CN101379077A

CN101379077A - 因子ⅷ和因子ⅷ-类似蛋白的小肽或者拟肽亲合性配体

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Publication number: CN101379077A
Application number: CNA2006800525677A
Authority: CN
Inventors: 塞巴斯蒂安·诺尔; 霍斯特·凯瑟勒; 夏洛特·豪泽; 爱丽克西·克伦诺夫; 伊夫冈尼·萨恩科
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2005-12-07
Filing date: 2006-12-07
Publication date: 2009-03-04
Also published as: CA2632714A1; JP2009518345A; WO2007065691A2; WO2007065691A3; US20090215025A1; EP1968999A2

Abstract

本发明涉及对因子VIII和因子VIII－类似蛋白表现出高亲合性的化合物和它们的用途。所述化合物的特征在于通式B－Q－X，其中B表示二肽、三肽或者拟肽；Q表示间隔物和X表示锚定分子；Q和X是任选的。这些化合物可以用于涂覆固体载体物质。所得的经涂覆的固体载体物质可以用于通过亲合色谱法纯化因子VIII。此外，本发明化合物可以用于稳定因子VIII和用于增强它的活性。由此，本发明还涉及制造含有增强活性的药物的稳定因子VIII的方法。此外，本发明化合物可以用于诊断试剂盒中和作为研究工具。

Description

因子Ⅷ和因子Ⅷ-类似蛋白的小肽或者拟肽亲合性配体

技术领域

本发明涉及小分子的组合物和它们在蛋白分离和纯化领域的用途。

特别是，本发明涉及含有对凝血因子VIII和/或因子VIII-类似多肽具有亲合性的小肽或者拟肽的化合物的合成和优化。这些化合物可以用于从含有所述因子VIII和因子VIII-类似多肽的生理和非生理溶液中标记、检测、鉴定、分离并优选用于纯化因子VIII和因子VIII-类似多肽。此外，这些化合物可以在本发明方法中用作结合因子VIII和因子VIII-类似多肽的配体。

为了本发明的目的，所有在此引用的参考文献都全文引入作为参考。

背景技术

因子VIII(FVIII)是血液凝固内源性途径的主要组分(Bolton-Maggs，P.H.B.；K.J.Pasi Lancet 2003，361，1801)。该血浆蛋白在血液中以与von Willebrand因子(vWf)的配合物的形式循环，所述配合物保护和稳定该蛋白。FVIII功能的遗传缺陷导致通称为血友病甲的危急生命的失血疾病，一种最通常的失血疾病，其通过重复输入FVIII进行治疗。血友病甲是因子VIII的遗传缺陷导致的结果。对于医学治疗，患者通常服用源于血浆或者重组细胞的因子VIII剂量。

血友病甲，由凝血因子VIII(FVIII)的缺乏或者结构缺陷导致的遗传性X染色体-相关的失血疾病，在5000个男性中大约一个受到影响。血友病甲的临床严重程度与因子缺乏的程度相关，并且可以分类为FVIII水平小于1％的严重疾病，中度(1-5％FVIII水平)和轻微疾病(5-25％FVIII水平)。该疾病的特征在于自发性失血以及在外伤或者手术的情形中无法控制的失血。血友病甲的其它临床标志是急性再发性疼痛关节积血，其可以发展为特征在于软骨和相邻骨骼的渐进性破坏、肌肉血肿、脑内出血和血尿症的慢性关节病(Klinge，J.；Ananyeva，N.M.；Hauser，C.A.；Saenko，E.L.Semin.Thromb.Hemost.2002，28，309-322)。

血友病甲通过重复输入源于人类血浆或者表达FVIII的重组细胞的FVIII进行治疗。

FVIII分子(～300kDa，2332个氨基酸残基)由三个同源A结构域、两个同源C结构域和一个B结构域组成，其以A1-A2-B-A3-C1-C2的顺序排列。在它分泌入血浆中之前，FVIII在细胞内处理成通过在B-A3连接位置裂解产生的Me²⁺-连接的杂二聚体。该裂解产生由A1(1-372)、A2(373-740)和B结构域(741-1648)组成的重链(HCh)和由A3(1690-2019)、C1(2020-2172)和C2(2173-2332)结构域组成的轻链(LCh)。由于在B结构域内大量的另外的裂解，给出具有不同长度B-结构域的分子，因此所得的蛋白在尺寸上是不均匀的。A1(氨基酸337-372)和A2(氨基酸711-740)结构域的C-末端部分和LCh(氨基酸1649-1689)的N-末端部分含有大量带负电的残基，被称为酸性区结构域(分别为AR1、AR2和AR3)。

为了应对更好供应FVIII的现有需求以及降低病毒和朊病毒污染的风险，在过去的数年内，重组FVIII的应用已经显著增加(Ananyeva N.，Khrenov A.，Darr F.，Summers R.，Sarafanov A.，Saenko E.Expert Opin.Pharmacother.2004；5:1061-1070)。因为因子VIII基因在1984年已经被分离(Vehar，G.A.；Keyt，B.；Eaton，D.；Rodriguez，H.；O′Brien，D.P.；Rotblat，F.；Oppermann，H.；Keck，R.；Wood，W.I.；Harkins，R.N.Nature 1984，312，337-342；Toole，J.J.；Knopf，J.L.；Wozney，J.M.；Sultzman，L.A.；Buecker，J.L.；Pittman，D.D.；Kaufman，R.J.；Brown，E.；Shoemaker，C.；Orr，E.C.Nature 1984，312，342-347)，新颖的重组因子VIII分子的制剂已经得到了显著改进。此外，因子VIII的结构功能关系以及分子生物学中更复杂技术的更深入研究开启了形成重组因子VIII的新的可能性。

当前，数种治疗学重组FVIII产品以冻干浓缩物的形式获得。

(1)为了合成RECOMBINATE(Baxter)和BIOCLATE(Centeon)，用于FVIII和vWf的基因已经被插入到中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中。vWf在细胞培养中充当FVIII稳定剂的作用。重组蛋白通过以下方法进行纯化:利用鼠单克隆抗体进行单个免疫亲和层析，随后进行两步离子交换色谱步骤，从而完成纯化工艺。纯化的重组FVIII最后通过加入巴氏杀菌的人白蛋白进行稳定。该纯化工艺并不包括分离病毒灭活步骤(Kaufman，R.J.；Wasley，L.C；Furie，B.C；Furie，B.；Shoemaker，C.B.J.Biol.Chem.1986，261，9622-9628)。

(2)在KOGENATE(Bayer)和HELIXATE(Centeon)的情形中，已经将用于因子VIII的基因插入到得自于小仓鼠肾(BHK)的确定细胞系中。分泌的重组FVIII通过多个纯化步骤进行处理，包括两步离子交换色谱法凝胶过滤和尺寸排阻色谱法，以及利用鼠单克隆抗体进行双重免疫亲和层析。然后，纯化的蛋白通过巴氏杀菌的人白蛋白进行稳定。病毒灭活通过热处理实现(Addiego，J.E.Jr.；Gomperts，E.；Liu，S.L.；Bailey，P.；Courter，S.G.；Lee，M.L.；Neslund，G.G.；Kingdon，H.S.；Griffith，M.J.Thrombosis and haemostasis 1992，67，19-27)。

(3)KOGENATE FS(Bayer)已经被开发为第二代产品。与KOGENATE不同，KOGENATE FS在含有重组胰岛素和人血浆蛋白溶液(HPPS)的细胞培养介质中进行培养，但是其中没有源于动物源的蛋白。

(4)REFACTO(Wyeth-Ayerst Pharmacia and Upjohn)是第一种被批准的B结构域缺失的重组FVIII分子(BDDrFVIII)。编码单链170kDa多肽的r-FVIII SQ基因源自于，通过除去编码B-结构域的区结构域的主要部分的全长cDNA。r-FVIII SQ载体系统被插入到CHO细胞中，并在补充有人白蛋白和重组胰岛素的无血清介质中进行培养。纯化包括五种不同的层析步骤，包括用针对FVIII重链的单克隆抗体进行免疫亲合和化学溶剂/净化剂病毒灭活步骤(Eriksson，R.K.；Fenge，C；Lindner-Olsson，E.；Ljungqvist，C；Rosenquist，J.；Smeds，A.L.；Ostlin，A.；Charlebois，T.；Leonard，M.；Kelley，B.D.；Ljungqvist，A.Sem.Hematol，2001，38，24-31)。

为了改进安全性，在FVIII产品的开发中避免使用任何动物或者人类蛋白是重要的。同当前许可的重组FVIII制剂相比，下一代FVIII产品使生产方法适于不含有任何人类或者动物来源组分的培养介质。由此，最终目标是在FVIII的生产中改进至完全避免与任何源于动物或者人类原料的组分接触的程度。还存在改进FVIII的纯化方法的需要。还需要提供直接从多种溶液如血液或者细胞培养上清液中获得的高纯度和活性的FVIII的方法，从而降低纯化步骤的数目以及涉及的成本。根据现有技术，以更快、更有效和更有效益的方式获得FVIII的新方法仍然未实现。

因子VIII通常使用单克隆抗体作为配体，通过亲合色谱法进行浓缩(Amatschek，K；Necina，R.；Hahn，R.；Schallaun，E.；Schwinn，H.；Josic，D.；Jungbauer，A.J.High Resol.Chromatogr.2000，23，47-58)。根据Medical and Advisory Councilof the US National Hemophilia Foundation和the WorldFederation of Hemophilia的最近声明，应当将所有努力致力于从重组细胞产品的制造工艺中除去人类和牛蛋白(Medical andScientific Advisory Council(MASAC)document #151＂MASACRECOMMENDATIONS CONCERNING THE TREATMENT OFHEMOPHILIA AND OTHER BLEEDING DISORDERS＂，得自于国家血友病基金网址(National Hemophilia Foundationwebside))。

低聚肽和多肽作为亲和配体多肽的配偶体的应用已经被提出(参见，WO 9914232；或者US 2003165822，其全部内容在此引入作为参考)。不过，该方法仍然存在缺点。首先，低聚肽的大规模合成和纯化并非微不足道，而是相当高成本的。此外，低聚肽对蛋白水解降解敏感，如果将源于血液或者细胞培养的原料用于亲和柱中，蛋白酶的存在将是不能完全避免的。这将迅速导致亲和纯化步骤的失效和降低的选择性，此外，将导致洗脱因子样品降低的纯度和半衰期以及昂贵的柱材料的半衰期。

由此，与当前可市场购买到的重组FVIII的制剂不同，本发明涉及化合物和用于在无任何人类或者动物来源组分的培养介质中制备下一代产品的方法。此外，本发明还涉及血浆-源FVIII制剂的纯化。

本发明包括包含化学合成的独特高亲合性肽和拟肽的化合物，其可以替换单克隆抗体并具有同上述已知的低聚肽相比改进的蛋白水解稳定性。此外，本发明化合物适于大规模溶液合成，因此将使生产成本最小化。

发明内容

本发明涉及包含肽和/或拟肽的特定化合物。这些化合物表现出结合和/或释放FVIII或者FVIII-相关多肽的特定性能，并且可以充当亲合分离FVIII或者FVIII-相关多肽的配体。

在具体实施方案中，包含肽和/或拟肽的本发明化合物是以亲合性结合FVIII和/或FVIII-相关蛋白，足以色谱纯化FVIII的二肽、三肽或者拟肽。

在某些实施方案中，所述化合物是对结合目标因子VIII多肽表现出明显特性以及对于释放(洗脱)目标多肽表现出特异特性的结合分子(即，具体组成和应用的pH值与洗脱缓冲液)。为了促进产品在温和条件下的洗脱，可以轻易通过现有化学方法对化合物进行改性。对于通常应用的抗体，所述改性在技术上是不可行的。

进一步的实施方案涉及作为载体物质的惰性基质，其包含固定的化合物，优选肽和/或拟肽。在具体实施方案中，载体材料为聚合物材料。在另一具体实施方案中，化合物被化学结合到载体基质上。在另一具体实施方案中，化合物经锚定分子被化学结合到载体基质上。在进一步的具体实施方案中，化合物经间隔分子被化学结合到载体基质上。还预期化合物经锚定分子和另外的间隔分子化学结合到载体基质上。

本发明涉及含有固定在基质上的本发明化合物的诊断设备或者试剂盒，其中化合物特异性地结合在FVIII或者FVIII-相关蛋白上。在某些实施方案中，化合物直接或者经锚定化合物和/或间隔分子固定在基质上，所述基质可以为聚合物材料，例如为树脂。

在又一实施方案中，化合物在方法中用作FVIII或者FVIII-相关蛋白的标记物。

在本发明的实施方案中，化合物在识别和/或纯化FVIII或者FVIII-相关蛋白的方法中使用。

本发明进一步涉及本发明化合物在疾病治疗中的医药用途。

附图说明

图1示出如实施例3所述的用于纯化先前纯化的FVIII的纯化轮廓图。

图2表明如实施例3所述的由用FVIII示踪的含FBS的细胞条件培养基得到的FVIII的纯化轮廓图。

图3是如实施例3所述的由纯FVIII的吸附和洗脱(条带2～6)和由用FVIII示踪的含FBS的细胞条件培养基纯化(条带7～12)得到的馏份的SDS-PAGE照片。条带1:分子量标准样品；条带2:纯FVIII；条带3:用于柱的具有纯FVIII的源溶液；条带4:通过流；条带5和6:洗脱馏分；条带7:介质；条带8:用于柱的具有FVIII的介质；条带9:通过流；条带10和11:用0.2M NaCl预洗涤的洗脱馏分；条带12:用1M NaCl的洗脱馏分。

图4是如实施例3所述的由纯FVIII吸附和洗脱(条带2-6)和由用FVIII示踪的含FBS的细胞条件培养基纯化(条带8-12)的馏份的Western印迹照片。条带1:纯FVIII；条带2:用于柱的具有纯FVIII的源溶液；条带3:通过流；条带4和5:洗脱馏分；条带6:用于柱的具有FVIII的介质；条带7:通过流；条带8和9:用0.2M NaCl预洗涤的洗脱馏分；条带10：用1M NaCl的洗脱馏分。

图5(a)示出如实施例4所述的用于纯化先前纯化的FVIII的纯化轮廓图。

图5(b)是如实施例4所述的由纯化先前纯化的FVIII得到的馏份的SDS-PAGE照片(条带1-4)。条带1:纯FVIII；条带2:通过流；条带3:洗涤馏份；条带4:用1M NaCl洗脱的馏分。

图5(c)示出如实施例4所述的由纯化先前纯化的FVIII得到的馏份的Western印迹分析照片。条带5:纯FVIII；条带6:通过流；条带7:用1M NaCl洗脱的馏分。

图6(a)示出如实施例4所述的用FVIII示踪的由含FBS的DMEM条件培养基中进行纯化的纯化轮廓图。

图6(b)是如实施例4所述的用FVIII示踪的由含FBS的DMEM条件培养基中进行纯化得到的馏份的SDS-PAGE照片(条带1-4)。条带1:粗介质；条带2:用于柱的源溶液；条带3:通过流；条带4:用1M NaCl洗脱的馏分。

图6(c)是如实施例4所述的用FVIII示踪的由纯化含FBS的DMEM条件培养基得到的馏份的Western印迹照片。条带5:纯FVIII；条带6:通过流；条带7:用1M NaCl洗脱的馏分。

具体实施方式

亲合色谱法是沿用已久的强有力的技术，它是用于纯化复杂分子如蛋白的的现有方法(Jack，G.W.；Beer，D.J.MethodsMoI.Biol.1996，59，187-196)。亲合色谱法通过目标分子和配体之间的强相互作用提供了将具有优良选择性的目标蛋白与污染蛋白分离的独特可能性，其中所述配体被固定在树脂上。通常配体为多克隆或者单克隆抗体。单克隆抗体是优选的，这是因为它们是单一特异性的并且可以精确形成(Scopes，R.K.Protein purification:Principles and Practice.Springer，NewYork，1994)。迄今为止，小的化学配体仅仅限于用于亲合分离中。然而，组合库的应用已经扩展用于肽配体的免疫亲和层析工艺的专门技术(Lowe，C.R.Curr.Opin.Chem.Biol.2001，5，248-256)。基于生物学或者化学系统，组合方法的使用已经形成了独特的肽，其提供中等或者甚至高结合亲合性，从而捕获目标蛋白和在温和条件下洗脱它。

例如，Huang，Ping Y.等人在＂Bioorganic & MedicinalChemistry＂，Vol.4，No.5，pp.699-708，1996中描述了固定肽用于免疫亲和层析纯化von Willebrand因子(vWF)的应用。多聚体vWF的纯化是一种主要的挑战，因为其分子量在0.5～10百万道尔顿的巨大尺寸范围内。von Willebrand因子是在凝血级联系统中直接涉及的多功能血浆蛋白。在导致正常阻止失血的情形中，它具有突出的作用。vWF和FVIII之间的相互作用导致FVIII得到稳定和运送。两种高亲合结合位点确保有效捕获(Sadler.J.E.；Mannucci.P.M.；Berntorp.E.；Bochkov.N.；Boulyjenkov.V.；Ginsburg.D.；Meyer.D.；Peake.I.；Rodeghiero.F.；Srivastava.A.Thromb.Haemost，2000，84，160-174)。

FVIII是一种在凝血级联系统中起重要作用并且具有强治疗学重要性的大而复杂的蛋白。由遗传突变引起的体内FVIII产生的缺乏可以导致血友病，其通过输注纯化的人类FVIII制剂进行治疗(Lee，C.Thromb.Haemo st.1999，82，516-524)。用于治疗血友病患者的人类FVIII的当前来源是血浆源FVIII和重组FVIII，后者在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(Kaufman，R.J.；Wasley，L.C；Dorner，A.J.J.Biol.Chem.1988，263，6352-6362)和小仓鼠肾(BHK)细胞(Boedeker，B.D.G.Sem.Thromb.Hemost.2001，27，385-394)中合成。除了高纯度指标之外，确保免疫学和病毒安全性是至关重要的。

存在几种已知利用色谱技术纯化人类FVIII的方法。对于所有重组FVIII制剂和对于多种血浆源FVIII产品，应用免疫亲和层析树脂是常规的制造方法。包括亲合色谱法的当前制造方法使用对于FVIII特异性的单克隆抗体(mAb)(Lee，C.，Recombinant clotting factors in the treatment of hemophilia.Thromb.Haemost.1999，82，516-524)。为了制造的目的，抗FVIII的抗体通过鼠杂交瘤细胞系产生，然后固定在色谱树脂上。当前工业FVIII纯化应用mAb免疫亲合步骤，该步骤对方法相关的杂质(比如DNA和宿主细胞)提供优良的除去作用。

然而，还存在多种与当前利用固定的单克隆抗体的免疫亲和层析方法相关的疑虑和限制。一个缺点是树脂容量的限制，因为几种分子尺寸巨大的抗体分子将覆盖树脂表面的相当大的部分。此外，抗体制备是一种冗长和昂贵的方法，抗体的纯度和活性将取决于各次重复制备而变化。抗体通过作为生产宿主的杂交瘤来生产，这使得抗体对病毒，特别是逆转录病毒可能被引入到目标蛋白的制造工艺中的低但是非零的风险敏感。最后，抗体由载体基质(即，树脂)中的渗漏可以引起严重的产品污染和由于免疫原性导致产品损失。由此，存在充分的动力，以用更精确的、低本高效的方法替换当前方法。通过在降低或者消除数种所述缺陷的免疫亲和层析纯化方法中提供其为化学合成的小肽或者拟肽衍生物的化合物，本发明满足了该需求。

Pflegerl等人(J.Peptide Res.2002，59，174-182)报道了对FVIII具有高亲合性的不同八肽的研制。发现必需的氨基酸序列是位于肽C-末端一侧的WEY。

包含小肽或者拟肽衍生物的本发明化合物作为配体具有优势，因为在渗漏入产品中的情形中，它们不可能引起免疫应答。同抗体相比，小肽或者拟肽衍生物还更加稳定。另一优点是它们显著较低的生产成本，因为它们可以容易地在良好制造规范(GMP)下大量无菌生产。小肽或者拟肽衍生物和本发明方法的应用获得了不使用动物来源或者人类来源的原料的纯化产品。最后但非最不重要，在此所述的完善化学合成使得精制步骤改进了小肽或者拟肽衍生物对它们的目标蛋白的亲合性。

因此，本发明向本领域普通技术人员提供了化合物和改进通常使用的FVIII纯化方法的工艺。

如本文中所述，本发明提供了FVIII纯化方法，其对于FVIII的免疫亲和纯化避免使用鼠单克隆抗体。本发明包括化学合成的独特高亲合性肽和拟肽，其可以替换单克隆抗体并具有同上述已知的低聚肽相比改进的蛋白水解稳定性。这将满足当前对生物学安全性的需要。此外，我们的化合物适于大规模溶液合成，因此将使得亲合性配体的生产成本最小。

本发明包括新颖化合物，优选二肽、三肽和拟肽，其作为配体用于检测、鉴定、分离和纯化以及标记活性因子VIII和因子VIII-类似蛋白，所述蛋白来自含有所述蛋白的溶液中。本发明的因子VIII结合分子表现出显著的稳定性以及对于因子VIII和因子VIII类似蛋白的高亲合性。除非另作说明或者指出，在此使用的术语“因子VIII和因子VIII类似蛋白”包括来源于任何动物、任何重组或者杂交的因子VIII或者任何改性的因子VIII。在优选的实施方案中，所述“因子VIII和因子VIII类似蛋白”的特征在于活性(通过标准一期凝血法进行确定，例如，如Bowie，E.J.W.和C.A.Owen，Disorders of Hemostasis(Ratnoff和Forbes，eds.)pp.43-72，Grunn & Stratton，Inc.，Orlando，FIa.(1984)中所述)为因子VIII天然人类形式的活性的至少10％，更优选至少50％，最优选至少80％。

因子VIII类似蛋白还包括任何来源的因子VIII蛋白的结构域、片段和表位及其杂交组合物。此外，术语“因子VIII类似蛋白”进一步包括可以用作用于研究目的的探针或者用作诊断剂的因子VIII的片段，即使所述片断几乎没有或者没有表现出血液凝固活性。优选所述蛋白或者多肽包含至少50个氨基酸，更优选至少100个氨基酸。优选的因子VIII和因子VIII类似蛋白的结构域、表位和片段包括其轻链，含有结构域A3-C1、C1-C2、A3、C1或者C2的轻链部分和单个结构域A3、C1和C2。可以根据本发明纯化的因子VIII和因子VIII类似蛋白还包括描述在US7,122,634、US 7,041,635、US 7,012,132和US 6,866,848中的所有重组蛋白、杂交体、衍生物、突变体、结构域、片段和表位，所有这些文献的全部内容都在此引入作为参考。除非在本文中另有说明，术语“氨基酸”包括含有至少一个氨基和至少一个酸性基团的任何有机化合物。所述氨基酸可以是任何天然存在的化合物或者合成来源的化合物。优选氨基酸含有至少一个伯氨基和/或至少一个羧酸基团。术语“氨基酸”还指包含在来源于所述氨基酸化合物和通过肽键或者拟肽键键接在相邻残基上的较大分子(比如肽和蛋白)中的残基。

本发明提供了确保快速分离和纯化商业量的可用于血友病甲治疗和研究中的蛋白和相关物质的低本高效方法。

本发明涉及包含式I的肽和/或拟肽的化合物以及它们的盐。

(I)B-Q-X

其中

B是对FVIII和/或FVIII-类似蛋白提供亲合性的二肽、三肽或者拟肽，

Q不存在或者为有机间隔分子和

X不存在或者为锚定分子，

根据本发明的其它化合物包含两个或者更多个可以彼此相同或者不同的基团B。这些基团B可以连接在相同的间隔物Q上，从而形成通式(B)r-Q-X所表示的化合物，r的范围为2～4。作为选择，它们可以通过其它间隔物Q(各个间隔物Q彼此相同或者不同)彼此连接，从而形成类型(B-Q)s-X的低聚化合物，s的范围为2～4。

根据本发明的另一实施方案，所述基团B本身或者基团B和Q一起或者B和X一起或者B和Q和X一起可以形成环。任选该环可以包括选自有机二价基团的另外的环-形成部分，所述有机二价基团比如任选取代的亚烷基基团、氨基酸、二肽或者三肽及其组合。

术语“拟肽”包括能够模拟或者拮抗亲本肽的生物学作用的含有非肽结构成分的化合物。优选所述化合物几乎不含(或者不含)肽键。本发明的优选实施方案涉及由本发明的二肽和三肽通过用一个或者多个选自以下的官能团替换一个或者多个肽键衍生得到的拟肽:-CO-NR²-、-NR²-CO-、-CH₂-NR²-或者-NR²-CH₂-、-CO-CHR²-、-CHR²-CO-、-CR²＝CR²-和-CR²＝CR²-，其中R²为如下关于通式(II)所定义的。应当理解，在含有基团-NR²-的选项中，取代基R²可以是各氨基酸(类肽氨基酸)的侧链。在这种情况下，相邻的Cα不带有侧链。另一方面，除了连接Cα的侧链之外，还存在其它取代基R²。此外，如果多于一个R²存在，应当理解，各个R²可以相同或者彼此不同。

特别优选的拟肽组包括含有残基Z1-Z2-Z3(如下所定义)的那些化合物，其中(至少)Z2和Z3之间的肽键选自-CH₂-NR²-或者-NR²-CH₂-、-CR²＝CR²-和-CR²＝CR²。

“亲合性”是促使它们保持联合的原子或者分子间吸引力。这是亲合色谱法的基础。在本发明上下文中，如果根据以下测试方案测量与FVIII的结合，认为肽或者拟肽对FVIII或者FVIII-类似蛋白表现出至少10％，优选至少25％和最优选至少40％的亲合性。结合程度通过重现实施例1中所述的试验，利用¹²⁵I-标记的FVIII进行测量。

优选本发明的肽或者拟肽衍生物B(在此使用的术语“拟肽”和“拟肽衍生物”可以互换使用)可以化学键接到载体基质的表面，从而形成肽包衣的载体基质。这优选借助于锚定分子X和/或间隔分子Q实现，或者如果Q和X不存在，优选借助于化合物B的SH、N₃、NH-NH₂、O-NH₂、NH₂、-CH₂-L、C≡CH、羰基或者羧基实现。在本文中，L包括离去基团，比如Cl、Br或者I。

本发明还涉及所述肽包衣的载体基质。

术语“化学结合”包括两个(或更多个)原子、或者一个(或者更多个)原子和一种(或更多种)化合物或者两种(或更多种)化合物之间的共价、离子、疏水和/或其它配合相互作用及其混合和组合。

载体物质包括无机或者有机物质，特别是聚合物物质。因此，可以使用相同的聚合物物质(即直链多糖)，其通常用于生物聚合物的色谱分离。特别是，产生亲水性表面的聚合物适宜作为色谱载体物质，即树脂。例如，使用ToyoperalAF-Epoxy-650M树脂。所述载体物质还可以具有另外的锚定分子，所述锚定分子提供用于固定如根据式I的肽或者拟肽的化合物的SH、N₃、NH-NH₂、O-NH₂、NH₂、-CH₂-L、C≡CH、环氧基、羰基或者羧基。

由于本发明的优选化合物与FVIII和/或FVIII-类似蛋白相互作用的事实，包含肽或者拟肽衍生物的优选化合物适用于诊断设备和试剂盒中。优选诊断设备或者试剂盒包含至少一种对FVIII或者FVIII相关蛋白具有高亲合性的化合物，至少一种化合物可以任选化学键接的载体基质和必要时的其它试剂。

为了跟踪本发明的化合物，优选肽或者拟肽衍生物，与FVIII和/或FVIII-类似蛋白的反应结果，将化合物进行标记。标记化合物存在数种可能性，即通过使用放射性标记物进行标记，通过使用荧光配体进行标记，通过使用亲和素/链霉亲和素(avidine/steptavidine)系统进行标记，或者如ELISA工艺中通常应用的，通过使用引起显色反应的酶进行标记。

本发明涉及含有适于标记、检测、鉴定、分离和/或纯化FVIII和/或FVIII-类似蛋白的肽和拟肽衍生物的化合物。

在上文和下文中给出的氨基酸缩写表示以下氨基酸的残基:

Abu 4-氨基丁酸

Aha 6-氨基己酸

Ala 丙氨酸

Asn 天门冬酰胺

Asp 天冬氨酸

Arg 精氨酸

Bpa 对苯甲酰基苯丙氨酸

Cys 半胱氨酸

Dab 2，4-二氨基丁酸

Dap 2，3-二氨基丙酸

GIn 谷氨酰胺

GIp 焦谷氨酸

GIu 谷氨酸

GIy 甘氨酸

His 组氨酸

homo-Cys 同型半胱氨酸

homo-Phe 同型苯丙氨酸

IAA 2-(吲哚-3-基)乙酸

IBA 4-(吲哚-3-基)丁酸

IPA 3-(吲哚-3-基)丙酸

Ile 异亮氨酸

Leu 亮氨酸

Lys 赖氨酸

Met 蛋氨酸

1-Nal 1-萘基丙氨酸

2-Nal 2-萘基丙氨酸

Nle 正亮氨酸

Orn 鸟氨酸

Phe 苯丙氨酸

Phg 苯基甘氨酸

4-Hal-Phe 4-卤素-苯丙氨酸

Pro 脯氨酸

Ser 丝氨酸

Thr 苏氨酸

Trp 色氨酸

Tyr 酪氨酸

Val 缬氨酸

此外，使用以下缩略语:

Ac 乙酰基

BOC 叔丁氧羰基

tBu 叔丁基

CBZ或者Z 苄氧羰基

DCCI 二环己基碳二亚胺

DIPEA N-乙基二异丙基乙胺

DMF 二甲基甲酰胺

EDCI N-乙基-N，N′-(二甲基氨基丙基)-碳二亚胺

Et 乙基

Fmoc 9-芴基甲氧羰基

HOBt 1-羟基苯并三唑

Me 甲基

MBHA 4-甲基-二苯甲胺

Mtr 4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯基-磺酰基

HATU O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯；

HONSu N-羟基琥珀酰亚胺

OtBu 叔丁基酯

Oct 辛酰基

OMe 甲基酯

OEt 乙基酯

POA 苯氧基乙酰基

Pbf 五甲基苯并呋喃基

Pmc 2，2，5，7，8-五甲基色满(Pentamethylchroman)-6-磺酰基

Sal 水杨酰基

Su 琥珀酰基

TIPS 三异丙基硅烷

TFA 三氟醋酸

TFE 三甲基甲硅烷基溴

Trt 三苯甲基(三苯基甲基)。

如果式I化合物的结构单元(即上述的氨基酸)可以以多种光学异构形式存在，那么包括所有这些形式及其混合物(例如DL形式)。

此外，作为式I化合物组成部分的氨基酸可例如带有自身已知的相应保护基。优选基团为Asp和GIu的衍生物，特别是Tyr的侧链或者衍生物的甲基-、乙基-、丙基-、丁基-、叔丁基-、新戊基-或者苄基酯，特别是侧链的甲基-、乙基-、丙基-、丁基-、叔丁基-、新戊基-或者苄基酯。此外，所述化合物可以带有一个或者多个另外的保护基，所述保护基在以下结合本发明化合物的制备进行了描述。

此外，比如N-末端改性或者羧基-末端改性衍生物的结构部分同样属于本发明的一部分。优选基团为氨基-末端甲基-、乙基-、丙基-、丁基-、叔丁基-、新戊基-、苯基-或者苄基-基团，氨基-末端基团比如BOC、Mtr、CBZ、Fmoc和特别是乙酰基、苯甲酰基或者(吲哚-3-基)碳酸基团，此外，羧基-末端甲基-、乙基-、丙基-、丁基-、叔丁基-、新戊基-或者苄基酯，甲基-、乙基-、丙基-、丁基-、叔丁基-、新戊基-或者苄基酰胺，并且特别是羧酰胺。

α氨基可以由适宜的保护基保护，所述保护基选自芳香氨基甲酸酯型的保护基，比如烯丙氧羰基、苄氧羰基(Z)和取代的苄氧羰基，比如对-氯苄氧羰基、对-硝基苄氧羰基、对-溴苄氧羰基、对-联苯-异丙氧羰基、9-芴甲氧羰基(Fmoc)和对-甲氧基苄氧羰基(Moz)；脂族尿烷型的保护基，比如叔丁氧羰基(Boc)、二异丙基甲氧羰基和异丙氧羰基。在此，对于α氨基保护，Fmoc是最优选的。

可以用于形成根据本发明的肽或者拟肽的氨基酸可以属于天然存在和非蛋白氨基酸。氨基酸和氨基酸残基可以进行衍生化，不过优选N-甲基-、N-乙基-、N-丙基-或者N-苄基-衍生物。例如，如果使用甲基，酰胺键的N-烷基化作用会对相应化合物的活性具有强烈影响(Levian-Teitelbaum，D.；Kolodny，N.；Chorev，M.；Selinger，Z.；Gilon，C.Biopolymers 1989，28，51-64，其全文在此引入作为参考)。另外，可以应用的氨基酸的其它结构替换物包括在侧链上具有改性的氨基酸、β-氨基酸、氮杂-氨基酸(α-氨基酸的衍生物，其中α-CH-基团被N-原子取代)和/或类肽-氨基酸(α-氨基酸的衍生物，其中氨基酸侧链键接在氨基上，而不是α-C-原子上)或者上述变型的环化衍生物。

根据本发明的一种实施方案，还可以将天然存在的氨基酸的同型-衍生物用作结构单元。它们是天然存在的氨基酸的衍生物，其中亚甲基基团被插入到侧链中，直接与Cα相邻。类似地，还可以使用根据本发明的天然存在的氨基酸的α-甲基化衍生物。在上下文中，除非另外明确说明，残基B、Q和X为关于式I所定义的。

在本发明的一个实施方案中，式I化合物如所附权利要求2～17中任一项中所定义。

在另一实施方案中，优选B由以下通式表示

Z1-Z2-Z3，

其中Q、X或者载体可以直接键接到残基Z1、Z2和Z3中任一残基上。优选经残基Z1或者Z3进行键接，更优选经残基Z3进行键接。

在该实施方案中，Z1是具有大侧链的天然存在或者非蛋白氨基酸残基或者其衍生物。这意味着侧链含有至少3个碳原子，优选至少5个碳原子和更优选6～25个碳原子。一个或者多个所述碳原子可以被选自N、O和S的杂原子替代。优选Z1的侧链含有可以为单环、双环或者三环的环状基团。此外，该环状基团可以是饱和的、不饱和的或者芳香基团。更优选芳香基团以及双环基团。特别优选芳香双环基团。在所附权利要求4～17中对于另一实施方案详述的特征描述了该实施方案的其它优选化合物。

在该实施方案中，还可以优选Z1为下式的残基Ar-(CH₂)_m-(CHR¹)_n-(CH₂)_o-A¹ (II)

其中

A¹表示选自NR²、CO、OCO、CHR²、O或者S的基团，

R¹表示选自C_1-4烷基、苯基、苄基和N(R²)₂的基团，其中烷基、苯基或者苄基可以带有一个或多个独立地选自A和N(R²)₂的取代基，其中两个或更多个A和/或两个或更多R²可以彼此相同或者不同，

Ar是具有6-14个碳原子的单-、双-或者三环芳香环系统的芳香基，饱和或者部分不饱和的C5-14单-或者双环烷基，它们各自未被取代或者带有1-3个独立地选自A、Ar¹、O-Ar¹、C(O)-Ar¹、CH₂-Ar¹、OH、OA、CF₃、OCF₃、CN、NO₂、Hal的取代基；或者Ar可以是Het，

Hal选自F、Cl、Br或者I，

Ar¹是具有6-14个碳原子的单-、双-或者三环芳香环系统的芳香基，优选苯基或者萘基基团，更优选苯基。Ar¹可以自身未被取代或者带有1-3个独立地选自A、OH、OA、CF₃、OCF₃、CN、NO₂和Hal的取代基；

Het表示具有5-12个环成员的饱和、部分或者完全不饱和的单-或者双环杂环残基，其中环成员包含1-3个N-和/或1个S-或者O-原子。

杂芳基或者单环或者双环5员-12员杂环环基团可以基于的杂环的实例为吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、吡唑、噁唑、异噁唑、噻唑、异噻唑、四唑、吡啶、吡嗪、嘧啶、吲哚、异吲哚、吲唑、酞嗪、喹啉、异喹啉、喹喔啉、喹唑啉、噌啉、β-咔啉或者这些杂环的苯并稠合、环戊基稠合、环己基稠合或者环庚基稠合衍生物。

氮杂环还可以作为N-氧化物存在。

可以为杂芳基或者单环或者双环5员-12员杂环环的基团为，例如，2-或者3-吡咯基、苯基吡咯基(例如4-或者5-苯基-2-吡咯基)、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、4-咪唑基、甲基咪唑基(例如1-甲基-2-、-4-或者-5-咪唑基)、1，3-噻唑-2-基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、N-氧化-2-吡啶基、N-氧化-3-吡啶基或者N-氧化-4-吡啶基、2-吡嗪基、2-嘧啶基、4-嘧啶基或者5-嘧啶基、2-吲哚基、3-吲哚基或者5-吲哚基、取代的2-吲哚基(例如1-甲基-、5-甲基-、5-甲氧基-、5-苄氧基-、5-氯-或者4，5-二甲基-2-吲哚基)、1-苄基-2-吲哚基或者1-苄基-3-吲哚基、4，5，6，7-四氢-2-吲哚基、环庚并[b]-5-吡咯基、2-喹啉基、3-喹啉基或者4-喹啉基、1-异喹啉基、3-异喹啉基或者4-异喹啉基、1-氧代-1，2-二氢-3-异喹啉基、2-喹喔啉基、2-苯并呋喃基、2-苯并噻吩基、2-苯并噁唑基或者2-苯并噻唑基，或者作为部分氢化或者完全氢化的杂环环的基团，还例如二氢吡啶基、吡咯烷基(例如2-或者3-(N-甲基吡咯烷基)、哌嗪基、吗啉基、硫代吗啉基、四氢噻吩基、苯并二噁烷基(benzodioxolanyl)。

表示基团Het的杂环基团可以在碳原子和/或环氮原子上未被取代或者被单取代或者多取代，例如被相同或者不同的取代基二取代、三取代、四取代或者五取代。碳原子可以被取代，例如，被(C₁-C₈)-烷基取代，特别是被(C₁-C₄)-烷基，被(C₁-C₈)-烷氧基取代，特别是被(C₁-C₄)-烷氧基取代(上述取代基的烷基部分可以自身未被取代或者被COOR²或者N(R²)₂取代)，被卤素、硝基、N(R²)₂、三氟甲基、OCF₃、羟基、氧代、氰基、COOR²、氨基羰基、(C₁-C₄)-烷氧基羰基、苯基、苯氧基、苄基、苄氧基、四唑基取代，特别是被(C₁-C₄)-烷基(例如甲基、乙基或者叔丁基)、(C₁-C₄)烷氧基(例如甲氧基)、羟基、氧、苯基、苯氧基、苄基、苄氧基取代。硫原子可以被氧化成亚砜或者砜。基团Het的实例为1-吡咯烷基、1-哌啶基、1-哌嗪基、4-取代的1-哌嗪基、4-吗啉基、4-硫代吗啉基、1-氧代-4-硫代吗啉基、1，1-二氧代-4-硫代吗啉基、全氢恶嗪-1-基(perhydroazepin-1-yl)、2，6-二甲基-1-哌啶基、3，3-二甲基-4-吗啉基、4-异丙基-2，2，6，6-四甲基-1-哌嗪基、4-乙酰基-1-哌嗪基和4-乙氧羰基-1-哌嗪基。

A表示COOR²、N(R²)₂或者具有1-6个C原子的直链、支链或者环状烷基，其可以未被取代或者被COOR²或者N(R²)₂取代，

m和o独立地选自0、1、2、3和4，

n为0或者1，和

R²为H、C_1-4烷基、苯基或者苄基，或者在类肽-氨基酸的情形中，为氨基酸侧链。

更优选的基团Z1包括蛋白原芳香氨基酸(Phe、Tyr、Trp、His)及其衍生物，特别是在其侧链上带有1-3个独立地选自R⁶(如下所定义)的取代基的那些衍生物。所述衍生物的一般实例为Tyr(OMe)、Tyr(OBn)、Trp(Me)。更优选的基团Z1包括Tyr、Tyr(OMe)和Tyr(OBn)的衍生物，其中取代基连接在苯基的间位或者邻位。其它更优选的基团Z1包括环己基丙氨酸、1-萘基丙氨酸、2-萘基丙氨酸、2-噻吩丙氨酸、3-噻吩丙氨酸、苯并噻吩丙氨酸(其中双环环系统可以在环系统的任何位置上连接在分子的剩余部分上，优选在噻吩基环的2-或者3-位)、苯基甘氨酸、对-苯甲酰基苯丙氨酸、高苯丙氨酸、同型酪氨酸、同型色氨酸、同型组氨酸和以上关于天然氨基酸所述的它们的衍生物。

其它更优选的基团Z1包括以上通式(II)表示的基团，其由以下通式(III)表示:

Ar²-(CH₂)_m-(CHR³)_n-(CH₂)_o-CO- (III)

其中

Ar²表示由Ar限定的芳香基团的优选亚组(subgroup)，包括苯基、2-羟苯基、3-羟苯基、4-羟苯基、1-萘基、2-萘基、对-苯甲酰基苯基、(邻、间或者对-)联苯基、2-吲哚基、3-吲哚基、2-硫代苯基、3-硫代苯基、2-苯并噻吩基、3-苯并噻吩基，其每一个可带有1～3个独立地选自A和Hal的取代基，和

其中式(III)的剩余取代基为如关于式(II)所定义的，和

R³为H、R⁶、-COR⁶、-COOR⁶和

R⁶表示H、C_1-4烷基、苯基或者苄基，各自可以未被取代或者独立地被A、OH、OA、CF₃、OCF₃、CN、NO₂或者Hal单取代、二取代或者三取代。

特别优选的基团Z1选自Ac-Trp、Trp、1-萘基丙氨酸、2-萘基丙氨酸、对-苯甲酰基苯丙氨酸和以上通式(III)的基团，其中Ar表示3-吲哚基、1-萘基、2-萘基或者对-苯甲酰基苯基，和m＝0-3，n＝0，o＝0。

最优选通式(III)表示的基团Z1，其中Ar为3-吲哚基，m＝1，n＝0，o＝0。

Z2不存在或者为天然存在或者非蛋白氨基酸残基或者其衍生物。优选Z2不是芳香族的。

更优选Z2为包括Ser、Thr、Glu、Asp、Asn、Gln、Arg、Lys及其衍生物的极性氨基酸(包括，例如N-烷基化的和Cα-甲基化的极性氨基酸和具有改性侧链长度的极性氨基酸衍生物，比如同型衍生物和Orn)。特别优选的基团Z2选自在生理条件下带有负电荷的如上所定义的极性氨基酸，比如GIu、Asp、同型-Glu和同型-Asp。最优选的基团Z2为GIu或者Asp。

Z3是如以上对于Z1所定义的残基。也就是说，Z3为天然存在或者非蛋白氨基酸残基或者其衍生物，或者通式(II)表示的基团，其中

A¹表示NR²、CO、CHR²、O或者S，

R¹表示C_1-4烷基、苯基或者苄基，和N(R²)，其中烷基、苯基或者苄基带有至少一个基团N(R²)和任选一个或多个独立地选自A和N(R²)₂的取代基，其中两个或更多个A和/或两个或更多个R²可以彼此相同或者不同，和

Ar是具有6-14个碳原子的单-、双-或者三环芳香环系统的芳香基团，饱和或者部分不饱和的C_5-14单-或者双环烷基，它们各自未被取代或者被一个、两个或者三个独立地选自A、O-Ar¹、C(O)-Ar¹、CH₂-Ar¹、OH、OA、CF₃、OCF₃、CN、NO₂或Hal的基团取代，或者Het，

Hal选自F、Cl、Br或者I，

Het是如以上对于Z1所定义的杂环残基，

m和o独立地选自0、1、2、3和4，

n为0或者1，和

R²为H、C_1-4烷基、苯基或者苄基，或者在类肽-氨基酸的情况下，为氨基酸侧链。

更优选的基团Z3包括蛋白原芳香氨基酸(Phe、Tyr、Trp、His)及其衍生物，特别是在其侧链上带有1～3个独立地选自C_1-4烷基、卤素原子或者苄基的取代基的那些衍生物。所述衍生物的一般实例为Tyr(OMe)、Tyr(OBn)、Trp(Me)。其它更优选的基团Z3包括环己基丙氨酸、1-萘基丙氨酸、2-萘基丙氨酸、噻吩丙氨酸、苯并噻吩丙氨酸、苯基甘氨酸、对-苯甲酰基丙氨酸、高苯丙氨酸(homophenylalanine)、同型酪氨酸(homotyrosinc)、同型色氨酸(homotryptophane)、同型组氨酸(homohistidine)和如上关于天然氨基酸所述的它们的衍生物。

其它更优选的基团Z3包括以上通式(III)表示的基团，其中Ar表示苯基、2-羟苯基、3-羟苯基、4-羟苯基、1-萘基、2-萘基、对-苯甲酰基苯基、联苯基、2-吲哚基、3-吲哚基、噻吩、苯并噻吩，它们各自带有1～3个独立地选自A和Hal的取代基，和其中式(III)的剩余取代基如以上关于Z1所定义的。

最优选的基团Z3选自1-NaI、Phe、Tyr和Tyr(OMe)。本发明的二肽和三肽基团B中的残基Z1和Z3或者Z1和Z2以及Z2和Z3各自经肽键进行连接。

本发明的优选化合物包括选自以下残基组合的那些二肽或者三肽基团B:

(i)Z1的更优选实施方案与Z2和Z3的优选实施方案的组合；

(ii)Z1的特别优选实施方案与Z2和Z3的优选实施方案的组合；

(iii)Z1的最优选实施方案与Z2和Z3的优选实施方案的组合；

(iv)Z2的更优选实施方案与Z1和Z3的优选实施方案的组合；

(v)Z2的特别优选实施方案与Z1和Z3的优选实施方案的组合；

(vi)Z2的最优选实施方案与Z1和Z3的优选实施方案的组合；

(vii)Z3的更优选实施方案与Z1和Z2的优选实施方案的组合；

(viii)Z3的最优选实施方案与Z1和Z2的优选实施方案的组合；

(ix)Z1的更优选实施方案与Z2和Z3的更优选实施方案的组合；

(x)Z1的特别优选实施方案与Z2和Z3的更优选实施方案的组合；

(xi)Z1的最优选实施方案与Z2和Z3的更优选实施方案的组合；

(xii)Z2的更优选实施方案与Z1和Z3的更优选实施方案的组合；

(xiii)Z2的特别优选实施方案与Z1和Z3的更优选实施方案的组合；

(xiv)Z2的最优选实施方案与Z1和Z3的更优选实施方案的组合；

(xv)Z3的更优选实施方案与Z1和Z2的更优选实施方案的组合；

(xvi)Z3的最优选实施方案与Z1和Z2的更优选实施方案的组合；

(xvii)Z1的更优选实施方案与Z2和Z3的最优选实施方案的组合；

(xviii)Z1的特别优选实施方案与Z2和Z3的最优选实施方案的组合；

(xix)Z1的最优选实施方案与Z2和Z3的最优选实施方案的组合；

(xx)Z2的更优选实施方案与Z1和Z3的最优选实施方案的组合；

(xxi)Z2的特别优选实施方案与Z1和Z3的最优选实施方案的组合；

(xxii)Z3的更优选实施方案与Z1和Z2的最优选实施方案的组合；

肽和/或拟肽序列的方向可以反转(称为“反式肽(retropeptide)”)。

Q为任选的有机间隔分子。

有机间隔分子在本质上是已知的。“有机物”为除碳化物和碳酸盐化合物的所有碳化合物，参见Beilstein′s Handbook ofOrganic Chemistry。通常，有机间隔分子是在一个或者两个末端具有官能团的直链烃。所述烃链可以被改性。优选的有机间隔分子包括氨基酸或者[-NH-(CH₂)_x-CO]_w、[-NH-(CH₂CH₂-O-)_yCH₂-CO]_w、[CO-(CH₂)_z-CO-]、[NH-(CH₂)_z-NH-]、[CO-CH₂-(OCH₂CH₂)_y-O-CH₂-CO-]或者[NH-CH₂CH₂-(OCH₂CH₂)_y-NH-]残基及其组合。标记w、x、y和z分别为1-8；1-5；1-6和1-6。此外，肽、糖和其它聚醚可以充当有机间隔分子。

X为任选的有机锚定分子。

有机锚定分子是可以用于连接片断(即化合物和树脂)的分子或者分子基团。所述有机锚定分子在本质上是已知的。通常，有机锚定分子包含两个或者更多个可以形成化学键的官能团。

优选的有机锚定分子包括天然存在或者非蛋白氨基酸或者-A¹-(CH₂)_p-A²、-A¹-CH₂-(OCH₂CH₂)_y-O-CH₂-A²、A¹-CH₂CH₂-(OCH₂CH₂)_y-A²、＝CR²-(CH₂)_p-A²、-A¹-CH(NHR³)-(CH₂)_q-A²、＝CR²-CH(NHR³)-(CH₂)_q-A²、-A¹-CH(COR⁴)(CH₂)_q-A²或者＝CR²-CH(COR⁴)-(CH₂)_q-A²残基。

优选A¹为NH，还可以是CO、CHR²、O或者S，和优选A2为SH，还可以是N₃、C≡CH、NH-NH₂、O-NH₂、NH₂、Hal¹、CR⁵O或者羧基。

此外

R²为如上所定义的，

R³为如上关于Z1所定义的，

R⁴为-OR⁶或者-NHR³，

R⁵为H、C_1-4烷基或者未被取代或者被A、OH、OA、CF₃、OCF₃、CN、NO₂或者Hal单、二或者三取代的苯基或者苄基，

R⁶如上关于Z1所定义，

p为1-20，

q为1-20，

y为1-6，

z为1-6，

Hal如上所定义，

Hal¹为Cl、Br或者I。

在本发明的优选实施方案中，基团-Q-X的特征在于一个残基选自-同型-Cys-OH、-Gly-Cys-OH、-Aha-Cys-OH、-Gly-Aha-Cys-OH及其衍生物。优选的衍生物是含有硫醇基以及参与与相邻残基(优选Z3)形成肽键的氮原子，和其中所述氮原子和硫醇基的硫原子通过2～14个独立地选自C、N和O的原子的线性链进行连接。优选所述衍生物未被取代或者带有1～3个选自如以上对于Z1所定义的R³的取代基。

此外，本发明涉及制备式I化合物及其盐的方法。预期比如N-末端改性或者羧基-末端改性的衍生物的结构单元属于本发明的一部分。

所述式I化合物可具有一个或多个手性中心，并且因此可以以多种立体异构形式存在。本发明包括所有所述立体异构形式。

据此，本发明特别涉及其中至少一个所述残基被提及作为优选的式I化合物。

特别优选给出以下式I的化合物(在此使用的结合分子B以粗体标记，间隔物Q以斜体标记):

a)H-Trp-Glu-Tyr-Cys-OH (P1)

b)Ac-Trp-Glu-Tyr-Cys-NH₂ (P2)

c)H-Trp-Glu-Tyr-homo-Cys-OH (P3)

d)H-Trp-Glu-Tyr-Gly-Cys-OH (P4)

e)H-Trp-Glu-Tyr-Aha-Cys-OH (P5)

f)H-Trp-Glu-Tyr-Gly-Aha-Cys-OH (P6)

g)H-D-Cys-D-Tyr-D-Glu-D-Trp-OH (P7)

h)H-Trp-Glu-Phe-Cys-OH (P8)

i)H-Trp-Glu-1-Nal-Cys-OH (P9)

j)H-Trp-Glu-Tyr(OMe)-Cys-OH (P10)

k)H-Trp-Asp-Tyr-Cys-OH (P11)

l)H-Bpa-Glu-Tyr-Cys-OH (P12)

m)H-1-Nal-Glu-Tyr-Cys-OH (P13)

n)H-2-Nal-Glu-Tyr-Cys-OH (P14)

o)IAA-Glu-Tyr-Cys-OH (P15)

p)IAA-Asp-Tyr-Cys-OH (P16)

q)IBA-Glu-Tyr-Cys-OH (P17)

r)IBA-Asp-Tyr-Cys-OH (P18)

s)IPA-Glu-Tyr-Cys-OH (P19)

t)IPA-Asp-Tyr-Cys-OH (P20)

u)

n＝1 (P21)

n＝2 (P22)

n＝1 (P23)

n＝2 (P24)

w)

式I化合物可以被理解为非天然肽或者拟肽衍生物，并且可以部分或者完全合成，例如利用本领域已知的溶液或者固态合成工艺(Gysin，B.F.；Merrifield，R.B.J.Am.Chem.Soc.1972，94，3102；或者Merrifield，R.B.Angew.Chemie Int.Ed.1985，24(10)，799-810)，应用适当的氨基或者羧基结构单元合成。顺序合成是在被关注的。可以将其它有机合成方法用于根据式I的化合物的合成中，比如描述在Houben-Weyl，Methods ofOrganic Chemistry，Georg-Thieme-Verlag，Stuttgart中的方法。

如果期望，所述原料还可以原位形成，无需将它们从反应混合物中分离，而是随后将它们进一步转化为式I的化合物。

适宜的惰性溶剂为，例如，烃类如己烷、石油醚、苯、甲苯或者二甲苯；氯代烃如三氯乙烯、1，2-二氯乙烷、四氯甲烷、氯仿或者二氯甲烷；醇如甲醇、乙醇、异丙醇、正丙醇、正丁醇或者叔丁醇；醚如二乙醚、二异丙醚、四氢呋喃(THF)或者二噁烷；二醇醚如1，2-二甲氧基乙烷；乙酰胺如N-甲基吡咯烷酮、二甲基乙酰胺或者二甲基甲酰胺(DMF)；腈如乙腈；亚砜如二甲亚砜(DMSO)；二硫化碳；羧酸如甲酸或者乙酸；硝基化合物如硝基甲烷或者硝基苯；酯如乙酸乙酯；水或者所述溶剂的混合物。

此外，式I的化合物可以由官能衍生物通过溶剂解如水解或者氢解释放获得。

用于溶剂解或者氢解的优选原料是具有相应的受保护氨基和/或羟基而不是一个或者多个游离氨基和/或羟基的那些，优选带有氨基保护基而不是键接到N原子上的H原子的那些，例如那些符合式I，但是含有NHR′基团(其中R′为氨基保护基，例如BOC或者CBZ)而不是NH₂基团的那些。

此外，优选给出带有羟基保护基而不是羟基H原子的原料，例如符合式I，但是含有R″O-苯基(其中R″为羟基保护基，例如叔丁基或者苄基)而不是羟基-苯基的那些。换言之，通过保护基保护共价键接至芳香环上的羟基不被转化。

此外，优选给出带有羧基保护基而不是羧基H原子的原料，例如符合式I，但是含有R″′O-CO基团(其中R″′为羧基保护基，例如叔丁基或者苄基)而不是羧基的那些。换言之，通过保护基保护羧基的氧原子不被转化。

在分子中还可以存在多于一个相同或者不同的保护基。如果存在的多于一个的保护基彼此不同，这提供了以下优点:它们可以选择性地进行裂解。

术语“氨基保护基”是已知的通用术语，涉及适于防止(阻止)氨基进行化学反应但是容易除去的基团。所述基团一般为，特别是未被取代或者被取代的酰基、芳基、芳烷氧基甲基或者芳烷基。由于所述氨基保护基在期望的反应(或者反应顺序)发生之后被除去，而且它们的类型和大小并非至关重要的；然而，优选给出具有1～20个碳原子，特别是具有1～8个碳原子的那些。术语“酰基”包括源于脂族、芳脂族、芳族或者杂环羧酸或者磺酸的酰基基团，并且尤其是烷氧基羰基、芳氧基羰基和特别是芳烷氧基羰基。所述酰基的实例为烷酰基如乙酰基、丙酰基和丁酰基；芳烷酰基如苯乙酰基；芳酰基如苯甲酰基或者甲苯酰基；芳氧基烷酰基如POA；烷氧基羰基如甲氧羰基、乙氧羰基、2，2，2-三氯乙氧羰基、BOC、2-碘乙氧羰基；芳烷氧基羰基如CBZ(“苄氧羰基”)、4-甲氧基苄氧羰基、Fmoc；芳基磺酰基如Mtr、Pbf或者Pmc。优选的氨基保护基为BOC、Mtr、CBZ、Fmoc、苄基和乙酰基。

术语“羟基保护基”同样是已知的通用术语，是指适用于防止羟基进行化学反应、但是在期望的化学反应在分子其它位置已经进行之后易于被除去的基团。所述基团一般为上述未被取代或者被取代的芳基、芳烷基或者酰基，此外还可以为烷基。羟基保护基的本性和大小并不是至关重要的，因为它们在期望的化学反应或者反应序列之后会被再次除去；优选给出具有1～20个，特别是1～10个碳原子的基团。羟基保护基的实例尤其是苄基、对硝基苯甲酰基、叔丁基和乙酰基，其中特别优选苄基和叔丁基。

术语“羧基保护基”同样是已知的通用术语，是指适用于防止羧基进行化学反应、但是在期望的化学反应在分子其它位置已经进行之后易于被除去的基团。所述基团一般为上述未被取代或者被取代的芳基、芳烷基或者酰基，此外还可以为烷基。羧基保护基的本性和大小并不是至关重要的，因为它们在期望的化学反应或者反应序列之后会被再次除去；优选给出具有1～20个，特别是1～10个碳原子的基团。羧基保护基的实例尤其是苄基、叔丁基和乙酰基，其中特别优选苄基和叔丁基。

式I的化合物自它们的官能衍生物脱离(取决于所应用的保护基)，例如使用强酸(有利地使用TFA或者高氯酸)，而且也可以使用强无机酸(比如盐酸或者硫酸)、强有机羧酸(比如三氯乙酸)或者磺酸(比如苯磺酸或者对甲苯磺酸)。也可以存在其它惰性溶剂，但是并不总是必需的。适宜的惰性溶剂优选为有机溶剂，例如羧酸(比如乙酸)、醚(比如四氢呋喃或者二噁烷)、酰胺(比如DMF)、卤代烃(比如二氯甲烷)，此外还可以为醇(比如甲醇、乙醇或者异丙醇)和水。此外，上述溶剂的混合物也是适宜的。优选过量使用TFA而不加入其它溶剂，优选高氯酸以比例9:1的乙酸和70％高氯酸的混合物形式应用。用于离解的反应温度有利地为约0～约50℃，优选15～30℃(室温)。

BOC、OBut、Pbf、Pmc和Mtr基团可以，例如，优选利用TFA在二氯甲烷中进行离解，或者利用大约3～5N HCl在二噁烷在15-30℃下进行离解，Fmoc基团可以利用大约5～50％的二甲胺、二乙胺或者哌啶的DMF溶液在15-30℃下进行离解。

三苯甲基基团用于保护氨基酸组氨酸、天门冬酰胺、谷氨酰胺和半胱氨酸。它们利用TFA/10％苯硫酚、TFA/苯甲醚、TFA/茴香硫醚或者TFA/TIPS/H₂O进行离解，三苯甲基基团从所有所述氨基酸上都被离解下来。

Pbf(五甲基苯并呋喃基)基团用于保护Arg。它利用例如TFA在二氯甲烷中进行离解。

可氢化除去的保护基(例如CBZ或者苄基)可以例如在催化剂(例如，贵金属催化剂，比如钯，有利地在比如碳的载体上)存在下通过氢气处理得到离解。在此，适宜的溶剂为如上所述的那些溶剂，特别是，例如醇(比如甲醇或者乙醇)或者酰胺(比如DMF)。氢解通常在约0～100℃的温度和在约1～200bar的压力下进行，优选在10～30℃和1～10bar下进行。在甲醇中的5～10％Pd/C上或者使用在甲醇/DMF中的Pd/C上的甲酸铵(而不是氢)在10～30℃下，CBZ基团的氢解可以充分完成。

将式I的碱可以利用酸转化为相关的酸加成盐，例如使等量的碱与酸在惰性溶剂(比如乙醇)中反应，随后进行蒸发。由此，可以使用无机酸，例如硫酸、硝酸、氢卤酸(比如，氢氯酸或者氢溴酸)、磷酸(比如正磷酸)或者氨基磺酸。可以使用有机酸，包括脂族、脂环族、芳脂族、芳香族或者杂芳香一元或者多元羧酸、磺酸或者硫酸，例如甲酸、乙酸、三氟乙酸、丙酸、新戊酸、二乙基乙酸、丙二酸、琥珀酸、庚二酸、富马酸、马来酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、柠檬酸、葡糖酸、抗坏血酸、烟酸、异烟酸、甲磺酸或者乙磺酸、乙二磺酸、2-羟基乙磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、萘单磺酸和萘二磺酸以及月桂基硫酸。盐，例如苦味酸盐，还可以用于分离和/或纯化式I的化合物。

另一方面，通过与碱反应，式I的酸可以转化为它的一种金属铵盐。在此适宜的盐为，特别是钠、钾、镁、钙和铵盐，其它取代的铵盐，例如二甲基-、二乙基-或者二异丙基-铵盐，单乙醇-、二乙醇-或者二异丙酰基铵盐，环己基铵盐、二环己基铵盐、二苄基亚乙基二铵盐，此外，例如与精氨酸或者赖氨酸形成的盐。

根据本发明的一种实施方案，提供了制备上述在Z2和Z3之间具有还原肽键的拟肽的有利方法:

为了获得较大量的所述肽和拟肽，通常认为在溶液中进行合成是有利的，而不是利用固态合成方法。然而，与固态合成方法不同，在溶液中进行的合成包括一些在温和酸性条件下进行的反应步骤，这可能潜在地导致酸敏感保护基(比如三苯甲基保护基)的不慎离解(Zervas，L.；Photaki，I.On Cysteine andCystine Peptides.1.New S-Protecting Groups for Cysteine.Journal of the American Chemical Society 1962，84，3887-3897)。

基于以下原因，该问题对本发明的多种化合物是特别显著的。本发明的多种化合物在C-末端含有半胱氨酸残基，因为半胱氨酸的硫醇基可以用于将化合物结合到树脂载体上。然而，溶液态合成通常在C-末端至N-末端上进行，从而抑制了产生外消旋化副反应的问题。如果本发明化合物利用该方法实现，那么半胱氨酸残基应当在多步反应序列的早期阶段引入。这反过来意味着半胱氨酸残基的三苯甲基保护基必须要经受相对大量的反应步骤。这显然加重了所述的三苯甲基-相关的稳定性问题。

根据本发明的该实施方案，提供了使所述三苯甲基-相关的稳定性问题最小化同时保持低外消旋化副反应风险的合成方法。也就是说，现已发现，如果合成方向逆向使得半胱氨酸残基在多步反应顺序末引入到分子中，与三苯甲基-相关的稳定性问题可以得到有效避免。此外，已经发现，与肽的合成相反，如果Z2和Z3之间的键不含有羰基，不会引发外消旋化问题。由此，本发明提供了制备根据本发明的拟肽的方法，其特征在于，在残基Z2和Z3之间的键中不存在羰基，并且优选含有半胱氨酸残基作为锚定分子，其中所述方法在溶液中进行，使得半胱氨酸残基成为最后被引入的残基。

为了例证说明的目的，以下提供了根据本发明该实施方案的拟肽P22合成的一般说明:

P22的溶液相合成。该合成由其中吲哚氮被叔丁氧羰基(Boc)基团根据文献方法保护的3-吲哚乙酸(35)开始(途径1):通过在甲醇中用SOCl₂处理，将化合物35转化为它的甲酯，随后吲哚氮通过与二碳酸叔丁酯和DMAP在乙腈中反应而用Boc基团保护，从而获得36。然后进行皂化，得到期望的吲哚乙酸37。

途径1.N-取代的glutamol 40的合成。

试剂和条件:(a)SOCl₂、MeOH，18h；(b)Boc₂O、DMAP、乙腈，4h，(两步)；(c)LiOH、THF、MeOH、H₂O，18h；(d)哌啶、DMF，1h；(e)HOBt、TBTU、DIPEA，0℃→室温，4h，(两步)。

向40的转化可以利用HOBt和TBTU作为偶联剂，通过将37偶联到侧链受保护的glutamol 39上实现。通过用哌啶处理，39可以容易由市售Fmoc-Glutamol(OtBu)(37)获得，其不需进一步纯化即可使用。39中的游离羟基官能度的保护不是必需的，反应可以清洁地进行，从而给出N-取代的glutamol 40。目标化合物P22中连接谷氨酸和酪氨酸残基的还原肽键由相应的醛41和市售Tyr(tBu)OMe的还原氨基化形成(途径2)。

途径2.拟肽P22(指定为化合物33)的合成

试剂和条件:(a)Dess-Martin过碘烷、DCM，6h；(b)1)Tyr(tBu)OMe^*HCl、MgSO₄、DCM，30min；2)NaB(OAc)₃H，18h，(三步)；(c)LiOH、THF、二噁烷、H₂O，1.5h；(d)Cys(Trt)OtBu^*HCl、HOBt、TBTU、2，4，6-三甲基吡啶，10℃→室温，18h，(两步)；(e)TIPS、H₂O、TFA，0→95％，8h。

在醛形成期间避免碱性反应条件是重要的，因为这会导致外消旋化。由此，通过利用Dess-Martin过碘烷氧化作用和在不存在碱下短期原位预形成亚胺，然后迅速加入还原剂，外消旋化可以得到完全避免。该方法通过三步给出期望的仲胺42。通过HPLC-MS，仅仅观察到痕量的二烷基化副产品。通过皂化使42中的甲酯离解和使所得游离酸在HOBt/TBTU和弱碱2，4，6-三甲基吡啶存在下偶联到Cys(Trt)OtBu^*HCl上，得到43(两步)。虽然应用的半胱氨酸叔丁酯不能市场购得，但是它优于市售的甲酯，因为它易于合成并且允许43的一步去保护，从而在酸性条件下获得期望的游离拟肽P22。此外，这可以避免皂化之后光学纯度的显著损失。

就P22的经济生产而言，最终的去保护和纯化是关键步骤。通过将P22悬浮在剧烈搅拌的水和TIPS(1:1)的混合物中和在8小时时间内缓慢加入TFA至95％的最后浓度，这些步骤可以进行而无副产品形成。通过该方法，副产品形成被大大降低，从而在醚/戊烷中沉淀之后以高产率和高纯度获得最终的游离拟肽P22。

本发明化合物可以按照如下所述进行应用。

诊断应用:血友病甲的确切诊断通过进行FVIII测定和测量凝固时间进行评价。因此，将患者血浆与来自先天缺乏FVIII的患者或者来自人工排除来源(artificially depleted source)的FVIII-缺乏血浆混合。将缩短凝结时间的有效性程度与正常血浆的程度进行对比。标准曲线使用血友病血浆稀释收集的新鲜正常人血浆和绘制凝结时间与稀释液的曲线来形成。

虽然凝结测试仍然是用于手术前药物筛选和用于治疗监控的最经常进行的测定，但是这些测试完全依赖于酶促步骤。血浆中的凝血因子通常是惰性的，第一步需要进行蛋白水解活化。此外，这些酶促步骤不仅需要活化的凝血因子，而且还需要活化的辅因子、磷脂和钙离子。这意味着在测定中涉及相对不稳定的蛋白的非常复杂混合物，这可能低估实际的FVIII水平。为了克服该问题，另外评价患者中FVIII的绝对水平是重要的。这通常通过应用不稳定的抗-FVIII抗体的ELISA测试实现。这些抗体可以用本发明的肽和拟肽替换。当用于该目的时，同当前使用的用于ELISA测试中的不稳定抗-FVIII抗体相比，根据本发明的肽具有显著的优点。用于检测患者血浆中总FVIII量的敏感筛选试剂盒的研制受益于肽的优点，发现它们具有更强的稳定性、更高的敏感性和更低的测定成本。

用于稳定目的:FVIII显示出迅速失活作用和短的半衰期。FVIII的半衰期的定义为活性杂三聚FVIII(A1/A2/A3-C1-C2)的A2亚单位的自发分解速率，其中A2亚单位与A1和A3-C1-C2亚单位经离子相互作用微弱缔合。对于活性FVIII的正常稳定性，需要杂三聚体中存在A2。

本发明的肽和拟肽不仅对FVIII表现出高亲合性，而且通过结合，它们还用于稳定杂三聚体。由此，这些创造性的化合物与FVIII的结合可以在血友病甲治疗中以有利的方式使用，从而增强治疗期间FVIII的稳定性和半衰期。替代治疗期间FVIII的较长半衰期将缓解患者的安宁状况(well-being)，因为这可以降低FVIII的输注频率。所述稳定作用还可以用于有利地增强含FVIII药物在它们给药之前的贮存期限。

用于标记、检测和鉴定:本发明化合物还可以带有标记物基团，比如放射性同位素或者可以进行着色反应的官能团等等。本发明所述化合物与FVIII的接触将导致标记物肽或者拟肽与FVIII的结合。这反过来允许检测，和根据具体情况定量存在于样品中的FVIII。在治疗中的应用:除了上述稳定作用之外，本发明化合物此外可以增强FVIII的生物活性。此外，本申请的化合物可能具有抑制抗体与给药的FVIII结合的有利作用。通过使FVIII与本发明化合物在给药之前接触，这些有益作用可以用于治疗中。本发明化合物将结合FVIII，由此形成配合物。该配合物而不是纯FVIII的给药会导致增强的生物学作用(或者，作为选择，允许给药更低的FVIII剂量)。此外，该配合物的给药可能有助于降低抗体的失活作用。简要地说，本发明化合物可以用于制造同通常的FVIII相比显示出更高的稳定性和优良活性的基于FVIII的药物。在所述常规的FVIII被抗体钝化的情形中，所述基于FVIII的药物还可以用于替代常规的FVIII。此外，本发明还涉及治疗血友病甲的方法，包括将有效剂量的所述FVIII配合物和本发明化合物给药至需要其的对象的步骤。在制造基于FVIII的药物中的应用:本发明的另一实施方案涉及本发明化合物用于纯化粗FVIII和FVIII-类似蛋白的用途。这优选包括本发明化合物在固体载体上的固定。更优选，亲合色谱法利用由本发明化合物涂覆的树脂进行。所述应用更详细地描述在以下实施例3～5中。

在制造诊断学和/或研究工具中的应用:此外，本发明涉及本发明化合物用于纯化FVIII和FVIII-类似蛋白的结构域、表位和片段的用途。虽然所述纯化的结构域等等可能不会表现出与FVIII相当的凝结活性，不过它们可以作为研究工具等等用于诊断试剂盒中。

实施例

根据以下参数使用层析法:RT＝保留时间(分钟)，在HPLC上，在以下系统中:

柱:YMC ODS A RP 5C₁₈，250×4.6mm

洗脱液A:在水中0.1％TFA

洗脱液B:在乙腈中0.1％TFA

流速:1mL/min

梯度:10->50％B/30min。

质谱(MS):ESI(电喷射离子化)(M+H)⁺

SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE):FVIII SDS-PAGE利用10％Tris-Glycine Bio-Rad ReadyGel进行。将样品稀释于含有2-巯基乙醇的加样缓冲液中并且施加到凝胶上。电泳在恒定电流(25mA/gel)下在置于冰上的Bio-Rad Mini-Protean 3装置上进行。电泳之后，凝胶利用标准银染色方案进行染色。

免疫印迹:将蛋白转入在具有传送阻塞(transfer block)的Bio-Rad Mini-Protean 3装置中的硝化纤维膜上。传送在恒定70V电压(～250mA)下进行4小时，同时安装冷冻的冷却阻塞(cooling block)。膜用在TBS中的5％脱脂奶粉，pH8.0阻断过夜。然后，膜用在含有0.1％Tween-20的TBS pH＝7.4中的5％脱脂奶粉溶液中稀释至1μg/mL的一抗温育1小时。

在含有0.1％Tween-20的TBS(pH＝7.4)中将膜洗涤3次，并且用在TBS pH＝7.4，0.1％Tween-20中的5％脱脂奶粉中稀释至1:3000的过氧化物酶-标记的山羊抗鼠抗体(Mab C5和Mab 413)温育1小时。用TBS，0.1％Tween-20洗涤3次之后，将膜在ECL化学发光基质中(Pharmacia)进行显影和利用BioMax-XL胶片(Kodak)对化学发光进行检测。

Rink-amid树脂代表4-(2′，4′-二甲氧基苯基-Fmoc-氨甲基)-苯氧基树脂，其使得例如具有C-末端-CONH₂基团的肽和拟肽衍生物能够合成，TCP树脂表示三苯甲基氯-聚苯乙烯树脂。

化合物P1～P20利用Fmoc-策略，分别在TCP树脂和用于化合物P2的Rink-amide树脂上经固相肽合成进行合成(参见Fields，G.B.；Nobie，R.L.Int.J.Pept.Protein Res.1990，35，161)。

N-末端乙酰化(化合物P2)在固相下，通过在最终离解和去保护步骤之前，用NMP/Ac₂O/DIPEA(91:7:2)混合物处理相应的N-末端去保护化合物实现(参见以下)。

化合物P21～P25在TCP树脂上利用Fmoc-策略连续完全合成。“还原的肽键”在固相上，利用氨基酸相应的醛，经自身已知的还原烷基化反应形成(＂amino aldehyde＂，参见Krchnak，V.；Weichsel，A.S.；Cabel，D.；Flegelova，Z.；Lebl，M.MoI.Diversity1995，1，149)。反应在水截留(water trapping solvent)的溶剂(比如三甲氧基甲烷)中，在室温下进行。形成为中间产物的相应亚胺化合物的还原在非质子溶剂(比如二氯甲烷)中，在室温下进行。作为还原剂，使用配位硼氢化合物，比如NaBH(OAc)₃。

利用90％TFA，5％H₂O和5％TIPS，肽或者拟肽从固相的离解和它们的侧链保护基的离解同时进行。

所有化合物都通过制备的HPLC进行纯化。

实施例1:作为对于FVIII的亲合性配体的化合物的制备和pd-FVIII的结合

将肽P1～P25固定在Toyopearl AF-Epoxy-650M树脂(TosohBiosep)上，如Jungbauer等人所述。为了进行固定，将2.5mg各种肽溶于0.25mL固定缓冲液(0.2M碳酸氢钠，pH10.3)中，并且将0.036g干燥树脂粉末(相当于0.125mL溶胀树脂)加入其中，随后在温和转动下将混合物温育48小时。在温育48小时之后，树脂用固定缓冲液洗涤一次，用1M NaCl洗涤一次，然后用结合缓冲液洗涤3次，并且对¹²⁵I-标记的pd-FVIII与肽涂覆树脂和对照树脂的结合进行测试。在各个记录的试验中，各种肽的偶联密度记载在表1中。在肽不存在下，在平行试验中，对对照0.25mL树脂部分进行类似地处理，并且随后在¹²⁵I-pd-FVIII结合试验中将其用作对照(指定为背景)。¹²⁵I-pd-FVIII结合/背景的比例计算如下，使结合到固定肽的¹²⁵I-pd-FVIII的量除以结合到如上所述制备的未涂覆对照树脂的量。该比例表示微珠测定的信号/噪声比，因为与肽结合的¹²⁵I-pd-FVIII表示信号值，肽未涂覆树脂结合的¹²⁵I-pd-FVIII表示背景(噪声)值。

源于血浆(pd-)的人类因子VIII(FVIII)通过以下方法从浓缩物中纯化，在抗-FVIII单克隆抗体柱上进行免疫亲和层析，随后通过离子交换色谱法，利用Resource Q HR5/5柱浓缩pd-FVIII。为了从vWf中分离FVIII，在亲合性纯化之前，在0.35MNaCl，0.04M CaCl₂中对浓缩物进行温育。

可能存在于pd-FVIII制剂中的痕量vWf通过使pd-FVIII制剂通过具有抗-vWf高亲合性单克隆抗体的柱被除去，其中高亲合性单克隆抗体以1.4mg/ml树脂的密度固定。

利用乳过氧化物酶珠粒和0.5mCi Na¹²⁵I，10μg纯化的pd-FVIII得到碘化。

在结合缓冲液(0.01M Hepes，0.1M NaCl，5mM CaCl₂，0.01％Tween-80)中，对具有固定肽的树脂进行洗涤。随后，在结合缓冲液将树脂稀释为1:7浆液并且将试样等分入Eppendorf管中(40μl/管)。将¹²⁵I-pd-FVIII(100000cpm，10μl)加入到管中，并且通过加入50μl含有4％BSA的结合缓冲液将混合物的体积调节至100μl，从而给出2％的最终BSA浓度。在旋转器上在室温下温育2小时之后，在结合下将样品洗涤4次。在各次洗涤之后，在Eppendorf微量离心机中，在5000rpm下将管离心1分钟，将上清液除去，将树脂再悬浮在洗涤缓冲液中，随后在相同条件下进行离心。四次洗涤之后，对具有丸粒而无上清液的管的放射能力进行读数。对不存在肽的树脂进行类似处理以说明与管和树脂自身的非特异性pd-FVIII结合，并且将该对照管的放射能力认为是背景值。因为¹²⁵I-pd-FVIII含有一些在放射性标记期间被破坏的组分，因此将结合计算为与用抗-FVIII Mab 8860-涂覆树脂进行的分离试验中确定的最大可实现结合的百分比。

所有测量都一式两份进行。各试验利用两个独立制备的固定肽样品进行。存在于各个图中的数据是四次测定的平均值:两次测定中的重复测量利用肽在不同天数时独立固定于其上的珠粒进行。以上四次重复测定(在两次独立试验中重复进行测定)的标准偏差值一般小于与肽结合的¹²⁵I-pd-FVIII的测量值的10％。

比较例1:制备具有错义序列(scrabled sequence)的比较化合物作为用于FVIII的比较配体和与pd-FVIII的结合

利用具有任意的错义氨基酸序列(ECYYEHWS)的肽，重复实施例1中描述的方法。随后，按照与以上实施例1中所述的相同方式，对FVIII与带有该错义肽的树脂的结合以及FVIII与未涂覆树脂的结合进行研究。结果示于下表2中。

表2:¹²⁵I-标记的因子VIII与固定在

AF-Epoxy-650M上的比较化合物和与未涂覆形式的相同树脂的结合。

化合物	RT(min)	MS(ESI):m/z	％结合pdFVIII	结合，相对于对照	负载密度(μmol/mL)
化合物	RT(min)	MS(ESI):m/z	％结合pdFVIII	结合，相对于对照	负载密度(μmol/mL)	错义^a	16.2	1116.6(M+H)⁺calcd:1115.4	6.5±0.5	4.1±0.3	10.3±0.4
对照^b	-	-	1.6±0.5	-	-	错义^a	16.2	1116.6(M+H)⁺calcd:1115.4	6.5±0.5	4.1±0.3	10.3±0.4

^a序列:ECYYEHWS；^b未涂覆树脂

实施例1中报道的结果与比较例1的结果对比表明，同错义肽相比，本发明化合物对FVIII表现出显著更高的亲合性。

实施例2:利用P15涂覆的树脂和P22涂覆的树脂的重组FVIII的结合和

是分别从Bayer以及Wyeth-AyerstPharmacia and Upjohn商购获得的FVIII重组形式。

由总量4000IU(5管形瓶)利用免疫亲合色谱法，随后利用使用具有NaCl线性梯度的Resource Q HR5/5柱的离子交换色谱来纯化。纯化

的浓度为130μg/ml，活性740IU/mL，和比活性5700IU/μg。

由总量5000IU(5管形瓶)利用免疫亲合色谱法，随后利用使用Resource Q HR5/5柱的离子交换色谱来纯化。经纯化的

的浓度为89μg/ml，活性864IU/mL，和比活性97071U/μg。

按照与实施例1中关于pd-FVIII所述相同的方式，对

和

进行碘化。利用与以上实施例1所述相同的方法，对蛋白结合进行测量。这些试验的结果概述于下表3中。

表3：重组FVIII与P15涂覆的树脂和P22涂覆的树脂的结合

序列no.	肽密度(μmol/mL)	¹²⁵I-ReFacto结合(全部的％)	¹²⁵I-Kogenated FS结合(全部的％)
序列no.	肽密度(μmol/mL)	¹²⁵I-ReFacto结合(全部的％)	¹²⁵I-Kogenated FS结合(全部的％)	P15	19.2±1.0	54.9±6.3	49.6±1.7
P22	17.3±0.9	53.3±2.3	40.6±2.3	P15	19.2±1.0	54.9±6.3	49.6±1.7

该试验的结果表明，本发明化合物还对FVIII-类似蛋白如重组FVIII表现出高亲合性。

实施例3:利用P22涂覆的树脂进行的活性pd-FVIII的纯化

如实施例1中所述，将拟肽衍生物P22固定在Toyopearl上树脂。使用25mg肽和360mg树脂。将所得树脂(～1ml)填塞到玻璃柱(Pharmacia-Biotech)中。利用Waters 650E Advanced ProteinPurification System进行纯化工艺。缓冲液A为0.01M Hepes，0.1M NaCl，5mM CaCl₂，0.01％Tween-80，缓冲液B为0.01MHepes，1M NaCl，5mM CaCl₂，0.01％Tween-80(pH6.8)。通过流经UV检测器(Waters 490 E)通过在280nm(OD280)下的光密度，对洗脱进行监控。然后，通过确定OD280分析洗脱馏分的蛋白含量，FVIII活性在一期APTT分析中利用MLA Electra-800自动凝血计时器进行确定。来自于洗脱馏分的样品通过10％PAGE，随后银染色和利用抗FVIII的单克隆抗体的Western印迹法进行分析。

如上所述的预先通过免疫亲合和离子交换色谱法纯化的FVIII(0.5mg)，用0.01M Hepes，5mM CaCl₂，0.01％Tween-80稀释至最终0.1M NaCl的盐浓度。将混合物施加到P22-柱上，随后用缓冲液A洗涤，直至OD280重新回到背景值为止。结合的蛋白用20％缓冲液A、80％缓冲液B洗脱。所得洗脱图形示于图1中。

FVIII的纯化从含FBS的SF9细胞条件培养基中进行，用FVIII示踪。如上所述的预先通过免疫亲合和离子交换色谱法纯化的FVIII(0.5mg)与含FBS的SF9细胞条件培养基混合，所述介质用0.01M Hepes、5mM CaCl₂、0.01％Tween-80稀释至最终0.1MNaCl的盐浓度。将混合物施加到柱上，随后用缓冲液A洗涤，直至OD280重新回到背景值为止。用85％缓冲液A、15％缓冲液B进行洗涤，从而洗脱一些结合污染的蛋白。结合的蛋白用40％缓冲液A、60％缓冲液B洗脱。所得洗脱图形示于图2中。

表4.在含FBS的培养基中进行FVIII纯化的定量参数。

在两次纯化中，都实现了高度满意的柱保留和成功洗脱(图3和4)。在从含FBS的培养基中纯化FVIII期间，相对于FVIII过量存在于源溶液中的污染蛋白被成功除去(图3和4，表4)。

拟肽-纯化的FVIII样品视觉上不同于以下谱带，使用商购的纯FVIII制剂作为阳性对照(条带2，图3，条带2图4):230-90kDa重链谱带，由于B-结构域的不同蛋白水解而不均质，和～80kDa轻链双重谱带(由于不同的糖基化(glycosilation))，其通常不能再溶解，分子量～55kDa的个别蛋白水解谱带，和分子量～45kDa的另一蛋白水解谱带。两种制剂都未含有可检测量的一些源于45kDa重链蛋白水解谱带的更深度蛋白水解。SDS-PAGE表明，用FVIII示踪的由先前纯化的FVIII的纯化和由含FBS的DMEM条件培养基的纯化的洗脱馏分具有基本上相同数目的蛋白谱带，和谱带之间的物质分布基本上没有不同于阳性对照FVIII。这些结果证实，同市售免疫亲合纯化的FVIII对照相比，由细胞条件培养基或者纯背景得到的肽-纯化FVIII制剂显示出相同的SDS-PAGE和Western blot图案。

实施例4:用P1涂覆的树脂的FVIII的纯化

如实施例1中所述，将肽P1键接至树脂上。使用25mg肽和360mg树脂。将所得树脂(～1ml)填塞到玻璃柱(Pharmacia-Biotech)中。如关于实施例3所述对含FVIII的样品进行纯化，两次试验之间的唯一差异在于在本试验中不存在用缓冲液A的预洗脱步骤。

纯化的细节概括于以下表5中:

在两次纯化中，都实现了高度满意的柱保留和成功洗脱(图5和6)。在从含FBS的培养基中纯化FVIII期间，相对于FVIII过量存在于源溶液中的污染蛋白被成功除去(图6，表5)。

Claims

1.式I的化合物以及它们的盐，

B-Q-X (I)

其中B表示Z1-Z2-Z3，

其中Z1为具有单环、双环或者三环侧链的天然存在或者非蛋白氨基酸残基或者其衍生物，所述单环、双环或者三环侧链具有6～25个碳原子，其中这些碳原子中的一个或者多个可以被选自N、O和S的杂原子替换，或者其中

Z1为下式的残基

Ar-(CH₂)_m-(CHR¹)_n-(CH₂)_o-A¹ (II)

其中

A¹表示选自NR²、CO、OCO、CHR²、O或者S的基团，

R¹表示选自C_1-4烷基、苯基、苄基和N(R²)₂的基团，其中烷基、苯基或者苄基可以带有一个或多个独立地选自A和N(R²)₂的取代基，其中两个或更多个A和/或两个或更多个R²可以彼此相同或者不同，

Ar是具有6-14个碳原子的单-、双-或者三环芳环体系的芳香基团，饱和或者部分不饱和的C5-14单-或者双环烷基，它们各自未被取代或者带有1-3个独立地选自A、Ar¹、O-Ar¹、C(O)-Ar¹、CH₂-Ar¹、OH、OA、CF₃、OCF₃、CN、NO₂、Hal的取代基；或者Ar可以是Het，

Hal选自F、Cl、Br或者I，

Ar¹是具有6-14个碳原子的单-、双-或者三环芳环体系的芳香基团，优选苯基或者萘基，更优选苯基，Ar¹可以自身未被取代或者带有1-3个独立地选自A、OH、OA、CF₃、OCF₃、CN、NO₂和Hal的取代基；

Het表示具有5-12个环成员的任选取代的饱和、部分或者完全不饱和的单-或者双环杂环残基，该环成员包含1-3个N-和/或1个S-或者O-原子，

m和。独立地选自0、1、2、3和4，

n为0或者1，和

R²为H、C_1-4烷基、苯基或者苄基，或者在类肽-氨基酸的情形中，其为氨基酸侧链；

Z2表示天然存在或者非天然氨基酸，在其侧链上不带有芳香基团；

Z3表示如上对于Z1所定义的基团，其中Z1和Z3可以彼此相同或者不同，条件是化合物内Z1和Z3的不同位置通过在键合或者游离价的位置上不存在或者存在的另外的氢原子分别确定；

Q不存在或者是具有1～100个骨架原子的有机间隔分子；

X不存在或者是具有选自SH、N₃、NH-NH₂、O-NH₂、NH₂、Cl、Br、I、C≡CH、CR⁵O或者羧基的末端基团的有机锚定分子，其中

R⁵选自H、C_1-4烷基或者苯基或者苄基，该苯基或者苄基可以为未被取代或者被A、OH、OA、CF₃、OCF₃、CN、NO₂或者Hal独立地单、二或者三取代。

2.式I的化合物及其盐，

B-Q-X (I)

包括:

B是提供对FVIII和/或FVIII-类似蛋白的亲合性的二肽、三肽或者拟肽，

Q不存在或者为有机间隔分子，和

X不存在或者为有机锚定分子。

3.根据权利要求2所述的化合物，其中

B为Z1-Z2-Z3，

包括:

Z1天然存在或者非蛋白氨基酸残基或者其衍生物，或者Ar-(CH₂)_m-(CHR¹)_n-(CH₂)_o-Al，

Z2不存在或者为天然存在或者非蛋白氨基酸残基或者其衍生物，

Z3天然存在或者非蛋白氨基酸残基或者其衍生物，或者Ar-(CH₂)_n-(CHR¹)_m-(CH₂)_o-A¹，

A¹NR²、CO、CHR²、O或者S，

R¹C_1-4烷基、苯基或者苄基，

Ar未被取代或者被A、OH、OA、CF₃、OCF₃、CN、NO₂或者Hal单、二或者三取代的苯基，其可以为被A、OH、OA、CF₃、OCF₃、CN、NO₂或者Hal单、二或者三取代的苯基，以此方式形成未被取代或者取代的联苯基，或者Het，

HalF、Cl、Br或者I，

Het具有5-12个环成员的饱和、部分或者完全不饱和的单-或者双环杂环残基，该环成员包含1-3个N-和/或1个S-或者O-原子，其中杂环残基可以被CN、Hal、OH、NH₂、COOH、OA、CF₃、A、NO₂、Ar或者OCF₃单取代或者二取代，

ACOOH、NH₂或者具有1-6个C原子的、未被取代或者被COOH或者NH₂取代的烷基，

m，o 0、1、2、3或者4，

n 0或者1，

由此

Z1和Z3或者Z1和Z2以及Z2和Z3可以通过酸-酰胺键-CO-NR²-或者-NR²-CO-，优选通过所谓的还原肽键-CH₂-NR²-或者-NR²-CH₂-以及通过-CO-CHR²-、-CHR²-CO-、-CR²＝CH-或者-CH＝CR²-键进行结合，

其中

R²为H、C_1-4烷基、苯基或者苄基，或者在类肽-氨基酸的情形中，其为氨基酸侧链。

4.根据权利要求2或者3所述的化合物，其中Q为选自以下基团之一的有机间隔分子

[-NH-(CH₂)_x-CO]_w、

[-NH-(CH₂CH₂-O-)_yCH₂-CO]_w、

[CO-(CH₂)_z-CO-]、

[-NH-(CH₂)_z-NH-]、

[CO-CH₂-(OCH₂CH₂)_y-O-CH₂-CO-]、

[NH-CH₂CH₂-(OCH₂CH₂)_y-NH-]、

氨基酸、肽、糖或者聚醚以及它们的组合，

其中w分别独立地为1～8，

x为1-5，

y为1-6和

z为1-6。

5.根据权利要求2、3或者4所述的化合物，其中X为选自以下基团之一的有机锚定分子

天然存在或者非蛋白氨基酸、

-A¹-(CH₂)_p-A²、

-A¹-CH₂-(OCH₂CH₂)_y-O-CH₂-A²、

-A¹-CH₂CH₂-(OCH₂CH₂)_y-A²、

＝CR²-(CH₂)_p-A²、

-A¹-CH(NHR³)-(CH₂)_q-A²、

＝CR²-CH(NHR³)-(CH₂)_q-A²、

-A¹-CH(COR⁴)-(CH₂)_q-A²或者

＝CR²-CH(COR⁴)-(CH₂)_q-A²，

其中

A¹为NR²、CO、CHR²、O或者S，

A²为SH、N₃、NH-NH₂、O-NH₂、NH₂、Hal¹、C≡CH、CR⁵O或者羧基，

R²为如权利要求2中所定的义的，

R³为H、R⁶、-COR⁶、-COOR⁶，

R⁴为-OR⁶或者-NHR³，

R⁶为H、C_1-4烷基或者未被取代或者被A、OH、OA、CF₃、OCF₃、CN、NO₂或者Hal单、二或者三取代的苯基或者苄基，

p为1-20，

q为1-20，

y为1-6，

z为1-6，

Hal为如权利要求3中所定义的，

Hal¹为Cl、Br或者I。

6.根据权利要求2～5任一项所述的化合物，其特征还在于Z1为Ar-(CH₂)_m-(CHR³)_n-(CH₂)_o-CO-

由此

Ar为

和m、n和。为如权利要求3中所定义的。

7.根据权利要求2～6任一项所述的化合物，其特征还在于，m为1、2或者3，n为0和o为0。

8.根据权利要求2～5任一项所述的化合物，其特征还在于，

Z1为1-NaI、2-NaI、Bpa或者R⁷-Trp

由此

R⁷为H、R⁸、-COR⁸、-COOR⁸，

其中R⁸为C_1-4烷基或者未被取代或者被A、OH、OA、CF₃、OCF₃、CN、NO₂或者Hal单、二或者三取代的苯基或者苄基，

以及A和Hal为如权利要求3中所定义的。

9.根据权利要求2～8任一项所述的化合物，其特征还在于，

R⁷为H或者-COR⁸

其中R⁸为甲基。

10.根据权利要求2～9任一项所述的化合物，其特征还在于，

Z2是具有谷氨酸或者天冬氨酸侧链的氨基酸残基。

11.根据权利要求2～10任一项所述的化合物，特征还在于，

Z3是具有1-萘基丙氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸或者O-甲基化酪氨酸侧链的氨基酸残基。

12.根据权利要求2～11任一项所述的化合物，其特征还在于，

Q为[-NH-(CH₂)_x-CO]_w，

x和w为如权利要求4中所定义的。

13.根据权利要求2～12任一项所述的化合物，其特征还在于，

x为1或者5，w为0或者1。

14.根据权利要求2～13任一项所述的化合物，其特征还在于，

X为-A¹-CH(COR⁴)-(CH₂)_q-A²，

其中

A¹为NH，

R⁴为OH或者NH₂，

A²为SH，

和q为如权利要求5中所定义的。

15.根据权利要求2～14任一项所述的化合物，其特征还在于，

q为1或者2。

16.根据权利要求2～15任一项所述的化合物，其特征还在于，

X为-A¹-CH(NHR³)-(CH₂)_q-A²，

其中

A¹为CO，

R³为H

A²为SH

和q为如权利要求5中所定义的。

17.根据权利要求2～16任一项所述的化合物，其特征还在于，

q为1。

18.根据权利要求1～17任一项所述的化合物，其特征还在于，

氨基酸残基可以独立地选自α-氨基碳酸残基、β-氨基碳酸残基、氮杂-氨基碳酸残基和类肽-氨基碳酸残基。

19.根据权利要求1～18任一项所述的化合物，其特征还在于，

氨基酸残基选自α-氨基酸残基。

20.根据权利要求1～19任一项所述的化合物，其特征还在于，

残基Z1和Z3或者Z1和Z2或者Z2和Z3分别通过酸-酰胺键-CO-NH-彼此结合。

21.根据权利要求1～20任一项所述的化合物，其特征还在于，

一个或多个肽键可以根据权利要求2独立地进行改性。

22.根据权利要求1～21任一项所述的化合物，其特征还在于，

残基Z1和Z3或者Z1和Z2或者Z2和Z3分别通过-CHH₂-NH-键彼此结合。

23.根据权利要求1～22任一项所述的化合物，其特征还在于，

肽和/或拟肽的方向被逆转(“反式肽”)。

24.根据权利要求1～23任一项所述的化合物，其用于疾病的治疗。

25.一种载体基质，其表面键合有根据权利要求1～23任一项所述的化合物。

26.根据权利要求25所述的载体基质，其包含无机或者有机材料，特别是聚合物材料。

27.根据权利要求25或者26所述的载体基质，其中根据权利要求1～23任一项所述的化合物化学结合到该载体基质的表面，例如结合在树脂上。

28.根据权利要求25或者26所述的载体基质，其中根据权利要求1～23任一项所述的一种或多种化合物通过有机间隔物结合到载体基质的表面，例如结合在树脂上。

29.根据权利要求25或者26所述的载体基质，其中权利要求1～23任一项所述的一种或多种化合物通过有机锚定分子结合到载体基质的表面，例如结合在树脂上。

30.根据权利要求25或者26所述的载体基质，其中权利要求1～23任一项所述的化合物通过有机间隔物和有机锚定分子结合到载体基质的表面，例如结合在树脂上。

31.一种诊断设备或者试剂盒，其含有根据权利要求1～23任一项所述的化合物，根据权利要求25～30任一项所述的载体基质，和必要时的辅助工具以及任选的用于化合物标记的另一工具。

32.根据权利要求1～23任一项所述的化合物的用途，其用于标记、检测、鉴定、分离和纯化FVIII或者FVIII-相关蛋白。

33.一种检测、鉴定、分离和纯化FVIII或者FVIII-相关蛋白的方法，其包括使含有FVIII或者FVIII-相关蛋白的样品与包含已固定有根据权利要求1～22任一项所述的化合物的基质，在适于FVIII或者FVIII-相关蛋白和所述化合物之间结合的条件下接触。

34.根据权利要求33所述的方法，其中将根据权利要求1～23任一项所述的化合物固定在载体上，该载体为聚合物材料。

35.根据权利要求33或者34所述的方法，其中根据权利要求1～23任一项所述的化合物选自由P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7、P8、P9、P10、P11、P12、P13、P14、P15、P16、P17、P18、P19、P20、P21、P22、P23、P24和P25组成的组。

36.根据权利要求33或者34所述的方法，其中该聚合物材料为树脂。

37.根据权利要求33～35任一项所述的方法，其中该样品为细胞培养上清液。

38.根据权利要求33～35任一项所述的方法，其中该样品为体液。

39.根据权利要求38所述的方法，其中该体液包括血液。

40.一种凹坑或者孔，其包含(1)根据权利要求1～23任一项所述的化合物，(2)包括聚合物材料的基质，其中所述化合物被固定在该聚合物材料上。

41.根据权利要求40所述的凹坑或者孔，其中该化合物进一步包括标记物。

42.根据权利要求33或者34所述的方法，其中该化合物经与所述聚合物材料化学结合而被固定在该聚合物材料上。

43.根据权利要求33或者34所述的方法，其中肽或者拟肽经化学结合在所述聚合物材料上的有机锚定分子被固定在该聚合物材料上。

44.根据权利要求33或者34所述的方法，其中该有机锚定分子为

-A¹-(CH₂)_p-A²，

-A1-CH₂-(OCH₂CH₂)_y-O-CH₂-A²，

-A¹-CH₂CH₂-(OCH₂CH₂)_y-A²，

＝CR²-(CH₂)_p-A²，

-A¹-CH(NHR³)-(CH₂)_q-A²，

＝CR²-CH(NHR³)-(CH₂)_q-A²，

-A¹-CH(COR⁴)-(CH₂)_q-A²，

＝CR²-CH(COR⁴)-(CH₂)_q-A²

其中A¹、A²、R²、R³、R⁴、p、q和y为如权利要求5中所定义的。

45.根据权利要求33、34或者44所述的方法，其中肽或者拟肽进一步包含有机间隔分子。

46.根据权利要求45所述的方法，其中该有机间隔分子选自以下基团的一种:

[-NH-(CH₂)_x-CO]_w，

[-NH-(CH₂CH₂-O-)_yCH₂-CO]_w，

[CO-(CH₂)_z-CO-]，

[NH-(CH₂)_z-NH-]，

[CO-CH₂-(OCH₂CH₂)_y-O-CH₂-CO-]，

[NH-CH₂CH₂-(OCH₂CH₂)_y-NH-]，

或者氨基酸、肽、糖或者聚醚以及它们的组合，

其中w、x、y和z为如权利要求4中所定义的。