BE1008491A3 - Sequence polypeptidique antigenique du facteur viii, fragments et/ou epitopes de celle-ci. - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne une séquence polypeptidique antigénique du facteur VIII, comprise entre l'Acide Glutamique 1649 et l'Acide Aspartique 2019, de préférence comprise entre l'Arginine 1652 et l'Arginine 1917 de la séquence polypeptidique du facteur VIII, des fragments et des épitopes de celle-ci, les inhibiteurs dirigés contre cette séquence, ses fragments et/ou ses épitopes, ainsi que les inhibiteurs dirigés contre lesdits inhibiteurs. La présente invention concerne également une composition pharmaceutique ainsi qu'un dispositif de diagnostic comprenant les molécules susmentionnées.

Description

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   SEQUENCE POLYPEPTIDIQUE   ANTIGENIQUE   DU FACTEUR VIII,
FRAGMENTS ET/OU EPITOPES DE CELLE-CI. 



  Objet de l'invention. 



   La présente invention concerne une séquence polypeptidique antigénique du facteur VIII, des fragments et des épitopes de celle-ci, les inhibiteurs dirigés contre cette séquence, ses fragments et/ou ses épitopes, ainsi que les inhibiteurs dirigés contre lesdits inhibiteurs. 



   La présente invention concerne également une composition pharmaceutique ainsi qu'un dispositif de diagnostic comprenant les molécules sus-mentionnées. 



  Arrière-plan technologique à la base de l'invention. 



   L'hémophilie est le dysfonctionnement le plus fréquent de la coagulation sanguine. C'est une maladie récessive, liée au sexe transmise par les femmes et exprimée chez les hommes. Son incidence est estimée à 5 pour 100.000 dans les pays industrialisés et elle n'est pas restreinte géographiquement. 



   L'hémophilie A est caractérisée par un déficit fonctionnel du facteur VIII, et l'hémophilie B ou"maladie de Christmas"par une carence en facteur IX, tous deux composants de la coagulation sanguine. L'hémophilie A est cinq à six fois plus fréquente que l'hémophilie B. Elle est caractérisée par un très haut niveau de mutations hétérogènes qui toutes se situeraient dans le gène FVIII (Naylor et al., 1992). 

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  1. Symptômes
Chez le patient atteint d'hémophilie A, la sévérité de la maladie est généralement mise en parallèle avec l'absence ou la carence en facteur VIII. Celle-ci peut atteindre moins de 1% de la concentration sanguine normale en facteur VIII   (c'est-à-dire   0, 01U/ml) provoquant des hémarthroses fréquentes pouvant mener, en absence de toute thérapie de remplacement, à des deformations irréversibles avec des restrictions importantes du mouvement. Les premiers symptômes apparaissent rapidement dès l'âge de 8 à 12 mois. En plus d'une espérance de vie fortement réduite, les saignements spontanés dans les muscles et les articulations constituent un des autres problèmes communs aux hémophiles et contribuent à une intégration sociale difficile. 



   Cliniquement, l'hémophilie A et B sont identiques. 



  Chez les hémophiles A atteints modérément (5 à 40% FVIII), les saignements apparaissent généralement après trauma. 



  2. Traitements de l'hémophilie A
Classiquement le facteur VIII (= FVIII) ou facteur anti-hémophilique est présent dans le plasma humain en faible concentration (0,1   ug/ml   ou lU/ml). Transfuser du plasma complet s'est révélé insuffisant pour combattre les épisodes de saignements, et peut mener à une surcharge de protéines dans le système circulatoire. En 1964, Pool et al. obtiennent par précipitation à froid, le cryoprécipité, une préparation riche en facteur VIII, qu'ils lyophilisent. L'espérance de vie passe de 11 à 57 ans. 



   Plus récemment, ont été mises en quantités suffisantes, à la disposition des hémophiles, des préparations de facteur VIII purifiées à partir de grands pools de plasma par chromatographie échangeuse d'ions, ou très récemment par immunoaffinité. Grâce à un accès plus facile au FVIII et une éducation adéquate des patients, le traitement par voie intraveineuse peut être mené à domicile et être donné à titre 

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 prophylactique pour retarder le plus possible le stade subclinique. 



   L'espérance de vie est passée à 63-69 ans selon la gravité de la maladie (Rosendaal et al., 1991). Différentes préparations de FVIII obtenues par DNA ingénierie, sont actuellement en développement ou en étude clinique. Ces FVIII sont soit des molécules entières, soit délétées (Bihoreau, 1992). 



  Les doses de FVIII à infuser de manière continue peuvent être importantes : par exemple, dans les cas d'hémophilie sévère, la dose peut être plus de 3000 unités/kg/an (Gomperts et al., 1992). 



  3. Transfusion et infection. 



   La plus sérieuse complication de l'utilisation de concentrés de FVIII produits à partir de pools de plasmas provenant parfois de plus de 20.000 donations est la transmission d'infections virales présentes dans le plasma tels que les virus de l'hépatite B, C ou l'HIV. La contamination par le virus du Sida des hémophiles (de 6 à 80% selon le pays), a démontré de manière dramatique la nécessité absolue de soumettre à des techniques d'inactivation virale tous les produits thérapeutiques issus du plasma humain. Actuellement, les produits plasmatiques doivent être inactivés viralement par un traitement soit chimique, soit physique. L'efficacité du traitement d'élimination et/ou d'inactivation virale doit être validée par chaque Producteur au moyen de virus modèles (Recommandations de l'Union Européenne). 



  4. Facteur VIII et coagulation sanguine. 



   Tous les composants protéiniques et cellulaires impliqués dans la coagulation sanguine, existent sous forme inactive dans des conditions physiologiques normales. La réponse physiologique à un dommage vasculaire mène à la formation locale d'un caillot insoluble de fibrine et de plaquettes. La coagulation sanguine nécessite 13 à 14 protéines 

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 dont une (ou plusieurs) composante (s) des surfaces membranaires, des ions calcium et des plaquettes. Cette cascade de réactions (figure 1) est amplifiée via une séquence de zymogen devenant protéases et permet la conversion par la thrombine   (Fila)   du fibrinogène (FI) en fibrine (FIa). La plupart des réactions sont catalysées par des complexes enzymatiques composés d'une serine protéase et d'un cofacteur protéinique enzymatiquement non actif.

   Ces complexes catalysent les conversions zymogen-protéases via une protéolyse limitée à des taux de   104 à 105 fois   plus grands que les taux de réaction observée avec la sérine protéase seule. 



   Ces complexes enzymatiques sont stabilisés par des interactions protéines-protéines, protéines-lipides, protéines-ion calcium (Mann, 1988). La concentration de ces facteurs dans le sang est très variable : elle peut aller de 0,01 mg/ml pour un facteur initial comme le FX à 3 mg/ml pour le fibrinogène. 



  5. Fonction et structure du FVIII
Le FVIII est un cofacteur glycoprotéinique de la coagulation plasmatique et agit au niveau de l'activation du facteur X (FX) (figure 1). La caractérisation du FVIII et de son mécanisme d'action est rendue plus ardue par sa faible concentration dans le plasma, l'hétérogénéité de taille, et son extrême sensibilité à la dégradation enzymatique. Cette réaction comprend la protéolyse du FX en facteur X activé (FXa = facteur Stuart) et fait intervenir un complexe (complexe Tenase) comprenant l'enzyme (FIX activé ou FIXa), un cofacteur (le FVIII activé ou FVIIIa), des ions calcium et des phospholipides. Ce complexe peut se fixer soit sur une surface phospholipique, soit sur une surface plaquettaire. II y a environ 300 sites de fixation pour le FVIII par plaquette activée.

   Cette activation du FX est accélérée d'environ   104   à 105 fois par la présence du FVIII, préalablement activé par la thrombine (= facteur   IIa   ou FIIa), FXa ou FIXa. Le FXa, ainsi formé, hydrolyse la prothrombine (facteur II ou FII) en 

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 trombine en présence du   cotacteur     FVa     (30%   d'homologie structurelle avec FVIII). La thrombine va à son tour transformer le fibrinogène (Facteur I ou FI) en fibrine, et activer le Facteur XIII qui lui-même stabilise la fibrine. Les monomères de la fibrine vont former, en liaison avec le facteur XIII activé (FXIIIa), un réseau englobant les plaquettes qui arrête le saignement. 



   Le FVIII est une protéine si complexe que, bien que   la séquence du gène soit connue depuis 1984 (Wood et al. ), la   structure complète du FVIII plasmatique n'est pas encore établie (près de 50% de la protéine a seulement été séquencée) ainsi que la structure précise des carbohydrates. La séquence de DNA a été admise comme définissant la séquence primaire du FVIII (rare exception aux directives prescrites par la FDA pour les produits thérapeutiques issus de la biotechnologie). 



   Cependant, des différences subtiles entre le FVIII plasmatique et le FVIII recombinant ont été établies : glycosylation, demi-vie plasmatique après infusion,... 



  (Limentani et al., 1993). 



   Le FVIII est essentiellement synthétisé dans les hépatocytes. Il a été   cloné   dans des cellules de mammifères, d'insectes et de levures (Wood et al., 1984, Webb et al., 1993). Ces glycoprotéines produites par des processus biotechnologiques peuvent présenter des différences dans la structure et la composition des sucres par rapport à la protéine naturelle. Le cDNA du FVIII a aussi été exprimé dans des ovins transgéniques (Halter et al., 1993). 



   Le cDNA code pour un polypeptide de 2351 acides aminés y compris le peptide signal de 19 acides aminés clivé dans le réticulum endoplasmique. Des modifications post-traductionnelles ont lieu dans l'appareil de Golgi : glycosylation des sérines et des thréonines et addition d'ions sulfates aux résidus tyrosine. Après maturation, la protéine est ensuite sécrétée dans le plasma, sous forme de 2 chaînes 210 kDa (là 1648 résidus) et 80 kDa (de 1649 à 2332 résidus) unies par un ion divalent, et dont la plus légère est associée 

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 de manière non covalente au Facteur von Willebrand (vWf) par son extrémité N-terminale (1 molécule vWf par molécule de FVIII). Dans le plasma, ce complexe est stabilisé par des liens hydrophobes et hydrophiles en présence de 50 fois plus de vWf. 



  Ce dernier inhiberait la fixation du FVIII aux phospholipides. 



  Le fait que FVIII se lie aux plaquettes a été établi, toutefois la présence de récepteurs spécifiques exprimés à la surface des plaquettes n'a pas été clairement démontrée (Nesheim et al., 1993). Après sa fixation sur les phospholipides membranaires, il démasquerait des sites de liaison de haute affinité pour le FIXa (Bardelle et al., 1993). 



   Le FVIII est formé de trois domaines structuraux A, B et C (Kaufman RJ, 1992 ; Bihoreau et al., 1992) organisés en   A1   : A2 : B : A3 : C1 : C2 (figure 2). Les domaines A ont plus de 40% d'homologie et sont aussi homologues à la céruloplasmine. Il existe également 30% d'homologie entre le domaine A du facteur V et du FVIII. Le domaine C intervient deux fois et serait capable de lier des glycoconjugués et des phospholipides à charge nette négative (Kemball-Cook and Barrowcliffe, 1992 ; Fay,   PJ, 1993) ). II présente une homologie avec des lectines capables   de se lier aux phospholipides chargés négativement. C'est à ce niveau qu'a été localisé le site de fixation aux plaquettes (domaine C2) (Foster et al., 1990).

   Le domaine B qui représente plus de 40% de la masse du FVIII, n'a aucune activité spécifique connue mais pourrait jouer un rôle subtil dans la régulation de FVIII en Le protégeant par exemple de l'action de la thrombine. Il n'a pas d'homologie connue avec d'autres protéines. 



   Il possède 19 sites de glycolsylation sur les 25 identifiés pour le FVIII. La comparaison des séquences en acides aminés entre les FVIII humain et porcin, fait apparaître des différences majeures au niveau de cette région B. Néanmoins le FVIII porcin est utilisé efficacement pour traiter les hémophiles présentant des inhibiteurs (voir µ3. 3). Ces observations ont mené à la construction d'un gène FVIII délété dans la partie codante de cette région B et qui permet la 

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 production d'un FVIII recombinant délété destiné au traitement de l'hémophilie. 



   Par immunopurification, différentes formes de FVIII actif ont été isolées qui ont en commun une chaîne légère de 80 kDa et dont la chaîne lourde peut avoir un poids moléculaire entre 210 et 90 kDa. Ces formes seraient issues de la dégradation progressive de l'extrémité C-terminale de la chaîne lourde. La liaison des deux chaînes est non covalente et 
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 résulte via une liaison d'un ion métallique divalent (Me++) entre les résidus responsables des domaines Al et A3. Après formation du complexe activé (50-45 kDa) (chaîne lourde avec domaine A2 accessible) et 70 kDa (chaîne légère), une phase d'inactivation est observée suite probablement à un contact prolongé à la thrombine et une dissociation des fragments 50 kDa et 45 kDa. Le FVIIIa est aussi inactivé par la protéine C activée (APC) après protéolyse de la chaîne lourde.

   Cette inactivation est accélérée si le FVIIIa est fixé sur une surface phospholipique.   Cette"down-regulation"de   l'activité du FVIIIa dépendrait d'une phosphorylation par un enzyme plaquettaire (Kalafatis et al., 1990). 



   La plupart des épitopes reconnus par les divers monoclonaux murins isolés à ce jour ne semblent pas être localisés dans   les"sites fonctionnels"du FVIII.   Quelques épitopes reconnus par des anticorps ayant un effet sur l'activité du FVIII (inhibition du test chromogénique et/ou clotting) ont été identifiés. 



   Ces déterminants antigéniques sont constitués des fragments 351-365 (domaine   Al-chaîne   lourde) (Foster et al., 1988 a et b), 713-740 (domaine A2), 1670-1684 (domaine   A3-chaîne   légère) (NH2 terminal de la chaîne légère) ou encore 2303-2332 (domaine   C2-chaîne   légère) (FOster C, 1990). Les anticorps reconnaissent ces divers sites, interfèrent respectivement avec l'activation du FVIII, la liaison du vWf ou la liaison des phospholipides (voir schéma 2). 

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   D'autres anticorps, non inhibiteurs des test classiques d'activité in vitro, peuvent agir sur l'action du FVIII avec les autres constituants de la cascade de coagulation en se fixant sur des sites de la molécule fort distants des sites actifs. Ceux-ci, ainsi modifiés, peuvent interférer avec le reploiement naturel du FVIII, altérant certaines de ses propriétés ("modèle allostérique"). 



     - - -Ces expériences de "mapping" utilisent   des peptides synthétisés par des fragments de gènes du FVIII   clonés   dans E coli, et ne permettant qu'une idée approximative de la localisation des déterminants antigéniques reconnus par ces monoclonaux. En effet, la taille des fragments identifiés s'échelonne entre 30 et 100 acides aminés. 



   Actuellement, pour identifier sans équivoque les sites antigéniques d'une protéine, il faut la cristalliser et l'analyser aux RX. Malheureusement, on ne dispose d'aucune donnée pour le FVIII dont le haut poids moléculaire est un handicap majeur pour la cristallisation. 



   Les régions antigéniques coïncident avec le caractère hydrophile de ces régions. plus la séquence oligopeptidique sera exposée au milieu extérieur (située à la surface), plus cette partie sera susceptible d'être reconnue dans une réaction d'immunisation. Par contre, les parties hydrophobes, situées généralement à l'intérieur de la protéine, sont considérées comme peu antigéniques (Hopp et al., 1989). 



   Grâce au développement des méthodes de purification et la connaissance des cliniciens au cours de ces trente dernières années, le traitement de l'hémophilie A se révèle de plus en plus efficace et permet aux hémophiles de mener une vie normale. 



   Actuellement, une notion qui prédomine chez les patients hémophiles, les cliniciens et les fractionneurs, est la   disponibil-ité d'un FVIII purifié,   dépourvu de tout contaminant plasmatique pathogène et d'effets secondaires. 

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   Aussi, pour assurer la plus grande sécurité virale des diverses préparations de FVIII, qu'elles soient purifiées à partir du plasma par chromatographie échangeuse d'ions ou bien immunoaffinité, ou encore le produit recombinant, une étape d'inactivation virale drastique est introduite (pasteurisation, chauffage, inactivation chimique). Une proposition énoncée par la Commission CE demande même d'introduire deux étapes différentes d'inactivation virale dans le procédé de production du FVIII pour éliminer et inactiver aussi bien les virus enveloppés que non enveloppés'. 



   Cependant, il se crée un vrai débat sur la valeur de la pureté du FVIII   (Aronson,   1990). L'activité spécifique des préparations a été augmentée de 0,01 U/mg protéine à > 2000 U/mg protéine. Que ce soit après immunopurification à l'aide de monoclonaux murins, ou après obtention par recombinaison génétique dans des cellules de mammifères, le FVIII hautement purifié est extrêmement instable pour des raisons qui ne sont pas apparentes. Pour pouvoir le stabiliser, on ajoute des quantités importantes d'albumine humaine plasmatique au cours de la purification de sorte que l'activité spécifique finale est de l'ordre de 2-3 U/mg protéine. Il en va de même pour le rFVIII coexprimé avec du facteur von Willebrand, stabilisateur naturel, dans des cellules CHO.

   Ces données semblent suggérer une influence des étapes de purification sur la molécule de FVIII, pouvant interférer avec son reploiement naturel, introduire des changements conformationnels plus ou moins stables et dévoiler des épitopes potentiels nouveaux après infusion chez le patient. 



  6. Inhibiteurs du facteur FVIII. 



   Une des complications sérieuses présente chez 5 à 50% selon les auteurs (Ehrenforth et al., 1992, Ljung et al., 1992 ; Sultan et al., 1992 ; Lorenzo et al., 1992) des hémophiles qui reçoivent des infusions thérapeutiques multiples de FVIII, est l'apparition d'anticorps (inhibiteurs) qui inactivent le FVIII 

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 et rend inefficace toute injection ultérieure de FVIII. 



   L'apparition spontanée d'auto-anticorps avec une activité anti-FVIII pathologique est rare chez les non-hémophiles (prévalence :   10-5)   et est signalée chez les individus âgés, manifestant des troubles immunologiques ou en post-partum (Kessler, 1991, Hultin, 1991). Une étude multicentrique effectuée sur 3435 patients hémophiles, montre que tous les groupes d'âge sont concernés y compris les   patients. de   moins de 5 ans. La majorité (82%) présentent une réponse très élevée ( > 10 BU) (Sultan et al., 1992). Ces anti-FVIII seraient composés essentiellement de IgG, de type IgG4 mais, des IgG2 (Gilles et al., 1993b) IgA et des IgM ont été aussi décrits (Lottenburg et al., 1987). Ils réagissent faiblement avec des molécules FVIII hétérologues purifiées d'autres mammifères (Bennett, B et al., 1972).

   A l'heure actuelle, on ignore les causes qui induisent chez certains hémophiles l'apparition des inhibiteurs. S'il existe une association entre la sévérité de la délétion du gène et le développement d'une réponse immmunitaire ne reconnaissant plus le FVIII comme une protéine du soi, cette association n'est démontrée que chez une minorité de patients. Aucune susceptibilité spécifique de l'hôte, liée à des marqueurs génétiques, n'a pu être mise en évidence comme par exemple une association privilégiée avec certains déterminants du complexe MHC de classe II (Hoyer 1991), sans doute, parce que tous les épitopes du FVIII, reconnus par les anticorps spécifiques n'ont pas encore été déterminés.

   Il semble aussi que les différentes méthodes de préparation du FVIII pourraient influencer sa structure, ses propriétés physico-chimiques ou son micro-environnement naturel (Vermeylen, J and Peerlinck, 1991 ; Gomperts, et al., 1992 ; Peerlinck et al., 1993). Barrowcliffe et al. (1983) ont montré que les phospholipides protégeraient l'activité procoagulante de l'inactivation par des anticorps spécifiques humains. La présence d'anticorps naturels anti-FVIII chez 17% de donneurs sains (screening effectué sur 500 dons de plasma), sans manifestation pathologique, démontre 

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 l'importance de mieux connaître l'aspect structurel tridimensionnel que revêt un FVIII physiologique (Ciavarella and Schiavoni, 1992). 



   La transfusion étudiée sur des cultures mixtes de lymphocytes, chez des modèles animaux et lors d'essais cliniques, a montré une modification de l'immunomodulation chez le transfusé, induisant une allo-immunisation et aussi une down-regulation de certaines fonctions immunitaires. Elle se manifeste sous forme de cellules suppressives, d'anticorps anti-idiotypes ou une diminution des cellules NK. Tout se passe comme si on induisait un certain degré de tolérance. Ces effets peuvent être renversés par l'infusion de l'interleukine-2 (IL-2) (Triulzi et al., 1990). In vitro, un effet inhibiteur de la sécrétion de IL-2 ainsi que la prolifération de mononucléaires de sang périphérique, sont obtenus en présence de cryoprécipité ou des préparations peu purifiées de FVIII (0,5 à 10 U/mg protéines) (Madhok et al., 1991 ; Wadhwa, M et al., 1992).

   Ces effets ne sont pas observés en présence de rFVIIl ou de FVIII purifiés par immunoaffinité. Cette dernière préparation aurait un effet activateur sur les cellules T (Madhok et al., 1991). Toutefois, ces données ne sont pas directement extrapolables à une situation in vivo. 



   Il n'existe aucun modèle expérimental permettant de poser un pronostic quant à l'immunogénéicité ou l'effet immunomodulateur des préparations de FVIII ou la susceptibilité de l'hôte avant leur administration clinique. Ce modèle devient une nécessité absolue devant l'augmentation de la fréquence d'apparition d'anticorps anti-FVIII lors des essais cliniques actuels utilisant des préparations de FVIII de très haute activité spécifique obtenues soit par immunopurification soit par des techniques d'ingénierie du DNA (Seremetis et al., 1991). De plus, Aledorf (1993) montre qu'en utilisant ces deux types de préparations chez des sujets vierges, non transfusés auparavant (PUPS), on observe une prévalence en inhibiteurs allant jusqu'à 27%. 

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  Etat de la technique. 



   Les patients qui développent une réponse immune anti-FVIII se trouvent dans une situation grave qui nécessite l'utilisation de moyens lourds, agressifs et excessivement coûteux. Une des techniques les plus utilisées est de noyer l'organisme en injectant régulièrement de très hautes doses de FVIII (100 à 200 U/kg/jour) (Erwing et al., 1988) en association avec un complexe Prothrombine concentré (FEIBA) (protocole de Bonn), ce qui réduit effectivement le taux d'inhibiteurs dans le sang (Sultan et al., 1986). De plus, ce type de traitement doit être poursuivi pendant un temps très long (Lian et al., 1989). Les essais menés en utilisant des doses moindres de FVIII ont rencontré un certain succès chez des patients dont le taux d'anticorps anti-FVIII est beaucoup plus faible (Gruppo, 1991). 



   Une voie alternative est l'utilisation de FVIII d'espèce non humaine comme celle de porc, non neutralisé par les anti-FVIII du patient et permettant l'hémostase. Une étude multicentrique a montré les bénéfices d'un tel traitement mais a aussi mis en évidence des anticorps anti-FVIII porcin (Lozier 1993 ; Moreau et al., 1993, Hay and Bolton-Maggs, 1991 ; Clyne et   al.,   1992). Le facteur VII activé, obtenu par DNA recombinant, a été aussi utilisé comme voie alternative de la coagulation chez des patients présentant des inhibiteurs (Ingerslev et al., 1991). 



   Récemment, une stratégie fructueuse (Nilsson et al., 1990) pour réduire le taux d'inhibiteurs a consisté à soumettre les patients à une circulation extra-corporelle pour permettre l'absorption en phase solide des IgG totales sur Protéine A tout en les traitant avec des agents cytostatiques comme la cyclophosphamide. 



   L'infusion d'immunoglobulines intraveineuses polyvalentes (IVIG) combinées ou non (Hiller et   al.,   1986) avec un traitement immunosuppresseur s'est révélée relativement efficace, la raison de cette efficacité n'étant pas encore bien établie. Différentes hypothèses ont été avancées impliquant une 

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 inhibition feed-back de la synthèse des IgG, le stimulation de leur clearance, l'activation des T suppresseurs (Bloom, 1992). 



  Une explication intéressante est que ces immunoglobulines intraveineuses commerciales contiendraient des anticorps capables de réagir avec des anticorps anti-FVIII au niveau de leur partie variable (idiotypes) et les neutraliser (Sultan et al., 1987). Cette activité anti-idiotype serait spécifique à chaque donneur et pourrait être synergique dans un pool d'IgG (Dietrich et al., 1992). 



   Malheureusement, aucune de ces approches ne s'est révélée satisfaisante en termes de sécurité, d'efficacité et de coût. 



  Buts de l'invention. 



   La présente invention vise à obtenir une séquence polypeptidique antigénique du facteur VIII, des fragments et des épitopes de celle-ci, destinés à améliorer le diagnostic et/ou la thérapie de désordres immunitaires, en particulier ceux induits par les inhibiteurs du FVIII. 



   Un autre but de l'invention vise à obtenir des inhibiteurs présentant une immunoaffinité avec cette séquence polypeptidique antigénique, ses fragments et/ou ses épitopes, destinés également à améliorer le diagnostic et/ou la thérapie de désordres immunitaires. 



   Un but complémentaire vise à obtenir des inhibiteurs dirigés contre lesdits inhibiteurs susmentionnés, destinés à améliorer le diagnostic et/ou la thérapie de désordres immunitaires. 



  Brève description des figures. 



   La figure 1 représente la séquence polypeptidique A3 du facteur VIII comprise entre l'Acide Glutamique 1649 et l'Acide Aspartique 2019 renumumérotée de 1 à 371 acides aminés. 



   La figure 2 représente le graphique d'hydrophilicité de ladite séquence renumérotée de 1 à 371 acides aminés (valeur de surface pour chaque acide aminé). 

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   La figure 3 représente le graphique de flexibilité de ladite séquence renumérotée de 1 à 371 acides aminés (valeur de surface pour chaque acide aminé). 



   La figure 4 représente le graphique d'accessibilité de ladite séquence renumérotée de 1 à 371 acides aminés (valeur de surface pour chaque acide aminé). 



   La figure 5 représente le grapique général reprenant la somme des valeurs définies dans les graphiques 2 à 4. 
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  Eléments caractéristiques de l'invention. 



   La présente invention concerne la séquence polypeptidique antigénique A3 du facteur VIII, des fragments et/ou des épitopes de celle-ci. Ladite séquence est comprise entre l'Acide Glutamique 1649 et l'Acide Aspartique 2019, de préférence comprise entre l'Arginine 1652 et l'Arginine 1917 de la séquence polypeptidique du facteur VIII telle que publiée   par Vehar et al. (Nature, vol. 312, p 339 (1984) ) et Toole et   al. (Nature, vol. 312, pp 342-347 (1984)). 



   Préférentiellement, les fragments de ladite séquence sont compris entre l'Arginine 1652 et l'Arginine 1696, entre le Tryptophane 1739 et l'Asparagine 1831 ou entre l'Acide Glutamique 1885 et l'Arginine 1917. 



   L'invention concerne également les épitopes de séquence de ces fragments, notamment :   - l'épitope   compris entre l'Arginine 1652 et la Tyrosine 1664 défini par la séquence suivante : SEQ ID NO : 1 : Arg Thr Thr Leu Gln Ser Asp   Gln   Glu Glu Ile Asp Tyr
1 5 10 
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 l'épitope compris entre l'Asparagine 1681 et l'Arginine 1696 défini par la séquence suivante : SEQ ID NO : 2 : Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser Pro Arg Ser Phe Gln Lys Lys Thr Arg
1 5 10 15 

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 - l'épitope compris entre le Tryptophane 1739 et la Tyrosine 1748 défini par la séquence suivante : SEQ ID NO : 3 : Thr Asp Gly Ser Phe Thr Gin Pro Leu Tyr   1 5   10   - l'épitope   compris entre l'Acide Aspartique 1777 et la Phenylalanine 1785 défini par la séquence suivante : SEQ ID NO : 4 :

   Asn Gin   A-la   Ser Arg Pro Tyr Ser Phe   1 5     - l'épitope   compris entre l'Acide Glutamique 1794 et la Tyrosine 1815 défini par la séquence suivante : SEQ ID NO : 5 : Glu Asp Gin Arg Gin Gly Ala Glu Pro Arg Lys Asn Phe Val Lys Pro
1 5 10 15 Asn Glu Thr Lys Thr Tyr
20   - l'épitope   compris entre la Methionine 1823 et l'Asparagine 1831 défini par la séquence suivante : SEQ ID NO : 6 : Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp   1 5     - l'épitope   compris entre l'Acide Glutamique 1885 et la Phenylalanine 1891 défini par la séquence suivante : SEQ ID NO : 7 : Glu Thr Lys Ser Trp Tyr Phe   1 5     - l'épitope   compris entre l'Acide Glutamique 1893 et l'Alanine 1901 défini par la séquence suivante : SEQ ID NO : 8 :

   Glu Asn Met Glu Arg Asn Cys Arg Ala   1 5   l'épitope compris entre l'Asparagine 1909 et l'Arginine 1917 défini par la séquence suivante : SEQ ID NO : 9 : Asp Pro Thr Phe Lys Glu Asn Tyr Arg
1 5 

 <Desc/Clms Page number 16> 

 
Avantageusement, ladite séquence, ses fragments particuliers et ses épitopes présentent une caractéristique antigénique illustrée par les figures 2 à 5 annexées. 



   Cette séquence et/ou ses fragments sont caractérisés de manière particulièrement avantageuse par une hydrophilicité élevée telle que décrite par Parker, Guo et Hodges   (Biochemistry 25, pp 5425-5432 (1986) ), une importante   flexibilité telle que décrite par Karplus et Schultz (Naturwissenschaften 72, p 212 (1985)) et une importante accessibilité telle que décrite par Janin (Nature 277, pp 491- 492 (1979)). 



   Ces fragments et ces épitopes sont en particulier exposés à la surface de la protéine du facteur VIII et présentent une caractéristique antigénique marquée. 



   Avantageusement, ladite séquence polypeptidique, ses fragments et/ou ses épitopes sont également indépendamment immunogènes (c'est-à-dire qu'ils sont immunogènes même sans être complexés à une protéine de grande taille telle que la BSA,   l'hémocyanine,...),   et présentent de préférence une immunoaffinité avec des inhibiteurs du facteur VIII, tels que des anticorps anti-facteur VIII et/ou présentent une immunoaffinité pour les récepteurs des lymphocytes T et/ou B. 



   Cette séquence, ces fragments et/ou ces épitopes provoquent une réaction immunitaire (synthèse d'anticorps) lorsqu'ils sont injectés à un lapin. 



   Ces caractéristiques sont particulièrement importantes pour les épitopes SEQ ID NO : 2 et SEQ ID NO : 5 qui comprennent des séquences   relativement"longues"en   acides aminés, respectivement de 16 et 22 acides aminés. 



   Ces séquences devraient donc être caractérisées par une importante immunogénicité vis-à-vis d'anticorps monoclonaux et polyclonaux. 



   Cependant, ces séquences sont suffisamment courtes pour être aisément obtenues par synthèse. 



   La présente invention concerne également les épitopes conformationnels comprenant au moins deux fragments différents 

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 de ladite séquence   et/ou   au moins ceux épitopes de séquence différents selon l'invention et identifiés ci-dessus. 



   Les épitopes conformationnels sont composés de deux ou plusieurs portions différentes d'une séquence polypeptidique situées à proximité les unes des autres lors du reploiement de la protéine dans sa structure tertiaire. 



   Ces épitopes sont susceptibles d'être"reconnus" 
 EMI17.1 
 (c'est-à-dire de présenter une immunoaffinité), de préférence simultanément, avec des inhibiteurs du facteur VIII, notamment des lymphocytes B (via le locus majeur d'histocompatibilité   (MHC I et/ou II) ) et/ou des anticorps anti-facteur VIII   (Scandello et al., Blood 76, p 437 (1990)). 



   De préférence, cette séquence, ces fragments et/ou ces épitopes sont complexés avec une protéine ou un peptide, tels que la BSA ou l'hémocyanine, de manière à former un complexe présentant une plus forte immunogénéicité. 



   Un autre aspect de la présente invention concerne un inhibiteur du facteur VIII présentant une immunoaffinité avec la séquence polypeptidique antigénique selon la présente invention, avec des fragments, des épitopes de celle-ci et/ou le complexe selon l'invention. 



   On entend par inhibiteur, toute molécule biologique ou cellule intervenant avec et/ou contre le facteur VIII, et susceptible de créer des désordres immunitaires. 



   En particulier, un tel inhibiteur peut être un anticorps (gammaglobuline) monoclonal ou polyclonal ou un fragment d'anticorps anti-facteur VIII (tel que la portion hypervariable FAB dudit anticorps), qui inactive ledit facteur VIII. 



   Avantageusement, lesdits inhibiteurs sont synthétisés par un animal chimérique comportant un système immunitaire humain tel qu'une souris SCID-hu produisant des anticorps humains. 



   Les souris SCID (severe combined immunodeficient) sont des souris présentant une déficience en lymphocytes B et T fonctionnels due à un dysfonctionnement de la recombinaison 

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 des gènes responsables des récepteurs antigéniques. Ces souris peuvent être facilement colonisées par des cellules xénogènes (Smith et al., 1991). Ces souris immunodéficientes doivent être maintenues avec des soins et des précautions particulières pour éviter la contamination des agents opportunistes tels que Pneumocystis carinii. Le système immunitaire des souris SCID peut être reconstitué avec des cellules immunocompétentes d'origine humaine provenant d'organes fétaux ou de sang périphérique (Mosler et al., 1988 ;   Mc   Cune et al., 1988).

   Une fois reconstituées, ces souris SCID-hu produisent des anticorps humains soit spontanément, soit après immunisation. Il a aussi été démontré que les cellules B prolifèrent et colonisent la rate du receveur. Ce modèle a été utilisé avec succès pour la sécrétion d'auto-anticorps anti-thyroïde ou dressés contre les antigènes nucléaires (Macht et al., 1990 ; Duchosal et al., 1990). 



   La reconstitution de souris SCID avec des lymphocytes de patients hémophiles n'a pas encore été décrite. 



   Il semble qu'il n'existe pas de réactivité croisée dramatique entre les facteurs VIII humain et murin (Kessler, 1991). Celle-ci pourrait conduire à des perturbations du système de coagulation de la souris, sans doute avec quelques analogies avec la maladie humaine. En effet, le cDNA du facteur murin a été récemment isolé, et la séquence a été déterminée (Elder et al., 1993). Il code pour une protéine de taille plus petite 2319 acides aminés et présente 74% d'homologie avec la séquence du facteur VIII humain. Le facteur VIII murin intervient dans la cascade de coagulation comparable au système humain, mais avec des différences qui pourraient avoir une signification fonctionnelle. 



   Les lymphocytes du sang périphérique sont prélevés chez plusieurs types de donneurs : volontaires non hémophiles, hémophiles dépourvus d'inhibiteurs détectables par les méthodes classiques, hémophiles présentant un taux important d'inhibiteurs ainsi que des donneurs produisant des autoanticorps. 

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   Ce modèle est utilisé dans deux types de travaux. 



  D'abord, la reconstitution de souris est obtenue avec des cellules d'un seul donneur, et après vérification de la reproductibilité du système, on peut comparer l'antigénicité de plusieurs préparations du facteur VIII. 



   D'autre part, ce modèle permet d'obtenir et d'étudier une réponse anti-facteur VIII au niveau   clonal.   



   L'étude de la réponse spécifique monoclonale des cellules B est très importante, car elle permet précisément d'identifier les épitopes séquentiels et conformationnels du facteur VIII. Les cellules B sont cultivées clonées en présence ou non d'anti-CD40, à partir de la rate des souris produisant des anti-facteur VIII, ou bien transformées en présence du virus EBV. Les anticorps anti-CD40 reconnaissent un antigène membranaire et activent les cellules B en présence d'une ligne de fibroblastes (Banchereau et al., 1991). Il est dès lors possible d'envisager l'utilisation de ces épitopes immunodominants comme cible possible de l'immunothérapie. 



   La détermination de marqueurs MHC de classe I et de classe II portés par les clones de lymphocytes B permet d'analyser la réponse immunitaire des anti-facteur VIII au niveau génétique, et ainsi de suivre la reconnaissance par les cellules T spécifiques. Ceci est également une excellente méthode pour voir s'il existe un facteur de risque associé à cette pathologie. a) Production d'anticorps monoclonaux anti-facteur VIII. 



   Les souris balb/c choisies pour la préparation des mAbs anti-facteur VIII sont préalablement injectées à trois reprises à 2 semaines d'intervalle avec une solution de facteur VIII recombinant (rFVIII). Ce type de préparation présente l'avantage de contenir un facteur VIII de haute pureté à une concentration élevée avec un minimum de protéines contaminantes. Quatre jours après la dernière injection, les splénocytes sont fusionnés avec des cellules d'un myélome de souris (SP207) (van Snick et Coulie, 1982). La sélection des hybridomes produisant des anticorps anti-facteur VIII 

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 s'effectue par la technique ELISA utilisant des plaques de polystyrène sur lesquelles du rFVIII a préalablement été insolubilisé.

   Les surnageants d'hybridomes contenant des anticorps anti-facteur VIII sont   clonés   par la technique de dilution limite, puis cultivés in vitro. 



   Les anticorps sont purifiés par chromatographie au départ de ces surnageants. b) Caractérisation des anticorps monoclonaux anti-facteur VIII. 



   La quantification, la détermination de la chaîne légère (k ou   l)   et la sous-classe   (IgG1,   IgG2a, IgG2b, IgG3) des mAbs anti-facteur VIII s'effectuent par la technique ELISA. 



   La détermination des épitopes reconnus sur la molécule de facteur VIII se réalise par la technique d'immunotransfert avec des solutions de facteur VIII natives ou après clivage enzymatique à la thrombine. 



   La capacité des mAbs anti-facteur VIII produits à inhiber la fonction est évaluée, pour chacun de ceux-ci, par une méthode de coagulation (méthode Bethesda) (Kasper et al., 1975) ainsi que par une méthode chromogénique basée sur la capacité qu'a le facteur X activé par l'association du facteur VIII et du facteur IX activé, de transformer un substrat incolore en un substrat coloré (Svendsen et al., 1984). 



  Transformation EBV. 



   Les lignées cellulaires productrices d'anticorps monoclonaux humains anti-facteur VIII sont dérivées à partir des lymphocytes B humains prélevés dans la cavité abdominale de souris SCID immmunisées avec différents lots de facteur VIII après reconstitution du système immunitaire des animaux avec des lymphocytes humains. Ces cellules sont immortalisées suivant la technique d'injection par le virus Epstein-Barr (Kozbor, 1981) et ensuite clonées jusqu'à obtention des lignées monoclonales. Les difficultés inhérentes à cette technique sont liées d'une part au faible pourcentage de cellules immortalisées (environ 10% des cellules) et d'autre part à la difficulté du clonage.

   Ces deux difficultés peuvent maintenant être surmontées en activant au préalable les lymphocytes B par 

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 l'intermédiaire du récepteur CD40 présent sur ces cellules (Banchereau, 1991). Les lymphocytes B sont mis en culture en présence de cellules fibroblastiques exprimant un récepteur pour la portion Fcg des immunoglubulines sur laquelle est fixé un anticorps monoclonal anti-CD40. Ces cellules activées par la polymérisation du récepteur CD40 sont alors infectées et immortalisées par le virus Epstein-Barr. Les lignées cellulaires produisant les anticorps recherchés peuvent alors être sous-clonées. 



  Modèle SCID. 



   Les souris SCID sont maintenues en micro-isolateurs, sous flux laminaire. Elles reçoivent trois fois par semaine du trimetoprim et du sulfamethoxazole. Seules les souris qui produisent moins de 10 pg/ml d'immunoglobulines résiduelles sont utilisées pour les expériences. 



   Le modèle est mis au point en utilisant des globules blancs périphériques provenant de volontaires immunisés contre le tétanos. 



   La reconstitution est menée avec une seule injection i. p. de 15 à 20.106 mononucléaires d'origine humaine. Ces cellules sont obtenues après centrigugation en gradient FicollHypaque de sang périphérique (environ 200 ml). Douze à vingt souris peuvent être reconstituées à partir d'un seul donneur. La production d'immunoglobulines humaines est mesurée en fonction du temps. 



   Un autre aspect de l'invention concerne un inhibiteur caractérisé en ce qu'il est dirigé contre ledit inhibiteur du facteur VIII (inhibiteur présentant une immunoaffinité avec la séquence polypeptidique antigénique, des fragments et/ou des épitopes de celle-ci). 



   On entend par inhibiteur dirigé contre l'inhibiteur du facteur VIII, toute molécule biologique et/ou cellule susceptible d'interférer avec ledit inhibiteur de manière à assurer son inactivation. 



   De préférence, un tel inhibiteur est un anticorps (monoclonal ou polyclonal), ou un fragment d'anticorps anti- 

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 idiotypique anti-facteur VIII. 



   Avantageusement, ces inhibiteurs dirigés contre les inhibiteurs du facteur VIII sont synthétisés par un animal transgénique présentant un système immunitaire humain tel qu'une souris SCID-hu. 



   Les anticorps anti-idiotypiques anti-facteur VIII sont purifiés à partir d'un pool de plasma de départ, qui est constitué à partir de dons volontaires d'au moins 7200 donneurs pour augmenter la probabilité de trouver des anticorps antiidiotypiques, par immunoaffinité au moyen d'anticorps antifacteur VIII humains fixés de manière covalente sur une colonne de Sepharose ou par une partie Fc sur une colonne de protéine G. Après fractionnement, par la méthode de Cohn-Oncley, deux fractions Fr II et Fr III riches en IgG sont obtenues. Elles serviront de préparation de départ pour la purification des anticorps anti-idiotypiques. Ces anticorps monoclonaux seront obtenus à partir de cellules B prélevées chez les patients hémophiles.

   Ces cellules ont au préalable proliféré dans les souris SCID et ont été transformées en cultures cellulaires sécrétrices par le virus EBV. L'utilisation de ces anticorps monoclonaux humains permet d'éviter l'introduction de protéines non humaines dans les préparations thérapeutiques. Ces préparations sont évaluées pour leur efficacité de neutralisation des inhibiteurs provenant du plus grand nombre de patients hémophiles possible, par des analyses immunochimiques approfondies. Deux étapes d'inactivation virale thermique et/ou chimique (par exemple par solvant-détergent) sont introduites dans le procédé de purification afin d'assurer la plus grande sécurité virale possible. 



   Les résultats sont soigneusement étudiés en vue d'une étude clinique rigoureuse, et de leur exploitation industrielle. 



   L'idiotype propre aux anticorps humains est analysé en séquençant la partie variable de la molécule. Ces données sont d'importance extrême, car elles sont de grande utilité à la fois dans le diagnostic et la régulation de la production 

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 des anti-facteur VIII. 



   Jusqu'à présent, la source d'anticorps nécessaires à la confection de complexes antigènes-anticorps a été autologue,   c'est-à-dire   que le patient lui-même fournissait les anticorps. Nous savons depuis peu que des individus normaux avec des taux normaux de facteur VIII circulant, produisent des anticorps anti-facteur VIII dont l'activité dans le plasma est limitée par des anticorps anti-idiotypique correspondants. On peut donc faire l'hypothèse que des anticorps anti-facteur VIII préparés à partir d'un pool de gammaglobulines pourrait remplacer avantageusement la source autologue. 



   Un autre aspect de l'invention concerne une composition pharmaceutique comprenant un élément choisi parmi le groupe constitué par ladite séquence polypeptidique antigénique du facteur VIII, des fragments et/ou des épitopes de celle-ci, un inhibiteur du facteur VIII dirigé contre ladite séquence, ses fragments et/ou ses épitopes, un inhibiteur dirigé contre ledit inhibiteur, et/ou un mélange d'entre eux. 



   Un autre aspect de l'invention concerne un dispositif de diagnostic, tel qu'un kit de diagnostic ou une colonne de chromatographie, comprenant un élément choisi parmi le groupe constitué par ladite séquence polypeptidique antigénique, de fragments et/ou des épitopes de celle-ci, le complexe selon l'invention, un inhibiteur dirigé contre ladite séquence, ses fragments, ses épitopes et/ou ledit complexe, un inhibiteur dirigé contre ledit inhibiteur, et/ou un mélange d'entre eux. 



   Un dernier aspect de l'invention concerne le procédé d'obtention de dispositifs de diagnostic selon la présente invention, dans lequel on fixe sur un support solide, de préférence via un bras, un élément choisi parmi le groupe constitué par la séquence polypeptidique antigénique, des fragments, des épitopes de celle-ci et/ou le complexe selon la présente invention.

Claims (17)

REVENDICATIONS.

1. Séquence polypeptidique antigénique du facteur VIII et des fragments de celle-ci, caractérisée en ce que ladite séquence est comprise entre l'Acide Glutamique 1649 et l'Acide Aspartique 2019, de préférence comprise entre l'Arginine 1652 et l'Arginine 1917 de la séquence polypeptidique du facteur VIII.

2. Séquence selon la revendication 1 caractérisée en ce qu'elle est immunogénique.

3. Séquence selon la revendication 2 caractérisée en ce qu'elle présente une immunoaffinité avec des inhibiteurs du facteur VIII, de préférence avec des anticorps anti-facteur VIII.

4. Séquence selon la revendication 2 ou 3 caractérisée en ce qu'elle présente une immunoaffinité pour les récepteurs des lymphocytes T et/ou B.

5. Fragment de la séquence polypeptidique antigénique du facteur VIII selon l'une quelconque des revendications précédentes 1 à 4, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi le groupe constitué par le fragment de la séquence compris entre l'Arginine 1652 et l'Arginine 1696, le fragment de la séquence compris entre le Tryptophane 1739 et l'Asparagine 1831 et/ou le fragment de la séquence compris entre l'Acide Glutamique 1885 et l'Arginine 1917.

6. Epitope de séquence du fragment selon la revendication 5 caractérisé en ce qu'il est choisi parmi le groupe constitué par : - l'épitope compris entre l'Arginine 1652 et la Tyrosine 1664 défini par la séquence suivante : SEQ ID NO : 1 : Arg Thr Thr Leu Gln Ser Asp Gln Glu Glu Ile Asp Tyr 1 5 10 <Desc/Clms Page number 25> - l'épitope compris entre l'Asparagine 1681 et l'Arginine 1696 défini par la séquence suivante : SEQ ID NO : 2 : Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser Pro Arg Ser Phe Gln Lys Lys Thr Arg 1 5 10 15, - l'épitope compris entre le Tryptophane 1739 et la Tyrosine 1748 défini par la séquence suivante : SEQ ID NO : 3 :

Thr Asp Gly Ser Phe Thr Gln Pro Leu Tyr 1 5 10, - l'épitope compris entre l'Acide Aspartique 1777 et la Phenylalanine 1785 défini par la séquence suivante : SEQ ID NO : 4 : Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe 1 5, - l'épitope compris entre l'Acide Glutamique 1794 et la Tyrosine 1815 défini par la séquence suivante : SEQ ID NO : 5 : Glu Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu Pro Arg Lys Asn Phe Val Lys Pro 1 5 10 15 Asn Glu Thr Lys Thr Tyr EMI25.1 20 - l'épitope compris entre la Methionine 1823 et l'Asparagine 1831 défini par la séquence suivante : SEQ ID NO : 6 : Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp 1 5, EMI25.2 - l'épitope compris entre l'Acide Glutamique 1885 et la Phenylalanine 1891 défini par la séquence suivante : SEQ ID NO : 7 :

Glu Thr Lys Ser Trp Tyr Phe 15, EMI25.3 - l'épitope compris entre l'Acide Glutamique 1893 et l'Alanine 1901 défini par la séquence suivante : SEQ ID NO : 8 : Glu Asn Met Glu Arg Asn Cys Arg Ala 1 5 <Desc/Clms Page number 26> et l'épitope compris entre l'Asparagine 1909 et l'Arginine 1917 défini par la séquence suivante : SEQ ID NO : 9 : Asp Pro Thr Phe Lys Glu Asn Tyr Arg 1 5.

7. Epitope conformationnel caractérisé en ce qu'il comprend au moins deux fragments différents selon la revendication 5 et/ou au moins deux épitopes différents selon la revendication 6.

8. Complexe comprenant une protéine ou un polypeptide lié à un élément choisi parmi le groupe constitué par la séquence polypeptidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, un fragment de celle-ci selon la revendication 5 et/ou un épitope de celle-ci selon la revendication 6 ou 7.

9. Inhibiteur du facteur VIII caractérisé en ce qu'il présente une immunoaffinité avec la séquence polypeptidique antigénique selon l'une quelconque des revendications précédentes 1 à 4, un fragment de celle-ci selon la revendication 5, un épitope de celle-ci selon la revendication 6 ou 7 et/ou le complexe selon la revendication 8.

10. Inhibiteur selon la revendication 9 caractérisé en ce qu'il est un anticorps ou un fragment d'anticorps antifacteur VIII.

11. Inhibiteur caractérisé en ce qu'il est dirigé contre l'inhibiteur du facteur VIII selon la revendication 9 ou 10.

12. Inhibiteur selon la revendication 11 caractérisé en ce qu'il est un anticorps ou un fragment d'anticorps antiidiotypique anti-facteur VIII.

13. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un élément choisi parmi le groupe constitué par une séquence polypeptidique antigénique du facteur VIII selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, un fragment de celle-ci selon la revendication-5, un épitope de celle-ci selon la revendication 6 ou 7, un complexe selon la revendication 8, un inhibiteur du facteur VIII selon la revendication 9 ou 10, un inhibiteur dirigé contre l'inhibiteur <Desc/Clms Page number 27> du facteur VIII selon la revendication 11 ou 12 et/ou un mélange d'entre eux.

14. Dispositif de diagnostic caractérisé en ce qu'il comprend au moins un élément choisi parmi le groupe constitué par une séquence polypeptidique antigénique du facteur VIII selon l'une quelconque des revendications précédentes 1 à 4, un fragment de celle-ci selon la revendication 5, un épitope de celle-ci selon la revendication 6 ou 7, un complexe selon la revendication 8, un inhibiteur du facteur VIII selon la revendication 9 ou 10, un inhibiteur dirigé contre l'inhibiteur du facteur VIII selon la revendication 11 ou 12 et/ou un mélange d'entre eux.

15. Dispositif selon la revendication 14, caractérisé en ce qu'il est une trousse de diagnostic.

16. Dispositif selon la revendication 14, caractérisé en ce qu'il est une colonne de chromatographie.

17. Procédé d'obtention des dispositifs de diagnostic selon l'une quelconque des revendications 14 à 16, caractérisé en ce qu'on fixe sur un support solide, de préférence via un bras, un élément choisi parmi le groupe constitué par une séquence polypeptidique antigénique du facteur VIII selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, un fragment de celle-ci selon la revendication 5, un épitope de celle-ci selon la revendication 6 ou 7, le complexe selon la revendication 8, un inhibiteur du facteur VIII selon la revendication 9 ou 10, un inhibiteur dirigé contre l'inhibiteur du facteur VIII selon la revendication 11 ou 12, et/ou un mélange d'entre eux.