CN114391024A - 具有增加的半衰期的因子viii蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及重组凝血因子，特别是半衰期延长的重组因子VIII(FVIII)蛋白。它们包含因子VIII的重链部分和轻链部分以及至少两个白蛋白结合结构域，其中至少一个白蛋白结合结构域在重链部分的C‑末端，至少一个白蛋白结合结构域在轻链部分的C‑末端。如果蛋白质是单链蛋白质，则在重链部分的C‑末端的白蛋白结合结构域是在轻链部分的N‑末端。本发明的蛋白质还可以是去免疫因子VIII蛋白质，其在确定的位置包含特异性点突变，用于降低免疫原性，其中该蛋白质基本上保留其凝血活性。本发明还涉及编码本发明蛋白质的核酸，它们的制备方法和包含这些中的任一种的药物组合物，其中所述药物组合物优选用于治疗血友病A。

Description

具有增加的半衰期的因子VIII蛋白
本发明涉及重组凝血因子，特别是半衰期延长的重组因子VIII(FVIII)蛋白。它们包含因子VIII的重链部分和轻链部分以及至少两个白蛋白结合结构域，其中至少一个白蛋白结合结构域在重链部分的C-末端，和至少一个白蛋白结合结构域在轻链部分的C-末端。如果蛋白质是单链蛋白，则在重链部分的C-末端的白蛋白结合结构域是在轻链部分的N-末端。本发明的蛋白质还可以是去免疫的重组因子VIII蛋白，其在确定的位置处包含特定点突变，用于降低所述FVIII蛋白的免疫原性，其中因子VIII蛋白基本上保留其凝血活性。本发明还涉及编码本发明蛋白质的核酸、它们的制备方法和包含这些中的任一种的药物组合物，其中所述药物组合物优选用于治疗血友病A。
FVIII是凝血级联反应中的重要辅因子。野生型人FVIII是作为由2351个氨基酸组成的单链合成的，其包含被短酸性序列(a1-a3)中断的三个A结构域(A1-A3)、一个B结构域和两个C结构域(C1和C2)。前19个氨基酸是信号序列，该信号序列被细胞内蛋白酶切割，导致FVIII分子具有2332个氨基酸。所得到的结构域结构是A1-a1-A2-a2-B-a3-A3-C1-C2。在翻译后修饰期间，FVIII被糖基化、硫酸化和蛋白水解加工。硫酸化对于与不同蛋白，尤其是凝血酶和血管性血友病因子(vWF)的胞外相互作用非常重要。其发生在酸性区a1、a2和a3的六个酪氨酸上。丝氨酸蛋白酶弗林蛋白酶的细胞内切割将FVIII分成重链(A1-a1-A2-a2-B)和轻链(a3-A3-C1-C2)。在这一切割过程中，部分B结构域可能会丢失。因而，轻链的分子量为80kDa，而重链可能略有异质性，其分子量在210kDa左右。重链与轻链之间的结合不是共价的，而是由A1和A3域之间的二价金属离子Cu2+介导的。
在循环中，FVIII通过a3、C1和C2结构域与vWF结合，从而保护FVIII免于早期激活和降解。
激活后，FVIII在三个位置被凝血酶切割，导致产生异源三聚体和B结构域的丢失(异源三聚体FVIIIa)。异源三聚体与被激活的凝血因子IXa和凝血因子X形成复合物，并且轻链与磷脂双层结合，例如(被激活的)血小板的细胞膜。
血友病A主要是X染色体连锁的遗传性出血性疾病，在5000名新生男性中有1名发生。然而，由于针对FVIII的自身免疫应答，因而血友病A也可能自发发生。血友病A患者遭受更长的出血持续时间、自发性出血和内出血，影响其日常生活。
通常通过施用FVIII治疗血友病A患者。根据疾病的严重程度(轻度、中度或重度)，根据需要进行治疗或预防。治疗性FVIII产品是从人血浆中纯化的(pFVIII)，或者该产品是在细胞培养物中重组生产的(rFVIII)。
在开发用于治疗的重组FVIII分子的过程中，已经设计了B结构域缺失的FVIII分子，因为B结构域对于凝血中FVIII的功能并不重要。这主要导致尺寸减小。最常见的B结构域缺失的FVIII产品之一是辉瑞公司生产的ReFacto或ReFacto AF。这种FVIII变体缺乏B结构域的894个氨基酸。
在开发用于治疗的重组FVIII分子的过程中，已经设计了B-结构域缺失的FVIII分子，因为B-结构域对于FVIII在凝血中的功能并不重要。这主要导致尺寸减小。最常见的B结构域缺失的FVIII产品之一是Pfizer生产的
Figure BDA0003525742080000021
或ReFacto
Figure BDA0003525742080000022
该FVIII变体缺少B结构域的894个氨基酸。
关于FVIII替代疗法的一个问题是血浆来源或重组的因子VIII蛋白的相对低的体内半衰期。已经有不同的方法来增强FVIII半衰期，从PEG化到白蛋白掺入、单链分子和Fc融合。
WO 2014/070953A1涉及通过施用长效因子VIII多肽降低或减少血友病患者的出血率的方法，其中所述长效因子VIII多肽可以是因子VIII多肽与异源部分的融合体，所述异源部分是FcRn结合伴体并且可以包含Fc区。
WO 91/01743A1描述了用于通过将生物活性蛋白质或肽共价偶联至能够结合血清蛋白，尤其是血清白蛋白的多肽片段来延长所述蛋白质或肽的体内半衰期的方法。优选地，白蛋白结合片段衍生自链球菌蛋白G或葡萄球菌蛋白A。产生的融合蛋白在体内与血清白蛋白结合，并受益于其较长的半衰期，从而增加融合的治疗上有意义的蛋白或肽的净半衰期。WO 2005/097202A2一般地提及了在单个多肽链中组合治疗性蛋白和血浆蛋白的融合蛋白，其中这样的融合蛋白可以在需要较低频率注射和体内较高治疗性蛋白质水平的方面提供临床益处。
WO 2009/016043A2公开了白蛋白结合多肽。WO 2010/054699A1公开了用于调节哺乳动物中具有生物功能的靶标的药代动力学和/或药效学的捕获分子，其中所述分子包含至少一个白蛋白结合部分。
WO 2011/101284A1描述了因子VIII融合蛋白。提及白蛋白结合部分。推测融合伴体通过与血清白蛋白相互作用而延迟体内FVIII的清除。白蛋白结合多肽，如ABD1多肽，作为融合伴体的实例被提及。建议的融合蛋白包含四个白蛋白结合部分(白蛋白结合结构域-ABD)，其包含ABD1，例如B结构域中的4×ABD1或FVIII轻链C末端的4×ABD1。
WO 2012/004384A2公开了白蛋白结合序列。其描述了与白蛋白结合多肽的融合蛋白或缀合物，其中第二部分可以是因子VIII。
WO 2013/143890A1公开了用于口服施用的化合物，其包含具有期望的治疗活性的部分和结合白蛋白的部分。
WO 2014/048977A1公开了一类对白蛋白具有结合亲和力的工程化多肽。WO 2014/064237A1提供了包含ABD结合基序的白蛋白结合结构域结合多肽。WO 2015/091957A1涉及一类对白蛋白具有结合亲和力的工程化多肽，其中所述多肽对蛋白水解裂解具有高抗性。
WO 2015/023894A1提供了重组FVIII蛋白，其中至少一个许可环或a3结构域中的一个或多个氨基酸被置换或缺失，或被异源性部分替代，同时保留促凝血FVIII活性。所产生的FVIII蛋白应该具有例如增加的体内稳定性。
此外，多达30％的患有严重血友病A的患者会产生针对治疗性FVIII的抑制性抗FVIII抗体。这是由于以下事实：这些患者的免疫系统将所应用的治疗性FVIII识别为外源性，因为患者产生改变的内源性FVIII变体(可以被突变或截短)，或者根本没有FVIII。已知针对FVIII的抑制性抗体经历了类别转换和亲和性成熟。这提示分泌抗体的B细胞的T细胞依赖性激活。这种T细胞依赖性B细胞激活需要激活的辅助性T细胞，所述辅助性T细胞是通过与抗原提呈细胞(APC)相互作用从初始(naive)辅助性T细胞衍生而来的，所述抗原提呈细胞呈递FVIII抗原和其他共刺激。
至少一些血友病患者可以将FVIII的完整人类序列(作为治疗剂施用)视为外源蛋白质，因为尚未发展出对该蛋白的中央耐受性。根据受试者的HLA，给药频率以及每个受试者FVIII中存在的突变的位置和性质，可以通过FVIII治疗诱导对FVIII的免疫应答。将那些干扰FVIII功能的针对FVIII的那些抗体称为抑制性抗体或抑制剂。过去，接受FVIII治疗的受试者中FVIII抑制剂的开发与FVIII的更严重的突变或不表达相关。可以预期，替代疗法越“外源“，则所产生的免疫应答就越强大。事实上，在血友病患者中，抗治疗性免疫应答可以是治疗性FVIII和健康的功能性免疫系统之间相互作用的正常和预期的结果。
在形成抑制剂的情况下，患者大多接受免疫耐受诱导(ITI)疗法。在可能需要数周、数月或数年的该治疗期间，将非常高剂量的FVIII应用于患者，以耗尽免疫系统并相应地诱导耐受性。对于患者及其护理者而言，这种疗法非常昂贵并且费力。在ITI期间，每天应用FVIII，在一些情况下甚至一天两次。除了治疗剧烈以外，当存在抑制剂时出血数量也会增加。保护患者免于因关节出血而导致残疾的目的损害了患者以及整个家庭的社会生活。此外，在很大比例的患者中，ITI并不成功。
重组猪FVIII被FDA批准用于治疗已对人FVIII已产生自身免疫应答的血友病A患者。WO 99/46274A1公开了具有人和动物FVIII序列或人FVIII和非FVIII序列的杂交FVIII，包括修饰的因子VIII，其中氨基酸序列通过一个或多个特定基因座的置换而改变，其中因子VIII不受针对A2或C2结构域表位的抑制性抗体的抑制。
WO 2016/123200A1还描述了重组或嵌合FVIII蛋白，其中一个或多个蛋白结构域包含衍生自祖先重构的氨基酸序列的氨基酸序列，其中所得的FVIII显示出抑制剂结合降低，即其中B细胞表位已缺失。
由于认为T细胞参与了针对FVIII的高亲和性抗体的产生，因而建议开发不含常见T细胞表位并因此在患者中不诱导免疫应答的重组FVIII分子(Scott，2014,Haemophilia20(01):80-86；Tangri等人，2005，J Immunol.174：3187-3196)。Moise等人(2012，ClinImmunol 142(3)：329-331)公开了去免疫化FVIII肽，其中已通过计算机途径鉴定了C2结构域T细胞表位并对其进行修饰。已在HLA结合测定中对修饰的肽进行了评价，并用于免疫小鼠。Schubert等(2018,PLoS Comput Biol 14(3):e1005983)公开了一种用于对去免疫化蛋白生物疗法进行群体特异性设计的类似方法，其描述了一种用于鉴定FVIII的C2结构域中的突变的计算方法，该突变导致免疫原性降低，同时保留药物活性和蛋白功能。例如，其教导了具有至多三个同时的点突变的序列的去免疫化结果(例如，V2333E、L2321F、Q2335H或V2313M/V2313T)。作为计算机模拟计算的实验验证，其测量了15mer肽对特定HLA等位基因的亲和性。
WO 2011/060371 A2公开了一种修饰的FVIII多肽，其包含在FVIII的C2结构域的一个特定区域中的至少一个氨基酸修饰，认为该特定区域形成了针对抑制剂的B细胞表位，和/或在FVIII的A2结构域的一个特定区域中的至少一个氨基酸修饰，认为该特定区域形成了相关T细胞表位，所述修饰的FVIII多肽用于在罹患血友病A的患者中预防或降低对因子VIII的初始免疫应答或者用于在具有针对因子VIII的预形成抑制剂抗体的患者中降低免疫应答的强度。
根据现有技术，本发明的发明人解决了提供具有增加的半衰期的重组FVIII蛋白的问题，其优选允许对患者更方便的替代疗法，从而允许超过三天或甚至超过一周或更长的给药间隔。
该问题由本发明解决，例如通过要求保护的主题。
发明描述
本发明人构建了新的FVIII变体，其具有更长的体内半衰期和优异的比活性，如通过不同的生物活性测定所证明的。这些蛋白质还具有高水平的表达和低的片段和副产物谱。其它优点和优选实施例在本说明书的其它地方说明。本发明人已经发现白蛋白结合结构域的特定排列有助于增加体内半衰期。
因此，本发明提供了包含因子VIII的重链部分和轻链部分以及至少两个白蛋白结合结构域的重组因子VIII蛋白，其中至少一个白蛋白结合结构域在重链部分的C-末端，和至少一个白蛋白结合结构域在轻链部分的C-末端。如果蛋白质是单链蛋白质，则在重链部分的C-末端的白蛋白结合结构域是在轻链部分的N-末端。
与vonWillebrand因子(vWF)复合的因子VIII具有约12小时的体内半衰期。不与vWF结合的FVIII通常降解得快得多。
白蛋白具有约19天的体内半衰期。通过在FVIII序列中引入至少两个白蛋白结合结构域，可以获得显著的半衰期延长。为了鉴定整合的白蛋白结合部分的最佳位置和数量，已经测试了白蛋白结合部分的不同位置和不同数量。
不受理论的束缚，据信通过本文所述特定位置的白蛋白结合结构域与本发明FVIII蛋白结合的白蛋白在抑制本发明FVIII蛋白分解方面特别有效。这似乎比与血液中天然FVIII相关的vWF结合增加了更多的体内半衰期。
FVIII
技术人员理解术语FVIII(或因子VIII)，并知道野生型FVIII及其典型变体的结构和生物学功能。除本文所述的特征外，本发明的FVIII蛋白可设计为技术人员认为合适和有利的。
特别地，本发明的因子VIII蛋白通常应包含已知对生物学功能重要的所有必需部分和结构域。例如，优选地，FVIII蛋白还包含与野生型FVIII的A和C结构域，特别是A1、A2、A3、C1和C2结构域对应、基本上对应和/或功能上对应的结构域。它还可以包含另外的部分和结构域。例如，优选地，FVIII蛋白进一步包含在A1和A2结构域之间的α1结构域及在A2结构域C-末端的α2结构域。对于双链蛋白，在单独的链上，或对于单链蛋白，在所述结构域的C-末端，和任选地在B-结构域或截短的B-结构域和至少一个白蛋白结合结构域的C-末端，FVIII蛋白至少包含截短的α3结构域。在加工前，本发明的因子VIII蛋白还可包含信号序列。因此，重链部分优选包含结构域A1和A2，并且通常包含结构域A1-a1-A2-a2或A1-a1-A2-a2-B。优选地，因子VIII蛋白的B-结构域至少部分缺失。轻链部分优选包含结构域A3和C1和C2，且通常包含结构域a3-A3-C1-C2。任何或所有所述结构域可以是野生型(wt)FVIII结构域，或它们可以与野生型结构域不同，例如，如本领域已知的或技术人员认为合适的。
该结构域优选以该顺序包含在蛋白质中，即从蛋白质的N-末端到C-末端。
虽然本发明的FVIII蛋白的部分可由技术人员根据需要设计，但FVIII优选保持高FVIII生物活性。如实施例中所示，本发明允许产生具有高生物活性的FVIII蛋白，如例如通过显色活性测定的。因此，优选根据本发明的FVIII蛋白具有至少与wt FVIII蛋白的活性相当的显色活性，即它具有wt蛋白(SEQ ID NO：1)的比显色活性的至少50％。优选地，根据本发明的FVIII蛋白具有wt蛋白的比显色活性的至少80％、至少100％或大于100％。优选地，显色活性也是ReFacto
Figure BDA0003525742080000071
(国际非专有名称：Moroctocogα)，一种市售的B-结构域缺失的FVIII(Pfizer)的显色活性的至少50％、至少80％、至少90％、至少100％或大于100％。
本发明的FVIII蛋白应具有wt FVIII蛋白的至少一种生物活性或功能，特别是关于凝血的功能。FVIII蛋白应可通过凝血酶切割，从而导致活化。优选地，根据本发明的FVIII蛋白包含至少一个凝血酶识别和/或凝血酶切割位点，其中所述凝血酶识别和/或凝血酶切割位点可以对应于或基本上对应于野生型FVIII的那些。然后它能够与活化的凝血因子IXa和凝血因子X形成复合物，并且轻链能够结合磷脂双层，例如(活化的)血小板的细胞膜。
如本文所述，FVIII的生物活性可通过分析蛋白质的显色、凝结或凝血活性来测定。通常，显色活性作为生物活性的量度。
作为双链蛋白的本发明的因子VIII蛋白可以获得增加的体内半衰期。可形成本发明FVIII蛋白的基础的双链蛋白是本领域已知的，例如wt FVIII或其B-结构域缺失或截短的形式，例如ReFacto
Figure BDA0003525742080000081
此外，本发明人发现，作为单链蛋白的本发明的因子VIII蛋白体内半衰期显著增加。可构成本发明FVIII蛋白的基础的单链因子VIII蛋白是本领域已知的。通常，单链FVIII蛋白不包含功能性弗林蛋白酶切割位点，且因此在激活前，作为单链保留在循环中。这样的蛋白质也在EP申请No.19173440中公开或在本文中教导。
作为本发明蛋白质的单链骨架，已经开发了单链FVIII分子，其中缺失了包括弗林蛋白酶切割位点(位置R1664-R1667，其中还计入了信号肽)的几个氨基酸。B结构域在很大程度上缺失，其中B结构域的内部片段(至少NPP)被维持并且完整的凝血酶切割位点在该内部片段之前。该单链因子VIII蛋白(FVIII-sc)已显示比wt因子VIII更稳定。因此，在一个优选的实施方案中，本发明的重组因子VIII蛋白在单链中包含含有因子VIII的A1和A2结构域的重链部分和含有因子VIII的A3、C1和C2结构域的轻链部分，其中
a)在所述重组因子VIII蛋白中，对应于如SEQ ID NO：1中定义的野生型因子VIII的F761和P1659之间的连续氨基酸的894个氨基酸被删除，导致第一缺失；
b)所述重组因子VIII蛋白包含跨越第一缺失的位点的加工序列，所述加工序列包含SEQ ID NO：2或在SEQ ID NO：2中具有至多一个氨基酸置换的序列，其中所述加工序列包含第一凝血酶切割位点；
c)在所述重组因子VIII蛋白中，至少对应于野生型因子VIII的氨基酸R1664至R1667的氨基酸被删除，导致第二缺失；以及
d)所述重组因子VIII蛋白包含在第二缺失的C-末端和A3结构域的N-末端的第二凝血酶切割位点。
如在a)中所定义的，在本发明的FVIII中，对应于如在SEQ ID NO：1中定义的野生型因子VIII的F761和P1659之间的连续氨基酸的894个氨基酸在本发明的因子VIII蛋白中缺失，导致第一缺失。在某些实施方案中，特别地，从没有缺失或插入的FVIII中的氨基酸编号开始，术语“对应于”应理解为意指“与…同一”。
对于与wt相比可能发生突变的特定氨基酸，对应于野生型aa的氨基酸通过比对确定，例如使用EMBOSS Needle(基于Needleman-Wunsch算法；设置：MATRIX:“BLOSUM62”,GAPOPEN:“20”,GAP EXTEND:“0.5”,END GAP PENALTY:“false”,END GAP OPEN:“10”,END GAPEXTEND:“0.5”)。
为了评估两个多肽的序列同一性，这种比对可以分两步进行：I.使用EMBOSSNeedle(设置：MATRIX:“BLOSUM62”,GAP OPEN:“20”,GAP EXTEND:”0.5”,END GAP PENALTY:“false”,END GAP OPEN:“10”,END GAP EXTEND:“0.5”)进行全局蛋白比对以识别具有最高相似性的特定区域。II.通过使用EMBOSS Needle(设置：MATRIX:“BLOSUM62”,GAP OPEN:“20”,GAP EXTEND:”0.5”,END GAP PENALTY:“false”,END GAP OPEN:“10”,END GAPEXTEND:“0.5”)比较(I)中鉴定的完全重叠的多肽序列同时排除非配对氨基酸的第二次比对来定义确切的序列同一性。
“之间”不包括所列举的氨基酸，例如，它意味着所列举的氨基酸被保留。“缺失”或“被缺失”并不一定意味着蛋白实际上是通过缺失先前存在于前体分子中的氨基酸来制备的，而仅定义为不存在所述氨基酸，与分子的制备无关。例如，可以基于通过从头合成或通过基因工程技术制备的核酸来生产蛋白。
如b)中所定义，重组因子VIII蛋白包含跨越第一缺失位点的加工序列，所述加工序列包含SEQ ID NO:2(PRSFSQNPP)或在SEQ ID NO:2中具有至多一个氨基酸置换的序列，其中所述加工序列包含第一凝血酶切割位点。因此，加工序列的至少一个氨基酸对应于缺失的C末端侧的氨基酸，并且加工序列的至少一个氨基酸对应于缺失的N末端侧的氨基酸。加工序列包含SEQ ID NO:2或在SEQ ID NO:2中具有至多一个氨基酸置换的序列，即加工序列可以更长。特别地，加工序列选自包括SEQ ID NO:2、3、4、5、6、7或8的组。本发明人已经发现，本发明的加工序列能够通过凝血酶进行特别好的切割。
在优选的实施方案中，加工序列不长于SEQ ID NO:4。加工序列可以直接位于来自a2结构域的序列的C-末端侧，例如wt a2结构域序列。加工序列的前两个N末端氨基酸可能已经属于a2结构域。优选地，加工序列的直接N-末端侧的氨基酸是E。
SEQ ID NO:2中的一个氨基酸可以被置换，例如，以降低免疫原性。任选地，F、F的C-末端侧的S、Q或N被置换。
优选地，F被置换为例如A或S，导致F761A或F761S置换。
加工序列可以是SEQ ID NO:4(PRSFSQNPPVL)或在所述序列中具有至多一个氨基酸置换的序列，其中，任选地，F、F的C-末端侧的S、Q或N被置换。此外，本发明人已经表明，在加工序列的C-末端的L(如SEQ ID NO:4、5、6、7或8中)赋予FVIII特别好的活性。单链FVIII蛋白的一个特别优选的实例，其可形成本发明蛋白的骨架，在实施例中以名称V0(SEQ IDNO：16)更详细地显示。已发现特别有利的FVIII蛋白V0的加工序列由SEQ ID NO:4组成，其是SEQ ID NO:5-8的具体实施方案。
替代加工序列SEQ ID NO:5(PRSXSQNPPVL)、SEQ ID NO:6(PRSFXQNPPVL)、SEQ IDNO:7(PRSFSXNPPVL)和SEQ ID NO:8(PRSFSQXPPVL)是变体，其中X可以是任何天然存在的氨基酸。任选地，与SEQ ID NO:4中的相应氨基酸相比，X是保守置换，即疏水性氨基酸被疏水性氨基酸置换，亲水性氨基酸被亲水性氨基酸置换，芳香族氨基酸被芳香族氨基酸置换，酸性氨基酸被酸性氨基酸置换并且碱性氨基酸被碱性氨基酸置换。
例如，在SEQ ID NO：5中，计算机模拟预测其中X是A或S的SEQ ID NO：5的替代加工序列导致免疫原性较低的产物(表11)。这适用于例如本文分析的变体F01_AD2CD2_SC、F02_AD2CD2_SC。加工序列的另一个去免疫变体是SEQ ID NO：132(PRSFSQNPEVL)。或者，加工序列的直接C-末端的S(即接头的第一个氨基酸，例如凝血酶切割接头)可被置换为D，如SEQID NO：131中所示。
如c)中所定义，在本发明的FVIII蛋白中，对应于野生型因子VIII的氨基酸R1664至R1667的氨基酸被缺失，导致第二缺失。这些氨基酸对应于wt FVIII的弗林蛋白酶切割识别位点。因此，蛋白基本上不被弗林蛋白酶切割。在组合物中，至少80％，任选地，至少90％或至少95％的本发明的FVIII蛋白以单链形式存在。
如d)中所定义，本发明的重组因子VIII蛋白在第二缺失的C-末端侧和A3结构域的N-末端包含第二凝血酶切割位点。因此，在激活时，加工序列中凝血酶切割位点与第二凝血酶切割位点之间的FVIII蛋白的部分从激活的FVIII蛋白切除。
此外，本发明提供了重组因子VIII蛋白，其在单链中包含含有因子VIII的A1和A2结构域的重链部分和含有因子VIII的A3、C1和C2结构域的轻链部分，其中，
a)所述重组因子VIII蛋白包含加工序列，其包含SEQ ID NO：2或在SEQ ID NO：2中具有至多一个氨基酸置换的序列，其中所述加工序列包含第一凝血酶切割位点；
b)直接在所述加工序列的C-末端，所述因子VIII蛋白包含含有至少一个，优选两个白蛋白结合结构域的异源序列；
c)直接在所述异源序列的C-末端，所述因子VIII蛋白包含与SEQ ID NO：9具有至少90％序列同一性的合并序列(例如，SEQ ID NO：9)；以及
d)所述重组因子VIII蛋白在SEQ ID NO：9的C-末端包含第二凝血酶切割位点；以及
e)所述重组因子VIII蛋白在轻链部分的C-末端包含至少一个，优选两个白蛋白结合结构域。
所述重组FVIII蛋白可以是如上所述的FVIII蛋白。FVIII蛋白通常包含至少一个另外的凝血酶切割位点。
在一个实施方案中，任选为单链蛋白的本发明FVIII蛋白包含与SEQ ID NO：1的aa20-aa1667具有至少90％序列同一性的重链部分，和与SEQ ID NO：1的aa1668-aa2351具有至少90％序列同一性的轻链部分。任选地，相应的与SEQ ID NO：1的aa20-aa1667的序列同一性和与SEQ ID NO：1的aa1668-aa2351的序列同一性为至少95％。相应的与SEQ ID NO：1的aa20-aa1667的序列同一性和与SEQ ID NO：1的aa1668-aa2351的序列同一性可以是至少98％。任选地，与所述序列的相应序列同一性为至少99％。本发明还提供包含具有SEQ IDNO：1的aa20-aa1667的重链部分和具有SEQ ID NO：1的aa1668-aa2351的轻链部分的本发明的FVIII蛋白。
本发明人进行的几个实验是用基于具有至少一个引入重链部分C-末端和轻链部分C-末端的白蛋白结合结构域的V0单链构建体(SEQ ID NO：16)的本发明的单链FVIII进行的，如本文所述。这样的蛋白质在表达、稳定性、体内半衰期和纯化方面显示出有利的特征。因此，本发明的优选FVIII蛋白，其可以是单链蛋白，包含与SEQ ID NO：16的aa20-aa768具有至少90％序列同一性的重链部分，和与SEQ ID NO：16的aa769-aa1445具有至少90％序列同一性的轻链部分。任选地，相应的与SEQ ID NO：16的aa20-aa768的序列同一性和与SEQID NO：16的aa769-aa1445的序列同一性是至少95％。相应的与SEQ ID NO：16的aa20-aa768的序列同一性和与SEQ ID NO：16的aa769-aa1445的序列同一性可以是至少98％。任选地，与所述序列的相应序列同一性为至少99％。本发明还提供了本发明的FVIII蛋白，其包含具有SEQ ID NO：16的aa20-aa768的重链部分和具有SEQ ID NO：16的aa769-aa1445的轻链部分。
wt FVIII通常被vWF结合。vWF屏障蔽FVIII免于蛋白水解降解和肝脏内的受体介导的清除，例如通过低密度脂蛋白(LDL)受体相关蛋白(LRP1)、LDL-受体(LDLR)和硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)(Lenting等人，2007.J Thromb Haematol 5:1353-60)。然而，已经证明vWF的半衰期约为15小时，从而限制了FVIII:vWF复合物对vWF相关清除途径的半衰期。本发明人发现，与wt FVIII或ReFacto
Figure BDA0003525742080000131
相比，本发明FVIII蛋白的vWF结合效力可能降低，这可以通过由白蛋白结合引起的空间位阻来解释。例如，本发明的FVIII蛋白可具有ReFacto
Figure BDA0003525742080000132
与vWF的结合效力的0％-90％、10％-80％、20-70％、30-60％或40-50％，其可通过如下所述的测定法测定。优选地，在生理浓度的人血白蛋白存在下，所述结合效力小于ReFacto
Figure BDA0003525742080000133
与vWF的结合效力的50％。
vWF结合特别地由氨基酸位置Y1683和Y1699介导。为了避免vWF结合，例如对应于SEQ ID NO：1的wt FVIII的Y1683和/或Y1699的氨基酸可以突变。例如，对应于SEQ ID NO：1的wt FVIII的Y1683和/或Y1699的氨基酸可突变为C或F，例如Y1699C或Y1699F。特别地，已经证实对应于Y1699的氨基酸突变为F和对应于Y1683的氨基酸突变为F，两种突变一起命名为“b突变”，进一步降低vWF与本发明FVIII蛋白的结合。除“b突变”外，本发明人另外测试了包含SEQ ID NO：1的wt FVIII的氨基酸置换Y737F、Y738F和Y742F的“a突变”和包含SEQ IDNO：1的wt FVIII的氨基酸置换I2117S和R2169H的“c突变”。另外，发明人已经测试了“a突变”和“b突变”的组合以及“a突变”和“b突变”和“c突变”的进一步组合。观察到“c突变”对蛋白质表达和功能有负面影响。“b突变”单独或与“a突变”组合不影响蛋白质表达和功能性，但强烈降低与vWF的结合。相比之下，“a突变”不降低与vWF的结合。
因此，为了进一步降低vWF结合，本发明的重组因子VIII蛋白可具有如本文所述的合适突变，例如“b突变”，即SEQ ID NO：1的wt因子VIII蛋白中1699位对应于Y1699的氨基酸突变为F和1683位对应于Y1683的氨基酸的突变为F。例如，本发明的FVIII蛋白可以包含因子VIII的重链部分和轻链部分以及至少两个白蛋白结合结构域，其中至少两个白蛋白结合结构域(例如两个)在重链部分的C-末端，并且至少两个白蛋白结合结构域(例如两个)在轻链部分的C-末端，其中FVIII蛋白进一步包含b突变。这样的FVIII蛋白可以进一步包含接头，例如，任选邻接甘氨酸-丝氨酸接头的凝血酶切割接头，在白蛋白结合结构域和蛋白的其它部分之间以及在白蛋白结合结构域之间。或者，这种FVIII蛋白不包含接头。在本发明的上下文中，“邻接”是指相关部分紧密邻近，优选具有至多10、5或2个氨基酸位置的距离。任选地，相关部分直接相邻。
白蛋白结合结构域
本发明的重组因子VIII蛋白包含因子VIII的重链部分和轻链部分以及至少两个白蛋白结合结构域，其中至少一个白蛋白结合结构域在重链部分的C-末端，和至少一个白蛋白结合结构域在轻链部分的C-末端。
在本发明的上下文中可以使用不同的白蛋白结合结构域(ABD)。历史上，ABD通常是小的三螺旋蛋白结构域，其衍生自由革兰氏阳性细菌表达的各种表面蛋白之一。例如，源自链球菌G蛋白的结构域和来自大芬戈尔德菌(Finegoldia magna)的蛋白PAB(其具有共同的起源且因此代表了感兴趣的进化系统)已经在结构和功能上进行了彻底的研究。已经定位了它们的白蛋白结合位点，并且这些结构域形成了广泛的蛋白质工程途径的基础。通过置换-诱变，它们已经被工程化以分别实现更宽的特异性、增加的稳定性或改善的结合亲和力。
例如，可以使用Nilvebrant等人(2013,Comput Struct Biotechnol J.6:e201303009)、Johansson等人(2001,JBC 277:8114-8120)、Jacobs等人(2015,ProteinEngineering,Design and Selection 28(10)；385-393)、WO91/01743A1、WO2009/016043A2、WO2010/054699A1、WO2012/004384A2、WO2014/048977A1或WO2015/091957A1公开的白蛋白结合结构域。
优选地，白蛋白结合结构域包含根据SEQ ID NO：44的序列：
LAX3AKX6X7ANX10ELDX14YGVSDFYKRLIX26KAKTVEGVEA LKX39X40ILX43X44LP
其中彼此独立地
X3选自E、S、Q和C，优选地E；
X6选自E、S、C和V，优选地E；
X7选自A、S和L，优选地A；
X10选自A、S和R，优选地A；
X14选自A、S、C和K，优选地S；
X26选自D、E和N，优选地D；
X39选自D、E和L，优选地D；
X40选自A、E和H，优选地A；
X43选自A和K，优选地A；
X44选自A、S和E，优选地A；
位置45中的L存在或不存在，优选存在；并且
位置46中的P存在或不存在，优选存在。
或者，白蛋白结合结构域可以包含与SEQ ID NO：44的序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。
本发明人使用称为ABD1的白蛋白结合结构域(SEQ ID NO：45)获得了良好的结果。优选使用已对人免疫系统去免疫的ABD2序列(SEQ ID NO：46)，即适应于避免人体中的免疫反应。如果没有另外提及，所述白蛋白结合结构域用于本文所示的实验中。ABD2可以由SEQID NO：57的核酸编码，其被密码子优化用于在人细胞中表达。
尽管可以在FVIII蛋白的不同位置使用不同的白蛋白结合结构域，但通常FVIII蛋白中的所有白蛋白结合结构域将具有相同的序列，优选ABD2。或者，为了获得多价白蛋白结合，可以在FVIII蛋白内的不同位置使用不同的白蛋白结合结构域。
例如，在本发明的FVIII蛋白中，一个白蛋白结合结构域可以在重链部分的C-末端，和一个白蛋白结合结构域在轻链部分的C-末端。或者，在两个选择的位置之一中，可以有一个白蛋白结合结构域，而在另一个中可以有两个、三个、四个或更多个白蛋白结合结构域。例如，一个白蛋白结合结构域可以在重链部分的C-末端并且两个白蛋白结合结构域可以在轻链部分的C-末端，或一个白蛋白结合结构域可以在重链部分的C-末端并且三个白蛋白结合结构域可以在轻链部分的C-末端，或一个白蛋白结合结构域可以在重链部分的C-末端并且四个白蛋白结合结构域可以在轻链部分的C-末端。
在本发明的FVIII蛋白中，两个白蛋白结合结构域可以在重链部分的C-末端，和一个白蛋白结合结构域在轻链部分的C-末端，或三个白蛋白结合结构域可以在重链部分的C-末端，和一个白蛋白结合结构域在轻链部分的C-末端，或四个白蛋白结合结构域可以在重链部分的C-末端，和一个白蛋白结合结构域在轻链部分的C-末端。
优选地，在两个位置的每一个中白蛋白结合结构域的数量是相同的。如果本发明的FVIII蛋白包含至少4个白蛋白结合结构域，也证明是有利的。本发明人发现包含重链部分C-末端的至少两个白蛋白结合结构域和轻链部分C-末端的至少两个白蛋白结合结构域的本发明的因子VIII蛋白的半衰期增加还更好，优选重链部分C-末端的两个白蛋白结合结构域和轻链部分C-末端的两个白蛋白结合结构域。
本发明还提供了本发明的因子VIII蛋白，其具有重链部分C-末端的两个白蛋白结合结构域和轻链部分C-末端的三个白蛋白结合结构域，或具有重链部分C-末端的两个白蛋白结合结构域和轻链部分C-末端的四个白蛋白结合结构域，或具有重链部分C-末端的三个白蛋白结合结构域和轻链部分C-末端的两个白蛋白结合结构域，或具有重链部分C-末端的四个白蛋白结合结构域和轻链部分C-末端的两个白蛋白结合结构域。任选地，在重链的C-末端和轻链的C-末端具有偶数个白蛋白结合结构域。
接头
尽管本发明人已经证明接头对于本发明的FVIII蛋白的活性和稳定性不是主要必需的，但是为了增加本发明的FVIII的所有结构域的可及性，特别是血液中的白蛋白可及，将接头引入本发明的一些FVIII蛋白中。本发明人已经证明，接头，特别地包含至少甘氨酸-丝氨酸接头部分，进一步改善了表达和功能。特别地，除了白蛋白可及之外，凝血酶的可及性也似乎得到改善。因此，优选地，白蛋白结合结构域可以通过接头与重链部分和/或轻链部分和/或其它白蛋白结合结构域分开，其中任选地，白蛋白结合结构域通过接头与重链部分和轻链部分以及(如果另外直接相邻的话)其它白蛋白结合结构域分开。白蛋白结合结构域也可以通过接头与重链部分和轻链部分以及(如果另外直接相邻的话)其它白蛋白结合结构域分开，除了在轻链的N-末端没有接头，因为α3结构域含有凝血酶切割位点。
在一个优选的实施方案中，在本发明的重组因子VIII蛋白中，接头包含凝血酶切割接头部分。任选地，凝血酶切割接头具有SEQ ID NO：39的序列(abbr.L)。进一步的凝血酶切割位点是本领域已知的，例如Gallwitz等人(2012,PLoS ONE 7(2):e31756)公开的。因此，凝血酶切割接头也可以包含这些可切割位点中的任一个。凝血酶切割接头的优点是，在产生活性蛋白时，即在被凝血酶激活后，接头可被切割，且因此，白蛋白结合结构域可从活性蛋白除去。
或者，在本发明的重组因子VIII蛋白中，不可切割的甘氨酸-丝氨酸接头部分可用于在基序之间引入柔性的空间距离以避免结构影响。因此，任选地，接头包含甘氨酸-丝氨酸接头部分，其任选地具有SEQ ID NO：40(abbr.G1,优选的)或SEQ ID NO：41(abbr.G2)。接头G1可以例如由SEQ ID NO：58编码。接头G2可以例如由SEQ ID NO：59编码。
在优选的实施方案中，将不同的接头部分组合。例如，不可切割的接头部分用于邻接中心凝血酶切割接头部分以保持凝血酶切割接头部分的凝血酶可及性。因此，在一些实施方案中，所述接头包含凝血酶切割接头部分，其每一侧邻接甘氨酸-丝氨酸接头部分，其中所述组合接头任选具有SEQ ID NO：42或SEQ ID NO：43的序列，优选SEQ ID NO：42。
所有接头的多核苷酸序列优选地是对于人使用密码子优化的。本文在本发明的FVIII蛋白的情况中提供了示例性密码子优化的序列。
本发明的特异性FVIII蛋白
本发明的所有FVIII蛋白都表现出良好的体外功能性，其中FVIII蛋白表现出与白蛋白结合结构域数量增加相关的降低的vWF结合。vWF对FVIII的半衰期具有主要影响。发现通过白蛋白对vWF屏蔽FVIII积极影响FVIII蛋白的半衰期。显示了具有在重链和轻链之间的一个位置和在蛋白质的C-末端的一个位置的白蛋白结合结构域的广泛分布增强了FVIII与vWF的屏蔽。
优选地，本发明的重组因子VIII蛋白包含在重链部分和轻链部分之间的一个白蛋白结合结构域，和在轻链部分的C-末端的一个白蛋白结合结构域，其中该序列与SEQ IDNO：47具有至少70％，任选地至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％序列同一性。优选地，所述蛋白质是单链蛋白质。具有SEQ ID NO：47的单链蛋白命名为ADLCLD_SC。与ReFacto
Figure BDA0003525742080000181
相比，其体内半衰期增加约1.5倍。
在特别优选的实施方案中，本发明的重组因子VIII蛋白包含在重链部分和轻链部分之间的至少两个白蛋白结合结构域，和在轻链部分的C-末端包含的至少两个白蛋白结合结构域，其中该蛋白与SEQ ID NO：48、49、51中的任一个具有至少80％的序列同一性，任选地至少90％、至少95％或至少99％的序列同一性。优选地，重组因子VIII蛋白与SEQ ID NO：48具有至少80％序列同一性，任选地至少90％、至少95％或至少99％序列同一性。优选地，所述蛋白质是单链蛋白质。
重组因子VIII蛋白也可与SEQ ID NO：49具有至少80％序列同一性，任选地至少90％、至少95％或至少99％序列同一性。优选地，所述蛋白质是单链蛋白质。
重组因子VIII蛋白也可与SEQ ID NO：51具有至少80％序列同一性，任选地至少90％、至少95％或至少99％序列同一性。优选地，所述蛋白质是单链蛋白质。
例如，本发明提供了具有SEQ ID NO：48(AD2CD2_SC)、SEQ ID NO：49(AD2CD2woL_SC)或SEQ ID NO：51(AbD2CD2_SC)的重组FVIII蛋白。已显示此类FVIII蛋白具有特别延长的体内半衰期，例如对于AD2CD2_SC，已在血友病A小鼠中发现延长2.5倍的体内半衰期且在白蛋白缺陷型转基因新生儿Fc受体小鼠中发现4倍的半衰期延长(参见实施例)。对于AbD2CD2_SC，已发现体内半衰期延长2.2倍。可分析FVIII抗原水平或活性(例如显色活性)水平或两者的半衰期增加。优选地，在显色活性水平上进行分析。
因此，本发明提供了本发明的FVIII蛋白，其中与SEQ ID NO：28的重组因子VIII蛋白(ReFacto
Figure BDA0003525742080000191
)相比，重组因子VIII蛋白的体内半衰期延长(即增加)至少1.2倍，优选至少1.5倍，任选地至少2倍或至少2.5倍。尽管可以在模型系统例如小鼠、大鼠或狗中分析体内半衰期的增加，例如在血友病A小鼠或具有鼠白蛋白敲除并表达人FcRn a链而不是鼠a链的白蛋白缺陷型Tg32小鼠(B6.Cg-Albem12Mvw Fcgrttm1Dcr Tg(FCGRT)32Dcr/MvwJ)中，观察到的体内半衰期的增加可能被低估，因为人白蛋白具有比例如鼠白蛋白更长的半衰期，并且预期在鼠模型中观察到的增加比在人类中还更显著。
融合伴体可用于延长本发明FVIII蛋白的体内血浆半衰期。在一个实施方案中，本发明的重组因子VIII蛋白是融合蛋白，其除了白蛋白结合部分之外还具有至少一个其它异源融合伴体，优选具有延长FVIII蛋白体内血浆半衰期的其它融合伴体。融合伴体可以例如选自Fc区、白蛋白、PAS多肽、HAP多肽、绒毛膜促性腺激素β亚基的C-末端肽及其组合。FVIII蛋白可以可选地或另外地与非蛋白质融合伴体如白蛋白结合小分子(例如达比加群)、PEG(聚乙二醇)和/或HES(羟乙基淀粉)共价连接。PAS多肽或PAS序列是包含主要包含丙氨酸和丝氨酸残基或主要包含丙氨酸、脯氨酸和丝氨酸残基的氨基酸序列的多肽，PAS序列在生理条件下形成无规卷曲构象，如WO 2015/023894中所定义。HAP多肽或序列是同型氨基酸聚合物(HAP)，包括例如WO 2015/023894中定义的甘氨酸或甘氨酸和丝氨酸的重复序列。潜在融合、融合伴体及其组合更详细地描述于例如WO 2015/023894中。
任选地，对于某些治疗应用，重组FVIII蛋白可以与Fc区融合。与Fc区的融合可用于延长半衰期和降低免疫原性。
任选地，所述异源融合伴体可以直接插入到白蛋白结合结构域之一的N-末端或直接插入其C末端，例如重链的C-末端，和/或C2结构域的C末端，或重链C-末端的白蛋白结合结构域的C-末端或重链C-末端的白蛋白结合结构域的C-末端。本发明人已发现这些位置有利于融合，同时保持FVIII蛋白的良好生物活性。任选地，融合蛋白进一步包含至少一个接头。
蛋白可以进一步被糖基化和/或硫酸化。优选地，蛋白的翻译后修饰如糖基化和/或硫酸化发生在人类细胞中。使用用于生产的人细胞系，例如CAP细胞，尤其是CAP-T细胞或CAP-Go细胞可以实现特别合适的翻译后修饰谱((WO 2001/36615；WO 2007/056994；WO2010/094280；WO 2016/110302))。可从Cevec Pharmaceuticals GmbH(德国科隆)获得的CAP细胞源自人类羊水细胞，因为它们是在常规羊膜穿刺术期间经腹分离的。获得的羊水细胞用腺病毒功能(E1A、E1B和pIX功能)转化，随后适应在无血清培养基中悬浮生长。
在翻译后修饰过程中，本发明的FVIII蛋白可以例如在酸性区域a1、a2和a3中的一个、两个、三个、四个、五个或六个酪氨酸上被硫酸化。
去免疫因子VIII蛋白
任选地，本发明的重组因子VIII蛋白是去免疫的蛋白，即在血友病患者中该蛋白与wt FVIII相比具有降低的免疫原性。例如，引入某些突变，优选置换，以避免可能存在于人HLA分子，优选共同人HLA分子上的表位的存在。
本发明提供了本发明的重组因子VIII蛋白，其在选自以下的位置包含至少三个氨基酸置换：Y748、L171、S507、N79、I80、I105、S112、L160、V184、N233、L235、V257、I265、N299、Y426、Y430、L505、F555、I610、N616、I632、L706、N754、K1837、R1936、S2030、S2037、N2038、S2077、M2123、S2125、F2215、K2226、K2258、V2313、S2315、V2333和Q2335；
其中N的置换独立地选自以下：D、H、S和E；其中I的置换独立地选自以下：T和V；其中S的置换独立地选自以下：A、N、G、T和E；其中L的置换独立地选自以下：N、Q、F和S；其中V的置换独立地选自以下：A和T；其中Y的置换独立地选自以下：N、H和S；其中F的置换独立地选自以下：H和S；其中K的置换独立地选自以下：N、D、E、Q、S和T；其中R的置换独立地选自以下：Q、H和S；其中M的置换选自以下：R、Q、K和T；和/或其中Q的置换选自以下：R、D、E、H和K；
其中所述位置是相对于包含信号序列编号的SEQ ID NO:1所示的全长人因子VIII分子而指定的；
并且其中与由SEQ ID NO：60(FVIII-6rs)组成的因子VIII蛋白相比，所述重组因子VIII蛋白保留至少50％的凝血活性，如在显色测定中所测定的。本发明还提供了所述重组因子VIII蛋白的融合蛋白。
在一个方面，本发明还提供了本发明的重组因子VIII蛋白，所述重组因子VIII蛋白在选自Y748、L171、S507、N79、I80、I105、S112、L160、V184、N233、L235、V257、I265、N299、Y426、Y430、L505、F555、I610、N616、L706、N754、K1837、R1936、S2030、S2037、N2038、S2077、M2123、F2215、K2226、K2258、V2313、S2315、V2333和Q2335的位置处包含至少三个氨基酸置换；
其中N的置换独立地选自以下：D、H、S和E；其中I的置换独立地选自以下：T和V；其中S的置换独立地选自以下：A、N、G、T和E；其中L的置换独立地选自以下：N、Q、F和S；其中V的置换独立地选自以下：A和T；其中Y的置换独立地选自以下：N、H和S；其中F的置换独立地选自以下：H和S；其中K的置换独立地选自以下：N、D、E、Q、S和T；其中R的置换独立地选自以下：Q、H和S；其中M的置换选自以下：R、Q、K和T；和/或其中Q的置换选自以下：R、D、E、H和K；
其中所述位置是相对于包含信号序列编号的SEQ ID NO:1所示的全长人因子VIII分子而指定的；
和其中与由SEQ ID NO:60组成的因子VIII蛋白(FVIII-6rs)相比，如在显色测定中所测定的，所述重组因子VIII蛋白保留了至少50％的凝血活性。本发明还提供了本发明所述重组因子VIII蛋白的融合蛋白。
本发明进一步提供了本发明的重组因子VIII蛋白，其在选自以下的位置包含至少一个氨基酸置换：Y748、L171、S507、N79、I80、I105、S112、L160、V184、N233、L235、V257、I265、N299、Y426、Y430、L505、F555、I610、N616、I632、L706、N754、K1837、R1936、S2030、S2037、N2038、S2077、M2123、S2125、F2215、K2226、K2258、V2313、S2315、V2333和Q2335；(或优选地Y748、L171、S507、N79、I80、I105、S112、L160、V184、N233、L235、V257、I265、N299、Y426、Y430、L505、F555、I610、N616、L706、N754、K1837、R1936、S2030、S2037、N2038、S2077、M2123、F2215、K2226、K2258、V2313、S2315、V2333和Q2335)。
其中N的置换独立地选自以下：D、H、S和E；其中I的置换独立地选自以下：T和V；其中S的置换独立地选自以下：A、N、G、T和E；其中L的置换独立地选自以下：N、Q、F和S；其中V的置换独立地选自以下：A和T；其中Y的置换独立地选自以下：N、H和S；其中F的置换独立地选自以下：H和S；其中K的置换独立地选自以下：N、D、E、Q、S和T；其中R的置换独立地选自以下：Q、H和S；其中M的置换选自以下：R、Q、K和T；和/或其中Q的置换选自以下：R、D、E、H和K；
其中，如果所述置换在位置S507，则其是S507E，和如果所述置换在位置N616，则其是N616E，和如果所述置换在位置F2215，则其是F2215H；
其中所述位置是相对于包含信号序列编号的SEQ ID NO:1所示的全长人因子VIII分子而指定的，
和其中与由SEQ ID NO:60组成的因子VIII蛋白(FVIII-6rs)相比，如在显色测定中所确定的，所述重组因子VIII蛋白保留了至少50％的凝血活性，
或者所述重组因子VIII蛋白的融合蛋白。所述蛋白还优选地是包含至少三个上文所定义的置换的蛋白。
优选地，如果置换在位置K2226，则其是K2226Q，和如果所述置换在位置Q2335，则其是Q2335H。在一个实施方式中，无Q2335的置换。
发明人已经发现，具有如本文所定义的置换的本发明的重组因子VIII蛋白具有显著降低的免疫原性，同时基本上保持了凝血活性。因此，其对于治疗血友病A是有用的，特别是避免生成和/或进一步产生包括FVIII抑制性抗体在内的抗FVIII抗体。
本发明的FVIII蛋白已在T细胞表位水平上去免疫化。在通常情况下，抗原以与APC表面上的II类MHC结合的肽的形式呈递至T细胞。由于在本发明的蛋白中已经鉴定并消除了与大多数人群相关的T细胞表位，因而将有较少的免疫原性肽被抗原呈递细胞(APC)(例如，树突状细胞(DC)或B细胞)呈递到T细胞。这继而阻止或减少了初始T细胞的激活。在没有激活的辅助性T细胞的情况下，初始B细胞不会被激活，也无法分化成分泌抗FVIII抗体的浆细胞和记忆B细胞。
因此，通过本发明的方法，在该过程非常早期时就减少或者最佳地阻止了抗体的形成，即通过减少响应于FVIII抗原的初始辅助性T细胞的刺激。除了减少初始辅助性T细胞的成熟以外，由于根据本发明方法的抗原呈递减少，还可能防止或减少可能已经存在的针对FVIII的记忆辅助性T细胞的再刺激。
肽结合所需的II类MHC结合小沟中的位置以及对于结合重要的肽氨基酸是已知的。作为第一步，已将计算机分析方法用于预测哪种FVIII肽最有可能与常见的II类MHC复合物结合，且其中的哪些仅在FVIII中发生，而在其他人类蛋白中不发生。将这些肽认为是免疫原性的。使用进一步的计算机软件工具，并将其与来自其他物种的FVIII和无关人蛋白进行比较，提出氨基酸突变的建议，以防止FVIII肽与II类MHC复合物结合。如2019年4月11日提交的PCT/EP2019/059233中所述，基于这些预测和实验测试，已经产生了突变的FVIII变体，其在凝血中仍具有功能，但认为其在血友病A患者中不再会激发产生相同程度的抑制性抗体。对于本发明，已经产生并测试了包含因子VIII的重链部分和轻链部分以及至少两个白蛋白结合结构域的去免疫FVIII蛋白，其中至少一个白蛋白结合结构域在重链部分的C-末端，至少一个白蛋白结合结构域在轻链部分的C-末端，其中如果蛋白是单链蛋白，则在重链部分C-末端的白蛋白结合结构域是在轻链部分的N-末端。
与由SEQ ID NO:60组成的因子VIII蛋白(FVIII-6rs)相比，如在显色测定中所确定的，本发明的去免疫VIII蛋白保留了至少50％的凝血活性。FVIII-6rs是不包含其他突变的B结构域缺失的FVIII蛋白，其具有与野生型人FVIII基本上相同的凝血活性。优选地，与由SEQ ID NO:60组成的因子VIII蛋白相比，本发明的FVIII蛋白具有70％、至少80％、至少90％或至少100％的凝血活性。凝血活性还可能更高，例如，与由SEQ ID NO:60组成的因子VIII蛋白相比，至少110％、至少120％、至少130％、至少140％、至少150％、至少190％、至少200％或至少400％的凝血活性。
在本发明中，如果没有另外说明，则凝血活性是在显色测定中确定的。根据标准程序进行显色测定，例如如在下述实施例中详细描述的。该测定优选使用转染表达载体(例如，如实施例中所述的)并表达目标FVIII变体的人细胞(例如，HEK293-F)细胞的上清液进行，相比于在相同条件下使用表达FVIII-6rs的相同基本表达载体转染的相同细胞上清液。因此，可以分析相对凝血活性，其中将突变体的显色凝血活性标准化至未突变分子(即FVIII-6rs)的显色凝血活性。该测定检测细胞合成和分泌突变蛋白的能力以及分泌蛋白的凝血活性。
此外，本发明的FVIII优选还具有较高的比凝血活性。比凝血活性描述了上文所定义的FVIII显色凝血活性与FVIII抗原浓度的比率，如通过FVIII特异性ELISA(例如，如本文所述的)所确定的。本发明的FVIII蛋白的比凝血活性可以是例如至少50％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少110％、至少120％、至少130％、至少150％、至少170％或至少190％。
在上清液中具有低的相对凝血活性，但具有高比凝血活性的蛋白可能假定具有合成、折叠和/或分泌问题。这能够通过在特定细胞系中表达潜在地改善，例如通过伴体蛋白的过表达。
本发明的因子VIII蛋白与FVIII-6rs相比可以具有至少50％，优选地，至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少110％、至少120％或至少130％的凝血活性和比凝血活性(均通过显色方法确定)。
凝血活性可以可选地或另外地通过一期凝结法来评估，如本文实验部分所述的。在一个特别优选的实施方式中，通过显色法和通过凝结法确定的凝血活性与FVIII-6rs的凝血活性相比均至少为50％，优选地，至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％或者甚至至少150％。
发明人发现，就降低免疫原性和保持凝血中的功能活性而言，所检测的特定置换是特别有利的。因此，在本发明中，本发明的重组因子VIII蛋白的氨基酸置换优选地选自以下：Y748S、L171Q、S507E、N79S、I80T、I105V、S112T、L160S、V184A、N233D、L235F、V257A、I265T、N299D、Y426H、Y430H、L505N、F555H、I610T、N616E、I632T、L706N、N754D、K1837E、R1936Q、S2030A、S2037G、N2038D、S2077G、M2123K、S2125G、F2215H、K2226Q、K2258Q、V2313A、S2315T、V2333A和Q2335H。
本发明的因子VIII蛋白例如可以包含3-38、3-25、4-25、5-24、6-23、7-22、8-21、9-20、10-19、11-18、12-17、13-16或14-15个所述置换。优选地，本发明的重组因子VIII蛋白包含3-25个所述置换，且所述置换位于不同的免疫原性簇内。免疫原性簇是在蛋白中鉴定的肽，其以高亲和性结合多种HLA-DR超类型。换言之，免疫原性簇是针对蛋白中鉴定的不同HLA超类型的T细胞表位的簇，例如，如在下述实施例中更加详细描述的。FVIII的免疫原性簇如SEQ ID NO：74-108和112中所定义的(表6)。优选地，每个免疫原性簇仅有一个所述置换。更优选地，本发明的重组因子VIII蛋白包含15-19个所述置换。
本发明的重组因子VIII蛋白包含位于不同免疫原性簇内的至少三个置换，优选地包含在选自以下的位置的至少三个氨基酸置换：Y748、L171、S507、N79、S112、L160、V184、N233、I265、N299、Y426、F555、N616、I632、L706、K1837、R1936、N2038、S2077、S2125、F2215、K2226、K2258、S2315和V2333。至少三个氨基酸置换优选地选自以下：Y748S、L171Q、S507E、N79S、S112T、L160S、V184A、N233D、I265T、N299D、Y426H、F555H、N616E、I632T、L706N、K1837E、R1936Q、N2038D、S2077G、S2125G、F2215H、K2226Q、K2258Q、S2315T和V2333A。
优选的FVIII蛋白在A1区中的4个位置和/或A1中的7个位置和/或A1A2中的3个位置和/或A2中的5个位置和/或A3C1C2中的6个位置引入置换，其具有超过100％的比凝血活性，例如根据下述列表：
A1：N79、S112、N233、I265，特别是N79S、S112T、N233D、I265T；
A1：N79、S112、L160、L171、V184、N233、I265，特别是N79S、S112T、L160S、L171Q、V184A、N233D、I265T；
A1A2：N299、Y426、S507；特别是N299D、Y426H、S507E；
A2：F555、N616、I632、L706、Y748，特别是F555H、N616E、I632T、L706N、Y748S；
A3C1C2：N2038、S2077、S2125、K2258、S2315、V2333，特别是N2038D、S2077G、S2125G、K2258Q、S2315T、V2333A。
进一步优选的FVIII蛋白在A2中的4个位置和/或在A3C1C2中的3个位置和/或在A3C1C2中的4个位置和/或在A3C1C2中的4个位置和/或在A3C1C2中的5个位置引入置换：
A2：F555、N616、L706、Y748，特别是F555H、N616E、L706N、Y748S；
A3C1C2：S2077、S2315、V2333，特别是S2077G、S2315T、V2333A；
A3C1C2：N2038、S2077、S2315、V2333，特别是N2038D、S2077G、S2315T、V2333A；
A3C1C2：S2077、K2258、S2315、V2333，特别是S2077G、K2258Q、S2315T、V2333A；
A3C1C2：N2038、S2077、K2258、S2315、V2333，特别是N2038D、S2077G、K2258Q、S2315T、V2333A。
在凝血活性(显色凝血活性、凝结凝血活性和比凝血活性)方面具有特别优异结果的优选的组合在以下位置引入置换：
FVIII-GOF1：L171、S507、Y748、V2333，特别是L171Q、S507E、Y748S、V2333A；
FVIII-GOF2：L171、N299、N616、V2333，特别是L171Q、N299D、N616E、V2333A。
在降低簇评分方面(其相应地计算为强烈降低免疫原性)具有特别好的结果的进一步优选的组合为：
FVIII-LS1：S112、S507、Y748、K1837、N2038，特别是S112T、S507E、Y748S、K1837E、N2038D；
FVIII-LS2：S112、Y426、N754、K1837、N2038，特别是S112T、Y426H、N754D、K1837E、N2038D。
本发明的优选的重组因子VIII蛋白至少在以下位置处包含氨基酸置换
a.N79S、S112T、N233D和I265T；和/或
b.N79S、S112T、L160S、L171Q、V184A、N233D和I265T；和/或
c.N299D、Y426H和S507E；和/或
d.F555H、N616E、L706N、Y748S；和/或
e.F555H、N616E、I632T、L706N和Y748S；和/或
f.S2077G、S2315T和V2333A；和/或
g.N2038D、S2077G、S2315T和V2333A；和/或
h.S2077G、K2258Q、S2315T和V2333A；和/或
i.N2038D、S2077G、K2258Q、S2315T和V2333A；和/或
j.N2038D、S2077G、S2125G、K2258Q、S2315T和V2333A；和/或
k.L171Q、S507E、Y748S和V2333A；和/或
l.L171Q、N299D、N616E和V2333A；和/或
m.S112T、S507E、Y748S、K1837E和N2038D；和/或
n.S112T、Y426H、N754D、K1837E和N2038D。
本发明的优选蛋白具有本文图14中列出的置换。
特别优选的蛋白至少组合b和c中指定的置换。如图14中所示，这些置换的组合导致较高显色和凝结凝血活性以及较高比凝血活性。本发明进一步特别优选的蛋白至少组合在b和c中指定的置换以及在d或e和/或f、g、h、i或j中指定的置换和/或K1837E。本发明的蛋白例如可以包含在b、c和d或e中指定的置换。本发明其他有利的蛋白包含在b、c和d以及f、g、h、i或j中指定的置换。本发明其他有利的蛋白包含在b、c和e以及f、g、h、i或j中指定的置换。
任选地，蛋白进一步包含K1837E。这种置换对免疫原性评分具有很高影响，但似乎对蛋白的凝血活性具有负面影响。因此，还设想本发明的蛋白在K1837处不包含置换，或不包含K1837E。
任选地，本发明的蛋白(例如，包含置换Y748S、L171Q、S507E、N79S、S112T、L160S、V184A、N233D、I265T、N299D、Y426H、F555H、I632T、L706N、K1837E、R1936Q、N2038D、S2077G、S2125G、F2215H、K2226Q、K2258Q、S2315T和V2333A)不包含在N616的置换，如N616E。另一方面，包含该置换进一步降低了免疫原性评分和蛋白的免疫原性，因此，通常，优选包含该置换。
在一个组合中，本发明的蛋白包含置换Y748S、L171Q、N79S、S112T、L160S、V184A、I265T、N299D、Y426H、F555H、I632T、L706N、R1936Q、N2038D、S2077G、S2125G、F2215H、K2226Q、K2258Q和任选地，S507E。
发明人可以特别地显示重组因子VIII蛋白的置换的有利组合，所述重组因子VIII蛋白的置换至少在以下位置包含氨基酸置换：N79、S112、L160、L171、V184、N233、I265、N299、Y426、S507、F555、N616、L706和Y748，其中优选地置换是N79S、S112T、L160S、L171Q、V184A、N233D、I265T、N299D、Y426H、S507E、F555H、N616E、L706N和Y748S(例如，FVIII-14M)。优选地，蛋白还包含在K1837的置换，如K1837E。
优选地，在指定位置选择置换的所有氨基酸均会降低相关免疫原性簇的簇评分。
与由SEQ ID NO:60组成的因子VIII蛋白(FVIII-6rs)相比，本发明的重组因子VIII蛋白具有降低的免疫原性。可以通过免疫原性评分确定免疫原性，其可以如本文所述进行计算。FVIII-6rs的免疫原性评分是7.01，和ReFacto AF的免疫原性评分是10.03。优选地，本发明的因子VIII蛋白与不具有所述置换的因子VIII蛋白相比(例如，与FVIII-6rs相比)，具有降低至少3、至少5、至少7、至少10、至少12、至少13或至少15的免疫原性评分。例如，FVIII-19M具有-10.55的免疫原性评分，即与FVIII-6rs相比免疫原性评分降低17.56。作为进一步的实例，SEQ ID NO：16(AC_SC)具有11.18的免疫原性评分，当并入所述19个去免疫氨基酸置换(SEQ ID：113(AC-19M_SC)时，其降低17.58。SEQ ID NO：114中并入另外四个白蛋白结合结构域与接头(AD2CD2-19M_SC)导致甚至更低的-14.93的免疫原性评分。
优选地，可以通过测定确定免疫原性，所述测定包括将与所述蛋白一起孵育的树突状细胞与供体的调节性T细胞耗竭的CD4+T细胞共培养并检测所述T细胞的激活。在下面进一步详细描述由发明人提供的这种测定法。T细胞可以来自健康供体或来自患者，例如来自血友病A患者。
在本发明的所有去免疫重组FVIII蛋白中，将位置指定为相对于SEQ ID NO:1所示的全长人因子VIII分子。在现有技术中，作者之间对FVIII分子中的氨基酸的注释不同。这主要是由于19个氨基酸的信号序列，可以将其包括在氨基酸计数中，也可以省略。正负19个氨基酸的这种变异通常是全长FVIII序列的唯一数字差异。对于B结构域缺失的FVIII序列，该缺失也可能导致计数移位。对于重链，数量与全长FVIII的数量相关。B结构域缺失后，轻链数量与全长FVIII分子保持相同(例如，缺失前的Q763在缺失后紧接D1582)，或者可以是连续的，就像没有发生缺失一样(例如，尽管缺少氨基酸，但Q763之后是D764)。如果不知道缺失了多少氨基酸，则连续计数会使氨基酸序列的比较复杂化。连续计数是罕见的，尽管有B结构域缺失，但是大多数作者仍保持全长FVIII分子计数。据此，在本发明中，相对于SEQID NO:1的全长人FVIII分子，规定了重组FVIII蛋白中的置换位置。但是，分泌的重组FVIII蛋白不包含信号序列，包含本文指定的白蛋白结合结构域，并且通常是B结构域缺失的变体。
本领域公知，FVIII的正常凝血功能不需要B结构域，因此，各种B结构域缺失的FVIII蛋白是众所周知的。在本发明的上下文中，B结构域缺失的FVIII蛋白可以包含B结构域的全部或部分缺失。B结构域缺失的FVIII蛋白可以仍含有B结构域的氨基末端序列，例如其可能对翻译产物的蛋白水解过程是重要的。而且，B结构域缺失的FVIII蛋白可以包含B结构域的一个或多个片段，以保留一个或多个N-连接的糖基化位点。优选地，FVIII蛋白不含任何弗林蛋白酶切割位点，导致蛋白的轻链和重链共价连接的单链蛋白。
例如，B结构域缺失的FVIII蛋白可能仍包含B结构域的0-200个残基，例如1-100个残基，优选地8至90个残基。B结构域的剩余残基可以来自B结构域的N末端和/或C末端和/或来自内部区域。例如，来自B结构域C末端的剩余残基可以含有1-100个、优选地20-90个、更优选地86个残基。在其他实施方式中，来自C末端的剩余残基可以含有1-20个残基，例如4个残基。例如，来自B结构域N末端的剩余残基可以含有1-100个、优选地2-20残基、更优选地2-10个残基、更优选地4个残基。例如，来自B结构域内部区域的剩余残基可以含有2-20个、优选地2-10个、更优选地4至8个残基。在一个优选的实施方式中，FVIII蛋白包含B结构域的86个C末端残基和B结构域的4个N末端残基，例如FVIII-19M。
在整个发明中，本发明的重组因子VIII蛋白可以与SEQ ID NO:63所示的成熟(即，不包括信号序列)FVIII-19M蛋白具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性，其中序列同一性的确定仅考虑将A1、a1、A2、a2、a3、A3、C1和C2结构域(残基20-759和残基1668-2351)。换言之，对于确定序列同一性，不考虑B结构域(全长人序列SEQ ID NO:1的残基760-1667，以及在部分B结构域缺失的蛋白中与之对应的残基)和信号序列(残基1-19)，以及白蛋白结合结构域和任选的接头或其它融合伴体。
因此，与SEQ ID NO:1所示的成熟全长人因子VIII蛋白或其B结构域缺失变体(例如，根据SEQ ID NO:3)，与SEQ ID NO:63所示的FVIII蛋白的序列同一性％是相同的，特别地是98.67％，其中序列同一性的确定仅考虑A1、a1、A2、a2、a3、A3、C1和C2结构域。本发明优选的FVIII蛋白与SEQ ID NO:63具有至少98.74％的序列同一性，其中序列同一性的确定仅考虑A1、a1、A2、a2、a3、A3、C1和C2结构域。
例如，对于仅具有一个所述置换的成熟B结构域缺失的FVIII蛋白，在A1、a1、A2、a2、a3、A3、C1和C2结构域确定相对于SEQ ID NO:63所示成熟FVIII-19M蛋白的序列同一性％，即1424个氨基酸中的18个被置换，因此该蛋白与SEQ ID NO：63的FVIII-19M蛋白具有至少98.74％的序列同一性。对于具有也在FVIII-19M中发生的3个所述置换的成熟B结构域缺失的FVIII蛋白，在A1、a1、A2、a2、a3、A3、C1和C2结构域确定相对于SEQ ID NO:63所示成熟FVIII-19M蛋白的序列同一性％，即1424个氨基酸中的16个被置换，因此该蛋白与SEQ IDNO：63的FVIII-19M蛋白具有至少98.88％的序列同一性。对于具有也在FVIII-19M中发生的4个所述置换的本发明的成熟B结构域缺失的FVIII蛋白，其1424个氨基酸中的15个被置换，因此具有98.95％序列同一性。与FVIII-19M相比，引入全部38个所述置换的成熟B结构域缺失的FVIII蛋白具有19个另外的置换，因此与FVIII-19M相比具有98.67％序列同一性。
如果仅通过参考A1、a1、A2、a2、a3、A3、C1和C2结构域来定义序列同一性，而且序列同一性仅针对分子的因子VIII部分(定义为基于A1、a1、A2、a2、a3、A3、C1和C2结构域)确定，即不考虑白蛋白结合结构域和任选的接头，或如果该蛋白为具有另外的融合伴体的融合蛋白(例如，含有任何尺寸的插入)、融合的或插入的部分、蛋白结构域或区域(例如，如本文中进一步描述的)均未被考虑。因此，为了确定序列同一性，如果存在，则将忽略融合伴体，然后计算与A1、a1、A2、a2、a3、A3、C1和C2的序列同一性％。可以根据本领域所公知的计算序列同一性，例如使用Needleman-Wunsch算法，或优选地，Smith-Waterman算法(Smith等人，1981，“Identification of Common Molecular Subseqences”，JMol Biol.147：195-197)。
在一个实施方式中，除了本文特定的置换以外，FVIII蛋白的所有残基，特别是针对A1、a1、A2、a2、a3、A3、C1和C2结构域的残基，均对应于(即，与之相同)SEQ ID NO:1所示的人因子VIII蛋白的残基。任选地，这也可以适用于B结构域或B结构域中存在的那些部分。
在另一个实施方式中，本发明的FVIII蛋白还引入其他突变，例如，本领域公知的可降低关于其他T细胞表位和/或B细胞表位的免疫原性的突变，和/或本领域公知的可改善蛋白血清半衰期的突变，和/或促进蛋白纯化的突变，例如，产生单链蛋白。由于B结构域的部分缺失和单链蛋白的工程化，也可以引入突变。
本发明的重组因子VIII蛋白可以与SEQ ID NO：65(FVIII-15M)的氨基酸20-1533具有例如至少90％，任选地100％的序列同一性，即成熟蛋白不包含19aa的N-末端信号序列，其中序列同一性的确定仅考虑A1、a1、A2、a2、a3、A3、C1和C2结构域。
优选的重组因子VIII蛋白在位置N79、S112、L160、L171、V184、N233、I265、N299、Y426、S507、F555、N616、L706、Y748、N2034、S2077、S2315和V2333处包含至少18个氨基酸置换，其中优选地该18个置换是N79S、S112T、L160S、L171Q、V184A、N233D、I265T、N299D、Y426H、S507E、F555H、N616E、L706N、Y748S、N2034D、S2077G、S2315T和V2333A。任选地，所述蛋白质与SEQ ID NO：64(FVIII-18M)的氨基酸20-1533具有至少90％，例如100％的序列同一性，即成熟蛋白质不包含19个氨基酸的N-末端信号序列，其中序列同一性的确定仅考虑A1、a1、A2、a2、a3、A3、C1和C2结构域。
另一优选的重组因子VIII蛋白在位置N79、S112、L160、L171、V184、N233、I265、N299、Y426、S507、F555、N616、L706、Y748、K1837、N2038、S2077、S2315和V2333处包含至少19个氨基酸置换，其中优选地该19个置换是N79S、S112T、L160S、L171Q、V184A、N233D、I265T、N299D、Y426H、S507E、F555H、N616E、L706N、Y748S、K1837E、N2038D、S2077G、S2315T和V2333A。任选地，所述蛋白质与SEQ ID NO：63(FVIII-19M)的氨基酸20-1533具有100％序列同一性，即成熟蛋白质不包含19个氨基酸的N-末端信号序列，其中序列同一性的确定仅考虑A1、a1、A2、a2、a3、A3、C1和C2结构域用于。
尽管，总体上，本发明人发现引入上述19个突变导致T细胞表位数量减少，但发现在位置L160、F555和S2315处的突变导致潜在的从头合成T细胞表位。因此，避免这些突变可能是有利的。因此，另一优选的重组因子VIII蛋白在位置N79、S112、L171、V184、N233、I265、N299、Y426、S507、N616、L706、Y748、K1837、N2038、S2077和V2333处包含至少16个氨基酸置换，其中优选地该16个置换是N79S、S112T、L171Q、V184A、N233D、I265T、N299D、Y426H、S507E、N616E、L706N、Y748S、K1837E、N2038D、S2077G和V2333A。优选地，所述蛋白质包含L160、F555和S2315中的至少一个，优选全部，即其在这些位置处不包含突变。任选地，所述蛋白质与SEQ ID NO：134(FVIII-16M_SC)的氨基酸20-1533具有100％序列同一性，即成熟蛋白质不包含19个氨基酸的N-末端信号序列，其中序列同一性的确定仅考虑A1、a1、A2、a2、a3、A3、C1和C2结构域。
本发明蛋白可与之具有100％序列同一性(其中仅考虑A1、a1、A2、a2、a3、A3、C1和C2结构域用于确定序列同一性)的其它FVIII蛋白的序列提供为SEQ ID NO：66-73或109，其中尽管所述序列都包含19个氨基酸的N-末端信号序列，但本发明的优选成熟FVIII蛋白不再包含所述信号序列。因此，它们可以分别与SEQ ID NO：66-73或103的氨基酸20-1533具有至少90％或任选地100％的序列同一性，其中序列同一性的确定仅考虑A1、a1、A2、a2、a3、A3、C1和C2结构域。
本发明还提供了与SEQ ID NO：114-119中任一个具有100％序列同一性的本发明FVIII蛋白，其中序列同一性的确定仅考虑A1、a1、A2、a2、a3、A3、C1和C2结构域，其中尽管所述序列都包含19个氨基酸的N-末端信号序列，但本发明的优选成熟FVIII蛋白不再包含所述信号序列。因此，它们可以分别与SEQ ID NO：114的aa 20-1778，或与SEQ ID NO：115的aa20-1594，或与SEQ ID NO：116的aa 20-1575，或与SEQ ID NO：117的aa 20-1575，或与SEQID NO：118的aa 20-1686，或与SEQ ID NO：119的aa 20-1778具有100％序列同一性，其中序列同一性的确定仅考虑A1、a1、A2、a2、a3、A3、C1和C2结构域用于。
本发明还提供与SEQ ID NO：114-119中任一个具有至少80％，优选至少90％、至少95％、至少99％或100％序列同一性的FVIII蛋白，其中尽管所述序列都包含19个氨基酸的N-末端信号序列，但本发明的优选成熟FVIII蛋白不再包含所述信号序列。这些蛋白质还可以包含如SEQ ID NO：114-119中定义的白蛋白结合结构域和/或接头。因此，它们可以与SEQID NO：114的氨基酸20-1778具有至少80％，优选至少90％、至少95％、至少99％或100％的序列同一性。本发明的蛋白质可以与SEQ ID NO：115的氨基酸20-1594具有至少80％，优选至少90％、至少95％、至少99％或100％的序列同一性。本发明的蛋白质可以与SEQ ID NO：116的氨基酸20-1575具有至少80％，优选至少90％、至少95％、至少99％或100％的序列同一性。本发明的蛋白可以与SEQ ID NO：117的氨基酸20-1575具有至少80％，优选至少90％、至少95％、至少99％或100％的序列同一性。本发明的蛋白质可以与SEQ ID NO：118的aa20-1686具有至少80％，优选地至少90％、至少95％、至少99％或100％序列同一性。本发明的蛋白可以与SEQ ID NO：119的氨基酸20-1778具有至少80％，优选至少90％、至少95％、至少99％或100％的序列同一性。
如上所述，本发明FVIII蛋白的FVIII部分可以是去免疫的。另外地或可选地，还可以使FVIII部分，ABD和接头之间的接头区去免疫化。导致这些区域去免疫化的位置中的置换在下表10中指定。本发明的FVIII蛋白可以包含至少一个，优选2个或更多、3个或更多、4个或更多、5个或更多、6个或更多、7个或更多、8个或更多、9个或更多、10个或更多、11个或更多、12个或更多、13个或更多或者14个在所述表中列举的置换，优选以所列组合之一。此外，加工序列C末端的凝血酶切割接头的第一氨基酸可被置换为D，如例如上文所定义的。
除了包含在本发明FVIII蛋白中的白蛋白结合结构域之外，该蛋白可以是具有另一融合伴体的融合蛋白，例如，与如SEQ ID NO:63中所示的FVIII-19M具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的重组因子FVIII蛋白的融合蛋白，其中仅将A1、a1、A2、a2、a3、A3、C1和C2结构域考虑用于计算序列同一性。
融合伴体优选延长本发明的FVIII蛋白的体内血清半衰期。融合伴体可以选自以下，包括：Fc区、白蛋白、PAS多肽、HAP多肽、绒毛膜促性腺激素β亚基的C末端肽及其组合。FVIII蛋白可以替代地或另外地与非蛋白融合伴体如白蛋白结合小分子和/或PEG(聚乙二醇)和/或HES(羟乙基淀粉)共价连接。PAS多肽或PAS序列是包含氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列主要包含丙氨酸和丝氨酸残基或主要包含丙氨酸、脯氨酸和丝氨酸残基，PAS序列在生理条件下形成无规则卷曲构象，如在WO 2015/023894中所定义的。HAP多肽或序列是高氨基酸聚合物(HAP)，其包含例如WO 2015/023894中定义的甘氨酸或甘氨酸和丝氨酸的重复序列。例如在WO2015/023894中更详细地描述了潜在的融合、融合伴体及其组合。
优选地，对于治疗应用，将重组FVIII蛋白至少融合至Fc区域。FVIII与Fc区的融合蛋白在现有技术中已知降低免疫原性(Krishnamoorthy等人，“Recombinant factor VIIIFc(rFVIIIFc)fusion protein reduces immunogenicity and induces tolerance inhemophilia A mice”，Cell.Immunol.2016，http://dx.doi.org/10.1016/j.cellimm.2015.12.2008；Carcao等人，“Recombinant factor VIII Fc fusion proteinfor immune tolerance induction in patients with severe haemophilia A withinhibitors–Aretrospective analysis”，Haemophilia 2018：1-8)。
融合伴体可以例如连接至本发明的FVIII蛋白的N末端或C末端，但是其也可以插入在FVIII序列内，只要FVIII蛋白保持如本文所定义的功能即可。如上文所述，当通过参考A1、a1、A2、a2、a3、A3、C1和C2结构域定义序列同一性时，为了确定序列同一性，不考虑插入例如如本文所定义的1、2、3、4、5、6、7、8、9个或10个融合伴体来降低序列同一性。
发明人发现，在选择用于生产的细胞系中产生了高比例的作为单链蛋白的本发明的FVIII蛋白。据信作为单链蛋白生产FVIII不会降低凝血活性，但是可能对纯化有益。为了简化纯化，本发明的FVIII蛋白可以是单链蛋白或至少具有至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的比例的单链蛋白。或者，可以将本发明的FVIII蛋白作为异源二聚体FVIII蛋白生产。优选地，本发明的FVIII蛋白是单链B结构域缺失的因子VIII蛋白。
重组单链FVIII蛋白是本领域公知的，其中，例如，去除至少部分B结构域以及相邻酸性a3结构域的4个氨基酸(例如，全长FVIII的残基784-1671)，特别是去除弗林蛋白酶裂解位点(EMA/CHMP/699390/2016–评估报告AFSTYLA)。示例性的单链FVIII蛋白提供为SEQID NO:62。示例性FVIII单链蛋白基于SEQ ID NO:62，其掺入本文所示的19个突变，例如，与FVIII-19M中引入的19个突变相同，缺少FVIII-19M的a3结构域的4个氨基酸，即其与SEQ IDNO:63具有99.72％(至少99％)序列同一性，其中仅考虑A1、a1、A2、a2、a3、A3、C1和C2结构域用于计算序列同一性。所述蛋白可以是B结构域缺失的，并且可以是融合蛋白，例如如上文所述的。
蛋白可以进一步被糖基化和/或硫酸化。优选地，在人细胞中发生蛋白的翻译后修饰，如糖基化和/或硫酸化。
在本发明的一个实施方式中，蛋白能够与vWF结合。例如，本发明的FVIII蛋白与vWF的结合效力是ReFacto AF与vWF结合效力的0％-100％、10％-90％、20-80％、30-70％、40-60％或50-60％，可以通过基于ELISA的方法确定，例如，如本文所述的。如本文所示，与ReFacto AF相比，包含几个所述突变的本发明的FVIII蛋白的结合能力可以是降低的，例如，降低至小于60％。
本发明的蛋白优选在体外和体内在人血浆中是稳定的，因此其可以在药学上使用。发明人可以显示出，在人血浆中在37℃下体外温育24小时后，保持了FVIII-19M的显色凝血活性的约83％。对于FVIII-6rs，在相同条件下，保持了约91％的凝血活性，对于ReFacto AF和Nuwiq，其为97％。
优选地，在体内，本发明的FVIII蛋白在人血清(在未使用抑制剂的患者中)的半衰期为约至少6小时，优选地，至少12小时、至少18小时、至少24小时或至少30小时。如本文所定义的，FVIII蛋白可以是无进一步的融合伴体的FVIII蛋白，或者其可以是如本文所定义的融合蛋白。任选地，在没有融合伴体的情况下，已经获得了特定的半衰期。在存在其他伴体的情况下，FVIII蛋白的半衰期可能是相容的，或者甚至更长。
本文所述的置换的组合降低了具有至少一个分析的HLA-DR超类型等位基因(DRB1*0101、DRB1*0301、DRB1*0401、DRB1*0701、DRB1*0801、DRB1*1101、DRB1*1301、DRB1*1501)的所有对象的免疫原性评分。这些超类型存在于超过90％的人群中(参见Southwood等人，J.Immunol.1998，160，3363-3373)。因此，本发明的FVIII可以有利地用于治疗有需要的所有患者，特别是具有HLA-DR超类型等位基因之一的那些患者。表5显示，在FVIII-19M的实施例中，具有不同等位基因的患者的免疫原性被不同地降低。
表5A-C：个体的T细胞表位测量(ITEM)评分，所述评分表明FVIII-6rs(A)和FVIII-19M(B)对不同的HLA-DR超类型具有免疫原性，且表明与FVIII-6rs对不同的HLA-DR超类型的免疫原性相比，FVIII-19M对不同的HLA-DR超类型的免疫原性绝对降低(C)。ITEM评分基于蛋白长度标准化的一对等位基因的EpiMatrix命中的数量和强度(方法见下文)。表5A或B中较低的ITEM评分反映了较低的免疫原性。表5C中ITEM评分高度降低，即所述表中的高正值，反映了来自引入的置换的高获益。
A：FVIII-6rs
Figure BDA0003525742080000391
B：FVIII-19M
Figure BDA0003525742080000392
Figure BDA0003525742080000401
C：与FVIII-6rs相比FVIII-19M免疫原性评分的绝对降低
Figure BDA0003525742080000402
对于分析的所有等位基因，免疫原性评分均降低，尤其是免疫原性评分降低超过13。在免疫原性评分超过17的特别高的降低表明，具有以下HLA类型组合之一的患者可以从本发明的药物组合物治疗中特别获益：
·DRB1*0701与DRB1*0101、DRB1*0301、DRB1*0401、DRB1*0701、DRB1*0801、DRB1*1101或DRB1*1501组合；
·DRB1*0801与DRB1*0101、DRB1*0701、DRB1*0801、DRB1*1101或DRB1*1501组合；
·DRB1*1101与DRB1*0101、DRB1*0301、DRB1*0401、DRB1*0701、DRB1*0801、DRB1*1101、DRB1*1301或DRB1*1501组合；
·DRB*1301与DRB1*1101组合；
·DRB1*1501与DRB1*0101、DRB1*0301、DRB1*0401、DRB1*0701、DRB1*0801、DRB1*1101、DRB1*1501组合
超过20的免疫原性评分的更高降低还表明，具有以下HLA类型组合之一的患者甚至可以更特别地受益于本发明药物组合物的治疗：DRB1*1101与DRB1*0701、DRB1*0801、DRB1*1101或DRB1*1501组合。优选治疗免疫原性评分特别高的患者。
本发明教导一种用于制备本发明的FVIII蛋白的体外方法，其包括培养在适宜条件下表达所述FVIII蛋白的本发明的宿主细胞，和分离所述FVIII蛋白，其中任选地将所述蛋白配制为药物组合物。如本文所描述的，宿主细胞优选是人细胞。
本发明还公开了一种用于确定蛋白(例如，本发明的FVIII蛋白)的免疫原性的测定，其包括将与所述蛋白一起孵育的树突状细胞与供体(例如，健康人或患者，例如患有血友病A)的调节性T细胞耗竭的CD4+T细胞共培养，并检测所述T细胞的激活。对于此类测定，单核细胞可以是纯化的(例如，从PBMC中)，分化成未成熟的DC(iDC)(例如，在存在IL-4和GM-CSF的条件下)，并最终刺激成为成熟的DC(mDC)(例如，使用LPS或细胞因子的混合物，如IL-1β、IL-6和TNF-α)，并且，同时与抗原(即，目标蛋白)一起孵育。CD4+CD25-T细胞是从同一供体的PBMC(优选地，从同一批次PBMC)中纯化的，并用CFSE(羧乙酸二乙酸丁二酯琥珀酸酯)标记，用于以后的增殖检测，并在共培养之前对其进行培养，例如，以提供使细胞恢复并除去不稳定结合的CFSE的时间。在与DC共培养之后，其优选以DC:T细胞的比例至少为1:10进行例如约12h至约2周，1天至9天或2天至7天，然后，通过流式细胞术分析T细胞的激活和/或增殖。替代地或另外地，可以分析上清液中的细胞因子。在以下实施例中描述了测定的优选条件。该测定法的优点在于，在不存在调节性CD25+T细胞的情况下，其可以评估一级和二级T细胞介导的免疫应答，这有助于检测免疫应答。预期结果与体内蛋白的免疫原性相关。
对于去免疫的FVIII蛋白FVIII-19M，该测定证实，在所分析的大多数受试者中，响应于FVIII-19M的T细胞增殖减少。可以得出结论，在体外测定中低的免疫原性评分与蛋白的低免疫原性相关，即，在计算机中鉴定的表位中的置换转化为降低的免疫原性。
核酸和宿主细胞
本发明还提供了编码本发明的重组因子VIII蛋白的核酸。所述核酸可以是表达载体，例如适合于在哺乳动物细胞如人细胞(如CAP细胞)中表达所述重组因子VIII蛋白。
所述核酸优选编码具有N-末端信号序列，例如SEQ ID NO：1的19个氨基酸的信号序列。本发明优选的核酸编码具有SEQ ID NO：47(ADLCLD_SC)、SEQ ID NO:48(AD2CD2_SC)、SEQ ID NO:49(AD2CD2woL_SC)、SEQ ID NO:50(AD2CD2woLG_SC)或SEQ ID NO:51(AbD2CD2_SC)的重组FVIII蛋白。它们可以是SEQ ID NO：52-56。编码去免疫FVIII蛋白的本发明核酸可以具有例如SEQ ID NO：121-126中的任一个。本发明的核酸可以是DNA分子或RNA分子。核酸可以优化以在相应宿主细胞，例如人细胞，例如CAP细胞中表达。
表达载体包含编码FVIII蛋白的序列，优选地以密码子优化的形式，在合适启动子的功能控制下，所述启动子可以是组成型或诱导型启动子。启动子可以是在自然界中与FVIII的表达无关的启动子，例如EF-1α或异源启动子，例如CMV或SV40。它还可以进一步包含原核和/或真核选择标记物，如氨苄青霉素抗性和二氢叶酸还原酶(dhfr)，以及复制起点，例如SV40起点和/或pBR322起点。“密码子优化的”是指优化用于在宿主细胞中表达，优选地用于在人宿主细胞中表达。
在某些实施方案中，核酸可以是适用于基因疗法，例如，适用于人类患者的基因疗法的载体。适用于基因疗法的载体是本领域已知的，例如基于病毒的载体，例如基于腺病毒或腺相关病毒(AAV)或基于逆转录病毒(如慢病毒载体等)，或非基于病毒的载体，例如但不限于小质粒和基于小环或转座子的载体。本发明的基于AAV的载体可以例如包装在AAV颗粒中用于血友病A患者的基因疗法。
本发明还提供包含本发明核酸的宿主细胞。宿主细胞可以是细菌细胞、植物细胞、真菌细胞、酵母细胞或动物细胞。优选地，宿主细胞是动物细胞，特别是包含适于在所述细胞中表达所述重组因子VIII蛋白的表达载体的哺乳动物细胞。宿主细胞优选地是包含适合于在所述人细胞中表达所述重组因子VIII蛋白的表达载体的人细胞。可用本发明的核酸瞬时或稳定转染细胞。所述细胞可以是细胞系、原代细胞或干细胞。对于蛋白的生产，细胞通常是细胞系，例如HEK细胞，如HEK-293细胞、CHO细胞、BHK细胞、人胚胎视网膜细胞，如Crucell's Per.C6或人羊水细胞，如CAP。为了用蛋白治疗人类患者，宿主细胞优选地是人类细胞，例如HEK293细胞系或CAP细胞系(例如CAP-T细胞或CAP-Go细胞)。本发明人已经发现，在CAP细胞系中，产生了特别高单链含量的本发明的FVIII蛋白。在CAP细胞中，CAP-T细胞优选地用于瞬时表达，而CAP-Go细胞可用于创建稳定的细胞系，将有利的糖基化特征传递给FVIII分子。
所述细胞可以是血友病A患者，特别是人血友病A患者的自体细胞，其适合在转染并重新引入患者体内后在患者体内产生FVIII。所述细胞可以是干细胞，例如造血干细胞，但优选地不是胚胎干细胞，特别是当患者是人时。所述细胞也可以是肝细胞、肝窦内皮细胞或血小板。
表达本发明蛋白的细胞系也可用于制备本发明蛋白的方法，包括在适合表达FVIII蛋白的条件下培养所述细胞并纯化所述蛋白，例如，使用技术人员已知的多种方法，例如，如本文所述。此类纯化方法可包括用于细胞去除的标准收获程序，例如离心，然后是色谱步骤，例如亲和层析，以及将FVIII蛋白交换到合适缓冲剂中的方法。本发明因此还提供了一种制备因子VIII蛋白的方法，包括在适合于表达因子VIII蛋白的条件下培养本发明的宿主细胞并分离因子VIII蛋白，其中所述方法任选地包括将因子VIII蛋白制备成药物组合物。
药物组合物
本发明提供包含本发明的重组因子VIII蛋白、本发明的核酸或本发明的宿主细胞的药物组合物。此类药物组合物可包含合适的赋形剂或载体，例如缓冲剂、稳定剂、填充剂、防腐剂、另一种(例如重组)蛋白或其组合。在本发明的上下文中，如果没有另外明确说明，“一个”被理解为表示一个或多个。
用于配制本发明蛋白质的合适缓冲剂可以例如在蒸馏水中含有205mM NaCl、5.3mM CaCl2、6.7mM L-组氨酸、1.3％蔗糖和0.013％Tween 20并且具有pH值为7.0(FVIII制剂缓冲剂)。如果没有另外说明，所述缓冲剂用于本文所述的实验中。FVIII的制剂可以是无菌的，例如无菌过滤的，特别是用于体内使用。
任选地，包含FVIII蛋白的本发明的药物组合物还包含白蛋白，对于人类患者，优选人血清白蛋白。白蛋白的浓度可以是例如0.1-10％w/w，例如1-5％人血清白蛋白(w/w)。白蛋白可在施用于人类受试者之前或之后与本发明FVIII蛋白的ABD结合。
技术人员可以根据需要适当地制备药物组合物，例如用于静脉内(i.v.)或皮下应用、腹膜内或肌肉内应用。一般来讲，它用于缓慢i.v.推注施用。连续输注适用于例如需要因严重出血或外科手术而入院的患者。可能有助于耐受性诱导的口服应用也是可能的，例如在植物中表达后。药物组合物可以用于缓释。
可以冻干包含FVIII的药物组合物。
由于体内半衰期的增加，本发明的药物组合物可以与以前的FVIII组合物相比以更长的间隔施用。例如，它们可用于每5至14天，优选每7至10天施用。
可酌情选择剂量和治疗方案，例如用于预防出血或对出血事件进行间歇性按需治疗。给药的决定可由医生做出。给药取决于患者，例如体重、FVIII状态、疾病的严重程度等。例如，根据疾病的严重程度，本发明的FVIII可以每0.5-14天或每6-7天以0.5至250IU/kg体重的剂量静脉内施用，通常为0.5至200IU/kg体重。
本发明还提供了包含与免疫抑制剂(例如，甲泼尼龙、泼尼松龙、地塞米松、环磷酰胺、利妥昔单抗和/或环孢菌素)组合的本发明的FVIII蛋白的药物组合物，和/或它可以与这种药剂基本上同时(例如，在5分钟内至12小时内)施用。因此，本发明还提供了试剂盒，其除了本发明的FVIII蛋白外，还包含任选地与白蛋白组合的免疫抑制剂，例如选自包含甲泼尼龙、泼尼松龙、地塞米松、环磷酰胺、利妥昔单抗和/或环孢菌素的免疫抑制剂。
药物组合物，例如包含本发明的蛋白，可用于治疗有此需要的患者，特别是血友病A患者，例如患有涉及对FVIII的自身免疫应答的获得性血友病或先天性血友病A的患者。哺乳动物如小鼠或狗可用本发明的药物组合物治疗，但患者通常是人类患者。
如本文所述，包含去免疫FVIII蛋白或编码其的核酸的本发明药物组合物的用途使用在其中需要降低的免疫原性的情况下特别有利，例如用于治疗先前未用任何重组或血浆因子VIII蛋白治疗的血友病A患者。根据本发明，与用常规FVIII的治疗相比，在患者中产生包括抑制性抗体的抗体的发生率和/或严重性因此降低，或优选地，防止产生包括抑制性抗体的抗体。本发明的药物组合物还可以用于治疗先前已经用重组和/或血浆因子VIII蛋白治疗的患者。在具有包括对重组和/或血浆因子VIII蛋白的抑制性抗体反应的抗体的患者中，药物组合物可例如用于免疫耐受诱导(ITI)治疗，因为需要使用具有低免疫原性或甚至致耐受性特征的FVIII蛋白(Carcao等人，Recombinant factor VIII Fc fusionprotein for immune tolerance induction in patients with severe haemophilia Awith inhibitors-Aretrospective analysis.Haemophilia 2018:1-8)。因此，本发明的组合物也可用于拯救ITI。药物组合物还可以有利地用于已经具有包括对重组和/或血浆因子VIII蛋白的抑制性抗体反应的抗体反应的患者，例如已经通过ITI治疗的患者。所述药物组合物还可有利地用于包括具有对重组和/或血浆因子VIII蛋白的抑制性抗体反应的抗体反应的患者，所述患者尚未用ITI治疗。
本发明还提供了包含本发明的药物组合物的小瓶，例如注射器。注射器可以是预装注射器，例如即用型注射器。
本发明人设想，在基因治疗的情况下，由于白蛋白结合结构域的存在，与常规FVIII的表达相比，本发明FVIII蛋白的长期表达和折叠可得到改善。
本文引用的所有公开出版物均全文并入本文。通过以下实施方案、附图和实施例进一步说明本发明，这些实施方案、附图和实施例不应理解为限制本发明的范围。
实施方案
总之，在第一实施方案中，本发明提供了包含因子VIII的重链部分和轻链部分以及至少两个白蛋白结合结构域的重组因子VIII蛋白，其中至少一个白蛋白结合结构域在重链部分的C-末端，和至少一个白蛋白结合结构域在轻链部分的C-末端，其中如果蛋白是单链蛋白，在重链部分C-末端的白蛋白结合结构域是在轻链部分的N-末端。
在第二实施方案中，第一实施方案(实施方案1)的重组因子VIII蛋白是单链蛋白。
在第三实施方案中，实施方案1的重组因子VIII蛋白是双链蛋白。
在第四实施方案中，在实施方案1-3任一项的重组因子VIII蛋白中，一个白蛋白结合结构域在重链部分的C-末端，和一个白蛋白结合结构域位于轻链部分的C-末端。
在第五实施方案中，在实施方案1-3任一项的重组因子VIII蛋白中，一个白蛋白结合结构域在重链部分的C-末端，和两个白蛋白结合结构域在轻链部分的C-末端。在第六实施方案中，在实施方案1-3任一项的重组因子VIII蛋白中，一个白蛋白结合结构域在重链部分的C-末端，和三个白蛋白结合结构域在轻链部分的C-末端。在第七实施方案中，在实施方案1-3任一项的重组因子VIII蛋白中，一个白蛋白结合结构域在重链部分的C-末端，和四个白蛋白结合结构域在轻链部分的C-末端。
在第八实施方案中，在实施方案1-3任一项的重组因子VIII蛋白中，两个白蛋白结合结构域在重链部分的C-末端，和一个白蛋白结合结构域在轻链部分的C-末端。在第九实施方案中，在实施方案1-3任一项的重组因子VIII蛋白中，三个白蛋白结合结构域在重链部分的C-末端，和一个白蛋白结合结构域在轻链部分的C-末端。在第十实施方案中，在实施方案1-3任一项的重组因子VIII蛋白中，四个白蛋白结合结构域在重链部分的C-末端，和一个白蛋白结合结构域在轻链部分的C-末端。
在第十一实施方案中，在实施方案1-3任一项的重组因子VIII蛋白中，至少两个白蛋白结合结构域在重链部分的C-末端且至少两个白蛋白结合结构域在轻链部分的C-末端，优选地，两个白蛋白结合结构域在重链部分的C-末端且两个白蛋白结合结构域在轻链部分的C-末端。在第十二实施方案中，在实施方案11的重组因子VIII蛋白中，两个白蛋白结合结构域在重链部分的C-末端，和三个白蛋白结合结构域在轻链部分的C-末端。在第十三实施方案中，在实施方案11的重组因子VIII蛋白中，两个白蛋白结合结构域在重链部分的C-末端，和四个白蛋白结合结构域在轻链部分的C-末端。在第十四实施方案中，在实施方案11的重组因子VIII蛋白中，三个白蛋白结合结构域在重链部分的C-末端，和两个白蛋白结合结构域在轻链部分的C-末端。在第十五实施方案中，在实施方案11的重组因子VIII蛋白中，四个白蛋白结合结构域在重链部分的C-末端，和两个白蛋白结合结构域在轻链部分的C-末端。
在第十六实施方案中，在实施方案1-15任一项的重组因子VIII蛋白中，白蛋白结合结构域通过接头与重链部分和/或轻链部分和/或其它白蛋白结合结构域分开，其中优选地，白蛋白结合结构域通过接头与重链部分和轻链部分以及其它白蛋白结合结构域分开。
在第十七实施方案中，在实施方案16的重组因子VIII蛋白中，接头包含凝血酶切割接头部分，其任选地具有SEQ ID NO：39的序列。
在第十八实施方案中，在实施方案16或17任一项的重组因子VIII蛋白中，接头包含甘氨酸-丝氨酸接头部分，其任选具有SEQ ID NO：40或SEQ ID NO：41的序列。
在第十九实施方案中，在实施方案16-18任一项的重组因子VIII蛋白中，所述接头是不同接头部分的组合，例如所述接头包含每一侧邻接甘氨酸-丝氨酸接头部分的凝血酶切割接头部分，其中所述接头任选地具有SEQ ID NO：42或SEQ ID NO：43的序列。
在第二十实施方案中，在实施方案1-19中任一项的重组因子VIII蛋白中，白蛋白结合结构域包含根据SEQ ID NO：44的序列。
在第二十一实施方案中，在实施方案20的重组因子VIII蛋白中，白蛋白结合结构域包含根据SEQ ID NO：46的序列。
在第二十二实施方案中，在实施方案1-21任一项的重组因子VIII蛋白中，重链部分包含结构域A1和A2，并任选地包含结构域A1-a1-A2-a2或A1-a1-A2-a2-B。
在第二十三实施方案中，在实施方案1-22任一项的重组因子VIII蛋白中，轻链部分包含结构域A3和C1和C2，并且任选地包含结构域a3-A3-C1-C2。
在第二十四实施方案中，在实施方案1-23任一项的重组因子VIII蛋白中，因子VIII蛋白的B-结构域至少部分缺失。
在第二十五实施方案中，实施方案1-24任一项的重组因子VIII蛋白在单链中包含含有因子VIII的A1和A2结构域的重链部分和含有因子VIII的A3、C1和C2结构域的轻链部分，其中
a)在所述重组因子VIII蛋白中，对应于如SEQ ID NO：1中定义的野生型因子VIII的F761和P1659之间的连续氨基酸的894个氨基酸被删除，导致第一缺失；
b)所述重组因子VIII蛋白包含跨越第一缺失的位点的加工序列，所述加工序列包含SEQ ID NO：2或在SEQ ID NO：2中具有至多一个氨基酸置换的序列，其中所述加工序列包含第一凝血酶切割位点；
c)在所述重组因子VIII蛋白中，至少对应于野生型因子VIII的氨基酸R1664至R1667的氨基酸被删除，导致第二缺失；以及
d)所述重组因子VIII蛋白在第二缺失的C-末端和A3结构域的N-末端包含第二凝血酶切割位点。
在第二十六实施方案中，任选地为单链蛋白的实施方案1-25任一项的重组因子VIII蛋白包含与SEQ ID NO：16的aa20-aa768具有至少90％序列同一性的重链部分和与SEQID NO：16的aa769-aa1445具有至少90％序列同一性的轻链部分，其中所述序列同一性优选为至少95％、至少98％或100％。
在第二十七实施方案中，任选地为单链蛋白的实施方案1-26任一项的重组因子VIII蛋白包含与SEQ ID NO：1的aa20-aa1667具有至少90％序列同一性的重链部分和与SEQID NO：1的aa1668-aa2351具有至少90％序列同一性的轻链部分，其中所述序列同一性任选地为至少95％、至少98％或100％。在第二十八实施方案中，实施方案1-4和16-27任一项的重组因子VIII蛋白包含在重链部分和轻链部分之间的一个白蛋白结合结构域和在轻链部分的C-末端的一个白蛋白结合结构域，
其中所述序列与SEQ ID NO：47具有至少70％的序列同一性。
在第二十九实施方案中，实施方案11-28任一项的重组因子VIII蛋白是单链蛋白，其包含在重链部分和轻链部分之间的至少两个白蛋白结合结构域，及在轻链部分的C-末端的至少两个白蛋白结合结构域，其中所述蛋白与SEQ ID NO：48、49或51中任一个具有至少80％序列同一性，任选地至少90％序列同一性、至少95％序列同一性或至少98％序列同一性。在第三十实施方案中，实施方案29的重组因子VIII蛋白与SEQ ID NO：48具有至少80％的序列同一性，例如，它具有SEQ ID NO：48或SEQ ID NO：51。
在第三十一实施方案中，实施方案1-30任一项的重组因子VIII蛋白具有“b突变”，即在SEQ ID NO：1的wt因子VIII蛋白中，在位置1699处对应于Y1699至F的氨基酸的突变和在位置1683处对应于Y1683至F的氨基酸的突变。
在第三十二实施方案中，与SEQ ID NO：28的重组因子VIII蛋白相比，实施方案1-31任一项的重组因子VIII蛋白在人类受试者中的体内半衰期延长至少1.2倍，优选至少1.5倍，任选地至少2倍或至少2.5倍。
在第三十三实施方案中，实施方案1-32任一项的重组因子VIII蛋白是与至少一种融合伴体的融合蛋白，所述融合伴体选自由Fc区、白蛋白、PAS多肽、HAP多肽、绒毛膜促性腺激素β亚基的C-末端肽、聚乙二醇和羟乙基淀粉。
在第三十四实施方案中，实施方案1-33任一项的重组因子VIII蛋白是去免疫的蛋白。
作为第三十五实施方案，本发明提供了如实施方案1-34任一项所述的重组因子VIII蛋白，其包含在选自以下位置处的至少三个氨基酸置换：Y748、L171、S507、N79、I80、I105、S112、L160、V184、N233、L235、V257、I265、N299、Y426、Y430、L505、F555、I610、N616、I632、L706、N754、K1837、R1936、S2030、S2037、N2038、S2077、M2123、S2125、F2215、K2226、K2258、V2313、S2315、V2333和Q2335；
其中N的置换独立地选自D、H、S和E；其中I的置换独立地选自T和V；其中S的置换独立地选自A、N、G、T和E；其中L的置换独立地选自N、Q、F和S；其中V的置换独立地选自A和T；其中Y的置换独立地选自N、H和S；其中F的置换独立地选自H和S；其中K的置换独立地选自N、D、E、Q、S和T；其中R的置换独立地选自Q、H和S；其中M的置换选自R、Q、K和T；和/或其中Q的置换选自R、D、E、H和K；
其中所述位置是相对于SEQ ID NO：1的全长人因子VIII分子指定的；
并且其中所述重组因子VIII蛋白与由SEQ ID NO：60组成的因子VIII蛋白相比保留至少50％凝血活性，如在显色测定中所测定的。重组因子VIII蛋白可以是融合蛋白。在第三十七实施方案中，实施方案35的重组因子VIII蛋白在选自以下的位置处包含至少三个氨基酸置换：Y748、L171、S507、N79、I80、I105、S112、L160、V184、N233、L235、V257、I265、N299、Y426、Y430、L505、F555、I610、N616、L706、N754、K1837、R1936、S2030、S2037、N2038、S2077、M2123、F2215、K2226、K2258、V2313、S2315、V2333和Q2335。
在第三十七实施方案中，实施方案1-36任一项的重组因子VIII蛋白在选自以下的位置处包含至少一个氨基酸置换：Y748、L171、S507、N79、I80、I105、S112、L160、V184、N233、L235、V257、I265、N299、Y426、Y430、L505、F555、I610、N616、I632、L706、N754、K1837、R1936、S2030、S2037、N2038、S2077、M2123、S2125、F2215、K2226、K2258、V2313、S2315、V2333和Q2335；
其中N的置换独立地选自D、H、S和E；其中I的置换独立地选自T和V；其中S的置换独立地选自A、N、G、T和E；其中L的置换独立地选自N、Q、F和S；其中V的置换独立地选自A和T；其中Y的置换独立地选自N、H和S；其中F的置换独立地选自H和S；其中K的置换独立地选自N、D、E、Q、S和T；其中R的置换独立地选自Q、H和S；其中M的置换选自R、Q、K和T；和/或其中Q的置换选自R、D、E、H和K；
其中，如果所述突变在位置S507处，则为S507E，并且如果所述突变在位置N616处，则为N616E，并且如果所述突变在位置F2215处，则为F2215H；
其中所述位置是相对于SEQ ID NO：1的全长人因子VIII分子指定的，
并且其中所述重组因子VIII蛋白与由SEQ ID NO：60组成的因子VIII蛋白相比保留至少50％的凝血活性，如在显色测定中所测定的。蛋白质可以是融合蛋白。
在第三十八实施方案中，实施方案35-37任一项的重组因子VIII蛋白可例如包含选自以下的氨基酸置换：Y748S、L171Q、S507E、N79S、I80T、I105V、S112T、L160S、V184A、N233D、L235F、V257A、I265T、N299D、Y426H、Y430H、L505N、F555H、I610T、N616E、I632T、L706N、N754D、K1837E、R1936Q、S2030A、S2037G、N2034D、S2077G、M2123K、S2125G、F2215H、K2226Q、K2258Q、V2313A、S2315T、V2333A和Q2335H。
在第三十九实施方案中，实施方案35-38任一项的重组因子VIII蛋白可以例如包含3-25个所述置换，并且所述置换可以位于不同的免疫原性簇中。
在第四十实施方案中，实施方案35-39任一项的重组因子VIII蛋白可例如在选自Y748、L171、S507、N79、S112、L160、V184、N233、I265、N299、Y426、F555、N616、I632、L706、K1837、R1936、N2038、S2077、S2125、F2215、K2226、K2258、S2315和V2333的位置包含至少三个氨基酸置换；
其中所述至少三个氨基酸置换优选选自Y748S、L171Q、S507E、N79S、S112T、L160S、V184A、N233D、I265T、N299D、Y426H、F555H、N616E、I632T、L706N、K1837E、R1936Q、N2038D、S2077G、S2125G、F2215H、K2220Q、K2258Q、S2315T和V2333A。
在第四十一实施方案中，实施方案35-40任一项的重组因子VIII蛋白可以例如至少在以下位置处包含氨基酸置换
a.N79S、S112T、N233D和I265T；和/或
b.N79S、S112T、L160S、L171Q、V184A、N233D和I265T；和/或
c.N299D、Y426H和S507E；和/或
d.F555H、N616E、L706N、Y748S；和/或
e.F555H、N616E、I632T、L706N和Y748S；和/或
f.S2077G、S2315T和V2333A；和/或
g.N2038D、S2077G、S2315T和V2333A；和/或
h.S2077G、K2258Q、S2315T和V2333A；和/或
i.N2038D、S2077G、K2258Q、S2315T和V2333A；和/或
j.N2038D、S2077G、S2125G、K2258Q、S2315T和V2333A；和/或
k.L171Q、S507E、Y748S和V2333A；和/或
l.L171Q、N299D、N616E和V2333A；和/或
m.S112T、S507E、Y748S、K1837E和N2038D；和/或
n.S112T、Y426H、N754D、K1837E和N2038D
优选地，组合至少在b和c下指定的置换，任选地进一步包括选自在d或e和/或f、g、h、l或j下指定的那些的置换和/或K1837E。
在第四十二实施方案中，实施方案35-41任一项的重组因子VIII蛋白可以例如在位置N79、S112、L160、L171、V184、N233、I265、N299、Y426、S507、F555、N616、L706和Y748处包含至少一个氨基酸置换，其中优选所述置换是N79S、S112T、L160S、L171Q、V184A、N233D、I265T、N299D、Y426H、S507E、F555H、N616E、L706N和Y748S。在第四十三实施方案中，实施方案42的蛋白质进一步包括K1837E。任选地，该蛋白质包含根据SEQ ID NO：119的氨基酸20-1533的氨基酸序列。
在第四十四实施方案中，实施方案35-42任一项的重组因子VIII蛋白可以例如在位置N79、S112、L160、L171、V184、N233、I265、N299、Y426、S507、F555、N616、L706、Y748、N2038、S2077、S2315和V2333处包含至少一个氨基酸置换，其中优选地18个置换是N79S、S112T、L160S、L171Q、V184A、N233D、I265T、N299D、Y426H、S507E、F555H、N616E、L706N、Y748S、N2038D、S2077G、S2315T和V2333A。在第四十五实施方案中，实施方案44的蛋白质包含与SEQ ID NO：114的氨基酸20-1533具有至少90％，优选95％序列同一性的氨基酸序列。
在第46实施方案中，实施方案35-38任一项的重组因子VIII蛋白包含L160、F555和S2315中的至少一个，优选全部，即其在这些位置不包含突变。在第47实施方案中，实施方案35-38和46任一项的重组因子VIII蛋白可例如在位置N79、S112、L171、V184、N233、I265、N299、Y426、S507、N616、L706和Y748处包含至少一个氨基酸置换，其中优选地所述置换是N79S、S112T、L171Q、V184A、N233D、I265T、N299D、Y426H、S507E、N616E、L706N和Y748S。在第48实施方案中，实施方案47的蛋白质进一步包含K1837E。
在第49实施方案中，实施方案35-38或46-48任一项的重组因子VIII蛋白可例如在位置N79、S112、L171、V184、N233、I265、N299、Y426、S507、N616、L706、Y748、N2038、S2077和V2333处包含至少一个氨基酸置换，其中优选该15个置换是N79S、S112T、L171Q、V184A、N233D、I265T、N299D、Y426H、S507E、N616E、L706N、Y748S、N2038D、S2077G和V2333A。在第50实施方案中，实施方案49的蛋白质包含与SEQ ID NO：134(FVIII-16M_SC)的氨基酸20-1533具有至少90％，优选95％序列同一性的氨基酸序列。在第51实施方案中，实施方案49的蛋白质包含具有SEQ ID NO：114的氨基酸序列，除了位置L160、F555和S2315(AD2CD2-19M_SC-16M)。
在第52实施方案中，实施方案35-51任一项的重组因子VIII蛋白可例如包含至少位置K1837处的氨基酸置换，其中优选地所述置换是K1837E。在第53实施方案中，实施方案52的蛋白质包含根据SEQ ID NO：114的aa 20-1533的氨基酸序列。
在第54实施方案中，与由SEQ ID NO：60组成的因子VIII蛋白相比，并且优选也与由SEQ ID NO：61组成的因子VIII蛋白相比，实施方案35-52任一项的重组因子VIII蛋白可以例如具有降低的免疫原性。
在第55实施方案中，在实施方案54的重组因子VIII蛋白中，所述免疫原性通过免疫原性评分或包括共培养与所述蛋白一起孵育的树突细胞和供体的调节性T细胞耗竭的CD4+T细胞，并测试所述T细胞的活化来确定，优选通过所述测定。
在第56实施方案中，实施方案35-55任一项的重组因子VIII蛋白可以例如与SEQID NO：63的因子VIII蛋白具有至少90％的序列同一性，其中序列同一性的确定仅考虑A1、a1、A2、a2、a3、A3、C1和C2结构域。它也可以是所述重组因子VIII蛋白的融合蛋白。
在第57实施方案中，实施方案1-56任一项的重组因子VIII蛋白可以例如是单链因子VIII蛋白。在第58实施方案中，实施方案1-57任一项的重组因子VIII蛋白可以例如是异二聚体因子VIII蛋白。
在第59实施方案中，实施方案1-57任一项的重组因子VIII蛋白可以是例如单链B-结构域缺失的因子VIII蛋白。在第60实施方案中，实施方案59的重组因子VIII蛋白包含SEQID NO：2的加工序列。
在第61实施方案中，实施方案59的重组因子VIII蛋白包含SEQ ID NO：5的加工序列，其中X优选为A或S。在第62实施方案中，实施方案61的重组因子VIII蛋白包含SEQ IDNO：5的加工序列，其中X是A。在第63实施方案中，实施方案61的重组因子VIII蛋白包含SEQID NO：5的加工序列，其中X是S。在第64实施方案中，实施方案59的重组因子VIII蛋白包含SEQ ID NO：132的加工序列。在第65实施方案中，实施方案59的重组因子VIII蛋白包含SEQID NO：2的加工序列，并进一步包含与所述加工序列重叠的SEQ ID NO：131的序列。实施方案61-65避免了可能由SEQ ID NO：2的加工序列引入的潜在T细胞表位的产生。
在第66实施方案中，实施方案1-65任一项的重组因子VIII蛋白可以是例如融合蛋白，其中融合伴体选自Fc区、白蛋白、PAS多肽、HAP多肽、绒毛膜促性腺激素β亚基的C-末端肽、白蛋白结合小分子、聚乙二醇、羟乙基淀粉及其组合。
重组因子VIII蛋白也可以在FVIII、接头和ABD序列之间融合产生的接合处去免疫。因此，在第67实施方案中，实施方案1-66任一项的重组因子VIII蛋白可以包含置换F761G、F779G、F1632G、F858G、F1711G和F936G中的一个或多个，优选全部。在第68实施方案中，实施方案1-67任一项的重组因子VIII蛋白可包含置换P766Q和N772D中的一个或多个，优选全部。在第69实施方案中，实施方案1-66或68任一项的重组因子VIII蛋白可包含置换R784Q、S787G、R1637Q、S1640G、R836Q、S866G、R1716Q、S1719G、R941Q和S944G中的一个或多个，优选全部。在第70实施方案中，实施方案1-69任一项的重组因子VIII蛋白可包含置换S926G。在第71实施方案中，实施方案1-70任一项的重组因子VIII蛋白可包含置换N1625D。在第72实施方案中，实施方案1-70任一项的重组因子VIII蛋白可包含置换N1625Y。在第73实施方案中，实施方案1-67任一项的重组因子VIII蛋白可包含所有置换F761G、F779G、F1632G、F858G、F1711G、S926G和F936G。在第74实施方案中，实施方案1-67或73任一项的重组因子VIII蛋白可包含所有置换F761G、F779G、F1632G、F858G、F1711G、S926G、F936G和N1625D。在第75实施方案中，实施方案1-66或68-69任一项的重组因子VIII蛋白可包含所有置换P766Q、N772D、R784Q、S787G、R1637Q、S1640G、R863Q、S866G、R1716Q、S1719G、R941Q和S944G。在第76实施方案中，实施方案1-66或68-69或75任一项的重组因子VIII蛋白可包含所有置换P766Q、N772D、R784Q、S787G、R1637Q、S1640G、R863Q、S866G、R17167Q、S1719G、S926G、R941Q和S944G。在第77实施方案中，实施方案1-66或68-69或75-76任一项的重组因子VIII蛋白可包含置换P766Q、N772D、R784Q、S787G、R1637Q、S1640G、R863Q、S866G、R1716Q、S1719G、S926G、R941Q、S944G和N1625D中的至少一个，优选全部。在第78实施方案中，实施方案1-66或68-69或75-76任一项的重组因子VIII蛋白可包含置换P766Q、N772D、R784Q、S787G、R1637Q、S1640G、R863Q、S866G、R1716Q、S1719G、S926G、R941Q、S944G和N1625Y中的至少一个，优选全部。
在实施方案67-78中，所命名的置换涉及相对于SEQ ID NO：48或114的位置(SEQID NO：48和114具有相同的位置编号，因此是可互换的)。虽然对于位置提及的这些序列不一定意味着需要将置换引入这些序列的FVIII蛋白中，但在第79实施方案中，将实施方案67-78中任一项中命名的置换引入SEQ ID NO：48的FVIII蛋白中。在第80实施方案中，将实施方案67-78任一项中命名的置换引入SEQ ID NO：114的FVIII蛋白中。然而，相应的置换也可以被引入到其它AD2CD2_SC蛋白中。例如，在第81实施方案中，将在实施方案67-78任一项中命名的置换引入AD2CD2-16M_SC，其具有SEQ ID NO：114，但具有L160、F555和S2315(这三个位置是指相对于SEQ ID NO：1的位置)。
在第82实施方案中，本发明提供了编码实施方案1-81任一项的重组因子VIII蛋白的核酸。在第83实施方案中，实施方案82的核酸是表达载体，优选适合于在哺乳动物细胞中，优选在人细胞如CAP细胞中表达所述重组因子VIII蛋白。
在第84实施方案中，本发明提供了包含实施方案82或83任一项的核酸的宿主细胞。在第85实施方案中，实施方案84的宿主细胞是包含适合于在所述细胞中表达所述重组因子VIII蛋白的表达载体的哺乳动物细胞，优选选自Hek293细胞或CAP细胞(例如CAP-T细胞或CAP-Go细胞)的人细胞。
在第86实施方案中，本发明提供了制备重组因子VIII蛋白的方法，包括在适合因子VIII蛋白表达的条件下培养实施方案84或85的宿主细胞，并分离重组因子VIII蛋白，其中该方法任选地包括将因子VIII蛋白配制为药物组合物。
在第87实施方案中，本发明提供了包含实施方案1-81任一项的重组因子VIII蛋白，实施方案82-83任一项的核酸或实施方案84-85任一项的宿主细胞的药物组合物。在第88实施方案中，实施方案87的药物组合物还包含生物学上可接受的载体如水或缓冲剂，任选地在生理pH下，优选FVIII制剂缓冲剂，和/或药学上可接受的赋形剂。在第89实施方案中，实施方案87或88任一项的药物组合物还包含白蛋白，例如0.1-5％，如1％人血清白蛋白。
在第90实施方案中，本发明提供实施方案87-89任一项的药物组合物或试剂盒，其还包含免疫抑制剂，例如选自包含甲泼尼龙、泼尼松龙、地塞米松、环磷酰胺、利妥昔单抗和/或环孢菌素的组的免疫抑制剂。
作为第91实施方案，本发明还提供了实施方案87-90任一项的药物组合物，其用于治疗血友病A，其中任选地，所述治疗是免疫耐受诱导(ITI)。在第92实施方案中，实施方案87-91任一项的药物组合物用于治疗患有血友病A的患者，其选自先前未用任何因子VIII蛋白治疗的患者、先前用因子VIII蛋白治疗的患者、具有包括对因子VIII蛋白的抑制性抗体反应的抗体反应的患者以及已经用ITI治疗或未用ITI治疗的具有包括对因子VIII蛋白的抑制性抗体反应的抗体反应的患者。
在第93实施方案中，实施方案87-92任一项的药物组合物用于每5-14天，优选每7-10天施用。
在第94实施方案中，本发明提供了包含实施方案87-93任一项的药物组合物的小瓶，例如预装或即用注射器。
在第95实施方案中，本发明提供了治疗方法，其包括向有需要的患者，例如患有血友病A的患者施用有效量的实施方案87-93任一项的药物组合物，所述患者可选自本文所定义的患者组。
本文公开了例如具有以下序列的蛋白质和核酸：
SEQ ID NO：1wt人类FVIII
SEQ ID NO：2在优选的单链构建体中的加工序列
SEQ ID NO：4V0中的加工序列
SEQ ID NO：5变体加工序列，X对于去免疫可以变化
SEQ ID NO：6变体加工序列，X对于去免疫可以变化
SEQ ID NO：7变体加工序列，X对于去免疫可以变化
SEQ ID NO：8变体加工序列，X对于去免疫可以变化
SEQ ID NO：9合并序列，例如在V0中
SEQ ID NO:16单链FVIII V0(AC_SC)
SEQ ID NO：28 6rs-REF
SEQ ID NO：39凝血酶切割接头
SEQ ID NO：40甘氨酸-丝氨酸接头G1，在位置14中的G存在或不存在
SEQ ID NO：41甘氨酸-丝氨酸接头G2
SEQ ID NO：42凝血酶切割接头，每一侧邻接甘氨酸-丝氨酸接头，严格重复的
SEQ ID NO：43凝血酶切割接头，每一侧邻接甘氨酸-丝氨酸接头，非重复的
SEQ ID NO：44ABD共有序列，见上文
SEQ ID NO：45ABD1
SEQ ID NO：46ABD2
SEQ ID NO：47ADLCLD2_SC aa
SEQ ID NO：48AD2CD2_SC aa
SEQ ID NO：49AD2CD2woL_SC aa
SEQ ID NO：50AD2CD2woLG_SC aa
SEQ ID NO：51AbD2CD2_SC aa
SEQ ID NO：52ADLCLD_SC na
SEQ ID NO：53AD2CD2_SC na
SEQ ID NO：54AD2CD2woL_SC na
SEQ ID NO：55AD2CD2woLG_SC na
SEQ ID NO：57编码SEQ ID NO：46的优化的DNA序列
SEQ ID NO：58编码SEQ ID NO：40的甘氨酸-丝氨酸接头G1的示例性DNA
SEQ ID NO：59编码SEQ ID NO：41的甘氨酸-丝氨酸接头G2的示例性DNA
SEQ ID NO：60FVIII-6rs
SEQ ID NO：61ReFacto AF
SEQ ID NO：62B-结构域缺失的scFVIII
SEQ ID NO：63FVIII-19M
SEQ ID NO：64FVIII-18M
SEQ ID NO：65FVIII-15M
SEQ ID NO：66FVIII-A1-7M
SEQ ID NO：67FVIII-A2-4M
SEQ ID NO：68FVIII-BA3-1M
SEQ ID NO：69FVIII-A3C2-4M
SEQ ID NO：70FVIII-GOF1
SEQ ID NO：71FVIII-GOF2
SEQ ID NO：72FVIII-LS1
SEQ ID NO：73FVIII-LS2
SEQ ID NO：74-108+112免疫原性簇
SEQ ID NO：109FVIII-A1A2-3M
SEQ ID NO：110提供编码FVIII-19M的核酸序列。
SEQ ID NO：111提供编码FVIII-6rs的核酸序列。
SEQ ID NO：113单链V0-19M(AC-19M_SC)aa
SEQ ID NO：114AD2CD2-19M_SC aa
SEQ ID NO：115ADLCLD-19M_SC aa
SEQ ID NO：116ADLCLD-19M_SC-V1 aa
SEQ ID NO：117ADLCLD-19M_SC-V2 aa
SEQ ID NO：118AD2CD-19M_SC aa
SEQ ID NO：119AD2CD2-15M_SC aa
SEQ ID NO：120单链V0-19M(AC-19M_SC)na
SEQ ID NO：121AD2CD2-19M_SC na
SEQ ID NO：122ALDLCLD-19M_SC na
SEQ ID NO：123ALDCLD-19M_SC-V1 na
SEQ ID NO：124ALDCLD-19M_SC-V2 na
SEQ ID NO：125AD2CD-19M_SC na
SEQ ID NO：126AD2CD2-15M_SC na
SEQ ID NO：127序列F761-S769，与sc加工序列SEQ ID NO：2重叠：
SEQ ID NO：128具有F761A的SEQ ID NO：127的去免疫变体
SEQ ID NO：129具有F761S的SEQ ID NO：127的去免疫变体
SEQ ID NO：130具有P766E的SEQ ID NO：127的去免疫变体
SEQ ID NO：131具有S769D的SEQ ID NO：127的去免疫变体
SEQ ID NO：132具有P766E的去免疫加工序列
SEQ ID NO：133FVIII-16M
SEQ ID NO：134单链V0-16M(AC-16M_SC)
SEQ ID NO：135F01_AD2CD2-19M_SC
SEQ ID NO：136F02_AD2CD2-19M_SC
SEQ ID NO：137F03_AD2CD2-19M_SC
SEQ ID NO：138F04_AD2CD2-19M_SC
SEQ ID NO：139F01_AD2CD2-16M_SC
SEQ ID NO：140F02_AD2CD2-16M_SC
SEQ ID NO：141F01_AD2CD2_SC
SEQ ID NO：142F02_AD2CD2_SC
SEQ ID NO：143F03_AD2CD2_SC
SEQ ID NO：144F04_AD2CD2_SC
SEQ ID NO：145D01_AD2CD2_SC
SEQ ID NO：146D02_AD2CD2_SC
SEQ ID NO：147D03_AD2CD2_SC
SEQ ID NO：148D04_AD2CD2_SC
SEQ ID NO：149D05_AD2CD2_SC
SEQ ID NO：150D06_AD2CD2_SC
SEQ ID NO：151D07_AD2CD2_SC
SEQ ID NO：152D08_AD2CD2_SC
SEQ ID NO：153D09_AD2CD2_SC
SEQ ID NO：154D10_AD2CD2_SC
SEQ ID NO：155D11_AD2CD2_SC
SEQ ID NO：156E01_AD2CD2-19M_SC
SEQ ID NO：157E02_AD2CD2-19M_SC
SEQ ID NO：158E03_AD2CD2-19M_SC
SEQ ID NO：159E04_AD2CD2-19M_SC
SEQ ID NO：160E05_AD2CD2-19M_SC
SEQ ID NO：161E06_AD2CD2-19M_SC
SEQ ID NO：162E07_AD2CD2-19M_SC
SEQ ID NO：163E08_AD2CD2-19M_SC
SEQ ID NO：164E09_AD2CD2-19M_SC
SEQ ID NO：165E10_AD2CD2-19M_SC
SEQ ID NO：166E11_AD2CD2-19M_SC
SEQ ID NO：167G08_AD2CD2-16M_SC
SEQ ID NO：168G11_AD2CD2-16M_SC
附图图例
图1显示ADLCLD_SC(包含两个白蛋白结合结构域的本发明FVIII蛋白)与FVIII6rs-Ref(具有ReFacto AF序列的蛋白)相比的人白蛋白结合。在存在和不存在HSA的情况下通过所描述的白蛋白结合能力测定测试两种FVIII蛋白。
图2显示了不同FVIII-白蛋白结合结构域融合蛋白相对于ReFacto AF的von-Willebrand因子(vWF)结合能力。在存在或不存在人白蛋白的情况下测试所有FVIII分子的vWF结合。越多的白蛋白的结构域并入到FVIII中，通常与vWF的结合越低。人白蛋白的存在显著降低了与vWF的结合。
图3:未纯化的FVIII-ABD融合变体和FVIII对照的体外功能性的比较。分析表达双链FVIII分子6rs-REF、单链FVIII分子AC_SC和FVIII-ABD融合分子AD2CD2_SC、AD2CD2woLG_SC、AD2CD2wL_SC、ACD4woLG_SC和ACL(GD)4_SC的CAP-T细胞的细胞培养物上清液的显色FVIII活性(A)、由肌动蛋白FSL诱导的FVIII凝结活性(B)和指示总FVIII蛋白量的FVIII抗原水平(C)。比显色活性计算为显色FVIII活性与FVIII抗原比率，以％表示(D)。比凝血活性计算为FVIII凝结活性与FVIII抗原比率，以％表示(E)。n＝2。
图4:未纯化的FVIII-ABD融合变体和FVIII对照蛋白的蛋白质印迹分析，用于评价结构性质。通过非还原的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离表达双链FVIII分子6rs-REF、单链FVIII分子AC_SC和FVIII-ABD融合分子AD2CD2_SC、AD2CD2woLG_SC、AD2CD2wL_SC和ACD4woLG_SC的CAP-T细胞的细胞培养物上清液，随后印迹转移到PVDF膜上。纯化的绵羊抗人因子VIII一抗和CF680偶联的驴抗绵羊IgG(H&L)抗体用于检测。对于尺寸测定，使用Precision plus All Blue作为标记。
图5证明了在将200U/kg FVIII(含有1％人白蛋白)单次注射到具有鼠白蛋白敲除并表达人α链而不是鼠新生儿Fc受体的小鼠中之后，与ReFacto AF相比，AD2CD2_SC的体内药代动力学。将测定的FVIII抗原值标准化并以随时间的百分比显示。
图6证明了在向
Figure BDA0003525742080000631
小型猪单次注射与1或10％人白蛋白配制的30UFVIII抗原/kg后，与ReFacto AF相比，AD2CD2_SC的体内药代动力学。抽取血浆样品并通过ELISA测量FVIII抗原水平。平均FVIII抗原水平随时间(以小时计)以U/ml表示。n＝每组3只小型猪。
图7显示血友病A小鼠尾部横切后的总出血时间(每组的柱1，左Y轴)和总失血量(每组的柱2，右Y轴)，所述小鼠在20小时前施用媒介物对照、ReFacto AF、Eloctate、AD2CD2_SC或ADLCLD_SC。非血友病C57BL/6NCrl小鼠用0.9％NaCl处理并用作对照。
图8：(A)FVIII蛋白的结构和本发明的FVIII-19M蛋白在几轮选择中的产生。(B)包括信号序列的FVIII-19M氨基酸序列。信号序列：斜体，A1结构域：加下划线，A2结构域：双下划线，B结构域：粗下划线，A3结构域：点线下划线，C1结构域：虚线下划线，C2结构域：波状下划线，中间结构域a1、a2、a3：未标出，相对于FVIII-6rs的突变用斜体、粗体和较大字型标记。
图9：具有单一突变的FVIII变体的相对凝血活性。相对于对照FVIII-6rs的FVIII凝血活性计算每种单突变变体的FVIII凝血活性。括号表示属于一个簇的突变。(A)A1结构域中的突变。(B)A2结构域中的突变。(C)A3结构域中的突变。(D)C1结构域中的突变。(E)C2结构域中的突变。
图10：具有单一突变的FVIII变体的比凝血活性。计算每种单突变变体的FVIII凝血活性与FVIII抗原的关系。括号表示属于一个簇的突变。(A)A1结构域中的突变。(B)A2结构域中的突变。(C)A3结构域中的突变。(D)C1结构域中的突变。(E)C2结构域中的突变。
图11：A1、A1A2、A2和A3C1C2部分中的组合突变的结果。(A)FVIII变体的相对凝血活性。相对于对照FVIII-6rs的FVIII凝血活性计算每种变体的FVIII凝血活性。(B)FVIII变体的比凝血活性。计算每种变体的FVIII凝血活性与FVIII抗原的关系。
图12：基于DOE基质包含不同突变的FVIII变体的相对凝血活性。相对于对照FVIII-6rs的FVIII凝血活性计算每种变体的FVIII凝血活性。(A)A2结构域中变体的结果。(b)A3C1C2结构域中变体的结果。
图13：在DOE基质后具有A2和A3C1C2部分中的组合突变的FVIII的凝血活性。(A)FVIII变体的相对凝血活性。相对于对照FVIII-6rs的FVIII凝血活性计算每种变体的FVIII凝血活性。(B)FVIII变体的比凝血活性。计算每种变体的显色FVIII凝血活性与FVIII抗原的比率。
图14：具有特定突变的FVIII变体的相对和比凝血活性(A，B)。相对凝血活性定义为与FVIII-6rs的凝血活性相比。比凝血活性涉及显色凝血活性与抗原的比率。在FVIII的特定结构域中具有突变的有利FVIII蛋白(A)和具有三个突变的FVIII蛋白(B)的凝血活性。没有测定FVIII-BA3-1M的凝结凝血活性。
图15：分析凝结时间的FVIII-19M、FVIII-6rs、ReFacto AF和Nuwiq的ROTEM分析。分析不同的FVIII浓度。测量一式两份进行并显示平均值。
图16：ReFacto AF、Nuwiq、FVIII-19M和FVIII-6rs的TGA(凝血酶生成测定)结果。将所有产品稀释至0.25U/ml、0.063U/ml和0.016U/ml FVIII凝血活性。每个点表示来自一个TGA的结果。线表示所进行的四次测定的中值。使用Friedman检验进行统计分析。(A)基于凝血酶标准品，给定浓度下每种产品生成的峰值凝血酶的量。(B)给定浓度下每种产品的曲线下面积。(C)给定浓度下每种产品的峰值凝血酶生成的时间。
图17：不同FVIII产品与vWF的结合。将ReFacto AF与vWF结合的效力设置为1，并作为其它产品的基准。每个点表示一个ELISA的结果。线表示所进行的三次测定的中值。使用Friedman检验进行统计分析。
图18：基于纯化的蛋白质，FVIII-6rs和FVIII-19M的四个独立产生的比凝血活性。(A)基于显色FVIII凝血活性测量的比凝血活性。线表示四次测量的中值。(B)基于凝结FVIII凝血活性测量的比凝血活性。线表示四次测量的中值。
图19：凝血酶激活的FVIII的蛋白质印迹。每种产品以其非激活和激活形式施用。在非激活形式中，单链(≈200kDa)、重链(≈95-110kDa)和轻链(≈80-90kDa)的典型条带是可检测的。凝血酶切割后，可检测到A1A2(≈90kDa)、A3C1C2(≈75kDa)、A1(≈50kDa)、A2(≈40kDa)和Ba3(≈20kDa)的另外的条带。用多克隆绵羊抗人因子VIII一抗和驴抗绵羊IgGIRDye 800CW二抗检测FVIII。
图20：体外免疫原性测定。单核细胞从PBMC纯化，分化为iDC，并最终刺激以成为mDC，并与抗原(即感兴趣的蛋白质)孵育。CD4+CD25-T细胞也从PBMC纯化并在共培养前培养以再生。共培养后，通过流式细胞术分析T细胞的活化和/或增殖。任选地，分析上清液中的细胞因子。
图21：体外免疫原性测定的结果。针对用IL-Mix加FVIII-19M刺激的DC和用IL-Mix加FVIII-6rs刺激的DC的CD4+T细胞增殖之间的差异。低于0的柱表示对FVIII-19M的CD4+T细胞反应降低。使用Wilcoxon检验，与FVIII-6rs相比，对FVIII-19M的较低T细胞反应是显著的(p＝0.0371)。
图22：具有(AD2CD2-19M_SC)或不具有(AD2CD2_SC)19个去免疫氨基酸置换的未纯化FVIII-ABD融合变体与FVIII对照在蛋白质表达和体外功能性方面的比较。分析表达双链FVIII分子6rs-REF(ReFacto序列)、FVIII-ABD融合分子AD2CD2_SC和去免疫的FVIII-ABD融合分子AD2CD2-19M_SC的CAP-T细胞的细胞培养物上清液的显色FVIII活性(A)和指示总FVIII蛋白量的FVIII抗原水平(B)。比显色活性计算为显色FVIII活性与FVIII抗原比率，以％表示(C)。n＝2。
图23显示了在向血友病A小鼠单次静脉内注射200U/kg FVIII后，与ReFacto AF相比，AD2CD2-19M_SC的体内药代动力学。测定FVIII抗原值和显色FVIII活性。显示随时间的FVIII抗原值。本发明的蛋白质显然具有更长的体内半衰期。
图24显示了在单次静脉内注射10％人白蛋白配制的30UFVIII:Ag/kg到
Figure BDA0003525742080000671
小型猪中后，与ReFacto AF相比，AD2CD2_SC和AD2CD2-19M_SC的体内药代动力学。抽取血浆样品并测量FVIII抗原水平。平均FVIII抗原水平随时间(以小时计)以U/mL显示。n＝每组3只小型猪。本发明的蛋白质显然具有更长的体内半衰期。
图25显示血友病A小鼠的尾静脉横切后的总出血时间，所述小鼠在30分钟前静脉内施用媒介物对照(组6)或不同剂量(组1至5)的AD2CD2-19M_SC(200、70、20、7或2U/kgFVIII)。此外，非血友病C57BL/6NCrl小鼠用媒介物对照处理(组7)。N＝每组10只小鼠。
图26显示五种抗FVIII抗体(ESH-8、GMA-8009、GMA-8015、GMA-8026、CL20035AP)对标准人血浆(SHP)、ReFacto AF、AD2CD2_SC和AD2CD2-19M_SC的抑制潜能。
图27显示了在不同FVIII变体，即ReFacto AF、AC-19M_SC和AD2CD2-19M_SC中，通过MAPPs技术鉴定的免疫原性簇的数量。与ReFacto AF相比，AC-19M_SC和AD2CD2-19M_SC中簇的总数降低(簇的总数：1-3列)。第4列和第5列中显示了与ReFacto AF相比供体群组中频率降低(FRQ)的簇的数目，包括消除的簇的数量(列的交叉阴影部分)。在列6和7中显示出与ReFacto AF相比具有增加的FRQ的簇的数目，包括在列的交叉阴影部分中示出的对于ReFacto AF没有观察到的簇。
图28显示了本发明的特异性接合区去免疫的FVIII蛋白的显色(A，C)和比显色(B，D)FVIII活性。
图29显示了施用不同量的本发明特异性接合区去免疫的FVIII蛋白后血友病A小鼠的总出血时间。
图30显示了本发明的特定FVIII蛋白的标准化显色FVIII活性(A)和标准化FVIII抗原水平(B)。
实施例
1.添加白蛋白结合结构域的因子VIII蛋白用于开发新的血友病A治疗剂的评价
材料和方法
构建体的制备
进行实验以发现和开发用于白蛋白结合结构域整合的适合主链。实验基于FVIII的B-结构域缺失型和FVIII的单链变体进行。基础双链构建体是ReFacto
Figure BDA0003525742080000681
(Pfizer)的密码子优化序列，其中为了简化克隆，通过沉默突变添加6个限制性位点，但由于密码子优化，这些限制性位点中的一些被再次排除。基础双链序列是6rs-REF(SEQ ID NO：28)。使用的基础单链构建体是V0(SEQ ID NO：16，EP19173440)。
首先，将ABD蛋白序列(Affibody AB，Solna，Sweden)作为DNA序列设计的基础。如果没有另外提及，则使用ABD2序列。此外，开发了密码子优化的接头，其可被凝血酶部分裂解。如果没有另外说明，甘氨酸-丝氨酸接头是G1，且凝血酶可切割接头是L。下表1显示了单链分子的具有白蛋白结合结构域(ABD)的融合蛋白的结构。
对于编码本发明的FVIII的构建体和在这一情况中分析的比较构建体，合成了完整的FVIII序列或携带从FVIIIα2结构域到A3结构域的大约700-1200bp的DNA区域。对合成的DNA进行总的靶基因的密码子优化。a2至A3 DNA片段的5'末端侧翼为EcoRV限制性位点，3'末端侧翼为EcoRI限制性位点，且这些限制性位点也存在于所用的基础FVIII序列中。对于与轻链的C-末端融合，也以密码子优化的形式合成携带约1500-2100bp的DNA片段。这些DNA片段的5'末端侧翼为A3结构域内的EcoRI限制性位点，和3'末端侧翼为NotI限制性位点。DNA插入物和FVIII骨架质粒的限制允许靶向连接和FVIII单链质粒的产生。完全合成的FVIII DNA 5'末端侧翼为HindIII限制性位点，且3'末端侧翼为NotI限制性位点。
通过用所述质粒转化大肠杆菌K12，在氨苄青霉素选择和质粒制备下扩增转化的细菌，可以制备大量的质粒。利用VectorNTI软件(Thermo Fisher Scientific,Massachusetts,USA)设计后，通过Thermo Fisher Scientific进行基因工程工作。
CAP-T细胞的培养
为了分析新重组FVIII分子的候选物，整合在表达载体中的构建体在人细胞系中瞬时和稳定表达。优选的细胞系是Hek293和CAP细胞，两者都源自人羊膜细胞。由于活性FVIII分子的较高产量，CAP细胞，特别是CAP-T细胞被选择为用于瞬时转染的优选表达系统及用于稳定表达的CAP-Go细胞。
瞬时转染用核转染程序进行。筛选上清液的FVIII活性和抗原。从CAP细胞纯化重组蛋白，包括FVIII亲和层析。
详细地，CAP-T细胞(Cevec Pharmaceuticals,
Figure BDA0003525742080000691
Germany)在补充有4mMGlutaMAX(Thermo Fisher Scientific,35050038)和5μg/ml杀稻瘟菌素的PEM培养基(Thermo Fisher Scientific,R21001；完全PEM培养基)中培养。为了解冻细胞，将所需量的冷冻小瓶转移到37℃水浴中。解冻后，将每个小瓶转移到10ml冷冻的完全PEM培养基中。将细胞悬浮液在150x g下离心5分钟。在该洗涤步骤中，除去用于冷冻保存的二甲基亚砜(DMSO)。将沉淀重悬于15ml温热的完全PEM培养基中并转移到125ml摇瓶中。将细胞在37℃下在具有含5％CO2的气氛的加湿培养箱中孵育。将烧瓶置于摇动平台上，以185rpm旋转，轨道为50mm。
每3-4天对细胞进行传代培养。通过将所需量的培养细胞悬浮液转移到新烧瓶中并加入完全PEM培养基，将新鲜培养物设定为0.5×106细胞/ml。在转移的细胞悬液超过总体积的20％的情况下，将悬浮液在150xg下离心5分钟，并将沉淀重悬于新鲜的完全PEM培养基中。每摇瓶的细胞悬浮液体积为总烧瓶体积的20％。
在进行转染实验之前，解冻后进行最少三次传代培养。
通过瞬时转染的CAP-T细胞的蛋白质表达
使用4D-NucleofectorTM(Lonza,Basel,Switzerland)转染CAP-T细胞。对于每次转染，将10×106个CAP-T细胞在15ml锥形管中以150xg离心5分钟。考虑到沉淀的体积和质粒溶液的体积，将细胞重悬于95μl补充的SE缓冲液中。然后，将5μg相应的质粒加入到细胞悬浮液中，随后温和混合。将溶液转移到100μl Nucleocuvettes中。所用的转染程序是ED-100。转染后，将来自一个Nucleocuvette的细胞转移到含有12.5ml完全PEM培养基的125ml摇瓶中。如上所述培养细胞4天。在第4天，通过以150xg离心5分钟收获细胞。如上所述通过组合12.5ml途径可以产生更大的蛋白质量。
收获后直接筛选上清液的FVIII活性和抗原。
进一步分析重组因子VIII蛋白。通过显色活性测定和凝血活性FSL测定测量FVIII活性。通过FVIII抗原ELISA评估抗原。作为生物活性的进一步测定法，分析凝血酶对重组蛋白的裂解。此外，通过蛋白质印迹测试链分布和外观。此外，测试了vWF结合和白蛋白结合。
通过稳定细胞库的CAP Go细胞中的蛋白质表达
为了产生大物质量以进行小型猪研究，在Cevec Pharmaceuticals GmbH(Cologne,Germany)产生表达AD2CD2_SC或AD2CD2-19M_SC的稳定CAP-Go库。因此，使用SgrD1和Not1限制性位点将FVIII编码序列克隆到CEVEC的pStbl-bsd-MCS(-)质粒中。随后通过琼脂糖凝胶电泳分离片段，通过凝胶过滤纯化并克隆到pStbl-bsd-MCS(-)中，其预先用SgrD1和Not1切割并用小牛肠磷酸酶(CIP)处理。使用T4-DNA连接酶连接插入物和载体，并转化到化学感受态大肠杆菌细胞(XL2-Blue)中。使用来自Machery-Nagel的Maxi试剂盒纯化质粒DNA。整个克隆过程以及质粒纯化在无TSE的生产过程中进行。
在核转染之前，用ScaI将环状质粒线性化。因此，将20-40μg质粒DNA与50-200U相应酶在37℃下孵育5-8小时。随后，通过苯酚-氯仿-异戊醇提取纯化DNA并用氯仿-异戊醇洗去苯酚。为了通过乙醇沉淀纯化DNA，用1/10体积的3M NaOAc,pH＝5.2和2体积的乙醇补充DNA溶液，并在-20℃下孵育过夜。通过离心(30min，13000rpm，4℃)使DNA沉淀物沉淀，用70％乙醇洗涤，再次离心，风干，并重悬于TE缓冲液中。通过DNA琼脂糖凝胶分析确保线性化DNA的质量。
对于核转染，通过Cedex XS(Roche Applied Science,Innovatis)计数CAP-Go细胞，并测定活细胞密度和生存力。对于每个核转染反应，通过离心(150xg，5分钟)收获1×107个细胞。将细胞重悬于100μL完全核因子溶液V(Lonza)中并与5μg相应构建体的线性化质粒混合。将DNA/细胞悬浮液转移到小池中，并在Nucleofector II(Lonza)上使用X001程序进行核转染。脉冲后，通过将500μL预热的完全PEM培养基(＝补充有4mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺)添加到小池中并温和转移到125mL摇瓶中的11.5mL完全PEM培养基中来回收细胞。将小池用500μL新鲜培养基洗涤一次以回收残余细胞。
核转染后72小时，测定转染细胞的细胞数和细胞存活力。通过离心收获细胞，并将其重悬于含有作为选择标记的5μg/ml杀稻瘟菌素的20ml完全PEM培养基中。将细胞在Kühner振荡培养箱中在37℃，5％CO2下以185rpm和5cm振幅培养。一旦细胞从选择中回收并可以扩增，将来自稳定库的细胞冷冻保存。
对于分批生产，将培养物以1×106细胞/ml的活细胞密度接种于2L摇瓶中的800mL完全PEM培养基中。将细胞在Kühner振荡培养箱中在185rpm，37℃，5％CO2下孵育4天。通过离心收集含FVIII的细胞上清液，并如本文别处所述通过亲和层析纯化。
FVIII活性-显色活性测定
通过显色分析测定FVIII的活性。在该两步测定中，FIXa和FVIIIa在第一步中激活FX。在第二步中，激活的FX水解显色底物，导致颜色变化，其可以在405nm测量。由于钙和磷脂以最佳量存在并且可获得过量的FIXa和FX的事实，FX的活化速率仅取决于样品中活性FVIII的量。
用于该显色FVIII活性测定的试剂获自
Figure BDA0003525742080000711
SP FVIII试剂盒。该试剂盒含有磷脂、氯化钙(CaCl2)、痕量凝血酶、底物S-2765、FIXa和FX的混合物以及凝血酶抑制剂I-2581。加入抑制剂，以防止底物被反应过程中累积的凝血酶水解。所有稀释均在蒸馏水或Tris-BSA(TBSA)缓冲液中进行，所述缓冲液含有25mM Tris、150mM氯化钠(NaCl)和1％牛血清白蛋白(BSA)，设定为pH 7.4。用FVIII-耗尽的血浆将每个样品至少1：2稀释。使用TBSA缓冲液进行进一步稀释。
使用BCS XP(Siemens Healthcare,Erlangen,Germany)，一种全自动凝血分析仪进行测定。将所有试剂(包括水、TBSA缓冲液和样品)插入分析仪中。对于每个样品，分析仪混合34μl氯化钙、20μlTBSA缓冲液、10μl样品、40μl水、1μl磷脂和56μl FIXa-FX混合物。将该混合物孵育300秒。然后，将50μl的S-2765+I-2581加入到反应中。加入底物后，测量405nm处的吸收200秒。
为了计算活性FVIII的量，分析仪的软件评价反应开始后30秒和190秒之间测量的动力学的斜率。该结果与用FVIII的生物参考制剂(BRP)产生的校准曲线相关。BRP的活性以IU/ml表示。然而，可以假定IU/ml等同于U/ml。结果表示为“正常的％”。将这些结果转化为U/ml，因为100％的正常FVIII活性等同于1U FVIII活性/ml。
凝结活性FSL
除了两阶段显色测定(见上文)外，还进行一阶段凝结测定以测定活性FVIII的量。在该测定过程中，在一个步骤中混合FVIII耗竭的血浆、CaCl2、激活剂肌动蛋白FSL和含FVIII的样品。激活剂导致FXIa的产生，其激活FIX。FVIIIa、FIXa和FX构建了tenase复合物并且FX变成激活的。凝血酶原和纤维蛋白原的进一步活化最终导致纤维蛋白凝块的形成。测量形成凝块所需的时间，活化部分凝血活酶时间(aPTT)。aPTT根据FVIII的量而变化。
使用BCS XP进行凝血测定。将TBSA缓冲液，FVIII耗尽的血浆，肌动蛋白FSL，CaCl2和样品插入分析仪中。用FVIII耗尽的血浆将样品稀释至少1：2。使用TBSA缓冲液进行进一步稀释。对于每个样品，分析仪混合45μl TBSA缓冲液，5μl样品，50μl FVIII耗尽血浆和50μl肌动蛋白FSL。通过加入50μl CaCl2开始反应。分析仪测量凝块形成所需的时间。
为了计算活性FVIII的量，分析仪的软件在反应开始时评价405nm处的基线消光。在200秒的时间内，分析所有以下消光值与基线消光的差异。超过规定阈值的第一时间点被确定为凝血时间。该结果与用FVIII的BRP产生的校准曲线相关。
FVIII抗原ELISA
使用
Figure BDA0003525742080000731
VIII:Ag ELISA(Diagnostica Stago,Asnières surSeine Cedex,France)测定FVIII抗原的量。在该夹心ELISA中，应用的FVIII被小鼠单克隆抗人FVIII F(ab')2片段结合，该片段由制造商包被到板上。通过与过氧化物酶偶联的小鼠单克隆抗人FVIII抗体检测结合的FVIII。在FVIII存在的情况下，过氧化物酶偶联的抗体结合FVIII并可通过加入四甲基联苯胺(TMB)检测。TMB在与过氧化物酶反应时从澄清变为蓝-绿色溶液。短时间后，通过加入硫酸(H2SO4)停止该反应，使溶液变为黄色。结合的FVIII的量与黄色的强度相关，其可以在450nm处测量。用校准曲线计算FVIII的最终量，所述校准曲线通过用已知抗原浓度的校准品测量至少5个连续稀释液产生。
在开始ELISA之前30分钟，用500μl蒸馏水重构所提供的校准品和对照。在该孵育时间后，将校准品在提供的磷酸盐缓冲液中以1：10稀释。这代表起始浓度。将校准品进一步连续1：2稀释直至1：64的稀释度。由于校准品的浓度含有约1U/ml FVIII，取决于批次，起始浓度等同于0.1U/ml FVIII，而最后的稀释液含有约0.0016U/ml FVIII。对照用磷酸盐缓冲液以1：10和1：20稀释。用磷酸盐缓冲液稀释所有样品，这取决于它们先前测定的活性(参见上文)，目的是在校准曲线的中间。在稀释FVIII样品、对照和校准品后，一式两份每孔施加200μl各种溶液。除此之外，用200μl磷酸盐缓冲液填充两个孔作为空白对照。将平板在室温下孵育2小时，用薄膜覆盖。在此期间，过氧化物酶偶联的抗人FVIII抗体用8ml磷酸盐缓冲液重构并在室温下孵育30分钟。抗原固定后，用所提供的洗涤溶液洗涤孔5次，洗涤溶液预先用蒸馏水以1：20稀释。洗涤后，立即向各孔中加入200μl过氧化物酶偶联的抗人FVIII抗体，并在室温下孵育2小时，用薄膜覆盖。然后，如前所述洗涤板5次。为了显示结合的FVIII的量，将200μl TMB溶液加入到每个孔中，并在室温下孵育精确的5分钟。通过向各孔中加入50μl 1M H2SO4终止该反应。在室温下孵育15分钟后，使用POLARstar Omega读板仪(BMGLABTECH，Ortenberg，Germany)在450nm下测量每个孔的吸光度。
使用MARS软件(BMG Labtech)计算ELISA的结果。在第一步中，将所有孔进行空白校正并计算重复的平均值。然后，应用4-参数拟合，以便从校准曲线计算浓度。根据该校准曲线，测定各孔中FVIII抗原的量。在最后一步中，值用稀释因子校正，得到每个样品的FVIII抗原量。
用于测量
Figure BDA0003525742080000741
小型猪样品的适应FVIII抗原ELISA
Figure BDA0003525742080000742
VIII供应的校准品和
Figure BDA0003525742080000743
VIII:Ag ELISA(Diagnostica Stago,Asnières sur Seine Cedex,France,Cat.No.00280)的对照在开始ELISA之前30分钟用500μl蒸馏水重构。在该孵育时间后，将校准品在
Figure BDA0003525742080000744
小型猪血浆中以1：5稀释，并进一步在提供的磷酸盐缓冲液中以1：2稀释。这代表起始浓度。将校准品进一步连续1：2稀释直至覆盖96mU/mL至1.5mU/mL的浓度范围。所有样品用小型猪血浆稀释，除了最后的稀释步骤，其在磷酸盐缓冲液中以1：2进行。所有稀释针对校准曲线的中间。在稀释FVIII样品和校准品后，每孔一式两份施加100μl每种溶液(与指南相比体积减少50％)。此外，向两个孔中填充100μl磷酸盐缓冲液作为空白对照。将平板在室温下孵育2小时，用薄膜覆盖。在此期间，过氧化物酶偶联的抗人FVIII抗体用8ml磷酸盐缓冲液重构并在室温下孵育30分钟。抗原固定后，用所提供的洗涤溶液洗涤孔5次，洗涤溶液预先用蒸馏水以1：20稀释。洗涤后，立即向各孔中加入200μl过氧化物酶偶联的抗人FVIII抗体，并在室温下孵育2小时，用薄膜覆盖。然后，如前所述洗涤板5次。为了显示结合的FVIII的量，将200μlTMB溶液加入到每个孔中，并在室温下孵育精确的5分钟。通过向各孔中加入50μl 1M H2SO4终止该反应。在室温下孵育15分钟后，使用POLARstar Omega读板仪(BMG LABTECH，Ortenberg，Germany)在450nm下测量每个孔的吸光度。
使用MARS软件(BMG Labtech)计算ELISA的结果。在第一步中，将所有孔进行空白校正并计算重复的平均值。然后，应用4-参数拟合，以便从校准曲线计算浓度。根据该校准曲线，测定各孔中FVIII抗原的量，并通过稀释因子校正该值，得到各样品的FVIII抗原量。由于在白蛋白存在下AD2CD2_SC和AD2CD2-19M_SC检测减少，通过将施用溶液掺入小型猪血浆中并评价FVIII:AG检测的减少来确定校正因子。应用所得校正因子计算用于进一步药代动力学评价的特定浓度。
白蛋白结合能力测定
在PBS中以1：4000稀释20％人血清白蛋白(HSA)。用稀释的HSA溶液以100μl/孔填充96孔ELISA板，并在加热振荡器上在37℃和400rpm下孵育2小时过程中进行包被。用300μl/孔洗涤缓冲液洗涤ELISA板3次。用Tris/NaCl pH7.4将标准对照和FVIII样品(有或没有白蛋白预孵育)稀释至0.5U/ml显色活性的浓度，并以7步1：2连续稀释加入100μl/孔。在加热振荡器上覆盖37℃下孵育1小时。同时，将FIXa和FX一起溶于10ml aqua dest.中，底物(S-2765和I-2581)溶于12ml aqua dest.中。FVIII孵育后，将板用300μl/孔洗涤缓冲液再次洗涤3次。将磷脂和FIXa/FX溶液以1：5混合，随后加入50μl/孔的该溶液并在37℃下孵育5分钟。在没有任何洗涤步骤的情况下，将25μl CaCl2加入到每个孔中，然后在37℃下孵育5分钟。最后，加入50μl/孔底物，并在405nm下检测激活的FX介导的底物周转25个循环，随后使用ELISA阅读仪进行终点测量。
vWF结合能力测定
将1u/ml的每种FVIII分子与或不与40mg/ml白蛋白在室温预孵育30分钟以促进ABD-白蛋白结合，并且如下进行用于测定vWF结合能力的试验：
用0.9％氯化钠溶液将血浆纯化的vWF(Biotest AG)稀释至0.1U/ml的浓度。通过将100μl该溶液转移到每个孔中，然后在37℃和400rpm下孵育2小时完成在96孔ELISA板上的包被。将孔用300μl洗涤缓冲液(8mM磷酸钠，2mM磷酸钾，0.14M NaCl，10mM KCl，0.05％吐温-20，pH 7.4)洗涤3次。根据显色活性，用稀释缓冲液(25mM Tris，150mM NaCl，pH 7.4)将FVIII标准品(不含vWF的市售rFVIII)和样品预稀释至0.25U/ml的浓度，并作为7步连续1：2稀释液转移到每个板孔中(100μl/孔)。在37℃和400rpm下孵育1小时。同时，将FIXa和FX一起溶于10ml aqua dest.中，将底物(S-2765和I-2581)溶于12ml aqua dest.中。FVIII孵育后，将板用300μl/孔洗涤缓冲液再洗涤3次。将磷脂和FIXa/FX溶液以1：5混合，随后加入50μl/孔的该溶液并在37℃下孵育5分钟。在没有任何洗涤步骤的情况下，将25μl CaCl2加入到每个孔中，然后在37℃下孵育5分钟。最后，加入50μl/孔底物，并在405nm下检测激活的FX-介导的底物周转25个循环，随后使用ELISA阅读仪进行终点测量。
蛋白质印迹
还原十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)
用1x NuPAGE LDS样品缓冲液(4x，Thermo Fisher Scientific，NP0007)适当稀释细胞上清液、细胞裂解物或FVIII变体的纯化材料，并用还原样品缓冲液进一步1：2稀释。通过将2.5份NuPAGE LDS样品缓冲液与1份NuPAGE样品还原剂(10x，Thermo FisherScientific，NP0004)组合来制备还原样品缓冲液。20μl各样品与20μl还原样品缓冲液在1.5ml小瓶中混合，并使用加热振荡器(Eppendorf)在70℃下加热10分钟。将NuPAGE 4-12％Bis-Tris蛋白凝胶(Thermo Fisher Scientific)插入到XCell SureLock微细胞电泳系统(Thermo Fisher Scientific)中，用1×NuPAGE MOPS SDS电泳缓冲液(Thermo FisherScientific，NP0001)填充内室和外室。500μl的NuPAGE的抗氧化剂(Thermo FisherScientific)加入到内室中。10μl每种制备的样品和4μl Precision Plus Protein AllBlue标准品(Bio-Rad，161-0373)(在1x LDS样品缓冲液中1/10稀释)加载到凝胶上。通过在200V的恒定电压下运行凝胶50-60分钟实现样品分离。
非还原SDS-PAGE
20μl的细胞上清液，细胞裂解物或纯化的FVIII变体材料在预稀释或不预稀释的情况下与10μl的NuPAGE LDS样品缓冲液(4x，Thermo Fisher Scientific，NP0007)和10μl的aqua dest.适当稀释。使用加热振荡器(Eppendorf)将样品在70℃下加热10分钟。将NuPAGETM 3-8％Tris-乙酸盐蛋白凝胶(Thermo Fisher Scientific)插入到XCellSureLock微细胞电泳系统(Thermo Fisher Scientific)中，用1×NuPAGETM Tris-乙酸盐SDS电泳缓冲液(Thermo Fisher Scientific，LA0041)填充内室和外室。10μl每种制备的样品和4μl Precision Plus Protein All Blue标准品(Bio-Rad，161-0373)(在1x LDS样品缓冲液中以1/10稀释)加载到凝胶上。通过在150V的恒定电压下运行凝胶55-70分钟实现样品分离。
蛋白质印迹和检测
为了通过免疫荧光检测研究分离的蛋白质，通过使用用于半湿式蛋白质转移的XCell II印迹模块(Thermo Fisher Scientific)将它们转移到Odyssey硝酸纤维素膜(Li-Cor)或Amersham Hybond低荧光0.2μm聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(GE Healthcare LifeSciences)上。PVDF膜在甲醇中活化，然后施加到SDS凝胶上，而硝酸纤维素膜直接施加到SDS凝胶上。根据制造商的说明书，用NuPAGE转移缓冲液(20X，Thermo Fisher Scientific)填充系统。蛋白质印迹在30V下进行1小时。蛋白质转移后，将膜在4℃下在Odyssey封闭缓冲液(Li-Cor)中封闭过夜。然后将膜在室温下与兔抗凝血因子VIII单克隆抗体(SinoBiological，13909-R226，1：1000)和小鼠抗人因子VIII单克隆抗体(Merck，MAB038，1：2500)或与0.0004μg/μl绵羊抗人因子VIII:C多克隆抗体(Cedarlane，CL20035AP，1.5000)同时孵育1小时，各自在含有0.05％Tween20的Odyssey封闭缓冲液中稀释。孵育后，将膜在0.1％PBST中洗涤4次，持续5分钟。为了检测FVIII重链和轻链，将膜与在含有0.05％Tween20的Odyssey封闭缓冲液中稀释的0.067μg/ml IRDye 800CW驴抗小鼠(Li-Cor，926-32212，1：15000)和0.067μg/ml IRDye 680RD驴抗兔(Li-Cor，926-68073，1：15000)在室温下孵育1h。或者，将CF680驴抗绵羊IgG(H&L)抗体(Biotium，20062-1)以Odyssey封闭缓冲液1：5000稀释用于结合相应的一抗。最后，将膜在0.1％PBST中洗涤4次，持续5分钟，在PBS中洗涤2次，持续5分钟，并在水中漂洗。膜使用Licor Odyssey成像器显现。
药效学研究
凝血因子通过单次静脉内尾静脉注射给予雌性血友病A小鼠，剂量高达200U/kg体重，或相应量的对照溶液。给药后0.5、4或20小时，如下进行尾静脉横切出血试验：将动物在30％O2和70％N2O中用5％异氟烷麻醉，并立即以俯卧位置于+37℃的加热垫上。如Johansen等，2016.Haemophilia 22(4):625-631所述进行尾静脉横切。
监测出血60分钟，并使用秒钟确定出血时间。记录首次出血时间，直至首次出血中止。初次出血后，将尾部放入装有预热盐水的新离心管中。如果小鼠在损伤后15、30和45分钟没有出血，则将尾部从盐水中提起，并通过用盐水润湿的纱布拭子沿远端方向轻轻擦拭两次来攻击伤口。攻击后立即将尾部重新浸入盐水中。所有后续出血的累积出血时间构成二次出血时间。总出血时间定义为初次和所有二次出血时间的总和。
测定出血时间后，将试管在室温下以4140g离心3分钟。除1mL外，除去上清液。再悬浮细胞沉淀，用类似于Elm等(2012)描述的方法测定血红蛋白含量。
结果和讨论
覆盖FVIII双链和单链构建体的几种不同FVIII-ABD融合蛋白的产生和预筛选在初始实验中是非常有希望的，并且在单链和双链骨架中是类似的。
当ABD融合在重链和轻链之间时，与双链形式相比，单链FVIII分子的形成增加(数据未显示)。
本文进一步开发和生产的FVIII蛋白列于表1中。
表1.具有ABD融合的FVIII的相关变体的结构。A＝FVIII A1+a1+A2+a2+截短的B结构域，C＝FVIII a3(任选截短的)+A3+C1+C2结构域，L＝凝血酶切割接头，G＝柔性甘氨酸-丝氨酸接头1(G1)，D＝ABD2，
Figure BDA0003525742080000791
计算机模拟产生6个单链FVIII-ABD融合分子，并测试相应DNA构建体在HEK293或CAP-T细胞中的表达(参见表2)。由于所有这些FVIII-ABD变体都被表达、分泌且是功能性的，基于显色FVIII活性测量的结果，所有分子在中等规模的CAP-T细胞培养中产生，并根据进一步表征和PK(药代动力学)分析的需要以更大量成功纯化。
表2.在转染的HEK293或CAP-T细胞上清液中分析的FVIII-ABD融合蛋白。(n/a：不可用)
Figure BDA0003525742080000801
所有6种纯化的FVIII-ABD融合变体通过几种方法广泛表征，包括测定FVIII抗原和显色活性、肌动蛋白FSL凝结、通过蛋白质印迹(WB)检测重链和轻链、凝血酶切割分析及与vWF和白蛋白的结合。表3给出了所产生的FVIII-ABD变体在显色和凝结活性以及最终溶液中的抗原水平方面的概述。这些值的测量表明FVIII-ABD融合蛋白仍然能够具有其生物学功能：桥接因子IXa和因子X，从而导致后者的激活。比显色活性(显色活性/抗原*100)的比较证明ADLC_SC和ReFacto
Figure BDA0003525742080000802
是相似的(109％对104％)。然而，所有其它FVIII-ABD的比显色活性好得多，范围为130％至206％。
有趣的是，结果表明一个FVIII分子内ABD基序数目的增加降低了凝结活性以及vWF结合的能力。凝结活性的降低可以由测定的设置引起，其是严格时间依赖性的。这可能不反映体内凝结活性。
表3.显色FVIII活性、FSL凝结活性和抗原水平的测量。通过显色活性与抗原的比率计算指示的比活性。
Figure BDA0003525742080000811
蛋白质印迹用于观察与ReFacto
Figure BDA0003525742080000812
相比不同FVIII-ABD融合分子的重链和轻链模式(数据未显示)。分析表明，与ReFacto
Figure BDA0003525742080000813
相反，FVIII-ABD变体主要以单链分子表达。
FVIII-ABD变体的激活通过与凝血酶在37℃下直接孵育8min并且随后提供还原SDS–PAGE接着蛋白质印迹来研究。凝血酶激活的或未处理的FVIII-ABD分子的条带模式显示所有FVIII-ABD分子以与ReFacto
Figure BDA0003525742080000814
相当的方式被凝血酶激活(数据未显示)。
与FVIII 6rs-ref相比较，通过测定测试ADLCLD_SC变体的白蛋白结合，证明白蛋白结合的能力(图1)。过量的未结合的可溶性白蛋白抑制与板结合白蛋白的结合。
在两个设置中研究ABD和接头修饰对FVIII和vWF之间结合的影响：1.直接，不存在白蛋白；2.与生理浓度的白蛋白预孵育30分钟后，促进ABD-白蛋白结合。如图2所示，FVIII-ABD融合蛋白的vWF结合通过增加ABD基序的数目而直接降低。然而，在不存在白蛋白的情况下，每个FVIII仅一个ABD基序对vWF结合没有影响，与其在分子内的位置无关。当FVIII-ABD与白蛋白预孵育时，观察到所有FVIII-ABD变体的vWF结合降低。vWF结合的减少越高，结合到FVIII中的ABD结构域越多。
为了研究接头对FVIII-ABD变体的产生和功能性的影响，还产生了一种优选的变体AD2CD2_SC，(I)在FVIII和ABD-结构域之间没有任何接头(AD2CD2woLG_SC)和(II)具有G1接头但没有凝血酶切割的L接头(AD2CD2woL_SC)。将这些变体与双链FVIII6rs-ref(ReFacto氨基酸序列)、单链FVIII骨架AC_SC和具有四个C-末端ABD结构域的两个FVIII-ABD变体(不具有任何接头(ACD4woLG_SC)或具有一个凝血酶切割接头随后被G1接头分开的四个ABD结构域(ACL(GD)4_SC))进行比较。
将编码不同FVIII变体的相应质粒核转染到CAP-T细胞中，并根据上述方法测试4-天细胞培养物上清液的显色FVIII活性、FVIII凝结活性和FVIII抗原水平。如图3所示，AD2CD2woLG_SC、ACD4woLG_SC和ACL(GD)4_SC仅以低量表达，并且显色活性强烈降低。AD2CD2woLG_SC不大量表达，但具有一些比显色活性。任何这些变体都不能检测到FVIII凝结活性。与所有其它对照相比，AD2CD2_SC和AD2CD2woL_SC显示出良好的FVIII抗原水平和大的FVIII显色和凝结活性，导致约200％或更高的优异比显色活性值。AD2CD2_SC显示出特别高的比凝结活性。
图4显示了基于这些变体的非还原SDS-PAGE分离的蛋白质印迹分析。除了FVIII6rs-ref，所有其它变体主要作为单链FVIII分子存在。然而，AD2CD2woLG_SC和AD2CD2woL_SC倾向于形成多聚体或聚集体，其对于AD2CD2_SC变体没有观察到。
3.药代动力学实验
基于转染的CAP-T细胞的上清液，通过强阴离子交换色谱和亲和色谱进行FVIIIABD变体的纯化用于体内实验。
为了研究引入FVIII分子中的ABD基序的半衰期延长作用，在血友病A小鼠中进行了两个药代动力学(PK)研究。每个测试项使用12只小鼠，每个时间点使用2只或3只。通过向雌性血友病A小鼠(B6，129S4-F8<tm1Kaz>/J)单次静脉内尾静脉注射，将所有FVIII-ABD分子以200U/kg体重(6ml/kg)的单次剂量施用到尾静脉中。分析注射后0.5、4、8、12和20h(和24h)采集的血浆样品的FVIII显色活性和随后通过离心提取的柠檬酸盐血浆中的抗原水平。将血浆样品储存在-80℃并分析FVIII抗原和显色活性。在FVIII-ABD变体之外，测试ReFacto
Figure BDA0003525742080000831
作为对照。
结果示于表4中。
表4.FVIII-ABD变体的计算t1/2。*AD2C_SC数据是高度可变的。t1/2以小时计
Figure BDA0003525742080000832
因此，通过血友病A小鼠中的药代动力学研究，鉴定了本发明的优选FVIII蛋白，其显示半衰期延长至2.5倍(例如ADLCLD_SC-约1.5倍；AD2CD2_SC-约2.5x)。在单独的研究中测试了AbD2CD2_SC的药代动力学，其类似于AD2CD2_SC。
注意到血友病A小鼠模型甚至可能由于鼠和人白蛋白的差异而低估半衰期延长(鼠白蛋白仅具有约两天的半衰期)。然而，观察到的本发明FVIII蛋白的相对延长的半衰期已经使得血友病患者的静脉内FVIII注射可能从2-3天降低至每周一次给药。
此外，在具有鼠白蛋白敲除并表达人FcRn a-链而不是鼠FcRnα-链的白蛋白缺陷型Tg32小鼠(B6.Cg-Albem12Mvw Fcgrttm1Dcr Tg(FCGRT)32Dcr/MvwJ)中进行了药代动力学概念验证研究。与血友病A小鼠相比，该小鼠模型(Alb-/mFcRn-/hFcRn+)揭示了更接近人的情况，因为注射的人白蛋白具有约20天的半衰期，这与人体中的半衰期相似。静脉内FVIII注射(AD2CD2_SC；ReFacto
Figure BDA0003525742080000841
)用200U/kg(基于显色活性)加1％人白蛋白进行。
图5中所示的结果证明，与ReFacto
Figure BDA0003525742080000842
相比，AD2CD2_SC的半衰期延长约4倍，使得静脉内FVIII注射的患者可能从2-3天减少到8-12天给药。
此外，在
Figure BDA0003525742080000843
小型猪中进行了药代动力学研究。每组3只动物经耳静脉注射30U FVIII抗原/kg体重的(I)ReFacto AF+1％人血清白蛋白(HSA)，(II)ReFacto AF+10％HSA，(III)AD2CD2_SC+1％HSA或(IV)AD2CD2_SC+10％HSA。在给药前，给药后4、12、36、48和120小时采集血样，并通过离心立即分离柠檬酸盐血浆。通过FVIII抗原ELISA进行生物分析样品测量，其对于人FVIII是特异性的并且不检测任何猪FVIII。通过非房室分析(图6)的评价得到半衰期：(I)ReFacto AF+1％HAS 7.1h，(II)ReFacto AF+10％HAS 6.4h，(III)AD2CD2_SC+1％HAS18.6h和(IV)AD2CD2_SC+10％HAS 20.7h。因此，在该模型中，与ReFactoAF相比，观察到AD2CD2_SC的半衰期延长约3倍。
此外，已经进行了药效学研究。血友病A小鼠(Jackson No.B6；129S4-F8<tm1Kaz>/J)和对照小鼠(Jackson No.C57BL/6NCrl)静脉内注射200U/kg(基于显色FVIII活性)的每种FVIII变体(
Figure BDA0003525742080000844
Figure BDA0003525742080000845
AD2CD2_SC、ADLCLD_SC)或对照溶液(媒介物对照，0.9％NaCl)，并且分析通过出血的体重减轻、出血时间和通过OD550的Hb量。进行另外的血浆采样(0.5h p.a，通过眼眶后抽取，实验后)用于FVIII活性的分析。如图7所示，本发明的所有FVIII蛋白减少总出血时间和失血量，类似于对照小鼠，表明AD2CD2_SC和ADLCLD_SC的体内功能性。
4.去免疫FVIII蛋白的产生
使用EpiMatrix工具(Epivax,Providence,RI,USA)以及ClustiMer算法对人FVIII中与MHC II类(T细胞表位)结合的肽进行了计算机初步分析，EpiMatrix工具可预测八种常见II类超类型等位基因(DRB1*0101、DRB1*0301、DRB1*0401、DRB1*0701、DRB1*0801、DRB1*1110、DRB1*1301、DRB1*1501)的结合潜力，其覆盖了大多数人群(>90％)，ClustiMer算法鉴定推定的T细胞表位簇(指定的免疫原性簇)。对SEQ ID NO:60所示的FVIII序列(FVIII-6rs)进行分析，其包含1514个氨基酸，不包括19个氨基酸的信号序列和818个氨基酸的B结构域。排除的B结构域的氨基酸不干扰弗林蛋白酶或凝血酶切割位点。计算机工具揭示了共有52个免疫原性肽簇，簇评分范围在4至34之间，表明在高值时具有很高的亲和性，而在低值时则具有较低的亲和性。簇包含14至22个之间的氨基酸，并且一些簇有一些氨基酸重叠。
在52个簇中的12个簇中，由于对活性、结合或稳定性重要的区域的干扰或缺乏可能的交换而排除了氨基酸突变。为了将其余40个簇去免疫化，选择了74个突变。交换的氨基酸优选基于其他物种中自然发生的变化。如果没有天然变化可用，则从包含自然选择发生的突变的点接受突变(PAM)矩阵中选择氨基酸交换。特别地，基于PAM矩阵，N的置换独立地选自以下：D、H、S；其中I的置换是T；其中S的置换独立地选自以下：A、N、G、T；其中L的置换独立地选自以下：N和Q；其中V的置换独立地选自以下：A和T；其中Y的置换独立地选自以下：N和H；其中F的置换独立地选自以下：H和S；其中K的置换独立地选自以下：N、D、E、Q、S和T；其中R的置换独立地选自以下：Q、H和S；其中M的置换选自以下：R、Q、K和T；和/或其中Q的置换选自以下：R、D、E、H和K。
对于一些簇，指示出至多三个突变，所有这些突变都会导致簇评分大大降低。在这些情况下，选择所有突变进行整合。如果其他突变仅导致分数降低较少，则将该突变搁置在一旁。此外，五个簇中的突变被完全搁置，因为该簇的总分已经很低，并且预测的通过突变的改善是微不足道的。这些排除标准导致引入B结构域缺失的(BDD)-FVIII的突变从74个减少到57个：
N79S、I80T、I105V、L107N、S112T、L160S、L171Q、V184A、F214H、N233D、L235F、V257A、I265T、N299D、I310T、F312S、Y426H、Y430H、L481N、F484S、L505N、S507E、L548N、F555H、I610T、N616E、F627H、I632T、Y657D、M701K、L706N、Y748S、N754D、F1710H、F1794H、K1837E、R1936Q、F1937H、L1963Q、S2030A、S2037G、N2038D、S2077G、M2123K、S2125G、Y2134H、Y2167N、F2215H、K2226Q、F2253H、K2258Q、V2276A、F2279H、V2313A、S2315T、V2333A、Q2335H。
表6：在FVIII中鉴定的免疫原性簇
Figure BDA0003525742080000861
Figure BDA0003525742080000871
Figure BDA0003525742080000881
在三轮中进行了突变的整合。在第一轮中，仅整合了单突变，而第二轮和第三轮则包含了第一轮中成功整合的单突变的组合。对于每一轮，最重要的读取(readout)是突变的FVIII变体与未突变的对照FVIII相比的凝血活性。该方法如图8中所示。
合成所有FVIII变体的DNA序列，并在EF-1a启动子的控制下克隆至载体骨架。为了缩小合成的片段的尺寸，通过沉默突变将三个另外的限制性位点整合至FVIII序列中。该序列在FVIII序列的开头(HindIII)和结尾(XbaI)已经具有一个限制性酶切位点，用于克隆到骨架中。在去除B结构域序列之后，自然地出现了一个另外的限制性位点(BamHI)。与另外引入的三个限制性位点(KpnI、XmaI和EcoRI)相组合，这导致产生了具有六个独特限制性位点的FVIII分子。结果，不仅缩短了要合成的序列，而且还提供了使突变组合更容易制备的模块化系统。来自具有六个限制性位点的序列的FVIII分子是进行所有实验的参照分子，称为FVIII-6rs。氨基酸序列如SEQ ID NO:60所示。根据人密码子使用表选择新氨基酸的碱基三联体。选择人类基因组中氨基酸最常用的碱基三联体。
对所有突变进行检测，以判断单置换是否仍导致功能性FVIII分子。在小规模HEK293-F培养物中生产含有单突变的FVIII变体。对于Nucleocuvette中的每个FVIII构建体，一式两份转染HEK293-F细胞。将转染的细胞培养4天。培养后，通过离心收集含有FVIII的上清液。如本文所述，用显色法一式两份地分析上清液中的FVIII凝血活性。将剩余上清液冷冻直至进行FVIII抗原ELISA。为了比较来自不同转染天的不同构建体的凝血活性结果，为了比较来自不同转染天的不同构建体的凝血活性结果，另外用编码FVIII-6rs的参照载体转染HEK293-F细胞。因此，没有以U/ml表示每种变体的FVIII凝血活性，但是计算了相对凝血活性，表明了相对于同一转染日的FVIII-6rs，该变体的凝血活性。
在图9中，显示了分配至FVIII的结构域的单突变变体的相对凝血活性。分析表明，仅八个突变导致细胞培养上清液中FVIII凝血活性完全丧失。这些中的一个L1963Q是已知导致严重血友病A的对照突变。十一个突变导致上清液中的FVIII凝血活性低于对照凝血活性的50％。因此，由于其具有较低或缺乏的FVIII凝血活性，将共计19个突变从进一步的实验中排除。尽管如此，尽管19个排除的突变分布在16个免疫原性簇上，但由于另外的突变已成功整合到其他6个簇中，因此只需要排除10个免疫原性簇即可。其余38个突变导致产生具有凝血活性的FVIII变体，其至少等同于FVIII-6rs的凝血活性的一半。除了凝血活性外，还测定了FVIII变体的抗原值和所得的比凝血活性(图10)由于比凝血活性是FVIII显色凝血活性与FVIII抗原的比率，因此100％表示FVIII凝血活性的量等于FVIII抗原的量。但是，大多数值都在100％以上。较高的值可能表明变体的凝血活性有所提高。在38个活性FVIII变体中，35个具有至少100％的比凝血活性。其余三个变体的比凝血活性低于100％但高于70％，表明产生的FVIII的一部分没有活性。被排除的FVIII变体中有五个显示出低于70％的比凝血活性，其中三个的值甚至低于25％，表明大多数分泌的FVIII都没有活性。与此相反，排除的变体中有六个具有高于100％的高比凝血活性，这暗示了存在有活性但分泌减少的FVIII。没有FVIII凝血活性的所有八个变体(导致0％的比凝血活性)也没有FVIII抗原。这表明引入的突变导致不产生或不分泌FVIII变体。
在该第一轮筛选中，38个单置换(N79S、I80T、I105V、S112T、L160S、L171Q、V184A、N233D、L235F、V257A、I265T、N299D、Y426H、Y430H、L505N、S507E、F555H、I610T、N616E、I632T、L706N、Y748S、N754D、K1837E、R1936Q、S2030A、S2037G、N2038D、S2077G、M2123K、S2125G、F2215H、K2226Q、K2258Q、V2313A、S2315T、V2333A、Q2335H)导致产生具有大量(subtantial)凝血活性(至少相当于FVIII-6rs凝血活性的一半)的功能性FVIII分子。
检测了五个另外的单突变(S660G、I658T、N1796D、N2137H、I2168T)。这些突变是针对由于非功能性突变变体而必须在第一轮筛选中排除的免疫原性簇中的四个而提出。这五个突变最初未经测试，因为其对降低免疫原性的影响较小。但是，对变体的分析显示，上清液中FVIII凝血活性很小或没有，尽管其中三个变体的比凝血活性约为100％。然而，由于凝血活性非常低，并未将突变转移到第二轮筛选中，对于I658T和N2137H，仅超过50％限制约10％。
尽管所有成功整合的38个单突变均具有转移至第二轮筛选的特征，但每个免疫原性簇仅选择一个突变，以使单突变的组合可行。因此，排除了导致较低FVIII凝血活性的突变。此外，发现突变S2030A不是包含S2037G和N2038D的簇的一部分，而是此前的簇的一部分。由于该簇的计算评分在没有突变的情况下已经非常低，因此也排除了S2030A。这导致了25个突变，将这些突变转移到第二轮筛选中。
在第二轮筛选中，选择了38个突变中的25个(N79S、S112T、L160S、L171Q、V184A、N233D、I265T、N299D、Y426H、S507E、F555H、N616E、I632T、L706N、Y748S、K1837E、R1936Q、N2038D、S2077G、S2125G、F2215H、K2226Q、K2258Q、S2315T、V2333A)。
在计算机模拟中尝试了整合突变的FVIII变体，但是由于缺乏具有足够高分辨率的FVIII的完整晶体结构而未能成功。发明人选择将功能性单突变组合在小群中以保持鉴定突变，其导致无活性的蛋白与其他蛋白组合。对于每个部分(由限制性酶切位点定义)，设计一个包含所有突变的载体，从而导致产生相对凝血活性高于50％的FVIII变体。另外，设计了一种仅包含导致相对凝血活性超过80％且使簇的免疫原性评分降低至少15分的突变的载体。对于A1A2和A2部分，仅构建了一个载体，因为所有突变的相对凝血活性均超过80％，且评分降低了15分以上。基于此，产生了在以下位置包含置换的FVIII突变，如表7所示。
表7
Figure BDA0003525742080000911
Figure BDA0003525742080000921
FVIII变体的产生如第一轮所述。产生四天后，确定细胞培养基上清液中的FVIII凝血活性。在A1和A1A2部分(图11A)实现了与对照FVIII-6rs相当甚至更好的凝血活性。特别地，A1A2部分中三个突变的组合似乎对FVIII变体的产生和/或分泌具有积极影响，导致其量超过分泌的活性FVIII-6rs的量的两倍。由于良好的凝血活性，将A1中的七个突变和A1A2中的三个突变带入第三轮。在A2部分中，FVIII变体的凝血活性低于80％，而A3C1C2部分的两个变体显示凝血活性低于40％。由于这些结果，必须进一步分析A2和A3C1C2中组合的突变。除了在A3C1C2部分有9个突变的变体以外，所有组合的比凝血活性均高于100％，表明产生的FVIII变体具有功能(图11B)。该变体的低比凝血活性表明主要分泌了无活性的FVIII。
为了检测A2和A3C1C2部分中干扰FVIII变体的凝血活性的突变，生成了两个实验设计(DOE)矩阵。为避免合成具有每种可能的突变组合的载体，在A2部分中的五个突变以半析因设计进行了建模，而在A3C1C2部分中的六个突变在第8部分分数设计中进行了分析。除了已经测试过的变体(单突变、全突变和初始(naive)变体)之外，为A2部分设计了10个载体，为A3C1C2部分设计了14个载体。如前所述，在HEK293-F细胞中产生变体，并确定上清液中的FVIII凝血活性。分析表明，A2部分中的突变I632T可能是导致凝血活性降低的原因，因为其已整合到所有凝血活性低于100％的变体中(图5A)。所述突变优选地不包含在本发明的蛋白中。在A3C1C2部分中，三个突变N2038D、S2125G和K2258Q似乎降低了FVIII的凝血活性(图12B)。然而，仅对于突变S2125G可检测到对降低的凝血活性的明显影响，其优选不包含在本发明的蛋白中。对于N2038D和K2258Q，尚不清楚其影响是否可能仅是相互组合出现还是与S2125G一起出现。
在A2和A3C1C2部分中的所有变体的比凝血活性至少约为100％(数据未显示)。这表明与FVIII-6rs相比，FVIII凝血活性降低可能是由于生产或分泌问题，而不是由于FVIII失活所致。
根据DOE矩阵的结果，设计了用于A2部分的一个载体和用于A3C1C2部分的四个载体。四个A3C1C2载体仅省略了突变S2125G，或突变S2125G与K2258Q或N2038D的组合，或全部三个突变。在五个载体中整合的变体如下表8中所示。
表8
Figure BDA0003525742080000931
对转染了不同载体的HEK293-F细胞上清液中FVIII凝血活性的测量结果表明，在A2部分具有四个突变的变体的凝血活性与FVIII-6rs的凝血活性相当(图13A)。与此相反，尽管所有四个A3C1C2变体均具有活性，但与FVIII-6rs相比，包含五个突变和不具有突变N2038D的四个突变的变体的凝血活性显示出降低的凝血活性。这表明，由于凝血活性仍然很低，仅排除突变N2038D对FVIII的产生或分泌没有影响。而相反的是，排除K2258Q导致FVIII凝血活性增加。然而，尽管作为单缺失无效，但除去N2038D与K2258Q的组合具有累加作用，并进一步提高了该变体的FVIII凝血活性。尽管如此，将仍然包含N2038D的四个突变的组合转移至第三轮。这是由于其目的是整合很多突变，因此，尽可能降低免疫原性。此外，该变体的凝血活性结果为约100％，与其他部分的组合的结果相似。所有变体的比凝血活性为至少100％，表明仅存在活性FVIII。
最后，第二轮筛选导致19个变体，可以在五个部分中组合。对于A1和A1A2部分，可以包含来来自第一轮的所有突变的组合。对于A2和A3C1C2部分，这是不可能的。基于DOE矩阵，必须在A2部分中排除一个突变，而必须在A3C1C2部分中排除五个突变。
因此，在第二轮中，搁置了另外六个突变。最后一轮筛选包含单个FVIII分子，其包含在第1轮和第2轮筛选中保留的所有19个突变(N79S、S112T、L160S、L171Q、V184A、N233D、I265T、N299D、Y426H、S507E、F555H、N616E、L706N、Y748S、K1837E、N2038D、S2077G、S2315T、V2333A)。该突变的FVIII变体显示出在凝血中起作用，并且包含大量的单置换，这使得分子的免疫原性降低。
由于将19个突变引入FVIII序列，FVIII-6rs的初始免疫原性评分7.01降至FVIII-19M的-10.55。免疫原性评分表示目标蛋白相对于具有随机序列的蛋白的免疫原性。将随机蛋白的免疫原性评分设定为0。为了能够比较不同长度不同蛋白的评分，每1000个9-mer会给出一个评分，将蛋白拆分进行计算机分析。以下为其他蛋白的示例性免疫原性评分：破伤风毒素的评分约为23，Refacto AF的评分约为10.3，白蛋白的评分约为-10，或IgG Fc区的评分约为-42。
由于A3C1C2部分显示受引入的突变的影响最大，因而设计了在A3C1C2部分中无突变的另外的载体(FVIII-15M)，以比较凝血活性。这导致两种蛋白，总计包含15个突变(FVIII-15M，SEQ ID NO:65)和19个突变(FVIII-19M，SEQ ID NO:63)。对这两种载体，上清液中的FVIII凝血活性的分析均表明，凝血活性至少与FVIII-6rs相当。与具有19个突变的变体相比，具有15个突变的变体以更高浓度的活性FVIII分泌。FVIII-15M的比凝血活性接近100％，FVIII-19M的比凝血活性超过100％。
另一变体在位置K1837处不包含置换，如K1837E置换，其似乎降低了凝血活性，但是包含FVIII-19M的其他置换。将该变体称为FVIII-18M。其具有与FVIII-19M大约相同的比凝血活性，但在上清液中测得的显色凝血活性更高。可以得出结论，K1837E置换可能在一定程度上降低FVIII的产生、折叠或分泌。然而，就凝结(clotting)测定而言，FVIII-18M的凝血活性也得到了改善，因此，置换也可能降低凝血活性。然而，下文所述的进一步测定表明FVIII-19M可用于治疗。
产生了其他有利的变体，例如，具有置换L171Q、S507E、Y748S和V2333A的FVIII蛋白FVIII-GOF1；以及具有置换L171Q、N299D、N616E和V2333A的FVIII-GOF2。这些变体在不同区域引入置换，显示了关于凝血活性和比凝血活性的最佳结果。下述变体引入了具有降低的免疫原性评分的最佳结果的置换：具有置换S112T、S507E、Y748S、K1837E和N2038D的FVIII-LS1；和具有置换S112T、Y426H、N754D、K1837E和N2038D的FVIII-LS2。值得注意的是，在这两个方面上，S507E和Y748S的置换是非常有利的。因此，本发明的优选的蛋白至少包含所述置换，以及任选地包含L171Q和V2333A。对于降低免疫原性而言，进一步最佳的方法是将所有七个优选的置换引入A1区。
图14总结了不同因子VIII蛋白的显色凝血活性、凝结凝血活性和比凝血活性，其中已在HEK293-F细胞中产生了所有构建体，并在细胞上清液中进行了分析。测得的相对凝血活性以基于FVIII-6rs的凝血活性的百分比表示，其始终平行产生和检测。比凝血活性基于如下所述通过ELISA检测的上清液中显色凝血活性与上清液中检测的抗原的比率。
为了进一步实验，已经在CAP-T细胞中产生了构建体FVIII-19M和FVIII-6rs，导致更高的蛋白质量。进一步，从细胞培养上清液中纯化出FVIII-19M和FVIII-6rs。
使用SDS-PAGE和蛋白质印迹进行了不同的FVIII-19M与FVIII-6rs、ReFacto AF和Nuwiq的比较分析。印迹表明，与两个主要为双链FVIII的市售产品相比，FVIII-19M和FVIII-6rs主要作为单链蛋白生产。这种差异可能是由于用于生产的细胞系不同所致。另外两个蛋白质印迹结果表明FVIII-19M和FVIII-6rs被糖基化和硫酸化，这证实了翻译后修饰发生在CAP-T细胞中。然而，关于所有六个酪氨酸是否都被硫酸化以及添加了哪些糖基化模式，无法得出详细的结论。
使用ROTEM方法确定不同FVIII产品的凝结时间。在此分析过程中，将根据所施加的FVIII的量和功能来分析血浆的凝结时间。将FVIII产物添加到FVIII缺陷血浆中，并通过内在途径引发凝血。测量直至凝块开始形成的时间。通过添加不同浓度的FVIII，检测到凝血时间的增加与FVIII浓度的降低相关。当比较均为B结构域缺失的不同产品ReFacto AF(辉瑞公司(Pfizer Inc.)，在CHO细胞中生产)和Nuwiq(Octapharma AG公司，在HEK细胞中生产)时，都显示出非常相似的凝结时间，而FVIII-6rs的凝结时间延长，FVIII-19M甚至更长(图15)。但是，在1U/ml FVIII下所有凝结时间仅在120秒至160秒之间改变，其在健康人中仍处于100-240秒的正常凝结时间范围内。
在凝血酶生成测定中(图16)，FVIII-6rs在峰值凝血酶生成量和至峰值凝血酶生成时间方面类似于ReFacto AF和Nuwiq，但曲线下面积略有减小。FVIII-19M显示出显著更低的产生的峰值凝血酶、曲线下面积和达到峰值凝血酶产生所需的时间，特别是与ReFactoAF和Nuwiq相比。然而，这些结果与ROTEM结果相当，表明FVIII-19M的凝结时间略有延长。
用基于ELISA的方法确定FVIII-19M和FVIII-6rs与vWF的结合效力。将ReFacto AF用作参照，将ReFacto AF与vWF的结合力设定为1。所有其他效力是相对于ReFacto AF计算的。数据表明，ReFacto AF和Nuwiq的vWF结合相似，但FVIII-6rs和FVIII-19M受损(图17)。但是，仅能在Nuwiq和FVIII-19M之间检测到显著差异。FVIII-6rs的结合也减少，也可能是由于CAP-T细胞进行了不同的翻译后修饰。这可能与在蛋白质印迹中重链和轻链中检测到的硫酸化减少有关。缺失的硫酸化可能影响vWF的结合，尤其是Y1683的硫酸化对于vWF的结合很重要。然而，减少硫酸化不是造成vWF结合减少的唯一原因，因为ReFacto AF在蛋白质印迹上几乎没有硫酸化，但具有良好的vWF结合。因此，与FVIII-6rs相比，FVIII-19M效力的降低可能是由于源自引入突变的其他结构变化，从而影响了vWF结合。
在凝结时间、凝血酶生成和与vWF结合方面进行的实验中，FVIII-19M的凝血活性稍低，这至少可以部分解释为，与显色测定相比，在凝结测定中测得的凝血活性较低，因为显色测定可能特别高估了FVIII-19M的凝血活性(图18)。
使用两种不同方法分析了本发明蛋白的免疫原性：
免疫原性评分
通过计算机模拟计算方法评价了具有19个单点突变的FVIII分子降低的免疫原性。由无突变分子的初始免疫原性评分约7降至具有19个单点突变的FVIII分子的约-11。对于具有与分析的FVIII相同长度随机序列的蛋白，计算免疫原性评分。
免疫原性评分是使用EpiVax的EpiMatrix系统计算得出的蛋白的免疫原性可能性。为了能够将目标蛋白的免疫原性评分与其他蛋白的评分进行比较，将其与具有随机氨基酸序列的蛋白评分相关联。将该“平均“蛋白的免疫原性评分设定为零。另外，免疫原性评分是每1000个肽指示的，每个肽包含9个氨基酸。由此可以对不同长度的蛋白进行比较。高于零的免疫原性评分表示存在过量的II类MHC配体，并表示具有更高的免疫原性可能性，而低于零的评分表明，与随机蛋白相比，其潜在的II类MHC配体存在的可能性较小，且具有较低的免疫原性。将高于+20的蛋白评分认为具有显著的免疫原性可能性。
体外免疫原性测定
建立了一种用于分析目标蛋白(如FVIII)的免疫原性的体外T细胞测定法，该方法基于健康供体的树突状细胞(DC)和调节性T细胞耗竭的CD4+T细胞，并使用目标蛋白进行刺激。
与没有突变的FVIII分子相比，通过体外免疫原性T细胞测定法显示，重组分子FVIII-19M具有较低的免疫原性。
体外测定能够确定是否由于在DC表面上FVIII-19M肽的呈递减少而导致较少的T细胞被激活。测定包括来源于单核细胞的DC和CD4+CD25-T细胞。在共培养前将CD4+CD25+T细胞耗竭，因为该亚群主要包含调节性T细胞。这是重要的，因为预期来自健康供体以及耐受性血友病A患者的T细胞群包含调节性T细胞，其抑制在发育过程中未耗竭的FVIII特异性T细胞(Kamate，C.，Lenting，P.J.，van den Berg，H.M.&Mutis，T.，“Depletion of CD4+/CD25 high regulatory T cells may enhance or uncover factor VIII-specific T-cell responses in healthy individuals”，Journal of Thrombosis and Haemostasis5，611–613(2007))。由于该测定的目的是刺激FVIII特异性T细胞，因此调节性T细胞被耗尽。选择使用DC作为APC的方法有两个原因。一方面，将焦点集中在基于与呈递的FVIII表位相互作用的CD4+T细胞的激活。与其他免疫细胞相互作用引起的影响可能会使结果失真。另一方面，测定还可以使用来自血友病A患者的细胞进行。这些患者(特别是此前未治疗的血友病A患者)可能仍具有初始T细胞，并且初始T细胞的激活主要因DC而发生。
如图20中所示，从解冻的PBMC中纯化单核细胞，并使用IL-4和GM-CSF(例如，在5天内)分化至未成熟的DC(iDC)。用细胞因子(例如，如下文所定义的IL-Mix)和抗原(例如，目标FVIII)刺激细胞(例如，1天)，以获得成熟的DC(mDC)。在与mDC共培养前两天从PBMC中纯化CD4+CD25-T细胞。纯化后，使用CFSE(羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯)标记CD4+CD25-T细胞，并在IL-2存在下培养两天，以使其从纯化和标记过程中恢复。将mDC和标记的CD4+CD25-T细胞共培养，例如9天。收获T细胞并通过流式细胞术进行分析。
使用FVIII-19M和FVIII-6rs进行DC-T细胞测定。从健康供体的PBMC中纯化细胞。分化后，用此前确定的单独的IL-Mix或IL-Mix与其他蛋白刺激DC。其他蛋白是作为FVIII特异性T细胞增殖的阳性对照的ReFacto AF以及作为目标蛋白的FVIII-6rs和FVIII-19M。FVIII产物的浓度是15U/ml，以确保存在足够的FVIII。在48孔板中进行共培养，导致DC:T细胞的比率至少为1：10。将其纯化后，通过流式细胞术分析所有细胞，以确保纯度，并且在共培养之前对T细胞进行分析，以排除预激活，以及在共培养9天后对T细胞进行分析。共培养9天后，对T细胞的流式细胞术分析结果进行进一步分析。对于每种方法，确定所有CD4+T细胞的增殖。
共计分析了23个不同的健康供体。对于最终分析，显示仅用IL-Mix处理的供体与使用IL-Mix和FVIII相比具有更高的T细胞对DC的应答，并且当排除使用不同FVIII蛋白刺激时，供体显示出显著不同的T细胞活力。因为不是所有健康人均具有针对FVIII的T细胞，因而预期不是所有的健康供体均与FVIII反应。基于这种选择，分析了10个健康供体的结果。
图21显示了针对由IL-Mix加FVIII-19rs刺激的DC的CD4+T细胞增殖与针对由IL-Mix加FVIII-6rs刺激的DC的CD4+T细胞增殖之间的差异。低于0的结果表明，与FVIII-6rs相比，针对FVIII-19M的T细胞应答有所降低。在大部分数供体中检测到这种降低的应答。然而，在小部分供体中检测到高于0的结果。即使如此，对于这些供体增殖的差异低于10％，但在对FVIII-19M显示出应答降低的供体组中检测到更高的差异。总体而言，显示出对FVIII-19M应答降低的供体数量更大，从而导致针对由IL-Mix和FVIII-19M刺激的DC的CD4+T细胞增殖的显著减少。体外DC-T细胞测定的这些结果证实，响应于含有19个氨基酸突变的去免疫化FVIII变体，CD4+T细胞增殖减少。
体外稳定性
在37℃下在FVIII缺陷血浆中孵育本发明的重组FVIII蛋白，并且与ReFacto AF、Nuwiq和FVIII-6rs比较，在不同时间段后分析了凝血活性。如表9中所示，对于所有分析的蛋白，凝血活性的损失都是可接受的。
表9：在37℃下在FVIII缺陷血浆中孵育的FVIII蛋白的显色凝血活性
Figure BDA0003525742080001001
方法
计算机模拟分析
使用计算机模拟T细胞表位建模(EpiMatrix工具)以鉴定II类MHC结合肽，对结果进行簇，将簇与其他蛋白进行比较并预测氨基酸交换。
用于计算机分析的建模工具可从EpiVax(Providence,RI,USA)商购获得。该工具分析蛋白序列，以发现与II类MHC结合的肽。对这些肽的潜在的氨基酸交换进行进一步分析，以降低这种结合。
用于建模过程的FVIII分子是B结构域缺失的因子VIII分子(BDD FVIII)，其中B结构域的818个氨基酸被缺失(FVIII-6rs，SEQ ID NO:60)。建模过程包括四个步骤。在第一步中，EpiMatrix工具将蛋白分解为由9个氨基酸组成的肽，即9-mer。这是由于以下事实：II类MHC的核心结合区包含九个氨基酸。9-mer的序列及其随后9-mer有八个氨基酸重叠。通过构建这些高度重叠的9-mer，不会丢失潜在的结合肽。针对八个常见II类HLA超类型等位基因，检测了所有9-mer的结合能力(DRB1*0101、DRB1*0301、DRB1*0401、DRB1*0701、DRB1*0801、DRB1*1101、DRB1*1301、DRB1*1501)，其覆盖超过90％的人群(De Groot，A S，MCMURRY，J.&MOISE，L.，“Prediction of immunogenicity：in silico paradigms,ex vivo and invivo correlates”，Current Opinion in Pharmacology 8，620–626(2008)；Moise,L.等人，“Effect of HLA DR epitope de-immunization of Factor VIII in vitro and invivo”，Clinical Immunology 142，320–331(2012))。每个9-mer结合HLA等位基因的可能性由“Z评分”指示。该评分表示结合强度，其已归一化为人群中给定等位基因的频率(DeGroot，Anne S.&Martin，W.，“Reducing risk,improving outcomes:Bioengineering lessimmunogenic protein therapeutics”，Clinical Immunology 131，189–201(2009))。对于至少四个HLA等位基因具有高Z-评分的9-mer被认为具有高免疫原性，并被称为EpiBar(Weber,C.A.等人，“T cell epitope:Friend or Foe？Immunogenicity of biologics incontext”，Advanced Drug Delivery Reviews 61，965–976(2009))。
在接下来的步骤中，使用程序ClustiMer将重叠的EpiBar簇。(Moise,L.等人，”Effect of HLA DR epitope de-immunization of Factor VIII in vitro and invivo”，Clinical Immunology 142，320–331(2012))。该分析导致最多25个氨基酸的EpiBar簇与衍生自多个HLA等位基因的II类MHC结合。在优化这些簇之前，使用JanusMatrix程序对与其他内源性蛋白的相似性进行了分析。序列与至少两个其他内源性蛋白的重叠导致将该簇排除在进一步修饰之外，因为很可能已建立了对常见内源性肽的中央耐受性。除此之外，包含裂解位点、激活位点或对FVIII活性重要的其他位点的簇被搁置并且没有改变。在最后一步中，使用OptiMatrix计算了氨基酸交换。该工具评价了已鉴定的簇的每个氨基酸对与II类MHC结合的贡献(Moise,L.等人，“Effect of HLA DR epitope de-immunization ofFactor VIII in vitro and in vivo”，Clinical Immunology 142，320–331(2012))。之后，OptiMatrix计算出哪些氨基酸置换降低了与II类MHC的结合亲和性(De Groot,AnneS.&Moise,L.，“Prediction of immunognicity for therapeutic proteins:State ofthe art”，Current Opinion in Drug Discovery&Development 10,1–9(2007))。这些优化基于以下原则：氨基酸交换必须是保守的，优选发生在其他物种中，并且未在包含所有导致血友病A的已知FVIII突变的数据库中进行注册(Kemball-Cook,G.,Tuddenham,EdwardG.D.&Wacey,A.I.，“The Factor VIII Structure and Mutation Resource Site:HAMSTeRS Version 4”，Nucleic Acids Research 26，216–219(1998))。
突变的分析
通过计算机分析结果，推荐的氨基酸交换被整合至了FVIII序列中。对因子VIII分子的每个突变进行了FVIII凝血活性的筛选。在第一轮中，引入了单突变。第二轮和第三轮包括成功引入的来自第一轮的单突变的组合。参照分子为具有六个独特的限制性位点的FVIII-6rs。分析了在人类细胞系(HEK293-F)中生产(瞬时转染)后的单突变(第一轮)和突变的组合(第二轮和第三轮)，其中在细胞培养上清液中分析了产生的和分泌的蛋白。通过显色和凝结方法分析了FVIII凝血活性。通过FVIII抗原ELISA分析了抗原值。将比凝血活性计算为凝血活性与抗原的关系。
在第一轮中，由于FVIII凝血活性较低或不存在，从57个推荐的突变中排除了19个突变。其余的38个突变导致FVIII变体的凝血活性至少等于参照分子凝血活性的一半。在第二轮中，选择了25个突变，且每个免疫原性簇仅有一个突变。分析了在部分(由限制性位点定义)中组合的突变的组合(相对和比凝血活性)。基于DOE矩阵进行了进一步分析。
通过瞬时转染和后续纯化(SAEx-强阴离子交换色谱-替代地TFF-切向流过滤，AC-FVIII亲和层析，通过SEC-体积排阻色谱的缓冲液交换)，在CAP-T细胞中大规模生产了重组蛋白。
对于翻译后修饰和功能性进行了进一步分析(蛋白质印迹检测FVIII重链和轻链、凝血酶切割、糖基化和硫酸化、2D-DIGE和功能性测定ROTEM4、TGA和vWF-FVIII ELISA)。
在计算机和体外(DC-T细胞测定)中证实了根据本发明的重组蛋白的降低的免疫原性。
转染
对于瞬时转染，使用称为CAP-T细胞和HEK细胞的真核细胞系统。CAP细胞是一种基于原代人类羊膜细胞的永生化细胞系，可在悬浮液中生长。CAP-T细胞以原始CAP细胞为基础，并另外表达猿猴病毒40的大T抗原。CAP-T细胞特别地用于瞬时转染。而且，将HEK 293-F细胞系用于瞬时转染。HEK 293-F细胞系衍生自原始HEK293细胞系，其适用于在无血清培养基中悬浮培养。将HEK细胞用于小规模生产各种突变的FVIII变体。
通过电穿孔使用市售的4D-Nucleofector系统(Lonza Group Ltd.,Basel，Basel)进行瞬时转染。使用7·106个HEK293-F细胞和7μgFVIII质粒在100μl体积中进行电穿孔。用5μg FVIII质粒以100μl体积转染1·107个CAP-T细胞。转染后，将细胞孵育4天。将细胞和上清液用于进一步分析。
蛋白纯化
在CAP-T细胞中以高达800ml的规模生产FVIII-6rs和FVIII-19M。通过FPLC直接从细胞培养上清液中纯化。第一步是使用强阴离子交换柱HiTrap Capto Q(GE HealthcareEurope GmbH,Freiburg)进行切向流过滤或离子交换色谱。在该步骤中将样品浓缩，使宿主细胞蛋白丢失并交换缓冲液。根据色谱图确定含有洗脱的蛋白的级分。第二步是亲和层析，使用装有市售VIIISelect树脂(GE Healthcare Europe GmbH，Freiburg)的层析柱。根据色谱图确定含有洗脱的FVIII的级分。最后一步是使用HiTrap脱盐柱(GE Healthcare EuropeGmbH，Freiburg)通过体积排阻色谱法将缓冲液交换为FVIII制剂缓冲液。根据色谱图中的高UV峰和稳定的电导率峰确定含FVIII的级分。纯化后，通过截留分子量为10kDa的旋转柱(Merck Millipore，Darmstadt)浓缩FVIII产物。所有色谱柱均在生产厂商指定的条件下运行。
分析
如果没有另外提及，则如上所述进行分析。
为了在蛋白质印迹中检测磺基酪氨酸，使用小鼠抗人磺基酪氨酸抗体(MerckMillipore，Darmstadt)。二抗为与IRDye 800CW偶联的驴抗小鼠抗体。如上文所述进行制备。
为了确定FVIII变体是否可以被凝血酶激活，在SDS-PAGE和蛋白质印迹之前，将样品与10U/ml凝血酶在37℃下孵育8分钟。如上文所述进行SDS-PAGE和蛋白质印迹。为了在蛋白质印迹中检测FVIII的一抗为检测重链和轻链的多克隆绵羊抗人因子VIII抗体(Cedarlane，Burlington)以及与IRDye 800CW偶联的二抗驴抗绵羊抗体(LI-CORBiotechnology GmbH，Bad Homburg)。
功能性测定
在凝血酶生成测定(TGA)中，测量了凝血酶的生成量。通过组织因子经由外在途径起始开始凝结级联。最终生成的凝血酶裂解了可以在460nm处测量的荧光底物。用在FVIII缺陷的血浆中稀释的FVIII进行测定。分析了高达0.25U/ml的FVIII浓度。根据生产厂商的方案，将均可通过Technoclone公司(Vienna)购买获得的TGA试剂C low和TGA底物添加到每个样品孔中。TGA试剂low由含有重组人组织因子的低浓度磷脂胶束组成，以引发凝结级联。底物是最终被产生的凝血酶裂解的荧光底物。反应在37℃下在酶标仪中进行，并测量荧光底物的显色两小时。除了样品以外，还使用TGA Cal Set测量校准曲线，TGA Cal Set也可从Technoclone公司(Vienna)获得。根据校准曲线计算凝血酶的产生量。此外，根据生成的曲线的第一偏差来计算曲线下面积和至最大凝血酶生成时间。
还将使用ROTEM系统(Tem International GmbH，Munich)的血栓弹力测定法(TEM)用于确定FVIII变体的功能。在该方法中，将样品施加到杯子上，并将针插入杯子的中间。样品位于杯子和针之间的空间中。转动针，并通过光束监控其旋转，光束从针反射到检测器上。开始凝血后，当形成最终凝块时，产生的凝血将针的运动限制到最大。与TGA不同的是，凝结是通过ROTEM系统中的固有途径使用可以从Tem International GmbH(Munich)购得的内部试剂引发的。基于显色凝血活性，分析了介于1U/ml与0.01U/ml之间的FVIII浓度。使用如在生产厂商的方案中所述的试剂。测量和计算由ROTEM系统全自动化地进行。最后，确定凝结时间。
体外DC-T细胞测定
用于体外测定的DC和T细胞来自健康供体的PBMC。使用Lymphoflot(Bio-RadLaboratories GmbH，München)通过密度梯度从白血球分离术产品或健康捐献者的全血中纯化PBMC。将PBMC在-150℃下冷冻保存，直至溶于测定。使用可从Miltenyi Biotec(Miltenyi Biotec GmbH，Bergisch Gladbach)商购的MACS技术纯化单核细胞以及CD4+CD25-T细胞。对于单核细胞纯化，使用CD14MicroBeads，而将CD4+CD25+调节性T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec GmbH，Bergisch Gladbach)用于T细胞纯化。根据生产厂商的方案对单核细胞进行纯化。对于纯化CD4+CD25-T细胞，将生产厂商的方案中建议的两步纯化过程合并成一步，同时平行进行CD4+T细胞的阴性选择和CD25+细胞的阳性选择，并且仅使用一个纯化柱。抗体的使用量根据方案，孵育时间根据阴性选择步骤。单核细胞是测定期间首先纯化的细胞。纯化后，将单核细胞以1·106个细胞/ml在X-VIVO 15培养基(Lonza，Basel)中接种在培养板上。为了使单核细胞分化成DC，在每个孔中加入终浓度为4000U/ml的粒细胞-单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)和1250U/ml白介素(IL)-4(PeproTech，Hamburg)。将单核细胞在37℃下培养5天。4天后，进行CD4+CD25-T细胞的纯化。纯化后，根据Quah等人于2007年在Nature Protocols杂志上发表的文献，使用CFSE(BioLegend，Koblenz)标记T细胞。随后，将纯化的T细胞以在X-VIVO-15中2·106个细胞/ml的终浓度接种在培养板上。以20U/ml的终浓度将IL-2(PeproTech，Hamburg)添加到细胞混悬液中。使T细胞在37℃下培养2天。在开始将DC与CD4+CD25-T细胞共培养前24小时，使用IL-Mix刺激DC，IL-Mix由10ng/ml IL-1β、10ng/ml IL-6和10ng/ml肿瘤坏死因子(TNF)-α(Miltenyi Biotec GmbH，BergischGladbach)，含有或不含15U/ml FVIII组成。次日，收获T细胞并确定细胞计数。将T细胞浓度调整为在新鲜X-VIVO 15中的2·106个细胞/ml。小心移除含有DC的孔中的上清液，以免扰动DC。将T细胞混悬液添加到DC孔中，以达到DC:T细胞之比为至少1:10。T细胞混悬液的加入量取决于其中原始接种DC的孔的尺寸。未向培养基中加入其他细胞因子。将细胞在37℃下共培养9天。随后，收集T细胞并通过流式细胞术分析其增殖。
5.本发明的去免疫FVIII蛋白
FVIII-19M的19个去免疫化氨基酸置换在DNA水平上并入到FVIII-ABD融合分子中。使用VectorNTI(Thermo Fisher Scientific，Massachusetts，USA)在计算机上产生DNA序列，然后合成全FVIII序列并克隆到目标载体中。通过用所述质粒转化大肠杆菌K12、在氨苄青霉素选择下扩增转化的细菌和制备质粒，可以制备大量的质粒。由Thermo FisherScientific完成基因工程工作。
CAP-T细胞的培养和通过瞬时转染的FVIII编码质粒的表达如本文别处所述进行。为了验证与白蛋白结合结构域融合的去免疫FVIII蛋白的表达水平和功能性，将编码去免疫FVIII-ABD变体AD2CD2-19M_SC和融合分子AD2CD2_SC(两者均包括4个白蛋白结合结构域)和FVIII对照6rs-ref(ReFacto序列)的质粒核转染到CAP-T细胞中。根据上述方法测试4-天细胞培养物上清液的显色FVIII活性和FVIII抗原水平。如图22所示，AD2CD2-19M_SC的FVIII显色活性和FVIII抗原水平与6rs-ref相比高至少3倍。有趣的是，AD2CD2-19M_SC导致比AD2CD2_SC更好的显色活性和FVIII抗原水平(分别显色活性：2.64对1.90U/mL和FVIII抗原：2.00对1.40U/mL)。6rs-ref的比显色活性为113％，而AD2CD2_SC和AD2CD2-19M_SC分别为136％和133％。
用亲和层析纯化的FVIII材料在血友病A小鼠(B6，129S4-F8<tm1Kaz>/J)中进行首次体内药代动力学实验以研究AD2CD2-19M_SC的半衰期延长作用。每个测试项使用12只小鼠，每个时间点3只。将AD2CD2-19M_SC和ReFacto AF(对照)以尾静脉中200U/kg体重(7.14ml/kg)的单剂量通过单次静脉内尾静脉注射施用至雌性小鼠中。注射后0.5、4、8、12和20小时获取血样，通过离心提取柠檬酸盐血浆。将血浆样品储存在-80℃并如所述的分析FVIII抗原和显色活性。对于药代动力学评价，使用Phoenix WinNonlin(Certara USAInc.,USA)进行非房室分析。FVIII抗原水平随时间的平均值如图23所示。对于AD2CD2-19M_SC，分别对于显色活性和FVIII抗原检测到12.45h和11.58h的终末半衰期，并基于个体动物的平均值。相比之下，ReFacto AF产生的最终半衰期对于显色活性为6.48h和对于FVIII抗原为6.08h。因此，在该模型中证实了半衰期延长约2倍。使用中值代替平均值的额外评价得到半衰期延长约3倍。
此外，在
Figure BDA0003525742080001071
小型猪中进行了测试AD2CD2-19M_SC分子的药代动力学研究。每组3只动物经耳静脉注射30U FVIII抗原/kg体重的(I)ReFacto AF+1％人血清白蛋白(HSA)，(II)ReFacto AF+10％HSA，(III)AD2CD2_SC+1％HSA，(IV)AD2CD2_SC+10％HSA，(V)AD2CD2-19M_SC+1％HSA，(VI)AD2CD2-19M_SC+10％HSA。在给药前，给药后4、12、36、48和120小时采集血样，并立即通过离心分离柠檬酸盐血浆。通过如上所述的适应FVIII抗原ELISA进行生物分析样品测量。通过非房室分析的评价(图24，为清楚起见，仅显示II、IV和VI组)获得以下的半衰期：(I)ReFacto AF+1％HSA的7.1h，(II)ReFacto AF+10％HSA的6.4h，(III)AD2CD2_SC+1％HSA的18.6h，(IV)AD2CD2_SC+10％HSA的20.7h，(V)AD2CD2-19M_SC+1％HSA的19.2h和(VI)AD2CD2-19M_SC+10％HSA的21.0h。因此，除了在该模型中AD2CD2_SC相对于的ReFacto AF的约3倍的半衰期延长之外，对于AD2CD2-19M_SC观察到类似或甚至更高的半衰期延长。
如药效学研究所述，使用尾静脉横切试验另外测试AD2CD2-19M_SC的体内功能性。血友病A小鼠(Jackson No.B6；129S4-F8<tm1Kaz>/J)静脉内注射不同剂量的AD2CD2-19M_SC，涵盖200U/kg(组1)、70U/kg(组2)、20U/kg(组3)、7U/kg(组4)和2U/kg(组5)(全部基于显色FVIII活性)或制剂缓冲液(组6)(n＝10只小鼠/组)。非血友病C57BL/6NCrl小鼠用作对照(组7)。测试项施用后30分钟进行尾静脉横切试验。分析通过出血的体重减轻、出血时间和通过OD550的Hb量作为读数。进行额外的血浆采样(0.25h p.a.，通过眼眶后抽血并在实验后)用于FVIII活性的分析。如图25所示，AD2CD2-19M_SC以剂量浓度依赖性方式将总出血时间减少至对照小鼠的总出血时间，清楚地表明其体内功能性。
为了评价去免疫FVIII-ABD融合蛋白是否在最初针对WT或B-结构域截短的FVIII产生的抑制性抗FVIII抗体的存在下保持一定的FVIII活性(旁路活性)，进行改进的Nijmegen-Bethesda测定。Bethesda测定广泛用于定量因子VIII抑制剂(抑制性抗体)的浓度。1个Bethesda单位(BU)定义为在37℃下孵育120分钟后将中和正常血浆中1单位FVIII活性的50％的抑制剂的量。因此，将五种不同的抗FVIII抗体(ESH-8、GMA-8009、GMA-8015、GMA-8026和CL20035AP)(全部具有对人FVIII活性的抑制概率)以1：100掺入咪唑缓冲液(Jackson No.B6；129S4-F8<tm1Kaz>/J)中，其用作储备溶液。将重组FVIII变体ReFactoAF、AD2CD2_SC和AD2CD2-19M_SC掺入FVIII耗尽的血浆(Siemens HealthcareDiagnostics,Germany,#OTXW17)中至终浓度为1U/mL。将标准人血清(Siemens HealthcareDiagnostics,Germany,#ORKL17)在咪唑缓冲液中重构，得到1U/mL的FVIII活性，作为进一步的对照。将抗-FVIII抗体储备液以1：2稀释直至1：1024(1：2连续稀释)于含有FVIII产品的FVIII耗尽血浆中。另外，将用FVIII-耗尽的血浆1：2稀释的每种FVIII产品测定为基线FVIII活性(应得到约0.5U/mL)。用FVIII-耗尽的血浆以1：2至1：128稀释(1：2连续稀释系列)的FVIII-抑制剂血浆标准品(Technoclone,Austria,#5159008,16.0BU/ml)用作阳性对照。将所有样品在37℃下孵育2小时，并通过显色FVIII活性测量来测定活性。通过下式计算每个样品内的剩余FVIII活性：
显色FVIII活性样品[U/mL]/显色FVIII活性基线[U/mL]*100
随后，使用下式计算25-75％的剩余活性范围中的Bethesda单位：
(2-Log(剩余FVIII活性)/0.30103×稀释因子
然后，将每个样品的Bethesda单位除以每次运行的阳性对照的Bethesda单位以进行更严格的比较。
AD2CD2_SC和AD2CD2-19M_SC与标准人血浆(SHP)和ReFacto AF相比针对五种抑制性抗FVIII抗体ESH-8、GMA-8009、GMA-8015、GMA-8026和CL20035AP的FVIII旁路活性结果示于图26中。通常，对于SHP观察到最高的FVIII失活，随后是ReFacto AF。相反，AD2CD2_SC和AD2CD2-19M_SC的FVIII活性受所有抗FVIII抑制剂影响的程度低得多。有趣的是，抗FVIII抗体GMA-8009具有针对SHP和ReFacto AF的高抑制潜力，对AD2CD2_SC具有中等抑制潜力和对AD2CD2-19M_SC仅具有边缘抑制潜力，表明通过引入的去免疫突变之一消除B细胞表位。
抗原呈递细胞表面上HLA-DR呈递肽的鉴定
使用主要组织相容性复合物相关肽蛋白质组学(MAPP)技术分析ReFacto AF、AC-19M_sc和AD2CD2-19M_sc以鉴定经由HLA-DR由MoDC呈递的肽(如Webster,C.I.et al.,2016.mAbs,Vol.8,No.2,pp.253-63中所述)。简言之，MoDC来自10个健康供体的群组，并与测试样品一起孵育。然后裂解细胞，免疫捕获HLA-DR/肽复合物，洗脱肽并通过质谱(MS)测序。MS数据分析鉴定了对单个供体独特的和在多个供体间共有的肽。随后使用iTopeTM分析来预测呈递的肽簇中的核心结合9聚体。
根据以下等式计算群组中每个簇的频率：
群组内的簇频率＝簇共同的供体的数目/供体总数x100
如所预期的，对于ReFacto AF鉴定的所有肽来自野生型FVIII，即相对于健康供体是自身来源的，但是由于FVIII肽被识别为外源的，它们可以在血友病A患者中引发抑制剂发生。总之，对于ReFacto AF，观察到具有10-80％供体的频率的40个肽簇。对于AC-19M_SC，即使出现新的簇，簇的总数减少到37。与ReFacto AF相比，这37个簇中的15个显示出降低的供体频率，而与ReFacto AF相比，这15个簇中的6个甚至在AC-19M_SC中被消除(参见图27)。相反，与ReFacto AF相比，针对AC-19M_SC鉴定的所述37个簇中的8个具有更高的频率，其中这8个簇中的3个是新表位。有趣的是，对于AD2CD2-19M_SC，发现了甚至更低的31的总簇数。与ReFacto AF相比，这31个簇中的24个显示降低的供体频率，而这24个簇中的11个完全消除。与ReFacto AF相比，具有增加的频率的簇的数量仅为3个，包括2个新表位。
有趣的是，并入的去免疫突变中的几种消除或至少降低了供体中的发生频率。然而，分析进一步表明L160S、F555H和S2315T突变可导致相应FVIII表位的呈递。在一个实施方案中，本发明因此提供了包含16个去免疫突变的本发明FVIII-ABD蛋白，即除L160S、F555H和S2315T突变外的19个优选突变(19M)。因此，优选地，所述蛋白质包含L160、F555和S2315。这种突变组合命名为16M。
6.FVIII、接头和白蛋白结合结构域之间的接合区的去免疫
为了进一步去免疫化，通过两种不同的方法对通过FVIII、接头和ABD序列之间的融合产生的接合区进行计算机评估。
第一种方法是利用上面第4节所述的EpiMatrix工具。因此，计算机模拟分离具有FVIII序列中8个氨基酸重叠的AD2CD2-19M_SC的非FVIII序列，并使用EpiMatrix工具鉴定潜在免疫原性的簇。这也包括应用JanusMatrix对与内源蛋白的同源性的研究(见上文)。
使用VectorNTI(Thermo Fisher Scientific,Massachusetts,USA)将来自计算机评估的单独选择的和最有希望的去免疫突变并入AD2CD2_SC和AD2CD2-19M_SC的DNA序列中，分别产生携带如表10中概述的突变的变体D01-D11和E01-E11。合成全FVIII序列并克隆到靶载体中。在转染的大肠杆菌K12中进行相应质粒的扩增，随后质粒制备。
表10：通过EpiMatrix分析鉴定并用于AD2CD2_SC(SEQ ID 48)和AD2CD2-19M_SC(SEQ ID NO：114)的FVIII、ABD和接头区之间的接合区的去免疫的突变。该表中的位置涉及SEQ ID NO 48或SEQ ID NO：114(其中这种命名是相同的)。也可以将相应的置换引入其它AD2CD2_SC蛋白中，例如对应于SEQ ID NO：114但具有L160、F555和S2315的AD2CD2-16M_SC(这三个位置是指相对于SEQ ID NO：1的位置)。
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CAP-T细胞的培养和通过瞬时转染的FVIII编码质粒的表达如本文中别处所述进行。为了验证与白蛋白结合结构域融合的所述接合区去免疫的FVIII蛋白的表达水平和功能性，将相应质粒核转染到CAP-T细胞中。根据上述方法测试4-天细胞培养物上清液的显色FVIII活性和FVIII抗原水平。结果如图28所示。所有接合区去免疫的AD2CD2_SC变体D01、D02、D03、D04、D05、D07、D08、D09、D10和D11能够在显色测定中诱导底物加工，证明每种变体的表达和分泌以及它们的体外功能性(图28A)。比显色活性(显色活性与FVIII抗原水平的比率)在132-190％的范围内(图28B)。在该体外评估中，所有基于AD2CD2_SC的接合区去免疫变体与初始AD2CD2_SC分子一样有效或甚至更有效。发现所有测试的接合区去免疫的AD2CD2-19M_SC变体E01、E02、E04、E05、E06、E07、E08、E10和E11的上清液提供显色FVIII活性，证明蛋白质表达、分泌和总体功能性。观察的FVIII显色范围在E04_AD2CD2-19M_SC的1.15U/mL和E11_AD2CD2-19M_SC的3.99U/mL之间。对于骨架AD2CD2-19M_SC变体，发现1.98U/mL的浓度。比显色FVIII活性在113至187％的范围内，表明所有基于AD2CD2-19M_SC的FVIII变体的有利的蛋白质质量。
即使所有测试的接合区去免疫的基于AD2CD2_SC和AD2CD2-19M_SC的变体在体外是功能性的，变体D08和D11以及E08和E11在免疫学方面可能是优选的，因为在这些变体中消除了最高数目的潜在免疫原性簇。因此为了进一步研究，变体D08_AD2CD2_SC和D11_AD2CD2_SC通过稳定表达CAP Go池以更大的量产生，并且将上清液如上所述亲和纯化。
接合区去免疫FVIII-ABD蛋白的体内功能性
有利的接合区去免疫的D08_AD2CD2_SC和D11_AD2CD2_SC FVIII变体的体内功效通过使用如上所述的血友病A小鼠的尾静脉横切试验来评估。每组至少8只动物给予20、5或2U/kg(针对显色FVIII活性调节)的D08_AD2CD2_SC或D11_AD2CD2_SC。用FVIII制剂缓冲液处理7只血友病A小鼠和5只C57Bl/6小鼠(非血友病)作为阳性和阴性对照。施用后0.5小时开始尾静脉横切，且总出血时间的结果如图29所示。用FVIII制剂缓冲液处理的血友病A小鼠的平均出血时间为29分钟22秒，而C57Bl/6野生型小鼠的平均出血时间仅为2：30分。当将D08_AD2CD2_SC施用于血友病A小鼠时，对于所用剂量20、5和2U/kg体重观察到的出血时间分别为3：03、6：01和16：43分。与FVIII制剂缓冲液处理的血友病A小鼠相比，所有剂量的出血时间的减少都是显著的。对于用20、5和2U/kg体重的D11_AD2CD2_SC处理的动物，观察到6：47、4：41和22：04min的相应出血时间。在20和5U/kg体重下观察到出血时间显著减少。总之，该药效学出血测定以剂量依赖性方式证明接合区去免疫变体D08_AD2CD2_SC和D11_AD2CD2_SC两者的体内功效。
FVIII接合区去免疫的第二种方法
通过利用对AD2CD2_SC氨基酸序列的Abzena's iTope计算机分析，对FVIII、接头和ABD之间的接合区进行去免疫的第二种方法。与上述MHC II肽鉴定分析一致，对于跨越从F761到S769的9mer-核心的接合区仅鉴定了一个表位。为使该表位去免疫化，根据Gallwitz等人(Gallwitz M,Enoksson M,Thorpe M,Hellman L.The extended cleavagespecificity of human thrombin.PLoS One.2012；7(2):e31756.doi:10.1371/journal.pone.0031756)，就维持凝血酶裂解位点通过iTope分析评估并考虑几个突变。表11中概述的所得去免疫化氨基酸置换在计算机上清楚地证明了与所有MHC II型的结合急剧降低。
表11：通过iTope分析鉴定并用于AD2CD2_SC(SEQ ID 48)的FVIII、ABD和接头区之间的接合区去免疫化的突变。也可将相应的置换引入本发明的其它蛋白质中，例如对应于SEQ ID NO：114但具有L160、F555和S2315(这三个位置是指相对于SEQ ID NO：1的位置)的AD2CD2-16M_SC或AD2CD2-19M_SC(SEQ ID NO：114)。
序列 突变 SEQ ID NO MHC II配体 高亲和性配体
FSQNPPVLS - 127 13 8
ASQNPPVLS F761A 128 0 0
SSQNPPVLS F761S 129 0 0
FSQNPEVLS P766E 130 1 0
FSQNPPVLD S769D 131 3 0
编码包含表11的四个突变之一的AD2CD2_SC变体(即包含F761A的F01_AD2CD2_SC、包含F761S的F02_AD2CD2_SC、包含P766E的F03_AD2CD2_SC和包含S769D的F04_AD2CD2_SC)的DNA构建体使用VectorNTI计算机模拟产生。合成全FVIII序列并克隆到目标载体中。在转染的大肠杆菌K12中进行相应质粒的扩增，随后质粒制备。
将编码F01_AD2CD2_SC、F02_AD2CD2_SC、F03_AD2CD2_SC、F04_AD2CD2_SC和AD2CD2_SC的质粒瞬时转染到CAP-T细胞中用于如上所述的表达和功能性评估。分析12.5ml规模的4-天分批培养物的上清液的显色FVIII活性和FVIII抗原水平。AD2CD2_SC标准化的结果分别在图30A和B中显示。没有发现显色FVIII浓度的主要差异-与AD2CD2_SC相比，所有接合区去免疫的变体在101至110％的范围内。相比之下，对于所述变体，AD2CD2_SC标准化的FVIIII抗原水平比AD2CD2_SC对照高，具有109-186％的范围。这导致接合区去免疫FVIII变体F01_AD2CD2_SC、F02_AD2CD2_SC和F03_AD2CD2_SC的较低比活性，然而，其仍显示出240至313％的显著良好的比活性值。相比之下，F04_AD2CD2_SC和AD2CD2_SC显示448和439％的比活性。总之，该第二种方法的所有四种接合区去免疫的FVIII变体都被表达，并发现在体外是功能性的。根据iTope分析的计算机预测，变体F01_AD2CD2_SC和F02_AD2CD2_SC可能是优选的。
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Claims (24)

1.一种重组因子VIII蛋白，其包含因子VIII的重链部分和轻链部分以及至少两个白蛋白结合结构域，其中至少一个白蛋白结合结构域在所述重链部分的C-末端且至少一个白蛋白结合结构域在所述轻链部分的C-末端，
其中，如果所述蛋白质是单链蛋白，则在所述重链部分的C-末端的所述白蛋白结合结构域是在所述轻链部分的N-末端。
2.根据权利要求1所述的重组因子VIII蛋白，其是单链蛋白，其中所述蛋白质优选至少部分B结构域缺失。
3.前述权利要求中任一项所述的重组因子VIII蛋白，其中两个白蛋白结合结构域在所述重链部分的C-末端，且两个白蛋白结合结构域在所述轻链部分的C-末端。
4.前述权利要求中任一项所述的重组因子VIII蛋白，其中白蛋白结合结构域通过接头与所述重链部分和/或所述轻链部分和/或其它白蛋白结合结构域分开，其中所述接头选自：
a)任选地具有SEQ ID NO：39的序列的包含凝血酶切割接头的接头，和b)任选地具有SEQ ID NO：40或SEQ ID NO：41的序列的包含甘氨酸-丝氨酸接头的接头，和c)任选地具有SEQ ID NO：42或SEQ ID NO：43的序列的包含每一侧邻接甘氨酸-丝氨酸接头的凝血酶切割接头的接头。
5.前述权利要求中任一项所述的重组因子VIII蛋白，其中所述白蛋白结合结构域包含根据SEQ ID NO：44的序列，其中优选地所述序列是SEQ ID NO：46。
6.前述权利要求中任一项所述的重组因子VIII蛋白，其任选地是单链蛋白，其中所述蛋白包含与SEQ ID NO：16的aa20-aa768具有至少90％序列同一性的重链部分和与SEQ IDNO：16的aa769-aa1445具有至少90％序列同一性的轻链部分。
7.前述权利要求中任一项所述的重组因子VIII蛋白，其是包含在所述重链部分和所述轻链部分之间的至少两个白蛋白结合结构域及在所述轻链部分的C-末端的至少两个白蛋白结合结构域的单链蛋白，其中所述蛋白质与SEQ ID NO：48、49或51中的任一个具有至少80％的序列同一性，
其中优选地所述蛋白质与SEQ ID NO：48具有至少80％的序列同一性。
8.前述权利要求中任一项所述的重组因子VIII蛋白，其中所述重组因子VIII蛋白在选自以下的位置处包含至少三个氨基酸置换：Y748、L171、S507、N79、I80、I105、S112、L160、V184、N233、L235、V257、I265、N299、Y426、Y430、L505、F555、I610、N616、L706、N754、K1837、R1936、S2030、S2037、N2038、S2077、M2123、F2215、K2226、K2258、V2313、S2315、V2333和Q2335；
其中N的置换独立地选自D、H、S和E；其中I的置换独立地选自T和V；其中S的置换独立地选自A、N、G、T和E；其中L的置换独立地选自N、Q、F和S；其中V的置换独立地选自A和T；其中Y的置换独立地选自N、H和S；其中F的置换独立地选自H和S；其中K的置换独立地选自N、D、E、Q、S和T；其中R的置换独立地选自Q、H和S；其中M的置换选自R、Q、K和T；和/或其中Q的置换选自R、D、E、H和K；
其中所述位置是相对于SEQ ID NO：1的全长人因子VIII分子指定的；
并且其中与由SEQ ID NO：60组成的因子VIII蛋白相比，所述重组因子VIII蛋白保留至少50％的凝血活性，如在显色测定中所测定的。
9.根据权利要求8所述的重组因子VIII蛋白，其中所述氨基酸置换选自Y748S、L171Q、S507E、N79S、I80T、I105V、S112T、L160S、V184A、N233D、L235F、V257A、I265T、N299D、Y426H、Y430H、L505N、F555H、I610T、N616E、L706N、N754D、K1837E、R1936Q、S2030A、S2037G、N2038D、S2077G、M2123K、F2215H、K2226Q、K2258Q、V2313A、S2315T、V2333A和Q2335H。
其中优选地，所述重组因子VIII蛋白包含3-25个所述置换，并且所述置换位于不同的免疫原性簇内。
10.根据权利要求8或9中任一项所述的重组因子VIII蛋白，其包含在选自Y748、L171、S507、N79、S112、L160、V184、N233、I265、N299、Y426、F555、N616、I632、L706、K1837、R1936、N2038、S2077、S2125、F2215、K2226、K2258、S2315和V2333的位置处的至少三个氨基酸置换；
其中所述至少三个氨基酸置换优选选自Y748S、L171Q、S507E、N79S、S112T、L160S、V184A、N233D、I265T、N299D、Y426H、F555H、N616E、I632T、L706N、K1837E、R1936Q、N2038D、S2077G、S2125G、F2215H、K2226Q、K2258Q、S2315T和V2333A。
11.根据权利要求8-10中任一项所述的重组因子VIII蛋白，其包含至少在位置N79、S112、L160、L171、V184、N233、I265、N299、Y426、S507、F555、N616、L706和Y748处的氨基酸置换，其中优选地所述置换是N79S、S112T、L160S、L171Q、V184A、N233D、I265T、N299D、Y426H、S507E、F555H、N616E、L706N和Y748S，任选地还包含在位置K1837处的氨基酸置换，如K1837E。
12.根据权利要求8-11中任一项所述的重组因子VIII蛋白，其包含至少在位置N79、S112、L160、L171、V184、N233、I265、N299、Y426、S507、F555、N616、L706、Y748、N2038、S2077、S2315和V2333处的氨基酸置换，其中优选地所述置换是N79S、S112T、L160S、L171Q、V184A、N233D、I265T、N299D、Y426H、S507E、F555H、N616E、L706N、Y748S、N2038D、S2077G、S2315T和V2333A，任选地还包含K1837处的氨基酸置换，如K1837E，例如与SEQ ID NO：114的因子VIII蛋白具有至少90％序列同一性。
13.根据权利要求8-10中任一项所述的重组因子VIII蛋白，其中所述蛋白质包含L160、F555和S2315中的至少一个，优选全部，
其中所述蛋白质任选地具有SEQ ID NO：114，除了L160、F555和S2315。
14.根据权利要求8-10或13中任一项所述的重组因子VIII蛋白，其包含至少在位置N79、S112、L171、V184、N233、I265、N299、Y426、S507、N616、L706、Y748、N2038、S2077和V2333处的氨基酸置换，其中优选地，所述置换是N79S、S112T、L171Q、V184A、N233D、I265T、N299D、Y426H、S507E、N616E、L706N、Y748S、N2038D、S2077G和V2333A，任选地还包含在位置K1837处的氨基酸置换，如K1837E，例如与SEQ ID NO：114的因子VIII蛋白具有至少90％序列同一性。
15.根据权利要求8-14中任一项所述的重组因子VIII蛋白，其与SEQ ID NO：63的因子VIII蛋白具有至少90％的序列同一性，其中在序列同一性的确定中仅考虑A1、a1、A2、a2、a3、A3、C1和C2结构域，
其中所述蛋白质任选地具有SEQ ID NO：114。
16.根据前述权利要求中任一项所述的重组因子VIII蛋白，其是至少部分B结构域缺失且包含SEQ ID NO：5的加工序列的单链蛋白，其中X是A或S，任选地A。
17.根据前述权利要求中任一项所述的重组因子VIII蛋白，其包含置换F761G、F779G、F1632G、F858G、F1711G、S926G、F936G和N1625D中的至少一个，优选全部，其中命名的所述置换涉及相对于SEQ ID NO：48的位置。
18.根据权利要求1-16中任一项所述的重组因子VIII蛋白，其包含置换P766Q、N772D、R784Q、S787G、R1637Q、S1640G、R863Q、S866G、R1716Q、S1719G、S926G、R941Q、S944G和N1625D中的至少一个，优选全部，其中命名的所述置换涉及相对于SEQ ID NO：48的位置。
19.根据前述权利要求中任一项所述的重组因子VIII蛋白，其中所述蛋白质是融合蛋白。
20.编码前述权利要求中任一项的重组因子VIII蛋白的核酸，其中所述核酸优选地是适合在哺乳动物细胞中表达所述重组因子VIII蛋白的表达载体，任选地是人细胞，如CAP细胞。
21.包含权利要求20的核酸的宿主细胞，其中优选地所述宿主细胞是包含适合于在所述细胞中表达所述重组因子VIII蛋白的表达载体的哺乳动物细胞。
22.一种制备重组因子VIII蛋白的方法，包括在适合所述因子VIII蛋白表达的条件下培养权利要求21的宿主细胞并分离所述重组因子VIII蛋白，其中该方法任选地包括将所述因子VIII蛋白配制成药物组合物。
23.一种药物组合物，其包含权利要求1-19中任一项的重组因子VIII蛋白、权利要求20的核酸或权利要求21的宿主细胞，任选地还包含生物学上可接受的载体和/或白蛋白，
其中所述药物组合物优选用于治疗血友病A。
24.一种治疗血友病A的方法，包括将有效量的权利要求23的组合物施用于需要的受试者。
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