EA028309B1

EA028309B1 - Полипептиды химерного фактора viii и их применение

Info

Publication number: EA028309B1
Application number: EA201491186A
Authority: EA
Inventors: Экта Сет Чабра; Туняо Лю; Роберт Питерс; Хайянь Цзян
Original assignee: Байоджен Эмэй Инк.
Priority date: 2012-01-12
Filing date: 2013-01-12
Publication date: 2017-11-30
Also published as: CN111499761A; JP2020078338A; EA035323B1; RS59670B1; EP3505179A1; PH12018501250A1; PL2804623T3; LT2804623T; TW202204392A; CN111499760A; SG11201403764XA; AU2013205647A8; WO2013106787A1; NZ626945A; EP2804623B1; TW201348253A; HRP20191920T1; PH12014501602A1; JP7475613B2; MY201293A

Abstract

В изобретении предложены фрагмент ФВ, содержащий домен D' и домен D3 ФВ, химерный белок, содержащий фрагмент ФВ и гетерологичный компонент, или химерный белок, содержащий фрагмент ФВ и белок Ф-VIII, а также способы их применения. Полипептидная цепь, содержащая фрагмент ФВ, являющегося объектом изобретения, связывается или является соединенной с полипептидной цепью, содержащей белок Ф-VIII, и полипептидная цепь, содержащая фрагмент ФВ, может предотвращать или подавлять связывание эндогенного ФВ с белком Ф-VIII. Путем предотвращения или подавления связывания эндогенного ФВ с Ф-VIII, которое является фактором, ограничивающим время полужизни связывание эндогенного ФВ с белком Ф-VIII, фрагмент ФВ может индуцировать продление времени полужизни белка Ф-VIII. В изобретении также предложены нуклеотиды, векторы, клетки-хозяева, способы применения фрагмента ФВ или химерные белки.

Description

Уровень техники

Свертывание является сложным процессом образования кровью тромбов. Важной частью гемостаза является прекращение тока крови из поврежденного сосуда, при котором стенка поврежденного сосуда покрывается бляшками и содержащими фибрин тромбами для того, чтобы остановить кровотечение и начать восстановление поврежденного сосуда. Нарушения свертываемости крови могут привести к повышенному риску возникновения кровотечений (геморрагии) или образованию закупоривающих тромбов (тромбозу).

Свертывание начинается практически сразу после того, как при повреждении кровеносного сосуда была повреждена эндотелиальная выстилка сосуда. Воздействие на кровь таких белков, как тканевой фактор, инициирует изменения в тромбоцитах и плазменном белке фибриногене - факторе свертывания крови. Тромбоциты мгновенно образуют пробку в месте повреждения; это называется первичным гемостазом. Одновременно происходит вторичный гемостаз: белки, находящиеся в плазме крови, которые называются факторами коагуляции или факторами свертывания крови, откликаются сложным каскадом реакций, образуя фибриновые нити, которые укрепляют тромбоцитарную пробку. Неограничивающие факторы коагуляции включают, но не ограничиваются этим, фактор I (фибриноген), фактор II (протромбин), тканевый фактор, фактор V (проакцелерин, лабильный фактор), фактор VII (стабильный фактор, проконвертин), фактор VIII (антигемофильный глобулин А), фактор IX (антигемофильный глобулин В или кристмас-фактор), фактор X (фактор Стюарта-Прауэра), фактор XI (плазменный предшественник тромбопластина), фактор XII (фактор Хагемана), фактор XIII (фибринстабилизирующий фактор), ФВ, прекалликреин (фактор Флетчера), высокомолекулярный кининоген (ВМК) (фактор Фитцджеральда), фибронектин, антитромбин III, кофактор гепарина II, протеин С, протеин 3, протеин Ζ, плазминоген, альфа 2-антиплазмин, тканевой активатор плазминогена (ТАП), урокиназа, ингибитор активатора плазминогена-1 (ИАП-1), ингибитор активатора плазминогена-2 (ИАП-2).

Гемофилия А является нарушением свертываемости крови, возникающим из-за дефектов в гене, кодирующем фактор коагуляции VIII (Ф-УШ), и проявляющимся у 1-2 из 10000 младенцев мужского пола; Сга\ус1 с1 а1., ΝαΙ. Кеу. Сспс1. 6(6): 488-501 (2005). Пациентов, страдающих гемофилией А, можно лечить путем вливаний очищенного или полученного с помощью рекомбинантных технологий Ф-УШ. При этом все коммерчески доступные продукты, содержащие Ф-^Н, как известно, имеют время полужизни, составляющее 8-12 ч, и требуют частых внутривенных введений пациентам; смотрите Уешет М.А. апб Сато, М.3., Реб1аЬтс Нета!о1оду 3есге!8, Ьее, М.Т., 12. Обогбеп, о£ Соа§и1аЬоп, Е18еу1ег НеаИЬ Заепсек, 2001; ЫШсгар, Ό. ТЬготЬ. Кек. 122 Зирр1 4:32-8 (2008). Помимо этого было предпринято большое количество попыток с целью продлить время полужизни Ф-^Н. Например, подходы в разработках для продления времени полужизни факторов свертывания крови включают пэгилирование, гликопэгилирование и конъюгацию с альбумином; смотрите ОитоШе! а1., В1ооб. 119(13): 3024-3030 (опубликовано онлайн 13 января 2012 г.) Независимо от используемой белковой инженерии, разрабатываемые в последнее время содержащие Ф-ХШ продукты длительного действия обладают продленными временами полужизни, но эти времена полужизни, как сообщается, ограничены - на доклинических животных моделях было получено продление - всего лишь в около 1,5-2 раза; смотрите И. Схожие результаты были продемонстрированы для людей, например, сообщалось, что для пациентов, страдающих гемофилией А, время полужизни Ш^ИРс продлено в ~1,7 раз по сравнению с А^VАТЕ®; смотрите И. Следовательно, продление времени полужизни, несмотря на небольшое увеличение, может указывать на присутствие других ограничивающих Т1/2 факторов; 3ее Ьш, Т. е! а1., 2007 ШТН теебпд, аЬкбас! #Р-М-035; Неппк, А. е! а1., 2011 ШТН тееЬпд, аЬкбас! #Р=МО-181; Ьш, Т. е! а1., 2011 ШТН тееЬпд аЬкбас! #Р-УЕ-131.

Плазменный фактор Виллебранда (ФВ) имеет время полужизни, составляющее приблизительно 12 ч (в диапазоне от 9 до 15 ч); Ь!1р://ттт.пЬ1Ы.шЬ.доу/§шбе1ше8/утб/2_8с1еп!Шсоуегу1ет.Ь!т (последний визит 22 октября 2011 г.). На время полужизни ФВ может воздействовать большое количество факторов: профиль гликозилирования, АОАМТ3-13 (дезинтегрин и металлопротеаза в сочетании с тромбоспондином мотив-13), а также различные мутации в ФВ.

В плазме 95-98% Ф-'УШ циркулирует в тесном нековалентном комплексе с полноразмерным ФВ. Образование этого комплекса важно для поддержки соответствующих плазменных уровней Ф-'УШ ίη У1уо; Ьепбпд е! а1., В1ооб. 92(11): 3983-96 (1998); Ьеп!ш§ е! а1., ί. ТЬтотЬ. Наеток!. 5(7): 1353-60 (2007). Полноразмерный Ф-'УШ дикого типа в основном находится в виде гетеродимера, содержащего тяжелую цепь (ММ 200 кДа) и легкую цепь (ММ 73 кДа). Когда Ф-^П активируется благодаря протеолизу на позициях 372 и 740 тяжелой цепи и на позиции 1689 легкой цепи, связанный с Ф-'УШ ФВ отделяется от активированного Ф-'УШ. Активированный Ф-'УШ вместе с активированным фактором IX, кальцием и фосфолипидом (теназный комплекс) участвуют в активации фактора X, вырабатывая большие количества тромбина. Тромбин, в свою очередь, расщепляет фибриноген до образования растворимых мономеров фибрина, которые затем спонтанно полимеризуются до образования растворимого фибринового полимера. Тромбин также активирует фактор XIII, который вместе с кальцием служит для перекрестного связывания и стабилизации растворимого фибринового полимера, образуя перекрестно-связанный (нерастворимый) фибрин. Активированный Ф-'УШ быстро удаляется из циркуляции при помощи протеолиза.

- 1 028309

Из-за частого дозирования и неудобств, связанных с режимом дозирования, до сих пор существует потребность в разработке продуктов, содержащих Ф-УШ, которые требуют менее частого применения, т.е. содержащего Ф-УШ продукта, который имеет время полужизни, превышающее ограничение в 1,5-2кратное увеличение времени полужизни.

Краткое описание изобретения

Настоящее изобретение относится к химерному белку, содержащему белок фактора УШ (Ф-УШ) и дополнительный компонент (ДК), причем дополнительный компонент подавляет или предотвращает связывание эндогенного ФВ с белком Ф-УШ. Белок Ф-УШ и дополнительная группа связаны между собой ковалентной связью для того, чтобы предотвратить диссоциацию дополнительного компонента в присутствии эндогенного ФВ. В одном варианте реализации изобретения ковалентная связь представляет собой пептидную связь, дисульфидную связь или линкер, который является достаточно сильным для того, чтобы предотвратить диссоциацию дополнительного компонента от белка Ф-УШ в присутствии эндогенного ФВ. В другом варианте реализации изобретения дополнительный компонент предотвращает выведение белка Ф-УШ в процессе выведения ФВ. В других вариантах реализации изобретения дополнительный компонент подавляет или предотвращает связывание эндогенного ФВ с белком Ф-УШ путем экранирования или блокирования ФВ-связывающего участка белка Ф-УШ. Например, ФВ-связывающий участок находится в домене А3 или домене С2 белка Ф-УШ, или в обоих - домене А3 и домене С2.

В некоторых вариантах реализации изобретения химерный белок включает конструкцию, содержащую белок Ф-УШ и дополнительный компонент, которые связаны между собой ковалентной связью, при этом химерный белок не содержит фактор, ограничивающий время полужизни Ф-УШ, который индуцирует ограничение времени полужизни белка Ф-УШ, например полноразмерный белок ФВ или зрелый белок ФВ. Следовательно, в некоторых вариантах реализации изобретения время полужизни белка ФУШ химерного белка выходит за пределы ограничения по времени полужизни белка Ф-УШ в присутствии эндогенного ФВ.

В некоторых вариантах реализации изобретения дополнительный компонент обладает по меньшей мере одним ФВ-подобным Ф-УШ-защитным свойством. Примеры ФВ-подобного Ф-УШ-защитного свойства включают, но не ограничиваются этим, защиту белка Ф-УШ от одного или более расщеплений протеазой, защиту белка Ф-УШ от активации, стабилизацию тяжелой цепи и/или легкой цепи белка ФУШ или предотвращение выведения белка Ф-УШ одним или более фагоцитарными рецепторами. В одном варианте реализации изобретения дополнительный компонент содержит полипептид, неполипептидный компонент или оба этих компонента. В другом варианте реализации изобретения дополнительный компонент может представлять собой полипептид, содержащий аминокислотную последовательность длиной в по меньшей мере около 40, по меньшей мере около 50, по меньшей мере около 60, по меньшей мере около 70, по меньшей мере около 80, по меньшей мере около 90, по меньшей мере около 100, по меньшей мере около 110, по меньшей мере около 120, по меньшей мере около 130, по меньшей мере около 140, по меньшей мере около 150, по меньшей мере около 200, по меньшей мере около 250, по меньшей мере около 300, по меньшей мере около 350, по меньшей мере около 400, по меньшей мере около 450, по меньшей мере около 500, по меньшей мере около 550, по меньшей мере около 600, по меньшей мере около 650, по меньшей мере около 700, по меньшей мере около 750, по меньшей мере около 800, по меньшей мере около 850, по меньшей мере около 900, по меньшей мере около 950 или по меньшей мере около 1000 аминокислот. В определенных вариантах реализации изобретения дополнительный компонент содержит фрагмент ФВ, константную область иммуноглобулина или ее часть, альбумин или его фрагмент, альбумин-связывающее вещество, последовательность РА8, последовательность НАР, трансферрин или его фрагмент или любые комбинации этих компонентов. В других вариантах реализации изобретения дополнительный компонент представляет собой неполипептидный компонент, содержащий полиэтиленгликоль (ПЭГ), полисиаловую кислоту, гидроксиэтиловый крахмал (ГЭК), их производные или любые комбинации этих компонентов.

В определенных вариантах реализации изобретения дополнительный компонент содержит фрагмент ФВ, содержащий домен Ό' и домен Ό3 ФВ, при этом фрагмент ФВ связан с белком Ф-УШ нековалентной связью в дополнение к ковалентной связи между белком Ф-УШ и дополнительным компонентом (фрагментом ФВ). В одном примере фрагмент ФВ является мономером. В другом примере фрагмент ФВ содержит два, три, четыре, пять или шесть фрагментов ФВ, связанных друг с другом одной или более связями.

В одном аспекте реализации изобретения химерный белок содержит дополнительный компонент, например фрагмент ФВ, и по меньшей мере один гетерологичный компонент (Н1) и произвольный линкер между дополнительным компонентом, например фрагментом ФВ, и гетерологичным компонентом (Н1). В одном варианте реализации изобретения гетерологичный компонент (Н1) может содержать вещество, которое продлевает время полужизни белка Ф-УШ, например полипептид, выбранный из группы, состоящей из константной области иммуноглобулина или ее части, альбумина или его фрагмента, альбумин-связывающего вещества, последовательности РА8, последовательности НАР, трансферрина или его фрагмента и любых комбинаций этих компонентов, либо неполипептидный компонент, выбранный из группы, состоящей из полиэтиленгликоля (ПЭГ), полисиаловой кислоты, гидроксиэтилового крахмала

- 2 028309 (ГЭК), их производных и любых комбинаций этих компонентов. В одном варианте реализации изобретения гетерологичный компонент (Н1) содержит первую Рс-область. В другом варианте реализации изобретения гетерологичный компонент (Н1) содержит аминокислотную последовательность, содержащую по меньшей мере около 50 аминокислот, по меньшей мере около 100 аминокислот, по меньшей мере около 150 аминокислот, по меньшей мере около 200 аминокислот, по меньшей мере около 250 аминокислот, по меньшей мере около 300 аминокислот, по меньшей мере около 350 аминокислот, по меньшей мере около 400 аминокислот, по меньшей мере около 450 аминокислот, по меньшей мере около 500 аминокислот, по меньшей мере около 550 аминокислот, по меньшей мере около 600 аминокислот, по меньшей мере около 650 аминокислот, по меньшей мере около 700 аминокислот, по меньшей мере около 750 аминокислот, по меньшей мере около 800 аминокислот, по меньшей мере около 850 аминокислот, по меньшей мере около 900 аминокислот, по меньшей мере около 950 аминокислот или по меньшей мере около 1000 аминокислот. В других вариантах реализации изобретения химерный белок содержит линкер между дополнительным компонентом, например фрагментом ФВ, и гетерологичным компонентом (Н1), который является отщепляемым линкером.

В другом аспекте реализации изобретения белок Ф-УШ в химерном белке содержит Ф-УШ и по меньшей мере один гетерологичный компонент (Н2). В одном варианте реализации изобретения гетерологичный компонент (Н2) способен продлевать время полужизни белка Ф-УШ, например полипептида, выбранного из группы, состоящей из константной области иммуноглобулина или ее части, альбумина или его фрагмента, альбумин-связывающего вещества, последовательности ΡΆ8, последовательности НАР, трансферрина или его фрагмента и любых комбинаций этих компонентов, либо неполипептидного компонента, выбранного из группы, состоящей из полиэтиленгликоля (ПЭГ), полисиаловой кислоты, гидроксиэтилового крахмала (ГЭК), их производных и любых комбинаций этих компонентов. В конкретном варианте реализации изобретения гетерологичный компонент (Н2) содержит вторую Рс-область.

В некоторых вариантах реализации изобретения химерный белок содержит первую полипептидную цепь, содержащую фрагмент ФВ, первый гетерологичный компонент и линкер, и вторую полипептидную цепь, содержащую белок Ф-УШ и второй гетерологичный компонент, при этом первая полипептидная цепь и вторая полипептидная цепь связаны друг с другом ковалентной связью. В одном примере первый гетерологичный компонент и второй гетерологичный компонент связаны друг с другом ковалентной связью, например дисульфидной связью, пептидной связью или линкером, при этом ковалентная связь препятствует замещению фрагмента ФВ в первой полипептидной цепи эндогенным ФВ ίη νίνο. В некоторых вариантах реализации изобретения линкер между белком Ф-УШ и вторым гетерологичным компонентом является отщепляемым линкером.

В определенных вариантах реализации изобретения первый гетерологичный компонент (Н1), связанный с фрагментом ФВ, и второй гетерологичный компонент (Н2), связанный с белком Ф-УШ, связаны посредством линкера, например линкера оц-Рс, который является процессируемым линкером.

В других вариантах реализации изобретения белок Ф-УШ химерного белка дополнительно содержит третий гетерологичный компонент (Н3), четвертый гетерологичный компонент (Н4), пятый гетерологичный компонент (Н5), шестой гетерологичный компонент (Н6) или любые их комбинации. В одном варианте реализации изобретения один или более из третьего гетерологичного компонента (Н3), четвертого гетерологичного компонента (Н4), пятого гетерологичного компонента (Н5), шестого гетерологичного компонента (Н6) способны продлевать время полужизни белка Ф-УШ. В других вариантах реализации изобретения третий гетерологичный компонент (Н3), четвертый гетерологичный компонент (Н4), пятый гетерологичный компонент (Н5) и шестой гетерологичный компонент (Н6) связаны с С-концом или Ν-концом Ф-УШ либо вставлены между двумя аминокислотами Ф-УШ. В других вариантах реализации изобретения один или более из третьего гетерологичного компонента (Н3), четвертого гетерологичного компонента (Н4), пятого гетерологичного компонента (Н5) или шестого гетерологичного компонента (Н6) содержит аминокислотную последовательность, содержащую по меньшей мере около 50 аминокислот, по меньшей мере около 100 аминокислот, по меньшей мере около 150 аминокислот, по меньшей мере около 200 аминокислот, по меньшей мере около 250 аминокислот, по меньшей мере около 300 аминокислот, по меньшей мере около 350 аминокислот, по меньшей мере около 400 аминокислот, по меньшей мере около 450 аминокислот, по меньшей мере около 500 аминокислот, по меньшей мере около 550 аминокислот, по меньшей мере около 600 аминокислот, по меньшей мере около 650 аминокислот, по меньшей мере около 700 аминокислот, по меньшей мере около 750 аминокислот, по меньшей мере около 800 аминокислот, по меньшей мере около 850 аминокислот, по меньшей мере около 900 аминокислот, по меньшей мере около 950 аминокислот или по меньшей мере около 1000 аминокислот.

В некоторых вариантах реализации изобретения линкер между белком Ф-УШ и вторым гетерологичным компонентом или линкер между фрагментом ФВ и первым гетерологичным компонентом дополнительно содержит первый сайт расщепления (Р1) на Ν-концевом участке линкера, второй сайт расщепления (Р2) на С-концевом участке линкера, либо оба этих компонента. В других вариантах реализации изобретения один или более элементов из линкера между белком Ф-УШ и дополнительным компонентом, линкера между белком Ф-УШ и вторым гетерологичным компонентом и линкера между фрагментом ФВ и первым гетерологичным компонентом имеют длину от около 1 до около 2000 аминокислот.

- 3 028309

В других вариантах реализации изобретения химерный белок содержит белок Ф-УШ и дополнительный компонент, которые связаны посредством линкера между белком Ф-У111 и дополнительным компонентом, при этом линкер дополнительно содержит распознающий сортазу мотив, например последовательность ЬРХТС- (ЗЕр ГО N0: 106).

Настоящее изобретение относится к фрагменту фактора Виллебранда (ФВ), содержащему домен Ώ' и домен Ώ3 ФВ, причем фрагмент ФВ связывается с фактором УШ (Ф-УШ) и препятствует связыванию эндогенного ФВ с белком Ф-УШ. В одном варианте реализации изобретения фрагмент ФВ, являющийся объектом изобретения, не является аминокислотами от 764 до 1274 из ЗЕр ГО N0: 2. В одном варианте реализации изобретения белок Ф-УШ без фрагмента ФВ имеет время полужизни сравнимое с Ф-УШ дикого типа. В другом варианте реализации изобретения белок Ф-УШ является слитым белком, содержащим Ф-УШ и гетерологичный компонент, который способен продлевать время полужизни Ф-УШ. Гетерологичный компонент может являться полипептидом, неполипептидным компонентом или обоими этими компонентами. Гетерологичный полипептидный компонент может быть выбран из группы, состоящей из константной области иммуноглобулина или ее части, альбумина или его фрагмента, альбуминсвязывающего вещества, последовательности РАЗ, последовательности НАР, трансферрина или его фрагмента и любой комбинации этих компонентов. В других вариантах реализации изобретения гетерологичный полипептидный компонент является константной областью иммуноглобулина или ее частью, например Ее-областью. В других вариантах реализации изобретения неполипептидный компонент выбран из группы, состоящей из полиэтиленгликоля (ПЭГ), полисиаловой кислоты, гидроксиэтилового крахмала (ГЭК), их производных и любых комбинаций этих компонентов. В определенных вариантах реализации изобретения белок Ф-УШ содержит первую полипептидную цепь и вторую полипептидную цепь, при этом первая полипептидная цепь содержит Ф-УШ и первую Ес-область, а вторая полипептидная цепь содержит вторую Ес-область без Ф-УШ.

В другом варианте реализации изобретения фрагмент ФВ продлевает время полужизни Ф-УШ. Аминокислотная последовательность домена Ώ' может быть по меньшей мере на 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичной аминокислотам от 764 до 866 из ЗЕр ГО N0: 2. Также аминокислотная последовательность домена Ώ3 может быть по меньшей мере на 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичной аминокислотам от 867 до 1240 из ЗЕр ГО N0: 2. В определенных вариантах реализации изобретения фрагмент ФВ содержит по меньшей мере одну аминокислотную замену в остатке, соответствующем остатку 1099, остатку 1142 либо им обоим из ЗЕр ГО N0: 2. В конкретном варианте реализации изобретения фрагмент ФВ содержит, состоит преимущественно из или состоит из аминокислот от 764 до 1240 из ЗЕр ГО N0: 2. Фрагмент ФВ может дополнительно содержать домен Ώ1, домен Ώ2 или домены Ώ1 и Ώ2, принадлежащие ФВ. В некоторых вариантах реализации изобретения фрагмент ФВ дополнительно содержит домен ФВ, выбранный из группы, состоящей из домена А1, домена А2, домена А3, домена Ώ4, домена В1, домена В2, домена В3, домена С1, домена С2, домена СК, одного или более их фрагментов и любых комбинаций этих компонентов. В других вариантах реализации изобретения фрагмент ФВ является пэгилированным, гликопэгилированным, гэкилированным или полисиалилированным.

Настоящее изобретение также относится к химерному белку, содержащему описанный в данном тексте фрагмент ФВ, гетерологичный компонент и произвольный линкер между фрагментом ФВ и гетерологичным компонентом. Гетерологичный компонент может являться полипептидом, неполипептидным компонентом или обоими этими компонентами. В одном варианте реализации изобретения гетерологичный полипептидный компонент выбран из группы, состоящей из константной области иммуноглобулина или ее части, альбумина или его фрагмента, альбумин-связывающего вещества, последовательности РАЗ, последовательности НАР, трансферрина или его фрагмента и любой комбинации этих компонентов. В другом варианте реализации изобретения гетерологичный неполипептидный компонент выбран из группы, состоящей из полиэтиленгликоля (ПЭГ), полисиаловой кислоты, гидроксиэтилового крахмала (ГЭК), их производных и любых комбинаций этих компонентов. В конкретном варианте реализации изобретения гетерологичный компонент представляет собой первую Ес-область. Химерный белок может дополнительно содержать вторую Ес-область, при этом вторая Ес-область связана или соединена с первой Ес-областью либо связана или соединена с фрагментом ФВ.

В одном аспекте химерный белок, являющийся объектом изобретения, содержит формулу, выбранную из группы, состоящей из:

(аа) У-Ы-Н1-Ь2-Н2, (бб) Н2-Ь2-Н1-Ы-У, (вв) Н1-Ы-У-Ь2-Н2, и (гг) Н2-Ь2-У-Ы-Н1, где У является одним или более из описанных в данном тексте фрагментов ФВ; каждый из Е1 и Е2 является произвольным линкером;

Н1 является первым гетерологичным компонентом;

(-) представляет пептидную связь либо одну или более аминокислот;

- 4 028309

Н2 является произвольным вторым гетерологичным компонентом.

В одном варианте реализации изобретения Н1 является первым гетерологичным компонентом, например продлевающей время полужизни молекулой, известной в данной области техники. В одном варианте реализации изобретения первый гетерологичный компонент является полипептидом. Первый гетерологичный полипептидный компонент выбран из группы, состоящей из константной области иммуноглобулина или ее части, альбумина или его фрагмента, альбумин-связывающего вещества, последовательности РА§, последовательности НАР, трансферрина или его фрагмента и любых комбинаций этих компонентов. В другом варианте реализации изобретения Н1 является неполипептидным компонентом, выбранным из группы, состоящей из полиэтиленгликоля (ПЭГ), полисиаловой кислоты, гидроксиэтилового крахмала (ГЭК), их производных и любых комбинаций этих компонентов. Н2 является произвольным вторым гетерологичным компонентом, например продлевающей время полужизни молекулой, известной в данной области техники. В одном варианте реализации изобретения второй гетерологичный компонент может быть выбран из группы, состоящей из константной области иммуноглобулина или ее части, альбумина или его фрагмента, альбумин-связывающего вещества, последовательности РА§, последовательности НАР, трансферрина или его фрагмента и любой комбинации этих компонентов. В другом варианте реализации изобретения Н2 является неполипептидным компонентом, который выбран из группы, состоящей из полиэтиленгликоля (ПЭГ), полисиаловой кислоты, гидроксиэтилового крахмала (ГЭК), их производных и любых комбинаций этих компонентов. В определенных вариантах реализации изобретения Н1 является первой Рс-областью, а Н2 является второй Рс-областью. Первая Рс-область и вторая Рс-область могут быть одинаковыми или различными, и могут быть связаны друг с другом линкером или ковалентной связью, например дисульфидной связью. В другом варианте реализации изобретения вторая Рс-область связана или соединена с белком фактора VIII. В некоторых случаях может присутствовать третий гетерологичный компонент Н3, который продлевает время полужизни и который связан с фрагментом ФВ, первым гетерологичным компонентом или вторым гетерологичным компонентом. Неограничивающие примеры третьего гетерологичного компонента могут включать полипептидный или неполипептидный компоненты либо оба эти компонента. В одном варианте реализации изобретения третий гетерологичный компонент может быть выбран из группы, состоящей из константной области иммуноглобулина или ее части, альбумина или его фрагмента, альбумин-связывающего вещества, последовательности РА§, последовательности НАР, трансферрина или его фрагмента или любых комбинаций этих компонентов. В другом варианте реализации изобретения Н2 является неполипептидным компонентом, который может быть выбран из группы, состоящей из полиэтиленгликоля (ПЭГ), полисиаловой кислоты, гидроксиэтилового крахмала (ГЭК), их производных и любых комбинаций этих компонентов. В некоторых вариантах реализации изобретения Н3 связан с фрагментом ФВ или первым либо вторым гетерологичным компонентом посредством отщепляемого линкера, например тромбин-отщепляемым линкером. Неограничивающие примеры линкеров приведены в другом месте данного текста.

В другом аспекте изобретения предложен химерный белок, содержащий описанный в данном тексте фрагмент ФВ, белок Ф-νΐΙΙ и произвольный линкер между фрагментом ФВ и белком Ф-νΐΙΙ. Фрагмент ФВ может быть связан с белком Ф-νΙΙΙ. В одном варианте реализации изобретения химерный белок содержит описанный в данном тексте фрагмент ФВ, который связан с гетерологичным компонентом. Гетерологичный компонент может являться компонентом, который продлевает время жизни белка, который содержит полипептид, неполипептидный компонент или оба эти компонента. Примеры такого гетерологичного полипептида включают, например, константную область иммуноглобулина или ее часть, альбумин или его фрагмент, альбумин-связывающее вещество, последовательность РА§, последовательность НАР, трансферрин или его фрагмент или любые комбинации этих компонентов. Примеры неполипептидного компонента включают, например, полиэтиленгликоль (ПЭГ), полисиаловую кислоту, гидроксиэтиловый крахмал (ГЭК), их производные или любые комбинации этих компонентов. В другом варианте реализации изобретения гетерологичный компонент является первой Рс-областью, связанной с фрагментом ФВ. В других вариантах реализации изобретения химерный белок дополнительно содержит вторую Рс-область, связанную с белком Ф-νΙΙΙ. Фрагмент ФВ или белок Ф-νΊΙΙ могут быть связаны с первой Рс-областью или второй Рс-областью соответственно посредством линкера. В других вариантах реализации изобретения химерный белок содержит описанный в данном тексте фрагмент ФВ, связанный с первым гетерологичным компонентом, например с первой Рс-областью, и белок Ф-νΙΙΙ, связанный со вторым гетерологичным компонентом, например с второй Рс-областью, при этом фрагмент ФВ дополнительно связан со вторым гетерологичным компонентом (например, второй Рс-областью) или белком ФνΙΙΙ посредством линкера или ковалентной связью либо первый гетерологичный компонент (например, Рс-область) дополнительно связан с белком Ф-νΙΙΙ или вторым гетерологичным компонентом (например, второй Рс-областью) посредством линкера или ковалентной связью. В некоторых вариантах реализации изобретения белок Ф-νΙΙΙ химерного белка содержит частичный В-домен. В некоторых вариантах реализации изобретения белок Ф-νΙΙΙ с неполным В-доменом является Ф-ЩП198 (8ЕЦ ГО N0: 105). В других вариантах реализации изобретения химерный белок дополнительно содержит распознающий сортазу мотив.

В некоторых вариантах реализации результатом изобретения является продление времени полу- 5 028309 жизни белка Ф-УШ по сравнению с белком Ф-УШ без фрагмента ФВ или Ф-УШ дикого типа. Время полужизни белка Ф-У111 по меньшей мере в 1,5 раз, по меньшей мере в 2 раза, по меньшей мере в 2,5 раз, по меньшей мере в 3 раза, по меньшей мере в 4 раза, по меньшей мере в 5 раз, по меньшей мере в 6 раз, по меньшей мере в 7 раз, по меньшей мере в 8 раз, по меньшей мере в 9 раз, по меньшей мере в 10 раз, по меньшей мере в 11 раз или по меньшей мере в 12 раз больше, чем время полужизни белка Ф-У111 без фрагмента ФВ. В одном варианте реализации изобретения время полужизни Ф-У111 приблизительно 1,520-кратно, приблизительно 1,5-15-кратно или приблизительно 1,5-10-кратно превышает время полужизни Ф-У111 дикого типа. В другом варианте реализации изобретения время полужизни Ф-У111 продлено в от около 2 до около 10 раз, от около 2 до около 9 раз, от около 2 до около 8 раз, от около 2 до около 7 раз, от около 2 до около 6 раз, от около 2 до около 5 раз, от около 2 до около 4 раз, от около 2 до около 3 раз, от около 2,5 до около 10 раз, от около 2,5 до около 9 раз, от около 2,5 до около 8 раз, от около 2,5 до около 7 раз, от около 2,5 до около 6 раз, от около 2,5 до около 5 раз, от около 2,5 до около 4 раз, от около 2,5 до около 3 раз, от около 3 до около 10 раз, от около 3 до около 9 раз, от около 3 до около 8 раз, от около 3 до около 7 раз, от около 3 до около 6 раз, от около 3 до около 5 раз, от около 3 до около 4 раз, от около 4 до около 6 раз, от около 5 до около 7 раз или от около 6 до около 8 раз по сравнению с Ф-У111 дикого типа или белком Ф-У111 без фрагмента ФВ. В других вариантах реализации изобретения время полужизни Ф-У111 составляет по меньшей мере около 17, по меньшей мере около 18, по меньшей мере около 19, по меньшей мере около 20, по меньшей мере около 21, по меньшей мере около 22, по меньшей мере около 23, по меньшей мере около 24, по меньшей мере около 25, по меньшей мере около 26, по меньшей мере около 27, по меньшей мере около 28, по меньшей мере около 29, по меньшей мере около 30, по меньшей мере около 31, по меньшей мере около 32, по меньшей мере около 33, по меньшей мере около 34, по меньшей мере около 35, по меньшей мере около 36, по меньшей мере около 48, по меньшей мере около 60, по меньшей мере около 72, по меньшей мере около 84, по меньшей мере около 96 или по меньшей мере около 108 ч. В других вариантах реализации изобретения время полужизни Ф-У111 составляет от около 15 ч до около двух недель, от около 16 ч до около одной недели, от около 17 ч до около одной недели, от около 18 ч до около одной недели, от около 19 ч до около одной недели, от около 20 ч до около одной недели, от около 21 ч до около одной недели, от около 22 ч до около одной недели, от около 23 ч до около одной недели, от около 24 ч до около одной недели, от около 36 ч до около одной недели, от около 48 ч до около одной недели, от около 60 ч до около одной недели, от около 24 ч до около шести дней, от около 24 ч до около пяти дней, от около 24 ч до около четырех дней, от около 24 ч до около трех дней или от около 24 ч до около двух дней.

В некоторых вариантах реализации изобретения среднее время полужизни Ф-У111 у пациента составляет около 15, около 16, около 17, около 18, около 19, около 20, около 21, около 22, около 23 ч, около 24 ч (1 дня), около 25, около 26, около 27, около 28, около 29, около 30, около 31, около 32, около 33, около 34, около 35, около 36, около 40, около 44 ч, около 48 ч (2 дней), около 54, около 60 ч, около 72 ч (3 дней), около 84 ч, около 96 ч (4 дней), около 108 ч, около 120 ч (5 дней), около шести дней, около семи дней (одной недели), около 8, около 9, около 10, около 11, около 12, около 13 или около 14 дней.

В другом аспекте химерный белок, являющийся объектом изобретения, содержит формулу, выбранную из группы, состоящей из:

(а)	У-Ы-Н1-ЬЗ-С-Б2-Н2,
(Ь)	Н2-Ь2-С- Ь3-Н1-Ы-У,
(с)	С-Ь2-Н2- ЬЗ-У-Ы-Н1,
(Ф	Н1-ы-у- ьз-нг-ьг-с,
(е)	Н1-Ы-У-Ь3-С-Ь2-Н2,
ω	Н2-Ь2-С- ЬЗ- У-Ы-Н1,
(8)	У-Ы-Н1-Ь3-Н2-Ь2-С,
(Ф	С-Ь2-Н2- ЬЗ-НЬЫ-У,
0)	Н2-Ь3-Н1-Ы-У-Ь2-С,
0)	С-Ь2-У-Ы-Н1-Ь3-Н2,
(Ф	У-Ь2-С-Ы-Н1-Ь3-Н2, и
О)	Н2-Ь3-Н1-Ы-С-Ь2-У,

где У является описанным в данном тексте фрагментом ФВ;

каждый из 1.1 или 1.2 является произвольным линкером, например тромбин-отщепляемым линкером;

1,3 является произвольным линкером, например оц-Ре линкером, например процессируемым линкером;

каждый из Н1 или Н2 является произвольным гетерологичным компонентом; и С является белком Ф^Ш; и

- 6 028309 (-) представляет пептидную связь либо одну или более аминокислот.

В других аспектах химерный белок, являющийся объектом изобретения, содержит формулу, выбранную из группы, состоящей из:

(ш)	У-Ы-Н1: Н2-Ь2-С,
(п)	У-Ы-Н1:С-Р2-Н2,
(о)	Н1-Ы-У:Н2-Р2-С,
(Р)	Н1-Ы-У:С-Р2-Н2,
(ч)	У:С-Ь1-Н1:Н2,
(0	У:Н1-Ы-С:Н2,
(8)	Н2:Н1-Ы-С:У,
(9	С:У-Ь1-Н1:Н2, и
(и)	С:Н1-Ы-У:Н2,

где V является описанным в данном тексте фрагментом ФВ;

каждый из Ь1 или Ь2 является произвольным линкером, например тромбин-отщепляемым линкером;

каждый из Н1 или Н2 является произвольным гетерологичным компонентом;

С является белком Ф-νΐΙΙ;

(:) представляет химическое или физическое соединение между Н1 и Н2, между V и С, и между V и Н1 и С и Н2. (:) представляет собой химическое соединение, например по меньшей мере одну непептидную связь. В определенных вариантах реализации изобретения химическое соединение, т.е. (:), является ковалентной связью. В некоторых вариантах реализации изобретения соединение между Н1 и Н2 является ковалентной связью, например дисульфидной связью. В других вариантах реализации изобретения соединение, т. е. (:), является нековалентным взаимодействием, например ионным взаимодействием, гидрофобным взаимодействием, гидрофильным взаимодействием, Ван-дер-Ваальсовским взаимодействием, водородной связью. В определенных вариантах реализации изобретения соединение между белком ФVIII и фрагментом ФВ является нековалентной связью. В других вариантах реализации изобретения (:) является непептидной ковалентной связью. В других вариантах реализации изобретения (:) является пептидной связью. В одном варианте реализации изобретения Н1 является первым гетерологичным компонентом. В одном варианте реализации изобретения первый гетерологичный компонент способен продлевать время полужизни активности Ф^Ш. В другом варианте реализации изобретения первый гетерологичный компонент является полипептидом, неполипептидным компонентом или обеими этими компонентами. В одном варианте реализации изобретения первый гетерологичный компонент может быть выбран из группы, состоящей из константной области иммуноглобулина или ее части, альбумина или его фрагмента, альбумин-связывающего вещества, последовательности РАЗ, последовательности НАР, трансферрина или его фрагмента и любых комбинаций этих компонентов. В другом варианте реализации изобретения неполипептидный компонент выбран из группы, состоящей из полиэтиленгликоля (ПЭГ), полисиаловой кислоты, гидроксиэтилового крахмала (ГЭК), их производных и любых комбинаций этих компонентов. В некоторых вариантах реализации изобретения Н2 является вторым гетерологичным компонентом. Второй гетерологичный компонент также может являться известным в данной области техники веществом, продлевающим время полужизни, и являться полипептидным, неполипептидным компонентом или обеими этими компонентами. В одном варианте реализации изобретения второй гетерологичный компонент выбран из группы, состоящей из константной области иммуноглобулина или ее части, альбумина или его фрагмента, альбумин-связывающего вещества, последовательности РАЗ, последовательности НАР, трансферрина или его фрагмента и любых комбинаций этих компонентов. В определенных вариантах реализации изобретения неполипептидный компонент выбран из группы, состоящей из полиэтиленгликоля (ПЭГ), полисиаловой кислоты, гидроксиэтилового крахмала (ГЭК), их производных и любых комбинаций этих компонентов. В конкретном варианте реализации изобретения Н1 является первой Ре-областью. В некоторых вариантах реализации изобретения Н2 является второй Ре-областью. В некоторых случаях может присутствовать третий гетерологичный компонент Н3, который продлевает время полужизни. Н3 может быть связан с одним или более элементом из V, С, Н1 или Н2 посредством произвольного линкера, например отщепляемого линкера, например тромбин-отщепляемого линкера. Неограничивающие примеры третьего гетерологичного компонента могут включать константную область иммуноглобулина или ее часть, альбумин или его фрагмент, полиэтиленгликоль (ПЭГ), последовательность РАЗ, гидроксиэтиловый крахмал (ГЭК) или их производные.

В определенных вариантах реализации изобретения один или более из линкеров, применяемых для соединения друг с другом фрагмента ФВ, белка Ф^Ш, первого гетерологичного компонента и/или вто- 7 028309 рого гетерологичного компонента, соответствующих формулам от (а) до (и), является отщепляемым линкером. Один или более из сайтов расщепления химерного белка могут отщепляться протеазой, выбранной из группы, состоящей из фактора Х1а, фактора Х11а, калликреина, фактора У11а, фактора 1Ха, фактора Ха, фактора 11а (тромбина), эластазы-2, гранзима В, ВГТ, энтерокиназы, протеазы 3С, сортазы А, ММП-12, ММП-13, ММП-17 и ММП-20. В других вариантах реализации изобретения один или более линкеров, применяемых в формулах от (а) до (1) (например, Ь3), содержат процессируемый линкер. Процессируемые линкеры могут отщепляться внутриклеточным ферментом непосредственно после секреции. Процессируемый линкер может содержать первый сайт расщепления (Р1) на Ν-концевом участке линкера, второй сайт расщепления (Р2) на С-концевом участке линкера, либо оба этих компонента.

В некоторых вариантах реализации изобретения один или более из линкеров, применяемых в изобретении, имею длину в по меньшей мере от около 1 до около 2000 аминокислот. В определенном варианте реализации изобретения один или более из линкеров, применяемых в изобретении, имею длину в по меньшей мере около 20, 35, 42, 48, 73, 98, 144, 288, 324, 576 или 864 аминокислот. В конкретном варианте реализации изобретения один или более из линкеров содержат пептид §1у/§ег. Пептид §1у/§ег может представлять собой (О1у4 §ег)₃ или (О1у4 §ег)₄.

В других аспектах реализации изобретения белок Ф-УШ в химерном белке является функциональным белком фактора УШ. Белок Ф-УШ может содержать один или более доменов Ф-УШ, выбранных из группы, состоящей из домена А1, домена А2, домена В, домена А3, домена С1, домена С2, одного или более их фрагментов и любых их комбинаций. В одном варианте реализации изобретения белок Ф-УШ содержит В-домен или его часть. В другом варианте реализации изобретения белок Ф-УШ является ФУШ-§0 с удаленным В-доменом. В других вариантах реализации изобретения белок Ф-УШ содержит одиночную цепь Ф-УШ. В других вариантах реализации изобретения белок Ф-УШ содержит тяжелую цепь Ф-УШ и легкую цепь фактора УШ, при этом тяжелая цепь и легкая цепь соединены между собой металлической связью. В определенных вариантах реализации изобретения белок Ф-УШ обладает низкой аффинностью к либо не связывается с белком, родственным рецептору липопротеинов низкой плотности (БРР). Например, белок Ф-УШ, применяемый в изобретении, может содержать по меньшей мере одну аминокислотную замену, которая снижает аффиность к или исключает связывание с БРР. Неограничивающими примерами по меньшей мере одной аминокислотной замены являются замены остатков полноразмерного зрелого Ф-УШ, соответствующих остатку 471, остатку 484, остатку 487, остатку 490, остатку 497, остатку 2092, остатку 2093 либо двум или более их комбинациям. В некоторых вариантах реализации изобретения белок Ф-УШ в химерном белке, являющемся объектом данного изобретения, содержит по меньшей мере одну аминокислотную замену, которая обуславливает стабильность белка ФУШ большую, чем у белка Ф-УШ без замены. В других вариантах реализации изобретения белок Ф-УШ содержит по меньшей мере две аминокислотных замены в домене А2 и по меньшей мере одну аминокислотную замену в домене А3, при этом домен А2 и домен А2 соединены между собой ковалентной связью. Неограничивающими примерами аминокислотной замены в домене А2 являются замены остатков полноразмерного зрелого Ф-УШ, соответствующих остатку 662 или 664. Вдобавок, неограничивающими примерами аминокислотной замены в домене А3 являются замены остатков полноразмерного зрелого полисиалилированного Ф-УШ, соответствующих остатку 1826 или 1828.

В дополнительных аспектах изобретения предложен полинуклеотид, кодирующий описанный в данном тексте фрагмент ФВ или описанный в данном тексте химерный белок, либо группа полинуклеотидов, содержащая первую нуклеотидную цепь и вторую нуклеотидную цепь, при этом первая нуклеотидная цепь колирует фрагмент ФВ, а вторая нуклеотидная цепь кодирует вторую Рс-область, или фактор свертывания крови, или его фрагмент, принадлежащие химерному белку. В одном варианте реализации изобретения группа полинуклеотидов дополнительно содержит третью полипептидную цепь, которая кодирует пропротеин конвертазу, которая принадлежит семейству субтилизин-подобных пропротеин конвертаз. Неограничивающие примеры пробелка конвертазы включают пропротеин конвертазу субтилизин/кексин типа 3 (РАСЕ или РС8К3), пропротеин конвертазу субтилизин/кексин типа 5 (РС8К5 или РС5), пропротеин конвертазу субтилизин/кексин типа 7 (РС8К7 или РС7) или дрожжевую протеазу Кех 2. В других аспектах изобретение включает вектор, содержащий полинуклеотид или группу полинуклеотидов и один или более промоторов, функционально связанных с полинуклеотидом или группой полинуклеотидов, либо группу векторов, содержащую первый вектор и второй вектор, при этом первый вектор кодирует первую полинуклеотидную цепь группы полинуклеотидов, а второй вектор кодирует вторую полинуклеотидную цепь группы полинуклеотидов. Группа векторов может дополнительно содержать третий вектор, который содержит третью полинуклеотидную цепь, кодирующую РС5 или РС7. В некоторых вариантах реализации изобретения вектор дополнительно содержит РАСЕ. В некоторых вариантах реализации изобретения РАСЕ отщепляет домены Ό1Ό2 фрагмента ФВ.

Некоторые аспекты изобретения относятся к фармацевтическому составу, содержащему фрагмент ФВ, химерный белок, полинуклеотид, группу полинуклеотидов, вектор или группу векторов и фармацевтически приемлемый носитель. Состав, являющийся объектом данного изобретения, может продлевать время полужизни фактора УШ. В других аспектах изобретение включает клетку-хозяина, содержащую полинуклеотид, группу полинуклеотидов, вектор или группы векторов.

- 8 028309

Другие аспекты настоящего изобретения относятся к химерному белку, содержащему белок Ф-УШ, дополнительный компонент и произвольный линкер, при этом дополнительный компонент подавляет или предотвращает связывание эндогенного ФВ с белком Ф-УШ и обладает по меньшей мере одним ФВподобным Ф-УШ-защитным свойством. ФВ-подобное Ф-УШ-защитное свойство включает защиту белка Ф-УШ от одного или более расцеплений протеазой, защиту белка Ф-УШ от активации, стабилизацию тяжелой цепи и/или легкой цепи белка Ф-УШ или предотвращение выведения белка Ф-УШ одним или более фагоцитарными рецепторами.

Дополнительный компонент химерного белка может подавлять или предотвращать связывание эндогенного ФВ с белком Ф-УШ путем защиты или блокирования ФВ-связывающего участка белка Ф-УШ. В некоторых вариантах реализации изобретения ФВ-связывающий участок находится в домене А3 или домене С2 белка Ф-УШ, или в обоих - домене А3 и домене С2 белка Ф-УШ. В другом варианте реализации изобретения ФВ-связывающий участок представляет собой аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотам от 1669 до 1689 и от 2303 до 2332 из 8Еф ГО N0: 16. В некоторых вариантах реализации изобретения дополнительный компонент является полипептидным, неполипептидным компонентом или обоими этими компонентами. Полипептид, применяемый в качестве дополнительного компонента, может содержать аминокислотную последовательность длиной по меньшей мере в 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 или 1000 аминокислот. Например, полипептид, применяемый в качестве дополнительного компонента, может быть выбран из группы, состоящей из константной области иммуноглобулина или ее части, альбумина или его фрагмента, альбумин-связывающего вещества, последовательности РА8, последовательности НАР, других продлевающих время полужизни соединений и любых комбинаций этих компонентов. Неполипептидный компонент, применяемый в качестве дополнительного компонента, может быть выбран из группы, состоящей из полиэтиленгликоля (ПЭГ), полисиаловой кислоты, гидроксиэтилового крахмала (ГЭК) или их производных и любых комбинаций этих компонентов. В одном варианте реализации изобретения дополнительный компонент является описанным в данном тексте фрагментом ФВ. Дополнительный компонент и белок Ф-УШ могут быть связанными, например, посредством линкера, или соединенными друг с другом. Линкер может содержать отщепляемый линкер, например тромбин-отщепляемый линкер.

В одном аспекте изобретения предложен способ предотвращения или подавления связывания белка Ф-УШ с эндогенным ФВ, включающий введение эффективного количества фрагмента ФВ, химерного белка, полинуклеотида или группы полинуклеотидов в клетку, содержащую белок Ф-УШ или полинуклеотид, кодирующий белок Ф-УШ, при этом фрагмент ФВ связывается с белком Ф-УШ. В другом аспекте изобретение включает способ предотвращения или подавления связывания белка Ф-УШ с эндогенным ФВ, включающий введение эффективного количества химерного белка, полинуклеотида или группы полинуклеотидов нуждающемуся в этом пациенту, при этом фрагмент ФВ связывается с белком Ф-УШ и тем самым предотвращает или подавляет связывание белка Ф-УШ. В некоторых аспектах изобретение включает способ продления или увеличения времени полужизни белка Ф-УШ, при этом способ включает введение эффективного количества фрагмента ФВ, химерного белка, полинуклеотида или группы полинуклеотидов в клетку, содержащую белок Ф-УШ или полинуклеотид, кодирующий белок Ф-УШ, или нуждающемуся в этом пациенту, при этом фрагмент ФВ связывается с белком Ф-УШ. Другие аспекты изобретения относятся к способу предотвращения или подавления выведения белка Ф-УШ из клетки, при этом способ включает введение эффективного количества фрагмента ФВ, химерного белка, полинуклеотида или группы полинуклеотидов в клетку, содержащую белок Ф-УШ или полинуклеотид, кодирующий белок Ф-УШ, или нуждающемуся в этом пациенту, при этом фрагмент ФВ связывается с белком Ф-УШ.

Другой аспект изобретения относится к способу лечения заболевания или нарушения, связанного с кровотечением, у нуждающегося в этом пациента, включающему введение эффективного количества фрагмента ФВ, химерного белка, полинуклеотида или группы полинуклеотидов, при этом заболевание или нарушение, связанное с кровотечением, выбрано из группы, состоящей из нарушения свертываемости крови, гемартроза, мышечного кровотечения, кровотечения в полости рта, кровоизлияния, кровоизлияния в мышцы, кровоизлияния в полость рта, травмы, травмы головы, желудочно-кишечного кровотечения, внутричерепного кровоизлияния, кровоизлияния в брюшную полость, внутригрудного кровоизлияния, перелома костей, кровотечения в центральной нервной системе, кровотечения в заглоточном пространстве, кровотечения в забрюшинном пространстве и кровотечения во влагалище подвздошнопоясничной мышцы. В других вариантах реализации изобретения лечение является профилактическим или осуществляется по требованию. В других вариантах реализации изобретения предложен способ лечения заболевания или нарушения, связанного с болезнью Виллебранда типа 2Ν, у нуждающегося в этом пациента, включающий введение эффективного количества фрагмента ФВ, химерного белка, полинуклеотида или группы полинуклеотидов, при этом заболевание или нарушение излечивается.

- 9 028309

Краткое описание чертежей

Фиг. 1А-Е - схематические изображения белков ФВ. На фиг. 1А показаны два фрагмента ФВ, содержащие аминокислоты от 1 до 276 из §ЕЦ ГО N0: 73 (аминокислоты от 764 до 1039 из §ЕЦ ГО N0: 2). ФВ-001 синтезирован без пре/пропептидных последовательностей ФВ, а ФВ-009 синтезирован с пре/пропептидными последовательностями (домены Ό1 и Ό2). Препептид ФВ-009 отщепляется во время синтеза, а ФВ-009 содержит пропептид с последовательностями доменов Ό' и Ό3. На фиг. 1Б показаны три фрагмента ФВ, содержащие аминокислоты от 1 до 477 из §ЕЦ ГО N0: 73 (аминокислоты от 764 до 1240 из §ЕЦ ГО N0: 2). ФВ-002 синтезирован без пре/пропептидных последовательностей. ФВ-010 содержит домены Ό1Ό2 дополнительно к доменам Ό'Ό3. ФВ-013 содержит домены Ό1Ό2Ό'Ό3 дополнительно к остаткам аланина, замещающим цистеин в остатках 336 и 379 из §ЕЦ ГО N0: 72. На фиг. 1В показаны два фрагмента ФВ, содержащие домены Ό'Ό3 и часть домена А1. ФВ-003 содержит аминокислоты от 764 до 1274 из §ЕЦ ГО N0: 2. ФВ-011 содержит домены Ό1Ό2 дополнительно к доменам Ό'Ό3. На фиг. 1Г показаны две конструкции -ФВ-004 и ФВ-012. ФВ-004 содержит домены Ό'Ό3 и полную последовательность домена А1. ФВ-012 содержит домены Ό1Ό2Ό'Ό3 и полную последовательность домена А1. На фиг. 1Д показаны три конструкции. ФВ-006 содержит домены Ό1Ό2Ό'Ό3 и домен СК ФВ (цистеиновый узловой домен - от англ. су81ешекпо1боташ). ФВ-008 является полноразмерным ФВ. ФВ-031 (ФВ-Рс) демонстрирует конструкцию, содержащую домены Ό1Ό2Ό'Ό3, связанные с одиночной Рсобластью посредством отщепляемого линкера. ФВ-053 представляет собой домены Ό1Ό2. На фиг. 1Е показан полноразмерный белок ФВ, содержащий пропептид (домены Ό1 и Ό2) и зрелые субъединицы (домены Ό', Ό3, А1, А2, А3, Ό4, В1-3, С1-2). Белок ФВ является белком в около 250 кДа и образует мультимеры (> 20 МДа) путем дисульфидного связывания. Белок ФВ объединяется с Ф-УШ (95-98%) в нековалентный комплекс и далее продлевает время полужизни Ф-УШ, защищая Ф-УШ от отщепления протеазой/активации, стабилизируя тяжелую и легкую цепь и предотвращая очищение от Ф-УШ фагоцитарными рецепторами. Белок ФВ также может ограничивать время полужизни Ф-УШ путем очищения комплекса Ф-УШ-ФВ при помощи рецепторов ФВ и предотвращая пиноцитоз и рециклинг рФ-УШРс.

Фиг. 2 - схематические изображения примеров конструкций гетеродимеров ФВ:Ф-УШ. Левая конструкция демонстрирует фрагмент ФВ, содержащий домены ΌΌ3 полноразмерного ФВ (аминокислоты 1-477 из БЕС ГО N0: 73) и содержащий замены аланина в остатках 336 и 379 из §ЕЦ ГО N0: 72. Конструкция химерного белка (Ф-УШ 064/065) содержит С-конец фрагмента ФВ, связанный с первой Рсобластью посредством линкера, а Ф-УШ связан со второй Рс-областью, при этом вторая Рс-область дополнительно связана с ^концом фрагмента ФВ посредством линкера (например, формула С-Н1-Ш-УЬ2-Н2, в которой У является фрагментом ФВ, С является Ф-УШ, Н1 и Н2 являются Рс-областями, а Ь1 и Ь2 являются отщепляемыми линкерами). Конструкция на фиг. 2б является внутриклеточно процессированной конструкцией гетеродимера ФВ:Ф-УШ, в которой был отщеплен линкер между второй Рсобластью и ^концом фрагмента ФВ. Ф-УШ-064 содержит домены ΌΌ3 ФВ (аминокислоты от 1 до 477 из БЕС ГО N0: 73 с заменами С336А и С379). Ф-УШ-065 содержит домены ΌΌ3 ФВ (аминокислоты от 1 до 276 из 8ЕЦ ГО N0: 73). Ф-УШ-136 содержит Ф-УШРс, связанную с Рс-фрагментом Ό'Ό3 посредством линкера, который может процессировать внутриклеточный протеазный фермент. Когда экспрессируется Ф-УШ-136, фермент отщепляет линкер между второй Рс-областью (соединенной с Ф-УШ-ЛЦ) и Ό'Ό3 фрагментом ФВ (соединенным с первой Рс-областью), в то время как Рс-область, соединенная с (или связанная с) Ф-УШ-ЛЦ, образует ковалентную связь (например, дисульфидную связь) с первой Рсобластью, соединенной с (или связанной с) фрагментом ФВ. Ф-УШ-148 является одноцепочечным ФУШРс с фрагментом Ό'Ό3 (одноцепочечный Ф-УШ, получен путем внесения мутации Р1645А/Р1648А в ген Ф-УШ).

Фиг. 3 - схематические изображения примеров конструкций гетеродимеров ФВ:Ф-УШ, содержащие примеры переменных линкеров между ФВ и Рс-областью. Конструкции (Ф-УШ-064, Ф-УШ-159, Ф-УШ160, Ф-УШ-178 и Ф-УШ-179) имеют общую структуру, представленную формулой С-Н1-Ь1-У-Ь2-Н2, но содержат в качестве примеров различные линкеры или аминокислотные замены. Показанные конструкции содержат одинаковый фрагмент ФВ, который представляет собой домены Ό' и Ό3 ФВ (т.е. аминокислоты от 1 до 477 из 8ЕЦ ГО N0: 73 с аминокислотными заменами С336А и С379). Конструкция ФУШ 64 содержит тромбин-отщепляемый линкер (т.е. Ь2) между фрагментом ФВ и Рс-областью (т.е. Н2), который содержит 20 аминокислот. Конструкция Ф-УШ 159 содержит тромбин-отщепляемый линкер (т.е. Ь2) между фрагментом ФВ и Рс-областью (т.е. Н2), который содержит 35 аминокислот. Конструкция Ф-УШ 160 содержит тромбин-отщепляемый линкер (т.е. Ь2) между фрагментом ФВ и Рс-областью (т.е. Н2), который содержит 48 аминокислот. Конструкции Ф-УШ-180, Ф-УШ-181 и Ф-УШ-182 являются производными Ф-УШ-160, содержащими мутацию К2092А в домене С1 Ф-УШ, мутацию К2093А в домене С1 Ф-УШ и мутации К2092А/К2093А в домене С1 Ф-УШ соответственно. Конструкция Ф-УШ-178 содержит тромбин-отщепляемый линкер (т.е. Ь2) между фрагментом ФВ и Рс-областью (т.е. Н2), который содержит 73 аминокислоты. Конструкция Ф-УШ-179 содержит тромбин-отщепляемый линкер (т.е. Ь2) между фрагментом ФВ и Рс-областью (т.е. Н2), который содержит 98 аминокислот.

Фиг. 4 - схематические изображения примеров конструкций Ф-УШ-ФВ, в которых ФВ является Ό1Ό2Ό'Ό3 фрагментом ФВ, линкер является линкером переменной длины, содержащим сайт расщепле- 10 028309 ния, например сайт расщепления тромбином, ОЦ Ф-УШ является одноцепочечным Ф-УШ, который содержит замены К1645Л/К1648Л, Н является гетерологичным компонентом, например константной областью иммуноглобулина или ее частью, компонентом для конъюгации полиэтиленгликоля (ПЭГ) и/или ПЭГ, альбумином или фрагментом альбумина, альбумин-связывающим веществом, последовательностью НАР, компонентом для полисиалирования и/или полисиаловой кислотой, компонентом для гидроксиэтилового крахмала (ГЭК) и/или ГЭК или последовательностью РА8 и т.д., ТЦ Ф-УШ является тяжелой цепью Ф-УШ, ЛЦ Ф-УШ является легкой цепью Ф-УШ, а Рс является Ре-областью константной области иммуноглобулина. На фиг. 4А приведена формула ФВ-линкер-ОЦ Ф-УШ. На фиг. 4Б приведена формула ФВ-линкер-Н-линкер-ОЦ Ф-УШ. Линкеры (первый линкер между ФВ и Н и второй линкер между Н и ОЦ Ф-УШ) могут быть одинаковыми или разными. На фиг. 4В приведена формула ФВ-линкерОЦ Ф-УШ-линкер-Н. Линкеры (первый линкер между ФВ и ОЦ Ф-УШ и второй линкер между ОЦ ФУШ и Н) могут быть одинаковыми или разными. На фиг. 4Г приведена формула ФВ-линкер-ТЦ Ф-У111Н-линкер-ЛЦ Ф-УШ. Линкеры (первый линкер между ФВ и ТЦ Ф-УШ и второй линкер между Н и ЛЦ Ф-УШ) могут быть одинаковыми или разными. На фиг. 4Д приведена формула ТЦ Ф-УШ-Н-ЛЦ Ф-УШлинкер-первая Рс-линкер-ФВ-линкер-вторая Рс. Линкеры (первый линкер между ЛЦ Ф-УШ и первой Рсобластью, второй линкер между первой Рс-областью и ФВ и третий линкер между ФВ и второй Рсобластью) могут быть одинаковыми или разными. Линкеры могут являться отщепляемыми линкерами. Например, линкер между первой Рс-областью и ФВ может являться отщепляемым линкером, содержащим сайт расщепления на Ν-конце и/или С-конце линкера. Первая Рс-область и вторая Рс-область могут быть одинаковыми или разными. На фиг. 4Е приведена формула ТЦ Ф-УШ-Н-ЬС Ф-УШ-линкер-первая Рс-линкер-ФВ-линкер-вторая Рс. Линкеры (первый линкер между ЛЦ Ф-УШ и первой Рс-областью, второй линкер между первой Рс-областью и ФВ и третий линкер между ФВ и второй Рс-областью) могут быть одинаковыми или разными. Один или более линкеров могут являться отщепляемыми линкерами. Например, линкер между первой Рс-областью и ФВ может являться отщепляемым линкером, содержащим сайт расщепления на Ν-конце и/или С-конце линкера. Первая Рс-область и вторая Рс-область могут быть одинаковыми или разными. На фиг. 4Ж приведена формула ОЦ Ф-УШ-линкер-Рс-линкер-ФВ-Нлинкер-Рс. На фиг. 4З приведена формула пэгилированной или гэкилированной ОЦ Ф-УШ-линкер-Рслинкер-ФВ-Н-линкер-Рс. Линкеры (первый линкер между ОЦ Ф-УШ и первой Рс-областью, второй линкер между первой Рс-областью и ФВ и третий линкер между Н и второй Рс-областью) могут быть одинаковыми или разными. Один или более линкеров могут являться отщепляемыми линкерами. Например, линкер между первой Рс-областью и ФВ может являться отщепляемым линкером, содержащим сайт расщепления на Ν-конце и/или С-конце линкера. Первая Рс-область и вторая Рс-область могут быть одинаковыми или разными.

Фиг. 5 - схематические изображения системы совместной трансфекции гетеродимеров Ф-УШ-ФВ. Конструкция Ф-УШ-155 содержит полноразмерную последовательность Ф-УШ (с замещением остатком аланина остатков аргинина в позициях 1645 и 1648), связанную с Рс-областью. ФВ-031 содержит фрагмент Ό1Ό2ΌΌ3 (с замещением остатком аланина остатков цистеина в позициях 336 и 379), который связан с другой Рс-областью посредством 48 тромбин-отщепляемым линкером. После внутриклеточного процессирования конструкция Ф-УШ-155 продуцирует полноразмерный одноцепочечный Ф-УШ (ОЦФУШ), соединенный с одним Рс-фрагментом, конструкция ФВ-031 продуцирует фрагмент Ό'Ό3 длиной в 477 аминокислот, связанный с другим Рс-фрагментом. Две ковалентные связи могут образовываться между Рс-фрагментами, которые связаны с ОЦ Ф-УШ или фрагментом ΌΌ3, что, в свою очередь, делает возможной ковалентное соединение Ф-УШ и ΌΌ3, которое является основной характеристикой требуемого конечного продукта.

Фиг. 6 иллюстрирует невосстановительный и восстановительный ДСН-ПААГ ФВ-009 (Ό1Ό2Ό'Ό3 аминокислоты 1-276 х 6 ΗΙ8), который показывает, что ФВ-009 существует в виде мономера. Непроцессированный обозначает ФВ-009 с пропептидом (домены Ό1Ό2).

Фиг. 7 иллюстрирует невосстановительный и восстановительный ДСН-ПААГ ФВ-002 (ΌΌ3 аминокислоты 1-447 х 6 Ыз) или ФВ-010 (Ό1Ό2Ό'Ό3 аминокислоты 1-447 х 6 Ыз), который показывает, что ФВ-002 существует в виде мономера, а ФВ-010 существует в виде димера.

На фиг. 8 показано расщепление тромбином гетеродимера Ф-УШ-ФВ, приведенного на фиг. 2(б). На дорожке 1 показан маркер. Дорожка 2 соответствует рФ-УШ-Рс без тромбина. Дорожка 3 соответствует рФ-УШ-Рс с тромбином. Дорожка 5 соответствует Ф-УШРс-ФВ. Дорожка 6 соответствует ФУШРс-ФВ и тромбину. А1 обозначает домен А1 Ф-УШ, А2 обозначает домен А2 Ф-УШ, а Аа3 ЛЦ обозначает легкую цепь Ф-УШ.

На фиг. 9А, Б показана активность Ф-УШ, определенная при помощи хромогенного анализа Ф-УШ. На фиг. 9А показан фармакокинетический профиль рФ-УШ и рФ-УШРс для мышей с гемофилией А. На фиг. 9Б показан ФК профиль рФ-УШ и рФ-УШРс для мышей с двойным Ф-УШ/ФВ генным нокаутом (ДГН). На оси Υ показана активность Ф-УШ в мМЕ/мл, а на оси X показано время.

На фиг. 10А, Б показана защита Ф-УШ фрагментами Ό'Ό3, что отражает уровень мФ-УШ в плазме (мМЕ/мл) и уровень экспрессии ФВ (нМ/мл) через 48 ч после плазмидной инъекции. Фрагментами ФВ,

- 11 028309 применяемыми для демонстрации защиты Ф-УШ, являются ФВ-001 (276ак, мономер), ФВ-009 (276ак, мономер), ФВ-002 (477ак, мономер), ФВ-010 (477ак, димер), ФВ-003 (511ак, мономер), ФВ-011 (511ак, димер), ФВ-004 (716ак, мономер), ФВ-012 (716ак, димер), ФВ-006 и ФВ-008.

На фиг. 11 показан фармакокинетический профиль рУВД-Ф-УШ для Ф-УШ-ФВ ДГН мышей при совместном применении с фрагментами И'И3. На фиг. 11А показана активность Ф-УШ (мМЕ/мл), определенная при помощи хромогенного анализа Ф-УШ, после совместного применения рУВД-Ф-УШ и ФВ002, или рУВД-Ф-УШ и ФВ-010, или одного рУВД-Ф-УШ к Ф-УШ/ФВ ДГН мышам. На фиг. 11Б показан уровень ФВ-002 и ФВ-010 в плазме (нг/мл) после применения. Ось X отображает время в часах.

На фиг. 12 показан фармакокинетический профиль рФ-УШРс для мышей, экспрессирующих Ό'Ό3 ФВ. На фиг. 12А показана последовательность гидродинамической инъекции (ГДИ) плазмидной ДНК, кодирующей домен Ό'Ό3 (день -5), внутривенного дозирования рФ-УШРс (день 0) и забора образца ФК (день 0-3) На фиг. 12Б показана активность плазменного Ф-УШ (мМЕ/мл) после инфузии рФ-УШРс, определенная при помощи хромогенного анализа для Ф-УШ/ФВ ДГН мышей, которым проводили ГДИ доменов Ό1Ό2Ό'Ό3 (477ак) (кружки) и доменов Ό1Ό2Ό'Ό3 (477ак) с цистеиновыми заменами (прямоугольники). Активность Ф-УШ для контрольных мышей без ГДИ доменов ΌΌ3 показана в виде треугольников. На фиг. 12В показан уровень Ό'Ό3 в плазме (нг/мл) после применения ГДИ Ό1Ό2Ό'Ό3 димерной или Ό1Ό2Ό'Ό3 мономерной конструкции ДНК. Ось X отображает время в часах.

На фиг. 13 показана подборка линкеров ИТО-Рс по ГДИ для Ф-УШ/ФВ ДГН мышей. Между доменами ΌΌ3 и Рс-областью были вставлены линкеры различной длины (20ак (Ф-УШ-064), 35ак (Ф-У111159) или 48ак (Ф-УШ-160)). Активность Ф-УШ (мМЕ/мл) определяли при помощи хромогенного анализа после ГДИ для Ф-УШ/ФВ ДГН мышей.

На фиг. 14 показана ГДИ одноцепочечного гетеродимера Ф-УШРс/И'И3 Ф-УШ/ФВ ДГН мышам. Активности Ф-УШ процессированного (двухцепочечного) рФ-УШРс-Э'И3 (п-§УК-Ф-УШ-136) и одноцепочечного рФ-УШРс-И'И3 (п-§УК-Ф-УШ-148) определяли через 24 и 48 ч после ГДИ.

На фиг. 15 показана аффинность связывания гетеродимера Ф-УШ-155/ФВ-031 с обездвиженным чФВ, определенная при помощи платформы Ос1с1. Ф-УШРс, Ф-УШ и 1§О также использовали в качестве контроля. На оси х показано время в часах, а на оси у показано связывание в нанометрах (нм).

На фиг. 16 показана фармакокинетика Ф-УШ-155/ФВ-031 для мышей с дефицитом Ф-УШ/ФВ (ФУШ/ФВ ДГН). На оси х показано время в часах, а на оси у показано восстановление Ф-УШ относительно исходного уровня в процентах.

Фиг. 17 - схематические изображения примеров конструкций фрагментов ФВ, в которых ФВ является Ό1Ό2Ό'Ό3 фрагментом ФВ; линкер является линкером переменной длины, содержащим сайт расщепления, например сайт расщепления тромбином; Н является гетерологичным компонентом, например константной областью иммуноглобулина или ее частью, компонентом для конъюгации полиэтиленгликоля (ПЭГ) и/или ПЭГ, альбумином или фрагментом альбумина, альбумин-связывающим веществом, последовательностью НАР, компонентом для полисиалирования и/или полисиаловой кислотой, компонентом для гидроксиэтилового крахмала (ГЭК) и/или ГЭК или последовательностью РЛ§ и т.д.; и Рс является Рс-областью иммуноглобулина. На фиг. 17А приведена формула ПГО2-О'-составляющей И3-Нсоставляющая И3-линкер-Рс. На фиг. 17Б приведена формула О1Э2-составляющей Ό'-Н- составляющая ИТО-линкер-Рс. На фиг. 17В приведена формула Э1Э2-пэгилированной или гэкилированной Ό'Ό3линкер-Рс. В некоторых случаях линкер может быть отщеплен.

Фиг. 18А - показана потеря со временем Ф-УШ-активности Ф-УШРс как в гемА-плазме (ромбы), так и в ДГН-плазме (квадраты). Активность Ф-УШ определена при помощи хромогенного анализа. На оси х показано время в часах, а на оси у показана относительная активность. На фиг. 18Б показано, что потеря Ф-УШ-активности происходит из-за диссоциации или деградации тяжелой цепи (ТЦ). На левой панели показан иммунопреципитационный анализ, в котором использовалось овечье поликлональное антитело к Ф-УШ в Вю-габ 4-15% геле. Гель был гидрирован и визуализирован при помощи системы Вю-габ. На дорожке 1 показан неокрашенный маркер Вю-габ; на дорожке 2 показаны Ф-УШРс и ФБР; на дорожке 3 показаны Ф-УШРс и ДГН-плазма; и на дорожке 5 показано одно овечье поликлональное антитело к Ф-УШ. На правой панели показан вестерн-блоттинг геля, в котором использовалось антитело к тяжелой цепи Ф-УШ (ОМЛ012). На дорожке 1 показан неокрашенный маркер Вю-габ; на дорожке 2 показаны Ф-УШРс и ФБР; на дорожке 3 показаны Ф-УШРс и ДГН-плазма; и на дорожке 4 показано одно овечье поликлональное антитело к Ф-УШ.

На фиг. 19 показана Ф-УШ-активность как функция времени для Ф-УШРс дикого типа (кружки), оцФ-УШРс (одноцепочечного Ф-УШ) (закрашенные треугольники) или гетеродимеров Ф-У1111:ФВ (например, Ф-УШ155/ФВ031) (пустые треугольники), определенная при помощи хромогенного анализа в плазме ДГН мышей (левая панель) и плазме гемА мышей (правая панель). На оси Υ показана относительная активность Ф-УШ. Ф-УШРс дикого типа содержит двойную цепь Ф-УШ (т.е. тяжелую цепь ФУШ и легкую цепь Ф-УШ, которые удерживаются вместе нековалентной связью) и, таким образом, имеет три цепи - тяжелую цепь Ф-УШ, легкую цепь Ф-УШ, сшитую с Рс, и саму Рс-область. ОцФ-УППРс содержит одиночную цепь Ф-УШ и, таким образом, имеет две цепи, одну, в которой одиночная цепь ФУШ сшита с Рс, и другую, содержащую только Рс. Гетеродимер Ф-УШ:ФВ (например, Ф- 12 028309

УШ155/ФВ031) содержит одиночную цепь Ф-УШ, сшитую с Рс, и фрагмент ФВ (ΌΌ3), сшитый с Рс.

На фиг. 20 показан процессинг домена Ό1Ό2, принадлежащего фрагменту ФВ (например, ФВ031(Э1Э2Э'Э3Рс)), при помощи РС5 или РАСЕ (фурина) различных концентраций. Процессинг Ό1Ό2 показан в Βίο-тай 4-15% геле в восстановительных условиях при помощи устройства для визуализации Βίο-тай. На дорожке 1 показан один ФВ031; на дорожке 2 показан один РС5; на дорожке 3 показан один РАСЕ; на дорожке 4 показаны ФВ031 и РС5 при 2,5%; на дорожке 5 показаны ФВ031 и РС5 при 5%; на дорожке 6 показаны ФВ031 и РС5 при 7,5%; на дорожке 7 показаны ФВ031 и РС5 при 10%; на дорожке 8 показаны ФВ031 и РАСЕ при 2,5%; на дорожке 9 показаны ФВ031 и РАСЕ при 5%; на дорожке 10 показан ФВ031 при 7,5%; и на дорожке 11 показаны ФВ031 и РАСЕ при 10%.

Фиг. 21А - приведен анализ связывания гетеродимера Ф-У1111:ФВ (например, Ф-УШ-155/ФВ-031), проведенный при помощи октетной установки РойеВю. Для анализа при помощи сенсора ЛР8 был снят полноразмерный ФВ. На нижней левой панели показано связывание Ф-УШРс и Ф-УШ с полноразмерным ФВ. На нижней правой панели показано отсутствие связывания между Ф-УШ1680 (мутантом, не обладающим аффинностью к ФВ) и гетеродимером Ф-УШ:ФВ (Ф-УШ155/ФВ031). На фиг. 21Б приведен другой связывания гетеродимера Ф-У1111:ФВ (например, Ф-УШ-155/ФВ-031). При проведении этого анализа конструкции (конструкция ФВ031, Ф-УШ155/ФВ031 или Ф-УШ) были обездвижены на О-белковом сенсоре. Было определено связывание конструкций с Ф-УШ.

На фиг. 22 показана аффинность связывания доменов Ό'Ό3 ФВ с молекулой Ф-УШ, определенная экспериментом по поверхностному плазмонному резонансу. Конструкция ФВ031 (100 КЕ) захватывалась античеловеческим 1дО в 1000 КЕ. Ф-УШ с удаленным В-доменом применяли в одноцикловом кинетическом режиме в соотношении 1:1. Общее количество составляло 4.

На фиг. 23 показано влияние различной длины линкеров в гетеродимерных конструкциях ФУШРс/ФВ на фармакокинетику при применении на Ф-У111/ФВ ДГН мышах. Между Э'Э3 и Рс были вставлены три различных линкера (в 48 ак, 73 ак или 98 ак), т.е. ФВ031, ФВ035 и ФВ036. Активность ФУШ, нормированная относительно 5-минутной, величины (%) показана на оси Υ.

На фиг. 24 показаны примеры лигирования сортазой фрагмента ФВ с Ф-УШ. На фиг. 24А) показаны две конструкции лигирования, где (1) фрагмент ФВ в области С-конца сшит с распознающим сортазу мотивом (например, ЬРХТО), и (2) Ф-УШ содержит глицин (п) в области Ν-конца. После реакции с сортазой фрагмент ФВ и распознающий сортазу мотив оказываются лигированными к Ν-концу Ф-УШ. На фиг. 24Б) показаны две конструкции лигирования, где (1) Ф-УШ в области С-конца сшит с распознающим сортазу мотивом, и (2) фрагмент ФВ содержит глицин (п) в области Ν-конца. После реакции с сортазой Ф-УШ и распознающий сортазу мотив оказываются сшитыми с фрагментом ФВ в Ν-конце фрагмента ФВ. На фиг. 24В) показаны две конструкции лигирования, где (1) фрагмент ФВ сшит с распознающим сортазу мотивом при помощи линкера переменной длины, и (2) Ф-УШ в области Ν-конца сшит с глицином (п). После реакции с сортазой ФВ, сшитый при помощи линкера с распознающим сортазу мотивом, оказывается лигированным к Ν-концу Ф-УШ. На фиг. 24Г) показаны две конструкции лигирования, где (1) Ф-УШ сшит с распознающим сортазу мотивом при помощи линкера переменной длины, и (2) фрагмент ФВ в области Ν-конца сшит с глицином (п). После реакции с сортазой Ф-УШ, сшитый при помощи линкера с распознающим сортазу мотивом, оказывается лигированным к Ν-концу фрагмента ФВ. На фиг. 24Д) показана конструкция лигирования, содержащая фрагмент ФВ, сшитый с распознающим сортазу мотивом при помощи линкера переменной длины, который также сшит с сайтом расщепления протеазой (например, сайтом расщепления тромбином), сшитом с Рс при помощи линкера переменной длины.

На фиг. 25 показано схематическое сравнение Ф-УШ155 и Ф-УШ198. Ф-УШ155 кодирует одноцепочечный белок Ф-УШРс. Ф-УШ198 является одноцепочечной молекулой-226Ж) Ф-УШРс, содержащей частичный В-домен. 226 обозначает 226 Ν-концевых аминокислот В-домена Ф-УШ, а Ν6 обозначает шесть участков Ν-гликозилирования в В-домене.

Фиг. 26А) показан анализ стабильности, в котором определяется относительная активность ФУШ155 и Ф-УШ198 в ДГН-плазме как функция времени. Как видно из чертежа, наличие частичного Вдомена в Ф-УШ198 повысило стабильность одноцепочечного Ф-УШРс по сравнению с Ф-УШ155; на фиг. 26Б) показано сравнение времен полужизни Ф-УШ155 и Ф-У111198 и двухцепочечного (дцФ-У111Рс) в ДГН мышах. Как видно из чертежа, для одноцепочечного Ф-УШ (Ф-УШ155) наблюдается увеличение времени полужизни в 1,5 раз по сравнению с двухцепочечным Ф-УШ. Одноцепочечный Ф-УШ с 266Ν6 В-доменом (Ф-УШ198) демонстрирует дополнительно увеличение времени полужизни в 1,5 раз. На графике показана зависимость восстановления Ф-УШ от 5-минутного значения (%) как функция времени.

Детальное описание изобретения Определения

Стоит отметить, что употребление единственного числа по отношению к какому-либо объекту относится к одному или более объектам, например, под выражением нуклеотидная последовательность подразумевается одна или более нуклеотидных последовательностей. Соответственно фирма единственного числа и термины один или более и по меньшей мере один могут взаимозаменяемо употребляться в данном тексте.

- 13 028309

Термин полинуклеотид или нуклеотид включает в себя как одиночную нуклеиновую кислоту, так и множественные нуклеиновые кислоты, и относится к выделенной молекуле или конструкции нуклеиновой кислоты, например информационной РНК (иРНК) или плазмидной ДНК (пДНК). В определенных вариантах реализации изобретения полинуклеотид содержит обычную фосфодиэфирную связь или альтернативную связь (например, амидную связь, которую можно обнаружить в пептидных нуклеиновых кислотах (ПНК)). Термин нуклеиновая кислота относится к какому-либо одному или более сегментам нуклеиновой кислоты, например фрагментам ДНК или РНК, присутствующим в полинуклеотиде. Под выделенными нуклеиновой кислотой или полинуклеотидом подразумевается молекула нуклеиновой кислоты, ДНК или РНК, которая была удалена из своей естественной среды. Например, рекомбинантный полинуклеотид, кодирующий полипептид фактора VIII, содержащийся в векторе, считается выделенным в контексте настоящего изобретения. Дополнительные примеры выделенного полинуклеотида включают рекомбинантные полинуклеотиды, содержащиеся в гетерологичной клетке-хозяине или очищенные (частично или в значительной степени) от других полинуклеотидов в растворе. Выделенные молекулы РНК включают ίη νίνο или ίηνίΐτο РНК транскрипты полинуклеотидов, являющихся объектами настоящего изобретения. Выделенные полинуклеотиды или нуклеиновые кислоты согласно настоящему изобретению дополнительно включают такие молекулы, полученные синтетическим способом. Вдобавок полинуклеотид или нуклеиновая кислота может содержать регуляторные элементы, такие как промоторы, энхансеры, участки связывания рибосом или сигналы терминации транскрипции.

При употреблении в данном тексте кодирующая область или кодирующая последовательность представляют собой фрагмент полинуклеотида, который состоит из кодонов, которые могут транслироваться в аминокислоты. Хотя стоп-кодон (ТАС, ТСА или ТАА) обычно не транслируется в аминокислоту, он может считаться частью кодирующей области, но любые фланкирующие последовательности, например промоторы, участки связывания рибосом, терминаторы транскрипции, интроны и тому подобные элементы не являются частью кодирующей области. Границы кодирующей области обычно определяются стартовым кодоном на 5'-конце, кодирующем аминоконец результирующего полипептида, и трансляционным стоп-кодоном на З'-конце, кодирующем карбоксильный конец результирующего полипептида. Две или более кодирующих областей согласно настоящему изобретению могут присутствовать в одиночной полинуклеотидной конструкции, например в одиночном векторе, или в отдельных полинуклеотидных конструкциях, например в отдельных (различных) векторах. Следовательно, отсюда вытекает, что одиночный вектор может содержать только одиночную кодирующую область или содержать две или более кодирующих областей, например одиночный вектор может отдельно кодировать связывающий домен-А и связывающий домен-В, как описано ниже. Вдобавок вектор, полинуклеотид или нуклеиновая кислота, являющиеся объектами данного изобретения, могут кодировать гетерологичные кодирующие области, как сшитые, так и несшитые с нуклеиновой кислотой, кодирующей связывающий домен согласно изобретению. Гетерологичные кодирующие области без ограничений включают специализированные элементы или мотивы, такие как секреторный сигнальный пептид или гетерологичный функциональный домен.

Определенные белки, секретируемые клетками млекопитающих, связаны с секреторным сигнальным пептидом, который отщепляется от зрелого белка, как только инициируется экспорт растущей белковой цепи через шероховатый эндоплазматический ретикулум. Специалистам в данной области техники известно, что сигнальные пептиды в общем случае сшиты с Ν-концом полипептида для того, чтобы вырабатывать секретируемую или зрелую форму полипептида. В определенных вариантах реализации изобретения применяется нативный сигнальный пептид, например сигнальный пептид тяжелой цепи или легкой цепи иммуноглобулина, либо функциональное производное такой последовательности, которое сохраняет способность управлять секрецией функционально связанного с ней полипептида. В альтернативном варианте может применяться гетерологичный сигнальный пептид млекопитающего, например человеческий тканевой активатор плазминогена (ТАП) или мышиный сигнальный пептид Рглюкуронидазы, либо его функциональное производное.

Термин нижележащая относится к нуклеотидной последовательности, которая расположена в направлении З' от основной нуклеотидной последовательности. В определенных вариантах реализации изобретения нижележащие нуклеотидные последовательности относятся к последовательностям, которые следуют за точкой старта транскрипции. Например, кодон инициации трансляции гена расположен ниже сайта старта транскрипции.

Термин вышележащая относится к нуклеотидной последовательности, которая расположена в направлении 5' от основной нуклеотидной последовательности. В определенных вариантах реализации изобретения вышележащие нуклеотидные последовательности относятся к последовательностям, которые расположены на 5' стороне кодирующей области или точки старта транскрипции. Например, большинство промоторов располагаются выше сайта старта транскрипции.

При употреблении в данном тексте регуляторная область относится к нуклеотидным последовательностям, расположенным выше (в направлении 5' некодирующих последовательностей), в рамках или ниже (в направлении 3' некодирующих последовательностей) кодирующей области, и которые оказывают влияние на транскрипцию, процессинг РНК, стабильность или трансляцию связанной с ней коди- 14 028309 рующей области. Регуляторные области могут включать промоторы, трансляционные лидерные последовательности, интроны, последовательности распознавания полиаденилирования, участки процессинга РНК, участки связывания эффекторов и структуры типа стебель - петля. Если кодирующая область предназначена для экспрессии в эукариотической клетке, сигнальная последовательность полиаденилирования и последовательность терминации транскрипции обычно расположены в направлении 3' относительно кодирующей последовательности.

Полинуклеотид, который кодирует генный продукт, например полипептид, может включать промотор и/или другие транскрипционные или трансляционные контрольные элементы, функционально связанные с одной или более кодирующими областями. Находящаяся в функциональной связи кодирующая область для генного продукта, например полипептида, связана с одной или более регуляторными областями таким образом, чтобы экспрессия генного продукта оказалась под влиянием или контролем регуляторной области (областей). Например, кодирующая область и промотор являются функционально связанными, если индукция действия промотора приводит к транскрипции иРНК, кодирующей генный продукт, кодируемый кодирующей областью, и если природа связи между промотором и кодирующей областью не препятствует возможности промотора управлять экспрессией генного продукта или не препятствует возможности транскрибирования ДНК-матрицы. Другие транскрипционные контрольные элементы, кроме промотора, например энхансеры, операторы, репрессоры и сигналы терминации транскрипции, также могут быть функционально связанными с кодирующей областью для того, чтобы управлять экспрессией генного продукта.

Специалистам в данной области техники известно множество транскрипционных контрольных областей. Они включают без ограничения транскрипционные контрольные области, которые функционируют в клетках позвоночных, такие как промоторные и энхансерные сегменты цитомегаловирусов (предранний промотор в сочетании с интроном-А), вирус обезьян 40 (ранний промотор) и ретровирусы (такие как вирус саркомы Рауса). Другие транскрипционные контрольные области включают те, которые получены из генов позвоночных, такие как актин, белок теплового шока, бычий гормон роста и кроличий βглобин, а также другие последовательности, способные контролировать генную экспрессию в эукариотических клетках. Дополнительные подходящие транскрипционные контрольные области включают тканеспецифические промоторы и энхансеры, а также лимфокин-индуцибельные промоторы (например, индуцибельные интерферонами или интерлейкинами промоторы).

Аналогично, специалистам в данной области техники известно множество трансляционных контрольных элементов. Они включают без ограничения участки связывания рибосом, кодоны инициации и терминации трансляции и элементы, полученные из пикорнавирусов (в частности, участок внутренней посадки рибосомы или УВПР, также называемый С1ТЕ-последовательностью).

Употребляемый в данном тексте термин экспрессия относится к процессу, посредством которого полинуклеотид продуцирует генный продукт, например РНК или полипептид. Он включает без ограничения транскрипцию полинуклеотида в информационную РНК (иРНК), транспортную РНК (тРНК), малую шпилечную РНК (мшРНК), малую интерферирующую РНК (миРНК) или любой другой РНКпродукт, и трансляцию иРНК в полипептид. При помощи экспрессии получают генный продукт. При употреблении в данном тексте генный продукт может представлять нуклеиновую кислоту, например информационную РНК, полученную посредством транскрипции гена, или полипептид, который был транслирован с транскрипта. Описанные в данном тексте генные продукты дополнительно включают нуклеиновые кислоты, прошедшие пост-транскрипционные модификации, например полиаденилирование или сплайсинг, или полипептиды, прошедшие пост-транскрипционные модификации, например метилирование, гликозилирование, добавление липидов, объединение с другими белковыми субъединицами или протеолитическое расщепление.

Вектор относится к любому средству для клонирования и/или переноса нуклеиновой кислоты в клетку-хозяина. Вектор может являться репликоном, к которому может быть присоединен сегмент другой нуклеиновой кислоты таким образом, чтобы привести к репликации присоединенного сегмента. Репликон относится к любому генетическому элементу (например, плазмиде, фагу, космиде, хромосоме, вирусу), который функционирует как автономная единица репликации ίη νίνο, т.е. способен к самостоятельно управляемой репликации. Термин вектор включает как вирусной, так и невирусной природы средства для внесения нуклеиновой кислоты в клетку ίηνίΐΓο, ех νίνο или ίη νίνο. В данной области техники известно и применяется большое количество векторов, включая, например, плазмиды, модифицированные эукариотические вирусы или модифицированные бактериальные вирусы. Вставку полинуклеотида в подходящий вектор можно осуществить путем лигирования соответствующих фрагментов полинуклеотида в выбранный вектор, который имеет комплементарные липкие концы.

Векторы могут быть сконструированы таким образом, чтобы кодировать селектируемые маркеры или репортеры, которые обеспечивают отбор или идентификацию клеток, в которые был инкорпорирован вектор. Экспрессия селектируемых маркеров или репортеров позволяет осуществлять идентификацию и/или отбор клеток-хозяев, которые инкорпорируют и экспрессируют другие кодирующие области, содержащиеся в векторе. Примеры известных и применяемых в данной области техники генов селектируемых маркеров включают: гены, обеспечивающие устойчивость к ампициллину, стрептомицину, ген- 15 028309 тамицину, канамицину, гигромицину, гербициду биалафос, сульфонамиду и тому подобным веществам; и гены, которые применяются в качестве фенотипических маркеров, т.е. регуляторные гены антоцианов, ген изопентенил трансферазы и тому подобные. Примеры известных и применяемых в данной области техники репортеров включают: люциферазу (Люц), зеленый флуоресцентный белок (ЗФБ), хлорамфеникол-ацетилтрансферазу (ХАТ), -галактозидазу (ЛакЗ), -глюкуронидазу (Гуз) и тому подобные вещества. Селектируемые маркеры также могут считаться репортерами.

Термин плазмида относится к внехромосомному элементу, часто несущему ген, который не является частью центрального метаболизма клетки, и обычно находящемуся в форме кольцевых двухцепочечных молекул ДНК. Такие элементы могут являться автономно реплицирующимися последовательностями, интергирующимися в геном последовательностями, фагом или нуклеотидными последовательностями, линейными, кольцевыми или сверхспиральными одно- или двухцепочечных ДНК или РНК, полученными из произвольного источника, в которых определенное число нуклеотидных последовательностей было соединено или рекомбинировано в уникальную конструкцию, которая способна внести в клетку фрагмент промотора и последовательность ДНК для выбранного генного продукта вместе с соответствующей 3' нетранслируемой последовательностью.

Эукариотические вирусные векторы, которые могут применяться, включают, но не ограничиваются этим, аденовирусные векторы, ретровирусные векторы, адено-ассоциированные вирусные векторы, поксвирус, например векторы на основе вируса осповакцины, векторы на основе бакуловирусов или векторы на основе вируса герпеса. Невирусные векторы включают плазмиды, липосомы, электрически заряженные липиды (цитофектины), ДНК-белковый комплексы и биополимеры.

Клонирующий вектор относится к репликону, который является единицей длины нуклеиновой кислоты, которая последовательно реплицируется и которая содержит точку начала репликации, такую как плазмида, фаг или космида, к которой может быть присоединен сегмент другой нуклеиновой кислоты таким образом, чтобы привести к репликации присоединенного сегмента. Определенные клонирующие векторы способны к репликации в одном типе клеток, например в бактериальных клетках, и экспрессии в другом, например в эукариотических клетках. Клонирующие векторы обычно содержат одну или более последовательностей, которые могут применяться для отбора клеток, содержащих вектор, и/или один или более множественных клонирующих участков для вставки представляющих интерес нуклеотидных последовательностей.

Термин экспрессионный вектор относится к элементу, сконструированному для того, чтобы сделать возможной экспрессию вставленной нуклеотидной последовательности после внесение в клеткухозяина. Вставленная нуклеотидная последовательность размещается в функциональной связи с регуляторными областями, как описано выше.

Векторы вносят в клетки-хозяев способами, хорошо известными в данной области техники, например путем трансфекции, электропорации, микроинъекции, трансдукции, клеточного слияния, при помощи диэтиламиноэтилдекстрана, осаждения фосфата кальция, липофекции (слияния лизосом), применения генной пушки или транспортера ДНК-вектора.

При употреблении в данном тексте культивировать, культивирование и культивация обозначают инкубацию клеток в таких ίηνίίΓΟ условиях, которые способствуют росту клеток или делению, или поддержанию клеток в живом состоянии. При употреблении в данном тексте культивированные клетки обозначают клетки, которые были размножены ίηνίίΓΟ.

При употреблении в данном тексте термин полипептид включает в себя как одиночный полипептид, так и множественные полипептиды, и относится к молекуле, состоящей из мономеров (аминокислот), линейно связанных амидными связями (также известными как пептидные связи). Термин полипептид относится к любой цепи или цепям двух или более аминокислот и не относится к специфичной длине продукта. Таким образом, пептиды, дипептиды, трипептиды, олигопептиды, белок, аминокислотная цепь либо любой другой термин, применяемый для обозначения цепи или цепей двух или более аминокислот, включены в определение полипептида, а термин полипептид может применяться вместо либо взаимозаменяемо с любым из этих терминов. Термин полипептид также относится к продуктам пост-экспрессионной модификации полипептида, включая без ограничений гликозилирование, ацетилирование, фосфорилирование, амидирование, дериватизацию известными защитными/блокирующими группами, протеолитическое расщепление или модификацию аминокислотами неприродного происхождения. Полипептид может быть получен из природного биологического ресурса или при помощи рекомбинатной технологии, но не обязательно являться транслированным из определенной нуклеотидной последовательности. Он может быть получен любым способом, включая химический синтез.

Выделенный полипептид или его фрагмент, вариант или производное обозначает полипептид, который не находится в своем естественном окружении. Никакой конкретный уровень очистки не требуется. Например, выделенный полипептид может быть просто удален из своего природного или естественного окружения. Полученные при помощи рекомбинантных технологий полипептиды и белки, экспрессируемые в клетках-хозяевах, считаются выделенными в контексте данного изобретения, как и нативные или рекомбинантные полипептиды, которые были отделены, фракционированы либо частично или в зна- 16 028309 чительной степени очищены любым подходящим способом.

Также в настоящее изобретение включены фрагменты или варианты полипептидов и любые их комбинации. Термин фрагмент или вариант в отношении связывающих доменов полипептидов или связывающих молекул, являющихся объектами настоящего изобретения, включают любые полипептиды, которые сохраняют, по меньшей мере, некоторые свойства (например, аффинность связывания с РсКп в случае РсКп-связывающего домена или Рс-варианта, активность коагуляции в случае Ф-УШ-варианта или Ф-УШ-связывающую активность в случае фрагмента ФВ) основного полипептида. Фрагменты полипептидов включают протеолитические фрагменты, а также делеционные фрагменты дополнительно к специфическим фрагментам антител, обсуждаемым в другом месте данного текста, но не включают полноразмерный полипептид природного происхождения (или зрелый полипептид). Варианты связывающих доменов полипептидов или связывающих молекул, являющихся объектами настоящего изобретения, включают фрагменты, как описано выше, а также полипептиды с аминокислотными последовательностями, измененными вследствие аминокислотных замен, делеций или инсерций. Варианты могут быть природного и неприродного происхождения. Варианты неприродного происхождения могут быть получены путем известных в данной области техники методов мутагенеза. Вариантные полипептиды могут содержать консервативные или неконсервативные аминокислотные замены, делеций или добавки.

Употребляемый в данном тексте термин фрагмент ФВ или фрагменты ФВ обозначает любые фрагменты ФВ, которые взаимодействуют с Ф-УШ и сохраняют по меньшей мере одно или более свойств, которые обычно обеспечивает Ф-УШ полноразмерный ФВ, например предотвращение преждевременной активации Ф-УШа, предотвращение преждевременного протеолиза, предотвращение связывания с фосфолипидными мембранами, которое может привести к преждевременному клиренсу, предотвращение связывания с клиренс-рецепторами Ф-УШ, которые могут связывать незащищенный Ф-УШ, но не ФВ-связанный Ф-УШ, и/или стабилизацию взаимодействий тяжелой цепи и легкой цепи Ф-УШ. Употребляемый в данном тексте термин фрагмент ФВ не включает полноразмерный или зрелый белок ФВ. В конкретном варианте реализации изобретения упоминаемый в данном тексте фрагмент ФВ содержит домен Ό' и домен Ό3 белка ФВ, но не содержит домен А1, домен А2, домен А3, домен Ό4, домен В1, домен В2, домен В3, домен С1, домен С2 и домен СК белка ФВ.

Употребляемый в данном тексте термин фактор, ограничивающий время полужизни или фактор, ограничивающий время полужизни Ф-УШ определяет фактор, который предупреждает продление времени полужизни белка Ф-УШ более чем в 1,5 раз или 2 раза по сравнению с Ф-УШ дикого типа (например, АОУАТЕ® или КЕРАСТО®). Например, полноразмерный или зрелый ФВ может действовать как фактор, ограничивающий время полужизни Ф-УШ, индуцируя выведение комплекса Ф-УШ и ФВ из системы в процессе одного или более каскадов выведения ФВ. В одном примере эндогенный ФВ является фактором, ограничивающим время полужизни Ф-УШ. В другом примере полноразмерная рекомбинантная молекула ФВ, нековалентно связанная с белком Ф-УШ, является фактором, ограничивающим время полужизни Ф-УШ.

Употребляемый в данном тексте термин эндогенный ФВ определяет молекулы ФВ, присутствующие в плазме в природном состоянии. Эндогенная молекула ФВ может являться мультимером, но может быть и мономером или димером. Эндогенный ФВ в плазме связывается с Ф-УШ и образует с ФУШ нековалентный комплекс.

Консервативной аминокислотной заменой является такая, при которой аминокислотный остаток замещается аминокислотным остатком, имеющим аналогичную боковую цепь. Семейства аминокислотных остатков, имеющих аналогичные боковые цепи, были определены в данной области техники, включая основные боковые цепи (например, лизин, аргинин, гистидин), кислотные боковые цепи (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженные полярные боковые цепи (например, глицин, аспарагин, глутами, серин, треонин, тирозин, цистеин), неполярные боковые цепи (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), бета-разветвленные боковые цепи (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматические боковые цепи (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Таким образом, если аминокислота в полипептиде замещается другой аминокислотой, принадлежащей тому же семейству боковых цепей, такая замена считается консервативной. В другом варианте реализации изобретения ряд аминокислот может быть консервативно заменен структурно подобным рядом, который отличается порядком и/или составом представителей семейства боковых цепей.

Как известно в данной области техники идентичность последовательностей между двумя полипептидами определяется путем сравнения аминокислотной последовательности одного полипептида с последовательностью второго полипептида. При обсуждении в данном тексте определение того, является ли любой конкретный полипептид идентичным по меньшей мере на около 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99 или 100% другому полипептиду, осуществляется при помощи известных в данной области техники методов и компьютерных программ/программного обеспечения, включающих, но не ограничивающихся этим, программу ВЕЗТР1Т ^18соп8ш§едиепсеАпа1у818Раскаде, Версия 8 для Ишх, Оепейс8Сотри1егОгоир, ипщег8ЙуКе8еагсЬРагк, 575 ЗаепсеОгАе, МаФ8оп, XVI 53711). ВЕЗТР1Т использует алгоритм локальной гомологии Смита и Уотермана, ААапсе8шАрр11е4Ма1кета1:ю8 2:482-489 (1981), для того, чтобы

- 17 028309 найти сегмент наибольшей гомологии между двумя последовательностями. При применении ВЕЗТЕ1Т или любой другой программы для выравнивания последовательностей для определения того, является ли конкретная последовательность, например, на 95% идентичной основной последовательности согласно настоящему изобретению, параметры устанавливают, конечно, таким образом, что процент идентичности рассчитывается относительно полной длины основной полипептидной последовательности и допускаются расхождения в гомологии до 5% относительно общего числа аминокислот в основной последовательности.

При употреблении в данном тексте аминокислота, соответствующая чему-либо или эквивалентная аминокислота в последовательности ФВ или последовательности белка Ф-УШ определяются по выравниванию с целью максимизировать идентичность или сходство между первой последовательностью ФВ или Ф-УШ и второй последовательностью ФВ или Ф-УШ. Число, применяемое для определения эквивалентной аминокислоты во второй последовательности ФВ или Ф-УШ, зависит от числа, применяемого для определения соответствующей аминокислоты в первой последовательности ФВ или ФУШ.

Слитый или химерный белок содержит первую аминокислотную последовательность, связанную со второй аминокислотной последовательностью, с которой она не связана в естественном состоянии. Аминокислотные последовательности, которые обычно присутствуют в разных белках, могут быть соединены вместе в слитом полипептиде, либо аминокислотные последовательности, которые обычно присутствуют в одном белке, могут быть размещены в новом порядке в слитом полипептиде, примером чего является слияние домена фактора УШ, являющегося объектом данного изобретения, с Ес-доменом иммуноглобулина. Слитый белок создают, например, путем химического синтеза или путем создания и трансляции полинуклеотида, в котором пептидные области кодируются в необходимом взаиморасположении. Химерный белок может дополнительно содержать вторую аминокислотную последовательность, связанную с первой аминокислотной последовательностью ковалентной, непептидной связью или нековалентной связью.

Употребляемый в данном тексте термин время полужизни относится к биологическому времени полужизни конкретного полипептида ίη νίνο. Время полужизни может обозначать время, необходимое для того, чтобы половина количества введенного испытуемому объекту препарата была выведена из кровообращения и/или других тканей животного. При построении кривой выведения данного полипептида как функции времени кривая обычно является двухфазной с быстрой α-фазой и более длинной β-фазой. α-фаза обычно отображает равновесное распределение введенного Ес полипептида между внутрисосудистым и внесосудистым пространством и частично определяется размером полипептида. β-фаза обычно отображает катаболизм полипептида во внутрисосудистом пространстве. В некоторых вариантах реализации изобретения Ф-УШ и содержащие Ф-УШ химерные белки являются монофазными и, таким образом, не имеют альфа-фазы, а только бета-фазу. Следовательно, в определенных вариантах реализации изобретения употребляемый в данном тексте термин время полужизни относится ко времени полужизни полипептида в β-фазе. Обычное время полужизни β-фазы человеческого антитела у человека составляет 21 день.

При применении к полинуклеотиду или полипептиду термин гетерологичный означает, что полинуклеотид или полипептид получены из объекта, отличного от того объекта, с которым проводится сравнение. Следовательно, гетерологичный полипептид, связанный с фрагментом ФВ, обозначает полипептидную цепь, которая связана с фрагментом ФВ и не является частью фрагмента ФВ природного происхождения. Например, гетерологичный полипептид или антиген может быть получен от различных видов, из различных типов клеток особи либо одинаковых или различных типов клеток различных особей.

Употребляемый в данном тексте термин связанный относится к первой аминокислотной последовательности или нуклеотидной последовательности, ковалентно или нековалентно соединенной со второй аминокислотной последовательностью или нуклеотидной последовательностью соответственно. Термин ковалентно связанный или ковалентная связь относится к ковалентной связи, например дисульфидной связи, пептидной связи или одной или более аминокислотам, например линкеру, между двумя связанными между собой компонентами. Первая аминокислотная или нуклеотидная последовательность может быть прямым образом связана или соединена со второй аминокислотной или нуклеотидной последовательностью, или в другом варианте промежуточная последовательность может ковалентно связывать первую последовательность со второй последовательностью. Термин связанный обозначает не только сшивание первой аминокислотной последовательности со второй аминокислотной последовательностью в области С-конца или Оконца, но также включает вставку полной первой аминокислотной последовательности (или второй аминокислотной последовательности) между любыми двумя аминокислотами второй аминокислотной последовательности (или первой аминокислотной последовательности соответственно). В одном варианте реализации изобретения первая аминокислотная последовательность может быть соединена со второй аминокислотной последовательностью посредством пептидной связи или линкера. Первая аминокислотная последовательность может быть соединена со второй аминокислотной последовательностью посредством фосфодиэфирной связи или линкера. Линкер может представ- 18 028309 лять собой пептид или полипептид (для полипептидных цепей) или нуклеотид или нуклеотидную цепь (для нуклеотидных цепей) либо любое химическое соединение (как для полипептидных, так и для полинуклеотидных цепей). Ковалентную связь иногда обозначают как (-) или дефис.

Употребляемый в данном тексте термин связанный с относится к ковалентной или нековалентной связи, образованной между первой аминокислотной цепью и второй аминокислотной цепью. В одном варианте реализации изобретения термин связанный с обозначает ковалентную, непептидную связь или нековалентную связь. В некоторых вариантах реализации изобретения такую связь обозначают двоеточием, т. е. (:). В другом варианте реализации изобретения он обозначает ковалентную связь за исключением пептидной связи. В других вариантах реализации изобретения употребляемый в данном тексте термин ковалентно связанный обозначает связь между двумя компонентами посредством ковалентной связи, например дисульфидной связи, пептидной связи или одной или более аминокислот (например, линкера). Например, аминокислота цистеин содержит тиольную группу, которая может образовывать дисульфидную связь или мостик с тиольной группой второго остатка цистеина. В большинстве молекул 1дС природного происхождения области СН1 и СЬ связаны дисульфидной связью, а две тяжелые цепи связаны двумя дисульфидными связями в позициях, соответствующих 239 и 242 согласно системе нумерации Кабата (позиции 226 и 229 в Европейской системе нумерации). Примеры ковалентных связей включают, но не ограничиваются этим, пептидную связь, металлическую связь, водородную связь, дисульфидную связь, сигма-связь, пи-связь, дельта-связь, гликозидную связь, агностическую связь, изогнутую связь, диполярную связь, пи-обратную связь, двойную связь, тройную связь, четвертную связь, пятерную связь, шестерную связь, конъюгацию, гиперконъюгацию, ароматичность, гаптичность или антисвязывание. Неограничивающие примеры нековалентной связи включают ионную связь (например, катионную пи-связь или соляную связь), металлическую связь, водородную связь (например, диводородную связь, диводородный комплекс, низкобарьерную водородную связь или симметричную водородную связь), Ван-дер-Ваальсовы силы, лондоновские дисперсионные силы, механическую связь, галогенную связь, аурофильность, интеркаляцию, стэкинг, энтропийные силы или химическую полярность.

Употребляемый в данном тексте термин мономерно-димерный гибрид относится к химерному белку, содержащему первую полипептидную цепь и вторую полипептидную цепь, которые связаны друг с другом дисульфидной связью, при этом первая цепь содержит фактор свертывания крови, например фактор УШ, и Рс-область, а вторая цепь содержит, состоит преимущественно из или состоит из Рсобласти без фактора свертывания крови. Мономерно-димерная гибридная конструкция, таким образом, является гибридом, содержащим мономерную часть, содержащую только один фактор свертывания крови, и димерную часть, содержащую две Рс-области.

Употребляемый в данном тексте термин сайт расщепления или сайт ферментного расщепления относится к сайту, распознаваемому ферментом. Определенные сайты ферментного расщепления содержат сайт внутриклеточного процессинга. В одном варианте реализации изобретения полипептид содержит сайт ферментного расщепления, расщепляемый ферментом, который активируется во время каскада свертывания таким образом, что расщепление таких сайтов происходит на участке образования тромба. Примеры таких сайтов включают, например, те, которые распознаются тромбином, фактор Х1а или фактор Ха. Примеры сайтов расщепления Ф-Х1а включают, например, ΤΟ8ΡΝΩΡΤΚ (8ЕЦ ГО N0: 47) и 8У8ОТ8КЬТК (8Е0 ГО N0: 48). Примеры сайтов расщепления тромбином включают, например, ПРЬАЕОООУК (8ЕО ГО N0: 49), ТТК1КРК (8ЕО ГО N0: 50), ЬУРКО (8ЕО ГО N0: 55) и АЬКРК (аминокислоты от 1 до 5 из 8Е0 ГО N0: 51). Другие сайты ферментного расщепления известны в данной области техники.

Употребляемый в данном тексте термин сайт процессинга или сайт внутриклеточного процессинга относится к такому типу сайтов ферментного расщепления в полипептиде, являющемся целью для ферментов, которые действуют после трансляции полипептида. В одном варианте реализации изобретения такие ферменты действуют во время переноса из полости аппарата Гольджи в транс-Гольджи компартмент. Ферменты внутриклеточного процессинга расщепляют полипептиды перед секрецией белка из клетки. Примеры таких сайтов процессинга включают, например, те, на которые нацелены представители семейства РАСЕ/фурин (где РАСЕ является акронимом от англ. РацейЪа8юАттоасМС1еаушдЕп/уте - фермент, расщепляющий спаренные основные аминокислоты) эндопептидаз. Эти ферменты находятся в мембране Гольджи и расщепляют белки со стороны карбоксильного конца мотива последовательности Агд-[любой остаток]-(Ьу8 или Агд)-Агд. Упоминаемые в данном тексте представители фуринового семейства ферментов включают, например, РС8К1 (также известный как РС1/Рс3), РС8К2 (также известный как РС2), РС8К3 (также известный как фурин или РАСЕ), РС8К4 (также известный как РС4), РС8К5 (также известный как РС5 или РС6), РС8К6 (также известный как РАСЕ4) или РС8К7 (также известный как РС7/ЬРС, РС8 или 8РС7). Другие сайты процессинга известны в данной области техники.

Термин фурин относится к ферментам, соответствующим ЕС№о 3.4.21.75. Фурин является субтилизин-подобной пробелковой конвертазой, которая также известна под названием РАСЕ (Ра1гейЪа81сАпипоасИОеаутдЕп/уте). Фурин удаляет секции неактивных белков-предшественников для того, чтобы конвертировать их в биологически активные белки. Во время своего внутриклеточного перемеще- 19 028309 ния пропептид отщепляется от зрелой молекулы ФВ ферментом фурином в аппарате Гольджи.

Понятно, что в конструкциях, содержащих более одного сайта процессинга или расщепления, данные сайты могут быть одинаковыми либо разными.

При употреблении в данном тексте гемостатическое нарушение означает генетически унаследованное или приобретенное заболевание, которое характеризуется склонностью к кровоизлияниям, как к спонтанным, так и в результате травмы, из-за нарушения способности или неспособности образовывать фибриновые сгустки. Примеры таких нарушений включают разные виды гемофилии. Тремя основными формами являются гемофилия А (дефицит фактора УШ), гемофилия В (дефицит фактора IX или болезнь Кристмаса) и гемофилия С (дефицит фактора XI, склонность к умеренным кровотечениям). Другие гемостатические нарушения включают, например, болезнь Виллебранда, дефицит фактора XI (дефицит ПТП), дефицит фактора XII, дефицит или структурные аномалии фибриногена, протромбина, фактора У, фактора УП, фактора X или фактора XIII, синдром Бернара-Сулье, который является дефектом или дефицитом ОРШ. ОРШ - рецептор для ФВ - может быть дефективным и приводить к недостатку первичного тромбообразования (первичного гемостаза) и повышенной склонности к кровотечениям, и тромбастении Гланцманна и Негели (тромбастении Гланцманна). При печеночной недостаточности (острой и хронической формах) наблюдается недостаточная выработка факторов свертывания крови печенью, что может привести к повышенному риску кровотечений.

Химерные молекулы, являющиеся объектом данного изобретения, можно применять в профилактических целях. Употребляемый в данном тексте термин профилактическое лечение относится к применению данной молекулы до случая кровотечения. В одном варианте реализации изобретения пациенту, нуждающемуся в общем гемостатическом средстве, проводят или собираются проводить хирургическую операцию. Химерный белок, являющийся объектом данного изобретения, можно применять до или после хирургической операции в качестве профилактики. Химерный белок, являющийся объектом данного изобретения, можно применять во время или после хирургической операции для контролирования острых случаев кровотечения. Хирургическая операция может включать, но не ограничивается этим, трансплантацию печение, резекцию печени, стоматологические процедуры или трансплантацию стволовых клеток.

Химерный белок, являющийся объектом данного изобретения, также применяется для лечения по требованию (также называемому эпизодическим). Термин лечение по требованию или эпизодическое лечение относится к применению химерной молекулы в ответ на проявление симптомов случая кровотечения или перед действием, которое может вызвать кровотечение. В одном аспекте реализации лечение пациента по требованию (эпизодическое лечение) может проводиться тогда, когда кровотечение началось, например, после травмы, или тогда, когда кровотечение ожидается, например, перед хирургической операцией. В другом аспекте реализации лечение пациента по требованию может проводиться до действий, которые повышают риск кровотечения, например, в случае контактного спорта.

Употребляемый в данном тексте термин острое кровотечение относится к случаю кровотечения вне зависимости от его причин. Например, пациент может получить травму, страдать уремией, наследственным нарушением, связанным с кровотечением (например, дефицитом фактора УП), нарушением тромбоцитарного звена гемостаза или обладать сопротивлением благодаря выработке антител к факторам свертывания крови.

При употреблении в данном тексте лечение, проведение лечения, осуществление лечения относится, например, к снижению степени тяжести заболевания или болезненного состояния; снижению продолжительности заболевания; уменьшению интенсивности одного или более симптомов, связанных с заболеванием или болезненным состоянием, без обязательного излечения заболевания или болезненного состояния или предупреждения одного или более симптомов, связанных с заболеванием или болезненным состоянием. В одном варианте реализации изобретения термин лечение или проведение лечения означает поддержание у пациента минимального уровня Ф-УШ, составляющего по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 МЕ/дЛ, путем введения химерного белка или фрагмента ФВ, которые являются объектами данного изобретения. В другом варианте реализации изобретения лечение или проведение лечения означает поддержание минимального уровня Ф-УШ между около 1 и около 20 МЕ/дЛ, около 2 и около 20 МЕ/дЛ, около 3 и около 20 МЕ/дЛ, около 4 и около 20 МЕ/дЛ, около 5 и около 20 МЕ/дЛ, около 6 и около 20 МЕ/дЛ, около 7 и около 20 МЕ/дЛ, около 8 и около 20 МЕ/дЛ, около 9 и около 20 МЕ/дЛ или около 10 и около 20 МЕ/дЛ. Лечение или проведение лечения заболевания или болезенного состояния также может включать поддержание активности Ф-УШ у пациента на уровне, сравнимом по меньшей мере приблизительно с 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20% активности Ф-УШ у пациента, не страдающего гемофилией. Минимальный уровень, необходимый для проведения лечения может быть определен при помощи одного или более известных способов и может быть подобран (увеличен или уменьшен) для каждого отдельного пациента.

Химерные белки.

Настоящее изобретение относится к продлению времени полужизни белка фактора УШ путем предотвращения или подавления ίη νίνο связывания фактора, ограничивающего время полужизни Ф-УШ (например, эндогенного ФВ) с белком Ф-УШ. Эндогенный ФВ связывает от около 95 до около 98% Ф- 20 028309

VIII в нековалентные комплексы. Известно, что связывание эндогенного ФВ с белком Ф-^П защищает Ф-^И разными способами. Например, полноразмерный ФВ (в виде мультимера размером в около 250 кДа) может защитить Ф-^П от протеазного расщепления и активации Ф-^П, стабилизировать тяжелую цепь и/или легкую цепь Ф-^П и предотвратить выведение Ф-^П фагоцитарными рецепторами. При этом в то же время эндогенный ФВ ограничивает время полужизни Ф-^П, путем предотвращения пиноцитоза и путем выделения комплекса Ф-ЩП-ФВ из системы в процессе очищения ФВ. Считается, как показано в примерах, что эндогенный ФВ является ограничивающим время полужизни фактором, который препятствует продлению времени полужизни белка Ф-^П, слитого с компонентом, продлевающим время полужизни, более чем приблизительно в два раза по отношению к Ф-^П дикого типа. Следовательно, в настоящем изобретение предотвращается или подавляется взаимодействие между эндогенным ФВ и белком Ф-^П при помощи дополнительного компонента, и тем самым предотвращается выведение белка Ф-^П в процессе очищения ФВ и/или индукция пиноцитоза. В одном варианте реализации изобретения дополнительный компонент способен предотвращать или подавлять связывание белка ФVIII с эндогенным ФВ и обладает по меньшей мере одним ФВ-подобным Ф-^П-защитным свойством. Вдобавок дополнительный компонент снижает выведение Ф-^П из системы, предотвращая или подавляя взаимодействие с эндогенным ФВ. Дополнительные компоненты, являющиеся объектами настоящего изобретения, связываются или ассоциируют с (например, путем нековалентного связывания) белком Ф-^П и/или физически или химически блокируют ФВ-связывающий участок белка Ф-^П. Таким образом, белок Ф-^П, связанный с дополнительным компонентом, выводится из кровообращения клиренсрецепторами ФВ более медленно по сравнению с Ф-^П дикого типа или несвязанным с дополнительным компонентом Ф-^П.

Примеры дополнительных компонентов, являющихся объектами настоящего изобретения, включают, например, полипептиды либо химические или физические модификации, добавления, делеции или вариации белка Ф-^П. Дополнительный компонент, применяемый в настоящем изобретении, может содержать полипептид, неполипептидный компонент или оба эти компонента. Неограничивающие примеры полипептида, применяемого в качестве дополнительного компонента, включают, например, описанный в данном тексте фрагмент ФВ, константную область иммуноглобулина или ее часть, трансферрин или его фрагмент, альбумин или его фрагмент, альбумин-связывающее вещество, последовательность НАР, последовательность РАЗ, или любые комбинации этих компонентов. Неограничивающие примеры неполипептидного компонента включают полиэтиленгликоль (ПЭГ), полисиаловую кислоту, гидроксиэтиловый крахмал (ГЭК), их производные или любую комбинацию этих компонентов. Другие подобные компоненты, применяемые в настоящем изобретении, известны в данной области техники.

В одном варианте реализации изобретения дополнительный компонент соединен (или связан) с белком Ф-ЩП ковалентной или нековалентной связью. При этом, в некоторых случаях, физическое блокирование или химическая связь (например, нековалентное связывание) между дополнительным компонентом и белком Ф-^П могут быть недостаточно сильными для того, чтобы обеспечить существование устойчивого комплекса, содержащего белок Ф-^П и дополнительный компонент, в присутствии эндогенного ФВ. Например, фрагмент ФВ, образующий нековалентную связь с белком Ф-^П без каких-либо дополнительных соединений, может легко быть отделен ίη νίνο от белка Ф-^П в присутствии эндогенного ФВ, при этом фрагмент ФВ (например, рекомбинантного ФВ, т.е. рФВ) замещается эндогенным ФВ. Следовательно, нековалентно связанный с эндогенным ФВ белок Ф-^П будет подвержен процессу очистку выведения ФВ и будет выведен из системы. С целью предотвращения отделения дополнительного компонента от белка Ф-^П в некоторых вариантах реализации изобретения связь между белком ФVIII и дополнительным компонентом является ковалентной связью, например пептидной связью, одной или более аминокислотами либо дисульфидной связью. В определенных вариантах реализации изобретения соединение (т.е. связь) между дополнительным компонентом и белком Ф-^П является пептидной связью или линкером между белком Ф-^П и дополнительным компонентом (линкер Ф^Ш/ДК) Неограничивающие примеры линкеров описаны в другом месте данного текста. В некоторых вариантах реализации изобретения дополнительный компонент является полипептидом, содержащим, состоящим преимущественно из или состоящим по меньшей мере из 10, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2500, 3000 или 4000 аминокислот. В других вариантах реализации изобретения дополнительный компонент является полипептидом, содержащим, состоящим преимущественно из или состоящим из от около 100 до около 200 аминокислот, от около 200 до около 300 аминокислот, от около 300 до около 400 аминокислот, от около 400 до около 500 аминокислот, от около 500 до около 600 аминокислот, от около 600 до около 700 аминокислот, от около 700 до около 800 аминокислот, от около 800 до около 900 аминокислот или от около 900 до около 1000 аминокислот. В некоторых вариантах реализации изобретения дополнительный компонент, ковалентно связанный с белком Ф-^И, является фрагментом ФВ, описанным в другом месте данного текста.

В определенных вариантах реализации изобретения дополнительный компонент химически (например, нековалентно) связывается с или физически блокирует один или более ФВ-связывающих участков белка Ф-^Н ФВ-связывающий участок белка Ф-ЩП расположен в пределах домена А3 или домена С2 белка Ф-^Н В других вариантах реализации изобретения ФВ-связывающий участок белка Ф-^П

- 21 028309 расположен в пределах домена А3 и домена С2. Например, ФВ-связывающий участок белка Ф-УШ может соответствовать аминокислотам от 1669 до 1689 и/или от 2303 до 2332 из §ЕЦ ГО N0: 16 [полноразмерный зрелый Ф-УШ].

В других вариантах реализации химерный белок, являющийся объектом настоящего изобретения, содержит белок Ф-УШ, связанный с дополнительным компонентом, при этом дополнительный компонент является молекулой ФВ, например фрагментом ФВ, содержащим домен Ό' и домен Ό3, но не содержащим участок связывания клиренс-рецептора ФВ, и экранирует или защищает ФВ-связывающий участок белка Ф-УШ, тем самым подавляя или предотвращая взаимодействие белка Ф-УШ с эндогенным ФВ. В некоторых вариантах реализации изобретения дополнительный компонент является фрагментом ФВ. Фрагмент ФВ, применяемый в настоящем изобретении, содержит домен Ό' и домен Ό3, обеспечивая белку Ф-УШ одно или более преимуществ ФВ-подобных свойств, но при этом фрагмент ФВ не подвергается процессу выведения ФВ. Белок Ф-УШ и дополнительный компонент могут быть ковалентно связанными посредством линкера (например, линкера Ф-УШ/ДК). В одном варианте реализации изобретения линкер может являться отщепляемым линкером. Неограничивающие примеры линкеров приведены в другом месте данного текста.

В других вариантах реализации химерный белок, являющийся объектом настоящего изобретения, содержит белок Ф-УШ и константную область иммуноглобулина или ее часть (т.е. дополнительный компонент), при этом константная область иммуноглобулина или ее часть экранирует или защищает ФВсвязывающий участок белка Ф-УШ, тем самым подавляя или предотвращая взаимодействие белка Ф-УШ с эндогенным ФВ. В других вариантах реализации изобретения константная область иммуноглобулина или ее часть является Ре-областью.

Один аспект реализации настоящего изобретения относится к химерному или слитому белку либо гибриду, содержащему один или более из описанных в данном тексте фрагментов ФВ, и его применению. Химерный или слитый белок может быть сшит или связан с одним или более гетерологичным компонентом (иногда обозначаемом в данном тексте как Н или Н1). В одном варианте реализации изобретения гетерологичный компонент (Н1) является гетерологичным пептидом или гетерологичным полипептидом, который в естественных условиях не встречается с и/или связан с фрагментом ФВ. В другом варианте реализации изобретения гетерологичный компонент (Н1) является неполипептидным компонентом, например химической модификацией или комбинацией пептида или полипептида и неполипептидного компонента. В некоторых вариантах реализации изобретения фрагменты ФВ связаны или соединены с гетерологичным компонентом (Н1) посредством линкера (также называемым в данном тексте ФВлинкером). В одном варианте реализации изобретения ФВ-линкер является отщепляемым линкером. Неограничивающие примеры линкеров между фрагментом ФВ и гетерологичным компонентом (Н1) раскрыты в другом месте данного текста.

В одном варианте реализации гетерологичный компонент (Н1), применяемый в данном изобретении, улучшает одно или более из фармакокинетических свойств фрагментов ФВ без заметного влияния на биологическую активность или функционирование фрагментов ФВ (например, их связывание или соединение с белком Ф-УШ). В другом варианте реализации изобретения гетерологичный компонент (Н1), связанный с фрагментом ФВ, может продлевать время полужизни фрагментов ФВ. Неограничивающие примеры гетерологичного полипептидного компонента включают константную область иммуноглобулина или ее часть, альбумин или его фрагмент, альбумин-связывающее вещество, последовательность РА§, последовательность НАР, трансферрин или его фрагмент, либо две или более комбинации этих компонентов. Неограничивающие примеры гетерологичного неполипептидного компонента включают полиэтиленгликоль (ПЭГ), полисиаловую кислоту, гидроксиэтиловый крахмал (ГЭК), их производные или любые комбинации этих компонентов.

В некоторых вариантах реализации изобретения гетерологичный компонент (Н1) может применяться для соединения фрагмента ФВ и белка Ф-УШ ковалентной связью. Примеры гетерологичного компонента, который может обеспечить ковалентное связывание, включают, но не ограничиваются этим, константную область иммуноглобулина или ее часть, содержащую шарнирный участок, например Рсобласть или партнера по связыванию РсКи. В отдельном примере белок Ф-УШ связан с первой Рсобластью, а фрагмент ФВ связан со второй Рс-областью, при этом первая Рс-область и вторая Рс-область образуют одну или более дисульфидную связь.

В некоторых вариантах реализации изобретения гетерологичный компонент (иногда обозначаемый в данном тексте как Н или Н1) является константной областью иммуноглобулина или ее частью. Неограничивающие примеры константной области иммуноглобулина или ее части могут быть выбраны из группы, состоящей из домена СН1, домена СН2, домена СН3, домена СН4, шарнирного домена и двух или более комбинаций этих компонентов. В одном варианте реализации изобретения константная область иммуноглобулина или ее часть содержит по меньшей мене один домен СН1, по меньшей мене один домен СН2, по меньшей мене один домен СН3, по меньшей мене один домен СН4 или их функциональные фрагменты. В другом варианте реализации изобретения константная область иммуноглобулина или ее часть содержит по меньшей мене один шарнирный домен или его часть и по меньшей мене один домен СН2 или его часть (например, в ориентации шарнир-СН2). В других вариантах реализации изобрете- 22 028309 ния константная область иммуноглобулина или ее часть содержит по меньшей мене один домен СН2 или его часть и по меньшей мене один домен СН3 или его часть (например, в ориентации СН2-СН3). Примеры комбинаций включают, но не ограничиваются этим, домен СН2, домен СН3 и шарнирный домен, которые также известны как Рс-область (или Рс-домен), например первая Рс-область. В других вариантах реализации изобретения гетерологичный компонент (Н1) связан с фрагментом ФВ посредством линкера. В определенных вариантах реализации изобретения гетерологичный компонент (Н1) является партнером по связыванию РсКл, как описано в другом месте данного текста. В других вариантах реализации изобретения гетерологичный компонент (Н1) является шарнирным участком.

В определенных вариантах реализации изобретения химерный белок дополнительно содержит второй (или дополнительный) гетерологичный компонент (иногда обозначаемый в данном тексте как Н2). Стоит отметить, что первый гетерологичный компонент (Н1) и второй гетерологичный компонент (Н2) могут применяться взаимозаменяемо и быть одинаковыми либо разными. Второй гетерологичный компонент (Н2) может быть связанным с белком Ф-УШ или с любым участком химерного белка пептидной связью, одной или более аминокислотами или посредством линкера (например, линкера Ф-УШ в случае связывания с Ф-УШ). Такие конструкции иногда могут называться гетеродимерами Ф-УШ/ФВ. В одном варианте реализации изобретения гетерологичный компонент (Н2) содержит гетерологичный полипептид. В другом варианте реализации изобретения гетерологичный компонент (Н2) содержит неполипептидный компонент. В других вариантах реализации изобретения гетерологичный компонент (Н2) содержит комбинацию гетерологичного компонента и неполипептидного компонента. Второй гетерологичный компонент (Н2) может являться компонентом, продлевающим время полужизни. Неограничивающие примеры второго гетерологичного полипептидного компонента (Н2) включают константную область иммуноглобулина или ее часть, альбумин или его фрагмент, альбумин-связывающее вещество, последовательность РА8, последовательность НАР, трансферрин или его фрагмент, либо две или более комбинации этих компонентов. Неограничивающие примеры гетерологичного неполипептидного компонента включают полиэтиленгликоль (ПЭГ), полисиаловую кислоту, гидроксиэтиловый крахмал (ГЭК), их производные или любые комбинации этих компонентов. В определенных вариантах реализации изобретения первый гетерологичный компонент (Н1) и второй гетерологичный компонент являются одинаковыми или разными. Каждый или оба компонента - первый гетерологичный компонент (Н1) и второй гетерологичный компонент (Н2) могут обеспечить продление времени полужизни белка Ф-УШ в химерном белке, обеспечить соединение, более сильное, чем нековалентная связь, т. е. одну или более ковалентных связей между белком Ф-УШ и фрагментом ФВ в химерном белке, либо и то и другое. После того как фрагмент ФВ, сшитый или связанный с гетерологичным компонентом (Н1) снимает ограничение по времени полужизни путем предотвращения или подавления взаимодействия между белком Ф-УШ и эндогенным белком ФВ, связанный с гетерологичными компонентами белок Ф-УШ может достичь своего полного потенциала и может иметь время полужизни, более чем 2-кратно превышающее таковое у ФУШ дикого типа.

В определенных вариантах реализации изобретения первый гетерологичный компонент (например, первая Рс-область), связанный с фрагментом ФВ, и второй гетерологичный компонент (например, вторая Рс-область), связанный с белком Ф-УШ, соединены друг с другом таким образом, что это соединение препятствует замещению фрагмента ФВ эндогенным ФВ ίη νίνο. В одном варианте реализации изобретения второй гетерологичный компонент является второй Рс-областью, при этом вторая Рс-область связана или соединена с первым гетерологичным компонентом, например, первой Рс-областью, ковалентной связью, например дисульфидной связью, пептидной связью или посредством линкера (одной или более аминокислотами). Например, второй гетерологичный компонент (например, вторая Рс-область), связанный с белком Ф-УШ со стороны одного конца, может быть дополнительно связанным с первым гетерологичным компонентом (например, первой Рс-областью), связанным с фрагментом ФВ посредством линкера (например, оц-Рс линкером), или соединенным с первым гетерологичным компонентом ковалентной или нековалентной связью. В другом варианте реализации изобретения второй гетерологичный компонент (например, вторая Рс-область) связан с фрагментом ФВ, который уже связан с первым гетерологичным компонентом. В некоторых вариантах реализации изобретения химерный белок содержит первую полипептидную цепь, содержащую фрагмент ФВ и первый гетерологичный компонент, и вторую полипептидную цепь, содержащую белок Ф-УШ и второй гетерологичный компонент, при этом первая полипептидная цепь и вторая полипептидная цепь соединены, причем соединение между первой полипептидной цепью, содержащей первый гетерологичный компонент, и второй полипептидной цепью, содержащей второй гетерологичный компонент, является ковалентной связью, тем самым создавая возможность фрагменту ФВ и белку Ф-УШ поддерживать взаимодействие друг с другом. В то же время эндогенный ФВ, который может образовывать нековалентную связь с белком Ф-УШ, не может заместить ковалентно связанную полипептидную цепь, содержащую фрагмент ФВ.

Линкер между первым гетерологичным компонентом (Н1) и фрагментом ФВ (например, ФВлинкер) может являться отщепляемым линкером, например тромбин-отщепляемым линкером. Отщепляемые линкеры могут отщепляться протеазой, выбранной из группы, состоящей из фактора Х1а, фактора Х11а, калликреина, фактора У11а, фактора 1Ха, фактора Ха, фактора 11а (тромбина), эластазы-2, гран- 23 028309 зима В, ВГТ, энтерокиназы, протеазы 3С, сортазы А, ММП-12, ММП-13, ММП-17 и ММП-20 и их комбинаций. Эти отщепляемые линкеры обеспечивают возможность отщепления и отделения фрагмента ФВ от белка Ф-νΙΙΙ после активации каскада реакций свертывания, что приводит к получению белка Ф-νΊΙΙ с полным потенциалом действия.

В других вариантах реализации изобретения химерный белок получают в виде одиночной полипептидной цепи, содержащей фрагмент ФВ, отщепляемый линкер, первый гетерологичный компонент (Н1), процессируемый линкер, белок Ф-νΙΙΙ и второй гетерологичный компонент (Н2) в любом порядке. После синтеза процессируемый линкер может перед секрецией отщепляться внутриклеточным протеазным ферментом, образуя, таким образом, две полипептидные цепи, как описано выше. В случае конструкции, содержащей одиночную цепь, перед секрецией второй гетерологичный компонент (например, вторая Рсобласть) может связываться с фрагментом ФВ посредством процессируемого линкера. В определенных других вариантах реализации изобретения один или более линкеров могут содержать один или более сайтов расщепления.

В некоторых вариантах реализации химерный белок, являющийся объектом данного изобретения, дополнительно содержит третий гетерологичный компонент (иногда обозначаемый в данном тексте как НЗ). Третий гетерологичный компонент (НЗ) может продлевать время полужизни. Гетерологичный компонент (НЗ) может содержать гетерологичный полипептид, неполипептидный компонент либо оба эти компонента. Неограничивающие примеры третьего гетерологичного компонента (Н3) включают константную область иммуноглобулина или ее часть, альбумин или его фрагмент, альбумин-связывающее вещество, последовательность РА§, последовательность НАР, трансферрин или его фрагмент, любые производные или варианты, либо две или более комбинации этих компонентов. Неограничивающие примеры неполипептидного компонента включают полиэтиленгликоль (ПЭГ), полисиаловую кислоту, гидроксиэтиловый крахмал (ГЭК), их производное или любые комбинации этих компонентов. Первый гетерологичный компонент (Н1), связанный с фрагментом ФВ, второй гетерологичный компонент (Н2), связанный с белком Ф-νΐΙΙ, и третий гетерологичный компонент (НЗ) могут быть одинаковыми либо разными. В одном варианте реализации изобретения первый гетерологичный компонент (Н1) идентичен второму гетерологичному компоненту (Н2), но отличается от третьего гетерологичного компонента (НЗ). В другом варианте реализации изобретения третий гетерологичный компонент (НЗ) сшит или связан с белком Ф-νΐΙΙ или фрагментом ФВ химерного белка. В некоторых вариантах реализации третий гетерологичный компонент вставлен в один или более доменов белка Ф-νΐΙΙ или между двумя доменами белка Ф-νΐΙΙ.

В одном варианте реализации изобретения химерный белок содержит первую полипептидную цепь и вторую полипептидную цепь, при этом первая цепь содержит белок Ф-νΙΙΙ, связанный с первым гетерологичным компонентом (Н1), например, первой Рс-областью, посредством произвольного линкера (например, Ф-ШП-линкера), а вторая цепь содержит фрагмент ФВ, связанный со вторым гетерологичным компонентом (Н2), например, второй Рс-областью, посредством произвольного линкера (например, ФВ-линкера). Белок Ф-νΙΙΙ может дополнительно содержать третий гетерологичный компонент (НЗ), например любой продлевающий время полужизни компонент, например альбумин или последовательность РА§, между тяжелой цепью Ф-νΙΙΙ и легкой цепью Ф-νΙΙΙ (т.е. аминокислотный остаток 1648 из 8ЕЭ ГО N0: 16), являясь, таким образом, одноцепочечным белком Ф-νΙΙΙ. В альтернативном варианте белок Ф-νΙΙΙ может являться двухцепочечным белком, т.е. содержащим тяжелую цепь Ф-νΙΙΙ и легкую цепь Ф-νΙΙΙ, которые соединены друг с другом ковалентной или нековалентной связью (например, металлической связью), при этом тяжелая цепь дополнительно связана с третьим гетерологичным компонентом (НЗ), например, неструктурным полипептидом, продлевающим время полужизни, альбумином или его фрагментом или последовательностью РА§. В другом варианте реализации изобретения химерный белок содержит первую полипептидную цепь и вторую полипептидную цепь, при этом первая цепь содержит белок Ф-νΙΙΙ, связанный с первым гетерологичным компонентом (Н1), например, первой Рсобластью, посредством произвольного линкера (например, Ф-ШП-линкера), а вторая цепь содержит фрагмент ФВ, связанный с третьим гетерологичным компонентом (НЗ), например, неструктурным полипептидом, продлевающим время полужизни, альбумином или последовательностью РА§, который связан со вторым гетерологичным компонентом (Н2), например, второй Рс-областью, посредством произвольного линкера. В некоторых вариантах реализации изобретения третий гетерологичный компонент (НЗ) (например, полипептид, продлевающий время полужизни) может быть связан с С-концом или Ν-концом белка Ф-νΙΙΙ или вставлен между двумя доменами белка Ф-νΙΙΙ или между двумя аминокислотами в домене белка Ф-νΙΙΙ.

В других вариантах реализации химерный белок, являющийся объектом данного изобретения, дополнительно содержит четвертый гетерологичный компонент (иногда обозначаемый в данном тексте как Н4) и/или пятый гетерологичный компонент (иногда обозначаемый в данном тексте как Н5). Четвертый и пятый гетерологичные компоненты также можгут продлевать время полужизни. Четвертый гетерологичный компонент и/или пятый гетерологичный компонент могут быть одинаковыми или разными с третьим гетерологичным компонентом. Гетерологичный компонент может содержать гетерологичный полипептид, неполипептидный компонент либо комбинациию этих компонента. Неограничивающие

- 24 028309 примеры четвертого или пятого гетерологичного компонента включают константную область иммуноглобулина или ее часть, альбумин или его фрагмент, альбумин-связывающее вещество, последовательность РАЗ, последовательность НАР, трансферрин или его фрагмент, любые производные или варианты, либо две или более комбинации этих компонентов. Неограничивающие примеры неполипептидного компонента включают полиэтиленгликоль (ПЭГ), полисиаловую кислоту, гидроксиэтиловый крахмал (ГЭК), их производное или любые комбинации этих компонентов. Первый гетерологичный компонент, второй гетерологичный компонент, третий гетерологичный компонент, четвертый гетерологичный компонент и пятый гетерологичный компонент могут быть одинаковыми либо разными. В некоторых вариантах реализации изобретения четвертый гетерологичный компонент (например, полипептид, продлевающий время полужизни) может быть связан с С-концом или Ν-концом белка Ф-νΙΙΙ или вставлен между двумя доменами белка Ф-νΙΙΙ или между двумя аминокислотами в домене белка Ф-νΙΙΙ. В других вариантах реализации изобретения пятый гетерологичный компонент (например, полипептид, продлевающий время полужизни) также может быть связан с С-концом или Ν-концом белка Ф-νΙΙΙ или вставлен между двумя доменами белка Ф-νΙΙΙ или между двумя аминокислотами в домене белка Ф-νΙΙΙ.

В определенных вариантах реализации изобретения химерный белок содержит белок Ф-νΙΙΙ, фрагмент ФВ, первый гетерологичный компонент, второй гетерологичный компонент, третий гетерологичный компонент, четвертый гетерологичный компонент и пятый гетерологичный компонент, при этом первый гетерологичный компонент и второй гетерологичный компонент образуют связь (например, ковалентную связь) между цепью, содержащей белок Ф-νΙΙΙ, и цепью, содержащей фрагментов, а третий гетерологичный компонент, четвертый гетерологичный компонент и пятый гетерологичный компонент являются продлевающими время полужизни компонентами, и при этом связь между цепью, содержащей белок Ф-νΙΙΙ, и цепью, содержащей фрагментов, является более сильной, чем нековалентное взаимодействие между Ф-νΙΙΙ и фрагментом ФВ, и тем самым предотвращается связывание эндогенного ФВ с белком Ф-νΙΙΙ ίη νίνο, ίη νίίΓΟ или ех νίνο.

В других вариантах реализации изобретения химерный белок содержит белок Ф-νΙΙΙ, фрагмент ФВ, первый гетерологичный компонент, второй гетерологичный компонент, третий гетерологичный компонент, четвертый гетерологичный компонент, пятый гетерологичный компонент и шестой гетерологичный компонент (иногда обозначаемый в данном тексте как Н6), при этом первый гетерологичный компонент и второй гетерологичный компонент образуют связь между цепью, содержащей белок Ф-νΙΙΙ, и цепью, содержащей фрагментов, а третий гетерологичный компонент, четвертый гетерологичный компонент, пятый гетерологичный компонент и шестой гетерологичный компонент являются продлевающими время полужизни компонентами, и при этом связь между цепью, содержащей белок Ф-νΙΙΙ, и цепью, содержащей фрагментов, является более сильной, чем взаимодействие между Ф-νΙΙΙ и фрагментом ФВ, и тем самым предотвращается связывание эндогенного ФВ с белком Ф-νΙΙΙ ίη νίνο, ίη νίίΓο или ех νίνο.

В некоторых вариантах реализации изобретения химерный белок содержит формулу, выбранную из группы, состоящей из:

(аа) У-Ь1-Н1-Ь2-Н2, (ЬЬ) Н2-Ь2-Н1-Ь1-У, (сс) Н1-Ы-У-Ь2-Н2, и (άά) Н2-Ь2-У-Ы-Н1, где ν содержит описанный в данном тексте фрагмент ФВ; каждый из Ы или Ь2 является произвольным линкером; и Н1 содержит первый гетерологичный компонент; и

Н2 содержит произвольный второй гетерологичный компонент. Первый гетерологичный компонент и второй гетерологичный компонент либо оба могут являться компонентом, продлевающим время полужизни. В одном варианте реализации изобретения Н1 содержит полипептид, неполипептидный компонент либо оба эти компонента. Полипептид, применяемый в качестве Н1, может содержать константную область иммуноглобулина или ее часть, альбумин или его фрагмент, альбумин-связывающее вещество, последовательность РАЗ, последовательность НАР, любые производные или варианты, либо любые комбинации этих компонентов. Неполипептидный компонент может содержать полиэтиленгликоль (ПЭГ), полисиаловую кислоту и гидроксиэтиловый крахмал (ГЭК), их производное или вариант или любые комбинации этих компонентов. В другом варианте реализации изобретения Н2 содержит полипептид, неполипептидный компонент либо оба эти компонента. Полипептид, применяемый в качестве Н2, может содержать константную область иммуноглобулина или ее часть, альбумин или его фрагмент, альбуминсвязывающее вещество, последовательность РАЗ, последовательность НАР, любые производные или варианты, либо любые комбинации этих компонентов. Неполипептидный компонент может содержать полиэтиленгликоль (ПЭГ), полисиаловую кислоту, гидроксиэтиловый крахмал (ГЭК), их производное или вариант или любые комбинации этих компонентов. В определенных вариантах реализации изобретения линкер между Н1 и Н2 в формулах (аа) и (бб) является процессируемым линкером. В других вари- 25 028309 антах реализации изобретения линкер между фрагментом ФВ и Н1 в формулах (аа) и (бб) является отщепляемым линкером, например тромбин-отщепляемым линкером, который может отщепляться тромбином.

Ориентация приведенных в данном тексте формул полипептидов идет от Ν-конца (слева) до Сконца (справа). Например, формула Н-Ь^ означает формулу NН2-Н-^-V-СООН. В одном варианте реализации изобретения описанные в данном тексте формулы могут содержать дополнительные последовательности между двумя компонентами. Например, формула V-^1-Н1-^2-Н2 может дополнительно содержать последовательностина Ν-конце V, между V и Ь1, между Ь1 и Н1, между Н1 или Ь2, между Ь2 или Н2, или на С-конце Н2, если не указано иное. В другом варианте реализации изобретения дефис (-) указывает на наличие пептидной связи либо одной или более аминокислот.

В конкретных вариантах реализации изобретения химерный белок содержит, состоит преимущественно из или состоит из одной или более формул, выбранных из группы, состоящей из (а1) V-Н, (а2) НV, (а3) V-^-Н, (а4) Н-Ь^, (а5) V-^1-Н1-Н2, (а6) Н2-Н1-^1-V, (а7) V-^1-Н1:Н2, (а8) Н2:Н1-^1-V, (а9) VН1:Н2, (б1) Н2:Н1-¥, (б2) V-^1-Н1-^2-Н2, (б3) Н2-^2-Н1-^1-V, (б4) Н1-V-Н2, (б5) Н1-^1-V-^2-Н2 и (б6) ^^2^^1-41, где V один или более из описанных в данном тексте фрагментов ФВ, Ь, Ь1 или Ь2 содержит линкер, Н или Н1 содержит первый гетерологичный компонент. В одном варианте реализации изобретения первый гетерологичный компонент (Н1) может являться полипептидом, неполипептидным компонентом либо и тем и другим. Гетерологичный полипептидный компонент может содержать константную область иммуноглобулина или ее часть, альбумин или его фрагмент, альбумин-связывающее вещество, последовательность РАЗ, последовательность НАР или любые комбинации этих компонентов. Неограничивающие примеры неполипептидного компонента, применяемого в качестве Н1, включают полиэтиленгликоль (ПЭГ), полисиаловую кислоту, гидроксиэтиловый крахмал (ГЭК), их производное или любые комбинации этих компонентов. В другом варианте реализации изобретения Н2 содержит второй гетерологичный компонент. Второй гетерологичный компонент может являться полипептидом, неполипептидным компонентом либо и тем и другим. Гетерологичный полипептидный компонент может содержать константную область иммуноглобулина или ее часть, альбумин или его фрагмент, альбуминсвязывающее вещество, последовательность РАЗ, последовательность НАР или любые комбинации этих компонентов. Неограничивающие примеры неполипептидного компонента, применяемого в качестве Н1, включают полиэтиленгликоль (ПЭГ), полисиаловую кислоту, гидроксиэтиловый крахмал (ГЭК), их производное или любые комбинации этих компонентов. В определенных вариантах реализации изобретения линкер между первым гетерологичным компонентом и вторым гетерологичным компонентом является процессируемым линкером. В других вариантах реализации изобретения линкер между фрагментом ФВ и первым гетерологичным компонентом или вторым гетерологичным компонентом является отщепляемым линкером, который содержит один или более сайтов расщепления, например тромбинотщепляемым линкером.

Химерный белок, являющийся объектом настоящего изобретения, содержит формулу, выбранную из группы, состоящей из (аа), (бб), (вв), (гг), (а1), (а2), (а3), (а4), (а5), (а6), (а7), (а8), (а9), (б1), (б2), (б3), (б4), (б5) и (б6), и белок Ф-’УШ, который ковалентно связан или ковалентно соединен с фрагментом ФВ, первым гетерологичным компонентом (например, первой Рс-областью) или вторым гетерологичным компонентом (например, второй Рс-областью) из формулы. В одном варианте реализации изобретения белок Ф-'УШ связан или соединен с фрагментом ФВ ковалентной или нековалентной связью либо посредством линкера. В другом варианте реализации изобретениям белок Ф-'УШ может быть связан с первым гетерологичным компонентом или вторым гетерологичным компонентом ковалентной или нековалентной связью либо посредством линкера.

В одном варианте реализации химерный белок, являющийся объектом настоящего изобретения, содержит описанный в данном тексте фрагмент ФВ, ковалентно связанный или ковалентно соединенный с белком Ф-^И. Например, химерный белок может содержать фрагмент ФВ и белок Ф^Ш, при этом фрагмент ФВ и белок Ф-'УШ связаны ковалентной непептидной связью, пептидной связью, нековалентной связью или посредством линкера, например отщепляемого линкера. В конкретном варианте реализации изобретения фрагмент ФВ и белок Ф-'УШ связаны или взаимодействуют друг с другом посредством одной или более дисульфидных связей. В другом конкретном варианте реализации изобретения фрагмент ФВ связан или взаимодействует с белком Ф-'УШ в области домена А3 Ф-'УШ, домена С2 Ф-'УШ или обоих - домена А3 и домена С2 Ф^Ш - посредством нековалентной связи. В другом варианте реализации изобретения фрагмент ФВ, связанный или взаимодействующий с белком Ф-’УШ, связан или сшит с первым гетерологичным компонентом. В других вариантах реализации изобретения белок Ф-'УШ, связанный или взаимодействующий с фрагментом ФВ, дополнительно связан со вторым гетерологичным компонентом. В некоторых вариантах реализации изобретения фрагмент ФВ, связанный или взаимодействующий с белком Ф-УШ, дополнительно связан с первым гетерологичным компонентом, а белок ФVIII дополнительно связан со вторым гетерологичным компонентом. В определенных вариантах реализации изобретения первая полипептидная цепь, содержащая фрагмент ФВ и первый гетерологичный компонент, и вторая полипептидная цепь, содержащая белок Ф-¥Ш и второй гетерологичный компонент, соединены друг с другом таким образом, что это соединение не дает возможности белку Ф-^И

- 26 028309 взаимодействовать с другими компонентами, например, эндогенным ФВ. В одном варианте реализации изобретения соединение представляет собой ковалентную связь, например дисульфидную связь.

Как фрагмент ФВ, так и белок Ф-УШ могут быть соединены или связаны с первым или вторым гетерологичным компонентом посредством линкера, например отщепляемого линкера, например тромбинотщепляемого линкера. Линкер между фрагментом ФВ и первым гетерологичным компонентом может обозначаться в данном тексте как ФВ-линкер. Линкер между белком Ф-УШ и вторым гетерологичным компонентом может обозначаться в данном тексте как Ф-УШ-линкер. Либо оба компонента - фрагмент ФВ и белок Ф-УШ могут быть соединены или связаны с первым или вторым гетерологичным компонентом посредством линкера, например отщепляемого линкера, например тромбин-отщепляемого линкера. В определенных вариантах реализации изобретения первый гетерологичный компонент, связанный с фрагментом ФВ, содержит полипептидный, неполипептидный компонент либо оба. Неограничивающие примеры первого гетерологичного полипептидного компонента включают константную область иммуноглобулина или ее часть, альбумин или его фрагмент, альбумин-связывающее вещество, последовательность РА8, последовательность НАР, трансферрин или его фрагмент, либо две или более комбинации этих компонентов. Неограничивающие примеры неполипептидного компонента включают полиэтиленгликоль (ПЭГ), полисиаловую кислоту, гидроксиэтиловый крахмал (ГЭК), их производное или вариант, или любые комбинации этих компонентов. В других вариантах реализации изобретения второй гетерологичный компонент, связанный с белком Ф-УШ, содержит полипептидный, неполипептидный компонент либо оба. Неограничивающие примеры второго гетерологичного компонента включают константную область иммуноглобулина или ее часть, альбумин или его фрагмент, альбумин-связывающее вещество, последовательность РА8, последовательность НАР, трансферрин или его фрагмент, либо две или более комбинации этих компонентов. Неограничивающие примеры неполипептидного компонента включают полиэтиленгликоль (ПЭГ), полисиаловую кислоту, гидроксиэтиловый крахмал (ГЭК), их производное или вариант, или любые комбинации этих компонентов. В некоторых вариантах реализации изобретения фрагмент ФВ присоединен к Ф-УШ при помощи опосредованного сортазой ίη νίίτο лигирования белка. В некоторых вариантах реализации изобретения применяется распознающий сортазу мотив.

В одном варианте реализации изобретения первый гетерологичный компонент является константной областью иммуноглобулина или ее частью. В конкретном варианте реализации изобретения первый гетерологичный компонент является первой Рс-областью. В некоторых вариантах реализации изобретения второй гетерологичный компонент является константной областью иммуноглобулина или ее частью. В конкретном варианте реализации изобретения второй гетерологичный компонент является второй Рсобластью. В конкретном варианте реализации изобретения химерный белок содержит описанный в данном тексте фрагмент ФВ и белок Ф-УШ, при этом фрагмент ФВ связан с константной областью иммуноглобулина или ее частью, которая является Рс-областью. В другом варианте реализации изобретения химерный белок содержит описанный в данном тексте фрагмент ФВ и белок Ф-УШ, при этом белок ФУШ связан с константной областью иммуноглобулина или ее частью, которая является Рс-областью. В других вариантах реализации изобретения химерный белок содержит описанный в данном тексте фрагмент ФВ и белок Ф-УШ, при этом фрагмент ФВ связан с первой с константной областью иммуноглобулина, которая является первой Рс-областью, а белок Ф-УШ связан со второй константной областью иммуноглобулина, которая является второй Рс-областью, и при этом фрагмент ФВ и белок Ф-УШ связаны или взаимодействуют друг с другом посредством нековалентной связи, либо первая Рс-область и вторая Рс-область соединены друг с другом посредством ковалентной связи. В других вариантах реализации изобретения фрагмент ФВ, связанный с первым гетерологичным компонентом, дополнительно связан со вторым гетерологичным компонентом, например, второй Рс-областью, посредством линкера, например процессируемого линкера. В одном аспекте реализации фрагмент ФВ связан с первым гетерологичным компонентом посредством линкера, например ФВ-линкера, например отщепляемого линкера. В другом аспекте реализации белок Ф-УШ связан со вторым гетерологичным компонентом посредством линкера, например Ф-УШ-линкера, например отщепляемого линкера. Неограничивающие примеры гетерологичных компонентов раскрыты в другом месте данного текста, например константная область иммуноглобулина или ее часть в параграфах [0165]-[0193], альбумин, его фрагмент или вариант в параграфах [0194]-[0198], последовательность НАР в параграфе [0293], трансферрин, его фрагмент или вариант в параграфах [0204]-[0205], полимер, например полиэтиленгликоль, в параграфах [0206]-[0213], ГЭК в параграфах [0214]-[0219] или последовательности Р8А в параграфе [0220] и РА8 в параграфах [0199][0202].

- 27 028309

В некоторых вариантах реализации химерный белок, являющийся объектом настоящего изобретения, содержит, в значительной степени описывается из или описывается формулой, выбранной из группы, состоящей из:

(а)	У-Ы-Н1-ЬЗ- С-Ь2-Н2,
(Ь)	Н2-Ь2-С- ЬЗ-Ш-Ы-У,
(с)	С-Ь2-Н2- ЬЗ-У-Ы-Н1,
(Ф	Н1-Ы-У- Ь3-Н2-Ь2-С,
(е)	Н1-Ы-У-Ь3-С-Ь2-Н2,
(8)	Н2-Ь2-С- ЬЗ-У-Ы-Н1,
(8)	У-Ы-Н1-Ь3- Н2-Ь2-С,
(8)	С-Ь2-Н2- ЬЗ-НШЛ-У,
0)	Н2-Ь3-Н1-Ы-У-Ь2-С,
(Ϊ)	С-Ь2-У-Ь1-Н1-Ь3-Н2,
(к)	У-Ь2-С-Ь1-Н1-Ь3-Н2, и
О)	Н2-Ь3-Н1-Ь1-С-Ь2-У,

каждый из Г1 или Ь2 является произвольным линкером, например отщепляемым линкером, например тромбин-отщепляемым линкером;

1,3 является произвольным линкером, например оц-Ес линкером, например процессируемым линкером;

каждый из Н1 или Н2 является произвольным гетерологичным компонентом; и

С является белком Ф-У111; и (-) представляет пептидную связь либо одну или более аминокислот.

(ш) У-Ы-Н1: Н2-Ь2-С, (п) У-Ы-Н1:С-Ь2-Н2;

(о) Н1-Ы-У:Н2-Ь2-С;

(р) Н1-Ы-У:С-Ь2-Н2;

(ς) У:С-Ы-Н1:Н2;

(г) У:Н1-Ь1-С:Н2;

(з) Н2:Н1-Ы-С:У, (ί) С:У-Ы-Н1:Н2, и (и) С:Н1-Ы-У:Н2.

(-) представляет пептидную связь либо одну или более аминокислот; и

С является белком Ф-У111; и (:) представляет химическое или физическое соединение между Н1 и Н2.

В одном варианте реализации изобретения один или более гетерологичных компонентов являются соединениями, продлевающими время полужизни. Соединения, продлевающие время полужизни, известны в данной области техники, а неограничивающие примеры таких продлевающих время полужизни соединений включают константную область иммуноглобулина или ее часть, альбумин или его фрагмент, альбумин-связывающее вещество, последовательность РАЗ, последовательность НАР, трансферрин или его фрагмент, производное либо вариант или две или более комбинации этих компонентов. Неполипептидный компонент может содержать полиэтиленгликоль (ПЭГ), полисиаловую кислоту, гидроксиэтиловый крахмал (ГЭК), производное или любые комбинации этих компонентов.

В одном варианте реализации изобретения (:) в формулах от (н) до (х) представляет химическое соединение, например по меньшей мере одну непептидную связь. В определенных вариантах реализации изобретения химическое соединение, т. е. (:), является ковалентной связью. В других вариантах реализации изобретения соединение, т. е. (:), является нековалентным взаимодействием, например ионным взаи- 28 028309 модействием, гидрофобным взаимодействием, гидрофильным взаимодействием, Ван-дер-Ваальсовским взаимодействием, водородной связью. В других вариантах реализации изобретения (:) является непептидной ковалентной связью. В других вариантах реализации изобретения (:) является пептидной связью. В других вариантах реализации изобретения (:) в формулах от (н) до (х) представляет физическое соединение между двумя последовательностями, при этом часть первой последовательности находится в непосредственной близости ко второй последовательности так, что первая последовательность защищает или блокирует часть второй последовательности от взаимодействия с другим компонентом, и, дополнительно к этому, данное физическое соединение поддерживается таким образом, что не дает возможности второй последовательности взаимодействовать с другими компонентами.

Формулы (а)-(х) включены в данный текст в качестве неограничивающих примеров конструкций, являющихся объектами настоящего изобретения. Ориентация формул полипептидов идет от Ν-конца (слева) до С-конца (справа). Например, формула У-Ы-Н1-Ь3-С-Ь2-Н2 означает формулу N^^-0-41Ь3-С-Ь2-Н2-СООН. Дополнительно (:) может являться соединением или взаимодействием между двумя полипептидными цепями посредством ковалентной связи или нековалентной связи между любой частью первой цепи и любой частью второй цепи, если не указано иное. Например, формула У-Н1:Н2-С содержит две полипептидные цепи, первую цепь представляет У-Н1, а вторую цепь представляет С-Н2, при этом У из первой цепи взаимодействует или соединено с С из второй цепи и/или Н1 из первой цепи взаимодействует или соединено с Н2 С из второй цепи. В других некоторых реализации изобретения (:) обозначает ковалентную, непептидную связь или нековалентную связь.

В определенных вариантах реализации изобретения химерный белок содержит, в значительной степени описывается из или описывается формулой, выбранной из группы, состоящей из:

(1)	УС, (2)	Н-У:С ог С:У-Н,
(3)	У:С-Н ог Н-С:У, (4)	У-Н1:Н2-С огН1-У:С-Н2,
(5)	У:С-Н1:Н2 ог Н2:Н1-С:У, (6)	Н2:Н1-У:С огС:У-Н1:Н2,
(Ό	Н-Ь-УС ог С: У-Ь-Н, (8)	У:С-Ь-Н ог Н-Ь-С:У,
(9)	У-СогС-У, (10)	Н-У-С ог С-У-Н,
(П)	У-Н-С ог С-Н-У, (12)	У-С-Н ог Н-С-У,
(13)	У-Н1-С-Н2 ог Н2-С-Н1-У, (14)	Н1-У-С-Н2 ог Н2-С-У-Н1,
(15)	Н1-У-Н2-С ог С-Н2-У-Н1, (16)	У-Н1-Н2-С ог С-Н2-Н1-У,
(17)	У-Ь-С ог С-Ь-У, (18)	Н-Ь-У-С ог С-У-Ь-Н,
(19)	Н-У-Ь-С ог С-Ь-У-Н, (20)	У-Ь-Н-С ог С-Н-Ь-У,
(21)	У-Н-Ь-С ог С-Ь-Н-У, (22)	У-Ь-С-Н ог Н-С-Ь-У,

- 29 028309 (23) У-С-Ь-Н ог Н-Ь-С-У, (24) Н-Ь1-У-Ь2-С ог С-Ь2-У-Ь1-Н, (25) У-Ь-Н1 :Н2-С ог С-Н2:Н1-Ь-У, (26) У-Н1 :Н2-Ь-С ог С-Ь-Н2:Н1-У, (27) У:С-Н1-Н2 ог Н2-Н1-С:У, (28) Н2-Н1-У:С ог С:У-Н1-Н2, (29) У:С-Ь-Н1:Н2 ог Н2:Н1-Ь-С:У, (30) Н2:Н1-Ь-У:С ог С:У-Ь-Н1:Н2, (31) У-Ь1-Н1:Н2-Ь2-С ог Ь-Ь2-Н2:Н1-Ь1-У, (32) У:С-Ь-Н1-Н2 ог Н2-Н1-Ь-С:У, (33) У:С-Н1-Ь-Н2 ог Н2-Ь-Н1-С:У, (34) У:С-Ы-Н1-Ь2-Н2 ог Н2-Ь2-Н1-Ы-С:У, (35) Н2-Н1-У:С ог С:У-Н1-Н2, (36) Н2-Н1-Ь-У:С ог С:У-Ь-Н1-Н2, (37) Н2-Ь-Н1-У:С ог С:У-Н1-Ь-Н2, (38) Н2-Ь2-Н1-Ы-У:С ог С:У-Ы-Н1-Ь2-Н2, (39) У-Ь1 -Н-Ь2-С ог С-Ь2-Н-Ь1 -V, (40) У-Ь 1 -С-Ь2-Н ог Н-Ь2-С-Ь1 -V, (41) У-Ь-Н1-С-Н2 ог Н2-С-Н1-Ь-У, (42) У-Н1-С-Ь-Н2 огН2-Ь-С-Н1-У, (43) У-Н1-Ь-С-Н2 ог Н2-С-Ь-Н1-У, (44) Н1-Ь-У-С-Н2 ог Н2-С-У-Ь-Н1, (45) Н1-У-Ь-С-Н2 огН2-С-Ь-У-Н1, (46) ΗΙ-У-С-Ь-Н ог Н-Ь-С-У-Н1, (47) Н1-Ь-У-Н2-С ог С-Н2-У-Ь-Н1, (48) Н1-У-Ь-Н2-С ог С-Н2-Ь-У-Н1, (49) Н1-У-Н2-Ь-С ог С-Ь-Н2-У-Н1, (50) У-Ь-Н1-Н2-С ог С-Н2-Н1-Ь-У, (51) У-Н1-Ь-Н2-С ог С-Н2-Ь-Н1-У, (52) У-Н1-Н2-Ь-С ог С-Ь-Н2-Н1-У, (53) У-Ы-Н1-Ь2-С-Н2 ог Н2-С-Ь2-Н1-Ы-У, (54) У-Ы-Н1-С-Ь2-Н2 ог Н2-Ь2-С-Н1-Ы-У, (55) У-Ы-Н1-Ь2-С-Ь3-Н2 ог Н2-Ь3-С-Ь2-Н1-Ь1-У, (56) У-Н1-Ы-С-Ь2-Н2 ог Н2-Ь2-С-Ы-Н1-У, (57) Н1-Ы-У-Ь2-С-Н2 ог Н2-С-Ь2-У-Ы-Н1, (58) Н1-Ы-У-С-Ь2-Н2 ог Н2-Ь2-С-У-Ы-Н1, (59) Н1-Ь1-У-Ь2-С-Ь3-Н2 ог Н2-Ь3-С-Ь2-У-Ы-Н1, (60) Н1-У-Ы-С-Ь2-Н2 огН2-Ь2-С-Ы-У-Н1, (61) Н1-Ы-У-Ь2-Н2-С ог С-Н2-Ь2-У-Ы-Н1, (62) Н1-Ы-У-Н2-Ь2-С ог С-Ь2-Н2-У-Ы-Н1, (63) Н1-Ь1-У-Ь2-Н2-Ь3-С ог С-Ь3-Н2-Ь2-У-Ы-Н1, (64) Н1-У-Ы-Н2-Ь2-С ог С-Ь2-Н2-Ы-У-Н1, (65) У-Ы-Н1-Ь2-Н2-С ог С-Н2-Ь2-Н1-Ы-У, (66) У-Ы-Н1-Н2-Ь2-С ог С-Ь2-Н2-Н1-Ы-У, (67) У-Ь1-Н1-Ь2-Н2-Ь3-С ог С-Ь3-Н2-Ь2-Н1-Ь1-У, и (68) У-Н1-Ы-Н2-Ь2-С ог С-Ь2-Н2-Ы-Н1-У,

- 30 028309

У является описанным в данном тексте фрагментом ФВ;

С является белком Ф-УШ;

Н1 или Н2 является гетерологичным компонентом или первым гетерологичным компонентом;

Н2 является вторым гетерологичным компонентом; первый гетерологичный компонент и второй гетерологичный компонент могут быть одинаковыми или разными;

каждый из Ь, Ь1 или Ь2 является произвольным линкером;

(:) представляет химическое или физическое соединение. Линкеры могут быть одинаковыми или разными и каждый может являться отщепляемым линкером, содержащим один или более сайтов расщепления ферментами. Гетерологичные компоненты могут представлять известную в данной области техники технологию и являться полипептидом, неполипептидными компонентами или обоими этими компонентами. Полипептидный компонент может содержать константную область иммуноглобулина или ее часть, альбумин или его фрагмент, альбумин-связывающее вещество, последовательность РАЗ, последовательность НАР, любые их производные либо варианты или любые комбинации этих компонентов (например, Рс-область). Неполипептидный компонент может содержать полиэтиленгликоль (ПЭГ), полисиаловую кислоту, гидроксиэтиловый крахмал (ГЭК), их производное либо вариант или любые комбинации этих компонентов. Каждый из Н, Н1 или Н2 может быть выбран отдельно на основе своих характеристик, и эти компоненты могут все быть одинаковыми или разными. Неограничивающие примеры гетерологичных компонентов раскрыты в другом месте данного текста, например константная область иммуноглобулина или ее часть - в параграфах [0126]-[0153], альбумин или его фрагмент либо вариант - в параграфах [0154]-[0157], полимер, например полиэтиленгликоль, - в параграфах [0166]-[0173], и последовательность РАЗ - в параграфах [0159]-[0162]. Формулы (1)-(68) включены в данный текст в качестве неограничивающих примеров конструкций, являющихся объектами настоящего изобретения.

В одном варианте реализации изобретения (:) представляет химическое соединение, например по меньшей мере одну непептидную связь. В определенных вариантах реализации изобретения химическое соединение, т. е. (:), является ковалентной связью. В других вариантах реализации изобретения соединение, т.е. (:), является нековалентным взаимодействием, например ионным взаимодействием, гидрофобным взаимодействием, гидрофильным взаимодействием, Ван-дер-Ваальсовским взаимодействием, водородной связью. В других вариантах реализации изобретения (:) является непептидной ковалентной связью. В других вариантах реализации изобретения (:) является пептидной связью. В других вариантах реализации изобретения (:) представляет физическое соединение между двумя последовательностями, при этом часть первой последовательности находится в непосредственной близости ко второй последовательности так, что первая последовательность защищает или блокирует часть второй последовательности от взаимодействия с другим компонентом, и, дополнительно к этому, данное физическое соединение поддерживается таким образом, что не дает возможности второй последовательности взаимодействовать с другими компонентами.

В одном варианте реализации изобретения первый гетерологичный компонент (Н или Н1), связанный с фрагментом ФВ в химерном белке, является первой Рс-областью. В другом варианте реализации изобретения второй гетерологичный компонент (или Н2), связанный с белком Ф-УШ в химерном белке, является второй Рс-областью.

В определенных вариантах изобретения химерный белок, являющийся объектом данного изобретения, содержит две полипептидные цепи, с первой цепью, содержащей, состоящей преимущественно из или состоящей из аминокислотной последовательности, кодирующей Ф-УШ (например, одноцепочечный Ф-УШ), и первого гетерологичного компонента (например, первой Рс-области) и второй цепью, содержащей, состоящей преимущественно из или состоящей из аминокислотной последовательности, кодирующей фрагмент ФВ, содержащий домен Ό' и домен Ό3, второго гетерологичного компонента (например, второй Рс-области) и линкера между фрагментом ФВ и вторым Рс-доменом (например, ФВлинкера). Линкер между фрагментом ФВ и вторым Рс-доменом может являться тромбин-отщепляемым линкером. В некоторых вариантах реализации изобретения одноцепочечный белок Ф-УШ содержит третий гетерологичный компонент, например продлевающий время полужизни компонент, который связан с Ν-концом, С-концом или одним или более участками в составе последовательности Ф-УШ.

В других вариантах реализации химерный белок, являющийся объектом данного изобретения, содержит три полипептидные цепи, при этом первая цепь содержит, состоит преимущественно из или состоит из тяжелой цепи Ф-УШ, вторая цепь, содержит, состоит преимущественно из или состоит из легкой цепи Ф-УШ, сшитой с первым гетерологичным компонентом (например, первой Рс-областью), и третья полипептидная цепь содержит, состоит преимущественно из или состоит из фрагмента ФВ, содержащего домен Ό' и домен Ό3, второго гетерологичного компонента (например, второй Рс-области) и линкера. Линкер между фрагментом ФВ и вторым гетерологичным компонентом может являться тромбин-отщепляемым линкером. В некоторых вариантах реализации изобретения тяжелая цепь Ф-УШ связана с третьим гетерологичным компонентом, например продлевающим время полужизни компонентом, который может быть связан с Ν-концом, С-концом или одним или более участками в составе последовательности Ф-УШ.

- 31 028309

В других вариантах реализации химерный белок, являющийся объектом данного изобретения, содержит две полипептидные цепи с первой цепью, содержащей, состоящей преимущественно из или состоящей из тяжелой цепи Ф-УШ, и второй цепью, содержащей, состоящей преимущественно из или состоящей из легкой цепи Ф-УШ, первого гетерологичного компонента (например, первой Рс-области), первого линкера (например, сайта расщепления протеазой, содержащего один или более сайтов внутриклеточного процессинга), фрагмента ФВ, второго линкера (например, тромбин-отщепляемого линкера) и второго гетерологичного компонента (например, второй Рс-области), при этом легкая цепь Ф-УШ связана с первым гетерологичным компонентом (например, первой Рс-областью), который дополнительно связан с фрагментом ФВ посредством первого линкера (например, процессируемого линкера, содержащего сайт расщепления протеазой, содержащего один или более сайтов внутриклеточного процессинга), а фрагмент ФВ связан со второй Рс-областью посредством второго линкера (например, тромбинотщепляемого линкера). В определенных вариантах реализации изобретения первый линкер и второй линкер являются идентичными либо разными.

В определенных вариантах реализации химерный белок, являющийся объектом данного изобретения, содержит одну полипептидную цепь, которая содержит одноцепочечный белок Ф-УШ, первый гетерологичный компонент (например, первую Рс-область), первый линкер (например, тромбинотщепляемый линкер), фрагмент ФВ, второй линкер (например, тромбин-отщепляемый линкер) и второй гетерологичный компонент (например, вторую Рс-область), при этом одноцепочечный белок Ф-УШ связан с первым гетерологичным компонентом, который дополнительно связан с фрагментом ФВ посредством первого линкера, а фрагмент ФВ связан со второй Рс-областью посредством второго линкера. В одном варианте реализации изобретения первый линкер является отщепляемым линкером, содержащим первый сайт расщепления и второй сайт расщепления. В другом варианте реализации изобретения второй линкер является отщепляемым линкером, содержащим один или два сайта расщепления. В конкретном варианте реализации изобретения второй линкер является тромбин-отщепляемым линкером. Линкер, применяемый в данном изобретении, может иметь любую длину, например, по меньшей мере 10, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600 или 700 аминокислот. Например, линкер может состоять из 20, 35, 42, 73 или 98 аминокислот.

В определенных вариантах реализации изобретения фрагмент ФВ напрямую связан с белком Ф-УШ посредством пептидной связи или линкера. В качестве одного из способов связывания фрагмента ФВ и белка Ф-УШ напрямую или посредством линкера может применяться ферментативное лигирование (например, с участием сортазы). Например, сортаза относится к группе прокариотических ферментов, которые модифицируют поверхностные белки путем распознавания и расщепления карбоксил-терминального сортировочного сигнала. Для большинства субстратов ферментов сортазы распознающий сигнал состоит из мотива ЬРХТС (Ьеи-Рго-любая аминокислота-ТЬг-С1у) (§ЕЦ ГО N0: 106), затем идет высокогидрофобная трансмембранная последовательность, затем - кластер из основных остатков, таких как аргинин. Расщепление происходит между ТЬг и С1у с временным присоединением через остаток ТЬг к Су8 остатку активного участка лигационного партнера, за чем следует транспептидация, во время которой белок ковалентно присоединяется к стенке клетки. В некоторых вариантах реализации изобретения лигационный партнер содержит С1у(и).

В одном варианте реализации изобретения фрагмент ФВ, связанный с распознающим сортазу мотивом посредством произвольного линкера, может быть сшит с белком Ф-УШ, связанным сортазой с С1у(и), при этом п может иметь любое численное значение. Лигационная конструкция содержит фрагмент ФВ (Ν-концевая часть конструкции) и белок Ф-УШ (С-концевая часть конструкции), при этом между ними вставлен распознающий сортазу мотив. Пример конструкции показан на фиг. 24(А). Другая лигационная конструкция содержит фрагмент ФВ (Ν-концевая часть конструкции), линкер, распознающий сортазу мотив и белок Ф-УШ (С-концевая часть конструкции) (например, фиг. 24(В)). В другом варианте реализации изобретения белок Ф-УШ, связанный с распознающим сортазу мотивом посредством произвольного линкера, может быть сшит с фрагментом ФВ, связанным сортазой с С1у(и), при этом п может иметь любое численное значение. Полученная лигационная конструкция содержит белок Ф-УШ (Ν-концевая часть конструкции) и фрагмент ФВ (С-концевая часть конструкции), при этом между ними вставлен распознающий сортазу мотив. Пример конструкции показан на фиг. 24(Б). Другая лигационная конструкция содержит белок Ф-УШ (Ν-концевая часть конструкции), линкер, распознающий сортазу мотив и фрагмент ФВ (С-концевая часть конструкции) (например, фиг. 24(Г)). В других вариантах реализации изобретения фрагмент ФВ, связанный с распознающим сортазу мотивом посредством первого произвольного линкера, может быть сшит с гетерологичным компонентом, например, константной областью иммуноглобулина или ее частью, например Рс-областью, связанной с сайтом расщепления тромбином посредством второго произвольного линкера. Полученная конструкция может содержать фрагмент ФВ (Ν-концевая часть), первый линкер, распознающий сортазу мотив, сайт расщепления протеазой, второй произвольный линкер и гетерологичный компонент (например, фиг. 24(Д)). В определенных вариантах реализации изобретения эта полученная конструкция является частью химерного белка, содержащего белок Ф-УШ и второй гетерологичный компонент, например константную область иммуноглобулина или ее часть, например Рс-область. В другом примере химерный белок содержит три полипептидные

- 32 028309 цепи с первой цепью, содержащей фрагмент ФВ, первый линкер, распознающий сортазу мотив, сайт расщепления протеазой, второй произвольный линкер, первый гетерологичный компонент, второй цепью, содержащей легкую цепь белка Ф-УШ и второй гетерологичный компонент, и третьей цепью, содержащей тяжелую цепь белка Ф-УШ.

В других вариантах реализации химерный белок, являющийся объектом данного изобретения, содержащий фрагмент ФВ и белок Ф-УШ, причем фрагмент ФВ и белок Ф-УШ ковалентно соединены друг с другом либо ковалентно связаны друг с другом, обладает меньшей иммуногенностью чем белок Ф-УШ без фрагмента ФВ. Сниженная иммуногенность включает, но не ограничивается этим, более слабый гуморальный иммунный ответ, например более низкий титр нейтрализующих антител, или более слабый клеточно-опосредованный иммунный ответ на Ф-УШ, например меньшую выработку различных цитокинов.

В других вариантах реализации результатом данного изобретения было продление времени полужизни белка Ф-УШ (либо химерного белка) по сравнению с белком Ф-УШ без фрагмента ФВ или Ф-УШ дикого типа. Время полужизни белка Ф-УШ по меньшей мере в 1,5, по меньшей мере в 2, по меньшей мере в 2,5, по меньшей мере в 3, по меньшей мере в 4, по меньшей мере в 5, по меньшей мере в 6, по меньшей мере в 7, по меньшей мере в 8, по меньшей мере в 9, по меньшей мере в 10, по меньшей мере в 11 или по меньшей мере в 12 раз больше, чем время полужизни белка Ф-УШ без фрагмента ФВ. В одном варианте реализации изобретения время полужизни Ф-УШ приблизительно 1,5-20-кратно, приблизительно 1,5-15-кратно или приблизительно 1,5-10 кратно превышает время полужизни Ф-УШ дикого типа. В другом варианте реализации изобретения время полужизни Ф-УШ продлено в от около 2 до около 10 раз, от около 2 до около 9 раз, от около 2 до около 8 раз, от около 2 до около 7 раз, от около 2 до около 6 раз, от около 2 до около 5 раз, от около 2 до около 4 раз, от около 2 до около 3 раз, от около 2,5 до около 10 раз, от около 2,5 до около 9 раз, от около 2,5 до около 8 раз, от около 2,5 до около 7 раз, от около 2,5 до около 6 раз, от около 2,5 до около 5 раз, от около 2,5 до около 4 раз, от около 2,5 до около3 раз, от около 3 до около 10 раз, от около 3 до около 9 раз, от около 3 до около 8 раз, от около 3 до около 7 раз, от около 3 до около 6 раз, от около 3 до около 5 раз, от около 3 до около 4 раз, от около 4 до около 6 раз, от около 5 до около 7 раз или от около 6 до около 8 раз по сравнению с Ф-УШ дикого типа или белком ФУШ без фрагмента ФВ. В других вариантах реализации изобретения время полужизни Ф-УШ составляет по меньшей мере около 17, по меньшей мере около 18, по меньшей мере около 19, по меньшей мере около 20, по меньшей мере около 21, по меньшей мере около 22, по меньшей мере около 23, по меньшей мере около 24, по меньшей мере около 25, по меньшей мере около 26, по меньшей мере около 27, по меньшей мере около 28, по меньшей мере около 29, по меньшей мере около 30, по меньшей мере около 31, по меньшей мере около 32, по меньшей мере около 33, по меньшей мере около 34, по меньшей мере около 35, по меньшей мере около 36, по меньшей мере около 48, по меньшей мере около 60, по меньшей мере около 72, по меньшей мере около 84, по меньшей мере около 96 или по меньшей мере около 108 ч. В других вариантах реализации изобретения время полужизни Ф-УШ составляет от около 15 ч до около двух недель, от около 16 ч до около одной недели, от около 17 ч до около одной недели, от около 18 ч до около одной недели, от около 19 ч до около одной недели, от около 20 ч до около одной недели, от около 21 ч до около одной недели, от около 22 ч до около одной недели, от около 23 ч до около одной недели, от около 24 ч до около одной недели, от около 36 ч до около одной недели, от около 48 ч до около одной недели, от около 60 ч до около одной недели, от около 24 ч до около шести дней, от около 24 ч до около пяти дней, от около 24 ч до около четырех дней, от около 24 ч до около трех дней или от около 24 ч до около двух дней.

В некоторых вариантах реализации изобретения среднее время полужизни Ф-УШ у пациента составляет около 15, около 16, около 17, около 18, около 19, около 20, около 21, около 22, около 23 ч, около 24 ч (1 дня), около 25, около 26, около 27, около 28, около 29, около 30, около 31, около 32, около 33, около 34, около 35, около 36, около 40, около 44 ч, около 48 ч (2 дней), около 54, около 60 ч, около 72 ч (3 дней), около 84 ч, около 96 ч (4 дней), около 108 ч, около 120 ч (5 дней), около 6 дней, около 7 дней (одной недели), около 8, около 9, около 10, около 11, около 12, около 13 или около 14 дней.

В определенных вариантах реализации изобретения время полужизни белка Ф-УШ, ковалентно связанного с фрагментом ФВ, было продлено в случае мышей с двойным Ф-УШ/ФВ генным нокатутом (ДГН) по сравнению с полипептидом, состоящим из Ф-УШ или мономер-димерного гибрида Ф-УШ.

А) Фрагменты фактора Виллебранда (ФВ).

ФВ (также известный как Ф8ФВ) является крупным мультимерным гликопротеином, который находится в плазме крови и постоянно вырабатывается в эндотелии (в тельцах Вейбеля-Палада), мегакариоцитах (α-гранулах тромбоцитов) и субэндотелиальной соединительной ткани. Основной мономер ФВ представляет собой белок из 2813 аминокислот. Каждый мономер содержит определенное количество специфических доменов со специфическими функциями, домены Ό' и Ό3 (которые совместно связываются с фактором УШ), домен А1 (который связывается с тромбоцитарным ОР1Ь-рецептором, гепарином и/или, возможно, коллагеном), домен А3 (который связывается с коллагеном), домен С1 (в котором домен ΚΟΌ связывается с тромбоцитарным интегрином аПЬР3, когда он находится в активированном со- 33 028309 стоянии) и цистеин-узловой домен у С-терминального конце белка (который ФВ делит с тромбоцитарным фактором роста (РООР), трансформирующим фактором роста β (ТОРР) и β человеческим хорионическим гонадотропином фХГЧ)).

Состоящая из 2813 аминокислот последовательность человеческого ФВ представлена в ОепЬапк как

Лссе§§юп КитЬег _ΝΡ_000543.2_. Нуклеотидная последовательность, кодирующая человеческий ФВ, представлена в ОепЬапк как Лссе§§юп ХитЬег ΝΜ 000552.3 . Нуклеотидная последовательность человеческого ФВ обозначена как ВЕС) ΙΌ ΝΟ: 1. δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 2 представляет аминокислотную последовательность, кодируемую δΕΕ) ΙΌ ΝΟ: 1. Каждый из доменов ФВ перечислен в табл. 1.

Таблица 1

Домены ФВ

Аминокислотная последовательность

Сигнальный пептид ФВ (Аминокислоты от 1 до 22 из δΕρίϋΝΟ: 2)

М1РАЕЕАСУЬ ЬАЬАЫЬРСТ ЬС

ОЮ2 участок ФВ (Аминокислоты от 23 до 763 из

8ЕЦПЖО: 2)

Домен ϋ’ ФВ (Аминокислоты от 764 до 866 из 8Е()ПЖО:2)

Домен ЭЗ ФВ (Аминокислоты от 867 до 1240 из

8ЕЦПЖО: 2)

ЗАЕбТКбКЗЗТАКСЗЬЕбЗОЕУЫТЕОбЗМ

УЗЕАбУСЗУЬЬАббССККЗЕЗЫбОЕСЫбККУЗЬЗУУЬбЕЕЕОтЬЕУПб ιοί тут<2ео<2РЛ''змруАзкеьуьЕТЕАеуукьзбЕАУеЕ^гУАК1оезеыг<2Уьь 151 ЗОКУЕЫКТСбЬСбЫЕЬПЕАЕООЕМТСЕбТЬТЗОРУОЕАЫЗИАЬЗЗбЕСЖ: 201 ЕЕАЗРРЗЗЗСЫ1336ЕМСК6ЬНЕСССЬЬКЗТЗУЕАЕСНРЬУОРЕРЕУАЬС 251 ЕКТЬСЕСАееЬЕСАСРАЬЬЕУАРТСА<2ЕеМУЬУеИТОНЗАСЗРУСРАеМЕ 301 УЕССУЗРСАЕТССЗЬНтЕМССЕЕСУОбСЗСРЕбСЬЬОЕбЬСУЕЗТЕСРС 351 УН36ККУРР6ТЗЬЗКОСЫТС1СКЫЗСте1СЗЫЕЕСР6ЕСЬУТ623НЕКЗЕО 401 ЫКУЕТЕ361ССУЫАЕОС2ОНЗЕ31У1ЕТУеСАООЕОАУСТЕЗУТУЕЬР6 451 ЬНЫЗЬУКЬКН6А6УАМ06201СЬРЬЬК60ЬК1СНТУТАЗУЕЬЗУ6Е0ЬСМ 501 отэерерььукьзрууАектсеьсеыуыеыоеоогьтрзеьАЕРРУЕОге 551 ЫАт<ЬН6ОС<2ОЬ<2К<2НЗОРСАЬЫРКМТРГЗЕЕАСАУЬТЗРТГЕАСНКАУЗ 601 РЬРУЬКЪГСКУРУСЗСЗР6КЕСЬС6АЬАЗУАААСА6К6УКУАтеКЕР6КСЕЬ 651 ЫСРК6СУУЬСС6ТРСЫЬТСЕЗЬЗУРОЕЕСМЕАСЬЕ6СЕСРР6ЬУМОЕЕ6О 701 СУРКАССРСУУ06Е1ЕСРЕ01Е30ННТМСУСЕ06ЕМНСТМ36УР63ЬЬР0 751 АУЬЗЗРЬЗНКЗКК763

64 ЗЬЗСКРРМУКЬУСРАРЫЬКАЕСЬЕСТК

ТСОЫУРЬЕСМ

801

851

ЗМССУЗССЬСРРСМУКНЕЫКСУАЬЕКСРСЕНОСКЕУАРСЕТУКТССЫТСУ

СКРККЖГСТР НУСРАТ866 ⁸⁶⁷ С 3 ΤI ОМАН УЬТ ЕРСЬКУЬЕР^ЗЕСОУУЬУОР УССЗ

01 ΝΡΟΤΕΕΙ ЬуСЫКСуууууУ1уЛ<КЕуТ1 ЬУЕССЕ1 БЬЕРСЕУЛуКЕРМКРЕ

951 ТНЕЕУУЕ3 СЕУуууууу^ууууУИРЕНЬЗ I ЗУУЬКдТ УдЕКУССЬССЫЕР

01 С12уурьтззуьуууууууы;еы^^^ зосартккурьрз зρατοηννι

1051 МКОТМУР33 СЫ ЬТуууТОР^ЛЛСЬУР Ρ Ε Р УЬРУСIΥΡΤ С 3 СЕ 31СРСАС Е

1101 СРТ1ААУАНуСАднуууу™1Ж1ТЬСРдЗСЕЕЕ14ЬЕЕЫСУЕСЕ№ЕУЫЗСА

1151 РАСруТСОНРЕуЬАуу\у^ЗУЕССНАНСРРСК1ЬРЕЬЬдТСУРРЕРСРУСЕ

01 УАСЕЕЕАЗСККутуыууууууусуСНСРуУМЬТСЕАСдЕР

1240

Домен А1 ФВ (Аминокислоты от 1241 до 1479 из δΕΟΙϋΝΟ: 2)

1241 ССЬУУРРТРА

1251 РУЗРТТЬУУЕР13ЕРРЬНРЕУСЗКЬЬРЬУЕЬЬРСЗЗКЬЗЕАЕЕЕУЬКАЕУ

01 УРММЕКЬК13<2К1лГУРУАУУЕУН0еЗНАУ1еЬК0КККРЗЕЬКК1АЗ<2УКУА

1351 еЗ<2УАЗТЗЕУЬКУТЬЕ<21ЕЗК1РКРЕАЗК1АЬЬЬМАЗ<2ЕР<2КМЗИ4ЕУРУ

01 У<2еЬККККУ1У1РУе1еРНАЛЬК<21КЫЕК<2АРЕ1\ГКАЕУЬЗЗУ0ЕЬЕ<2<2К

1451 РЕ1УЗУЬСРЬАРЕАРРРТЬРР0МА<2УТУе 1479

1480 РСЬЬСУЗТЬСРККЫЗМУЬРУА

01 ЕУЬЕСЗОК1СЕАОЕ1\ГКЗКЕЕМЕЕУ1<2КМОУС<2О31НУТУЫ2УЗУМУТУЕУ

1551 РЕЗЕА<23КеО1Ы2КУКЕ1Р.У<2еС1\ГКТ1\ГТеЬАЬКУЬЗОНЗЕЬУЗ<2еОКЕ<2А

1600

1601 РЫЬУУМУТеЫРА30Е1ККЬРе01<2УУР1еУСРЫАЛУ<2ЕЬЕК1С1лГРЫАР1Ь

1651 1<2ОЕЕТЬРКЕАРОЬУЫ2КССЗСЕеЫ21РТЬЗРАРОСЗ<2РЬОУ1ЬЬЬОеЗЗ

01 3 ЕРАЗ ΥΕΡΕΜΚ3 ΕΑΚΑΕΙ3 ΚΑΝΙ СРКЬТ<2УЗ УЫ2УСЗI ТТ IРУРШУУРЕ

51 КАНЬЬЗЬУОУМ<2КЕееРЗ<21еОАЬСЕАУКУЬТЗЕМНеАКРеАЗКАУУ1ЬУ

01 ТОУЗУОЗУОАААОААКЗЫРУТУЕР1е1еОКУОАА<2ЬК1ЬАСРАеОЗЫУУК

1851 Ы2К1Е0ЬРТМУТЬеЫЗЕЬНКЬСЗеЕУР1СМ0Е0еЫЕККРС0У1лГТЬР0<2СН

1901 ТУТС<2Р0е<2ТЬЬКЗНКУКС0КСЬКРЗСРЫЗ<23РУКУЕЕТСеСК1лГТСРСУС

- 34 028309

	1951 Те55ТКН1УТГОе<2ЫГКЬТС5С5УУЬГ<21\ГКЕ<2ОЬЕУ1ЬНЫеАС5РеАК<2С 2 001 СМК31ЕУКНЗАЬЗУЕХНЗОМЕУТШГСР1Л/ЗУРУУееЫМЕШГУУСА1МНЕУ 2 051 РЕЫНЬеН1ЕТЕТР<2ЫЫЕЕ<2Ь<2Ь5РКТЕА5КТУеЬСС1СОЕЫеАКОЕМЬРО 2101 еТУТТО№КТЬУСЕ№ТУ<2РРС<2ТС<2Р1ЬЕЕ<2С1Л/РО55НС<2УЬЬЬРЬЕАЕС 2151 НКУЬАРАТЕУА1С<2<2О5СН<2Е<2УСЕУ1А5УАНЬСРТЫСУСУО1лГРТРОЕСА 2201 МЗСРРЗЬУУЫНСЕНССРРНСОСЫУЗЗССОНРЗЕССЕСРРОКУМЬЕСЗСУР 22 51 ЕЕАСТ<2С1еЕОеУ<2Н<2ЕЬЕАт/РОН<2РС<21СТСЬ5СРКШГСТТ<2РСРТАК 2301 АРТСеЬСЕУАРЬР<2ЫАО<2ССРЕУЕСУСОРУ5СОЬРРУРНСЕРСЬ<2РТЬТЫ 2351 РСЕСРРЫЕТСАСРКЕЕСКРУЗРРЗСРРНРЬРТЬРКТОССОЕУЕСАСЫСУЦ 24 01 ЗТУЗСРЬСУЬАЗТАТЫОСССТТТТСЬРРКУСУНРЗТ1 ΥΡνΟφΕΙ/ίΕΕΟΟΟν 2451 СТСТОМЕОАУмСЬРУАОСЗОКРСЕОЗСРЗСЕТУУЬНЕСЕСССРСЬРЗАСЕ 2501 УУТСЗРРСОЗ<2331лГКЗУеЗ<21лГАЗРЕЫРСЫЫЕСУРУКЕЕУЕ1<2<2Р1\ГУЗСР 2 551 ОЬЕУРУСРЗСЕСЬЗСКТЗАССРЗСРСЕРМЕАСМЬЫСТУЮРСКТУМЮУС 2 601 ТТСРСМУ<2УСУ1 ЗСЕКЬЕСРКТТСЫРСРЬСУКЕЕЫЫТСЕСССРСЬРТАСТ 2 651 1<2ЬРее<21МТЬКРОЕТЬ<2ОеСОТНЕСКШГЕРСЕУЕ1лГЕКРУТеСРРЕОЕНК 2701 СЬАЕССК1МК1РСТССОТСЕЕРЕСЫО1ТАРЬ0УУКУСЗСКЗЕУЕУО1НУС 2751 СеКСАЗКАМУ31О1ЫОУ<2О<2СЗССЗРТРТЕРМ<2УАЬНСТЫеЗУУУНЕУЬЫ 2801 АМЕСКСЗРРК СЗК
	Нуклеотидная последовательность
Полноразмерный ФВ (δΕΟΙϋΝΟ: 1)	АТ6АТТССТ6ССА6АТТТ6СС6666Т6СТ6СТТ6СТСТ66СССТСАТТТТ6ССА666АСССТТТ6Т6С А6АА66ААСТС6С66СА66ТСАТССАС66ССС ТАСТАА66АС66ТСТАААС66ССССАС6АС6ААС6А6АСС666А6ТААААС66ТСССТ666АААСАС6 ТСТТССТТ6А6С6СС6ТССА6ТА66Т6СС666 6АТ6СА6ССТТТТС66АА6Т6АСТТС6ТСААСАССТТТ6АТ666А6САТ6ТАСА6СТТТ6С666АТАС Т6СА6ТТАССТССТ66СА66666СТ6ССА6АА СТАС6ТС66АААА6ССТТСАСТ6АА6СА6ТТ6Т66АААСТАСССТС6ТАСАТ6ТС6АААС6СССТАТ6 АС6ТСААТ66А66АСС6ТССССС6АС66ТСТТ АС6СТССТТСТС6АТТАТТ6666АСТТССА6ААТ66САА6А6А6Т6А6ССТСТСС6Т6ТАТСТТ6666 ААТТТТТТСАСАТССАТТТСТТТСТСААТССТ Т6С6А66АА6А6СТААТААССССТ6АА66ТСТТАСС6ТТСТСТСАСТС66А6А66САСАТА6ААСССС Т ТААААААСТ 6ТА6 6ТАААСАААСА6ТТАС СА АСС6Т6АСАСА66666АССААА6А6ТСТССАТ6СССТАТ6ССТССААА666СТ6ТАТСТА6АААСТ6А 66СТ666ТАСТАСАА6СТ6ТСС66Т6А66ССТ Т66САСТ6Т6ТСССССТ66ТТТСТСА6А66ТАС666АТАС66А66ТТТССС6АСАТА6АТСТТТ6АСТ СС6АСССАТ6АТ6ТТС6АСА66ССАСТСС66А АТ66СТТТ6Т66ССА66АТС6АТ66СА6С66СААСТТТСАА6ТССТ6СТ6ТСА6АСА6АТАСТТСААС АА6АССТ6С666СТ6Т6Т66СААСТТТААСАТ ТАСС6АААСАСС66ТССТА6СТАСС6ТС6СС6ТТ6ААА6ТТСА66АС6АСА6ТСТ6ТСТАТ6АА6ТТ6 ТТСТ66АС6ССС6АСАСАСС6ТТ6АААТТ6ТА СТТТ6СТ6АА6АТ6АСТТТАТ6АСССАА6АА666АССТТ6АССТС66АСССТТАТ6АСТТТ6ССААСТ САТ666СТСТ6А6СА6Т66А6ААСА6Т66Т6Т 6АААС6АСТТСТАСТ6АААТАСТ666ТТСТТСССТ66ААСТ66А6ССТ666ААТАСТ6АААС66ТТ6А 6ТАССС6А6АСТС6ТСАССТСТТ6ТСАССАСА САА СССССАТСТССТСССАС СА С С Т САТ С САА САТ СТССТСТССС САААТ С СА САА СССССТСТСС СА ССАСТСССАССТТСТСААСАССАССТСССТСТ СТТСССССТАСАССАСССТССТССАСТАССТТСТАСАССАСАССССТТТАССТСТТСССССАСАСССТ ССТСАСССТССААСАСТТСТССТССАСССАСА ТТССССССТСССАСССТСТССТССАСССССАСССТТТТСТСССССТСТСТСАСААСАСТТТСТСТСАС ТСТССТСССССССТССАСТСССССТССССТСС ААССССССАСССТСССАСАССАССТСССССТСССААААСАСССССАСАСАСТСТТСТСАААСАСАСТС АСАССАСССССССАССТСАСССССАССССАСС ССТССТССАСТАСССССССАССТСТССССАССАСССААТССТССТСТАССССТССАСССАССАСАССС ССТССАССССАСТСТССССТССТССТАТССАС ССАССАССТСАТСССССССТССАСАССССТССТСССТТАССАССАСАТССССАССТСССТССТСТССС ССАССТССССТСАСАССССАССАССАТАССТС ТАТАСССАСТСТСТСТССССТТСССССАССАССТСССАСАСССТССАСАТСААТСАААТСТСТСАССА СССАТСССТССАТСССТССАССТССССТСАСС АТАТСССТСАСАСАСАССССААСССССТССТССАСССТСТСССАССТСТАСТТАСТТТАСАСАСТССТ СССТАСССАССТАСССАССТССАССССАСТСС САСАССТССТССАТСААССССТСТСССТССАСАССАСССАСТСТСССТСССТССАТТССССАААСССС ТАСССТССССССАССТСССТСТСТССАСАСТС СТСТССАССАССТАСТТССССАСАСССАССТСТССТСССТСАСАСССАСССАССТААССССТТТСССС АТСССАССССССТССАСССАСАСАССТСТСАС СААСАССТССАТТТССССАААСАСССАСТССАТСТССАССААТСААСААТСТССАССССАСТСССТТС ТСАСТССТСААТСССАСТТСААСАССТТТСАС СТТСТССАССТАААССССТТТСТСССТСАССТАСАССТССТТАСТТСТТАСАССТССССТСАСССААС АСТСАССАСТТАСССТСААСТТСТССАААСТС

- 35 028309

ААСА6АТАСТТСАССТТСА6Т666АТСТ6ССА6ТАССТ6СТ66ССС666АТТ6ССА66АССАСТССТТ СТССАТТ6ТСАТТ6А6АСТ6ТССА6Т6Т6СТ6 ТТ6ТСТАТ6АА6Т66АА6ТСАСССТА6АС66ТСАТ66АС6АСС666СССТААС66ТССТ66Т6А66АА 6А66ТААСА6ТААСТСТ6АСА66ТСАСАС6АС АТ6АСС6С6АС6СТ6Т6Т6САССС6СТСС6ТСАСС6ТСС66СТ6ССТ66ССТ6САСААСА6ССТТ6Т6 АААСТ6АА6САТ6666СА66А6ТТ6ССАТ66А ТАСТ66С6СТ6С6АСАСАС6Т666С6А66СА6Т66СА66СС6АС66АСС66АС6Т6ТТ6ТС66ААСАС ТТТ6АСТТС6ТАСССС6ТССТСААС66ТАССТ Т66ССА66АСАТССА6СТСССССТССТ6ААА66Т6АССТСС6САТССА6САТАСА6Т6АС66ССТСС6 Т6С6ССТСА6СТАС6666А66АССТ6СА6АТ6 АСС66ТССТ6ТА66ТС6А66666А66АСТТТССАСТ66А66С6ТА66ТС6ТАТ6ТСАСТ6СС66А66С АС6С66А6ТС6АТ6ССССТССТ66АС6ТСТАС 6АСТ666АТ66СС6С666А66СТ6СТ66Т6АА6СТ6ТССССС6ТСТАТ6СС666АА6АССТ6С66ССТ 6Т6Т666ААТТАСААТ66СААССА666С6АС6 СТ6АСССТАСС66С6СССТСС6АС6АССАСТТС6АСА66666СА6АТАС66СССТТСТ66АС6СС66А САСАСССТТААТ6ТТАСС6ТТ66ТССС6СТ6С АСТТССТТАСССССТСТ666СТ66СК6А6СССС666Т66А66АСТТС666ААС6ССТ66АА6СТ6САС 6666АСТ6ССА66АССТ6СА6АА6СА6САСА6 Т6АА66ААТ66666А6АССС6АСС6УСТС6666СССАССТССТ6АА6СССТТ6С66АССТТС6АС6Т6 ССССТ6АС66ТССТ66АС6ТСТТС6ТС6Т6ТС С6АТСССТ6С6СССТСААССС6С6САТ6АССА66ТТСТСС6А66А66С6Т6С6С66ТССТ6АС6ТССС ССАСАТТС6А66ССТ6ССАТС6Т6СС6ТСА6С 6СТА666АС6С666А6ТТ666С6С6ТАСТ66ТССАА6А66СТССТСС6САС6С6ССА66АСТ6СА666 66Т6ТАА6СТСС66АС66ТА6САС66СА6ТС6 СС6СТ6СССТАССТ6С66ААСТ6СС6СТАС6АС6Т6Т6СТССТ6СТС66АС66СС6С6А6Т6ССТ6Т6 С66С6СССТ66ССА6СТАТ6СС6С66ССТ6С6 66С6АС666АТ66АС6ССТТ6АС66С6АТ6СТ6САСАС6А66АС6А6ССТ6СС66С6СТСАС66АСАС 6СС6С666АСС66ТС6АТАС66С6СС66АС6С С6666А6А66С6Т6С6С6ТС6С6Т66С6С6А6ССА66СС6СТ6Т6А6СТ6ААСТ6ССС6ААА66ССА6 6Т6ТАССТ6СА6Т6С666АСССССТ6СААССТ 6ССССТСТСС6САС6С6СА6С6САСС6С6СТС66ТСС66С6АСАСТС6АСТТ6АС666СТТТСС66ТС САСАТ66АС6ТСАС6СССТ66666АС6ТТ66А 6АССТ6СС6СТСТСТСТСТТАССС66АТ6А66ААТ6СААТ6А66ССТ6ССТ66А666СТ6СТТСТ6СС ССССА666СТСТАСАТ66АТ6А6А666666АС СТ66АС66С6А6А6А6А6ААТ666ССТАСТССТТАС6ТТАСТСС66АС66АССТССС6АС6АА6АС66 Т6С6Т6СССАА66СССА6Т6ССССТ6ТТАСТАТ6АС66Т6А6АТСТТССА6ССА6АА6АСАТСТТСТС А6АССАТСАСАССАТ6Т6СТАСТ6Т6А66АТ6 АС6САС666ТТСС666ТСАС6666АСААТ6АТАСТ6ССАСТСТА6АА66ТС66ТСТТСТ6ТА6АА6А6 ТСТ66ТА6Т6Т66ТАСАС6АТ6АСАСТССТАС 6СТТСАТ6САСТ6ТАССАТ6А6Т66А6ТСССС66АА6СТТ6СТ6ССТ6АС6СТ6ТССТСА6СА6ТССС СТ6ТСТСАТС6СА6САААА66А6ССТАТССТ6 С6АА6ТАС6Т6АСАТ66ТАСТСАССТСА6666ССТТС6ААС6АС66АСТ6С6АСА66А6ТС6ТСА666 6АСА6А6ТА6С6ТС6ТТТТССТС66АТА66АС ТСССССССССАТСеТСААССТССТСТСТСССССТСАСААССТССССССТСААССССТССАСТСТАССА АААС6Т6ССА6ААСТАТ6АССТ66А6Т6САТ6 А6СС666666ТАССА6ТТС6АССАСАСА666С6АСТ6ТТ66АС6ССС6АСТТССС6А6СТСАСАТ66Т ТТТ6САС66ТСТТ6АТАСТ66АССТСАС6ТАС А6САТ666СТ6Т6ТСТСТ66СТ6ССТСТ6СССССС666САТ66ТСС66САТ6А6ААСА6АТ6Т6Т66С ССТ66ААА66Т6ТСССТ6СТТССАТСА666СА ТС6ТАССС6АСАСА6А6АСС6АС66А6АС666666ССС6ТАССА66СС6ТАСТСТТ6ТСТАСАСАСС6 66АССТТТССАСА666АС6АА66ТА6ТССС6Т А66А6ТАТ6ССССТ66А6АААСА6Т6АА6АТТ66СТ6СААСАСТТ6Т6ТСТ6ТС666АСС66АА6Т66 ААСТ6САСА6АССАТ6Т6Т6Т6АТ6ССАС6Т6 ТССТСАТАС6666АССТСТТТ6ТСАСТТСТААСС6АС6ТТ6Т6ААСАСА6АСА6СССТ66ССТТСАСС ТТ6АС6Т6ТСТ66ТАСАСАСАСТАС66Т6САС СТССАС6АТС66САТ66СССАСТАССТСАССТТС6АС666СТСАААТАССТ6ТТСССС6666А6Т6СС А6ТАС6ТТСТ66Т6СА66АТТАСТ6С66СА6Т 6А66Т6СТА6СС6ТАСС666Т6АТ66А6Т66АА6СТ6ССС6А6ТТТАТ66АСАА6666ССССТСАС66 ТСАТ6САА6АССАС6ТССТААТ6АС6СС6ТСА ААСССТ666АССТТТС66АТССТА6Т6666ААТАА666АТ6СА6ССАССССТСА6Т6АААТ6САА6АА АС666ТСАССАТССТ66Т66А666А66А6А6А ТТ666АСССТ66ААА6ССТА66АТСАССССТТАТТСССТАС6ТС66Т6666А6ТСАСТТТАС6ТТСТТ Т6СССА6Т66ТА66АССАССТСССТССТСТСТ ТТ6А6СТ6ТТТ6АС6666А66Т6ААТ6Т6АА6А66СССАТ6АА66АТ6А6АСТСАСТТТ6А66Т66Т6 6А6ТСТ66СС66ТАСАТСАТТСТ6СТ6СТ666 ААСТС6АСАААСТ6ССССТССАСТТАСАСТТСТСС666ТАСТТССТАСТСТ6А6Т6АААСТССАССАС СТСА6АСС66ССАТ6ТА6ТАА6АС6АС6АССС СААА6СССТСТСС6Т66ТСТ666АСС6ССАССТ6А6САТСТСС6Т66ТССТ6АА6СА6АСАТАССА66 А6ААА6Т6Т6Т66ССТ6Т6Т666ААТТТТ6АТ 6ТТТС666А6А66САССА6АСССТ66С66Т66АСТС6ТА6А66САССА66АСТТС6ТСТ6ТАТ66ТСС

- 36 028309

ТСТТТСАСАСАСС66АСАСАСССТТААААСТА 66САТССА6ААСААТ6АССТСАССА6СА6СААССТССАА6Т66А66АА6АСССТ6Т66АСТТТ666АА СТССТ66ААА6Т6А6СТС6СА6Т6Т6СТ6АСА СС6ТА66ТСТТ6ТТАСТ66А6Т66ТС6ТС6ТТ66А66ТТСАССТССТТСТ666АСАССТ6АААСССТТ 6А66АССТТТСАСТС6А6С6ТСАСАС6АСТ6Т ССА6АААА6Т6ССТСТ66АСТСАТССССТ6ССАССТ6ССАТААСААСАТСАТ6АА6СА6АС6АТ66Т6 6АТТССТССТ6ТА6ААТССТТАССА6Т6АС6Т 66ТСТТТТСАС66А6АССТ6А6ТА6666АС66Т66АС66ТАТТ6ТТ6ТА6ТАСТТС6ТСТ6СТАССАС СТАА66А66АСАТСТТА66ААТ66ТСАСТ6СА СТТССА66АСТ6СААСАА6СТ66Т66АСССС6А6ССАТАТСТ66АТ6ТСТ6САТТТАС6АСАССТ6СТ ССТ6Т6А6ТССАТТ6666АСТ6С6ССТ6СТТС 6АА66ТССТ6АС6ТТ6ТТС6АССАССТ6666СТС66ТАТА6АССТАСА6АС6ТАААТ6СТ6Т66АС6А 66АСАСТСА66ТААССССТ6АС6С66АС6АА6 Т6С6АСАССАТТ6СТ6ССТАТ6СССАС6Т6Т6Т6СССА6САТ66САА66Т66Т6АССТ66А66АС66С САСАТТ6Т6СССССА6А6СТ6С6А66А6А66А АСССТСТССТААССАСССАТАССССТССАСАСАССССТССТАСССТТССАССАСТССАССТССТСССС 6Т6ТААСАС66666ТСТС6АС6СТССТСТССТ АТСТСС666А6ААС666ТАТ6А6Т6Т6А6Т66С6СТАТААСА6СТ6Т6САССТ6ССТ6ТСАА6ТСАС6 Т6ТСА6САСССТ6А6ССАСТ66ССТ6СССТ6Т ТА6А66СССТСТТ6СССАТАСТСАСАСТСАСС6С6АТАТТ6ТС6АСАС6Т66АС66АСА6ТТСА6Т6С АСА6ТС6Т666АСТС66Т6АСС66АС666АСА 6СА6Т6Т6Т66А666СТ6ССАТ6СССАСТ6СССТССА666ААААТССТ66АТ6А6СТТТТ6СА6АССТ 6С6ТТ6АСССТ6АА6АСТ6ТССА6Т6Т6Т6А6 С6ТСАСАСАССТССС6АС66ТАС666Т6АС666А66ТСССТТТТА66АССТАСТС6ААААС6ТСТ66А С6СААСТ666АСТТСТ6АСА66ТСАСАСАСТС 6Т66СТ66СС66С6ТТТТ6ССТСА66ААА6ААА6ТСАССТТ6ААТСССА6Т6АСССТ6А6САСТ6ССА 6АТТТ6ССАСТ6Т6АТ6ТТ6ТСААССТСАССТ САСС6АСС66СС6СААААС66А6ТССТТТСТТТСА6Т66ААСТТА666ТСАСТ666АСТС6Т6АС66Т СТАААС66Т6АСАСТАСААСА6ТТ66А6Т66А 6Т6АА6ССТ6ССА66А6СС666А66ССТ66Т66Т6ССТСССАСА6АТ6СССС66Т6А6ССССАССАСТ СТ6ТАТ6Т66А66АСАТСТС66ААСС6СС6ТТ САСТТС66АС66ТССТС66СССТСС66АССАССАС66А666Т6ТСТАС6666ССАСТС6666Т66Т6А 6АСАТАСАССТССТ6ТА6А6ССТТ66С66САА 6САС6АТТТСТАСТ6СА6СА66СТАСТ66АССТ66ТСТТССТ6СТ66АТ66СТССТССА66СТ6ТСС6 А66СТ6А6ТТТ6АА6Т6СТ6АА66ССТТТ6Т6 С6Т6СТААА6АТ6АС6ТС6ТСС6АТ6АССТ66АССА6АА66АС6АССТАСС6А66А66ТСС6АСА66С ТСС6АСТСАААСТТСАС6АСТТСС66АААСАС 6Т66АСАТ6АТ66А6С66СТ6С6САТСТСССА6АА6Т666ТСС6С6Т66СС6Т66Т66А6ТАССАС6А С66СТСССАС6ССТАСАТС666СТСАА66АСС САССТ6ТАСТАССТС6СС6АС6С6ТА6А666ТСТТСАСССА66С6САСС66САССАССТСАТ66Т6СТ 6СС6А666Т6С66АТ6ТА6ССС6А6ТТССТ66 66АА6С6АСС6ТСА6А6СТ6С66С6САТТ6ССА6ССА66Т6АА6ТАТ6С666СА6ССА66Т66ССТСС АССА6С6А66ТСТТ6АААТАСАСАСТ6ТТССА ССТТС6СТ66СА6ТСТС6АС6СС6С6ТААС66ТС66ТССАСТТСАТАС6ССС6ТС66ТССАСС66А66 Т66ТС6СТССА6ААСТТТАТ6Т6Т6АСАА66Т ААТСТТСА6САА6АТС6АСС6СССТ6АА6ССТССС6САТС6СССТ6СТССТ6АТ66ССА6ССА66А6С СССААС66АТ6ТССС66ААСТТТ6ТСС6СТАС ТТА6АА6ТС6ТТСТА6СТ66С666АСТТС66А666С6ТА6С666АС6А66АСТАСС66ТС66ТССТС6 666ТТ6ССТАСА666ССТТ6АААСА66С6АТ6 6ТССА666ССТ6АА6АА6АА6АА66ТСАТТ6Т6АТССС66Т666САТТ666ССССАТ6ССААССТСАА 6СА6АТСС6ССТСАТС6А6АА6СА66ССССТ6 СА66ТССС66АСТТСТТСТТСТТССА6ТААСАСТА666ССАССС6ТААССС6666ТАС66ТТ66А6ТТ С6ТСТА66С66А6ТА6СТСТТС6ТСС6666АС А6ААСАА66ССТТС6Т6СТ6А6СА6Т6Т66АТ6А6СТ66А6СА6СААА666АС6А6АТС6ТТА6СТАС СТСТ6Т6АССТТ6ССССТ6АА6ССССТССТСС ТСТТ6ТТСС66АА6САС6АСТС6ТСАСАССТАСТС6АССТС6ТС6ТТТСССТ6СТСТА6СААТС6АТ6 6А6АСАСТ66ААС6666АСТТС6666А66А66 ТАСТСТ6СССССС6АСАТ66САСАА6ТСАСТ6Т666ССС6666СТСТТ66666ТТТС6АСССТ6666С ССАА6А66ААСТССАТ66ТТСТ66АТ6Т66С6 АТ6А6АС666666СТ6ТАСС6Т6ТТСА6Т6АСАССС666СССС6А6ААСССССАААЗСТ666АСССС6 66ТТСТССТТ6А66ТАССАА6АССТАСАСС6С ТТС6ТССТ66АА66АТС66АСААААТТ66Т6АА6СС6АСТТСААСА66А6САА66А6ТТСАТ66А66А 66Т6АТТСА6С66АТ66АТ6Т666ССА66АСА АА6СА66АССТТССТА6ССТ6ТТТТААССАСТТС66СТ6АА6ТТ6ТССТС6ТТССТСАА6ТАССТССТ ССАСТАА6ТС6ССТАССТАСАССС66ТССТ6Т 6САТССАС6ТСАС66Т6СТ6СА6ТАСТССТАСАТ66Т6АСС6Т66А6ТАССССТТСА6С6А66САСА6 ТССААА6666АСАТССТ6СА6С666Т6С6А6А С6ТА66Т6СА6Т6ССАС6АС6ТСАТ6А66АТ6ТАССАСТ66САССТСАТ6666АА6ТС6СТСС6Т6ТС А66ТТТССССТ6ТА66АС6ТС6СССАС6СТСТ 6АТСС6СТАССА666С66СААСА66АССААСАСТ666СТ66СССТ6С66ТАССТСТСТ6АССАСА6СТ ТСТТССТСАСССАСССТСАСССССАССАСССС

- 37 028309

СТА66С6АТ66ТССС6СС6ТТ6ТССТ66ТТ6Т6АССС6АСС666АС6ССАТ66А6А6АСТ66Т6ТС6А А6ААССА6ТС66ТСССАСТ66СССТС6ТСС6С СССААССТ66ТСТАСАТ66ТСАСС66АААТССТ6ССТСТ6АТ6А6АТСАА6А66СТ6ССТ66А6АСАТ ССА66Т66Т6СССАТТ66А6Т666СССТААТ6 666ТТ66АССА6АТ6ТАССА6Т66ССТТТА66АС66А6АСТАСТСТАЕТТСТСС6АС66АССТСТ6ТА 66ТССАССАС666ТААССТСАССС666АТТАС ССААС6Т6СА66А6СТ66А6А66АТТ66СТ66СССААТ6ССССТАТССТСАТССА66АСТТТ6А6АС6 СТССССС6А6А66СТССТ6АССТ66Т6СТ6СА 66ТТ6САС6ТССТС6АССТСТССТААСС6АСС666ТТАС6666АТА6СА6ТА66ТССТ6АААСТСТ6С 6А66666СТСТСС6А66АСТ66АССАС6АС6Т 6А66Т6СТ6СТСС66А6А6666СТ6СА6АТССССАСССТСТССССТ6САССТ6АСТ6СА6ССА6СССС Т66АС6Т6АТССТТСТССТ66АТ66СТССТСС СТССАС6АС6А66ССТСТСССС6АС6ТСТА6666Т666А6А6666АССТ66АСТ6АС6ТС66ТС6666 АССТ6САСТА66АА6А66АССТАСС6А66А66 АСТТТСССАССТТСТТАТТТТСАТСАААТСААСАСТТТССССААСССТТТСАТТТСААААСССААТАТ А666ССТС6ТСТСАСТСА66Т6ТСА6Т6СТ6С ТСААА666ТС6АА6ААТААААСТАСТТТАСТТСТСААА6С66ТТСС6ААА6ТААА6ТТТТС66ТТАТА ТССС66А6СА6А6Т6А6ТССАСА6ТСАС6АС6 А6ТАТ66АА6САТСАССАССАТТ6АС6Т6ССАТ66ААС6Т66ТССС6ЕА6ААА6СССАТТТ6СТ6А6С СТТ6Т66АС6ТСАТ6СА6С666А666А66ССС ТСАТАССТТС6ТА6Т66Т66ТААСТ6САС66ТАССТТ6САССА666ССТСТТТС666ТАААС6АСТС6 6ААСАССТ6СА6ТАС6ТС6СССТСССТСС666 СА6ССАААТС6666АТ6ССТТ666СТТТ6СТ6Т6С6АТАСТТ6АСТТСА6АААТ6САТ66Т6ССА66С С666А6ССТСААА66С66Т66ТСАТССТ66ТС 6ТС66ТТТА6ССССТАС66ААССС6АААС6АСАС6СТАТ6ААСТ6ААЕТСТТТАС6ТАССАС66ТСС6 6СССТС66А6ТТТСС6ССАССА6ТА66АССА6 АС66АС6ТСТСТ6Т66АТТСА6Т66АТ6СА6СА6СТ6АТ6СС6ССА6ЕТССААСА6А6Т6АСА6Т6ТТ СССТАТТ66ААТТ66А6АТС6СТАС6АТ6СА6 Т6ССТ6СА6А6АСАССТАА6ТСАССТАС6ТС6ТС6АСТАС66С66ТССА66ТТ6ТСТСАСТ6ТСАСАА 666АТААССТТААССТСТА6С6АТ6СТАС6ТС СССА6СТАС66АТСТТ66СА66СССА6СА66С6АСТССААС6Т66Т6АА6СТССА6С6ААТС6АА6АС СТСССТАССАТ66ТСАССТТ666СААТТССТТ 666ТС6АТ6ССТА6ААСС6ТСС666ТС6ТСС6СТ6А66ТТ6САССАСТТС6А66ТС6СТТА6СТТСТ6 6А666АТ66ТАССА6Т66ААССС6ТТАА66АА ССТССАСАААСТ6Т6СТСТ66АТТТ6ТТА66АТТТ6САТ66АТ6А66АТ666ААТ6А6АА6А66ССС6 СССАССТСТССАССТТСССАСАССАСТСССАС 66А66Т6ТТТ6АСАС6А6АССТАААСААТССТАААС6ТАССТАСТССТАСССТТАСТСТТСТСС666С СССТ6СА6АССТ66ААС66ТСТ66ТСАС66Т6 АСС6Т6АСТТ6ССА6ССА6АТ66ССА6АССТТ6СТ6АА6А6ТСАТС6С6ТСААСТ6Т6АСС66666СТ 6А66ССТТС6Т6СССТААСА6ССА6ТССССТ6 Т66САСТ6ААС66ТС66ТСТАСС66ТСТ66ААС6АСТТСТСА6ТА6СССА6ТТ6АСАСТ66ССССС6А СТСС66АА6САС666АТТ6ТС66ТСА6666АС ТТААА6Т66АА6А6АССТ6Т66СТ6СС6СТ66АССТ6ССССТ6У6Т6Т6САСА66СА6СТССАСТС66 САСАТС6Т6АССТТТ6АТ666СА6ААТТТСАА ААТТТСАССТТСТСТ66АСАСС6АС66С6АССТ66АС6666АСКСАСАС6Т6ТСС6ТС6А66Т6А6СС 6Т6ТА6САСТ66АААСТАССС6ТСТТААА6ТТ 6СТ6АСТ66СА6СТ6ТТСТТАТ6ТССТАТТТСААААСАА66А6СА66АССТ66А66Т6АТТСТССАТА АТ66Т6ССТ6СА6СССТ66А6САА66СА666С С6АСТ6АСС6ТС6АСАА6ААТАСА66АТААА6ТТТТ6ТТССТС6ТССТ66АССТССАСТАА6А66ТАТ ТАССАС66АС6ТС666АССТС6ТТСС6ТССС6 Т6САТ6АААТССАТС6А66Т6АА6САСА6Т6СССТСТСС6ТС6А65ТССАСА6Т6АСАТ66А66Т6АС 66Т6ААТ666А6АСТ66ТСТСТ6ТТССТТАС6 АС6ТАСТТТА66ТА6СТССАСТТС6Т6ТСАС666А6А66СА6СТСЗАС6Т6ТСАСТ6ТАССТССАСТ6 ССАСТТАСССТСТ6АССА6А6АСАА66ААТ6С Т666Т666ААСАТ66АА6ТСААС6ТТТАТ66Т6ССАТСАТ6САТ6А6СТСА6АТТСААТСАССТТ66Т САСАТСТТ САСАТТ САСТ ССАСААААСААТ 6А АСССАСССТТ6ТАССТТСА6ТТ6САААТАССАС66ТА6ТАС6ТАСТССА6ТСТАА6ТТА6Т66ААССА 6Т6ТА6АА6Т6ТАА6Т6А66Т6ТТТТ6ТТАСТ 6ТТССААСТ6СА6СТСА6ССССАА6АСТТТТ6СТТСААА6АС6ТАТ6СТСТ6Т6Т666АТСТ6Т6АТ6 А6ААС66А6ССААТ6АС±± САТ6СТ6А666АТ САА66ТТ6АС6ТС6А6ТС6666ТТСТ6ААААС6АА6ТТТСТ6САТАССА6АСАСАСССТА6АСАСТАС ТСТТ6ССТС66ТТАСТ6АА6ТАС6АСТСССТА 66САСА6ТСАССАСА6АСТ66ААААСАСТТ6ТТСА66ААТ66АСТ6ТССА6С66ССА666СА6АС6Т6 ССА6СССАТССТ66А66А6СА6Т6ТСТТ6ТСС СС6Т6ТСА6Т66Т6ТСТ6АССТТТТ6Т6ААСАА6ТССТТАССТ6АСАС6ТС6СС66ТССС6ТСТ6САС 66ТС666ТА66АССТССТС6ТСАСА6ААСА66 СС6АСА6СТСССАСТ6ССА66ТССТССТСТТАССАСТ6ТТТ6СТ6ААТ6ССАСАА66ТССТ66СТССА 6ССАСАТТСТАТ6ССАТСТ6ССА6СА66АСА6 66СТ6ТС6А666Т6АС66ТССА66А66А6ААТ66Т6АСАААС6АСТТАС66Т6ТТССА66АСС6А66Т СЕЕТЕТААЕАТАСЕЕТАЕАСЕЕТСЕТССТЕТС ТТ6ССАССА66А6САА6Т6Т6Т6А66Т6АТС6ССТСТТАТ6СССАССТСТ6ТС66АССААС6666ТСТ

- 38 028309

6С6ТТ6АСТ66А66АСАССТ6АТТТСТ6Т6СТ ААС66Т66ТССТС6ТТСАСАСАСТССАСТА6С66А6ААТАС666Т66А6АСА6ССТ66ТТ6ССССА6А С6СААСТ6АССТССТ6Т66АСТААА6АСАС6А АТ6ТСАТ6СССАССАТСТСТ66ТСТАСААССАСТ6Т6А6САТ66СТ6ТСССС66САСТ6Т6АТ66САА С6Т6А6СТССТ6Т6666АССАТСССТСС6АА6 ТАСА6ТАС666Т66ТА6А6АССА6АТ6ТТ66Т6АСАСТС6ТАСС6АСА6666СС6Т6АСАСТАСС6ТТ 6САСТС6А66АСАССССТ66ТА666А66СТТС 6СТ6ТТТСТ6СССТССА6АТААА6ТСАТ6ТТ66АА66СА6СТ6Т6ТСССТ6АА6А66ССТ6САСТСА6 Т6САТТ66Т6А66АТ66А6ТССА6САССА6ТТ С6АСААА6АС666А66ТСТАТТТСА6ТАСААССТТСС6ТС6АСАСА666АСТТСТСС66АС6Т6А6ТС АС6ТААССАСТССТАССТСА66ТС6Т66ТСАА ССТ66АА6ССТ666ТССС66АССАССА6СССТ6ТСА6АТСТ6САСАТ6ССТСА6С666С66АА66ТСА АСТ6САСААС6СА6СССТ6ССССАС66ССААА 66АССТТС66АСССА666ССТ66Т66ТС666АСА6ТСТА6АС6Т6ТАС66А6ТС6ССС6ССТТССА6Т Т6АС6Т6ТТ6С6ТС666АС6666Т6СС66ТТТ 6СТСССАС6Т6Т66ССТ6Т6Т6АА6ТА6ССС6ССТСС6ССА6ААТ6СА6АССА6Т6СТ6СССС6А6ТА Т6А6Т6Т6Т6Т6Т6АСССА6Т6А6СТ6Т6АСС С6А666Т6САСАСС66АСАСАСТТСАТС666С66А66С66ТСТТАС6ТСТ66ТСАС6АС6666СТСАТ АСТСАСАСАСАСАСТ666ТСАСТС6АСАСТ66 Т6СССССА6Т6ССТСАСТ6Т6ААС6Т66ССТССА6СССАСАСТ6АССААСССТ66С6А6Т6СА6АССС ААСТТСАССТ6С6ССТ6СА66АА66А66А6Т6 АС66666ТСАС66А6Т6АСАСТТ6САСС66А66ТС666Т6Т6АСТ66ТТ666АСС6СТСАС6ТСТ666 ТТ6АА6Т66АС6С66АС6ТССТТССТССТСАС САААА6А6Т6ТССССАСССТССТ6СССССС6САСС6ТТТ6СССАСССТТС66АА6АСССА6Т6СТ6Т6 АТ 6А6ТАТ 6А6Т СТ СС СТ ССААСТ СТ СТ СААС СТТТТСТСАСАССССТСССАССАСССССССССТСССАААССССТСССААСССТТСТСССТСАССАСАС ТАСТСАТАСТСАСАСССАССТТСАСАСАСТТС ТССАСАСТСАССТСТССССТТСССТАСТТССССТСААСССССАССААТСАСТСТСССТСТАССАСААС САССТСССТТССССАСААССТСТСТСТССАСС АССТСТСАСТССАСАССССААСССАТСААССССАСТТСССССТССТТАСТСАСАСССАСАТССТСТТС СТССАСССААССССТСТТССАСАСАСАССТСС СААССАССАТСТАСССТСТСССССАСТТСТСССАССАССССТСССАТСТСТССАССТССАСССАСАТС САССАТССССТСАТСССССТСССССТСССССА СТТССТССТАСАТСССАСАСССССТСААСАСССТССТССССАСССТАСАСАССТССАССТСССТСТАС СТССТАССССАСТАСССССАСССССАСССССТ СТССТСССАСААССССТСТСАССАСАССТСТСССТСССССТТСАСТТАССТТСТССАТСААССССАСТ ССТСТССААССТСССТСССАТСТСССТСТСАС САССАСССТСТТССССАСАСТССТСТССАСАСССАСССССААСТСААТССААСАССТАСТТССССТСА ССАСАССТТССАСССАСССТАСАСССАСАСТС СТССТСАСТСССТСАССССССССССАСТСССАСТСТТССТССААСАСТСТССССТСССАСТСССССТС СССССАСААССССТСССТСАТСААТСАСТСТС САССАСТСАСССАСТССССССССССТСАСССТСАСААССАССТТСТСАСАССССАСССТСАСССССАС СССССТСТТССССАСССАСТАСТТАСТСАСАС ТСССАСТСААССАССАССТСТТТАТАСААСАААССААССТСТССТССССССАССТССАССТСССТСТС ТСССССТСССССТТТСАССТСАССТСТААСАС АСССТСАСТТССТССТССАСАААТАТСТТСТТТССТТССАСАССАССССССТССАССТССАСССАСАС АСССССАСССССАААСТССАСТССАСАТТСТС СТСАСССТССТССССААССТСТСССТСТСАССССАТССАССССТССАТССТСААТСССАСТСТСАТТС ССССССССААСАСТСТСАТСАТССАТСТСТСС САСТСССАССАССССТТССАСАСССАСАСТССССТАССТССССАССТАССАСТТАСССТСАСАСТААС ССССССССТТСТСАСАСТАСТАССТАСАСАСС АССАССТСССССТССАТССТССАССТСССССТСАТСТСТССАТТСААССТССАСТССАССААСАССАС СТССААССССТССССССТСССТТАСААССААС ТССТССАСССССАССТАССАССТССАСССССАСТАСАСАССТААСТТССАССТСАССТССТТСТССТС САССТТССССАССССССАСССААТСТТССТТС ААААТААСАСАССТСААТСТТСТСССАСАТСТТТСССТАССССТТССАССАТТСАССТААСАССАССА САСАТ САТ САСАСТ СААС ССТ САТ САСАСС СТ ТТТТАТТСТСТССАСТТАСААСАСССТСТАСАААСССАТССССААССТССТААСТССАТТСТССТССТ СТСТАСТАСТСТСАСТТСССАСТАСТСТСССА ССАССАТСССТСТСАТАСТСАСТТСТССААССТСААТСАСАСАССАСАСТАСТТСТСССАСААСАССС ТСАСАСССТССССАСССТТТСАТСААСАСААС ССТССТАСССАСАСТАТСАСТСААСАССТТССАСТТАСТСТСТССТСТСАТСААСАСССТСТТСТССС АСТСТСССАССССТСССАААСТАСТТСТСТТС ТСТСТТССТСАСССАССТААААТТАТСААААТТССАСССАССТССТСТСАСАСАТСТСАССАСССТСА СТССААССАСАТСАСТСССАСССТССАСТАТС АСАСААССАСТСССТССАТТТТААТАСТТТТААССТСССТССАССАСАСТСТСТАСАСТССТСССАСТ САССТТССТСТАСТСАСССТСССАССТСАТАС ТСААССТСССААССТСТААСТСТСААСТАСАССТССАТАТССАСТАСТСССАССССАААТСТСССАСС АААСССАТСТАСТССАТТСАСАТСААССАТСТ АСТТССАСССТТССАСАТТСАСАСТТСАТСТССАССТАТАССТСАТСАСССТССССТТТАСАСССТСС ТТТСССТАСАТСАССТААСТСТАСТТССТАСА

ССАССАССАСТССТССТССТССТСТСССАСАСССАСССАССССАТССАССТСССССТССАСТССАССА АТСССТСТСТТСТСТАССАТСАССТТСТСААТ ССТССТССТСАССАССАССАССАСАСССТСТСССТСССТССССТАССТССАСССССАССТСАССТССТ ТАСССАСАСААСАСАТССТАСТССААСАСТТА СССАТССАСТССАААТССТСССССАССААСТССАССААСТСА

Настоящее изобретение относится к фрагменту фактора Виллебранда (ФВ), содержащему домен □' и домен ОЗ ФВ, отличающемуся тем, что фрагмент ФВ препятствует связыванию эндогенного ФВ (полноразмерного ФВ) с белком Ф-νΙΙΙ. В одном варианте реализации изобретения фрагмент ФВ связывается или соединяется с белком Ф-νΙΙΙ. Путем связывания или соединения с белком Ф-νΙΙΙ фрагмент ФВ, являющийся объектом данного изобретения, защищает Ф-νΙΙΙ от расщепления протеазой и активации ФνΙΙΙ, стабилизирует тяжелую цепь и легкую цепь Ф-νΙΙΙ и предотвращает выведение Ф-νΙΙΙ фагоцитарными рецепторами. В другом варианте реализации изобретения фрагмент ФВ связывается или соединяется с белком Ф-νΙΙΙ и блокирует или предотвращает связывание белка Ф-νΙΙΙ с фосфолипидом и активированным протеином С. Путем предотвращения или подавления связывания белка Ф-νΙΙΙ с эндоген- З9 028309 ным полноразмерным ФВ фрагмент ФВ, являющийся объектом данного изобретения снижает выведение Ф-νΊΙΙ клиренс-рецепторами ФВ и, таким образом, продлевает время полужизни Ф-νΙΙΙ. Продление времени полужизни белка Ф-νΙΙΙ происходит, следовательно, благодаря связыванию или соединению фрагмента ФВ, в котором отсутствует участок связывания с клиренс-рецептором ФВ, с белком Ф-νΙΙΙ и экранированию или защите фрагментом ФВ белка Ф-νΙΙΙ от эндогенного ФВ, который содержит участок связывания с клиренс-рецептором ФВ. Наличие белка Ф-νΙΙΙ, связанного или защищенного фрагментом ФВ, также дает возможность рециклинга белка Ф-νΙΙΙ. Следовательно, фрагмент ФВ не может являться полноразмерным зрелым ФВ. Из-за удаления участков связывания клиренс-рецепторов ФВ, содержащихся в полноразмерной молекуле ФВ, гетеродимеры Ф-ЩП/ФВ, являющиеся объектами данного изобретения, выключаются из процесса выведения ФВ, что позволяет дополнительно продлить время полужизни Ф-νΙΙΙ.

Фрагмент ФВ, содержащий домен Ό' и домен Ό3, может дополнительно содержать домен ФВ, выбранный из группы, состоящей из домена А1, домена А2, домена А3, домена Ό1, домена Ό2, домена Ό4, домена В1, домена В2, домена В3, домена С1, домена С2, домена СК, одного или более их фрагментов или любых их комбинаций. В одном варианте реализации изобретения фрагмент ФВ содержит, состоит преимущественно из или состоит из: (1) принадлежащих ФВ доменов Ό' и Ό3 или их фрагментов; (2) принадлежащих ФВ доменов Ό1, Ό' и Ό3 или их фрагментов; (3) принадлежащих ФВ доменов Ό2, Ό' и Ό3 или их фрагментов; (4) принадлежащих ФВ доменов Ό1, Ό2, Ό' и Ό3 или их фрагментов; или (5) принадлежащих ФВ доменов ΌΊ, Ό2, Ό', Ό3 и А1 или их фрагментов. Описанный в данном тексте фрагмент ФВ не содержит участок, связывающийся с клиренс-рецептором ФВ. В другом варианте реализации изобретения описанный в данном тексте фрагмент ФВ не является аминокислотами от 764 до 1274 из ЗЕО ГО N0: 2. Фрагмент ФВ, являющийся объектом данного изобретения, может содержать любые другие последовательности, связанные или сшитые с фрагментом ФВ, но не являться полноразмерным ФВ. Например, описанный в данном тексте фрагмент ФВ может дополнительно содержать сигнальный пептид.

В одном варианте реализации фрагмент ФВ, являющийся объектом данного изобретения, содержит домен Ό' и домен Ό3 ФВ, при этом домен Ό' является по меньшей мере на 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97%, 98, 99 или 100% идентичным аминокислотам от 764 до 866 из ЗЕО ГО N0: 2, при этом фрагмент ФВ связывается с белком Ф-νΊΙΙ, защищает, подавляет или предотвращает связывание эндогенного ФВ с белком Ф-νΙΙΙ. В другом варианте реализации изобретения фрагмент ФВ содержит домен Ό' и домен Ό3 ФВ, при этом домен Ό3 является по меньшей мере на 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичным аминокислотам от 867 до 1240 из ЗЕО ГО N0: 2, при этом фрагмент ФВ связывается с белком Ф-νΙΙΙ, или подавляет, или предотвращает связывание эндогенного ФВ с белком Ф-νΙΙΙ. В некоторых вариантах реализации изобретения описанный в данном тексте фрагмент ФВ содержит, состоит преимущественно из или состоит из домена Ό' и домена Ό3 ФВ, которые являются по меньшей мере на 60, 70, 80, 85, 90, 95,

96, 97, 98, 99 или 100% идентичным аминокислотам от 764 до 1240 из ЗЕО ГО N0: 2, при этом фрагмент ФВ связывается с белком Ф-νΙΙΙ, или подавляет, или предотвращает связывание эндогенного ФВ с белком Ф-νΙΙΙ. В других вариантах реализации изобретения фрагмент ФВ содержит, состоит преимущественно из или состоит из доменов Ό1, Ό2, Ό', Ό3 и является по меньшей мере на 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96,

97, 98, 99 или 100% идентичным аминокислотам от 23 до 1240 из ЗЕО ГО N0: 2, при этом фрагмент ФВ связывается с белком Ф-νΙΙΙ, или подавляет, или предотвращает связывание эндогенного ФВ с белком Ф-νΊΙΙ. В других вариантах реализации изобретения фрагмент ФВ дополнительно содержит функционально связанный с ним сигнальный пептид.

В некоторых вариантах реализации фрагмент ФВ, являющийся объектом данного изобретения, состоит преимущественно из или состоит из (1) домена Ό'Ό3, домена Ό1Ό'Ό3, домена Ό2ΌΌ3 или домена Ό1Ό2Ό'Ό3 и (2) дополнительной последовательности ФВ, содержащей до около 10 аминокислот (например, любые последовательности от аминокислот от 764 до 1240 из ЗЕО ГО N0: 2 до аминокислот от 764 до 1250 из ЗЕО ГО N0: 2), до около 15 аминокислот (например, любые последовательности от аминокислот от 764 до 1240 из ЗЕО ГО N0: 2 до аминокислот от 764 до 1255 из ЗЕО ГО N0: 2), до около 20 аминокислот (например, любые последовательности от аминокислот от 764 до 1240 из ЗЕО ГО N0: 2 до аминокислот от 764 до 1260 из ЗЕО ГО N0: 2), до около 25 аминокислот (например, любые последовательности от аминокислот от 764 до 1240 из ЗЕО ГО N0: 2 до аминокислот от 764 до 1265 из ЗЕО ГО N0: 2) или до около 30 аминокислот (например, любые последовательности от аминокислот от 764 до 1240 из ЗЕО ГО N0: 2 до аминокислот от 764 до 1260 из ЗЕО ГО N0: 2). В конкретном варианте реализации изобретения фрагмент ФВ, содержащий или состоящий преимущественно из домена Ό' и домена Ό3 не представляет собой как аминокислоты от 764 до 1274 из ЗЕО ГО N0: 2, так и полноразмерный зрелый ФВ.

В других вариантах реализации изобретения фрагмент ФВ, содержащий домены Ό'Ό3, связанные с доменами Ό1Ό2, дополнительно содержит внутриклеточный сайт расщепления (например, сайт расщепления РАСЕ или РС5), что делает возможным отщепление доменов Ό1Ό2 от доменов Ό'Ό3 после экспрессии. Неограничивающие примеры внутриклеточных сайтов расщепления раскрыты в другом месте данного текста.

В других вариантах реализации изобретения фрагмент ФВ содержит домен Ό' и домен Ό3, но не содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из (1) аминокислот от

- 40 028309

1241 до 2813 из 8Е0 ΙΌ ΝΟ: 2, (2) аминокислот от 1270 до аминокислот 2813 из 8ЕО ГО N0: 2, (3) аминокислот от 1271 до аминокислот 2813 из 8Е0 ГО N0: 2, (4) аминокислот от 1272 до аминокислот 2813 из 8Е0 ГО N0: 2, (5) аминокислот от 1273 до аминокислот 2813 из 8Е0 ГО N0: 2 и (6) аминокислот от 1274 до аминокислот 2813 из 8Е0 ГО N0: 2.

В других вариантах реализации фрагмент ФВ, являющийся объектом данного изобретения, содержит, состоит преимущественно из или состоит из аминокислотной последовательности, соответствующей домену Ό', домену Ό3 и домену А1, при этом аминокислотная последовательность является по меньшей мере на 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичной аминокислотам от 764 до 1479 из 8Е0 ГО N0: 2, при этом фрагмент ФВ связывается с Ф-УШ. В конкретном варианте реализации изобретения фрагмент ФВ не представляет собой аминокислоты от 764 до 1274 из 8Е0 ГО N0: 2.

В некоторых вариантах реализации фрагмент ФВ, являющийся объектом данного изобретения, содержит домен Ό' и домен Ό3, но не содержит по меньшей мере один домен ФВ, выбранный из группы, состоящей из (1) домена А1, (2) домена А2, (3) домена А3, (4) домена Ό4, (5) домена В1, (6) домена В2, (7) домена В3, (8) домена С1, (9) домена С2, (10) домена СК, (11) домена СК и домена С2, (12) домена СК, домена С2 и домена С1, (13) домена СК, домена С2, домена С1, домена В3, (14) домена СК, домена С2, домена С1, домена В3, домена В2, (15) домена СК, домена С2, домена С1, домена В3, домена В2 и домена В1, (16) домена СК, домена С2, домена С1, домена В3, домена В2, домена В1 и домена Ό4 йотат, (17) домена СК, домена С2, домена С1, домена В3, домена В2, домена В1, домена Ό4 и домена А3, (18) домена СК, домена С2, домена С1, домена В3, домена В2, домена В1, домена Ό4, домена А3 и домена А2, (19) домена СК, домена С2, домена С1, домена В3, домена В2, домена В1, домена Ό4, домена А3, домена А2 и домена А1 йотат, и (20) любых комбинаций этих доменов.

В других вариантах реализации изобретения фрагмент ФВ содержит домены Ό'Ό3 и один или более доменов или модулей. Примеры таких доменов и модулей включают, но не ограничиваются этим, домены и модули, описанные в работе ΖΗοιπ βί а1., В1оой, опубликованной онлайн 6 апреля 2012 г.: Ό0Ι 10.1182/Ыоой-2012-01-405134. Например, фрагмент ФВ может содержать домен Ό'Ό3 и один или более доменов или модулей, выбранных из группы, состоящей из домена А1, домена А2, домена А3, модуля Ό4№ модуля У\УЭ4. модуля С8-4, модуля ТГС-4, модуля С1, модуля С2, модуля С3, модуля С4, модуля С5, модуля С5, модуля С6 и любых комбинаций этих элементов.

В других вариантах реализации изобретения фрагмент ФВ связан с гетерологичным компонентом, при этом гетерологичный компонент связан с ^концом или С-концом фрагмента ФВ либо вставлен между двумя аминокислотами во фрагменте ФВ. Например, инсерционным участком для гетерологичного компонента во фрагменте ФВ может являться домен Ό', домен Ό3 либо они оба. Гетерологичный компонент может являться компонентом, продлевающим время полужизни.

В определенных вариантах реализации фрагмент ФВ, являющийся объектом данного изобретения, образует мультимер, например димер, тример, тетрамер, пентамер, гексамер, гептамер либо мультимеры высших порядков. В других вариантах реализации изобретения фрагмент ФВ является мономером, содержащим только один фрагмент ФВ. В некоторых вариантах реализации фрагмент ФВ, являющийся объектом данного изобретения, может одердать одну или более аминокислотных замен, делеций, присоединений или модификаций. В одном варианте реализации изобретения фрагмент ФВ может содержать аминокислотные замены, делеций, присоединения или модификации, которые приводят к тому, что фрагмент ФВ становится неспособным к образованию дисульфидной связи или образованию димера или мультимера. В другом варианте реализации изобретения аминокислотная замена находится в пределах домена Ό' и домена Ό3. В конкретном варианте реализации фрагмент ФВ, являющийся объектом данного изобретения, содержит по меньшей мере одну аминокислотную замену на месте остатка, соттветствующего остатку 1099, остатку 1142 или обоим остаткам 1099 и 1142 из 8Е0 ГО N0: 2. По меньшей мере одна аминокислотная замена может представлять собой любые аминокислоты, которые в естественном состоянии не встречаются в ФВ дикого типа. Например, аминокислотная замена может представлять собой любые аминокислоты, кроме цистеина, например изолейцин, аланин, лейцин, аспарагин, лизин, аспарагиновую кислоту, метионин, фенилаланин, глутаминовую кислоту, треонин, глутамин, триптофан, глицин, валин, пролин, серин, тирозин, аргинин или гистидин. В другом примере аминокислотная замена содержит одну или более аминокислот, которые предотвращают или подавляют образование мультимеров фрагментами ФВ.

В определенных вариантах реализации фрагмент ФВ, применяемый в данном изобретении, может быть дополнительно модифицирован с целью улучшения его взаимодействия с Ф-УШ, например улучшения аффинности связывания с Ф-УШ. В качестве неограничивающего примера можно привести фрагмент ФВ, который содержит остаток серина на месте остатка, соответствующего аминокислоте 764 из 8Е0 ГО N0: 2, и остаток лизина на месте остатка, соответствующего аминокислоте 773 из 8Е0 ГО N0: 2. Остатки 764 и/или 773 могут влиять на аффинность связывания фрагментов ФВ с Ф-УШ. В других вариантах реализации изобретения фрагмент ФВ может содержать другие модификации, например фрагмент может пэгилированным, гликозилированным, гэкилированным или полисиалилированным.

- 41 028309

Б) Гетерологичные компоненты.

Гетерологичный компонент может являться гетерологичным полипептидным или неполипептидным компонентом. В определенных вариантах реализации изобретения гетерологичный компонент является продлевающей время полужизни молекулой, которая известна в данной области техники, и содержит полипептидн, неполипептидный компонент либо комбинацию обоих этих компонентов. Гетерологичный полипептидный компонент может содержать константную область иммуноглобулина или ее часть, альбумин или его фрагмент, альбумин-связывающее вещество, трансферрин или его фрагмент, последовательность РАЗ, последовательность НАР, их производные либо варианты или любые комбинации этих компонентов. В некоторых вариантах реализации изобретения неполипептидный связывающий компонент содержит полиэтиленгликоль (ПЭГ), полисиаловую кислоту, гидроксиэтиловый крахмал (ГЭК), производное или любые комбинации этих компонентов. В определенных вариантах реализации изобретения может быть один, два, три или более гетерологичных компонентов, которые могут являться одинаковыми либо разными молекулами.

1) Константная область иммуноглобулина или ее часть.

Константная область иммуноглобулина состоит из доменов, называемых СН (константными тяжелыми - от англ. согМап! Ьеа\у) доменами (СН1, СН2 и т.д.). В зависимости от изотипа (т.е. 1дО, 1дМ, 1дА Ι§Ό или 1дЕ) константная область может состоять из трех или четырех СН доменов. Некоторые изотипы (например, 1дО) константных областей также содержат шарнирный участок. Смотрите 1апеиау е! а1. 2001, 1ттипоЬю1оду, Оаг1ап4 РиЬЬ8Ып§, Ν.Υ., Ν.Υ.

Константную область иммуноглобулина или ее часть для получения химерного белка, являющегося объектом настоящего изобретения, можно получить из большого числа различных источников. В предпочтительных вариантах реализации изобретения константная область иммуноглобулина или ее часть получена из человеческого иммуноглобулина. При этом понятно, что константная область иммуноглобулина или ее часть может быть получена из иммуноглобулина других видов млекопитающих, включая, к примеру, виды грызунов (например, мышь, крысу, кролика, морскую свинку) или приматов за исключением человека (например, шимпанзе, макаку). Более того, константная область иммуноглобулина или ее часть может быть получена из иммуноглобулина любого класса, включая 1дМ, 1дО, Ι§Ό, 1дА и 1дЕ, и иммуноглобулина любого изотипа, включая 1дО1, 1дО2, 1дО3 и 1дО4. В одном варианте реализации изобретения применяется человеческий изотип 1дО1.

Большое количество генетических последовательностей константной области иммуноглобулина (например, человеческих генетических последовательностей константной области) доступны в виде открытых баз данных. Можно выбрать последовательность доменов константной области, имеющую определенную эффекторную функцию (или с отсутствием определенной эффекторной функции), или с определенной модификацией для снижения иммуногенности. Было опубликовано большое количество данных последовательностей антител и кодирующих антитела генов, и подходящие последовательности константной области 1д (например, шарнирная, СН2 и/или СН3 последовательности или их части) можно получить из этих последовательностей, используя общепринятые в данной области техники методы. Генетический материал, полученный любым из вышеописанных способов, может затем быть изменен либо синтезирован для того, чтобы получить полипептиды, являющиеся объектами настоящего изобретения. Следует также принять во внимание, что в объем данного изобретения включены аллели, варианты и мутации ДНК последовательностей константной области.

Последовательности константной области иммуноглобулина или ее части можно клонировать, например, при помощи полимеразной цепной реакции и праймеров, которые выбраны таким образом, чтобы амплифицировать представляющий интерес домен. Для того чтобы клонировать константную область иммуноглобулина или ее часть из антитела, можно выделить иРНК из клеток гибридомы, селезенки или лимфоцитов, обратно транскрибировать в ДНК, а гены антитела амплифицировать ПЦРМетоды ПЦРамплификации детально описаны в патентах ИЗ № 4683195; 4683202; 4800159; 4965188; и, например, в РСК РгоЮсоЕ: А Ош4е Ю МеБюА апй АррНсаДоп8 1пт8 е! а1. ей8., АсаЬепис Рге88, Зап О1едо, СА (1990); Но е! а1. 1989. Оепе 77:51; Нойоп е! а1. 1993. Ме1Ьо48 Еп/уто1. 217:270). ПЦРможет инициироваться консенсусными праймерами константной области или более специфичными праймерами на основе опубликованных данных по ДНК- и аминокислотным последовательностям тяжелой и легкой цепи. Как обсуждалось выше, ПЦРтакже можно применять для выделения клонов ДНК, кодирующих легкую и тяжелую цепи антитела. В этом случае скрининг библиотек может проводиться по консенсусному праймеру или более крупным гомологичным зондам, таким как зонды мышиной константной области. В данной области техники известны многочисленные группы праймеров, подходящих для амплификации генов антител (например, 5'-концевые праймеры на основе Ν-концевой последовательности очищенных антител (ВепЬаг апй Ра8!ап. 1994. Рго1еш Епдшееппд 7:1509); быстрая амплификация концов кДНК (КиЬеЫ, Р. е! а1. 1994. 1. 1ттипо1. Ме1Ьо48 173:33); лидерные последовательности антител (Ьатск е! а1. 1989 ВюсЬет. ВюрЬу8. Ке8. Соттип. 160:1250). Клонирование последовательностей антител дополнительно описано в №итап е! а1., патент ИЗ № 5658570, зарегистрированного 25 января 1995 г., который включен в данный текст посредством ссылки.

Применяемая в данном изобретении константная область иммуноглобулина может содержать все

- 42 028309 домены и шарнирный участок либо их части. В одном варианте реализации изобретения константная область иммуноглобулина или ее часть содержит домен СН2, домен СН3 и шарнирный участок, например Рс-область или РсКп партнера по связыванию.

Употребляемый в данном тексте термин Рс-область определяется как часть полипептида, которая соответствует Рс-области нативного иммуноглобулина, т. е. как так, что образована путем димерной ассоциации соответствующих Рс-доменов своих двух тяжелых цепей. Нативная Рс-область образует гомодимер с другой Рс-областью. В противоположность этому, употребляемый в данном тексте термин генетически-слитая Рс-область или одноцепочечная Рс-область (оц-Рс-область) относится к синтетической димерной Рс-области, состоящей из Рс-доменов, генетически связанных в пределах одной полипептидной цепи (т. е. кодируемых одиночной непрерывной генетической последовательностью).

В одном варианте реализации изобретения термин Рс-область относится к части одиночной тяжелой цепи иммуноглобулина, начиная с шарнирного участка выше сайта расщепления папаином (т.е. остатка 216 в ^О, принимая, что первый остаток тяжелой цепи константной области имеет номер 114) и заканчивая С-концом антитела. Соотвественно полная Рс-область содержит, по меньшей мере, шарнирный участок, домен СН2 и домен СН3.

Рс-область константной области иммуноглобулина в зависимости от изотипа иммуноглобулина может содержать домены СН2, СН3 и СН4, а также шарнирный участок. Химерные белки, содержащие Рс-область иммуноглобулина, приобретают некоторое количество необходимых свойст химерного белка, включая повышенную стабильность, повышенное сывороточное время полужизни (смотрите Сароп е! а1., 1989, №Лиге 337:525), а также связывание с Рс-рецепторами, такими как неонатальный Рс-рецептор (РсКп) (патенты ИЗ № 6086875, 6485726, 6030613; УО 03/077834; И32003-0235536А1), которые в полном объеме включены в данный текст посредством ссылки.

Константная область иммуноглобулина или ее часть может являться партнером по связыванию РсКп. РсКп активен во взрослых эпителиальных тканях и экспрессируется в полости кишечника, в легочных дыхательных путях, на носовых поверхностях, на вагинальных поверхностях, поверхностях толстой и прямой кишок (патент ИЗ № 6485726). Партнер по связыванию РсКп представляет собой часть иммуноглобулина, которая связывается с РсКп.

РсКп-рецептор выделяли из нескольких видов млекопитающих, включая человека. Известны последовательности человеческого РсКп, обезьяннего РсКп, крысиного РсКп и мышиного РсКп (3!огу е! а1. 1994, I. Ехр. Меб. 180:2377). РсКп-рецептор связывает ЦО (но не связывает другие классы иммуноглобулина, такие как ЦА. ЦМ. и !дЕ) при относительно низком уровне рН, активно транспортирует ЦО трансцеллюлярно в направлении от люминального к серозному, а затем высвобождает ЦО при относительно более высоком уровне рН, характерном для интерстициальных жидкостей. Он экспрессируется во взрослой эпителиальной ткани (патенты ИЗ № 6485726, 6030613, 6086875; У О 03/077834; И320030235536А1), включая легочный и кишечный эпителий (!8гае1 е! а1. 1997, [тишпоШду 92:69), почечный проксимальный тубулярный эпителий (КоЬауакЫ е! а1. 2002, Ат. I. РЬу8ю1. Кепа1 РЬу8ю1. 282:Р358), а также эпителий носовой полости, вагинальные поверхности и поверхности желчных протоков.

Партнеры по связыванию РсКп, применяемые в настоящем изобретении, включают молекулы, которые могут специфически связываться с РсКп-рецептором, всключая целый ЦО, Рс-фрагмент ЦО и другие фрагменты, которые содержат полный связывающий участок РсКп-рецептора. Участок той части Рс-области ЦО, которая связывается с РсКп-рецептором, был описан на основе рентгеноструктурной кристаллографии (Вигте18!ег е! а1. 1994, №Лиге 372:379). Основная контактная область Рс с РсКп находится в районе соединения доменов СН2 и СН3. Все контакты Рс-РсКп находятся в пределах одиночной тяжелой цепи Ц. Партнеры по связыванию РсКп включают целый ЦО, Рс-фрагмент ЦО и другие фрагменты ЦО, которые содержат полный связывающий участок РсКп. Основные контактные участки включают аминокислотные остатки 248, 250-257, 272, 285, 288, 290-291, 308-311 и 314 домена СН2 и аминокислотные остатки 385-387, 428 и 433-436 домена СН3. Все ссылки, приведенные на нумерацию иммуноглобулинов или фрагментов либо цчастков иммуноглобулина, основаны на КаЬа! е! а1. 1991, Зециепсек о£ Рго!еш8 о£ ПптипоШщсгб Шегек!, и.З. Перабтеп! о£ РиЬйс НеаИЬ, ВеШекба, Мб.

Рс-области или партнеры по связыванию РсКп, связанные с РсКп, могут эффективно переноситься через эпителиальные барьеры посредством РсКп, что, таким образом, обеспечивает неинвазионные средства для систематического введения необходимой терапевтической молекулы. Вдобавок, слитые белки, содержащие Рс-области или партнеров по связыванию РсКп, эндоцитозируются клетками, экспрессирующими РсКп. Но, вместо того, чтобы помечаться для дальнейшей деградации, эти слитые белки снова возвращаются в циркуляцию, что, таким образом, увеличивает ш У1уо время полужизни этих белком. В определенных вариантах реализации изобретения части константных областей иммуноглобулина являются Рс-областью или партнером по связыванию РсКп, которые обычно объединяются при помощи дисульфидных связей и других неспецифических взаимодействий с другой Рс-областью или другим партнером по связыванию РсКп для того, чтобы образовать димер или мультимеры более высоких порядков.

Два РсКп-рецептора могут связывать одиночную Рс-молекулу. Кристаллографические данные позволяют предположить, что каждая молекула РсКп связывает одиночный полипептид гомодимера Рс. В одном варианте реализации изобретения присоединение партнера по связыванию РсКп, например Рс- 43 028309 фрагмента 1дС. к биологически активной молекуле обеспечивает средства доставки биологически активной молекулы перорально, буккально, подъязычно, ректально, вагинально, в виде назально применяемого аэрозоля или через легочные дыхательные пути, либо через окулярные пути. В другом варианте реализации изобретения химерный белок можно вводить инвазионно, например подкожно, внутривенно.

Участок партнера по связыванию РсКп является такой молекулой или ее частью, которая может специфически связываться РсКп-рецептором с последующим активным транспортом посредством РсКпрецептора Рс-области. Специфическое связываниет обозначает образование двумя молекулами комплекса, который является относительно стабильным в физиологических условиях. Специфическое связывание характеризуется высокой аффинностью и емкостью от низкой до умеренной в отличие от неспецифического связывания, которое обычно обладает низкой аффинностью с емкостью от умеренной до высокой. Как правило, связывание считается специфическим, когда постоянная аффинности КА выше чем 10⁶ М^-1 или выше чем 10⁸ М^-1. В случае необходимости неспецифическое связывание може быть снижено без существенного влияния на специфическое связывание при помощи варьирования условий связывания. Соответствующие условия связывания, такие как концентрация молекул, ионная сила раствора, температура, время, отведенное на связывание, концентрация блокирующего вещества (например, сывороточного альбумина, молочного казеина) и т.д., могут быть оптимизированы специалистов в данной области техники при помощи стандартных методов.

В определенных вариантах реализации химерный белок, являющийся объектом данного изобретения, содержит один или более процессированных Рс-областей, которые, несмотря на это, способны обеспечивать Рс-области связывающие свойства Рс-рецептора (РсК). Например, часть Рс-области, которая связывается с РсКп (т.е. связывающая часть РсКп), содержит аминокислоты, приблизительно соответствующие 282-438 аминокислотам 1§С1 по европейской нумерации (с первичными контактными участками, соответстсующими аминокислотам 248, 250-257, 272, 285, 288, 290-291, 308-311 и 314, принадлежащим домену СН2, и аминокислотным остаткам 385-387, 428 и 433-436, принадлежащим домену СН3). Таким образом, Рс-область, являющаяся объектом данного изобретения, может содержать или состоять из связывающей части РсКп. Связывающие части РсКп могут быть получены из тяжелых цепей любого изотипа, включая 1дС1, 1§С2, 1§С3 и 1§С4. В одном варианте реализации изобретения используется связывающая часть РсКп из антитела человеческого изотипа 1дС1. В другом варианте реализации изобретения используется связывающая часть РсКп из антитела человеческого изотипа 1дС4.

В другом варианте реализации изобретения Рс-область содержит аминокислотную последовательность Рс-домена или полученную из Рс-домена. В определенных вариантах реализации изобретения Рс-область содержит по меньшей мере один элемент из: шарнирного (например, верхнего, среднего и/или нижнего шарнирного участка) домена (приблизительно соответствующего аминокислотам 216-230 Рс-области антитела согласно европейской нумерации), домена СН2 (приблизительно соответствующего аминокислотам 231-340 Рс-области антитела согласно европейской нумерации), домена СН3 (приблизительно соответствующего аминокислотам 341-438 Рс-области антитела согласно европейской нумерации), домена СН4 либо их варианта, части или фрагмента. В других вариантах реализации изобретения Рс-область содержит полный Рс-домен (т.е. шарнирный домен, домен СН2 и домен СН3). В некоторых вариантах реализации изобретения Рс-область содержит, состоит преимущественно из или состоит из шарнирного домена (или его части), сшитого с доменом СН3 (или его частью), шарнирного домена (или его части), сшитого с доменом СН2 (или его частью), домена СН2 (или его части), сшитого с доменом СН3 (или его частью), домена СН2 (или его части), сшитого с шарнирным доменом (или его частью) и доменом СН3 (или его частью). В других вариантах реализации изобретения в Рс-области отсутствует по меньшей мере часть домена СН2 (например, весь домен СН2 или его часть). В конкретном варианте реализации изобретения Рс-область содержит или состоит из аминокислот, соответствующих номерам от 221 до 447 по европейской нумерации.

Рс-области, обозначаемые в данном тексте как Р, Р1 или Р2, могут быть получены из большого количества различных источников. В одном варианте реализации изобретения Рс-область полипептида получена из человеческого иммуноглобулина. При этом понятно, что Рс-область может быть получена из иммуноглобулина других видов млекопитающих, включая, к примеру, виды грызунов (например, мышь, крысу, кролика, морскую свинку) или приматов за исключением человека (например, шимпанзе, макаку). Более того, полипептид Рс-доменов или его части могут быть получены из иммуноглобулина любого класса, включая 1дМ, 1§С, 1дЭ, 1дА и 1дЕ, и иммуноглобулина любого изотипа, включая 1дС1, 1дС2, 1§С3 и 1дС4. В другом варианте реализации изобретения используется человеческий изотип 1дС1.

В определенных вариантах реализации изобретения Рс-вариант приводит к изменению по меньшей мере в одной эффекторной функции, обеспечиваемой Рс-областью, содержащей указанный Рс-домен дикого типа (например, улучшению или снижению способности Рс-области связываться с Рсрецепторами (например, РсуК1, РсуКП или РсуКШ) или белками комплемента (например, С1ц), либо к триггерной антителозависимой клеточной цитотоксичности (АЗКЦ), фагоцитозу или комплементзависимой клеточной цитотоксичности (КЗКЦ)). В других вариантах реализации изобретения Рс-вариант обкспечивает наличие сконструированного остатка цистеина.

Рс-области, являющиеся объектами данного изобретения, могут включать принятые в данной об- 44 028309 ласти техники Рс-варианты, которые, как известно, приводят к изменению (например, усилению или снижению) в эффекторной функции и/или связывании РсК или РсКп. В частности, связывающая молекула, являющаяся объектом данного изобретения, может содержать, например, изменение (например, замену) в одной или более аминокислотных позициях, подобное описанным в международных публикациях согласно РСТ Ш088/07089А1, Ш096/14339А1, Ш098/05787А1, Ш098/23289А1, Ш099/51642А1, Ш099/58572А1, Ш000/09560А2, Ш000/32767А1, Ш000/42072А2, Ш002/44215А2, Ш002/060919А2, Ш003/074569А2, Ш004/016750А2, Ш004/029207А2, Ш004/035752А2, Ш004/063351А2, \\Ό04/074455А2, Ш004/099249А2, Ш005/040217А2, Ш004/044859, Ш005/070963А1, Ш005/077981А2, Ш005/092925А2, Ш005/123780А2, Ш006/019447А1, Ш006/047350А2 и Ш006/085967А2; патентных публикациях ϋδ №№ ϋδ2007/0231329, ϋδ2007/0231329, ϋδ2007/0237765, ϋδ2007/0237766,

ИБ2007/0237767, ϋδ2007/0243188, ϋδ20070248603, ϋδ20070286859, ИБ20080057056; или патентах ϋδ 5648260; 5739277; 5834250; 5869046; 6096871; 6121022; 6194551; 6242195; 6277375; 6528624; 6538124; 6737056; 6821505; 6998253; 7083784; 7404956 и 7317091, которые все включены в данный текст посредством ссылки. В одном варианте реализации изобретения может быть внесено конкретное изменение (например, конкретная замена одной или более аминокислот, описанная в данной области техники) в одну или более из описанных аминокислотных позиций. В другом варианте реализации изобретения может быть внесено отличное изменение в одну или более из описанных аминокислотных позиций (например, отличная замена одной или более аминокислот, описанная в данной области техники).

Рс-область или партнер по связыванию РсКп, принадлежащие ΙβΟ, могут быть модифицированы в соответствии с общепринятыми процедурами, такими как сайтнаправленный мутагенез и тому подобное, для получения модифицированных фрагментов ΙβΟ или Рс или их частей, которые будут связываться РсКп. Такие модификации включают модификации удаленные от контактных участков РсКп, а также модификации. Находящиеся в пределах контактных участков РсКп, которые сохраняют или даже усиливают связывание с РсКп. Например, следующие одиночные аминокислотные остатки в Рс человеческого ΙβΟ1 (Рс γ1) можно заменить без значительной потери аффинности связывания Рс к РсКп

Р238А, δ239Α, К246А, К248А, Ό249Α, М252А, Т256А, Е258А, Т260А, Ό265Α, δ267Α,

Н268А, Е269А, Ό270Α, Е272А, Е274А, Ν276Α, Υ278Α, Ό280Α, У282А, Е283А,

Н285А, Ν286Α, Т289А, К290А, К292А, Е293А, Е294А, (}295А, Υ296Ρ, Ν297Α, δ298Α, Υ300Ρ, К301А, УЗОЗА, У305А, Т307А, Е309А, 0311 Α, Ό312Α, Ν315Α,

К317А, Е318А, К320А, К322А, δ324Α, К326А, А327(}, Р329А, А330(}, Р331А,

ЕЗЗЗА, К334А, Т335А, δ337Α, К338А, К340А, (}342А, К344А, Е345А, (}347А,

К355А, Е356А, М358А, Т359А, К360А, Ν361Α, (}362А, Υ373Α, δ375Α, Ό376Α,

Α378ζ), Е380А, Е382А, δ383Α, Ν384Α, (}386А, Е388А, Ν389Α, Ν390Α, Υ391Ρ,

К392А, Р398А, δ400Α, Ό401Α, Ό413Α, К414А, К416А, (}418А, (}419А, Ν421Α,

У422А, δ424Α, Е430А, Ν434Α, Т437А, (}438А, К439А, δ440Α, δ444Α и К447А, где, например, Р238А представляет пролин дикого типа, замещенный аланином в позиции номер

238. В качестве примера конкретный вариант реализации изобретения включает мутацию N297А, при помощи которой удаляется высококонсервативный участок ^гликозилирования. Вдобавок к аланину другие аминокислоты могут замещать аминокислоты дикого типа в позициях, приведенных выше. Мутации могут одиночно вноситься в Рс, что приводит к получению более чем сотни Рс-областей, отличных от нативной Рс. Вдобавок, комбинации двух, трех или более из этих отдельных мутаций могут вноситься совместно, что приводит к получению сотен дополнительных Рс-областей. Более того, одна или более из Рс-областей конструкции, являющейся объектом данного изобретения, может быть мутированной, в то время как другая Рс-область конструкции не является мутированной, либо они обе могут быть мутированными, но содержать различные мутации.

Отдельные из вышеописынных мутаций могут приводить к новым функциональным возможностям Рс-области или партнера по связыванию РсКп. Например, один вариант реализации изобретения включает N297А, при помощи которой удаляется высококонсервативный участок Υ-гликозилирования. Действие этой мутации состоит в снижении иммуногенности, тем самым повышая время полужизни циркуляции Рс-области, и в приведении Рс-области в состояние, в котором она не способна связываться с РсγКI, РсγКIIА, РсγКIIВ и РсγКIIIА без потери аффинности к РсКп (Кои!1ей§е е! а1. 1995, Тгапзр1ап!а!юп 60:847; Рпепб е! а1. 1999, Тгапзр1ап!а!юп 68:1632; БЫе1бз е! а1. 1995, I. Βίο1. СНет. 276:6591). Дополнительным примером новых функциональных возможностей, обусловленных вышеописанными мутациями, является возможное в некоторых случаях повышение аффинности к РсКп по сравнению с таковой для дикого типа. Эта повышенная аффинность может отражаться на повышенной скорости ассоциации, сниженной скорости диссоциации либо как повышенной скорости ассоциации, так и сниженной скорости диссоциа- 45 028309 ции. Примеры мутаций, которые, как считается, приводят к повышенной аффинности к РсКп, включают, но не ограничиваются этим, Т256А, Т307А, Е380А и Ν434Α (§Ые1Й8 е1 а1. 2001, 1. ΒίοΙ. СЬет. 276:6591).

Вдобавок, обнаружилось, что по меньшей мере три человеческих Рс гамма рецептора распознают связывающий участок 1§С в пределах нижнего шарнирного участка, а именно, аминокислоты 234-237. Следовательно, другой пример новых функциональных возможностей и потенциально сниженной иммуногенности может обуславливаться мутациями в этой области, например, замещением аминокислот 233236 человеческого 1дС1 ЕЬЬО соответствующей последовательностью из 1§С2 РУА (с одной аминокислотной делецией). Было показано, что РсуК1, РсуКП и РсуКШ, которые опосредуют различные эффекторные функции, не будут связываться с 1§С1 в случае внесения таких мутаций. \Уагй апй СНейе 1995, ТЬегареийс 1ттипо1оду 2:77 и Агтоиг е1 а1. 1999, Еиг. ί. 1ттипо1. 29:2613.

В одном варианте реализации изобретения константная область иммуноглобулина или ее часть, например Рс-область, представляет собой полипептид, содержащий последовательность ΡΚΝδδΜΙδΝΤΡ (8ЕЦ ΙΌ N0: 3) и в некоторых случаях дополнительно содержащий последовательность, выбранную из I ГО51.СТС) (8ЕЦ ГО N0: 4), IГОМУОСК (8ЕЦ ГО N0: 5), I ГОМ51)С.К (8ЕЦ ГО N0: 6) или УШЗНЬСЦ (8ЕЦ ГО N0: 7) (патент И8 № 5739277).

В другом варианте реализации изобретения константная область иммуноглобулина или ее часть содержит аминокислотную последовательность в шарнирном участке или его части, который образует одну или более дисульфидных связей с другой константной областью иммуноглобулина или ее частью. Дисульфидная связь, образованная константной областью иммуноглобулина или ее частью, приводит к размещению вместе первого полипептида, содержащего Ф-УШ, и второго полипептида, содержащего фрагмент ФВ, таким образом, что эндогенный ФВ не замещает фрагмент ФВ и не связывается с Ф-УШ. Следовательно, дисульфидная связь между первой константной областью иммуноглобулина или ее частью и второй константной областью иммуноглобулина или ее частью предотвращает взаимодействие между эндогенным ФВ и белком Ф-УШ. Подавление взаимодействия между ФВ и белком Ф-УШ дает возможность выйти за пределы 2-кратного увеличения времени полужизни белка Ф-УШ. Шарнирный участок или его часть может быть дополнительно связан с одним или более доменами из СН1, СН2, СН3, их фрагментами или любыми их комбинациями. В конкретном примере константная область иммуноглобулина или ее часть содержит шарнирный участок и участок СН2 (например, аминокислоты 221-340 Рсобласти).

В определенных вариантах реализации изобретения константная область иммуноглобулина или ее часть является гемигликозилированной. Например, химерный белок, содержащий две Рс-области или двух партнеров по связыванию РсКп, может содержать первую гликозилированную Рс-область (например, гликозилированный участок СН2) или партнера по связыванию РсКп и вторую агликозилированную Рс-область (например, агликозилированный участок СН2) или партнера по связыванию РсКп. В одном варианте реализации изобретения между гликозилированной и агликозилированной областями может быть помещен линкер. В другом варианте реализации изобретения Рс-область или партнер по связыванию РсКп является полностью гликозилированным, т.е. все Рс-области гликозилированы. В других вариантах реализации изобретения Рс-область может быть агликозилированной, т.е. ни один из компонентов Рс не является гликозилированным.

В определенных вариантах реализации химерный белок, являющийся объектом данного изобретения, содержит аминокислотную замену в константной области иммуноглобулина или ее части (например, Рс-варианты), которая изменяет антиген-независимые эффекторные функции константной области 1д, в частности время полужизни циркуляции белка.

Такие белки демонстрируют как повышенное, так и сниженное связывание с РсКп по сравнению с белками, у которых отсутствуют подобные замены, и, следовательно, характеризуются соответственно увеличенным или сниженным временем полужизни в сыворотке крови. Предполагается, что Рс-варианты с улучшенной аффинностью к РсКп характеризуются более продолжительным временем полужизни в сыворотке крови, и такие молекулы имеют полезные применения в способах лечения млекопитающих, в которых требуется продолжительное время полужизни применяемого полипептида, например, для лечения хронического заболевания или нарушения (смотрите, например, патенты И8 7348004, 7404956 и 7862820). В противоположность этому считается, что Рс-варианты со сниженной аффинностью связывания РсКп характеризуются более короткими временами полужизни, и такие молекулы также применимы, например, для введения млекопитающим в случае, когда более короткое время циркуляции может быть более преимущественным, например, для ш νινο диагностической визуализации или в ситуациях, когда исходный полипептид имеет токсические побочные эффекты при нахождении в циркуляции на протяжении продолжительных периодов. Также Рс-варианты со сниженной аффинностью связывания РсКп имеют меньшую вероятность прохождения через плаценту и, следовательно, применимы также для лечения заболеваний или нарушений у беременных женщин. Вдобавок, другие применения, в которых может требоваться сниженная аффинность связывания РсКп, включают такие применения, в которых требуется локализация мозга, почки и/или печени. В одном иллюстративном варианте реализации химерный белок, являющийся объектом данного изобретения, демонстрирует сниженный транспорт из сосудистой системы через эпителий почечных клубочков. В другом варианте реализации химерный белок, являющийся

- 46 028309 объектом данного изобретения, демонстрирует сниженный транспорт через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) из мозга в сосудистое пространство. В одном варианте реализации изобретения белок с измененным связыванием РсКп содержит по меньшей мере одну Рс-область или одного партнера по связыванию РсКп (например, одну или две Рс-области или партнеров по связыванию РсКп), содержащую одну или более аминокислотных замен в пределах РсКп-связывающей петли константной области Ι§. РсКпсвязывающая петля состоит из аминокислотных остатков 280-299 (согласно европейской нумерации) полноразмерной Рс-области дикого типа. В других вариантах реализации изобретения константная область Ι§ в химерном белке или ее часть, являющаяся объектом данного изобретения и имеющая измененную аффинность связывания РсКп, содержит по меньшей мере одну Рс-область или одного партнера по связыванию РсКп, содержащую одну или более аминокислотных замен в пределах 15А-й контактной зоны РсКп. Употребляемый в данном тексте термин 15А-ая контактная зона РсКп включает в себя остатки в следующих позициях полноразмерного Рс-компонента дикого типа: 24З-261, 275-280, 282-29З, З02-З19, ЗЗ6- З48, З67, З69, З72-З89, З91, З9З, 408, 424, 425-440 (европейская нумерация). В других вариантах реализации изобретения константная область Ι§ или ее часть, являющаяся объектом данного изобретения и имеющая измененную аффинность связывания РсКп, содержит по меньшей мере одну Рсобласть или одного партнера по связыванию РсКп, содержащую одну или более аминокислотных замен в аминокислотной позиции, соответствующей любой из следующих позиций согласно европейской нумерации: 256, 277-281, 28З-288, З0З-З09, З1З, ЗЗ8, З42, З76, З81, З84, З85, З87, 4З4 (например, ЖЗ4А или ЖЗ4К) и 4З8. Примеры аминокислотных замен, которые изменяют активность связывания РсКп, раскрыты в международной публикации согласно РСТ № \У005/047З27. которая включена в данный текст посредством ссылки.

Рс-область или партнер по связыванию РсКп, применяемые в данном изобретении, могут также содержать общепринятую в данной области техники аминокислотную замену. Которая изменяет гликозилирование химерного белка. Например, Рс-область или партнер по связыванию РсКп химерного белка, связанные с фрагментом ФВ или белком Ф-νΙΙΙ, могут содержать Рс-область, содержащую мутацию, которая приводит к сниженному гликозилированию (например, Ν- или О-связанному гликозилированию), либо могут содержать измененную гликоформу Рс-компонента дикого типа (например, гликан с низким содержанием или отсутствием фукозы).

В одном варианте реализации непроцессированный химерный белок, являющийся объектом данного изобретения, может содержать генетически сшитую Рс-область (т.е. оц-Рс-область), содержащую одну или более непрерывных константных областей или их частей, независимо выбранных из описанных в данном тексте константных областей или их частей. В одном варианте реализации изобретения Рсобласти димерной Рс-области являются одинаковыми. В другом варианте реализации изобретения по меньшей мере две Рс-области являются разными. Например, Рс-области или партнеры по связыванию РсКп, принадлежащие белкам, являющимся объектами данного изобретения, содержат одинаковое количество аминокислотных остатков либо они могут отличаться по длине на один или более аминокислотных остатков (например, на около 5 аминокислотных остатков (например, 1, 2, З, 4 или 5 аминокислотных остатков), около 10 остатков, около 15 остатков, около 20 остатков, около З0 остатков, около 40 остатков или около 50 остатков). В других вариантах реализации Рс-области или партнеры по связыванию РсКп, принадлежащие белку, являющемуся объектом данного изобретения, могут отличаться в последовательности по одной или более аминокислотным позициям. Например, по меньшей мере две Рс-области или два партнера по связыванию РсКп могут отличаться по около 5 аминокислотным позициям (например, 1, 2, З, 4 или 5 аминокислотным позициям), около 10 позициям, около 15 позициям, около 20 позициям, около З0 позициям, около 40 позициям или около 50 позициям).

2) Альбумин или его фрагмент, или вариант.

В определенных вариантах реализации изобретения, гетерологичный компонент, связанный с фрагментом ФВ или связанный с белком Ф-νΙΙΙ, является альбумином или его функциональным фрагментом. В других вариантах реализации химерный белок, являющийся объектом данного изобретения, содержит белок Ф-νΙΙΙ и альбумин или его фрагмент, при этом альбумин или его фрагмент экранирует или защищает ФВ-связывающий участок белка Ф-νΙΙΙ, тем самым подавляя или предотвращая взаимодействие белка Ф-νΙΙΙ с эндогенным ФВ.

Человеческий сывороточный альбумин (ЧСА или СА) - белок, имеющий полноразмерную форму из 609 аминокислот - отвечает за значительную часть осмотического давления сыворотки, а также действует как носитель эндогенных и экзогенных лигандов. Употребляемый в данном тексте термин альбумин включает в себя полноразмерный альбумин или его функциональный фрагмент, вариант, производное или аналог.

В одном варианте реализации изобретения химерный белок содержит описанный в данном тексте фрагмент ФВ и альбумин, его фрагмент или вариант, при этом фрагмент ФВ связан с альбумином или его фрагментом или вариантом. В другом варианте реализации изобретения химерный белок содержит фрагмент ФВ и белок Ф-νΙΙΙ, которые связаны друг с другом, при этом фрагмент ФВ связан с альбумином или его фрагментом или вариантом, белок, имеющий активность νΙΙΙ, связан с альбумином или его фрагментом или вариантом, либо и фрагмент ФВ и белок, имеющий активность νΙΙΙ, связаны с альбуми- 47 028309 ном или его фрагментом или вариантом. В других вариантах реализации изобретения химерный белок содержит фрагмент ФВ, связанный с альбумином или его фрагментом или вариантом, и дополнительно связанный с гетерологичным компонентом, выбранным из группы, состоящей из константной области иммуноглобулина или ее части (например, Рс-области), последовательности РА8, ГЭК и ПЭГ. В других вариантах реализации изобретения химерный белок содержит фрагмент ФВ и белок Ф-УШ, которые связаны друг с другом, при этом белок Ф-УШ связан с альбумином или его фрагментом или вариантом и дополнительно связан с гетерологичным компонентом, выбранным из группы, состоящей из константной области иммуноглобулина или ее части (например, Рс-области), последовательности РА8, ГЭК и ПЭГ. В других вариантах реализации изобретения химерный белок содержит фрагмент ФВ, связанный с альбумином или его фрагментом или вариантом, и белок Ф-УШ, связанный с альбумином или его фрагментом или вариантом, которые связаны друг с другом, при этом фрагмент ФВ дополнительно связан с первым гетерологичным компонентом, выбранным из группы, состоящей из константной области иммуноглобулина или ее части (например, Рс-области), последовательности РА8, ГЭК и ПЭГ, а белок Ф-УШ дополнительно связан со вторым гетерологичным компонентом, выбранным из группы, состоящей из константной области иммуноглобулина или ее части (например, Рс-области), последовательности РА8, ГЭК и ПЭГ.

В других вариантах реализации изобретения гетерологичным компонентом, связанным с фрагментом ФВ или белком Ф-УШ, является альбумин или его фрагмент или вариант, который продлевает (или способен продлевать) время полужизни фрагмента ФВ или белка Ф-УШ. Дополнительные примеры альбумина или его фрагментов или вариантов раскрыты в патентных публикациях И8 № 2008/0194481А1, 2008/0004206 А1, 2008/0161243 А1, 2008/0261877 А1, или 2008/0153751 А1 или заявки на публикацию на патентную публикацию И8 № 2008/033413 А2, 2009/058322 А1 или 2007/021494 А2.

3) Альбумин-связывающее вещество.

В определенных вариантах реализации изобретения гетерологичным компонентом, связанным с фрагментом ФВ или белком Ф-УШ, является альбумин-связывающее вещество, которое содержит альбумин-связывающий пептид, бактериальный альбумин-связывающий домен, фрагмент альбуминсвязывающего антитела или любые комбинации этих компонентов. Например, альбумин-связывающий белок может являться бактериальным альбумин-связывающим белком, антителом или фрагментом антитела, включая доменные антитела (смотрите патент И8 № 6,696,245). Альбумин связывающий белок, к примеру, может являться бактериальным альбумин-связывающим доменом, таким как домен стрептококкового протеина О (Котд, Т. апй 8кегга, А. (1998) 1. 1ттипо1. МеШойз 218, 73-83). Другие примеры альбумин-связывающих пептидов, которые могут применяться в качестве конъюгационных партнеров, включают, например, те, которые содержат консенсусные последовательности Суз-Хаа₁-Хаа₂-Хаа₃-Хаа₄Суз, где Хаа₁ является Азр, Азп, 8ег, ТЬг или Тгр; Хаа₂ является Азп, О1п, Η является, 11е, Ьеи или Ьуз; Хаа₃ является А1а, Азр, РЬе, Тгр или Туг; и Хаа₄ является Азр, О1у, Ьеи, РЬе, 8ег и ТЬг, как описано в патентной заявке И8 2003/0069395 или в Оептз е1 а1. (ГОепшз е1 а1. (2002) 1. Вю1. СЬет.277, 35035-35043).

4) Последовательность РА8.

В других вариантах реализации изобретения гетерологичным компонентом, связанным с фрагментом ФВ или белком Ф-УШ, является последовательность РА8. В одном варианте реализации изобретения химерный белок содержит описанный в данном тексте фрагмент ФВ и последовательность РА8, при этом фрагмент ФВ связан с последовательностью РА8. В другом варианте реализации химерный белок, являющийся объектом данного изобретения, содержит белок Ф-УШ и последовательность РА8, при этом последовательность РА8 экранирует или защищает ФВ-связывающий участок белка Ф-УШ, тем самым подавляя или предотвращая взаимодействие белка Ф-УШ с эндогенным ФВ.

При употреблении в данном тексте выражение последовательность РА8 обозначает аминокислотную последовательность, содержащую, главным образом, остатки аланина и серина, или содержащую, главным образом, остатки аланина, серина и пролина, аминокислотную последовательность, образующую произвольную спиральную конформацию в физиологических условиях. Соотвественно, последовательность РА8 является строительным блоком, аминокислотным полимером либо кассетой последовательности, содержащей, состоящей преимущественно из или состоящей из аланина, серина и пролина, и которая может быть использована как часть гетерологичного компонента в химерном белке. При этом специалисту в данной области техники известно, что аминокислотный полимер также может образовывать произвольную спиральную конформацию в случае, когда отличные от аланина, серина и пролина остатки добавляют в последовательность РА8 в качестве минорных компонентов. Употребляемый в данном тексте термин минорный компонент означает, что аминокислоты, отличные от аланина, серина и пролина, можно добавлять в последовательность РА8 до определенной степени, например до около 12%, т.е. около 12 из 100 аминокислот последовательности РА8, до около 10%, т.е. около 10 из 100 аминокислот последовательности РА8, до около 9%, т.е. около 9 из 100 аминокислот, до около 8%, т.е. около 8 из 100 аминокислот, около 6%, т.е. около 6 из 100 аминокислот, около 5%, т.е. около 5 из 100 аминокислот, около 4%, т.е. около 4 из 100 аминокислот, около 3%, т.е. около 3 из 100 аминокислот, около 2%, т.е. около 2 из 100 аминокислот, около 1%, т. е. около 1 из 100 из аминокислот. Аминокислоты, отличные от аланина, серина и пролина, могут быть выбраны из группы, состоящей из Агд, Азп, Азр, Суз, О1п, О1и,

- 48 028309

01у, Ηΐδ, Не, Ьеи, Ьу8, Ме1. РЬе, ТЬг, Тгр, Туг и ναΐ.

В физиологических условиях участок последовательности РАЗ образует произвольную спиральную конформацию и тем самым может опосредовать повышенную ίη νίνο и/или ίη νίίτο устойчивость к фактору ФВ или белку коагулирующей активности. Так как произвольная спиральная конформация сама по себе не образует устойчивой структуры или не функционирует, биологическая активность, опосредованная фрагментом ФВ или белком Ф-νΙΙΙ, с которым она сшита, сохраняется в значительной степени. В других вариантах реализации изобретения последовательности РАЗ, которые образуют произвольную спиральную конформацию, являются биологически инертными, в особенности в отношении протеолиза в плазме крови, иммуногенности, изоэлектрической точки/изоэлектрического поведения, связывания с рецепторами клеточных поверхностей или интернализации, но в то же время являются биоразлагаемыми, что обеспечивает чистое преимущество перед синтетическими полимерами, такими как ПЭГ.

Неограничивающие примеры последовательностей РАЗ, образующих произвольную спиральную конформацию, включают аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из АЗРААРАРАЗРААРАРЗАРА (ЗЕО ГО N0: 8), ААРАЗРАРААРЗАРАРААРЗ (ЗЕО ГО N0: 9), АРЗЗРЗРЗАРЗЗРЗРАЗРЗЗ (ЗЕО ΙΌ N0: 10), АРЗЗРЗРЗАРЗЗРЗРАЗРЗ (ЗЕО ΙΌ N0: 11), ЗЗРЗАРЗРЗЗРАЗРЗРЗЗРА (ЗЕО ГО N0: 12), ААЗРААРЗАРРАААЗРААРЗАРРА (ЗЕО ГО N0: 13) и АЗАААРАААЗАААЗАРЗААА (ЗЕО ГО N0: 14) или любых их комбинаций. Дополнительные примеры последовательностей РАЗ известны из, например, патентной публикации ИЗ № 2010/0292130 А1 и заявки на публикацию на патентную публикацию ИЗ № \У0 2008/155134 А1.

5) Последовательность НАР.

В определенных вариантах реализации изобретения гетерологичным компонентом, связанным с фрагментом ФВ или белком Ф-νΙΙΙ, является богатый глицином гомо-аминокислотный полимер (НАР от англ. Ιιοιηο-αιηί ηο-асЮ ρο1νιικΓ). Последовательность НАР может содержать повторяющуюся последовательность глицина, которая составляет по меньшей мере 50, по меньшей мере 100, 120, 140, 160, 180, 200, 250, 300, 350, 400, 450 или 500 аминокислот в длину. В одном варианте реализации изобретения последовательность НАР способна продлевать время полужизни компонента, сшитого или связанного с последовательностью НАР. Неограничивающие примеры последовательности НАР включают, но не ограничиваются этим, (О1у)п, (С1у₄Зег)_м или З(О1у,|Зег)_||„ где η равно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, или 20. ΙΒ одном варианте реализации изобретения, η равно 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 26, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 или 40. В другом варианте реализации изобретения, η равно 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 или 200; смотрите, например, ЗсЫарзсЬу М. е( а1., Рго1еш Енд. Эевщн ЗекОющ 20: 273-284 (2007).

6) Трансферрин или его фрагмент.

В определенных вариантах реализации изобретения гетерологичным компонентом, связанным с фрагментом ФВ или белком Ф-νΙΙΙ, является трансферрин или его фрагмент. Для получения химерного белка, являющегося объектом данного изобретения, может быть использован любой трансферрин. Примером может служить человеческий Тф(Тф) дикого типа, который является белком из 679 аминокислот, примерно в 75 КДа (без учета гликозилирования), с двумя основными доменами - N (около 330 аминокислот) и С (около 340 аминокислот), происхождение которого связано с дупликацией гена; см. учетные номера ΟеηΒаηк ММ001063, ХМ002793, М12530, ХМ039845, ХМ 039847 и З95936 ('№·№'№.ηΛί.η^.ηίΕ.£ον/), которые в полном объеме включены в данный текст посредством ссылки. Трансферрин содержит два домена - домен N и домен С. Домен N содержит два субдомена - домен N1 и домен N2, а домен С содержит два субдомена - домен С1 и домен С2.

В одном варианте реализации изобретения часть трансферрина химерного белка содержит сплайсвариант трансферрина. В одном примере сплайс-вариант трансферрина может являться сплайсвариантом человеческого трансферрина, например это номер ΟеηЬаηк ААА61140. В другом варианте реализации изобретения часть трансферрина химерного белка содержит один или более доменов последовательности трансферрина, например домен N домен С, домен N1, домен N2, домен С1, домен С2 или любые их комбинации.

7) Полимер, например полиэтиленгликоль (ПЭГ).

В других вариантах реализации изобретения гетерологичным компонентом, присоединенным к фрагменту ФВ или белку, характеризующемуся коагулирующей активностью, например Ф-νΙΙΙактивностью, является растворимый полимер, известный в данной области техники, включая, но не ограничиваясь этим, полиэтиленгликоль, кополимеры этиленгликоль/пропиленгликоль, карбоксиметилцеллюлозу, декстран или поливиниловый спирт. Гетерологичный компонент, такой как растворимый полимер, может быть присоединен в любой позиции в пределах фрагмента ФВ или белка Ф-νΙΙΙ, либо к N или С-концу. В других вариантах реализации химерный белок, являющийся объектом данного изобретения, содержит белок Ф-νΙΙΙ и ПЭГ, при этом ПЭГ экранирует или защищает ФВ-связывающий участок белка Ф-νΙΙΙ, тем самым подавляя или предотвращая взаимодействие белка Ф-νΙΙΙ с эндогенным ФВ.

В определенных вариантах реализации изобретения химерный белок содержит описанный в данном тексте фрагмент ФВ и ПЭГ, при этом фрагмент ФВ связан с ПЭГ. В другом варианте реализации изобретения химерный белок содержит фрагмент ФВ и белок Ф-νΙΙΙ, которые связаны друг с другом, при этом

- 49 028309 фрагмент ФВ связан с ПЭГ, белок Ф-УШ связан с ПЭГ либо и фрагмент ФВ и белок Ф-УШ связаны с ПЭГ. 1В других вариантах реализации изобретения химерный белок, содержащий фрагмент ФВ, связанный с ПЭГ, дополнительно связан с гетерологичным компонентом, выбранным из группы, состоящей из константной области иммуноглобулина или ее части (например, Рс-области), последовательности РАЗ, ГЭК, альбумина, его фрагмента или варианта. В других вариантах реализации изобретения химерный белок содержит фрагмент ФВ и белок Ф-УШ, которые связаны друг с другом, при этом белок Ф-УШ дополнительно связан гетерологичным компонентом, выбранным из группы, состоящей из константной области иммуноглобулина или ее части (например, Рс-области), последовательности РАЗ, ГЭК, альбумина, его фрагмента или варианта. В других вариантах реализации изобретения химерный белок содержит фрагмент ФВ, связанный с ПЭГ, и белок Ф-УШ, связанный с ПЭГ, которые связаны друг с другом, при этом фрагмент ФВ дополнительно связан с первым гетерологичным компонентом, выбранным из группы, состоящей из константной области иммуноглобулина или ее части (например, Рс-области), последовательности РАЗ, ГЭК, альбумина, его фрагмента или варианта, а белок Ф-УШ дополнительно связан со вторым гетерологичным компонентом, выбранным из группы, состоящей из константной области иммуноглобулина или ее части (например, Рс-области), последовательности РАЗ, ГЭК, альбумина, его фрагмента или варианта.

Также в изобретении предложены химически модифицированные производные химерного белка, являющегося объектом данного изобретения, которые могут обеспечивать дополнительные преимущества, такие как повышенные растворимость, стабильность и время циркуляции полипептида либо сниженная иммуногенность (смотрите патент ИЗ № 4179337). Химические компоненты для модификации могут быть выбраны из группы, состоящей из водорастворимых полимеров, включая, но не ограничиваясь этим, полиэтиленгликоль, кополимеры этиленгликоль/пропиленгликоль, карбоксиметилцеллюлозу, декстран или поливиниловый спирт. Химерный белок может быть модифицирован в произвольных позициях в пределах молекулы или в Ν- или С-концах либо в заданных позициях в пределах молекулы, и может содержать один, два, три или более присоединенных химических компонентов.

Полимер может иметь любую молекулярную массу и может быть разветвленным или неразветвленным. Для полиэтиленгликоля, в одном варианте реализации изобретения, молекулярная масса составляет величину между около 1 и около 100 кДа для удобства в эксплуатации и производстве. Могут использоваться и другие размеры в зависимости от необходимого профиля (например, необходимой продолжительности пролонгированного высвобождения, воздействий в случае какой-либо биологической активности, удобства в эксплуатации, степени или отсутствия антигенности и других известных воздействий полиэтиленгликоля на белок или его аналог). Например, полиэтиленгликоль может имень среднюю молекулярную массу, составляющую около 200, 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 9500, 10,000, 10,500, 11,000, 11,500, 12,000, 12,500, 13,000, 13,500, 14,000, 14,500, 15,000, 15,500, 16,000, 16,500, 17,000, 17,500, 18,000, 18,500, 19,000, 19,500, 20,000, 25,000, 30,000, 35,000, 40,000, 45,000, 50,000, 55,000, 60,000, 65,000, 70,000, 75,000, 80,000, 85,000, 90,000, 95,000 или 100,000 кДа.

В некоторых вариантах реализации изобретения полиэтиленгликоль может иметь разветвленную структуру. Разветвленные полиэтиленгликоли описаны, например, в патенте ИЗ № 5643575; Могригдо е! а1., Арр1. ВюсЬет. Вю1есЬпо1. 56:59-72 (1996); Уο^οЬ^еνеΐ а1., №с1ео814е8№с1еоЬ4е8 18:2745-2750 (1999) и СаЬсеЬе! а1., Вюсопщд. СЬет. 10:638-646 (1999), которые все в полном объеме включены в данный текст посредством ссылки.

Также может варьироваться количество (т. е. степень замещения) полиэтиленгликольных компонентов, присоединенных к каждому химерному белку, фрагменту ФВ или белку Ф-УШ, которые являются объектами данного изобретения. Например, пэгилированные белки, которые являются объектами данного изобретения, могут быть связаны в среднем с 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 17, 20 или более молекулами полиэтиленгликоля. Аналогично, средняя степень замещения находится в пределах диапазонов, таких как 1-3, 2-4, 3-5, 4-6, 5-7, 6-8, 7-9, 8-10, 9-11, 10-12, 11-13, 12-14, 13-15, 14-16, 15-17, 16-18, 17-19 или 18-20 полиэтиленгликольных компонентов на молекулу белка. Способы определения степени замещения обсуждаются, например, в Эе1да4о е! а1., СгЪ. Ке\'. ТЬет. Эгид Сатег Зу8. 9:249-304 (1992).

В некоторых вариантах реализации изобретения белок Ф-УШ может быть ПЭГилированным. ПЭГилированный фактор УШ может обозначать конъюгат, образованный между фактором УШ и по меньшей мере одной молекулой полиэтиленгликоля (ПЭГ).

В других вариантах реализации применяемый в изобретении белок Ф-УШ конъюгирован с одним или более полимерами. Полимер может быть водораствомимым и ковалентно либо нековалентно присоединенным к фактору УШ или другим компонентам, конъюгированным с фактором УШ. Неограничивающими примерами могут быть поли(оксид алкилена), поли(винилпирролидон), поли(виниловый спирт), полиоксазолин или поли(акрилоилморфолин). Дополнительные типы полимерконъюгированного Ф-УШ раскрыты в патенте ИЗ № 7199223.

- 50 028309

8) Гидроксиэтиловый крахмал (ГЭК).

В определенных вариантах реализации изобретения гетерологичным компонентом, присоединенным к фрагменту ФВ или белку Ф-УШ, является полимер, например гидроксиэтиловый крахмал (ГЭК) или его производное. В одном варианте реализации изобретения химерный белок содержит описанный в данном тексте фрагмент ФВ и ГЭК, при этом фрагмент ФВ связан с ГЭК. ГВ других вариантах реализации химерный белок, являющийся объектом данного изобретения, содержит белок Ф-УШ, сшитый с гидроксиэтиловым крахмалом (ГЭК), при этом гидроксиэтиловый крахмал или его производное экранирует или защищает ФВ-связывающий участок белка Ф-УШ от эндогенного ФВ, тем самым подавляя или предотвращая взаимодействие белка Ф-УШ с эндогенным ФВ.

Гидроксиэтиловый крахмал (ГЭК) является производным амилопектина природного происхождения и в организме расщепляется альфа-амилазой. ГЭК является замещенным производным углеводного полимера амилопектина, который присутствует в кукурузном крахмале в концентрации до 95% по массе. ГЭК проявляет полезные биологические свойства и применяется клиниками в качестве вещества для замещения объема крови в гемодилюционной терапии (Зоттегтеуег еГ а1., КгапкепНаи5рНагта/1е. 8(8), 271-278 (1987) и \Уе1б1ег еГ а1., Аг/пеип.-РогесНипд/ОгидВею 41, 494-498 (1991)).

Амилопектин содержит компоненты глюкозы, при этом в основной цепи находятся альфа-1,4гликозидные связи, а в разветвляющихся участках находятся альфа-1,6-гликозидные связи. Физикохимические свойства этой молекулы определяются, главным образом, типом гликозидных связей. Благодаря разорванной альфа-1,4-гликозидной связи получают спиральные структуры, содержащие около шести мономеров глюкозы на виток. Физико-химические, а также биохимические свойства полимера могут быть модифицированы при помощи замещения. При помощи щелочного гидроксиэтилирования можно осуществлять введение гидроксиэтиловой группы. Подбирая условия реакции можно получить различную реактивность соответствующей гидрокси-группы в незамещенном мономере глюкозы по отношению к гидроксиэтилированию. Благодаря этому факту, специалист в данной области техники может в ограниченной степени влиять на схему замещения.

ГЭК главным образом характеризуется распределением молекулярной массы и степенью замещения. Степень замещение, обозначаемая как СЗ, обозначает молярное замещение, известное специалистам в данной области; смотрите Зоттегтеуег еГ а1.,КгапкепЬаи8рЬагта71е, 8(8), 271-278 (1987), как указано выше, в частности, с. 273.

В одном варианте реализации изобретения гидроксиэтиловый крахмал имеет среднюю молекулярную массу (среднюю массу), составляющую от 1 до 300 кД, от 2 до 200 кД, от 3 до 100 кД или от 4 до 70 кД. Гидроксиэтиловый крахмал может дополнительно иметь степень молярного замещения, составляющую от 0,1 до 3, предпочтительно от 0,1 до 2, более предпочтительно от 0,1 до 0,9, предпочтительно от 0,1 до 0,8, и соотношение между С2:С6 заменой в диапазоне от 2 до 20 по отношению к гидроксиэтиловым группам. Неограничивающим примером ГЭК, имеющего среднюю молярную массу около 130 кД, является ГЭК со степенью замещения, составляющей от 0,2 до 0,8, например 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7 или 0,8, предпочтительно от 0,4 до 0,7, например 0,4, 0,5, 0,6 или 0,7. В конкретном варианте реализации изобретения ГЭК со средней молярной массой около 130 кД является ВОЛЮВЕН® от Ргекешик. ВОЛЮВЕН® является искусственным коллоидом, применяемым, например, для замещения объема, которое используется в показаниях к применению для лечения или профилактики гиповолемии. Характеристиками ВОЛЮВЕН являются средняя молярная масса в 130,000+/-20,000 Д, молярное замещение 0,4 и соотношение С2:С6 около 9:1. В других вариантах реализации изобретения диапазоны средней молекулярной массы гидроксиэтилового крахмала составляют, например, от 4 до 70 кД, или от 10 до 70 кД, или от 12 до 70 кД, или от 18 до 70 кД, или от 50 до 70 кД, или от 4 до 50 кД, или от 10 до 50 кД, или от 12 до 50 кД, или от 18 до 50 кД, или от 4 до 18 кД, или от 10 до 18 кД, или от 12 до 18 кД, или от 4 до 12 кД, или от 10 до 12 кД, или от 4 до 10 кД. В других вариантах реализации изобретения средняя молекулярная масса применяемого гидроксиэтилового крахмала находится в диапазоне от более чем 4 кД и до 70 кД, например около 10 кД, или в диапазоне от 9 до 10 кД, или от 10 до 11 кД, или от 9 до 11 кД, или около 12 кД, или в диапазоне от 11 до 12 кД, или от 12 до 13 кД, или от 11 до 13 кД, или около 18 кД, или в диапазоне от 17 до 18 кД, или от 18 до 19 кД, или от 17 до 19 кД, или окло 30 кД, или в диапазоне от 29 до 30 кД, или от 30 до 31 кД, или около 50 кД, или в диапазоне от 49 до 50 кД, или от 50 до 51 кД, или от 49 до 51 кД.

В определенных вариантах реализации изобретения гетерологичным компонентом могут быть смеси гидроксиэтиловых крахмалов, имеющих различные средние молекулярные массы и/или различные степени замещения, и/или различные соотношения С2:С6 замещения. Следовательно, могут применяться смеси гидроксиэтиловых крахмалов, имеющие различные средние молекулярные массы и различные степени замещения, и различные соотношения С2:С6 замещения, или имеющие различные средние молекулярные массы и различные степени замещения, и одинаковые либо приблизительно одинаковые соотношения С2: С6 замещения, или имеющие различные средние молекулярные массы и одинаковые либо приблизительно одинаковые степени замещения, и различные соотношения С2:С6 замещения, или имеющие одинаковые либо приблизительно одинаковые средние молекулярные массы и различные степени

- 51 028309 замещения, и различные соотношения С2:С6 замещения, или имеющие различные средние молекулярные массы и одинаковые либо приблизительно одинаковые степени замещения, и одинаковые либо приблизительно одинаковые соотношения С2:С6 замещения, или имеющие одинаковые либо приблизительно одинаковые средние молекулярные массы и различные степени замещения, и одинаковые либо приблизительно одинаковые соотношения С2:С6 замещения, или имеющие одинаковые либо приблизительно одинаковые средние молекулярные массы и одинаковые либо приблизительно одинаковые степени замещения, и различные соотношения С2:С6 замещения, или имеющие одинаковые либо приблизительно одинаковые средние молекулярные массы и одинаковые либо приблизительно одинаковые степени замещения, и одинаковые либо приблизительно одинаковые соотношения С2:С6 замещения.

9) Полисиаловые кислоты (ПСК).

В определенных вариантах реализации изобретения неполипептидным гетерологичным компонентом, присоединенным к фрагменту ФВ или белку Ф-'УШ, является полимер, например полисиаловые кислоты (ПСК) или их производные. Полисиаловые кислоты (ПСК) имеют природное происхождение и являются неразветвленными полимерами сиаловой кислоты, которые синтезируются определенными бактериальными штаммами или в определенных клетках млекопитающих Ко!Ь I., е! а1. (1993) ш Ро1у81а1ю Ааб: Ргот МюгоЬек !о Мап, ебк Ко!Ь I., КибкЬаикег и., Тгоу Р.А. (ВткЬаикег Vе^1ад, Ваке1, ЗШЕебапб), р. 335-348. Их можно синтезировать с различной степенью полимеризации от п=около 80 или более остатков сиаловой кислоты до п=2 при помощи ограниченного кислотного гидролиза или при помощи расщепления нейраминидазами, или при помощи фракционирования природных, полученных из бактерий форм полимера. Состав различных полисиаловых кислот также варьируется таким образом, что существуют гомополимерные формы, т.е. альфа-2,8-связанная полисиаловая кислота, содержащая капсульный полисахарид штамма К1 Е. соН и менингококки группы В, которую также можно обнаружить в эмбриональной форме адгезивных молекул нервных клеток (Ν-САМ - от англ. пеигопа1 се11 абЬекюп то1еси1е). Также существуют гетерополимерные формы, такие как чередующаяся альфа-2,8 и альфа-2,9 полисиаловая кислота штамма К92 Е. соН и полисахариды группы С Ν. тешпдШб18. Сиаловую кислоту также можно обнаружить в чередующихся кополимерах с мономерами, отличающимися от сиаловой кислоты, таких как группа У135 или группа Υ Ν. тешпдШб18. Полисиаловые кислоты обладают важными биологическими функциями, включая уклонение патогенных бактерий от иммунной системы и системы комплемента и регуляцию глиальной адгезионной способности незрелых нейронов во время фетального развития (при этом полимер имеет анти-адгезионную функцию) СЬо апб Тгоу, РШ.А.З., ИЗА, 91 (1994) 1142711431, хотя рецепторы полисиаловых кислот у млекопитающих не известны. Альфа-2,8-связанная полисиаловая кислота штамма К1 Е. соН также известна как коломиновая кислота и используется (с разными длинами) в качестве примера реализации настоящего изобретения. Были описаны различные способы присоединения или конъюгации полисиаловых кислот к полипептиду (например, смотрите патент ИЗ № 5846951; УО-А-0187922 и ИЗ 2007/0191597 А1, которые все в полном объеме включены в данный текст посредством ссылки.

С) Белок Ф-’УШ.

Употребляемое в данном тексте выражение белок Ф-^И обозначает функциональный полипептид Ф-’УШ в своей обычной роли в коагуляции, если не указано иное. Термин белок Ф^Ш включает в себя функциональный фрагмент, вариант, аналог или производное, которые сохраняют функцию полноразмерного фактора VIII дикого типа в процессе коагуляции. Выражение белок Ф-УШ взаимозаменяемо употребляется с выражение полипептид (или белок) Ф-^П или просто Ф-^И. Примеры функций ФVIII включают, но не ограничиваются этим, способность активировать коагуляцию, способность действовать как кофактор фактора IX или способность образовывать теназный комплекс с фактором IX в присутствии Са2+ и фосфолипидов, которые затем преобразует фактор X в активированную форму Ха. Белок Ф-^П может являться человеческим, свиным, собачьим, крысиным или мышиным белком Ф-^И. Вдобавок, при сравнении Ф-^И, полученного от людей и других видов, были обнаружены консервативные остатки, которые, вероятно, являются необходимыми для функционирования (Сатегоп е! а1., ТЬготЬ. Наето8!. 79:317-22 (1998); ИЗ 6251632).

Существует большое количество тестов для оценки функции системы свертывания крови: тест на активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ), хромогенный анализ, метод ротационной тромбоэластометрии (РОТЭМ), тест на протромбиновый индекс (ПИ) (также применяемый для определения МНО), фибриноген-тест (часто проводимый методом Клауса), количество тромбоцитов, тестирование тромбоцитарной функции (часто проводимый при помощи РРА-100), тромбиновое время, время кровотечения, тест смешивания (показывающий, исправляется ли нарушение при смешивании плазмы крови пациента с нормальной плазмой), анализ фактора свертывания крови, антифосфолипидные антитела, Ό-димер, генетические тесты (например, фактор V Ляйдена, мутация протромбина О20210А), время разбавленного яда гадюки Рассела (бКVVТ-тест), различные тесты тромбоцитарной функции, тромбоэластография (ТЭГ или Соноклот), тромбоэластометрия (ТЭМ®, например РОТЭМ®) или время лизиса эуглобулина (ВЛЭ).

АЧТВ-тест является показателем эффективности и определяет эффективность как внутреннего (также называемого механизмом активации свертывания крови), так и общего механизма коагуляции.

- 52 028309

Этот тест обычно применяется для определения коагулирующей активности коммерчески доступных рекомбинантных факторов свертывания крови, например Ф-У111 или Ф-1Х. Он применяется совместно с тестом на протромбиновый индекс (ПИ), который определяет внешний механизм.

РОТЭМ-анализ дает информацию о полной кинетике гемостаза: времени свертывания крови, образовании тромбов, стабильности тромбов и лизисе. Разные параметры в тромбоэластометрии зависят от активности плазматической коагулирующей системы, тромбоцитарной функции, фибринолиза или многих факторов, которые влияют на эти взаимодействия. Данный метод может дать полную информацию о вторичном гемостазе.

Известны полипептидные и полинуклеотидные последовательности Ф-У111, как и последовательности большого количества функциональных фрагментов, мутантов и модифицированных версий. Примеры последовательностей (полноразмерных) человеческого Ф-У111 приведены как подпоследовательности в 8Ер ΙΌ Ν0: 16 или 18.

Таблица 2

Полноразмерный Ф-У111 (сигнальный пептид Ф-У111 выделен подчеркиванием; тяжелая цепь Ф-У111 выделена двойным подчеркиванием; В-домен выделен курсивом и легкая цепь Ф-У111 показана обычным текстом)С

Сигнальный пептид: (δΕρίϋΝΟ: 15)

М01ЕЬЗТСЕЕЬСЬЬРЕСЕЗ

Зрелый фактор VIII (8 Ер ΟΝΟ: 16)*

АТРРУУЬбАУЕЬЗТОУМОЗРЬбЕЬРУРАРЕРРРУРКЗЕРЕЫТЗУУУККТЬЕУЕЕТРНЬЕЫТАКРРРРОТМбЬ

ЬбРТЮАЕУУРТУУРТЬКЫМАЗНРУЗРНАУбУЗУ^КАЗЕбАЕУРРОТЗОРЕКЕРРКУЕРббЗНТУУлГОУЬК

ЕЫ6РМА5РРРСРТ¥5¥Ь5НУРРУКРРЫ56Ы6АРРУСРЕ65РАКЕКТ0ТРНКЕ1РЬЕАУЕРЕ6К5№Н5ЕТК

Ы5РМ0РРРАА5АРА№РКМНТУК6¥УКР5ЬР6Ы6СНРК5У¥№НУ16М6ТТРЕУН51ЕРЕ6НТЕЬУРЫНР0А

5ЬЕ15Р1ТЕЬТА0ТШУ[РР60ЕРРЕСН155Н0НР6МЕА¥УКУР5СРЕЕР0РРМКЫЫЕЕАЕР¥РРРРТР5ЕМ

ΡννΡΕΡΡΡΝ5Ρ5ΕΙ0ΙΡ5νΑΚΚΗΡΚΤ№νΗΥΙΑΑΕΕΕΡ№ΡΥΑΡΡνΡΑΡΡΡΡ5ΥΚ50ΥΡΝΝ6Ρ0ΡΙ6ΡΚΥΚΚν

ΡΕΜΑΥΤΡΕΤΕΚΤΡΕΑΙ0ΗΕ56ΙΡ6ΡΡΡΥ6Εν6ΡΤΡΡΙΙΕΚΝ0Α5ΡΡΥΝΙΥΡΗ6ΙΤΡνΡΡΡΥ5ΡΡΡΡΚ6νΚΗ

ЬКРЕР1РР6Е1ЕК¥К№ТУТУЕР6РТК5РРРСРТР¥¥55ЕУКМЕРРРА56Ы6РЬЫС¥КЕ5УР0Р6Ы01М5

РКРЫУТЬЕЗУЕРЕЫРЗОТУЬТЕЫЮРЕЬРЫРАбУОЬЕРРЕЕОАЗХПМНЗТЫбУУЕРЗЬОЬЗУСЬНЕУАУОТУ!

РЗТбАОТРЕРЗУЕЕЗбУТЕКНКМУУЕРТРТРЕРЕЗбЕТУЕМЗМЕЫРбЫлИРбСНЫЗРЕРЫРбМТАРРКУЗЗ εΡΚΝΤ6ΡΥΥΕΡ5ΥΕΡΙ5ΑΥΡΡ5ΚΝΝΑΙΕΡΡ5Γ5Ο№5Ρ#Ρ5ΤΡΰΚΰΡΝΑΤΤΙΡΕΝΌΙΕΚΤΌΡΚΡΑΗΡТРМРК ΙΰΝν333ΟΕΡΜΡΕΡΰ3ΡΤΡΗι3Ρ3Ρ3ΟΡΰΕΑΚΥΕΤΕ3ΟΟΡ3Ρι3ΑΙΟ3ΝΝ3Ρ3ΕΜΤΗΕΡΡΰΡΗΗ3ι3ΟΜνΕΤΡΕ 33ΕΰΡΡΡΝΕΚΡι3ΤΤΑΑ ΤΕΕΚΚΕΌΡΚνΡΕ Τ3ΝΝΕ13 ΤΙΡ3ΟΝΕΑΑ3ΤΟΝΤ33Ε 3ΡΡ3ΜΡνΗΥΌ3ΰΕΌΤΤΕΡ3 ΚΚ33ΡΕΤΕ333ΡΕ3Ε3ΕΕΝΝ03ΚΕΕΕ33ΕΜΝ3ΰΕ33^3ΚΝν33ΤΕ33ΡΕΕΚ3ΚΡΑΗ3ΡΑΕΕΤΚ0ΝΑΕΕΚν3 Ι3ΕΕΚΤΝΚΤ3ΝΝ3ΑΤΝΡΚΤΗΙΡ3Ρ3ΕΡΙΕΝ3Ρ3νΚΰΝΙΡΕ3ΠΤΕΡΚΚνΤΡΕΙΗΏΡΜΕΜΌΚΝΑΤΑΕΡΕΝΗΜ3 ΝΚΤΤ33ΚΝΜΕΜνΰΰΚΚΕ3ΡΙΡΡΌΑΰΝΡΌΜ3ΡΡΚΜΕΡΕΡΕ3ΑΡΚΙΰΡΤΗ3ΚΝ3ΕΝ33ΰ3Ρ3ΡΚΰΕν3Ε3ΡΕΚ 3νΕ3ΰΝΡΕ3ΕΚΝΚννν3Κ3ΕΡΤΚΠν3ΕΚΕΜνΡΡ33ΡΝΕΡΕΤΝΕΠΝΕΗΕΝΝΤΗΝΰΕΚΚΙΰΕΕΙΕΚΚΕΤΕΙΰΕ ΝννΡΡΰΙΗΤνΤ3ΤΚΝΡΜΚΝΡΡΡΕ3ΤΡΰΝνΕ33ΥΠ3ΑΥΑΡνΡΰΠΕΡ3ΡΝΠ3ΤΝΡΤΚΚΗΤΑΗΡ3ΚΚ3ΕΕΕΝΕΕ 3Ε3ΝΰΤΚΰΐνΕΚΥΑ3ΤΤΡΙ3ΡΝΤ3ΰΰΝΡνΤΰΡ3ΚΡΑΕΚΰΡΡΕΡΕΕΕΤΕΕΕΚΡΙΐνΠΠΤ3ΤΰΝ3ΚΝΜΚΗΕΤΡ ЗТЬ Τζ)ΙΟΥΝΕΚΕΚ(3ΑΙΤζ)3ΡΕ3Ο(3Ε ΤΡ3Η3ΙΡ<ΰΑΝΡ3ΡΕΡΙΑΚν33ΡΡ3ΙΡΡΙΥΕ ΤΡνΕΡζ)ΟΝ33ΡΙΕΡΑΑ3 ΥΡΚΚΌ33νΰΕ33ΗΡΡΰ3ΑΚΚΝΝΡ3ΡΑΙΡΤΕΕΜΤ3ΠΰΡΕν33Ρ3Τ3ΑΤΝ3νΤΥΚΚνΕΝΤνΡΡΚΡΠΕΡΚΤ33Κ νΕΕΕΡΚνΗΙΥΰΚΟΕΡΡΤΕΤ3Ν(33Ρ3ΗΕΟΕνΕ33ΕΕΰ3ΤΕ3ΑΙΚΝΝΕΑΝΡΡ3ΚνΡΡΕΡνΑΤΕ33ΑΚΤΡ3ΚΕΕ ΰΡΕΑ^ΟΝΗΥ3ΤΰΙΡΚΕΕ^Κ3ΰΕΚ3ΡΕΚΤΑΡΚΚΚΟΤΙΕ3ΕΝΑ3Ε3ΝΗΑΙΑΑΙΝΕ3ΰΝΚΡΕΙΕνΤ^ΑΚΰ3ΡΤΕ ΡΡΟ5ρ7νΡΡνΡΚΡΗρΡΕΙΤΡΤΤΡ05Ρ0ΕΕΙΡΥΡΡΤΙ5νΕΜΚΚΕΡΕΡΙΥΡΕΡΕΝ05ΡΡ5Ε0ΚΚΤΡΗΥΕΙΑΑνΕ ΡΡ№ΡΥΟΜ555ΡΗνΡΡΝΡΑ05Ο5νΡ0ΕΚΚννΕ0ΕΕΤΡΟ5ΕΤ0ΡΡΥΡΟΕΡΝΕΗΡΟΡΡΟΡΥΙΡΑΕνΕΡΝΙΜνΤΕ ΡΝ<2Α5ΡΡΥ5ΕΥ55ΡΙ5ΥΕΕΡ<2Ρ<2ΟΑΕΡΡΚΝΕΥΚΡΝΕΤΚΤΥΕ1/ίΚν<2ΗΗΜΑΡΤΚΡΕΕΡ(ΡΚΑ1/ίΑΥΕ5ΡνΡΡΕΚΡ νΗ50ΡΙ0ΡΡΡν0ΗΤΝΤΡΝΡΑΗ0Ρ<2ντν<2ΕΕΑΡΕΕΤΙΕΡΕΤΚ51/ίΥΕΤΕΝΜΕΡΝ0ΡΑΡ0ΝΙ<2ΜΕΡΡΤΕΚΕΝΥΡ ΕΗΑΙΝΟΥΙΜΡΤΡΡΟΡνΜΑΟΡΟΡΙΡΙ/ίΥΡΡΕΜΟΕΝΕΝΙΗΕΙΗΕΕΟΗΥΕΤΥΡΚΚΕΕΥΚΜΑΡΥΝΡΥΡΟνΕΕΤνΕΜ ΡΡ5ΚΑ0™ΡνΕ0ΡΙ0ΕΗΡΗΑ0Μ5ΤΡΕΡνΥ5ΝΚ0<2ΤΡΡ0ΜΑ50ΗΙΡΡΕ<2ΙΤΑ50<2Υ0<21/ίΑΡΚΡΑΡΡΗΥ505Ι ΝΑ№5ΤΚΕΡΕ51/ίΙΚΥΡΡΡΑΡΜΙΙΗΟΙΚΤ<2ΟΑΡ<2ΚΕ55ΡΥΙ5<2ΕΙΙΜΥ5ΡΡΟΚΚ№2ΤΥΡΟΝ5ΤΟΤΡΜνΕΕΟΝν Ρ55ΟΙΚΗΝΙΕΝΡΡΙ1АР¥1РЬНРТН¥51Р5ТРРМЕРМССРРЫ5С5МРЬСМЕ5КА15ΡΑ<2ΙΤΑ55ΥΕΤΝΜΕΑ ™5Ρ5ΚΑΡΡΗΡςθΡ5ΝΑ№ΡΡ0νΝΝΡΚΕ№Ρ0νΡΕ0ΚΤΜΚνΤθνΤΤ0θνΚ5ΡΡΤ5ΜΥνΚΕΕΡΙ5550ΡΟΗ0№Τ ЬЕЕ<2ЫСКУКУЕ<2еЫ<2О5ЕТРУУК5ЬОРРЬЬТРУЬР1НР<251лГУН<21АЬРМЕУЬеСЕА<2ОЬ¥

- 53 028309

Таблица З

Нуклеотидная последовательность, кодирующая полноразмерный Ф-νΙΙΙ (5ЕР ΙΏ N0: 17)*

661 АТ6САААТА6А6СТСТССАССТ6

721 СТТСТТТСТ6Т6ССТТТТ6С6АТТСТ6СТТТА6Т6ССАССА6АА6АТАСТАССТС66Т6С

781 АСТССААСТСТСАТСССАСТАТАТССАААСТСАТСТСССТСАССТСССТСТССАСССААС

841 АТТТССТССТАСАСТСССААААТСТТТТССАТТСААСАССТСАСТССТСТАСАААААСАС

901 ТСТСТТТСТАСААТТСАСССАТСАССТТТТСААСАТСССТААСССААССССАСССТССАТ

961 СССТСТССТАССТССТАССАТССАСССТСАССТТТАТСАТАСАСТССТСАТТАСАСТТАА

1021 СААСАТСССТТСССАТССТСТСАСТСТТСАТССТСТТССТСТАТССТАСТССАААССТТС

1081 ТСАСССАССТСААТАТСАТСАТСАСАССАСТСАААСССАСАААСААСАТСАТАААСТСТТ

1141 СССТССТССААСССАТАСАТАТСТСТСССАССТССТСАААСАСААТССТССААТССССТС

1201 ТСАСССАСТСТСССТТАССТАСТСАТАТСТТТСТСАТСТССАССТССТААААСАСТТСАА

1261 ТТСАССССТСАТТССАССССТАСТАСТАТСТАСАСААСССАСТСТССССААССААААСАС

1321 АСАСАССТТССАСАААТТТАТАСТАСТТТТТССТСТАТТТСАТСААСССААААСТТСССА

1381 СТСАСАААСАААСААСТССТТСАТССАССАТАСССАТССТССАТСТССТССССССТСССС

1441 ТААААТССАСАСАСТСААТССТТАТСТАААСАССТСТСТСССАССТСТСАТТССАТСССА

1501 САССАААТСАСТСТАТТСССАТСТСАТТССААТССССАССАСТССТСААСТССАСТСААТ

1561 АТТССТССААССТСАСАСАТТТСТТСТСАССААССАТССССАССССТССТТССАААТСТС

1621 СССААТААСТТТССТТАСТССТСАААСАСТСТТСАТССАССТТССАСАСТТТСТАСТСТТ

1681 ТТСТСАТАТСТСТТСССАССААСАТСАТСССАТССААССТТАТСТСАААСТАСАСАССТС

1741 ТССАСАССААССССААСТАССААТСАААААТААТСААСААССССААСАСТАТСАТСАТСА

1801 ТСТТАСТСАТТСТСАААТССАТСТССТСАССТТТСАТСАТСАСААСТСТССТТССТТТАТ

1861 ССАААТТСССТСАСТТСССААСААССАТССТААААСТТСССТАСАТТАСАТТССТССТСА

1921 АСАССАССАСТСССАСТАТССТСССТТАСТССТССССССССАТСАСАСААСТТАТААААС

1981 ТСААТАТТТСААСААТСССССТСАССССАТТССТАССААСТАСААААААСТСССАТТТАТ

2041 СССАТАСАСАСАТСАААССТТТААСАСТССТСААССТАТТСАССАТСААТСАССААТСТТ

2101 СССАССТТТАСТТТАТССССААСТТССАСАСАСАСТСТТСАТТАТАТТТААСААТСААСС

2161 ААССАСАССАТАТААСАТСТАСССТСАСССААТСАСТСАТСТСССТССТТТСТАТТСААС

2221 САСАТТАССААААССТСТААААСАТТТСААССАТТТТССААТТСТСССАССАСАААТАТТ

2281 САААТАТАААТССАСАСТСАСТСТАСААСАТСССССААСТАААТСАСАТССТСССТСССТ

2341 САСССССТАТТАСТСТА6ТТТССТТААТАТССАСАСАСАТСТАССТТСАССАСТСАТТСС

2401 СССТСТССТСАТСТССТАСАААСААТСТСТАСАТСАААСАССАААССАСАТААТСТСАСА

2461 СААСАССААТСТСАТССТСТТТТСТСТАТТТСАТСАСААСССААССТССТАССТСАСАСА

2521 СААТАТАСААСССТТТСТССССААТССАССТССАСТССАССТТСАССАТССАСАСТТССА

2581 АСССТССААСАТСАТССАСАССАТСААТСССТАТСТТТТТСАТАСТТТССАСТТСТСАСТ

2641 ТТСТТТССАТСАССТСССАТАСТССТАСАТТСТААССАТТССАССАСАСАСТСАСТТССТ

- 54 028309

2701 ТТСТСТСТТСТТСТСТССАТАТАССТТСАААСАСААААТССТСТАТСААСАСАСАСТСАС 2761 ССТАТТСССАТТСТСАССАСАААСТСТСТТСАТСТССАТССААААСССАССТСТАТССАТ 2821 ТСТССССТСССАСААСТСАСАСТТТСССААСАСАСССАТСАСССССТТАСТСААССТТТС 2 8 81 ТАСТТСТСАСААСААСАСТССТСАТТАТТАССАССАСАСТТАТСААСАТАТТТСАССАТА 2941 СТТ6СТ6А6ТАААААСААТ6ССАТТ6ААССАА6АА6СТТСТСССА6ААТТСАА6АСАССС 3001 ТАССАСТАСССААААССААТТТААТСССАССАСААТТССАСААААТСАСАТАСАСААСАС 3061 ТСАСССТТССТТТССАСАСАСААСАССТАТСССТААААТАСААААТСТСТССТСТАСТСА 3121 ТТТСТТСАТССТСТТСССАСАСАСТССТАСТССАСАТССССТАТССТТАТСТСАТСТССА 3181 АСААСССАААТАТСАСАСТТТТТСТСАТСАТССАТСАССТССАССААТАСАСАСТААТАА 3241 САСССТСТСТСАААТСАСАСАСТТСАССССАСАССТССАТСАСАСТССССАСАТССТАТТ 3301 ТАССССТСАСТСАССССТССААТТААСАТТАААТСАСАААСТССССАСААСТССАССААС 3361 АСАСТ Т СААСАААС Τ Т САТ Τ Т САААСТ Τ Т С ТАСТАСАТ САААТААТ С Т САТ Τ Т СААСААТ 3421 ТССАТСАСАСААТТТСССАССАССТАСТСАТААТАСААСТТССТТАССАСССССААСТАТ 3481 СССАСТТСАТТАТСАТАСТСААТТАСАТАССАСТСТАТТТСССАААААСТСАТСТССССТ 3541 ТАСТСАСТСТССТССАССТСТСАССТТСАСТСААСААААТААТСАТТСАААСТТСТТАСА 3601 АТСАССТТТААТСААТАСССААСАААСТТСАТССССААААААТСТАТССТСААСАСАСАС 3661 ТССТАССТТАТТТАААСССААААСАССТСАТССАССТССТТТСТТСАСТАААСАТААТСС 3721 СТТАТТСАААСТТАССАТСТСТТТСТТАААСАСАААСААААСТТССААТААТТСАССААС 3781 ТААТАСАААСАСТСАСАТТСАТСССССАТСАТТАТТААТТСАСААТАСТССАТСАСТСТС 3841 ССААААТАТАТТАСАААСТСАСАСТСАСТТТААААААСТСАСАССТТТСАТТСАТСАСАС 3901 ААТССТТАТССАСАААААТССТАСАССТТТСАСССТАААТСАТАТСТСАААТААААСТАС 3961 ТТСАТСААААААСАТССАААТССТССААСАСААААААСАСССССССАТТССАССАСАТСС 4 021 АСААААТССАСАТАТСТССТТСТТТААСАТССТАТТСТТСССАСААТСАССААССТССАТ 4081 АСАААССАСТСАТССАААСААСТСТСТСААСТСТССССААССССССАСТССАААССААТТ 4141 АСТАТССТТАССАССАСАААААТСТСТССААССТСАСААТТТСТТСТСТСАСАААААСАА 4201 АСТССТАСТАССАААСССТСААТТТАСАААССАССТАССАСТСАААСАСАТССТТТТТСС 4261 ААССАССАСАААССТАТТТСТТАСТААСТТССАТААТТТАСАТСААААТААТАСАСАСАА 4321 ТСААСАААААААААТТСАССААСАААТАСААААСААССАААСАТТААТССААСАСААТСТ 4381 АСТТТТСССТСАСАТАСАТАСАСТСАСТСССАСТААСААТТТСАТСААСААССТТТТСТТ 4441 АСТСАССАСТАСССААААТСТАСААССТТСАТАТСАССССССАТАТССТССАСТАСТТСА 4 5 01 АСАТТТТАССТСАТТАААТСАТТСААСАААТАСААСАААСАААСАСАСАССТСАТТТСТС 4561 АААААААССССАССААСААААСТТССААСССТТСССАААТСАААССААССАААТТСТАСА 4621 САААТАТССАТССАССАСААССАТАТСТССТААТАСААСССАССАСААТТТТСТСАСССА 4681 АССТАСТААСАСАССТТТСАААСААТТСАСАСТСССАСТАСААСАААСАСААСТТСАААА 4741 ААССАТААТТСТССАТСАСАССТСААСССАСТССТССАААААСАТСАААСАТТТСАСССС 4801 САССАСССТСАСАСАСАТАСАСТАСААТСАСААССАСАААССССССАТТАСТСАСТСТСС 4861 СТТАТСАСАТТСССТТАССАССАСТСАТАССАТСССТСААССАААТАСАТСТССАТТАСС 4921 САТТССАААССТАТСАТСАТТТССАТСТАТТАСАССТАТАТАТСТСАССАСССТССТАТТ 4981 ССААСАСААСТСТТСТСАТСТТССАССАССАТСТТАТАСАААСАААСАТТСТССССТССА 5041 АСАААССАСТСАТТТСТТАСААССАСССААААААААТААССТТТСТТТАСССАТТСТААС 5101 СТТССАСАТСАСТССТСАТСАААСАСАССТТСССТСССТССССАСААСТСССАСАААТТС 5161 АСТ САСАТАСААСАААСТ Т САСААСАСТ СТ Т СТ С С С САААС САСАСТ Т СС С СААААСАТ С 5221 ТСССАААСТТСААТТССТТССААААСТТСАСАТТТАТСАСААССАССТАТТСССТАСССА 5281 ААСТАССААТСССТСТССТССССАТСТССАТСТССТССААСССАСССТТСТТСАСССААС 5341 АСАСССАСССАТТААСТССААТСААССАААСАСАССТССААААСТТСССТТТСТСАСАСТ 5401 АССААСАСАААССТСТССАААСАСТСССТССААССТАТТССАТССТСТТССТТСССАТАА 5461 ССАСТАТССТАСТСАСАТАССААААСААСАСТССАААТСССААСАСААСТСАССАСАААА 5521 ААСАССТТТТААСАААААССАТАССАТТТТСТСССТСААСССТТСТСАААССААТСАТСС 5581 ААТАССАССААТАААТСАСССАСААААТААСССССАААТАСААСТСАССТССССАААССА 5641 АССТАССАСТСАААСССТСТССТСТСААААСССАССАСТСТТСАААССССАТСААССССА 5701 ААТААСТССТАСТАСТСТТСАСТСАСАТСААСАССАААТТСАСТАТСАТСАТАССАТАТС 5761 АСТТСАААТСААСААССААСАТТТТСАСАТТТАТСАТСАССАТСААААТСАСАССССССС 5821 САССТТТСААААСААААСАССАСАСТАТТТТАТТССТССАСТССАСАСССТСТСССАТТА 5881 ТСССАТСАСТАССТССССАСАТСТТСТААСАААСАССССТСАСАСТСССАСТСТСССТСА 5941 СТТСААСАААСТТСТТТТССАССААТТТАСТСАТСССТССТТТАСТСАССССТТАТАССС 6001 ТССАСААСТАААТСААСАТТТСССАСТССТССССССАТАТАТААСАССАСААСТТСААСА 6061 ТААТАТСАТССТААСТТТСАСАААТСАССССТСТССТСССТАТТССТТСТАТТСТАСССТ 6121 ТАТТТСТТАТСАССААСАТСАСАСССААССАССАСААССТАСААААААСТТТСТСААССС 6181 ТААТСАААССААААСТТАСТТТТССАААСТССААСАТСАТАТСССАСССАСТАААСАТСА 6241 СТТТСАСТССАААСССТССССТТАТТТСТСТСАТСТТСАССТССАААААСАТСТССАСТС 6301 АССССТСАТТССАССССТТСТССТСТСССАСАСТААСАСАСТСААСССТССТСАТСССАС 6361 АСААСТСАСАСТАСАССААТТТССТСТСТТТТТСАССАТСТТТСАТСАСАССААААССТС 6421 СТАСТТСАСТСААААТАТССАААСАААСТССАССССТСССТССААТАТССАСАТССААСА 6481 ТСССАСТТТТАААСАСААТТАТСССТТССАТССААТСААТСССТАСАТААТССАТАСАСТ

- 55 028309

6541 АССТСССТТАСТААТСССТСАССАТСАААССАТТССАТССТАТСТССТСАССАТССССАС 6601 СААТ СААААСАТ С САТ Т СТАТ Т САТ Т Т САСТ ССАСАТ СТ СТ Т САС Т СТАС САААААААСА 6661 ССАСТАТААААТСССАСТСТАСААТСТСТАТССАССТСТТТТТСАСАСАСТССАААТСТТ 6721 АССАТССАААССТССААТТТССССССТССААТСССТТАТТССССАССАТСТАСАТССТСС 6781 САТСАССАСАСТТТТТСТССТСТАСАССААТААСТСТСАСАСТССССТСССААТСССТТС 6841 ТССАСАСАТТАСАСАТТТТСАСАТТАСАССТТСАССАСААТАТССАСАСТСССССССААА 6901 ССТССССАСАСТТСАТТАТТССССАТСААТСААТСССТССАССАССААССАССССТТТТС 6961 ТТССАТСААССТССАТСТСТТСССАССААТСАТТАТТСАССССАТСААСАСССАСССТСС 7021 СССТСАСААСТТСТССАСССТСТАСАТСТСТСАСТТТАТСАТСАТСТАТАСТСТТСАТСС 7081 СААСААСТСССАСАСТТАТССАССАААТТССАСТССААССТТААТССТСТТСТТТСССАА 7141 ТСТССАТТСАТСТСССАТААААСАСААТАТТТТТААСССТССААТТАТТССТССАТАСАТ 7201 СССТТТССАСССААСТСАТТАТАССАТТСССАССАСТСТТСССАТССАСТТСАТССССТС 7261 ТСАТТТАААТАСТТССАССАТСССАТТСССААТССАСАСТАААССААТАТСАСАТССАСА 7321 САТТАСТССТТСАТССТАСТТТАССААТАТСТТТСССАССТССТСТССТТСААААССТСС 7381 АСТТСАССТССААСССАССАСТААТСССТССАСАССТСАССТСААТААТССААААСАСТС 7441 ССТССААСТССАСТТССАСААСАСААТСАААСТСАСАССАСТААСТАСТСАСССАСТААА 7501 АТСТСТССТТАССАССАТСТАТСТСААССАСТТССТСАТСТССАССАСТСААСАТССССА 7561 ТСАСТССАСТСТСТТТТТТСАСААТСССАААСТАААССТТТТТСАСССАААТСААСАСТС 7621 СТТСАСАССТСТССТСААСТСТСТАСАСССАСССТТАСТСАСТСССТАССТТССААТТСА 7681 СССССАСАСТТСССТССАССАСАТТССССТСАССАТССАССТТСТССССТСССАСССАСА 7741 ССАССТСТАС *Выделенные подчеркиванием нуклеиновые кислоты кодируют сигнальный пептид.

Полипептиды Ф-Ж включают полноразмерный Ф-^П, полноразмерный Ф-Ж минус Ме! на Νконце, зрелый Ф-^П (минус сигнальная последовательность), зрелый Ф-^П с добавочным Ме! на Νконце и/или Ф-^П с полной или частичной делецией В-домена. В определенных вариантах реализации изобретения варианты Ф-^П включают делеции В-домена, как частичные, так и полные.

Ген человеческого Ф-^П был выделен и экспрессирован в клетках млекопитающих (Тоо1е, РР, е! а1., Х'аПн'е 312:342-347 (1984); ОйзсЫег, I., е! а1., Х'аПн'е 312:326-330 (1984); \\'оос1, Υ.Ρ, е! а1., Να Пне 312:330-337 (1984); ХУНаг, О.А., е! а1., Ναίπτβ 312:337-342 (1984); ΥΟ 87/04187; ΥΟ 88/08035; ΥΟ 88/03558 и патент иЗ № 4757006). Аминокислотная последовательность Ф-Ж была получена с кДНК, как показано в патенте иЗ № 4965199. Ф-Ж с частично или полностью удаленным В-доменом дополнительно приведен в патентах иЗ № 4994371 и 4868112. В некоторых вариантах реализации изобретения В-домен человеческого Ф-Ж замещен В-доменом человеческого фактора V, как показано в патенте иЗ № 5004803. Последовательность кДНК, кодирующая человеческий фактор VIII, и аминокислотная последовательность приведены в ЗЕР ГО ΝΟ§: 17 и 16 соответственно из заявки на патентную публикацию иЗ № 2005/0100990.

Данные о последовательности свиного Ф-^П были опубликованы в Тоо1е, РР, е! а1., Ргос. Ν!1. Асай. Зс1. иЗА 83:5939-5942 (1986). В Неа1еу, РР., е! а1., В1оой 88:4209-4214 (1996) дополнительно сообщалось о полной свиной последовательности кДНК, полученной при помощи ПЦР амплификации последовательностей Ф-^П из библиотеки кДНК из свиной селезенки. В патенте иЗ № 5364771 авторства Ро11аг и Рипус' и в ΥΟ 93/20093 описаны гибридный человеческий/свиной Ф-МП, содержащий замены всех доменов, всех субъединиц, и и специфические аминокислотные последовательности. Недавно в ΥΟ 94/11503 были опубликованы нуклеотидная и соответствующай ей аминокислотная последовательности доменов А1 и А2 свиного Ф-Ш и химерного Ф-МП, в котором свиные домены А1 и/или А2 замещают соответствующие человеческие домены. В патенте иЗ № 5859204, Ро11аг, РЗ., также описаны последовательность свиной кДНК и полученные аминокислотные последовательности. В патенте иЗ № 6458563 описан Ф-ЭДП с удаленным В-доменом.

В патенте иЗ № 5859204 авторстава ЬоПаг, 1. З. сообщается о функциональных мутантах Ф-МП, обладающих сниженной антигенностью и сниженной иммунореактивностью. В патенте иЗ № 6376463 авторстава Ьо11аг, РЗ. также сообщается о мутантах Ф-ЭДП, обладающих сниженной иммунореактивностью. В заявке на патентную публикацию иЗ № 2005/0100990 авторства Заепко е! а1. сообщается о функциональных мутациях в домене А2 Ф-Ж

В одном варианте реализации изобретения Ф-Ж (или часть Ф-Ж в химерном белке) может быть по меньшей мере на 50, 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичным аминокислотной последовательности Ф-Ж из аминокислот от 1 до 1438 из ЗЕР ГО ΝΟ: 18 или аминокислот от 1 до 2332 из ЗЕР ГО ΝΟ: 15 и ЗЕР ГО ΝΟ: 16 (без сигнальной последовательности), или аминокислотной последовательности Ф-Ж из аминокислот от 19 до 1438 из ЗЕР ГО ΝΟ: 15 и ЗЕР ГО ΝΟ: 18 или аминокислот от 19 до 2332 из ЗЕР ГО ΝΟ: 15 и ЗЕР ГО ΝΟ: 16 (с сигнальной последовательностью), при этом Ф-Ж обладает коагулирующей активностью, например активирует как кофактор фактор IX для того, чтобы преобразовать фактор X в активированный фактор X. Ф-Ж (или часть Ф-Ж в химерном белке) может быть идентичным аминокислотной последовательности Ф-Ж из аминокислот от 1 до 1438 из ЗЕР ГО ΝΟ: 18 или аминокислот от 1 до 2332 из ЗЕР ГО ΝΟ: 16 (без сигнальной последовательности). Ф-Ж может дополнительно содержать сигнальную последовательность.

Употребляемое в данном тексте выражение В-домен Ф-Ж означает то же самое, что и известный в данной области техники В-домен, который определяется внутренней идентичностью аминокислотной последовательности и сайтами протеолитического расщепления, например это остатки Зег741Агу1648 полноразмерного человеческого Ф-Ж. Другие домены человеческого Ф-Ж определяются

- 56 028309 следующими аминокислотными остатками: А1, остатки А1а1-Аг§372; А2, остатки 8ег373-Аг§740; А3, остатки 8ег1690-А§п2019; С1, остатки Ьу§2020-А8п2172; С2, остатки 8ег2173-Туг2332. Последовательность А3-С1-С2 включает остатки 8ег1690-Туг2332. Оставшуюся последовательность, включающую остатки С1и1649-Аг§1689, обычно называют а3 кислотным участком. Расположение границ для всех доменов, включая В-домены, для свиного, мышиного и собачьего Ф-УШ также известны в данной области техники. В одном варианте реализации изобретения В-домен Ф-УШ удален (фактор УШ с удаленным В-доменом или УВД). Примером Ф-УШ с удаленным В-доменом является РЕФАКТО® (рекомбинантный Ф-УШ с удаленным В-доменом), который имеет ту же последовательность, что и часть последовательности фактора УШ в табл. 4. (тяжелая цепь Ф-УШ с удаленным В-доменом выделена двойным подчеркиванием; В-домен выделен курсивом; и легкая цепь Ф-УШ с удаленным В-доменом показана обычным текстом).

Таблица 4

Ф-У111с удаленным В-доменом (8ЕР ΙΌ N0: 18)

АТККУУЬбАУЕЬЗТОУМрЗРЬбЕЬРУРАКЕРРКУРКЗЕРЕЫТЗУУУККТЬЕУЕЕТРНЬЕЫТАКРКРРЧМбЬ

РбРТЮАЕУУРТУУТТЬКЫМАЗНРУЗЬНАУбУЗУЧКАЗЕбАЕУРРОТЗОРЕКЕРРКУЕРббЗНТУУЧОУЬК

ЕЫбРМАЗРРЬСРТУЗУРЗНУРРУКРРЫЗбЫбАРРУСРЕбЗРАКЕКТОТРНКПРЬЕАУЕРЕбКЗЧНЗЕТК

ЫЗРМ0РРРААЗАРА№РКМНТУК6УУКРЗЬР6ЫеСНРКЗУУ№НУ16М6ТТРЕУН31ЕРЕ6НТЕЬУРЫНР0А

ЗЬЕТЗРТТЕРТАОТРРМРРбОЕРРЕСНТЗЗНОНРбМЕАУУКУРЗСРЕЕРОРРМКЫЫЕЕАЕРУРРРЬТРЗЕМ

РУУРЕРРРЫЗРЗЕЮТРЗУАККНРКТЧУНУТААЕЕЕРЧРУАРЬУЬАРРРРЗУКЗОУЬЫЫбРОРТбРКУККУ

РЕМАУТРЕТЕКТРЕА1ОНЕ561Ь6РЬЬУ6ЕУ6РТЬЫ1ЕКЫОА5РРУЫ1УРН61ТРУРРЬУ5РРЬРК6УКН

ЬКРЕР1РР6Е1ЕКУК№ТУТУЕР6РТКЗРРРСРТРУУЗЗЕУКМЕРРРА36Ы6РЬЫСУКЕЗУР0Р6Ы01МЗ

РКРЫУ1ЬЕЗУЕРЕЫРЗ№УРТЕЫ10РЕРРЫРА6У0РЕРРЕЕ0АЗЫ1МН31Ы6УУЕРЗР0РЗУСЬНЕУАУ№У1

Р316А0ТРЕЬЗУЕЕ36УТЕКНКМУУЕРТРТЬЕРЕ36ЕТУЕМЗМЕЫР6Ш1ЬбСНЫЗРЕРЫРбМТАЬЬКУЗЗ

СРКЫТ6РУУЕРЗУЕР13АУЬЬЗКЫЫА1ЕРР5Е5С>7УРРУААРЯС>РЕ1Т РТТ Ь<23 ΡφΕΕΙ ΡΥΡΡΤ15 УЕМККЕ РЕР1УРЕРЕЫ<25РР5Е<2ККТРНУЕ1ААУЕРЫлГР¥еМ555РНУРРЫРА<25е5УР<2ЕККУУЕ<2ЕЕТРС5ЕТ<2Р РУРСЕ1ЛЕНРеРРеРУ1РАЕУЕРЫ1МУТЕРЫ<2А5РРУ5ЕУ55Ы5УЕЕР<2Р<2еАЕРРКЫЕУКРЫЕТКТУЕ1лГ КУ2ННМАРТКРЕЕРСКА№АУЕ5РУРРЕКРУН5еР1СРРРУСНТ1\ГТ1ЛРАНеР<2УТУ<2ЕЕАРЕЕТ1ЕРЕТК5 №ΥΕΤΕΝΜΕΡΝΟΡΑΡΟΝΙ<2ΜΕΡΡΤΕΚΕΝΥΡΕΗΑΙΝΟΥΙΜΡΤΡΡΟΙΛ/ΜΑ<2Ρ<2ΡΙΡ1/ίΥΡΡ5ΜΟ5ΝΕΝΙΗ5ΙΗΕ5 СНУЕТУРККЕЕУКМАЬУЫРУРСУЕЕТУЕМРРЗКАСПлГРУЕСЫСЕНРНАСМЗТРЕРУУЗЫКССТРЬСМАЗС Н1РРЕ<21ТАЗС<2УС<21лГАРК1АРРНУЗез™А1лГЗТКЕРЕЗШКУРЫАРМ11Не1КТ<2еАР<2КЕЗЗРУ13<2Е ΙΙΜΥ3ΡΡΟΚΚ№<2ΤΥΡΟΝ3ΤΟΤΡΜνΕΕΟΝΥΡ33ΟΙΚΗΝΙΕΝΡΡΙΙΑΡΥΙΡΡΗΡΤΗΥ3ΙΡ3ΤΡΡΜΕΡΜΟΟΡΡΝ ЗСЗМРЬ6МЕЗКА13РАС1ТАЗЗУЕТЫМЕА™ЗР5КАРЬНЬ<26РЗЫАМРР<2У™РКЕ1лГЬ<2УРЕ<2КТМКУТ6У ΤΤ0θνΚ3ΡΡΤ3ΜΥΥΚΕΕΡΙ333<2ΡΟΗ<21/ίΤΡΕΕ<2ΝΟΚνκνΕ<2ΟΝ<2Ρ3ΕΤΡννΝ3ΡΡΡΡΡΡΤΡΥΡΡΙΗΡ<231/ίν Н<21АЬРМЕУРССЕА<2РРУ

Таблица 5

Нуклеотидная последовательность, кодирующая Ф-У111с удаленным В-доменом (8ЕР ΙΌ N0: 19)*

661 АТ0САААТАСА6СТСТССАССТССТТСТТТС

721 ТеТСССТТТТ6СеАТТСТССТТТАСТ6ССАССАСАА6АТАСТАССТС6СТССА6ТеОААС

781 Т6ТСАТ6С6АСТАТАТССААА6Т6АТСТС6СТСА6СТСССТСТС6АСССАА6АТТТССТС

841 СТАСАСТСССААААТСТТТТССАТТСААСАССТСАСТС6Т6ТАСААААА6АСТСТ6ТТТС

901 ТАСААТТСАСбОАТСАССТТТТСААСАТСбСТААбССААСбССАСССТСбАТСбеТСТеС

- 57 028309

61 ТАССТССТАССАТССАСССТСАССТТТАТСАТАСАСТССТСАТТАСАСТТААСААСАТСС 1021 СТТСССАТССТСТСАСТСТТСАТССТСТТССТСТАТССТАСТССАААССТТСТСАСССАС 1081 СТСААТАТСАТСАТСАСАССАСТСАААСССАСАААСААСАТСАТАААСТСТТСССТССТС 1141 СААСССАТАСАТАТСТСТСССАССТССТСАААСАСААТССТССААТССССТСТСАСССАС 1201 ТСТСССТТАССТАСТСАТАТСТТТСТСАТСТССАССТССТААААСАСТТСААТТСАСССС 1261 ТСАТТССАССССТАСТАСТАТСТАСАСААСССАСТСТССССААССААААСАСАСАСАССТ 1321 ТССАСАААТТТАТАСТАСТТТТТССТСТАТТТСАТСААСССААААСТТСССАСТСАСААА 1381 САААСААСТССТТСАТССАССАТАСССАТССТССАТСТССТССССССТССССТААААТСС 1441 АСАСАСТСААТССТТАТСТАААСАССТСТСТСССАССТСТСАТТССАТСССАСАССАААТ 1501 САСТСТАТТСССАТСТСАТТССААТССССАССАСТССТСААСТССАСТСААТАТТССТСС 1561 ААССТСАСАСАТТТСТТСТСАССААССАТССССАССССТССТТССАААТСТССССААТАА 1621 СТТТССТТАСТССТСАААСАСТСТТСАТССАССТТССАСАСТТТСТАСТСТТТТСТСАТА 1681 ТСТСТТСССАССААСАТ6АТ66САТ66АА6СТТАТ6ТСААА6ТА6АСА6СТ6ТССАСА66 1741 ААССССААСТАССААТСАААААТААТСААСААССССААСАСТАТСАТСАТСАТСТТАСТС 1801 АТТСТСАААТССАТСТССТСАССТТТСАТСАТСАСААСТСТССТТССТТТАТССАААТТС 1861 ССТСАСТТСССААСААССАТССТААААСТТСССТАСАТТАСАТТССТССТСААСАССАСС 1921 АСТС6САСТАТССТСССТТАСТССТССССССССАТСАСАСААСТТАТААААСТСААТАТТ 1981 ТСААСААТСССССТСАССССАТТССТАССААСТАСААААААСТСССАТТТАТСССАТАСА 2041 САСАТСАААССТТТААСАСТССТСААССТАТТСАССАТСААТСАССААТСТТСССАССТТ 2101 ТАСТТТАТССССААСТТССАСАСАСАСТСТТСАТТАТАТТТААСААТСААССААССАСАС 2161 САТАТААСАТСТАСССТСАСССААТСАСТСАТСТСССТССТТТСТАТТСААССАСАТТАС 2221 СААААССТСТААААСАТТТСААССАТТТТССААТТСТСССАССАСАААТАТТСАААТАТА 2281 ААТССАСАСТСАСТСТАСААСАТСССССААСТАААТСАСАТССТСССТСССТСАСССССТ 2341 АТТАСТСТАСТТТССТТААТАТССАСАСАСАТСТАССТТСАССАСТСАТТСССССТСТСС 2401 ТСАТСТССТАСАААСААТСТСТАСАТСАААСАССАААССАСАТААТСТСАСАСААСАССА 2461 АТСТСАТССТСТТТТСТСТАТТТСАТСАСААСССААССТССТАССТСАСАСАСААТАТАС 2521 ААСССТТТСТССССААТССАССТССАСТССАССТТСАССАТССАСАСТТССААСССТССА 2581 АСАТСАТ6САСА6САТСААТ66СТАТ6ТТТТТ6АТА6ТТТ6САСТТ6ТСА6ТТТ6ТТТ6С 2641 АТСАССТСССАТАСТССТАСАТТСТААССАТТССАССАСАСАСТСАСТТССТТТСТСТСТ 2701 ТСТТСТСТССАТАТАССТТСАААСАСААААТССТСТАТСААСАСАСАСТСАСССТАТТСС 2761 САТТСТСАССАСАААСТСТСТТСАТСТССАТССААААСССАССТСТАТССАТТСТССССТ 2821 6ССАСААСТСА6АСТТТС66ААСА6А66САТ6АСС6ССТТАСТСАА66ТТТСТА6ТТ6Т6 2881 АСААСААСАСТССТСАТТАТТАССАССАСАСТТАТСААСАТАТТТСАССАТАСТТССТСА 2941 СТАААААСААТСССАТТСААССААСААССТТСТСТСААААСССАССАСТСТТСАААСССС 3001 АТСААССССАААТААСТССТАСТАСТСТТСАСТСАСАТСААСАССАААТТСАСТАТСАТС 3061 АТАССАТАТСАСТТСАААТСААСААССААСАТТТТСАСАТТТАТСАТСАССАТСААААТС 3121 АСАССССССССАССТТТСААААСААААСАССАСАСТАТТТТАТТССТССАСТССАСАССС 3181 ТСТСССАТТАТСССАТСАСТАССТССССАСАТСТТСТААСАААСАССССТСАСАСТСССА 3241 СТСТСССТСАСТТСААСАААСТТСТТТТССАССААТТТАСТСАТСССТССТТТАСТСАСС 3301 ССТТАТАСССТССАСААСТАААТСААСАТТТСССАСТССТССССССАТАТАТААСАССАС 3361 ААСТТСААСАТААТАТСАТССТААСТТТСАСАААТСАССССТСТССТСССТАТТССТТСТ 3421 АТТСТАСССТТАТТТСТТАТСАССААСАТСАСАСССААССАССАСААССТАСААААААСТ 3481 ТТ6ТСАА6ССТААТ6АААССААААСТТАСТТТТ66ААА6Т6СААСАТСАТАТ66САСССА 3541 СТАААСАТСАСТТТСАСТССАААСССТССССТТАТТТСТСТСАТСТТСАССТССАААААС 3601 АТСТССАСТСАССССТСАТТССАССССТТСТССТСТСССАСАСТААСАСАСТСААСССТС 3661 СТСАТСССАСАСААСТСАСАСТАСАССААТТТССТСТСТТТТТСАССАТСТТТСАТСАСА 3721 ССАААА6СТ66ТАСТТСАСТ6ААААТАТ66ААА6АААСТ6СА6С6СТСССТ6СААТАТСС 3781 АСАТССААСАТСССАСТТТТАААСАСААТТАТСССТТССАТССААТСААТСССТАСАТАА 3841 ТССАТАСАСТАССТСССТТАСТААТСССТСАССАТСАААССАТТССАТССТАТСТССТСА 3901 ССАТССССАССААТСААААСАТССАТТСТАТТСАТТТСАСТССАСАТСТСТТСАСТСТАС 3961 САААААААСАССАСТАТААААТСССАСТСТАСААТСТСТАТССАССТСТТТТТСАСАСАС 4021 ТССАААТСТТАССАТССАААССТССААТТТССССССТССААТСССТТАТТССССАССАТС 4081 ТАСАТССТСССАТСАССАСАСТТТТТСТССТСТАСАССААТААСТСТСАСАСТССССТСС 4141 СААТСССТТСТССАСАСАТТАСАСАТТТТСАСАТТАСАССТТСАССАСААТАТССАСАСТ 4201 СССССССАААССТССССАСАСТТСАТТАТТССССАТСААТСААТСССТССАССАССААСС 4261 АССССТТТТСТТССАТСААССТССАТСТСТТСССАССААТСАТТАТТСАССССАТСААСА 4321 СССАСССТСССССТСАСААСТТСТССАСССТСТАСАТСТСТСАСТТТАТСАТСАТСТАТА 4381 6ТСТТ6АТ666АА6АА6Т66СА6АСТТАТССА66АААТТССАСТ66ААССТТААТ6СТСТ 4441 ТСТТТСССААТСТССАТТСАТСТСССАТААААСАСААТАТТТТТААСССТССААТТАТТС 4501 СТССАТАСАТСССТТТССАСССААСТСАТТАТАССАТТСССАССАСТСТТСССАТССАСТ 4561 ТСАТССССТСТСАТТТАААТАСТТССАССАТСССАТТСССААТССАСАСТАААССААТАТ 4621 САСАТССАСАСАТТАСТССТТСАТССТАСТТТАССААТАТСТТТСССАССТССТСТССТТ 4681 САААА6СТС6АСТТСАССТССАА666А66А6ТААТ6ССТ66А6АССТСА66Т6ААТААТС 4741 СААААСАСТСССТССААСТССАСТТССАСААСАСААТСАААСТСАСАССАСТААСТАСТС 4801 АСССАСТААААТСТСТССТТАССАССАТСТАТСТСААССАСТТССТСАТСТССАССАСТС 4861 ААСАТССССАТСАСТССАСТСТСТТТТТТСАСААТСССАААСТАААССТТТТТСАСССАА 4921 АТСААСАСТССТТСАСАССТСТССТСААСТСТСТАСАСССАСССТТАСТСАСТСССТАСС 4981 ТТССААТТСАСССССАСАСТТСССТССАССАСАТТССССТСАССАТССАССТТСТССССТ 5041 СССАСССАСАССАССТСТАС *Выделенные подчеркиванием нуклеиновые кислоты кодируют сигнальный пептид.

Ф-У111 с удаленным В-доменом может содержать полные либо частичные делеции, описанные в патентах иЗ № 6316226, 6346513, 7041635, 5789203, 6060447, 5595886, 6228620, 5972885, 6048720, 5543502, 5610278, 5171844, 5112950, 4868112 и 6458563. В некоторых вариантах реализации последовательность Ф-У111 с удаленным В-доменом, являющаяся объектом настоящего изобретения, содержит любую из делеций, приведенных в патенте иЗ № 6316226 (также в патенте иЗ 6346513) от кол. 4, строка 4 до кол. 5, строка 28, и в примерах 1-5. В другом варианте реализации изобретения фактор У111 с удаленным В-доменом является фактором У111 с удаленным В-доменом З743/Р1638 (ЗО УВД Ф-У111) (например, фактором УШ, содержащим делецию от аминокислоты 744 до аминокислоты 1637, например фак- 58 028309 тором νΙΙΙ, содержащим аминокислоты 1-743 и аминокислоты 1638-2332 из ЗЕО ГО N0: 16, т.е. ЗЕО ГО N0: 18). В некоторых вариантах реализации Ф-νΙΙΙ с удаленным В-доменом, являющийся объектом настоящего изобретения, содержит делецию, приведенную в кол. 2, строки 26-51 и примерах 5-8 патента иЗ № 5,789,203 (а также в патентах ИЗ 6060447, 5595886 и 6228620). В некоторых вариантах реализации изобретения Ф-νΙΙΙ с удаленным В-доменом содержит делецию, приведенную в патенте ИЗ № 5972885, от кол. 1, строка 25 до кол. 2, строка 40; в патенте ИЗ № 6048720, кол. 6, строки 1-22 и пример 1; в патенте ИЗ № 5543502, кол. 2, строки 17-46; в патенте ИЗ № 5171844, от кол. 4, строка 22 до кол. 5, строка 36; в патенте ИЗ № 5112950, кол. 2, строки 55-68, фиг. 2 и пример 1; в патенте ИЗ № 4868112, от кол. 2, строка 2 до кол. 19, строка 21 и табл. 2; в патенте ИЗ № 7041635, от кол. 2, строка 1 до кол. 3, строка 19, от кол. 3, строка 40 до кол. 4, строка 67, от кол. 7, строка 43 до кол. 8, строка 26, и от кол. 11, строка 5 до кол. 13, строка 39; или в патенте ИЗ № 6458563, кол. 4, строки 25-53.

В некоторых вариантах реализации изобретения Ф-νΙΙΙ с удаленным В-доменом содержит делецию большей части В-домена, но при этом сохраняет аминотерминальные последовательности В-домена, которые выжны для ίη νίνο протеолитического процессинга продукта первичной трансляции в двуполипептидную цепь, как описано в \У0 91/09122. В некоторых вариантах реализации изобретения конструкция Ф-νΙΙΙ с удаленным В-доменом содержит делецию аминокислот 747-1638, т.е. фактически полную делецию В-домена. ΗοеЬеη К.С., е1 а1. ί. Βίο1. СЬет. 265 (13): 7318-7323 (1990). Фактор νΙΙΙ с удаленным Вдоменом также может содержать делецию аминокислот 771-1666 или аминокислот 868-1562 Ф-νΙΙΙ. МеиНеи Р., е1 а1. Рго1ет Енд. 2(4): 301-6 (1988). Дополнительные делеции В-домена, которые являются частью данного изобретения, включают: делецию аминокислот от 982 до 1562 или от 760 до 1639 (ΤοοΕ е1 а1., Ргос. №И. Асаб. ЗсЕ и.З.А. (1986) 83, 5939-5942)), от 797 до 1562 (Вакт е1 а1. ВгосЬет181гу (1986) 25:8343-8347)), от 741 до 1646 (Κοι^ (заявка на публикацию согласно РСТ № У0 87/04187)), 7471560 (Загуег, е1 а1., ^NА (1987) 6:553-564)), от 741 до 1648 (Разек (заявка на публикацию согласно РСТ № 88/00831)) или от 816 до 1598 либо от 741 до 1648 (Еадг1ег (ВеЬгтд Ιηβί. МЫ. (1988) № 82:16-25, ЕП 295597)). В других вариантах реализации изобретения Ф-νΙΙΙ с удаленным В-доменом содержит полипептид Ф-νΙΙΙ, содержащий фрагменты В-домена, в которых сохранены один или более ^связанных участков гликозилирования, например остатки 757, 784, 828, 900, 963 или, в некоторых случаях, 943, которые соответствуют аминокислотной последовательности полноразмерной последовательности Ф-νΙΙΙ. Примеры фрагментов В-домена включают 226 аминокислот или 163 аминокислоты В-домена, как описано в Мню, Η.Ζ., е1 а1., Β1οο6 103(а): 3412-3419 (2004), Казиба, А., е1 а1., ί. ТЬготЪ. Ηаетο5ί. 6: 1352-1359 (2008) и Р1ре, ЗЛУ., е1 а1., ί. ТЬготЪ. Ηаетο8ί. 9: 2235-2242 (2011) (т.е. сохранены первые 226 аминокислот или 163 аминокислоты В-домена). В некоторых вариантах реализации изобретения Ф-νΙΙΙ, содержащий частичный В-домен, является ФЮП198 (ЗЕО ГО N0: 105). ФЮП198 является одноцепочечной молекулой-226Ж> ФЖШЕс, содержащей частичный В-домен. 226 обозначает 226 Жконцевых аминокислот В-домена Ф-νΙΙΙ, а N6 обозначает шесть участков Жгликозилирования в В-домене. В других вариантах реализации изобретения Ф-νΙΙΙ с удаленным В-доменом дополнительно содержит точечную мутацию в остатке 309 (от РЬе до Зег) для того, чтобы улучшить экспрессию белка Ф-νΙΙΙ с удаленным В-доменом. Смотрите М^аο, Η.Ζ., е1 а1., Β1οο6 103(а): 3412-3419 (2004). В других вариантах реализации изобретения Ф-νΙΙΙ с удаленным В-доменом содержит полипептид Ф-νΙΙΙ, содержащий часть В-домена, но не содержащий один или более сайтов расщепления фурином (например, Агд1313 и Агд 1648). Смотрите Р1ре, З.У., е1 а1., ί. ТЬготЪ. Ηаетο8ί. 9: 2235-2242 (2011). Каждую из вышеописанных делеций можно внести в любую последовательность Ф-νΙΙΙ.

Белок Ф-νΙΙΙ, применяемый в настоящем изобретении, может включать Ф-νΙΙΙ, содержащий одну или более гетерологичных последовательностей или их химических или физических модификаций, которые не оказывают влияния на коагулирующую активность Ф-νΙΙΙ. Подобные гетерологичные последовательности или их химические или физические модификаций могут быть сшитыми с С-концом или N концом белка Ф-νΙΙΙ либо вставленными между одним или более из двух аминокислотных остатков в белке Ф-νΙΙΙ. Такие вставки в белок Ф-νΙΙΙ не оказывают влияния на коагулирующую активность Ф-νΙΙΙ или функционирование Ф-νΙΙΙ. В одном варианте реализации изобретения данные вставки улучшают фармакокинетические свойства белка Ф-νΙΙΙ (например, время полужизни). В другом варианте реализации изобретения вставки могут быть сделаны на более чем двух, трех, четырех, пяти или шести участках.

В одном варианте реализации изобретения белок Ф-νΙΙΙ расщепляется сразу за аргинином при аминокислоте 1648 (в полноразмерном факторе νΙΙΙ или ЗЕО ГО N0: 16), аминокислоте 754 (в факторе νΙΙΙ с удаленным В-доменом З743/Ц1638 или ЗЕО ГО N0: 16), или соответствующим аргинину остатком (в других вариантах), тем самым приводя к наличию тяжелой цепи и легкой цепи. В другом варианте реализации изобретения Ф-νΙΙΙ содержит тяжелую цепь и легкую цепь, которые связаны или соединены посредством ион-опосредованной нековалентной связи.

В других вариантах реализации изобретения Ф-νΙΙΙ является одноцепочечным Ф-νΙΙΙ, который не был расщеплен сразу за аргинином при аминокислоте 1648 (в полноразмерном факторе νΙΙΙ или ЗЕО ГО N0: 16), аминокислоте 754 (в факторе νΙΙΙ с удаленным В-доменом З743/Ц1638 или ЗЕО ГО N0: 18), или соответствующим аргинину остатком (в других вариантах). Одноцепочечный Ф-νΙΙΙ может содержать одну или более аминокислотных замен. В одном варианте реализации изобретения аминокислотная за- 59 028309 мена проведена в остатке, соответствующем остатку 1648, остатку 1645 или им обоим полипептида полноразмерного зрелого фактора УШ (8Е0 ГО N0: 16), либо остатку 754, остатку 751 или им обоим фактора УШ с удаленным В-доменом (8Е0 ГО N0: 18). Аминокислотная замена может представлять собой любые аминокислоты, кроме аргинина, например изолейцин, лейцин, лизин, метионин, фенилаланин, треонин, триптофан, валин, аланин, аспарагин, аспарагиновую кислоту, цистеин, глутаминовую кислоту, глутамин, глицин, пролин, селеноцистеин, серин, тирозин, гистидин, орнитин, пирролизин или таурин.

Ф-УШ может дополнительно расщепляться тромбином, а затем активироваться как Ф-УШа, выполняя функцию кофактора для активированного фактора IX (Ф-Ка). Активированный Ф-К совместно с активированным Ф-УШ образует комплекс Х-азу и преобразует фактор X в активированный фактор X (ФХа). Для активации Ф-УШ расщепляется тромбином за тремя остатками аргинина в аминокислотах 372, 740 и 1689 (соответствующих аминокислотам 372, 740 и 795 в последовательности Ф-УШ с удаленным В-доменом), при этом расщепление приводит к образованию Ф-УШа, содержащего цепи А1 в 50 кДа, А2 в 43 кДа и А3-С1-С2 в 73 кДа. В одном варианте реализации белок Ф-УШ, применяемый в настоящем изобретении, является неактивированным Ф-УШ. В другом варианте реализации изобретения белок Ф-УШ является активированным Ф-УШ.

Белок, содержащий полипептид Ф-УШ, связанный или соединенный с фрагментом ФВ, может содержать последовательность по меньшей мере на 50, 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичную 8Е0 ГО N0: 16 или 18, при этом последовательность обладает коагулирующей активностью Ф-УШ, например активирует фактор IX как кофактор для преобразования фактора X в активированный фактор X (ОХа).

Употребляемое в данном тексте выражение гибридные полипептиды и белки означает комбинацию первой полипептидной цепи, например фрагмента ФВ, в некоторых случаях связанной с первым гетерологичным компонентом, со второй полипептидной цепью, например белком Ф-УШ, в некоторых случаях связанной со вторым гетерологичным компонентом, образующую, таким образом, гетеродимер. В одном варианте реализации изобретения первый полипептид и второй полипептид в гибриде связаны друг с другом посредством белок-белковых взаимодействий, таких как заряд-зарядное или гидрофобное взаимодействия. В другом варианте реализации изобретения первый полипептид и второй полипептид в гибриде связаны друг с другом посредством дисульфидной или другой ковалентной связи(ей). Гибриды описаны, к примеру, в патенте И8 2004/101740 и патенте И8 2006/074199. Второй полипептид может являться идентичной копией первого полипептида или быть неидентичным полипептидом. В одном варианте реализации изобретения первый полипептид является слитым белком из фрагмента ФВ и Рс, а второй полипептид является полипептидом, содержащим, состоящим преимущественно из или состоящим из РсКп-связывающего домена, при этом первый полипептид и второй полипептид связаны друг с другом. В другом варианте реализации изобретения первый полипептид содержит слитый белок из фрагмента ФВ и Рс, а второй полипептид содержит слитый белок из Ф-УШ и Рс, что превращает гибрид в гетеродимер. Первый полипептид и второй полипептид могут быть связаны посредством ковалентной связи, например дисульфидной связи между первой Рс-областью и второй Рс-областью. Первый полипептид и второй полипептид могут быть дополнительно связаны друг с другом посредством связывания между фрагментом ФВ и белком Ф-УШ.

Г) Линкеры.

Химерный белок, являющийся объектом настоящего изобретения, дополнительно содержит линкер. Между двумя белками может находиться один или более линкеров, например между дополнительным компонентом и белком Ф-УШ (иногда также называемый Ф-УШ/ДК линкер), между фрагментом ФВ и первым гетерологичным компонентом (иногда также называемый ФВ линкер), например, первая Рсобласть, между белком Ф-УШ и вторым гетерологичным компонентом (иногда также называемый ФУШ линкер), например, вторая Рс-область, между фрагментом ФВ и белком Ф-УШ (например, ФУШ/ДК линкер), между фрагментом ФВ и вторым гетерологичным компонентом и/или между белком ФУШ и первым гетерологичным компонентом. Все линкеры могут иметь одинаковую или разную последовательность. В одном варианте реализации изобретения линкер является полипептидным линкером. В другом варианте реализации изобретения линкер является неполипептидным линкером.

Линкер, применяемый в настоящем изобретении, может содержать любую органическую молекулу. В одном варианте реализации изобретения линкер является полимером, например полиэтиленгликолем (ПЭГ) или гидроксиэтиловым крахмалом (ГЭК). В другом варианте реализации изобретения линкер представляет собой аминокислотную последовательность (например, полипептидный линкер). Полипептидный линкер может содержать по меньшей мере 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900 или 2000 аминокислот. Линкер может содержать 1-5 аминокислот, 1-10 аминокислот, 1-20 аминокислот, 10-50 аминокислот, 50100 аминокислот, 100-200 аминокислот, 200-300 аминокислот, 300-400 аминокислот, 400-500 аминокислот, 500-600 аминокислот, 600-700 аминокислот, 700-800 аминокислот, 800-900 аминокислот или 9001000 аминокислот.

Примеры полипептидных линкеров хорошо известны в данной области техники. В одном варианте реализации изобретения линкер содержит последовательность О_п. Линкер может содержать последова- 60 028309 тельность (ОА)_П. Линкер может содержать последовательность (ООЗ)п</81. В других вариантах реализации изобретения линкер содержит (ОООЗ)_п (ЗЕО ГО N0: 20). В других вариантах реализации изобретения линкер содержит последовательность (ООЗ)п(ООООЗ)_п (ЗЕО ГО N0: 21). В этих случаях η может быть целым числом в диапазоне 1-100. В других случаях η может быть целым числом в диапазоне 1-20, т.е. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20. Примеры линкеров включают, но не ограничиваются этим, ООО, ЗООЗООЗ (ЗЕО ГО N0: 22), ООЗООЗООЗООЗООО (ЗЕО ГО N0: 23), ООЗООЗООООЗООООЗ (ЗЕО ГО N0: 24), ООЗООЗООЗООЗООЗООЗ (ЗЕО ГО N0: 25), ООООЗООООЗООООЗ (ЗЕО ГО N0: 26), линкеры в табл. 13 (ЗЕО ГО N08: 92, 93 и 94), и линкеры в табл. 14А (ЗЕО ГО N08: 95, 96 и 97). Линкер не блокирует и не снижает активность фрагмента ФВ или коагулирующую активность фактора УШ. В некоторых случаях линкер усиливает активность фрагмента ФВ или коагулирующую активность белка фактора УШ, например, дополнительно снижая эффекты стерического несоответствия и обеспечивая фрагменту ФВ или части фактора УШ больший доступ к их целевому связывающему участку.

В одном варианте реализации изобретения длина линкера, применяемого в химерном белке, составляет 15-25 аминокислот. В другом варианте реализации изобретения длина линкера, применяемого в химерном белке, составляет 15-20 аминокислот. В некоторых вариантах реализации изобретения длина линкера, применяемого в химерном белке, составляет 10-25 аминокислот. В других вариантах реализации изобретения длина линкера, применяемого в химерном белке, составляет 15 аминокислот. В других вариантах реализации изобретения линкер, применяемый в химерном белке, представляет собой (ООООЗ)п (ЗЕО ГО N0: 27), где О является глицином, З является серином, а η является целым числом в диапазоне 1-20.

Д) Сайты расщепления.

Линкер также может содержать компонент, который может отщепляться химически (например, гидролиз или эфирная связь), ферментативно (т.е. включение последовательности расщепления протеазой) или фотолитически (например, хромофор, такой как 3-амино-(2-нитрофенил) проприоновая кислота (АНП)), с целью отделить одну молекулу от другой.

В одном варианте реализации изобретения линкер является отщепляемым линкером. Отщепляемые линкеры могут содержать один или более сайтов расщепления на Юконце или С-конце, либо на обоих. В другом варианте реализации изобретения отщепляемый линкер состоит преимущественно из или состоит из одного или более отщепляемых участков. В других вариантах реализации изобретения отщепляемый линкер содержит описанные в данном тексте гетерологичные аминокислотные линкерные последовательности или полимеры и один или более отщепляемых участков.

В определенных вариантах реализации изобретения отщепляемый линкер содержит один или более сайтов расщепления, которые могут расщепляться в клетке-хозяине (т.е. сайты внутриклеточного процессинга). Неограничивающие примеры сайтов расщепления включают КККК (ЗЕО ГО N0: 52), КККККК (ЗЕО ГО N0: 53) и ККККЗ (ЗЕО ГО N0: 54).

В других вариантах реализации изобретения отщепляемый линкер содержит один или более сайтов расщепления, которые расщепляются протеазой после введения пациенту химерного белка, содержащего отщепляемый линкер. В одном варианте реализации изобретения сайт расщепления расщепляется протеазой, выбранной из группы, состоящей из фактора Х1а, фактора Х11а, калликреина, фактора У11а, фактора 1Ха, фактора Ха, фактора 11а (тромбина), эластазы-2, ММП-12, ММП-13, ММП-17 и ММП-20. В другом варианте реализации изобретения сайт расщепления выбран из группы, состоящей из сайта расщепления Ф-Х1а (например, КЬТК 4 АЕТ (ЗЕО ГО N0: 29)), сайта расщепления Ф-Х1а (например, ЭЕТК 4 УУО (ЗЕО ГО N0: 30)), сайта расщепления Ф-Х11а (например, ТМТК 4 1УОО (ЗЕО ГО N0: 31)), сайта расщепления калликреином (например, ЗРЕК 4 ЗТОО (ЗЕО ГО N0: 32)), сайта расщепления Ф-УПа (например, ЬОУК 4 1УОО (ЗЕО ГО N0: 33)), сайта расщепления Ф-1Ха (например, РЬОК 4 1УОО (ЗЕО ГО N0: 34)), сайта расщепления ФХа (например, 1ЕОК 4 ТУОО (ЗЕО ГО N0: 35)), сайта расщепления ФПа (тромбином) (например, ЬТРК 4 ЗЬЬУ (ЗЕО ГО N0: 36)), сайта расщепления эластазой-2 (например, ЬОРУ 4 ЗОУР (ЗЕО ГО N0: 37)), сайта расщепления гранзимом В (например, УАОЭ 4 ЗЬЕЕ (ЗЕО ГО N0: 38)), сайта расщепления ММР-12 (например, ОРАО 4 ЬООА (ЗЕО ГО N0: 39)), сайта расщепления ММР-13 (например, ОРАО 4 ЬКОА (ЗЕО ГО N0: 40)), сайта расщепления ММР-17 (например, АРЬО 4 ЬКЕК (ЗЕО ГО N0: 41)), сайта расщепления ММР-20 (например, РАЬР 4 ЬУАО (ЗЕО ГО N0: 42)), сайта расщепления ВГТ (например, ЕЖ-УЕО 4 О (ЗЕО ГО N0: 43)), сайта расщепления энтерокиназой (например, ΌΌΌΚ 4 1УОО (ЗЕО ГО N0: 44)), сайта расщепления протеазой 3С (РКЕЗС1ЗЗЮЮ^М) (например, ЬЕУЪЕО 4 ОР (ЗЕО ГО N0: 45)) и сайта расщепления сортазой А (например, ЬРКТ 4 ОЗЕЗ) (ЗЕО ГО N0: 46). В определенных вариантах реализации изобретения сайты расщепления Ф-Х1а включают, но не ограничиваются этим, например, ТОЗЕНЭЕТК (ЗЕО ГО N0: 47) и ЗУЗОТЗКЬТК (ЗЕО ГО N0: 48). Неограничивающие примеры сайта расщепления тромбином включают, например, ЭЕЬАЕОООУК (ЗЕО ГО N0: 49), ТТК1КРК (ЗЕО ГО N0: 50) или ЬУРКО (ЗЕО ГО N0: 55), и последовательность, содержащую, состоящую преимущественно из или состоящую из АЬКРК (например, АЬКРКУУООА (ЗЕО ГО N0: 51)).

- 61 028309

В конкретном варианте реализации изобретения сайтом расщепления является ТЬОРКБРЬЕКЫРМЖ¥ЕРЕ\\'Е1)ЕЕк (БЕЦ ГО N0: 56).

Полинуклеотиды, векторы, клетки-хозяева и способы их получения.

Также в изобретении предложен полинуклеотид, кодирующий описанный в данном тексте фрагмент ФВ, химерный белок, содержащий фрагмент ФВ и гетерологичный компонент, химерный белок, содержащий белок Ф-УШ и дополнительный компонент, или химерный белок, содержащий фрагмент ФВ и белок Ф-УШ. В случае, когда фрагмент ФВ в химерном белке связан с гетерологичным компонентом или белком Ф-УШ в виде одиночной полипептидной цепи, данное изобретение относится к полинуклеотиду, кодирующему фрагмент ФВ, связанный с гетерологичным компонентом или белком Ф-УШ. В случае, когда химерный белок содержит первую и вторую полипептидные цепи, с первой полипептидной цепью, содержащей фрагмент ФВ и первый гетерологичный компонент (например, первую Рсобласть), и второй полипептидной цепью, содержащей фрагмент ФВ и второй гетерологичный компонент (например, вторую Рс-область), причем первая полипептидная цепь и вторая полипептидная цепь соединены друг с другом, полинуклеотид может содержать первую нуклеотидную последовательность и вторую нуклеотидную последовательность. В одном варианте реализации изобретения первая нуклеотидная последовательность и вторая нуклеотидная последовательность принадлежат одному и тому же полинуклеотиду. В другом варианте реализации изобретения первая нуклеотидная последовательность и вторая нуклеотидная последовательность принадлежат двум разным полинуклеотидам (например, разным векторам). В определенных вариантах реализации настоящее изобретение относится группе полинуклеотидов, содержащей первую нуклеотидную цепь и вторую нуклеотидную цепь, причем первая нуклеотидная цепь кодирует фрагмент ФВ химерного белка, а вторая нуклеотидная цепь кодирует белок ФУШ.

В других вариантах реализации изобретения группа полинуклеотидов дополнительно содержит добавочную нуклеотидную цепь (например, вторую нуклеотидную цепь, если химерный белок кодируется одиночной полинуклеотидной цепью, или третью нуклеотидную цепь, если химерный белок кодируется двумя полинуклеотидными цепями), которая кодирует протеин-конвертазу. Протеин-конвертаза может быть выбрана из группы, состоящей из пропротеин конвертазы субтилизин/кексин типа 5 (РСБК5 или РС5), пропротеин конвертазы субтилизин/кексин типа 7 (РСБК7 или РС7), дрожжевой протеазы Кех 2, пропротеин конвертазы субтилизин/кексин типа 3 (РАСЕ или РСБК3) и двух или более комбинаций этих компонентов. В некоторых вариантах реализации изобретения протеин-конвертаза представляет собой РАСЕ, РС5 или РС7. В конкретном варианте реализации изобретения протеин-конвертаза представляет собой РС5 или РС7; смотрите международную заявку № РСТ/иБ2011/043568, которая включена в данный текст посредством ссылки. В другом варианте реализации изобретения протеин-конвертаза представляет собой РАСЕ/фурин.

В определенных вариантах реализации данное изобретение относится группе полинуклеотидов, содержащей первую нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент ФВ, содержащий домен Ό' и домен Ό3 ФВ, вторую нуклеотидную последовательность, кодирующую белок Ф-УШ, и третью нуклеотидную последовательность, кодирующую домен Ό1 и домен Ό2 ФВ. В этом варианте реализации изобретения домен Ό1 и домен Ό2 экспрессируются отдельно (и не связаны с доменом Ό'Ό3 фрагмента ФВ) с целью образования подходящей дисульфидной связи и филдинга доменов Ό'Ό3. Экспрессия домена Ό1Ό2 может происходить как в цис-, так и в транс-форме.

Употребляемое в данном тексте выражение экспрессионный вектор относится к любой нуклеотидной конструкции, которая содержит необходимые элементы для транскрипции и трансляции вставленной кодирующей последовательности или, в случае вирусного РНК вектора, необходимые элементы для репликации и трансляции при внесении в соответствующую клетку-хозяина. Экспрессионные векторы могут включать плазмиды, фадмиды, вирусы и их производные.

Экспрессионные векторы, являющиеся объектами данного изобретения, будут содержать полинуклеотиды, кодирующие фрагмент ФВ или химерный белок, содержащий фрагмент ФВ.

В одном варианте реализации изобретения последовательность, кодирующая фрагмент ФВ, второй гетерологичный компонент (например, вторую Рс-область) или белок Ф-УШ, функционально связанная с управляющей экспрессионной последовательностью. В данном контексте две нуклеотидные последовательности являются функционально связанными, когда они ковалентно связаны таким образом, чтобы обеспечить сохранение функциональности каждого компонента нуклеотидной последовательности. Считается, что кодирующая последовательность и управляющая генной экспрессией последовательность функционально связаны, когда они ковалентно связаны таким образом, чтобы экспрессия или транскрипция и/или трансляция кодирующей последовательности оказалась под влиянием или управлением последовательности, управляющей генной экспрессией. Считается, что две последовательности ДНК функционально связаны, если индукция промотора в 5' последовательности генной экспрессии приводит к транскрипции кодирующей последовательности и если природа связи между двумя последовательностями ДНК не (1) приводит к внесению мутации со сдвигом рамки, (2) препятствует возможности промоторной области управлять транскрипцией кодирующей последовательности или (3) препятствует возможности соответствующего РНК-транскрипта быть транслированным в белок. Таким образом, последо- 62 028309 вательность генной экспрессии будет функционально связана с кодирующей нуклеотидной последовательностью, если последовательность генной экспрессии способна осуществить транскрипцию данной кодирующей нуклеотидной последовательности так, что полученный транскрипт транслируется в необходимый белок или полипептид.

В данном контексте управляющая генной экспрессией последовательность представляет собой любую регуляторную нуклеотидную последовательность, такую как промоторная последовательность или промоторно-энхансерная комбинация, которая способствует эффективной транскрипции и трансляции кодирующей нуклеиновой кислоты, с которой она функционально связана. Управляющая генной экспрессией последовательность может, к примеру, являться промотором млекопитающего или вируса, таким как конститутивный или индуцибельный промотор. Конститутивные промоторы млекопитающих включают, но не ограничиваются этим, промоторы для следующих генов: гипоксантингуанинфосфорибозилтрансферазы (ГГРТ), аденозиндеаминазы, пируваткиназы, промотор бета-актина и другие конститутивные промоторы. Примеры вирусных промоторов, которые конститутивно функционируют в эукариотических клетках, включают, например, промоторы из цитомегаловируса (ЦМВ), вируса обезьяны (например, 3V40), вируса папилломы, аденовируса, вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), вируса саркомы Рауса, цитомегаловируса, длинные концевые повторы (ДКП) вируса лейкоза Молони и другие ретровирусы, а также тимидинкиназный промотор вируса простого герпеса. Другие конститутивные промоторы известны специалистам в данной области техники. Промоторы, применимые в качестве последовательностей генной экспрессии согласно изобретению, также включают индуцибельные промоторы. Индуцибельные промоторы экспрессируются в присутствии индуктора. Например, индукция промотора металлотионеина для стимуляции транскрипции или трансляции происходит в присутствии определенных ионов металлов. Другие индуцибельные промоторы известны специалистам в данной области техники.

В общем случае управляющая генной экспрессией последовательность будет включать, при необходимости, 5' нетранскрибируемые и 5' нетранслируемые последовательности, участвующий в инициации, соответственно транскрипции и трансляции, такие как ТАТА-бокс, кэпирующая последовательность, последовательность ЦААТ и им подобные. В частности, такие 5' нетранскрибируемые последовательности будут включать промоторную область, которая содержит промоторную последовательность для управления транскрипцией функционально присоединенной кодирующей нуклеиновой кислоты. Последовательности генной экспрессии в некоторых случаях содержат энхансерные последовательности или вышележащие активаторные последовательности, если они необходимы.

Вирусные векторы включают, но не ограничиваются этим, нуклеотидные последовательности следующих вирусов: ретровируса, такого как вирус лейкоза мышей Молони, вирус саркомы мышей Харви, вирус опухоли молочной железы мышей и вирус саркомы Рауса; аденовируса, адено-ассоциированного вируса; вирусов типа 3V40; полиомавирусов; вирусов Эпштейна-Барра; вирусов папилломы; вируса герпеса; вируса осповакцины; полиовируса; и РНК-вируса, такого как ретровирус. Также можно применять другие хорошо известные в данной области техники векторы. Определенные вирусные векторы происходят от нецитопатических эукариотических вирусов, в которых несущественные гены были заменены генами, представляющими интерес. Нецитопатические вирусы включают ретровирусы, жизненный цикл которых включает обратную транскрипцию геномной вирусной РНК в ДНК с последующим провирусным внедрением в клеточную ДНК хозяина. Ретровирусы были апробированы в экспериментах по генной терапии человека. Наиболее подходящими есть такие ретровирусы, которые являются дефектными по репликации (т. е. способными к прямому синтезу необходимых белков, но неспособными к созданию инфекционных частиц). Такие генетически измененные ретровирусны экспрессионные векторы в общем случае используются для высокоэффективной трансдукции генов ш У1уо. Стандартные протоколы по получению дефектных по репликации ретровирусов (включая этапы внесения экзогенного генетического материала в плазмиды, трансфекции пакующей клеточной линии плазмидами, получения рекомбинантных ретровирусов при помощи пакующей клеточной линии, забора вирусных частиц из тканевой культуральной среды и инфекцирования целевых клеток вирусными частицами) приведены в КпеЦег М., Оепе Тгап8£ег апб Ехрге88юп, А ЬаЬога!огу Мапиа1, У.Н. Ргеетап Со., №ν Υо^к (1990) и Миггу, Е. I., Ме!Ьоб8 ш Мо1еси1аг Вю1о§у, ^1. 7, Нитапа Рге88, Шс., СбЖоп, Ν.Ι (1991).

В одном варианте реализации изобретения вирус является адено-ассоциированным вирусом, двухцепочечным ДНК-вирусом. Адено-ассициированный вирус может быть сконструирован так, чтобы быть дефектным по репликации, и способным инфицировать большое количество типов и видов клеток. Дополнительно он обладает такими преимуществами, как устойчивость к температуре и липидным растворителям; высокие частоты трансдукции в клетках из различных клеточных линий, включая гемопоэтические клетки; и отсутствие ингибирования суперинфекции, что дает возможность осуществления множественных серий трансдукций. Согласно имеющимся сведениям адено-ассоциированный вирус может интегрироваться в человеческую клеточную ДНК сайт-специфическим образом, тем самым минимизируя возможность инсерционного мутагенеза и вариабельность экспрессионных характеристик ретровирусной инфекции вставленного гена. Вдобавок, адено-ассоциированные вирусные инфекции дикого типа претерпели в тканевой культуре более чем 100 переносов в отсутствии селективного давления, что указыва- 63 028309 ет на то, что геномная интеграция адено-ассоциированного вируса является относительно стабильным явлением. Адено-ассоциированный вирус также может функционировать внехромосомным способом.

Другие векторы включают плазмидные векторы. Плазмидные векторы были подробно описаны в данной области техники и хорошо известны специалистам; смотрите, например, 8атЪгоок е! а1., Мо1еси1аг С1отпд: А ЬаЪогаЮгу Мапиа1, 8есопб ЕбШоп, Со1б 8рппд НагЪог ЬаЪогайгу Ргекк, 1989. В последние несколько лет было обнаружено, что плазмидные векторы являются исключительно удобными для доставки генов в клетки ш У1уо благодаря своей неспособности реплицироваться внутри клетки и интегрироваться в геном организма-хозяина. При этом плазмиды имеют промотор, совместимый с клеткойхозяином, и могут экспрессировать пептид из гена, функционально кодируемого в пределах плазмиды. Некоторые широкоприменяемые плазмиды, предлагаемые частными поставщиками, включают рВК322, рИС18, рИС19, различные плазмиды рс^NА, рКС/СМУ, различные плазмиды рСМУ, р8У40 и рВ1ие8спр1. Дополнительные примеры отдельных плазмид включают рс^NА3.1, номер в каталоге У79020; рс^NА3.1/гигро, номер в каталоге У87020; рс^NА4/тус-Н^к, номер в каталоге У86320; и рВибСЕ4.1, номер в каталоге У53220, предоставляемые все компанией Инвитроген (Карлсбад, Калифорния). Другие плазмиды известны специалистам в данной области техники. Вдобавок, плазмиды могут быть разработаны индивидуально при помощи стандартных методов молекулярной биологии для удаления и/или добавления отдельных фрагментов ДНК.

В одной экспрессионной системе насекомого происхождения, которую можно применять для получения белков, являющихся объектами данного изобретения, для экспрессии чужеродных генов в качестве вектора используется вирус ядерного полигидроза АнЮдгарка саПГогшса (АсЖУ). Вирус выращивается в клетках 8робор1ега Ггид1регба. Кодирующая последовательность может быть клонирована в несущественные области (например, ген в форме многогранника) вируса и помещена под управления промотора Ас№У (например, промотора в форме многогранника). Успешная вставка кодирующей последовательности приведет к инактивации гена в форме многогранника и получению невкрапленного рекомбинантного вируса (т. е. вируса с отсутствием белкового покрытия, кодируемого геном в форме многогранника). Эти рекомбинантные вирусы впоследствии применяются для инфицирования клеток 8робор1ега Ггид1регба, в которых экспрессируется вставленный ген. (смотрите, например, 8ιηί11ι е! а1. (1983) 1 У1го1 46:584; патент И8 № 4215051). Дополнительные примеры подобной экспрессионной системы можно найти в АикиЪе1 е! а1., ебк. (1989) Сштеп1 Рго1осо1к ш Мо1еси1аг Вю1оду, Уо1. 2, Огееие РиЪЕкк. Аккос. & \УПеу 1п1егкс1епсе.

Другой системой, которую можно применять для получения белков, являющихся объектами данного изобретения, является система генной экспрессии глутамин синтетазы, также называемая экспрессионной системой ГС (Ъоп/а Вю1од1ек РЬС, ВегккЫге ИК). Эта экспрессионная система детально описана в патенте И8 № 5981216.

В клетках-хозяевах, принадлежащих млекопитающим, может применяться большое количество экспрессионных систем на вирусной основе. В случаях, когда в качестве экспрессионного вектора применяется аденовирус, кодирующая последовательность может быть лигирована к аденовирусному комплексу, управляющему транскрипцией/трансляцией, например позднему промотору и трехкомпонентной лидерной последовательности. Затем этот химерный ген может быть вставлен в геном аденовируса путем ш νίΙΐΌ или ш У1уо рекомбинации. Вставка несущественной области вирусного генома (например, области Е1 или Е3) приведет к образованию рекомбинантного вируса, который является жизнеспособным и способным экспрессировать пептид в инфицированном организме-хозяине; смотрите, например, Ьодап & 8Ьепк (1984) Ргос №·ιΐ1 Асаб 8с1 И8А 81:3655). В качестве альтернативного варианта может применяться промотор 7.5 К осповакцины; см., например, МаскеИе! а1. (1982) Ргос Асаб 8а И8А 79:7415; Маске!1е1 а1. (1984) I У1го1 49:857; РашсаП е! а1. (1982) Ргос N6 Асаб 8с И8А 79:4927.

Для повышения эффективности производства полинуклеотиды могут быть сконструированы таким образом, чтобы кодировать множественные звенья белка, являющегося объектом данного изобретения, разделенные сайтами расщепления ферментами. Результирующий полипептид может быть расщеплен (например, путем обработки соответствующим ферментом) с целью восстановления звеньев полипептида. Это может увеличить выход полипептидов, управляемых одиночным промотором. При применении в соответствующих вирусных экспрессионных системах управление трансляцией каждого полипептида, кодируемого иРНК, происходит внутри транскрипта, например осуществляется участком внутренней посадки рибосомы или УВПР. Таким образом, полицистронная конструкция управляет транскрипцией одиночной, крупной полицистронной иРНК, которая, в свою очередь, управляет трансляцией множественных отдельных полипептидов. В этом подходе не используется получение и ферментативный процессинг полипротеинов, что может значительно повысить выход полипептидов, управляемых одиночным промотором.

Применяемые для трансформации векторы обычно будут содержать селектируемый маркер, который используется для идентификации трансформантов. В бактериальных системах они могут включать гены устойчивости к антибиотикам, таким как ампициллин и канамицин. Селектируемые маркеры для применения в культивируемых клетках млекопитающих включают гены, которые придают устойчивость к лекарственным препаратам, таким как неомицин, гигромицин и метотрексат. Селектируемый маркер

- 64 028309 может быть амплифицируемым селектируемым маркером. Одним из амплифицируемых селектируемых маркеров является ген дегидрофолатредуктазы (ДГФР). Бтопзеп С.С. е! а1. (1983) Ргос №Ш Асаб Бс1 ИБА 80:2495-9. Обзор по селектируемым маркерам сделан ТЫ11у (1986) Маттайап Се11 ТесЬпо1оду, ΒιιΙ(епуоПН РиЬЬзЬегз, БЮпеНат. Мазз., а выбор селектируемых маркеров не составит трудности для специалистов в данной области техники.

Селектируемые маркеры могут быть внесены в клетку при помощи отдельной плазмиды одновременно с представляющим интерес геном, либо они могут быть внесены при помощи той же самой плазмиды. В случае применения одной плазмиды селектируемый маркер и представляющий интерес ген могут находиться под управлением разных промоторов или одного и того же промотора, при этом последняя конфигурация приводит к получению двухцистронной иРНК. Конструкции такого типа известны в данной области техники (например, патент ИБ № 4713339).

Экспрессионные векторы могут кодировать метки, которые дают возможность легкого выведения рекомбинантно произведенного белка. Примеры включают, но не ограничиваются этим, вектор рИК278 (КиШег е! а1. (1983) ЕМВ0 1 2:1791), в котором кодирующие последовательности для экспрессируемого белка могут быть лигированными в вектор в рамку с кодирующей областью 1ас ζ таким образом, что это приводит к получению меченного слитого белка; векторы рОЕХ можно применять для экспрессии белков, являющихся объектами данного изобретения, с глутатион-Б-трансферазной (ОБТ) меткой. Обычно эти белки растворимы и легко могут быть выведены из клеток путем адсорбции на глутатион-арагозных гранулах с последующей элюцией в присутствии свободного глутатиона. Векторы содержат сайты расщепления (тромбином или протеазой фактора Ха или РКЕБСIББЮN РК0ТЕАБЕ™ (РЬагтааа, Реараск, N.1.)) для легкого удаления метки после выведения.

Затем экспрессионные векторы трансфицируются или ко-трансфицируются в подходящую клеткумишень, которая будет экспрессировать полипептиды. Известные в данной области техники трансфекционные методы включают, но не ограничиваются этим, осаждение фосфата кальция (\1§1ег е! а1. (1978) Се11 14:725), электропорацию (№итапи е! а1. (1982) ЕМВ0 1 1:841) и реагенты на основе липосом. Для экспрессии описанных в данном тексте белков можно применять большое количество систем хозяиэкспресионный вектор, включая как прокариотические, так и эукариотические клетки. Такие системы включают, но не ограничиваются этим, микроорганизмы, такие как бактерии (например, Е. сой), трансформированные при помощи рекомбинантной ДНК бактериофага или экспрессионных векторов плазмидной ДНК, содержащих соответствующую кодирующую последовательность; дрожжевые или мицелиальные грибы, трансформированные при помощи рекомбинантных дрожжевых или грибных экспрессионных векторов, содержащих соответствующую кодирующую последовательность; клеточные системы насекомого происхождения, инфицированные рекомбинантными вирусными экспрессионными векторами (например, бакуловируса), содержащими соответствующую кодирующую последовательность; клеточные системы растительного происхождения, инфицированные рекомбинантными вирусными экспрессионными векторами (например, вируса мозаики цветной капусты или вируса табачной мозаики) или трансформированные при помощи рекомбинантных плазмидных экспрессионных векторов (например, ТЬплазмиды), содержащих соответствующую кодирующую последовательность; или клеточные системы животного происхождения, включая клетки млекопитающих (например, клетки НЕК 293, СНО, Соз, НеЬа, НКВ11 и ВНК).

В одном варианте реализации изобретения клеткой-хозяином является эукариотическая клетка. При употреблении в данном тексте эукариотическая клетка относится к любой животной или растительной клетке, имеющей сформировавшееся ядро. Эукариотические клетки животных включают клетки позвоночных, например млекопитающих, и клетки беспозвоночных, например насекомых. Эукариотические клетки растений, в частности, могут без ограничений включать дрожжевые клетки. Эукариотическая клетка отличается от прокариотической клетки, например бактерии.

В некоторых вариантах реализации изобретения эукариотическая клетка является клеткой млекопитающего. Клеткой млекопитающего является любая клетка, полученная от млекопитающего. Клетки млекопитающих включают, в частности, но не ограничиваются этим, клеточные линии млекопитающих. В одном варианте реализации изобретения клетка млекопитающего является клеткой человека. 1В другом варианте реализации изобретения клетка млекопитающего является клеткой НЕК 293, которая принадлежит к клеточной линии из человеческих эмбриональных почек. Клетки НЕК 293 предоставляются под маркировкой СКЬ-1533 американской коллекцией типовых культур, Манассас, Вирджиния, и под маркировкой клетки 293-Н, каталог № 11631-017, или клетки 293-Р, каталог № 11625-019 Инвитроген (Карлсбад, Калифорния). В некоторых вариантах реализации изобретения клетка млекопитающего является клеткой РЕК.С6®, которая принадлежит к человеческой клеточной линии, полученной из сетчатки. Клетки РЕК.С6® предоставляются Сгисе11 (Ляйден, Нидерланды). В других вариантах реализации изобретения клетка млекопитающего является клеткой яичников китайского хомячка (СНО - от англ. СЫпезе Натз!ег оуагу). Клетки СНО предоставляются американской коллекцией типовых культур, Манассас, Вирджиния, (например, СНО-К1; ССЬ-61). В других вариантах реализации изобретения клетка млекопитающего является клеткой почки новорожденного хомячка (ВНК - от англ. ЬаЬу Натз!ег Ыбпеу).

- 65 028309

Клетки ВНК предоставляются американской коллекцией типовых культур, Манассас, Вирджиния, (например, СКЬ-1632). В некоторых вариантах реализации изобретения клетка млекопитающего является клеткой НКВ11, которая представляет гибридную клеточную линию из линий клеток НЕК293 и человеческих В-клеток; Ме1 еГ а1., Мо1. ВюГесЬпо1. 34(2): 165-78 (2006).

В одном варианте реализации плазмида, кодирующая фрагмент ФВ или химерный белок, являющиеся объектами данного изобретения, дополнительно содержит селектируемый маркер, например, отвечающий за устойчивость к зеоцину, и трансфицируется в клетки НЕК 293 для продуцирования фрагмента ФВ или химерного белка.

В другом варианте реализации первая плазмида, содержащая последовательность, кодирующую слитый белок фактор УШ-Рс, и первый селектируемый маркер, например ген, отвечающий за устойчивость к зеоцину, и вторая плазмида, содержащая последовательность, кодирующую фрагмент ФВ-Рс, и второй селектируемый маркер, например ген, отвечающий за устойчивость к неомицину, котрансфицируются в клетки НЕК 293 для создания гибрида фактор УШ-Рс - фрагмент ФВ-Рс. Первая и вторая плазмиды могут быть внесены в одинаковых количествах (т.е. в соотношении 1:1), либо они могут быть внесены в неодинаковых количествах.

В некоторых вариантах реализации изобретения первая плазмида, содержащая последовательность, кодирующую слитый белок фактор УШ-Рс, и первый селектируемый маркер, например ген, отвечающий за устойчивость к зеоцину, и вторая плазмида, содержащая последовательность, кодирующую фрагмент ФВ-Рс, и второй селектируемый маркер, например ген, отвечающий за устойчивость к неомицину, и третья плазмида, содержащая последовательность, кодирующую протеинконвертазу (например, РС5 или фурин), и третий селектируемый маркер, например ген, отвечающий за устойчивость к гигромицину, котрансфицируются в клетки НЕК 293 для создания гибрида фактор УШ-фрагмент ФВ. Первая и вторая плазмиды могут быть внесены в одинаковых количествах (т. е. в молярном соотношении 1:1), либо они могут быть внесены в неодинаковых количествах. В определенных вариантах реализации изобретения первая плазмида, содержащая последовательность, кодирующую слитый белок фактор УШ-Рс, последовательность, кодирующую фрагмент ФВ-Рс, и первый селектируемый маркер, например ген, отвечающий за устойчивость к зеоцину, и вторая плазмида, содержащая последовательность, кодирующую протеинконвертазу (например, РС5 или фурин), и второй селектируемый маркер, например ген, отвечающий за устойчивость к гигромицину, котрансфицируются в клетки НЕК 293 для создания гибрида фактор УШ-фрагмент ФВ. В одном варианте реализации изобретения нуклеотидные последовательности, кодирующие последовательность Ф-УШ-Рс и последовательность ФВ-Рс, могут быть соединены для того, чтобы кодировать один единственный полипептид. В другом варианте реализации изобретения нуклеотидные последовательности, кодирующие последовательность Ф-УШ-Рс и последовательность ФВ-Рс, могут кодировать две полипептидные цепи. Промоторы последовательности, кодирующей слитый белок фактор УШ-Рс, и последовательности, кодирующей фрагмент ФВ-Рс, могут быть разными либо одинаковыми.

В некоторых вариантах реализации изобретения плазмида, содержащая фурин, котрансфицируется с плазмидой, содержащей последовательность, кодирующую Ф-УШ-Рс, и/или последовательность, кодирующую ФВ-Рс. В некоторых вариантах реализации изобретения белок фурин находится на той же плазмиде, которая содержит последовательность, кодирующую слитый белок Ф-УШ-Рс. В некоторых вариантах реализации изобретения белок фурин находится на той же плазмиде, которая содержит последовательность, кодирующую фрагмент ФВ-Рс. В некоторых вариантах реализации изобретения белок фурин находится на отдельной плазмиде.

В других вариантах реализации изобретения трансфицированные клетки являются стабильно трансфицированными. Эти клетки могут быть собраны и сохранены в качестве стабильной клеточной линии при помощи традиционных методов, известных специалисту в данной области техники.

Клетки-хозяева, содержащие ДНК-конструкции белка, выращиваются в подходящей питательной среде. Употребляемый в данном тексте термин подходящая питательная среда обозначает среду, содержащую питательные вещества, необходимые для роста клеток. Питательные вещества, необходимые для роста клеток, могут включать источник углерода, источник азота, незаменимые аминокислоты, витамины, минералы и факторы роста. В некоторых случаях среда может содержать один или более селективных факторов. В некоторых случаях среда может содержать телячью сыворотку или фетальную телячью сыворотку (ФТС). В одном варианте реализации изобретения среда практически не содержит ^О. В общем случае питательная среда рассчитана на клетки, содержащие ДНК-конструкцию, при помощи, например, отбора по чувствительности к лекарственному препарату или дефициту незаменимого питательного веществ, которая дополнена селектируемым маркером на ДНК-конструкции или котрансфицируется с ДНК-конструкцией. Культивируемые клетки млекопитающих в общем случае выращивают на коммерчески доступных содержащих сыворотку или бессывороточных средах (например, МЕМ, ОМЕМ, ОМЕМ/Р12). В одном варианте реализации изобретения средой является СЭ293 (Инвитроген, Карлсбад, Калифорния). В другом варианте реализации изобретения средой является ί'.Ό17 (Инвитроген, Карлсбад, Калифорния). Выбор среды, подходящей для конкретной применяемой клеточной линии, является стандартным навыком для специалиста в данной области техники.

- 66 028309

Для того чтобы экспрессировать фрагмент ФВ и второй гетерологичный компонент или белок ФVIII, клетки-хозяева культивируются в условиях, которые обеспечивают возможность экспрессии фрагмента ФВ и второго гетерологичного компонента или белка Ф-’УШ. Употребляемый в данном тексте термин культивирование относится к сохранению живых клеток ш уйго на протяжении, по меньшей мере, определенного времени. Сохранение может, но не обязательно, включать рост популяции живых клеток. Например, сохраняемые в культуре клетки могут иметь статическую популяцию, но при этом жизнеспособными и способными к продуцированию необходимого продукта, например рекомбинантного белка или рекомбинантного слитого белка. Условия, подходящие для культивирования эукариотических клеток, хорошо известны в данной области техники и включают подходящий выбор питательной среды, добавок к среде, температуры, уровня рН, насыщения кислородом и тому подобное. В коммерческих целях культивирование может включать использование любых из множества типов систем для расширения масштаба, включая шуттель-аппараты, роллерные флаконы, биореакторы с полыми волокнами, биореакторы с механическим перемешиванием, эрлифтные биореакторы, волновые биореакторы и другие.

Условия культивирования клеток также выбираются таким образом, чтобы обеспечить возможность связывания фрагмента ФВ со вторым гетерологичным компонентом или белком Ф-ШИ. Условия, которые обеспечивают возможность экспрессии фрагмента ФВ и/или белка Ф-Щ^П, могут включать наличие источника витамина К. Например, в одном варианте реализации изобретения стабильно трансфицированные клетки НЕК 293 культивируются в среде ί'Ό293 (Инвитроген, Карлсбад, Калифорния) или в среде ОрИСНО (Инвитроген, Карлсбад, Калифорния), дополненной 4 мМ глутамина.

В одном аспекте реализации настоящее изобретение относится к способу экспрессии, создания или получения фрагмента ФВ, являющегося объектом изобретения, включающему а) трансфекцию клеткихозяина полинуклеотидом, кодирующим фрагмент ФВ, и б) культивирование клетки-хозяина в культуральной среде в условиях, подходящих для экспрессии фрагмента ФВ, при этом фрагмент ФВ экспрессируется. В одном варианте реализации изобретение относится к способу получения зрелого белка ФВ или его фрагмента, включающему, а) трансфекцию клетки-хозяина первым полинуклеотидом, кодирующим белок ФВ или его фрагмент, который сшит с пропептидом ФВ, и вторым полинуклеотидом, кодирующим протеинконвертазу, например РС5, РС7 или фурин, и б) культивирование клетки-хозяина в культуральной среде в условиях, подходящих для экспрессии зрелого белка ФВ или его фрагмента. Полинуклеотид, кодирующий белок ФВ или его фрагмент, также может быть сшит с препептидом ФВ. Последовательность препептида может отщепляться во время внесения в эндоплазматический ретикулум перед секрецией.

В другом аспекте реализации данное изобретение относится к способу экспрессии, создания или получения химерного белка, содержащего фрагмент ФВ, связанный или соединенный с гетерологичным компонентом белка Ф-ШП, включающему а) трансфекцию одной или более клеток-хозяев полинуклеотидом или группой полинуклеотидов, кодирующими химерный белок, и б) культивирование клеткихозяина в культуральной среде в условиях, подходящих для экспрессии химерного белка. В одном варианте реализации изобретение относится к способу экспрессии, создания или получения химерного белка, включающему а) трансфекцию клетки-хозяина первым полинуклеотидом, кодирующим фрагмент ФВ, связанный с гетерологичным компонентом, и вторым полинуклеотидом, кодирующим белок Ф-ШП, связанный с гетерологичным компонентом, и б) культивирование клетки-хозяина в культуральной среде в условиях, подходящих для экспрессии химерного белка. Первый полинуклеотид и второй полинуклеотид могут находиться в одном векторе или в двух векторах. В другом варианте реализации изобретение относится к способу экспрессии, создания или получения химерного белка, включающему а) трансфекцию клетки-хозяина первым полинуклеотидом, кодирующим фрагмент ФВ, связанный с гетерологичным компонентом, вторым полинуклеотидом, кодирующим белок Ф-ШП, связанный с гетерологичным компонентом, и третьим полинуклеотидом, кодирующим протеинконвертазу, и б) культивирование клеткихозяина в культуральной среде в условиях, подходящих для экспрессии химерного белка. В других вариантах реализации изобретение относится к способу экспрессии, создания или получения химерного белка, включающему а) трансфекцию клетки-хозяина первым полинуклеотидом, кодирующим фрагмент ФВ, содержащий домен Ό' и домен Ό3, связанный с гетерологичным компонентом, вторым полинуклеотидом, кодирующим белок Ф-ШП, связанный с гетерологичным компонентом, и третьим полинуклеотидом, кодирующим домен Ό1 и домен Ό2 ФВ, и б) культивирование клетки-хозяина в культуральной среде в условиях, подходящих для экспрессии химерного белка. В одном варианте реализации изобретения первый полинуклеотид, второй полинуклеотид и третий полинуклеотид могут находиться в одном векторе или в разных векторах. В другом варианте реализации изобретения первый полинуклеотид и второй полинуклеотид могут находиться в одном векторе, а третий полинуклеотид может находиться в другом векторе. В других вариантах реализации изобретения первый полинуклеотид и третий полинуклеотид могут находиться в одном векторе, а второй полинуклеотид может находиться в другом векторе. В некоторых вариантах реализации изобретения второй полинуклеотид и третий полинуклеотид могут находиться в одном векторе, а первый полинуклеотид может находиться в другом векторе.

В дополнительных вариантах реализации изобретения белковый продукт, содержащий фрагмент ФВ или химерный белок, содержащий фрагмент ФВ, секретируется в среду. Среду отделяют от клеток,

- 67 028309 концентрируют, фильтруют, а затем пропускают через две или три колонки для аффинной хроматографии, например колонку протеина А и одну или более анионообменных колонок.

В определенных аспектах реализации настоящее изобретение относится к полипептиду фрагмента ФВ или химерного белка, получаемому описанными в данном тексте способами.

Ιη νίίτο производство дает возможность для расширения масштаба для получения больших количеств необходимых измененных полипептидов, являющихся объектами данного изобретения. Методы культивирования клеток млекопитающих в условиях тканевого культивирования известны в данной области техники и включают гомогенное суспензионное культивирование, например, в эрлифтном реакторе или реакторе с механическим перемешиванием для непрерывного культивирования, или культивирование иммобилизованных или обездвиженных клеток, например, в полых волокнах, микрокапсулах, на арагозных микрогранулах или пьезокерамических головках. При необходимости и/или при желании растворы полипептидов могут быть очищены при помощи принятых хроматографических методов, например гель-фильтрации, ионообменной хроматографии, хроматографии с гидрофобным взаимодействием (ХГВ), хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе или аффинной хроматографии.

Фармацевтический состав.

Составы, содержащие фрагмент ФВ или химерный белок, являющиеся объектами настоящего изобретения, могут содержать подходящий фармацевтически приемлемый носитель. Например, они могут содержать наполнители и/или вспомогательные вещества, которые способствуют превращению активных компонентов в препараты, предназначенные для доставки в место действия.

Фармацевтический состав может быть приготовленным для парентерального введения (т.е. внутривенного, подкожного или внутримышечного) при помощи болюсной инъекции. Лекарственная форма для инъекции может быть представлена в виде единичной дозировки, например, в ампулах или в многодозовых контейнерах с добавление консерванта. Составы могут иметь вид суспензий, растворов или эмульсий на основе масляных или водных растворителей, и содержать вспомогательные вещества, такие как суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие вещества. В альтернативном варианте активный ингредиент может находиться в виде порошка для соединения с подходящим растворителем, например апирогенной водой.

Подходящие лекарственные формы для парентерального введения также включают водные растворы активных компонентов в водорастворимой форме, например водорастворимые соли. Вдобавок, могут применяться суспензии активных компонентов в виде подходящих масляных суспензий для инъекций. Подходящие липофильные растворители или среды включают жирные масла, например кунжутное масло, или эфиры синтетических жирных кислот, например этилолеат или триглицериды. Водные суспензии для инъекций могут содержать вещества, которые повышают вязкость суспензии, включая, например, натриевую карбоксиметилцеллюлозу, сорбитол и декстран. В некоторых случаях суспензия также может содержать стабилизаторы. Также могут использоваться липосомы для инкапсуляции молекул, являющихся объектами данного изобретения, для доставки их в клетки или интерстициальное пространство. Примерами фармацевтически приемлемых носителей являются физиологически совместимые растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые вещества, изотонические и замедляющие всасывание вещества, вода, солевой раствор, фосфатно-солевой буферный раствор, декстроза, глицерол, этанол и тому подобное. В некоторых вариантах реализации изобретения состав содержит изотонические вещества, например сахара, полиспирты, такие как маннитол, сорбитол, или хлорид натрия. В других вариантах реализации изобретения составы содержат фармацевтически приемлемые вещества, такие как смачивающие вещества, или небольшие количества вспомогательных веществ, таких как смачивающие или эмульгирующие вещества, консерванты или буферы, которые повышают срок годности или эффективность активных ингредиентов.

Составы, являющиеся объектами данного изобретения, могут находиться в различных формах, включая, например, жидкость (например, растворы для инъекций и инфузий), дисперсии, суспензии, полутвердые и твердые дозировочные формы. Предпочтительная форма зависит от способа введения и терапевтического применения.

Состав может быть изготовлен в виде раствора, микроэмульсии, дисперсии, липосомной или другой упорядоченной структуры, подходящей для высокой концентрации лекарственного препарата. Стерильные растворы для инъекций можно изготовить путем внесения необходимого количества активного ингредиента в подходящий растворитель, в случае необходимости - с одним или комбинацией вышеперечисленных ингредиентов, с последующей фильтрующей стерилизацией. В общем случае дисперсии изготавливают путем внесения активного ингредиента в стерильный растворитель, который содержит базовую дисперсную среду и другие необходимые ингредиенты из вышеперечисленных. В случае стерильных порошков для изготовления стерильных растворов для инъекций предпочтительными способами изготовления являются вакуумная сушка и лиофильная сушка, которая на выходе дает порошок из активного ингредиента плюс любой дополнительный необходимый ингредиент из исходного стерильноотфильтрованного раствора. Необходимую текучесть раствора можно сохранить, например, путем применения покрытия, такого как лецитин, путем сохранения необходимого размера частиц в случае дисперсии и путем применения поверхностно-активных веществ. Пролонгированное всасывание составов

- 68 028309 для инъекций может быть достигнуто путем включения в состав вещества, которое замедляет всасывание, например, солей моностеарата или желатина.

Активный ингредиент может быть изготовлен так, чтобы иметь форму приспособление для контролируемого высвобождения. Примеры таких лекарственных форм и приспособлений включают импланты, трансдермальные пластыри и микроинкапсулированные системы доставки. Могут применяться биоразлагаемые, биосовместимые полимеры, например этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, полиортоэфиры и полилактидная кислота. Способы изготовления таких лекарственных форм и приспособлений известны в данной области техники; смотрите, например, Зи81атеД апД Соп1го11еД Ке1еа8е Эгид ЭеЮегу Зу81ст8.1.К. КоЫп8оп, еД., Магсе1 Эеккег, 1пс., №\ν Уогк, 1978.

Депо лекарственных препаратов для инъекций может быть создано путем образования микроинкапсулированных матриц препаратов в биоразлагаемых полимерах, таких как полилактид-полигликолид. В зависимости от соотношения препарата и полимера и природы применяемого полимера можно контролировать скорость высвобождения препарата. Другими примерами биоразлагаемых полимеров являются полиортоэфиры и полиангидриды. Депо лекарственных препаратов для инъекций может быть изготовлено путем заключения препарата в липосомы или микроэмульсии.

В составы могут включаться дополнительные активные соединения. В одном варианте реализации фрагмент ФВ или химерный белок, являющиеся объектами данного изобретения, изготавливается вместе с другим фактором свертывания крови или его вариантом, фрагментом, аналогом или производным. Например, факторы свертывания крови включают, но не ограничиваются этим, фактор У, фактор УП, фактор УШ, фактор 1Х, фактор Х, фактор Х1, фактор Х11, фактор Х111, протромбин, фибриноген, фактор Виллебранда или рекомбинантный растворимый тканевой фактор (ррТФ) либо активированные формы любого из предыдущих веществ. Фактор свертывания крови гемостатического средства также может содержать антифибринолитические препараты, например эпсилон-амино-капроновую кислоту, транексамовую кислоту.

Схемы приема лекарственных препаратов можно подобрать таким образом, чтобы они обеспечивали оптимальные необходимый ответ. Например, можно вводить единичную болюсную дозу, можно вводить несколько отдельных доз в течение продолжительного периода или дозы можно пропорционально уменьшать или увеличивать как того требует терапевтическая ситуация. Парентеральные составы удобно изготавливать в виде единичной дозировки для облегчения введения и постоянства дозировки; смотрите, например, Кетшд£оп'8 РкагтасеиДса1 Зс1епсе8 (Маск РиЬ. Со., Еа81оп, Ра. 1980).

Дополнительно к активному соединению жидкая форма дозировки может содержать инертные ингредиенты, такие как вода, этиловый спирт, этилкарбонат, этилацетат, бензиловый спирт, бензилбензоат, пропиленгликоль, 1,3-бутиленгликоль, диметилформамид, масла, глицерол, тетрагидрофурфуриловый спирт, полиэтиленгликоли и сложные эфиры жирных кислот или сорбитан.

Неограничивающие примеры подходящих фармацевтических носителей также описаны в Кетшд1оп'8 РЬагтасеиНса1 Заепсе8 авторства Е.^. МагПп. Некоторые примеры наполнителей включают крохмал, глюкозу, лактозу, сахарозу, желатин, солод, рис, муку, мел, силиконовый гель, стеарат натрия, глицерол моностеарат, тальк, хлорид натрия, сухое обезжиренное молоко, глицерол, пропилен, гликоль, воду, этанол и тому подобное. Состав также может содержать рН буферные реагенты и смачивающие или эмульгирующие вещества.

Для перорального введения фармацевтический состав может иметь форму таблеток или капсул, изготовленных стандартными способами. Также состав может быть изготовлен в виде жидкости, например сиропа или суспензии. Жидкость может содержать суспендирующие вещества (например, сорбитный сироп, производные целлюлозы или гидрогенезированные пищевые жиры), эмульгирующие вещества (лецитин или гуммиарабик), неводные растворители (например, миндальное масло, жирные эфиры, этиловый спирт или фракционированные растительные масла) и консерванты (например, метил или пропилп-гидроксибензоаты или сорбиновую кислоту). Препараты также могут содержать ароматизирующие, окрашивающие вещества и подсластители. В альтернативном варианте состав может представлять собой сухой продукт для соединения с водой либо другим подходящим растворителем.

Для буккального введения состав может иметь форму таблеток или леденцов в соответствии о стандартными протоколами.

Для введения путем ингаляции соединения для применения согласно настоящему изобретению обычно доставляются в форме распыляемого аэрозоля с или без наполнителей или в форме спрейаэрозоля из аэрозольной упаковки или ингалятора, в некоторых случаях с пропеллентом, например дихлордифторметаном, трихлорфторметаном, дихлортетрафтрометаном, двуокисью углерода или другим подходящим газом. В случае аэрозольной упаковки единичная дозировка может быть определена, если нажатие клапана приводит к выделению дозированного количества вещества. Капсулы и картриджы из, к примеру, желатина, для использования в ингаляторе или инжекторе, можно изготовить с содержанием порошкообразной смеси из соединения и подходящей порошковой основы, такой как лактоза или крахмал.

Также можно изготовить фармацевтический состав для ректального введения в виде суппозитория или микроклизмы с удержанием, например, с содержанием обычных основ для суппозитория, таких как

- 69 028309 кокосовое масло или другие глицериды.

Генная терапия.

Фрагмент ФВ или содержащий его химерный белок, являющиеся объектами данного изобретения, могут продуцироваться ίη νί\Ό в организме млекопитающего, например пациента-человека, при применении терапевтически эффективных подходов генной терапии в лечении заболевания или нарушения, связанного с кровотечением, выбранного из группы, состоящей из нарушения свертываемости крови, гемартроза, мышечного кровотечения, кровотечения в полости рта, кровоизлияния, кровоизлияния в мышцы, кровоизлияния в полость рта, травмы, травмы головы, желудочно-кишечного кровотечения, внутричерепного кровоизлияния, кровоизлияния в брюшную полость, внутригрудного кровоизлияния, перелома костей, кровотечения в центральной нервной системе, кровотечения в заглоточном пространстве, кровотечения в забрюшинном пространстве и кровотечения во влагалище подвздошно-поясничной мышцы. В одном варианте реализации изобретения заболевание или нарушение, связанное с кровотечением, является гемофилией. В другом варианте реализации изобретения заболевание или нарушение, связанное с кровотечением, является гемофилией А. Лечение включает введение подходящего фрагмента ФВ или нуклеиновой кислоты, кодирующей химерный белок, функционально связанной с подходящей управляющей экспрессией последовательностью. В определенном варианте реализации изобретения эти последовательности включены в вирусный вектор. Подходящие вирусные векторы для указанной генной терапии включают аденовирусные векторы, лентивирусные векторы, бакуловирусные векторы, векторы на основе вируса Эпштейна-Барра, паповавирусные векторы, векторы на основе вируса осповакцины, векторы на основе вируса простого герпеса и аденоассоциированные вирусные (ААВ) векторы. Вирусный вектор может являтьться дефектным по репликации вирусным вектором. В других вариантах реализации изобретения аденовирусный вектор содержит делецию в гене Е1 или в гене Е3. При применении аденовирусного вектора организм млекопитающего можно не подвергать обработке нуклеиновой кислотой, кодирующей ген селектируемого маркера. В других вариантах реализации изобретения последовательности включены в невирусный вектр, известный специалистам в данной области техники.

Способы применения фрагмента ФВ или химерного белка.

Один аспект реализации настоящего изобретения относится к предотвращению или подавлению взаимодействия Ф-^И с эндогенным ФВ путем блокирования или экранирования ФВ-связывающего участка на Ф-^И от эндогенного ФВ. В одном варианте реализации изобретение относится к способу создания белка Ф-^И, который имеет время полужизни большее, чем Ф-^И дикого типа, или мономерно-димерного гибрида Ф-^И, при этом способ включает ковалентное соединение дополнительного компонента с белком Ф-^И, тем самым создавая химерный белок, содержащий белок Ф-^И и дополнительный компонент, причем дополнительный компонент экранирует или предотвращает взаимодействие белка Ф-ЩП с эндогенным ФВ. Химерный белок, применяемый в данном способе, включает один или более описанных в данном тексте химерных белков.

Другой аспект реализации изобретения включает способ введения нуждающемуся в этом пациенту белка Ф-^И, который имеет время полужизни большее, чем Ф^Ш дикого типа, или мономернодимерного гибрида Ф-^И, который состоит из двух полипептидных цепей, с первой цепью, состоящей из аминокислотной последовательности, кодирующей Ф-^И и Рс-область, и второй цепью, состоящей из Рс-области, при этом способ включает введение описанного в данном тексте фрагмента ФВ или описанного в данном тексте химерного белка пациенту. Аминокислотная последовательность Ф-^И в мономерно-димерном гибриде может являться последовательностью Ф-ЩП или Ф-^И дикого типа.

В одном варианте реализации изобретение относится к способу применения вспосогательного компонента, например, описанного в данном тексте фрагмента ФВ или химерного белка, содержащего фрагмент ФВ, для того, чтобы предотвратить или подавить взаимодействие эндогенного ФВ с белком Ф-^И. В другом варианте реализации изобретения белок Ф^Ш, который способен взаимодействовать с фрагментом ФВ, является эндогенным Ф-^И. В других вариантах реализации изобретения белок Ф-^И, который способен взаимодействовать с фрагментом ФВ, является составом Ф-^И, который вводится пациенту отдельно, до или после либо одновременно с фрагментом ФВ или химерным белком, содержащим фрагмент ФВ. В других вариантах реализации изобретения белок Ф^Ш, который способен связываться с фрагментом ФВ, является составом Ф-^И, который вводится пациенту вместе с фрагментом ФВ или химерным белком. В других вариантах реализации изобретения белок Ф-^И, который способен связываться с фрагментом ФВ, является Ф-^И, присутствующим с фрагментом ФВ или соединенным с фрагментом ФВ в химерном белке. Фрагмент ФВ или химерный белок, содержащий фрагмент ФВ, связывается или соединен с белком Ф-^И и, таким образом, продлевает время полужизни белка Ф-^И, связанного с фрагментом ФВ или химерным белком. Белок Ф-^И, связанный с фрагментом ФВ или химерным белком экранирован или защищен от процесса выведения ФВ и, таким образом, характерихуется сниженным выведением по сравнению с белком Ф-^И, не связанным с фрагментом ФВ или химерным белком. Таким образом, экранированный белок Ф-^И имеет большее время полужизни чем белок ФVIII, не связанный или не соединенный с фрагментом ФВ или химерным белком. В определенных вариантах реализации изобретения белок Ф-^И, соединенный с или защищенный фрагментом ФВ или химерным белком, являющимися объектами данного изобретения, не выводится клиренс-рецепторами ФВ.

- 70 028309

В других вариантах реализации изобретения белок Ф-УШ, соединенный с или защищенный фрагментом ФВ или химерным белком, выводится из системы медленнее, чем белок Ф-УШ, не соединенный с или не защищенный фрагментом ФВ.

В одном аспекте реализации фрагмент ФВ, являющийся объектом данного изобретения, или содержащий его химерный белок характеризуется сниженным выведение из циркуляции, так как данный фрагмент ФВ или химерный белок не содержит участка связывания клиренс-рецепторов ФВ. Фрагмент ФВ предотвращает или подавляет выведение из системы Ф-УШ, связанного или соединенного с фрагментом ФВ, в процессе выведения ФВ. Применяемые в настоящем изобретении фрагменты ФВ также могут обеспечивать по меньшей мере одно или более из ФВ-подобных Ф-УШ-защитных свойств, которые обеспечиваются эндогенным ФВ. В определенных вариантах реализации изобретения фрагменты ФВ также могут маскировать один или более из участков связывания клиренс-рецепторов Ф-УШ, тем самым предотвращая выведение Ф-УШ в процессе его собственного выведения.

В другом аспекте реализации фрагмент ФВ или химерный белок, являющиеся объектами данного изобретения, можно применять для лечения или предотвращения заболевания или нарушения, связанного с болезнью Виллебранда (БВ) типа 2№ БВ типа 2N является качественным дефектом ФВ, который есть следствием нарушения связывания ФВ с Ф-УШ и в результате приводит к низким уровням циркулирующего Ф-УШ. Следовательно, фрагмент ФВ или химерный белок, являющиеся объектами данного изобретения, путем связывания с или будучи связанными с белком Ф-УШ, не только стабилизируют белок Ф-УШ, но также предотвращают выведение белка Ф-УШ из циркуляции.

В некоторых вариантах реализации изобретения предотвращение или подавление связывания белка Ф-УШ с эндогенным ФВ фрагментом ФВ или химерным белком может происходить ш νίΙΐΌ или ш νί\Ό.

Также предложен способ увеличения времени полужизни белка Ф-УШ, включающий введение фрагмента ФВ или химерного белка, содержащего фрагмент ФВ, и белка Ф-УШ нуждающемуся в этом пациенту. Время полужизни неактивированного Ф-УШ, связанного или соединенного с полноразмерным ФВ, в плазме крови составляет от 12 до 14 ч. При БВ типа 3, когда в циркуляции практически отсутствует ФВ, время полужизни Ф-УШ составляет всего около 6 ч, что приводит к появлению у таких пациентов симптомов легкой или умеренной формы гемофилии А по причине пониженных концентраций Ф-УШ. Время полужизни белка Ф-УШ, связанного или соединенного с фрагментом ФВ, являющимся объектом настоящего изобретения, может возрастать по меньшей мере приблизительно в 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9 или 4,0 раз по сравнению со временем полужизни неактивированного Ф-УШ, связанного или соединенного с полноразмерным ФВ. В одном варианте реализации изобретения время полужизни белка Ф-УШ, связанного или соединенного с фрагментом ФВ в химерном белке возрастает по меньшей мере приблизительно в 2, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 7, 8, 9 или 10 раз по сравнению со временем полужизни неактивированного Ф-УШ, связанного или соединенного с полноразмерным ФВ. В другом варианте реализации изобретения время полужизни белка Ф-УШ, связанного или соединенного с фрагментом ФВ в химерном белке возрастает в от около 2 до около 5 раз, от около 3 до около 10 раз, от около 5 до около 15 раз, от около 10 до около 20 раз, от около 15 до около 25 раз, от около 20 до около 30 раз, от около 25 до около 35 раз, от около 30 до около 40 раз, от около 35 до около 45 раз по сравнению со временем полужизни неактивированного ФУШ, связанного или соединенного с полноразмерным ФВ. В конкретном варианте реализации изобретения время полужизни белка Ф-УШ, связанного или соединенного с фрагментом ФВ в химерном белке возрастает по меньшей мере в около 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 или 40 раз по сравнению со временем полужизни Ф-УШ дикого типа у мышей с двойным Ф-УШ- и ФВ-генным нокаутом. В некоторых вариантах реализации изобретения время полужизни химерного белка, содержащего фрагмент ФВ, сшитый с первым гетерологичным компонентом, например, первой Рс-областью, и белок Ф-УШ, связанный со вторым гетерологичным компонентом, например, второй Рс-областью, превышает время полужизни химерного белка, содержащего белок Ф-УШ и две Рс-области, где белок Ф-УШ связан с одной из двух Рс-областей (т.е. мономерно-димерный гибрид Ф-УШ). В других вариантах реализации изобретения время полужизни химерного белка, содержащего фрагмент ФВ, сшитый с первым гетерологичным компонентом, например, первой Рс-областью, и белок Ф-УШ, связанный со вторым гетерологичным компонентом, например, второй Рс-областью, превышает по меньшей мере в около 1,5, 2, 2,5, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,5 или 5,0 раз время полужизни химерного белка, содержащего белок Ф-УШ и две Рс-области, где белок Ф-УШ связан с одной из двух Рс-областей (т.е. мономерно-димерный гибрид Ф-УШ).

В некоторых вариантах реализации результатом изобретения является продление времени полужизни белка Ф-УШ по сравнению с белком Ф-УШ без фрагмента ФВ или Ф-УШ дикого типа. Время полужизни белка Ф-УШ по меньшей мере в 1,5, по меньшей мере в 2, по меньшей мере в 2,5, по меньшей мере в 3, по меньшей мере в 4, по меньшей мере в 5, по меньшей мере в 6, по меньшей мере в 7, по меньшей мере в 8, по меньшей мере в 9, по меньшей мере в 10, по меньшей мере в 11 или по меньшей мере в 12 раз больше, чем время полужизни белка Ф-УШ без фрагмента ФВ. В одном варианте реализации изобретения время полужизни Ф-УШ приблизительно 1,5-20-кратно, приблизительно 1,5-15-кратно или приблизительно 1,5-10-кратно превышает время полужизни Ф-УШ дикого типа. В другом варианте реализации изобретения время полужизни Ф-УШ продлено в от около 2 до около 10 раз, от около 2 до

- 71 028309 около 9 раз, от около 2до около 8 раз, от около 2 до около 7 раз, от около 2 до около 6 раз, от около 2 до около 5 раз, от около 2 до около 4 раз, от около 2 до около 3 раз, от около 2,5 до около 10 раз, от около 2,5 до около 9 раз, от около 2,5 до около 8 раз, от около 2,5 до около 7 раз, от около 2,5 до около 6 раз, от около 2,5 до около 5 раз, от около 2,5 до около 4 раз, от около 2,5 до около 3 раз, от около 3 до около 10 раз, от около 3 до около 9 раз, от около 3 до около 8 раз, от около 3 до около 7 раз, от около 3 до около 6 раз, от около 3 до около 5 раз, от около 3 до около 4 раз, от около 4 до около 6 раз, от около 5 до около 7 раз или от около 6 до около 8 раз по сравнению с Ф-УШ дикого типа или белком Ф-УШ без фрагмента ФВ. В других вариантах реализации изобретения время полужизни Ф-УШ составляет по меньшей мере около 17, по меньшей мере около 18, по меньшей мере около 19, по меньшей мере около 20, по меньшей мере около 21, по меньшей мере около 22, по меньшей мере около 23, по меньшей мере около 24, по меньшей мере около 25, по меньшей мере около 26, по меньшей мере около 27, по меньшей мере около 28, по меньшей мере около 29, по меньшей мере около 30, по меньшей мере около 31, по меньшей мере около 32, по меньшей мере около 33, по меньшей мере около 34, по меньшей мере около 35, по меньшей мере около 36, по меньшей мере около 48, по меньшей мере около 60, по меньшей мере около 72, по меньшей мере около 84, по меньшей мере около 96 или по меньшей мере около 108 ч. В других вариантах реализации изобретения время полужизни Ф-УШ составляет от около 15 ч до около двух недель, от около 16 ч до около одной недели, от около 17 ч до около одной недели, от около 18 ч до около одной недели, от около 19 ч до около одной недели, от около 20 ч до около одной недели, от около 21 ч до около одной недели, от около 22 ч до около одной недели, от около 23 ч до около одной недели, от около 24 ч до около одной недели, от около 36 ч до около одной недели, от около 48 ч до около одной недели, от около 60 ч до около одной недели, от около 24 ч до около шести дней, от около 24 ч до около пяти дней, от около 24 ч до около четырех дней, от около 24 ч до около трех дней или от около 24 ч до около двух дней.

В конкретном варианте реализации время полужизни химерного белка, являющегося объектом данного изобретения, примерно в два раза больше, чем время полужизни Ф-УШ дикого типа или Ф-УШ с удаленным В-доменом. В другом варианте реализации изобретения время полужизни химерного белка примерно в три раза больше, чем время полужизни Ф-УШ дикого типа или Ф-УШ с удаленным Вдоменом.

В изобретении дополнительно предложен способ лечения или предотвращения заболевания или нарушения, связанного с кровотечением, включающий введение эффективного количества фрагмента ФВ или химерного белка (например, химерного белка, содержащего фрагмент ФВ, связанный с первым гетерологичным компонентом, например, первой Рс-областью, и белок Ф-УШ, связанный со вторым гетерологичным компонентом, например, второй Рс-областью, где фрагмент ФВ связан или соединен с белком Ф-УШ). В одном варианте реализации изобретения заболевание или нарушение, связанное с кровотечением, выбрано из группы, состоящей из нарушения свертываемости крови, гемартроза, мышечного кровотечения, кровотечения в полости рта, кровоизлияния, кровоизлияния в мышцы, кровоизлияния в полость рта, травмы, травмы головы, желудочно-кишечного кровотечения, внутричерепного кровоизлияния, кровоизлияния в брюшную полость, внутригрудного кровоизлияния, перелома костей, кровотечения в центральной нервной системе, кровотечения в заглоточном пространстве, кровотечения в забрюшинном пространстве и кровотечения во влагалище подвздошно-поясничной мышцы. В конкретном варианте реализации изобретения заболевание или нарушение, связанное с кровотечением, является гемофилией А.

Для специалиста в данной области техники будет очевидно, что фрагмент ФВ и химерный белок, содержащий дополнительный компонент, например, описанный в данном тексте фрагмент ФВ, и белок Ф-УШ, изготовленный согласно изобретению, имеют много применений, включая, но не ограничиваясь этим, способы лечения пациента с нарушением гемостатики и способы лечения нуждающегося в общем гемостатическом средстве пациента. В одном варианте реализации изобретение относится к способу лечения пациента с нарушением емостатики, включающему введение пациенту терапевтически эффективного количества фрагмента ФВ или химерного белка.

Часть белка Ф-УШ в составе химерного белка излечивает или предотвращается нарушение гемостатики, выполняя роль кофактора фактору IX на негативно заряженной фосфолипидной поверхности, образуя тем самым комплекс Хазы. Связывание активированных факторов свертывания крови с фосфолипидной поверхностью локализирует этот процесс на поврежденных участках сосуда. На фосфолипидной поверхности фактор УШа повышает максимальную скорость активации фактора X фактором ка приблизительно в 200,000 раз, что приводит к второй большой волне образования тромбина.

Химерный белок, содержащий дополнительный компонент, например фрагмент ФВ, и белок Ф- 72 028309

VIII, можно применять для лечения любого нарушения гемостатики. Нарушения гемостатики, которые могут лечиться введением химерного белка, являющегося объектом данного изобретения, включают, но не ограничиваются этим, гемофилию А, а также дефицит или структурные аномалии в отношении фактора VIII. В одном варианте реализации изобретения нарушение гемостатики является гемофилией А.

Химерный белок, содержащий дополнительный компонент, например фрагмент ФВ, и белок ФVIII, можно применять профилактически для лечения пациента с нарушением гемостатики. Химерный белок, являющийся объектом данного изобретения, можно применять для лечения острых случаев кровотечения у пациента с нарушением гемостатики. В другом варианте реализации изобретения нарушение гемостатики может быть результатом дефективности фактора свертывания крови, например фактора Виллебранда. В одном варианте реализации изобретения нарушение гемостатики является наследственным нарушением. В другом варианте реализации изобретения нарушение гемостатики является приобретенным нарушением. Приобретенное нарушение может являться следствием первопричинного заболевания или состояния. Состоянием, не связанным с заболеванием, в качестве примера, но не ограничения, может являться рак, аутоиммунное заболевание или беременность. Приобретенное нарушение может являться следствием преклонного возраста или медикаментозного лечения первопричинного заболевания (например, химиотерапии при раке).

Изобретение также относится к способам лечения пациента, который не имеет врожденного нарушения гемостатики, но имеет первопричинное заболевание или состояние, которое приводит к появлению нарушения гемостатики, например, вследствие выработки антител к Ф-’УШ или хирургической операции. Таким образом, изобретение относится к способу лечения нуждающегося в общем гемостатическом средстве пациента, включающему введение пациенту терапевтически эффективного количества химерного белка, содержащего фрагмент ФВ и белок Ф-’УШ, изготовленного согласно представленным способам.

Настоящее изобретение также относится к способам снижения иммуногенности Ф-’УШ или индуцирования меньшей иммуногенности против Ф-УШ, сключающим введение эффективного количества описанного в данном тексте фрагмента ФВ, описанных в данном тексте химерных белков или кодирующих их полинуклеотидов.

В одном варианте реализации изобретения пациенту, нуждающемуся в общем гемостатическом средстве, проводят или собираются проводить хирургическую операцию. Химерный белок, содержащий фрагмент ФВ и белок Ф-УШ, можно применять до, во время или после хирургической операции в качестве профилактики. Химерный белок, содержащий фрагмент ФВ и белок Ф-УШ, можно применять до, во время или после хирургической операции для контролирования острых случаев кровотечения.

Химерный белок, содержащий фрагмент ФВ и белок Ф-УШ, можно применять для лечения острых случаев кровотечения у пациента без нарушениея гемостатики. Острые случаи кровотечения могут являться следствием тяжелой травмы, например хирургической операции, автомобильной катастрофы, ранения, проникающего огнестрельного ранения или любого травматического происшествия, которое приводит к неконтролируемому кровотечению. Неограничивающие примеры случаев кровотечения включают нарушение свертываемости крови, гемартроз, мышечное кровотечение, кровотечение в полости рта, кровоизлияние, кровоизлияние в мышцы, кровоизлияние в полость рта, травмы, травмы головы, желудочно-кишечное кровотечение, внутричерепное кровоизлияние, кровоизлияние в брюшную полость, внутригрудное кровоизлияние, переломы костей, кровотечение в центральной нервной системе, кровотечение в заглоточном пространстве, кровотечение в забрюшинном пространстве, кровотечение во влагалище подвздошно-поясничной мышцы и любые их комбинации.

При профилактических применениях один или более составов, содержащих химерный белок или фрагмент ФВ, являющиеся объектами данного изобретения, либо их смесь вводят пациенту, у которого еще не наблюдается болезненного состояния, для того, чтобы повысить устойчивость пациента или облегчить симптомы, связанные с заболеванием или нарушением. Такое количество препарата определяется как эффективная профилактическая доза. При терапевтических применениях иногда требуется относительно высокая дозировка (например, от 1 до 400 мг/кг полипептида на дозу, при этом дозировки в диапазоне от 5 до 25 мг являются более общеупотребимыми для радиоиммуноконьюгатов и более высокие дозы - для полипептидов, модифицированных цитотоксичными препаратами) при относительно коротких интервалах до того времени, пока прогрессирование заболевания снизится или закончится, и пока у пациента не появятся признаки частичного либо полного уменьшения интенсивности симптомов заболевания. После этого пациент может быть переведен на профилактический режим.

В некоторых вариантах реализации химерный белок, фрагмент ФВ или состав, являющиеся объектами данного изобретения, применяются для лечения по требованию, которое включает лечение случая кровотечения, гемартроза, мышечного кровотечения, кровотечения в полости рта, кровоизлияния, кровоизлияния в мышцы, кровоизлияния в полость рта, травмы, травмы головы, желудочно-кишечного кровотечения, внутричерепного кровоизлияния, кровоизлияния в брюшную полость, внутригрудного кровоизлияния, перелома костей, кровотечения в центральной нервной системе, кровотечения в заглоточном пространстве, кровотечения в забрюшинном пространстве или кровотечения во влагалище подвздошнопоясничной мышцы. Пациент может нуждаться в оперативной профилактике, периоперативной терапии

- 73 028309 или лечении для осуществления хирургической операции. Такие хирургические операции включают, например, малые хирургические операции, обширные хирургические операции, удаление зубов, тонзилэктомию, паховое грыжесечение, синовэктомию, полную замену коленного сустава, краниотомию, остеосинтез, травматическую хирургию, внутричерепную хирургию, внутрибрюшинную хирургию, внутригрудную хирургию или операции по протезированию суставов.

В одном варианте реализации изобретения химерный белок, содержащий фрагмент ФВ и белок ФУШ, вводится внутривенно, подкожно, внутримышечно или через любую слизистую поверхность, например, перорально, подъязычно, буккально, назально, ректально, вагинально или через легочные дыхательные пути. Химерный белок, содержащий фрагмент ФВ и белок Ф-УШ, может быть находиться в составе или быть связанным с биополимерным твердофазным носителем, что дает возможность медленного высвобождения химерного белка в месте кровотечения, или находиться в составе пропитки бандажа/повязки. Дозировка химерного белка, содержащего фрагмент ФВ и белок Ф-УШ, будет варьироваться в зависимости от пациента и от конкретно применяемого способа введения. Дозировки могут находиться в диапазоне от 0,1 до 100000 мкг/кг массы тела. В одном варианте реализации изобретения диапазон дозировок составляет 0,1-1000 мкг/кг. В другом варианте реализации изобретения диапазон дозировок составляет 0,1-500 мкг/кг. Белок может вводиться в непрерывном режиме или через определенные временные интервалы. Для определения оптимальных диапазонов дозировок и/или графиков введения препаратов можно применять методы ίη νΐίτο аналитики. Методы ίη νίΐτο аналитики для измерения активности фактора свертывания крови известны в данной области техники, например это анализ коагулирующей активности У11а-гТР §ТА-СЬОТ или анализ коагулирующей активности РОТЭМ. Вдобавок, эффективные дозировки могут быть экстраполированы из кривых доза-ответ, полученных при испытаниях на животных моделях, например на собаках с гемофилией (ΜοιιηΙ еί а1. 2002, Βίοοά 99(8) 2670).

После детального описания настоящего изобретения его содержание станет более понятным с отсылкой на нижеприведенные примеры, которые включены в данный текст исключительно в иллюстративных целях и не ограничивают данное изобретение. Все патенты и публикации, упоминаемые в данном тексте, включены в прямой форме посредством ссылки.

Примеры

Во всех примерах, если не указано иное, применяли нижеприведенные материалы и способы.

Материалы и способы.

В общем случае в осуществлении настоящего изобретения применяют, если не указано иное, общепринятые методы химии, биофизики, молекулярной биологии, рекомбинантной ДНК-технологии, иммунологии (в частности, например, технологии антител) и стандартных методов электрофореза; смотрите, например, δηιηόΐΌοΚ. РгШсН апб МаШабз, Мοίесиίа^ Οοηίη§: Со1б δρπη§ ΗπγΡογ ^аЬο^аίο^у Ргезз (1989); ΛηΙίόο6ν Еидтеепид РгоШ^з (Мебюбз ίη Мοίесиίа^ Βίοίο§γ), 510, Раи1, δ., Нитаиа Рг (1996); ΛηΙίόο6ν Еидтеепид: А Ргас11са1 АрргоасЬ (РгасПса1 АрргоасЬ 8епех 169), МсСаГГеПу, Еб., 1г1 Рг (1996); Аиί^Ьοб^е8: А ^аЬο^аίο^у Маииа1, Наг^и еί а1., С8.Н.Ь. Ргезз, РиЬ. (1999); и СиггеШ РгоШ^з ίη Мοίесиίа^ Βίο1ο§\\ ебз. Аи8иЬе1 еί а1., ίοΐιη \УПеу & δοιίδ (1992).

Пример 1. Клонирование различных доменов ФВ (фиг. 1).

(а) Клонирование р8УК-ФВ-001, 002, 003 и 004.

ρδΥΝ-ФВ от 001 до 004 содержат нуклеотидные последовательности, кодирующие фрагменты ФВ, которыми являются аминокислоты 1-276 (001), аминокислоты 1-477 (002), аминокислоты 1-511 (003) и аминокислоты 1-716 (004) белковой последовательности ФВ-Б'Б3А. Следующая нумерация аминокислот представляет последовательность зрелого ФВ без пропептида и соответствует аминокислотам 7641039 (001), аминокислотам 764-1240 (002), аминокислотам 764-1274 (003) и аминокислотам 764-1479 (004) из 8ЕО ГО N0: 2 соответственно. Все четыре конструкции содержат сигнальный пептид Ф-УШ при Ν-конце, что делает возможной необходимую секрецию синтезированного белка, за которым следует метка 6хН18 при С-конце, которая используется для очистки белка. Вышеприведенные конструкции синтезировали при помощи следующих комбинаций праймеров:

- 74 028309 ρδΥΝ ФВ-001:

Е8С48- Прям. - ΦΒ-ΟΌ3 с сигналом VIII и сайтом ВзГ\У4

ТССССАССТАССССССССАССАТССАААТАСАССТСТССАССТССТТСТТТСТСТСС СТТТТСССАТТСТССТТТАСССТАТССТСТСССССССССАТС(8ЕОГОЫО: 57)

Е8С50- Обрати,- ФВ- частичный ϋΌ3 (аминокислоты 1-276) с сайтом 6 Ηίδ и Νοΐΐ

ТСАССТССАССССССССТСАСТССТСАТССТСАТСАТССАеАСССАСТТТТСТССТС

ТСА6САСАСТ6(8Е0ПЖО: 58) ρδΥΝ ФВ- 002:

ΕδΟ48- Прям. - ΦΒ-ΟΌ3 с сигналом VIII и сайтом ВзГ\У4

ТССССАССТАССССССССАССАТССАААТАСАССТСТССАССТССТТСТТТСТСТСС СТТТТ6С6АТТСТ6СТТТА6ССТАТССТ6ТС66ССССССАТ6(8Е0ПЖО: 59)

ΕδΟ51- Обрати,- ФВ ΟΌ3 (аминокислоты 1-477) с сайтом 6 Ηίδ и Νοΐΐ

ТСАССТССАССССССССТСАСТССТСАТССТСАТСАТСССССТССТСССАСССТТСА

САССТСАСеТТСАСААС^Е()ПЖО: 60) ρδΥΝΦΒ- 003:

ТССССАССТАССССССССАССАТССАААТАСАССТСТССАССТССТТСТТТСТСТСС СТТТТСССАТТСТССТТТАСССТАТССТСТСССССССССАТС(8ЕОГОЫО: 61)

ΕδΟ52- Обратн.-ФВ-О'ОЗ Рагйа1А1 (аминокислоты 1-511) с сайтом 6 Ηίδ и Νοΐΐ

ТСАССТССАССССССССТСАСТССТСАТССТСАТСАТСССТССТССАСТАСАААТСС

Т6СААС66С66ТТС(8Е0ПЖО: 62) ρδΥΝ ФВ- 004:

ТССССАССТАССССССССАССАТССАААТАСАССТСТССАССТССТТСТТТСТСТСС

СТТТТСССАТТСТССТТТАСССТАТССТСТСССССССССАТС(8ЕОГОЫО:63)

ΕδΟ53-Обрати,- ΦΒ-ΟΌ3Α1 (аминокислоты 1-716) с сайтом 6 Ηίδ ηΝοϊΙ

ТСАССТССАССССССССТСАСТССТСАТССТСАТСАТСССССАСАСТСАСТТСТССС

ΑΤ6Τ6666(8Ε0Π)ΝΟ: 64)

Предполагается, что белки из конструкций ФВ-001, 002, 003 и 004 существуют в виде мономера.

Реакцию ПЦР проводили в 50 мкл с комбинациями праймеров Е8С 48/Е8С50, Е8С 48/Е8С 51, Е8С 48/Е8С52, Е8С48/Е8С53 и полноразмерной ФВ-плазмидой в качестве матрицы, используя двухэтапный цикл ПЦР-амплификации: 94°С 2 мин; 21 цикл с (96°С 30 с, 68°С 2 мин). Полосы правильного размера (~960 п.н.о. для ФВ 001; 1460 для ФВ 002, 1520 п.н.о. для ФВ 003; и 2150 п.н.о. для ФВ 004) очищали гелем при помощи Ое1 Ех1гасйоп кй (Киаген (^адеп^ Валенсия, Калиф.) и клонировали в сайты рестрикции ВкАХЧ и Ж1 пцДНК 4 для получения р8УЮФВ 001,002,003 и 004 соответственно.

(б) Клонирование р8У№ФВ-006.

р8У№ФВ-006 содержит домен ОШ2П^Г03-СК (от англ. сук!ете кпо1) ФВ. Для клонирования этой конструкции использовали синтез фрагмента ДНК, содержащего часть домена Ό3 и домена СК (Оепксйр! - идентификационный номер последовательности 122026, показано ниже). Фрагмент конструкции Оепкспр! субклонировали в расщепленную ВатН1/ЕсоКУ р8УЮФВ 008, т.е. вектор, кодирующий полноразмерный ФВ.

- 75 028309

СгепзспрЕНомер последовательности - 122026 (8Εί)ΙϋΝΟ: 65)

СеАТССТАСТССССААТААСССАТССАСССАССССТСАСТСАААТССААСАААССССТСАССАТССТССТС

САСССАССАСАСАТТСАССТСТТТСАСССССАССТСААТСТСААСАСССССАТСААССАТСАСАСТСАСТТ

ТеАССТССТССАСТСТССССССТАСАТСАТТСТССТССТССССАААССССТСТСССТССТСТСССАССССС

АССТСАССАТСТСССТССТССТСААССАСАСАТАССАССАСАААСТСТСТССССТСТСТСССААТТТТСАТ

СеСАТССАСААСААТСАССТСАССАССАССААССТССААСТССАССААСАСССТСТССАСТТТСССААСТС

СТ66АААСТ6А6СТС6САеТ6Т6СТ6АСАССА6АААА6Т6ССТСТбеАСТСАТССССТ6ССАССТ6ССАТА

АСААСАТСАТСААССАСАССАТССТССАТТССТССТСТАСААТССТТАССАСТСАССТСТТССАССАСТСС

ААСААССТССТССАСССССАСССАТАТСТССАТСТСТССАТТТАССАСАССТССТССТСТСАСТССАТТСС

ССАСТСССССТССТТСТСССАСАССАТТССТСССТАТССССАССТСТСТССССАССАТСССААССТССТ6А

ССТССАССАСССССАСАТТСТССССССАСАССТСССАССАСАССААТСТСССССАСААССССТАТСАСТСТ

САСТСССССТАТААСАССТСТССАССТСССТСТСААСТСАССТСТСАССАСССТСАСССАСТССССТСССС

ТСТССАСТСТСТССАССССТСССАТССССАСТССССТССАСССААААТССТССАТСАССТТТТССАСАССТ 6С6ТТ6АСССТ6АА6АСТ6ТССА6Т6Т6Т6А66Т66СТ66СС66С6ТТТТ6ССТСА66ААА6ААА6ТСАСС ТТСААТСССАСТСАСССТСАССАСТСССАСАТТТСССАСТСТСАТСТТСТСААССТСАССТСТСААСССТС ССАССАССССССАССССТССТССТСССТСССАСАеАТеСССССбТСАСССССАССАСТСТСТАТСТССАТС АСАСССТССАССАТСССТСТСАТАСТСАСТТСТССААССТСААТСАСАСАССАСАСТАСТТСТСССАСААС АСССТСАСАСССТССССАСССТТТСАТСААСАСААСТСТСТТССТСАСССАССТААААТТАТСААААТТСС А6ССАССТестСТ6АСАСАТ6Т6А66А6ССТСА6Т6СААССАСАТСАСТ6ССА6ССТССАСТАТ6ТСААС6 ТСССААССТСТААСТСТСААСТАСАССТССАТАТС (в) Клонирование рЗУ\-ФВ-009, 010, 011, 012 и 013.

Конструкция рЗΥN ФВ 008 содержит последовательность полноразмерного ФВ в пцДНК 3.1 (аминокислоты 1-2813 из ЗЕР 10 N0: 2). Она содержит пропептид длиной в 763 аминокислоты (т.е. домены [)11)2), за которым следует остальная последовательность из 2050 аминокислот зрелого ФВ. рЗУ\-ФВ009, 010, 011 и 012 содержат одинаковые кодирующие последовательности как и ФВ 001, 002, 003 и 004 соответственно, но дополнительно содержат домены О1О2 (пропептида ФВ) при \-конце вместо сигнального пептида Ф-νΙΙΙ. рЗΥN ФВ 008 содержит сайт ΒатΗ1 в Агд907 и сайт \οΐ1 в конце кодирующей области (после стоп-кодона). рЗУ\-ФВ-008, 001, 002, 003 и 004 расщепляли рестрикционными ферментами ΒатΗ1 и ^П. Вставки из рЗУ\-ФВ-001 (423 п.н.о.), рЗУ\-ФВ-002 (1026 п.н.о.), рЗУ\-ФВ-003 (1128 п.н.о.) и рЗУ\-ФВ-004 (1743 п.н.о.) были лигированы в расщепленную ЪатΗ1/Nοί1 рЗУ\-ФВ-008 (8242 п.н.о.), чтобы получить рЗУ\-ФВ-009 (Ό1Ό2Ώ'Ώ3: аминокислоты 1-1039 из ЗЕО ГО N0: 2); рЗУУФВ-010 (Ώ1Ώ2Ώ'Ώ3: аминокислоты 1-1240 из ЗЕО ГО N0: 2); рЗУ\-ФВ-011 (Ό1Ό2Ώ'Ώ3: аминокислоты 1-1274 из ЗЕР ГО N0: 2); рЗУ\-ФВ-012 (Ό1Ό2Ώ'Ώ3: аминокислоты 1-1479). Все 4 конструкции содержат метку 6χΗΐδ при С-конце. В трансфицированных клетках рЗУ\-ФВ-009, 010, 011 и 012 синтезируются с пропептидом, но вследствие внутриклеточного процессинга секретируемые продукты не содержат пропептид (1)11)2). Белок, экспрессируемый из конструкции ФВ-009, существует в виде мономера, а белки, экспрессируемые из конструкции ФВ-010, 011 и 012, как предполагается, существуют в виде димеров, как показано на фиг. 6 и 7, где в качестве приверов взяты соответственно ФВ-009 и ФВ-010.

рЗУ\-ФВ-010 использовали для получения рЗУ\-ФВ-013, которая содержит две точечные мутации в С336А и С379А, соответствующие ЗЕО 10 N0: 73 (нумерация аминокислот представляет последовательность зрелого ФВ без ФВ последовательности 2 доменов 1)11)2). Эти мутации должны предотвращать димеризацию домена ΏΌ3 ФВ.

(г) Клонирование рЗУ\-ФВ-025 и 029.

рЗУ\-ФВ-025 содержит 1)11)21)2)3 последовательности дикого типа полноразмерного ФВ в векторе р[3\Т2 в то время как рЗУ\-ФВ-029 содержит домены Ώ1Ώ2Ώ'Ώ3 с мутациями С336А/С379А в векторе ρΒίνΐ/ Для клонирования рЗУ^-ФВ-025 и 029 использовали следующие комбинации праймеров:

ЕЗС 89-прям. с сайтом №е1ЮТСАСТАТАСССАСАСССААССТСССТАСССС(ЗЕ<5ПЖО:

66)

Е8С 91-обрати, с 8а11=

СТССАТССССССАСТССАСТССТСАСТССТСАТССТСАТСАТС(ЗЕЦПЖО: 67)

Реакцию ПЦР проводили в 50 мкл с комбинациями праймеров ЕЗС 89/ЕЗС91 и плазмидами рЗУУФВ-010 (для рЗУ\-ФВ-025) или рЗУ\-ФВ-013 (для рЗУ\-ФВ-029) в качестве матрицы, используя трехэтапный цикл ПЦР-амплификации: 94°С - 2 мин; 21 цикл с (96°С - 30 с, 55°С - 30 с, 68°С - 4 мин). Полосу с ожидаемым размером (-3800 п.н.о.) очищали гелем при помощи Се1 Вxί^асί^οη кй (Киаген (^^адеη), Валенсия, Калиф.) и клонировали в рестрикционные сайты \Не1 и За11 вектора ркОТ/Мииз (Инвитроген, Карлсбад, Калиф.) для получения рЗУ\-ФВ-025 и 029.

(д) Клонирование рЗУ\-ФВ-031.

рЗУ\-ФВ-031 является ПГО2П'П3(С336А/С379А)-Рс конструкцией, котораясодержиттромбинотщепляемыйлинкердлинойв 48 аминокислот (8х ССССЗ (ЗЕО 10 N0: 110) + тромбин-сайт) междупоследовательностямиФВ ОГО2О'О3(С336А/С379А) и Рс. Для создания этой конструкции область ФВ-Рс амплифицировали из конструкции рЗУ\-Ф-\'П 1-064 (смотрите нижеприведенную конструкцию Ф-νΙΙΙФВ). рЗУ^ФУШ-ФВ расщепляли ХЪа1 и №е1. Полученную область вставки в 4165 п.н.о., содержащую фрагмент ФВ и Рс-область, использовали в качестве матрицы для амплификации ФВ и Рс-области при помощи комбинаций праймеров к\У 22/1.У23.

- 76 028309

1ΛΥ 22-ПРЯМ.-ФВ-0'ОЗ с сигнальными последовательностями ФУШ и сайтом ВзГ\У!

ССССССССССТАССАТССАААТАСАССТСТССАССТССТТСТТТСТСТСССТТТТСС САТТСТССТТТАСССТАТССТСТСССССССССАТС(8ЕРПЖО: 68)

1ΛΥ 23-Обратн,- Рс со стоп-кодоном и сайтом Νοΐΐ

ТСАТСААТСТАТСТТАТСАТСТСТСААТТСССССССССТСАТТТАСС^ЕЦПЖО

69)

Нуклеотидная последовательность ФВ 031 (8Ε()ΙΕ)ΝΟ: 108)

АТСАТТССТСССАСАТТТСССССССТССТССТТССТСТСССССТСАТТТТ

СССАСССАСССТТТСТССАСААССААСТССССССАССТСАТССАСССССС

101 САТССАСССТТТТСССААСТСАСТТССТСААСАССТТТСАТСССАССАТС

151 ТАСАССТТТСССССАТАСТССАСТТАССТССТСССАССССССТСССАСАА

201 АСССТССТТСТССАТТАТТССССАСТТССАСААТСССААСАСАСТСАССС

251 ТСТСССТСТАТСТТССССААТТТТТТСАСАТССАТТТСТТТСТСААТССТ

301 АСССТСАСАСАСССССАССАААСАСТСТССАТССССТАТСССТССАААСС

351 ССТСТАТСТАСАААСТСАСССТСССТАСТАСААССТСТССССТСАССССТ

401 АТСССТТТСТССССАССАТССАТСССАСССССААСТТТСААСТССТССТС

451 ТСАСАСАСАТАСТТСААСААСАССТССССССТСТСТСССААСТТТААСАТ

501 СТТТССТСААСАТСАСТТТАТСАСССААСААСССАССТТСАССТСССАСС

551 СТТАТСАСТТТСССААСТСАТССССТСТСАССАСТССАСААСАСТССТСТ

601 СААСССССАТСТССТСССАССАССТСАТССААСАТСТССТСТССССАААТ

651 ССАСААСССССТСТСССАССАСТСССАССТТСТСААСАССАССТСССТСТ

701 ТТССССССТСССАСССТСТССТССАСССССАСССТТТТСТСССССТСТСТ

751 САСААСАСТТТСТСТСАСТСТССТСССССССТССАСТСССССТССССТСС

801 ССТССТССАСТАСССССССАССТСТССССАССАСССААТССТССТСТАСС

851 ССТССАСССАССАСАСССССТССАССССАСТСТССССТССТССТАТССАС

901 ТАТАСССАСТСТСТСТССССТТСССССАССАССТСССАСАСССТССАСАТ

951 СААТСАААТСТСТСАССАСССАТСССТССАТСССТССАССТССССТСАСС

1001 САСАССТССТССАТСААССССТСТСССТССАСАССАСССАСТСТСССТСС

1051 СТССАТТССССАААССССТАСССТССССССАССТСССТСТСТССАСАСТС

1101 СААСАССТССАТТТССССАААСАСССАСТССАТСТССАССААТСААСААТ

1151 СТССАССССАСТСССТТСТСАСТССТСААТСССАСТТСААСАССТТТСАС

1201 ААСАСАТАСТТСАССТТСАСТСССАТСТСССАСТАССТССТССССССССА

1251 ТТСССАССАССАСТССТТСТССАТТСТСАТТСАСАСТСТССАСТСТССТС

1301 АТСАСССССАСССТСТСТССАСССССТСССТСАСССТСССССТСССТССС

1351 СТССАСААСАСССТТСТСАААСТСААССАТСССССАССАСТТСССАТССА

1401 ТССССАССАСАТССАССТСССССТССТСАААССТСАССТССССАТССАСС

1451 АТАСАСТСАСССССТСССТСССССТСАССТАСССССАССАССТССАСАТС

1501 САСТСССАТСССССССССАСССТССТССТСААССТСТССССССТСТАТСС

1551 ССССААСАССТССССССТСТСТСССААТТАСААТСССААССАСССССАСС

1601 АСТТССТТАСССССТСТССССТСССССАССССССССТССАССАСТТСССС

1651 ААССССТССААССТССАСССССАСТСССАССАССТССАСААССАССАСАС

1701 ССАТСССТССССССТСААСССССССАТСАССАССТТСТСССАССАССССТ

1751 ССССССТССТСАССТСССССАСАТТССАССССТСССАТССТССССТСАСС

1801 ССССТССССТАССТССССААСТСССССТАССАССТСТССТССТССТСССА

1851 ссссссссастссстстссссссссстссссасстатссссссссстссс

1901 СССССАСАССССТСССССТССССТССССССАСССАССССССТСТСАССТС

1951 ААСТСССССАААССССАССТСТАССТССАСТСССССАСССССТССААССТ

2001 САССТСССССТСТСТСТСТТАСССССАТСАССААТССААТСАССССТССС

2051 ТССАССССТССТТСТСССССССАССССТСТАСАТССАТСАСАССССССАС

2101 ТеССТССССААСССССАеТСССССТСТТАСТАТСАСеСТСАСАТСТТССА

2151 С С САСААСАСАТ С Τ Т С Т САСАССАТ САСАС САТ СТ С С ТАС Т С ТСАССАТ С

2201 ССТТСАТССАСТСТАССАТСАСТССАСТССССССААССТТССТСССТСАС

2251 ССТСТССТСАССАСТССССТСТСТСАТСССАССААААССАСССТАТССТС

2301 ТСССССССССАТССТСААССТССТСТСТСССССТСАСААССТССССССТС

2351 ААС С С С Т С САСТ С ТАС СААААС С Т С С С АСААС ТАТ САС С Т С САСТ ССАТ С

2401 АССАТССССТСТСТСТСТСССТСССТСТСССССССССССАТССТСССССА

2451 ТСАСААСАСАТСТСТСССССТССАААССТСТСССТССТТССАТСАССССА

2501 АССАСТАТСССССТССАСАААСАСТСААСАТТСССТССААСАСТТСТСТС

2551 ТСТС С ССАС С ССААСТ ССААС Т С САСАСАС САТ СТ СТ СТ САТ СС САС СТС

2601 СТССАССАТССССАТСССССАСТАССТСАССТТССАСССССТСАААТАСС

2651 ТСТТССССССССАСТСССАСТАССТТСТССТССАССАТТАСТСССССАСТ

2701 ААСССТСССАССТТТСССАТССТАСТССССААТААСССАТССАСССАССС

2751 СТСАСТСАААТССААСАААССССТСАССАТССТССТССАСССАССАСАСА

2801 ТТСАССТСТТТСАСССССАССТСААТСТСААСАСССССАТСААССАТСАС

2851 АСТСАСТТТСАССТССТССАСТСТССССССТАСАТСАТТСТССТССТССС

2901 САААССССТСТСССТССТСТСССАСССССАССТСАССАТСТСССТССТСС

951 Т СААССАСАСАТАС САССАСАААСТ СТ СТ ССС СТ СТ СТ СССААТ ТТТ САТ

3001 СССАТССАСААСААТСАССТСАССАССАССААССТССААСТССАССААСА

- 77 028309

3051 СССТСТССАСТТТСССААСТССТССАААСТСАССТСССАСТСТССТСАСА 3101 ССАСААААСТСССТСТССАСТСАТССССТСССАССТСССАТААСААСАТС 3151 АТСААССАСАССАТССТССАТТССТССТСТАСААТССТТАССАСТСАССТ 3201 СТТССАССАСТССААСААССТССТССАСССССАСССАТАТСТССАТСТСТ 3251 ССАТТТАССАСАССТССТССТСТСАСТССАТТССССАСТСССССССАТТС 3301 ТСССАСАССАТТССТСССТАТССССАССТСТСТССССАССАТСССААССТ 3351 66Т6АССТ66А66АС66ССАСАТТ6Т6СССССА6А6СТ6С6А66А6А66А 3401 АТСТСССССАСААССССТАТСАСССТСАСТСССССТАТААСАССТСТССА 3451 ССТСССТСТСААСТСАССТСТСАССАСССТСАСССАСТССССТССССТСТ 3501 ССАСТСТСТССАССССТСССАТССССАСТССССТССАСССААААТССТСС 3551 АТСАССТТТТССАСАССТСССТТСАСССТСААСАСТСТССАСТСТСТСАС 3601 СТСССТССССССССТТТТСССТСАССАААСАААСТСАССТТСААТСССАС 3651 ТСАСССТСАССАСТСССАСАТТТСССАСТСТСАТСТТСТСААССТСАССТ 3701 СТСААСССТСССАССАССССАТАТСТСССССТССАССТТССССТСССССС 3751 ССАТСССССССТССАССТТСССССССТССАССТТССССТССССССССАТС 3801 СССТССССССССАТСССТССТССССССССССАСССССССТССАССТТССС 3851 СТССССССССАТСССАСААААСТСАСАСАТССССАСССТССССАССТССА 3901 СААСТССТССССССАСССТСАСТСТТССТСТТССССССААААСССААССА 3951 САСССТСАТСАТСТСССССАССССТСАССТСАСАТСССТССТССТССАСС 4001 ТСАСССАССААСАСССТСАССТСААСТТСААСТССТАССТССАСССССТС 4051 САССТССАТААТСССААСАСАААССССССССАССАССАСТАСААСАССАС 4101 СТАСССТСТССТСАСССТССТСАСССТССТССАССАССАСТСССТСААТС 4151 ССААССАСТАСААСТССААССТСТССААСАААССССТСССАССССССАТС 4201 САСААААССАТСТССАААСССАААССССАССССССАСААССАСАССТСТА 4251 САСССТССССССАТССССССАТСАССТСАССААСААССАССТСАСССТСА 4301 ССТСССТССТСАААСССТТСТАТСССАСССАСАТСССССТССАСТСССАС 4351 АССААТССССАСССССАСААСААСТАСААСАССАССССТССССТСТТССА 4401 СТСССАССССТССТТСТТССТСТАСАССААССТСАСССТССАСААСАССА 4451 ССТСССАССАССССААССТСТТСТСАТССТСССТСАТССАТСАСССТСТС 4501 САСААССАСТАСАСССАСААСАСССТСТСССТСТСТСССССТАААТСА

Белковая последовательность ФВ 031 (δΕΟΙΡΝΟ: 109)

М1РАЕЕАСУЬЬАЬАЫЬРСТЬСАЕСТЕСЕЗЗТАЕСЗЬЕСЗОЕУЫТЕОСЗМ

УЗЕАСУСЗУЬЬАССССКЕЗЕЗИСОЕСЫСКЕУЗЬЗУУЬСЕЕЕОТНЬЕУЫС

101 ТУТ<2еО<2КУ5МРУА5КеЬУЬЕТЕАеУУКЬ5еЕАУеЕУАК1ОС5еЫЕ<2УЬЬ

151 ЗОКУЕЫКТССЬССЫЕ1\Г1ЕАЕООЕМТ(2ЕСТЬТЗОРУОЕАЫ31лГАЬЗЗСЕ(21лГС

01 ЕКА5РР555СЫ155еЕМ<2КСЫлГЕ<2С<2ЬЬК5Т5УЕАКСНР1Л/ОРЕРЕУАЬС

51 ЕКТЬСЕСАССЬЕСАСРАЬЬЕУАЕТСАОЕСМУЬУСЧТОНЗАСЗ РУСРАСМЕ

301 УКССУ5РСАКТС<25ЬН1ЫЕМС<2ЕКСУОеС5СРЕе<2ЬЬОЕСЬСУЕ5ТЕСРС

351 УН5еККУРРеТ5Ь5КОС14ТС:1СИ45<21лГ1С5ЫЕЕСРеЕС1Л/Те<25НЕК5ЕО

401 ΝΕΥΕΤ ЕЗ С1 С<2УЫАМ)С<2ОН5 ЕЗ1VI ЕТУ<2САООКОАУСТКЗ УТУРЬРС

451 ЬНЫ5ЬУКЬКНСАеУАМОеСО1СЬРЬЬКеОЬК1<2НТУТА5УРЬ5УСЕОЬ<2М

501 отоекекь1л/кь5РУУАектсеьсеыуыеы<2еооЕьтР5еьАЕРКУЕОЕе

551 ЫА№КЬНеЕС<2ОЬ<2К<2Н5ОРСАЬЫРКМТКЕ5ЕЕАСАУЬТ5РТЕЕАСНКАУ5

601 РЬРУЬРЫСКУОУСЗСЗОеКЕСЬСеАЬАЗУАААСАекеУРУАЧКЕРСКСЕЬ

651 14СРКе<2УУЬ<2СеТРС14ЬТСК5Ь5УРОЕЕСЫЕАСЬЕеСЕСРРеЬУМОЕКеО

01 СУРКА<2СРСУУОСЕ1 ΕφΡΕϋΙ ЕЗОННТМСУСЕОСЕМНСТМЗСУРСЗЬЬРО

751 АУЬ55РЬ5НК5КК5Ь5СКРРМУК1Л/СРАО14ЬКАЕеЬЕСТКТС<2ЫУОЬЕСМ

01 ЗМССУЗССЬСРРСМУЕНЕЫКСУАЬЕЕСРСЕНОСКЕУАРСЕТУКЮСЫТСУ

851 СКОККЖГСТОНУСОАТС5Т1еМАНУЬТЕОеЬКУЬЕРеЕС<2УУ1Л/<2ОУСС5

901 ЫРСТЕЕ1ЬУСЫКСС5НР5УКСККЕУТ1ЬУЕССЕ1ЕЬЕОСЕУЫУККРМКОЕ

951 ТНЕЕУУЕ36КУ11ЬЬЬ6КАЬЗУУТОКНЬ313УУЬКСТУСЕЮ/С6ЬС6ЫЕ0

01 С1<2ЫЫОЬТЗ 3ΝΕ<2νΕΕΟΡνϋΕΟΝ31/ίΚν3 3<2СА0ТККУРЬ03 3 ΡΑΤΟΗΝΝΙ

1051 МК(2ТМУ1)ЗЗСК1ЬТЗОУЕ(2ОС1\ГК1Л/1)РЕРУЬОУС1УОТСЗСЕ31СОСААЕ

1101 СОТ1ААУАНУСАСНСКУУГВДКТАТЬСР<23СЕЕИ4ЬКЕЫСУЕАЕ1лГКУЫЗСА

1151 РАС<2УТС<2НРЕРЬАСРУ<2СУЕССНАНСРРеК1 ЬОЕЬЬОТСУОРЕБСРУСЕ

01 УАеккЕАзеккутьырзоРЕНс<21снсоуу1\гьтсЕАС<2ЕР1зеесезеее

1251 СЗССССЗССССЗССССЗССССЗЬУРЕСЗССССЗССССЗОКТНТСРРСРАР

1301 ЕЬЬ66РЗУЕЬЕРРКРК0ТЬМ13ΗΤΡΕνΤ0ννν0ν3ΗΕ0ΡΕνΚΕΝΐΐΥν06ν

1351 ЕУНЫАКТКРКЕЕ0УЫЗТУКУУЗУЬТУЬН<2О1лГЬЫеКЕУКСКУ314КАЬРАР1

01 ЕКТ13КАКеСРКЕР<2УУТЬРРЗКОЕЬТКЫ<2УЗЬТС1Л/КСЕУРЗО1АУЕ1лГЕ

51 ЗЫеОРЕЫЫУКТТРРУЬОЗОСЗЕЕЬУЗКЬТУОКЗК1лГ<2<2е1А/ЕЗСЗУМНЕАЬ

1501 НЫНУТ<2КЗЬЗ ЬЗРСК*

- 78 028309

Конструкция ДНК	Линкер между ФВ Рс
ФВ035	73 ак= Ιδ{11Χ(ΟΟΟΟδ)}ΕνΡΚΟδΟΟΟΟδΟΟΟΟδ (δΕΟ ГО ΝΟ: 96)
ФВ036	98 ак= 13{16Х(ООООЗ)}ЕУРКОЗООООЗОО<тОЗ (δΕΟ ГО ΝΟ: 97)
ФВ= ϋΌ3 (ак 1-477 с С336А/С379А)

Продукт ПЦР, полученный амплификацией ΙΑΥ22 'ΙΑΥ23 (~2300 п.н.о.) клонировали в расщепляемую В81\\'1'Х’о11 рЗ¥\-ФВ-()()2 для получения промежуточного продукта рЗУХ-ФВ-014. рЗУХ-ФВ-014 содержит 20-аминокислотный тромбин-отщепляемый линкер между сигнальным пептидом Ф-У111 и Ό'Ό3, за которым следует Ес-область.

Для создания конструкции 1)11)21)'1)3-1^;с область Ό1Ό2Ό'Ό3 амплифицировали обычным ПЦРметодом из ρЗΥN-ФВ-013, используя комбинацию праймеров ΙΑΥ241ΑΥ27.

1ЛУ24- Прям,- ФВ Ο1ϋ2ϋΌ3 клонирующий олиго с сайтом ВзГ\У1

ССССССССССТАССАТСАТТССТСССАСАТТТСССССССТС(ЗЕ()ПЖО: 70)

1ЛУ27-Обратн.-ФВ ΌΌ3 олигосЕсоКУ

ССАСССССАСАТАТССССТССТСССАСССТТСАСАССТСАС (8Εζ) ГО N0:71)

Продукт ПЦР, полученный амплификацией ΙΛΥ221ΛΥ23 (-3750 п.н.о.) клонировали в расщепляемую В81\\'1ЕсоКУ рЗУ^ФВФМ для получения промежуточного продукта рЗУ^ФВФ^. Длина линкера между фрагментом ФВ и Ес-областью изменили, чтобы получить рЗУ^ФВ-ГОЕ

Белковая последовательность полноразмерного ФВ приведена в табл. 1.

Белковая последовательность ФВ-0ГО2ОГОЗ 16 (8Ε()ΙΕ)ΝΟ: 72)

М1РАКЕАСУЪЪАЪАЪ1ЪРСТЬСАЕСТКСК55ТАКС5ЪЕС5ВЕУКТЕОС5М

УЗЕАСУСЗУЪЪАСССОКИЗЕЗИСВЕОКСКИУЗЪЗУУЪСЕЕЕВТНЬЕШС

101 ТУТОбВСКУЗМРУАЗКбЬУЪЕТЕАСУУКЬЗбЕАУСЕУАКЮбЗбМЕОУЪЪ

151 5ОКУЕЫКТССЪССМЕМ1ЕАЕООЕМТ<2ЕСТЬТ5ОРУВЕАК5ИАЬ55СЕ(21лГС

01 ЕКА5РР553СЫ15 3еЕМ<2КСШЕ<2С<2ЬЬКЗТ5УЕАКСНРЪУ0РЕРЕУАЪС

51 ЕКТЬСЕСАССЪЕСАСРАЬЬЕУАКТСАОЕСМУЬУСТлГТОНЗАСЗ РУСРАСМЕ

301 УЕОСУЗРСАВТСОЗЬН1МЕМСОЕВСУВеСЗСРЕ6ОЪЪВЕСЬСУЕЗТЕСРС

351 УН5СККУРРСТ5Ъ5КОСЫТС1СКЫ50ТС1С5ЫЕЕСРСЕСЪУТС05НГК5ГО

01 ΝΗΥΕΤΕ3ΟΙСОУЪЬАИОСООНЗ ЕЗIVIЕТУОСАООКОАУСТИЗУТУКЪРС

451 ЬНМЗЬУКЪКНСАСУАМО60О10ЪРЪЪК6ОЬК10НТУТА5УНЬ5У6ЕОЪ0М

501 ОТОСКСРШЪУКЪ5РУУАСКТССЪССЫУ14СМ<2СООЕЪТР5СЬАЕРКУЕОЕС

551 ΝΑ№Κ1ιΗΟϋΟζ2ΏΙιζ)Κζ2Η3ΠΡΟΑ1ιΝΡΚΜΤΚΕ3ΕΕΑΟΑνΐιΤ5ΡΤΕΕΑ(3ΗΚΑν5

601 РЬРУЬВЫСКУПУСЗСЗВСКЕСЬССАЬАЗУАААСАСКСУВУАИКЕРСВСЕЬ

651 ЫСРКСОУУЬОССТРСЫЪТСКЗЪЗУРВЕЕСЫЕАСЪЕССЕСРРСЬУМВЕКСВ

01 СУРКА(2СРСУУОСЕ1Е<2РЕВ1Е5ОННТМСУСЕВеЕМНСТМЗСУРСЗЪЬРО

751 АУЬЗЗРЬЗНВЗКВЗЬЗСКРРМУКЬУСРАОЫЬКАЕСЬЕСТКТСОИУВЪЕСМ

01 ЗМССУЗССЬСРРСМУКНЕЫВСУАЬЕКСРСЕНОСКЕУАРСЕТУКЮСЫТСУ

51 СКВККШТСТВНУСВАТСЗТ1СМАНУЬТГВСЬКУЬГРСЕС<2УУЬУ<2ВУСС5

901 ЫРСТЕК1ЬУеЫКСС5НР5УКСКККУТ1ЪУЕССЕ1ЕЬЕОСЕУИУККРМКВЕ

951 ТНЕЕУУЕЗСРУ11ЬЬЬеКАЬЗУУУРР.НЬ313УУЬКГ)ТУ0ЕКУССЬССЕЕВ

01 С10ΝΝΏΒΤ3 ЗИЬСУЕЕВРУВЕСИЗиКУЗ ЗОСАОТККУРЬОЗ 3 ΡΑΤΟΗΝΝΙ

1051 ΜΚΟΤΜνθ55(3Κ.Ι1ιΤ3ΠνΕ<2ϋΟΝΚΙινθΡΕΡΥΙιϋν(3Ι ΥϋΤ050Ε3Ι6ϋ0Α0Ε

1101 СВТТААУАНУСАОНСКУУтаКТАТЪСРОЗСЕЕКЫЪКЕЫСУЕСЕиКУЫЗСА

1151 РАСОУТС<2НРЕРЬАСРУ(2СУЕеСНАНСРРСК1ЬВЕЬЬ<2ТСУОРЕПСРУСЕ

01 УА6КР.ЕА36ККУТЬЫРЗПРЕНС01СНСПУУ1\ГЬТСЕАС0ЕР*

Белковая последовательность ФВГОГОЗ 2 (8Е()ПЖО: 73)

ЗЬЗСКРРМУКЬУСРАПЫЬКАЕСЬЕСТКТССЫУОЬЕСМЗМССУЗССЬСРРС

ΜνΚΗΕΝΚΟνΑΕΕΚΟΡΟΕΗςΟΚΕΥΑΡΟΕΤνΚΙΟΟΝΤΟνΟΒΏΚΚΪίΝΟΤϋΗνΟ

101 ВАТСЗТЮМАНУЬТЕВСЬКУЬЕРСЕССУУЬУСВУССЗИРСТЕЫЬУСЫКС

151 СЗНРЗУКСККР.УТ1ЬУЕССЕ1ЕЬЕОСЕУЫУКК.РМКОЕТНЕЕУУЕЗСКУ11

01 ЬЬЬ6КАЬ5УУ?ГОКНЬ513УУЬК(2Т¥(2ЕКУС:СЪСеЫЕОе1<2ШПЪТ331\ГЬ(2

51 УЕЕОРУВЕ6ИЗ№КУ350САОТККУРЬВ5 5РАТСНЫЫ1МК<2ТМУО5 5СК1Ь

301 Τ3ϋνΕζ)ϋΟΝΚΙινθΡΕΡΥΙιϋνθΙ УПТСЗСЕЗЮОСАСЕСОНААУАНУСАО

351 НСКУУтаВТАТЪСРОЗСЕЕВЫЬВЕЫСУЕСЕИВУЫЗСАРАСОУТСОНРЕРЬ

401 АСРУОСУЕССНАНСРРСКИГОЕЬЪОТСУОРЕПСРУСЕУАСКВЕАЗСККУТ

451 ЬИРЗОРЕНСОТСНСВУУМЬТСЕАСОЕР

- 79 028309

Пример 2. Гетеродимерные конструкции, содержащие Ф-УШ-Рс и ФВ-1)'1)3 домен при аминоконце второй цепи Рс (гетеродимер Ф-УШ-ФВ-Рс, фиг. 2).

(а) Клонирование р5У^Ф-УШ-064.

Плазмида Ф-УШ-064 содержит одноцепочечный остов РС (§сРс) с сайтами расщепления ферментами, которые процессируются во время синтеза в клетке. Конструкция содержит Ф-УШ-связывающий домен полноразмерного ФВ (ΏΌ3).

Плазмида (р5¥^Ф-УШ-064) была сконструирована для экспрессии гетеродимера Ф-УШ-Рс и ФВРс, в котором домены ΏΌ3 предназначены для связывания Ф-УШ и предотвращения взаимодействия ФУШ с фосфолипидами и активированным протеином С и/или предотвращения или подавления связывания с эндогенным ФВ. Белок из р5¥^Ф-УШ-064 экспрессируется в клетке в виде одиночного полипептида, где С-конец субъединицы Ф-УШ-Рс связан с \'-концом субъединицы ФВ О'П3-Рс посредством полипептидного линкера 6х (ОООО8) (8ЕР ГО N0: 74). Дополнительно в 5'- и 3'-концы полипептидного линкера были вставлены последовательности КККК8 (8ЕР ГО N0: 75) и КККККК (8ЕР ГО N0: 76) соответственно для внутриклеточного расщепления пропротеинконвертазами сразу после последнего Агд в каждой последовательности. Следовательно, клетки могут экспрессировать двухцепочечный гетеродимер Ф-УШ-РсГО'П3-Рс, в котором цепь Ф-УШ-Рс содержит последовательность КККК8 (8ЕР ГО N0: 75) в С-конце, но при это остаток последовательности линкера удален. Другой полипептидный линкер 3х (ОООО8) (5ЕР ГО N0: 28) вместе с сайтом расщепления тромбином вставляли между доменами ФВ и Рс-областью для того, чтобы способствовать отделению фрагмента ФВ от Ф-УШ в случае активации гетеродимерного белка Ф-УШ-ФВ тромбином, которая делает возможным взаимодействие Ф-УШ с другими факторами свертывания крови.

Проводили синтез фрагментов ДНК, содержащих часть первой Рс-области, за которой следует 6х (ОООО8) (5Ер ГО N0: 74), домен ФВГОГО3 ботат (ак 1-477; мутация С336А/С379А), 3х (ОООО8) (8Ер ГО N0:28), сайт расщепления тромбином и часть второй Рс-области (ОепзспрГ-номер последовательности 103069, показана ниже). Фрагмент конструкции Оепзспр! субклонировали в расщепляемую ЗаЦ/КзКП р8У^Ф-УШ-049, которая являетсяконструкцией Ф-УШ-Рс с отщепляемым линкером между двумя Рс-доменами. ОепзспрГ-номер последовательности 103069 (8ЕР ГО N0: 82):

СССТССАСААСАССАССТСССАССАССССААССТСТТСТСАТССТСССТСАТССАТСАСССТСТССАСААС

САСТАСАСССАСААСАСССТСТСССТСТСТСССССТАААССССССССССССАССССТССССССССАТСАСС

ТСССССТССАТСАСССССТССАССТТССССТССССССССАТСССССССТССАССТТССССТСССССТССАТ

САА66АА6А66А66АА6А6АА6ССТАТССТ6ТС66ССССССАТ66ТСАА6СТ66Т6Т6ТССС6СТ6АСААС

СТССССССТСААССССТССАСТСТАССААААССТСССАСААСТАТСАССТССАСТССАТСАССАТССССТС

ТСТСТСТСССТСССТСТСССССССССССАТССТСССССАТСАСААТССАТСТСТСССССТССАААССТСТС

ССТССТТССАТСАССССААССАСТАТСССССТССАСАААСАСТСААСАТТСССТССААСАСТТСТСТСТСТ

ССССАССССААСТССААСТССАСАСАССАТСТСТСТСАТСССАССТССТССАССАТССССАТСССССАСТА

ССТСАССТТССАСбСССТСАААТАССТСТТССССССССАСТСССАСТА.ССТТСТССТССАССАТТАСТССС

ССАСТААСССТСССАССТТТСССАТССТАСТССССААТААСССАТССАСССАССССТСАСТСАААТССААС

АААССССТСАССАТССТССТССАСССАССАСАСАТТСАССТСТТТСАСССССАССТСААТСТСААСАСССС

САТСААССАТСАСАСТСАСТТТСАССТССТССАСТСТССССССТАСАТСАТТСТССТССТССССАААСССС

ТСТСССТССТСТСССАСССССАССТСАССАТСТСССТССТССТСААССАСАСАТАССАССАСАААСТСТСТ

ССССТСТСТСССААТТТТСАТСССАТССАСААСААТСАССТСАССАССАССААССТССААСТССАССААСА

СССТСТССАСТТТСССААСТССТССАААСТСАССТСССАСТСТССТСАСАССАСААААСТСССТСТССАСТ

САТССССТСССАССТСССАТААСААСАТСАТСААССАСАССАТССТССАТТССТССТСТАСААТССТТАСС

АСТСАССТСТТССАССАСТССААСААССТССТССАСССССАСССАТАТСТССАТСТСТССАТТТАССАСАС

СТССТССТСТСАСТССАТТССССАСТСССССССАТТСТСССАСАССАТТССТСССТАТССССАССТСТСТС

СССАССАТСССААССТССТСАССТССАССАСССССАСАТТСТССССССАСАССТСССАССАСАС6ААТСТС

ССССАСААССССТАТСАСССТСАСТСССССТАТААСАССТСТССАССТСССТСТСААСТСАССТСТСАССА

СССТСАСССАСТССССТССССТСТССАСТСТСТССАССССТСССАТССССАСТССССТССАСССААААТСС

ТССАТСАССТТТТССАСАССТСССТТСАСССТСААСАСТСТССАСТСТСТСАССТСССТССССССССТТТТ

СССТСАССАААСАААСТСАССТТСААТСССАСТСАСССТСАССАСТСССАСАТТТСССАСТСТСАТСТТСТ

СААССТСАССТСТСААСССТСССАССАССССАТССАТСССССТССАССТТССССТССССССССАТСССТСС

ТССССССССССАССССАССССАСААААСТСАСАСАТССССАСССТССССАССТССАСААСТССТССССССА

СССТСА (б) Клонирование р8¥^Ф-УШ-065.

Плазмида Ф-УШ-065 содержит первые 276 аминокислот домена Ώ'Ώ3 ФВ, присоединенные ко второй Рс-области. Фрагмент ФВ амплифицировали при помощи ПЦР из полноразмерной плазмиды р8У\'ФВ-008, используя комбинации праймеров Е8С17 и Е8С41.

Е8С17-Прям,- ФВ клонирующий олиго с С1а1 СТСССССАТСАСААТССАТСТСТС(8ЕЦГОЖ): 77)

Е8С41- Обрати.-ФВ с ЕсоКУ

ССТССАСССССА6АТАТСАСАС6САСТТТТС (ЗЕ() Π)ΝΟ: 78)

Полосу с ожидаемым размером (~692 п.н.о.) очищали гелем при помощи Ое1 ЕхГгасЁоп кЦ (Киаген (Р1адеп), Валенсия, Калиф.) и клонировали в сайты С1а1 и ЕсоКУ р5У^Ф-УШ-064 для получения р8У№Ф-УШ-065.

- 80 028309

Пример 3. Клонирование р3ΥN-Ф-VIII-159, 160, 178, 179 (фиг. 3).

С целью изменения длины линкера между фрагментом ФВ и Рс-областью в месте соединения ФВ и начала 20-аминокислотного линкера в р3ΥN-Ф-VIII-064 вставляли сайт ЕсоКУ, затем линкеры переменной длины использовали для замещения 20-ак линкера в р3ΥN-Ф-VIII-064. Новыми конструкциями ДНК являются: р3ΥN-Ф-VIII-159, 160, 178 и 179, которые содержат 35-ак, 48-ак, 73-ак и 98-ак линкеры соотвественно.

Для того чтобы вставить 35-аминокислотный линкер в р3ΥN-Ф-VIII-159 были заказаны два олиго (ЕЗС78 - 105 п.н.о. и ЕЗС79 - 107 п.н.о.) от Ыедгагёб Ι)ΝΆ ТесЬпо1о§1е8, Его (Коралвилль, Айова). Олиго ренатурировали и продлевали при помощи стандартного метода ПНР.

Праймеры:

Е8С78- Прям, с сайтом ЕсоКУ

АААСТСССТСТСАТАТСТСдСССТССАдСТТССССТСдССССССАТССССТСССССС ССАТССССТССССССССАТССССТССССССССАТСССТССТССССССС (8Е(3 II)

ΝΟ: 79)

Е8С79- Обрати, с сайтом КзКП

СААСАССААСАСТСАСССТССССССАССАСТТСТССАССТССССАСССТССССАТСТ СТСАСТТТТСТССССТССССТССССССССССАССАСССАТССССССССАС (δΕ(^ ГО ΝΟ: 80)

Реакцию ПЦР по ренатурированию и продлению олиго проводили в 50 мкл с комбинациями праймеров ЕЗС78/ЕЗС79, используя трехэтапный цикл ПЦР-амплификации: 25 циклов с (96°С 30 с, 55°С 30 с, 68°С 30 с).

Полосу с ожидаемым размером (~186 п.и.о.) очищали гелем при помощи Ое1 Ех!гас!юп 1<й (Киаген (Р1а§еп), Валенсия, Калиф.) и клонировали в рестрикционные сайты ЕсоКУ и К8КП р3ΥN-Ф-VIII-064 для получения р3ΥN-Ф-VIII-159.

(б) Клонирование р3ΥN-Ф-VIII-160, 178 и 179.

р3ΥN-VIII-160 содержит 48-аминокислотный линкер между фрагментом ФВ и Рс-областью. Проводили синтез фрагмента ДНК, кодирующего 48-аминокислотный линкер (1566

6656666566665666656666566665ЪУРН656666566665) (δΕ(} ГО ΝΟ: 81) _{и часть} Р_с-об_ласти (Ое^сПрЕ

Последовательность номер-132601, показана ниже). Фрагмент конструкции Оеп8спр! субклонировали в расщепляемую ЕсоКУ/К8КН р3ΥN-Ф-VIII-0159 (упомянуто выше). Оеп8спр!-Последовательность номер132601 (ЗЕр ГО 83)

ААА6Т6ССТСТ6АТАТСТ66С66Т66А66ТТСС66Т66С66666АТСС66С66Т66АС6ТТСС66С66Т66

АССТТССССТССССССССАТССССТССССССССАТСССТССТССССССССССАСССССССТССАССТТССС

6Т66С66666АТСС6АСААААСТСАСАСАТ6СССАСС6Т6СССА6СТССА6ААСТССТ666С66АСС6ТСА

6ТСТТСС

3ΥN-VIII-178 содержит 73-аминокислотный линкер между фрагментом ФВ и Рс-областью. Проводили синтез фрагмента ДНК, кодирующего 73-аминокислотный линкер

КС80еСС50СС(35) (§Е() ГО ΝΟ: 84) и часть Рс-области (Оеп8спр!-Последовательность номер-144849, показано ниже). Фрагмент конструкции Оеп8сг1р! субклонировали в расщепляемую ЕсоКУ/К8КП р3ΥN-Ф-VIII-0159 (упомянуто выше). Оеп8сг1р!-Последовательность номер-144849 (ЗЕр ГО NО: 85)

СССТ6ССА66АССССАТАТСТССС66ТССА6СТТССССТ6СССССССАТСССССС6ТССА66ТТСС6СССС

ТССАССТТССС6ТССС6ССССАТССС6СССТ6САССТТССССТСССС6СССАТСССССССТССАССТТССС

6С66ТС6А66ТТСС6СТ66С66666АТСС66Т66С6С666АТСССТС6ТССССС6С66СА6СС6С66Т66А

С6ТТСС6СТ66СС666САТСССАСААААСТСАСАСАТ6ССССССТ6СССА6СТССА6ААСТССТС66СССА

СССТСА6ТСТТССТС

3ΥN-VIII-179 содержит 98-аминокислотный линкер между фрагментом ФВ и Рс-областью. Проводили синтез фрагмента ДНК, кодирующего 98-аминокислотный линкер (15СССС5С03С8СССС8С0СС5ССС35СССС8ССЗС8СССС5СССС8ССС05СССС5СЗ ссзебсйзссссзбсссзссбезьурисзбйссзссссз) (_§Ер _{ш Ν0}.₈₆) _и часть Рс-области (Оеп8спр!-Последовательность номер-144849, показано ниже). Фрагмент конструкции Оеп8сг1р! субклонировали в расщепляемую ЕсоКУ/К8КН р3ΥN-Ф-VIII-0159 (упомянуто выше).

- 81 028309

ОепзсприПоследовательность номер-144849 (8ЕР ГО N0: 87)

6ССТ6ССА66А6СС6АТАТСТ66С66Т66А66ТТСС66Т66С66666АТСС66С66Т66А66ТТСС66С66

Т66А66ТТСС66Т66С66666АТСС66С66Т66А66ТТСС66Т66С66666АТСС66С66Т66А66ТТСС6

6С66Т66А66ТТСС66Т66С66666АТСС66С66Т66А66ТТСС66Т66С66666АТСС66С66Т66А66Т

ТСС66С66Т66А66ТТСС66Т66С66666АТСС66Т66С66666АТСССТ66ТССССС6666СА6С66С66

Т66А66ТТСС66Т66С66666АТСС6АСААААСТСАСАСАТ6СССАСС6Т6СССА6СТССА6ААСТССТ66

6С66АСС6ТСА6ТСТТССТСТТССС

Клонирование р8ΥN-Ф-УШ-180, 181 и 182.

р8ΥN-Ф-УШ-180, 181 и 182 получали из р8ΥN-Ф-УШ-160. В р8ΥN-Ф-УШ-160РУШ в домен С1 ФУ111 вносили мутации К2093А или Р2093А или К2093А/Р2093А для создания соответственно р8ΥN-ФУ111-180, р8ΥN-Ф-УШ-181 и р8ΥN-Ф-УШ-182.

Белковая последовательность гетеродимера Ф-УШ-ФВ-Рс (81 /О ГО N0: 88) (аминокислотные позиции 1-1457 последовательности Ф-УШ; область, выделенная подчеркиванием, представляет Рс-область; выделение подчеркиванием волнистой линией представляет отщепляемый линкер между первой Рсобластью и фрагментом ФВ; выделенная двойным подчеркиванием область представляет фрагмент ФВ; выделенная жирным шрифтом область представляет отщепляемый линкер переменной длины между фрагментом ФВ и Рс. Длина линкера отличается для конструкций Ф-У111-064, 159, 160, 178 и 179).

М21ЕЬЗТСРР ЬСЬЬКРСРЗА ТРЖУУЬСАУЕ РЗТОУМОЗРЬ СЕЬРУРАКРР 51 РКУРКЗРРРЫ ТЗУУУККТЬЕ УЕРТРНЬЕЫ1 АКРКРРИМбЬ Ь6РТ1<2АЕУУ

101 РТУУ1ТЬКЫМ АЗНРУЗЬНАУ 6УЗУ№КАЗЕ6 АЕУРР<2Т5<2К ЕКЕРРКУРР6 151 С5НТУУ№2УЬ ΚΕΝ6ΡΜΑ3ΡΡ ЬСЬТУЗУЬЗН УРЬУКРЬЫЗб ЫбАЬЬУСКЕ 2 01 63ЕАКЕКТ<2Т ЬНКР1ЬЬРАУ РРЕСКЗТлГНЗЕ ТКЫЗЬМ<2РКР ААЗАКАИРКМ 251 ΗΤνΝΟΥνΝΚ3 ЬРбЫбСНКК ЗУУИНУ16М6 ТТРЕУН31ЕЬ ЕбНТЕЬУКЫН 301 К<2АЗЬЕ13Р1 ТРЬТА<2ТЬЬМ РЬ6<2РЬЬРСН Ι33Η<2Ηϋ6ΜΕ АУУКУРЗСРЕ 351 ΕΡ<2ΣΚΜΚΝΝΕ ЕАЕРУРРРЬТ РЗЕМРУУКРР ΡΡΝ3Ρ5ΡΚ2Ι КЗУАККНРКТ 4 01 ЦУНУ1ААЕЕЕ РТОУАРЬУЬА РРРКЗУКЗСУ ΤΝΝ6Ρ<2ΚΙ6Κ КУККУКЕМАУ 451 ΤΒΕΤΕΚΤΚΕΑ ТуНЕЗбТЬбР ЬЬУбЕУбРТЬ ΕΙΙΡΚΝζλΑ3κ ΡΥΝΙϊ'ΡΗΘΙΤ 501 ВУКРЬУЗККЬ РКбУКНЬКРЕ Р1ЬР6Е1ЕКУ КИТУТУЕР6Р ТКЗВРКСЬТК 551 УУЗЗРШГМЕК РЬАЗбЫбРЬ ЫСУКЕЗУВ<2 Κ6Ν<2ΙΜ5ΡΚΚ ЫУ1ЬРЗУРБЕ 601 ЫКЗИУЬТЕЫ1 <2КРЬРЫРАСУ <2ЬЕРРЕЕ<2АЗ ΝΙΜΗ3ΙΝΘΥν ЕВЗЬ<2Ь5УСЬ 651 НЕУАУИУ1Ь5 1СА<2ТВЕЬЗУ ΡΡ3ΘΥΤΡΚΗΚ МУУЕРТЬТЬЕ РРЗСЕТУРМЗ 701 МЕЫРбЫ/ИЬб 0ΗΝ3ΒΕΚΝΚ6 МТАЬЬКУЗЗС ΒΚΝΤ6ΡΥΥΕΡ ЗУЕВ13АУЬЬ 751 3ΚΝΝΑΙΕΡΚ3 ЕЗ<2ЫРРУЬКК Н<2КЕ1ТКТТЬ <23Р<2ЕЕ1РУР ΒΤΙ3ΥΕΜΚΚΕ 801 ΒΕΡΙΥΡΕΡΕΝ 03ΡΕ3Ρ0ΚΚΤ КНУЕ1ААУЕК Ы/ГОУ6М533Р НУЬКИКАОЗб 851 3νΡζ)ΕΚΚννΕ <2ΕΕΤϋΘ3ΕΤ<2 РЬУКбЕЬЫЕН Ь6ЬЬ6РУ1КА ΕΥΕΡΝΙΜνΤΕ 901 ΚΝ0Α3ΚΡΥ3Ρ УЗЗЫЗУЕЕО 0Κ0ΘΑΕΡΚΚΝ ЕУКРЫЕТКТУ РЦКУфННМАР

951 ТКВЕЕРСКАЦ АУЕЗРУРЬЕК РУНЗбЫбРЬ ЬУСНТЫТЬЫР АНСКфУТУфЕ 1001 ΕΑΤΕΕΤΙΕΡΕ ΤΚ3№ΥΡΤΕΝΜ ΕΕΝΟΕΑΡΟΝΙ ΟΜΕΡΡΤΕΚΕΝ ΥΚΕΗΑΙΝ6ΥΙ 1051 МРТЬРбЬУМА <2В<2К1К№УЬЬ 3ΜΘ3ΝΕΝΙΗ3 1НЕ36НУЕТУ КККЕЕУКМАЬ 1101 ΥΝΡΥΡΘνΕΕΤ УЕМЬРЗКА61 ИКУЕСЫ6ЕН ЬНАСМЗТЬЕЬ УУЗЫКС<2ТРЬ 1151 ΘΜΑ3ΘΗΙΚΒΕ ζ)ΙΤΑ36ζ)Υ6ζ) ИАРКЬАКЬНУ 3Θ3ΙΝΑ№3ΤΚ ЕРЕЗШКУВЬ 1201 ЬАРМ11Н61К Т<2САК<2КЕЗЗ ЬУ13<2Е11МУ ЗЬВбККЦфТУ КСЫЗТбТЬМУ 1251 ΕΕ6ΝΥΒ33ΘΙ ΚΗΝΙΕΝΡΡΙΙ АКУ1КЬНРТН У31КЗТЬКМЕ ЬМССРЬИЗСЗ 1301 ΜΡΤ6ΜΕ3ΚΑΙ 3ϋΑ<2ΙΤΑ33Υ ΕΤΝΜΕΑΤ№3Ρ ЗКАКЬНЬфбК 3ΝΑ№ΚΡφνΝΝ 1351 РКЕ№Ь<2УВЕ<2 КТМКУТСУТТ <26УКЗЬЬТЗМ УУКЕЕЫЗЗЗ <2В6Н<ЖГЬЕЕ 1401 <2ΝΘΚΥΚΥΡ<26 Νζ)Β3ΕΤΡνΥΝ ЗЬВРРЬЬТКУ ЬК1НР<231л(УН <21АЬКМЕУЬС 1451 СЕАОРЬУРКТ НТСРРСРАРЕ ЬЬбСРЗУЕЬЕ РРКРКРТЬМ! ЗКТРЕУТСУУ

1501	УРУЗНЕРРЕУ КРШУУРСУЕ УНИАКТКРКЕ	ЕОУЫЗТУРУУ ЗУЬТУЬНОВИ
1551	ЬИСКЕУКСКУ 3ΝΚΑΣΡΑΡΙΕ КТ13КАК6<2Р	КЕРОУУТЬРР 3ΚΡΕΡιΤΚΝζ)ν
1601	ЗЬТСЬУКСЕУ РЗР1АУЕЦЕЗ ΝΘφΡΕΝΝΥΚΤ	ТРРУРРЗРСЗ ЕЕЬУЗКЬТУР
1651	Κ5Κ№<2<26ΝΥΡ ЗСЗУМНЕАЬН ЫНУТ<2К5ЬЗЬ	3Ρ6ΚΚΚΚΚ36 6663666636
1701	66С3666636 66Θ36Θ663Κ КККККЗЬЗСК	РРМУКЬУСРА РЫЬЕАЕбЬЕС
1751	ТКТСОЫУРЬЕ СМЗМССУЗСС ЬСРРСМУКНЕ	ИРСУЛЬЕРСР СРНОСКЕУАР
1801	СЕТУКЮСЫТ СУСКРККЖГС ТРНУСРАТСЗ	ТЫМАНУЬТЕ РбЬКУЬЕРбЕ
1851	СОУУЬУОРУС 63ΝΡ6ΤΕΚΙΗ УбИКбСЗНРЗ	УКСКККУТ1Ь УЕ66Е1ЕЬЕР
1901	ΘΕΎΝνΚΚΡΜΚ ВЕТНЕЕУУЕЗ СКУЫЬЬЬСК	АЬЗУУлГВКНЬ 313УУЬКОТУ
1951	ОЕКУССЬССЫ ЕРСЮЫЫРЬТ ЗЗЫЬОУЕЕРР	УРЕбЫЗТлГКУЗ ЗОСАРТККУР
2001	ЬРЗЗРАТСНЫ ЫМКОТМУВЗ ЗСКЫТЗРУР	ОРСЫКЬУРРЕ РУЬРУС1УРТ
2051	СЗСЕ31СРСА АЕСВТ1ААУА НУСАОНСКУУ	ТИКТАТЬСРО 3ΟΕΕΚΝΣΚΕΝ
2101	6ΥΕΑΕΊ/ίΚΥΝ5 САРАСОУТСО НРЕРЬАСРУО	СУЕССНАНСР РСЫЬВЕЬЬО
2151	ТСУРРЕРСРУ СЕУА6ККЕАЗ СККУТЬЫРЗВ	РЕНСО1СНСР УУЛЬТСЕАСО
2201	ΕΡΙΟΘΘΘΘ3Θ ббСЗЬУРКбЗ 66РКТНТСРР	СРАРЕЬЬббР ЗУЕЬЕРРКРК
2251	ΡΤΡΜΙ3ΕΤΡΕ УТСУУУРУЗН ЕРРЕУКЕЖГУ	УВбУЕУНИАК ΤΚΡΚΕΕ0ΥΝ3
2301	ТУКУУЗУЬТУ ЬНОВЫИСКЕ УКСКУЗЫКАЬ	ΡΑΡΙΕΚΤΙ3Κ АК6<2РКЕР<2У
2351	УТРРРЗЕРЕЬ ТКИОУЗЬТСЬ УКСЕУРЗР1А	ΥΕ1/ίΕ3Ν6<2ΡΕ ЫЫУКТТРРУЬ
2401	РЗРСЗЕЕЬУЗ КЬТУРКЗКИО ОбИУЕЗСЗУМ	ΗΕΑΣΗΝΗΥΤζ) КЗЬЗЬЗРбК

Пример 4. Пример ДНК-конструкций Ф-УШ-ФВ (фиг. 4).

Фрагмент ФВ и белок Ф-УШ могут быть связаны вместе посредством линкера или другого белка, или полипептида при помощи общепринятых рекомбинантных ДНК-технологий, как показано на фиг. 4. На фиг. 4 А домен Ώ1Ώ2Ώ'Ώ3 ФВ связан с белком Ф-УШ посредством 48-ак линкера

-18ОООО8ОООО8ОООО8ОООО8ОООО8ОООО8БУРКО8ОООО8ОООО8 (81%) ГО N0: 89)и защищает Ф-УШ от преждевременного выведения. Для того чтобы дополнительно увеличить Ф-УШ-защитную активность 1)'1)3 в конструкцию можно включить другой белок или полипептид, который обладает свойством продления времени полужизни, такой как альбумин или последовательность РА8 (гетерологичные

- 82 028309 компоненты). Гетерологичный компонент, например белок альбумина или последовательность РАЗ, можно вносить в различные позиции молекулы Ф-Ж; несколько примеров показано на фиг. 4Б-4Г: в Ν'конце Ф-Ж (4Б), в С-конце Ф-Ж (4В) или в В-области (4Г). В этих конструкциях дополнительные белковые последовательности могут увеличить защитную активность Ό'Ό3 и дополнительно продлить время полужизни Ф-Ж.

Вдобавок, гетерологичный компонент, например альбумин или последовательность РАЗ, также можно вносить в гетеродимерные конструкции.

Ф-^П/ФВ как показано на фиг. 4Д-4Ж. На фиг. 4Д гетерологичный компонент, например альбумин или последовательность РАЗ, внесен в В-доменную область Ф-Ж, белка Ф-VIII-148; на фиг. 4Е гетерологичный компонент, например альбумин или последовательность РАЗ, внесен в В-доменную область Ф-Ж, белка 0^40-136; на фиг. 4Ж гетерологичный компонент, например альбумин или последовательность РАЗ, используется в качестве линкера для соединения фрагмента Ό'Ό3 и Рс. Ожидается, что в этих конфигурациях общий эффект от Ό'Ό3, Рс и гетерологичного компонента, который является продлевающим время полужизни веществом (например, альбумин/последовательность РАЗ), отразится на продлении времени полужизни Ф-Ж.

Пример 5. Плазмидное конструирование системы котрансфекции для гетеродимера Ф-VIIIРс-ФВ (фиг. 5).

Для получения гетеродимера Ф-VIIIРс-ФВ создавали систему котрансфекции, которая содержит три конструкции ДНК. Первая конструкция ДНК - ρЗΥN-Ф-VIII-155 - кодирует слитый белок Ф^Ш-Рс, в котором одноцепочечный белок Ф-Ж напрямую сшит с одиночным фрагментом Рс, а второй конструкцией ДНК является рЗУ^ФВ-031, которая кодирует слитый белок О'П3-Рс (упомянутый выше в примере 1). Клетки НЕК293Р трансфицировали двумя плазмидами совместно с третьей плазмидой (РС5) в соотношении 80:15:5. Котрансфекцию РС5 проводили для того, чтобы точно обеспечить полный пропептидный процессинг областей Ό1 и Ό2, чтобы в итоге получить зрелые домены Ό'Ό3. Синтезированные белки секретировались в виде гетеродимера Ф-VIIIРс/^'^3Рс и гомодимера П'П3Рс, после чего гетеродимер Ф-VIIIРс/^'^3Рс отделяли от гомодимера П'П3Рс при помощи очистки белка.

Последовательность зрелого белка рЗΥN-Ф-VIII-155 (ЗЕР ГО ΝΟ: 90)

АТРРУУЬСАУЕЬ5ТОУМ<25ОЬСЕЬРУОАРЕРРРУРК5ЕРЕ1\ГТ5УУУККТЬЕУЕЕТОНЬЕ1\Г1АКРРРР1лГМеЬ

ЬСРТ1<2АЕУУОТУУ1ТЬКИМА5НРУ5ЬНАУСУ5У1лГКА5ЕеАЕУОО<2Т5<2РЕКЕООКУЕРее5НТУУ1лГ<2УЬК

ЕИСРМА5ОРЬСЬТУ5УЬ5НУОЬУКОЬИ5СЫСАЬЬУСРЕС5ЬАКЕКТ0ТЬНКЕ1ЬЬЕАУЕОЕСК51лГН5ЕТК

И5ЬМ0ОРОАА5АРА1лГРКМНТУИСУУИР5ЬРСЫССНРК5УУ1лГНУ1СМСТТРЕУН51ЕЬЕСНТЕЬУРИНРСА

5ЬЕ15Р1ТЕЬТАСТЬЬМОЬе<2ЕЬЬЕСН155Н<2НОСМЕАУУКУО5СРЕЕР<2ЬРМКИИЕЕАЕОУОООЬТО5ЕМ

ОУУРЕОООИ5Р5Е101Р5УАККНРКТ1/А/НУ1ААЕЕЕО1лЩУАР1Л/ЬАРООР5УК5<2УЬИИеР<2Р1еРКУККУ

РЕМАУТОЕТЕКТРЕА1<2НЕ5е1ЬеРЬЬУСЕУеОТЬЫ1ЕКИ<2А5РРУ1\Г1УРНе1ТОУРРЬУ5РРЬРКеУКН

ЬКОЕР1ЬРеЕ1ЕКУК№ТУТУЕОеРТК5ОРРСЬТРУУ55ЕШГМЕРОЬА5еЬ1еРЬЬ1СУКЕ5УО<2РСИ<21М5

ОКР1\ГУ1ЬЕ5УЕОЕЫР51лГУЬТЕ1\Г1<2РЕЬРЫРАеУ<2ЬЕОРЕЕ<2А51\Г1МН5™еУУЕО5Ь<2Ь5УСЬНЕУАУ1лГУ1

Ь51САСТОЕЬ5УЕЕ5СУТЕКНКМУУЕОТЬТЬЕРЕ5СЕТУЕМ5МЕЫРСЫлГ1ЬССНЫ5ОЕРЫРСМТАЬЬКУ55

СОКЫТеОУУЕО5УЕО15АУЬЬ5гаЖА1ЕРР5Е5<2ИРРУЬКАН<2АЕ1ТРТТЬ<25О<2ЕЕ1ОУООТ15УЕМККЕ

ОЕО1УОЕОЕЫ<25РР5Е<2ККТРНУЕ1ААУЕРЫлЩУеМ555РНУЬРЫРА<25е5УР<2ЕККУУЕ<2ЕЕТОС5ЕТ<2Р

ЬУРСЕЬЫЕНЬСЬЬеРУ1РАЕУЕО1\Г1МУТЕРИ<2А5РРУ5ЕУ55Ы5УЕЕО<2Р<2еАЕРРКИЕУКРИЕТКТУЕ1лГ

КУСННМАРТКОЕЕОСКА1лГАУЕ5ОУОЬЕКОУН5еЬ1еРЬ1Л/СНТЫТЬЫРАНеР<2УТУ<2ЕЕАЬЕЕТ1ЕОЕТК5 νΓίΕΤΕΝΜΕΡΝΟΡΑΡΟΝΙ<2ΜΕΟΡΤΕΚΕΝΥΡΕΗΑΙΝΟΥΙΜΟΤΕΡΟΙΛ/ΜΑ<2Ο<2ΡΙΡ1/ίΥΕΕ5ΜΟ5ΝΕΝΙΗ5ΙΗΕ5

6НУГТУРККЕЕУКМАЬУЫЬУР6УГЕТУЕМЬР5КА6™РУЕСЫ6ЕНЬНА6М5ТЬГЬУУ5ЫКС<2ТРЬ6МА56

Н1РОЕС1ТА5еСУеС№АРКЬАРЬНУ5С51ИА1лГ5ТКЕРЕ5ШКУОЬЬАРМ11Не1КТ<2еАР<2КЕ55ЬУ15<2Е

11МУ5ЬОСКК№СТУРСИ5ТСТЬМУЕЕСИУО55С1КНИ1ЕИРР11АРУ1РЬНРТНУ51Р5ТЬРМЕЬМССОЬИ

5С5МРЬеМЕ5КА15ОАС1ТА55УЕТИМЕАТ7ЩР5КАРЬНЬ<2СР5ИА1лГРР<2ШЩРКЕ1лГЬ<2УОЕ<2КТМКУТеУ

ТТ0СУК5ЬЬТ5МУУКЕЕЫ5550ОСНС1лГТЬЕЕСИСКУКУЕССИСО5ЕТРУУИ5ЬОРРЬЬТРУЬР1НРС51лГУ

Н<21АЬРМЕУЬССЕА<2ОЬУОКТНТСРРСРАРЕЬЬеСР5УЕЬЕРРКРКОТЬМ15РТРЕУТСЛЛ/УОУ5НЕОРЕУ

КЕШУУ06УЕУНЫАКТКРРЕЕ<2УЫ5ТУРУУ5УЬТУЬН<20МЬЫ6КЕУКСКУ5ЫКАЬРАР1ЕКТ15КАК6<2РР

ЕР0УУТЬРР5РОЕЬТКИ<2У5ЬТС1Л/КСЕУР5О1АУЕ1лГЕ5Ие<2РЕИИУКТТРРУЬО5Ое5ЕЕЬУ5КЬТУОК5

Р№<2<2СИУЕ5С5УМНЕАЬН1\ГНУТ<2К5Ь5Ь5РеК

- 83 028309

Последовательность ДНК ρδΥN-Ф-УIII-155 ΟΝΆ (8Ер ГО N0: 91)

АТССАААТАСАССТСТССАССТССТТСТТТСТСТСССТТТТСССАТТСТССТТТАСТСССАССАСААСАТА СТАССТСССТССАСТССААСТСТСАТСССАСТАТАТССАААСТСАТСТСССТСАССТСССТСТССАСССАА САТТТССТССТАСАСТСССААААТСТТТТССАТТСААСАССТСАСТССТСТАСАААААСАСТСТСТТТСТА СААТТСАСССАТСАССТТТТСААСАТСССТААСССААССССАСССТССАТСССТСТССТАССТССТАССАТ ССАСССТСАССТТТАТСАТАСАСТССТСАТТАСАСТТААСААСАТСССТТСССАТССТСТСАСТСТТСАТС СТСТТССТСТАТССТАСТССАААССТТСТСАСССАССТСААТАТСАТСАТСАСАССАСТСАААСССАСААА СААСАТСАТАААСТСТТСССТССТССААСССАТАСАТАТСТСТСССАССТССТСАААСАСААТССТССААТ ССССТСТСАСССАСТСТСССТТАССТАСТСАТАТСТТТСТСАТСТССАССТССТААААСАСТТСААТТСАС СССТСАТТССАССССТАСТАСТАТСТАСАСААСССАСТСТССССААССААААСАСАСАСАССТТССАСААА ТТТАТАСТАСТТТТТССТСТАТТТСАТСААСССААААСТТСССАСТСАСАААСАААСААСТССТТСАТССА ССАТАСССАТССТССАТСТССТССССССТССССТААААТССАСАСАСТСААТССТТАТСТАААСАССТСТС ТСССАССТСТСАТТССАТСССАСАССАААТСАСТСТАТТСССАТСТСАТТССААТССССАССАСТССТСАА СТССАСТСААТАТТССТССААССТСАСАСАТТТСТТСТСАССААССАТССССАССССТССТТССАААТСТС СССААТААСТТТССТТАСТССТСАААСАСТСТТСАТССАССТТССАСАСТТТСТАСТСТТТТСТСАТАТСТ СТТСССАССААСАТСАТСССАТССААССТТАТСТСАААСТАСАСАССТСТССАСАССААССССААСТАССА АТСАААААТААТСААСААССССААСАСТАТСАТСАТСАТСТТАСТСАТТСТСАААТССАТСТССТСАССТТ ТСАТСАТСАСААСТСТССТТССТТТАТССАААТТСССТСАСТТСССААСААССАТССТААААСТТСССТАС АТТАСАТТССТССТСААСАССАССАСТСССАСТАТССТСССТТАСТССТССССССССАТСАСАСААСТТАТ ААААСТСААТАТТТСААСААТСССССТСАССССАТТССТАССААСТАСААААААСТСССАТТТАТСССАТА САСАСАТСАААССТТТААСАСТССТСААССТАТТСАССАТСААТСАССААТСТТСССАССТТТАСТТТАТС СССААСТТССАСАСАСАСТСТТСАТТАТАТТТААСААТСААССААССАСАССАТАТААСАТСТАСССТСАС ССААТСАСТСАТСТСССТССТТТСТАТТСААССАСАТТАССААААССТСТААААСАТТТСААССАТТТТСС ААТТ СТ СССАССАСАААТАТТСАААТАТАААТ ССАСАСТСАСТ СТАСААСАТ СССССААСТАААТ САСАТ С СТСССТСССТСАСССССТАТТАСТСТАСТТТССТТААТАТССАСАСАСАТСТАССТТСАССАСТСАТТССС ССТ СТ ССТ САТ СТ ССТАСАААСААТ СТ СТАСАТ САААСАССАААССАСАТААТСТ САСАСААСАССААТ СТ САТССТСТТТТСТСТАТТТСАТСАСААСССААССТССТАССТСАСАСАСААТАТАСААСССТТТСТССССА АТССАССТССАСТССАССТТСАССАТССАСАСТТССААСССТССААСАТСАТССАСАССАТСААТСССТАТ СТТТТТСАТАСТТТССАСТТСТСАСТТТСТТТССАТСАССТСССАТАСТССТАСАТТСТААССАТТССАСС АСАСАСТСАСТТССТТТСТСТСТТСТТСТСТССАТАТАССТТСАААСАСААААТССТСТАТСААСАСАСАС ТСАСССТАТТСССАТТСТСАССАСАААСТСТСТТСАТСТССАТССААААСССАССТСТАТССАТТСТСССС ТСССАСААСТСАСАСТТТСССААСАСАСССАТСАСССССТТАСТСААССТТТСТАСТТСТСАСААСААСАС ТССТСАТТАТТАССАССАСАСТТАТСААСАТАТТТСАССАТАСТТССТСАСТАААААСААТСССАТТСААС СААСААССТТСТСТСААААСССАССАСТСТТСАААССССАТСАСССССАААТААСТССТАСТАСТСТТСАС Т САСАТ СААСАС САААТ Т САС ТАТ САТ САТАС САТАТ САСТ Т САААТ СААСААС СААСАТ Τ Τ Т САСАТ Τ ТА ТСАТСАССАТСААААТСАСАССССССССАССТТТСААААСААААСАССАСАСТАТТТТАТТССТССАСТСС АСАСССТСТСССАТТАТСССАТСАСТАССТССССАСАТСТТСТААСАААСАССССТСАСАСТСССАСТСТС ССТСАСТТСААСАААСТТСТТТТССАССААТТТАСТСАТСССТССТТТАСТСАССССТТАТАСССТССАСА АСТАААТСААСАТТТСССАСТССТССССССАТАТАТААСАССАСААСТТСААСАТААТАТСАТССТААСТТ ТСАСАААТСАССССТСТССТСССТАТТССТТСТАТТСТАСССТТАТТТСТТАТСАССААСАТСАСАСССАА ССАССАСААССТАСААААААСТТТСТСААСССТААТСАААССААААСТТАСТТТТССАААСТССААСАТСА ТАТСССАСССАСТАААСАТСАСТТТСАСТССАААСССТССССТТАТТТСТСТСАТСТТСАССТССАААААС АТСТССАСТСАССССТСАТТССАССССТТСТССТСТСССАСАСТААСАСАСТСААСССТССТСАТСССАСА СААСТСАСАСТАСАССААТТТССТСТСТТТТТСАССАТСТТТСАТСАСАССААААССТССТАСТТСАСТСА АААТАТССАААСАААСТССАССССТСССТССААТАТССАСАТССААСАТСССАСТТТТАААСАСААТТАТС ССТТССАТССААТСААТСССТАСАТААТССАТАСАСТАССТСССТТАСТААТСССТСАССАТСАААССАТТ ССАТССТАТСТССТСАССАТССССАССААТСААААСАТССАТТСТАТТСАТТТСАСТССАСАТСТСТТСАС ТСТАССАААААААСАССАСТАТААААТСССАСТСТАСААТСТСТАТССАССТСТТТТТСАСАСАСТССААА ТСТТАССАТССАААССТССААТТТССССССТССААТСССТТАТТССССАССАТСТАСАТССТСССАТСАСС АСАСТТТТТСТССТСТАСАССААТААСТСТСАСАСТССССТСССААТСССТТСТССАСАСАТТАСАСАТТТ ТСАСАТТАСАССТТСАССАСААТАТССАСАСТСССССССАААССТССССАСАСТТСАТТАТТССССАТСАА ТСААТСССТССАССАССААССАССССТТТТСТТССАТСААССТССАТСТСТТСССАССААТСАТТАТТСАС СССАТСААСАСССАСССТСССССТСАСААСТТСТССАСССТСТАСАТСТСТСАСТТТАТСАТСАТСТАТАС ТСТТСАТСССААСААСТСССАСАСТТАТССАССАААТТССАСТССААССТТААТССТСТТСТТТСССААТС ТССАТТСАТСТСССАТААААСАСААТАТТТТТААСССТССААТТАТТССТССАТАСАТСССТТТССАСССА АСТСАТТАТАССАТТСССАССАСТСТТСССАТССАСТТСАТССССТСТСАТТТАААТАСТТССАССАТССС АТТ СССААТ ССАСАСТАААССААТАТ САСАТ ССАСАСАТТ АСТ ССТ Т САТ С СТ АСТ ТТАССААТАТ СТТТ С ССАССТССТСТССТТСААААССТССАСТТСАССТССААСССАССАСТААТСССТССАСАССТСАССТСААТ ААТ ССААААСАСТ СССТ ССААСТ ССАСТТ ССАСААСАСААТ САААСТ САСАССАСТААСТАСТ САСССАСТ ААААТСТСТССТТАССАССАТСТАТСТСААССАСТТССТСАТСТССАССАСТСААСАТССССАТСАСТССА СТСТСТТТТТТСАСААТСССАААСТАААССТТТТТСАСССАААТСААСАСТССТТСАСАССТСТССТСААС ТСТСТАСАСССАСССТТАСТСАСТСССТАССТТССААТТСАСССССАСАСТТСССТССАССАСАТТССССТ САССАТССАССТТСТССССТСССАСССАСАССАССТСТАССАСААААСТСАСАСАТССССАСССТССССАС СТССАСААСТССТССССССАСССТСАСТСТТССТСТТССССССААААСССААССАСАСССТСАТСАТСТСС СССАССССТСАССТСАСАТСССТССТССТССАССТСАСССАССААСАСССТСАССТСААСТТСААСТССТА ССТССАСССССТССАССТССАТААТСССААСАСАААССССССССАССАССАСТАСААСАССАССТАСССТС ТССТСАСССТССТСАСССТССТССАССАССАСТСССТСААТСССААССАСТАСААСТССААССТСТССААС АААССССТСССАССССССАТССАСААААССАТСТССАААСССАААССССАССССССАСААССАСАССТСТА САСССТССССССАТССССССАТСАССТСАССААСААССАССТСАСССТСАССТСССТССТСАААСССТТСТ АТСССАСССАСАТСССССТССАСТСССАСАССААТССССАСССССАСААСААСТАСААСАССАССССТССС СТСТТССАСТСССАССССТССТТСТТССТСТАСАССААССТСАСССТССАСААСАССАССТСССАССАССС СААССТСТТСТСАТССТСССТСАТССАТСАСССТСТССАСААССАСТАСАСССАСААСАСССТСТСССТСТ СТСССССТААА

- 84 028309

Ниже перечислены дополнительные сконструированные фрагменты ФВ и гетеродимеры Ф-У111РСФВ.

Таблица 6

Фрагменты ФВ и гетеродимерные конструкции Ф-У111/ФВ

Конструкция	Описание	Вектор
ФВ
ρδΥΝ-ν\νΡ-001	ООЗ-область сигнального пептида ФУШ (1-276 аминокислот в длину бхРПз)	ροΟΝ А 4
ρδΥΝ-ν\νΡ-002	ΩΌ3-область сигнального пептида ФУШ (1-477 аминокислот в длину бхРПз)	ροΟΝ А 4
ρδΥΝ-ν\νΡ-003	Э'ЭЗ-область сигнального пептида ФУШ частично А1 (1511 аминокислот в длину бхРПз)	ροΟΝ А 4
ρδΥΝ-ν\νΡ-004	ΩΌ3-область сигнального пептида ФУШ (1-716 аминокислот в длину бхРПз)	ροΟΝ А 4
ρδΥΝ-ν\νΡ-006	ОЮ2О'ОЗ-линкер-СК1	ροΟΝΑ 3.1
ρδΥΝ-ν\νΡ-008	Полноразмерный ФВ дикого типа	ροΟΝΑ 3.1
ρδΥΝ-ν\νΡ-009	01Ο2ΟΌ3-область (1-276 ак, 6\Ηίδ)	ροΟΝΑ 3.1
ρδΥΝ-ν\νΡ-010	01Ο2ΟΌ3-область (1-477 ак, 6\Ηίδ)	ροΟΝΑ 3.1
ρδΥΝ-ν\νΡ-011	01Ο2ΟΌ3-область частично А1 (1-511 ак, 6χΗΐ8)	ροΟΝΑ 3.1
ρδΥΝ-ν\νΡ-012	01Ο2ΟΌ3Α1-область (1-716 ак, 6\ Ηίδ)	ροΟΝΑ 3.1
ρ4ΥΝ-ν\νΡ-013	ЩГ)7Г)Т)3 гесчоп (1-477 як Г336А/Г379А 6х Ηίδ)	ρρ,Γ)ΝΑ 3 1
ρδΥΝ-ν\νΡ-014	Сигнальный пептид ФУШ-О'ОЗ (1-477ак, С336А/С379А)одиночная Рс с 20ак линкером, содержащим сайт тромбина	ροΟΝ Α 4
ρδΥΝ-ν\νΡ-015	Ο1Ο2ΟΌ3 (1-477ак, С336А/С379А)- одиночная Рс с 20ак линкером, содержащим сайт тромбина	ροΟΝ Α 4
ρδΥΝ-ν\νΡ-016	Сигнальный пептид ФУШ-О'ОЗ (1-477ак, ДТ)-одиночная Рс с 20ак линкером, содержащим сайт тромбина	ροΟΝ Α 4
ρδΥΝ-ΥΥνΡ-017	Ο1Ο2ΟΌ3 (1-477ак, ДТ)-одиночная Рс с 20ак линкером, содержащим сайт тромбина	ροΟΝ Α 4

- 85 028309

ρδΥΝ-ν\νΡ-025	ϋ 102003-область (1-477 ак, бхГНз) в рПУЕ	рПУЕ
ρδΥΝ-ν\νΡ-029	ϋ 102003-область (1-477 ак, С336А/С379А, 6х№з) в рПУЕ	рПУЕ
ρδΥΝ-ν\νΡ-030	Сигнальный пептид ФУШЪЪЗ (1-477ак, С336А/С379А)одиночная Гс с 48ак линкером, содержащим сайт тромбина	ροΟΝΑ 4
ρδΥΝ-УЧТ-ОЗ1	Ο1Ο2ΟΌ3 (1-477ак, С336А/С379А)- одиночная Гс с 48ак линкером, содержащим сайт тромбина	ροΟΝΑ 4
ρδΥΝ-ν\νΡ-032	Сигнальный пептид ФУШ-ОЪЗ (1-477ак, ДТ)- одиночная Гс с 48ак линкером, содержащим сайт тромбина	ροΟΝΑ 4
ρδΥΝ-ν\νΡ-033	Сигнальный пептид ФУШ-ОЪЗ (1-477ак, ДТ)- одиночная Гс с 35ак линкером, содержащим сайт тромбина	ροΟΝΑ 4
ρνιιι
ρδΥΝ-ΡνΠΙ-055	УВД-ФУШ оцГс с Κ336Ι и Υ1680Γ	рВГЪ
ρδΥΝ-ΡνΐΙΙ-056	УВД-ФУШ оцГс с Κ336Ι, К562 и Υ1680Γ	рВГЪ
ρδΥΝ-ΡνΠΙ-057	УВД-ФУШ оцГс с Υ1680Γ	рВГЪ
ρδΥΝ-ΡνΠΙ-058	УВД-ФУШ оцГс с δ488Α	рВГЪ
ρδΥΝ-ΡνΠΙ-059	УВД-ФУШ оцГс с Κ336Ι, К562К, δ488Α	рВГЪ
ρδΥΝ-ΡνΐΙΙ-060	УВД-ФУШ оцГс с Κ336Ι, К562К, Υ1680Γ	рВГЪ
ρδΥΝ-г νΐΙΙ-061	усД-фуш оцгс с ι юоиг	рвив
ρδΥΝ-ΡνΐΙΙ-064	УВД-ФУШ отщепляемая оцГс с ФВ 003 (1-477ак, С336А/С379А) на второй Гс и 20ак тромбин-отщепляемым линкером между ними	рВГЪ
ρδΥΝ-ΡνΐΙΙ-065	УВД-ФУШ отщепляемая оцГс с ФВ 003 (1-276ак) на второй Гс и 20ак тромбин-отщепляемым линкером между ними	рВГЪ
ρδΥΝ-ΡνΠΙ-083	УВД-ФУШ оцГс с Κ336Ι, δ488Α,Κ562Κ, Υ1680Γ, Е1984У	рВГЪ
ρδΥΝ-ΡνΐΙΙ-086	УВД-ФУШоцГсс 6χ(ΟΟΟΟδ) линкероммеждуС2 ФУШиГс	рВГЪ
ρδΥΝ-ΡνΠΙ-095	УВД-ФУШ оцГс с δ КИС, Κ562Κ,Υ1680Γ, О1960С	рВГЪ
ρδΥΝ-ΡνΐΙΙ-101	УВД-ФУШ оцГс из ΦVIII-041 в пцДНК 3.3. Торо	ρεϋΝΑ3.3 Торо
ρδΥΝ-ΡνΠΙ-102	УВД-ФУШ (М662СЪ1828С для дисульфидной связи; АРС мутации расщепления Κ336Ι/Κ562Κ; вместе с мутацией Υ1680Γ для связывания ФВ)	рВГЪ
ρδΥΝ-ΡνΐΙΙ-103	УВД-ФУШ оцГс (У662С/Т1828С)	рВГЪ
ρδΥΝ-ΡνΠΙ-104	УВД-ФУШ оцГс (Сг655С^Т1788С)	рВГЪ
ρδΥΝ-ΡνΐΙΙ-113	УВД-ФУШ (К490А/Н497А) отщепляемая оцГс с ФВ 003 (1-477ак, С336А/С379А) на второй Гс и 20ак тромбинотщепляемым линкером между ними	рВГЪ
ρδΥΝ-ΡνΐΙΙ-114	УВД-ФУШ (К490А/Н497А) отщепляемая оцГс с ФВ 003 (1-276) на второй Гс и 20ак тромбин-отщепляемым линкером между ними	рВГЪ
ρδΥΝ-ΡνΐΙΙ-126	УВД-ФУШ оцГс (М662С/О1828С)	ροΟΝΑ 3.3 Торо
ρδΥΝ-ΡνΐΙΙ-127	УВД-ФУШ оцГс (М662СЪ1828С для дисульфидной связи; АРС мутации расщепления Κ336Ι/Κ562Κ; вместе с мутацией Υ1680Γ для связывания ФВ)	ροΟΝΑ 3.3 Торо
ρδΥΝ-ΡνΐΙΙ-128	УВД-ФУШ оцГс (У664С/Т1826С)	ροΟΝΑ 3.3 Торо
ρδΥΝ-ΡνΐΙΙ-129	мутация КЗ 361 К562К К490А Н497А Ν1224Α на фоне ρδΥΝ-νΐΙΙ-64	рВГЪ
ρδΥΝ-ΡνΐΙΙ-130	мутация КЗ 361 К562К К490А Н497А Ν1224Α на фоне ρδΥΝ-νΐΙΙ-65	рВГЪ
ρδΥΝ-ΡνΐΙΙ-131	мутация К471А Υ487Α К490А Н497А Ν1224Α на фоне ρδΥΝ-νΐΙΙ-64	рВГЪ
ρδΥΝ-ΡνΐΙΙ-132	мутация К471А Υ487Α К490А Н497А Ν1224Α на фоне ρδΥΝ-νΐΙΙ-65	рВГЪ

- 86 028309

ρδΥΝ-ΡνΐΙΙ-135	УВД-ФУШ оцРс с Κ1645Α/Κ1648Α	ρεϋΝΑ3.3 Торо
ρδΥΝ-ΡνΐΙΙ-136	УВД-ФУШ отщепляемая оцРс с ФВ ϋΤ)3 (1-477ак, С336А/С379А) на второй Рс и 20ак тромбин-отщепляемым линкером между ними	ρεϋΝΑ3.3 Торо
ρδΥΝ-ΡνΐΙΙ-137	УВД-ФУШ отщепляемая оцРс с ФВ ϋΤ)3 (1-276ак) на второй Рс и 20ак тромбин-отщепляемым линкером между ними	ρεϋΝΑ3.3 Торо
ρδΥΝ-ΡνΐΙΙ-145	УВД-ФУШ оцРс с Κ471Α/Υ487Α, К490А/Н497А	ρεϋΝΑ3.3 Торо
ρδΥΝ-ΡνΐΙΙ-146	УВД-ФУШ отщепляемая оцРс (Κ471Α/Υ487Α) с ФВ ϋΤ)3 (1-477ак, С336А/С379А) на второй Рс и 20ак тромбинотщепляемым линкером	ρεϋΝΑ3.3 Торо
ρδΥΝ-ΡνΐΙΙ-147	УВД- ФУШ отщепляемая оцРс (Κ471Α/Υ487Α) с ФВ ϋΌ3 (1-276ак) на второй Рс и 20ак тромбин-отщепляемым линкером между ними	ρεϋΝΑ3.3 Торо
ρδΥΝ-ΡνΐΙΙ-148	УВД-ФУШ отщепляемая оцРс (К1645А/К1648А) с ФВ ϋΤ)3 (1-477ак, С336А/С379А) на второй Рс и 20ак тромбинотщепляемым линкером	ρεϋΝΑ3.3 Торо
ρδΥΝ-ΡνΐΙΙ-149	УВД- ФУШ отщепляемая оцРс (К1645А/К1648А) ννίίΡι ФВ ϋΤ)3 (1-276ак) на второй Рс и 20ак тромбин-отщепляемым линкером	ρεϋΝΑ3.3 Торо
ρδΥΝ-ΡνΐΙΙ-155	УВД-ФУШ сшитый с одиночной Рс (К1645А/К1648А)	ρεϋΝΑ 4
ρδΥΝ-ΡνΐΙΙ-159	УВД-ФУШ отщепляемая оцРс с ФВ ϋΤ)3 (1-477ак, С336А/С379А) на второй Рс и 35ак тромбин-отщепляемым линкером между	рвио
ρδΥΝ-ΡνΐΙΙ-160	УВД-ФУШ отщепляемая оцРс с ФВ ϋΤ)3 (1-477ак, С336А/С379А) на второй Рс и 48ак тромбин-отщепляемым линкером между ними	рвио
ρδΥΝ-ΡνΐΙΙ-164	УВД-ФУШ отщепляемая оцРс (К490А/Н497А, К1645А/К1648А) с ФВ ϋΌ3 ( 1-477ак, С336А/С379А) на второй Рс и 20ак тромбин-отщепляемым линкером	ρεϋΝΑ3.3 Торо
ρδΥΝ-ΡνΐΙΙ-165	УВД-ФУШ отщепляемая оцРс (Κ336Ι/Κ562Κ, К490А/Н497А, К1645А/К1648А) с ФВ ϋΤ)3 (1-477ак, С336А/С379А) на второй Рс и 20ак тромбин-отщепляемым линкером	ρεϋΝΑ3.3 Торо
ρδΥΝ-ΡνΐΙΙ-178	УВД-ФУШ отщепляемая оцРс с ФВ ϋΤ)3 (1-477ак, С336А/С379А) на второй Рс и 73ак тромбин-отщепляемым линкером между ними	рвио
ρδΥΝ-ΡνΐΙΙ-179	УВД-ФУШ отщепляемая оцРс с ФВ ϋΤ)3 (1-477ак, С336А/С379А) на второй Рс и 98ак тромбин-отщепляемым линкером между ними	рвио
ρδΥΝ-ΡνΠΙ-180	УВД-ФУШ (К2092А) отщепляемая оцРс с ФВ ΟΌ3 (1477ак, С336А/С379А) на второй Рс и 48ак тромбинотщепляемым линкером между ними	рвио
ρδΥΝ-ΡνΐΙΙ-181	УВД-ФУШ (Р2093А) отщепляемая оцРс с ФВ ϋΤ)3 (1477ак, С336А/С379А) на второй Рс и 48ак тромбинотщепляемым линкером между ними	рвио
ρδΥΝ-ΡνΐΙΙ-182	УВД-ФУШ (К2092А/Р2093А) отщепляемая оцРс с ФВ ϋΌ3 (1-477ак, С336А/С379А) на второй Рс и 48ак тромбинотщепляемым линкером между ними	рвио

Пример 6. Белковая очистка.

Белковая очистка фрагментов ФВ.

Фрагменты ФВ очищали с применением двухэтапного метода очистки. Для первичной очистки использовали заряженную колонку с сульфатом никеля для афинной хроматографии на иммобилизованном металле (АХИМ), а для окончательной очистки использовали ионообменную колонку с ДЭАЭфрактогелем. Ниже детально описан способ очистки.

(а) Первичная очистка фрагмента ФВ на АХИМ никеле.

14-мл никелевую АХИМ колонку с НР-сефарозой ^К26/3] уравновешивали 25 мМ ГЭПЭС, 500 мМ №С1, 10 мМ имидазола и 0,05% Твин-20 @ рН 7,5. Приблизительно 7.2 л ФВ-кондиционированной среды доводили 100 мл 1 М ГЭПЭС @ рН 7,5 и 600 мл 5 М №С1. Затем добавляли 80 мл 1 М имидазола (@ рН 7.5) до достижения конечной концентрации в 10 мМ. Затем 7,8 Ь доведенной ФВкондиционированной среды загружали в колонку при 2-8°С при 10 мл/мин [113 см/ч]. Этапы отмывки проводили при 13.3 мл/мин [150 см/ч]. Сначала проводили отмывку 2х объемов колонки (ОК) с 25 мМ ГЭПЭС, 500 мМ №С1, 10 мМ имидазола и 0,05% Твин-20 @ рН 7,5 в нормальном потоке {нисходящем потоке}. Затем проводили отмывку 3хОК с 25 мМ ГЭПЭС, 500 мМ №С1, 10 мМ имидазола и 0,05% ТВИН-20 @ рН 7,5 в обратном потоке {восходящем потоке}. И наконец, проводили отмывку 3хОК с 25 мМ ГЭПЭС, 500 мМ КаС1, 10 мМ имидазола и 0,05% Твин-20 @ рН 7,5 в нормальном потоке {нисходящем потоке}. Элюирование проводили как градиент 10хОК до 50% В1 (25 мМ ГЭПЭС, 500 мМ

- 87 028309 №С1, 500 мМ имидазола и 0,05% ТВИН-20 @ рН 7,5). Объем фракции положили равным 10 мл. Затем колонку очищали 100% В1. После этого проводили отмывку с 25 мМ ГЭПЭС, 500 мМ №С1, 10 мМ имидазола и 0,05% Твин-20 @ рН 7,5. Вторую очистку проводили с 1Н №ОН. Затем колонку промывали с 1 М Трис, 1 М Ν;·ιΟ @ рН 7,8, и после этого - 25 мМ ГЭПЭС, 500 мМ №С1, 10 мМ имидазола и 0,05% Твин-20 @ рН 7,5. В конце колонку промывали с 5 ОК ФСБД + 20% этанола и хранили при 4°С.

(б) Вторичная очистка фрагмента ФВ на ДЭАЭ-фрактогеле.

Вторичную очистку фрагмента ФВ проводили на ДЭАЭ-фрактогеле @ рН 7,5. Сначала 20 мл элюата АХИМ никеля (что соответствует пику фрагмента ФВ) доводили 200 мг цвиттергента 3-14 цвиттерионного детергента, чтобы попытаться разделить агрегированные частицы без применения денатурации или восстановительных добавок. После растворения детергента белок оставляли при комнатной температуре приблизительно на 15 мин. Затем белок доводили 4 г трегалозы, 1 мл 10% Твин-20, 5 мл 1 М ГЭПЭС @ рН 7,5 и 174 мл воды Милли-Кью. Равновесный буфер А12 содержал 25 мМ ГЭПЭС, 50 мМ №С1, 1% трегалозы, 0,05% Твин-20 @ рН 7,5. Элюирующий буфер В1 содержал 25 мМ ГЭПЭС, 1000 мМ №С1, 1% трегалозы, 0,05% Твин-20 @ рН 7,5. Элюирование проводили как градиент 10 ОК до 50% В1 с удерживанием 5+ ОК, после чего следовал этап доведения до 100% В1. Затем колонку очищали 0,85% ортофосфорной кислоты, и после этого - 1 М Трис, 1 М Ν;·ιΟ @ рН 7,5. Затем колонку очищали 1Н №ОН, 2 М Ν;·ιΟ и после этого - 1 М Трис, 1 М Ν;·ιΟ @ рН 7,5. Затем колонку промывали с 25 мМ ГЭПЭС, 100 мМ Ν;·ιΟ + 20% этанола @ рН 7,5 для хранения.

(с) Белковая очистка гетеродимера Ф-УШ-ФВ.

Сначала гетеродимер Ф-УШ-ФВ очищали на аффинной колонке (ОЕ УШ§е1ес£), после чего проводили очистку на ионообменной колонке, содержащей фрактогель ТМАЕ. (МсСие !Т. 8еГОйеШ К. \Уа1кег I. I СЬготаШдгА. 2009 Νον 6; 1216(45):7824-30. ЕриЬ 2009 8ер 23.)

Для очистки Ф-УШ-155/ФВ-31 проводили этап тангенциальной поточной фильтрации (ТПФ) для замены буфера очищаемой кондиционированной среды. Затем при помощи аффинной хроматографии проводили захват целевых белков в фильтрате. После этого проводили этап слабой анионообменной хроматографии для уменьшения количества высокомолекулярных компонентов. Чистоту и размер молекул оценивали при помощи эксклюзионной ВЭЖХ и ДСН-ПААГ. Наличие разных доменов Ф-УШ155/ФВ-31 дополнительно подтверждали Вестерн-блоттингом. Специфическая активность молекул была сравнима с Ф-УШ с удаленным В-доменом.

(г) Расщепление тромбином гетеродимера Ф-УШ-ФВ (фиг. 8).

Гетеродимер Ф-УШ-ФВ или Ф-УШ-Рс (контроль) смешивали с тромбином в соотношении 1:10 в тромбин-расщепляющем буфере (50 мМ Трис, рН 7,4, 150 мМ №С1, 2 мМ СаС1₂, 5% глицерола). Реакцию инкубировали при 37°С на протяжении 20 мин. Расщепленный продукт проводили в 4-12% восстановительном трис-глициновом геле. Нерасщепленный белок использовали в качестве контроля. Полосы визуализировали красителем кумасси.

(д) Оценка ФВ-связывающей способности Ф-УШ-155/ФВ-31 при помощи октетного анализа.

ФВ-связывающую способность Ф-УШ-155/ФВ-31 определяли при помощи измерений на основе био-слоевой интерферометрии (БСИ) (октетный анализ) при 25°С при помощи измерительной установки ΕοιΝΒίο Ос1е1 384 с использованием буферного раствора Трис (50 мМ Тпз, рН 7,2, 150 мМ №С1, 5 мМ СаС1₂). Октетный анализ для определения связывания Ф-УШ основан на гидрофобной иммобилизации человеческого фактора Виллебранда (чФВ) (НаетаФ^дю ТесЬиοίοд^е8, каталог № НСУ^Р-0191) на АФС-биосенсоре, за которой следует связывание 1,0% бычьего сывороточного альбумина (ί;κ1<5οη 1ттииοΚе8еа^сЬ, каталог № 001-000-161). Вкратце, чФВ (38,5 нМ) растворяли в Трис-буфере и загружали на АФС-биосенсоры на 600 с, получая приблизительно 3,0-3,5 нм связывание на реакционных зондах. Контрольные АФС-зонды загружали 1,0% БСА в отсутствие чФВ для базового вычитания. После загрузки все зонды инкубировали в Трис-буфере на протяжении 300 с для установления новой базовой линии. После этого биосенсорные зонды инкубировали в растворах Ф-УШ-155/ФВ-031, лекарственного вещества с содержанием Ф-УШРс или рФ-УШ (60 нМ) на протяжении 5 мин при комнатной температуре с последующим 5-минутным этапом диссоциации. При помощи программного обеспечения для октетного анализа данных связывающий отклик (нм) получали путем вычетания данных (реакционный зонд минус контрольный зонд). Как показано на фиг. 15, по сравнению с ФВ-связывающей активностью рФ-УШРс и рФ-УШ ФВ-связывающая активность Ф-УШ-155/ФВ-031 является значительно более слабой. Это указывает на успешное экранирование Ф-УШ от полноразмерного ФВ фрагментом Б'Б3 гетеродимера ФУШРс/ФВ.

Пример 7. ФВ-Ф-УШ взаимодействие является ограничивающим фактором для продления времени полужизни Ф-УШ.

Большая часть циркулирующего Ф-УШ существует в виде комплекса Ф-УШ-ФВ (>95% плазменного Ф-УШ). Это Ф-УШ-ФВ взаимодействие способствует выведению Ф-УШ в процессе выведения ФВ, тем самым делая время полужизни ФВ (Т1/2) ограничителем для продления времени полужизни Ф-УШ. Для оценки этой гипотезы при помощи Рс-технологий проводили испытания по ограничению продления времени полужизни Ф-УШ у мышей с дефицитом Ф-УШ (мышей с гемофилией А, которые имеют интактный ген ФВ) и у мышей с дефицитом Ф-УШ/ФВ (с двойным Ф-УШ-ФВ генным нокаутом (ДГН)).

- 88 028309

Мышей с гемофилией А или ФУШ-ФВ ДГН мышей лечили путем введения единичной внутривенной дозы рФ-νΙΙΙ или рФУШРс в рассчете 125 МЕ/кг в случае мышей с гемофилией А или 200 МЕ/кг в случае ДГН мышей. Образцы крови брали до 72 ч у мышей с гемофилией А или до 8 ч у ФУШ/ФВ ДГН мышей. Затем измеряли активность Ф-νΙΙΙ в образцах плазмы крови при помощи хромогенного анализа Ф-νΙΙΙ. Фармакокинетический (ФК) профиль двух вариаций рФ-νΙΙΙ анализировали при помощи программы Уш^Ыше.

Как показано в табл. 7 и на фиг. 9, для ФУШ/ФВ ДГН мышей рФУШРс продемонстрировал приблизительно в 4,8 раз большее Т_1/2 (т.е. Т_1/2 1,2 ч) по сравнению с Т_1/2 рФ-νΙΙΙ (т.е. Т_1/2 в 0,25 ч). В противоположность этому, при испытаниях на мышах с гемофилией А рФУШРс имел только в 1,8 раз большее Тш по сравнению с рФ-νΙΙΙ. Т₁/₂ рФУШРс составило 13,7 ч, что совпадает со временем полужизни эндогенного мышиного ФВ. Это указывает на то, что ФУШ-ФВ взаимодействие является ограничивающим фактором для продления времени полужизни Ф-νΙΙΙ. Для того чтобы достичь более чем 2-кратного увеличения времени полужизни Ф-νΙΙΙ, ФУШ-ФВ взаимодействие должно быть устранено.

Таблица 7

ФК Ф-νΙΙΙ для мышей с гемофилией А и ФУШ/ФВ ДГН мышей

Тестируемая молекула	Мыши с дефицитом ФУШ	Мыши с дефицитом ΦΥΙΠ/ΦΒ
БД⁴)	Соотношение Т к рФУШ	БД⁴)	Соотношение Т
рФУШ	7,6	1	0,25	1
рФУШРс	13,7	1,8	1,2	4,8

Хромогенный анализ Ф-νΙΙΙ.

Активность Ф-νΙΙΙ определяли при помощи набора инструментов С0АТЕЗТ ЗР ЕVШ от О1аРЬагта (1οί# N089019), а все инкубирования проводили на плоском нагревателе при 37°С с встряхиванием.

Диапазон калибровочной пробы рФ-νΙΙΙ составлял от 100 до 0,78 мМЕ/мл. Смешанные образцы контрольной нормальной человеческой плазмы и плазмы (разведенные в 1Х буфере Сοаίезί) добавляли в 96-луночные планшеты Iтти1οη 2ΗΒ в дубликате (25 мкл/лунку). Свежеприготовленную смесь 1Ха/ФХ/Фосфодинид (50 мкл), 25 мкл 25 мМ СаС1₂ и 50 мкл субстрата ФХа последовательно добавляли в каждую лунку с 5 мин инкубации между добавлениями. После инкубации с субстратом добавляли 25 мкл 20% уксусной кислоты для терминации цветной реакции и измеряли поглощение 00405 при помощи установки ЗресйаМАХ р1из ^ο^^^ ^еν^сез). Данные анализировали при помощи программного обеспечения ЗοйМаx Рго (версия 5.2). Нижний предел количественного определения (НПКО) равен 7,8 мМЕ/мл.

Пример 8. Димер ФВ ΏΌ3 защищает Ф-νΙΙΙ от ФУШ-протеолиза и выведения (фиг. 10).

ФУШ-защитную активность фрагментов ФВ оценивали по их способности защищать эндогенный мышиный Ф-νΙΙΙ от выведения у мышей с дефицитом ФВ. В циркуляцию крови мышей с дефицитом ФВ вводили разные фрагменты ФВ, перечисленные в табл. 8, колонка 1 (фиг. 1, пример 1), при помощи гидродинамической инъекции соответствующих конструкций ДНК в расчете 100 мкг/мышь. Образцы плазмы крови брали через 48 ч после инъекции, а плазменную активность мышиного Ф-νΙΙΙ измеряли при помощи хромогенного анализа Ф-νΙΙΙ. Уровень экспрессии ФВ измеряли при помощи ЕЫЗА ФВ.

Исследовали четыре фрагмента ФВ разной длины, составляющей 276, 477, 511 и 716 аминокислот. Диапазон аминокислот от 276 до 716 исследовали, чтобы определить длину фрагментов ФВ, которая требуется для связывания Ф-νΙΙΙ (276 ак) в отсутствие связывающего домена клиренс-рецептора ФВ (716 ак). Полноразмерный ФВ и мультимер ОГО2О'О3СК использовали в качестве положительного контроля для защиты Ф-νΙΙΙ. В циркуляции крови фрагменты ФВ, синтезированные с доменом О1О2, существуют в виде димера и в виде мономеров, если они синтезированы без доменов О1О2.

Повышение активности мышиного Ф-νΙΙΙ в плазме крови после гидродинамической инъекции определяет ФЛ'Ш-затитное действие фрагментов ФВ. Как показано в табл. 8 и на фиг. 10А-Б, первые 276 ак фрагмента ΟΌ311е проявляют ФЛ'Ш-защитной активности, что демонстрируют одинаковые уровни Ф-νΙΙΙ в плазме крови до/после инъекции (фиг. 10А). При этом введение других фрагментов ФВ привело к значительному повышению уровня Ф-νΙΙΙ в плазме крови, что указывает на то, что эти фрагменты ФВ могут защищать Ф-νΙΙΙ от выведения.

- 89 028309

Таблица 8

Уровень мышиного Ф-У111 в плазме крови Ф-У111/ФВ ДГН мышей до/после введения фрагментов ФВ (конструкции ДНК проиллюстрированы на фиг. 1)

Конструкция ДНК	Кодирующий Фрагмент ФВ	Активность ФУШ -до (мМЕ/мЛ)	Активность ФУШ -48 ч (мМЕ/мЛ)	ФВ антиген-48 ч (нМ/мЛ)
Ср.	СО	Ср.	СО	Ср.	СО
УАЕ-001	О'О3276аа	53	31	86	16	2,8	1,9
УАЕ-009	ОЮ2ОТ)3276аа	45	20	65	17	1,8	1,3
УАР-002	О'О3477аа	56	3	257	38	17,0	0,5
УАР-010	ОЮ2ОТ)3477аа	42	11	387	22	8,2	1,6
УАР-003	Э'ЭЗАЦпаа	88	21	253	47	12,9	2,2
УАР-011	ШО2О'ОЗА1₅11аа	63	42	360	15	9,3	2,3
УАР-004	ОТ)ЗА171баа	87	8	239	56
УАР-012	ШО2О'ОЗА1₇16аа	64	22	307	29
УАР-006	ШО2ОТ)ЗСК	38	10	249	20	2,4	1,0
УАР-008	Полноразмерный ФВ	51	8	380	41	10,6	2,3

В табл. 8 приведены значение активности плазменного Ф-У111 и плазменный уровень антигена фрагментов ФВ, которые содержат домен ΌΌ3 полноразмерного ФВ, после инъекции. Аналогичные послеинъекционные значения Ф-У111/ФВ наблюдали для полноразмерного ФВ и двух димерных форм фрагментов ФВ, что означает, что эти два димера фрагментов ФВ обеспечивают такую же защиту ФУ111, что и полноразмерный ФВ. Вдобавок, 3-кратно превышающее значение Ф-У111/ФВ наблюдали для димерных изоформ фрагмента ФВ по сравнению с соответствующими им мономерами: димер Ό'Ό3 (477 ак) характеризуется значением Ф-У111/ФВ в 38,7 мМЕ/нмоль; мономер ΌΌ3 (477 ак) характеризуется значением Ф-У111/ФВ в 11,6 мМЕ/нмоль: димер ΌΌ3Ά1 (511 ак) характеризуется значением Ф-У111/ФВ в 32,9 мМЕ/нмоль; и мономер ΌΌ3 (511 ак) характеризуется значением Ф-У111/ФВ в 13,8 мМЕ/нмоль, что указывает на то, что димерные изоформы фрагментов ФВ обеспечивают лучшую защиту Ф-У111 по сравнению с соответствующими им мономерами.

Таблица 9

Эффект защиты Ф-У111 полноразмерным фрагментом Ό'Ό3

Конструкция ДНК	Кодирующий Фрагмент ФВ	Форма мультимера	ФУШ/ФВ (мМЕ/нмоль)
Среднее	(СО)
УЛУР-002	ОТ)3477аа	Мономер	П,6	(4,4)
УЛУР-010	ϋ Ю2ОТ)3477яа	Димер	38,7	(117)
УЛУР-003	О'ОЗАЕнаа	Мономер	13,8	(1,3)
УЛУР-011	ОЮ2О'ОЗА1₅11аа	Димер	32,9	(5,5)
УЛУР-008	Полноразмерный ФВ	Мультимер	31Д	(6,7)

Гидродинамическая инъекция.

Гидродинамическая инъекция является эффективным и безопасным методом доставки генов в печень небольших животных, таких как мыши и крысы. Впервые он был описан как быстрая инъекция чистой плазмидной ДНК/солевого раствора без содержания эндотоксинов в размере десятой части от массы тела животного, проводимая за 5-7 с. Чистая плазмидная ДНК содержит представляющий интерес ген, а целевой белок, вырабатывающийся в печени из инъектированной ДНК, можно обнаружить в пределах 24 ч после инъекции. Затем образцы плазмы крови брали для изучения терапевтических свойств экспрессируемого белка.

Во всех гидродинамических инъекциях, которые проводили в рамках данной патентной заявки, мышам массой 20-35 г в течение 4-7 с путем внутривенной инъекции в хвостовую вену доставляли 2 мл плазмидной ДНК в 0,9% стерильном солевом растворе. За мышами внимательно наблюдали на протяже- 90 028309 нии первых нескольких часов до тех пор, пока не восстанавливалась нормальная активность. После того, как при помощи метода отбора образцов крови из ретроорбитального синуса образцы крови были взяты, из них получали образцы плазмы крови и хранили при -80°С для дальнейшего анализа.

ЕЫ8А ФВ.

Для ЕБ18А ФВ использовали козлиное антитело к ФВ (аффинно очищенное, аффинно биологическое, КАФВ-АО) в качестве иммобилизованного антитела в количестве 0,5 мкг/лунку, а ФВ-ИФА-Д (АГПпИу Вю1о§юа1к, ФВ-ИФА-Д, разведение 1:100) использовали в качестве детектирующего антитела. Анализ ЕЫ8А проводили согласно стандартной процедуре ЕЫ8А, в качестве субстрата ПХ использовали ТМБ, в качестве блокирующего и связывающего буфера использовали буфер ФСБТ/1,5% БСА/0,5М №С1. Стандартный диапазин анализа составляет от 100 нг до 0,78 нг, а нижний предел количественного определения (НПКО) в анализе равен 7,8 нг/мл.

Пример 9. Совместное введение полноразмерного П'Э3-фрагмента ФВ продлевает время полужизни рУВД-Ф-УШ у Ф-У111-ФВ ДГН мышей.

Пример 8 продемонстрировал, что полноразмерный фрагмент ΏΌ3 может защитить эндогенный ФУ111 от процесса его выведения. Для того чтобы дополнительно оценить Ф-У111-защитную активность белка П'Э3, Ф-У111-ФВ ДГН мышам вводили совместно Ф-УШ с удаленным В-доменом (рУВД-Ф-У111) и димер ΏΌ3 (ФВ-010) или рУВД-Ф-У111 и мономер ΏΌ3 (ФВ-002) при помощи внутривенной инъекции в расчете 200 МЕ/кг для рУВД-Ф-У111, 770 мкг/кг для димера ΏΌ3 и 590 мкг/кг для мономера ΏΌ3. ФК профиль рУВД-Ф-У111 изучали по его плазменной активности после инъекции. Из-за короткого т У1уо времени полужизни фрагментов ΏΌ3 через 3 ч после первичной совместной инъекции вводили еще одну дозу ΏΌ3 тем же самым путем для того, чтобы поддерживать необходимый уровень ΏΌ3 в плазме крови.

Для анализа ФК образцы плазмы крови получали при помощи метода отбора образцов крови из ретроорбитального синуса через 5, 30 мин, 1, 2, 4 и 6 ч после инъекции, активность плазменного Ф-УШ и уровень ангигена ΏΌ3 анализировали при помощи хромогенного анализа Ф-УШ и ЕБ18А ФВ.

Как показано на фиг. 11 и в табл. 10, мономер ΏΌ3 продлил время полужизни рУВД-Ф-У111 в 2,5 раз и улучшил его восстановление в 1,8 раз. Димер П'Э3 продлил время полужизни рУВД-Ф-У111 в 4,1 раз и улучшил его восстановление в 3,5 раз. Также для обеих изоформ наблюдали улучшенные параметры среднего времени нахождения, выведения и ПИК. При этом димер П'Э3 показывал лучшие результаты по всем ФК параметрам по сравнению со своей мономерной формой.

Таким образом, совместное введение полноразмерного ΏΌ3 защищает Ф-УШ от процесса выведения, что показывает улучшение профиля ФК рУВД-Ф-У111. Потенциальное клиническое значение этого открытия нуждается в дополнительной оценке.

Таблица 10

Параметры ФК рУВД-Ф-У111 у Ф-У111-ФВ ДГН мышей при совместном введении им фрагментов ΏΌ3

Лечение	5 мин Восстанов ление(%)	Τ 1/2 (ч)	свн (ч)	Вывед. (мЛ/ч/кг)	Орс (мЛ/кг)	ппкд (чкгмМЕ/ мЛ/мМЕ)	т ¹ 1/2 Кратность увеличения	Восстанов ление Кратность увеличени я
гВОО-РУШ	25	0,23	0,24	407,72	133,14	0,0025
гВОО-РУШ УЛУР-002	44	0,57	0,58	151,93	124,63	0,0066	2,5	1,8
ΓΒϋϋ-ΡνίΙΙ ν\νρ-οιο	87	0,95	0,98	71,48	97,54	0,014	4,1	3,5

Пример 10. Мономер П'Э3, синтезированный с доменом Π1Ώ2, и его димерная изоформа обладают такой же Ф-У111-защитной активностью и дополнительно продлевают время полужизни Ф-У111Рс приблизительно в ~4 раза у Ф-У111-ФВ ДГН мышей.

Для того чтобы количественно оценить Ф-У111-защитную способность доменов ΏΌ3 и выяснить, является ли димеризация ΏΌ3 необходимой для Ф-У111-защитной активности, каждую из двух конструкций ДНК (т.е. ФВ-025 (содержащую последовательность ДНК, кодирующую Π1Π2ΠΌ3) и ФВ-029 (содержащую Π1Π2ΠΌ3 кодон ДНК с мутациями С336А и С379А)) вводили Ф-У111/ФВ ДГН мышам путем гидродинамической инъекции. Эта инъекция приводила к экспрессии димера П'Э3 (ФВ-025) или экспрессии мономера (ФВ-029) у Ф-У111/ФВ ДГН мышей. На 5 день после гидродинамической инъекциивводили единичную внутривенную дозу рФ-У111Рс в расчете 200 МЕ/кг, а образцы плазмы крови брали через 5 мин, 4, 8, 16, 24, 31, 40, 55, 66 ч после инъекции рФ-У111Рс 1У. Исследование ФК рФ-У111Рс, проводимое на ранее не подвергавшихся экспериментам Ф-У111-ФВ ДГН мышах с аналогичными дозировками, использовалось в качестве базовой линии времени полужизни рФ-У111Рс. Активность плазменного Ф-УШ анализировали при помощи хромогенного анализа Ф-УШ. Плазменный уровень П'Э3 измеряли при помощи ЕБ18А ФВ, а ФК профиль рФ-У111Рс анализировали при помощи программы АтШпПп.

Как показано в табл. 11 и на фиг. 12, при наличии в циркуляции П'Э3-фрагментов ФВ исходное восстановление рФ-У111Рс возрастает от 42 до 75% для димера ΏΌ3 и 60% для мономера П'Э3. Т_1/2 для

- 91 028309 рФ-УШРс также возросло от 2,5 ч до 9,3 ч и 9,2 ч соответственно. Вместе с Т_1/2 наблюдали улучшенные параметры среднего времени нахождения, выведения и объемного распределения у мышей, экспрессирующих мономеры и димеры Ό'Ό3. В целом, наблюдали приблизительно 8-кратное увеличение времени полужизни рФ-УШРс и 6-кратное увеличение ППК у мышей, экспрессирующих и мономеры и димеры Ό'Ό3. Так же, как и его димерная изоформа, мономер Ό'Ό3 полноразмерного ФВ, который синтезировали с пропептидом (Ό1Ό2) ФВ, может обеспечивать полный Ф-УШ-защитный эффект, что и полноразмерная молекула ФВ.

У Ф-УШ/ФВ ДГН мышей Ф-УШ дикого типа имеет 0,25 ч Т_1/2. Метод слияния Рс повышает Т_1/2 ФУШ до 1,2 ч, что является приблизительно 4,8-кратным увеличением. Когда метод слияния Рс объединили с доменами Ό'Ό3, Т1/2 Ф-УШ возросло до 9,3 ч (димер Ό'Ό3) и 9,2 ч (мономер Ό'Ό3), что в целом является приблизительно 37-кратным увеличением (табл. 10). Этот результат демонстрирует синергетический эффект слияния Рс и В'Р3-фрагмента ФВ на продление времени полужизни Ф-УШ.

Таблица 11

ФК параметры рФ-УШРс с/без фрагмента Ό'Ό3 в циркуляции крови

Лечение	5 мин Восстанов ление(%)	т 1/2 (ч)	свн (ч)	Вывед. (мЛ/ч/кг)	Орс (мЛ/кг)	ппкд (чкгмМЕ/ мЛ/мМЕ)	Д/2 Кратность увеличени я	ППКД Кратность увеличени я
гРУШРс	43	1,2	0,76	39,5	67,0	0,025
гРУШРс У\УР-025	75	9,3	П,1	6,1	67,6	0,164	7,8	6,6
гРУШРс У\УР-029	60	9,2	п,з	6,7	75,7	0,149	7,7	6,0

Пример 11. ФК гетеродимеров Ф-УШ-ФВ у мышей с гемофилией А.

На мышах с гемофилией А проводят исследование ФК профиля основных представителей гетеродимеров Ф-УШ-ФВ (таких как Ф-УШ-155/ФВ-031) для того, чтобы оценить их способность экранировать Ф-УШ от эндогенного ФВ и их способность продлевать время полужизни Ф-УШ.

Мышей с гемофилией А обрабатывают единичной внутривенной дозой основных представителей в расчете 200 МЕ/кг, затем берут образцы плазмы крови через 5 мин, 4, 8, 24, 48, 72, 96 и 120 ч, исследуют активность плазменного Ф-УШ при помощи хромогенного анализа Ф-УШ, а изменение времени полужизни Ф-УШ рассчитывают при помощи программы ^тШпРп.

В оптимальной конфигурации гетеродимера Ф-УШ/ФВ, связывание Ф-УШ с эндогенным ФВ будет полностью подавляться, следовательно, базовая линия времени полужизни рФ-УШ снизится от 7,6 до 0,25 ч, как показано в примере 7. При нековалентном соединении фрагмента Ό'Ό3 с Ф-УШ наблюдали приблизительно 8-кратное увеличение времени полужизни (пример 9). У основных представителей гетеродимеров Ф-УШ/ФВ фрагмент ФВ ковалентно соединен с молекулой Ф-УШ, соответственно должна быть достигнута лучшая защита Ф-УШ. Изобретение, описанное в данной заявке, открывает двери дальнейшему продлению времени полужизни Ф-УШ за границу 2-кратного увеличения с применением доступных способов продления времени полужизни, пациенты с гемофилией А в ближайшем будущем могут надеяться на вариант Ф-УШ более длительного действия.

На мышах с гемофилией А и Ф-УШ/ФВ ДГН мышах исследовали ФК профиль Ф-УШ-155/ФВ-031 для того, чтобы оценить способность фрагмента Ό'Ό3 экранировать компонент Ф-УШ от эндогенного ФВ. Мышей с гемофилией А и Ф-УШ/ФВ ДГН мышей лечили единичной внутривенной дозой Ф-УШ155/ФВ-031 в расчете 200 МЕ/кг, затем брали образцы плазмы крови через 5 мин, 8, 24 и 48 ч после дозирования. Ф-УШ-активность образца плазмы исследовали при помощи хромогенного анализа Ф-УШ, а время полужизни Ф-УШ-155/ФВ-031 рассчитывали при помощи программы ^шШпПп.

Методом биослоевой интерферометрии для Ф-УШ-155/ФВ-031 по сравнению с рФ-УШРс и рФ-УШ было зарегистрировано очень слабое связывание с иммобилизованным ФВ (фиг. 15, Октет; РогГеВю Ыс., Менло-Парк, Калифорния). Это показывает, что домен Ό'Ό3 в молекуле успешно блокирует связывание Ф-УШ с нативными молекулами ФВ. Следовательно, ожидается, что для двух разных мышиных линий времена полужизни рФ-УШ-155/ФВ-031 будут сходными. Результаты исследования приведены на фиг. 16 и в табл. 12А. Как и предсказывалось, ФК профайл рФ-УШ-155/ФВ-031 сравним в обоих случаях мышей с гемофилией А и Ф-УШ/ФВ ДГН мышей, что указывает на то, что время полужизни гетеродимера Ф-УШРс/ФВ не зависит от времени полужизни эндогенного ФВ. Результаты показывают, что подавление взаимодействия рФ-УШРс с эндогенным ФВ В'Р3-доменами ФВ дает возможность снять ограничение по времени полужизни Ф-УШ и открывает возможность продления времени полужизни Ф-УШ за границы времени полужизни, достигаемые в отсутствие Ό'Ό3-доменов ФВ (приблизительно в два раз по сравнению с Ф-УШ дикого типа).

- 92 028309

Таблица 12А

ФК Ф-У111-155/ФВ-031 у Ф-У111/ФВ ДГН мышей и мышей с гемофилией А

Лечение	5 мин Восстановление (%)	т_1/2 (ч)	свн (ч)	Вывед. (мЛ/ч/кг)	Орс (мЛ/кг)	ппкд (ч* кг* мМЕ/мЛ/мМЕ)
РУШ- 155/νΛΥΈ- 031 ϋΚΟ	49	9,9	6,9	11,6	80,5	0,09
ρνιιι- 155/νΛΥΈ- 031 НетА	69	10,8	707	П,9	92,1	0,08

Ф-У111-защитную способность доменов Ό'Ό3 оценивали путем сравнения ί_1/2 для Ф-У111-155/ФВ-031 с Ф-УШРс у Ф-У111/ФВ ДГН мышей. После одноразового введения 1У брали образцы крови через 5 мин, 8 ч, 24 ч и 48 ч для Ф-У111-155/ФВ-031, и через 5 мин, 1, 2, 4, 6 и 8 ч для Ф-УШРс. Активность Ф-УШ образцов плазмы крови исследовали при помощи хромогенного анализа Ф-УШ, а время полужизни ФУ111-155/ФВ-031 рассчитывали при помощи программы \Υίιι\οιι1ίιι.

Фиг. 16Б и табл. 12Б демонстрируют значительно улучшенный ФК профиль для Ф-У111-155/ФВ-031 по сравненю с рФ-УШРс для ДГН мышей: приблизительно 6-кратное увеличение для ί_1/2; и приблизительно 5-кратное увеличение для параметров выведения и ПИК. Этот результат демонстрирует, что домен Ό'Ό3 гетеродимера Ф-УШРс/ФВ защищает компонент Ф-УШ от некоторых процессов выведения, обеспечивая, таким образом, часть защиты, которую обычно обеспечивает полноразмерный ФВ. Этот вывод был также подтвержден в случае мышей с гемофилией А. По сравнению с рФ-УШРс у мышей с гемофилией А рФ-У111-155/ФВ-031 имеет более короткое ΐ_1/2 и меньшую ППК, что означает, что в такой конфигурации домены Ό'Ό3 (ФВ-031) успешно предотвращают связывание белка Ф-УШ (рФ-У111-155) с эндогенным ФВ, который до определенной степени обладает свойствами продления времени полужизни, равно как и свойствами, ограничивающими время полужизни Ф-УШ. Полноразмерный ФВ имеет длину в 250 кДа и образует мультимеры так, что эндогенный ФВ может иметь длину до 2 МДа, и, таким образом, это согласуется с гипотезой о том, что в данном контексте 1)'1)3-участок ФВ длиной в 55 кДа не обеспечивает защиту в той же степени, в какой ее предоставляет гораздо более крупный эндогенный ФВ. Так как фрагмент ФВ предотвращает связывание эндогенным ФВ рФ-У111-155/ФВ-031, в этой конкретной конструкции время полужизни у мышей с гемофилией А сокращается. Следовательно, результаты, приведенные в табл. 12Б, указывают на то, что молекула рФ-У111-155/ФВ-031 способна предотвращать связывание рФ-У111-155/ФВ-031 с компонентом, продлевающим время полужизни Ф-УШ (эндогенным ФВ). При этом эксперименты показывают, что устранение фактора, ограничивающего время полужизни Ф-УШ, открывает возможность продления времени полужизни белка Ф-УШ за пределы ранее осуществляемого 1,5-кратного или 2-кратного увеличения. Комбинируя Ф-УШ с другими продлевающими время полужизни элементами, можно выйти за ограничение на более чем 2-кратное продление времени полужизни.

Таблица 12Б

ФК рФ-УШ-155/ФВ-031 и Ф-УШРс у Ф-У111/ФВ ДГН мышей

Лечение	5 мин Восстановление (%)	Τΐ/2 (ч)	СВН (ч)	Вывед. (мЛ/ч/кг)	Орс (мЛ/кг)	ППКД (чкгмМЕ/мЛ/мМЕ)
РУШРс ЭКО	43	1,6	1,9	63,9	123,2	0,02
РУШ- 155ЛАУР- озюко	49	9,9	6,9	11,6	80,5	0,09
Ροϊά Ьгсгеазе		6,2	3,6	5,5		4,5
РУШ- 155ЛАУР- 031 НетА	69	10,8	7,7	П,9	92,1	0,08
РУШРс НетА	86	16,4	20,3	2,9	57,7	0,35

- 93 028309

Пример 12. Оптимизация Ю'1Э3-1^;с линкера гетеродимера Ф-УШ/В'ВЭ (фиг. 13).

Для того чтобы обеспечить возможность рФ-УШРс избежать процесса выведения ФВ и устранить ограничение в виде 2-кратного увеличения времени полужизни Ф-УШ, ΟΌ3-фрагмент ФВ вносили в молекулу рФ-У111Рс (фиг. 2), что приводило к образованию гетеродимера Ф-УШРс/ФВ. Чтобы исключить взаимодействие междк рФ-У111Рс и эндогенным ФВ и максимизировать Ф-У111-защитный потенциал Ό'Ό3, между доменом Ό'Ό3 и Рс-областью добавляли линкер, чтобы обеспечить возможность оптимального связывания Ф-УШ/В'В3. Более оптимальный линкер обеспечит домену Ό'Ό3 возможность предоставлять большую защиту Ό'Ό3, чем это делает менее оптимальная конструкция линкера. Это предположение можно проверить путем проведения гидродинамической инъекции конструкций ДНК ФУ111/ФВ ДГН мышам. Более оптимальная конструкция приведет к более стабильной экспрессии гетеродимера Ф-УШРс/В'В3.

Для того чтобы выбрать оптимальный линкер было создано три разных гетеродимера ФУШРсГО'В3 (фиг. 3, пример 3). Возможные линкеры между доменами Ό'Ό3 и Рс-областью перечислены в табл. 13. Данные конструкции ДНК вводили Ф-УШ/ФВ ДГН мышам при помощи гидродинамической инъекции (ГДИ) в расчете 100 мкг/мышь, образцы плазмы брали через 48 ч после ГДИ. Активность циркулирующего гетеродимера Ф-УШРс/В'В3 анализировали при помощи хромогенного анализа Ф-УШ.

Результаты исследований показаны на фиг. 13. Через 48 ч после ГДИ наблюдали одинаковый уровень экспрессии, достигаемый Ф-У111-064 и Ф-У111-159, что указывает на то, что 20 ак линкер и 35 ак линкер обеспечивают одинаковый уровень взаимодействия Ф-УШ/В'В3. С другой стороны, Ф-У111-160 продемонстрировал значительно более высоку экспрессию, чем Ф-У111-064, что указывает на то, что 48 ак линкер обеспечивает возможность лучшего связывания Ф-УШ/В'В3 по сравнению с 20 ак и 35 ак линкерами.

Оптимальный линкер между фрагментом ФВ и Рс-областью является одним из ключевых элементов в гетеродимере Ф-УШРс/ФВ. Нахождение лучшего линкера позволит получить оптимальное взаимодействие между Ф-УШ и фрагментом ФВ, предотвратит связывание Ф-УШ с эндогенным ФВ, даст возможность Ф-УШ избежать процесса выведения ФВ и продлит время полужизни Ф-УШ за пределы времени полужизни плазменного ФВ.

Таблица 13

Различные линкеры между Ό'Ό3 и фрагментом Рс

Конструкция ДНК	Линкер между ϋΌ3 и Рс
ΡνΐΙΙ-064 (δΕΟ ГО ΝΟ: 92)	20 аа= I ϋ О О О О δ О О О О δ Р V Р К О δ О О
РУШ-159 (δΕ(} ГО ΝΟ: 93)	35 аа= I δ О О О О δ О О О О δ О О О О δ О О О О δ О О О О δ Р V Р КО δΟΟ
РУШ-160 (δΕ(} ГО ΝΟ: 94)	48 3Η = ΙδΟΟΟΟδΟΟΟΟδΟΟΟΟδΟΟΟΟδΟΟΟΟδΟΟΟΟδ ΕΥΡΚΟδΟΟΟΟδΟΟΟΟδ

Пример 13. Стабильность одноцепочечного Ф-УШ.

Одноцепочечный белок Ф-УШ должен быть более стабильным, чем его изоформа с двойной цепью. Для проверки этой гипотезы были созданы две конструкции ДНК: Ф-У111-136 (процессируемый Ф-У111Рс с доменом Ό'Ό3) и Ф-У111-148 (одноцепочечный (ОЦ) Ф-У111Рс с доменом Ό'Ό3, который содержит мутацию К1645А/К1648А, чтобы предотвратить расщепление между тяжелой цепью и легкой цепью ФУ111).

Обе плазмиды вводили Ф-УШ/ФВ ДГН мышам при помощи гидродинамической инъекции. Образцы плазмы брали через 24 и 48 ч после инъекций для того, чтобы измерить уровень экспрессии двух изоформ Ф-УШРс/В'В3. Как показано на фиг. 14 для обеих временных точек лучшую экспрессию наблюдали для конструкции ОЦ-Ф-УШРсГО'В3 (Ф-У111-148) (р=0,12, р=0,19), что указывает на то, что одноцепочечный Ф-УШ может являться более стабильным или лучше экспрессируемым, чем его двухцепочечная изоформа (Ф-У111-136). ФК профиль двух изоформ Ф-УШ и уровни их экспрессии в клеточной культуре будут дополнительно исследованы. Одноцепочечную изоформу Ф-УШ потенциально можно использовать для замещения традиционной двухцепочечной изоформы для достижения лучшей выработки белка и лучшего ϊη νίνο времени полужизни Ф-УШ.

Пример 14. ПЭГилирование.

Одну или более молекул полиэтиленгликоля (ПЭГ) можно присоединить к любой области белка ФУШ, фрагмента ФВ или их обоих. Так как согласно данным по кристаллической структуре Ф-УШ не содержит на своей поверхности свободного цистеина (РОВ:2К7Е, δίκη еί а1., Β1οο6 111:1240 (2008); РВВ:3СВ2, Ν§ο, ЗДисШге, 16:597-606 (2008)), одним из подходов является либо вставка цистеинсодержащего пептида (например, ОООЗОСОООЗ) (ЗЕр ΙΌ ΝΟ: 107), либо его присоединение к белку ФУ111, фрагменту ФВ или им обоим. Затем молекулы ПЭГ, содержащие малеимид, могут быть специфически конъюгированы с цистеином, внедренным в рекомбинантный белок Ф-УШ. Вкратце, рекомбинантный белок Ф-УШ, содержащий Суз-вставку, можно сконструировать при помощи стандартной молеку- 94 028309 лярной технологии, а экспрессируемый в экспрессионной системе млекопитающего рекомбинантный белок Ф-νΙΙΙ (например, в клетках НЕК29З, СНО, ВНК21, РЕК.С6 и САР) можно очистить при помощи аффинной и ионообменной хроматографии. Очищенный рекомбинантный белок Ф-νΙΙΙ восстанавливают трис-(2-карбоксиэтил)фосфином (ТКЭФ) для того, чтобы открыть тиоловую группу внедренного цистеина, а затем проводят реакцию с содержащим малеимид ПЭГ. Полученный рекомбинантный белок Ф-νΙΙΙ исследуют на предмет прокоагулирующей активности и продления времени полужизни.

ПЭГ присоединяют в одной из позиций, раскрытых в патентной заявке И8 № 61/670,55З, которая в полном объеме включена в данный текст посредством ссылки, либо в других подходящих для вставки позициях. Активность циркулирующего гетеродимера Ф-ШП-активность ПЭГилированного рекомбинантного белка Ф-νΙΙΙ анализировали при помощи хромогенного анализа Ф-νΙΙΙ. 0К ПЭГилированного рекомбинантного белка Ф-νΙΙΙ анализировали для мышей с гемофилией А и Ф-ШП-ФВ ДГН мышей как описано выше.

Пример 15. Стабильность Ф-νΙΙΙ в плазме крови мышей с гемофилией А и мышей с двойным ФνΙΙΙ/ФВ генным нокаутом (ДГН).

Плазменную стабильность разных слитых белков Ф-ШПРс исследовали в плазме крови мышей с гемофилией А и мышей с двойным Ф-ШП/ФВ генным нокаутом (ДГН). Для анализа стабильности 5 МЕ/мл разных белков Ф-ШПРс инкубировали вместе с с плазмой крови мышей с гемофилией А или ДГН мышей при З7°С. Аликвоты брали для разных временных точек, чтобы измерить активность при помощи хромогенного анализа Ф-νΙΙΙ. Активность для каждой временной точки измеряли дважды, а среднюю активность наносили на график как функцию времени.

Для анализа иммунопреципитации Ф-ШПРс 5 мкг Ф-ШПРс инкубировали с 250 мкл ОСБ или плазмой крови ДГН мыши на протяжении 24 ч при З7°С. Ф-ШПРс иммунопреципитировали путем добавления 5 мкг овечьего поликлонального антитела к Ф-νΙΙΙ (аЪ61З70) на протяжении 1 ч при комнатной температуре и 100 мкл гранул протеина А. После 4x1 мл ФСБ отмывок гранулы пересуспендировали в 50 мл 1х восстановительного ДСН-ПААГ буфера. После кипячения 20 мкл (т.е. ~1мкг ФШШРс) загружали в 415% не содержащий красителей Вю-Ка4 гель. Гель визуализировали при помощи установки Вю-Ка4 и после этого проводили вестерн-блоттинг с антителом к тяжелой цепи Ф-νΙΙΙ (СМА012).

Активность Ф-ШПРс (двухцепочечной молекулы Ф-νΙΙΙ, которая содержит отдельные тяжелую и легкую цепи Ф-νΙΙΙ, удерживающиеся посредством нековалентных взаимодействий) уменьшается со временем в плазме крови как мышей с гемофилией А, так и ДГН мышей (фиг. 18А). Из-за отсутствия опосредованной ФВ защитыуменыпение активности Ф-ШПРс более четко выражено в плазме крови ДГН мышей. Это уменьшение активности Ф-νΙΙΙ происходит, главным образом, из-за диссоциации или деградации тяжелой цепи (ТЦ) Ф-νΙΙΙ. После 24-часовой инкубации в плазме крови ДГН мышей наблюдали около 75% уменьшение тяжелой цепи Ф-ШПРс (фиг. 18Б). Для легкой цепи (ЛЦ) (данные не приведены) или непроцессированного/одноцепочечного Ф-ШПРс (т.е. молекулы Ф-νΙΙΙ, в которой легкая цепь и тяжелая цепь удерживаются вместе посредством ковалентной связи - верхняя полоса в гель-изображении) не наблюдали значительного уменьшения (фиг. 18Б).

Так как предполагается, что ФВ повышает стабильность Ф-νΙΙΙ ш νίνο, проводили исследования, чтобы выяснить, будет ли химерный белок гетеродимера ФШШ-ФВ (Ф-ШП155:ФВЗ1, который содержит О'ИЗ ФВ, ковалентно присоединенный к Ф-νΙΙΙ через Рс) более стабильным в плазме крови мышей с гемофилией А и ДГН мышей. Согласно приведенным на фиг. 19 данным по плазменной стабильности, наличие ЭИЗ повышает стабильность Ф-ШПс в плазме крови как мышей с гемофилией А, так и ДГН мышей. Одноцепочечный Ф-ШПРс без ЭИЗ использовали в этих экспериментах в качестве контроля (оцФ-νΙΙΙ). Согласно Фиг. 19, одноцепочечный Ф-νΙΙΙ оказался более стабильным, чем двухцепочечный Ф-ШПРс; при этом наличие О'ЭЗ значительно повышает плазменную стабильность одноцепочечной молекулы Ф-ШПРс. На основе этого можно предположить, что ЭИЗ стабилизирует Ф-νΙΙΙ не только путем удержания вместе тяжелой и легкой цепей, но также при помощи других неизвестных механизмов.

Пример 16. Применение фурина/РАСЕ для процессинга ФВ.

ФВ является уникальным белком в том смысле, что он содержит очень большой пропептид (т.е. домен Ό1Ό2 ФВ, ~85 кДа). Пропептид ФВ исполняет роль внутреннего шаперона для правильного фолдинга молекулы ФВ. Два фермента - РС5 и фурин (РАСЕ) исследовали на предмет процессинга ФВ. Конструкцией ФВ0З1 (О1О2О'ОЗРс) временно трансфицировали клетки НЕК29З у применение разных концентраций РС5 или РАСЕ. Через четыре дня культуральную тканевую среду собирали и подвергали понижению протеина А. Даже при более низкой концентрации (2,5%) фурин (РАСЕ) был более эффективным, чем 10% РС5, в удалении пропептида (Ό1Ό2) из ЭИЗРс (фиг. 20). Удаление Ό1Ό2 является важным, так как известно, что Ό1Ό2 приводит к предотвращению взаимодействия О'ИЗ с Ф-νΙΙΙ.

Пример 17. Фрагмент ФВ в гетеродимере Ф-ШП-ФВ предотвращает взаимодействие Ф-νΙΙΙ с полноразмерным ФВ.

Для исследования связывания гетеродимерной конструкции Ф-νΙΙΙ 155/ФВЗ1 с полноразмерным ФВ использовали октетную установку РойеВю (фиг. 21 А). Для проведения анализа связывания полноразмерный ФВ иммобилизовали при помощи АФС-сенсора, после чего блокировали 1% БСА. После

- 95 028309 блокирования исследовали разные конструкции Ф-νΙΙΙ на предмет связывания с ФВ. Как и предполагалось, Ф-νΙΙΙ дикого типа и Ф-^ПРс прочно связываются с сенсорами ФВ. ФУШ-мутант У1680Р, для которого, как известно, характерна низкая аффинность или отсутствие аффинности к ФВ, демонстрировал в значительной степени сниженное связывание ФВ. Гетеродимер Ф-\'П1155/ФВ31 вообще не связывался с полноразмерным ФВ, что подтверждает экранирование Ф-νΙΙΙ [)Т)3 в гетеродимере Ф-^П-ФВ.

Тот же самый эксперимент проводили наоборот, чтобы определить, может ли часть 1)Т)3 гетеродимера Ф-^П-ФВ взаимодействовать с другими молекулами Ф-νΙΙΙ, которые не являются ковалентно присоединенными к Р)'Р)3. Как показано на фиг. 21Б, конструкция ФВ31 (П'П3Рс), иммобилизованная на сенсоре из протеина О, сама может прочно связываться с Ф-νΙΙΙ, при этом О'О3 в гетеродимере ФVШ155:ФВ31 не проявляет связывания с Ф-νΙΙΙ. Протеин О вместе с Ф-νΙΙΙ использовали в качестве контроля. Эти эксперименты по связыванию подтвердили, что О'О3 в гетеродимере может взаимодействовать только с молекулой Ф-νΙΙΙ, которая ковалентно присоединена к нему, и предотвращать взаимодействие Ф-νΙΙΙ с полноразмерными молекулами ФВ дикого типа.

Для определения точного значения аффинности связывания 1)'1)3 ФВ с молекулой Ф-νΙΙΙ для ФВ031 проводили эксперимент по поверхностному плазмонному резонансу (фиг. 22). Конструкцию ФВ031 (П'О3Рс) иммобилидовали при помощи анти-человеческого ^О, а Ф-νΙΙΙ с удаленным Вдоменом проводили через чип, содержащий Р)'Р)3Р'с. Для Ф-νΙΙΙ наблюдали ΚΌ, составляющую около 10 нМ. Такая аффинность приблизительно в 25 раз ниже по сравнению молекулой ФВ дикого типа и соответствует той величине, о которой ранее сообщалось в литературе.

Пример 18. Влияние разной длины линкеров между О'О3 и Рс на активность и ФК гетеродимера.

Чтобы проверить, оказывает ли влияние на ФК и активность гетеродимера Ф-^П-ФВ изменение длины тромбин-отщепляемого линкера между Ώ'Ώ3 и Рс, разные конструкции ФВ экспрессировали совместно с Ф-νΙΙΙ 155. Исследовали конструкции линкеров трех разных длин, перечисленных в табл. 14А (ФВ031, ФВ035 и ФВ036). Каждую плазмиду смешивали с плазмидой Ф-^П155 (Пример 5) и трансфицировали клетки ΗВΚ293. На четвертый день после трансфекции культуральную клеточную среду собирали и концентрировали до 10 МЕ/мл хромогенной активности Ф-νΙΙΙ.

Затем концентрированную клеточную среду вводили 8-12 недельным Ф-^П/ФВ ДГН мышам в дозировке 100 МЕ/10 мл/кг. Образцы плазмы крови брали через 5 мин, 8, 16, 24, 32 и 48 ч после дозирования. ФЛИП-активность образцов плазмы анализировали при помощи хромогенного анализа Ф-νΙΙΙ, а время полужизни рассчитывали при помощи программы У^ηNοη1^η-РЬοеη^x.

Как показано на фиг. 23, когда длину линкера между 1)Т)3 и Рс-фрагментом увеличили от 48 ак до 73 ак или 98 ак, время полужизни соответствующего гетеродимера ФУШРс/ФВ увеличилось и достигло 12,2 ч и 13,3 ч соответственно. Это отвечает от 1,5-1,6-кратному увеличению по сравнению с вариантом длиной в 48 ак. На сегодняшний день 98 ак линкер является наиболее оптимальным линкером при использовании ФЛ'П Ι-защитной активности фрагмента ΟΌ3, и именно его включают в состав гетеродимера ФУШРс/ФВ для дополнительного увеличения его времени полужизни.

Для сравнения влияния линкера на активность Ф-νΙΙΙ проводили хромогенный анализ Ф-νΙΙΙ и АЧТВ-анализ культуральной тканевой среды из клеток, экспрессирующих разные гетеродимеры Ф-νΙΙΙФВ. Хотя для гетеродимерных конструкций АЧТВ-активность оказалась в 2 раза меньшей по сравнению с хромогенной активностью, не наблюдали значительных различий между разными линкерами, за исключением случая, когда линкер содержит сайт РАК1 рядом с сайтом тромбина (табл. 14Б).

Таблица 14А

Последовательность разных линкеров между Ώ'Ώ3 ФВ и Рс

Конструкция ДНК	Линкер между ϋΌ3 и Рс
УУГ031	48аа = 18ОООО8ОООО8ОООО8ОООО8ОООО8ОООО8ЕУ Р КО δ О О О О δ О О О О δ (δΕ() ГО ΝΟ: 95)
УУГ035	73аа= ΙδΟΟΟΟδΟΟΟΟδΟΟΟΟδΟΟΟΟδΟΟΟΟδΟΟΟΟδΟΟΟ ΟδΟΟΟΟδΟΟΟΟδΟΟΟΟδΟΟΟΟδΕνΡΚΟδΟΟΟΟδΟΟΟΟ δ (δΕΟ ГО ΝΟ: 96)
УУГ036	98аа=1 δΟΟΟΟδΟΟΟΟδΟΟΟΟδΟΟΟΟδΟΟΟΟδΟΟΟΟδΟΟΟ ΟδΟΟΟΟδΟΟΟΟδΟΟΟΟδΟΟΟΟδΟΟΟΟδΟΟΟΟδΟΟΟΟδ ΟΟΟΟδΟΟΟΟδΕΥΡΚΟδΟΟΟΟδΟΟΟΟδ (δΕΟ ГО ΝΟ: 97)

- 96 028309

Таблица 14Б

Активность гетеродимеров, содержащих линкеры разной длины

ш образца	Описание образца	Длина линкера между ϋΌ3 и Рс (ак)	Хромогенный МЕ/мЛ	АЧТВ МЕ/мЛ	Хромогенный/ АЧТВ
1	РУШ Рс 155+У\УТ15	20	1,81	0,85	2,14
2	РУШ Рс 1δδ+ν\ΥΈ31	48	2,32	1,05	2,21
3	РУШ Рс 155+У\УРЗЗ	35	2,21	1,02	2,16
4	РУШ Рс 155+У\УР35	73	2,65	1,24	2,14
5	РУШ Рс 155+У\УР36	98	2,75	1,П	2,47
6	РУШ Рс 155+У\УР39	26 (громбин+РАК 1)	1,85	1,21	1,53

Пример 19. Связывание Ф-УШ с фрагментом ФВ при помощи фермента сортазы.

В другом аспекте реализации изобретения фрагмент ФВ (например, домен Ώ1Ώ2ΏΌ3 или ΏΌ3) присоединяют к Ф-УШ при помощи опосредованного сортазой метода ш уйго белкового лигирования. В одном примере распознающий сортазу А (^РXТО) мотив З!арЬу1ососси8 аигеи8 вносили в С-конец фрагмента ФВ, а остаток О1у(п) - в Ν-конец Ф-УШ (где количество остатком глицина может меняться). Применяемая молекула Ф-УШ может являться как одноцепочечной, так и двухцепочечной. Катализированная сортазой реакция транспептидации ковалентно присоединяет фрагмент ФВ к Ф-УШ. Обратную ориентацию распознающего мотива также можно применять для того, чтобы связать эти два белка, при этом Ф-УШ будет находиться на Ν-конце с мотивом РРКТО, а фрагмент ФВ - на С-конце с О1у(п) (смотрите фиг. 24 - пример сортазного лигирования для ссылки). Мотив 1ЗЕКТИ и остатки глицина можно заменить другими распознающими сортазу последовательностями.

Также создали фрагмент ФВ, содержащий распознающую сортазу А последовательность слитого Рс-белка. Для конструкций слияния Рс, Ώ1Ώ2ΏΌ3-фрагмент ФВ сшивали с Рс-областью !дО посредством ОЗ-линкера, который содержит распознающую сортазу последовательность и сайт расщепления тромбином (табл. 15 и 16). После того как белок экспрессируют и очищают на протеин А-колонке, Рсобласть можно отделить при помощи расщепления тромбином. Полученный фрагмент ФВ с распознающим сортазу участком можно затем использовать для лигирования с молекулой Ф-УШ (фиг. 24 - пример сортазного лигирования для ссылки - ряд Д).

р3ΥN-ФВ-051 содержит 54-аминокислотный линкер с сортазным и тромбиновым сайтами между фрагментом ФВ и Рс-областью. Проводили синтез фрагмента ДНК, кодирующего 54-аминокислотный линкер (КОООСЗОСС ОЗООООЗООО ОЗООООЗООО ОЗЬРЕТОАЬК РКУУООООЗО ОООЗ) (ЗЕО го NО: 98) и часть Рс-области ((Зепеуа/ - Последовательность №-10-210746313, показана ниже). Фрагмент конструкции (Зепеуа/ субклонировали в расщепляемый ЕсоКУ/КлКП р3ΥN-ФВ-031. (Зепеуа/ - Последовательность №-10-210746313 (ЗЕР ГО NО: 99)

АССАССССАТАТСТСССССТССАССТТССССТССССССССАТСССССССТССАССТТСССССС

СТССАССТТССССТССССССССАТССССТССССССССАТССТТАССТСАААСТССАССССТСССССССС

СССТССТССССССТССАССТТССССТССССССССАТСССАСААААСТСАСАСАТССССАСССТССССАС

СТССАСААСТССТССССООАССОТСАСТСТТ

Последовательность одноцепочечного Ф-УШ, содержащего Ν-концевой пентаглицин, приведена в табл. 17 и 18.

Таблица 15

Нуклеотидная последовательность р3ΥN-ФВ051 (ОГО2П'П3Рс ФВ с распознающим сортазу А мотивом и тромбин-отщепляемым линкером между фрагментом ФВ и Рс) (ЗЕР ГО NО: 100)

АТСАТТССТСССАеАТТТСССССССТССТССТТССТСТСССССТСАТТТТ

СССАСССАСССТТТбТССАСААССААСТСССеССАССТСАТССАСбСССС

101 САТССАСССТТТТСеСААСТСАСТТССТСААСАССТТТСАТСССАССАТС

251 ТСТСССТСТАТСТТеСССААТТТТТТСАСАТССАТТТСТТТСТСААТССТ

301 АСССТСАСАСАССееСАССАААСАСТСТССАТССССТАТСССТССАААСС

401 АТСССТТТСТССССАееАТССАТСССАСССССААСТТТСААСТССТССТС

451 ТСАСАСАСАТАСТТСААСААСАССТССеееСТСТСТСССААСТТТААСАТ

- 97 028309

501 СТТТССТСААСАТСАСТТТАТСАСССААСААСССАССТТСАССТСССАСС 551 СТТАТСАСТТТСССААСТСАТССССТСТСАССАСТССАСААСАСТССТСТ 601 СААСССССАТСТССТСССАЕСАССТСАТССААСАТСТССТСТССССАААТ 651 ССАСААСССССТСТСССАССАСТСССАССТТСТСААСАССАССТСССТСТ 701 ТТССССССТСССАСССТСТЕСТССАСССССАСССТТТТСТСССССТСТСТ 751 САСААСАСТТТСТСТСАСТЕТССТСССССССТССАСТСССССТССССТСС 801 ССТССТССАСТАСССССССАССТСТССССАССАСССААТССТССТСТАСС 851 ССТССАСССАССАСАССССЕТССАССССАСТСТССССТССТССТАТССАС 901 ТАТАСССАСТСТСТСТССССТТСССССАССАССТСССАСАСССТССАСАТ 951 СААТСАААТСТСТСАССАСССАТСССТССАТСССТССАССТССССТСАСС

1001 САСАССТССТССАТСААССССТСТСССТССАСАССАСССАСТСТСССТСС 1051 СТССАТТССССАААССССТАСССТССССССАССТСССТСТСТССАСАСТС 1101 СААСАССТССАТТТССССАААСАСССАСТССАТСТССАССААТСААСААТ 1151 СТССАССССАСТСССТТСТСАСТССТСААТСССАСТТСААСАССТТТСАС 1201 ААСАСАТАСТТСАССТТСАЕТСССАТСТСССАСТАССТССТССССССССА 1251 ТТСССАССАССАСТССТТСТССАТТСТСАТТСАСАСТСТССАСТСТССТС 1301 АТСАСССССАСССТСТСТССАСССССТСССТСАСССТСССССТСССТССС 1351 СТССАСААСАСССТТСТСАААСТСААССАТСССССАССАСТТСССАТССА 1401 ТССССАССАСАТССАССТСССССТССТСАААССТСАССТССССАТССАСС 1451 АТАСАСТСАСССССТСССТЕССССТСАССТАСССССАССАССТССАСАТС 1501 САСТСССАТСССССССССАЕССТССТССТСААССТСТССССССТСТАТСС 1551 ССССААСАССТССССССТСТСТСССААТТАСААТСССААССАСССССАСС 1601 АСТТССТТАСССССТСТССЕСТСССССАССССССССТССАССАСТТСССС 1651 ААССССТССААССТССАССЕССАСТСССАССАССТССАСААССАССАСАС 1701 ССАТСССТССССССТСААСССССССАТСАССАССТТСТСССАССАССССТ 1751 ССССССТССТСАССТСССССАСАТТССАССССТСССАТССТССССТСАСС 1801 ССССТССССТАССТССССААСТСССССТАССАССТСТССТССТССТСССА 1851 ССССССССАСТСССТСТССЕССССССТССССАССТАТСССССССССТССС 1901 СССССАСАССССТСССССТССССТССССССАСССАССССССТСТСАССТС 1951 ААСТСССССАААССССАССТСТАССТССАСТСССССАСССССТССААССТ 2001 САССТСССССТСТСТСТСТТАСССССАТСАССААТССААТСАССССТССС 2051 ТССАССССТССТТСТСССССССАССССТСТАСАТССАТСАСАССССССАС 2101 ТСССТССССААСССССАСТЕССССТСТТАСТАТСАСССТСАСАТСТТССА 2151 СССАСААСАСАТСТТСТСАЕАССАТСАСАССАТСТССТАСТСТСАССАТС 2201 ССТТСАТССАСТСТАССАТЕАСТССАСТССССССААССТТССТСССТСАС 2251 ССТСТССТСАССАСТССССТСТСТСАТСССАССААААССАСССТАТССТС 2301 ТСССССССССАТССТСААССТССТСТСТСССССТСАСААССТССССССТС 2351 ААССССТССАСТСТАССААААССТСССАСААСТАТСАССТССАСТССАТС 2401 АЕСАТЕЕЕСТЕТЕТСТСТЕЕСТЕССТСТЕССССССЕЕЕСАТЕЕТССЕЕСА 2451 ТСАСААСАСАТСТСТСССССТССАААССТСТСССТССТТССАТСАССССА 2501 АССАСТАТСССССТССАСАААСАСТСААСАТТСССТССААСАСТТСТСТС 2551 ТСТССССАССССААСТССААСТССАСАСАССАТСТСТСТСАТСССАССТС 2601 СТССАССАТССССАТСССССАСТАССТСАССТТССАСССССТСАААТАСС 2651 ТСТТССССССССАСТСССАЕТАССТТСТССТССАССАТТАСТСССССАСТ 2701 ААСССТСССАССТТТСССАТССТАСТССССААТААСССАТССАСССАССС 2751 СТСАСТСАААТССААСАААССССТСАССАТССТССТССАСССАССАСАСА 2801 ТТСАССТСТТТСАСССССАЕСТСААТСТСААСАСССССАТСААССАТСАС 2851 АСТСАСТТТСАССТССТССАСТСТССССССТАСАТСАТТСТССТССТССС 2901 САААССССТСТСССТССТСТСССАСССССАССТСАССАТСТСССТССТСС 2951 ТСААССАСАСАТАССАССАЕАААСТСТСТССССТСТСТСССААТТТТСАТ 3001 СССАТССАСААСААТСАССТСАССАССАССААССТССААСТССАССААСА 3051 СССТЕТЕЕАСТТТЕЕЕААСТССТЕЕАААЕТЕАЕСТСЕСАЕТЕТЕСТЕАСА 3101 ССАСААААСТСССТСТССАСТСАТССССТСССАССТСССАТААСААСАТС 3151 АТСААССАСАССАТССТССАТТССТССТСТАСААТССТТАССАСТСАССТ 3201 СТТССАССАСТССААСААССТССТССАСССССАСССАТАТСТССАТСТСТ 3251 ССАТТТАССАСАССТССТССТСТСАСТССАТТССССАСТСССССССАТТС 3301 ТСССАСАССАТТССТСССТАТССССАССТСТСТССССАССАТСССААССТ 3351 ССТСАССТССАССАСССССАСАТТСТССССССАСАССТСССАССАСАССА 3401 АТСТСССССАСААССССТАТСАСССТСАСТСССССТАТААСАССТСТССА 3451 ССТСССТСТСААСТСАССТЕТСАССАСССТСАСССАСТССССТССССТСТ 3501 ССАСТСТСТССАССССТСССАТССССАСТССССТССАСССААААТССТСС 3551 АТСАССТТТТССАСАССТСССТТСАСССТСААСАСТСТССАСТСТСТСАС 3601 СТСССТССССССССТТТТСССТСАССАААСАААСТСАССТТСААТСССАС 3651 ТСАСССТСАССАСТСССАСАТТТСССАСТСТСАТСТТСТСААССТСАССТ

- 98 028309

3701 СТСААСССТСССАССАССССАТАТСТСССССТССАССТТССССТСССССС

3751 ССАТСССССССТССАССТТСССССССТССАССТТССССТССССССССАТС

3801 С66Т66С66С66АТССТТАССТ6АААСТ66А6СССТ6С66СССС666ТС6

3851 ТССССССТССАССТТССССТССССССССАТСССАСААААСТСАСАСАТСС

3901 ССАСССТССССАССТССАСААСТССТССССССАСССТСАСТСТТССТСТТ

3951 ССССССААААСССААССАСАСССТСАТСАТСТСССССАССССТСАССТСА

4001 САТСССТССТССТССАССТСАСССАССААСАСССТСАССТСААСТТСААС

4051 ТССТАССТССАСССССТССАССТССАТААТСССААСАСАААССССССССА

4101 ССАССАСТАСААСАССАССТАСССТСТССТСАСССТССТСАСССТССТСС

4151 АССАССАСТСССТСААТСССААССАСТАСААСТССААССТСТССААСААА

4201 6СССТСССАССССССАТС6А6ААААССАТСТССААА6ССААА66ССА6СС

4251 СССАСААССАСАССТСТАСАСССТССССССАТССССССАТСАССТСАССА

4301 АСААССАССТСАСССТСАССТСССТССТСАААСССТТСТАТСССАСССАС

4351 АТСССССТССАСТСССАСАССААТССССАСССССАСААСААСТАСААСАС

4401 САССССТССССТСТТССАСТСССАССССТССТТСТТССТСТАСАССААСС

4451 ТСАСССТССАСААСАССАССТСССАССАССССААССТСТТСТСАТССТСС

4501 СТСАТССАТСАСССТСТССАСААССАСТАСАСССАСААСАСССТСТСССТ

4551 СТСТСССССТАААТСА

Таблица 16

Белковая последовательность ФВ051 ((ПГО2П^гО3Рс ФВ с распознающим сортазу А мотивом и тромбин-отщепляемым линкером между фрагментом ФВ и Рс; сайт сортазы А выделен жирным) (8ЕЦ ГО N0: 101)

М1РАКЕАСУЬЬАЬАЫЬРСТЬСАЕСТЕСЕЗЗТАЕСЗЬЕСЗОЕУЫТЕОСЗМ узгАбУсзуььАеес<2ккзгз11еог<2ыеккузьзууьеЕгго1ньгшге ιοί тут<2бо<2КУЗмруАзкеьуьЕТЕАеуукьзеЕАУеЕУАК1оезеыЕ<2Уьь

151 ЗОКУЕЫКТСеЬССЫЕ141ЕАЕООЕМТ<2ЕеТЬТЗОРУОЕАМ31лГАЬЗЗеЕ<21/ГС

01 ЕКАЗРРЗЗЗСЫ133еЕМ<2КСЫлГЕ<2С<2ЬЬКЗТЗУЕАКСНР1Л/ОРЕРЕУАЬС

251 ЕКТЬСЕСАССЬЕСАСРАЬЬЕУАЕТСАОЕСМУЬУСТлГТОНЗАСЗРУСРАСМЕ

301 УКССУЗРСАКТС<23ЬН1ЫЕМС<2ЕКСУОеСЗСРЕе<2ЬЬОЕСЬСУЕЗТЕСРС

351 УНЗеККУРРеТЗЬЗКОС14ТС1СИ43<21лГ1СЗЫЕЕСРеЕС1Л/Те<23НЕКЗЕО

01 ЫКУЕТЕЗе1С<2УЬЬАКОС<2ОНЗЕ31У1ЕТУ<2САООКОАУСТКЗУТУКЬРС

451 ЬНЫЗЬУКЬКНСАеУАМОе<2О1<2ЬРЬЬКеОЬК1<2НТУТАЗУКЬЗУСЕОЬ<2М

501 отоекекь1л/кьзрууАектсеьсеыуыеы<2еооЕьтрзеьАЕРКУЕОЕе

551 ЫА№КЬНеОС<2ОЬ<2К<2НЗОРСАЬЫРКМТКЕЗЕЕАСАУЬТЗРТЕЕАСНКАУЗ

601 РЬРУЬЕЫСЕУОУСЗСЗОСЕЕСЬССАЬАЗУАААСАСЕСУЕУАТлГЕЕРСЕСЕЬ

651 14СРК6<2УУЬ<2СеТРС14ЬТСКЗЬЗУРОЕЕСЫЕАСЬЕеСЕСРРеЬУМОЕКеО

01 СУРКА<2СРСУУОСЕ1 Ε<2ΡΕϋΙ ЕЗОННТМСУСЕОСЕМНСТМЗСУРСЗЬЬРР

751 АУЬЗЗРЬЗНКЗККЗЬЗСКРРМУК1Л/СРАО14ЬКАЕеЬЕСТКТС<2ЫУОЬЕСМ

01 ЗМеСУЗеСЬСРРеМУКНЕЫКСУАЬЕКСРСЕН<2еКЕУАРСЕТУК1еС14ТСУ

851 СКОККШСТОНУСОАТСЗТ1еМАНУЬТЕОеЬКУЬЕРСЕС<2УУ1Л/<2ОУСеЗ

901 ыретЕК1ЬУеыкесзнрзукскккут11л/ЕееЕ1ЕЬЕоеЕ1/ттжрмкоЕ

951 ТНЕЕУУЕЗеКУ11ЬЬЬеКАЬЗУУТОКНЬ313УУЬК<2ТУ<2ЕКУССЬСеЫЕО

01 екдащьтз 3ΝΣ<2νΕΕ0Ρν0Ε0Ν31/ίΚν3 3<2САРТККУРЬ03 3 ΡΑΤΟΗΝΝΙ

1051 МК<2ТМУОЗЗСК1ЬТЗОУЕ<2ОС14К1Л/ОРЕРУЬОУС1УОТСЗСЕ31еОСААЕ

1101 СОТ1ААУАНУСА<2НеКУУТ1лЩТАТЬСР<23СЕЕИ4ЬКЕЫеУЕАЕ1лЩУЫЗСА

1151 РАС<2УТС<2НРЕРЬАСРУ<2СУЕССНАНСРРеК1ЬОЕЬЬ<2ТСУОРЕОСРУСЕ

01 УАеккЕАзеккутьырзоРЕНс<21снсоушгьтсЕАС<2ЕР1зеееезеее

1251 СЗССССЗССССЗССССЗССССЗЬРЕТбАЬЕРЕУУССССЗССССЗРКТНТС

1301 РРСРАРЕЬЬССРЗУЕЬЕРРКРКОТЬМ13ΕΤΡΕνΤ0νννΌν3ΗΕ0ΡΕνΚΕΝ

1351 №УУОСУЕУНЫАКТКРКЕЕ<2УЫЗТУКУУЗУЬТУЬН<2О1лГЬЫеКЕУКСКУ314К

01 АЬРАР1ЕКТ13КАКе<2РКЕР<2УУТЬРРЗКОЕЬТКЫ<2УЗЬТС1Л/КСЕУРЗО

51 1АУЕЖЗЫе<2РЕЫЫУКТТРРУЬОЗОСЗЕЕЬУЗКЬТУОКЗК1лГ<2<2е14УЕЗСЗ

1501 УМНЕАЬНЫНУТ<2КЗЬЗЬЗРСК*

Таблица 17

Нуклеотидная последовательность Ф-УШ 265 (одноцепочечной молекулы Ф-УШ с пентаглицином на №конце) (8ЕЦ ГО N0: 102)

АТССАААТАСАССТСТССАССТССТТСТТТСТСТСССТТТТСССАТТСТС

СТТТАСТС6А66А6САССА66А6ССАССА6ААСАТАСТАССТС66ТССА6

101 ТССААСТСТСАТСССАСТАТАТССАААСТСАТСТСССТСАССТСССТСТС

151 САСССААСАТТТССТССТАСАСТСССААААТСТТТТССАТТСААСАССТС

201 АСТССТСТАСАААААСАСТСТСТТТСТАСААТТСАСССАТСАССТТТТСА

- 99 028309

251 АСАТСССТААСССААССССАСССТССАТСССТСТССТАССТССТАССАТС 301 САСССТСАССТТТАТСАТАСАСТССТСАТТАСАСТТААСААСАТСССТТС 351 ССАТССТСТСАСТСТТСАТССТСТТССТСТАТССТАСТССАААССТТСТС 401 АСССАССТСААТАТСАТСАТСАСАССАСТСАААСССАСАААСААСАТСАТ 451 АААСТСТТСССТССТССААСССАТАСАТАТСТСТСССАССТССТСАААСА 501 СААТССТССААТССССТСТСАСССАСТСТСССТТАССТАСТСАТАТСТТТ 551 СТСАТСТССАССТССТААААСАСТТСААТТСАССССТСАТТССАССССТА 601 СТАСТАТСТАСАСААСССАСТСТССССААССААААСАСАСАСАССТТССА 651 САААТТТАТАСТАСТТТТТССТСТАТТТСАТСААСССААААСТТСССАСТ 701 САСАААСАААСААСТССТТСАТССАССАТАСССАТССТССАТСТССТССС 751 СССТССССТААААТССАСАСАСТСААТССТТАТСТАААСАССТСТСТССС 801 АССТСТСАТТССАТСССАСАССАААТСАСТСТАТТСССАТСТСАТТССАА 851 ТССССАССАСТССТСААСТССАСТСААТАТТССТССААССТСАСАСАТТТ 901 СТТСТСАССААССАТССССАССССТССТТССАААТСТССССААТААСТТТ 951 ССТТАСТССТСАААСАСТСТТСАТССАССТТССАСАСТТТСТАСТСТТТТ

1001 СТСАТАТСТСТТСССАССААСАТСАТСССАТССААССТТАТСТСАААСТА 1051 САСАС С Т СТ С САСАС СААС С С СААС ТАС СААТ САААААТААТ СААСААСС 1101 ССААСАСТАТСАТСАТСАТСТТАСТСАТТСТСАААТССАТСТССТСАССТ 1151 ТТСАТСАТСАСААСТСТССТТССТТТАТССАААТТСССТСАСТТСССААС 1201 ААССАТССТААААСТТСССТАСАТТАСАТТССТССТСААСАССАССАСТС 1251 ССАСТАТССТСССТТАСТССТССССССССАТСАСАСААСТТАТААААСТС 1301 ААТАТТТСААСААТСССССТСАССССАТТССТАССААСТАСААААААСТС 1351 ССАТТТАТСССАТАСАСАСАТСАААССТТТААСАСТССТСААССТАТТСА 1401 ССАТСААТСАССААТСТТСССАССТТТАСТТТАТССССААСТТССАСАСА 1451 САСТСТТСАТТАТАТТТААСААТСААССААССАСАССАТАТААСАТСТАС 1501 ССТСАСССААТСАСТСАТСТСССТССТТТСТАТТСААССАСАТТАССААА 1551 АССТСТААААСАТТТСААССАТТТТССААТТСТСССАССАСАААТАТТСА 1601 ААТАТАААТ ССАСАСТ САСТ СТАСААСАТ СССССААСТАААТ САСАТ ССТ 1651 СССТСССТСАСССССТАТТАСТСТАСТТТССТТААТАТССАСАСАСАТСТ 1701 АССТТСАССАСТСАТТСССССТСТССТСАТСТССТАСАААСААТСТСТАС 1751 АТСАААСАССАААССАСАТААТСТСАСАСААСАССААТСТСАТССТСТТТ 1801 ТСТСТАТТТСАТСАСААСССААССТССТАССТСАСАСАСААТАТАСААСС 1851 СТТТСТССССААТССАССТССАСТССАССТТСАССАТССАСАСТТССААС 1901 ССТССААСАТСАТССАСАССАТСААТСССТАТСТТТТТСАТАСТТТССАС 1951 ТТСТСАСТТТСТТТССАТСАССТСССАТАСТССТАСАТТСТААССАТТСС 2001 АССАСАСАСТСАСТТССТТТСТСТСТТСТТСТСТССАТАТАССТТСАААС 2051 АСААААТССТСТАТСААСАСАСАСТСАСССТАТТСССАТТСТСАССАСАА 2101 АСТСТСТТСАТСТССАТССААААСССАССТСТАТССАТТСТССССТСССА 2151 СААСТСАСАСТТТСССААСАСАСССАТСАСССССТТАСТСААССТТТСТА 2201 СТТСТСАСААСААСАСТССТСАТТАТТАССАССАСАСТТАТСААСАТАТТ 2251 ТСАССАТАСТТССТСАСТАААААСААТСССАТТСААССААСААССТТСТС 2301 ТСААААСССАССАСТСТТСААСССССАТСАСССССАААТААСТССТАСТА 2351 СТСТТ САСТ САСАТ СААСАССАААТ Т САСТАТ САТ САТАС САТАТ САСТ Т 2401 САААТСААСААССААСАТТТТСАСАТТТАТСАТСАССАТСААААТСАСАС 2451 СССССССАССТТТСААААСААААСАССАСАСТАТТТТАТТССТССАСТСС 2501 АСАСССТСТСССАТТАТСССАТСАСТАССТССССАСАТСТТСТААСАААС 2551 АССССТСАСАСТСССАСТСТСССТСАСТТСААСАААСТТСТТТТССАССА 2601 АТТТАСТСАТСССТССТТТАСТСАССССТТАТАСССТССАСААСТАААТС 2651 ААСАТТТСССССТССТССССССАТАТАТААСАССАСААСТТСААСАТААТ 2701 АТСАТССТААСТТТСАСАААТСАССССТСТССТСССТАТТССТТСТАТТС 2751 ТАСССТТАТТТСТТАТСАССААСАТСАСАСССААССАССАСААССТАСАА 2801 ААААСТТТСТСААСССТААТСАААССААААСТТАСТТТТССАААСТССАА 2851 САТСАТАТСССАСССАСТАААСАТСАСТТТСАСТССАААСССТССССТТА 2901 ТТТСТСТСАТСТТСАССТССАААААСАТСТССАСТСАССССТСАТТССАС 2951 СССТТСТССТСТСССАСАСТААСАСАСТСААСССТССТСАТСССАСАСАА 3001 СТСАСАСТАСАССААТТТССТСТСТТТТТСАССАТСТТТСАТСАСАССАА 3051 ААССТССТАСТТСАСТСААААТАТССАААСАААСТССАССССТСССТССА 3101 АТАТССАСАТССААСАТСССАСТТТТАААСАСААТТАТСССТТССАТССА 3151 АТСААТСССТАСАТААТССАТАСАСТАССТСССТТАСТААТСССТСАССА 32 01 Т САААССАТТ ССАТ ССТАТ СТ ССТ САССАТ ССССАССААТ СААААСАТ СС 3251 АТТСТАТТСАТТТСАСТССАСАТСТСТТСАСТСТАССАААААААСАССАС 3301 ТАТААААТСССАСТСТАСААТСТСТАТССАССТСТТТТТСАСАСАСТССА 3351 ААТСТТАССАТССАААССТССААТТТССССССТССААТСССТТАТТСССС 3401 АССАТСТАСАТССТСССАТСАССАСАСТТТТТСТССТСТАСАССААТААС

- 100 028309

3451 ТСТСАСАСТССССТСССААТСССТТСТССАСАСАТТАСАСАТТТТСАСАТ

3501 ТАСАССТТСАССАСААТАТССАСАСТСССССССАААССТССССАСАСТТС

3551 АТТАТТССССАТСААТСААТСССТССАССАССААССАССССТТТТСТТСС

3601 АТСААССТССАТСТСТТСССАССААТСАТТАТТСАССССАТСААСАСССА

3651 СССТСССССТСАСААСТТСТССАСССТСТАСАТСТСТСАСТТТАТСАТСА

3701 ТСТАТАСТСТТСАТСССААСААСТСССАСАСТТАТССАССАААТТССАСТ

3751 ССААССТТААТССТСТТСТТТСССААТСТССАТТСАТСТСССАТААААСА

3801 СААТАТТТТТААСССТССААТТАТТССТССАТАСАТСССТТТССАСССАА

3851 СТСАТТАТАССАТТСССАССАСТСТТСССАТССАСТТСАТССССТСТСАТ

3901 ТТАААТАСТТССАССАТСССАТТСССААТССАСАСТАААССААТАТСАСА

3951 ТССАСАСАТТАСТССТТСАТССТАСТТТАССААТАТСТТТСССАССТССТ

4001 СТССТТСААААССТССАСТТСАССТССААСССАССАСТААТСССТССАСА

051 ССТ САССТ СААТААТ ССААААСАСТ СССТ ССААСТ ССАСТТ С САСААСАС

4101 ААТСАААСТСАСАССАСТААСТАСТСАСССАСТААААТСТСТССТТАССА

4151 ССАТ СТАТ СТ СААССАСТТ ССТ САТ СТ ССАССАСТ СААСАТ ССС САТ САС

4201 ТССАСТСТСТТТТТТСАСААТСССАААСТАААССТТТТТСАСССАААТСА

4251 АСАСТССТТСАСАССТСТССТСААСТСТСТАСАСССАСССТТАСТСАСТС

4301 ССТАССТТССААТТСАСССССАСАСТТСССТССАССАСАТТССССТСАСС

4351 АТССАССТТСТССССТСССАСССАСАССАССТСТАСТСА

Таблица 18

Белковая последовательность Ф-УШ 265 (одноцепочечной молекулы Ф-УШ с пентаглицином на Ν-конце; пентаглицин выделен жирным) (8ЕР Ιϋ ΝΟ: 103)

М21ЕЬЗТСЕЕЬСЬШЕСЕ366666АТККУУЬСАУЕЬЗТОУМ230ЬСЕЬРУ

ОАКЕРРКУРКЗЕРЕИТЗУУУККТЬЕУЕЕТОНЬЕЫ1АКРКРР1лГМСЬЬСРТ1

101 2АЕУУОТУУ1ТЬКЫМАЗНРУЗЬНАУСУЗУ1лГКАЗЕСАЕУОО2Т32КЕКЕОО

151 КУЕРССЗНТУШОУЬКЕЫСРМАЗОРЬСЬТУЗУЬЗНУОЬУКОЬЫЗСЫСАЬ

01 ЬУСКЕСЗЬАКЕКТ<2ТЬНКЕ1ЬЬЕАУЕОЕеК51лГНЗЕТКЦ5ЬМ<2ОКОААЗАК

251 А№РКМНТУКСУУККЗЬРСЫССНККЗУУ№НУ1СМСТТРЕУН31ЕЬЕСНТЕ

301 ЬУИ\ГНК<2АЗЬЕ13Р1ТЕЬТА<2ТЬЬМОЬС<2ЕЬЬЕСН133Н<2НОСМЕАУУКУ

351 ОЗСРЕЕР<2ЬКМКЦЦЕЕАЕОУОООЬТОЗЕМОУУКЕОООЦЗРЗЕ1<21КЗУАК

01 КНРК™УНУ1ААЕЕЕОТОУАРЬУЬАРООКЗУКЗ<2УЬЦЦСР<2К1СККУККУ

451 КЕМАУТОЕТЕКТКЕА1<2НЕЗе1ЬеРЬЬУСЕУеОТЬЫ1ЕКЦ<2АЗКРУ141У

501 РНС1ТОУКРЬУЗККЬРКСУКНЬКОЕР1ЬРСЕ1ЕКУК№ТУТУЕОСРТКЗОР

551 КСЬТКУУЗЗЕУЦМЕКО1АЗеЬ1СРЬЬ1СУКЕЗУО<2КеЦ<21МЗОКИ4У1ЬЕ

601 ЗУЕОЕ14К31лГУЬТЕ141<2КЕЬРЦРАеУ<2ЬЕОРЕЕ<2А3141МН3114СУУЕОЗЬ<2

651 ЬЗУСЬНЕУАУИУ1Ь31еА<2ТОЕЬЗУЕЕЗеУТЕКНКМУУЕОТЬТЬЕРЕЗСЕ

01 ТУЕМЗМЕЦРСЫлГ1ЬССНЦЗОЕЕИЕСМТАЬЬКУЗЗСОКЦТСОУУЕОЗУЕО1

751 ЗАУЬЬЗКЫЫА1ЕРКЗЕЗ<2ЫРРУЬКАН<2АЕ1ТКТТЬ<23О<2ЕЕ1ОУООТ13У

01 ЕМККЕОЕО1УОЕОЕН<23РКЗЕ<2ККТКНУЕ1ААУЕКЫ/ГОУСМЗЗЗРНУЬИ4

851 КА<23еЗУР<2ЕККУУЕ<2ЕЕТОеЗЕТ<2РЬУКСЕЬЦЕНЬеЬЬеРУ1КАЕУЕОЦ

901 ΙΜνΤΕΚΝ<2Α3ΚΡΥ3ΕΥ33ΕΙ3ΥΕΕ0<2Κ<2ΟΑΕΡΚΚΝΕνΚΡΝΕΤΚΤΥΕ№Κν<2

951 ННМАРТКОЕЕОСКАИАУЕЗОУОЬЕКОУНЗСЫСРЬЬУСНТЫТЬЫРАНСЕ2

1001 УТУ<2ЕЕАЬЕЕТ1 ΕΟΕΤΚ5ΝΥΕΤΕΝΜΕΚΝΟΡΑΡΟΝΙ<2ΜΕΟΡΤΕΚΕΝΥΚΕΗΑ

1051 1ЫСУ1МОТЬРС1Л/МА<2О<2К1К1лЕ1ЬЬЗМеЗЦЕ1\Г1Н31НЕЗеНУЕТУКККЕЕ

1101 УКтЬУ14ЬУРСУЕЕТУЕМЬРЗКАе™КУЕСЬ1еЕНЬНАСМЗТЬЕ1ЛЛ1314К

1151 С2ТРЬСМАЗСН1КОЕ21ТАЗС2У221лГАРКЬАКЬНУЗС31ЫА№ЗТКЕРЕЗ№

01 1КУОЬЬАРМ11НС1КТ2САК2КЕ331А132Е11]УП13ЬОСКК1лГ2ТУКСЦЗТ

1251 СТЬМУЕЕСЫУОЗЗС1КНЫ1ЕЫРР11АКУ1КЬНРТНУ31КЗТЬЕМЕЬМССО

01 ЬЫЗСЗМРЬСМЕЗКА13ОА21ТАЗЗУЕТЦМЕА™зРЗКАКЬНЬ2СЕЗИА1лГЕ

1351 Р2УКЫРКЕ№Ь2УОЕ2КТМКУТСУТТ2СУКЗЬЬТЗМУУКЕЕЫ3332ОСН2

01 №ТЬЕЕ2МСКУКУЕ2СЫ203ЕТРУУКЗЕ0РРЬЬТКУЬК1НР231лГУН21АЬК

1451 МЕУЬССЕА2РЬУ*

Пример 20. Плазменная стабильность и ФК <РУШ198 в плазме крови мышей с гемофилией А и мышей с двойным Ф-УШ/ФВ генным нокаутом (ДГН).

Плазменную стабильность Ф-УШ198 (которая является одноцепочечной Ф-УШРс-226М6молекулой, частично содержащей В-домен; где 226 представляет 226 Ν-концевых аминокислот В-домена Ф-УШ, а Ν6 представляет шесть участков Ν-гликозилирования в В-домене) сравнивали с Ф-УШРс (ФУШ 155/Рс) в в плазме крови мышей с двойным Ф-УШ/ФВ генным нокаутом (ДГН). Схематическое изображение Ф-У111155 и Ф-УШ198 представлено на фиг. 25.

Для анализа стабильности 5 МЕ/мл белков Ф-УШ 198 или Ф-УШРс с мышиной или ДГН плазмой при 37°С. Аликвоты брали для разных временных точек, чтобы измерить активность при помощи хромогенного анализа Ф-УШ. Активность для каждой временной точки измеряли дважды, а среднюю активность наносили на график как функцию времени. Анализ стабильности показал, что наличие частичного В-домена повышает стабильность одноцепочечного Ф-УШРс (фиг. 26 А).

Время полужизни Ф-УШ 198 (одноцепочечная Β226Ν6) также сравнивали с Ф-УШ155 (одноцепочечный Ф-УШ с удаленным В-доменом) для ДГН мышей. Ф-УШ 198 имеет по менбшей мере приблизительно в 1,5 раз большее время полужизни по сравнению с Ф-УШ155 (фиг. 26Б). Эти эксперименты позволяют предположить, что возможно существование взаимосвязи между стабильностью Ф-УШ и его ίηνίνο временем полужизни.

- 101 028309

Нуклеотидная последовательность белка Ο-νΙΙΙ198 (Ф^ШРс с частичным 226\6)(8Е() ГО N0: 104)

АТССАААТАСАССТСТССАССТССТТСТТТСТСТСССТТТТСССАТТСТС 51 СТТТАСТСССАССАСААСАТАСТАССТСССТССАСТССААСТСТСАТССС

101 АСТАТАТССАААСТСАТСТСССТСАССТСССТСТССАСССААСАТТТССТ 151 ССТАСАСТСССААААТСТТТТССАТТСААСАССТСАСТССТСТАСААААА 201 САСТСТСТТТСТАСААТТСАСССАТСАССТТТТСААСАТСССТААСССАА 251 ССССАСССТССАТСССТСТССТАССТССТАССАТССАСССТСАССТТТАТ 301 САТАСАСТССТСАТТАСАСТТААСААСАТСССТТСССАТССТСТСАСТСТ 351 ТСАТССТСТТССТСТАТССТАСТССАААССТТСТСАСССАССТСААТАТС 401 АТСАТСАСАССАСТСАААСССАСАААСААСАТСАТАААСТСТТСССТССТ 451 ССААСССАТАСАТАТСТСТСССАССТССТСАААСАСААТССТССААТССС 501 СТСТСАСССАСТСТСССТТАССТАСТСАТАТСТТТСТСАТСТССАССТСС 551 ТААААСАСТТСААТТСАССССТСАТТССАССССТАСТАСТАТСТАСАСАА 601 СССАСТСТССССААССААААСАСАСАСАССТТССАСАААТТТАТАСТАСТ 651 ТТТТССТСТАТТТСАТСААСССААААСТТСССАСТСАСАААСАААСААСТ 701 ССТТСАТССАССАТАСССАТССТССАТСТССТССССССТССССТААААТС 751 САСАСАСТСААТССТТАТСТАААСАССТСТСТСССАССТСТСАТТССАТС 801 ССАСАССАААТСАСТСТАТТСССАТСТСАТТССААТССССАССАСТССТС 851 ААСТССАСТСААТАТТССТССААССТСАСАСАТТТСТТСТСАССААССАТ 901 ССССАССССТССТТССАААТСТССССААТААСТТТССТТАСТССТСАААС 951 АСТСТТСАТССАССТТССАСАСТТТСТАСТСТТТТСТСАТАТСТСТТССС

1001 АССААСАТСАТСССАТССААССТТАТСТСАААСТАСАСАССТСТССАСАС 1051 СААС С С СААС ТАС СААТ САААААТААТ СААСААС С С СААСАС ТАТ САТ СА 1101 ТСАТСТТАСТСАТТСТСАААТССАТСТССТСАССТТТСАТСАТСАСААСТ 1151 СТССТТССТТТАТССАААТТСССТСАСТТСССААСААССАТССТААААСТ 1201 ТСССТАСАТТАСАТТССТССТСААСАССАССАСТСССАСТАТССТСССТТ 1251 АСТССТССССССС САТ САСАСААСТ ТАТААААСТ СААТАТ Τ Т СААСААТС 1301 ССССТСАССССАТТССТАССААСТАСААААААСТСССАТТТАТСССАТАС 1351 АСАСАТСАААССТТТААСАСТССТСААССТАТТСАССАТСААТСАССААТ 1401 СТТСССАССТТТАСТТТАТССССААСТТССАСАСАСАСТСТТСАТТАТАТ

В-доменом.

- 102 028309

1451 ТТААСААТСААССААССАСАССАТАТААСАТСТАСССТСАСССААТСАСТ 15 01 САТ СТСССТССТТТ СТАТ Т СААССАСАТ ТАС СААААССТ СТААААСАТ ТТ 1551 СААС САТ Τ Τ Т С СААТ Т С Т С С САС САСАААТАТ Т САААТАТАААТ С САСАС 1601 ТСАСТСТАСААСАТСССССААСТАААТСАСАТССТСССТСССТСАССССС 1651 ТАТТАСТСТАСТТТССТТААТАТССАСАСАСАТСТАССТТСАССАСТСАТ 17 01 ТСССССТСТССТСАТСТССТАСАААСААТСТСТАСАТСАААСАССААА.СС

51 АСАТААТ СТ САСАСААСАССААТ СТ САТ ССТ СТТТТ СТ СТАТ ТТ САТ САС

01 ААСССААССТССТАССТСАСАСАСААТАТАСААСССТТТСТССССАА.ТСС 1851 АССТССАСТССАССТТСАССАТССАСАСТТССААСССТССААСАТСАТСС 1901 АСАССАТСААТСССТАТСТТТТТСАТАСТТТССАСТТСТСАСТТТСТТТС 1951 САТСАССТСССАТАСТССТАСАТТСТААССАТТССАССАСАСАСТСАСТТ 2001 ССТТТСТСТСТТСТТСТСТССАТАТАССТТСАААСАСААААТССТСТАТС 2051 ААСАСАСАСТСАСССТАТТСССАТТСТСАССАСАААСТСТСТТСАТСТСС 2101 АТССААААСССАССТСТАТССАТТСТССССТСССАСААСТСАСАСТТТСС 2151 СААСАСАСССАТСАСССССТТАСТСААССТТТСТАСТТСТСАСААСААСА 2201 СТССТСАТТАТТАССАССАСАСТТАТСААСАТАТТТСАССАТАСТТССТС 2251 АСТАААААСААТСССАТТСААССААСААССТТСТСТСАСААТТСААСАСА 2301 СССТАССАСТАСССААААССААТТТААТСССАССАСААТТССАСААААТС 2351 АСАТАСАСААСАСТСАСССТТССТТТССАСАСАСААСАССТАТСССТААА 2401 АТАСААААТСТСТССТСТАСТСАТТТСТТСАТССТСТТСССАСАСАСТСС 2451 ТАСТССАСАТССССТАТССТТАТСТСАТСТССААСААСССАААТАТСАСА 2501 СТТТТТСТСАТСАТССАТСАССТССАССААТАСАСАСТААТААСАСССТС 2551 ТСТСАААТСАСАСАСТТСАССССАСАССТССАТСАСАСТССССАСАТССТ 2601 АТТТАССССТСАСТСАССССТССААТТААСАТТАААТСАСАААСТССССА 2651 СААСТССАССААСАСАСТТСААСАААСТТСАТТТСАААСТТТСТАСТАСА 2701 ТСАААТААТСТСАТТТСААСААТТССАТСАСАСААТТТСССАССАССТАС 2751 ТСАТААТАСААСТТССТТАССАСССССААСТАТСССАСТТСАТТАТСАТА 2801 СТСААТТАСАТАССАСТСТАТТТСССАААААСТСАТСТССССТТАСТСАС 2851 ТСТССТССАССТСТСАССТТСАСТСААСААААТААТСАТТСАААСТТСТТ 2901 АСААТСАССТТТААТСААТАСССААСАААСТТСАТССССААААААТСТАТ 2 951 ССТ САСАААТААСТ ССТАСТАСТ СТТ САСТ САСАТ СААСАССАААТТ САС 3001 ТАТСАТСАТАССАТАТСАСТТСАААТСААСААССААСАТТТТСАСАТТТА 3051 ТСАТСАССАТСААААТСАСАССССССССАССТТТСААААСААААСАССАС 3101 АСТАТТТТАТТССТССАСТССАСАСССТСТСССАТТАТСССАТСАСТАСС 3151 ТССССАСАТСТТСТААСАААСАССССТСАСАСТСССАСТСТСССТСАСТТ 3201 СААСАААСТТСТТТТССАССААТТТАСТСАТСССТССТТТАСТСАССССТ 3251 ТАТАСССТССАСААСТАААТСААСАТТТСССАСТССТССССССАТАТАТА 33 01 АСАС САСААСТ Т СААСАТААТАТ САТ ССТААСТТТ САСАААТ САС СС С Т С

3401 СССААССАССАСААССТАСААААААСТТТСТСААСССТААТСАААССААА 3451 АСТТАСТТТТССАААСТССААСАТСАТАТСССАСССАСТАААСАТСАСТТ 3501 ТСАСТССАААСССТССССТТАТТТСТСТСАТСТТСАССТССАААААСАТС 3551 ТССАСТСАССССТСАТТССАССССТТСТССТСТСССАСАСТААСАСАСТС 3601 ААСССТССТСАТСССАСАСААСТСАСАСТАСАССААТТТССТСТСТТТТТ 3651 САССАТСТТТСАТСАСАССААААССТССТАСТТСАСТСААААТАТССААА 3701 САААСТССАССССТСССТССААТАТССАСАТССААСАТСССАСТТТТААА 3751 САСААТТАТСССТТССАТССААТСААТСССТАСАТААТССАТАСАСТАСС 3801 ТСССТТАСТААТСССТСАССАТСАААССАТТССАТССТАТСТССТСАССА 3851 ТССССАССААТСААААСАТССАТТСТАТТСАТТТСАСТССАСАТСТСТТС 3901 АСТСТАССАААААААСАССАСТАТААААТСССАСТСТАСААТСТСТАТСС 3 951 АССТСТТТТТСАСАСАСТССАААТСТТАССАТССАААССТССАА.ТТТССС

4001 СССТССААТСССТТАТТССССАССАТСТАСАТССТСССАТСАССАСАСТТ 4051 ТТТСТССТСТАСАССААТААСТСТСАСАСТССССТСССААТСССТТСТСС 4101 АСАСАТТАСАСАТТТТСАСАТТАСАССТТСАССАСААТАТССАСАСТССС 4151 ССССАААССТССССАСАСТТСАТТАТТССССАТСААТСААТСССТССАСС 4201 АССААССАССССТТТТСТТССАТСААССТССАТСТСТТСССАССААТСАТ 4251 ТАТТСАССССАТСААСАСССАСССТСССССТСАСААСТТСТССАСССТСТ 4301 АСАТСТСТСАСТТТАТСАТСАТСТАТАСТСТТСАТСССААСААСТСССАС 4351 АСТТАТССАССАААТТССАСТССААССТТААТССТСТТСТТТСССАА.ТСТ 4401 ССАТТСАТСТСССАТААААСАСААТАТТТТТААСССТССААТТАТТССТС 4451 САТАСАТСССТТТССАСССААСТСАТТАТАССАТТСССАССАСТСТТССС 4501 АТССАСТТСАТССССТСТСАТТТАААТАСТТССАССАТСССАТТСССААТ 4 551 ССАСАСТАААССААТАТ САСАТ ССАСАСАТТАСТ ССТТ САТ С СТАСТТТА 4601 ССААТАТСТТТСССАССТССТСТССТТСААААССТССАСТТСАССТССАА

- 103 028309

4651 СССАССАСТААТСССТССАСАССТСАССТСААТААТССААААСАСТСССТ 4701 ССААСТССАСТТССАСААСАСААТСАААСТСАСАССАСТААСТАСТСАСС 4751 САСТААААТСТСТССТТАССАССАТСТАТСТСААССАСТТССТСАТСТСС 4801 АССАСТСААСАТССССАТСАСТССАСТСТСТТТТТТСАСААТСССАААСТ 4851 АААССТТТТТСАСССАААТСААСАСТССТТСАСАССТСТССТСААСТСТС 4901 ТАСАСССАСССТТАСТСАСТСССТАССТТССААТТСАСССССАСАСТТСС 4951 СТССАССАСАТТССССТСАССАТССАССТТСТССССТСССАСССАСАССА 5001 ССТСТАССАСААААСТСАСАСАТССССАСССТССССАССТССАСААСТСС 5051 ТССССССАСССТСАСТСТТССТСТТССССССААААСССААССАСАСССТС 5101 АТСАТСТСССССАССССТСАССТСАСАТСССТССТССТССАССТСАСССА 5151 ССААСАСССТСАССТСААСТТСААСТССТАССТССАСССССТССАССТСС 5201 АТААТСССААСАСАААССССССССАССАССАСТАСААСАССАССТАСССТ 5251 СТССТСАСССТССТСАСССТССТССАССАССАСТСССТСААТСССААССА 5301 СТАСААСТССААССТСТССААСАААССССТСССАССССССАТССАСАААА 5351 ССАТСТССАААСССАААССССАССССССАСААССАСАССТСТАСАСССТС 5401 СССССАТССССССАТСАССТСАССААСААССАССТСАСССТСАССТСССТ 5451 ССТСАААСССТТСТАТСССАСССАСАТСССССТССАСТСССАСАССААТС 5501 СССАСССССАСААСААСТАСААСАССАССССТССССТСТТССАСТСССАС 5551 СССТССТТСТТССТСТАСАССААССТСАСССТССАСААСАССАССТСССА 5601 ССАССССААССТСТТСТСАТССТСССТСАТССАТСАСССТСТССАСААСС 5651 АСТАСАСССАСААСАСССТСТСССТСТСТСССССТАААТСА

Последовательность белка Ф-УШ 198 (ЗЕР ΙΌ ΝΟ: 105)

М<21ЕЬЗТСЕЕЬСЬЬКЕСЕЗАТККУУЬСАУЕЬЗТОУМ<23ОЬеЕЬРУОАКЕР

РРУРКЗЕРЕИТЗУУУККТЬЕУЕЕТОНЬЕ141АКРРРР1лМСЬЬеРТ1<2АЕУУ

101 ОТУУ1ТЬКИМАЗНРУЗЬНАУеУЗУ№КАЗЕСАЕУОО<2ТЗ<2РЕКЕООКУЕРС

151 СЗНТУУлГдУЬКЕЫСРМАЗОРЬСЬТУЗУЬЗНУОЬУКОЬИЗСЫСАЬЬУСРЕ

01 СЗЬАКЕКТОТЬНКИЬЬЕАУЕОЕСКЗТлГНЗЕТКЫЗЬМООРОААЗАРАТлГРКМ

251 НТУМСУУМРЗЬРСЫССНРКЗУУИНУ1СМСТТРЕУН31ЕЬЕСНТЕЬУРИН

301 РСА5ЬЕ13Р1ТЕЬТАСТЬЬМОЬ6<2ЕЬЬЕСН155Н<2НО6МЕАУУКУО5СРЕ

351 ЕР<2ЬРМКИИЕЕАЕОУОООЬТОЗЕМОУУРЕОООИЗРЗЕ1<21РЗУАККНРКТ

01 №УНУ1ААЕЕЕО1лШУАРЬУЬАРООРЗУКЗ<2У11ЩСР<2Р1СРКУККУРЕМАУ

451 ТОЕТЕКТКЕА10НЕЗС1ЬСРЬЬУеЕУСОТЬЫ1ЕКЫ0АЗРРУЫ1УРНС1Т

501 ОУРРЬУЗРРЬРКСУКНЬКРЕР1ЬРСЕ1ЕКУК1л7ТУТУЕОеРТКЗОРРСЬТР

551 УУЗЗЕШГМЕРОЬАЗеыеРЬЫСУКЕЗУО<2РСЫ<21МЗОКР1\ГУ1ЬЕЗУЕОЕ

601 ΝΡ5ϊΛ7ΥΕΤΕΝΙ0ΡΕΕΡΝΡΑθν<2ΕΕΌΡΕΕ<2Α5ΝΙΜΗ5ΙΝΟΥνΕΟ5Ε<2Ε5ν<3Ε

651 НЕУАУ№У1Ь31еА<2ТОЕЬЗУЕЕЗСУТЕКНКМУУЕОТЬТЬЕРЕЗСЕТУЕМЗ

01 МЕИРСЫл71ЬССНЫЗОЕРИРСМТАЬЬКУЗЗСОКИТСОУУЕОЗУЕО1 ЗАУЬЬ

751 3ΚΝΝΑΙΕΡΡ3Ε3<2Ν3ΡΗΡ3ΤΡ<2Κ<2ΕΝΑΤΤΙΡΕΝϋΙΕΚΤΟΡ1/ίΕΑΗΡΤΡΜΡΚ

01 1<2ИУЗЗЗОЬЬМЬЬР<23РТРНеЬЗЬЗОЫ2ЕАКУЕТЕЗООРЗРСА1ОЗИИЗЬ

851 5ЕМТНЕРР<2ЬНН36ОМУЕТРЕ56Ь<2ЬРЬЫЕКЬ6ТТААТЕЬККЬОЕКУ55Т

901 ЗИКГЫЗТ1РЗЫ4ЬААеТЫ4ТЗЗЬСРРЗМРУНУОЗ<2ЬОТТЬЕеККЗЗРЬТЕ

951 ЗССРЬЗЬЗЕЕИИОЗКЬЬЕЗСЬМИЗОЕЗЗТлГСКИУЗЗЕЬТРТТЫЭЗЫЭЕЕЮ

1001 ΥϋϋΤΙЗУЕМККЕОЕЫΥϋΕϋΕΝ03 РРЗ ЕОККТРНУЕ1ААУЕРЫл7РУСМЗ 3

1051 ЗРНУЬРИРА<23еЗУР<2ЕККУУЕ<2ЕЕТОеЗЕТ<2РЬУРеЕЬИЕНЬеЬЬСРУ1

1101 РАЕУЕЫ41МУТЕРИ<2АЗРРУЗЕУЗЗЫЗУЕЕО<2Р<2САЕРРКИЕУКРИЕТК

1151 ТУЕ№КУОННМАРТКОЕЕЬСКА1л7АУЕЗОУОЬЕКОУНЗСЫ СРЬЬУСНТИТЬ

01 ЫРАНСР<2УТУ<2ЕЕАЬЕЕТ1ЕОЕТК31л7УЕТЕЫМЕР14СРАРС1\Г1<2МЕОРТЕК

1251 ΕΝΥΡΕΗΑΙΝ6ΥΙΜΟΤΕΡ61Λ/ΜΑ<2ϋ<2ΡΙΡνίΥ1®3Μ63ΝΕΝΙΗ3ΙΗΕ36ΗνΕ

01 ТУРККЕЕУКМАЬУИЬУРСУЕЕТУЕМЬРЗКАСЫлГРУЕСЫ СЕНЬНАСМЗТЬ

1351 ЕЬУУЗЫКС<2ТРЬСМАЗСН1РОЕ<21ТАЗС<2УС<2№АРКЬАРЬНУЗС31ЫА№3

01 ТКЕРЕЗ№1КУОЬЬАРМЫНе1КТ<2САР<2КЕЗЗЬУ13<2ЕЫМУЗЬОСКК№<2

1451 ТУКСЫЗТСТЬМУЕЕСЫУОЗЗС1КНЫ1ЕЫРР11АКУ1РЬНРТНУ31РЗТЬК

01 МЕЬМССОЬЫЗСЗМРЬеМЕЗКА13ВА<21ТАЗЗУЕТЫМЕАТ1л73РЗКАРЬНЬ<2

1551 СРЗЫА№РР<2УШРКЕ№Ы2УОЕ<2КТМКУТСУТТ<2СУКЗЬЬТЗМУУКЕЕЫ 3

1601 ЗЗСОеНСВДТЬЕЕ<2ЫСКУКУЕ<2еЫ<2ОЗЕТРУШГЗЬОРРЬЬТРУЬР1НР<231л7

1651 УН01АЬРМЕУЬССЕА0ОЬУОКТНТСРРСРАРЕЬЬССРЗУЕЬЕРРКРКРТЬ

1701 ΜΙ3ΡΤΡ Е УТ СУУУЬУЗ Η Ε ϋ Ρ Е УК ΕΝ№УУЬ СУЕ УНЫАКТ К Р РЕ Е<2 ΥΝ 3 Τ ΥΡ

1751 УУЗУЬТУЬН<2Ыл7ЬЫСКЕУКСКУЗЫКАЬРАР1ЕКТ13КАКе<2РРЕР<2УУТЬ

01 РРЗРОЕЬТКЫ<2УЗЬТСЬУКеЕУРЗО1АУЕ1л7Е314С<2РЕЫЫУКТТРРУЬОЗО

1851 еЗЕЕЬУЗКЬТУОКЗР№<2<2еЫУЕЗСЗУМНЕАЬНЫНУТ<2КЗЬЗЬЗРСК*

Пример 21. Экспрессия белка Ό1Ό2 ФВ.

Правильный фолдинг домена Ό'Ό3 важен для его связывания с Ф-УШ.

Пропептид ФВ (Ό1Ό2 - аминокислоты 1-763) необходим для эффективного образования дисульфидной связи и фолдинга Ό'Ό3. Он действует как внутренний шаперон для фолдинга Ό'Ό3. Конструкции ФВ, создающие фрагменты ФВ, также могут экспрессироваться там, где пропептид ФВ (т.е. домен Ό1Ό2) напрямую связан с доменом О'О3, и удаляться во время регулярного внутриклеточного процессинга Ό'Ό3 (т.е. в цис-форме), или же, он может экспрессироваться с другой плазмиды, т.е. в трансформе. Гетеродимер Ф-УШ-ФВ был сконструирован таким образом, чтобы Ό1Ό2 мог экспрессироваться как в цис-, так и в транс-форме.

Клонирование ФВ 053: клон ФВ 053 экспрессирует пропептид ФВ (домен Ό1Ό2) для экспрессии Ό1Ό2 в транс-форме. Пропептид ФВ амплифицировали ПЦР из полноразмерной формы при помощи ЕЗС 54 и ЕЗС124.

- 104 028309

Е8С54-ФВ прямая с сайтом ΒδίΧΥΊ (8ΕΟΙΡΝΟ: 111) (С6СТТС6С6АС6ТАС66СС6ССАССАТ6АТТССТ6ССА6АТТТ6СС6666Т6СТ6СТТ6СТС)

Е8С 124 - Р1Р2 клонирующий олиго с сайтом Νοΐΐ - обратная (8ΕΟΙΡΝΟ: 112) (СТА6АСТС6А6С66СС6СТСАССТТТТ6СТ6С6АТ6А6АСА6666АСТ6СТ6А66АСА6С)

Продукт ПЦР расщепляли Βз^У1 и лигировали в Βз^У1/Nοί1-расщепленный пЦДНК 4. Нуклеотидная последовательность ФВ 053 (пропептид Ό1Ό2 ФВ) (ЗЕЦ ГО N0: 113)

АТЕАТТССТЕССАЕАТТТЕССЕЕЕЕТЕСТЕСТТЕСТСТЕЕСССТСАТТТТ

ЕССАЕЕЕАСССТТТЕТЕСАЕААЕЕААСТСЕСЕЕСАЕЕТСАТССАСЕЕССС

101 ЕАТЕСАЕССТТТТСЕЕААЕТЕАСТТСЕТСААСАССТТТЕАТЕЕЕАЕСАТЕ

151 ТАСАЕСТТТЕСЕЕЕАТАСТЕСАЕТТАССТССТЕЕСАЕЕЕЕЕСТЕССАЕАА

201 АСЕСТССТТСТСЕАТТАТТЕЕЕЕАСТТССАЕААТЕЕСААЕАЕАЕТЕАЕСС

251 ТСТССЕТЕТАТСТТЕЕЕЕААТТТТТТЕАСАТССАТТТЕТТТЕТСААТЕЕТ

301 АССЕТЕАСАСАЕЕЕЕЕАССАААЕАЕТСТССАТЕСССТАТЕССТССАААЕЕ

351 ЕСТЕТАТСТАЕАААСТЕАЕЕСТЕЕЕТАСТАСААЕСТЕТССЕЕТЕАЕЕССТ

401 АТЕЕСТТТЕТЕЕССАЕЕАТСЕАТЕЕСАЕСЕЕСААСТТТСААЕТССТЕСТЕ

451 ТСАЕАСАЕАТАСТТСААСААЕАССТЕСЕЕЕСТЕТЕТЕЕСААСТТТААСАТ

501 СТТТЕСТЕААЕАТЕАСТТТАТЕАСССААЕААЕЕЕАССТТЕАССТСЕЕАСС

551 СТТАТЕАСТТТЕССААСТСАТЕЕЕСТСТЕАЕСАЕТЕЕАЕААСАЕТЕЕТЕТ

601 ЕААСЕЕЕСАТСТССТСССАЕСАЕСТСАТЕСААСАТСТССТСТЕЕЕЕАААТ

651 ЕСАЕААЕЕЕССТЕТЕЕЕАЕСАЕТЕССАЕСТТСТЕААЕАЕСАССТСЕЕТЕТ

701 ТТЕСССЕСТЕССАСССТСТЕЕТЕЕАССССЕАЕССТТТТЕТЕЕСССТЕТЕТ

751 ЕАЕААЕАСТТТЕТЕТЕАЕТЕТЕСТЕЕЕЕЕЕСТЕЕАЕТЕСЕССТЕСССТЕС

801 ССТССТЕСАСТАСССССЕСАССТСТЕСССАСЕАСЕСААТССТЕСТСТАСС

851 ЕСТЕЕАССЕАССАСАЕСЕСЕТЕСАЕСССАЕТЕТЕСССТЕСТЕЕТАТЕЕАЕ

901 ТАТАЕЕСАЕТЕТЕТЕТССССТТЕСЕССАЕЕАССТЕССАЕАЕССТЕСАСАТ

951 СААТЕАААТЕТЕТСАЕЕАЕСЕАТЕСЕТЕЕАТЕЕСТЕСАЕСТЕСССТЕАЕЕ

1001 ЕАСАЕСТССТЕЕАТЕААЕЕССТСТЕСЕТЕЕАЕАЕСАССЕАЕТЕТСССТЕС

1051 ЕТЕСАТТССЕЕАААЕСЕСТАСССТСССЕЕСАССТСССТСТСТСЕАЕАСТЕ

1101 СААСАС СТ ЕСАТ ТТ ЕС СЕАААСАЕС САЕТЕЕАТ СТ ЕСАЕСААТЕААЕААТ

1151 ЕТССАЕЕЕЕАЕТЕССТТЕТСАСТЕЕТСААТСССАСТТСААЕАЕСТТТЕАС

1201 ААСАЕАТАСТТСАССТТСАЕТЕЕЕАТСТЕССАЕТАССТЕСТЕЕСССЕЕЕА

1251 ТТЕССАЕЕАССАСТССТТСТССАТТЕТСАТТЕАЕАСТЕТССАЕТЕТЕСТЕ

1301 АТЕАССЕСЕАСЕСТЕТЕТЕСАСССЕСТССЕТСАССЕТССЕЕСТЕССТЕЕС

1351 СТЕСАСААСАЕССТТЕТЕАААСТЕААЕСАТЕЕЕЕСАЕЕАЕТТЕССАТЕЕА

1401 ТЕЕССАЕЕАСАТССАЕСТСССССТССТЕАААЕЕТЕАССТССЕСАТССАЕС

1451 АТАСАЕТЕАСЕЕССТССЕТСССССТСАЕСТАСЕЕЕЕАЕЕАССТССАЕАТЕ

1501 ЕАСТЕЕЕАТЕЕССЕСЕЕЕАЕЕСТЕСТЕЕТЕААЕСТЕТСССССЕТСТАТЕС

1551 СЕЕЕААЕАССТЕСЕЕССТЕТЕТЕЕЕААТТАСААТЕЕСААССАЕЕЕСЕАСЕ

1601 АСТТССТТАСССССТСТЕСССТСССЕЕАЕССССЕЕЕТЕЕАЕСАСТТСЕЕЕ

1651 ААСЕССТЕЕААЕСТЕСАСЕЕЕЕАСТЕССАЕЕАССТЕСАЕААЕСАЕСАСАЕ

1701 СЕАТСССТЕСЕСССТСААСССЕСЕСАТЕАССАЕЕТТСТССЕАЕЕАЕЕСЕТ

1751 ЕСЕСЕЕТССТСАССТСССССАСАТТССАССССТСССАТССТССССТСАЕС

1801 ССЕСТЕСССТАССТЕСЕЕААСТЕССЕСТАСЕАСЕТЕТЕСТССТЕСТСЕЕА

1851 СЕЕССЕСЕАЕТЕССТЕТЕСЕЕСЕСССТЕЕССАЕСТАТЕССЕСЕЕССТЕСЕ

1901 СЕЕЕЕАЕАЕЕСЕТЕСЕСЕТСЕСЕТЕЕСЕСЕАЕССАЕЕССЕСТЕТЕАЕСТЕ

1951 ААСТЕСССЕАААЕЕССАЕЕТЕТАССТЕСАЕТЕСЕЕЕАСССССТЕСААССТ

2001 ЕАССТЕССССТСТСТСТСТТАССССЕАТЕАЕЕААТЕСААТСАССССТЕСС

2051 ТЕЕАЕЕЕСТЕСТТСТЕССССССАЕЕЕСТСТАСАТЕЕАТЕАЕАЕЕЕЕЕЕАС

2101 ТЕСЕТЕСССААЕЕСССАЕТЕССССТЕТТАСТАТЕАСЕЕТЕАЕАТСТТССА

2151 ЕССАЕААЕАСАТ СТ Т СТ САЕАС САТ САСАС САТ ЕТ ЕСТАСТ ЕТЕАЕЕАТ Е

2201 ЕСТТСАТЕСАСТЕТАССАТЕАЕТЕЕАЕТССССЕЕААЕСТТЕСТЕССТЕАС

2251 ЕСТЕТССТСАЕСАЕТССССТСТСТСАТСЕСАЕСААААЕЕ

- 105 028309

Белковая последовательность ФВ 053 (пропептид ОГО2 ФВ) (8ЕЦ ГО N0: 114)

УЗЕАеУСЗУЫАСеС<2ККЗЕ311еОЕ<2ЫеККУЗЬЗУУЬСЕЕЕО1НЬЕУКе ιοί тут<2ео<2КУЗмруАзкеьуьЕТЕАеуукьзеЕАУСЕУАК1оезеыЕ<2Уьь

151 ЗОКУЕЫКТСеЬССЫЕЫ1ЕАЕООЕМТ<2ЕСТЬТЗОРУОЕАК31лГАЬЗЗеЕ<21/ГС

01 ЕКАЗРРЗЗЗСЫ133еЕМ<2КСШЕ<2С<2ЬЬКЗТЗУЕАКСНР1Л/ОРЕРЕУАЬС

351 УНЗеККУРРеТЗЬЗКОС1\ГТС1СИ\ГЗ<2ШСЗЫЕЕСРеЕС1Л/Те<23НЕКЗЕО

01 ЫКУЕТЕЗе1С<2УЬ1АКОС<2ОНЗЕ31У1ЕТУ<2САООКОАУСТКЗУТУКЬРС

451 ЬНЫЗЬУКЬКНСАСУАМОеСО1СЬРЬЬКеОЬК1<2НТУТАЗУКЬЗУеЕОЬ<2М

651 1\ГСРКе<2УУЬ<2СеТРС1\ГЬТСКЗЬЗУРОЕЕСЫЕАСЬЕеСЕСРРеЬУМОЕКеО

01 СУРКА<2СРСУУОСЕ1Е<2РЕО1ЕЗОННТМСУСЕОСЕМНСТМЗеУРСЗЬЬРО

751 АУЬЗЗРЬЗНЕЗКК

Вышеприведенное описание характерных вариантов реализации раскрывает общий характер данного изобретения в настолько полном объеме, что другие специалисты могут, применяя знания в данной области техники, с легкостью модифицировать и/или адаптировать эти характерные варианты реализации для различных применений, без проведения лишних экспериментов и без отступления от общей концепции настоящего изобретения. Следовательно, такие адаптации и модификации находятся в пределах содержания и серии эквивалентов раскрытых вариантов реализации на основе представленных в данном тексте идеи и методологических принципов. Стоит понимать, что употребляемая в данном тексте фразеология и терминология имеет цель описания, но не ограничения, поэтому специалистам в данной области техники следует интерпретировать терминологию или фразеологию описания настоящего изобретения в свете его идеи и методологических принципов.

Существование других вариантов реализации изобретения будет очевидным для специалистов в данной области техники из приведенных в тексте обсуждения и реализации изобретения. Описание изобретения и примеры стоит рассматривать как иллюстративные, а подлинные суть и объем данного изобретения определены прилагающейся формулой изобретения.

Все перечисленные в данном тексте патентные публикации в полном объеме включены в текст посредством ссылки.

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <110> БАЙОДЖЕН АЙДЕК МА ИНК.

Чабра, Экта Сет Лю, Туняо Питерс, Роберт <120> ПОЛИПЕПТИДЫ ХИМЕРНОГО ФАКТОРА У111 И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ <130> 2159.359РС04/ЕК8/С-К/Е-Н <140> На присвоение <141> 2013-01-11 <150> США 61/586,099 <151> 2012-01-12 <150> США 61/586,654 <151> 2012-01-13 <150> США 61/667,901 <151> 2012-07-03 <150> США 61/734,954 <151> 2012-12-07 <160> 114 <170> Патентная версия 3.5

- 106 028309 <210> 1 <211> 16842 <212> ДНК <213> Ното 8ар1еп8 <400> 1 а1да11сс1д ссадаШдс сдддд1дс1д сПдсЮдд ссс1саШ1 дссадддасс 60 сШдЦсад ааддааскд сддсадд1са 1ссасддссс 1ас1ааддас дд1с1ааасд 120 дссссасдас даасдадасс дддад1аааа сдд1ссс1дд дааасасд1с йссОдадс 180 дссдксад! адд1дссддд дгйдсадса Шсддаад! дасПсдйа асассШда 240

1дддадса1д 1асадсШд сддда1ас1д садйасск с1ддсадддд дс1дссадаа 300 сйюдйдда ааадссйса с1даадса§1ЮддаааШ ассс1сд1ас ;йд1сдааас 360 дсссйКдас д1саа1ддад дассд1сссс сдасддйП асдсксйс кдайайд 420 дддасйсса даа(ддсаад адад(дадсс 1с1ссд1д1а (сйддддаа йййдаса 480 (ссаШдй 1д1саа1дд1 (дсдаддаад адс(аа(аас ссс(даадд( сйассдйс 540

1с1сас1сдд ададдсаса! адаассссй аааааас(д( адд(ааасаа асадйасса 600 ассд(дасас адддддасса аадад(с(сс а1дссс1;йд сс(ссааадд дс1д1;йс1а 660 дааас(дадд с1ддд1ас1а саадс(д(сс дд(даддсс( 1ддсас1д1д 1ссссс1дд1 720 йскададд 1асддда1ас ддаддШсс сдаса(ада( сШдасйс дассса(да( 780 дйсдасадд ссас(ссдда ;йддсШд1 ддссадда(с да(ддсадсд дсаасШса 840 ад1сс1дс1д (садасада! асйсаасаа дасс(дсддд с1д1д1ддса асШааса! 900 (ассдаааса ссдд(сс(ад с(ассд(сдс сдйдааад! (саддасдас ад1с1д1с1а 960 (даадйдй с(ддасдссс дасасассд! (дааа((д(а с(((дс(даа да(дас(((а 1020 (дасссаада адддасс((д асс(сддасс с((а(дас(( (дссаас(са (дддс(с(да 1080 дсад(ддада асад(дд(д( дааасдас(( с(ас(дааа( ас(ддд((с( (ссс(ддаас 1140 (ддадсс(дд даа(ас(даа асдд((дад( асссдадас( сд(сасс(с( (д(сассаса 1200 даасдддса( с(сс(сссад садс(са(дс ааса(с(сс( с(ддддааа( дсадаадддс 1260 с1д1дддадс ад1дссадс11с1даададс асс1сдд1д1 с11дсссд1а даддаддд1с 1320 д(сдад(асд йдкдадда дассссШа сдкйсссд дасассс1сд 1сасдд1сда 1380 адасйскд 1ддадссаса йдсссдс1д ссассс1с1д д1ддассссд адссййд! 1440 ддссс1д1д1 дадаадас111д1д1дад1д 1дс1дддддд с1ддад1дсд сс1дссс1дс 1500 аасдддсдас дд1дддадас сасс1ддддс 1сддааааса ссдддасаса сййадаа 1560 асасас1сас асдасссссс дасс1сасдс ддасдддасд сс1сс1ддад 1асдсссдда 1620 ссЮдссса ддадддаа1д д1дс1д1асд дс1ддассда ссасадсдсд 1дсадсссад 1680

- 107 028309

1д1дссс1дс 1дд1а1ддад ддаддассй а1дсдддсс1 ддасасддд! ссЮссйас 1740 сасдаса1дс сдасс1ддс1 дд1д1сдсдс асд1сддд1с асасдддасд асса1асс1с 1800

1а1аддсад1 д1д1д1сссс йдсдссадд асс1дссада дсс1дсаса1 саа1дааа1д 1860

1д1саддадс да1дсд1дда 1ддс1дсадс 1дссс1дадд а1а1ссд1са сасасадддд 1920 аасдсддйс 1ддасдд1с1 сддасд1д1а дйасШас асад1сс1сд с1асдсасс1 1980 ассдасдйд асдддасйс дасадсйс! дда1дааддс с1с1дсд1дд ададсассда 2040 д1д1ссс1дс д1дсайссд дааадсдсЫ сссйссддс асс1ссс1с1 с1сдадас1д 2100 с1д1сдадда ссЫсйссд дадасдсасс 1с1сд1ддс1 сасадддасд сасдЫаддс 2160 сШсдсда! дддадддссд (ддадддада дадс1с1дас саасасс1дс аШдссдаа 2220 асадссад1д да1с1дсадс аа1даадаа1 дссадддда д1дссйд1с ас1дд1саа1 2280 сссасйсаа дадсШдас д11д1ддасд (ааасддсй1д1сдд1сас с1адасд1сд 2З40 йасйсйа саддйссс! сасддаасад кдассадйа дддХдаадй с1сдааас1д 2400 аасад;йас1 йассйсад 1ддда1с1дс сад1асс1дс (ддсссддда йдссаддас 2460 сасйсПс! ссайд1с;й 1дадас1д1с сад1д1дс1д 11д1с1а1да ад1ддаад1с 2520 асссЫдасд д1са1ддасд ассдддссс! аасдд1сс1д д1даддаада дд1аасад1а 2580 ас1с1дасад дсасасдас ;йдассдсда сдс1д1д1дс асссдсйсд 1сассд1ссд 2640 дс1дсс1ддс Ыдсасааса дссйдХдаа ас1даадса1 ддддсаддад йдссакдда 2700

Ос^сдс! дсдасасасд 1дддсдаддс ад1ддсаддс сдасддассд дасд1д11д1 2760 сддаасасй 1дасйсд1а ссссд1сс1с аасдд1асс1 (ддссаддас а1ссадс1сс 2820 ссс1сс1даа адд1дасс1с сдсайсадс ;йасад1дас ддсс1ссд1д сдссйадс! 2880 асддддадда сс1дсада1д ассдд1сс1д 1адд1сдадд дддаддасй 1ссас1ддад 2940 дсд1адд1сд 1а1д1сас1д ссддаддсас дсддадйда 1усссс1сс1 ууасу1с1ас З000 дас1ддда1д дссдсдддад дс1дс1дд1д аадс1д1ссс ссд1с1а1дс сдддаадасс З060

1дсддсс1д1 у1дддаа11а саа1ддсаас садддсдасд с1дассс1ас сддсдсссй З120 сдасдассас йсдасаддд ддсадаЫсд дсссйскдд асдссддаса сасссйаа! З180 дйассдйд д1сссдс1дс асйссйас сссс1с1ддд Ыддсгдадс сссддд1дда З240 ддас11сддд аасдсс1дда адс1дсасдд ддас1дссад дасс1дсада адсадсасад ЗЗ00

1дааддаа1д ддддадассс дассдусйд дддсссасс! сс1даадссс йдсддасс! ЗЗ60

1сдасд1дсс сс1дасдд1с с1ддасд1с1 1сд1сд1д1с сда1ссс1дс дссс1саасс З420 сдсдса1дас садд11с1сс даддаддсд1 дсдсдд1сс1 дасд1ссссс аса11сдадд З480 сс1дсса1сд 1дссд1садс дс1адддасд сдддад11дд дсдсд1ас1д д1ссаададд З540

- 108 028309 с1сс1ссдса сдсдссадда сдсаддддд 1д1аадс1сс ддасддХадс асддсадйд 3600 ссдс1дссс1 асс1дсддаа с1дссдс1ас дасд1д1дс1 сс1дс1сдда сддссдсдад 3660

1дсс1д1дсд дсдссс1ддс садс1а1дсс дсддсс1дсд ддсдасддда 1ддасдсс11 3720 уасуусуа1у с1усасасуа ууасуаусс! дссддсдсй асддасасдс сдсдддассд 3780 д1сда1асдд сдссддасдс сддддададд сд1дсдсд1с дсд1ддсдсд адссаддссд 3840 с1у1уаус1у аас1усссуа ааууссауу! у1асс1усау (усуууассс сс1усаасс1 3900 дссссЫсс дсасдсдсад сдсассдсдс 1сдд1ссддс уасас1суас Пуасууус! 3960

Пссддйса са1ууасу1с асуссс1ууу ууасуНууа уасс1уссус 1с1с1с1сй 4020 асссдда1да ууаа1усаа1 уауусс1усс 1ддадддс1д сйс1дсссс ссаууусЫ 4080 аса1дда1да даддддддас с1ддасддсд ададададаа 1дддсс1ас1 ссйасдйа 4140 сйсддасдд ассйссдас даадасдддд уу1сссуауа 1д1асс1ас1 с1сссссс1у 4200

1усу1уссса ауусссау1у сссс1дйас 1а1уасуу1у адайПсса дссадаадас 4260 а1сйс1сад асса!сасас са1д1дс1ас 1д1дадда1д асусасууу! 1ссддд1сас 4320 ууууасаа1у а1ас1уссас 1с1ауаауу1 сдд1сйс1д 1адаадад1с 1уу1ау1у1у 4380 у1асасуа1у асас1сс1ас дсйса1дса с1у1асса1у ад1ддад1сс ссддаадсй 4440 ус1усс1уас ус1у1сс1са усау1сссс1 у1с1са1сус адсаааадда усс1а1сс1у 4500 суаау1асу1 уаса1уу1ас 1сасс1садд ддссйсдаа суасууас1у суасаууау! 4560 сдйадддда сауау1аусу 1сдййсс1 сууа1аууас йддсссссс а1уу1сааус 4620

1дд1д1д1сс сус1уасаас с1дсдддс1д аадддсйда у1у1ассааа асу1уссауа 4680 асЕйуасс! ддад1дса1д адссдддддд (ассауйсу ассасасадд усдас1дИд 4740 дасдсссдас йсссдадс! саса1ддШ 1дсасдд1с1 1да1ас1дда сс(сасд(ас 4800 адса!дддс! д!д!с!с!дд с!дсс!с!дс сссссдддса !дд!ссддса !дадаасада 4860 !д!д!ддссс !ддааадд!д !ссс!дс!!с са!садддса !сд!асссда сасададасс 4920 дасддадасд дддддсссд! ассаддссд! ас!с!!д!с! асасассддд асс!!!ссас 4980 адддасдаад д!ад!сссд! аддад!а!дс ссс!ддадаа асад!даада !!ддс!дсаа 5040 сасйд!д1с 1д1сдддасс ддаад(ддаа с(дсасадас са1д1д1д1д а(дссасд(д 5100

1сс1са1асд дддасс1сй 1д1сасйс1 аассдасдй д(даасасад асадссс(дд 5160 сс!!сасс!! дасд!д!с!д д!асасасас !асдд!дсас с!ссасда!с ддса!ддссс 5220 ас!асс!сас с!!сдасддд с!сааа!асс !д!!ссссдд ддад!дссад !асд!!с!дд 5280

1дсаддайа с1дсддсад1 дадд1дс1ад ссд1ассддд 1да1ддад1д даадс1дссс 5340 дад!!!а!дд асааддддсс сс!сасдд!с а!дсаадасс асд!сс!аа! дасдссд!са 5400

- 109 028309 аассс!ддда сс!йсдда! сс!ад!дддд аа!ааддда! дсадссассс с!сад!дааа 5460 !дсаадааас ддд!сасса! сс!дд!ддад ддаддадада !!дддассс! ддааадсс!а 5520 дда!сасссс йа!!ссс!а сд!сдд!ддд дад!сасй! асдйсй!д сссад!дд!а 5580 ддассасс!с сс!сс!с!с! йдадс!дй !дасддддад д!даа!д!да ададдссса! 5640 даадда!дад ас!сасй!д адд!дд!дда д!с!ддссдд !аса!са!!с 1дс1дс1ддд 5700 аас!сдасаа ас!дсссс!с сасйасас! !с!ссддд!а сйсс!ас!с !дад!дааас 5760 !ссассасс! садассддсс а!д£ад1аад асдасдассс сааадссс!с !ссд!дд!с! 5820 дддассдсса сс!дадса!с !ссд!дд!сс !даадсадас а!ассаддад ааад!д!д!д 5880 дсс!д!д!дд дааййда! дй!сдддад аддсассада ссс!ддсдд! ддас!сд!ад 5940 аддсассадд ас!!сд!с!д !а!дд!сс!с Шсасасас сддасасасс сйаааас!а 6000 ддса!ссада асаа!дасс! сассадсадс аасс!ссаад !ддаддаада ссс!д!ддас 6060 !!!дддаас! сс!ддааад! дадс!сдсад !д!дс!даса ссд!адд!с! !д!!ас!дда 6120 д!дд!сд!сд !!ддадд!!с асс!сс!!с! дддасасс!д ааассс!!да ддасс!!!са 6180 с!сдадсд!с асасдас!д! ссадаааад! дсс!с!ддас !са!сссс!д ссасс!дсса 6240 !аасааса!с а!даадсада сда!дд!дда !!сс!сс!д! адаа!сс!!а ссад!дасд! 6300 дд!с!!йса сддадасс!д ад!аддддас дд!ддасдд! айдйд!ад !ас!!сд!с! 6360 дс!ассасс! ааддаддаса !с!!аддаа! дд!сас!дса с!!ссаддас !дсаасаадс 6420 !дд!ддассс сдадсса!а! с!дда!д!с! дса!!!асда сасс!дс!сс !д!дад!сса 6480 !!ддддас!д сдсс!дс!!с даадд!сс!д асд!!д!!сд ассасс!ддд дс!сдд!а!а 6540 дасс!асада сд!ааа!дс! д!ддасдадд асас!садд! аасссс!дас дсддасдаад 6600 !дсдасасса !!дс!дсс!а !дсссасд!д !д!дсссадс а!ддсаадд! дд!дасс!дд 6660 аддасддсса са!!д!дссс ссададс!дс даддададда асдс!д!дд! аасдасдда! 6720 асддд!дсас асасддд!сд !ассд!!сса ссас!ддасс !сс!дссдд! д!аасасддд 6780 дд!с!сдасд с!сс!с!сс! а!с!ссддда даасддд!а! дад!д!дад! ддсдс!а!аа 6840 садс!д!дса сс!дсс!д!с аад!сасд!д !садсассс! дадссас!дд сс!дссс!д! 6900 !ададдссс! с!!дссса!а с!сасас!са ссдсда!а!! д!сдасасд! ддасддасад 6960 !!сад!дсас ад!сд!ддда с!сдд!дасс ддасдддаса дсад!д!д!д дадддс!дсс 7020 а!дсссас!д ссс!ссаддд аааа!сс!дд а!дадс!!!! дсадасс!дс д!!дассс!д 7080 аадас!д!сс ад!д!д!дад сд!сасасас с!сссдасдд !асддд!дас дддадд!ссс 7140 !!!!аддасс !ас!сдаааа сд!с!ддасд саас!дддас !!с!дасадд !сасасас!с 7200 д!ддс!ддсс ддсд!!!!дс с!саддааад ааад!сасс! !даа!сссад !дассс!дад 7260

- 110 028309 сас1дссада Шдссас1д 1да1д11д1с аасс1сасс1 сассдассдд ссдсаааасд 7320 дад1ссШс Шсад1дда ас11аддд1с ас1дддас1с д1дасдд1с1 ааасдд1дас 7380 ас1асаасад Идда^дда д1даадсс1д ссаддадссд ддаддсс1дд 1дд1дсс1сс 7440 сасада1дсс ссдд1дадсс ссассасШ д1а1д1ддад дасаШсдд аассдссдй 7500 сас11сддас дд1сс1сддс сс1ссддасс ассасддадд д1д1с1асдд ддссас1сдд 7560 дд1дд1дада са1асасс1с с1д1ададсс 11ддсддсаа дсасда111с 1ас1дсадса 7620 ддс1ас1дда сс1дд1с11с с1дс1дда1д дс1сс1ссад дс1д1ссдад дс1дад111д 7680 аад1дс1даа ддсс111д1д сд1дс1ааад а1дасд1сд1 ссда1дасс1 ддассадаад 7740 дасдасс1ас сдаддадд1с сдасаддс1с сдас1сааас 11сасдас11 ссддааасас 7800 д1ддаса1да 1ддадсддс1 дсдса1с1сс садаадХёёё 1ссдсд1ддс сд1дд1ддад 7860

1ассасдасд дс1сссасдс с1аса1сддд с1сааддасс сасс1д1ас1 асс1сдссда 7920 сдсд1ададд д1с11сассс аддсдсассд дсассасс1с а1дд1дс1дс сдаддд1дсд 7980 да1д1адссс дад11сс1дд ддаадсдасс д1сададс1д сддсдса11д ссадссадд1 8040 даад1а1дсд ддсадссадд 1ддсс1ссас садсдаддХс Идааа1аса сас1д11сса 8100 сс11сдс1дд сад1с1сдас дссдсд1аас дд1сдд1сса с11са1асдс ссд1сдд1сс 8160 ассддадд1д д1сдс1ссад аас111а1д1 д1дасаадд1 аа1с11садс аада1сдасс 8220 дссс1даадс с1сссдса1с дссс1дс1сс 1да1ддссад ссаддадссс саасдда1д1 8280 сссддаас11 1д1ссдс1ас 11адаад1сд 11с1адс1дд сдддас11сд дадддсд1ад 8340 сдддасдадд ас1ассдд1с дд1сс1сддд д11дсс1аса дддсс11даа асаддсда1д 8400 д1ссадддсс 1даадаадаа даадд1са11 д1да1сссдд 1дддса11дд дсссса1дсс 8460 аасс1саадс ада1ссдсс1 са1сдадаад саддсссс1д садд1сссдд ас11с11с11 8520 с11ссад1аа сас1адддсс асссд1аасс сдддд1асдд 11ддад11сд 1с1аддсдда 8580 д1адс1с11с д1ссддддас адаасааддс с11сд1дс1д адсад1д1дд а1дадс1дда 8640 дсадсааадд дасдада1сд 11адс1асс1 с1д1дасс11 дсссс1даад сссс1сс1сс 8700

1с11д11ссд даадсасдас 1сд1сасасс 1ас1сдасс1 сд1сд111сс с1дс1с1адс 8760 аа1сда1дда дасас1ддаа сддддас11с ддддаддадд 1ас1с1дссс сссдаса1дд 8820 сасаад1сас 1д1дддсссд дддс1с11дд ддд111сдас сс1ддддссс аададдаас1 8880 сса1дд11с1 дда1д1ддсд а1дадасддд дддс1д1асс д1д11сад1д асасссдддс 8940 сссдадаасс сссааадс1д ддассссддд 11с1сс11да дд1ассаада сс1асассдс 9000

11сд1сс1дд аадда1сдда саааа11дд1 даадссдас1 1саасаддад сааддад11с 9060 а1ддаддадд 1да11садсд да1дда1д1д ддссаддаса аадсаддасс ХХссХадссХ 9120

- 111 028309 дййаасса сйсддс1да ад11д1сс1с дИссйаад 1асс1сс1сс ас1аад1сдс 9180 с1асс1асас ссдд1сс1д1 дса1ссасд1 сасдд1дс1д сад1ас1сс1 аса1дд1дас 9240 сд1ддад1ас сссйсадсд аддсасадй саааддддас а1сс1дсадс ддд1дсдада 9300 сд1адд1дса д1дссасдас д1са1дадда 1д1ассас1д дсасс1са1д дддаадйдс 9360

1ссд1д1сад дШсссс1д 1аддасд1сд сссасдсй! да1ссдс1ас садддсддса 9420 асаддассаа сас1дддс1д дссс1дсдд1 асс1с1с1да ссасадсйс Пддйадсс 9480 аддд1дассд ддадсаддсд с1аддсда1д д1сссдссд1 1д1сс1дд11 дХдасссдас 9540 сдддасдсса 1ддададас1 дд1д1сдаад аассадйдд 1сссас1ддс ссйдйсдс 9600 сссаасс1дд 1с1аса1дд1 сассддааа1 сс1дсс1с1д а1дада1саа даддс1дсс1 9660 ддадаса1сс адд1дд1дсс са11ддад1д ддссс1аа1д ддд11ддасс ада1д1асса 9720 д1ддсс111а ддасддадас 1ас1с1ад11 с1ссдасдда сс1с1д1адд 1ссассасдд 9780 д1аасс1сас ссддда11ас ссаасд1дса ддадс1ддад адда11ддс1 ддсссаа1дс 9840 ссс1а1сс1с а1ссаддас1 11дадасдс1 сссссдадад дс1сс1дасс 1дд1дс1дса 9900 дд11дсасд1 сс1сдасс1с 1сс1аассда ссддд11асд ддда1аддад 1адд1сс1да 9960 аас1с1дсда дддддс1с1с сдаддас1дд ассасдасд1 дадд1дс1дс 1ссддададд 10020 ддс1дсада1 ссссасссй 1сссс1дсас с1дас1дсад ссадсссс1д дасд1да1сс 10080 йс1сс1дда 1ддс1сс1сс сйсасдасд аддссййс ссдасдйЫ дддд1дддад 10140 аддддасд1д дас1дасд1с дд1сддддас с1дсас1адд аададдасс1 ассдаддадд 10200 адШсссад сйсйаШ 1да1дааа1д аададШсд ссааддсШ саШсаааа 10260 дссаайИад ддсс1сд1с1 сас1садд1д 1сад1дс1дс 1саааддд1с даадаа1ааа 10320 ас1асШас йсйааадс ддйссдааа д1ааадйИ сддйайИс ссддадсада 10380 д1дад1ссас адйасдасд адйИддаад сайассасс айдасд1дс са1ддаасд1 10440 ддйссддад ааадсссай 1дс1дадсс11д1ддасдй а1дсадсддд адддаддссс 10500

1са1ассйс д1ад1дд1дд 1аас1дсасд д1ассйдса ссадддссй ййдддйа 10560 асдасйдда асасс1дсад 1асд1сдссс йссйсддд садссааай дддда1дсс1 10620

1дддсШдс 1д1дсда1ас йдасйсад ааа1дса1дд (дссаддссд ддадссйаа 10680 аддсдд1дд1 са1сс1дд1с дйддШад ссссйсдда асссдааасд асасдсйИд 10740 аас1даад1с ШасдЫсс асддйсддс ссйддадП йсдссасса д1аддассад 10800 асддасдй! с1д1дда11с ад1дда1дса дсадс1да1д ссдссадд1с саасадад1д 10860 асад1дИсс сЫПддаа!1ддада1сдс 1асда1дсад 1дсс1дсада дасасс1аад 10920

1сасс1асд1 сд1сдас1ас ддсддйсад дПдййас 1д1сасаадд да1аассйа 10980

- 112 028309 асс!с!адсд аίдсίасдίс сссадс!асд даШйддса ддсссадсад дсдас!ссаа 11040 сд£дд!даад Шссадсдаа 1сдаадасс1 сссίассаίд дШассйдд дсаайссй 11100 дддίсдаίдс с1адаассд1 ссддд1сд1с сдШдаддй дсассасйс даддШдсй 11160 адсйШдда дддаίддίас садίддаасс сдйааддаа сс!ссасааа ШдХдсЮд 11220 даИдйад даίίίдсаίд даίдаддаίд ддааίдадаа даддсссддд дасдЮдда 11280 ссйдссада ссадίдссас ддаддХдШ дасасдадас с1ааасаа1с с1ааасд1ас 11340 с!ас!сс!ас ссйаШсй Шссдддссс с!дсадасс! ддаасддШ дд1сасдд1д 11400 ассдХдасй дссадссада ίддссадасс йдШдаада д1са1сддд1 саасίдίдас 11460 сдддддШда ддссίίсдίд ссШаасадс сад1сссс1д ίддсасίдаа сдд1сдд1с1 11520 ассддШдд аасдасйс! сад!адссса дйдасаШд дсссссдас! ссддаадсас 11580 дддайдХсд д!саддддас йааадХдда ададасШд! ддШдссдШ ддасШдссс 11640 с1дуд1д1дс асаддсадс! ссаШсддса са1сд1дасс ίίίдаίдддс адааШсаа 11700 ааШсасс! 1с1с1ддаса ссдасддсда сс!ддасддд дасгсасасд 1д1ссд1сда 11760 дд1дадссд1 д1адсас1дд ааас!асссд 1с11ааад11 дс1дас1ддс адс1д11с11 11820 а1д1сс1а11 !саааасаад дадсаддасс 1ддадд1да11с1сса1аа1 дд1дсс1дса 11880 дссс!ддадс ааддсадддс сдас!дассд !сдасаадаа 1асадда1аа адННдНс 11940 с1сд1сс1дд асс1ссас1а ададд1а11а ссасддасд! сдддасс!сд 11ссд1сссд 12000

1дса1дааа1 сса1сдадд1 даадсасад! дсссШссд 1сдадз1дса сад1даса1д 12060 дадд!дасдд 1даа1дддад ас1дд1с1с1 дйссйасд асд1асШа дд1адс1сса 12120 с11сд1д1са сдддададдс адс1сзасд1 д1сас1д1ас с1ссас1дсс ас11ассс1с 12180 !дассадада сааддаа!дс 1ддд1дддаа са1ддаад1с аасдШа1д д1дсса1са1 12240 дса1дадд1с ада11саа1с асс11дд1са са1с11саса 11сас1ссас аааасаа!да 12300 асссасссП д1ассПсад Пдсааа1ас сасдд1ад1а сд1ас1ссад 1с1аадПад 12360

1ддаассад1 д1адаад1д1 аад1дадд1д Ш1д11ас1 дПссаас1д садс!садсс 12420 ссаадасШ 1дсПсааад асд1а1дд1с 1д1д1ддда1 с1д1да1дад аасддадсса 12480 а1дасПса1 дс1даддда1 сааддйдас д1сдад1сдд ддПс1дааа асдаадШс 12540

1дса1ассад асасассс!а дасас1ас1с Пдсс1сдд11ас1даад1а сдас1ссс1а 12600 ддсасад!са ссасадас!д даааасасП дПсаддаа! ддас1д1дса дсддссаддд 12660 садасд!дсс адссса1сс1 ддаддадсад 1д1с11д1сс ссд1д1сад1 дд1д1с1дас 12720 сййдХдаа саад1ссПа сс1дасасд1 сдссдд!ссс дШдсасдд 1сддд1адда 12780 сс1сс1сд1с асадаасадд ссдасадс!с ссас!дссад д1сс1сс1с11ассас1дП 12840

- 113 028309

1дс1даа1дс сасаадд!сс 1ддс1ссадс сасайсЬй дссаШдсс адсаддасад 12900 ддс1д1сдад дд1дасдд1с саддаддада а1дд1дасаа асдасйасд д1д11ссадд 12960 ассдадд!сд д1д1аада1а сдд1адасдд 1сд1сс1д1с йдссассад дадсаад1д1 13020 д1дадд1да1 сдссййа! дсссассй! д1сддассаа сддддШдс дйдас1дда 13080 ддасасс1да Шс1д1дс1 аасдд1дд1с сйдйсаса сас1ссас1а дсддадаа1а 13140 сддд1ддада садсс1ддй дссссадасд саас1дасс1 сс1д1ддас1 ааадасасда 13200 а1д1са1дсс сасса1с1с1 дд1с1асаас сас1д1дадс а1ддс1д1сс ссддсас1д1 13260 да1ддсаасд 1дадс1сс1д 1ддддасса1 сссйсдаад 1асад1асдд д1дд1адада 13320 ссада1дйд д1дасас1сд (ассдасадд ддссд1даса с1ассдйдс асйдаддас 13380 асссс1дд1а дддаддсйс дс1дШс1д ссс1ссада1 ааад1са1д1 (ддааддсад 13440 с1д1д1ссс1 даададдсс! дсас1сад1д сайддХдад да1ддад1сс адсассадй 13500 сдасааадас дддаддШа Шсад1аса ассйссдХс дасасаддда сйсйсдда 13560 сд1дад1сас д1аассас1с с1асс1садд 1сд1дд1саа сс1ддаадсс 1ддд1сссдд 13620 ассассадсс с1д1сада1с 1дсаса1дсс (садсдддсд даадд1саас (дсасаасдс 13680 адссс1дссс сасддссааа ддассйсдд асссадддсс 1дд1дд1сдд дасад1с1ад 13740 асд1д1асдд ад1сдсссдс сйссадйд асд1д11дсд 1сдддасддд дХдссддт 13800 дсйссасд! д1ддсс1д1д 1даад1адсс сдссйсдсс адаа1дсада ссад1дс1дс 13860 сссдадйИд ад1д1д1д1д 1дасссад1д адс1д1дасс сдаддд1дса сассддасас 13920 асПсайдд дсддаддсдд 1с11асд1с1 ддйасдасд дддс1са1ас йасасасас 13980 ас1ддд1сас 1сдасас1дд 1дсссссад1 дсс1сас1д1 даасд1ддсс йсадсссас 14040 ас1дассаас сс1ддсдад1 дсадасссаа сйсасс1дс дсс1дсадда аддаддад1д 14100 асддддд1са сддад1даса сйдсассдд аддХсдддХд 1дас1дд11д ддассдс1са 14160 сд1с1дддй даад1ддасд сддасдйс! 1сс1сс1сас саааадад1д 1ссссассс1 14220 сс1дсссссс дсассдШд сссасссйс ддаадассса д1дс1д1да1 дадйИдад! 14280 д1дсс1дсаа с1д1д1саас д1111с1сас адддд1ддда ддасдддддд сд1ддсааас 14340 ддд1дддаад сс11с1ддд1 сасдасас1а с1са1ас1са сасддасдй дасасадйд 14400

1ссасад1да дс1д1сссс11ддд1ас11д дссйаассд ссассаа1да с1д1ддс1д1 14460 ассасаасса сс1дсс11сс сдасаадд1д 1д1д1ссасс адд1д1сас1 сдасадддда 14520 ассса1даас сддад11ддс дд1дд11ас1 дасассдаса 1дд1дйдд1 ддасёёааёё 14580 дс1дйссас асасадд1дд даадсасса! с1ассс1д1д ддссадйс! дддаддаддд 14640 с1дсда1д1д 1дсасс1дса ссдаса1дда дда1дссд1д а1дддсс1сс дсд1ддссса 14700

- 114 028309 сйсд1дд£а да!дддасас ссддсаада ссс1сс1ссс дасдс1асас асд£ддасд1 14760 ддс1д1асс1 сс1асддсас (асссддадд сдсассддд! дХдсйссад аадссс1д1д 14820 аддасадс!д 1сдд£сдддс йсасйасд йс1дса1да аддсдад£дс 1д1ддаадд1 14880 дссЩссай 1дсс1д1дад сасдадддй йсдддасас 1сс1д1сдас адссадсссд 14940 аад!даа1дс аадасд1ас11ссдс1сасд асассйсса сддасдд£ад асддасасй 15000 д1дд1дас1д дсйассдсд дддддасйс садйПсс! ддаададд сддсйссад 15060

1дддсс1ссс сддадаассс с1дсс1са1с аа1дад1д1д сассас1дас сдад£ддсдс 15120 ссссс!дадд дсадаадда ссйсйаса дссдадддй асссддаддд дссййддд 15180 дасддад!ад йасйасас 1ссдад1даа ддаддадд£с ййИасаас аааддаасд! 15240 с1сс1дсссс садс1ддадд 1ссс1д1с1д ссссйдддс й1садс1да дс1д£аадас 15300 аддсйасй ссйсйсад ааа1а!дйд Шссйдса даддасдддд дйдассйс 15360 адддасадас ддддадсссд ааадйдас! сдасайс1д с1садсд1дс 1дсссаадс1 15420 д1сдс1д1да дсдса!ддад дсс1дса1дс 1саа1ддсас 1д£сайддд сссдддаада 15480 с1д1да1да1 сда1д1д1дс дадйдсасд асдддйсда садсдасас! сдсд1асс1с 15540 сддасд£асд адйассд!д асад1аассс дддсссйс! дасас1ас1а дс!асасасд 15600 асдасШдсс дс!дса1дд£ дсаддХдддд д1са1с1с1д дайсаадс! ддадХдсадд 15660 аадассасс! дсаасссс!д ссссс1ддд1 (асааддаад 1дс1ддасдд сдасдШсса 15720 сдссасссс сад!ададас с1аадйсда ссйасдйс йс1дд£дда сдйддддас 15780 дддддассса а!дйссйс аааа1аасас адд1даа1д11д1дддада1 дШдссШс 15840 ддсйдсасс айсадйаа даддаддаса да1са1даса с!даадсд!д а1дадасдс1 15900 ййайд!д йсасйаса асассс1с1а сааасдда!д ссдаасд!дд 1аад1сда11 15960 с1сс1сс1д1 с1ад1ас1д1 дасйсдсас 1ас1с1дсда ссадда!ддс 1д1да1ас1с 16020 асйс1дсаа дд1саа1дад ададдадад! асйс!ддда даададдд!с асаддс!дсс 16080 сасссШда !даасасаад дд1сс1ассд асасбйдад (даадасдй ссадйасй 16140

1с1сс1с1са 1даадассс1 сйсйссад 1д1ссдасдд д1дддааас1 асйд£дйс 16200

1д1сйдс1д адддадд1аа аайа1дааа айссаддса сс1дс1д1да саса1д£дад 16260 дадсШдад! дсаасдаса! сас1дссадд ЫдсадйИд асадаасдас 1ссс1ссай 16320 йаа1асШ 1аадд1ссд1 ддасдасас! д1д1асас1с Шсддасйа сдйдШдШ 16380 д£дасдд1сс дасд1са1ас 1саадд£ддд аадс1д1аад 1с1даад1ад адд1дда1а1 16440 ссас1ас1дс садддсааа! ддссадсаа адсса1д1ас йсайдаса 1саасда1д1 16500 адйссассс йсдасайс адасйсай 1ссасс1а1а дд!да1дасд дсссдШа 16560

- 115 028309 сасддХсдП1сдд1аса1д адд1аас1д1 ад11дс1аса дсаддассад Хдс1сс1дсХ 16620 дс1с1ссдас асддасддад ссса1дсадд 1ддссс1дса сХдсассааХ ддс1с1д11д 16680

1д1асса1да дд11с1саа1 сдХсс1ддХс асдаддасда сдададдс1д 1дсс1дсс1с 16740 ддд1асд1сс ассдддасд! дасд1дд11а ссдадасаас аса1дд1ас1 ссаададПа 16800 дсса1ддад1 дсааа1дс1с ссссаддаад 1дсадсаад1 да 16842 <210> 2 <211> 2813 <212> Белок <213> Ното 8ар1еп8 <220>

<221> примечание <222> (1)..(22) <223> Сигнальный пептид ФВ <220>

<221> примечание <222> (23)..(763) <223> Э1Э2-участок ФВ <220>

<221> примечание <222> (764)..(866) <223> Домен Э'ФВ <220>

<221> примечание <222> (867)..(1240) <223> Домен Ό3 ФВ <220>

<221> примечание <222> (1241)..(1479) <223> Домен А1 ФВ <220>

<221> примечание <222> (2016)..(2016) <223> Хаа может являться аминокислотой природного происхождения <400> 2

Ме1 11е Рго А1а Агд РНе А1а О1у Уа1 Ьеи Ьеи А1а Ьеи А1а Ьеи 11е 1 5 10 15

Ьеи Рго О1у ТНг Ьеи Су8 А1а О1и О1у ТНг Агд О1у Агд Зег Зег ТЬг 20 25 30

А1а Агд Су8 Зег Ьеи РЬе О1у Зег А8р РЬе Уа1 А8п ТЬг РЬе А8р О1у 35 40 45

- 116 028309

Зег Ме! Туг Зег РЬе А1а О1у Туг Су8 Зег Туг Ьеи Ьеи А1а О1у О1у 50 55 60

Су8 О1п Ьу8 Агд Зег РЬе Зег Не Не О1у А8р РЬе О1п А8п О1у Ьу8 65 70 75 80

Агд Уа1 Зег Ьеи Зег Уа1 Туг Ьеи О1у О1и РЬе РЬе А8р Ие Н18 Ьеи 85 90 95

РЬе Уа1 А8п О1у ТЬг Уа1 ТЬг О1п О1у А8р О1п Агд Уа1 Зег Ме! Рго 100 105 110

Туг А1а Зег Ьу8 О1у Ьеи Туг Ьеи О1и ТЬг О1и А1а О1у Туг Туг Ьу8 115 120 125

Ьеи Зег О1у О1и А1а Туг О1у РЬе Уа1 А1а Агд Ие А8р О1у Зег О1у 130 135 140

А8п РЬе О1п Уа1 Ьеи Ьеи Зег А8р Агд Туг РЬе А8п Ьу8 ТЬг Су8 О1у 145 150 155 160

Ьеи Су8 О1у А8п РЬе А8п Не РЬе А1а О1и А8р А8р РЬе Ме! ТЬг О1п 165 170 175

О1и О1у ТЬг Ьеи ТЬг Зег А8р Рго Туг А8р РЬе А1а А8п Зег Тгр А1а 180 185 190

Ьеи Зег Зег О1у О1и О1п Тгр Су8 О1и Агд А1а Зег Рго Рго Зег Зег 195 200 205

Зег Су8 А8п Ие Зег Зег О1у О1и Ме! О1п Ьу8 О1у Ьеи Тгр О1и О1п 210 215 220

Су8 О1п Ьеи Ьеи Ьу8 Зег ТЬг Зег Уа1 РЬе А1а Агд Су8 Н18 Рго Ьеи 225 230 235 240

Уа1 А8р Рго О1и Рго РЬе Уа1 А1а Ьеи Су8 О1и Ьу8 ТЬг Ьеи Су8 О1и 245 250 255

Су8 А1а О1у О1у Ьеи О1и Су8 А1а Су8 Рго А1а Ьеи Ьеи О1и Туг А1а 260 265 270

Агд ТЬг Су8 А1а О1п О1и О1у Ме! Уа1 Ьеи Туг О1у Тгр ТЬг А8р Н18 275 280 285

Зег А1а Су8 Зег Рго Уа1 Су8 Рго А1а О1у Ме! О1и Туг Агд О1п Су8 290 295 300

- 117 028309

Уа1 8ег Рго Сук А1а Агд ТЬг Сук С1п §ег Ьеи Ηίκ 11е Акп С1и Ме1 305 310 315 320

Сук С1п С1и Агд Сук Уа1 Акр С1у Сук 8ег Сук Рго С1и С1у С1п Ьеи 325 330 335

Ьеи Акр С1и С1у Ьеи Сук Уа1 С1и 8ег ТЬг С1и Сук Рго Сук Уа1 Нк 340 345 350

8ег С1у Ьук Агд Туг Рго Рго С1у ТЬг §ег Ьеи 8ег Агд Акр Сук Акп 355 360 365

ТЬг Сук 11е Сук Агд Акп §ег С1п Тгр 11е Сук 8ег Акп С1и С1и Сук 370 375 380

Рго С1у С1и Сук Ьеи Уа1 ТЬг С1у С1п §ег Нк РЬе Ьук 8ег РЬе Акр 385 390 395 400

Акп Агд Туг РЬе ТЬг РЬе 8ег С1у 11е Сук С1п Туг Ьеи Ьеи А1а Агд 405 410 415

Акр Сук С1п Акр Нк 8ег РЬе 8ег 11е Уа1 11е С1и ТЬг Уа1 С1п Сук 420 425 430

А1а Акр Акр Агд Акр А1а Уа1 Сук ТЬг Агд §ег Уа1 ТЬг Уа1 Агд Ьеи 435 440 445

Рго С1у Ьеи Нк Акп §ег Ьеи Уа1 Ьук Ьеи Ьук Нк С1у А1а С1у Уа1 450 455 460

А1а Ме1 Акр С1у С1п Акр 11е С1п Ьеи Рго Ьеи Ьеи Ьук С1у Акр Ьеи 465 470 475 480

Агд 11е С1п Нк ТЬг Уа1 ТЬг А1а 8ег Уа1 Агд Ьеи 8ег Туг С1у С1и 485 490 495

Акр Ьеи С1п Ме1 Акр Тгр Акр С1у Агд С1у Агд Ьеи Ьеи Уа1 Ьук Ьеи 500 505 510

8ег Рго Уа1 Туг А1а С1у Ьук ТЬг Сук С1у Ьеи Сук С1у Акп Туг Акп 515 520 525

С1у Акп С1п С1у Акр Акр РЬе Ьеи ТЬг Рго 8ег С1у Ьеи А1а С1и Рго 530 535 540

- 118 028309

Агд Уа1 О1и А8р РЬе О1у А8п А1а Тгр Ьу8 Ьеи Ηΐ8 О1у А8р Су8 О1п 545 550 555 560

А8р Ьеи О1п Ьу8 О1п Ηΐ8 Зег А8р Рго Су8 А1а Ьеи А8п Рго Агд Ме1 565 570 575

ТЬг Агд РЬе Зег О1и О1и А1а Су8 А1а Уа1 Ьеи ТЬг Зег Рго ТЬг РЬе 580 585 590

О1и А1а Су8 Ηΐ8 Агд А1а Уа1 Зег Рго Ьеи Рго Туг Ьеи Агд А8п Су8 595 600 605

Агд Туг А8р Уа1 Су8 Зег Су8 Зег А8р О1у Агд О1и Су8 Ьеи Су8 О1у 610 615 620

А1а Ьеи А1а Зег Туг А1а А1а А1а Су8 А1а О1у Агд О1у Уа1 Агд Уа1 625 630 635 640

А1а Тгр Агд О1и Рго О1у Агд Су8 О1и Ьеи А8п Су8 Рго Ьу8 О1у О1п 645 650 655

Уа1 Туг Ьеи О1п Су8 О1у ТЬг Рго Су8 А8п Ьеи ТЬг Су8 Агд Зег Ьеи 660 665 670

Зег Туг Рго А8р О1и О1и Су8 А8п О1и А1а Су8 Ьеи О1и О1у Су8 РЬе 675 680 685

Су8 Рго Рго О1у Ьеи Туг Ме1 А8р О1и Агд О1у А8р Су8 Уа1 Рго Ьу8 690 695 700

А1а О1п Су8 Рго Су8 Туг Туг А8р О1у О1и 11е РЬе О1п Рго О1и А8р 705 710 715 720

11е РЬе Зег А8р Ηΐ8 Ηΐ8 ТЬг Ме1 Су8 Туг Су8 О1и А8р О1у РЬе Ме1 725 730 735

ΗΪ8 Су8 ТЬг Ме1 Зег О1у Уа1 Рго О1у Зег Ьеи Ьеи Рго А8р А1а Уа1 740 745 750

Ьеи Зег Зег Рго Ьеи Зег Ηΐ8 Агд Зег Ьу8 Агд Зег Ьеи Зег Су8 Агд 755 760 765

Рго Рго Ме1 Уа1 Ьу8 Ьеи Уа1 Су8 Рго А1а А8р А8п Ьеи Агд А1а О1и 770 775 780

О1у Ьеи О1и Су8 ТЬг Ьу8 ТЬг Су8 О1п А8п Туг А8р Ьеи О1и Су8 Ме1 785 790 795 800

- 119 028309

Зег Ме! О1у Су8 Уа1 Зег О1у Су8 Ьеи Су8 Рго Рго О1у Ме! Уа1 Агд 805 810 815

Н18 О1и А8п Агд Су8 Уа1 А1а Ьеи О1и Агд Су8 Рго Су8 РЬе Н18 О1п 820 825 830

О1у Ьу8 О1и Туг А1а Рго О1у О1и ТЬг Уа1 Ьу8 Не О1у Су8 А8п ТЬг 835 840 845

Су8 Уа1 Су8 Агд А8р Агд Ьу8 Тгр А8п Су8 ТЬг А8р Н18 Уа1 Су8 А8р 850 855 860

А1а ТЬг Су8 Зег ТЬг Не О1у Ме! А1а Н18 Туг Ьеи ТЬг РЬе А8р О1у 865 870 875 880

Ьеи Ьу8 Туг Ьеи РЬе Рго О1у О1и Су8 О1п Туг Уа1 Ьеи Уа1 О1п А8р 885 890 895

Туг Су8 О1у Зег А8п Рго О1у ТЬг РЬе Агд Ие Ьеи Уа1 О1у А8п Ьу8 900 905 910

О1у Су8 Зег Н18 Рго Зег Уа1 Ьу8 Су8 Ьу8 Ьу8 Агд Уа1 ТЬг Не Ьеи 915 920 925

Уа1 О1и О1у О1у О1и Ие О1и Ьеи РЬе А8р О1у О1и Уа1 А8п Уа1 Ьу8 930 935 940

Агд Рго Ме! Ьу8 А8р О1и ТЬг Н18 РЬе О1и Уа1 Уа1 О1и Зег О1у Агд 945 950 955 960

Туг Не Ие Ьеи Ьеи Ьеи О1у Ьу8 А1а Ьеи Зег Уа1 Уа1 Тгр А8р Агд 965 970 975

Н18 Ьеи Зег Не Зег Уа1 Уа1 Ьеи Ьу8 О1п ТЬг Туг О1п О1и Ьу8 Уа1 980 985 990

Су8 О1у Ьеи Су8 О1у А8п РЬе А8р О1у Ие О1п А8п А8п А8р Ьеи ТЬг 995 1000 1005

Зег Зег А8п Ьеи О1п Уа1 О1и О1и А8р Рго Уа1 А8р РЬе О1у А8п 1010 1015 1020

Зег Тгр Ьу8 Уа1 Зег Зег О1п Су8 А1а А8р ТЬг Агд Ьу8 Уа1 Рго 1025 1030 1035

- 120 028309

Ьеи Азр Зег Зег Рго А1а ТЬг Суз Шз Азп Азп Не Ме1 Ьуз 01η 1040 1045 1050

ТЬг Ме1 Vа1 Азр Зег Зег Суз Агд Не Ьеи ТЬг Зег Азр Vа1 РЬе 1055 1060 1065

О1п Азр Суз Азп Ьуз Ьеи Vа1 Азр Рго О1и Рго Туг Ьеи Азр Vа1 1070 1075 1080

Суз Не Туг Азр ТЬг Суз Зег Суз О1и Зег Не О1у Азр Суз А1а 1085 1090 1095

Суз РЬе Суз Азр ТЬг Не А1а А1а Туг А1а Шз Vа1 Суз А1а 01п 1100 1105 1110

Шз О1у Ьуз Vа1 Vа1 ТЬг Тгр Агд ТЬг А1а ТЬг Ьеи Суз Рго 01п 1115 1120 1125

Зег Суз О1и О1и Агд Азп Ьеи Агд О1и Азп О1у Туг О1и Суз О1и 1130 1135 1140

Тгр Агд Туг Азп Зег Суз А1а Рго А1а Суз 01п Vа1 ТЬг Суз 01п 1145 1150 1155

Шз Рго О1и Рго Ьеи А1а Суз Рго Vа1 01п Суз Vа1 О1и О1у Суз 1160 1165 1170

Шз А1а Шз Суз Рго Рго О1у Ьуз Не Ьеи Азр О1и Ьеи Ьеи 01п 1175 1180 1185

ТЬг Суз Vа1 Азр Рго О1и Азр Суз Рго Vа1 Суз О1и Vа1 А1а О1у 1190 1195 1200

Агд Агд РЬе А1а Зег О1у Ьуз Ьуз Vа1 ТЬг Ьеи Азп Рго Зег Азр 1205 1210 1215

Рго О1и Шз Суз 01п Не Суз Шз Суз Азр Vа1 Vа1 Азп Ьеи ТЬг 1220 1225 1230

Суз О1и А1а Суз 01п О1и Рго О1у О1у Ьеи Vа1 Vа1 Рго Рго ТЬг 1235 1240 1245

Азр А1а Рго Vа1 Зег Рго ТЬг ТЬг Ьеи Туг Vа1 О1и Азр Не Зег 1250 1255 1260

О1и Рго Рго Ьеи Шз Азр РЬе Туг Суз Зег Агд Ьеи Ьеи Азр Ьеи 1265 1270 1275

- 121 028309

Уа1 РНе Ьеи Ьеи Азр О1у Бег Бег Агд Ьеи Бег О1и А1а О1и РНе 1280 1285 1290

О1и Уа1 Ьеи Ьуз А1а РНе Уа1 Уа1 Азр Ме1 Ме1 О1и Агд Ьеи Агд 1295 1300 1305

11е Бег О1п Ьуз Тгр Уа1 Агд Уа1 А1а Уа1 Уа1 О1и Туг Шз Азр 1310 1315 1320

О1у Бег Шз А1а Туг 11е О1у Ьеи Ьуз Азр Агд Ьуз Агд Рго Бег 1325 1330 1335

О1и Ьеи Агд Агд 11е А1а Бег О1п Уа1 Ьуз Туг А1а О1у Бег О1п 1340 1345 1350

Уа1 А1а Бег ТЬг Бег О1и Уа1 Ьеи Ьуз Туг ТЬг Ьеи РНе О1п 11е 1355 1360 1365

РНе Бег Ьуз 11е Азр Агд Рго О1и А1а Бег Агд 11е А1а Ьеи Ьеи 1370 1375 1380

Ьеи Ме1 А1а Бег О1п О1и Рго О1п Агд Ме1 Бег Агд Азп РНе Уа1 1385 1390 1395

Агд Туг Уа1 О1п О1у Ьеи Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Уа1 11е Уа1 11е Рго 1400 1405 1410

Уа1 О1у 11е О1у Рго Шз А1а Азп Ьеи Ьуз О1п 11е Агд Ьеи 11е 1415 1420 1425

О1и Ьуз О1п А1а Рго О1и Азп Ьуз А1а РНе Уа1 Ьеи Бег Бег Уа1 1430 1435 1440

Азр О1и Ьеи О1и О1п О1п Агд Азр О1и 11е Уа1 Бег Туг Ьеи Суз 1445 1450 1455

Азр Ьеи А1а Рго О1и А1а Рго Рго Рго ТНг Ьеи Рго Рго Азр Ме1 1460 1465 1470

А1а О1п Уа1 ТНг Уа1 О1у Рго О1у Ьеи Ьеи О1у Уа1 Бег ТНг Ьеи 1475 1480 1485

О1у Рго Ьуз Агд Азп Бег Ме1 Уа1 Ьеи Азр Уа1 А1а РНе Уа1 Ьеи 1490 1495 1500

- 122 028309

О1и О1у Зег А8р Ьу8 11е О1у О1и А1а А8р РЬе А8п Агд Зег Ьу8 1505 1510 1515

О1и РЬе Ме! О1и О1и Уа1 11е О1п Агд Ме! А8р Уа1 О1у О1п А8р 1520 1525 1530

Зег 11е Н18 Уа1 ТЬг Уа1 Ьеи О1п Туг Зег Туг Ме! Уа1 ТЬг Уа1 1535 1540 1545

О1и Туг Рго РЬе Зег О1и А1а О1п Зег Ьу8 О1у А8р 11е Ьеи О1п 1550 1555 1560

Агд Уа1 Агд О1и 11е Агд Туг О1п О1у О1у А8п Агд ТЬг А8п ТЬг 1565 1570 1575

О1у Ьеи А1а Ьеи Агд Туг Ьеи Зег А8р Н18 Зег РЬе Ьеи Уа1 Зег 1580 1585 1590

О1п О1у А8р Агд О1и О1п А1а Рго А8п Ьеи Уа1 Туг Ме! Уа1 ТЬг 1595 1600 1605

О1у А8п Рго А1а Зег А8р О1и 11е Ьу8 Агд Ьеи Рго О1у А8р 11е 1610 1615 1620

О1п Уа1 Уа1 Рго 11е О1у Уа1 О1у Рго А8п А1а А8п Уа1 О1п О1и 1625 1630 1635

Ьеи О1и Агд 11е О1у Тгр Рго А8п А1а Рго 11е Ьеи 11е О1п А8р 1640 1645 1650

РЬе О1и ТЬг Ьеи Рго Агд О1и А1а Рго А8р Ьеи Уа1 Ьеи О1п Агд 1655 1660 1665

Су8 Су8 Зег О1у О1и О1у Ьеи О1п 11е Рго ТЬг Ьеи Зег Рго А1а 1670 1675 1680

Рго А8р Су8 Зег О1п Рго Ьеи А8р Уа1 11е Ьеи Ьеи Ьеи А8р О1у 1685 1690 1695

Зег Зег Зег РЬе Рго А1а Зег Туг РЬе А8р О1и Ме! Ьу8 Зег РЬе 1700 1705 1710

А1а Ьу8 А1а РЬе 11е Зег Ьу8 А1а А8п 11е О1у Рго Агд Ьеи ТЬг 1715 1720 1725

О1п Уа1 Зег Уа1 Ьеи О1п Туг О1у Зег 11е ТЬг ТЬг 11е А8р Уа1 1730 1735 1740

- 123 028309

Рго Тгр А8п Уа1 Уа1 Рго О1и Ьу8 А1а Ηΐ8 Ьеи Ьеи Зег Ьеи Уа1 1745 1750 1755

А8р Уа1 Ме1 О1п Агд О1и О1у О1у Рго Зег О1п 11е О1у А8р А1а 1760 1765 1770

Ьеи О1у РЬе А1а Уа1 Агд Туг Ьеи ТЬг Зег О1и Ме1 Ηΐ8 О1у А1а 1775 1780 1785

Агд Рго О1у А1а Зег Ьу8 А1а Уа1 Уа1 11е Ьеи Уа1 ТЬг А8р Уа1 1790 1795 1800

Зег Уа1 А8р Зег Уа1 А8р А1а А1а А1а А8р А1а А1а Агд Зег А8п 1805 1810 1815

Агд Уа1 ТЬг Уа1 РЬе Рго 11е О1у 11е О1у А8р Агд Туг А8р А1а 1820 1825 1830

А1а О1п Ьеи Агд 11е Ьеи А1а О1у Рго А1а О1у А8р Зег А8п Уа1 1835 1840 1845

Уа1 Ьу8 Ьеи О1п Агд 11е О1и А8р Ьеи Рго ТЬг Ме1 Уа1 ТЬг Ьеи 1850 1855 1860

О1у А8п Зег РЬе Ьеи Ηΐ8 Ьу8 Ьеи Су8 Зег О1у РЬе Уа1 Агд 11е 1865 1870 1875

Су8 Ме1 А8р О1и А8р О1у А8п О1и Ьу8 Агд Рго О1у А8р Уа1 Тгр 1880 1885 1890

ТЬг Ьеи Рго А8р О1п Су8 Ηΐ8 ТЬг Уа1 ТЬг Су8 О1п Рго А8р О1у 1895 1900 1905

О1п ТЬг Ьеи Ьеи Ьу8 Зег Ηΐ8 Агд Уа1 А8п Су8 А8р Агд О1у Ьеи 1910 1915 1920

Агд Рго Зег Су8 Рго А8п Зег О1п Зег Рго Уа1 Ьу8 Уа1 О1и О1и 1925 1930 1935

ТЬг Су8 О1у Су8 Агд Тгр ТЬг Су8 Рго Су8 Уа1 Су8 ТЬг О1у Зег 1940 1945 1950

Зег ТЬг Агд Ηΐ8 11е Уа1 ТЬг РЬе А8р О1у О1п А8п РЬе Ьу8 Ьеи 1955 1960 1965

- 124 028309

ТЬг 01у Зег Суз Зег Туг Vа1 Ьеи РЬе 01п Азп Ьуз 01и 01п Азр 1970 1975 1980

Ьеи О1и Vа1 Не Ьеи Шз Азп О1у А1а Суз Зег Рго О1у А1а Агд 1985 1990 1995

01п О1у Суз Ме1 Ьуз Зег Не О1и Vа1 Ьуз Шз Зег А1а Ьеи Зег 2000 2005 2010

Vа1 О1и Хаа Шз Зег Азр Ме1 О1и Vа1 ТЬг Vа1 Азп О1у Агд Ьеи 2015 2020 2025 νΗί Зег νΗί Рго Туг Vа1 О1у О1у Азп Ме1 О1и Vа1 Азп Vа1 Туг 2030 2035 2040

О1у А1а Не Ме1 Шз О1и νΗ1 Агд РЬе Азп Шз Ьеи О1у Шз Не 2045 2050 2055

РЬе ТЬг РЬе ТЬг Рго 01п Азп Азп О1и РЬе 01п Ьеи 01п Ьеи Зег 2060 2065 2070

Рго Ьуз ТЬг РЬе А1а Зег Ьуз ТЬг Туг О1у Ьеи Суз О1у Не Суз 2075 2080 2085

Азр О1и Азп О1у А1а Азп Азр РЬе Ме1 Ьеи Агд Азр О1у ТЬг νΗ1 2090 2095 2100

ТЬг ТЬг Азр Тгр Ьуз ТЬг Ьеи νΗ1 01η О1и Тгр ТЬг νΗ1 01η Агд 2105 2110 2115

Рго О1у 01п ТЬг Суз 01п Рго Не Ьеи О1и О1и 01п Суз Ьеи Vа1 2120 2125 2130

Рго Азр Зег Зег Шз Суз 01п Vа1 Ьеи Ьеи Ьеи Рго Ьеи РЬе А1а 2135 2140 2145

О1и Суз Шз Ьуз Vа1 Ьеи А1а Рго А1а ТЬг РЬе Туг А1а Не Суз 2150 2155 2160

01п 01п Азр Зег Суз Шз 01п О1и 01η νΗ1 Суз О1и ν^ Не А1а 2165 2170 2175

Зег Туг А1а Шз Ьеи Суз Агд ТЬг Азп О1у Vа1 Суз νΗ1 Азр Тгр 2180 2185 2190

Агд ТЬг Рго Азр РЬе Суз А1а Ме1 Зег Суз Рго Рго Зег Ьеи νΗ1 2195 2200 2205

- 125 028309

Туг Азп Шз Суз О1и Шз О1у Суз Рго Агд Шз Суз Азр О1у Азп 2210 2215 2220

Уа1 8ег 8ег Суз О1у Азр Шз Рго 8ег О1и О1у Суз РЬе Суз Рго 2225 2230 2235

Рго Азр Ьуз Уа1 Ме1 Ьеи О1и О1у 8ег Суз Уа1 Рго О1и О1и А1а 2240 2245 2250

Суз ТЬг О1п Суз 11е О1у О1и Азр О1у Уа1 О1п Шз О1п РЬе Ьеи 2255 2260 2265

О1и А1а Тгр Уа1 Рго Азр Шз О1п Рго Суз О1п 11е Суз ТЬг Суз 2270 2275 2280

Ьеи 8ег О1у Агд Ьуз Уа1 Азп Суз ТЬг ТЬг О1п Рго Суз Рго ТЬг 2285 2290 2295

А1а Ьуз А1а Рго ТЬг Суз О1у Ьеи Суз О1и Уа1 А1а Агд Ьеи Агд 2300 2305 2310

О1п Азп А1а Азр О1п Суз Суз Рго О1и Туг О1и Суз Уа1 Суз Азр 2315 2320 2325

Рго Уа1 8ег Суз Азр Ьеи Рго Рго Уа1 Рго Шз Суз О1и Агд О1у 2330 2335 2340

Ьеи О1п Рго ТЬг Ьеи ТЬг Азп Рго О1у О1и Суз Агд Рго Азп РЬе 2345 2350 2355

ТЬг Суз А1а Суз Агд Ьуз О1и О1и Суз Ьуз Агд Уа1 8ег Рго Рго 2360 2365 2370

8ег Суз Рго Рго Шз Агд Ьеи Рго ТЬг Ьеи Агд Ьуз ТЬг О1п Суз 2375 2380 2385

Суз Азр О1и Туг О1и Суз А1а Суз Азп Суз Уа1 Азп 8ег ТЬг Уа1 2390 2395 2400

8ег Суз Рго Ьеи О1у Туг Ьеи А1а 8ег ТЬг А1а ТЬг Азп Азр Суз 2405 2410 2415

О1у Суз ТЬг ТЬг ТЬг ТЬг Суз Ьеи Рго Азр Ьуз Уа1 Суз Уа1 Шз 2420 2425 2430

- 126 028309

Агд §ег ТЬг 11е Туг Рго Уа1 С1у С1п РЬе Тгр С1и С1и С1у Сук 2435 2440 2445

Акр Уа1 Сук ТЬг Сук ТЬг Акр Ме1 С1и Акр А1а Уа1 Ме1 С1у Ьеи 2450 2455 2460

Агд Уа1 А1а С1п Сук 8ег С1п Ьук Рго Сук С1и Акр 8ег Сук Агд 2465 2470 2475

8ег С1у РЬе ТЬг Туг Уа1 Ьеи Нк С1и С1у С1и Сук Сук С1у Агд 2480 2485 2490

Сук Ьеи Рго 8ег А1а Сук С1и Уа1 Уа1 ТЬг С1у 8ег Рго Агд С1у 2495 2500 2505

Акр 8ег С1п §ег §ег Тгр Ьук 8ег Уа1 С1у 8ег С1п Тгр А1а 8ег 2510 2515 2520

Рго С1и Акп Рго Сук Ьеи 11е Акп С1и Сук Уа1 Агд Уа1 Ьук С1и 2525 2530 2535

С1и Уа1 РЬе 11е С1п С1п Агд Акп Уа1 8ег Сук Рго С1п Ьеи С1и 2540 2545 2550

Уа1 Рго Уа1 Сук Рго 8ег С1у РЬе С1п Ьеи 8ег Сук Ьук ТЬг §ег 2555 2560 2565

А1а Сук Сук Рго 8ег Сук Агд Сук С1и Агд Ме1 С1и А1а Сук Ме1 2570 2575 2580

Ьеи Акп С1у ТЬг Уа1 11е С1у Рго С1у Ьук ТЬг Уа1 Ме1 11е Акр 2585 2590 2595

Уа1 Сук ТЬг ТЬг Сук Агд Сук Ме1 Уа1 С1п Уа1 С1у Уа1 11е 8ег 2600 2605 2610

С1у РЬе Ьук Ьеи С1и Сук Агд Ьук ТЬг ТЬг Сук Акп Рго Сук Рго 2615 2620 2625

Ьеи С1у Туг Ьук С1и С1и Акп Акп ТЬг С1у С1и Сук Сук С1у Агд 2630 2635 2640

Сук Ьеи Рго ТЬг А1а Сук ТЬг 11е С1п Ьеи Агд С1у С1у С1п 11е 2645 2650 2655

Ме1 ТЬг Ьеи Ьук Агд Акр С1и ТЬг Ьеи С1п Акр С1у Сук Акр ТЬг 2660 2665 2670

- 127 028309

Н13 РЬе Суз Ьуз Уа1 Ази О1и Агд О1у О1и Туг РЬе Тгр О1и Ьуз 2675 2680 2685

Агд Уа1 ТЬг О1у Суз Рго Рго РЬе Азр О1и Шз Ьуз Суз Ьеи А1а 2690 2695 2700

О1и О1у О1у Ьуз 11е Ме! Ьуз 11е Рго О1у ТЬг Суз Суз Азр ТЬг 2705 2710 2715

Суз О1и О1и Рго О1и Суз Ази Азр 11е ТЬг А1а Агд Ьеи О1и Туг 2720 2725 2730

Уа1 Ьуз Уа1 О1у Зег Суз Ьуз Зег О1и Уа1 О1и Уа1 Азр 11е Шз 2735 2740 2745

Туг Суз О1и О1у Ьуз Суз А1а Зег Ьуз А1а Ме! Туг Зег 11е Азр 2750 2755 2760

11е Ази Азр Уа1 О1и Азр О1и Суз Зег Суз Суз Зег Рго ТЬг Агд 2765 2770 2775

ТЬг О1и Рго Ме! О1и Уа1 А1а Ьеи Шз Суз ТЬг Ази О1у Зег Уа1 2780 2785 2790

Уа1 Туг Шз О1и Уа1 Ьеи Ази А1а Ме! О1и Суз Ьуз Суз Зег Рго 2795 2800 2805

Агд Ьуз Суз Зег Ьуз 2810 <210> 3 <211> 11 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> полипептид <400> 3

Рго Ьуз Ази Зег Зег Ме! 11е Зег Ази ТЬг Рго 1 5 10 <210> 4 <211> 7 <212> Белок <213> Искусственная <220>

- 128 028309 <223> полипептид <400> 4

Шк О1п Зег Ьеи О1у ТЬг О1п 1 5 <210> 5 <211> 8 <212> Белок <213> Искусственная <220>

<223> полипептид <400> 5

Н18 О1п Акп Ьеи Зег Акр О1у Ьук 1 5 <210> 6 <211> 8 <212> Белок <213> Искусственная <220>

<223> полипептид <400> 6

Н1к О1п Акп Не Зег Акр О1у Ьук 1 5 <210> 7 <211> 8 <212> Белок <213> Искусственная <220>

<223> полипептид <400> 7

Vа1 Не Зег Зег Шк Ьеи О1у О1п 1 5 <210> 8 <211> 20 <212> Белок <213> Искусственная <220>

<223> Последовательность РАЗ <400> 8

А1а Зег Рго А1а А1а Рго А1а Рго А1а Зег Рго А1а А1а Рго А1а Рго 1 5 10 15

- 129 028309

8ег А1а Рго А1а 20 <210> 9 <211> 20 <212> Белок <213> Искусственная <220>

<223> Последовательность РА8 <400> 9

А1а А1а Рго А1а 8ег Рго А1а Рго А1а А1а Рго 8ег А1а Рго А1а Рго 1 5 10 15

А1а А1а Рго 8ег 20 <210> 10 <211> 20 <212> Белок <213> Искусственная <220>

<223> Последовательность РА8 <400> 10

А1а Рго 8ег 8ег Рго 8ег Рго 8ег А1а Рго 8ег 8ег Рго 8ег Рго А1а 1 5 10 15

8ег Рго 8ег 8ег 20 <210> 11 <211> 19 <212> Белок <213> Искусственная <220>

<223> Последовательность РА8 <400> 11

8ег Рго 8ег <210> 12 <211> 20

- 130 028309 <212> Белок <213> Искусственная <220>

<223> Последовательность РАБ <400> 12

Бег Бег Рго Бег А1а Рго Бег Рго Бег Бег Рго А1а Бег Рго Бег Рго 1 5 10 15

Бег Бег Рго А1а 20 <210> 13 <211> 24 <212> Белок <213> Искусственная <220>

<223> Последовательность РАБ <400> 13

А1а А1а Бег Рго А1а А1а Рго Бег А1а Рго Рго А1а А1а А1а Бег Рго 1 5 10 15

А1а А1а Рго Бег А1а Рго Рго А1а 20 <210> 14 <211> 20 <212> Белок <213> Искусственная <220>

<223> Последовательность РАБ <400> 14

А1а Бег А1а А1а А1а Рго А1а А1а А1а Бег А1а А1а А1а Бег А1а Рго 1 5 10 15

Бег А1а А1а А1а 20 <210> 15 <211> 19 <212> Белок <213> Искусственная <220>

<223> Сигнальный пептид ФУШ <400> 15

- 131 028309

Ме1 О1п 11е О1и Ьеи 8ег ТЬг Суз РЬе РЬе Ьеи Суз Ьеи Ьеи Агд РЬе 1 5 10 15

Суз РЬе 8ег <210> 16 <211> 2332 <212> Белок <213> Ното зар1епз <400> 16

А1а ТЬг Агд Агд Туг Туг Ьеи О1у А1а Уа1 О1и Ьеи 8ег Тгр Азр Туг 1 5 10 15

Ме1 О1п 8ег Азр Ьеи О1у О1и Ьеи Рго Уа1 Азр А1а Агд РЬе Рго Рго 20 25 30

Агд Уа1 Рго Ьуз 8ег РЬе Рго РЬе Азп ТЬг 8ег Уа1 Уа1 Туг Ьуз Ьуз 35 40 45

ТЬг Ьеи РЬе Уа1 О1и РЬе ТЬг Азр Шз Ьеи РЬе Азп 11е А1а Ьуз Рго 50 55 60

Агд Рго Рго Тгр Ме1 О1у Ьеи Ьеи О1у Рго ТЬг 11е О1п А1а О1и Уа1 65 70 75 80

Туг Азр ТЬг Уа1 Уа1 11е ТЬг Ьеи Ьуз Азп Ме1 А1а 8ег Шз Рго Уа1 85 90 95

8ег Ьеи Шз А1а Уа1 О1у Уа1 8ег Туг Тгр Ьуз А1а 8ег О1и О1у А1а 100 105 110

О1и Туг Азр Азр О1п ТЬг 8ег О1п Агд О1и Ьуз О1и Азр Азр Ьуз Уа1 115 120 125

РЬе Рго О1у О1у 8ег Шз ТЬг Туг Уа1 Тгр О1п Уа1 Ьеи Ьуз О1и Азп 130 135 140

О1у Рго Ме1 А1а 8ег Азр Рго Ьеи Суз Ьеи ТЬг Туг 8ег Туг Ьеи 8ег 145 150 155 160

Шз Уа1 Азр Ьеи Уа1 Ьуз Азр Ьеи Азп 8ег О1у Ьеи 11е О1у А1а Ьеи 165 170 175

Ьеи Уа1 Суз Агд О1и О1у 8ег Ьеи А1а Ьуз О1и Ьуз ТЬг О1п ТЬг Ьеи 180 185 190

- 132 028309

Шк Ьук РЬе Не Ьеи Ьеи РЬе А1а Vа1 РЬе Акр 01и 01у Ьук Зег Тгр 195 200 205

Шк Зег О1и ТЬг Ьук Акп Зег Ьеи Ме! О1п Акр Агд Акр А1а А1а Зег 210 215 220

А1а Агд А1а Тгр Рго Ьук Ме! Шк ТЬг Vа1 Акп О1у Туг Vа1 Акп Агд 225 230 235 240

Зег Ьеи Рго О1у Ьеи Не О1у Сук Шк Агд Ьук Зег Vа1 Туг Тгр Шк 245 250 255

Vа1 Не О1у Ме! О1у ТЬг ТЬг Рго О1и Vа1 Шк Зег Не РЬе Ьеи О1и 260 265 270

О1у Шк ТЬг РЬе Ьеи Vа1 Агд Акп Шк Агд О1п А1а Зег Ьеи О1и Не 275 280 285

Зег Рго Не ТЬг РЬе Ьеи ТЬг А1а О1п ТЬг Ьеи Ьеи Ме! Акр Ьеи О1у 290 295 300

О1п РЬе Ьеи Ьеи РЬе Сук Шк Не Зег Зег Шк О1п Шк Акр О1у Ме! 305 310 315 320

О1и А1а Туг Vа1 Ьук Vа1 Акр Зег Сук Рго О1и О1и Рго О1п Ьеи Агд 325 330 335

Ме! Ьук Акп Акп О1и О1и А1а О1и Акр Туг Акр Акр Акр Ьеи ТЬг Акр 340 345 350

Зег О1и Ме! Акр Vа1 Vа1 Агд РЬе Акр Акр Акр Акп Зег Рго Зег РЬе 355 360 365

Не О1п Не Агд Зег Vа1 А1а Ьук Ьук Шк Рго Ьук ТЬг Тгр Vа1 Шк 370 375 380

Туг Не А1а А1а О1и О1и О1и Акр Тгр Акр Туг А1а Рго Ьеи Vа1 Ьеи 385 390 395 400

А1а Рго Акр Акр Агд Зег Туг Ьук Зег О1п Туг Ьеи Акп Акп О1у Рго 405 410 415

О1п Агд Не О1у Агд Ьук Туг Ьук Ьук Vа1 Агд РЬе Ме! А1а Туг ТЬг 420 425 430

Акр О1и ТЬг РЬе Ьук ТЬг Агд О1и А1а Не О1п Шк О1и Зег О1у Не

- 133 028309

435 440 445

Ьеи С1у Рго Ьеи Ьеи Туг С1у С1и Уа1 С1у Акр ТЬг Ьеи Ьеи 11е 11е 450 455 460

РЬе Ьук Акп С1п А1а 8ег Агд Рго Туг Акп 11е Туг Рго Н1к С1у 11е 465 470 475 480

ТЬг Акр Уа1 Агд Рго Ьеи Туг 8ег Агд Агд Ьеи Рго Ьук С1у Уа1 Ьук 485 490 495

Н1к Ьеи Ьук Акр РЬе Рго 11е Ьеи Рго С1у С1и 11е РЬе Ьук Туг Ьук 500 505 510

Тгр ТЬг Уа1 ТЬг Уа1 С1и Акр С1у Рго ТЬг Ьук 8ег Акр Рго Агд Сук 515 520 525

Ьеи ТЬг Агд Туг Туг 8ег 8ег РЬе Уа1 Акп Ме! С1и Агд Акр Ьеи А1а 530 535 540

8ег С1у Ьеи 11е С1у Рго Ьеи Ьеи 11е Сук Туг Ьук С1и 8ег Уа1 Акр 545 550 555 560

С1п Агд С1у Акп С1п 11е Ме! 8ег Акр Ьук Агд Акп Уа1 11е Ьеи РЬе 565 570 575

8ег Уа1 РЬе Акр С1и Акп Агд 8ег Тгр Туг Ьеи ТЬг С1и Акп 11е С1п 580 585 590

Агд РЬе Ьеи Рго Акп Рго А1а С1у Уа1 С1п Ьеи С1и Акр Рго С1и РЬе 595 600 605

С1п А1а 8ег Акп 11е Ме! Н1к 8ег 11е Акп С1у Туг Уа1 РЬе Акр 8ег 610 615 620

Ьеи С1п Ьеи 8ег Уа1 Сук Ьеи Н1к С1и Уа1 А1а Туг Тгр Туг 11е Ьеи 625 630 635 640

8ег 11е С1у А1а С1п ТЬг Акр РЬе Ьеи 8ег Уа1 РЬе РЬе 8ег С1у Туг 645 650 655

ТЬг РЬе Ьук Н1к Ьук Ме! Уа1 Туг С1и Акр ТЬг Ьеи ТЬг Ьеи РЬе Рго 660 665 670

РЬе 8ег С1у С1и ТЬг Уа1 РЬе Ме! 8ег Ме! С1и Акп Рго С1у Ьеи Тгр 675 680 685

- 134 028309

11е Ьеи О1у Сук Ηίκ Акп Зег Акр РЬе Агд Акп Агд О1у Ме1 ТЬг А1а 690 695 700

Ьеи Ьеи Ьук Уа1 Зег Зег Сук Акр Ьук Акп ТЬг О1у Акр Туг Туг О1и 705 710 715 720

Акр Зег Туг О1и Акр 11е Зег А1а Туг Ьеи Ьеи Зег Ьук Акп Акп А1а 725 730 735

11е О1и Рго Агд Зег РЬе Зег О1п Акп Зег Агд ΗΕ Рго Зег ТЬг Агд 740 745 750

О1п Ьук О1п РЬе Акп А1а ТЬг ТЬг 11е Рго О1и Акп Акр 11е О1и Ьук 755 760 765

ТЬг Акр Рго Тгр РЬе А1а ΗΕ Агд ТЬг Рго Ме1 Рго Ьук 11е О1п Акп 770 775 780

Уа1 Зег Зег Зег Акр Ьеи Ьеи Ме1 Ьеи Ьеи Агд О1п Зег Рго ТЬг Рго 785 790 795 800

Шк О1у Ьеи Зег Ьеи Зег Акр Ьеи О1п О1и А1а Ьук Туг О1и ТЬг РЬе 805 810 815

Зег Акр Акр Рго Зег Рго О1у А1а 11е Акр Зег Акп Акп Зег Ьеи Зег 820 825 830

О1и Ме1 ТЬг Шк РЬе Агд Рго О1п Ьеи Шк Шк Зег О1у Акр Ме1 Уа1 835 840 845

РЬе ТЬг Рго О1и Зег О1у Ьеи О1п Ьеи Агд Ьеи Акп О1и Ьук Ьеи О1у 850 855 860

ТЬг ТЬг А1а А1а ТЬг О1и Ьеи Ьук Ьук Ьеи Акр РЬе Ьук Уа1 Зег Зег 865 870 875 880

ТЬг Зег Акп Акп Ьеи 11е Зег ТЬг 11е Рго Зег Акр Акп Ьеи А1а А1а 885 890 895

О1у ТЬг Акр Акп ТЬг Зег Зег Ьеи О1у Рго Рго Зег Ме1 Рго Уа1 Шк 900 905 910

Туг Акр Зег О1п Ьеи Акр ТЬг ТЬг Ьеи РЬе О1у Ьук Ьук Зег Зег Рго 915 920 925

Ьеи ТЬг О1и Зег О1у О1у Рго Ьеи Зег Ьеи Зег О1и О1и Акп Акп Акр

- 135 028309

930 935 940

Зег Ьуз Ьеи Ьеи О1и Зег О1у Ьеи Ме! Ази Зег О1и О1и Зег Зег Тгр 945 950 955 960

О1у Ьуз Ази Уа1 Зег Зег ТЬг О1и Зег О1у Агд Ьеи РЬе Ьуз О1у Ьуз 965 970 975

Агд А1а Шз О1у Рго А1а Ьеи Ьеи ТЬг Ьуз Азр Ази А1а Ьеи РЬе Ьуз 980 985 990

Уа1 Зег 11е Зег Ьеи Ьеи Ьуз ТЬг Ази Ьуз ТЬг Зег Ази Ази Зег А1а 995 1000 1005

ТЬг Ази Агд Ьуз ТЬг Шз 11е Азр О1у Рго Зег Ьеи Ьеи 11е О1и 1010 1015 1020

Ази Зег Рго Зег Уа1 Тгр О1и Ази 11е Ьеи О1и Зег Азр ТЬг О1и 1025 1030 1035

РЬе Ьуз Ьуз Уа1 ТЬг Рго Ьеи 11е Шз Азр Агд Ме! Ьеи Ме! Азр 1040 1045 1050

Ьуз Ази А1а ТЬг А1а Ьеи Агд Ьеи Ази Шз Ме! Зег Ази Ьуз ТЬг 1055 1060 1065

ТЬг Зег Зег Ьуз Ази Ме! О1и Ме! Уа1 О1и О1и Ьуз Ьуз О1и О1у 1070 1075 1080

Рго 11е Рго Рго Азр А1а О1и Ази Рго Азр Ме! Зег РЬе РЬе Ьуз 1085 1090 1095

Ме! Ьеи РЬе Ьеи Рго О1и Зег А1а Агд Тгр 11е О1и Агд ТЬг Шз 1100 1105 1110

О1у Ьуз Ази Зег Ьеи Ази Зег О1у О1и О1у Рго Зег Рго Ьуз О1и 1115 1120 1125

Ьеи Уа1 Зег Ьеи О1у Рго О1и Ьуз Зег Уа1 О1и О1у О1и Ази РЬе 1130 1135 1140

Ьеи Зег О1и Ьуз Ази Ьуз Уа1 Уа1 Уа1 О1у Ьуз О1у О1и РЬе ТЬг 1145 1150 1155

Ьуз Азр Уа1 О1у Ьеи Ьуз О1и Ме! Уа1 РЬе Рго Зег Зег Агд Ази 1160 1165 1170

- 136 028309

Ьеи РЬе Ьеи ТЬг А8п Ьеи А8р А8п Ьеи Н18 О1и А8п А8п ТЬг Н18 1175 1180 1185

А8п О1п О1и Ьу8 Ьу8 11е О1п О1и О1и 11е О1и Ьу8 Ьу8 О1и ТЬг 1190 1195 1200

Ьеи 11е О1п О1и А8п Уа1 Уа1 Ьеи Рго О1п 11е Н18 ТЬг Уа1 ТЬг 1205 1210 1215

О1у ТЬг Ьу8 А8п РЬе Ме! Ьу8 А8п Ьеи РЬе Ьеи Ьеи Зег ТЬг Агд 1220 1225 1230

О1п А8п Уа1 О1и О1у Зег Туг А8р О1у А1а Туг А1а Рго Уа1 Ьеи 1235 1240 1245

О1п А8р РЬе Агд Зег Ьеи А8п А8р Зег ТЬг А8п Агд ТЬг Ьу8 Ьу8 1250 1255 1260

Н18 ТЬг А1а Н18 РЬе Зег Ьу8 Ьу8 О1у О1и О1и О1и А8п Ьеи О1и 1265 1270 1275

О1у Ьеи О1у А8п О1п ТЬг Ьу8 О1п 11е Уа1 О1и Ьу8 Туг А1а Су8 1280 1285 1290

ТЬг ТЬг Агд 11е Зег Рго А8п ТЬг Зег О1п О1п А8п РЬе Уа1 ТЬг 1295 1300 1305

О1п Агд Зег Ьу8 Агд А1а Ьеи Ьу8 О1п РЬе Агд Ьеи Рго Ьеи О1и 1310 1315 1320

О1и ТЬг О1и Ьеи О1и Ьу8 Агд 11е 11е Уа1 А8р А8р ТЬг Зег ТЬг 1325 1330 1335

О1п Тгр Зег Ьу8 А8п Ме! Ьу8 Н18 Ьеи ТЬг Рго Зег ТЬг Ьеи ТЬг 1340 1345 1350

О1п 11е А8р Туг А8п О1и Ьу8 О1и Ьу8 О1у А1а 11е ТЬг О1п Зег 1355 1360 1365

Рго Ьеи Зег А8р Су8 Ьеи ТЬг Агд Зег Н18 Зег 11е Рго О1п А1а 1370 1375 1380

А8п Агд Зег Рго Ьеи Рго 11е А1а Ьу8 Уа1 Зег Зег РЬе Рго Зег 1385 1390 1395

11е Агд Рго 11е Туг Ьеи ТЬг Агд Уа1 Ьеи РЬе О1п А8р А8п Зег

- 137 028309

1400	1405	1410
Зег Шз	Ьеи Рго А1а А1а Зег	Туг Агд Ьуз Ьуз Азр Зег О1у ν;·ι1
1415	1420	1425
01п 01и	Зег Зег Шз РЬе Ьеи	01η О1у А1а Ьуз Ьуз Азп Азп Ьеи
1430	1435	1440
Зег Ьеи	А1а Не Ьеи ТЬг Ьеи	01и Ме1 ТЬг 01у Азр 01п Агд 01и
1445	1450	1455
νΗ1 01у	Зег Ьеи О1у ТЬг Зег А1а ТЬг Азп Зег Vа1 ТЬг Туг Ьуз
1460	1465	1470
Ьуз ν;·ι1	О1и Азп ТЬг ν;·ι1 Ьеи Рго Ьуз Рго Азр Ьеи Рго Ьуз ТЬг
1475	1480	1485

Зег 01у Ьуз ν;·ι1 01и Ьеи Ьеи Рго Ьуз Vа1 Шз Не Туг 01п Ьуз 1490 1495 1500

Азр Ьеи РЬе Рго ТЬг О1и ТЬг Зег Азп О1у Зег Рго О1у Шз Ьеи 1505 1510 1515

Азр Ьеи ν;·ι1 О1и О1у Зег Ьеи Ьеи 01п О1у ТЬг О1и О1у А1а Не 1520 1525 1530

Ьуз Тгр Азп О1и А1а Азп Агд Рго О1у Ьуз Vа1 Рго РЬе Ьеи Агд 1535 1540 1545 ν;·ι1 А1а ТЬг О1и Зег Зег А1а Ьуз ТЬг Рго Зег Ьуз Ьеи Ьеи Азр 1550 1555 1560

Рго Ьеи А1а Тгр Азр Азп Шз Туг О1у ТЬг 01п Не Рго Ьуз О1и 1565 1570 1575

О1и Тгр Ьуз Зег 01п О1и Ьуз Зег Рго О1и Ьуз ТЬг А1а РЬе Ьуз 1580 1585 1590

Ьуз Ьуз Азр ТЬг Не Ьеи Зег Ьеи Азп А1а Суз О1и Зег Азп Шз 1595 1600 1605

А1а Не А1а А1а Не Азп О1и О1у 01п Азп Ьуз Рго О1и Не О1и 1610 1615 1620 ν;·ι1 ТЬг Тгр А1а Ьуз 01п О1у Агд ТЬг О1и Агд Ьеи Суз Зег 01п 1625 1630 1635

- 138 028309

Азп Рго Рго Уа1 Ьеи Ьуз Агд Шз О1п Агд О1и 11е ТНг Агд ТНг 1640 1645 1650

ТНг Ьеи О1п Бег Азр О1п О1и О1и 11е Азр Туг Азр Азр ТНг 11е 1655 1660 1665

Бег Уа1 О1и Ме1 Ьуз Ьуз О1и Азр РНе Азр 11е Туг Азр О1и Азр 1670 1675 1680

О1и Азп О1п Бег Рго Агд Бег РНе О1п Ьуз Ьуз ТНг Агд Шз Туг 1685 1690 1695

РНе 11е А1а А1а Уа1 О1и Агд Ьеи Тгр Азр Туг О1у Ме1 Бег Бег 1700 1705 1710

Бег Рго Шз Уа1 Ьеи Агд Азп Агд А1а О1п Бег О1у Бег Уа1 Рго 1715 1720 1725

О1п РНе Ьуз Ьуз Уа1 Уа1 РНе О1п О1и РНе ТНг Азр О1у Бег РНе 1730 1735 1740

ТНг О1п Рго Ьеи Туг Агд О1у О1и Ьеи Азп О1и Шз Ьеи О1у Ьеи 1745 1750 1755

Ьеи О1у Рго Туг 11е Агд А1а О1и Уа1 О1и Азр Азп 11е Ме1 Уа1 1760 1765 1770

ТНг РНе Агд Азп О1п А1а Бег Агд Рго Туг Бег РНе Туг Бег Бег 1775 1780 1785

Ьеи 11е Бег Туг О1и О1и Азр О1п Агд О1п О1у А1а О1и Рго Агд 1790 1795 1800

Ьуз Азп РНе Уа1 Ьуз Рго Азп О1и ТНг Ьуз ТНг Туг РНе Тгр Ьуз 1805 1810 1815

Уа1 О1п Шз Шз Ме1 А1а Рго ТНг Ьуз Азр О1и РНе Азр Суз Ьуз 1820 1825 1830

А1а Тгр А1а Туг РНе Бег Азр Уа1 Азр Ьеи О1и Ьуз Азр Уа1 Шз 1835 1840 1845

Бег О1у Ьеи 11е О1у Рго Ьеи Ьеи Уа1 Суз Шз ТНг Азп ТНг Ьеи 1850 1855 1860

Азп Рго А1а Шз О1у Агд О1п Уа1 ТНг Уа1 О1п О1и РНе А1а Ьеи

- 139 028309

1865 1870 1875

РЬе РЬе ТЬг Не РЬе Азр С1и ТЬг Ьуз 8ег Тгр Туг РЬе ТЬг С1и 1880 1885 1890

Азп Ме1 С1и Агд Азп Суз Агд А1а Рго Суз Азп Не С1п Ме1 С1и 1895 1900 1905

Азр Рго ТЬг РЬе Ьуз С1и Азп Туг Агд РЬе Шз А1а Не Азп С1у 1910 1915 1920

Туг Не Ме1 Азр ТЬг Ьеи Рго С1у Ьеи Vа1 Ме1 А1а С1п Азр С1п 1925 19З0 19З5

Агд Не Агд Тгр Туг Ьеи Ьеи 8ег Ме1 С1у 8ег Азп С1и Азп Не 1940 1945 1950

Шз 8ег Не Шз РЬе 8ег С1у Шз Vа1 РЬе ТЬг Vа1 Агд Ьуз Ьуз 1955 1960 1965

С1и С1и Туг Ьуз Ме1 А1а Ьеи Туг Азп Ьеи Туг Рго С1у Vа1 РЬе 1970 1975 1980

С1и ТЬг Vа1 С1и Ме1 Ьеи Рго 8ег Ьуз А1а С1у Не Тгр Агд Vа1 1985 1990 1995

С1и Суз Ьеи Не С1у С1и Шз Ьеи Шз А1а С1у Ме1 §ег ТЬг Ьеи 2000 2005 2010

РЬе Ьеи Vа1 Туг §ег Азп Ьуз Суз С1п ТЬг Рго Ьеи С1у Ме1 А1а 2015 2020 2025

8ег С1у Шз Не Агд Азр РЬе С1п Не ТЬг А1а 8ег С1у С1п Туг 20З0 20З5 2040

С1у С1п Тгр А1а Рго Ьуз Ьеи А1а Агд Ьеи Шз Туг §ег С1у 8ег 2045 2050 2055

Не Азп А1а Тгр §ег ТЬг Ьуз С1и Рго РЬе 8ег Тгр Не Ьуз Vа1 2060 2065 2070

Азр Ьеи Ьеи А1а Рго Ме1 Не Не Шз С1у Не Ьуз ТЬг С1п С1у 2075 2080 2085

А1а Агд С1п Ьуз РЬе 8ег §ег Ьеи Туг Не 8ег С1п РЬе Не Не 2090 2095 2100

- 140 028309

Ме1 Туг §ег Ьеи Акр С1у Ьук Ьук Тгр С1п ТЬг Туг Агд С1у Акп 2105 2110 2115

8ег ТЬг С1у ТЬг Ьеи Ме1 Уа1 РЬе РЬе С1у Акп Уа1 Акр 8ег §ег 2120 2125 2130

С1у 11е Ьук Нк Акп 11е РЬе Акп Рго Рго 11е 11е А1а Агд Туг 2135 2140 2145

11е Агд Ьеи Нк Рго ТЬг Нк Туг §ег 11е Агд §ег ТЬг Ьеи Агд 2150 2155 2160

Ме1 С1и Ьеи Ме1 С1у Сук Акр Ьеи Акп §ег Сук 8ег Ме1 Рго Ьеи 2165 2170 2175

С1у Ме1 С1и 8ег Ьук А1а 11е 8ег Акр А1а С1п 11е ТЬг А1а 8ег 2180 2185 2190 §ег Туг РЬе ТЬг Акп Ме1 РЬе А1а ТЬг Тгр §ег Рго 8ег Ьук А1а 2195 2200 2205

Агд Ьеи Нк Ьеи С1п С1у Агд §ег Акп А1а Тгр Агд Рго С1п Уа1 2210 2215 2220

Акп Акп Рго Ьук С1и Тгр Ьеи С1п Уа1 Акр РЬе С1п Ьук ТЬг Ме1 2225 2230 2235

Ьук Уа1 ТЬг С1у Уа1 ТЬг ТЬг С1п С1у Уа1 Ьук 8ег Ьеи Ьеи ТЬг 2240 2245 2250

8ег Ме1 Туг Уа1 Ьук С1и РЬе Ьеи 11е 8ег §ег §ег С1п Акр С1у 2255 2260 2265

Нк С1п Тгр ТЬг Ьеи РЬе РЬе С1п Акп С1у Ьук Уа1 Ьук Уа1 РЬе 2270 2275 2280

С1п С1у Акп С1п Акр 8ег РЬе ТЬг Рго Уа1 Уа1 Акп §ег Ьеи Акр 2285 2290 2295

Рго Рго Ьеи Ьеи ТЬг Агд Туг Ьеи Агд 11е Нк Рго С1п §ег Тгр 2300 2305 2310

Уа1 Нк С1п 11е А1а Ьеи Агд Ме1 С1и Уа1 Ьеи С1у Сук С1и А1а 2315 2320 2325

С1п Акр Ьеи Туг

- 141 028309

2330 <210> 17 <211> 7053 <212> ДНК <213> Ното зар1епз <400> 17 а1дсааа1ад адс1с1ссас с1дс11с111 с1д1дсс111 1дсда11с1д с111ад1дсс 60 ассадаада! ас1асс1ддд 1дсад1ддаа с1д1са1ддд ас1а1а1дса аад1да1с1с 120 дд1дадс1дс с1д1ддасдс аадаШсс! сс1адад1дс саааайШ йсайсаас 180 асс1сад1сд 1д1асааааа дас1с1д111 д1адаа11са сдда1сасс1 111сааса1с 240 дс1аадссаа ддссассс1д да1ддд1с1д с1адд1сс1а сса1ссаддс 1дадд111а1 300 да1асад1дд 1са11асас1 1аадааса1д дс11ссса1с с1д1сад1с1 1са1дс1д11 360 дд1д1а1сс1 ас1ддааадс 11с1даддда дс1даа1а1д а1да1садас сад1сааадд 420 дадааадаад а1да1ааад1 с11ссс1дд1 ддаадсса1а са1а1д1с1д дсадд1сс1д 480 ааададаа1д д1ссаа1ддс с1с1дассса с1д1дсс11а сс1ас1са1а 1с111с1са1 540 д1ддасс1дд 1аааадас11 даа11саддс с1са11ддад ссс1ас1ад1 а1д1ададаа 600 дддад1с1дд ссааддаааа дасасадасс 11дсасааа1 11а1ас1ас1 1111дс1д1а 660

111да1даад ддаааад11д дсас1садаа асааадаас1 сс11да1дса дда1аддда1 720 дс1дса1с1д с1сдддсс1д дсс1аааа1д сасасад1са а1дд11а1д1 ааасадд1с1 780 с1дссадд1с 1да11дда1д ссасаддааа 1сад1с1а11 ддса1д1да1 1ддаа1дддс 840 ассас1сс1д аад1дсас1с аа1а11сс1с даадд1саса са111с11д1 даддаасса1 900 сдссаддсд1 сс11ддааа1 с1сдссаа1а ас111сс11а с1дс1сааас ас1с11да1д 960 дассНддас адШс1ас1 дШ1д1са1 айййссс ассааса1да 1ддса1ддаа 1020 дсПа1д1са аад1адасад с1д1ссадад даассссаас 1асдаа1даа ааа1аа1даа 1080 даадсддаад ас1а1да1да 1да1с11ас1 дайс1дааа 1дда1д1дд1 саддШда! 1140 да1дасаас1 сйсйссй 1а1ссааай сдсйадйд ссаадаадса 1сс1аааас1 1200

1ддд1аса11 аса11дс1дс (даададдад дас1дддас1 а1дс1ссс11 адйсйдсс 1260 сссда1даса даадПаЫа аадйаайИ 11даасаа1д дсссйадсд дайддйдд 1320 аадЫсаааа аадйсдай 1а1ддса1ас асада1дааа ссШаадас 1сд1даадс1 1380 айсадса1д аайаддаа! сНдддасс! НасШа1д дддаадйдд адасасас1д 1440

Нда11а1а1 Паадаайа адсаадсада ссакИааса 1с1ассс1са сддаайас! 1500 да1д1ссд1с сШдЬШс ааддадайа ссаааадд1д 1аааасаШ дааддайИ 1560 ссаа11с1дс саддадааа! ;Шсааа1а1 ааа1ддасад 1дас1д1ада ада1дддсса 1620

- 142 028309 ас!ааа!сад а!сс!сдд!д сс!дасссдс !а!!ас!с!а д!!!сд!!аа !а!ддадада 1680 да!с!адс!! саддас!са! !ддссс!с!с с!са!с!дс! асааадаа!с !д!ада!саа 1740 ададдааасс ада!аа!д!с адасаададд аа!д!са!сс !д!!!!с!д! а!!!да!дад 1800 аассдаадс! дд!асс!сас ададаа!а!а саасдс!!!с !ссссаа!сс адс!ддад!д 1860 садс!!дадд а!ссадад!! ссаадсс!сс ааса!са!дс асадса!саа !ддс!а!д!! 1920 !!!да!ад!! !дсад!!д!с ад!!!д!!!д са!дадд!дд са!ас!дд!а са!!с!аадс 1980 а!!ддадсас адас!дас!! сс!!!с!д!с !!с!!с!с!д да!а!асс!! сааасасааа 2040 а!дд!с!а!д аадасасас! сассс!а!!с сса!!с!сад дадааас!д! с!!са!д!сд 2100 а!ддаааасс садд!с!а!д да!!с!дддд !дссасаас! садас!!!сд даасададдс 2160 а!дассдсс! !ас!даадд! !!с!ад!!д! дасаадааса с!дд!да!!а !!асдаддас 2220 ад!!а!даад а!а!!!садс а!ас!!дс!д ад!аааааса а!дсса!!да ассаадаадс 2280 !!с!сссада а!!саадаса ссс!адсас! аддсаааадс аа!!!аа!дс сассасаа!! 2340 ссадаааа!д аса!ададаа дас!дассс! !дд!!!дсас асадаасасс !а!дсс!ааа 2400 а!асаааа!д !с!сс!с!ад !да!!!д!!д а!дс!с!!дс дасадад!сс !ас!ссаса! 2460 дддс!а!сс! !а!с!да!с! ссаадаадсс ааа!а!дада с!!!!!с!да !да!сса!са 2520 сс!ддадсаа !адасад!аа !аасадсс!д !с!дааа!да сасас!!сад дссасадс!с 2580 са!сасад!д дддаса!дд! а!!!асссс! дад!саддсс !ссаа!!аад а!!ааа!дад 2640 ааас!дддда саас!дсадс аасадад!!д аадааас!!д а!!!сааад! !!с!ад!аса 2700 !сааа!аа!с !да!!!саас аа!!сса!са дасаа!!!дд садсадд!ас !да!аа!аса 2760 ад!!сс!!ад дасссссаад !а!дссад!! са!!а!да!а д!саа!!ада !ассас!с!а 2820 !!!ддсаааа ад!са!с!сс сс!!ас!дад !с!дд!ддас с!с!дадс!! дад!даадаа 2880 аа!аа!да!! сааад!!д!! адаа!садд! !!аа!даа!а дссаадааад !!са!дддда 2940 ааааа!д!а! сд!саасада дад!дд!адд !!а!!!ааад ддаааададс !са!ддасс! 3000 дс!!!д!!да с!ааада!аа !дсс!!а!!с ааад!!адса !с!с!!!д!! ааадасааас 3060 аааас!!сса а!аа!!садс аас!аа!ада аадас!саса !!да!ддссс а!са!!а!!а 3120 а!!дадаа!а д!сса!сад! с!ддсаааа! а!а!!адааа д!дасас!да д!!!аааааа 3180 д!дасасс!! !да!!са!да садаа!дс!! а!ддасаааа а!дс!асадс !!!даддс!а 3240 аа!са!а!д! сааа!аааас !ас!!са!са аааааса!дд ааа!дд!сса асадаааааа 3300 дадддсссса !!ссассада !дсасаааа! ссада!а!д! сд!!с!!!аа да!дс!а!!с 3360 !!дссадаа! садсаадд!д да!асааадд ас!са!ддаа адаас!с!с! даас!с!ддд 3420 сааддсссса д!ссааадса а!!ад!а!сс !!аддассад ааааа!с!д! ддаадд!сад 3480

- 143 028309 аа!!!с!!д! с!дадааааа сааад!дд!а д!аддааадд д!даа!!!ас аааддасд!а 3540 ддас!сааад ада!дд!!!! !ссаадсадс адааасс!а! !!с!!ас!аа с!!дда!аа! 3600 !!аса!дааа а!аа!асаса саа!саадаа ааааааа!!с аддаадааа! адаааадаад 3660 даааса!!аа !ссаададаа !д!ад!!!!д сс!сада!ас а!асад!дас !ддсас!аад 3720 аа!!!са!да адаасс!!!! с!!ас!дадс ас!аддсааа а!д!адаадд !!са!а!дас 3780 ддддса!а!д с!ссад!ас! !саада!!!! адд!са!!аа а!да!!саас ааа!адааса 3840 аадааасаса садс!са!!! с!сааааааа ддддаддаад аааас!!дда аддс!!ддда 3900 аа!сааасса адсааа!!д! ададааа!а! дса!дсасса саадда!а!с !сс!аа!аса 3960 адссадсада а!!!!д!сас дсаасд!ад! аадададс!! !дааасаа!! садас!ссса 4020 с!адаадааа садаас!!да ааааадда!а а!!д!дда!д асасс!саас ссад!дд!сс 4080 аааааса!да ааса!!!дас сссдадсасс с!сасасада !адас!асаа !дадааддад 4140 аааддддсса !!ас!сад!с !ссс!!а!са да!!дсс!!а сдаддад!са !адса!ссс! 4200 саадсааа!а да!с!сса!! ассса!!дса аадд!а!са! са!!!сса!с !а!!адасс! 4260 а!а!а!с!да ссаддд!сс! а!!ссаадас аас!с!!с!с а!с!!ссадс адса!с!!а! 4320 адааадааад а!!с!дддд! ссаадааадс ад!са!!!с! !асааддадс саааааааа! 4380 аасс!!!с!! !адсса!!с! аасс!!ддад а!дас!дд!д а!сааадада дд!!ддс!сс 4440 с!ддддасаа д!дссасааа !!сад!саса !асаадааад !!дадаасас !д!!с!сссд 4500 ааассадас! !дсссаааас а!с!ддсааа д!!даа!!дс !!ссаааад! !саса!!!а! 4560 садааддасс !а!!ссс!ас ддааас!адс аа!ддд!с!с с!ддсса!с! дда!с!сд!д 4620 даадддадсс !!с!!саддд аасададдда дсда!!аад! ддаа!даадс ааасадасс! 4680 ддаааад!!с сс!!!с!дад ад!адсааса дааадс!с!д сааадас!сс с!ссаадс!а 4740 !!дда!сс!с !!дс!!ддда !аассас!а! дд!ас!сада !ассаааада адад!ддааа 4800 !сссаадада ад!сассада ааааасадс! !!!аадаааа адда!асса! !!!д!ссс!д 4860 аасдс!!д!д ааадсаа!са !дсаа!адса дсаа!ааа!д адддасаааа !аадсссдаа 4920 а!адаад!са сс!дддсааа дсаадд!адд ас!даааддс !д!дс!с!са ааасссасса 4980 д!с!!дааас дсса!саасд ддааа!аас! сд!ас!ас!с !!сад!сада !саададдаа 5040 а!!дас!а!д а!да!асса! а!сад!!даа а!даадаадд аадаййда са!йа!да! 5100 дадда!дааа а!сададссс ссдсадс!!! саааадаааа сасдасас!а ййайдс! 5160 дсад!ддада ддс!с!ддда !!а!ддда!д ад!адс!ссс саса!д!!с! аадааасадд 5220 дс!садад!д дсад!д!ссс !сад!!саад ааад!!д!!! !ссаддаа!! !ас!да!ддс 5280 !сс!!!ас!с адссс!!а!а ссд!ддадаа с!ааа!даас а!!!дддас! сс!ддддсса 5340

- 144 028309 !а!а!аадад садаад!!да ада!аа!а!с а!дд!аас!! !садааа!са ддсс!с!сд! 5400 ссс!а!!сс! !с!а!!с!ад сс!!а!!!с! !а!даддаад а!сададдса аддадсадаа 5460 сс!адааааа ас!!!д!саа дсс!аа!даа ассаааас!! ас!!!!ддаа ад!дсааса! 5520 са!а!ддсас ссас!ааада !дад!!!дас !дсааадсс! дддс!!а!!! с!с!да!д!! 5580 дасс!ддааа аада!д!дса с!саддсс!д а!!ддасссс !!с!дд!с!д ссасас!аас 5640 асас!даасс с!дс!са!дд дадасаад!д асад!асадд аа!!!дс!с! д!!!!!сасс 5700 а!с!!!да!д адассаааад с!дд!ас!!с ас!даааа!а !ддааадааа с!дсадддс! 5760 ссс!дсаа!а !ссада!дда ада!сссас! !!!ааадада а!!а!сдс!! сса!дсаа!с 5820 аа!ддс!аса !аа!дда!ас ас!асс!ддс !!ад!аа!дд с!садда!са аадда!!сда 5880 !дд!а!с!дс !садса!ддд садсаа!даа ааса!сса!! с!а!!са!!! сад!ддаса! 5940 д!д!!сас!д !асдаааааа ададдад!а! аааа!ддсас !д!асаа!с! с!а!ссадд! 6000 д!!!!!дада сад!ддааа! д!!асса!сс ааадс!ддаа !!!ддсддд! ддаа!дсс!! 6060 а!!ддсдадс а!с!аса!дс !ддда!дадс асас!!!!!с !дд!д!асад саа!аад!д! 6120 садас!сссс !дддаа!ддс !!с!ддасас а!!адада!! !!сада!!ас адс!!садда 6180 саа!а!ддас ад!дддсссс ааадс!ддсс адас!!са!! а!!ссдда!с аа!саа!дсс 6240 !ддадсасса аддадссс!! !!с!!дда!с аадд!дда!с !д!!ддсасс аа!дайа!1 6300 сасддса!са адасссаддд !дсссд!сад аад!!с!сса дсс!с!аса! с!с!сад!!! 6360 а!са!са!д! а!ад!с!!да !дддаадаад !ддсадас!! а!сдаддааа !!ссас!дда 6420 асс!!аа!дд !с!!с!!!дд саа!д!дда! !са!с!ддда !аааасасаа !а!!!!!аас 6480 сс!ссаа!!а !!дс!сда!а са!ссд!!!д сасссаас!с а!!а!адса! !сдсадсас! 6540 с!!сдса!дд ад!!да!ддд с!д!да!!!а аа!ад!!дса дса!дсса!! дддаа!ддад 6600 ад!ааадсаа !а!сада!дс асада!!ас! дс!!са!сс! ас!!!ассаа !а!д!!!дсс 6660 асс!дд!с!с с!!саааадс !сдас!!сас с!ссааддда ддад!аа!дс с!ддадасс! 6720 садд!даа!а а!ссаааада д!ддс!дсаа д!ддас!!сс адаадасаа! дааад!саса 6780 ддад!аас!а с!садддад! аааа!с!с!д с!!ассадса !д!а!д!даа ддад!!сс!с 6840 а!с!ссадса д!саада!дд сса!сад!дд ас!с!с!!!! !!садаа!дд сааад!ааад 6900 д!!!!!садд дааа!саада с!сс!!саса сс!д!дд!да ас!с!с!ада сссассд!!а 6960 с!дас!сдс! асс!!сдаа! !сасссссад ад!!ддд!дс ассада!!дс сс!дадда!д 7020 дадд!!с!дд дс!дсдаддс асаддасс!с !ас 7053 <210> 18 <211> 1438

- 145 028309 <212> Белок <213> Искусственная <220>

<223> ФУШ с удаленным В-доменом <400> 18

А1а ТЬг Агд Агд Туг Туг Ьеи О1у А1а Уа1 О1и Ьеи 8ег Тгр Акр Туг 1 5 10 15

Ме1 О1п 8ег Акр Ьеи О1у О1и Ьеи Рго Уа1 Акр А1а Агд РЬе Рго Рго 20 25 30

Агд Уа1 Рго Ьук 8ег РЬе Рго РЬе Акп ТЬг 8ег Уа1 Уа1 Туг Ьук Ьук 35 40 45

ТЬг Ьеи РЬе Уа1 О1и РЬе ТЬг Акр Шк Ьеи РЬе Акп 11е А1а Ьук Рго 50 55 60

Туг Акр ТЬг Уа1 Уа1 11е ТЬг Ьеи Ьук Акп Ме1 А1а 8ег Шк Рго Уа1 85 90 95

8ег Ьеи Шк А1а Уа1 О1у Уа1 8ег Туг Тгр Ьук А1а 8ег О1и О1у А1а 100 105 110

О1и Туг Акр Акр О1п ТЬг 8ег О1п Агд О1и Ьук О1и Акр Акр Ьук Уа1 115 120 125

РЬе Рго О1у О1у 8ег Шк ТЬг Туг Уа1 Тгр О1п Уа1 Ьеи Ьук О1и Акп 130 135 140

О1у Рго Ме1 А1а 8ег Акр Рго Ьеи Сук Ьеи ТЬг Туг 8ег Туг Ьеи 8ег 145 150 155 160

Шк Уа1 Акр Ьеи Уа1 Ьук Акр Ьеи Акп 8ег О1у Ьеи 11е О1у А1а Ьеи 165 170 175

Ьеи Уа1 Сук Агд О1и О1у 8ег Ьеи А1а Ьук О1и Ьук ТЬг О1п ТЬг Ьеи 180 185 190

Шк Ьук РЬе 11е Ьеи Ьеи РЬе А1а Уа1 РЬе Акр О1и О1у Ьук 8ег Тгр 195 200 205

Шк 8ег О1и ТЬг Ьук Акп 8ег Ьеи Ме1 О1п Акр Агд Акр А1а А1а 8ег 210 215 220

- 146 028309

А1а Агд А1а Тгр Рго Ьуз Ме1 Шз ТНг Уа1 Азп О1у Туг Уа1 Азп Агд 225 230 235 240

Бег Ьеи Рго О1у Ьеи 11е О1у Суз Шз Агд Ьуз Бег Уа1 Туг Тгр Шз 245 250 255

Уа1 11е О1у Ме1 О1у ТНг ТНг Рго О1и Уа1 Шз Бег 11е РНе Ьеи О1и 260 265 270

О1у Шз ТНг РНе Ьеи Уа1 Агд Азп Шз Агд О1п А1а Бег Ьеи О1и 11е 275 280 285

Бег Рго 11е ТНг РНе Ьеи ТНг А1а О1п ТНг Ьеи Ьеи Ме1 Азр Ьеи О1у 290 295 300

О1п РНе Ьеи Ьеи РНе Суз Шз 11е Бег Бег Шз О1п Шз Азр О1у Ме1 305 310 315 320

О1и А1а Туг Уа1 Ьуз Уа1 Азр Бег Суз Рго О1и О1и Рго О1п Ьеи Агд 325 330 335

Ме1 Ьуз Азп Азп О1и О1и А1а О1и Азр Туг Азр Азр Азр Ьеи ТНг Азр 340 345 350

Бег О1и Ме1 Азр Уа1 Уа1 Агд РНе Азр Азр Азр Азп Бег Рго Бег РНе 355 360 365

11е О1п 11е Агд Бег Уа1 А1а Ьуз Ьуз Шз Рго Ьуз ТНг Тгр Уа1 Шз 370 375 380

Туг 11е А1а А1а О1и О1и О1и Азр Тгр Азр Туг А1а Рго Ьеи Уа1 Ьеи 385 390 395 400

А1а Рго Азр Азр Агд Бег Туг Ьуз Бег О1п Туг Ьеи Азп Азп О1у Рго 405 410 415

О1п Агд 11е О1у Агд Ьуз Туг Ьуз Ьуз Уа1 Агд РНе Ме1 А1а Туг ТНг 420 425 430

Азр О1и ТНг РНе Ьуз ТНг Агд О1и А1а 11е О1п Шз О1и Бег О1у 11е 435 440 445

Ьеи О1у Рго Ьеи Ьеи Туг О1у О1и Уа1 О1у Азр ТНг Ьеи Ьеи 11е 11е 450 455 460

- 147 028309

РЬе Ьук Акп О1п А1а Зег Агд Рго Туг Акп 11е Туг Рго Шк О1у 11е 465 470 475 480

ТЬг Акр Уа1 Агд Рго Ьеи Туг Зег Агд Агд Ьеи Рго Ьук О1у Уа1 Ьук 485 490 495

Шк Ьеи Ьук Акр РЬе Рго 11е Ьеи Рго О1у О1и 11е РЬе Ьук Туг Ьук 500 505 510

Тгр ТЬг Уа1 ТЬг Уа1 О1и Акр О1у Рго ТЬг Ьук Зег Акр Рго Агд Сук 515 520 525

Ьеи ТЬг Агд Туг Туг Зег Зег РЬе Уа1 Акп МеХ О1и Агд Акр Ьеи А1а 530 535 540

Зег О1у Ьеи 11е О1у Рго Ьеи Ьеи 11е Сук Туг Ьук О1и Зег Уа1 Акр 545 550 555 560

О1п Агд О1у Акп О1п 11е МеХ Зег Акр Ьук Агд Акп Уа1 11е Ьеи РЬе 565 570 575

Зег Уа1 РЬе Акр О1и Акп Агд Зег Тгр Туг Ьеи ТЬг О1и Акп 11е О1п 580 585 590

Агд РЬе Ьеи Рго Акп Рго А1а О1у Уа1 О1п Ьеи О1и Акр Рго О1и РЬе 595 600 605

О1п А1а Зег Акп 11е МеХ Шк Зег 11е Акп О1у Туг Уа1 РЬе Акр Зег 610 615 620

Ьеи О1п Ьеи Зег Уа1 Сук Ьеи Шк О1и Уа1 А1а Туг Тгр Туг 11е Ьеи 625 630 635 640

Зег 11е О1у А1а О1п ТЬг Акр РЬе Ьеи Зег Уа1 РЬе РЬе Зег О1у Туг 645 650 655

ТЬг РЬе Ьук Шк Ьук МеХ Уа1 Туг О1и Акр ТЬг Ьеи ТЬг Ьеи РЬе Рго 660 665 670

РЬе Зег О1у О1и ТЬг Уа1 РЬе МеХ Зег МеХ О1и Акп Рго О1у Ьеи Тгр 675 680 685

11е Ьеи О1у Сук Шк Акп Зег Акр РЬе Агд Акп Агд О1у МеХ ТЬг А1а 690 695 700

- 148 028309

Азр Зег Туг 01и Азр Не Зег А1а Туг Ьеи Ьеи Зег Ьуз Азп Азп А1а 725 730 735

Не 01и Рго Агд Зег РЬе Зег 01п Азп Рго Рго Vа1 Ьеи Ьуз Агд Шз 740 745 750

01п Агд 01и Не ТЬг Агд ТЬг ТЬг Ьеи 01п Зег Азр 01п 01и 01и Не 755 760 765

Азр Туг Азр Азр ТЬг Не Зег ν;·ι1 01и Ме1 Ьуз Ьуз 01и Азр РЬе Азр 770 775 780

Не Туг Азр 01и Азр 01и Азп 01п Зег Рго Агд Зег РЬе 01п Ьуз Ьуз 785 790 795 800

ТЬг Агд Шз Туг РЬе Не А1а А1а Vа1 01и Агд Ьеи Тгр Азр Туг 01у 805 810 815

Ме1 Зег Зег Зег Рго Шз Vа1 Ьеи Агд Азп Агд А1а 01п Зег 01у Зег 820 825 830 ν;·ι1 Рго 01п РЬе Ьуз Ьуз Vа1 ν;·ι1 РЬе 01п 01и РЬе ТЬг Азр 01у Зег 835 840 845

РЬе ТЬг 01п Рго Ьеи Туг Агд 01у 01и Ьеи Азп 01и Шз Ьеи 01у Ьеи 850 855 860

Ьеи 01у Рго Туг Не Агд А1а 01и ν;·ι1 01и Азр Азп Не Ме1 Vа1 ТЬг 865 870 875 880

РЬе Агд Азп 01п А1а Зег Агд Рго Туг Зег РЬе Туг Зег Зег Ьеи Не 885 890 895

Зег Туг 01и 01и Азр 01п Агд 01п 01у А1а 01и Рго Агд Ьуз Азп РЬе 900 905 910 ν;·ι1 Ьуз Рго Азп 01и ТЬг Ьуз ТЬг Туг РЬе Тгр Ьуз Vа1 01п Шз Шз 915 920 925

Ме1 А1а Рго ТЬг Ьуз Азр 01и РЬе Азр Суз Ьуз А1а Тгр А1а Туг РЬе 930 935 940

Зег Азр Vа1 Азр Ьеи 01и Ьуз Азр Vа1 Шз Зег 01у Ьеи Не 01у Рго 945 950 955 960

- 149 028309

Ьеи Ьеи Уа1 Суз Шз ТЬг Ази ТЬг Ьеи Ази Рго А1а Шз С1у Агд С1и 965 970 975

Уа1 ТЬг Уа1 С1и С1и РЬе А1а Ьеи РЬе РЬе ТЬг 11е РЬе Азр С1и ТЬг 980 985 990

Ьуз Зег Тгр Туг РЬе ТЬг С1и Ази Ме! С1и Агд Ази Суз Агд А1а Рго 995 1000 1005

Суз Ази 11е С1и Ме! С1и Азр Рго ТЬг РЬе Ьуз С1и Ази Туг Агд 1010 1015 1020

РЬе Шз А1а 11е Ази С1у Туг 11е Ме! Азр ТЬг Ьеи Рго С1у Ьеи 1025 1030 1035

Уа1 Ме! А1а С1и Азр С1и Агд 11е Агд Тгр Туг Ьеи Ьеи Зег Ме! 1040 1045 1050

С1у Зег Ази С1и Ази 11е Шз Зег 11е Шз РЬе Зег С1у Шз Уа1 1055 1060 1065

РЬе ТЬг Уа1 Агд Ьуз Ьуз С1и С1и Туг Ьуз Ме! А1а Ьеи Туг Ази 1070 1075 1080

Ьеи Туг Рго С1у Уа1 РЬе С1и ТЬг Уа1 С1и Ме! Ьеи Рго Зег Ьуз 1085 1090 1095

А1а С1у 11е Тгр Агд Уа1 С1и Суз Ьеи 11е С1у С1и Шз Ьеи Шз 1100 1105 1110

А1а С1у Ме! Зег ТЬг Ьеи РЬе Ьеи Уа1 Туг Зег Ази Ьуз Суз С1и 1115 1120 1125

ТЬг Рго Ьеи С1у Ме! А1а Зег С1у Шз 11е Агд Азр РЬе С1и 11е 1130 1135 1140

ТЬг А1а Зег С1у С1и Туг С1у С1и Тгр А1а Рго Ьуз Ьеи А1а Агд 1145 1150 1155

Ьеи Шз Туг Зег С1у Зег 11е Ази А1а Тгр Зег ТЬг Ьуз С1и Рго 1160 1165 1170

РЬе Зег Тгр 11е Ьуз Уа1 Азр Ьеи Ьеи А1а Рго Ме! 11е 11е Шз 1175 1180 1185

С1у 11е Ьуз ТЬг С1и С1у А1а Агд С1и Ьуз РЬе Зег Зег Ьеи Туг 1190 1195 1200

- 150 028309

11е Зег О1п РЬе 11е 11е Ме! Туг Зег Ьеи А8р О1у Ьу8 Ьу8 Тгр 1205 1210 1215

О1п ТЬг Туг Агд О1у А8п Зег ТЬг О1у ТЬг Ьеи Ме! Уа1 РЬе РЬе 1220 1225 1230

О1у А8п Уа1 А8р Зег Зег О1у 11е Ьу8 Н18 А8п 11е РЬе А8п Рго 1235 1240 1245

Рго 11е 11е А1а Агд Туг 11е Агд Ьеи Н18 Рго ТЬг Н18 Туг Зег 1250 1255 1260

11е Агд Зег ТЬг Ьеи Агд Ме! О1и Ьеи Ме! О1у Су8 А8р Ьеи А8п 1265 1270 1275

Зег Су8 Зег Ме! Рго Ьеи О1у Ме! О1и Зег Ьу8 А1а 11е Зег А8р 1280 1285 1290

А1а О1п 11е ТЬг А1а Зег Зег Туг РЬе ТЬг А8п Ме! РЬе А1а ТЬг 1295 1300 1305

Тгр Зег Рго Зег Ьу8 А1а Агд Ьеи Н18 Ьеи О1п О1у Агд Зег А8п 1310 1315 1320

А1а Тгр Агд Рго О1п Уа1 А8п А8п Рго Ьу8 О1и Тгр Ьеи О1п Уа1 1325 1330 1335

А8р РЬе О1п Ьу8 ТЬг Ме! Ьу8 Уа1 ТЬг О1у Уа1 ТЬг ТЬг О1п О1у 1340 1345 1350

Уа1 Ьу8 Зег Ьеи Ьеи ТЬг Зег Ме! Туг Уа1 Ьу8 О1и РЬе Ьеи 11е 1355 1360 1365

Зег Зег Зег О1п А8р О1у Н18 О1п Тгр ТЬг Ьеи РЬе РЬе О1п А8п 1370 1375 1380

О1у Ьу8 Уа1 Ьу8 Уа1 РЬе О1п О1у А8п О1п А8р Зег РЬе ТЬг Рго 1385 1390 1395

Уа1 Уа1 А8п Зег Ьеи А8р Рго Рго Ьеи Ьеи ТЬг Агд Туг Ьеи Агд 1400 1405 1410

11е Н18 Рго О1п Зег Тгр Уа1 Н18 О1п 11е А1а Ьеи Агд Ме! О1и 1415 1420 1425

- 151 028309

Уа1 Ьеи С1у Сук С1и А1а С1п Акр Ьеи Туг 1430 1435 <210> 19 <211> 4371 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> ФУШ с удаленным В-доменом <400> 19 а!дсааа!ад адс!с!ссас с!дс!!с!!! с!д!дсс!!! !дсда!!с!д с!!!ад!дсс 60 ассадаада! ас!асс!ддд !дсад!ддаа с!д!са!ддд ас!а!а!дса аад!да!с!с 120 дд!дадс!дс с!д!ддасдс аада!!!сс! сс!адад!дс саааа!с!!! !сса!!саас 180 асс!сад!сд !д!асааааа дас!с!д!!! д!адаа!!са сдда!сасс! !!!сааса!с 240 дс!аадссаа ддссассс!д да!ддд!с!д с!адд!сс!а сса!ссаддс !дадд!!!а! 300 да!асад!дд !са!!асас! !аадааса!д дс!!ссса!с с!д!сад!с! !са!дс!дй 360 дд!д!а!сс! ас!ддааадс !!с!даддда дс!даа!а!д а!да!садас сад!сааадд 420 дадааадаад а!да!ааад! с!!ссс!дд! ддаадсса!а са!а!д!с!д дсадд!сс!д 480 ааададаа!д д!ссаа!ддс с!с!дассса с!д!дсс!!а сс!ас!са!а !с!!!с!са! 540 д!ддасс!дд !аааадас!! даа!!саддс с!са!!ддад ссс!ас!ад! а!д!ададаа 600 дддад!с!дд ссааддаааа дасасадасс !!дсасааа! !!а!ас!ас! !!!!дс!д!а 660 !!!да!даад ддаааад!!д дсас!садаа асааадаас! сс!!да!дса дда!аддда! 720 дс!дса!с!д с!сдддсс!д дсс!аааа!д сасасад!са а!дд!!а!д! ааасадд!с! 780 с!дссадд!с !да!!дда!д ссасаддааа !сад!с!а!! ддса!д!да! !ддаа!дддс 840 ассас!сс!д аад!дсас!с аа!а!!сс!с даадд!саса са!!!с!!д! даддаасса! 900 сдссаддсд! сс!!ддааа! с!сдссаа!а ас!!!сс!!а с!дс!сааас ас!с!!да!д 960 дасс!!ддас ад!!!с!ас! д!!!!д!са! а!с!с!!ссс ассааса!да !ддса!ддаа 1020 дс!!а!д!са аад!адасад с!д!ссадад даассссаас !асдаа!даа ааа!аа!даа 1080 даадсддаад ас!а!да!да !да!с!!ас! да!!с!дааа !дда!д!дд! садд!!!да! 1140 да!дасаас! с!сс!!сс!! !а!ссааа!! сдс!сад!!д ссаадаадса !сс!аааас! 1200 !ддд!аса!! аса!!дс!дс !даададдад дас!дддас! а!дс!ссс!! ад!сс!сдсс 1260 сссда!даса даадйа!аа аад!саа!а! !!даасаа!д дссс!садсд да!!дд!адд 1320 аад!асаааа аад!ссда!! !а!ддса!ас асада!дааа ссЮаадас !сд!даадс! 1380 а!!садса!д аа!саддаа! с!!дддасс! !!ас!!!а!д дддаад!!дд адасасас!д 1440 !!да!!а!а! !!аадаа!са адсаадсада сса!а!ааса !с!ассс!са сддаа!сас! 1500

- 152 028309 да!д!ссд!с с!!!д!а!!с ааддада!!а ссаааадд!д !ааааса!!! даадда!!!! 1560 ссаа!!с!дс саддадааа! а!!сааа!а! ааа!ддасад !дас!д!ада ада!дддсса 1620 ас!ааа!сад а!сс!сдд!д сс!дасссдс !а!!ас!с!а д!!!сд!!аа !а!ддадада 1680 да!с!адс!! саддас!са! !ддссс!с!с с!са!с!дс! асааадаа!с !д!ада!саа 1740 ададдааасс ада!аа!д!с адасаададд аа!д!са!сс !д!!!!с!д! а!!!да!дад 1800 аассдаадс! дд!асс!сас ададаа!а!а саасдс!!!с !ссссаа!сс адс!ддад!д 1860 садс!!дадд а!ссадад!! ссаадсс!сс ааса!са!дс асадса!саа !ддс!а!д!! 1920 !!!да!ад!! !дсад!!д!с ад!!!д!!!д са!дадд!дд са!ас!дд!а са!!с!аадс 1980 а!!ддадсас адас!дас!! сс!!!с!д!с !!с!!с!с!д да!а!асс!! сааасасааа 2040 а!дд!с!а!д аадасасас! сассс!а!!с сса!!с!сад дадааас!д! с!!са!д!сд 2100 а!ддаааасс садд!с!а!д да!!с!дддд !дссасаас! садас!!!сд даасададдс 2160 а!дассдсс! !ас!даадд! !!с!ад!!д! дасаадааса с!дд!да!!а !!асдаддас 2220 ад!!а!даад а!а!!!садс а!ас!!дс!д ад!аааааса а!дсса!!да ассаадаадс 2280 !!с!с!сааа асссассад! с!!дааасдс са!саасддд ааа!аас!сд !ас!ас!с!! 2340 сад!сада!с аададдааа! !дас!а!да! да!асса!а! сад!!дааа! даадааддаа 2400 да!!!!даса !!!а!да!да дда!даааа! сададссссс дсадс!!!са ааадааааса 2460 сдасас!а!! !!а!!дс!дс ад!ддададд с!с!ддда!! а!ддда!дад !адс!сссса 2520 са!д!!с!аа дааасадддс !садад!ддс ад!д!ссс!с ад!!саадаа ад!!д!!!!с 2580 саддаа!!!а с!да!ддс!с с!!!ас!сад ссс!!а!асс д!ддадаас! ааа!дааса! 2640 !!дддас!сс !ддддсса!а !а!аададса даад!!даад а!аа!а!са! дд!аас!!!с 2700 адааа!садд сс!с!сд!сс с!а!!сс!!с !а!!с!адсс !!а!!!с!!а !даддаада! 2760 сададдсаад дадсадаасс !адаааааас !!!д!саадс с!аа!дааас саааас!!ас 2820 !!!!ддааад !дсааса!са !а!ддсассс ас!ааада!д ад!!!дас!д сааадсс!дд 2880 дс!!а!!!с! с!да!д!!да сс!ддааааа да!д!дсас! саддсс!да! !ддасссс!! 2940 с!дд!с!дсс асас!аасас ас!даассс! дс!са!ддда дасаад!дас ад!асаддаа 3000 !!!дс!с!д! !!!!сасса! с!!!да!дад ассаааадс! дд!ас!!сас !даааа!а!д 3060 дааадааас! дсадддс!сс с!дсаа!а!с сада!ддаад а!сссас!!! !ааададаа! 3120 !а!сдс!!сс а!дсаа!саа !ддс!аса!а а!дда!асас !асс!ддс!! ад!аа!ддс! 3180 садда!сааа дда!!сда!д д!а!с!дс!с адса!дддса дсаа!даааа са!сса!!с! 3240 а!!са!!!са д!ддаса!д! д!!сас!д!а сдааааааад аддад!а!аа аа!ддсас!д 3300 !асаа!с!с! а!ссадд!д! !!!!дадаса д!ддааа!д! !асса!ссаа адс!ддаа!! 3360

- 153 028309

1ддсддд1дд аа1дсс11а1 1ддсдадса1 с1аса1дс1д дда1дадсас ас11111с1д З420 д1д1асадса а1аад1д1са дас1сссс1д ддаа1ддс11 с1ддасаса1 1адада1111 З480 сада11асад с11саддаса а1а1ддасад 1дддссссаа адс1ддссад ас11са11а1 З540

1ссдда1саа 1саа1дсс1д дадсассаад дадссс1111 с11дда1саа дд1дда1с1д З600

11ддсассаа 1да11а11са сддса1саад асссаддд1д сссд1садаа д11с1ссадс З660 с1с1аса1с1 с1сад111а1 са1са1д1а1 ад1с11да1д ддаадаад1д дсадас11а1 З720 сдаддааа11 ссас1ддаас с11аа1дд1с 11с111ддса а1д1дда11с а1с1ддда1а З780 ааасасаа1а 11111аассс 1ссаа11а11 дс1сда1аса 1ссд111дса сссаас1са1 З840

1а1адса11с дсадсас1с1 1сдса1ддад 11да1дддс1 д1да111ааа 1ад11дсадс З900 а1дсса11дд даа1ддадад 1ааадсаа1а 1сада1дсас ада11ас1дс 11са1сс1ас З960

111ассаа1а 1д111дссас с1дд1с1сс1 1саааадс1с дас11сасс1 ссаадддадд 4020 ад1аа1дсс1 ддадасс1са дд1даа1аа1 ссаааадад1 ддс1дсаад1 ддас11ссад 4080 аадасаа1да аадсасадд ад1аас1ас1 садддадЫа аа1с1с1дс11ассадса1д 4140

1а1д1даадд ад11сс1са1 с1ссадсад1 саада1ддсс а1сад1ддас 1с1с111111 4200 садаа1ддса аад1ааадд1 1111саддда аа1саадас1 сс11сасасс 1д1дд1даас 4260

1с1с1адасс сассд11ас1 дас1сдс1ас с11сдаа11с асссссадад 11ддд1дсас 4З20 сада11дссс 1дадда1дда дд11с1дддс 1дсдаддсас аддасс1с1а с 4З71 <210> 20 <211> 500 <212> Белок <21З> Искусственная <220>

<22З> линкер <400> 20

С1у С1у С1у С1у Зег С1у С1у С1у С1у Зег С1у С1у С1у С1у Зег С1у 1 5 10 15

С1у С1у С1у Зег С1у С1у С1у С1у Зег С1у С1у С1у С1у Зег С1у С1у 20 25 З0

С1у С1у Зег С1у С1у С1у С1у Зег С1у С1у С1у С1у Зег С1у С1у С1у З5 40 45

С1у Зег С1у С1у С1у С1у Зег С1у С1у С1у С1у Зег С1у С1у С1у С1у 50 55 60

- 154 028309

Зег С1у С1у С1у С1у Зег С1у С1у С1у С1у Зег С1у С1у С1у С1у Зег 65 70 75 80

С1у С1у С1у С1у Зег С1у С1у С1у С1у Зег С1у С1у С1у С1у Зег С1у 85 90 95

С1у С1у С1у Зег С1у С1у С1у С1у Зег С1у С1у С1у С1у Зег С1у С1у 100 105 110

С1у С1у Зег С1у С1у С1у С1у Зег С1у С1у С1у С1у Зег С1у С1у С1у 115 120 125

С1у Зег С1у С1у С1у С1у Зег С1у С1у С1у С1у Зег С1у С1у С1у С1у 130 135 140

Зег С1у С1у С1у С1у Зег С1у С1у С1у С1у Зег С1у С1у С1у С1у Зег 145 150 155 160

С1у С1у С1у С1у Зег С1у С1у С1у С1у Зег С1у С1у С1у С1у Зег С1у 165 170 175

С1у С1у С1у Зег С1у С1у С1у С1у Зег С1у С1у С1у С1у Зег С1у С1у 180 185 190

С1у С1у Зег С1у С1у С1у С1у Зег С1у С1у С1у С1у Зег С1у С1у С1у 195 200 205

С1у Зег С1у С1у С1у С1у Зег С1у С1у С1у С1у Зег С1у С1у С1у С1у 210 215 220

Зег С1у С1у С1у С1у Зег С1у С1у С1у С1у Зег С1у С1у С1у С1у Зег 225 230 235 240

С1у С1у С1у С1у Зег С1у С1у С1у С1у Зег С1у С1у С1у С1у Зег С1у 245 250 255

С1у С1у С1у Зег С1у С1у С1у С1у Зег С1у С1у С1у С1у Зег С1у С1у 260 265 270

С1у С1у Зег С1у С1у С1у С1у Зег С1у С1у С1у С1у Зег С1у С1у С1у 275 280 285

С1у Зег С1у С1у С1у С1у Зег С1у С1у С1у С1у Зег С1у С1у С1у С1у 290 295 300

Зег С1у С1у С1у С1у Зег С1у С1у С1у С1у Зег С1у С1у С1у С1у Зег 305 310 315 320

- 155 028309

С1у С1у С1у С1у 8ег С1у С1у С1у С1у 8ег С1у С1у С1у С1у 8ег С1у 325 330 335

С1у С1у С1у 8ег С1у С1у С1у С1у 8ег С1у С1у С1у С1у 8ег С1у С1у 340 345 350

С1у С1у 8ег С1у С1у С1у С1у 8ег С1у С1у С1у С1у 8ег С1у С1у С1у 355 360 365

С1у 8ег С1у С1у С1у С1у 8ег С1у С1у С1у С1у 8ег С1у С1у С1у С1у 370 375 380

8ег С1у С1у С1у С1у 8ег С1у С1у С1у С1у 8ег С1у С1у С1у С1у 8ег 385 390 395 400

С1у С1у С1у С1у 8ег С1у С1у С1у С1у 8ег С1у С1у С1у С1у 8ег С1у 405 410 415

С1у С1у С1у 8ег С1у С1у С1у С1у 8ег С1у С1у С1у С1у 8ег С1у С1у 420 425 430

С1у С1у 8ег С1у С1у С1у С1у 8ег С1у С1у С1у С1у 8ег С1у С1у С1у 435 440 445

С1у 8ег С1у С1у С1у С1у 8ег С1у С1у С1у С1у 8ег С1у С1у С1у С1у 450 455 460

8ег С1у С1у С1у С1у 8ег С1у С1у С1у С1у 8ег С1у С1у С1у С1у 8ег 465 470 475 480

С1у С1у С1у С1у 8ег С1у С1у С1у С1у 8ег С1у С1у С1у С1у 8ег С1у 485 490 495

С1у С1у С1у 8ег 500 <210> 21 <211> 800 <212> Белок <213> Искусственная <220>

<223> линкер <220>

<221> ПОВТОР <222> (1)..(300)

- 156 028309 <223> С1у-С1у-Бег повтор от 1 до 100 раз <220>

<221> ПОВТОР <222> (301)..(800) <223> О1у-О1у-О1у-О1у-Бег повтор от 1 до 100 раз <400> 21

О1у О1у Бег С1у С1у Бег С1у С1у Бег С1у С1у Бег С1у С1у Бег О1у 1 5 10 15

О1у Бег О1у О1у Бег О1у О1у Бег С1у С1у Бег С1у С1у Бег О1у О1у 20 25 30

Бег О1у О1у Бег О1у О1у Бег С1у С1у Бег С1у С1у Бег О1у О1у Бег 35 40 45

О1у О1у Бег С1у С1у Бег С1у С1у Бег С1у С1у Бег С1у С1у Бег О1у 50 55 60

О1у Бег О1у О1у Бег О1у О1у Бег С1у С1у Бег С1у С1у Бег 01у 01у 65 70 75 80

Бег 01у 01у Бег 01у 01у Бег С1у С1у Бег С1у С1у Бег 01у 01у Бег 85 90 95

01у 01у Бег С1у С1у Бег С1у С1у Бег С1у С1у Бег С1у С1у Бег 01у 100 105 110

01у Бег 01у 01у Бег 01у 01у Бег С1у С1у Бег С1у С1у Бег 01у 01у 115 120 125

Бег 01у 01у Бег 01у 01у Бег С1у С1у Бег С1у С1у Бег 01у 01у Бег 130 135 140

01у 01у Бег С1у С1у Бег С1у С1у Бег С1у С1у Бег С1у С1у Бег 01у 145 150 155 160

01у Бег 01у 01у Бег 01у 01у Бег С1у С1у Бег С1у С1у Бег 01у 01у 165 170 175

Бег 01у 01у Бег 01у 01у Бег С1у С1у Бег С1у С1у Бег 01у 01у Бег 180 185 190

01у 01у Бег С1у С1у Бег С1у С1у Бег С1у С1у Бег С1у С1у Бег 01у 195 200 205

01у Бег 01у 01у Бег 01у 01у Бег С1у С1у Бег С1у С1у Бег 01у 01у

- 157 028309

210 215 220

8ег С1у С1у 8ег С1у С1у 8ег С1у С1у 8ег С1у С1у 8ег С1у С1у 8ег 225 230 235 240

С1у С1у 8ег С1у С1у 8ег С1у С1у 8ег С1у С1у 8ег С1у С1у 8ег С1у 245 250 255

С1у 8ег С1у С1у 8ег С1у С1у 8ег С1у С1у 8ег С1у С1у 8ег С1у С1у 260 265 270

8ег С1у С1у 8ег С1у С1у 8ег С1у С1у 8ег С1у С1у 8ег С1у С1у 8ег 275 280 285

С1у С1у 8ег С1у С1у 8ег С1у С1у 8ег С1у С1у 8ег С1у С1у С1у С1у 290 295 300

8ег С1у С1у С1у С1у 8ег С1у С1у С1у С1у 8ег С1у С1у С1у С1у 8ег 305 310 315 320

- 158 028309

Зег 01у 01у 01у 01у Зег 01у 01у 01у 01у Зег 01у 01у 01у 01у Зег 465 470 475 480

01у 01у 01у 01у Зег 01у 01у 01у 01у Зег 01у 01у 01у 01у Зег 01у 485 490 495

01у 01у 01у Зег 01у 01у 01у 01у Зег 01у 01у 01у 01у Зег 01у 01у 500 505 510

01у 01у Зег 01у 01у 01у 01у Зег 01у 01у 01у 01у Зег 01у 01у 01у 515 520 525

01у Зег 01у 01у 01у 01у Зег 01у 01у 01у 01у Зег 01у 01у 01у 01у 530 535 540

Зег 01у 01у 01у 01у Зег 01у 01у 01у 01у Зег 01у 01у 01у 01у Зег 545 550 555 560

01у 01у 01у 01у Зег 01у 01у 01у 01у Зег 01у 01у 01у 01у Зег 01у 565 570 575

01у 01у 01у Зег 01у 01у 01у 01у Зег 01у 01у 01у 01у Зег 01у 01у 580 585 590

01у 01у Зег 01у 01у 01у 01у Зег 01у 01у 01у 01у Зег 01у 01у 01у 595 600 605

01у Зег 01у 01у 01у 01у Зег 01у 01у 01у 01у Зег 01у 01у 01у 01у 610 615 620

Зег 01у 01у 01у 01у Зег 01у 01у 01у 01у Зег 01у 01у 01у 01у Зег 625 630 635 640

01у 01у 01у 01у Зег 01у 01у 01у 01у Зег 01у 01у 01у 01у Зег 01у 645 650 655

01у 01у 01у Зег 01у 01у 01у 01у Зег 01у 01у 01у 01у Зег 01у 01у 660 665 670

01у 01у Зег 01у 01у 01у 01у Зег 01у 01у 01у 01у Зег 01у 01у 01у 675 680 685

01у Зег 01у 01у 01у 01у Зег 01у 01у 01у 01у Зег 01у 01у 01у 01у 690 695 700

Зег 01у 01у 01у 01у Зег 01у 01у 01у 01у Зег 01у 01у 01у 01у Зег

- 159 028309

705 710 715 720

О1у О1у О1у О1у Зег О1у О1у О1у О1у Зег О1у О1у О1у О1у Зег О1у 725 730 735

О1у О1у О1у Зег О1у О1у О1у О1у Зег О1у О1у О1у О1у Зег О1у О1у 740 745 750

О1у О1у Зег О1у О1у О1у О1у Зег О1у О1у О1у О1у Зег О1у О1у О1у 755 760 765

О1у Зег О1у О1у О1у О1у Зег О1у О1у О1у О1у Зег О1у О1у О1у О1у 770 775 780

Зег О1у О1у О1у О1у Зег О1у О1у О1у О1у Зег О1у О1у О1у О1у Зег 785 790 795 800 <210> 22 <211> 7 <212> Белок <213> Искусственная <220>

<223> линкер <400> 22

Зег О1у О1у Зег О1у О1у Зег 1 5 <210> 23 <211> 15 <212> Белок <213> Искусственная <220>

<223> линкер <400> 23

О1у О1у Зег О1у О1у Зег О1у О1у Зег О1у О1у Зег О1у О1у О1у 1 5 10 15 <210> 24 <211> 16 <212> Белок <213> Искусственная <220>

<223> линкер <400> 24

О1у О1у Зег О1у О1у Зег О1у О1у О1у О1у Зег О1у О1у О1у О1у Зег

- 160 028309

5 10 15 <210> 25 <211> 18 <212> Белок <213> Искусственная <220>

<223> линкер <400> 25

С1у С1у Зег С1у С1у Зег С1у С1у Зег С1у С1у Зег С1у С1у Зег С1у 1 5 10 15

С1у Зег <210> 26 <211> 15 <212> Белок <213> Искусственная <220>

<223> линкер <220>

<221> ПОВТОР <222> (1)..(15) <223> О1у-О1у-О1у-О1у-Зег повтор от 1 до 3 раз <400> 26

О1у О1у О1у О1у Зег О1у О1у О1у О1у Зег О1у О1у О1у О1у Зег 1 5 10 15 <210> 27 <211> 100 <212> Белок <213> Искусственная <220>

<223> линкер <220>

<221> ПОВТОР <222> (1)..(100) <223> О1у-О1у-О1у-О1у-Зег повтор от 1 до 20 раз <400> 27

О1у О1у О1у О1у Зег О1у О1у О1у О1у Зег О1у О1у О1у О1у Зег О1у 1 5 10 15

О1у О1у О1у Зег О1у О1у О1у О1у Зег О1у О1у О1у О1у Зег О1у О1у

- 161 028309

25 30

С1у С1у Зег С1у С1у С1у С1у Зег С1у С1у С1у С1у Зег С1у С1у С1у 35 40 45

С1у С1у С1у Зег 100 <210> 28 <211> 15 <212> Белок <213> Искусственная <220>

<223> линкер <220>

<221> ПОВТОР <222> (1)..(15) <223> О1у-О1у-О1у-О1у-Зег повтор от 1 до 3 раз <400> 28

О1у О1у О1у С1у Зег С1у С1у О1у О1у Зег О1у О1у О1у О1у Зег 1 5 10 15 <210> 29 <211> 7 <212> Белок <213> Искусственная <220>

<223> отщепляемый линкер <220>

<221> примечание <222> (4)..(5) <223> Сайт расщепления ФХ1а <400> 29

Ьу8 Ьеи ТЬг Агд А1а С1и ТЬг 1 5

- 162 028309 <210> 30 <211> 7 <212> Белок <213> Искусственная <220>

<223> отщепляемый линкер <220>

<221> примечание <222> (4)..(5) <223> Сайт расщепления ФХ1а <400> 30

Лер РЬе ТЬг Агд Уа1 Уа1 О1у 1 5 <210> 31 <211> 8 <212> Белок <213> Искусственная <220>

<223> отщепляемый линкер <220>

<221> примечание <222> (4)..(5) <223> Сайт расщепления ФХ11а <400> 31

ТЬг Ме! ТЬг Агд 11е Уа1 О1у О1у 1 5 <210> 32 <211> 8 <212> Белок <213> Искусственная <220>

<223> отщепляемый линкер <220>

<221> примечание <222> (4)..(5) <223> Сайт расщепления калликреином <400> 32 §ег Рго РЬе Агд §ег ТЬг О1у О1у 1 5 <210> 33 <211> 8

- 163 028309 <212> Белок <213> Искусственная <220>

<223> отщепляемый линкер <220>

<221> примечание <222> (4)..(5) <223> Сайт расщепления Ф^Ш <400> 33

Ьеи С1п Vа1 Агд Не Vа1 С1у С1у 1 5 <210> 34 <211> 8 <212> Белок <213> Искусственная <220>

<223> отщепляемый линкер <220>

<221> примечание <222> (4)..(5) <223> Сайт расщепления ФКа <400> 34

Рго Ьеи С1у Агд Не Vа1 С1у С1у 1 5 <210> 35 <211> 8 <212> Белок <213> Искусственная <220>

<223> отщепляемый линкер <220>

<221> примечание <222> (4)..(5) <223> Сайт расщепления ФХа <400> 35

Не С1и С1у Агд ТЬг Vа1 С1у С1у 1 5 <210> 36 <211> 8 <212> Белок <213> Искусственная

- 164 028309 <220>

<223> отщепляемый линкер <220>

<221> примечание <222> (4)..(5) <223> Сайт расщепления Ф11а (тромбином) <400> 36

Ьеи ТЬг Рго Агд §ег Ьеи Ьеи Уа1

5 <210> 37 <211> 8 <212> Белок <213> Искусственная <220>

<223> отщепляемый линкер <220>

<221> примечание <222> (4)..(5) <223> Сайт расщепления эластазой-2 <400> 37

Ьеи О1у Рго Уа1 8ег О1у Уа1 Рго 1 5 <210> 38 <211> 8 <212> Белок <213> Искусственная <220>

<223> отщепляемый линкер <220>

<221> примечание <222> (4)..(5) <223> Сайт расщепления гранзимом-В <400> 38

Уа1 А1а О1у Авр 8ег Ьеи О1и О1и 1 5 <210> 39 <211> 8 <212> Белок <213> Искусственная <220>

- 165 028309 <223> отщепляемый линкер <220>

<221> примечание <222> (4)..(5) <223> Сайт расщепления ММР-12 <400> 39

С1у Рго А1а С1у Ьеи С1у С1у А1а 1 5 <210> 40 <211> 8 <212> Белок <213> Искусственная <220>

<223> отщепляемый линкер <220>

<221> примечание <222> (4)..(5) <223> Сайт расщепления ММР-13 <400> 40

С1у Рго А1а С1у Ьеи Агд С1у А1а 1 5 <210> 41 <211> 8 <212> Белок <213> Искусственная <220>

<223> отщепляемый линкер <220>

<221> примечание <222> (4)..(5) <223> Сайт расщепления ММР-17 <400> 41

А1а Рго Ьеи С1у Ьеи Агд Ьеи Агд 1 5 <210> 42 <211> 8 <212> Белок <213> Искусственная <220>

<223> отщепляемый линкер

- 166 028309 <220>

<221> примечание <222> (4)..(5) <223> Сайт расщепления ММР-20 <400> 42

Рго А1а Ьеи Рго Ьеи Уа1 А1а С1и 1 5 <210> 43 <211> 7 <212> Белок <213> Искусственная <220>

<223> отщепляемый линкер <220>

<221> примечание <222> (6)..(7) <223> Сайт расщепления ВГТ <400> 43

С1и Ази Ьеи Туг РЬе С1и С1у 1 5 <210> 44 <211> 8 <212> Белок <213> Искусственная <220>

<223> отщепляемый линкер <220>

<221> примечание <222> (4)..(5) <223> Сайт расщепления энтерокиназой <400> 44

Азр Азр Азр Ьуз 11е Уа1 С1у С1у 1 5 <210> 45 <211> 8 <212> Белок <213> Искусственная <220>

<223> отщепляемый линкер <220>

- 167 028309 <221> примечание <222> (6)..(7) <22З> Сайт расщепления протеазой С (РКЕЗОЗЗЮЩ <400> 45

Ьеи С1и Vа1 Ьеи РЬе С1п С1у Рго

5 <210> 46 <211> 8 <212> Белок <21З> Искусственная <220>

<22З> отщепляемый линкер <220>

<221> примечание <222> (4)..(5) <22З> Сортаза А <400> 46

Ьеи Рго Ьуз ТЬг С1у Зег С1и Зег 1 5 <210> 47 <211> 9 <212> Белок <21З> Искусственная <220>

<22З> отщепляемый линкер <400> 47

ТЬг С1п Зег РЬе Азп Азр РЬе ТЬг Агд 1 5 <210> 48 <211> 10 <212> Белок <21З> Искусственная <220>

<22З> сайт расщепления <400> 48

Зег Vа1 Зег С1п ТЬг Зег Ьуз Ьеи ТЬг Агд 1 5 10 <210> 49 <211> 10 <212> Белок <21З> Искусственная

- 168 028309 <220>

<223> сайт расщепления <400> 49

Авр РЬе Ьеи А1а О1и О1у О1у О1у Уа1 Агд 1 5 10 <210> 50 <211> 7 <212> Белок <213> Искусственная <220>

<223> сайт расщепления <400> 50

ТЬг ТЬг Ьув 11е Ьув Рго Агд 1 5 <210> 51 <211> 10 <212> Белок <213> Искусственная <220>

<223> сайт расщепления <400> 51

А1а Ьеи Агд Рго Агд Уа1 Уа1 О1у О1у А1а 1 5 10 <210> 52 <211> 4 <212> Белок <213> Искусственная <220>

<223> сайт расщепления <400> 52

Агд Агд Агд Агд 1 <210> 53 <211> 6 <212> Белок <213> Искусственная <220>

<223> сайт расщепления <400> 53

- 169 028309

Агд Ьук Агд Агд Ьук Агд 1 5 <210> 54 <211> 5 <212> Белок <213> Искусственная <220>

<223> сайт расщепления <400> 54

Агд Агд Агд Агд Зег 1 5 <210> 55 <211> 5 <212> Белок <213> Искусственная <220>

<223> сайт расщепления <400> 55

Ьеи Уа1 Рго Агд С1у 1 5 <210> 56 <211> 25 <212> Белок <213> Искусственная <220>

<223> сайт расщепления и линкера <400> 56

ТЬг Ьеи Акр Рго Агд Зег РЬе Ьеи Ьеи Агд Акп Рго Акп Акр Ьук Туг 1 5 10 15

С1и Рго РЬе Тгр С1и Акр С1и С1и Ьук 20 25 <210> 57 <211> 99 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> ЕЗС48-Прям-ФВ-Э'П3 с сигналом VIII и сайтом Вк1\У1 для рЗУЯ ФВ-001 <400> 57 !сдсдасд!а сддссдссас са!дсааа!а дадс!с!сса сс!дс!!с!! !с!д!дсс!! 60

- 170 028309 !!дсда!!с! дс!!!адсс! а!сс!д!сдд сссссса!д 99 <210> 58 <211> 68 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> ЕЗС50- Обратн- ФВ- частичный ΌΌ3 (аминокислоты 1-276) с сайтом 6 Шз и Νο!1 для рЗУЯ ФВ- 001 <400> 58 !дасс!сдад сддссдс!са д!дд!да!дд !да!да!дса даддсас!!! !с!дд!д!са 60 дсасас!д 68 <210> 59 <211> 99 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> ЕЗС48- Прям - ФВ-Б'Б3 с сигналом УШ и сайтом Вз1\У1 для ρЗΥN ФВ- 002 <400> 59 !сдсдасд!а сддссдссас са!дсааа!а дадс!с!сса сс!дс!!с!! !с!д!дсс!! 60 !!дсда!!с! дс!!!адсс! а!сс!д!сдд сссссса!д 99 <210> 60 <211> 71 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> ЕЗС51- Обратн- ФВ Б'Б3 (аминокислоты 1-477) с сайтом 6Шз и Νο! 1 для ρЗΥN ФВ- 002 <400> 60 !дасс!сдад сддссдс!са д!дд!да!дд !да!да!дсс !дс!дсад!а дааа!сд!дс 60 аасддсдд!! с 71 <210> 61 <211> 99 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> ЕЗС48- Прям - ФВ-Б'Б3 с сигналом УШ и сайтом Вз1\У1 для ρЗΥN ФВ- 003 <400> 61 !сдсдасд!а сддссдссас са!дсааа!а дадс!с!сса сс!дс!!с!! !с!д!дсс!! 60 !!дсда!!с! дс!!!адсс! а!сс!д!сдд сссссса!д 99

- 171 028309 <210> 62 <211> 65 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> Е8С52- Обратн-ФВ-Э'П3 Частичный А1 (аминокислоты 1-511) с сайтом 6Ηίβ и №)11 для ρδΥΝ ФВ- 003 <400> 62

1дасс1сдад сддссдс1са д1дд1да1дд 1да1да1ддс ссасад1дас 11д1дсса1д 60

1дддд 65 <210> 63 <211> 99 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> Е8С48- Прям - ФВ-ЭП3 с сигналом УШ и сайтом Ββί^1 для ρδΥΝ ФВ- 004 <400> 63

1сдсдасд1а сддссдссас са1дсааа1а дадс1с1сса сс1дс11с11 1с1д1дсс11 60

11дсда11с1 дс111адсс1 а1сс1д1сдд сссссса1д 99 <210> 64 <211> 65 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> Е§С53-Обратн- ФВ-ОП3А1 (аминокислоты 1-716) с сайтом 6Ηίβ и Νϋί1 для ρδΥΝ ФВ- 004 <400> 64

1дддд 65 <210> 65 <211> 1313 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> клонированный вектор <400> 65 дда1сс1ад1 ддддаа1аад дда1дсадсс асссс1сад1 дааа1дсаад ааасддд1са 60 ссаЗссЗддЗ ддадддадда дадайдадс ЗдШдасдд ддаддЗдааЗ дЗдаададдс 120 ссаЗдаадда ЗдадасЗсас Шдадд1дд ЗддадЗсЗдд ссдд!аса1с айсЗдсЗдс 180

1дддсааадс сс1с1ссд1д д1с1дддасс дссасс1дад са1с1ссд1д д1сс1даадс 240

- 172 028309 адаса1асса ддадааад1д 1д1ддсс1д1 д1дддаа111 1да1ддса1с садаасаа1д З00 асс1сассад садсаасс1с саад1ддадд аадассс1д1 ддас111ддд аас1сс1дда З60 аад1дадс1с дсад1д1дс1 дасассадаа аад1дсс1с1 ддас1са1сс сс1дссасс1 420 дсса1аасаа са1са1даад садасда1дд 1дда11сс1с с1д1адаа1с с11ассад1д 480 асд1с11сса ддас1дсаас аадс1дд1дд ассссдадсс а1а1с1дда1 д1с1дса111 540 асдасасс1д с1сс1д1дад 1сса11дддд ас1дсдсс1д с11с1дсдас асса11дс1д 600 сс1а1дссса сд1д1д1дсс садса1ддса адд1дд1дас с1ддаддасд дссаса11д1 660 дсссссадад с1дсдаддад аддаа1с1сс дддадаасдд д1а1дад1д1 дад1ддсдс1 720 а1аасадс1д 1дсасс1дсс 1д1саад1са сд1д1садса ссс1дадсса с1ддсс1дсс 780 с1д1дсад1д 1д1ддадддс 1дсса1дссс ас1дссс1сс адддаааа1с с1дда1дадс 840

1111дсадас с1дсд11дас сс1даадас1 д1ссад1д1д 1дадд1ддс1 ддссддсд11 900

11дсс1садд ааадааад1с асс11даа1с ссад1дассс 1дадсас1дс сада111дсс 960 ас1д1да1д11д1саасс1с асс1д1даад сс1дссадда дссдддаддс с1дд1дд1дс 1020 сЮссасада 1дссссдд1д адссссасса с1с1д1а1д1 дда1дадасд с1ссадда1д 1080 дс1д1да1ас 1сас11с1дс аадд1саа1д адададдада д1асйс1дд дадаададдд 1140

1сасаддс1д сссасссШ да1даасаса ад1д1сйдс 1дадддадд1 ааааШЦда 1200 ааайссадд сасс1дс1д1 дасаса1д1д аддадсс1да д1дсаасдас а1сас1дсса 1260 ддс1дсад1а 1д1саадд1д ддаадс1д1а ад1с1даад1 ададд1дда1 а1с 1З1З <210> 66 <211> З2 <212> ДНК <21З> Искусственная <220>

<22З> ЕЗС 89-прям с сайтом К1Ье1 <400> 66 с1сас1а1ад ддадасссаа дс1ддс1адс сд З2 <210> 67 <211> 4З <212> ДНК <21З> Искусственная <220>

<22З> ЕЗС 91-обратн с За11 <400> 67 с1дда1сссд ддад1сдас1 сд1сад1дд1 да1дд1да1д а1д 4З

- 17З 028309 <210> 68 <211> 92 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> Ь\У 22-ПРЯМ-ФВ-Э'Э3 с сигнальной последовательностью ФУШ и сайтом Вк1\У1 <400> 68 дсдссддссд 1асда1дсаа а1ададс1с1 ссасс1дс11 с111с1д1дс с1111дсда1 60

1с1дс111ад сс1а1сс1д1 сддсссссса 1д 92 <210> 69 <211> 47 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> Ь\У 23-Обратн- Рс со стоп-кодоном и сайтом ЫоХ1 <400> 69

1са1саа1д1 а1с11а1са1 д1с1даа11с дсддссдс1с а111асс 47 <210> 70 <211> 41 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> Ь\У24- Прям- ФВ Ό1Ό2Ό'Ό3 клонирующий олиго с сайтом Вк1\У1 <400> 70 дсдссддссд 1асда1да11 сс1дссада1 11дссдддд1 д 41 <210> 71 <211> 41 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> Ь^27-Обратн-ФВ Э'Э3 олиго с ЕсоКУ <400> 71 ссассдссад а1а1сддс1с с1ддсаддс1 1сасадд1да д 41 <210> 72 <211> 1240 <212> Белок <213> Искусственная <220>

<223> ФВ-Э1Э2Э'Э3 <400> 72

МеХ 11е Рго А1а Агд РЬе А1а О1у Уа1 Ьеи Ьеи А1а Ьеи А1а Ьеи 11е 1 5 10 15

- 174 028309

Ьеи Рго С1у ТЬг Ьеи Су8 А1а С1и С1у ТЬг Агд С1у Агд Зег Зег ТЬг 20 25 30

А1а Агд Су8 Зег Ьеи РЬе С1у Зег А8р РЬе Уа1 А8п ТЬг РЬе А8р С1у 35 40 45

Зег Ме! Туг Зег РЬе А1а С1у Туг Су8 Зег Туг Ьеи Ьеи А1а С1у С1у 50 55 60

Су8 С1п Ьу8 Агд Зег РЬе Зег 11е 11е С1у А8р РЬе С1п А8п С1у Ьу8 65 70 75 80

Агд Уа1 Зег Ьеи Зег Уа1 Туг Ьеи С1у С1и РЬе РЬе А8р 11е Н18 Ьеи 85 90 95

РЬе Уа1 А8п С1у ТЬг Уа1 ТЬг С1п С1у А8р С1п Агд Уа1 Зег Ме! Рго 100 105 110

Туг А1а Зег Ьу8 С1у Ьеи Туг Ьеи С1и ТЬг С1и А1а С1у Туг Туг Ьу8 115 120 125

Ьеи Зег С1у С1и А1а Туг С1у РЬе Уа1 А1а Агд 11е А8р С1у Зег С1у 130 135 140

А8п РЬе С1п Уа1 Ьеи Ьеи Зег А8р Агд Туг РЬе А8п Ьу8 ТЬг Су8 С1у 145 150 155 160

Ьеи Су8 С1у А8п РЬе А8п 11е РЬе А1а С1и А8р А8р РЬе Ме! ТЬг С1п 165 170 175

С1и С1у ТЬг Ьеи ТЬг Зег А8р Рго Туг А8р РЬе А1а А8п Зег Тгр А1а 180 185 190

Ьеи Зег Зег С1у С1и С1п Тгр Су8 С1и Агд А1а Зег Рго Рго Зег Зег 195 200 205

Зег Су8 А8п 11е Зег Зег С1у С1и Ме! С1п Ьу8 С1у Ьеи Тгр С1и С1п 210 215 220

Су8 С1п Ьеи Ьеи Ьу8 Зег ТЬг Зег Уа1 РЬе А1а Агд Су8 Н18 Рго Ьеи 225 230 235 240

Уа1 А8р Рго С1и Рго РЬе Уа1 А1а Ьеи Су8 С1и Ьу8 ТЬг Ьеи Су8 С1и 245 250 255

- 175 028309

Сук А1а С1у С1у Ьеи С1и Сук А1а Сук Рго А1а Ьеи Ьеи С1и Туг А1а 260 265 270

Агд ТЬг Сук А1а С1п С1и С1у Ме! ν;·ι1 Ьеи Туг С1у Тгр ТЬг Акр Шк 275 280 285

Зег А1а Сук Зег Рго ν;·ι1 Сук Рго А1а С1у Ме! С1и Туг Агд С1п Сук 290 295 300 ν;·ι1 Зег Рго Сук А1а Агд ТЬг Сук С1п Зег Ьеи Шк 11е Акп С1и Ме! 305 310 315 320

Сук С1п С1и Агд Сук ν;·ι1 Акр С1у Сук Зег Сук Рго С1и С1у С1п Ьеи 325 330 335

Ьеи Акр С1и С1у Ьеи Сук Vа1 С1и Зег ТЬг С1и Сук Рго Сук ν;·ι1 Шк 340 345 350

Зег С1у Ьук Агд Туг Рго Рго С1у ТЬг Зег Ьеи Зег Агд Акр Сук Акп 355 360 365

ТЬг Сук 11е Сук Агд Акп Зег С1п Тгр 11е Сук Зег Акп С1и С1и Сук 370 375 380

Рго С1у С1и Сук Ьеи ν;·ι1 ТЬг С1у С1п Зег Шк РЬе Ьук Зег РЬе Акр 385 390 395 400

Акп Агд Туг РЬе ТЬг РЬе Зег С1у 11е Сук С1п Туг Ьеи Ьеи А1а Агд 405 410 415

Акр Сук С1п Акр Шк Зег РЬе Зег 11е ν;·ι1 11е С1и ТЬг Vа1 С1п Сук 420 425 430

А1а Акр Акр Агд Акр А1а ν;·ι1 Сук ТЬг Агд Зег Vа1 ТЬг ν;·ι1 Агд Ьеи 435 440 445

Рго С1у Ьеи Шк Акп Зег Ьеи ν;·ι1 Ьук Ьеи Ьук Шк С1у А1а С1у Vа1 450 455 460

А1а Ме! Акр С1у С1п Акр 11е С1п Ьеи Рго Ьеи Ьеи Ьук С1у Акр Ьеи 465 470 475 480

Агд 11е С1п Шк ТЬг Vа1 ТЬг А1а Зег ν;·ι1 Агд Ьеи Зег Туг С1у С1и 485 490 495

Акр Ьеи С1п Ме! Акр Тгр Акр С1у Агд С1у Агд Ьеи Ьеи Vа1 Ьук Ьеи 500 505 510

- 176 028309

8ег Рго Уа1 Туг А1а С1у Ьуз ТЬг Суз С1у Ьеи Суз С1у Азп Туг Азп 515 520 525

С1у Азп С1п С1у Азр Азр РЬе Ьеи ТЬг Рго 8ег С1у Ьеи А1а С1и Рго 530 535 540

Агд Уа1 С1и Азр РЬе С1у Азп А1а Тгр Ьуз Ьеи Шз С1у Азр Суз С1п 545 550 555 560

Азр Ьеи С1п Ьуз С1п Шз 8ег Азр Рго Суз А1а Ьеи Азп Рго Агд Ме1 565 570 575

ТЬг Агд РЬе 8ег С1и С1и А1а Суз А1а Уа1 Ьеи ТЬг 8ег Рго ТЬг РЬе 580 585 590

С1и А1а Суз Шз Агд А1а Уа1 8ег Рго Ьеи Рго Туг Ьеи Агд Азп Суз 595 600 605

Агд Туг Азр Уа1 Суз 8ег Суз 8ег Азр С1у Агд С1и Суз Ьеи Суз С1у 610 615 620

А1а Ьеи А1а 8ег Туг А1а А1а А1а Суз А1а С1у Агд С1у Уа1 Агд Уа1 625 630 635 640

А1а Тгр Агд С1и Рго С1у Агд Суз С1и Ьеи Азп Суз Рго Ьуз С1у С1п 645 650 655

Уа1 Туг Ьеи С1п Суз С1у ТЬг Рго Суз Азп Ьеи ТЬг Суз Агд 8ег Ьеи 660 665 670

8ег Туг Рго Азр С1и С1и Суз Азп С1и А1а Суз Ьеи С1и С1у Суз РЬе 675 680 685

Суз Рго Рго С1у Ьеи Туг Ме1 Азр С1и Агд С1у Азр Суз Уа1 Рго Ьуз 690 695 700

А1а С1п Суз Рго Суз Туг Туг Азр С1у С1и 11е РЬе С1п Рго С1и Азр 705 710 715 720

11е РЬе 8ег Азр Шз Шз ТЬг Ме1 Суз Туг Суз С1и Азр С1у РЬе Ме1 725 730 735

Шз Суз ТЬг Ме1 8ег С1у Уа1 Рго С1у 8ег Ьеи Ьеи Рго Азр А1а Уа1 740 745 750

- 177 028309

Ьеи Зег Зег Рго Ьеи Зег Шз Агд Зег Ьуз Агд Зег Ьеи Зег Суз Агд 755 760 765

Рго Рго Ме! Уа1 Ьуз Ьеи Уа1 Суз Рго А1а Азр Ази Ьеи Агд А1а О1и 770 775 780

О1у Ьеи О1и Суз ТЬг Ьуз ТЬг Суз О1и Ази Туг Азр Ьеи О1и Суз Ме! 785 790 795 800

Зег Ме! О1у Суз Уа1 Зег О1у Суз Ьеи Суз Рго Рго О1у Ме! Уа1 Агд 805 810 815

Шз О1и Ази Агд Суз Уа1 А1а Ьеи О1и Агд Суз Рго Суз РЬе Шз О1и 820 825 830

О1у Ьуз О1и Туг А1а Рго О1у О1и ТЬг Уа1 Ьуз 11е О1у Суз Ази ТЬг 835 840 845

Суз Уа1 Суз Агд Азр Агд Ьуз Тгр Ази Суз ТЬг Азр Шз Уа1 Суз Азр 850 855 860

А1а ТЬг Суз Зег ТЬг 11е О1у Ме! А1а Шз Туг Ьеи ТЬг РЬе Азр О1у 865 870 875 880

Ьеи Ьуз Туг Ьеи РЬе Рго О1у О1и Суз О1и Туг Уа1 Ьеи Уа1 О1и Азр 885 890 895

Туг Суз О1у Зег Ази Рго О1у ТЬг РЬе Агд 11е Ьеи Уа1 О1у Ази Ьуз 900 905 910

О1у Суз Зег Шз Рго Зег Уа1 Ьуз Суз Ьуз Ьуз Агд Уа1 ТЬг 11е Ьеи 915 920 925

Уа1 О1и О1у О1у О1и 11е О1и Ьеи РЬе Азр О1у О1и Уа1 Ази Уа1 Ьуз 930 935 940

Агд Рго Ме! Ьуз Азр О1и ТЬг Шз РЬе О1и Уа1 Уа1 О1и Зег О1у Агд 945 950 955 960

Туг 11е 11е Ьеи Ьеи Ьеи О1у Ьуз А1а Ьеи Зег Уа1 Уа1 Тгр Азр Агд 965 970 975

Шз Ьеи Зег 11е Зег Уа1 Уа1 Ьеи Ьуз О1и ТЬг Туг О1и О1и Ьуз Уа1 980 985 990

Суз О1у Ьеи Суз О1у Ази РЬе Азр О1у 11е О1и Ази Ази Азр Ьеи ТЬг 995 1000 1005

- 178 028309

Зег Зег Акп Ьеи О1п Уа1 О1и О1и Акр Рго Уа1 Акр РЬе О1у Акп 1010 1015 1020

Зег Тгр Ьук Уа1 Зег Зег О1п Сук А1а Акр ТЬг Агд Ьук Уа1 Рго 1025 1030 1035

Ьеи Акр Зег Зег Рго А1а ТЬг Сук Шк Акп Акп 11е МеХ Ьук О1п 1040 1045 1050

ТЬг МеХ Уа1 Акр Зег Зег Сук Агд 11е Ьеи ТЬг Зег Акр Уа1 РЬе 1055 1060 1065

О1п Акр Сук Акп Ьук Ьеи Уа1 Акр Рго О1и Рго Туг Ьеи Акр Уа1 1070 1075 1080

Сук 11е Туг Акр ТЬг Сук Зег Сук О1и Зег 11е О1у Акр Сук А1а 1085 1090 1095

Сук РЬе Сук Акр ТЬг 11е А1а А1а Туг А1а Шк Уа1 Сук А1а О1п 1100 1105 1110

Шк О1у Ьук Уа1 Уа1 ТЬг Тгр Агд ТЬг А1а ТЬг Ьеи Сук Рго О1п 1115 1120 1125

Зег Сук О1и О1и Агд Акп Ьеи Агд О1и Акп О1у Туг О1и Сук О1и 1130 1135 1140

Тгр Агд Туг Акп Зег Сук А1а Рго А1а Сук О1п Уа1 ТЬг Сук О1п 1145 1150 1155

Шк Рго О1и Рго Ьеи А1а Сук Рго Уа1 О1п Сук Уа1 О1и О1у Сук 1160 1165 1170

Шк А1а Шк Сук Рго Рго О1у Ьук 11е Ьеи Акр О1и Ьеи Ьеи О1п 1175 1180 1185

ТЬг Сук Уа1 Акр Рго О1и Акр Сук Рго Уа1 Сук О1и Уа1 А1а О1у 1190 1195 1200

Агд Агд РЬе А1а Зег О1у Ьук Ьук Уа1 ТЬг Ьеи Акп Рго Зег Акр 1205 1210 1215

Рго О1и Шк Сук О1п 11е Сук Шк Сук Акр Уа1 Уа1 Акп Ьеи ТЬг 1220 1225 1230

- 179 028309

Сув С1и А1а Сув С1п С1и Рго 1235 1240 <210> 73 <211> 477 <212> Белок <213> Искусственная <220>

<223> ФВ-1У1У <400> 73 δе^ Ьеи δе^ Сув Агд Рго Рго Ме! Уа1 Ьув Ьеи Уа1 Сув Рго А1а Авр 1 5 10 15

Авп Ьеи Агд А1а С1и С1у Ьеи С1и Сув ТЬг Ьув ТЬг Сув С1п Авп Туг 20 25 30

Авр Ьеи С1и Сув Ме! δе^ Ме! С1у Сув Уа1 δе^ С1у Сув Ьеи Сув Рго 35 40 45

Рго С1у Ме! Уа1 Агд Шв С1и Авп Агд Сув Уа1 А1а Ьеи С1и Агд Сув 50 55 60

Рго Сув РЬе Н1в С1п С1у Ьув С1и Туг А1а Рго С1у С1и ТЬг Уа1 Ьув 65 70 75 80

11е С1у Сув Авп ТЬг Сув Уа1 Сув Агд Авр Агд Ьув Тгр Авп Сув ТЬг 85 90 95

Авр Н1в Уа1 Сув Авр А1а ТЬг Сув δе^ ТЬг 11е С1у Ме! А1а Шв Туг 100 105 110

Ьеи ТЬг РЬе Авр С1у Ьеи Ьув Туг Ьеи РЬе Рго С1у С1и Сув С1п Туг 115 120 125

Уа1 Ьеи Уа1 С1п Авр Туг Сув С1у δе^ Авп Рго С1у ТЬг РЬе Агд 11е 130 135 140

Ьеи Уа1 С1у Авп Ьув С1у Сув δе^ Шв Рго δе^ Уа1 Ьув Сув Ьув Ьув 145 150 155 160

Агд Уа1 ТЬг 11е Ьеи Уа1 С1и С1у С1у С1и 11е С1и Ьеи РЬе Авр С1у 165 170 175

С1и Уа1 Авп Уа1 Ьув Агд Рго Ме! Ьув Авр С1и ТЬг Шв РЬе С1и Уа1 180 185 190

- 180 028309 ν;·ι1 01и Зег 01у Агд Туг 11е 11е Ьеи Ьеи Ьеи 01у Ьуз А1а Ьеи Зег 195 200 205 ν;·ι1 ν;·ι1 Тгр Азр Агд Шз Ьеи Зег 11е Зег ν;·ι1 ν;·ι1 Ьеи Ьуз 01п ТЬг 210 215 220

Туг 01п 01и Ьуз ν;·ι1 Суз 01у Ьеи Суз 01у Азп РЬе Азр 01у 11е 01п 225 230 235 240

Азп Азп Азр Ьеи ТЬг Зег Зег Азп Ьеи 01п Vа1 01и 01и Азр Рго Vа1 245 250 255

Азр РЬе 01у Азп Зег Тгр Ьуз Vа1 Зег Зег 01п Суз А1а Азр ТЬг Агд 260 265 270

Ьуз ν;·ι1 Рго Ьеи Азр Зег Зег Рго А1а ТЬг Суз Шз Азп Азп 11е Ме1 275 280 285

Ьуз 01п ТЬг Ме1 ν;·ι1 Азр Зег Зег Суз Агд 11е Ьеи ТЬг Зег Азр ν;·ι1 290 295 300

РЬе 01п Азр Суз Азп Ьуз Ьеи Vа1 Азр Рго 01и Рго Туг Ьеи Азр Vа1 305 310 315 320

Суз 11е Туг Азр ТЬг Суз Зег Суз 01и Зег 11е 01у Азр Суз А1а Суз 325 330 335

РЬе Суз Азр ТЬг 11е А1а А1а Туг А1а Шз ν;·ι1 Суз А1а 01п Шз 01у 340 345 350

Ьуз ν;·ι1 Vа1 ТЬг Тгр Агд ТЬг А1а ТЬг Ьеи Суз Рго 01п Зег Суз 01и 355 360 365

01и Агд Азп Ьеи Агд 01и Азп 01у Туг 01и Суз 01и Тгр Агд Туг Азп 370 375 380

Зег Суз А1а Рго А1а Суз 01η ν;·ι1 ТЬг Суз 01п Шз Рго 01и Рго Ьеи 385 390 395 400

А1а Суз Рго ν;·ι1 01η Суз ν;·ι1 01и 01у Суз Шз А1а Шз Суз Рго Рго 405 410 415

01у Ьуз 11е Ьеи Азр 01и Ьеи Ьеи 01п ТЬг Суз Vа1 Азр Рго 01и Азр 420 425 430

Суз Рго Vа1 Суз 01и Vа1 А1а 01у Агд Агд РЬе А1а Зег 01у Ьуз Ьуз 435 440 445

- 181 028309 νΗί ТЬг Ьеи Азп Рго Зег Азр Рго С1и Шз Суз С1п Не Суз Шз Суз 450 455 460

Азр νΗ1 ν;·ι1 Азп Ьеи ТЬг Суз С1и А1а Суз С1п О1ц Рго 465 470 475 <210> 74 <211> З0 <212> Белок <21З> Искусственная <220>

<22З> Домен ФВГОЪЗ (1-477 ак; мутация СЗЗ6А/СЗ79А) <220>

<221> ПОВТОР <222> (1)..(З0) <22З> О1у-О1у-О1у-О1у-Зег повтор 6 раз <400> 74

О1у О1у О1у Зег О1у О1у О1у О1у Зег О1у О1у О1у О1у Зег 20 25 З0 <210> 75 <211> 5 <212> Белок <21З> Искусственная <220>

<22З> линкер <400> 75

Агд Агд Агд Агд Зег 1 5 <210> 76 <211> 6 <212> Белок <21З> Искусственная <220>

<22З> линкер <400> 76

Агд Ьуз Агд Агд Ьуз Агд 1 5

- 182 028309 <210> 77 <211> 24 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> ЕБС17-Прям- ФВ клонирующий олиго с С1а1 <400> 77 д1ссддса1д адаа1сда1д 1д1д 24 <210> 78 <211> 31 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> ЕБС41- Обратн-ФВ с ЕсоКУ <400> 78 сс1ссассдс сада1а1сад аддсас1111 с 31 <210> 79 <211> 105 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> ЕБС78- Прям с сайтом ЕсоКУ <400> 79 ааад1дсс1с 1да1а1с1дд сдд1ддадд1 1ссдд1ддсд дддда1ссдд 1ддсддддда

1ссдд1ддсд ддддайсдд 1ддсддддда 1ссс1дд1сс сссдд 105 <210> 80 <211> 107 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> ЕБС79- Обратн с сайтом КзК11 <400> 80 даададдаад ас1дасдд1с сдсссаддад 11с1ддадс1 дддсасдд1д ддса1д1д1д адПИдйд сс1ссдс1дс сссдддддас садддайсс ссдссас 107 <210> 81 <211> 48 <212> Белок <213> Искусственная <220>

<223> линкер <400> 81

- 183 028309

11с 8ег С1у С1у С1у С1у 8ег С1у С1у С1у С1у 8ег С1у С1у С1у С1у

5 10 15

8ег С1у С1у С1у С1у 8ег С1у С1у С1у С1у 8ег С1у С1у С1у С1у 8ег 20 25 30

Ьеи Уа1 Рго Агд С1у 8ег С1у С1у С1у С1у 8ег С1у С1у С1у С1у 8ег 35 40 45 <210> 82 <211> 1781 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> р8¥ШФУШ-049, которая является конструкцией ФУШ-Рс с отщепляемым линкером между двумя Рс-доменами; ОепзспрННомер последовательности 103069 <400> 82 ссд1сдасаа дадсадд1дд садсадддда асд1с11с1с а1дс1ссд1д а1дса1дадд 60 сЫдсасаа ссасЫсасд садаададсс 1с1ссс1д1с 1ссддд1ааа сддсдссдсс 120 ддадсдд1дд сддсдда1са дд1ддддд1д да1саддсдд 1ддадд11сс дд1ддсдддд 180 да1ссддсдд 1ддадд11сс дд1ддддд1д да1сааддаа даддаддаад адаадсс1а1 240 сс1д1сддсс сссса1дд1с аадс1дд1д1 д1сссдс1да саасс1дсдд дс1даадддс 300

1сдад1д1ас саааасд1дс садаас1а1д асс1ддад1д са1дадса1д ддс1д1д1с1 360 с1ддс1дсс1 с1дссссссд ддса1дд1сс ддса1дадаа 1сда1д1д1д дссс1ддааа 420 дд1д1ссс1д с11сса1сад ддсааддад1 а1дсссс1дд адааасад1д аада11ддс1 480 дсаасас11д 1д1с1д1сдд дассддаад1 ддаас1дсас адасса1д1д 1д1да1дсса 540 сд1дс1ссас да1сддса1д дсссас1асс 1сасс11сда сдддс1сааа 1асс1д11сс 600 ссддддад1д ссад1асд11 с1дд1дсадд а11ас1дсдд сад1аассс1 дддасс111с 660 дда1сс1ад1 ддддаа1аад дда1дсадсс асссс1сад1 дааа1дсаад ааасддд1са 720 сса1сс1дд1 ддадддадда дада11дадс 1д111дасдд ддадд1даа1 д1даададдс 780 сса1даадда 1дадас1сас 111дадд1дд 1ддад1с1дд ссдд1аса1с а11с1дс1дс 840

1дддсааадс сс1с1ссд1д д1с1дддасс дссасс1дад са1с1ссд1д д1сс1даадс 900 адаса1асса ддадааад1д 1д1ддсс1д1 д1дддаа111 1да1ддса1с садаасаа1д 960 ассйассад садсаассй саад1ддадд аадассс1д1 ддасШддд аас1сс1дда 1020 аад1дадс1с дсад1д1дс1 дасассадаа аад1дсс1с1 ддасйайс сс1дссасс1 1080 дссаЫасаа са1са1даад садасда1дд 1дда11сс1с с1д1адаа1с сйассад1д 1140 асдйПсса ддас1дсаас аадс1дд1дд ассссдадсс а1а1с1дда1 д1с1дсаШ 1200

- 184 028309 асдасасс!д с!сс!д!дад !сса!!дддд ас!дсдссдс а!!с!дсдас асса!!дс!д 1260 сс!а!дссса сд!д!д!дсс садса!ддса адд!дд!дас с!ддаддасд дссаса!!д! 1320 дсссссадад с!дсдаддад аддаа!с!сс дддадаасдд д!а!даддс! дад!ддсдс! 1380 а!аасадс!д !дсасс!дсс !д!саад!са сд!д!садса ссс!дадсса с!ддсс!дсс 1440 с!д!дсад!д !д!ддадддс !дсса!дссс ас!дссс!сс адддаааа!с с!дда!дадс 1500 !!!!дсадас с!дсд!!дас сс!даадас! д!ссад!д!д !дадд!ддс! ддссддсд!! 1560 !!дсс!садд ааадааад!с асс!!даа!с ссад!дассс !дадсас!дс сада!!!дсс 1620 ас!д!да!д! !д!саасс!с асс!д!даад сс!дссадда дссда!сда! ддсдд!ддад 1680 д!!ссдд!дд сддддда!сс с!дд!ссссс ддддсадсдд аддсдасааа ас!сасаса! 1740 дсссассд!д сссадс!сса даас!сс!дд дсддассд!с а 1781 <210> 83 <211> 220 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> Фрагмент конструкции Сепкспр! был субклонирован в расщепляемую ЕсоК^КкКП рЗΥN-ФVШ-0159; Сепкспр!-Последовательность №-132601 <400> 83 ааад!дсс!с !да!а!с!дд сдд!ддадд! !ссдд!ддсд дддда!ссдд сдд!ддадд! 60 !ссддсдд!д дадд!!ссдд !ддсддддда !ссдд!ддсд дддда!ссс! дд!сссссдд 120 ддсадсддсд д!ддадд!!с сдд!ддсддд дда!ссдаса ааас!сасас а!дсссассд 180 !дсссадс!с садаас!сс! дддсддассд !сад!с!!сс 220 <210> 84 <211> 73 <212> Белок <213> Искусственная <220>

<223> рЗΥN-VШ-178 содержит 73-аминокислотный линкер между фрагментом ФВ и Рс-областью; синтез фрагмента ДНК, кодирующего 73-аминокислотный линкер <400> 84

Пе Зег С1у С1у С1у С1у Зег С1у С1у С1у С1у Зег С1у С1у С1у С1у

5 10 15

Зег С1у С1у С1у С1у Зег С1у С1у С1у С1у Зег С1у С1у С1у С1у Зег 20 25 30

- 185 028309

С1у С1у С1у С1у Зег С1у С1у С1у С1у Зег С1у С1у С1у С1у Зег С1у 35 40 45

С1у С1у С1у Зег С1у С1у С1у С1у Зег Ьеи Уа1 Рго Агд С1у Зег С1у 50 55 60

С1у С1у С1у Зег С1у С1у С1у С1у Зег 65 70 <210> 85 <211> 299 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> Сеп8сг1р!-Последовательность №-144849 <400> 85 дсс!дссадд адссда!а!с !ддсдд!дда дд!!ссдд!д дсддддда!с сддсдд!дда дд!!ссддсд д!ддадд!!с сдд!ддсддд дда!ссддсд д!ддадд!!с сдд!ддсддд дда!ссддсд д!ддадд!!с сддсдд!дда дд!!ссдд!д дсддддда!с сдд!ддсддд дда!ссс!дд !сссссдддд садсддсдд! ддадд!!ссд д!ддсддддд а!ссдасааа ас!сасаса! дсссссд!дс ссадс!ссад аас!сс!ддд сддассд!са д!с!!сс!с 299 <210> 86 <211> 98 <212> Белок <213> Искусственная <220>

<223> линкер <400> 86

11с Зег С1у С1у С1у С1у Зег С1у С1у С1у С1у Зег С1у С1у С1у С1у 1 5 10 15

С1у С1у С1у Зег С1у С1у С1у С1у Зег С1у С1у С1у С1у Зег С1у С1у 50 55 60

С1у С1у Зег С1у С1у С1у С1у Зег С1у С1у С1у С1у Зег С1у С1у С1у 65 70 75 80

- 186 028309

01у Зег Ьеи Уа1 Рго Агд О1у Зег О1у О1у О1у О1у Зег О1у О1у О1у 85 90 95

О1у Зег <210> 87 <211> 380 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> Оеизсг1р!-Последовательность №-144849 <400> 87 дсс!дссадд адссда!а!с !ддсдд!дда дд!!ссдд!д дсддддда!с сддсдд!дда дд!!ссддсд д!ддадд!!с сдд!ддсддд дда!ссддсд д!ддадд!!с сдд!ддсддд дда!ссддсд д!ддадд!!с сддсдд!дда дд!!ссдд!д дсддддда!с сддсдд!дда дд!!ссдд!д дсддддда!с сддсдд!дда дд!!ссддсд д!ддадд!!с сдд!ддсддд дда!ссдд!д дсддддда!с сс!дд!сссс сддддсадсд дсдд!ддадд !!ссдд!ддс ддддда!ссд асаааас!са саса!дссса ссд!дсссад с!ссадаас! сс!дддсдда ссд!сад!с! !сс!с!!ссс 380

120

180

240

300

360 <210> 88 <211> 2449 <212> Белок <213> Искусственная <220>

<223> Гетеродимер ФУШ-ФВ-Рс <400> 88

Ме! О1и 11е О1и Ьеи Зег ТЬг Суз РЬе РЬе Ьеи Суз Ьеи Ьеи Агд РЬе 1 5 10 15

Суз РЬе Зег А1а ТЬг Агд Агд Туг Туг Ьеи О1у А1а Уа1 О1и Ьеи Зег 20 25 30

Тгр Азр Туг Ме! О1и Зег Азр Ьеи О1у О1и Ьеи Рго Уа1 Азр А1а Агд 35 40 45

РЬе Рго Рго Агд Уа1 Рго Ьуз Зег РЬе Рго РЬе Ази ТЬг Зег Уа1 Уа1 50 55 60

Туг Ьуз Ьуз ТЬг Ьеи РЬе Уа1 О1и РЬе ТЬг Азр Шз Ьеи РЬе Ази 11е 65 70 75 80

- 187 028309

А1а Ьук Рго Агд Рго Рго Тгр Ме1 С1у Ьеи Ьеи С1у Рго ТЬг 11е С1п 85 90 95

А1а С1и Уа1 Туг Акр ТЬг Уа1 Уа1 11е ТЬг Ьеи Ьук Акп Ме1 А1а 8ег 100 105 110

Шк Рго Уа1 8ег Ьеи Шк А1а Уа1 С1у Уа1 8ег Туг Тгр Ьук А1а 8ег 115 120 125

С1и С1у А1а С1и Туг Акр Акр С1п ТЬг 8ег С1п Агд С1и Ьук С1и Акр 130 135 140

Акр Ьук Уа1 РЬе Рго С1у С1у 8ег Шк ТЬг Туг Уа1 Тгр С1п Уа1 Ьеи 145 150 155 160

Ьук С1и Акп С1у Рго Ме1 А1а 8ег Акр Рго Ьеи Сук Ьеи ТЬг Туг 8ег 165 170 175

Туг Ьеи 8ег Шк Уа1 Акр Ьеи Уа1 Ьук Акр Ьеи Акп 8ег С1у Ьеи 11е 180 185 190

С1у А1а Ьеи Ьеи Уа1 Сук Агд С1и С1у 8ег Ьеи А1а Ьук С1и Ьук ТЬг 195 200 205

С1п ТЬг Ьеи Шк Ьук РЬе 11е Ьеи Ьеи РЬе А1а Уа1 РЬе Акр С1и С1у 210 215 220

Ьук 8ег Тгр Шк 8ег С1и ТЬг Ьук Акп 8ег Ьеи Ме1 С1п Акр Агд Акр 225 230 235 240

А1а А1а 8ег А1а Агд А1а Тгр Рго Ьук Ме1 Шк ТЬг Уа1 Акп С1у Туг 245 250 255

Уа1 Акп Агд 8ег Ьеи Рго С1у Ьеи 11е С1у Сук Шк Агд Ьук 8ег Уа1 260 265 270

Туг Тгр Шк Уа1 11е С1у Ме1 С1у ТЬг ТЬг Рго С1и Уа1 Шк 8ег 11е 275 280 285

РЬе Ьеи С1и С1у Шк ТЬг РЬе Ьеи Уа1 Агд Акп Шк Агд С1п А1а 8ег 290 295 300

Ьеи С1и 11е 8ег Рго 11е ТЬг РЬе Ьеи ТЬг А1а С1п ТЬг Ьеи Ьеи Ме1 305 310 315 320

Акр Ьеи С1у С1п РЬе Ьеи Ьеи РЬе Сук Шк 11е 8ег 8ег Шк С1п Шк 325 330 335

- 188 028309

Азр 01у Ме1 01и А1а Туг Уа1 Ьуз Уа1 Азр Бег Суз Рго О1и О1и Рго 340 345 350

О1п Ьеи Агд Ме1 Ьуз Азп Азп О1и О1и А1а О1и Азр Туг Азр Азр Азр 355 360 365

Ьеи ТНг Азр Бег О1и Ме1 Азр Уа1 Уа1 Агд РНе Азр Азр Азр Азп Бег 370 375 380

Рго Бег РНе 11е О1п 11е Агд Бег Уа1 А1а Ьуз Ьуз Шз Рго Ьуз ТНг 385 390 395 400

Тгр Уа1 Шз Туг 11е А1а А1а О1и О1и О1и Азр Тгр Азр Туг А1а Рго 405 410 415

Ьеи Уа1 Ьеи А1а Рго Азр Азр Агд Бег Туг Ьуз Бег О1п Туг Ьеи Азп 420 425 430

Азп О1у Рго О1п Агд 11е О1у Агд Ьуз Туг Ьуз Ьуз Уа1 Агд РНе Ме1 435 440 445

А1а Туг ТНг Азр О1и ТНг РНе Ьуз ТНг Агд О1и А1а 11е О1п Шз О1и 450 455 460

Бег О1у 11е Ьеи О1у Рго Ьеи Ьеи Туг О1у О1и Уа1 О1у Азр ТНг Ьеи 465 470 475 480

Ьеи 11е 11е РНе Ьуз Азп О1п А1а Бег Агд Рго Туг Азп 11е Туг Рго 485 490 495

Шз О1у 11е ТНг Азр Уа1 Агд Рго Ьеи Туг Бег Агд Агд Ьеи Рго Ьуз 500 505 510

О1у Уа1 Ьуз Шз Ьеи Ьуз Азр РНе Рго 11е Ьеи Рго О1у О1и 11е РНе 515 520 525

Ьуз Туг Ьуз Тгр ТНг Уа1 ТНг Уа1 О1и Азр О1у Рго ТНг Ьуз Бег Азр 530 535 540

Рго Агд Суз Ьеи ТНг Агд Туг Туг Бег Бег РНе Уа1 Азп Ме1 О1и Агд 545 550 555 560

Азр Ьеи А1а Бег О1у Ьеи 11е О1у Рго Ьеи Ьеи 11е Суз Туг Ьуз О1и 565 570 575

- 189 028309

Зег Уа1 Акр О1п Агд О1у Акп О1п 11е МеХ Зег Акр Ьук Агд Акп Уа1 580 585 590

11е Ьеи РЬе Зег Уа1 РЬе Акр О1и Акп Агд Зег Тгр Туг Ьеи ТЬг О1и 595 600 605

Акп 11е О1п Агд РЬе Ьеи Рго Акп Рго А1а О1у Уа1 О1п Ьеи О1и Акр 610 615 620

Рго О1и РЬе О1п А1а Зег Акп 11е МеХ Шк Зег 11е Акп О1у Туг Уа1 625 630 635 640

РЬе Акр Зег Ьеи О1п Ьеи Зег Уа1 Сук Ьеи Шк О1и Уа1 А1а Туг Тгр 645 650 655

Туг 11е Ьеи Зег 11е О1у А1а О1п ТЬг Акр РЬе Ьеи Зег Уа1 РЬе РЬе 660 665 670

Зег О1у Туг ТЬг РЬе Ьук Шк Ьук МеХ Уа1 Туг О1и Акр ТЬг Ьеи ТЬг 675 680 685

Ьеи РЬе Рго РЬе Зег О1у О1и ТЬг Уа1 РЬе МеХ Зег МеХ О1и Акп Рго 690 695 700

О1у Ьеи Тгр 11е Ьеи О1у Сук Шк Акп Зег Акр РЬе Агд Акп Агд О1у 705 710 715 720

МеХ ТЬг А1а Ьеи Ьеи Ьук Уа1 Зег Зег Сук Акр Ьук Акп ТЬг О1у Акр 725 730 735

Туг Туг О1и Акр Зег Туг О1и Акр 11е Зег А1а Туг Ьеи Ьеи Зег Ьук 740 745 750

Акп Акп А1а 11е О1и Рго Агд Зег РЬе Зег О1п Акп Рго Рго Уа1 Ьеи 755 760 765

Ьук Агд Шк О1п Агд О1и 11е ТЬг Агд ТЬг ТЬг Ьеи О1п Зег Акр О1п 770 775 780

О1и О1и 11е Акр Туг Акр Акр ТЬг 11е Зег Уа1 О1и МеХ Ьук Ьук О1и 785 790 795 800

Акр РЬе Акр 11е Туг Акр О1и Акр О1и Акп О1п Зег Рго Агд Зег РЬе 805 810 815

О1п Ьук Ьук ТЬг Агд Шк Туг РЬе 11е А1а А1а Уа1 О1и Агд Ьеи Тгр 820 825 830

- 190 028309

Акр Туг С1у Ме! 8ег 8ег 8ег Рго Шк Уа1 Ьеи Агд Акп Агд А1а С1п 835 840 845

8ег С1у 8ег Уа1 Рго С1п РЬе Ьук Ьук Уа1 Уа1 РЬе С1п С1и РЬе ТЬг 850 855 860

Акр С1у 8ег РЬе ТЬг С1п Рго Ьеи Туг Агд С1у С1и Ьеи Акп С1и Шк 865 870 875 880

Ьеи С1у Ьеи Ьеи С1у Рго Туг 11е Агд А1а С1и Уа1 С1и Акр Акп 11е 885 890 895

Ме! Уа1 ТЬг РЬе Агд Акп С1п А1а 8ег Агд Рго Туг 8ег РЬе Туг 8ег 900 905 910

8ег Ьеи 11е 8ег Туг С1и С1и Акр С1п Агд С1п С1у А1а С1и Рго Агд 915 920 925

Ьук Акп РЬе Уа1 Ьук Рго Акп С1и ТЬг Ьук ТЬг Туг РЬе Тгр Ьук Уа1 930 935 940

С1п Шк Шк Ме! А1а Рго ТЬг Ьук Акр С1и РЬе Акр Сук Ьук А1а Тгр 945 950 955 960

А1а Туг РЬе 8ег Акр Уа1 Акр Ьеи С1и Ьук Акр Уа1 Шк 8ег С1у Ьеи 965 970 975

11е С1у Рго Ьеи Ьеи Уа1 Сук Шк ТЬг Акп ТЬг Ьеи Акп Рго А1а Шк 980 985 990

С1у Агд С1п Уа1 ТЬг Уа1 С1п С1и РЬе А1а Ьеи РЬе РЬе ТЬг 11е РЬе 995 1000 1005

Акр С1и ТЬг Ьук 8ег Тгр Туг РЬе ТЬг С1и Акп Ме! С1и Агд Акп 1010 1015 1020

Сук Агд А1а Рго Сук Акп 11е С1п Ме! С1и Акр Рго ТЬг РЬе Ьук 1025 1030 1035

С1и Акп Туг Агд РЬе Шк А1а 11е Акп С1у Туг 11е Ме! Акр ТЬг 1040 1045 1050

Ьеи Рго С1у Ьеи Уа1 Ме! А1а С1п Акр С1п Агд 11е Агд Тгр Туг 1055 1060 1065

- 191 028309

Ьеи Ьеи δе^ Ме! С1у δе^ Авп С1и Авп 11е Шв δе^ 11е Шв РЬе 1070 1075 1080 δе^ С1у Шв Уа1 РЬе ТЬг Уа1 Агд Ьув Ьув С1и С1и Туг Ьув Ме! 1085 1090 1095

А1а Ьеи Туг Авп Ьеи Туг Рго С1у Уа1 РЬе С1и ТЬг Уа1 С1и Ме! 1100 1105 1110

Ьеи Рго δе^ Ьув А1а С1у 11е Тгр Агд Уа1 С1и Сув Ьеи 11е С1у 1115 1120 1125

С1и Шв Ьеи Шв А1а С1у Ме! δе^ ТЬг Ьеи РЬе Ьеи Уа1 Туг δе^ 1130 1135 1140

Авп Ьув Сув С1п ТЬг Рго Ьеи С1у Ме! А1а δе^ С1у Шв 11е Агд 1145 1150 1155

Авр РЬе С1п 11е ТЬг А1а δе^ С1у С1п Туг С1у С1п Тгр А1а Рго 1160 1165 1170

Ьув Ьеи А1а Агд Ьеи Шв Туг δе^ С1у δе^ 11е Авп А1а Тгр δе^ 1175 1180 1185

ТЬг Ьув С1и Рго РЬе δе^ Тгр 11е Ьув Уа1 Авр Ьеи Ьеи А1а Рго 1190 1195 1200

Ме! 11е 11е Шв С1у 11е Ьув ТЬг С1п С1у А1а Агд С1п Ьув РЬе 1205 1210 1215 δе^ δе^ Ьеи Туг 11е δе^ С1п РЬе 11е 11е Ме! Туг δе^ Ьеи Авр 1220 1225 1230

С1у Ьув Ьув Тгр С1п ТЬг Туг Агд С1у Авп δе^ ТЬг С1у ТЬг Ьеи 1235 1240 1245

Ме! Уа1 РЬе РЬе С1у Авп Уа1 Авр δе^ δе^ С1у 11е Ьув Шв Авп 1250 1255 1260

11е РЬе Авп Рго Рго 11е 11е А1а Агд Туг 11е Агд Ьеи Шв Рго 1265 1270 1275

ТЬг Шв Туг δе^ 11е Агд δе^ ТЬг Ьеи Агд Ме! С1и Ьеи Ме! С1у 1280 1285 1290

Сув Авр Ьеи Авп δе^ Сув δе^ Ме! Рго Ьеи С1у Ме! С1и δе^ Ьув 1295 1300 1305

- 192 028309

А1а 11е Зег Акр А1а С1п 11е ТЬг А1а Зег Зег Туг РЬе ТЬг Акп 1310 1315 1320

Ме1 РЬе А1а ТЬг Тгр Зег Рго Зег Ьук А1а Агд Ьеи Нк Ьеи С1п 1325 1330 1335

С1у Агд Зег Акп А1а Тгр Агд Рго С1п Уа1 Акп Акп Рго Ьук С1и 1340 1345 1350

Тгр Ьеи С1п Уа1 Акр РЬе С1п Ьук ТЬг Ме1 Ьук Уа1 ТЬг С1у Уа1 1355 1360 1365

ТЬг ТЬг С1п С1у Уа1 Ьук Зег Ьеи Ьеи ТЬг Зег Ме1 Туг Уа1 Ьук 1370 1375 1380

С1и РЬе Ьеи 11е Зег Зег Зег С1п Акр С1у Нк С1п Тгр ТЬг Ьеи 1385 1390 1395

РЬе РЬе С1п Акп С1у Ьук Уа1 Ьук Уа1 РЬе С1п С1у Акп С1п Акр 1400 1405 1410

Зег РЬе ТЬг Рго Уа1 Уа1 Акп Зег Ьеи Акр Рго Рго Ьеи Ьеи ТЬг 1415 1420 1425

Агд Туг Ьеи Агд 11е Нк Рго С1п Зег Тгр Уа1 Нк С1п 11е А1а 1430 1435 1440

Ьеи Агд Ме1 С1и Уа1 Ьеи С1у Сук С1и А1а С1п Акр Ьеи Туг Акр 1445 1450 1455

Ьук ТЬг Нк ТЬг Сук Рго Рго Сук Рго А1а Рго С1и Ьеи Ьеи С1у

1460	1465	1470
С1у Рго	Зег Уа1 РЬе Ьеи РЬе Рго Рго Ьук Рго Ьук Акр ТЬг Ьеи
1475	1480	1485
Ме1 11е	Зег Агд ТЬг Рго С1и Уа1 ТЬг Сук Уа1 Уа1 Уа1 Акр Уа1
1490	1495	1500

Зег Нк С1и Акр Рго С1и Уа1 Ьук РЬе Акп Тгр Туг Уа1 Акр С1у 1505 1510 1515

Уа1 С1и Уа1 Нк Акп А1а Ьук ТЬг Ьук Рго Агд С1и С1и С1п Туг 1520 1525 1530

- 193 028309

Азп Зег ТЬг Туг Агд νΗ1 ν;·ι1 Зег νΗ1 Ьеи ТЬг νΗ1 Ьеи Шз О1п 15З5 1540 1545

Азр Тгр Ьеи Азп О1у Ьуз О1и Туг Ьуз Суз Ьуз νΗ1 Зег Азп Ьуз 1550 1555 1560

А1а Ьеи Рго А1а Рго 11е О1и Ьуз ТЬг 11е Зег Ьуз А1а Ьуз О1у 1565 1570 1575

О1п Рго Агд О1и Рго О1п Vа1 Туг ТЬг Ьеи Рго Рго Зег Агд Азр 1580 1585 1590

О1и Ьеи ТЬг Ьуз Азп О1п Vаί Зег Ьеи ТЬг Суз Ьеи Vа1 Ьуз О1у 1595 1600 1605

РЬе Туг Рго Зег Азр 11е А1а Vаί О1и Тгр О1и Зег Азп О1у О1п 1610 1615 1620

Рго О1и Азп Азп Туг Ьуз ТЬг ТЬг Рго Рго Vа1 Ьеи Азр Зег Азр 1625 16З0 16З5

О1у Зег РЬе РЬе Ьеи Туг Зег Ьуз Ьеи ТЬг Vаί Азр Ьуз Зег Агд 1640 1645 1650

Тгр О1п О1п О1у Азп Vаί РЬе Зег Суз Зег Vаί Ме1 Шз С1и А1а 1655 1660 1665

Ьеи Шз Азп Шз Туг ТЬг С1п Ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи Зег Рго С1у 1670 1675 1680

Ьуз Агд Агд Агд Агд Зег С1у С1у С1у С1у Зег С1у С1у С1у С1у 1685 1690 1695

Зег С1у С1у С1у С1у Зег С1у С1у С1у С1у Зег С1у С1у С1у С1у 1700 1705 1710

Зег С1у С1у С1у С1у Зег Агд Ьуз Агд Агд Ьуз Агд Зег Ьеи Зег 1715 1720 1725

Суз Агд Рго Рго Ме1 Vаί Ьуз Ьеи Vаί Суз Рго А1а Азр Азп Ьеи 17З0 17З5 1740

Агд А1а С1и С1у Ьеи С1и Суз ТЬг Ьуз ТЬг Суз С1п Азп Туг Азр 1745 1750 1755

Ьеи С1и Суз Ме1 Зег Ме1 С1у Суз Vаί Зег С1у Суз Ьеи Суз Рго 1760 1765 1770

- 194 028309

Рго 01у Ме1 Vа1 Агд Шз 01и Азп Агд Суз Vа1 А1а Ьеи 01и Агд 1775 1780 1785

Суз Рго Суз РЬе Шз 01п 01у Ьуз 01и Туг А1а Рго 01у 01и ТЬг 1790 1795 1800 ν;·ι1 Ьуз 11е 01у Суз Азп ТЬг Суз ν;·ι1 Суз Агд Азр Агд Ьуз Тгр 1805 1810 1815

Азп Суз ТЬг Азр Шз Vа1 Суз Азр А1а ТЬг Суз Зег ТЬг 11е 01у 1820 1825 1830

Ме1 А1а Шз Туг Ьеи ТЬг РЬе Азр 01у Ьеи Ьуз Туг Ьеи РЬе Рго 1835 1840 1845

01у 01и Суз 01п Туг ν;·ι1 Ьеи Vа1 01п Азр Туг Суз 01у Зег Азп 1850 1855 1860

Рго 01у ТЬг РЬе Агд 11е Ьеи ν;·ι1 01у Азп Ьуз 01у Суз Зег Шз 1865 1870 1875

Рго Зег Vа1 Ьуз Суз Ьуз Ьуз Агд ν;·ι1 ТЬг 11е Ьеи Vа1 01и 01у 1880 1885 1890

01у 01и 11е 01и Ьеи РЬе Азр 01у 01и Vа1 Азп Vа1 Ьуз Агд Рго 1895 1900 1905

Ме1 Ьуз Азр 01и ТЬг Шз РЬе 01и Vа1 Vа1 01и Зег 01у Агд Туг 1910 1915 1920

11е 11е Ьеи Ьеи Ьеи 01у Ьуз А1а Ьеи Зег Vа1 Vа1 Тгр Азр Агд 1925 1930 1935

Шз Ьеи Зег 11е Зег Vа1 ν;·ι1 Ьеи Ьуз 01п ТЬг Туг 01п 01и Ьуз 1940 1945 1950 ν;·ι1 Суз 01у Ьеи Суз 01у Азп РЬе Азр 01у 11е 01п Азп Азп Азр 1955 1960 1965

Ьеи ТЬг Зег Зег Азп Ьеи 01η ν;·ι1 01и 01и Азр Рго ν;·ι1 Азр РЬе 1970 1975 1980

01у Азп Зег Тгр Ьуз Vа1 Зег Зег 01п Суз А1а Азр ТЬг Агд Ьуз 1985 1990 1995

- 195 028309

Уа1 Рго Ьеи Азр Зег Зег Рго А1а ТЬг Суз Шз Ази Ази 11е Ме! 2000 2005 2010

Ьуз О1и ТЬг Ме! Уа1 Азр Зег Зег Суз Агд 11е Ьеи ТЬг Зег Азр 2015 2020 2025

Уа1 РЬе О1и Азр Суз Ази Ьуз Ьеи Уа1 Азр Рго О1и Рго Туг Ьеи 2030 2035 2040

Азр Уа1 Суз 11е Туг Азр ТЬг Суз Зег Суз О1и Зег 11е О1у Азр 2045 2050 2055

Суз А1а А1а РЬе Суз Азр ТЬг 11е А1а А1а Туг А1а Шз Уа1 Суз 2060 2065 2070

А1а О1и Шз О1у Ьуз Уа1 Уа1 ТЬг Тгр Агд ТЬг А1а ТЬг Ьеи Суз 2075 2080 2085

Рго О1и Зег Суз О1и О1и Агд Ази Ьеи Агд О1и Ази О1у Туг О1и 2090 2095 2100

А1а О1и Тгр Агд Туг Ази Зег Суз А1а Рго А1а Суз О1и Уа1 ТЬг 2105 2110 2115

Суз О1и Шз Рго О1и Рго Ьеи А1а Суз Рго Уа1 О1и Суз Уа1 О1и 2120 2125 2130

О1у Суз Шз А1а Шз Суз Рго Рго О1у Ьуз 11е Ьеи Азр О1и Ьеи 2135 2140 2145

Ьеи О1и ТЬг Суз Уа1 Азр Рго О1и Азр Суз Рго Уа1 Суз О1и Уа1 2150 2155 2160

А1а О1у Агд Агд РЬе А1а Зег О1у Ьуз Ьуз Уа1 ТЬг Ьеи Ази Рго 2165 2170 2175

Зег Азр Рго О1и Шз Суз О1и 11е Суз Шз Суз Азр Уа1 Уа1 Ази 2180 2185 2190

Ьеи ТЬг Суз О1и А1а Суз О1и О1и Рго 11е Азр О1у О1у О1у О1у 2195 2200 2205

Зег О1у О1у О1у О1у Зег Ьеи Уа1 Рго Агд О1у Зег О1у О1у Азр 2210 2215 2220

Ьуз ТЬг Шз ТЬг Суз Рго Рго Суз Рго А1а Рго О1и Ьеи Ьеи О1у 2225 2230 2235

- 196 028309

С1у Рго Зег Vа1 РЬе Ьеи РЬе Рго Рго Ьук Рго Ьук Акр ТЬг Ьеи 2240 2245 2250

Ме! 11е Зег Агд ТЬг Рго С1и Vа1 ТЬг Сук ν;·ι1 Vа1 Vа1 Акр Vа1 2255 2260 2265

Зег Шк С1и Акр Рго С1и Vа1 Ьук РЬе Акп Тгр Туг Vа1 Акр С1у 2270 2275 2280 ν;·ι1 С1и ν;·ι1 Шк Акп А1а Ьук ТЬг Ьук Рго Агд С1и С1и С1п Туг 2285 2290 2295

Акп Зег ТЬг Туг Агд Vа1 ν;·ι1 Зег Vа1 Ьеи ТЬг Vа1 Ьеи Шк С1п 2300 2305 2310

Акр Тгр Ьеи Акп С1у Ьук С1и Туг Ьук Сук Ьук Vа1 Зег Акп Ьук 2315 2320 2325

А1а Ьеи Рго А1а Рго 11е С1и Ьук ТЬг 11е Зег Ьук А1а Ьук С1у 2330 2335 2340

С1п Рго Агд С1и Рго С1п Vа1 Туг ТЬг Ьеи Рго Рго Зег Агд Акр 2345 2350 2355

С1и Ьеи ТЬг Ьук Акп С1п ν;·ι1 Зег Ьеи ТЬг Сук Ьеи Vа1 Ьук С1у 2360 2365 2370

РЬе Туг Рго Зег Акр 11е А1а ν;·ι1 С1и Тгр С1и Зег Акп С1у С1п 2375 2380 2385

Рго С1и Акп Акп Туг Ьук ТЬг ТЬг Рго Рго Vа1 Ьеи Акр Зег Акр 2390 2395 2400

С1у Зег РЬе РЬе Ьеи Туг Зег Ьук Ьеи ТЬг ν;·ι1 Акр Ьук Зег Агд 2405 2410 2415

Тгр С1п С1п С1у Акп ν;·ι1 РЬе Зег Сук Зег ν;·ι1 Ме! Шк С1и А1а 2420 2425 2430

Ьеи Шк Акп Шк Туг ТЬг С1п Ьук Зег Ьеи Зег Ьеи Зег Рго С1у 2435 2440 2445

Ьук

- 197 028309 <210> 89 <211> 48 <212> Белок <213> Искусственная <220>

<223> 48-аминокислотный линкер <400> 89

11с Зег О1у О1у О1у О1у Зег О1у О1у О1у О1у Зег О1у О1у О1у О1у 1 5 10 15

Зег О1у О1у О1у О1у Зег О1у О1у О1у О1у Зег О1у О1у О1у О1у Зег 20 25 30

Ьеи Уа1 Рго Агд О1у Зег О1у О1у О1у О1у Зег О1у О1у О1у О1у Зег 35 40 45 <210> 90 <211> 1665 <212> Белок <213> Искусственная <220>

<223> зрелый белок рЗУК-ФУШ-155 <400> 90

А1а ТЬг Агд Агд Туг Туг Ьеи О1у А1а Уа1 О1и Ьеи Зег Тгр Акр Туг 1 5 10 15

МеХ О1п Зег Акр Ьеи О1у О1и Ьеи Рго Уа1 Акр А1а Агд РЬе Рго Рго 20 25 30

Агд Уа1 Рго Ьук Зег РЬе Рго РЬе Акп ТЬг Зег Уа1 Уа1 Туг Ьук Ьук 35 40 45

Агд Рго Рго Тгр МеХ О1у Ьеи Ьеи О1у Рго ТЬг 11е О1п А1а О1и Уа1 65 70 75 80

Туг Акр ТЬг Уа1 Уа1 11е ТЬг Ьеи Ьук Акп МеХ А1а Зег Шк Рго Уа1 85 90 95

Зег Ьеи Шк А1а Уа1 О1у Уа1 Зег Туг Тгр Ьук А1а Зег О1и О1у А1а 100 105 110

О1и Туг Акр Акр О1п ТЬг Зег О1п Агд О1и Ьук О1и Акр Акр Ьук Уа1 115 120 125

- 198 028309

РНе Рго О1у О1у Бег Шз ТНг Туг Уа1 Тгр О1п Уа1 Ьеи Ьуз О1и Азп 130 135 140

О1у Рго Ме1 А1а Бег Азр Рго Ьеи Суз Ьеи ТНг Туг Бег Туг Ьеи Бег 145 150 155 160

Шз Уа1 Азр Ьеи Уа1 Ьуз Азр Ьеи Азп Бег О1у Ьеи 11е О1у А1а Ьеи 165 170 175

Ьеи Уа1 Суз Агд С1и С1у Бег Ьеи А1а Ьуз С1и Ьуз ТНг С1п ТНг Ьеи 180 185 190

Шз Ьуз РНе 11е Ьеи Ьеи РНе А1а Уа1 РНе Азр С1и С1у Ьуз Бег Тгр 195 200 205

Шз Бег С1и ТНг Ьуз Азп Бег Ьеи Ме1 С1п Азр Агд Азр А1а А1а Бег 210 215 220

А1а Агд А1а Тгр Рго Ьуз Ме1 Шз ТНг Уа1 Азп С1у Туг Уа1 Азп Агд 225 230 235 240

Бег Ьеи Рго С1у Ьеи 11е С1у Суз Шз Агд Ьуз Бег Уа1 Туг Тгр Шз 245 250 255

Уа1 11е С1у Ме1 С1у ТНг ТНг Рго С1и Уа1 Шз Бег 11е РНе Ьеи С1и 260 265 270

С1у Шз ТНг РНе Ьеи Уа1 Агд Азп Шз Агд С1п А1а Бег Ьеи С1и 11е 275 280 285

Бег Рго 11е ТНг РНе Ьеи ТНг А1а С1п ТНг Ьеи Ьеи Ме1 Азр Ьеи С1у 290 295 300

С1п РНе Ьеи Ьеи РНе Суз Шз 11е Бег Бег Шз С1п Шз Азр С1у Ме1 305 310 315 320

С1и А1а Туг Уа1 Ьуз Уа1 Азр Бег Суз Рго С1и С1и Рго С1п Ьеи Агд 325 330 335

Ме1 Ьуз Азп Азп С1и С1и А1а С1и Азр Туг Азр Азр Азр Ьеи ТНг Азр 340 345 350

Бег С1и Ме1 Азр Уа1 Уа1 Агд РНе Азр Азр Азр Азп Бег Рго Бег РНе 355 360 365

- 199 028309

11е С1п 11е Агд Зег Уа1 А1а Ьук Ьук Нк Рго Ьук ТЬг Тгр Уа1 Нк 370 375 380

Туг 11е А1а А1а С1и С1и С1и Акр Тгр Акр Туг А1а Рго Ьеи Уа1 Ьеи 385 390 395 400

А1а Рго Акр Акр Агд Зег Туг Ьук Зег С1п Туг Ьеи Акп Акп С1у Рго 405 410 415

С1п Агд 11е С1у Агд Ьук Туг Ьук Ьук Уа1 Агд РЬе Ме1 А1а Туг ТЬг 420 425 430

Акр С1и ТЬг РЬе Ьук ТЬг Агд С1и А1а 11е С1п Нк С1и Зег С1у 11е 435 440 445

РЬе Ьук Акп С1п А1а Зег Агд Рго Туг Акп 11е Туг Рго Нк С1у 11е 465 470 475 480

ТЬг Акр Уа1 Агд Рго Ьеи Туг Зег Агд Агд Ьеи Рго Ьук С1у Уа1 Ьук 485 490 495

Нк Ьеи Ьук Акр РЬе Рго 11е Ьеи Рго С1у С1и 11е РЬе Ьук Туг Ьук 500 505 510

Тгр ТЬг Уа1 ТЬг Уа1 С1и Акр С1у Рго ТЬг Ьук Зег Акр Рго Агд Сук 515 520 525

Ьеи ТЬг Агд Туг Туг Зег Зег РЬе Уа1 Акп Ме1 С1и Агд Акр Ьеи А1а 530 535 540

Зег С1у Ьеи 11е С1у Рго Ьеи Ьеи 11е Сук Туг Ьук С1и Зег Уа1 Акр 545 550 555 560

С1п Агд С1у Акп С1п 11е Ме1 Зег Акр Ьук Агд Акп Уа1 11е Ьеи РЬе 565 570 575

Зег Уа1 РЬе Акр С1и Акп Агд Зег Тгр Туг Ьеи ТЬг С1и Акп 11е С1п 580 585 590

С1п А1а Зег Акп 11е Ме1 Нк Зег 11е Акп С1у Туг Уа1 РЬе Акр Зег 610 615 620

- 200 028309

Ьеи С1п Ьеи 8ег Уа1 Сук Ьеи Шк С1и Уа1 А1а Туг Тгр Туг 11е Ьеи 625 630 635 640

ТЬг РЬе Ьук Шк Ьук Ме1 Уа1 Туг С1и Акр ТЬг Ьеи ТЬг Ьеи РЬе Рго 660 665 670

РЬе 8ег С1у С1и ТЬг Уа1 РЬе Ме1 8ег Ме1 С1и Акп Рго С1у Ьеи Тгр 675 680 685

11е Ьеи С1у Сук Шк Акп 8ег Акр РЬе Агд Акп Агд С1у Ме1 ТЬг А1а 690 695 700

Ьеи Ьеи Ьук Уа1 8ег 8ег Сук Акр Ьук Акп ТЬг С1у Акр Туг Туг С1и 705 710 715 720

Акр 8ег Туг С1и Акр 11е 8ег А1а Туг Ьеи Ьеи 8ег Ьук Акп Акп А1а 725 730 735

11е С1и Рго Агд 8ег РЬе 8ег С1п Акп Рго Рго Уа1 Ьеи Ьук А1а Шк 740 745 750

С1п А1а С1и 11е ТЬг Агд ТЬг ТЬг Ьеи С1п 8ег Акр С1п С1и С1и 11е 755 760 765

Акр Туг Акр Акр ТЬг 11е 8ег Уа1 С1и Ме1 Ьук Ьук С1и Акр РЬе Акр 770 775 780

11е Туг Акр С1и Акр С1и Акп С1п 8ег Рго Агд 8ег РЬе С1п Ьук Ьук 785 790 795 800

ТЬг Агд Шк Туг РЬе 11е А1а А1а Уа1 С1и Агд Ьеи Тгр Акр Туг С1у 805 810 815

Ме1 8ег 8ег 8ег Рго Шк Уа1 Ьеи Агд Акп Агд А1а С1п 8ег С1у 8ег 820 825 830

Уа1 Рго С1п РЬе Ьук Ьук Уа1 Уа1 РЬе С1п С1и РЬе ТЬг Акр С1у 8ег 835 840 845

РЬе ТЬг С1п Рго Ьеи Туг Агд С1у С1и Ьеи Акп С1и Шк Ьеи С1у Ьеи 850 855 860

- 201 028309

Ьеи О1у Рго Туг 11е Агд А1а О1и Уа1 О1и Акр Акп 11е Ме1 Уа1 ТЪг 865 870 875 880

РЪе Агд Акп О1п А1а 8ег Агд Рго Туг 8ег РЪе Туг 8ег 8ег Ьеи 11е 885 890 895

8ег Туг О1и О1и Акр О1п Агд О1п О1у А1а О1и Рго Агд Ьук Акп РЪе 900 905 910

Уа1 Ьук Рго Акп О1и ТЪг Ьук ТЪг Туг РЪе Тгр Ьук Уа1 О1п НЕ НЕ 915 920 925

Ме1 А1а Рго ТЪг Ьук Акр О1и РЪе Акр Сук Ьук А1а Тгр А1а Туг РЪе 930 935 940

8ег Акр Уа1 Акр Ьеи О1и Ьук Акр Уа1 Шк 8ег О1у Ьеи 11е О1у Рго 945 950 955 960

Ьеи Ьеи Уа1 Сук Шк ТЪг Акп ТЪг Ьеи Акп Рго А1а Шк О1у Агд О1п 965 970 975

Уа1 ТЪг Уа1 О1п О1и РЪе А1а Ьеи РЪе РЪе ТЪг 11е РЪе Акр О1и ТЪг 980 985 990

Ьук 8ег Тгр Туг РЪе ТЪг О1и Акп Ме1 О1и Агд Акп Сук Агд А1а Рго 995 1000 1005

Сук Акп 11е О1п Ме1 О1и Акр Рго ТЪг РЪе Ьук О1и Акп Туг Агд 1010 1015 1020

РЪе Шк А1а 11е Акп О1у Туг 11е Ме1 Акр ТЪг Ьеи Рго О1у Ьеи 1025 1030 1035

Уа1 Ме1 А1а О1п Акр О1п Агд 11е Агд Тгр Туг Ьеи Ьеи 8ег Ме1 1040 1045 1050

О1у 8ег Акп О1и Акп 11е Шк 8ег 11е Шк РЪе 8ег О1у Шк Уа1 1055 1060 1065

РЪе ТЪг Уа1 Агд Ьук Ьук О1и О1и Туг Ьук Ме1 А1а Ьеи Туг Акп 1070 1075 1080

Ьеи Туг Рго О1у Уа1 РЪе О1и ТЪг Уа1 О1и Ме1 Ьеи Рго 8ег Ьук 1085 1090 1095

А1а О1у 11е Тгр Агд Уа1 О1и Сук Ьеи 11е О1у О1и Шк Ьеи Шк 1100 1105 1110

- 202 028309

А1а С1у Ме! 8ег ТЬг Ьеи РЬе Ьеи Уа1 Туг 8ег Акп Ьук Сук С1п 1115 1120 1125

ТЬг Рго Ьеи С1у Ме! А1а 8ег С1у Шк 11е Агд Акр РЬе С1п 11е 1130 1135 1140

ТЬг А1а 8ег С1у С1п Туг С1у С1п Тгр А1а Рго Ьук Ьеи А1а Агд 1145 1150 1155

Ьеи Шк Туг 8ег С1у 8ег 11е Акп А1а Тгр 8ег ТЬг Ьук С1и Рго 1160 1165 1170

РЬе 8ег Тгр 11е Ьук Уа1 Акр Ьеи Ьеи А1а Рго Ме! 11е 11е Шк 1175 1180 1185

С1у 11е Ьук ТЬг С1п С1у А1а Агд С1п Ьук РЬе 8ег 8ег Ьеи Туг 1190 1195 1200

11е 8ег С1п РЬе 11е 11е Ме! Туг 8ег Ьеи Акр С1у Ьук Ьук Тгр 1205 1210 1215

С1п ТЬг Туг Агд С1у Акп 8ег ТЬг С1у ТЬг Ьеи Ме! Уа1 РЬе РЬе 1220 1225 1230

С1у Акп Уа1 Акр 8ег 8ег С1у 11е Ьук Шк Акп 11е РЬе Акп Рго 1235 1240 1245

Рго 11е 11е А1а Агд Туг 11е Агд Ьеи Шк Рго ТЬг Шк Туг 8ег 1250 1255 1260

11е Агд 8ег ТЬг Ьеи Агд Ме! С1и Ьеи Ме! С1у Сук Акр Ьеи Акп 1265 1270 1275

8ег Сук 8ег Ме! Рго Ьеи С1у Ме! С1и 8ег Ьук А1а 11е 8ег Акр 1280 1285 1290

А1а С1п 11е ТЬг А1а 8ег 8ег Туг РЬе ТЬг Акп Ме! РЬе А1а ТЬг 1295 1300 1305

Тгр 8ег Рго 8ег Ьук А1а Агд Ьеи Шк Ьеи С1п С1у Агд 8ег Акп 1310 1315 1320

А1а Тгр Агд Рго С1п Уа1 Акп Акп Рго Ьук С1и Тгр Ьеи С1п Уа1 1325 1330 1335

- 203 028309

Акр РЬе О1п Ьук ТЬг МеГ Ьук Уа1 ТЬг О1у Уа1 ТЬг ТЬг О1п О1у 1340 1345 1350

Уа1 Ьук 8ег Ьеи Ьеи ТЬг 8ег МеГ Туг Уа1 Ьук О1и РЬе Ьеи Не 1355 1360 1365

8ег 8ег 8ег О1п Акр О1у Шк О1п Тгр ТЬг Ьеи РЬе РЬе О1п Акп 1370 1375 1380

О1у Ьук Уа1 Ьук Уа1 РЬе О1п О1у Акп О1п Акр 8ег РЬе ТЬг Рго 1385 1390 1395

Уа1 Уа1 Акп 8ег Ьеи Акр Рго Рго Ьеи Ьеи ТЬг Агд Туг Ьеи Агд 1400 1405 1410

Не Шк Рго О1п 8ег Тгр Уа1 Шк О1п Не А1а Ьеи Агд МеГ О1и 1415 1420 1425

Уа1 Ьеи О1у Сук О1и А1а О1п Акр Ьеи Туг Акр Ьук ТЬг Шк ТЬг 1430 1435 1440

Сук Рго Рго Сук Рго А1а Рго О1и Ьеи Ьеи О1у О1у Рго 8ег Уа1 1445 1450 1455

РЬе Ьеи РЬе Рго Рго Ьук Рго Ьук Акр ТЬг Ьеи МеГ Не 8ег Агд 1460 1465 1470

ТЬг Рго О1и Уа1 ТЬг Сук Уа1 Уа1 Уа1 Акр Уа1 8ег Шк О1и Акр 1475 1480 1485

Рго О1и Уа1 Ьук РЬе Акп Тгр Туг Уа1 Акр О1у Уа1 О1и Уа1 Шк 1490 1495 1500

Акп А1а Ьук ТЬг Ьук Рго Агд О1и О1и О1п Туг Акп 8ег ТЬг Туг 1505 1510 1515

Агд Уа1 Уа1 8ег Уа1 Ьеи ТЬг Уа1 Ьеи Шк О1п Акр Тгр Ьеи Акп 1520 1525 1530

О1у Ьук О1и Туг Ьук Сук Ьук Уа1 8ег Акп Ьук А1а Ьеи Рго А1а 1535 1540 1545

Рго Не О1и Ьук ТЬг Не 8ег Ьук А1а Ьук О1у О1п Рго Агд О1и 1550 1555 1560

Рго О1п Уа1 Туг ТЬг Ьеи Рго Рго 8ег Агд Акр О1и Ьеи ТЬг Ьук 1565 1570 1575

- 204 028309

А8п С1п Уа1 Зег Ьеи ТЬг Су8 Ьеи Уа1 Ьу8 С1у РЬе Туг Рго Зег 1580 1585 1590

А8р 11е А1а Уа1 С1и Тгр С1и Зег А8п С1у С1п Рго С1и А8п А8п 1595 1600 1605

Туг Ьу8 ТЬг ТЬг Рго Рго Уа1 Ьеи А8р Зег А8р С1у Зег РЬе РЬе 1610 1615 1620

Ьеи Туг Зег Ьу8 Ьеи ТЬг Уа1 А8р Ьу8 Зег Агд Тгр С1п С1п С1у 1625 1630 1635

А8п Уа1 РЬе Зег Су8 Зег Уа1 Ме! Н18 С1и А1а Ьеи Н18 А8п Н18 1640 1645 1650

Туг ТЬг С1п Ьу8 Зег Ьеи Зег Ьеи Зег Рго С1у Ьу8 1655 1660 1665 <210> 91 <211> 5052 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> рЗУ№ФУШ-155 <400> 91 а!дсааа!ад адс!с!ссас с!дс!!с!!! с!д!дсс!!! !дсда!!с!д с!!!ад!дсс 60 ассадаада! ас!асс!ддд !дсад!ддаа с!д!са!ддд ас!а!а!дса аад!да!с!с 120 дд!дадс!дс с!д!ддасдс аада!!!сс! сс!адад!дс саааа!с!!! !сса!!саас 180 асс!сад!сд !д!асааааа дас!с!д!!! д!адаа!!са сдда!сасс! !!!сааса!с 240 дс!аадссаа ддссассс!д да!ддд!с!д с!адд!сс!а сса!ссаддс !дадд!!!а! 300 да!асад!дд !са!!асас! !аадааса!д дс!!ссса!с с!д!сад!с! !са!дс!д!! 360 дд!д!а!сс! ас!ддааадс !!с!даддда дс!даа!а!д а!да!садас сад!сааадд 420 дадааадаад а!да!ааад! с!!ссс!дд! ддаадсса!а са!а!д!с!д дсадд!сс!д 480 ааададаа!д д!ссаа!ддс с!с!дассса с!д!дсс!!а сс!ас!са!а !с!!!с!са! 540 д!ддасс!дд !аааадас!! даа!!саддс с!са!!ддад ссс!ас!ад! а!д!ададаа 600 дддад!с!дд ссааддаааа дасасадасс !!дсасааа! !!а!ас!ас! !!!!дс!д!а 660 !!!да!даад ддаааад!!д дсас!садаа асааадаас! сс!!да!дса дда!аддда! 720 дс!дса!с!д с!сдддсс!д дсс!аааа!д сасасад!са а!дд!!а!д! ааасадд!с! 780 с!дссадд!с !да!!дда!д ссасаддааа !сад!с!а!! ддса!д!да! !ддаа!дддс 840

- 205 028309 ассас1сс1д аад1дсас1с аа1а11сс1с дааддкаса саШсйд! даддаасса! 900 сдссаддсд! ссйддааа! с1сдссаа1а асШссйа с1дс1сааас ас1с11да1д 960 дассйддас адШс1ас1 дййдка! а1с1с11ссс ассааса!да 1ддса1ддаа 1020 дсйа1дка аад!адасад с(дксадад даассссаас 1асдаа1даа ааа1аа1даа 1080 даадсддаад ас1а1да1да 1дак11ас1 дайс1дааа 1дда1д1дд1 саддШда! 1140 да1дасаас1 сксйссй 1а1ссааа11 сдскадИд ссаадаадса 1сс1аааас1 1200

1ддд!асай асайдс(дс !даададдад дас1дддас1 а1дсксс11 ад1сс1сдсс 1260 сссда!даса даадйа1аа аад1саа1а1 йдаасаа1д дссскадсд да11дд1адд 1320 аад!асаааа аадксдай 1а1ддса1ас асада!дааа ссШаадас кд1даадс1 1380 айсадса(д аа1саддаа1 сйдддасс! йасШа1д дддаадйдд адасасас!д 1440

11да11а1а1 йаадаака адсаадсада сса1а1ааса 1с1ассс1са сддаакас! 1500 да1дксдк сШд1а11с ааддадайа ссааааддд 1аааасаШ дааддайй 1560 ссаайс(дс саддадааа! айсаааЮ ааа!ддасад 1дас1д1ада ада1дддсса 1620 ас1ааа1сад акскдд1д сс!дасссдс 1а11ас1с1а дШсдйаа !а!ддадада 1680 да1с1адс11 саддаска! (ддссскк скак1дс1 асааадаак 1д1ада1саа 1740 ададдааасс ада1аа1д1с адасаададд аа1д1са1сс 1дШк1д1 аШда1дад 1800 аассдаадс! дд1асс1сас ададаа1а1а саасдсШс ксссаакс адс1ддад1д 1860 садсйдадд аксададИ ссаадсскс ааса1са1дс асадсакаа 1ддс1а1д11 1920

Шда1ад111дсад11дк адШдШд са1дадд1дд са1ас1дд1а са1к1аадс 1980 айддадсас адас1дас11 ссШс1дк 1к1кк1д даЮассй сааасасааа 2040 а1ддк1а1д аадасасас! сассс1айс ссаПскад дадааас1д1 с1ка1дкд 2100 а!ддаааасс саддкППд да1к1дддд 1дссасаас1 садасШсд даасададдс 2160 а1дассдсс11ас1даадд1 Ис1ад11д1 дасаадааса с1дд1даПа йасдаддас 2220 адШПдаад а1аШсадс а1асПдс1д ад!аааааса а1дссаПда ассаадаадс 2280

Псккааа асссассад! сйдааадсс сакаддсдд ааакаскд 1ас1аскП 2340 садкадак аададдааа! 1дас1а1да1 да1асса1а1 садПдааа! даадааддаа 2400 даййдаса Ша1да1да дда1даааа1 сададссссс дсадсШса ааадааааса 2460 сдасасПШ йайдс1дс ад!ддададд ск1дддаН а1ддда1дад (адскссса 2520 са1дПс1аа дааасадддс кадад1ддс ад1дксск адйсаадаа адйдййс 2580 саддааШа с1да1ддск сШаскад сссйа1асс д1ддадаас1 ааа1дааса1 2640

Идддаскс 1ддддсса1а 1а1аададса даадйдаад а1аа1ака1 дд1аасШс 2700

- 206 028309 адааа!садд сс!с!сд!сс с!а!!сс!!с !а!!с!адсс !!а!!!с!!а !даддаада! 2760 сададдсаад дадсадаасс !адаааааас !!!д!саадс с!аа!дааас саааас!!ас 2820 !!!!ддааад !дсааса!са !а!ддсассс ас!ааада!д ад!!!дас!д сааадсс!дд 2880 дс!!а!!!с! с!да!д!!да сс!ддааааа да!д!дсас! саддсс!да! !ддасссс!! 2940 с!дд!с!дсс асас!аасас ас!даассс! дс!са!ддда дасаад!дас ад!асаддаа 3000 !!!дс!с!д! !!!!сасса! с!!!да!дад ассаааадс! дд!ас!!сас !даааа!а!д 3060 дааадааас! дсадддс!сс с!дсаа!а!с сада!ддаад а!сссас!!! !ааададаа! 3120 !а!сдс!!сс а!дсаа!саа !ддс!аса!а а!дда!асас !асс!ддс!! ад!аа!ддс! 3180 садда!сааа дда!!сда!д д!а!с!дс!с адса!дддса дсаа!даааа са!сса!!с! 3240 а!!са!!!са д!ддаса!д! д!!сас!д!а сдааааааад аддад!а!аа аа!ддсас!д 3300 !асаа!с!с! а!ссадд!д! !!!!дадаса д!ддааа!д! !асса!ссаа адс!ддаа!! 3360 !ддсддд!дд аа!дсс!!а! !ддсдадса! с!аса!дс!д дда!дадсас ас!1!!1с!д 3420 д!д!асадса а!аад!д!са дас!сссс!д ддаа!ддс!! с!ддасаса! !адада!!1! 3480 сада!!асад с!!саддаса а!а!ддасад !дддссссаа адс!ддссад ас!!са!!а! 3540 !ссдда!саа !саа!дсс!д дадсассаад дадссс!!!! с!!дда!саа дд!дда!с!д 3600 йддсассаа !да!!а!!са сддса!саад асссаддд!д сссд!садаа д!!с!ссадс 3660 с!с!аса!с! с!сад!!!а! са!са!д!а! ад!с!!да!д ддаадаад!д дсадасйа! 3720 сдаддааа!! ссас!ддаас с!!аа!дд!с !!с!!!ддса а!д!дда!!с а!с!ддда!а 3780 ааасасаа!а !!Шаассс !ссаайа!1 дс!сда!аса !ссд!!!дса сссаас!са! 3840

1а1адсайс дсадсас!с! !сдса!ддад !!да!дддс! д!да!!!ааа !ад!!дсадс 3900 а!дсса!!дд даа!ддадад !ааадсаа!а !сада!дсас ада!!ас!дс !!са!сс!ас 3960 !!!ассаа!а !д!!!дссас с!дд!с!сс! !саааадс!с дас!!сасс! ссаадддадд 4020 ад!аа!дсс! ддадасс!са дд!даа!аа! ссаааадад! ддс!дсаад! ддас!!ссад 4080 аадасаа!да аад!сасадд ад!аас!ас! садддад!аа аа!с!с!дс! !ассадса!д 4140 !а!д!даадд ад!!сс!са! с!ссадсад! саада!ддсс а!сад!ддас !с!с!!!!!! 4200 садаа!ддса аад!ааадд! !!!!саддда аа!саадас! сс!!сасасс !д!дд!даас 4260 !с!с!адасс сассдйас! дас!сдс!ас с!!сдаа!!с асссссадад !!ддд!дсас 4320 сада!!дссс !дадда!дда дд!!с!дддс !дсдаддсас аддасс!с!а сдасаааас! 4380 сасаса!дсс сассд!дссс адс!ссадаа с!сс!дддсд дассд!сад! с!!сс!с!!с 4440 сссссаааас ссааддасас сс!са!да!с !сссддассс с!дадд!сас а!дсд!дд!д 4500 д!ддасд!да дссасдаада ссс!дадд!с аадйсаас! дд!асд!дда сддсд!ддад 4560

- 207 028309 д!дса!аа!д ссаадасааа дссдсдддад дадсад!аса асадсасд!а ссд!д!дд!с 4620 адсд!сс!са ссд!сс!дса ссаддас!дд с!даа!ддса аддад!асаа д!дсаадд!с 4680 !ссаасааад ссс!сссадс сссса!сдад аааасса!с! ссааадссаа адддсадссс 4740 сдадаассас адд!д!асас сс!дссссса !сссддда!д адс!дассаа даассадд!с 4800 адсс!дасс! дсс!дд!саа аддс!!с!а! сссадсдаса !сдссд!дда д!дддададс 4860 аа!дддсадс сддадаасаа с!асаадасс асдсс!сссд !д!!ддас!с сдасддс!сс 4920 !!с!!сс!с! асадсаадс! сассд!ддас аададсадд! ддсадсаддд даасд!с!!с 4980 !са!дс!ссд !да!дса!да ддс!с!дсас аассас!аса сдсадаадад сс!с!ссс!д 5040 !с!ссддд!а аа 5052 <210> 92 <211> 19 <212> Белок <213> Искусственная <220>

<223> СФУШ-159 <400> 92

11е Авр С1у С1у С1у С1у δ^'Γ С1у С1у С1у С1у δ^'Γ Ьеи Уа1 Рго Агд 1 5 10 15

С1у δ^'Γ С1у <210> 93 <211> 34 <212> Белок <213> Искусственная <220>

<223> СФУШ-160 <400> 93

11е δ^'Γ С1у С1у С1у С1у δ^'Γ С1у С1у С1у С1у δ^'Γ С1у С1у С1у С1у 1 5 10 15 δ^'Γ С1у С1у С1у С1у δ^'Γ С1у С1у С1у С1у δ^'Γ Ьеи Уа1 Рго Агд С1у

25 30 <210> 94 <211> 48

- 208 028309 <212> Белок <213> Искусственная <220>

<223> ФУШ-064 <400> 94

11е Зег 01у 01у 01у 01у Зег 01у 01у 01у 01у Зег 01у 01у 01у 01у 1 5 10 15

Ьеи Уа1 Рго Агд О1у Зег О1у О1у О1у О1у Зег О1у О1у О1у О1у Зег 35 40 45 <210> 95 <211> 48 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ФВ031 <400> 95

11е Зег О1у О1у О1у О1у Зег О1у О1у О1у О1у Зег О1у О1у О1у О1у 1 5 10 15

Ьеи Уа1 Рго Агд О1у Зег О1у О1у О1у О1у Зег О1у О1у О1у О1у Зег 35 40 45 <210> 96 <211> 73 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ФВ035 <400> 96

О1у О1у О1у О1у Зег О1у О1у О1у О1у Зег О1у О1у О1у О1у Зег О1у 35 40 45

- 209 028309

01у 01у 01у Зег 01у 01у 01у 01у Зег Ьеи ν^ Рго Агд О1у Зег О1у 50 55 60

О1у О1у О1у Зег О1у О1у О1у О1у Зег 65 70 <210> 97 <211> 98 <212> Белок <21З> Искусственная последовательность <220>

<22З> ФВ0З6 <400> 97

Пе Зег О1у О1у О1у О1у Зег О1у О1у О1у О1у Зег О1у О1у О1у О1у 1 5 10 15

Зег О1у О1у О1у О1у Зег О1у О1у О1у О1у Зег О1у О1у О1у О1у Зег 20 25 З0

О1у О1у О1у О1у Зег О1у О1у О1у О1у Зег О1у О1у О1у О1у Зег О1у З5 40 45

О1у О1у О1у Зег О1у О1у О1у О1у Зег О1у О1у О1у О1у Зег О1у О1у 50 55 60

О1у О1у Зег О1у О1у О1у О1у Зег О1у О1у О1у О1у Зег О1у О1у О1у 65 70 75 80

О1у Зег Ьеи Vаί Рго Агд О1у Зег О1у О1у О1у О1у Зег О1у О1у О1у 85 90 95

О1у Зег <210> 98 <211> 54 <212> Белок <21З> Искусственная последовательность <220>

<22З> линкер рЗУЯ-ФВ-051 <400> 98

- 210 028309

Ьеи Рго С1и ТЬг С1у А1а Ьеи Агд Рго Агд Уа1 Уа1 С1у С1у С1у С1у 35 40 45

8ег С1у С1у С1у С1у 8ег 50 <210> 99 <211> 232 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Сепе\\а/-Последовательность №-10-210746313 <400> 99 аддадссда1 а1с1ддсдд1 ддадд11ссд д1ддсддддд а1ссддсдд1 ддадд11ссд 60 дсдд1ддадд 11ссдд1ддс ддддда1ссд д1ддсддддд а1сс11асс1 дааас1ддад 120 ссс1дсддсс ссддд1сд1с ддсдд1ддад д11ссдд1дд сддддда1сс дасаааас1с 180 асаса1дссс ассд1дссса дс1ссадаас 1сс1дддсдд ассд1сад1с 11 232 <210> 100 <211> 4566 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> р8¥\-ФВ051 <400> 100 а1да11сс1д ссада111дс сдддд1дс1д с11дс1с1дд ссс1са1111 дссадддасс 60 сШд1дсад ааддаасйд сддсаддйа йсасддссс да1дсадсс1 Шсддаад! 120 дасйсдйа асассШда 1дддадса1д 1асадсШд сддда1ас1д садйассй 180 с1ддсадддд дс1дссадаа асдс1сс11с 1сда11а11д дддас11сса даа1ддсаад 240 адад1дадсс 1с1ссд1д1а 1с11ддддаа 111111даса 1сса111д11 1д1саа1дд1 300 ассд1дасас адддддасса аадад1с1сс а1дссс1а1д сс1ссааадд дс1д1а1с1а 360 дааас1дадд с1ддд1ас1а саадс1д1сс дд1даддсс1 а1ддс111д1 ддссадда1с 420 да1ддсадсд дсаас111са ад1сс1дс1д 1садасада1 ас11саасаа дасс1дсддд 480 с1д1д1ддса ас111ааса1 с111дс1даа да1дас111а 1дасссаада адддасс11д 540 асс1сддасс с11а1дас11 1дссаас1са 1дддс1с1да дсад1ддада асад1дд1д1 600 даасдддса1 с1сс1сссад садс1са1дс ааса1с1сс1 с1ддддааа1 дсадаадддс 660 с1д1дддадс ад1дссадс1 1с1даададс асс1сдд1д1 11дсссдс1д ссассс1с1д 720

- 211 028309 д!ддассссд адсс!!!!д! ддссс!д!д! дадаадас!! !д!д!дад!д !дс!дддддд 780 с!ддад!дсд сс!дссс!дс сс!сс!ддад !асдсссдда сс!д!дссса ддадддаа!д 840 д!дс!д!асд дс!ддассда ссасадсдсд !дсадсссад !д!дссс!дс !дд!а!ддад 900 !а!аддсад! д!д!д!сссс !!дсдссадд асс!дссада дсс!дсаса! саа!дааа!д 960 !д!саддадс да!дсд!дда !ддс!дсадс !дссс!дадд дасадс!сс! дда!дааддс 1020 с!с!дсд!дд ададсассда д!д!ссс!дс д!дса!!ссд дааадсдс!а ссс!сссддс 1080 асс!ссс!с! с!сдадас!д саасасс!дс а!!!дссдаа асадссад!д да!с!дсадс 1140 аа!даадаа! д!ссадддда д!дсс!!д!с ас!дд!саа! сссас!!саа дадс!!!дас 1200 аасада!ас! !сасс!!сад !ддда!с!дс сад!асс!дс !ддсссддда !!дссаддас 1260 сас!сс!!с! сса!!д!са! !дадас!д!с сад!д!дс!д а!дассдсда сдс!д!д!дс 1320 асссдс!ссд !сассд!ссд дс!дсс!ддс с!дсасааса дсс!!д!даа ас!даадса! 1380 ддддсаддад !!дсса!дда !ддссаддас а!ссадс!сс ссс!сс!даа адд!дасс!с 1440 сдса!ссадс а!асад!дас ддсс!ссд!д сдсс!садс! асддддадда сс!дсада!д 1500 дас!ддда!д дссдсдддад дс!дс!дд!д аадс!д!ссс ссд1с!а!дс сдддаадасс 1560 !дсддсс!д! д!дддаа!!а саа!ддсаас садддсдасд ас!!сс!!ас сссс!с!ддд 1620 с!ддсддадс сссддд!дда ддас!!сддд аасдсс!дда адс!дсасдд ддас!дссад 1680 дасс!дсада адсадсасад сда!ссс!дс дссс!саасс сдсдса!дас садд!!с!сс 1740 даддаддсд! дсдсдд!сс! дасд!ссссс аса!!сдадд сс!дсса!сд !дссд!садс 1800 ссдс!дссс! асс!дсддаа с!дссдс!ас дасд!д!дс! сс!дс!сдда сддссдсдад 1860 !дсс!д!дсд дсдссс!ддс садс!а!дсс дсддсс!дсд сддддададд сд!дсдсд!с 1920 дсд!ддсдсд адссаддссд с!д!дадс!д аас!дсссда ааддссадд! д!асс!дсад 1980 !дсдддассс сс!дсаасс! дасс!дссдс !с!с!с!с!! асссдда!да ддаа!дсаа! 2040 даддсс!дсс !ддадддс!д с!!с!дсссс ссадддс!с! аса!дда!да даддддддас 2100 !дсд!дссса аддсссад!д сссс!д!!ас !а!дасдд!д ада!с!!сса дссадаадас 2160 а!с!!с!сад асса!сасас са!д!дс!ас !д!дадда!д дс!!са!дса с!д!асса!д 2220 ад!ддад!сс ссддаадс!! дс!дсс!дас дс!д!сс!са дсад!сссс! д!с!са!сдс 2280 адсаааадда дсс!а!сс!д !сддсссссс а!дд!саадс !дд!д!д!сс сдс!дасаас 2340 с!дсдддс!д аадддс!сда д!д!ассааа асд!дссада ас!а!дасс! ддад!дса!д 2400 адса!дддс! д!д!с!с!дд с!дсс!с!дс сссссдддса !дд!ссддса !дадаасада 2460 !д!д!ддссс !ддааадд!д !ссс!дс!!с са!садддса аддад!а!дс ссс!ддадаа 2520 асад!даада !!ддс!дсаа сас!!д!д!с !д!сдддасс ддаад!ддаа с!дсасадас 2580

- 212 028309 саХдХдХдХд аХдссасдХд сХссасдаХс ддсаХддссс асХассХсас сХХсдасддд 2640 сХсаааХасс ХдХХссссдд ддадХдссад ХасдХХсХдд ХдсаддаХХа сХдсддсадХ 2700 аасссХддда ссХХХсддаХ ссХадХдддд ааХаадддаХ дсадссассс сХсадХдааа 2760

Хдсаадааас дддХсассаХ ссХддХддад ддаддадада ХХдадсХдХХ Хдасддддад 2820 дХдааХдХда ададдсссаХ дааддаХдад асХсасХХХд аддХддХдда дХсХддссдд 2880

ХасаХсаХХс ХдсХдсХддд сааадсссХс ХссдХддХсХ дддассдсса ссХдадсаХс 2940

ХссдХддХсс Хдаадсадас аХассаддад ааадХдХдХд дссХдХдХдд дааХХХХдаХ 3000 ддсаХссада асааХдассХ сассадсадс аассХссаад Хддаддаада сссХдХддас 3060

ХХХдддаасХ ссХддааадХ дадсХсдсад ХдХдсХдаса ссадаааадХ дссХсХддас 3120

ХсаХссссХд ссассХдсса ХаасаасаХс аХдаадсада сдаХддХдда ХХссХссХдХ 3180 адааХссХХа ссадХдасдХ сХХссаддас Хдсаасаадс ХддХддассс сдадссаХаХ 3240 сХддаХдХсХ дсаХХХасда сассХдсХсс ХдХдадХсса ХХддддасХд сдссдсаХХс 3300

Хдсдасасса ХХдсХдссХа ХдсссасдХд ХдХдсссадс аХддсааддХ ддХдассХдд 3360 аддасддсса саХХдХдссс ссададсХдс даддададда аХсХссддда даасдддХаХ 3420 даддсХдадХ ддсдсХаХаа садсХдХдса ссХдссХдХс аадХсасдХд ХсадсасссХ 3480 дадссасХдд ссХдсссХдХ дсадХдХдХд дадддсХдсс аХдсссасХд сссХссаддд 3540 ааааХссХдд аХдадсХХХХ дсадассХдс дХХдасссХд аадасХдХсс адХдХдХдад 3600 дХддсХддсс ддсдХХХХдс сХсаддааад ааадХсассХ ХдааХсссад ХдасссХдад 3660 сасХдссада ХХХдссасХд ХдаХдХХдХс аассХсассХ дХдаадссХд ссаддадссд 3720 аХаХсХддсд дХддаддХХс сддХддсддд ддаХссддсд дХддаддХХс сддсддХдда 3780 ддХХссддХд дсдддддаХс сддХддсддд ддаХссХХас сХдааасХдд адсссХдсдд 3840 ссссдддХсд ХсддсддХдд аддХХссддХ ддсдддддаХ ссдасаааас ХсасасаХдс 3900 ссассдХдсс садсХссада асХссХдддс ддассдХсад ХсХХссХсХХ ссссссаааа 3960 сссааддаса сссХсаХдаХ сХсссддасс ссХдаддХса саХдсдХддХ ддХддасдХд 4020 адссасдаад асссХдаддХ саадХХсаас ХддХасдХдд асддсдХдда ддХдсаХааХ 4080 дссаадасаа адссдсддда ддадсадХас аасадсасдХ ассдХдХддХ садсдХссХс 4140 ассдХссХдс ассаддасХд дсХдааХддс ааддадХаса адХдсааддХ сХссаасааа 4200 дсссХсссад сссссаХсда даааассаХс Хссааадсса аадддсадсс ссдадаасса 4260 саддХдХаса сссХдссссс аХсссдддаХ дадсХдасса адаассаддХ садссХдасс 4320

ХдссХддХса ааддсХХсХа Хсссадсдас аХсдссдХдд адХдддадад сааХдддсад 4380 ссддадааса асХасаадас сасдссХссс дХдХХддасХ ссдасддсХс сХХсХХссХс 4440

- 213 028309

Гасадсаадс ГсассдГдда саададсадд Гддсадсадд ддаасдГсГГ сГсаГдсГсс 4500 дГдаГдсаГд аддсГсГдса саассасГас асдсадаада дссГсГсссГ дГсГссдддГ 4560 аааГда 4566 <210> 101 <211> 1521 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ФВ051 <400> 101

МеГ Не Рго А1а Агд РЬе А1а О1у Уа1 Ьеи Ьеи А1а Ьеи А1а Ьеи Не 1 5 10 15

Ьеи Рго О1у ТЬг Ьеи Сук А1а О1и О1у ТЬг Агд О1у Агд 8ег 8ег ТЬг 20 25 30

А1а Агд Сук 8ег Ьеи РЬе О1у 8ег Акр РЬе Уа1 Акп ТЬг РЬе Акр О1у 35 40 45

8ег МеГ Туг 8ег РЬе А1а О1у Туг Сук 8ег Туг Ьеи Ьеи А1а О1у О1у 50 55 60

Сук О1п Ьук Агд 8ег РЬе 8ег Не Не О1у Акр РЬе О1п Акп О1у Ьук 65 70 75 80

Агд Уа1 8ег Ьеи 8ег Уа1 Туг Ьеи О1у О1и РЬе РЬе Акр Не Шк Ьеи 85 90 95

РЬе Уа1 Акп О1у ТЬг Уа1 ТЬг О1п О1у Акр О1п Агд Уа1 8ег МеГ Рго 100 105 110

Туг А1а 8ег Ьук О1у Ьеи Туг Ьеи О1и ТЬг О1и А1а О1у Туг Туг Ьук 115 120 125

Ьеи 8ег О1у О1и А1а Туг О1у РЬе Уа1 А1а Агд Не Акр О1у 8ег О1у 130 135 140

Акп РЬе О1п Уа1 Ьеи Ьеи 8ег Акр Агд Туг РЬе Акп Ьук ТЬг Сук О1у 145 150 155 160

Ьеи Сук О1у Акп РЬе Акп Не РЬе А1а О1и Акр Акр РЬе МеГ ТЬг О1п 165 170 175

- 214 028309

01и 01у ТНг Ьеи ТНг Бег Азр Рго Туг Азр РНе А1а Азп Бег Тгр А1а 180 185 190

Ьеи Бег Бег О1у О1и О1п Тгр Суз О1и Агд А1а Бег Рго Рго Бег Бег 195 200 205

Бег Суз Азп 11е Бег Бег С1у С1и Ме1 С1п Ьуз С1у Ьеи Тгр С1и С1п 210 215 220

Суз С1п Ьеи Ьеи Ьуз Бег ТНг Бег Уа1 РНе А1а Агд Суз Шз Рго Ьеи 225 230 235 240

Уа1 Азр Рго С1и Рго РНе Уа1 А1а Ьеи Суз С1и Ьуз ТНг Ьеи Суз С1и 245 250 255

Суз А1а С1у С1у Ьеи С1и Суз А1а Суз Рго А1а Ьеи Ьеи С1и Туг А1а 260 265 270

Агд ТНг Суз А1а С1п С1и С1у Ме1 Уа1 Ьеи Туг С1у Тгр ТНг Азр Шз 275 280 285

Бег А1а Суз Бег Рго Уа1 Суз Рго А1а С1у Ме1 С1и Туг Агд С1п Суз 290 295 300

Уа1 Бег Рго Суз А1а Агд ТНг Суз С1п Бег Ьеи Шз 11е Азп С1и Ме1 305 310 315 320

Суз С1п С1и Агд Суз Уа1 Азр С1у Суз Бег Суз Рго С1и С1у С1п Ьеи 325 330 335

Ьеи Азр С1и С1у Ьеи Суз Уа1 С1и Бег ТНг С1и Суз Рго Суз Уа1 Шз 340 345 350

Бег С1у Ьуз Агд Туг Рго Рго С1у ТНг Бег Ьеи Бег Агд Азр Суз Азп 355 360 365

ТНг Суз 11е Суз Агд Азп Бег С1п Тгр 11е Суз Бег Азп С1и С1и Суз 370 375 380

Рго С1у С1и Суз Ьеи Уа1 ТНг С1у С1п Бег Шз РНе Ьуз Бег РНе Азр 385 390 395 400

Азп Агд Туг РНе ТНг РНе Бег С1у 11е Суз С1п Туг Ьеи Ьеи А1а Агд 405 410 415

Азр Суз С1п Азр Шз Бег РНе Бег 11е Уа1 11е С1и ТНг Уа1 С1п Суз 420 425 430

- 215 028309

А1а Акр Акр Агд Акр А1а Уа1 Сук ТЬг Агд 8ег Уа1 ТЬг Уа1 Агд Ьеи 435 440 445

Рго С1у Ьеи Шк Акп 8ег Ьеи Уа1 Ьук Ьеи Ьук Шк С1у А1а С1у Уа1 450 455 460

Агд 11е С1п Шк ТЬг Уа1 ТЬг А1а 8ег Уа1 Агд Ьеи 8ег Туг С1у С1и 485 490 495

Акр Ьеи С1п Ме! Акр Тгр Акр С1у Агд С1у Агд Ьеи Ьеи Уа1 Ьук Ьеи 500 505 510

Агд Уа1 С1и Акр РЬе С1у Акп А1а Тгр Ьук Ьеи Шк С1у Акр Сук С1п 545 550 555 560

Акр Ьеи С1п Ьук С1п Шк 8ег Акр Рго Сук А1а Ьеи Акп Рго Агд Ме! 565 570 575

ТЬг Агд РЬе 8ег С1и С1и А1а Сук А1а Уа1 Ьеи ТЬг 8ег Рго ТЬг РЬе 580 585 590

С1и А1а Сук Шк Агд А1а Уа1 8ег Рго Ьеи Рго Туг Ьеи Агд Акп Сук 595 600 605

Агд Туг Акр Уа1 Сук 8ег Сук 8ег Акр С1у Агд С1и Сук Ьеи Сук С1у 610 615 620

А1а Ьеи А1а 8ег Туг А1а А1а А1а Сук А1а С1у Агд С1у Уа1 Агд Уа1 625 630 635 640

А1а Тгр Агд С1и Рго С1у Агд Сук С1и Ьеи Акп Сук Рго Ьук С1у С1п 645 650 655

Уа1 Туг Ьеи С1п Сук С1у ТЬг Рго Сук Акп Ьеи ТЬг Сук Агд 8ег Ьеи 660 665 670

- 216 028309

8ег Туг Рго Акр С1и С1и Сук Акп С1и А1а Сук Ьеи С1и С1у Сук РЬе 675 680 685

Сук Рго Рго С1у Ьеи Туг Ме1 Акр С1и Агд С1у Акр Сук Уа1 Рго Ьук 690 695 700

А1а С1п Сук Рго Сук Туг Туг Акр С1у С1и 11е РЬе С1п Рго С1и Акр 705 710 715 720

11е РЬе 8ег Акр Шк Шк ТЬг Ме1 Сук Туг Сук С1и Акр С1у РЬе Ме1 725 730 735

Шк Сук ТЬг Ме1 8ег С1у Уа1 Рго С1у 8ег Ьеи Ьеи Рго Акр А1а Уа1 740 745 750

Ьеи 8ег 8ег Рго Ьеи 8ег Шк Агд 8ег Ьук Агд 8ег Ьеи 8ег Сук Агд 755 760 765

Рго Рго Ме1 Уа1 Ьук Ьеи Уа1 Сук Рго А1а Акр Акп Ьеи Агд А1а С1и 770 775 780

С1у Ьеи С1и Сук ТЬг Ьук ТЬг Сук С1п Акп Туг Акр Ьеи С1и Сук Ме1 785 790 795 800

8ег Ме1 С1у Сук Уа1 8ег С1у Сук Ьеи Сук Рго Рго С1у Ме1 Уа1 Агд 805 810 815

Шк С1и Акп Агд Сук Уа1 А1а Ьеи С1и Агд Сук Рго Сук РЬе Шк С1п 820 825 830

С1у Ьук С1и Туг А1а Рго С1у С1и ТЬг Уа1 Ьук 11е С1у Сук Акп ТЬг 835 840 845

Сук Уа1 Сук Агд Акр Агд Ьук Тгр Акп Сук ТЬг Акр Шк Уа1 Сук Акр 850 855 860

А1а ТЬг Сук 8ег ТЬг 11е С1у Ме1 А1а Шк Туг Ьеи ТЬг РЬе Акр С1у 865 870 875 880

Ьеи Ьук Туг Ьеи РЬе Рго С1у С1и Сук С1п Туг Уа1 Ьеи Уа1 С1п Акр 885 890 895

Туг Сук С1у 8ег Акп Рго С1у ТЬг РЬе Агд 11е Ьеи Уа1 С1у Акп Ьук 900 905 910

С1у Сук 8ег Шк Рго 8ег Уа1 Ьук Сук Ьук Ьук Агд Уа1 ТЬг 11е Ьеи 915 920 925

- 217 028309

Уа1 О1и О1у О1у О1и 11е О1и Ьеи РЪе Акр О1у О1и Уа1 Акп Уа1 Ьук 930 935 940

Агд Рго Ме1 Ьук Акр О1и ТЪг Шк РЪе О1и Уа1 Уа1 О1и 8ег О1у Агд 945 950 955 960

Туг 11е 11е Ьеи Ьеи Ьеи О1у Ьук А1а Ьеи 8ег Уа1 Уа1 Тгр Акр Агд 965 970 975

Шк Ьеи 8ег 11е 8ег Уа1 Уа1 Ьеи Ьук О1п ТЪг Туг О1п О1и Ьук Уа1 980 985 990

Сук О1у Ьеи Сук О1у Акп РЪе Акр О1у 11е О1п Акп Акп Акр Ьеи ТЪг 995 1000 1005

8ег 8ег Акп Ьеи О1п Уа1 О1и О1и Акр Рго Уа1 Акр РЪе О1у Акп 1010 1015 1020

8ег Тгр Ьук Уа1 8ег 8ег О1п Сук А1а Акр ТЪг Агд Ьук Уа1 Рго 1025 1030 1035

Ьеи Акр 8ег 8ег Рго А1а ТЪг Сук Шк Акп Акп 11е Ме1 Ьук О1п 1040 1045 1050

ТЪг Ме1 Уа1 Акр 8ег 8ег Сук Агд 11е Ьеи ТЪг 8ег Акр Уа1 РЪе 1055 1060 1065

Сук 11е Туг Акр ТЪг Сук 8ег Сук О1и 8ег 11е О1у Акр Сук А1а 1085 1090 1095

А1а РЪе Сук Акр ТЪг 11е А1а А1а Туг А1а Шк Уа1 Сук А1а О1п 1100 1105 1110

Шк О1у Ьук Уа1 Уа1 ТЪг Тгр Агд ТЪг А1а ТЪг Ьеи Сук Рго О1п 1115 1120 1125

8ег Сук О1и О1и Агд Акп Ьеи Агд О1и Акп О1у Туг О1и А1а О1и 1130 1135 1140

Тгр Агд Туг Акп 8ег Сук А1а Рго А1а Сук О1п Уа1 ТЪг Сук О1п 1145 1150 1155

- 218 028309

Нк Рго С1и Рго Ьеи А1а Сук Рго Уа1 С1п Сук Уа1 С1и С1у Сук 1160 1165 1170

Нк А1а Нк Сук Рго Рго С1у Ьук 11е Ьеи Акр С1и Ьеи Ьеи С1п 1175 1180 1185

ТЬг Сук Уа1 Акр Рго С1и Акр Сук Рго Уа1 Сук С1и Уа1 А1а С1у 1190 1195 1200

Агд Агд РЬе А1а Зег С1у Ьук Ьук Уа1 ТЬг Ьеи Акп Рго Зег Акр 1205 1210 1215

Рго С1и Нк Сук С1п 11е Сук Нк Сук Акр Уа1 Уа1 Акп Ьеи ТЬг 1220 1225 1230

Сук С1и А1а Сук С1п С1и Рго 11е Зег С1у С1у С1у С1у Зег С1у 1235 1240 1245

С1у С1у С1у Зег С1у С1у С1у С1у Зег С1у С1у С1у С1у Зег С1у 1250 1255 1260

С1у С1у С1у Зег С1у С1у С1у С1у Зег Ьеи Рго С1и ТЬг С1у А1а 1265 1270 1275

Ьеи Агд Рго Агд Уа1 Уа1 С1у С1у С1у С1у Зег С1у С1у С1у С1у 1280 1285 1290

Зег Акр Ьук ТЬг Нк ТЬг Сук Рго Рго Сук Рго А1а Рго С1и Ьеи 1295 1300 1305

Ьеи С1у С1у Рго Зег Уа1 РЬе Ьеи РЬе Рго Рго Ьук Рго Ьук Акр 1310 1315 1320

ТЬг Ьеи Ме1 11е Зег Агд ТЬг Рго С1и Уа1 ТЬг Сук Уа1 Уа1 Уа1 1325 1330 1335

Акр Уа1 Зег Нк С1и Акр Рго С1и Уа1 Ьук РЬе Акп Тгр Туг Уа1 1340 1345 1350

Акр С1у Уа1 С1и Уа1 Нк Акп А1а Ьук ТЬг Ьук Рго Агд С1и С1и 1355 1360 1365

С1п Туг Акп Зег ТЬг Туг Агд Уа1 Уа1 Зег Уа1 Ьеи ТЬг Уа1 Ьеи 1370 1375 1380

Нк С1п Акр Тгр Ьеи Акп С1у Ьук С1и Туг Ьук Сук Ьук Уа1 Зег 1385 1390 1395

- 219 028309

Ази Ьуз А1а Ьеи Рго А1а Рго 11е О1и Ьуз ТЬг 11е Зег Ьуз А1а 1400 1405 1410

Ьуз О1у О1и Рго Агд О1и Рго О1и Уа1 Туг ТЬг Ьеи Рго Рго Зег 1415 1420 1425

Агд Азр О1и Ьеи ТЬг Ьуз Ази О1и Уа1 Зег Ьеи ТЬг Суз Ьеи Уа1 1430 1435 1440

Ьуз О1у РЬе Туг Рго Зег Азр 11е А1а Уа1 О1и Тгр О1и Зег Ази 1445 1450 1455

О1у О1и Рго О1и Ази Ази Туг Ьуз ТЬг ТЬг Рго Рго Уа1 Ьеи Азр 1460 1465 1470

Зег Азр О1у Зег РЬе РЬе Ьеи Туг Зег Ьуз Ьеи ТЬг Уа1 Азр Ьуз 1475 1480 1485

Зег Агд Тгр О1и О1и О1у Ази Уа1 РЬе Зег Суз Зег Уа1 Ме! Шз 1490 1495 1500

О1и А1а Ьеи Шз Ази Шз Туг ТЬг О1и Ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи Зег 1505 1510 1515

Рго О1у Ьуз 1520 <210> 102 <211> 4389 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ФУШ 265 <400> 102 а!дсааа!ад адс!с!ссас с!дс!!с!!! с!д!дсс!!! !дсда!!с!д с!!!ад!дда 60 ддаддаддад дадссассад аада!ас!ас с!ддд!дсад !ддаас!д!с а!дддас!а! 120 а!дсааад!д а!с!сдд!да дс!дсс!д!д дасдсаада! !!сс!сс!ад ад!дссаааа 180 !с!!!!сса! !саасасс!с ад!сд!д!ас ааааадас!с !д!!!д!ада а!!сасдда! 240 сасс!!!!са аса!сдс!аа дссааддсса ссс!дда!дд д!с!дс!адд !сс!асса!с 300 саддс!дадд !!!а!да!ас ад!дд!са!! асас!!аада аса!ддс!!с сса!сс!д!с 360 ад!с!!са!д с!д!!дд!д! а!сс!ас!дд ааадс!!с!д адддадс!да а!а!да!да! 420 садассад!с ааадддадаа адаада!да! ааад!с!!сс с!дд!ддаад сса!аса!а! 480

- 220 028309 дХсХддсадд ХссХдааада дааХддХсса аХддссХсХд асссасХдХд ссХХассХас 540

ХсаХаХсХХХ сХсаХдХдда ссХддХаааа дасХХдааХХ саддссХсаХ ХддадсссХа 600 сХадХаХдХа дадаадддад ХсХддссаад даааадасас адассХХдса саааХХХаХа 660 сХасХХХХХд сХдХаХХХда Хдаадддааа адХХддсасХ садааасааа даасХссХХд 720 аХдсаддаХа дддаХдсХдс аХсХдсХсдд дссХддссХа аааХдсасас адХсааХддХ 780

ХаХдХаааса ддХсХсХдсс аддХсХдаХХ ддаХдссаса ддаааХсадХ сХаХХддсаХ 840 дХдаХХддаа Хдддсассас ХссХдаадХд сасХсааХаХ ХссХсдаадд ХсасасаХХХ 900 сХХдХдадда ассаХсдсса ддсдХссХХд даааХсХсдс сааХаасХХХ ссХХасХдсХ 960 сааасасХсХ ХдаХддассХ ХддасадХХХ сХасХдХХХХ дХсаХаХсХс ХХсссассаа 1020 саХдаХддса ХддаадсХХа ХдХсааадХа дасадсХдХс сададдаасс ссаасХасда 1080 аХдаааааХа аХдаадаадс ддаадасХаХ даХдаХдаХс ХХасХдаХХс ХдаааХддаХ 1140 дХддХсаддХ ХХдаХдаХда саасХсХссХ ХссХХХаХсс аааХХсдсХс адХХдссаад 1200 аадсаХссХа ааасХХдддХ асаХХасаХХ дсХдсХдаад аддаддасХд ддасХаХдсХ 1260 сссХХадХсс Хсдсссссда ХдасадаадХ ХаХаааадХс ааХаХХХдаа сааХддсссХ 1320 садсддаХХд дХаддаадХа саааааадХс сдаХХХаХдд саХасасада ХдааассХХХ 1380 аадасХсдХд аадсХаХХса дсаХдааХса ддааХсХХдд дассХХХасХ ХХаХддддаа 1440 дХХддадаса сасХдХХдаХ ХаХаХХХаад ааХсаадсаа дсадассаХа ХаасаХсХас 1500 ссХсасддаа ХсасХдаХдХ ссдХссХХХд ХаХХсаадда даХХассааа аддХдХаааа 1560 саХХХдаадд аХХХХссааХ ХсХдссадда даааХаХХса ааХаХаааХд дасадХдасХ 1620 дХадаадаХд ддссаасХаа аХсадаХссХ сддХдссХда сссдсХаХХа сХсХадХХХс 1680 дХХааХаХдд адададаХсХ адсХХсадда сХсаХХддсс сХсХссХсаХ сХдсХасааа 1740 дааХсХдХад аХсааададд ааассадаХа аХдХсадаса ададдааХдХ саХссХдХХХ 1800

ХсХдХаХХХд аХдадаассд аадсХддХас сХсасадада аХаХасаасд сХХХсХсссс 1860 ааХссадсХд дадХдсадсХ ХдаддаХсса дадХХссаад ссХссаасаХ саХдсасадс 1920 аХсааХддсХ аХдХХХХХда ХадХХХдсад ХХдХсадХХХ дХХХдсаХда ддХддсаХас 1980

ХддХасаХХс ХаадсаХХдд адсасадасХ дасХХссХХХ сХдХсХХсХХ сХсХддаХаХ 2040 ассХХсааас асааааХддХ сХаХдаадас асасХсассс ХаХХсссаХХ сХсаддадаа 2100 асХдХсХХса ХдХсдаХдда ааасссаддХ сХаХддаХХс ХддддХдсса саасХсадас 2160

ХХХсддааса даддсаХдас сдссХХасХд ааддХХХсХа дХХдХдасаа даасасХддХ 2220 даХХаХХасд аддасадХХа ХдаадаХаХХ ХсадсаХасХ ХдсХдадХаа ааасааХдсс 2280 аХХдаассаа даадсХХсХс Хсаааассса ссадХсХХда аддсссаХса ддссдаааХа 2340

- 221 028309 ас!сд!ас!а с!с!!сад!с ада!саадад дааа!!дас! а!да!да!ас са!а!сад!! 2400 дааа!даада аддаада!!! !даса!!!а! да!дадда!д аааа!садад сссссдсадс 2460 !!!саааада ааасасдаса с!а!!!!а!! дс!дсад!дд ададдс!с!д дда!!а!ддд 2520 а!дад!адс! ссссаса!д! !с!аадааас адддс!сада д!ддсад!д! ссс!сад!!с 2580 аадааад!!д !!!!ссадда а!!!ас!да! ддс!сс!!!а с!садссс!! а!ассд!дда 2640 даас!ааа!д ааса!!!ддд сс!сс!сддс сса!а!а!аа дадсадаад! !даада!аа! 2700 а!са!дд!аа с!!!садааа !саддсс!с! сд!ссс!а!! сс!!с!а!!с !адсс!!а!! 2760 !с!!а!дадд аада!садад дсааддадса даасс!адаа аааас!!!д! саадсс!аа! 2820 дааассаааа с!!ас!!!!д дааад!дсаа са!са!а!дд сасссас!аа ада!дад!!! 2880 дас!дсааад сс!дддс!!а !!!с!с!да! д!!дасс!дд ааааада!д! дсас!саддс 2940 с!да!!ддас ссс!!с!дд! с!дссасас! аасасас!да ассс!дс!са !дддадасаа 3000 д!дасад!ас аддаа!!!дс !с!д!!!!!с асса!с!!!д а!дадассаа аадс!дд!ас 3060 йсас!дааа а!а!ддааад ааас!дсадд дс!ссс!дса а!а!ссада! ддаада!ссс 3120 асййааад адаа!!а!сд сйсса!дса а!саа!ддс! аса!аа!дда !асас!асс! 3180 ддсйад!аа !ддс!садда !саааддай сда!дд!а!с !дс!садса! дддсадсаа! 3240 дааааса!сс а!!с!а!!са !!!сад!дда са!д!д!!са с!д!асдааа аааададдад 3300 !а!аааа!дд сас!д!асаа !с!с!а!сса дд!д!!!!!д адасад!дда аа!д!!асса 3360 !ссааадс!д даа!!!ддсд дд!ддаа!дс с!!а!!ддсд адса!с!аса !дс!ддда!д 3420 адсасас!!! йс!дд!д!а садсаа!аад !д!садас!с ссс!дддаа! ддсйс!дда 3480 сасайадад аййсада! !асадсйса ддасаа!а!д дасад!дддс сссааадс!д 3540 дссадас!!с а!!а!!ссдд а!саа!саа! дсс!ддадса ссааддадсс с!!!!с!!дд 3600 а!саадд!дд а!с!дйддс ассаа!дай а!!сасддса !саадассса ддд!дсссд! 3660 садаад!!с! ссадсс!с!а са!с!с!сад !йа!са!са !д!а!ад!с! !да!дддаад 3720 аад!ддсада с!!а!сдадд ааа!!ссас! ддаасс!!аа !дд!с!!с!! !ддсаа!д!д 3780 дайса!с!д дда!ааааса саа!а!!й! аассс!ссаа !!айдс!сд а!аса!ссд! 3840 йдсасссаа с!сайа!ад сайсдсадс ас!с!!сдса !ддад!!да! дддс!д!да! 3900 !!ааа!ад!! дсадса!дсс а!!дддаа!д дадад!ааад саа!а!сада !дсасада!! 3960 ас!дс!!са! сс!ас!!!ас саа!а!д!!! дссасс!дд! с!сс!!сааа адс!сдас!! 4020 сасс!ссаад ддаддад!аа !дсс!ддада сс!садд!да а!аа!ссааа адад!ддс!д 4080 саад!ддас! !ссадаадас аа!дааад!с асаддад!аа с!ас!саддд ад!аааа!с! 4140 с!дс!!асса дса!д!а!д! дааддад!!с с!са!с!сса дсад!саада !ддсса!сад 4200

- 222 028309 !ддас!с!с! !!!!!садаа !ддсааад!а аадд!!!!!с адддааа!са адас!сс!!с 4260 асасс!д!дд !даас!с!с! адасссассд !!ас!дас!с дс!асс!!сд аа!!сасссс 4320 садад!!ддд !дсассада! !дссс!дадд а!ддадд!!с !дддс!дсда ддсасаддас 4380 с!с!ас!да 4389 <210> 103 <211> 1462 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ФУШ 265 <400> 103

Ме! С1п 11е С1и Ьеи δе^ ТЬг Сув РЬе РЬе Ьеи Сув Ьеи Ьеи Агд РЬе 1 5 10 15

Сув РЬе δе^ С1у С1у С1у С1у С1у А1а ТЬг Агд Агд Туг Туг Ьеи С1у 20 25 30

А1а Уа1 С1и Ьеи δе^ Тгр Авр Туг Ме! С1п δе^ Авр Ьеи С1у С1и Ьеи 35 40 45

Рго Уа1 Авр А1а Агд РЬе Рго Рго Агд Уа1 Рго Ьув δе^ РЬе Рго РЬе 50 55 60

Авп ТЬг δе^ Уа1 Уа1 Туг Ьув Ьув ТЬг Ьеи РЬе Уа1 С1и РЬе ТЬг Авр 65 70 75 80

Н1в Ьеи РЬе Авп 11е А1а Ьув Рго Агд Рго Рго Тгр Ме! С1у Ьеи Ьеи 85 90 95

С1у Рго ТЬг 11е С1п А1а С1и Уа1 Туг Авр ТЬг Уа1 Уа1 11е ТЬг Ьеи 100 105 110

Ьув Авп Ме! А1а δе^ Шв Рго Уа1 δе^ Ьеи Шв А1а Уа1 С1у Уа1 δе^ 115 120 125

Туг Тгр Ьув А1а δе^ С1и С1у А1а С1и Туг Авр Авр С1п ТЬг δе^ С1п 130 135 140

Агд С1и Ьув С1и Авр Авр Ьув Уа1 РЬе Рго С1у С1у δе^ Шв ТЬг Туг 145 150 155 160

Уа1 Тгр С1п Уа1 Ьеи Ьув С1и Авп С1у Рго Ме! А1а δе^ Авр Рго Ьеи 165 170 175

- 223 028309

Сук Ьеи ТЬг Туг Зег Туг Ьеи Зег Шк Уа1 Акр Ьеи Уа1 Ьук Акр Ьеи 180 185 190

Акп Зег О1у Ьеи 11е О1у А1а Ьеи Ьеи Уа1 Сук Агд О1и О1у Зег Ьеи 195 200 205

А1а Ьук О1и Ьук ТЬг О1п ТЬг Ьеи Шк Ьук РЬе 11е Ьеи Ьеи РЬе А1а 210 215 220

Уа1 РЬе Акр О1и О1у Ьук Зег Тгр Шк Зег О1и ТЬг Ьук Акп Зег Ьеи 225 230 235 240

МеХ О1п Акр Агд Акр А1а А1а Зег А1а Агд А1а Тгр Рго Ьук МеХ Шк 245 250 255

ТЬг Уа1 Акп О1у Туг Уа1 Акп Агд Зег Ьеи Рго О1у Ьеи 11е О1у Сук 260 265 270

Шк Агд Ьук Зег Уа1 Туг Тгр Шк Уа1 11е О1у МеХ О1у ТЬг ТЬг Рго 275 280 285

О1и Уа1 Шк Зег 11е РЬе Ьеи О1и О1у Шк ТЬг РЬе Ьеи Уа1 Агд Акп 290 295 300

Шк Агд О1п А1а Зег Ьеи О1и 11е Зег Рго 11е ТЬг РЬе Ьеи ТЬг А1а 305 310 315 320

О1п ТЬг Ьеи Ьеи МеХ Акр Ьеи О1у О1п РЬе Ьеи Ьеи РЬе Сук Шк 11е 325 330 335

Зег Зег Шк О1п Шк Акр О1у МеХ О1и А1а Туг Уа1 Ьук Уа1 Акр Зег 340 345 350

Сук Рго О1и О1и Рго О1п Ьеи Агд МеХ Ьук Акп Акп О1и О1и А1а О1и 355 360 365

Акр Туг Акр Акр Акр Ьеи ТЬг Акр Зег О1и МеХ Акр Уа1 Уа1 Агд РЬе 370 375 380

Акр Акр Акр Акп Зег Рго Зег РЬе 11е О1п 11е Агд Зег Уа1 А1а Ьук 385 390 395 400

Ьук Шк Рго Ьук ТЬг Тгр Уа1 Шк Туг 11е А1а А1а О1и О1и О1и Акр 405 410 415

- 224 028309

Тгр Акр Туг А1а Рго Ьеи Уа1 Ьеи А1а Рго Акр Акр Агд 8ег Туг Ьук 420 425 430

8ег С1п Туг Ьеи Акп Акп С1у Рго С1п Агд Не С1у Агд Ьук Туг Ьук 435 440 445

Ьук Уа1 Агд РЬе МеГ А1а Туг ТЬг Акр С1и ТЬг РЬе Ьук ТЬг Агд С1и 450 455 460

А1а Не С1п Шк С1и 8ег С1у Не Ьеи С1у Рго Ьеи Ьеи Туг С1у С1и 465 470 475 480

Уа1 С1у Акр ТЬг Ьеи Ьеи Не Не РЬе Ьук Акп С1п А1а 8ег Агд Рго 485 490 495

Туг Акп Не Туг Рго Шк С1у Не ТЬг Акр Уа1 Агд Рго Ьеи Туг 8ег 500 505 510

Агд Агд Ьеи Рго Ьук С1у Уа1 Ьук Шк Ьеи Ьук Акр РЬе Рго Не Ьеи 515 520 525

Рго С1у С1и Не РЬе Ьук Туг Ьук Тгр ТЬг Уа1 ТЬг Уа1 С1и Акр С1у 530 535 540

Рго ТЬг Ьук 8ег Акр Рго Агд Сук Ьеи ТЬг Агд Туг Туг 8ег 8ег РЬе 545 550 555 560

Уа1 Акп МеГ С1и Агд Акр Ьеи А1а 8ег С1у Ьеи Не С1у Рго Ьеи Ьеи 565 570 575

Не Сук Туг Ьук С1и 8ег Уа1 Акр С1п Агд С1у Акп С1п Не МеГ 8ег 580 585 590

Акр Ьук Агд Акп Уа1 Не Ьеи РЬе 8ег Уа1 РЬе Акр С1и Акп Агд 8ег 595 600 605

Тгр Туг Ьеи ТЬг С1и Акп Не С1п Агд РЬе Ьеи Рго Акп Рго А1а С1у 610 615 620

Уа1 С1п Ьеи С1и Акр Рго С1и РЬе С1п А1а 8ег Акп Не МеГ Шк 8ег 625 630 635 640

Не Акп С1у Туг Уа1 РЬе Акр 8ег Ьеи С1п Ьеи 8ег Уа1 Сук Ьеи Шк 645 650 655

С1и Уа1 А1а Туг Тгр Туг Не Ьеи 8ег Не С1у А1а С1п ТЬг Акр РЬе 660 665 670

- 225 028309

Ьеи Зег ν;·ι1 РЬе РЬе Зег С1у Туг ТЬг РЬе Ьук Шк Ьук Ме! ν;·ι1 Туг 675 680 685

С1и Акр ТЬг Ьеи ТЬг Ьеи РЬе Рго РЬе Зег С1у С1и ТЬг Vа1 РЬе Ме! 690 695 700

Зег Ме! С1и Акп Рго С1у Ьеи Тгр 11е Ьеи С1у Сук Шк Акп Зег Акр 705 710 715 720

РЬе Агд Акп Агд С1у Ме! ТЬг А1а Ьеи Ьеи Ьук ν;·ι1 Зег Зег Сук Акр 725 730 735

Ьук Акп ТЬг С1у Акр Туг Туг С1и Акр Зег Туг С1и Акр 11е Зег А1а 740 745 750

Туг Ьеи Ьеи Зег Ьук Акп Акп А1а 11е С1и Рго Агд Зег РЬе Зег С1п 755 760 765

Акп Рго Рго ν;·ι1 Ьеи Ьук А1а Шк С1п А1а С1и 11е ТЬг Агд ТЬг ТЬг 770 775 780

Ьеи С1п Зег Акр С1п С1и С1и 11е Акр Туг Акр Акр ТЬг 11е Зег ν;·ι1 785 790 795 800

С1и Ме! Ьук Ьук С1и Акр РЬе Акр 11е Туг Акр С1и Акр С1и Акп С1п 805 810 815

Зег Рго Агд Зег РЬе С1п Ьук Ьук ТЬг Агд Шк Туг РЬе 11е А1а А1а 820 825 830 ν;·ι1 С1и Агд Ьеи Тгр Акр Туг С1у Ме! Зег Зег Зег Рго Шк Vа1 Ьеи 835 840 845

Агд Акп Агд А1а С1п Зег С1у Зег ν;·ι1 Рго С1п РЬе Ьук Ьук Vа1 ν;·ι1 850 855 860

РЬе С1п С1и РЬе ТЬг Акр С1у Зег РЬе ТЬг С1п Рго Ьеи Туг Агд С1у 865 870 875 880

С1и Ьеи Акп С1и Шк Ьеи С1у Ьеи Ьеи С1у Рго Туг 11е Агд А1а С1и 885 890 895 ν;·ι1 С1и Акр Акп 11е Ме! ν;·ι1 ТЬг РЬе Агд Акп С1п А1а Зег Агд Рго 900 905 910

- 226 028309

Туг Зег РЬе Туг Зег Зег Ьеи 11е Зег Туг О1и О1и Азр О1и Агд О1и 915 920 925

О1у А1а О1и Рго Агд Ьуз Ази РЬе Уа1 Ьуз Рго Ази О1и ТЬг Ьуз ТЬг 930 935 940

Туг РЬе Тгр Ьуз Уа1 О1и Шз Шз Ме! А1а Рго ТЬг Ьуз Азр О1и РЬе 945 950 955 960

Азр Суз Ьуз А1а Тгр А1а Туг РЬе Зег Азр Уа1 Азр Ьеи О1и Ьуз Азр 965 970 975

Уа1 Шз Зег О1у Ьеи 11е О1у Рго Ьеи Ьеи Уа1 Суз Шз ТЬг Ази ТЬг 980 985 990

Ьеи Ази Рго А1а Шз О1у Агд О1и Уа1 ТЬг Уа1 О1и О1и РЬе А1а Ьеи 995 1000 1005

РЬе РЬе ТЬг 11е РЬе Азр О1и ТЬг Ьуз Зег Тгр Туг РЬе ТЬг О1и 1010 1015 1020

Ази Ме! О1и Агд Ази Суз Агд А1а Рго Суз Ази 11е О1и Ме! О1и 1025 1030 1035

Азр Рго ТЬг РЬе Ьуз О1и Ази Туг Агд РЬе Шз А1а 11е Ази О1у 1040 1045 1050

Туг 11е Ме! Азр ТЬг Ьеи Рго О1у Ьеи Уа1 Ме! А1а О1и Азр О1и 1055 1060 1065

Агд 11е Агд Тгр Туг Ьеи Ьеи Зег Ме! О1у Зег Ази О1и Ази 11е 1070 1075 1080

Шз Зег 11е Шз РЬе Зег О1у Шз Уа1 РЬе ТЬг Уа1 Агд Ьуз Ьуз 1085 1090 1095

О1и О1и Туг Ьуз Ме! А1а Ьеи Туг Ази Ьеи Туг Рго О1у Уа1 РЬе 1100 1105 1110

О1и ТЬг Уа1 О1и Ме! Ьеи Рго Зег Ьуз А1а О1у 11е Тгр Агд Уа1 1115 1120 1125

О1и Суз Ьеи 11е О1у О1и Шз Ьеи Шз А1а О1у Ме! Зег ТЬг Ьеи 1130 1135 1140

РЬе Ьеи Уа1 Туг Зег Ази Ьуз Суз О1и ТЬг Рго Ьеи О1у Ме! А1а 1145 1150 1155

- 227 028309

8ег С1у Шз 11е Агд Азр РЬе С1п 11е ТЬг А1а 8ег С1у С1п Туг 1160 1165 1170

С1у С1п Тгр А1а Рго Ьуз Ьеи А1а Агд Ьеи Шз Туг 8ег С1у 8ег 1175 1180 1185

11е Азп А1а Тгр 8ег ТЬг Ьуз С1и Рго РЬе 8ег Тгр 11е Ьуз Уа1 1190 1195 1200

Азр Ьеи Ьеи А1а Рго Ме1 11е 11е Шз С1у 11е Ьуз ТЬг С1п С1у 1205 1210 1215

А1а Агд С1п Ьуз РЬе 8ег 8ег Ьеи Туг 11е 8ег С1п РЬе 11е 11е 1220 1225 1230

Ме1 Туг 8ег Ьеи Азр С1у Ьуз Ьуз Тгр С1п ТЬг Туг Агд С1у Азп 1235 1240 1245

8ег ТЬг С1у ТЬг Ьеи Ме1 Уа1 РЬе РЬе С1у Азп Уа1 Азр 8ег 8ег 1250 1255 1260

С1у 11е Ьуз Шз Азп 11е РЬе Азп Рго Рго 11е 11е А1а Агд Туг 1265 1270 1275

11е Агд Ьеи Шз Рго ТЬг Шз Туг 8ег 11е Агд 8ег ТЬг Ьеи Агд 1280 1285 1290

Ме1 С1и Ьеи Ме1 С1у Суз Азр Ьеи Азп 8ег Суз 8ег Ме1 Рго Ьеи 1295 1300 1305

С1у Ме1 С1и 8ег Ьуз А1а 11е 8ег Азр А1а С1п 11е ТЬг А1а 8ег 1310 1315 1320

8ег Туг РЬе ТЬг Азп Ме1 РЬе А1а ТЬг Тгр 8ег Рго 8ег Ьуз А1а 1325 1330 1335

Агд Ьеи Шз Ьеи С1п С1у Агд 8ег Азп А1а Тгр Агд Рго С1п Уа1 1340 1345 1350

Азп Азп Рго Ьуз С1и Тгр Ьеи С1п Уа1 Азр РЬе С1п Ьуз ТЬг Ме1 1355 1360 1365

Ьуз Уа1 ТЬг С1у Уа1 ТЬг ТЬг С1п С1у Уа1 Ьуз 8ег Ьеи Ьеи ТЬг 1370 1375 1380

- 228 028309

8ег Ме1 Туг Уа1 Ьук О1и РЪе Ьеи 11е 8ег 8ег 8ег О1п Акр О1у 1385 1390 1395

Шк О1п Тгр ТЪг Ьеи РЪе РЪе О1п Акп О1у Ьук Уа1 Ьук Уа1 РЪе 1400 1405 1410

О1п О1у Акп О1п Акр 8ег РЪе ТЪг Рго Уа1 Уа1 Акп 8ег Ьеи Акр 1415 1420 1425

Рго Рго Ьеи Ьеи ТЪг Агд Туг Ьеи Агд 11е Шк Рго О1п 8ег Тгр 1430 1435 1440

Уа1 Шк О1п 11е А1а Ьеи Агд Ме1 О1и Уа1 Ьеи О1у Сук О1и А1а 1445 1450 1455

О1п Акр Ьеи Туг 1460 <210> 104 <211> 5691 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ФУШ198 <400> 104 а1дсааа1ад адсЫссас с1дсйсй1 с1д1дссШ 1дсдайс1д сШаЦдсс 60 ассадаада! ас1асс1ддд 1дсад1ддаа с1д1са1ддд ас1а1а1дса ааЦдаЫс 120 дд1дадс1дс с1д1ддасдс аадаШсс! сс1адад1дс саааайШ (ссайсаас 180 асс1сад1сд Щасааааа дасШдй! дХадаайса сдда1сасс1 Шсаасай 240 дс!аадссаа ддссассйд да1ддд1с1д с1адд1сс1а сса1ссаддс 1даддШа1 300 да!асад1дд 1сайасас11аадааса1д дсйсссай с1д1сад1с11са1дс1д11 360 дд1д1а1сс1 айддааадс йс1даддда дс1даа1а1д а1да1садас садХсааадд 420 дадааадаад а1да1ааад1 сйссс1дд1 ддаадсса!а сайИдЫд дсадд1сс1д 480 ааададаа1д д1ссаа1ддс сЫдассса сЩдссПа сс1ас1са1а 1сШс1са1 540 д1ддасс1дд (аааадасй даайсаддс с1сайддад ссс1ас1ад1 а1д1ададаа 600 дддадШдд ссааддаааа дасасадасс йдсасааа! 11а1ас1ас11Шдс1д1а 660

Шда1даад ддаааадйд дсаскадаа асааадаас! ссйда1дса дда1аддда1 720 дс1дса1с1д с1сдддсс1д дсс1аааа1д сасасадйа а1дд11а1д1 ааасаддЫ 780 с1дссадд1с 1дайдда1д ссасаддааа 1сад1с1а11 ддса1д1да1 1ддаа1дддс 840 ассас1сс1д аад1дсас1с аа1айсс1с дааддХсаса сай1сйд1 даддаасса1 900

- 229 028309 сдссаддсд! сс!!ддааа! с!сдссаа!а ас!!!сс!!а с!дс!сааас ас!с!!да!д 960 дасс!!ддас ад!!!с!ас! д!!!!д!са! а!с!с!!ссс ассааса!да !ддса!ддаа 1020 дс!!а!д!са аад!адасад с!д!ссадад даассссаас !асдаа!даа ааа!аа!даа 1080 даадсддаад ас!а!да!да !да!с!!ас! да!!с!дааа !дда!д!дд! садд!!!да! 1140 да!дасаас! с!сс!!сс!! !а!ссааа!! сдс!сад!!д ссаадаадса !сс!аааас! 1200 !ддд!аса!! аса!!дс!дс !даададдад дас!дддас! а!дс!ссс!! ад!сс!сдсс 1260 сссда!даса даад!!а!аа аад!саа!а! !!даасаа!д дссс!садсд да!!дд!адд 1320 аад!асаааа аад!ссда!! !а!ддса!ас асада!дааа сс!!!аадас !сд!даадс! 1380 а!!садса!д аа!саддаа! с!!дддасс! !!ас!!!а!д дддаад!!дд адасасас!д 1440 !!да!!а!а! !!аадаа!са адсаадсада сса!а!ааса !с!ассс!са сддаа!сас! 1500 да!д!ссд!с с!!!д!а!!с ааддада!!а ссаааадд!д !ааааса!!! даадда!!!! 1560 ссаа!!с!дс саддадааа! а!!сааа!а! ааа!ддасад !дас!д!ада ада!дддсса 1620 ас!ааа!сад а!сс!сдд!д сс!дасссдс !а!!ас!с!а д!!!сд!!аа !а!ддадада 1680 да!с!адс!! саддас!са! !ддссс!с!с с!са!с!дс! асааадаа!с !д!ада!саа 1740 ададдааасс ада!аа!д!с адасаададд аа!д!са!сс !д!!!!с!д! а!!!да!дад 1800 аассдаадс! дд!асс!сас ададаа!а!а саасдс!!!с !ссссаа!сс адс!ддад!д 1860 садс!!дадд а!ссадад!! ссаадсс!сс ааса!са!дс асадса!саа !ддс!а!д!! 1920 !!!да!ад!! !дсад!!д!с ад!!!д!!!д са!дадд!дд са!ас!дд!а са!!с!аадс 1980 а!!ддадсас адас!дас!! сс!!!с!д!с !!с!!с!с!д да!а!асс!! сааасасааа 2040 а!дд!с!а!д аадасасас! сассс!а!!с сса!!с!сад дадааас!д! с!!са!д!сд 2100 а!ддаааасс садд!с!а!д да!!с!дддд !дссасаас! садас!!!сд даасададдс 2160 а!дассдсс! !ас!даадд! !!с!ад!!д! дасаадааса с!дд!да!!а !!асдаддас 2220 ад!!а!даад а!а!!!садс а!ас!!дс!д ад!аааааса а!дсса!!да ассаадаадс 2280 !!с!с!сада а!!саадаса ссс!адсас! аддсаааадс аа!!!аа!дс сассасаа!! 2340 ссадаааа!д аса!ададаа дас!дассс! !дд!!!дсас асадаасасс !а!дсс!ааа 2400 а!асаааа!д !с!сс!с!ад !да!!!д!!д а!дс!с!!дс дасадад!сс !ас!ссаса! 2460 дддс!а!сс! !а!с!да!с! ссаадаадсс ааа!а!дада с!!!!!с!да !да!сса!са 2520 сс!ддадсаа !адасад!аа !аасадсс!д !с!дааа!да сасас!!сад дссасадс!с 2580 са!сасад!д дддаса!дд! а!!!асссс! дад!саддсс !ссаа!!аад а!!ааа!дад 2640 ааас!дддда саас!дсадс аасадад!!д аадааас!!д а!!!сааад! !!с!ад!аса 2700 !сааа!аа!с !да!!!саас аа!!сса!са дасаа!!!дд садсадд!ас !да!аа!аса 2760

- 230 028309 ад!!сс!!ад дасссссаад !а!дссад!! са!!а!да!а д!саа!!ада !ассас!с!а 2820 !!!ддсаааа ад!са!с!сс сс!!ас!дад !с!дд!ддас с!с!дадс!! дад!даадаа 2880 аа!аа!да!! сааад!!д!! адаа!садд! !!аа!даа!а дссаадааад !!са!дддда 2940 ааааа!д!а! сд!садааа! аас!сд!ас! ас!с!!сад! сада!саада ддааа!!дас 3000 !а!да!да!а сса!а!сад! !дааа!даад ааддаада!! !!даса!!!а !да!дадда! 3060 даааа!сада дсссссдсад с!!!саааад аааасасдас ас!а!Ша! !дс!дсад!д 3120 дададдс!с! ддда!!а!дд да!дад!адс !ссссаса!д !!с!аадааа садддс!сад 3180 ад!ддсад!д !ссс!сад!! саадааад!! д!!!!ссадд аа!йас!да !ддс!сс!!! 3240 ас!садссс! !а!ассд!дд адаас!ааа! дааса!!!дд дас!сс!ддд дсса!а1а1а 3300 ададсадаад !!даада!аа !а!са!дд!а ас!!!садаа а!саддсс!с !сд!ссс!а! 3360 !сс!!с1ай с!адсс!!а! йсйа!дад даада!сада ддсааддадс адаасс!ада 3420 ааааас!!!д !саадсс!аа !дааассааа асйас!!!! ддааад!дса аса!са!а!д 3480 дсасссас!а аада!дад!! !дас!дсааа дсс!дддс!! а!!!с!с!да !д!!дасс!д 3540 дааааада!д !дсас!садд сс!да!!дда сссс!!с!дд !с!дссасас !аасасас!д 3600 аассс!дс!с а!дддадаса ад!дасад!а саддаа!!!д с!с!д!!!!! сасса!с!!! 3660 да!дадасса ааадс!дд!а с!!сас!даа аа!а!ддааа дааас!дсад ддс!ссс!дс 3720 аа!а!ссада !ддаада!сс сас!!!!ааа дадаа!!а!с дс!!сса!дс аа!саа!ддс 3780 !аса!аа!дд а!асас!асс !ддс!1ад!а а!ддс!садд а!сааадда! !сда!дд!а! 3840 с!дс!садса !дддсадсаа !дааааса!с са!!с!а!!с а!1!сад1дд аса!д!д!!с 3900 ас!д!асдаа ааааададда д!а!аааа!д дсас!д!аса а!с!с!а!сс адд!д!!!!! 3960 дадасад!дд ааа!д!!асс а!ссааадс! ддаа!!!ддс ддд!ддаа!д сс!!а!!ддс 4020 дадса!с!ас а!дс!ддда! дадсасас!! !!!с!дд!д! асадсаа!аа д!д!садас! 4080 сссс!дддаа !ддс!!с!дд асаса!!ада да!!!!сада !!асадс!!с аддасаа!а! 4140 ддасад!ддд ссссааадс! ддссадас!! са!!а!!ссд да!саа!саа !дсс!ддадс 4200 ассааддадс сс!!!!с!!д да!саадд!д да!с!д!!дд сассаа!да! !а!!сасддс 4260 а!саадассс аддд!дсссд !садаад!!с !ссадсс!с! аса!с!с!са д!!!а!са!с 4320 а!д!а!ад!с !!да!дддаа даад!ддсад ас!!а!сдад дааа!!ссас !ддаасс!!а 4380 а!дд!с!!с! !!ддсаа!д! дда!!са!с! ддда!аааас асаа!а!!!! !аассс!сса 4440 а!!а!!дс!с да!аса!ссд !!!дсассса ас!са!!а!а дса!!сдсад сас!с!!сдс 4500 а!ддад!!да !дддс!д!да !!!ааа!ад! !дсадса!дс са!!дддаа! ддадад!ааа 4560 дсаа!а!сад а!дсасада! !ас!дс!!са !сс!ас!!!а ссаа!а!д!! !дссасс!дд 4620

- 231 028309 !с!сс!!саа аадс!сдас! !сасс!ссаа дддаддад!а а!дсс!ддад асс!садд!д 4680 аа!аа!ссаа аадад!ддс! дсаад!ддас !!ссадаада саа!дааад! сасаддад!а 4740 ас!ас!садд дад!аааа!с !с!дс!!асс адса!д!а!д !дааддад!! сс!са!с!сс 4800 адсад!саад а!ддсса!са д!ддас!с!с !!!!!!сада а!ддсааад! ааадд!!!!! 4860 садддааа!с аадас!сс!! сасасс!д!д д!даас!с!с !адасссасс д!!ас!дас! 4920 сдс!асс!!с даа!!сассс ссадад!!дд д!дсассада !!дссс!дад да!ддадд!! 4980 с!дддс!дсд аддсасадда сс!с!асдас аааас!саса са!дсссасс д!дсссадс! 5040 ссадаас!сс !дддсддасс д!сад!с!!с с!с!!ссссс саааасссаа ддасассс!с 5100 а!да!с!ссс ддасссс!да дд!саса!дс д!дд!дд!дд асд!дадсса сдаадассс! 5160 дадд!саад! !саас!дд!а сд!ддасддс д!ддадд!дс а!аа!дссаа дасааадссд 5220 сдддаддадс ад!асаасад сасд!ассд! д!дд!садсд !сс!сассд! сс!дсассад 5280 дас!ддс!да а!ддсаадда д!асаад!дс аадд!с!сса асааадссс! сссадссссс 5340 а!сдадаааа сса!с!ссаа адссаааддд садссссдад аассасадд! д!асассс!д 5400 ссссса!ссс ддда!дадс! дассаадаас садд!садсс !дасс!дсс! дд!саааддс 5460 !!с!а!ссса дсдаса!сдс сд!ддад!дд дададсаа!д ддсадссдда даасаас!ас 5520 аадассасдс с!сссд!д!! ддас!ссдас ддс!сс!!с! !сс!с!асад саадс!сасс 5580 д!ддасаада дсадд!ддса дсаддддаас д!с!!с!са! дс!ссд!да! дса!даддс! 5640 с!дсасаасс ас!асасдса даададсс!с !ссс!д!с!с сддд!ааа!д а 5691 <210> 105 <211> 1896 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ФУШ 198 <400> 105

Сув РЬе δе^ А1а ТЬг Агд Агд Туг Туг Ьеи С1у А1а Уа1 С1и Ьеи δе^

25 30

Тгр Авр Туг Ме! С1п δе^ Авр Ьеи С1у С1и Ьеи Рго Уа1 Авр А1а Агд 35 40 45

РЬе Рго Рго Агд Уа1 Рго Ьув δе^ РЬе Рго РЬе Авп ТЬг δе^ Уа1 Уа1 50 55 60

- 232 028309

Туг Ьук Ьук ТЬг Ьеи РЬе Уа1 С1и РЬе ТЬг Акр Шк Ьеи РЬе Акп 11е 65 70 75 80

- 233 028309

Ьеи 01и 11е Бег Рго 11е ТНг РНе Ьеи ТНг А1а О1п ТНг Ьеи Ьеи Ме1 305 310 315 320

Азр Ьеи О1у О1п РНе Ьеи Ьеи РНе Суз Шз 11е Бег Бег Шз О1п Шз 325 330 335

Азр О1у Ме1 О1и А1а Туг Уа1 Ьуз Уа1 Азр Бег Суз Рго О1и О1и Рго 340 345 350

- 234 028309

Азр Ьеи А1а Зег 01у Ьеи 11е 01у Рго Ьеи Ьеи 11е Суз Туг Ьуз О1и 565 570 575

Зег Vаί Азр О1п Агд О1у Азп О1п 11е Ме1 Зег Азр Ьуз Агд Азп Vаί 580 585 590

11е Ьеи РЬе Зег Vаί РЬе Азр О1и Азп Агд Зег Тгр Туг Ьеи ТЬг О1и 595 600 605

Азп 11е О1п Агд РЬе Ьеи Рго Азп Рго А1а О1у Vа1 О1п Ьеи О1и Азр 610 615 620

Рго О1и РЬе О1п А1а Зег Азп 11е Ме1 Шз Зег 11е Азп О1у Туг Vа1 625 6З0 6З5 640

РЬе Азр Зег Ьеи О1п Ьеи Зег Vа1 Суз Ьеи Шз О1и Vаί А1а Туг Тгр 645 650 655

Туг 11е Ьеи Зег 11е О1у А1а О1п ТЬг Азр РЬе Ьеи Зег Vа1 РЬе РЬе 660 665 670

Зег О1у Туг ТЬг РЬе Ьуз Шз Ьуз Ме1 Vаί Туг О1и Азр ТЬг Ьеи ТЬг 675 680 685

Ьеи РЬе Рго РЬе Зег О1у О1и ТЬг Vа1 РЬе Ме1 Зег Ме1 О1и Азп Рго 690 695 700

О1у Ьеи Тгр 11е Ьеи О1у Суз Шз Азп Зег Азр РЬе Агд Азп Агд О1у 705 710 715 720

Ме1 ТЬг А1а Ьеи Ьеи Ьуз Vаί Зег Зег Суз Азр Ьуз Азп ТЬг С1у Азр 725 7З0 7З5

Туг Туг С1и Азр Зег Туг С1и Азр 11е Зег А1а Туг Ьеи Ьеи Зег Ьуз 740 745 750

Азп Азп А1а 11е С1и Рго Агд Зег РЬе Зег С1п Азп Зег Агд Шз Рго 755 760 765

Зег ТЬг Агд С1п Ьуз С1п РЬе Азп А1а ТЬг ТЬг 11е Рго С1и Азп Азр 770 775 780

11е С1и Ьуз ТЬг Азр Рго Тгр РЬе А1а Шз Агд ТЬг Рго Ме1 Рго Ьуз 785 790 795 800

- 2З5 028309

11е С1п Акп Уа1 8ег 8ег 8ег Акр Ьеи Ьеи Ме! Ьеи Ьеи Агд С1п 8ег 805 810 815

Рго ТЬг Рго Шк С1у Ьеи 8ег Ьеи 8ег Акр Ьеи С1п С1и А1а Ьук Туг 820 825 830

С1и ТЬг РЬе 8ег Акр Акр Рго 8ег Рго С1у А1а 11е Акр 8ег Акп Акп 835 840 845

8ег Ьеи 8ег С1и Ме! ТЬг Шк РЬе Агд Рго С1п Ьеи Шк Шк 8ег С1у 850 855 860

Акр Ме! Уа1 РЬе ТЬг Рго С1и 8ег С1у Ьеи С1п Ьеи Агд Ьеи Акп С1и 865 870 875 880

Ьук Ьеи С1у ТЬг ТЬг А1а А1а ТЬг С1и Ьеи Ьук Ьук Ьеи Акр РЬе Ьук 885 890 895

Уа1 8ег 8ег ТЬг 8ег Акп Акп Ьеи 11е 8ег ТЬг 11е Рго 8ег Акр Акп 900 905 910

Ьеи А1а А1а С1у ТЬг Акр Акп ТЬг 8ег 8ег Ьеи С1у Рго Рго 8ег Ме! 915 920 925

Рго Уа1 Шк Туг Акр 8ег С1п Ьеи Акр ТЬг ТЬг Ьеи РЬе С1у Ьук Ьук 930 935 940

8ег 8ег Рго Ьеи ТЬг С1и 8ег С1у С1у Рго Ьеи 8ег Ьеи 8ег С1и С1и 945 950 955 960

Акп Акп Акр 8ег Ьук Ьеи Ьеи С1и 8ег С1у Ьеи Ме! Акп 8ег С1п С1и 965 970 975

8ег 8ег Тгр С1у Ьук Акп Уа1 8ег 8ег С1и 11е ТЬг Агд ТЬг ТЬг Ьеи 980 985 990

С1п 8ег Акр С1п С1и С1и 11е Акр Туг Акр Акр ТЬг 11е 8ег Уа1 С1и 995 1000 1005

Ме! Ьук Ьук С1и Акр РЬе Акр 11е Туг Акр С1и Акр С1и Акп С1п 1010 1015 1020

8ег Рго Агд 8ег РЬе С1п Ьук Ьук ТЬг Агд Шк Туг РЬе 11е А1а 1025 1030 1035

А1а Уа1 С1и Агд Ьеи Тгр Акр Туг С1у Ме! 8ег 8ег 8ег Рго Шк 1040 1045 1050

- 236 028309

Уа1 Ьеи Агд Акп Агд А1а О1п Зег О1у Зег Уа1 Рго О1п РЬе Ьук 1055 1060 1065

Ьук Уа1 Уа1 РЬе О1п О1и РЬе ТЬг Акр О1у Зег РЬе ТЬг О1п Рго 1070 1075 1080

Ьеи Туг Агд О1у О1и Ьеи Акп О1и Шк Ьеи О1у Ьеи Ьеи О1у Рго 1085 1090 1095

Туг 11е Агд А1а О1и Уа1 О1и Акр Акп 11е МеХ Уа1 ТЬг РЬе Агд 1100 1105 1110

Акп О1п А1а Зег Агд Рго Туг Зег РЬе Туг Зег Зег Ьеи 11е Зег 1115 1120 1125

Туг О1и О1и Акр О1п Агд О1п О1у А1а О1и Рго Агд Ьук Акп РЬе 1130 1135 1140

Уа1 Ьук Рго Акп О1и ТЬг Ьук ТЬг Туг РЬе Тгр Ьук Уа1 О1п Шк 1145 1150 1155

Шк МеХ А1а Рго ТЬг Ьук Акр О1и РЬе Акр Сук Ьук А1а Тгр А1а 1160 1165 1170

Туг РЬе Зег Акр Уа1 Акр Ьеи О1и Ьук Акр Уа1 Шк Зег О1у Ьеи 1175 1180 1185

11е О1у Рго Ьеи Ьеи Уа1 Сук Шк ТЬг Акп ТЬг Ьеи Акп Рго А1а 1190 1195 1200

Шк О1у Агд О1п Уа1 ТЬг Уа1 О1п О1и РЬе А1а Ьеи РЬе РЬе ТЬг 1205 1210 1215

11е РЬе Акр О1и ТЬг Ьук Зег Тгр Туг РЬе ТЬг О1и Акп МеХ О1и 1220 1225 1230

Агд Акп Сук Агд А1а Рго Сук Акп 11е О1п МеХ О1и Акр Рго ТЬг 1235 1240 1245

РЬе Ьук О1и Акп Туг Агд РЬе Шк А1а 11е Акп О1у Туг 11е МеХ 1250 1255 1260

Акр ТЬг Ьеи Рго О1у Ьеи Уа1 МеХ А1а О1п Акр О1п Агд 11е Агд 1265 1270 1275

- 237 028309

Тгр Туг Ьеи Ьеи 8ег МеГ С1у 8ег Акп С1и Акп 11е Шк 8ег 11е 1280 1285 1290

Шк РЬе 8ег С1у Шк Уа1 РЬе ТЬг Уа1 Агд Ьук Ьук С1и С1и Туг 1295 1300 1305

Ьук МеГ А1а Ьеи Туг Акп Ьеи Туг Рго С1у Уа1 РЬе С1и ТЬг Уа1 1310 1315 1320

С1и МеГ Ьеи Рго 8ег Ьук А1а С1у 11е Тгр Агд Уа1 С1и Сук Ьеи 1325 1330 1335

11е С1у С1и Шк Ьеи Шк А1а С1у МеГ 8ег ТЬг Ьеи РЬе Ьеи Уа1 1340 1345 1350

Туг 8ег Акп Ьук Сук С1п ТЬг Рго Ьеи С1у МеГ А1а 8ег С1у Шк 1355 1360 1365

11е Агд Акр РЬе С1п 11е ТЬг А1а 8ег С1у С1п Туг С1у С1п Тгр 1370 1375 1380

А1а Рго Ьук Ьеи А1а Агд Ьеи Шк Туг 8ег С1у 8ег 11е Акп А1а 1385 1390 1395

Тгр 8ег ТЬг Ьук С1и Рго РЬе 8ег Тгр 11е Ьук Уа1 Акр Ьеи Ьеи 1400 1405 1410

А1а Рго МеГ 11е 11е Шк С1у 11е Ьук ТЬг С1п С1у А1а Агд С1п 1415 1420 1425

Ьук РЬе 8ег 8ег Ьеи Туг 11е 8ег С1п РЬе 11е 11е МеГ Туг 8ег 1430 1435 1440

Ьеи Акр С1у Ьук Ьук Тгр С1п ТЬг Туг Агд С1у Акп 8ег ТЬг С1у 1445 1450 1455

ТЬг Ьеи МеГ Уа1 РЬе РЬе С1у Акп Уа1 Акр 8ег 8ег С1у 11е Ьук 1460 1465 1470

Шк Акп 11е РЬе Акп Рго Рго 11е 11е А1а Агд Туг 11е Агд Ьеи 1475 1480 1485

Шк Рго ТЬг Шк Туг 8ег 11е Агд 8ег ТЬг Ьеи Агд МеГ С1и Ьеи 1490 1495 1500

МеГ С1у Сук Акр Ьеи Акп 8ег Сук 8ег МеГ Рго Ьеи С1у МеГ С1и 1505 1510 1515

- 238 028309

Зег Ьук А1а 11е Зег Акр А1а С1п 11е ТЬг А1а Зег Зег Туг РЬе 1520 1525 1530

ТЬг Акп Ме1 РЬе А1а ТЬг Тгр Зег Рго Зег Ьук А1а Агд Ьеи Нк 1535 1540 1545

Ьеи С1п С1у Агд Зег Акп А1а Тгр Агд Рго С1п Уа1 Акп Акп Рго 1550 1555 1560

Ьук С1и Тгр Ьеи С1п Уа1 Акр РЬе С1п Ьук ТЬг Ме1 Ьук Уа1 ТЬг 1565 1570 1575

С1у Уа1 ТЬг ТЬг С1п С1у Уа1 Ьук Зег Ьеи Ьеи ТЬг Зег Ме1 Туг 1580 1585 1590

Уа1 Ьук С1и РЬе Ьеи 11е Зег Зег Зег С1п Акр С1у Нк С1п Тгр 1595 1600 1605

ТЬг Ьеи РЬе РЬе С1п Акп С1у Ьук Уа1 Ьук Уа1 РЬе С1п С1у Акп 1610 1615 1620

С1п Акр Зег РЬе ТЬг Рго Уа1 Уа1 Акп Зег Ьеи Акр Рго Рго Ьеи 1625 1630 1635

Ьеи ТЬг Агд Туг Ьеи Агд 11е Нк Рго С1п Зег Тгр Уа1 Нк С1п 1640 1645 1650

11е А1а Ьеи Агд Ме1 С1и Уа1 Ьеи С1у Сук С1и А1а С1п Акр Ьеи 1655 1660 1665

Туг Акр Ьук ТЬг Нк ТЬг Сук Рго Рго Сук Рго А1а Рго С1и Ьеи 1670 1675 1680

Ьеи С1у С1у Рго Зег Уа1 РЬе Ьеи РЬе Рго Рго Ьук Рго Ьук Акр 1685 1690 1695

ТЬг Ьеи Ме1 11е Зег Агд ТЬг Рго С1и Уа1 ТЬг Сук Уа1 Уа1 Уа1 1700 1705 1710

Акр Уа1 Зег Нк С1и Акр Рго С1и Уа1 Ьук РЬе Акп Тгр Туг Уа1 1715 1720 1725

Акр С1у Уа1 С1и Уа1 Нк Акп А1а Ьук ТЬг Ьук Рго Агд С1и С1и 1730 1735 1740

- 239 028309

С1п Туг Авп δе^ ТЬг Туг Агд Уа1 Уа1 δе^ Уа1 Ьеи ТЬг Уа1 Ьеи 1745 1750 1755

Н1в С1п Авр Тгр Ьеи Авп С1у Ьув С1и Туг Ьув Сув Ьув Уа1 δе^ 1760 1765 1770

Авп Ьув А1а Ьеи Рго А1а Рго 11е С1и Ьув ТЬг 11е δе^ Ьув А1а 1775 1780 1785

Ьув С1у С1п Рго Агд С1и Рго С1п Уа1 Туг ТЬг Ьеи Рго Рго δе^ 1790 1795 1800

Агд Авр С1и Ьеи ТЬг Ьув Авп С1п Уа1 δе^ Ьеи ТЬг Сув Ьеи Уа1 1805 1810 1815

Ьув С1у РЬе Туг Рго δе^ Авр 11е А1а Уа1 С1и Тгр С1и δе^ Авп 1820 1825 1830

С1у С1п Рго С1и Авп Авп Туг Ьув ТЬг ТЬг Рго Рго Уа1 Ьеи Авр 1835 1840 1845 δе^ Авр С1у δе^ РЬе РЬе Ьеи Туг δе^ Ьув Ьеи ТЬг Уа1 Авр Ьув 1850 1855 1860 δе^ Агд Тгр С1п С1п С1у Авп Уа1 РЬе δе^ Сув δе^ Уа1 Ме! Шв 1865 1870 1875

С1и А1а Ьеи Шв Авп Шв Туг ТЬг С1п Ьув δе^ Ьеи δе^ Ьеи δе^ 1880 1885 1890

Рго С1у Ьув 1895 <210> 106 <211> 5 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> распознающий сортазу мотив <220>

<221> примечание <222> (3)..(3) <223> Хаа может являться любой аминокислотой природного происхождения <400> 106

Ьеи Рго Хаа ТЬг С1у 1 5

- 240 028309 <210> 107 <211> 10 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> цистеин-содержащий пептид <400> 107

С1у С1у С1у Зег С1у Сук С1у С1у С1у Зег

5 10 <210> 108 <211> 4548 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ФВ 031 <400> 108 а!да!!сс!д ссада!!!дс сдддд!дс!д с!!дс!с!дд ссс!са!!!! дссадддасс 60 с!!!д!дсад ааддаас!сд сддсадд!са !ссасддссс да!дсадсс! !!!сддаад! 120 дас!!сд!са асасс!!!да !дддадса!д !асадс!!!д сддда!ас!д сад!!асс!с 180 с!ддсадддд дс!дссадаа асдс!сс!!с !сда!!а!!д дддас!!сса даа!ддсаад 240 адад!дадсс !с!ссд!д!а !с!!ддддаа !!!!!!даса !сса!!!д!! !д!саа!дд! 300 ассд!дасас адддддасса аадад!с!сс а!дссс!а!д сс!ссааадд дс!д!а!с!а 360 дааас!дадд с!ддд!ас!а саадс!д!сс дд!даддсс! а!ддс!!!д! ддссадда!с 420 да!ддсадсд дсаас!!!са ад!сс!дс!д !садасада! ас!!саасаа дасс!дсддд 480 с!д!д!ддса ас!!!ааса! с!!!дс!даа да!дас!!!а !дасссаада адддасс!!д 540 асс!сддасс с!!а!дас!! !дссаас!са !дддс!с!да дсад!ддада асад!дд!д! 600 даасдддса! с!сс!сссад садс!са!дс ааса!с!сс! с!ддддааа! дсадаадддс 660 с!д!дддадс ад!дссадс! !с!даададс асс!сдд!д! !!дсссдс!д ссассс!с!д 720 д!ддассссд адсс!!!!д! ддссс!д!д! дадаадас!! !д!д!дад!д !дс!дддддд 780 с!ддад!дсд сс!дссс!дс сс!сс!ддад !асдсссдда сс!д!дссса ддадддаа!д 840 д!дс!д!асд дс!ддассда ссасадсдсд !дсадсссад !д!дссс!дс !дд!а!ддад 900 !а!аддсад! д!д!д!сссс !!дсдссадд асс!дссада дсс!дсаса! саа!дааа!д 960 !д!саддадс да!дсд!дда !ддс!дсадс !дссс!дадд дасадс!сс! дда!дааддс 1020 с!с!дсд!дд ададсассда д!д!ссс!дс д!дса!!ссд дааадсдс!а ссс!сссддс 1080 асс!ссс!с! с!сдадас!д саасасс!дс а!!!дссдаа асадссад!д да!с!дсадс 1140

- 241 028309 аа!даадаа! д!ссадддда д!дсс!!д!с ас!дд!саа! сссас!!саа дадс!!!дас 1200 аасада!ас! !сасс!!сад !ддда!с!дс сад!асс!дс !ддсссддда !!дссаддас 1260 сас!сс!!с! сса!!д!са! !дадас!д!с сад!д!дс!д а!дассдсда сдс!д!д!дс 1320 асссдс!ссд !сассд!ссд дс!дсс!ддс с!дсасааса дсс!!д!даа ас!даадса! 1380 ддддсаддад !!дсса!дда !ддссаддас а!ссадс!сс ссс!сс!даа адд!дасс!с 1440 сдса!ссадс а!асад!дас ддсс!ссд!д сдсс!садс! асддддадда сс!дсада!д 1500 дас!ддда!д дссдсдддад дс!дс!дд!д аадс!д!ссс ссд!с!а!дс сдддаадасс 1560 !дсддсс!д! д!дддаа!!а саа!ддсаас садддсдасд ас!!сс!!ас сссс!с!ддд 1620 с!ддсддадс сссддд!дда ддас!!сддд аасдсс!дда адс!дсасдд ддас!дссад 1680 дасс!дсада адсадсасад сда!ссс!дс дссс!саасс сдсдса!дас садд!!с!сс 1740 даддаддсд! дсдсдд!сс! дасд!ссссс аса!!сдадд сс!дсса!сд !дссд!садс 1800 ссдс!дссс! асс!дсддаа с!дссдс!ас дасд!д!дс! сс!дс!сдда сддссдсдад 1860 !дсс!д!дсд дсдссс!ддс садс!а!дсс дсддсс!дсд сддддададд сд!дсдсд!с 1920 дсд!ддсдсд адссаддссд с!д!дадс!д аас!дсссда ааддссадд! д!асс!дсад 1980 !дсдддассс сс!дсаасс! дасс!дссдс !с!с!с!с!! асссдда!да ддаа!дсаа! 2040 даддсс!дсс !ддадддс!д с!!с!дсссс ссадддс!с! аса!дда!да даддддддас 2100 !дсд!дссса аддсссад!д сссс!д!!ас !а!дасдд!д ада!с!!сса дссадаадас 2160 а!с!!с!сад асса!сасас са!д!дс!ас !д!дадда!д дс!!са!дса с!д!асса!д 2220 ад!ддад!сс ссддаадс!! дс!дсс!дас дс!д!сс!са дсад!сссс! д!с!са!сдс 2280 адсаааадда дсс!а!сс!д !сддсссссс а!дд!саадс !дд!д!д!сс сдс!дасаас 2340 с!дсдддс!д аадддс!сда д!д!ассааа асд!дссада ас!а!дасс! ддад!дса!д 2400 адса!дддс! д!д!с!с!дд с!дсс!с!дс сссссдддса !дд!ссддса !дадаасада 2460 !д!д!ддссс !ддааадд!д !ссс!дс!!с са!садддса аддад!а!дс ссс!ддадаа 2520 асад!даада !!ддс!дсаа сас!!д!д!с !д!сдддасс ддаад!ддаа с!дсасадас 2580 са!д!д!д!д а!дссасд!д с!ссасда!с ддса!ддссс ас!асс!сас с!!сдасддд 2640 с!сааа!асс !д!!ссссдд ддад!дссад !асд!!с!дд !дсадда!!а с!дсддсад! 2700 аассс!ддда сс!!!сдда! сс!ад!дддд аа!ааддда! дсадссассс с!сад!дааа 2760 !дсаадааас ддд!сасса! сс!дд!ддад ддаддадада !!дадс!д!! !дасддддад 2820 д!даа!д!да ададдссса! даадда!дад ас!сас!!!д адд!дд!дда д!с!ддссдд 2880 !аса!са!!с !дс!дс!ддд сааадссс!с !ссд!дд!с! дддассдсса сс!дадса!с 2940 !ссд!дд!сс !даадсадас а!ассаддад ааад!д!д!д дсс!д!д!дд даа!!!!да! 3000

- 242 028309 ддса!ссада асаа!дасс! сассадсадс аасс!ссаад !ддаддаада ссс!д!ддас 3060 !!!дддаас! сс!ддааад! дадс!сдсад !д!дс!даса ссадаааад! дсс!с!ддас 3120 !са!сссс!д ссасс!дсса !аасааса!с а!даадсада сда!дд!дда !!сс!сс!д! 3180 адаа!сс!!а ссад!дасд! сйссаддас !дсаасаадс !дд!ддассс сдадсса!а! 3240 с!дда!д!с! дса!!!асда сасс!дс!сс !д!дад!сса !!ддддас!д сдссдсайс 3300 !дсдасасса йдс!дсс!а !дсссасд!д !д!дсссадс а!ддсаадд! дд!дасс!дд 3360 аддасддсса са!!д!дссс ссададс!дс даддададда а!с!ссддда даасддд!а! 3420 даддс!дад! ддсдс!а!аа садс!д!дса сс!дсс!д!с аад!сасд!д !садсассс! 3480 дадссас!дд сс!дссс!д! дсад!д!д!д дадддс!дсс а!дсссас!д ссс!ссаддд 3540 аааа!сс!дд а!дадс!!!! дсадасс!дс д!!дассс!д аадас!д!сс ад!д!д!дад 3600 д!ддс!ддсс ддсд!!!!дс с!саддааад ааад!сасс! !даа!сссад !дассс!дад 3660 сас!дссада !!!дссас!д !да!д!!д!с аасс!сасс! д!даадсс!д ссаддадссд 3720 а!а!с!ддсд д!ддаддйс сдд!ддсддд дда!ссддсд д!ддадд!!с сддсдд!дда 3780 дд!!ссдд!д дсддддда!с сдд!ддсддд дда!ссс!дд !сссссдддд садсддсдд! 3840 ддадд!!ссд д!ддсддддд а!ссдасааа ас!сасаса! дсссассд!д сссадс!сса 3900 даас!сс!дд дсддассд!с ад!с!!сс!с !!ссссссаа аасссаадда сассс!са!д 3960 а!с!сссдда сссс!дадд! саса!дсд!д д!дд!ддасд !дадссасда адассс!дад 4020 д!саад!!са ас!дд!асд! ддасддсд!д дадд!дса!а а!дссаадас ааадссдсдд 4080 даддадсад! асаасадсас д!ассд!д!д д!садсд!сс !сассд!сс! дсассаддас 4140 !ддс!даа!д дсааддад!а саад!дсаад д!с!ссааса аадссс!ссс адссссса!с 4200 дадаааасса !с!ссааадс сааадддсад ссссдадаас сасадд!д!а сассс!дссс 4260 сса!сссддд а!дадс!дас саадаассад д!садсс!да сс!дсс!дд! саааддсйс 4320 !а!сссадсд аса!сдссд! ддад!дддад адсаа!дддс адссддадаа саас!асаад 4380 ассасдсс!с ссд!д!!дда с!ссдасддс !сс!!с!!сс !с!асадсаа дс!сассд!д 4440 дасаададса дд!ддсадса ддддаасд!с !!с!са!дс! ссд!да!дса !даддс!с!д 4500 сасаассас! асасдсадаа дадсс!с!сс с!д!с!ссдд д!ааа!да 4548 <210> 109 <211> 1515 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ФВ 031 <400> 109

- 243 028309

Ме1 11е Рго А1а Агд РЬе А1а С1у Уа1 Ьеи Ьеи А1а Ьеи А1а Ьеи 11е 1 5 10 15

Ьеи Рго С1у ТЬг Ьеи Сук А1а С1и С1у ТЬг Агд С1у Агд 8ег 8ег ТЬг 20 25 30

А1а Агд Сук 8ег Ьеи РЬе С1у 8ег Акр РЬе Уа1 Акп ТЬг РЬе Акр С1у 35 40 45

8ег Ме1 Туг 8ег РЬе А1а С1у Туг Сук 8ег Туг Ьеи Ьеи А1а С1у С1у 50 55 60

Сук С1п Ьук Агд 8ег РЬе 8ег 11е 11е С1у Акр РЬе С1п Акп С1у Ьук 65 70 75 80

Агд Уа1 8ег Ьеи 8ег Уа1 Туг Ьеи С1у С1и РЬе РЬе Акр 11е Шк Ьеи 85 90 95

РЬе Уа1 Акп С1у ТЬг Уа1 ТЬг С1п С1у Акр С1п Агд Уа1 8ег Ме1 Рго 100 105 110

Туг А1а 8ег Ьук С1у Ьеи Туг Ьеи С1и ТЬг С1и А1а С1у Туг Туг Ьук 115 120 125

Ьеи 8ег С1у С1и А1а Туг С1у РЬе Уа1 А1а Агд 11е Акр С1у 8ег С1у 130 135 140

Акп РЬе С1п Уа1 Ьеи Ьеи 8ег Акр Агд Туг РЬе Акп Ьук ТЬг Сук С1у 145 150 155 160

Ьеи Сук С1у Акп РЬе Акп 11е РЬе А1а С1и Акр Акр РЬе Ме1 ТЬг С1п 165 170 175

С1и С1у ТЬг Ьеи ТЬг 8ег Акр Рго Туг Акр РЬе А1а Акп 8ег Тгр А1а 180 185 190

Ьеи 8ег 8ег С1у С1и С1п Тгр Сук С1и Агд А1а 8ег Рго Рго 8ег 8ег 195 200 205

8ег Сук Акп 11е 8ег 8ег С1у С1и Ме1 С1п Ьук С1у Ьеи Тгр С1и С1п 210 215 220

Сук С1п Ьеи Ьеи Ьук 8ег ТЬг 8ег Уа1 РЬе А1а Агд Сук Шк Рго Ьеи 225 230 235 240

Уа1 Акр Рго С1и Рго РЬе Уа1 А1а Ьеи Сук С1и Ьук ТЬг Ьеи Сук С1и

- 244 028309

245 250 255

Агд ТЬг Суз А1а С1п С1и С1у Ме1 Уа1 Ьеи Туг С1у Тгр ТЬг Азр Шз 275 280 285

8ег А1а Суз 8ег Рго Уа1 Суз Рго А1а С1у Ме1 С1и Туг Агд С1п Суз 290 295 300

Уа1 8ег Рго Суз А1а Агд ТЬг Суз С1п 8ег Ьеи Шз 11е Азп С1и Ме1 305 310 315 320

Суз С1п С1и Агд Суз Уа1 Азр С1у Суз 8ег Суз Рго С1и С1у С1п Ьеи 325 330 335

Ьеи Азр С1и С1у Ьеи Суз Уа1 С1и 8ег ТЬг С1и Суз Рго Суз Уа1 Шз 340 345 350

8ег С1у Ьуз Агд Туг Рго Рго С1у ТЬг 8ег Ьеи 8ег Агд Азр Суз Азп 355 360 365

ТЬг Суз 11е Суз Агд Азп 8ег С1п Тгр 11е Суз 8ег Азп С1и С1и Суз 370 375 380

Рго С1у С1и Суз Ьеи Уа1 ТЬг С1у С1п 8ег Шз РЬе Ьуз 8ег РЬе Азр 385 390 395 400

Азп Агд Туг РЬе ТЬг РЬе 8ег С1у 11е Суз С1п Туг Ьеи Ьеи А1а Агд 405 410 415

Азр Суз С1п Азр Шз 8ег РЬе 8ег 11е Уа1 11е С1и ТЬг Уа1 С1п Суз 420 425 430

А1а Азр Азр Агд Азр А1а Уа1 Суз ТЬг Агд 8ег Уа1 ТЬг Уа1 Агд Ьеи 435 440 445

Рго С1у Ьеи Шз Азп 8ег Ьеи Уа1 Ьуз Ьеи Ьуз Шз С1у А1а С1у Уа1 450 455 460

А1а Ме1 Азр С1у С1п Азр 11е С1п Ьеи Рго Ьеи Ьеи Ьуз С1у Азр Ьеи 465 470 475 480

Агд 11е С1п Шз ТЬг Уа1 ТЬг А1а 8ег Уа1 Агд Ьеи 8ег Туг С1у С1и 485 490 495

- 245 028309

А8р Ьеи С1п Ме! А8р Тгр А8р С1у Агд С1у Агд Ьеи Ьеи Уа1 Ьу8 Ьеи 500 505 510

Зег Рго Уа1 Туг А1а С1у Ьу8 ТЬг Су8 С1у Ьеи Су8 С1у А8п Туг А8п 515 520 525

С1у А8п С1п С1у А8р А8р РЬе Ьеи ТЬг Рго Зег С1у Ьеи А1а С1и Рго 530 535 540

Агд Уа1 С1и А8р РЬе С1у А8п А1а Тгр Ьу8 Ьеи Н18 С1у А8р Су8 С1п 545 550 555 560

А8р Ьеи С1п Ьу8 С1п Н18 Зег А8р Рго Су8 А1а Ьеи А8п Рго Агд Ме! 565 570 575

ТЬг Агд РЬе Зег С1и С1и А1а Су8 А1а Уа1 Ьеи ТЬг Зег Рго ТЬг РЬе 580 585 590

С1и А1а Су8 Н18 Агд А1а Уа1 Зег Рго Ьеи Рго Туг Ьеи Агд А8п Су8 595 600 605

Агд Туг А8р Уа1 Су8 Зег Су8 Зег А8р С1у Агд С1и Су8 Ьеи Су8 С1у 610 615 620

А1а Ьеи А1а Зег Туг А1а А1а А1а Су8 А1а С1у Агд С1у Уа1 Агд Уа1 625 630 635 640

А1а Тгр Агд С1и Рго С1у Агд Су8 С1и Ьеи А8п Су8 Рго Ьу8 С1у С1п 645 650 655

Уа1 Туг Ьеи С1п Су8 С1у ТЬг Рго Су8 А8п Ьеи ТЬг Су8 Агд Зег Ьеи 660 665 670

Зег Туг Рго А8р С1и С1и Су8 А8п С1и А1а Су8 Ьеи С1и С1у Су8 РЬе 675 680 685

Су8 Рго Рго С1у Ьеи Туг Ме! А8р С1и Агд С1у А8р Су8 Уа1 Рго Ьу8 690 695 700

А1а С1п Су8 Рго Су8 Туг Туг А8р С1у С1и 11е РЬе С1п Рго С1и А8р 705 710 715 720

11е РЬе Зег А8р Н18 Н18 ТЬг Ме! Су8 Туг Су8 С1и А8р С1у РЬе Ме! 725 730 735

Н18 Су8 ТЬг Ме! Зег С1у Уа1 Рго С1у Зег Ьеи Ьеи Рго А8р А1а Уа1

- 246 028309

740 745 750

Рго Рго Ме1 ν;·ι1 Ьуз Ьеи νΗ1 Суз Рго А1а Азр Азп Ьеи Агд А1а О1и 770 775 780

О1у Ьеи О1и Суз ТЬг Ьуз ТЬг Суз С1п Азп Туг Азр Ьеи С1и Суз Ме1 785 790 795 800

Зег Ме1 С1у Суз Vа1 Зег С1у Суз Ьеи Суз Рго Рго С1у Ме1 Vа1 Агд 805 810 815

Шз С1и Азп Агд Суз Vаί А1а Ьеи С1и Агд Суз Рго Суз РЬе Шз С1п 820 825 8З0

С1у Ьуз С1и Туг А1а Рго С1у С1и ТЬг Vа1 Ьуз 11е С1у Суз Азп ТЬг 8З5 840 845

Суз Vа1 Суз Агд Азр Агд Ьуз Тгр Азп Суз ТЬг Азр Шз Vа1 Суз Азр 850 855 860

А1а ТЬг Суз Зег ТЬг 11е С1у Ме1 А1а Шз Туг Ьеи ТЬг РЬе Азр С1у 865 870 875 880

Ьеи Ьуз Туг Ьеи РЬе Рго С1у С1и Суз С1п Туг Vаί Ьеи Vаί С1п Азр 885 890 895

Туг Суз С1у Зег Азп Рго С1у ТЬг РЬе Агд 11е Ьеи Vаί С1у Азп Ьуз 900 905 910

С1у Суз Зег Шз Рго Зег Vа1 Ьуз Суз Ьуз Ьуз Агд Vа1 ТЬг 11е Ьеи 915 920 925

Vаί С1и С1у С1у С1и 11е С1и Ьеи РЬе Азр С1у С1и Vаί Азп Vаί Ьуз 9З0 9З5 940

Агд Рго Ме1 Ьуз Азр С1и ТЬг Шз РЬе С1и Vаί Vаί С1и Зег С1у Агд 945 950 955 960

Туг 11е 11е Ьеи Ьеи Ьеи С1у Ьуз А1а Ьеи Зег Vа1 Vа1 Тгр Азр Агд 965 970 975

Шз Ьеи Зег 11е Зег Vаί Vа1 Ьеи Ьуз С1п ТЬг Туг С1п С1и Ьуз Vаί 980 985 990

- 247 028309

Сув С1у Ьеи Сув С1у Авп РЬе Авр С1у 11е С1п Авп Авп Авр Ьеи ТЬг 995 1000 1005 δе^ δе^ Авп Ьеи С1п Уа1 С1и С1и Авр Рго Уа1 Авр РЬе С1у Авп 1010 1015 1020 δе^ Тгр Ьув Уа1 δе^ δе^ С1п Сув А1а Авр ТЬг Агд Ьув Уа1 Рго 1025 1030 1035

Ьеи Авр δе^ δе^ Рго А1а ТЬг Сув Шв Авп Авп 11е Ме! Ьув С1п 1040 1045 1050

ТЬг Ме! Уа1 Авр δе^ δе^ Сув Агд 11е Ьеи ТЬг δе^ Авр Уа1 РЬе 1055 1060 1065

С1п Авр Сув Авп Ьув Ьеи Уа1 Авр Рго С1и Рго Туг Ьеи Авр Уа1 1070 1075 1080

Сув 11е Туг Авр ТЬг Сув δе^ Сув С1и δе^ 11е С1у Авр Сув А1а 1085 1090 1095

А1а РЬе Сув Авр ТЬг 11е А1а А1а Туг А1а Шв Уа1 Сув А1а С1п 1100 1105 1110

Шв С1у Ьув Уа1 Уа1 ТЬг Тгр Агд ТЬг А1а ТЬг Ьеи Сув Рго С1п 1115 1120 1125 δе^ Сув С1и С1и Агд Авп Ьеи Агд С1и Авп С1у Туг С1и А1а С1и 1130 1135 1140

Тгр Агд Туг Авп δе^ Сув А1а Рго А1а Сув С1п Уа1 ТЬг Сув С1п 1145 1150 1155

Шв Рго С1и Рго Ьеи А1а Сув Рго Уа1 С1п Сув Уа1 С1и С1у Сув 1160 1165 1170

Шв А1а Шв Сув Рго Рго С1у Ьув 11е Ьеи Авр С1и Ьеи Ьеи С1п 1175 1180 1185

ТЬг Сув Уа1 Авр Рго С1и Авр Сув Рго Уа1 Сув С1и Уа1 А1а С1у 1190 1195 1200

Агд Агд РЬе А1а δе^ С1у Ьув Ьув Уа1 ТЬг Ьеи Авп Рго δе^ Авр 1205 1210 1215

Рго С1и Шв Сув С1п 11е Сув Шв Сув Авр Уа1 Уа1 Авп Ьеи ТЬг

- 248 028309

1220 1225 1230

Суз О1и А1а Суз О1и О1и Рго Пе Зег О1у О1у О1у О1у Зег О1у 1235 1240 1245

О1у О1у О1у Зег О1у О1у О1у О1у Зег О1у О1у О1у О1у Зег О1у 1250 1255 1260

О1у О1у О1у Зег О1у О1у О1у О1у Зег Ьеи Уа1 Рго Агд О1у Зег 1265 1270 1275

О1у О1у О1у О1у Зег О1у О1у О1у О1у Зег Азр Ьуз ТЬг Шз ТЬг 1280 1285 1290

Суз Рго Рго Суз Рго А1а Рго О1и Ьеи Ьеи О1у О1у Рго Зег Уа1 1295 1300 1305

РЬе Ьеи РЬе Рго Рго Ьуз Рго Ьуз Азр ТЬг Ьеи Ме! 11е Зег Агд 1310 1315 1320

ТЬг Рго О1и Уа1 ТЬг Суз Уа1 Уа1 Уа1 Азр Уа1 Зег Шз О1и Азр 1325 1330 1335

Рго О1и Уа1 Ьуз РЬе Ази Тгр Туг Уа1 Азр О1у Уа1 О1и Уа1 Шз 1340 1345 1350

Ази А1а Ьуз ТЬг Ьуз Рго Агд О1и О1и О1и Туг Ази Зег ТЬг Туг 1355 1360 1365

Агд Уа1 Уа1 Зег Уа1 Ьеи ТЬг Уа1 Ьеи Шз О1и Азр Тгр Ьеи Ази 1370 1375 1380

О1у Ьуз О1и Туг Ьуз Суз Ьуз Уа1 Зег Ази Ьуз А1а Ьеи Рго А1а 1385 1390 1395

Рго 11е О1и Ьуз ТЬг 11е Зег Ьуз А1а Ьуз О1у О1и Рго Агд О1и 1400 1405 1410

Рго О1и Уа1 Туг ТЬг Ьеи Рго Рго Зег Агд Азр О1и Ьеи ТЬг Ьуз 1415 1420 1425

Ази О1и Уа1 Зег Ьеи ТЬг Суз Ьеи Уа1 Ьуз О1у РЬе Туг Рго Зег 1430 1435 1440

Азр 11е А1а Уа1 О1и Тгр О1и Зег Ази О1у О1и Рго О1и Ази Ази 1445 1450 1455

- 249 028309

Туг Ьуз ТНг ТНг Рго Рго Уа1 Ьеи Азр Бег Азр О1у Бег РНе РНе 1460 1465 1470

Ьеи Туг Бег Ьуз Ьеи ТНг Уа1 Азр Ьуз Бег Агд Тгр О1п О1п О1у 1475 1480 1485

Азп Уа1 РНе Бег Суз Бег Уа1 Ме1 Шз О1и А1а Ьеи Шз Азп Шз 1490 1495 1500

Туг ТНг О1п Ьуз Бег Ьеи Бег Ьеи Бег Рго О1у Ьуз 1505 1510 1515 <210> 110 <211> 40 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> линкер <220>

<221> ПОВТОР <222> (1)..(5) <223> О1у-О1у-О1у-О1у-Бег повтор <400> 110

О1у О1у О1у С1у Бег С1у С1у О1у О1у Бег О1у О1у О1у О1у Бег С1у 1 5 10 15

О1у О1у О1у Бег С1у С1у С1у С1у Бег С1у О1у О1у О1у Бег С1у С1у 20 25 30

О1у О1у Бег С1у С1у С1у О1у Бег 35 40 <210> 111 <211> 62 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ЕБС54-ФВ в прямом направлении с сайтом Вз1\У1 <400> 111 сдсйсдсда сд1асддссд ссасса1да1 1сс1дссада Шдссдддд 1дс1дсйдс

1с 62 <210> 112 <211> 60 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность

- 250 028309 <220>

<223> ЕЗС 124 - Ό1Ό2 клонирующий олиго с сайтом ЫоХ1 кйе-в обратном направлении <400> 112 сХадасХсда дсддссдсХс ассйХХдсХ дсдаХдадас аддддасХдс Хдаддасадс 60 <210> 113 <211> 2289 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ФВ 053 (Э1Э2-пропептид ФВ) <400> 113 аХдаХХссХд ссадаХХХдс сддддХдсХд сХХдсХсХдд сссХсаХХХХ дссадддасс 60 сХйдХдсад ааддаасХсд сддсаддХса Хссасддссс даХдсадссХ ХйсддаадХ 120 дасХХсдХса асассХХХда ХдддадсаХд ХасадсХХХд сдддаХасХд садйассХс 180 сХддсадддд дсХдссадаа асдсХссХХс ХсдаХХаХХд дддасХХсса дааХддсаад 240 ададХдадсс ХсХссдХдХа ХсХХддддаа ХХййдаса ХссаХХХдХХ ХдХсааХддХ 300 ассдХдасас адддддасса аададХсХсс аХдсссХаХд ссХссааадд дсХдХаХсХа 360 дааасХдадд сХдддХасХа саадсХдХсс ддХдаддссХ аХддсХХХдХ ддссаддаХс 420 даХддсадсд дсаасХХХса адХссХдсХд ХсадасадаХ асХХсаасаа дассХдсддд 480 сХдХдХддса асХХХаасаХ сХХХдсХдаа даХдасХХХа Хдасссаада адддассХХд 540 ассХсддасс сХХаХдасХХ ХдссаасХса ХдддсХсХда дсадХддада асадХддХдХ 600 даасдддсаХ сХссХсссад садсХсаХдс аасаХсХссХ сХддддаааХ дсадаадддс 660 сХдХдддадс адХдссадсХ ХсХдаададс ассХсддХдХ ХХдсссдсХд ссасссХсХд 720 дХддассссд адссййдХ ддсссХдХдХ дадаадасХХ ХдХдХдадХд ХдсХдддддд 780 сХддадХдсд ссХдсссХдс ссХссХддад Хасдсссдда ссХдХдссса ддадддааХд 840 дХдсХдХасд дсХддассда ссасадсдсд Хдсадсссад ХдХдсссХдс ХддХаХддад 900

ХаХаддсадХ дХдХдХсссс ХХдсдссадд ассХдссада дссХдсасаХ сааХдаааХд 960

ХдХсаддадс даХдсдХдда ХддсХдсадс ХдсссХдадд дасадсХссХ ддаХдааддс 1020 сХсХдсдХдд ададсассда дХдХсссХдс дХдсаХХссд дааадсдсХа сссХсссддс 1080 ассХсссХсХ сХсдадасХд саасассХдс аХХХдссдаа асадссадХд даХсХдсадс 1140 ааХдаадааХ дХссадддда дХдссХХдХс асХддХсааХ сссасХХсаа дадсйХдас 1200 аасадаХасХ ХсассХХсад ХдддаХсХдс садХассХдс Хддсссддда йдссаддас 1260 сасХссйсХ ссаХХдХсаХ ХдадасХдХс садХдХдсХд аХдассдсда сдсХдХдХдс 1320 асссдсХссд ХсассдХссд дсХдссХддс сХдсасааса дссХХдХдаа асХдаадсаХ 1380

- 251 028309 ддддсаддад Идсса!дда !ддссаддас а!ссадс!сс ссс!сс!даа адд!дасс!с 1440 сдса!ссадс а!асад!дас ддсс!ссд!д сдсс!садс! асддддадда сс!дсада!д 1500 дас!ддда!д дссдсдддад дс!дс!дд!д аадс!д!ссс ссд!с!а!дс сдддаадасс 1560 !дсддсс!д! д!дддаа!!а саа!ддсаас садддсдасд ас!!сс!!ас сссс!с!ддд 1620 с!ддсддадс сссддд!дда ддасйсддд аасдсс!дда адс!дсасдд ддас!дссад 1680 дасс!дсада адсадсасад сда!ссс!дс дссс!саасс сдсдса!дас садд!!с!сс 1740 даддаддсд! дсдсдд!сс! дасд!ссссс аса!!сдадд сс!дсса!сд !дссд!садс 1800 ссдс!дссс! асс!дсддаа с!дссдс!ас дасд!д!дс! сс!дс!сдда сддссдсдад 1860 !дсс!д!дсд дсдссс!ддс садс!а!дсс дсддсс!дсд сддддададд сд!дсдсд!с 1920 дсд!ддсдсд адссаддссд с!д!дадс!д аас!дсссда ааддссадд! д!асс!дсад 1980 !дсдддассс сс!дсаасс! дасс!дссдс !с!с!с!с!! асссдда!да ддаа!дсаа! 2040 даддсс!дсс !ддадддс!д с!!с!дсссс ссадддс!с! аса!дда!да даддддддас 2100 !дсд!дссса аддсссад!д сссс!д!!ас !а!дасдд!д ада!с!!сса дссадаадас 2160 а!с!!с!сад асса!сасас са!д!дс!ас !д!дадда!д дс!!са!дса с!д!асса!д 2220 ад!ддад!сс ссддаадс!! дс!дсс!дас дс!д!сс!са дсад!сссс! д!с!са!сдс 2280 адсаааадд 2289 <210> 114 <211> 763 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ФВ 053 (рт2-пропептид ФВ) <400> 114

Ме! 11е Рго А1а Агд РЬе А1а С1у Уа1 Ьеи Ьеи А1а Ьеи А1а Ьеи 11е 1 5 10 15

8ег Ме! Туг 8ег РЬе А1а С1у Туг Сук 8ег Туг Ьеи Ьеи А1а С1у С1у 50 55 60

- 252 028309

Агд Уа1 Зег Ьеи Зег Уа1 Туг Ьеи С1у С1и РЬе РЬе Акр 11е Нк Ьеи 85 90 95

РЬе Уа1 Акп С1у ТЬг Уа1 ТЬг С1п С1у Акр С1п Агд Уа1 Зег Ме1 Рго 100 105 110

Туг А1а Зег Ьук С1у Ьеи Туг Ьеи С1и ТЬг С1и А1а С1у Туг Туг Ьук 115 120 125

Ьеи Зег С1у С1и А1а Туг С1у РЬе Уа1 А1а Агд 11е Акр С1у Зег С1у 130 135 140

Акп РЬе С1п Уа1 Ьеи Ьеи Зег Акр Агд Туг РЬе Акп Ьук ТЬг Сук С1у 145 150 155 160

С1и С1у ТЬг Ьеи ТЬг Зег Акр Рго Туг Акр РЬе А1а Акп Зег Тгр А1а 180 185 190

Ьеи Зег Зег С1у С1и С1п Тгр Сук С1и Агд А1а Зег Рго Рго Зег Зег 195 200 205

Зег Сук Акп 11е Зег Зег С1у С1и Ме1 С1п Ьук С1у Ьеи Тгр С1и С1п 210 215 220

Сук С1п Ьеи Ьеи Ьук Зег ТЬг Зег Уа1 РЬе А1а Агд Сук Нк Рго Ьеи 225 230 235 240

Уа1 Акр Рго С1и Рго РЬе Уа1 А1а Ьеи Сук С1и Ьук ТЬг Ьеи Сук С1и 245 250 255

Агд ТЬг Сук А1а С1п С1и С1у Ме1 Уа1 Ьеи Туг С1у Тгр ТЬг Акр Нк 275 280 285

Зег А1а Сук Зег Рго Уа1 Сук Рго А1а С1у Ме1 С1и Туг Агд С1п Сук 290 295 300

Уа1 Зег Рго Сук А1а Агд ТЬг Сук С1п Зег Ьеи Нк 11е Акп С1и Ме1 305 310 315 320

- 253 028309

Ьеи Акр С1и С1у Ьеи Сук Уа1 С1и 8ег ТЬг С1и Сук Рго Сук Уа1 Шк 340 345 350

8ег С1у Ьук Агд Туг Рго Рго С1у ТЬг 8ег Ьеи 8ег Агд Акр Сук Акп 355 360 365

ТЬг Сук 11е Сук Агд Акп 8ег С1п Тгр 11е Сук 8ег Акп С1и С1и Сук 370 375 380

Рго С1у С1и Сук Ьеи Уа1 ТЬг С1у С1п 8ег Шк РЬе Ьук 8ег РЬе Акр 385 390 395 400

Акр Сук С1п Акр Шк 8ег РЬе 8ег 11е Уа1 11е С1и ТЬг Уа1 С1п Сук 420 425 430

А1а МеГ Акр С1у С1п Акр 11е С1п Ьеи Рго Ьеи Ьеи Ьук С1у Акр Ьеи 465 470 475 480

Акр Ьеи С1п МеГ Акр Тгр Акр С1у Агд С1у Агд Ьеи Ьеи Уа1 Ьук Ьеи 500 505 510

Акр Ьеи С1п Ьук С1п Шк 8ег Акр Рго Сук А1а Ьеи Акп Рго Агд МеГ 565 570 575

- 254 028309

ТЬг Агд РЬе Зег С1и С1и А1а Сук А1а ν;·ι1 Ьеи ТЬг Зег Рго ТЬг РЬе 580 585 590

С1и А1а Сук Шк Агд А1а Vа1 Зег Рго Ьеи Рго Туг Ьеи Агд Акп Сук 595 600 605

Агд Туг Акр ν;·ι1 Сук Зег Сук Зег Акр С1у Агд С1и Сук Ьеи Сук С1у 610 615 620

А1а Ьеи А1а Зег Туг А1а А1а А1а Сук А1а С1у Агд С1у Vа1 Агд ν;·ι1 625 630 635 640

А1а Тгр Агд С1и Рго С1у Агд Сук С1и Ьеи Акп Сук Рго Ьук С1у С1п 645 650 655 ν;·ι1 Туг Ьеи С1п Сук С1у ТЬг Рго Сук Акп Ьеи ТЬг Сук Агд Зег Ьеи 660 665 670

Зег Туг Рго Акр С1и С1и Сук Акп С1и А1а Сук Ьеи С1и С1у Сук РЬе 675 680 685

Сук Рго Рго С1у Ьеи Туг Ме! Акр С1и Агд С1у Акр Сук Vа1 Рго Ьук 690 695 700

11е РЬе Зег Акр Шк Шк ТЬг Ме! Сук Туг Сук С1и Акр С1у РЬе Ме! 725 730 735

Шк Сук ТЬг Ме! Зег С1у ν;·ι1 Рго С1у Зег Ьеи Ьеи Рго Акр А1а ν;·ι1 740 745 750

Ьеи Зег Зег Рго Ьеи Зег Шк Агд Зег Ьук Агд 755 760

Claims

1. Химерный белок, содержащий белок фактора VIII (Ф-νΐΙΙ) и фрагмент фактора Виллебранда (ФВ), которые связаны ковалентной связью, при этом указанный фрагмент ФВ содержит домен Ό' и домен Ό3 ФВ и связывается с белком Ф-νΐΙΙ.

2. Химерный белок по п.1, отличающийся тем, что указанный домен Ό' содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентичную аминокислотам 764-866 из ЗЕЦ ГО N0: 2, и/или указанный домен Ό3 содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотам 867-1240 из З1У) ГО N0: 2.

- 255 028309

3. Химерный белок по любому из пп.1, 2, отличающийся тем, что указанный белок Ф-УШ содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентичную δΕΟ ΙΌ N0: 18, при этом указанный белок Ф-УШ обладает активностью Ф-УШ.

4. Химерный белок по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что указанный белок Ф-УШ содержит тяжелую цепь фактора УШ и легкую цепь фактора УШ, при этом указанная тяжелая цепь фактора УШ содержит аминокислоты 1-740 δΕΟ ΙΌ N0: 16 и указанная легкая цепь фактора УШ содержит аминокислоты 1649-2332.

5. Химерный белок по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что ковалентная связь предотвращает диссоциацию фрагмента ФВ от белка Ф-УШ в присутствии эндогенного ФВ.

6. Химерный белок по любому из пп.1-5, отличающийся тем, что указанный фрагмент ФВ предотвращает выведение белка Ф-УШ в процессе выведения ФВ или указанный фрагмент ФВ подавляет или предотвращает связывание эндогенного ФВ с белком Ф-УШ, экранируя или блокируя ФВ-связывающий участок на белке Ф-УШ.

7. Химерный белок по п.6, отличающийся тем, что ФВ-связывающий участок является аминокислотной последовательностью, соответствующей аминокислотам 1669-1689 и 2303-2332 из δΕΟ ΙΌ N0: 16.

8. Химерный белок по любому из пп.1-7, отличающийся тем, что время полужизни белка Ф-УШ продлевается за пределы ограничения времени полужизни белка Ф-УШ в присутствии эндогенного ФВ.

9. Химерный белок по любому из пп.1-8, отличающийся тем, что фрагмент ФВ содержит по меньшей мере один гетерологичный компонент (Н1) и необязательный линкер между фрагментом ФВ и указанным гетерологичным компонентом (Н1).

10. Химерный белок по п.9, отличающийся тем, что гетерологичный компонент (Н1) содержит константную область иммуноглобулина или ее часть, альбумин или его фрагмент, связывающее альбумин вещество, последовательность ΡАδ, последовательность НАР, трансферрин или его фрагмент, полиэтиленгликоль (ПЭГ), полисиаловую кислоту, гидроксиэтиловый крахмал (ГЭК), их производные или любые комбинации этих компонентов.

11. Химерный белок по п.10, отличающийся тем, что указанный гетерологичный компонент (Н1) содержит первую Рс-область.

12. Химерный белок по п.9, отличающийся тем, что химерный белок содержит линкер между фрагментом ФВ и гетерологичным компонентом (Н1), который является отщепляемым линкером.

13. Химерный белок по любому из пп.1-12, отличающийся тем, что белок Ф-УШ дополнительно содержит по меньшей мере один гетерологичный компонент (Н2).

14. Химерный белок по п.13, отличающийся тем, что гетерологичный компонент (Н2) способен продлевать время полужизни белка Ф-УШ.

15. Химерный белок по п.13 или 14, отличающийся тем, что указанный гетерологичный компонент (Н2) содержит константную область иммуноглобулина или ее часть, альбумин или его фрагмент, полиэтиленгликоль (ПЭГ), полисиаловую кислоту, гидроксиэтиловый крахмал (ГЭК), его производное, связывающее альбумин вещество, последовательность ΡАδ, последовательность НАР, трансферрин или его фрагмент или любые комбинации этих компонентов.

16. Химерный белок по п.13, отличающийся тем, что указанный гетерологичный компонент (Н2) содержит вторую Рс-область.

17. Химерный белок по любому из пп.1-16, который содержит первый полипептид, содержащий фрагмент ФВ, первый гетерологичный компонент и линкер, и второй полипептид, содержащий белок ФУШ и второй гетерологичный компонент, при этом первый полипептид и второй полипептид связаны друг с другом ковалентной связью.

18. Химерный белок по п.17, отличающийся тем, что указанные первый гетерологичный компонент и второй гетерологичный компонент связаны друг с другом ковалентной связью, при этом ковалентная связь препятствует замещению фрагмента ФВ в первом полипептиде эндогенным ФВ ш νί\Ό.

19. Химерный белок по любому из пп.13-18, отличающийся тем, что линкер между белком Ф-УШ и вторым гетерологичным компонентом является отщепляемым линкером.

20. Химерный белок по любому из пп.1-19, содержащий формулу, выбранную из:

(a) У-Ь1-Н1-Ь3-С-Ь2-Н2, (b) Н2-Ь2-С-Ь3-Н1-Ь1-У, (c) С-Ь2-Н2-Ь3-У-Ь1-Н1, (й) Н1-Ы-У-Ь3-Н2-Ь2-С, (е) Н1-Ь1-У-Ь3-С-Ь2-Н2, (£) Н2-Ь2-С-Ь3-У-Ь1-Н1, (д) У-Ы-Н1-Ь3-Н2-Ь2-С, (Ь) С-Ь2-Н2-Ь3-Н1-Ь1-У, (ί) Н2-Ь3-Н1-Ы-У-Ь2-С,

(]) С-Ь2-У-Ь1-Н1-Ь3-Н2,

- 256 028309 (k) V-^2-С-^1-Η1-^3-Η2 и (l) Н2-ЬЗ-Ш-Ы-С-Ь2Ш, где ν содержит указанный фрагмент ФВ, содержащий домен Ό' и домен ОЗ ФВ;

Ь1 является необязательным линкером;

Ь2 является необязательным линкером;

ЬЗ в (а)-(£) является необязательным линкером,

ЬЗ в (д)-(1) является необязательным зсРс линкером, каждый из Н1 или Н2 содержит необязательный гетерологичный компонент;

С содержит указанный белок Ф-νΊΙΙ;

(-) представляет пептидную связь либо одну или более аминокислот.

21. Химерный белок по любому из пп.1-19, содержащий формулу, выбранную из:

(т) ^Ь1-Н1:Н2-Ь2-С, (п) У-Ь1-Н1:С-Ь2-Н2;

(о) Ш-Ь1Ш:Н2-Ь2-С;

(р) Ш-Ь1Ш:С-Ь2-Н2;

(Я) ^С-Ь1-Н1:Н2;

(г) УН1-Ь1-С:Н2;

(з) Н2:Н1-Ь1-С:Ч (!) С:У-Ь1-Н1:Н2 и (и) С:Н1-Ь1Ш:Н2, где ν является указанным фрагментом ФВ, содержащим домен Ό' и домен ОЗ ФВ;

Ь1 является необязательным линкером;

Ь2 является необязательным линкером;

Н2 является вторым гетерологичным компонентом;

С является указанным белком Ф-νΊΙΙ;

(:) представляет ковалентную связь между Н1 и Н2.

22. Химерный белок по любому из пп.20-22, отличающийся тем, что Н1 содержит первую Рсобласть, Н2 содержит вторую Рс-область или Н1 содержит первую Рс-область и Н2 содержит вторую Рсобласть.

23. Химерный белок по любому из пп.1-22, отличающийся тем, что белок Ф-νΊΙΙ содержит третий гетерологичный компонент (НЗ), четвертый гетерологичный компонент (Н4), пятый гетерологичный компонент (Н5) или шестой гетерологичный компонент (Н6).

24. Химерный белок по пп.1-2З, который дополнительно содержит линкер между белком Ф-νΙΙΙ и указанным фрагментом ФВ.

25. Химерный белок по п.24, отличающийся тем, что линкер представляет собой распознающий сортазу мотив.

26. Химерный белок по любому из пп.1-25, отличающийся тем, что указанный фрагмент ФВ, по существу, состоит из домена Ό' и домена ОЗ ФВ.

27. Химерный белок по любому из пп.1-26, отличающийся тем, что указанный фрагмент ФВ содержит по меньшей мере одну аминокислотную замену в остатке, соответствующем остатку 1099, остатку 1142 либо обоим остаткам 1099 и 1142 из ЗЕО ГО N0: 2.

28. Химерный белок по любому из пп.1-27, отличающийся тем, что последовательность указанного фрагмента ФВ содержит аминокислоты 764-1240 из ЗЕО ГО N0: 2.

29. Химерный белок по любому из пп.1-28, отличающийся тем, что указанный фрагмент ФВ дополнительно содержит домен Ό1, домен Ό2 или домены Ό1 и Ό2 ФВ.

30. Химерный белок по любому из пп.1-29, отличающийся тем, что белок Ф-νΙΙΙ содержит домен В или его часть.

31. Химерный белок по любому из пп.1-З0, отличающийся тем, что белок Ф-νΙΙΙ содержит одноцепочечный Ф-νΙΙΙ или Ф-νΙΙΙ с двумя цепями.

32. Химерный белок по любому из пп.1-З1, отличающийся тем, что химерный белок не содержит фактор, ограничивающий время полужизни белка Ф-νΙΙΙ.

33. Полинуклеотид или набор полинуклеотидов, которые кодируют химерный белок по любому из пп.1-З2.

34. Вектор или набор векторов, которые содержат полинуклеотид или набор полинуклеотидов по п.ЗЗ и один или более промоторов, функционально связанных с полинуклеотидом или набором полинуклеотидов.

35. Клетка-хозяин, содержащая полинуклеотид или набор полинуклеотидов по п.З9 или вектор или набор векторов по п.З4.

36. Клетка-хозяин по п.З5, которая является клеткой млекопитающего.

37. Клетка-хозяин по п.З6, отличающаяся тем, что клетка млекопитающего выбрана из группы, со- 257 028309 стоящей из клетки НЕК293, клетки СНО и клетки ВНК.

38. Фармацевтический состав, содержащий химерный белок по любому из пп.1-32 и фармацевтически приемлемый носитель.

39. Фармацевтический состав, содержащий полинуклеотид или набор полинуклеотидов по п.33 и фармацевтически приемлемый носитель.

40. Способ предотвращения или подавления взаимодействия белка Ф-УШ с эндогенным ФВ, включающий введение нуждающемуся в этом пациенту эффективного количества химерного белка по любому из пп.1-32, при этом указанный фрагмент ФВ предотвращает или подавляет взаимодействие белка ФУШ с эндогенным ФВ.

41. Способ предотвращения или подавления взаимодействия белка Ф-УШ с эндогенным ФВ, включающий введение нуждающемуся в этом пациенту эффективного количества полинуклеотида или набора полинуклеотидов по п.33, при этом указанный фрагмент ФВ предотвращает или подавляет взаимодействие белка Ф-УШ с эндогенным ФВ.

42. Способ устранения или снижения фактора, ограничивающего время полужизни белка Ф-УШ, при этом данный способ включает введение эффективного количества химерного белка по любому из пп.1-32, при этом указанный химерный белок предотвращает или подавляет взаимодействие белка ФУШ с эндогенным ФВ.

43. Способ устранения или снижения фактора, ограничивающего время полужизни белка Ф-УШ, при этом указанный способ включает введение эффективного количества полинуклеотида или набора полинуклеотидов по п.33, при этом указанный химерный белок, кодируемый полинуклеотидом, предотвращает или подавляет взаимодействие белка Ф-УШ с эндогенным ФВ.

44. Способ продления или увеличения времени полужизни белка Ф-УШ, при этом указанный способ включает введение эффективного количества химерного белка по любому из пп.1-32, при этом фрагмент ФВ химерного белка предотвращает или подавляет взаимодействие белка Ф-УШ с эндогенным ФВ.

45. Способ продления или увеличения времени полужизни белка Ф-УШ, при этом указанный способ включает введение эффективного количества полинуклеотида или набора полинуклеотидов по п.33, при этом фрагмент ФВ химерного белка предотвращает или подавляет взаимодействие белка Ф-УШ с эндогенным ФВ.

46. Способ лечения заболевания или болезненного состояния, связанного с кровотечением, у нуждающегося в этом пациента, включающий введение эффективного количества химерного белка по любому из пп.1-32, при этом указанное заболевание или болезненное состояние, связанное с кровотечением, выбрано из группы, состоящей из нарушения свертываемости крови, гемартроза, мышечного кровотечения, кровотечения в полости рта, кровоизлияния, кровоизлияния в мышцы, кровоизлияния в полость рта, травмы, травмы головы, желудочно-кишечного кровотечения, внутричерепного кровоизлияния, кровоизлияния в брюшную полость, внутригрудного кровоизлияния, перелома кости, кровотечения в центральной нервной системе, кровотечения в заглоточном пространстве, кровотечения в забрюшинном пространстве, кровотечения во влагалище подвздошно-поясничной мышцы и любых их комбинаций.

47. Способ лечения заболевания или болезненного состояния, связанного с кровотечением, у нуждающегося в этом пациента, включающий введение эффективного количества полинуклеотида или набора полинуклеотидов по п.33, при этом указанное заболевание или болезненное состояние, связанное с кровотечением, выбрано из группы, состоящей из нарушения свертываемости крови, гемартроза, мышечного кровотечения, кровотечения в полости рта, кровоизлияния, кровоизлияния в мышцы, кровоизлияния в полость рта, травмы, травмы головы, желудочно-кишечного кровотечения, внутричерепного кровоизлияния, кровоизлияния в брюшную полость, внутригрудного кровоизлияния, перелома костей, кровотечения в центральной нервной системе, кровотечения в заглоточном пространстве, кровотечения в забрюшинном пространстве, кровотечения во влагалище подвздошно-поясничной мышцы и любых их комбинаций.

48. Способ получения химерного белка, включающий трансфекцию одной или более клеток-хозяев полинуклеотидом или набором нуклеотидов по п.33 или вектором или набором векторов по п.34 и экспрессию фрагмента ФВ или химерного белка в клетке-хозяине.

49. Способ конструирования химерного белка по любому из пп.1-32, включающий лигирование фрагмента ВФ с белком Ф-УШ ковалентной связью в присутствии фермента сортазы.