
ＸＴＥＮに連結されていない該生物活性タンパク質の該貯蔵寿命と比較してより長く、貯
蔵寿命はベースライン試料と比較したインターバル後の生物活性の保持によって確認され
ること；（ｃ）該ＸＴＥＮに連結された該生物活性タンパク質の生理的条件下での溶解度
が該ＸＴＥＮに連結されていない該生物活性タンパク質の該溶解度と比較して増加される
こと；（ｄ）被験体に投与されるときに、該ＸＴＥＮに連結されている該生物活性タンパ
ク質に選択的に結合するＩｇＧ抗体の産生が、該ＸＴＥＮに連結されていない該生物活性
タンパク質が同程度の用量で被験体に投与されるときの該ＩｇＧの産生と比較して低下す
ること；および／または（ｅ）被験体に投与されるときの該ＸＴＥＮに連結された該生物
活性タンパク質の治療ウインドウ内で費やされる時間が、被験体に投与されるときの該Ｘ
ＴＥＮに連結されていない該生物活性タンパク質と比較してより長いことを特徴とする特
性を達成するステップを含む、生物活性タンパク質の特性を改善する方法。
本発明の特徴および利点は、例証的な実施形態を説明する以下の詳細な記述および添付
図面を参照することによってさらに説明され得る。
図１は、すべてＮ末端からＣ末端方向に描かれている、例示的なＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質の概略図（図１Ａ～Ｇ）である。図１Ａは、それぞれ単一の生物活性タンパク質（ＢＰ）およびＸＴＥＮを含む、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質の２つの異なる配置（１００）を示し、第１の配置はＢＰ（１０３）のＣ末端に付着したＸＴＥＮ分子（１０２）を有し、第２の配置はＢＰ（１０３）のＮ末端に付着したＸＴＥＮ分子を有する。図１Ｂは、それぞれ単一のＢＰ、スペーサ配列およびＸＴＥＮを含む、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質の２つの異なる配置（１００）を示し、第１の配置はスペーサ配列（１０４）のＣ末端に付着したＸＴＥＮ分子（１０２）を有し、該スペーサ配列はＢＰ（１０３）のＣ末端に付着し、第２の配置はスペーサ配列（１０４）のＮ末端に付着したＸＴＥＮ分子を有し、該スペーサ配列はＢＰ（１０３）のＮ末端に付着している。図１Ｃは、それぞれ単一のＢＰの分子２個およびＸＴＥＮの分子１個を含む、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質の２つの異なる配置（１０１）を示し、第１の配置は第１のＢＰのＣ末端に連結されたＸＴＥＮを有し、そのＢＰが第２のＢＰのＣ末端に連結され、第２の配置は、ＸＴＥＮが第１のＢＰのＮ末端に連結されているのと反対の向きであり、そのＢＰが第２のＢＰのＮ末端に連結されている。図１Ｄは、それぞれ単一のＢＰの分子２個、スペーサ配列およびＸＴＥＮの分子１個を含む、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質の２つの異なる配置（１０１）を示し、第１の配置はスペーサ配列のＣ末端に連結されたＸＴＥＮを有し、該スペーサ配列は、第２のＢＰのＣ末端に連結された第１のＢＰのＣ末端に連結され、第２の配置はＸＴＥＮがスペーサ配列のＮ末端に連結されているのと反対の向きであり、該スペーサ配列は、第１のＢＰのＮ末端に連結され、そのＢＰは第２のＢＰのＮ末端に連結されている。図１Ｅは、それぞれ単一のＢＰの分子２個、スペーサ配列およびＸＴＥＮの分子１個を含む、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質の２つの異なる配置（１０１）を示し、第１の配置は第１のＢＰのＣ末端に連結されたＸＴＥＮを有し、該第１のＢＰは、第２のＢＰ分子のＣ末端に連結されているスペーサ配列のＣ末端に連結され、第２の配置は、スペーサ配列のＮ末端に連結された第１のＢＰのＮ末端に連結されたＸＴＥＮと反対の配置であり、スペーサ配列のＮ末端は今度は、ＢＰの第２の分子のＮ末端に連結されている。図１Ｆは、それぞれ単一のＢＰの分子２個、およびＸＴＥＮの分子２個を含む、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質の２つの異なる配置（１０５）を示し、第１の配置は、ＢＰの第２の分子のＣ末端に連結されている第２のＸＴＥＮのＣ末端に連結されている第１のＢＰのＣ末端に連結された第１のＸＴＥＮを有し、第２の配置は、第２のＢＰのＮ末端に連結された第２のＸＴＥＮのＮ末端に連結された第１のＢＰのＮ末端に連結されたＸＴＥＮの反対の配置にある。図１Ｇは、ＢＰのＮ末端およびＣ末端にて２個のＸＴＥＮに連結された単一のＢＰの配置（１０６）を示す。 図２は、図１の対応するＢＰＸＴＥＮポリペプチドをコードするＢＰＸＴＥＮ遺伝子の例示的なポリヌクレオチド構築物の概略図（図２Ａ～Ｇ）を示す；すべて５’→３’方向で描く。これらの例証的な例において、遺伝子は、ＢＰ１個およびＸＴＥＮ１個（１００）；またはＢＰ２個、スペーサ配列１個およびＸＴＥＮ１個（２０１）；ＢＰ２個およびＸＴＥＮ２個（２０５）；またはＢＰ１個およびＸＴＥＮ２個（２０６）を備えたＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質をコードする。これらの描写で、ポリヌクレオチドは、以下の構成要素：ＸＴＥＮ（２０２）、ＢＰ（２０３）、および切断配列（２０４）を包含することができるスペーサアミノ酸をコードして、すべての配列はインフレームで連結される。 図３は、内因的に利用可能なプロテアーゼによって作用される例示的な単量体ＢＰＸＴＥＮおよび単量体融合タンパク質または反応生成物が細胞表面の標的受容体に結合する能力、続いての細胞シグナル伝達の概略図である。図３Ａは、ＢＰ（１０３）およびＸＴＥＮ（１０２）が切断可能な配列（１０４）を含有するスペーサ配列により連結されているＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質（１０１）を示し、切断可能な配列（１０４）はＭＭＰ－１３プロテアーゼ（１０５）に対して感受性である。図３Ｂは、遊離ＢＰ、スペーサ配列およびＸＴＥＮの反応生成物を示す。図３Ｃは、反応生成物の遊離ＢＰ（１０３）またはＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質（１０１）とＢＰに対する標的受容体（１０６）との細胞表面（１０７）での相互作用を示す。この場合、ＢＰが遊離Ｃ末端を有するときに、遊離ＢＰ（１０３）の受容体への結合によって証明されるように、受容体への所望の結合が提示されるが、未切断融合タンパク質は受容体に堅く結合しない。図３Ｄは、高い結合親和性を有する遊離ＢＰ（１０３）が受容体（１０６）に結合したままであるが、無傷のＢＰＸＴＥＮ（１０１）が受容体から離れるのを示す。図３Ｅは、結合ＢＰが細胞（１０７）内のエンドソーム（１０８）に内部移行したことを示し、結合ＢＰの受容体媒介クリアランスおよび点描された細胞質として描かれた細胞シグナル伝達（１０９）の誘発が示されている。 図３は、内因的に利用可能なプロテアーゼによって作用される例示的な単量体ＢＰＸＴＥＮおよび単量体融合タンパク質または反応生成物が細胞表面の標的受容体に結合する能力、続いての細胞シグナル伝達の概略図である。図３Ａは、ＢＰ（１０３）およびＸＴＥＮ（１０２）が切断可能な配列（１０４）を含有するスペーサ配列により連結されているＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質（１０１）を示し、切断可能な配列（１０４）はＭＭＰ－１３プロテアーゼ（１０５）に対して感受性である。図３Ｂは、遊離ＢＰ、スペーサ配列およびＸＴＥＮの反応生成物を示す。図３Ｃは、反応生成物の遊離ＢＰ（１０３）またはＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質（１０１）とＢＰに対する標的受容体（１０６）との細胞表面（１０７）での相互作用を示す。この場合、ＢＰが遊離Ｃ末端を有するときに、遊離ＢＰ（１０３）の受容体への結合によって証明されるように、受容体への所望の結合が提示されるが、未切断融合タンパク質は受容体に堅く結合しない。図３Ｄは、高い結合親和性を有する遊離ＢＰ（１０３）が受容体（１０６）に結合したままであるが、無傷のＢＰＸＴＥＮ（１０１）が受容体から離れるのを示す。図３Ｅは、結合ＢＰが細胞（１０７）内のエンドソーム（１０８）に内部移行したことを示し、結合ＢＰの受容体媒介クリアランスおよび点描された細胞質として描かれた細胞シグナル伝達（１０９）の誘発が示されている。 図４は、ＸＴＥＮの構築（ａｓｓｅｍｂｌｙ）、産生および評価の各ステップの概略フローチャートである。 図５は、融合タンパク質をコードするＢＰ－ＸＴＥＮポリヌクレオチド構築物の構築の各ステップの概略フローチャートである。個々のオリゴヌクレオチド５０１は配列モチーフ５０２、たとえば１２アミノ酸モチーフ（「１２マー」）にアニーリングされ、配列モチーフ５０２は続いてＢｂｓＩおよびＫｐｎＩ制限部位５０３を含有するオリゴとライゲーションされる。所望の長さのＸＴＥＮ遺伝子５０４が達成されるまで、ライブラリからの追加の配列モチーフがアニーリングされ１２マーとなる。ＸＴＥＮ遺伝子は、スタッファベクターにクローニングされる。そのベクターはＦｌａｇ配列５０６を、続いてＢｓａＩ、ＢｂｓＩ、およびＫｐｎＩ部位５０７ならびにエキセンジン－４遺伝子５０８がフランキングするストッパ配列をコードして、ＢＰＸＴＥＮの組み合わせへの組み入れのためのＢＰ－ＸＴＥＮ融合物をコードする遺伝子５００を生じる。 図６は、生物活性タンパク質（ＢＰ）およびＸＴＥＮを含む融合タンパク質をコードする遺伝子の構築、融合タンパク質としてのその発現および回収、ならびに候補ＢＰＸＴＥＮ生成物としてのその評価における各ステップの概略フローチャートである。 図７は、様々な処理戦略を用いた、ＩＬ－１ｒａＸＴＥＮ発現ベクターの設計の概略図である。図７Ａは、生物活性タンパク質ＩＬ－１ｒａをコードする配列の３’端に融合されたＸＴＥＮをコードする発現ベクターを示す。このベクターには追加のリーダー配列が必要ないことに注目する。図７Ｂは、ＣＢＤリーダー配列およびＴＥＶプロテアーゼ部位を有する、ＩＬ－１ｒａをコードする配列の５’端に融合されたＸＴＥＮをコードする発現ベクターを描く。図７Ｃは、ＣＢＤおよびＴＥＶプロセシング部位が最適化Ｎ末端リーダー配列（ＮＴＳ）によって置き換えられた、図７Ｂと同じ発現ベクターを描く。図７Ｄは、ＮＴＳ配列をコードする発現ベクター、ＸＴＥＮ、ＩＬ－１ｒａをコードする配列、および次に（ｔｈａｎ）ＸＴＥＮをコードする第２の配列を描く。 図８は、ＧＦＰおよびＸＴＥＮ配列を含む示された構築物についての発現アッセイの結果を示す。発現培養物を蛍光プレートリーダ（励起３９５ｎｍ、発光５１０ｎｍ）を用いてアッセイして、存在するＧＦＰレポータの量を決定した。ボックスおよびウィスカープロットとしてグラフ作成された結果によって、中央値発現レベルが「ベンチマーク」ＣＢＤＮ末端ヘルパードメインと比べて、発現レベルのおおよそ半分であったが、ライブラリからの最良のクローンがベンチマークにはるかに近いことが示され、これらの配列の周囲でのさらなる最適化が保証されたことを示している。結果は、アミノ酸ＭＡで開始するライブラリがＭＥで始まるライブラリよりも良好な発現レベルを有したことも示す（実施例１４を参照）。 図９は、ＬＣＷ５４６、ＬＣＷ５４７およびＬＣＷ５５２からクローンのＮ末端配列の第３および第４のコドンに使用される３つの無作為化ライブラリを示す。示したような許容され得るＸＴＥＮコドンのすべての組み合わせがこれらの位置に存在するように改変された第３および第４の残基を用いて、ライブラリを設計した。許容され得るすべてのＸＴＥＮコドンを各ライブラリに包含するために、第３および第４の残基のコドン多様性を有する１２アミノ酸をコードする９対のオリゴヌクレオチドを設計、アニーリングして、ＮｄｅＩ／ＢｓａＩ制限酵素で消化したスタッファベクターｐＣＷ０５５１（Ｓｔｕｆｆｅｒ－ＸＴＥＮ＿ＡＭ８７５－ＧＦＰ）にライゲーションして、大腸菌ＢＬ２１Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）コンピテント細胞に形質変換して、３つのライブラリＬＣＷ０５６９（配列番号１，７０８および１，７０９）、ＬＣＷ０５７０（配列番号１，７１０および１，７１１）、およびＬＣＷ０５７１（配列番号１，７１２および１，７１３）のコロニーを得た。 図１０は、ベンチマークＣＢＤ＿ＡＭ８７５構築物に対する、ＧＦＰ蛍光シグナルについての、実施例１５に記載したような最適化ステップ後の上位７５のクローンの再試験のヒストグラムを示す。結果により、図１０に見られるように、数個のクローンが今やベンチマーククローンより優位であることが示された。 図１１は、Ｎ末端４８アミノ酸の２つの領域についてのコドン最適化選択性の組合せ（ｕｎｉｏｎ ｏｆ ｃｏｄｏｎ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）に対して行われたコンビナトリアル手法の概略図である。該手法により、発現の最適化を評価するための、ＸＴＥＮタンパク質のＮ末端の位置に新規の４８マーを生成させ、それにより、ＸＴＥＮがＢＰに対してＮ末端側にあるＸＴＥＮタンパク質発現のための解決策（ｓｏｌｕｔｉｏｎ）であり得るリーダー配列をもたらした。 図１２は、構築物の配列のＮ末端にＣＢＤリーダー配列を含むベンチマークＸＴＥＮクローンと比較した、ＸＴＥＮのＮ末端コドン最適化実験から得た好ましいクローンの発現を確認するＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを示す。 図１３は、ＧＦＰのＮ末端に融合されたＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４の融合タンパク質の安定性試験による試料のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを示す（実施例２１を参照）。ＧＦＰ－ＸＴＥＮは、カニクイザル血漿およびラット腎臓溶解物中３７℃にて最長７日間インキュベートした。さらにカニクイザルに投与したＧＦＰ－ＸＴＥＮも評価した。試料を第０、１および７日に採取して、ＳＤＳ ＰＡＧＥによって分析し、ウェスタン分析による検出およびＧＦＰに対する抗体による検出を続けた。 図１４は、実施例２３に記載したように非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥを受けさせた、ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４に連結されたＩＬ－１ｒａの２ｍｃｇおよび１０ｍｃｇの最終精製タンパク質の２つの試料を示す。結果は、約１６０ｋＤａのおおよその分子量を有するＩＬ－１ｒａＸＴＥＮ組成物がプロセスによって回収されたことを示す。 図１５は、実施例２３に記載したように行った代表的なサイズ排除クロマトグラフィー分析の結果を示す。破線で示す校正標準は、マーカーのサイログロブリン（６７０ｋＤａ）、ウシガンマグロブリン（１５８ｋＤａ）、ニワトリ卵白アルブミン（４４ｋＤａ）、ウマミオグロビン（１７ｋＤａ）およびビタミンＢ１２（１．３５ｋＤａ）を包含する。ＸＴＥＮ＿ＡＭ８７５に連結されたＩＬ－１ｒａのＢＰＸＴＥＮ構成要素融合タンパク質を実線として示す。データは、ＢＰＸＴＥＮ構築物の見かけの分子量が、球状タンパク質で予想される分子量よりも著しく大きく（同じアッセイの標準タンパク質の泳動との比較により示されるように）、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって決定された分子量（データは示さず）よりも顕著に大きい見かけの分子量を有することを示す。 図１６は、精製ＩＬ－１ｒａ＿ＸＴＥＮ＿ＡＭ８７５の逆相Ｃ１８分析を示す。吸光度の出力対時間の結果は、最終生成物の融合タンパク質の純度を実証する。 図１７は、結合等温線を作成するためにＩＬ－１ｒａ－ＸＴＥＮ＿ＡＭ８７５またはＩＬ－１ｒａの濃度の関数としてプロットされた、ＩＬ－１受容体結合アッセイの結果を示す。ＩＬ－１受容体に対する各融合タンパク質の結合親和性を推定するために、結合データをＳ字状用量反応曲線に当てはめた。データの当てはめから、実施例２３に記載するように、各構築物のＥＣ５０（シグナルが最大半量であるＩＬ－１ｒａまたはＩＬ－１ｒａ－ＸＴＥＮの濃度）を決定した。陰性対照ＸＴＥＮ＿ＡＭ８７５－ｈＧＨ構築物は、実験条件下で結合を示さなかった。 図１８は、実施例２３に記載するように、ＩＬ－１ｒａを、ＸＴＥＮ＿ＡＭ８７５に連結されたＩＬ－１ｒａのＢＰＸＴＥＮと比較する、熱安定性試験のＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す。ＩＬ－１ｒａの試料およびＸＴＥＮに連結されたＩＬ－１ｒａの試料を２５℃および８５℃にて１５分間インキュベートして、その時点であらゆる不溶性のタンパク質を遠心分離によって迅速に除去した。次に可溶性画分を図１８に示すようにＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析すると、加熱後にＩＬ－１ｒａ－ＸＴＥＮのみが可溶性のままであるが、これに対して（融合パートナーとしてのＸＴＥＮがない）組換えＩＬ－１ｒａは加熱後に完全に沈殿したことが示される。 図１９は、図１９に示す試料に行ったＩＬ－１ｒａ受容体結合アッセイの結果を示す。実施例２３に記載するように、熱処理によって完全に変性した組換えＩＬ－１ｒａは、熱処理後のその受容体活性の０．１％未満を保持した。しかしＸＴＥＮに連結されたＩＬ－１ｒａは、その受容体結合活性のおおよそ４０％を保持した。 図２０は、実施例２４に記載するように、カニクイザルに別々に皮下投与された、異なるＸＴＥＮ配列に連結されたＩＬ－１ｒａの３つの異なるＢＰＸＴＥＮ組成物の単回皮下投薬後の薬物動態プロフィール（血漿濃度）を示す。 図２１は、２つの融合タンパク質；すなわちＹ２８８に連結されたグルカゴン（Ｇｃｇ－ＸＴＥＮ）およびＡＥ８６４に連結されたエキセンジン－４（Ｅｘ４－ＸＴＥＮ）の組み合わせを使用する、薬力学的試験および代謝試験からの体重の結果、マウスの食餌誘発肥満モデルにおける組み合わせ効能（実験の詳細については実施例２６を参照）を示す。グラフは、２８日間の連続薬物投与の間の、食餌誘発肥満マウスの体重変化を示す。示した値は、１群当り動物１０匹（プラセボ群は動物２０匹）の平均±ＳＥＭである。 図２２は、食餌誘発肥満マウスモデルにおける、２つのＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質；すなわちＹ２８８に連結されたグルカゴン（Ｇｃｇ－ＸＴＥＮ）およびＡＥ８６４に連結されたエキセンジン－４（Ｅｘ４－ＸＴＥＮ）を単独でおよび組み合わせて使用する、薬力学的および代謝試験からの空腹時グルコースレベルの変化を示す（実験の詳細については実施例２６を参照）。群は以下の通りである：群１ トリスビヒクル；群２ Ｅｘ４－ＡＥ５７６、１０ｍｇ／ｋｇ；群３ Ｅｘ４－ＡＥ５７６，２０ｍｇ／ｋｇ；群４ ビヒクル、５０％ＤＭＳＯ；群５ エクセナチド、３０μｇ／ｋｇ／日；群６ エクセナチド、３０ｕＬ／ｋｇ／日＋Ｇｃｇ－Ｙ２８８ ２０μｇ／ｋｇ；群７ Ｇｃｇ－Ｙ２８８、２０μｇ／ｋｇ；群８ Ｇｃｇ－Ｙ２８８、４０μｇ／ｋｇ；群９ Ｅｘ４－ＡＥ５７６ １０ｍｇ／ｋｇ＋Ｇｃｇ－Ｙ２８８ ２０μｇ／ｋｇ；群１０ Ｇｃｇ－Ｙ２８８ ４０μｇ／ｋｇ＋Ｅｘ４－ＡＥ５７６ ２０ｍｇ／ｋｇ。グラフは、２８日間の連続薬物投与の間の、食餌誘発肥満マウスの空腹時血中グルコースレベルの変化を示す。示した値は、１群当り動物１０匹（プラセボ群は動物２０匹）の平均±ＳＥＭである。 図２３は、実施例２０に記載するように、皮下または静脈内のどちらかで投与された、可変長の非構造化ポリペプチドに連結されたＧＦＰの異なる組成物の単回投与後のカニクイザルにおける薬物動態プロフィール（血漿濃度）を示す。組成物はＧＦＰ－Ｌ２８８、ＧＦＰ－Ｌ５７６、ＧＦＰ－ＸＴＥＮ＿ＡＦ５７６、ＧＦＰ－Ｙ５７６およびＸＴＥＮ＿ＡＤ８３６－ＧＦＰであった。注射後の各種の時点で血液試料を分析して、血漿中のＧＦＰの濃度は、捕捉のためのＧＦＰに対するポリクローナル抗体および検出のための同じポリクローナル抗体のビオチン化調製物を用いたＥＬＩＳＡによって測定した。結果は、投薬後の血漿濃度対時間（時間）として表示され、特に、最長の配列長のＸＴＥＮを有する組成物であるＸＴＥＮ＿ＡＤ８３６－ＧＦＰで半減期のかなりの増加が示されている。最短配列長の構築物のＧＦＰ－Ｌ２８８は、半減期が最も短かった。 図２４は、実施例３０に記載するように行った、Ｅｘ４－ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４の近紫外円偏光二色性スペクトルを示す。 図２５は、皮下および静脈内経路でカニクイザルに投与されたＥｘ４－ＡＥ８６４の薬物動態結果を示す（実験の詳細については実施例２７を参照）。 図２６は、４つの動物種；すなわちマウス、ラット、カニクイザルおよびイヌによる測定結果に基づく、Ｅｘ４－ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４に対する予測されたヒト応答の相対スケーリング結果を例証する。図２６Ａは、測定した最終半減期対体重を示し、ヒトでの予測Ｔ１／２は１３９時間である。図２６Ｂは、測定した薬物クリアランス対体重を示し、ヒトでの予測クリアランス速度の値は３０ｍｌ／時である。図２６Ｃは、測定した分布容積対体重を示し、ヒトでの予測値は５９７０ｍｌである。 図２７は、グルカゴンとＹ２８８に連結されたグルカゴンを比較する、グルカゴン活性のインビトロ細胞アッセイの結果を示す（実験の詳細については実施例３１を参照）。 図２８は、未処理細胞（黒ひし形）を陰性対照として用いる、２つの市販元からのエキセンジン－４（黒三角形）とＹ２８８に連結されたエキセンジン－４（黒正方形）を比較する、ＧＬＰ－１活性のインビトロ細胞アッセイの結果を示す（実験の詳細については実施例３１を参照）。ＥＣ５０は破線によって示されている。 図２９は、ｈＧＨおよびＡＭ８６４－ｈＧＨの安定性に対する熱処理の効果を示す。図２９Ａは、２５℃および８０℃で１５分間処理した２つの調製物のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルである。図２９Ｂは、２５℃処理に対する８０℃試料の受容体結合活性の対応するパーセンテージを示す。

図３０は、ｈＧＨＲ－Ｆｃに対するｈＧＨ－ＡＭ８６４（円）およびＡＭ８６４－ｈＧＨ（逆三角形）のインビトロ結合親和性アッセイの結果を示す。比較のために未改変組換えｈＧＨ（正方形）が示されている。 図３１は、ｈＧＨＲ－Ｆｃに結合する、未改変ｈＧＨと比較した、ｈＧＨのＮ末端およびＣ末端に連結されたＸＴＥＮ配列を有する成長ホルモン融合タンパク質のインビトロ結合親和性アッセイの結果を示す。ＡＥ９１２＿ｈＧＨ＿ＡＥ１４４（円）および未改変組換えｈＧＨ（正方形）について、各化合物の見かけのＥＣ５０値を示す。 図３２は、未改変組換えｈＧＨと比較した、皮下経路によってラットに投与された４種類のｈＧＨ ＢＴＸＥＮ融合タンパク質の薬物動態結果を示す。 図３３は、カニクイザルへの皮下投与後の、３種類のｈＧＨ ＸＴＥＮ構築物の濃度プロフィールを示す。 図３４は、低酸素症（ｈｙｐｏｘ）ラットモデルにおける、体重に対する、示された用量でのｈＧＨまたはＡＭ８６４－ｈＧＨの投与の効果を示す。結果は、有効性がｈＧＨと同等であるＢＰＸＴＥＮ構築物による、またより低い頻度の投薬での生物活性の保持を示す。 図３５は、処置９日後の脛骨の組織断面で示した、低酸素症ラットの脛骨骨端軟骨の成長に対するプラセボ、ｈＧＨ、およびＡＭ８６４－ｈＧＨの投与の効果比較を示す（群は図３４によって使用された群であった）。 図３６は、例示的なＦＩＸおよびＦＩＸ－ＸＴＥＮ融合タンパク質の概略図を示す。図３６Ａは、天然ＦＩＸのドメイン構造物を、ガンマ－カルボキシグルタメートドメイン、ＥＧＦ１およびＥＧＦ２ドメイン、活性化ペプチド、ならびにプロテアーゼドメインで示す。矢印は、活性化ペプチドドメインの切断部位を示す。図３６は、ＸＴＥＮポリペプチドがＣ末端に付着したＦＩＸ分子を示し、ＸＴＥＮを放出するタンパク質分解切断の部位を表示する。 図３７は、ＦＩＸ－ＸＴＥＮ配置および関連するプロテアーゼ切断部位の数種の例を例証する。図３７Ａは、融合タンパク質のＦＩＸの部分の近位側にて、ＸＴＥＮ内に２個のタンパク質分解切断部位（矢印）を有するＦＩＸ－ＸＴＥＮを示す。図３７Ｂは、自己触媒的に活性化でき、同時にＸＴＥＮを放出するＦＩＸ－ＸＴＥＮを示す。図３７Ｃは、ＸＴＥＮがＦＩＸの各種ドメインの間に組込まれた、ＦＩＸ－ＸＴＥＮの４種類の配置を示す。図３７Ｄは、ＦＩＸのタンパク質分解活性化の際にＸＴＥＮを放出する、ＸＴＥＮ部分が活性化ペプチドに挿入されたＦＩＸ－ＸＴＥＮを示す。図３７Ｅは、異なるドメイン間に挿入された複数のＸＴＥＮ配列を含有するＦＩＸ－ＸＴＥＮを例証する。図３７Ｆは、ＸＴＥＮがＦＩＸのドメイン内に挿入されているＦＩＸ－ＸＴＥＮを例証する。図３７Ｇは、ＸＴＥＮがＦＩＸのＣ末端に連結され、ＸＴＥＮのＮ末端付近の複数の切断部位を含有する、ＦＩＸ－ＸＴＥＮを例証する。 ＦＩＸ－ＸＴＥＮからのＸＴＥＮの放出の概略図である。関連付けられたＸＴＥＮを有するＦＩＸ－ＸＴＥＮは、半減期が増加しているが、たいてい不活性なプロドラッグ形態で存在する。ＸＴＥＮ放出部位（矢印）でのタンパク質分解切断の後に、ＦＩＸ部分は凝固カスケードによって活性化することができるが、短い半減期を有する。 外因性経路および内因性経路の両方を示す、凝固カスケードの概略図である。 ＦＩＸをコードする遺伝子内のエキソン位置を使用する、ＦＩＸ－ＸＴＥＮ設計手法の戦略を例証して、エキソン境界の間のＸＴＥＮ挿入のための例示的な部位を矢印によって示す。 図４１Ａは、３種類の代表的なＦＩＸ－ＸＴＥＮ構築物ＡＣ２９６、ＡＣ２９９、およびＡＣ３００の概略図である。ＦＩＸ配列の２個の矢印は、ＦＸＩ活性化部位を示す。ＡＣ２９９およびＡＣ３００の追加の矢印は、ＸＴＥＮ放出部位を示す。図４１Ｂは、トロンビン処理タンパク質ＡＣ２９６、ＡＣ２９９、およびＡＣ３００のウェスタンブロットであり、円内の、ウェスタンブロットの左側のＦＩＸの陽性対照と同様の位置において、ＦＩＸがＸＴＥＮ部分から放出されたことを示す。 図４２は、ＦＩＸ－ＸＴＥＮ遺伝子を含有するＦＩＸ－ＸＴＥＮ発現ベクターｐＣＷ０５９０の設計の概略図を示す。 図４３Ａは、発現生成物である未処理ＦＩＸポリペプチド鎖、およびＦＩＸ分泌中に出現するＮ末端での翻訳後切断を包含する成熟ＦＩＸポリペプチド鎖の図である。図８Ｂは、未処理形態および成熟形態の両方における除去された活性化ペプチドの残基数を示すＦＩＸａのマッチング概略図である。 図４４は、ＦＩＸａへのタンパク質分解切断および活性化の後の、ＦＩＸ－ＸＴＥＮ構築物ＦＩＸ－ＣＦＸＩａ－ＡＧ８６４（配列番号１８１９）、プレＦＸＩａ切断物、ならびに得られたフラグメント１、２、３および４（配列番号１８２０～１８２３、それぞれ出現順）の配列を示すチャートである。 ＦＶＩＩアッセイの結果のグラフを、ＦＶＩＩ標準の各種濃度の反応プロフィールおよびＦＶＩＩ－ＸＴＥＮの反応プロフィールと共に示す。ＦＶＩＩ－ＸＴＥＮのアッセイの結果をグラフの下の表に示す。 図４６は、ＦＶＩＩ－ＸＴＥＮ遺伝子を含有する発現ベクターｐＣＷ０５９０のプラスミドマップである。 図４７は、分子量が既知のタンパク質標準に対して測定したグルカゴン－ＸＴＥＮ構築物試料のサイズ排除クロマトグラフィー分析の結果を、吸光度対保持容量のグラフの結果と共に示す。グルカゴン－ＸＴＥＮ構築物は、１）グルカゴン－Ｙ２８８；２）グルカゴンＹ－１４４；３）グルカゴン－Ｙ７２；および４）グルカゴン－Ｙ３６である。結果によって、見かけの分子量がＸＴＥＮ部分の長さの増加と共に増加することが示される。
本発明の実施形態を説明する前に、このような実施形態が例示のためのみに提供される
ことと、本明細書に記載する本発明の実施形態の各種の代替が本発明の実施で用いられ得
ることが理解されるべきである。当業者は、本発明から逸脱せずに、多くの変形、変更お
よび置換をここで想到する。
別途定義しない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発
明が属する分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本発明の実施
または試験では、本明細書に記載する方法および材料と同様または同等の方法および材料
を使用することができるが、好適な方法および材料は以下に記載される。矛盾がある場合
には、定義を包含して本特許明細書が優先する。さらに材料、方法および実施例は例証の
ためだけであり、制限を意図するものではない。当業者は、本発明から逸脱せずに、多く
の変形、変更および置換をここで想到する。
定義
本明細書で使用する場合、以下の用語は、別途規定しない限り、その用語に属する意味
を有する。
本明細書および特許請求の範囲で使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈ
ｅ」は、文脈が別途明確に指示しない限り、複数の参照物を包含する。たとえば「細胞」
という用語は、その混合物を包含して、複数の細胞を包含する。
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、本明細書で互
換的に使用されて、いずれかの長さのアミノ酸のポリマーを指す。ポリマーは直鎖または
分枝であり得て、ポリマーは改変アミノ酸を含み得て、およびポリマーは非アミノ酸によ
って割り込まれ得る。該用語は、たとえばジスルフィド結合形成、グリコシレーション、
脂質化（ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ）、アセチル化、リン酸化、またはその他の操作、たとえ
ば標識成分によるコンジュゲーションによって改変されたアミノ酸ポリマーも含む。
本明細書で使用する場合、「アミノ酸」という用語は、これに限定されるわけではない
が、グリシンおよびＤおよびＬの両方の光学異性体、ならびにアミノ酸類似体およびペプ
チドミメティックを包含する、天然および／または非天然もしくは合成アミノ酸のいずれ
かを指す。標準の１文字または３文字コードを使用して、アミノ酸を命名する。
「天然Ｌ－アミノ酸」という用語は、グリシン（Ｇ）、プロリン（Ｐ）、アラニン（Ａ
）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、メチオニン（Ｍ）、システイ
ン（Ｃ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、ヒスチジ
ン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ），グルタミン（Ｑ）、アスパラギン（Ｎ）、
グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン酸（Ｄ）、セリン（Ｓ）、およびトレオニン（Ｔ）の
Ｌ光学異性体形態を意味する。
「天然に存在しない」という用語は、配列に適用される場合および本明細書で使用する
場合、哺乳動物で見出される野生型または天然に存在する配列に対する対応物を有さない
、相補的でないまたは高度の相同性を有さないポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列
を意味する。たとえば天然に存在しないポリペプチドは、好適に整列させるときに天然に
存在する配列と比較して、９９％、９８％、９５％、９０％、８０％、７０％、６０％、
５０％以下またはなお低いアミノ酸配列同一性を共有し得る。
「親水性」および「疎水性」という用語は、物質が有する水との親和性の程度を指す。
親水性物質は、水に対して強い親和性を有し、水に溶解する、水と混合する、または水に
湿潤化される傾向があるが、疎水性物質は、水に対する親和性が実質的になく、水をはじ
くおよび吸収しない傾向があり、水に溶解しない、水と混合しないまたは水により湿潤化
しない傾向がある。アミノ酸は、その疎水性に基づいて特徴付けることができる。いくつ
かのスケールが開発されている。１つの例は、Ｈｏｐｐ，ＴＰら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ
Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９８１）７８：３８２４に挙げられているＬｅｖｉｔｔ，
Ｍ，ら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ（１９７６）１０４：５９によって開発されたスケールで
ある。「親水性アミノ酸」の例は、アルギニン、リジン、トレオニン、アラニン、アスパ
ラギン、およびグルタミンである。特に興味深い親水性アミノ酸は、アスパルテート、グ
ルタメート、およびセリン、およびグリシンである。「疎水性アミノ酸」の例は、トリプ
トファン、チロシン、フェニルアラニン、メチオニン、ロイシン、イソロイシン、および
バリンである。
「フラグメント」は、治療活性および／または生物活性の少なくとも一部を保持する、
天然生物活性タンパク質（ｎａｔｉｖｅ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｐ
ｒｏｔｅｉｎ）の切断型である。「変異体」は、生物活性タンパク質の治療活性および／
または生物活性の少なくとも一部を保持する、天然生物活性タンパク質に対して配列相同
性を有するタンパク質である。たとえば変異体タンパク質は、参照生物活性タンパク質と
少なくとも７０％の、７５％の、８０％の、８５％の、９０％の、９５％の、９６％の、
９７％の、９８％のまたは９９％のアミノ酸配列同一性を共有し得る。本明細書で使用す
る場合、「生物活性タンパク質部分」という用語は、たとえば部位特異的変異誘発、挿入
によって意図的に、または変異によって偶発的に改変されたタンパク質を包含する。
「宿主細胞」は、対象ベクターのレシピエントであり得る、またはレシピエントであっ
た個々の細胞または細胞培養物を包含する。宿主細胞は、単一の宿主細胞の子孫を包含す
る。子孫は、天然の、偶発的、または意図的な変異のために、元の親細胞と必ずしも（Ｄ
ＮＡ相補体全体の形態またはゲノムが）完全に同一でないことがある。宿主細胞は、本発
明のベクターによってインビボで形質移入することができる。
「単離された」は、本明細書で開示する各種のポリペプチドを説明するために使用する
場合に、その天然環境の構成要素から同定ならびに分離および／または回収されたポリペ
プチドを意味する。その天然環境の夾雑物質構成要素は、ポリペプチドの診断または治療
用途を通例妨害する物質であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タン
パク質性溶質を包含し得る。当業者に明らかなように、天然に存在しないポリヌクレオチ
ド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、またはそのフラグメントは、それをそ
の天然に存在する対応物から区別するための「単離」を必要としない。さらに、「濃縮さ
れた」、「分離された」または「希釈された」ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチ
ド、タンパク質、抗体、またはそのフラグメントは、体積当たりの分子の濃度または数が
概してその天然に存在する対応物よりも大きいという点で、その天然に存在する対応物か
ら区別できる。一般に、組換え手段によって作られ、宿主細胞にて発現されたポリペプチ
ドは、「単離」されると見なされる。
「単離」ポリヌクレオチドもしくはポリペプチドコード核酸または他のポリペプチドコ
ード核酸は、同定され、ポリペプチドコード核酸の天然源において通常それが、関連する
少なくとも１つの夾雑物質核酸分子から分離される核酸分子である。単離ポリペプチドコ
ード核酸分子は、該核酸分子が自然界で見出される形または状態以外である。それゆえ、
単離ポリペプチドコード核酸分子は、該核酸分子が天然細胞に存在するときに、特異的ポ
リペプチドコード核酸分子から区別される。しかし単離ポリペプチドコード核酸分子は、
普通、たとえば核酸分子が天然細胞のものとは異なる染色体位置または染色体外の位置に
あるポリペプチドを発現する細胞に含有されたポリペプチドコード核酸分子を包含する。
「キメラ」タンパク質は、自然界で出現する配列内の位置とは異なる配列内の位置に領
域を含む、少なくとも１つの融合ポリペプチドを含有する。その領域は、典型的には別個
の複数のタンパク質に存在し得、融合ポリペプチドではそれらが合わせられる；またはそ
れらの領域は典型的には、同じタンパク質に存在し得るが、融合ポリペプチドでは新たな
配置で置かれる。キメラタンパク質は、たとえば化学合成によって、またはそれらのペプ
チド領域がその所望の関係でコードされるポリヌクレオチドを生成および翻訳することに
よって生成され得る。
「コンジュゲートされた」、「連結された」、「融合された」、および「融合」は、本
明細書では互換的に使用される。これらの用語は、化学コンジュゲーションまたは組換え
手段を包含するどの手段によっても、さらにもう２つの化学元素または構成要素を結合さ
せることを指す。たとえば、プロモータまたはエンハンサは、該プロモータまたはエンハ
ンサが配列の転写に影響を及ぼす場合に、コード配列に作動可能に連結される。概して、
「作動的に連結された」は、連結されているＤＮＡ配列が隣接して、読み取り相またはイ
ンフレームにあることを意味する。「インフレーム融合」は、２個以上の読み取り枠（Ｏ
ＲＦ）を結合して（ｊｏｉｎｉｎｇ）、元のＯＲＦの正しい読み取り枠を維持する様式で
、連続したより長いＯＲＦを形成することを指す。それゆえ、得られた組換え融合タンパ
ク質は、元のＯＲＦによってコードされたポリペプチドに対応する２個以上のセグメント
（該セグメントは自然界では通常は、このように結合されない）を含有する単一のタンパ
ク質である。
ポリペプチドの文脈では、「直鎖配列」または「配列」は、アミノ末端→カルボキシ末
端の方向でのポリペプチドにおけるアミノ酸の順序であり、配列内の相互に隣り合う残基
は、ポリペプチドの１次構造において隣接している。「部分配列」は、１方向または両方
向で追加の残基を含むことが公知であるポリペプチドの一部の直鎖配列である。
「異種の」は、実体が、それが比較されている実体の残りの部分とは遺伝子型が異なる
実体に由来することを意味する。たとえばその天然コード配列から除去されて、天然配列
以外のコード配列に作動的に連結されたグリシンリッチ配列は、異種グリシンリッチ配列
である。「異種の」という用語は、ポリヌクレオチド、ポリペプチドに適用される場合、
該ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、それが比較されている実体の残りのポリヌク
レオチドまたはポリペプチドとは遺伝子型が異なる実体に由来することを意味する。
「ポリヌクレオチド」、「核酸」、「ヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」と
いう用語は、互換的に使用される。これらの用語は、任意の長さのデオキシリボヌクレオ
チドもしくはリボヌクレオチド、またはその類似体の任意のヌクレオチドのポリマー形態
である。ポリヌクレオチドは、いずれかの３次元構造を有し得て、既知または未知のいず
れかの機能を果たし得る。以下は、ポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子また
は遺伝子フラグメントのコード領域または非コード領域、連結解析から定義された複数の
遺伝子座（単数の遺伝子座）、エキソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ
）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌク
レオチド、分枝ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、いずれかの配列の単離ＤＮＡ
、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマ。ポリヌクレオチドは、改変
ヌクレオチド、たとえばメチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体を含み得る。ヌ
クレオチド構造物に対する改変は、存在する場合、ポリマーの構築（ａｓｓｅｍｂｌｙ）
の前または後に与えられ得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド構成要素によって
割り込まれ（ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｅｄ）得る。ポリヌクレオチドは、たとえば標識成分を
用いたコンジュゲーションによって重合後にさらに改変され得る。
「ポリヌクレオチドの相補体」という用語は、ポリヌクレオチド分子であって、相補的
塩基配列と、該ポリヌクレオチド分子が参照配列を完全な忠実度でハイブリダイズできる
ように、参照配列と比較して逆の向きとを有するポリヌクレオチド分子を示す。
ポリヌクレオチドに適用されるような「組換え」は、インビトロクローニング、制限お
よび／またはライゲーションステップ、および宿主細胞にて潜在的に発現させることがで
きる構築物を生じる他の手順の各種の組み合わせの生成物であることを意味する。
「遺伝子」または「遺伝子フラグメント」の用語は、本明細書では互換的に使用される
。これらは、転写および翻訳された後に、特定のタンパク質をコードすることができる少
なくとも１つの読み取り枠を含有するポリヌクレオチドを指す。遺伝子または遺伝子フラ
グメントは、ポリヌクレオチドが、コード領域全体またはそのセグメントを対象とし得る
、少なくとも１つの読み取り枠を含有する限り、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡであり得る
。「融合遺伝子」は、共に連結されている少なくとも２個の異種ポリヌクレオチドから成
る遺伝子である。
「相同性」または「相同の」は、２個以上のポリヌクレオチド配列または２個以上のポ
リペプチド配列の間の配列類似性または互換性を指す。ＢｅｓｔＦｉｔなどのプログラム
を使用して２つの異なるアミノ酸配列の間の配列同一性、類似性または相同性を決定する
ときに、デフォルト設定が使用され得るか、または適切なスコアリングマトリクス、たと
えばｂｌｏｓｕｍ４５もしくはｂｌｏｓｕｍ８０が選択されて同一性、類似性または相同
性スコアが最適化され得る。好ましくは、相同であるポリヌクレオチドは、これらの配列
に、本明細書で定義するように厳密性条件下でハイブリダイズして、少なくとも７０％の
、好ましくは少なくとも８０％の、さらに好ましくは少なくとも９０％の、さらに好まし
くは９５％の、さらに好ましくは９７％の、さらに好ましくは９８％の、およびなおさら
に好ましくは９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチドである。
「厳密性条件」または「厳密性ハイブリダイゼーション条件」という用語は、ポリヌク
レオチドがその標的配列に、他の配列よりも検出可能な高い程度まで（たとえばバックグ
ラウンドの少なくとも２倍）ハイブリダイズする条件への参照を包含する。概して、ハイ
ブリダイゼーションの厳密性は一部は、洗浄ステップが行われる温度および塩濃度に関連
して表される。通例、厳密性条件は、 塩濃度がｐＨ７．０～８．３にて約１．５Ｍ未満
のＮａイオン、通例、約０．０１～１．０ＭのＮａイオン濃度（または他の塩）であり、
温度は、短いポリヌクレオチド（たとえば１０～５０のヌクレオチド）では少なくとも約
３０℃および長いポリヌクレオチド（たとえば５０超のヌクレオチド）では少なくとも約
６０℃である条件である。たとえば「厳密性条件」は、５０％ホルムアミド、１Ｍ Ｎａ
Ｃｌ、１％ ＳＤＳにおける、３７℃でのハイブリダイゼーション、および６０～６５℃
における０．１×ＳＳＣ／１％ＳＤＳにおいてそれぞれ１５分間の洗浄３回を包含するこ
とができる。あるいは、約６５℃、６０℃、５５℃、または４２℃の温度が使用され得る
。ＳＳＣ濃度は約０．１～２×ＳＳＣで変動され得て、ＳＤＳは約０．１％で存在する。
このような洗浄温度は通例、定義されたイオン強度およびｐＨにて特異的配列の熱融点（
ｃ）よりも約５℃～２０℃低くなるように選択される。Ｔｍは、（定義されたイオン強度
およびｐＨの下で）標的配列の５０％が完全に一致するプローブにハイブリダイズする温
度である。核酸ハイブリダイゼーションのためのＴｍおよび条件を計算する式は公知であ
り、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，ｖｏｌ．１－３，Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ Ｎ．Ｙ．に見出される；
特にｖｏｌｕｍｅ ２およびｃｈａｐｔｅｒ ９を参照。通例、ブロッキング試薬を使用
して非特異的ハイブリダイゼーションをブロックする。このようなブロッキング試薬はた
とえば、約１００～２００μｇ／ｍｌの剪断および変性サケ精子ＤＮＡを包含する。有機
溶媒、たとえば約３５～５０％ｖ／ｖの濃度のホルムアミドも、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリ
ダイゼーションなどの特定の状況下で使用され得る。これらの洗浄条件に対する有用な変
形は、当業者にただちに明らかとなる。
「パーセント同一性」および「％同一性」という用語は、ポリヌクレオチド配列に適用
される場合、標準化アルゴリズムを使用して配置された（ａｌｉｇｎｅｄ）少なくとも２
個のポリヌクレオチド配列の残基一致のパーセンテージをいう。このようなアルゴリズム
は、２個の配列の間のアライメントを最適化して、したがって２個の配列のより意味のあ
る比較を達成するために、標準化された再現可能な方法で、比較されている配列にギャッ
プを挿入し得る。パーセント同一性は、たとえば特定の配列番号によって定義された場合
、定義されたポリヌクレオチド配列全体の長さにわたって測定され得るか、またはより短
い長さにわたって、たとえばより大型の定義されたポリヌクレオチド配列から得たフラグ
メントの長さ、たとえば少なくとも４５連続残基の、少なくとも６０連続残基の、少なく
とも９０連続残基の、少なくとも１２０連続残基の、少なくとも１５０連続残基の、少な
くとも２１０連続残基のまたは少なくとも４５０連続残基のフラグメントにわたって測定
され得る。このような長さは例示のためだけであり、本明細書、表、図または配列リスト
によって裏付けられる任意のフラグメント長を使用して、パーセンテージ同一性が測定さ
れ得る長さが説明され得ることが理解される。
「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、本明細書で同定されるポリペプチド配列
に関して、該配列を配置して、最大パーセント配列同一性を達成するために必要な場合に
はギャップを導入した後に、いずれの保存的置換も配列同一性の一部と見なさずに、第２
の参照ポリペプチド配列またはその一部のアミノ酸残基と同一であるクエリ配列のアミノ
酸残基のパーセンテージとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定するた
めの配列比較は、当分野の技術の範囲に含まれる各種の方法、たとえば公に利用可能なコ
ンピュータソフトウェア、たとえばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅ
ｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアを使用して達成することができる。当業者
は、比較されている配列の全長にわたる最大配列比較を達成するのに必要ないずれのアル
ゴリズムも包含して、配列比較を測定するための適切なパラメータを決定することができ
る。パーセント同一性は、たとえば特定の配列番号によって定義された場合、定義された
ポリペプチド配列全体の長さにわたって測定され得るか、またはより短い長さにわたって
、たとえばより大型の定義されたポリペプチド配列から得たフラグメントの長さ、たとえ
ば少なくとも１５連続残基の、少なくとも２０連続残基の、少なくとも３０連続残基の、
少なくとも４０連続残基の、少なくとも５０連続残基の、少なくとも７０連続残基のまた
は少なくとも１５０連続残基のフラグメントにわたって測定され得る。このような長さは
例示のためだけであり、本明細書、表、図または配列リストによって裏付けられる任意の
フラグメント長を使用して、パーセンテージ同一性が測定され得る長さが説明され得るこ
とが理解される。
「非反復性」という用語は、ポリペプチドの文脈において本明細書で使用する場合、ペ
プチドまたはポリペプチド配列の内部相同性の欠如または制限された程度を示す。「実質
的に非反復性」のという用語は、たとえば同一の種類のアミノ酸である、配列内の４連続
アミノ酸の例がほとんどもしくは全くないこと、またはポリペプチドが１０以下のサブ配
列スコア（下で定義）を有すること、またはポリペプチド配列を構成する配列モチーフの
、Ｎ末端からＣ末端の順序でのパターンがないことを意味し得る。「反復性」という用語
は、ポリペプチドの文脈において本明細書で使用する場合、ペプチドまたはポリペプチド
配列の内部相同性の程度を示す。これに対して、「反復性」配列は、短いアミノ酸配列の
複数の同一のコピーを含有し得る。たとえば、目的のポリペプチド配列はｎマー配列に分
割され得て、同一配列の数をカウントすることができる。高反復性配列は、高い割合で同
一配列を含有するが、非反復性配列は同一配列をほとんど含有しない。ポリペプチドの文
脈において、配列は、定義された長さまたは可変長のより短い配列の複数のコピー、すな
わちモチーフを含有することができ、モチーフ自体は非反復性配列を有し、全長ポリペプ
チド実質的に非反復性にする。非反復性がその中で測定されるポリペプチドの長さは、３
アミノ酸～約２００アミノ酸、約６～約５０アミノ酸、または約９～約１４アミノ酸で変
化することができる。ポリヌクレオチド配列の文脈で使用される「反復性」は、所与の長
さの同一ヌクレオチド配列の頻度などの、配列における内部相同性の程度を示す。反復性
は、たとえば同一配列の頻度を分析することによって測定できる。
「ベクター」は、挿入された核酸分子を宿主細胞に、および／または宿主細胞間に移入
する、適切な宿主において好ましくは自己複製する、核酸分子である。該用語は、主にＤ
ＮＡもしくはＲＮＡの細胞への挿入のために機能するベクター、主にＤＮＡもしくはＲＮ
Ａの複製のために機能するベクターの複製、ならびにＤＮＡもしくはＲＮＡの転写および
／または翻訳のために機能する発現ベクターを包含する。上の機能の２つ以上を提供する
ベクターも包含される。「発現ベクター」は、適切な宿主細胞に導入されたときに、ポリ
ペプチド（複数可）に転写および翻訳することができるポリヌクレオチドである。「発現
系」は通常、所望の発現生成物を産するように機能できる発現ベクターから成る好適な宿
主細胞を意味する。
「血清分解耐性」は、ポリペプチドに適用される場合、血清または血漿中にプロテアー
ゼを通例包含する血液またはその構成要素において、ポリペプチドが分解に耐える能力を
指す。血清分解耐性は、通例一連の日数（たとえば０．２５、０．５、１、２、４、８、
１６日間）にわたって、通例約３７℃にてタンパク質をヒト（または必要に応じてマウス
、ラット、サル）血清または血漿と組み合わせることによって測定することができる。こ
れらの時点の試料でウェスタンブロットアッセイを行うことが可能であり、抗体によりタ
ンパク質が検出される。抗体は、そのタンパク質においてタグ化することができる。その
タンパク質がウェスタンで単一のバンドを示す場合、該タンパク質のサイズが注入したタ
ンパク質のサイズと同一であるならば、分解はおこっていない。この例示的な方法では、
ウェスタンブロットまたは同等の技法によって判定されるように、タンパク質の５０％が
分解されている時点が、タンパク質の血清分解半減期または「血清半減期」である。
「ｔ１／２」という用語は、本明細書で使用する場合、ｌｎ（２）／Ｋｅｌとして計算
される最終半減期を意味する。Ｋｅｌは、ｌｏｇ濃度対時間曲線の最終直線部分の線形回
帰によって計算された最終消失速度定数である。半減期は通例、正常な生物学的プロセス
によって代謝または消失される、生体（ｌｉｖｉｎｇ ｏｒｇａｎｉｓｍ）内に沈着した
投与済み物質の量の半分にとって必要な時間を示す。「ｔ１／２」、「最終半減期」、「
消失半減期」および「循環半減期」という用語は、本明細書では互換的に使用される．
「見かけの分子量係数」または「見かけの分子量」は、特定のアミノ酸配列によって提
示された見かけの分子量の相対的増加または減少の尺度を示す関連用語である。該見かけ
の分子量は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）および同様の方法を使用して球状
タンパク質標準と比較して決定され、「見かけのｋＤ」単位で測定される。見かけの分子
量係数は、見かけの分子量と実際の分子量との間の比である；実際の分子量は、アミノ酸
組成に基づいて、その組成の各種類のアミノ酸の計算された分子量を加算することによっ
て予測される。
「流体力学半径」または「ストークス半径」は、溶液中の分子の有効半径（Ｒｈ（ｎｍ
））であって、分子が溶液中を移動して、溶液の粘度による抵抗を受ける物体であると仮
定することによって測定される有効半径である。本発明の実施形態において、ＸＴＥＮ融
合タンパク質の流体力学半径測定値は、より直観的な尺度である「見かけの分子量係数」
と相関している。タンパク質の「流体力学半径」は、水溶液中でのその拡散速度ならびに
高分子のゲルにおいて移動するその能力に影響を及ぼす。タンパク質の流体力学半径は、
その分子量によって、ならびに形状および緻密性を包含するその構造によって決定される
。Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏｓ．６，４０６，６３２および７，２９４，５１３に記載
されているような、たとえばサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）の使用による流体
力学半径を決定する方法は、当分野で周知である。大半のタンパク質は球状構造を有し、
球状構造はタンパク質が最小の流体力学半径によって取ることができる最も小型の３次元
構造である。いくつかのタンパク質は、ランダムで開いた、非構造化、または「直鎖」高
次構造を取り、結果として、同様の分子量の通例の球状タンパク質と比較してはるかに大
きい流体力学半径を有する。
「生理的条件」は、生体被験体のこのような状態を模倣する温度、塩濃度、ｐＨを包含
する、生体宿主における一連の条件ならびにインビトロ条件を示す。インビトロアッセイ
で使用するための生理的に関連する条件の宿主が確立されている。概して、生理的バッフ
ァーは、生理的濃度の塩を含有し、約６．５～約７．８に、および好ましくは約７．０～
約７．５に及ぶ中性ｐＨに調整される。多種多様の生理的バッファーがＳａｍｂｒｏｏｋ
ら（１９８９）に記載されている。生理的に関連する温度は、約２５℃～約３８℃に、好
ましくは約３５℃～約３７℃に及ぶ。
「反応基」は、第２の反応性基に連結できる化学構造物である。反応基の例は、アミノ
基、カルボキシ基、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基、アルデヒド基、アジド基である
。いくつかの反応基を活性化させて、第２の反応基との連結を促進することができる。活
性化の例は、カルボキシ基とカルボジイミドとの反応、カルボキシ基の活性化エステルへ
の変換、またはカルボキシ基のアジド機能への変換である。
「制御放出剤」、「低速放出剤」、「デポー調合物」または「持続放出剤」は互換的に
使用されて、ポリペプチドが薬剤の非存在下で投与されるときの放出期間と比較して、本
発明のポリペプチドの放出期間を延長することができる薬剤を示す。本発明の異なる実施
形態は、異なる放出速度を有し、異なる治療量をもたらし得る。
「抗原」、「標的抗原」または「免疫原」という用語は本明細書では互換的に使用され
て、抗体フラグメントまたは抗体フラグメントに基づく治療薬が結合する、または特異性
を有する構造物または結合決定基を示す。
「ペイロード」という用語は本明細書で使用する場合、生物活性または治療活性を有す
るタンパク質またはペプチド配列；小型分子のファルマコフォアの対応物を示す。ペイロ
ードの例は、これに限定されるわけではないが、サイトカイン、酵素、ホルモン、ならび
に血液因子および成長因子を包含する。ペイロードは、遺伝子的に融合または化学的にコ
ンジュゲートされた部分、たとえば化学療法剤、抗ウイルス化合物、毒素または造影剤を
さらに含むことができる。これらのコンジュゲートされた部分は、切断可能または切断不
能であり得るリンカーによってポリペプチドの残りの部分に結合することができる。
「アンタゴニスト」という用語は、本明細書で使用する場合、本明細書で開示する天然
ポリペプチドの生物活性を部分的または完全に遮断、阻害、または中和する任意の分子を
包含する。ポリペプチドのアンタゴニストを同定する方法は、天然ポリペプチドを候補ア
ンタゴニスト分子と接触させることと、正常には天然ポリペプチドに関連付けられた１つ
以上の生物活性の検出可能な変化を測定することとを含み得る。本発明の文脈において、
アンタゴニストは、タンパク質、核酸、炭水化物、抗体または生物活性タンパク質の効果
を減少させる任意のその他の分子を包含し得る。
「アゴニスト」という用語は最も広い意味で使用され、本明細書で開示する天然ポリペ
プチドの生物活性を模倣する任意の分子を包含する。好適なアゴニスト分子は、具体的に
アゴニスト抗体または抗体フラグメント、天然ポリペプチド、ペプチド、小型有機分子な
どのフラグメントまたはアミノ酸配列変異体を包含する。天然ポリペプチドのアゴニスト
を同定する方法は、天然ポリペプチドを候補アゴニスト分子と接触させることと、正常に
は天然ポリペプチドに関連付けられた１つ以上の生物活性の検出可能な変化を測定するこ
ととを含み得る。
本明細書の目的のための「活性」は、対応する天然生物活性タンパク質の作用または効
果と一致する、融合タンパク質の構成要素の作用または効果を示し、「生物活性」は、こ
れに限定されるわけではないが受容体結合、拮抗物質活性、アゴニスト活性、または細胞
応答もしくは生理的応答を包含する、インビトロまたはインビボ生物機能または効果を示
す。
本明細書で使用する場合、「処置」または「処置すること」または「軽減すること（ｐ
ａｌｌｉａｔｉｎｇ）」または「緩和すること」は、本明細書では互換的に使用される．
これらの用語は、これに限定されるわけではないが、治療利益および／または予防利益を
包含する、有益または所望の結果を得るための手法を示す。治療利益とは、根底にある処
置する障害の根絶または緩和を意味する。また治療利益は、被験体が根底にある障害にな
お罹患しているかもしれないかにかかわらず被験体に改善が観察されるように、根底にあ
る障害に関連付けられた生理的異常の１つ以上の根絶または緩和によって達成される。予
防利益では、組成物は、特定の疾患を発症するリスクにある被験体に、または疾患の生理
的異常の１つ以上を、この疾患の診断が行われていなくても、報告している被験体に投与
され得る。
「治療効果」は本明細書で使用する場合、これに限定されるわけではないが、生物活性
タンパク質が所有する抗原エピトープに対する抗体産生を誘導する能力以外の、本発明の
融合ポリペプチドによって引き起こされる、ヒトもしくは他の動物における疾患の治癒、
軽減、緩和、もしくは防止、またはそうでなければヒトもしくは動物の身体的もしくは精
神的健康を包含する、生理的効果のことをいう。治療的有効量の決定は、とりわけ本明細
書で提供された詳細な開示を考慮して、十分に当業者の能力の範囲内である。
「治療的有効量」および「治療的有効用量」という用語は、本明細書で使用する場合、
疾患状態または病状のいずれかの状態、態様、測定パラメータまたは特徴に対する任意の
検出可能な有益な効果を有することができる、被験体に単回または反復用量で投与したと
きに、融合タンパク質組成物の単独またはその一部としてのいずれかの、生物活性タンパ
ク質の量をいう。このような効果は、絶対に有益である必要はない。
「治療的有効用量レジメン」という用語は、本明細書で使用する場合、用量が治療的有
効量で投与されて疾患状態または病状の任意の症状、態様、測定パラメータまたは特徴に
対する持続的な有益な効果をもたらす、融合タンパク質組成物の単独またはその一部とし
てのいずれかの、生物活性タンパク質の連続投与用量のスケジュールを指す。
Ｉ）一般技法
本発明の実施は、別途示さない限り、当該技術の範囲内である、免疫学、生化学、化学
、分子生物学、微生物学、細胞生物学、ゲノミクスおよび組換えＤＮＡの従来の技法を用
いる。その内容が全体として参照により本明細書に組み入れられている、Ｓａｍｂｒｏｏ
ｋ，Ｊ．ら、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａ
ｎｕａｌ，”３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２００１；”Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ
ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら ｅｄｓ．，１９
８７；ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，”Ａｃａ
ｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ．；“ＰＣＲ ２：ａ ｐｒａｃｔ
ｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ”，Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ
ａｎｄ Ｇ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ ｅｄｓ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒ
ｅｓｓ，１９９５；“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ
”Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ｄ．ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８；”Ｇｏｏｄｍａｎ ＆ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ
Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉ
ｃｓ，”１１ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ，２００５；およびＦｒｅ
ｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．，“Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａ
ｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，”４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈ
ｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｓｏｍｅｒｓｅｔ，ＮＪ，２０００を参照。
ＩＩ）延長組換えポリペプチド
本発明は、延長組換えポリペプチド（「ＸＴＥＮ」または「ＸＴＥＮｓ」）を含む組成
物を提供する。いくつかの実施形態において、ＸＴＥＮは概して、主に小型親水性アミノ
酸から成る天然に存在しない実質的に非反復性の配列を有する延長された長さのポリペプ
チドであり、該配列は生理的条件下では、低い程度で２次もしくは３次構造を有するか、
または２次もしくは３次構造を有さない。
本発明の一態様において、生物活性タンパク質（「ＢＰ」）に連結されて、ＢＰＸＴＥ
Ｎ融合タンパク質（たとえば単量体融合物）をもたらすことができる融合パートナーとし
て有用であるＸＴＥＮポリペプチド組成物が開示される。ＸＴＥＮは、生物活性タンパク
質に連結されて融合タンパク質を生成するときに、特定の化学的および薬学的特性を与え
ることができるという点で、融合タンパク質パートナーとしての有用性を有することがで
きる。このような所望の特性は、下記の他の特性の中でも、これに限定されるわけではな
いが、増強された薬物動態パラメータおよび溶解性の特徴を包含する。このような融合タ
ンパク質の組成物は、本明細書に記載するような、特定の疾患、障害または状態を処置す
る有用性を有し得る。本明細書で使用する場合、「ＸＴＥＮ」は、抗体または抗体フラグ
メント、たとえば単鎖抗体、軽鎖または重鎖のＦｃフラグメントを特異的に排除する。
いくつかの実施形態において、ＸＴＥＮは、単一の配列として使用されるときには約１
００超～約３０００のアミノ酸残基、好ましくは４００超～約３０００残基を有し、単一
の融合タンパク質またはコンジュゲートにおいて１を超えるＸＴＥＮ単位として使用され
るときには約４００超～約３０００のアミノ酸残基を累積的に有する、長いポリペプチド
である。融合タンパク質の半減期の増加が不要であるが、生物活性タンパク質融合パート
ナーの溶解度または他の物理的／化学的特性が所望である、他の場合において、１００ア
ミノ酸残基より短い、たとえば約９６、または約８４、または約７２、または約６０、ま
たは約４８、または約３６アミノ酸残基のＸＴＥＮ配列は、融合タンパク質組成物にＢＰ
と共に組み入れられて特性を及ぼし得る。
生物活性タンパク質に連結されて本発明の融合タンパク質を生成するＸＴＥＮの選択基
準は概して、ＸＴＥＮの、物理的／化学的特性および高次構造の構造物の属性に関連して
おり、この属性は今度は、薬学的および薬物動態特性の向上を融合タンパク質に与えるこ
とができる。本発明のＸＴＥＮは、以下の有利な特性：高次構造の柔軟性、水溶性の増強
、高度のプロテアーゼ耐性、低い免疫原性、哺乳動物受容体への弱い結合、および流体力
学半径（またはストークス半径）の増加；融合タンパク質パートナーとしてＸＴＥＮを特
に有用にすることができる特性の１つ以上を提示し得る。ＸＴＥＮによって増強され得る
、ＢＰを含む融合タンパク質の特性の非限定的な例は、全体的な溶解度および／または代
謝安定性の増加、タンパク質分解に対する感受性の低下、免疫原性の低下、皮下または筋
肉内投与したときの吸収速度の低下、ならびに最終半減期および曲線下面積（ＡＵＣ）な
どの薬物動態特性の増強を包含し、皮下または筋肉内注射後の（ＸＴＥＮに連結されてい
ないＢＰと比較して）より低速の吸収によって、Ｃｍａｘがより低くなり、これにより今
度はＢＰの有害作用の低下が引き起こされ、全体として、被験体に投与されたＢＰＸＴＥ
Ｎ組成物の融合タンパク質が、ＸＴＥＮに連結されていない対応するＢＰ構成要素と比較
して、治療ウインドウ内に残存する期間の増加を引き起こすことができる。
本発明のＸＴＥＮを含む融合タンパク質組成物などのタンパク質の物理的／化学的特性
；２次または３次構造、溶解度、タンパク質凝集、融解特性、夾雑および含水量などの特
性を決定する多種多様の方法およびアッセイが、当分野で公知である。このような方法は
、分析用遠心分離、ＥＰＲ、ＨＰＬＣ－イオン交換、ＨＰＬＣ－サイズ排除、ＨＰＬＣ－
逆相、光散乱、キャピラリー電気泳動、円偏光二色性、示差走査熱量測定、蛍光、ＨＰＬ
Ｃ－イオン交換、ＨＰＬＣ－サイズ排除、ＩＲ、ＮＭＲ、ラマン分光法、屈折率測定およ
び紫外／可視分光法を包含する。追加の方法は、Ａｒｎａｕら、Ｐｒｏｔ Ｅｘｐｒ ａ
ｎｄ Ｐｕｒｉｆ（２００６）４８，１－１３に開示されている。これらの方法の発明へ
の適用は、当業者の理解の範囲内である。
通例、融合タンパク質のＸＴＥＮ構成要素は、ポリマーの延長した長さにかかわらず、
生理的条件下で変性ペプチド配列のように挙動するよう設計されている。変性した（ｄｅ
ｎａｔｕｒｅｄ）とは、ペプチド主鎖の高次構造の自由度が大きいことを特徴とする、溶
解したペプチドの状態を説明する。大半のペプチドおよびタンパク質は、高濃度の変性剤
の存在下でまたは高温にて、変性した高次構造を取る。変性した高次構造のペプチドは、
たとえば特徴的な円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルを有し、ＮＭＲによって決定される長
距離（ｌｏｎｇ－ｒａｎｇｅ）相互作用の欠如を特徴とする。「変性した高次構造」およ
び「非構造化高次構造」は、本明細書では同義語として使用される。いくつかの場合にお
いて，本発明は、生理的条件下で、２次構造を大部分欠く変性した配列に似せることがで
きるＸＴＥＮ配列を提供する。他の場合では、ＸＴＥＮ配列は、生理的条件下で２次構造
を実質的に欠くことができる。「大部分欠く」は、本文脈で使用する場合、本明細書に記
載する手段によって測定または決定されるように、ＸＴＥＮ配列のＸＴＥＮアミノ酸残基
の５０％未満が２次構造に寄与することを意味する。「実質的に欠く」は、本文脈で使用
する場合、本明細書に記載する手段によって測定または決定されるように、ＸＴＥＮ配列
のＸＴＥＮアミノ酸残基の少なくとも約６０％、または約７０％、または約８０％、また
は約９０％、または約９５％、または少なくとも約９９％が２次構造に寄与しないことを
意味する。
所与のポリペプチドにおける２次および３次構造の存在または非存在を識別するための
多種多様の方法が、当分野で確立されてきた。特に２次構造は、「遠紫外」スペクトル領
域（１９０～２５０ｎｍ）において、たとえば円偏光二色性分光法によって分光光度法で
測定することができる。２次構造要素、たとえばアルファらせんおよびベータシートはそ
れぞれ、ＣＤスペクトルの特徴的な形状および大きさを生じる。ポリペプチド配列の２次
構造は、特定のコンピュータプログラムまたはアルゴリズム、たとえばＵＳ Ｐａｔｅｎ
ｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．２００３０２２８３０９
Ａ１に記載されているような、周知のＣｈｏｕ－Ｆａｓｍａｎアルゴリズム（Ｃｈｏｕ，
Ｐ．Ｙ．ら（１９７４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１３：２２２－４５）およびＧａｒ
ｎｉｅｒ－Ｏｓｇｕｔｈｏｒｐｅ－Ｒｏｂｓｏｎ（「ＧＯＲ」）アルゴリズム（Ｇａｒｎ
ｉｅｒ Ｊ，Ｇｉｂｒａｔ ＪＦ，Ｒｏｂｓｏｎ Ｂ．（１９９６），ＧＯＲ ｍｅｔｈ
ｏｄ ｆｏｒ ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｔｒｕ
ｃｔｕｒｅ ｆｒｏｍ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅ
ｎｚｙｍｏｌ ２６６：５４０－５５３）によっても予測することができる。所与の配列
では、アルゴリズムは、２次構造がいくつか存在するかまたは全く存在しないかを予測す
ることができ、２次構造の存在はたとえばアルファらせんもしくはベータシートを形成す
る配列の残基の総数および／もしくはパーセンテージ、または（２次構造を欠いた）ラン
ダムコイル形成物を生じることが予測される配列の残基のパーセンテージとして表される
。
いくつかの場合において、本発明の融合タンパク質組成物で使用されるＸＴＥＮ配列は
、Ｃｈｏｕ－Ｆａｓｍａｎアルゴリズムによって決定されるように、０％から約５％未満
に及ぶアルファらせんのパーセンテージを有することができる。他の場合において、融合
タンパク質組成物のＸＴＥＮ配列は、Ｃｈｏｕ－Ｆａｓｍａｎアルゴリズムによって決定
されるように、０％から約５％未満に及ぶベータシートのパーセンテージを有することが
できる。いくつかの場合において，融合タンパク質組成物のＸＴＥＮ配列は、Ｃｈｏｕ－
Ｆａｓｍａｎアルゴリズムによって決定されるように、０％から約５％未満に及ぶアルフ
ァらせんのパーセンテージおよび０％から約５％未満に及ぶベータシートのパーセンテー
ジを有することができる。好ましい実施形態において、融合タンパク質組成物のＸＴＥＮ
配列は、約２％未満のアルファらせんのパーセンテージおよび約２％未満のベータシート
のパーセンテージを有する。他の場合において、融合タンパク質組成物のＸＴＥＮ配列は
、ＧＯＲアルゴリズムによって決定されるように、高度のランダムコイルパーセンテージ
を有することができる。いくつかの実施形態において、ＸＴＥＮ配列は、ＧＯＲアルゴリ
ズムによって決定されるように、少なくとも約８０％の、さらに好ましくは少なくとも約
９０％の、さらに好ましくは少なくとも約９１％の、さらに好ましくは少なくとも約９２
％の、さらに好ましくは少なくとも約９３％の、さらに好ましくは少なくとも約９４％の
、さらに好ましくは少なくとも約９５％の、さらに好ましくは少なくとも約９６％の、さ
らに好ましくは少なくとも約９７％の、さらに好ましくは少なくとも約９８％の、および
最も好ましくは少なくとも約９９％のランダムコイルを有することができる。
１．非反復性配列
主題の組成物のＸＴＥＮ配列は、実質的に非反復性であることができる。一般に、反復
性アミノ酸配列は、天然反復性配列、たとえばコラーゲンおよびロイシンジッパーによっ
て例示されるように、凝集するもしくは高次構造物（ｈｉｇｈｅｒ ｏｒｄｅｒ ｓｔｒ
ｕｃｔｕｒｅ）を形成する、または接触物を形成して結晶構造物もしくは偽結晶構造物を
生じる傾向を有する。これに対して、非反復性配列は凝集する傾向が低いために、配列が
そうでなければ反復性である場合には凝集しやすい荷電アミノ酸を比較的低頻度で有する
、長い配列のＸＴＥＮが設計できるようになる。通例、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質は、
約１００超～約３０００のアミノ酸残基、好ましくは４００超～約３０００の残基のＸＴ
ＥＮ配列を含み、該配列は実質的に非反復性である。一実施形態において、ＸＴＥＮ配列
は、約１００超～約３０００のアミノ酸残基、好ましくは４００超～約３０００のアミノ
酸残基を有し得、該配列において、配列内の連続する３個のアミノ酸が同じ種類のアミノ
酸であることはなく（該アミノ酸（単数）がセリンでない限り）、この場合、３個以下の
連続アミノ酸はセリン残基である。上述の実施形態において、ＸＴＥＮ配列は実質的に非
反復性である。
ポリペプチドまたは遺伝子の反復度は、コンピュータプログラムもしくはアルゴリズム
によって、または当分野で公知の他の手段によって測定することができる。ポリペプチド
配列の反復性は、たとえば所与の長さのより短い配列がポリペプチド内で出現する回数を
決定することによって評価できる。たとえば２００のアミノ酸残基のポリペプチドは、１
９２の重複９－アミノ酸配列（すなわち９マー「フレーム」）および１９８の３マーフレ
ームを有するが、独自の９マー配列または３マー配列の数は、配列内の反復の量に依存す
る。ポリペプチド配列全体におけるサブ配列の反復度を反映するスコア（以下「サブ配列
スコア」）を生成させることができる。本発明の文脈において、「サブ配列スコア」は、
２００アミノ酸配列内の独自の３マーサブ配列の絶対数で割った、ポリペプチドの２００
連続アミノ酸配列全治にわたる独自の３マーフレームそれぞれの出現数の和を意味する。
反復性および非反復性ポリペプチドの最初の２００アミノ酸に由来するこのようなサブ配
列スコアの例を実施例７３に表示する。いくつかの実施形態において、本発明はＸＴＥＮ
をそれぞれ含むＢＰＸＴＥＮを提供し、該ＸＴＥＮは、１２未満の、さらに好ましくは１
０未満の、さらに好ましくは９未満の、さらに好ましくは８未満の、さらに好ましくは７
未満の、さらに好ましくは６未満の、および最も好ましくは５未満のサブ配列スコアを有
することができる。本段落の上で記載した上記の実施形態において、約１０未満（すなわ
ち９、８、７など）のサブ配列スコアを有するＸＴＥＮが「実質的に非反復性」である。
ＸＴＥＮの非反復性の特徴は、反復性配列を有するポリペプチドと比較して、溶解度が
より高く、凝集する傾向がより低いＢＰ（複数可）を融合タンパク質に与えることができ
る。これらの特性は、いくつかの場合において１００ｍｇ／ｍｌを超える非常に高い薬物
濃度を含有する、ＸＴＥＮを含む薬学的調製物の調合を容易にすることができる。
さらに、本実施形態のＸＴＥＮポリペプチド配列は、哺乳動物に投与されるときに免疫
原性を低下または実質的に消失させるために、低度の内部反復性を有するように設計され
る。３種類のアミノ酸、たとえばグリシン、セリンおよびグルタメートに大部分限定され
た短い反復モチーフから構成されたポリペプチド配列は、哺乳動物に投与されたときに、
これらの配列に予測されたＴ細胞エピトープが存在しないにもかかわらず、比較的高い抗
体力価を生じ得る。これは、ポリペプチドの反復性の性質によって引き起こされ得る。な
ぜなら、タンパク質凝集体を包含する、反復エピトープを有する免疫原、架橋免疫原、お
よび反復性炭水化物が高い免疫原性であり、たとえばＢ細胞活性化を引き起こすＢ細胞受
容体の架橋を生成できることが示されているためである。（Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ，Ｊ．ら
（２００７）Ｖａｃｃｉｎｅ，２５：１６７６－８２；Ｙａｎｋａｉ，Ｚ．ら（２００６
）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ，３４５：１３６５－７１；
Ｈｓｕ，Ｃ．Ｔ．ら（２０００）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，６０：３７０１－５）；Ｂａｃ
ｈｍａｎｎ ＭＦら、Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９５）２５（１２）：３４４
５－３４５１）。
２．例示的な配列モチーフ
本発明は、より短い配列の複数の単位、すなわちモチーフを含むことができるＸＴＥＮ
を含み、ここで該モチーフのアミノ酸配列は非反復性である。ＸＴＥＮ配列の設計におい
て、多量体化されてＸＴＥＮ配列を生成する配列モチーフのライブラリを使用する「ビル
ディングブロック」手法の使用にもかかわらず、非反復性基準が満たされ得ることが見出
された。それゆえＸＴＥＮ配列がわずか４つの異なる種類の配列モチーフの複数単位から
成り得るのは、モチーフ自体が概して非反復性アミノ酸配列から成り、ＸＴＥＮ配列全体
が実質的に非反復性にされるためである。
一実施形態において、ＸＴＥＮは約１００超～約３０００のアミノ酸残基の、好ましく
は４００超～約３０００の残基の非反復性配列を有することができ、該ＸＴＥＮ配列の少
なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少な
くとも約９５％、または少なくとも約９７％、または約１００％は、非重複配列モチーフ
から成り、該モチーフそれぞれが約９～３６のアミノ酸残基を有する。他の実施形態にお
いて、ＸＴＥＮ配列の少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくと
も約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または約１００％
は、非重複配列モチーフから成り、該モチーフそれぞれが９～１４のアミノ酸残基を有す
る。なお他の実施形態において、ＸＴＥＮ配列構成要素の少なくとも約８０％、または少
なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少な
くとも約９７％、または約１００％は、非重複配列モチーフから成り、該モチーフはそれ
ぞれ１２のアミノ酸残基を有する。これらの実施形態において、配列全体が非構造化の柔
軟な特徴を有するように、配列モチーフは小型親水性アミノ酸から主に構成されることが
好ましい。ＸＴＥＮに包含されることができるアミノ酸の例は、たとえばアルギニン、リ
ジン、トレオニン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、アスパルテート、グルタメー
ト、セリン、およびグリシンである。試験変数、たとえばコドン最適化、配列モチーフを
コードする構築ポリヌクレオチド、タンパク質の発現、発現されたタンパク質の電荷分布
および溶解度、ならびに２次および３次構造の結果として、増強された特徴を備えたＸＴ
ＥＮ組成物は主にグリシン（Ｇ）残基、アラニン（Ａ）残基、セリン（Ｓ）残基、トレオ
ニン（Ｔ）残基、グルタメート（Ｅ）残基およびプロリン（Ｐ）残基を包含し、該配列が
実質的に非反復性となるように設計されることが見出された。好ましい実施形態において
、ＸＴＥＮ配列は、長さが約１００超～約３０００のアミノ酸残基、好ましくは４００超
～約３０００残基である実質的に非反復性の配列に配置されている、グリシン（Ｇ）、ア
ラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）またはプロリン（
Ｐ）から選択される４～６種類のアミノ酸を主として有する。いくつかの実施形態におい
て、ＸＴＥＮは約１００超～約３０００のアミノ酸残基の、好ましくは４００超～約３０
００の残基の配列を有することができ、該配列の少なくとも約８０％が非重複配列モチー
フから成り、該モチーフの各々は９～３６のアミノ酸残基を有し、該モチーフの各々はグ
リシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）
およびプロリン（Ｐ）から選択される４～６種類のアミノ酸から成り、全長ＸＴＥＮの任
意の１種類のアミノ酸の含有量が３０％を超えない。他の実施形態において、ＸＴＥＮ配
列の少なくとも約９０％が非重複配列モチーフから成り、該モチーフの各々は９～３６の
アミノ酸残基を有し、該モチーフの各々はグリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ
）、トレオニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）およびプロリン（Ｐ）から選択される４～６
種類のアミノ酸から成り、全長ＸＴＥＮの任意の１種類のアミノ酸の含有量が３０％を超
えない。他の実施形態において、ＸＴＥＮ配列の少なくとも約９０％が非重複配列モチー
フから成り、該モチーフの各々は、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、ト
レオニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）およびプロリン（Ｐ）から選択される４～６種類の
アミノ酸から成る１２アミノ酸残基を有し、全長ＸＴＥＮの任意の１種類のアミノ酸の含
有量が３０％を超えない。また他の実施形態において、ＸＴＥＮ配列の少なくとも約９０
％が、または約９１％が、または約９２％が、または約９３％が、または約９４％が、ま
たは約９５％が、または約９６％が、または約９７％が、または約９８％が、または約９
９％～約１００％が非重複配列モチーフから成り、該モチーフはそれぞれグリシン（Ｇ）
、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）およびプロリ
ン（Ｐ）から成る１２アミノ酸残基を有し、全長ＸＴＥＮの任意の１種類のアミノ酸の含
有量が３０％を超えない。
なお他の実施形態において、ＸＴＥＮは約１００超～約３０００のアミノ酸残基の、好
ましくは４００超～約３０００のアミノ酸残基の非反復性配列を含み、該配列の少なくと
も約８０％が、または少なくとも約９０％が、または約９１％が、または約９２％が、ま
たは約９３％が、または約９４％が、または約９５％が、または約９６％が、または約９
７％が、または約９８％が、または約９９％が９～１４個のアミノ酸残基の非重複配列モ
チーフから成り、該モチーフがグリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオ
ニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）およびプロリン（Ｐ）から選択される４～６種類のアミ
ノ酸から成り、任意の１つのモチーフの任意の２個の連続アミノ酸残基の配列が該配列モ
チーフにおいて２回を超えて反復されない。他の実施形態において、ＸＴＥＮ配列の少な
くとも約９０％が、または約９１％が、または約９２％が、または約９３％が、または約
９４％が、または約９５％が、または約９６％が、または約９７％が、または約９８％が
、または約９９％が１２個のアミノ酸残基の非重複配列モチーフから成り、該モチーフが
グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ
）およびプロリン（Ｐ）から選択される４～６種類のアミノ酸から成り、任意の１つの配
列モチーフの任意の２個の連続アミノ酸残基の配列が該配列モチーフにおいて２回を超え
て反復されない。他の実施形態において、ＸＴＥＮ配列の少なくとも約９０％が、または
約９１％が、または約９２％が、または約９３％が、または約９４％が、または約９５％
が、または約９６％が、または約９７％が、または約９８％が、または約９９％が１２個
のアミノ酸残基の非重複配列モチーフから成り、該モチーフがグリシン（Ｇ）、アラニン
（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）およびプロリン（Ｐ）か
ら成り、任意の１つの配列モチーフの任意の２個の連続アミノ酸残基の配列が該配列モチ
ーフにおいて２回を超えて反復されない。また他の実施形態において、ＸＴＥＮは１２ア
ミノ酸配列モチーフから成り、該アミノ酸はグリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（
Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）およびプロリン（Ｐ）から選択され、任意
の１つの配列モチーフの任意の２個の連続アミノ酸残基の配列が該配列モチーフにおいて
２回を超えて反復されず、全長ＸＴＥＮの任意の１種類のアミノ酸の含有量が３０％を超
えない。本段落の上で記載した上述の実施形態において、ＸＴＥＮ配列は実質的に非反復
性である。
いくつかの場合において、本発明は、約１００超～約３０００のアミノ酸残基の、好ま
しくは４００超～約３０００の残基の非反復性ＸＴＥＮ配列を含む組成物を提供し、配列
の少なくとも約８０％が、または少なくとも約９０％が、または約９１％が、または約９
２％が、または約９３％が、または約９４％が、または約９５％が、または約９６％が、
または約９７％が、または約９８％が、または約９９％～約１００％が、表１のアミノ酸
配列から選択される２個以上の非重複配列モチーフの複数の単位から成る。いくつかの場
合において、ＸＴＥＮは、配列の約８０％が、または少なくとも約９０％が、または約９
１％が、または約９２％が、または約９３％が、または約９４％が、または約９５％が、
または約９６％が、または約９７％が、または約９８％が、または約９９％～約１００％
が、表１の単一モチーフファミリから選択される２個以上の非重複配列から成り、該配列
全体が実質的に非反復性のままである「ファミリ」配列を生じる非重複配列モチーフを含
む。したがって、これらの実施形態において、ＸＴＥＮ配列は、表１の配列のＡＤモチー
フファミリの、またはＡＥモチーフファミリの、またはＡＦモチーフファミリの、または
ＡＧモチーフファミリの、またはＡＭモチーフファミリの、またはＡＱモチーフファミリ
の、またはＢＣファミリの、またはＢＤファミリの非重複配列モチーフの複数の単位を含
むことができる。他の場合において、ＸＴＥＮは、表１のモチーフファミリの２つ以上か
らのモチーフ配列を含む。
Figure 0007461438000001

他の場合において、ＢＰＸＴＥＮ組成物は約１００超～約３０００のアミノ酸残基の、
好ましくは４００超～約３０００の残基の非反復性ＸＴＥＮ配列を含む組成物を含むこと
ができ、配列の少なくとも約８０％が、または少なくとも約９０％が、または約９１％が
、または約９２％が、または約９３％が、または約９４％が、または約９５％が、または
約９６％が、または約９７％が、または約９８％が、または約９９％～約１００％が、表
１２～１５のポリペプチド配列の１つ以上から選択される非重複３６アミノ酸配列モチー
フから成る。
ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質のＸＴＥＮ構成要素が、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）
、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）およびプロリン（Ｐ）から選択
される４～６種類のアミノ酸から成るそのアミノ酸の１００％未満を、または表１の配列
モチーフもしくは表１２～１５のポリペプチド配列から成る配列の１００％未満を、また
は表２からのＸＴＥＮとの１００％未満の配列同一性を有するこのような実施形態におい
て、残りのアミノ酸残基は、任意のその他の１４種類の天然Ｌ－アミノ酸から選択するこ
とができる。残りのアミノ酸は、ＸＴＥＮ配列全体に散在され得るか、配列モチーフの中
もしくは配列モチーフの間に位置し得るか、またはＸＴＥＮ配列の１個以上の短いストレ
ッチに集中し得る。ＢＰＸＴＥＮのＸＴＥＮ構成要素がグリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）
、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）およびプロリン（Ｐ）以外のア
ミノ酸を含むような場合、アミノ酸が疎水性残基でなく、ＸＴＥＮ構成要素について２次
構造を実質的に与えるべきでないことが望ましい。それゆえ上述の好ましい実施形態にお
いて、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタメー
ト（Ｅ）およびプロリン（Ｐ）に加えて他のアミノ酸を含むＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質
のＸＴＥＮ構成要素は、Ｃｈｏｕ－Ｆａｓｍａｎアルゴリズムによって測定されるように
、アルファらせんおよびベータシートに寄与する残基が５％未満の配列を有し、ＧＯＲア
ルゴリズムによって測定されるように、少なくとも９０％のランダムコイル形成物を有す
る。
３．配列の長さ
詳細な特徴において、本発明は、延長した長さの配列を有するＸＴＥＮポリペプチドを
含むＢＰＸＴＥＮ組成物を含む。本発明は、非反復性の非構造化ポリペプチドの長さを増
大させることにより、ＸＴＥＮの非構造化の性質ならびにＸＴＥＮを含む融合タンパク質
の生物および薬物動態特性が増強されるという発見を利用する。実施例でさらに十分に記
載するように、ＸＴＥＮの長さの比例的増加は、単一ファミリの配列モチーフ（たとえば
表１の４種類のＡＥモチーフ）の固定反復順序によって生成された場合でも、ＧＯＲアル
ゴリズムによって決定されるように、より短いＸＴＥＮ長と比較して、より高いパーセン
テージのランダムコイル形成物を有する配列を生じることができる。さらに実施例に記載
するように、非構造化ポリペプチド融合パートナーの長さを増加させることにより、配列
長がより短い非構造化ポリペプチドパートナーを有する融合タンパク質と比較して、最終
半減期が非比例的に増加した融合タンパク質を得られることが見出された。
本発明のＢＰＸＴＥＮへの包含が意図されたＸＴＥＮの非限定的な例を表２に表示する
。したがって本発明は、融合タンパク質（複数可）のＸＴＥＮ配列長が約１００超～約３
０００のアミノ酸残基であり、いくつかの場合において４００超～約３０００のアミノ酸
残基であるＢＰＸＴＥＮ組成物を提供し、該ＸＴＥＮは、ＸＴＥＮに連結されていないペ
イロードと比較して、ＢＰＸＴＥＮにおいて増強された薬物動態特性を与える。いくつか
の場合において、本発明のＢＰＸＴＥＮ組成物のＸＴＥＮ配列は、長さが約１００の、ま
たは約１４４の、または約２８８の、または約４０１の、または約５００の、または約６
００の、または約７００の、または約８００の、または約９００の、または約１０００の
、または約１５００の、または約２０００の、または約２５００の、または約３０００ま
でのアミノ酸残基であることができる。他の場合において、ＸＴＥＮ配列は、長さが約１
００～１５０の、約１５０～２５０の、約２５０～４００の、４０１～約５００の、約５
００～９００の、約９００～１５００の、約１５００～２０００の、または約２０００～
約３０００のアミノ酸残基であることができる。一実施形態において、ＢＰＸＴＥＮは、
配列が表２から選択したＸＴＥＮに対して、少なくとも約８０％の配列同一性を、または
あるいは８１％の、８２％の、８３％の、８４％の、８５％の、８６％の、８７％の、８
８％の、８９％の、９０％の、９１％の、９２％の、９３％の、９４％の、９５％の、９
６％の、９７％の、９８％の、９９％、もしくは１００％の配列同一性を示すＸＴＥＮ配
列を含むことができる。いくつかの場合において、ＸＴＥＮ配列は、ＢＰＸＴＥＮのＮ末
端構成要素の最適化発現のために設計される。上述の一実施形態において、ＸＴＥＮ配列
は、ＡＥ９１２またはＡＭ９２３の配列に対して、少なくとも９０％配列同一性を有する
。上述の別の実施形態において、ＸＴＥＮは実施例１４～１７に記載されたＮ末端残基を
有する。
他の場合において、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質は第１および第２のＸＴＥＮ配列を含
むことができ、ＸＴＥＮ配列の残基の累積合計は、約４００超～約３０００のアミノ酸残
基である。上述の実施形態において、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質は、配列がそれぞれ、
表２から選択された少なくとも第１のまたはその上第２のＸＴＥＮに対して、少なくとも
約８０％の配列同一性を、またはあるいは８１％の、８２％の、８３％の、８４％の、８
５％の、８６％の、８７％の、８８％の、８９％の、９０％の、９１％の、９２％の、９
３％の、９４％の、９５％の、９６％の、９７％の、９８％の、９９％、もしくは１００
％の配列同一性を示す第１および第２のＸＴＥＮ配列を含むことができる。１個を超える
ＸＴＥＮがＢＰＸＴＥＮ組成物で使用される例は、これに限定されるわけではないが、少
なくとも１個のＢＰのＮ末端およびＣ末端の両方にＸＴＥＮが連結された構築物を包含す
る。
以下でさらに十分に記載するように、本発明は、ＢＰＸＴＥＮが、ＸＴＥＮの長さを選
択することによって被験体に投与された融合タンパク質に標的半減期を与えるように設計
される方法を提供する。一般に、ＢＰＸＴＥＮ組成物に組み入れられるＸＴＥＮの長さが
より長いと、より短いＸＴＥＮと比較して、より長い半減期が生じる。しかし、別の実施
形態において、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質は、被験体への皮下または筋肉内投与後のよ
り低い全身吸収速度を与えるために選択される、より長い配列長のＸＴＥＮを含むように
設計することができる。このような場合、Ｃｍａｘは、ＸＴＥＮに連結していないＢＰの
同程度の用量と比較して低下して、これによりＢＰＸＴＥＮを組成物の治療ウインドウ内
に維持する能力に寄与する。それゆえＸＴＥＮは、投与されたＢＰＸＴＥＮに、本明細書
に記載する残りの物理的／化学的特性に加えて、デポー特性を与える。
Figure 0007461438000002
Figure 0007461438000003
Figure 0007461438000004
Figure 0007461438000005
Figure 0007461438000006

４．正味電荷
他の場合において、ＸＴＥＮポリペプチドは、ＸＴＥＮ配列への正味電荷を有するアミ
ノ酸残基の組み入れおよび／または疎水性アミノ酸の割合の低下によって与えられた非構
造化特徴を有することができる。全体の正味電荷および正味電荷密度は、ＸＴＥＮ配列の
荷電アミノ酸の含有量を改変することによって制御され得る。いくつかの場合において、
組成物のＸＴＥＮの正味電荷密度は、＋０．１超の電荷／残基または－０．１未満の電荷
／残基であり得る。他の場合において、ＸＴＥＮの正味電荷は、約０％、約１％、約２％
、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約
１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％、ま
たは約２０％以上であることができる。
ヒトまたは動物の大半の組織および表面は負の正味電荷を有するので、ＸＴＥＮ配列は
、ＸＴＥＮ含有組成物と各種の表面、たとえば血管、健常組織、または各種の受容体との
間の非特異的相互作用を最小化するために負の正味電荷を有するように設計することがで
きる。特定の理論に縛られるものではないが、ＸＴＥＮは、高い負の正味電荷を個々に担
持して、ＸＴＥＮポリペプチドの配列全体にわたって分布されたＸＴＥＮポリペプチドの
個々のアミノ酸の間の静電反発力により、開放高次構造（ｏｐｅｎ ｃｏｎｆｏｒｍａｔ
ｉｏｎ）を取ることができる。ＸＴＥＮの延長された配列長における負の正味電荷のこの
ような分布は、非構造化高次構造をもたらすことができ、今度は流体力学半径の効果的な
増加を生じさせることができる。したがって、一実施形態において、本発明は、ＸＴＥＮ
配列が約８％の、１０％の、１５％の、２０％の、２５％の、またはなお約３０％のグル
タミン酸を含有する、ＸＴＥＮを提供する。本発明の組成物のＸＴＥＮは概して、正に荷
電したアミノ酸を全く含まない、または低い含有量で含む。いくつかの場合において、Ｘ
ＴＥＮは、約１０％未満の、正電荷を持つアミノ酸残基、または約７％未満の、または約
５％未満の、または約２％未満の、正電荷を持つアミノ酸残基を有し得る。しかし、本発
明は、制限された数の正電荷を持つアミノ酸、たとえばリジンがＸＴＥＮに包含されて、
リジンのイプシロンアミンとペプチドの反応基、リンカーブリッジ、またはＸＴＥＮ主鎖
にコンジュゲートされる薬物または小型分子の反応基との間のコンジュゲーションを可能
にし得る構築物を意図する。上述において、ＸＴＥＮ、生物活性タンパク質、さらに代謝
性疾患または障害の処置で有用な化学療法剤を含む融合タンパク質を構築することができ
、ＸＴＥＮ構成要素に組み入れられる薬剤の分子の最大数は、ＸＴＥＮに組み入れられた
リジンまたは反応性側鎖を持つ他のアミノ酸（たとえばシステイン）の数によって決定さ
れる。
いくつかの場合において、ＸＴＥＮ配列は、他の残基、たとえばセリンまたはグリシン
によって離された荷電残基を含み得て、このことによりさらに良好な発現または精製挙動
がもたらされ得る。主題の組成物のＸＴＥＮは、正味電荷に基づいて、１．０の、１．５
の、２．０の、２．５の、３．０の、３．５の、４．０の、４．５の、５．０の、５．５
の、６．０の、またはなお６．５の等電点（ｐＩ）を有し得る。好ましい実施形態におい
て、ＸＴＥＮは１．５～４．５の等電点を有する。これらの実施形態において、本発明の
ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質組成物に組み入れられたＸＴＥＮは生理的条件下で、非構造
化高次構造およびＸＴＥＮ構成要素の哺乳動物タンパク質および組織への結合の低減に寄
与し得る、負の正味電荷を担持する。
疎水性アミノ酸は構造をポリペプチドに与えることができるため、本発明は、ＸＴＥＮ
の疎水性アミノ酸の含有量が通例、５％未満、または２％未満、または１％未満の疎水性
アミノ酸含有量であることを条件とする。一実施形態において、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパ
ク質のＸＴＥＮ構成要素のメチオニンおよびトリプトファンのアミノ酸含有量は通例、５
％未満、または２％未満、および最も好ましくは１％未満である。別の実施形態において
、ＸＴＥＮは１０％未満の、正電荷を持つアミノ酸残基、または約７％未満の、または約
５％未満の、または約２％未満の、正電荷を持つアミノ酸残基を有する配列を有し、メチ
オニンおよびトリプトファン残基の和は２％未満であり、アスパラギンおよびグルタミン
残基の和はＸＴＥＮ配列全体の１０％未満である。
５．低い免疫原性
別の態様において、本発明は、ＸＴＥＮ配列が低度の免疫原性を有するか、または実質
的に非免疫原性である組成物を提供する。いくつかの因子、たとえば非反復性配列、非構
造化高次構造、高度の溶解度、低度のまたは欠如した自己凝集、低度のまたは欠如した配
列内のタンパク質分解部位、および低度のまたは欠如したＸＴＥＮ配列のエピトープが、
ＸＴＥＮの低い免疫原性に寄与することができる。
高次構造エピトープは、タンパク質抗原の複数の不連続アミノ酸配列から構成されるタ
ンパク質表面の領域によって形成される。タンパク質の正確な折畳みによって、これらの
配列は明確で安定した空間配置、すなわちエピトープをもたらし、エピトープは宿主体液
性免疫系によって「異物」として認識されることが可能であり、タンパク質に対する抗体
の産生が生じるか、または細胞媒介免疫応答が誘発される。後者の場合では、個体のタン
パク質に対する免疫応答は、その個体のＨＬＡ－ＤＲアロタイプのペプチド結合特異性の
関数である、Ｔ細胞エピトープ認識によって大きく左右される。Ｔ細胞表面の同族Ｔ細胞
受容体によるＭＨＣクラスＩＩペプチド複合体の結合（ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ）は、特定
の他の共受容体、たとえばＣＤ４分子の交差結合と共に、Ｔ細胞内で活性化状態を誘導す
ることができる。活性化は、サイトカインの放出をもたらし、他のリンパ球、たとえばＢ
細胞をさらに活性化して抗体を産生するか、または十分な細胞免疫応答としてＴキラー細
胞を活性化する。
ＡＰＣ（抗原提示細胞）の表面での提示のためにペプチドが所与のＭＨＣクラスＩＩ分
子を結合する能力は、いくつかの因子；最も顕著にはその１次配列に依存する。一実施形
態において、より低度の免疫原性は、抗原提示細胞での抗原プロセシングに抵抗するＸＴ
ＥＮ配列を設計すること、および／またはＭＨＣ受容体を良好に結合しない配列を選択す
ることによって達成され得る。本発明は、ＭＨＣＩＩ受容体との結合を低下するように、
ならびにＴ細胞受容体または抗体結合のためのエピトープの形成を回避して、低度の免疫
原性を生じるように設計された、実質的に非反復性のＸＴＥＮポリペプチドを有するＢＰ
ＸＴＥＮ融合タンパク質を提供する。免疫原性の回避は一部は、ＸＴＥＮ配列の高次構造
柔軟性の直接の結果；すなわちアミノ酸残基の選択および順序により２次構造が欠如して
いることである。たとえば特に興味深いのは、高次構造エピトープを生じることができる
、水溶液中または生理的条件下で小型に折り畳まれた高次構造を取る傾向が低い配列であ
る。従来の治療実践および投薬を用いる、ＸＴＥＮを含む融合タンパク質の投与は、概し
てＸＴＥＮ配列に対する中和抗体の形成をもたらさず、ＢＰＸＴＥＮ組成物のＢＰ融合パ
ートナーの免疫原性も低下し得る。
一実施形態において、主題の融合タンパク質で利用されるＸＴＥＮ配列は、ヒトＴ細胞
によって認識されるエピトープを実質的に含まないことができる。免疫原性のより低いタ
ンパク質を生成する目的での、このようなエピトープの消失は、以前に開示されている；
たとえば、参照により本明細書に組み入れられているＷＯ ９８／５２９７６、ＷＯ ０
２／０７９２３２、およびＷＯ ００／３３１７を参照。ヒトＴ細胞エピトープのアッセ
イが記載されている（Ｓｔｉｃｋｌｅｒ，Ｍ．ら（２００３）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ，２８１：９５－１０８）。特に興味深いのは、Ｔ細胞エピトープまたは非ヒ
ト配列を生成せずにオリゴマー化することができるペプチド配列である。これは、Ｔ細胞
エピトープの存在についてならびに６～１５マー、および特にヒトでない９マー配列の出
現についてこれらの配列の直接反復を試験することによって、次にエピトープ配列を消失
または破壊するようにＸＴＥＮ配列の設計を改変することによって達成できる。いくつか
の場合において、ＸＴＥＮ配列は、ＭＨＣ受容体に結合することが予測されたＸＴＥＮの
エピトープの数を制限することよって、実質的に非免疫原性である。ＭＨＣ受容体を結合
することができるエピトープの数を減少させることにより、Ｔ細胞活性化ならびにＴ細胞
ヘルパー機能の能力の同時低下、Ｂ細胞活性化または上方制御の低下および抗体産生の低
下が起こる。低度の予測Ｔ細胞エピトープは、実施例７４で示すような、ＴＥＰＩＴＯＰ
Ｅ（Ｓｔｕｒｎｉｏｌｏ，Ｔ．ら（１９９９）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１７：５
５５－６１）のようなエピトープ予測アルゴリズムによって決定することができる。タン
パク質内の所与のペプチドフレームのＴＥＰＩＴＯＰＥスコアは、Ｓｔｕｒｎｉｏｌｏ，
Ｔ．ら（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７：５５５）に開示
されているように、そのペプチドフレームの複数の最も一般的なヒトＭＨＣ対立遺伝子へ
の結合のＫｄのｌｏｇ（解離定数、親和性、オフレート）である。スコアは、約１０～約
－１０の少なくとも２０対数（１０ｅ１０Ｋｄ～１０ｅ－１０Ｋｄの結合拘束に対応）に
及び、Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｆなどの、ＭＨＣにおけるペプチド提示の間にアンカー残基とし
て働くことができる疎水性アミノ酸を回避することによって低下させることができる。い
くつかの実施形態において、ＢＰＸＴＥＮに組み入れられたＸＴＥＮ構成要素は、約－５
以上の、もしくは－６以上の、もしくは－７以上の、もしくは－８以上のＴＥＰＩＴＯＰ
Ｅスコアにて、または－９以上のＴＥＰＩＴＯＰＥスコアにて予測Ｔ細胞エピトープを有
さない。本明細書で使用する場合、「－９以上の」のスコアは、１０～－９（１０および
－９を包含する）のＴＥＰＩＴＯＰＥスコアを含むが、－１０は－９より小さいため、－
１０のスコアは含まない。
別の実施形態において、主題のＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質に組み入れられたＸＴＥＮ
配列を包含する、本発明のＸＴＥＮ配列は、ＸＴＥＮの配列からの公知のタンパク質分解
部位の制限によって実質的に非免疫原性にすることができ、ＭＨＣＩＩ受容体に結合可能
である小型ペプチドへのＸＴＥＮのプロセシングを低下させる。別の実施形態において、
ＸＴＥＮ配列は、実質的に２次構造を含まない配列を使用することによって実質的に非免
疫原性にすることができ、構造物の高いエントロピーのために多くのプロテアーゼに対す
る耐性を与える。したがって、ＴＥＰＩＴＯＰＥスコアの低下およびＸＴＥＮからの公知
のタンパク質分解部位の消失によって、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質組成物のＸＴＥＮを
包含するＸＴＥＮ組成物は、免疫系の哺乳動物受容体を包含する、哺乳動物受容体によっ
て実質的に結合できないようになり得る。一実施形態において、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパ
ク質のＸＴＥＮは、哺乳動物受容体に対して１００ｎＭ超のＫｄの結合、または哺乳動物
細胞表面もしくは循環ポリペプチド受容体に対して５００ｎＭ超のＫｄ、もしくは１μＭ
超のＫｄを有することができる。
その上、非反復性配列およびＸＴＥＮのエピトープの対応する欠如によって、Ｂ細胞が
ＸＴＥＮを結合するまたはＸＴＥＮによって活性化される能力を制限することができる。
反復性配列は認識されて、さらには少数のＢ細胞とも多価接触物を形成することができ、
複数のＴ細胞非依存性受容体の架橋の結果として、Ｂ細胞増殖および抗体産生を刺激する
ことができる。これに対して、ＸＴＥＮはその延長配列にわたって多くの異なるＢ細胞と
接触することができるが、個々のＢ細胞はそれぞれ、配列の反復性の欠如のために、個々
のＸＴＥＮとの１個のみまたは少数の接触物を作り得る。結果として、ＸＴＥＮは通例、
Ｂ細胞の増殖およびそれゆえ免疫応答を刺激する、はるかに低い傾向を有し得る。一実施
形態において、ＢＰＸＴＥＮは、融合されていない対応するＢＰと比較して、免疫原性の
低下を有し得る。一実施形態において、ＢＰＸＴＥＮの３回までの非経口用量の哺乳動物
への投与により、１：１００の血清希釈度では検出可能な抗ＢＰＸＴＥＮ ＩｇＧが生じ
得るが、１：１０００の希釈度では生じ得ない。別の実施形態において、ＢＰＸＴＥＮの
３回までの非経口用量の哺乳動物への投与により、１：１００の血清希釈度では検出可能
な抗ＢＰ ＩｇＧが生じ得るが、１：１０００の希釈度では生じ得ない。別の実施形態に
おいて、ＢＰＸＴＥＮの３回までの非経口用量の哺乳動物への投与により、１：１００の
血清希釈度では検出可能な抗ＸＴＥＮ ＩｇＧが生じ得るが、１：１０００の希釈度では
生じ得ない。上述の実施形態において、哺乳動物はマウス、ラット、ウサギ、またはカニ
クイザルであることができる。
高い反復度を有する配列に対する、非反復性配列を有するＸＴＥＮの追加の特色は、非
反復性ＸＴＥＮが抗体とより弱い接触物を形成することであり得る。抗体は多価分子であ
る。たとえばＩｇＧは２個の同一の結合部位を有し、ＩｇＭは１０個の同一の結合部位を
有する。反復性配列に対する抗体は、このような反復性配列と高いアビディティで多価接
触物を形成することができ、高いアビディティはこのような反復性配列の有効性および／
または消失に影響を及ぼすことができる。これに対して、非反復性ＸＴＥＮに対する抗体
は１価相互作用を産し、免疫クリアランスをもたらす可能性がより少ないので、ＢＰＸＴ
ＥＮ組成物が、増加した期間にわたって循環中に残存することができる。
６．流体力学半径の増加
別の態様において、本発明により、ＸＴＥＮポリペプチドが、ＸＴＥＮを組み入れたＢ
ＰＸＴＥＮ融合タンパク質に対して対応する見かけの分子量の増加を与える高い流体力学
半径を有することができるＸＴＥＮを提供される。実施例１９で詳述するように、ＸＴＥ
ＮのＢＰ配列への連結によって、ＸＴＥＮに連結していないＢＰと比較して、流体力学半
径の増大、見かけの分子量の増加、および見かけの分子量係数の増加を有することができ
る、ＢＰＸＴＥＮ組成物を生じることができる。たとえば半減期の延長が所望である治療
用途において、高い流体力学半径を有するＸＴＥＮが１個以上のＢＰを含む融合タンパク
質に組み入れられた組成物は、組成物の流体力学半径をおおよそ３～５ｎｍの糸球体孔サ
イズを超えて効果的に拡大させることができ（約７０ｋＤＡの見かけの分子量に相当）（
Ｃａｌｉｃｅｔｉ．２００３．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ ａｎｄ ｂｉｏｄｉｓ
ｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌ
ｙｃｏｌ）－ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ．Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ
Ｒｅｖ ５５：１２６１－１２７７）、循環タンパク質の腎クリアランスの低下を生じる
。タンパク質の流体力学半径は、その分子量によって、ならびに形状および緻密性を包含
するその構造物によって決定される。特定の理論に縛られるものではないが、ＸＴＥＮは
、ペプチドの個々の電荷の間の静電反発力または２次構造を与える能力が欠如した配列に
おける特定のアミノ酸によって与えられた固有の柔軟性のために、開放立体配置を取るこ
とができる。ＸＴＥＮポリペプチドの開放、延長および非構造化高次構造物は、２次およ
び／または３次構造、たとえば代表的な球状タンパク質を有する、同程度の配列長および
／または分子量のポリペプチドと比較して、より大きい比例的流体力学半径を有すること
ができる。Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏｓ．６，４０６，６３２および７，２９４，５１
３に記載されているような、たとえばサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）の使用に
よる流体力学半径を決定する方法は、当分野で周知である。実施例１９の結果が証明する
ように、ＸＴＥＮの増加長の追加により、流体力学半径、見かけの分子量、および見かけ
の分子量係数のパラメータの比例的増大が生じて、ＢＰＸＴＥＮを所望の特徴的なカット
オフの見かけの分子量または流体力学半径に適応させることが可能となる。したがって、
ある実施形態において、融合タンパク質が少なくとも約５ｎｍの、または少なくとも約８
ｎｍの、または少なくとも約１０ｎｍの、または１２ｎｍの、または少なくとも約１５ｎ
ｍの流体力学半径を有することができるようなＸＴＥＮを用いて、ＢＰＸＴＥＮ融合タン
パク質を構成することができる。上述の実施形態において、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質
のＸＴＥＮによって与えられた大きい流体力学半径は、得られた融合タンパク質の腎クリ
アランスの低下をもたらし、最終半減期の対応する増加、平均滞留時間の増加、および／
または腎クリアランス速度の減少をもたらすことができる。
別の実施形態において、選んだ長さおよび配列のＸＴＥＮは、ＢＰＸＴＥＮに選択的に
組み入れられて、生理的条件下で、少なくとも約１５０ｋＤａの、または少なくとも約３
００ｋＤａの、または少なくとも約４００ｋＤａの、または少なくとも約５００ｋＤＡの
、または少なくとも約６００ｋＤａの、または少なくとも約７００ｋＤＡの、または少な
くとも約８００ｋＤａの、または少なくとも約９００ｋＤａの、または少なくとも約１０
００ｋＤａの、または少なくとも約１２００ｋＤａの、または少なくとも約１５００ｋＤ
ａの、または少なくとも約１８００ｋＤａの、または少なくとも約２０００ｋＤａの、ま
たは少なくとも約２３００ｋＤａ以上の見かけの分子量を有する融合タンパク質を生成す
ることができる。別の実施形態において、選んだ長さおよび配列のＸＴＥＮは、ＢＰに選
択的に連結されて、生理的条件下で、少なくとも３の、あるいは少なくとも４の、あるい
は少なくとも５の、あるいは少なくとも６の、あるいは少なくとも８の、あるいは少なく
とも１０の、あるいは少なくとも１５の見かけの分子量係数を、または少なくとも２０以
上の見かけの分子量係数を有するＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質を生じることができる。別
の実施形態において、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質は、生理的条件下で、融合タンパク質
の実際の分子量に対して、約４～約２０である、または約６～約１５である、または約８
～約１２である、または約９～約１０である見かけの分子量係数を有する。
ＩＩＩ）ＢＸＴＥＮ融合タンパク質組成物の生物活性タンパク質
本発明は一部は、生物活性タンパク質およびＸＴＥＮを含む融合タンパク質組成物なら
びに被験体の疾患、障害または状態の処置のためのその使用に関するものである。
一態様において、本発明は、１個以上の延長組換えポリペプチド（「ＸＴＥＮ」）を含
む融合タンパク質に共有結合的に連結して、ＸＴＥＮ融合タンパク質組成物（以下「ＢＰ
ＸＴＥＮ」）を生じる、少なくとも第１の生物活性タンパク質（以下「ＢＰ」）を提供す
る。以下でさらに十分に記載するように、融合タンパク質は、プロテアーゼによって作用
を受けたときに融合タンパク質からＢＰを放出する切断配列をさらに含むことができる、
スペーサ配列を場合により包含することができる。
「ＢＰＸＴＥＮ」という用語は、本明細書で使用する場合、１つ以上の生物活性または
治療活性を媒介する生物活性タンパク質をそれぞれ含む１つ以上のペイロード領域および
少なくとも１つのＸＴＥＮポリペプチドを含む少なくとも１つの他の領域を含む、融合ポ
リペプチドを含むことを意味する。
主題の組成物のＢＰ、特に表３から８に開示したものは、その対応する核酸およびアミ
ノ酸配列と共に当分野で周知であり、説明および配列は、公共データベース、たとえばＣ
ｈｅｍｉｃａｌ Ａｂｓｔｒａｃｔｓ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ Ｄａｔａｂａｓｅｓ（たとえ
ばｔｈｅ ＣＡＳ Ｒｅｇｉｓｔｒｙ）、ＧｅｎＢａｎｋ、Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ（ＵｎｉＰｒｏｔ）およびサブスクリプション提供
データベース、たとえばＧｅｎＳｅｑ（たとえばＤｅｒｗｅｎｔ）で入手できる。ポリヌ
クレオチド配列は、所与のＢＰをコードする野生型ポリヌクレオチド配列（たとえば全長
または成熟のどちらか）であり得るか、またはいくつかの例において、配列は野生型ポリ
ヌクレオチド配列の変異体（たとえば野生型生物活性タンパク質をコードするポリヌクレ
オチドであり、前記ポリヌクレオチドのＤＮＡ配列は、たとえば特定の種での発現のため
に最適化されている；または野生型タンパク質の変異体、たとえば部位特異的変異体（ｍ
ｕｔａｎｔ）または対立遺伝子変異体（ｖａｒｉａｎｔ）をコードするポリヌクレオチド
であり得る。当分野で公知の方法を使用することによって、ならびに／または本明細書で
提供され、実施例でさらに詳細に記載されたガイダンスおよび方法と併せて、ＢＰの野生
型もしくはコンセンサスｃＤＮＡ配列またはコドン最適化変異体を使用して本発明で意図
されるＢＰＸＴＥＮ構築物を生成することは、十分に当業者の能力の範囲内である。
本発明のＢＰＸＴＥＮへの包含のためのＢＰは、生物的、治療的、予防的、もしくは診
断的重要性もしくは機能がある、または被験体に投与したときに、生物活性を媒介するも
しくは疾患、障害もしくは状態を防止もしくは改善するのに有用である、任意のタンパク
質を包含することができる。特に興味深いのは、薬物動態パラメータの増加、溶解度の増
加、安定性の増加、またはいくつかのその他の薬学的特性の増強が求められているＢＰ、
または最終半減期の増加によって有効性、安全性が改善され、もしくは投薬頻度の低下が
生じ、および／もしくは患者コンプライアンスが改善されるＢＰである。それゆえＢＰＸ
ＴＥＮ融合タンパク質組成物は、たとえば被験体への投与のときに、ＸＴＥＮに連結され
ていないＢＰと比較して、インビボ曝露またはＢＰＸＴＥＮが治療ウインドウ内に残存す
る長さを増大させることによって、生物活性化合物の治療有効性を改善させることを包含
する、各種の目的を念頭に置いて調製される。
本発明のＢＰは、天然全長タンパク質であることができるか、または天然タンパク質の
生物活性の少なくとも一部を保持する生物活性タンパク質のフラグメントもしくは配列変
異体であることができる。
一実施形態において、主題の組成物に組み入れられたＢＰは、自然界で見出されるタン
パク質に対応する配列を有する組換えポリペプチドであることができる。別の実施形態に
おいて、ＢＰは、天然ＢＰの生物活性の少なくとも一部を保持する天然配列の配列変異体
、フラグメント、ホモログ、およびミメティックであることができる。非限定的な例にお
いて、ＢＰは、表３～８から選択されるタンパク質配列に対して、少なくとも約８０％の
配列同一性を、またはあるいは８１％の、８２％の、８３％の、８４％の、８５％の、８
６％の、８７％の、８８％の、８９％の、９０％の、９１％の、９２％の、９３％の、９
４％の、９５％の、９６％の、９７％の、９８％の、９９％、もしくは１００％の配列同
一性を示す配列であることができる。一実施形態において、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質
は、ＸＴＥＮに連結された単一のＢＰ分子を含むことができる（以下でさらに十分に記載
するように）。別の実施形態において、ＢＰＸＴＥＮは、第１のＢＰおよび同じＢＰの第
２の分子を含み、１つ以上のＸＴＥＮに連結された２つのＢＰ（たとえばグルカゴン２分
子、またはｈＧＨ２分子）を含む融合タンパク質を生じることができる。
一般に、ＢＰは、インビボで使用されるときまたはインビトロアッセイで利用されると
きに、所与の標的に対する結合特異性または別の所望の生物学的特徴を示す。たとえばＢ
Ｐは、アゴニスト、受容体、リガンド、アンタゴニスト、酵素、またはホルモンであるこ
とができる。特に興味深いのは、比較的短い最終半減期を有し、薬物動態パラメータの増
加（必要に応じて、スペーサ配列の切断により融合タンパク質から放出させることができ
る）がより低い頻度の投薬または薬理学的効果の増強を可能にする、疾患もしくは障害に
使用されるまたは疾患もしくは障害に有用であることが公知のＢＰである。また興味深い
のは、最小有効用量または最小血中濃度（Ｃｍｉｎ）と最大許容投与量または最大血中濃
度（Ｃｍａｘ）との間の狭い治療ウインドウを有するＢＰである。このような場合、選択
ＸＴＥＮ配列（複数可）を含む融合タンパク質へのＢＰの連結によってこれらの特性の改
善を生じさせて、ＸＴＥＮに連結されていないＢＰと比較して、これらのＢＰを治療剤ま
たは防止剤としてより有用にすることができる。
本発明の組成物に含まれるＢＰは、これに限定されるわけではないが、グルコース障害
およびインスリン障害、代謝性障害、心血管疾患、凝固／出血障害、成長障害または状態
、腫瘍形成症状、炎症症状、自己免疫症状などを包含する各種の治療カテゴリまたは疾患
カテゴリの処置で有用性を有することができる。
（ａ）グルコース調節ペプチド
内分泌および肥満関連疾患または障害は、大半の先進国で流行規模に達して、大半の先
進国で相当な増加しつつある保健管理上の重荷となり、体の臓器、組織、および循環系に
影響を及ぼす多種多様の症状を包含する。特に関心があるのは、内分泌および肥満関連疾
患および障害であり、これらの中で最重要なのは、米国で主要な死亡原因の１つである糖
尿病である。糖尿病は、２つの主要なサブクラス－若年性糖尿病、すなわちインスリン依
存型糖尿病（ＩＤＤＭ）としても公知のＩ型、および成人発症糖尿病、すなわちインスリ
ン非依存型糖尿病（ＮＩＤＤＭ）としても公知の、ＩＩ型に分けられる。Ｉ型糖尿病は、
このような被験体における膵臓のインスリン産生細胞を完全にまたは一部破壊する自己免
疫疾患の形態であり、その生涯の間、外因性インスリンの使用が必要である。十分に管理
された被験体においても、偶発性合併症が出現する可能性があり、そのいくつかは生命を
脅かすものである。
ＩＩ型糖尿病患者では、食後の血中グルコースレベルの上昇が、膵臓によるインスリン
産生を適正に刺激しない。その上、末梢組織は概して、インスリンの効果に対して抵抗性
であり、このような被験体は、体がそのインスリン抵抗性の克服を試みるため、正常より
も高い血漿インスリン値を有する（高インスリン血症）。病状が進行すると、インスリン
分泌も損なわれる。
インスリン抵抗性および高インスリン血症は、かなりの健康上のリスクをもたらす他の
２種類の代謝性障害：グルコース寛容減損および代謝性肥満にも関連している。グルコー
ス寛容減損は、摂食前の正常なグルコースレベルが、食事後にレベルが上昇する（高血糖
）傾向を有する特徴がある。このような個体は、糖尿病および冠動脈疾患のより高いリス
クにあると見なされる。肥満も、高血圧、冠動脈疾患（動脈硬化症）、および乳酸アシド
ーシス、ならびに関連疾患状態と同様に、インスリン抵抗症候群、すなわち「シンドロー
ムＸ」と呼ばれる状態の群にとってのリスク因子である。肥満の病因は多因子性であると
考えられるが、根底にある問題は、過剰な脂肪組織が存在するまで、肥満（ｔｈｅ ｏｂ
ｅｓｅ）において栄養素利用性およびエネルギー消費が均衡していないことである。他の
関連する疾患または障害は、これに限定されるわけではないが、妊娠性糖尿病、若年性糖
尿病、肥満、食欲亢進、不十分な飽満感、代謝性障害、グルカゴノーマ、網膜神経変性プ
ロセス、およびＩ型糖尿病の「ハネムーン期間」を包含する。
脂質異常症は、糖尿病患者の間で頻繁に出現し；通例、血漿トリグリセリドの上昇、低
いＨＤＬ（高密度リポタンパク質）コレステロール、正常～高レベルのＬＤＬ（低密度リ
ポタンパク質）コレステロールおよび小型高密度ＬＤＬ粒子の血中レベル増加を特徴とす
る。脂質異常症は、糖尿病被験体の間での冠動脈イベントおよび死亡の生成率増加の主要
な寄与因子である。
グルコース恒常性およびインスリン応答における大半の代謝プロセスは、複数のペプチ
ドおよびホルモンによって調節され、このような多くのペプチドおよびホルモン、ならび
にその類似体は、代謝性疾患および障害の処置に有用性を見出している。これらのペプチ
ドの多くは、それらが反対の生物機能を所有するときでさえ、相互に相同性が高い傾向に
ある。グルコース上昇ペプチドはペプチドホルモンのグルカゴンによって例示されるが、
グルコース低下ペプチドは、エキセンジン－４、グルカゴン様ペプチド１、およびアミリ
ンを包含する。しかし、治療用ペプチドおよび／またはホルモンの使用は、小型分子薬の
使用によって増強されるときでも、このような疾患および障害の管理の成功は限定されて
いた。特に用量最適化は、代謝性疾患の処置に使用される薬物および生物製剤、とりわけ
狭い治療ウインドウを有するものにとっては重要である。一般に、グルコース恒常性に関
与するホルモン、およびペプチドは、狭い治療ウインドウを有することが多い。狭い治療
ウインドウは、このようなホルモンおよびペプチドが通例、臨床利益を達成するために頻
繁な投薬が必要となる短い半減期を有するという事実と組み合されて、このような患者の
管理に困難を生じる。治療タンパク質に対する化学改変、たとえばペグ化は、そのインビ
ボクリアランス速度および続いての血清半減期を改変することができるが、それは追加の
製造ステップを必要とし、不均質の最終生成物を生じる。さらに、慢性投与からの許容さ
れない副作用が報告されている。あるいは、Ｆｃドメインを治療タンパク質またはペプチ
ドへの融合による遺伝子改変によって、治療タンパク質のサイズが増加して、腎臓経由の
クリアランス速度が低下し、ＦｃＲｎ受容体によるリソソームからの再利用が促進される
。運の悪いことに、Ｆｃドメインは組換え発現の間に効率的に折畳まれず、封入体として
公知の不溶性沈殿物を形成する傾向がある。これらの封入体を可溶化する必要があり、機
能性タンパク質を再生する必要があり；時間がかかり、非効率的であり、費用のかかるプ
ロセスである。
それゆえ本発明の一態様は、グルコース恒常性、インスリン抵抗性および肥満に関与す
るペプチド（集合的に、「グルコース調節ペプチド」）のＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質へ
の組み入れることによる、グルコース障害、疾患および関連状態、インスリン障害、疾患
および関連状態、および肥満障害、疾患および関連状態の処置に有用性を有する組成物を
生成することである。グルコース調節ペプチドは、グルコース恒常性またはインスリン抵
抗性または肥満を有する疾患、障害または状態を防止、処置、媒介（ｍｅｄｉａｔｉｎｇ
）、または改善するのに有用である、生物的、治療的、または予防的重要性または機能の
ある任意のタンパク質を包含することができる。ＸＴＥＮに連結されてＢＰＸＴＥＮを生
成することができる好適なグルコース調節ペプチドは、膵臓ベータ細胞によるインスリン
のグルコース依存性分泌を増加させる、またはインスリンの作用を強化するすべての生物
活性ポリペプチドを包含する。グルコース調節ペプチドは、膵臓ベータ細胞のプロインス
リン遺伝子転写を刺激するすべての生物活性ポリペプチドも包含することができる。さら
に、グルコース調節ペプチドは、胃排出時間を低速化させ、食物取り込みを低下させるす
べての生物活性ポリペプチドも包含することができる。グルコース調節ペプチドは、ラン
ゲルハンス島のアルファ細胞からのグルカゴン放出を抑制するすべての生物活性ポリペプ
チドを包含することができる。表３は、本発明のＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質に含まれる
グルコース調節ペプチドの配列の非限定的なリストを提供する。本発明のＢＰＸＴＥＮ組
成物のグルコース調節ペプチドは、表３から選択されるタンパク質配列に対して、少なく
とも約８０％の配列同一性を、またはあるいは８１％の、８２％の、８３％の、８４％の
、８５％の、８６％の、８７％の、８８％の、８９％の、９０％の、９１％の、９２％の
、９３％の、９４％の、９５％の、９６％の、９７％の、９８％の、９９％、もしくは１
００％の配列同一性を示すペプチドであることができる。
Figure 0007461438000007
Figure 0007461438000008

「アドレノメデュリン」または「ＡＤＭ」は、ヒトアドレノメデュリンペプチドホルモ
ンならびに成熟ＡＤＭの生物活性の少なくとも一部を有するその種および配列変異体を意
味する。ＡＤＭは、１８５アミノ酸プレプロホルモンから連続酵素切断およびアミド化に
よって生成し、２２分の測定血漿半減期を有する５２アミノ酸の生物活性ペプチドを生じ
る。本発明のＡＤＭ含有融合タンパク質は、膵島細胞からのインスリン分泌に対する刺激
効果ゆえにグルコース調節の必要な糖尿病において、または持続性低血圧の被験体におい
て、特定の用途を見出し得る。ヒトＡＭの完全なゲノムインフラストラクチャが報告され
ており（Ｉｓｈｉｍｉｔｓｕら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕ
ｎ ２０３：６３１－６３９（１９９４））、およびＡＤＭペプチドの類似体は、Ｕ．Ｓ
．Ｐａｔ．Ｎｏ．６，３２０，０２２に記載されるようにクローニングされている。
「アミリン」は、アミリン、プラムリンチドと呼ばれるヒトペプチドホルモン、およびＵ
．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，２３４，９０６に記載されているように、成熟アミリンの生物
活性の少なくとも一部を有する、その種の変形を意味する。
アミリンは、栄養素取り込みに応答して、膵臓ベータ細胞によってインスリンと同時分
泌される、３７アミノ酸ポリペプチドホルモンであり（Ｋｏｄａら、Ｌａｎｃｅｔ ３３
９：１１７９－１１８０．１９９２）、グルコースのグリコーゲンへの組み入れを包含す
る、炭水化物代謝の数種の重要経路を調整することが報告されている。本発明のアミリン
含有融合タンパク質は、胃排出を調節して、グルカゴン分泌および食物取り込みを抑止し
、それにより循環中でのグルコース出現の速度に影響を及ぼすので、糖尿病および肥満に
特定の用途を見出し得る。それゆえ融合タンパク質は、循環からのグルコース消滅速度お
よび末梢組織によるその取り込みを調節するインスリンの作用を補完し得る。アミリン類
似体は、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏｓ．５，６８６，４１１および７，２７１，２３８に記載
されるようにクローニングされている。生物活性を保持するアミリンミメティックを生成
することができる。たとえばプラムリンチドは配列ＫＣＮＴＡＴＣＡＴＮＲＬＡＮＦＬＶ
ＨＳＳＮＮＦＧＰＩＬＰＰＴＮＶＧＳＮＴＹ（配列番号４３）を有し、ここでラットアミ
リン配列からのアミノ酸は、ヒトアミリン配列のアミノ酸に代えて置換されている。一実
施形態において、本発明は、配列ＫＣＮＴＡＴＣＡＴＸ１ＲＬＡＮＦＬＶＨＳＳＮＮＦＧ
Ｘ２ＩＬＸ２Ｘ２ＴＮＶＧＳＮＴＹ（配列番号４４）（ここでＸ１は独立して、Ｎまたは
Ｑであり、Ｘ２は独立して、Ｓ、ＰまたはＧである）のアミリンミメティックを含む融合
タンパク質を意図する。一実施形態において、ＢＰＸＴＥＮに組み入れられたアミリンミ
メティックは、配列ＫＣＮＴＡＴＣＡＴＮＲＬＡＮＦＬＶＨＳＳＮＮＦＧＧＩＬＧＧＴＮ
ＶＧＳＮＴＹ（配列番号４５）を有することができる。アミリンミメティックがＢＰＸＴ
ＥＮのＣ末端で使用される別の実施形態において、該ミメティックは、配列ＫＣＮＴＡＴ
ＣＡＴＮＲＬＡＮＦＬＶＨＳＳＮＮＦＧＧＩＬＧＧＴＮＶＧＳＮＴＹ（ＮＨ２）（配列番
号４６）を有することができる。
「カルシトニン」（ＣＴ）は、ヒトカルシトニンタンパク質ならびに成熟ＣＴの生物活
性の少なくとも一部を有する、サケカルシトニン（「ｓＣＴ」）を包含する、その種およ
び配列変異体を意味する。ＣＴは、神経系および脈管系で機能するようにみえる甲状腺の
より大型のプロホルモンから切断された３２アミノ酸ペプチドであるが、飽満反射の強力
なホルモンメディエータであることも報告されている。ＣＴは、誘発された高カルシウム
血症に応答したその分泌およびその迅速なカルシウム低下効果にちなんで命名されている
。ＣＴは、Ｃ細胞と呼ばれる甲状腺の神経内分泌細胞で産生および分泌される。ＣＴは破
骨細胞に対する効果を有し、ＣＴによる破骨細胞機能の抑制によって骨吸収の減少が生じ
る。ＣＴのインビトロ効果は、波状縁（ｒｕｆｆｌｅｄ ｂｏｒｄｅｒ）の迅速な損失お
よびリソソーム酵素の放出減少を包含する。ＣＴ（１－３２）の主な機能は、非常事態で
の急性高カルシウム血症に対抗すること、ならびに／または「カルシウムストレス」たと
えば成長、妊娠、および授乳の間に骨格を保護することである。（Ｂｅｃｋｅｒ，ＪＣＥ
Ｍ，８９（４）：１５１２－１５２５（２００４）およびＳｅｘｔｏｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ６：１０６７－１０９３（１９９９）に総
説されている）。本発明のカルシトニン含有融合タンパク質は、骨粗鬆症の処置に、およ
び骨のパジェット病の療法として特定の用途を見出し得る。合成カルシトニンペプチドは
、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏｓ．５，１７５，１４６および５，３６４，８４０に記載される
ように生成されている。
「カルシトニン遺伝子関連ペプチド」または「ＣＧＲＰ」は、ヒトＣＧＲＰペプチドな
らびに成熟ＣＧＲＰの生物活性の少なくとも一部を有するその種および配列変異体を意味
する。カルシトニン遺伝子関連ペプチドは、ペプチドのカルシトニンファミリのメンバで
あり、ヒトでは２つの形態、α－ＣＧＲＰ（３７アミノ酸ペプチド）およびβ－ＣＧＲＰ
で存在する。ＣＧＲＰは、ヒトアミリンと４３～４６％の配列同一性を有する。本発明の
ＣＧＲＰ含有融合タンパク質は、糖尿病に関連付けられた罹患率の低下、高血糖およびイ
ンスリン欠損の改善、膵島へのリンパ球浸潤の抑制、ならびに自己免疫破壊に対するベー
タ細胞の保護に特定の用途を見出し得る。合成ＣＧＲＰおよび組換えＣＧＲＰを作る方法
は、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，３７４，６１８に記載されている。
「コレシストキニン」または「ＣＣＫ」は、ヒトＣＣＫペプチドならびに成熟ＣＣＫの
生物活性の少なくとも一部を有するその種および配列変異体を意味する。ＣＣＫ－５８は
成熟配列であるが、ヒトで最初に同定されたＣＣＫ－３３アミノ酸配列は、ペプチドの主
な循環形態である。ＣＣＫファミリは、８－アミノ酸インビボＣ末端フラグメント（「Ｃ
ＣＫ－８」）、Ｃ末端ペプチドＣＣＫ（２９－３３）であるペンタガストリンまたはＣＣ
Ｋ－５、およびＣ末端テトラペプチドＣＣＫ（３０－３３）であるＣＣＫ－４も包含する
。ＣＣＫは、脂肪およびタンパク質の消化の刺激を担当する、胃腸管系のペプチドホルモ
ンである。本発明のＣＣＫ－３３およびＣＣＫ－８含有融合タンパク質は、食事摂取の循
環グルコースの増加の低下および循環インスリン増加の増強に特定の用途を見出し得る。
ＣＣＫ－８の類似体は、Ｕ．Ｓ．Ｎｏ．５，６３１，２３０に記載されるように調製され
ている。
「エキセンジン－３」は、メキシコドクトカゲ（Ｈｅｌｏｄｅｒｍａ ｈｏｒｒｉｄｕ
ｍ）から単離されたグルコース調節ペプチドおよび成熟エキセンジン－３の生物活性の少
なくとも一部を有するその配列変異体を意味する。エキセンジン－３アミドは、膵臓ｃＡ
ＭＰの増加、ならびにインスリンおよびアミラーゼの放出を媒介する特異的エキセンジン
受容体アンタゴニストである。本発明のエキセンジン－３含有融合タンパク質は、糖尿病
およびインスリン抵抗性障害の処置に特定の用途を見出し得る。配列およびそのアッセイ
方法は、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐａｔｅｎｔ５，４２４２，８６に記載されてい
る。
「エキセンジン－４」は、アメリカドクトカゲ（Ｇｉｌａ－ｍｏｎｓｔｅｒ Ｈｅｌｏ
ｄｅｒｍａ ｓｕｓｐｅｃｔｕｍ）の唾液に見出されたグルコース調節ペプチド、ならび
にその種および配列変異体を意味して、天然３９アミノ酸配列Ｈｉｓ－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－
Ｇｌｙ－Ｔｈｒ－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｇｌｎ－
Ｍｅｔ－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ｖａｌ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ－Ｐｈｅ－Ｉｌｅ－
Ｇｌｕ－Ｔｒｐ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ－Ａｓｎ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－
Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ（配列番号４７）ならびにその相同配
列およびペプチドミメティック、および変異体；成熟エキセンジン－４の生物活性の少な
くとも一部を有する、たとえば霊長類からの天然配列、および非天然配列を包含する。エ
キセンジン－４は、血中グルコースを減少させ、インスリン分泌を促進して、胃排出を減
速させ、飽満感を改善して、食後高血糖の顕著な改善を提供するインクレチンポリペプチ
ドホルモンである。エキセンジンは、グルカゴン様ペプチドファミリのメンバに一部配列
類似性を有し、最大の同一性はＧＬＰ－１に対してである（Ｇｏｋｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．，２６８：１９６５０－５５（１９９３））。多種多様の相同配列は、天然エ
キセンジン－４およびＧＬＰ－１と機能的に同等であることが可能である。異なる種から
のＧＬＰ－１配列の保存は、Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ２００１ ９８
ｐ．１－１２に表示されている。表４は多岐にわたる種からの配列を示すが、表５は、
合成ＧＬＰ－１類似体のリストを示す；そのすべては、本明細書に記載するＢＰＸＴＥＮ
での使用を意図する。エキセンジン－４は、ＧＬＰ－１受容体にてインスリン分泌βＴＣ
１細胞に結合して、また摘出胃でソマトスタチン放出を刺激して、ガストリン放出を抑制
する（Ｇｏｋｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１９６５０－５５，１９９３）。
エキセンジン－４は、ＧＬＰ－１のミメティックとして同様の広い範囲の生物活性を呈す
るが、平均最終半減期が２．４時間という、ＧＬＰ－１よりも長い半減期をなお有する。
エクセナチドは、Ｂｙｅｔｔａによって販売されているエキセンジン－４の合成版である
。しかしその短い半減期のために、エクセナチドは現在、１日２回投与され、その有用性
が制限されている。本発明のエキセンジン－４含有融合タンパク質は、糖尿病およびイン
スリン抵抗性障害の処置に特定の用途を見出し得る。
「線維芽細胞増殖因子２１」、または「ＦＧＦ－２１」は、ＦＧＦ２１遺伝子によって
コードされたヒトタンパク質、または成熟ＦＧＦ２１の生物活性の少なくとも一部を有す
るその種および配列変異体を意味する。ＦＧＦ－２１は、他の細胞型ではなくて、脂肪細
胞へのグルコース取り込みを刺激する；効果は、インスリンの活性に相加的である。ｏｂ
／ｏｂマウスへのＦＧＦ－２１注射によって、脂肪組織でのＧｌｕｔ１の増加が生じる。
ＦＧＦ２１はまた、トランスジェニックマウスで過剰発現されるときに動物を食餌誘発性
肥満から保護して、糖尿病げっ歯動物に投与されたときに血中グルコースおよびトリグリ
セリドレベルを低下させる（Ｋｈａｒｉｔｏｎｅｎｋｏｖ Ａら、（２００５）“ＦＧＦ
－２１ ａｓ ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ”．Ｊ．Ｃｌ
ｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１５：１６２７－３５）。本発明のＦＧＦ－２１含有融合タンパ
ク質は、エネルギー消費、脂肪利用および脂質排泄の増加を引き起こすことを包含する、
糖尿病の処置に特定の用途を見出し得る。ＦＧＦ－２１は、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．６，
７１６，６２６に開示されるようにクローニングされている。
「ＦＧＦ－１９」、または「線維芽細胞増殖因子１９」は、ＦＧＦ１９遺伝子によって
コードされたヒトタンパク質、または成熟ＦＧＦ－１９の生物活性の少なくとも一部を有
するその種および配列変異体を意味する。ＦＧＦ－１９は、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ
）ファミリのタンパク質メンバである。ＦＧＦファミリメンバは、広範な分裂誘発性の活
性および細胞生存活性を所有し、多種多様の生物プロセスに関与する。ＦＧＦ－１９は、
肥満マウスモデルにおいて、レプチン受容体の肝臓での発現、代謝速度を増加させ、脂肪
細胞へのグルコース取り込みを刺激して、減量をもたらす（Ｆｕ，Ｌら 本発明のＦＧＦ
－１９含有融合タンパク質は、代謝速度の上昇および食餌性およびレプチン欠損糖尿病の
逆転での特定の用途を見出し得る。ＦＧＦ－１９は、ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃ
ａｔｉｏｎ Ｎｏ．２００２００４２３６７に記載されるように、クローニングおよび発
現されている。
「ガストリン」は、切断版のヒトガストリンペプチド、ならびに成熟ガストリンの生物
活性の少なくとも一部を有するその種および配列変異体を意味する。ガストリンは、十二
指腸のＧ細胞によって産生されるまたは胃の幽門洞における直鎖ペプチドホルモンであり
、血流中に分泌される。ガストリンは主として３つの形態：ガストリン－３４（「ビッグ
ガストリン」）；ガストリン－１７（「リトルガストリン」）；およびガストリン－１４
（「ミニガストリン」）で見出される。ガストリンはＣＣＫと相同性の配列を共有する。
本発明のガストリン含有融合タンパク質は、グルコース調節の必要な肥満および糖尿病の
処置に特定の用途を見出し得る。ガストリンは、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，８４３，４
４６に記載されるように合成されている。
「グレリン」は、飽満を誘発するヒトホルモン、または天然の、処理された２７もしく
は２８アミノ酸配列および相同配列を包含する、その種および配列変異体を意味する。グ
レリンは主に、ヒト胃基底部の内側を覆うＰ／Ｄ１細胞および飢餓を刺激する膵臓のイプ
シロン細胞によって産生され、レプチンに対応するホルモンと見なされる。グレリンレベ
ルは、食前に増加して、食後に減少し、視床下部におけるレベルで働く作用によって食物
取り込みの増加および脂肪質量の増加を引き起こすことができる。グレリンは、成長ホル
モンの放出も刺激する。グレリンは、セリン残基にて、ｎ－オクタン酸によってアシル化
される；このアシル化は、ＧＨＳ１ａ受容体への結合およびグレリンのＧＨ放出能力にと
って不可欠である。本発明のグレリン含有融合タンパク質はアゴニストとして、たとえば
胃腸管運動障害においてＧＩ管の運動性を選択的に刺激すること、胃排出を加速すること
、または成長ホルモンの放出を刺激することに特定の用途を見出し得る。たとえばＵ．Ｓ
．Ｐａｔ．Ｎｏ．７，３８５，０２６に記載されるような配列置換のあるグレリン類似体
または切断変異体は、グルコース恒常性の改善、インスリン抵抗性の処置および肥満の処
置のためのアンタゴニストとして使用するための、ＸＴＥＮの融合パートナーとして、特
定の用途を見出し得る。グレリンの単離およびキャラクタリゼーションが報告されており
（Ｋｏｊｉｍａ Ｍ，ら、Ｇｈｒｅｌｉｎ ｉｓ ａ ｇｒｏｗｔｈ－ｈｏｒｍｏｎｅ－
ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ａｃｙｌａｔｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ｆｒｏｍ ｓｔｏｍａｃｈ．
Ｎａｔｕｒｅ．１９９９；４０２（６７６２）：６５６－６６０．）および、Ｕ．Ｓ．Ｐ
ａｔ．Ｎｏ．６，９６７，２３７に記載されるように、合成類似体がペプチド合成によっ
て調製されている。
「グルカゴン」は、ヒトグルカゴングルコース調節ペプチド、または天然２９アミノ酸
配列および相同配列を包含する、その種および配列変異体；成熟グルカゴンの生物活性の
少なくとも一部を有する、たとえば霊長類からの天然配列変異体、および非天然配列変異
体を意味する。「グルカゴン」という用語は、本明細書で使用する場合、グルカゴンのペ
プチドミメティックも包含する。天然グルカゴンは、膵臓によって産生され、血中グルコ
ースレベルがあまりに低下したときに放出されて、肝臓に貯蔵されたグリコーゲンをグル
コースに変換して血流中に放出させるようにする。グルカゴンの作用は、体の細胞に血中
からグルコースを取り込むようにシグナルを出すインスリンの作用と反対であるが、グル
カゴンもインスリンを放出を刺激するので、血流中の新たに利用できるグルコースは、イ
ンスリン依存性組織によって取り込まれ、使用され得る。本発明のグルカゴン含有融合タ
ンパク質は、現存する肝臓グリコーゲン貯蔵を有する個体の血中グルコースレベルを上昇
させることおよび糖尿病でのグルコース恒常性を維持することに特定の用途を見出し得る
。グルカゴンは、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，８２６，７６３に記載されるようにクロー
ニングされている。
「ＧＬＰ－１」は、ヒトグルカゴン様ペプチド－１および成熟ＧＬＰ－１の生物活性の
少なくとも一部を有するその配列変異体を意味する。「ＧＬＰ－１」という用語は、ヒト
ＧＬＰ－１（１－３７）、ＧＬＰ－１（７－３７）、およびＧＬＰ－１（７－３６）アミ
ドを包含する。ＧＬＰ－１はインスリン分泌を刺激するが、高血糖の期間中のみである。
インスリンに比較したＧＬＰ－１の安全性は、この特性によって、およびインスリンの分
泌量が高血糖の規模に比例して分泌されるという観察結果によって増強される。ＧＬＰ－
１（７－３７）ＯＨの生物学的半減期は、わずか３～５分である（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ
．５，１１８，６６６）。本発明のＧＬＰ－１含有融合タンパク質は、グルコース調節の
必要な糖尿病およびインスリン抵抗性障害の処置に特定の用途を見出し得る。ＧＬＰ－１
は、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，１１８，６６６に記載されるようにクローニングされ、
誘導体が調製されている。広範な種からのＧＬＰ－１配列の非限定的な例が表４に示され
ているが、表５は、いくつかの合成ＧＬＰ－１類似体の配列を示す；そのすべては、本明
細書に記載するＢＰＸＴＥＮ組成物での使用を意図する。
Figure 0007461438000009
Figure 0007461438000010

ＧＬＰ天然配列は、以下に表示されている数種の配列モチーフによって記載され得る。
カッコ内の文字は、各配列位置での許容され得るアミノ酸を表す：［ＨＶＹ］［ＡＧＩＳ
ＴＶ］［ＤＥＨＱ］［ＡＧ］［ＩＬＭＰＳＴＶ］［ＦＬＹ］［ＤＩＮＳＴ］［ＡＤＥＫＮ
ＳＴ］［ＡＤＥＮＳＴＶ］［ＬＭＶＹ］［ＡＮＲＳＴＹ］［ＥＨＩＫＮＱＲＳＴ］［ＡＨ
ＩＬＭＱＶＹ］［ＬＭＲＴ］［ＡＤＥＧＫＱＳ］［ＡＤＥＧＫＮＱＳＹ］［ＡＥＩＫＬＭ
ＱＲ］［ＡＫＱＲＳＶＹ］［ＡＩＬＭＱＳＴＶ］［ＧＫＱＲ］［ＤＥＫＬＱＲ］［ＦＨＬ
ＶＷＹ］［ＩＬＶ］［ＡＤＥＧＨＩＫＮＱＲＳＴ］［ＡＤＥＧＮＲＳＴＷ］［ＧＩＬＶＷ
］［ＡＩＫＬＭＱＳＶ］［ＡＤＧＩＫＮＱＲＳＴ］［ＧＫＲＳＹ］。さらに、ＧＬＰ－１
の合成類似体は、グルコース関連障害の処置で有用な生物活性を有するＢＰＸＴＥＮを生
成するための、ＸＴＥＮに対する融合パートナーとして有用であることができる。エキセ
ンジン－４またはＧＬＰ－１に相同性のさらなる配列は、標準相同性検索技法によって見
出され得る。
Figure 0007461438000011
Figure 0007461438000012
Figure 0007461438000013
Figure 0007461438000014

「ＧＬＰ－２」は、ヒトグルカゴン様ペプチド－２および成熟ＧＬＰ－２の生物活性の
少なくとも一部を有するその配列変異体を意味する。”さらに詳細には、ＧＬＰ－２は、
小腸および大腸の腸内分泌細胞からＧＬＰ－１と共に同時分泌される、３３アミノ酸ペプ
チドである。
「ＩＧＦ－１」または「インスリン様成長因子１」は、ヒトＩＧＦ－Ｉタンパク質なら
びに成熟ＩＧＦ－１の生物活性の少なくとも一部を有するその種および配列変異体を意味
する。かつてソマトメジンＣと呼ばれたＩＧＦ－１は、インスリンに分子構造が類似して
おり、成長ホルモンの作用を調整するポリペプチドタンパク質同化ホルモンである。ＩＧ
Ｆ－１は、７０アミノ酸で構成され、内分泌ホルモンとして主に肝臓によってならびに標
的組織において、パラクリン／オートクリン方式で産生される。本発明のＩＧＦ－１含有
融合タンパク質は、グルコース調節の必要な糖尿病およびインスリン抵抗性障害の処置に
特定の用途を見出し得る。ＩＧＦ－１は、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐａｔｅｎｔ
Ｎｏ．５，３２４，６３９に記載されるように、大腸菌および酵母でクローニングされ、
発現されている。
「ＩＧＦ－２」または「インスリン様成長因子２」は、ヒトＩＧＦ－２タンパク質なら
びに成熟ＩＧＦ－２の生物活性の少なくとも一部を有するその種および配列変異体を意味
する。ＩＧＦ－２は、インスリンに分子構造が類似しており、妊娠中に成長促進ホルモン
としての主な役割を備えたポリペプチドタンパク質ホルモンである。ＩＧＦ－２は、Ｂｅ
ｌｌ ＧＩら、Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉ
ｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｇｅｎｅｓ：ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｇｒｏｗ
ｔｈ ｆａｃｔｏｒ ＩＩ ａｎｄ ｉｎｓｕｌｉｎ ｇｅｎｅｓ ａｒｅ ｃｏｎｔｉ
ｇｕｏｕｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．１９８５．８２（１
９）：６４５０－４に記載されるようにクローニングされている。
「ＩＮＧＡＰ」、または「膵島新生随伴タンパク質」、または「膵臓ベータ細胞成長因
子」は、ヒトＩＮＧＡＰペプチドならびに成熟ＩＮＧＡＰの生物活性の少なくとも一部を
有するその種および配列変異体を意味する。ＩＮＧＡＰは、膵島新生の必要条件である、
導管細胞増殖の開始が可能である。本発明のＩＮＧＡＰ含有融合タンパク質は、糖尿病お
よびインスリン抵抗性障害の処置または防止に特定の用途を見出し得る。ＩＮＧＡＰは、
Ｒ Ｒａｆａｅｌｏｆｆ Ｒら、Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ
ｔｈｅ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｉｓｌｅｔ ｎｅｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｓｓｏｃｉａ
ｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＩＮＧＡＰ）ｇｅｎｅ ａｎｄ ｉｔｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏ
ｎ ｉｎ ｉｓｌｅｔ ｎｅｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｈａｍｓｔｅｒｓ．Ｊ Ｃｌｉｎ
Ｉｎｖｅｓｔ．１９９７．９９（９）：２１００－２１０９に記載されるように、クロ
ーニングおよび発現されている。
「インターメジン」または「ＡＦＰ－６」は、ヒトインターメジンペプチドならびに成
熟インターメジンの生物活性の少なくとも一部を有するその種および配列変異体を意味す
る。インターメジンは、カルシトニン受容体様受容体のリガンドである。インターメジン
処置は、正常被験体および高血圧被験体の両方での血圧低下、ならびに胃排出活性の抑止
をもたらし、グルコース恒常性に関係している。本発明のインターメジン含有融合タンパ
ク質は、糖尿病、インスリン抵抗性障害、および肥満の処置に特定の用途を見出し得る。
インターメジンペプチドおよび変異体は、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．６，９６５，０１３に
記載されるように、クローニングされている。
「レプチン」は、任意の種からの天然に存在するレプチン、ならびに生物活性Ｄアイソ
フォーム、またはそのフラグメントおよび配列変異体を意味する。レプチンは、食欲およ
び代謝を包含する、エネルギー取り込みおよびエネルギー消費を調節するのに主要な役割
を果たす。本発明のレプチン含有融合タンパク質は、グルコース調節の必要な糖尿病、イ
ンスリン抵抗性障害、および肥満の処置に特定の用途を見出し得る。レプチンは、Ｉｎｔ
ｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐａｔｅｎｔ Ｐｕｂ．Ｎｏ．ＷＯ ９６／０５３０９に記載さ
れるように、ｏｂ遺伝子のポリペプチド生成物である。レプチンはＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ
．７，１１２，６５９に、ならびにレプチン類似体およびフラグメントはＵ．Ｓ．Ｐａｔ
．Ｎｏ．５，５２１，２８３、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，５３２，３３６、ＰＣＴ／Ｕ
Ｓ９６／２２３０８およびＰＣＴ／ＵＳ９６／０１４７１に記載されるように、クローニ
ングされている。
「ニューロメジン」は、ニューロメジンＵおよびＳペプチドを包含するペプチドのニュ
ーロメジンファミリ、ならびにその配列変異体を意味する。天然活性ヒトニューロメジン
Ｕペプチドホルモンは、ニューロメジン－Ｕ２５、特にそのアミド形態である。特に興味
深いのは、その処理された活性ペプチドホルモンならびにその類似体、誘導体およびフラ
グメントである。ニューロメジンＵファミリには、各種の切断変異体またはスプライス変
異体、たとえばＦＬＦＨＹＳＫＴＱＫＬＧＫＳＮＶＶＥＥＬＱＳＰＦＡＳＱＳＲＧＹＦＬ
ＦＲＰＲＮ（配列番号１８０）が包含される。例示的なニューロメジンＳファミリは、配
列ＩＬＱＲＧＳＧＴＡＡＶＤＦＴＫＫＤＨＴＡＴＷＧＲＰＦＦＬＦＲＰＲＮ（配列番号１
８１）を有するヒトニューロメジンＳ、特にそのアミド形態である。本発明のニューロメ
ジン融合タンパク質は、肥満、糖尿病の処置、食物取り込みの低減、本明細書に記載する
ような他の関連症状および障害の処置に特定の用途を見出し得る。特に興味深いのは、ア
ミリンファミリペプチド、エキセンジンペプチドファミリまたはＧＬＰＩペプチドファミ
リモジュールと組み合わされたニューロメジンモジュールである。
「オキシントモジュリン」、または「ＯＸＭ」は、ヒトオキシントモジュリンならびに
成熟ＯＸＭの生物活性の少なくとも一部を有するその種および配列変異体を意味する。Ｏ
ＸＭは、８アミノ酸カルボキシ末端延長が続くグルカゴンの２９アミノ酸配列を含有する
、結腸で産生される３７アミノ酸ペプチドである。ＯＸＭは食欲を抑えることが見出され
ている。本発明のＯＸＭ含有融合タンパク質は、グルコース調節の必要な糖尿病、インス
リン抵抗性障害、肥満の処置に特定の用途を見出し得て、減量処置薬として使用すること
ができる。
「ＰＹＹ」は、ヒトペプチドＹＹポリペプチドならびに成熟ＰＹＹの生物活性の少なく
とも一部を有するその種および配列変異体を意味する。ＰＹＹは、ＰＰ折畳み構造モチー
フを有する、ヒト全長３６アミノ酸ペプチドＰＹＹ１－３６およびＰＹＹ３－３６の両方
を包含する。ＰＹＹは、胃運動性を抑制して、結腸での水および電解質の吸収を増加させ
る。ＰＹＹは、膵臓分泌も抑え得る。本発明のＰＰＹ含有融合タンパク質は、グルコース
調節の必要な糖尿病、インスリン抵抗性障害、および肥満の処置に特定の用途を見出し得
る。ＰＹＹの類似体は、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏｓ．５，６０４，２０３、５，５７４，０
１０および７，１６６，５７５に記載されるように調製されている。
「ウロコルチン」は、ヒトウロコルチンペプチドホルモンおよび成熟ウロコルチンの生
物活性の少なくとも一部を有するその配列変異体を意味する。３種類のヒトウロコルチン
：Ｕｃｎ－１、Ｕｃｎ－２およびＵｃｎ－３がある。さらなるウロコルチンおよび類似体
は、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．６，２１４，７９７に記載されている。ウロコルチンＵｃｎ
－２およびＵｃｎ－３は、食物取り込み抑止特性、抗高血圧特性、心臓保護特性、および
変力特性を有する。Ｕｃｎ－２およびＵｃｎ－３は、ストレス刺激、たとえば規定食摂取
／絶食後の慢性ＨＰＡ活性化を抑止する能力を有し、ＣＲＦ２型受容体に特異的であり、
ＡＣＴＨ放出を媒介するＣＲＦ－Ｒ１を活性化しない。ウロコルチン、たとえばＵｃｎ－
２またはＵｃｎ－３を含むＢＰＸＴＥＮは、血管拡張に、およびそれゆえ心血管用途、た
とえば慢性心不全に有用であり得る。本発明のウロコルチン含有融合タンパク質は、ＡＣ
ＴＨ放出刺激、血管拡張効果による高血圧、ＡＣＴＨ上昇以外によって媒介された炎症、
高体温、食欲障害、うっ血性心不全、ストレス、不安、および乾癬に関連付けられた状態
の処置または防止にも特定の用途を見出し得る。ウロコルチン含有融合タンパク質はまた
、ナトリウム排泄増加ペプチドモジュール、アミリンファミリ、およびエキセンジンファ
ミリ、またはＧＬＰ１ファミリモジュールと組み合わされて、心血管利益の増強、たとえ
ば有益な血管拡張効果を提供することによるＣＨＦの処置を提供し得る。
（ｂ）代謝性疾患および心血管タンパク質
代謝性疾患および心血管疾患は、大半の先進国で相当な保健管理上の重荷となり、心血
管疾患は、米国および大半の欧州諸国で死亡および障害（ｄｉｓａｂｉｌｉｔｙ）の第１
の原因に今なおなっている。代謝性疾患および代謝性障害は、体の臓器、組織、および循
環系に影響を及ぼす多種多様の症状を包含する。これらの中で最重要なのが、米国で主要
な死亡原因の１つの糖尿病であるのは、糖尿病が脈管構造、中枢神経系、主要臓器、およ
び末梢組織に病態および代謝障害の両方を生じるためである。インスリン抵抗性および高
インスリン血症は、かなりの健康上のリスク引き起こす他の２種類の代謝性障害：グルコ
ース寛容減損および代謝性肥満にも連結してきた。グルコース寛容減損は、摂食前の正常
グルコースレベルを特徴として、食事後のグルコースレベルが上昇する（高血糖）傾向が
ある。このような個体は、糖尿病および冠動脈疾患のより高いリスクに瀕していると見な
される。肥満も、高血圧、冠動脈疾患（動脈硬化症）、および乳酸アシドーシス、ならび
に関連疾患状態と同様に、インスリン抵抗症候群、すなわち「シンドロームＸ」と呼ばれ
る状態の群にとってのリスク因子である。肥満の病因は多因子性であると考えられるが、
根底にある問題は、過剰な脂肪組織が存在するまで、肥満において栄養素利用性およびエ
ネルギー消費が均衡していないことである。
脂質異常症は、糖尿病患者および心血管疾患を有する被験体の間で頻繁に出現し；通例
、血漿トリグリセリドの上昇、低いＨＤＬ（高密度リポタンパク質）コレステロール、正
常～高レベルのＬＤＬ（低密度リポタンパク質）コレステロールおよび小型高密度ＬＤＬ
粒子の血中レベル増加などのパラメータを特徴とする。脂質異常症および高血圧は、糖尿
病および心血管疾患のような代謝性疾患を有する被験体の間で、冠動脈イベント、腎疾患
、および死亡の発生率の増加の主要な寄与因子（ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｏｒ）である。
心血管疾患は、特に動脈瘤、狭心症、アテローム性動脈硬化、脳血管障害（発作）、脳
血管疾患、うっ血性心不全、冠動脈疾患、心筋梗塞、心拍出量減少および末梢血管疾患、
高血圧、低血圧、血液マーカー（たとえばＣ反応性タンパク質、ＢＮＰ、および酵素、た
とえばＣＰＫ、ＬＤＨ、ＳＧＰＴ、ＳＧＯＴ）などを包含する、全身に及ぶ心臓、脈管お
よび臓器系を含む、臨床パラメータの多くの障害、状態および変化によって明らかである
ことができる。
大半の代謝プロセスおよび多くの心血管パラメータは、複数のペプチドおよびホルモン
（「代謝タンパク質」）によって調節され、多くのこのようなペプチドおよびホルモン、
ならびにその類似体は、このような疾患および障害の処置に有用性を見出している。しか
し、治療用ペプチドおよび／またはホルモンの使用は、小型分子薬の使用によって増強さ
れるときでも、このような疾患および障害の管理の成功は限定されていた。特に用量最適
化は、代謝性疾患の処置に使用される薬物および生物製剤、とりわけ狭い治療ウインドウ
を有するものにとっては重要である。一般に、グルコース恒常性に関与するホルモン、お
よびペプチドは、狭い治療ウインドウを有することが多い。狭い治療ウインドウは、この
ようなホルモンおよびペプチドが通例、臨床利益を達成するために頻繁な投薬が必要とな
る短い半減期を有するという事実と組み合されて、このような患者の管理に困難を生じる
。したがって、代謝性疾患の処置での有効性および安全性が増加した治療薬に対する要求
が依然として存在している。
それゆえ本発明の一態様は、このような障害、疾患および関連症状の処置での有用性を
有する組成物を生成するための、代謝疾患および心血管疾患ならびに障害の処置に関与す
るまたは使用される生物活性代謝タンパク質の、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質への組み入
れである。代謝タンパク質は、代謝性疾患または心血管疾患、障害または状態を防止、処
置、媒介または緩和するのに有用である、生物的、治療的、または予防的重要性または機
能のある任意のタンパク質を包含することができる。表６は、本発明のＢＰＸＴＥＮ融合
タンパク質に含まれる代謝性ＢＰのこのような配列の非限定的なリストを提供する。本発
明のＢＰＸＴＥＮ組成物の代謝タンパク質は、表６から選択されるタンパク質配列に対し
て、少なくとも約８０％の配列同一性を、またはあるいは８１％の、８２％の、８３％の
、８４％の、８５％の、８６％の、８７％の、８８％の、８９％の、９０％の、９１％の
、９２％の、９３％の、９４％の、９５％の、９６％の、９７％の、９８％の、９９％、
もしくは１００％の配列同一性を示すタンパク質であることができる。
Figure 0007461438000015
Figure 0007461438000016

「抗ＣＤ３」は、ＯＫＴ３（ムロモナブとも呼ばれる）およびヒト化抗ＣＤ３モノクロ
ーナル抗体（ｈＯＫＴ３１（Ａｌａ－Ａｌａ））を包含する、Ｔ細胞表面タンパク質ＣＤ
３に対するモノクローナル抗体、その種および配列変異体、ならびにフラグメントを意味
する（ＫＣ Ｈｅｒｏｌｄら、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄ
ｉｃｉｎｅ ３４６：１６９２－１６９８．２００２） 抗ＣＤ３は、すべての分化Ｔ細
胞に存在するＴ細胞受容体複合体を結合することによって、Ｔ細胞の活性化および増殖を
防止する。本発明の抗ＣＤ３含有融合タンパク質は、治療エフェクタとしての抗ＣＤ３な
らびにＢＰＸＴＥＮ組成物の第２の治療ＢＰの標的部分の使用を包含して、初発の１型糖
尿病を遅らせることに特定の用途を見出し得る。可変領域の配列および抗ＣＤ３の生成は
、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏｓ ５，８８５，５７３および６，４９１，９１６に記載
されている。
「ＩＬ－１ｒａ」は、ヒトＩＬ－Ｉ受容体アンタゴニストタンパク質ならびに、成熟Ｉ
Ｌ－１ｒａの生物活性の少なくとも一部を有する、配列変異体のアナキンラ（Ｋｉｎｅｒ
ｅｔ（登録商標））を包含する、ヒトＩＬ－Ｉ受容体アンタゴニストタンパク質の種およ
び配列変異体を意味する。ヒトＩＬ－１ｒａは、１５２アミノ酸残基の成熟糖タンパク質
である。ＩＬ－１ｒａの抑制作用は、Ｉ型ＩＬ－１受容体へのその結合から生じる。該タ
ンパク質は２５ｋＤａの天然分子量を有し、該分子は、ＩＬ－１α（１９％）およびＩＬ
－１β（２６％）に対して制限された配列相同性を示す。アナキンラは、非グリコシレー
ション組換えヒトＩＬ－１ｒａであり、Ｎ末端メチオニンの付加により内因性ヒトＩＬ－
１ｒａとは異なる。アナキンラの市販品は、Ｋｉｎｅｒｅｔ（登録商標）として販売され
ている。アナキンラは、天然ＩＬ－１ｒａおよびＩＬ－Ｉｂと同じアビディティでＩＬ－
Ｉ受容体に結合するが、ＩＬ－１αおよびＩＬ－１β上のこのような２つのモチーフに対
してＩＬ－１ｒａ上の唯一の受容体結合モチーフの存在に起因する効果である、受容体活
性化（シグナル伝達）を生じない。アナキンラは、１５３のアミノ酸および１７．３ｋＤ
のサイズを有し、おおよそ４～６時間の半減期が報告されている。
ＩＬ－Ｉ産生の増加は、各種のウイルス、細菌、真菌、および寄生虫感染症；血管内凝
固；高用量ＩＬ－２療法；固形腫瘍；白血病；アルツハイマー病；ＨＩＶ－１感染症；自
己免疫障害；外傷（外科手術）；血液透析；虚血性疾患（心筋梗塞）；非感染性肝炎；喘
息；紫外線照射；閉鎖性頭部外傷；膵炎；腹膜炎；対宿主性移植片病；移植片拒絶を有す
る患者において；および激しい運動後の健常被験体において報告されている。アルツハイ
マー病患者におけるＩＬ－１β産生の増加とアミロイド前駆体タンパク質の放出における
ＩＬ １の考えられる役割の間に関連がある。ＩＬ－１は、疾患、たとえば２型糖尿病、
肥満、高血糖、高インスリン血症、１型糖尿病，インスリン抵抗性、網膜神経変性プロセ
ス、インスリン抵抗性を特徴とする疾患状態および症状、急性心筋梗塞（ＡＭＩ）、急性
冠動脈症候群（ＡＣＳ）、アテローム性動脈硬化、慢性炎症障害、関節リウマチ、椎間円
板変性症、サルコイドーシス、クローン病、潰瘍性大腸炎、妊娠性糖尿病、食欲亢進、不
十分な飽満感、代謝性障害、グルカゴノーマ、気道の分泌障害、骨粗鬆症、中枢神経系疾
患、再狭窄、神経変性疾患、腎不全、うっ血性心不全、ネフローゼ症候群、肝硬変、肺水
腫、高血圧、食物取り込みの低下が所望である障害、過敏性腸症候群、心筋梗塞、発作、
術後異化作用変化、冬眠心筋、糖尿病性心筋症、不十分な尿中ナトリウム排泄、過剰な尿
中カリウム濃度、毒性血液量過多に関連付けられた症状または障害、多嚢胞性卵巣症候群
、呼吸窮迫、慢性皮膚潰瘍、腎症、左心室収縮不全、消化管下痢、術後ダンピング症候群
、過敏性腸症候群、重症疾患多発ニューロパチー（ＣＩＰＮ）、全身性炎症反応症候群（
ＳＩＲＳ）、脂質異常症、虚血後再灌流傷害、および冠動脈心疾患リスクファクター（Ｃ
ＨＤＲＦ）症候群にも関連付けられてきた。本発明のＩＬ－１ｒａ含有融合タンパク質は
、上述の疾患および障害の任意の処置に特定の用途を見出し得る。ＩＬ－１ｒａは、Ｕ．
Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏｓ．５，０７５，２２２および６，８５８，４０９に記載されるように
クローニングされている。
「ナトリウム排泄増加ペプチド」は、心房ナトリウム排泄増加ペプチド（ＡＮＰ）、脳
ナトリウム排泄増加ペプチド（ＢＮＰまたはＢ型ナトリウム排泄増加ペプチド）およびＣ
型ナトリウム排泄増加ペプチド（ＣＮＰ）；成熟した対応するナトリウム排泄増加ペプチ
ドの生物活性の少なくとも一部を有する、ヒトおよび非ヒトの両方のその種および配列変
異体を意味する。アルファ心房ナトリウム排泄増加ペプチド（ａＡＮＰ）または（ＡＮＰ
）および脳ナトリウム排泄増加ペプチド（ＢＮＰ）およびＣ型ナトリウム排泄増加ペプチ
ド（ＣＮＰ）は、体液および電解質の恒常性の調節に関与する相同ポリペプチドホルモン
である。ナトリウム排泄増加ペプチドの有用な形態の配列は、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｐ
ｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ２００１００２７１８１に開示されている。ＡＮＰの例は、ヒト
ＡＮＰ（Ｋａｎｇａｗａら、ＢＢＲＣ １１８：１３１（１９８４））またはブタおよび
ラットＡＮＰを包含する、各種の種からのＡＮＰ（Ｋａｎｇａｗａら、ＢＢＲＣ １２１
：５８５（１９８４））を包含する。配列解析によって、プレプロＢＮＰは１３４残基か
ら成り、１０８アミノ酸ＰｒｏＢＮＰに切断されることが明らかになる。ＰｒｏＢＮＰの
Ｃ末端からの３２アミノ酸配列の切断によって、循環中の生理的活性形態のヒトＢＮＰ（
７７－１０８）が生じる。３２アミノ酸ヒトＢＮＰは、ジスルフィド結合の形成に関与す
る（Ｓｕｄｏｈら、ＢＢＲＣ １５９：１４２０（１９８９））ならびにＵ．Ｓ．Ｐａｔ
．Ｎｏｓ．５，１１４，９２３、５，６７４，７１０、５，６７４，７１０、および５，
９４８，７６１。ＢＰＸＴＥＮ含有の１つ以上のナトリウム排泄増加機能は、高血圧の処
置、利尿誘導、ナトリウム排泄増加誘導、血管拡張または弛緩、ナトリウム排泄増加ペプ
チド受容体（たとえばＮＰＲ－Ａ）結合、腎臓からのａｐｉｄａ分泌抑止、副腎からのア
ルドステロン（ａｌｄｏｓｔｒｅｒｏｎｅ）分泌抑止、心血管疾患および障害の処置、心
イベント後のまたはうっ血性心不全の結果としての心臓リモデリングの低減、停止または
逆転、腎疾患および障害の処置；虚血性発作の処置または防止、ならびに喘息の処置に有
用であり得る。
「ＦＧＦ－２」またはへパリン結合成長因子２は、ヒトＦＧＦ－２タンパク質、ならび
に成熟対応物（ｍａｔｕｒｅ ｃｏｕｎｔｅｒｐａｒｔ）の生物活性の少なくとも一部を
有するその種および配列変異体を意味する。ＦＧＦ－２は、線条体様ニューロンに分化し
た神経幹細胞の増殖を刺激して、ハンチントン舞踏病の毒素誘発モデルにおける線条体ニ
ューロンを保護することが示され、心再灌流傷害の処置での有用性も有し得て、内皮細胞
成長、抗脈管形成特性および腫瘍抑止特性、創傷治癒、ならびに骨の骨折治癒の促進を有
し得る。ＦＧＦ－２は、Ｂｕｒｇｅｓｓ，Ｗ．Ｈ．ａｎｄ Ｍａｃｉａｇ，Ｔ．，Ａｎｎ
．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５８：５７５－６０６（１９８９）；Ｃｏｕｌｉｅｒ，Ｆ
．ら、１９９４，Ｐｒｏｇ．Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｓ．５：１；およびＰＣ
Ｔ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ＷＯ ８７／０１７２８に記載されるようにクローニング
されている。
「ＴＮＦ受容体」は、ヒトＴＮＦ受容体、ならびに成熟ＴＮＦＲの生物受容体活性の少
なくとも一部を有するその種および配列変異体を意味する。Ｐ７５ ＴＮＦ受容体分子は
、ｐ５５ ＴＮＦ受容体を包含する構造的に相同な受容体のファミリ由来である、ｐ７５
ＴＮＦ受容体の細胞外ドメインである。ＴＮＦαおよびＴＮＦβ（ＴＮＦリガンド）は
、ｐ５５ ＴＮＦ受容体およびｐ７５ ＴＮＦ受容体への結合に関して競合する。ヒトｐ
５５ ＴＮＦ受容体の細胞外ドメインおよびＴＮＦβによって形成された複合体のｘ線結
晶構造が決定されている（参照により本明細書に組み入れられている、Ｂａｎｎｅｒら、
Ｃｅｌｌ ７３：４３１，１９９３）。
（ｃ）凝固因子
血友病では、特定の血漿凝固因子の欠如によって、血液の凝固が妨げられる。ヒト第Ｉ
Ｘ因子（ＦＩＸ）は、血液凝固カスケードの内因性経路の重要な構成要素である、セリン
プロテアーゼのチモーゲンである。ＦＩＸ欠損のない個体では、ＦＩＸの平均半減期は短
く、おおよそ１８～２４時間である。男性３０，０００人のうち約１人に出現する、Ｘ連
鎖障害による機能性ＦＩＸの欠乏によって、クリスマス病としても公知の血友病Ｂが生じ
る。第ＩＸ因子の１００を超える変異が記載されている；いくつかは症状を引き起こさな
いが、多くは顕著な出血障害をもたらす。未処置のときには、血友病Ｂは筋肉、関節、お
よび体腔への制御不能の出血を伴い、死をもたらすことがある。以前には本疾患の処置は
、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）およびＣ型肝炎（ＨＣＶ）ウイルスを包含する血液媒
介ウイルスによる感染という付帯リスクを有する、ドナープールに由来するヒト血漿から
調製されたＦＩＸの投与を包含していた。つい最近では、組換えＦＩＸ生成物が市販され
るようになった。外因的に供給された第ＩＸ因子のインビボ活性は、タンパク質半減期お
よび抗トロンビンＩＩＩを包含する凝固抑制因子の両方によって制限される。第ＩＸ因子
組成物は通例、半減期が短く、注射が頻繁に必要である。また最新のＦＩＸに基づく治療
薬は、生物学的利用能が不十分であるため、静脈内投与が必要である。それゆえ血友病Ｂ
の防止および／または治療レジメンの一部として投与されるときに、半減期が延長され、
活性が保持されている第ＩＸ因子組成物への要求がある。
凝固の生理的引き金となるものは、正常には脈管構造の外部に位置する、ＴＦ発現細胞
の表面での、組織因子（ＴＦ）と第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）との間の複合体の形成で
ある。これにより、第ＩＸ因子および第Ｘ因子の活性化がもたらされ、最終的にトロンビ
ンが一部生成される。今度はトロンビンが血液凝固カスケードのいわゆる「内因性の」ア
ームである第ＶＩＩＩ因子および第ＩＸ因子を活性化して、それゆえ十分なトロンビンの
バーストが生成して完全な止血を達成するために必要である、第Ｘａ因子の生成を増幅さ
せる。続いて、高濃度の第ＶＩＩａ因子を投与することにより、特定の出血障害における
第ＶＩＩＩａ因子および第ＩＸａ因子への要求が回避され、止血を達成できることが示さ
れた。凝固障害および出血障害は、プロトロンビン時間、部分プロトロンビン時間、出血
時間、凝固時間、血小板数、プロトロンビンフラグメント１＋２（Ｆ１＋２）、トロンビ
ン－抗トロンビンＩＩＩ複合体（ＴＡＴ）、Ｄ－ダイマー、出血エピソードの生成率、赤
血球沈降速度（ＥＳＲ）、Ｃ反応性タンパク質、および凝固因子の血中濃度などのパラメ
ータの変化を生じることができる。
それゆえ第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）タンパク質は、ＦＶＩＩＩまたはＦＩＸに対す
る抑制因子を有する血友病ＡまたはＢ患者および後天性血友病患者における出血エピソー
ドの処置、ならびにＦＶＩＩＩまたはＦＩＸに対する抑制因子を有する血友病ＡまたはＢ
患者における外科的介入または侵襲的手順での出血の防止に有用性が見出されている。さ
らに第ＶＩＩａ因子は、先天性第ＶＩＩ因子欠損患者における出血エピソードの処置およ
び先天性ＦＶＩＩ欠乏患者における外科的介入または侵襲的手順での出血の防止で利用で
きる。しかし、ＦＶＩＩａを含有する生成物の静脈内投与は、血栓イベント、発熱および
注射部位反応を包含する副作用をもたらし得る。さらに第ＶＩＩａ因子のおおよそ２時間
の短い半減期によってその適用が制限され、止血を達成するために２～４時間ごとの反復
注射が必要となり得る。それゆえ血友病Ｂの防止レジメンおよび／または治療レジメンの
一部として投与されるときに、半減期が延長され、活性が保持されている第ＩＸ因子組成
物および第ＶＩＩａ因子組成物、ならびに副作用を低下させて、静脈内および皮下経路の
両方で投与できる調合物への要求が今なお存在している。
本発明のＢＰＸＴＥＮに包含するための凝固因子は、血液凝固障害、疾患、または欠損
を防止、処置、媒介または改善するのに有用である、生物的、治療的、または予防的重要
性または機能のあるタンパク質を包含することができる。好適な凝固タンパク質は、基質
、酵素または補因子として凝固カスケードに関与する生物活性ポリペプチドを包含する。
表７は、本発明のＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質に含まれる凝固因子の配列の非限定的な
リストを提供する。本発明のＢＰＸＴＥＮへの包含のための凝固因子は、表７から選択さ
れるタンパク質配列に対して、少なくとも約８０％の配列同一性を、またはあるいは８１
％の、８２％の、８３％の、８４％の、８５％の、８６％の、８７％の、８８％の、８９
％の、９０％の、９１％の、９２％の、９３％の、９４％の、９５％の、９６％の、９７
％の、９８％の、９９％、もしくは１００％の配列同一性を示すタンパク質であることが
できる。
Figure 0007461438000017
Figure 0007461438000018
Figure 0007461438000019

「第ＩＸ因子」（「ＦＩＸ」）は、ヒト第ＩＸ因子タンパク質ならびに成熟第ＩＸ因子
の生物受容体活性の少なくとも一部を有するその種および配列変異体を包含する。ＦＩＸ
は、血液凝固第ＩＸ因子の代表的な特徴を備えた任意の形態の第ＩＸ因子分子であるもの
とする。ＦＩＸは、血漿からのＦＩＸおよびたとえばＦＩＸの欠損（たとえば血友病Ｂ）
によって引き起こされた患者の出血障害を治癒することができる任意の形態の組換えＦＩ
Ｘを包含するものとする。いくつかの実施形態において、ＦＩＸペプチドは、表７の配列
を包含する、本明細書に記載するＦＩＸペプチドの任意の構造類似体またはペプチドミメ
ティックである。ポリペプチドの生物活性を無効にしない（すなわちその活性を野生型形
態（＝１００％）の１０％未満またはなお５％未満に低下させること）、ＦＩＸのポリペ
プチド配列のアミノ酸の軽度の欠損、付加および／または置換も、生物活性誘導体、とり
わけ改善された比活性を有するもの（野生型形態の１００％の活性を超える）として本出
願に包含される。本発明によるＦＩＸは、任意の脊椎動物、たとえば哺乳動物に由来し得
る。
いくつかの実施形態において、ＦＩＸペプチドは、表７の配列を包含する、本明細書に
記載するＦＩＸペプチドの任意の構造類似体またはペプチドミメティックである。ポリペ
プチドの生物活性を無効にしない（すなわちその活性を野生型形態（＝１００％）の１０
％未満またはなお５％未満に低下させること）、ＦＩＸのポリペプチド配列のアミノ酸の
軽度の欠損、付加および／または置換も、生物活性誘導体、とりわけ改善された比活性を
有するもの（野生型形態の１００％の活性を超える）として本出願に包含される。本発明
によるＦＩＸは、任意の脊椎動物、たとえば哺乳動物に由来し得る。本発明の詳細な１例
において、ＦＩＸはヒトＦＩＸである。別の実施形態において、ＦＩＸは、表７からのポ
リペプチド配列である。
ヒト第ＩＸ因子（ＦＩＸ）は、Ｘ染色体のｑ２７．１に存在するシングルコピー遺伝子
によってコードされる。ヒトＦＩＸｍＲＮＡは、５’非翻訳領域の２０５塩基、プレプロ
第ＩＸ因子の１３８３塩基、停止コドンおよび３’非翻訳領域の１３９２塩基で構成され
る。ＦＩＸポリペプチドは、５５ｋＤａであり、３つの領域：２８アミノ酸のシグナルペ
プチド、グルタミン酸残基のガンマカルボキシル化に必要である、１８アミノ酸のプロペ
プチド、および４１５アミノ酸の成熟第ＩＸ因子から構成されるプレプロポリペプチド鎖
として合成される。成熟第ＩＸ因子はドメインで構成される。ドメインはＮ→Ｃ末端配置
では、Ｇｌａドメイン、ＥＧＦ１ドメイン、ＥＧＦ２ドメイン、活性化ペプチドドメイン
、およびプロテアーゼ（または触媒）ドメインである。プロテアーゼドメインは、ＦＩＸ
のＦＩＸａへの活性化時に、ＦＩＸの触媒活性を提供する。活性化後に、単鎖ＦＩＸは２
本鎖分子となり、この分子で２本の鎖は、酵素をＧｌａドメインに付着するジスルフィド
結合によって連結される。活性化された第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩａ）は、ＦＩＸａ活
性の完全発現のための特異的補因子である。本明細書で使用する場合、「第ＩＸ因子」お
よび「ＦＩＸ」は、ドメインＧ１ａ、ＥＧＦ１、ＥＧＦ２、活性化ペプチド、およびプロ
テアーゼ含むポリペプチド、または当分野で公知のこれらのドメインの同義語を含むポリ
ペプチドを含むことを意図する。
ＦＩＸは、活性ＦＩＸを産するために、翻訳後プロセシングを必要とする前駆体ポリペ
プチドとして発現される。特に、ＦＩＸの前駆体ポリペプチドは、いわゆるガンマ－カル
ボキシグルタメートドメインにおける特定のグルタミン酸残基のガンマカルボキシル化お
よびプロペプチドの切断を必要とする。プロペプチドは、ガンマ－カルボキシグルタメー
トドメインのＮ末端の１８アミノ酸残基配列である。プロペプチドは、ビタミンＫ依存性
ガンマカルボキシラーゼを結合して、次に内因性プロテアーゼ、たいていは、フューリン
またはＰＣＳＫ３としても公知である、ＰＡＣＥ（対合塩基性アミノ酸切断酵素）によっ
てＦＩＸの前駆体ポリペプチドから切断される。Ｇｌａドメインは、ガンマカルボキシル
化がないと、カルシウムを結合してタンパク質を負に荷電したリン脂質表面に固定するた
めに必要な正しい高次構造を取ることができず、これにより第ＩＸ因子は機能しなくなる
。Ｇｌａドメインが、カルボキシル化されている場合でも正しく機能するためにプロペプ
チドの切断に依存するのは、残存するプロペプチドがカルシウムおよびリン脂質への最適
な結合に必要なＧｌａドメインの高次構造変化を妨害するためである。得られた成熟第Ｉ
Ｘ因子は、おおよそ１７重量％の炭水化物を含有する４１５アミノ酸残基の単鎖タンパク
質である（Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ａ．Ｅ．ら（２００３）Ｔｒｅｎｄｓ Ｃａｒｄｉｏｖａｓ
ｃ Ｍｅｄ，１３：３９）。
成熟ＦＩＸは、第ＩＸａ因子を産するために、活性化された第ＸＩ因子によって活性化
される必要がある。凝固カスケードの内因性経路において、ＦＩＸは活性化された第ＶＩ
ＩＩ因子、第Ｘ因子、カルシウム、およびリン脂質の複合体と会合する。複合体において
、ＦＩＸは第Ｘｉａ因子によって活性化される。第ＩＸ因子の活性化は、分子からの活性
化ペプチド（Ａｌａ １４６－Ａｒｇ １８０）の２ステップ除去によって達成される。
（Ｂａｊａｊら、“Ｈｕｍａｎ ｆａｃｔｏｒ ＩＸ ａｎｄ ｆａｃｔｏｒ ＩＸａ，
”ｉｎ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ．１９９３）。第１の切断は、第
Ｘｉａ因子または第ＶＩｌａ因子／組織因子のどちらかによってＡｒｇ１４５－Ａｌａ１
４６部位にて行われる。第２の律速切断は、Ａｒｇ１８０－Ｖａｌ１８１にて行われる。
活性化によって３５残基が除去される。活性化されたヒト第ＩＸ因子は、重鎖および軽鎖
のジスルフィド連結ヘテロダイマーとして存在する。第ＩＸa因子は今度は、活性化され
た第ＶＩＩＩ因子と協調して第Ｘ因子を活性化する。あるいは、第ＩＸ因子および第Ｘ因
子はどちらも、外因性経路を介して生成した、ａｐｉｄａｔｅｄ組織因子と複合体化され
た第ＶＩＩａ因子によって活性化することができる。第Ｘａ因子は次に、プロトロンビン
はトロンビンに変換され、トロンビンは今度はフィブリノーゲンをフィブリンに変換して
クロットを形成する、最終共通経路に関与する。
いくつかの場合において、凝固因子は、第ＩＸ因子、第ＩＸ因子の配列変異体、または
第ＩＸ因子部分、たとえば表７の例示的な配列、ならびにその生物学的特性が第ＩＸ因子
の活性をもたらす、第ＩＸ因子に実質的に相同である任意のタンパク質またはポリペプチ
ドである。本明細書で使用する場合、「第ＩＸ因子部分」という用語は、たとえば部位特
異的変異誘発によって意図的に、または変異によって偶発的に改変された、少なくともい
くらかの第ＩＸ因子活性を保持する第ＩＸ因子配列を生じるタンパク質を包含する。「第
ＩＸ因子部分」という用語は、タンパク質のＮ末端またはカルボキシ末端にまたは第ＩＸ
因子部分の配列の内部に少なくとも１個の追加のアミノ酸を有する誘導体も包含する。第
ＩＸ因子部分の非限定的な例は、以下：第ＩＸ因子；第ＩＸａ因子；第ＩＸ因子の切断版
；第ＩＸ因子活性を有するハイブリッドタンパク質および第ＩＸ因子活性を有するペプチ
ドミメティックを包含する。少なくともある程度の第ＩＸ因子活性または活性化の潜在力
を保持する上述の任意の生物活性フラグメント、欠失変異体、置換変異体または付加変異
体は、第ＩＸ因子配列として働くことができる。
「第ＶＩＩ因子」（ＦＶＩＩ）は、ヒトタンパク質、ならびに活性化された第ＶＩＩ因
子の生物活性の少なくとも一部を有するその種および配列変異体を意味する。第ＶＩＩ因
子および組換えヒトＦＶＩＩａは、補充凝固因子に対して抑制因子を発達させた血友病患
者（第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子が欠損した）における制御不能な出血で使用するた
めに導入されている。第ＶＩＩ因子は、トロンビン、第ＩＸａ因子、第Ｘａ因子または第
ＸＩＩａ因子によって第ＦＶＩＩａ因子に活性化され得る。ＦＶＩＩは、Ａｒｇ１５２－
Ｉｌｅ１５３における単一ペプチド結合のタンパク質分解によってその活性型の第ＶＩＩ
ａ因子に変換されて、１個のジスルフィド架橋によってひとまとめにされている２本のポ
リペプチド鎖、Ｎ末端軽鎖（２４ｋＤａ）およびＣ末端重鎖（２８ｋＤａ）の形成をもた
らす。他のビタミンＫ依存性凝固因子とは対照的に、これらの他のビタミンＫ依存性凝固
因子の活性化の間に切断される活性化ペプチドは、ＦＶＩＩについては、記載されていな
い。Ａｒｇ１５２－Ｉｌｅ１５３切断部位およびいくつかの下流アミノ酸は、他のビタミ
ンＫ依存性ポリペプチドの活性化切断部位に対する相同性を示している。組換えヒト第Ｖ
ＩＩａ因子は、補充凝固因子に対して抑制因子を発達させた血友病患者を包含する、血友
病患者（第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子が欠損した）における制御不能な出血の処置に
有用性を有する。ＦＶＩＩは、血液凝固第ＶＩＩ因子の代表的な特徴を備えた任意の形態
の第ＶＩＩ因子分子であるものとする。ＦＶＩＩは、血漿からのＦＶＩＩおよびたとえば
ＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａの欠損によって引き起こされた患者の出血障害を改善することがで
きる任意の形態の組換えＦＶＩＩを包含するものとする。いくつかの実施形態において、
ＦＶＩＩペプチドは、表７の配列を包含する、本明細書に記載するＦＶＩＩペプチドの任
意の活性型（ＦＶＩＩａ）、構造類似体またはペプチドミメティックである。第ＶＩＩ因
子および第ＶＩＩａ因子は、ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．６，８０６，０６３およびＵＳ
Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．２００８０２６１８８６に記載される
ようにクローニングされている。
一態様において、本発明は、キメラ分子を生成するためにＸＴＥＮに共有結合的に連結
された、表７のＦＩＸ配列を包含する、ＦＩＸの全長配列、または活性フラグメント、ま
たは配列変異体、または任意の生物活性誘導体を含むＦＩＸの単量体ＢＰＸＴＥＮ融合タ
ンパク質を提供する。いくつかの場合において、ＦＩＸなどの凝固因子を含む融合タンパ
ク質は、１個以上のタンパク質分解切断部位配列をさらに含む。別の実施形態において、
融合タンパク質は第１および第２の異なる切断配列を含む。上述の実施形態において、切
断配列（複数可）は表１０から選択される。ＸＴＥＮの存在によってＦＩＸ活性化形態（
以下「ＦＩＸａ」）へのＦＩＸの活性化が抑制される場合には（たとえばＸＴＥＮはＦＩ
ＸのＣ末端に付着されている場合）、以下でさらに十分に記載するように、プロテアーゼ
によって作用を受けたときに１個以上のタンパク質分解切断部位がＸＴＥＮ配列の放出を
可能にする。上述の特色において、無傷のＦＩＸ－ＸＴＥＮ組成物はプロドラッグとして
働き、タンパク質分解によるＦＩＸ－ＸＴＥＮ分子からのＸＴＥＮの放出が、放出された
ＦＩＸ配列のＦＩＸａへの変換を可能にする。一実施形態において、１個以上の切断配列
は、表１０からの配列に対して少なくとも約８０％の配列同一性を、または表１０からの
配列に対して少なくとも約８５％の、または少なくとも約９０％の、または少なくとも約
９５％の、または少なくとも約９６％の、または少なくとも約９７％の、または少なくと
も約９８％の、または少なくとも約９９％の、または１００％の配列同一性を有する配列
であることができる。
ＦＩＸ－ＸＴＥＮ融合タンパク質は、異なる配置で設計することができる。図３７Ａに
例証されるような一実施形態において、融合タンパク質は以下の順序（Ｎ→Ｃ末端）で構
成要素：ＦＩＸ；およびＸＴＥＮを含み、該ＸＴＥＮは、ＸＴＥＮ配列の内部に切断配列
を含み得る。図３７Ｂに例証されるような別の実施形態において、融合タンパク質は、以
下の順序（Ｎ→Ｃ末端）で構成要素：ＦＩＸ；切断配列；およびＸＴＥＮを含む。いくつ
かの場合において、図３７Ｃおよび３７Ｄに例証されるように、融合タンパク質は、ＸＴ
ＥＮがＦＩＸドメインの間に挿入されてＦＩＸポリペプチドの内部に位置する構成要素を
含む。一実施形態において、図３７Ｃに示すように、ＸＴＥＮのＮ末端はＦＩＸ Ｇ１ａ
ドメインのＣ末端に連結され、ＸＴＥＮのＣ末端はＦＩＸのＥＧＦ１ドメインのＮ末端に
連結されて、追加の切断配列が導入されていないＦＩＸ－ＸＴＥＮを生じる。別の実施形
態において、図３７Ｃに示すように、ＸＴＥＮのＮ末端はＦＩＸ ＥＧＦ１ドメインのＣ
末端に連結され、ＸＴＥＮのＣ末端はＦＩＸのＥＧＦ２ドメインのＮ末端に連結されて、
追加の切断配列が導入されていないＦＩＸ－ＸＴＥＮを生じる。第ＩＸ因子配列がＰＤＶ
ＤＹＶＮＳＴＥＡＥＴＩＬＤＮＩＴＱＳＴＱＳＦＮＤＦ（配列番号１７４８）配列を含む
活性化ペプチドドメインを含む別の実施形態において、ＸＴＥＮ配列のＮ末端およびＣ末
端は、活性化ペプチドドメイン配列の任意の２個の連続アミノ酸または任意の２個の非連
続アミノ酸の間に挿入され、そして活性化ペプチドドメイン配列の任意の２個の連続アミ
ノ酸または任意の２個の非連続アミノ酸に連結することができ、該ＸＴＥＮは場合により
、同一であり得るまたは異なり得る第１および第２の切断配列を両方含む。上述の別の実
施形態において、ＸＴＥＮは、ＸＴＥＮのＮ末端がＴアミノ酸のＣ末端に連結され、ＸＴ
ＥＮのＣ末端がＩアミノ酸のＮ末端に連結されている、上述の配列の連続するＴおよびＩ
アミノ酸の間に挿入することができる。
図３７Ｅに例証されるような別の実施形態において、融合タンパク質は、２個のＸＴＥ
Ｎ分子：上述のようにＦＩＸの２個のドメイン間に位置する第１のＸＴＥＮ、および第２
のＸＴＥＮであって、ＸＴＥＮのＮ末端がＦＩＸのＣ末端に連結され、または第２のＸＴ
ＥＮのＮ末端が、ＦＩＸのＣ末端に連結されている切断配列のＣ末端に連結されている、
第２のＸＴＥＮを含む。
図３７Ｆに例証されるような他の場合において、ＦＩＸ－ＸＴＥＮ融合タンパク質は、
ＸＴＥＮがＦＩＸドメインの配列内に位置して、既存の構造ループの一部としてドメイン
に挿入されるか、またはドメイン構造物の外部にループを生成する構成要素を含む。ＦＩ
Ｘが、ＫＮＳＡＤＮＫ（配列番号１７４９）ループを含むＥＧＦ２ドメインを含む一実施
形態において、ＸＴＥＮ配列は、ＸＴＥＮのＮ末端がＳのＣ末端に連結され、ＸＴＥＮの
Ｃ末端がＡのＮ末端に連結されたループ配列のＳアミノ酸とＡアミノ酸の間に挿入されて
、ＸＴＥＮポリペプチドが球状凝固タンパク質の外側に延長するループ配列が生じ、該Ｘ
ＴＥＮは（場合により）、同一であり得るまたは異なり得る第１および第２の切断配列の
両方を含む。別の実施形態において、ＸＴＥＮは、ＫＮＳＡＤＮＫループ配列の任意の２
個の連続または非連続アミノ酸の間に挿入されることができる。ＦＩＸが、ＬＡＥＮルー
プを含むＥＧＦ２ドメインを含む別の実施形態において、ＸＴＥＮ配列はＬＥＡＮループ
の連続するＡアミノ酸とＥアミノ酸との間に挿入されることができ、ＸＴＥＮのＮ末端が
ＡのＣ末端に連結され、ＸＴＥＮのＣ末端がＥのＮ末端に連結され、ループ配列ＬＡ－Ｘ
ＴＥＮ－ＥＮが生じ、該ＸＴＥＮは（場合により）、同一であり得るまたは異なり得る第
１および第２の切断配列の両方を含むことができる。ＦＩＸがＧｌａドメインを含む別の
実施形態において、ＸＴＥＮは、ＸＴＥＮがループ構造物を形成するＧｌａ配列の２個の
連続アミノ酸の間に挿入および連結されることができ、該ループ構造物はＧｌａ構造物の
実質的に外部であり、該ＸＴＥＮは（場合により）、同じであり得るまたは異なり得る第
１および第２の切断配列の両方を含むことができる。ＦＩＸがＥＧＦ１ドメインを含む別
の実施形態において、ＸＴＥＮは、ＸＴＥＮがループ構造物を形成するＥＧＦ１配列の２
個の連続アミノ酸の間に挿入および連結されることができ、該ループ構造物はＥＧＦ１構
造物の実質的に外部であり、該ＸＴＥＮは（場合により）同じであり得るまたは異なり得
る第１および第２の切断配列の両方を含むことができる。
図３７Ｇに例証されるような別の実施形態において、融合タンパク質は、ＦＩＸ；およ
びＸＴＥＮの順序で構成要素を含み、該ＸＴＥＮは、ＸＴＥＮのＮ末端付近に、好ましく
はＸＴＥＮの最初の１４４アミノ酸残基内に、さらに好ましくはＸＴＥＮ配列のＮ末端の
最初の約８０アミノ酸内に、さらに好ましくはＸＴＥＮ配列のＮ末端の最初の約４２アミ
ノ酸内に、さらに好ましくはＸＴＥＮ配列のＮ末端の最初の約１８アミノ酸内に、および
なおさらに好ましくはＸＴＥＮ配列のＮ末端の最初の１２アミノ酸内に、複数の切断配列
を含む。
他の実施形態において、ＦＩＸ－ＸＴＥＮは、配置（Ｎ→Ｃ末端）ＸＴＥＮ－ＦＩＸで
、あるいはＸＴＥＮ－ＦＩＸ－ＸＴＥＮで、あるいはＸＴＥＮ－ＣＳ－ＦＩＸで、あるい
はＦＩＸ－ＸＴＥＮ－ＦＩＸで、あるいはＦＩＸ－ＣＳ－ＸＴＥＮ－ＣＳ－ＸＴＥＮで、
または上述のマルチマーで存在することができる。
一実施形態において、ＦＩＸ－ＸＴＥＮは、ＦＩＸ－ＸＴＥＮ組成物のＦＩＸを、ＸＴ
ＥＮの一部または全部を放出させずに凝固プロテアーゼによってＦＩＸａに活性化できる
ように構成される。ＦＩＸ－ＸＴＥＮが少なくとも２個のＸＴＥＮを含む別の実施形態に
おいて、ＦＩＸ－ＸＴＥＮは、ＦＩＸ－ＸＴＥＮ組成物のＦＩＸを、ＸＴＥＮの１個を放
出させずに凝固プロテアーゼによってＦＩＸａに活性化できるように構成される。ＦＩＸ
のＦＩＸａへの活性化前、またはＦＩＸのＦＩＸａへの活性化と同時のどちらかにおいて
ＸＴＥＮがＦＩＸ－ＸＴＥＮから放出される別の実施形態において、任意の残存するＸＴ
ＥＮまたは切断配列残基がＦＩＸの活性化を認められるほどには妨害せず、またプロテア
ーゼへの十分なアクセスを提供して対応する切断配列の切断に作用するように、切断配列
はＦＩＸの任意の部分に連結されたＸＴＥＮの端に十分に接近して位置する。ＸＴＥＮが
ＦＩＸのＣ末端に連結されている（上記のように）一実施形態において、１個以上の切断
部位は、ＸＴＥＮのＮ末端の最初の約１００アミノ酸以内に、さらに好ましくはＸＴＥＮ
のＮ末端の最初の８０アミノ酸以内に、さらに好ましくはＸＴＥＮのＮ末端の最初の５４
アミノ酸以内に、さらに好ましくはＸＴＥＮのＮ末端の最初の４２アミノ酸以内に、さら
に好ましくはＸＴＥＮのＮ末端の最初の３０アミノ酸以内に、さらに好ましくはＸＴＥＮ
のＮ末端の最初の１８アミノ酸以内に、および最も好ましくはＸＴＥＮのＮ末端の最初の
６アミノ酸以内に位置することができる。２個のＦＩＸドメインの間かもしくはＦＩＸド
メインの外部ループ内かまたはドメイン配列の内部のいずれかで、ＸＴＥＮがＦＩＸ配列
の内部へ連結されている（上記のように）別の実施形態において、ＸＴＥＮは、少なくと
も１個の切断部位がＸＴＥＮのＮ末端の最初の約１００アミノ酸以内に、ＸＴＥＮのＮ末
端の８０アミノ酸以内に、ＸＴＥＮのＮ末端の５４アミノ酸以内に、ＸＴＥＮのＮ末端の
４２アミノ酸以内に、ＸＴＥＮのＮ末端の３０アミノ酸以内に、ＸＴＥＮのＮ末端の１８
アミノ酸以内に、またはＸＴＥＮのＮ末端の６アミノ酸以内に位置することができる２個
以上の切断配列を含むことができ、ＸＴＥＮは、ＸＴＥＮのＣ末端の最後の１００アミノ
酸以内に、ＸＴＥＮのＣ末端の８０アミノ酸以内に、ＸＴＥＮのＣ末端の５４アミノ酸以
内に、ＸＴＥＮのＣ末端の４２アミノ酸以内に、ＸＴＥＮのＣ末端の３０アミノ酸以内に
、ＸＴＥＮのＣ末端の１８アミノ酸以内に、またはＸＴＥＮのＣ末端の６アミノ酸以内に
位置する少なくとも第２の切断部位を含むことができる。
いくつかの場合において、融合タンパク質のプロテアーゼ切断によって、続いてＦＩＸ
配列を活性化できるように、被験体においてＦＩＸ配列からＸＴＥＮが放出される。他の
場合において、融合タンパク質のプロテアーゼ切断は、ＦＩＸのＦＩＸａへのプロセシン
グおよび活性化と同時にＸＴＥＮが放出されるような、凝固カスケードのプロテアーゼの
作用の結果である。それゆえいくつかの実施形態の特定の特色において、ＦＩＸ－ＸＴＥ
Ｎ融合タンパク質のＸＴＥＮおよび関連付けられている切断部位（複数可）は、ＸＴＥＮ
がタンパク質分解切断によって融合タンパク質から放出されるまでＦＩＸ配列が活性化さ
れないように、位置することができる。このような実施形態において、ＦＩＸ－ＸＴＥＮ
は、一旦被験体に投与されると、活性化されることができるプロドラッグとして使用する
ことができる。一実施形態において、特にＦＩＸ－ＸＴＥＮが２個のＸＴＥＮ配列を含む
ときに、放出されたＦＩＸポリペプチドはＸＴＥＮの全部または一部を含有することがで
きる。あるいは、放出されたＦＩＸポリペプチドはＸＴＥＮを、またはＸＴＥＮの実質的
にすべてを含まないことができる。
他の実施形態において、切断部位は融合タンパク質の合成手順の間に使用される。たと
えば融合タンパク質は、組換え産生後の融合タンパク質の単離のために親和性タグをさら
に含有することができる。融合タンパク質の切断部位を認識するプロテアーゼはタグを除
去して、それによりＸＴＥＮに連結されたＦＩＸである最終生成物をもたらすことができ
る。
それゆえ融合タンパク質は切断部位を有することができ、該切断部位は、注射前、注射
後（プロテアーゼによって血液循環または組織で）に切断することができ、ＸＴＥＮが内
因性プロテアーゼによって放出されるまで治療生成物と共にとどまって、治療生成物を凝
固カスケードによって活性化させるか、またはＸＴＥＮが凝固カスケードのプロテアーゼ
によって放出されるかのどちらかとなるように位置することができる。
いくつかの実施形態において、ＦＩＸの融合タンパク質は、循環中または体組織内もし
くは体腔内のいずれかにおいて、部位特異的プロテアーゼによって不活性タンパク質から
活性タンパク質（たとえばＦＩＸａ）に変換される。この切断は、薬学的活性ドメイン（
プロドラッグ活性化）の有効性の増加を誘発し得るか、または切断生成物のその標的への
結合を増強し得る。そのためたとえばＦＩＸ－ＸＴＥＮ融合タンパク質は被験体の血液中
で切断されることができ、ＦＩＸ配列は凝固カスケードによって、または本明細書で開示
する別のプロテアーゼによって活性化させることができる。ＦＩＸ融合タンパク質の活性
形態は、ＸＴＥＮの少なくともフラグメントを含有し得るか、または含有し得ない。ＦＩ
Ｘ－ＸＴＥＮプロドラッグ実施形態の特色において、従来のＦＩＸ治療薬と比較してより
多い投薬量のＦＩＸ－ＸＴＥＮ組成物が投与され得るのは、活性化可能であるＦＩＸの放
出が、切断配列の選択、または活性化可能であるＦＩＸの形態の放出前に切断する必要の
ある切断部位の数の変更によって制御できるためである。当業者が認めるように、本明細
書で開示する切断部位の任意の配列が、タンパク質分解切断の動態を改変して、それによ
りＦＩＸ放出および続いての活性化の動態に影響を及ぼすために、アミノ酸変形を切断配
列に導入することによって改変できる。
本発明は、凝固タンパク質およびＸＴＥＮを含む．ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質を提供
する。いくつかの場合において、ＢＰＸＴＥＮは、表７から選択される凝固タンパク質に
対して、少なくとも約８０％の配列同一性を、またはあるいは８１％の、８２％の、８３
％の、８４％の、８５％の、８６％の、８７％の、８８％の、８９％の、９０％の、９１
％の、９２％の、９３％の、９４％の、９５％の、９６％の、９７％の、９８％の、９９
％、もしくは１００％の配列同一性を示す凝固タンパク質を含む。上述の一実施形態にお
いて、ＢＰＸＴＥＮは、表２から選択されるＸＴＥＮに対して、少なくとも約８０％の配
列同一性を、またはあるいは８１％の、８２％の、８３％の、８４％の、８５％の、８６
％の、８７％の、８８％の、８９％の、９０％の、９１％の、９２％の、９３％の、９４
％の、９５％の、９６％の、９７％の、９８％の、９９％、もしくは１００％の配列同一
性を有するＸＴＥＮ配列をさらに含む。別の実施形態において、ＢＰＸＴＥＮは、表４３
から選択される配列に対して、少なくとも約８０％の配列同一性を、またはあるいは８１
％の、８２％の、８３％の、８４％の、８５％の、８６％の、８７％の、８８％の、８９
％の、９０％の、９１％の、９２％の、９３％の、９４％の、９５％の、９６％の、９７
％の、９８％の、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有する配列を含む。本発明は
、表７からの任意のＦＩＸ配列の、表２からの任意のＸＴＥＮの、および表１０からの任
意の切断配列の、表４３のそれぞれの構成要素、または上述したものに対して少なくとも
９０％配列同一性を有する配列に代えての置換も意図する。
別の実施形態において、ＢＰＸＴＥＮ凝固タンパク質は表７のＦＶＩＩ配列であり、Ｘ
ＴＥＮはＡＥ８６４およびＡＭ８７５から選択される。上述の一実施形態において、ＢＰ
ＸＴＥＮはＮ→Ｃ末端配置のＦＶＩＩ－ＡＥ８６４を含む。別の実施形態において、ＢＰ
ＸＴＥＮは、Ｎ→Ｃ末端でＦＶＩＩ－ＡＭ８７５として構成される。別の実施形態におい
て、構成されたＢＰＸＴＥＮは、少なくとも約７０％、または８０％、または９０％、ま
たは少なくとも約９５％以上が活性化ＦＶＩＩａ形態である、ＦＶＩＩを含む。別の実施
形態において、ＦＶＩＩおよびＸＴＥＮを含むＢＰＸＴＥＮは、表１０から選択される配
列を包含し得る、切断配列をさらに含むことができる。
（ｄ）成長ホルモンタンパク質
「成長ホルモン」または「ＧＨ」は、ヒト成長ホルモンタンパク質ならびにその種およ
び配列変異体を意味して、これに限定されるわけではないが、ＧＨの１９１単鎖アミノ酸
ヒト配列を包含する。それゆえＧＨは、天然の全長タンパク質であることができるか、ま
たは天然タンパク質の生物活性の少なくとも一部を保持する切断フラグメントもしくは配
列変異体であることができる。体の組織に対するＧＨの効果は概して、同化作用として説
明される。他の大半のタンパク質ホルモンと同様に、ＧＨは、成長ホルモン受容体と呼ば
れる特異的原形質膜受容体と相互作用することによって働く。下垂体に由来する公知の２
種類のヒトＧＨ（以下「ｈＧＨ」）：約２２，０００ダルトンの分子量を有するｈＧＨ（
２２ｋＤ ｈＧＨ）および約２０，０００ダルトンの分子量を有するｈＧＨ（２０ｋＤ
ｈＧＨ）が存在する。２０ｋＤＨＧＨは、２２ｋＤ ｈＧＨの３２番目から４６番目の
１５アミノ酸残基が消失していることを除いて、１９１アミノ酸から成る２２ｋＤ ｈＧ
Ｈのアミノ酸配列に一致するアミノ酸配列を有する。いくつかの報告は、２０ｋＤ ｈＧ
Ｈが２２ｋＤ ｈＧＨよりも低いリスクおよび高い活性を示すことが見出されたことを示
している。本発明は、本明細書のＢＰＸＴＥＮ組成物の生物活性ポリペプチドとして使用
するのに適切である２０ｋＤ ｈＧＨの使用も意図する。
本発明は、たとえば霊長類、哺乳動物（家畜を包含する）由来の天然配列変異体である
任意のＧＨ相同配列、配列フラグメント、ならびにＧＨの生物活性もしくは生物機能の少
なくとも一部を保持するＧＨおよび／またはＧＨ関連疾患、欠損、障害また症状を防止、
処置、媒介、もしくは改善するのに有用である非天然配列変異体の、ＢＰＸＴＥＮへの包
含を意図する。非哺乳動物ＧＨ配列は文献に十分に記載されている。たとえば魚類ＧＨの
配列アラインメントは、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ ２００３ ２６ ｐ．２９５－３００に見出すことができる。トリＧＨ配列の進化の
解析は、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２００６
１９ｐ．８４４－８５４に表示されている。さらにヒトＧＨに相同性の天然配列は、標
準相同性検索技法、たとえばＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴによって見出され得る。
一実施形態において、主題の組成物に組み入れられたＧＨは、自然界で見出されるタン
パク質に一致する配列を有する組換えポリペプチドであることができる。別の実施形態に
おいて、ＧＨは、天然ＧＨの生物活性の少なくとも一部を保持する天然配列の配列変異体
、フラグメント、ホモログ、またはミメティックであることができる。表８は、本発明の
ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質に含まれる多種多様の哺乳類種からのＧＨの非限定的な配列
のリストを提供する。これらのＧＨ配列または種もしくはファミリ間の個々の変異を組み
替える（ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ ）ことによって構築された相同誘導体のいずれも、本発明
の融合タンパク質に有用であり得る。ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質に組み入れることがで
きるＧＨは、表８から選択されるタンパク質配列に対して、少なくとも約８０％の配列同
一性を、またはあるいは８１％の、８２％の、８３％の、８４％の、８５％の、８６％の
、８７％の、８８％の、８９％の、９０％の、９１％の、９２％の、９３％の、９４％の
、９５％の、９６％の、９７％の、９８％の、９９％、もしくは１００％の配列同一性を
示すタンパク質を包含することができる。
Figure 0007461438000020
Figure 0007461438000021
Figure 0007461438000022

ＩＶ）ＢＰＸＴＥＮ構造物配置および特性
主題の組成物のＢＰは、天然の全長ポリペプチドに限定されないが、組換えポリペプチ
ドならびにその生物活性変異体またはフラグメントおよび／または薬理活性変異体または
フラグメントも包含する。たとえば、各種のアミノ酸置換がＧＰにて行われて、ＢＰの生
物活性または薬理特性に関して、本発明の精神から逸脱することなく変異体を生成できる
ことが認められる。ポリペプチド配列中のアミノ酸の保存的置換の例を表９に示す。しか
し、本明細書で開示する特異的配列と比較して、ＢＰの配列同一性が１００％未満である
ＢＰＸＴＥＮの実施形態において、本発明は、隣接アミノ酸残基を包含する、ＢＰの配列
内の任意の位置であり得る、他の１９の天然Ｌ－アミノ酸のいずれかによる所与のＢＰの
所与のアミノ酸残基の置換を意図する。任意の１個の置換によって生物活性の所望でない
変化が生じた場合、次に、本明細書に記載する方法によって、またはその内容が全体とし
て参照により組み入れられている、たとえばＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，３６４，９３４
に記載された保存的および非保存的変異の技法およびガイドラインのいずれかを使用して
、または当業者に概して公知の方法を使用して、代わりのアミノ酸１個を用いて、構築物
を評価することができる。さらに、変異体はたとえば、天然ペプチドの生物活性の少なく
とも一部を保持する、１個以上のアミノ酸残基がＢＰの全長天然アミノ酸配列のＮ末端ま
たはＣ末端にて付加または欠失されたポリペプチドも包含することができる。
Figure 0007461438000023

（ａ）ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質配置
本発明は、グルコース恒常性、インスリン抵抗性、または肥満に関連する疾患、障害ま
たは状態を防止、処置、媒介、または改善するのに有用な、１個以上のＸＴＥＮポリペプ
チドに連結されたＢＰを含むＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質組成物を提供する。いくつかの
場合において、ＢＰＸＴＥＮは、１個以上のＸＴＥＮポリペプチドに連結されたＢＰを有
する単量体融合タンパク質である。他の場合において、ＢＰＸＴＥＮ組成物は、１個以上
のＸＴＥＮポリペプチドに連結された２個のＢＰ分子を含むことができる。本発明は、こ
れに限定されるわけではないが、表３～８より選択されたＢＰ（またはそのフラグメント
もしくは配列変異体）、および表２より選択されたＸＴＥＮまたはその配列変異体を含む
ＢＰＸＴＥＮを意図する。いくつかの場合において、それぞれのＢＰの生物活性の少なく
とも一部は無傷のＢＰＸＴＥＮによって保持される。他の場合において、ＢＰ構成要素は
、以下でさらに十分に記載するように、スペーサ配列に組み入れられた必要に応じた切断
配列の切断によるＸＴＥＮのＢＰＸＴＥＮへのその放出の際に、生物活性となるか、また
は活性の増加を有するかのどちらかである。
ＢＰＸＴＥＮ組成物の一実施形態において、本発明は式Ｉの融合タンパク質を提供する
：
（ＢＰ）－（Ｓ）ｘ－（ＸＴＥＮ） Ｉ
式中、各出現について、独立して、ＢＰは本明細書で上記のような生物活性タンパク質で
あり；Ｓは、（以下でさらに十分に記載するような）切断配列を場合により包含すること
ができる１～約５０のアミノ酸残基を有するスペーサ配列であり；ｘは０または１のどち
らかであり；およびＸＴＥＮは本明細書で上記のような延長組換えポリペプチドである。
該実施形態は、ＢＰが所望の生物活性のために遊離Ｎ末端を必要とする、またはＢＰのＣ
末端の融合タンパク質への連結によって生物活性が低下して、投与したＢＰＸＴＥＮの生
物活性および／または副作用を低下させることが所望である、特別の有用性を有する。
ＢＰＸＴＥＮ組成物の別の実施形態において、本発明は式ＩＩの融合タンパク質（上記
の構成要素）を提供する：
（ＸＴＥＮ）－（Ｓ）ｘ－（ＢＰ） ＩＩ
式中、各出現について、独立して、ＢＰは本明細書で上記のような生物活性タンパク質で
あり；Ｓは、（以下でさらに十分に記載するような）切断配列を場合により包含すること
ができる１～約５０のアミノ酸残基を有するスペーサ配列であり；ｘは０または１のどち
らかであり；およびＸＴＥＮは本明細書で上記のような延長組換えポリペプチドである。
該実施形態は、ＢＰが所望の生物活性のために遊離Ｃ末端を必要とする場合に、またはＢ
ＰのＮ末端の融合タンパク質への連結によって生物活性が低下して、投与したＢＰＸＴＥ
Ｎの生物活性および／または副作用を低下させることが所望である場合に、特定の有用性
を有する。
それゆえ単一のＢＰおよび単一のＸＴＥＮを有するＢＰＸＴＥＮは、Ｎ→Ｃ末端方向で
それぞれ挙げられた、少なくとも以下の配置の順列を有することができる：ＢＰ－ＸＴＥ
Ｎ；ＸＴＥＮ－ＢＰ；ＢＰ－Ｓ－ＸＴＥＮ；またはＸＴＥＮ－Ｓ－ＢＰ。
別の実施形態において、本発明は単離融合タンパク質を提供し、該融合タンパク質は式
ＩＩＩの融合タンパク質であり：
（ＢＰ）－（Ｓ）ｘ－（ＸＴＥＮ）－（Ｓ）ｙ－（ＢＰ）－（Ｓ）ｚ－（ＸＴＥＮ）ｚ
ＩＩＩ
式中、各出現について、独立して、ＢＰは本明細書で上記のような生物活性タンパク質で
あり；Ｓは、（以下でさらに十分に記載するような）切断配列を場合により包含すること
ができる１～約５０のアミノ酸残基を有するスペーサ配列であり；ｘは０または１のどち
らかであり；ｙは０または１のどちらかであり；ｚは０または１のどちらかであり；およ
びＸＴＥＮは本明細書で上記のような延長組換えポリペプチドである。
別の実施形態において，本発明は単離融合タンパク質を提供し、該融合タンパク質は式
ＩＶの融合タンパク質（上記のような構成要素）である：
（ＸＴＥＮ）ｘ－（Ｓ）ｙ－（ＢＰ）－（Ｓ）ｚ－（ＸＴＥＮ）－（ＢＰ） ＩＶ 別の
実施形態において、本発明は単離融合タンパク質を提供し、該融合タンパク質は式Ｖの融
合タンパク質（上記のような構成要素）である：
（ＢＰ）ｘ－（Ｓ）ｘ－（ＢＰ）－（Ｓ）ｙ－（ＸＴＥＮ） Ｖ
別の実施形態において、本発明は単離融合タンパク質を提供し、該融合タンパク質は式
ＶＩの融合タンパク質（上記のような構成要素）である：
（ＸＴＥＮ）－（Ｓ）ｘ－（ＢＰ）－（Ｓ）ｙ－（ＢＰ） ＶＩ
別の実施形態において、本発明は単離融合タンパク質を提供し、該融合タンパク質は式
ＶＩＩの融合タンパク質（上記のような構成要素）である：
（ＸＴＥＮ）－（Ｓ）ｘ－（ＢＰ）－（Ｓ）ｙ－（ＢＰ）－（ＸＴＥＮ） ＶＩＩ
式Ｉ～ＶＩＩの融合タンパク質の上述の実施形態において、実施形態の治療的有効用量
の融合タンパク質のそれを必要とする被験体への投与によって、ＸＴＥＮに連結されてお
らず、同程度の用量で被験体に投与された対応するＢＰと比較して、少なくとも２倍、ま
たは少なくとも３倍、または少なくとも４倍、または少なくとも５倍以上の、治療ウイン
ドウ内で費やされる時間の増大をもたらすことができる。
いずれのスペーサ配列基も、本発明に含まれる融合タンパク質において任意選択である
。スペーサは、宿主細胞からの融合タンパク質の発現を増強するために、またはＢＰ構成
要素がその所望の３次構造を取り得るおよび／もしくはその標的分子と適切に相互作用し
得るように立体障害を減少させるために提供され得る。スペーサおよび所望のスペーサを
同定する方法については、たとえば参照により詳細に本明細書に組み入れられている、Ｇ
ｅｏｒｇｅら（２００３）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １５：８７１－８
７９を参照。一実施形態において、スペーサは、長さが１～５０アミノ酸残基、または長
さが約１～２５残基、もしくは約１～１０残基である１個以上のペプチド配列を含む。ス
ペーサ配列は、切断部位を除いて、２０種類の天然Ｌアミノ酸のいずれかを含むことがで
き、これに限定されるわけではないが、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）
、トレオニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）およびプロリン（Ｐ）を包含することができる
、立体障害のない親水性アミノ酸を含む。いくつかの場合において、スペーサはポリグリ
シンまたはポリアラニンであることができ、または主としてグリシン残基アラニン残基の
組み合わせの混合物である。切断配列を除くスペーサポリペプチドは、大部分から実質的
に２次構造が存在しない。一実施形態において、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質組成物の一
方または両方のスペーサ配列はそれぞれ、同一であり得るまたは異なり得る切断配列をさ
らに含有し得て、該切断配列は融合タンパク質においてプロテアーゼによる作用を受けて
、融合タンパク質からＢＰを放出し得る。
いくつかの場合において、ＢＰＸＴＥＮへの切断配列の組み入れは、ＸＴＥＮからのＢ
Ｐの放出の際に活性にまたはより活性になるＢＰの放出を可能にするように設計される。
切断後にＢＰに付着しているいずれの残存残基もＢＰの活性（たとえば受容体への結合）
を認められるほどには妨害しないが、プロテアーゼへの十分なアクセスを提供して切断配
列の切断を行うように、切断配列はＢＰ配列に十分接近して、概してＢＰ配列末端の１８
アミノ酸以内に、または１２アミノ酸以内に、または６アミノ酸以内に、または２アミノ
酸以内に位置する。いくつかの実施形態において、ＢＰＸＴＥＮが被験体への投与後に切
断できるように、切断部位は、哺乳動物被験体に内因性のプロテアーゼによって切断でき
る配列である。このような場合、ＢＰＸＴＥＸはプロドラッグまたはＢＰの循環デポーと
して働くことができる。本発明で意図される切断部位の例は、これに限定されるわけでは
ないが、ＦＸＩａ、ＦＸＩＩａ、カリクレイン、ＦＶＩＩａ、ＦＩＸａ、ＦＸａ、ＦＩＩ
ａ（トロンビン）、エラスターゼ－２、グランザイムＢ、ＭＭＰ－１２、ＭＭＰ－１３、
ＭＭＰ－１７もしくはＭＭＰ－２０から選択される哺乳動物内因性プロテアーゼによって
、または非哺乳動物プロテアーゼ、たとえばＴＥＶ、エンテロキナーゼ、ＰｒｅＳｃｉｓ
ｓｉｏｎ（商標）プロテアーゼ（ライノウイルス３Ｃプロテアーゼ）およびソルターゼＡ
によって切断できるポリペプチド配列を包含する。上述のプロテアーゼによって切断され
ることが知られている配列は、当分野で公知である。例示的な切断配列および配列内のカ
ット部位を配列変異体と共に表１０に表示する。たとえばトロンビン（活性化凝固第ＩＩ
因子）は、配列の４位のアルギニンの後でカットされる、配列ＬＴＰＲＳＬＬＶ（配列番
号２２２）に作用する［Ｒａｗｌｉｎｇｓ Ｎ．Ｄ．ら（２００８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３６：Ｄ３２０］。活性ＦＩＩａは、リン脂質およびカルシウムの
存在下でのＦＸａによるＦＩＩの切断によって産生され、凝固経路の第ＩＸ因子から下流
にある。いったん活性化されると、凝固におけるその天然の役割はフィブリノーゲンを切
断することであり、これにより次に、今度はクロット形成が開始する。ＦＩＩａ活性は厳
重に制御され、適正な止血のために凝固が必要なときにのみ出現する。しかし凝固は、Ｂ
ＰＸＴＥＮのＢＰとＸＴＥＮとの間への、ＬＴＰＲＳＬＬＶ（配列番号２２３）配列の組
み入れによる、哺乳動物における進行中のプロセスであるため、ＸＴＥＮドメインは、凝
固が生理的に必要とされるときに外因性または内因性のどちらかの凝固経路の活性化と同
時に、隣のＢＰから除去されて、それにより経時的にＢＰが放出される。同様に、内因性
プロテアーゼによる作用を受けるＢＰＸＴＥＮへの他の配列の組み入れは、特定の場合に
は、より高度の活性をＢＰＸＴＥＮの「プロドラッグ」形態からのＢＰに提供し得る、Ｂ
Ｐの持続放出を提供する。
いくつかの場合において、カット部位の両側にフランキングするわずか２または３のア
ミノ酸（合計４～６アミノ酸）が切断配列に組み入れられる。他の場合において、公知の
切断配列は、１個以上の欠失もしくは挿入を有し得るかまたは公知の配列任意の１個もし
くは２個もしくは３個のアミノ酸に代えての１個もしくは２個もしくは３個のアミノ酸に
よる置換を有することができ、欠失、挿入または置換は、プロテアーゼに対する感受性の
非存在ではなく、感受性の低下または増強を生じて、ＸＴＥＮからのＢＰの放出速度を適
応させる能力を生じる。例示的な置換を表１０に示す。
Figure 0007461438000024

一実施形態において、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質に組み入れられたＢＰは、表３～８
からの配列に対して少なくとも約８０％配列同一性を、あるいは表３～８からの配列と比
較して少なくとも約８１％の、または約８２％の、または約８３％の、または約８４％の
、または約８５％の、または約８６％の、または約８７％の、または約８８％の、または
約８９％の、または約９０％の、または約９１％の、または約９２％の、または約９３％
の、または約９４％の、または約９５％の、または約９６％の、または約９７％の、また
は約９８％の、または約９９％の、または約１００％の配列同一性を示す配列を有するこ
とができる。上述の実施形態のＢＰは、本明細書に記載するアッセイまたは測定もしくは
決定されたパラメータを使用して、活性について評価することができ、対応する天然ＢＰ
配列と比較して、少なくとも約４０％の、または約５０％の、または約５５％の、または
約６０％の、または約７０％の、または約８０％の、または約９０％の、または約９５％
以上の活性を保持する配列は、主題のＢＰＸＴＥＮへの包含に好適と見なされる。好適な
活性レベルを保持することが見出されたＢＰは、本明細書で上記の１個以上のＸＴＥＮポ
リペプチドに連結させることができる。一実施形態において、好適な活性レベルを保持す
ることが見出されたＢＰは、表２からの配列に対して少なくとも約８０％の配列同一性を
、あるいは表２の配列と比較して少なくとも約８１％の、８２％の、８３％の、８４％の
、８５％の、８６％の、８７％の、８８％の、８９％の、９０％の、９１％の、９２％の
、９３％の、９４％の、９５％の、９６％の、９７％の、９８％の、９９％の、または約
１００％の配列同一性を有する１個以上のＸＴＥＮポリペプチドに連結させて、キメラ融
合タンパク質を生じることができる。
単一のＸＴＥＮに連結された単一のＢＰを含有する融合タンパク質の配列の非限定的な
例を表４０、４２、４３、および４４に表示する。一実施形態において、ＢＰＸＴＥＮ組
成物は、表４０、４２、４３の、または４４からのＢＰＸＴＥＮに少なくとも約８０％配
列同一性を、あるいは表４０、４２、４３、または４４からのＢＰＸＴＥＮと比較して少
なくとも約８１％の、８２％の、８３％の、８４％の、８５％の、８６％の、８７％の、
８８％の、８９％の、９０％の、９１％の、９２％の、９３％の、９４％の、９５％の、
９６％の、９７％の、９８％の、９９％の、または約１００％の配列同一性を有する融合
タンパク質を含む。１個以上のＸＴＥＮに連結された同じＢＰの分子２個を含有する融合
タンパク質の配列の非限定的な例を表４１に表示するが、本発明は、表２から選択された
同じであり得るまたは異なり得る、１個または２個のＸＴＥＮに連結された表３～８から
選択される他のＢＰの置換も意図する。本段落における本明細書で上記の、上述の融合タ
ンパク質において、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質は、表１０からの切断配列をさらに含む
ことができる；該切断配列は、ＢＰとＸＴＥＮとの間にまたは隣接ＢＰ間に位置する。い
くつかの場合において、切断配列を含むＢＰＸＴＥＮは、ＢＰと切断配列との間にまたは
ＸＴＥＮと切断配列との間に１個以上のスペーサ配列アミノ酸も有し、プロテアーゼのア
クセスを促進する；任意の天然アミノ酸を含む該スペーサアミノ酸は、好ましいアミノ酸
としてグリシンおよびアラニンを包含する。ＢＰ、ＸＴＥＮ、切断配列（複数可）および
スペーサアミノ酸を含むＢＰＸＴＥＮの非限定的な例を表４２および４３に表示する。し
かし、本発明は、表３～８のＢＰ配列のいずれかによる表４２または４３のＢＰ配列に代
えての置換、表２の任意のＸＴＥＮ配列による表４２または４３のＸＴＥＮ配列に代えて
の置換、および表１０の任意の切断配列による表４２または４３の切断配列に代えての置
換も意図する。
（ｂ）ＢＰＸＴＥＮの薬物動態特性
本発明は、本明細書に記載する方法によって組成物に対して決定された用量で使用され
るときに、薬理学的効果を生じるが、ＸＴＥＮに連結されていないＢＰの同程度の用量と
比較して延長された期間にわたって組成物の生物活性構成要素の安全範囲内になおとどま
る循環濃度を達成することができる、ＸＴＥＮに連結されていないＢＰと比較して薬物動
態が増強されたＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質を提供する。このような場合、ＢＰＸＴＥＮ
は、延長された期間にわたって融合タンパク質組成物の治療ウインドウ内に依然として存
在する。本明細書で使用する場合、「同程度の用量」は、同程度の様式で被験体に投与さ
れる活性ＢＰのファルマコフォアと等価のモル／ｋｇを有する用量を意味する。ＢＰＸＴ
ＥＮ融合タンパク質の「同程度の投薬量」は、薬剤のより大きい重量を表すが、融合タン
パク質の用量におけるＢＰの本質的に同じモル当量を有するおよび／またはＢＰに対して
同じおおよそのモル濃度を有することが、当分野で理解される。
所与のＸＴＥＮをＢＰに連結することによって増強することができるＢＰの薬物動態特
性は、最終半減期、曲線下面積（ＡＵＣ）、Ｃｍａｘ分布容積、および生物学的利用能を
包含する。
ＸＴＥＮを含む融合タンパク質の薬物動態特徴に関する実施例でさらに十分に記載する
ように、ＸＴＥＮ配列の長さの増加が、ＸＴＥＮを含む融合タンパク質の最終半減期の不
均衡な増加を与え得ることが驚くべきことに発見された。したがって本発明は、被験体に
投与されるＢＰＸＴＥＮ組成物に対する標的とする半減期を提供するようにＸＴＥＮを選
択することができる、ＸＴＥＮを含むＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質を提供する。いくつか
の実施形態において、本発明は、ＸＴＥＮを含む単量体融合タンパク質を提供し、ここで
、ＸＴＥＮが、融合タンパク質に連結されていない対応するＢＰと比較して、投与したＢ
ＰＸＴＥＮの最終半減期において少なくとも約２倍の長さの増加を、または少なくとも約
３倍の、または少なくとも約４倍の、または少なくとも約５倍の、または少なくとも約６
倍の、または少なくとも約７倍の、または少なくとも約８倍の、または少なくとも約９倍
の、または少なくとも約１０倍の、または少なくとも約１５倍の、または少なくとも２０
倍以上の、融合タンパク質に連鎖されていないＢＰと比較した最終半減期の増加を与える
ように選択される。同様に、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質は、融合タンパク質に連結され
ていない対応するＢＰと比較して、少なくとも約５０％のＡＵＣの増加を、または少なく
とも約６０％の、または少なくとも約７０％の、または少なくとも約８０％の、または少
なくとも約９０％の、または少なくとも約１００％の、または少なくとも約１５０％の、
または少なくとも約２００％の、または少なくとも約３００％のＡＵＣの増加を有するこ
とができる。ＢＰＸＴＥＮの薬物動態パラメータは、投与量（ｄｏｓｉｎｇ）、時間間隔
での血液試料の採取、およびＥＬＩＳＡ、ＨＰＬＣ、放射能定量、または当分野で公知の
もしくは本明細書に記載するような他の方法を使用するタンパク質のアッセイを含む標準
方法、続いての半減期および他の薬物動態パラメータを導出するデータの標準計算によっ
て決定することができる。
本発明は、切断配列をさらに含み得るスペーサ配列によって場合により離された、また
は第２のＸＴＥＮ配列によって離された、第１および第２のＢＰ分子を含むＢＰＸＴＥＮ
をさらに提供する。一実施形態において、ＢＰは、融合タンパク質に連結されていない対
応するＢＰと比較して、融合タンパク質に連結されたときにより低い活性を有する。この
ような場合、図３８に例証されるように、被験体への投与の際にＢＰ構成要素が切断配列
（複数可）の切断によって徐々に放出され、その上、ＢＰ構成要素が活性またはその標的
受容体もしくはリガンドに結合する能力を回復するように、ＢＰＸＴＥＮを設計すること
ができる。したがって上述のＢＰＸＴＥＮはプロドラッグまたは循環デポーとして働き、
融合タンパク質に連結されていないＢＰと比較して、より長い最終半減期を生じる。
（ｃ）ＢＰＸＴＥＮの薬理特性および薬学的特性
本発明は、ＸＴＥＮに連結されていないＢＰと比較して増強された特性を有することが
できる、ＸＴＥＮに共有結合的に連結されたＢＰを含むＢＰＸＴＥＮ組成物、ならびに組
成物の２つのそれぞれのＢＰ構成要素の治療活性または効果および／もしくは生物活性ま
たは効果を増強する方法を提供する。さらに本発明は、免疫グロブリンポリペプチドパー
トナー、より短い長さのポリペプチドおよび／または反復性配列を有するポリペプチドパ
ートナーを含有する当分野で公知の融合タンパク質と比較して、増強された特性を有する
ＢＰＸＴＥＮ組成物を提供する。さらにＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質は、化学コンジュゲ
ート、たとえばＰＥＧ化構築物に勝る顕著な利点、注目すべきは、生成物の研究および開
発段階ならびに製造段階の両方で時間および費用を低下させて、ならびにＰＥＧ化コンジ
ュゲートと比較してＢＰＸＴＥＮの生成物および代謝産物の両方についてより毒性の低い
、より均質で明確な生成物を生じることが可能な細菌細胞発現系において、組換えＢＰＸ
ＴＥＮ融合タンパク質を作製することができるという事実を提供する。
治療剤として、ＢＰＸＴＥＮはたとえば溶解度の増加、熱安定性の増加、免疫原性の低
下、見かけの分子量の増加、腎クリアランスの低下、タンパク質分解の低下、代謝の低下
、治療効率の増強、有効治療用量の低減、生物学的利用能の増加、ＢＰの治療ウインドウ
内で血中濃度を維持する投薬間の時間の増加、「適応された（ｔａｉｌｏｒｅｄ）」吸収
速度、凍結乾燥安定性の増強、血清／血漿安定性の増強、最終半減期の増加、血流中での
溶解度の増加、中和抗体による結合の減少、受容体媒介クリアランスの低下、副作用の低
下、受容体／リガンド結合親和性または受容体／リガンド活性化の保持、分解に対する安
定性、凍結－解凍に対する安定性、プロテアーゼに対する安定性、ユビキチン化に対する
安定性、投与の容易さ、他の薬学的賦形剤またはキャリアとの適合性、被験体においての
残留性、貯蔵安定性の増加（たとえば貯蔵寿命の増加）、生物または環境における毒性の
低下などを包含する、ＸＴＥＮを含まない治療剤に勝るいくつかの利点を所有し得る。増
強された特性の正味の効果は、ＢＰＸＴＥＮが、代謝性疾患または障害を有する被験体に
投与されたときに、治療効果および／または生物学的効果の増強を生じ得ることである。
ＢＰの薬学的または物理化学特性（たとえば水溶解度または安定性の程度）の増強が所
望である他の場合において、第１および第２の融合タンパク質の第１および第２のＸＴＥ
Ｎ配列の長さおよび／またはモチーフファミリ組成物は、ＢＰＸＴＥＮ組成物の薬学的特
性全体が増強されるように、異なる程度の溶解度および／または安定性をそれぞれの融合
タンパク質に与えるようにそれぞれ選択され得る。ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質は、本明
細書に記載する方法を使用して構築およびアッセイされて、物理化学特性および所望の特
性を生じるために必要に応じて調整されたＸＴＥＮを確認することができる。一実施形態
において、ＢＰＸＴＥＮのＸＴＥＮ配列は、融合タンパク質が融合タンパク質に連結され
ていないＢＰと比較して少なくとも２５％まで大きい、または融合タンパク質に連結され
ていない対応するＢＰよりも少なくとも約３０％、または少なくとも約４０％、または少
なくとも約５０％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約１００％、または少
なくとも約２００％、または少なくとも約３００％、または少なくとも約４００％、また
は少なくとも約５００％、または少なくとも約１０００％大きい水溶解度を有するように
選択される。本段落の上で記載した上記の実施形態において、融合タンパク質のＸＴＥＮ
は、表２から選択されたＸＴＥＮに対して少なくとも約８０％の配列同一性を、または約
９０％の、または約９１％の、または約９２％の、または約９３％の、または約９４％の
、または約９５％の、または約９６％の、または約９７％の、または約９８％の、または
約９９％の、または約１００％の配列同一性を有することができる。
一実施形態において，本発明は、ＸＴＥＮに連結されていない対応するＢＰの同程度の
投薬量と比較して、より長期間にわたって治療ウインドウ内にＢＰ構成要素を維持するこ
とができるＢＰＸＴＥＮ組成物を提供する。ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質の「同程度の投
薬量」は、薬剤のより大きい重量を表すが、融合タンパク質の用量にＢＰの同じおおよそ
のモル当量を有するおよび／またはＢＰに対して同じおおよそのモル濃度を有することが
、当分野で理解される。
本発明は、用量の選択と適合したときに、延長された期間にわたって治療ウインドウ内
にＢＰの循環濃度を維持することによって投与された組成物の有効性の増加を可能にする
、所望の薬物動態特性を提供するためのコンジュゲーションに適切なＸＴＥＮを選択する
方法も提供する。本明細書で使用する場合、「治療ウインドウ」は、許容されない毒性を
伴わずに、時間の経過とともに、疾患または症状に対する有効性または所望の薬理学的効
果を提供する、血中または血漿濃度範囲としての薬物または生物製剤の量；任意の正の治
療効果を達成する最小量と、被験体に対する毒性の直前の応答である（より高い用量また
は濃度における）応答を生じる最大量との間の循環血中濃度の範囲を意味する。その上、
治療ウインドウは概して、時間の側面；許容されない毒性または有害事象を生じない、経
時的に所望の薬理学的効果を生じる最大および最小濃度を含む。被験体に対する治療ウイ
ンドウ内にとどまっている投薬された組成物は、「安全性範囲」内にあると言うことがで
きる。
用量最適化は、すべての薬物、とりわけ狭い治療ウインドウを有する薬物にとっては重
要である。たとえばグルコース恒常性に関与する多くのペプチドは、狭い治療ウインドウ
を有する。狭い治療ウインドウを有するＢＰ、たとえばグルカゴンまたはグルカゴン類似
体では、多種多様の症状を示すすべての患者について標準化された単回用量は、常に有効
ということでないこともある。異なるグルコース調節ペプチドは糖尿病被験体の処置で共
に使用されることが多いため、それらを共に組み合わせるおよび投薬することによって達
成される、それぞれの効果および相互作用効果もまた考慮する必要がある。許容されない
毒性を生じ、該毒性を安全性範囲外に置くことになる量と対比してＢＰＸＴＥＮの治療的
または薬理学的有効量を決定する目的でのこれらの因子の考慮は、十分に通常の技術を有
する臨床医の範囲内である。
多くの場合において、主題の組成物のＢＰ構成要素の治療ウインドウは確立されており
、公開された文献で入手できるか、またはＢＰを含有する承認された生成物の薬物ラベル
に明示されている。他の場合において、治療ウインドウを確立することができる。所与の
組成物について治療ウインドウを確立する方法は、当業者に公知である（たとえばＧｏｏ
ｄｍａｎ ＆ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉ
ｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，１１ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉ
ｌｌ（２００５）を参照）。たとえば有効性または所望の薬理学的効果を決定するための
標的疾患または障害を有する被験体における用量増加試験を用いることによって、有害事
象の出現、および循環血中濃度の決定、所与の被験体または被験体集団の治療ウインドウ
を、所与の薬物もしくは生物製剤、または生物製剤もしくは薬物の組み合わせについて決
定することができる。用量増加試験によって、当分野で公知であるような、または代謝性
疾患もしくは障害に関連付けられている１個以上のパラメータについて本明細書で記載す
るような生理学的または生化学的パラメータ、または観察結果と共に、特定の適応症につ
いての有益な結果に関連する臨床パラメータおよび／または決定されたまたは得られた循
環血中濃度を確立する薬物動態パラメータの測定と共に、無作用量、有害事象、最大許容
投与量などを決定する測定パラメータを監視する被験体または被験体群での代謝試験を通
じて、ＢＰＸＴＥＮの活性を評価することができる。結果は次に、投与された用量および
上述の決定されたパラメータまた効果レベルと一致する治療剤の血中濃度と相関させるこ
とができる。これらの方法により、一連の用量および血中濃度を最小有効用量ならびに最
大用量および所望の効果が出現して、それを超えると毒性が生じる血中濃度と相関させて
、これにより投薬された治療薬の治療ウインドウを確立することができる。最大を超える
融合タンパク質の（またはＢＰ構成要素によって測定されたような）血中濃度は、治療ウ
インドウ外または安全性範囲外と見なされる。それゆえ上述の方法により、Ｃｍｉｎ血中
濃度が確立され、該Ｃｍｉｎより下ではＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質は所望の薬理学的効
果を有さず、許容されない副作用、毒性または有害事象を引き出す濃度に達する前に最高
循環濃度を示し、その濃度をＢＰＸＴＥＮの安全範囲外におくＣｍａｘ血中濃度が確立さ
れる。このような濃度が確立されると、投薬頻度および投薬量は、ＣｍａｘおよびＣｍｉ
ｎの測定によってさらに精密化されて、融合タンパク質（複数可）を治療ウインドウ内に
保つための適切な用量および投薬頻度を提供することができる。当業者は、本明細書で開
示する手段によってまたは当分野で公知の他の方法によって、投与されたＢＰＸＴＥＮが
所望の間隔にわたって治療ウインドウに残存することを、またはＸＴＥＮの用量もしくは
長さもしくは配列の調整を必要とすることを確認することができる。さらにＢＰＸＴＥＮ
を治療ウインドウ内に保つための適切な用量および用量頻度の決定によって、治療的有効
用量レジメン；治療ウインドウ内に残存する連続Ｃｍａｘピークおよび／またはＣｍｉｎ
トラフを生じる、治療的有効用量の融合タンパク質を使用する、それを必要とする被験体
への複数回連続用量の投与のスケジュールが確立され、標的疾患、障害または状態に関係
する少なくとも１個の測定されたパラメータの改善が生じる。いくつかの場合において、
適切な用量で被験体に投与されたＢＰＸＴＥＮは、ＸＴＥＮに連結されておらず、同程度
の用量で投与された対応するＢＰと比較して少なくとも２倍長い期間にわたって；あるい
は、ＸＴＥＮに連結されておらず、同程度の用量で投与された対応するＢＰと比較して、
少なくとも約３倍長い；あるいは少なくとも約４倍長い；あるいは少なくとも約５倍長い
；あるいは少なくとも約６倍長い；あるいは少なくとも約７倍長い；あるいは少なくとも
約８倍長い；あるいは少なくとも約９倍長いまたは少なくとも約１０倍以上長い期間にわ
たって、治療ウインドウ内に残存するＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質の血中濃度を生じ得る
。本明細書で使用する場合、「適切な用量」は、被験体に投与したときに所望の治療効果
または薬理学的効果ならびに治療ウインドウ内の血中濃度を生じる、薬物または生物製剤
の用量を意味する。
一実施形態において、治療的有効用量レジメンで投与されるＢＰＸＴＥＮは、融合タン
パク質に連結されておらず、同程度の用量レジメンで被験体に投与される融合タンパク質
の対応する生物活性タンパク質と比較して、融合タンパク質の血中濃度の少なくとも２つ
の連続するＣｍａｘピークおよび／またはＣｍｉｎトラフの間に、少なくとも約３倍長い
；あるいは少なくとも約４倍長い；あるいは少なくとも約５倍長い；あるいは少なくとも
約６倍長い；あるいは少なくとも約７倍長い；あるいは少なくとも約８倍長い；あるいは
少なくとも約９倍長いまたは少なくとも約１０倍長い、時間の増大を生じる。別の実施形
態において、治療的有効用量レジメンで投与されるＢＰＸＴＥＮは、融合タンパク質に連
結されておらず、ＢＰの治療的有効用量レジメンを使用して被験体に投与される、対応す
る生物活性タンパク質構成要素（複数可）と比較して、薬学的組成物の融合タンパク質の
より低い頻度の投薬またはより少ない総投薬量（モル）を使用する１個、または２個、ま
たは３個以上の測定パラメータの類似した改良を生じる。測定パラメータは、本明細書で
開示する臨床パラメータ、生化学パラメータ、もしくは生理学的パラメータのいずれか、
またはグルコースもしくはインスリン関連障害、代謝性疾患もしくは障害、凝固（ｃｏａ
ｇｕａｔｉｏｎ）もしくは出血障害、または成長ホルモン関連障害を有する被験体を評価
するための当分野で公知の他のパラメータを包含し得る。
機能特徴または生物活性および薬理学的活性および生じるパラメータを包含する本発明
のＢＰＸＴＥＮ組成物活性は、所望の特徴を測定するための当分野で公知の任意の好適な
スクリーニングアッセイによって決定され得る。ＢＰ構成要素を含むＢＰＸＴＥＮポリペ
プチドの活性および構造物は、本明細書に記載するアッセイ；たとえば表３９から選択さ
れる１つ以上のアッセイ、実施例のアッセイによって、または溶解度、構造物および生物
活性の保持の程度を解明するための当分野で公知の方法によって測定され得る。結合定数
（Ｋｄ）、ＥＣ５０値、ならびにリガンド－受容体複合体の解離のその半減期（Ｔ１／２
）を包含する、ＢＰ受容体またはリガンドに対するＢＰＸＴＥＮの結合特徴の決定を可能
にするアッセイを行うことができる。結合親和性は、受容体またはリガンドに特異的に結
合する能力の変化を検出する競合型結合アッセイによって測定することができる。その上
、技法、たとえばフローサイトメトリーまたは表面プラズモン共鳴を使用して結合イベン
トを検出することができる。アッセイは、可溶性受容体分子を含み得るか、または細胞発
現受容体への結合を決定し得る。このようなアッセイは、増殖、細胞死、アポトーシスお
よび細胞遊走のアッセイを含む細胞に基づくアッセイを包含し得る。他の可能なアッセイ
は、発現ポリペプチドの受容体結合を決定し得て、該アッセイは可溶性受容体分子を含み
得るか、または細胞発現受容体への結合を決定し得る。対応するＢＰの標的受容体または
リガンドに対するＢＰＸＴＥＮの結合親和性は、結合アッセイまたは競合結合アッセイ、
たとえばＵＳ Ｐａｔｅｎｔ ５，５３４，６１７に記載されるようなチップ結合受容体
もしくは結合タンパク質を用いるＢｉａｃｏｒｅアッセイまたはＥＬＩＳＡアッセイ、本
明細書の実施例に記載されるアッセイ、放射受容体アッセイ、または当分野で公知の他の
アッセイを使用してアッセイすることができる。さらにＢＰ配列変異体（単一構成要素と
してまたはＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質としてアッセイされる）は、競合的ＥＬＩＳＡ結
合アッセイを使用して天然ＢＰと比較して、ＢＰ配列変異体がＢＰＸＴＥＮへの包含に好
適であるように、ＢＰ配列変異体が天然ＢＰ、またはいくつかのその一部と同じ結合特異
性および親和性を有するか否かを決定することができる。
本発明は、ＢＰＸＴＥＮによるＢＰ標的受容体またはリガンドに対する結合親和性がＸ
ＴＥＮに結合されていない天然ＢＰの標的受容体またはリガンドに対する親和性の少なく
とも約１０％、または少なくとも約２０％、または少なくとも約３０％、または少なくと
も約４０％、または少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％、または少なくとも
約７０％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約
９５％、または少なくとも約９９％、または少なくとも約１００％以上であることができ
る単離ＢＰＸＴＥＮを提供する。いくつかの場合において、主題ＢＰＸＴＥＮとＢＰＸＴ
ＥＮの天然受容体またはリガンドとの間の結合親和性Ｋｄは、ＢＰＸＴＥＮと天然受容体
またはリガンドとの間の親和性の少なくとも約１０－４Ｍ、あるいは少なくとも約１０－
５Ｍ、あるいは少なくとも約１０－６Ｍ、または少なくとも約１０－７Ｍである。
他の場合において、本発明は、融合タンパク質が高い親和性で標的受容体に結合して、
それにより天然リガンドに対する拮抗活性を生じるように設計されている単離ＢＰＸＴＥ
Ｎを提供する。このようなＢＰＸＴＥＮの非限定的な例はＩＬ－１ｒａＸＴＥＮであり、
該ＩＬ－１ｒａＸＴＥＮは結合組成物がＩＬ－１αおよび／またはＩＬ－１βのＩＬ－１
受容体への結合を実質的に妨害するように、ＩＬ－１受容体に結合するために構成されて
いる。特定の場合において、アンタゴニストＢＰＸＴＥＮ（たとえばこれに限定されるわ
けではないがＩＬ－１ｒａＸＴＥＮ）による天然リガンドの標的受容体への結合の妨害は
、少なくとも約１％、または約１０％、または約２０％、または約３０％、または約４０
％、または約５０％、または約６０％、または約７０％、または約８０％、または約９０
％、または約９５％、または約９９％、または約１００％であることができる。他の実施
形態において、本発明は、単離ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質の細胞受容体への結合が、天
然リガンドによって誘起されたものと比較して２０％未満の、または１０％未満の、また
は５％未満の、結合されたＢＰＸＴＥＮアンタゴニストを有する細胞のシグナル伝達経路
の活性化を引き出す、単離ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質（たとえばこれに限定されるわけ
ではないが、ＩＬ－１ｒａＸＴＥＮ）を提供する。他の場合において、拮抗性ＢＰＸＴＥ
Ｎ組成物は標的受容体に約１０ｎＭ以下の、約５ｎＭ以下の、約１ｎＭ以下の、約５００
ｐＭ以下の、約２５０ｐＭ以下の、約１００ｐＭ以下の、約５０ｐＭ以下の、または約２
５ｐＭ以下の解離定数で結合する。拮抗性ＢＰＸＴＥＮの特異的構築物の非限定的な例は
、ＩＬ－１ｒａ－ＡＭ８７５、ＩＬ－１ｒａ－ＡＥ８６４、またはＩＬ－１ｒａ－ＡＭ
１２９６を包含することができる。
いくつかの場合において、本発明のＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質は、公知のまたは代謝
性症状および障害の処置および防止での天然ＢＰの使用と関連付けられているインビトロ
生物活性または薬理学的効果に関する、該融合タンパク質に連結されていない対応するＢ
Ｐの生物活性の、少なくとも約１０％、または約２０％、３０％、４０％、５０％、６０
％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％パーセントを保持する。上
述の実施形態のいくつかの場合において、ＢＰ構成要素の活性は無傷のＢＰＸＴＥＮ融合
タンパク質によって明らかであり得るが、他の場合においてＢＰ構成要素の活性は、ＢＰ
ＸＴＥＮ融合タンパク質に組み入れられた切断配列に作用するプロテアーゼの作用による
融合タンパク質からのＢＰの切断および放出の際にに主に明らかになる。上述において、
図３に例証されるように、ＢＰＸＴＥＮは、上でさらに十分に記載したように、ＸＴＥＮ
に連結されているときには受容体またはリガンドに対するＢＰ構成要素の結合親和性を低
下させるが、ＢＰＸＴＥＮ配列に組み入れられた切断配列（複数可）の切断によるＸＴＥ
Ｎから放出されるときには親和性の増加を有するように設計することができる。
他の場合において、ＢＰＸＴＥＮは、ＸＴＥＮに連結されているときにＢＰ構成要素の
結合親和性を低下させて、たとえば受容体媒介クリアランスを低下させることによって被
験体に投与されたＢＰＸＴＥＮの最終半減期を増加するか、または投与された組成物によ
る毒性もしくは副作用を低下させる。ＸＴＥＮに連結されていないＢＰの毒物学的無作用
量または血中濃度が低い場合（天然ペプチドが副作用を生じる高い可能性を有することを
意味する）、本発明はＢＰ構成要素の生物有効性または活性を低下させるように構成され
ているＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質を提供する。
いくつかの場合において、ＢＰＸＴＥＮの配置により対応するＢＰ構成要素の結合親和
性の低下を生じないＢＰＸＴＥＮの活性と比較して、結合親和性の実質的な低下（Ｋｄと
して発現される）および対応する生物活性の低下を有するように構成できること、ならび
にこのような配置が長い最終半減期を呈すると共に十分な程度の生物活性を保持する組成
物を有する点で好都合であることが見出されている。１例において、単一のＸＴＥＮのグ
ルカゴンのＣ末端への連結によってその標的受容体への顕著な結合親和性の保持が生じる
が（実施例３１を参照）、ＸＴＥＮのＮ末端への連結によって、ＸＴＥＮがＣ末端に結合
されている構築物と比較して、その結合親和性および対応する生物活性が低下することが
見出されている。別の例において、実施例に記載されるように、ヒト成長ホルモン（ｈＧ
Ｈ）のＸＴＥＮ分子のＣ末端への連結によってｈＧＨ受容体への結合が実質的に妨害され
ないが、同じ分子のＣ末端への第２のＸＴＥＮの付加（第２のＸＴＥＮのｈＧＨのＣ末端
への配置）によって、ｈＧＨ受容体に対する分子の親和性が低下して、ＸＴＥＮ－ｈＧＨ
配置と比較してＸＴＥＮ－ｈＧＨ－ＸＴＥＮ配置の最終半減期の増加も生じたことが見出
されている。ＢＰのその標的受容体への結合親和性を低下させる能力は、特定のＢＰが遊
離Ｎ末端またはＣ末端を有する必要条件に依存し得る。したがって本発明は、少なくとも
第１の生物活性タンパク質および１個以上のＸＴＥＮを含む、構成要素の特異的Ｎ→Ｃ末
端配置を有する単鎖融合タンパク質構築物を産生することによってＢＰＸＴＥＮの最終半
減期を増加する方法を提供し、生物活性タンパク質およびＸＴＥＮ構成要素の第１のＮ→
Ｃ末端配置にある該融合タンパク質は、第２のＮ→Ｃ末端配置のＢＰＸＴＥＮと比較して
受容体媒介クリアランス（ＲＭＣ）の低下および対応する最終半減期の増加を有する。上
述の一実施形態において、ＢＰＸＴＥＮは、Ｎ→Ｃ末端でＢＰ－ＸＴＥＮとして構成され
る。上述の別の実施形態において、ＢＰＸＴＥＮは構成されたＸＴＥＮ－ＢＰである。上
述の別の実施形態において、ＢＰＸＴＥＮは構成されたＸＴＥＮ－ＢＰ－ＸＴＥＮである
。後者の実施形態において、２個のＸＴＥＮ分子は同一であることができるか、または該
ＸＴＥＮ分子は異なる配列組成物または長さであり得る。単一のＢＰに連結された２個の
ＸＴＥＮを有する上述の実施形態の非限定的な例は、構築物ＡＥ９２１－ｈＧＨ－ＡＥ１
４４（配列番号１８１７）、ＡＥ９２１－ｈＧＨ－ＡＥ２８８（配列番号１８１８、ＡＥ
８６４－ｈＧＨ－ＡＥ１４４、ＡＭ８７５－ｈＧＨ－ＡＥ１４４、およびＡＭ８７５－ｈ
ＧＨ－ＡＥ２８８を包含する。１個のＸＴＥＮに連結された１個のＢＰを有する上述の実
施形態の非限定的な例は、ＡＥ１４４－グルカゴン（配列番号８２７）、ＡＥ２８８－グ
ルカゴン（配列番号８２８）、ＡＤ５７６－グルカゴン（配列番号８３１）、ＡＭ９２３
－グルカゴン（配列番号８４０）、Ｙ７２－グルカゴン（配列番号８２３）、ＡＭ８７５
－ＩＬ－１ｒａまたはＡＥ８６４－ＩＬ－ｌｒａを包含する。本発明は、表３～８からの
ＢＰおよび表２からのＸＴＥＮによって上述の例のそれぞれの構成要素が置換され、それ
ぞれの構成要素の代替配置と比較して、構築物が受容体媒介クリアランスの低下を有する
ように構成されている、他の構築物を意図する。
いくつかの場合において、該方法は、受容体媒介クリアランスの低下が、ＲＭＣが低下
していない第２の配置のＢＰＸＴＥＮの半減期と比較して、少なくとも２倍の、または少
なくとも３倍の、または少なくとも４倍の、または少なくとも５倍の最終半減期の増加を
生じることができる、構成されたＢＰＸＴＥＮを提供する。本発明は、オンレートの減少
またはオフレートの増加のどちらかの結果としての受容体に対する結合親和性の低下が、
Ｎ末端またはＣ末端のどちらかの障害、および別のＢＰ、ＸＴＥＮ、またはスペーサ配列
のいずれにせよ、組成物の別のポリペプチドへの連結としてその末端を使用することによ
って成し遂げられ得る、ＢＰリガンドを利用する。ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質の特定の
配置を選定することにより、受容体媒介クリアランスの速度低下が達成されるように受容
体に対する結合親和性の程度を低下させることができる。概して、受容体の活性化は、活
性化を伴わないポリペプチドのその受容体の結合によってＲＭＣがもたらされないが、受
容体の活性化によってＲＭＣがもたらされるように、ＲＭＣに連結されている。しかし、
特にリガンドがオフレートを増加させたいくつかの場合において、リガンドはそれにもか
かわらず、受容体媒介クリアランスを誘発せずに細胞シグナル伝達を開始するのに十分に
結合し得て、ＢＰＸＴＥＮが生物学的に利用可能なままであるという最終結果を伴う。こ
のような場合、構成されたＢＰＸＴＥＮは、より高度のＲＭＣをもたらす配置と比較して
、半減期の増加を有する。
受容体媒介クリアランスを低下させるために結合親和性の低下が所望であるが、生物活
性の少なくとも一部の保持が所望である場合、所望の受容体活性化を得るのに十分な結合
親和性がそれにもかかわらず維持される必要があることが明らかになる。それゆえ一実施
形態において、本発明は、標的受容体に対するＢＰＸＴＥＮの結合親和性が、結合親和性
が低下していない配置の対応するＢＰＸＴＥＮと比較した結合親和性の約０．０１％～４
０％の、または約０．１％～３０％の、または約１％～２０％の範囲にあるように構成さ
れたＢＰＸＴＥＮを提供する。構成されたＢＸＴＥＮの結合親和性はそれゆえ好ましくは
、同程度の条件下で決定された、標的受容体に対するＢＰ構成要素の結合親和性が、低下
していない配置の対応するＢＰＸＴＥＮの結合親和性と比較して、または融合タンパク質
に連結されていないＢＰと比較して、少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、
または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％、ま
たは少なくとも約９９．９％、または少なくとも約９９．９９％低下する。別様に表現す
れば、構成されたＢＰＸＴＥＮのＢＰ構成要素は、ＢＰ構成要素の結合親和性が低下して
いない配置でのＢＰＸＴＥＮの対応するＢＰ構成要素の結合親和性の、わずか約０．０１
％、または少なくとも約０．１％、または少なくとも約１％、または少なくとも約２％、
または少なくとも約３％、または少なくとも約４％、または少なくとも約５％、または少
なくとも約１０％、または少なくとも約２０％の結合親和性を有し得る。本段落の上で記
載した上述の実施形態において、標的受容体に対する構成されたＢＰＸＴＥＮの結合親和
性は、対応するＢＰ構成要素の結合親和性が低下していない配置を有する、対応する天然
ＢＰまたはＢＰＸＴＥＮと比較して、「実質的に低下して」いる。したがって、本発明は
、所望のインビボ生物応答を得るのに十分な数の受容体を結合および活性化するが、この
ような応答を得るのに必要なものより多くの受容体の活性化を回避することができるよう
に、ＢＰＸＴＥＮを構成することによって、ＲＭＣの低下を有する組成物およびＲＭＣの
低下を有する組成物を産生する方法を提供する。一実施形態において、ＢＰＸＴＥＮは主
題ＢＰがＢＰＸＴＥＮのＮ末端にあるように構成され、投与されたＢＰＸＴＥＮのＲＭＣ
はＸＴＥＮのＣ末端に連結された主題ＢＰによって構成されたＢＰＸＴＥＮと比較して低
下しており、天然ＢＰの生物活性の少なくとも一部が保持される。別の実施形態において
、ＢＰＸＴＥＮは主題ＢＰがＢＰＸＴＥＮのＣ末端にあるように構成され、投与されたＢ
ＰＸＴＥＮのＲＭＣは、主題ＢＰがＢＰＸＴＥＮのＮ末端にあるように構成されたＢＰＸ
ＴＥＮと比較して低下しており、天然ＢＰの生物活性の少なくとも一部が保持される。別
の実施形態において、ＢＰＸＴＥＮはＮ→Ｃ末端でＸＴＥＮ－ＢＰ－ＸＴＥＮとして構成
され、投与されたＢＰＸＴＥＮのＲＭＣは１個のＸＴＥＮによって構成されたＢＰＸＴＥ
Ｎと比較して低下しており、天然ＢＰの生物活性の少なくとも一部が保持されている。こ
の特性を達成する他の配置が、たとえばＢＰの第２の分子またはスペーサ配列の付加が本
発明によって意図されることが、当業者に明らかになる。本段落の上で記載した上述の実
施形態において、ＢＰＸＴＥＮの半減期は、ＢＰ構成要素の結合親和性およびＲＭＣが低
下していない構成されたＢＰＸＴＥＮと比較して、少なくとも約５０％、または少なくと
も約７５％、または少なくとも約１００％、または少なくとも約１５０％、または少なく
とも約２００％、または少なくとも約３００％増加することができる。本段落の上で記載
した上述の実施形態において、半減期の増加によって、ＸＴＥＮに連結されていないＢＰ
と比較してまたはＢＰ構成要素が天然ＢＰと同程度の受容体に対する結合親和性を保持す
るＢＰＸＴＥＮ配置と比較して、投薬量の上昇または投薬頻度の低下が可能となる。
特異的インビボおよびエクスビボ生物アッセイも、各構成されたＢＰＸＴＥＮおよび／
またはＢＰＸＴＥＮに組み入れられるＢＰ構成要素の生物活性を評価するために使用され
得る。たとえば膵臓ベータ細胞からのインスリン分泌および／または転写の増加は、当分
野で公知の方法によって測定することができる。組織によるグルコース取り込みも、例え
ばグルコース・クランプ・アッセイなどの方法によって評価できる。代謝性疾患および障
害の処置で投与されたＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質の活性を評価するのに好適な他のイン
ビボおよびエクスビボパラメータは、空腹時グルコースレベル、ピーク食後グルコースレ
ベル、グルコース恒常性、経口グルコース負荷試験に対する応答、インスリンチャレンジ
に対する応答、ＨＡ１Ｃ、カロリー取り込み、飽満、胃排出速度、膵臓分泌、インスリン
分泌，末梢組織インスリン感受性、ベータ細胞量（ｂｅｔａ ｃｅｌｌ ｍａｓｓ）、ベ
ータ細胞破壊、血中脂質レベルもしくプロフィール、ボディマスインデックス、または体
重を包含する。これらのアッセイまたは当分野で公知の他のアッセイの結果に基づいて、
ＢＰＸＴＥＮ配置または組成物を確認することができる、または必要な場合は、調整およ
び再アッセイして標的結合親和性または生物活性を確認することができる。
例えば、タンパク質凝集、溶解度、２次および３次構造、融解特性、夾雑物質および水
の含有量などを決定する方法を包含する、発現されたタンパク質の物理特性および構造特
性を測定するための特異的アッセイおよび方法は、当分野で公知である。このような方法
は、分析用遠心分離、ＥＰＲ、ＨＰＬＣ－イオン交換、ＨＰＬＣ－サイズ排除、ＨＰＬＣ
－逆相、光散乱、キャピラリー電気泳動、円偏光二色性、示差走査熱量測定、蛍光、ＨＰ
ＬＣ－イオン交換、ＨＰＬＣ－サイズ排除、ＩＲ、ＮＭＲ、ラマン分光法、屈折率測定お
よび紫外／可視分光法を包含する。追加の方法は、Ａｒｎａｕら、Ｐｒｏｔ Ｅｘｐｒ
ａｎｄ Ｐｕｒｉｆ（２００６）４８，１－１３に開示されている。これらの方法の発明
への適用は、当業者の理解の範囲内である。
Ｖ）本発明の組成物の使用
別の態様において、本発明は、ＢＰに媒介される疾患、障害または状態において有益な
効果を達成するための方法を提供する。本発明は、比較的短い最終半減期および／または
最小有効用量と最大許容投与量との間の狭い治療ウインドウを有するＢＰの欠点および／
または制限に対処する。
一実施形態において，本発明は、被験体に治療または予防有効量のＢＰＸＴＥＮを投与
するステップを含む、被験体において有益な効果（ａｆｆｅｃｔ）を達成する方法を提供
する。有効量は、疾患または障害の処置を助けるのに有益な効果をもたらすことができる
。いくつかの場合において、有益な効果を達成するための方法は、これに限定されるわけ
ではないが、１型糖尿病，２型糖尿病、シンドロームＸ、インスリン抵抗性，高インスリ
ン血症，アテローム性動脈硬化、糖尿病性ニューロパシー、脂質異常症、肥満、摂食障害
、妊娠性糖尿病、高コレステロール血症、高血圧、膵臓ベータ細胞量の不足、肺高血圧、
または網膜神経変性プロセスを包含する、グルコース関連疾患、障害、または状態または
代謝性疾患、障害、または状態を有する被験体を処置するために、治療的有効量のＢＰＸ
ＴＥＮ融合タンパク質組成物を投与することを包含することができる。本発明のＢＰＸＴ
ＥＮ組成物による処置から利益を得ることがあるグルコース関連疾患または代謝性疾患ま
たは臨床障害の他の例は、これに限定されるわけではないが、Ｉ型糖尿病の「ハネムーン
期間」、若年性糖尿病、食欲亢進、不十分な飽満感、代謝性障害、グルカゴノーマ、クロ
ーン病、潰瘍性大腸炎、腎不全、うっ血性心不全、ネフローゼ症候群、食物取り込みの低
下が所望である障害、術後異化作用変化、冬眠心筋もしくは糖尿病性心筋症，不十分な尿
中ナトリウム排泄、過剰な尿中カリウム濃度、毒性血液量過多に関連付けられた症状また
は障害、多嚢胞性卵巣症候群、腎症、胃腸管障害、たとえば下痢、術後ダンピング症候群
、過敏性腸症候群、重症疾患多発ニューロパチー（ＣＩＰＮ）、全身性炎症反応症候群（
ＳＩＲＳ）、脂質異常症、発作、虚血後再灌流傷害、および冠動脈心疾患リスクファクタ
ー（ＣＨＤＲＦ）症候群、または食物取り込みの低下が所望である障害を包含する。
いくつかの場合において、有益な効果を達成する方法は、これに限定されるわけではな
いが、第ＶＩＩ因子欠損、第Ｘ因子欠損、第ＸＩＩ因子欠損、血友病Ａ、血友病Ｂ（クリ
スマス疾患）、血友病Ｃ、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、フォン・ウィルブラン
ト病（Ｉ型およびＩＩ型）、外傷に関連付けられた出血、または外科的出血を包含する、
凝固タンパク質欠損または出血障害を有する被験体を処置するために、治療的有効量のＢ
ＰＸＴＥＮ融合タンパク質組成物を投与することを包含することができる。
他の場合において、有益な効果を達成する方法は、これに限定されるわけではないが、
成人および小児の成長ホルモン欠損、ターナー症候群、プラーダー・ヴィリ症候群、慢性
腎不全、子宮内発育遅延、特発性低身長、ＡＩＤＳによるるい痩、肥満、多発性硬化症、
加齢、線維筋痛症、クローン病、潰瘍性大腸炎、筋ジストロフィーまたは筋肉量（たとえ
ば筋肉増強）の低下、低骨密度、または成長ホルモンが利用されるその他の任意の適応症
を包含することができる、成長ホルモン関連障害または状態を有する被験体を治療するた
めに、治療的有効量のＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質組成物を投与することを含むことがで
きる。
一実施形態において、方法は、ＸＴＥＮに連結されていないＢＰを含み、同程度の用量
で投与される薬学的組成物の投与によって媒介された効果と比較して、ＢＰ構成要素（複
数可）によって媒介された少なくとも１つのパラメータ、生理的条件、または臨床結果の
より大きな改善を生じる、治療的有効量の、ＸＴＥＮ配列（複数可）に連結されたＢＰを
含むＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質組成物および少なくとも１つの薬学的に許容され得るキ
ャリアを含む薬学的組成物をそれを必要とする被験体に投与することを含む。１実施形態
において、薬学的組成物は治療的有効用量で投与される。別の実施形態において、薬学的
組成物は、投薬期間の長さにわたって治療的有効用量レジメン（本明細書で定義するよう
な）を用いて、複数連続用量を使用して投与される。
本明細書に記載するように、ＢＰＸＴＥＮの薬物動態パラメータの増強の結果として、
ＢＰは、代謝性疾患、障害もしくは状態の症状もしくは臨床異常を防止、処置、軽減、逆
転もしくは緩和する、または処置されている被験体の生存を延ばすために、ＸＴＥＮに連
結されていない対応するＢＰと比較して、用量間のより長い間隔を使用して投与され得る
。
本発明の方法は、所望のパラメータまたは臨床効果を達成および／または維持するのに
十分な期間にわたる治療的有効量のＢＰＸＴＥＮの連続用量の投与を包含し得て、このよ
うな治療的有効量の連続用量によって、ＢＰＸＴＥＮの治療的有効用量レジメン；すなわ
ち用量が治療的有効量で投与されて、これに限定されるわけではないが、本明細書に記載
するものを包含する、代謝性疾患状態または状態の任意の臨床徴候または症状、側面、測
定パラメータまたは特徴に対する持続した有益な効果を生じる、融合タンパク質組成物の
連続投与用量のスケジュールが確立される。
ＢＰＸＴＥＮの治療的有効量は、個体の疾患状態、年齢、性別、および体重、ならびに
抗体または抗体部分が個体における所望の応答を引き出す能力などの因子によって変化し
得る。治療的有効量は、ＢＰＸＴＥＮの任意の毒性または有害作用を治療的に有益な効果
が上回る量でもある。予防的有効量は、所望の予防結果を達成するために必要な期間に必
要とされるＢＰＸＴＥＮの量を指す。
本発明の方法では、患者の利便性を改善するために、用量間の間隔を増加するために、
および持続効果を達成するために必要とされる薬物の量を低下させるために、より長期間
作用するＢＰＸＴＥＮ組成物が好ましい。一実施形態において、処置方法は、融合タンパ
ク質に連結されておらず、同程度の用量で被験体に投与される対応する構成要素（複数可
）と比較して、組成物の融合タンパク質について確立された治療ウインドウ内で費やされ
る時間の増大を生じる、治療的有効用量のＢＰＸＴＥＮのそれを必要とする被験体への投
与を含む。いくつかの場合において、治療ウインドウ内で費やされる時間の増大は、融合
タンパク質に連結されておらず、同程度の用量で被験体に投与される対応するＢＰ構成要
素と比較して、少なくとも約３倍、または少なくとも約４倍、または少なくとも約５倍、
または少なくとも約６倍、または少なくとも約８倍、または少なくとも約１０倍、または
少なくとも約２０倍、または少なくとも約４０倍である。その方法によりさらに、治療的
有効用量レジメンを使用して投与される複数連続用量のＢＰＸＴＥＮのそれを必要とする
被験体への投与が、融合タンパク質に連結されておらず、そのＢＰについて確立された用
量レジメンを使用して投与される対応するＢＰ（複数可）と比較して、融合タンパク質の
血中濃度の連続Ｃｍａｘピークおよび／またはＣｍｉｎトラフ間の時間の増大をもたらし
得ることが提供される。上述の実施形態において、連続Ｃｍａｘピークおよび／またはＣ
ｍｉｎトラフの間に費やされた時間の増大は、融合タンパク質に連結されておらず、その
ＢＰについて確立された用量レジメンを使用して投与される対応するＢＰ構成要素（複数
可）と比較して、少なくとも約３倍、または少なくとも約４倍、または少なくとも約５倍
、または少なくとも約６倍、または少なくとも約８倍、または少なくとも約１０倍、また
は少なくとも約２０倍、または少なくとも約４０倍であることができる。本段落の上で記
載した上記の実施形態において、融合タンパク質の投与は、融合タンパク質に連結されて
おらず、同程度の単位用量または用量レジメンで被験体に投与される対応するＢＰ構成要
素（複数可）と比較して、融合タンパク質のより低い単位用量（モル）を使用して、（被
験体の疾患、状態または障害を評価するのに有用であるとして本明細書で開示された）パ
ラメータの少なくとも１つの改善を生じることができる。
一実施形態において、ＢＰＸＴＥＮは、同じアッセイを使用して、または測定された臨
床パラメータに基づいて決定された、ＸＴＥＮに連結されていないＢＰ構成要素の活性よ
り大きい、臨床パラメータ、生化学パラメータまたは生理学的パラメータの１つの改善を
生じる活性を有することができる。別の実施形態において、ＢＰＸＴＥＮは、同じアッセ
イを使用して、または測定された臨床パラメータに基づいて決定された、ＸＴＥＮに連結
されていないＢＰ構成要素と比較して、集合的に増強効果を生じる異なるＢＰの１つによ
ってそれぞれ媒介される、２つ以上の臨床または代謝性関連パラメータ（たとえば糖尿病
被験体におけるグルコース恒常性および体重管理、または血友病被験体におけるプロトロ
ンビンおよび出血回数の低下、または成長ホルモン欠損被験体における筋肉量および骨密
度の増加）の活性を有することができる。別の実施形態において、ＢＰＸＴＥＮの投与は
、同じアッセイを使用して、または測定された臨床パラメータに基づいて決定された、Ｘ
ＴＥＮに連結されていない単一のＢＰ構成要素の１つの活性よりも長期間である、臨床パ
ラメータまたは生化学パラメータまたは生理学的パラメータの１つ以上において活性を生
じる。
一実施形態において、処置方法は、糖尿病またはインスリン抵抗性に関連付けられた１
個以上のパラメータの改善を及ぼす治療的有効用量レジメンを使用する、ＢＰＸＴＥＮの
投与を含む。上述の実施形態において、改善は、主要な有効性または臨床エンドポイント
、たとえばヘモグロビンＡ１ｃの改善によって評価され得る（ＨｂＡ１ｃ、たとえばＲｅ
ｙｎｏｌｄｓら、ＢＭＪ，３３３（７５６８）：５８６－５８９，２００６を参照）。治
療有効性を示すＨｂＡ１ｃの改善は、患者における初期ベースライン測定によって変化し
得て、より大きい減少はより高い初期ベースラインに相当することが多く、より小さい減
少はより低い初期ベースラインに相当することが多い。いくつかの実施形態において、方
法は、投薬前レベルと比較して、少なくとも約０．５％、またはあるいは少なくとも約１
％、またはあるいは少なくとも約１．５％、またはあるいは少なくとも約２％、またはあ
るいは少なくとも約２．５％、またはあるいは少なくとも約３％、またはあるいは少なく
とも約３．５％、または少なくとも約４％以上のＨｂＡ１ｃの減少を生じることができる
。他の実施形態において、処置方法は、１３０ｍｇ／ｄＬ未満までの、あるいは１２５ｍ
ｇ／ｄＬ未満の、あるいは１２０ｍｇ／ｄＬ未満の、あるいは１１５ｍｇ／ｄＬ未満の、
あるいは１１０ｍｇ／ｄＬ未満の、あるいは１０５ｍｇ／ｄＬ未満の空腹時血糖（たとえ
ばグルコース）レベルを、または１００ｍｇ／ｄＬ未満の空腹時血糖レベルを生じること
ができる。他の実施形態において、方法は、投薬前レベルと比較して、約２０％超の、さ
らに好ましくは約３０％超の、さらに好ましくは約４０％超の、さらに好ましくは約５０
％超の、さらに好ましくは約６０％超の、さらに好ましくは約７０％超の、さらに好まし
くは約８０％超の、最も好ましくは約９０％超の空腹時血糖（たとえばグルコース）レベ
ルの低下を生じることができる。他の実施形態において、方法は、約２００ｍｇ／ｄＬ未
満の、さらに好ましくは約１９０ｍｇ／ｄＬ未満の、さらに好ましくは約１８０ｍｇ／ｄ
Ｌ未満の、さらに好ましくは約１７０ｍｇ／ｄＬ未満の、さらに好ましくは約１６０ｍｇ
／ｄＬ未満の、さらに好ましくは約１５０ｍｇ／ｄＬ未満の、最も好ましくは約１４０ｍ
ｇ／ｄＬ未満の１２０分間経口グルコース負荷試験（ＯＧＴＴ）のグルコースレベルを生
じることができる。血友病被験体のプロトロンビン（ｐｒｏｔｈｒｏｍｉｎ）時間を改善
すること；たとえばＦＩＸを含むＢＰＸＴＥＮを投与することを包含する、パラメータに
よって評価される処置方法の他の例は、正常被験体と比較して、少なくとも約４０％、さ
らに好ましくは少なくとも約５０％、さらに好ましくは少なくとも約６０％、さらに好ま
しくは少なくとも約７０％、さらに好ましくは少なくとも約８０％、さらに好ましくは少
なくとも約９０％、またはさらに好ましくは少なくとも約９５％であるプロトロンビン時
間を生じることができる。
本発明は、本明細書で提供された方法に従って使用されるＢＰＸＴＥＮが、糖尿病、イ
ンスリン抵抗性、代謝性障害、出血障害、または成長障害の処置に有用な他の処置方法お
よび薬学的組成物と併せて投与され得ることをさらに意図する。このような組成物は、た
とえばＤＰＰ－ＩＶ抑制因子、インスリン、インスリン類似体、ＰＰＡＲガンマアゴニス
ト、二重作用ＰＰＡＲアゴニスト、ＧＬＰ－１アゴニストもしくは類似体、ＰＴＰ１Ｂ抑
制因子、ＳＧＬＴ抑制因子、インスリン分泌促進物質、ＲＸＲアゴニスト、グリコーゲン
シンターゼキナーゼ－３抑制因子、インスリン増感剤、免疫調節物質、ベータ－３アドレ
ナリン作動性受容体アゴニスト、Ｐａｎ－ＰＰＡＲアゴニスト、１１ベータ－ＨＳＤ１抑
制因子、ビグアニド、アルファ－グルコシダーゼ抑制因子、メグリチニド、チアゾリジン
ジオン、スルホニル尿素および当分野で公知の他の糖尿病薬、または抗高血圧薬物、カル
シウムチャネルブロッカ、または凝固因子および関連生成物を包含し得る。いくつかの場
合において、ＢＰＸＴＥＮの投与により、被験体の疾患、障害または状態に対する同程度
の臨床効果または測定パラメータを達成するために、より少ない投薬量の同時投与薬学的
組成物の使用が可能になり得る。
上述にもかかわらず、特定の実施形態において、本発明の方法によって使用されるＢＰ
ＸＴＥＮは、グルコース関連疾患、代謝性疾患もしくは障害、凝固障害、または成長ホル
モン欠損もしくは成長障害を有する被験体における追加の処置方法または薬物もしくは他
の薬学的組成物の使用に対する必要性を防止または遅延し得る。他の実施形態において、
ＢＰＸＴＥＮは、根底にある疾患、障害または状態を処置するのに必要とされる追加の処
置方法または薬物もしくは他の薬学的組成物の量、頻度または継続期間を低下させ得る。
別の態様において，本発明は、所望の薬理学的特性または薬学的特性を有するＢＰＸＴ
ＥＮ組成物を設計する方法を提供する。ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質は（融合タンパク質
に連結されていないＢＰ構成要素と比較して）、代謝性疾患または障害の処置のための治
療有効性の改善、ＢＰと比較した融合タンパク質の薬物動態特徴の増強、薬理学的効果を
達成するために必要とされる用量の低減または投薬頻度の低減、薬学的特性の増強、およ
び延長された期間にわたって治療ウインドウ内に残存するＢＰ構成要素の能力の増強を包
含する、各種の目的を念頭に置いて設計および調製される。
一般に、融合タンパク質および本発明の組成物の設計および産生のステップは、図４～
６に例証されるように：（１）特定の疾患、障害または状態を処置するためのＢＰ（たと
えば天然タンパク質，ペプチドホルモン、活性を有するペプチド類似体または誘導体、ペ
プチドフラグメントなど）の選択；（２）所望のＰＫおよび物理化学特徴を、得られたＢ
ＰＸＴＥＮに与えるＸＴＥＮの選択（たとえば被験体への組成物の投与は、ＸＴＥＮに連
結されていないＢＰと比較してより長期間にわたって治療ウインドウ内に維持される融合
タンパク質を生じる）；（３）所望の有効性またはＰＫパラメータを達成するための、Ｂ
ＰＸＴＥＮの所望のＮ→Ｃ末端配置の確立；（４）構成されたＢＰＸＴＥＮをコードする
発現ベクターの設計の確立；（５）発現ベクターを有する好適な宿主の形質転換；ならび
に（６）得られた融合タンパク質の発現および回収を包含し得る。半減期の増加（１６時
間を超える）または治療ウインドウ内で費やされる期間の延長が所望であるＢＰＸＴＥＮ
では、組み入れのために選ばれたＸＴＥＮは概して、単一のＸＴＥＮがＢＰＸＴＥＮに組
み入れられる、少なくとも約５００、または約５７６、または約８６４、または約８７５
、または約９１３、または約９２４アミノ酸残基を有する。別の実施形態において、ＢＰ
ＸＴＥＮは、上述の長さの第１のＸＴＥＮ、および約１４４、または約２８８、または約
５７６、または約８６４、または約８７５、または約９１３、または約９２４アミノ酸残
基の第２のＸＴＥＮを含むことができる。
半減期の増加が必要とされないが、薬学的特性（たとえば溶解度）の増加が所望である
他の場合において、ＢＰＸＴＥＮは、より短い長さのＸＴＥＮを有するように設計するこ
とができる。上述のいくつかの実施形態において、ＢＰＸＴＥＮは少なくとも約２４、ま
たは約３６、または約４８、または約６０、または約７２、または約８４、または約９６
アミノ酸残基を有するＸＴＥＮに連結されたＢＰを含むことができ、生理的条件下での該
融合タンパク質の溶解度は、ＸＴＥＮに連結されていない対応するＢＰよりも少なくとも
３倍大きく、またはあるいはＸＴＥＮに連結されていないグルカゴンよりも、少なくとも
４倍、または５倍、または６倍、または７倍、または８倍、または９倍、または少なくと
も１０倍、または少なくとも２０倍、または少なくとも３０倍、または少なくとも５０倍
、または少なくとも６０倍またはそれより多い。上述の一実施形態において、ＢＰはグル
カゴンである。上述の別の実施形態において、ＢＰＸＴＥＮは、グルカゴンおよび表１２
～１５から選択されるポリペプチド配列を含むことができる。グルカゴン含有ＢＰＸＴＥ
Ｎ融合タンパク質に２～６時間の半減期が所望である（たとえば夜間低血糖の処置におい
て）なお他の場合において、融合タンパク質は、グルカゴン含有ＢＰＸＴＥＮのＸＴＥＮ
構成要素の、中間長の、たとえば約１００アミノ酸、または約１４４アミノ酸、または約
１５６アミノ酸、または約１６８アミノ酸、または約１８０アミノ酸、または約１９６ア
ミノ酸のＸＴＥＮを用いて設計することができる。
別の態様において、本発明は、天然ＢＰと比較して、製造の容易さを改善して、安定性
の増加、水溶解度の増加、および／または調合の容易さを生じるための、ＢＰＸＴＥＮ組
成物を作製する方法を提供する。一実施形態において、本発明は、非融合状態のＢＰと比
較して、得られたＢＰＸＴＥＮの可溶性形態での高濃度が生理的条件下で達成できるよう
に、ＢＰを１個以上のＸＴＥＮに連結するステップを含む、ＢＰの水溶解度を上昇させる
方法を包含する。融合タンパク質に組み入れられたときに、ＢＰの水溶解度の増加を与え
るＸＴＥＮの特性に寄与する因子は、ＸＴＥＮ融合パートナーの高い溶解度および溶解し
た分子とＸＴＥＮとの間の低度の自己凝集を包含する。いくつかの実施形態において、方
法は、生理的条件下での水溶解度が、非融合ＢＰと比較して、少なくとも約５０％の、ま
たは少なくとも約６０％大きい、または少なくとも約７０％大きい、または少なくとも約
８０％大きい、または少なくとも約９０％大きい、または少なくとも約１００％大きい、
または少なくとも約１５０％大きい、または少なくとも約２００％大きい、または少なく
とも約４００％大きい、または少なくとも約６００％大きい、または少なくとも約８００
％大きい、または少なくとも約１０００％大きい、または少なくとも約２０００％大きい
、または少なくとも約４０００％大きい、または少なくとも約６０００％大きいＢＰＸＴ
ＥＮ融合タンパク質を生じる。
別の実施形態において、本発明は、得られたＢＰＸＴＥＮの貯蔵寿命が非融合状態のＢ
Ｐと比較して延長されるように選択された１個以上のＸＴＥＮとＢＰとを連結するステッ
プを含む、ＢＰの貯蔵寿命を増強する方法を包含する。本明細書で使用する場合、貯蔵寿
命は、溶解状態のまたはその他の貯蔵調合物のＢＰまたはＢＰＸＴＥＮの機能活性が、過
度の活性消失を伴わずに安定なままである期間を指す。本明細書で使用する場合、「機能
活性」は、当分野で公知であるような薬理学的効果または生物活性、たとえば受容体もし
くはリガンドを結合する能力、または酵素活性、またはＢＰに関連付けられた１つ以上の
公知の機能活性を呈することを示す。分解または凝集するＢＰは概して、溶解状態のまま
であるＢＰと比較して、機能活性の低下または生物学的利用能の低下を有する。融合タン
パク質に組み入れられたときに、該方法の、ＢＰの貯蔵寿命を延長する能力に寄与する因
子は、ＸＴＥＮ融合パートナーの水溶解度の増加、溶解状態での自己凝集の低下、および
熱安定性の増加を包含する。特に、ＸＴＥＮの低い凝集傾向によって、より高い薬物濃度
のＢＰを含有する薬学的調製物の調合方法が容易となり、ＸＴＥＮの熱安定性は、ＢＰＸ
ＴＥＮ融合タンパク質が延長された期間にわたって可溶性および機能活性のままである特
性に寄与する。一実施形態において、方法は、同じ貯蔵および取扱い条件を受けた標準と
比較してより大きい活性を示す、「引き延ばされた」または「延長された」貯蔵寿命を有
するＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質を生じる。標準は、非融合全長ＢＰであり得る。一実施
形態において、方法は、ＸＴＥＮがその非構造化高次構造を保持する能力およびＢＰＸＴ
ＥＮが対応する非融合ＢＰよりも長い時間にわたって調合物において可溶性のままである
能力を増強する、１つ以上の薬学的に許容され得る賦形剤を有する単離ＢＰＸＴＥＮを調
合するステップを包含する。一実施形態において、方法は、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質
を生成するためにＸＴＥＮにＢＰを連結することを含み、所与の時点で比較したときにお
よび標準と同じ貯蔵および取扱い条件を受けたときに、約１００％を超える機能活性を、
または標準の機能活性の約１０５％、１１０％、１２０％、１３０％、１５０％または２
００％を超えて保持する溶液を生じて、それによりその貯蔵寿命を増強する。
貯蔵寿命は、貯蔵後に残存する機能活性に関しても評価され得て、貯蔵が開始したとき
に機能活性に正規化される。延長または延長された機能活性によって提示されるような、
引き延ばされたまたは延長された貯蔵寿命を有する本発明のＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質
は、同じ条件を同じ期間にわたって受けたときに、ＸＴＥＮに連結されていない同等のＢ
Ｐの機能活性の約５０％以上の機能活性を、または約６０％、７０％、８０％、または９
０％以上の機能活性を保持し得る。たとえばＸＴＥＮ配列に融合されたエキセンジン－４
またはグルカゴンを含む本発明のＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質は、各種の温度条件下で最
大５週間以上の期間にわたって、溶解状態でその元の活性の約８０％以上を保持し得る。
いくつかの実施形態において、ＢＰＸＴＥＮは、８０℃にて１０分間加熱したときに、溶
解状態でその元の活性の少なくとも約５０％、または約６０％、または少なくとも約７０
％、または少なくとも約８０％の、および最も好ましくは少なくとも約９０％以上を保持
する。他の実施形態において、ＢＰＸＴＥＮは、３７℃にて約７日間にわたって加熱また
は維持したときに、溶解状態でその元の活性の少なくとも約５０％、好ましくは少なくと
も約６０％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％、またはあるいは少
なくとも約９０％以上を保持する。別の実施形態において、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質
は、約１時間～約１８時間の期間にわたって約３０℃～約７０℃の温度への曝露後に、そ
の機能活性の少なくとも約８０％以上を保持する。本段落の上で記載した上述の実施形態
において、ＢＰＸＴＥＮの保持された活性は、融合タンパク質に連結されていない対応す
るＢＰの活性よりも、所与の時点において少なくとも約２倍の、または少なくとも約３倍
、または少なくとも約４倍、または少なくとも約５倍、または少なくとも約６倍大きい。
ＶＩ）本発明のＤＮＡ配列
本発明は、相同変異体を含むＢＰＸＴＥＮキメラポリペプチドをコードするポリ核酸分
子に相補的なＢＰＸＴＥＮキメラポリペプチドおよび配列をコードする、単離ポリ核酸を
提供する。別の態様において、本発明は、相同変異体を含むＢＰＸＴＥＮキメラポリペプ
チドをコードするポリ核酸分子に相補的なＢＰＸＴＥＮキメラポリペプチドおよび配列を
コードするポリ核酸を産生する方法を含む。一般に、および図４～６に例証されるように
、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を産生して、得られた
遺伝子産物を発現する方法は、ＢＰおよびＸＴＥＮをコードするヌクレオチドを構築する
ことと、フレーム内の構成要素を連結することと、コード遺伝子を適切な発現ベクターに
組み入れることと、適切な宿主細胞を発現ベクターによって形質転換することと、および
形質転換された宿主細胞で融合タンパク質を発現させることと、それにより生物活性ＢＰ
ＸＴＥＮポリペプチドを産生することとを含む。分子生物学における標準組換え技法を使
用して、本発明のポリヌクレオチドおよび発現ベクターを作製することができる。
本発明により、ＢＰＸＴＥＮをコードする核酸配が使用されて、適切な宿主細胞におい
てＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質の発現を誘導する組換えＤＮＡ分子が生成され得る。数種
のクローニング戦略が本発明を行うために好適であることが想定され、その多くを使用し
て本発明のＢＰＸＴＥＮ組成物の融合タンパク質をコードする遺伝子、またはその相補体
を含む構築物を生成することができる。一実施形態において、クローニング戦略が使用さ
れて、少なくとも第１のＢＰおよび少なくとも第１のＸＴＥＮポリペプチド、またはその
相補体を含む単量体ＢＰＸＴＥＮをコードする遺伝子が生成される。別の実施形態におい
て、クローニング戦略が使用されて、ＢＰＸＴＥＮ組成物を調合するために使用される融
合タンパク質の発現のために宿主細胞を形質転換するのに使用される、１個のＢＰの第１
および第２の分子および少なくとも第１のＸＴＥＮ（またはその相補体）を含む単量体Ｂ
ＰＸＴＥＮをコードする遺伝子が生成される。本段落の上で記載した上述の実施形態にお
いて、遺伝子は、切断配列（複数可）もコードし得るスペーサ配列をコードするヌクレオ
チドをさらに含むことができる。
所望のＸＴＥＮ配列の設計において、本発明の組成物のＸＴＥＮの非反復性の性質が、
ＸＴＥＮコード配列の生成における「ビルディングブロック」分子手法の使用にもかかわ
らず達成可能であることが見出された。これは、次に多量体化されてＸＴＥＮ配列をコー
ドする遺伝子を生成する配列モチーフをコードする、ポリヌクレオチドのライブラリの使
用によって達成された（図４および５を参照）。それゆえ、発現されたＸＴＥＮがわずか
４つの異なる配列モチーフの複数単位から成り得るのは、モチーフ自体が非反復性アミノ
酸配列から成り、ＸＴＥＮ配列全体が非反復性にされるためである。したがって，一実施
形態において、ＸＴＥＮコードポリヌクレオチドは、インフレームで操作可能に連結され
、そこで得られた発現ＸＴＥＮアミノ酸配列が非反復性である、非反復性配列をコードす
る複数のポリヌクレオチド、またはモチーフを含む。
１つの手法において、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質に対応するＤＮＡ配列を含有する構
築物が最初に調製される。組成物のＢＰをコードするＤＮＡは、ＢＰｍＲＮＡを所有して
、検出可能なレベルでそれを発現すると考えられる組織または単離細胞から、標準方法を
使用して調製されたｃＤＮＡライブラリから得られ得る。必要な場合は、コード配列をＳ
ａｍｂｒｏｏｋら、上掲に記載されるように、従来のプライマ延長手順を使用して得て、
ｃＤＮＡに逆転写されていない場合があるｍＲＮＡの前駆体およびプロセシング中間体を
検出することができる。したがってＤＮＡは、このような源から調製したｃＤＮＡライブ
ラリから都合よく得ることができる。ＢＰコード遺伝子（複数可）は、ゲノムライブラリ
からも得られ得るか、または当分野で公知の標準合成手順（たとえば自動化核酸合成）に
よって、公に利用可能なデータベース、特許、または参考文献から得たＤＮＡ配列を使用
しても生成され得る。このような手順は当分野で周知であり、科学文献および特許文献に
十分に記載されている。配列はたとえば、ＢＡＰのアミノ酸配列、またはＢＡＰのフラグ
メントもしくは変異体のアミノ酸配列を含有するＣＡＳ ＲｅｇｉｓｔｒｙまたはＧｅｎ
Ｂａｎｋデータベースへのエントリに一致するｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖのワー
ルド・ワイド・ウェブで利用できる、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）ウェブページを通じて利用
できる、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｂｓｔｒａｃｔｓ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（ＣＡＳ）登録番号
（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙにより公開）および／またはＧ
ｅｎＢａｎｋ受託番号（たとえばＬｏｃｕｓ ＩＤ、ＮＰ＿ＸＸＸＸＸ、およびＸＰ＿Ｘ
ＸＸＸＸ）モデルタンパク質識別子から得ることができる。本明細書で提供するこのよう
な配列識別子では、これらのＣＡＳおよびＧｅｎＢａｎｋおよびＧｅｎＳｅｑ受託番号な
らびに引用ジャーナル刊行物（たとえばＰｕｂＭｅｄ ＩＤ番号（ＰＭＩＤ））のそれぞ
れに関連付けられた要約ページは、特に本明細書に記載するアミノ酸配列に関して、参照
によりその全体がそれぞれ組み入れられている。一実施形態において、ＢＰコード遺伝子
は、表３～８の任意の１つからのタンパク質、またはそのフラグメントもしくは変異体を
コードする。
主題ＢＰＸＴＥＮタンパク質のＢＰ部分をコードする遺伝子またはポリヌクレオチドは
、単一ＢＰを含む発現融合タンパク質の場合、次に、構築物にクローニングすることがで
き、該構築物は、生物系での高レベルタンパク質発現に適切な転写配列および翻訳配列の
制御下でのプラスミドまたは他のベクターであることができる。後のステップにおいて、
ＸＴＥＮをコードする第２の遺伝子またはポリヌクレオチドは、ＢＰをコードする遺伝子
（複数可）に隣接し、その遺伝子とインフレームの構築物に、該遺伝子またはポリヌクレ
オチドをクローニングすることによって、ＢＰ遺伝子のＮ末端および／またはＣ末端をコ
ードするヌクレオチドに遺伝子的に融合される。この第２のステップは、ライゲーション
または多量体化ステップを通じて出現することができる。本段落の上で記載した上述の実
施形態において、生成される遺伝子構築物があるいは、それぞれの融合タンパク質をコー
ドするそれぞれの遺伝子の相補体であることができることが理解される。
ＸＴＥＮをコードする遺伝子は、完全合成、または酵素プロセスと組み合わせた合成、
たとえば制限酵素媒介クローニング、ＰＣＲおよび重複延長のどちらかによって、１つ以
上のステップで作製することができる。ＸＴＥＮポリペプチドは、ＸＴＥＮ－コード遺伝
子が低い反復性を有するが、コードされたアミノ酸配列がある程度の反復性を有するよう
に構築することができる。非反復性配列を有する、ＸＴＥＮをコードする遺伝子は、遺伝
子合成の標準技法を使用して、オリゴヌクレオチドから構築することができる。遺伝子設
計は、コドン使用（ｕｓａｇｅ）およびアミノ酸組成を最適化するアルゴリズムを使用し
て行うことができる。本発明の１つの方法において、図４および５に例証されるように、
比較的短いＸＴＥＮコードポリヌクレオチド構築物のライブラリが生成され、次に構築さ
れる。これは、各ライブラリメンバが同じアミノ酸配列を有するが、多くの異なるコード
配列が可能であるように、純粋なコドンライブラリであることができる。このようなライ
ブラリは、部分的に無作為化されたオリゴヌクレオチドから構築され、配列モチーフを含
むＸＴＥＮセグメントの大型ライブラリを生成させるために使用することができる。無作
為化スキームは、各位置でのアミノ酸の選定ならびにコドン使用を制御するために最適化
できる。
ポリヌクレオチドライブラリ
別の態様において、本発明は、所望の長さおよび配列のＸＴＥＮをコードする遺伝子を
構築するために使用できるＸＴＥＮ配列をコードするポリヌクレオチドのライブラリを提
供する。
ある実施形態において、ＸＴＥＮコードライブラリ構築物は、固定長のポリペプチドセ
グメントをコードするポリヌクレオチドを含む。初期ステップとして、９～１４アミノ酸
残基のモチーフをコードするオリゴヌクレオチドのライブラリを構築することができる。
好ましい実施形態において、１２アミノ酸のモチーフをコードするオリゴヌクレオチドの
ライブラリが構築される。
ＸＴＥＮコード配列セグメントは、より長いコード配列に２量体化または多量体化する
ことができる。２量体化または多量体化は、ライゲーション、重複延長、ＰＣＲ構築また
は当分野で公知の同様のクローニング技法によって行うことができる。得られたＸＴＥＮ
コード配列が配列の組織化および所望の長さに達して、ＸＴＥＮコード遺伝子を提供する
まで、このプロセスを複数回反復することができる。認められるように、１２アミノ酸を
コードするポリヌクレオチドのライブラリは、３６アミノ酸をコードするポリヌクレオチ
ドのライブラリに２量体化することができる。今度は、３６アミノ酸をコードするポリヌ
クレオチドのライブラリは、ＸＴＥＮ配列をコードする連続したより長いポリヌクレオチ
ドを含有するライブラリに、連続的に２量体化することができる。いくつかの実施形態に
おいて、特異的配列ＸＴＥＮファミリ；たとえば表１のＡＤ、ＡＥ、ＡＦ、ＡＧ、ＡＭ、
またはＡＱ配列に限定されるアミノ酸をコードするポリヌクレオチドのライブラリを構築
することができる。他の実施形態において，ライブラリは、表１からの２つ以上のモチー
フファミリ配列をコードする配列を含むことができる。３６マーをコードするライブラリ
の代表的な非限定的なポリヌクレオチド配列の名称および配列を表１２～１５に表示し、
これらを生成するために使用される方法を実施例でさらに十分に記載する。ライブラリを
今度は、連続２量体化またはライゲーションに使用して、たとえば７２、１４４、２８８
、５７６、８６４、９１２、９２３、１２９６アミノ酸の、または全長約３０００までの
アミノ酸の、ならびに中間長の、ＸＴＥＮ配列をコードするポリヌクレオチド配列ライブ
ラリを達成することができる。いくつかの場合において、ポリヌクレオチドライブラリ配
列は、以下でさらに十分に記載する、「シーケンシングアイランド」として使用される追
加の塩基も包含し得る。
図５は、本発明の実施形態における、ＸＴＥＮポリヌクレオチド構築物およびＢＰＸＴ
ＥＮポリヌクレオチド構築物の構築における代表的な非限定的なステップの概略フローチ
ャートである。個々のオリゴヌクレオチド５０１は配列モチーフ５０２、たとえば１２ア
ミノ酸モチーフ（「１２マー」）にアニーリングされ、１２マーは続いてＢｂｓＩおよび
ＫｐｎＩ制限部位５０３を含有するオリゴとライゲーションすることができる。所望の長
さのＸＴＥＮ遺伝子５０４が達成されるまで、ライブラリからの追加の配列モチーフがア
ニーリングされ１２マーとなる。ＸＴＥＮ遺伝子は、スタッファベクターにクローニング
される。ベクターは場合により、Ｆｌａｇ配列５０６と、それに続くＢｓａＩ、ＢｂｓＩ
、およびＫｐｎＩ部位５０７ならびに、この場合は、単一のＢＰ遺伝子（この例ではエキ
センジン－４をコードする）５０８が隣接するスタッファ配列とをコードして、単一のＢ
Ｐ５００を含むＢＰＸＴＥＮをコードする遺伝子を生じることができる。ＸＴＥＮをコー
ドするポリヌクレオチドおよび前駆体配列のＸＴＥＮ名および配列番号の非網羅的なリス
トを表１１に提供する。
Figure 0007461438000025
Figure 0007461438000026
Figure 0007461438000027
Figure 0007461438000028
Figure 0007461438000029
Figure 0007461438000030
Figure 0007461438000031
Figure 0007461438000032
Figure 0007461438000033
Figure 0007461438000034

ＸＴＥＮ－コード遺伝子のライブラリを、当分野で公知の１個以上の発現ベクターにク
ローニングされ得る。十分に発現するライブラリメンバの同定を容易にするために、リポ
ータータンパク質への融合物としてライブラリを構築することができる。好適なリポータ
ー遺伝子の非制限的な例は、緑色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、アルカリホスファタ
ーゼ、およびベータ－ガラクトシダーゼである。スクリーニングすることによって、好ま
しい宿主生物にて高濃度で発現できる短いＸＴＥＮ配列を同定することができる。続いて
、ランダムＸＴＥＮダイマーのライブラリを生成させて、高レベル発現のスクリーニング
を反復することができる。続いて、得られた構築物をいくつかの特性、たとえば発現レベ
ル、プロテアーゼ安定性、または抗血清への結合についてスクリーニングすることができ
る。
本発明の一態様は、融合タンパク質の構成要素をコードするポリヌクレオチド配列を提
供することであり、該配列の生成はコドン最適化を受けている。特に興味深いのは、ポリ
ペプチド組成物の発現を改善する、および産生宿主におけるコード遺伝子の遺伝的安定性
を改善する目標を有するコドン最適化である。たとえばコドン最適化は、グリシンが豊富
である、または非常に反復性のアミノ酸配列を有するＸＴＥＮ配列にとって特に重要であ
る。コドン最適化はコンピュータプログラム（Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ，Ｃら（２００４）
Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２２：３４６－５３）を使用して行うことができ
、コンピュータプログラムのいくつかはリボソーム停止を最小化する（Ｃｏｄａ Ｇｅｎ
ｏｍｉｃｓ Ｉｎｃ．）。一実施形態において、ライブラリのすべてのメンバが同じアミ
ノ酸配列をコードするが、コドン使用が多様であるコドンライブラリを構築することによ
って、コドン最適化を行うことができる。このようなライブラリは、ＸＴＥＮ含有生成物
の大規模産生に特に好適である、高発現で遺伝的に安定なメンバについてスクリーニング
することができる。ＸＴＥＮ配列を設計するときに、いくつかの特性を考慮することがで
きる。コードＤＮＡ配列の反復性を最小化することができる。さらに産生宿主によってま
れにしか使用されないコドン（たとえば大腸菌におけるＡＧＧおよびＡＧＡのアルギニン
コドンならびに１個のロイシンコドン）の使用を回避または最小化することができる。大
腸菌の場合、２個のグリシンコドン、ＧＧＡおよびＧＧＧは、高発現されたタンパク質で
はまれにしか使用されない。それゆえＸＴＥＮ配列をコードする遺伝子のコドン最適化は
、非常に所望であり得る。高レベルのグリシンを有するＤＮＡ配列は、不安定性または低
発現レベルをもたらすことができる高いＧＣ含有量を有する傾向がある。それゆえ可能な
場合、ＸＴＥＮコード配列のＧＣ含有量がＸＴＥＮを製造するために使用される産生生物
に好適であるように、コドンを選定することが好ましい。
場合により、全長ＸＴＥＮ－コード遺伝子は、１個以上のシーケンシングアイランドを
含み得る。本文脈において、シーケンシングアイランドは、ＸＴＥＮライブラリ構築物配
列とは別個であり、全長ＸＴＥＮ－コード遺伝子に存在しない、または存在することが予
想されない制限部位を包含する、短ストレッチ配列である。一実施形態において、シーケ
ンシングアイランドは、配列５’－ＡＧＧＴＧＣＡＡＧＣＧＣＡＡＧＣＧＧＣＧＣＧＣＣ
ＡＡＧＣＡＣＧＧＧＡＧＧＴ－３’（配列番号２６１）である。別の実施形態において、
シーケンシングアイランドは、配列５’－ＡＧＧＴＣＣＡＧＡＡＣＣＡＡＣＧＧＧＧＣＣ
ＧＧＣＣＣＣＡＡＧＣＧＧＡＧＧＴ－３’（配列番号２６２）である。
代替として、ライブラリのすべてのメンバがアミノ酸配列をコードするが、コドン使用
が多様であるコドンライブラリを構築することができる。このようなライブラリは、ＸＴ
ＥＮ含有生成物の大規模産生に特に好適である、高発現で遺伝的に安定なメンバについて
スクリーニングすることができる。
場合により、望ましくない配列を含有する単離体を消失させるためのライブラリのクロ
ーンを配列決定することができる。短いＸＴＥＮ配列の初期ライブラリによって、アミノ
酸配列のいくつかの変形が可能となる。たとえば、いくつかの親水性アミノ酸が特定の位
置に出現できるように、いくつかのコドンを無作為化することができる。
繰返し多量体化のプロセスの間に、得られたライブラリメンバを高レベル発現のスクリ
ーンに加えて、溶解度またはプロテアーゼ抵抗性などの他の特徴についてスクリーニング
することができる。
所望の長さおよび特性のＸＴＥＮをコードする遺伝子がいったん選択されると、その遺
伝子は、ＢＰをコードする遺伝子と隣接して、その遺伝子とインフレームの、またはスペ
ーサ配列に隣接した構築物に該遺伝子をクローニングすることによって、ＢＰ遺伝子（複
数可）のＮ末端および／またはＣ末端をコードするヌクレオチドに遺伝子的に融合される
。本発明は、コードされるＢＰＸＴＥＮに応じて、上述の各種の順列を提供する。たとえ
ば、上に描いたように、式ＩＩＩまたはＩＶによって実現されるような、２個のＢＰを含
むＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質をコードする遺伝子では、該遺伝子は２個のＢＰをコード
するポリヌクレオチド、少なくとも第１のＸＴＥＮ、および場合により第２のＸＴＥＮお
よび／またはスペーサ配列を有する。ＢＰ遺伝子をＸＴＥＮ構築物にクローニングするス
テップは、ライゲーションまたは多量体化ステップを通じて出現できる。図２に示すよう
に、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質をコードする構築物は、構成要素のＸＴＥＮ２０２、Ｂ
Ｐ２０３、およびスペーサ配列２０４の異なる配置で設計することができる。一実施形態
において、図２Ａに例証されるように、構築物は、以下の順序（５’→３’）ＢＰ２０３
およびＸＴＥＮ２０２で、または逆順で、構成要素の単量体ポリペプチドに相補的である
ポリヌクレオチド配列、または該単量体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列
を含む。別の実施形態において、図２Ｂに例証されるように、構築物は、以下の順序（５
’→３’）ＢＰ２０３、スペーサ配列２０４、およびＸＴＥＮ２０２で、または逆順で、
構成要素の単量体ポリペプチドに相補的であるポリヌクレオチド配列、または該単量体ポ
リペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。別の実施形態において、図２Ｃに
例証されるように、構築物２０１は、以下の順序（５’→３’）：ＢＰ２０３の２個の分
子およびＸＴＥＮ２０２で、または逆順で、構成要素に相補的であるポリヌクレオチド配
列、または構成要素をコードするポリヌクレオチド配列を含む単量体ＢＰＸＴＥＮをコー
ドする。別の実施形態において、図２Ｄに例証されるように、構築物は、以下の順序（５
’→３’）：２個のＢＰ２０３の分子、スペーサ配列２０４、およびＸＴＥＮ２０２、ま
たは逆順で、構成要素の単量体ポリペプチドに相補的であるポリヌクレオチド配列、また
は該単量体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。別の実施形態におい
て、図２Ｅに例証されるように、構築物は、以下の順序（５’→３’）：ＢＰ２０３、ス
ペーサ配列２０４、ＢＰ２０３の第２の分子、およびＸＴＥＮ２０２、または逆順で、構
成要素の単量体ポリペプチドに相補的であるポリヌクレオチド配列、または該単量体ポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。別の実施形態において、図２Ｆに例
証されるように、構築物は、以下の順序（５’→３’）：ＢＰ２０３、ＸＴＥＮ２０２、
ＢＰ２０３、および第２のＸＴＥＮ２０２、または逆順で、構成要素の単量体ポリペプチ
ドに相補的であるポリヌクレオチド配列、または該単量体ポリペプチドをコードするポリ
ヌクレオチド配列を含む。スペーサポリヌクレオチドは、切断配列をコードする配列を場
合により包含することができる。当業者に明らかになるように、上述の他の順列も可能で
ある。
本発明は、（ａ）表１１からのポリヌクレオチド配列、または（ｂ）（ａ）のポリヌク
レオチドに相補的である配列に対する高いパーセンテージの配列同一性を有する、ＸＴＥ
Ｎコードポリヌクレオチド変異体を含む。高いパーセンテージの配列同一性を有するポリ
ヌクレオチドは、上述の（ａ）または（ｂ）に対して、少なくとも約８０％の核酸配列同
一性、あるいは少なくとも約８１％の、あるいは少なくとも約８２％の、あるいは少なく
とも約８３％の、あるいは少なくとも約８４％の、あるいは少なくとも約８５％の、ある
いは少なくとも約８６％の、あるいは少なくとも約８７％の、あるいは少なくとも約８８
％の、あるいは少なくとも約８９％の、あるいは少なくとも約９０％の、あるいは少なく
とも約９１％の、あるいは少なくとも約９２％の、あるいは少なくとも約９３％の、ある
いは少なくとも約９４％の、あるいは少なくとも約９５％の、あるいは少なくとも約９６
％の、あるいは少なくとも約９７％の、あるいは少なくとも約９８％の、およびあるいは
少なくとも約９９％の核酸配列同一性を有する、または厳密性条件下で標的ポリヌクレオ
チドもしくはその相補体とハイブリダイズできる、ポリヌクレオチドである。
ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の相同性、配列類似性または配列同一性も、公知
のソフトウェアまたはコンピュータプログラム、たとえばＢｅｓｔＦｉｔまたはＧａｐ対
比較プログラム（ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃ
ｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，
Ｗｉｓ．５３７１１）を使用することによって都合よく決定され得る。ＢｅｓｔＦｉｔ
は、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの局所相同性アルゴリズム（Ａｄｖａｎｃｅｓ
ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ．１９８１．２：４８２－４８９）を使
用して、２個の配列間の同一性または類似性が最良のセグメントを発見する。Ｇａｐは、
ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈの方法（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．１９７０．４８：４４３－４５３）を使用して、１個の配列すべ
ての、別の類似配列すべてとのグローバルアラインメントを行う。配列相同性、類似性ま
たは同一性の程度を決定するために、ＢｅｓｔＦｉｔなどの配列アラインメントプログラ
ムを使用するとき、デフォルト設定が使用され得るか、または適切なスコアリングマトリ
クスが選択されて同一性、類似性または相同性スコアが最適化され得る。
「相補的」である核酸配列は、標準Ｗａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ相補性規則に従って塩基
対合可能である核酸配列である。本明細書で使用する場合、「相補的配列」という用語は
、上記の同じヌクレオチド比較によって評価され得るように、または本明細書に記載する
条件のような厳密性条件下でＢＰＸＴＥＮ配列をコードするポリヌクレオチドにハイブリ
ダイズできるとして定義されるような、実質的に相補的である核酸配列を意味する。
ＢＰＸＴＥＮキメラ組成物をコードする得られたポリヌクレオチドは次に、発現ベクタ
ーに個々にクローニングすることができる。核酸配列は、多種多様の手順によってベクタ
ーに挿入され得る。一般に、ＤＮＡは、適切な制限エンドヌクレアーゼ部位（複数可）に
当分野で公知の技法を使用して挿入される。ベクター構成要素は概して、これに限定され
るわけではないが、１つ以上のシグナル配列、複製起点、１つ以上のマーカー遺伝子、エ
ンハンサ要素、プロモータ、および転写終結配列を包含する。これらの構成要素の１つ以
上を含有する好適なベクターの構築は、当業者に公知である標準ライゲーション技法を用
いる。このような技法は当分野で周知であり、科学文献および特許文献に十分に記載され
ている。
各種のベクターが公に利用可能である。ベクターはたとえば、プラスミド、コスミド、
ウイルス粒子、またはファージの形態で存在する。発現ベクターおよびクローニングベク
ターはどちらも、ベクターが１つ以上の選択された宿主細胞において複製できるようにす
る核酸配列を含有する。多種多様の細菌、酵母、およびウイルスのこのようなベクター配
列は、周知である。使用できる有用な発現ベクターは、たとえば染色体、非染色体および
合成ＤＮＡ配列のセグメントを包含する。好適なベクターは、これに限定されるわけでは
ないが、ＳＶ４０およびｐｃＤＮＡの誘導体ならびに公知の細菌プラスミド、たとえばｃ
ｏｌ ＥＩ、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭａｌ－Ｃ２、ｐＥＴ、ｐＧＥＸ（Ｓｍｉｔｈ
ら、Ｇｅｎｅ ５７：３１－４０（１９８８）に記載されたような）、ｐＭＢ９およびそ
の誘導体、プラスミド、たとえばＲＰ４、ファージＤＮＡ、たとえばファージＩの多数の
誘導体、たとえばＮＭ９８９、ならびに他のファージＤＮＡ、たとえばＭ１３および線維
状１本鎖ファージＤＮＡ；酵母プラスミド、たとえば２ミクロンプラスミドまたは２ｍプ
ラスミドの誘導体、ならびにセントメリック（ｃｅｎｔｏｍｅｒｉｃ）シャトルベクター
および組込み酵母シャトルベクター；真核細胞で有用なベクター、たとえば昆虫細胞また
は哺乳動物細胞で有用なベクター；プラスミドおよびファージＤＮＡの組み合わせから誘
導されたベクター、たとえばファージＤＮＡまたは発現制御配列を用いるように改変され
ているプラスミド；などを包含する。必要条件は、ベクターが好ましい宿主細胞において
複製可能および生存可能であることである。低または高コピー数ベクターは所望通りに使
用され得る。
原核生物宿主による発現ベクターでの使用に好適なプロモータは、β－ラクタマーゼお
よびラクトースプロモータ系［Ｃｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ，２７５：６１５（１９７８
）；Ｇｏｅｄｄｅｌら、Ｎａｔｕｒｅ，２８１：５４４（１９７９）］、アルカリホスフ
ァターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモータ系［Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，８：４０５７（１９８０）；ＥＰ３６，７７６］、およびハイブ
リッドプロモータ、たとえばｔａｃプロモータ［ｄｅＢｏｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８０：２１－２５（１９８３）］を包含する。細菌系で使用
するためのプロモータは、ＢＰＸＴＥＮポリペプチドをコードするＤＮＡに操作可能に連
結されたシャイン・ダルガノ（Ｓ．Ｄ．）配列も含有することができる。
たとえばバキュロウイルス発現系において、非融合移入ベクター、たとえばこれに限定
されるわけではないが、ｐＶＬ９４１（ＢａｍＨＩクローニング部位、Ｓｕｍｍｅｒｓら
、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８４：３９０－４０２（１９７８）から利用可能）、ｐＶＬ１３９
３（ＢａｍＨＩ、Ｓｍａｌ、Ｘｂａｌ、ＥｃｏＲＩ、ＩＶｏｔｌ、Ｘｍａｌｌｌ、ＢｇＩ
ＩＩおよびＰｓｔｌクローニング部位；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＶＬ１３９２（Ｂｇ
ＩＩＩ、Ｐｓｔｌ、ＮｏｔＩ、ＸｍａＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ、Ｘｂａｌｌ、Ｓｍａｌおよび
ＢａｍＨＩクローニング部位；Ｓｕｍｍｅｒｓら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８４：３９０－４
０２（１９７８）およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ（Ｂａｍ
ＨＩ、ＢｇＩＩＩ、Ｐｓｔｌ、ＮｃｏｌおよびＨｉｎｄｉＩＩクローニング部位、青色／
白色組換えスクリーニングによる、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、および融合移入ベクター、
たとえばこれに限定されるわけではないが、ｐＡｃ７００（ＢａｍＨＩ認識部位が開始コ
ドンではじまる、ＢａｍＨＩおよびＫｐｎＩクローニング部位；Ｓｕｍｍｅｒｓら、Ｖｉ
ｒｏｌｏｇｙ ８４：３９０－４０２（１９７８））、ｐＡｃ７０１およびｐＡｃ７０－
２（ｐＡｃ７００と同じ、異なる読み取り枠を有する）、ｐＡｃ３６０［ポリヘドリン開
始コドンの３６塩基対下流の、ＢａｍＨＩクローニング部位；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（１
９９５））およびｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓＡ、Ｂ、Ｃ（ＢａｍＨＩ、ＢｇＩＩＩ、Ｐｓｔ
ｌ、Ｎｃｏ１およびＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位を有する３つの異なる読み取り枠、
ＰｒｏＢｏｎｄ精製およびプラークの青色／白色組換えスクリーニングのためのＮ末端ペ
プチド；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（２２０）のどちらも使用できる。
哺乳動物発現ベクターは、複製起点、好適なプロモータおよびエンハンサ、ならびに任
意の必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよびアクセプ
タ部位、転写終結配列、ならびに５’フランキング非転写配列も含むことができる。ＳＶ
４０スプライス、およびポリアデニル化部位から誘導されたＤＮＡ配列は、必要とされる
非転写遺伝要素を提供するために使用され得る。本発明で使用のために意図される哺乳動
物発現ベクターは、誘導性プロモータを有するベクター、たとえばジヒドロ葉酸還元酵素
プロモータ、ＤＨＦＲ発現カセットを有する任意の発現ベクターまたはＤＨＦＲ／メトト
レキサート同時増幅ベクター、たとえばｐＥＤ（Ｐｓｔｌ、Ｓａｉｌ、Ｓｂａｌ、Ｓｍａ
ｌおよびＥｃｏＲＩクローニング部位、クローン化遺伝子およびＤＨＦＲの両方を発現す
るベクターを有する；Ｒａｎｄａｌ Ｊ．Ｋａｕｆｍａｎ，１９９１，Ｒａｎｄａｌ Ｊ
．Ｋａｕｆｍａｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ，１６，１２（１９９１））を包含する。あるいはグルタミンシンテター
ゼ／メチオニンスルホキシミン同時増幅ベクター、たとえばｐＥＥ１４（ベクターがグル
タミンシンテターゼおよびクローン化遺伝子を発現する、Ｈｉｎｄｌｌｌ、Ｘｂａｌｌ、
Ｓｍａｌ、Ｓｂａｌ、ＥｃｏＲＩおよびＳｅｌｌクローニング部位；Ｃｅｌｌｔｅｃｈ）
。エプスタイン・バー・ウイルス（ＥＢＶ）または核抗原（ＥＢＮＡ）の制御下でエピソ
ーム発現を誘導するベクター、たとえばｐＲＥＰ４（ＢａｍＨＩ ｒ ＳｆＨ、Ｘｈｏｌ
、ＮｏｔＩ、Ｎｈｅｌ、Ｈｉｎｄｉ ＩＩ、ＮｈｅＩ、ＰｖｕＩＩおよびＫｐｎ１クロー
ニング部位、構成的ＲＳＶ－ＬＴＲプロモータ、ハイグロマイシン選択可能マーカー；Ｉ
ｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＣＥＰ４（ＢａｍＨＩ、ＳｆＨ、Ｘｈｏｌ、ＮｏｔI、Ｎｈｅ
ｌ、Ｈｉｎｄｌｌｌ、Ｎｈｅｌ、ＰｖｕＩＩおよびＫｐｎ１クローニング部位、構成的ｈ
ＣＭＶ最初期遺伝子プロモータ、ハイグロマイシン選択可能マーカー；Ｉｎｖｉｔｒｏｇ
ｅｎ）、ｐＭＥＰ４（Ｋｐｎｌ、Ｐｖｕｌ、Ｎｈｅｌ、Ｈｉｎｄｌｌｌ、ＮｏｔＩ、Ｘｈ
ｏｌ、Ｓｆｉｌ、ＢａｍＨＩクローニング部位、誘導性メタロチオネイン（ｍｅｔｈａｌ
ｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ）Ｈａ遺伝子プロモータ、ハイグロマイシン選択可能マーカー、Ｉ
ｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＲＥＰ８（ＢａｍＨＩ、Ｘｈｏｌ、ＮｏｔＩ、Ｈｉｎｄｌｌｌ
、ＮｈｅｌおよびＫｐｎｌクローニング部位、ＲＳＶ－ＬＴＲプロモータ、ヒスチジノー
ル選択可能マーカー；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＲＥＰ９（Ｋｐｎｌ、Ｎｈｅｌ、Ｈｉ
ｎｄｌｌｌ、ＮｏｔＩ、Ｘｈｏ１、Ｓｆｉ１、ＢａｍＨＩクローニング部位、ＲＳＶ－Ｌ
ＴＲプロモータ、Ｇ４１８選択可能マーカー；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびｐＥＢＶ
Ｈｉｓ（ＲＳＶ－ＬＴＲプロモータ、ハイグロマイシン選択可能マーカー、ＰｒｏＢｏｎ
ｄ樹脂によって精製可能であり、エンテロキナーゼによって切断されたＮ末端ペプチド；
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が使用できる。
本発明で使用するための選択可能哺乳動物発現ベクターは、これに限定されるわけでは
ないが、ｐＲｃ／ＣＭＶ（Ｈｉｎｄ １１１、ＢｓｔＸＩ、ＮｏｔＩ、ＳｂａｌおよびＡ
ｐａｌクローニング部位、Ｇ４１８選択、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＲｃ／ＲＳＶ（Ｈ
ｉｎｄ ＩＩ、Ｓｐｅｌ、ＢｓｔＸＩ、ＮｏｔＩ、Ｘｂａｌクローニング部位、Ｇ４１８
選択、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などを含む。本発明で使用できるワクシニアウイルス哺乳
動物発現ベクター（たとえばＲａｎｄａｌｌ Ｊ．Ｋａｕｆｍａｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐ
ｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １６．１２（Ｆｒｅｄ
ｅｒｉｃｋ Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら、編、Ｗｉｌｅｙ １９９１を参照）は、これに限定
されるわけではないが、ｐＳＣｌ１（Ｓｍａｌクローニング部位、ＴＫ－およびベータ－
ｇａｌ選択）、ｐＭＪ６０１（Ｓａｌ １、Ｓｍａ １、Ａ ｆｌＩ、Ｎａｒｌ、Ｂｓｐ
ＭｌＩ、ＢａｍＨＩ、Ａｐａｌ、Ｎｈｅｌ、ＳａｃＩＩ、Ｋｐｎ１およびＨｉｎｄｌｌｌ
クローニング部位；ＴＫ－および－ｇａｌ選択）、ｐＴＫｇｐｔＦ１Ｓ（ＥｃｏＲＩ、Ｐ
ｓｔｌ、ＳａＩＩＩ、Ａｃｃｌ、ＨｉｎｄＩＩ、Ｓｂａｌ、ＢａｍＨＩおよびＨｐａクロ
ーニング部位、ＴＫまたはＸＰＲＴ選択）などを包含する。
本発明でまた使用できる酵母発現系は、これに限定されるわけではないが、非融合ｐＹ
ＥＳ２ベクター（ＸＪｂａｌ、Ｓｐｈｌ、Ｓｈｏｌ、ＮｏｔＩ、ＧｓｔＸＩ、ＥｃｏＲＩ
、ＢｓｔＸＩ、ＢａｍＨＩ、Ｓａｄ、Ｋｐｎ１およびＨｉｎｄｌｌｌクローニング部位、
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、融合ｐＹＥＳＨｉｓＡ、Ｂ、Ｃ（Ｘｂａｌｌ、Ｓｐｈｌ、Ｓｈ
ｏｌ、ＮｏｔＩ、ＢｓｔＸＩ、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、Ｓａｄ、ＫｐｎｌおよびＨｉｎ
ｄｉＩＩクローニング部位、ＰｒｏＢｏｎｄ樹脂によって精製され、エンテロキナーゼに
よって切断されたＮ末端ペプチド；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＲＳベクターなどを包含
する。
さらにキメラＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質コードポリヌクレオチド分子を含有する発現
ベクターは、薬物選択マーカーを包含し得る。このようなマーカーは、クローニングなら
びにキメラＤＮＡ分子を含有するベクターの選択または同定を補助する。たとえばネオマ
イシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）抑制
因子、グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＧＰＴ）、ゼオシン、およびヒスチ
ジノールに抵抗性を与える遺伝子は、有用な選択可能マーカーである。あるいは酵素、た
とえば単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼ（ｔｋ）またはクロラムフェニコールアセチル
トランスフェラーゼ（ＣＡＴ）が用いられ得る。免疫マーカーも用いることができる。い
ずれの公知の選択可能マーカーも、遺伝子産物をコードする核酸と同時に発現可能である
限り用いられ得る。選択可能マーカーのさらなる例は当業者に周知であり、リポーター、
たとえば増強緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、ベータ－ガラクトシダーゼ（β－ｇａｌ
）またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）を包含する。
一実施形態において、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質組成物をコードするポリヌクレオチ
ドは、発現宿主系に適切なＮ末端シグナル配列のＣ末端側に融合することができる。シグ
ナル配列は、トランスロケーションおよび分泌プロセスの間に通例タンパク質分解により
タンパク質から除去されて、限定した（ｄｅｆｉｎｅｄ）Ｎ末端が生じる。細菌系、酵母
系、昆虫系および哺乳動物系を包含する大半の発現系で、多岐にわたるシグナル配列が記
載されている。各発現系の好ましい例の非限定的なリストは、本明細書に従う。好ましい
シグナル配列は、大腸菌発現のためのＯｍｐＡ、ＰｈｏＡ、およびＤｓｂＡである。酵母
発現に好ましいシグナルペプチドは、ｐｐＬ－アルファ、ＤＥＸ４、インベルターゼシグ
ナルペプチド、酸性ホスファターゼシグナルペプチド、ＣＰＹ、またはＩＮＵ１である。
昆虫細胞発現に好ましいシグナル配列は、タバコスズメガ脂肪動員ホルモン前駆体、ＣＰ
１、ＣＰ２、ＣＰ３、ＣＰ４、ＴＰＡ、ＰＡＰ、またはｇｐ６７である。哺乳動物発現に
好ましいシグナル配列は、ＩＬ２Ｌ、ＳＶ４０、ＩｇＧカッパおよびＩｇＧラムダである
。
別の実施形態において、十分に発現された非依存性タンパク質ドメインを潜在的に含む
リーダー配列は、プロテアーゼ切断部位によって離された、ＢＰＸＴＥＮ配列のＮ末端に
融合させることができる。設計されたタンパク質分解部位での切断を抑制しないいずれの
リーダーペプチド配列も使用できるが、好ましい実施形態の配列は、組成物全体の発現お
よび折畳みが著しく悪影響を及ぼされず、好ましくは発現、溶解度、および／または折畳
み効率が著しく改善されるように、安定な十分に発現された配列を含む。多岐にわたる好
適なリーダー配列が文献に記載されている。好適な配列の非限定的なリストは、マルトー
ス結合タンパク質、セルロース結合ドメイン、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ、６
ｘＨｉｓタグ（配列番号２６３）、ＦＬＡＧタグ、ヘマグルチニン（ｈｅｍａｇｌｕｔｉ
ｎｉｎ）タグ、および緑色蛍光タンパク質を包含する。リーダー配列は、文献および本明
細書の上で十分に記載された方法による、とりわけＡＴＧ開始コドンの後の第２コドン位
置におけるコドン最適化によって、さらに改善することもできる。
特定の部位にてタンパク質を切断する各種のインビトロ酵素方法が公知である。このよ
うな方法は、エンテロキナーゼ（ＤＤＤＫ（配列番号２６４））、第Ｘａ因子（ＩＤＧＲ
（配列番号２６５））、トロンビン（ＬＶＰＲＧＳ（配列番号２６６））、ＰｒｅＳｃｉ
ｓｓｉｏｎ（商標）（ＬＥＶＬＦＱＧＰ（配列番号２６７））、ＴＥＶプロテアーゼ（Ｅ
ＱＬＹＦＱＧ（配列番号２６８））、３Ｃプロテアーゼ（ＥＴＬＦＱＧＰ（配列番号２６
９））、ソルターゼＡ（ＬＰＥＴＧ）、グランザイムＢ（Ｄ／Ｘ、Ｎ／Ｘ、Ｍ／Ｎまたは
Ｓ／Ｘ）、インテイン、ＳＵＭＯ、ＤＡＰａｓｅ（ＴＡＧＺｙｍｅ（商標））、Ａｅｒｏ
ｍｏｎａｓアミノペプチダーゼ、アミノペプチダーゼＭ、ならびにカルボキシペプチダー
ゼＡおよびＢの使用を包含する。追加の方法は、Ａｒｎａｕら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐ
ｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ４８：１－１３（２００６）に開
示されている。
他の実施形態において、ＸＴＥＮ特徴を有する少なくとも約２０～約６０アミノ酸をコ
ードする最適化ポリヌクレオチド配列は、ＸＴＥＮ配列のＮ末端で包含されて、翻訳の開
始を促進し、ヘルパードメインの存在なしでタンパク質のＮ末端でのＸＴＥＮ融合物の発
現を可能にできる。上述の利点において、配列は続いての切断を必要とせず、そのために
ＸＴＥＮ含有組成物を製造するステップの数が低減される。実施例でさらに詳細に記載さ
れるように、最適化Ｎ末端配列は、非構造化タンパク質の属性を有するが、翻訳の開始お
よび増強された発現を促進するその能力のために選択されたアミノ酸をコードするヌクレ
オチド塩基を包含し得る。上述の一実施形態において、最適化ポリヌクレオチドは、ＡＥ
９１２（配列番号２１７）に対して少なくとも約９０％の配列同一性を有するＸＴＥＮ配
列をコードする。上述の別の実施形態において、最適化ポリヌクレオチドは、ＡＭ９２３
（配列番号２１８）に対して少なくとも約９０％の配列同一性を有するＸＴＥＮ配列をコ
ードする。
別の実施形態において、リーダー配列構築物のプロテアーゼ部位は、該部位がインビボ
プロテアーゼによって認識されるように選定される。本実施形態において、タンパク質は
、適切なプロテアーゼとの接触を回避することによってリーダーを保持しながら、発現系
から精製される。全長構築物は次に、患者に注射される。注射の際に、構築物は切断部位
に特異的なプロテアーゼと接触して、プロテアーゼによって切断される。未切断タンパク
質が切断形態よりも実質的に活性が低い場合、本方法は、活性形態がインビボでゆっくり
と生じるため、毒性を回避しながら、より高い初期用量を可能にする有益な効果を有する
。本用途に有用であるインビボプロテアーゼのいくつかの非限定的な例は、組織カリクレ
イン、血漿カリクレイン、トリプシン、ペプシン、キモトリプシン、トロンビン、および
マトリクスメタロプロテイナーゼ、または表１０のプロテアーゼを包含する。
本方式では、単量体ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質をコードするキメラＤＮＡ分子が構築
物内で生じる。場合により、本キメラＤＮＡ分子は、さらに適切な発現ベクターである別
の構築物へ移行またはクローン化され得る。この時点で、キメラＤＮＡ分子を発現できる
宿主細胞をキメラＤＮＡ分子によって形質転換することができる。目的のＤＮＡセグメン
トを含有するベクターは、宿主細胞に、周知の方法によって、細胞宿主の種類に応じて移
行することができる。たとえば、塩化カルシウム形質移入は普通、原核細胞に利用される
のに対して、リン酸カルシウム処理、リポフェクション、または電気穿孔は他の細胞宿主
に使用され得る。哺乳動物細胞を形質変換するために使用される他の方法は、ポリブレン
の使用、プロトプラスト融合、リポソーム、電気穿孔、およびマイクロインジェクション
を包含する。概してＳａｍｂｒｏｏｋら、上掲を参照。
形質転換は、キャリア、たとえば発現ベクターを利用して、または利用せずにおこり得
る。次に、形質転換された宿主細胞は、ＢＰＸＴＥＮをコードするキメラＤＮＡ分子の発
現に好適な条件下で培養される。
本発明は、本明細書で開示する単量体融合タンパク質組成物を発現する宿主細胞も提供
する。好適な真核宿主細胞の例は、これに限定されるわけではないが、哺乳動物細胞、た
とえばＶＥＲＯ細胞、ＨＥＬＡ細胞、たとえばＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ２、ＣＨＯ細胞系
統、ＣＯＳ細胞、ＷＩ３８細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、３Ｔ３細胞、Ａ５４９細
胞、ＰＣ１２細胞、Ｋ５６２細胞、２９３細胞、Ｓｆ９細胞およびＣｖＩ細胞を包含する
。好適な非哺乳動物真核細胞の例は真核微生物を包含し、たとえば糸状菌または酵母は、
ベクターをコードするのに好適なクローニング宿主または発現宿主である。Ｓａｃｃｈａ
ｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、普通に使用される低級真核宿主微生物である
。他はＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ（Ｂｅａｃｈ ａｎｄ Ｎ
ｕｒｓｅ，Ｎａｔｕｒｅ，２９０：１４０［１９８１］；１９８５年５月２日に公開され
たＥＰ １３９，３８３）；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ宿主（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．
４，９４３，５２９；Ｆｌｅｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：９６８－９７
５（１９９１））たとえば、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ（ＭＷ９８－８Ｃ，ＣＢＳ６８３，ＣＢＳ
４５７４；Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，７３７［１９８３］
）、Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ（ＡＴＣＣ １２，４２４）、Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ（Ａ
ＴＣＣ １６，０４５）、Ｋ．ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ（ＡＴＣＣ ２４，１７８）、Ｋ．
ｗａｌｔｉｉ（ＡＴＣＣ ５６，５００）、Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ（ＡＴＣＣ
３６，９０６；Ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８：１
３５（１９９０）），Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、およびＫ．ｍａｒｘｉａｎｕ
ｓ；ｙａｒｒｏｗｉａ（ＥＰ ４０２，２２６）；Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ（Ｅ
Ｐ １８３，０７０；Ｓｒｅｅｋｒｉｓｈｎａら、Ｊ．Ｂａｓｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
．，２８：２６５－２７８ ［１９８８］）；Ｃａｎｄｉｄａ；Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ
ｒｅｅｓｉａ（ＥＰ ２４４，２３４）；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ（Ｃａ
ｓｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７６：５２５９－５２６３［
１９７９］）；Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ、たとえばＳｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ
ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ（１９９０年１０月３１日に公開されたＥＰ ３９４，５３
８）；および糸状菌、たとえばＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ，Ｔｏｌ
ｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ（１９９１年１月１０日に公開されたＷＯ ９１／００３５７）、
およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ宿主、たとえばＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓ（Ｂａｌｌａｎｃｅ
ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１１２：２８４－２８
９［１９８３］；Ｔｉｌｂｕｒｎら、Ｇｅｎｅ，２６：２０５－２２１［１９８３］；Ｙ
ｅｌｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：１４７０－１４
７４［１９８４］）およびＡ．ｎｉｇｅｒ（Ｋｅｌｌｙ ａｎｄ Ｈｙｎｅｓ，ＥＭＢＯ
Ｊ．，４：４７５－４７９［１９８５］）を包含する。メチロトローフ酵母は、本明細
書で好適であり、これに限定されるわけではないが、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｃａｎｄｉｄ
ａ、Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｏｒｕｌｏｐ
ｓｉｓ、およびＲｈｏｄｏｔｏｒｕｌａから成る属より選択されるメタノールでの増殖が
可能な酵母を包含する。このクラスの酵母を例示する具体的な種のリストは、Ｃ．Ａｎｔ
ｈｏｎｙ，Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｓ，２
６９（１９８２）に見出され得る。
本発明で使用できる他の好適な細胞は、これに限定されるわけではないが、原核宿主細
胞株、たとえば大腸菌（たとえばＤＨ５－α株）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ
，Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ，Ｓ
ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓおよびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属の株を包含する。好適な
原核生物の非制限的な例は、属：Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ；Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕ
ｓ；Ｂｄｅｌｌｏｖｉｂｒｉｏ；Ｂｏｒｒｅｌｉａ；Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ；Ｅｎｔ
ｅｒｏｃｏｃｃｕｓ；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ；Ｌｉｓｔ
ｅｒｉａ；Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ；Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎ
ａｓ；Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ；Ｓｔｒｅｐｔｏｍ
ｙｃｅｓ；Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ；およびＶｉｂｒｉｏからの原核生物を包含する。
具体的な株の非制限的な例は：Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ；Ｂｄｅ
ｌｌｏｖｉｂｒｉｏ ｂａｃｔｅｒｉｏｖｏｒｕｓ；Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒ
ｆｅｒｉ；Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ；Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃ
ｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ；Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ；Ｌａｃｔｏｂａ
ｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ
；Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ；Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ；Ｌｉｓ
ｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ；Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｈｅｙｅ
ｎｓｉｓ；Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ；Ｐｓｅｕｄ
ｏｍｏｎａｓ ｍｅｖａｌｏｎｉｉ；Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ；Ｓ
ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ；Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ
ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ；Ｓ
ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｏｌｏｓｐｏｒｅｕｓ；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕ
ｓ ｍｕｔａｎｓ；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ；Ｓｔｒｅｐｔ
ｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ；Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕ
ｍ；Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ｖｏｌｃａｎｉｕｍ；Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ
；Ｖｉｂｒｉｏ ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ；およびＶｉｂｒｉｏ ｖｕｌｎｉ
ｆｉｃｕｓを包含する。
目的のポリヌクレオチドを含有する宿主細胞は、プロモータの活性化、形質転換体の選
択または遺伝子の増幅に適切に改変された従来の栄養媒体（たとえばＨａｍの栄養混合物
）で培養することができる。培養条件、たとえば温度、ｐＨなどは、発現に選択された宿
主細胞を用いて以前使用された条件であり、当業者に明らかになる。細胞は通例、遠心分
離によって収集して、物理的または化学的手段によって破壊し、得られた粗抽出物はさら
なる精製のために保持する。宿主細胞によって分泌された組成物では、遠心分離からの上
清を分離して、さらなる精製のために保持する。タンパク質の発現で用いられる微生物細
胞は、凍結－解凍サイクリング、超音波処理、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用を包
含する、任意の便利な方法によって破壊することができ、そのすべては当業者に周知であ
る。細胞溶解を包含する実施形態は、キメラＤＮＡ分子の発現後に分解を制限するプロテ
アーゼ抑制因子を含有するバッファーの使用を伴い得る。好適なプロテアーゼ抑制因子は
、これに限定されるわけではないが、ロイペプチン、ペプスタチンまたはアプロチニンを
包含する。上清は次に、連続した増加濃度の飽和硫酸アンモニウムに沈殿され得る。
遺伝子発現は、たとえば従来のサザンブロッティング、ｍＲＮＡの転写を定量するノー
ザンブロッティング（［Ｔｈｏｍａｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
，７７：５２０１－５２０５（１９８０）］）、ドットブロッティング（ＤＮＡ分析）、
またはインサイチュハイブリダイゼーションによって、適切に標識されたプローブを使用
して本明細書で提供する配列に基づいて、試料において直接測定され得る。あるいは、Ｄ
ＮＡ２本鎖、ＲＮＡ２本鎖、およびＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド２本鎖またはＤＮＡ－タ
ンパク質２本鎖を含む、特定の２本鎖を認識できる抗体が用いられ得る。抗体は今度は標
識され得て、アッセイは、２本鎖が表面に結合されているところで実施され得、その結果
、表面での２本鎖の形成の際に２本鎖に結合された抗体の存在を検出できる。
遺伝子発現は、あるいは、遺伝子産物の発現を直接定量するための免疫蛍光法、たとえ
ば細胞もしくは組織切片の免疫組織化学染色および細胞培養物もしくは体液のアッセイま
たは選択可能マーカーの検出によって測定され得る。免疫組織化学染色および／または試
料流体のアッセイに有用な抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルのどちらでもよ
く、任意の哺乳動物で調製され得る。好都合にも、抗体は、天然配列ＢＰポリペプチドに
対して、または本明細書で提供されるＤＮＡ配列に基づく合成ペプチドに対して、または
ＢＰに融合され、特異的抗体エピトープをコードする外因性配列に対して調製され得る。
選択可能マーカーの例は当業者に周知であり、リポーター、たとえば増強緑色蛍光タンパ
ク質（ＥＧＦＰ）、ベータ－ガラクトシダーゼ（β－ｇａｌ）またはクロラムフェニコー
ルアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）を包含する。
発現されたＢＰＸＴＥＮポリペプチド生成物（複数可）は、当分野で公知の方法を介し
て、または本明細書で開示する方法によって精製され得る。それぞれの宿主細胞によって
産生される融合タンパク質を回収および精製するようにそれぞれ適応させた手順、たとえ
ばゲル濾過、親和性精製、塩分画、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマト
グラフィー、ヒドロキシアパタイト吸着クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグ
ラフィーおよびゲル電気泳動が使用され得る。いくつかの発現されたＢＰＸＴＥＮは、単
離および精製の間に再折畳みを必要とし得る。精製方法は、Ｒｏｂｅｒｔ Ｋ．Ｓｃｏｐ
ｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐ
ｒａｃｔｉｃｅ，Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒ．Ｃａｓｔｏｒ（ｅｄ．），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖ
ｅｒｌａｇ １９９４、およびＳａｍｂｒｏｏｋら、上掲に記載されている。複数ステッ
プ精製分離もＢａｒｏｎら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０：１７９－
９０（１９９０）およびＢｅｌｏｗら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ．６７９：６７－
８３（１９９４）に記載されている。
ＶＩＩ）薬学的組成物
本発明は、ＢＰＸＴＥＮを含む薬学的組成物を提供する。一実施形態において、薬学的
組成物は、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質および少なくとも１つの薬学的に許容され得るキ
ャリアを含む。本発明のＢＰＸＴＥＮポリペプチドは、公知の方法に従って調合されて、
薬学的に有用な組成物を調製することができ、これによりポリペプチドは薬学的に許容さ
れ得るキャリアビヒクル、たとえば水溶液またはバッファー、薬学的に許容され得る懸濁
物およびエマルションと混合して組み合わされる。非水性溶媒の例は、プロピルエチレン
グリコール、ポリエチレングリコールおよび植物油を包含する。治療調合物は貯蔵のため
に、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６
ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に記載されるように、所望の
純度を有する活性成分を任意選択の生理的に許容され得るキャリア、賦形剤または安定剤
と混合することによって、凍結乾燥調合物または水溶液の形態で調製される。
薬学的組成物は、経口で、鼻内に、非経口で、または吸入療法によって投与することが
でき、錠剤、ロゼンジ剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、アンプル剤、坐剤またエアゾール
形態の形態を取り得る。薬学的組成物は、水性または非水性希釈剤における活性剤の懸濁
剤、液剤およびエマルジョン、シロップ、顆粒剤または粉剤の形態も取り得る。さらに、
薬学的組成物は他の薬学的活性化合物または複数の本発明の化合物も含有することができ
る。
さらに詳細には、本薬学的組成物は、経口、直腸、鼻、局所（経皮、エアゾール、口腔
（ｂｕｃｃａｌ）および舌下を包含する）、膣、非経口（皮下、輸液ポンプによる皮下、
筋肉内、静脈内および皮内を包含する）、硝子体内、および肺を包含する任意の好適な経
路による治療のために投与され得る。好ましい経路がレシピエントの状態および年齢、な
らびに処置される疾患によって変化することも認められる。
一実施形態において、薬学的組成物は皮下投与される。本実施形態において、組成物は
、投与前に再構成される凍結乾燥粉剤として供給され得る。組成物は、患者に直接投与す
ることができる液体形態でも供給され得る。一実施形態において、組成物は、患者が容易
に組成物を自分で投与できるように、プレフィルドシリンジ中の液剤として供給される。
本発明で有用な徐放調合物は、マトリクスおよびコーティング組成物を含む、経口調合
物であり得る。好適なマトリクス材料は、ロウ（たとえばカルナウバ（ｃａｍａｕｂａ）
、ミツロウ、パラフィンロウ、セレシン、シェラックロウ、脂肪酸および脂肪アルコール
）、油、硬化油または脂（たとえば硬化ナタネ油、ヒマシ油、牛脂、パーム油、およびダ
イズ油）、およびポリマー（たとえばヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリ
ドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、およびポリエチレングリコール）を包含し
得る。他の好適なマトリクス打錠材料は、他のキャリア、または充填剤を含む、微結晶性
セルロース、粉末セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、エチルセルロースである
。錠剤は、顆粒、コート粉末、またはペレットも含有し得る。錠剤は複数層（ｍｕｌｔｉ
－ｌａｙｅｒｅｄ）でもあり得る。複数層錠剤は、活性成分が顕著に異なる薬物動態プロ
フィールを有するときにとりわけ好ましい。場合により、完成錠剤はコーティングされ得
るか、未コーティングであり得る。
コーティング組成物は、不溶性マトリクスポリマーおよび／または水溶性材料を含み得
る。水溶性材料は、ポリマー、たとえばポリエチレングリコール、ヒドロキシプロピルセ
ルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルア
ルコール、または単量体材料、たとえば糖（たとえばラクトース、スクロース、フルクト
ース、マンニトールなど）、塩（たとえば塩化ナトリウム、塩化カリウムなど）、有機酸
（たとえばフマル酸、コハク酸、乳酸、および酒石酸）、およびその混合物であることが
できる。場合により、腸溶ポリマーがコーティング組成物に組み入れられ得る。好適な腸
溶ポリマーは、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アセテートスクシネート（ａｃｅ
ｔａｔｅ ｓｕｃｃｉｎａｔｅ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、フタレート、
ポリビニルアセテートフタレート、セルロースアセテートフタレート、セルロースアセテ
ートトリメリテート、シェラック、ゼイン、およびカルボキシ基を含有するポリメタクリ
レートを包含する。コーティング組成物は好適な可塑剤、たとえばフタル酸ジエチル、ク
エン酸エステル、ポリエチレングリコール、グリセロール、アセチル化グリセリド、アセ
チル化クエン酸エステル、セバシン酸ジブチル、およびヒマシ油などを添加することによ
って可塑化され得る。コーティング組成物は充填剤も包含し得て、該充填剤は不溶性材料
、たとえば２酸化ケイ素、２酸化チタン、タルク、カオリン、アルミナ、デンプン、粉末
セルロース、ＭＣＣ、またはポラクリリンカリウムであることができる。コーティング組
成物は、有機溶媒また水性溶媒またはその混合物による溶液またはラテックスとして利用
され得る。溶媒、たとえば水、低級アルコール、低級塩素化炭化水素、ケトン、またはそ
の混合物が使用され得る。
本発明の組成物は、多種多様の賦形剤を使用して調合され得る。好適な賦形剤は、微結
晶性セルロース（たとえばＡｖｉｃｅｌ ＰＨ１０２、Ａｖｉｃｅｌ ＰＨ１０１）、ポ
リメタクリレート、ポリ（エチルアクリレート、メチルメタクリレート、トリメチルアン
モニオエチルメタクリレートクロライド）（たとえばＥｕｄｒａｇｉｔ ＲＳ－３０Ｄ）
、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（Ｍｅｔｈｏｃｅｌ Ｋ１００Ｍ、Ｐｒｅｍｉｕ
ｍ ＣＲ Ｍｅｔｈｏｃｅｌ Ｋ１００Ｍ、Ｍｅｔｈｏｃｅｌ Ｅ５、Ｏｐａｄｒｙ（登
録商標））、ステアリン酸マグネシウム、タルク、クエン酸トリエチル、水性エチルセル
ロース分散物（スレレアーゼ（登録商標））、および硫酸プロタミンを包含する。低速放
出剤はキャリアも含み得て、該キャリアはたとえば溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤
および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤を含むことができる。薬学的に許容され得る塩
、たとえば無機塩、たとえば塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、または硫酸塩、ならびに
有機酸の塩、たとえば酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、または安息香酸塩もこれら
の低速放出剤で使用できる。組成物は、液体、たとえば水、食塩水、グリセロール、およ
びエタノール、ならびに物質、たとえば湿潤剤、乳化剤、またはｐＨ緩衝剤も含有し得る
。リポソームもキャリアとして使用され得る。
別の実施形態において、本発明の組成物はリポソーム内にカプセル化され、これは延長
された期間にわたって制御された方式で有益な活性剤を送達する有用性を証明している。
リポソームは、封入した水性容量を含有する閉じた２重層膜である。リポソームは、単膜
２重層を所有する単層ベシクル、またはそれぞれ次の層から水層によって離された多重膜
２重層を備えた多層状ベシクルであり得る。得られた膜２重層の構造物は、脂質の疎水性
（非極性）テールが２重層の中心に向けられているが、親水性（極性）ヘッドが水相に向
くようになっている。一実施形態において、リポソームは、単核食細胞系の臓器、主に肝
臓および脾臓による取り込みを回避する軟性水溶性ポリマーによってコーティングされ得
る。リポソームを包囲するのに好適な親水性ポリマーは制限なく、その内容が全体として
参照により組み入れられているＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏｓ．６，３１６，０２４；６，１２
６，９６６；６，０５６，９７３；６，０４３，０９４に記載されているような、ＰＥＧ
、ポリビニルピロリドン、ポリビニルメチルエーテル、ポリメチルオキサゾリン、ポリエ
チルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルメタ
クリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、ポリヒドロキシプ
ロピルメタクリレート、ポリヒドロキシ（ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘ）エチルアクリレート、
ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ポリエチレングリコール、
ポリアスパルタミドおよび親水性ペプチド配列を包含する。
リポソームは、当分野で公知のいずれの脂質または脂質の組み合わせからも成り得る。
たとえばベシクル形成脂質は、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏｓ．６，０５６，９７３および５，
８７４，１０４に開示されているように、リン脂質、たとえばホスファチジルコリン、ホ
スファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、ホスファチジルセリン、ホスファチ
ジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、およびスフィンゴミエリンを包含する
天然に存在する脂質または合成脂質であり得る。ベシクル形成脂質は、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．
Ｎｏ．６，０５６，９７３にも開示されているような、糖脂質、セレブロシド、またはカ
チオン性脂質、たとえば１，２－ジオレイルオキシ－３－（トリメチルアミノ）プロパン
（ＤＯＴＡＰ）；Ｎ－［１－（２，３，－ジテトラデシルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ－
ジメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）；Ｎ－［１［（２
，３，－ジオレイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルアン
モニウムブロミド（ＤＯＲＩＥ）；Ｎ－［１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル］
－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＴＭＡ）；３［Ｎ－（Ｎ’，Ｎ
’－ジメチルアミノエタン）カルバモイル（ｃａｒｂａｍｏｌｙ）］コレステロール（Ｄ
Ｃ－Ｃｈｏｌ）；またはジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡＢ）でもあり得る
。コレステロールも、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏｓ．５，９１６，５８８および５，８７４，
１０４に開示されているように、ベシクルに安定性を付与する適正な範囲内で存在し得る
。
さらなるリポソーム技術は、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏｓ．６，７５９，０５７；６，４０
６，７１３；６，３５２，７１６；６，３１６，０２４；６，２９４，１９１；６，１２
６，９６６；６，０５６，９７３；６，０４３，０９４；５，９６５，１５６；５，９１
６，５８８；５，８７４，１０４；５，２１５，６８０；および４，６８４，４７９に記
載されており、その内容は参照により本明細書に組み入れられている。これらはリポソー
ムおよび脂質コートマイクロバブル、ならびにその製造方法について記載している。それ
ゆえ、本発明の開示およびこれらの他の特許の開示の両方を考慮している当業者は、本発
明のポリペプチドの徐放のためのリポソームを産生できる。
液体調合物では、所望の特性は、該調合物が静脈内、筋肉内、関節内、または皮下投与
のために２５、２８，３０、３１、３２ゲージ針を通過できる形態で供給されることであ
る。
経皮調合物による投与は、概してたとえば、参照によりその全体が本明細書に組み入れ
られている、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏｓ．５，１８６，９３８および６，１８３，７７０、
４，８６１，８００、６，７４３，２１１、６，９４５，９５２、４，２８４，４４４、
およびＷＯ ８９／０９０５１に記載されているものを包含する、また当分野で公知の方
法を使用して行うことができる。経皮パッチは、吸収の問題を有するポリペプチドを用い
た特に有用な実施形態である。パッチは、皮膚浸透性活性成分の放出を１２時間、２４時
間、３日間、および７日間の期間にわたって制御するように作製することができる。１例
において、本発明のポリペプチドの２倍の１日過剰量が不揮発性流体に置かれる。本発明
の組成物は粘性不揮発性液体の形態で提供される。特定の調合物の皮膚を通じた浸透は、
当分野の標準方法によって測定され得る（たとえばＦｒａｎｚら、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄ
ｅｒｍ．６４：１９４－１９５（１９７５））。好適なパッチの例は、受動移行皮膚パッ
チ、イオン導入皮膚パッチ、またはニコダームなどのマイクロニードルを用いたパッチで
ある。
他の実施形態において、組成物は鼻内、口腔、または舌下経路を介して脳に送達されて
、活性剤の嗅覚路を通じたＣＮＳへの移行を可能とし、全身投与を低下させ得る。この投
与経路で普通に使用される器具は、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．６，７１５，４８５に包含さ
れている。この経路を介して送達される組成物は、ＣＮＳ投薬の増加または全身負荷の低
下を可能にして、特定の薬物に関連付けられた全身毒性リスクを低下させ得る。皮下に移
植可能な器具での送達のための薬学的組成物の調製は、当分野で公知の方法、たとえばＵ
．Ｓ．Ｎｏｓ．３，９９２，５１８；５，６６０，８４８；および５，７５６，１１５に
記載された方法を使用して行うことができる。
浸透圧ポンプは、錠剤、丸剤、カプセル剤または移植可能な器具の形態で低速放出剤と
して使用され得る。浸透圧ポンプは、当分野で周知であり、徐放薬物送達用の浸透圧ポン
プの提供に経験がある会社から、当業者が容易に利用することができる。例はＡＬＺＡの
ＤＵＲＯＳ（商標）；ＡＬＺＡのＯＲＯＳ（商標）；Ｏｓｍｏｔｉｃａ Ｐｈａｒｍａｃ
ｅｕｔｉｃａｌのＯｓｍｏｄｅｘ（商標）システム；Ｓｈｉｒｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓのＥｎＳｏＴｒｏｌ（商標）システム；およびＡｌｚｅｔ（商標）である。浸透圧ポ
ンプ技術について記載した特許は、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏｓ．６，８９０，９１８；６，
８３８，０９３；６，８１４，９７９；６，７１３，０８６；６，５３４，０９０；６，
５１４，５３２；６，３６１，７９６；６，３５２，７２１；６，２９４，２０１；６，
２８４，２７６；６，１１０，４９８；５，５７３，７７６；４，２００，０９８４；お
よび４，０８８，８６４であり、その内容は参照により本明細書に組み入れられている。
本発明の開示およびこれらの他の特許の開示の両方を考慮している当業者は、本発明のポ
リペプチドの徐放のための浸透圧ポンプを産生できる。
シリンジポンプも低速放出剤（ｓｌｏｗ ｒｅｌｅａｓｅ ａｇｅｎｔ）として使用さ
れ得る。このような器具は、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏｓ．４，９７６，６９６；４，９３３
，１８５；５，０１７，３７８；６，３０９，３７０；６，２５４，５７３；４，４３５
，１７３；４，３９８，９０８；６，５７２，５８５；５，２９８，０２２；５，１７６
，５０２；５，４９２，５３４；５，３１８，５４０；および４，９８８，３３７に記載
されており、その内容は参照により本明細書に組み入れられている。本発明の開示および
これらの他の特許の開示の両方を考慮している当業者は、本発明の組成物の徐放のための
シリンジポンプを産生できる。
ＶＩＩＩ）薬学的キット
別の態様において、本発明は、ＢＰＸＴＥＮポリペプチドの使用を容易にするキットを
提供する。一実施形態において、キットは、少なくとも第１の容器に、すぐに注射できる
調合物として合わせてまたは滅菌水、バッファー、もしくはデキストロースによる再構成
の準備ができている調合物として合せた：（ａ）それを必要とする被験体への投与の際に
疾患、状態または障害を処置するのに十分な量のＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質組成物；お
よび（ｂ）ある量の薬学的に許容され得るキャリアを；ＢＰＸＴＥＮ薬物ならびに貯蔵お
よびに取扱い条件を明記したラベル、ならびに該薬物の承認された適応症、承認された適
応症の防止および／または処置に使用するためのＢＰＸＴＥＮ薬物の再構成および／また
は投与の説明、適切な投薬情報および安全性情報、ならびに薬物のロットおよび有効期限
（ｅｘｐｉｒａｔｉｏｎ）を明示した情報を共に含む。上述の別の実施形態において、キ
ットは、被験体に送達されるＢＰＸＴＥＮの適切な濃度を使用者に提供する、ＢＰＸＴＥ
Ｎ組成物に好適な希釈剤を収容できる第２の容器を含むことができる。
（実施例１）
ＸＴＥＮ＿ＡＤ３６モチーフセグメントの構築
以下の実施例は、３６アミノ酸のモチーフ配列をコードするコドン最適化遺伝子のコレ
クションの構築について記載する。第１のステップとして、スタッファベクターｐＣＷ０
３５９を、ｐＥＴベクターおよびＴ７プロモータを含むｐＥＴベクターに基づいて構築し
た。ｐＣＷ０３５９は、セルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）およびＴＥＶプロテアーゼ認
識部位、それに続くＢｓａＩ、ＢｂｓＩ、およびＫｐｎＩ部位がフランキングするスタッ
ファ配列をコードする。ＢｓａＩおよびＢｂｓＩ部位は、これらが消化後に適合性の突出
部を生じるように挿入された。スタッファ配列には、切断型のＧＦＰ遺伝子およびＨｉｓ
タグが続く。スタッファ配列は停止コドンを含有し、それゆえスタッファプラスミドｐＣ
Ｗ０３５９を担持する大腸菌細胞は非蛍光コロニーを形成する。スタッファベクターｐＣ
Ｗ０３５９はＢｓａＩおよびＫｐｎＩによって消化されて、スタッファセグメントを除去
して、得られたベクターフラグメントをアガロースゲル精製によって単離する。配列はモ
チーフのＡＤファミリを反映して、ＸＴＥＮ＿ＡＤ３６と命名した。そのセグメントはア
ミノ酸配列［Ｘ］３を有し、ここでＸは、配列：ＧＥＳＰＧＧＳＳＧＳＥＳ（配列番号２
７０）、ＧＳＥＧＳＳＧＰＧＥＳＳ（配列番号２７１）、ＧＳＳＥＳＧＳＳＥＧＧＰ（配
列番号２７２）、またはＧＳＧＧＥＰＳＥＳＧＳＳ（配列番号２７３）を有する１２マー
ペプチドである。以下の対のリン酸化合成オリゴヌクレオチド対をアニーリングすること
によって、インサートを得た：
Figure 0007461438000035

本発明者らは、リン酸化オリゴヌクレオチド３ＫｐｎＩｓｔｏｐｐｅｒＦｏｒ：ＡＧＧ
ＴＴＣＧＴＣＴＴＣＡＣＴＣＧＡＧＧＧＴＡＣ（配列番号２８１）および非リン酸化オリ
ゴヌクレオチドｐｒ＿３ＫｐｎＩｓｔｏｐｐｅｒＲｅｖ：ＣＣＴＣＧＡＧＴＧＡＡＧＡＣ
ＧＡ（配列番号２８２）もアニーリングした。アニーリングされたオリゴヌクレオチド対
をライゲーションすると、１つのＢｂｓＩ／ＫｐｎＩセグメントにライゲーションされた
可変数の１２マー反復を表す可変長を有する生成物の混合物が生じた。３６アミノ酸の長
さに相当する生成物は、分取アガロースゲル電気泳動によって混合物から単離して、Ｂｓ
ａＩ／ＫｐｎＩ消化スタッファベクターｐＣＷ０３５９にライゲーションした。ＬＣＷ０
４０１と命名した得られたライブラリのクローンの大半は誘導後に緑色蛍光を示し、これ
はＸＴＥＮ＿ＡＤ３６の配列がインフレームでＧＦＰ遺伝子とライゲーションされて、Ｘ
ＴＥＮ＿ＡＤ３６の大半の配列が良好な発現レベルを有したことを示している。
本発明者らは高レベルの蛍光についてライブラリＬＣＷ０４０１からの９６の単離体を
、ＩＰＴＧを含有する寒天プレートに単離体をスタンプすることによってスクリーニング
した。同じ単離体をＰＣＲによって評価して、３６アミノ酸ならびに強い蛍光を有するセ
グメントを含有する４８の単離体を同定した。これらの単離体を配列決定して、正しいＸ
ＴＥＮ＿ＡＤ３６セグメントを含有する３９のクローンを同定した。ヌクレオチドおよび
アミノ酸構築物のファイル名ならびにこれらのセグメントの配列番号を表１２に挙げる。
Figure 0007461438000036
Figure 0007461438000037
Figure 0007461438000038

（実施例２）
ＸＴＥＮ＿ＡＥ３６セグメントの構築
３６アミノ酸長のＸＴＥＮ配列をコードするコドンライブラリを構築した。ＸＴＥＮ配
列をＸＴＥＮ＿ＡＥ３６と命名した。そのセグメントはアミノ酸配列［Ｘ］３を有し、こ
こでＸは、配列：ＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥ（配列番号３５９）、ＧＳＥＰＡＴＳＧＳＥ
ＴＰ（配列番号３６０）、ＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰ（配列番号３６１）、またはＧＴＳ
ＴＥＰＳＥＧＳＡＰ（配列番号３６２）を有する１２マーペプチドである。以下の対のリ
ン酸化合成オリゴヌクレオチド対をアニーリングすることによって、インサートを得た：
Figure 0007461438000039

本発明者らは、リン酸化オリゴヌクレオチド３ＫｐｎＩｓｔｏｐｐｅｒＦｏｒ：ＡＧＧ
ＴＴＣＧＴＣＴＴＣＡＣＴＣＧＡＧＧＧＴＡＣ（配列番号３７１）および非リン酸化オリ
ゴヌクレオチドｐｒ＿３ＫｐｎＩｓｔｏｐｐｅｒＲｅｖ：ＣＣＴＣＧＡＧＴＧＡＡＧＡＣ
ＧＡ（配列番号３７２）もアニーリングした。アニーリングされたオリゴヌクレオチド対
をライゲーションすると、１つのＢｂｓＩ／ＫｐｎＩセグメントにライゲーションされた
可変数の１２マー反復を表す可変長を有する生成物の混合物が生じた。３６アミノ酸の長
さに相当する生成物は、分取アガロースゲル電気泳動によって混合物から単離して、Ｂｓ
ａＩ／ＫｐｎＩ消化スタッファベクターｐＣＷ０３５９にライゲーションした。ＬＣＷ０
４０２と命名した得られたライブラリのクローンの大半は誘導後に緑色蛍光を示し、これ
はＸＴＥＮ＿ＡＥ３６の配列がインフレームでＧＦＰ遺伝子とライゲーションされて、Ｘ
ＴＥＮ＿ＡＥ３６の大半の配列が良好な発現を示すことを示している。
本発明者らは高レベルの蛍光についてライブラリＬＣＷ０４０２からの９６の単離体を
、ＩＰＴＧを含有する寒天プレートに単離体をスタンプすることによってスクリーニング
した。同じ単離体をＰＣＲによって評価して、３６アミノ酸ならびに強い蛍光を有するセ
グメントを含有する４８の単離体を同定した。これらの単離体を配列決定して、正しいＸ
ＴＥＮ＿ＡＥ３６セグメントを含有する３７のクローンを同定した。ヌクレオチドおよび
アミノ酸構築物のファイル名ならびにこれらのセグメントの配列番号を表１３に挙げる。
Figure 0007461438000040
Figure 0007461438000041
Figure 0007461438000042
Figure 0007461438000043

（実施例３）
ＸＴＥＮ＿ＡＦ３６セグメントの構築
３６アミノ酸長の配列をコードするコドンライブラリを構築した。配列をＸＴＥＮ＿Ａ
Ｆ３６と命名した。そのセグメントはアミノ酸配列［Ｘ］３を有し、ここでＸは、配列：
ＧＳＴＳＥＳＰＳＧＴＡＰ（配列番号４４７）、ＧＴＳＴＰＥＳＧＳＡＳＰ（配列番号４
４８）、ＧＴＳＰＳＧＥＳＳＴＡＰ（配列番号４４９）、またはＧＳＴＳＳＴＡＥＳＰＧ
Ｐ（配列番号４５０）を有する１２マーペプチドである。以下の対のリン酸化合成オリゴ
ヌクレオチド対をアニーリングすることによって、インサートを得た：
Figure 0007461438000044

本発明者らは、リン酸化オリゴヌクレオチド３ＫｐｎＩｓｔｏｐｐｅｒＦｏｒ：ＡＧＧ
ＴＴＣＧＴＣＴＴＣＡＣＴＣＧＡＧＧＧＴＡＣ（配列番号４５９）および非リン酸化オリ
ゴヌクレオチドｐｒ＿３ＫｐｎＩｓｔｏｐｐｅｒＲｅｖ：ＣＣＴＣＧＡＧＴＧＡＡＧＡＣ
ＧＡ（配列番号４６０））もアニーリングした。アニーリングされたオリゴヌクレオチド
対をライゲーションすると、１つのＢｂｓＩ／ＫｐｎＩセグメントにライゲーションされ
た可変数の１２マー反復を表す可変長を有する生成物の混合物が生じた。３６アミノ酸の
長さに相当する生成物は、分取アガロースゲル電気泳動によって混合物から単離して、Ｂ
ｓａＩ／ＫｐｎＩ消化スタッファベクターｐＣＷ０３５９にライゲーションした。ＬＣＷ
０４０３と命名した得られたライブラリのクローンの大半は誘導後に緑色蛍光を示し、こ
れはＸＴＥＮ＿ＡＦ３６の配列がインフレームでＧＦＰ遺伝子とライゲーションされて、
ＸＴＥＮ＿ＡＦ３６の大半の配列が良好な発現を示すことを示している。
本発明者らは高レベルの蛍光についてライブラリＬＣＷ０４０３からの９６の単離体を
、ＩＰＴＧを含有する寒天プレートに単離体をスタンプすることによってスクリーニング
した。同じ単離体をＰＣＲによって評価して、３６アミノ酸ならびに強い蛍光を有するセ
グメントを含有する４８の単離体を同定した。これらの単離体を配列決定して、正しいＸ
ＴＥＮ＿ＡＦ３６セグメントを含有する４４のクローンを同定した。ヌクレオチドおよび
アミノ酸構築物のファイル名ならびにこれらのセグメントの配列番号を表１４に挙げる。
Figure 0007461438000045
Figure 0007461438000046
Figure 0007461438000047
Figure 0007461438000048

（実施例４）
ＸＴＥＮ＿ＡＧ３６セグメントの構築
３６アミノ酸長の配列をコードするコドンライブラリを構築した。配列をＸＴＥＮ＿Ａ
Ｇ３６と命名した。そのセグメントはアミノ酸配列［Ｘ］３を有し、ここでＸは、配列：
ＧＴＰＧＳＧＴＡＳＳＳＰ（配列番号５４９）、ＧＳＳＴＰＳＧＡＴＧＳＰ（配列番号５
５０）、ＧＳＳＰＳＡＳＴＧＴＧＰ（配列番号５５１）、またはＧＡＳＰＧＴＳＳＴＧＳ
Ｐ（配列番号５５２）を有する１２マーペプチドである。以下の対のリン酸化合成オリゴ
ヌクレオチド対をアニーリングすることによって、インサートを得た：
Figure 0007461438000049

本発明者らは、リン酸化オリゴヌクレオチド３ＫｐｎＩｓｔｏｐｐｅｒＦｏｒ：ＡＧＧ
ＴＴＣＧＴＣＴＴＣＡＣＴＣＧＡＧＧＧＴＡＣ（配列番号５６１）および非リン酸化オリ
ゴヌクレオチドｐｒ＿３ＫｐｎＩｓｔｏｐｐｅｒＲｅｖ：ＣＣＴＣＧＡＧＴＧＡＡＧＡＣ
ＧＡ（配列番号５６２）もアニーリングした。アニーリングされたオリゴヌクレオチド対
をライゲーションすると、１つのＢｂｓＩ／ＫｐｎＩセグメントにライゲーションされた
可変数の１２マー反復を表す可変長を有する生成物の混合物が生じた。３６アミノ酸の長
さに相当する生成物は、分取アガロースゲル電気泳動によって混合物から単離して、Ｂｓ
ａＩ／ＫｐｎＩ消化スタッファベクターｐＣＷ０３５９にライゲーションした。ＬＣＷ０
４０４と命名した得られたライブラリのクローンの大半は誘導後に緑色蛍光を示し、これ
はＸＴＥＮ＿ＡＧ３６の配列がインフレームでＧＦＰ遺伝子とライゲーションされて、Ｘ
ＴＥＮ＿ＡＧ３６の大半の配列が良好な発現を示すことを示している。
本発明者らは高レベルの蛍光についてライブラリＬＣＷ０４０４からの９６の単離体を
、ＩＰＴＧを含有する寒天プレートに単離体をスタンプすることによってスクリーニング
した。同じ単離体をＰＣＲによって評価して、３６アミノ酸ならびに強い蛍光を有するセ
グメントを含有する４８の単離体を同定した。これらの単離体を配列決定して、正しいＸ
ＴＥＮ＿ＡＧ３６セグメントを含有する４４のクローンを同定した。ヌクレオチドおよび
アミノ酸構築物のファイル名ならびにこれらのセグメントの配列番号を表１５に挙げる。
Figure 0007461438000050
Figure 0007461438000051
Figure 0007461438000052
Figure 0007461438000053

（実施例５）
ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４セグメントの構築
ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４をＸＴＥＮ＿ＡＥ３６のＡＥ７２、１４４，２８８、５７６およ
び８６４への連続２量体化から構築した。ＸＴＥＮ＿ＡＥ７２セグメントのコレクション
をＸＴＥＮ＿ＡＥ３６の３７の異なるセグメントから構築した。３７すべての異なる３６
アミノ酸セグメントを内部に持つ大腸菌の培養物を混合して、プラスミドを単離した。こ
のプラスミドプールをＢｓａＩ／Ｎｃｏｌで消化して、小型フラグメントをインサートと
して生成させた。同じプラスミドプールをＢｂｓＩ／Ｎｃｏｌで消化して、大型フラグメ
ントをベクターとして生成させた。インサートフラグメントおよびベクターフラグメント
をライゲーションすると、長さの倍増が生じ、ライゲーション混合物をＢＬ２１Ｇｏｌｄ
（ＤＥ３）細胞に形質転換させて、ＸＴＥＮ＿ＡＥ７２のコロニーを得た。
ＸＴＥＮ＿ＡＥ７２セグメントのこのライブラリをＬＣＷ０４０６と命名した。ＬＣＷ
０４０６からのすべてのクローンを組み合わせて、上記と同じプロセスを使用して再度２
量体化して、ＸＴＥＮ＿ＡＥ１４４のライブラリＬＣＷ０４１０を産した。ＬＣＷ０４１
０からのすべてのクローンを組み合わせて、上記と同じプロセスを使用して再度２量体化
して、ＸＴＥＮ＿ＡＥ２８８のライブラリＬＣＷ０４１４を産した。２つの単離体ＬＣＷ
０４１４．００１およびＬＣＷ０４１４．００２をライブラリからランダムに選び出し、
配列決定して同一性を検証した。ＬＣＷ０４１４からのすべてのクローンを組み合わせて
、上記と同じプロセスを使用して再度２量体化して、ＸＴＥＮ＿ＡＥ５７６のライブラリ
ＬＣＷ０４１８を産した。本発明者らは高レベルのＧＦＰ蛍光についてライブラリＬＣＷ
０４１８から９６の単離体をスクリーニングした。ＰＣＲおよび強蛍光によって正しいサ
イズのインサートを有する８つの単量体を配列決定し、２つの単離体（ＬＣＷ０４１８．
０１８およびＬＣＷ０４１８．０５２）を将来使用するために配列決定および発現データ
に基づいて選定した。
ＸＴＥＮ＿ＡＥ５７６のＬＣＷ０４１８．０１８およびＸＴＥＮ＿ＡＥ２８８のＬＣＷ
０４１４．００２を組み合わせることによって、上記と同じ２量体化プロセスを使用して
、ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４の特異的クローン（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｌｏｎｅ）ｐＣＷ０４
３２を構築した。
（実施例６）
ＸＴＥＮ＿ＡＭ１４４の構築
ＸＴＥＮ＿ＡＥ３６の３７の異なるセグメント、ＸＴＥＮ＿ＡＦ３６の４４のセグメン
ト、およびＸＴＥＮ＿ＡＧ３６の４４のセグメントから開始して、ＸＴＥＮ＿ＡＭ１４４
セグメントのコレクションを構築した。
１２５すべての異なる３６アミノ酸セグメントを内部に持つ大腸菌の培養物を混合して
、プラスミドを単離した。このプラスミドプールをＢｓａＩ／ＮｃｏＩで消化して、小型
フラグメントをインサートとして生成させた。同じプラスミドプールをＢｂｓＩ／Ｎｃｏ
Ｉで消化して、大型フラグメントをベクターとして生成させた。インサートフラグメント
およびベクターフラグメントをライゲーションすると、長さの倍増が生じ、ライゲーショ
ン混合物をＢＬ２１Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）細胞に形質転換させて、ＸＴＥＮ＿ＡＭ７２のコ
ロニーを得た。
ＸＴＥＮＡＭ７２セグメントのこのライブラリをＬＣＷ０４６１と命名した。ＬＣＷ０
４６１からのすべてのクローンを組み合わせて、上記と同じプロセスを使用して再度２量
体化して、ライブラリＬＣＷ０４６２を産した。ライブラリＬＣＷ０４６２からの１５１
２の単離体をタンパク質発現についてスクリーニングした。個々のコロニーを９６ウェル
プレートに移して、スターター培養物として一晩培養した。これらのスターター培養物を
新たな自己誘導媒体に希釈して、２０～３０時間培養した。蛍光プレートリーダを励起３
９５ｎｍおよび発光５１０ｎｍにて使用して、発現を測定した。１９２の単離体が高レベ
ルの発現を示し、それらにつきＤＮＡ配列決定を行った。ライブラリＬＣＷ０４６２の大
半のクローンが良好な発現および同様の物理化学特性を示し、ＸＴＥＮ＿ＡＭ３６セグメ
ントの大半の組み合わせが有用なＸＴＥＮ配列を産することが示唆された。複数のＸＴＥ
Ｎセグメントを含有する多機能性タンパク質の構築のための、ＸＴＥＮ＿ＡＭ１４４セグ
メントの好ましいコレクションとして、ＬＣＷ０４６２からの３０の単離体を選定した。
ヌクレオチドおよびアミノ酸構築物のファイル名ならびにこれらのセグメントの配列番号
を表１６に挙げる。
Figure 0007461438000054
Figure 0007461438000055
Figure 0007461438000056
Figure 0007461438000057
Figure 0007461438000058
Figure 0007461438000059
Figure 0007461438000060
Figure 0007461438000061
Figure 0007461438000062
Figure 0007461438000063

（実施例７）
ＸＴＥＮ＿ＡＭ２８８の構築
ライブラリＬＣＷ０４６２全体を実施例６に記載するように２量体化して、得られたＸ
ＴＥＮ＿ＡＭ２８８クローンのライブラリをＬＣＷ０４６３と命名した。ライブラリＬＣ
Ｗ０４６３からの１５１２の単離体を実施例６に記載したプロトコルを使用してスクリー
ニングした。１７６の高発現クローンを配列決定して、２８８アミノ酸残基を有する複数
のＸＴＥＮセグメントを含有する多機能性タンパク質の構築のために、４０の好ましいＸ
ＴＥＮ＿ＡＭ２８８セグメントを選定した。
（実施例８）
ＸＴＥＮ＿ＡＭ４３２の構築
本発明者らは、ＸＴＥＮ＿ＡＭ１４４セグメントのライブラリＬＣＷ０４６２からのセ
グメントおよびＸＴＥＮ＿ＡＭ２８８セグメントのライブラリＬＣＷ０４６３からのセグ
メントを組み換えることより、ＸＴＥＮ＿ＡＭ４３２セグメントのライブラリを生成させ
た。ＸＴＥＮ＿ＡＭ４３２セグメントのこの新たなライブラリをＬＣＷ０４６４と命名し
た。プラスミドは、ＬＣＷ０４６２およびＬＣＷ０４６３を内部に持つ大腸菌の培養物か
らそれぞれを単離した。ライブラリＬＣＷ０４６４からの１５１２の単離体を実施例６に
記載したプロトコルを使用してスクリーニングした。１７６の高発現クローンを配列決定
して、より長いＸＴＥＮの構築のためにおよび４３２アミノ酸残基を有する複数のＸＴＥ
Ｎセグメントを含有する多機能性タンパク質の構築のために、３９の好ましいＸＴＥＮ＿
ＡＭ４３２セグメントを選定した。
並行して本発明者らは、ＸＴＥＮ＿ＡＭ１４４およびＸＴＥＮ＿ＡＭ２８８の好ましい
セグメントを使用して、ＸＴＥＮ＿ＡＭ４３２セグメントのライブラリＬＭＳ０１００を
構築した。このライブラリのスクリーニングは、さらなる構築のために選択される４の単
離体を産した。
（実施例９）
ＸＴＥＮ＿ＡＭ８７５の構築
スタッファベクターｐＣＷ０３５９をＢｓａＩおよびＫｐｎＩによって消化して、スタ
ッファセグメントを除去して、得られたベクターフラグメントをアガロースゲル精製によ
って単離した。
本発明者らは、アミノ酸ＧＡＳＡＳＧＡＰＳＴＧ（配列番号７１９）をコードして、制
限酵素ＡｓｃＩ認識ヌクレオチド配列ＧＧＣＧＣＧＣＣを内部に有するシーケンシングア
イランドＡ（ＳＩ－Ａ）を導入するために、リン酸化オリゴヌクレオチドＢｓａＩ－Ａｓ
ｃＩ－ＫｐｎＩｆｏｒＰ：ＡＧＧＴＧＣＡＡＧＣＧＣＡＡＧＣＧＧＣＧＣＧＣＣＡＡＧＣ
ＡＣＧＧＧＡＧＧＴＴＣＧＴＣＴＴＣＡＣＴＣＧＡＧＧＧＴＡＣ（配列番号７１７）およ
び非リン酸化オリゴヌクレオチドＢｓａＩ－ＡｓｃＩ－ＫｐｎＩｒｅｖ：ＣＣＴＣＧＡＧ
ＴＧＡＡＧＡＣＧＡＡＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＴＧＧＣＧＣＧＣＣＧＣＴＴＧＣＧＣＴＴ
ＧＣ（配列番号７１８）をアニーリングした。アニーリングしたオリゴヌクレオチド対を
上で調製したＢｓａＩおよびＫｐｎＩ消化スタッファベクターｐＣＷ０３５９とライゲー
ションして、ＳＩ－Ａを含有するｐＣＷ０４６６を産した。本発明者らは次に、実施例５
に記載したのと同じ２量体化プロセスを使用して、実施例８からの４３の好ましいＸＴＥ
Ｎ＿ＡＭ４３２セグメントおよびｐＣＷ０４６６からのＳＩ－ＡセグメントをＣ末端にて
組み換えることによって、ＸＴＥＮ＿ＡＭ４４３セグメントのライブラリを生成させた。
ＸＴＥＮ＿ＡＭ４４３セグメントのこの新たなライブラリをＬＣＷ０４７９と命名した。
本発明者らは、実施例５に記載したのと同じ２量体化プロセスを使用して、ＸＴＥＮ＿
ＡＭ４４３セグメントのライブラリＬＣＷ０４７９からのセグメントおよび実施例８から
の４３の好ましいＸＴＥＮ＿ＡＭ４３２セグメントを組み換えることによって、ＸＴＥＮ
＿ＡＭ８７５セグメントのライブラリを生成させた。ＸＴＥＮ＿ＡＭ８７５のセグメント
のこの新たなライブラリをＬＣＷ０４８１と命名した。
（実施例１０）
ＸＴＥＮ＿ＡＭ１３１８の構築
本発明者らは、アミノ酸ＧＰＥＰＴＧＰＡＰＳＧ（配列番号７２２）をコードして、制
限酵素ＦｓｅＩ認識ヌクレオチド配列ＧＧＣＣＧＧＣＣを内部に有するシーケンシングア
イランドＢ（ＳＩ－Ｂ）を導入するために、リン酸化オリゴヌクレオチドＢｓａＩ－Ｆｓ
ｅＩ－ＫｐｎＩｆｏｒＰ：ＡＧＧＴＣＣＡＧＡＡＣＣＡＡＣＧＧＧＧＣＣＧＧＣＣＣＣＡ
ＡＧＣＧＧＡＧＧＴＴＣＧＴＣＴＴＣＡＣＴＣＧＡＧＧＧＴＡＣ（配列番号７２０）およ
び非リン酸化オリゴヌクレオチドＢｓａＩ－ＦｓｅＩ－ＫｐｎＩｒｅｖ：ＣＣＴＣＧＡＧ
ＴＧＡＡＧＡＣＧＡＡＣＣＴＣＣＧＣＴＴＧＧＧＧＣＣＧＧＣＣＣＣＧＴＴＧＧＴＴＣＴ
ＧＧ（配列番号７２１）をアニーリングした。アニーリングしたオリゴヌクレオチド対を
実施例９で使用したようなＢｓａＩおよびＫｐｎＩ消化スタッファベクターｐＣＷ０３５
９とライゲーションして、ＳＩ－Ｂを含有するｐＣＷ０４６７を産した。本発明者らは次
に、実施例５に記載したのと同じ２量体化プロセスを使用して、実施例８からの４３の好
ましいＸＴＥＮ＿ＡＭ４３２セグメントおよびｐＣＷ０４６７からのＳＩ－Ｂセグメント
をＣ末端にて組み換えることによって、ＸＴＥＮ＿ＡＭ４４３セグメントのライブラリを
生成させた。ＸＴＥＮ＿ＡＭ４４３セグメントのこの新たなライブラリをＬＣＷ０４８０
と命名した。
本発明者らは、実施例５に記載の２量体化プロセスと同様の２量体化プロセスを使用し
て、ＸＴＥＮ＿ＡＭ４４３セグメントのライブラリＬＣＷ０４８０およびＸＴＥＮ＿ＡＭ
８７５セグメントのライブラリＬＣＷ０４８１を組み換えることにより、ＸＴＥＮ＿ＡＭ
１３１８セグメントのライブラリを生成させた。ＸＴＥＮ＿ＡＭ１３１８セグメントのこ
の新たなライブラリをＬＣＷ０４８７と命名した。
（実施例１１）
ＸＴＥＮ＿ＡＤ８６４の構築
本発明者らは２量体化を数回連続して使用して、実施例１に挙げたＸＴＥＮ＿ＡＤ３６
のセグメントから開始してＸＴＥＮ＿ＡＤ８６４配列のコレクションを構築した。これら
の配列を実施例５に記載したように構築した。ＸＴＥＮ＿ＡＤ８６４からの数個の単離体
を評価して、生理的条件下で良好な発現および優れた溶解性を示すことを見出した。ＸＴ
ＥＮ＿ＡＤ５７６の１つの中間構築物を配列決定した。このクローンをカニクイザルのＰ
Ｋ実験で評価して、約２０時間の半減期を測定した。
（実施例１２）
ＸＴＥＮ＿ＡＦ８６４の構築
本発明者らは２量体化を数回連続して使用して、実施例３に挙げたＸＴＥＮ＿ＡＦ３６
のセグメントから開始してＸＴＥＮ＿ＡＦ８６４配列のコレクションを構築した。これら
の配列を実施例５に記載したように構築した。ＸＴＥＮ＿ＡＦ８６４からの数個の単離体
を評価して、生理的条件下で良好な発現および優れた溶解性を示すことを見出した。ＸＴ
ＥＮ＿ＡＦ５４０の１つの中間構築物を配列決定した。このクローンをカニクイザルのＰ
Ｋ実験で評価して、約２０時間の半減期を測定した。ＸＴＥＮ＿ＡＦ８６４の全長クロー
ンはカニクイザルにおいて、優れた溶解性を有し、６０時間を超える半減期を示した。実
施例９に記載したようなシーケンシングアイランドを含むＸＴＥＮ＿ＡＦ配列の第２のセ
ットを構築した。
（実施例１３）
ＸＴＥＮ＿ＡＧ８６４セグメントの構築
本発明者らは２量体化を数回連続して使用して、実施例１に挙げたＸＴＥＮ＿ＡＤ３６
のセグメントから開始してＸＴＥＮ＿ＡＧ８６４配列のコレクションを構築した。これら
の配列を実施例５に記載したように構築した。ＸＴＥＮ＿ＡＧ８６４からの数個の単離体
を評価して、生理的条件下で良好な発現および優れた溶解性を示すことを見出した。ＸＴ
ＥＮ＿ＡＧ８６４の全長クローンはカニクイザルにおいて、優れた溶解性を有し、６０時
間を超える半減期を示した。
（実施例１４）
ＸＴＥＮのＮ末端延長物の構築－１２マー付加ライブラリの構築およびスクリーニング
本実施例は、翻訳の開始を促進し、ヘルパードメインの存在なしで融合タンパク質のＮ
末端でのＸＴＥＮ融合物の発現を可能にするための、ＸＴＥＮタンパク質のＮ末端の最適
化ステップについて詳述する。コドンレベルで多様性を生成するために、７アミノ酸配列
を選択して、多様なコドンを用いて調製した。コドン多様性を有する１２アミノ酸をコー
ドする７対のオリゴヌクレオチドを設計、アニーリングして、ＮｄｅＩ／ＢｓａＩ制限酵
素消化スタッファベクターｐＣＷ０５５１（Ｓｔｕｆｆｅｒ－ＸＴＥＮ＿ＡＭ８７５－Ｇ
ＦＰ）にライゲーションし、大腸菌ＢＬ２１Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）コンピテント細胞に形質
転換して、７つのライブラリのコロニーを得た。得られたクローンは、ＸＴＥＮ＿ＡＭ８
７５－ＧＦＰにインフレームで融合されたＮ末端ＸＴＥＮ１２マーを有し、発現のスクリ
ーニングのためにＧＦＰ蛍光を使用できるようにする。生成した７つのライブラリから個
々のコロニーを選び出し、９６深ウェルプレート内のスーパーブロス媒体５００μｌ中で
一晩、飽和になるまで生育させた。選び出されたコロニーの数は、ライブラリの理論的多
様性の約半分から３分の１に及んだ（表１７を参照）。
Figure 0007461438000064

一晩飽和させた培養物を使用して、新鮮な培養物５００μｌを自己誘導媒体に接種し、
そこで培養物を２６℃にて一晩生育させた。次にこれらの発現培養物を蛍光プレートリー
ダ（励起３９５ｎｍ、発光５１０ｎｍ）を用いてアッセイして、存在するＧＦＰレポータ
の量を決定した。結果により、中央値発現レベルがＣＢＤのＮ末端ヘルパードメインによ
る発現レベルのおおよそ半分であることが示される。しかしライブラリからの最良のクロ
ーンがベンチマークにはるかに近く、これらの配列の周囲でのさらなる最適化が保証され
たことが示された。アミノ酸ＭＡで開始するライブラリがＭＥで始まるライブラリよりも
良好な発現を産生したことも明白であった。このことは、最良のクローン（ベンチマーク
により近い）がたいていＭＡで開始するので、その最良のクローンを見れば最も明らかで
あった。ＣＢＤ－ＡＭ８７５ベンチマークの３３％以内の１７６クローンのうち８７％が
ＭＡで始まり、上記ライブラリにおける配列の７５％のみがＭＡで始まるので、ＭＡで始
まるそれらのクローンが最高レベルでの発現を表すことは明らかであった。最良のクロー
ンのうち９６を配列決定して同一性を確認し、ＬＣＷ５４６から４つ、ＬＣＷ５４７から
４つおよびＬＣＷ５５２から４つの１２配列（表１８を参照）をさらなる最適化のために
選択した。
Figure 0007461438000065
Figure 0007461438000066

（実施例１５）
ＸＴＥＮのＮ末端延長物の構築－コドン３および４を最適化するライブラリの構築およ
びスクリーニング
本実施例は、翻訳の開始を促進し、ヘルパードメインの存在なしでタンパク質のＮ末端
でのＸＴＥＮ融合物の発現を可能にするための、ＸＴＥＮタンパク質のＮ末端の最適化ス
テップについて詳述する。確立された最初の２つのコドンに対する選択性（上の例を参照
）を用いて、第３および第４のコドンを無作為化して選択性を決定した。許容されるＸＴ
ＥＮコドンのすべての組合せがこれらの位置に存在するように改変された第３および第４
の残基を用いて、ＬＣＷ５４６、ＬＣＷ５４７およびＬＣＷ５５２による最良のクローン
に基づく３つのライブラリを設計した。許容されるすべてのＸＴＥＮコドンを各ライブラ
リに含めるために、第３および第４の残基のコドン多様性を有する１２アミノ酸をコード
する９対のオリゴヌクレオチドを設計、アニーリングして、ＮｄｅＩ／ＢｓａＩ制限酵素
で消化したスタッファベクターｐＣＷ０５５１（Ｓｔｕｆｆｅｒ－ＸＴＥＮ＿ＡＭ８７５
－ＧＦＰ）にライゲーションして、大腸菌ＢＬ２１Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）コンピテント細胞
に形質変換して、３つのライブラリＬＣＷ０５６９－５７１のコロニーを得た。２４ＸＴ
ＥＮコドンでは、各ライブラリの理論的多様性は５７６のユニークなクローンである。生
成した３つのライブラリから合計５０４の個々のコロニーを選び出し、９６深ウェルプレ
ート内のスーパーブロス媒体５００μｌ中で一晩、飽和になるまで生育させた。これによ
り相対的なライブラリの性能および配列選択性を理解するために十分な適用範囲が提供さ
れる。一晩飽和させた培養物を使用して、新しい培養物５００μｌを自己誘導媒体に接種
して、そこで培養物を２６℃にて一晩生育させた。次に、これらの発現培養物を蛍光プレ
ートリーダ（励起３９５ｎｍ、発光５１０ｎｍ）を用いてアッセイして、存在するＧＦＰ
レポータの量を決定した。スクリーニングによる上位７５のクローンを配列決定して、Ｇ
ＦＰリポーター発現をベンチマーク試料に対して再試験した。５２のクローンが使用可能
な配列決定データを産し、続いての分析に使用した。結果はライブラリによって分類され
、ＬＣＷ５４６が優位なライブラリであることを示した。結果を表１９に表示する。
Figure 0007461438000067

第３位および第４位の特定のコドンに対する選択性を示すさらなる傾向がデータに見ら
れた。ＬＣＷ５６９ライブラリ内では、表２０に見られるように、第３位のグルタメート
コドンＧＡＡおよびトレオニンコドンＡＣＴがより高い発現に関連付けられた。
Figure 0007461438000068

その上、上位７５のクローンの再試験により、数個がベンチマーククローンより優位で
あることが示された。
（実施例１６）
ＸＴＥＮのＮ末端延長物の構築－コンビナトリアル１２マーおよび３６マーライブラリ
の構築およびスクリーニング
本実施例は、翻訳の開始を促進し、ヘルパードメインの存在なしでタンパク質のＮ末端
でのＸＴＥＮ融合物の発現を可能にするための、ＸＴＥＮタンパク質のＮ末端の最適化ス
テップについて詳述する。確立された最初の２つのコドンに対する選択性（上の例を参照
）を用いて、まさにＮ末端にある選択した１２の１２マー配列（上掲の実施例を参照）と
それに続く以前に構築した１２５の３６マーセグメント（上掲の実施例を参照）をコンビ
ナトリアル方式で組み合わせることによって、より広い状況でＮ末端を検査した。これに
よりＸＴＥＮタンパク質のＮ末端に新規４８マーが生成され、より長い配列の発現に対す
るＮ末端におけるより長い範囲の相互作用の影響の評価が可能となった（図１１）。３６
マーを構築するために使用した２量体化手順（上の実施例を参照）と同様に、選択した１
２５の３６マーセグメントを含有するプラスミドを制限酵素ＢｂｓＩ／ＮｃｏＩで消化し
て、適切なフラグメントをゲル精製した。クローンＡＣ９４（ＣＢＤ－ＸＴＥＮ＿ＡＭ８
７５－ＧＦＰ）からのプラスミドをＢｓａＩ／ＮｃｏＩで消化して、適切なフラグメント
をゲル精製した。これらのフラグメントを共にライゲーションして、大腸菌ＢＬ２１Ｇｏ
ｌｄ（ＤＥ３）コンピテント細胞に形質転換し、ライブラリＬＣＷ０５７９のコロニーを
得て、該コロニーはまさにＮ末端において選択された１２の１２マーのさらなるクローニ
ングのためのベクターとしての役割も果たした。ＬＣＷ０５７９のプラスミドをＮｄｅＩ
／ＥｃｏＲＩ／ＢｓａＩで消化して、適切なフラグメントをゲル精製した。選択した１２
の１２マー配列をコードするオリゴヌクレオチドの１２対を設計、アニーリングし、Ｎｄ
ｅＩ／ＥｃｏＲＩ／ＢｓａＩ消化ＬＣＷ０５７９ベクターによってライゲーションして、
大腸菌ＢＬ２１Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）コンピテント細胞に形質転換し、ライブラリＬＣＷ０
５８０のコロニーを得た。１５００のユニークなクローンの理論的多様性を用いて、生成
されたライブラリから合計１５１２の個々のコロニーを選び出し、９６深ウェルプレート
内のスーパーブロス媒体５００μｌ中で一晩、飽和になるまで生育させた。これにより相
対的なライブラリの性能および配列選択性を理解するために十分な適用範囲が提供される
。一晩飽和させた培養物を使用して、新しい培養物５００μｌを自己誘導媒体に接種して
、そこで培養物を２６℃にて一晩生育させた。次に、これらの発現培養物を蛍光プレート
リーダ（励起３９５ｎｍ、発光５１０ｎｍ）を用いてアッセイして、存在するＧＦＰレポ
ータの量を決定した。上位９０のクローンを配列決定して、ＧＦＰリポーター発現を再試
験した。８３のクローンが使用可能な配列決定データを産し、続いての分析に使用した。
配列決定データを使用して各クローンに存在するリード１２マーを決定して、各１２マー
の発現に対する影響を評価した。クローンＬＣＷ５４６＿０６およびＬＣＷ５４６＿０９
は優れたＮ末端として突出していた（表２１を参照）。
Figure 0007461438000069

配列決定および再試験によって、同じ結果を産生するデータにおける同じ配列の非依存
性複製物の数個の例も明らかとなり、それゆえアッセイの信頼度が増加した。その上、６
つユニークな配列を有する１０のクローンはベンチマーククローンより優位であった。こ
れを表２２に表示する。これらのクローンがこれらの配列の唯一の出現であることに注目
され、いかなる場合もこれらの配列のうちの１つが出現して、ベンチマーククローンに勝
てないことがなかった。この６つの配列でさらなる最適化を進めた。
Figure 0007461438000070
Figure 0007461438000071

（実施例１７）
ＸＴＥＮのＮ末端延長物の構築－ＸＴＥＮ－ＡＭ８７５およびＸＴＥＮ－ＡＥ８６４の
コンビナトリアル１２マーおよび３６マーライブラリの構築およびスクリーニング
本実施例は、翻訳の開始を促進し、ヘルパードメインの存在なしでタンパク質のＮ末端
でのＸＴＥＮ融合物の発現を可能にするための、ＸＴＥＮタンパク質のＮ末端の最適化ス
テップについて詳述する。最初の４つのコドンに対する（上掲の実施例を参照、ならびに
確立されたＮ末端１２マーおよび３６マーの最良の対合に対する（上掲の実施例を参照）
選択性を用いて、コンビナトリアル手法に着手して、これらの選択性の組合せ（ｕｎｉｏ
ｎ）を検査した。これによりＸＴＥＮタンパク質のＮ末端に新規４８マーが生成され、以
前の結果のコンフルエンスの試験が可能となった。その上、これらのリーダー配列がすべ
てのＸＴＥＮタンパク質にとって普遍的な解決策となる能力を、ＸＴＥＮ－ＡＥ８６４お
よびＸＴＥＮ－ＡＭ８７５の両方の前に新しい４８マーを置くことによって評価した。３
６マーセグメントの１２５のクローンすべてを使用するあるいは、コンビナトリアルライ
ブラリで最良のＧＦＰ発現を有する３６マーセグメントの選択した６つのクローンからの
プラスミドをＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩ／ＢｓａＩで消化して、適切なフラグメントをゲル精
製した。クローンＡＣ９４（ＣＢＤ－ＸＴＥＮ＿ＡＭ８７５－ＧＦＰ）およびＡＣ１０４
（ＣＢＤ－ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４－ＧＦＰ）からのプラスミドをＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩ／
ＢｓａＩで消化して、適切なフラグメントをゲル精製した。これらのフラグメントを共に
ライゲーションして、大腸菌ＢＬ２１Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）コンピテント細胞に形質転換し
、ライブラリＬＣＷ０５８５（－ＸＴＥＮ＿ＡＭ８７５－ＧＦＰ）およびＬＣＷ０５８６
（－ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４－ＧＦＰ）のコロニーを得て、該コロニーはまさにＮ末端にお
いて選択された８つの１２マーのさらなるクローニングのためのベクターとしての役割も
果たし得た。ＬＣＷ０５８５およびＬＣＷ０５８６のプラスミドをＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩ
／ＢｓａＩで消化して、適切なフラグメントをゲル精製した。以前の（第２世代）スクリ
ーニングで最良のＧＦＰ発現を有する８つの選択された１２マー配列をコードするオリゴ
ヌクレオチドの８対を設計、アニーリングし、ＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩ／ＢｓａＩ消化ＬＣ
Ｗ０５８５およびＬＣＷ０５８６ベクターによってライゲーションして、大腸菌ＢＬ２１
Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）コンピテント細胞に形質転換し、最終ライブラリＬＣＷ０５８７（Ｘ
ＴＥＮ＿ＡＭ９２３－ＧＦＰ）およびＬＣＷ０５８８（ＸＴＥＮ＿ＡＥ９１２－ＧＦＰ）
のコロニーを得た。４８のユニークなクローンの理論的多様性を用いて、生成したライブ
ラリから２５２の個々のコロニーを選び出し、９６深ウェルプレート内のスーパーブロス
媒体５００μｌ中で一晩、飽和になるまで生育させた。これにより相対的なライブラリの
性能および配列選択性を理解するために十分な適用範囲が提供された。一晩飽和させた培
養物を使用して、新しい培養物５００μｌを自己誘導媒体に接種して、そこで培養物を２
６℃にて一晩生育させた。次に、これらの発現培養物を蛍光プレートリーダ（励起３９５
ｎｍ、発光５１０ｎｍ）を用いてアッセイして、存在するＧＦＰレポータの量を決定した
。上位３６のクローンを配列決定して、ＧＦＰリポーター発現を再試験した。３６のクロ
ーンが使用可能な配列決定データを産し、これらの３６のクローンを続いての分析に使用
した。配列決定データにより、クローンに存在する１２マー、第３コドン、第４コドンお
よび３６マーが決定され、それらのクローンの多くが同じ配列の非依存性複製物であるこ
とが明らかにされた。その上、これらのクローンの再試験結果は値が近接しており、スク
リーニングプロセスが頑強であったことが示される。Ｎ末端における特定の組み合わせに
対する選択性が見られ、ベンチマーク対照よりも高い蛍光値を一貫して産していた（表２
３および２４を参照）。
Figure 0007461438000072
Figure 0007461438000073

顕著にはＸＴＥＮ－ＡＭ８７５のＮ末端の好ましい組み合わせおよびＸＴＥＮ－ＡＥ８
６４の好ましい組み合わせは同じではなく（表２３および２４）、開始部位からの１５０
を超えるさらに複雑な相互作用が発現レベルを左右することが示される。好ましいヌクレ
オチド配列についての配列は表２５に挙げられており、好ましいクローンをＳＤＳ－ＰＡ
ＧＥによって分析して独立して発現を確認した。ＸＴＥＮ＿ＡＭ９２３およびＸＴＥＮ＿
ＡＥ９１２の完全配列をさらなる分析のために選択した。
Figure 0007461438000074

（実施例１８）
ＢＰＸＴＥＮ；例としてＸＴＥＮ－Ｅｘ４を産生および評価する方法
ＢＰＸＴＥＮ組成物を産生および評価するための一般スキームが図６に表示され、本実
施例の概要の基礎を形成する。開示した方法および当業者に公知の方法を例証的な実施例
で提供したガイダンスと共に使用すると、当業者は当分野で公知のＸＴＥＮ、ＢＰおよび
ＢＰの変異体を含む一連のＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質を生成および評価することができ
る。したがって、本実施例は、方法の単なる例証であり、いかなるやり方でも決して方法
を制限するものではないと解釈される；当業者には多くの変形が明らかとなる。本実施例
において、モチーフのＡＥファミリのＸＴＥＮに連結されたエキセンジン－４（「Ｅｘ４
」）のＢＰＸＴＥＮが生成される。
ＸＴＥＮをコードするポリヌクレオチドを産生する一般スキームを図４および５に表示
する。図５は、本発明の実施形態の１つにおけるＸＴＥＮポリヌクレオチド構築物の構築
における代表的なステップの概略フローチャートである。個々のオリゴヌクレオチド５０
１は配列モチーフ５０２、たとえば１２アミノ酸モチーフ（「１２マー」）にアニーリン
グされ、１２アミノ酸モチーフは続いてＢｂｓＩおよびＫｐｎＩ制限部位５０３を含有す
るオリゴとライゲーションされる。モチーフライブラリは、特異的配列ＸＴＥＮファミリ
；たとえば表１のＡＤ、ＡＥ、ＡＦ、ＡＧ、ＡＭ、またはＡＱ配列に限定することができ
る。この場合、ＡＥファミリ（配列番号１８６－１８９）のモチーフはモチーフライブラ
リとして使用され、１２マーにアニーリングされて「ビルディングブロック」長；たとえ
ば３６アミノ酸をコードするセグメントを生成する。ＸＴＥＮ遺伝子５０４の所望の長さ
が達成されるまで「ビルディングブロック」のライゲーションおよび多量体化によって、
ＸＴＥＮ配列をコードする遺伝子を構築することができる。図５に示すように、この場合
のＸＴＥＮ長は４８アミノ酸残基であるが、より長い長さが本プロセスによって達成でき
る。たとえば、多量体化は、ライゲーション、重複延長、ＰＣＲ構築または当分野で公知
の同様のクローニング技法によって行うことができる。ＸＴＥＮ遺伝子は、スタッファベ
クターにクローニングすることができる。図５に例証する実施例において、ベクターはＦ
ｌａｇ配列５０６を、続いてＢｓａＩ、ＢｂｓＩ、およびＫｐｎＩ部位５０７がフランキ
ングするスタッファ配列ならびにＢＰ遺伝子（たとえばエキセンジン－４）５０８をコー
ドして、ＢＰＸＴＥＮ５００をコードする遺伝子を生じることができ、この場合、該遺伝
子は配置Ｎ→Ｃ末端にて融合タンパク質ＸＴＥＮ－Ｅｘ４をコードする。
Ｅｘ４（または別の候補ＢＰ）をコードするＤＮＡ配列は、ゲノムライブラリからの、
適切な細胞源から調製されたｃＤＮＡライブラリから当分野で公知の標準手順によって都
合よく得ることができるか、または公に利用可能なデータベース、特許、もしくは参考文
献から得たＤＮＡ配列を使用して合成的に（たとえば自動化核酸合成）生成され得る。タ
ンパク質のＥｘ４部分をコードする遺伝子またはポリヌクレオチドは次に、構築物、たと
えば本明細書に記載する構築物にクローニングすることができ、該構築物は、生物系での
高レベルタンパク質発現に適切な転写配列および翻訳配列の制御下でのプラスミドまたは
他のベクターであることができる。（４８アミノ酸残基を有するＡＥとして例証された図
５の場合）ＸＴＥＮ部分をコードする第２の遺伝子またはポリヌクレオチドは、ライゲー
ションまたは多量体化ステップにより、Ｅｘ４をコードする遺伝子に隣接して、該遺伝子
とインフレームの構築物に該第２の遺伝子またはポリヌクレオチドをクローニングするこ
とによって、Ｅｘ４遺伝子のＮ末端をコードするヌクレオチドに遺伝子的に融合させるこ
とができる。本方式では、ＸＴＥＮ－Ｅｘ４ ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質をコードする
（またはＸＴＥＮ－Ｅｘ４ ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質に相補的な）キメラＤＮＡ分子
が構築物内に生成される。構築物を異なる配置で設計して、単量体ポリペプチドとしての
融合パートナーを各種の順列でコードすることができる。たとえば順序（Ｎ→Ｃ末端）：
Ｅｘ４－ＸＴＥＮ；ＸＴＥＮ－Ｅｘ４；Ｅｘ４－ＸＴＥＮ－Ｅｘ４；ＸＴＥＮ－Ｅｘ４－
ＸＴＥＮの融合タンパク質；ならびに上述の多量体をコードするための、遺伝子を生成す
ることができる。場合により、本キメラＤＮＡ分子は、さらに適切な発現ベクターである
別の構築物へ移行またはクローン化され得る。この時点で、キメラＤＮＡ分子を発現でき
る宿主細胞はキメラＤＮＡ分子によって形質転換される。目的のＤＮＡセグメントを含有
するベクターは、上記のように、適切な宿主細胞に周知の方法によって、細胞宿主の種類
に応じて移行することができる。
ＸＴＥＮ－Ｅｘ４発現ベクターを含有する宿主細胞は、プロモータを活性化するために
適切に改変された従来の栄養媒体で培養される。培養条件、たとえば温度、ｐＨなどは、
発現に選択された宿主細胞によって以前使用された条件であり、当業者には明らかである
。融合タンパク質の発現後に、細胞は下記のように、遠心分離によって収集され、物理的
または化学的手段によって破壊され、得られた粗抽出物は融合タンパク質の精製のために
保持される。宿主細胞によって分泌されたＢＰＸＴＥＮ組成物では、遠心分離からの上清
が分離され、さらなる精製のために保持される。
遺伝子発現は、たとえば従来のサザンブロッティング、ｍＲＮＡの転写を定量するノー
ザンブロッティング［Ｔｈｏｍａｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，
７７：５２０１－５２０５（１９８０）］、ドットブロッティング（ＤＮＡ分析）、また
はインサイチュハイブリダイゼーションによって、適切に標識されたプローブを使用して
本明細書で提供する配列に基づいて、試料において直接測定する。あるいは、遺伝子発現
は、免疫蛍光方法、例えば遺伝子産物の発現を直接定量するための細胞の免疫組織化学染
色によって測定される。免疫組織化学染色および／または試料流体のアッセイに有用な抗
体は、モノクローナルまたはポリクローナルのどちらでもよく、任意の哺乳動物で調製さ
れ得る。便利には、抗体は、本明細書で提供された配列に基づく合成ペプチドを使用する
Ｅｘ４配列ポリペプチドに対して、またはＥｘ４に融合され、特異的抗体エピトープをコ
ードする外因性配列に対して調製され得る。選択可能マーカーのさらなる例は当業者に周
知であり、リポーター、たとえば増強緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、ベータ－ガラク
トシダーゼ（β－ｇａｌ）またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（Ｃ
ＡＴ）を含む。
ＸＴＥＮ－Ｅｘ４ポリペプチド生成物は、当分野で公知の方法によって精製される。ゲ
ル濾過、親和性精製、塩分画、イオン交換クロマトグラフィー，サイズ排除クロマトグラ
フィー，ヒドロキシアパタイト吸着クロマトグラフィー，疎水性相互作用クロマトグラフ
ィーまたはゲル電気泳動などの手順は、すべてが精製で使用され得る技法である。精製の
具体的な方法は、Ｒｏｂｅｒｔ Ｋ．Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａ
ｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒ．Ｃ
ａｓｔｏｒ，ｅｄ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ １９９４、およびＳａｍｂｒｏ
ｏｋら、上掲に記載されている。複数ステップ精製分離もＢａｒｏｎら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅ
ｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０：１７９－９０（１９９０）およびＢｅｌｏｗら、Ｊ．
Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ．６７９：６７－８３（１９９４）に記載されている。
図６に例証されるように、単離ＸＴＥＮ－Ｅｘ４融合タンパク質は次に、その化学特性
および活性特性についてキャラクタリゼーションされる。単離融合タンパク質は、たとえ
ば配列、純度、見かけの分子量、溶解度および安定性について、当分野で公知の標準方法
を使用してキャラクタリゼーションされる。予想された標準を満足する融合タンパク質は
次に、本明細書で開示する１つ以上のアッセイ；たとえば実施例または表３９のアッセイ
を使用してインビトロまたはインビボで測定することができる活性について、評価される
。
さらにＸＴＥＮ－Ｅｘ４融合タンパク質は、実施例２５に記載されるように、１つ以上
の動物種に投与されて標準薬物動態パラメータが決定される。
ＸＴＥＮ－Ｅｘ４構築物の産生、発現および回収の繰返しプロセス、それに続く本明細
書で開示する方法または当分野で公知の他の方法を使用するそのキャラクタリゼーション
によって、Ｅｘ４およびＸＴＥＮを含むＢＰＸＴＥＮ組成物が当業者によって産生および
評価されて、対応する未融合Ｅｘ４と比較して増強された全体の治療活性につながる、予
想された特性、たとえば溶解度の増強、安定性の増強、薬物動態の改善および免疫原性の
低下を確認することができる。所望の特性を所有しないこれらの融合タンパク質では、こ
のような特性を有する組成物を得るためにこれらの方法によって異なる配列を構築、発現
、単離および評価することができる。
（実施例１９）
ＸＴＥＮ融合タンパク質の分析サイズ排除クロマトグラフィー
サイズ排除クロマトグラフィー分析を、増加する長さの各種の治療タンパク質および非
構造化組換えタンパク質を含有する融合タンパク質に対して行った。例示的なアッセイは
ＴＳＫＧｅｌ－Ｇ４０００ ＳＷＸＬ（７．８ｍｍ×３０ｃｍ）カラムを使用して、該カ
ラム内で４０μｇの、濃度１ｍｇ／ｍｌの精製グルカゴン融合タンパク質を２０ｍＭリン
酸塩ｐＨ６．８、１１４ｍＭ ＮａＣｌにおいて流速０．６ｍｌ／分にて分離した。ＯＤ
２１４ｎｍおよびＯＤ２８０ｎｍを使用して、クロマトグラムプロフィールを監視した。
すべてのアッセイのカラム校正は、ＢｉｏＲａｄからのサイズ排除校正標準を使用して行
った；マーカーは、サイログロブリン（６７０ｋＤａ）、ウシガンマグロブリン（１５８
ｋＤａ）、ニワトリ卵白アルブミン（４４ｋＤａ）、ウマミオグロビン（１７ｋＤａ）お
よびビタミンＢ１２（１．３５ｋＤａ）を含む。グルカゴン－Ｙ２８８、グルカゴン－Ｙ
１４４、グルカゴン－Ｙ７２、グルカゴン－Ｙ３６の代表的なクロマトグラフィープロフ
ィールは、図１５にオーバーレイとして示す。データは、各化合物の見かけの分子量が付
着したｒＰＥＧ配列の長さに比例することを示す。しかしデータは、各構築物の見かけの
分子量が球状タンパク質で予想される分子量よりも顕著に大きい（同じアッセイの標準タ
ンパク質泳動との比較により示されるように）ことも示す。評価したすべての構築物のＳ
ＥＣ分析に基づいて、見かけの分子量、見かけの分子量係数（見かけの分子量の計算した
分子量に対する比として表現される）および流体力学半径（ｎＭでのＲＨ）を表２６に示
す。結果は、５７６以上のアミノ酸の異なるＸＴＥＮの組み入れが、融合タンパク質のお
およそ３３９ｋＤａ～７６０ｋＤａの見かけの分子量を与えることと、８６４以上のアミ
ノ酸のＸＴＥＮがおおよそ８００ｋＤＡ超の見かけの分子量を与えることとを示している
。実際の分子量に対する見かけの分子量の比例的増加の結果は、少なくとも４倍の増加お
よび約１７倍もの高い比を有する、複数の異なるモチーフファミリ；すなわちＡＤ、ＡＥ
、ＡＦ、ＡＧ、およびＡＭからのＸＴＥＮを有する生成された融合タンパク質に一致して
いた。その上、５７６以上のアミノ酸を有するＸＴＥＮ融合パートナーのグルコース調節
ペプチドを有する融合タンパク質への組み入れは、おおよそ３～５ｎｍの糸球体孔径を十
分に超える７ｎｍ以上の流体力学半径によって生じた。したがって、グルコース調節ペプ
チドおよびＸＴＥＮを含む融合タンパク質が腎クリアランスを低下させて、対応する未融
合生物活性タンパク質と比べて、最終半減期の増加および治療または生物製剤効果の改善
に寄与することが結論付けられる。
Figure 0007461438000075

（実施例２０）
カニクイザルにおけるＧＦＰに融合された延長ポリペプチドの薬物動態
カニクイザルにおけるＧＦＰ－Ｌ２８８、ＧＦＰ－Ｌ５７６、ＧＦＰ－ＸＴＥＮ＿ＡＦ
５７６、ＧＦＰ－ＸＴＥＮ＿Ｙ５７６およびＸＴＥＮ＿ＡＤ８３６－ＧＦＰの薬物動態を
試験して、非構造化ポリペプチドの組成および長さのＰＫパラメータに対する効果を決定
した。注射後の各種の時点で血液試料を分析して、血漿中のＧＦＰの濃度を、捕捉のため
のＧＦＰに対するポリクローナル抗体および検出のための同じポリクローナル抗体のビオ
チン化調製物を用いたＥＬＩＳＡによって測定した。結果を図２３にまとめる。結果は、
ＸＴＥＮ配列の長さの増加と共に、半減期の驚くべき増加を示す。たとえばＧＦＰ－ＸＴ
ＥＮ＿Ｌ２８８（ＸＴＥＮに２８８アミノ酸残基を有する）では、１０時間の半減期が決
定された。５７６アミノ酸に対する非構造化ポリペプチド融合パートナーの長さが２倍に
なると、複数の融合タンパク質構築物、すなわちＧＦＰ－ＸＴＥＮ＿Ｌ５７６、ＧＦＰ－
ＸＴＥＮ＿ＡＦ５７６、ＧＦＰ－ＸＴＥＮ＿Ｙ５７６で半減期が２０～２２時間に増加し
た。８３６残基に対する非構造化ポリペプチド融合パートナーの長さのさらなる増加は、
ＸＴＥＮ＿ＡＤ８３６－ＧＦＰで７２～７５時間の半減期を生じた。それゆえ２８８残基
から５７６残基への２８８残基のポリマー長の増加は、インビボ半減期を約１０時間増加
させた。しかし、５７６残基から８３６残基への２６０残基のポリペプチド長の増加は半
減期を５０時間超増加させた。これらの結果は、インビボ半減期の比例的増大よりも大き
い増大を生じる、非構造化ポリペプチド長の驚くべき閾値があることを示す。それゆえ、
延長非構造化ポリペプチドを含む融合タンパク質は、より短い長さのポリペプチドと比較
して薬物動態増強特性を有することが予想される。
（実施例２１）
ＸＴＥＮの血清安定性
ＧＦＰのＮ末端に融合されたＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４を含有する融合タンパク質をサル血
漿およびラット腎臓溶解物中３７℃にて最長７日間インキュベートした。図１３に示すよ
うに、試料を第０、１および７日に採取して、ＳＤＳ ＰＡＧＥによって分析し、ウェス
タン分析による検出およびＧＦＰに対する抗体による検出を続けた。ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６
４の配列は、血漿中での７日間にわたって、分解の徴候は無視できるものであった。しか
し、ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４はラット腎臓溶解物中で３日間にわたって迅速に分解された。
融合タンパク質のインビボ安定性を上記のように、ＧＦＰ＿ＡＥ８６４が免疫沈降された
血漿試料で試験して、ＳＤＳ ＰＡＧＥで分析した。注射後最大７日まで採取した試料は
、分解の徴候をほとんど示さなかった。結果によって、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質の薬
物動態特性の増強における因子である血清プロテアーゼによる分解に対する、ＢＰＸＴＥ
Ｎの抵抗性を証明する。
（実施例２２）
ＢＰＸＴＥＮ構成要素ＸＴＥＮ＿ＩＬ－１ｒａ遺伝子およびベクターの構築
１５３ａａのヒトＩＬ－１ｒａをコードする遺伝子をプライマ５’－ＡＴＡＡＡＧＧＧ
ＴＣＴＣＣＡＧＧＴＣＧＴＣＣＧＴＣＣＧＧＴＣＧＴＡＡＡＴＣ（配列番号７５６）およ
び５’－ＡＡＣＴＣＧＡＡＧＣＴＴＴＴＡＴＴＣＧＴＣＣＴＣＣＴＧＧＡＡＧＴＡＡＡＡ
（配列番号７５７）を用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅して、これに
よりＸＴＥＮデスティネーションベクターのスタッファにフランキングするＢｂｓＩおよ
びＨｉｎｄＩＩＩ部位と適合性である、フランキングＢｓａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ（下
線）制限部位を導入した（図７Ｃ）。ＸＴＥＮデスティネーションベクターは、カナマイ
シン抵抗性遺伝子を含有して、セルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）－ＸＴＥＮ－緑色蛍光
タンパク質（ＧＦＰ）の形式の、ＮｏｖａｇｅｎからのｐＥＴ３０誘導体であり、ＧＦＰ
はＣ末端にてペイロードをクローニングするためのスタッファである。ＸＴＥＮデスティ
ネーションベクターのＧＦＰをＩＬ－１ｒａコードフラグメントで置き換えることによっ
て、構築物を生成させた（図７）。ＸＴＥＮデスティネーションベクターは、ＣＢＤの上
流のＴ７プロモータ、それに続くスタッファＧＦＰ配列の上流にてインフレームで融合さ
れたＸＴＥＮ配列を特色とする。用いたＸＴＥＮ配列は、それぞれ８７５、１３１８、８
７５および８６４アミノ酸の長さを有するＡＭ８７５、ＡＭ１３１８、ＡＦ８７５および
ＡＥ８６４である。ＢｂｓＩおよびＨｉｎｄＩＩＩエンドヌクレアーゼを使用する制限消
化によって、スタッファＧＦＰフラグメントを除去した。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを使用し
て、ＢｓａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限消化ＩＬ－１ｒａ ＤＮＡフラグメントをＢｂｓ
ＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ消化ＸＴＥＮデスティネーションベクターにライゲーションして
、ライゲーション混合物を電気穿孔によって大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｇｏｌｄ（Ｓｔ
ｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換した。抗生物質カナマイシンを含有するＬＢプレートで成
長する能力によって、形質転換体を同定した。プラスミドＤＮＡを選択したクローンから
単離して、制限分析およびＤＮＡ配列決定によって確認した。最終ベクターはＴ７プロモ
ータの制御下でＣＢＤ ＸＴＥＮ＿Ｌ－１ｒａ遺伝子を産し、ＣＢＤは改変（ｅｎｇｉｎ
ｅｅｒｅｄ）ＴＥＶ切断部位によって末端で切断されてＸＴＥＮ＿ＩＬ１－ｒａを生じる
。Ｃ末端にて異なるＸＴＥＮに融合されたＩＬ－１ｒａを有する各種の構築物は、ＡＣ１
７２３（ＣＢＤ－ＸＴＥＮ＿ＡＭ８７５－ＩＬ－１ｒａ）、ＡＣ１７５（ＣＢＤ－ＸＴＥ
Ｎ＿ＡＭ１３１８－ＩＬ－１ｒａ）、ＡＣ１８０（ＣＢＤ－ＸＴＥＮ＿ＡＦ８７５－ＩＬ
－１ｒａ）、およびＡＣ１８２（ＣＢＤ－ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４－ＩＬ－１ｒａ）を含む
。
（実施例２３）
ＸＴＥＮ＿ＡＭ８７５およびＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４に融合されたヒトインターロイキン
－１受容体アゴニスト（ＩＬ－１ｒａ）の発現、精製、およびキャラクタリゼーション
細胞培養物の産生
スターター培養物は、ＡＥ８６４、ＡＭ８７５、またはＡＭ１２９６に融合されたＩＬ
－１ｒａをコードするプラスミドを担持する大腸菌のグリセロールストックを、４０ｕｇ
／ｍＬカナマイシンを含有する１００ｍＬの２ｘＹＴ媒体に接種することによって調製し
た。培養物を次に３７℃にて一晩振とうした。１００ｍＬのスターター培養物を使用して
、４０μｇ／ｍＬカナマイシンを含有する２５リットルの２ｘＹＴに接種し、３７℃にて
ＯＤ６００が約１．０に達するまで（５時間にわたって）振とうした。温度を次に２６℃
まで低下させて、１．０ｍＭの最終濃度のＩＰＴＧによってタンパク質発現を誘導した。
培養物を次に２６℃にて一晩振とうした。細胞を遠心分離によって収集して、合計２００
グラムの細胞ペーストを産した。ペーストは使用するまで－８０℃にて凍結貯蔵した。
ＩＬ－１ｒａ－ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４またはＩＬ－１ｒａ－ＡＭ８７５を含むＢＰＸＴ
ＥＮの精製
細胞ペーストを２０ｍＭトリスｐＨ６．８、５０ｍＭ ＮａＣｌに、細胞ペースト１グ
ラム当たり４ｍｌのバッファーの比で懸濁させた。細胞ペーストを次に、トップスターラ
ーを使用してホモジナイズした。２００００ｐｓｉにてマイクロフルイダイザに試料を１
回通過させることによって、細胞溶解を達成した。Ｓｏｒｖａｌｌ Ｇ３Ａロータで１２
０００ｒｐｍにて２０分間遠心分離することにより、溶解物を清澄にした。
２０ｍＭトリスｐＨ６．８、５０ｍＭ ＮａＣｌで平衡させた８００ｍｌのＭａｃｒｏ
ｃａｐ Ｑアニオン交換樹脂（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に、清澄溶解物を直
接適用した。カラムを５０ｍＭ、１００ｍＭ、および１５０ｍＭ ＮａＣｌを含有するト
リスｐＨ６．８バッファーによって続けて洗浄した。生成物を２０ｍＭトリスｐＨ ６．
８、２５０ｍＭ ＮａＣｌによって溶出させた。
２５０ｍＬオクチルセファロースＦＦカラムを平衡化バッファー（２０ｍＭトリスｐＨ
６．８、１．０Ｍ Ｎａ２ＳＯ４）によって平衡化した。固体Ｎａ２ＳＯ４をＭａｃｒｏ
ｃａｐ Ｑ溶出物プールに添加して、１．０Ｍの最終濃度を達成した。結果として生じる
溶液を濾過して（０．２２ミクロン）、ＨＩＣカラムにロードした。カラムを次に、１０
ＣＶの平衡化バッファーで洗浄して、未結合のタンパク質および宿主細胞ＤＮＡを除去し
た。生成物を次に、２０ｍＭトリスｐＨ６．８、０．５Ｍ Ｎａ２ＳＯ４によって溶出さ
せた。
プールしたＨＩＣ溶出物画分を次に、２０ｍＭトリスｐＨ７．５によって希釈して、５
．０ミリオーム未満の導電率を達成した。希薄生成物を、２０ｍＭトリスｐＨ７．５、５
０ｍＭ ＮａＣｌによって平衡化した３００ｍｌ ＱセファロースＦＦアニオン交換カラ
ムにロードした。
バッファー交換タンパク質を次に、Ｐｅｌｌｉｃｏｎ ＸＬ Ｂｉｏｍａｘ ３０００
０ｍｗｃｏカートリッジを使用して限外濾過／ダイアフィルトレーション（ＵＦ／ＤＦ）
によって３０ｍｇ／ｍｌ超まで濃縮した。０．２２ミクロンのシリンジフィルタを使用し
て、濃縮物を滅菌濾過した。最終溶液を等分割して－８０℃で貯蔵し、以下に続く実験に
使用した。
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析
２および１０ｍｃｇの最終精製タンパク質に、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのＮｕＰＡＧ
Ｅ４－１２％ビス－トリスゲルを製造者の仕様書に従って使用して、非還元ＳＤＳ－ＰＡ
ＧＥを受けさせた。結果（図１４）は、約１６０ｋＤａの適切なＭＷを有するＩＬ－１ｒ
ａ－ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４組成物が、上で詳述したプロセスによって回収されたことを示
す。
分析サイズ排除クロマトグラフィー
Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ ＢｉｏＳＥＰ ＳＥＣ Ｓ４０００（７．８×３００ｍｍ）カ
ラムを使用して、サイズ排除クロマトグラフィー分析を行った。１ｍｇ／ｍｌの濃度の、
２０μｇの精製タンパク質を２０ｍＭトリス－Ｃｌ ｐＨ ７．５、３００ｍＭ ＮａＣ
ｌにおいて０．５ｍｌ／分の流速で分離した。２１４ｎｍおよび２８０ｎｍにおける吸光
度によって、クロマトグラムプロフィールを監視した。カラム校正は、ＢｉｏＲａｄによ
るサイズ排除校正標準を使用して行い、マーカーは、サイログロブリン（６７０ｋＤａ）
、ウシガンマグロブリン（１５８ｋＤａ）、ニワトリ卵白アルブミン（４４ｋＤａ）、ウ
マミオグロビン（１７ｋＤａ）およびビタミンＢ１２（１．３５ｋＤａ）を含む。ＩＬ－
１ｒａ－ＸＴＥＮ＿ＡＭ８７５の代表的なクロマトグラフプロフィールを図１５に示し、
校正標準を破線で示し、ＩＬ－１ｒａ－ＸＴＥＮ＿ＡＭ８７５を実線によって示す。デー
タは、上記のように、各構築物の見かけの分子量が、球状タンパク質で予想される分子量
よりも著しく大きく（同じアッセイの標準タンパク質泳動との比較により示されるように
）、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって決定された分子量よりも顕著に大きい見かけの分子量を有
することを示す。
分析ＲＰ－ＨＰＬＣ
Ｖｙｄａｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃ４（４．６×１５０ｍｍ）カラムを使用して、分析Ｒ
Ｐ－ＨＰＬＣクロマトグラフィー分析を行った。カラムをＨＰＬＣグレードの水中の０．
１％トリフルオロ酢酸によって１ｍｌ／分の流速にて平衡化した。０．２ｍｇ／ｍｌの濃
度の１０マイクログラムの精製タンパク質を別個に注射した。タンパク質を０．１％ＴＦ
Ａ中５％～９０％アセトニトリルの直線勾配で溶出させた。ＯＤ２１４ｎｍおよびＯＤ２
８０ｎｍを使用して、クロマトグラムプロフィールを監視した。ＩＬ－１ｒａ－ＸＴＥＮ
＿ＡＭ８７５の代表的なバッチのクロマトグラムを図１６に示す。
ＩＬ－１受容体結合
ＩＬ－Ｉｒａ－含有ＸＴＥＮ融合タンパク質の活性を評価するために、ＥＬＩＳＡに基
づく受容体結合アッセイを使用した。ここでＣｏｓｔａｒ ３６９０アッセイプレートの
ウェルをウェル当り５０ｎｇの、ヒトＩｇＧのＦｃドメインに融合されたマウスＩＬ－１
受容体（ＩＬ－１Ｒ／Ｆｃ，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）で一晩コーティングした。続いて
ウェルを３％ＢＳＡでブロッキングして、固相との非特異的相互作用を防止した。ウェル
を十分に洗浄した後、ＩＬ－１ｒａ－ＸＴＥＮ＿ＡＭ８７５、ＸＴＥＮ＿ＡＭ８７５－Ｉ
Ｌ－１ｒａ、またはＩＬ－１ｒａ（アナキンラ）の任意の希釈系列をウェルに適用した。
結合反応を室温にて２時間進行させた。未結合Ｉｌ－１ｒａを反復洗浄によって除去した
。結合ＩＬ－１ｒａおよびＩＬ－１ｒａ－ＸＴＥｎ融合物をビオチン化抗ヒトＩＩ－１ｒ
ａ抗体およびホースラディッシュペルオキシダーゼ結合体化ストレプトアビジンによって
検出した。反応物をＴＭＢ基質によって室温にて２０分間展開させた（ｄｅｖｅｌｏｐｅ
ｄ）。０．２Ｎ硫酸の添加によって色展開を停止させた。４５０ｎｍおよび５７０ｎｍに
おける各ウェルの吸光度をＳｐｅｃｔｒＭａｘ ３８４Ｐｌｕｓ分光光度計で記録した。
補正吸光度シグナル（Ａｂｓｃｏｒｒ＝Ａｂｓ４５０ｎｍ－Ａｂｓ５７０ｎｍ）をＩＬ－
１ｒａ－ＸＴＥＮまたはＩＬ－Ｉｒａ濃度の関数としてプロットして、図１７に示すよう
に結合等温線を産生した。
ＩＬ－１受容体に対する各融合タンパク質の結合親和性を推定するために、結合データ
をＳ字状用量反応曲線に当てはめた。データの当てはめから、各構築物のＥＣ５０（シグ
ナルが最大半量であるＩＬ－１ｒａまたはＩＬ－１ｒａ－ＸＴＥＮの濃度）を決定した。
図１７に示すように、ペイロードがＸＴＥＮのＮ末端に付着されたＩＬ－１ｒａ－ＸＴＥ
Ｎ＿ＡＭ８７５のＥＣ５０は、未改変ＩＬ－１ｒａと同程度であった（アナキンラＥＣ５
０＝０．０１３ｎＭ、ＩＬ－１ｒａ－ＸＴＥＮ＿ＡＭ８７５ＥＣ５０＝０．０１９ｎＭ）
。ペイロードがＸＴＥＮのＣ末端に付着されたＸＴＥＮ＿ＡＭ８７５－ＩＬ－１ｒａは、
ＩＬ－１ｒａよりもおおよそ１５倍高いＥＣ５０（０．２０４ｎＭ）を有するより弱い結
合を提示した。陰性対照ＸＴＥＮ＿ｈＧＨ構築物は、実験条件下で結合を示さなかった。
ＸＴＥＮによるＩＬ－１ｒａの熱安定性
タンパク質治療薬の血清半減期を延長することに加えて、ＸＴＥＮポリペプチドは、そ
れが融合されるペイロードの熱安定性を改善する特性を有する。たとえばＸＴＥＮポリペ
プチドの親水性の性質は、凝集を低下または防止し、それゆえペイロードタンパク質の再
折畳みに有利であり得る。ＸＴＥＮのこの特色は、多種多様のタンパク質治療薬のための
室温で安定な調合物の開発を補助し得る。
ＸＴＥＮコンジュゲーションによって与えられたＩＬ－１ｒａの熱安定性を証明するた
めに、１リットル当たり２００マイクロモルのＩＬ－１ｒａ－ＸＴＥＮおよび組換えＩＬ
－１ｒａを２５℃および８５℃にて１５分間インキュベートして、その時点であらゆる不
溶性のタンパク質は遠心分離によって迅速に除去した。次に可溶性画分を図１８に示すよ
うにＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析した。加熱後にＩＬ－１ｒａ－ＸＴＥＮのみが可溶性
のままであるが、これに対して組換えＩＬ－１ｒａ（融合パートナーとしてのＸＴＥＮが
ない）は加熱後に完全に沈殿したことに注目する。
ＩＬ－１ｒａ－ＸＴＥＮのＩＬ－１受容体結合活性を上記の熱処理後に評価した。上記
のように受容体結合を行った。熱処理によって完全に変性した組換えＩＬ－１ｒａは、熱
処理後のその受容体活性の０．１％未満を保持した。しかしＩＬ－１ｒａ－ＸＴＥＮは、
その受容体結合活性のおおよそ４０％を保持した（図１９）。これらのデータは共に、Ｘ
ＴＥＮポリペプチドがそのペイロード融合パートナーの熱誘導変性を防止できることを証
明して、ＸＴＥＮが安定化特性を有するという結論を裏付けている。
（実施例２４）
ＩＬ－１ｒａおよびＸＴＥＮを含む融合タンパク質のＰＫ分析
各融合タンパク質のインビボ薬物動態パラメータを決定するために、ＢＰＸＴＥＮ融合
タンパク質ＩＬ－１ｒａ＿ＡＥ８６４、ＩＬ－１ｒａ＿ＡＭ８７５、およびＩＬ－１ｒａ
＿ＡＭ１２９６をカニクイザルにおいて評価した。すべての組成物を水性バッファー中で
得て、皮下（ＳＣ）経路で個々の動物（ｎ＝４／群）に１ｍｇ／ｋｇおよび／または１０
ｍｇ／ｋｇ単回用量を使用して投与した。血漿試料を投与後の各種の時点で採取して、被
験物質（ｔｅｓｔ ａｒｔｉｃｌｅ）の濃度を分析した。分析はサンドイッチＥＬＩＳＡ
形式を使用して行った。ウサギポリクローナル抗ＸＴＥＮ抗体をＥＬＩＳＡプレートのウ
ェルにコーティングした。ウェルをブロッキング、洗浄して、血漿試料を次に様々な希釈
度で、ウェル中でインキュベートして、コート抗体による化合物の捕捉を可能にした。ウ
ェルを広範囲に洗浄して、ポリクローナル抗ＩＬ－１ｒａ抗体のビオチン化調製物および
ストレプトアビジンＨＲＰを使用して、結合タンパク質を検出した。各血清希釈度での比
色反応を標準曲線に対して比較することによって、被験物質の濃度を各時点で計算した。
薬物動態パラメータは、ＷｉｎＮｏｎＬｉｎソフトウェアパッケージを使用して計算した
。
図２０は４つのＩＬ－１ｒａ含有構築物の濃度プロフィールを示し、計算したＰＫパラ
メータを表２７に示す。皮下投与の後、最終半減期は、３３６時間の期間にわたる各種の
調製物について、おおよそ１５～２８時間であると計算された。参考のために、未改変Ｉ
Ｌ－１ｒａの公開されている半減期は、文献にはヒト成人で４～６時間として十分に記載
されている。
結論：ＩＬ－１ｒａを含むＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質への異なるＸＴＥＮ配列の組み
入れによって、霊長類モデルで証明されたように、３つすべての組成物で薬物動態パラメ
ータの顕著な増強が生じ、このような融合タンパク質組成物の有用性が証明される。
Figure 0007461438000076

（実施例２５）
エキセンジン－４およびＸＴＥＮを含む融合タンパク質のＰＫ分析
単回皮下投薬後の融合タンパク質のインビボ薬物動態パラメータを決定するために、Ｂ
ＰＸＴＥＮ融合タンパク質Ｅｘ４＿ＡＥ８６４をカニクイザルにおいて評価した。
方法：ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質を２０ｍＭトリス、ｐＨ７．５、１３５ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ中で２種類の濃度；８ｍｇ／ｍＬおよび４０ｍｇ／ｍＬに調合した。サル４頭（オス
２頭およびメス２頭、２～６ｋｇ）の３群それぞれに１ｍｇ／ｋｇ（１群、０．１２５ｍ
Ｌ／ｋｇ）、１ｍｇ／ｋｇ（２群、０．０２５ｍＬ／ｋｇ）、または５ｍｇ／ｋｇ（３群
、０．１２５ｍＬ／ｋｇ）を、各動物の背中の肩甲部における皮膚と組織の基底層との間
へのボーラス注入によって投薬した。連続血液試料（１ｍｌ±０．５ｍｌ）を以前に順応
させた動物の大腿静脈または動脈から、１４日間にわたって、麻酔（ａｅｓｔｈｅｓｉａ
）を用いずにチェア拘束を利用してシリンジによって採取した。必要な場合は、チェア拘
束を最大３０分間利用した。すべての動物を投薬前の一晩および血液試料採取の最初の４
時間を通して絶食させた（食物は、適用可能な場合、４時間の採取間隔の最後の血液試料
の採取後３０分以内に戻した）。各血液試料をへパリン血漿セパレータに採取して、遠心
分離まで氷（２℃～８℃）でおおよそ５分間保管した。血液試料を遠心分離して（８，０
００ｘｇで５分間）、血漿をポリプロピレンチューブに移した。血漿試料を急速凍結させ
て、アッセイまでおおよそ－７０℃にて貯蔵した。分析はサンドイッチＥＬＩＳＡ形式を
使用して行った。
結果：サルの薬物動態パラメータを計算して、結果を表２８で表にした。すべての動物
の実験未使用の（ｎａｉｖｅ）プーリングの両方を使用して、および標準２段階分析を使
用して、薬物動態パラメータ分析した。結果は、Ｔｍａｘ、Ｃｍａｘ、ＡＵＣおよび分布
容積（Ｖｚ）の値によって明示されるように、１群対２群の投与された用量体積に基づく
融合タンパク質の吸収の差を示す。しかし、計算した半減期値は３つの群で同程度であり
、２．４時間のエクセナチドの報告された最終半減期を大きく超えている。
Figure 0007461438000077

結論：ＢＰＸＴＥＮ融合物を生成するためのエキセンジン－４のＸＴＥＮへの連結によ
って、霊長類モデルで証明されたように、３つすべての調合物で、半減期の少なくとも３
０倍の増加と共に薬物動態パラメータの顕著な増強が生じ、このような融合タンパク質組
成物の有用性が証明される。
（実施例２６）
食餌誘発性肥満マウスモデルにおけるＢＰＸＴＥＮの使用
ＸＴＥＮに連結されたグルコース調節ペプチド併用療法の効果を食餌誘発性肥満のマウ
スモデルにおいて評価して、単一ＢＰＸＴＥＮ組成物としての単量体融合タンパク質の固
定併用の有用性を確認した。
方法：Ｙ－２８８－ＸＴＥＮに連結されたグルカゴン（「Ｇｃｇ－ＸＴＥＮ」）および
ＡＥ５７６－ＸＴＥＮに連結されたエクセナチド（「Ｅｘ４－ＸＴＥＮ」）の併用療法ま
たはエクセナチド単独の効果を、１０週齢のオスＣ５７ＢＬ／６Ｊ食餌誘発性肥満（ＤＩ
Ｏ）マウスで試験した。６０％高脂肪食で飼育したマウスを処置群（群当りｎ＝１０）Ｅ
ｘ４－ＸＴＥＮ８６４（１０ｍｇ／ｋｇ ＩＰ Ｑ２Ｄ）、Ｅｘ４－ＸＴＥＮ８６４（２
０ｍｇ／ｋｇ ＩＰ Ｑ４Ｄ）、Ｅｘ４－ＸＴＥＮ８６４（１０ｍｇ／ｋｇ ＩＰ Ｑ２
Ｄ）プラスＧｃｇ－ＸＴＥＮ２８８（２０μｇ／ｋｇ ＩＰ ＢＩＤ）、およびＥｘ４－
ＸＴＥＮ８６４（２０ｍｇ／ｋｇ ＩＰ Ｑ４Ｄ）プラスＧｃｇ－ＸＴＥＮ２８８（４０
μｇ／ｋｇ ＩＰ ＱｌＤ）に無作為化した。２０ｍＭトリスｐＨ７．５、１３５ｍＭ
ＮａＣｌ ＩＰ Ｑ１Ｄで処置したプラセボ群（ｎ＝１０）を並行して試験した。すべて
の群に２８日間続けて投薬した。試験を通じて体重を定期間隔で監視して、空腹時血中グ
ルコースを処置期間の前後に測定した。群には、２８日間の処置期間にわたって続けて投
薬した。試験を通じて体重を続けて監視して、空腹時血中グルコースを処置期間の前後に
測定し、脂質レベルを処置期間後に決定した。
結果：結果を図２１～２２に示す。データは、１ヶ月にわたる連続投薬が、試験の経過
にわたって、プラセボと比べて、Ｇｃｇ－ＸＴＥＮ単独およびＥｘ４－ＸＴＥＮ単独で処
置した動物において体重増加の顕著な低下を産することを示している。さらにＥｘ４－Ｘ
ＴＥＮを、またはＧｃｇ－ＸＴＥＮおよびＥｘ４－ＸＴＥＮを同時に投薬された動物は、
Ｇｃｇ－ＸＴＥＮを単独で投与された動物と比較しておよびプラセボを投与された動物と
比較して、統計的に有意なより大きい体重減少を示した。グルカゴン投与の毒性作用は、
十分に記録されている。ラットおよびビーグル犬における、１ｍｇ／ｋｇ／日として最近
報告されたグルカゴンの最大無作用量は、両方の種で明確な無毒性影響量と見なされた（
Ｅｉｓｔｒｕｐ Ｃ，Ｇｌｕｃａｇｏｎ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ｒｅｃｏｍｂｉｎａ
ｎｔ ＤＮＡ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： ｒｅｐｅａｔｅｄ ｄｏｓｅ ｔｏｘｉｃｉｔ
ｙ ｓｔｕｄｉｅｓ，ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｔｏ
ＣＤ ｒａｔｓ ａｎｄ ｂｅａｇｌｅ ｄｏｇｓ ｆｏｒ ｆｏｕｒ ｗｅｅｋｓ．Ｐ
ｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｏｘｉｃｏｌ．１９９３ Ａｕｇ；７３（２）：１０３－１０８）
。
データは、１ヶ月にわたる連続投薬が、プラセボに比べてＥｘ４－ＸＴＥＮ単独で処置
された動物では空腹時血中グルコースの顕著な低下を産したが、Ｇｃｇ－ＸＴＥＮ単独で
処置した動物では産しなかったことも示す。しかし、Ｇｃｇ－ＸＴＥＮおよびエクセナチ
ドの両方を同時に投薬した動物は、単独で投与されたどちらかのグルコース調節ペプチド
と比較して、空腹時血中グルコースレベルの統計的有意なより大きな低下を示した。注目
すべきは、Ｅｘ４－ＸＴＥＮと併用されて有益な効果を生じたＧｃｇ－ＸＴＥＮ組成物の
用量が、げっ歯動物種においてグルカゴン単独について報告された無作用量の少なくとも
２５分の１である、２０および４０μｇ／ｋｇであったことである（完全融合タンパク質
組成物の重量）。
結論：データは、ＸＴＥＮに連結されたグルコース調節ペプチドの２つの融合タンパク
質による併用療法が、単一のグルコース調節ペプチドで見られるよりも有益な相乗効果を
もたらし得ることを裏付けており、それゆえ、単一の生物製剤の投与と比較して、組み合
わせ組成物の投与により、投薬頻度または投薬量を低下させることができ、毒性または許
容されない副作用の脅威を低下させることができる。
（実施例２７）
カニクイザルにおけるＥｘ４－ＸＴＥＮ ＢＰＸＴＥＮのＰＫ分析
Ｅｘ４－ＡＥ８６４ ＢＰＸＴＥＮの薬物動態を、０．５ｍｇ／ｋｇのＢＰＸＴＥＮの
１分間にわたる皮下または静脈内注射によってＢＰＸＴＥＮを投与されたカニクイザル（
１群あたり３頭）において決定した。血漿試料を注射１４日後までの各種の時点で採取し
て、被験物質の血清濃度および免疫原性の両方を決定するためにＥＬＩＳＡで分析した。
Ｅｘ４－ＡＥ８６４の抗被験物質抗体反応は、投与後にいずれの動物でも観察されなかっ
た。サンドイッチＥＬＩＳＡを１００ｎｇ捕捉抗体（ウサギ抗エクセナチド、Ｐｅｎｉｎ
ｓｕｌａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓａｎ Ｃａｒｌｏｓ， ＣＡ）のポリスチレン
・マイクロタイター・プレート（Ｃｏｓｔａｒ ３６９０，Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ、Ｃ
ｏｒｎｉｎｇ， Ｎ．Ｙ．）の各ウェルへの１２時間超の動員、それに続く３％ウシ血清
アルブミン（ＢＳＡ）によるブロッキングによって行った。ＰＢＳによる３回の洗浄後、
血漿試料を、１％ＢＳＡおよび０．５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ中でプレート全
体にわたって連続滴定した。２時間のインキュベーションおよび洗浄後に、試料をビオチ
ン化ＩｇＧ（インハウスでビオチン化したウサギ抗エクセナチド、Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓａｎ Ｃａｒｌｏｓ， ＣＡ）の各ウェルへの添加によっ
てプローブした。インキュベーションおよび洗浄の後、プレートをホースラディッシュペ
ルオキシダーゼ結合体化ストレプトアビジン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎ
ｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）、それに続くテトラメチルベンジン基質（Ｎｅｏ
ｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ， ＫＹ）で展開させて、次に０
．２Ｎ Ｈ２ＳＯ４によって反応停止して、４５０ｎｍにて読み取った。ノンコンパート
メント薬物動態パラメータは、ＷｉｎＮｏｎＬｉｎプログラム、Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．１
（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｔ．Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を使用して計
算した。
結果を図２５に描く。構築物の本調合物の最終半減期は６０時間であり、皮下注射によ
る生物学的利用能は８０％であった。これは市販版のエキセンジン－４であるＢｙｅｔｔ
ａ（登録商標）で報告された２．４時間の半減期と同程度である。重要なことに、ＸＴＥ
Ｎ融合タンパク質の特徴であるとみなされる低速吸収期（ｓｌｏｗ ａｂｓｏｒｐｔｉｏ
ｎ ｐｈａｓｅ）は皮下注射後に認められた。吸収期は、注射後の２４～４８時間のＣｍ
ａｘおよび線形消失期に達する前の約１００時間にわたる本質的に平坦な血清濃度プロフ
ィールを生じた。
結論：結果から、グルコース調節ペプチド、たとえばエキセンジン－４へのＸＴＥＮの
付加は、ＸＴＥＮに連結されていないペプチドと比較して最終半減期を大きく増加させて
、他の薬物動態パラメータも同様に増強できることが結論付けられる。
（実施例２８）
複数の種でのＥｘ４－ＸＴＥＮ ＢＰＸＴＥＮのＰＫ分析および予測ヒト半減期
ＸＴＥＮに融合された治療タンパク質のヒトにおける予測薬物動態プロフィールを決定
するために、単一の融合ポリペプチドとしてＡＥ８６４ ＸＴＥＮに融合されたエキセン
ジン－４を使用して試験を行った。このＥｘ４－ＸＴＥＮ構築物を４つの異なる動物種に
０．５～１．０ｍｇ／ｋｇにて皮下および静脈内投与した。投与後に間隔を置いて血清試
料を採取し、標準方法を使用して血清濃度を決定した。各種の半減期を決定して、表２９
で表にした。結果を使用して、最終半減期の相対スケーリング、分布容積、および平均体
重に基づくクリアランス速度を用いて、ヒト半減期を予測した。図２６Ａは、動物種にお
ける測定した最終半減期対体重のプロットを示し、７５ｋｇヒトでの予測Ｔ１／２は、エ
クセナチドで報告された２．４時間の半減期と比較して１４０時間である（Ｂｏｎｄ，Ａ
．Ｐｒｏｃ（Ｂａｙｌ Ｕｎｉｖ Ｍｅｄ Ｃｅｎｔ）１９（３）：２８１－２８４．（
２００６））。図２６Ｂは、測定した薬物クリアランス対体重を示し、７５ｋｇのヒトで
の予測クリアランス速度値は３０ｍｌ／時間である。図２６Ｃは、測定した分布容積対体
重を示し、７５ｋｇのヒトでの予測値は５９７０ｍｌである。
結論：結果から、グルコース調節ペプチド、たとえばエキセンジン－４へのＸＴＥＮの
付加は、ＸＴＥＮに連結されていないペプチドと比較して最終半減期を大きく増加させら
れることと、同程度の半減期を有するＢＰＸＴＥＮ調合物が、毎週の、１週おきの、また
はなお１ヶ月間隔での投薬による、グルコース調節ペプチドの市販製品で現在用いられる
よりもかなり低い頻度の投薬を可能にすることが結論付けられる。
Figure 0007461438000078

（実施例２９）
ＸＴＥＮへの連結によるＢＰの溶解度および安定性の増加
ＸＴＥＮが溶解度および安定性の物理／化学特性を増強する能力を評価するために、よ
り短い長さのＸＴＥＮを含むグルカゴンの融合タンパク質を調製して評価した。この被験
物質を中性ｐＨのトリス緩衝食塩水で調製して、Ｇｃｇ－ＸＴＥＮ溶液のキャラクタリゼ
ーションは逆相ＨＰＬＣおよびサイズ排除クロマトグラフィーによって、タンパク質は溶
液中で均質であり、凝集していないことを確認した。データを表３０に表示する。比較の
目的で同じバッファーにおける未改変グルカゴンの溶解度限界を６０μＭ（０．２ｍｇ／
ｍＬ）にて測定して、結果により、付加したＸＴＥＮのすべての長さで溶解度の実質的な
増加が獲得されたことが証明される。重要なことに、大半の場合でグルカゴン－ＸＴＥＮ
融合タンパク質は、標的濃度を達成するように調製され、所与の構築物の最大溶解度限界
を決定するように評価されなかった。しかし、ＡＦ－１４４ ＸＴＥＮに連結されたグル
カゴンの場合、溶解度限界が決定され、結果として、ＸＴＥＮに連結されていないグルカ
ゴンと比較して、６０倍の溶解度の増加が達成された。さらにグルカゴン－ＡＦ１４４
ＢＰＸＴＥＮは、安定性について評価され、液体調合物において冷蔵条件下で少なくとも
６ヶ月間および３７℃でおおよそ１ヶ月間安定であることが見出された（データは示さず
）。
結論：データは、グルカゴンなどの生物活性タンパク質への短い長さのＸＴＥＮポリペ
プチドの連結が、得られた融合タンパク質によってタンパク質の溶解性特性を顕著に増強
し、ならびにより高いタンパク質濃度において安定性を与えられるという結論を裏付けて
いる。
Figure 0007461438000079
Figure 0007461438000080

（実施例３０）
ＢＰＸＴＥＮの２次構造のキャラクタリゼーション
ＢＰＸＴＥＮ Ｅｘ４－ＡＥ８６４を円偏光二色性分光法によって２次構造の程度につ
いて評価した。ＣＤ分光法は、Ｊａｓｃｏ Ｐｅｌｔｉｅｒ温度コントローラ（ＴＰＣ－
３４８ＷＩ）を装備したＪａｓｃｏ Ｊ－７１５（Ｊａｓｃｏ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
、Ｔｏｋｙｏ， Ｊａｐａｎ）分光偏光計で行った。タンパク質濃度を２０ｍＭリン酸ナ
トリウムｐＨ７．０、５０ｍＭ ＮａＣｌ中で０．２ｍｇ／ｍＬに調整した。実験は、光
路長０．１ｃｍのＨＥＬＬＭＡ石英セルを使用して行った。ＣＤスペクトルを５℃、２５
℃、４５℃、および６５℃にて取得して、Ｊ－７００ ｖｅｒｓｉｏｎ １．０８．０１
（Ｂｕｉｌｄ １）Ｊａｓｃｏ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｆｏｒ Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標
）を使用して処理した。ＣＤ測定を行う前に、試料を各温度にて５分間平衡化した。すべ
てのスペクトルは帯域幅１ｎｍおよび時間定数２秒を使用して、走査速度１００ｎｍ／分
にて３００ｎｍ～１８５ｎｍまでを２連で記録した。図２４に示すＣＤスペクトルは、安
定な２次構造の証拠を示さず、非構造化ポリペプチドと一致している。
（実施例３１）
グルカゴンおよびＥｘ４ ＢＰＸＴＥＮ構築物の生物活性
ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質としてそれぞれＹ２８８に連結された精製グルカゴンおよ
びエキセンジン－３を生物活性について、インビトロ細胞アッセイを使用してアッセイし
た。簡潔には、ＣｈｅｍｉＳｃｒｅｅｎ安定カルシウム最適化グルカゴン受容体細胞系統
を、グルカゴンおよびグルカゴン－ＸＴＥＮ構築物のリアルタイムカルシウム動員アッセ
イに使用して、天然ＧＬＰ－１受容体を発現する最適化エキセンジン－４受容体細胞系統
をエキセンジン－４およびＥｘ４構築物に使用した。本系において、細胞は天然受容体を
発現して、本受容体の活性化は、ＦＬＩＰＲ装置を使用して検出できる細胞内でのカルシ
ウム流動を生じる。図２７に示すように、天然グルカゴンは、用量依存方式でシグナルの
増加を生じる。本系における天然グルカゴンのＥＣ５０は、４．１ｎＭであることが見出
された。グルカゴン－Ｙ２８８構築物の滴定は、同程度の応答曲線を産し、ＥＣ５０は７
２ｎＭであった。図２８に示すように、２つの異なる市販元（ＡｎａｓｐｅｃおよびＴｏ
ｃｒｉｓ）からの天然エキセンジン－４は、用量依存方式でシグナルの増加を生じ、ＥＣ
５０（破線で示す）はそれぞれ７５ｐＭおよび１１０ｐＭであった。エキセンジン－４－
Ｙ５７６構築物の滴定は、同程度の応答曲線を産し、ＥＣ５０は９８ｐＭであり、補助タ
ンパク質の融合が全生物活性を保持することが示された。
結論：結果により、非構造化組換えタンパク質へのグルコース調節ペプチドの融合が生
物活性を保持する組成物を生じることが示される。
（実施例３２）
ｈＧＨ＿ＸＴＥＮ－ＡＥ遺伝子およびｈＧＨ＿ＸＴＥＮ－ＡＭ遺伝子およびベクターの
構築
ｈＧＨをコードする遺伝子をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅して、これ
によりＸＴＥＮデスティネーションベクターのスタッファにフランキングするＮｄｅＩお
よびＢｓａＩ部位と適合性である、ＮｄｅＩおよびＢｂｓＩ制限部位を導入した。ｐＸＴ
ＥＮプラスミドは、スタッファ－ＸＴＥＮの形式のＮｏｖａｇｅｎからのｐＥＴ３０誘導
体であり、スタッファは緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）またはＣＢＤのどちらかであるこ
とができ、ＸＴＥＮは３６～５７６以上の任意の長さであることができる。ｐＸＴＥＮの
スタッファ配列をｈＧＨコードフラグメントで置き換えることによって、構築物を生成さ
せた。ｐＸＴＥＮは、スタッファ配列の上流のＴ７プロモータ、およびスタッファ配列の
下流にてインフレームで融合されたＸＴＥＮ配列を特色とする。用いたＸＴＥＮ配列は、
ファミリＸＴＥＮ＿ＡＥまたはＸＴＥＮ＿ＡＭに属し、３６、７２、１４４、２８８、５
７６、８６４、８７５および１２９６アミノ酸を含む長さをコードする。ＮｄｅＩおよび
ＢｓａＩエンドヌクレアーゼを使用する制限消化によって、スタッファフラグメントを除
去した。Ｔ４ＤＮＡリガーゼを使用して、制限消化ｈＧＨ ＤＮＡフラグメントを切断ｐ
ＸＴＥＮベクターにライゲーションし、ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｇｏｌｄ（Ｓｔｒａｔａｇｅ
ｎｅ）中へと電気穿孔した。形質転換体をＤＮＡミニプレップによってスクリーニングし
て、所望の構築物をＤＮＡ配列決定によって確認した。最終ベクターはＴ７プロモータの
制御下でｈＧＨ＿ＸＴＥＮ遺伝子を産する。
（実施例３３）
ＸＴＥＮ－ＡＥ＿ｈＧＨ遺伝子およびＸＴＥＮ－ＡＭ＿ｈＧＨ遺伝子およびベクターの
構築
ｈＧＨをコードする遺伝子をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅して、これ
によりＸＴＥＮデスティネーションベクターのスタッファにフランキングするＢｂｓＩお
よびＨｉｎｄＩＩＩ部位と適合性である、ＢｂｓＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を導入
した。ｐＣＢＤ－ＸＴＥＮプラスミドは、セルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）－ＸＴＥＮ
－スタッファの形式のＮｏｖａｇｅｎからのｐＥＴ３０誘導体であり、スタッファは緑色
蛍光タンパク質（ＧＦＰ）であり、ＸＴＥＮは３６～５７６以上の任意の長さであること
ができる。ｐＣＢＤ－ＸＴＥＮのスタッファ配列をｈＧＨコードフラグメントで置き換え
ることによって、構築物を生成させた。ｐＣＢＤ－ＸＴＥＮは、ＣＢＤの上流のＴ７プロ
モータ、それに続くスタッファ配列の上流にてインフレームで融合されたＸＴＥＮ配列を
特色とする。用いたＸＴＥＮ配列は、ファミリＸＴＥＮ＿ＡＥおよびＸＴＥＮ＿ＡＭに属
し、３６、７２、１４４、２８８、５７６、８６４、８７５および１２９６アミノ酸を含
む長さをコードする。ＢｂｓＩおよびＨｉｎｄＩＩＩエンドヌクレアーゼを使用する制限
消化によって、スタッファフラグメントを除去した。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを使用して、
制限消化ｈＧＨ ＤＮＡフラグメントを切断ｐＣＢＤ－ＸＴＥＮベクターにライゲーショ
ンし、ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｇｏｌｄ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中へと電気穿孔した。形質
転換体をＤＮＡミニプレップによってスクリーニングして、所望の構築物をＤＮＡ配列決
定によって確認した。最終ベクターはＴ７プロモータの制御下でＣＢＤ＿ＸＴＥＮ＿ｈＧ
Ｈ遺伝子を産する。
（実施例３４）
ＸＴＥＮ－ＡＥ＿ｈＧＨ＿ＸＴＥＮ－ＡＥ＿ｈＧＨ遺伝子およびベクターの構築
ｈＧＨをコードする遺伝子をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅して、これ
によりＸＴＥＮデスティネーションベクターのスタッファにフランキングするＢｂｓＩお
よびＢｓａＩ部位に適合性である、ＢｂｓＩおよびＢｓａＩ制限部位を導入した。ｐＮＴ
Ｓ－ＸＴＥＮプラスミドは、４８アミノ酸のＮ末端ＸＴＥＮ発現配列の形式のＮｏｖａｇ
ｅｎからのｐＥＴ３０誘導体であり、スタッファは緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）であり
、ＸＴＥＮは３６～５７６以上の任意の長さであることができる。ｐＣＢＤ－ＸＴＥＮの
スタッファ配列をｈＧＨコードフラグメントで置き換えることによって、構築物を生成さ
せた。ｐＮＴＳ－ＸＴＥＮは、ＮＴＳの上流のＴ７プロモータ、それに続くスタッファ配
列の上流にてインフレームで融合されたＸＴＥＮ配列を特色とする。用いたＸＴＥＮ配列
は、ファミリＸＴＥＮ＿ＡＥに属し、３６、７２、１４４、２８８、５７６、８６４、お
よび１２９６アミノ酸を含む長さをコードする。ＢｂｓＩおよびＢｓａＩエンドヌクレア
ーゼを使用する制限消化によって、スタッファフラグメントを除去した。Ｔ４ ＤＮＡリ
ガーゼを使用して、制限消化ｈＧＨ ＤＮＡフラグメントを切断ｐＮＴＳ－ＸＴＥＮベク
ターにライゲーションし、ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｇｏｌｄ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中へと
電気穿孔した。いくつかの場合において、１４４または２８８アミノ酸の第２のＸＴＥＮ
＿ＡＥ配列をｈＧＨ遺伝子のＣ末端にライゲーションした。形質転換体をＤＮＡミニプレ
ップによってスクリーニングして、所望の構築物をＤＮＡ配列決定によって確認した。最
終ベクターはＴ７プロモータの制御下でＮＴＳ＿ＸＴＥＮ＿ｈＧＨ遺伝子またはＮＴＳ＿
ＸＴＥＮ＿ｈＧＨ＿ＸＴＥＮ遺伝子を産する。
（実施例３５）
ＧＨ＿ＸＴＥＮ構築物の精製
タンパク質発現
上記のプラスミドをＢＬ２１（ＤＥ３）－Ｇｏｌｄ大腸菌株（Ｎｏｖａｇｅｎ）に形質
転換して、適切な抗生物質を含むＬＢ寒天プレートに蒔き、３７℃にて一晩生育させた。
単一のコロニーを５ｍｌのＴＢ１２５媒体に接種して、３７℃にて一晩生育させた。翌日
、接種物を、５００ｍｌのＴＢ１２５を有する２Ｌ容器中へと変え（ｔｒａｎｓｆｏｒｍ
ｅｄ）、ＯＤ＝Ｏ．６に達するまで生育させて、続いて０．１ｍＭ ＩＰＴＧを用いて２
６℃にて１６時間にて引き続き生育させた。
細胞を遠心分離によって採取して、細胞ペレットを５ｍＭトリスｐＨ＝８．０、１００
ｍＭ ＮａＣｌを含有する５０ｍｌバッファーに再懸濁させた。超音波処理細胞破壊器を
使用して細胞を破壊して、細胞片を１５０００ＲＰＭの遠心分離で４℃にて除去した。次
に溶解物のｐＨを酢酸によってｐＨ４．５に調整して、夾雑宿主細胞タンパク質を沈殿さ
せ、続いて遠心分離により清澄にした。清澄になった酸処理溶解物を次にＤＥ５２アニオ
ン交換クロマトグラフィーカラムに適用して、ＮａＣｌで溶解させた。溶出した画分を次
に、ｐＨ４．０までさらに酸性化して、ＭａｃｒｏＣａｐＳＰカチオン交換クロマトグラ
フィーカラムに適用した。生成物をＮａＣｌによる連続溶出を使用して溶出させた。
タンパク質純度は９８％超と推定された。溶出した融合タンパク質の量をＳＤＳ－ＰＡ
ＧＥ分析によって、および総タンパク質濃度の測定によって決定した。溶出した融合タン
パク質の量が多いことは、ｈＧＨ単独に比べて融合タンパク質のより溶解性が高いことを
反映している。
最終調合物および貯蔵
次にバッファー交換タンパク質を１０Ｋ ＭＷＣＯ Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ濃縮器を使用
して２ｍＬの最終体積まで濃縮した。０．２２ｕｍのシリンジフィルタを使用して、濃縮
物を滅菌濾過した。最終溶液を等分割して－８０℃で貯蔵した。
（実施例３６）
ＥＬＩＳＡに基づく結合アッセイ
ＧＨへのＸＴＥＮ融合物を標準ＥＬＩＳＡに基づくアッセイで試験して、ＧＨ受容体へ
結合するその能力を評価した。アッセイは、組換えｈＧＨ受容体（ｈＧＨＲ－Ｆｃ）がＥ
ＬＩＳＡプレートのウェルにコーティングされているサンドイッチＥＬＩＳＡ形式を使用
して行った。次にウェルをブロッキングし、洗浄し、ＢＰＸＴＥＮ試料を次にさまざまな
希釈度のウェルにてインキュベートして、ＢＰＸＴＥＮの捕捉を可能にした。ウェルを広
範囲に洗浄して、ポリクローナルまたはモノクローナル抗ＧＨ抗体または抗ＸＴＥＮ抗体
のビオチン化調製物およびストレプトアビジンＨＲＰを使用して、結合タンパク質を検出
した。各血清希釈度での比色反応を未改変ＧＨの標準曲線に対して比較することによって
、結合タンパク質の割合を計算した。図３０に示した結果により、見かけのＥＣ５０値は
天然ｈＧＨで０．０７０１ｎＭ、ＡＭ８６４＿ｈＧＨで０．３９０５、およびｈＧＨ＿Ａ
Ｍ８６４で２．７３３であることが示される。
結論：結果により、ＸＴＥＮ融合物は融合後に顕著な量の受容体結合活性を保持して、
Ｃ末端にｈＧＨを有するＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質は、Ｎ末端にｈＧＨを有する融合タ
ンパク質と比較して、より大きな結合親和性を保持することが示される。
（実施例３７）
ラットにおけるｈＧＨ ＸＴＥＮ融合ポリペプチドのＰＫ分析
ｈＧＨＸＴＥＮポリペプチドのインビボ薬物動態パラメータを決定するために、ＢＰＸ
ＴＥＮ融合タンパク質ＡＥ９１２－ｈＧＨ、ＡＭ８６４－ｈＧＨ（本実施例および以下の
実施例でＡＭ８７５－ｈＧＨの同義語）、ＡＥ９１２－ｈＧＨ－ＡＥ１４４およびＡＥ９
１２－ｈＧＨ－ＡＥ２８８をラットで評価した。すべての組成物を水性バッファーにおい
て提供して、皮下（ＳＣ）経路で個々の動物に１．５ｍｇ／ｋｇ単回用量を使用して投与
した。血漿試料を投与後の各種の時点で採取して、被験物質の濃度を分析した。分析はサ
ンドイッチＥＬＩＳＡ形式を使用して行った。組換えｈＧＨＲ－ＦｃをＥＬＩＳＡプレー
トのウェルにコーティングした。ウェルをブロッキングし、洗浄し、血漿試料を次に様々
な希釈度でウェルにてインキュベートして、コート抗体による化合物の捕捉を可能にした
。ウェルを広範囲に洗浄して、ポリクローナル抗ｈＧＨ抗体のビオチン化調製物およびス
トレプトアビジンＨＲＰを使用して、結合タンパク質を検出した。各血清希釈度での比色
反応を標準曲線に対して比較することによって、被験物質の濃度を各時点で計算した。薬
物動態パラメータは、ＷｉｎＮｏｎＬｉｎソフトウェアパッケージを使用して計算した。
図３２は、皮下投与後の４つのｈＧＨ ＸＴＥＮ構築物の濃度プロフィールを示す。計
算した最終半減期は、ＡＥ９１２－ｈＧＨで７．５時間、ＡＭ８６４－ｈＧＨ（ＡＭ８７
５－ｈＧＨの同義語）で６．８時間、ＡＥ９１２－ｈＧＨ－ＡＥ１４４で１２．４時間お
よびＡＥ９１２－ｈＧＨ－ＡＥ２８８で１３．１時間であった。比較のために、未改変ｈ
ＧＨについて並行して同じ実験を行うと、劇的により短い血漿半減期を示した。
結論：ｈＧＨを含む融合タンパク質への異なるＸＴＥＮ配列の組み入れによって、げっ
歯類モデルで証明されたように、未改変ｈＧＨと比較して、４つすべての組成物で薬物動
態パラメータの顕著な増強が生じ、このような融合タンパク質組成物の有用性が証明され
る。ＡＥ－ｈＧＨ構築物のＣ末端への第２のＸＴＥＮタンパク質の付加により、おそらく
受容体媒介クリアランスの低下のために、単一のＸＴＥＮを有する構築物と比較して、最
終半減期のさらなる増強が生じる。
（実施例３８）
カニクイザルにおけるｈＧＨ ＸＴＥＮ融合ポリペプチドのＰＫ分析
ｈＧＨＸＴＥＮポリペプチドのインビボ薬物動態パラメータに対する第２のＸＴＥＮの
包含の効果を決定するために、１個または２個のＸＴＥＮ分子を含有するＢＰＸＴＥＮ融
合タンパク質（ＡＥ９１２－ｈＧＨ、ＡＭ８６４－ｈＧＨ、およびＡＥ９１２－ｈＧＨ－
ＡＥ１４４）をカニクイザルにおいて評価した。すべての組成物を水性バッファーにおい
て提供して、皮下（ＳＣ）経路で個々の動物に１．５ｍｇ／ｋｇ単回用量を使用して投与
した。血漿試料を投与後の各種の時点で収集して、被験物質の濃度を分析した。分析はサ
ンドイッチＥＬＩＳＡ形式を使用して行った。組換えｈＧＨＲ－ＦｃをＥＬＩＳＡプレー
トのウェルにコーティングした。ウェルをブロッキングし、洗浄し、血漿試料を次に様々
な希釈度でウェルにてインキュベートして、コート抗体による化合物の捕捉を可能にした
。ウェルを広範囲に洗浄して、ポリクローナル抗ｈＧＨ抗体のビオチン化調製物およびス
トレプトアビジンＨＲＰを使用して、結合タンパク質を検出した。各血清希釈度での比色
反応を標準曲線に対して比較することによって、被験物質の濃度を各時点で計算した。薬
物動態パラメータは、ＷｉｎＮｏｎＬｉｎソフトウェアパッケージを使用して計算した。
融合タンパク質の平均最終半減期は、ＡＭ８６４－ｈＧＨで３３時間、ＡＥ９１２－ｈＧ
Ｈで４４時間、およびＡＥ９１２－ｈＧＨ－ＡＥ１４４（ｈＧＨのＮ末端およびＣ末端に
連結された２個のＸＴＥＮを含有）で１１０時間であった。
図３３は、皮下投与後の３つのｈＧＨ ＸＴＥＮ構築物の濃度プロフィールを示し、計
算したＰＫパラメータを示す。皮下投与の後、最終半減期は、３３６時間の期間にわたる
各種の調製物について、おおよそ３３～１１０時間であると計算された。
結論：ｈＧＨを含む融合タンパク質への異なるＸＴＥＮ配列の組み入れによって、カニ
クイザルモデルで証明されたように、３つすべての組成物で薬物動態パラメータの顕著な
増強が生じ、このような融合タンパク質組成物の有用性が証明され、ｈＧＨのＣ末端に連
結された第２のＸＴＥＮを含有する構築物は、最終半減期について２倍の増強を示した。
（実施例３９）
体重増大に対するｈＧＨおよびＡＭ８６４－ｈＧＨの効果の比較
ＢＰＸＴＥＮ ＡＭ８６４－ｈＧＨが薬理学的効力を保持する能力を、投与した化合物
に応答した低酸素症ラットにおける体重増大についての測定パラメータを使用して評価し
た。図３４は、示した用量および投与頻度でのｈＧＨまたはＡＭ８６４－ｈＧＨの投与の
低酸素症ラットの体重に対する効果を示す。結果は、ｈＧＨの同程度の投薬量と効力が同
等であるＢＰＸＴＥＮ構築物による、またより低い頻度の投薬での生物活性の保持を示す
。ＡＭ８６４－ｈＧＨの用量レベルの増加は、実験の期間にわたって体重増大の増加をも
たらす。
（実施例４０）
骨軟骨に対するｈＧＨおよびＡＭ８６４－ｈＧＨの効果の比較
ｈＧＨに連結されたＡＭ８６４のＢＰＸＴＥＮが薬理学的効力を保持する能力を、低酸
素症ラットにおける脛骨端板（ｔｉｂｉａｌ ｅｐｉｐｈｙｓｅａｌ ｐｌａｔｅ）幅の
増加についての測定パラメータを使用して評価した。図３５は、処置９日後のラットから
の脛骨の組織断面に示す、プラセボ、ｈＧＨ、およびＡＭ８６４－ｈＧＨの投与の効果の
比較を示し、縁（ｍａｒｇｉｎ）は点線で記されている。群は図３５で示すものと同じで
ある。図３５Ａは、プラセボ群が９日後に３４４±３８．６μｍの脛骨端板の平均断面幅
を有したことを示す。図３５Ｂは、ｈＧＨ群（毎日１０μｇ）が９日後に５９８±８．５
μｍの平均断面幅を有したことを示す。図３５Ｃは、ＡＭ８６４－ｈＧＨ（１５ｍｇ／ｋ
ｇ ｑ３ｄ）が９日後に９４４±８．５μｍの平均断面幅を有したことを示す。結果によ
って、より頻繁でない間隔で投薬されたにもかかわらず、ＧＨＵＰＲ構築物による活性の
増強が示される。
（実施例４１）
ＦＸＩａによって放出可能なＣ末端ＸＴＥＮ
ＦＩＸのＣ末端に融合されたＸＴＥＮタンパク質から成るＦＩＸ－ＸＴＥＮ融合タンパ
ク質は、図３６Ｂに描くように、ＦＩＸ構成要素およびＸＴＥＮ構成要素の間に配置され
たＸＴＥＮ放出部位切断配列によって生成することができる。例示的な配列を表４３に提
供する。この場合には、放出部位切断配列は、ＦＸＩａプロテアーゼ（ＥＣ３．４．２１
．２７，Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０３９５１）によって認識および切断されるアミノ酸配列を
含有するＦＩＸ－ＸＴＥＮに組み入れることができる。特にアミノ酸配列ＫＬＴＲ↓ＶＶ
ＧＧ（配列番号２２４）［Ｒａｗｌｉｎｇｓ Ｎ．Ｄら（２００８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３６：Ｄ３２０］は、配列のアルギニンの後でＦＸＩａプロテアー
ゼによって切断される。ＦＸＩは、内因性凝固経路または接触活性化凝固経路においてＦ
ＩＸの直前に位置する凝固促進プロテアーゼである。活性ＦＸＩａは、ＦＸＩＩａによる
チモーゲンのタンパク質分解切断によりＦＸＩから産生される。いったん活性化されると
、凝固におけるその天然の役割は、ＦＩＸの位置Ｒ１９１およびＲ２２６にてタンパク質
を切ることによりチモーゲンからペプチドを切除してＦＩＸを活性化して、次に、今度は
凝固経路を永続化させることである。ＦＸＩａの産生は厳重に制御され、適正な止血のた
めに凝固が必要なときにのみ出現する。それゆえ、切断配列の組み入れにより、ＸＴＥＮ
ドメインのみが、内因性凝固経路の活性化と同時に、および凝固が生理的に必要とされる
ときにＦＩＸから除去される。これにより、ＦＩＸ－ＸＴＥＮ融合タンパク質が内因性経
路の活性化の間に１つの追加の方式で処理される状況が生じる。ＦＸＩａによりＦＩＸド
メインのＲ１９１およびＲ２２６にて起こる天然の切断（ｎａｔｕｒａｌ ｃｌｅａｖａ
ｇｅ）に加えて、ＸＴＥＮタンパク質から今や活性化されたＦＩＸａを分離する（ｄｅｃ
ｏｕｐｌｅ）第３の切断が、ＸＴＥＮ放出部位に出現する。本発明の組成物の所望の特色
では、これにより凝固の活性化までＦＩＸ－ＸＴＥＮがプロドラッグとして無傷のままで
ある状況が生じ、凝固の活性化のときにその分子が処理されて、それを必要とする被験体
において凝固機能を再構成または増進させる遊離ＦＩＸａを産生する。
（実施例４２）
ＦＸＩＩａによって放出可能なＣ末端ＸＴＥＮ
ＦＩＸのＣ末端に融合されたＸＴＥＮタンパク質から成るＦＩＸ－ＸＴＥＮ融合タンパ
ク質は、図３６Ｂに描くように、ＦＩＸ構成要素およびＸＴＥＮ構成要素の間に配置され
たＸＴＥＮ放出部位切断配列によって生成することができる。例示的な配列を表４３に提
供する。この場合には、ＸＴＥＮ放出部位配列は、ＦＸＩＩａプロテアーゼ（ＥＣ３．４
．２１．３８，Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ００７４８）によって認識および切断されるアミノ酸
配列を含有できる。具体的に配列ＴＭＴＲ↓ＩＶＧＧ（配列番号２２５）は、配列の位置
４のアルギニンの後で切られる。ＦＸＩＩは、内因性凝固経路または接触活性化凝固経路
においてＦＩＸの前に位置する凝固促進プロテアーゼである。活性ＦＸＩＩａは、非自己
表面との接触によって、およびカリクレインによる切断によって、ＦＸＩＩから産生され
る。いったん活性化されると、凝固におけるその天然の役割は、チモーゲンのタンパク質
分解切断によりＦＸＩを活性化して、次に、今度は凝固経路を永続化させることである。
ＦＸＩＩａの産生は厳重に制御され、適正な止血のために凝固が必要なときにのみ出現す
る。それゆえ、切断配列の組み入れにより、ＸＴＥＮドメインのみが、内因性凝固経路の
活性化と同時に、および凝固が生理的に必要とされるときにＦＩＸから除去される。これ
により、ＦＩＸ－ＸＴＥＮ融合物が内因性経路の活性化の間に１つの追加の方式で処理さ
れる状況が生じる。ＦＸＩａによりＦＩＸドメインのＲ１９１およびＲ２２６にておこる
天然の切断に加えて、ＸＴＥＮタンパク質から今や活性化されたＦＩＸａを分離する第３
の切断が、ＸＴＥＮ放出部位におこる。本発明の組成物の所望の特色では、これにより凝
固の活性化までＦＩＸ－ＸＴＥＮがプロドラッグとして無傷のままである状況が生じ、凝
固の活性化のときにその分子が処理されて、それを必要とする被験体において凝固機能を
再構成または増進させる遊離ＦＩＸａを産生する。
（実施例４３）
カリクレインによって放出可能なＣ末端ＸＴＥＮ
ＦＩＸのＣ末端に融合されたＸＴＥＮタンパク質から成るＦＩＸ－ＸＴＥＮ融合タンパ
ク質は、図３６Ｂに描くように、ＦＩＸ構成要素およびＸＴＥＮ構成要素の間に配置され
たＸＴＥＮ放出部位切断配列によって生成することができる。例示的な配列を表４３に提
供する。この場合には、ＸＴＥＮ放出部位配列は、カリクレインプロテアーゼ（ＥＣ３．
４．２１．３４，Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０３９５２）によって認識および切断されるアミノ
酸配列を含有できる。具体的に配列ＳＰＦＲ↓ＳＴＧＧ（配列番号２２６）［Ｒａｗｌｉ
ｎｇｓ Ｎ．Ｄ．ら（２００８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３６：Ｄ３２
０］は、配列の位置４のアルギニンの後で切られる。カリクレインは、内因性凝固経路ま
たは接触活性化凝固経路においてＦＩＸの前に位置する凝固促進プロテアーゼである。活
性カリクレインは、非自己表面との接触によって、血漿カリクレイン（Ｋａｌｌｉｒｉｅ
ｎ）から産生される。いったん活性化されると、凝固におけるその天然の役割は、チモー
ゲンのタンパク質分解切断によりＦＸＩＩ（図３９）を活性化して、次に、今度は凝固経
路を永続化させることである。カリクレインの産生は厳重に制御され、適正な止血のため
に凝固が必要なときにのみ出現する。それゆえ、切断配列の組み入れにより、ＸＴＥＮド
メインのみが、内因性凝固経路の活性化と同時に、および凝固が生理的に必要とされると
きにＦＩＸから除去される。これにより、ＦＩＸ－ＸＴＥＮ融合物が内因性経路の活性化
の間に１つの追加の方式で処理される状況が生じる。ＦＸＩａによりＦＩＸドメインのＲ
１９１およびＲ２２６にておこる天然の切断に加えて、ＸＴＥＮタンパク質から今や活性
化されたＦＩＸａを分離する第３の切断が、ＸＴＥＮ放出部位におこる。本発明の組成物
の所望の特色では、これにより凝固の活性化までＦＩＸ－ＸＴＥＮがプロドラッグとして
無傷のままである状況が生じ、凝固の活性化のときにその分子が処理されて、それを必要
とする被験体において凝固機能を再構成または増進させる遊離ＦＩＸａを産生する。
（実施例４４）
ＦＶＩＩａによって放出可能なＣ末端ＸＴＥＮ
ＦＩＸのＣ末端に融合されたＸＴＥＮタンパク質から成るＦＩＸ－ＸＴＥＮ融合タンパ
ク質は、図３６Ｂに描くように、ＦＩＸ構成要素およびＸＴＥＮ構成要素の間に配置され
たＸＴＥＮ放出部位切断配列によって生成することができる。例示的な配列を表４３に提
供する。この場合には、放出部位配列は、ＦＶＩＩａプロテアーゼ（ＥＣ３．４．２１．
２１，Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０８７０９）によって認識および切断されるアミノ酸配列を含
有する。具体的に配列ＬＱＶＲ↓ＩＶＧＧ（配列番号２２７）［Ｒａｗｌｉｎｇｓ Ｎ．
Ｄ．ら（２００８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３６：Ｄ３２０］は、配列
の位置４のアルギニンの後で切られる。ＦＶＩＩａは、外因性凝固経路または細胞傷害活
性化凝固経路においてＦＩＸの前に位置する凝固促進プロテアーゼである。活性ＦＶＩＩ
ａは、組織因子、リン脂質およびカルシウムへの結合によって補助される自己触媒プロセ
スにおいてＦＶＩＩから産生される。いったん活性化されると、凝固におけるその天然の
役割は、チモーゲンのタンパク質分解切断によりＦＩＸおよびＦＸ（図３９）を活性化し
て、次に、今度は凝固経路を永続化させることである。ＦＶＩＩａ活性は厳重に制御され
、適正な止血のために凝固が必要なときにのみ出現する。それゆえ、切断配列の組み入れ
により、ＸＴＥＮドメインのみが、内因性凝固経路の活性化と同時に、および凝固が生理
的に必要とされるときにＦＩＸから除去される。これにより、ＦＩＸ－ＸＴＥＮ融合物が
内因性経路の活性化の間に１つの追加の方式で処理される状況が生じる。ＦＶＩＩａによ
りＦＩＸドメインのＲ１９１およびＲ２２６にておこる天然の切断に加えて、ＸＴＥＮタ
ンパク質から今や活性化されたＦＩＸａを分離する第３の切断が、ＸＴＥＮ放出部位にお
こる。本発明の組成物の所望の特色では、これにより凝固の活性化までＦＩＸ－ＸＴＥＮ
がプロドラッグとして無傷のままである状況が生じ、凝固の活性化のときにその分子が処
理されて、それを必要とする被験体において凝固機能を再構成または増進させる遊離ＦＩ
Ｘａを産生する。
（実施例４５）
ＦＩＸａによって放出可能なＣ末端ＸＴＥＮ
ＦＩＸのＣ末端に融合されたＸＴＥＮタンパク質から成るＦＩＸ－ＸＴＥＮ融合タンパ
ク質は、図３６Ｂに描くように、ＦＩＸ構成要素およびＸＴＥＮ構成要素の間に配置され
たＸＴＥＮ放出部位切断配列によって生成することができる。例示的な配列を表４３に提
供する。この場合には、放出部位切断配列は、ＦＩＸａプロテアーゼ（ＥＣ３．４．２１
．２２，Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ００７４０）によって認識および切断されるアミノ酸配列を
含有する。具体的に配列ＰＬＧＲ↓ＩＶＧＧ（配列番号２２８）［Ｒａｗｌｉｎｇｓ Ｎ
．Ｄ．ら（２００８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３６：Ｄ３２０］は、配
列の位置４のアルギニンの後で切られる。活性ＦＩＸａは、リン脂質およびカルシウムの
存在下でのＦＸＩａまたはＦＶＩＩａのどちらかによるＦＩＸの切断によって産生される
。いったん活性化されると、凝固におけるその天然の役割は、チモーゲンのタンパク質分
解切断によりＦＸ（図３９）を活性化して、次に、今度は凝固経路を永続化させることで
ある。ＦＩＸａ活性は厳重に制御され、適正な止血のために凝固が必要なときにのみ出現
する。それゆえ、切断配列の組み入れにより、ＸＴＥＮドメインのみが、外因性凝固経路
または内因性凝固経路の活性化と同時に、および凝固が生理的に必要とされるときにＦＩ
Ｘから除去される。これにより、ＦＩＸ－ＸＴＥＮ融合物が内因性経路の活性化の間に１
つの追加の方式で処理される状況が生じる。ＦＶＩＩａまたはＦＸＩａによりＦＩＸドメ
インのＲ１９１およびＲ２２６にておこる天然の切断に加えて、ＸＴＥＮタンパク質から
今や活性化されたＦＩＸａを分離する第３の切断が、ＸＴＥＮ放出部位におこる。本発明
の組成物の所望の特色では、これにより凝固の活性化までＦＩＸ－ＸＴＥＮがプロドラッ
グとして無傷のままである状況が生じ、凝固の活性化のときにその分子が処理されて、そ
れを必要とする被験体において凝固機能を再構成または増進させる遊離ＦＩＸａを産生す
る。
（実施例４６）
ＦＸａによって放出可能なＣ末端ＸＴＥＮ
ＦＩＸのＣ末端に融合されたＸＴＥＮタンパク質から成るＦＩＸ－ＸＴＥＮ融合タンパ
ク質は、図３６Ｂに描くように、ＦＩＸ構成要素およびＸＴＥＮ構成要素の間に配置され
たＸＴＥＮ放出部位切断配列によって生成することができる。例示的な配列を表４３に提
供する。この場合には、放出部位は、ＦＸａプロテアーゼ（ＥＣ３．４．２１．６，Ｕｎ
ｉｐｒｏｔ Ｐ００７４２）によって認識および切断されるアミノ酸配列を含有する。具
体的に配列ＩＥＧＲ↓ＴＶＧＧ（配列番号２２９）［Ｒａｗｌｉｎｇｓ Ｎ．Ｄ．ら（２
００８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３６：Ｄ３２０］は、配列の位置４の
アルギニンの後で切られる。活性ＦＸａは、リン脂質およびカルシウムの存在下でのＦＩ
ＸａによるＦＸの切断によって産生され、凝固経路の第ＩＸ因子からすぐ下流のステップ
である。いったん活性化されると、凝固におけるその天然の役割は、チモーゲンのタンパ
ク質分解切断によりＦＩＩ（図３９）を活性化して、次に、今度は凝固経路を永続化させ
ることである。ＦＸａ活性は厳重に制御され、適正な止血のために凝固が必要なときにの
み出現する。それゆえ、切断配列の組み入れにより、ＸＴＥＮドメインのみが、外因性凝
固経路または内因性凝固経路の活性化と同時に、および凝固が生理的に必要とされるとき
にＦＩＸから除去される。これにより、ＦＩＸ－ＸＴＥＮ融合物が凝固の活性化の間に１
つの追加の方式で処理される状況が生じる。ＦＶＩＩａまたはＦＸＩａによりＦＩＸドメ
インのＲ１９１およびＲ２２６にておこる天然の切断に加えて、ＸＴＥＮタンパク質から
今や活性化されたＦＩＸａを分離する第３の切断が、ＸＴＥＮ放出部位におこる。本発明
の組成物の所望の特色では、これにより凝固の活性化までＦＩＸ－ＸＴＥＮがプロドラッ
グとして無傷のままである状況が生じ、凝固の活性化のときにその分子が処理されて、そ
れを必要とする被験体において凝固機能を再構成または増進させる遊離ＦＩＸａを産生す
る。
（実施例４７）
ＦＩＩａ（トロンビン）によって放出可能なＣ末端ＸＴＥＮ
ＦＩＸのＣ末端に融合されたＸＴＥＮタンパク質から成るＦＩＸ－ＸＴＥＮ融合タンパ
ク質は、図３６Ｂに描くように、ＦＩＸ構成要素およびＸＴＥＮ構成要素の間に配置され
たＸＴＥＮ放出部位切断配列によって生成することができる。例示的な配列を表４３に提
供する。この場合には、放出部位は、ＦＩＩａプロテアーゼ（ＥＣ３．４．２１．５，Ｕ
ｎｉｐｒｏｔ Ｐ００７３４）によって認識および切断されるアミノ酸配列を含有する。
具体的に配列ＬＴＰＲ↓ＳＬＬＶ（配列番号２３０）［Ｒａｗｌｉｎｇｓ Ｎ．Ｄ．ら（
２００８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３６：Ｄ３２０］は、配列の位置４
のアルギニンの後で切られる。活性ＦＩＩａは、リン脂質およびカルシウムの存在下での
ＦＸａによるＦＩＩの切断によって産生され、凝固経路の第ＩＸ因子から下流にある。い
ったん活性化されると、凝固におけるその天然の役割はフィブリノーゲン（ｆｉｂｒｉｎ
ｇｉｎ）（図３９）を切断することであり、これにより次に、今度はクロット形成が開始
する。ＦＩＩａ活性は厳重に制御され、適正な止血のために凝固が必要なときにのみ出現
する。それゆえ、切断配列の組み入れにより、ＸＴＥＮドメインのみが、外因性凝固経路
または内因性凝固経路の活性化と同時に、および凝固が生理的に必要とされるときにＦＩ
Ｘから除去される。これにより、ＦＩＸ－ＸＴＥＮ融合物が凝固の活性化の間に１つの追
加の方式で処理される状況が生じる。ＦＶＩＩａまたはＦＸＩａによりＦＩＸドメインの
Ｒ１９１およびＲ２２６にておこる天然の切断に加えて、ＸＴＥＮタンパク質から今や活
性化されたＦＩＸａを分離する第３の切断が、ＸＴＥＮ放出部位におこる。本発明の組成
物の所望の特色では、これにより凝固の活性化までＦＩＸ－ＸＴＥＮがプロドラッグとし
て無傷のままである状況が生じ、凝固の活性化のときにその分子が処理されて、それを必
要とする被験体において凝固機能を再構成または増進させる遊離ＦＩＸａを産生する。
（実施例４８）
エラスターゼ－２によって放出可能なＣ末端ＸＴＥＮ
ＦＩＸのＣ末端に融合されたＸＴＥＮタンパク質から成るＦＩＸ－ＸＴＥＮ融合タンパ
ク質は、図３６Ｂに描くように、ＦＩＸ構成要素およびＸＴＥＮ構成要素の間に配置され
たＸＴＥＮ放出部位切断配列によって生成することができる。例示的な配列を表４３に提
供する。この場合には、放出部位は、エラスターゼ－２プロテアーゼ（ＥＣ３．４．２１
．３７，Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０８２４６）によって認識および切断されるアミノ酸配列を
含有する。具体的に配列ＬＧＰＶ↓ＳＧＶＰ（配列番号２３１）［Ｒａｗｌｉｎｇｓ Ｎ
．Ｄ．ら（２００８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３６：Ｄ３２０］は、配
列の位置４の後で切られる。エラスターゼは好中球によって構成的に発現され、循環中に
常時存在する。その活性はセルピンによって厳重に制御され、それゆえ、ほぼ常に最小限
に活性である。それゆえ、長寿命ＦＩＸ－ＸＴＥＮが循環するときに、その一部が切断さ
れて、凝固に使用されるより短寿命のＦＩＸのプールを生成する。本発明の組成物の所望
の特色では、これにより予防量のＦＩＸを絶えず放出する循環プロドラッグデポーが生成
される。
（実施例４９）
ＭＭＰ－１２によって放出可能なＣ末端ＸＴＥＮ
ＦＩＸのＣ末端に融合されたＸＴＥＮタンパク質から成るＦＩＸ－ＸＴＥＮ融合タンパ
ク質は、図３６Ｂに描くように、ＦＩＸ構成要素およびＸＴＥＮ構成要素の間に配置され
たＸＴＥＮ放出部位切断配列によって生成することができる。例示的な配列を表４３に提
供する。この場合には、放出部位は、ＭＭＰ－１２プロテアーゼ（ＥＣ３．４．２４．６
５，Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ３９９００）によって認識および切断されるアミノ酸配列を含有
する。具体的に配列ＧＰＡＧ↓ＬＧＧＡ（配列番号２３３）［Ｒａｗｌｉｎｇｓ Ｎ．Ｄ
．ら（２００８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３６：Ｄ３２０］は、配列の
位置４の後で切られる。ＭＭＰ－１２は全血中で構成的に発現される。それゆえ、長寿命
ＦＩＸ－ＸＴＥＮが循環するときに、その一部が切断されて、凝固に使用されるより短寿
命のＦＩＸのプールを生成する。本発明の組成物の所望の特色では、これにより予防量の
ＦＩＸを絶えず放出する循環プロドラッグデポーが生成される。
（実施例５０）
ＭＭＰ－１３によって放出可能なＣ末端ＸＴＥＮ
ＦＩＸのＣ末端に融合されたＸＴＥＮタンパク質から成るＦＩＸ－ＸＴＥＮ融合タンパ
ク質は、図３６Ｂに描くように、ＦＩＸ構成要素およびＸＴＥＮ構成要素の間に配置され
たＸＴＥＮ放出部位切断配列によって生成することができる。例示的な配列を表４３に提
供する。この場合には、放出部位は、ＭＭＰ－１３プロテアーゼ（ＥＣ３．４．２４．－
，Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ４５４５２）によって認識および切断されるアミノ酸配列を含有す
る。具体的に配列ＧＰＡＧ↓ＬＲＧＡ（配列番号２３４）［Ｒａｗｌｉｎｇｓ Ｎ．Ｄ．
ら（２００８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３６：Ｄ３２０］は、位置４の
後で切られる（矢印で示す）。ＭＭＰ－１３は全血中で構成的に発現される。それゆえ、
長寿命ＦＩＸ－ＸＴＥＮが循環するときに、その一部が切断されて、凝固に使用されるよ
り短寿命のＦＩＸのプールを生成する。本発明の組成物の所望の特色では、これにより予
防量のＦＩＸを絶えず放出する循環プロドラッグデポーが生成される。
（実施例５１）
ＭＭＰ－１７によって放出可能なＣ末端ＸＴＥＮ
ＦＩＸのＣ末端に融合されたＸＴＥＮタンパク質から成るＦＩＸ－ＸＴＥＮ融合タンパ
ク質は、図３６Ｂに描くように、ＦＩＸ構成要素およびＸＴＥＮ構成要素の間に配置され
たＸＴＥＮ放出部位切断配列によって生成することができる。例示的な配列を表４３に提
供する。この場合には、放出部位は、ＭＭＰ－２０プロテアーゼ（ＥＣ．３．４．２４．
－，Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ９ＵＬＺ９）によって認識および切断されるアミノ酸配列を含有
する。具体的に配列ＡＰＬＧ↓ＬＲＬＲ（配列番号２３５）［Ｒａｗｌｉｎｇｓ Ｎ．Ｄ
ら（２００８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３６：Ｄ３２０］は、配列の位
置４の後で切られる。ＭＭＰ－１７は全血中で構成的に発現される。それゆえ、長寿命Ｆ
ＩＸ－ＸＴＥＮが循環するときに、その一部が切断されて、凝固に使用されるより短寿命
のＦＩＸのプールを生成する。本発明の組成物の所望の特色では、これにより予防量のＦ
ＩＸを絶えず放出する循環プロドラッグデポーが生成される。
（実施例５２）
ＭＭＰ－２０によって放出可能なＣ末端ＸＴＥＮ
ＦＩＸのＣ末端に融合されたＸＴＥＮタンパク質から成るＦＩＸ－ＸＴＥＮ融合タンパ
ク質は、図３６Ｂに描くように、ＦＩＸ構成要素およびＸＴＥＮ構成要素の間に配置され
たＸＴＥＮ放出部位切断配列によって生成することができる。例示的な配列を表４３に提
供する。この場合には、放出部位は、ＭＭＰ－２０プロテアーゼ（ＥＣ．３．４．２４．
－，Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｏ６０８８２）によって認識および切断されるアミノ酸配列を含有
する。具体的に配列ＰＡＬＰ↓ＬＶＡＱ（配列番号２３６）［Ｒａｗｌｉｎｇｓ Ｎ．Ｄ
．ら（２００８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３６：Ｄ３２０］は、位置４
の後で切られる（矢印で示す）。ＭＭＰ－２０は全血中で構成的に発現される。それゆえ
、長寿命ＦＩＸ－ＸＴＥＮが循環するときに、その一部が切断されて、凝固に使用される
より短寿命のＦＩＸのプールを生成する。本発明の組成物の所望の特色では、これにより
予防量のＦＩＸを絶えず放出する循環プロドラッグデポーが生成される。
（実施例５３）
ＫＮＳＡＤＫループへの内部ＸＴＥＮ融合物
ＦＩＸのループに挿入されたＸＴＥＮタンパク質から成るＦＩＸ－ＸＴＥＮ融合タンパ
ク質は、図３７Ｆに描くように生成することができる。具体的にＸＴＥＮ配列は、公知の
血友病Ｂ変異を有さず、ＦＩＸ結晶構造物で高度に構造化されていないＥＧＦ２ドメイン
（残基１４６－１５２）のＫＮＳＡＤＮＫ（配列番号１７４９）ループに、融合物として
挿入される。この場合には、挿入は、ループ配列のＳＡ結合にて天然配列を分割して、Ｘ
ＴＥＮ配列をギャップに融合することによって作られる。これにより、ＸＴＥＮがＦＩＸ
配列に対して内部であるが、球状タンパク質に対して外部であるループ配列が生まれる。
本発明の組成物の所望の特色では、これにより凝固の活性化までＦＩＸ－ＸＴＥＮがプロ
ドラッグとして無傷のままである状況が生じ、凝固の活性化のときにその分子が処理され
て、それを必要とする被験体において凝固機能を再構成または増進させるＦＩＸａ－ＸＴ
ＥＮを産生する。
（実施例５４）
ＬＡＥＮループへの内部ＸＴＥＮ融合物
ＦＩＸのループに挿入されたＸＴＥＮタンパク質から成るＦＩＸ－ＸＴＥＮ融合タンパ
ク質は、図３７Ｆに描くように生成することができる。具体的にＸＴＥＮ配列は、公知の
血友病Ｂ変異を有さず、ＦＩＸ結晶構造物で高度に構造化されていないＥＧＦ２ドメイン
（残基１６３－１６６）のＬＡＥＮ（配列番号１７７８）ループに、融合物として挿入さ
れる。この場合には、挿入は、配列のＡＥ結合にて天然配列を分割して、ＸＴＥＮ配列を
ギャップに融合することによって作られる。これによりループ配列ＬＡ－ＸＴＥＮ－ＥＮ
が生まれる。本発明の組成物の所望の特色では、これにより凝固の活性化までＦＩＸ－Ｘ
ＴＥＮがプロドラッグとして無傷のままである状況が生じ、凝固の活性化のときにその分
子が処理されて、それを必要とする被験体において凝固機能を再構成または増進させるＦ
ＩＸａ－ＸＴＥＮを産生する。
（実施例５５）
活性化ペプチドへの内部ＸＴＥＮ融合物
ＦＩＸのループに挿入されたＸＴＥＮタンパク質から成るＦＩＸ－ＸＴＥＮ融合タンパ
ク質は、図３７Ｄに描くように生成することができる。具体的にＸＴＥＮ融合物は、２つ
の天然ＦＸＩａ切断部位がどちらも破壊されないように、活性化ペプチド（残基１９２－
２２６）に配置される。挿入は、配列のＴ２０９－Ｉ２１０結合（↓によって示す）にて
天然配列を分割して、ＸＴＥＮ配列をギャップに融合することによって作られる。これに
より活性化ペプチドの残基１８８にて開始する、ＸＴＥＮが挿入された配列が生まれる。
ＦＸＩは、内因性凝固経路または接触活性化凝固経路においてＦＩＸの直前に位置する凝
固促進プロテアーゼである。活性ＦＸＩａは、ＦＸＩＩａによるチモーゲンのタンパク質
分解切断によりＦＸＩから産生される。いったん活性化されると、凝固におけるその天然
の役割は、位置Ｒ１９１およびＲ２２６にてタンパク質を切ることによりＦＩＸチモーゲ
ンから活性化ペプチドを切除してＦＩＸ（図３９）を活性化することである。これらのカ
ット部位は矢印によって描かれ、配列は、Ｐ４－Ｐ４’部位を変化させずに残して、凝固
カスケードの間の天然の切断活性を可能とするように設計される。それゆえ、ＸＴＥＮド
メインのみが、内因性凝固経路内の正常な活性化プロセスの一部としてＦＩＸから除去さ
れる。
（実施例５６）
ＦＩＸ ＥＧＦドメインの間の内部ＸＴＥＮ融合物
ＦＩＸのループに挿入されたＸＴＥＮタンパク質から成るＦＩＸ－ＸＴＥＮ融合タンパ
ク質は、図３７Ｃに描くように生成することができる。具体的にＸＴＥＮ融合物は、ＦＩ
Ｘの２つのＥＧＦ様ドメインの間に配置される（結合部は残基１２９と１３０の間である
）。挿入は、Ｅ１２９－Ｌ１３０結合にて天然配列を分割して、ＸＴＥＮ配列をギャップ
に融合することによって作られる。これにより残基１２１にて開始する、ＸＴＥＮが挿入
された配列が生まれる。実際に、これにより凝固の活性化までＦＩＸ－ＸＴＥＮが無傷で
循環する状況が生じ、凝固の活性化のときにその分子が処理されて、個体において凝固機
能を再構成または増進させるＦＩＸａ－ＸＴＥＮを産生する。
（実施例５７）
Ｃ末端ＸＴＥＮの放出速度の最適化
Ｃ末端ＸＴＥＮの放出速度が変化する上述の実施例４１～５７の変異体を生成すること
ができる。ＸＴＥＮ放出プロテアーゼによるＸＴＥＮ放出の速度はＸＴＥＮ放出部位の配
列に依存しているため、ＸＴＥＮ放出部位のアミノ酸配列を変更することによって、ＸＴ
ＥＮ放出の速度を制御することができる。多くのプロテアーゼの配列特異性は当分野で周
知であり、数種のデータベースに記録されている。この場合には、プロテアーゼのアミノ
酸特異性は基質のコンビナトリアルライブラリを使用して［Ｈａｒｒｉｓ，Ｊ．Ｌ．ら（
２０００）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９７：７７５４］または［
Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｖ．ら（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２：
４３４４］に例証されるように基質混合物の切断に従ってマップされる。代替は、ファー
ジディスプレイによる所望のプロテアーゼ切断配列の同定である［Ｍａｔｔｈｅｗｓ，Ｄ
．ら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６０：１１１３］。構築物は変異体配列を用いて作
られ、ＸＴＥＮポリペプチド検出のための標準アッセイを使用してＸＴＥＮ放出について
アッセイされる。
（実施例５８）
ＦＩＸ－ＸＴＥＮのトロンビン活性化
ＦＸＩに特異的なＸＴＥＮ放出部位をＦＩＸ－ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４に挿入して、構築
物ＡＣ２９９をもたらした。トロンビンに特異的なＸＴＥＮ放出部位をＦＩＸ－ＸＴＥＮ
＿ＡＥ８６４に挿入して、構築物ＡＣ３００をもたらした。ＸＴＥＮ放出部位が欠損した
構築物ＡＣ２９６を対照として使用した。ＦｕＧｅｎｅ６形質移入試薬（Ｒｏｃｈｅ）を
使用して、発現プラスミドをＢＨＫ－２１細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎによる１０ｍｌの
ＯｐｔｉＭＥＭ媒体の１．２×１０ｅ６細胞）に形質移入した。４日後に媒体を収集して
、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ遠心分離フィルタ（Ｕｌｔｒａｃｅｌ＿３０Ｋ，Ｍｉｌｌｉ
ｐｏｒｅ）濃縮器を使用して４０倍に濃縮した。６７μｌの濃縮媒体を１０×トロンビン
バッファーで希釈して、２５μｌの固定トロンビン（Ｔｈｒｏｍｂｉｎ ＣｌｅａｎＣｌ
ｅａｖｅキット、ＲＥＣＯＭ－Ｔ，Ｓｉｇｍａ）を用いて室温にて８時間インキュベート
した。すべての試料におけるＦＩＸ濃度を、抗体（ｃａｔ＃ ＦＩＸ－ＥＩＡ，Ａｆｆｉ
ｎｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ ｉｎｃ．Ｃａｎａｄａ）を使用してＥＬＩＳＡによ
って決定した。凝固活性をａＰＰＴアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐ
ａｃｉｆｉｃ Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ，Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して決定し、１ｍＵのＦＩ
Ｘが４．５ｎｇ／ｍｌに等しいと仮定して活性をＦＩＸの濃度に変換した。結果を下の表
３１でまとめる。データは、トロンビンインキュベーションがＡＣ２９６およびＡＣ２９
９のＥＬＩＳＡシグナルおよび凝固活性に対して顕著な効果を有さなかったことを示し、
このことは両方の構築物がトロンビン部位を欠損しているという事実に一致する。これに
対して、トロンビン処理により、ＡＣ３００の凝固活性の２７倍の増加が生じた。トロン
ビン処理は、ＡＣ３００の凝固活性を遊離ＦＩＸの８０％まで回復した。これらのデータ
は、ＦＩＸのＣ末端へのＸＴＥＮの融合が凝固活性の５０分の１～１００分の１までの低
下をもたらすことを証明する。ＸＴＥＮのタンパク質分解放出は、これらのＣ末端ＦＩＸ
－ＸＴＥＮ構築物のプロドラッグ特性の概念を裏付けて、凝固活性の大半を回復した。
Figure 0007461438000081

（実施例５９）
エキソン構造物に基づくＦＩＸへのＸＴＥＮ挿入
タンパク質のエキソン構造物は、哺乳動物タンパク質へのＸＴＥＮの挿入を導くことが
できるドメイン境界に関する貴重な情報を提供する［Ｋｏｌｋｍａｎ，Ｊ．Ａ．ら（２０
０１）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１９：４２３］。図４０は、この手法がＦＩＸ－
ＸＴＥＮ組成物の生成に適用される方法の数種の例を、示されたエキソン境界の間のＸＴ
ＥＮ挿入のための例示的な位置と共に例証する。
（実施例６０）
設計製作したＦＩＸ配列に基づくＦＩＸ－ＸＴＥＮ
活性の改善のためにＦＩＸの多くの変異体（ｍｕｔａｎｔ）が設計製作されてきた（ｈ
ａｖｅ ｂｅｅｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）。特に有用なのは、プロテアーゼ活性の増加
を有する変異体である。しかしＧｌａおよび／またはＥＧＦドメインに改良を有する変異
体は、実験臨床評価の後に天然ＦＩＸ配列のあるいは該変異体を使用できるように、血友
病Ｂの処置にも有用であることができる。有用なＦＩＸ変異体の例を表７に表示する。
（実施例６１）
ＦＩＸ－ＸＴＥＮの産生
ＦＩＸ－ＸＴＥＮ融合タンパク質を多種多様の哺乳動物発現ベクターにおいて発現させ
ることができる。ｐＳｅｃＴａｇ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に基づく例示的なベクター
ｐＣＷ０５０９０を図４２に例証する。発現構築物は、ＣＭＶプロモータ、ＦＩＸのシグ
ナルペプチド、ＦＩＸのプロペプチド、ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４をコードする遺伝子に融合
した成熟ＦＩＸ遺伝子、それに続くポリアデニル化部位を含む発現カセットを含有する。
ベクターは、哺乳動物細胞における選択のためのゼオシン（ｚｅｏｓｉｎ）マーカー、大
腸菌のｐＵＣ複製起点、および大腸菌における選択のためのアンピシリンマーカーを含有
する。発現ベクターは発現のためにＣＨＯ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、またはＢＨＫ細胞に
形質移入することができる。発現はＥＬＩＳＡまたは凝固アッセイによって監視すること
ができる。ＦＩＸ－ＸＴＥＮ融合タンパク質はイオン交換、特にアニオン交換によって精
製することができる。本実験の目的のために、ＦＩＸ－ＸＴＥＮ融合タンパク質をＣＨＯ
細胞に形質移入した。
アニオン交換クロマトグラフィーによる初期プロセス捕捉
形質移入細胞の培養物からの細胞培養媒体を２０ｍＭトリスｐＨ６．８、５０ｍＭ Ｎ
ａＣｌで平衡化した８００ｍｌのＭａｃｒｏｃａｐ Ｑアニオン交換樹脂（ＧＥ Ｌｉｆ
ｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に直接適用した。カラムを５０ｍＭ、１００ｍＭ、および１５０
ｍＭ ＮａＣｌを含有するトリスｐＨ６．８バッファーによって続けて洗浄した。生成物
を２０ｍＭトリスｐＨ６．８、２５０ｍＭ ＮａＣｌによって溶出させた。
オクチルセファロースＦＦを使用する疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）
２５０ｍＬオクチルセファロースＦＦカラムを平衡化バッファー（２０ｍＭトリスｐＨ
６．８、１．０Ｍ Ｎａ２ＳＯ４）によって平衡化した。固体Ｎａ２ＳＯ４をＭａｃｒｏ
ｃａｐ Ｑ溶出物プールに添加して、１．０Ｍの最終濃度を達成した。結果として生じる
溶液を濾過して（０．２２ミクロン）、ＨＩＣカラムにロードした。カラムを次に、１０
ＣＶの平衡化バッファーで洗浄して、未結合のタンパク質および宿主細胞ＤＮＡを除去し
た。生成物を次に、２０ｍＭトリスｐＨ６．８、０．５Ｍ Ｎａ２ＳＯ４によって溶出さ
せた。
アニオン交換クロマトグラフィーによる生成物の仕上げ
プールしたＨＩＣ溶出物画分を次に、２０ｍＭトリスｐＨ７．５によって希釈して、５
．０ミリオーム未満の導電率を達成した。希薄生成物を、２０ｍＭトリスｐＨ７．５、５
０ｍＭ ＮａＣｌによって平衡化した３００ｍｌ ＱセファロースＦＦアニオン交換カラ
ムにロードした。
最終調合物および貯蔵
バッファー交換タンパク質を次に、Ｐｅｌｌｉｃｏｎ ＸＬ Ｂｉｏｍａｘ ３０００
０ ｍｗｃｏカートリッジを使用して限外濾過／ダイアフィルトレーション（ＵＦ／ＤＦ
）によって３０ｍｇ／ｍｌ超まで濃縮した。０．２２ミクロンのシリンジフィルタを使用
して、濃縮物を滅菌濾過した。最終溶液を等分割して－８０℃で貯蔵した。
（実施例６２）
ＦＩＸ－ＸＴＥＮのコドン最適化
コドン最適化を適用してＦＩＸ－ＸＴＥＮの発現を増加させることができる。コドン最
適化は、ヒト遺伝子のコドン選択性（ｃｏｄｏｎ ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）、ＲＮＡ構造
予測ならびに内部反復の予測を考慮に入れるコンピュータアルゴリズムを使用して行うこ
とができる。
（実施例６３）
ＦＩＸ－ＸＴＥＮのデポー調合物
ＸＴＥＮは、注射部位でデポーを形成する調合物のための特定の特性によって選定する
ことができる。これは注射部位からのＦＩＸ－ＸＴＥＮの低速放出をもたらし、投薬間隔
の間の時間を増加させる。デポー調合物はＦＩＸ－ＸＴＥＮを、ＦＩＸ－ＸＴＥＮと相互
作用して複合体または凝集体の形成をもたらす賦形剤と共に調合することによって容易に
することができる。有用な賦形剤の例は亜鉛、プロタミン、ＰＥＧ、ポリカチオン、ポリ
マー、ポリアルギニン、ポリリジンである。デポーは、ＦＩＸ－ＸＴＥＮを粒子、たとえ
ばアルギン酸塩、キチン、ポリ乳酸、ＰＬＧＡ、ヒアルロン酸、ヒドロキシアパタイトま
たは当業者に公知の他のポリマーにロードすることによっても形成することができる。
（実施例６４）
安定性の増加を有するＦＩＸ－ＸＴＥＮ
遊離ＦＩＸは凝集しやすく、凝集はタンパク質の調合を複雑にする。この特徴は、ｓｃ
注射に必要な少量注射体積を可能にする高濃度調合物の開発も妨げる。融合パートナーの
凝集を低下させるＸＴＥＮの特性のために、１）ＦＩＸの凝集を防止する；および２）皮
下または筋肉内投与を可能にする、ＦＩＸ－ＸＴＥＮの組成物を生成することができる。
（実施例６５）
ＦＶＩＩ－ＸＴＥＮ＿ＡＧ８６４
第ＶＩＩ因子（「ＦＶＩＩ」）をコードする遺伝子をインフレームでＸＴＥＮ＿ＡＥ８
６４に融合して、発現ベクターｐＣＷ０５９０に挿入した．ＣＨＯ－Ｋ１細胞に発現ベク
ターを形質移入して、ゼオシンを使用して安定なプールを選択し、発現したタンパク質を
回収した。発現した第ＶＩＩ因子－ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４のアミノ酸配列を表４３に挙げ
る。１５９ｎｇ／ｍｌのＦＶＩＩ等価物の発現レベルをＥＬＩＳＡによって検出して、２
１４ｎｇ／ｍｌのＦＶＩＩ等価物はＰＰＴ凝固アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉ
ｆｉｃ Ｐａｃｉｆｉｃ Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ，Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して検出した。
このことは、ＢＰＸＴＥＮを生成するＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４のＦＶＩＩへの融合がＦＶＩ
Ｉの凝固活性を保持する融合タンパク質を生じることを証明する。
（実施例６６）
ＦＶＩＩａ－ＸＴＥＮの製造
ＦＩＸ－ＸＴＥＮについて実施例６１で記載されるのと本質的に同様に、ＦＶＩＩａ－
ＸＴＥＮを製造することができる。ＦＶＩＩ－ＸＴＥＮをＦＶＩＩａ－ＸＴＥＮに変換す
るために、活性化ステップが追加される。あるいは、ＦＶＩＩａの両方のタンパク質鎖が
別々に発現され、活性化ＦＶＩＩａ－ＸＴＥＮに直接構築されるように、バイシストロニ
ックベクターを使用することができる。
（実施例６７）
第ＶＩＩ因子－ＦＶＩＩ－ＸＴＥＮ融合ポリペプチドの活性の評価
標準曲線は、正常対照血漿（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ １００５９５）
をＦＶＩＩ欠損血漿（１０００７０）によって１０倍に希釈して、次に第ＶＩＩ因子欠損
血漿によって４、５倍の連続希釈を再度行うことによって調製した。これにより活性の１
００、２０、４、０．８および０．１６ｍＵｎｉｔｓ／ｍｌに点（ｐｏｉｎｔｓ）を有す
る標準曲線が生成され、１ユニット（ｕｎｉｔ）の活性は、１ｍｌの正常ヒト血漿におけ
るＦＶＩＩ活性の量として定義される。ゼロ血漿（ｎｕｌｌ ｐｌａｓｍａ）での活性の
バックグラウンドレベルを決定するために、ＦＶＩＩ欠損血漿も含めた。試料は、ＦＶＩ
Ｉ－ＸＴＥＮコード配列を含有するベクターを一過性に形質移入されたＨＥＫ２９３細胞
によって、該細胞の成育により馴化媒体（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｍｅｄｉｕｍ）中に
分泌されたＦＶＩＩ－ＸＴＥＮを、ＦＶＩＩ欠損血漿に対して１：１０の体積比で添加す
ることによって調製した。馴化媒体の可能な干渉を補正するために、空のベクターによる
形質移入ＨＥＫ２９３細胞からの馴化媒体を標準曲線試料に対して１：１０の体積比で添
加した。以下のようにプロトロンビン時間アッセイを使用して、試料を試験した。試料を
ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｖｉｃｅｓプレートリーダ分光光度計で３７℃にて３分間イン
キュベートして、この時点で試料１体積当りトロンボプラスチン（Ｄａｄｅ Ｉｎｎｏｖ
ｉｎ，Ｂ４２１２－５０）２体積の添加により、凝固反応を開始させた。濁度を４０５ｎ
ｍにて５分間監視して、反応プロフィールを生成した。ＰＴ時間、すなわち凝固活性の開
始までの時間をＯＤ４０５ｎｍがベースラインを超えて０．０６増加した第１の時間とし
て定義した。ＰＴ時間に線形に関連する活性の対数によって、対数－線形標準曲線を生成
した。これからプレートウェル内の試料の活性を決定して、次にＦＶＩＩ欠損血漿への希
釈度に相当する１１を掛けることによって、試料の活性を決定した。２回の測定に基づい
て、ＦＶＩＩ－ＸＴＥＮ融合物の活性は２０３ｍＵｎｉｔｓ／ｍｌであった。反応プロフ
ィールを図９に表示し、ここではＦＶＩＩ欠損血漿が太破線で示され、標準からの３つの
試料が破線で示され、ＦＶＩＩ－ＸＴＥＮ試料が太線で示されている。
（実施例６８）
第ＶＩＩ因子－ＸＴＥＮ融合タンパク質精製
ＦＶＩＩ－ＸＴＥＮ融合タンパク質を多種多様の哺乳動物発現ベクターにおいて発現さ
せることができる。ｐＳｅｃＴａｇ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に基づくベクターｐＣＷ
０５０９０を図４６に例証する。発現構築物は、ＣＭＶプロモータ、ＦＶＩＩのシグナル
ペプチド、ＦＶＩＩのプロペプチド、ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４をコードする遺伝子に融合し
た成熟ＦＶＩＩ遺伝子、それに続くポリアデニル化部位を含む発現カセットを含有する。
ベクターは、哺乳動物細胞における選択のためのゼオシン（ｚｅｏｓｉｎ）マーカー、大
腸菌のｐＵＣ複製起点、および大腸菌における選択のためのアンピシリンマーカーを含有
する。発現ベクターは発現のためにＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、また
はＢＨＫ細胞に形質移入することができる。発現はＥＬＩＳＡまたは凝固アッセイによっ
て監視することができる。ＦＶＩＩ－ＸＴＥＮ融合タンパク質はイオン交換、特にアニオ
ン交換によって精製することができる。
アニオン交換クロマトグラフィーによる初期プロセス捕捉
２０ｍＭトリスｐＨ６．８、５０ｍＭ ＮａＣｌで平衡化した８００ｍｌのＭａｃｒｏ
ｃａｐ Ｑアニオン交換樹脂（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に、細胞培養媒体を
直接適用した。カラムを５０ｍＭ、１００ｍＭ、および１５０ｍＭ ＮａＣｌを含有する
トリスｐＨ６．８バッファーによって続けて洗浄した。生成物を２０ｍＭトリスｐＨ６．
８、２５０ｍＭ ＮａＣｌによって溶出させ、実施例６７の方法を使用して検証した。
（実施例６９）
ＦＩＸ活性決定のためのａＰＴＴアッセイ
第ＩＸ因子は、内因性凝固経路または接触活性化凝固経路にある。活性化部分トロンボ
プラスチン時間アッセイ（ａＰＴＴ）を使用してＦＩＸ－ＸＴＥＮおよびタンパク質分解
副生成物の活性を評価するために、この凝固経路の活性を使用する。ＦＩＸ活性を以下の
ように具体的に測定し、標準曲線は、正常対照血漿（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｈｅｍｏｓｔａｓ
ｉｓ ｃａｔ＃ １００５９５）をＦＩＸ欠損血漿（ｃａｔ＃ １００９００）によって
２倍に希釈して、次に第ＩＸ因子欠損血漿によって６、４倍の連続希釈を再度行うことに
よって作成した。これにより活性の５００、１３０、３１、７．８、２．０、０．５およ
び０．１ｍＵｎｉｔｓ／ｍｌに点を有する標準曲線が生成され、１ユニットの活性は、１
ｍｌの正常ヒト血漿におけるＦＩＸ活性の量として定義される。ゼロ血漿での活性のバッ
クグラウンドレベルを決定するために、ＦＩＸ欠損血漿も含めた。試料は、ＦＶＩＩ－Ｘ
ＴＥＮコード配列を含有するベクターを一過性に形質移入されたＨＥＫ２９３細胞によっ
て、該細胞の成育により馴化媒体（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｍｅｄｉｕｍ）中に分泌さ
れたＦＶＩＩ－ＸＴＥＮを、ＦＶＩＩ欠損血漿に対して１：１０の体積比で添加すること
によって調製した。馴化媒体の可能な干渉を補正するために、空のベクターによる形質移
入ＣＨＯ細胞からの馴化媒体を標準曲線試料に１：１０の体積比で添加した。以下のよう
にａＰＴＴアッセイを使用して、試料を試験した。試料をｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｖｉ
ｃｅｓプレートリーダ分光光度計で３７℃にて２分間インキュベートして、この時点で等
しい体積のａＰＴＴ試薬（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ ｃａｔ＃ １００４
０２）を添加して、追加の３分間の３７℃でのインキュベーションを行った。インキュベ
ーション後、１体積の塩化カルシウム（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ ｃａｔ
＃ １００３０４）を添加することによって、アッセイを活性化した。濁度を４５０ｎｍ
にて５分間監視して、反応プロフィールを生成した。ａＰＰＴ時間、すなわち凝固活性の
開始までの時間をＯＤ４５０ｎｍがベースラインを超えて０．０６増加した第１の時間と
して定義した。ａＰＰＴ時間に線形に関連する活性の対数によって、対数－線形標準曲線
を生成した。これからプレートウェル内の試料の活性を決定して、次にＦＩＸ欠損血漿へ
の希釈度に相当する１１を掛けることによって、試料の活性を決定した。
（実施例７０）
ＦＩＸ濃度決定のためのＥＬＩＳＡアッセイ
各種のＦＩＸ－ＸＴＥＮ組成物およびタンパク質分解副生成物の第ＩＸ因子濃度を、検
出を簡単にするために検出抗体がＨＲＰにコンジュゲートされた抗体の特異的適合対を用
いる、ＥＬＩＳＡアッセイを使用して決定した（Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａ
ｌｓ ｃａｔ＃ ＦＩＸ－ＥＩＡ）。捕捉抗体を高結合９６ウェルアッセイプレート（Ｃ
ｏｒｎｉｎｇ ３６９０）に、４℃にて一晩コーティングした。プレートをＰＢＳ中の３
％ＢＳＡによって室温にて１時間ブロッキングした。プレートをＰＢＳＴでプレート洗浄
器によって６回洗浄した。ＰＢＳＴで希釈した試料または標準を次に、適切なウェルにお
いて室温にて２時間結合させた。標準曲線は２５ｎｇ／ｍｌ～＜１ｐｇ／ｍｌに及び、既
知の濃度の市販ＦＩＸ（Ａｂｃａｍ Ｃａｔ＃ ａｂ６２５４４）をＰＢＳＴで連続希釈
して調製した。プレートをＰＢＳＴでプレート洗浄器によって再度、６回洗浄した。ＦＩ
Ｘを次に、３７℃にて１時間結合された検出抗体を使用して検出した。プレートをＰＢＳ
Ｔでプレート洗浄器によって再度、６回洗浄して、水によってさらに１回洗浄した。シグ
ナル次に、ＴＭＢ基質によって展開させて、ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｖｉｃｅｓプレー
トリーダ分光光度計で４０５ｎｍにて読み取ることにより定量した。次に標準に対して４
パラメータフィットを行って、試料の濃度を標準曲線との比較によって決定した。
（実施例７１）
ＢＰＸＴＥＮを評価するためのヒト臨床試験設計
臨床試験は、単一の生物製剤に対するＢＰＸＴＥＮ組成物の有効性および利点をヒトに
おいて検証できるように設計することができる。たとえば上の実施例に記載されるように
、グルカゴンおよびエクセナチドの両方を含むＢＰＸＴＥＮ融合構築物は、組成物の有効
性をキャラクタリゼーションする臨床試験で使用することができる。該臨床試験は、グル
カゴンおよびエクセナチドの投与によって改善、緩和、または抑制される１つ以上の代謝
性疾患、障害、または状態に行うことができる。成人患者におけるこのような試験は３つ
の相を含む。成人患者における第１の第Ｉ相安全性および薬物動態試験は、ヒト（正常被
験体または代謝性疾患もしくは症状を有する患者のどちらか）における最大許容投与量な
らびに薬物動態および薬力学を決定するために、ならびに将来の試験で追跡される潜在毒
性および有害事象を定義するために行われる。該試験は、単一漸増用量の、グルカゴンお
よびエクセナチドに連結されたＸＴＥＮの融合タンパク質の組成物が投与される該試験が
行われ、生化学、ＰＫ、および臨床パラメータが測定される。これにより最大許容投与量
の決定が可能となり、それぞれの構成要素の治療ウインドウを構成する投与量および循環
薬物の閾値および最大濃度が確立される。その後、臨床試験は疾患、障害または状態を有
する患者において行われる。
糖尿病における臨床試験
糖尿病、インスリン抵抗性および肥満症状に対して適切な血清グルコースの薬力学的パ
ラメータならびに他の生理学的パラメータ、ＰＫパラメータ、安全性パラメータおよび臨
床パラメータ（下に挙げるような）がグルカゴンおよびエクセナチドに連結されたＸＴＥ
Ｎを含む融合タンパク質の投薬の関数として測定される第ＩＩ相投薬試験は、糖尿病患者
に行われ、有害事象に関連する安全性データを収集することに加えて、第ＩＩＩ相試験に
適切な用量に関する用量範囲情報を産する。ＰＫパラメータは生理学的、臨床および安全
性パラメータデータに相関して、ＢＰＸＴＥＮ組成物の各構成要素の治療ウインドウを確
立し、臨床医が、１つのグルコース調節ペプチドをそれぞれ含む２つの構成要素融合タン
パク質の適切な比を確立できるようにするか、または２つのグルコース調節ペプチドを含
むモノマーＢＰＸＴＥＮの単一用量を決定できるようにする。最後に、糖尿病患者がＢＰ
ＸＴＥＮ組成物、陽性対照、またはプラセボのいずれかを毎日、隔週、または毎週（また
はＢＰＸＴＥＮ組成物の薬物動態および薬力学的特性を考慮して、適切と考えられる他の
投薬スケジュールで）延長された期間にわたって投与される、第ＩＩＩ相有効性試験が行
われる。有効性の１次結果指標はＨｂＡ１ｃ濃度を含むことができるが、２次結果指標は
、試験の間のインスリン必要条件、シミュレートされたＣペプチドおよびインスリン濃度
、空腹時血漿グルコース（ＦＰＧ）、血清サイトカインレベル、ＣＲＰレベル、ならびに
インスリンおよびグルコース測定値を用いたＯＧＴＴから誘導されたインスリン分泌およ
びインスリン感受性指数、ならびに体重、食物消費、およびプラセボまたは陽性対照群に
対して追跡される他の許容される糖尿病マーカーを含むことができる。有効性結果は標準
統計方法を使用して決定される。毒性および有害事象マーカーも本試験で追跡されて、記
載した方式で使用されたときに化合物が安全であることを検証する。
関節炎における臨床試験
ヒト患者の第ＩＩ相臨床試験は、ＩＬ－１ｒａおよび／もしくは抗ＩＬ－２、抗ＣＤ３
または好適な抗炎症タンパク質に連結されたＸＴＥＮを含むＢＰＸＴＥＮを投与された関
節炎患者において行われ、関節腫脹、関節圧痛、炎症、朝のこわばり、および疼痛を低下
させることを含む、関節リウマチに関連付けられた少なくとも１つの症状を和らげるのに
適切な用量、または赤血球沈降速度、ならびにＣ反応性タンパク質および／またはＩＬ２
受容体の血清レベルの低下を含む、関節リウマチに関連付けられた少なくとも１つの生物
学的代用マーカーを決定する。さらに有害事象に関連する安全性データが収集される。関
節炎患者がＢＰＸＴＥＮ、陽性対照、またはプラセボのいずれかを毎日、隔週、または毎
週（または化合物の薬物動態および薬力学的特性を考慮して、適切と考えられる他の投薬
スケジュールで）延長された期間にわたって投与される、第ＩＩＩ相有効性試験が行われ
る。患者は、関節腫脹、関節圧痛、炎症、朝のこわばり、患者および医師によって評価さ
れた疾患活性、ならびにたとえば標準化健康調査評価（Ｈｅａｌｔｈ Ｑｕｅｓｔｉｏｎ
ｎａｉｒｅ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ）（ＨＡＱ）によって評価される障害、および疼痛を
含む、いずれかの処置を受ける前の疾患活性のベースライン症状について評価される。追
加のベースライン評価は、赤血球沈降速度（ＥＳＲ）、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）お
よび可溶性ＩＬ－２受容体（ＩＬ－２ｒ）の血清レベルを含むことができる。処置に対す
る臨床応答は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ（
ＡＣＲ）によって確立された基準、例えばＡＣＲ２０基準；すなわち圧痛および腫張関節
カウントに２０パーセントの改善ならびに測定した５つの残存する症状、たとえば患者の
全般的疾患変化（ｇｌｏｂａｌ ｄｉｓｅａｓｅ ｃｈａｎｇｅ）および医師の全般的疾
患変化、疼痛、障害、および急性期反応物質のうち３つの２０パーセントの改善があるか
どうかを使用して評価できる（Ｆｅｌｓｏｎ，Ｄ．Ｔ．ら、１９９３ Ａｒｔｈｒｉｔｉ
ｓ ａｎｄ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ ３６：７２９－７４０；Ｆｅｌｓｏｎ，Ｄ．Ｔ．ら
、１９９５ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ ３８：１－９）。同
様に、被験体は、圧痛および腫張関節カウントそれぞれの５０または７０パーセント改善
ならびに測定した５つの残存する症状、たとえば患者の全般的疾患変化および医師の全般
的疾患変化、疼痛、障害、および急性反応物質、たとえばＣＲＰまたはＥＳＲそれぞれの
５０または７０パーセントの改善があるかどうかという、ＡＣＲ５０またはＡＣＲ７０基
準を満足する。さらにリウマチ因子、ＣＲＰ、ＥＳＲ、可溶性ＩＬ－２Ｒ、可溶性ＩＣＡ
Ｍ－Ｉ、可溶性Ｅ－セレクチン、およびＭＭＰ－３を含む、疾患活性の潜在的バイオマー
カーを測定することができる。有効性結果は標準統計方法を使用して決定される。毒性お
よび有害事象マーカーも本試験で追跡されて、記載した方式で使用されたときに化合物が
安全であることを検証する。
急性冠動脈症候群および急性心筋梗塞における臨床試験
急性冠動脈症候群（ＡＣＳ）および／または急性心筋梗塞（ＡＭＩ）と診断された患者
がたとえばＩＬ－１ｒａおよびＢＮＰを含むＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質、陽性対照、Ｂ
ＰＸＴＥＮ融合タンパク質と陽性対照物質との組み合わせ、またはプラセボのいずれかを
毎日、隔週、または毎週（または化合物の薬物動態および薬力学的特性を考慮して、適切
と考えられる他の投薬スケジュールで）延長された期間にわたって投与される、ＡＣＳお
よび／またはＡＭＩにおける第ＩＩＩ相試験が行われる。該試験は、最近の急性冠動脈症
候群を有する被験体における心血管による死亡、非致死性心筋梗塞、または虚血性発作を
防止する他の処置レジメンよりも優れているか否かを決定するために行われる。患者は、
不安定狭心症、左腕および顎左側に放散する胸部絞扼感として経験される胸部痛、人為的
発汗（発汗）、悪心および嘔吐、息切れの徴候または症状、ならびに非Ｑ波心筋梗塞およ
びＱ波心筋梗塞の心電図（ＥＣＧ）による証拠を含む、いずれかの処置を受ける前の疾患
活性のベースライン症状について評価される。追加のベースライン評価は、虚血修飾アル
ブミン（ＩＭＡ）、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）、グリコーゲンホスホリラーゼア
イソエンザイムＢＢ－（ＧＰＢＢ）、トロポニン、ナトリウム排泄増加ペプチド（Ｂ型ナ
トリウム排泄増加ペプチド（ＢＮＰ）およびＮ末端Ｐｒｏ ＢＮＰの両方）、および単球
化学誘引活性タンパク質（ＭＣＰ）－１を含む、バイオマーカーの測定を含むことができ
る。処置に対する臨床応答は心血管による死亡、心筋梗塞、または虚血性発作の最初の出
現までの時間を１次結果指標として使用して評価することができ、最初の不安定狭心症、
出血性発作、または致死性出血の出現またはそれまでの時間は２次結果指標として作用す
ることができる。有効性結果は標準統計方法を使用して決定される。毒性および有害事象
マーカーも本試験で追跡されて、記載した方式で使用されたときに化合物が安全であるこ
とを検証する。
（実施例７２）
予測アルゴリズムによる２次構造についての配列の分析
アミノ酸配列の２次構造は、特定のコンピュータプログラムまたはアルゴリズム、たと
えば周知のＣｈｏｕ－Ｆａｓｍａｎアルゴリズム（Ｃｈｏｕ，Ｐ．Ｙ．ら（１９７４）Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１３：２２２－４５）およびＧａｒｎｉｅｒ－Ｏｓｇｕｔｈｏ
ｒｐｅ－Ｒｏｂｓｏｎ、すなわち「ＧＯＲ」法（Ｇａｒｎｉｅｒ Ｊ，Ｇｉｂｒａｔ Ｊ
Ｆ，Ｒｏｂｓｏｎ Ｂ．（１９９６）．ＧＯＲ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｐｒｅｄｉｃｔ
ｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｆｒｏｍ ａｍｉ
ｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ ２６６：５４０
－５５３）によって評価することができる。所与の配列では、上記アルゴリズムは、２次
構造がいくつか存在するかまたは全く存在しないかを予測することができ、２次構造の存
在はたとえばアルファらせんもしくはベータシートを形成する配列の残基の総数および／
もしくはパーセンテージ、またはランダムコイル形成物をもたらすことが予測される配列
の残基のパーセンテージとして表される。
これらの配列の２次構造の程度を評価するＣｈｏｕ－ＦａｓｍａｎおよびＧＯＲ法のた
めの２つのアルゴリズムツールを使用して、ＸＴＥＮ「ファミリ」からの数種の代表的な
配列が評価されている。このＣｈｏｕ－Ｆａｓｍａｎツールは、Ｗｉｌｌｉａｍ Ｒ．Ｐ
ｅａｒｓｏｎおよびＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｖｉｒｇｉｎｉａによって、．ｆａｓ
ｔａ．ｂｉｏｃｈ．Ｖｉｒｇｉｎｉａ．ｅｄｕ／ｆａｓｔａ＿ｗｗｗ２／ｆａｓｔａ＿ｗ
ｗｗ．ｃｇｉ？ｒｍ＝ｍｉｓｃｌのワールド・ワイド・ウェブ上に位置するＵＲＬの「Ｂ
ｉｏｓｕｐｐｏｒｔ」インターネットサイトにて、２００９年６月１９日にそれが存在し
たときに提供された。ＧＯＲツールは、Ｐｏｌｅ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｑｕｅ Ｌｙｏｎ
ｎａｉｓによって、．ｎｐｓａ－ｐｂｉｌ．ｉｂｃｐ．ｆｒ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ｓｅｃｐ
ｒｅｄ＿ｇｏｒ４．ｐｌのワールド・ワイド・ウェブ上に位置するＵＲＬのＮｅｔｗｏｒ
ｋ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓインターネットサイトにて、
２００８年６月１９日にそれが存在したときに提供された。
分析の最初のステップとして、単一のＸＴＥＮ配列を２つのアルゴリズムによって分析
した。ＡＥ８６４組成物は、アミノ酸Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｅ、Ｐ、およびＡから成る４つの１２
アミノ酸配列モチーフの複数のコピーから生成された８６４アミノ酸残基を有するＸＴＥ
Ｎである。配列モチーフは、任意の１つの１２アミノ酸モチーフ内でいずれの２つの連続
アミノ酸の配列も２回を超えて反復されない、および全長ＸＴＥＮの３個の連続アミノ酸
が同一でないという点で、モチーフ内および配列全体内の反復性が制限されているという
事実を特徴とする。Ｎ末端からのＡＦ８６４配列の連続したより長い部分をＣｈｏｕ－Ｆ
ａｓｍａｎアルゴリズムおよびＧＯＲアルゴリズムによって分析した（後者は１７アミノ
酸の最低長を必要とする）。ＦＡＳＴＡ形式配列を予測ツールに入力して、分析を実行す
ることによって、配列を分析した。分析による結果を表３２に表示する。
その結果から、Ｃｈｏｕ－Ｆａｓｍａｎ計算により、ＡＥファミリの４個のモチーフ（
表１）がアルファらせんもベータシートも有さないことが示される。２８８残基までの配
列は同様に、アルファらせんもベータシートも有さないことが判明した。４３２残基配列
は、少量の２次構造を有し、２個のアミノ酸のみが全体のパーセンテージで０．５％のア
ルファらせんに寄与することが予測される。全長ＡＦ８６４ポリペプチドは、全体のパー
センテージで０．２％のアルファらせんに寄与する同じ２個のアミノ酸を有する。ランダ
ムコイル形成物の計算によって、長さが増加すると、ランダムコイル形成物のパーセンテ
ージが増加することが明らかになった。配列の最初の２４アミノ酸は９１％のランダムコ
イル形成物を有し、これは長さの増加と共に全長配列で９９．７７％の値まで増加した。
他のモチーフファミリからの５００以上の長さのアミノ酸の多数のＸＴＥＮ配列も分析
され、大多数が９５％を超えるランダムコイル形成物を有することが明らかにされた。例
外は、予測されたベータシート形成物をもたらす、３つの連続セリン残基の１つ以上の例
を有する配列であった。しかし、これらの配列でもおおよそ９９％のランダムコイル形成
物をなお有した。
これに対して、Ａ、Ｓ、およびＰアミノ酸に限定された８４残基のポリペプチド配列を
、高度の予測アルファらせんが予測されるＣｈｏｕ－Ｆａｓｍａｎアルゴリズムによって
評価した。複数反復「ＡＡ」および「ＡＡＡ」配列を有する配列は、６９％のアルファら
せん構造物の全体の予測パーセンテージを有した。ＧＯＲアルゴリズムは、本実施例で分
析された、アミノ酸Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｅ、Ｐから成る１２アミノ酸配列モチーフから成るいず
れの配列よりはるかに少ない、７８．５７％のランダムコイル形成物を予測した。
結論：分析は：１）連続アミノ酸に関して限定された反復性を有するＧ、Ｓ、Ｔ、Ｅ、
Ｐ、およびＡの複数の配列モチーフから生成されたＸＴＥＮは、非常に少ない量のアルフ
ァらせんおよびベータシートを有することが予測されること；２）ＸＴＥＮの長さの増加
は、アルファらせんまたはベータシート形成物の確率を認められるほどには増加させない
こと；および３）アミノ酸Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｅ、Ｐ、およびＡから成る非反復性１２マーの付
加によるＸＴＥＮ配列の長さの漸増によって、ランダムコイル形成物のパーセンテージの
増加をもたらすという結論を裏付けている。これに対して、より高度の内部反復性を有す
る、Ａ、ＳおよびＰに限定されたアミノ酸から生成されたポリペプチドは、Ｃｈｏｕ－Ｆ
ａｓｍａｎアルゴリズムによって決定されたように、高いパーセンテージのアルファらせ
ん、ならびにランダムコイル形成物を有することが予測される。これらの方法によって評
価された多数の配列に基づいて、長さが約４００アミノ酸残基を超える限定された反復性
（任意の１個のモチーフに２個以下の同一の連続アミノ酸として定義される）を有するＧ
、Ｓ、Ｔ、Ｅ、Ｐ、およびＡの配列モチーフから生成されたＸＴＥＮが非常に限定された
２次構造を有すると予想されることは概して事実である。３個の連続セリンを含有するモ
チーフを除いて、表１からの配列モチーフの任意の順序または組合せを使用して、２次構
造が実質的にないＸＴＥＮ配列をもたらす約４００残基を超える長さのＸＴＥＮポリペプ
チドを生成できると考えられる。このような配列は、本明細書で開示する本発明のＢＰＸ
ＴＥＮ実施形態に記載された特徴を有することが予想される。
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（実施例７３）
反復性についてのポリペプチド配列の分析
より短いサブ配列がポリペプチド全体内に出現する回数を定量することによって、ポリ
ペプチドアミノ酸配列を反復性について評価することができる。たとえば２００のアミノ
酸残基のポリペプチドは、１９２の重複９－アミノ酸サブ配列（すなわち９マー「フレー
ム」）を有するが、独自の９マーサブ配列の数は、配列内の反復の量に依存する。本分析
において、２００アミノ酸配列以内の独自の３マーサブ配列の絶対数で割ったポリマー部
分の最初の２００アミノ酸全体にわたる各３－アミノ酸フレームについての独自の３マー
サブ配列すべての出現を合計することによって、異なる配列を反復性について評価した。
得られたサブ配列スコアは、ポリペプチド内の反復度の反映である。
表３３に示した結果は、２または３のアミノ酸タイプから成る非構造化ポリペプチドが
高いサブ配列スコアを有するが、低度の内部反復性を有する６種類のアミノ酸Ｇ、Ｓ、Ｔ
、Ｅ、Ｐ、およびＡの１２アミノ酸モチーフから成る非構造化ポリペプチドは１０未満の
、いくつかの場合においては５未満のサブ配列スコアを有することを示している。たとえ
ばＬ２８８配列は、２つのアミノ酸タイプを有し、短い高反復性配列を有し、５０．０の
サブ配列スコアをもたらす。ポリペプチドＪ２８８は３つのアミノ酸タイプを有するが、
また短い反復性配列を有し、３３．３のサブ配列スコアをもたらす。Ｙ５７６も３つのア
ミノ酸タイプを有するが、内部反復から作られておらず、最初の２００アミノ酸にわたっ
て１５．７のサブ配列スコアに反映されている。Ｗ５７６は４タイプのアミノ酸から成る
が、より高度の内部反復性、たとえば「ＧＧＳＧ」（配列番号７８２）を有し、２３．４
のサブ配列スコアをもたらす。ＡＤ５７６は、それぞれ４タイプのアミノ酸から成る、４
タイプの１２アミノ酸モチーフからなる。個々のモチーフの低度の内部反復性のために、
最初の２００アミノ酸にわたるサブ配列全体のスコアは１３．６である。これに対して、
４つのモチーフから成るＸＴＥＮは６タイプのアミノ酸を含有し、低度の内部反復性を有
するそれぞれはより低いサブ配列スコア；すなわちＡＥ８６４（６．１）、ＡＦ８６４（
７．５）、およびＡＭ８７５（４．５）を有する。
結論：結果は、本質的に非反復性である４～６のアミノ酸タイプからそれぞれ成る１２
アミノ酸サブ配列モチーフの、より長いＸＴＥＮポリペプチドへの組み合わせによって、
非反復性である全体配列がもたらされることを示す。これは、各サブ配列モチーフが配列
全体にわたって複数回使用され得るという事実にもかかわらずである。これに対して、よ
り少ない数のアミノ酸タイプから生成されたポリマーによってより高いサブ配列スコアが
もたらされたが、実際の配列を調整して反復度を低下させて、より低いサブ配列スコアを
もたらすことができる。
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（実施例７４）
ＴＥＰＩＴＯＰＥスコアの計算
９マーペプチド配列のＴＥＰＩＴＯＰＥスコアは、Ｓｔｕｒｎｉｏｌｏ［Ｓｔｕｒｎｉ
ｏｌｏ，Ｔ．ら（１９９９）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１７：５５５］によって記
載されたポケットポテンシャルを加えることによって計算できる。本実施例において、個
々のＨＬＡ対立遺伝子について個々のＴｅｐｉｔｏｐｅスコアを計算した。表３４は、例
として、白人集団にて高頻度で出現するＨＬＡ＊０１０１Ｂのポケットポテンシャルを示
す。配列Ｐ１－Ｐ２－Ｐ３－Ｐ４－Ｐ５－Ｐ６－Ｐ７－Ｐ８－Ｐ９のペプチドのＴＥＰＩ
ＴＯＰＥスコアを計算するために、表３４の対応する個々のポケットポテンシャルを加え
た。配列ＦＤＫＬＰＲＴＳＧ（配列番号８００）を有する９マーペプチドのＨＬＡ＊０１
０１Ｂスコアは、０、－１．３、０、０．９、０、－１．８、０．０９、０、０の和であ
る。
長いペプチドのＴＥＰＩＴＯＰＥスコアを評価するために、配列の９マーサブ配列すべ
てに対してプロセスを反復することができる。本プロセスは、他のＨＬＡ対立遺伝子によ
ってコードされたタンパク質に対して反復することができる。表３５～３８は、白人集団
にて高頻度で出現するＨＬＡ対立遺伝子のタンパク質生成物のポケットポテンシャルを与
える。
本方法によって計算されたＴＥＰＩＴＯＰＥスコアは、おおよそ－１０～＋１０に及ぶ
。しかし、Ｐ１位置に疎水性アミノ酸（ＦＫＬＭＶＷＹ（配列番号８０１））を欠いた９
マーペプチドは、－１００９～－９８９の範囲の計算されたＴＥＰＩＴＯＰＥスコアを有
する。この値は、生物学的に意味がなく、疎水性アミノ酸がＨＬＡ結合のアンカー残基と
して働き、Ｐ１に疎水性残基を欠いたペプチドがＨＬＡに対する非バインダーと見なされ
るという事実を反映している。大半のＸＴＥＮ配列は疎水性残基を欠いているので、９マ
ーサブ配列の組合せはすべて、－１００９～－９８９の範囲にＴＥＰＩＴＯＰＥを有する
。本方法は、ＸＴＥＮポリペプチドが予測されたＴ細胞エピトープをほとんどまたは全く
有し得ないことを確認する。
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Claims (4)

  1. 配列番号１９０、配列番号１９１、配列番号１９２、または配列番号１９３の配列モチーフを含む、生物活性タンパク質に連結された延長組換えポリペプチドであって、
    該延長組換えポリペプチドは、配列番号２０５、２０８、２１１、４６１～４６５、４６７～４７７、４７９、４８０～４８９、４９１～５０４、６９２、６９９、７７２、または７９３と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、
    該延長組換えポリペプチドに連結された該生物活性タンパク質の最終半減期は、該延長組換えポリペプチドに連結されていない該生物活性タンパク質の最終半減期と比較してより長い、延長組換えポリペプチド。
  2. グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）およびプロリン（Ｐ）残基は、前記延長組換えポリペプチドの全アミノ酸配列の８０％超を構成する、請求項１に記載の延長組換えポリペプチド。
  3. （ｉ）アミノ酸がセリン残基でない限り、前記延長組換えポリペプチドの配列が同一である３個の連続アミノ酸を含まないように、または（ｉｉ）前記延長組換えポリペプチドの配列の少なくとも８０％が非重複配列モチーフを含み、該配列モチーフの各々が１２アミノ酸残基を含み、任意の２つの連続アミノ酸残基が該配列モチーフの各々において３回以上出現しないように、前記延長組換えポリペプチドの全アミノ酸配列は、実質的に非反復である、請求項２に記載の延長組換えポリペプチド。
  4. （ａ）アスパラギン残基およびグルタミン残基の和が前記延長組換えポリペプチドの全アミノ酸配列の１０％未満である；（ｂ）メチオニン残基およびトリプトファン残基の和が前記延長組換えポリペプチドの全アミノ酸配列の２％未満である；（ｃ）いずれの１種類のアミノ酸も前記延長組換えポリペプチドの配列の３０％超を構成しない；および／または（ｄ）前記延長組換えポリペプチドは、アミノ酸がセリンでない限り、３個の連続アミノ酸が同一ではない配列を含み、この場合、３個以下の連続アミノ酸がセリン残基である、請求項３に記載の延長組換えポリペプチド。
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