JPH10506610A - 因子ｖｉｉｉの抗原ポリペプチド配列、その断片および／またはエピトープ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明はグルタミン酸１６４９とアスパラギン２０１９の間に含まれ、好適には因子VIIIのポリペプチド配列のアルギニン１６５２とアルギニン１９１７の間に含まれる、またはアラニン１０８とメチオニン３５５の間に含まれる、またはアスパラギン酸４０３とアスパラギン酸７２５，またはリジン２０８５とリジン２２４９の間に含まれる因子VIIIの抗原ポリペプチド配列に関するものである。

Description

【発明の詳細な説明】 因子VIIIの抗原ポリペプチド配列、その断片および／またはエピトープ 発明の目的 本発明は因子VIIIの抗原ポリペプチド配列、その断片および／またはエピトー プおよびこのエピトープの強い部分、この配列に対して誘導された阻害剤、その 断片、そのエピトープおよび／またはこのエピトープの強い部分、ならびに前記 阻害剤に対して誘導された抗阻害剤に関するものである。 本発明はさらに上述の分子を含む医薬品組成物ならびに診断装置にも関するも のである。 発明の基礎となる技術的背景 近年、イオン交換クロマトグラフィーによる、あるいはもっと最近では免疫親 和性による血漿の大きなプールから精製された因子VIIIの調製剤が血友病患者の ために十分な量が提供されている。 遺伝子工学によって得られた因子VIIIの多種多様な調製剤が現在開発または臨 床研究段階にある。これらの因子VIIIは完全な分子、または欠損分子である(Bih oreau(1992))。 因子VIIIは血漿凝固のグリコタンパク補助因子であり、因子Ｘ（ＦＸ）の活性 化部位に作用する。因子VIIIとその作用機転の特性化は、血漿中の濃度が低く、 サイズが不揃いで、酵素変質感受性が極端に高いので一層困難になった。この反 応はＦＸの活性化因子Ｘ（ＦＸａ＝Stuart因子）への蛋白質加水分解を含み、酵 素（活性化ＦＩＸまたはＦＩＸａ）を含む錯体（Tenase錯体）、補助因子（活性 化因子VIIIまたはFVIIIａ）、カルシウムイオンおよびリン脂質を介在させる。 因子VIIIは非常に複雑なタンパク質なので、遺伝子配列は１９８４年以来判明 しているか（Verhar et al.，Nature 312，pp.317-342 (1984)）、血漿因子VIII の完全な構造も（タンパク質の５０％近くの配列が決定されただけ）、炭水化物 の正確な構造もまだ確立されていない。ＤＮＡの配列は因子VIIIの１次配列を決 定するものと認められた（バイオテクノロジーから生まれた治療物質についてＦ ＤＡが規定した誘導体に対する例外はまれ）。 しかしながら、血漿因子VIIIと組み替え因子VIIIの間のわずかな差異が確定さ れた：グリコシル化、注入後の血漿半減期、・・・・ 因子VIIIは大半が肝細胞内で合成される。それは哺乳類、昆虫および酵母の細 胞内でクローン化された(Webb et al.,1993)。これらの生命工学的方法で産生し たグリコタンパク質は天然のタンパク質と比較して糖の構造と組成に差異がある ことがある。因子VIIIのｃＤＮＡはトランスジェニックヒツジにも発現した(Hal ter et al.，1993) 。 ｃＤＮＡはペプチドを含む２３５１のアミノ酸のポリペプチドについて小胞体 内で切断された１９のアミノ酸の信号を暗号化する。翻訳後の修飾はGolgiの装 置内で起きる：セリンとトレオニンのグリコシル化と硫酸塩イオンのチロシン残 基への添加。成熟した後、タンパク質は次に、２価イオンによって結合された２ １０ｋＤａ（これは１６４８残基）と８０ｋＤａ（１６４９から２３３２の残基 ）の２本の鎖の形で血漿内に分泌され、そのもっとも軽いものはＮ−末端によっ てvon Willebrand因子（ｖＷｆ）に非共有結合で結びつく（因子VIII１分子当た りｖＷｆ１分子）。血漿内でこの錯体は５０倍多いｖＷｆの存在の下で疎水およ び親水結合によって安定化される。後者は因子VIIIのリン脂質への固定を阻害す るらしい。因子VIIIが血小板に結びつく事実は確定されたが、血小板の表面に発 現した特定の受容体の存在は明確には実証されていない（Nesheim et al.，1993 ）。膜リン脂質の上に固定した後、ＦＩＸａに対する親和性が高い結合部位を明 らかにするだろう（Bardelle et al.，1993）。 因子VIIIはＡ１：Ａ２：Ｂ：Ａ３：Ｃ１：Ｃ２（図１）に組織された３つの構 造ドメインＡ，Ｂ，Ｃで形成される(Kaufman RJ,1992; Bihoreau et al.,1992) 。ドメインＡは４０％を越える相同性を有し、またセルロプラスミンとも相同で ある。さらに因子ＶのドメインＡと因子VIIIのドメインＡの間にも３０％の相同 性がある。ドメインＣは２回介在し、複合糖質と総電荷が負のリン脂質を結合で きるらしい（Kemball-Cook and Barrowc liffe(1992); Fay，PJ,1993)）。それ は電 荷が負のリン脂質に結合することのできるレクチンとの相同性を有する。このレ ベルに血小板(ドメインＣ２)への固定部位が同定された(Foster et al.,(1990)) 。因子VIIIの質量の４０％超をしめるドメインＢは特定の活性か全く知られてい ないが、例えば、トロンビンの作用から保護して因子VIIIの調節に微妙な役割を 果たしている可能性がある。他のタンパク質との相同性は知られていない。 それは因子VIIIで確認された２５の内１９のグリコシル化部位を有する。ヒト とブタの因子VIIIのアミノ酸の配列の比較から、この領域Ｂのレベルでの主要な 相違が明らかにされた。しかしながら、ブタの因子VIIIは阻害剤を示す血友病患 者の治療に効果的に使用された。この所見からこの領域Ｂの暗号化部分が欠損し 、血友病の治療のための欠損組み替え因子VIIIの産生を可能にする因子VIII遺伝 子の構築に至った。 免疫精製によって、様々な形の活性因子VIIIが単離され、それらは共通して８ ０ｋＤａの軽い鎖を有し、その重い鎖は２１０から９０ｋＤａの分子量を有する ことがある。これらの形は重い鎖のＣ末端の段階的変質から発生するらしい。２ 本の鎖の結合は非共有結合であり、ドメインＡ１とＡ３に責任がある残基の間の ２価金属イオン（Ｍｅ⁺⁺）の結合を介して生じる。活性化錯体の形成後（５０− ４５ｋＤａ）（アクセス可能なドメインＡ２を備えた重い鎖）と７０ｋＤａ（軽 い鎖）、不活性化段階が観察されたが、これはおそらくトロンビンとの長い接触 と、５０ｋＤａと４５ｋＤａの断片の解離によるものである。因子VIIIａは重い 鎖の蛋白質加水分解の後に活性化したタンパク質Ｃ（ＡＰＣ）によっても不活性 化される。この不活性化は因子VIIIａがリン脂質表面に固定されたときに加速さ れる。この因子VIIIａの活性の「ダウンレギュレーション」は血小板酵素による リン酸化に依存するらしい（Kalafatis et al.，(1990)）。 今日までに単離された各種のネズミのモノクローナルによって認識された大半 のエピトープは因子VIIIの「官能部位」に位置づけられるようには思われない。 因子VIIIの活性に対する効果（色素形成および／または凝固試験の阻害）を有す る抗体によって認識されるいくつかのエピトープが同定された。 これらの抗原決定基は断片３５１−３６５（ドメインＡ１−重い鎖）、７１３ −７４０（ドメインＡ２）、１６７０−１６８４（ドメインＡ３−軽い鎖）（軽 い鎖の末端ＮＨ2）または２３０３−２３３２（ドメインＣ２−軽い鎖）(Foster C，(1990))、断片７０１−７５０(Ware et al．(1989))、１６７３−１６８９(L eyte et al．(1989))、３３０−４７２，１６９４−１７８２(ＥＰ−０ ２０２ ８５３)、３２２−７４０および２１７０−２３２２（Scandella et al．(1992) ）によって構成される。 抗体はこれら各種の部位を認識し、それぞれ因子VIIIの活性化、ｖＷｆの結合 、またはリン脂質の結合に干渉する。 試験管内の活性の古典的試験を阻害しないその他の抗体は、活性部位から遠く 離れた分子の部位に固定することによって凝固カスケードの他の構成要素との因 子VIIIの作用に影響する可能性がある。活性部位は、このように修飾され、その 特性のいくつかを変化させて（「アロステリックモデル」）因子VIIIの天然の折 り畳みに干渉する可能性がある。 これらの「マッピング」実験は大腸菌の中でクローン化された因子VIII遺伝子 の断片によって合成されたペプチドを使用し、これらのモノクローナルによって 認識された抗原決定基の局在化の近似的な姿しか示さない。事実、識別された断 片のサイズは３０から１００アミノ酸に渡っている。 現在、タンパク質の抗原部位を曖昧さなしに識別するために、それを結晶化し 、ＲＸで分析する必要がある。残念ながら、その高分子が結晶化の大きな障害に なっている因子VIIIのデータは全くない。 抗原領域はこれらの領域の親水性と一致している：オリゴペプチド配列が外部 媒体（表面に位置する）にさらされるほど、この部分は免疫化反応において認識 されやすくなる。反対に、一般的にタンパク質の内部に位置する疎水性部分は、 抗原性が低いと考えられる。 現在、血友病患者、臨床医と分画業者の念頭を占めているのは、病原性の一切 の血漿汚染物質と副作用のない、精製された因子VIIIの入手可能性である。 しかしながら、ネズミのモノクローナルの支援による免疫精製の後でも、哺乳 類の細胞内の遺伝子組み替えによって獲得した後でも、高純度で精製した因子VI IIは極度に不安定で、その理由は明確ではない。それを安定化させるために、精 製過程で血漿ヒトアルブミンを大量に添加して、最終特定活性がタンパク質１mg あたり２−３Ｕ程度になるようにする。ＣＨＯ細胞内で、天然安定化剤の、von Willebrand因子とともに同時発現したｒ因子VIIIについても同じことである。こ れらのデータが示唆するところでは、因子VIIIの分子に対する精製過程の影響が 、その天然折り畳みと干渉して、程度の差はあっても安定した立体配座の変化を 引き起こし、患者の中に注入した後に新たな潜在的エピトープが現れる可能性が ある。 因子VIIIの多数の治療注入を受ける血友病患者の、報告者ら（Ljung et al．( 1992); Sultan et al.,(1992); Lorenzo et al.(1992)）によれば５から５０％ に見られる重篤な合併症の１つが因子VIIIを不活性化し、それ以降の一切の因子 VIIIの注射を無効にする抗体（阻害剤）の出現である。 病理的抗因子VIII活性を有する自己抗体の自然発生は非血友病患者においては まれであり（有病率＝１０^-5）、免疫不全のある、あるいは産褥期の高齢者に見 られる（Kessler (1991)，Hultin(1991)）。３４３５人の血友病患者の多重研究 は５歳未満の患者を含めてすべての年齢群に関わることがわかった。過半数（８ ２％）が非常に高い反応（＞１０ ＢＵ）を示した。（Sultan et al．(1992)） 。この抗因子VIIIは主としてＩｇＧ４タイプのＩｇＧから構成されるらしいが、 ＩｇＧ２（Gilles et al.(1993)b）ＩｇＡとＩｇＭも報告されている（Lottenbu rget al.(1987)）。これらは他の哺乳類の精製異種因子VIII分子とはあまり反応 しない（Bennett，B et al．(1972)）。現時点では、一部の血友病患者に阻害剤 の発生を誘発する原因は分かっていない。遺伝子欠損の重篤性と因子VIIIを自己 のタンパク質と認めなくなる免疫反応の発生の間に関連があるとしても、この関 連はごく一部の患者においてしか実証されていない。遺伝子マーカーに結びつく 、寄主に固有の感受性は、例えば、１１種のＭＨＣ錯体の特定の決定基との特権 的関連（Hoyer(1991)）のようには実証されていないが、これはおそらく、特定 の抗体によって認識される因子VIIIのすべてのエピトープがまだ決定されていな いからである。さらに因子VIIIの異なる調製法がその構造、その物理化学特性ま たはその天然微小環境に影響するのかもしれない（Vermeylen，J and Peerlinck (1991); Gomperts，et al.(1992); Peerlinck et al．(1993)）。Barrowcliffe et al．(1983)はリン脂質がヒトの特定の抗体による非活性化の凝固促進作用を 保護する可能性を示した。病理的兆候のない、健康なドナー（５００の血漿の寄 贈に対して選別を実施）の１７％における抗因子VIII天然抗体の存在は生理因子 VIIIを有する３次元的構造の相をもっとよく知ることの重要性を示している(Cia varella and Schiavoni(1992))。 動物のモデルにおける、臨床試験の際の、リンパ球混合培養で研究した輸液は 輸液を受けた側の免疫修飾の変化が認められ、同種免疫と一部の免疫機能のダウ ンレギュレーションが誘導された。これは抗イデオタイプ抗体の抑制細胞または ＮＫ細胞の減少の形で現れる。すべてはある程度の耐性を誘導したかのように現 れる。これらの作用はインターロイキン−２（ＩＬ−２）の注入で逆転できる（ Triulzi et al.，1990）。試験管内で、ＩＬ−２の分泌の阻害効果ならびに末梢 血液の単核の増殖は因子VIIIの寒冷沈降物または純度の低い調製物（タンパク質 １mgあたり０.５から１０Ｕ）の存在の下で得られた（Madhok et al.，1991;Wad hwa，M et al.，1992）。これらの効果はｒ因子VIIIまたは免疫親和性によって 精製された因子VIIIが存在するときは観察されなかった。後者の調製物はＴ細胞 に対する活性剤効果があると思われる (Madhok et al.，1991)。しかしながら、 これらのデータを生体内の状況に直接適用することはできない。 因子VIII調製物の免疫原性または免疫修飾効果または臨床投与に先立つ寄主の 感受性に関する予測を可能にする実験モデルは存在しない。このモデルは免疫精 製あるいはＤＮＡ工学の技術によって得られた特定活性が非常に高い因子VIIIの 調製物を使用する現実の臨床試験の際に抗因子VIII抗体の発生頻度が増加してい るだけに絶対必要である（Seremetis et al.(1991)）。さらに、Aledorf(1993) は以前に輸液を受けたことがない（ＰＵＰＳ）初体験の被験者に対してこれら２ つのタイプの調製物を使用して、最高２７％の阻害剤の有病率が観察されること を示した。 現状技術 抗因子VIII免疫反応を示す患者は重い、攻撃的な、極端に高価な手段の使用が 必要な、重大な状況にいる。もっとも広く使用されている技術の１つが濃縮プロ トロンビン錯体と組み合わせて（ＦＥＩＢＡ）（Bonnの手順）極めて高用量の因 子VIII（１００から２００Ｕ/kg/日）を定期的に注射して有機体に充満させるこ とである（Ewing et al.(1988)）、これによって血液中の阻害剤の率を効果的に 減らすことができる（Sultan et al，1986）。さらに、この種の治療は非常に長 期間継続しなければならない（Lian et al.,1989）。もっと低い用量の因子VIII を使用して実施した試験では、抗因子VIII抗体の率がはるかに低い患者において ある程度の成功が認められた（Gruppo,(1991)）。 代替法は、患者の抗因子VIIIによって中和されず、止血を可能にするブタの細 胞のようなヒト以外の種の因子VIIIの使用である。多重研究によれば、このよう な治療の利点が明らかにされたが、同時にブタの抗因子VIII抗体の存在も明らか にされた（Lozier(1993); Moreau et al.(1993);Hay and Bolton-Maggs(1991); Clyne et al.(1992)）。組み替えＤＮＡによって得られた活性化因子VIIIも阻害 剤を示す患者における凝固の代替法として使用された(Ingerslev et al.(1991)) 。 最近、阻害剤の率を減らすために効果を上げた戦略は(Nilsson et al.(1990)) 、シクロホスホアミドなどの細胞増殖抑制剤で処理しながらタンパク質Ａ上の完 全ＩｇＧの固体相での吸収を可能にするために患者を体外循環にかけるものであ る。 免疫抑制処置との組み合わせの有無を問わず、多価静脈内免疫グロブリン注入 （ＩＶＩＧ）は比較的効果があることがわかったが、この有効性の理由はまだ十 分確定されていない。様々な仮説が立てられ、ＩｇＧ合成のフィードバック阻害 、そのクリアランスの促進、Ｔ抑制因子の活性化 (Bloom(1992))などが挙げられ ている。興味深い説明によれば、これらの市販の静脈内免疫グロブリンはその可 変部分(イデオタイプ)において抗因子VIII抗体と反応し、それらを中和すること のできる抗体を含んでいるという。この抗イデオタイプ活性はそれぞれのドナー に固有で、ＩｇＧのプールと相乗作用があると思われる(Dietrich et al.(1992) )。 残念ながらこれらの取り組みのどれも、安全性、有効性および費用の面から不 十分であることがわかった。 発明の目的 本発明は因子VIII阻害剤、因子VIIIのvon Willebrand の因子（ｖＷｆ）およ び／または膜リン脂質（ＰＬ）との結合阻害剤によって誘導されるものをはじめ と する免疫不全の診断および／または治療を改善するための因子VIIIの抗原ポリペ プチド配列、その断片およびエピトープを得ることを目的とする。 本発明の別の目的は同じく免疫不全の診断および／または治療を改善するため にこの抗原ポリペプチド配列、その断片および／またはエピトープとの免疫親和 性を示す阻害剤を得ることである。 補足的目的は免疫不全の診断および／または治療を改善するために上述の前記 阻害剤に対して誘導された抗体をはじめとする、抗阻害剤を得ることである。 図面の簡単な説明 図１は因子VIIIのポリペプチド配列の概略を示している。 図２は１から３７１のアミノ酸の番号を付け直した因子VIIIのＡ３配列の親水 性を図示したものである（それぞれのアミノ酸についての表面値）。 図３はこの因子VIIIのＡ３配列の柔軟性を図示したものである。 図４はこの因子VIIIのＡ３配列の接近可能性を図示したものである。 図５は図２から４に定義した値の総和を全体として図示したものである。 図６はＥＬＩＳＡ試験によるマウスの血清内の抗因子VIII抗体の存在を明らか にする図である。 本発明の特徴的要素 本発明は Verhar et al.(Nature,vol.312,p 339(1984))が記載しているような 、因子VIIIおよび／またはその断片の抗原ポリペプチド配列に関するものである 。 「因子VIIIの抗原ポリペプチド配列」とは因子VIIIの合成および／または遺伝子 工学による（即ち、場合によっては、血液凝固機転に関与しない部分が欠損した 配列を含む）、Cohnの分画Ｉをはじめとする、血漿のプールの精製によって得ら れた、場合によってはグリコシル化した、ヒトまたは動物の天然の配列を意味す る。 本発明は特に、アラニン３２２−セリン７５０，ロイシン１６５５−アルギニ ン１６８９，レシン１６９４−プロリン１７８２およびアスパラギン酸２１７０ −チロシン２３３２断片が欠損した因子VIIIの抗原ポリペプチド配列に関するも のである。 本発明は特に、因子VIIIの抗原ポリペプチド配列Ａ１,Ａ２,Ａ３及びＣ(Ｃ１ 及びＣ２)に関するものである。 以下本書において、アミノ酸は下表に示したごとく３文字の略号または１文字 の記号で示すものとする。 本発明の第１の実施態様は因子VIIIのＡ３抗原ポリペプチド配列、その断片お よび／またはエピトープに関するものである。上記の配列は Verhar et al.(Nat ure，vol．312，p 339(1984))と Toole et al．(Nature，vol．312，pp．342-34 7(1984))が公表しているような因子VIIIのポリペプチド配列のグルタミン酸１６ ４９とアスパラギン２０１９の間に含まれ、好適にはアルギニン１６５２とアル ギニン１９１７の間またはアルギニン１８０３とアルギニン１９１７の間に含ま れる。 好適には、前記配列の断片はアルギニン１６５２とアルギニン１６９６，好適 にはアルギニン１６５２とアルギニン１６８９の間、トレオニン１７３９とアス パラギン酸１８３１の間、またはグルタミン酸１８８５とアルギニン１９１７の 間に含まれる。 本発明は、 −下記の配列によって定義されるアルギニン１６５２とチロシン１６６４の間 に含まれるエピトープ： −下記の配列によって定義されるアスパラギン酸１６８１とアルギニン１６９ ６の間に含まれるエピトープ： −下記の配列によって定義されるトレオニン１７３９とチロシン１７４８の間 に含まれるエピトープ： −下記の配列によって定義されるアスパラギン１７７７とフェニルアラニン１ ７８５の間に含まれるエピトープ： −下記の配列によって定義されるグルタミン酸１７９４とチロシン１８１５の 間に含まれるエピトープ： −下記の配列によって定義されるメチオニン１８２３とアスパラギン酸１８３ １の間に含まれるエピトープ： −下記の配列によって定義されるグルタミン酸１８８５とフェニルアラニン１ ８９１の間に含まれるエピトープ： −下記の配列によって定義されるグルタミン酸１８９３とアラニン１９０１の 間に含まれるエピトープ： −下記の配列によって定義されるアスパラギン酸１９０９とアルギニン１９１ ７の間に含まれるエピトープ： をはじめとする、これらの断片の配列のエピトープにも関するものである。 有利には、前記配列、その特定の断片、およびそのエピトープは附属の図の２ から５に示した抗原特性を示す。 本発明のもう１つの推奨実施態様は因子VIIIのＡ１抗原ポリペプチド配列、そ の断片および／またはエピトープに関するものである。 好適には、前記配列の断片はアラニン１０８とメチオニン３５５の間に、好適 にはアラニン１０８とグルタミン２２８の間に含まれる。 本発明はさらに −下記の配列によって定義されるアラニン１０８とバリン１２８の間に含まれ るエピトープ： −下記の配列によって定義されるグルタミン酸１８１とロイシン１９２の間に 含まれるエピトープ： −下記の配列によって定義されるアスパラギン酸２０３とグルタミン２１８の 間に含まれるエピトープ： −下記の配列によって定義されるアスパラギン酸３２７とメチオニン３５５の 間に含まれるエピトープ： をはじめとする、これらの断片の配列のエピトープにも関するものである。 本発明のもう１つの推奨実施態様は因子VIIIのＡ２抗原ポリペプチド配列、そ の断片および／またはエピトープに関するものである。 好適には、前記配列の断片はアスパラギン酸４０３とアスパラギン酸７２５の 間に、好適にはヒスチジン６９３とアスパラギン酸７２５の間に含まれる。 本発明はさらに −下記の配列によって定義されるアスパラギン酸４０３とリジン４２５の間に 含まれるエピトープ： −下記の配列によって定義されるバリン５１７とアルギニン５２７の間に含ま れるエピトープ： −下記の配列によって定義されるヒスチジン６９３とグリシン７０１の間に含 まれるエピトープ： −下記の配列によって定義されるセリン７１０とアスパラギン酸７２５の間に 含まれるエピトープ： をはじめとする、これらの断片の配列のエピトープにも関するものである。 本発明のもう１つの推奨実施態様は因子VIIIのＣ抗原ポリペプチド配列、その 断片および／またはエピトープに関するものである。好適には、前記配列の断片 はリジン２０８５とリジン２２４９の間に、好適にはリジン２０８５とグリシン ２１２１の間に含まれる。 本発明はさらに −下記の配列によって定義されるリジン２０８５とフェニルアラニン２０９３ の間に含まれるエピトープ： −下記の配列によって定義されるアスパラギン酸２１０８とグリシン２１２１ の間に含まれるエピトープ： −下記の配列によって定義されるグリシン２２４２とリジン２２４９の間に含 まれるエピトープ： をはじめとする、これらの断片の配列のエピトープにも関するものである。 本発明はさらに前記エピトープまたは前記断片の強い部分、即ち因子VIII阻害 剤に対して意外にも特に高い親和性を示すアミノ酸のチロシンとヒスチジンを含 む前記エピトープの配列の部分にも関するものである。好適には、これらの強い 部分は同一または別の他の少なくとも２つのアミノ酸に結びついた前記アミノ酸 チロシンまたはヒスチジンを含んでいる。 これらの配列、これらの断片およびこれらのエピトープ、特にエピトープまた は断片の強い部分は Parker,Guo et Hodges(Biochemistry 25，pp 5425-5432(19 86))が記載しているような高い親水性、Karplus et Schultz(Naturwissenschaft en 72，p 212(1985))が記載しているような大きな柔軟性と Janin(Nature 277， pp 491-492(1979))が記載しているような大きな接近可能性によって特に有利に 特徴づけられる（参照：図２から５）。 これらの断片およびこれらのエピトープは特に因子VIIIのタンパク質の表面に 露出し、顕著な抗原特性を示す。 有利には前記ポリペプチド配列、その断片、そのエピトープおよび/または前 記断片またはエピトープのこれらの強い部分はさらに独立して免疫原性であり( 即ち、ＢＳＡ、ヘモシアニン、などの大きなサイズのタンパク質と錯体を形成し なくても免疫原性となる)、好適には抗因子VIII抗体などの因子VIII阻害剤との 免疫親和性を示し、および／または、Ｔおよび／またはＢリンパ球の受容体に対 する免疫親和性を示す。 この配列、これらの断片およびこれらのエピトープ、および／または前記断片 または前記エピトープの強い部分はウサギに注射したときに免疫反応（抗体の合 成）を引き起こす。 これらの特徴は、それぞれ１６から２２のアミノ酸の、比較的「長い」アミノ 酸配列を含むＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２とＳＥＱＩＤＮＯ：５のエピトープについて は特に重要である。 従って、これらの配列はモノクローナルおよびポリクローナル抗体に対する大 きな免疫原性によって特徴づけられる。 しかしながら、これらの配列は合成によって簡単に得られるほど十分短い。 例えば、ペプチドＡｓｐ１６８１−Ａｒｇ１６９６とＡｓｐ３２７−Ｍｅｔ３ ５５がＥＬＩＳＡ試験によってマウスの血清内の抗因子VIII抗体の存在を明らか にするために合成された。 遊離ペプチド（ベクタータンパク質に結合していない）が次の方式に従って２ 匹のＢＡＬＢ／Ｃマウスに注射された： −０日：不完全なFreundの補佐薬内で乳化したペプチド１００μｇを筋注で注 射した。 −７，１４，２１，２８日： ペプチド５０μｇによる免疫化。 毎日、注射の前に血液サンプルを採取した。ポリスチレンの微小滴定プレート （ＮＵＮＣ）を４０ＵＩ／ｍｌで希釈した血漿因子の調製剤で飽和した。５０μ Ｉの逓増希釈（マウスの抗血清に対して１／６０，１／３００と１／６００）を 井戸に添加した。保温、洗浄の後、抗因子VIII抗体の存在がビオチンで標識を付 けたマウスの抗ＩｇＧウサギの抗体の１／５０００希釈を５０μｌ添加して明ら かにされた。保温と洗浄後、井戸を５０μｌのアビジン＝パーオキシダーゼ（１ ／２５００）で保温し、洗浄し、最終的に、１００ｍｌのＯＰＤを井戸に添加し た。光学的密度は４９０ｍｍで測定した。ＥＬＩＳＡの結果は附属の図６に示し た（ＥＸＡ、ＥＸ２とブランクの役割を果たす標本ＢＬＣ）。 本発明はさらに、前記配列とは異なる少なくとも２つの断片と、配列の少なく とも２つのエピトープおよび／または本発明による、先に識別された、前記エピ トープまたは異なる前記断片の少なくとも２つの強い部分を含む立体配座エピト ープにも関するものである。 立体配座エピトープは３要素または４要素構造内のタンパク質の折り畳みの際 に互いに近接して位置づけられたポリペプチド配列の２つまたは複数個の異なる 部分で構成される。 これらのエピトープは、リンパ球Ｂ（組織適合性の大きな遺伝子座（ＭＨＣ Ｉおよび／またはＩＩ）を介して）および／または抗因子VIII抗体(Scandella e t al.，Blood 76，p 437(1990))をはじめとする因子VIIIの阻害剤で、好適には 同時に、「認識」される（即ち、免疫親和性を示すことができる）。 好適には、前記配列、前記断片、前記エピトープおよび／または前記エピトー プまたは前記断片の強い部分はＢＳＡまたはヘモシアニンなどの担体タンパク質 または担体ペプチドと錯体を形成して、より強い免疫原性を示す錯体を形成する 。 本発明の別の側面は本発明による抗原ポリペプチド配列との、断片、配列のエ ピトープ、前記エピトープまたは前記断片の強い部分および／または本発明によ る錯体との免疫親和性を示す因子VIIIの阻害剤に関するものである。 阻害剤とは、因子VIIIとともに、および／またはそれに対して介在して、免疫 不全を引き起こす可能性のある一切の生物分子または細胞を意味する。 特に、かかる阻害剤は前記因子VIIIを無効にし、および／または因子VIIIとvo n Willebrand 因子および／または膜リン脂質との結合を阻害するモノクローナ ルまたはポリクローナル抗体（ガンマグロブリン）または（前記抗体の超可変部 分Ｆａｂなどの）抗因子VIII抗体の断片であることがある。 有利には、前記阻害剤は、ヒトの抗体を産生するＳＣＩＤ−ｈｕマウスのよう なヒトの免疫系を有する「キメラ」動物によって合成される。 ＳＣＩＤ（重症合性免疫不全症）マウスは抗原受容体に責任のある遺伝子の組 み替えの機能障害による機能ＢまたはＴリンパ細胞の欠陥を示す。ＳＣＩＤマウ スの免疫系は胎児の臓器あるいは末梢血液に由来するヒト起源の免疫適格細胞に よって再構成することができる(Mosler et al．(1988))。 いったん再構成されると、これらのＳＣＩＤ−ｈｕマウスは自発的に、あるい は免疫化の後ヒトの抗体を産生する。 ヒトとネズミの因子VIIIの間に劇的な交差反応性は存在しないと思われる（Ke ssler，1991）。 末梢血液のリンパ球は多数のタイプのドナーから採取した：非血友病の志願者 、古典的方法で検出できる阻害剤の欠失した血友病患者、阻害剤の率が高い血友 病の患者、ならびに自己抗体を産生するドナー。 このモデルを２種類の研究に使用した。まず、単一のドナーの細胞でマウスの 再構成が得られた、系の再現可能性を検証した後、因子VIIIの複数個の調製剤の 免疫原性を比較することができる。 他方、このモデルによってクローナルレベルでの抗因子VIII反応を得て、研究 することができる。 Ｂ細胞のモノクロナール特定反応の研究は極めて重要である、なぜなら因子VI IIの配列および立体配座エピトープの識別をまさに可能にするからである。Ｂ細 胞は抗因子VIIIを産生するマウスの脾臓から、抗ＣＤ４０の存在の有無を問わず 、クーロン化培養される、あるいはＥＢＶウィルスの存在の下に形質転換される 。抗ＣＤ４０抗体は膜抗原を認識し、１系統の(une ligne de)線維芽細胞の存在 の下にＢ細胞を活性化する（Banchereau et al．(1991)）。このときから、これ らの免疫主体エピトープを免疫治療の潜在標的として使用することが考えられる 。 Ｂリンパ球のクローンに担持されたＩ種またはＩＩ種のＭＨＣマーカーの決定 は遺伝子レベルで抗因子VIIIの免疫反応を分析することを可能にし、それによっ て特定Ｔ細胞による認識を追跡することができる。これもまたこの病理に結びつ く危険因子の存在を確かめるための優れた方法である。 抗因子VIIIｍＡｂｓの調製のために選択されたＢＡＬＢ／Ｃマウスに２週間間 隔であらかじめ３回組み替え因子VIII（ｒ因子VIII）溶液を注射する。このタイ プの調製剤は最小限の汚染タンパク質で高濃度の高純度因子VIIIを含むという利 点を示す。最後の注射から４日目に、脾細胞をマウスの骨髄腫細胞（ＳＰ２０７ ）と融合した（van Snick et Coulie(1982)）。抗因子VIII抗体を産生するハイ ブリドーマの選定はその上にあらかじめｒ因子VIIIを不溶化したポリスチレンの プレートを使用するＥＬＩＳＡ技術によって実施する。抗因子VIII抗体を含むハ イブリドーマの上澄みを限界希釈技術でクローン化し、次いで試験管内で培養し た。 抗体はこれらの上澄みから開始してクロマトグラフィーによって精製した。 軽い鎖（ｋまたはｌ）および抗因子VIII抗体ｍＡｂｓの亜綱（ＩｇＧ１，Ｉｇ Ｇ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３）の定量化、決定はＥＬＩＳＡ技術で実施する。 因子VIII分子の上で認識されたエピトープの決定は自生因子VIIIの溶液の免疫 転移技術によって、またはトロンビンでの酵素解離の後に実現される。 産生した抗因子VIIIｍＡｂｓの機能阻害能力は、個別に、凝固法(Bethesda法) (Kasper et al.(1975))ならびに因子VIIIと活性型因子ＩＸの組み合わせによっ て活性化された因子Ｘの、無色基質を有色基質に変える能力に基づく色素産生法 (Svendsen et al.(1984))によって評価される。 抗因子VIIIヒトモノクローナル抗体を産生する細胞系統はヒトのリンパ球で動 物の免疫系を再構成した後に因子VIIIの異なるロットで免疫化したＳＣＩＤマウ スの腹腔から採取したヒトＢリンパ球から誘導される。Ｂリンパ球はその上に抗 ＣＤ４０モノクローナル抗体が固定された免疫グロブリンのＦｃ部分に対する受 容体を発現する線維芽細胞の存在の下に培養する。ＣＤ４０受容体の重合によっ て活性化されたこれらの細胞を次に感染させ、Epstein-Barrウィルスで不死化す る（Kozbor，(1981)）。次に所望の抗体を産生する細胞の系統をサブクローン化 することができる。 本発明のもう１つの側面は先に述べた因子VIIIの前記阻害剤に対して誘導され たことを特徴とする抗阻害剤に関するものである。 因子VIII阻害剤に対して誘導された抗阻害剤とは、不活性化を確実にする形で 前記阻害剤と干渉することのできる一切の生物分子および／または細胞を意味す る。 好適には、かかる抗阻害剤は抗体（モノクローナルまたはポリクローナル）ま たは抗因子VIII抗イデオタイプ抗体の断片である。 有利には、因子VIII阻害剤に対して誘導されたこれらの抗阻害剤はＳＣＩＤ− ｈｕマウスなどのヒト免疫系を示す「キメラ」動物によって合成される。 残留免疫グロブリン１０μｇ／ｍｌ未満を産生するマウスだけを実験に使用し た。 モデルは破傷風に対して免疫化した志願者に由来する末梢白血球を使用して開 発した。 再構成はヒト起源の１５から２０，１０６の単核のｉ．ｐ．注射だけで実施し た。これらの細胞は末梢血液のFicoll-Hypaque勾配遠心分離の後に得られた（お よそ２００ｍｌ）。単一のドナーから１２から２０匹のマウスを再構成すること ができる。ヒト免疫グロブリンの産生は経時測定した。 抗因子VIII抗イデオタイプ抗体はSepharoseコロニー上に共有結合で固定され たヒト抗因子VIII抗体を用いる免疫親和性によって、またはＧタンパク質のコロ ニー上のＦｃ部分によって、抗イデオタイプの抗体を見いだす確率を高めるため に７２００以上のドナーの自主的寄贈から構成された、開始血漿プールから精製 された。分画の後、Cohn - Oncley法によって、ＩｇＧが豊富な２つの分画因子 ｒＩＩと因子ｒＩＩＩが得られた。これらは抗イデオタイプ抗体の精製の開始調 製物に使えるだろう。これらのモノクローナル抗体は血友病患者から採取したＢ 細胞から得られるだろう。これらの細胞はＳＣＩＤマウス内であらかじめ増殖し 、ＥＢＶウィルスによって分泌細胞培養に形質変換された。これらのヒトモノク ローナル抗体の使用によって治療調製物内に非ヒトタンパク質が導入されるのが 防止される。これらの調製物は、徹底した免疫化学分析によって、大多数の潜在 血友病患者に由来する阻害剤の中和効果が評価される。物理的（ＵＶＣＦ線によ る処理）熱的および／または化学的（例えば、溶剤−洗剤による）ウィルス不活 性化のいくつかの段階が、できる限り高いウィルス安全性を確保するために精製 工程に導入される。 ヒト抗体に固有のイデオタイプは分子の可変部分を配列決定して分析される。 これらのデータは極めて重要である、なぜならそれらは診断にも抗因子VIII産生 の規制にも大きな有用性を持つからである。 現在まで、抗原抗体錯体の製造に必要な抗体源は自己移植であった、即ち患者 自身が抗体を提供していた。少し前から、循環因子VIIIの率が正常な健常者が産 生する抗因子VIII抗体は血漿内活性が対応する抗イデオタイプ抗体によって制限 されることがわかっている。ガンマグロブリンのプールから調製された抗因子VI II抗体は有利に自己移植源に代わることができる。 同様に、血友病の有無を問わず患者の阻害剤を産生するＥＢＶウィルスによっ て形質転換されたヒトのＢ細胞を得ることもできる。このようにして４系統が得 られ、そのうち１つが因子VIIIの軽い鎖を認識する。ＳＣＩＤマウスに血友病患 者に由来するか否かを問わず阻害剤分泌Ｂ細胞を再移植した。産生は血漿因子VI IIと組み替え因子VIIIの注射によって促進された。従って、前記阻害剤を産生す る試験管内の連続培養を得ることができる。この技術によって、抗因子VIII抗イ デオタイプ抗体の連続産生を得ることもできる。 本発明のもう１つの側面は因子VIIIの前記抗原ポリペプチド配列、その断片、 そのエピトープおよび／または前記エピトープまたは前記断片の強い部分、それ らに対して導かれた因子VIII阻害剤、前記阻害剤に対して導かれた抗阻害剤、お よび／またはそれらの間の混合物から成る群から選択された要素を含む医薬品組 成物に関するものである。 本発明の別の側面は本発明による抗原ポリペプチド配列、その断片、そのエピ トープおよび／または前記エピトープまたは前記断片の強い部分、本発明による 錯体、それらに対して導かれた阻害剤、前記阻害剤に対して導かれた抗阻害剤、 および／またはそれらの間の混合物から成る群から選択された要素を含む診断キ ットまたはクロマトグラフィーカラム（記載例：Ezzedine et al．(1993)）など の診断および／または精製装置に関するものである。 従って、精製装置はクロマトグラフィーカラムの固体相に固定された因子VIII 配列、その断片、エピトープおよび／または前記断片またはエピトープの強い部 分を含む Ezzedine et al．(1993)が記載しているようなクロマトグラフィーカ ラムから成る。 次にこのクロマトグラフィーカラムに因子VIII阻害剤を有する患者の生理的液 体（例えば、血清）を通し、前記阻害剤（例えば、抗体）が前記因子VIII、前記 断片、前記エピトープまたは前記強い部分の上に特定の仕方で固定する。 溶出した後、抗阻害剤（抗因子VIII抗イデオタイプ抗体）と反応させて前記阻 害剤を回収することができる。 このように、固体相で因子VIII阻害剤が上に固定されたクロマトグラフィーカ ラムにこれらの抗阻害剤を通して血清内に存在する抗因子VIII抗イデオタイプ抗 体を特性化することもてきる。 本発明の最後の側面は、因子VIII阻害剤、von Willebrand の因子VIII（ｖＷ Ｆ）の結合阻害剤および／または膜リン脂質に対する因子VIIIの結合の阻害剤に よって誘発されるものをはじめとして、免疫障害の予防および／または治療のた めの医薬品調製のために本発明による医薬品組成物を使用することに関するもの である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 16/36 Ｃ０７Ｋ 16/42 16/42 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/53 33/50 Ｔ // Ｇ０１Ｎ 33/50 Ａ６１Ｋ 37/02

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．因子VIIIのポリペプチド配列であることを特徴とする抗原ポリペプチド配 列。 ２．抗原ポリペプチド配列において、 アラニン３２２−セリン７５０，ロイシン１６５５−アルギニン１６８９，レ シン１６９４−プロリン１７８２およびアスパラギン酸２１７０−チロシン２３ ３２断片が欠損していることを特徴とする配列。 ３．請求項１または２に記載の配列において、 免疫原性であることを特徴とする配列。 ４．請求項３に記載の配列において、 因子VIII阻害剤との、好適には抗因子VIII抗体との免疫親和性を示すことを特 徴とする配列。 ５．請求項３または４に記載の配列において、 Ｔおよび／またはＢリンパ球の受容体に対する免疫親和性を示すことを特徴と する配列。 ６．請求項１または２による配列の抗原断片において、 因子VIIIのポリペプチド配列Ａ１，Ａ２，Ａ３またはＣから成る群から選択さ れることを特徴とする断片。 ７．請求項６に記載のＡ３ポリペプチド配列の抗原断片において、 アルギニン１６５２とアルギニン１６９６の間に含まれる配列の断片、トレオ ニン１７３９とアスパラギン酸１８３１の間に含まれる配列の断片、および／ま たはグルタミン酸１８８５とアルギニン１９１７の間に含まれる配列の断片とか ら成る群から選択されることを特徴とする断片。 ８．請求項７に記載の断片の配列のエピトープにおいて、 −下記の配列によって定義されるアルギニン１６５２とチロシン１６６４の間 に含まれるエピトープ： −下記の配列によって定義されるアスパラギン酸１６８１とアルギニン１６９ ６の間に含まれるエピトープ： −下記の配列によって定義されるトレオニン１７３９とチロシン１７４８の間 に含まれるエピトープ： −下記の配列によって定義されるアスパラギン１７７７とフェニルアラニン１ ７８５の間に含まれるエピトープ： −下記の配列によって定義されるグルタミン酸１７９４とチロシン１８１５の 間に含まれるエピトープ： −下記の配列によって定義されるメチオニン１８２３とアスパラギン酸１８３ １の間に含まれるエピトープ： −下記の配列によって定義されるグルタミン酸１８８５とフェニルアラニン１ ８９１の間に含まれるエピトープ： −下記の配列によって定義されるグルタミン酸１８９３とアラニン１９０１の 間に含まれるエピトープ： −下記の配列によって定義されるアスパラギン酸１９０９とアルギニン１９１ ７の間に含まれるエピトープ： から成る群から選択されることを特徴とする断片の配列のエピトープ。 ９．請求項６に記載のＡ１ポリペプチド配列の抗原断片において、 アラニン１０８とメチオニン３５５の間、好適にはアラニン１０８とグルタミ ン２２８の間で選択されることを特徴とする配列の抗原断片。 １０．請求項９に記載の断片の配列のエピトープにおいて、 −下記の配列によって定義されるアラニン１０８とバリン１２８の間に含まれ るエピトープ： −下記の配列によって定義されるグルタミン酸１８１とロイシン１９２の間に 含まれるエピトープ： −下記の配列によって定義されるアスパラギン酸２０３とグルタミン２１８の 間に含まれるエピトープ： −下記の配列によって定義されるアスパラギン酸３２７とメチオニン３５５の 間に含まれるエピトープ： から成る群から選択されることを特徴とする断片の配列のエピトープ。 １１．請求項６に記載のＡ２抗原ポリペプチド配列の抗原断片において、 アスパラギン酸４０３とアスパラギン酸７２５の間に、好適にはヒスチジン６ ９３とアスパラギン酸７２５の間に含まれることを特徴とする配列の抗原断片。 １２．請求項１１に記載の断片の配列のエピトープにおいて、 −下記の配列によって定義されるアスパラギン酸４０３とリジン４２５の間に 含まれるエピトープ： −下記の配列によって定義されるバリン５１７とアルギニン５２７の間に含ま れるエピトープ： −下記の配列によって定義されるヒスチジン６９３とグリシン７０１の間に含 まれるエピトープ： −下記の配列によって定義されるセリン７１０とアスパラギン酸７２５の間に 含まれるエピトープ： から成る群から選択されることを特徴とする断片の配列のエピトープ。 １３．請求項６に記載のC抗原ポリペプチド配列の抗原断片において、 リジン２０８５とリジン２２４９の間に、好適にはリジン２０８５とグリシン ２１２１の間に含まれることを特徴とする配列の抗原断片。 １４．請求項１３に記載の断片の配列のエピトープにおいて、 −下記の配列によって定義されるリジン２０８５とフェニルアラニン２０９３ の間に含まれるエピトープ： −下記の配列によって定義されるアスパラギン酸２１０８とグリシン２１２１ の間に含まれるエピトープ： −下記の配列によって定義されるグリシン２２４２とリジン２２４９の間に含 まれるエピトープ： から成る群から選択されることを特徴とする断片の配列のエピトープ。 １５．請求項６〜１４のいずれか一つに記載の断片および／またはエピトープ の強い部分において、 同一または異なる少なくとも２つの他のアミノ酸に結びついたアミノ酸チロシ ンおよび／またはアミノ酸ヒスチジンを含んでいることを特徴とする強い部分。 １６．請求項６〜１５のいずれか一つに記載の少なくとも２つの異なる断片、 少なくとも２つの異なるエピトープおよび／または少なくとも２つの強い部分を 含んでいることを特徴とする立体配座エピトープ。 １７．請求項１〜１６のいずれか一つに記載の配列、断片、エピトープおよび ／またはエピトープまたは断片の強い部分から成る群から選択された要素に結合 した担体タンパク質または担体ペプチドを含む錯体。 １８．請求項１〜１７のいずれか一つに記載の配列、断片、エピトープ、エピ トープまたは断片の強い部分および／または錯体との免疫親和性を示すことを特 徴とする因子VIIIの阻害剤。 １９．請求項１８に記載の阻害剤において、 抗体または抗因子VIII抗体の断片であることを特徴とする阻害剤。 ２０．請求項１８または１９に記載の因子VIIIの阻害剤に対して誘導されたこ とを特徴とする抗阻害剤。 ２１．請求項２０に記載の抗阻害剤において、 抗体または抗因子VIII抗イデオタイプ抗体の断片であることを特徴とする抗阻 害剤。 ２２．請求項１〜２１のいずれか一つによる配列、断片、エピトープ、強い部 分、錯体、阻害剤および／または抗阻害剤から成る群から選択された少なくとも １つの要素を含むことを特徴とする医薬品組成物。 ２３．請求項１〜２１のいずれか一つによる配列、断片、エピトープ、強い部 分、錯体、阻害剤および／または抗阻害剤から成る群から選択された少なくとも １つの要素を含むことを特徴とする診断および／または精製装置。 ２４．請求項２３に記載の装置において、 診断キットであることを特徴とする装置。 ２５．請求項２３に記載の装置において、 クロマトグラフィーカラムであることを特徴とする装置。 ２６．免疫障害の予防および／または治療のための医薬品調製のための請求項 ２２に記載の医薬品組成物の使用。 ２７．請求項２６に記載の使用において、 免疫障害が因子VIII阻害剤、von Willebrand の因子への因子VIIIの結合阻害 剤および／または膜リン脂質に対する因子VIIIの結合の阻害剤によって誘発され る障害であることを特徴とする使用。 ２８．免疫障害の治療および／または予防処置の方法において、 請求項２２に記載の医薬品組成物を患者に投与することを特徴とする方法。 ２９．請求項２８に記載の治療および／または予防処置の方法において、 免疫障害が因子VIII阻害剤、von Willebrand の因子への因子VIIIの結合阻害 剤および／または膜リン脂質に対する因子VIIIの結合の阻害剤によって誘発され る障害であることを特徴とする方法。 ３０．請求項１８〜２１のいずれか一つによる阻害剤および／または抗阻害剤 の識別および獲得法において、 クロマトグラフィーカラムの固体担体に請求項１〜１７のいずれか一つに記載 の配列、断片、エピトープ、強い部分および／または錯体から成る群から選択さ れた要素を固定する過程と； 前記クロマトグラフィーカラムに因子VIII阻害剤を有する患者の、生理的液体 を通す過程と； 請求項１〜１７のいずれか一つに記載の配列、断片、エピトープ、強い部分お よび／または錯体から成る群から選択された１つ以上の要素と免疫親和性を示し た因子VIIIの阻害剤の分画を溶離し、回収する過程を特徴とし、場合によって前 記方法が、回収した因子VIIIの阻害剤をクロマトグラフィーカラムの固体担体上 に固定し、抗因子VIII抗イデオタイプ抗体などの因子VIII抗阻害剤を前記カラム に通し、因子VIII阻害剤と免疫親和性を示した抗阻害剤を溶離し、回収する過程 ：を含むことを特徴とする方法。