CN106046148A - 一种利用肽配基亲和纯化凝血因子viii的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用肽配基亲和纯化凝血因子VIII的方法，该方法选用了对人凝血因子Ⅷ的特异性的肽配基作为亲和基质，并将该特异性的肽配基固定在琼脂糖凝胶载体上，实现凝血因子Ⅷ的快速、特异、高效纯化。其中，所述肽配基为能与凝血因子VIII发生亲和反应的多肽；所述多肽为EYCPC、GCVSGCLCWEYC和RKWNCTDHEYC中的任意一种或者EYCPC、GCVSGCLCWEYC和RKWNCTDHEYC按任意比混合后得到的混合物。利用该方法得到的凝血因子VIII的得率高、比活高，可以实现凝血因子Ⅷ的规模化纯化与制备。
Description
技术领域
本发明涉及生物分离纯化领域，具体涉及一种利用肽配基亲和纯化凝血因子VIII的方法。
背景技术
凝血因子VIII(coagulation factor VIII，FVIII)是内源性凝血途径中一种重要的凝血因子，作为凝血因子IXa的辅因子，参与凝血因子X的激活，在血浆中的含量约为0.1mg/L。FVIII遗传性缺乏将导致甲型血友病(或血友病A)，所以又被称为抗血友病球蛋白或抗血友病因子。静注FVIII制品替代治疗甲型血友病，是当前的主要治疗手段。
早在19世纪，欧美国家就开始通过输血治疗甲型血友病患者的出血症状，但是这种治疗方式效果并不明显；1956年一种粗纯的凝血因子Ⅷ制品面世，并用以治疗甲型血友病患者的出血症状。1964年制备的比活性仅有0.5IU/mg蛋白已经可以十分有效的对甲型血友病患者进行替代治疗。随着各种层析工艺的开发与应用，比活性可以达到10IU/mg蛋白的中纯凝血因子Ⅷ产品开始用于临床治疗。到了20纪70年代末期，以凝血因子Ⅷ抗体为配基的亲和层析工艺开始应用于凝血因子Ⅷ产品的纯化，但是由于该类凝血因子Ⅷ产品稳定性很差，需要加入人血白蛋白作为保护剂，比活性也只能达到15IU/mg蛋白，而且也增加了产品的成本。1992年Baxter公司成功推出第一个基因重组的凝血因子Ⅷ产品。
尽管基因重组类的凝血因子Ⅷ产品己经有了较好的临床应用效果，但并不意味着我们就要放弃血浆来源的凝血因子Ⅷ。一方面血浆来源的凝血因子Ⅷ成本要低于重组类的凝血因子Ⅷ，而且因为是从人血液中提取的天然蛋白质，因此没有临床副反应的发生；另一方面，血浆是一种宝贵的资源，除凝血因子Ⅷ外，还可以提取人免疫球蛋白、人血白蛋白、人凝血酶原复合物、纤维蛋白原等产品；而且如果以低温离心冷沉淀为起始原料提取凝血因子Ⅷ的话，基本对上述产品的提取没有影响，既提高了血浆的综合利用效率和使用价值，又分摊了单个血液产品的成本。因此，寻找一种替代单抗纯化凝血因子Ⅷ的方法就显得尤为重要。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中存在的缺陷，提供一种利用肽配基亲和纯化凝血因子VIII的方法；该方法选用了对人凝血因子Ⅷ的特异性的肽配基作为亲和基质，并将该特异性的肽配基固定在载体上，实现凝血因子Ⅷ的快速、特异、高效纯化。
本发明采用的技术方案为：
一种利用肽配基亲和纯化凝血因子VIII的方法，包括以下步骤：
(1)纯化用亲和层析树脂的制备：
a、肽配基溶液的配制：称取2.8-3.2μmol肽配基溶于0.8-2ml双蒸水中，搅拌至肽配基完全溶解，得到肽配基溶液；其中，所述的肽配基为能与凝血因子VIII发生亲和反应的多肽；所述多肽为EYCPC(其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)、GCVSGCLCWEYC(其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)和RKWNCTDHEYC(其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示)中的任意一种或者EYCPC、GCVSGCLCWEYC和RKWNCTDHEYC按任意比混合后得到的混合物，所述多肽EYCPC、GCVSGCLCWEYC和RKWNCTDHEYC均采用常规多肽合成方法合成的，每种多肽的纯度不低于95％；
b、琼脂糖凝胶预处理：量取8-12ml保存于20％乙醇水溶液中的琼脂糖凝胶，采用过量蒸馏水对琼脂糖凝胶进行反复洗涤，除去琼脂糖凝胶表面的乙醇，得到湿琼脂糖凝胶；
c、将经过步骤b处理后得到的湿琼脂糖凝胶装入离心管中，向离心管中加入20-25ml预冷的1mM HCl，振荡混合均匀后在4℃静置8-12min；然后在4℃3000rpm离心4-8min，弃上清，得到沉淀；向沉淀中加入25-35ml去离子水，振荡混合均匀后在4℃静置8-12min；然后在4℃3000rpm离心4-8min，弃上清，得到凝胶沉淀；向凝胶沉淀中加入0.8-2ml步骤a配制的肽配基溶液和8-15ml去离子水，振荡混合均匀，再加入0.8-1.5ml 5mg/ml的碳二亚胺溶液，振荡混合均匀后在室温下100rpm反应3.5-5h；
d、反应结束后，向步骤c的反应液中加入0.5-1ml冰乙酸，振荡混合均匀，在室温下100rpm继续反应1-1.5h；
e、反应结束后，向步骤d的反应液中加入0.8-1.5ml含20％哌啶的二甲基甲酰胺溶液，振荡混合均匀，在室温下100rpm继续反应7-10min，收集反应产物；
f、用100-150ml 5mmol/L pH4.4的醋酸-醋酸钠缓冲液对步骤e得到的反应产物进行洗涤；然后再分别用0.5M NaCl的pH8.0的0.1M Tris-HCl溶液和含0.5M NaCl的20mMpH4.4醋酸-醋酸钠缓冲液各20-30ml对反应产物进行交替洗涤3次；
g、将经过步骤f处理后的反应产物用100-150ml去离子水进行洗涤，然后再用50-100ml 20％的乙醇水溶液洗涤，洗涤结束后，即得到纯化用亲和层析树脂；将纯化用亲和层析树脂4℃保存在20％的乙醇水溶液中，备用；
(2)将步骤(1)制备得到的纯化用亲和层析树脂装入凝胶过滤层析柱中，然后向凝胶过滤层析柱上加入0.02M PBS缓冲液进行洗涤处理，洗涤至流出液的pH值与0.02M PBS缓冲液相同时，停止洗涤；
(3)将待纯化的血清或血浆用0.02M PBS缓冲液稀释4-6倍，然后用蛋白纯化仪将稀释后的血清或血浆泵入凝胶过滤层析柱中，控制蛋白纯化仪恒流泵的转速为2ml/min，凝胶过滤层析柱的柱压为0.3MPa；用50ml的含0.5M NaCl的pH8.0的0.1M Tris-HCl溶液进行洗脱，然后再用25ml含0.5M NaCl的pH2.5的50mM的甘氨酸溶液进行洗脱，采用部分收集器对洗脱液进行收集，每管收集3-5mL，并用紫外检测设备对收集的洗脱液进行检测，出现凝血因子VIII洗脱峰的洗脱液即为凝血因子VIII粗品；
(4)用pH8.8的0.1M Tris-HCl溶液将凝血因子VIII粗品的pH值调节至pH5.0-pH7.0之间，然后再用0.02M pH7.2的PBS缓冲液作为透析液对其进行透析处理，透析处理时透析液与凝血因子VIII粗品的体积比为10：1，每次透析时间为4h，连续透析6次；透析处理后既得到纯化的凝血因子VIII，即凝血因子VIII纯品。
根据上述的利用肽配基亲和纯化凝血因子VIII的方法，步骤a中所述多肽为GCVSGCLCWEYC、RKWNCTDHEYC和EYCPC按摩尔比1:1:1混合后得到的混合物。
根据上述的利用肽配基亲和纯化凝血因子VIII的方法，步骤b中所述的琼脂糖凝胶为琼脂糖凝胶微球。
根据上述的利用肽配基亲和纯化凝血因子VIII的方法，所述琼脂糖微球优选为Sepharose CL-4B即琼脂糖凝胶CL-4B。
本发明取得的积极有益效果：
(1)本发明的方法有效避免了冷沉淀制剂回收凝血因子VIII比活不确定、纯度较低等问题，同时也解决了离子层析法对工艺条件要求较高及单克隆抗体亲和层析制备容易造成单抗亲和层析中鼠类蛋白的污染问题，丰富了凝血因子VIII的纯化方法，有效提高原料血浆的利用率。
(2)本发明采用肽配基理性设计筛选出了能够与人凝血因子Ⅷ的特异性亲和的肽配基，选用该肽配基作为亲和基质，并将该特异性的肽配基固定在载体上，实现了凝血因子Ⅷ的快速、特异、高效纯化；并且该肽配基亲和效率高、廉价、易于制备，因此，利用本发明的方法可以实现凝血因子Ⅷ的规模化纯化与制备。
(3)与药典中所述的冷沉淀法相比，采用本发明的方法，凝血因子Ⅷ的得率平均提高了41.8％，比活平均提高了58.5％；而且，采用本发明的纯化方法不仅可以有效降低上清中其他人凝血因子及纤维结合蛋白的量，还避免了Al3+的引入，从而增加凝血因子Ⅷ的临床静脉注射安全性，克服了传统方法存在的凝血因子Ⅷ得率低、比活低的难题。分别采用冷沉淀法与本发明方法对三批原料进行实验，其对比结果见表1。
表1 本发明方法与冷沉淀法纯化凝血因子Ⅷ的结果比较
具体实施方式
以下通过具体实施例对本发明作进一步详细说明，但并不限定本发明的保护范围。
实施例1：
一种利用肽配基亲和纯化凝血因子VIII的方法，包括以下步骤：
(1)纯化用亲和层析树脂的制备：
a、肽配基溶液的配制：称取2.8μmol肽配基溶于0.8ml双蒸水中，搅拌至肽配基完全溶解，得到肽配基溶液；其中，所述的肽配基为能与凝血因子VIII发生亲和反应的多肽；所述多肽为GCVSGCLCWEYC；
b、琼脂糖凝胶预处理：量取8ml保存于20％乙醇水溶液中的Sepharose CL-4B即琼脂糖凝胶CL-4B，采用过量蒸馏水对琼脂糖凝胶CL-4B进行反复洗涤，除去琼脂糖凝胶CL-4B表面的乙醇，得到湿琼脂糖凝胶CL-4B；
c、将经过步骤b处理后得到的湿琼脂糖凝胶CL-4B装入离心管中，向离心管中加入20ml预冷的1mM HCl，振荡混合均匀后在4℃静置8min；然后在4℃3000rpm离心4min，弃上清，得到沉淀；向沉淀中加入25ml去离子水，振荡混合均匀后在4℃静置8min；然后在4℃3000rpm离心4min，弃上清，得到凝胶沉淀；向凝胶沉淀中加入0.8ml步骤a配制的肽配基溶液和8ml去离子水，振荡混合均匀，再加入0.8ml 5mg/ml的碳二亚胺溶液，振荡混合均匀后在室温下100rpm反应3.5h；
d、反应结束后，向步骤c的反应液中加入0.5ml冰乙酸，振荡混合均匀，在室温下100rpm继续反应1h；
e、反应结束后，向步骤d的反应液中加入0.8ml含20％哌啶的二甲基甲酰胺溶液，振荡混合均匀，在室温下100rpm继续反应7min，收集反应产物；
f、用100ml 5mmol/L pH4.4的醋酸-醋酸钠缓冲液对步骤e得到的反应产物进行洗涤；然后再分别用0.5M NaCl的pH8.0的0.1M Tris-HCl溶液和含0.5M NaCl的20mM pH4.4醋酸-醋酸钠缓冲液各20ml对反应产物进行交替洗涤3次；
g、将经过步骤f处理后的反应产物用100ml去离子水进行洗涤，然后再用50ml20％的乙醇水溶液洗涤，洗涤结束后，即得到纯化用亲和层析树脂；将纯化用亲和层析树脂4℃保存在20％的乙醇水溶液中，备用；
(2)将步骤(1)制备得到的纯化用亲和层析树脂装入凝胶过滤层析柱中，然后向凝胶过滤层析柱上加入0.02M PBS缓冲液进行洗涤处理，洗涤至流出液的pH值与0.02M PBS缓冲液相同时，停止洗涤；
(3)将待纯化的血清或血浆用0.02M PBS缓冲液稀释4倍，然后用蛋白纯化仪将稀释后的血清或血浆泵入凝胶过滤层析柱中，控制蛋白纯化仪恒流泵的转速为2ml/min，凝胶过滤层析柱的柱压为0.3MPa；用50ml的含0.5M NaCl的pH8.0的0.1M Tris-HCl溶液进行洗脱，然后再用25ml含0.5M NaCl的pH2.5的50mM的甘氨酸溶液进行洗脱，采用部分收集器对洗脱液进行收集，每管收集3mL，并用紫外检测设备对收集的洗脱液进行检测，出现凝血因子VIII洗脱峰的洗脱液即为凝血因子VIII粗品；
(4)用pH8.8的0.1M Tris-HCl溶液将凝血因子VIII粗品的pH值调节至pH5.0-pH7.0之间，然后再用0.02M pH7.2的PBS缓冲液作为透析液对其进行透析处理，透析处理时透析液与凝血因子VIII粗品的体积比为10：1，每次透析时间为4h，连续透析6次；透析处理后既得到纯化的凝血因子VIII，即凝血因子VIII纯品。
实施例2：
一种利用肽配基亲和纯化凝血因子VIII的方法，包括以下步骤：
(1)纯化用亲和层析树脂的制备：
a、肽配基溶液的配制：称取3.0μmol肽配基溶于1ml双蒸水中，搅拌至肽配基完全溶解，得到肽配基溶液；其中，所述的肽配基为能与凝血因子VIII发生亲和反应的多肽；所述多肽为RKWNCTDHEYC；
b、琼脂糖凝胶预处理：量取10ml保存于20％乙醇水溶液中的Sepharose CL-4B即琼脂糖凝胶CL-4B，采用过量蒸馏水对琼脂糖凝胶CL-4B进行反复洗涤，除去琼脂糖凝胶CL-4B表面的乙醇，得到湿琼脂糖凝胶CL-4B；
c、将经过步骤b处理后得到的湿琼脂糖凝胶CL-4B装入离心管中，向离心管中加入25ml预冷的1mM HCl，振荡混合均匀后在4℃静置10min；然后在4℃3000rpm离心6min，弃上清，得到沉淀；向沉淀中加入30ml去离子水，振荡混合均匀后在4℃静置10min；然后在4℃3000rpm离心5min，弃上清，得到凝胶沉淀；向凝胶沉淀中加入1ml步骤a配制的肽配基溶液和10ml去离子水，振荡混合均匀，再加入1ml 5mg/ml的碳二亚胺溶液，振荡混合均匀后在室温下100rpm反应4h；
d、反应结束后，向步骤c的反应液中加入0.8ml冰乙酸，振荡混合均匀，在室温下100rpm继续反应1.2h；
e、反应结束后，向步骤d的反应液中加入1ml含20％哌啶的二甲基甲酰胺溶液，振荡混合均匀，在室温下100rpm继续反应10min，收集反应产物；
f、用120ml 5mmol/L pH4.4的醋酸-醋酸钠缓冲液对步骤e得到的反应产物进行洗涤；然后再分别用0.5M NaCl的pH8.0的0.1M Tris-HCl溶液和含0.5M NaCl的20mM pH4.4醋酸-醋酸钠缓冲液各25ml对反应产物进行交替洗涤3次；
g、将经过步骤f处理后的反应产物用120ml去离子水进行洗涤，然后再用80ml20％的乙醇水溶液洗涤，洗涤结束后，即得到纯化用亲和层析树脂；将纯化用亲和层析树脂4℃保存在20％的乙醇水溶液中，备用；
(2)将步骤(1)制备得到的纯化用亲和层析树脂装入凝胶过滤层析柱中，然后向凝胶过滤层析柱上加入0.02M PBS缓冲液进行洗涤处理，洗涤至流出液的pH值与0.02M PBS缓冲液相同时，停止洗涤；
(3)将待纯化的血清或血浆用0.02M PBS缓冲液稀释5倍，然后用蛋白纯化仪将稀释后的血清或血浆泵入凝胶过滤层析柱中，控制蛋白纯化仪恒流泵的转速为2ml/min，凝胶过滤层析柱的柱压为0.3MPa；用50ml的含0.5M NaCl的pH8.0的0.1M Tris-HCl溶液进行洗脱，然后再用25ml含0.5M NaCl的pH2.5的50mM的甘氨酸溶液进行洗脱，采用部分收集器对洗脱液进行收集，每管收集5mL，并用紫外检测设备对收集的洗脱液进行检测，出现凝血因子VIII洗脱峰的洗脱液即为凝血因子VIII粗品；
(4)用pH8.8的0.1M Tris-HCl溶液将凝血因子VIII粗品的pH值调节至pH5.0-pH7.0之间，然后再用0.02M pH7.2的PBS缓冲液作为透析液对其进行透析处理，透析处理时透析液与凝血因子VIII粗品的体积比为10：1，每次透析时间为4h，连续透析6次；透析处理后既得到纯化的凝血因子VIII，即凝血因子VIII纯品。
实施例3：
一种利用肽配基亲和纯化凝血因子VIII的方法，包括以下步骤：
(1)纯化用亲和层析树脂的制备：
a、肽配基溶液的配制：称取3.2μmol肽配基溶于2ml双蒸水中，搅拌至肽配基完全溶解，得到肽配基溶液；其中，所述的肽配基为能与凝血因子VIII发生亲和反应的多肽；所述多肽为EYCPC；
b、琼脂糖凝胶预处理：量取12ml保存于20％乙醇水溶液中的Sepharose CL-4B即琼脂糖凝胶CL-4B，采用过量蒸馏水对琼脂糖凝胶CL-4B进行反复洗涤，除去琼脂糖凝胶CL-4B表面的乙醇，得到湿琼脂糖凝胶CL-4B；
c、将经过步骤b处理后得到的湿琼脂糖凝胶CL-4B装入离心管中，向离心管中加入25ml预冷的1mM HCl，振荡混合均匀后在4℃静置12min；然后在4℃3000rpm离心8min，弃上清，得到沉淀；向沉淀中加入35ml去离子水，振荡混合均匀后在4℃静置12min；然后在4℃3000rpm离心8min，弃上清，得到凝胶沉淀；向凝胶沉淀中加入1.5ml步骤a配制的肽配基溶液和12ml去离子水，振荡混合均匀，再加入1.2ml 5mg/ml的碳二亚胺溶液，振荡混合均匀后在室温下100rpm反应5h；
d、反应结束后，向步骤c的反应液中加入1ml冰乙酸，振荡混合均匀，在室温下100rpm继续反应1.5h；
e、反应结束后，向步骤d的反应液中加入1.5ml含20％哌啶的二甲基甲酰胺溶液，振荡混合均匀，在室温下100rpm继续反应9min，收集反应产物；
f、用150ml 5mmol/L pH4.4的醋酸-醋酸钠缓冲液对步骤e得到的反应产物进行洗涤；然后再分别用0.5M NaCl的pH8.0的0.1M Tris-HCl溶液和含0.5M NaCl的20mM pH4.4醋酸-醋酸钠缓冲液各30ml对反应产物进行交替洗涤3次；
g、将经过步骤f处理后的反应产物用150ml去离子水进行洗涤，然后再用100ml20％的乙醇水溶液洗涤，洗涤结束后，即得到纯化用亲和层析树脂；将纯化用亲和层析树脂4℃保存在20％的乙醇水溶液中，备用；
(2)将步骤(1)制备得到的纯化用亲和层析树脂装入凝胶过滤层析柱中，然后向凝胶过滤层析柱上加入0.02M PBS缓冲液进行洗涤处理，洗涤至流出液的pH值与0.02M PBS缓冲液相同时，停止洗涤；
(3)将待纯化的血清或血浆用0.02M PBS缓冲液稀释6倍，然后用蛋白纯化仪将稀释后的血清或血浆泵入凝胶过滤层析柱中，控制蛋白纯化仪恒流泵的转速为2ml/min，凝胶过滤层析柱的柱压为0.3MPa；用50ml的含0.5M NaCl的pH8.0的0.1M Tris-HCl溶液进行洗脱，然后再用25ml含0.5M NaCl的pH2.5的50mM的甘氨酸溶液进行洗脱，采用部分收集器对洗脱液进行收集，每管收集4mL，并用紫外检测设备对收集的洗脱液进行检测，出现凝血因子VIII洗脱峰的洗脱液即为凝血因子VIII粗品；
(4)用pH8.8的0.1M Tris-HCl溶液将凝血因子VIII粗品的pH值调节至pH5.0-pH7.0之间，然后再用0.02M pH7.2的PBS缓冲液作为透析液对其进行透析处理，透析处理时透析液与凝血因子VIII粗品的体积比为10：1，每次透析时间为4h，连续透析6次；透析处理后既得到纯化的凝血因子VIII，即凝血因子VIII纯品。
实施例4：
一种利用肽配基亲和纯化凝血因子VIII的方法，包括以下步骤：
(1)纯化用亲和层析树脂的制备：
a、肽配基溶液的配制：称取3.0μmol肽配基溶于1.5ml双蒸水中，搅拌至肽配基完全溶解，得到肽配基溶液；其中，所述的肽配基为能与凝血因子VIII发生亲和反应的多肽；所述多肽为GCVSGCLCWEYC、RKWNCTDHEYC和EYCPC按摩尔比1:1:1混合后得到的混合物；
b、琼脂糖凝胶预处理：量取12ml保存于20％乙醇水溶液中的Sepharose CL-4B即琼脂糖凝胶CL-4B，采用过量蒸馏水对琼脂糖凝胶CL-4B进行反复洗涤，除去琼脂糖凝胶CL-4B表面的乙醇，得到湿琼脂糖凝胶CL-4B；
c、将经过步骤b处理后得到的湿琼脂糖凝胶CL-4B装入离心管中，向离心管中加入25ml预冷的1mM HCl，振荡混合均匀后在4℃静置12min；然后在4℃3000rpm离心8min，弃上清，得到沉淀；向沉淀中加入35ml去离子水，振荡混合均匀后在4℃静置12min；然后在4℃3000rpm离心8min，弃上清，得到凝胶沉淀；向凝胶沉淀中加入2ml步骤a配制的肽配基溶液和15ml去离子水，振荡混合均匀，再加入1.5ml 5mg/ml的碳二亚胺溶液，振荡混合均匀后在室温下100rpm反应5h；
d、反应结束后，向步骤c的反应液中加入1ml冰乙酸，振荡混合均匀，在室温下100rpm继续反应1.5h；
e、反应结束后，向步骤d的反应液中加入1.5ml含20％哌啶的二甲基甲酰胺溶液，振荡混合均匀，在室温下100rpm继续反应10min，收集反应产物；
f、用150ml 5mmol/L pH4.4的醋酸-醋酸钠缓冲液对步骤e得到的反应产物进行洗涤；然后再分别用0.5M NaCl的pH8.0的0.1M Tris-HCl溶液和含0.5M NaCl的20mM pH4.4醋酸-醋酸钠缓冲液各30ml对反应产物进行交替洗涤3次；
g、将经过步骤f处理后的反应产物用150ml去离子水进行洗涤，然后再用100ml20％的乙醇水溶液洗涤，洗涤结束后，即得到纯化用亲和层析树脂；将纯化用亲和层析树脂4℃保存在20％的乙醇水溶液中，备用；
(2)将步骤(1)制备得到的纯化用亲和层析树脂装入凝胶过滤层析柱中，然后向凝胶过滤层析柱上加入0.02M PBS缓冲液进行洗涤处理，洗涤至流出液的pH值与0.02M PBS缓冲液相同时，停止洗涤；
(3)将待纯化的血清或血浆用0.02M PBS缓冲液稀释5倍，然后用蛋白纯化仪将稀释后的血清或血浆泵入凝胶过滤层析柱中，控制蛋白纯化仪恒流泵的转速为2ml/min，凝胶过滤层析柱的柱压为0.3MPa；用50ml的含0.5M NaCl的pH8.0的0.1M Tris-HCl溶液进行洗脱，然后再用25ml含0.5M NaCl的pH2.5的50mM的甘氨酸溶液进行洗脱，采用部分收集器对洗脱液进行收集，每管收集5mL，并用紫外检测设备对收集的洗脱液进行检测，出现凝血因子VIII洗脱峰的洗脱液即为凝血因子VIII粗品；
(4)用pH8.8的0.1M Tris-HCl溶液将凝血因子VIII粗品的pH值调节至pH5.0-pH7.0之间，然后再用0.02M pH7.2的PBS缓冲液作为透析液对其进行透析处理，透析处理时透析液与凝血因子VIII粗品的体积比为10：1，每次透析时间为4h，连续透析6次；透析处理后既得到纯化的凝血因子VIII，即凝血因子VIII纯品。
实施例5：
一种利用肽配基亲和纯化凝血因子VIII的方法，包括以下步骤：
(1)纯化用亲和层析树脂的制备：
a、肽配基溶液的配制：称取2.8μmol肽配基溶于1.2ml双蒸水中，搅拌至肽配基完全溶解，得到肽配基溶液；其中，所述的肽配基为能与凝血因子VIII发生亲和反应的多肽；所述多肽为者GCVSGCLCWEYC、RKWNCTDHEYC和EYCPC按任意比混合后得到的混合物；
b、琼脂糖凝胶预处理：量取10ml保存于20％乙醇水溶液中的Sepharose CL-4B即琼脂糖凝胶CL-4B，采用过量蒸馏水对琼脂糖凝胶CL-4B进行反复洗涤，除去琼脂糖凝胶CL-4B表面的乙醇，得到湿琼脂糖凝胶CL-4B；
c、将经过步骤b处理后得到的湿琼脂糖凝胶CL-4B装入离心管中，向离心管中加入25ml预冷的1mM HCl，振荡混合均匀后在4℃静置10min；然后在4℃3000rpm离心5min，弃上清，得到沉淀；向沉淀中加入30ml去离子水，振荡混合均匀后在4℃静置10min；然后在4℃3000rpm离心5min，弃上清，得到凝胶沉淀；向凝胶沉淀中加入1.5ml步骤a配制的肽配基溶液和12ml去离子水，振荡混合均匀，再加入1.5ml 5mg/ml的碳二亚胺溶液，振荡混合均匀后在室温下100rpm反应5h；
d、反应结束后，向步骤c的反应液中加入0.8ml冰乙酸，振荡混合均匀，在室温下100rpm继续反应1h；
e、反应结束后，向步骤d的反应液中加入1.2ml含20％哌啶的二甲基甲酰胺溶液，振荡混合均匀，在室温下100rpm继续反应10min，收集反应产物；
f、用120ml 5mmol/L pH4.4的醋酸-醋酸钠缓冲液对步骤e得到的反应产物进行洗涤；然后再分别用0.5M NaCl的pH8.0的0.1M Tris-HCl溶液和含0.5M NaCl的20mM pH4.4醋酸-醋酸钠缓冲液各20ml对反应产物进行交替洗涤3次；
g、将经过步骤f处理后的反应产物用140ml去离子水进行洗涤，然后再用50ml20％的乙醇水溶液洗涤，洗涤结束后，即得到纯化用亲和层析树脂；将纯化用亲和层析树脂4℃保存在20％的乙醇水溶液中，备用；
(2)将步骤(1)制备得到的纯化用亲和层析树脂装入凝胶过滤层析柱中，然后向凝胶过滤层析柱上加入0.02M PBS缓冲液进行洗涤处理，洗涤至流出液的pH值与0.02M PBS缓冲液相同时，停止洗涤；
(3)将待纯化的血清或血浆用0.02M PBS缓冲液稀释4倍，然后用蛋白纯化仪将稀释后的血清或血浆泵入凝胶过滤层析柱中，控制蛋白纯化仪恒流泵的转速为2ml/min，凝胶过滤层析柱的柱压为0.3MPa；用50ml的含0.5M NaCl的pH8.0的0.1M Tris-HCl溶液进行洗脱，然后再用25ml含0.5M NaCl的pH2.5的50mM的甘氨酸溶液进行洗脱，采用部分收集器对洗脱液进行收集，每管收集3mL，并用紫外检测设备对收集的洗脱液进行检测，出现凝血因子VIII洗脱峰的洗脱液即为凝血因子VIII粗品；
(4)用pH8.8的0.1M Tris-HCl溶液将凝血因子VIII粗品的pH值调节至pH5.0-pH7.0之间，然后再用0.02M pH7.2的PBS缓冲液作为透析液对其进行透析处理，透析处理时透析液与凝血因子VIII粗品的体积比为10：1，每次透析时间为4h，连续透析6次；透析处理后既得到纯化的凝血因子VIII，即凝血因子VIII纯品。
实施例6：
一种利用肽配基亲和纯化凝血因子VIII的方法，包括以下步骤：
(1)纯化用亲和层析树脂的制备：
a、肽配基溶液的配制：称取3.2μmol肽配基溶于1.5ml双蒸水中，搅拌至肽配基完全溶解，得到肽配基溶液；其中，所述的肽配基为能与凝血因子VIII发生亲和反应的多肽；所述多肽为GCVSGCLCWEYC；
b、琼脂糖凝胶预处理：量取8ml保存于20％乙醇水溶液中的Sepharose CL-4B即琼脂糖凝胶CL-4B，采用过量蒸馏水对琼脂糖凝胶CL-4B进行反复洗涤，除去琼脂糖凝胶CL-4B表面的乙醇，得到湿琼脂糖凝胶CL-4B；
c、将经过步骤b处理后得到的湿琼脂糖凝胶CL-4B装入离心管中，向离心管中加入20ml预冷的1mM HCl，振荡混合均匀后在4℃静置12min；然后在4℃3000rpm离心4min，弃上清，得到沉淀；向沉淀中加入25ml去离子水，振荡混合均匀后在4℃静置12min；然后在4℃3000rpm离心4min，弃上清，得到凝胶沉淀；向凝胶沉淀中加入2ml步骤a配制的肽配基溶液和10ml去离子水，振荡混合均匀，再加入1.0ml 5mg/ml的碳二亚胺溶液，振荡混合均匀后在室温下100rpm反应3.5h；
d、反应结束后，向步骤c的反应液中加入0.6ml冰乙酸，振荡混合均匀，在室温下100rpm继续反应1h；
e、反应结束后，向步骤d的反应液中加入1.0ml含20％哌啶的二甲基甲酰胺溶液，振荡混合均匀，在室温下100rpm继续反应8min，收集反应产物；
f、用100ml 5mmol/L pH4.4的醋酸-醋酸钠缓冲液对步骤e得到的反应产物进行洗涤；然后再分别用0.5M NaCl的pH8.0的0.1M Tris-HCl溶液和含0.5M NaCl的20mM pH4.4醋酸-醋酸钠缓冲液各30ml对反应产物进行交替洗涤3次；
g、将经过步骤f处理后的反应产物用150ml去离子水进行洗涤，然后再用80ml20％的乙醇水溶液洗涤，洗涤结束后，即得到纯化用亲和层析树脂；将纯化用亲和层析树脂4℃保存在20％的乙醇水溶液中，备用；
(2)将步骤(1)制备得到的纯化用亲和层析树脂装入凝胶过滤层析柱中，然后向凝胶过滤层析柱上加入0.02M PBS缓冲液进行洗涤处理，洗涤至流出液的pH值与0.02M PBS缓冲液相同时，停止洗涤；
(3)将待纯化的血清或血浆用0.02M PBS缓冲液稀释4倍，然后用蛋白纯化仪将稀释后的血清或血浆泵入凝胶过滤层析柱中，控制蛋白纯化仪恒流泵的转速为2ml/min，凝胶过滤层析柱的柱压为0.3MPa；用50ml的含0.5M NaCl的pH8.0的0.1M Tris-HCl溶液进行洗脱，然后再用25ml含0.5M NaCl的pH2.5的50mM的甘氨酸溶液进行洗脱，采用部分收集器对洗脱液进行收集，每管收集5mL，并用紫外检测设备对收集的洗脱液进行检测，出现凝血因子VIII洗脱峰的洗脱液即为凝血因子VIII粗品；
(4)用pH8.8的0.1M Tris-HCl溶液将凝血因子VIII粗品的pH值调节至pH5.0-pH7.0之间，然后再用0.02M pH7.2的PBS缓冲液作为透析液对其进行透析处理，透析处理时透析液与凝血因子VIII粗品的体积比为10：1，每次透析时间为4h，连续透析6次；透析处理后既得到纯化的凝血因子VIII，即凝血因子VIII纯品。
实施例7：
一种利用肽配基亲和纯化凝血因子VIII的方法，包括以下步骤：
(1)纯化用亲和层析树脂的制备：
a、肽配基溶液的配制：称取3.2μmol肽配基溶于1.0ml双蒸水中，搅拌至肽配基完全溶解，得到肽配基溶液；其中，所述的肽配基为能与凝血因子VIII发生亲和反应的多肽；所述多肽为GCVSGCLCWEYC、RKWNCTDHEYC和EYCPC按摩尔比1:1:1混合后得到的混合物；
b、琼脂糖凝胶预处理：量取12ml保存于20％乙醇水溶液中的Sepharose CL-4B即琼脂糖凝胶CL-4B，采用过量蒸馏水对琼脂糖凝胶CL-4B进行反复洗涤，除去琼脂糖凝胶CL-4B表面的乙醇，得到湿琼脂糖凝胶CL-4B；
c、将经过步骤b处理后得到的湿琼脂糖凝胶CL-4B装入离心管中，向离心管中加入20ml预冷的1mM HCl，振荡混合均匀后在4℃静置10min；然后在4℃3000rpm离心6min，弃上清，得到沉淀；向沉淀中加入25ml去离子水，振荡混合均匀后在4℃静置10min；然后在4℃3000rpm离心6min，弃上清，得到凝胶沉淀；向凝胶沉淀中加入2ml步骤a配制的肽配基溶液和10ml去离子水，振荡混合均匀，再加入1.0ml 5mg/ml的碳二亚胺溶液，振荡混合均匀后在室温下100rpm反应4h；
d、反应结束后，向步骤c的反应液中加入0.6ml冰乙酸，振荡混合均匀，在室温下100rpm继续反应1.5h；
e、反应结束后，向步骤d的反应液中加入1.0ml含20％哌啶的二甲基甲酰胺溶液，振荡混合均匀，在室温下100rpm继续反应8min，收集反应产物；
f、用100ml 5mmol/L pH4.4的醋酸-醋酸钠缓冲液对步骤e得到的反应产物进行洗涤；然后再分别用0.5M NaCl的pH8.0的0.1M Tris-HCl溶液和含0.5M NaCl的20mM pH4.4醋酸-醋酸钠缓冲液各30ml对反应产物进行交替洗涤3次；
g、将经过步骤f处理后的反应产物用150ml去离子水进行洗涤，然后再用80ml20％的乙醇水溶液洗涤，洗涤结束后，即得到纯化用亲和层析树脂；将纯化用亲和层析树脂4℃保存在20％的乙醇水溶液中，备用；
(2)将步骤(1)制备得到的纯化用亲和层析树脂装入凝胶过滤层析柱中，然后向凝胶过滤层析柱上加入0.02M PBS缓冲液进行洗涤处理，洗涤至流出液的pH值与0.02M PBS缓冲液相同时，停止洗涤；
(3)将待纯化的血清或血浆用0.02M PBS缓冲液稀释4倍，然后用蛋白纯化仪将稀释后的血清或血浆泵入凝胶过滤层析柱中，控制蛋白纯化仪恒流泵的转速为2ml/min，凝胶过滤层析柱的柱压为0.3MPa；用50ml的含0.5M NaCl的pH8.0的0.1M Tris-HCl溶液进行洗脱，然后再用25ml含0.5M NaCl的pH2.5的50mM的甘氨酸溶液进行洗脱，采用部分收集器对洗脱液进行收集，每管收集5mL，并用紫外检测设备对收集的洗脱液进行检测，出现凝血因子VIII洗脱峰的洗脱液即为凝血因子VIII粗品；
(4)用pH8.8的0.1M Tris-HCl溶液将凝血因子VIII粗品的pH值调节至pH5.0-pH7.0之间，然后再用0.02M pH7.2的PBS缓冲液作为透析液对其进行透析处理，透析处理时透析液与凝血因子VIII粗品的体积比为10：1，每次透析时间为4h，连续透析6次；透析处理后既得到纯化的凝血因子VIII，即凝血因子VIII纯品。
Claims (4)
1.一种利用肽配基亲和纯化凝血因子VIII的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)纯化用亲和层析树脂的制备：
a、肽配基溶液的配制：称取2.8-3.2μmol肽配基溶于0.8-2ml双蒸水中，搅拌至肽配基完全溶解，得到肽配基溶液；其中，所述的肽配基为能与凝血因子VIII发生亲和反应的多肽；所述多肽为EYCPC、GCVSGCLCWEYC和RKWNCTDHEYC中的任意一种或者EYCPC、GCVSGCLCWEYC和RKWNCTDHEYC按任意比混合后得到的混合物；
b、琼脂糖凝胶预处理：量取8-12ml保存于20％乙醇水溶液中的琼脂糖凝胶，采用过量蒸馏水对琼脂糖凝胶进行反复洗涤，除去琼脂糖凝胶表面的乙醇，得到湿琼脂糖凝胶；
c、将经过步骤b处理后得到的湿琼脂糖凝胶装入离心管中，向离心管中加入20-25ml预冷的1mM HCl，振荡混合均匀后在4℃静置8-12min；然后在4℃3000rpm离心4-8min，弃上清，得到沉淀；向沉淀中加入25-35ml去离子水，振荡混合均匀后在4℃静置8-12min；然后在4℃3000rpm离心4-8min，弃上清，得到凝胶沉淀；向凝胶沉淀中加入0.8-2ml步骤a配制的肽配基溶液和8-15ml去离子水，振荡混合均匀，再加入0.8-1.5ml 5mg/ml的碳二亚胺溶液，振荡混合均匀后在室温下100rpm反应3.5-5h；
d、反应结束后，向步骤c的反应液中加入0.5-1ml冰乙酸，振荡混合均匀，在室温下100rpm继续反应1-1.5h；
e、反应结束后，向步骤d的反应液中加入0.8-1.5ml含20％哌啶的二甲基甲酰胺溶液，振荡混合均匀，在室温下100rpm继续反应7-10min，收集反应产物；
f、用100-150ml 5mmol/L pH4.4的醋酸-醋酸钠缓冲液对步骤e得到的反应产物进行洗涤；然后再分别用0.5M NaCl的pH8.0的0.1M Tris-HCl溶液和含0.5M NaCl的20mM pH4.4醋酸-醋酸钠缓冲液各20-30ml对反应产物进行交替洗涤3次；
g、将经过步骤f处理后的反应产物用100-150ml去离子水进行洗涤，然后再用50-100ml20％的乙醇水溶液洗涤，洗涤结束后，即得到纯化用亲和层析树脂；将纯化用亲和层析树脂4℃保存在20％的乙醇水溶液中，备用；
(2)将步骤(1)制备得到的纯化用亲和层析树脂装入凝胶过滤层析柱中，然后向凝胶过滤层析柱上加入0.02M PBS缓冲液进行洗涤处理，洗涤至流出液的pH值与0.02M PBS缓冲液相同时，停止洗涤；
(3)将待纯化的血清或血浆用0.02M PBS缓冲液稀释4-6倍，然后用蛋白纯化仪将稀释后的血清或血浆泵入凝胶过滤层析柱中，控制蛋白纯化仪恒流泵的转速为2ml/min，凝胶过滤层析柱的柱压为0.3MPa；用50ml的含0.5M NaCl的pH8.0的0.1M Tris-HCl溶液进行洗脱，然后再用25ml含0.5M NaCl的pH2.5的50mM的甘氨酸溶液进行洗脱，采用部分收集器对洗脱液进行收集，每管收集3-5mL，并用紫外检测设备对收集的洗脱液进行检测，出现凝血因子VIII洗脱峰的洗脱液即为凝血因子VIII粗品；
(4)用pH8.8的0.1M Tris-HCl溶液将凝血因子VIII粗品的pH值调节至pH5.0-pH7.0之间，然后再用0.02M pH7.2的PBS缓冲液作为透析液对其进行透析处理，透析处理时透析液与凝血因子VIII粗品的体积比为10：1，每次透析时间为4h，连续透析6次；透析处理后既得到纯化的凝血因子VIII，即凝血因子VIII纯品。
2.根据权利要求1所述的利用肽配基亲和纯化凝血因子VIII的方法，其特征在于，步骤a中所述多肽为GCVSGCLCWEYC、RKWNCTDHEYC和EYCPC按摩尔比1:1:1混合后得到的混合物。
3.根据权利要求1所述的利用肽配基亲和纯化凝血因子VIII的方法，其特征在于，步骤b中所述的琼脂糖凝胶为琼脂糖凝胶微球。
4.根据权利要求3所述的利用肽配基亲和纯化凝血因子VIII的方法，其特征在于，所述琼脂糖微球为Sepharose CL-4B即琼脂糖凝胶CL-4B。
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| CN102584933A (zh) * | 2012-02-13 | 2012-07-18 | 汪志友 | 一种利用亲和双水相系统提高凝血因子ⅷ及其类似物分离效率、纯度与生物比活性的方法 |
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