WO1996002572A2 - Sequence polypeptidique antigenique du facteur viii, fragments et/ou epitopes de celle-ci - Google Patents

Sequence polypeptidique antigenique du facteur viii, fragments et/ou epitopes de celle-ci Download PDF

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WO1996002572A2
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Ruth Laub
Mario Di Giambattista
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Croix-Rouge De Belgique
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
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    • C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
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    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to the antigenic polypeptide sequence of factor VIII, fragments, epitopes thereof and the strong parts of these epitopes, the inhibitors directed against this sequence, its fragments, its epitopes and / or the strong parts of these epitopes. , as well as the anti-inhibitors directed against said inhibitors.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition and a diagnostic device comprising the above-mentioned molecules.
  • FVIII is a glycoprotein cofactor for plasma coagulation and acts on the activation of factor X (FX).
  • FX factor X
  • the characterization of FVIII and its mechanism of action is made more difficult by its low concentration in plasma, size heterogeneity, and its extreme sensitivity to enzymatic degradation.
  • FVIII is such a complex protein that, although the gene sequence has been known since 1984 (Verhar et al., Nature 312, pp. 317-342 (1984)), the complete structure of plasma FVIII has not yet been established. (almost 50% of the protein has only been sequenced) as well as the precise structure of the carbohydrates.
  • the DNA sequence has been accepted as defining the primary sequence of FVIII (rare exception to guidelines prescribed by the FDA for therapeutic products derived from biotechnology).
  • FVIII farnesoid protein
  • hepatocytes The cDNA of FVIII has also been expressed in transgenic sheep (Halter et al., 1993).
  • CDNA codes for a polypeptide of 2351 amino acids including the signal peptide of 19 amino acids cleaved in the endoplasmic reticulum.
  • Post-translational modifications take place in the Golgi apparatus: glycosylation of serines and threonmes and addition of sulphate ions to tyrosine residues.
  • the protein After maturation, the protein is then secreted in the plasma, in the form of 2 chains 210 kDa (there 1648 residues) and 80 Da (from 1649 to 2332 residues) united by a divalent ion, and the lightest of which is associated non-covalently to von Willebrand Factor (vWf) by its N-terminal end (1 molecule vWf per molecule of FVIII).
  • vWf von Willebrand Factor
  • the FVIII is made up of three structural domains A, B and C (Kaufman RJ, 1992; Bihoreau et al., 1992) organized in Al: A2: B: A3: C1: C2 ( Figure 1). Domains A have more than 40% homology and are also homologous to ceruloplasmin. There is also 30% homology between the A domain of factor V and FVIII. Domain C intervenes twice and would be able to bind glycoconjugates and phospholipids with negative net charge (Kemball-Cook and Barrowcliffe (1992); Fay, PJ, 1993)). It presents a homology with lectins capable of binding to negatively charged phospholipids.
  • Domain C2 which represents more than 40% of the mass of FVIII, has no known specific activity but could play a subtle role in the regulation of FVIII by protecting it, for example, from the action of thro bine. It has no known homology with other proteins.
  • the bond of the two chains is non-covalent and results via a bond of a divalent metal ion (Me ++) between the residues responsible for the domains Al and A3.
  • a divalent metal ion Me ++
  • a mactivation phase is observed probably following prolonged contact with thrombin and dissociation of the 50 kDa fragments. and 45 kDa.
  • FVIIIa is also inactivated by activated protein C (APC) after proteolysis of the heavy chain. This mactivation is accelerated if the FVIIIa is fixed on a phospholipic surface.
  • antigenic determinants consist of fragments 351 - 365 (domain Al - heavy chain), 713 - 740 (domain A2), 1670 - 1684 (domain A3 - light chain) (NH2 terminal of the light chain) or 2303 - 2332 ( domain C2 - light chain) (Foster C, (1990)), the fragments 701 - 750 (Ware et al. (1989)), 1673 - 1689 (Leyte et al. (1989)), 330 - 472, 1694-1782 (EP-0 202 853), 322 - 740 and 2170 - 2322 (Scandella et al. (1992)).
  • the antibodies recognize these various sites, respectively interfere with the activation of FVIII, the binding of vWf or the binding of phospholipids.
  • Other antibodies which are not inhibitors of conventional in vitro activity tests, can act on the action of FVIII with the other constituents of the coagulation cascade by binding to sites on the molecule which are very far from the active sites. These, thus modified, can interfere with the natural folding of FVIII, altering some of its properties ("allosteric model").
  • mapping experiments use peptides synthesized by fragments of FVIII genes cloned into E coii, and allowing only an approximate idea of the location of the antigenic determinants recognized by these monoclonals. Indeed, the size of the identified fragments ranges from 30 to 100 amino acids.
  • the antigenic regions coincide with the hydrophilic character of these regions: the more the oligopeptide sequence is exposed to the external medium (located on the surface), the more this part will be likely to be recognized in an immunization reaction.
  • the hydrophobic parts generally located inside the protein, are considered to be not very antigenic.
  • IL-2 (Triulzi et al., 1990).
  • FVIII 0.5 to 10 U / mg proteins
  • Activated factor VIII obtained by recombinant DNA, has also been used as an alternative coagulation pathway in patients with inhibitors (Ingerslev et al. (1991)).
  • IVIG polyvalent intravenous immunoglobulins
  • the present invention aims to obtain an antigenic polypeptide sequence of factor VIII, fragments and epitopes thereof, intended to improve the diagnosis and / or therapy of immune disorders, in particular those induced by FVIII inhibitors, the inhibitors of the binding of FVIII to von Willebrand factor (vWf) and / or to membrane phospholipids (PL).
  • FVIII inhibitors the inhibitors of the binding of FVIII to von Willebrand factor (vWf) and / or to membrane phospholipids (PL).
  • Another object of the invention is to obtain inhibitors having immunoaffinity with this antigenic polypeptide sequence, its fragments and / or its epitopes, also intended to improve the diagnosis and / or the therapy. immune disorders.
  • FIG. 1 schematically represents the polypeptide sequence of factor VIII.
  • FIG. 2 represents the hydrophilicity graph of the A3 sequence of factor VIII renumbered from 1 to
  • FIG. 3 represents the flexibility graph of this A3 sequence of factor VIII.
  • FIG. 4 represents the accessibility graph of this A3 sequence of factor VIII.
  • FIG. 5 represents the general graph showing the sum of the values defined in graphs 2 to 4.
  • FIG. 6 represents the detection of anti-factor VIII antibodies in the sera of mice by an ELISA test. Characteristic elements of the invention.
  • the present invention relates to the antigenic polypeptide sequence of factor VIII and / or fragments thereof, as described by Verhar et al. (Nature, vol. 312, p 339 (1984)).
  • factor VIII polypeptide sequence means the natural human or animal sequence, optionally glycosylated, obtained by purification of plasma pools, in particular Cohn fraction I, by synthesis and / or genetic engineering (that is to say also say a possibly deleted sequence of the portions not involved in the blood coagulation mechanism) of factor VIII.
  • the present invention relates in particular to the factor VIII antigenic polypeptide sequence lacking fragments Alanine 322 - Serine 750, Leucme 1655 - Arginine 1689, Lysine 1694 - Prolme 1782 and Aspartic Acid 2170 - Tyrcsme 2332.
  • the present invention relates in particular to the antigenic polypeptide sequences A1, A2, A3, and C (Cl and C2) of factor VIII.
  • amino acids will be represented by their three-letter abbreviation or by the symbol of a single letter as identified in the table below.
  • a first embodiment of the invention relates to the A3 antigenic polypeptide sequence of factor VIII, fragments and / or epitopes thereof.
  • Said sequence is between Glutamic Acid 1649 and Asparagine 2019, preferably between Arginine 1652 and Arginine 1917 or between Arginine 1803 and Arginine 1917, of the polypeptide sequence of factor VIII such as published by Verhar et al. (Nature, vol. 312, p 339 (1984)) and Toole et al. (Nature, vol. 312, pp. 342-347 (1984)).
  • the fragments of said sequence are between Arg ine 1652 and Arginme 1696, preferably between Arginine 1652 and Argmine 1689, between Threonine 1739 and Aspartic Acid 1831 or between Acid Glutamic 1885 and Arginine 1917.
  • the invention also relates to the sequence epitopes of these fragments, in particular:
  • Threonine 1739 and Tyrosine 1748 defined by the following sequence:
  • SEQ ID NO: 7 Glu Thr Lys Ser Trp Tyr Phe 1 5
  • said sequence, its specific fragments and its epitopes exhibit an antigenic characteristic illustrated by FIGS. 2 to 5 appended.
  • Another preferred embodiment of the invention relates to the A1 antigenic polypeptide sequence of factor VIII, fragments and / or epitopes thereof.
  • the fragments of said sequence are between Alanine 108 and Methionine 355, preferably between Alanine 108 and Glutamine 228.
  • the invention also relates to the sequence epitopes of these fragments, in particular: - the epitope between Alanine 108 and Val e 128 defined by the following sequence: SEQ ID NO: 10:
  • Another preferred embodiment of the invention relates to the A2 antigenic polypeptide sequence of factor VIII, fragments and / or epitopes thereof.
  • the fragments of said sequence are between the Aspartic Acid 403 and the Aspartic Acid 725, preferably between the Histidme 693 and the Aspartic Acid 725.
  • the invention also relates to the epitopes of the sequence of these fragments, in particular: the epitope comprised between Aspartic Acid 403 and Lysine 425 defined by the following sequence:
  • Glycine 701 defined by the following sequence: SEQ ID NO: 16:
  • a final preferred embodiment of the invention relates to the factor VIII antigenic polypeptide sequence C, fragments and / or epitopes thereof.
  • the fragments of said sequence are between Lysine 2085 and Lysine 2249, preferably between Lysine 2085 and Glycine 2121.
  • the invention also relates to the epitopes of the sequence of these fragments, in particular: - the epitope between Lysine 2085 and Phenylalanine 2093 defined by the following sequence:
  • the epitope comprised between Aspartic Acid 2108 and Glycine 2121 defined by the following sequence:
  • the invention also relates to the strong parts of said epitopes or of said fragments, that is to say the sequence portions of said epitopes comprising the amino acids Tyrosine and Histidme, which unexpectedly exhibit a particularly high affinity towards factor VIII inhibitors.
  • these strong parts comprise said amino acid Tyrosine or Histidine linked to at least two other identical or different amino acids.
  • sequences, these fragments and these epitopes, in particular the strong parts of the epitopes or of the fragments, are characterized in a particularly advantageous manner by a high hydrophilicity as described by Parker, Guo and Hodges (Biochemistry 25, pp 5425-5432 (1986) ), significant flexibility as described by Karplus and Schultz (Naturwissenschaften 72, p 212 (1985)) and significant accessibility as described by Janin (Nature 277, pp 491-492 (1979)) (see Figures 2 to 5) .
  • said polypeptide sequence, its fragments, its epitopes and / or these strong parts of said fragments or said epitopes are also independently immunogenic (that is to say that they are immunogenic even without being complexed with a large protein such as BSA, hemocyanin, ...), and preferably exhibit immunoaffinity with factor VIII inhibitors, such as anti-factor VIII antibodies and / or exhibit immunoaffinity for T and / or B lymphocyte receptors .
  • sequences are therefore characterized by a high immunogenicity with respect to monoclonal and polyclonal antibodies.
  • the peptides Asp 1681 - Arg 1696 and Asp 327 - Met 355 were synthesized to demonstrate anti-factor VIII antibodies in the sera of mice by an ELISA test.
  • the present invention also relates to conformational epitopes comprising at least two different fragments of said sequence, at least two epitopes of sequence and / or at least two strong parts of said epitopes or said different fragments according to the invention and identified above. of two or several different portions of a polypeptide sequence located close to each other during the folding of the protein into its tertiary or quaternary structure.
  • epitopes are likely to be "recognized” (that is to say to have an immunoaffinity), preferably simultaneously, with inhibitors of factor VIII, in particular B lymphocytes (via the major locus of histoco patibility
  • said sequence, said fragments, said epitopes and / or the strong parts of said epitopes or said fragments are complexed with a carrier protein or a carrier peptide, such as BSA or hemocyanin, so as to form a complex having a stronger immunogenicity.
  • Another aspect of the present invention relates to a factor VIII inhibitor having immunoaffinity with the antigenic polypeptide sequence according to the present invention, with fragments, epitopes thereof, strong parts of said epitopes or said fragments and / or the complex. according to the invention.
  • inhibitor is intended to mean any biological molecule or cell intervening with and / or against factor VIII, and capable of creating immune disorders.
  • an inhibitor can be a monoclonal or polyclonal antibody (gamma globulin) or an anti-factor VIII antibody fragment (such as the hypervariable Fab portion of said antibody), which inactivates said factor VIII and / or which inhibits the binding of factor VIII to von Willebrand factor and / or to membrane phospholipids.
  • said inhibitors are synthesized by a "chimeric" animal comprising a human immune system such as a SCID-hu mouse producing human antibodies.
  • SCID severe combined immunodeficient mice are mice with a deficiency in functional B and T lymphocytes due to a dysfunction in the recombination of the genes responsible for antigenic receptors.
  • the immune systems of SCID mice can be reconstituted with human immunocompetent cells from fetal organs or peripheral blood (Mosler et al. (1988) •
  • Peripheral blood lymphocytes are taken from several types of donors: non-hemophiliac volunteers, hemophiliacs lacking inhibitors detectable by conventional methods, hemophiliacs with a high rate inhibitors as well as donors producing auto ⁇ antibodies.
  • This model is used in two types of work.
  • mice is obtained with cells from a single donor, and after checking the reproducibility of the system, the antigenicity of several preparations of factor VIII can be compared.
  • B cells are cultured cloned in the presence or not of anti-CD40, from the spleen of mice producing anti-factor VIII, or else transformed in the presence of the EBV virus.
  • Anti-CD40 antibodies recognize a membrane antigen and activate B cells in the presence of a line of fibroblasts (Banchereau et al. (1991)). It is therefore possible to envisage the use of these immunodominant epitopes as a possible target of immunotherapy.
  • MHC class I and class II markers carried by the clones of B lymphocytes makes it possible to analyze the immune response of anti-factor VIII at the genetic level, and thus to follow the recognition by specific T cells. This is also a great method to see if there is a risk factor associated with this condition.
  • BALB / C mice chosen for the preparation of anti-factor VIII mAbs are injected three times beforehand, 2 weeks apart with a solution of recombinant factor VIII (rFVIII).
  • This type of preparation has the advantage of containing a factor VIII of high purity at a high concentration with a minimum of contaminating proteins.
  • SP207 mouse myeloma
  • the selection of hybridomas producing anti-factor VIII antibodies are carried out by the ELISA technique using polystyrene plates on which rFVIII has previously been insolubilized.
  • Supernatants of hybridomas containing anti-factor VIII antibodies are cloned by the limiting dilution technique, then cultured in vitro.
  • the antibodies are purified by chromatography from these supernatants.
  • the quantification, the determination of the light chain (k or 1) and the subclass (IgGl, IgG2a, IgG2b, IgG3) of anti-factor VIII mAbs are carried out by the ELISA technique.
  • the determination of the epitopes recognized on the factor VIII molecule is carried out by the immunoblot technique with native factor VIII solutions or after enzymatic cleavage with thrombin.
  • the capacity of the anti-factor VIII mAbs produced to inhibit function is evaluated, for each of these, by a coagulation method (Bethesda method) (Kasper et al.
  • the cell lines producing human monoclonal anti-factor VIII antibodies are derived from human B lymphocytes taken from the abdominal cavity of SCID mice immunized with different batches of factor VIII after reconstitution of the animal immune system with human lymphocytes.
  • the B lymphocytes are cultured in the presence of fibroblastic cells expressing a receptor for the Fc portion of the immunoglobulins to which a monoclonal anti-CD40 antibody is attached.
  • These cells activated by the polymerization of the CD40 receptor, are then infected and immortalized by the Epstein-Barr virus (Kozbor, (1981)).
  • the cell lines producing the desired antibodies can then be subcloned.
  • Another aspect of the invention relates to an anti ⁇ inhibitor characterized in that it is directed against said factor VIII inhibitor previously described.
  • anti-inhibitor directed against the factor VIII inhibitor means any biological molecule and / or cell capable of interfering with said inhibitor so as to ensure its inactivation.
  • such an anti-inhibitor is an antibody (monoclonal or polyclonal), or a fragment of anti-idiotypic anti-factor VIII antibody.
  • these anti-inhibitors directed against factor VIII inhibitors are synthesized by a "chimeric" animal exhibiting a human immune system such as a SCID-hu mouse. Only mice which produce less than 10 ⁇ g / ml of residual immunoglobulins are used for the experiments.
  • the model is developed using peripheral white blood cells from volunteers immunized against tetanus.
  • Reconstitution is carried out with a single i.p. from 15 to 20,106 mononuclear cells of human origin. These cells are obtained after centrifugation in a Ficoll-Hypaque gradient of peripheral blood (approximately 200 ml). Twelve to twenty mice can be reconstructed from a single donor. The production of human immunoglobulins is measured as a function of time.
  • Anti-idiotypic anti-factor VIII antibodies are purified from a starting plasma pool, which is made up of voluntary donations from at least 7200 donors to increase the probability of finding anti-idiotypic antibodies, by immunoaffinity by means of human anti-factor VIII antibodies covalently attached to a Sepharose column or by an Fc part to a protein G column. After fractionation, by the Cohn-Oncley method, two rich Fr II and Fr III fractions in IgG are obtained. They will serve as a starting preparation for the purification of anti-idiotypic antibodies. These monoclonal antibodies will be obtained from B cells collected from hemophiliac patients. These cells have previously proliferated in SCID mice and have been transformed into secreting cell cultures by the EBV virus.
  • the idiotype specific to human antibodies is analyzed by sequencing the variable part of the molecule. These data "are of extreme importance, because they are of great utility .. both in the diagnosis and the regulation of the production of anti-factor VIII.
  • Anti-factor VIII antibodies prepared from a pool of gamma globulins can advantageously replace the autologous source.
  • Another aspect of the invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising an element chosen from the group consisting of said factor VIII antigenic polypeptide sequence, fragments, epitopes thereof and / or strong parts of said epitopes or said fragments, a a factor VIII inhibitor directed against them, an anti-inhibitor directed against said inhibitor, and / or a mixture of them.
  • a diagnostic and / or purification device such as a diagnostic kit or a chromatography column (as described by Ezzedine et al. (1993)), comprising an element chosen from group consisting of the antigenic polypeptide sequence according to the invention, fragments, epitopes thereof and / or the strong parts of said epitopes or said fragments, the complex according to the invention, an inhibitor directed against them, an anti-inhibitor directed against said inhibitor, and / or a mixture thereof.
  • the purification device can therefore consist of a chromatography column as described by Ezzedine et al. (1993), comprising the factor VIII sequence, fragments, epitopes thereof and / or the strong parts of said fragments or epitopes attached to the solid phase of the chromatography column.
  • a physiological liquid (such as serum) from a patient comprising inhibitors of factor VIII is then passed over this chromatography column, said inhibitors (for example antibodies) binding specifically to said factor VIII, said fragments. said epitopes or said strong parts.
  • a final aspect of the invention relates to the use of the pharmaceutical composition according to the invention, for the preparation of a medicament intended for the prevention and / or treatment of immune disorders, in particular those induced by factor VIII inhibitors , von Willebrand factor VIII binding inhibitors (vWF) and / or inhibitors of factor VIII binding to membrane phospholipids.
  • anti-inhibitors anti-idiotypic anti-factor VIII antibodies
  • vWF von Willebrand factor VIII binding inhibitors

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Abstract

La présente invention concerne une séquence polypeptidique antigénique du facteur VIII, comprise entre l'Acide Glutamique 1649 et l'Asparagine 2019, de préférence comprise entre l'Arginine 1652 et l'Arginine 1917 de la séquence polypeptidique du facteur VIII, ou comprise entre l'Alanine 108 et la Méthionine 355, ou comprise entre l'Acide Aspartique 403 et l'Acide Aspartique 725, ou comprise entre la Lysine 2085 et la Lysine 2249.

Description

SEQUENCE POLYPEPTIDIQUE ANTIGENIOUE DU FACTEUR VIII.
FRAGMENTS ET/OU EPITOPES DE CELLE-CI.
Objet, dg l'invention,
La présente invention concerne la séquence polypeptidique antigénique du facteur VIII, des fragments, des épitopes de celle-ci et les parties fortes de ces épitopes, les inhibiteurs dirigés contre cette séquence, ses fragments, ses épitopes et/ou les parties fortes de ces épitopes, ainsi que les anti-inhibiteurs dirigés contre lesdits inhibiteurs. La présente invention concerne également une composition pharmaceutique ainsi qu'un dispositif de diagnostic comprenant les molécules sus-mentionnées.
Arrière-Plan technologique à la base de l'invention.
Récemment, ont été mises en quantités suffisantes, à la disposition des hémophiles, des préparations de facteur
VIII purifiées à partir de grands pools de plasma par chromatographie échangeuse d'ions, ou très récemment par immunoaffinité.
Différentes préparations de FVIII obtenues par ingénierie génétique sont actuellement en développement ou en étude clinique. Ces FVIII sont soit des molécules entières, soit délétées (Bihoreau (1992)).
Le FVIII est un cofacteur glycoprotéinique de la coagulation plasmatique et agit au niveau de l'activation du facteur X (FX) . La caracterisation du FVIII et de son mécanisme d'action est rendue plus ardue par sa faible concentration dans le plasma, l'hétérogénéité de taille, et son extrême sensibilité a la dégradation enzymatique. Cette reaction comprend la proteolyse du FX en facteur X active (FXa = facteur Stuart) et fait intervenir un complexe (complexe Tenase) comprenant l'enzyme (FIX activé ou FIXa) , un cofacteur (le FVIII activé ou FVIIIa) , des ions calcium et des phospholipides.
Le FVIII est une protéine si complexe que, bien que la séquence du gène soit connue depuis 1984 (Verhar et al., Nature 312, pp. 317-342 (1984)), la structure complète du FVIII plasmatique n'est pas encore établie (près de 50% de la protéine a seulement été séquencée) ainsi que la structure précise des carbohydrates. La séquence de DNA a été admise comme définissant la séquence primaire du FVIII (rare exception aux directives prescrites par la FDA pour les produits thérapeutiques issus de la biotechnologie) .
Cependant, des différences subtiles entre le FVIII plasmatique et le FVIII recombinant ont été établies : glycosylation, demi-vie plasmatique après infusion, ... . Le FVIII est essentiellement synthétisé dans les hépatocytes. Il a été clone dans des cellules de mammifères, d'insectes et de levures (Webb et al., 1993) . Ces glycoprotémes produites par des processus biotechnologiques peuvent présenter des différences dans la structure et la composition des sucres par rapport à la protéine naturelle. Le cDNA du FVIII a aussi été exprimé dans des ovins transgéniques (Halter et al., 1993) .
Le cDNA code pour un polypeptide de 2351 acides aminés y compris le peptide signal de 19 acides aminés clivé dans le réticulum endoplasmique. Des modifications post-traductionnelles ont lieu dans l'appareil de Golgi: glycosylation des serines et des thréonmes et addition d'ions sulfates aux résidus tyrosine. Après maturation, la protéine est ensuite sécrétée dans le plasma, sous forme de 2 chaînes 210 kDa (là 1648 résidus) et 80 Da (de 1649 à 2332 résidus) unies par un ion divalent, et dont la plus légère est associée de manière non covalente au Facteur von Willebrand (vWf) par son extrémité N-terminale (1 molécule vWf par molécule de FVIII) . Dans le plasma, ce complexe est stabilisé par des liens hydrophobes et hydrophiles en présence de 50 fois plus de vWf. Ce dernier inhiberait la fixation du FVIII aux phospholipides. Le fait que FVIII se lie aux plaquettes a été établi, toutefois la présence de récepteurs spécifiques exprimés à la surface des plaquettes n'a pas été clairement démontrée (Neshei et al., 1993) . Après sa fixation sur les phospholipides membranaires, il démasquerait des sites de liaison de haute affinité pour le FIXa (Bardelle et al.,1993).
Le FVIII est formé de trois domaines structuraux A, B et C (Kaufman RJ, 1992; Bihoreau et al., 1992) organisés en Al :A2:B:A3:C1:C2 (figure 1). Les domaines A ont plus de 40% d'homologie et sont aussi homologues à la céruloplasmine. Il existe également 30% d'homologie entre le domaine A du facteur V et du FVIII. Le domaine C intervient deux fois et serait capable de lier des glycoconjugués et des phospholipides à charge nette négative (Kemball-Cook and Barrowcliffe (1992) ; Fay, PJ, 1993) ) . II présente une homologie avec des lectines capables de se lier aux phospholipides chargés négativement. C'est à ce niveau qu'a été localisé le site de fixation aux plaquettes (domaine C2) (Foster et al., (1990)) . Le domaine B qui représente plus de 40% de la masse du FVIII, n'a aucune activité spécifique connue mais pourrait jouer un rôle subtil dans la régulation de FVIII en Le protégeant par exemple de l'action de la thro bine. Il n'a pas d'homologie connue avec d'autres protéines.
Il possède 19 sites de glycosylation sur les 25 identifiés pour le FVIII. La comparaison des séquences en acides aminés entre les FVIII humain et porcin, fait apparaître des différences majeures au niveau de cette région B. Néanmoins le FVIII porcin est utilisé efficacement pour traiter les hémophiles présentant des inhibiteurs. Ces observations ont mené à la construction d'un gène FVIII délété dans la partie codante de cette région B et qui permet la production d'un FVIII recombinant delété destiné au traitement de l'hémophilie. Par îmmunopuπfication, différentes formes de FVIII actif ont été isolées qui ont en commun une chaîne légère de 80 kDa et dont la chaîne lourde peut avoir un poids moléculaire entre 210 et 90 kDa. Ces formes seraient issues de la dégradation progressive de l'extrémité C-termmale de la chaîne lourde. La liaison des deux chaînes est non covalente et résulte via une liaison d'un ion métallique divalent (Me++) entre les résidus responsables des domaines Al et A3. Après formation du complexe activé (50-45 kDa) (chaîne lourde avec domaine A2 accessible) et 70 kDa (chaîne légère) , une phase d' mactivation est observée suite probablement à un contact prolongé à la thrombine et une dissociation des fragments 50 kDa et 45 kDa. Le FVIIIa est aussi inactivé par la protéine C activée (APC) après proteolyse de la chaîne lourde. Cette mactivation est accélérée si le FVIIIa est fixé sur une surface phospholipique. Cette "down-regulation" de l'activité du FVIIIa dépendrait d'une phosphorylation par un enzyme plaquettaire (Kalafatis et al, (1990)). La plupart des épitopes reconnus par les divers monoclonaux murins isolés à ce jour ne semblent pas être localisés dans les "sites fonctionnels" du FVIII. Quelques épitopes reconnus par des anticorps ayant un effet sur l'activité du FVIII (inhibition du test chromogénique et/ou clottmg) ont été identifiés.
Ces déterminants antigémques sont constitués des fragments 351 - 365 (domaine Al - chaîne lourde) , 713 - 740 (domaine A2) , 1670 - 1684 (domaine A3 - chaîne légère) (NH2 terminal de la chaîne légère) ou encore 2303 - 2332 (domaine C2 - chaîne légère) (Foster C, (1990)), les fragments 701 - 750 (Ware et al. (1989)), 1673 - 1689 (Leyte et al. (1989)), 330 - 472, 1694- 1782 (EP-0 202 853), 322 - 740 et 2170 - 2322 (Scandella et al. (1992)).
Les anticorps reconnaissent ces divers sites, interfèrent respectivement avec l'activation du FVIII, la liaison du vWf ou la liaison des phospholipides. D'autres anticorps, non inhibiteurs des tests classiques d'activité in vitro, peuvent agir sur l'action du FVIII avec les autres constituants de la cascade de coagulation en se fixant sur des sites de la molécule fort distants des sites actifs. Ceux-ci, ainsi modifiés, peuvent interférer avec le reploiement naturel du FVIII, altérant certaines de ses propriétés ("modèle allostérique") .
Ces expériences de "mapping" utilisent des peptides synthétisés par des fragments de gènes du FVIII clones dans E coii, et ne permettant qu'une idée approximative de la localisation des déterminants antigéniques reconnus par ces monoclonaux. En effet, la taille des fragments identifiés s'échelonne entre 30 et 100 acides aminés.
Actuellement, pour identifier sans équivoque les sites antigéniques d'une protéine, il faut la cristalliser et l'analyser aux RX. Malheureusement, on ne dispose d'aucune donnée pour le FVIII dont le haut poids moléculaire est un handicap majeur pour la cristallisation.
Les régions antigéniques coïncident avec le caractère hydrophile de ces régions : plus la séquence oligopeptidique sera exposée au milieu extérieur (située à la surface) , plus cette partie sera susceptible d'être reconnue dans une réaction d'immunisation. Par contre, les parties hydrophobes, situées généralement à l'intérieur de la protéine, sont considérées comme peu antigénique.
Actuellement, une notion qui prédomine chez les patients hémophiles, les cliniciens et les fractionneurs, est la disponibilité d'un FVIII purifié, dépourvu de tout contaminant plasmatique pathogène et d'effets secondaires. Cependant, que ce soit après immunopurification à l'aide de monoclonaux murins, ou après obtention par recombinaison génétique dans des cellules de mammifères, le FVIII hautement purifié est extrêmement instable pour des raisons qui ne sont pas apparentes. Pour pouvoir le stabiliser, on ajoute des quantités importantes d'albumine humaine plasmatique au cours de la purification de sorte que l'activité spécifique finale est de l'ordre de 2-3 U/mg protéine. Il en va de même pour le rFVIII coexprime avec du facteur von illebrand, stabilisateur naturel, dans des cellules CHO. Ces données semblent suggérer une influence des étapes de purification sur la molécule de FVIII, pouvant interférer avec son reploiement naturel, introduire des changements conformationnels plus ou moins stables et dévoiler des épitopes potentiels nouveaux après infusion chez le patient.
Une des complications sérieuses présente chez 5 à 50% selon les auteurs (L]ung et al. (1992); Sultan et al., (1992); Lorenzo et al. (1992)) des hémophiles qui reçoivent des infusions thérapeutiques multiples de FVIII, est l'apparition d'anticorps (inhibiteurs) qui inactivent le FVIII et rend inefficace toute injection ultérieure de FVIII. L'apparition spontanée d'auto-anticorps avec une activité anti-FVIII pathologique est rare chez les non-hémophiles (prévalence: 10"5) et est signalée chez les individus âgés, manifestant des troubles immunologiques ou en post-partum (Kessler (1991), Hultin (1991)). Une étude multicentrique effectuée sur 3435 patients hémophiles, montre que tous les groupes d'âge sont concernés y compris les patients de moins de 5 ans. La majorité (82%) présentent une réponse très élevée (>10 BU) (Sultan et al. (1992)). Ces anti-FVIII seraient composés essentiellement de IgG, de type IgG4 mais, des IgG2 (Gilles et al. (1993)b) IgA et des IgM ont été aussi décrits (Lottenburg et al. (1987)) . Ils réagissent faiblement avec des molécules FVIII hétérologues purifiées d'autres mammifères (Bennett, B et al. (1972)) . A l'heure actuelle, on ignore les causes qui induisent chez certains hémophiles l'apparition des inhibiteurs. S'il existe une association entre la sévérité de la délétion du gène et le développement d'une réponse îmmmunitaire ne reconnaissant plus le FVIII comme une protéine du soi, cette association n'est démontrée que chez une minorité de patients. Aucune susceptibilité spécifique de l'hôte, liée à des marqueurs génétiques, n'a pu être mise en évidence comme par exemple une association privilégiée avec certains déterminants du complexe MHC de classe II (Hoyer (1991)), sans doute, parce que tous les épitopes du FVIII, reconnus par les anticorps spécifiques n'ont pas encore été déterminés. Il semble aussi que les différentes méthodes de préparation du FVIII pourraient influencer sa structure, ses propriétés physico-chimiques ou son micro-environnement naturel (Vermeylen, J and Peerlinck (1991); Gomperts, et al. (1992); Peerlinck et al. (1993)). Barrowcliffe et al. (1983) ont montré que les phospholipides protégeraient l'activité procoagulante de l'inactivation par des anticorps spécifiques humains. La présence d'anticorps naturels anti-FVIII chez 17% de donneurs sains (screening effectué sur 500 dons de plasma) , sans manifestation pathologique, démontre l'importance de mieux connaître l'aspect structurel tridimensionnel que revêt un FVIII physiologique (Ciavarella and Schiavoni (1992)).
La transfusion étudiée sur des cultures mixtes de lymphocytes, chez des modèles animaux et lors d'essais cliniques, a montré une modification de l'immunomodulation chez le transfusé, induisant une allo-immunisation et aussi une down-regulation de certaines fonctions immunitaires. Elle se manifeste sous forme de cellules suppressives, d'anticorps anti-idiotypes ou une diminution des cellules NK. Tout se passe comme si on induisait un certain degré de tolérance. Ces effets peuvent être renversés par l'infusion de l'interleukine-2
(IL-2) (Triulzi et al., 1990). In vitro, un effet inhibiteur de la sécrétion de IL-2 ainsi que la prolifération de mononucléaires de sang périphérique, sont obtenus en présence de cryoprécipité ou des préparations peu purifiées de FVIII (0,5 à 10 U/mg protéines) (Madhok et al., 1991; adhwa, M et al., 1992). Ces effets ne sont pas observés en présence de rFVIIl ou de FVIII purifiés par immunoaffinité. Cette dernière préparation aurait un effet activateur sur les cellules T
(Madhok et al., 1991). Toutefois, ces données ne sont pas directement extrapolables à une situation in vivo.
Il n'existe aucun modèle expérimental permettant de poser un pronostic quant à l'immunogénéicité ou l'effet immunomodulateur des préparations de FVIII ou la susceptibilité de l'hôte avant leur administration clinique. Ce modèle devient une nécessité absolue devant l'augmentation de la fréquence d'apparition d'anticorps anti-FVIII lors des essais cliniques actuels utilisant des préparations de FVIII de très haute activité spécifique obtenues soit par immunopurification soit par des techniques d'ingénierie du DNA (Seremetis et al. (1991)) . De plus, Aledorf (1993) montre qu'en utilisant ces deux types de préparations chez des sujets vierges, non transfusés auparavant (PUPS) , on observe une prévalence en inhibiteurs allant jusqu'à 27%. Etat de la technicrue.
Les patients qui développent une réponse immune anti-FVIII se trouvent dans une situation grave qui nécessite l'utilisation de moyens lourds, agressifs et excessivement coûteux. Une des techniques les plus utilisées est de noyer l'organisme en injectant régulièrement de très hautes doses de FVIII (100 à 200 U/kg/jour) (Ewing et al. (1988)) en association avec un complexe Prothrombine concentré (FEIBA) (protocole de Bonn) , ce qui réduit effectivement le taux d'inhibiteurs dans le sang (Sultan et al., 1986). De plus, ce type de traitement doit être poursuivi pendant un temps très long (Lian et al., 1989). Les essais menés en utilisant des doses moindres de FVIII ont rencontré un certain succès chez des patients dont le taux d'anticorps anti-FVIII est beaucoup plus faible (Gruppo, (1991)).
Une voie alternative est l'utilisation de FVIII d'espèce non humaine comme celle de porc, non neutralisé par les anti-FVIII du patient et permettant l'hémostase. Une étude multicentrique a montré les bénéfices d'un tel traitement mais a aussi mis en évidence des anticorps anti-FVIII porcin (Lozier
(1993); Moreau et al. (1993); Hay and Bolton-Maggs (1991);
Clyne et al. (1992)). Le facteur VIII activé, obtenu par DNA recombinant, a été aussi utilisé comme voie alternative de la coagulation chez des patients présentant des inhibiteurs (Ingerslev et al. (1991)) .
Récemment, une stratégie fructueuse (Nilsson et al. (1990)) pour réduire le taux d'inhibiteurs a consisté à soumettre les patients à une circulation extra-corporelle pour permettre l'absorption en phase solide des IgG totales sur Protéine A tout en les traitant avec des agents cytostatiques comme la cyclophosphamide.
L'infusion d'immunoglobulines intraveineuses polyvalentes (IVIG) combinées ou non avec un traitement im unosuppresseur s'est révélée relativement efficace, la raison de cette efficacité n'étant pas encore bien établie. Différentes hypothèses ont été avancées impliquant une inhibition feed-back de la synthèse des IgG, le stimulation de leur clearance, l'activation des T suppresseurs (Bloom (1992)). Une explication intéressante est que ces immunoglobulines intraveineuses commerciales contiendraient des anticorps capables de réagir avec des anticorps anti-FVIII au niveau de leur partie variable (idiotypes) et les neutraliser. Cette activité anti-idiotype serait spécifique à chaque donneur et pourrait être synergique dans un pool d'IgG (Dietrich et al. (1992) ) .
Malheureusement, aucune de ces approches ne s'est révélée satisfaisante en termes de sécurité, d'efficacité et de coût. 9utg de l'invention.
La présente invention vise à obtenir une séquence polypeptidique antigénique du facteur VIII, des fragments et des épitopes de celle-ci, destinés à améliorer le diagnostic et/ou la thérapie de désordres immunitaires, en particulier ceux induits par les inhibiteurs du FVIII, les inhibiteurs de la liaison du FVIII au facteur de von Willebrand (vWf) et/ou aux phospholipides membranaires (PL) .
Un autre but de l'invention vise à obtenir des inhibiteurs présentant une immunoaffinité avec cette séquence polypeptidique antigénique, ses fragments et/ou ses épitopes, destinés également à améliorer le diagnostic et/ou la thérapie de desordres immunitaires.
Un but complémentaire vise a obtenir des anti- înhibiteurs, en particulier des anticorps, dirigés contre lesdits inhibiteurs susmentionnés, destinés à améliorer le diagnostic et/ou la thérapie de désordres immunitaires. Brève description des figures. La figure 1 représente de manière schématique la séquence polypeptidique du facteur VIII. La figure 2 représente le graphique d'hydrophilicité de la séquence A3 du facteur VIII renumérotée de 1 à
371 acides aminés (valeur de surface pour chaque acide aminé) . La figure 3 représente le graphique de flexibilité de cette séquence A3 du facteur VIII. La figure 4 représente le graphique d'accessibilité de cette séquence A3 du facteur VIII. La figure 5 représente le graphique général reprenant la somme des valeurs définies dans les graphiques 2 à 4. La figure 6 représente la mise en évidence d'anticorps anti¬ facteur VIII dans les sera de souris par un test ELISA. Eléments caractéristiques de l'invention.
La présente invention concerne la séquence polypeptidique antigénique du facteur VIII et/ou des fragments de celle-ci, tels que décrits par Verhar et al. (Nature, vol. 312, p 339 (1984) ) .
On entend par "séquence polypeptidique du facteur VIII" la séquence naturelle humaine ou animale, éventuellement glycosylée, obtenue par purification de pools de plasma, en particulier la fraction I de Cohn, par synthèse et/ou ingénierie génétique (c'est-à-dire également une séquence éventuellement délétée des portions n'intervenant pas dans le mécanisme de coagulation sanguine) du facteur VIII. La présente invention concerne en particulier la séquence polypeptidique antigénique du facteur VIII dépourvue des fragments Alanine 322 - Serine 750, Leucme 1655 - Arginine 1689, Lysine 1694 - Prolme 1782 et Acide Aspartique 2170 - Tyrcsme 2332.
La présente invention concerne en particulier les séquences polypeptidiques antigéniques Al, A2, A3, et C (Cl et C2) du facteur VIII.
Dans la suite du texte, les acides aminés seront représentés par leur abréviation en trois lettres ou par le symbole d'une lettre unique telle qu'identifiée dans le tableau ci-dessous.
Alanine Ala A Leucme Leu L
Arginine Arg R Lysine Lys K
Asparagine Asn N Méthionine Met M
Acide Asp D Phénylalanme Phe F Aspartique
Cystéine Cys C Proline Pro P
Glutamme Gin Q Serine Ser S
Acide Glu E Thréonine Thr T Glutamique
Glycine Gly G Tryptophane Trp w
Histidine His H Tyrosine Tyr Y
Isoleucme Ile I Valme Val V
Une première forme d'exécution de l'invention concerne la séquence polypeptidique antigénique A3 du facteur VIII, des fragments et/ou des épitopes de celle-ci. Ladite séquence est comprise entre l'Acide Glutamique 1649 et l'Asparagine 2019, de préférence comprise entre l 'Arginine 1652 et l 'Arginine 1917 ou entre l'Arginine 1803 et l'Arginine 1917, de la séquence polypeptidique du facteur VIII telle que publiée par Verhar et al. (Nature, vol. 312, p 339 (1984)) et Toole et al. (Nature, vol. 312, pp. 342-347 (1984)) .
Préférentiellement, les fragments de ladite séquence sont compris entre l'Arg ine 1652 et l 'Arginme 1696, de préférence entre l'Arginine 1652 et l'Argmine 1689, entre la Thréonine 1739 et l'Acide Aspartique 1831 ou entre l'Acide Glutamique 1885 et l'Arginine 1917.
L'invention concerne également les épitopes de séquence de ces fragments, notamment:
- l'épitope compris entre l'Arginine 1652 et la Tyrosine 1664 défini par la séquence suivante :
SEQ ID NO:l:
Arg Thr Thr Leu Gin Ser Asp Gin Glu Glu Ile Asp Tyr 1 5 10
- l'épitope compris entre l'Acide Aspartique 1681 et l'Arginine 1696 défini par la séquence suivante : SEQ ID NO:2:
Asp Glu Asp Glu Asn Gin Ser Pro Arg Ser Phe Gin Lys Lys Thr Arg 1 5 10 15
- l'épitope compris entre la Thréonine 1739 et la Tyrosine 1748 défini par la séquence suivante :
SEQ ID NO:3:
Thr Asp Gly Ser Phe Thr Gin Pro Leu Tyr 1 5 10
- l'épitope compris entre l'Asparagine 1777 et la Phenylalanine 1785 défini par la séquence suivante :
SEQ ID NO:4:
Asn Gin Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe 1 5
- l'épitope compris entre l'Acide Glutamique 1794 et la Tyrosine 1815 défini par la séquence suivante :
SEQ ID NO:5: Glu Asp Gin Arg Gin Gly Ala Glu Pro Arg Lys Asn Phe Val Lys Pro 1 5 10 15
Asn Glu Thr Lys Thr Tyr 20 - l'épitope compris entre la Méthionine 1823 et l'Acide Aspartique 1831 défini par la séquence suivante : SEQ ID NO: 6:
Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp 1 5
- l'épitope compris entre l'Acide Glutamique 1885 et la Phenylalanine 1891 défini par la séquence suivante :
SEQ ID NO:7: Glu Thr Lys Ser Trp Tyr Phe 1 5
- l'épitope compris entre l'Acide Glutamique 1893 et l'Alanine 1901 défini par la séquence suivante : SEQ ID NO:8:
Glu Asn Met Glu Arg Asn Cys Arg Ala 1 5
- l'épitope compris entre l'Acide Aspartique 1909 et l'Arginine 1917 défini par la séquence suivante :
SEQ ID NO:9:
Asp Pro Thr Phe Lys Glu Asn Tyr Arg 1 5
Avantageusement, ladite séquence, ses fragments particuliers et ses épitopes présentent une caractéristique antigénique illustrée par les figures 2 à 5 annexées.
Une autre forme d'exécution préférée de l'invention concerne la séquence polypeptidique antigénique Al du facteur VIII, des fragments et/ou des épitopes de celle-ci.
Préférentiellement, les fragments de ladite séquence sont compris entre l'Alanine 108 et la Méthionine 355, de préférence entre l'Alanine 108 et la Glutamine 228.
L'invention concerne également les épitopes de séquence de ces fragments, notamment : - l'épitope compris entre l'Alanine 108 et la Val e 128 défini par la séquence suivante : SEQ ID NO:10:
Ala Ser Glu Gly Ala Glu Tyr Asp Asp Gin Thr Ser Gin Arg Glu Lys 1 5 10 15
Glu Asp Asp Lys Val 20
- l'épitope compris entre l'Acide Glutamique 181 et la Leucme 192 défini par la séquence suivante : SEQ ID NO: 11:
Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr Gin Thr Leu 1 5 10
- l'épitope compris entre l'Acide Aspartique 203 et la Glutamine 218 défini par la séquence suivante : SEQ ID NO: 12:
Asp Glu Gly Lys Ser Trp His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gin 1 5 10 15 - l'épitope compris entre l'Acide Aspartique 327 et la Méthionine 355 défini par la séquence suivante : SEQ ID NO:13:
Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro Gin Leu Arg Met Lys Asn Asn Glu Glu 1 5 10 15 Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp Leu Thr Asp Ser Glu Met
20 25
Une autre forme d'exécution préférée de l'invention concerne la séquence polypeptidique antigénique A2 du facteur VIII, des fragments et/ou des épitopes de celle-ci. Préférentiellement, les fragments de ladite séquence sont compris entre l'Acide Aspartique 403 et l'Acide Aspartique 725, de préférence entre l'Histidme 693 et l'Acide Aspartique 725.
L'invention concerne également les épitopes de la séquence de ces fragments, notamment : - l'épitope compris entre l'Acide Aspartique 403 et la Lysine 425 défini par la séquence suivante :
SEQ ID NO: 14:
Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gin Tyr Leu Asn Asn Gly Pro Gin Arg 1 5 10 15
Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys
20
- l'épitope compris entre la Valine 517 et l'Arginine 527 défini par la séquence suivante :
SEQ ID NO:15:
Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp Pro Arg 1 5 10
- l ' épitope compris entre l ' Histidme 693 et la
Glycine 701 défini par la séquence suivante : SEQ ID NO : 16 :
His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly 1 5
- l'épitope compris entre la Serine 710 et l'Acide Aspartique 725 défini par la séquence suivante :
SEQ ID NO:17:
Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp Tyr Try Gly Asp Ser Tyr Glu Asp 1 5 10 15
Une dernière forme d'exécution préférée de l'invention concerne la séquence polypeptidique antigénique C du facteur VIII, des fragments et/ou des épitopes de celle-ci. De préférence, les fragments de ladite séquence sont compris entre la Lysine 2085 et la Lysine 2249, de préférence entre la Lysine 2085 et la Glycine 2121.
L'invention concerne également les épitopes de la séquence de ces fragments, notamment : - l'épitope compris entre le Lysine 2085 et la Phenylalanine 2093 défini par la séquence suivante :
SEQ ID NO: 18:
Lys Thr Gin Gly Ala Arg Gin Lys Phe 1 5
- l'épitope compris entre l'Acide Aspartique 2108 et la Glycine 2121 défini par la séquence suivante :
SEQ ID NO: 19: Asp Gly Lys Lys Trp Gin Thr Tyr Arg Gly Asn Ser Thr Gly 1 5 10
- l'épitope compris entre la Glycine 2242 et la Lysine 2249 défini par la séquence suivante : SEQ ID NO:20:
Gly Val Thr Thr Gin Gly Val Lys 1 5
L'invention concerne également les parties fortes desdits épitopes ou desdits fragments, c'est-à-dire les portions de séquence desdits épitopes comprenant les acides aminés Tyrosine et Histidme, qui présentent de manière inattendue une affinité particulièrement élevée vis-à-vis des inhibiteurs du facteur VIII. De préférence, ces parties fortes comprennent ledit acide aminé Tyrosine ou Histidine lié à au moins deux autres acides aminés identiques ou différents.
Ces séquences, ces fragments et ces épitopes, en particulier les parties fortes des épitopes ou des fragment, sont caractérisés de manière particulièrement avantageuse par une hydrophilicité élevée telle que décrite par Parker, Guo et Hodges (Biochemistry 25, pp 5425-5432 (1986)), une importante flexibilité telle que décrite par Karplus et Schultz (Naturwissenschaften 72, p 212 (1985) ) et une importante accessibilité telle que décrite par Janin (Nature 277, pp 491- 492 (1979)) (voir figures 2 à 5) .
Ces fragments et ces épitopes sont en particulier exposés à la surface de la protéine du facteur VIII et présentent une caractéristique antigénique marquée.
Avantageusement, ladite séquence polypeptidique, ses fragments, ses épitopes et/ou ces parties fortes desdits fragments ou desdits épitopes sont également indépendamment immunogènes (c'est-à-dire qu'ils sont immunogènes même sans être complexés à une protéine de grande taille telle que la BSA, l'hémocyanine, ... ) , et présentent de préférence une immunoaffinité avec des inhibiteurs du facteur VIII, tels que des anticorps anti-facteur VIII et/ou présentent une immunoaffinité pour les récepteurs des lymphocytes T et/ou B.
Cette séquence, ces fragments, ces épitopes et/ou les parties fortes desdits fragments ou desdits épitopes provoquent une réaction immunitaire (synthèse d'anticorps) lorsqu'ils sont injectés à un lapin. Ces caractéristiques sont particulièrement importantes pour les épitopes SEQ ID NO:2 et SEQ ID NO:5 qui comprennent des séquences relativement "longues" en acides aminés, respectivement de 16 et 22 acides aminés.
Ces séquences sont donc caractérisées par une importante immunogénéicité vis-à-vis d'anticorps monoclonaux et polyclonaux.
Cependant, ces séquences sont suffisamment courtes pour être aisément obtenues par synthèse.
A titre d'exemple, les peptides Asp 1681 - Arg 1696 et Asp 327 - Met 355 ont été synthétisés pour mettre en évidence des anticorps anti-facteur VIII dans les sera de souris par un test ELISA.
Les peptides libres (non couplés à une protéine vectrice) ont été injectés à deux souris BALB/C selon le schéma suivant :
- jour 0 100 μg de peptide émulsionné dans de l'adjuvant de
Freund incomplet sont injectés par voie intramusculaire.
- jours 7, 14, 21 et 28 : immunisation avec 50 μg de peptide. Un échantillon de sang est prélevé chaque jour avant l'injection. Des plaques de microtitration en polystyrène (NUNC) sont saturées avec une préparation de facteur plasmatique diluée à l'aide de 40 Ul/ml. 50 μl de dilutions croissantes (1/60, 1/300 et 1/600 à des antiséra de souris sont ajoutés aux puits. Après incubation et lavage, la présence d'anticorps anti-facteur VIII est mise en évidence par l'addition de 50 μl d'une dilution 1/5000 d'un anticorps de lapin anti-IgG de souris marquée à la biotine. Après incubation et lavage, les puits sont incubés avec 50 μl d'avidine-peroxydase (1/2500) et lavés, et finalement, 100 ml d'OPD sont ajoutés aux puits. La densité optique est mesurée à 490 mm. Les résultats des ELISA sont repris dans la figure 6 annexée (EXA, EX2 et un échantillon BLC qui sert de blanc) . La présente invention concerne également les épitopes conformationnels comprenant au moins deux fragments différents de ladite séquence, au moins deux épitopes de séquence et/ou au moins deux parties fortes desdits épitopes ou desdits fragments différents selon l'invention et identifiés ci-dessus. Les épitopes conformationnels sont composés de deux ou plusieurs portions différentes d'une séquence polypeptidique situées à proximité les unes des autres lors du reploiement de la protéine dans sa structure tertiaire ou quaternaire.
Ces épitopes sont susceptibles d'être "reconnus" (c'est-à-dire de présenter une immunoaffinité), de préférence simultanément, avec des inhibiteurs du facteur VIII, notamment des lymphocytes B (via le locus majeur d'histoco patibilité
(MHC I et/ou II)) et/ou des anticorps anti-facteur VIII
(Scandella et al., Blood 76, p 437 (1990)). De préférence, ladite séquence, lesdits fragments, lesdits épitopes et/ou les parties fortes desdits épitopes ou desdits fragments sont complexés avec une protéine porteuse ou un peptide porteur, tels que la BSA ou l'hémocyanine, de manière à former un complexe présentant une plus forte immunogénéicité. 19
Un autre aspect de la présente invention concerne un inhibiteur du facteur VIII présentant une immunoaffinité avec la séquence polypeptidique antigénique selon la présente invention, avec des fragments, des épitopes de celle-ci, des parties fortes desdits épitopes ou desdits fragments et/ou le complexe selon l'invention.
On entend par inhibiteur, toute molécule biologique ou cellule intervenant avec et/ou contre le facteur VIII, et susceptible de créer des désordres immunitaires. En particulier, un tel inhibiteur peut être un anticorps (gammaglobuline) monoclonal ou polyclonal ou un fragment d'anticorps anti-facteur VIII (tel que la portion hypervariable Fab dudit anticorps) , qui inactive ledit facteur VIII et/ou qui inhibe la liaison du facteur VIII au facteur de von Willebrand et/ou aux phospholipides membranaires.
Avantageusement, lesdits inhibiteurs sont synthétisés par un animal "chimérique" comportant un système immunitaire humain tel qu'une souris SCID-hu produisant des anticorps humains. Les souris SCID (severe combined immunodeficient) sont des souris présentant une déficience en lymphocytes B et T fonctionnels due à un dysfonctionnement de la recombinaison des gènes responsables des récepteurs antigéniques. Le système immunitaire des souris SCID peut être reconstitué avec des cellules immunocompetentes d'origine humaine provenant d'organes fétaux ou de sang périphérique (Mosler et al. (1988) •
Une fois reconstituées, ces souris SCID-hu produisent des anticorps humains soit spontanément, : Dit après immunisation. II semble qu'il n'existe pas de réactivité croisée dramatique entre les facteurs VIII humain et murin (Kessler, 1991) .
Les lymphocytes du sang périphérique sont prélevés chez plusieurs types de donneurs : volontaires non hémophiles, hémophiles dépourvus d'inhibiteurs détectables par les méthodes classiques, hémophiles présentant un taux important d'inhibiteurs ainsi que des donneurs produisant des auto¬ anticorps.
Ce modèle est utilisé dans deux types de travaux.
D'abord, la reconstitution de souris est obtenue avec des cellules d'un seul donneur, et après vérification de la reproductibilité du système, on peut comparer l'antigénéicité de plusieurs préparations du facteur VIII.
D'autre part, ce modèle permet d'obtenir et d'étudier une réponse anti-facteur VIII au niveau clonal. L'étude de la réponse spécifique monoclonale des cellules B est très importante, car elle permet précisément d'identifier les épitopes séquentiels et conformationnels du facteur VIII. Les cellules B sont cultivées clonées en présence ou non d'anti-CD40, à partir de la rate des souris produisant des anti-facteur VIII, ou bien transformées en présence du virus EBV. Les anticorps anti-CD40 reconnaissent un antigène membranaire et activent les cellules B en présence d'une ligne de fibroblastes (Banchereau et al. (1991)) . Il est dès lors possible d'envisager l'utilisation de ces épitopes immunodominants comme cible possible de l'immunothérapie.
La détermination de marqueurs MHC de classe I et de classe II portés par les clones de lymphocytes B permet d'analyser la réponse immunitaire des anti-facteur VIII au niveau génétique, et ainsi de suivre la reconnaissance par les cellules T spécifiques. Ceci est également une excellente méthode pour voir s'il existe un facteur de risque associé à cette pathologie.
Les souris BALB/C choisies pour la préparation des mAbs anti-facteur VIII sont préalablement injectées à trois reprises à 2 semaines d'intervalle avec une solution de facteur VIII recombinant (rFVIII) . Ce type de préparation présente l'avantage de contenir un facteur VIII de haute pureté à une concentration élevée avec un minimum de protéines contaminantes. Quatre jours après la dernière injection, les splénocytes sont fusionnés avec des cellules d'un myélome de souris (SP207) (van Snick et Coulie (1982)). La sélection des hybridomes produisant des anticorps anti-facteur VIII s'effectue par la technique ELISA utilisant des plaques de polystyrène sur lesquelles du rFVIII a préalablement été insolubilisé. Les surnageants d'hybridomes contenant des anticorps anti-facteur VIII sont clones par la technique de dilution limite, puis cultivés in vitro.
Les anticorps sont purifiés par chromatographie au départ de ces surnageants.
La quantification, la détermination de la chaîne légère (k ou 1) et la sous-classe (IgGl, IgG2a, IgG2b, IgG3) des mAbs anti-facteur VIII s'effectuent par la technique ELISA.
La détermination des épitopes reconnus sur la molécule de facteur VIII se réalise par la technique d'immunotransfert avec des solutions de facteur VIII natives ou après clivage enzymatique à la thrombine.
La capacité des mAbs anti-facteur VIII produits à inhiber la fonction est évaluée, pour chacun de ceux-ci, par une méthode de coagulation (méthode Bethesda) (Kasper et al.
(1975) ) ainsi que par une méthode chromogénique basée sur la capacité qu'a le facteur X activé par l'association du facteur VIII et du facteur IX activé, de transformer un substrat incolore en un substrat coloré (Svendsen et al. (1984)).
Les lignées cellulaires productrices d'anticorps monoclonaux humains anti-facteur VIII sont dérivées à partir des lymphocytes B humains prélevés dans la cavité abdominale de souris SCID immunisées avec différents lots de facteur VIII après reconstitution du système immunitaire des animaux avec des lymphocytes humains. Les lymphocytes B sont mis en culture en présence de cellules fibroblastiques exprimant un récepteur pour la portion Fc des immunoglobulines sur laquelle est fixé un anticorps monoclonal anti-CD40. Ces cellules activées par la polymérisation du récepteur CD40 sont alors infectées et immortalisées par le virus Epstein-Barr (Kozbor, (1981)). Les lignées cellulaires produisant les anticorps recherchés peuvent alors être sous-clonées. Un autre aspect de l'invention concerne un anti¬ inhibiteur caractérisé en ce qu'il est dirigé contre ledit inhibiteur du facteur VIII précédemment décrit.
On entend par anti-inhibiteur dirigé contre l'inhibiteur du facteur VIII, toute molécule biologique et/ou cellule susceptible d'interférer avec ledit inhibiteur de manière à assurer son inactivation.
De préférence, un tel anti-inhibiteur est un anticorps (monoclonal ou polyclonal) , ou un fragment d'anticorps anti-idiotypique anti-facteur VIII.
Avantageusement, ces anti-inhibiteurs dirigés contre les inhibiteurs du facteur VIII sont synthétisés par un animal "chimérique" présentant un système immunitaire humain tel qu'une souris SCID-hu. Seules les souris qui produisent moins de 10 μg/ml d' immunoglobulines résiduelles sont utilisées pour les expériences.
Le modèle est mis au point en utilisant des globules blancs périphériques provenant de volontaires immunisés contre le tétanos.
La reconstitution est menée avec une seule injection i.p. de 15 à 20.106 mononucléaires d'origine humaine. Ces cellules sont obtenues après centrifugation en gradient Ficoll- Hypaque de sang périphérique (environ 200 ml) . Douze à vingt souris peuvent être reconstituées à partir d'un seul donneur. La production d'immunoglobulines humaines est mesurée en fonction du temps.
Les anticorps anti-idiotypiques anti-facteur VIII sont purifiés à partir d'un pool de plasma de départ, qui est constitué à partir de dons volontaires d'au moins 7200 donneurs pour augmenter la probabilité de trouver des anticorps anti- idiotypiques, par immunoaffinité au moyen d'anticorps anti¬ facteur VIII humains fixés de manière covalente sur une colonne de Sepharose ou par une partie Fc sur une colonne de protéine G. Après fractionnement, par la méthode de Cohn-Oncley, deux fractions Fr II et Fr III riches en IgG sont obtenues. Elles serviront de préparation de départ pour la purification des anticorps anti-idiotypiques. Ces anticorps monoclonaux seront obtenus à partir de cellules B prélevées chez les patients hémophiles. Ces cellules ont au préalable proliféré dans les souris SCID et ont été transformées en cultures cellulaires sécrétrices par le virus EBV. L'utilisation de ces anticorps monoclonaux humains permet d'éviter l'introduction de protéines non humaines dans les préparations thérapeutiques. Ces préparations sont évaluées pour leur efficacité de neutralisation des inhibiteurs provenant du plus grand nombre de patients hémophiles possible, par des analyses immunochimiques approfondies. Plusieurs étapes d'inactivation virale physique (traitement par rayonnement UVCF) , thermique et/ou chimique (par exemple par solvant-détergent) sont introduites dans le procédé de purification afin d'assurer la plus grande sécurité virale possible.
L'idiotype propre aux anticorps humains est analysé en séquençant la partie variable de la molécule. Ces donnée" sont d'importance extrême, car elles sont de grande utilité .. la fois dans le diagnostic et la régulation de la production des anti-facteur VIII.
Jusqu'à présent, la source d'anticorps nécessaires à la confection de complexes antigènes-anticorps a été autologue, c'est-à-dire que le patient lui-même fournissait les anticorps. Nous savons depuis peu que des individus normaux avec des taux normaux de facteur VIII circulant, produisent des anticorps anti-facteur VIII dont l'activité dans le plasma est limitée par des anticorps anti-idiotypique correspondants. Des anticorps anti-facteur VIII préparés à partir d'un pool de gammaglobulines peuvent remplacer avantageusement la source autologue.
Il est également possible d'obtenir des cellules B humaines transformées avec le virus EBV qui produisent des inhibiteurs de patients hémophiles ou non hémophiles. Quatre lignées ont ainsi été obtenues, l'une d'elles reconnaissant la chaîne légère du facteur VIII. Des souris SCID ont été repeuplées avec les cellules B sécrétrices d'inhibiteurs provenant de patients hémophiles ou non. La production est stimulée avec l'injection de facteur VIII plasmatique et de facteur VIII recombinant. Il est donc possible d'obtenir des cultures continues in vitro produisant lesdits inhibiteurs. Cette technique permet également d'obtenir une production continue d'anticorps anti-idiotypes anti-facteur VIII.
Un autre aspect de l'invention concerne une composition pharmaceutique comprenant un élément choisi parmi le groupe constitué par ladite séquence polypeptidique antigénique du facteur VIII, des fragments, des épitopes de celle-ci et/ou des parties fortes desdits épitopes ou desdits fragments, un inhibiteur du facteur VIII dirigé contre eux, un anti-inhibiteur dirigé contre ledit inhibiteur, et/ou un mélange d'entre eux.
Un autre aspect de l'invention concerne un dispositif de diagnostic et/ou de purification, tel qu'un kit de diagnostic ou une colonne de chromatographie (telle que décrite par Ezzedine et al. (1993)), comprenant un élément choisi parmi le groupe constitué par la séquence polypeptidique antigénique selon l'invention, des fragments, des épitopes de celle-ci et/ou les parties fortes desdits épitopes ou desdits fragments, le complexe selon l'invention, un inhibiteur dirigé contre eux, un anti-inhibiteur dirigé contre ledit inhibiteur, et/ou un mélange d'entre eux.
Le dispositif de purification peut donc consister en une colonne de chromatographie telle que décrite par Ezzedine et al. (1993), comprenant la séquence du facteur VIII, des fragments, des épitopes de celle-ci et/ou les parties fortes desdits fragments ou épitopes fixés à la phase solide de la colonne de chromatographie.
On fait ensuite passer sur cette colonne de chromatographie un liquide physiologique (tel que le sérum) d'un patient comprenant des inhibiteurs du facteur VIII, lesdits inhibiteurs (par exemple des anticorps) se fixant de manière spécifique sur ledit facteur VIII, lesdits fragments. lesdits épitopes ou lesdites parties fortes.
Après élution, il est possible de recueillir lesdits inhibiteurs en les faisant réagir avec des anti-inhibiteurs (anticorps anti-idiotypiques anti-facteur VIII) . II est possible aussi de caractériser les anticorps anti-idiotypiques anti-facteur VIII présents dans un sérum en faisant passer ces anti-inhibiteurs sur une colonne de chromatographie sur laquelle des inhbiteurs du facteur VIII ont été fixés à la phase solide. Un dernier aspect de l'invention concerne l'utilisation de la composition pharmaceutique selon l'invention, pour la préparation d'une médicament destiné à la prévention et/ou au traitement des désordres immunitaires, en particulier ceux induits par les inhibiteurs du facteur VIII, les inhibiteurs de la liaison du facteur VIII de von Willebrand (vWF) et/ou les inhibiteurs de la liaison du facteur VIII aux phospholipides membranaires.
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Claims

REVENDICATIONS.
1. Séquence polypeptidique antigénique, caractérisée en ce qu'elle est la séquence polypeptidique du facteur VIII.
2. Séquence polypeptidique antigénique, caractérisée en ce que en ce qu'elle est dépourvue des fragments suivants :
Alanine 322 - Serine 750, Leucine 1655 - Arginine 1689, Lysine 1694 - Proline 1782 et Acide Aspartique 2170 - Tyrosine 2332.
3. Séquence selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce qu'elle est immunogénique.
4. Séquence selon la revendication 3, caractérisée en ce qu'elle présente une immunoaffinité avec des inhibiteurs du facteur VIII, de préférence avec des anticorps anti-facteur VIII.
5. Séquence selon la revendication 3 ou 4 caractérisée en ce qu'elle présente une immunoaffinité pour les récepteurs des lymphocytes T et/ou B.
6. Fragment antigénique de la séquence selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi le groupe constitué par les séquences polypeptidiques Al, A2, A3 ou C du facteur VIII.
7. Fragment antigénique de la séquence polypeptique A3 selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi le groupe constitué par le fragment de séquence compris entre l'Arginine 1652 et l'Arginine 1696, le fragment de séquence compris entre la Thréonine 1739 et l'Acide Aspartique 1831 et/ou le fragment de séquence compris entre l'Acide Glutamique 1885 et l'Arginine 1917.
8. Epitope de séquence du fragment selon la revendication 7 caractérisé en ce qu'il est choisi parmi le groupe constitué par :
- l'épitope compris entre l'Arginine 1652 et la
Tyrosine 1664 défini par la séquence suivante :
SEQ ID NO:l:
Arg Thr Thr Leu Gin Ser Asp Gin Glu Glu Ile Asp Tyr 1 5 10 - l'épitope compris entre l'Acide Aspartique 1681 et l'Arginine 1696 défini par la séquence suivante :
SEQ ID NO:2:
Asp Glu Asp Glu Asn Gin Ser Pro Arg Ser Phe Gin Lys Lys Thr Arg 1 5 10 15 ,
- l'épitope compris entre la Thréonine 1739 et la Tyrosine 1748 défini par la séquence suivante :
SEQ ID NO:3: Thr Asp Gly Ser Phe Thr Gin Pro Leu Tyr 1 5 10,
- l'épitope compris entre l'Asparagine 1777 et la Phenylalanine 1785 défini par la séquence suivante : SEQ ID NOM:
Asn Gin Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe 1 5
- l'épitope compris entre l'Acide Glutamique 1794 et la Tyrosine 1815 défini par la séquence suivante :
SEQ ID NO:5:
Glu Asp Gin Arg Gin Gly Ala Glu Pro Arg Lys Asn Phe Val Lys Pro
1 5 10 15
Asn Glu Thr Lys Thr Tyr 20
- l ' épitope compris entre la Méthionine 1823 et l ' Acide Aspartique 1831 défini par la séquence suivante : SEQ ID NO : 6 : Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp
1 5
- l'épitope compris entre l'Acide Glutamique 1885 et la Phenylalanine 1891 défini par la séquence suivante : SEQ ID NO:7:
Glu Thr Lys Ser Trp Tyr Phe 1 5 - l'épitope compris entre l'Acide Glutamique 1893 et l'Alanine 1901 défini par la séquence suivante :
SEQ ID NO:8:
Glu Asn Met Glu Arg Asn Cys Arg Ala 1 5
- l'épitope compris entre l'Acide Aspartique 1909 et l'Arginine 1917 défini par la séquence suivante :
SEQ ID NO:9: Asp Pro Thr Phe Lys Glu Asn Try Arg 1 5
9. Fragment antigénique de la séquence polypeptidique Al selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il est choisi entre l'Alanine 108 et la Méthionine 355, de préférence entre l'Alanine 108 et la Glutamine 228.
10. Epitope de séquence du fragment selon la revendication 9, caractérisé en qu'il est choisi parmi le groupe constitué par
- l'épitope compris entre l'Alanine 108 et la Valine 128 défini par la séquence suivante :
SEW ID N0:10:
Ala Ser Glu Gly Ala Glu Try Asp Asp Gin Thr Ser Gin Arg Glu Lys
1 5 10 15
Glu Asp Asp Lys Val 20
- l ' épitope compris entre l 'Acide Glutamique 181 et la Leucine 192 défini par la séquence suivante :
SEQ ID NO : 11 : Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr Gin Thr Leu
1 5 10
- l'épitope compris entre l'Acide Aspartique 203 et la Glutamine 218 défini par la séquence suivante : SEQ ID NO: 12:
Asp Glu Gly Lys Ser Trp His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gin 1 5 10 15 - l'épitope compris entre l'Acide Aspartique 327 et la Méthionine 355 défini par la séquence suivante :
SEQ ID N0:13:
Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro Gin Leu Arg Met Lys Asn Asn Glu Glu 1 5 10 15
Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp Leu Thr Asp Ser Glu Met 20 25
11. Fragment antigénique de la séquence polypeptidique antigénique A2 selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il est compris entre l'Acide Aspartique 403 et l'Acide Aspartique 725, de préférence entre l'Histidine 693 et l'Acide Aspartique 725.
12. Epitope de séquence du fragment selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi le groupe constitué par :
- l'épitope compris entre l'Acide Aspartique 403 et la Lysine 425 défini par la séquence suivante :
SEQ ID NO:14:
Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gin Tyr Leu Asn Asn Gly Pro Gin Arg 1 5 10 15
Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys
20
- l'épitope compris entre la Valine 517 et l'Arginine 527 défini par la séquence suivante :
SEQ ID NO:15:
Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp Pro Arg 1 5 10
- l'épitope compris entre l'Histidine 693 et la
Glycine 701 défini par la séquence suivante : SEQ ID NO:16:
His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly 1 5
- l'épitope compris entre la Serine 710 et l'Acide Aspartique 725 défini par la séquence suivante : SEQ ID NO : 17 :
Ser Cys Aso Lys Asn Thr Gly Asp Tyr Try Gly Asp Ser Tyr Glu Asp 1 5 10 15
13. Fragment antigénique de la séquence polypeptidique antigénique C selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il est compris entre la Lysine 2085 et la Lysine 2249, de préférence entre la Lysine 2085 et la Glycine 2121.
14. Epitope de séquence du fragment selon la revendication 13, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi le groupe constitué par :
- l'épitope compris entre la Lysine 2085 et la Phenylalanine 2093 défini par la séquence suivante :
SEQ ID NO:18: Lys Thr Gin Gly Ala Arg Gin Lys Phe 1 5
- l'épitope compris entre l'Acide Aspartique 2108 et la Glycine 2121 défini par la séquence suivante : SEQ ID NO:19:
Asp Gly Lys Lys Trp Gin Thr Tyr Arg Gly Asn Ser Thr Gly 1 5 10
- l'épitope compris entre la Glycine 2242 et la Lysine 2249 défini par la séquence suivante :
SEQ ID NO:20:
Gly Val Thr Thr Gin Gly Val Lys 1 5
15. Partie forte des fragments et/ou des épitopes selon l'une quelconque des revendications précédentes 6 à 14, caractérisée en ce qu'elle comprend l'acide aminé Tyrosine et/ou l'acide aminé Histid e lié à au moins deux autres acides aminés identiques ou différents.
16. Epitope conformationnel caractérisé en ce qu'il comprend au moins deux fragments différents, au moins deux épitopes différents et/ou au moins deux parties fortes différentes selon l'une quelconque des revendications précédentes 6 à 15.
17. Complexe comprenant une protéine porteuse ou un peptide porteur lié à un élément choisi parmi le groupe constitué par la séquence, le fragment, l'épitope et/ou la partie forte d'un epitope ou d'un fragment selon l'une quelconque des revendications précédentes.
18. Inhibiteur du facteur VIII caractérisé en ce qu'il présente une immunoaffinité avec la séquence, le fragment, l'épitope, la partie forte d'un epitope ou d'un fragment et/ou le complexe selon l'une quelconque des revendications précédentes.
19. Inhibiteur selon la revendication 18, caractérisé en ce qu'il est un anticorps ou un fragment d'anticorps anti¬ facteur VIII.
20. Anti-inhibiteur caractérisé en ce qu'il est dirigé contre l'inhibiteur du facteur VIII selon la revendication 18 ou 19.
21. Anti-inhibiteur selon la revendication 20, caractérisé en ce qu'il est un anticorps ou un fragment d'anticorps anti-idiotypique anti-facteur VIII.
22. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un élément choisi parmi le groupe constitué par la séquence, le fragment, l'épitope, la partie forte, le complexe, l'inhibiteur et/ou l'anti-inhibiteur selon l'une quelconque des revendications précédentes.
23. Dispositif de diagnostic et/ou de purification caractérisé en ce qu'il comprend au moins un élément choisi parmi le groupe constitué par la séquence, le fragment, l'épitope, la partie forte, le complexe, l'inhibiteur et/ou 1 'anti-inhibiteur selon l'une quelconque des revendications précédentes 1 à 21.
24. Dispositif selon la revendication 23, caractérisé en ce qu'il est une trousse de diagnostic.
25. Dispositif selon la revendication 23, caractérisé en ce qu'il est une colonne de chromatographie.
26. Utilisation de la composition pharmaceutique selon la revendication 22 pour la préparation d'un médicament destine a la prévention et/ou à la thérapie de désordres immunitaires.
27. Utilisation selon la revendication 26, caractérisée en ce que les désordres immunitaires sont des désordres induits par les inhibiteurs du facteur VIII, les inhibiteurs de la liaison du facteur VIII au facteur de von Willebrand et/ou les inhibiteurs de la liaison du facteur VIII aux phospholipides membranaires.
28. Procédé de traitement thérapeutique et/ou préventif de désordres immunitaires, caractérisé en ce que l'on administre à un patient la composition pharmaceutique selon la revendication 22.
29. Procédé de traitement thérapeutique et/ou préventif selon la revendication 28, caractérisé en ce que les désordres immunitaires sont des désordres induits par les inhibiteurs du facteur VIII, les inhibiteurs de la liaison du facteur VIII au facteur de von Willebrand et/ou les inhibiteurs de la liaison du facteur VIII aux phospholipides membranaires.
30. Procédé d'identification et d'obtention d'inhibiteurs et/ou d'anti-inhibiteurs selon l'une quelconque des revendications précédentes 18 à 21, caractérisé en ce que l'on fixe sur un support solide d'une colonne de chromatographie un élément choisi parmi le groupe constitué par la séquence, le fragment, l'épitope, la partie forte et/ou le complexe selon l'une quelconque des revendications précédentes 1 à 17, en ce que l'on fait passer sur ladite colonne de chromatographie un liquide physiologique d'un patient comprenant des inhibiteurs du facteur VIII, en ce que l'on élue et on recueille la fraction des inhibiteurs du facteur VIII ayant présenté une immunoaffinité avec au moins un élément choisi parmi le groupe constitué par la séquence, le fragment, l'épitope, la partie forte et/ou le complexe selon l'une quelconque des revendications précédentes 1 à 17, et éventuellement en ce ledit procédé comporte les étapes suivantes : on fixe lesdits inhibiteurs du facteur VIII recueillis sur le support solide d'une colonne de chromatographie, on fait passer sur ladite colonne, des anti¬ inhibiteurs du facteur VIII, tels que des anticorps anti- idiotypiques anti-Facteur VIII, on élue et on recueille les anti-inhibiteurs ayant présnté une immunoaffinité avec les inhibiteurs du facteur VIII.
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