ES2753124T3

ES2753124T3 - Polipéptidos quiméricos de factor VIII y usos de los mismos

Info

Publication number: ES2753124T3
Application number: ES13735649T
Authority: ES
Inventors: Ekta Chhabra; Tongyao Liu; Robert Peters; Haiyan Jiang
Original assignee: Bioverativ Therapeutics Inc
Current assignee: Bioverativ Therapeutics Inc
Priority date: 2012-01-12
Filing date: 2013-01-12
Publication date: 2020-04-07
Anticipated expiration: 2033-01-12
Also published as: US20230011438A1; AU2016202875A1; LT2804623T; BR112014017165A8; JP2022159331A; SI2804623T1; IL261632B; MX2014008512A; CN109111526A; AU2016202875B2; IL233463A0; TWI727187B; CA2863328A1; TW201348253A; JP7475613B2; PH12014501602A1; AU2013205647A1; JP2015504679A; TWI826778B; TW201839011A

Abstract

Una proteína quimérica que comprende una proteína factor VIII ("FVIII") y un fragmento de factor de von Willebrand (VWF), en donde la proteína FVIII comprende un dominio A1, un dominio A2, un dominio A3, un dominio C1 y un dominio C2; en donde el fragmento de VWF comprende un dominio D' y un dominio D3 de VWF; y en donde el fragmento de VWF y la proteína FVIII se unen por un enlace covalente, que previene la disociación del fragmento de VWF de la proteína FVIII en presencia de VWF endógeno, en donde el fragmento de VWF inhibe o previene que VWF endógeno se una a la proteína FVIII por protección o bloqueo de un sitio de unión de VWF sobre la proteína FVIII.

Description

DESCRIPCIÓN

Polipéptidos quiméricos de factor VIII y usos de los mismos

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La coagulación es un proceso complejo por el que la sangre forma coágulos. Es una parte importante de la hemostasia, el cese de la pérdida de sangre de un vaso dañado, en donde la pared de un vaso sanguíneo dañado se cubre por un coágulo que contiene plaquetas y fibrina para detener el sangrado y empezar a reparar el vaso dañado. Los trastornos de la coagulación pueden conducir a un riesgo elevado de sangrado (hemorragia) o coagulación obstructiva (trombosis).

La coagulación empieza casi instantemente después de que una lesión al vaso sanguíneo haya dañado el revestimiento de endotelio del vaso. La exposición de la sangre a proteínas tales como factor tisular inicia cambios en las plaquetas sanguíneas y el fibrinógeno de la proteína plasmática, un factor de coagulación. Las plaquetas forman inmediatamente un tapón en el sitio de lesión; esto se denomina hemostasia primaria. La hemostasia secundaria ocurre simultáneamente: Las proteínas en el plasma sanguíneo, denominadas factores de coagulación, responden en una compleja cascada para formar cadenas de fibrina, que refuerzan el tapón de plaquetas. Los factores de la coagulación no limitantes incluyen, pero no se limitan a, factor I (fibrinógeno), factor II (protrombina), factor tisular, factor V (proacelerina, factor lábil), factor VII (factor estable, proconvertina), factor VIII (factor antihemofílico A), factor IX (factor anti-hemofílico B o factor de Christmas), factor X (factor de Stuart-Prower), factor XI (antecedente de la tromboplastina plasmática), factor XII (factor Hageman), factor XIII (factor estabilizador de la fibrina), VWF, precalicreína (factor de Fletcher), cininógeno de alto peso molecular (HMWK) (factor de Fitzgerald), fibronectina, antitrombina III, cofactor II de heparina, proteína C, proteína S, proteína Z, plasminógeno, alfa 2-antiplasmina, activador tisular del plasminógeno (tPA), urocinasa, inhibidor 1 del activador del plasminógeno (PAI1) e inhibidor 2 del activador del plasminógeno (PAI2).

La hemofilia A es un trastorno hemorrágico provocado por defectos en el gen que codifica el factor de coagulación VIII (FVIII) y afecta a 1-2 en 10.000 varones nacidos. Graw et al., Nat. Rev. Genet. 6(6): 488-501 (2005). Los pacientes afectados con hemofilia A se pueden tratar con infusión de FVIII purificado o recombinantemente producido. Todos los productos de FVIII comercialmente disponibles, sin embargo, son conocidos por tener una semivida de aproximadamente 8-12 horas, que requiere la frecuente administración intravenosa a los pacientes. Véase Weiner M.A. and Cairo, M.S., Pediatric Hematology Secrets, Lee, M.T., 12. Disorders of Coagulation, Elsevier Health Sciences, 2001; Lillicrap, D. Thromb. Res. 122 Supl 4:S2-8 (2008). Además, varios enfoques han intentado prolongar la semivida de FVIII. Por ejemplo, los enfoques en el desarrollo para prolongar la semivida de los factores de coagulación incluyen pegilación, glucopegilación, y conjugación con albúmina. Véase Dumont et al., Blood.

119(13): 3024-3030 (publicado en línea el 13 de enero de 2012). Independientemente de la ingeniería de proteínas usada, sin embargo, los productos de FVIII de acción prolongada actualmente en desarrollo tienen semividas mejoradas, pero se informa que las semividas están limitadas - solo a aproximadamente 1,5 a 2 veces de mejora en modelos animales preclínicos. Véase ídem. Se han demostrado resultados coherentes en seres humanos, por ejemplo, se informó que rFVIIIFc mejoraba la semivida hasta ~1,7 veces en comparación con ADVATE® en paciente con hemofilia A. Véase ídem. Por tanto, los aumentos en la semivida, a pesar de mejoras menores, pueden indicar la presencia de otros factores limitantes de T1/2. Véase Liu, T. et al., reunión de ISTH de 2007, resumen N° P-M-035; Henrik, A. et al., reunión de ISTH de 2011, resumen N° P=MO-181; Liu, T. et al., reunión de iSt H de 2011, resumen N2 P-WE-131.

El factor von Willebrand plasmático (VWF) tiene una semivida de aproximadamente 12 horas (que varía desde 9 hasta 15 horas). http://www.nhlbi.nih.gov/guidelines/vwd/2_scientificoverview.htm (visitado por última vez el 22 de octubre de 2011). La semivida de VWF se puede afectar por varios factores: patrón de glucosilación, ADAMTS-13 (una desintegrina y metaloproteasa con motivo-13 de trombospondina), y diversas mutaciones en VWF.

En plasma, el 95-98 % de FVIII circula en un estrecho complejo no covalente con VWF de longitud completa. La formación de este complejo es importante para el mantenimiento de niveles apropiados en plasma de FVIII in vivo. Lenting et al., Blood. 92(11): 3983-96 (1998); Lenting et al., J. Thromb. Haemost. 5(7): 1353-60 (2007). El FVIII no mutante de longitud completa está principalmente presente como un heterodímero que tiene una cadena pesada (MW 200 kd) y una cadena ligera (MW 73 kd). Cuando FVIII se activa debido a la proteólisis en las posiciones 372 y 740 en la cadena pesada y en la posición 1689 en la cadena ligera, se retira el VWF unido a FVIII de FVIII activado. El FVIII activado, junto con el factor IX activado, calcio y fosfolípido ("complejo de tenasa"), implica la activación de factor X, generando grandes cantidades de trombina. La trombina, a su vez, escinde entonces el fibrinógeno para formar monómeros de fibrina solubles, que entonces se polimerizan espontáneamente para formar el polímero soluble de fibrina. La trombina también activa el factor XIII que, junto con el calcio, sirve para reticular y estabilizar el polímero soluble de fibrina, que forma fibrina reticulada (insoluble). El FVIII activado se elimina rápidamente de la circulación por proteólisis.

Debido a la frecuente dosificación y molestia provocada por el programa de dosificación, todavía existe la necesidad de desarrollar productos de FVIII que requieran administración menos frecuente, es decir, un producto de FVIII que tenga una semivida más larga que la limitación de semivida de 1,5 a 2 veces.

BREVE SUMARIO DE LA INVENCIÓN

Basándose en la divulgación que está contenida en el presente documento, la presente invención proporciona una proteína quimérica que comprende una proteína de factor VIII ("FVIII") y un fragmento de factor de von Willebrand (VWF),

en donde la proteína FVIII comprende un dominio A1, un dominio A2, un dominio A3, un dominio C1, y un dominio C2;

en donde el fragmento de VWF comprende un dominio D' y un dominio D3 de VWF; y

en donde el fragmento de VWF y la proteína FVIII están unidos por un enlace covalente, que previene la disociación del fragmento de VWF de la proteína FVIII en presencia de VWF endógeno,

en donde el fragmento de VWF inhibe o previene que VWF endógeno se una a la proteína FVIII por protección o bloqueo de un sitio de unión de VWF sobre la proteína FVIII.

En un aspecto relacionado, la presente invención proporciona un polinucleótido o un conjunto de polinucleótidos que codifica la proteína quimérica de la invención.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una célula hospedadora que comprende el polinucleótido o el conjunto de polinucleótidos de la invención.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende la proteína quimérica de la invención, el polinucleótido o el conjunto de polinucleótidos de la invención, o la célula hospedadora la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En otro aspecto, la presente invención proporciona la proteína quimérica de la invención, el polinucleótido o el conjunto de polinucleótidos de la invención, la célula hospedadora de la invención, o la composición de la invención para su uso en el tratamiento de una enfermedad o afección hemorrágica en un sujeto en necesidad del mismo, en donde la enfermedad hemorrágica o trastorno se selecciona del grupo que consiste en un trastorno hemorrágico de la coagulación, hemartrosis, sangrado muscular, sangrado bucal, hemorragia, hemorragia dentro de los músculos, hemorragia bucal, traumatismo, traumatismo craneal, sangrado gastrointestinal, hemorragia intracraneal, hemorragia intraabdominal, hemorragia intratorácica, fractura de huesos, sangrado del sistema nervioso central, sangrado en el espacio retrofaríngeo, sangrado en el espacio retroperitoneal, sangrado en la vaina del iliopsoas, y cualquier combinación de los mismos.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método de preparación de la proteína quimérica de la invención, que comprende transfectar una o más células hospedadoras con el polinucleótido o el conjunto de polinucleótidos de la invención, y expresar la proteína quimérica en la célula hospedadora.

La presente invención y las realizaciones de la misma se explican en las reivindicaciones adjuntas

En ciertas realizaciones, el fragmento de VWF se asocia con la proteína FVIII por un enlace no covalente, además del enlace covalente entre la proteína FVIII y el resto auxiliar (fragmento de VWF). En un ejemplo, el fragmento de VWF es un monómero. En otro ejemplo, el fragmento de VWF comprende dos, tres, cuatro, cinco o seis fragmentos de VWF unidos a uno o más entre sí.

En un aspecto, la proteína quimérica comprende el fragmento de VWF, y al menos un resto heterólogo (H1) y un conector opcional entre el fragmento de VWF y el resto heterólogo (H1). En una realización, el resto heterólogo (H1) puede comprender un resto que prolonga la semivida de la proteína FVIII, por ejemplo, un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en una región constante de inmunoglobulina o una porción de la misma, albúmina o un fragmento de la misma, un resto de unión a albúmina, una secuencia de PAS, una secuencia de HAP, transferrina o un fragmento de la misma, y cualquier combinación de los mismos o un resto no de polipéptido seleccionado del grupo que consiste en polietilenglicol (PEG), ácido polisiálico, hidroxietilalmidón (HES), un derivado de los mismos, y cualquier combinación de los mismos. En una realización, el resto heterólogo (H1) comprende una primera región Fc. En otra realización, el resto heterólogo (H1) comprende una secuencia de aminoácidos que comprende al menos aproximadamente 50 aminoácidos, al menos aproximadamente 100 aminoácidos, al menos aproximadamente 150 aminoácidos, al menos aproximadamente 200 aminoácidos, al menos aproximadamente 250 aminoácidos, al menos aproximadamente 300 aminoácidos, al menos aproximadamente 350 aminoácidos, al menos aproximadamente 400 aminoácidos, al menos aproximadamente 450 aminoácidos, al menos aproximadamente 500 aminoácidos, al menos aproximadamente 550 aminoácidos, al menos aproximadamente 600 aminoácidos, al menos aproximadamente 650 aminoácidos, al menos aproximadamente 700 aminoácidos, al menos aproximadamente 750 aminoácidos, al menos aproximadamente 800 aminoácidos, al menos aproximadamente 850 aminoácidos, al menos aproximadamente 900 aminoácidos, al menos aproximadamente 950 aminoácidos, o al menos aproximadamente 1000 aminoácidos. En otras realizaciones, la proteína quimérica comprende un conector entre el resto auxiliar, por ejemplo, un fragmento de VWF, y el resto heterólogo (H1), que es un conector escindible.

En otro aspecto, la proteína FVIII en la proteína quimérica comprende FVIII y al menos un resto heterólogo (H2). En una realización, el resto heterólogo (H2) es capaz de prolongar la semivida de la proteína FVIII, por ejemplo, un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en una región constante de inmunoglobulina o una porción de la misma, albúmina o un fragmento de la misma, un resto de unión a albúmina, una secuencia de PAS, una secuencia de HAP, transferrina o un fragmento de la misma, y cualquier combinación de los mismos, o un resto no de polipéptido que comprende polietilenglicol (PEG), ácido polisiálico, hidroxietilalmidón (HES), un derivado de los mismos, y cualquier combinación de los mismos. En una realización particular, el resto heterólogo (H2) comprende una segunda región Fc.

En algunas realizaciones, la proteína quimérica comprende una primera cadena de polipéptidos que comprende el fragmento de VWF, un primer resto heterólogo, y un conector y una segunda cadena de polipéptidos que comprende la proteína FVIII y un segundo resto heterólogo, en donde la primera cadena de polipéptidos y la segunda cadena de polipéptidos se unen entre sí por un enlace covalente. En un ejemplo, el primer resto heterólogo y el segundo resto heterólogo se unen entre sí por el enlace covalente, por ejemplo, un enlace disulfuro, un enlace peptídico, o un conector, en donde el enlace covalente previene la sustitución del fragmento de VWF en la primera cadena de polipéptidos con VWF endógeno in vivo. En algunas realizaciones, el conector entre la proteína FVIII y el segundo resto heterólogo es un conector escindible.

En ciertas realizaciones, el primer resto heterólogo (H1) unido al fragmento de VWF y el segundo resto heterólogo (H2) unido a la proteína FVIII se unen por un conector, por ejemplo, un conector scFc, que es un conector procesable.

Aún en otras realizaciones, la proteína FVIII en la proteína quimérica comprende además un tercer resto heterólogo (H3), un cuarto resto heterólogo (H4), un quinto resto heterólogo (H5), un sexto resto heterólogo (H6), o cualquier combinación de los mismos. En una realización, uno o más del tercer resto heterólogo (H3), el cuarto resto heterólogo (H4), el quinto resto heterólogo (H5), el sexto resto heterólogo (H6) son capaces de prolongar la semivida de la proteína FVIII. En otras realizaciones, el tercer resto heterólogo (H3), el cuarto resto heterólogo (H4), el quinto resto heterólogo (H5) y el sexto resto heterólogo (H6) se unen al extremo C o extremo N de FVIII o se insertan entre dos aminoácidos de FVIII. En otras realizaciones, uno o más del tercer resto heterólogo (H3), el cuarto resto heterólogo (H4), el quinto resto heterólogo (H5) o el sexto resto heterólogo (H6) comprenden una secuencia de aminoácidos que comprende al menos aproximadamente 50 aminoácidos, al menos aproximadamente 100 aminoácidos, al menos aproximadamente 150 aminoácidos, al menos aproximadamente 200 aminoácidos, al menos aproximadamente 250 aminoácidos, al menos aproximadamente 300 aminoácidos, al menos aproximadamente 350 aminoácidos, al menos aproximadamente 400 aminoácidos, al menos aproximadamente 450 aminoácidos, al menos aproximadamente 500 aminoácidos, al menos aproximadamente 550 aminoácidos, al menos aproximadamente 600 aminoácidos, al menos aproximadamente 650 aminoácidos, al menos aproximadamente 700 aminoácidos, al menos aproximadamente 750 aminoácidos, al menos aproximadamente 800 aminoácidos, al menos aproximadamente 850 aminoácidos, al menos aproximadamente 900 aminoácidos, al menos aproximadamente 950 aminoácidos, o al menos aproximadamente 1000 aminoácidos.

En algunas realizaciones, el conector entre la proteína FVIII y el segundo resto heterólogo o el conector entre el fragmento de VWF y el primer resto heterólogo comprende además un primer sitio de escisión (P1) en la región del extremo N del conector, un segundo sitio de escisión (P2) en la región del extremo C del conector, o ambos. En otras realizaciones, uno o más del conector entre la proteína FVIII y el resto auxiliar, el conector entre la proteína FVIII y el segundo resto heterólogo, y el conector entre el fragmento de VWF y el primer resto heterólogo, tienen una longitud de aproximadamente 1 a aproximadamente 2000 aminoácidos.

En otros casos, la proteína quimérica comprende una proteína FVIII y un resto auxiliar, que están unidos por un conector entre la proteína FVIII y el resto auxiliar, en donde el conector comprende además un motivo de reconocimiento de sortasa, por ejemplo, la secuencia de LPXTG (SEQ ID NO: 106).

La presente divulgación se refiere a un fragmento de factor de von Willebrand (VWF) que comprende el dominio D' y el dominio D3 de VWF, en donde el fragmento de VWF se une al factor VIII (FVIII) e inhibe la unión de VWF endógeno a una proteína FVIII. En un caso, el fragmento de VWF de la divulgación no es los aminoácidos 764 a 1274 de SEQ ID NO: 2. En un caso, la proteína FVIII, sin el fragmento de VWF, tiene una semivida comparable a FVIII no mutante. En otro caso, la proteína FVIII es una proteína de fusión que comprende FVIII y un resto heterólogo que es capaz de prolongar la semivida de FVIII. El resto heterólogo puede ser un polipéptido, un resto no de polipéptido, o ambos. El resto heterólogo de polipéptido se puede seleccionar del grupo que consiste en una región constante de inmunoglobulina o una porción de la misma, albúmina o un fragmento de la misma, un resto de unión a albúmina, una secuencia de PAS, una secuencia de HAP, transferrina o un fragmento de la misma, y cualquier combinación de los mismos. En otros casos, el resto heterólogo es una región constante de inmunoglobulina o una porción de la misma, por ejemplo, una región Fc. Aún en otros casos, el resto no de polipéptido se selecciona del grupo que consiste en polietilenglicol (PEG), ácido polisiálico, hidroxietilalmidón (HES), un derivado de los mismos, y cualquier combinación de los mismos. En ciertos casos, la proteína FVIII comprende una primera cadena de polipéptidos y una segunda cadena de polipéptidos, en donde la primera cadena de polipéptidos comprende FVIII y una primera región Fc y la segunda cadena de polipéptidos comprende una segunda región Fc sin FVIII.

En otro caso, el fragmento de VWF prolonga la semivida de FVIII. La secuencia de aminoácidos del dominio D' puede ser al menos 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a los aminoácidos 764 a 866 de SEQ ID NO: 2. Por tanto, la secuencia de aminoácidos del dominio D3 puede ser al menos 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a los aminoácidos 867 a 1240 de SEQ ID NO: 2. En ciertos casos, el fragmento de VWF contiene al menos una sustitución de aminoácidos en un resto correspondiente al resto 1099, resto 1142, o ambos, de SEQ ID NO: 2. En un caso particular, un fragmento de VWF comprende, consiste esencialmente en, o consiste en los aminoácidos 764 a 1240 de SEQ ID NO: 2. El fragmento de VWF puede comprender además el dominio D1, el dominio D2, o los dominios D1 y D2 de VWF. En algunos casos, el fragmento de VWF comprende además un dominio de VWF seleccionado del grupo que consiste en el dominio A1, el dominio A2, el dominio A3, el dominio D4, el dominio B1, el dominio B2, el dominio B3, el dominio C1, el dominio C2, el dominio CK, uno o más fragmentos de los mismos, y cualquier combinación de los mismos. En otros casos, el fragmento de VWF está pegilado, glucosilado, hesilado, o polisialilado.

La presente divulgación también se refiere a una proteína quimérica que comprende un fragmento de VWF descrito en el presente documento, un resto heterólogo, y un conector opcional entre el fragmento de VWF y el resto heterólogo. El resto heterólogo puede ser un polipéptido, un resto no de polipéptido, o ambos. En un caso, el resto heterólogo de polipéptido se selecciona del grupo que consiste en una región constante de inmunoglobulina o una porción de la misma, albúmina o un fragmento de la misma, un resto de unión a albúmina, una secuencia de PAS, una secuencia de HAP, transferrina o un fragmento de la misma, y cualquier combinación de los mismos. En otro caso, el resto no de polipéptido heterólogo se selecciona de grupo que consiste en polietilenglicol (PEG), ácido polisiálico, hidroxietilalmidón (HES), un derivado de los mismos, y cualquier combinación de los mismos. En un caso particular, el resto heterólogo es una primera región Fc. La proteína quimérica puede comprender además una segunda región Fc, en donde la segunda región Fc se une o asocia a la primera región Fc o se une o asocia al fragmento de VWF.

En un aspecto, una proteína quimérica de la divulgación comprende una fórmula seleccionada del grupo que consiste en:

(aa) V-L1-H1-L2-H2,

(bb) H2-L2-H1-L1 -V,

(cc) H1-L1-V-L2-H2, y

(dd) H2-L2-V-L1-H1,

en donde V es uno o más de los fragmentos de VWF descritos en el presente documento,

cada uno de L1 y L2 es un conector opcional;

H1 es un primer resto heterólogo;

(-) es un enlace peptídico o uno o más aminoácidos; y

H2 es un segundo resto heterólogo opcional.

En un caso, H1 es un primer resto heterólogo, por ejemplo, una molécula que prolonga la semivida que se conoce en la técnica. En un caso, el primer resto heterólogo es un polipéptido. El primer resto heterólogo de polipéptido se selecciona del grupo que consiste en una región constante de inmunoglobulina o una porción de la misma, albúmina o un fragmento de la misma, un resto de unión a albúmina, una secuencia de PAS, una secuencia de HAP, transferrina o un fragmento de la misma, y cualquier combinación de los mismos. En otro caso, H1 es un resto no de polipéptido seleccionado del grupo que consiste en polietilenglicol (PEG), ácido polisiálico, hidroxietilalmidón (HES), un derivado de los mismos, y cualquier combinación de los mismos. H2 es un segundo resto heterólogo opcional, por ejemplo, una molécula que prolonga la semivida que se conoce en la técnica. En un caso, el segundo resto heterólogo se puede seleccionar del grupo que consiste en una región constante de inmunoglobulina o una porción de la misma, albúmina o un fragmento de la misma, un resto de unión a albúmina, una secuencia de PAS, una secuencia de HAP, transferrina o un fragmento de la misma, y cualquier combinación de los mismos. En otro caso, H2 es un resto no de polipéptido, que se selecciona del grupo que consiste en polietilenglicol (PEG), ácido polisiálico, hidroxietilalmidón (HES), un derivado de los mismos, y cualquier combinación de los mismos. En ciertos casos, H1 es una primera región Fc y H2 es una segunda región Fc. La primera región Fc y la segunda región Fc pueden ser iguales o diferentes y se pueden unir entre sí por un conector o un enlace covalente, por ejemplo, un enlace disulfuro. En otro caso, la segunda región Fc se une o asocia a una proteína factor VIII. Opcionalmente, también podría ser un tercer resto heterólogo, H3, que es un prolongador de la semivida, que se une al fragmento de VWF, el primer resto heterólogo, o el segundo resto heterólogo. Los ejemplos no limitantes del tercer resto heterólogo pueden incluir un polipéptido o un resto no de polipéptido, o ambos. En un caso, el tercer resto heterólogo de polipéptido se puede seleccionar del grupo que consiste en una región constante de inmunoglobulina o una porción de la misma, albúmina o un fragmento de la misma, un resto de unión a albúmina, una secuencia de PAS, una secuencia de HAP, transferrina o un fragmento de la misma, o cualquier combinación de los mismos. En otro caso, H2 es un resto no de polipéptido, que se selecciona del grupo que consiste en polietilenglicol (PEG), ácido polisiálico, hidroxietilalmidón (HES), un derivado de los mismos, y cualquier combinación de los mismos. En algunos casos, H3 se une al fragmento de VWF o el primer o el segundo resto heterólogo por un conector escindible, por ejemplo, un conector escindible de trombina. Los ejemplos no limitantes de los conectores se desvelan en cualquier parte en el presente documento.

En una realización, la proteína quimérica comprende un fragmento de VWF descrito en el presente documento, que se une a un resto heterólogo. El resto heterólogo puede ser un resto que prolonga la semivida de la proteína, que comprende un polipéptido, un resto no de polipéptido, o ambos. Los ejemplos de dicho resto heterólogo de polipéptido incluyen, por ejemplo, una región constante de inmunoglobulina o una porción de la misma, albúmina o un fragmento de la misma, un resto de unión a albúmina, una secuencia de PAS, una secuencia de HAP, cualquier derivado o variante de los mismos, o cualquier combinación de los mismos. Los ejemplos de un resto no de polipéptido incluyen, por ejemplo, polietilenglicol (PEG), ácido polisiálico, hidroxietilalmidón (HES), un derivado de los mismos, o cualquier combinación de los mismos. En otra realización, el resto heterólogo es una primera región Fc unida al fragmento de VWF. En otras realizaciones, la proteína quimérica comprende además una segunda región Fc unida a la proteína FVIII. El fragmento de VWF o la proteína FVIII se pueden unir a la primera región Fc o la segunda región Fc, respectivamente, por un conector. En otras realizaciones más, una proteína quimérica comprende un fragmento de VWF descrito en el presente documento unido a un primer resto heterólogo, por ejemplo, primera región Fc, y una proteína FVIII unida a un segundo resto heterólogo, por ejemplo, segunda región Fc, en donde el fragmento de VWF se une además al segundo resto heterólogo (por ejemplo, segunda región Fc) o la proteína FVIII por un conector o por enlace covalente, o el primer resto heterólogo (por ejemplo, región Fc) se une además a la proteína FVIII o el segundo resto heterólogo (por ejemplo, segunda región Fc) por un conector o un enlace covalente. En algunas realizaciones, el FVIII de la proteína quimérica tiene un dominio B parcial. En algunas realizaciones, la proteína FVIII con un dominio B parcial es FVI11198 (SEQ ID NO: 105). En otras realizaciones, la proteína quimérica comprende además un motivo de reconocimiento de sortasa.

En algunas realizaciones, como resultado de la invención, la semivida de la proteína FVIII se prolonga en comparación con una proteína FVIII sin el fragmento de VWF o FVIII no mutante. La semivida de la proteína FVIII es al menos aproximadamente 1,5 veces, al menos aproximadamente 2 veces, al menos aproximadamente 2,5 veces, al menos aproximadamente 3 veces, al menos aproximadamente 4 veces, al menos aproximadamente 5 veces, al menos aproximadamente 6 veces, al menos aproximadamente 7 veces, al menos aproximadamente 8 veces, al menos aproximadamente 9 veces, al menos aproximadamente 10 veces, al menos aproximadamente 11 veces, o al menos aproximadamente 12 veces más larga que la semivida de una proteína FVIII sin el fragmento de VWF. En una realización, la semivida de FVIII es aproximadamente 1,5 veces a aproximadamente 20 veces, aproximadamente 1,5 veces a aproximadamente 15 veces, o aproximadamente 1,5 veces a aproximadamente 10 veces más larga que la semivida de FVIII no mutante. En otra realización, la semivida de FVIII se prolonga aproximadamente 2 veces a aproximadamente 10 veces, aproximadamente 2 veces a aproximadamente 9 veces, aproximadamente 2 veces a aproximadamente 8 veces, aproximadamente 2 veces a aproximadamente 7 veces, aproximadamente 2 veces a aproximadamente 6 veces, aproximadamente 2 veces a aproximadamente 5 veces, aproximadamente 2 veces a aproximadamente 4 veces, aproximadamente 2 veces a aproximadamente 3 veces, aproximadamente 2,5 veces a aproximadamente 10 veces, aproximadamente 2,5 veces a aproximadamente 9 veces, aproximadamente 2,5 veces a aproximadamente 8 veces, aproximadamente 2,5 veces a aproximadamente 7 veces, aproximadamente 2,5 veces a aproximadamente 6 veces, aproximadamente 2,5 veces a aproximadamente 5 veces, aproximadamente 2,5 veces a aproximadamente 4 veces, aproximadamente 2,5 veces a aproximadamente 3 veces, aproximadamente 3 veces a aproximadamente 10 veces, aproximadamente 3 veces a aproximadamente 9 veces, aproximadamente 3 veces a aproximadamente 8 veces, aproximadamente 3 veces a aproximadamente 7 veces, aproximadamente 3 veces a aproximadamente 6 veces, aproximadamente 3 veces a aproximadamente 5 veces, aproximadamente 3 veces a aproximadamente 4 veces, aproximadamente 4 veces a aproximadamente 6 veces, aproximadamente 5 veces a aproximadamente 7 veces, o aproximadamente 6 veces a aproximadamente 8 veces en comparación con FVIII no mutante o una proteína FVIII sin el fragmento de VWF. En otras realizaciones, la

os os os os os os

os

realizaciones más, la semivida de FVIII es aproximadamente 15 horas a aproximadamente dos semanas, aproximadamente 16 horas a aproximadamente una semana, aproximadamente 17 horas a aproximadamente una semana, aproximadamente 18 horas a aproximadamente una semana, aproximadamente 19 horas a aproximadamente una semana, aproximadamente 20 horas a aproximadamente una semana, aproximadamente 21 horas a aproximadamente una semana, aproximadamente 22 horas a aproximadamente una semana, aproximadamente 23 horas a aproximadamente una semana, aproximadamente 24 horas a aproximadamente una semana, aproximadamente 36 horas a aproximadamente una semana, aproximadamente 48 horas a aproximadamente una semana, aproximadamente 60 horas a aproximadamente una semana, aproximadamente 24 horas a aproximadamente seis días, aproximadamente 24 horas a aproximadamente cinco días, aproximadamente 24 horas a aproximadamente cuatro días, aproximadamente 24 horas a aproximadamente tres días, o aproximadamente 24 horas a aproximadamente dos días.

En algunas realizaciones, la semivida promedio de la proteína FVIII por sujeto es aproximadamente 15 horas, aproximadamente 16 horas, aproximadamente 17 horas, aproximadamente 18 horas, aproximadamente 19 horas, aproximadamente 20 horas, aproximadamente 21 horas, aproximadamente 22 horas, aproximadamente 23 horas, aproximadamente 24 horas (1 día), aproximadamente 25 horas, aproximadamente 26 horas, aproximadamente 27 horas, aproximadamente 28 horas, aproximadamente 29 horas, aproximadamente 30 horas, aproximadamente 31 horas, aproximadamente 32 horas, aproximadamente 33 horas, aproximadamente 34 horas, aproximadamente 35 horas, aproximadamente 36 horas, aproximadamente 40 horas, aproximadamente 44 horas, aproximadamente 48 horas (2 días), aproximadamente 54 horas, aproximadamente 60 horas, aproximadamente 72 horas (3 días), aproximadamente 84 horas, aproximadamente 96 horas (4 días), aproximadamente 108 horas, aproximadamente 120 horas (5 días), aproximadamente seis días, aproximadamente siete días (una semana), aproximadamente ocho días, aproximadamente nueve días, aproximadamente 10 días, aproximadamente 11 días, aproximadamente 12 días, aproximadamente 13 días, o aproximadamente 14 días.

En otro aspecto, una proteína quimérica de la invención comprende una fórmula seleccionada del grupo que consiste en:

(a) V-L1-H1-L3- C-L2-H2,

(b) H2-L2-C- L3- H1-L1-V,

(c) C-L2-H2- L3- V-L1-H1,

(d) H1-L1-V- L3-H2-L2-C,

(e) H1-L1-V-L3-C-L2-H2,

(f) H2-L2-C- L3- V-L1-H1,

(g) V-L1-H1-L3- H2-L2-C,

(h) C-L2-H2- L3- H1-L1-V,

(i) H2-L3-H1-L1-V-L2-C,

(j) C-L2-V-L1-H1-L3-H2,

(k) V-L2-C-L1-H1-L3-H2, y

(l) H2-L3-H1-L1-C-L2-V,

en donde V es un fragmento de VWF descrito en el presente documento;

cada uno de L1 o L2 es un conector opcional, por ejemplo, un conector escindible de trombina;

L3 es un conector opcional, por ejemplo, conector scFc, por ejemplo, un conector procesable;

cada uno de H1 o H2 es un resto heterólogo opcional; y

C es una proteína FVIII; y

(-) es un enlace peptídico o uno o más aminoácidos.

En otros aspectos, una proteína quimérica de la invención comprende una fórmula seleccionada del grupo que consiste en:

(m) V-L1-H1: H2-L2-C,

(n) V-L1 -H1 :C-L2-H2,

(o) H1-L1 -V:H2-L2-C,

(p) H1-L1 -V:C-L2-H2,

(q) V:C-L1-H1:H2,

(r) V:H1-L1-C:H2,

(s) H2:H1-L1-C:V,

(t) C:V-L1-H1 :H2, y

(u) C:H1-L1-V:H2,

en donde V es un fragmento de VWF descrito en el presente documento;

cada uno de H1 o H2 es un resto heterólogo opcional; y

C es una proteína FVIII;

(-) es un enlace peptídico o uno o más aminoácidos; y

(:) es un enlace covalente entre H1 y H2, entre V y C, y entre V y H1 y C y H2. (:) representa al menos un enlace no peptídico. En ciertas realizaciones, la asociación química, es decir, (:) es un enlace covalente. En algunas realizaciones, la asociación entre H1 y H2 es un enlace covalente, por ejemplo, un enlace disulfuro. En otras realizaciones, (:) es un enlace covalente no peptídico. En otras realizaciones más, (:) es un enlace peptídico. En una realización, H1 es un primer resto heterólogo. En una realización, el primer resto heterólogo es capaz de prolongar la semivida de la actividad de FVIII. En otra realización, el primer resto heterólogo es un polipéptido, un resto no de polipéptido, o ambos. En una realización, el primer resto heterólogo de polipéptido se puede seleccionar del grupo que consiste en una región constante de inmunoglobulina o una porción de la misma, albúmina o fragmento de la misma, un resto de unión a albúmina, una secuencia de PAS, una secuencia de HAP, transferrina o un fragmento de la misma, y cualquier combinación de los mismos. En otra realización, el resto no de polipéptido se selecciona del grupo que consiste en polietilenglicol (PEG), ácido polisiálico, hidroxietilalmidón (HES), un derivado de los mismos, y cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, H2 es un segundo resto heterólogo. El segundo resto heterólogo también puede ser un prolongador de la semivida conocido en la técnica y puede ser un polipéptido, un resto no de polipéptido, o una combinación de ambos. En una realización, el segundo resto heterólogo se selecciona del grupo que consiste en una región constante de inmunoglobulina o una porción de la misma, albúmina o fragmento de la misma, un resto de unión a albúmina, una secuencia de PAS, una secuencia de HAP, transferrina o un fragmento de la misma, y cualquier combinación de los mismos. En ciertas realizaciones, el resto no de polipéptido se selecciona del grupo que consiste en polietilenglicol (PEG), ácido polisiálico, hidroxietilalmidón (HES), un derivado de los mismos, y cualquier combinación de los mismos. En una realización particular, H1 es una primera región Fc. En algunas realizaciones, H2 es una segunda región Fc. Opcionalmente, también podría ser un tercer resto heterólogo, H3, que es un prolongador de la semivida. H3 se puede unir a uno o más de V, C, H1 o H2 por un conector opcional, por ejemplo, un conector escindible, por ejemplo, un conector escindible de trombina. Los ejemplos no limitantes del tercer resto heterólogo pueden incluir una región constante de inmunoglobulina o una porción de la misma, albúmina o un fragmento de la misma, polietilenglicol (PEG), una secuencia de PAS, y hidroxietilalmidón (HES) o un derivado del mismo.

En ciertas realizaciones, uno o más de los conectores usados para conectar el fragmento de VWF, la proteína FVIII, el primer resto heterólogo, y/o el segundo resto heterólogo de las fórmulas (a) a (u) entre sí es un conector escindible. Uno o más de los sitios de escisión usados en la proteína quimérica se pueden escindir por una proteasa seleccionada del grupo que consiste en factor XIa, factor XIIa, calicreína, factor VIIa, factor IXa, factor Xa, factor IIa (trombina), elastasa-2, granzima-B, TEV, enterocinasa, proteasa 3C, sortasa A, MMP-12, MMP-13, MMP-17 y MMP-20. En otras realizaciones, uno o más conectores usados en las fórmulas (a) a (l) (por ejemplo, L3) comprenden un conector procesable. Los conectores procesables se pueden escindir por una enzima intracelular tras la secreción. El conector procesable puede comprender un primer sitio de escisión (P1) en la región del extremo N del conector, un segundo sitio de escisión (P2) en la región del extremo C del conector, o ambos.

En algunas realizaciones, uno o más de los conectores usados en la invención tienen una longitud de al menos aproximadamente 1 a 2000 aminoácidos. En una realización específica, uno o más de los conectores usados en la invención tienen una longitud de al menos aproximadamente 20, 35, 42, 48, 73, 98, 144, 288, 324, 576 u 864 aminoácidos. En una realización particular, uno o más de los conectores comprenden un péptido gly/ser. El péptido gly/ser puede ser (Gly4 Ser)3 o (Gly4 Ser)4.

En otros aspectos, una proteína FVIII en una proteína quimérica es una proteína funcional factor VIII. La proteína FVIII puede comprender uno o más dominios de FVIII seleccionados del grupo que consiste en el dominio A1, el dominio A2, el dominio B, el dominio A3, el dominio C1, el dominio C2, uno o más fragmentos de los mismos, y cualquier combinación de los mismos. En una realización, la proteína FVIII comprende el dominio B o una porción del mismo. En otra realización, la proteína FVIII es SQ FVIII de dominio B delecionado. En otras realizaciones, la proteína FVIII comprende FVIII de cadena sencilla. En otras realizaciones más, la proteína FVIII comprende una cadena pesada de FVIII y una cadena ligera de factor VIII, en donde la cadena pesada y la cadena ligera se asocian entre sí por un enlace metálico. En ciertas realizaciones, la proteína FVIII tiene una baja afinidad por o no se une a una proteína relacionada con el receptor de lipoproteína de baja densidad (LRP). Por ejemplo, una proteína FVIII útil para la invención puede contener al menos una sustitución de aminoácidos que reduce la afinidad por o elimina la unión a la LRP. Los ejemplos no limitantes de la al menos una sustitución de aminoácidos es en un resto correspondiente al resto 471, resto 484, resto 487, resto 490, resto 497, resto 2092, resto 2093, o dos o más combinaciones de los mismos, de FVIII maduro de longitud completa. En algunas realizaciones, la proteína FVIII en una proteína quimérica de la presente invención contiene al menos una sustitución de aminoácidos, que induce que la proteína FVIII sea más estable que una proteína FVIII sin la sustitución. En otras realizaciones, la proteína FVIII contiene al menos una sustitución de aminoácidos en el dominio A2 y al menos una sustitución de aminoácidos en el dominio A3, en donde el dominio A2 y el dominio A3 se asocian entre sí por un enlace covalente. Los ejemplos no limitantes de la sustitución de aminoácidos en el dominio A2 es en un resto correspondiente al resto 662 o 664 de FVIII maduro de longitud completa. Además, los ejemplos no limitantes de la sustitución de aminoácidos en el dominio A3 es en un resto correspondiente al resto 1826 o 1828 de FVIII maduro de longitud completa que está polisialilado.

En aspectos adicionales, la divulgación proporciona un polinucleótido que codifica un fragmento de VWF descrito en el presente documento o una proteína quimérica descrita en el presente documento, o un conjunto de polinucleótidos que comprende una primera cadena de nucleótido y una segunda cadena de nucleótido, en donde la primera cadena de nucleótido codifica el fragmento de VWF y la segunda cadena de nucleótido codifica la segunda región Fc o el factor de coagulación o fragmento del mismo de la proteína quimérica. En un caso, el conjunto de polinucleótidos comprende además una tercera cadena de polinucleótido, que codifica una proproteína convertasa que pertenece a la familia de proproteínas convertasa de tipo subtilisina. Los ejemplos no limitantes de la proproteína convertasa incluyen proproteína convertasa subtilisina/kexina tipo 3 (PACE o PCSK3), proproteína convertasa subtilisina/kexina tipo 5 (PCSK5 o PC5), proproteína convertasa subtilisina/kexina tipo 7 (PCSK7 o PC7), o una levadura Kex 2. Aún en otros aspectos, la divulgación incluye un vector que comprende el polinucleótido o el conjunto de polinucleótidos y uno o más promotores operativamente unidos al polinucleótido o el conjunto de polinucleótidos o un conjunto de vectores que comprende un primer vector y un segundo vector, en donde el primer vector codifica la primera cadena de polinucleótido del conjunto de polinucleótidos y el segundo vector codifica la segunda cadena de polinucleótido del conjunto de polinucleótidos. El conjunto de vectores puede comprender además un tercer vector, que comprende una tercera cadena de polinucleótido que codifica PC5 o PC7. En algunos casos, el vector comprende además PACE. En algunos casos, PACE escinde los dominios D1D2 del fragmento de VWF.

En algunos aspectos, la divulgación se refiere a una composición farmacéutica que comprende el fragmento de VWF, la proteína quimérica, el polinucleótido, el conjunto de polinucleótidos, el vector, o el conjunto de vectores, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. La composición de la presente divulgación puede prolongar la semivida del factor VIII. En otros aspectos, la divulgación incluye una célula hospedadora que comprende el polinucleótido, el conjunto de polinucleótidos, el vector, o los conjuntos de vectores.

En otros aspectos, la presente divulgación se refiere a una proteína quimérica que comprende una proteína FVIII, un resto auxiliar y un conector opcional, en donde el resto auxiliar inhibe o previene que VWF endógeno se una a la proteína FVIII y tiene al menos una propiedad protectora de FVIII de tipo VWF. La propiedad protectora de FVIII de tipo VWF comprende proteger la proteína FVIII de una o más escisiones de proteasa, proteger la proteína FVIII de la activación, estabilización de la cadena pesada y/o la cadena ligera de la proteína FVIII, o prevenir la eliminación de la proteína FVIII por uno o más receptores depuradores.

El resto auxiliar en la proteína quimérica puede inhibir o prevenir que VWF endógeno se una a la proteína FVIII por protección o bloqueo de un sitio de unión de VWF sobre la proteína FVIII. En algunos casos, el sitio de unión de VWF se localiza en el dominio A3 o el dominio C2 de la proteína FVIII, o ambos, el dominio A3 y el dominio C2 de la proteína FVIII. En otro caso, el sitio de unión de VWF es la secuencia de aminoácidos correspondiente a los aminoácidos 1669 a 1689 y 2303 a 2332 de SEQ ID NO: 16. En algunos casos, el resto auxiliar es un polipéptido, un resto no de polipéptido, o ambos. El polipéptido útil como resto auxiliar puede comprender una secuencia de aminoácidos de al menos 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 o 1000 aminoácidos de longitud. Por ejemplo, el polipéptido útil como resto auxiliar se puede seleccionar del grupo que consiste en un fragmento de VWF, una región constante de inmunoglobulina o una porción de la misma, albúmina o un fragmento de la misma, un resto de unión a albúmina, una secuencia de PAS, una secuencia de HAP, otras tecnologías que prolongan la semivida, y cualquier combinación de los mismos. El resto no de polipéptido útil como resto auxiliar se puede seleccionar del grupo que consiste en polietilenglicol (PEG), ácido polisiálico, hidroxietilalmidón (HES) o un derivado del mismo, y cualquier combinación de los mismos. En un caso, el resto auxiliar es el fragmento de VWF descrito en el presente documento. El resto auxiliar y la proteína FVIII se pueden unir, por ejemplo, por un conector, o asociarse entre sí. El conector puede comprender un conector escindible, por ejemplo, un conector escindible de trombina.

En un aspecto, la divulgación proporciona un método de prevención o inhibición de la unión de una proteína FVIII con VWF endógeno que comprende añadir una cantidad eficaz del fragmento de VWF, la proteína quimérica, el polinucleótido, o el conjunto de polinucleótidos, a una célula que comprende una proteína FVIII o un polinucleótido que codifica la proteína FVIII, en donde el fragmento de VWF se une a la proteína FVIII. En otro aspecto, la divulgación incluye un método de prevención o inhibición de la unión de la proteína FVIII con VWF endógeno que comprende añadir una cantidad eficaz de la proteína quimérica, el polinucleótido, o el conjunto de polinucleótidos, a un sujeto en necesidad del mismo, en donde el fragmento de VWF se une a la proteína FVIII y así previene o inhibe la unión de la proteína FVIII. En algunos aspectos, la divulgación incluye un método de prolongación o aumento de la semivida de una proteína FVIII, en donde el método comprende añadir una cantidad eficaz del fragmento de VWF, la proteína quimérica, el polinucleótido, o el conjunto de polinucleótidos, a una célula que comprende una proteína FVIII o un polinucleótido que codifica la proteína FVIII, o a un sujeto en necesidad del mismo, en donde el fragmento de VWF se une a la proteína FVIII. En otros aspectos, la divulgación se refiere a un método de prevención o inhibición de la eliminación de una proteína FVIII de una célula, en donde el método comprende añadir una cantidad eficaz del fragmento de VWF, la proteína quimérica, el polinucleótido, o el conjunto de polinucleótidos, a una célula que comprende una proteína FVIII o un polinucleótido que codifica la proteína FVIII, o a un sujeto en necesidad del mismo, en donde el fragmento de VWF se une a la proteína FVIII.

En otro aspecto, la divulgación se refiere a un método de tratamiento de una enfermedad hemorrágica o trastorno en un sujeto en necesidad del mismo, que comprende administrar una cantidad eficaz del fragmento de VWF, la proteína quimérica, el polinucleótido, o el conjunto de polinucleótidos, en donde la enfermedad hemorrágica o trastorno se selecciona del grupo que consiste en un trastorno hemorrágico de la coagulación, hemartrosis, sangrado muscular, sangrado bucal, hemorragia, hemorragia dentro de los músculos, hemorragia bucal, traumatismo, traumatismo craneal, sangrado gastrointestinal, hemorragia intracraneal, hemorragia intraabdominal, hemorragia intratorácica, fractura de huesos, sangrado del sistema nervioso central, sangrado en el espacio retrofaríngeo, sangrado en el espacio retroperitoneal y sangrado en la vaina del iliopsoas. En otros casos, el tratamiento es profiláctico o a demanda. Aún en otros casos, la divulgación es un método de tratamiento de una enfermedad o trastorno asociado a enfermedad de von Willebrand de tipo 2N para un sujeto en necesidad del mismo, que comprende administrar una cantidad eficaz del fragmento de VWF, la proteína quimérica, el polinucleótido, o el conjunto de polinucleótidos, en donde se trata la enfermedad o trastorno.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS/FIGURAS

Figura 1A-F. Diagramas esquemáticos de proteínas VWF. La Fig. 1A muestra dos fragmentos de VWF que contienen los aminoácidos 1 a 276 de SEQ ID NO: 73 (aminoácidos 764 a 1039 de SEQ ID NO: 2). VWF-001 se sintetiza sin las secuencias de pre/propéptidos de VWF, mientras que VWF-009 se sintetiza con las secuencias de pre/propéptidos (dominios D1 y D2). El prepéptido de VWF-009 se escinde durante la síntesis, y VWF-009 contiene el propéptido con las secuencias de los dominios D' y D3. La Fig. 1B muestra tres fragmentos de VWF que contienen los aminoácidos 1 a 477 de SEQ ID NO: 73 (aminoácidos 764 a 1240 de SEQ ID NO: 2). VWF-002 se sintetiza sin las secuencias de pre/propéptidos. VWF-010 contiene los dominios D1D2, además de los dominios D'D3. VWF-013 contiene los dominios D1 D2D'D3, además de restos de alanina que sustituyen cisteínas en los restos 336 y 379 de SEQ ID NO: 72. La Fig. 1C muestra dos fragmentos de VWF que contienen los dominios D'D3 y una porción del dominio A1. VWF-003 tiene los aminoácidos 764 a 1274 de SEQ ID NO: 2). VWF-011 contiene los dominios D1D2, además de los dominios D'D3. La Fig. 1D muestra dos construcciones, VWF-004 y VWF-012. VWF-004 contiene los dominios D'D3 y la secuencia completa del dominio A1. VWF-012 contiene los dominios D1 D2D'D3 y la secuencia completa del dominio A1. La Fig. 1E muestra tres construcciones. VWF-006 contiene los dominios D1D2D'D3 y el dominio CK de VWF (dominio de nudo de cisteína). VWF-008 es VWF de longitud completa. VWF-031 (VWF-Fc) muestra una construcción que contiene los dominios D1D2D'D3 unidos a una única región Fc por un conector escindible. VWF-053 es los dominios D1D2. La Fig. 1F muestra la proteína VWF de longitud completa que comprende propéptido (los dominios D1 y D2) y subunidades maduras (los dominios D', D3, A1, A2, A3, D4, B1-3, C1-2). La proteína VWF es proteína de aproximadamente 250 kDa y forma los multímeros (> 20 MDa) por enlace disulfuro. La proteína VWF se asocia con FVIII (95-98 %) en un complejo no covalente y entonces prolonga la semivida de FVIII protegiendo FVIII de la escisión/activación por proteasa, estabilizando la cadena pesada y ligera, y previniendo la eliminación de FVIII por receptores depuradores. La proteína VWF también puede limitar la semivida de FVIII por eliminación del complejo FVIII-VWF mediante receptores de VWF y prevenir la pinocitosis y recirculación de rFVIIIFc.

Figura 2. Diagramas esquemáticos de los ejemplos de construcciones de heterodímeros VWF:FVIII. La construcción izquierda muestra un fragmento de VWF que tiene los dominios D'D3 de VWF de longitud completa (aminoácidos 1-477 de SEQ ID NO: 73) y que contiene sustituciones de alanina en los restos 336 y 379 de SEQ ID NO: 72. La construcción de proteína quimérica (FVIII 064/065) comprende el extremo C de un fragmento de VWF unido a una primera región Fc por un conector y FVIII se une a una segunda región Fc, en donde la segunda región Fc se une además al extremo N de un fragmento de VWF por un conector (por ejemplo, fórmula C-H1-L1-V-L2-H2, en donde V es un fragmento de VWF, C es FVIII, H1 y H2 son regiones Fc, y L1 y L2 son conectores escindibles). La construcción en la Figura 2b es una construcción de heterodímero VWF:FVIII intracelularmente procesada donde se ha escindido el conector entre la segunda Fc y el extremo N del fragmento de VWF. FVIII-064 contiene los dominios D'D3 de VWF (aminoácidos 1 a 477 de SeQ ID NO: 73 con sustituciones C336A y C379). FVIII-065 contiene los dominios D'D3 de VWF (aminoácidos 1 a 276 de SEQ ID NO: 73). FVIII-136 contiene FVIIIFc unido al fragmento Fc de D'D3 por un conector que se puede procesar por una enzima proteasa intracelular. Cuando se expresa FVIII-136, la enzima escinde el conector entre la segunda Fc (fusionada con FVIII-LC) y el fragmento D'D3 de VWF (fusionado con la primera Fc), mientras que la región Fc fusionada con (o unida a) FVIII-LC forma un enlace covalente (por ejemplo, un enlace disulfuro) con la primera Fc fusionada con (o unida a) el fragmento de VWF. FVIII-148 es FVIIIFc de cadena sencilla con el fragmento D'D3 (un FVIII de cadena sencilla introduciendo la mutación R1645A/R1648A dentro del gen FVIII).

Figura 3. Diagramas esquemáticos de los ejemplos de construcciones de heterodímeros VWF:FVIII que contienen ejemplos de conectores variables entre VWF y Fc. Las construcciones (FVIII-064, FVIII-159, FVIII-160, FVIII-178 y FVIII-179) tienen la estructura común representada como la fórmula C-H1-L1-V-L2-H2, pero contienen ejemplos de diferentes conectores o sustituciones de aminoácidos. Las construcciones mostradas contienen el mismo fragmento de VWF, que es los dominios D' y D3 de VWF (es decir, aminoácidos 1 a 477 de SEQ ID NO: 73 con sustituciones de aminoácidos C336A y C379A). La construcción FVIII 64 tiene un conector escindible de trombina (es decir, L2) entre el fragmento de VWF y Fc (es decir, H2), que tiene 20 aminoácidos. La construcción FVIII 159 tiene un conector escindible de trombina (es decir, L2) entre el fragmento de VWF y Fc (es decir, H2), que tiene 35 aminoácidos. La construcción FVIII 160 tiene un conector escindible de trombina (es decir, L2) entre el fragmento de VWF y Fc (es decir, H2), que tiene 48 aminoácidos. Las construcciones FVIII-180, FVIII-181 y FVIII-182 son derivados de FVIII-160 que contienen la mutación K2092A en el dominio C1 de FVIII, la mutación K2093A en el dominio C1 de FVIII, y las mutaciones K2092A/K2093A en el dominio C1 de FVIII, respectivamente. La construcción FVIII-178 tiene un conector escindible de trombina (es decir, L2) entre el fragmento de VWF y Fc (es decir, H2), que tiene 73 aminoácidos. La construcción FVIII-179 tiene un conector escindible de trombina (es decir, L2) entre el fragmento de VWF y Fc (es decir, H2), que tiene 98 aminoácidos.

Figura 4: Diagramas esquemáticos de los ejemplos de construcciones FVIII-VWF, en las que VWF es el de fragmento D1 D2D'D3 de VWF, el conector es un conector de longitud variable que contiene un sitio de escisión, por ejemplo, un sitio de escisión de trombina, SCFVIII es FVIII de cadena sencilla, que contiene las sustituciones R1645A/R1648A, H es un resto heterólogo, por ejemplo, una región constante de inmunoglobulina o una porción de la misma, un resto para conjugar polietilenglicol (PEG) y/o PEG, una albúmina o fragmento de albúmina, un resto de unión a albúmina, una secuencia de HAP, un resto para polisialilación y/o ácido polisiálico, un resto para hidroxietilalmidón (HES) y/o HES, o una secuencia de PAS, etc., FVIII HC es una cadena pesada de FVIII, FVIII LC es una cadena ligera de FVIII, y Fc es una región Fc de una región constante de inmunoglobulina. La Figura 4A tiene una fórmula de VWF-Conector-SCFVIII. La Figura 4B tiene una fórmula de VWF-Conector-H-Conector-SCFVIII. Los conectores (el primer conector entre VWF y H y el segundo conector entre H y SCFVIII) pueden ser idénticos o diferentes. La Figura 4C tiene una fórmula de VWF-Conector-SCFVIII-Conector-H. Los conectores (el primer conector entre VWF y SCFVIII y el segundo conector entre SCFVIII y H) pueden ser idénticos o diferentes. La Figura 4D tiene una fórmula de VWF-Conector-FVIII HC-H-Conector-FVIII LC. Los conectores (el primer conector entre VWF y FVIII HC y el segundo conector entre H y FVIII LC) pueden ser idénticos o diferentes. La Figura 4E tiene una fórmula de FVIII HC-H-FVIII LC-Conector-primera Fc-Conector-VWF-Conector-segunda Fc. Los conectores (el primer conector entre FVIII LC y la primera Fc, el segundo conector entre la primera Fc y VWF, y el tercer conector entre VWF y la segunda Fc) pueden ser idénticos o diferentes. Los conectores pueden ser un conector escindible. Por ejemplo, el conector entre la primera Fc y VWF puede ser un conector escindible que comprende un sitio de escisión en el extremo N y/o el extremo C del conector. La primera Fc y la segunda Fc pueden ser idénticas o diferentes. La Figura 4F tiene una fórmula de FVIII HC-H-FVIII LC-Conector-primera Fc-Conector-VWF-Conector-segunda Fc. Los conectores (el primer conector entre FVIII LC y primera Fc, el segundo conector entre primera Fc y VWF, y el tercer conector entre VWF y segunda Fc) pueden ser idénticos o diferentes. Uno o más conectores pueden ser un conector escindible. Por ejemplo, el conector entre la primera Fc y VWF puede ser un conector escindible que comprende un sitio de escisión en el extremo N y/o el extremo C del conector. La primera Fc y la segunda Fc pueden ser idénticas o diferentes. La Figura 4G tiene una fórmula de SCFVIII-Conector-Fc-Conector-VWF-H-Conector-Fc. La Figura 4H tiene una fórmula de SCFVIII pegilado o hesilado-Conector-Fc-Conector-VWF-H-Conector-Fc. Los conectores (el primer conector entre SCFVIII y primera Fc, el segundo conector entre primera Fc y VWF, y el tercer conector entre H y segunda Fc) pueden ser idénticos o diferentes. Uno o más conectores pueden ser un conector escindible. Por ejemplo, el conector entre la primera Fc y VWF puede ser un conector escindible que comprende un sitio de escisión en el extremo N y/o el extremo C del conector. La primera Fc y la segunda Fc pueden ser idénticas o diferentes.

Figura 5. Diagramas esquemáticos del sistema de co-transfección de heterodímeros FVIII-VWF. La construcción FVIII-155 contiene la secuencia de FVIII de longitud completa (sustituyendo un resto de alanina los restos de arginina en 1645 y 1648) unida a una región Fc. VWF-031 contiene el fragmento D1D2D'D3 (sustituyendo un resto de alanina los restos de cisteína en 336 y 379) que se une a otra región Fc con un conector escindible de trombina de 48. Después del procesamiento intracelular, la construcción FVIII-155 produce un FVIII de cadena sencilla (SCFVIII) de longitud completa fusionado con un fragmento Fc, la construcción VWF-031 produce un fragmento D'D3 de 477 aminoácidos unido a otro fragmento Fc. Se pueden formar dos enlaces covalentes entre los fragmentos Fc que se unen a SCFVIII o el fragmento D'D3, esto permite a su vez una asociación covalente de FVIII y D'D3, que es el carácter principal del producto final deseado.

La Figura 6 es una SDS-PAGE no reductora y reductora de VWF-009 (D1D2D'D3 1-276 aa x 6 HIS), que muestra que VWF-009 existe como un monómero. Sin procesar significa VVF-009 con el propéptido (los dominios D1 D2).

La Figura 7 es la SDS-PAGE no reductora y reductora de VWF-002 (D'D3 1-477 aa x 6 his) o VWF-010 (D1D2D'D3 1-477 aa x 6 his), que muestra que VWF-002 existe como un monómero y VWF-010 existe como un dímero.

La Figura 8 muestra la digestión con trombina del heterodímero FVIII-VWF mostrado en la Figura 2(b). El carril 1 muestra marcador. El carril 2 es rFVIII-Fc sin trombina. El carril 3 es rFVIII-Fc con trombina. El carril 5 es FVIIIFc-VWF. El carril 6 muestra FVIIIFc-VWF y trombina. A1 indica dominio A1 de FVIII, A2 indica dominio A2 de FVIII, y Aa3 LC indica la cadena ligera de FVIII.

La Figura 9A-B muestra la actividad de FVIII medida por un ensayo cromogénico de FVIII. La Fig. 9A muestra el perfil farmacocinético de rFVIII y rFVIIIFc en ratón HemA. La Fig. 9B muestra el perfil PK de rFVIII y rFVIIIFc en el ratón doblemente inactivado (DKO) en FVIII/VWF. El eje Y muestra la actividad de FVIII en mUI/mL, y el eje X muestra el tiempo.

La Figura 10A-B muestra la protección de FVIII por los fragmentos D'D3 como se muestra por el nivel de mFVIII en plasma (mUI/mL) y el nivel de expresión de VWF (nM/mL) 48 horas después de la inyección de plásmido. Los fragmentos de VWF usados para mostrar la protección de FVIII son VWF-001 (276 aa, monómero), VWF-009 (276 aa, monómero), VWF-002 (477 aa, monómero), VWF-010 (477 aa, dímero), VWF-003 (511 aa, monómero), V^wF-011 (511 aa, dímero), VWF-004 (716 aa, monómero), VWF-012 (716 aa, dímero), VWF-006 y VWF-008.

La Figura 11 muestra el perfil farmacocinético de rBDD-FVIII en ratones DKO FVIII-VWF cuando se co administran con fragmentos D'D3. La Figura 11A muestra la actividad de FVIII (mUI/mL) medida por un ensayo cromogénico de FVIII después de la co-administración de rBDD-FVIII y VWF-002 o rBDD-FVIII y VWF-010 o rBDD-FVIII solo en ratones DKO FVIII/VWF. La Fig. 11B muestra el nivel de VWF-002 y VWF-010 en plasma (ng/mL) después de la administración. El eje X representa el tiempo en horas.

La Figura 12 muestra el perfil farmacocinético de rFVIIIFc en ratones que expresan D'D3 de VWF. La Figura 12A muestra la cronología de la inyección hidrodinámica (HDI) del dominio D'D3 que codifica ADN de plásmido (día -5), dosis intravenosa de rFVIIIFc (día 0) y recogida de muestras PK (día 0 - día 3). La Figura 12B muestra la actividad de FVIII en plasma posterior a la infusión de rFVIIIFc (mUI/mL) medida por un ensayo cromogénico de FVIII en ratones ^dK^oFVIII/VWF con HDI de los dominios D1D2D'D3 (477 aa) (círculo) y los dominios D1 D2D'D3 (477 aa) con sustituciones de cisteína (rectángulo) en ratones DKO FVIII/VWF. La actividad de FVIII en ratones de control sin HDI de los dominios D'D3 se muestra como un triángulo. La Fig. 10C muestra el nivel de D'D3 en plasma (ng/mL) después de la administración por HDI de la construcción de ADN de dímero de D1 D2D'D3 o monómero de D1 D2D'D3. El eje X representa el tiempo en horas.

La Figura 13 muestra la selección de conector de D'D3-Fc por HDI en ratones DKO FVIII/VWF. Se insertaron diferentes longitudes de los conectores (20 aa (FVIII-064), 35 aa (FVIII-159), o 48 aa (FVIII-160)) entre los dominios D'D3 y la región Fc. Se midió la actividad de FVIII (mUI/mL) por un ensayo cromogénico de FVIII después de HDI en ratones DKO FVIII/VWF.

La Figura 14 muestra la HDI del heterodímero de FVIIIFc de cadena sencilla/D'D3 en ratones DKO FVIII/VWF. Se midieron las actividades de FVIII de rFVIIIFc-D'D3 (pSYN-FVIII-136) procesado (cadena doble) y rFVIIIFc-D'D3 (pSYN-FVIII-148) de cadena sencilla 24 horas y 48 horas después de HDI.

La Figura 15 muestra la afinidad de unión del heterodímero FVIII-155/VWF-031 por hVWF inmovilizado por ensayo de Octet. También se usaron FVIIIFc, FVIII e IgG como controles. El eje x muestra el tiempo en segundos, y el eje y muestra la unión en nanómetros (nm).

La Figura 16 muestra la farmacocinética de FVIII-155/VWF-031 en ratones deficientes en FVIII/VWF (DKO FVIII/VWF). El eje x indica el tiempo en horas, y el eje y indica la recuperación de FVIII frente a la entrada en porcentaje.

Figura 17: Diagramas esquemáticos de los ejemplos de construcciones de fragmentos de VWF, en las que VWF es el fragmento D1 D2D'D3 de VWF; el conector es un conector de longitud variable que contiene un sitio de escisión, por ejemplo, un sitio de escisión de trombina; H es un resto heterólogo, por ejemplo, una región constante de inmunoglobulina o una porción de la misma, un resto para conjugar polietilenglicol (PEG) y/o PEG, una albúmina o fragmento de albúmina, un resto de unión a albúmina, una secuencia de HAP, un resto para polisialilación y/o ácido polisiálico, un resto para hidroxietilalmidón (HES) y/o HES, o una secuencia de PAS, etc.; y Fc es una región Fc de una inmunoglobulina. La Figura 17A tiene una fórmula de D1D2-D'D3 parcial-H-D3 parcial-Conector-Fc. La Figura 17B tiene una fórmula de D1D2-D' parcial-H-D'D3 parcial-Conector-Fc. La Figura 17C tiene una fórmula de D1D2-D'D3 pegilado o hesilado-Conector-Fc. El conector puede estar opcionalmente escindido.

Figura 18: A) muestra que FVIIIFc pierde actividad de FVIII en tanto plasma de HemA (diamante) como de DKO (cuadrado) con el tiempo. La actividad de FVIII se mide por el ensayo cromogénico. El eje x muestra el tiempo en horas, y el eje y muestra la actividad relativa. B) muestra que la pérdida en la actividad de FVIII es debida a la disociación o degradación de la cadena pesada (HC). El panel izquierdo muestra un ensayo de inmunoprecipitación usando anticuerpo policlonal de oveja anti-FVIII en gel al 4-15 % de Bio-rad. Se redujo el gel y se obtuvieron imágenes por el sistema de Bio-rad. El carril 1 muestra marcador sin teñir de Bio-rad; el carril 2 muestra FVIIIFc y PBS; el carril 3 muestra plasma de FVIIIFc y DKO; y el carril 5 muestra anticuerpo policlonal de oveja anti-FVIII solo. El panel derecho muestra análisis Western de gel usando anticuerpo de FVIII anti-cadena pesada (GMA012). El carril 1 muestra marcador sin teñir de Bio-rad; el carril 2 muestra FVIIIFc y PBS; el carril 3 muestra plasma de FVIIIFc y DKO; y el carril 4 muestra anticuerpo policlonal de oveja anti-FVIII solo.

Figura 19: muestra la actividad de FVIII de FVIIIFc no mutante (círculo), scFVIIIFc (FVIII de cadena sencilla) (triángulo relleno), o heterodímero FVIII:VWF (por ejemplo, FVIII155/VWF31) (triángulo blanco) por ensayo cromogénico en plasma de ratón DKO (panel izquierdo) y plasma de ratón HemA (panel derecho) en función del tiempo. El eje y muestra la actividad relativa de FVIII. FVIIIFc no mutante contiene cadena doble de FVIII (es decir, cadena pesada de FVIII y cadena ligera de FVIII mantenidas juntas no covalentemente) y así tiene tres cadenas, una cadena pesada de FVIII, una cadena ligera de FVIII fusionada con una Fc, y una Fc sola. scFVIIIFc contiene un FVIII de cadena sencilla y así tiene dos cadenas, una con FVIII de cadena sencilla fusionada con una Fc y otra con una Fc sola. El heterodímero FVIII:VWF (por ejemplo, FVIII155/VWF031) contiene FVIII de cadena sencilla fusionado con una Fc y un fragmento de VWF (D'D3) fusionado con una Fc.

La Figura 20 muestra el procesamiento del dominio D1D2 del fragmento de VWF (por ejemplo, VWF-031(D1D2D'D3Fc)) por PC5 o PACE (furina) a diferentes concentraciones. El procesamiento de D1D2 se muestra en un gel al 4-15 % de Bio-rad en una condición reducida por generador de imágenes de Bio-rad. El carril 1 muestra VWF031 solo; el carril 2 muestra PC5 solo; el carril 3 muestra PACE solo; el carril 4 muestra VWF031 y PC5 a 2,5 %; el carril 5 muestra VWF031 y PC5 a 5 %; el carril 6 muestra VWF031 y PC5 a 7,5 %; el carril 7 muestra VWF031 y PC5 a 10 %; el carril 8 muestra VWF031 y PACE a 2,5 %; el carril 9 muestra VWF031 y PACE a 5 %; el carril 10 muestra VWF031 a 7,5 %; y el carril 11 muestra VWF031 y PACE a 10 %.

Figura 21: A) muestra que un ensayo de unión de un heterodímero FVIII:VWF (por ejemplo, FVIII-155/VWF-031) por el instrumento Octet de ForteBio. Para el ensayo, se capturó VWF de longitud completa usando sensor de APS. La unión de FVIIIFc y FVIII a VWF de longitud completa se muestra en el panel inferior izquierdo. La ausencia de unión de FVIIIY1680 (un mutante que no tiene afinidad por VWF) y el heterodímero FVIII:VWF (FVIII155/VWF031) se muestra en el panel inferior derecho. B) muestra otro ensayo de unión de un heterodímero FVIII:VWF (por ejemplo, FVIII-155/VWF-031). En este ensayo, las construcciones (construcción VWF031, FVIII-155/VWF031, o FVIII) se inmovilizaron sobre sensor de proteína G. Se midió la unión de las construcciones a FVIII.

La Figura 22 muestra la afinidad de unión de dominios D'D3 de VWF con la molécula FVIII medida por un experimento de resonancia plasmática superficial. Se capturó la construcción VWF031 (100 UR) por 1000 UR de anti-IgG humana. Se aplicó FVIII de dominio B delecionado en modo de cinética de ciclo único en ajuste 1:1. El número total fue 4.

La Figura 23 muestra los efectos de diferente longitud de conector en las construcciones de heterodímero FVIIIFc/VWF sobre la farmacocinética cuando se administran a ratones DKO FVIII/VWF. Se insertaron tres conectores diferentes (48 aa, 73aa, o 98aa) entre D'D3 y Fc, es decir, VWF031, VWF035 y VWF036. La actividad de FVIII normalizada al valor de 5 min (%) se muestra en el eje y.

La Figura 24 muestra ejemplos de unión de sortasa de un fragmento de VWF con FVIII. A) muestra dos construcciones de unión, (1) un fragmento de VWF fusionado con un motivo de reconocimiento de sortasa (por ejemplo, LPXTG) en el extremo C y (2) FVIII que tiene glicina (n) en el extremo N. Después de la reacción con sortasa, el fragmento de VWF y el motivo de reconocimiento de sortasa se unen al extremo N de FVIII. B) muestra dos construcciones de unión, (1) FVIII que se fusiona con un motivo de reconocimiento de sortasa en su extremo C y (2) un fragmento de VWF que tiene glicina (n) en su extremo N. Después de la reacción con sortasa, FVIII y el motivo de reconocimiento de sortasa se fusionan con el fragmento de VWF en el extremo N del fragmento de VWF. C) muestra dos construcciones de unión, (1) un fragmento de VWF fusionado con un motivo de reconocimiento de sortasa por un conector de longitud variable y (2) FVIII fusionado con glicina (n) en su extremo N. Después de la reacción con sortasa, el VWF fusionado por un conector con el motivo de reconocimiento de sortasa se une al extremo N de FVIII. D) muestra dos construcciones de unión, (1) FVIII fusionado por un conector de longitud variable con un motivo de reconocimiento de sortasa y (2) un fragmento de VWF fusionado con glicina (n) en su extremo N. Después de la reacción con sortasa, FVIII fusionado por un conector con el motivo de reconocimiento de sortasa se une al extremo N de fragmento de VWF. E) muestra una construcción de unión que contiene un fragmento de VWF fusionado por un conector de longitud variable con un motivo de reconocimiento de sortasa, que también se fusiona con un sitio de escisión de proteasa (por ejemplo, sitio de escisión de trombina) fusionado por un conector de longitud variable con una Fc.

La Figura 25 muestra una comparación esquemática de FVIII155 y FVIII198. FVIII155 codifica una proteína FVIIIFc de cadena sencilla. FVIII198 es un dominio B parcial que contiene la molécula de FVIIIFc de cadena sencilla-226N6. 226 representa el aminoácido 226 del extremo N del dominio B de FVIII, y N6 representa seis sitios de N-glucosilación en el dominio B.

La Figura 26 A) muestra un ensayo de estabilidad que mide la actividad relatividad de FVIII155 y FVIII198 en plasma de DKO en función del tiempo. Como se puede apreciar en la figura, la presencia del dominio B parcial en FVIII198 aumentó la estabilidad de FVIIIFc de cadena sencilla en comparación con FVIII155; B) muestra una comparación de las semividas de FVIII198, FVIII155 y cadena doble (dcFVIIIFc) en ratones DKO. Como se puede apreciar en la figura, FVIII de cadena sencilla (FVIII155) tiene un aumento de 1,5 veces en la semivida en comparación con FVIII de cadena doble. FVIII de cadena sencilla con el dominio B de 266N6 (FVIII198) tuvo un aumento adicional de 1,5 veces en la semivida. El gráfico muestra la recuperación de FVIII frente al valor de 5 minutos (%) en función del tiempo.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN DEFINICIONES

Se debe observar que el término "un" o "una" entidad se refiere a uno o más de esa entidad; por ejemplo, se entiende que "una secuencia de nucleótidos" representa una o más secuencias de nucleótidos. Como tal, los términos "un" (o "una"), "uno o más," y "al menos uno", se pueden usar indistintamente en el presente documento. El término "polinucleótido" o "nucleótido" pretende englobar un ácido nucleico singular, así como ácidos nucleicos plurales, y se refiere a una molécula o construcción de ácido nucleico aislada, por ejemplo, ARN mensajero (ARNm) o ADN de plásmido (ADNp). En ciertas realizaciones, un polinucleótido comprende un enlace fosfodiéster convencional o un enlace no convencional (por ejemplo, un enlace amida, tal como se encuentra en ácidos nucleicos peptídicos (PNA)). El término "ácido nucleico" se refiere a uno cualquiera o más segmentos de ácidos nucleicos, por ejemplo, fragmentos de ADN o ARN, presentes en un polinucleótido. Por ácido nucleico o polinucleótido "aislado" está prevista una molécula de ácido nucleico, ADN o ARN, que se ha retirado de su entorno nativo. Por ejemplo, un polinucleótido recombinante que codifica un polipéptido de factor VIII contenido en un vector se considera aislado para los fines de la presente invención. Los ejemplos adicionales de un polinucleótido aislado incluyen polinucleótidos recombinantes mantenidos en células hospedadoras heterólogas o purificados (parcialmente o sustancialmente) de otros polinucleótidos en una disolución. Las moléculas de ARN aisladas incluyen transcritos de ARN in vivo o in vitro de polinucleótidos de la presente invención. Los polinucleótidos aislados o ácidos nucleicos según la presente invención incluyen además dichas moléculas producidas sintéticamente. Además, un polinucleótido o un ácido nucleico pueden incluir elementos reguladores tales como promotores, potenciadores, sitios de unión al ribosoma, o señales de terminación de la transcripción.

Como se usa en el presente documento, una "región codificante" o "secuencia codificante" es una porción de polinucleótido que consiste en codones traducibles en aminoácidos. Aunque un "codón de terminación" (TAG, TGA, o TAA) normalmente no se traduce en un aminoácido, se puede considerar que es parte de una región codificante, pero cualquier secuencia flanqueante, por ejemplo, promotores, sitios de unión al ribosoma, terminadores transcripcionales, intrones, y similares, no es parte de una región codificante. Los límites de una región codificante normalmente se determinan por un codón de iniciación en el extremo 5', que codifica el extremo amino del polipéptido resultante, y un codón de terminación de la traducción en el extremo 3', que codifica el extremo carboxilo del polipéptido resultante. Pueden estar presentes dos o más regiones codificantes de la presente invención en una única construcción de polinucleótido, por ejemplo, en un único vector, o en construcciones de polinucleótido separadas, por ejemplo, en vectores separados (diferentes). De esto resulta, entonces, que un único vector puede contener solo una única región codificante, o comprender dos o más regiones codificantes, por ejemplo, un único vector puede codificar por separado un dominio de unión A y un dominio de unión B, como se describe más adelante. Además, un vector, polinucleótido, o ácido nucleico, de la invención puede codificar regiones codificantes heterólogas, o fusionadas o sin fusionar con un ácido nucleico que codifica un dominio de unión de la invención. Las regiones codificantes heterólogas incluyen sin limitación elementos o motivos especializados, tales como un péptido señal secretor o un dominio funcional heterólogo.

Ciertas proteínas secretadas por células de mamífero están asociados con un péptido señal secretor que se escinde de la proteína madura una vez se ha iniciado la exportación de la cadena de proteína en crecimiento a través del retículo endoplasmático rugoso. Los expertos habituales en la técnica conocen que los péptidos señal, en general, se fusionan con el extremo N del polipéptido, y se escinden del polipéptido completo o de "longitud completa" para producir una forma secretada o "madura" del polipéptido. En ciertas realizaciones, se usa un péptido señal nativo, por ejemplo, un péptido señal de cadena pesada o cadena ligera de la inmunoglobulina, o un derivado funcional de esa secuencia que retiene la capacidad para dirigir la secreción del polipéptido al que está operativamente asociado. Alternativamente, se puede usar un péptido señal de mamífero heterólogo, por ejemplo, un activador de plasminógeno de tejido humano (TPA). O péptido señal de p-glucuronidasa de ratón, o un derivado funcional del mismo.

El término "en la dirección 3'" se refiere a una secuencia de nucleótidos que se localiza 3' con respecto a una secuencia de nucleótidos de referencia. En ciertas realizaciones, las secuencias de nucleótidos en la dirección 3' se refieren a secuencias que siguen el punto de inicio de la transcripción. Por ejemplo, el codón de iniciación de la traducción de un gen se localiza en la dirección 3' del sitio de inicio de la transcripción.

El término "en la dirección 5'" se refiere a una secuencia de nucleótidos que se localiza 5' con respecto a una secuencia de nucleótidos de referencia. En ciertas realizaciones, las secuencias de nucleótidos en la dirección 5' se refieren a secuencias que se localizan en el lado 5' de una región codificante o punto de inicio de la transcripción. Por ejemplo, la mayoría de los promotores se localizan en la dirección 5' del sitio de inicio de la transcripción.

Como se usa en el presente documento, el término "región reguladora" se refiere a secuencias de nucleótidos localizadas en la dirección 5' (secuencias no codificantes 5'), dentro de, o en la dirección 3' (secuencias no codificantes 3') de una región codificante, y que influyen en la transcripción, procesamiento de ARN, estabilidad, o traducción de la región codificante asociada. Las regiones reguladoras pueden incluir promotores, secuencias conductoras de la traducción, intrones, secuencias de reconocimiento de la poliadenilación, sitios de procesamiento de ARN, sitios de unión a efector y estructuras de tallo-bucle. Si está prevista una región codificante para la expresión en una célula eucariota, una señal de poliadenilación y secuencia de terminación de la transcripción se localizará normalmente 3' con respecto a la secuencia codificante.

Un polinucleótido que codifica un producto génico, por ejemplo, un polipéptido, puede incluir un promotor y/u otros elementos de control de la transcripción o de la traducción operativamente asociados a una o más regiones codificantes. En una asociación operativa, una región codificante de un producto génico, por ejemplo, un polipéptido, se asocia con una o más regiones reguladoras de tal forma que pongan la expresión del producto génico bajo la influencia o control de la(s) región (regiones) reguladora(s). Por ejemplo, una región codificante y un promotor están "operativamente asociados" si la inducción de la función de promotor da como resultado la transcripción de ARNm que codifica el producto génico codificado por la región codificante, y si la naturaleza del enlace entre el promotor y la región codificante no interfiere con la capacidad del promotor para dirigir la expresión del producto génico o interferir con la capacidad del molde de ADN a transcribir. También se pueden asociar operativamente otros elementos de control de la transcripción, además de un promotor, por ejemplo, potenciadores, operadores, represores y señales de terminación de la transcripción, a una región codificante para dirigir la expresión del producto génico.

Los expertos en la técnica conocen una variedad de regiones de control de la transcripción. Estas incluyen, sin limitación, regiones de control de la transcripción que funcionan en células de vertebrado, tales como, pero no se limitan a, segmentos de promotores y potenciadores del citomegalovirus (el promotor temprano inmediato, conjuntamente con el intrón A), virus 40 simio (el promotor temprano) y retrovirus (tales como el virus del sarcoma de Rous). Otras regiones de control de la transcripción incluyen las derivadas de genes de vertebrados tales como actina, proteína de choque térmico, hormona de crecimiento bovina y p-globina de conejo, así como otras secuencias capaces de controlar la expresión génica en células eucariotas. Las regiones de control de la transcripción adecuadas adicionales incluyen promotores y potenciadores específicos de tejido, así como promotores inducibles por linfocinas (por ejemplo, promotores inducibles por interferones o interleucinas).

Similarmente, los expertos habituales en la técnica conocen una variedad de elementos de control de la traducción. Estos incluyen, pero no se limitan a, sitios de unión al ribosoma, codones de inicio y terminación de la traducción, y elementos derivados de picornavirus (particularmente un sitio interno de entrada al ribosoma, o IRES, también denominada una secuencia CITE).

El término "expresión", como se usa en el presente documento, se refiere a un proceso por el que un polinucleótido produce un producto génico, por ejemplo, un ARN o un polipéptido. Incluye, sin limitación, la transcripción del polinucleótido en ARN mensajero (ARNm), ARN de transferencia (ARNt), ARN de horquilla pequeña (ARNhp), ARN interferente pequeño (ARNip), o cualquier otro producto de ARN, y la traducción de un ARNm en un polipéptido. La expresión produce un "producto génico". Como se usa en el presente documento, un producto génico puede ser o un ácido nucleico, por ejemplo, un ARN mensajero producido por transcripción de un gen, o un polipéptido que se traduce de un transcrito. Los productos génicos descritos en el presente documento incluyen además ácidos nucleicos con modificaciones postranscripcionales, por ejemplo, poliadenilación o corte y empalme, o polipéptidos con modificaciones postraduccionales, por ejemplo, metilación, glucosilación, la adición de lípidos, asociación con otras subunidades de proteína, o escisión proteolítica.

Un "vector" se refiere a cualquier vehículo para la clonación de y/o transferencia de un ácido nucleico en una célula hospedadora. Un vector puede ser un replicón al que se puede unir otro segmento de ácido nucleico de manera que provoque la replicación del segmento unido. Un "replicón" se refiere a cualquier elemento genético (por ejemplo, plásmido, fago, cósmido, cromosoma, virus) que actúa como una unidad de replicación autónoma in vivo, es decir, capaz de replicación bajo su propio control. El término "vector" incluye tanto vehículos virales como no virales para introducir el ácido nucleico en una célula in vitro, ex vivo o in vivo. Se conocen un gran número de vectores y se usan en la técnica incluyendo, por ejemplo, plásmidos, virus eucariotas modificados, o virus bacterianos modificados. La inserción de un polinucleótido en un vector adecuado se puede llevar a cabo uniendo los fragmentos de polinucleótidos apropiados en un vector elegido que tiene extremos cohesivos complementarios.

Los vectores se pueden manipular para codificar marcadores de selección o indicadores que proporcionan la selección o identificación de células que han incorporado el vector. La expresión de marcadores de selección o indicadores permite la identificación y/o selección de células hospedadoras que incorporan y expresan otras regiones codificantes contenidas sobre el vector. Los ejemplos de genes marcadores de selección conocidos y usados en la materia incluyen: genes que proporcionan resistencia a ampicilina, estreptomicina, gentamicina, kanamicina, higromicina, el herbicida bialafos, sulfonamida, y similares; y genes que se usan como marcadores fenotípicos, es decir, genes reguladores de antocianina, gen isopentanil transferasa, y similares. Los ejemplos de indicadores conocidos y usados en la materia incluyen: luciferasa (Luc), proteína verde fluorescente (GFP), cloranfenicol acetiltransferasa (CAT), -galactosidasa (LacZ), -glucuronidasa (Gus), y similares. También se puede considerar que los marcadores de selección son indicadores.

El término "plásmido" se refiere a un elemento extracromosómico que frecuentemente lleva un gen que no es parte del metabolismo central de la célula, y normalmente en forma de moléculas de ADN bicatenario circular. Dichos elementos pueden ser secuencias que se replican de forma autónoma, secuencias que se integran en el genoma, secuencias de fagos o nucleótidos, lineales, circulares, o superenrolladas, de un ADN o ARN mono o bicatenario, derivados de cualquier fuente, en las que varias secuencias de nucleótidos se han unido o recombinado en una única construcción que es capaz de introducir un fragmento de promotor y secuencia de ADN para un producto génico seleccionado junto con secuencia no traducida de 3' apropiada dentro de una célula.

Los vectores virales eucariotas que se pueden usar incluyen, pero no se limitan a, vectores de adenovirus, vectores de retrovirus, vectores de virus adeno-asociado, poxvirus, por ejemplo, vectores de virus de la variolovacuna, vectores de baculovirus, o vectores de virus del herpes. Los vectores no virales incluyen plásmidos, liposomas, lípidos eléctricamente cargados (citofectinas), complejos de ADN-proteína y biopolímeros.

Un "vector de clonación" se refiere a un "replicón", que es una unidad de longitud de un ácido nucleico que se replica secuencialmente y que comprende un origen de replicación, tal como un plásmido, fago o cósmido, al que se puede unir otro segmento de ácido nucleico de manera que provoque la replicación del segmento unido. Ciertos vectores de clonación son capaces de replicación en un tipo de célula, por ejemplo, bacterias, y expresión en otro, por ejemplo, células eucariotas. Los vectores de clonación normalmente comprenden una o más secuencias que se pueden usar para la selección de células que comprenden el vector y/o uno o más sitios de clonación múltiple para la inserción de secuencias de ácidos nucleicos de interés.

El término "vector de expresión" se refiere a un vehículo diseñado para permitir la expresión de una secuencia de ácidos nucleicos insertada tras la inserción en una célula hospedadora. La secuencia de ácidos nucleicos insertada se pone en asociación operativa con regiones reguladoras, como se ha descrito anteriormente.

Los vectores se introducen en células hospedadoras por métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, transfección, electroporación, microinyección, transducción, fusión de células, DEAE-dextrano, precipitación con fosfato de calcio, lipofección (fusión de lisosomas), uso de una pistola de genes, o un transportador de vector de ADN.

"Cultivo", "para cultivar" y "cultivar", como se usan en el presente documento, significa incubar células en condiciones in vitro que permite el crecimiento o división celular, o mantener las células en un estado vivo. "Células cultivadas", como se usa en el presente documento, significa células que son propagadas in vitro.

Como se usa en el presente documento, el término "polipéptido" pretende englobar un "polipéptido" singular, así como "polipéptidos" plurales, y se refiere a una molécula compuesta de monómeros (aminoácidos) linealmente unidos por enlaces amida (también conocidos como enlaces peptídicos). El término "polipéptido" se refiere a cualquier cadena o cadenas de dos o más aminoácidos, y no se refiere a una longitud específica de producto. Así, los péptidos, dipéptidos, tripéptidos, oligopéptidos, "proteína", "cadena de aminoácidos", o cualquier otro término usado para referirse a una cadena o cadenas de dos o más aminoácidos, están incluidos dentro de la definición de "polipéptido", y el término "polipéptido" se puede usar en lugar de, o indistintamente, con cualquiera de estos términos. El término "polipéptido" también pretende referirse a los productos de modificaciones posteriores a la expresión del polipéptido, que incluyen, sin limitación, glucosilación, acetilación, fosforilación, amidación, derivatización por grupos protectores/de bloqueo conocidos, escisión proteolítica, o modificación por aminoácidos que no existen de forma natural. Un polipéptido se puede obtener de una fuente biológica natural o se produce por tecnología recombinante, pero no se traduce necesariamente de una secuencia de ácidos nucleicos designada. Se puede generar de cualquier manera, incluyendo por síntesis química.

Un polipéptido "aislado" o un fragmento, variante, o derivado del mismo, se refiere a un polipéptido que no está en su ámbito natural. No se requiere nivel de purificación particular. Por ejemplo, un polipéptido aislado se puede retirar simplemente de su entorno nativo o natural. Los polipéptidos y proteínas recombinantemente producidos expresados en células hospedadoras se consideran aislados para el fin de la invención, ya que son polipéptidos nativos o recombinantes que han sido separados, fraccionados, o parcialmente o sustancialmente purificados, por cualquier técnica adecuada.

También se incluyen en la presente divulgación fragmentos o variantes de polipéptidos, y cualquier combinación de los mismos. El término "fragmento" o "variante", cuando se refiere a dominios de unión a polipéptido o moléculas de unión de la presente divulgación, incluye cualquier polipéptido que retenga al menos algunas de las propiedades (por ejemplo, afinidad de unión de FcRn por un dominio de unión de FcRn o variante de Fc, actividad de coagulación para una variante de FVIII, o la actividad de unión de FVIII para el fragmento de VWF) del polipéptido de referencia. Los fragmentos de polipéptidos incluyen fragmentos proteolíticos, así como fragmentos de deleción, además de los fragmentos específicos de anticuerpo tratados en cualquier parte en el presente documento, pero no incluyen el polipéptido de longitud completa que existe de forma natural (o polipéptido maduro). Las variantes de dominios de unión de polipéptido o moléculas de unión de la presente divulgación incluyen fragmentos como se ha descrito anteriormente, y también polipéptidos con secuencias de aminoácidos alteradas debido a sustituciones de aminoácidos, deleciones, o inserciones. Las variantes pueden existir de forma natural o no existir de forma natural. Las variantes que no existen de forma natural se pueden producir usando técnicas de mutagénesis conocidas en la técnica. Los polipéptidos de variante pueden comprender sustituciones conservativas o no conservativas de aminoácidos, deleciones o adiciones.

El término "fragmento de VWF" o "fragmentos de VWF", usado en el presente documento, significa cualquier fragmento de VWF que interacciona con FVIII y retiene al menos una o más propiedades que normalmente se proporcionan a FVIII por VWF de longitud completa, por ejemplo, previniendo la activación prematura para FVIIIa, previniendo la proteólisis prematura, previniendo la asociación con membranas de fosfolípido que podrían conducir a eliminación prematura, previniendo la unión a receptores de eliminación de FVIII que se pueden unir a FVIII desnudo, pero no a FVIII unido a VWF, y/o estabilizando las interacciones de cadenas pesadas y cadenas ligeras de FVIII. El término "fragmento de VWF", como se usa en el presente documento, no incluye proteína VWF de longitud completa o madura. En una realización particular, el "fragmento de VWF", como se usa en el presente documento, comprende un dominio D' y un dominio D3 de la proteína VWF, pero no incluye el dominio A1, el dominio A2, el dominio A3, el dominio D4, el dominio B1, el dominio B2, el dominio B3, el dominio C1, el dominio C2 y el dominio CK de la proteína VWF.

El término "factor limitante de la semivida" o "factor limitante de la semivida de FVIII", como se usa en el presente documento, indica un factor que previene que la semivida de una proteína FVIII sea más larga de 1,5 veces o 2 veces en comparación con FVIII no mutante (por ejemplo, ADVATE® o REFACTO®). Por ejemplo, VWF de longitud completa o madura puede actuar de factor limitante de la semivida de FVIII induciendo que el complejo de FVIII y VWF se elimine del sistema por una o más vías de eliminación de VWF. En un ejemplo, VWF endógeno es un factor limitante de la semivida de FVIII. En otro ejemplo, una molécula de VWF recombinante de longitud completa no covalentemente unida a una proteína FVIII es un factor limitante de la semivida de FVIII.

El término "VWF endógeno", como se usa en el presente documento, indica moléculas de VWF naturalmente presentes en el plasma. La molécula de VWF endógeno puede ser un multímero, pero puede ser un monómero o un dímero. El VWF endógeno en plasma se une a FVIII y forma un complejo no covalente con FVIII.

Una "sustitución de aminoácidos conservativa" es una en la que el resto de aminoácido se sustituye por un resto de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Se han definido en la técnica las familias de restos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares, que incluyen cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares sin carga (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales betaramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Así, si un aminoácido en un polipéptido se sustituye por otro aminoácido de la misma familia de cadena lateral, se considera que la sustitución es conservativa. En otra realización, una cadena de aminoácidos se puede sustituir conservativamente con una cadena estructuralmente similar que se diferencia en orden y/o composición de los miembros de familia de la cadena lateral.

Como se conoce en la técnica, la "identidad de secuencia" entre dos polipéptidos se determina comparando la secuencia de aminoácidos de un polipéptido con la secuencia de un segundo polipéptido. Cuando se trata en el presente documento, si cualquier polipéptido particular es al menos aproximadamente 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % o 100 % idéntico a otro polipéptido, se puede determinar usando métodos y programas informáticos/software conocidos en la técnica tales como, pero no se limitan a, el programa BESTFIT (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versión 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711). BESTFIT usa el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981), para encontrar el mejor segmento de homología entre dos secuencias. Cuando se usa BESTFIT o cualquier otro programa de alineamiento de secuencias para determinar si una secuencia particular es, por ejemplo, 95 % idéntica a una secuencia de referencia según la presente invención, los parámetros se establecen, por supuesto, de forma que el porcentaje de identidad se calcule con respecto a la longitud completa de la secuencia de polipéptidos referencia y que se permitan huecos en la homología de hasta el 5 % del número total de aminoácidos en la secuencia de referencia.

Como se usa en el presente documento, un "aminoácido correspondiente a" o un "aminoácido equivalente" en una secuencia de VWF o una secuencia de proteínas de FVIII se identifica por alineamiento para maximizar la identidad o similitud entre una primera secuencia de VWF o FVIII y una segunda secuencia de VWF o FVIII. El número usado para identificar un aminoácido equivalente en una segunda secuencia de VWF o FVIII se basa en el número usado para identificar el aminoácido correspondiente en la primera secuencia de VWF o FVIII.

Una proteína de "fusión" o "quimérica" comprende una primera secuencia de aminoácidos unida a una segunda secuencia de aminoácidos con la que no se une naturalmente en la naturaleza. Las secuencias de aminoácidos que normalmente existen en proteínas separadas se pueden poner juntas en el polipéptido de fusión, o las secuencias de aminoácidos que normalmente existen en la misma proteína se pueden poner en una nueva disposición en el polipéptido de fusión, por ejemplo, fusión de un dominio de factor VIII de la invención con un dominio Fc de inmunoglobulina. Una proteína de fusión se crea, por ejemplo, por síntesis química, o por creación y traducción de un polinucleótido en el que las regiones de péptido están codificadas en la relación deseada. Una proteína quimérica puede comprender además una segunda secuencia de aminoácidos asociada a la primera secuencia de aminoácidos por un enlace no peptídico covalente, o un enlace no covalente.

Como se usa en el presente documento, el término "semivida" se refiere a una semivida biológica de un polipéptido particular in vivo. La semivida se puede representar por el tiempo requerido para que la mitad de la cantidad administrada a un sujeto sea eliminada de la circulación y/u otros tejidos en el animal. Cuando se construye una curva de eliminación de un polipéptido dado en función del tiempo, la curva es normalmente bifásica con una fase a rápida y una fase p larga. La fase a normalmente representa un equilibrio del polipéptido de Fc administrado entre el espacio intra- y extra-vascular y se determina, en parte, por el tamaño del polipéptido. La fase p normalmente representa el catabolismo del polipéptido en el espacio intravascular. En algunas realizaciones, FVIII y las proteínas quiméricas que comprenden FVIII son monofásicas, y así no tienen una fase alfa, sino solo la fase beta individual. Por tanto, en ciertas realizaciones, el término semivida, como se usa en el presente documento, se refiere a la semivida del polipéptido en la fase p. La semivida típica de la fase p de un anticuerpo humano en seres humanos es 21 días.

El término "heterólogo", como se aplica a un polinucleótido o un polipéptido, significa que el polinucleótido o polipéptido deriva de una entidad distinta de la entidad con la que se compara. Por tanto, un polipéptido heterólogo unido a un fragmento de VWF significa una cadena de polipéptidos que se une a un fragmento de VWF y no es una parte que existe de forma natural del fragmento de VWF. Por ejemplo, un polinucleótido o antígeno heterólogo puede derivar de una especie diferente, tipo diferente de célula de un individuo, o el mismo tipo de célula o tipo diferente de individuos distintos.

El término "unido", como se usa en el presente documento, se refiere a una primera secuencia de aminoácidos o secuencia de nucleótidos covalentemente o no covalentemente unida a una segunda secuencia de aminoácidos o secuencia de nucleótidos, respectivamente. El término "covalentemente unido" o "enlace covalente" se refiere a un enlace covalente, por ejemplo, un enlace disulfuro, un enlace peptídico, o uno o más aminoácidos, por ejemplo, un conector, entre los dos restos que se unen juntos. La primera secuencia de aminoácidos o de nucleótidos se puede unir directamente o yuxtaponer con la segunda secuencia de aminoácidos o de nucleótidos, o alternativamente una secuencia intercalada puede unir covalentemente la primera secuencia con la segunda secuencia. El término "unido" significa no solo una fusión de una primera secuencia de aminoácidos con una segunda secuencia de aminoácidos en el extremo C o el extremo N, sino que también incluye la inserción de toda la primera secuencia de aminoácidos (o la segunda secuencia de aminoácidos) en cualesquiera dos aminoácidos en la segunda secuencia de aminoácidos (o la primera secuencia de aminoácidos, respectivamente). En una realización, la primera secuencia de aminoácidos se puede unir a una segunda secuencia de aminoácidos por un enlace peptídico o un conector. La primera secuencia de nucleótidos se puede unir a una segunda secuencia de nucleótidos por un enlace fosfodiéster o un conector. El conector puede ser un péptido o un polipéptido (para cadenas de polipéptidos) o un nucleótido o una cadena de nucleótidos (para cadenas de nucleótidos), o cualquier resto químico (para tanto cadenas de polipéptidos como de polinucleótidos). El enlace covalente se indica algunas veces como (-) o guión.

Como se usa en el presente documento, el término "asociado a" se refiere a un enlace covalente o no covalente formado entre una primera cadena de aminoácidos y una segunda cadena de aminoácidos. En una realización, el término "asociado a" significa un enlace no peptídico covalente, o un enlace no covalente. En algunas realizaciones, esta asociación se indica por dos puntos, es decir, (:). En otra realización, significa un enlace covalente, excepto un enlace peptídico. En otras realizaciones, el término "covalentemente asociado", como se usa en el presente documento, significa una asociación entre dos restos por un enlace covalente, por ejemplo, un enlace disulfuro, un enlace peptídico, o uno o más aminoácidos (por ejemplo, un conector). Por ejemplo, el aminoácido cisteína comprende un grupo tiol que puede formar un enlace disulfuro o puente con un grupo tiol en un segundo resto de cisteína. En la mayoría de las moléculas de IgG que existen de forma natural, las regiones CH1 y CL están asociadas por un enlace disulfuro y las dos cadenas pesadas están asociadas por dos enlaces disulfuro en las posiciones correspondientes a 239 y 242 usando el sistema de numeración de Kabat (posición 226 o 229, sistema de numeración EU). Los ejemplos de enlaces covalentes incluyen, pero no se limitan a, un enlace peptídico, un enlace metálico, un enlace de hidrógeno, un enlace disulfuro, un enlace sigma, un enlace pi, un enlace delta, un enlace glucosídico, un enlace agnóstico, un enlace flexionado, un enlace dipolar, un esqueleto pi, un doble enlace, un triple enlace, un cuádruple enlace, un quíntuple enlace, un séxtuple enlace, conjugación, hiperconjugación, aromaticidad, hapticidad, o antienlace. Los ejemplos no limitantes de enlace no covalente incluyen un enlace iónico (por ejemplo, enlace catión-pi o enlace de sal), un enlace metálico, un enlace de hidrógeno (por ejemplo, enlace de dihidrógeno, complejo de dihidrógeno, enlace de hidrógeno de baja barrera, o enlace de hidrógeno simétrico), fuerza de van der Walls, fuerza de dispersión de London, un enlace mecánico, un enlace halógeno, aurofilicidad, intercalación, apilamiento, fuerza entrópica o polaridad química.

El término "híbrido monómero-dímero" usado en el presente documento se refiere a una proteína quimérica que comprende una primera cadena de polipéptidos y una segunda cadena de polipéptidos, que están asociadas entre sí por un enlace disulfuro, en donde la primera cadena comprende un factor de coagulación, por ejemplo, factor VIII, y una región Fc y la segunda cadena comprende, consiste esencialmente en, o consiste en una región Fc sin el factor de coagulación. La construcción híbrida monómero-dímero es así un híbrido que comprende un aspecto de monómero que tiene solo un factor de coagulación y un aspecto de dímero que tiene dos regiones Fc.

Como se usa en el presente documento, el término "sitio de escisión" o "sitio de escisión enzimática" se refiere a un sitio reconocido por una enzima. Ciertos sitios de escisión enzimática comprenden un sitio de procesamiento intracelular. En una realización, un polipéptido tiene un sitio de escisión enzimática escindido por una enzima que se activa durante la cascada de coagulación, de forma que la escisión de dichos sitios ocurre en el sitio de formación del coágulo. A modo de ejemplo, dichos sitios incluyen, por ejemplo, los reconocidos por trombina, factor XIa o factor Xa. A modo de ejemplo, los sitios de escisión de FXIa incluyen, por ejemplo, TQSFNDFTR (SEQ ID NO: 47) y SVSQTSKLTR (SEq ID NO: 48). A modo de ejemplo, los sitios de escisión de trombina incluyen, por ejemplo, DFLAEGGGVR (SEQ ID NO: 49), TTKIKPR (SEQ ID NO: 50), LVPRG (SEQ ID NO: 55) y ALRPR (aminoácidos 1 a 5 de SEQ ID NO: 51). Se conocen en la técnica otros sitios de escisión enzimática.

Como se usa en el presente documento, el término "sitio de procesamiento" o "sitio de procesamiento intracelular" se refiere a un tipo de sitio de escisión enzimática en un polipéptido que es la diana para enzimas que funcionan después de la traducción del polipéptido. En una realización, dichas enzimas funcionan durante el transporte desde la luz de Golgi hasta el compartimento trans-Golgi. Las enzimas de procesamiento intracelular escinden polipéptidos antes de la secreción de la proteína de la célula. Los ejemplos de dichos sitios de procesamiento incluyen, por ejemplo, los dirigidos por la familia PACE/furina (donde PACE es un acrónimo de enzima de escisión de aminoácidos básicos emparejados) de endopeptidasas. Estas enzimas se localizan en la membrana de Golgi y escinden proteínas en el lado del extremo carboxi del motivo de secuencia Arg-[cualquier resto]-(Lys o Arg)-Arg. Como se usa en el presente documento, la familia de "furina" de enzimas incluye, por ejemplo, PCSK1 (también conocida como PC1/Pc3), PCSK2 (también conocida como PC2), PCSK3 (también conocida como furina o PACE), PCSK4 (también conocida como PC4), PCSK5 (también conocida como PC5 o PC6), PCSK6 (también conocida como PACE4), o PCSK7 (también conocida como PC7/LPC, PC8 o SPC7). Se conocen en la técnica otros sitios de procesamiento.

El término "furina" se refiere a las enzimas correspondientes a EC n° 3.4.21.75. La furina es una proproteína convertasa de tipo subtilisina, que también se conoce como PACE (enzima de escisión de aminoácidos básicos emparejados). La furina deleciona secciones de proteínas precursoras inactivas para convertirlas en proteínas biológicamente activas. Durante su transporte intracelular, se escinde el pro-péptido de la molécula de VWF maduro por una enzima furina en el Golgi.

En construcciones que incluyen más de un sitio de procesamiento o de escisión, se entenderá que dichos sitios pueden ser iguales o diferentes.

Trastorno hemostático, como se usa en el presente documento, significa una afección genéticamente heredada o adquirida caracterizada por una tendencia a hemorragia, o espontáneamente, o como resultado de traumatismo, debido a una capacidad alterada o incapacidad de formar un coágulo de fibrina. Los ejemplos de dichos trastornos incluyen las hemofilias. Las tres formas principales son hemofilia A (deficiencia de factor VIII), hemofilia B (deficiencia de factor IX o "enfermedad de Christmas") y hemofilia C (deficiencia de factor XI, tendencia a sangrado leve). Otros trastornos hemostáticos incluyen, por ejemplo, enfermedad de von Willebrand, deficiencia de factor XI (deficiencia de PTA), deficiencia de factor XII, deficiencias o anomalías estructurales en fibrinógeno, protrombina, factor V, factor VII, factor X o factor XIII, síndrome de Bernard-Soulier, que es un defecto o deficiencia en GPIb. GPIb, el receptor para VWF, puede ser defectuoso y conducir a una ausencia de formación de coágulos primarios (hemostasia primaria) y elevada tendencia al sangrado), y trombastenia de Glanzman y Naegeli (trombastenia de Glanzmann). En insuficiencia hepática (formas agudas y crónicas), existe producción insuficiente de factores de coagulación por el hígado; esto puede aumentar el riesgo de sangrado.

Las moléculas quiméricas de la invención se pueden usar profilácticamente. Como se usa en el presente documento, el término "tratamiento profiláctico" se refiere a la administración de una molécula antes de un episodio de sangrado. En una realización, el sujeto en necesidad de un agente hemostático general se somete a, o está a punto de someterse a, cirugía. La proteína quimérica de la invención se puede administrar antes o después de la cirugía como un profiláctico. La proteína quimérica de la invención se puede administrar durante o después de la cirugía para controlar un episodio de sangrado agudo. La cirugía puede incluir, pero no se limita a, trasplante de hígado, resección hepática, procedimientos dentales, o trasplante de células madre.

La proteína quimérica de la invención también se usa para tratamiento a demanda (también denominado "episódico"). El término "tratamiento a demanda" o "tratamiento episódico" se refiere a la administración de una molécula quimérica en respuesta a síntomas de un episodio de sangrado o antes de una actividad que puede provocar sangrado. En un aspecto, el tratamiento a demanda (episódico) se puede administrar a un sujeto cuando el sangrado empieza, tal como después de una lesión, o cuando se espera sangrado, tal como antes de cirugía. En otro aspecto, el tratamiento a demanda se puede administrar antes de actividades que aumentan el riesgo de sangrado, tales como deportes de contacto.

Como se usa en el presente documento, el término "sangrado agudo" se refiere a un episodio de sangrado independientemente de la causa subyacente. Por ejemplo, un sujeto puede tener traumatismo, uremia, un trastorno de sangrado hereditario (por ejemplo, deficiencia de factor VII), un trastorno plaquetario, o resistencia debido al desarrollo de anticuerpos contra factores de coagulación.

Tratar, tratamiento, tratando, como se usa en el presente documento, se refiere a, por ejemplo, la reducción en la gravedad de una enfermedad o afección; la reducción en la duración de una evolución de la enfermedad; la mejora de uno o más síntomas asociados a una enfermedad o afección; la provisión de efectos beneficiosos a un sujeto con una enfermedad o afección, sin curar necesariamente la enfermedad o afección, o la profilaxis de uno o más síntomas asociados a una enfermedad o afección. En una realización, el término "tratar" o "tratamiento" significa mantener un nivel valle de FVIII de al menos aproximadamente 1 UI/dL, 2 UI/dL, 3 UI/dL, 4 UI/dL, 5 UI/dL, 6 UI/dL, 7 UI/dL, 8 UI/dL, 9 UI/dL, 10 UI/dL, 11 UI/dL, 12 UI/dL, 13 UI/dL, 14 UI/dL, 15 UI/dL, 16 UI/dL, 17 UI/dL, 18 UI/dL, 19 UI/dL, o 20 UI/dL en un sujeto administrando una proteína quimérica de la invención. En otra realización, tratar o tratamiento significa mantener un nivel valle de FVIII entre aproximadamente 1 y aproximadamente 20 UI/dL, aproximadamente 2 y aproximadamente 20 UI/dL, aproximadamente 3 y aproximadamente 20 UI/dL, aproximadamente 4 y aproximadamente 20 UI/dL, aproximadamente 5 y aproximadamente 20 UI/dL, aproximadamente 6 y aproximadamente 20 UI/dL, aproximadamente 7 y aproximadamente 20 UI/dL, aproximadamente 8 y aproximadamente 20 UI/dL, aproximadamente 9 y aproximadamente 20 UI/dL, o aproximadamente 10 y aproximadamente 20 UI/dL. Tratamiento o tratar de una enfermedad o afección también puede incluir mantener la actividad de FVIII en un sujeto a un nivel comparable a al menos aproximadamente 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, o 20 % de la actividad de FVIII en un sujeto no hemofílico. El nivel valle mínimo requerido para el tratamiento se puede medir por uno o más métodos conocidos y se puede ajustar (aumentar o reducir) para cada persona.

Proteínas quiméricas

La presente invención se refiere a prolongar la semivida de una proteína factor VIII previniendo o inhibiendo que un factor limitante de la semivida de FVIII (por ejemplo, VWF endógeno) in vivo se asocie con la proteína FVIII. VWF endógeno se asocia con aproximadamente 95 % a aproximadamente 98 % de FVIII en complejos no covalentes. Se conoce que los VWF endógenos unidos a una proteína FVIII protegen FVIII de diversas formas. Por ejemplo, VWF de longitud completa (como un multímero que tiene aproximadamente 250 kDa) puede proteger FVIII de la escisión de proteasas y la activación de FVIII, estabilizar la cadena pesada y/o cadena ligera de FVIII, y prevenir la eliminación de FVIII por receptores depuradores. Sin embargo, al mismo tiempo, VWF endógeno limita la semivida de FVIII, previniendo la pinocitosis y eliminando el complejo FVIII-VWF del sistema mediante la vía de eliminación de VWF. Se cree, como se muestra en los ejemplos, que VWF endógeno es el factor limitante de la semivida que previene que la semivida de una proteína FVIII fusionada con un prolongador de la semivida sea más larga de aproximadamente dos veces la de FVIII no mutante. Por tanto, la presente invención previene o inhibe la interacción entre VWF endógeno y una proteína FVIII usando un resto auxiliar, en donde el resto auxiliar es un fragmento de VWF que comprende una dominio D' y un dominio D3 de VWF, previniendo así que la proteína FVIII se elimine mediante la vía de eliminación de VWF y/o induciendo pinocitosis. En una realización, el resto auxiliar es capaz de prevenir o inhibir la unión de la proteína FVIII con VWF endógeno y tiene al menos una propiedad protectora de FVIII de tipo VWF. Además, el resto auxiliar reduce la eliminación de FVIII del sistema previniendo o inhibiendo la interacción con VWF endógeno. Los restos auxiliares de la presente invención se unen a o asocian mediante enlace covalente con una proteína FVIII y/o bloquean física o químicamente el sitio de unión de VWF sobre la proteína FVIII. Así, la proteína FVIII asociada al resto auxiliar se elimina de la circulación más lentamente por uno o más receptores de eliminación de VWF, en comparación con FVIII no mutante o FVIII no asociado a un resto auxiliar. El resto auxiliar en la presente invención es un fragmento de VWF descrito en el presente documento. En una realización, el resto auxiliar se asocia (o une) con la proteína FVIII por un enlace covalente. Para prevenir la disociación del resto auxiliar con la proteína FVIII, el enlace entre la proteína FVIII y el resto auxiliar es un enlace covalente, por ejemplo, un enlace peptídico, uno o más aminoácidos, o un enlace disulfuro. En ciertas realizaciones, la asociación (es decir, enlace) entre el resto auxiliar y la proteína FVIII es un enlace peptídico o un conector entre la proteína FVIII y el resto auxiliar ("conector de FVIII/AM"). Los ejemplos no limitantes de conector se describen en cualquier parte en el presente documento. El resto auxiliar covalentemente asociado a la proteína FVIII es un fragmento de VWF descrito en cualquier parte en el presente documento.

En ciertas realizaciones, el resto auxiliar se une químicamente (por ejemplo, no covalentemente) a o bloquea físicamente uno o más sitios de unión de VWF sobre una proteína FVIII. El sitio de unión de VWF sobre una proteína FVIII se localiza dentro del dominio A3 o el dominio C2 de la proteína FVIII. En otras realizaciones más, el sitio de unión de VWF sobre una proteína FVIII se localiza dentro del dominio A3 y dominio C2. Por ejemplo, el sitio de unión de VWF sobre una proteína FVIII puede corresponder a los aminoácidos 1669 a 1689 y/o 2303 a 2332 de SEQ ID NO: 16 [FVIII maduro de longitud completa].

En otras realizaciones, una proteína quimérica de la invención comprende una proteína FVIII unida a un resto auxiliar, en donde el resto auxiliar es un fragmento de VWF que comprende un dominio D' y un dominio D3, pero que no contiene el sitio de unión de receptor de eliminación de VWF, y escuda o protege el sitio de unión de VWF sobre la proteína FVIII, inhibiendo o previniendo así la interacción de la proteína FVIII con VWF endógeno. En ciertas realizaciones, el fragmento de VWF útil para la presente invención contiene el dominio D' y el dominio D3, proporcionando aún una o más ventajas de la propiedad de tipo VWF a la proteína FVIII, pero el fragmento de VWF no se somete a la vía de eliminación de VWF. La proteína FVIII y el resto auxiliar se pueden asociar covalentemente por un conector (por ejemplo, conector de FVIII/AM). En una realización, el conector puede ser un conector escindible. Los ejemplos no limitantes de los conectores se desvelan en cualquier parte en el presente documento.

En un aspecto, la presente invención se refiere a una proteína quimérica o de fusión o híbrido que comprende uno o más de los fragmentos de VWF desvelados en el presente documento y usos de los mismos. La proteína quimérica o de fusión se puede fusionar o unir a uno o más restos heterólogos (algunas veces indicados en el presente documento como H o H1). En una realización, el resto heterólogo (H1) es un péptido heterólogo o un polipéptido heterólogo que no se produciría naturalmente y/o se une al fragmento de VWF. En otra realización, el resto heterólogo (H1) es un resto no de polipéptido, por ejemplo, modificación química o una combinación de un péptido o polipéptido y un resto no de polipéptido. En algunas realizaciones, los fragmentos de VWF están unidos o conectados al resto heterólogo (H1) por un conector (también denominado en el presente documento "conector de VWF"). En una realización, el conector de VWF es un conector escindible. Los ejemplos no limitantes del conector entre el fragmento de VWF y el resto heterólogo (H1) se desvelan en cualquier parte en el presente documento.

En una realización, el resto heterólogo (H1) útil en la invención mejora una o más propiedades farmacocinéticas de los fragmentos de VWF sin afectar significativamente la actividad biológica o función de los fragmentos de VWF (por ejemplo, su unión a o asociación con una proteína FVIII). En otra realización, el resto heterólogo (H1) unido al fragmento de VWF puede prolongar la semivida de los fragmentos de VWF. Los ejemplos no limitantes del resto heterólogo de polipéptido comprenden una región constante de inmunoglobulina o una porción de la misma, albúmina o un fragmento de la misma, un resto de unión a albúmina, una secuencia de PAS, una secuencia de HAP, transferrina o un fragmento de la misma, o dos o más combinaciones de los mismos. Los ejemplos no limitantes de resto no de polipéptido heterólogo incluyen polietilenglicol (PEG), ácido polisiálico, hidroxietilalmidón (HES), un derivado de los mismos, o cualquier combinación de los mismos.

En algunas realizaciones, se puede usar un resto heterólogo (H1) para conectar el fragmento de VWF y la proteína FVIII por un enlace covalente. Los ejemplos de resto heterólogo que pueden proporcionar el enlace covalente incluyen, pero no se limitan a, una región constante de inmunoglobulina o una porción de la misma que comprende una región bisagra, por ejemplo, una región Fc o un componente de unión de FcRn. En un ejemplo específico, la proteína FVIII se une a una primera región Fc, y el fragmento de VWF se une a una segunda región Fc, en donde la primera región Fc y la segunda región Fc forman uno o más enlaces disulfuro.

En algunas realizaciones, el resto heterólogo (algunas veces indicado en el presente documento por "H" o "H1") es una región constante de inmunoglobulina o una porción de la misma. Los ejemplos no limitantes de la región constante de inmunoglobulina o una porción de la misma se pueden seleccionar del grupo que consiste en un dominio CH1, un dominio CH2, un dominio CH3, un dominio CH4, un dominio bisagra, y dos o más combinaciones de los mismos. En una realización, la región constante de inmunoglobulina o una porción de la misma comprende al menos un dominio CH1, al menos un dominio CH2, al menos un dominio CH3, al menos un dominio CH4, o los fragmentos funcionales de los mismos. En otra realización, la región constante de inmunoglobulina o una porción de la misma comprende al menos un dominio bisagra o una porción del mismo y al menos un dominio CH2 o una porción del mismo (por ejemplo, en la orientación bisagra-CH2). En otras realizaciones, el dominio constante de la inmunoglobulina o una porción del mismo comprende al menos un dominio CH2 o una porción del mismo y al menos un dominio CH3 o una porción del mismo (por ejemplo, en la orientación CH2-CH3). Los ejemplos de la combinación incluyen, pero no se limitan a, un dominio CH2, un dominio CH3 y un dominio bisagra, que también se conoce como una región Fc (o dominio Fc), por ejemplo, una primera región Fc. En otras realizaciones, el resto heterólogo (H1) se une al fragmento de VWF por un conector. En ciertas realizaciones, el resto heterólogo (H1) es un componente de unión de FcRn como se describe en cualquier parte en el presente documento. En otras realizaciones, el resto heterólogo (H1) es una región bisagra.

En ciertas realizaciones, la proteína quimérica comprende además un segundo resto heterólogo (o adicional) (indicado algunas veces en el presente documento por "H2"). Se observa que el primer resto heterólogo (H1) y el segundo resto heterólogo (H2) se pueden usar indistintamente y pueden ser iguales o diferentes. El segundo resto heterólogo (H2) se puede unir a la proteína FVIII o en cualquier parte en la proteína quimérica por un enlace peptídico, uno o más aminoácidos, o por un conector (por ejemplo, conector de FVIII si se une a FVIII). Dichas construcciones se pueden denominar algunas veces heterodímero FVIII/VWF. En una realización, el resto heterólogo (H2) comprende un polipéptido heterólogo. En otra realización, el resto heterólogo (H2) comprende un resto no de polipéptido. En otras realizaciones, el resto heterólogo (H2) comprende una combinación de un resto heterólogo y un resto no de polipéptido. El segundo resto heterólogo (H2) puede ser un prolongador de la semivida.

Los ejemplos no limitantes del segundo resto heterólogo de polipéptido (H2) incluyen una región constante de inmunoglobulina o una porción de la misma, albúmina o un fragmento de la misma, un resto de unión a albúmina, una secuencia de PAS, una secuencia de HAP, transferrina o un fragmento de la misma, o dos o más combinaciones de los mismos. Los ejemplos no limitantes del resto no de polipéptido heterólogo incluyen polietilenglicol (PEG), ácido polisiálico, hidroxietilalmidón (HES), un derivado de los mismos, o cualquier combinación de los mismos. En ciertas realizaciones, el primer resto heterólogo (H1) y el segundo resto heterólogo son iguales o diferentes. Cualquiera o ambos del primer resto heterólogo (H1) y el segundo resto heterólogo (H2) pueden conferir prolongación de la semivida a la proteína FVIII en una proteína quimérica, proporcionar una conexión más fuerte que la asociación no covalente, es decir, por uno o más enlaces covalentes entre la proteína FVIII y el fragmento de VWF en una proteína quimérica, o ambos. Una vez el fragmento de VWF fusionado o unido al primer resto heterólogo (H1) retira el techo de semivida previniendo o inhibiendo la interacción entre la proteína FVIII y la proteína VWF endógeno, la proteína FVIII fusionada con los restos heterólogos puede llegar a su potencial completo y puede tener una semivida de más de dos veces en comparación con FVIII no mutante.

En ciertas realizaciones, el primer resto heterólogo (por ejemplo, una primera región Fc) unido al fragmento de VWF y el segundo resto heterólogo (por ejemplo, una segunda región Fc) unido a la proteína FVIII se asocian entre sí de forma que la asociación prevenga la sustitución del fragmento de VWF por VWF endógeno in vivo. En una realización, el segundo resto heterólogo es una segunda región Fc, en donde la segunda región Fc se une o asocia al primer resto heterólogo, por ejemplo, la primera región Fc, por un enlace covalente, por ejemplo, enlace disulfuro, un enlace peptídico, o un conector (uno o más aminoácidos). Por ejemplo, el segundo resto heterólogo (por ejemplo, la segunda región Fc) unido a la proteína FVIII en un extremo se puede unir además al primer resto heterólogo (por ejemplo, la primera región Fc) unido al fragmento de VWF por un conector (por ejemplo, conector scFc) o asociar al primer resto heterólogo por un enlace covalente. En otra realización, el segundo resto heterólogo (por ejemplo, la segunda región Fc) se une al fragmento de VWF que ya se une al primer resto heterólogo. En algunas realizaciones, la proteína quimérica comprende una primera cadena de polipéptidos que comprende un fragmento de VWF y un primer resto heterólogo y una segunda cadena de polipéptidos que comprende una proteína FVIII y un segundo resto heterólogo, en donde la primera cadena de polipéptidos y la segunda cadena de polipéptidos se asocian, en donde la asociación entre la primera cadena de polipéptidos que comprende el primer resto heterólogo y la segunda cadena de polipéptidos que comprende el segundo resto heterólogo es un enlace covalente, permitiendo así que el fragmento de VWF y la proteína FVIII mantengan su interacción entre sí. Al mismo tiempo, VWF endógeno, que puede formar un enlace no covalente con la proteína FVIII, no puede sustituir la cadena de polipéptidos covalentemente unida que comprende el fragmento de VWF.

El conector entre el primer resto heterólogo (H1) y el fragmento de VWF (por ejemplo, conector de VWF) puede ser un conector escindible, por ejemplo, un conector escindible de trombina. Los conectores escindibles se pueden escindir por una proteasa seleccionada del grupo que consiste en factor XIa, factor XIIa, calicreína, factor VIIa, factor IXa, factor Xa, factor IIa (trombina), elastasa-2, granzima-B, TEV, enterocinasa, proteasa 3C, sortasa A, MMP-12, MMP-13, MMP-17, MMP-20, y cualquier combinación de los mismos. Estos conectores escindibles permiten que el fragmento de VWF se escinda y disocie de la proteína FVIII tras la activación de la cascada de coagulación, dando como resultado una proteína FVIII con potencial de actividad completa.

En otras realizaciones, la proteína quimérica se produce como una cadena sencilla de polipéptidos que comprende un fragmento de VWF, un conector escindible, un primer resto heterólogo (H1), un conector procesable, una proteína FVIII y un segundo resto heterólogo (H2) en cualquier orden. Después de la síntesis, el conector procesable se puede escindir por una enzima proteasa intracelular antes de la secreción, haciendo así las dos cadenas de polipéptidos como se ha descrito anteriormente. En la construcción de cadena sencilla antes de la secreción, el segundo resto heterólogo (por ejemplo, la segunda región Fc) se puede unir al fragmento de VWF por un conector procesable. En ciertas realizaciones, uno o más conectores pueden comprender uno o más sitios de escisión.

En algunas realizaciones, la proteína quimérica de la invención comprende además un tercer resto heterólogo (algunas veces indicado en el presente documento por "H3"). El tercer resto heterólogo (H3) puede ser un prolongador de la semivida. El resto heterólogo (H3) puede comprender un polipéptido heterólogo, un resto no de polipéptido, o una combinación de ambos. Los ejemplos no limitantes del tercer resto heterólogo (H3) incluyen una región constante de inmunoglobulina o una porción de la misma, albúmina o un fragmento de la misma, un resto de unión a albúmina, una secuencia de PAS, una secuencia de HAP, transferrina o un fragmento de la misma, cualquier derivado o variante de los mismos, o dos o más combinaciones de los mismos. Los ejemplos no limitantes del resto no de polipéptido incluyen polietilenglicol (PEG), ácido polisiálico, hidroxietilalmidón (HES), un derivado de los mismos, o cualquier combinación de los mismos. El primer resto heterólogo (H1) unido al fragmento de VWF, el segundo resto heterólogo (H2) unido a la proteína FVIII y el tercer resto heterólogo (H3) pueden ser iguales o diferentes. En una realización, el primer resto heterólogo (H1) es idéntico al segundo resto heterólogo (H2), pero es diferente del tercer resto heterólogo (H3). En otra realización, el tercer resto heterólogo (H3) se fusiona o une a una proteína FVIII o un fragmento de VWF de la proteína quimérica. En algunas realizaciones, el tercer resto heterólogo se inserta dentro de uno o más dominios de la proteína FVIII o entre dos dominios de la proteína FVIII.

En una realización, una proteína quimérica comprende una primera cadena de polipéptidos y una segunda cadena de polipéptidos, en donde la primera cadena comprende una proteína FVIII unida a un primer resto heterólogo (H1), por ejemplo, una primera región Fc, por un conector opcional (por ejemplo, conector de FVIII) y la segunda cadena comprende un fragmento de VWF unido a un segundo resto heterólogo (H2), por ejemplo, una segunda región Fc, por un conector opcional (por ejemplo, conector de VWF). La proteína FVIII puede comprender además un tercer resto heterólogo (H3), por ejemplo, cualquier resto prolongador de la semivida, por ejemplo, albúmina, o una secuencia de PAS, entre la cadena pesada de FVIII y la cadena ligera de FVIII (es decir, resto de aminoácido 1648 de SEQ ID NO: 16), siendo así una proteína FVIII de cadena sencilla. Alternativamente, la proteína FVIII puede ser una proteína de cadena doble, es decir, la cadena pesada de FVIII y la cadena ligera de FVIII asociadas entre sí por un enlace covalente o no covalente (por ejemplo, un enlace metálico), en donde la cadena pesada se une además a un tercer resto heterólogo (H3), por ejemplo, un polipéptido prolongador de la semivida no estructural, albúmina o un fragmento de la misma, o una secuencia de PAS. En otra realización, una proteína quimérica comprende una primera cadena de polipéptidos y una segunda cadena de polipéptidos, en donde la primera cadena comprende una proteína FVIII unida a un primer resto heterólogo (H1), por ejemplo, una primera región Fc, por un conector opcional (por ejemplo, conector de FVIII) y la segunda cadena comprende un fragmento de VWF unido a un tercer resto heterólogo (H3), por ejemplo, un polipéptido prolongador de la semivida no estructural, albúmina o una secuencia de PAS, que se une a un segundo resto heterólogo (H2), por ejemplo, una segunda región Fc, por un conector opcional. En algunas realizaciones, el tercer resto heterólogo (H3) (por ejemplo, un polipéptido prolongador de la semivida) se puede unir al extremo C o extremo N de la proteína FVIII o insertar entre dos dominios de la proteína FVIII, o entre dos aminoácidos en un dominio de la proteína FVIII.

En otras realizaciones, la proteína quimérica de la invención comprende además un cuarto resto heterólogo (algunas veces indicado en el presente documento por "H4") y/o un quinto resto heterólogo (algunas veces indicado en el presente documento por "H5"). El cuarto o quinto resto heterólogo también pueden ser un prolongador de la semivida. El cuarto resto heterólogo y/o el quinto resto heterólogo pueden ser iguales o diferentes del tercer resto heterólogo. El resto heterólogo puede comprender un polipéptido heterólogo, un resto no de polipéptido, o una combinación de ambos. Los ejemplos no limitantes del cuarto o quinto resto heterólogo incluyen una región constante de inmunoglobulina o una porción de la misma, albúmina o un fragmento de la misma, un resto de unión a albúmina, una secuencia de PAS, una secuencia de HAP, transferrina o un fragmento de la misma, cualquier derivado o variante de los mismos, o dos o más combinaciones de los mismos. Los ejemplos no limitantes del resto no de polipéptido incluyen polietilenglicol (PEG), ácido polisiálico, hidroxietilalmidón (HES), un derivado de los mismos, o cualquier combinación de los mismos. El primer resto heterólogo, el segundo resto heterólogo, el tercer resto heterólogo, el cuarto resto heterólogo y el quinto resto heterólogo pueden ser iguales o diferentes. En algunas realizaciones, el cuarto resto heterólogo (por ejemplo, un polipéptido prolongador de la semivida) se puede unir al extremo C o extremo N de la proteína FVIII o insertar entre dos dominios de la proteína FVIII o entre dos aminoácidos en un dominio de la proteína FVIII. En otras realizaciones, el quinto resto heterólogo (por ejemplo, un polipéptido prolongador de la semivida) también se puede unir al extremo C o extremo N de la proteína FVIII o insertar entre dos dominios de la proteína FVIII o entre dos aminoácidos en un dominio de la proteína FVIII.

En ciertas realizaciones, la proteína quimérica comprende una proteína FVIII, un fragmento de VWF, un primer resto heterólogo, un segundo resto heterólogo, un tercer resto heterólogo, un cuarto resto heterólogo, y un quinto resto heterólogo, en donde el primer resto heterólogo y el segundo resto heterólogo forman un enlace (por ejemplo, un enlace covalente) entre la cadena que comprende la proteína FVIII y la cadena que comprende el fragmento de VWF, y el tercer resto heterólogo, el cuarto resto heterólogo y el quinto resto heterólogo son prolongadores de la semivida, y en donde el enlace entre la cadena que comprende la proteína FVIII y la cadena que comprende el fragmento de VWF es más fuerte que la interacción no covalente entre FVIII y el fragmento de VWF, previniendo así la unión de VWF endógeno a la proteína FVIII in vivo, in vitro, o ex vivo.

En otras realizaciones, la proteína quimérica comprende una proteína FVIII, un fragmento de VWF, un primer resto heterólogo, un segundo resto heterólogo, un tercer resto heterólogo, un cuarto resto heterólogo, un quinto resto heterólogo y un sexto resto heterólogo (algunas veces indicado en el presente documento como "H6"), en donde el primer resto heterólogo y el segundo resto heterólogo forman un enlace entre la cadena que comprende la proteína FVIII y la cadena que comprende el fragmento de VWF, y el tercer resto heterólogo, el cuarto resto heterólogo, el quinto resto heterólogo y el sexto resto heterólogo son prolongadores de la semivida, y en donde el enlace entre la cadena que comprende la proteína FVIII y la cadena que comprende el fragmento de VWF es más fuerte que la interacción entre FVIII y el fragmento de VWF, previniendo así la unión de VWF endógeno a la proteína FVIII in vivo, in vitro o ex vivo.

En algunos casos, una proteína quimérica comprende una fórmula seleccionada del grupo que consiste en:

(aa) V-L1-H1-L2-H2,

(bb) H2-L2-H1-L1 -V,

(cc) H1-L1-V-L2-H2, y

(dd) H2-L2-V-L1-H1,

en donde V comprende un fragmento de VWF descrito en el presente documento;

cada uno de L1 y L2 comprende un conector opcional; y

H1 comprende un primer resto heterólogo; y

H2 comprende un segundo resto heterólogo opcional. Cualquiera o ambos del primer resto heterólogo y el segundo resto heterólogo puede ser un resto prolongador de la semivida. En un caso, H1 comprende un polipéptido, un resto no de polipéptido, o ambos. El polipéptido útil como H1 puede comprender una región constante de inmunoglobulina o una porción de la misma, albúmina o un fragmento de la misma, un resto de unión a albúmina, una secuencia de PAS, una secuencia de HAP, cualquier derivado o variante, o cualquier combinación de los mismos. El resto no de polipéptido puede comprender polietilenglicol (PEG), ácido polisiálico y hidroxietilalmidón (HES), un derivado o variante de los mismos, o cualquier combinación de los mismos. En otro caso, H2 comprende un polipéptido, un resto no de polipéptido, o ambos. El polipéptido útil como H2 puede comprender una región constante de inmunoglobulina o una porción de la misma, albúmina o un fragmento de la misma, un resto de unión a albúmina, una secuencia de PAS, una secuencia de HAP, cualquier derivado o variante, o cualquier combinación de los mismos. El resto no de polipéptido puede comprender polietilenglicol (PEG), ácido polisiálico, hidroxietilalmidón (HES), un derivado o variante de los mismos, o cualquier combinación de los mismos. En ciertos casos, el conector entre H1 y H2 en las fórmulas (aa) y (bb) es un conector procesable. En otros casos, el conector entre el fragmento de VWF y H1 en las fórmulas (aa) y (bb) es un conector escindible, por ejemplo, un conector escindible de trombina que se puede escindir por trombina.

La orientación de las fórmulas de polipéptido en el presente documento se enumera de extremo N (izquierda) a extremo C (derecha). Por ejemplo, la fórmula H-L-V significa la fórmula NH2-H-L-V-COOH. En un caso, las fórmulas descritas en el presente documento pueden comprender secuencias adicionales entre los dos restos. Por ejemplo, la fórmula V-L1-H1-L2-H2 puede comprender además secuencias en el extremo N de V, entre V y L1, entre L1 y H1, entre H1 o L2, entre L2 o H2, o en el extremo C de H2, a menos que se especifique de otro modo. En otro caso, el guión (-) indica un enlace peptídico o uno o más aminoácidos.

En casos específicos, una proteína quimérica comprende, consiste esencialmente en, o consiste en una o más fórmulas seleccionadas del grupo que consiste en (a1) V-H, (a2) H-V, (a3) V-L-H, (a4) H-L-V, (a5) V-L1-H1-H2, (a6) H2-H1-L1 -V, (a7) V-L1-H1:H2, (a8) H2:H1-L1-V, (a9) V-H1:H2, (b1) H2:H1-V, (b2) V-L1-H1-L2-H2, (b3) H2-L2-H1-L1-V, (b4) H1-V-H2, (b5) H1-L1-V-L2-H2, y (b6) H2-L2-V-L1-H1, en donde V comprende uno o más de los fragmentos de VWF descritos en el presente documento, L, L1 o L2 comprende un conector, H o H1 comprende un primer resto heterólogo. En un caso, el primer resto heterólogo (H1) puede ser un polipéptido, un resto no de polipéptido, o ambos. El resto heterólogo de polipéptido puede comprender una región constante de inmunoglobulina o una porción de la misma, albúmina o un fragmento de la misma, un resto de unión a albúmina, una secuencia de PAS, una secuencia de HAP, o cualquier combinación de los mismos. Los ejemplos no limitantes del resto no de polipéptido útil como H1 incluyen polietilenglicol (PEG), ácido polisiálico, hidroxietilalmidón (HES), un derivado de los mismos, o cualquier combinación de los mismos. En otro caso, H2 comprende un segundo resto heterólogo. El segundo resto heterólogo puede ser un polipéptido, un resto no de polipéptido, o ambos. El resto heterólogo de polipéptido puede comprender una región constante de inmunoglobulina o una porción de la misma, albúmina o un fragmento de la misma, un resto de unión a albúmina, una secuencia de PAS, una secuencia de HAP, o cualquier combinación de los mismos. Los ejemplos no limitantes del resto no de polipéptido útil como H1 incluyen polietilenglicol (PEG), ácido polisiálico, hidroxietilalmidón (HES), un derivado de los mismos, o cualquier combinación de los mismos. En ciertos casos, el conector entre el primer resto heterólogo y el segundo resto heterólogo es un conector procesable. En otros casos, el conector entre el fragmento de VWF y el primer resto heterólogo o el segundo resto heterólogo es un conector escindible, que comprende uno o más sitios de escisión, por ejemplo, un conector escindible de trombina.

La proteína quimérica de la presente invención comprende una fórmula seleccionada del grupo que consiste en (aa), (bb), (cc), (dd), (a1), (a2), (a3), (a4), (a5), (a6), (a7), (a8), (a9), (b1), (b2), (b3), (b4), (b5) y (b6) y una proteína FVIII, que se une covalentemente o se asocia covalentemente al fragmento de VWF, el primer resto heterólogo (por ejemplo, una primera región Fc), o el segundo resto heterólogo (por ejemplo, una segunda región Fc) de la fórmula. En una realización, la proteína FVIII se une o asocia al fragmento de VWF por un enlace covalente o por un conector. En otra realización, la proteína FVIII se puede unir al primer resto heterólogo o el segundo resto heterólogo por un enlace covalente o por un conector.

En una realización, una proteína quimérica de la presente invención comprende un fragmento de VWF descrito en el presente documento unido covalentemente a o asociado covalentemente a una proteína FVIII. Por ejemplo, la proteína quimérica puede comprender un fragmento de VWF y una proteína FVIII, en donde el fragmento de VWF y la proteína FVIII se unen por un enlace no peptídico covalente, un enlace peptídico, o por un conector, por ejemplo, un conector escindible. En una realización específica, el fragmento de VWF y la proteína FVIII se unen a o interaccionan entre sí por uno o más enlaces disulfuro. En otra realización, el fragmento de VWF unido a o que interacciona con la proteína FVIII se une o fusiona con un primer resto heterólogo. En otras realizaciones, la proteína FVIII unida a o que interacciona con el fragmento de VWF se une además a un segundo resto heterólogo. En algunas realizaciones, el fragmento de VWF unido a o que interacciona con la proteína FVIII se une además a un primer resto heterólogo y la proteína FVIII se une además a un segundo resto heterólogo. En ciertas realizaciones, la primera cadena de polipéptidos que comprende el fragmento de VWF y el primer resto heterólogo y la segunda cadena de polipéptidos que comprende la proteína FVIII y el segundo resto heterólogo se asocian entre sí de forma que la asociación no permita la interacción de la proteína FVIII con otros restos, por ejemplo, VWF endógeno, en donde la asociación es un enlace covalente, por ejemplo, un enlace disulfuro.

Cada uno del fragmento de VWF o la proteína FVIII se puede unir o conectar al primer y segundo resto heterólogo por un conector, por ejemplo, un conector escindible, por ejemplo, un conector escindible de trombina. El conector entre el fragmento de VWF y el primer resto heterólogo se puede indicar en el presente documento como un conector de VWF. El conector entre la proteína FVIII y el segundo resto heterólogo se puede indicar en el presente documento como un conector de FVIII. O ambos del fragmento de VWF o la proteína FVIII se pueden unir o conectar al primer y segundo resto heterólogo por un conector, por ejemplo, un conector escindible, por ejemplo, un conector escindible de trombina. En ciertas realizaciones, el primer resto heterólogo unido al fragmento de VWF comprende un polipéptido, un resto no de polipéptido, o ambos. Los ejemplos no limitantes del primer resto heterólogo de polipéptido incluyen una región constante de inmunoglobulina o una porción de la misma, albúmina o un fragmento de la misma, un resto de unión a albúmina, una secuencia de PAS, una secuencia de HAP, transferrina o un fragmento de la misma, o dos o más combinaciones de los mismos. Los ejemplos no limitantes del resto no de polipéptido incluyen polietilenglicol (PEG), ácido polisiálico, hidroxietilalmidón (HES o HAES), un derivado o variante de los mismos, o cualquier combinación de los mismos. En otras realizaciones, el segundo resto heterólogo unido a la proteína FVIII comprende un polipéptido, un resto no de polipéptido, o ambos. Los ejemplos no limitantes del segundo resto heterólogo incluyen una región constante de inmunoglobulina o una porción de la misma, albúmina o un fragmento de la misma, un resto de unión a albúmina, una secuencia de PAS, una secuencia de HAP, transferrina o un fragmento de la misma, o dos o más combinaciones de los mismos. Los ejemplos no limitantes del resto no de polipéptido incluyen polietilenglicol (PEG), ácido polisiálico, hidroxietilalmidón (HES o HAES), un derivado o variante de los mismos, o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el fragmento de VWF se une a FVIII usando unión de proteínas in vitro mediada por sortasa. En algunas realizaciones, se usa un motivo de reconocimiento de sortasa.

En una realización, el primer resto heterólogo es una región constante de inmunoglobulina o una porción de la misma. En una realización particular, el primer resto heterólogo es una primera región Fc. En algunas realizaciones, el segundo resto heterólogo es una región constante de inmunoglobulina o una porción de la misma. En una realización específica, el segundo resto heterólogo es una segunda región Fc. En una realización particular, la proteína quimérica comprende un fragmento de VWF descrito en el presente documento y una proteína FVIII, en donde el fragmento de VWF se une a una región constante de inmunoglobulina o una porción de la misma, que es una región Fc. En otra realización, la proteína quimérica comprende un fragmento de VWF descrito en el presente documento y una proteína FVIII, en donde la proteína FVIII se une a una región constante de inmunoglobulina o una porción de la misma, que es una región Fc. En otras realizaciones, una proteína quimérica comprende un fragmento de VWF descrito en el presente documento y una proteína FVIII, en donde el fragmento de VWF se une a una primera región constante de inmunoglobulina, que es una primera región Fc, y la proteína FVIII se une a una segunda región constante de inmunoglobulina, que es una segunda región Fc, y en donde la primera región Fc o la segunda región Fc se asocian entre sí por un enlace covalente. En otras realizaciones más, el fragmento de VWF unido al primer resto heterólogo se une además al segundo resto heterólogo, por ejemplo, una segunda región Fc, por un conector, por ejemplo, un conector procesable. En un aspecto, el fragmento de VWF se une al primer resto heterólogo por un conector, por ejemplo, conector de VWF, por ejemplo, un conector escindible. En otro aspecto, la proteína FVIII se une al segundo resto heterólogo por un conector, por ejemplo, conector de FVIII, por ejemplo, un conector escindible. Los ejemplos no limitantes de restos heterólogos se desvelan en cualquier parte en el presente documento, por ejemplo, región constante de inmunoglobulina o una porción de la misma en los párrafos [0165] -[0193], albúmina, fragmento o variante de la misma en los párrafos [0194] -[0198], secuencias HAP en el párrafo [0293], transferrina, fragmentos, o variantes de la misma en los párrafos [0204] -[0205], polímero, por ejemplo, polietilenglicol, en los párrafos [0206] -[0213], HES en los párrafos [0214] -[0219], o P^sA en el párrafo [0220]- y secuencias pAs en los párrafos [0199] -[0202].

En algunas realizaciones, una proteína quimérica de la presente invención comprende, consiste esencialmente en, o consiste en una fórmula seleccionada del grupo que consiste en:

(a) V-L1-H1-L3-C-L2-H2,

(b) H2-L2-C-L3-H1-L1 -V,

(c) C-L2-H2-L3-V-L1-H1,

(d) H1-L1-V-L3-H2-L2-C,

(e) H1-L1-V-L3-C-L2-H2,

(g) H2-L2-C-L3-V-L1-H1,

(g) V-L1-H1-L3-H2-L2-C,

(g) C-L2-H2-L3-H1-L1 -V,

(i) H2-L3-H1-L1-V-L2-C,

(j) C-L2-V-L1-H1-L3-H2,

(k) V-L2-C-L1-H1-L3-H2, y

(l) H2-L3-H1-L1-C-L2-V,

en donde V es un fragmento de VWF descrito en el presente documento;

cada uno de L1 o L2 es un conector opcional, por ejemplo, un conector escindible, por ejemplo, un conector escindible de trombina;

L3 es un conector opcional, por ejemplo, un conector procesable

cada uno de H1 y H2 es un resto heterólogo opcional;

C es una proteína FVIII; y

(-) es un enlace peptídico o uno o más aminoácidos.

(m) V-L1 -H1 :H2-L2-C,

(n) V-L1 -H1 :C-L2-H2;

(o) H1-L1 -V:H2-L2-C;

(p) H1-L1 -V:C-L2-H2;

(q) V:C-L1-H1 :H2;

(r) V:H1-L1-C:H2;

(s) H2:H1-L1-C:V,

(t) C:V-L1-H1 :H2, y

(u) C:H1-L1-V:H2.

en donde V es un fragmento de VWF descrito en el presente documento;

cada uno de H1 o H2 es un resto heterólogo opcional;

(-) es un enlace peptídico o uno o más aminoácidos; y

C es una proteína FVIII; y (:) es un enlace covalente entre H1 y H2.

En una realización, uno o más de los restos heterólogos son un prolongador de la semivida. Los prolongadores de la semivida se conocen en la técnica, y ejemplos no limitantes de dichos prolongadores de la semivida incluyen una región constante de inmunoglobulina o una porción de la misma, albúmina o fragmento de la misma, un resto de unión a albúmina, una secuencia de PAS, una secuencia de HAP, transferrina o un fragmento de la misma, un derivado o variante de los mismos, o dos o más combinaciones de los mismos. El resto no de polipéptido puede comprender polietilenglicol (PEG), ácido polisiálico, hidroxietilalmidón (HES), un derivado de los mismos, o cualquier combinación de los mismos.

En una realización, (:) en las fórmulas (m) a (u) representa al menos un enlace no peptídico. En ciertas realizaciones, la asociación química, es decir, (:) es un enlace covalente. En otras realizaciones más, (:) es un enlace peptídico. Las fórmulas (a) -(u) están incluidas en el presente documento simplemente como ejemplos no limitantes de las construcciones de la presente invención. La orientación de las fórmulas de polipéptido se muestra de extremo N (izquierda) a extremo C (derecha). Por ejemplo, la fórmula V-L1-H1-L3-C-L2-H2 significa la fórmula NH2-V-L1-H1-L3-C-L2-H2-COOH. Además, (:) puede ser una asociación o interacción entre dos cadenas de polipéptidos por un enlace covalente entre cualquier parte de la primera cadena y cualquier parte de la segunda cadena, a menos que se indique lo contrario. Por ejemplo, la fórmula V-H1 :H2-C tiene dos cadenas de polipéptidos, siendo la primera cadena V-H1 y siendo la segunda cadena C-H2, en donde V en la primera cadena interacciona o se asocia con C en la segunda cadena y/o H1 en la primera cadena interacciona o se asocia con H2 en la segunda cadena.

En ciertas realizaciones, una proteína quimérica comprende, consiste esencialmente en, o consiste en una fórmula seleccionada del grupo que consiste en:

(1) V:C, (2) H-V:C o C:V-H,

(3) V:C-H o H-C:V, (4) V-H1 :H2-C o H1-V:C-H2,

(5) V:C-H1:H2 o H2:H1-C:V, (6) H2:H1-V:C o C:V-H1:H2,

(7) H-L-V:C o C:V-L-H, (8) V:C-L-H o H-L-C:V,

(9) V-C o C-V, (10) H-V-C o C-V-H,

(11) V-H-C o C-H-V, (12) V-C-H o H-C-V,

(13) V-H1-C-H2 o H2-C-H1-V, (14) H1-V-C-H2 o H2-C-V-H1,

(15) H1-V-H2-C o C-H2-V-H1, (16) V-H1-H2-C o C-H2-H1-V,

(17) V-L-C o C-L-V, (18) H-L-V-C o C-V-L-H,

(19) H-V-L-C o C-L-V-H, (20) V-L-H-C o C-H-L-V,

(21) V-H-L-C o C-L-H-V, (22) V-L-C-H o H-C-L-V,

(23) V-C-L-H o H-L-C-V, (24) H-L1-V-L2-C o C-L2-V-L1-H,

(25) V-L-H1 :H2-C o C-H2:H1-L-V,

(26) V-H1 :H2-L-C o C-L-H2:H1-V,

(27) V:C-H1-H2 o H2-H1-C:V,

(28) H2-H1-V:C o C:V-H1-H2,

(29) V:C-L-H1:H2 o H2:H1-L-C:V,

(30) H2:H1-L-V:C o C:V-L-H1:H2,

(31) V-L1-H1 :H2-L2-C o L-L2-H2:H1-L1-V,

(32) V:C-L-H1-H2 o H2-H1-L-C:V,

(33) V:C-H1-L-H2 o H2-L-H1-C:V,

(34) V:C-L1 -H1-L2-H2 o H2-L2-H1-L1 -C:V,

(35) H2-H1-V:C o C:V-H1-H2,

(36) H2-H1-L-V:C o C:V-L-H1-H2,

(37) H2-L-H1-V:C o C:V-H1-L-H2,

(38) H2-L2-H1-L1 -V:C o C:V-L1 -H1-L2-H2,

(39) V-L1-H-L2-C o C-L2-H-L1 -V,

(40) V-L1-C-L2-H o H-L2-C-L1 -V,

(41) V-L-H 1-C-H2 o H2-C-H1-L-V,

(42) V-H1-C-L-H2 o H2-L-C-H1-V,

(43) V-H1-L-C-H2 o H2-C-L-H1-V,

(44) H1-L-V-C-H2 o H2-C-V-L-H1,

(45) H1-V-L-C-H2 o H2-C-L-V-H1,

(46) H1-V-C-L-H o H-L-C-V-H1,

(47) H1-L-V-H2-C o C-H2-V-L-H1,

(48) H1-V-L-H2-C o C-H2-L-V-H1,

(49) H1-V-H2-L-C o C-L-H2-V-H1,

(50) V-L-H1-H2-C o C-H2-H1-L-V,

(51) V-H1-L-H2-C o C-H2-L-H1-V,

(52) V-H1-H2-L-C o C-L-H2-H1-V,

(53) V-L1-H1-L2-C-H2 o H2-C-L2-H1-L1 -V,

(54) V-L1-H1-C-L2-H2 o H2-L2-C-H1-L1 -V,

(55) V-L1-H1-L2-C-L3-H2 o H2-L3-C-L2-H1-L1 -V,

(56) V-H1-L1-C-L2-H2 o H2-L2-C-L1-H1-V,

(57) H1-L1-V-L2-C-H2 o H2-C-L2-V-L1 -H1,

(58) H1-L1-V-C-L2-H2 o H2-L2-C-V-L1 -H1,

(59) H1-L1-V-L2-C-L3-H2 o H2-L3-C-L2-V-L1 -H1,

(60) H1-V-L1-C-L2-H2 o H2-L2-C-L1-V-H1,

(61) H1-L1-V-L2-H2-C o C-H2-L2-V-L1 -H1,

(62) H1-L1-V-H2-L2-C o C-L2-H2-V-L1 -H1,

(63) H1-L1-V-L2-H2-L3-C o C-L3-H2-L2-V-L1 -H1,

(64) H1-V-L1-H2-L2-C o C-L2-H2-L1-V-H1,

(65) V-L1-H1-L2-H2-C o C-H2-L2-H1-L1 -V,

(66) V-L1-H1-H2-L2-C o C-L2-H2-H1-L1 -V,

(67) V-L1-H1-L2-H2-L3-C o C-L3-H2-L2-H1-L1 -V, y

(68) V-H1-L1-H2-L2-C o C-L2-H2-L1-H1-V,

V es un fragmento de VWF descrito en el presente documento;

C es una proteína FVIII;

H o H1 es un resto heterólogo o un primer resto heterólogo;

H2 es un segundo resto heterólogo; el primer y segundo restos heterólogos pueden ser iguales o diferentes; cada uno de L, L1 o L2 es un conector opcional;

(-) es un enlace peptídico o uno o más aminoácidos; y

(:) es un enlace covalente. Los conectores pueden cada uno ser iguales o diferentes y pueden cada uno ser un conector escindible, que comprende uno o más sitios de escisión enzimática. Los restos heterólogos pueden ser una tecnología de prolongación de la semivida que se conoce en la técnica, un polipéptido, un resto no de polipéptido, o ambos. Un resto de polipéptido puede comprender una región constante de inmunoglobulina o una porción de la misma, albúmina o un fragmento de la misma, un resto de unión a albúmina, una secuencia de PAS, una secuencia de HAP, cualquier derivado o variante de los mismos, o cualquier combinación de los mismos (por ejemplo, una región Fc). Un resto no de polipéptido puede comprender polietilenglicol (PEG), ácido polisiálico, hidroxietilalmidón (HES), un derivado o variante de los mismos, o cualquier combinación de los mismos. Cada uno de H, H1 o H2 se puede seleccionar individualmente basándose en las características y pueden ser todos iguales, o cada uno diferente. Los ejemplos no limitantes de restos heterólogos se desvelan en cualquier parte en el presente documento, por ejemplo, región constante de inmunoglobulina o una porción de la misma en los párrafos [0126] -[0153], albúmina o fragmento o variante de la misma en los párrafos [0154] -[0157], polímero, por ejemplo, polietilenglicol, en los párrafos [0166] -[0173], y secuencias PAS en los párrafos [0159] -[0162]. Las fórmulas (1) -(68) están incluidas en el presente documento simplemente como ejemplos no limitantes de construcciones de la presente invención.

En una realización, (:) representa al menos un enlace no peptídico. En ciertas realizaciones, la asociación química, es decir, (:) es un enlace covalente. En otras realizaciones más, (:) es un enlace peptídico.

En una realización, el primer resto heterólogo (H o H1) unido al fragmento de VWF en la proteína quimérica es una primera región Fc. En otra realización, el segundo resto heterólogo (o H2) unido a la proteína FVIII en la proteína quimérica es una segunda región Fc.

En ciertas realizaciones, una proteína quimérica de la invención comprende dos cadenas de polipéptidos, una primera cadena que comprende, consiste esencialmente en, o que consiste en una secuencia de aminoácidos que codifica FVIII (por ejemplo, FVIII de cadena sencilla) y un primer resto heterólogo (por ejemplo, una primera región Fc) y una segunda cadena que comprende, consiste esencialmente en, o que consiste en una secuencia de aminoácidos que codifica un fragmento de VWF que comprende dominio D' y dominio D3, un segundo resto heterólogo (por ejemplo, una segunda región Fc), y un conector entre el fragmento de VWF y el segundo dominio Fc (por ejemplo, conector de VWF). El conector entre el fragmento de VWF y el segundo dominio Fc puede ser un conector escindible de trombina. En algunas realizaciones, la proteína FVIII de cadena sencilla comprende un tercer resto heterólogo, por ejemplo, un prolongador de la semivida, que se une al extremo N, extremo C, o uno o más sitios dentro de la secuencia de FVIII.

En otras realizaciones, una proteína quimérica de la invención comprende tres cadenas de polipéptidos, en donde una primera cadena comprende, consiste esencialmente en, o consiste en una cadena pesada de FVIII, una segunda cadena comprende, consiste esencialmente en, o consiste en una cadena ligera de FVIII fusionada con un primer resto heterólogo (por ejemplo, una primera región Fc), y una tercera cadena de polipéptidos comprende, consiste esencialmente en, o consiste en un fragmento de VWF que comprende el dominio D' y el dominio D3, un segundo resto heterólogo (por ejemplo, una segunda región Fc) y un conector. El conector entre el fragmento de VWF y el segundo resto heterólogo puede ser un conector escindible de trombina. En algunas realizaciones, la cadena pesada FVIII se une a un tercer resto heterólogo, por ejemplo, un prolongador de la semivida, que se puede unir al extremo N, extremo C, o uno o más sitios dentro de la secuencia de FVIII.

Aún en otras realizaciones, una proteína quimérica de la invención comprende dos cadenas de polipéptidos, una primera cadena que comprende, consiste esencialmente en, o que consiste en una cadena pesada de FVIII y una segunda cadena que comprende, consiste esencialmente en, o que consiste en una cadena ligera de FVIII, un primer resto heterólogo (por ejemplo, una primera región Fc), un primer conector (por ejemplo, un sitio de escisión de proteasa que comprende uno o más sitios de procesamiento intracelular), un fragmento de VWF, un segundo conector (por ejemplo, un conector escindible de trombina), y un segundo resto heterólogo (por ejemplo, una segunda región Fc), en donde la cadena ligera de FVIII se une al primer resto heterólogo (por ejemplo, la primera región Fc), que se une además al fragmento de VWF por el primer conector (por ejemplo, un conector procesable que tiene un sitio de escisión de proteasa que comprende uno o más sitios de procesamiento intracelular), y en donde el fragmento de VWF se une a la segunda región Fc por el segundo conector (por ejemplo, un conector escindible de trombina). En ciertas realizaciones, el primer conector y el segundo conector son idénticos o diferentes. En ciertas realizaciones, una proteína quimérica de la invención comprende una cadena de polipéptidos, que comprende una proteína FVIII de cadena sencilla, un primer resto heterólogo (por ejemplo, una primera región Fc), un primer conector (por ejemplo, un conector escindible de trombina), un fragmento de VWF, un segundo conector (por ejemplo, un conector escindible de trombina), y un segundo resto heterólogo (por ejemplo, una segunda región Fc), en donde la proteína FVIII de cadena sencilla se une al primer resto heterólogo, que también se une al fragmento de VWF por el primer conector, y el fragmento de VWF se une a la segunda región Fc por el segundo conector. En una realización, el primer conector es un conector escindible que comprende un primer sitio escindible y un segundo sitio escindible. En otra realización, el segundo conector es un conector escindible que comprende uno o dos sitios escindibles. En una realización específica, el segundo conector es un conector escindible de trombina. El conector útil en la invención puede ser de cualquier longitud, por ejemplo, al menos 10, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600 o 700 aminoácidos. Por ejemplo, el conector puede ser 20 aminoácidos, 35 aminoácidos, 42 aminoácidos, 73 aminoácidos, o 98 aminoácidos.

En ciertas realizaciones, el fragmento de VWF se une directamente a la proteína FVIII por un enlace peptídico o un conector. Como una forma de unir el fragmento de VWF y la proteína FVIII directamente o mediante un conector, se puede emplear una unión enzimática (por ejemplo, sortasa). Por ejemplo, sortasa se refiere a un grupo de enzimas procariotas que modifican las proteínas de la superficie reconociendo y escindiendo una señal de clasificación de extremo carboxilo. Para la mayoría de los sustratos de enzimas sortasas, la señal de reconocimiento consiste en el motivo LPXTG (Leu-Pro-cualquiera-Thr-Gly (SEQ ID NO: 106), luego una secuencia transmembranaria altamente hidrófoba, luego una agrupación de restos básicos tales como arginina. La escisión ocurre entre Thr y Gly, con unión transitoria mediante el resto de Thr debido al resto de Cys de sitio activo de un componente de unión, seguido por transpeptidación que une la proteína covalentemente a la pared celular. En algunas realizaciones, el componente de unión contiene Gly(n).

En una realización, un fragmento de VWF unido a un motivo de reconocimiento de sortasa por un conector opcional se puede fusionar con una proteína FVIII unida a Gly(n) por una sortasa, en donde n puede ser cualquier número entero. Una construcción de unión comprende el fragmento de VWF (porción de extremo N de la construcción) y la proteína FVIII (porción de extremo C de la construcción), en donde el motivo de reconocimiento de sortasa se inserta

entre medias. Una construcción a modo de ejemplo se muestra en la Figura 24(A). Otra construcción de unión

comprende el fragmento de VWF (porción de extremo N de la construcción, el conector, el motivo de reconocimiento

de sortasa y la proteína FVIII (porción de extremo C de la construcción) (por ejemplo, Figura 24(C)). En otra

realización, una proteína FVIII unida a un motivo de reconocimiento de sortasa por un conector opcional se puede

fusionar con un fragmento de VWF unido a Gly(n) por una sortasa, en donde n es cualquier número entero. Una

construcción de unión resultante comprende la proteína FVIII (porción de extremo N de la construcción) y el

fragmento de VWF (porción de extremo C de la construcción), en donde el motivo de reconocimiento de sortasa se

inserta entremedias. Una construcción a modo de ejemplo se muestra en la Figura 24(B). Otra construcción de unión

resultante comprende la proteína FVIII (porción de extremo N de la construcción), el conector, el motivo de

reconocimiento de sortasa y el fragmento de VWF (porción de extremo C de la construcción) (por ejemplo, la Figura

24(D)). En otras realizaciones, un fragmento de VWF unido a un motivo de reconocimiento de sortasa por un primer

conector opcional se puede fusionar con un resto heterólogo, por ejemplo, una región constante de inmunoglobulina

o una porción de la misma, por ejemplo, una región Fc, unida a un sitio de escisión de trombina por un segundo

conector opcional. Una construcción resultante puede comprender el fragmento de VWF (porción de extremo N), el

primer conector, el motivo de reconocimiento de sortasa, el sitio de escisión de proteasa, el segundo conector

opcional y el resto heterólogo (por ejemplo, Figura 24(E)). En ciertas realizaciones, esta construcción resultante es

una parte de una proteína quimérica que comprende la proteína FVIII y un segundo resto heterólogo, por ejemplo,

una región constante de inmunoglobulina o una porción de la misma, por ejemplo, una segunda región Fc. En un

ejemplo, en otro ejemplo, un quimérico comprende tres cadenas de polipéptidos, comprendiendo la primera cadena

un fragmento de VWF, el primer conector, el motivo de reconocimiento de sortasa, el sitio de escisión de proteasa, el

segundo conector opcional, el primer resto heterólogo, la segunda cadena que comprende la cadena ligera de la

proteína FVIII y el segundo resto heterólogo, y comprendiendo la tercera cadena la cadena pesada de la proteína

FVIII.

En otras realizaciones más, la proteína quimérica de la invención que comprende un fragmento de VWF y una

proteína FVIII, en donde el fragmento de VWF y la proteína FVIII se asocian covalentemente entre sí o se unen

covalentemente entre sí, tiene menos inmunogenicidad que una proteína FVIII sin el fragmento de VWF. La reducida

inmunogenicidad incluye, pero no se limita a, menos respuesta inmunitaria humoral, por ejemplo, menos título de

anticuerpo neutralizante, o menos respuesta inmunitaria celular contra FVIII, por ejemplo, producción de diversas

citocinas.

Aún en otras realizaciones, como resultado de la invención, la semivida de la proteína FVIII (o una proteína

quimérica) se prolonga en comparación con una proteína FVIII sin el fragmento de VWF o FVIII no mutante. La

semivida de la proteína FVIII es al menos aproximadamente 1,5 veces, al menos aproximadamente 2 veces, al

menos aproximadamente 2,5 veces, al menos aproximadamente 3 veces, al menos aproximadamente 4 veces, al

menos aproximadamente 5 veces, al menos aproximadamente 6 veces, al menos aproximadamente 7 veces, al

menos aproximadamente 8 veces, al menos aproximadamente 9 veces, al menos aproximadamente 10 veces, al

menos aproximadamente 11 veces, o al menos aproximadamente 12 veces más larga que la semivida de una

proteína FVIII sin el fragmento de VWF. En una realización, la semivida de FVIII es aproximadamente 1,5 veces a

aproximadamente 20 veces, aproximadamente 1,5 veces a aproximadamente 15 veces, o aproximadamente 1,5

veces a aproximadamente 10 veces más larga que la semivida de FVIII no mutante. En otra realización, la semivida

de FVIII se prolonga aproximadamente 2 veces a aproximadamente 10 veces, aproximadamente 2 veces a

aproximadamente 9 veces, aproximadamente 2 veces a aproximadamente 8 veces, aproximadam aproximadamente 7 veces, aproximadamente 2 veces a aproximadamente 6 veces, aproximadam aproximadamente 5 veces, aproximadamente 2 veces a aproximadamente 4 veces, aproximadam aproximadamente 3 veces, aproximadamente 2,5 veces a aproximadamente 10 veces, aproximadamente 2,5 veces

a aproximadamente 9 veces, aproximadamente 2,5 veces a aproximadamente 8 veces, aproximadamente 2,5 veces

a aproximadamente 7 veces, aproximadamente 2,5 veces a aproximadamente 6 veces, aproximadamente 2,5 veces

a aproximadamente 5 veces, aproximadamente 2,5 veces a aproximadamente 4 veces, aproximadamente 2,5 veces

a aproximadamente 3 veces, aproximadamente 3 veces a aproximadamente 10 veces, aproximadamente 3 veces a

aproximadamente 9 veces, aproximadamente 3 veces a aproximadamente 8 veces, aproximadam aproximadamente 7 veces, aproximadamente 3 veces a aproximadamente 6 veces, aproximadam aproximadamente 5 veces, aproximadamente 3 veces a aproximadamente 4 veces, aproximadam aproximadamente 6 veces, aproximadamente 5 veces a aproximadamente 7 veces, o aproximadamente 6 veces a

aproximadamente 8 veces en comparación con FVIII no mutante o una proteína FVIII sin el fragmento de VWF. En

otras realizaciones, la semivida de FVIII es al menos aproximadamente 17 horas, al menos aproximadamente 18

horas, al menos aproximadamente 19 horas, al menos aproximadamente 20 horas, al menos aproximadamente 21

horas, al menos aproximadamente 22 horas, al menos aproximadamente 23 horas, al menos aproximadamente 24

horas, al menos aproximadamente 25 horas, al menos aproximadamente 26 horas, al menos aproximadamente 27

horas, al menos aproximadamente 28 horas, al menos aproximadamente 29 horas, al menos aproximadamente 30

horas, al menos aproximadamente 31 horas, al menos aproximadamente 32 horas, al menos aproximadamente 33

horas, al menos aproximadamente 34 horas, al menos aproximadamente 35 horas, al menos aproximadamente 36

horas, al menos aproximadamente 48 horas, al menos aproximadamente 60 horas, al menos aproximadamente 72

horas, al menos aproximadamente 84 horas, al menos aproximadamente 96 horas, o al menos aproximadamente

108 horas. En otras realizaciones más, la semivida de FVIII es aproximadamente 15 horas a aproximadamente dos semanas, aproximadamente 16 horas a aproximadamente una semana, aproximadamente 17 horas a aproximadamente una semana, aproximadamente 18 horas a aproximadamente una semana, aproximadamente 19 horas a aproximadamente una semana, aproximadamente 20 horas a aproximadamente una semana, aproximadamente 21 horas a aproximadamente una semana, aproximadamente 22 horas a aproximadamente una semana, aproximadamente 23 horas a aproximadamente una semana, aproximadamente 24 horas a aproximadamente una semana, aproximadamente 36 horas a aproximadamente una semana, aproximadamente 48 horas a aproximadamente una semana, aproximadamente 60 horas a aproximadamente una semana, aproximadamente 24 horas a aproximadamente seis días, aproximadamente 24 horas a aproximadamente cinco días, aproximadamente 24 horas a aproximadamente cuatro días, aproximadamente 24 horas a aproximadamente tres días, o aproximadamente 24 horas a aproximadamente dos días.

En ciertas realizaciones, la semivida de la proteína FVIII unida covalentemente al fragmento de VWF se puede prolongar en ratones doblemente inactivados ("DKO") en FVIII/VWF en comparación con un polipéptido que consiste en FVIII o un híbrido monómero-dímero de FVIII.

A) Fragmentos de factor de von Willebrand (VWF)

VWF (también conocido como F8VWF) es una glucoproteína multimérica grande presente en plasma sanguíneo y producido constitutivamente en endotelio (en los cuerpos de Weibel-Palade), megacariocitos (a-gránulos de plaquetas) y tejido conjuntivo subendotelial. El monómero básico de VWF es una proteína de 2813 aminoácidos. Cada monómero contiene varios dominios específicos con una función específica, los dominios D' y D3 (que juntos se unen al factor VIII), el dominio A1 (que se une a receptor de GPIb de plaquetas, heparina, y/o posiblemente colágeno), el dominio A3 (que se une a colágeno), el dominio C1 (en el que el dominio de RGD se une a integrina de plaquetas aIIbp3 cuando ésta se activa), y el dominio de "nudo de cisterna" en el extremo C de la proteína (cuyo VWF comparte con factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor de crecimiento transformante p (TGFp) y gonadotropina coriónica humana p (pHCG)).

La secuencia de aminoácidos del monómero 2813 para VWF humano se informa como Número de acceso_NP_000543.2_en Genbank. La secuencia de nucleótidos que codifica el VWF humano se informa como Número de acceso_NM_000552.3_en Genbank. La secuencia de nucleótidos de VWF humano se designa SEQ ID NO: 1. SEQ ID NO: 2 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID NO: 1. Cada dominio de VWF se enumera en la Tabla 1.

Tabla 1

La presente invención se refiere a un fragmento de factor de von Willebrand (VWF) que comprende un dominio D' y un dominio D3 de VWF, en donde el fragmento de VWF inhibe la unión de VWF endógeno (VWF de longitud completa) a una proteína FVIII. En una realización, el fragmento de VWF se une por un enlace covalente a una proteína FVIII. El fragmento de VWF de la invención protege FVIII de la escisión por proteasa y activación de FVIII, estabiliza la cadena pesada y cadena ligera de FVIII, y previene la eliminación de FVIII por receptores depuradores. En otra realización, el fragmento de VWF se une por un enlace covalente a una proteína FVIII y bloquea o previene la unión de la proteína FVIII a fosfolípido y proteína C activada. Previniendo o inhibiendo la unión de la proteína FVIII con VWF endógeno de longitud completa, el fragmento de VWF de la invención reduce la eliminación de FVIII por receptores de eliminación de VWF y así prolonga la semivida de FVIII. La prolongación de la semivida de una proteína FVIII se debe así a la unión o asociación con el fragmento de VWF que carece de un sitio de unión de receptor de eliminación de VWF a la proteína FVIII y que escuda o que protege la proteína FVIII por el fragmento de VWF de VWF endógeno que contiene el sitio de unión de receptor de eliminación de VWF. La proteína FVIII unida a o protegida por el fragmento de VWF también puede permitir la recirculación de una proteína FVIII. Por tanto, el fragmento de VWF no puede ser VWF maduro de longitud completa. Eliminando los sitios de unión de receptor de la vía de eliminación de VWF contenidos en la molécula de VWF de longitud completa, los heterodímeros FVIII/VWF de la invención se desacoplan de la vía de eliminación de VWF, que permite la prolongación adicional de la semivida de FVIII.

El fragmento de VWF que comprende el dominio D' y el dominio D3 puede comprender además un dominio de VWF seleccionado del grupo que consiste en un dominio A1, un dominio A2, un dominio A3, un dominio D1, un dominio D2, un dominio D4, un dominio B1, un dominio B2, un dominio B3, un dominio C1, un dominio C2, un dominio CK, uno o más fragmentos de los mismos, y cualquier combinación de los mismos. En una realización, un fragmento de VWF comprende, consiste esencialmente en, o consiste en: (1) los dominios D' y D3 de VWF o fragmentos de los mismos; (2) los dominios D1, D' y D3 de VWF o fragmentos de los mismos; (3) los dominios D2, D' y D3 de VWF o fragmentos de los mismos; (4) los dominios D1, D2, D' y D3 de VWF o fragmentos de los mismos; o (5) los dominios D1, D2, D', D3 y A1 de VWF o fragmentos de los mismos. El fragmento de VWF descrito en el presente documento no contiene un sitio que se una a un receptor de eliminación de VWF. En otra realización, el fragmento de VWF descrito en el presente documento no es los aminoácidos 764 a 1274 de SEQ ID NO: 2. El fragmento de VWF de la presente invención puede comprender cualquier otra secuencia unida a o fusionada con el fragmento de VWF, pero no es VWF de longitud completa. Por ejemplo, un fragmento de VWF descrito en el presente documento puede comprender además un péptido señal.

En una realización, un fragmento de VWF de la presente invención comprende el dominio D' y el dominio D3 de VWF, en donde el dominio D' es al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntico a los aminoácidos 764 a 866 de SEQ ID NO: 2, en donde el fragmento de VWF se une a una proteína FVIII, escuda, inhibe o previene la unión del fragmento de VWF endógeno a una proteína FVIII. En otra realización, un fragmento de VWF comprende el dominio D' y el dominio D3 de VWF, en donde el dominio D3 es al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntico a los aminoácidos 867 a 1240 de SEQ ID NO: 2, en donde el fragmento de VWF se une a una proteína FVIII o inhibe o previene la unión del fragmento de VWF endógeno a una proteína FVIII. En algunas realizaciones, un fragmento de VWF descrito en el presente documento comprende, consiste esencialmente en, o consiste en el dominio D' y dominio D3 de VWF, que son al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idénticos a los aminoácidos 764 a 1240 de SEQ ID NO: 2, en donde el fragmento de VWF se une a una proteína FVIII o inhibe o previene la unión del fragmento de VWF endógeno a una proteína FVIII. En otras realizaciones, un fragmento de VWF comprende, consiste esencialmente en, o consiste en los dominios D1, D2, D' y D3 al menos 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntico a los aminoácidos 23 a 1240 de SEQ ID NO: 2, en donde el fragmento de VWF se une a una proteína FVIII o inhibe o previene la unión de fragmento de VWF endógeno a una proteína FVIII. En otras realizaciones más, el fragmento de VWF comprende además un péptido señal operativamente unido al mismo.

En algunas realizaciones, un fragmento de VWF de la invención consiste esencialmente de o consiste en (1) el dominio D'D3, el dominio D1 D'D3, dominio D2 D'D3, o dominio D1D2 D'D3 y (2) una secuencia de VWF adicional de hasta aproximadamente 10 aminoácidos (por ejemplo, cualquier secuencia desde los aminoácidos 764 a 1240 de SEQ ID NO: 2 hasta los aminoácidos 764 a 1250 de SEQ ID NO: 2), hasta aproximadamente 15 aminoácidos (por ejemplo, cualquier secuencia desde los aminoácidos 764 a 1240 de SEQ ID NO: 2 hasta los aminoácidos 764 a 1255 de SEQ ID NO: 2), hasta aproximadamente 20 aminoácidos (por ejemplo, cualquier secuencia desde los aminoácidos 764 a 1240 de SEQ ID NO: 2 hasta los aminoácidos 764 a 1260 de SEQ ID NO: 2), hasta aproximadamente 25 aminoácidos (por ejemplo, cualquier secuencia desde los aminoácidos 764 a 1240 de SEQ ID NO: 2 hasta los aminoácidos 764 a 1265 de SEQ ID NO: 2), o hasta aproximadamente 30 aminoácidos (por ejemplo, cualquier secuencia desde los aminoácidos 764 a 1240 de SEQ ID NO: 2 hasta los aminoácidos 764 a 1260 de SEQ ID NO: 2). En una realización particular, el fragmento de VWF que comprende o que consiste esencialmente en el dominio D' y el dominio D3 no es ni los aminoácidos 764 a 1274 de SEQ ID NO: 2 ni VWF maduro de longitud completa.

En otras realizaciones, el fragmento de VWF que comprende los dominios D'D3 unidos a los dominios D1D2 comprende además un sitio de escisión intracelular, por ejemplo, (un sitio de escisión por PACE o PC5), que permite la escisión de los dominios D1D2 de los dominios D'D3 tras la expresión. Los ejemplos no limitantes del sitio de escisión intracelular se desvelan en cualquier parte en el presente documento.

Aún en otras realizaciones, un fragmento de VWF comprende el dominio D' y el dominio D3, pero no comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en (1) aminoácidos 1241 a 2813 de SEQ ID NO: 2, (2) aminoácidos 1270 a aminoácidos 2813 de SEQ ID NO: 2, (3) aminoácidos 1271 a aminoácidos 2813 de SE^qID NO: 2 , (4) aminoácidos 1272 a aminoácidos 2813 de S^eQ ID NO: 2 , (5) aminoácidos 1273 a aminoácidos 2813 de SEQ ID No : 2, y (6) aminoácidos 1274 a aminoácidos 2813 de SEQ ID NO: 2.

En otras realizaciones más, un fragmento de VWF de la presente invención comprende, consiste esencialmente en, o consiste en una secuencia de aminoácidos correspondiente al dominio D', dominio D3 y dominio A1, en donde la secuencia de aminoácidos es al menos 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica al aminoácido 764 a 1479 de SEQ ID NO: 2, en donde VWF se une a FVIII. En una realización particular, el fragmento de VWF no es los aminoácidos 764 a 1274 de SEQ ID NO: 2.

En algunas realizaciones, un fragmento de VWF de la invención comprende el dominio D' y el dominio D3, pero no comprende al menos un dominio de VWF seleccionado del grupo que consiste en (1) un dominio A1, (2) un dominio A2, (3) un dominio A3, (4) un dominio D4, (5) un dominio B1, (6) un dominio B2, (7) un dominio B3, (8) un dominio C1, (9) un dominio C2, (10) un dominio CK, (11) un dominio CK y dominio C2, (12) un dominio CK, un dominio C2 y un dominio C1, (13) un dominio CK, un dominio C2, un dominio C1, un dominio B3, (14) un dominio CK, un dominio C2, un dominio C1, un dominio B3, un dominio B2, (15) un dominio CK, un dominio C2, un dominio C1, un dominio B3, un dominio B2, y un dominio B1, (16) un dominio CK, un dominio C2, un dominio C1, un dominio B3, un dominio B2, un dominio B1, y un dominio D4, (17) un dominio CK, un dominio C2, un dominio C1, un dominio B3, un dominio B2, un dominio B1, un dominio D4 y un dominio A3, (18) un dominio CK, un dominio C2, un dominio C1, un dominio B3, un dominio B2, un dominio B1, un dominio D4, un dominio A3, y un dominio A2, (19) un dominio CK, un dominio C2, un dominio C1, un dominio B3, un dominio B2, un dominio B1, un dominio D4, un dominio A3, un dominio A2 y un dominio A1, y (20) cualquier combinación de los mismos.

Aún en otras realizaciones, el fragmento de VWF comprende los dominios D'D3 y uno o más dominios o módulos. Los ejemplos de dichos dominios o módulos incluyen, pero no se limitan a, los dominios y módulos desvelados en Zhour et al., Blood, publicado en línea el 6 de abril de 2012: DOI 10.1182/blood-2012-01-405134. Por ejemplo, el fragmento de VWF puede comprender el dominio D'D3 y uno o más dominios o módulos seleccionados del grupo que consiste en dominio A1, dominio A2, dominio A3, módulo D4N, módulo VWD4, módulo C8-4, módulo TIL-4, módulo C1, módulo C2, módulo C3, módulo C4, módulo C5, módulo C5, módulo C6, y cualquier combinación de los mismos.

En otras realizaciones más, el fragmento de VWF se une a un resto heterólogo, en donde el resto heterólogo se une al extremo N o el extremo C del fragmento de VWF, o se inserta entre dos aminoácidos en el fragmento de VWF. Por ejemplo, los sitios de inserción para el resto heterólogo en el fragmento de VWF pueden estar en el dominio D', el dominio D3, o ambos. El resto heterólogo puede ser un prolongador de la semivida.

En ciertas realizaciones, un fragmento de VWF de la invención forma un multímero, por ejemplo, dímero, trímero, tetrámero, pentámero, hexámero, heptámero, o los multímeros de orden superior. En otras realizaciones, el fragmento de VWF es un monómero que tiene solo un fragmento de VWF. En algunas realizaciones, el fragmento de VWF de la presente invención puede tener una o más sustituciones, deleciones, adiciones, o modificaciones de aminoácidos. En una realización, el fragmento de VWF puede incluir sustituciones, deleciones, adiciones o modificaciones de aminoácidos de forma que el fragmento de VWF no sea capaz de formar un enlace disulfuro o formar un dímero o un multímero. En otra realización, la sustitución de aminoácidos está dentro del dominio D' y el dominio D3. En una realización particular, un fragmento de VWF de la invención contiene al menos una sustitución de aminoácidos en un resto correspondiente al resto 1099, resto 1142, o ambos, los restos 1099 y 1142 de SEQ ID NO: 2. La al menos una sustitución de aminoácidos puede ser cualquier aminoácido que no ocurra naturalmente en el VWF no mutante. Por ejemplo, la sustitución de aminoácidos puede ser cualquier aminoácido distinto de cisteína, por ejemplo, isoleucina, alanina, leucina, asparagina, lisina, ácido aspártico, metionina, fenilalanina, ácido glutámico, treonina, glutamina, triptófano, glicina, valina, prolina, serina, tirosina, arginina, o histidina. En otro ejemplo, la sustitución de aminoácidos tiene uno o más aminoácidos que previenen o inhiben que los fragmentos de VWF formen multímeros.

En ciertas realizaciones, el fragmento de VWF útil en el presente documento se puede modificar adicionalmente para mejorar su interacción con FVIII, por ejemplo, para mejorar la afinidad de unión por FVIII. Como ejemplo no limitante, el fragmento de VWF comprende un resto de serina en el resto correspondiente al aminoácido 764 de SEQ ID NO: 2 y un resto de lisina en el resto correspondiente al aminoácido 773 de SEQ ID NO: 2. Los restos 764 y/o 773 pueden contribuir a la afinidad de unión de los fragmentos de VWF por FVIII. En otras realizaciones, el fragmento de VWF puede tener otras modificaciones, por ejemplo, el fragmento puede estar pegilado, glucosilado, hesilatado, o polisialilado.

B) Restos heterólogos

El resto heterólogo puede ser un polipéptido heterólogo o un resto no de polipéptido heterólogo. En ciertas realizaciones, el resto heterólogo es una molécula que prolonga la semivida que se conoce en la técnica y comprende un polipéptido, un resto no de polipéptido, o la combinación de ambos. El resto heterólogo de polipéptido puede comprender una región constante de inmunoglobulina o una porción de la misma, albúmina o un fragmento de la misma, un resto de unión a albúmina, transferrina o un fragmento de la misma, una secuencia de PAS, una secuencia de HAP, un derivado o variante de los mismos, o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el resto de unión de no polipéptido comprende polietilenglicol (PEG), ácido polisiálico, hidroxietilalmidón (HES), un derivado de los mismos, o cualquier combinación de los mismos. En ciertas realizaciones, puede haber una, dos, tres o más restos heterólogos, que pueden cada uno ser moléculas iguales o diferentes.

1) Región constante de inmunoglobulina o porción de la misma

Una región constante de inmunoglobulina está comprendida de dominios denominados dominios CH (constantes pesados) (CH1, CH2, etc.). Dependiendo del isotipo (es decir, IgG, IgM, IgA IgD o IgE), la región constante puede estar comprendida de tres o cuatro dominios CH. Las regiones constantes de algunos isotipos (por ejemplo IgG) también contienen una región bisagra. Véase Janeway et al. 2001, Immunobiology, Garland Publishing, N.Y., N.Y. Se puede obtener de varias fuentes diferentes una región constante de inmunoglobulina o una porción de la misma para producir la proteína quimérica de la presente invención. En realizaciones preferidas, una región constante de inmunoglobulina o una porción de la misma deriva de una inmunoglobulina humana. Se entiende, sin embargo, que la región constante de inmunoglobulina o una porción de la misma puede derivar de una inmunoglobulina de otra especie de mamífero, que incluye, por ejemplo, una especie de roedor (por ejemplo, un ratón, rata, conejo, cobaya) o primate no humano (por ejemplo, chimpancé, macaco). Además, la región constante de inmunoglobulina o una porción de la misma puede derivar de cualquier clase de inmunoglobulina, que incluye IgM, IgG, IgD, IgA e IgE, y cualquier isotipo de inmunoglobulina, que incluye IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. En una realización, se usa el isotipo humano IgG1.

Están disponibles una variedad de las secuencias de genes de la región constante de inmunoglobulina (por ejemplo, secuencias de genes de la región constante humana) en forma de depósitos públicamente accesibles. Se puede seleccionar la secuencia de dominios de la región constante que tiene una función efectora particular (o que carece de una función efectora particular) o con una modificación particular para reducir la inmunogenicidad. Se han publicado muchas secuencias de anticuerpos y genes que codifican anticuerpos y se pueden derivar secuencias adecuadas de la región constante de Ig (por ejemplo, secuencias de bisagra, CH2, y/o CH3, o porciones de las mismas) de estas secuencias usando técnicas reconocidas en la técnica. Entonces, el material genético obtenido usando cualquiera de los métodos anteriores se puede alterar o sintetizar para obtener polipéptidos de la presente invención. Se apreciará además que el alcance de la presente invención engloba alelos, variantes y mutaciones de secuencias de ADN de la región constante.

Se pueden clonar las secuencias de la región constante de inmunoglobulina o una porción de la misma, por ejemplo, usando la reacción en cadena de la polimerasa y cebadores que se seleccionan para amplificar el dominio de interés. Para clonar una secuencia de la región constante de inmunoglobulina o una porción de la misma de un anticuerpo, se puede aislar ARNm de hibridoma, bazo o células linfáticas, transcribirse de forma inversa en ADN, y amplificarse los genes de anticuerpo por PCR. La amplificación por métodos de PCR se describe en detalle en las patentes de EE. UU. N° 4.683.195; 4.683.202; 4.800.159; 4.965.188; y en, por ejemplo, "PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications" Innis et al. eds., Academic Press, San Diego, CA (1990); Ho et al. 1989. Gene 77:51; Horton et al. 1993. Methods Enzymol. 217:270). Se puede iniciar PCR por cebadores de la región constante consenso o por cebadores más específicos basándose en las secuencias de aminoácidos publicadas de ADN de la cadena pesada y ligera. Como se trata anteriormente, también se puede usar PCR para aislar clones de ADN que codifican las cadenas ligeras y pesadas del anticuerpo. En este caso, las bibliotecas se pueden cribar por cebadores consenso o sondas homólogas mayores, tales como sondas de región constante de ratón. Se conocen en la técnica numerosos conjuntos de cebadores adecuados para amplificación de genes de anticuerpo (por ejemplo, cebadores de 5' basados en la secuencia del extremo N de anticuerpos purificados (Benhar y Pastan. 1994. Protein Engineering 7:1509); amplificación rápida de extremos de ADNc (Ruberti, F. et al. 1994. J. Immunol. Methods 173:33); secuencias conductoras de anticuerpos (Larrick et al. 1989 Biochem. Biophys. Res. Commun. 160:1250). La clonación de secuencias de anticuerpos se describe además en Newman et al., patente de EE. UU. N° 5.658.570, presentada el 25 de enero de 1995.

Una región constante de inmunoglobulina usada en el presente documento puede incluir todos los dominios y la región bisagra o porciones de la misma. En una realización, la región constante de inmunoglobulina o una porción de la misma comprende dominio CH2, dominio CH3, y una región bisagra, es decir, una región Fc o un componente de unión de FcRn.

Como se usa en el presente documento, el término "región Fc" se define como la porción de un polipéptido que corresponde a la región Fc de inmunoglobulina nativa, es decir, como se forma por la asociación dimérica de los dominios Fc respectivos de sus dos cadenas pesadas. Una región Fc nativa forma un homodímero con otra región Fc. A diferencia, el término "región Fc genéticamente fusionada" o "región Fc de cadena sencilla" (región scFc), como se usa en el presente documento, se refiere a una región Fc dimérica sintética comprendida de dominios Fc genéticamente unidos dentro de una cadena sencilla de polipéptidos (es decir, codificada en una única secuencia genética contigua).

En una realización, la "región Fc" se refiere a la porción de una única cadena pesada de la inmunoglobulina que empieza en la región bisagra justo en la dirección 5' del sitio de escisión por papaína (es decir, resto 216 en IgG, que toma el primer resto de la región constante de la cadena pesada para que sea 114) y que termina en el extremo C del anticuerpo. Por consiguiente, un dominio Fc completo comprende al menos un dominio bisagra, un dominio CH2 y un dominio CH3.

La región Fc de una región constante de inmunoglobulina, dependiendo del isotipo de inmunoglobulina, puede incluir los dominios CH2, CH3 y CH4, así como la región bisagra. Las proteínas quiméricas que comprenden una región Fc de una inmunoglobulina conceden varias propiedades deseables a una proteína quimérica que incluyen elevada estabilidad, elevada semivida en suero (véase Capon et al., 1989, Nature 337:525), así como unión a receptores de Fc tales como el receptor de Fc neonatal (FcRn) (patentes de EE. UU. N° 6.086.875, 6.485.726, 6.030.613; documentos de patente WO 03/077834; US2003-0235536A1).

Una región constante de inmunoglobulina o una porción de la misma puede ser un componente de unión de FcRn. FcRn es activo en tejidos epiteliales adultos y se expresa en la luz de los intestinos, vías respiratorias pulmonares, superficies nasales, superficies vaginales, colon y superficies rectales (patente de EE. UU. N° 6.485.726). Un componente de unión de FcRn es una porción de una inmunoglobulina que se une a FcRn.

Se ha aislado el receptor de FcRn de varias especies de mamífero que incluyen seres humanos. Se conocen las secuencias de FcRn humano, FcRn de mono, FcRn de rata y FcRn de ratón (Story et al. 1994, J. Exp. Med.

180:2377). El receptor FcRn se une a IgG (pero no a otras clases de inmunoglobulina tales como IgA, IgM, IgD e IgE) a pH relativamente bajo, transporta activamente la IgG transcelularmente en una dirección de luminal a serosal, y entonces libera la IgG al pH relativamente más alto encontrado en los fluidos intersticiales. Se expresa en tejido epitelial adulto (patentes de EE. UU. N° 6.485.726, 6.030.613, 6.086.875; documentos de patente W^o03/077834; US2003-0235536A1) que incluye epitelio pulmonar e intestinal (Israel et al. 1997, Immunology 92:69), epitelio tubular proximal renal (Kobayashi et al. 2002, Am. J. Physiol. Renal Physiol. 282:F358), así como epitelio nasal, superficies vaginales y superficies de los árboles biliares.

Los componentes de unión de FcRn útiles en la presente invención engloban moléculas que se pueden unir específicamente por el receptor FcRn que incluyen IgG completa, el fragmento Fc de IgG, y otros fragmentos que incluyen la región de unión completa del receptor FcRn. La región de la porción Fc de IgG que se une al receptor FcRn se ha descrito basándose en cristalografía de rayos X (Burmeister et al. 1994, Nature 372:379). La principal área de contacto de Fc con el FcRn está cerca del empalme de los dominios CH2 y CH3. Los contacto Fc-FcRn están todos dentro de una cadena pesada sencilla de Ig. Los componentes de unión de FcRn incluyen IgG completa, el fragmento Fc de IgG, y otros fragmentos de IgG que incluyen la región de unión de FcRn completa. Los principales sitios de contacto incluyen los restos de aminoácidos 248, 250-257, 272, 285, 288, 290-291, 308-311 y 314 del dominio CH2 y los restos de aminoácidos 385-387, 428, y 433-436 del dominio CH3. Las referencias hechas a la numeración de aminoácidos de inmunoglobulinas o fragmentos de inmunoglobulinas, o regiones, se basan todas en Kabat et al. 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Public Health, Bethesda, Md.

Las regiones Fc o componentes de unión de FcRn unidos a FcRn se pueden llevar eficazmente a través de barreras epiteliales por FcRn, proporcionando así un medio no invasivo para administrar por vía sistémica una molécula terapéutica deseada. Además, las proteínas de fusión que comprenden una región Fc o un componente de unión de FcRn son endocitosadas por células que expresan el FcRn. Pero en lugar de ser marcadas para degradación, estas proteínas de fusión se recirculan fuera en la circulación otra vez, aumentando así la semivida in vivo de estas proteínas. En ciertas realizaciones, las porciones de regiones constantes de inmunoglobulina son una región Fc o un componente de unión de FcRn que normalmente se asocia, mediante enlaces disulfuro y otras interacciones no específicas, con otra región Fc u otro componente de unión de FcRn para formar dímeros y multímeros de orden superior.

Se pueden unir dos receptores de FcRn a una única molécula de Fc. Los datos cristalográficos sugieren que cada molécula de FcRn se une a un único polipéptido del homodímero de Fc. En una realización, la unión del componente de unión de FcRn, por ejemplo, un fragmento Fc de una IgG, a una molécula biológicamente activa proporciona un medio de administración de la molécula biológicamente activa por vía oral, por vía bucal, por vía sublingual, por vía rectal, por vía vaginal, como un aerosol administrado nasalmente o por una vía pulmonar, o por una vía ocular. En otra realización, la proteína quimérica se puede administrar invasivamente, por ejemplo, por vía subcutánea, por vía intravenosa.

Un componente de unión de la región de FcRn es una molécula o una porción de la misma que se puede unir específicamente por el receptor de FcRn con el consecuente transporte activo por el receptor de FcRn de la región Fc. Se une específicamente se refiere a dos moléculas que forman un complejo que es relativamente estable en condiciones fisiológicas. La unión específica se caracteriza por una alta afinidad y una capacidad de baja a moderada como se distingue de la unión no específica que normalmente tiene una baja afinidad con una capacidad de moderada a alta. Normalmente, la unión se considera específica cuando la constante de afinidad KA es superior a 106 M-1, o superior a 108 M-1. Si fuera necesario, se puede reducir la unión no específica sin afectar sustancialmente la unión específica variando las condiciones de unión. Un experto puede optimizar las condiciones de unión apropiadas, tales como concentración de las moléculas, fuerza iónica de la disolución, temperatura, tiempo permitido para la unión, concentración de un agente de bloqueo (por ejemplo, albúmina de suero, caseína de la leche), etc., usando técnicas rutinarias.

En ciertas realizaciones, una proteína quimérica de la invención comprende una o más regiones Fc truncadas que son, sin embargo, suficientes para conferir propiedades de unión de receptor de Fc (FcR) a la región Fc. Por ejemplo, la porción de una región Fc que se une a FcRn (es decir, la porción de unión de FcRn) comprende desde aproximadamente los aminoácidos 282-438 de IgG1, numeración EU (siendo los sitios de contacto primarios los aminoácidos 248, 250-257, 272, 285, 288, 290-291, 308-311 y 314 del dominio CH2 y los restos de aminoácidos 385-387, 428 y 433-436 del dominio CH3. Así, una región Fc de la invención puede comprender o consistir en una porción de unión de FcRn. Las porciones de unión de FcRn pueden derivar de cadenas pesadas de cualquier isotipo, que incluyen IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. En una realización, se usa una porción de unión de FcRn de un anticuerpo de isotipo humano IgG1. En otra realización, se usa una porción de unión de FcRn de un anticuerpo del isotipo humano IgG4.

En otra realización, la "región Fc" incluye una secuencia de aminoácidos de un dominio Fc o derivada de un dominio Fc. En ciertas realizaciones, una región Fc comprende al menos uno de: un dominio de bisagra (por ejemplo, región bisagra superior, media y/o inferior) (aproximadamente los aminoácidos 216-230 de una región Fc de anticuerpo según la numeración EU), un dominio CH2 (aproximadamente los aminoácidos 231-340 de una región Fc de anticuerpo según la numeración de EU), un dominio CH3 (aproximadamente los aminoácidos 341-438 de una región Fc de anticuerpo según la numeración EU), un dominio CH4, o una variante, porción, o fragmento de los mismos. En otras realizaciones, una región Fc comprende un dominio Fc completo (es decir, un dominio bisagra, un dominio CH2 y un dominio CH3). En algunas realizaciones, una región Fc comprende, consiste esencialmente en, o consiste en un dominio bisagra (o una porción del mismo) fusionado con un dominio CH3 (o una porción del mismo), un dominio bisagra (o una porción del mismo) fusionado con un dominio CH2 (o una porción del mismo), un dominio CH2 (o una porción del mismo) fusionado con un dominio CH3 (o una porción del mismo), un dominio CH2 (o una porción del mismo) fusionado con tanto un dominio bisagra (o una porción del mismo) como un dominio CH3 (o una porción del mismo). En otras realizaciones más, una región Fc carece de al menos una porción de un dominio CH2 (por ejemplo, todo o parte de un dominio CH2). En una realización particular, una región Fc comprende o consiste en los aminoácidos correspondientes a los números de EU 221 a 447.

Las regiones Fc indicadas como F, F1 o F2 en el presente documento se pueden obtener de varias fuentes diferentes. En una realización, una región Fc del polipéptido deriva de una inmunoglobulina humana. Se entiende, sin embargo, que una región Fc puede derivar de una inmunoglobulina de otra especie de mamífero, que incluye, por ejemplo, una especie de roedor (por ejemplo, un ratón, rata, conejo, cobaya) o de primate no humano (por ejemplo, chimpancé, macaco). Además, el polipéptido de los dominios Fc o porciones de los mismos puede derivar de cualquier clase de inmunoglobulina, que incluye IgM, IgG, IgD, IgA e IgE, y cualquier isotipo de inmunoglobulina, que incluye IgG 1, IgG2, IgG3 e IgG4. En otra realización, se usa el isotipo humano IgG 1.

En ciertas realizaciones, la variante Fc confiere un cambio en al menos una función efectora conferida por una región Fc que comprende dicho dominio Fc no mutante (por ejemplo, una mejora o reducción en la capacidad de la región Fc para unirse a receptores de Fc (por ejemplo, FcyRI, FcyRII o FcyRiII) o proteínas del complemento (por ejemplo, C1q), o para desencadenar citotoxicidad dependiente de anticuerpo (ADCC), fagocitosis, o citotoxicidad dependiente del complemento (CDCC)). En otras realizaciones, la variante de Fc proporciona un resto de cisteína manipulado.

Las regiones Fc de la invención pueden emplear variantes de Fc reconocidas en la técnica que se conocen por conferir un cambio (por ejemplo, un potenciamiento o reducción) en la función efectora y/o unión de FcR o FcRn. Específicamente, una molécula de unión de la invención puede incluir, por ejemplo, un cambio (por ejemplo, una sustitución) en una o más de las posiciones de aminoácidos desveladas en las publicaciones PCT internacionales WO88/07089A1, WO96/14339A1, WO98/05787A1, WO98/23289A1, WO99/51642A1, WO99/58572A1, WO00/09560A2, WO00/32767A1, WO00/42072A2, WO02/44215A2, WO02/060919A2, WO03/074569A2, WO04/016750A2, WO04/029207A2, WO04/035752A2, WO04/063351A2, WO04/074455A2, WO04/099249A2, WO05/040217A2, WO04/044859, WO05/070963A1, WO05/077981A2, WO05/092925A2, WO05/123780A2, WO06/019447A1, WO06/047350A2, y WO06/085967A2; las publicaciones de patente de EE. UU. N2 US2007/0231329 US2007/0231329, US2007/0237765, US2007/0237766, US2007/0237767, US2007/0243188, US20070248603, US20070286859, US20080057056; o las patentes de EE. UU. 5.648.260; 5.739.277; 5.834.250; 5.869.046 6.096.871; 6.121.022; 6.194.551; 6.242.195; 6.277.375; 6.528.624; 6.538.124; 6.737.056; 6.821.505; 6.998.253 7.083.784; 7.404.956 y 7.317.091. En una realización, se puede hacer el cambio específico (por ejemplo, la sustitución específica de uno o más aminoácidos desvelados en la materia) en una o más de las posiciones de aminoácidos desveladas. En otra realización, se puede hacer un cambio diferente en una o más de las posiciones de aminoácidos desveladas (por ejemplo, la sustitución diferente de una o más posiciones de aminoácidos desvelada en la técnica).

La región Fc o componente de unión de FcRn de IgG se puede modificar según procedimientos bien reconocidos tales como mutagénesis dirigida al sitio y similares para dar IgG modificada o fragmentos Fc, o porciones de los mismos, que se unirán por FcRn. Dichas modificaciones incluyen modificaciones remotas de los sitios de contacto de FcRn, así como modificaciones dentro de los sitios de contacto que preservan o incluso potencian la unión al FcRn. Por ejemplo, se pueden sustituir los siguientes restos de aminoácidos individuales en Fc de IgG 1 humana (F^cy1) sin pérdida significativa de la afinidad de unión de Fc por FcRn: P238A, S239A, K246A, K248A, D249A, M252A, T256A, E258A, T260A, D265A, S267A, H268A, E269A, D270A, E272A, L274A, N276A, Y278A, D280A, V282A, E283A, H285A, N286A, T289A, K290A, R292A, E293A, E294A, Q295A, Y296F, N297A, S298A, Y300F, R301A, V303A, V305A, T307A, L309A, Q311A, D312A, N315A, K317A, E318A, K320A, K322A, S324A, K326A, A327Q, P329A, A330Q, P331A, E333A, K334A, T335A, S337A, K338A, K340A, Q342A, R344A, E345A, Q347A, R355A, E356A, M358A, T359A, K360A, N361A, Q362A, Y373A, S375A, D376A, A378Q, E380A, E382A, S383A, N384A, Q386A, E388A, N389A, N390A, Y391F, K392A, L398A, S400A, D401A, D413A, K414A, R416A, Q418A, Q419A, N421A, V422A, S424A, E430A, N434A, T437A, Q438A, K439A, S440A, S444A y K447A, donde, por ejemplo, P238A representa prolina no mutante sustituida con alanina en la posición número 238. Como un ejemplo, una realización específica incorpora la mutación N297A, retirando un sitio de N-glucosilación altamente conservado. Además de alanina, se pueden sustituir otros aminoácidos por los aminoácidos no mutantes en las posiciones especificadas anteriormente. Las mutaciones se pueden introducir individualmente en Fc, dando lugar a más de cien regiones Fc distintas de Fc nativa. Además, se pueden introducir juntas las combinaciones de dos, tres, o más de estas mutaciones individuales, dando lugar a cientos de regiones Fc más. Además, se puede mutar una de la región Fc de una construcción de la invención y la otra región Fc de la construcción no mutar en absoluto, o ambas se pueden mutar pero con mutaciones diferentes.

Ciertas de las mutaciones anteriores pueden conferir nueva funcionalidad a la región Fc o componente de unión de FcRn. Por ejemplo, una realización incorpora N297A, retirando un sitio de N-glucosilación altamente conservado. El efecto de esta mutación es reducir la inmunogenicidad, potenciando así la semivida en circulación de la región Fc, y convirtiendo la región Fc en incapaz de unirse a FcyRI, FcyRIIA, FcyRIIB y FcyRIIIA, sin comprometer la afinidad por FcRn (Routledge et al. 1995, Transplantation 60:847; Friend et al. 1999, Transplantation 68:1632; Shields et al.

1995, J. Biol. Chem. 276:6591). Como ejemplo adicional de la nueva funcionalidad que surge de las mutaciones descritas anteriormente, la afinidad por FcRn se puede aumentar más allá de la del no mutante en algunos casos. Esta elevada afinidad puede afectar una elevada velocidad de "asociación", una reducida velocidad de "disociación", o ambas, una elevada velocidad de "asociación" y una reducida velocidad de "disociación". Los ejemplos de mutaciones que se cree que confieren una elevada afinidad por FcRn incluyen, pero no se limitan a, T256A, T307A, E380A y N434A (Shields et al. 2001, J. Biol. Chem. 276:6591).

Además, al menos tres receptores gamma de Fc humanos parecen reconocer un sitio de unión sobre IgG dentro de la región bisagra inferior, en general, los aminoácidos 234-237. Por tanto, otro ejemplo de nueva funcionalidad y posible inmunogenicidad reducida puede surgir de mutaciones de esta región, como, por ejemplo, reemplazando los aminoácidos 233-236 de la IgG1 humana "ELLG" con la secuencia correspondiente de IgG2 "PVA" (con deleción de un aminoácido). Se ha mostrado que F^cyRI, F^cyRII y F^cyRIII, que median en diversas funciones efectoras, no se unirán a IgG 1 cuando se hayan introducido dichas mutaciones. Ward y Ghetie 1995, Therapeutic Immunology 2:77 y Armour et al. 1999, Eur. J. Immunol. 29:2613.

En una realización, la región constante de inmunoglobulina o una porción de la misma, por ejemplo, una región Fc, es un polipéptido que incluye la secuencia PKNSSMISNTP (SEQ ID NO: 3) y opcionalmente adicionalmente que incluye una secuencia seleccionada de HQSLGTQ (SEQ ID NO: 4), HQNLSDGK (SEQ ID NO: 5), HQNISDGK (SEQ ID NO: 6), o VISSHLGQ (SEQ ID NO: 7) (patente de EE. UU. N25.739.277).

En otra realización, la región constante de inmunoglobulina o una porción de la misma comprende una secuencia de aminoácidos en la región bisagra o una porción de la misma que forma uno o más enlaces disulfuro con otra región constante de inmunoglobulina o una porción de la misma. El enlace disulfuro por la región constante de inmunoglobulina o una porción de la misma pone juntos el primer polipéptido que comprende FVIII y el segundo polipéptido que comprende el fragmento de VWF de manera que VWF endógeno no sustituya el fragmento de VWF y no se una a FVIII. Por tanto, el enlace disulfuro entre la primera región constante de inmunoglobulina o una porción de la misma y una segunda región constante de inmunoglobulina o una porción de la misma previene la interacción entre VWF endógeno y la proteína FVIII. Esta inhibición de la interacción entre VWF y la proteína FVIII permite que la semivida de la proteína FVIII vaya más allá del límite de dos veces. La región bisagra o una porción de la misma se puede unir adicionalmente a uno o más dominios de CH1, CH2, CH3, un fragmento de los mismos, y cualquier combinación de los mismos. En un ejemplo particular, una región constante de inmunoglobulina o una porción de la misma comprende una región bisagra y región CH2 (por ejemplo, los aminoácidos 221-340 de una región Fc).

En ciertas realizaciones, la región constante de inmunoglobulina o una porción de la misma está semi-glucosilada. Por ejemplo, la proteína quimérica que comprende dos regiones Fc o componentes de unión de FcRn puede contener una primera región Fc glucosilada (por ejemplo, una región CH2 glucosilada) o componente de unión de FcRn y una segunda región Fc aglucosilada (por ejemplo, una región CH2 aglucosilada) o componente de unión de FcRn. En una realización, un conector se puede interponer entre las regiones Fc glucosiladas y aglucosiladas. En otra realización, la región Fc o componente de unión de FcRn está completamente glucosilada, es decir, todas las regiones Fc están glucosiladas. En otras realizaciones, la región Fc puede estar aglucosilada, es decir, ninguno de los restos de Fc está glucosilado.

En ciertas realizaciones, una proteína quimérica de la invención comprende una sustitución de aminoácidos en una región constante de inmunoglobulina o una porción de la misma (por ejemplo, variantes de Fc), que altera las funciones efectoras independientes de antígeno de la región constante de Ig, en particular la semivida en circulación de la proteína.

Dichas proteínas presentan o elevada o reducida unión de FcRn cuando se compara con proteínas que carecen de estas sustituciones y, por tanto, tienen una elevada o reducida semivida en suero, respectivamente. Se espera que las variantes de Fc con afinidad mejorada por FcRn tengan semividas en suero más largas, y dichas moléculas tienen aplicaciones útiles en métodos de tratamiento de mamíferos donde se desea una larga semivida del polipéptido administrado, por ejemplo, para tratar una enfermedad crónica o trastorno (véanse, por ejemplo, las patentes de US 7.348.004, 7.404.956 y 7.862.820). A diferencia, se espera que las variantes de Fc con afinidad de unión de FcRn reducida tengan semividas más cortas, y dichas moléculas también son útiles, por ejemplo, para administración a un mamífero donde puede ser ventajoso un tiempo de circulación acortado, por ejemplo para la obtención de imágenes de diagnóstico in vivo o en situaciones donde el polipéptido de partida tiene efectos secundarios tóxicos cuando está presente en la circulación durante periodos prolongados. También es menos probable que las variantes de Fc con afinidad de unión de FcRn reducida crucen la placenta y así también son útiles en el tratamiento de enfermedades o trastornos en mujeres embarazadas. Además, otras aplicaciones en las que se puede desear la afinidad de unión de FcRn reducida incluyen las aplicaciones en las que se desea la localización del cerebro, riñón y/o hígado. En una realización a modo de ejemplo, la proteína quimérica de la invención presenta transporte reducido a través del epitelio de glomérulos renales de la vasculatura. En otra realización, la proteína quimérica de la invención presenta transporte reducido a través de la barrera hematoencefálica (BBB) del cerebro, en el espacio vascular. En una realización, una proteína con unión de FcRn alterada comprende al menos una región Fc o componente de unión de FcRn (por ejemplo, una o dos regiones Fc o componentes de unión de FcRn) que tiene una o más sustituciones de aminoácidos dentro del "bucle de unión de FcRn" de una región constante de Ig. El bucle de unión de FcRn comprende los restos de aminoácidos 280-299 (según la numeración EU) de una región Fc no mutante de longitud completa. En otras realizaciones, una región constante de Ig o una porción de la misma en una proteína quimérica de la invención que tiene afinidad de unión de FcRn alterada comprende al menos una región Fc o componente de unión de FcRn que tiene una o más sustituciones de aminoácidos dentro de la "zona de contacto" de FcRn de 15 Á. Como se usa en el presente documento, el término "zona de contacto" de FcRn de 15 Á incluye restos en las siguientes posiciones de un resto Fc no mutante de longitud completa: 243-261, 275-280, 282-293, 302-319, 336-348, 367, 369, 372-389, 391, 393, 408, 424, 425-440 (numeración EU). En otras realizaciones, una región constante de Ig o una porción de la misma de la invención que tiene afinidad de unión de FcRn alterada comprende al menos una región Fc o componente de unión de FcRn que tiene una o más sustituciones de aminoácidos en una posición de aminoácido correspondiente a una cualquiera de las siguientes posiciones de EU: 256, 277-281, 283-288, 303-309, 313, 338, 342, 376, 381, 384, 385, 387, 434 (por ejemplo, N434A o N434K) y 438. Las sustituciones de aminoácidos a modo de ejemplo que alteraron la actividad de unión de FcRn se desvelan en la publicación PCT internacional N° WO05/047327.

Una región Fc o componente de unión de FcRn usado en la invención también puede comprender una sustitución de aminoácidos reconocida en la técnica que altera la glucosilación de la proteína quimérica. Por ejemplo, la región Fc o componente de unión de FcRn de la proteína quimérica unido a un fragmento de VWF o una proteína FVIII puede comprender una región Fc que tiene una mutación que conduce a glucosilación reducida (por ejemplo, glucosilación unida en N u O) o puede comprender una glucoforma alterada del resto Fc no mutante (por ejemplo, un glucano bajo en fucosa o libre de fucosa).

En una realización, una proteína quimérica sin procesar de la invención puede comprender una región Fc genéticamente fusionada (es decir, región scFc) que tiene dos o más de su región constante de Ig constituyente o una porción de la misma independientemente seleccionada de la región constante de Ig o una porción de la misma descrita en el presente documento. En una realización, las regiones Fc de una región Fc dimérica son las mismas. En otra realización, al menos dos de las regiones Fc son diferentes. Por ejemplo, las regiones Fc o componentes de unión de FcRn de las proteínas de la invención comprenden el mismo número de restos de aminoácidos o se pueden diferenciar en longitud por uno o más restos de aminoácidos (por ejemplo, por aproximadamente 5 restos de aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4 o 5 restos de aminoácidos), aproximadamente 10 restos, aproximadamente 15 restos, aproximadamente 20 restos, aproximadamente 30 restos, aproximadamente 40 restos, o aproximadamente 50 restos). Aún en otras realizaciones, las regiones Fc o componentes de unión de FcRn de la proteína de la invención se pueden diferenciar en la secuencia en una o más posiciones de aminoácidos. Por ejemplo, al menos dos de las regiones Fc o componentes de unión de FcRn se pueden diferenciar en aproximadamente 5 posiciones de aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4 o 5 posiciones de aminoácidos), aproximadamente 10 posiciones, aproximadamente 15 posiciones, aproximadamente 20 posiciones, aproximadamente 30 posiciones, aproximadamente 40 posiciones, o aproximadamente 50 posiciones).

2) Albúmina o fragmento, o variante de la misma

En ciertas realizaciones, el resto heterólogo unido al fragmento de VWF o unido a una proteína FVIII es albúmina o un fragmento funcional de la misma.

La albúmina de suero humano (HSA, o HA), una proteína de 609 aminoácidos en su forma de longitud completa, es responsable de una significativa proporción de la presión osmótica del suero y también funciona como vehículo de ligandos endógenos y exógenos. El término "albúmina", como se usa en el presente documento, incluye albúmina de longitud completa o un fragmento funcional, variante, derivado, o análogo de la misma.

En un caso, la proteína quimérica comprende el fragmento de VWF descrito en el presente documento y albúmina, fragmento, o variante de la misma, en donde el fragmento de VWF se une a albúmina o un fragmento o variante de la misma. En una realización, la proteína quimérica comprende el fragmento de VWF y una proteína FVIII, que están unidos entre sí, en donde el fragmento de VWF se une a albúmina o un fragmento o variante de la misma, la proteína que tiene VIII actividad se une a albúmina o un fragmento o variante de la misma, o ambos, el fragmento de VWF y la proteína que tiene VIII actividad se unen a albúmina o un fragmento o variante de la misma. En otras realizaciones, la proteína quimérica comprende el fragmento de VWF unido a albúmina, o un fragmento o variante de la misma se une además a un resto heterólogo seleccionado del grupo que consiste en una región constante de inmunoglobulina o una porción de la misma (por ejemplo, una región Fc), una secuencia de PAS, HES y PEG. En otras realizaciones más, la proteína quimérica comprende el fragmento de VWF y una proteína FVIII, que se unen entre sí, en donde la proteína FVIII se une a albúmina o un fragmento o variante de la misma y se une además a un resto heterólogo seleccionado del grupo que consiste en una región constante de inmunoglobulina o una porción de la misma (por ejemplo, una región Fc), una secuencia de PAS, HES y PEG. Aún en otras realizaciones, la proteína quimérica comprende el fragmento de VWF unido a albúmina o un fragmento o variante de la misma y una proteína FVIII unida a albúmina o un fragmento o variante de la misma, que se unen entre sí, en donde la actividad del fragmento de VWF se une además a un primer resto heterólogo seleccionado del grupo que consiste en una región constante de inmunoglobulina o una porción de la misma (por ejemplo, una región Fc), una secuencia de PAS, HES y PEG y en donde la actividad de la proteína FVIII se une además a un segundo resto heterólogo seleccionado del grupo que consiste en una región constante de inmunoglobulina o una porción de la misma (por ejemplo, una región Fc), una secuencia de PAS, HES y PEG.

En otras realizaciones, el resto heterólogo unido al fragmento de VWF o la proteína FVIII es albúmina o un fragmento o variante de la misma, que prolonga (o es capaz de prolongar) la semivida del fragmento de VWF o la proteína FVIII. Los ejemplos adicionales de albúmina o los fragmentos o variantes de la misma se desvelan en las publicaciones de patente de EE. UU. N22008/0194481A1,2008/0004206 A1, 2008/0161243 A 1,2008/0261877 A1 o 2008/0153751 A1, o las publicaciones de solicitud PCT N22008/033413 A2, 2009/058322 A1 o 2007/021494 A2.

3) Resto de unión de albúmina

En ciertas realizaciones, el resto heterólogo unido al fragmento de VWF o la proteína FVIII es un resto de unión a albúmina, que comprende un péptido de unión a albúmina, un dominio de unión a albúmina bacteriana, un fragmento de anticuerpo de unión a albúmina, o cualquier combinación de los mismos. Por ejemplo, la proteína de unión de albúmina puede ser una proteína de unión de albúmina bacteriana, un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo que incluye anticuerpos de dominio (véase la patente de EE. UU. N° 6.696.245). Una proteína de unión de albúmina, por ejemplo, puede ser un dominio de unión de albúmina bacteriana, tal como la de la proteína G estafilocócica (Konig, T. y Skerra, A. (1998) J. Immunol. Methods 218, 73-83). Otros ejemplos de péptidos de unión de albúmina que se pueden usar como componente de conjugación son, por ejemplo, los que tienen una secuencia consenso Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys, en donde Xaa1 es Asp, Asn, Ser, Thr, o Trp; Xaa2 es Asn, Gln, His, Ile, Leu o Lys; Xaa3 es Ala, Asp, Phe, Trp o Tyr; y Xaa4 es Asp, Gly, Leu, Phe, Ser o Thr como se describen en la solicitud de patente de EE. UU. 2003/0069395 o Dennis et al. (Dennis et al. (2002) J. Biol. Chem. 277, 35035-35043).

4) Secuencia de PAS

En otras realizaciones, el resto heterólogo unido al fragmento de VWF o a la proteína FVIII es una secuencia de PAS.

Una secuencia de PAS, como se usa en el presente documento, significa una secuencia de aminoácidos que comprende principalmente restos de alanina y serina, o que comprende principalmente restos de alanina, serina y prolina, formando la secuencia de aminoácidos la conformación de espiral al azar en condiciones fisiológicas. Por consiguiente, la secuencia de PAS es un elemento estructural, un polímero de aminoácido, o un casete de secuencia que comprende, consiste esencialmente en, o que consiste en alanina, serina y prolina que se pueden usar como parte del resto heterólogo en la proteína quimérica. Aún, el experto conoce que un polímero de aminoácido también puede formar la conformación de espiral al azar cuando restos distintos de alanina, serina y prolina se añaden como constituyente minoritario en la secuencia de PAS. El término "constituyente minoritario", como se usa en el presente documento, significa que aminoácidos distintos de alanina, serina y prolina se pueden añadir a la secuencia de PAS hasta un cierto grado, por ejemplo, hasta aproximadamente 12 %, es decir, aproximadamente 12 de 100 aminoácidos de la secuencia de PAS, hasta aproximadamente 10 %, es decir, aproximadamente 10 de 100 aminoácidos de la secuencia de PAS, hasta aproximadamente 9 %, es decir, aproximadamente 9 de 100 aminoácidos, hasta aproximadamente 8 %, es decir, aproximadamente 8 de 100 aminoácidos, aproximadamente 6 %, es decir, aproximadamente 6 de 100 aminoácidos, aproximadamente 5 %, es decir, aproximadamente 5 de 100 aminoácidos, aproximadamente 4 %, es decir, aproximadamente 4 de 100 aminoácidos, aproximadamente 3 %, es decir, aproximadamente 3 de 100 aminoácidos, aproximadamente 2 %, es decir, aproximadamente 2 de 100 aminoácidos, aproximadamente 1 %, es decir, aproximadamente 1 de 100 de los aminoácidos. Los aminoácidos diferentes de alanina, serina y prolina se pueden seleccionar del grupo que consiste en Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Thr, Trp, Tyr y Val.

En condiciones fisiológicas, la extensión de secuencia de PAS forma una conformación de espirales al azar y así puede mediar en una elevada estabilidad in vivo y/o in vitro para la actividad del factor VWF o de la proteína de coagulación. Puesto que el dominio de espiral al azar no adopta una estructura estable o función por sí mismo, se conserva esencialmente la actividad biológica mediada por el fragmento de VWF o la proteína FVIII con la que se fusiona. En otras realizaciones, las secuencias PAS que forman el dominio de espiral al azar son biológicamente inertes, especialmente con respecto a la proteólisis en plasma sanguíneo, inmunogenicidad, punto isoeléctrico/comportamiento electrostático, unión a receptores de la superficie celular, o internalización, pero son todavía biodegradables, que proporciona claras ventajas con respecto a los polímeros sintéticos tales como PEG.

Los ejemplos no limitantes de las secuencias PAS que forman la conformación de espiral al azar comprenden una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en ASPAAPAPASPAAPAPSAPA (SEQ ID NO: 8), AAPASPAPAAPSAPAPAAPS (SEQ ID NO: 9), APSSPSPSAPSSPSPASPSS (SEQ ID NO: 10), APSSPSPSAPSSPSPASPS (SEQ ID NO: 11), SSPSAPSPSSPASPSPSSPA (SEQ ID NO: 12), AASPAAPSAPPAAASPAAPSAPPA (SEQ ID NO: 13) y ASAAAPAAASAAASAPSAAA (SEQ ID NO: 14), o cualquier combinación de las mismas. Los ejemplos adicionales de secuencias PAS se conocen de, por ejemplo, la publicación de patente de EE. UU. N° 2010/0292130 A1 y la publicación de solicitud PCT N° WO 2008/155134 A1.

5) Secuencia de HAP

En ciertas realizaciones, el resto heterólogo unido al fragmento de VWF o la proteína FVIII es un homopolímero de aminoácidos rico en glicina (HAP). La secuencia de HAP puede comprender una secuencia repetitiva de glicina, que tiene al menos 50 aminoácidos, al menos 100 aminoácidos, 120 aminoácidos, 140 aminoácidos, 160 aminoácidos, 180 aminoácidos, 200 aminoácidos, 250 aminoácidos, 300 aminoácidos, 350 aminoácidos, 400 aminoácidos, 450 aminoácidos, o 500 aminoácidos de longitud. En una realización, la secuencia de HAP es capaz de prolongar la semivida de un resto fusionado con o unido a la secuencia de HAP. Los ejemplos no limitantes de la secuencia de HAP incluyen, pero no se limitan a, (Gly)n, (Gly4Ser)n o S(Gly4Ser)n, en donde n es 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20. En una realización, n es 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 26, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 o 40. En otra realización, n es 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 o 200. Véase, por ejemplo, Schlapschy M et al., Protein Eng. Design Selection, 20 : 273-284 (2007).

6) Transferrina o fragmento de la misma

En ciertas realizaciones, el resto heterólogo unido al fragmento de VWF o la proteína FVIII es transferrina o un fragmento de la misma. Se puede usar cualquier transferrina para preparar las proteínas quiméricas de la invención. Como un ejemplo, la Tf humana no mutante (Tf) es una proteína de 679 aminoácidos, de aproximadamente 75 KDa (que no supone glucosilación), con dos dominios principales, N (aproximadamente 330 aminoácidos) y C (aproximadamente 340 aminoácidos), que parece que se originan a partir de una duplicación génica. Véanse los números de acceso de GenBank NM001063, XM002793, M12530, XM039845, XM039847 y S95936 (www.ncbi.nlm.nih.gov/). La transferrina comprende dos dominios, dominio N y dominio C. El dominio N comprende dos subdominios, dominio N1 y dominio N2, y el dominio C comprende dos subdominios, dominio C1 y dominio C2. En una realización, la porción de transferrina de la proteína quimérica incluye una variante de corte y empalme de transferrina. En un ejemplo, una variante de corte y empalme de transferrina puede ser una variante de corte y empalme de transferrina humana, por ejemplo, acceso de Genbank AAA61140. En otra realización, la porción de transferrina de la proteína quimérica incluye uno o más dominios de la secuencia de transferrina, por ejemplo, dominio N, dominio C, dominio N1, dominio N2, dominio C1, dominio C2, o cualquier combinación de los mismos. 7) Polímero, por ejemplo, polietilenglicol (PEG)

En otras realizaciones, el resto heterólogo unido al fragmento de VWF o FVIII es un polímero soluble conocido en la técnica, que incluye, pero no se limita a, polietilenglicol, copolímeros de etilenglicol/propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano o poli(alcohol vinílico). El resto heterólogo, tal como polímero soluble, se puede unir a cualquier posición dentro del fragmento de VWF o la proteína FVIII o el extremo N o C.

En otra realización, la proteína quimérica comprende el fragmento de VWF y una proteína FVIII, que se unen entre sí, en donde el fragmento de VWF se une a PEG, la proteína FVIII se une a PEG, o ambos, el fragmento de VWF y la proteína FVIII se unen a PEG. En otras realizaciones, la proteína quimérica que comprende el fragmento de VWF unido a PEG se une además a un resto heterólogo seleccionado del grupo que consiste en una región constante de inmunoglobulina o una porción de la misma (por ejemplo, una región Fc), una secuencia de PAS, HES y albúmina, fragmento, o variante de los mismos. En otras realizaciones más, la proteína quimérica comprende el fragmento de VWF y una proteína FVIII, que se unen entre sí, en donde la proteína FVIII se une además a un resto heterólogo seleccionado del grupo que consiste en una región constante de inmunoglobulina o una porción de la misma (por ejemplo, una región Fc), una secuencia de PAS, HES, y albúmina, fragmento, o variante de los mismos. Aún en otras realizaciones, la proteína quimérica comprende el fragmento de VWF unido a PEG y una proteína FVIII unida a PEG, que se unen entre sí, en donde la actividad del fragmento de VWF se une además a un primer resto heterólogo seleccionado del grupo que consiste en una región constante de inmunoglobulina o una porción de la misma (por ejemplo, una región Fc), una secuencia de PAS, HES y albúmina, fragmento, o variante de los mismos, y en donde la actividad de la proteína FVIII se une además a un segundo resto heterólogo seleccionado del grupo que consiste en una región constante de inmunoglobulina o una porción de la misma (por ejemplo, una región Fc), una secuencia de PAS, HES, y albúmina, fragmento, o variante de los mismos.

También se proporcionan por la invención derivados químicamente modificados de la proteína quimérica de la invención que pueden proporcionar ventajas adicionales tales como elevada solubilidad, estabilidad y tiempo de circulación del polipéptido, o disminuida inmunogenicidad (véase la patente de EE. UU. N° 4.179.337). Los restos químicos para modificación se pueden seleccionar del grupo que consiste en polímeros solubles en agua que incluyen, pero no se limitan a, polietilenglicol, copolímeros de etilenglicol/propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano y poli(alcohol vinílico). La proteína quimérica se puede modificar en posiciones al azar dentro de la molécula o en el extremo N o C, o en posiciones predeterminadas dentro de la molécula, y puede incluir uno, dos, tres o más restos químicos unidos.

El polímero puede ser de cualquier peso molecular, y puede estar ramificado o sin ramificar. Para polietilenglicol, en una realización, el peso molecular está entre aproximadamente 1 kDa y aproximadamente 100 kDa para mayor facilidad en la manipulación y fabricación. Se pueden usar otros tamaños, dependiendo del perfil deseado (por ejemplo, la duración de la liberación sostenida deseada, los efectos, si lo hay, sobre la actividad biológica, la facilidad en la manipulación, el grado o ausencia de antigenicidad, y otros efectos conocidos del polietilenglicol con respecto a una proteína o análogo). Por ejemplo, el polietilenglicol puede tener un peso molecular medio de aproximadamente 200, 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 9500, 10.000, 10.500, 11.000, 11.500, 12.000, 12.500, 13.000, 13.500, 14.000, 14.500, 15.000, 15.500, 16.000, 16.500, 17.000, 17.500, 18.000, 18.500, 19.000, 19.500, 20.000, 25.000, 30.000, 35.000, 40.000, 45.000, 50.000, 55.000, 60.000, 65.000, 70.000, 75.000, 80.000, 85.000, 90.000, 95.000, o 100.000 kDa.

En algunas realizaciones, el polietilenglicol puede tener una estructura ramificada. Los polietilenglicoles ramificados se describen, por ejemplo, en la patente de EE. UU. N° 5.643.575; Morpurgo et al., Appl. Biochem. Biotechnol.

56:59-72 (1996); Vorobjev et al., Nucleosides Nucleotides 18:2745-2750 (1999); y Caliceti et al., Bioconjug. Chem.

10:638-646 (1999).

También puede variar el número de restos de polietilenglicol unidos a cada proteína quimérica, el fragmento de VWF, o la proteína FVIII de la invención (es decir, el grado de sustitución). Por ejemplo, las proteínas pegiladas de la invención se pueden unir, en promedio, a 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 17, 20, o más moléculas de polietilenglicol. Similarmente, el grado de sustitución promedio dentro de intervalos tales como 1-3, 2-4, 3-5, 4-6, 5-7, 6-8, 7-9, 8-10, 9-11, 10-12, 11-13, 12-14, 13-15, 14-16, 15-17, 16-18, 17-19 o 18-20 restos de polietilenglicol por molécula de proteína. Los métodos de determinación del grado de sustitución se tratan, por ejemplo, en Delgado et al., Crit. Rev. Thera. Drug Carrier Sys. 9:249-304 (1992).

En algunas realizaciones, la proteína FVIII puede estar PEGilada. Factor VIII PEGilado se puede referir a un conjugado formado entre el factor VIII y al menos una molécula de polietilenglicol (PEG).

En otras realizaciones, una proteína FVIII usada en la invención se conjuga con uno o más polímeros. El polímero puede ser soluble en agua y unirse covalentemente o no covalentemente al factor VIII u otros restos conjugados con factor VIII. Los ejemplos no limitantes de polímero pueden ser poli(óxido de alquileno), poli(vinilpirrolidona), poli(alcohol vinílico), polioxazolina, o poli(acriloilmorfolina). Los tipos adicionales de FVIII conjugado con polímero se desvelan en la patente de EE. UU. N° 7.199.223.

8) Hidroxietilalmidón (HES)

En ciertas realizaciones, el resto heterólogo unido al fragmento de VWF o la proteína FVIII es un polímero, por ejemplo, hidroxietilalmidón (HES) o un derivado del mismo.

El hidroxietilalmidón (HES) es un derivado de amilopectina que existe de forma natural y se degrada por alfa-amilasa en el cuerpo. El HES es un derivado sustituido del polímero de hidrato de carbono amilopectina, que está presente en almidón de maíz a una concentración de hasta 95 % en peso. HES presenta propiedades biológicas ventajosas y se usa como un agente de sustitución de volumen de sangre y en terapia de hemodilución en la clínica (Sommermeyer et al., Krankenhauspharmazie, 8(8), 271-278 (1987); y Weidler et al., Arzneim.-Forschung/Drug Res., 41,494-498 (1991)).

La amilopectina contiene restos de glucosa, en donde en la cadena principal están presentes enlaces alfa-1,4-glucosídicos y en los sitios de ramificación se encuentran enlaces alfa-1,6-glucosídicos. Las propiedades fisicoquímicas de esta molécula se determinan principalmente por el tipo de enlaces glucosídicos. Debido al enlace alfa-1,4-glucosídico mellado, se producen estructuras helicoidales con aproximadamente seis monómeros de glucosa por giro. Las propiedades fisicoquímicas, así como las propiedades bioquímicas, del polímero se pueden modificar mediante sustitución. Se puede lograr la introducción de un grupo hidroxietilo mediante hidroxietilación alcalina. Adaptando las condiciones de reacción es posible explotar la diferente reactividad del grupo hidroxi respectivo en el monómero de glucosa sin sustituir con respecto a una hidroxietilación. Debido a este hecho, el experto es capaz de influir en el patrón de sustitución de forma limitada.

HES se caracteriza principalmente por la distribución de pesos moleculares y el grado de sustitución. El grado de sustitución, indicado como DS, se refiere a la sustitución molar, es conocido por el experto. Véase Sommermeyer et al., Krankenhauspharmazie, 8(8), 271-278 (1987), como se ha citado anteriormente, en particular p. 273.

En una realización, el hidroxietilalmidón tiene un peso molecular medio (peso medio) de desde 1 hasta 300 kD, desde 2 hasta 200kD, desde 3 hasta 100 kD, o desde 4 hasta 70 kD. El hidroxietilalmidón puede presentar además una grado molar de sustitución de desde 0,1 hasta 3, preferentemente 0,1 a 2, más preferido 0,1 a 0,9, preferentemente 0,1 a 0,8, y una relación entre la sustitución C2:C6 en el intervalo de desde 2 hasta 20 con respecto a los grupos hidroxietilo. Un ejemplo no limitante de HES que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 130 kD es un HES con un grado de sustitución de 0,2 a 0,8 tal como 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7 o 0,8, preferentemente de 0,4 a 0,7 tal como 0,4, 0,5, 0,6 o 0,7. En una realización específica, HES con un peso molecular medio de aproximadamente 130 kD es VOLUVEN® de Fresenius. VOLUVEN® es un coloide artificial empleado, por ejemplo, para la sustitución de volumen usada en la indicación terapéutica para la terapia y profilaxis de hipovolemia. Las características de VOLUVEN® son un peso molecular medio de 130.000+/-20.000 D, una sustitución molar de 0,4 y una relación C2:C6 de aproximadamente 9:1. En otras realizaciones, los intervalos del peso molecular medio de hidroxietilalmidón son, por ejemplo, 4 a 70 kD o 10 a 70 kD o 12 a 70 kD o 18 a 70 kD o 50 a 70 kD o 4 a 50 kD o 10 a 50 kD o 12 a 50 kD o 18 a 50 kD o 4 a 18 kD o 10 a 18 kD o 12 a 18 kD o 4 a 12 kD o 10 a 12 kD o 4 a 10 kD. En otras realizaciones más, el peso molecular medio de hidroxietilalmidón empleado está en el intervalo de desde superior a 4 kD e inferior a 70 kD, tal como aproximadamente 10 kD, o en el intervalo de desde 9 hasta 10 kD o desde 10 hasta 11 kD o desde 9 hasta 11 kD, o aproximadamente 12 kD, o en el intervalo de desde 11 hasta 12 kD, o desde 12 hasta 13 kD o desde 11 hasta 13 kD, o aproximadamente 18 kD, o en el intervalo de desde 17 hasta 18 kD o desde 18 hasta 19 kD o desde 17 hasta 19 kD, o aproximadamente 30 kD, o en el intervalo de desde 29 hasta 30, o desde 30 hasta 31 kD, o aproximadamente 50 kD, o en el intervalo de desde 49 hasta 50 kD o desde 50 hasta 51 kD o desde 49 hasta 51 kD.

En ciertas realizaciones, el resto heterólogo puede ser mezclas de hidroxietilalmidones que tienen diferentes pesos moleculares medios y/o diferentes grados de sustitución y/o diferentes relaciones de sustitución C2:C6. Por tanto, se pueden emplear mezclas de hidroxietilalmidones que tienen diferentes pesos moleculares medios y diferentes grados de sustitución y diferentes relaciones de sustitución C2:C6, o que tienen diferentes pesos moleculares medios y diferentes grados de sustitución y la misma relación de sustitución C2:C6 o aproximadamente la misma, o que tienen diferentes pesos moleculares medios y el mismo grado de sustitución o aproximadamente el mismo y diferentes relaciones de sustitución C2:C6, o que tienen el mismo peso molecular medio o aproximadamente el mismo y diferentes grados de sustitución y diferentes relaciones de sustitución C2:C6, o que tienen diferentes pesos moleculares medios y el mismo grado de sustitución o aproximadamente el mismo y la misma relación de sustitución C2:C6 o aproximadamente la misma, o que tienen los mismos pesos moleculares medios o aproximadamente los mismos y diferentes grados de sustitución y la misma relación de sustitución C2:C6 o aproximadamente la misma, o que tiene el mismo peso molecular medio o aproximadamente el mismo y el mismo grado de sustitución o aproximadamente el mismo y diferentes relaciones de sustitución C2:C6, o que tienen aproximadamente el mismo peso molecular medio y aproximadamente el mismo grado de sustitución y aproximadamente la misma relación de sustitución C2:C6.

9) Ácidos polisiálicos (PSA)

En ciertas realizaciones, el resto heterólogo no de polipéptido unido al fragmento de VWF o la proteína FVIII es un polímero, por ejemplo, ácidos polisiálicos (PSAs) o un derivado de los mismos. Los ácidos polisiálicos (PSAs) son polímeros sin ramificar que existen de forma natural de ácido siálico producidos por ciertas cepas bacterianas y en mamíferos en ciertas células. Roth J., et al. (1993) en Polysialic Acid: From Microbes to Man, eds Roth J., Rutishauser U., Troy F. A. (Birkhauser Verlag, Basilea, Suiza), pp 335-348. Se pueden producir en diversos grados de polimerización a partir de n=aproximadamente 80 o más restos de ácido siálico hasta n=2 por hidrólisis ácida limitada o por digestión con neuraminidasas, o por fraccionamiento de las formas naturales bacterianamente derivadas del polímero. La composición de diferentes ácidos polisiálicos también varía de forma que existan formas homopoliméricas, es decir, el ácido polisiálico unido en alfa-2,8 que comprende el polisacárido capsular de la cepa K1 de E. coli y los meningococos del grupo B, que también se encuentran en la forma embrionaria de la molécula de adhesión a células neuronales (N-CAM). También existen formas heteropoliméricas, tales como el ácido polisiálico alternante alfa-2,8 alfa-2,9 de la cepa K92 de E. coli y los polisacáridos del grupo C de N. meningitidis. El ácido siálico también se puede encontrar en copolímeros alternantes con monómeros distintos de ácido siálico tales como el grupo W135 o grupo Y de N. meningitidis. Los ácidos polisiálicos tienen importantes funciones biológicas que incluyen la evasión de los sistemas inmunitarios y del complemento por bacterias patógenas y la regulación de la adhesividad de la glía de neuronas inmaduras durante el desarrollo fetal (en donde el polímero tiene una función antiadhesiva) Cho y Troy, P.N.A.S., USA, 91 (1994) 11427-11431, aunque no existen receptores conocidos para ácidos polisiálicos en mamíferos. El ácido polisiálico unido en alfa-2,8 de la cepa K1 de E. coli también se conoce como 'ácido colomínico' y se usa (en diversas longitudes) para ejemplificar la presente invención. Se han descrito diversos métodos de unión o conjugación de ácidos polisiálicos a un polipéptido (por ejemplo, véase la patente de EE. UU. N25.846.951; documentos de patente WO-A-0187922 y US 2007/0191597 A1.

C) Proteína FVIII

"Una proteína FVIII", como se usa en el presente documento, significa un polipéptido FVIII funcional en su función normal en la coagulación, a menos que se especifique de otro modo. El término una proteína FVIII incluye un fragmento funcional, variante, análogo, o derivado del mismo que retiene la función del factor VIII no mutante de longitud completa en la vía de coagulación. "Una proteína FVIII" se usa indistintamente con polipéptido FVIII (o proteína) o FVIII. Los ejemplos de funciones de FVIII incluyen, pero no se limitan a, una capacidad para activar la coagulación, una capacidad para actuar de cofactor para factor IX, o una capacidad para formar un complejo de tenasa con factor IX en presencia de Ca2+ y fosfolípidos, que luego convierten el factor X en la forma activada Xa. La proteína FVIII puede ser la proteína FVIII humana, porcina, canina, de rata o murina. Además, comparaciones entre FVIII de seres humanos y otras especies han identificado restos conservados que es probable que se requieran para la función (Cameron et al., Thromb. Haemost. 79:317-22 (1998); documento de patente US 6.251.632).

Están disponibles varias pruebas para evaluar la función del sistema de coagulación: prueba del tiempo de tromboplastina parcial activado (aPTT), ensayo cromogénico, ensayo ROTEM, prueba de tiempo de tromboplastina (PT) (también usado para determinar INR), prueba de fibrinógeno (frecuentemente por el método de Clauss), número de plaquetas, prueba de la función plaquetaria (frecuentemente por PFA-100), TCT, tiempo de sangrado, prueba de mezcla (si se corrige una anomalía si se mezcla el plasma del paciente con plasma normal), ensayos del factor de coagulación, anticuerpos anti-fosfolípido, D-dímero, pruebas genéticas (por ejemplo, factor V Leiden, mutación de protrombina G20210A), tiempo de veneno de la víbora de Russell diluido (dRVVT), diversas pruebas de la función plaquetaria, tromboelastografía (TEG o Sonoclot), tromboelastometría (TEM®, por ejemplo, ROTEM®), o tiempo de lisis de euglobulina (ELT).

La prueba de aPTT es un indicador de rendimiento que mide la eficacia de tanto las vías de coagulación "intrínsecas" (también denominadas la vía de activación por contacto) como las comunes. Esta prueba se usa comúnmente para medir la actividad de coagulación de factores de coagulación recombinantes comercialmente disponibles, por ejemplo, FVIII o FIX. Se usa conjuntamente con el tiempo de protrombina (PT), que mide la vía extrínseca.

El análisis ROTEM proporciona información sobre la cinética completa de la hemostasia: tiempo de coagulación, formación de coágulos, estabilidad y lisis de coágulos. Los diferentes parámetros en la tromboelastometría dependen de la actividad del sistema de coagulación plasmático, función plaquetaria, fibrinólisis, o muchos factores que influyen en estas interacciones. Este ensayo puede proporcionar un punto de vista completo de la hemostasia secundaria.

Se conocen el polipéptido FVIII y las secuencias de polinucleótidos, ya que son muchos fragmentos funcionales, mutantes y versiones modificadas. Los ejemplos de las secuencias de FVIII humano (longitud completa) se muestran como subsecuencias en SEQ ID NO: 16 o 18.

Tabla 2. FVIII de longitud completa (péptido señal de FVIII subrayado; la cadena pesada de FVIII está doblemente subrayada; el dominio B está en cursiva; y la cadena ligera de FVIII está en texto sin formato) Péptido señal: (SEQ ID NO: 15)

MQIELSTCFFLCLLRFCFS

Factor VIII maduro (SEQ ID NO: 16)*

QFKKWFQEFTDGSFTQPLYRGELNEHLGLLGPYIRAEVEDNIMVTFRNQASRPYSFYSSLISYEEDQRQGA

EPRKNFVKPNETKTYFWKVQHHMAPTKDEFDCKAWAYFSDVDLEKDVHSGLIGPLLVCHTNTLNPAHGRQVT

VQEFALFFTIFDETKSWYFTENMERNCRAPCNIQMEDPTFKENYRFHAINGYIMDTLPGLVMAQDQRIRWYL

LSMGSNENIHSIHFSGHVFTVRKKEEYKMALYNLYPGVFETVEMLPSKAGIWRVECLIGEHLHAGMSTLFLV

YSNKCQTPLGMASGHIRDFQITASGQYGQWAPKLARLHYSGSINAWSTKEPFSt-ÍIKVDLLAPMIIHGIKTQG

ARQKFSSLYISQFIIMYSLDGKKWQTYRGNSTGILMVFFGNVDSSGIKHNIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRS

TLRMELMGCDLNSCSMPLGMESKAISDAQITASSYFTNMFATWSPSKARLHLQGRSNAWRPQVNNPKEWLQV

DFQKTMKVTGVTTQGVKSLLISMYVKEFLISSSQDGHQWTLFFQNGKVKVFQGNQDSFTPWNSLDPPLLTR

YLRIHPQSWVHQIALRMEVLGCEAQDLY

Tabla 3. Secuencia de nucleótidos que codifica FVIII de longitud completa (SEQ ID NO: 17)*

661 ATG CAAATAGAGC TCTCCACCTG 721 CTTCTTTCTG TGCCTTTTGC GATTCTGCTT TAGTGCCACC AGAAGATACT ACCTGGGTGC 761 AGTGGAACTG TCATGGGACT ATATGCAAAG TGATCTCGGT GAGCTGCCTG TGGACGCAAG 841 ATTTCCTCCT AGAGTGCCAA AATCTTTTCC ATTCAACACC TCAGTCGTGT ACAAAAAGAC 901 TCTGTTTGTA GAATTCACGG ATCACCTTTT CAACATCGCT AAGCCAAGGC CACCCTGGAT 961 GGGTCTGCTA GGTCCTACCA TCCAGGCTGA GGTTTATGAT ACAGTGGTCA TTACACTTAA 1021 GAACATGGCT TCCCATCCTG TCAGTCTTCA TGCTGTTGGT GTATCCTACT GGAAAGCTTC 1081 TGAGGGAGCT GAATATGATG ATCAGACCAG TCAAAGGGAG AAAGAAGATG ATAAAGTCTT 1141 CCCTGGTGGA AGCCATACAT ATGTCTGGCA GGTCCTGAAA GAGAATGGTC CAATGGCCTC 1201 TGACCCACTG TGCCTTACCT ACTCATATCT TTCTCATGTG GACCTGGTAA AAGACTTGAA 1261 TTCAGGCCTC ATTGGAGCCC TACTAGTATG TAGAGAAGGG AGTCTGGCCA AGGAAAAGAC 1321 ACAGACCTTG CACAAATTTA TACTACTTTT TGCTGTATTT GATGAAGGGA AAAGTTGGCA 1361 CTCAGAAACA AAGAACTCCT TGATGCAGGA TAGGGATGCT GCATCTGCTC GGGCCTGGCC 1441 TAAAATGCAC ACAGTCAATG GTTATGTAAA CAGGTCTCTG CCAGGTCTGA TTGGATGCCA :i5oi CAGGAAATCA GTCTATTGGC ATGTGATTGG AATGGGCACC ACTCCTGAAG TGCACTCAAT ATTCCTCGAA GGTCACACAT TTCTTGTGAG GAACCATCGC CAGGCGTCCT TGGAAATCTC

1621 GCGAATAAGT TTCCTTACTG CTCAAACACT CTTGATGGAC CTTGGACAGT TTGTACTGTT 1681 TTGTCATATC TCTTCCCACC AACATGATGG CATGGAAGCT TATGTCAAAG TAGACAGCTG 1741 TCCAGAGGAA CCCCAACTAC GAATGAAAAA TAATGAAGAA GCGGAAGACT ATGATGATGA ¹301 TCTTACTGAT TCTGAAATGG ATGTGGTCAG GTTTGñTGAT GACAACTCTC CTTCCTTTAT 1S61 CCAAATTCGC TCAGTTGCCA AGAAGCATCC TAAAACTTGG GTACATTACA TTGCTGCTGA 1921 AGAGGAGGAC TGGGACTATG CTCCCTTAGT CCTCGCCCCC GATGACAGAA GTTATAAAAG 1991 TCAATATTTG AACAATGGCC CTCAGCGGAT TGGTAGGAAG TACAAAAAAG TCCGATTTAT 2041 GGCATACACA GATGAAACCT TTAAGACTCG TGAAGCTATT CAGCATGAAT CAGGAATCTT 2^.101 GGGACCTTTA CTTTATGGGG AAGTTGGAGA CACACTGTTG ATTATATTTA AGAATCAAGC 2161 AAGCAGACCA TATAACATCT ACCCTCACGG AATCACTGAT GTCCGTCCTT TGTATTCAAG 2221 GAGATTACCA AAAGGTGTAA AACATTTGAA GGATTTTCCA ATTCTGCCAG GAGAAATATT 2281 CAAATATAAA TGGACAGTGA CTGTAGAAGA TGGGCCAACT AAATCAGATC CTCGGTGCCT 2341 GACCCGCTAT TACTCTAGTT TCGTTAATAT GGAGAGAGAT CTAGCTTCAG GACTCATTGG 2401 CCCTCTCCTC ATCTGCTACA AAGAATCTGT AGATCAAAGA GGAAACCAGA TAATGTCAGA 2461 CAAGAGGAAT GTCATCCTGT TTTCTGTATT TGATGAGAAC CGAAGCTGGT ACCTCACAGA 2221 GAATATACAA CGCTTTCTCC CCAATCCAGC TGGAGTGCAG CTTGAGGATC CAGAGTTCCA 2581 AGCCTCCAAC ATCATGCACA GCATCAATGG CTATGTTTTT GATAGTTTGC AGTTGTCAGT 2641 TTGTTTGCAT GAGGTGGCAT ACTGGTACAT TCTAAGCATT GGAGCACAGA CTGACTTCCT 2701 TTCTGTCTTC TTCTCTGGAT ATACCTTCAA ACACAAAATG GTCTATGAAG ACACACTCAC 2^{7 í . l}CCTATTCCCA TTCTCAGGAG AAACTGTCTT CATGTCGATG GAAAACCCAG GTCTATGGAT 2821 TCTGGGGTGC CACAACTCAG ACTTTCGGAA CAGAGGCATG ACCGCCTTAC TGAAGGTTTC 2881 TAGTTGTGAC AAGAACACTG GTGATTATTA CGAGGACAGT TATGAAGATA TTTCAGCATA 2941 CTTGCTGAGT AAAAACAATG CCATTGAACC AAGAAGCTTC TCCCAGAATT CAAGACACCC 3001 TAGCACTAGG CAAAAGCAAT TTAATGCCAC CACAATTCCA GAAAATGACA TAGAGAAGAC 3061 TGACCCTTGG TTTGCACACA GAACACCTAT GCCTAAAATA CAAAATGTCT CCTCTAGTGA 3121 TTTGTTGATG CTCTTGCGAC AGAGTCCTAC TCCACATGGG CTATCCTTAT CTGATCTCCA 3181 AGAAGCCAAA TATGAGACTT TTTCTGATGA TCCATCACCT GGAGCAATAG ACAGTAATAA 3241 CAGCCTGTCT GAAATGACAC ACTTCAGGCC ACAGCTCCAT CACAGTGGGG ACATGGTATT 3301 TACCCCTGAG TCAGGCCTCC AATTAAGATT AAATGAGAAA CTGGGGACAA CTGCAGCAAC 3361 AGAGTTGAAG AAACTTGATT TCAAAGTTTC TAGTACATCA AATAATCTGA TTTCAACAAT 3421 TCCATCAGAC AATTTGGCAG CAGGTACTGA TAATACAAGT TCCTTAGGAC CCCCAAGTAT 3481 GCCAGTTCAT TATGATAGTC AATTAGATAC CACTCTATTT GGCAAAAAGT CATCTCCCCT 3941 TACTGAGTCT GGTGGACCTC TGAGCTTGAG TGAAGAAAAT AATGATTCAA AGTTGTTAGA 3601 ATCAGGTTTA ATGAATAGCC AAGAAAGTTC ATGGGGAAAA AATGTATCGT CAACAGAGAG 3651 TGGTAGGTTA TTTAAAGGGA AAAGAGCTCA TGGACCTGCT TTGTTGACTA AAGATAATGC 3721 CTTATTCAAA GTTAGCATCT CTTTGTTAAA GACAAACAAA ACTTCCAATA ATTCAGCAAC 3781 TAATAGAAAG ACTCACATTG ATGGCCCATC ATTATTAATT GAGAATAGTC CATCAGTCTG 3841 GCAAAATATA TTAGAAAGTG ACñCTGAGTT TAAAAAAGTG ACACCTTTGA TTCATGACAG 3901 AATGCTTATG GACAAAAATG CTACAGCTTT GAGGCTAAAT CATATGTCAA ATAAAACTAC 3961 TTCATCAAAA AACATGGAAA TGGTCCAACA GAAAAAAGAG GGCCCCATTC CACCAGATGC 4021 ACAAAATCCA GATATGTCGT TCTTTAAGAT GCTATTCTTG CCAGAATCAG CAAGGTGGAT 4081 ACAAAGGACT CATGGAAAGA ACTCTCTGAA CTCTGGGCAA GGCCCCAGTC CAAAGCAATT 4141 AGTATCCTTA GGACCAGAAA AATCTGTGGA AGGTCAGAAT TTCTTGTCTG AGAAAAACAA 4201 AGTGGTAGTA GGAAAGGGTG AATTTACAAA GGACGTAGGA CTCAAAGAGA TGGTTTTTCC 4261 AAGCAGCAGA AACCTATTTC TTACTAACTT GGATAATTTA CATGAAAATA ATACACACAA 4321 TCAAGAAAAA AAAATTCAGG AAGAAATAGA AAAGAAGGAA ACATTAATCC AAGAGAATGT 4381 AGTTTTGCCT CAGATACATA CAGTGACTGG CACTAAGAAT TTCATGAAGA ACCTTTTCTT 4441 ACTGAGCACT AGGCAAAATG TAGAAGGTTC ATATGACGGG GCATATGCTC CAGTACTTCA 4501 AjGATTTTAGG TCATTAAATG ATTCAACAAA TAGAACAAAG AAACACACAG CTCATTTCTC AAAAAAAGGG GAGGAAGAAA ACTTGGAAGG CTTGGGAAAT CAAACCAAGC AAATTGTAGA

4621 GAAATATGCA TGCACCACAA GGATATCTCC TAATACAAGC CAGCAGAATT TTGTCACGCA 4681 ACGTAGTAAG AGAGCTTTGA AACAATTCAG ACTCCCACTA GAAGAAACAG AACTTGAAAA 4741 AAGGATAATT GTGGATGACA CCTCAACCCA GTGGTCCAAA AACATGAAAC ATTTGACCCC 4301 GAGCACCCTC ACACAGATAG ACTACAATGA GAAGGAGAAA GGGGCCATTA CTCAGTCTCC 4861 CTTATCAGAT TGCCTTACGA GGAGTCATAG CATCCCTCAA GCAAATAGAT CTCCATTACC 4921 CATTGCAAAG GTATCATCAT TTCCATCTAT TAGACCTATA TATCTGACCA GGGTCCTATT 4981 CCAAGACAAC TCTTCTCATC TTCCAGCAGC ATCTTATAGA AAGAAAGATT CTGGGGTCCA

5041 AGAAAGCAGT CATTTCTTAC AAGGAGCCAA AAAAAATAAC CTTTCTTTAG CCATTCTAAC

5 J.01 CTTGGAGATG ACTGGTGATC AAAGAGAGGT TGGCTCCCTG GGGACAAGTG CCACAAATTC

5161 AGTCACATAC AAGAAAGTTG AGAACACTGT TCTCCCGAAA CCAGACTTGC CCAAAACATC

5221 TGGCAAAGTT GflATTGCTTC CAAAAGTTCA CATTTATCAG AAGGACCTAT TCCCTACGGA

5281 AACTAGCAAT GGGTCTCCTG GCCATCTGGA TCTCGTGGAA GGGAGCCTTC TTCAGGGAAC

5341 AGAGGGAGCG ATTAAGTGGA ATGAAGCAAA CAGACCTGGA AAAGTTCCCT TTCTGAGAGT

5101 AGCAACAGAA AGCTCTGCAA AGACTCCCTC CAAGCTATTG GATCCTCTTG CTTGGGATAA

5461 CCACTATGGT ACTCAGATAC CAAAAGAAGA GTGGAAATCC CAAGAGAAGT CACCAGAAAA

5521 AACAGCTTTT AAGAAAAAGG ATACCATTTT GTCCCTGAAC GCTTGTGAAA GCAATCATGC

5581 AATAGCAGCA ATAAATGAGG GACAAAATAA GCCCGAAATA GAAGTCACCT GGGCAAAGCA

5641 AGGTAGGACT GAAAGGCTGT GCTCTCAAAA CCCACCAGTC TTGAAACGCC ATCAACGGGA

5101 AATAACTCGT ACTACTCTTC AGTCAGATCA AGAGGAAATT GACTATGATG ATACCATATC

5161 AGTTGAAATG AAGAAGGAAG ATTTTGACAT TTATGATGAG GATGAAAATC AGAGCCCCCG

5821 CAGCTTTCAA AAGAAAACAC GACACTATTT TATTGCTGCA GTGGAGAGGC TCTGGGATTA

í 81 TGGGATGAGT AGCTCCCCAC ATGTTCTAAG AAACAGGGCT CAGAGTGGCA GTGTCCCTCA

' 41 GTTCAAGAAA GTTGTTTTCC AGGAATTTAC TGATGGCTCC TTTACTCAGC CCTTATACCG

¿r f ₁₀₁TGGAGAACTA AATGAACATT TGGGACTCCT GGGGCCATAT ATAAGAGCAG AAGTTGAAGA r161 TAATATCATG GTñACTTTCA GAAATCAGGC CTCTCGTCCC TATTCCTTCT ATTCTAGCCT 6 i 21 TATTTCTTAT GñGGAAGATC AGAGGCAAGG AGCAGAACCT AGAAAAAACT TTGTCAAGCC

6 i 81 TAATGAAACC AAAACTTACT TTTGGAAAGT GCAACATCAT ATGGCACCCA CTAAAGATGA

62141 GTTTGACTGC AAAGCCTGGG CTTATTTCTC TGATGTTGAC CTGGAAAAAG ATGTGCACTC

6301 AGGCCTGATT GGACCCCTTC TGGTCTGCCA CACTAACACA CTGAACCCTG CTCATGGGAG

6361 ACAAGTGACA GTACAGGAAT TTGCTCTGTT TTTCACCATC TTTGATGAGA CCAAAAGCTG

6421 GTACTTCACT GAAAATATGG AAAGAAACTG CAGGGCTCCC TGCAATATCC AGATGGAAGA

6481 TCCCACTTTT AAAGAGAATT ATCGCTTCCA TGCAATCAAT GGCTACATAA TGGATACACT

6341 ACCTGGCTTA GTAATGGCTC AGGATCAAAG GATTCGATGG TATCTGCTCA GCATGGGCAG

6601 CAATGAAAAC ATCCATTCTA TTCATTTCAG TGGACATGTG TTCACTGTAC GAAAAAAAGA

6661 GGAGTATAAA ATGGCACTGT ACAATCTCTA TCCAGGTGTT TTTGAGACAG TGGAAATGTT

5721 ACCATCCAAA GCTGGAATTT GGCGGGTGGA ATGCCTTATT GGCGAGCATC TACATGCTGG

6731 GATGAGCACA CTTTTTCTGG TGTACAGCAA TAAGTGTCAG ACTCCCCTGG GAATGGCTTC

6841 TGGACACATT AGAGATTTTC AGATTACAGC TTCAGGACAA TATGGACñGT GGGCCCCAAA

6901 GCTGGCCAGA CTTCATTATT CCGGATCAAT CAATGCCTGG AGCACCAAGG AGCCCTTTTC

6061 TTGGATCAAG GTGGATCTGT TGGCACCAAT GATTATTCAC GGCATCAAGA CCCAGGGTGC

7021 CCGTCAGAAG TTCTCCAGCC TCTACATCTC TCAGTTTATC ATCATGTATA GTCTTGATGG

7081 GAAGAAGTGG CAGACTTATC GAGGAAATTC CACTGGAACC TTAATGGTCT TCTTTGGCAA

7141 TGTGGATTCA TCTGGGATAA AACACAATAT TTTTAACCCT CCAATTATTG CTCGATACAT

7201 CCGTTTGCAC CCAACTCATT ATAGCATTCG CAGCACTCTT CGCATGGAGT TGATGGGCTG

7261 TGATTTAAAT AGTTGCAGCA TGCCATTGGG AATGGAGAGT AAAGCAATAT CAGATGCACA

7321 GATTACTGCT TCATCCTACT TTACCAATAT GTTTGCCACC TGGTCTCCTT CAAAAGCTCG

7331 ACTTCACCTC CAAGGGAGGA GTAATGCCTG GAGACCTCAG GTGAATAATC CAAAAGAGTG

7441 GCTGCAAGTG GACTTCCAGA AGACAATGAA AGTCACAGGA GTAACTACTC AGGGAGTAAA

7501 ATCTCTGCTT ACCAGCATGT ATGTGAAGGA GTTCCTCATC TCCAGCAGTC AAGATGGCCA

7561 TCAGTGGACT CTCTTTTTTC AGAATGGCAA AGTAAAGGTT TTTCAGGGAA. ATCAAGACTC

7621 CTTCACACCT GTGGTGAACT CTCTAGACCC ACCGTTACTG ACTCGCTACC TTCGAATTCA

7681 CCCCCAGAGT TGGGTGCACC AGATTGCCCT GAGGATGGAG GTTCTGGGCT GCGAGGCACA

GGACCTCTAC

* Los ácidos nucleicos subrayados codifican un péptido señal.

Los polipéptidos FVIII incluyen FVIII de longitud completa, FVIII de longitud completa menos Met en el extremo N, FVIII maduro (menos la secuencia señal), FVIII maduro con una Met adicional en el extremo N, y/o FVIII con una deleción total o completa del dominio B. En ciertas realizaciones, las variantes de FVIII incluyen deleciones del dominio B, tanto deleciones parciales como completas.

Se aisló el gen FVIII humano y se expresó en células de mamífero (Toole, J. J., et al., Nature 312:342-347 (1984); Gitschier, J., et al., Nature 312:326-330 (1984); Wood, W. I., et al., Nature 312:330-337 (1984); Vehar, G. A., et al., Nature 312:337-342 (1984); documentos de patente WO 87/04187; WO 88/08035; WO 88/03558; y patente de EE. UU. N° 4.757.006). Se dedujo la secuencia de aminoácidos de FVIII de ADNc como se muestra en la patente de EE. UU. N° 4.965.199. Además, se muestra FVIII de dominio B parcialmente o completamente delecionado en las patentes de EE. UU. N° 4.994.371 y 4.868.112. En algunas realizaciones, el dominio B de FVIII humano se sustituye por el dominio B de factor V humano como se muestra en la patente de EE. UU. N° 5.004.803. La secuencia de ADNc que codifica el factor VIII humano y la secuencia de aminoácidos se muestran en SEQ ID NOs: 17 y 16, respectivamente, de la publicación de solicitud de EE. UU. N° 2005/0100990.

La secuencia de FVIII porcino se publica en Toole, J. J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5939-5942 (1986). Además, la secuencia de ADNc porcino completa obtenida de la amplificación por PCR de las secuencias de FVIII de una biblioteca de ADNc de bazo de cerdo se ha informado en Healey, J. F., et al., Blood 88:4209-4214 (1996). Se desveló FVIII humano/porcino híbrido que tiene sustituciones de todos los dominios, todas las subunidades, y secuencias de aminoácidos específicas, en la patente de EE. UU. N° 5.364.771 por Lollar y Runge, y en el documento de patente WO 93/20093. Más recientemente, se informaron secuencias de nucleótidos y de aminoácidos correspondientes de los dominios A1 y A2 de FVIII porcino y un FVIII quimérico con dominios A1 y/o A2 porcinos sustituidos por los dominios humanos correspondientes en el documento de patente WO 94/11503. La patente de EE. UU. N° 5.859.204, Lollar, J. S., también desvela el ADNc porcino y las secuencias de aminoácidos deducidas. La patente de EE. UU. N° 6.458.563 desvela un FVIII porcino de dominio B delecionado.

La patente de EE. UU. N° 5.859.204 a Lollar, J. S. informa de mutantes de FVIII funcionales que tienen antigenicidad reducida e inmunorreactividad reducida. La patente de EE. UU. N° 6.376.463 a Lollar, J. S. también informa de mutantes de FVIII que tienen inmunorreactividad reducida. La publicación de solicitud de EE. UU. N° 2005/0100990 a Saenko et al. informa de mutaciones funcionales en el dominio A2 de FVIII.

En una realización, el FVIII (o porción de FVIII de una proteína quimérica) puede ser al menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntico a una secuencia de aminoácidos de FVIII de aminoácidos 1 a 1438 de SEQ ID NO: 18 o aminoácidos 1 a 2332 de SEQ ID NO: 16 (sin una secuencia señal) o una secuencia de aminoácidos de FVIII de aminoácidos -19 a 1438 de SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 18 o aminoácidos -19 a 2332 de SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16 (con una secuencia señal), en donde FVIII tiene una actividad de coagulación, por ejemplo, activa el factor IX como cofactor para convertir el factor X en el factor X activado. El FVIII (o porción de FVIII de una proteína quimérica) puede ser idéntico a una secuencia de aminoácidos de FVIII de aminoácidos 1 a 1438 de SEQ iD NO: 18 o aminoácidos 1 a 2332 de SEQ ID NO: 16 (sin una secuencia señal). FVIII puede comprender además una secuencia señal.

El "dominio B" de FVIII, como se usa en el presente documento, es el mismo que el dominio B conocido en la técnica que se define por identidad interna de la secuencia de aminoácidos y sitios de escisión proteolítica, por ejemplo, los restos Ser741-Arg1648 de FVIII humano de longitud completa. Los otros dominios de FVIII humano se definen por los siguientes restos de aminoácidos: A1, restos Ala1-Arg372; A2 , restos Ser373-Arg740; A3, restos Ser1690-Asn2019; C1, restos Lys2020-Asn2172; C2, restos Ser2173-Tyr2332. La secuencia de A3-C1-C2 incluye los restos Ser1690-Tyr2332. La secuencia restante, restos Glu1649-Arg1689, se denomina normalmente la región ácida a3. También se conocen en la técnica las localizaciones de los límites para todos los dominios, que incluyen los dominios B, para FVIII porcino, de ratón y canino. En una realización, el dominio B de FVIII está delecionado ("factor VIII de dominio B delecionado" o "BDD FVIII"). Un ejemplo de un BDD FVIII es REFACTO® (BDD FVIII recombinante), que tiene la misma secuencia que la porción del factor VIII de la secuencia en la Tabla 4. (La cadena pesada de BDD FVIII está doblemente subrayada; el dominio B está en cursiva; y la cadena ligera de BDD FVIII está en texto sin formato).

Tabla 4

BDD FVIII (SEQ ID NO: 18)

YTRRYYLGA DLGELPVD ARF F FRVPK S F P FNT í J _ 3H LFN IAK FR PPW M G LL

GPTIQAEVY~T— T11 -.1 ntl&SKPVSLB&VGVSYWK&SEGAEYDDOTSOBr.-'RpR' YFPGGSHTYTOOVLKEH GPMA5DPLCL1 Y u ¿ H LVKL jV c r e g s l a k e k t o t l b i t r r 3EG KSYH SETKNSI MQDRDARSARAWPKMHTVHGYVHRSLPGLIGCHRKSVYWHVIGMGTTPE Rb_ELEGKTFLVRMHRQASLEI

SPR SFQ K K TR H YF IA A V E R LW D YG M SSSPH V LR N R A Q SG SV PQ FK K W FQ E FTD G SFTQ PLYR G E LN E H LG L

LG PY IR A E V E D N IM V TFR N Q A S R PYS FYS S L IS YE E D Q R Q G A E P R K K FV K PN E TK TYFW K V Q H H M A P TK D E F

D C K A W A YFSD V D LE K D V H SG LIG PLLV C H TN TLN PA H G R Q V TV Q E FA LFFT IFD E TK S W YFTE N M E R N C R A P

C N IQ M E D PTFK E N YR FH A IN G YIM D TLPG LV M A Q D G R IR W YLLSM G SN E N 1H S 1H FS G H V FTV R K K E E YK I4A

LYW LYPG VFE TVE M LPSK AG IM R VE C LIG E H LH A G M STLFLVYSN K C Q TPLG M A SG H IR D FQ ITA SG Q YG Q VJ

A .P K LA R LH Y S G S IN A .W S T K E P F S W IK V D LLA P M I1H G IK T Q G A R Q K F S S LY IS Q F IIW Y S LD G K K M Q T Y R G N

STG TL1W FFG NVD S S G IK H N T F N P P IIA R Y IR L H P T H Y S IR S T L R M E L M G C D L N S C S M P L G M E S P tñ lS D ñ Q I

TASSYFTNM FATV íS PSKARLH LQ G RSNAW R PQ VNNPK EW LQ VD FQ KTM K VTG VTTQ G VKSLLTSM YVK EFLI

SSS Q D G H Q W TLFFQ N G K V K V FQ G N Q D SFTPW K S LD PPLLTR YLR 1H PQ SW V H Q IALR M E V LG C E A Q D LY

Tabla 5. Secuencia de nucleótidos que codifica BDD FVIII (SEQ ID NO: 19)*

661 A TGCAAATAGA GCTCTCCACC TGCTTCTTTC 721 TGTGCCTTTT GCGATTCTGC TTTAGTGCCA CCAGAAGATA CTACCTGGGT GCAGTGGAAC '781 TGTCATGGGA CTATATGCAA AGTGATCTCG GTGAGCTGCC TGTGGACGCA AGATTTCCTC 841 CTAGAGTGCC AAAATCTTTT CCATTCAACA CCTCAGTCGT GTACAAAAAG ACTCTGTTTG SOI TAGAATTCAC GGATCACCTT TTCAACATCG CTAAGCCAAG GCCACCCTGG ATGGGTCTGC

961 TAGGTCCTAC CATCCAGGCT GAGGTTTATG ATACAGTGGT CATTACACTT AAGAACATGG 1021 CTTCCCATCC TGTCAGTCTT CATGCTGTTG GTGTATCCTA CTGGAAAGCT TCTGAGGGAG 1081 CTGAATATGA TGATCAGACC AGTCAAAGGG AGAAAGAAGA TGATAAAGTC TTCCCTGGTG 1 :i -i i GAAGCCATAC ATATGTCTGG CAGGTCCTGA AAGAGAATGG TCCAATGGCC TCTGACCCAC 1201 TGTGCCTTAC CTACTCATAT CTTTCTCATG TGGACCTGGT AAAAGACTTG AATTCAGGCC 1261 TCATTGGAGC CCTACTAGTA TGTAGAGAAG GGAGTCTGGC CAAGGAAAAG ACACAGACCT 1321 TGCACAAATT TATACTACTT TTTGCTGTAT TTGATGAAGG GAAAAGTTGG CACTCAGAAA 1381 CAAAGAACTC CTTGATGCAG GATAGGGATG CTGCATCTGC TCGGGCCTGG CCTAAAATGC 1441 ACACAGTCAA TGGTTATGTA AACAGGTCTC TGCCAGGTCT GATTGGATGC CACAGGAAAT 1501 CAGTCTATTG GCATGTGATT GGAATGGGCA CCACTCCTGA AGTGCACTCA ATATTCCTCG 1561 AAGGTCACAC ATTTCTTGTG AGGAACCATC GCCAGGCGTC CTTGGAAATC TCGCCAATAA 1621 CTTTCCTTAC TGCTCAAACA CTCTTGATGG ACCTTGGACA GTTTCTACTG TTTTGTCATA 1681 TCTCTTCCCA CCAACATGAT GGCATGGAAG CTTATGTCAA AGTAGACAGC TGTCCAGAGG 17'41 AACCCCAACT ACGAATGAAA AATAATGAAG AAGCGGAAGA CTATGATGAT GATCTTACTG 1801 ATTCTGAAAT GGATGTGGTC AGGTTTGATG ATGACAACTC TCCTTCCTTT ATCCAAATTC 1661 GCTCAGTTGC CAAGAAGCAT CCTAAAACTT GGGTACATTA CATTGCTGCT GAAGAGGAGG 1921 ACTGGGACTA TGCTCCCTTA GTCCTCGCCC CCGATGACAG AAGTTATAAA AGTCAATATT 1981 TGAACAATGG CCCTCAGCGG ATTGGTAGGA AGTACAAAAA AGTCCGATTT ATGGCATACA 2041 CAGATGAAAC CTTTAAGACT CGTGAAGCTA TTCAGCATGA ATCAGGAATC TTGGGACCTT 2101 TACTTTATGG GGAAGTTGGA GACACACTGT TGATTATATT TAAGAATCAA GCAAGCAGAC 2161 CATATAACAT CTACCCTCAC GGAATCACTG ATGTCCGTCC TTTGTATTCA AGGAGATTAC 2221 CAAAAGGTGT AAAACATTTG AAGGATTTTC CAATTCTGCC AGGAGAAATA TTCAAATATA 2281 AATGGACAGT GACTGTAGAA GATGGGCCAA CTAAATCAGA TCCTCGGTGC CTGACCCGCT 2341 ATTACTCTAG TTTCGTTAAT ATGGAGAGAG ATCTAGCTTC AGGACTCATT GGCCCTCTCC 2401 TCATCTGCTA CAAAGAATCT GTAGATCAAA GAGGAAACCA GATAATGTCA GACAAGAGGA 2461 ATGTCATCCT GTTTTCTGTA TTTGATGAGA ACCGAAGCTG GTACCTCACA GAGAATATAC 2521 AACGCTTTCT CCCCAATCCA GCTGGAGTGC AGCTTGAGGA TCCAGAGTTC CAAGCCTCCA 2581 ACATCATGCA CAGCATCAAT GGCTATGTTT TTGATAGTTT GCAGTTGTCA GTTTGTTTGC 2641 ATGAGGTGGC ATACTGGTAC ATTCTAAGCA TTGGAGCACA GACTGACTTC CTTTCTGTCT 2701 TCTTCTCTGG ATATACCTTC AAACACAAAA TGGTCTATGA AGACACACTC ACCCTATTCC 2761 CATTCTCAGG AGAAACTGTC TTCATGTCGA TGGAAAACCC AGGTCTATGG ATTCTGGGGT 2821 GCCACAACTC AGACTTTCGG AACAGAGGCA TGACCGCCTT ACTGAAGGTT TCTAGTTGTG 2881 ACAAGAACAC TGGTGATTAT TACGAGGACA GTTATGAAGA TATTTCAGCA TACTTGCTGA 2941 GTAAAAACAA TGCCATTGAA CCAAGAAGCT TCTCTCAAAA CCCACCAGTC TTGAAACGCC 3001 ATCAACGGGA AATAACTCGT ACTACTCTTC AGTCAGATCA AGAGGAAATT GACTATGATG 3061 ATACCATATC AGTTGAAATG AAGAAGGAAG ATTTTGACAT TTATGATGAG GATGAAAATC 3121 AGAGCCCCCG CAGCTTTCAA AAGAAAACAC GACACTATTT TATTGCTGCA GTGGAGAGGC 3181 TCTGGGATTA TGGGATGAGT AGCTCCCCAC ATGTTCTAAG AAACAGGGCT CAGAGTGGCA 3241 GTGTCCCTCA GTTCAAGAAA GTTGTTTTCC AGGAATTTAC TGATGGCTCC TTTACTCAGC 3301 CCTTATACCG TGGAGAACTA AATGAACATT TGGGACTCCT GGGGCCATAT ATAAGAGCAG 3361 AAGTTGAAGA TAATATCATG GTAACTTTCA GAAATCAGGC CTCTCGTCCC TATTCCTTCT 3421 ATTCTAGCCT TATTTCTTAT GAGGAAGATC AGAGGCAAGG AGCAGAACCT AGAAAAAACT 3481 TTGTCAAGCC TAATGAAACC AAAACTTACT TTTGGAAAGT GCAACATCAT ATGGCACCCA 3541 CTAAAGATGA GTTTGACTGC AAAGCCTGGG CTTATTTCTC TGATGTTGAC CTGGAAAAAG 3601 ATGTGCACTC AGGCCTGATT GGACCCCTTC TGGTCTGCCA CACTAACACA CTGAACCCTG 3661 CTCATGGGAG ACAAGTGACA GTACAGGAAT TTGCTCTGTT TTTCACCATC TTTGATGAGA 3721 CCAAAAGCTG GTACTTCACT GAAAATATGG AAAGAAACTG CAGGGCTCCC TGCAATATCC 3781 AGATGGAAGA TCCCACTTTT AAAGAGAATT ATCGCTTCCA TGCAATCAAT GGCTACATAA 3641 TGGATACACT ACCTGGCTTA GTAATGGCTC AGGATCAAAG GATTCGATGG TATCTGCTCA 3901 GCATGGGCAG CAATGAAAAC ATCCA.TTCTA TTCATTTCAG TGGACATGTG TTCACTGTAC 3961 GAAAAAAAGñ GGAGTATAAA ATGGCACTGT ACAATCTCTA TCCAGGTGTT TTTGAGACAG

-3021 TGGAAATGTT ACCATCCAAA GCTGGAATTT GGCGGGTGGA ATGCCTTATT GGCGAGCATC

4081 TACATGCTGG GATGAGCACA CTTTTTCTGG TGTACAGCAA TAAGTGTCAG ACTCCCCTGG

4141 GAATGGCTTC TGGACACATT AGAGATTTTC AGATTACAGC TTCAGGACAA TATGGACAGT

4201 GGGCCCCAAA GCTGGCCAGA CTTCATTATT CCGGATCAAT CAATGCCTGG AGCACCAAGG

4261 AGCCCTTTTC TTGGATCAAG GTGGATCTGT TGGCACCAAT GATTATTCAC GGCATCAAGA

4321 CCCAGGGTGC CCGTCAGAAG TTCTCCAGCC TCTACATCTC TCAGTTTATC ATCATGTATA

4.381 GTCTTGATGG GAAGAAGTGG CAGACTTATC GAGGAAATTC CACTGGAACC TTAATGGTCT

4441 TCTTTGGCAA TGTGGATTCA TCTGGGATAA AACACAATAT TTTTAACCCT CCAATTATTG

4501 CTCGATACAT CCGTTTGCAC CCAACTCATT ATAGCATTCG CAGCACTCTT CGCATGGAGT

4561 TGATGGGCTG TGATTTAAAT AGTTGCAGCA TGCCATTGGG AATGGAGAGT AAAGCAATAT

4621 CAGATGCACA GATTACTGCT TCATCCTACT TTACCAATAT GTTTGCCACC TGGTCTCCTT

4683. CAAAAGCTCG ACTTCACCTC CAAGGGAGGA GTAATGCCTG GAGACCTCAG GTGAATAATC

4741 CAAAAGAGTG GCTGCAAGTG GACTTCCAGA AGACAATGAA AGTCACAGGA GTAACTACTC

4Ó01 AGGGAGTAAA ATCTCTGCTT ACCAGCATGT ATGTGAAGGA GTTCCTCATC TCCAGCAGTC

4861 AAGATGGCCA TCAGTGGACT CTCTTTTTTC AGAATGGCAA AGTAAAGGTT TTTCAGGGAA

4921 ATCAAGACTC CTTCACACCT GTGGTGAACT CTCTAGACCC ACCGTTACTG ACTCGCTACC

4981 TTCGAATTCA CCCCCAGAGT TGGGTGCACC AGATTGCCCT GAGGATGGAG GTTCTGGGCT

5041 GCGAGGCACA GGACCTCTAC

* Los ácidos nucleicos subrayados codifican un péptido señal.

Un "FVIII de dominio B delecionado'' puede tener las deleciones completas o parciales desveladas en las patentes de EE. UU. N26.316.226, 6.346.513, 7.041.635, 5.789.203, 6.060.447, 5.595.886, 6.228.620, 5.972.885, 6.048.720, 5.543.502, 5.610.278, 5.171.844, 5.112.950, 4.868.112 y 6.458.563. En algunas realizaciones, una secuencia de FVIII de dominio B delecionado de la presente invención comprende una cualquiera de las deleciones desveladas en la col. 4, línea 4 a col. 5, línea 28 y Ejemplos 1-5 de la patente de EE. UU. N° 6.316.226 (también en US 6.346.513). En otra realización, un factor VIII de dominio B delecionado es el factor VIII de dominio B delecionado S743/Q1638 (SQ BDD FVIII) (por ejemplo, factor VIII que tiene una deleción del aminoácido 744 al aminoácido 1637, por ejemplo, factor VIII que tiene los aminoácidos 1-743 y los aminoácidos 1638-2332 de SEQ ID NO: 16, es decir, SEQ ID NO: 18). En algunas realizaciones, un FVIII de dominio B delecionado de la presente invención tiene una deleción desvelada en la col. 2, líneas 26-51 y Ejemplos 5-8 de la patente de EE. UU. N° 5.789.203 (también US 6.060.447, US 5.595.886 y US 6.228.620). En algunas realizaciones, un factor VIII de dominio B delecionado tiene una deleción descrita en la col. 1, líneas 25 a col. 2, línea 40 de la patente de EE. UU. N° 5.972.885; col. 6, líneas 1-22 y Ejemplo 1 de la patente de EE. UU. N° 6.048.720; col. 2, líneas 17-46 de la patente de EE. UU. N° 5.543.502; col. 4, línea 22 a col. 5, línea 36 de la patente de EE. UU. N° 5.171.844; col. 2, líneas 55-68, Figura 2 y Ejemplo 1 de la patente de EE. UU. N° 5.112.950; col. 2, línea 2 a col. 19, línea 21 y Tabla 2 de la patente de EE. U^u. N° 4.868.112 ; col. 2 , línea 1 a col. 3, línea 19, col. 3, línea 40 a col. 4, línea 67, col. 7, línea 43 a col. 8, línea 26, y col. 11, línea 5 a col. 13, línea 39 de la patente de EE. UU. N° 7.041.635; o col. 4, líneas 25-53, de la patente de EE. UU. N26.458.563.

En algunas realizaciones, un FVIII de dominio B delecionado tiene una deleción de la mayoría del dominio B, pero todavía contiene secuencias del extremo amino del dominio B que son esenciales para el procesamiento proteolítico in vivo del producto de traducción primaria en la cadena de dos polipéptidos, como se desvela en el documento de patente WO 91/09122. En algunas realizaciones, un FVIII de dominio B delecionado se construye con una deleción de aminoácidos 747-1638, es decir, prácticamente una deleción completa del dominio B. Hoeben R.C., et al. J. Biol. Chem. 265 (13): 7318-7323 (1990). Un factor VIII de dominio B delecionado también puede contener una deleción de aminoácidos 771-1666 o aminoácidos 868-1562 de FVIII. Meulien P., et al. Protein Eng. 2(4): 301-6 (1988). Las deleciones del dominio B adicionales que son parte de la invención incluyen: deleción de aminoácidos 982 a 1562 o 760 a 1639 (Toole et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1986) 83, 5939-5942)), 797 a 1562 (Eaton, et al. Biochemistry (1986) 25:8343-8347)), 741 a 1646 (Kaufman (solicitud PCT publicada N2 WO 87/04187)), 747-1560 (Sarver, et al., DNA (1987) 6:553-564)), 741 a 1648 (Pasek (solicitud PCT N288/00831)), o 816 a 1598 o 741 a 1648 (Lagner (Behring Inst. Mitt. (1988) No 82:16-25, documento de patente EP 295597)). En otras realizaciones, BDD FVIII incluye un polipéptido FVIII que contiene fragmentos del dominio B que retienen uno o más sitios de glucosilación unidos en N, por ejemplo, los restos 757, 784, 828, 900, 963, u opcionalmente 943, que corresponden a la secuencia de aminoácidos de la secuencia de FVIII de longitud completa. Los ejemplos de fragmentos del dominio B incluyen 226 aminoácidos o 163 aminoácidos del dominio B, como se desvela en Miao, H.Z., et al., Blood 103(a): 3412-3419 (2004), Kasuda, A, et al., J. Thromb. Haemost. 6 : 1352-1359 (2008), y Pipe, S.W., et al., J. Thromb. Haemost. 9: 2235-2242 (2011) (es decir, se retienen los primeros 226 aminoácidos o 163 aminoácidos del dominio B). En algunas realizaciones, el FVIII con un dominio B parcial es FVIII198 (SEQ ID NO: 105). FVIII198 es una molécula de FVIIIFc de cadena sencilla que contiene el dominio B parcial-226N6. 226 representa el aminoácido 226 del extremo N del dominio B de FVIII, y N6 representa seis sitios de N-glucosilación en el dominio B. En otras realizaciones más, BDD FVIII comprende además una mutación puntual en el resto 309 (de Phe a Ser) para mejorar la expresión de la proteína BDD FVIII. Véase Miao, H.Z., et al., Blood 103(a): 3412-3419 (2004). En otras realizaciones más, el BDD FVIII incluye un polipéptido FVIII que contiene una porción del dominio B, pero que no contiene uno o más sitios de escisión de furina (por ejemplo, Arg1313 y Arg 1648). Véase Pipe, S.W., et al., J. Thromb. Haemost. 9: 2235-2242 (2011). Cada una de las deleciones anteriores se puede hacer en cualquier secuencia de FVIII.

Una proteína FVIII útil en la presente invención puede incluir FVIII que tiene una o más secuencias heterólogas adicionales o modificaciones químicas o físicas en ellas, que no afectan la actividad de coagulación de FVIII. Dichas secuencias heterólogas o modificaciones químicas o físicas se pueden fusionar con el extremo C o extremo N de la proteína FVIII o insertar entre uno o más de los dos restos de aminoácidos en la proteína FVIII. Dichas inserciones en la proteína FVIII no afectan la actividad de coagulación de FVIII o función de FVIII. En una realización, las inserciones mejoran las propiedades farmacocinéticas de la proteína FVIII (por ejemplo, semivida). En otra realización, las inserciones pueden ser más de dos, tres, cuatro, cinco, o seis sitios.

En una realización, FVIII se escinde poco después de la arginina en el aminoácido 1648 (en el factor VIII de longitud completa o SEQ ID NO: 16), aminoácido 754 (en el factor VIII de dominio B delecionado S743/Q1638 o SEQ ID NO: 16), o el resto de arginina correspondiente (en otras variantes), dando así como resultado una cadena pesada y una cadena ligera. En otra realización, FVIII comprende una cadena pesada y una cadena ligera, que se unen o asocian por un enlace no covalente mediado por ion metálico.

En otras realizaciones, FVIII es FVIII de cadena sencilla que no se ha escindido poco después de la arginina en el aminoácido 1648 (en FVIII de longitud completa o SEQ ID NO: 16), aminoácido 754 (en FVIII de dominio B delecionado S743/Q1638 o SEQ ID NO: 18), o el resto de arginina correspondiente (en otras variantes). Un FVIII de cadena sencilla puede comprender una o más sustituciones de aminoácidos. En una realización, la sustitución de aminoácidos está en un resto correspondiente al resto 1648, resto 1645, o ambos, de polipéptido factor VIII maduro de longitud completa (SEQ ID NO: 16) o resto 754, resto 751, o ambos, de factor VIII Sq BDD (SEQ ID NO: 18). La sustitución de aminoácidos puede ser cualquier aminoácido distinto de arginina, por ejemplo, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, treonina, triptófano, valina, alanina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutámico, glutamina, glicina, prolina, selenocisteína, serina, tirosina, histidina, ornitina, pirrolisina o taurina.

FVIII se puede escindir adicionalmente por trombina y luego activar como FVIIIa, que sirve de cofactor para factor IX activado (FIXa). Y FIX activado junto con FVIII activado forma un complejo Xasa y convierte el factor X en factor X activado (FXa). Para la activación, FVIII se escinde por trombina después de tres restos de arginina, en los aminoácidos 372, 740 y 1689 (correspondientes a los aminoácidos 372, 740 y 795 en la secuencia de FVIII de dominio B delecionado), generando la escisión FVIIIa que tiene las cadenas A1 de 50 kDa, A2 de 43 kDa y A3-C1-C2 de 73 kDa. En una realización, la proteína FVIII útil para la presente invención es FVIII no activo. En otra realización, la proteína FVIII es un FVIII activado.

La proteína que tiene polipéptido FVIII unido o asociado al fragmento de VWF puede comprender una secuencia al menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 16 o 18, en donde la secuencia tiene la actividad de coagulación de FVIII, por ejemplo, que activa el factor IX como cofactor para convertir el factor X en el factor X activado (FXa).

Polipéptidos y proteínas "híbridos", como se usa en el presente documento, significa una combinación de una primera cadena de polipéptidos, por ejemplo, el fragmento de VWF, opcionalmente fusionado con un primer resto heterólogo, con una segunda cadena de polipéptidos, por ejemplo, una proteína FVIII, opcionalmente fusionada con un segundo resto heterólogo, formando así un heterodímero. En otra realización, se asocian entre sí el primer polipéptido y el segundo polipéptido en un híbrido mediante disulfuro u otro(s) enlace(s) covalente(s). Los híbridos se describen, por ejemplo, en los documentos de patente US 2004/101740 y US 2006/074199. El segundo polipéptido puede ser una copia idéntica del primer polipéptido o un polipéptido no idéntico. En otra realización, el primer polipéptido comprende un fragmento de proteína de fusión VWF-Fc, y el segundo polipéptido comprende proteína de fusión FVIII-Fc, haciendo el híbrido un heterodímero. El primer polipéptido y el segundo polipéptido se pueden asociar mediante un enlace covalente, por ejemplo, un enlace disulfuro, entre la primera región Fc y la segunda región Fc. El primer polipéptido y el segundo polipéptido se pueden asociar adicionalmente entre sí por unión entre el fragmento de VWF y la proteína FVIII.

D) Conectores

La proteína quimérica de la presente invención comprende además un conector. Pueden estar presentes uno o más conectores entre cualesquiera dos proteínas, por ejemplo, entre el resto auxiliar y la proteína FVIII (algunas veces también denominado "conector FVIII/AM"), entre el fragmento de VWF y un primer resto heterólogo (algunas veces también denominado "conector de VWF"), por ejemplo, una primera región Fc, entre una proteína FVIII y un segundo resto heterólogo (algunas veces también denominado "conector de FVIII"), por ejemplo, una segunda región Fc, entre el fragmento de VWF y una proteína FVIII (por ejemplo, conector FVIII/AM), entre el fragmento de VWF y un segundo resto heterólogo, y/o entre una proteína FVIII y un primer resto heterólogo. Cada uno de los conectores puede tener la misma secuencia o diferente. En una realización, el conector es un conector polipeptídico. En otra realización, el conector es un conector no polipeptídico.

El conector útil en la presente invención puede comprender cualquier molécula orgánica. En una realización, el conector es un polímero, por ejemplo, polietilenglicol (PEG) o hidroxietilalmidón (HES). En otra realización, el conector es una secuencia de aminoácidos (por ejemplo, un conector polipeptídico). El conector polipeptídico puede comprender al menos aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900 o 2000 aminoácidos. El conector puede comprender 1-5 aminoácidos, 1-10 aminoácidos, 1-20 aminoácidos, 10-50 aminoácidos, 50-100 aminoácidos, 100 200 aminoácidos, 200-300 aminoácidos, 300-400 aminoácidos, 400-500 aminoácidos, 500-600 aminoácidos, 600 700 aminoácidos, 700-800 aminoácidos, 800-900 aminoácidos, o 900-1000 aminoácidos.

Se conocen bien en la técnica los ejemplos de conectores polipeptídicos. En una realización, el conector comprende la secuencia Gn. El conector puede comprender la secuencia (GA)n. El conector puede comprender la secuencia (GGS)n. En otras realizaciones, el conector comprende (GGGS)n (SEQ ID NO: 20). En otras realizaciones más, el conector comprende la secuencia (GGS)n(GGGGS)n (SEQ ID NO: 21). En estos casos, n pueden ser un número entero de 1 -100. En otros casos, n pueden ser un número entero de 1 -20, es decir, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20. Los ejemplos de conectores incluyen, pero no se limitan a, GGG, SGGSGGS (SEQ ID NO: 22), GGSGGSGGSGGSGGG (SEQ ID NO: 23), GGSGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 24), GGSGGSGGSGGSGGSGGS (SEQ ID NO: 25), GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 26), los conectores en la Tabla 13 (SEQ ID NOs: 92, 93 y 94), y los conectores en la Tabla 14A (SEQ ID NOs: 95, 96 y 97). El conector no se elimina o disminuye la actividad del fragmento de VWF o la actividad de coagulación del factor VIII. Opcionalmente, el conector potencia la actividad del fragmento de VWF o la actividad de coagulación de la proteína factor VIII, por ejemplo, disminuyendo adicionalmente los efectos del impedimento estérico y haciendo el fragmento de VWF o la porción de factor VIII más accesible a su sitio de unión diana.

En una realización, el conector útil para la proteína quimérica tiene 15-25 aminoácidos de longitud. En otra realización, el conector útil para la proteína quimérica tiene 15-20 aminoácidos de longitud. En algunas realizaciones, el conector para la proteína quimérica tiene 10-25 aminoácidos de longitud. En otras realizaciones, el conector para la proteína quimérica tiene 15 aminoácidos de longitud. En otras realizaciones más, el conector para la proteína quimérica es (GGGGS)n (SEQ ID NO: 27), donde G representa glicina, S representa serina y n es un número entero de 1 -20.

E) Sitios de escisión

El conector también puede incorporar un resto capaz de ser escindido o químicamente (por ejemplo, hidrólisis de un éster enlace), enzimáticamente (es decir, incorporación de una secuencia de escisión por proteasa), o fotolíticamente (por ejemplo, un cromóforo tal como ácido 3-amino-3-(2-nitrofenil)propriónico (ANP)) para liberar una molécula de otra.

En una realización, el conector es un conector escindible. Los conectores escindibles pueden comprender uno o más sitios de escisión en el extremo N o extremo C, o ambos. En otra realización, el conector escindible consiste esencialmente en o consiste en uno o más sitios escindibles. En otras realizaciones, el conector escindible comprende las secuencias conectoras de aminoácidos heterólogos descritas en el presente documento o polímeros y uno o más sitios escindibles.

En ciertas realizaciones, un conector escindible comprende uno o más sitios de escisión que se pueden escindir en una célula hospedadora (es decir, sitios de procesamiento intracelular). Los ejemplos no limitantes del sitio de escisión incluyen RRRR (SEQ ID NO: 52), RKRRKR (SEQ ID NO: 53) y RRRRS (SEQ ID NO: 54).

En otras realizaciones, un conector escindible comprende uno o más sitios de escisión que se escinden por una proteasa después de que se administre a un sujeto una proteína quimérica que comprende el conector escindible. En una realización, el sitio de escisión se escinde por una proteasa seleccionada del grupo que consiste en factor XIa, factor XIIa, calicreína, factor VIIa, factor IXa, factor Xa, factor IIa (trombina), elastasa-2, MMP-12, MMP-13, MMP-17 y MMP-20. En otra realización, el sitio de escisión se selecciona del grupo que consiste en un sitio de escisión de FXIa (por ejemplo, KLTR l AET (SEQ ID NO: 29)), un sitio de escisión de FXIa (por ejemplo, DFTR l VVG (SEQ ID NO: 30)), un sitio de escisión de FXIIa (por ejemplo, TMTR l IVGG (SEQ ID NO: 31)), un sitio de escisión de calicreína (por ejemplo, SPFR l STGG (SEQ ID NO: 32)), un sitio de escisión de FVIIa (por ejemplo, LQVR l IVGG (SEQ ID NO: 33)), un sitio de escisión de FIXa (por ejemplo, PLGR l IVGG (SEQ ID NO: 34)), un sitio de escisión de FXa (por ejemplo, IEGR l TVGG (SEQ ID NO: 35)), un sitio de escisión de FIIa (trombina) (por ejemplo, LTPR l ^sL^lV (S^eQ ID NO: 36)), un sitio de escisión de elastasa-2 (por ejemplo, LGPV l S^gVP (S^eQ ID NO: 37)), una escisión de granzima-B (por ejemplo, VAGD l SLEE (SEQ ⁱD NO: 38)), un sitio de escisión de MMP-12 (por ejemplo, GPAG l LGGA (SEQ ID ⁿO: 39)), un sitio de escisión de MMP-13 (por ejemplo, GPAG l LRGA (SEQ ID nO: 40)), un sitio de escisión de MMP-17 (por ejemplo, APLG l LRLR (SEQ iD NO: 41)), un sitio de escisión de MMP-20 (por ejemplo, PALP l LVAQ (SEQ ID ⁿO: 42)), un sitio de escisión de TEV (por ejemplo, ENLYFQ l G (SEQ ID NO: 43)), un sitio de escisión de enterocinasa (por ejemplo, DDDK l IVGG (SEQ ID ⁿO: 44)), un sitio de escisión de proteasa 3C (PRESCISSION™) (por ejemplo, LEv LfQ l GP (SEQ ID NO: 45)) y un sitio de escisión de sortasa A (por ejemplo, LPKT l GSES) (SEQ ID NO: 46). En ciertas realizaciones, los sitios de escisión de FXIa incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, TQSFNDFTR (SEQ ID NO: 47) y SVSQTSKLTR (SEQ ID NO: 48). Los sitios de escisión de trombina a modo de ejemplo no limitante incluyen, por ejemplo, DFLAEGGGVR (SEQ ID NO: 49), TTKIKPR (SEQ ID NO: 50) o LVPRG (SEQ ID NO: 55), y una secuencia que comprende, consiste esencialmente en, o que consiste en ALRPR (por ejemplo, ALRPRVVGGA (SEQ ID NO: 51)). En una realización específica, el sitio de escisión es TLDPRSFLLRNPNDKYEPFWEDEEK (SEQ ID NO: 56).

Polinucleótidos, vectores, células hospedadoras, y métodos de preparación

También se proporciona en la divulgación un polinucleótido que codifica un fragmento de VWF descrito en el presente documento, una proteína quimérica que comprende el fragmento de VWF y un resto heterólogo, una proteína quimérica que comprende una proteína FVIII y un resto auxiliar, o una proteína quimérica que comprende un fragmento de VWF y una proteína FVIII. Cuando un fragmento de VWF se une a un resto heterólogo o una proteína FVIII en una proteína quimérica como una cadena sencilla de polipéptidos, la invención se refiere a un polinucleótido que codifica el fragmento de VWF unido al resto heterólogo o la proteína FVIII. Cuando la proteína quimérica comprende una primera y una segunda cadenas de polipéptidos, la primera cadena de polipéptidos que comprende un fragmento de VWF y un primer resto heterólogo (por ejemplo, una primera región Fc) y la segunda cadena de polipéptidos que comprende un segundo resto heterólogo (por ejemplo, una segunda región Fc), en donde la primera cadena de polipéptidos y la segunda cadena de polipéptidos están asociadas entre sí, un polinucleótido puede comprender la primera secuencia de nucleótidos y la segunda secuencia de nucleótidos. En una realización, la primera secuencia de nucleótidos y la segunda secuencia de nucleótidos están en el mismo polinucleótido. En otra realización, la primera secuencia de nucleótidos y la segunda secuencia de nucleótidos están en dos polinucleótidos diferentes (por ejemplo, vectores diferentes). En ciertas realizaciones, la presente invención se refiere a un conjunto de polinucleótidos que comprende una primera cadena de nucleótidos y una segunda cadena de nucleótidos, en donde la primera cadena de nucleótidos codifica el fragmento de VWF de la proteína quimérica y la segunda cadena de nucleótidos codifica la proteína FVIII.

En otras realizaciones, el conjunto de los polinucleótidos comprende además una cadena de nucleótidos adicional (por ejemplo, una segunda cadena de nucleótidos cuando el polipéptido quimérico está codificado por una única cadena de polinucleótidos o una tercera cadena de nucleótidos cuando la proteína quimérica está codificada por dos cadenas de polinucleótidos) que codifica una proteína convertasa. La proteína convertasa se puede seleccionar del grupo que consiste en proproteína convertasa subtilisina/kexina tipo 5 (PCSK5 o PC5), proproteína convertasa subtilisina/kexina tipo 7 (PCSK7 o PC5), una levadura Kex 2, proproteína convertasa subtilisina/kexina tipo 3 (PACE o PCSK3), y dos o más combinaciones de las mismas. En algunas realizaciones, la proteína convertasa es PACE, PC5, o PC7. En una realización específica, la proteína convertasa es PC5 o PC7. Véase la solicitud internacional N° PCT/US2011/043568. En otra realización, la proteína convertasa es PACE/furina.

En ciertas realizaciones, la invención incluye un conjunto de polinucleótidos que comprende una primera secuencia de nucleótidos que codifica un fragmento de VWF que comprende un dominio D' y un dominio D3 de VWF, una segunda secuencia de nucleótidos que codifica una proteína FVIII, y una tercera secuencia de nucleótidos que codifica un dominio D1 y dominio d2 de VWF. En esta realización, el dominio D1 y dominio D2 se expresan por separado (no se unen al dominio D'D3 del fragmento de VWF) con el fin de la formación apropiada de enlace disulfuro y plegamiento de los dominios D'D3. La expresión del dominio D1D2 pueden estar o en cis o en trans.

Como se usa en el presente documento, un vector de expresión se refiere a cualquier construcción de ácidos nucleicos que contenga los elementos necesarios para la transcripción y traducción de una secuencia codificante insertada, o en el caso de un vector viral de ARN, los elementos necesarios para la replicación y traducción, cuando se introducen en una célula hospedadora apropiada. Los vectores de expresión pueden incluir plásmidos, fagémidos, virus, y derivados de los mismos.

Los vectores de expresión de la invención incluirán polinucleótidos que codifican el fragmento de VWF o la proteína quimérica que comprende el fragmento de VWF.

En una realización, una secuencia codificante para el fragmento de VWF, el segundo resto heterólogo (por ejemplo, una segunda región Fc), o la proteína FVIII, se une operativamente a una secuencia de control de la expresión. Como se usa en el presente documento, dos secuencias de ácidos nucleicos se unen operativamente cuando se unen covalentemente de tal forma que se permita que cada secuencia de ácidos nucleicos componente retenga su funcionalidad. Se dice que una secuencia codificante y una secuencia de control de la expresión génica se unen operativamente cuando se unen covalentemente de tal forma que se ponga la expresión o transcripción y/o traducción de la secuencia codificante bajo la influencia o el control de la secuencia de control de la expresión génica. Se dice que dos secuencias de ADN se unen operativamente si la inducción de un promotor en la secuencia de expresión del gen 5' da como resultado la transcripción de la secuencia codificante y si la naturaleza del enlace entre las dos secuencias de ADN no (1) da como resultado la introducción de una mutación con desplazamiento de marco, (2) interfiere con la capacidad de la región promotora para dirigir la transcripción de la secuencia codificante, o (3) interfiere con la capacidad del transcrito de ARN correspondiente que se va a traducir en una proteína. Así, una secuencia de expresión génica se uniría operativamente a una secuencia de ácidos nucleicos codificante si la secuencia de expresión génica fuera capaz de efectuar la transcripción de esa secuencia de ácidos nucleicos codificante de forma que el transcrito resultante se tradujera en la proteína deseada o polipéptido.

Una secuencia de control de la expresión génica como se usa en el presente documento es cualquier secuencia de nucleótidos reguladora, tal como una secuencia promotora o combinación de promotor-potenciador, que facilita la eficiente transcripción y traducción del ácido nucleico codificante al que se une operativamente. La secuencia de control de la expresión génica puede ser, por ejemplo, un promotor de mamífero o viral, tal como un promotor constitutivo o inducible. Los promotores constitutivos de mamífero incluyen, pero no se limitan a, los promotores para los siguientes genes: promotor de hipoxantina fosforibosil transferasa (HPRT), adenosina desaminasa, piruvato cinasa, beta-actina, y otros promotores constitutivos. Los promotores virales a modo de ejemplo que funcionan constitutivamente en células eucariotas incluyen, por ejemplo, promotores del citomegalovirus (CMV), virus simio (por ejemplo, SV40), virus del papiloma, adenovirus, virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), virus del sarcoma de Rous, citomegalovirus, las repeticiones terminales largas (LTR) del virus de la leucemia de Moloney, y otros retrovirus, y el promotor de timidina cinasa del virus del herpes simple. Los expertos habituales en la técnica conocen otros promotores constitutivos. Los promotores útiles como secuencias de expresión génica de la invención también incluyen promotores inducibles. Los promotores inducibles se expresan en presencia de un agente inductor. Por ejemplo, se induce el promotor de metalotioneína para promover la transcripción y traducción en presencia de ciertos iones metálicos. Los expertos habituales en la técnica conocen otros promotores inducibles.

En general, la secuencia de control de la expresión génica debe incluir, según sea necesario, secuencias no transcriptoras de 5' y no traductoras de 5' implicadas en el inicio de la transcripción y traducción, respectivamente, tal como una caja TATA, secuencia de terminación, secuencia CAAT, y similares. Especialmente, dichas secuencias no transcriptoras de 5' incluirán una región promotora que incluye una secuencia promotora para el control de la transcripción del ácido nucleico codificante operativamente unido. Las secuencias de expresión génica incluyen opcionalmente secuencias potenciadoras o secuencias activadoras en la dirección 5', según se desee.

Los vectores virales incluyen, pero no se limitan a, secuencias de ácidos nucleicos de los siguientes virus: retrovirus, tales como el virus de la leucemia murina de Moloney, virus del sarcoma murino de Harvey, virus del tumor mamario murino y virus del sarcoma de Rous; adenovirus, virus adeno-asociado; virus tipo SV40; virus del polioma; virus de Epstein-Barr; virus del papiloma; virus del herpes; virus de la variolovacuna; virus de la poliomielitis; y virus de ARN tales como un retrovirus. Se pueden emplear fácilmente otros vectores muy conocidos en la técnica. Ciertos vectores virales se basan en virus eucariotas no citopáticos en los que genes no esenciales se han sustituido con el gen de interés. Los virus no citopáticos incluyen retrovirus, cuyo ciclo vital implica transcripción inversa de ARN viral genómico en ADN con posterior integración proviral en ADN de la célula hospedadora. Los retrovirus han sido autorizados para ensayos de terapia de genes humanos. Los más útiles son los retrovirus que son deficientes en la replicación (es decir, capaces de dirigir la síntesis de las proteínas deseadas, pero incapaces de fabricar una partícula infecciosa). Dichos vectores de expresión retroviral genéticamente alterados tienen utilidad general para la transducción de alta eficiencia de genes in vivo. Se proporcionan protocolos convencionales para producir retrovirus deficientes en la replicación (incluyendo las etapas de incorporación de material genético exógeno dentro de un plásmido, transfección de una línea celular de encapsidación con plásmido, producción de retrovirus recombinantes por la línea celular de encapsidación, recogida de partículas virales de medios de cultivo de tejido, e infección de las células diana con partículas virales) en Kriegler, M., Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, W.H. Freeman Co., New York (1990) y Murry, E. J., Methods in Molecular Biology, Vol. 7, Humana Press, Inc., Cliffton, N.J. (1991).

En una realización, el virus es un virus adeno-asociado, un virus de ADN bicatenario. El virus adeno-asociado se puede manipular para ser deficiente en la replicación y es capaz de infectar una amplia variedad de tipos de células y especies. Tiene además ventajas tales como estabilidad al calor y disolventes lipídicos; altas frecuencias de transducción en células de diversos linajes, que incluyen células hemopoyéticas; y carecen de inhibición de la superinfección, permitiendo así múltiples series de transducciones. Supuestamente, el virus adeno-asociado se puede integrar dentro del ADN celular humano de un modo específico de sitio, minimizando así la posibilidad de mutagénesis insercional y variabilidad de la expresión génica insertada característica de la infección retroviral. Además, se han seguido las infecciones por virus adeno-asociados no mutantes en cultivo de tejido durante más de 100 pases en ausencia de presión selectiva, que implica que la integración genómica del virus adeno-asociado es un acontecimiento relativamente estable. El virus adeno-asociado también puede funcionar de un modo extracromosómico.

Otros vectores incluyen vectores plasmídicos. Los vectores plasmídicos se han descrito ampliamente en la técnica y son bien conocidos para los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. En los últimos años, se ha encontrado que los vectores plasmídicos son particularmente ventajosos para administrar genes a células in vivo debido a su incapacidad para replicarse dentro de e integrarse en un genoma hospedador. Estos plásmidos, sin embargo, que tienen un promotor compatible con la célula hospedadora, pueden expresar un péptido de un gen operativamente codificado dentro del plásmido. Algunos plásmidos comúnmente usados disponibles de proveedores comerciales incluyen pBR322, pUC18, pUC19, diversos plásmidos de pcDNA, pRC/CMV, diversos plásmidos de pCMV, pSV40 y pBlueScript. Los ejemplos adicionales de plásmidos específicos incluyen pcDNA3.1, número de catálogo V79020; pcDNA3.1/hygro, número de catálogo V87020; pcDNA4/myc-His, número de catálogo V86320; y pBudCE4.1, número de catálogo V53220, todos de Invitrogen (Carlsbad, CA.). Otros plásmidos son bien conocidos por los expertos habituales en la técnica. Además, los plásmidos pueden ser diseñados a medida usando técnicas convencionales de biología molecular para retirar y/o añadir fragmentos específicos de ADN.

En un sistema de expresión en insecto que se puede usar para producir las proteínas de la invención, se usa el virus de la poliedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) como vector para expresar los genes extraños. El virus crece en células de Spodoptera frugiperda. Se puede clonar una secuencia codificante en regiones no esenciales (por ejemplo, el gen poliédrico) del virus y ponerse bajo el control de un promotor de AcNPV (por ejemplo, el promotor poliédrico). La inserción satisfactoria de una secuencia codificante dará como resultado la inactivación del gen poliédrico y la producción de virus recombinante no ocluido (es decir, virus que carece de la cubierta proteinácea codificada por el gen poliédrico). Estos virus recombinantes se usan entonces para infectar células de Spodoptera frugiperda en las que se expresa el gen insertado (véase, por ejemplo, Smith et al. (1983) J Virol 46:584; patente de EE. UU. N° 4.215.051). Los ejemplos adicionales de este sistema de expresión se pueden encontrar en Ausubel et al., eds. (1989) Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience.

Otro sistema que se puede usar para expresar las proteínas de la invención es el sistema de expresión en gen glutamina sintetasa, también denominado el "sistema de expresión en GS" (Lonza Biologics PLC, Berkshire RU). Este sistema de expresión se describe con detalle en la patente de EE. UU. N° 5.981.216.

En células hospedadoras de mamífero, se pueden utilizar varios sistemas de expresión basados en virus. En los casos en los que un adenovirus se usa como vector de expresión, se puede unir una secuencia codificante a un complejo de control de la transcripción/traducción de adenovirus, por ejemplo, el promotor tardío y la secuencia conductora tripartita. Este gen quimérico se puede entonces insertar en el genoma del adenovirus por recombinación in vitro o in vivo. La inserción en una región no esencial del genoma viral (por ejemplo, región E1 o E3) dará como resultado un virus recombinante que es viable y capaz de expresar péptido en hospedadores infectados. Véase, por ejemplo, Logan & Shenk (1984) Proc Natl Acad Sci USA 81:3655). Alternativamente, se puede usar el promotor de la variolovacuna 7.5 K. Véanse, por ejemplo, Mackett et al. (1982) Proc Natl Acad Sci USA 79:7415; Mackett et al. (1984) J Virol 49:857; Panicali et al. (1982) Proc Natl Acad Sci USA 79:4927.

Para aumentar la eficiencia de producción, los polinucleótidos se pueden diseñar para codificar múltiples unidades de la proteína de la invención separadas por sitios de escisión enzimática. El polipéptido resultante se puede escindir (por ejemplo, mediante tratamiento con la enzima apropiada) para recuperar las unidades de polipéptido. Esto puede aumentar el rendimiento de polipéptidos accionados por un único promotor. Cuando se usa en sistemas de expresión virales apropiados, la traducción de cada polipéptido codificado por el ARNm se dirige internamente en el transcrito; por ejemplo, por un sitio interno de entrada al ribosoma, IRES. Así, la construcción policistrónica dirige la transcripción de un único ARNm policistrónico grande que, a su vez, dirige la traducción de múltiples polipéptidos individuales. Este enfoque elimina la producción y el procesamiento enzimático de poliproteínas y puede aumentar significativamente el rendimiento de polipéptidos accionados por un único promotor.

Los vectores usados en la transformación contendrán normalmente un marcador de selección usado para identificar transformantes. En sistemas bacterianos, esto puede incluir un gen de resistencia a antibióticos tal como ampicilina o kanamicina. Los marcadores de selección para su uso en células de mamífero cultivadas incluyen genes que confieren resistencia a fármacos, tales como neomicina, higromicina y metrotrexato. El marcador de selección puede ser un marcador de selección amplificable. Un marcador de selección amplificable es el gen dihidrofolato reductasa (DHFR). Simonsen C C et al. (1983) Proc Natl Acad Sci USA 80:2495-9. Los marcadores de selección se revisan por Thilly (1986) Mammalian Cell Technology, Butterworth Publishers, Stoneham, Mass., y la elección de los marcadores de selección está perfectamente dentro del nivel del experto habitual en la técnica.

Los marcadores de selección se pueden introducir en la célula sobre un plásmido separado al mismo tiempo que el gen de interés, o se pueden introducir sobre el mismo plásmido. Si es sobre el mismo plásmido, el marcador de selección y el gen de interés pueden estar bajo el control de diferentes promotores o el mismo promotor, produciendo la última disposición un mensaje dicistrónico. Se conocen en la técnica construcciones de este tipo (por ejemplo, la patente de ^eE. UU. N° 4.713.339).

Los vectores de expresión pueden codificar marcas que permiten la fácil purificación de la proteína recombinantemente producida. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, vector pUR278 (Ruther et al. (1983) EMBO J 2:1791), en el que las secuencias codificantes para la proteína a expresar se pueden unir en el vector en marco con la región codificante lac z de manera que se produzca una proteína de fusión marcada; se pueden usar vectores pGEX para expresar proteínas de la invención con una marca de glutatión S-transferasa (GST). Estas proteínas son normalmente solubles y se pueden purificar fácilmente de células por adsorción a perlas de glutatiónagarosa, seguido por elución en presencia de glutatión libre. Los vectores incluyen sitios de escisión (trombina o proteasa de factor Xa o PRESCISSION PROTEASE™ (Pharmacia, Peapack, N.J.)) para la fácil retirada de la marca después de la purificación.

Entonces, el vector o vectores de expresión se transfectan o co-transfectan en una célula diana adecuada, que expresará los polipéptidos. Las técnicas de transfección conocidas en la técnica incluyen, pero no se limitan a, precipitación con fosfato de calcio (Wigler et al. (1978) Cell 14:725), electroporación (Neumann et al. (1982) EMBO J 1:841) y reactivos basados en liposomas. Se puede utilizar una variedad de sistemas de vectores de expresión en huésped para expresar las proteínas descritas en el presente documento, que incluyen tanto células procariotas como eucariotas. Estos incluyen, pero no se limitan a, microorganismos tales como bacterias (por ejemplo, E. coli) transformadas con vectores de expresión recombinantes de ADN de bacteriófago o de ADN de plásmido que contienen una secuencia codificante apropiada; levadura u hongos filamentosos transformados con vectores de expresión recombinantes de levadura u hongos que contienen una secuencia codificante apropiada; sistemas de células de insecto infectadas con vectores de expresión de virus recombinantes (por ejemplo, baculovirus) que contienen una secuencia codificante apropiada; sistemas de células de planta infectados con vectores de expresión de virus recombinantes (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor o virus del mosaico del tabaco) o transformados con vectores de expresión de plásmidos recombinantes (por ejemplo, plásmido Ti) que contienen una secuencia codificante apropiada; o sistemas de células de animal, que incluyen células de mamífero (por ejemplo, células HEK 293, CHO, Cos, HeLa, HKB11 y BHK).

En una realización, la célula hospedadora es una célula eucariota. Como se usa en el presente documento, una célula eucariota se refiere a cualquier célula de animal o planta que tiene un núcleo definitivo. Las células eucariotas de animales incluyen células de vertebrados, por ejemplo, mamíferos, y células de invertebrados, por ejemplo, insectos. Las células eucariotas de plantas pueden incluir específicamente, sin limitación, células de levadura. Una célula eucariota es distinta de una célula procariota, por ejemplo, bacterias.

En ciertas realizaciones, la célula eucariota es una célula de mamífero. Una célula de mamífero es cualquier célula derivada de un mamífero. Las células de mamífero incluyen específicamente, pero no se limitan a, líneas celulares de mamífero. En una realización, la célula de mamífero es una célula humana. En otra realización, la célula de mamífero es una célula HEK 293, que es una línea celular de riñón embrionario humano. Las células HEK 293 están disponibles como CRL-1533 de la Colección Americana de Cultivos Tipo, Manassas, VA, y como células 293-H, N° de catálogo 11631-017 o células 293-F, N° de catálogo 11625-019 de Invitrogen (Carlsbad, Calif.). En algunas realizaciones, la célula de mamífero es una célula PER.C6®, que es una línea celular humana derivada de retina. Las células PER.C6® están disponibles de Crucell (Leiden, Países Bajos). En otras realizaciones, la célula de mamífero es una célula de ovario de hámster chino (CHO). Las células CHO están disponibles de la Colección Americana de Cultivos Tipo, Manassas, VA (por ejemplo, CHO-K1; CCL-61). En otras realizaciones más, la célula de mamífero es una célula de riñón de hámster bebé (BHK). Las células BHK están disponibles de la Colección Americana de Cultivos Tipo, Manassas, VA (por ejemplo, CRL-1632). En algunas realizaciones, la célula de mamífero es una célula HKB11, que es una línea celular híbrida de una célula HEK293 y una línea de linfocitos B humanos. Mei et al., Mol. Biotechnol. 34(2): 165-78 (2006).

En una realización, un plásmido que codifica el fragmento de VWF o la proteína quimérica de la invención incluye además un marcador de selección, por ejemplo, resistencia a zeocina, y se transfecta en células HEK 293, para la producción del fragmento de VWF o la proteína quimérica.

En otra realización, se cotransfectan en células HEK 293 un primer plásmido que comprende una secuencia codificante de la fusión factor VIII-Fc y un primer marcador de selección, por ejemplo, un gen de resistencia a zeocina, y un segundo plásmido que comprende una secuencia codificante del fragmento de VWF-Fc y un segundo marcador de selección, por ejemplo, un gen de resistencia a neomicina, para la producción de híbrido de factor VIII-Fc y VWF-Fc. El primer y segundo plásmidos se pueden introducir en cantidades iguales (es decir, relación 1:1), o se pueden introducir en cantidades no iguales.

En algunas realizaciones, se cotransfectan en células HEK 293 un primer plásmido que incluye una secuencia codificante de fusión de factor VIII-Fc y un primer marcador de selección, por ejemplo, un gen de resistencia a zeocina, y un segundo plásmido que incluye una secuencia codificante de fragmento de VWF-Fc y un segundo marcador de selección, por ejemplo, un gen de resistencia a neomicina, y un tercer plásmido que incluye una secuencia codificante de proteína convertasa (por ejemplo, PC5 o furina) y un tercer marcador de selección, por ejemplo, un gen de resistencia a higromicina, para la producción del híbrido de factor VIII-fragmento de VWF. El primer y segundo plásmidos se pueden introducir en cantidades iguales (es decir, relación molar 1 :1 ), o se pueden introducir en cantidades no iguales. En ciertas realizaciones, se cotransfectan en células HEK 293 un primer plásmido, que incluye una secuencia codificante de la fusión factor VIII-Fc, una secuencia codificante de fragmento de VWF-Fc, y un primer marcador de selección, por ejemplo, un gen de resistencia a zeocina, y un segundo plásmido que incluye una secuencia codificante de proteína convertasa (por ejemplo, PC5 o furina) y un segundo marcador de selección, por ejemplo, un gen de resistencia a higromicina, para la producción de híbrido de factor VIII-fragmento de VWF. En una realización, se puede conectar la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de FVIII-Fc y la secuencia del fragmento de VWF-Fc para codificar un único polipéptido. En otra realización, la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de FVIII-Fc y la secuencia del fragmento de VWF-Fc se pueden codificar como cadenas de dos polipéptidos. Los promotores para la secuencia codificante de la fusión factor VIII-Fc y la secuencia codificante del fragmento de VWF-Fc pueden ser diferentes o pueden ser los mismos.

En algunas realizaciones, un plásmido que comprende furina se co-transfecta con el plásmido que contiene la secuencia codificante del factor VIII-Fc y/o la secuencia codificante del fragmento de VWF-Fc. En algunas realizaciones, la proteína furina está sobre el mismo plásmido que comprende la secuencia codificante de la fusión de factor VIII-Fc. En algunas realizaciones, la proteína furina está sobre el mismo plásmido que comprende la secuencia codificante del fragmento de VWF-Fc. En algunas realizaciones, la proteína furina está sobre un plásmido separado.

En otras realizaciones más, las células transfectadas se transfectan establemente. Estas células se pueden seleccionar y mantener como una línea celular estable, usando técnicas convencionales conocidas por los expertos en la técnica.

Las células hospedadoras que contienen construcciones de ADN de la proteína se cultivan en un medio de crecimiento apropiado. Como se usa en el presente documento, el término "medio de crecimiento apropiado" significa un medio que contiene los nutrientes requeridos para el crecimiento de las células. Los nutrientes requeridos para el crecimiento celular pueden incluir una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, aminoácidos esenciales, vitaminas, minerales y factores de crecimiento. Opcionalmente, los medios pueden contener uno o más factores de selección. Opcionalmente, los medios pueden contener suero de ternero bovino o suero de ternero fetal (FCS). En una realización, los medios no contienen sustancialmente IgG. El medio de crecimiento, en general, se seleccionará para células que contienen la construcción de ADN por, por ejemplo, selección de fármacos o deficiencia en un nutriente esencial que se complementa por el marcador de selección sobre la construcción de ADN o se co-transfecta con la construcción de ADN. Las células de mamífero cultivadas, en general, se cultivan en medio que contiene suero o sin suero comercialmente disponible (por ejemplo, MEM, DMEM, DMEM/F12). En una realización, el medio es CD293 (Invitrogen, Carlsbad, CA.). En otra realización, el medio es CD17 (Invitrogen, Carlsbad, CA.). La selección de un medio apropiado para la línea celular particular usada está dentro del nivel de los expertos habituales en la técnica.

Para co-expresar el fragmento de VWF y un segundo resto heterólogo o una proteína FVIII, las células hospedadoras se cultivan en condiciones que permiten la expresión de tanto el fragmento de VWF como un segundo resto heterólogo o una proteína FVIII. Como se usa en el presente documento, cultivar se refiere a mantener las células vivas in vitro durante al menos un tiempo definido. Mantener puede incluir, pero no necesita incluir, un aumento en la población de células vivas. Por ejemplo, las células mantenidas en cultivo pueden ser estáticas en la población, pero todavía viables y capaces de producir un producto deseado, por ejemplo, una proteína recombinante o proteína de fusión recombinante. Se conocen bien en la técnica las condiciones adecuadas para cultivar células eucariotas e incluyen la selección apropiada de medios de cultivo, suplementos para medios, temperatura, pH, saturación de oxígeno, y similares. Para fines comerciales, cultivar puede incluir el uso de cualquiera de diversos tipos de sistemas de aumento de escala que incluyen matraces agitadores, botellas rotatorias, biorreactores de fibra hueca, biorreactores de tanque agitado, biorreactores de columna aireada, biorreactores Wave, y otros.

Las condiciones del cultivo celular también se seleccionan para permitir la asociación del fragmento de VWF con el segundo resto heterólogo o una proteína FVIII. La condiciones que permiten la expresión del fragmento de VWF y/o la proteína FVIII pueden incluir la presencia de una fuente de vitamina K. Por ejemplo, en una realización, se cultivan células HEK 293 establemente transfectadas en medio CD293 (Invitrogen, Carlsbad, CA) o medio OptiCHO (Invitrogen, Carlsbad, CA) complementado con glutamina 4 mM.

En un aspecto, la presente divulgación se refiere a un método de expresión, preparación o producción del fragmento de VWF de la divulgación que comprende a) transfectar una célula hospedadora con un polinucleótido que codifica el fragmento de VWF y b) cultivar la célula hospedadora en un medio de cultivo en una condición adecuada para expresar el fragmento de VWF, en donde se expresa el fragmento de VWF. En un caso, la divulgación se refiere a un método de producción de una proteína VWF madura o un fragmento de la misma que comprende a) transfectar una célula hospedadora con un primer polinucleótido que codifica la proteína VWF o un fragmento de la misma, que se fusiona con un propéptido de VWF, y un segundo polinucleótido que codifica una proteína convertasa, por ejemplo, PC5, PC7, o furina y b) cultivar la célula hospedadora en un medio de cultivo en una condición adecuada para expresar la proteína VWF madura o fragmento de la misma. El polinucleótido que codifica la proteína VWF o un fragmento de la misma también se puede fusionar con un prepéptido de VWF. La secuencia de prepéptidos se puede escindir durante la inserción al retículo endoplasmático antes de la secreción.

En otro aspecto, la divulgación se refiere a un método de expresión, preparación o producción de una proteína quimérica que comprende el fragmento de VWF unido o asociado a un resto heterólogo o una proteína FVIII que comprende a) transfectar una o más células hospedadoras con un polinucleótido o un conjunto de polinucleótidos que codifica la proteína quimérica y b) cultivar la célula hospedadora en un medio de cultivo en condiciones adecuadas para expresar la proteína quimérica. En una realización, la invención se refiere a un método de expresión, preparación o producción de una proteína quimérica que comprende a) transfectar una célula hospedadora con un primer polinucleótido que codifica un fragmento de VWF unido a un resto heterólogo y un segundo polinucleótido que codifica una proteína FVIII unida a un resto heterólogo y b) cultivar la célula hospedadora en un medio de cultivo en condiciones adecuadas para expresar la proteína quimérica. El primer y segundo polinucleótido puede estar en un vector o dos vectores. En otra realización, la invención se refiere a un método de expresión, preparación o producción de una proteína quimérica que comprende a) transfectar una célula hospedadora con un primer polinucleótido que codifica un fragmento de VWF unido a un resto heterólogo, un segundo polinucleótido que codifica una proteína FVIII unida a un resto heterólogo, y un tercer polinucleótido que codifica una proteína convertasa, y b) cultivar la célula hospedadora en un medio de cultivo en condiciones adecuadas para expresar la proteína quimérica. En otras realizaciones, la invención se refiere a un método de expresión, preparación o producción de una proteína quimérica que comprende a) transfectar una célula hospedadora con un primer polinucleótido que codifica un fragmento de VWF que comprende un dominio D' y un dominio D3 unido a un resto heterólogo, un segundo polinucleótido que codifica una proteína FVIII unida a un resto heterólogo, y un tercer polinucleótido que codifica un dominio D1 y un dominio D2 de VWF, y b) cultivar la célula hospedadora en un medio de cultivo en condiciones adecuadas para expresar la proteína quimérica. En una realización, el primer polinucleótido, el segundo polinucleótido y el tercer polinucleótido pueden estar en un vector o vectores separados. En otra realización, el primer y segundo polinucleótido pueden estar en un vector, y el tercer polinucleótido puede ser otro vector. En otras realizaciones, el primer polinucleótido y el tercer polinucleótido pueden estar en un vector, y el segundo polinucleótido puede ser otro vector. En algunas realizaciones, el segundo polinucleótido y el tercer polinucleótido pueden estar en un vector y el primer polinucleótido puede estar en otro vector.

En realizaciones adicionales, el producto de proteína que contiene el fragmento de VWF o la proteína quimérica que comprende el fragmento de VWF es secretado en el medio. El medio se separa de las células, se concentra, se filtra y entonces se pasa sobre dos o tres columnas de afinidad, por ejemplo, una columna de proteína A y una o dos columnas de intercambio aniónico.

En ciertos aspectos, la presente divulgación se refiere al fragmento de VWF o el polipéptido quimérico producido por los métodos descritos en el presente documento.

La producción in vitro permite el aumento de escala para dar grandes cantidades de los polipéptidos alterados deseados de la invención. Se conocen en la técnica técnicas para el cultivo de células de mamífero en condiciones de cultivo de tejido e incluyen cultivo en suspensión homogénea, por ejemplo en un reactor de columna aireada o en un reactor continuo con agitador, o cultivo celular inmovilizado o atrapado, por ejemplo en fibras huecas, microcápsulas, sobre microperlas de agarosa o cartuchos de cerámica. Si fuera necesario y/o se deseara, las disoluciones de polipéptidos se pueden purificar por los métodos habituales de cromatografía, por ejemplo filtración en gel, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de interacción hidrófoba (HIC, cromatografía sobre DEAE-celulosa o cromatografía de afinidad.

Composición farmacéutica

Las composiciones que contienen la proteína quimérica de la presente invención pueden contener un vehículo farmacéuticamente aceptable adecuado. Por ejemplo, pueden contener excipientes y/o auxiliares que facilitan el procesamiento de los compuestos activos en preparaciones diseñadas para administración al sitio de acción.

La composición farmacéutica se puede formular para administración parenteral (es decir, intravenosa, subcutánea, o intramuscular) por inyección en bolo. Las formulaciones para inyección se pueden presentar en forma farmacéutica unitaria, por ejemplo, en ampollas o en recipientes de múltiples dosis con un conservante añadido. Las composiciones pueden adoptar formas tales como suspensiones, disoluciones o emulsiones en vehículos aceitosos o acuosos, y contienen agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilizantes y/o dispersantes. Alternativamente, el principio activo puede estar en forma de polvo para constitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua sin pirógenos.

Las formulaciones adecuadas para administración parenteral también incluyen disoluciones acuosas de los compuestos activos en forma soluble en agua, por ejemplo, sales solubles en agua. Además, se pueden administrar suspensiones de los compuestos activos como suspensiones aceitosas apropiadas para inyección. Los disolventes o vehículos lipófilos adecuados incluyen aceites grasos, por ejemplo, aceite de sésamo, o ésteres de ácidos grasos sintéticos, por ejemplo, oleato de etilo o triglicéridos. Las suspensiones para inyección acuosa pueden contener sustancias, que aumentan la viscosidad de la suspensión, que incluyen, por ejemplo, carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol y dextrano. Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizadores. También se pueden usar liposomas para encapsular las moléculas de la invención para la administración en células o espacios intersticiales. Los vehículos farmacéuticamente aceptables a modo de ejemplo son disolventes fisiológicamente compatibles, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y de retraso de la absorción, agua, solución salina, solución salina tamponada con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y similares. En algunas realizaciones, la composición comprende agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, o cloruro sódico. En otras realizaciones, las composiciones comprenden sustancias farmacéuticamente aceptables tales como agentes humectantes o cantidades menores de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, conservantes o tampones, que potencian la estabilidad en almacén o la eficacia de los principios activos.

Las composiciones de la invención pueden estar en una variedad de formas, que incluyen, por ejemplo, líquidos (por ejemplo, disoluciones inyectables e infusibles), dispersiones, suspensiones, formas farmacéuticas semisólidas y sólidas. La forma preferida depende del modo de administración y la aplicación terapéutica.

La composición se puede formular como una disolución, microemulsión, dispersión, liposoma, u otra estructura ordenada adecuada para alta concentración de fármaco. Se pueden preparar disoluciones inyectables estériles incorporando el principio activo en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinación de los componentes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido por esterilización por filtración. En general, las dispersiones se preparan incorporando el principio activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros componentes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de disoluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son secado a vacío y liofilización, que dan un polvo del principio activo más cualquier componente deseado adicional de una disolución previamente esterilizada por filtración. La fluidez apropiada de una disolución se puede mantener, por ejemplo, usando un recubrimiento tal como lecitina, por el mantenimiento del tamaño de partículas requerido en el caso de dispersión y usando tensioactivos. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede provocar incluyendo en la composición un agente que retrasa la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina.

El principio activo se puede formular con una formulación o dispositivo de liberación controlada. Los ejemplos de dichas formulaciones y dispositivos incluyen implantes, parches transdérmicos y sistemas de administración microencapsulada. Se pueden usar polímeros biodegradables biocompatibles, por ejemplo, etileno-acetato de vinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Se conocen en la técnica los métodos para la preparación de dichas formulaciones y dispositivos. Véase por ejemplo, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.

Se pueden preparar formulaciones de liberación prolongada inyectables formando matrices microencapsuladas del fármaco en polímeros biodegradables tales como polilactida-poliglicolida. Dependiendo de la relación entre el fármaco y el polímero, y la naturaleza del polímero empleado, se puede controlar la velocidad de liberación del fármaco. Otros polímeros biodegradables a modo de ejemplo son poliortoésteres y polianhídridos. También se pueden preparar las formulaciones inyectables de liberación prolongada atrapando el fármaco en liposomas o microemulsiones.

Se pueden incorporar compuestos activos suplementarios en las composiciones. En una realización, la proteína quimérica de la invención se formula con otro factor de coagulación, o una variante, fragmento, análogo, o derivado del mismo. Por ejemplo, el factor de coagulación incluye, pero no se limita a, factor V, factor VII, factor VIII, factor IX, factor X, factor XI, factor XII, factor XIII, protrombina, fibrinógeno, factor de von Willebrand o factor tisular soluble recombinante (rsTF), o formas activadas de cualquiera de los precedentes. El factor de coagulación de agente hemostático también puede incluir fármacos antifibrinolíticos, por ejemplo, ácido épsilon-amino-caproico, ácido tranexámico.

Se pueden ajustar las pautas posológicas para proporcionar la respuesta deseada óptima. Por ejemplo, se puede administrar un único bolo, se pueden administrar varias dosis divididas con el tiempo, o se puede reducir o incrementar proporcionalmente la dosis como se indica por las exigencias de la situación terapéutica. Es ventajoso formular las composiciones parentales en forma de dosificación unitaria para facilitar la administración y uniformidad de la dosificación. Véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., Easton, Pa. 1980). Además del compuesto activo, la forma farmacéutica líquida puede contener componentes inertes tales como agua, alcohol etílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilenglicol, 1,3-butilenglicol, dimetilformamida, aceites, glicerol, alcohol tetrahidrofurfurílico, polietilenglicoles, y ésteres de ácidos grasos de sorbitano.

También se describen ejemplos no limitantes de vehículos farmacéuticos adecuados en Remington's Pharmaceutical Sciences por E. W. Martin. Algunos ejemplos de excipientes incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, caliza, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro sódico, leche desnatada en polvo, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol, y similares. La composición también puede contener reactivos de tamponamiento del pH, y agentes humectantes o emulsionantes.

Para administración por vía oral, la composición farmacéutica puede tomar la forma de comprimidos o cápsulas preparadas mediante medios convencionales. La composición también se puede preparar como un líquido, por ejemplo, un jarabe o una suspensión. El líquido puede incluir agentes de suspensión (por ejemplo, jarabe de sorbitol, derivados de celulosa o grasas comestibles hidrogenadas), agentes emulsionantes (lecitina o goma arábiga), vehículos no acuosos (por ejemplo, aceite de almendra, ésteres aceitosos, alcohol etílico, o aceites vegetales fraccionados) y conservantes (por ejemplo, p-hidroxibenzoatos de metilo o propilo o ácido sórbico). Las preparaciones también pueden incluir aromatizantes, colorantes y edulcorantes. Alternativamente, la composición se puede presentar como un producto seco para constitución con agua u otro vehículo adecuado.

Para administración por vía oral, la composición puede tomar la forma de comprimidos o pastillas para chupar según protocolos convencionales.

Para administración por inhalación, los compuestos para su uso según la presente invención se administran convenientemente en forma de un aerosol nebulizado con o sin excipientes, o en forma de un espray de aerosol de un envase presurizado o nebulizador, con opcionalmente un propulsor, por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluorometano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosificación se puede determinar proporcionando una válvula para administrar una cantidad dosificada. Se pueden formular cápsulas y cartuchos de, por ejemplo, gelatina para su uso en un inhalador o insuflador que contiene una mezcla en polvo del compuesto y una base en polvo adecuada tal como lactosa o almidón.

La composición farmacéutica también se puede formular para administración rectal como un supositorio o enema de retención, por ejemplo, que contiene bases de supositorio convencionales tales como manteca de cacao u otros glicéridos.

Terapia génica

Sería terapéuticamente beneficioso producir in vivo en un mamífero, por ejemplo, un paciente humano, una proteína quimérica del mismo de la invención usando un enfoque de terapia génica para el tratamiento de una enfermedad hemorrágica o trastorno seleccionado del grupo que consiste en un trastorno hemorrágico de la coagulación, hemartrosis, sangrado muscular, sangrado bucal, hemorragia, hemorragia dentro de los músculos, hemorragia bucal, traumatismo, traumatismo craneal, sangrado gastrointestinal, hemorragia intracraneal, hemorragia intraabdominal, hemorragia intratorácica, fractura de huesos, sangrado del sistema nervioso central, sangrado en el espacio retrofaríngeo, sangrado en el espacio retroperitoneal y sangrado en la vaina del iliopsoas. En un caso, la enfermedad hemorrágica o trastorno es hemofilia. En otro caso, la enfermedad hemorrágica o trastorno es hemofilia A. Esto implica la administración de un fragmento de VWF o ácido nucleico adecuado que codifica la proteína quimérica operativamente unida a secuencias de control de la expresión adecuadas. En ciertos casos, estas secuencias se incorporan en un vector viral. Los vectores virales adecuados para dicha terapia génica incluyen vectores adenovirales, vectores lentivirales, vectores baculovirales, vectores del virus de Epstein-Barr, vectores papovavirales, vectores del virus de la variolovacuna, vectores del virus del herpes y vectores de virus adenoasociados (AAV). El vector viral puede ser un vector viral defectuoso en la replicación. En otros casos, un vector adenoviral tiene una deleción en su gen E1 o gen E3. Cuando se usa un vector adenoviral, el mamífero puede no exponerse a un ácido nucleico que codifica un gen marcador de selección. En otros casos, las secuencias se incorporan en un vector no viral conocido para los expertos en la técnica.

Métodos de uso del fragmento de VWF o proteína quimérica

Un aspecto de la presente divulgación se refiere a prevenir o inhibir la interacción de FVIII con VWF endógeno bloqueando o escudando el sitio de unión de VWF sobre FVIII de VWF endógeno. En un caso, la divulgación se refiere a un método de construcción de una proteína FVIII que tiene semivida más larga que FVIII no mutante o un híbrido monómero-dímero de FVIII, comprendiendo el método asociar covalentemente un resto auxiliar con la proteína FVIII, preparando así una proteína quimérica que comprende la proteína FVIII y el resto auxiliar, en donde el resto auxiliar escuda o previene la interacción de la proteína FVIII con VWF endógeno. La proteína quimérica útil en el método incluye una cualquiera o más de las proteínas quiméricas descritas en el presente documento.

Otro aspecto de la divulgación incluye un método de administración de un sujeto en necesidad del mismo de una proteína FVIII que tiene semivida más larga que FVIII no mutante o un híbrido monómero-dímero de FVIII, que consiste en dos cadenas de polipéptidos, una primera cadena que consiste en una secuencia de aminoácidos que codifica FVIII y una región Fc y una segunda cadena que consiste en una región Fc, en donde el método comprende administrar el fragmento de VWF descrito en el presente documento o la proteína quimérica descrita en el presente documento al sujeto. La secuencia de aminoácidos de FVIII en el híbrido monómero-dímero puede ser SQ FVIII o FVIII no mutante.

En un caso, la divulgación se refiere a un método de uso de un resto auxiliar, por ejemplo, un fragmento de VWF descrito en el presente documento o una proteína quimérica que comprende el fragmento de VWF, para prevenir o inhibir la interacción de VWF endógeno con una proteína FVIII. En otro caso, una proteína FVIII que es capaz de interaccionar con el fragmento de VWF es FVIII endógeno. En otros casos, una proteína FVIII que es capaz de interaccionar con el fragmento de VWF es una composición de FVIII administrada por separado a un sujeto antes o después de o simultáneamente con el fragmento de VWF o la proteína quimérica que comprende el fragmento de VWF. En otros casos, una proteína FVIII que es capaz de unirse al fragmento de VWF es una composición de FVIII administrada a un sujeto junto con el fragmento de VWF o la proteína quimérica. Aún en otros casos, una proteína FVIII que es capaz de unirse al fragmento de VWF es FVIII presente con el fragmento de VWF o asociado al fragmento de VWF en la proteína quimérica. El fragmento de VWF o la proteína quimérica que comprende el fragmento de VWF se une a, o se asocia con, la proteína FVIII y así prolonga la semivida de la proteína FVIII unida al fragmento de VWF o la proteína quimérica. La proteína FVIII unida al fragmento de VWF o la proteína quimérica se escudan o protege de la vía de eliminación de VWF y así tiene eliminación reducida en comparación con la proteína FVIII no unida al fragmento de VWF o la proteína quimérica. La proteína FVIII escudada tiene así una semivida más larga que una proteína FVIII no unida o asociada al fragmento de VWF o la proteína quimérica. En ciertos casos, la proteína FVIII asociada a o protegida por un fragmento de VWF, o una proteína quimérica de la invención, no se elimina por un receptor de eliminación de VWF. En otros casos, la proteína FVIII asociada a o protegida por un fragmento de VWF, o una proteína quimérica, se elimina del sistema más lentamente que la proteína FVIII que no se asocia a o protege por el fragmento de VWF.

En un aspecto, la proteína quimérica que comprende la misma tiene eliminación reducida de la circulación ya que el fragmento de VWF o la proteína quimérica no contiene un sitio de unión de receptor de eliminación de VWF. El fragmento de VWF previene o inhibe la eliminación de FVIII unido o asociado al fragmento de VWF del sistema mediante la vía de eliminación de VWF. Los fragmentos de VWF útiles para la presente invención también pueden proporcionar al menos una o más propiedades de protección de FVIII de tipo VWF que se proporcionan por VWF endógeno. En ciertas realizaciones, los fragmentos de VWF también pueden enmascarar uno o más sitios de unión de receptor de eliminación de FVIII, previniendo así la eliminación de FVIII por su propia vía de eliminación.

En otro aspecto, la proteína quimérica de la invención se puede usar para tratar o prevenir una enfermedad o trastorno asociado a una enfermedad de von Willebrand de tipo 2N (VWD). VWD de tipo 2N es un defecto cualitativo de VWF resultante de la unión defectuosa de VWF a FVIII y, por consiguiente, dando como resultado bajos niveles de FVIII circulante. Por tanto, la proteína quimérica de la invención por unión a o uniéndose a la proteína FVIII no solo estabiliza la proteína FVIII, sino que también previene la eliminación de la proteína FVIII de la circulación.

En algunas realizaciones, la prevención o inhibición de la unión de una proteína FVIII a VWF endógeno por el fragmento de VWF o proteína quimérica puede ser in vitro o in vivo.

También se proporciona un método de aumento de la semivida de una proteína FVIII que comprende administrar el fragmento de VWF o la proteína quimérica que comprende el fragmento de VWF y una proteína FVIII a un sujeto en necesidad del mismo. La semivida de FVIII no activado unido o asociado a VWF de longitud completa es aproximadamente 12 a 14 horas en plasma. En VWD tipo 3, en donde casi no existe VWF en circulación, la semivida de FVIII es solo aproximadamente seis horas, que conduce a síntomas de hemofilia A de leve a moderada en dichos pacientes debido a las reducidas concentraciones de FVIII. La semivida de la proteína FVIII unida o asociada al fragmento de VWF de la presente invención puede aumentar al menos aproximadamente 1,5 veces, 1,6 veces, 1,7 veces, 1,8 veces, 1,9 veces, 2,0 veces, 2,1 veces, 2,2 veces, 2,3 veces, 2,4 veces, 2,6 veces, 2,7 veces, 2,8 veces, 2,9 veces, 3,0 veces, 3,1 veces, 3,2 veces, 3,3 veces, 3,4 veces, 3,5 veces, 3,6 veces, 3,7 veces, 3,8 veces, 3,9 veces, o 4,0 veces más que la semivida de FVIII no activado unido o asociado a VWF de longitud completa. En una realización, la semivida de la proteína FVIII unida o asociada al fragmento de VWF en la proteína quimérica aumenta al menos aproximadamente 2 veces, 2,5 veces, 3,0 veces, 3,5 veces, 4,0 veces, 4,5 veces, 5,0 veces, 5,5 veces, 6,0 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, o 10 veces más que la semivida de FVIII no activado unido o asociado a VWF de longitud completa. En otra realización, la semivida de la proteína FVIII unida o asociada al fragmento de VWF en la proteína quimérica aumenta aproximadamente 2 a aproximadamente 5 veces, aproximadamente 3 a aproximadamente 10 veces, aproximadamente 5 a aproximadamente 15 veces, aproximadamente 10 a aproximadamente 20 veces, aproximadamente 15 a aproximadamente 25 veces, aproximadamente 20 a aproximadamente 30 veces, aproximadamente 25 a aproximadamente 35 veces, aproximadamente 30 a aproximadamente 40 veces, aproximadamente 35 a aproximadamente 45 veces más que la semivida del FVIII no activado unido o asociado a VWF de longitud completa. En una realización específica, la semivida de la proteína FVIII unida o asociada al fragmento de VWF en la proteína quimérica aumenta al menos aproximadamente 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 o 40 veces más que la semivida del FVIII no mutante en un ratón con inactivación doble de FVIII y VWF. En algunas realizaciones, la semivida de la proteína quimérica que comprende el fragmento de VWF fusionado con un primer resto heterólogo, por ejemplo, una primera región Fc, y una proteína FVIII unida a un segundo resto heterólogo, por ejemplo, una segunda región Fc, es más larga que la semivida de una proteína quimérica que comprende una proteína FVIII y dos regiones Fc, en donde la proteína FVIII se une a una de las dos regiones Fc (es decir, híbrido monómero-dímero de FVIII). En otras realizaciones, la semivida de la proteína quimérica que comprende el fragmento de VWF fusionado con un primer resto heterólogo, por ejemplo, una primera región Fc, y una proteína FVIII unida a un segundo resto heterólogo, por ejemplo, una segunda región Fc, es al menos aproximadamente 1,5 veces, 2 veces, 2,5 veces, 3,5 veces, 3,6 veces, 3,7 veces, 3,8 veces, 3,9 veces, 4,0 veces, 4,5 veces, o 5,0 veces la semivida de una proteína quimérica que comprende una proteína FVIII y dos regiones Fc, en donde la proteína FVIII se une a una de las dos regiones Fc (es decir, híbrido monómero-dímero de FVIII).

En algunas realizaciones, como resultado de la invención, la semivida de la proteína FVIII se prolonga en comparación con una proteína FVIII sin el fragmento de VWF o FVIII no mutante. La semivida de la proteína FVIII es al menos aproximadamente 1,5 veces, al menos aproximadamente 2 veces, al menos aproximadamente 2,5 veces, al menos aproximadamente 3 veces, al menos aproximadamente 4 veces, al menos aproximadamente 5 veces, al menos aproximadamente 6 veces, al menos aproximadamente 7 veces, al menos aproximadamente 8 veces, al menos aproximadamente 9 veces, al menos aproximadamente 10 veces, al menos aproximadamente 11 veces, o al menos aproximadamente 12 veces más larga que la semivida de una proteína FVIII sin el fragmento de VWF. En una realización, la semivida de FVIII es aproximadamente 1,5 veces a aproximadamente 20 veces, aproximadamente 1,5 veces a aproximadamente 15 veces, o aproximadamente 1,5 veces a aproximadamente 10 veces más larga que la semivida de FVIII no mutante. En otra realización, la semivida de FVIII se prolonga aproximadamente 2 veces a aproximadamente 10 veces, aproximadamente 2 veces a aproximadamente 9 veces, aproximadamente 2 veces a aproximadamente 8 veces, aproximadamente 2 veces a aproximadamente 7 veces, aproximadamente 2 veces a aproximadamente 6 veces, aproximadamente 2 veces a aproximadamente 5 veces, aproximadamente 2 veces a aproximadamente 4 veces, aproximadamente 2 veces a aproximadamente 3 veces, aproximadamente 2,5 veces a aproximadamente 10 veces, aproximadamente 2,5 veces a aproximadamente 9 veces, aproximadamente 2,5 veces a aproximadamente 8 veces, aproximadamente 2,5 veces a aproximadamente 7 veces, aproximadamente 2,5 veces a aproximadamente 6 veces, aproximadamente 2,5 veces a aproximadamente 5 veces, aproximadamente 2,5 veces a aproximadamente 4 veces, aproximadamente 2,5 veces a aproximadamente 3 veces, aproximadamente 3 veces a aproximadamente 10 veces, aproximadamente 3 veces a aproximadamente 9 veces, aproximadamente 3 veces a aproximadamente 8 veces, aproximadamente 3 veces a aproximadamente 7 veces, aproximadamente 3 veces a aproximadamente 6 veces, aproximadamente 3 veces a aproximadamente 5 veces, aproximadamente 3 veces a aproximadamente 4 veces, aproximadamente 4 veces a aproximadamente 6 veces, aproximadamente 5 veces a aproximadamente 7 veces, o aproximadamente 6 veces a aproximadamente 8 veces en comparación con FVIII no muíante o una proteína FVIII sin el fragmento de VWF. En otras realizaciones, la semivida de FVIII es al menos aproximadamente 17 horas, al menos aproximadamente 18 horas, al menos aproximadamente 19 horas, al menos aproximadamente 20 horas, al menos aproximadamente 21 horas, al menos aproximadamente 22 horas, al menos aproximadamente 23 horas, al menos aproximadamente 24 horas, al menos aproximadamente 25 horas, al menos aproximadamente 26 horas, al menos aproximadamente 27 horas, al menos aproximadamente 28 horas, al menos aproximadamente 29 horas, al menos aproximadamente 30 horas, al menos aproximadamente 31 horas, al menos aproximadamente 32 horas, al menos aproximadamente 33 horas, al menos aproximadamente 34 horas, al menos aproximadamente 35 horas, al menos aproximadamente 36 horas, al menos aproximadamente 48 horas, al menos aproximadamente 60 horas, al menos aproximadamente 72 horas, al menos aproximadamente 84 horas, al menos aproximadamente 96 horas, o al menos aproximadamente 108 horas. En otras realizaciones más, la semivida de FVIII es aproximadamente 15 horas a aproximadamente dos semanas, aproximadamente 16 horas a aproximadamente una semana, aproximadamente 17 horas a aproximadamente una semana, aproximadamente 18 horas a aproximadamente una semana, aproximadamente 19 horas a aproximadamente una semana, aproximadamente 20 horas a aproximadamente una semana, aproximadamente 21 horas a aproximadamente una semana, aproximadamente 22 horas a aproximadamente una semana, aproximadamente 23 horas a aproximadamente una semana, aproximadamente 24 horas a aproximadamente una semana, aproximadamente 36 horas a aproximadamente una semana, aproximadamente 48 horas a aproximadamente una semana, aproximadamente 60 horas a aproximadamente una semana, aproximadamente 24 horas a aproximadamente seis días, aproximadamente 24 horas a aproximadamente cinco días, aproximadamente 24 horas a aproximadamente cuatro días, aproximadamente 24 horas a aproximadamente tres días, o aproximadamente 24 horas a aproximadamente dos días.

En una realización específica, una semivida de la proteína quimérica de la invención es aproximadamente dos veces más larga que la semivida de FVIII no mutante o BDD FVIII. En otra realización, una semivida de la proteína quimérica es aproximadamente tres veces más larga que la semivida de FVIII no mutante o BDD FVIII.

Además, la divulgación proporciona un método de tratamiento o prevención de una enfermedad hemorrágica o trastorno que comprende administrar una cantidad eficaz del fragmento de VWF o la proteína quimérica (por ejemplo, una proteína quimérica que comprende el fragmento de VWF unido a un primer resto heterólogo, por ejemplo, una primera región Fc, y una proteína FVIII unida a un segundo resto heterólogo, por ejemplo, una segunda región Fc, en donde el fragmento de VWF se une o asocia a la proteína FVIII). En un caso, la enfermedad hemorrágica o trastorno se selecciona del grupo que consiste en un trastorno hemorrágico de la coagulación, hemartrosis, sangrado muscular, sangrado bucal, hemorragia, hemorragia dentro de los músculos, hemorragia bucal, traumatismo, traumatismo craneal, sangrado gastrointestinal, hemorragia intracraneal, hemorragia intraabdominal, hemorragia intratorácica, fractura de huesos, sangrado del sistema nervioso central, sangrado en el espacio retrofaríngeo, sangrado en el espacio retroperitoneal y sangrado en la vaina del iliopsoas. En un caso específico, la enfermedad hemorrágica o trastorno es hemofilia A.

El fragmento de VWF y la proteína quimérica que comprende un resto auxiliar, por ejemplo, el fragmento de VWF descrito en el presente documento y una proteína FVIII preparada por la invención, tienen muchos usos, como se reconocerá por un experto en la técnica, que incluyen, pero no se limitan a, métodos de tratamiento de un sujeto que tiene un trastorno hemostático y métodos de tratamiento de un sujeto en necesidad de un agente hemostático general. En un caso, la divulgación se refiere a un método de tratamiento de un sujeto que tiene un trastorno hemostático que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz del fragmento de VWF o la proteína quimérica.

La porción de proteína FVIII en la proteína quimérica trata o previene un trastorno hemostático que sirve de cofactor para el factor IX sobre una superficie de fosfolípido negativamente cargada, formando así un complejo de Xasa. La unión de factores de coagulación activados a una superficie de fosfolípido localiza este proceso en sitios de daño vascular. Sobre una superficie de fosfolípido, el factor VIIIa aumenta la máxima velocidad de activación del factor X por el factor IXa, en aproximadamente 200.000 veces, que conduce a la gran segunda explosión de generación de trombina.

Se puede usar la proteína quimérica que comprende un resto auxiliar, por ejemplo, un fragmento de VWF, y una proteína FVIII para tratar cualquier trastorno hemostático. Los trastornos hemostáticos que se pueden tratar por la administración de la proteína quimérica de la invención incluyen, pero no se limitan a, hemofilia A, así como deficiencias o anomalías estructurales relacionadas con el factor VIII. En un caso, el trastorno hemostático es hemofilia A.

Se puede usar profilácticamente la proteína quimérica que comprende un resto auxiliar, por ejemplo, un fragmento de VWF, y una proteína FVIII para tratar un sujeto con un trastorno hemostático. La proteína quimérica de la invención se puede usar para tratar un episodio de sangrado agudo en un sujeto con un trastorno hemostático. En otro caso, el trastorno hemostático puede ser el resultado de un factor de coagulación defectuoso, por ejemplo, factor de von Willebrand. En un caso, el trastorno hemostático es un trastorno heredado. En otro caso, el trastorno hemostático es un trastorno adquirido. El trastorno adquirido puede resultar de una enfermedad o afección secundaria subyacente. La condición sin relacionar puede ser, como un ejemplo, pero no como una limitación, cáncer, una enfermedad autoinmunitaria, o embarazo. El trastorno adquirido puede resultar de vejez o de medicación para tratar un trastorno secundario subyacente (por ejemplo, quimioterapia para el cáncer).

La divulgación también se refiere a métodos de tratamiento de un sujeto que no tiene un trastorno hemostático congénito, pero tiene una enfermedad o afección secundaria que da como resultado la adquisición de un trastorno hemostático, por ejemplo, debido al desarrollo de un anticuerpo anti-FVIII o una cirugía. La divulgación se refiere así a un método de tratamiento de un sujeto en necesidad de un agente hemostático general que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de la proteína quimérica que comprende el fragmento de VWF y una proteína FVIII preparada por los presentes métodos.

La presente divulgación también está relacionada con métodos de reducción de la inmunogenicidad de FVIII o inducción de menos inmunogenicidad contra FVIII que comprenden administrar una cantidad eficaz del fragmento de VWF, las proteínas quiméricas descritas en el presente documento, o los polinucleótidos que las codifican.

En un caso, el sujeto en necesidad de un agente hemostático general está sometiéndose, o está a punto de someterse, a cirugía. La proteína quimérica que comprende el fragmento de VWF y una proteína FVIII se puede administrar antes de, durante, o después de cirugía como pauta profiláctica. La proteína quimérica que comprende el fragmento de VWF y una proteína FVIII se puede administrar antes de, durante, o después de la cirugía para controlar un episodio de sangrado agudo.

Se puede usar la proteína quimérica que comprende el fragmento de VWF y una proteína FVIII para tratar un sujeto que tiene un episodio de sangrado agudo que no tiene un trastorno hemostático. El episodio de sangrado agudo puede resultar de traumatismo severo, por ejemplo, cirugía, un accidente de coche, herida, laceración, disparo, o cualquier otro acontecimiento traumático que da como resultado el sangrado incontrolado. Los ejemplos no limitantes de episodios de sangrado incluyen un trastorno hemorrágico de la coagulación, hemartrosis, sangrado muscular, sangrado bucal, hemorragia, hemorragia dentro de los músculos, hemorragia bucal, traumatismo, traumatismo craneal, sangrado gastrointestinal, hemorragia intracraneal, hemorragia intraabdominal, hemorragia intratorácica, fractura de huesos, sangrado del sistema nervioso central, sangrado en el espacio retrofaríngeo, sangrado en el espacio retroperitoneal, sangrado en la vaina del iliopsoas, y cualquier combinación de los mismos. En aplicaciones profilácticas, se administran una o más composiciones que contienen la proteína quimérica de la invención o una mezcla de la misma a un paciente que ya no está en el estado de enfermedad para potenciar la resistencia del paciente o reducir los síntomas asociados a una enfermedad o trastorno. Dicha cantidad se define como que es una "dosis eficaz profiláctica". En aplicaciones terapéuticas, algunas veces se requiere una dosificación relativamente alta (por ejemplo, desde aproximadamente 1 hasta 400 mg/kg de polipéptido por dosis, siendo las dosificaciones de desde 5 hasta 25 mg las más comúnmente usadas para radioinmunoconjugados y dosis más altas para polipéptidos modificados con citotoxina-fármaco) a intervalos relativamente cortos hasta que se reduce o termina la progresión de la enfermedad, y hasta que el paciente muestra mejora parcial o completa de los síntomas de enfermedad. A partir de aquí, el paciente se puede administrar con un régimen profiláctico.

En algunos casos, se usa una proteína quimérica, un fragmento de VWF, o una composición de la divulgación, para el tratamiento a demanda, que incluye tratamiento para un episodio de sangrado, hemartrosis, sangrado muscular, sangrado bucal, hemorragia, hemorragia dentro de los músculos, hemorragia bucal, traumatismo, traumatismo craneal (traumatismo craneoencefálico), sangrado gastrointestinal, hemorragia intracraneal, hemorragia intraabdominal, hemorragia intratorácica, fractura de huesos, sangrado del sistema nervioso central, sangrado en el espacio retrofaríngeo, sangrado en el espacio retroperitoneal, o sangrado en la vaina del iliopsoas. El sujeto puede estar en necesidad de profilaxis quirúrgica, tratamiento perioperatorio, o tratamiento para cirugía. Dichas cirugías incluyen, por ejemplo, cirugía menor, cirugía mayor, extracción dental, amigdalectomía, herniotomía inguinal, sinovectomía, reemplazo total de rodilla, craneotomía, osteosíntesis, cirugía para traumatismo, cirugía intracraneal, cirugía intraabdominal, cirugía intratorácica, o cirugía de reemplazo articular.

En un caso, la proteína quimérica que comprende el fragmento de VWF y una proteína FVIII se administra por vía intravenosa, por vía subcutánea, por vía intramuscular, o por cualquier superficie mucosa, por ejemplo, por vía oral, por vía sublingual, por vía bucal, por vía nasal, por vía rectal, por vía vaginal o por vía pulmonar. La proteína quimérica que comprende el fragmento de VWF y una proteína FVIII se puede implantar dentro de o unir a un soporte sólido de biopolímero que permite la lenta liberación de la proteína quimérica al sitio de sangrado o implantarse en venda/apósito. La dosis de la proteína quimérica que comprende el fragmento de VWF y una proteína FVIII variará dependiendo del sujeto y de la vía de administración particular usada. Las dosificaciones pueden variar desde 0,1 hasta 100.000 pg/kg de peso corporal. En un caso, el intervalo de dosis es 0,1-1.000 pg/kg. En otro caso, el intervalo de dosis es 0,1-500 pg/kg. La proteína se puede administrar continuamente o en intervalos de tiempo especificados. Se pueden emplear ensayos in vitro para determinar intervalos de dosis óptima y/o programas para administración. Se conocen en la técnica ensayos in vitro que miden la actividad del factor de coagulación, por ejemplo, ensayo de coagulación STA-CLOT VIIa-rTF o ensayo de coagulación ROTEM. Además, se pueden extrapolar dosis eficaces de las curvas de dosis-respuesta obtenidas de modelos animales, por ejemplo, un perro hemofílico (Mount et al. 2002, Blood 99(8):2670).

Habiendo ahora descrito la presente invención con detalle, lo mismo será más claramente entendido por referencia a los siguientes ejemplos, que se incluyen con la presente para los fines de ilustración solo y no pretenden ser limitantes de la invención.

Ejemplos

En todos los ejemplos, se usaron los siguientes materiales y métodos, a menos que se establezca de otro modo. Materiales y métodos

En general, la práctica de la presente invención emplea, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de química, biofísica, biología molecular, tecnología de ADN recombinante, inmunología (especialmente, por ejemplo, tecnología de anticuerpos), y técnicas convencionales en electroforesis. Véanse, por ejemplo, Sambrook, Fritsch y Maniatis, Molecular Cloning: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Antibody Engineering Protocols (Methods in Molecular Biology), 510, Paul, S., Humana Pr (1996); Antibody Engineering: A Practical Approach (Practical Approach Series, 169), McCafferty, Ed., Irl Pr (1996); Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow et al., CS.H.L. Press, Pub. (1999); y Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons (1992).

Ejemplo 1: Clonación de diferentes dominios de VWF (Figura 1)

(a) Clonación de pSYN-VWF-001,002, 003 y 004

pSYN-VWF-001 a 004 contienen secuencias de nucleótidos que codifican fragmentos de VWF, que son los aminoácidos 1-276 (001), aminoácidos 1-477 (002), aminoácidos 1-511 (003) y aminoácidos 1-716 (004) de la secuencia de proteínas VWF-D'D3A. La numeración de aminoácidos representa la secuencia de VWF maduro sin propéptido y corresponde a los aminoácidos 764-1039 (001), aminoácidos 764-1240 (002), aminoácidos 764-1274 (003) y aminoácidos 764-1479 (004) de SEQ ID NO: 2, respectivamente. Las cuatro construcciones tienen el péptido señal de FVIII en el extremo N, que permite la apropiada secreción de la proteína sintetizada y seguido por una marca 6xHis en el extremo C, que se usa para la purificación de proteínas. Las construcciones anteriores se sintetizaron usando las siguientes combinaciones de cebadores:

pSYN VWF- 001:

ESC48- Fwd - VWF-D'D3 con señal de VIII y sitio BsiW1

TCGCGACGTACGGCCGCCACCATGCAAATAGAGCTCTCCACCTGCTTCTTTCTGTGC

CTTTTGCGATTCTGCTTTAGCCTflTCCTGTCGGCCCCCCñTG (SEQ ID N O : 57) ESC50- Rev- VWF- D'D3 parcial (1-276 aminoácidos) con 6 His y sitio Not1

TGACCTCGAGCGGCCGCTCAGTGGTGATGGTGATGATGCAGAGGCACTTTTCTGGTG

TCAGCACACTG (SEQ ID NO: 58)

pSYN VWF- 002:

ESC48- Fwd - VWF-D'D3 con señal de VIII y sitio BsiW1

TCGCGACGTACGGCCGCCACCATGCAAATAGAGCTCTCCACCTGCTTCTTTCTGTGC

CTTTTGCGATTCTGCTTTAGCCTATCCTGTCGGCCCCCCATG (SEQ ID NO: 59)

ESC51- Rev- VWF D'D3 (1-477 aminoácidos) con 6His y sitio Not 1

TGACCTCGAGCGGCCGCTCAGTGGTGATGGTGATGATGCGGCTCCTGGCAGGCTTCA

CAGGTGAGGTTGACAAC (SEQ ID NO: 60)

pSYN VWF- 003:

ESC48- Fwd - VWF-D'D3 con señal de VIII y sitio BsiWI

TCGCGACGTACGGCCGCCACCATGCAAATAGAGCTCTCCACCTGCTTCTTTCTGTGC

CTTTTGCGATTCTGCTTTAGCCTflTCCTGTCGGCCCCCCñTG (SEQ ID N O :61)

ESC52- Rev-VWF-D'D3 A1 parcial (1 -511 aminoácidos) con 6His y sitio Not1

TGACCTCGAGCGGCCGCTCAGTGGTGATGGTGATGATGCCTGCTGCAGTAGAAATCG

TGCAACGGCGGTTC (SEQ ID NO: 62)

pSYN VWF- 004:

ESC48- Fwd - VWF-D'D3 con señal de VIII y sitio BsiW1

TCGCGACGTACGGCCGCCACCATGCAAATAGAGCTCTCCACCTGCTTCTTTCTGTGC

CTTTTGCGATTCTGCTTTAGCCTATCCTGTCGGCCCCCCATG (SEQ ID NO:63)

ESC53-Rev- VWF-D'D3A1 (1-716 aminoácidos) con 6His y sitio Not1

TGACCTCGAGCGGCCGCTCAGTGGTGATGGTGATGATGGCCCACAGTGACTTGTGCC

ATGTGGGG (SEQ ID NO: 64)

Se supone que las proteínas de las construcciones VWF-001,002, 003 y 004 existen como un monómero.

Se llevó a cabo una reacción de PCR de 50 pL con las combinaciones de cebadores ESC48/ESC50, ESC48/ESC 51, ESC48/ESC52, ESC48/ESC53 y el plásmido de VWF de longitud completa como molde, usando el ciclo de amplificación por PCR de 2 etapas: 94 °C 2 minutos; 21 ciclos de (96 °C 30 segundos, 68 °C 2 minuto). Se purificaron en gel las bandas de tamaño correcto (~960 pb para VWF 001; 1460 para VWF 002, 1520 pb para VWF 003; y 2150 pb para VWF 004) con un kit de extracción de gel (Qiagen, Valencia, Calif.) y se clonaron en los sitios de restricción BsiWI y Not1 de pcDNA 4 para generar pSYN-VWF 001, 002, 003 y 004, respectivamente.

(b) Clonación de pSYN-VWF-006

pSYN-VWF-006 contiene el dominio D1D2D'D3-CK (nudo de cisteína) de VWF. Para clonar esta construcción, se subcontrató la síntesis del fragmento de ADN que contenía una porción de dominio D3 y dominio CK (número de ID de secuencia de Genscript 122026, mostrada a continuación). Se subclonó un fragmento de construcción de Genscript en pSYN-VWF 008 digerido con BamH1/EcoRV, es decir, el vector que codifica VWF de longitud completa.

Número de secuencia de Genscript 122026 (SEQ ID NO: 65)

GGATCCTAGTGGGGAATAAGGGATGCAGCCACCCCTCAGTGAAATGCAAGAAACGGGTCACCATCCTGGTGG

AGGGAGGAGAGATTGAGCTGTTTGACGGGGAGGTGAATGTGAAGAGGCCCATGAAGGATGAGACTCACTTTG

AjGGTGGTGGAGTCTGGCCGGTA.CATCATTCTGCTGCTGGGCAAAGCCCTCTCCGTGGTCTGGGACCGCCA.CC

TGAGCATCTCCGTGGTCCTGAAGCAGACATACCAGGAGAAAGTGTGTGGCCTGTGTGGGAATTTTGATGGCA

TCCAGAACAATGACCTCACCAGCAGCAACCTCCAAGTGGAGGAAGACCCTGTGGACTTTGGGAACTCCTGGA

AAGTGAGCTCGCAGTGTGCTGACACCAGAAAAGTGCCTCTGGACTCATCCCCTGCCACCTGCCATAACAACA

TCATGAAGCAGACGATGGTGGATTCCTCCTGTAGAATCCTTACCAGTGACGTCTTCCAGGACTGCAACAAGC

TGGTGGACCCCGAGCCATATCTGGATGTCTGCATTTACGACACCTGCTCCTGTGAGTCCATTGGGGACTGCG

CCTGCTTCTGCGACACCATTGCTGCCTATGCCCACGTGTGTGCCCAGCATGGCAAGGTGGTGACCTGGAGGA

CGGCCACATTGTGCCCCCAGAGCTGCGAGGAGAGGAATCTCCGGGAGAACGGGTATGAGTGTGAGTGGCGCT

ATAACAGCTGTGCACCTGCCTGTCAAGTCACGTGTCAGCACCCTGAGCCACTGGCCTGCCCTGTGCAGTGTG

TGGAGGGCTGCCATGCCCACTGCCCTCCAGGGAAAATCCTGGATGAGCTTTTGCAGACCTGCGTTGACCCTG

AAGACTGTCCAGTGTGTGAGGTGGCTGGCCGGCGTTTTGCCTCAGGAAAGAAAGTCACCTTGAATCCCAGTG

ACCCTGAGCACTGCCAGATTTGCCACTGTGATGTTGTCAACCTCACCTGTGAAGCCTGCCAGGAGCCGGGAG

GCCTGGTGGTGCCTCCCACAGATGCCCCGGTGAGCCCCACCACTCTGTATGTGGATGAGACGCTCCAGGATG

GCTGTGATACTCACTTCTGCAAGGTCAATGAGAGAGGAGAGTACTTCTGGGAGAAGAGGGTCACAGGCTGCC

CACCCTTTGATGAACACAAGTGTCTTGCTGAGGGAGGTAAAATTATGAAAATTCCAGGCACCTGCTGTGACA

CATGTGAGGAGCCTGAGTGCAACGACATCACTGCCAGGCTGCAGTATGTCAAGGTGGGAAGCTGTAAGTCTG

AAGTAGAGGTGGATATC

(c) Clonación de pSYN-VWF-009, 010, 011,012 y 013

La construcción pSYN VWF 008 contiene la secuencia de VWF de longitud completa en pcDNA 3.1 (aminoácidos 1 2813 de SEQ ID NO: 2). Incluye propéptido de 763 aminoácidos (es decir, dominios D1D2) seguido por la secuencia restante de 2050 aminoácidos de VWF maduro. pSYN-VWF-009, 010, 011 y 012 contienen las mismas secuencias codificantes que VWF 001, 002, 003 y 004, respectivamente, pero además tiene dominios D1D2 (propéptido de VWF) en el extremo N en lugar del péptido señal de FVIII. pSYN-VWF- 008 tiene un sitio BamH1 en Arg907 y sitio Not1 en el extremo de la región codificante (después del codón de terminación). Se digirieron pSYN- VWF- 008, 001, 002, 003 y 004 con enzimas de restricción BamH1 y Not1. Se unieron los insertos de pSYN-VWF-001 (423 pb), pSYN- VWF-002 (1026 pb), pSYN-VWF- 003 (1128 pb) y pSYN-VWF-004 (1743 pb) en pSYN-VWF-008 (8242 pb) digerido con BamH1/Not1 para obtener pSYN-VWF-009 (D1D2D'D3: aminoácido 1-1039 de SEQ ID NO: 2); psYN-VWF -010 (D1D2D'D3: aminoácido 1-1240 de SEQ ID NO: 2); pSYN-VWF-011 (D1D2D'D3: aminoácido 1-1274 de SEQ ID NO: 2); pSYN-VWF-012 (D1D2D'D3: aminoácido 1-1479). Las 4 construcciones tienen marca 6xHis en el extremo C. En células transfectadas, se sintetizan pSYN-VWF-009, 010, 011 y 012 con propéptido, pero debido al procesamiento intracelular, los productos secretados no contienen ningún propéptido (D1D2). La proteína expresada de la construcción de VWF-009 existe como un monómero y se supone que las proteínas expresadas de las construcciones VWF-010, 011 y 012 existen como dímeros, como se muestra en la Figura 6 y Figura 7 usando VWF-009 y VWF-010 como ejemplos, respectivamente.

Se usó pSYN-VWF-010 para generar pSYN-VWF-013, que tiene dos mutaciones puntuales en C336A y C379A correspondientes a SEQ ID NO: 73 (la numeración de aminoácidos representa la secuencia de VWF maduro sin dominio D1D2-VWF secuencia 2). Se predice que estas mutaciones previenen la dimerización del dominio D'D3 de VWF.

(d) Clonación de pSYN-VWF-025 y 029

pSYN-VWF-025 contiene secuencias de D1 D2D'D3 no mutantes de VWF de longitud completa en el vector pLIVE mientras que pSYN-VWF-029 contiene dominios D1 D2D'D3 con mutaciones C336A/C379A en el vector pLIVE. Para clonar pSYN-VWF-025 y 029, se usó la siguiente combinación de cebadores:

ESC 89-fwd con sitio Nhe1 = CTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCCG (SEQ ID NO: 66)

ESC 91-rev con Sal1= CTGGATCCCGGGAGTCGACTCGTCAGTGGTGATGGTGATGATG (SEQ ID NO: 67) Se llevó a cabo una reacción de PCR de 50 pL con combinaciones de cebadores ESC89/ESC91 y o plásmido pSYN-VWF-010 (para pSYN-VWF-025) o pSYN-VWF-013 (para pSYN-VWF-029) como molde usando el ciclo de amplificación por PCR de 3 etapas: 94 °C - 2 minutos; 21 ciclos de (96 °C - 30 segundos, 55 °C - 30 segundos, 68 °C - 4 minutos). Se purificó en gel la banda de tamaños esperados (~3800 pb) con un kit de extracción en gel (Qiagen, Valencia, Calif.) y se clonó en los sitios de restricción Nhe1 y Sal1 del vector pLIVE-Mirus (Invitrogen, Carlsbad, Calif.) para generar pSYN-VWF-025 y 029.

(e) Clonación de pSYN-VWF-031

pSYN-VWF-031 es una construcción de D1 D2D'D3(C336A/C379A) -Fc que tiene un conector escindible de trombina de 48 aminoácidos de longitud (8x GGg Gs (SEQ ID NO: 110) sitio de trombina) entre VWF D1 D2D'D3(C336A/C379A) y las secuencias de Fc. Para preparar esta construcción, se amplificó VWF-región Fc de la construcción pSYN-FVIII-064 (referir a la construcción FVIII-VWF a continuación). Se digirió pSYN-FVIII-VWF con Xba1 y Nhe1. Se usó la región de inserto resultante de 4165 pb, que contenía el fragmento de VWF y la región Fc como molde para amplificar VWF y la región Fc por combinaciones de cebadores LW 22/LW23.

LW 22-FWD-VWF-D'D3 con la secuencia señal de FVIII y sitio BsiW1

GCGCCGGCCGTACGATGCAAATAGAGCTCTCCACCTGCTTCTTTCTGTGCCTITTGC

GATTCTGCTTTAGCCTATCCTGTCGGCCCCCCATG (SEQ ID NO: 68)

LW 23-Rev- Fc con codón de terminación y sitio Not1 TCATCAATGTATCTTATCATGTCTGAATTCGCGGCCGCTCATTTACC (SEQ ID NO: 69)

Secuencia de nucleótidos de VWF 031 (SEQ ID NO: 108)

i ATGATTCCTG CCAGATTTGC CGGGGTGCTG CTTGCTCTGG CCCTCATTTT 51 GCCAGGGACC CTTTGTGCAG AAGGAACTCG CGGCAGGTCA TCCACGGCCC 101 GATGCAGCCT TTTCGGAAGT GACTTCGTCA ACACCTTTGA TGGGAGCATG 151 TACAGCTTTG CGGGATACTG CAGTTACCTC CTGGCñGGGG GCTGCCAGAA 201 ACGCTCCTTC TCGATTATTG GGGACTTCCA GAATGGCAAG AGAGTGAGCC 251 TCTCCGTGTA TCTTGGGGAA TTTTTtgaca TCCATTTGTT TGTCAATGGT 301 ACCGTGACAC AGGGGGACCA AAGAGTCTCC ATGCCCTATG CCTCCAAAGG 351 GCTGTATCTA GAAACTGAGG CTGGGTACTA CAAGCTGTCC GGTGAGGCCT 401 ATGGCTTTGT GGCCAGGATC GATGGCAGCG GCAACTTTCA AGTCCTGCTG 451 TCAGACAGAT ACTTCAACAA GACCTGCGGG CTGTGTGGCA ACTTTAACAT 501 CTTTGCTGAA GATGACTTTA TGACCCAAGA AGGGACCTTG ACCTCGGA.CC 551 CTTATGACTT TGCCAACTCA TGGGCTCTGA GCAGTGGAGA ACAGTGGTGT 601 GAACGGGCAT CTCCTCCCAG CAGCTCATGC AACATCTCCT CTGGGGAAAT 651 GCAGAAGGGC CTGTGGGAGC AGTGCCAGCT TCTGAAGAGC ACCTCGGTGT 701 TTGCCCGCTG CCACCCTCTG GTGGACCCCG AGCCTTTTGT GGCCCTGTGT 751 GAGAAGACTT TGTGTGAGTG TGCTGGGGGG CTGGAGTGCG CCTGCCCTGC 801 CCTCCTGGAG TACGCCCGGA CCTGTGCCCA GGAGGGAATG GTGCTGTACG 851 GCTGGACCGA CCACAGCGCG TGCAGCCCAG TGTGCCCTGC TGGTATGGAG 901 TATAGGCAGT GTGTGTCCCC TTGCGCCAGG ACCTGCCAGA GCCTGCACAT 951 CAATGAAATG TGTCAGGAGC GATGCGTGGA TGGCTGCAGC TGCCCTGAGG 1001 GACAGCTCCT GGATGAAGGC CTCTGCGTGG AGAGCACCGA GTGTCCCTGC 1051 GTGCATTCCG GAAAGCGCTA CCCTCCCGGC ACCTCCCTCT CTCGAGACTG 1101 CAACACCTGC ATTTGCCGAA ACAGCCAGTG GATCTGCAGC AATGAAGAAT 1151 GTCCAGGGGA GTGCCTTGTC ACTGGTCAAT CCCACTTCAA GAGCTTTGAC 1201 AACAGATACT TCACCTTCAG TGGGATCTGC CAGTACCTGC TGGCCCGGGA 1251 TTGCCAGGAC CACTCCTTCT CCATTGTCAT TGAGACTGTC CAGTGTGCTG 1301 ATGACCGCGA CGCTGTGTGC ACCCGCTCCG TCACCGTCCG GCTGCCTGGC 1351 CTGCACAACA GCCTTGTGAA ACTGAAGCAT GGGGCñGGAG TTGCCATGGA 1401 TGGCCAGGAC ATCCAGCTCC CCCTCCTGAA AGGTGACCTC CGCATCCAGC 1451 ATACAGTGAC GGCCTCCGTG CGCCTCAGCT ACGGGGAGGA CCTGCAGATG 1501 GACTGGGATG GCCGCGGGAG GCTGCTGGTG AAGCTGTCCC CCGTCTATGC 1551 CGGGAAGACC TGCGGCCTGT GTGGGAATTA CAATGGCAAC CAGGGCGACG 1601 ACTTCCTTAC CCCCTCTGGG CTGGCGGAGC CCCGGGTGGA GGACTTCGGG 1651 ññCGCCTGGA AGCTGCACGG GGACTGCCAG GACCTGCAGA AGCAGCACAG 1701 CGATCCCTGC GCCCTCAACC CGCGCATGAC CAGGTTCTCC GAGGAGGCGT 1751 GCGCGGTCCT GACGTCCCCC ACATTCGAGG CCTGCCATCG TGCCGTCA.GC 1801 CCGCTGCCCT ACCTGCGGAA CTGCCGCTAC GACGTGTGCT CCTGCTCGGA 1851 CGGCCGCGAG TGCCTGTGCG GCGCCCTGGC CAGCTATGCC GCGGCCTGCG 1S01 CGGGGAGAGG CGTGCGCGTC GCGTGGCGCG AGCCAGGCCG CTGTGAGCTG 1951 AACTGCCCGA AAGGCCAGGT GTACCTGCAG TGCGGGACCC CCTGCAACCT 2001 GACCTGCCGC TCTCTCTCTT ACCCGGATGA GGAATGCAAT GAGGCCTGCC 2051 TGGAGGGCTG CTTCTGCCCC CCAGGGCTCT ACATGGATGA GAGGGGGGAC 2101 TGCGTGCCCA AGGCCCAGTG CCCCTGTTAC TATGACGGTG AGATCTTCCA 2151 GCCAGAAGAC ATCTTCTCAG ACCATCACAC CATGTGCTAC TGTGAGGATG 2201 GCTTCATGCA CTGTACCATG AGTGGAGTCC CCGGAAGCTT GCTGCCTGAC 2251 GCTGTCCTCA GCAGTCCCCT GTCTCATCGC AGCAAAAGGA GCCTATCCTG 2301 TCGGCCCCCC ATGGTCAAGC TGGTGTGTCC CGCTGñCAAC CTGCGGGCTG 2351 AAGGGCTCGA GTGTACCAAA ACGTGCCAGA ACTATGACCT GGAGTGCATG 2401 AGCATGGGCT GTGTCTCTGG CTGCCTCTGC CCCCCGGGCA TGGTCCGGCA 2451 TGAGAACAGA TGTGTGGCCC TGGAAAGGTG TCCCTGCTTC CATCAGGGCA 2501 AGGAGTATGC CCCTGGAGAA ACAGTGAAGA TTGGCTGCAA CACTTGTGTC 2551 TGTCGGGACC GGAAGTGGAA CTGCACAGAC CATGTGTGTG ATGCCACGTG 2501 CTCCACGATC GGCATGGCCC ACTACCTCAC CTTCGACGGG CTCAAATACC 2651 TGTTCCCCGG GGAGTGCCAG TACGTTCTGG TGCAGGATTA CTGCGGCAGT 2701 AACCCTGGGA CCTTTCGGAT CCTAGTGGGG AATAAGGGAT GCAGCCACCC 2751 CTCAGTGAAA TGCAAGAAAC GGGTCACCAT CCTGGTGGAG GGAGGAGAGñ 2801 TTGAGCTGTT TGACGGGGAG GTGAATGTGA AGAGGCCCAT GAAGGATGAG 2851 ACTCACTTTG AGGTGGTGGA GTCTGGCCGG TACATCATTC TGCTGCTGGG 2901 CAAAGCCCTC TCCGTGGTCT GGGACCGCCA CCTGAGCATC TCCGTGGTCC 2951 TGAAGCAGAC ATACCAGGAG AAAGTGTGTG GCCTGTGTGG GAATTTTGAT 3001 GGCATCCAGA ACAATGACCT CACCAGCAGC AACCTCCAAG TGGAGGAAGA 3051 CCCTGTGGAC TTTGGGAACT CCTGGAAAGT GAGCTCGCAG TGTGCTGACA 3101 CCAGAAAAGT GCCTCTGGAC TCATCCCCTG CCACCTGCCA TAACAACATC 3151 ATGAAGCAGA CGATGGTGGA TTCCTCCTGT AGAATCCTTA CCAGTGACGT 3201 CTTCCAGGAC TGCAACAAGC TGGTGGACCC CGAGCCATAT CTGGATGTCT 3251 GCATTTACGA CACCTGCTCC TGTGAGTCCA TTGGGGACTG CGCCGCATTC 3301 TGCGACACCA TTGCTGCCTA TGCCCACGTG TGTGCCCAGC ATGGCAAGGT 3351 GGTGACCTGG AGGACGGCCA CATTGTGCCC CCAGAGCTGC GAGGAGAGGA 3401 ATCTCCGGGA GAACGGGTAT GAGGCTGAGT GGCGCTATAA CAGCTGTGCA 3451 CCTGCCTGTC AAGTCACGTG TCAGCACCCT GAGCCACTGG CCTGCCCTGT 3501 GCAGTGTGTG GAGGGCTGCC ATGCCCACTG CCCTCCAGGG AAAATCCTGG 3551 ATGAGCTTTT GCAGACCTGC GTTGACCCTG AAGACTGTCC AGTGTGTGAG 3501 GTGGCTGGCC GGCGTTTTGC CTCAGGAAAG AAAGTCACCT TGAATCCCAG 3651 TGACCCTGAG CACTGCCAGA TTTGCCACTG TGATGTTGTC AACCTCACCT 3701 GTGAAGCCTG CCAGGAGCCG ATATCTGGCG GTGGAGGTTC CGGTGGCGGG 3751 GGATCCGGCG GTGGAGGTTC CGGCGGTGGA GGTTCCGGTG GCGGGGGATC 3801 CGGTGGCGGG GGATCCCTGG TCCCCCGGGG CAGCGGCGGT GGAGGTTCCG 3851 GTGGCGGGGG ATCCGACAAA ACTCACACAT GCCCACCGTG CCCAGCTCCA 3501 GAACTCCTGG GCGGACCGTC AGTCTTCCTC TTCCCCCCAA AACCCAAGGA 3951 CACCCTCATG ATCTCCCGGA CCCCTGAGGT CACATGCGTG GTGGTGGACG 4001 TGAGCCACGA AGACCCTGAG GTCAAGTTCA ACTGGTACGT GGACGGCGTG 4051 GAGGTGCATA ATGCCAAGAC AAAGCCGCGG GAGGAGCAGT ACAACAGCAC 4101 GTACCGTGTG GTCAGCGTCC TCACCGTCCT GCACCAGGAC TGGCTGAATG 4151 GCAAGGAGTA CAAGTGCAAG GTCTCCAACA AAGCCCTCCC AGCCCCCATC 4201 GAGAAAACCA TCTCCAAAGC CAAAGGGCAG CCCCGAGAAC CACAGGTGTA 4251 CACCCTGCCC CCATCCCGGG ATGAGCTGAC CAAGAACCAG GTCAGCCTGA 4301 CCTGCCTGGT CAAAGGCTTC TATCCCAGCG ACATCGCCGT GGAGTGGGAG 4351 AGCAATGGGC AGCCGGAGAA CAACTACAAG ACCACGCCTC CCGTGTTGGA 4401 CTCCGACGGC TCCTTCTTCC TCTACAGCAA GCTCACCGTG GACAAGAGCA 4451 GGTGGCAGCA GGGGAACGTC TTCTCATGCT CCGTGATGCA TGAGGCTCTG 4501 CACAACCACT ACACGCAGAA GAGCCTCTCC CTGTCTCCGG GTAAATGA Secuencia de proteínas de VWF 031 (SEQ ID NO: 109)

1 MIPARFAGVL LALALILPGT LCAEGTRGRS STARCSLFGS DFVNTFDGSM

51 YSFAGYCSYL LAGGCQKRSF SIIGDFQNGK RVSLSVYLGE FFDIHLFVNG

101 TVTQGDQRVS MPYASKGLYL ETEAGYYKLS GEAYGFVARI DGSGNFQVLL

151 SDRYFNKTCG LCGNFNIFAE DDFMTQEGTL TSDPYDFANS WALSSGEQWC

201 ERASPPSSSC NISSGEMQKG LWEQCQLLKS TSVFARCHPL VDPEPFVALC

251 EKTLCECAGG LECACPALLE YARTCAQEGM VLYGWTDHSA CSPVCPAGME

301 YRQCVSPCAR TCQSLHINEM CQERCVDGCS CPEGQLLDEG LCVESTECPC

351 VHSGKRYPPG TSLSRDCNTC ICRNSQWICS NEECPGECLV TGQSHFKSFD

401 NRYFTFSGIC QYLLARDCQD HSFSIVIETV QCADDRDAVC TRSVTVRLPG

451 LHNSLVKLKH GAGVAMDGQD IQLPLLKGDL RIQHTVTASV RLSYGEDLQM

501 DWDGRGRLLV KLSPVYAGKT CGLCGNYNGN QGDDFLTPSG LAEPRVEDFG

551 NAWKLHGDCQ DLQKQHSDPC ALNPRMTRFS EEACAVLTSP TFEACHRAVS

601 PLPYLRNCRY DVCSCSDGRE CLCGALASYA AACAGRGVRV AWREPGRCEL

651 NCPKGQVYLQ CGTPCNLTCR SLSYPDEECN EACLEGCFCP PGLYMDERGD

701 CVPKAQCPCY YDGEIFQPED IFSDHHTMCY CEDGFMHCTM SGVPGSLLPD

751 AVLSSPLSHR SKRSLSCRPP MVKLVCPADN LRAEGLECTK TCQNYDLECM

801 SMGCVSGCLC PPGMVRHENR CVALERCPCF HQGKEYAPGE TVKIGCNTCV

851 CRDRKWNCTD HVCDATCSTI GMAHYLTFDG LKYLFPGECQ YVLVQDYCGS

901 NPGTFRILVG NKGCSHPSVK CKKRVTILVE GGEIELFDGE VNVKRPMKDE

951 THFEWESGR YIILLLGKAL SWWDRHLSI SWLKQTYQE KVCGLCGNFD

1001 GIQMNDLTSS NLQVEEDPVD FGNSWKVSSQ CADTRKVPLD SSPATCHNNI

1051 MKQTMVDSSC RILTSDVFQD CNKLVDPEPY LDVCIYDTCS CESIGDCAAF

1101 CDTIAAYAHV CAQHGKWTW RTATLCPQSC EERNLRENGY EAEWRYNSCA

1151 PACQVTCQHP EPLACPVQCV EGCHAHCPPG KILDELLQTC VDPEDCPVCE

1201 VAGRRFASGK KVTLNPSDPE HCQICHCDW NLTCEACQEP ISGGGGSGGG

1251 GSGGGGSGGG GSGGGGSGGG GSLVPRGSGG GGSGGGGSDK THTCPPCPAP

1301 ELLGGPSVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV WDVSHEDPE VKFNWYVDGV

1351 EVHNAKTKPR EEQYNSTYRV VSVLTVLHQD WLMGKEYKCK VSWKALPAPI

1401 EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSRDELTKNQ VSLTCLVKGF YPSDIAVEWE

1451 SNGQPENMYK TTPPVLDSDG SFFLYSKLTV DKSRiíQQGNV FSCSVMHEAL

1501 HNHYTQKSLS LSPGK*

Se clonó el producto de PCR obtenido de la amplificación de LW22/LW23 (~2300 pb) en pSYN-VWF-002 digerido con BsiW1/Not1 para obtener el producto intermedio pSYN-VWF-014. pSYN-VWF-014 contiene el péptido señal de FVIII-D'D3-conector escindible de trombina de 20 aminoácidos seguido por la región Fc.

Para generar la construcción de D1D2D'D3-Fc, se amplificó la región D1D2D'D3 de pSYN-VWF-013 usando la combinación de cebadores LW24/LW27 por el método de PCR estándar.

Oligonucleótido de clonación LW24- Fwd- VWF D1 D2D'D3 con sitio BsiW1

GCGCCGGCCGTACGATGATTCCTGCCAGATTTGCCGGGGTG (SEQ ID NO: 70)

Oligonucleótido LW27-Rev-VWF D'D3 con EcoRV

CCACCGCCAGATATCGGCTCCTGGCAGGCTTCACAGGTGAG (SEQ ID NO: 71)

Se clonó el producto de PCR obtenido de la amplificación de LW22/LW23 (~3750 pb) en pSYN-VWF-014 digerido con BsiW1/EcoRV para obtener el producto intermedio pSYN-VWF-015. Se cambió la longitud de conector entre el fragmento de VWF y la región Fc para obtener pSYN-VWF-031.

Se muestra la secuencia de proteínas de VWF de longitud completa en la Tabla 1.

Secuencia de proteínas 1b de VWF-D1 D2D'D3 (SEQ ID NO: 72)

1 MIPARFAGVL LALALILPGTLCAEGTRGRS STARCSLFGS DFVNTFDGSM

51 YSFAGYCSYL LAGGCQKRSFSIIGDFQNGK RVSLSVYLGE FFDIHLFVNG

101 TVTQGDQRVS MPYASKGLYLETEAGYYKLS GEAYGFVARI DGSGNFQVLL

151 SDRYFNKTCG LCGNFNIFAEDDFMTQEGTL TSDPYDFANS WALSSGEQWC

201 ERASPPSSSC NISSGEMQKGLWEQCQLLKS TSVFARCHPL VDPEPFVALC

251 EKTLCECAGG LECACPALLEYARTCAQEGM VLYG7JTDHSA CSPVCPAGME

301 YRQCVSPCAR TCQSLHINEMCQERCVDGCS CPEGQLLDEG LCVESTECPC

351 VHSGKRYPPG TSLSRDCNTCICRNSQWICS NEECPGECLV TGQSHFKSFD

401 NRYFTFSGIC QYLLARDCQDHSFSIVIETV QCADDRDAVC TRSVTVRLPG

451 LHNSLVKLKH GAGVAMDGQDIQLPLLKGDL RIQHTVTASV RLSYGEDLQM

501 DWDGRGRLLV KLSPVYAGKTCGLCGNYNGN QGDDFLTPSG LAEPRVEDFG

551 MAWKLHGDCQ DLQKQHSDPCALNPRMTRFS EEACAVLTSP TFEACHRAVS

601 PLPYLRNCRY DVCSCSDGRECLCGALASYA AACAGRGVRV AWREPGRCEL

651 NCPKGQVYLQ CGTPCNLTCRSLSYPDEECN EACLEGCFCP PGLYMDERGD

701 CVPKAQCPCY YDGEIFQPEDIFSDHHTMCY CEDGFMHCTM SGVPGSLLPD

751 AVLSSPLSHR SKRSLSCRPPMVKLVCPADN LRAEGLECTK TCQNYDLECM

801 SMGCVSGCLC PPGMVRHENRCVALERCPCF HQGKEYAPGE TVKIGCNTCV

851 CRDRKWNCTD HVCDATCSTIGMAHYLTFDG LKYLFPGECQ YVLVQDYCGS

90.1 MPGTFRILVG NKGCSHPSVKCKKRVTILVE GGEIELFDGE VNVKRPMKDE

951 THFEWESGR YIILLLGKALSWWDRHLSI SWLKQTYQE KVCGLCGNFD

1001 GIQNNDLTSS NLQVEEDPVDFGNSWKVSSQ CADTRKVPLD SSPATCHNKI

1051 MKQTMVDSSC RILTSDVFQDCNKLVDPEPY LDVCIYDTCS CESIGDCACF

1101 CDTIAAYAHV CAQHGKWTW RTATLCPQSC EERMLRENGY ECEWRYNSCA

1151 PACQVTCQHP EPLACPVQCVEGCHAHCPPG KILDELLQTC VDPEDCPVCE

1201 VAGRRFASGK KVTLNPSDPEHCQICHCDW NLTCEACQEP*

Secuencia de proteínas 2 de VWF-D'D3 (SEQ ID NO: 73)

SLSCRPPMVK LVCPADNLRA EGLECTKTCQ NYDLECMSMG CVSGCLCPPG

MVRHENRCVA LERCPCFHQG KEYAPGETVK IGCNTCVCRD RKWNCTDHVC

DATCSTIGMA HYLTFDGLKY LFPGECQYVL VQDYCGSNPG TFRILVGNKG

CSHPSVKCKK RVTILVEGGE IELFDGEVNV KRPMKDETHF EWESGRYII

LLLGKALSW WDRHLSISW LKQTYQEKVC GLCGNFDGIQ NNDLTSSNLQ

VEEDPVDFGN SWKVSSQCAD TRKVPLDSSP ATCHNMIMKQ TMVDSSCRIL

TSDVFQDCNK LVDPEPYLDV CIYDTCSCES IGDCACFCDT IAAYAHVCAQ

HGKWTWRTA TLCPQSCEER NLRENGYECE MRYNSCAPAC QVTCQHPEPL

ACPVQCVEGC HAHCPPGKIL DELLQTCVDP EDCPVCEVAG RRFASGKKVT

LNPSDPEHCQ ICHCDWNLT CEACQEP

Ejemplo 2: Construcciones heterodiméricas que comprenden FVIII-Fc y VWF-dominio D'D3 en el extremo amino de la segunda cadena de Fc (heterodímero de ^fVⁱII-VWF-F^c, Figura 2)

(a) Clonación de pSYN-FVIII-064

El plásmido FVIII-064 comprende un armazón de Fc de cadena sencilla (scFc) con sitios de escisión enzimática que se procesan durante la síntesis en una célula. La construcción tiene un dominio de unión de FVIII de VWF de longitud completa (D'D3).

Se diseñó el plásmido (pSYN-FVIII-064) para la expresión del heterodímero FVIII-Fc y VWF-Fc, donde los dominios D'D3 se unen a FVIII y previene la interacción de FVIII con fosfolípidos y proteína C activada y/o previene o inhibe la unión a VWF endógeno. La proteína de pSYN-FVIII-064 se expresa en la célula como un polipéptido individual donde el extremo C de la subunidad de FVIII-Fc se une al extremo N de la subunidad de VWF D'D3-Fc por un conector polipeptídico 6x (GGGGS) (SEQ ID NO: 74). Además, se insertaron secuencias de RRRRS (SEQ ID NO: 75) y RKRRKR (SEQ ID NO: 76) en el extremo 5' y 3' del conector polipeptídico, respectivamente, para escisión intracelular por proproteínas convertasas tras la última Arg en cada secuencia. Por tanto, las células pueden expresar una heterodímero FVIII-Fc/D'D3-Fc de cadena doble donde la cadena de FVIII-Fc tiene una secuencia RRRRS (SEQ ID NO: 75) en el extremo C, pero se ha retirado el resto de la secuencia conectora. Se introduce otro conector polipeptídico 3x (GGGGS) (SEQ ID NO: 28) junto con un sitio de escisión de trombina entre los dominios de VWF y la región Fc para facilitar la liberación del fragmento de VWF de FVIII una vez se activa la proteína heterodimérica FVIII-VWF por trombina permitiendo la interacción de FVIII con otros factores de coagulación.

Se encargó la síntesis de los fragmentos de ADN que contienen una porción de la primera región Fc seguida por 6x (GGGGS) (SEQ ID NO: 74), VWF-dominio D'D3 (1-477 aa; mutación C336A/C379A), 3x (GGGGS) (SEQ ID NO: 28), el sitio de escisión de trombina y una porción de la segunda Fc (número de secuencia de Genscript 103069, mostrada a continuación). Se subclonó un fragmento de construcción de Genscript en pSYN-FVIII-049 digerida con SalI/RsRII, que es la construcción FVIII-Fc con un conector escindible entre dos dominios Fc.

Número de secuencia de Genscript 103069 (SEQ ID NO: 82):

CCGTCGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACC

ACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAACGGCGCCGCCGGAGCGGTGGCGGCGGATCAGGTG

GGGGTGGATCAGGCGGTGGAGGTTCCGGTGGCGGGGGATCCGGCGGTGGAGGTTCCGGTGGGGGTGGATCAA

GGAAGAGGAGGAAGAGAAGCCTATCCTGTCGGCCCCCCATGGTCAAGCTGGTGTGTCCCGCTGACAACCTGC

GGGCTGAAGGGCTCGAGTGTACCAAAACGTGCCAGAACTATGACCTGGAGTGCATGAGCATGGGCTGTGTCT

CTGGCTGCCTCTGCCCCCCGGGCATGGTCCGGCATGAGAATCGATGTGTGGCCCTGGAAAGGTGTCCCTGCT

TCCATCAGGGCAAGGAGTATGCCCCTGGAGAAACAGTGAAGATTGGCTGCAACACTTGTGTCTGTCGGGACC

GGAAGTGGAACTGCACAGACCATGTGTGTGATGCCACGTGCTCCACGATCGGCATGGCCCACTACCTCACCT

TCGACGGGCTCAAATACCTGTTCCCCGGGGAGTGCCAGTACGTTCTGGTGCAGGATTACTGCGGCAGTAA.CC

CTGGGACCTTTCGGATCCTAGTGGGGAATAAGGGATGCAGCCACCCCTCAGTGAAATGCAAGAAACGGGTCA

CCATCCTGGTGGAGGGAGGAGAGATTGAGCTGTTTGACGGGGAGGTGAATGTGAAGAGGCCCATGAAGGATG

AGACTCACTTTGAGGTGGTGGAGTCTGGCCGGTACATCATTCTGCTGCTGGGCAAAGCCCTCTCCGTGGTCT

GGGACCGCCACCTGAGCATCTCCGTGGTCCTGAAGCAGACATACCAGGAGAAAGTGTGTGGCCTGTGTGGGA

ATTTTGATGGCATCCAGAACAATGACCTCACCAGCAGCAACCTCCAAGTGGAGGAAGACCCTGTGGACTTTG

GGAACTCCTGGAAAGTGAGCTCGCAGTGTGCTGACACCAGAAAAGTGCCTCTGGACTCATCCCCTGCCACCT

GCCATAACAACATCATGAAGCAGACGATGGTGGATTCCTCCTGTAGAATCCTTACCAGTGACGTCTTCCAGG

ACTGCAACAAGCTGGTGGACCCCGAGCCATATCTGGATGTCTGCATTTACGACACCTGCTCCTGTGAGTCCA

TTGGGGACTGCGCCGCATTCTGCGACñCCATTGCTGCCTATGCCCACGTGTGTGCCCAGCATGGCAAGGTGG

TGACCTGGAGGACGGCCACATTGTGCCCCCAGAGCTGCGAGGAGAGGAATCTCCGGGAGAACGGGTATGAGG

CTGAGTGGCGCTATAACAGCTGTGCACCTGCCTGTCAAGTCACGTGTCAGCACCCTGAGCCACTGGCCTGCC

CTGTGCAGTGTGTGGAGGGCTGCCATGCCCACTGCCCTCCAGGGAAAATCCTGGATGAGCTTTTGCAGACCT

GCGTTGACCCTGAAGACTGTCCAGTGTGTGAGGTGGCTGGCCGGCGTTTTGCCTCAGGAAAGAAAGTCACCT

TGAATCCCAGTGACCCTGAGCACTGCCAGATTTGCCACTGTGATGTTGTCAACCTCACCTGTGAAGCCTGCC

AGGAGCCGATCGATGGCGGTGGAGGTTCCGGTGGCGGGGGATCCCTGGTCCCCCGGGGCAGCGGAGGCGACA

AAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCTCCAGAACTCCTGGGCGGACCGTCñ

(b) Clonación de pSYN-FVIII-065

El plásmido FVIII-065 comprende los primeros 276 aminoácidos del dominio D'D3 de VWF unido a una segunda región Fc. Se amplificó por PCR el fragmento de VWF del plásmido de VWF de longitud completa pSYN-VWF-008 usando las combinaciones de cebadores ESC17 y ESC41.

Oligonucleótido de clonación ESC17-Fwd- VWF con Cla1

GTCCGGCATGAGAATCGATGTGTG (SEQ ID NO: 77)

ESC41 - Rev-VWF con EcoRV

CCTCCACCGCCAGATATCAGAGGCACTTTTC (SEQ ID NO: 78)

Se purificó en gel la banda de tamaño esperado (~692 pb) con un kit de extracción en gel (Qiagen, Valencia, Calif.) y se clonó en los sitios Cla1 y EcoRV de pSYN-FVIII-064 para generar pSYN-FVIII-065.

Ejemplo 3: Clonación de pSYN-FVIII-159, 160, 178, 179 (Figura 3)

Para variar la longitud de conector entre el fragmento de VWF y la región Fc, se introdujo un sitio EcoRV en el empalme de VWF y el comienzo del conector de 20 aminoácidos en pSYN-FVIII-064, entonces se usaron conectores de tamaño variable para sustituir el conector de 20 aa en PSYN-FVIII-064. Las nuevas construcciones de ADN son: pSYN-FVIII-159, 160, 178 y 179 que contienen conectores de 35 aa, 48 aa, 73 aa y 98 aa, respectivamente.

Para insertar un conector de 35 aminoácidos en pSYN-FVIII-159, se pidieron dos oligonucleótidos (ESC78- 105 pb y ESC79 -107 pb) de Integrated DNA Technologies, Inc (Coralville, IA). Los oligonucleótidos se hibridaron y se extendieron usando un método de PCR convencional:

Cebadores:

ESC78- Fwd con sitio EcoRV

AAAGTGCCTCTGATATCTGGCGGTGGAGGTTCCGGTGGCGGGGGATCCGGTGGCGGG

GGATCCGGTGGCGGGGGATCCGGTGGCGGGGGATCCCTGGTCCCCCGG (SEQ ID

NO: 79)

ESC79- Rev con sitio RsRIl

GAAGAGGAAGACTGACGGTCCGCCCAGGAGTTCTGGAGCTGGGCACGGTGGGCATGT

GTGAGTTTTGTCGCCTCCGCTGCCCCGGGGGACCAGGGATCCCCCGCCAC (SEQ ID

NO: 80)

Se llevó a cabo una reacción de hibridación y extensión de oligonucleótidos por PCR de 50 pL con la combinación de cebadores ESC78/ESC79 usando la amplificación de 3 etapas por ciclo de PCR: 25 ciclos de (96 °C 30 segundos, 55 °C 30 segundos, 68 °C 30 segundos). Se purificó en gel la banda de tamaño esperado (~186 pb) con un kit de extracción en gel (Qiagen, Valencia, Calif.) y se clonó en los sitios de restricción EcoRV y RsRIl de pSYN-FVIII-064 para generar pSYN-FVII l-159.

(b) Clonación de pSYN-FVI II-160, 178 y 179

pSYN-VIII-160 tiene un conector de 48 aminoácidos entre el fragmento de VWF y la región Fc. Se encargó la síntesis del fragmento de ADN que codifica el conector de 48 aminoácidos (ISGG GGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSLVPRGSGGGGSGGGGS) (SEQ ID NO: 81) y una porción de la región Fc (N° de secuencia de Genscript 132601, mostrada a continuación). Se subclonó un fragmento de la construcción Genscript en pSYN-FVIII-0159 digerido con EcoRV/RsRII (mencionado anteriormente).

N° de secuencia de Genscript 132601 (SEQ ID NO: 83)

AAAGTGCCTCTGATATCTGGCGGTGGAGGTTCCGGTGGCGGGGGATCCGGCGGTGGAGGTTCCGGCGGTGGA

GGTTCCGGTGGCGGGGGATCCGGTGGCGGGGGATCCCTGGTCCCCCGGGGCAGCGGCGGTGGAGGTTCCGGT

GGCGGGGGATCCGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCTCCAGAACTCCTGGGCGGACCGTCAGTC

TTCC

pSYN-VIII-178 tiene un conector de 73 aminoácidos entre el fragmento de VWF y la región Fc. Se encargó la síntesis del fragmento de ADN que codifica el conector de 73 aminoácidos (ISGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSLVP RGSGGGGSGGGGS) (SEQ ID NO: 84) y una porción de región Fc (N° de secuencia de Genscript 144849, mostrada a continuación). Se subclonó un fragmento de la construcción Genscript en pSYN-FVIII-0159 digerido con EcoRV/RsRII (mencionada anteriormente).

N° de secuencia de Genscript 144849 (SEQ ID NO: 85)

GCCTGCCAGGAGCCGATATCTGGCGGTGGAGGTTCCGGTGGCGGGGGATCCGGCGGTGGAGGTTCCGGCGGT

GGAGGTTCCGGTGGCGGGGGATCCGGCGGTGGAGGTTCCGGTGGCGGGGGATCCGGCGGTGGAGGTTCCGGC

GGTGGAGGTTCCGGTGGCGGGGGATCCGGTGGCGGGGGATCCCTGGTCCCCCGGGGCAGCGGCGGTGGAGGT

TCCGGTGGCGGGGGATCCGACAAAACTCACACATGCCCCCGTGCCCAGCTCCAGAACTCCTGGGCGGACCGT

CAGTCTTCCTC

pSYN-VIII-179 tiene un conector de 98 aminoácidos entre el fragmento de VWF y la región Fc. Se encargó la síntesis del fragmento de ADN que codifica el conector de 98 aminoácidos (ISGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGG GGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSLVPRGSGGGGSGGGGS) (SEQ ID NO: 86) y una porción de región Fc (N2 de secuencia de Genscript 144849, mostrada a continuación). Se subclonó un fragmento de la construcción Genscript en pSYN-FVIII-0159 digerido con EcoRV/RsRII (mencionada anteriormente).

N° de secuencia de Genscript 144849 (SEQ ID NO: 87)

GCCTGCCAGGAGCCGATATCTGGCGGTGGAGGTTCCGGTGGCGGGGGATCCGGCGGTGGAGGTTCCGGCGGT

GGAGGTTCCGGTGGCGGGGGATCCGGCGGTGGAGGTTCCGGTGGCGGGGGATCCGGCGGTGGAGGTTCCGGC

GGTGGAGGTTCCGGTGGCGGGGGATCCGGCGGTGGAGGTTCCGGTGGCGGGGGATCCGGCGGTGGAGGTTCC

GGCGGTGGAGGTTCCGGTGGCGGGGGATCCGGTGGCGGGGGATCCCTGGTCCCCCGGGGCAGCGGCGGTGGA

GGTTCCGGTGGCGGGGGATCCGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCTCCAGAACTCCTGGGCGGA

CCGTCAGTCTTCCTCTTCCC

Clonación de pSYN-FVIII-180, 181 y 182

Se construyeron pSYN-FVIII-180, 181 y 182 a partir de pSYN-FVIII-160. Se introdujeron las mutaciones K2093A o F2093A o K2093A/F2093A en el dominio C1 de FVIII en pSYN-FVIII-160 para formar pSYN-FVIII-180, pSYN-FVIII-181 y pSYN-FVIII-182, respectivamente.

Secuencia de proteínas del heterodímero FVIII-VWF-Fc (SEQ ID NO: 88)

(posición de aminoácidos de la secuencia de FVIII 1-1457; región subrayada representa la región Fc; subrayado ondulado representa el conector escindible entre la primera Fc y el fragmento de VWF; región doblemente subrayadas representa el fragmento de VWF; región en negrita representa el conector escindible de longitud variable entre el fragmento de VWF y Fc. La longitud de conector varía en las construcciones FVIII-064, 159, 160, 178 y 179).

MQIELSTCFF LCLLRFCFSA TRRYYLGAVE LSWDYMQSDL GELPVDARFP

51 PRVPKSFPFN TSWYKKTLF VEFTDHLFNI AKPRPPWMGL LGPTIQAEVY

101 DTWITLKNM ASHPVSLHAV GVSYWKASEG AEYDDQTSQR EKEDDKVFPG

151 GSHTYVWQVL KENGPMASDP LCLTYSYLSH VDLVKDLNSG LIGALLVCRE

2 DI GSLAKEKTQT LHKFILLFAV FDEGKSWHSE TKNSLMQDRD AASARAWPKM

251 HTVNGYVNRS LPGLIGCHRK SVYWHVIGMG TTPEVHSIFL EGHTFLVRNH

301 RQASLEISPI TFLTAQTLLM DLGQFLLFCH ISSHQHDGME AYVKVDSCPE

351 EPQLRMKNNE EAEDYDDDLT DSEMDWRFD DDNSPSFIQI RSVAKKHPKT

401 WVHYIAAEEE DWDYAPLVLA PDDRSYKSQY LNNGPQRIGR KYKKVRFMAY

451 TDETFKTREA IQHESGILGP LLYGEVGDTL LIIFKNQASR PYNIYPHGIT

501 DVRPLYSRRL PKGVKHLKDF PILPGEIFKY KWTVTVEDGP TKSDPRCLTR

551 YYSSFVNMER DLASGLIGPL LICYKESVDQ RGNQIMSDKR KVILFSVFDE

501 NRSWYLTENI QRFLPNPAGV QLEDPEFQAS NIMHSINGYV FDSLQLSVCL

651 HEVAYWYILS IGAQTDFLSV FFSGYTFKHK MVYEDTLTLF PFSGETVFMS

70.1 MENPGLWILG CHNSDFRNRG MTALLKVSSC DKNTGDYYED SYEDISAYLL

751 SKNNAIEPRS FSQNPPVLKR HQREITRTTL QSDQEEIDYD DTISVEMKKE

801 DFDIYDEDEN QSPRSFQKKT RHYFIAAVER LWDYGMSSSP HVLRNRAQSG

851 SVPQFKKWF QEFTDGSFTQ PLYRGELNEH LGLLGPYIRA EVEDNIMVTF

901 RNQASRPYSF YSSLISYEED QRQGAEPRKN FVKPNETKTY FWKVQHHMAP

951 TKDEFDCKAW AYFSDVDLEK DVHSGLIGPL LVCHTNTLNP AHGRQVTVQE

1001 FALFFTIFDE TKSWYFTENM ERNCRAPCNI QMEDPTFKEN YRFHAINGYI

1051 MDTLPGLVMA QDQRIRWYLL SMGSNENIHS IHFSGHVFTV RKKEEYKMAL

L 0 L YNLYPGVFET VEMLPSKAGI WRVECLIGEH LHAGMSTLFL VYSNKCQTPL

1151 GMASGHIRDF QITASGQYGO w’APKLARLHY SGSINAWSTK EPFSWIKVDL

1201 LAPMIIHGIK TQGARQKFSS LYISQFIIMY SLDGKKWQTY RGNSTGTLMV

1251 FFGNVDSSGI KHNIFWPPII ARYIRLHPTH YSIRSTLRME LMGCDLNSCS

1301 MPLGMESKAI SDAQITASSY FTNMFATWSP SKARLHLQGR SNAWRPQVNN

1351 PKEWLQVDFQ KTMKVTGVTT QGVKSLLTSM YVKEFLISSS QDGHQWTLFF

1401 QNGKVKVFQG NQDSFTPWN SLDPPLLTRY LRIHPQSWVH QIALRMEVLG

1451 CEAQD1YDKT HTCPPGPAPE LLGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCW

1501 VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYMSTYRW SVLTVLHQDW

1551 LNGKEYKCKV SMKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP SRDELTKNQV

1601 SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPEHHYKT TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD

1651 KSRWQQGMVF SCSVMHEALH HHYTQKSLSL SPGKRRRRSG .GGGSGGGGSG

1701 GGGSGGGGSG. GGGSGGGGSR KRRKRSLSCR PPMVKLVCPA DNLRAEGLEC

1751 TKTCQNYDLE CMSMGCVSGC LCPPGHVRHE MRCVALERCP CFHOGKEYAP

1801 GETVKIGCNT CVCRDRKWMC TDHVCDATCS TIGMAHYLTF DGLKYLFPGE

1851 COYV1VODYC GSNPGTFRIL VGMKGCSHPS VKCKKRVTIL VEGGEIELFD

1901 GEVHVKRPMK DETHFEWES GRYIILLLGK ALSWWDRHL SISWLKOTY

1951 OEKVCGLCGH FDGIOHNDLT SSMLOVEEDP VDFGNSWKVS SOCADTRKVP

2001 LDSSPATCHM NIMKOTMVDS SCRILTSDVF ODCNKLVDPE PYLDVCIYDT

2051 CSCESIGDCA AFCDTIAAYA HVCAOHGKW TWRTATLCPO SCEERHLREN

2101 GYEAEWRYHS CAPACOVTCO HPEPLACPVO CVEGCHAHCP PGKILDELLO

2151 TCVDPEDCPV CEVAGRRFAS GKKVTLMPSD PEHCOICHCD WMLTCEACO

2201 EPIDGGGGSG GGGSLVPRGS GGDKTHTCPP CPAPELLGGP SVFLFPPKPK

2251 DTLMISRTPE VTCWYDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQYHS

3301 TYRWSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSHKAL PAPIEKTISK AKGQPREPQV

YTLPPSRDEL TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL

2401 ^{DSDG5FFLYS KLTVDKSRWQ QGNVFSC5VM HEALHNHYTQ KSLSLSPGK}

Ejemplo 4: Ejemplo de construcciones de ADN de FVIII-VWF (Figura 4)

Se pueden unir juntos el fragmento de VWF y la proteína FVIII por un conector u otra proteína o un polipéptido usando técnicas de ADN recombinante convencionales, como se muestra en la Figura 4. En la Figura 4A, los dominios D1D2D'D3 de VWF se unen a la proteína FVIII por un conector de 48 aa-ISGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSLVPRGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 89) y protege FVIII de la eliminación prematura. Para potenciar adicionalmente la actividad protectora de FVIII de D'D3, se puede incorporar en la construcción otra proteína o polipéptido que tenga potencial de prolongación de la semivida, tal como albúmina o una secuencia de PAS (restos heterólogos). El resto heterólogo, por ejemplo, proteína de albúmina o secuencia de PAS, se puede incorporar en diferentes posiciones de la molécula de FVIII; se mostraron algunos ejemplos en la Figura 4B-4D: en los extremos N de FVIII (4B), en los extremos C de FVIII (4C), o en la región B (4D). En las construcciones, las secuencias de proteínas adicionales podrían potenciar la actividad protectora de D'D3 y prolongar más la semivida de FVIII.

Además, también se puede incorporar un resto heterólogo, por ejemplo, albúmina o secuencia de PAS, en las construcciones de heterodímero FVIII/VWF como se muestra en la Figura 4E-4G. En la Figura 4E, un resto heterólogo, por ejemplo, albúmina o secuencia de PAS, se incorpora en la región de dominio B de FVIII de FVIII-148; en la Figura 4F, un resto heterólogo, por ejemplo, albúmina o secuencia de PAS, se incorpora en la región de dominio B de FVIII de FVIII-136; en la Figura 4G, un resto heterólogo, por ejemplo, albúmina o secuencia de PAS, se usa como conector para conectar el fragmento D'D3 y Fc. En aquellas configuraciones, se espera un efecto sinérgico de D'D3, Fc y resto heterólogo que es un prolongador de la semivida (por ejemplo, albúmina/secuencia de PAS) sobre la prolongación de la semivida de FVIII.

Ejemplo 5: Construcción de plásmido del sistema de co-transfección para el heterodímero FVIIIFc-VWF (Figura 5)

Se generó un sistema de co-transfección para la producción de heterodímeros FVIIIFc-VWF, que contiene tres construcciones de ADN. La primera construcción de ADN- pSYN-FVIII-155 está codificando una proteína de fusión FVIII-Fc en la que una proteína FVIII de cadena sencilla se fusionó directamente con un único fragmento Fc, y la segunda construcción de ADN es pSYN-VWF-031, que codifica una proteína de fusión D'D3-Fc (mencionada anteriormente en el Ejemplo 1). Se transfectaron células HEK293F con los dos plásmidos junto con un tercer plásmido (PC5) en una relación 80:15:5. La co-transfección con PC5 es para garantizar el procesamiento de propéptidos completos de las regiones D1 y D2 de manera que los presentes inventores tengan dominios D'D3 maduros. Las proteínas sintetizadas se secretaron como heterodímero FVIIIFc/D'D3Fc y homodímero D'D3Fc y el heterodímero FVIIIFc/D'D3Fc se separó del homodímero D'D3Fc por purificación de proteínas.

Secuenciación de proteínas maduras de pSYN-FVIII-155 (SEQ ID NO: 90):

ATRRYYLGAVELSWDYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSWYKKTLFVEFTDHLFNIAKPRPPWMGLL

GPTIQAEVYDTWITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDDQTSQREKEDDKVFPGGSHTYVWQVLKEN

GPMASDPLCLTYSYLSHVDLVKDLNSGLIGALLVCREGSLAKEKTQTLHKFILLFAVFDEGKSWHSETKNSL

MQDRDAASARAWPKMHTVNGYVNRSLPGLIGCHRKSVYWHVIGMGTTPEVHSIFLEGHTFLVRNHRQASLEI

SPITFLTAQTLLMDLGQFLLFCHISSHQHDGMEAYVKVDSCPEEPQLRMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDWRF

DDDNSPSFIQIRSVAKKHPKTWVHYIAAEEEDWDYAPLYLAPDDRSYKSQYLNNGPQRIGRKYKKVRFMAYT

DETFKTREAIQHESGILGPLLYGEVGDTLLIIFKNQASRPYNIYPHGITDVRPLYSRRLPKGVKHLKDFPIL

PGEIFKYKWTVTVEDGPTKSDPRCLTRYYSSFVNMERDLASGLIGPLLICYKESVDQRGNQIMSDKRNVILF

SVFDENRSMYLTENIQRFLPNPAGVQLEDPEFQASNIMHSINGYVFDSLQLSVCLHEVAYWYILSIGAQTDF

LSVFFSGYTFKHKMVYEDTLTLFPFSGETVFMSMENPGLWILGCHNSDFRNRGMTALLKVSSCDKNTGDYYE

DSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFSQNPPVLKAHQAEITRTTLQSDQEEIDYDDTIEVEMKKEDFDIYDEDENQ

SPRSFQKKTRHYFIAAVERLWDYGMSSSPHVLRNRAQSGSVPQFKKWFQEFTDGSFTQPLYRGELNEHLGL

LGPYIRAEVEDNIMVTFRNQASRPYSFYSSLISYEEDQRQGAEPRKNFVKPNETKTYFWKVQHHMAPTKDEF

DCKAWAYFSDVDLEKDVHSGLIGPLLVCHTNTLNPAHGRQVTVQEFALFFTIFDETKSWYFTENMERNCRAP

CNIQMEDFTFKENYRFHAINGYIMDTLPGLVMAQDQRIRWYLLSMGSNENIHSIHFSGHVFTVRKKEEYKMA

LYNLYPGVFETVEMLPSKAGIWRVECLIGEHLHAGMSTLFLVYSNKCQTPLGMASGHIRDFQITASGQYGQW

APKLARLHYSGSINAWSTKEPFSWIKVDLLAPMIIHGIKTQGARQKFSSLYISQFIIMYSLDGKKMQTYRGN

STGTLMVFFGNVDSSGIKHNIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTLRMELMGCDLNSCSMPLGMESKAISDAQI

TASSYFTNMFATWSPSKARLHLQGRSNAWRPQVNNPKEWLQVDFQKTMKVTGVTTQGVKSLLTSMYVKEFLI

SSSQDGHQWTLFFQNGKVKVFQGNQDSFTPWNSLDPPLLTRYLRIHPQSWVHQIALRMEVLGCEAQDLYDK

THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE

QYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLT

CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQ

KSLSLSPGK

Secuenciación de ADN de pSYN-FVIII-155 (SEQ ID NO: 91):

ATGCAAATAGAGCTCTCCACCTGCTTCTTTCTGTGCCTTTTGCGATTCTGCTTTAGTGCCACCAGAAGATAC

TACCTGGGTGCAGTGGAACTGTCATGGGACTATATGCAAAGTGATCTCGGTGAGCTGCCTGTGGACGCAAGA

TTTCCTCCTAGAGTGCCAAAATCTTTTCCATTCAACACCTCAGTCGTGTACAAAAAGACTCTGTTTGTAGAA

TTCACGGATCACCTTTTCAACATCGCTAAGCCAAGGCCACCCTGGATGGGTCTGCTAGGTCCTACCATCCAG

GCTGAGGTTTATGATACAGTGGTCATTACACTTAAGAACATGGCTTCCCATCCTGTCAGTCTTCATGCTGTT

GGTGTATCCTACTGGAAAGCTTCTGAGGGAGCTGAATATGATGATCAGACCAGTCAAAGGGAGAAAGAAGAT

GATAAAGTCTTCCCTGGTGGAAGCCATACATATGTCTGGCAGGTCCTGAAAGAGAATGGTCCAATGGCCTCT

GACCCACTGTGCCTTACCTACTCATATCTTTCTCATGTGGACCTGGTAAAAGACTTGAATTCAGGCCTCATT

GGAGCCCTACTAGTATGTAGAGAAGGGAGTCTGGCCAAGGAAAAGACACAGACCTTGCACAAATTTATACTA

CTTTTTGCTGTATTTGATGAAGGGAAAAGTTGGCACTCAGAAACAAAGAACTCCTTGATGCAGGATAGGGAT

GCTGCATCTGCTCGGGCCTGGCCTAAAATGCACACAGTCAATGGTTATGTAAACAGGTCTCTGCCAGGTCTG

ATTGGATGCCACAGGAAATCAGTCTATTGGCATGTGATTGGAATGGGCACCACTCCTGAAGTGCACTCAATA

TTCCTCGAAGGTCACACATTTCTTGTGAGGAACCATCGCCAGGCGTCCTTGGAAATCTCGCCAATAACTTTC

CTTACTGCTCAAACACTCTTGATGGACCTTGGACAGTTTCTACTGTTTTGTCATATCTCTTCCCACCAACAT

GATGGCATGGAAGCTTATGTCAAAGTAGACAGCTGTCCAGAGGAACCCCAACTACGAATGAAAAATAATGAA

GAAGCGGAAGACTATGATGATGATCTTACTGATTCTGAAATGGATGTGGTCAGGTTTGATGATGACAACTCT

CCTTCCTTTATCCAAATTCGCTCAGTTGCCAAGAAGCATCCTAAAACTTGGGTACATTACATTGCTGCTGAA

GAGGAGGACTGGGACTATGCTCCCTTAGTCCTCGCCCCCGATGACAGAAGTTATAAAAGTCAATATTTGAAC

AATGGCCCTCAGCGGATTGGTAGGAAGTACAAAAAAGTCCGATTTATGGCATACACAGATGAAACCTTTAAG

ACTCGTGAAGCTATTCAGCATGAATCAGGAATCTTGGGACCTTTACTTTATGGGGAAGTTGGAGACACACTG

TTGATTATATTTAAGAATCAAGCAAGCAGACCATATAACATCTACCCTCACGGAATCACTGATGTCCGTCCT

TTGTATTCAAGGAGATTACCAAAAGGTGTAAAACATTTGAAGGATTTTCCAATTCTGCCAGGAGAAATATTC

AAATATAAATGGACAGTGACTGTAGAAGATGGGCCAACTAAATCAGATCCTCGGTGCCTGACCCGCTATTAC

TCTAGTTTCGTTAATATGGAGAGAGATCTAGCTTCAGGACTCATTGGCCCTCTCCTCATCTGCTACAAAGAA

TCTGTAGATCAAAGAGGAAACCAGATAATGTCAGACAAGAGGAATGTCATCCTGTTTTCTGTATTTGATGAG

AACCGAAGCTGGTACCTCACAGAGAATATACAACGCTTTCTCCCCAATCCAGCTGGAGTGCAGCTTGAGGAT

CCAGAGTTCCAAGCCTCCAACATCATGCACAGCATCAATGGCTATGTTTTTGATAGTTTGCAGTTGTCAGTT

TGTTTGCATGAGGTGGCATACTGGTACATTCTAAGCATTGGAGCACAGACTGACTTCCTTTCTGTCTTCTTC

TCTGGATATACCTTCAAACACAAAATGGTCTATGAAGACACACTCACCCTATTCCCATTCTCAGGAGAAACT

GTCTTCATGTCGATGGAAAACCCAGGTCTATGGATTCTGGGGTGCCACAACTCAGACTTTCGGAACAGAGGC

ATGACCGCCTTACTGAAGGTTTCTAGTTGTGACAAGAACACTGGTGATTATTACGAGGACAGTTATGAAGAT

ATTTCAGCATACTTGCTGAGTAAAAACAATGCCATTGAACCAAGAAGCTTCTCTCAAAACCCACCAGTCTTG

AAAGCCCATCAGGCGGAAATAACTCGTACTACTCTTCAGTCAGATCAAGAGGAAATTGACTATGATGATACC

ATATCAGTTGAAATGAAGAAGGAAGATTTTGACATTTATGATGAGGATGAAAATCAGAGCCCCCGCAGCTTT

CAAAAGAAAACACGACACTATTTTATTGCTGCAGTGGAGAGGCTCTGGGATTATGGGATGAGTAGCTCCCCA

CATGTTCTAAGAAACAGGGCTCAGAGTGGCAGTGTCCCTCAGTTCAAGAAAGTTGTTTTCCAGGAATTTACT

GATGGCTCCTTTACTCAGCCCTTATACCGTGGAGAACTAAATGAACATTTGGGACTCCTGGGGCCATATATA

AGAGCAGAAGTTGAAGATAATATCATGGTAACTTTCAGAAATCAGGCCTCTCGTCCCTATTCCTTCTATTCT

AGCCTTATTTCTTATGAGGAAGATCAGAGGCAAGGAGCAGAACCTAGAAAAAACTTTGTCAAGCCTAATGAA

ACCAAAACTTACTTTTGGAAAGTGCAACATCATATGGCACCCACTAAAGATGAGTTTGACTGCAAAGCCTGG

GCTTATTTCTCTGATGTTGACCTGGAAAAAGATGTGCACTCAGGCCTGATTGGACCCCTTCTGGTCTGCCAC

ACTAACACACTGAACCCTGCTCATGGGAGACAAGTGACAGTACAGGAATTTGCTCTGTTTTTCACCATCTTT

GATGAGACCAAAAGCTGGTACTTCACTGAAAATATGGAAAGAAACTGCAGGGCTCCCTGCAATATCCAGATG

GAAGATCCCACTTTTAAAGAGAATTATCGCTTCCATGCAATCAATGGCTACATAATGGATACACTACCTGGC

TTAGTAATGGCTCAGGATCAAAGGATTCGATGGTATCTGCTCAGCATGGGCAGCAATGAAAACATCCATTCT

ATTCATTTCAGTGGACATGTGTTCACTGTACGAAAAAAAGAGGAGTATAAAATGGCACTGTACAATCTCTAT

CCAGGTGTTTTTGAGACAGTGGAAATGTTACCATCCAAAGCTGGAATTTGGCGGGTGGAATGCCTTATTGGC

GAGCATCTACATGCTGGGATGAGCACACTTTTTCTGGTGTACAGCAATAAGTGTCAGACTCCCCTGGGAATG

GCTTCTGGACACATTAGAGATTTTCAGATTACAGCTTCAGGACAATATGGACAGTGGGCCCCAAAGCTGGCC

AGACTTCATTATTCCGGATCAATCAATGCCTGGAGCACCAAGGAGCCCTTTTCTTGGATCAAGGTGGATCTG

TTGGCACCAATGATTATTCACGGCATCAAGACCCAGGGTGCCCGTCAGAAGTTCTCCAGCCTCTACATCTCT

CAGTTTATCATCATGTATAGTCTTGATGGGAAGAAGTGGCAGACTTATCGAGGAAATTCCACTGGAACCTTA

ATGGTCTTCTTTGGCAATGTGGATTCATCTGGGATAAAACACAATATTTTTAACCCTCCAATTATTGCTCGA

TACATCCGTTTGCACCCAACTCATTATAGCATTCGCAGCACTCTTCGCATGGAGTTGATGGGCTGTGATTTA

AATAGTTGCAGCATGCCATTGGGAATGGAGAGTAAAGCAATATCAGATGCACAGATTACTGCTTCATCCTAC

TTTACCAATATGTTTGCCACCTGGTCTCCTTCAAAAGCTCGACTTCACCTCCAAGGGAGGAGTAATGCCTGG

AGACCTCAGGTGAATAATCCAAAAGAGTGGCTGCAAGTGGACTTCCAGAAGACAATGAAAGTCACAGGAGTA

ACTACTCAGGGAGTAAAATCTCTGCTTACCAGCATGTATGTGAAGGAGTTCCTCATCTCCAGCAGTCAAGAT

GGCCATCAGTGGACTCTCTTTTTTCAGAATGGCAAAGTAAAGGTTTTTCAGGGAAATCAAGACTCCTTCACA

CCTGTGGTGAACTCTCTAGACCCACCGTTACTGACTCGCTACCTTCGAATTCACCCCCAGAGTTGGGTGCAC

CAGATTGCCCTGAGGATGGAGGTTCTGGGCTGCGAGGCACAGGACCTCTACGACAAAACTCACACATGCCCA

CCGTGCCCAGCTCCAGAACTCCTGGGCGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTC

ATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTC

AACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACG

TACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTC

TCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAG

GTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAA.GAACCAGGTCAGCCTGA.CCTGCCTGGTCAAAGGC

TTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCT

CCCGTGTTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAG

GGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTG

TCTCCGGGTAAA

Se enumeran a continuación fragmentos de VWF y heterodímeros de FVIIIFC-VWF adicionales que se han construido.

Tabla 6. Fragmentos de VWF y construcciones de heterodímeros FVIII/VWF

Ejemplo 6: Purificación de proteínas

Purificación de proteínas de fragmentos de VWF

Se purificaron los fragmentos de VWF mediante un método de purificación de dos etapas. Se usó una columna IMAC (cromatografía de afinidad por metal inmovilizado) cargada con sulfato de níquel para la purificación primaria, se usó una columna de intercambio iónico Fractogel DEAE para la purificación final. Se describe a continuación método de purificación detallado.

(a) Purificación primaria de fragmento de VWF sobre de IMAC de níquel

Se equilibró una columna IMAC Sepharose HP de níquel de 14 mL [XK26/3] con HEPES 25 mM, NaCl 500 mM, imidazol 10 mM, y 0,05 % de Tween-20 a pH 7,5. Se ajustaron aproximadamente 7,2 L de medio acondicionado de VWF con 100 mL de HEPES 1 M a pH 7,5 y 600 mL de NaCl 5 M. Entonces se añadieron 80 mL de imidazol 1 M (a pH 7,5) a una concentración final de 10 mM. Entonces se cargaron 7,8 L del medio acondicionado de VWF ajustado sobre la columna a 2-8 °C a 10 mL/min [113 cm/hora]. Las etapas de lavado se realizaron a 13,3 mL/minuto [150 cm/hora]. Primero, se realizó un lavado de 2x volumen de columna (VC) con HEPES 25 mM, NaCl 500 mM, imidazol 10 mM y 0,05 % de Tween-20 a pH 7,5 en flujo normal ("Flujo descendente"}. A continuación, se realizó un lavado 3xVC con HEPES 25 mM, NaCl 500 mM, imidazol 10 mM y 0,05 % de Tween-20 a pH 7,5 en flujo inverso ("Flujo ascendente"}. Finalmente, se realizó un lavado 3xVC con HEPES 25 mM, NaCl 500 mM, imidazol 10 mM y 0,05 % de Tween-20 a pH 7,5 en flujo normal ("Flujo descendente"}. La elución se realizó como un gradiente 10xVC hasta 50 % de B1 (h Ep ES 25 mM, NaCl 500 mM, imidazol 500 mM y 0,05 % de Tween-20 a pH 7,5). Se estableció el volumen de fracción a 10 mL. Entonces, se sometió a arrastre la columna con 100 % de B1. Esto fue seguido por un lavado con HEPES 25 mM, NaCl 500 mM, imidazol 10 mM y 0,05 % de Tween-20 a pH 7,5. Se realizó un segundo arrastre con NaOH 1 N. Entonces se lavó la columna con TRIS 1 M, NaCl 1 M a pH 7,8, seguido por HEPES 25 mM, NaCl 500 mM, imidazol 10 mM y 0,05 % de Tween-20 a pH 7,5. Finalmente, se lavó la columna con 5 VC de DPBS 20 % de etanol y se guardó a 4 °C.

(b) Purificación secundaria de fragmento de VWF sobre Fractogel DEAE

Se realizó la purificación secundaria del fragmento de VWF sobre Fractogel DEAE a pH 7,5. En primer lugar, se ajustaron 20 mL de eluato de IMAC de níquel de VWF (correspondiente al pico del fragmento de VWF) con 200 mg de detergente de ión bipolar Zwittergent 3-14 en un intento por romper las especies agregadas sin usar excipientes desnaturalizantes o reductores. Después de disolver el detergente, la proteína se dejó a TA durante aproximadamente 15 minutos. Entonces, la proteína se ajustó con 4 o de trehalosa, 1 mL de 10 % de Tween-20, 5 mL de HEPES 1 M a pH 7,5 y 174 mL de agua "Milli-Q". El tampón de equilibrio "A12" fue HEPES 25 mM, NaCl 50 mM, 1 % de trehalosa, 0,05 % de Tween-20 a pH 7,5. El tampón de elución "B1" fue HEPES 25 mM, NaCl 1000 mM, 1 % de trehalosa, 0,05 % de Tween-20 a pH 7,5. La elución se realizó como un gradiente de 10 VC hasta 50 % de B1, con un mantenimiento de 5+ VC seguido por una etapa hasta 100 % de B1. Entonces se sometió a arrastre la columna con 0,85 % de ácido fosfórico, seguido por TRIS 1 M, NaCl 1 M a pH 7,5. Entonces, se sometió a arrastre la columna con NaOH 1 N, NaCl 2 M seguido por TRIS 1 M, NaCl 1 M a pH 7,5. Entonces, se lavó la columna con HEPES 25 mM, NaCl 100 mM 20 % de etanol a pH 7,5 para almacenamiento.

(c) Purificación de proteínas de heterodímero FVIII-VWF

Se purificó primero el heterodímero FVIII-VWF por una columna de afinidad (GE VIIISelect), luego seguido por una columna de intercambio iónico Fractogal TMAE (McCue JT, Selvitelli K, Walker J, J Chromatogr A. 2009 Nov 6; 1216(45):7824-30. Publicación electrónica 23 de septiembre de 2009).

Para la purificación de FVIII-155/VWF-31, se usó una etapa de filtración de flujo tangencial (TFF) para intercambiar de tampón el medio acondicionado clarificado. Entonces se capturaron las proteínas elegidas como diana en el filtrado usando cromatografía de afinidad. Siguió una etapa de cromatografía de intercambio aniónico débil para reducir las especies de HMW. Se accedió tanto a la pureza como al tamaño de la molécula por HPLC-SEC y SDS-PAGE. Se confirmó adicionalmente por transferencia Western la presencia de diferentes dominios de FVIII-155/VWF-31 . La actividad específica de la molécula fue comparable a FVIII de dominio B delecionado.

(d) Digestión con trombina del heterodímero FVIII-VWF (Figura 8)

Se mezcló el heterodímero FVIII-VWF-Fc o FVIII-Fc (control) con trombina en relación 1:10 en tampón de escisión de trombina (Tris 50 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, CaCl22 mM, 5 % de glicerol). Se incubó la reacción a 37 °C durante 20 minutos. Se ejecutó el producto digerido en gel reductor de Tris-glicina a 4-12 %. La proteína no digerida se usó como control. Las bandas se visualizaron por tinción con Coomassie.

(e) Evaluación de la capacidad de unión de VWF de FVIII-155/VWF-031 por ensayo Octet

Se determinó la capacidad de unión de VWF de FVIII-155/VWF-031 por mediciones basadas en interferometría de biocapa (BLI) (ensayo Octet) a 25 °C con un instrumento ForteBio Octet 384 usando tampón de unión Tris (Tris 50 mM, pH 7,2, NaCl 150 mM, CaCl25 mM). El ensayo Octet para determinar la unión de FVIII se basó en la inmovilización hidrófoba de factor humano de von Willebrand (hVWF) (N° de catálogo de Haematologic Technologies HCVWF-0191) sobre el biosensor de APS, seguido por la unión de 1,0 % de albúmina de suero bovino (N° de catálogo de Jackson ImmunoResearch 001-000-161). Brevemente, se diluyó hVWF (38,5 nM) en tampón Tris y se cargó a través de biosensores de APS durante 600 s, dando aproximadamente 3,0 - 3,5 nm de unión sobre las sondas de reacción. Se cargaron las sondas de APS de control APS con 1,0 % de BSA en ausencia de hVWF para la resta de referencia. Después de la carga, todas las sondas se incubaron en tampón Tris durante 300 segundos para establecer un nuevo nivel inicial. Posteriormente, se incubaron sondas de biosensor en disoluciones de FVIII-155/VWF-031, principio activo de FVIIIFc, o rFVIII (60 nM) durante 5 min a temperatura ambiente, seguido por una etapa de disociación de 5 min. Usando el software de análisis de datos Octet, la respuesta de unión (nm) derivó de los datos restados (Sonda de reacción menos Sonda de referencia). Como se muestra en la Figura 15, en comparación con la afinidad de unión de VWF de rFVIIIFc y rFVIII, la afinidad de unión de VWF de FVIII-155/VWF-031 fue gravemente afectada. Esto indica la protección satisfactoria de FVIII de VWF de longitud completa por el fragmento D'D3 dentro del heterodímero FVIIIFc/VWF.

Ejemplo 7. La interacción VWF-FVIII es un factor limitante para la prolongación de la semivida de FVIII La mayoría de FVIII en circulación existe como un complejo FVIII-VWF (>95 % de FVIII en plasma). Esta interacción FVIII-VWF promueve la eliminación de FVIII mediante la vía de eliminación de VWF, haciendo así la semivida de VWF (T1/2) una limitación de la prolongación de la semivida de FVIII. Para evaluar esta hipótesis, se probó la limitación de la prolongación de la semivida de FVIII por tecnología de Fc en ratones deficientes en FVIII (ratones HemA, que tienen gen VWF intacto) y ratones deficientes en FVIII/VWF (doblemente inactivados en FVIII-VWF (DKO)).

Se trataron los ratones HemA o ratones DKO FVIII-VWF con una única dosis intravenosa de rFVIII o rFVIIIFc a 125 UI/kg en ratones HemA o 200 UI/kg en ratones DKO. Se recogieron muestras de sangre hasta 72 horas en los ratones HemA o hasta 8 horas en los ratones DKO FVIII/VWF. Entonces se midió la actividad de la muestra de plasma de FVIII por un ensayo cromogénico de FVIII. Se analizó el perfil farmacocinético (FC) de las dos varianzas de rFVIII usando el programa WinNonlin.

Como se muestra en la Tabla 7 y la Figura 9, en los ratones DKO FVIII/VWF, rFVIIIFc mostró T1/2 aproximadamente 4,8 veces más larga (es decir, T1/2 de 1,2 horas) en comparación con T1/2 de rFVIII (es decir, T1/2 de 0,25 horas). A diferencia, cuando se probó en ratones HemA, rFVIIIFc solo tuvo T1/2 1,8 veces más larga en comparación con rFVIII. La T1/2 de rFVIIIFc fue 13,7 horas, que está en línea con la semivida de VWF murino endógeno. Esto indica que la interacción FVIII-VWF es un factor limitante para la prolongación de la semivida de FVIII. Para lograr una prolongación de la semivida de FVIII superior a 2 veces, se tendrá que eliminar la interacción FVIII-VWF.

Tabla 7: FC de FVIII en ratones HemA y DKO FVIIII/VWF

Ensayo cromogénico de FVIII

Se midió la actividad de FVIII usando el kit de FVIII COATEST SP de DiaPharma (lote N° N089019) y todas las incubaciones se realizaron sobre un calentador de placa a 37 °C con agitación.

El intervalo de patrón de rFVIII fue desde 100 mUI/mL hasta 0,78 mUI/mL. Se añadieron muestras de control de ensayo de plasma humano normal reunido y de plasma (diluidas con tampón IX Coatest) en placas de 96 pocillos Immulon 2HB por duplicado (25 pL/pocillo). Se añadieron secuencialmente mezcla recién preparada de IXa/FX/fosfolípido (50 pL), 25 pL de CaCl225 mM y 50 pL de sustrato FXa en cada pocillo con incubación de 5 minutos entre cada adición. Después de la incubación con el sustrato, se añadieron 25 pL de 20 % de ácido acético para terminar la reacción de color, y se midió la absorbancia de DO405 con un instrumento SpectraMAX plus (Molecular Devices). Los datos se analizaron con el software SoftMax Pro (versión 5.2). El nivel más bajo de cuantificación (LLOQ) es 7,8 mUI/mL.

Ejemplo 8. El dímero VWF D'D3 protege FVIII de la proteólisis y eliminación de FVIII (Figura 10)

Se evaluó la actividad de protección de FVIII de los fragmentos de VWF por su capacidad para proteger FVIII murino endógeno de su eliminación en ratones deficientes en VWF. Se introdujeron diferentes fragmentos de VWF como se enumera en la Tabla 8 Columna 1 (Figura 1, Ejemplo 1) en la circulación sanguínea de los ratones deficientes en VWF por inyección hidrodinámica de sus construcciones de ADN correspondientes a 100 pg/ratón. Se recogieron las muestras de plasma 48 horas después de la inyección, y se midió la actividad plasmática de FVIII murino por un ensayo cromogénico de FVIII. Se midió el nivel de expresión de VWF por ELISA de VWF.

Cuatro longitudes diferentes de los fragmentos de VWF que se han probado son 276, 477, 511 y 716 aminoácidos. Se probó el intervalo de 276 a 716 aminoácidos para encontrar la longitud de los fragmentos de VWF requerida para la unión de FVIII (276 aa) sin dominio de unión de receptor de eliminación de VWF (716 aa). Se usaron VWF de longitud completa y el multímero D1D2D'D3CK como control positivo para la protección de FVIII. En la circulación sanguínea, los fragmentos de VWF sintetizados con el dominio D1D2 existen como un dímero y existen como monómeros cuando se sintetizan sin el dominio D1D2.

El aumento de la actividad de FVIII murino en plasma después de la inyección hidrodinámica mide el efecto de protección de FVIII de los fragmentos de VWF. Como se muestra en la Tabla 8 y la Figura 10A-B, los primeros 276 aa del fragmento D'D3 no tuvieron actividad de protección de FVIII como se demuestra por el nivel de FVIII similar antes/después de la inyección en plasma (Figura 10A). Sin embargo, la introducción de los otros fragmentos de VWF indujo un aumento significativo en el nivel de FVIII en plasma, que indica que los fragmentos de VWF pueden proteger FVIII de su vía de eliminación.

Tabla 8: Nivel en plasma de FVIII murino de ratones DKO FVIII/VWF antes/después de la introducción de fragmentos de VWF (las construcciones de ADN se ilustraron en la Figura 1)

Se enumeraron en la Tabla 8 la relación de la actividad de FVIII en plasma después de la inyección y el nivel de antígeno en plasma de los fragmentos de VWF que contienen el dominio D'D3 de VWF de longitud completa. Se observó relación de FVIII/VWF después de la inyección similar de VWF de longitud completa y las dos formas de dímero de los fragmentos de VWF, que significa que los dos dímeros de fragmentos de VWF proporcionan la misma protección de FVIII que VWF de longitud completa. Además, se observó relación de FVIII/VWF tres veces más alta a partir de las isoformas de dímeros de fragmentos de VWF en comparación con sus monómeros correspondientes: el dímero D'D3 (477 aa) tiene la relación FVIII/VWF de 38,7 mUI/nmol; el monómero D'D3 (477 aa) tiene la relación FVIII/VWF de 11,6 mUI/nmol: el dímero D'D3A1 (511aa) tiene la relación FVIII/VWF de 32,9 mUI/nmol; y el monómero D'D3 (511aa) tiene la relación FVIII/VWF de 13,8 mUI/nmol, que indica que las isoformas de dímeros de los fragmentos de VWF proporcionan mejores protecciones de FVIII en comparación con sus monómeros correspondientes.

Tabla 9: Efecto de protección de FVIII del fragmento D'D3 de longitud completa

Inyección hidrodinámica:

La inyección hidrodinámica es un método de administración génica no viral eficiente y segunda al hígado en animales pequeños, tales como ratones y ratas. Se describió originalmente como una inyección rápida de un ADN de plásmido desnudo/solución salina libre de endotoxina a un décimo de volumen del peso corporal del animal en aproximadamente 5-7 segundos. El ADN de plásmido desnudo contiene el gen de interés y la proteína diana producida por el hígado del ADN inyectado se puede detectar en el plazo de 24 horas después de la inyección. Entonces se recogieron muestras de plasma para estudiar la propiedad terapéutica de la proteína expresada.

Para todas las inyecciones hidrodinámicas que se realizaron en el presente documento en la presente solicitud de patente, se administraron por inyección intravenosa 2 mL de ADN de plásmido en 0,9 % de solución salina estéril en la vena de la cola en el plazo de aproximadamente 4-7 segundos a ratones que pesaban 20-35 gramos. Los ratones se monitorizaron estrechamente durante el primer par de horas hasta que se reanudó la actividad normal. Después de recoger muestras de sangre por extracción de sangre retro-orbital, entonces se obtuvieron muestras de plasma y se guardaron a -80 °C para análisis adicionales.

ELISA DE VWF:

Se usó anticuerpo de cabra anti-VWF humano (purificado por afinidad, Affinity Biologicals, GAVWF-AP) como el anticuerpo de captura a 0,5 ug/pocillo y se usó VWF-EIA-D (Affinity Biologicals, VWF-EIA-D, dilución 1:100) como el anticuerpo de detección para ELISA de VWF. Se realizó ensayo de ELISA siguiendo el procedimiento convencional de ELISA, se usó TMB como el sustrato de HRP, se usó tampón PBST/1,5 % de BSA/ NaCl 0,5 M como tampón de boqueo y de unión. El intervalo de patrón del ensayo es 100 ng a 0,78 ng, y el límite de cuantificación más bajo del ensayo (LLOQ) es 7,8 ng/mL.

Ejemplo 9: Coadministración del fragmento D'D3 de VWF de longitud completa extiende la semivida de BDD-FVIII en ratones DKO FVIII-VWF (Figura 11)

El Ejemplo 8 ha demostrado que el fragmento D'D3 de longitud completa puede proteger FVIII endógeno de su vía de eliminación. Para evaluar adicionalmente la actividad de protección de FVIII de la proteína D'D3, se coadministraron ratones DKO FVIII-VWF con FVIII de dominio B delecionado (rBDD-FVIII) y dímero D'D3 (VWF-010) o rBDD-FVIII y monómero D'D3 (VWF-002), por inyección intravenosa a 200 UI/kg para rBDD-FVIII, 770 pg/kg para el dímero D'D3 y 590 pg/kg para el monómero D'D3. Entonces se monitorizó el perfil FC de rBDD-FVIII para su actividad de plasma después de la inyección. Debido a la corta semivida in vivo de los fragmentos D'D3, tres horas después de la co-inyección inicial, se administró otra dosis de D'D3 mediante la misma vía para mantener un nivel en plasma de D'D3 deseable.

Para análisis FC, se obtuvo muestra de plasma mediante extracción de sangre retro-orbital 5 min, 30 min, 1 hora, 2 hora, 4 horas y 6 horas después de la inyección, se analizó la actividad de FVIII en plasma y el nivel de antígeno de D'D3 por ensayo cromogénico de FVIII y ELISA de VWF.

Como se muestra en la Figura 11 y la Tabla 10, el monómero D'D3 prolongó la semivida de rBDD-FVIII 2,5 veces y mejoró su recuperación en 1,8 veces. El dímero D'D3 prolongó la semivida de rBDD-FVIII en 4,1 veces y mejoró su recuperación en 3,5 veces. También se observaron el tiempo de residencia medio mejorado, eliminación y ABC de ambas de las isoformas de D'D3. El dímero D'D3, sin embargo, logró mejores resultados en todos los parámetros FC en comparación con su forma de monómero.

En resumen, la co-inyección de D'D3 de longitud completa protege FVIII de su vía de eliminación, como se muestra en el perfil FC mejorado de rBDD-FVIII. El posible valor clínico de este hallazgo necesita ser evaluado más a fondo. Tabla 10: Parámetro FC de BDD-FVIII en ratones DKO FVIII-VWF cuando se co-administran con fragmentos D'D3

Ejemplo 10. El monómero D'D3 sintetizado con dominio D1D2 y su isoforma de dímero tiene la misma actividad de protección de FVIII y además prolongaron la semivida de FVIIIFc en ~4 veces en ratones DKO FVIII-VWF (Figura 12)

Para cuantificar la capacidad de protección de FVIII de los dominios D'D3 y determinar si la dimerización de D'D3 es necesaria para su actividad de protección de FVIII, se administró cada una de dos construcciones de ADN (es decir, VWF-025 (que contiene la secuencia de ADN que codifica D1 D2D'D3) y VWF-029 (que contiene ADN de codón de D1D2D'D3 con mutación C336A y C379A)) en ratones DKO FVIII/VWF por inyección hidrodinámica. Esta inyección produjo expresión de dímero D'D3 (VWF-025) o monómero (VWF-029) en los ratones DKO FVIII/VWF. En el día 5 después de la inyección hidrodinámica, se administró una dosis intravenosa única de rFVIIIFc a 200 UI/kg, y se recogieron muestras de plasma 5 min, 4, 8,16, 24, 31, 40, 55, 66 horas después de la inyección IV de rFVIIIFc. Se usó un estudio FC de rFVIIIFc que se realizó en ratones DKO FVIII-VWF sin tratamiento previo a la misma dosis como nivel inicial de la semivida de rFVIIIFc. Se analizó la actividad de FVIII en plasma por un ensayo cromogénico de FVIII. Se midió el nivel de D'D3 en plasma por ELISA de VWF, y se analizó el perfil FC de rFVIIIFc usando el programa WinNonlin.

Como se muestra en la Tabla 11 y la Figura 12, con los fragmentos D'D3 de VWF en la circulación, la recuperación inicial de rFVIIIFc aumentó desde 42 % hasta 75 % con el dímero D'D3 y 60 % con el monómero D'D3. También aumentó la T1/2 de rFVIIIFc desde 2,5 horas hasta 9,3 horas y 9,2 horas, respectivamente. Similar a T1/2, también se observaron tiempo de residencia medio, eliminación y distribución de volumen mejorados de los ratones que expresan monómero y dímero D'D3. En general, los presentes inventores observan mejoras de aproximadamente 8 veces en la semivida de rFVIIIFc y mejoras de 6 veces en ABC en tanto los ratones que expresan el monómero D'D3 como el dímero. Al igual que con su isoforma de dímero, el monómero D'D3 de VWF de longitud completa que se sintetizó con el propéptido (D1D2) de VWF es suficiente para proporcionar el efecto de protección completa de FVIII como la molécula de VWF de longitud completa.

En ratones DKO FVIII/VWF, WT-FVIII tiene una T1/2 de 0,25 h. La tecnología de fusión de Fc aumentó la T1/2 de FVIII a 1,2 horas, que es un aumento de aproximadamente 4,8 veces. Cuando se combinó la tecnología de fusión de Fc con los dominios D'D3, T1/2 de FVIII aumentó hasta 9,3 horas (dímero D'D3) y 9,2 horas (monómero D'D3), que son aumentos de aproximadamente 37 veces en total. (Tabla 10) Este resultado demostró el efecto sinérgico de la fusión de Fc y el fragmento D'D3 de VWF sobre la prolongación de la semivida de FVIII.

Tabla 11: Parámetro FC de rFVIIIFc con/sin fragmento D'D3 en circulación sanguínea

Ejemplo 11: FC de heterodímero FVIII-VWF en ratones HemA

Se probará el perfil FC de los candidatos a cabeza de serie del heterodímero FVIII-VWF (tal como FVIII-155/VWF-031) en ratones HemA para evaluar su capacidad de protección de FVIII de VWF endógeno y su capacidad para prolongación de la semivida de FVIII.

Se tratarán ratones HemA con una dosis intravenosa única de los candidatos a cabeza de serie a 200 UI/kg, entonces se recogerán muestras de plasma 5 min, 4 h, 8 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h y 120 h, se probará la actividad en plasma por ensayo cromogénico de FVIII, y se calculará la semivida de la varianza de FVIII por el programa WinNonlin.

En una configuración óptima de heterodímeros FVIII/VWF, la unión de FVIII a VWF endógeno será completamente inhibida, para lo que la semivida inicial de rFVIII disminuirá desde 7,6 h hasta 0,25 h, como se muestra en el Ejemplo 7. Cuando el fragmento D'D3 se asoció no covalentemente a FVIII, se observó un beneficio de semivida de aproximadamente 8 veces (Ejemplo 9). En los candidatos a cabeza de serie del heterodímero FVIII/VWF, el fragmento de VWF se asocia covalentemente a la molécula de FVIII, podría ser capaz de lograrse mejor protección de FVIII. La invención de la presente solicitud abrió la posibilidad de prologar más la semivida de FVIII más allá del techo de dos veces, con la combinación de las tecnologías de prolongación de la semivida disponibles, los pacientes HemA podrían esperar una mejor varianza de FVIII de acción prolongada en el futuro cercano.

Se probó el perfil FC de FVIII-155/VWF-031 en ratones HemA y DKO FVIII/VWF para evaluar la capacidad del fragmento D'D3 para proteger el resto de FVIII de VWF endógeno. Se trataron ratones HemA o DKO FVIII/VWF con una dosis intravenosa única de FVIII-155/VWF-031 a 200 UI/kg, entonces se recogieron muestras de plasma 5 min, 8 horas, 24 horas y 48 horas después de la dosis. Se probó la actividad de FVIII de la muestra de plasma por un ensayo cromogénico de FVIII, y se calculó la semivida de FVIII-155/VWF-031 usando el programa WinNonlin.

Se detectó unión gravemente alterada a VWF inmovilizado por interferometría de biocapa (Figura 15, Octet; ForteBio Inc., Menlo Park, CA) para FVIII-155/VWF-031 en comparación con rFVIIIFc y rFVIII. Esto muestra que el dominio D'D3 en la molécula había bloqueado satisfactoriamente la unión de FVIII a moléculas nativas de VWF. Por tanto, se esperaba semivida de rFVIII-155/VWF-031 similar en las dos cepas de ratón diferentes. Los resultados del estudio se enumeran en la Figura 16 y la Tabla 12A. Como se predijo, rFVIII-155NWF-031 tuvo perfil FC comparable en tanto ratones HemA como DKO FVIII/VWF, que indica que la semivida del heterodímero FVIIIFc/VWF es independiente de la semivida de VWF endógeno. Los resultados muestran que la inhibición de la interacción entre rFVIIIFc con VWF endógeno por los dominios D'D3 de VWF permite la eliminación del techo de semivida de FVIII y abre la posibilidad de prolongar la semivida de FVIII más allá de la semivida que puede lograrse sin los dominios D'D3 de VWF (aproximadamente dos veces de FVIII no mutante).

Tabla 12A. FC de FVIII-155/VWF-031 en ratones DKO FVIII/VWF y ratones HemA

Se evaluó la capacidad protectora de FVIII de los dominios D'D3 comparando t1/2 de FVIII-155/VWF-031 con FVIIIFc en ratones DKO FVIII/VWF. Después de una única administración IV, se recogieron muestras de sangre a los 5 min, 8 horas, 24 horas y 48 horas para FVIII-155/VWF-031, y a los 5 min, 1 horas, 2 horas, 4 horas, 6 horas y 8 horas para FVIIIFc. Se probó la actividad de FVIII de la muestra de plasma por un ensayo cromogénico de FVIII, y se calculó la semivida de FVIII-155/VWF-031 usando el programa WinNonlin.

La Figura 16B y la Tabla 12B muestran un perfil FC significativamente mejorado para FVIII-155/VWF-031 en comparación con rFVIIIFc en ratones DKO: aumento de aproximadamente 6 veces en t1/2; y aumento de aproximadamente 5 veces en la eliminación y ABC. Este resultado demuestra que el dominio D'D3 en el heterodímero FVIIIFc/VWF protege el resto de FVIII de algunas vías de eliminación, proporcionando así alguna de la protección normalmente proporcionada por VWF de longitud completa. Esta conclusión también se confirma en ratones HemA. Cuando se compara con rFVIIIFc en ratones HemA, rFVIII-155/VWF-031 ha mostrado t 1/2 más corta y menor ABC, que significa en esta configuración que los dominios D'D3 (VWF-031) previenen satisfactoriamente la unión de la proteína FVIII (rFVIII-155) a VWF endógeno, que tiene propiedades de prolongación de la semivida hasta cierto grado, así como una propiedad limitante de la semivida de FVIII. VWF de longitud completa tiene 250 kDa, y forma multímeros de forma que VWF endógeno puede tener hasta 2 MDa, y por tanto está de acuerdo con esta hipótesis de que la región D'D3 de VWF de 55 kDa no proporciona la misma protección normalmente proporcionada por el VWF endógeno mucho más grande en este contexto. Puesto que el fragmento de VWF previene que VWF endógeno se una a rFVIII-155/VWF-031, en esta construcción particular, la semivida disminuye en el ratón HemA. Por tanto, los resultados en la Tabla 12B indican que la molécula de rFVIII-155/VWF-031 es capaz de prevenir que el prolongador de la semivida de FVIII (VWF endógeno) se una a rFVIII-155/VWF-031. Sin embargo, el experimento muestra que el retirar el factor limitante de la semivida de FVIII ha abierto la posibilidad de prolongar una semivida de la proteína FVIII más allá de las 1,5 veces o 2 veces mostradas previamente. Cuando FVIII se combina con otros elementos de prolongación de la semivida como se muestra en la Figura 4, se podría conseguir un logro del techo de prolongación de la semivida de 2 veces de FVIII.

Tabla 12B. FC de FVIII-155/VWF-031 y FVIIIFc en ratones DKO FVIII/VWF

Ejemplo 12: Optimización del conector de D'D3-Fc del heterodímero FVIII/D'D3 (Figura 13)

Para permitir que rFVIIIFc escape de la vía de eliminación de VWF y elimine el techo de prolongación de la semivida de FVIII de 2 veces, el fragmento de D'D3 de VWF se ha incorporado en la molécula de rFVIIIFc (Figura 2), dando como resultado un heterodímero FVIIIFc/VWF. Para eliminar la interacción entre rFVIIIFc y VWF endógeno y maximizar el potencial de protección de D'D3 FVIII, se ajustó el conector entre el dominio D'D3 y la región Fc para permitir la óptima unión a FVIII/D'D3. Un conector más óptimo permitirá que el dominio D'D3 tenga mayor protección de FVIII que una construcción de conector menos óptima. Esto se puede probar por inyección hidrodinámica de las construcciones de ADN en ratones DKO FVIII/VWF. Una construcción más óptima dará mayor expresión de proteínas en estado estacionario del heterodímero FVI11 Fc/D'D3.

Se manipularon tres heterodímeros FVI11Fc/D'D3 diferentes (Figura 3, Ejemplo 3) para la selección óptima de conectores. Los posibles conectores entre los dominios D'D3 y la región Fc se enumeraron en la Tabla 13. Se administraron construcciones de ADN en ratones DKO FVIII/VWF por inyección hidrodinámica ("HDI") a 100 gg/ratón, y se recogieron muestras de plasma 48 h después de HDI. Se analizó la actividad de heterodímero FVIIIFc/D'D3 en circulación por un ensayo cromogénico de FVIII.

El resultado del estudio se mostró en la Figura 13. 48 horas después de HDI, se alcanzaron niveles de expresión similares por FVIII-064 y FVIII-159, que indica que el conector de 20 aa y el conector de 35 aa promueven nivel similar de interacción FVI I I/D'D3. Por otra parte, FVIII-160 mostró expresión significativamente más alta que FVIII-064, que significa que el conector de 48 aa permite mejor unión a FVIII/D'D3 en comparación con los conectores de 20 aa y 35 aa.

Un conector óptimo entre el fragmento de VWF y la región Fc es uno de los elementos clave del heterodímero FVIIIFc/VWF. Encontrar el mejor conector permitirá la interacción óptima entre FVIII y el fragmento de VWF, prevendrá la unión de FVIII a VWF endógeno, permitirá que FVIII escape de la vía de eliminación de VWF, y prolongará la semivida de FVIII más allá de la semivida de VWF en plasma.

Tabla 13: Diferentes conectores entre D'D3 y fragmento Fc

Ejemplo 13: Estabilidad de FVIII de cadena sencilla

La proteína FVIII de cadena sencilla podría ser más estable que su isoforma de cadena dual. Para probar esta hipótesis, se hicieron dos construcciones de ADN: FVIII-136 (FVIIIFc procesable con el dominio D'D3) y FVIII-148 (FVIIIFc de cadena sencilla (SC) con el dominio D'D3, que contiene la mutación R1645A/R1648A para prevenir la escisión entre la cadena pesada y cadena ligera de FVIII).

Se administraron ambos plásmidos en ratones DKO FVIII/VWF por inyección hidrodinámica. Se recogieron muestras de plasma 24 h y 48 h después de las inyecciones para medir el nivel de expresión de las dos isoformas de FVIIIFc/D'D3. Como se muestra en la Figura 14, en ambos puntos de tiempo, se observó una tendencia de mejor expresión por la construcción de SC-FVIIIFc/D'D3 (FVIII-148) (p=0,12, p=0,19), indicando que FVIII de cadena sencilla podría ser más estable o expresarse mejor que su isoforma de cadena doble (FVI11-136). El perfil FC de las dos isoformas de FVIII y se investigarán adicionalmente sus niveles de expresión en cultivo celular. La isoforma de FVIII de cadena sencilla podría ser posiblemente usada para sustituir la isoforma de cadena doble convencional para lograr mejor producción de proteínas y mejor semivida de FVIII in vivo.

Ejemplo 14. PEGilación

Se pueden unir una o más moléculas de polietilenglicol (PEG) dentro de cualquier región de la proteína FVIII, el fragmento de VWF, o ambos. Como FVIII no tiene una cisteína libre en su superficie basándose en la estructura cristalina (PDB:2R7E, Shen et al., Blood 111:1240 (2008); PDB:3CDZ, Ngo, Structure, 16:597-606 (2008)), un enfoque es insertar un péptido que contiene cisteína (por ejemplo, GGGSGCGGGS) (SEQ ID NO: 107) en o asociarlo a la proteína FVIII, el fragmento de VWF, o ambos. Las moléculas de PEG que contienen maleimida se pueden conjugar entonces específicamente con la cisteína introducida sobre la proteína FVIII recombinante. Brevemente, la proteína FVIII recombinante que contiene la inserción de Cys se puede construir por tecnología molecular convencional, y la proteína FVIII recombinante expresada en el sistema de expresión en mamífero (por ejemplo, células HEK293, c Ho , BHK21, PER.C6, y CAP) se puede purificar por cromatografía de afinidad y de intercambio iónico. La proteína FVIII recombinante purificada se reduce por Tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) para exponer el grupo tiol de la cisteína introducida y luego reacciona con maleimida-PEG. La proteína FVIII recombinante resultante se prueba para actividad procoagulante y semivida prolongada.

PEG se une a al menos una de las localizaciones desveladas en la solicitud de EE. UU. N° 61/670.553, u otros sitios de inserción adecuados. La actividad de FVIII de la proteína FVIII recombinante PEGilada se analiza usando un ensayo cromogénico de FVIII. La FC de la proteína FVIII recombinante PEGilada se analiza en ratones HemA y ratones DKO FVIII-VWF como se ha descrito anteriormente.

Ejemplo 15: Estabilidad de FVIII en plasma de HemA y de inactivación doble (DKO) de FVIII/VWF Se probó la estabilidad en plasma de diferentes fusiones de FVIIIFc en plasma de HemA o de inactivación doble (DKO) de FVIII/VWF. Para el ensayo de estabilidad, se incubaron 5 UI/mL de diversas proteínas FVIIIFc con o HemA de ratón o plasma DKO a 37 °C. Se recogieron las alícuotas en diferentes puntos de tiempo para medir la actividad por ensayo cromogénico de FVIII. Se midió la actividad en cada punto de tiempo por duplicado y se representó la actividad promedio en función del tiempo.

Para el ensayo de inmunoprecipitación de FVIIIFc, se incubaron 5 gg de FVIIIFc con o 250 gl de PBS o plasma de ratón DKO durante 24 horas a 37 °C. Se inmunoprecipitó FVIIIFc añadiendo 5 gg anticuerpo policlonal de oveja anti-FVIII (ab61370) durante 1 h a temperatura ambiente y 100 gl de perlas de proteína A. Después de 4x lavados de 1 mL de PBS, las perlas se resuspendieron en 50 gl de 1x tampón reductor de SDS-PAGE. Después de hervir, se cargaron 20 gl de muestra (es decir,- 1 gg de FVIIIFc) sobre 4-15 % de gel sin tinción Bio-Rad. Se obtuvieron imágenes de gel por el sistema Bio-rad, seguido por análisis western con anticuerpo anti-cadena pesada de FVIII (GMA012).

La actividad de FVIIIFc (molécula de FVIII de cadena doble, que tiene cadenas pesadas y ligeras de FVIII separadas, mantenidas juntas por interacciones no covalentes) disminuye con el tiempo en tanto plasma de HemA como de DKO (Figura 18A). Debido a la ausencia de protección mediada por VWF, la pérdida en la actividad de FVIIIFc fue más pronunciada en plasma de DKO. Esta pérdida en la actividad de FVIII fue principalmente debida a la disociación o degradación de la cadena pesada de FVIII (HC). Se observó una reducción de aproximadamente 75 % de reducción en cadena pesada de FVIIIFc después de una incubación de 24 h en plasma de DKO (Figura 18B). No se observó reducción significativa ni para la cadena ligera (LC) (datos no mostrados) ni FVIIIFc no procesado/de cadena sencilla (es decir, molécula FVIII en la que la cadena ligera y cadena pesada se mantiene todavía juntas covalentemente- banda superior en la imagen de gel) (Figura 18B).

Como VWF se propone para aumentar la estabilidad de FVIII in vivo, los presentes inventores probaron si la proteína quimérica - heterodímero FVIII-VWF (FVIII155:VWF31, que tiene D'D3 de VWF covalentemente unido a FVIII mediante Fc) era más estable en plasma de HemA y DKO. A partir de los datos de estabilidad en plasma mostrados en la Figura 19, la presencia de D'D3 aumentó la estabilidad de FVIIIFc, tanto en plasma de HemA como de DKO. Se usó FVIIIFc de cadena sencilla sin D'D3 como control en estos experimentos (SCFVIII). A partir de la Figura 19, el FVIII de cadena sencilla era más estable que FVIIIFc de cadena doble; sin embargo, la presencia de D'D3 aumentó significativamente más la estabilidad en plasma de la molécula de FVIIIFc de cadena sencilla. Esto sugiere que D'D3 estabiliza FVIII, no solo manteniendo la cadena pesada y ligera juntas, sino también mediante algunos otros mecanismos desconocidos.

Ejemplo 16: Uso de furina/PACE para procesamiento de VWF

VWF es una proteína única en el sentido de que contiene un pro-péptido muy grande (es decir, dominio D1D2 de VWF, -85 kDa). El pro-péptido de VWF sirve de chaperona interna para el apropiado plegamiento de la molécula de VWF. Se probaron dos enzimas para el procesamiento de VWF - PC5 y furina (PACE). Se co-transfectó transitoriamente la construcción de VWF031 (D1D2D'D3Fc) en células HEK293 con diversas concentraciones de o PC5 o PACE. Después de cuatro días, se recogió el medio de cultivo de tejido y se sometió a captura de proteína A. Incluso a una concentración más baja (2,5 %), la furina (PACE) fue más eficiente que 10 % de PC5, en eliminar el pro-péptido (D1D2) de D'D3Fc (Figura 20). La retirada de D1D2 es importante, ya que la presencia de D1D2 participa en la prevención de la interacción de D'D3 con FVIII.

Ejemplo 17: El fragmento de VWF en heterodímero FVIII-VWF previene la interacción de FVIII con VWF de longitud completa

Se usó un instrumento Octet de ForteBio para probar que la construcción de FVIII el heterodímero 155/VWF31 se une a VWF de longitud completa (Figura 21A). Para el ensayo de unión, se capturó VWF de longitud completa usando sensor de APS, seguido por el bloqueo con 1 % de BSA. Después del bloqueo, se probaron diferentes construcciones de FVIII para la unión de VWF. Como se predice, se unieron fuertemente FVIII no mutante y FVIIIFc a los sensores de VWF. FVIII Y1680F mutante, que se conoce por tener baja o ninguna afinidad por VWF, mostró unión de VWF significativamente reducida. El heterodímero FVI11155/VWF31 no se unió en absoluto a VWF de longitud completa, confirmando la protección de FVIII con D'D3 en el heterodímero FVIII-VWF.

Se realizó el mismo experimento en orientación inversa para determinar si la porción de D'D3 en el heterodímero FVIII-VWF podía interaccionar con otras moléculas de FVIII no covalentemente unidas a D'D3. Como se muestra en la Figura 21B, la construcción de VWF31 (D'D3Fc) sola, cuando se inmoviliza sobre el sensor de proteína G, se puede unir fuertemente a FVIII, sin embargo D'D3 en el heterodímero FVI II155 :VWF31 no mostró ninguna unión a FVIII. Se usó la proteína G sola con FVIII como control. Estos experimentos de unión confirmaron que D'D3 en el heterodímero puede interaccionar con solo una molécula de FVIII que se une covalentemente a ella y previene que FVIII interaccione con moléculas de VWF no mutante de longitud completa.

Para determinar la afinidad de unión exacta de VWF D'D3 por la molécula de FVIII, se realizaron experimentos de resonancia plasmática superficial con VWF031 (Figura 22). Se capturó la construcción VWF031 (D'D3Fc) usando IgG anti-humana y se pasó FVIII de dominio B delecionado sobre chip que contenía D'D3Fc. Se observó una K^dde aproximadamente 10 nM para FVIII. Esta afinidad es aproximadamente 25 veces más baja en comparación con la molécula de VWF no mutante de longitud completa y es similar a lo que se informa previamente en la bibliografía. Ejemplo 18: Efecto de la diferente longitud de conector entre D'D3 y Fc sobre la actividad de heterodímero y FC

Para comprobar si variar la longitud de conector escindible de trombina entre D'D3 y Fc tiene algún efecto sobre la FC y actividad del heterodímero FVIII-VWF, se co-expresaron diferentes construcciones de VWF junto con FVIII 155. Se probaron tres construcciones de longitudes de conector diferentes enumeradas en la Tabla 14A (VWF031, VWF035 y VWF036). Se mezcló cada plásmido con el plásmido FVIII155 (Ejemplo 5) y se transfectó en células HEK293. El día cuatro después de la transfección, se recogió el medio de cultivo celular y se concentró hasta 10 UI/mL de actividad cromogénica de FVIII.

Entonces se administró medio concentrado de células en ratones DKO FVIII/VWF de 8-12 semanas de edad a 100 UI/10 mL/kg de dosis. Se recogieron muestras de plasma a los 5 min, 8 h, 16 h, 24 h, 32 h y 48 h después de la dosis. Se analizó la actividad de FVIII de las muestras de plasma por ensayo cromogénico de FVIII y se calculó la semivida usando el programa WinNonlin-Phoenix.

Como se muestra en la Figura 23, cuando la longitud de conector entre D'D3 y el fragmento Fc aumentó desde 48 aa hasta 73 aa o 98 aa, la semivida del heterodímero FVIIIFc/VWF correspondiente aumentó y alcanzó 12,2 h y 13,3 h respectivamente. Esto representa un aumento de 1,5 a 1,6 veces con respecto a la varíate de 48 aa de longitud. Hasta la fecha, el conector de 98 aa es el conector más óptimo para utilizar la actividad de protección de FVIII del fragmento D'D3, y se incorporará en el heterodímero FVIIIFc/VWF para mejorar más su semivida.

Para comparar el efecto del conector sobre la actividad de FVIII, se realizaron ensayo cromogénico de FVIII y de aPTT en medio de cultivo de tejido de células que expresan diferentes heterodímeros FVIII-VWF. Aunque la actividad de aPTT era 2 veces reducida en comparación con la actividad cromogénica para construcciones heterodímeras, no se observó diferencia significativa entre diversos conectores, excepto cuando el conector también contenía un sitio PAR1 próximo al sitio de trombina (Tabla 14B).

Tabla 14A. Secuencia de conector variable entre VWF D'D3 y Fc

Tabla 14B: Actividad de heterodímero con diferente longitud de conector

Ejemplo 19: Unión de FVIII con fragmento de VWF usando enzima sortasa

En otro aspecto, un fragmento de VWF (por ejemplo D1 D2D'D3 o dominio D'D3) se une a FVIII usando el método de unión de proteínas in vitro mediado por sortasa. En un ejemplo, se introdujo el motivo de reconocimiento de sortasa A (LPXTG) de Staphylococcus aureus en el extremo C del fragmento de VWF y resto Gly(n) en el extremo N de FVIII (donde el número de restos de glicina es variable). La molécula de FVIII usada pueden ser o de cadena sencilla o de cadena doble. La reacción de trans-peptidación catalizada por sortasa unirá covalentemente el fragmento de VWF a FVIII. También se pueden usar la orientación inversa del motivo de reconocimiento para unir estas dos proteínas, donde los presentes inventores tienen FVIII en el extremo N con motivo LPXTG y fragmento de VWF en el extremo C con Gly(n) (véase la Figura 24- ejemplo de unión de sortasa para referencia). El motivo LPXTG y los restos de glicina se pueden sustituir con otras secuencias de reconocimiento de sortasa.

También se preparó el fragmento de VWF que contiene la proteína de fusión de secuencia de reconocimiento de sortasa A-Fc. Para construcciones de fusión de Fc, se fusionó el fragmento D1 D2D'D3 de VWF con la región Fc de IgG mediante un conector GS que contenía una secuencia de reconocimiento de sortasa y un sitio de escisión de trombina (Tabla 15 y 16). Una vez se expresa y purifica la proteína en columna de proteína A, la región Fc se pueden retirar por escisión de trombina. El fragmento de VWF resultante con el sitio de reconocimiento de sortasa A se puede usar entonces para la ligación con molécula de FVIII (Figura 24 - Ejemplo de unión de sortasa para referencia - fila E).

pSYN-VWF-051 tiene un conector de 54 aminoácidos con sortasa y sitio de trombina entre el fragmento de VWF y la región Fc. Se encargó la síntesis de fragmento de ADN que codifica el conector de 54 aminoácidos (ISGGGGSGGG GSGGGGSGGG GSGGGGSGGG GSLPETGALR PRVVGGGGSG GGGS) (SEQ ID NO: 98) y una porción de la región Fc (Secuencia de Genewiz N° 10-210746313, mostrada a continuación). Se subclonó un fragmento de la construcción de Genewiz en pSYN-VWF-031 digerido con EcoRV/RsRII.

Secuencia de Genewiz N1210-210746313 (SEQ ID NO: 99)

AGGAGCCGATATCTGGCGGTGGAGGTTCCGGTGGCGGGGGATCCGGCGGTGGAGGTTCCGGCG

GTGGAGGTTCCGGTGGCGGGGGATCCGGTGGCGGGGGATCCTTACCTGAAACTGGAGCCCTGCGGCCCC

GGGTCGTCGGCGGTGGAGGTTCCGGTGGCGGGGGATCCGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAG

CTCCAGAACTCCTGGGCGGACCGTCAGTCTT

La secuencia de pentaglicina de extremo N que contiene FVIII de cadena sencilla se muestra en la Tabla 17 y 18.

Tabla 15: Secuencia de nucleótidos de pSYN-VWF051 (D1 D2D’D3Fc de VWF con motivo de reconocimiento de sortasa A y conector escindible por trombina entre el fragmento de VWF y Fc) (SEQ ID NO: 100)

1 ATGATTCCTG CCAGATTTGC CGGGGTGCTG CTTGCTCTGGCCCTCATTTT

51 GCCAGGGACC CTTTGTGCAG AAGGAACTCG CGGCAGGTCATCCACGGCCC

101 GATGCAGCCT TTTCGGAAGT GACTTCGTCA ACACCTTTGATGGGAGCATG

151 TACAGCTTTG CGGGATACTG CAGTTACCTC CTGGCAGGGGGCTGCCAGAA

201 ACGCTCCTTC TCGATTATTG GGGACTTCCA GAATGGCAAGAGAGTGAGCC

251 TCTCCGTGTA TCTTGGGGAA TTTTTTGACA TCCATTTGTTTGTCAATGGT

301 ACCGTGACAC AGGGGGACCA AAGAGTCTCC ATGCCCTATGCCTCCAAAGG

351 GCTGTATCTA GAAACTGAGG CTGGGTACTA CAAGCTGTCCGGTGAGGCCT

401 ATGGCTTTGT GGCCAGGATC GATGGCAGCG GCAACTTTCAAGTCCTGCTG

451 TCA.GACAGATACTTCAACAA GACCTGCGGG CTGTGTGGCAACTTTAACAT

501 CTTTGCTGAA GATGACTTTA TGACCCAAGA AGGGACCTTGACCTCGGACC

551 CTTATGACTT TGCCAACTCA TGGGCTCTGA GCAGTGGAGAACAGTGGTGT

601 GAACGGGCAT CTCCTCCCAG CAGCTCATGC AACATCTCCTCTGGGGAAAT

651 GCAGAAGGGC CTGTGGGAGC AGTGCCAGCT TCTGAAGAGC ACCTCGGTGT 701 TTGCCCGCTG CCACCCTCTG GTGGACCCCG AGCCTTTTGT GGCCCTGTGT 751 GAGAAGACTT TGTGTGAGTG TGCTGGGGGG CTGGAGTGGG CCTGGCCTGC 801 CCTCCTGGAG TACGCCCGGA CCTGTGCCCA GGAGGGAATG GTGCTGTACG 851 GCTGGACCGA CCACAGCGCG TGCAGCCCAG TGTGCCCTGC TGGTATGGAG 901 TATAGGCAGT GTGTGTCCCC TTGCGCCAGG ACCTGCCAGA GCCTGCACAT 951 CAATGAAATG TGTCAGGAGC GATGCGTGGA TGGCTGCAGC TGCCCTGAGG 1001 GACAGCTCCT GGATGAAGGC CTCTGCGTGG AGAGCACCGA GTGTCCCTGC 1051 GTGCATTCCG GAAAGCGCTA CCCTCCCGGC ACCTCCCTCT CTCGAGACTG 1101 CAACACCTGC ATTTGCCGAA ACAGCCAGTG GATCTGCAGC AATGAAGAAT 1151 GTCCAGGGGA GTGCCTTGTC ACTGGGCAAT CCCACTTCAA GAGCTTTGAC 1201 AACAGATACT TCACCTTCAG TGGGAGCTGC CAGTACCTGC TGGCCCGGGA 1251 TTGCCAGGAC CACTCCTTCT CCATTGTCAT TGAGACTGTC CAGTGTGCTG 1301 ATGACCGCGA CGCTGTGTGC ACCCGCTCCG TCACCGTCCG GCTGCCTGGC 1351 CTGCACAACA GCCTTGTGAA ACTGAAGCAT GGGGCAGGAG TTGCCATGGA 1401 TGGCCAGGAC ATCCAGCTCC CCCTCCTGAA AGGTGACCTC CGCATCCAGC 1451 ATACAGTGAC GGCCTCCGTG CGCCTCAGCT ACGGGGAGGA CCTGCAGATG 1501 GACTGGGATG GCCGCGGGAG GCTGCGGGTG AAGCTGTCCC CCGTCTATGC 1551 CGGGAAGACC TGCGGCCTGT GTGGGAATTA CAATGGCAAC CAGGGCGACG 1601 ACTTCCTTAC CCCCTCTGGG CTGGCGGAGC CCCGGGTGGA GGACTTCGGG 1651 AACGCCTGGA AGCTGCACGG GGACTGCCAG GACCTGCAGA AGCAGCACAG 1701 CGATCCCTGC GCCCTCAACC CGCGCATGAC CAGGTTCTCC GAGGAGGCGT 1751 GCGCGGTCCT GACGTCCCCC ACATTCGAGG CCTGCCATCG TGCCGTCAGC 1801 CCGCTGCCCT ACCTGCGGAA CTGCCGCTAC GACGTGTGCT CCTGCTCGGA 1851 CGGCCGCGAG TGCCTGTGCG GCGCCCTGGC CAGCTATGCC GCGGCCTGCG 1901 CGGGGAGAGG CGTGCGCGTC GCGTGGCGCG AGCCAGGCCG CTGTGAGCTG 1951 AACTGCCCGA AAGGCCAGGT GTACCGGCAG TGCGGGACCC CCTGCAACCT 2001 GACCTGCCGC TCTCTCTCTT ACCCGGATGA GGAATGCAAT GAGGCCTGCC 2051 TGGAGGGCTG CTTCTGCCCC CCAGGGCTCT ACATGGATGA GAGGGGGGAC 2101 TGCGTGCCCA AGGCCCAGTG CCCCTGTTAC TATGACGGTG AGATCTTCCA 2151 GCCAGAAGAC ATCTTCTCAG ACCATCACAC CATGTGCTAC TGTGAGGATG 2201 GCTTCATGCA CTGTACCATG AGTGGAGTCC CCGGAAGCTT GCTGCCTGAC 2251 GCTGTCCTCA GCAGTCCCCT GTCTCATCGC AGCAAAAGGA GCCTATCCTG 2301 TCGGCCCCCC ATGGTCAAGC TGGTG-GTCC CGCTGACAAC CTGCGGGCTG 2351 AAGGGCTCGA GTGTACCAAA ACGTGCCAGA ACTATGACCT GGAGTGCATG 2401 AGCATGGGCT GTGTCTCTGG CTGCCGCTGC CCCCCGGGCA TGGTCCGGCA 2451 TGAGAACAGA TGTGTGGCCC TGGAAAGGTG TCCCTGCTTC CATCAGGGCA 2501 AGGAGTATGC CCCTGGAGAA ACAGTGAAGA TTGGCTGCAA CACTTGTGTC 2551 TGTCGGGACC GGAAGTGGAA CTGCACAGAC CATGTGTGTG ATGCCACGTG 2601 CTCCACGATC GGCATGGCCC ACTACCTCAC CTTCGACGGG CTCAAATACC 2651 TGTTCCCCGG GGAGTGCCAG TACGTGCTGG TGCAGGATTA CTGCGGCAGT 2701 AACCCTGGGA CCTTTCGGAT CCTAGGGGGG AATAAGGGAT GCAGCCACCC 2751 CTCAGTGAAA TGCAAGAAAC GGGTCACCAT CCTGGTGGAG GGAGGAGAGA 2801 TTGAGCTGTT TGACGGGGAG GTGAAGGTGA AGAGGCCCAT GAAGGATGAG 2851 ACTCACTTTG AGGTGGTGGA GTCTGGCCGG TACATCATTC TGCTGCTGGG 2901 CAAAGCCCTC TCCGTGGTCT GGGACCGCCA CCTGAGCATC TCCGTGGTCC 2951 TGAAGCAGAC ATACCAGGAG AAAGTGTGTG GCCTGTGTGG GAATTTTGAT 3001 GGCATCCAGA ACAATGACCT CACCAGCAGC AACCTCCAAG TGGAGGAAGA 3051 CCCTGTGGAC TTTGGGAACT CCTGGAAAGT GAGCTCGCAG TGTGCTGACA 3101 CCAGAAAAGT GCCTCTGGAC TCATCCCCTG CCACCTGCCA TAACAACATC 3151 ATGAAGCAGA CGATGGTGGA TTCCTCCTGT AGAATCCTTA CCAGTGACGT 3201 CTTCCAGGAC TGCAACAAGC TGGTGGACCC CGAGCCATAT CTGGATGTCT 3251 GCATTTACGA CACCTGCTCC TGTGAGTCCA TTGGGGACTG CGCCGCATTC 3301 TGCGACACCA TTGCTGCCTA TGCCCACGTG TGTGCCCAGC ATGGCAAGGT 3351 GGTGACCTGG AGGACGGCCA CATTGGGCCC CCAGAGCTGC GAGGAGAGGA 3401 ATCTCCGGGA GAACGGGTAT GAGGCGGAGT GGCGCTATAA CAGCTGTGCA 3451 CCTGCCTGTC AAGTCACGTG TCAGCACCCT GAGCCACTGG CCTGCCCTGT 3501 GCAGTGTGTG GAGGGCTGCC ATGCCCACTG CCCTCCAGGG AAAATCCTGG 3551 ATGAGCTTTT GCAGACCTGC GTTGACCCTG AAGACTGTCC AGTGTGTGAG

3601 GTGGCTGGCC GGCGTTTTGC CTCAGGAAAG AAAGTCACCT TGAATCCCAG

3651 TGACCCTGAG CACTGCCAGA TTTGCCACTG TGATGTTGTC AACCTCACCT

3701 GTGAAGCCTG CCAGGAGCCG ATATCTGGCG GTGGAGGTTC CGGTGGCGGG

3751 GGATCCGGCG GTGGAGGTTC CGGCGGTGGA GGTTCCGGTG GCGGGGGATC

3801 CGGTGGCGGG GGATCCTTAC CTGAAACTGG AGCCCTGCGG CCCCGGGTCG

3851 TCGGCGGTGG AGGTTCCGGT GGCGGGGGAT CCGACAAAAC TCACACATGC

3901 CCACCGTGCC CAGCTCCAGA ACTCCTGGGC GGACCGTCAG TCTTCCTCTT

3951 CCCCCCAAAA CCCAAGGACA CCCTCATGAT CTCCCGGACC CCTGAGGTCA

4001 CATGCGTGGT GGTGGACGTG AGCCACGAAG ACCCTGAGGT CAAGTTCAAC

4051 TGGTACGTGG ACGGCGTGGA GGTGCATAAT GCCAAGACAA AGCCGCGGGA

4101 GGAGCAGTAC AACAGCACGT ACCGTGTGGT CAGCGTCCTC ACCGTCCTGC

4151 ACCAGGACTG GCTGAATGGC AAGGAGTACA AGTGCAAGGT CTCCAACAAA

4201 GCCCTCCCAG CCCCCATCGA GAAAACCATC TCCAAAGCCA AAGGGCAGCC

4251 CCGAGAACCA CAGGTGTACA CCCTGCCCCC ATCCCGGGAT GAGCTGACCA

4301 AGAACCAGGT CAGCCTGACC TGCCTGGTCA AAGGCTTCTA TCCCAGCGAC

4351 ATCGCCGTGG AGTGGGAGAG CAATGGGCAG CCGGAGAACA ACTACAAGAC

4401 CACGCCTCCC GTGTTGGACT CCGACGGCTC CTTCTTCCTC TACAGCAAGC

4451 TCACCGTGGA CAAGAGCAGG TGGCAGCAGG GGAACGTCTT CTCATGCTCC

4501 GTGATGCATG AGGCTCTGCA CAACCACTAC ACGCAGAAGA GCCTCTCCCT

4551 GTCTCCGGGT AAATGA

Tabla 16: Secuencia de proteínas de VWF051 (D1 D2D’D3Fc de VWF con motivo de reconocimiento de sortasa A y conector escindible por trombina entre el fragmento de VWF y Fc; el sitio de sortasa A mostrado en negrita)

(SEQ ID NO: 101)

i MIPARFAGVL LñLALILPGT LCAEGTRGRS STARCSLFGS DFVNTFDGSM

51 YSFAGYCSYL LAGGCQKRSF SIIGDFQNGK RVSLSVYLGE FFDIHLFVNG

101 TVTQGDQRVS MPYASKGLYL ETEAGYYKLS GEAYGFVARI DGSGNFQVLL

151 SDRYFNKTCG LCGNFNIFAE DDFMTQEGTL TSDPYDFANS WALSSGEQWC

201 ERASPPSSSC NISSGEMQKG LWEQCQLLKS TSVFARCHPL VDPEPFVALC

251 EKTLCECAGG LECACPALLE YARTCAQEGM VLYGWTDHSA CSPVCPAGME

301 YRQCVSPCAR TCQSLHINEM CQERCVDGCS CPEGQLLDEG LCVESTECPC

351 VHSGKRYPPG TSLSRDCNTC ICRNSQWICS NEECPGECLV TGQSHFKSFD

401 NRYFTFSGIC QYLLARDCQD HSFSIVIETV QCADDRDAVC TRSVTVRLPG

451 LHNSLVKLKH GAGVAMDGQD IQLPLLKGDL RIQHTVTASV RLSYGEDLQM

501 DWDGRGRLLV KLSPVYAGKT CGLCGNYNGN QGDDFLTPSG LAEPRVEDFG

551 NAWKLHGDCQ DLQKQHSDPC ALNPRMTRFS EEACAVLTSP TFEACHRAVS

601 PLPYLRNCRY DVCSCSDGRE CLCGALASYA AACAGRGVRV AWREPGRCEL

651 NCPKGQVYLQ CGTPCNLTCR SLSYPDEECN EACLEGCFCP PGLYMDERGD

701 CVPKAQCPCY YDGEIFQPED IFSDHHTMCY CEDGFMHCTM SGVPGSLLPD

751 AVLSSPLSHR SKRSLSCRPP MVKLVCPADN LRAEGLECTK TCQWYDLECM

801 SMGCVSGCLC PPGMVRHENR CVALERCPCF HQGKEYAPGE TVKIGCNTCV

851 CRDRKWNCTD HVCDATCSTI GMAHYLTFDG LKYLFPGECQ YVLVQDYCGS

901 NPGTFRILVG NKGCSHPSVK CKKRVTILVE GGEIELFDGE VNVKRPMKDE

951 THFEWESGR YIILLLGKAL SVWDRHLSI SWLKQTYQE KVCGLCGNFD

1001 GIQNNDLTSS NLQVEEDPVD FGNSWKVSSQ CADTRKVPLD SSPATCHNNI

1051 MKQTMVDSSC RILTSDVFQD CNKLVDPEPY LDVCIYDTCS CESIGDCAAF

1101 CDTIAAYAHV CAQHGKWTW RTATLCPQSC EERNLRENGY EAEWRYNSCA

1151 PACQVTCQHP EPLACPVQCV EGCHAHCPPG KILDELLQTC VDPEDCPVCE

1201 VAGRRFASGK KVTLNPSDPE HCQICHCDW NLTCEACQEP ISGGGGSGGG

1251 G3GGGGSGGG GSGGGGSGGG GSLPETGALR PRWGGGGSG GGGSDKTHTC

1301 PPCPAPELLG GPSVFLFPPK PKDTLMISRT PEVTCWVDV SHEDPEVKFN

1351 WYVDGVEVHN AKTKPREEQY NSTYRWSVL TVLHQDWLNG KEYKCKVSNK

1401 ALPAPIEKTI SKAKGQPREP QVYTLPPSRD ELTKNQVSLT CLVKGFYPSD

1451 IAVEWESNGQ PENNYKTTPP VLDSDGSFFL YSKLTVDKSR WQQGNVFSCS

1501 VMHEALHNHY TQKSLSLSPG K*

Tabla 17: Secuencia de nucleótidos de FVIII 265 (molécula de cadena sencilla de FVIII con pentaglicinas en el extremo N) (SEQ ID NO: 102)

i ATGCAAATAG AGCTCTCCAC CTGCTTCTTT CTGTGCCTTT TGCGATTCTG

51 CTTTAGTGGA GGAGGAGGAG GAGCCACCAG AAGATACTAC CTGGGTGCAG

101 TGGAACTGTC AGGGGACTAT ATGCAAAGTG ATCTCGGTGA GCTGCCTGTG

151 GACGCAAGAT TTCCTCCTAG AGTGCCAAAA TCTTTTCCAT TCAACACCTC

201 AGTCGTGTAC AAAAAGACTC TGTTTGTAGA ATTCACGGAT CACCTTTTCA

251 ACATCGCTAA GCCAAGGCCA CCCTGGATGG GTCTGCTAGG TCCTACCATC

301 CAGGCTGAGG TGTATGATAC AGTGGTCATT ACACTTAAGA ACATGGCTTC

351 CCATCCTGTC AGTCTTCATC- CTGTTGGTGT ATCCTACTGG AAAGCTTCTG

401 AGGGAGCTGA AGATGATGAT CAGACCAGTC AAAGGGAGAA AGAAGATGAT

451 AAAGTCTTCC CGGGTGGAAC- CCATACATAT GTCTGGCAGG TCCTGAAAGA

501 GAATGGTCCA AGGGCCTCTC- ACCCACTGTG CCTTACCTAC TCATATCTTT

551 CTCATGTGGA CCTGGTAAAA GACTTGAATT CAGGCCTCAT TGGAGCCCTA

601 CTAGTATGTA GAGAAGGGAG TCTGGCCAAG GAAAAGACAC AGACCTTGCA

651 CAAATTTATA CGACTTTTTC- CTGTATTTGA TGAAGGGAAA AGTTGGCACT

701 CAGAAACAAA GAACTCCTTC- ATGCAGGATA GGGATGCTGC ATCTGCTCGG

751 GCCTGGCCTA AAATGCACAC AGTCAATGGT TATGTAAACA GGTCTCTGCC

801 AGGTCTGATT GGATGCCACA GGAAATCAGT CTATTGGCAT GTGATTGGAA

851 TGGGCACCAC TCCTGAAGTG CACTCAATAT TCCTCGAAGG TCACACATTT

901 CTTGTGAGGA ACCATCGCCA GGCGTCCTTG GAAATCTCGC CAATAACTTT

951 CCTTACTGCT CAAACACTCT TGATGGACCT TGGACAGTTT CTACTGTTTT

1001 GTCATATCTC TGCCCACCAA CATGATGGCA TGGAAGCTTA TGTCAAAGTA

1051 GACAGCTGTC CAGAGGAACC CCAACTACGA ATGAAAAATA ATGAAGAAGC

1101 GGAAGACTAT GATGATGATC TTACTGATTC TGAAATGGAT GTGGTCAGGT

1151 TTGATGATGA CAACTCTCCT TCCTTTATCC AAATTCGCTC AGTTGCCAAG

1201 AAGCATCCTA AAACTTGGGT ACATTACATT GCTGCTGAAG AGGAGGACTG

1251 GGACTATGCT CCCTTAGTCC TCGCCCCCGA TGACAGAAGT TATAAAAGTC

1301 AATATTTGAA CAATGGCCCT CAGCGGATTG GTAGGAAGTA CAAAAAAGTC

1351 CGATTTATGG CATACACAGA TGAAACCl'TT AAGACTCGTG AAGCTATTCA

1401 GCATGAATCA GGAATCTTGG GACCTTTACT TTATGGGGAA GTTGGAGACA

1451 CACTGTTGAT TATATTTAAG AATCAAGCAA GCAGACCATA TAACATCTAC

1501 CCTCACGGAA TCACTGATGT CCGTCCTTTG TATTCAAGGA GATTACCAAA

1551 AGGTGTAAAA CATTTGAAGG ATTTTCCAAT TCTGCCAGGA GAAATATTCA

1601 AATATAAATG GACAGTGACT GTAGAAGATG GGCCAACTAA ATCAGATCCT

1651 CGGTGCCTGA CCCGCTATTA CTCTAGTTTC GTTAATATGG AGAGAGATCT

1701 AGCTTCAGGA CGCATTGGCC CTCTCCTCAT CTGCTACAAA GAATCTGTAG

1751 ATCAAAGAGG AAACCAGATA ATGTCAGACA AGAGGAATGT CATCCTGTTT

1801 TCTGTATTTG AGGAGAACCG AAGCTGGTAC CTCACAGAGA ATATACAACG

1851 CTTTCTCCCC AATCCAGCTG GAGTGCAGCT TGAGGATCCA GAGTTCCAAG

1901 CCTCCAACAT CATGCACAGC ATCAATGGCT ATGTTTTTGA TAGTTTGCAG

1951 TTGTCAGTTT GGTTGCATGA GGTGGCATAC TGGTACATTC TAAGCATTGG

2001 AGCACAGACT GACTTCCTTT CTGTCTTCTT CTCTGGATAT ACCTTCAAAC

2051 ACAAAATGGT CGATGAAGAC ACACTCACCC TATTCCCATT CTCAGGAGAA

2101 ACTGTCTTCA TGTCGATGGA AAACCCAGGT CTATGGATTC TGGGGTGCCA

2151 CAACTCACAC TGTCGGAACA CACCCATGAC CCCCTTACTC AAGGTTTCTA

2201 GTTGTGACAA GAACACTGGT GATTATTACG AGGACAGTTA TGAAGATATT

2251 TCAGCATACT TGCTGAGTAA AAACAATGCC ATTGAACCAA GAAGCTTCTC

2301 TCAAAACCCA CCAGTCTTGA AGGCCCATCA GGCCGAAATA ACTCGTACTA

2351 CTCTTCAGTC AGATCAAGAG GAAATTGACT ATGATGATAC CATATCAGTT

2401 GAAATGAAGA AGGAAGATTT TGACATTTAT GATGAGGATG AAAATCAGAG

2451 CCCCCGCAGC TGTCAAAAGA AAACACGACA CTATTTTATT GCTGCAGTGG

2501 AGAGGCTCTG GGATTATGGG ATGAGTAGCT CCCCACATGT TCTAAGAAAC

2551 AGGGCTCAGA GGGGCAGTGT CCCTCAGTTC AAGAAAGTTG TTTTCCAGGA

2601 ATTTACTGAT GGCTCCTTTA CTCAGCCCTT ATACCGTGGA GAACTAAATG

2651 AACATTTGGG CCTCCTCGGC CCATATATAA GAGCAGAAGT TGAAGATAAT

2701 ATCATGGTAA CGTTCAGAAA TCAGGCCTCT CGTCCCTATT CCTTCTATTC

2751 TAGCCTTATT TCTTATGAGG AAGATCAGAG GCAAGGAGCA GAACCTAGAA

2801 AAAACTTTGT CAAGCCTAAT GAAACCAAAA CTTACTTTTG GAAAGTGCAA

2851 CATCATATGG CACCCACTAA AGATGAGTTT GACTGCAAAG CCTGGGCTTA

2901 TTTCTCTGAT GTTGACCTGG AAAAAGATGT GCACTCAGGC CTGATTGGAC

2951 CCCTTCTGGT CTGCCACACT AACACACTGA ACCCTGCTCA TGGGAGACAA

3001 GTGACAGTAC AGGAATTTGC TCTGTTTTTC ACCATCTTTG ATGAGACCAA

3051 AAGCTGGTAC TTCACTGAAA ATATGGAAñG AAACTGCAGG GCTCCCTGCñ

3101 ATATCCAGAT GGAAGATCCC ACTTTTAAAG AGAATTATCG CTTCCATGCA

3151 ATCAATGGCT ACATAATGGA TACACTACCT GGCTTAGTAA TGGCTCAGGA

3201 TCAAAGGATT CGATGGTATC TGCTCAGCAT GGGCAGCAAT GAAAACATCC

3251 ATTCTATTCA TTTCAGTGGA CATGTGTTCA CTGTACGAAA AAAAGAGGAG

3301 TATAAAATGG CACTGTACAA TCTCTATCCA GGTGTTTTTG AGACAGTGGA

3351 AATGTTACCA TCCAAAGCTG GAATTTGGCG GGTGGAATGC CTTATTGGCG

3401 AGCATCTACA TGCTGGGATG AGCACACTTT TTCTGGTGTA CAGCAATAAG

3451 TGTCAGACTC CCCTGGGAAT GGCTTCTGGA CACATTAGAG ATTTTCAGAT

3501 TACAGCTTCA GGACAATATG GACAGTGGGC CCCAAAGCTG GCCAGACTTC

3551 ATTATTCCGG ATCAATCAAT GCCTGGAGCA CCAAGGAGCC CTTTTCTTGG

3601 ATCAAGGTGG ATCTGTTGGC ACCAATGATT ATTCACGGCA TCAAGACCCA

3651 GGGTGCCCGT CAGAAGTTCT CCAGCCTCTA CATCTCTCAG TTTATCATCA

3701 TGTATAGTCT TGATGGGAAG AAGTGGCAGA CTTATCGAGG AAATTCCACT

3751 GGAACCTTAA TGGTCTTCTT TGGCAATGTG GATTCATCTG GGATAAAACA

3801 CAATATTTTT AACCCTCCAA TTATTGCTCG ATACATCCGT TTGCACCCAA

3851 CTCATTATAG CATTCGCAGC ACTCTTCGCA TGGAGTTGAT GGGCTGTGAT

3901 TTAAATAGTT GCAGCATGCC ATTGGGAATG GAGAGTAAAG CAATATCAGA

3951 TGCACAGATT ACTGCTTCAT CCTACTTTAC CAATATGTTT GCCACCTGGT

4001 CTCCTTCAAA AGCTCGACTT CACCTCCAAG GGAGGAGTAA TGCCTGGAGA

4051 CCTCAGGTGA ATAATCCAAA AGAGTGGCTG CAAGTGGACT TCCAGAAGAC

4101 AATGAAAGTC ACAGGAGTAA CTACTCAGGG AGTAAAATCT CTGCTTACCA

4151 GCATGTATGT GAAGGAGTTC CTCATCTCCA GCAGTCAAGA TGGCCATCAG

4201 TGGACTCTCT TTTTTCAGAA TGGCAAAGTA AAGGTTTTTC AGGGAAATCA

4251 AGACTCCTTC ACACCTGTGG TGAACTCTCT AGACCCACCG TTACTGACTC

4301 GCTACCTTCG AATTCACCCC CAGAGTTGGG TGCACCAGAT TGCCCTGAGG

4351 ATGGAGGTTC TGGGCTGCGA GGCACAGGAC CTCTACTGA

Tabla 18: Secuencia de proteínas de FVIII 265 (molécula de cadena sencilla de FVIII con pentaglicinas en el extremo N; pentaglicina mostrada en negrita) (SEQ ID NO: 103)

l MQIELSTCFF LCLLRFCFSG GGGGATRRYY LGAVELSWDY MQSDLGELPV

51 DARFPPRVPK SFPFNTSWY KKTLFVEFTD HLFNIAKPRP PWMGLLGPTI

101 QAEVYDTWI TLKNMASHPV SLHAVGVSYW KASEGAEYDD QTSQREKEDD

151 KVFPGGSHTY VWQVLKENGP MASDPLCLTY SYLSHVDLVK DLNSGLIGAL

201 LVCREGSLAK EKTQTLHKFI LLFAVFDEGK SWHSEIKNSL MQDRDAASAR

251 AWPKMHTVNG YVNRSLPGLI GCHRKSVYWH VIGMGTTPEV HSIFLEGHTF

301 LVRNHRQASL EISPITFLTA QTLLMDLGQF LLFCHISSHQ HDGMEAYVKV

351 DSCPEEPQLR MKNNEEAEDY DDDLTDSEMD WRFDDDNSP SFIQIRSVAK

401 KHPKTWVHYI AAEEEDWDYA PLVLAPDDRS YKSQYLNNGP QRIGRKYKKV

451 RFMAYTDETF KTREAIQHES GILGPLLYGE VGDTLLIIFK NQASRPYNIY

501 PHGITDVRPL YSRRLPKGVK HLKDFPILPG EIFKYKWTVT VEDGPTKSDP

551 RCLTRYYSSF VNMERDLASG LIGPLLICYK ESVDQRGNQI MSDKRMVILF

601 SVFDENRSWY LTENIQRFLP NPAGVQLEDP EFQASNIMHS INGYVFDSLQ

651 LSVCLHEVAY WYILSIGAQT DFLSVFFSGY TFKHKMVYED TLTLFPFSGE

701 TVFMSMENPG LWILGCHNSD FRNRGMTALL KVSSCDKNTG DYYEDSYEDI

751 SAYLLSKNNA IEPRSFSQNP PVLKAHQAEI TRTTLQSDQE EIDYDDTISV

801 EMKKEDFDIY DEDENQSPRS FQKKTRHYFI AAVERLWDYG MSSSPHVLRN

851 RAQSGSVPQF KKWFQEFTD GSFTQPLYRG ELNEHLGLLG PYIRAEVEDN

901 IMVTFRNQAS RPYSFYSSLI SYEEDQRQGA EPRKNFVKPN ETKTYFWKVQ

951 HHMAPTKDEF DCKAWAYFSD VDLEKDVHSG LIGPLLVCHT NTLNPAHGRQ

1001 VTVQEFALFF TIFDETKSWY FTENMERNCR APCNIQMEDP TFKENYRFHA

1051 INGYIMDTLP GLVMAQDQRI RWYLLSMGSN ENIHSIHFSG HVFTVRKKEE

1101 YKMALYNLYP GVFETVEMLP SKAGIWRVEC LIGEHLHAGM STLFLVYSNK

1151 CQTPLGMASG HIRDFQITAS GQYGQWAPKL ARLHYSGSIN AWSTKEPFSW

1201 IKVDLLAPMI IHGIKTQGAR QKFSSLYISQ F1IMYSLDGK KWQTYRGNST

1251 GTLMVFFGNV DSSGIKHWIF NPPIIARYIR LHPTHYSIRS TLRMELMGCD

1301 LNSCSMPLGM ESKAISDAQI TASSYFTNMF ATWSPSKARL HLQGRSNAWR

1351 PQVNNPKEWL QVDFQKTMKV TGVTTQGVKS LLTSMYVKEF LISSSQDGHQ

1401 WTLFFQNGKV KVFQGNQDSF TPWNSLDPP LLTRYLRIHP QSWVHQIALR

1451 MEVLGCEAQD LY*

Ejemplo 20: Estabilidad en plasma y FC de FVIII198 en plasma de HemA y de inactivación doble (DKO) en FVIII/VWF

Se comparó la estabilidad en plasma de FVIII 198 (que es una molécula de FVIIIFc de cadena sencilla que contiene dominio B parcial-226N6; donde 226 representa los 226 aminoácidos del extremo N del dominio B de FVIII y N6 representa los seis sitios de N-glucosilación en el dominio B) con FVIIIFc de cadena sencilla (FVIII 155/Fc) en plasma de inactivación doble en FVIII/VWF (DKO). Se puede observar la representación esquemática de FVIII155 y FVIII198 en la Figura 25.

Para el ensayo de estabilidad, se incubaron 5 UI/mL de proteínas FVIII 198 o FVIIIFc con plasma de ratón o DKO a 37 °C. Se recogieron alícuotas en diferentes puntos de tiempo para la medición de actividad por ensayo cromogénico de FVIII. Se midió la actividad en cada momento de tiempo por duplicado y se representó la actividad promedio en función del tiempo. En el ensayo de estabilidad, la presencia de dominio B parcial aumentó la estabilidad de FVIIIFc de cadena sencilla (Figura 26A).

También se comparó la semivida de FVIII 198 (de cadena sencilla-B226N6) con FVIII155 (FVIII de dominio B delecionado de cadena sencilla) en ratones DKO. FVIII 198 tiene una semivida al menos aproximadamente 1,5 veces más larga en comparación con FVIII155 (Figura 26B). Estos experimentos sugieren que podría haber una correlación entre la estabilidad de FVIII y su semivida in vivo.

Secuencia de nucleótidos de FVIII198 (FVIIIFc con dominio B parcial, 226N6) (SEQ ID NO: 104)

1 ATGCAAATAG AGCTCTCCACCTGCTTCTTT CTGTGCCTTT TGCGATTCTG

51 CTTTAGTGCC ACCAGAAGATACTACCTGGG TGCAGTGGAA CTGTCATGGG

101 ACTATATGCA AAGTGATCTCGGTGAGCTGC CTGTGGACGC AAGATTTCCT

151 CCTAGAGTGC CAAAATCTTTTCCATTCAAC ACCTCAGTCG TGTACAAAAA

201 GACTCTGTTT GTAGAATTCACGGATCACCT TTTCAAGATC GCTAAGGCAA

251 GGCCACCCTG GATGGGTCTGCTAGGTCCTA CCATCCAGGC TGAGGTTTAT

301 GATACAGTGG TCATTACACTTAAGAACATG GCTTCCCATC CTGTCAGTCT

351 TGATGCTGTT GGTGTATCCTACTGGAAAGC TTCTGAGGGA GCTGAATATG

401 ATGATCAGAC CAGTCAAAGGGAGAAAGAAG ATGATAAAGT CTTCCCTGGT

451 GGAAGCCATA CATATGTCTGGCAGGTCCTG AAAGAGAATG GTCCAATGGC

501 CTCTGACCCA CTGTGCCTTACCTACTCATA TCTTTCTCAT GTGGACCTGG

551 TAAAAGACTT GAATTCAGGCCTCATTGGAG CCCTACTAGT ATGTAGAGAA

601 GGGAGTCTGG CCAAGGAAAAGACACAGACC TTGCACAAAT TTATACTACT

651 TTTTGCTGTA TTTGATGAAGGGAAAAGTTG GCACTCAGAA ACAAAGAACT

701 CCTTGATGCA GGATAGGGATGCTGCATCTG CTCGGGCCTG GCCTAAAATG

751 CACACAGTCA ATGGTTATGTAAACAGGTCT CTGCCAGGTC TGATTGGATG

801 CCACAGGAAA TCAGTCTATTGGCATGTGAT TGGAATGGGC ACCACTCCTG

851 AAGTGCACTC AATATTCCTC GAAGGTCACA CATTTCTTGT GAGGAACCAT 901 CGCCAGGCGT CCTTGGAAAT CTCGCCAATA ACTTTCCTTA CTGGTCAAAC 951 ACTCTTGATG GACGTTGGAC AGTTTCTACT GTTTTGTCAT _ATCTCTTCCC1001 ACCAACATGA TGGCATGGAA GCTTATGTCA AAGTAGACAG CTGTCCAGAG 1051 GñACCCCAAC TACGAATGAA AAATAATGAA GAAGCGGAAG ACTATGATGA 1101 TGATCTTACT GATTCTGAAA TGGATGTGGT CAGGTTTGAT GATGACAACT 1151 CTCCTTCCTT 1ATCCAAATT CGCTCAGTTG CCAAC-AAGCA TCCTAAAACT 1201 TGGGTACATT ACATTGCTGC TGAAGAGGAG GACTGGGACT ATGCTCCCTT 1251 AGTCCTCGCC CCCGATGACA GAAGTTATAA AAGTCAATAT TTGAACAATG 1301 GCCCTCAGCG GATTGGTAGG AAGTACAAAA AAGTCCGATT TATGGCñTAC 1351 ACAGATGAAA CCTTTAAGAC TCGTGAAGCT ATTCAGCATG AATCAGGAAT 1401 CTTGGGACCT GTACTTTATG GGGAAGTTGG AGACACACTG TTGATTATAT 1451 TTAAGAATCA AGCAAGCAGA CCATATAACA TCTACCCTCA CGGAATCACT 1501 GATGTCCGTC CTTTGTATTC AAGGñGATTA CCAAAAGGTG TAAAACATTT 1551 GAAGGATTTT CCAATTCTGC CAGGAGAAAT ATTCAAATAT AAATGGACAG 1601 TGACTGTAGA AGATGGGCCA ACTAAATCAG ATCCTCGGTG CCTGACCCGC 1651 TATTACTCTA GTTTCGTTAA TATGGAGAGA GATCTAGCTT CAGGACTCAT 1701 TGGCCCTCTC CTCATCTGCT ACAAAGAATC TGTAGATCAA AGAGGAAACC 1751 AGATAATGTC AGACAAGAGG AATGTCATCC TGTTTTCTGT ATTTGATGAG 1801 AACCGAAGCT GGTACCTCAC AGAGAATATA CAACC-CTTTC TCCCCAATCC 1851 AGCTGGAGTG CAGCTTGAGG ATCCAGAGTT CCAAC-CCTCC AACATCATGC 1901 ACAGCATCAA 1GGCTATGTT TTTGATAGTT TGCAGTTGTC AGTTTGTTTG 1951 CATGAGGTGG CATACTGGTA CATTCTAAGC ATTGGAGCAC AGACTGACTT 2001 CCTTTCTGTC TTCTTCTCTG GATATACCTT CAAACACAAA ATGGTCTATG 2051 AAGACACACT CACCCTATTC CCATTCTCAG GAGAAACTGT CTTCATGTCG 2101 ATGGAAAACC CAGGTCTATG GATTCTGGGG TGCCACAACT CAGACTTTCG 2151 GAACAGAGGC ATGACCGCCT TACTGAAGGT TTCTAGTTGT GACAAGAACA 2201 CTGGTGATTA TTACGAGGAC AGTTATGAAG ATATTTCAGC ATACTTGCTG 2251 AGTAAAAACA ATGCCATTGñ ACCAAGAAGC TTCTCTCAGA ATTCAAGACA 2301 CCCTAGCACT AGGCAAAAGC AATTTAATGC CACCACAATT CCAGAAAATG 2351 ACATAGAGAA GACTGACCCT TGGTTTGCAC ACAGAACACG TATGCCTAAA 2401 ATACAAAATG TCTCCTCTAG TGATTTGTTG ATGCICTTGC GACAGAGTCC 2451 TACTCCACAT GGGCTATCCT TATCTGATCT CCAAGAAGCC AAATATGAGA 2501 CTTTTTCTGA GGATCCATCA CCTGGAGCAA TAGACAGTAA TAAGAGCCTG 2551 TCTGAAATGA CACACTTCAG GCCACAGCTC CATCACAGTG GGGACATGGT 2601 ATTTACCCCT GAGTCAGGCC TCCAATTAAG ATTAAATGAG AAACTGGGGA 2651 CAACTGCAGC AACAGAGTTG AAGAAACTTG ATTTCAAAGT TTCTAGTACA 2701 TCAAATAATC GGATTTCAAC AATTCGATCA GACAATTTGG CAGGAGGTAC 2751 TCATAATACA AGTTCCTTAG GACCCCCAAG TATGCCACTT CATTATGATA 2801 GTCAATTAGA GACCACTCTA TTTGGCAAAA AGTCATCTCC CCTTACTGAG 2851 TCTGGTGGAC CTCTGAGCTT GAGTGAAGAA AATAATGATT CAAAGTTGTT 2901 AGAATCAGGT TTAATGAATA GCCAAGAAAG TTCATGGGGA AAAAATGTAT 2951 CGTCAGAAAT AACTCGTACT ACTCTTCAGT CAGATCAAGA GGAAATTGAC 3001 TATGATGATA CCATATCAGT TGAAATGAAG AAGGAAGATT TTGACATTTA 3051 TGATGAGGAT GAAAATCAGA GCCCCGGCAG CTTTCAAAAG AAAACACGAC 3101 ACTATTTTAT TGCTGCAGTG GAGAGGCTCT GGGATTATGG GATGAGTAGC 3151 TCCCCACATG GTCTAAGAAA CAGGGCTCAG AGTGGCAGTG TCCCTCAGTT 3201 CAAGAAAGTT GTTTTCCAGG AATTTACTGA TGGCTCCTTT ACTCAGCCCT 3251 TATACCGTGG AGAACTAAAT GAACATTTGG GACTCCTGHG GCCATATATA 3301 AGAGCAGAAG TTGAAGATAA TATCATGGTA ACTTTCAGAA ATCAGGCCTC 3351 TCGTCCCTAT GCCTTCTATT CTAGCCTTAT TTCTTATGAG GAAGATCAGA 3401 GGCAAGGAGC AGAACCTAGA AAAAACTTTG TCAAGCCTAA TGAAACCAAA 3451 ACTTACTTTT GGAAAGTGCA ACATCATATG GCACCCACTA AAGATGAGTT 3501 TGACTGCAAA GCCTGGGCTT ATTTCTCTGA TGTTGACCTG GAAAAAGATG 3551 TGCACTCAGG CCTGATTGGA CCCCTTCTGG TCTGCCACAC taacacactg 3601 AACCCTGCTC ATGGGAGACA AGTGACAGTA CAGGAATTTG CTCTGTTTTT 3651 CACCATCTTT GATGAGACCA AAAGCTGGTA CTTCACTGAA AATATGGAAA 3701 GAAACTGCAG GGCTCCCTGC AATATCCAGA TGGAAGATCC CACTTTTAAA 3751 GAGAATTATC GCTTCCATGC AATCAATGGC TACATAATGG ATACACTACC 3801 TGGCTTAGTA ATGGCTCAGG ñTCAAAGGAT TCGATGGTAT CTGCTCAGCA 3851 TGGGCAGCAA GGAAAACATC CATTCTATTC ATTTCAGTGG ACATGTGTTC 3901 ACTGTACGAA AAAAAGAGGA GTATAAAATG GCACTGTACA ATCTCTATCC 3951 AGGTGTTTTT GAGACAGTGG AAATGTTACC ATCCAAAGCT GGAATTTGGC 4001 GGGTGGAATG CCTTATTGGC GAGCñTCTAC ATGCTGGGAT GAGCACACTT 4051 TTTCTGGTGT ACAGCAATAA GTGTCAGACT CCCCTGGGAA TGGCTTCTGG 4101 ACACATTAGA GATTTTCAGA TTACñGCTTC AGGACAATAT GGACAGTGGG 4151 CCCCAAAGCT GGCGAGACTT CATTATTCCG GATCAATCAA TGCCTGGAGC

4201 ACCAAGGAGC CCTTTTCTTGGATCAAGGTG GATCTGTTGG CACCAATGAT

4251 TATTCACGGC ATCAAGACCCAGGGTGCCCG TCAGAAGTTC TCCAGCCTCT

4301 ACATCTCTCA GTTTATCATCATGTATAGTC TTGATGGGAA GAAGTGGCAG

4351 ACTTATCGAG GAAATTCCACTGGAACCTTA ATGGTCTTCT TTGGCAATGT

4401 GGATTCATCT GGGATAAAACACAATATTTT TAACCCTCGA ATTATTGCTC

4451 GATACATCCG TTTGCACCCAACTCATTATA GCATTCGCAG CACTCTTCGC

4501 ATGGAGTTGA TGGGCTGTGñTTTAAATAGT TGCAGCATGC CATTGGGAAT

4551 GGAGAGTAAA GCAATATCAGATGCACAGAT TACTGCTTCA TCCTACTTTA

4601 CCAATATGTT TGCCACCTGGTCTCCTTCAA AAGCTCGACT TCACCTCCAA

4651 GGGAGGAGTA ATGCCTGGAGACCTCAGGTG AATAATCCAA AAGAGTGGCT

4701 GCAAGTGGAC TTCCAGAAGACAATGAAAGT CACAGGAGTA ACTACTCAGG

4751 GAGTAAAATC TCTGCTTACCAGCATGTATG TGAAGGAGTT CCTCATCTCC

4801 AGCAGTCAAG ATGGCCATCAGTGGACTGTC TTTTTTCAGA ATGGCAAAGT

4851 AAAGGTTTTT CAGGGAAATCAAGACTCCTT CACACCTGTG GTGAACTCTC

4901 TAGACCCACC GTTACTGACTCGCTACCTTC GAATTCACCC CCAGAGTTGG

4951 GTGCACCAGA TTGCCCTGAGGATGGAGGTT CTGGGCTGCG AGGCAGAGGA

5001 CCTCTACGAC AAAACTCfiCACATGCCCñCC GTGCCCAGCT CCAGAACTCC

5051 TGGGCGGACC GTCAGTCTTCCTCTTCCCCC CAAAACCCAA GGACACCCTC

5101 ATGATCTCCC GGACCCCTGAGGTCACATGC GTGGTGGTGG ACGTGAGCCA

5151 CGAAGACCCT GAGGTCAAGTTCAACTGGTA CGTGGACGGC GTGGAGGTGC

5201 ATAATGCCAA GACAAAGCCGCGGGAGGAGC AGTACAACAG CACGTACCGT

5251 GTGGTCAGCG TCCTCACCGTCCTGCACCAG GACTGGCTGA ATGGCAAGGA

5301 GTACAAGTGC AAGGTCTCCAACAAAGCCCT CCCAGCCCCC ATCGAGAAAA

5351 CCATCTCCAA AGCCAAAGGGCAGCCCCGAG AACCACAGGT GTACACCCTG

5401 CCCCCATCCC GGGATGAGCTGACCAAGAAC CAGGTCAGCC TGACCTGCCT

5451 GGTCAAAGGC TTCTATCCCAGCGACATGGC CGTGGAGTGG GAGAGCAATG

5501 GGCAGCCGGA GAACAACTACAAGACCACGC CTCCCGTGTT GGACTCCGAC

5551 GGCTCCTTCT TCCTCTACAGCAAGCTCACC GTGGACAAGA GCAGGTGGCA

5601 GCAGGGGAAC GTCTTCTCATGCTCCGTGAT GCATGAGGCT CTGCACAACC

5651 ACTACACGCA GAAGAGCCTCTCCCTGTCTC CGGGTAAATG A

Secuencia de proteínas de FVIII 198 (SEQ ID NO: 105)

i MQIELSTCFF LCLLRFCFSA TRRYYLGAVE LSWDYMQSDL GELPVDARFP

51 PRVPKSFPFN TSWYKKTLF VEFTDHLFNI AKPRPPWMGL LGPTIQAEVY

101 DTWITLKNM ASHPVSLHAV GVSYWKASEG AEYDDQTSQR EKEDDKVFPG

151 GSHTYVWQVL KEWGPMASDP LCLTYSYLSH VDLVKDLNSG LIGALEVCRE

201 GSLAKEKTQT LHKFILLFAV FDEGKSWHSE TKNSLMQDRD AASARAWPKM

251 HTVNGYVNRS LPGLIGCHRK SVYWHVIGMG TTPEVHSIFL EGHTFLVRNH

301 RQASLEISPI TFLTAQTLLM DLGQFLLFCH ISSHQHDGME AYVKVDSCPE

351 EPQLRMKNNE EAEDYDDDLT DSEMDVVRFD DDWSPSFIQI RSVAKKHPKT

401 WVHYIAAEEE DWDYAPLVLA PDDRSYKSQY LNKGPQRIGR KYKKVRFMAY

451 TDETFKTREA IQHESGILGP LLYGEVGDTL LIIFKNQASR PYNIYPHGIT

501 DVRPLYSRRL PKGVKHLKDF PILPGEIFKY KWTVTVEDGP TKSDPRCLTR

551 YYSSFVNMER DLASGLIGPL LICYKESVDQ RGNQIMSDKR NVILFSVFDE

601 NRSWYLTENI QRFLPNPAGV QLEDPEFQAS NIMHSINGYV FDSLQLSVCL

651 HEVAYWYILS IGAQTDFLSV FFSGYTFKHK MVYEDTLTLF PFSGETVFMS

701 MENPGLWILG CHRSDFRNRG MTALLKVSSC DKNTGDYYED SYEDISAYLL

751 SKNNAIEPRS FSQNSRHPST RQKQFNATTI PENDIEKTDP WFAHRTPMPK

801 IQNVSSSDLL MLLRQSPTPH GLSLSDLQEA KYETFSDDPS PGAIDSNNSL

851 SEMTHFRPQL HHSGDMVFTP ESGLQLRLNE KLGTTAATEL KKLDFKVSST

901 SNNLISTIPS DNLAAGTDNT SSLGPPSMPV HYDSQLDTTL FGKKSSPLTE

951 SGGPLSLSEE NNDSKLLESG LMNSQESSWG KNVSSEITRT TLQSDQEEID

1001 YDDTISVEMK KEDFDIYDED ENQSPRSFQK KTRHYFIAAV ERLWDYGMSS

1051 SPHVLRNRAQ SGSVPQFKKV VFQEFTDGSF TQPLYRGELN EHLGLLGPYI

1101 RAEVEDNIMV TFRNQASRPY SFYSSLISYE EDQRQGAEPR KNFVKPNETK

1151 TYFWKVQHHM APTKDEFDCK AWAYFSDVDL EKDVHSGLIG PLLVCHTNTL

1201 NPAHGRQVTV QEFALFFTIF DETKSWYFTE NMERNCRAPC NIQMEDPTFK

1251 ENYRFHAING YIMDTLPGLV MAQDQRIRWY LLSMGSNENI HSIHFSGHVF

1301 TVRKKEEYKM ALYNLYPGVF ETVEMLPSKA GIWRVECLIG EHLHAGMSTL

1351 FLVYSNKCQT PLGMASGH1R DFQITASGQY GQWAPKLARL HYSGSINAWS

1401 TKEPFSWIKV DLLAPMIIHG IKTQGARQKF SSLYISQFII MYSLDGKKWQ

1451 TYRGNSTGTL MVFFGNVDSS GIKHNIFNPP IIARYIRLHP THYSIRSTLR

1501 MELMGCDLNS CSMPLGMESK AISDAQITAS SYFTNMFATW SPSKARLHLQ

1551 GRSNAWRPQV NNPKEWLQVD FQKTMKVTGV TTQGVKSLLT SMYVKEFLIS

1601 SSQDGHQWTL FFQNGKVKVF QGNQDSFTPV VNSLDPPLLT RYLRIHPQSW

1651 VHQIALRMEV LGCEAQDLYD KTHTCPPCPA PELLGGPSVF LFPPKPKDTL

1701 MISRTPEVTC VVVDVSHEDP EVKFNWYVDG VEVHNAKTKP REEQYNSTYR

1751 WSVLTVLHQ DWLNGKEYKC KVSNKALPAP IEKTISKAKG QPREPQVYTL

1801 PPSRDELTKN QVSLTCLVKG FYPSDIAVEW ESWGQPENNY KTTPPVLDSD

1851 GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL SLSPGK*

Ejemplo 21. Expresión de proteína D1D2 de VWF

Es esencial el apropiado plegamiento del dominio D'D3 para su unión a FVIII. Se requiere el propéptido de VWF (D1 D2-aminoácidos 1 -763) para la eficiente formación de enlaces disulfuro y plegamiento de D'D3. Actúa como una chaperona interna para el plegamiento de D'D3. Las construcciones de VWF que preparan los fragmentos de VWF pueden o expresarse donde el propéptido VWF (es decir, dominio D1D2) se une directamente al dominio D'D3 y se retira durante el procesamiento intracelular regular de D'D3 (es decir, en cis), o se puede expresar a partir de otro plásmido, es decir, en trans. Los presentes inventores diseñaron el heterodímero FVIII-VWF de tal forma que D1D2 se puedan expresar o en cis o en trans.

Clonación de VWF 053: El clon VWF 053 expresa el propéptido VWF (dominio D1D2) para expresión en trans de D1D2 . Se amplificó por PCR el propéptido vW f a partir de la longitud completa usando ESC 54 y ESC124.

ESC54-VWF directo con sitio BsiW1 (SEQ ID NO: 111)

(CGCTTCGCGACGTACGGCCGCCACCATGATTCCTGCCAGATTTGCCGGGGTGCTGCTTGCTC)

Oligonucleótido de clonación ESC 124 - D1D2 con Not1 sitio-inverso (SEQ ID NO: 112)

(CTAGACTCGAGCGGCCGCTCACCTTTTGCTGCGATGAGACAGGGGACTGCTGAGGACAGC)

Se digirió el producto de PCR con BsiW1 y Not1 y se unió en pcDNA 4 digerido con BsiW1/Not1.

Secuencia de nucleótidos de VWF 053 (VWF D1 D2-propéptido) (SEQ ID NO: 113)

1 ATGATTCCTG CCAGATTTGC CGGGGTGCTG CTTGCTCTGG CCCTCATTTT

51 GCCAGGGACC CTTTGTGCAG AAGGAACTCG CGGCAGGTCA TCCACGGCCC

101 GATGCAGCCT TTTCGGAAGT GACTTCGTCA ACACCTTTGA TGGGAGCATG

151 TACAGCTTTG CGGGATACTG CAGTTACCTC CTGGCAGGGG GCTGCCAGAA

201 ACGCTCCTTC TCGATTATTG GGGACTTCCA GAATGGCAAG AGAGTGAGCC

251 TCTCCGTGTA TCTTGGGGAA TTTTTTGACA TCCATTTGTT TGTCAATGGT

301 ACCGTGACAC AGGGGGACCA AAGAGTCTCC ATGCCCTATG CCTCCAAAGG

351 GCTGTATCTA GAAACTGAGG CTGGGTACTA CAAGCTGTCC GGTGAGGCCT

401 ATGGCTTTGT GGCCAGGATC GATGGCAGCG GCAACTTTCA AGTCCTGCTG

451 TCAGACAGAT ACTTCAACAA GACCTGCGGG CTGTGTGGCA ACTTTAACAT

501 CTTTGCTGAA GATGACTTTA TGACCCAAGA AGGGACCTTG ACCTCGGACC

551 CTTATGACTT TGCCAACTCA TGGGCTCTGA GCAGTGGAGA ACAGTGGTGT

601 GAACGGGCAT CTCCTCCCAG CAGCTCATGC AACATCTCCT CTGGGGAAAT

651 GCAGAAGGGC CTGTGGGAGC AGTGCCAGCT TCTGAAGAGC ACCTCGGTGT

701 TTGCCCGCTG CCACCCTCTG GTGGACCCCG AGCCTTTTGT GGCCCTGTGT

751 GAGAAGACTT TGTGTGAGTG TGCTGGGGGG CTGGAGTGCG CCTGCCCTGC

801 CCTCCTGGAG TACGCCCGGA CCTGTGCCCA GGAGGGAATG GTGCTGTACG

851 GCTGGACCGA CCACAGCGCG TGCAGCCCAG TGTGCCCTGC TGGTATGGAG

901 TATAGGCAGT GTGTGTCCCC TTGCGCCAGG ACCTGCCAGA GCCTGCACAT

951 CAATGAAATG TGTCAGGAGC GATGCGTGGA TGGCTGCAGC TGCCCTGAGG

1001 GACAGCTCCT GGATGAAGGC CTCTGCGTGG AGAGCACCGA GTGTCCCTGC

1051 GTGCATTCCG GAAAGCGCTA CCCTCCCGGC ACCTCCCTCT CTCGAGACTG

1101 CAACACCTGC ATTTGCCGAA ACAGCCAGTG GATCTGCAGC AATGAAGAAT

1151 GTCCAGGGGA GTGCCTTGTC ACTGGTCAAT CCCACTTCAA GAGCTTTGAC

1201 AACAGATACT TCACCTTCAG TGGGATCTGC CAGTACCTGC TGGCCCGGGA

1251 TTGCCAGGAC CACTCCTTCT CCATTGTCAT TGAGACTGTC CAGTGTGCTG

1301 ATGACCGCGA CGCTGTGTGC ACCCGCTCCG TCACCGTCCG GCTGCCTGGC

1351 CTGCACAACA GCCTTGTGAA ACTGAAGCAT GGGGCAGGAG TTGCCATGGA

1401 TGGCCAGGAC ATCCAGCTCC CCCTCCTGAA AGGTGACCTC CGCATCCAA3C

1451 ATACAGTGAC GGCCTCCGTG CGCCTCAGCT ACGGGGAGGA CCTGCAGATG

1501 GACTGGGATG GCCGCGGGAG GCTGCTGGTG AAGCTGTCCC CCGTCTATGC

1551 CGGGAAGACC TGCGGCCTGT GTGGGAATTA CAATGGCAAC CAGGGCGACG

1601 ACTTCCTTAC CCCCTCTGGG CTGGCGGAGC CCCGGGTGGA GGACTTCGGG

1651 AACGCCTGGA AGCTGCACGG GGACTGCCAG GACCTGCAGA AGCAGCACAG

1701 CGATCCCTGC GCCCTCAACC CGCGCATGAC CAGGTTCTCC GAGGAGGCGT

1751 GCGCGGTCCT GACGTCCCCC ACATTCGAGG CCTGCCATCG TGCCGTCAGC

1801 CCGCTGCCCT ACCTGCGGAA CTGCCGCTAC GACGTGTGCT CCTGCTCGGA

1851 CGGCCGCGAG TGCCTGTGCG GCGCCCTGGC CAGCTATGCC GCGGCCTGCG

1501 CGGGGAGAGG CGTGCGCGTC GCGTGGCGCG AGCCAGGCCG CTGTGAGCTG

1951 AACTGCCCGA AAGGCCAGGT GTACCTGCAG TGCGGGACCC CCTGCAACCT

2001 GACCTGCCGC TCTCTCTCTT ACCCGGATGA GGAATGCAAT GAGGCCTGCC

2051 TGGAGGGCTG CTTCTGCCCC CCAGGGCTCT ACATGGATGA GAGGGGGGAC

2101 TGCGTGCCCA AGGCCCAGTG CCCCTGTTAC TATGACGGTG AGATCTTCCA

2151 GCCAGAAGAC ATCTTCTCAG ACCATCACAC CATGTGCTAC TGTGAGGATG

2201 GCTTCATGCA CTGTACCATG AGTGGAGTCC CCGGAAGCTT GCTGCCTGAC

2251 GCTGTCCTCA GCAGTCCCCT GTCTCATCGC AGCAAAAGG

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una proteína quimérica que comprende una proteína factor VIII ("FVIII") y un fragmento de factor de von Willebrand (VWF),

en donde la proteína FVIII comprende un dominio A1, un dominio A2, un dominio A3, un dominio C1 y un dominio C2;

en donde el fragmento de VWF comprende un dominio D' y un dominio D3 de VWF; y

en donde el fragmento de VWF y la proteína FVIII se unen por un enlace covalente, que previene la disociación del fragmento de VWF de la proteína FVIII en presencia de VWF endógeno,

2. La proteína quimérica de la reivindicación 1, en donde el enlace covalente comprende:

(i) un enlace peptídico o

(ii) un enlace disulfuro o

(iii) un conector entre la proteína FVIII y el fragmento de VWF.

3. La proteína quimérica de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el fragmento de VWF se asocia con la proteína FVIII por un enlace no covalente, además del enlace covalente.

4. La proteína quimérica de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el fragmento de VWF comprende al menos un resto heterólogo (H1).

5. La proteína quimérica de la reivindicación 3, en donde el fragmento de VWF comprende además un conector, en donde el conector está entre el fragmento de VWF y el resto heterólogo (H1).

6. La proteína quimérica de la reivindicación 4 o la reivindicación 5, en donde la proteína FVIII comprende al menos un resto heterólogo adicional (H2).

7. La proteína quimérica de la reivindicación 6, en donde el resto heterólogo (H1) comprende:

a. al menos una de una región constante de inmunoglobulina, albúmina, un resto de unión a albúmina, una secuencia Pro-Ala-Ser (PAS), una secuencia de homopolímero de aminoácidos (HAP), transferrina, polietilenglicol (PEG), ácido polisiálico, hidroxietilalmidón (HES), y cualquier combinación de los mismos; o b. una primera región Fc; y/o

el resto heterólogo (H2) comprende:

c. al menos una de una región constante de inmunoglobulina, albúmina, un resto de unión a albúmina, una secuencia de PAS, una secuencia de HAP, transferrina, polietilenglicol (PEG), ácido polisiálico, hidroxietilalmidón (HES), y cualquier combinación de los mismos; o

d. una segunda región Fc.

8. La proteína quimérica de la reivindicación 6 o la reivindicación 7, en donde el resto heterólogo (H1) comprende una primera región Fc, y el resto heterólogo (H2) comprende una segunda región Fc, en donde el enlace covalente es entre la primera región Fc y la segunda región Fc.

9. La proteína quimérica de la reivindicación 1, en donde la proteína quimérica comprende una fórmula seleccionada de:

(a) V-L1-H1-L3-H2-L2-C, o

(b) C-L2-H2-L3-H1-L1 -V,

en donde en las fórmulas (a) y (b)

V es el fragmento de VWF;

L1 es un conector opcional;

L2 es un conector opcional;

L3 es un conector opcional;

cada uno de H1 y H2 comprende un resto heterólogo opcional;

C comprende la proteína FVIII; y

(-) es un enlace peptídico o uno o más aminoácidos;

o en donde la proteína quimérica comprende la fórmula:

(c) V-L1-H1: H2-L2-C,

en donde en la fórmula (c)

V es el fragmento de VWF;

L1 es un conector opcional;

L2 es un conector opcional;

H1 es un primer resto heterólogo;

H2 es un segundo resto heterólogo;

C es la proteína FVIII;

(-) es un enlace peptídico o uno o más aminoácidos; y

(:) es un enlace covalente entre H1 y H2.

10. La proteína quimérica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende además un conector entre la proteína FVIII y el fragmento de VWF.

11. La proteína quimérica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde la secuencia de aminoácidos del dominio D' del fragmento de VWF es al menos 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a los aminoácidos 764 a 866 de SEQ ID NO: 2, y en donde la secuencia de aminoácidos del dominio D3 del fragmento de VWF es al menos 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a los aminoácidos 867 a 1240 de SEQ ID NO: 2.

12. La proteína quimérica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde el fragmento de VWF comprende además el dominio D1, el dominio D2, o los dominios D1 y D2 de VWF.

13. La proteína quimérica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde la proteína FVIII comprende el dominio B o una porción del mismo.

14. Un polinucleótido o un conjunto de polinucleótidos que codifica la proteína quimérica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en donde el conjunto de polinucleótidos comprende un primer polinucleótido que codifica el fragmento de VWF y un segundo polinucleótido que codifica la proteína FVIII.

15. Una célula hospedadora que comprende el polinucleótido o el conjunto de polinucleótidos de la reivindicación 14.

16. Una composición farmacéutica que comprende la proteína quimérica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, el polinucleótido o el conjunto de polinucleótidos de la reivindicación 14, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

17. La proteína quimérica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, el polinucleótido o el conjunto de polinucleótidos de la reivindicación 14, o la composición farmacéutica de la reivindicación 16, para su uso en el tratamiento de una enfermedad o afección hemorrágica en un sujeto en necesidad del mismo, en donde la enfermedad hemorrágica o trastorno se selecciona del grupo que consiste en un trastorno hemorrágico de la coagulación, hemartrosis, sangrado muscular, sangrado bucal, hemorragia, hemorragia dentro de los músculos, hemorragia bucal, traumatismo, traumatismo craneal, sangrado gastrointestinal, hemorragia intracraneal, hemorragia intraabdominal, hemorragia intratorácica, fractura de huesos, sangrado del sistema nervioso central, sangrado en el espacio retrofaríngeo, sangrado en el espacio retroperitoneal, sangrado en la vaina del iliopsoas, y cualquier combinación de los mismos.

18. Un método de preparación de la proteína quimérica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, que comprende transfectar uno o más células hospedadoras con el polinucleótido o el conjunto de polinucleótidos de la reivindicación 14, y expresar la proteína quimérica en la célula hospedadora.