CN102770450B - 因子viii融合蛋白 - Google Patents
因子viii融合蛋白 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102770450B CN102770450B CN201180009864.4A CN201180009864A CN102770450B CN 102770450 B CN102770450 B CN 102770450B CN 201180009864 A CN201180009864 A CN 201180009864A CN 102770450 B CN102770450 B CN 102770450B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- molecule
- fviii
- factor
- structural domain
- fusion
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
- C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
- C07K14/70535—Fc-receptors, e.g. CD16, CD32, CD64 (CD2314/705F)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/76—Albumins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/31—Fusion polypeptide fusions, other than Fc, for prolonged plasma life, e.g. albumin
Abstract
本发明涉及经修饰的凝血因子。具体地讲,本发明涉及缀合的因子VIII分子,所述因子VIII分子与诸如抗体结合蛋白或Fc结构域等多肽融合。
Description
发明领域
本发明涉及经修饰的凝血因子。特别是,本发明涉及与非同源多肽融合的因子VIII分子,所述多肽为例如抗体结合多肽,例如Fc受体或Fc结构域。本发明还涉及所述分子的用途以及所述分子的生产方法。
发明背景
A型血友病是由凝血因子VIII(FVIII)活性缺乏或功能障碍所致的一种遗传性出血性疾病。临床表现不在于最初的止血,即血块的形成正常发生,但血块因缺乏相继的凝血酶形成而不稳定。该病通过静脉内注射从血液中分离的或重组产生的凝血因子FVIII而得以治疗。
目前的治疗推荐由传统的按需治疗向预防转变。与冯维勒布兰德因子(vonWillebrandtFactor)结合的内源FVIII的循环半衰期是12-14小时,因此预防性治疗应一周进行数次,以使患者获得几乎无症状的生活。IV给予对于许多人,尤其是儿童和年轻人而言伴随明显的不便和/或痛苦。
在具有显著延长的循环半衰期的因子VIII变体的开发中已经采用多种方法。很多这类方法都涉及到将因子VIII与亲水性聚合物例如PEG(聚乙二醇)缀合在一起。
因此本领域需要具有因子VIII活性的新的因子VIII产品,其包括一种或多种以下特征:优选在结构上是同源的,优选为安全的,优选为生物可降解的,并优选具有显著延长的循环半衰期,以减少每周给予因子VIII的次数。本领域同样需要用于提供这类分子的相对简单的方法。
发明概述
本发明涉及重组因子VIII分子,其中所述因子VIII分子是融合蛋白。本发明还涉及所述分子的制备方法以及所述分子的用途。所述分子优选具有改良的循环半衰期。
发明描述
定义
融合蛋白:融合蛋白/嵌合蛋白,是通过原本编码分开的蛋白质的两种以上基因结合而产生的蛋白质。该融合基因经翻译而得到具有来源于每个原有蛋白质的功能特性的单个多肽。可将本发明的因子VIII分子与另一多肽融合。优选地,因子VIII融合蛋白将具有比非融合因子VIII分子更长的循环半衰期。
可将很多种融合配偶体与FVIII部分结合起来。这些融合配偶体可通过不同机制改变融合蛋白相对于野生型FVIII的性能。
推定多种融合配偶体通过与新生儿Fc受体(FcRn)相互作用而延迟FVIII的体内清除。推定通过与FcRn相互作用而延迟FVIII的融合配偶体的非限制性实例是免疫球蛋白Fc结构域、人血清白蛋白(hSA)和转铁蛋白或这些蛋白的组成部分。由与推定通过与FcRn相互作用而延迟FVIII的多肽结合的FVIII部分组成的融合蛋白的非限制性实例见表2。尽管因为IgG抗体的相对长的循环半衰期而通常优选IgGFc结构域,但“Fc融合衍生物”或“Fc融合蛋白”在本文中意指包括与可来源于任何抗体同种型的Fc结构域融合的本发明FVIII变体。Fc结构域还可经修饰以调节某些效应子功能,例如补体结合和/或与某些Fc受体结合。FVIII与具有与FcRn受体结合的能力的Fc结构域的融合,通常将会导致融合蛋白的循环半衰期延长(与wtFVIII的半衰期相比)。在IgGFc结构域中234、235和237位的突变通常将会导致与FcγRI受体的结合减少,还可能导致与FcγRIIa和FcγRIII受体的结合减少。这些突变不改变与FcRn受体的结合,其通过内吞再循环途径而促进了长循环半衰期。优选地,本发明的融合蛋白经修饰的IgGFc结构域包含一个或多个以下突变,所述突变将会分别导致对某些Fc受体的亲和力下降(L234A、L235E和G237A)以及C1q-介导的补体结合降低(A330S和P331S)。
然而,本发明也包含这样的FVIII变体:其与例如与新生儿Fc受体的结合特性发生改变的Fc结构域融合。如果例如Fc结构域变体具有增加的与例如新生儿Fc受体的亲和力,可能融合蛋白的体内循环半衰期将得到进一步延长。据信调节Fc结构域与新生儿Fc受体的亲和力的人IgG中氨基酸置换的实例是T250Q、M252Y、S254T、T256E、P257I、T307A、Q311I和M428L(残基编号按照EU索引)。
推定其它融合配偶体通过与免疫球蛋白相互作用而延迟FVIII的体内清除。推定通过与免疫球蛋白相互作用而延迟FVIII的融合配偶体的非限制性实例是Fc受体,例如FcγRI(CD64)或FcRn或这些蛋白的组成部分。由与推定通过与免疫球蛋白相互作用而延迟FVIII的多肽连接的FVIII部分组成的融合蛋白的非限制性实例见表3。
推定某些融合配偶体通过减少与清除受体的相互作用而延迟FVIII的体内清除。推定通过减少与清除受体的相互作用而延迟FVIII的融合配偶体的非限制性实例是低密度脂蛋白受体家族Fc受体成员,例如低密度脂蛋白受体相关蛋白或这些蛋白的组成部分,例如重复簇5(CR5)、6(CR6)和/或7(CR7)。由与推定通过减少与清除受体的相互作用而延迟FVIII的多肽连接的FVIII部分组成的融合蛋白的非限制性实例见表4。
推定其它融合配偶体通过与血小板相互作用而延迟FVIII的体内清除。推定通过与血小板相互作用而延迟FVIII的融合配偶体的非限制性实例是与血小板表面上的蛋白质例如GPIIIa结合的单链(SC)抗体。在SC抗体中,源自免疫球蛋白重链的多肽序列可位于源自免疫球蛋白轻链的多肽序列的N-端。该顺序称为HC-LC。源自免疫球蛋白重链的多肽序列也可位于源自免疫球蛋白轻链的多肽序列的C-端。这后一种顺序称为LC-HC。由与推定通过与血小板相互作用而延迟FVIII的多肽连接的FVIII部分组成的融合蛋白的非限制性实例见表5。
推定一些融合配偶体通过与血清白蛋白相互作用而延迟FVIII的体内清除。推定通过与血清白蛋白相互作用而延迟FVIII的融合配偶体的非限制性实例是单链抗血清白蛋白抗体(SC抗HSA)和白蛋白结合多肽例如ABD035多肽。白蛋白结合多肽可重复若干次,例如4次重复,正如在4XABD035融合配偶体中所示。由与推定通过与血清白蛋白相互作用而延迟FVIII的多肽连接的FVIII部分组成的融合蛋白的非限制性实例见表6。
推定其它融合配偶体通过保护(shielding)而延迟FVIII的体内清除。推定通过保护而延迟FVIII的融合配偶体的非限制性实例是具有非疏水性氨基酸段例如序列A(seqA)的多肽或充满弹性蛋白样多肽(ELP)例如ELP60的多肽。由与推定通过保护而延迟FVIII的多肽连接的FVIII部分组成的融合蛋白的非限制性实例见表7。
推定某些融合配偶体通过调节与vWF的亲和力而延迟FVIII的体内清除。推定通过调节与vWF的亲和力而延迟FVIII的融合配偶体的非限制性实例是FVIII的a3区(野生型人FVIII的氨基酸1649-1689)或a3区的部分,因此给FVIII添加一个或多个额外的a3区。由与推定通过调节与vWF的亲和力而延迟FVIII的多肽连接的FVIII部分组成的融合蛋白的非限制性实例见表8。
推定某些融合配偶体通过尚待确定的机制而延迟FVIII的体内清除。推定通过尚待确定的机制而延迟FVIII的融合配偶体的非限制性实例是生长激素结合蛋白(GHBP)、凝血因子IX(FIX)部分、vWF部分、vWF结合蛋白、绒毛膜促性腺激素部分和凝血因子X(FX)部分。源自FIX的融合配偶体的非限制性实例是人FIX的氨基酸298-342(FIX298-342)和人FIX的氨基酸47-125(FIX47-125)。源自vWF的融合配偶体的非限制性实例是人vWF的氨基酸1-272(vWF1-272)、人vWF的氨基酸1-1390(vWF1-1390)和人vWF的氨基酸497-716(vWF497-716)。源自绒毛膜促性腺激素的融合配偶体的非限制性实例是人绒毛膜促性腺激素β-链的C-端28个氨基酸(hCGC-端)。源自FX的融合配偶体的非限制性实例是人FX活化肽(F10AP)。由与推定通过尚待确定的机制而延迟FVIII的多肽连接的FVIII部分组成的融合蛋白的非限制性实例见表9。
推定某些融合配偶体通过调节与脂质的亲和力而延迟FVIII的体内清除。推定通过调节与脂质的亲和力而延迟FVIII的融合配偶体的非限制性实例是FVIII的C2结构域,因此给FVIII添加一个或多个额外C2结构域。由与推定通过调节与脂质的亲和力而延迟FVIII的多肽连接的FVIII部分组成的融合蛋白的非限制性实例见表10。
Fc受体:Fc受体是识别和结合抗体的Fc部分的细胞表面受体。根据其结构、细胞分布和与IgG的亲和力,将Fc受体分为3类:FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FCγRIII(CD16)。依据本发明,与因子VIII分子融合的Fc受体可以是全长或部分长度的Fc受体、及其任何变体(变体包括氨基酸取代、缺失和添加)。如果它们是部分长度的,则应保留与抗体结合的能力。
冯维勒布兰德因子(vWF):vWF是存在于血浆中并在内皮(在怀布尔-帕拉德体中)、巨核细胞(血小板α-颗粒)和内皮下结缔组织中组成性地产生的一种大的单聚/多聚糖蛋白。其主要功能是与其它蛋白、尤其是与因子VIII结合,并且它在血细胞粘附于受伤部位中是重要的。
因子VIII与vWF结合的同时在循环中失活;因子VIII当未与vWF结合时快速降解或被清除。因此由此断定,迄今已认为降低或消除FVIII的vWF结合能力在获取具有延长循环半衰期的因子FVIII变体中是非常不希望的途径。
术语“与vWF的结合能力降低”在本文中意指包括因子VIII变体,其中与vWF的结合能力降低至少50%,优选至少60%、更优选至少70%、更优选至少80%、更优选至少90%、和最优选约100%。FVIII与vWF的结合可通过ELISA样测定来检测或使用表面等离振子共振来测定为与固定化vWF的直接结合。在因子VIII中负责与vWF结合的区域是跨越残基1670-1684的区域,其公开于EP0319315。设想涉及该区域的因子VIII点突变和/或缺失突变(deltionmutatant)将会改变与vWF结合的能力。本发明特别优选的点突变的实例包括包含一个或多个以下点突变的变体:Y1680F、Y1680R、Y1680N、和E1682T、和Y1680C。
因子VIII分子:FVIII/因子VIII是主要由肝细胞产生的一种大而复杂糖蛋白。FVIII由2351个氨基酸组成,包括信号肽,并含有由同源性限定的若干不同结构域。有3个A结构域、1个独特的B结构域和2个C结构域。结构域的顺序可列为NH2-A1-A2-B-A3-C1-C2-COOH。FVIII在血浆内以在B-A3边界分开的2条链而循环。这两条链通过二价金属离子结合而连接。A1-A2-B链称为重链(HC),而A3-C1-C2称为轻链(LC)。
内源因子VIII分子在体内作为具有不同大小的B结构域的分子库而循环。在体内可能发生的是对B结构域的逐步酶切除,产生具有不同大小的B结构域的分子库。通常认为在740位的切割(B结构域的最后部分正是因此而被切除)的发生与凝血酶激活相关。然而,这并不能排除因子VIII变体(其中例如在740位的切割位点已经受损)可具有活性。
本文所用的“因子VIII”或“FVIII”是指作为内源性凝血途径的成员并对凝血而言至关重要的人血浆糖蛋白。“天然FVIII”是如SEQIDNO.1(氨基酸1-2332)所示的全长人FVIII分子。B结构域跨越SEQIDNO1中的氨基酸741-1648
。
本发明的因子VIII分子可以是B结构域截短的因子FVIII分子,其中剩余结构域基本对应于SEQIDNO1中氨基酸编号1-740和1649-2332所示序列,尽管在残基1670-1684之间的vWF结合区内可能也有例如一个或多个改变。然而,本发明的B结构域截短的分子可与SEQIDNO1所示序列具有微小差异,意即剩余结构域(即3个A结构域和2个C结构域)与SEQIDNO1所示氨基酸序列(氨基酸1-740和1649-2332)可具有微小差异,例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸差异或约1%、2%、3%、4%或5%差异,这是因为可引入突变以降低例如vWF结合能力这一事实。此外,可能在分子的其它位置导入氨基酸修饰(取代、缺失等),以改变因子VIII与多种其它组分(例如LRP、多种受体、其它凝血因子、细胞表面)的结合能力,引入和/或消除糖基化位点等。
本发明的因子VIII分子具有因子VIII活性,意即以下能力:在凝血级联中以与FVIII功能类似或等同的方式起作用,通过与被激活的血小板上的FIXa相互作用而诱导FXa的形成,并支持血块的形成。该活性可通过本领域熟知的技术在体外评估,所述技术为例如凝血分析、内源凝血酶潜在性分析等。本发明的因子VIII分子具有FVIII活性,其为天然人FVIII活性的至少约10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、和100%或甚至超过100%。
B结构域:因子VIII中的B结构域跨越SEQIDNO1的氨基酸741-1648。B结构域在若干不同位点被切割,在循环血浆FVIII分子中产生大的异质性。高度糖基化的B结构域的准确功能尚未知晓。已经知道的是该结构域对于凝血级联中的FVIII活性而言并非必要。这种明显的功能缺乏得到以下事实支持:B结构域缺失的/截短的FVIII看来具有与在全长天然FVIII中所见的相同的体内性能。话虽如此,据显示B结构域可减少与细胞膜的缔合,至少在无血清条件下是如此。
B结构域截短的/缺失的因子VIII分子:将内源全长FVIII合成为单链前体分子。分泌之前,将前体切割成重链和轻链。可由2种不同策略产生重组B结构域缺失的FVIII。将无B结构域的重链以及轻链分别合成为两种不同多肽链(两链策略)或者将B结构域缺失的FVIII合成为单条前体多肽链(单链策略),其按照与全长FVIII前体相同的方式切割为重链和轻链。
在B结构域缺失的FVIII前体多肽中,重链和轻链部分通常被接头间隔开来。为了尽量减小在B结构域缺失的FVIII中引入免疫原性表位的风险,接头序列优选源自FVIIIB结构域。至少,接头必须包含蛋白酶识别位点,所述酶将B结构域缺失的FVIII前体多肽分离为重链和轻链。在全长FVIII的B结构域中,氨基酸1644-1648构成该识别位点。在B结构域缺失的FVIII激活时导致接头去除的凝血酶位点位于重链上。因此,接头的大小和氨基酸序列不大可能影响其经由凝血酶激活而从剩余FVIII分子上切除。B结构域的缺失对于FVIII的产生是有利的。然而,B结构域的部分可包括在接头中而不降低产率。B结构域对产率的负面效应并不归因于B结构域的任何特定尺寸或序列。
截短的B结构域可含有若干O-糖基化位点。然而,依据一个优选的实施方案,所述分子在截短的B结构域中包含仅1个、备选2、3或4个O联寡糖。
依据一个优选的实施方案,截短的B结构域包含仅1个可能的O-糖基化位点并且侧链例如PEG或白蛋白结合剂与该O-糖基化位点共价缀合。
可将在本发明的B结构域截短的分子中的O联寡糖连接到O-糖基化位点,所述位点通过重组方式和/或通过经由B结构域截短而将“隐藏的”O-糖基化位点暴露而人工产生。在这两种情况下,可通过设计B结构域截短的因子VIII的氨基酸序列并随后对所述氨基酸序列进行计算机(insilico)分析,预测截短的B结构域中O-糖基化位点的概率,从而制备所述分子。可在合适宿主细胞中合成有相对高概率具有所述糖基化位点的分子,然后分析糖基化模式并随后选择在截短的B结构域中具有O联糖基化的分子。
所述因子VIII分子也含有大量N联寡糖并且它们每个都可同样作为用于连接疏水性侧基的锚。
用于产生本发明的重组因子VIII融合蛋白的合适宿主细胞优选是哺乳动物来源的,以确保所述分子被糖基化。在实施本发明时,所述细胞是哺乳动物细胞,更优选已确立的哺乳动物细胞系,包括但不限于CHO、COS-1、幼仓鼠肾(BHK)和HEK293细胞系。其它合适的细胞系包括但不限于大鼠HepI、大鼠HepII、TCMK、人肺、DUKX细胞(CHO细胞系)。还可使用的是3T3细胞、Namalwa细胞、骨髓瘤和骨髓瘤与其它细胞的融合物。在某些实施方案中,所述细胞可以是突变的或重组的细胞,例如与其所来源的细胞类型相比表达在质量或数量上不同的酶谱的细胞,所述酶催化蛋白质的翻译后修饰(例如糖基化酶例如糖基转移酶和/或糖苷酶,或加工酶例如前肽)。DUKX细胞(CHO细胞系)是特别优选的。
目前优选的细胞是HEK293、COS、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、幼仓鼠肾(BHK)和骨髓瘤细胞,尤其是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
在wtFVIII分子中B结构域的长度为约908个氨基酸。在本发明分子中截短的B结构域的长度可在约10-约800个氨基酸的范围内变化,例如约10个氨基酸-约700个氨基酸,例如约12-500个氨基酸、12-400个氨基酸、12-300个氨基酸、12-200个氨基酸、15-100个氨基酸、15-75个氨基酸、15-50个氨基酸、15-45个氨基酸、20-45个氨基酸、20-40个氨基酸、或20-30个氨基酸。所述截短的B结构域可包含重链和/或轻链的片段和/或wtFVIII分子中不存在的人工导入序列。术语“B结构域截短的”和“B结构域缺失的”在本文中可互换使用。
改良的循环半衰期:与野生型因子VIII分子相比,本发明的分子具有改变的循环半衰期,优选增加的循环半衰期。循环半衰期优选增加至少10%,优选至少15%,优选至少20%,优选至少25%,优选至少30%,优选至少35%,优选至少40%,优选至少45%,优选至少50%,优选至少55%,优选至少60%,优选至少65%,优选至少70%,优选至少75%,优选至少80%,优选至少85%,优选至少90%,优选至少95%,优选至少100%,更优选至少125%,更优选至少150%,更优选至少175%,更优选至少200%,和最优选至少250%或300%。甚至更优选地,所述分子具有的循环半衰期增加至少400%,500%,600%,或甚至700%。
亲水性聚合物:本发明的侧基优选是非天然存在的亲水性聚合物,其包含至少一个非天然存在的聚合部分。在另一实例中,非天然存在的修饰基团是经修饰的碳水化合物。
示例性的本发明亲水性聚合物包括水溶性聚合物,其可以是直链或支链并且可包含一个或多个独立选择的聚合部分,例如聚(亚烷基二醇)及其衍生物。本发明的聚合修饰基团可包括水溶性聚合物,例如聚(乙二醇)及其衍生物(PEG,m-PEG)、聚(丙二醇)及其衍生物(PPG,m-PPG)等。
本发明水溶性聚合物的聚合物主链可以是聚(乙二醇)(即PEG)。本发明相关的术语PEG包括任何形式的聚(乙二醇),包括烷氧基PEG、双功能PEG、多臂PEG、分叉PEG、分支PEG、垂悬PEG(即具有挂在聚合物主链上的一个或多个官能团的PEG或相关聚合物)、或其中具有可降解键的PEG。
聚合物主链可以是直链或支链的。支链聚合物主链是本领域公知的。通常,支链聚合物具有中央分支核心部分和与该中央分支核心连接的多个直链聚合物链。常使用支链形式的PEG,其可通过将氧化乙烯加成到不同多元醇例如甘油、季戊四醇和山梨醇中而制备。中央分支部分也可源自若干氨基酸,例如赖氨酸或半胱氨酸。在一个实例中,支链聚(乙二醇)可以通式表示为R(-PEG-OH)m,其中R代表核心部分,例如甘油或季戊四醇,m代表臂的数目。多臂PEG分子,例如美国专利号5,932,462(其通过引用全部结合到本文中)中描述的那些,也可用作聚合物主链。
许多其它聚合物也适合本发明。非肽和水溶性的聚合物主链特别可用于本发明。合适聚合物的实例包括但不限于其它聚(亚烷基二醇)、例如聚(丙二醇)("PPG")、乙二醇和丙二醇等的共聚物、聚(氧乙基化多元醇)、聚(烯醇(olefmicalcohol))、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(羟丙基甲基丙烯酰胺)、聚([α]-羟基酸)、聚(乙烯醇)、聚磷腈、聚噁唑啉、聚(N-丙烯酰吗啉)(例如美国专利号5,629,384(其通过引用全部结合到本文中)中描述的),及其共聚物、三元共聚物和混合物。
尽管所述聚合物主链每条链的分子量可变化,但典型的范围为约100Da-约160,000Da,例如约5,000Da-约100,000Da。更具体地讲,每种本发明缀合的亲水性聚合物的大小可在以下范围内变化:约500Da-约80,000Da,例如约1000Da-约80,000Da;约2000Da-约70,000Da;约5000-约70,000Da;约5000-约60,000Da;约10,000-约70,000Da;约20,000-约60,000Da;约30,000-约60,000Da;约30,000-约50,000Da;或约30,000-约40,000Da。应当知道,这些大小代表估计值,而并非准确测量值。依据一个优选的实施方案,将本发明的分子与亲水性聚合物的异质群体缀合,所述聚合物为例如大小如下的PEG:例如10,000、40,000或80,000Da+/-约5000、约4000、约3000、约2000或约1000Da。
侧链/侧基:也可将本发明的因子VIII分子与并非亲水性聚合物的侧基缀合。本发明的侧链可以例如选自以下列出的一种或多种:脂肪酸及其衍生物(有时也称为“白蛋白结合剂”)、肽等。本发明的疏水性侧基优选是生物可降解的。此外,可有不止一个疏水性侧基与单个因子VIII分子缀合,例如有2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个。此外由此得出还可将本发明的因子VIII分子与一个或多个疏水性侧基以及一个或多个疏水性侧基、肽侧基等缀合。
因此,单个本发明的因子VIII分子可包含侧基,例如亲水性和疏水性/肽类侧基。然而,将该分子与不同类型侧基缀合伴随着另外的努力,因此这种解决方案可变得在实践中相对不实用。本发明的分子因此优选仅包含1种侧链(例如亲水性侧链/疏水性侧链)。
然而,迄今为止,并不认为因子VIII同疏水性侧基的缀合是同亲水性基团的缀合的具有吸引力的备选。一种解释可能是预期到需要采用使用有机溶剂的费力和/或苛刻的化学方法。另一种解释可能是预期通常相对小的疏水性分子不能有效地将缀合的(大)因子VIII分子与例如白蛋白结合并因此可能保护分子免于清除。
白蛋白结合剂缀合物
已知可通过使用白蛋白结合侧链来改善这种蛋白质的体内性能。这种侧链或白蛋白结合剂可在给予之前连接到所述蛋白质上并且例如可以在体内稳定所述蛋白质或改进或延长所述蛋白质的体内半衰期。
因此白蛋白结合剂可促进衍生物在血流中循环。白蛋白结合剂可具有延长或延迟与之结合的蛋白质的作用时间的效果,这是因为以下事实:肽衍生物和白蛋白的复合物仅缓慢崩解以释放活性药物成分。因此,优选的取代基或侧链作为整体可称为白蛋白结合部分。
白蛋白结合剂(白蛋白结合部分)可包含与白蛋白结合以及因此在血流中循环的延长特别相关的部分,所述部分因此可称为延长部分。延长部分优选位于白蛋白结合部分相比于其与肽的连接点的相反一端或附近。
在一个优选的实施方案中,白蛋白结合剂是或包含能够与白蛋白形成非共价复合物的侧链。白蛋白结合剂可与白蛋白非共价结合和/或可逆结合。白蛋白结合剂可与白蛋白特异性结合。根据下述方法可以清楚的是,白蛋白结合剂可结合到环糊精。白蛋白结合剂可与环糊精非共价结合和/或可逆结合。白蛋白结合剂可与环糊精特异性结合。
本文所述的白蛋白结合剂通常是疏水性基团。
白蛋白结合部分的其它部分,即介于延长部分和与肽的连接点之间的部分,可称为接头部分、接头、间隔物等。然而,这类接头的存在是任选的,因此白蛋白结合部分可与延长部分相同。
在特别的实施方案中,白蛋白结合部分和/或延长部分是亲脂的,和/或在生理pH(7.4)下带负电荷。
白蛋白结合部分和/或延长部分可通过缀合化学例如烷基化、酰化或形成酰胺而与肽的氨基共价连接;或通过例如酯化、烷基化、肟化而与羟基共价连接。
在一个优选的实施方案中,白蛋白结合部分和/或延长部分的活性酯在形成酰胺键的条件下与唾液酸残基或唾液酸衍生物的氨基共价连接(该过程称为酰化)。
除非另有说明,否则当谈及蛋白质酰化时,应当理解为氨基与糖蛋白上的唾液酸残基连接。
对于本发明的目的,术语“白蛋白结合部分”、“延长部分”和“接头”包括这些分子的未反应形式以及反应形式。是否意指一种形式或其它形式,根据其中使用术语的上下文是清楚的。
白蛋白结合部分可以是或可包括脂肪酸或脂肪二酸或其衍生物或其任一种。
术语“脂肪酸”是指具有4-28个碳原子、例如16个碳原子的脂族一羧酸。其优选是无支链的,和/或偶数个的,并且它可以是饱和或不饱和的。
术语“脂肪二酸”是指如上定义的、但在ω位置上具有额外羧酸基团的脂肪酸。因此,脂肪二酸是二羧酸。
命名按照本领域常用的命名,例如-COOH以及HOOC-,是指羧基;-C6H4-是亚苯基;-CO-以及-OC-,是指羰基(O=C<);和C6H5-O-是指苯氧基。
在一个优选的实施方案中,所述接头部分,如果存在的话,具有2-80个C原子、优选5-70个C原子。在额外优选的实施方案中,所述接头部分,如果存在的话,具有4-20个杂原子,优选2-40个杂原子,更优选3-30个杂原子。杂原子的特别优选的实例是N原子和O原子。H原子不是杂原子。
在另一个实施方案中,所述接头包含至少一个OEG分子、和/或至少一个谷氨酸残基,或相应的基团(OEG是指8-氨基-3,6-二氧杂辛酸,即以下基团:-NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CO-)。
在一个优选的实施方案中,所述接头部分包含通过酰胺键与唾液酸残基连接的二羧基残基。在优选的实例中,所述二羧基残基具有2-30个C原子,优选4-20个C原子,更优选4-10个C原子。在另外的优选实例中,所述二羧基残基具有0-10个杂原子,优选0-5个杂原子。
在另一个优选的实例中,所述接头部分包含同时含有氨基和远端羧基的基团,所述基团通过其远端羧基经由酰胺键与唾液酸残基连接。在一个优选的实施方案中,该基团是OEG基团。
氨基酸谷氨酸(Glu)包含2个羧酸基团。其γ-羧基优选用于与唾液酸残基或唾液酸衍生物的氨基、或与OEG分子的氨基(如果有的话)、或与另一Glu残基的氨基(如果有的话)形成酰胺键。Glu的氨基进而与延长部分的羧基、或与OEG分子的羧基(如果有的话)、或与另一Glu的γ-羧基(如果有的话)形成酰胺键。这种包含Glu的方式偶尔简称为“γ-Glu”。
不受理论的束缚,设想之所以将疏水性侧基与具有降低的vWF结合能力的因子VIII分子连接,而不是将这类侧基与具有正常vWF结合能力的因子VIII分子连接可能有利的原因在于:侧基的相对大小在大的因子VIII/vWF复合物中是相对小的。假定相对大的侧基在保护游离因子VIII不被清除中起更有效的作用。还假定FVIII的半衰期与vWF的相关。与vWF结合能力降低的FVIII分子最有可能具有暴露的清除表位,所述清除表位通常已被vWF保护。因而假定通过连接侧基,该“清除保护”可被恢复。在其它情况下,侧基例如抗体片段的连接可通过例如将所述分子与具有相对长循环半衰期的蛋白、细胞或血小板连接而起作用。
O-联寡糖:N-聚糖和O-聚糖都通过产生蛋白质的细胞而与该蛋白连接。当初生蛋白质从核糖体向内质网移动时,细胞的N-糖基化机构识别氨基酸链中的N-糖基化信号(N-X-S/T基序)并使之糖基化(Kiely等,1976;Glabe等,1980)。
同样,O-聚糖连接到氨基酸链中的特异性O-糖基化位点,但触发O-糖基化的基序与N-糖基化信号相比要异质得多,并且我们对氨基酸序列中O-糖基化位点的预测能力尚不充分(Julenius等,2004)。因此,人工O-糖基化位点的构建有一些不确定性。
疏水性侧基的连接:可使用化学方法进行因子FVIII分子与疏水性侧基的缀合。然而,使用酶促方法具有很多潜在优势。根据本发明优选的酶促方法,可经化学方法制备[疏水性延长基团]-唾液酸基-CMP底物。使用唾液酸转移酶,可经酶促方法将该底物转移到因子FVIII上存在的聚糖上。本发明的发明人已经出乎意料地证明无需添加任何有机溶剂就可进行这种酶促方法。使用有机溶剂有很多的不利条件,例如丧失生物活性、环境问题、确保完全除去有机溶剂所采取的额外步骤等。也有可能可避免加入环糊精,环糊精是一种去垢剂,也可造成生物功能的损失。在酶促缀合过程中,添加甘油,例如5-30%甘油,优选10-20%甘油,可能是有利的。甘油的存在似乎例如在冷冻/融解过程中稳定因子VIII分子,并且它还可防止形成因子VIII结晶。因此,在缀合过程完成之后,无需除去酶促缀合期间所存在的甘油。
唾液酸转移酶:唾液酸转移酶是将唾液酸转移到初生寡糖上的酶。每种唾液酸转移酶对特定的糖底物具有特异性。唾液酸转移酶将唾液酸添加到唾液酸化糖脂(神经节苷脂)的末端部分或添加到糖蛋白的N-联糖链或O-联糖链上。存在大约20种不同唾液酸转移酶,其可根据它们所作用的受体结构和它们所形成的糖键类型而区分。本发明优选的唾液酸转移酶是ST3Gal-I(对O-聚糖具有特异性)和ST3Gal-III(对N-聚糖具有特异性)。因此有可能通过例如选择特异性唾液酸转移酶和/或改造具有特定糖基化模式的因子VIII分子,对本发明的缀合的因子VIII分子的结构进行改造。
药物组合物:药物组合物在本文优选意指包括包含本发明因子VIIII分子的适于胃肠外给药用的组合物,例如即用型无菌含水组合物或可在例如水或含水缓冲液中重构的干燥的无菌组合物。本发明的组合物可包含多种药学上可接受的赋形剂、稳定剂等。
在这类组合物中的额外成分可包括润湿剂、乳化剂、抗氧化剂、填充剂、张力调节剂、螯合剂、金属离子、油性溶媒、蛋白质(例如人血清白蛋白、明胶或蛋白)和两性离子(例如氨基酸,例如甜菜碱、牛磺酸、精氨酸、甘氨酸、赖氨酸和组氨酸)。这类额外成分当然不应对本发明药物制剂的总体稳定性有不利影响。胃肠外给药可通过使用注射器任选笔样注射器经由皮下、肌内、腹膜内或静脉内注射而进行。或者,胃肠外给药可通过输注泵的方式而进行。进一步的选项是组合物,其可以是以鼻或肺部喷雾的形式给予FVIII化合物的溶液剂或混悬剂。作为再一个进一步的选项,含有本发明FVIII化合物的药物组合物也可适于透皮给药,例如通过无针注射或贴剂(任选离子电渗贴剂),或透黏膜给药例如口腔给药。
本文所用的术语“治疗”是指对有需要的任何人类或其它动物受试者的医学治疗。预期所述受试者已经历医师的体检,所述医师已经做出试验性或确定性诊断,表明使用所述特定治疗对所述人类或其它动物受试者的健康而言是有益的。所述治疗的时机和目的可依据受试者的健康现状而因不同个体而异。因此,所述治疗可以是预防性的、治标的、针对症状的和/或治愈性的。
第一方面,本发明涉及重组因子VIII分子,其中所述因子VIII分子是包含因子VIII分子和融合配偶体的融合蛋白。在第一实施方案中,所述融合配偶体置换了因子VIII分子的a3结构域。因此,因子FVIII的小的a3结构域可被融合配偶体全部或部分置换。在第二实施方案中,所述融合配偶体插入到因子VIII的B结构域中。B结构域可以是全长B结构域,但在一个优选的实施方案中,B结构域是显著截短的。因此在融合配偶体的N-末端和C-末端有至少3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸来自B结构域。在另一个优选的实施方案中,所述融合配偶体插入到或位于因子FVIII的C2结构域的C-末端。
在第三实施方案中,本发明的因子VIII分子与抗体结合分子例如Fc受体融合。抗体结合分子的实例列于下表中。在第四实施方案中,因子VIII分子与具有与人血清白蛋白结合的能力的分子融合。在另一个实施方案中,因子VIII与转铁蛋白融合。其实例也在下文提供。在第五实施方案中,因子VIII分子与具有与血小板结合的能力的分子融合,这类分子的具体实例同样在下文提供。在再一个实施方案中,因子VIII分子与具有与因子VIII清除受体结合的能力的分子融合。
在第六实施方案中,本发明的因子VIII分子具有降低的vWF结合能力。优选地,这类因子VIII分子在跨越SEQIDNO1的氨基酸1670-1684的区域内包含突变(氨基酸的取代、缺失或添加)。最优选地,这类因子VIII分子包含一个以下点突变:Y1680F、Y1680R、Y1680N、和E1682T、和Y1680C。
在第七实施方案中,本发明的分子与侧基缀合。该侧基可选自以下列出的一种或多种:亲水性聚合物、肽和疏水性侧基。优选地,侧基是PEG基团、脂肪酸衍生物或多肽。优选地,使用酶促方法将这类侧基连接到分子上,所述方法为例如WO0331464中所公开的技术,其中O-联聚糖和/或N-联聚糖用作接头。
本发明的另一方面涉及与融合配偶体融合的FVIII分子,其中所述融合配偶体置换因子VIII分子的A3结构域。
在一个实施方案中,所述融合配偶体是白蛋白。在另一个实施方案中,所述融合配偶体是Fc受体。在另一个实施方案中,所述Fc受体是FcγRI。在另一个实施方案中,所述融合配偶体是Fc结构域。在另一个实施方案中,所述Fc结构域是具有降低的效应子功能和/或增加的对新生儿Fc受体的亲和力的突变Fc结构域。在另一个实施方案中,所述融合蛋白与侧基缀合。在另一个实施方案中,所述侧基通过N-联聚糖和/或O-联聚糖连接到融合蛋白。在另一个实施方案中,所述侧基通过唾液酸连接到N-联聚糖和/或O-联聚糖。在另一个实施方案中,所述侧基选自以下列出的一种或多种:亲水性聚合物、肽和疏水性侧基。在另一个实施方案中,所述FVIII分子是B结构域截短的分子,其中B结构域包含SEQIDNO2所示的序列。在另一个实施方案中,所述融合蛋白在包含SEQIDNO2所示氨基酸序列的截短的B结构域中包含与O-联聚糖连接的侧基。在另一个实施方案中,因子VIII分子具有降低的vWF结合能力。在另一个实施方案中,具有降低的vWF结合能力的因子VIII分子包含选自以下列出的突变:Y1680F、Y1680R、Y1680N、和E1682T、和Y1680C。
本发明的另一方面涉及与融合配偶体融合的FVIII分子,其中所述融合配偶体插入到因子VIII的B结构域中。
在一个实施方案中,所述融合配偶体是白蛋白。在另一个实施方案中,所述融合配偶体是Fc受体。在另一个实施方案中,所述Fc受体是FcγRI。在另一个实施方案中,所述融合配偶体是Fc结构域。在另一个实施方案中,所述Fc结构域是具有降低的效应子功能和/或增加对的新生儿Fc受体的亲和力的突变Fc结构域。在另一个实施方案中,所述融合蛋白与侧基缀合。在另一个实施方案中,所述侧基通过N-联聚糖和/或O-联聚糖与融合蛋白连接。在另一个实施方案中,所述侧基通过唾液酸连接到N-联聚糖和/或O-联聚糖。在另一个实施方案中,所述侧基选自以下列出的一种或多种:亲水性聚合物、肽和疏水性侧基。在另一个实施方案中,所述FVIII分子是B结构域截短的分子,其中所述B结构域包含SEQIDNO2所示的序列。在另一个实施方案中,所述融合蛋白在包含SEQIDNO2所示氨基酸序列的截短的B结构域中包含与O-联聚糖连接的侧基。在另一个实施方案中,因子VIII分子具有降低的vWF结合能力。在另一个实施方案中,具有降低的vWF结合能力的因子VIII分子包含选自以下列出的突变:Y1680F、Y1680R、Y1680N、和E1682T、和Y1680C。
本发明的另一方面涉及与融合配偶体融合的FVIII分子,其中所述融合配偶体插入到因子FVIII的C2结构域的C-末端。
在一个实施方案中,所述融合配偶体是白蛋白。在另一个实施方案中,所述融合配偶体是Fc受体。在另一个实施方案中,所述Fc受体是FcγRI。在另一个实施方案中,所述融合配偶体是Fc结构域。在另一个实施方案中,所述Fc结构域是具有降低的效应子功能和/或增加的对新生儿Fc受体的亲和力的突变Fc结构域。在另一个实施方案中,所述融合蛋白与侧基缀合。在另一个实施方案中,所述侧基通过N-联聚糖和/或O-联聚糖连接到融合蛋白。在另一个实施方案中,所述侧基通过唾液酸连接到N-联聚糖和/或O-联聚糖。在另一个实施方案中,所述侧基选自以下列出的一种或多种:亲水性聚合物、肽和疏水性侧基。在另一个实施方案中,所述FVIII分子是B结构域截短的分子,其中所述B结构域包含SEQIDNO2所示的序列。在另一个实施方案中,所述融合蛋白在包含SEQIDNO2所示氨基酸序列的截短的B结构域中包含与O-联聚糖连接的侧基。在另一个实施方案中,因子VIII分子具有降低的vWF结合能力。在另一个实施方案中,具有降低的vWF结合能力的因子VIII分子包含选自以下列出的突变:Y1680F、Y1680R、Y1680N、和E1682T、和Y1680C。
另一方面涉及本发明分子的制备方法,其中所述方法包括在合适条件下温育编码所述分子的宿主细胞。因此,本发明也涉及包含编码本发明分子的核酸序列的核酸分子以及表达载体和宿主细胞。经由这类方法获取的或可经由这类方法获取的分子同样是本发明的一个方面。
另一方面涉及本发明分子作为药物的用途。
另一方面涉及本发明分子用于治疗血友病、优选A型血友病的用途。
另一方面涉及包含本发明的分子和任选一种或多种药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
本发明的另一方面涉及血友病的治疗方法,所述方法包括给予有需要的患者治疗有效量的本发明分子。
实施例
实施例1
FVIII构架和融合配偶体
本发明的融合蛋白由与来自另一蛋白的多肽(融合配偶体)连接的FVIII蛋白(FVIII部分)组成。
融合蛋白的FVIII部分可以是具有FVIII活性的任何蛋白。FVIII部分可以是B结构域缺失的/截短的(BDD)FVIII蛋白,其中FVIIIB结构域部分已从该蛋白上切除。可构成融合蛋白的FVIII部分的FVIII构架的非限制性实例见表1。F8-500是一种BDD人FVIII蛋白。从N-端开始,F8-500由FVIII信号肽(氨基酸-19至-1)、后接无B结构域的FVIIIHC(氨基酸1-740)、21个氨基酸的接头(SFSQNSRHPSQNPPVLKRHQR)(SEQIDNO2)和FVIIILC(野生型人FVIII的氨基酸1649-2332)组成。21个氨基酸的接头序列源自FVIII的B结构域并由全长野生型人FVIII的氨基酸741-750和1638-1648组成。
F8-500-Δa3由无a3区的F8-500组成。在F8-500-Δa3中,将野生型人FVIII的氨基酸1647-1687从F8-500中除去。因此,氨基酸1645-1648处的弗林蛋白酶位点已被破坏。然而,合并的弗林蛋白酶和凝血酶位点是由在F8-500-Δa中的R1645-H1646-P1688-R1689氨基酸段所产生的。a3区对于FVIII与vWF的结合而言是重要的并因此与野生型FVIII相比,降低了F8-500-Δa3对vWF的亲和力。
F8-500-His由具有插入到F8-500接头的His标签的F8-500组成。因此F8-500-His的接头序列是SFSQNSRHPSHHHHHHSQNPPVLKRHQR(SEQIDNO3)。
F8-500-Δa3-His由无a3区、但具有插入到F8-500接头的His标签的F8-500组成。因此,在F8-500-Δa3-His中,野生型人FVIII氨基酸1647-1687已从F8-500中除去并且接头序列是SFSQNSRHPSHHHHHHSQNPPVLKRHQR(SEQIDNO4)。
F8-500-Y1680F和F8-500-Y1680C由F8-500组成,其中全长野生型人FVIII的氨基酸1680已从酪氨酸分别变为苯丙氨酸和半胱氨酸。这两个氨基酸置换降低了FVIII对vWF的亲和力。此外,Y1680C氨基酸置换引入游离半胱氨酸,其可用作将延长部分与融合蛋白缀合的柄(handle)。
可将融合配偶体与融合蛋白的FVIII部分的若干位置连接。用于连接融合配偶体的FVIII上的位置的非限制性实例是在介于FVIIIHC和LC之间的B结构域或B结构域衍生的接头中的位置,在a3的位置,和在FVIIILC的C-端。
实施例2
编码FVIII构架和融合蛋白的表达载体的构建
FVIII和融合配偶体间的融合都涉及用于扩增融合配偶体的PCR。将限制位点加入到所用的PCR引物的末端。限制酶用于克隆融合配偶体cDNA或合成DNA为FVIIIcDNA。
在F8-500的B结构域中的融合发生在aa750和aa1638之间。在B结构域内或其侧翼的限制位点AvrII、NruI、AgeI和MluI用于插入编码融合配偶体的DNA。
对于在FVIII轻链羧基端的融合,修饰F8-500编码构建体。通过定点诱变消除内部BamHI位点(aa604-606)并将编码柔性(GGGS)6接头的DNA插入到编码区3’。将一个新的BamHI位点引入编码接头的DNA的3’端,以便于将C-端融合配偶体克隆到BamHI位点和NotI位点之间。然后,插入融合配偶体DNA。来自该构建体的融合蛋白在表2-12中称为F8-500-C2-连接的-(GGGS)6-X。类似于(GGGS)6接头,将最小GS-接头(BamHI限制位点)插入到F8-500编码区3'端。BamHI限制位点(GGATCC)形成GS(甘氨酸-丝氨酸)的两个密码子。来自该构建体的融合蛋白在表2-12中称为F8-500-C2-连接的-GS-X。没有任何接头的情况下与F8-500的C-端的融合如下进行:通过用延伸引物PCR扩增融合物,所述延伸引物在5'端带有F8-500编码区最后的109bp和在PCR产物的3'端具有NotI限制位点。XbaI限制位点存在于离F8-500终止密码子的104-109bp处。XbaI限制酶和NotI限制酶用于克隆无接头的融合配偶体。来自后面这些构建体的融合蛋白在表2-12中称为F8-500-C2-连接的-X。
为了在a3位置插入融合配偶体编码DNA并由此在编码蛋白中用融合配偶体置换a3,将SacII限制位点引入a3编码区的3’。因此,融合配偶体编码DNA可通过插入AgeI位点和SacII位点之间或者AvrII位点和SacII位点之间而引入。
hFc(SEQIDNO5)
mFc(SEQIDNO6)
人血清白蛋白(HSA)(SEQIDNO7)
转铁蛋白(SEQIDNO8)
hFcγRI(CD64)(SEQIDNO9)
FcRn(SEQIDNO10)
FcRn-H166K(SEQIDNO11)
LRP-CR5-6(SEQIDNO12)
LRP-CR6-7(SEQIDNO13)
LRP-CR6(SEQIDNO14)
SC抗GPIIIa-1-HC-LC(SEQIDNO15)
接头-SC抗GPIIIa-1-HC-LC(SEQIDNO16)
SC抗GPIIIa-2-HC-LC(SEQIDNO17)
SC抗GPIIIa-2-LC-HC(SEQIDNO18)
ABD035(SEQIDNO19)
序列A(SEQIDNO20)
ELP80(SEQIDNO21)
额外的a3(SEQIDNO22)
GHBP(SEQIDNO23)
FIX298-342(SEQIDNO24)
FIX47-125(SEQIDNO25)
vWF1-272(SEQIDNO26)
vWF1-1390(SEQIDNO27)
vWF497-716-R545A(SEQIDNO28)
vWF结合蛋白(SEQIDNO29)
hCGC-端(SEQIDNO30)
F10AP(SEQIDNO31)
。
实施例3
FVIII构架和融合蛋白的瞬时表达
密度为0.9-1.1x106的HKB11细胞用质粒0.7mg/l和转染剂293Fectin(Invitrogen)1.4ml/l的混合物转染。通过将质粒和转染剂分别稀释在OPTIMEM(Invitrogen)中,混合这两种溶液,并将混合物在室温下温育20分钟,来制备转染混合物。将混合物加入到细胞悬液中并将悬液在振荡器培养箱中在36.5℃和5%CO2中温育5天。将细胞培养收获物在0.22μm膜滤器上过滤。按照实施例5所述,从细胞培养收获物中纯化FVIII构架和融合蛋白。
实施例4
表达融合蛋白的稳定的细胞
适应无血清的CHO-DUKX-B11细胞用编码F8-500-白蛋白-Δa3融合蛋白的表达质粒转染。转染后的细胞用二氢叶酸还原酶系统选择并通过有限稀释而克隆。通过ELISA和显色活性测定来筛选产生FVIII的克隆。选择克隆JsJH009用于扩大规模(upscaling)。将细胞移至生物反应器。按照实施例5所述,从细胞培养收获物中纯化F8-500-白蛋白-Δa3融合物。
实施例5
FVIII构架和融合蛋白的纯化
给柱填装树脂VIIISelect(GEHealthcare),其尺寸为:直径1.6cm和床高4cm(8mL);并将柱用20mM咪唑+10mMCaCl2+0.01%吐温80(Tween80)+250mMNaCl,pH7.3以500cm/h平衡。将按照实施例3所述制备的培养物滤液上柱,然后先用平衡缓冲液洗涤柱子,再用20mM咪唑+10mMCaCl2+0.01%吐温80+1.5MNaCl,pH7.3洗涤柱子。结合的FVIII用20mM咪唑+10mMCaCl2+0.01%吐温80+2.5MNaCl+6.5M丙二醇,pH7.3,以90cm/h等度洗脱。合并含有FVIII的流分并用20mM咪唑+10mMCaCl2+0.01%吐温80,pH7.31:10稀释,然后上样到填装有F25-Sepharose的柱上(Thim等,Haemophilia,2009)。柱尺寸为直径1.6cm和床高2cm,柱体积4mL。使用前,柱子用20mM咪唑+10mMCaCl2+0.01%吐温80+150mMNaCl+1M甘油,pH7.3,以180cm/h平衡。上样后,先用平衡缓冲液洗涤柱子,再用20mM咪唑+10mMCaCl2+0.01%吐温80+650mMNaCl,pH7.3洗涤柱子。结合的FVIII用20mM咪唑+10mMCaCl2+0.01%吐温80+2.5MNaCl+50%(v/v)乙二醇,pH7.3,以30cm/h等度洗脱。合并含有FVIII的流分并用20mM咪唑+10mMCaCl2+0.01%吐温80,pH7.31:15稀释,除了缺失a3结构域的FVIII-变体之外,其在相同缓冲液中1:45稀释。将稀释的合并液上样到填装有Poros50HQ(PerSeptiveBiosystem)的柱子上,柱尺寸为直径0.5cm和床高5cm,柱体积1mL。使用前,柱子用20mM咪唑+10mMCaCl2+0.01%吐温80+50mMNaCl+1M甘油,pH7.3,以300cm/h平衡。柱子用平衡缓冲液洗涤,然后用从平衡缓冲液至以下溶液的在5个柱体积内的线性梯度洗脱:20mM咪唑+10mMCaCl2+0.01%吐温80+1MNaCl+1M甘油,pH7.3。合并含有FVIII的流分并将合并液贮存于-80°直至使用。典型纯化的收率表见表11。
基本上如上所述地纯化具有HIS-标签的FVIII变体,然而第二纯化步骤(F25-sepharose)替换为装有2个柱体积1MNiSO4的螯合SepharoseFF(GEHealtcare)。柱尺寸为直径0.5cm和床高5cm,柱体积1mL。使用之前,柱子用30mM咪唑+10mMCaCl2+0.01%吐温80+1.5MNaCl,pH7.3,以180cm/h的流速平衡。上样后,柱子用30倍柱体积的平衡缓冲液洗涤,然后用在5个柱体积内到250mM咪唑+10mMCaCl2+0.01%吐温80+1.5MNaCl,pH7.3的线性梯度洗脱。合并含有FVIII的流分并用20mM咪唑+10mMCaCl2+0.01%吐温80,pH7.31:30稀释。最终的纯化步骤(Poros50HQ)如上所述地进行。
实施例6
通过显色测定而测量的细胞培养收获物中的FVIII:C
在显色FVIII测定中,使用CoatestSP试剂(Chromogenix)如下评价细胞培养收获物(上清液部分)中的rFVIII化合物的FVIII活性(FVIII:C):rFVIII样品和FVIII标准品(Coagulationreference,Technoclone)在Coatest测定缓冲液(50mMTris,150mMNaCl,1%BSA,pH7.3,含防腐剂)中稀释。将50μl样品、标准品和缓冲液阴性对照加入到96孔微量滴定板(SpectraplatesMB,PerkinElmer)。所有样品都以1:100、1:400、1:1600和1:6400稀释再测定。将来自CoatestSP试剂盒的因子IXa/因子X试剂、磷脂试剂和CaCl2按照5:1:3(体积比)混合,并取75μl加入到孔中。在室温下温育15min之后,加入50μl因子Xa底物S-2765/凝血酶抑制剂I-2581混合物并将反应物在室温下温育5min,然后加入25μl1M柠檬酸,pH3。在Envision微量滴定板读板器(PerkinElmer)上,测定在405nm处吸光度和在用作参考波长的620nm处的吸光度。从所有样品中减去阴性对照值并通过吸光度值对FVIII浓度作图的线性回归来制作标定曲线。通过样品活性除以经ELISA测得的蛋白质浓度而计算比活。结果见表1-10。
实施例7
FVIII构架和融合蛋白的纯化
融化溶于由以下成分组成的缓冲液的按照实施例5所述纯化的F8-500-白蛋白-Δa3(13mg,6.5mg/ml):含咪唑(20mM)、氯化钙(10mM)、吐温80(0.02%)、氯化钠(500mM)和甘油(1M)的水(pH7.3)。
加入9微克来自产脲节杆菌(Arthrobacterureafaciens)的唾液酸酶(1.9U,在7微升缓冲液中)、280微克唾液酸转移酶(在112微升中,His-ST3Gal-I,2.5mg/ml,EC2.4.99.4,WO2006102652)和59毫克胞苷一磷酸N-5’-PEG-甘油-神经氨酸(在290微升中,参见WO2007/056191),并用HCl(1M)将pH调节到6.9。终体积为2.7mL。然后让所得混合物在22-25摄氏度(室温)下静置22小时。
糖聚乙二醇化(glycopegylation)之后,混合物用缓冲液A(含Tris(25mM)、氯化钙(10mM)、吐温80(0.02%)和甘油(1M)的水,pH7.5)稀释至50ml。将稀释混合物上样到Source30Q柱(GEHealthcareBio-Sciences,Hiller?d,Denmark,柱体积1.1mL)。然后用缓冲液A(4倍柱体积)洗涤固定化材料,再用0-100%缓冲液B(含Tris(25mM)、氯化钙(10mM)、吐温80(0.02%)、氯化钠(0.7M)和甘油(1M)的水,pH7.5)的梯度从柱中洗脱。梯度:8CV5-10%缓冲液B,13.5CV10-100%缓冲液B和3CV100%缓冲液B。
将早期洗脱的2.5mL峰流分与1.2毫克胞苷一磷酸N-5’乙酰基-神经氨酸(在12微升中)和62微克唾液酸转移酶(在52微升中,MBP-SBD-ST3Gal-III,EC2.4.99.6,参见WO2006102652)混合。
让所得混合物在22-25摄氏度(室温)下静置22小时,然后上样到Superdex200pg柱(GEHealthcareBio-Sciences,Hiller?d,Denmark;柱体积120ml)。然后用由以下成分组成的缓冲液洗脱产物:含L-组氨酸(1.5g/L)、L-甲硫氨酸(55mg/L)、氯化钙(250mg/L)、吐温80(0.1g/L)、氯化钠(18g/L)和蔗糖(1.5g/L)的水,pH6.9。分离并合并最初的含产物的流分(12mL);产物浓度为大约0.06mg/mL。
最终,通过在AmiconCentriprepYM-50(截止值:50kDa)中离心而浓缩产物。浓缩后体积为1.7mL,含有0.35mg/mL糖聚乙二醇化的F8-500-白蛋白-Δa3(纯度>90%)。该化合物在表12中称为40K-PEG-O-F8-500-白蛋白-Δa3。
实施例8
通过显色测定而测量的纯化样品中的FVIII:C
如下在显色FVIII测定中,使用CoatestSP试剂(Chromogenix)评价纯化rFVIII化合物(按照实施例5所公开的方法而分离)的FVIII活性(FVIII:C):rFVIII样品和FVIII标准品(例如根据NIBSC的第7届国际FVIII标准品而标定的纯化野生型rFVIII)在Coatest测定缓冲液(50mMTris,150mMNaCl,1%BSA,pH7.3,含防腐剂)中稀释。将50μl样品、标准品和缓冲液阴性对照一式两份加入到96孔微量滴定板(Nunc)中。将来自CoatestSP试剂盒的因子IXa/因子X试剂、磷脂试剂和CaCl2按照5:1:3(体积比)混合,并取75μl加入到孔中。在室温下温育15min之后,加入50μl因子Xa底物S-2765/凝血酶抑制剂I-2581混合物并将反应物在室温下温育10min,然后加入25μl1M柠檬酸,pH3。在Spectramax微量滴定板读板器(MolecularDevices)上,测定在415nm处吸光度和在用作参考波长的620nm处的吸光度。从所有样品中减去阴性对照值并通过吸光度值对FVIII浓度作图的线性回归来制作标定曲线。通过样品活性除以经HPLC测得的蛋白质浓度而计算比活。对于HPLC,通过对在对应于轻链的色谱图中的峰下面积进行积分而求出样品浓度,并与野生型rFVIII的平行分析中同样的峰的面积进行比较,其中通过氨基酸分析测定浓度。结果见表1-10。
实施例9
通过一步法凝血测定而测量的纯化样品中的FVIII:C
如下在一步法FVIII凝血测定中进一步评价rFVIII化合物的FVIII:C:rFVIII样品和FVIII标准品(例如根据NIBSC的第7届国际FVIII标准品而标定的纯化野生型rFVIII)在HBS/BSA缓冲液(20mMhepes、150mMNaCl、pH7.4,含1%BSA)中稀释至大约10U/ml,再在含VWF而缺乏FVIII的血浆(DadeBehring)中稀释10倍。样品随后在HBS/BSA缓冲液中稀释。在ACL300R或ACL5000仪器(InstrumentationLaboratory)上,使用单因子程序,测定APTT凝血时间(clottime)。含VWF而缺乏FVIII的血浆(DadeBehring)用作测定血浆,且SynthASil,(HemosILTM,InstrumentationLaboratory)用作aPTT试剂。在凝血仪器中,在37℃,将稀释的样品或标准品与缺乏FVIII的血浆、aPTT试剂混合。加入(assed)氯化钙并用浊度确定血块形成的时间。根据FVIII标准品稀释液的血块形成时间的标准曲线来计算样品中的FVIII:C。结果见表1-10。
实施例10
在FVIII缺陷型和VWF缺陷型小鼠中FVIII构架和融合蛋白的药代动力学
在FVIII缺陷型小鼠(具有C57Bl/6背景的FVIII外显子16敲出(KO)小鼠,在TaconicM&B繁育)或在vWF缺陷型小鼠(具有C57Bl/6背景的vWF外显子4+5KO小鼠,在CharlesRiver,Germany繁育)中评价rFVIII变体的药代动力学。vWF-KO小鼠具有13%的正常FVIII:C(参见实施例6),而FVIII-KO小鼠没有可检测的FVIII:C。使用近似体重为25克,年龄范围在16-28周龄的雄性和雌性的混合群体(大约1:1)。小鼠在尾静脉接受rFVIII(280IU/kg)的单次静脉注射。在给药后直到64小时的时间点,使用无包被毛细玻璃管,从眼窝丛处采血。每只小鼠采3份样品,每一时间点采2-4份样品。用柠檬酸钠立即稳定血液并在4倍体积FVIIICoatestSP缓冲液(参见实施例6)中稀释,然后在4000×g离心5分钟。将得自稀释血液的血浆在干冰上冷冻并保存于-80℃。按照实施例6所述,在显色测定中检测FVIII:C。通过无房室(non-compartmental)法(NCA),使用WinNonlinPro4.1版软件,进行药代动力学分析。结果见表12。用融合蛋白的半衰期除以无融合配偶体的FVIII构架的半衰期,求出融合蛋白的延长倍数。
实施例11
与血小板结合的融合蛋白的分析
可通过流式细胞术测定融合蛋白的血小板结合。可纯化外周血血小板,或可使用全血。血小板可被激活或静止。将血小板与融合蛋白温育15-30min。融合蛋白可直接用荧光团标记或用荧光标记的第二抗体检测。
可加入不干扰融合蛋白结合的荧光标记的血小板特异性抗体,以评价与融合蛋白结合的颗粒是否真的是血小板。温育之后,洗涤细胞以除去融合蛋白,然后在流式细胞仪上分析样品。流式细胞仪检测未标记的细胞和与细胞结合的荧光标记的分子,并且因此可用于特异性地分析融合蛋白与血小板(或其它细胞)结合的程度。
可例如通过加入过量的未标记抗体(当使用直接标记的融合蛋白时),评价结合特异性。可例如通过加入过量的膜联蛋白V或FVIII,评价FVIII部分与血小板的结合。
可如下评价通过静止血小板对融合蛋白的内在化:例如通过将血小板与直接标记的融合蛋白一起温育,再与抗体一起温育,所述抗体猝灭来自表面结合(即非内在化的)融合蛋白的信号。然后仅内在化的融合蛋白才可被流式细胞术检测到。可假定被激活的血小板将会在血块形成部位释放内在化融合蛋白。
实施例12
在GPIIIa转基因小鼠中GPIIIa靶向的融合蛋白的药代动力学
GPIIIa靶向的融合蛋白与血小板上的人GPIIb/IIIa(整联蛋白a2b3)受体结合,但它不能识别鼠GPIIb/IIIa,这防止使用野生型小鼠用于药代动力学分析。可在表达人GPIIIa的转基因小鼠中分析GPIIIa靶向的融合蛋白的药代动力学特性,所述人GPIIIa与鼠GPIIb关联,这使融合蛋白能够与该受体结合。将融合蛋白经静脉内注射到GPIIIa转基因小鼠,并在注射之后的不同时间点(例如0.5、24、72、288小时)采血。可通过ELISA的方式定量测定注射的融合蛋白(游离的和/或与血小板结合的),或可将融合蛋白放射性标记或荧光标记并检测。
表1.可构成融合蛋白FVIII部分的BDDFVIII构架
*显色测定/凝血测定
**在细胞培养收获物中测定(高值可代表ELISA检测不良)
表2.与FcRn相互作用的融合蛋白
*显色测定/凝血测定
**在细胞培养收获物中测定(高的值可代表ELISA检测不良)
表3.与免疫球蛋白相互作用的融合蛋白
*显色测定/凝血测定
**在细胞培养收获物中测定(高的值可代表ELISA检测不良)
表4.具有降低与清除受体的相互作用的能力的融合蛋白
*显色测定/凝血测定
**在细胞培养收获物中测定(高的值可代表ELISA检测不良)
表5.与血小板结合的融合蛋白
*显色测定/凝血测定
**在细胞培养收获物中测定(高的值可代表ELISA检测不良)
表6.与血清白蛋白相互作用的融合蛋白
*显色测定/凝血测定
**在细胞培养收获物中测定(高的值可代表ELISA检测不良)
表7.保护分子避免清除受体的融合蛋白
*显色测定/凝血测定
**在细胞培养收获物中测定(高的值可代表ELISA检测不良)
表8.具有经调节的vWF亲和力的融合蛋白
*显色测定/凝血测定
**在细胞培养收获物中测定(高的值可代表ELISA检测不良)
表9.其它融合蛋白
*显色测定/凝血测定
**在细胞培养收获物中测定(高的值可代表ELISA检测不良)
表10.具有经调节的脂质亲和力的融合蛋白
*显色测定/凝血测定
**在细胞培养收获物中测定(高的值可代表ELISA检测不良)
表11.实施例5所述的纯化过程的典型收率
表12.FVIII构架和融合蛋白在FVIII缺陷型或vWF缺陷型小鼠中的体内半衰期
*显色测定/ELISA。
Claims (11)
1.一种与融合配偶体融合的FVIII分子,其中所述融合配偶体全部或部分置换因子VIII分子的a3区,所述FVIII分子序列如SEQIDNO:1所示,其中,当融合配体部分置换a3区域时,所述因子VIII分子在跨越SEQIDNO:1的氨基酸1670-1684的区域内仅包含突变Y1680F或Y1680C,且其中所述突变调节FVIII分子与vWF的亲和力。
2.权利要求1的分子,其中所述融合配偶体是白蛋白。
3.权利要求2的分子,其中所述分子与侧基缀合。
4.权利要求1的分子,其中所述因子VIII分子与Fc受体融合。
5.权利要求4的分子,其中所述Fc受体是FcγRI。
6.权利要求1-5中任一项的分子,其中所述因子VIII分子具有降低的vWF结合能力。
7.权利要求1-5中任一项的分子,其中所述FVIII融合蛋白与侧基缀合。
8.权利要求7的分子,其中所述侧基选自以下列出的一种或多种:亲水性聚合物、肽和疏水性侧基。
9.权利要求1-8中任一项的分子的制备方法,其中所述方法包括在合适条件下温育包含编码所述分子的核酸序列的宿主细胞。
10.权利要求1-8中任一项的分子在制备用于治疗血友病的药物中的用途。
11.一种包含权利要求1-8中任一项的分子的药物组合物。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201510524808.4A CN105153313A (zh) | 2010-02-16 | 2011-02-10 | 因子viii融合蛋白 |
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP10153715.7 | 2010-02-16 | ||
EP10153715 | 2010-02-16 | ||
US30617710P | 2010-02-19 | 2010-02-19 | |
US61/306177 | 2010-02-19 | ||
PCT/EP2011/051959 WO2011101284A1 (en) | 2010-02-16 | 2011-02-10 | Factor viii fusion protein |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201510524808.4A Division CN105153313A (zh) | 2010-02-16 | 2011-02-10 | 因子viii融合蛋白 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN102770450A CN102770450A (zh) | 2012-11-07 |
CN102770450B true CN102770450B (zh) | 2015-12-02 |
Family
ID=42244627
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201510524808.4A Withdrawn CN105153313A (zh) | 2010-02-16 | 2011-02-10 | 因子viii融合蛋白 |
CN201180009864.4A Expired - Fee Related CN102770450B (zh) | 2010-02-16 | 2011-02-10 | 因子viii融合蛋白 |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201510524808.4A Withdrawn CN105153313A (zh) | 2010-02-16 | 2011-02-10 | 因子viii融合蛋白 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US9493543B2 (zh) |
EP (2) | EP2536754A1 (zh) |
JP (3) | JP2013519699A (zh) |
CN (2) | CN105153313A (zh) |
WO (1) | WO2011101284A1 (zh) |
Families Citing this family (42)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2011028228A1 (en) | 2009-08-24 | 2011-03-10 | Amunix Operating Inc. | Coagulation factor vii compositions and methods of making and using same |
WO2011075185A1 (en) | 2009-12-18 | 2011-06-23 | Oligasis | Targeted drug phosphorylcholine polymer conjugates |
CN105524164A (zh) * | 2010-02-16 | 2016-04-27 | 诺沃—诺迪斯克有限公司 | 具有降低的vwf结合的因子viii分子 |
CA2863328A1 (en) * | 2012-01-12 | 2013-07-18 | Biogen Idec Ma Inc. | Chimeric factor viii polypeptides and uses thereof |
SI3564260T1 (sl) | 2012-02-15 | 2023-02-28 | Bioverativ Therapeutics Inc. | Sestavki faktorja VIII in postopki njegove izdelave in uporabe |
EP2822577B1 (en) | 2012-02-15 | 2019-02-06 | Bioverativ Therapeutics Inc. | Recombinant factor viii proteins |
US20150080309A1 (en) | 2012-04-24 | 2015-03-19 | Nova Nordisk A/S | Compounds Suitable for Treatment of Haemophilia |
US20150045303A1 (en) | 2012-04-24 | 2015-02-12 | Novo Nordisk A/S | Pharmaceutical Composition Suitable for Treatment of Haemophilia |
SG10201913893XA (en) | 2012-07-11 | 2020-03-30 | Bioverativ Therapeutics Inc | Factor viii complex with xten and von willebrand factor protein, and uses thereof |
WO2014176311A1 (en) | 2013-04-23 | 2014-10-30 | President And Fellows Of Harvard College | Genetic reprogramming of bacterial biofilms |
WO2015023891A2 (en) | 2013-08-14 | 2015-02-19 | Biogen Idec Ma Inc. | Factor viii-xten fusions and uses thereof |
WO2015035342A2 (en) | 2013-09-08 | 2015-03-12 | Oligasis Llc | Factor viii zwitterionic polymer conjugates |
SG10201913697UA (en) | 2014-01-10 | 2020-03-30 | Bioverativ Therapeutics Inc | Factor viii chimeric proteins and uses thereof |
WO2015132724A1 (en) * | 2014-03-05 | 2015-09-11 | Pfizer Inc. | Improved muteins of clotting factor viii |
US9840553B2 (en) | 2014-06-28 | 2017-12-12 | Kodiak Sciences Inc. | Dual PDGF/VEGF antagonists |
EP3177317B1 (en) | 2014-08-04 | 2020-03-18 | CSL Limited | Factor viii formulation |
CN107208076A (zh) | 2014-10-17 | 2017-09-26 | 科达制药 | 丁酰胆碱酯酶两性离子聚合物缀合物 |
KR20170125941A (ko) | 2015-03-06 | 2017-11-15 | 체에스엘 베링 리컴비넌트 퍼실리티 아게 | 개선된 반감기를 갖는 변형된 폰 빌레브란트 인자 |
WO2016164422A2 (en) * | 2015-04-06 | 2016-10-13 | President And Fellows Of Harvard College | Biosynthetic amyloid-based materials displaying functional protein sequences |
WO2016198521A1 (en) * | 2015-06-10 | 2016-12-15 | Novo Nordisk A/S | Fviii fusion proteins |
CN104926946B (zh) * | 2015-07-13 | 2021-09-17 | 中国科学院广州生物医药与健康研究院 | 具有延长体内半衰期的adamts13-mdtcs融合蛋白及其应用 |
MX2018001497A (es) | 2015-08-03 | 2018-05-15 | Bioverativ Therapeutics Inc | Proteinas de fusion de factor ix y metodos para producirlas y usarlas. |
EP3334452A4 (en) | 2015-08-12 | 2019-04-17 | Cell Machines, Inc. | METHODS AND COMPOSITIONS RELATING TO LONG LIFE COAGULATION COMPLEXES |
GB201520021D0 (en) * | 2015-11-13 | 2015-12-30 | Asterion Ltd | Fusion polypeptide |
EP3397276A4 (en) | 2015-12-30 | 2019-12-18 | Kodiak Sciences Inc. | ANTIBODIES AND CONJUGATES THEREOF |
US11098133B2 (en) | 2016-05-19 | 2021-08-24 | President And Fellows Of Harvard College | Methods of making gels and films using curli nanofibers |
CN106279437B (zh) | 2016-08-19 | 2017-10-31 | 安源医药科技(上海)有限公司 | 高糖基化人凝血因子viii融合蛋白及其制备方法与用途 |
EP3502143A4 (en) | 2016-08-19 | 2020-07-15 | Ampsource Biopharma Shanghai Inc. | BINDING PEPTIDE FOR THE CONSTRUCTION OF A FUSION PROTEIN |
CN107759694B (zh) | 2016-08-19 | 2023-01-13 | 安源医药科技(上海)有限公司 | 双特异性抗体及其制备方法与用途 |
CN108623695B (zh) * | 2017-03-24 | 2022-03-15 | 中国科学院过程工程研究所 | 一种白蛋白结合肽-人睫状神经营养因子融合蛋白及其制备方法和应用 |
CA3059938A1 (en) | 2017-04-14 | 2018-10-18 | Kodiak Sciences Inc. | Complement factor d antagonist antibodies and conjugates thereof |
GB201706781D0 (en) | 2017-04-28 | 2017-06-14 | Univ Sheffield | Parathyroid hormone fusion polypeptide |
WO2019219049A1 (zh) * | 2018-05-18 | 2019-11-21 | 北京辅仁瑞辉生物医药研究院有限公司 | 改进的fviii融合蛋白及其应用 |
WO2019219048A1 (zh) * | 2018-05-18 | 2019-11-21 | 北京辅仁瑞辉生物医药研究院有限公司 | 具有延长半衰期的融合多肽缀合物 |
CN110950964B (zh) * | 2018-09-26 | 2021-06-18 | 安源医药科技(上海)有限公司 | 突变型单链人凝血因子viii融合蛋白及其制备方法与用途 |
CN114072420A (zh) | 2019-07-04 | 2022-02-18 | 康诺贝林伦瑙有限公司 | 用于增加凝血因子viii的体外稳定性的截短的血管性血友病因子(vwf) |
CN114391024A (zh) | 2019-09-02 | 2022-04-22 | 生物测试股份公司 | 具有增加的半衰期的因子viii蛋白 |
EP3785726A1 (en) | 2019-09-02 | 2021-03-03 | Biotest AG | Factor viii protein with increased half-life |
CN114786731A (zh) | 2019-10-10 | 2022-07-22 | 科达制药股份有限公司 | 治疗眼部病症的方法 |
WO2021094344A1 (en) | 2019-11-11 | 2021-05-20 | CSL Behring Lengnau AG | Polypeptides for inducing tolerance to factor viii |
CN114901671B (zh) * | 2020-01-20 | 2024-02-20 | 上海药明生物技术有限公司 | 用于亲和层析的新的清洗缓冲溶液 |
CN117337307A (zh) * | 2022-05-25 | 2024-01-02 | 江苏晟斯生物制药有限公司 | 具有延长的半衰期的fviii融合蛋白缀合物及其应用 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2008077616A1 (en) * | 2006-12-22 | 2008-07-03 | Csl Behring Gmbh | Modified coagulation factors with prolonged in vivo half-life |
CN101379077A (zh) * | 2005-12-07 | 2009-03-04 | 夏洛特·豪泽 | 因子ⅷ和因子ⅷ-类似蛋白的小肽或者拟肽亲合性配体 |
Family Cites Families (25)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1988009343A1 (en) | 1987-05-29 | 1988-12-01 | Sagami Chemical Research Center | Fused protein containing lymphotoxin |
AU2645588A (en) | 1987-12-04 | 1989-06-15 | Scripps Clinic And Research Foundation | The von willebrand factor binding domain of factor viii |
US5843440A (en) | 1990-10-03 | 1998-12-01 | Redcell Canada, Inc. | Cellular and serum protein anchors for modulating pharmacokinetics |
US6939677B1 (en) | 1990-11-01 | 2005-09-06 | Cancer Research Fund Of Contra Costa | Antibody with 46 kdalton HMFG antigen binding specificity, immunoassay kit and diagnostic method |
US5859204A (en) | 1992-04-07 | 1999-01-12 | Emory University | Modified factor VIII |
US5629384A (en) | 1994-05-17 | 1997-05-13 | Consiglio Nazionale Delle Ricerche | Polymers of N-acryloylmorpholine activated at one end and conjugates with bioactive materials and surfaces |
US5932462A (en) | 1995-01-10 | 1999-08-03 | Shearwater Polymers, Inc. | Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces |
US6172213B1 (en) | 1997-07-02 | 2001-01-09 | Genentech, Inc. | Anti-IgE antibodies and method of improving polypeptides |
US6660843B1 (en) | 1998-10-23 | 2003-12-09 | Amgen Inc. | Modified peptides as therapeutic agents |
US6524572B1 (en) | 2000-06-26 | 2003-02-25 | Rainbow Therapeutic Company | Targeting recombinant virus with a bispecific fusion protein ligand in coupling with an antibody to cells for gene therapy |
PT2279753E (pt) | 2001-10-10 | 2016-01-15 | Novo Nordisk As | Remodelação e glicoconjugação de péptidos |
EP2052713A3 (en) | 2003-01-13 | 2009-05-20 | Macrogenics, Inc. | Soluble FcgammaR fusion proteins and methods of use thereof |
US7348004B2 (en) | 2003-05-06 | 2008-03-25 | Syntonix Pharmaceuticals, Inc. | Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids |
US20070106066A1 (en) | 2003-10-28 | 2007-05-10 | Alexander Cherkasky | Cherkasky fusion proteins containing antibody-, antigen- and microtubule-binding regions and immune response-triggering regions |
WO2005113584A1 (en) | 2004-04-29 | 2005-12-01 | Board Of Regents, University Of Texas System | Methods and compositions comprising protein l immunoglobulin binding domains for cell-specific targeting |
MX2007011801A (es) | 2005-03-24 | 2008-02-19 | Neose Technologies Inc | Expresion de glicosiltransferasas eucarioticas activas, solubles en organismos procarioticos. |
WO2007056191A2 (en) | 2005-11-03 | 2007-05-18 | Neose Technologies, Inc. | Nucleotide sugar purification using membranes |
JP5102635B2 (ja) | 2006-01-31 | 2012-12-19 | 石原産業株式会社 | エンベロープウイルスの構成成分に親和性を有するポリペプチドと細胞内物質導入への使用 |
ES2531934T3 (es) | 2006-09-01 | 2015-03-20 | Novo Nordisk Health Care Ag | Glicoproteínas modificadas |
JP2010511397A (ja) | 2006-12-05 | 2010-04-15 | アブリンクス エン.ヴェー. | 血清タンパク質と結合可能なペプチド |
AU2008209436A1 (en) * | 2007-01-23 | 2008-07-31 | Zymogenetics, Inc. | Soluble Fc gamma R1a for reducing inflammation |
US8043621B2 (en) | 2007-05-10 | 2011-10-25 | Ramot At Tel Aviv University Ltd. | Recombinant fusion protein and polynucleotide construct for immunotoxin production |
ES2400107T3 (es) | 2007-10-22 | 2013-04-05 | Merck Serono S.A. | IFN-beta sencillo fusionado a un fragmento Fc de lgG mutado |
AU2009219232B2 (en) * | 2008-02-27 | 2014-02-27 | Novo Nordisk A/S | Conjugated Factor VIII molecules |
PL2291523T3 (pl) | 2008-06-24 | 2015-05-29 | Csl Behring Gmbh | Czynnik VIII, czynnik von Willebranda lub ich kompleksy o wydłużonym okresie półtrwania in vivo |
-
2011
- 2011-02-10 CN CN201510524808.4A patent/CN105153313A/zh not_active Withdrawn
- 2011-02-10 JP JP2012553267A patent/JP2013519699A/ja not_active Withdrawn
- 2011-02-10 WO PCT/EP2011/051959 patent/WO2011101284A1/en active Application Filing
- 2011-02-10 CN CN201180009864.4A patent/CN102770450B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2011-02-10 EP EP11703448A patent/EP2536754A1/en not_active Withdrawn
- 2011-02-10 EP EP15159991.7A patent/EP2977055A1/en not_active Withdrawn
- 2011-02-10 US US13/574,686 patent/US9493543B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2016
- 2016-02-08 JP JP2016021624A patent/JP6185097B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2016-10-04 US US15/285,138 patent/US20170015729A1/en not_active Abandoned
-
2017
- 2017-07-26 JP JP2017144266A patent/JP2017190342A/ja not_active Withdrawn
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101379077A (zh) * | 2005-12-07 | 2009-03-04 | 夏洛特·豪泽 | 因子ⅷ和因子ⅷ-类似蛋白的小肽或者拟肽亲合性配体 |
WO2008077616A1 (en) * | 2006-12-22 | 2008-07-03 | Csl Behring Gmbh | Modified coagulation factors with prolonged in vivo half-life |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Factor VIII-Fc Fusion Protein Shows Extended Half-Life and Hemostatic Activity in Hemophilia A Dogs;Jennifer A Dumon et al;《BLOOD》;20091130;第114卷(第22期);摘要 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2017190342A (ja) | 2017-10-19 |
CN105153313A (zh) | 2015-12-16 |
US9493543B2 (en) | 2016-11-15 |
WO2011101284A1 (en) | 2011-08-25 |
US20170015729A1 (en) | 2017-01-19 |
JP2013519699A (ja) | 2013-05-30 |
CN102770450A (zh) | 2012-11-07 |
JP2016084365A (ja) | 2016-05-19 |
EP2536754A1 (en) | 2012-12-26 |
JP6185097B2 (ja) | 2017-08-23 |
US20130040889A1 (en) | 2013-02-14 |
EP2977055A1 (en) | 2016-01-27 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN102770450B (zh) | 因子viii融合蛋白 | |
CN102770449B (zh) | 具有降低的vwf结合的因子viii分子 | |
KR101648734B1 (ko) | 연장된 생체내 반감기를 갖는 인자 viii, 폰 빌레브란트 인자 또는 이들의 복합체 | |
US20160264645A1 (en) | Stabilized Factor VIII Variants | |
CN106279437B (zh) | 高糖基化人凝血因子viii融合蛋白及其制备方法与用途 | |
US20180092966A1 (en) | Covalent complex of von willebrand factor and factor viii, compositions, and uses relating thereto | |
EP2417155A1 (en) | Targeted delivery of factor viii proteins to platelets | |
CA2673459A1 (en) | Modified coagulation factors with prolonged in vivo half-life | |
JP7252890B2 (ja) | 血友病を処置するための切断型フォン・ヴィルブランド因子ポリペプチド | |
US20220033476A1 (en) | Fusion protein of mutated single-chain human coagulation factor viii, preparation method therefor, and use thereof | |
JP2020504082A (ja) | 血液凝固障害の処置又は予防における血管外投与のための切断型フォン・ヴィルブランド因子ポリペプチド |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20151202 Termination date: 20180210 |
|
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |