MX2014008512A - Polipeptidos de factor viii quimericos y usos de los mismos. - Google Patents
Polipeptidos de factor viii quimericos y usos de los mismos.Info
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Abstract
La presente invención proporciona un fragmento de VWF que comprende el dominio D´ y el dominio D3 de VWF, una proteína quimérica que comprende el fragmento de VWF y un resto heterólogo, o una proteína quimérica que comprende el fragmento de VWF y una proteína de FVIII y métodos para usarlos. Una cadena de polipéptidos que comprende un fragmento de VWF de la invención se une o está asociada a una cadena de polipéptidos que comprende una proteína de FVIII y la cadena de polipéptidos que comprende el fragmento de VWF puede evitar o inhibir la unión de VWF endógeno a la proteína de FVIII. Al evitar o inhibir la unión de VWF endógeno a FVIII, que es un factor limitante de la semivida para FVIII, el fragmento de VWF puede inducir la extensión de la semivida de la proteína de FVIII. La invención también incluye nucleótidos, vectores, células hospedadoras, métodos para usar el fragmento de VWF o las proteínas quiméricas.
Description
POLIPEPTIDOS DE FACTOR VIII QUIMERICOS Y USOS DE LOS
MISMOS
ANTECEDENTES DE LA INVENCION
La coagulación es un proceso complejo por el cual la sangre forma coágulos . Es una parte importante de la hemostasis, el cese de la pérdida de sangre de un vaso dañado, donde la pared del vaso sanguíneo dañado está cubierta por una plaqueta y un coágulo que contiene fibrina para detener el sangrado y comenzar la reparación del vaso dañado. Los trastornos de la coagulación pueden llevar a un mayor riesgo de sangrado (hemorragia) o coagulación obstructiva (trombosis) .
La coagulación comienza casi instantáneamente luego de que una lesión al vaso sanguíneo ha dañado el revestimiento del endotelio del vaso. La exposición de la sangre a proteínas tales como factor de tejido inicia cambios en las plaquetas sanguíneas y el fibrinógeno de proteína de plasma, un factor de coagulación. Las placas inmediatamente forman un tapón en el sitio de lesión; esto se denomina hemostasis primaria. La hemostasis secundaria ocurre simultáneamente: Las proteínas en el plasma sanguíneo, denominadas factores de coagulación, responden en una cascada compleja para formar hebras de fibrina que fortalecen el tapón de plaquetas. Los factores de coagulación no taxativos incluyen, de modo no
Ref.:249719
taxativo, factor I (fibrinógeno) , factor II (protrombina) , factor de tejido, factor V (proacelerina, factor lábil), factor VII (factor estable, proconvertina) , factor VIII (factor antihemofílico A) , factor IX (factor antihemofílico B o factor de Christmas) , factor X (factor Stuart -Prower) , factor XI (antecedente de tromboplastina plasmática) , factor XII (factor de Hageman) , factor XIII (factor estabilizante de la fibrina) , VWF, precalicreína (factor de Fletcher) , quininógeno de alto peso molecular (HMWK) (factor Fitzgerald) , fibronectina, antitrombina III, cofactor II de la heparina, proteína C, proteína S, proteína Z, plasminógeno, alfa 2-antiplasmina, activador de plasminógeno tisular (tPA) , urocinasa, inhibidor del activador del plasminógeno 1 (PAI1) e inhibidor del activador del plasminógeno 2 (PAI2) .
La hemofilia A es un trastorno de sangrado provocado por defectos en el gen que codifica el factor de coagulación VIII (FVIII) y afecta 1-2 en 10,000 nacimientos de hombres. Graw et ál . , Nat . Rev. Genet. 6(6): 488-501 (2005). Los pacientes afectados con hemofilia A se pueden tratar con una infusión de FVIII purificado o producido de manera recombinante . Se sabe que todos los productos de FVIII comercialmente disponibles, sin embargo, tienen una semivida de alrededor de 8-12 horas, lo que requiere frecuentes administraciones intravenosas a los pacientes. Véase Weiner
M.A. y Cairo, M.S., Pediatric Hematology Secrets, Lee, M.T., 12. Disorders of Coagulation, Elsevier Health Sciences, 2001; Lillicrap, D. Thromb. Res. 122 Supl 4:S2-8 (2008). Además, se han intentado varios enfoques para extender la semivida del FVIII. Por ejemplo, los enfoques que se encuentran en desarrollo para extender la semivida de los factores de coagulación incluyen pegilación, glicopegilación y conjugación con albúmina. Véase Dumont et ál . , Blood. 119(13): 3024-3030 (publicado en línea el 13 de enero, 2012). Sin embargo, independientemente de la ingeniería de proteínas usada, los productos de FVIII de larga actuación que se encuentran actualmente en desarrollo tienen semividas mejoradas, pero se informa que las semividas están limitadas - solo una mejora de alrededor de 1.5 a 2 veces en modelos de animales preclínicos. Véase Id. Se han demostrado resultados coherentes en humanos, por ejemplo, se informó que rFVIIIFc mejoraba la semivida hasta ~ 1.7 veces en comparación con ADVATE® en pacientes con hemofilia A. Véase Id. Por lo tanto, los aumentos de la semivida, pese a mejoras menores, puede indicar la presencia de otros factores que limitan la Tl/2. Véase Liu, T. et ál . , reunión de ISTH de 2007, sumario #P-M-035; Henrik, A. et ál . , reunión de ISTH de 2011, sumario #P=M0-181; Liu, T. et ál . , reunión de ISTH de 2011, sumario #P-WE-131.
El factor von illebrand en plasma (VWF) tiene una
semivida de aproximadamente 12 horas (que va de 9 a 15 horas) .
http : //www. hlbi . nih.gov/guidelines/vwd/2 scientificoverview . htm (última visita el 22 de octubre, 2011) . La semivida del VWF se puede ver afectada por varios factores : patrón de glicosilación, ADAMTS-13 (una desintegrina y metaloproteasa con motivo 13 de la trombospondina) y varias mutaciones al VWF .
En el plasma, 95-98% del FVIII circula en un complejo no covalente ajustado con VWF de longitud completa. La formación de este complejo es importante para el mantenimiento de niveles adecuados de FVIII en plasma in vivo. Lenting et ál . , Blood. 92(11): 3983-96 (1998); Lenting et ál . , J. Throm . Haemost. 5(7): 1353-60 (2007). El FVIII de tipo salvaje y longitud completa está en su mayoría presente como un heterodímero con una cadena pesada (MW 200kd) y una cadena ligera (MW 73kd) . Cuando el FVIII es activado debido a proteólisis en las posiciones 372 y 740 en la cadena pesada y en la posición 1689 en la cadena ligera, el VWF unido a FVIII se separa del FVIII activado. El FVIII activado, junto con el factor IX activado, calcio y fosfolípido ("complejo de tenasa") , están implicados en la activación del factor X, generando grandes cantidades de trombina. La trombina, a su vez, luego escinde el fibrinógeno para formar monómeros de fibrina solubles, que luego se polimerizan espontáneamente
para formar el polímero de fibrina soluble. La trombina también activa el factor XIII, que, junto con el calcio, sirve para reticular y estabilizar el polímero de fibrina soluble, formando una fibrina reticulada (insoluble) . El FVIII activado se depura rápido de la circulación mediante proteólisis .
Debido a la frecuente dosificación y los inconvenientes causados por el programa de dosificación, sigue existiendo una necesidad de desarrollar productos de FVIII que requieran una administración menos frecuente, es decir, un producto de FVIII que tiene una semivida más prolongada que la limitación de semivida de 1.5 a 2 veces .
SUMARIO DE LA INVENCION
La presente invención se refiere a una proteína quimérica que comprende una proteína de Factor VIII ("FVIII") y un resto adjunto ("AM", por sus siglas en inglés), donde el resto adjunto inhibe o evita la unión del VWF endógeno a la proteína de FVIII. La proteína de FVIII y el resto adjunto se enlazan entre sí por un enlace covalente para evitar la disociación del resto adjunto en presencia del VWF endógeno. En una modalidad, el enlace covalente es un enlace peptídico, un enlace disulfuro o un enlazador, que es lo suficientemente resistente como para evitar la disociación del resto adjunto de la proteína de FVIII en presencia de VWF endógeno. En otra modalidad, el resto adjunto evita que la proteína de FVIII se
depure a través de una vía de depuración de VWF. En otras modalidades, el resto adjunto inhibe o evita la unión del VWF endógeno a la proteína de FVIII protegiendo o bloqueando un sitio de unión a VWF en la proteína de FVIII. Por ejemplo, el sitio de unión a VWF está ubicado en el dominio A3 o el dominio C2 de la proteína de FVIII o tanto el dominio A3 como el dominio C2.
En algunas modalidades, la proteína quimérica incluye una construcción que comprende una proteína de FVIII y un resto adjunto enlazados entre sí por un enlace covalente, donde la proteína quimérica no comprende un factor que limita la semivida de FVIII, que induce la limitación de la semivida de la proteína de FVIII, por ejemplo, proteína de VWF de longitud completa o una proteína de VWF madura. Por lo tanto, en algunas modalidades, la semivida de la proteína de FVIII de la proteína quimérica se puede extender más allá de la limitación de semivida de la proteína de FVIII en presencia de VWF endógeno.
En determinadas modalidades, el resto adjunto tiene al menos una propiedad protectora de FVIII de tipo VWF. Ejemplos de la propiedad protectora de FVIII de tipo VWF incluyen, de modo no taxativo, proteger la proteína de FVIII de una o más escisiones de proteasa, proteger la proteína de FVIII de la activación, estabilizar la cadena pesada y/o la cadena ligera de la proteína de FVIII o evitar la depuración de la proteína
de FVIII por uno o más receptores depuradores. En una modalidad, el resto adjunto comprende un polipéptido, no resto polipéptido o ambos. En otra modalidad, el resto adjunto puede ser un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de al menos alrededor de 40, al menos alrededor de 50, al menos alrededor de 60, al menos alrededor de 70, al menos alrededor de 80, al menos alrededor de 90, al menos alrededor de 100, al menos alrededor de 110, al menos alrededor de 120, al menos alrededor de 130, al menos alrededor de 140, al menos alrededor de 150, al menos alrededor de 200, al menos alrededor de 250, al menos alrededor de 300, al menos alrededor de 350, al menos alrededor de 400, al menos alrededor de 450, al menos alrededor de 500, al menos alrededor de 550, al menos alrededor de 600, al menos alrededor de 650, al menos alrededor de 700, al menos alrededor de 750, al menos alrededor de 800, al menos alrededor de 850, al menos alrededor de 900, al menos alrededor de 950 o al menos alrededor de 1000 aminoácidos de longitud. En determinadas modalidades, el resto adjunto comprende un fragmento de VWF, una región constante de inmunoglobulina o una parte de esta, albúmina o un fragmento de esta, un resto de unión a la albúmina, una secuencia PAS, una secuencia HAP, transferrina o un fragmento de esta, o cualesquiera combinaciones de estos. En otras modalidades, el resto adjunto es un resto no
polipéptido que comprende polietilenglicol (PEG) , ácido polisiálico, almidón de hidroxietilo (HES) , un derivado de estos o cualesquiera combinaciones de estos.
En determinadas modalidades, el resto adjunto comprende un fragmento de VWF que comprende un dominio D1 y un dominio D3 de VWF, donde el fragmento de VWF está asociado con la proteína de FVIII por un enlace no covalente además del enlace covalente entre la proteína de FVIII y el resto adjunto (fragmento de VWF) . En un ejemplo, el fragmento de VWF es un monómero. En otro ejemplo, el fragmento de VWF comprende dos, tres, cuatro, cinco o seis fragmentos de VWF enlazados a uno o más de estos.
En un aspecto, la proteína quimérica comprende un resto adjunto, por ejemplo, un fragmento de VWF y al menos un resto heterólogo (Hl) y un enlazador opcional entre el resto adjunto, por ejemplo, fragmento de VWF y el resto heterólogo (Hl) . En una modalidad, el resto heterólogo (Hl) puede comprender un resto que extiende la semivida de la proteína de FVIII, por ejemplo, un polipéptido que se selecciona del grupo que consiste en una región constante de inmunoglobulina o una parte de esta, albúmina o un fragmento de esta, un resto de unión a la albúmina, una secuencia PAS, una secuencia HAP, transíerrina o un fragmento de esta y cualesquiera combinaciones de estos o un resto no polipéptido que se selecciona del grupo que consiste en polietilenglicol
(PEG) , ácido polisiálico, almidón de hidroxietilo (HES) , un derivado de estos y cualesquiera combinaciones de estos. En una modalidad, el resto heterólogo (Hl) comprende una primera región Fe. En otra modalidad, el resto heterólogo (Hl) comprende una secuencia de aminoácidos que comprende al menos alrededor de 50 aminoácidos, al menos alrededor de 100 aminoácidos, al menos alrededor de 150 aminoácidos, al menos alrededor de 200 aminoácidos, al menos alrededor de 250 aminoácidos, al menos alrededor de 300 aminoácidos, al menos alrededor de 350 aminoácidos, al menos alrededor de 400 aminoácidos, al menos alrededor de 450 aminoácidos, al menos alrededor de 500 aminoácidos, al menos alrededor de 550 aminoácidos, al menos alrededor de 600 aminoácidos, al menos alrededor de 650 aminoácidos, al menos alrededor de 700 aminoácidos, al menos alrededor de 750 aminoácidos, al menos alrededor de 800 aminoácidos, al menos alrededor de 850 aminoácidos, al menos alrededor de 900 aminoácidos, al menos alrededor de 950 aminoácidos o al menos alrededor de 1000 aminoácidos. En otras modalidades, la proteína quimérica comprende un enlazador entre el resto adjunto, por ejemplo, un fragmento de VWF y el resto heterólogo (Hl) , que es un enlazador escindible.
En otro aspecto, la proteína de FVIII en la proteína quimérica comprende FVIII y al menos un resto heterólogo (H2) . En una modalidad, el resto heterólogo (H2) puede
extender la semivida de la proteína de FVIII, por ejemplo, un polipéptido que se selecciona del grupo que consiste en una región constante de inmunoglob li a o una parte de esta, albúmina o un fragmento de esta, un resto de unión a la albúmina, una secuencia PAS, una secuencia HAP, transferrina o un fragmento de esta y cualesquiera combinaciones de estos o un resto no polipéptido que comprende polietilenglicol (PEG) , ácido polisiálico, almidón de hidroxietilo (HES) , un derivado de estos y cualesquiera combinaciones de estos. En una modalidad particular, el resto heterólogo (H2) comprende una segunda región Fe .
En algunas modalidades, la proteína quimérica comprende una primera cadena de polipéptidos que comprende el fragmento de VWF, un primer resto heterólogo y un enlazador y una segunda cadena de polipéptidos que comprende la proteína de FVIII y un segundo resto heterólogo, donde la primera cadena de polipéptidos y la segunda cadena de polipéptidos están enlazadas entre sí por un enlace covalente. En un ejemplo, el primer resto heterólogo y el segundo resto heterólogo están enlazados entre sí por el enlace covalente, por ejemplo, un enlace disulfuro, un enlace peptídico o un enlazador, donde el enlace covalente evita el remplazo del fragmento de VWF en la primera cadena de polipéptidos con VWF endógeno in vivo. En algunas modalidades, el enlazador entre la proteína de FVIII y el segundo resto heterólogo es un enlazador
escindible .
En determinadas modalidades, el primer resto heterologo (Hl) enlazado al fragmento de VWF y el segundo resto heterologo (H2) enlazado a la proteína de FVIII están enlazados por un enlazador, por ejemplo, un enlazador scFc, que es un enlazador procesable.
En aun otras modalidades, la proteína de FVIII en la proteína quimérica comprende además un tercer resto heterologo (H3) , un cuarto resto heterologo (H4) , un quinto resto heterologo (H5) , un sexto resto heterologo (H6) o cualesquiera combinaciones de estos. En una modalidad, uno o más del tercer resto heterologo (H3) , el cuarto resto heterologo (H4) , el quinto resto heterologo (H5) , el sexto resto heterologo (H6) pueden extender la semivida de la proteína de FVIII. En otras modalidades, el tercer resto heterologo (H3) , el cuarto resto heterologo (H4), el quinto resto heterologo (H5) y el sexto resto heterologo (H6) se enlazan al C-terminal o el N-terminal de FVIII o se insertan entre dos aminoácidos de FVIII. En otras modalidades, uno o más del tercer resto heterologo (H3) , el cuarto resto heterologo (H4) , el quinto resto heterologo (H5) o el sexto resto heterologo (H6) comprende una secuencia de aminoácidos que comprende al menos alrededor de 50 aminoácidos, al menos alrededor de 100 aminoácidos, al menos alrededor de 150 aminoácidos, al menos alrededor de 200 aminoácidos, al menos
alrededor de 250 aminoácidos, al menos alrededor de 300 aminoácidos, al menos alrededor de 350 aminoácidos, al menos alrededor de 400 aminoácidos, al menos alrededor de 450 aminoácidos, al menos alrededor de 500 aminoácidos, al menos alrededor de 550 aminoácidos, al menos alrededor de 600 aminoácidos, al menos alrededor de 650 aminoácidos, al menos alrededor de 700 aminoácidos, al menos alrededor de 750 aminoácidos, al menos alrededor de 800 aminoácidos, al menos alrededor de 850 aminoácidos, al menos alrededor de 900 aminoácidos, al menos alrededor de 950 aminoácidos o al menos alrededor de 1000 aminoácidos.
En algunas modalidades, el enlazador entre la proteína de FVIII y el segundo resto heterologo o el enlazador entre el fragmento de V F y el primer resto heterologo comprenden además un primer sitio de escisión (Pl) en la región de N-terminal del enlazador, un segundo sitio de escisión (P2) en la región de C-terminal del enlazador, o ambos. En otras modalidades, uno o más del enlazador entre la proteína de FVIII y el resto adjunto, el enlazador entre la proteína de FVIII y el segundo resto heterologo y el enlazador entre el fragmento de VWF y el primer resto heterologo tienen una longitud de alrededor de 1 a alrededor de 2000 aminoácidos.
En otras modalidades, la proteína quimérica comprende una proteína de FVIII y un resto adjunto, que están enlazadas por un enlazador entre la proteína de FVIII y el resto
adjunto, donde el enlazador comprende además un motivo de reconocimiento de la sortasa, por ejemplo, la secuencia de LPXTG (SEQ ID NO: 106) .
La presente invención se refiere a un fragmento de factor von Willebrand (VWF) que comprende el dominio D' y el dominio D3 de VWF, donde el fragmento de VWF se une al Factor VIII (FVIII) e inhibe la unión del VWF endógeno a una proteína de FVIII. En una modalidad, el fragmento de VWF de la invención no es aminoácidos 764 a 1274 de la SEQ ID NO: 2. En una modalidad, la proteína de FVIII, sin el fragmento de VWF, tiene una semivida comparable al FVIII de tipo salvaje. En otra modalidad, la proteína de FVIII es una proteína de fusión que comprende FVIII y un resto heterólogo que puede extender la semivida de FVIII. El resto heterólogo puede ser un polipéptido, no resto polipéptido o ambos. El resto polipéptido heterólogo se puede seleccionar del grupo que consiste en una región constante de inmunoglobulina o una parte de esta, albúmina o un fragmento de esta, un resto de unión a la albúmina, una secuencia PAS, una secuencia HAP, transferrina o un fragmento de esta y cualquier combinación de estos. En otras modalidades, el resto heterólogo es una región constante de inmunoglobulina o una parte de esta, por ejemplo, una región Fe. En aun otras modalidades, el resto no polipéptido se selecciona del grupo que consiste en polietilenglicol (PEG) , ácido polisiálico, almidón de
hidroxietilo (HES) , un derivado de estos y cualesquiera combinaciones de estos. En determinadas modalidades, la proteína de FVIII comprende una primera cadena de polipéptidos y una segunda cadena de polipéptidos , donde la primera cadena de polipéptidos comprende FVIII y una primera región Fe y la segunda cadena de polipéptidos comprende una segunda región Fe sin FVIII.
En otra modalidad, el fragmento de VWF extiende una semivida de FVIII. La secuencia de aminoácidos del dominio D' puede ser al menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a aminoácidos 764 a 866 de la SEQ ID NO: 2. Además, la secuencia de aminoácidos del dominio D3 puede ser al menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a aminoácidos 867 a 1240 de la SEQ ID NO: 2. En determinadas modalidades, el fragmento de VWF contiene al menos una sustitución de aminoácidos en un residuo que corresponde al residuo 1099, residuo 1142 o ambos de la SEQ ID NO: 2. En una modalidad particular, un fragmento de VWF comprende, consiste esencialmente en, o consiste en los aminoácidos 764 a 1240 de la SEQ ID NO: 2. El fragmento de VWF también puede comprender el dominio DI, el dominio D2 o los dominios DI y D2 de VWF. En algunas modalidades, el fragmento de VWF comprende además un dominio de VWF que se selecciona del grupo que consiste en el dominio Al, el dominio A2 , el dominio A3, el dominio D4 , el dominio Bl, el dominio B2 , el dominio B3 , el dominio Cl,
el dominio C2 , el dominio CK, uno o más fragmentos de estos y cualesquiera combinaciones de estos. En otras modalidades, el fragmento de VWF está pegilado, glicosilado, hesilado o polisialilado .
La presente invención también se refiere a una proteína quimérica que comprende un fragmento de VWF descrito en la presente, un resto heterólogo y un enlazador opcional entre el fragmento de VWF y el resto heterólogo. El resto heterólogo puede ser un polipéptido, no resto polipéptido o ambos. En una modalidad, el resto de polipéptido heterólogo se selecciona del grupo que consiste en una región constante de inmunoglobulina o una parte de esta, albúmina o un fragmento de esta, un resto de unión a la albúmina, una secuencia PAS, una secuencia HAP, transferrina o un fragmento de esta y cualquier combinación de estos. En otra modalidad, el resto no polipéptido heterólogo se selecciona del grupo que consiste en polietilenglicol (PEG) , ácido polisiálico, almidón de hidroxietilo (HES) , un derivado de estos y cualesquiera combinaciones de estos. En una modalidad particular, el resto heterólogo es una primera región Fe. La proteína quimérica también puede comprender una segunda región Fe, donde la segunda región Fe está enlazada o asociada a la primera región Fe o enlazada o asociada al fragmento de VWF.
En un aspecto, una proteína quimérica de la presente
invención comprende una fórmula que se selecciona del grupo que consiste en:
(aa) V-L1-H1-L2-H2,
(bb) H2-L2-H1-L1-V,
(ce) H1-L1-V-L2-H2, y
(dd) H2-L2-V-L1-H1,
donde la V es uno o más de los fragmentos de VWF descritos en la presente,
cada uno de Ll y L2 es un enlazador opcional;
Hl es un primer resto heterólogo;
( - ) es un enlace peptídico o uno o más aminoácidos y
H2 es un segundo resto heterólogo opcional . En una modalidad, Hl es un primer resto heterólogo, por ejemplo, una molécula que extiende la semivida que es conocida en la técnica. En una modalidad, el primer resto heterólogo es un polipéptido. El primer resto de polipéptido heterólogo se selecciona del grupo que consiste en una región constante de inmunoglobulina o una parte de esta, albúmina o un fragmento de esta, un resto de unión a la albúmina, una secuencia PAS, una secuencia HAP, transferrina o un fragmento de esta y cualesquiera combinaciones de estos. En otra modalidad, Hl es un resto no polipéptido que se selecciona del grupo que consiste en polietilenglicol (PEG) , ácido polisiálico, almidón de hidroxietilo (HES) , un derivado de estos y cualesquiera combinaciones de estos. H2 es un segundo
resto heterólogo opcional, por ejemplo, una molécula que extiende la semivida que es conocida en la técnica. En una modalidad, el segundo resto heterólogo se puede seleccionar del grupo que consiste en una región constante de inmunoglobulina o una parte de esta, albúmina o un fragmento de esta, un resto de unión a la albúmina, una secuencia PAS, una secuencia HAP, transferrina o un fragmento de esta y cualquier combinación de estos. En otra modalidad, H2 es un resto no polipéptido que se selecciona del grupo que consiste en polietilenglicol (PEG) , ácido polisiálico, almidón de hidroxietilo (HES) , un derivado de estos y cualesquiera combinaciones de estos. En determinadas modalidades, Hl es una primera región Fe y H2 es una segunda región Fe . La primera región Fe y la segunda región Fe pueden ser la misma o diferentes y se pueden enlazar entre sí por un enlazador o un enlace covalente, por ejemplo, un enlace disulfuro. En otra modalidad, la segunda región Fe está enlazada o asociada con una proteína del Factor VIII. Opcionalmente , podía haber un tercer resto heterólogo, H3 , que es un extensor de la semivida, que está enlazado al fragmento de VWF, el primer resto heterólogo o el segundo resto heterólogo. Los ejemplos no taxativos del tercer resto heterólogo pueden incluir un polipéptido o un resto no polipéptido o ambos. En una modalidad, el tercer resto polipéptido heterólogo se puede seleccionar del grupo que consiste en una región constante de
inmunoglobulina o una parte de esta, albúmina o un fragmento de esta, un resto de unión a la albúmina, una secuencia PAS, una secuencia HAP, transferrina o un fragmento de esta o cualquier combinación de estos. En otra modalidad, H2 es un resto no polipéptido que se selecciona del grupo que consiste en polietilenglicol (PEG) , ácido polisiálico, almidón de hidroxietilo (HES) , un derivado de estos y cualesquiera combinaciones de estos. En algunas modalidades, H3 está enlazado al fragmento de VWF o el primer o el segundo resto heterólogo por un enlazador escindible, por ejemplo, un enlazador escindible por trombina . Los ejemplos no taxativos de los enlazadores se describen en otras partes en la presente .
En otro aspecto, la invención proporciona una proteína quimérica que comprende un fragmento de VWF descrito en la presente, una proteína de FVIII y un enlazador opcional entre el fragmento de VWF y la proteína de FVIII. El fragmento de VWF puede estar unido a la proteína de FVIII. En una modalidad, una proteína quimérica comprende un fragmento de VWF que se describe en la presente, que se enlaza a un resto heterólogo. El resto heterólogo puede ser un resto que extiende la semivida de la proteína, que comprende un polipéptido, un resto no polipéptido o ambos. Ejemplos de tal resto polipéptido heterólogo incluye, por ejemplo, una región constante de inmunoglobulina o una parte de esta, albúmina o
un fragmento de esta, un resto de unión a la albúmina, una secuencia PAS, una secuencia HAP, cualesquiera derivados o variantes de estos o cualesquiera combinaciones de estos. Los ejemplos de un resto no polipéptido incluyen, por ejemplo, polietilenglicol (PEG) , ácido polisiálico, almidón de hidroxietilo (HES) , un derivado de estos o cualesquiera combinaciones de estos. En otra modalidad, el resto heterólogo es una primera región Fe enlazada al fragmento de VWF. En otras modalidades, la proteína quimérica también comprende una segunda región Fe enlazada a la proteína de FVIII. El fragmento de VWF o la proteína de FVIII se pueden enlazar a la primera región Fe o la segunda región Fe, respectivamente, mediante un enlazador. En aun otras modalidades, una proteína quimérica comprende un fragmento de VWF descrito en la presente enlazado a un primer resto heterólogo, por ejemplo, primera región Fe y una proteína de FVIII enlazada a un segundo resto heterólogo, por ejemplo, segunda región Fe, donde el fragmento de VWF se enlaza además al segundo resto heterólogo (por ejemplo, una segunda región Fe) o la proteína de FVIII por un enlazador o por enlace covalente o el primer resto heterólogo (por ejemplo, región Fe) se enlaza además a la proteína de FVIII o el segundo resto heterólogo (por ejemplo, segunda región Fe) por un enlazador o un enlace covalente. En algunas modalidades, el FVIII de la proteína quimérica tiene un dominio B parcial. En
algunas modalidades, la proteína de FVIII con un dominio B parcial es FVIII198 (SEQ ID NO: 105) . En otras modalidades, la proteína quimérica también comprende un motivo de reconocimiento de la sortasa.
En algunas modalidades, como resultado de la invención, la semivida de la proteína de FVIII se extiende en comparación con una proteína de FVIII sin el fragmento de VWF o FVIII de tipo salvaje. La semivida de la proteína de FVIII es al menos alrededor de 1.5 veces, al menos alrededor de 2 veces, al menos alrededor de 2.5 veces, al menos alrededor de 3 veces, al menos alrededor de 4 veces, al menos alrededor de 5 veces, al menos alrededor de 6 veces, al menos alrededor de 7 veces, al menos alrededor de 8 veces, al menos alrededor de 9 veces, al menos alrededor de 10 veces, al menos alrededor de 11 veces o al menos alrededor de 12 veces más larga que la semivida de una proteína de FVIII sin el fragmento de VWF. En una modalidad, la semivida de FVIII es de alrededor de 1.5 veces a alrededor de 20 veces, alrededor de 1.5 veces a alrededor de 15 veces o alrededor de 1.5 veces a alrededor de 10 veces más larga que la semivida del FVIII de tipo salvaje. En otra modalidad, la semivida del FVIII se extiende alrededor de 2 veces a alrededor de 10 veces, alrededor de 2 a alrededor de 9 veces, alrededor de 2 a alrededor de 8 veces, alrededor de 2 a alrededor de 7 veces, alrededor de 2 a alrededor de 6 veces, alrededor de 2 a alrededor de 5
veces, alrededor de 2 a alrededor de 4 veces, alrededor de 2 veces a alrededor de 3 veces, alrededor de 2.5 a alrededor de 10 veces, alrededor de 2.5 a alrededor de 9 veces, alrededor de 2.5 a alrededor de 8 veces, alrededor de 2.5 a alrededor de 7 veces, alrededor de 2.5 a alrededor de 6 veces, alrededor de 2.5 a alrededor de 5 veces, alrededor de 2.5 a alrededor de 4 veces, alrededor de 2.5 a alrededor de 3 veces, alrededor de 3 veces a alrededor de 10 veces, alrededor de 3 veces a alrededor de 9 veces, alrededor de 3 veces a alrededor de 8 veces, alrededor de 3 veces a alrededor de 7 veces, alrededor de 3 veces a alrededor de 6 veces, alrededor de 3 veces a alrededor de 5 veces, alrededor de 3 veces a alrededor de 4 veces, alrededor de 4 veces a alrededor de 6 veces, alrededor de 5 veces a alrededor de 7 veces o alrededor de 6 veces a alrededor de 8 veces en comparación con FVIII de tipo salvaje o una proteína de FVIII sin el fragmento de VWF. En otras modalidades, la semivida de FVIII es al menos alrededor de 17 horas, al menos alrededor de 18 horas, al menos alrededor de 19 horas, al menos alrededor de 20 horas, al menos alrededor de 21 horas, al menos alrededor de 22 horas, al menos alrededor de 23 horas, al menos alrededor de 24 horas, al menos alrededor de 25 horas, al menos alrededor de 26 horas, al menos alrededor de 27 horas, al menos alrededor de 28 horas, al menos alrededor de 29 horas, al menos alrededor de 30 horas, al menos
alrededor de 31 horas, al menos alrededor de 32 horas, al menos alrededor de 33 horas, al menos alrededor de 34 horas, al menos alrededor de 35 horas, al menos alrededor de 36 horas, al menos alrededor de 48 horas, al menos alrededor de 60 horas, al menos alrededor de 72 horas, al menos alrededor de 84 horas, al menos alrededor de 96 horas o al menos alrededor de 108 horas. En aun otras modalidades, la semivida de FVIII es de alrededor de 15 horas a alrededor de dos semanas, alrededor de 16 horas a alrededor de una semana, alrededor de 17 horas a alrededor de una semana, alrededor de 18 horas a alrededor de una semana, alrededor de 19 horas a alrededor de una semana, alrededor de 20 horas a alrededor de una semana, alrededor de 21 horas a alrededor de una semana, alrededor de 22 horas a alrededor de una semana, alrededor de 23 horas a alrededor de una semana, alrededor de 24 horas a alrededor de una semana, alrededor de 36 horas a alrededor de una semana, alrededor de 48 horas a alrededor de una semana, alrededor de 60 horas a alrededor de una semana, alrededor de 24 horas a alrededor de seis días, alrededor de 24 horas a alrededor de cinco días, alrededor de 24 horas a alrededor de cuatro días, alrededor de 24 horas a alrededor de tres días o alrededor de 24 horas a alrededor de dos días.
En algunas modalidades, la semivida promedio de la proteína de FVIII por sujeto es de alrededor de 15 horas, alrededor de 16 horas, alrededor de 17 horas, alrededor de 18
horas, alrededor de 19 horas, alrededor de 20 horas, alrededor de 21 horas, alrededor de 22 horas, alrededor de 23 horas, alrededor de 24 horas (1 día) , alrededor de 25 horas, alrededor de 26 horas, alrededor de 27 horas, alrededor de 28 horas, alrededor de 29 horas, alrededor de 30 horas, alrededor de 31 horas, alrededor de 32 horas, alrededor de 33 horas, alrededor de 34 horas, alrededor de 35 horas, alrededor de 36 horas, alrededor de 40 horas, alrededor de 44 horas, alrededor de 48 horas (2 días) , alrededor de 54 horas, alrededor de 60 horas, alrededor de 72 horas (3 días), alrededor de 84 horas, alrededor de 96 horas (4 días), alrededor de 108 horas, alrededor de 120 horas (5 días) , alrededor de seis días, alrededor de siete días (una semana), alrededor de ocho días, alrededor de nueve días, alrededor de 10 días, alrededor de 11 días, alrededor de 12 días, alrededor de 13 días o alrededor de 14 días.
En otro aspecto, una proteína quimérica de la invención comprende una fórmula que se selecciona del grupo que consiste en:
(a) V-L1-H1- L3- C-L2-H2,
(b) H2-L2-C- L3- Hl-Ll-V,
(c) C-L2-H2- L3- V-L1-H1,
(d) Hl-Ll-V- L3-H2-L2-C,
(e) H1-L1-V-L3-C-L2-H2,
(f) H2-L2-C- L3- V-L1-H1,
(g) V-L1-H1-L3- H2-L2-C,
(h) C-L2-H2- L3- Hl-Ll-V,
(i) H2-L3-H1-L1-V-L2-C,
(j) C-L2-V-L1-H1-L3-H2,
(k) V-L2-C-L1-H1-L3-H2, y
(1) H2-L3-H1-L1-C-L2-V,
donde V es un fragmento de VWF descrito en la presente ;
cada uno de Ll o L2 es un enlazador opcional, por ejemplo, un enlazador escindible por trombina;
L3 es un enlazador opcional, por ejemplo, un enlazador scFc, por ejemplo, un enlazador procesable;
cada uno de Hl o H2 es un resto heterólogo opcional; y
C es una proteína de FVIII; y
(-) es un enlace peptídico o uno o más aminoácidos.
En otros aspectos, una proteína quimérica de la invención comprende una fórmula que se selecciona del grupo que consiste en:
(m) V-L1-H1: H2-L2-C,
(n) V-L1-H1 :C-L2-H2,
(o) H1-L1-V:H2-L2-C,
(p) H1-L1-V:C-L2-H2,
(q) V:C-L1-H1 :H2,
(r) V:H1-L1-C:H2 ,
(s) H2 :H1-L1-C:V,
(t) C:V-L1-H1 :H2, y
(u) C:H1-L1-V:H2,
donde V es un fragmento de VWF descrito en la presente ;
cada uno de Ll o L2 es un enlazador opcional, por ejemplo, un enlazador escindible por trombina;
cada uno de Hl o H2 es un resto heterólogo opcional; y
C es una proteína de FVIII;
(-) es un enlace peptídico o uno o más aminoácidos y
( : ) es una asociación química o física entre Hl y H2, entre V y C y entre V y Hl y C y H2. (:) representa una asociación química, por ejemplo, al menos un enlace no peptídico. En determinadas modalidades, la asociación química, es decir, (:) es un enlace covalente . En algunas modalidades, la asociación entre Hl y H2 es un enlace covalente, por ejemplo, un enlace disulfuro. En otras modalidades, la asociación química, es decir, (:) es una interacción no covalente, por ejemplo, una interacción iónica, una interacción hidrofóbica, una interacción hidrofílica, una interacción de Van der Waals, una unión de hidrógeno. En determinadas modalidades, la asociación entre la proteína de FVIII y el fragmento de VWF es un enlace no
covalente . En otras modalidades, (:) es un enlace covalente no peptídico. En aun otras modalidades, (:) es un enlace peptídico. En una modalidad, Hl es un primer resto heterólogo. En una modalidad, el primer resto heterólogo puede extender la semivida de la actividad de FVIII. En otra modalidad, el primer resto heterólogo es un polipéptido, no resto polipéptido o ambos. En una modalidad, el primer resto polipéptido heterólogo se puede seleccionar del grupo que consiste en una región constante de inmunoglobulina o una parte de esta, albúmina o un fragmento de esta, un resto de unión a la albúmina, una secuencia PAS, una secuencia HAP, transferrina o un fragmento de esta y cualesquiera combinaciones de estos. En otra modalidad, el resto no polipéptido se selecciona del grupo que consiste en polietilenglicol (PEG) , ácido polisiálico, almidón de hidroxietilo (???) , un derivado de estos y cualesquiera combinaciones de estos. En algunas modalidades, H2 es un segundo resto heterólogo. El segundo resto heterólogo también puede ser un extensor de la semivida conocido en la técnica y puede ser un polipéptido, no resto polipéptido o una combinación de ambos. En una modalidad, el segundo resto heterólogo se selecciona del grupo que consiste en una región constante de inmunoglobulina o una parte de esta, albúmina o fragmento de esta, un resto de unión a la albúmina, una secuencia PAS, una secuencia HAP, transferrina o un fragmento
de esta y cualesquiera combinaciones de estos. En determinadas modalidades, el resto no polipéptido se selecciona del grupo que consiste en polietilenglicol (PEG) , ácido polisiálico, almidón de hidroxietilo (HES) , un derivado de estos y cualesquiera combinaciones de estos. En una modalidad particular, Hl es una primera región Fe. En algunas modalidades, H2 es una segunda región Fe. Opcionalmente, podría haber un tercer resto heterólogo, H3 , que es un extensor de la semivida . H3 puede estar enlazado a uno o más de V, C, Hl o H2 por un enlazador opcional, por ejemplo, un enlazador escindible, por ejemplo, un enlazador escindible por trombina. Ejemplos no taxativos del tercer resto heterólogo pueden incluir una región constante de inmunoglobulina o una parte de esta, albúmina o un fragmento de esta, polietilenglicol (PEG) , una secuencia PAS y almidón de hidroxietilo (HES) o un derivado de estos.
En determinadas modalidades, uno o más de los enlazadores usados para conectar el fragmento de VWF, la proteína de FVIII, el primer resto heterólogo y/o el segundo resto heterólogo de fórmulas (a) a (u) entre sí es un enlazador escindible. Uno o más de los sitios de escisión usados en la proteína quimérica se pueden escindir por una proteasa que se selecciona del grupo que consiste en el factor Xla, factor Xlla, calicreína, factor Vlla, factor IXa, factor Xa, factor lia (trombina), Elastasa-2, Granzima-B,
TEV, Enterocinasa, Proteasa 3C, Sortasa A, MMP-12, M P-13, MMP-17 y MMP-20. En otras modalidades, uno o más enlazadores usados en la fórmula (a) a (1) (por ejemplo, L3) comprende un enlazador procesable. Los enlazadores procesables se pueden escindir por una enzima intracelular tras la secreción. El enlazador procesable puede comprender un primer sitio de escisión (Pl) en la región del N-terminal del enlazador, un segundo sitio de escisión (P2) en la región del C-terminal del enlazador o ambos .
En algunas modalidades, uno o más de los enlazadores usados en la invención tienen una longitud de al menos alrededor de 1 a 2000 aminoácidos. En una modalidad específica, uno o más de los enlazadores usados en la invención tienen una longitud de al menos alrededor de 20, 35, 42, 48, 73, 98, 144, 288, 324, 576 o 864 aminoácidos. En una modalidad particular, uno o más de los enlazadores comprenden un péptido gly/ser. El péptido gly/ser puede ser (Gly4 Ser) 3 o (Gly4 Ser)4.
En otros aspectos, una proteína de FVIII en una proteína quimérica es una proteína de Factor VIII funcional. La proteína de FVIII puede comprender uno o más dominios de FVIII que se seleccionan del grupo que consiste en el dominio Al, el dominio A2 , el dominio B, el dominio A3 , el dominio Cl, el dominio C2 , uno o más fragmentos de estos y cualesquiera combinaciones de estos. En una modalidad, la
proteína de FVIII comprende el dominio B o una parte de este. En otra modalidad, la proteína de FVIII es un FVIII con dominio B SQ eliminado. En otras modalidades, la proteína de FVIII comprende FVIII de cadena simple. En aun otras modalidades, la proteína de FVIII comprende una cadena pesada de FVIII y una cadena ligera del Factor VIII, donde la cadena pesada y la cadena ligera se asocian entre sí por un enlace metálico. En determinadas modalidades, la proteína de FVIII tiene una baja afinidad a o no se une a una proteína relacionada con el receptor de lipoproteína de baja densidad (LRP) . Por ejemplo, una proteína de FVIII útil para la invención puede contener al menos una sustitución de aminoácidos que reduce la afinidad a o elimina la unión a la LRP. Ejemplos no taxativos de la al menos una sustitución de aminoácidos está en un residuo que corresponde al residuo 471, residuo 484, residuo 487, residuo 490, residuo 497, residuo 2092, residuo 2093 o dos o más combinaciones de estos de FVIII maduro de longitud completa. En algunas modalidades, la proteína de FVIII en una proteína quimérica de la presente invención contiene al menos una sustitución de aminoácidos, que induce a la proteína de FVIII a ser más estable que una proteína de FVIII sin la sustitución. En otras modalidades, la proteína de FVIII contiene al menos una sustitución de aminoácidos en el dominio A2 y al menos una sustitución de aminoácidos en el dominio A3 , donde el dominio A2 y el
dominio A3 están asociados entre sí por un enlace covalente. Ejemplos no taxativos de la sustitución de aminoácidos en el dominio A2 se producen en un residuo que corresponde al residuo 662 o 664 del FVIII maduro de longitud completa. Además, ejemplos no taxativos de la sustitución de aminoácidos en el dominio A3 se producen en un residuo que corresponde al residuo 1826 o 1828 del FVIII maduro de longitud completa que está polisialilado .
En otros aspectos, la invención proporciona un polinucleótido que codifica un fragmento de VWF descrito en la presente o una proteína quimérica descrita en la presente o un conjunto de polinucleótidos que comprenden una primera cadena de nucleotidos y una segunda cadena de nucleotidos, donde la primera cadena de nucleotidos codifica el fragmento de VWF y la segunda cadena de nucleotidos codifica la segunda región Fe o el factor de coagulación o un fragmento de estos de la proteína quimérica. En una modalidad, el conjunto de polinucleótidos comprende además una tercera cadena de polinucleótidos, que codifica una proproteína convertasa que corresponde a la familia de convertasa de proproteína tipo subtilisina. Ejemplos no taxativos de la proproteína convertasa incluyen proproteína convertasa subtilisina/kexina tipo 3 (PACE o PCSK3), proproteína convertasa subtilisina/kexina tipo 5 (PCSK5 o PC5) , proproteína convertasa subtilisina/kexina tipo 7 (PCSK7 o PC7) , o una Kex
2 de levadura. En aun otros aspectos, la invención incluye un vector que comprende el polinucleótido o el conjunto de polinucleótidos y uno o más promotores enlazados operativamente al polinucleótido o el conjunto de polinucleótidos o un conjunto de vectores que comprende un primer vector y un segundo vector, donde el primer vector codifica la primera cadena de polinucleótidos del conjunto de polinucleótidos y el segundo vector codifica la segunda cadena de polinucleótidos del conjunto de polinucleótidos. El conjunto de vectores también puede comprender un tercer vector, que comprende una tercera cadena de polinucleótidoa que codifica PC5 o PC7. En algunas modalidades, el vector comprende además PACE. En algunas modalidades, PACE escinde los dominios D1D2 del fragmento de VWF.
En algunos aspectos, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende el fragmento de VWF, la proteína quimérica, el polinucleótido, el conjunto de polinucleótidos, el vector o el conjunto de vectores y un portador farmacéuticamente aceptable. La composición de esta invención puede extender la semivida del Factor VIII. En otros aspectos, la invención incluye una célula hospedadora que comprende el polinucleótido, el conjunto de polinucleótidos, el vector o el conjunto de vectores.
En otros aspectos, la presente invención se refiere a una proteína quimérica que comprende una proteína de FVIII,
un resto adjunto y un enlazador opcional, donde el resto adjunto inhibe o evita que el V F endógeno se una a la proteína de FVIII y tiene al menos una propiedad de protección de FVIII tipo VWF. La propiedad de protección de FVIII tipo VWF comprender proteger la proteína de FVIII de una o más escisiones de proteasa, proteger la proteína de FVIII de la activación, estabilizar la cadena pesada y/o la cadena ligera de la protexna de FVIII o evitar la depuración de la proteína de FVIII por uno o más receptores depuradores.
El resto adjunto en la proteína quimérica puede inhibir o evitar que el VWF endógeno se una a la proteína de FVIII protegiendo o bloqueando un sitio de unión a VWF en la proteína de FVIII. En algunas modalidades, el sitio de unión a VWF se ubica en el dominio A3 o el dominio C2 de la proteína de FVIII o tanto el dominio A3 como el dominio C2 de la proteína de FVIII. En otra modalidad, el sitio de unión a VWF es la secuencia de aminoácidos que corresponde a aminoácidos 1669 a 1689 y 2303 a 2332 de la SEQ ID NO: 16. En algunas modalidades, el resto adjunto es un polipéptido, no resto polipéptido o ambos. El polipéptido útil como el resto adjunto puede comprender una secuencia de aminoácidos de al menos 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 o 1000 aminoácidos de longitud. Por ejemplo, el polipéptido útil como resto adjunto se puede
seleccionar del grupo que consiste en un fragmento de VWF, una región constante de inmunoglob lina o una parte de esta, albúmina o un fragmento de esta, un resto de unión a la albúmina, una secuencia PAS, una secuencia HAP, otras tecnologías que extienden la semivida y cualesquiera combinaciones de estas. El resto no polipéptido útil como resto adjunto se puede seleccionar del grupo que consiste en polietilenglicol (PEG) , ácido polisiálico, almidón de hidroxietilo (HES) , o un derivado de estos y cualesquiera combinaciones de estos. En una modalidad, el resto adjunto es el fragmento de VWF descrito en la presente. El resto adjunto y la proteína de FVIII se pueden enlazar, por ejemplo, por un enlazador o asociarse entre sí. El enlazador puede comprender un enlazador escindible, por ejemplo, en enlazador escindible por trombina.
En un aspecto, la invención proporciona un método para evitar o inhibir la unión de una proteína de FVIII con VWF endógeno que comprende agregar una cantidad eficaz del fragmento de VWF, la proteína quimérica, el polinucleótido o el conjunto de polinucleótidos a una célula que comprende una proteína de FVIII o un polinucleótido que codifica la proteína de FVIII, donde el fragmento de VWF se une a la proteína de FVIII. En otro aspecto, la invención incluye un método para evitar o inhibir la unión de la proteína de FVIII con VWF endógeno que comprende agregar una cantidad eficaz de
la proteína quimérica, el polinucleótido o el conjunto de polinucleótidos a un sujeto que lo necesita, donde el fragmento de VWF se une a la proteína de FVIII y por lo tanto evita o inhibe la unión de la proteína de FVIII. En algunos aspectos, la invención incluye un método para extender o aumentar la semivida de una proteína de FVIII, donde el método comprende agregar una cantidad eficaz del fragmento de VWF, la proteína quimérica, el polinucleótido o el conjunto de polinucleótidos a una célula que comprende una proteína de FVIII o un polinucleótido que codifica la proteína de FVIII o a un sujeto que lo necesita, donde el fragmento de VWF se une a la proteína de FVIII. En otros aspectos, la invención se refiere a un método para evitar o inhibir la depuración de una proteína de FVIII de una célula, donde el método comprende agregar una cantidad eficaz del fragmento de VWF, la proteína quimérica, el polinucleótido o el conjunto de polinucleótidos a una célula que comprende una proteína de FVIII o un polinucleótido que codifica la proteína de FVIII o a un sujeto que lo necesita, donde el fragmento de VWF se une a la proteína de FVIII.
En otro aspecto, la invención se refiere a un método para tratar una enfermedad o trastorno de sangrado en un sujeto que lo necesita que comprende administrarle una cantidad eficaz del fragmento de VWF, la proteína quimérica, el polinucleótido o el conjunto de polinucleótidos, donde la
enfermedad o trastorno de sangrado se selecciona del grupo que consiste en un trastorno de coagulación de sangrado, hemartrosis , sangrado muscular, sangrado oral, hemorragia, hemorragia a los músculos, hemorragia oral, traumatismo, trauma capitis, sangrado gastrointestinal, hemorragia intracraneal, hemorragia intraabdominal , hemorragia intratorácica, fractura ósea, sangrado del sistema nervioso central, sangrado en el espacio retrofaríngeo, sangrado en el espacio retroperitoneal y sangrado en la vaina del iliopsoas. En otras modalidades, el tratamiento es profiláctico o a demanda. En aun otras modalidades, la invención es un método para tratar una enfermedad o trastorno asociado con la enfermedad de von Willebrand tipo 2N a un sujeto que lo necesita, que comprende administrarle una cantidad eficaz del fragmento de VWF, la proteína quimérica, el polinucleótido o el conjunto de polinucleótidos , donde se trata la enfermedad o trastorno.
BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS
Figuras 1A-1F. Diagramas esquemáticos de las proteínas de VWF. La Fig. 1A muestra dos fragmentos de VWF que contienen aminoácidos 1 a 276 de la SEQ ID NO: 73 (aminoácidos 764 a 1039 de la SEQ ID NO: 2) . VWF-001 se sintetiza sin las secuencias de pre/propéptido de VWF, mientras que VWF-009 se sintetiza con las secuencias de pre/propéptido (dominios DI y D2) . El prepéptido de VWF-009
se escinde durante la síntesis y VWF- 009 contiene el propéptido con las secuencias de dominio D' y D3. La Fig. IB muestra tres fragmentos de VWF que contienen aminoácidos 1 a 477 de la SEQ ID NO: 73 (aminoácidos 764 a 1240 de la SEQ ID NO: 2). VWF-002 se sintetiza sin las secuencias de pre/propéptido . VWF-010 contiene los dominios D1D2 además de los dominios D'D3. VWF-013 contiene los dominios D1D2D' D3 además de residuos de alanina que sustituyen las cisteínas en los residuos 336 y 379 de la SEQ ID NO: 72. La Fig. 1C muestra dos fragmentos de VWF que contienen los dominios D'D3 y una parte del dominio Al. VWF- 003 tiene aminoácidos 764 a 1274 de la SEQ ID NO: 2) . VWF- 011 contiene los dominios D1D2 además de los dominios D'D3. La Fig. ID muestra dos construcciones, VWF-004 y VWF-012. VWF-004 contiene los dominios D'D3 y la secuencia completa del dominio Al. VWF-012 contiene los dominios D1D2D'D3 y la secuencia completa del dominio Al. La Fig. 1E muestra tres construcciones. VWF- 006 contiene los dominios D1D2D'D3 y el dominio CK de VWF (dominio de nudo de cisteína) . VWF- 008 es el VWF de longitud completa. VWF-031 (VWF-Fc) muestra una construcción que contiene los dominios D1D2D'D3 enlazados a una única región Fe por un enlazador escindible. VWF- 053 son los dominios D1D2. La Fig. 1F muestra la proteína de VWF de longitud completa que comprende el propéptido (los dominios DI y D2) y subunidades maduras (los dominios D' , D3 , Al, A2 , A3 , D4 , Bl-
3, Cl-2) . La proteína de VWF es una proteína de alrededor de 250 kDa y forma multímeros (> 20 Da) mediante la formación de enlaces disulfuro. La proteína de VWF se asocia con FVIII (95-98%) en complejo no covalente y luego extiende la semivida de FVIII protegiendo el FVIII de la escisión/activación de proteasa, estabilizando la cadena pesada y ligera y evitando la depuración de FVIII por receptores de depurador. La proteína de VFW también puede limitar la semivida de FVIII por la depuración del complejo FVIII -VWF a través de receptores de VWF y evitar la pinocitosis y reciclaje de rFVIIIFc.
Figuras 2A y 2B. Diagramas esquemáticos de ejemplos de construcciones de heterodímeros VWF: FVIII. La construcción de la fig. 2A muestra un fragmento de VWF que tiene los dominios D'D3 de VWF de longitud completa (aminoácidos 1-477 de la SEQ ID NO: 73) y que contiene sustituciones de alanina en los residuos 336 y 379 de la SEQ ID NO: 72. La construcción de proteína quimérica (FVIII 064/065) comprende el C-terminal de un fragmento de VWF enlazado a una primera región Fe por un enlazador y FVIII se enlaza a una segunda región Fe, donde la segunda región Fe también se enlaza al N-terminal de un fragmento de VWF por un enlazador (por ejemplo, fórmula C-Hl-L1-V-L2-H2, donde V es un fragmento de VWF, C es FVIII, Hl y H2 son regiones Fe y Ll y L2 son enlazadores escindibles) . La construcción de la Figura 2B es una construcción de
heterodímero VWF: FVIII procesada intracelularmente donde el enlazador entre la segunda Fe y el N-terminal del fragmento de VWF se ha escindido. FVIII-064 contiene los dominios D'D3 de VWF (aminoácidos 1 a 477 de la SEQ ID NO: 73 con sustituciones C336A y C379) . FVIII-065 contiene los dominios D'D3 de VWF (aminoácidos 1 a 276 de la SEQ ID NO: 73) . FVIII-136 contiene FVIIIFc enlazado al Fe de fragmento D'D3 por un enlazador que se puede procesar por una enzima de proteasa intracelular . Cuando se expresa FVIII-136, la enzima escinde el enlazador entre la segunda Fe (fusionado a FVIII-LC) y el fragmento D'D3 de VWF (fusionado a la primera Fe), mientras que la región Fe fusionada a (o enlazada a) FVIII-LC forma un enlace covalente (por ejemplo, un enlace disulfuro) donde la primera Fe está fusionado a (o enlazado a) el fragmento de VWF. FVIII-148 es un FVIIIFc de cadena simple con el fragmento D'D3 (un FVIII de cadena simple introduciendo una mutación R1645A/R1648A al gen de FVIII) .
Figura 3. Diagramas esquemáticos de los ejemplos de construcciones de heterodímero VWF: FVIII que contienen ejemplos de enlazadores variables entre VWF y Fe. Las construcciones (FVIII-064, FVIII-159, FVIII-160, FVIII-178 y FVIII-179) tienen la estructura común representada como fórmula C-H1-L1-V-L2-H2 , pero contienen ejemplos de diferentes enlazadores o sustituciones de aminoácidos. Las construcciones mostradas contienen el mismo fragmento de VWF
que es el dominio D' y D3 de VWF (es decir, aminoácidos 1 a 477 de la SEQ ID NO: 73 con sustituciones de aminoácidos C336A y C379A) . La construcción FVIII 64 tiene un enlazador escindible por trombina (es decir, L2) entre el fragmento de VWF y Fe (es decir, H2), que tiene 20 aminoácidos. La construcción FVIII 159 tiene un enlazador escindible por trombina (es decir, L2) entre el fragmento de VWF y Fe (es decir, H2 ) , que tiene 35 aminoácidos. La construcción FVIII 160 tiene un enlazador escindible por trombina (es decir, L2) entre el fragmento de VWF y Fe (es decir, H2), que tiene 48 aminoácidos. Las construcciones FVIII-180, FVIII-181 y FVIII-182 son derivados de FVIII-160 que contienen una mutación K2092A en el dominio Cl de FVIII, mutación K2093A en el dominio Cl de FVIII y mutación K2092A/K2093A en el dominio Cl de FVIII, respectivamente. La construcción FVIII-178 tiene un enlazador escindible por trombina (es decir, L2) entre el fragmento de VWF y Fe (es decir, H2) , que tiene 73 aminoácidos. La construcción FVIII-179 tiene un enlazador escindible por trombina (es decir, L2) entre el fragmento de VWF y Fe (es decir, H2) , que tiene 98 aminoácidos.
Figuras 4A-4H: Diagramas esquemáticos de ejemplos de construcciones de FVIII -VWF, donde VWF es un fragmento de D1D2D' D3 de VWF. El Enlazador es un enlazador de longitud variable que contiene un sitio de escisión, por ejemplo, un sitio de escisión de trombina, SC FVIII es un FVIII de cadena
simple, que contiene las sustituciones R1645A/R1648A, H es un resto heterólogo, por ejemplo, una región constante de inmunoglobulina o una parte de esta, un resto para la conjugación de polietilenglicol (PEG) y/o PEG, una albúmina o fragmento de albúmina, un resto de unión a la albúmina, una secuencia HAP, un resto para polisialilación y/o ácido polisiálico, un resto para almidón de hidroxietilo (HES) y/o HES, o una secuencia PAS, etc., HC FVIII es una cadena pesada de FVIII, LC FVIII es una cadena ligera de FVIII y Fe es una región Fe de una región constante de inmunoglobulina. La Figura 4A tiene una fórmula de VWF-Enlazador-SC FVIII. La Figura 4B tiene una fórmula de F-Enlazador-H-Enlazador-SC FVIII. Los enlazadores (el primer enlazador entre VWF y H y el segundo enlazador entre H y SC FVIII) pueden ser idénticos o diferentes. La Figura 4C tiene una fórmula de VWF-Enlazador-SC FVIII-Enlazador-H. Los enlazadores (el primer enlazador entre VWF y SC FVIII y el segundo enlazador entre SC FVIII y H) pueden ser idénticos o diferentes. La Figura 4D tiene una fórmula de VWF-Enlazador-HC FVIII -H-Enlazador-LC FVIII. Los enlazadores (el primer enlazador entre VWF y HC FVIII y el segundo enlazador entre H y LC FVIII) pueden ser idénticos o diferentes. La Figura 4E tiene una fórmula de HC FVIII-H-LC FVIII-Enlazador-primera Fe-Enlazador-VWF- Enlazador-segunda Fe. Los enlazadores (el primer enlazador entre LC FVIII y la primera Fe, el segundo enlazador entre la
primera Fe y VWF y el tercer enlazador entre VWF y la segunda Fe) pueden ser idénticos o diferentes. Los enlazadores pueden ser un enlazador escindible. Por ejemplo, el enlazador entre la primera Fe y VWF puede ser un enlazador escindible que comprende un sitio de escisión en el N-terminal y/o el C-terminal del enlazador. La primera Fe y la segunda Fe pueden ser idénticas o diferentes. La Figura 4F tiene una fórmula de HC FVIII-H-LC FVIII-Enlazador-primera Fe-Enlazador-VWF-Enlazador-segunda Fe. Los enlazadores (el primer enlazador entre LC FVIII y la primera Fe, el segundo enlazador entre la primera Fe y VWF y el tercer enlazador entre VWF y la segunda Fe) pueden ser idénticos o diferentes. Uno o más enlazadores pueden ser un enlazador escindible. Por ejemplo, el enlazador entre la primera Fe y VWF puede ser un enlazador escindible que comprende un sitio de escisión en el N-terminal y/o el C-terminal del enlazador. La primera Fe y la segunda Fe pueden ser idénticas o diferentes. La Figura 4G tiene una fórmula de SC FVIII-Enlazador-Fc-Enlazador-VWF-H-Enlazador-Fc . La Figura 4H tiene una fórmula de SC FVIII-Enlazador-Fc-Enlazador-VWF-H-Enlazador-Fc pegilado o hesilado. Los enlazadores (el primer enlazador entre SC FVIII y la primera Fe, el segundo enlazador entre la primera Fe y VWF y el tercer enlazador entre H y la segunda Fe) pueden ser idénticos o diferentes. Uno o más enlazadores pueden ser un enlazador escindible. Por ejemplo, el enlazador entre la primera Fe y VWF puede ser un
enlazador escindible que comprende un sitio de escisión en el N-terminal y/o el C-terminal del enlazador. La primera Fe y la segunda Fe pueden ser idénticas o diferentes.
Figura 5. Diagramas esquemáticos de sistema de cotransfección de heterodímero FVIII-VWF. La construcción FVIII-155 contiene la secuencia FVIII de longitud completa (donde un residuo de alanina sustituye los residuos de arginina en 1645 y 1648) enlazados a una región Fe. VWF-031 contiene el fragmento D1D2D'D3 (donde un residuo de alanina sustituye los residuos de Cisteína en 336 y 379) que está enlazado a otra región Fe con un enlazador escindible de 48 trombinas . Luego del procesamiento intracelular, la construcción FVIII-155 produce un FVIII de cadena simple y longitud completa (SCFVIII) fusionado a un fragmento Fe, la construcción VWF-031 produce un fragmento D'D3 de 477 aminoácidos enlazado a otro fragmento Fe. Se pueden formar dos enlaces covalentes entre los fragmentos Fe que se enlazan al SC FVIII o el fragmento D'D3, esto a su vez permite una asociación covalente de FVIII y D'D3, que es la naturaleza principal del producto final deseado.
La Figura 6 es la SDS PAGE reductora y no reductora de VWF-009 (D1D2DO3 1-276 aa x 6 HIS) , que muestra que VWF-009 existe como un monómero. No procesado significa WF-009 con el propéptido (los dominios D1D2) .
La Figura 7 es la SDS PAGE reductora y no reductora de
VWF-002 (D'D3 1-477 aa x 6 his) o VWF-010 (D1D2D'D3 1-477 aa x 6 his) , que muestra que VWF-002 existe como un monómero y VWF-010 existe como un dímero.
La Figura 8 muestra la digestión de trombina del heterodímero FVIII -VWF que se muestra en la Figura 2B. El carril 1 muestra el marcador. El carril 2 es rFVIII-Fc sin trombina. El carril 3 es rFVIII-Fc con trombina. El carril 5 es FVIIIFc-VWF. El carril 6 muestra FVIIIFc-VWF y trombina. Al indica el dominio Al de FVIII, A2 indica el dominio A2 de FVIII y Aa3 LC indica la cadena ligera de FVIII.
Las Figuras 9A-9B muestran la actividad de FVIII medida por un ensayo cromogénico de FVIII. La Fig. 9A muestra el perfil farmacocinético de rFVIII y rFVIIIFc en ratones HemA. La Fig. 9B muestra el perfil PK de rFVIII y rFVIIIFc en ratones con doble inactivación (DKO) de FVIII/VWF. El eje Y muestra la actividad de FVIII en mlU/mL, y el eje X muestra el tiempo.
Las Figuras 10A-10B muestran la protección de FVIII por los fragmentos de D'D3 como se muestra por el nivel plasmático de mFVIII (mlU/mL) y el nivel de expresión de VWF (nM/mL) 48 horas después de la inyección de plásmidos . Los fragmentos de VWF usados para mostrar la protección de FVIII son VWF-001 (276aa, monómero) , VWF-009 (276aa, monómero) , VWF-002 (477aa, monómero) , VWF-010 (477aa, dímero) , VWF-003 (511aa, monómero), VWF-011 (511aa, dímero), VWF-004 (716aa,
monómero) , VWF-012 (716aa, dímero) , VWF-006 y VWF-008.
Las Figuras 11A y 11B muestran el perfil farmacocinético de rBDD-FVIII en ratones DKO FVIII-VWF cuando se coadministra con fragmentos D'D3. La Figura 11A muestra la actividad de FVIII (mlU/mL) medida por un ensayo cromogénico de FVIII después de la coadministración de rBDD-FVIII y VWF-002 o rBDD-FVIII y VWF-010 o rBDD-FVIII solo en ratones DKO FVIII/VWF. La Fig . 11B muestra el nivel plasmático de VWF-002 y VWF-010 (ng/mL) luego de la administración. El eje X representa el tiempo en horas.
Las Figuras 12A-12C muestran el perfil farmacocinético de rFVIIIFc en ratones que expresan D'D3 de VWF. La Figura 12A muestra la línea de tiempo de la inyección hidrodinámica (HDI) del dominio D'D3 que codifica el ADN plásmido (día -5), dosificación intravenosa de rFVIIIFc (día 0) y recolección de muestras PK (día 0 - día 3) . La Figura 12B muestra la actividad de FVIII plasmática de después de la infusión de rFVIIIFc (mlU/mL) medida por un ensayo cromogénico de FVIII en ratones DKO FVIII/VWF con HDI de los dominios D1D2D' D3 (477aa) (círculo) y los dominios D1D2D' D3 (477aa) con sustituciones de cisteína (rectángulo) en ratones DKO FVIII/VWF. La actividad de FVIII en ratones de control sin HDI de los dominios D'D3 se muestra como un triángulo. La Fig. 12C muestra el nivel plasmático de D'D3 (ng/mL) luego de la administración de HDI del dímero D1D2D' D3 o la
construcción de ADN del monómero D1D2D'D3. El eje X representa el tiempo en horas.
La Figura 13 muestra la selección del enlazador D'D3-Fc por HDI en ratones DKO de FVIII/VWF. Las diferentes longitudes de los enlazadores (20aa (FVIII-064) , 35aa (FVIII-159) o 48aa (FVIII-160) ) se insertaron entre los dominios D'D3 y la región Fe. La actividad de FVIII (mIU/ml) se midió por un ensayo cromogénico de FVIII después de HDI en ratones DKO FVIII/VWF.
La Figura 14 muestra HDI de heterodímero FVIIIFc/D'D3 de cadena simple en ratones DKO FVIII/VWF. Las actividades de FVIII de rFVIIIFc-D'D3 procesado (de cadena doble) (pSY -FVIII-136) y rFVIIIFc-D' D3 de cadena simple (pSY -FVIII-148) se midieron 24 horas y 48 horas después de HDI.
La Figura 15 muestra la afinidad de unión de heterodímero FVIII-155/VWF-031 a hVWF inmovilizado por ensayo Octet . También se usaron FVIIIFc, FVIII e IgG como controles. El eje x muestra el tiempo en segundos y el eje y muestra la unión en nanómetros (nm) .
La Figura 16 muestra la farmacocinética de FVIII- 155/VWF-031 en ratones con deficiencia de FVIII/VWF (FVIII/VWF DKO) . El eje x indica el tiempo en horas y el eje y indica el porcentaje de recuperación de FVIII en contraste con la entrada.
Figuras 17A-17C: Diagramas esquemáticos de ejemplos de
construcciones de fragmento de VWF, donde VWF es un fragmento D1D2D' D3 de VWF; el Enlazador es un enlazador de longitud variable que contiene un sitio ' de escisión, por ejemplo, un sitio de escisión de trombina; H es un resto heterólogo, por ejemplo, una región constante de inmunoglobulina o una parte de esta, un resto para la conjugación de polietilenglicol (PEG) y/o PEG, una albúmina o fragmento de albúmina, un resto de unión a la albúmina, una secuencia HAP, un resto para polisialilación y/o ácido polisiálico, un resto para almidón de hidroxietilo (HES) y/o HES, o una secuencia PAS, etc. y Fe es una región Fe de una inmunoglobulina. La Figura 17A tiene una fórmula de D1D2 -D' parcial D3-H-Parcial D3 -Enlazador-Fc . La Figura 17B tiene una fórmula de D1D2-Parcial D' -H- parcial D'D3- Enlazador-Fc. La Figura 17C tiene una fórmula de D1D2-Pegilado o hesilado D'D3- Enlazador-Fc. El enlazador puede estar opcionalmente escindido.
Figuras 18A-18B: La fig. 18A muestra que FVIIIFc pierde la actividad de FVIII tanto en plasma de HemA (diamante) y DKO (cuadrado) durante el tiempo. La actividad de FVIII se mide por ensayo cromogénico. El eje x muestra el tiempo en horas y el eje y muestra la actividad relativa. La fig. 18B muestra que la pérdida de la actividad de FVIII se debe a la disociación o degradación de la cadena pesada (HC) . El panel de la izquierda muestra un ensayo de inmunoprecipitación usando anticuerpo policlonal anti-FVIII de oveja en 4-15% de
gel Bio-rad. El gel se redujo y se sometió a imágenes por un sistema Bio-rad. El carril 1 muestra un marcador no teñido con Bio-rad; el carril 2 muestra FVIIIFc y PBS; el carril 3 muestra plasma de FVIIIFc y DKO y el carril 5 muestra el anticuerpo policlonal anti-FVIII de oveja solo. El panel derecho muestra el análisis Western del gel usando anticuerpo anti-cadena pesada FVIII (GMA012) . El carril 1 muestra un marcador no teñido con Bio-rad; el carril 2 muestra FVIIIFc y PBS; el carril 3 muestra plasma de FVIIIFc y DKO y el carril 4 muestra el anticuerpo policlonal anti-FVIII de oveja solo.
Figuras 19A-19B: muestran la actividad de FVIII de FVIIIFc de tipo salvaje (círculo) , scFVIIIFc (FVIII de cadena simple) (triángulo relleno) o heterodímero FVIII :VWF (por ejemplo, FVIII155/VWF31) (triángulo vacío) por ensayo cromogénico en plasma de ratones DKO (Fig. 19A) y plasma de ratones HemA (Fig. 19B) en función del tiempo. El eje Y muestra la actividad relativa de FVIII. FVIIIFc de tipo salvaje contiene una cadena doble de FVIII (es decir, cadena pesada de FVIII y cadena ligera de FVIII sostenidas entre sí de forma no covalente) y por lo tanto tiene tres cadenas, una cadena pesada de FVIII, una cadena ligera de FVIII fusionada a una Fe y una Fe solo) . ScFVIIIFc contiene una cadena simple de FVIII y por lo tanto tiene dos cadenas, una con un FVIII de cadena simple fusionado a una Fe y otra con una Fe solo. El heterodímero FVIII :VWF (por ejemplo, FVIII155/VWF031)
contiene FVIII de cadena simple fusionado a una Fe y un fragmento de VWF (D'D3) fusionado a una Fe.
La Figura 20 muestra el procesamiento del dominio D1D2 del fragmento de VWF (por ejemplo, VWF-031 (DlD2D'D3Fc) ) por PC5 o PACE (Furina) en diferentes concentraciones. El procesamiento de D1D2 se muestra en un 4-15% de gel Bio-rad a una condición reducida por un aparato de resonancia magnética Bio-rad. El carril 1 muestra VWF031 solo; el carril 2 muestra PC5 solo; el carril 3 muestra PACE solo; el carril 4 muestra VWF031 y PC5 a 2.5%; el carril 5 muestra VWF031 y PC5 a 5%; el carril 6 muestra VWF031 y PC5 a 7.5%; el carril 7 muestra VWF031 y PC5 a 10%; el carril 8 muestra VWF031 y PACE a 2.5%; el carril 9 muestra VWF031 y PACE a 5%; el carril 10 muestra VWF031 a 7.5% y el carril 11 muestra VWF031 y PACE a 10%.
Figuras 21A y 21 B: Fig. 21A) muestra un ensayo de unión de un heterodímero FVIII :VWF (por ejemplo, FVIII-155/VWF-031) por un instrumento ForteBio octet. Para el ensayo, VWF de longitud completa se capturó usando un sensor APS. La unión de FVIIIFc y FVIII al VWF de longitud completa se muestra en el panel de la parte inferior izquierda. La falta de unión de FVIIIY1680 (un mutante que no tiene afinidad por VWF) y heterodímero FVIII :VWF (FVIII155/VWF031) se muestra en el panel de la parte inferior derecha. Fig. 21B) muestra otro ensayo de unión del heterodímero FVIII :VWF (por ejemplo, FVIII-155/VWF-031) . En este ensayo, las construcciones (construcción VWF031, FVIII-
155/VWF031 o FVIII) se inmovilizaron en el sensor de proteína G. Se midió la unión de las construcciones a FVIII.
La Figura 22 muestra la afinidad de unión de los dominios D'D3 de VWF con una molécula de FVIII medida por un experimento de resonancia de plasmones superficiales. La construcción VWF031 (100RU) se capturó por IgG anti -humana 1000RU. El FVIII con dominio B eliminado se aplicó en un modo de cinética de ciclo único en un ajuste 1:1. La cantidad total f e 4.
La Figura 23 muestra efectos de diferente longitud de enlazador en las construcciones de heterodímero FVIIIFc/VWF en farmacocinética cuando se administran a ratones DKO FVIII/VWF. Se insertaron tres enlazadores diferentes (48 aa, 73aaf o 98aa) entre D'D3 y Fe, es decir, VWF031, VWF035 y VWF036. La actividad de FVIII normalizada a un valor de 5 min (%) se muestra en el eje Y.
Las Figuras 24A-24E muestran ejemplos de ligación de sortasa de un fragmento de VWF con FVIII. Fig. 24A) muestra dos construcciones de ligación, (1) un fragmento de VWF fusionado a un motivo de reconocimiento de sortasa (por ejemplo, LPXTG) en el C-terminal y (2) FVIII que tiene glicina (n) en el N-terminal. Luego de la reacción con sortasa, el fragmento de VWF y el motivo de reconocimiento de sortasa se ligan al N-terminal de FVIII. Fig. 24B) muestra dos construcciones de ligación, (1) FVIII fusionado a un
motivo de reconocimiento de sortasa en el C-terminal y (2) un fragmento de VWF que tiene glicina (n) en su N-terminal. Luego de la reacción con sortasa, FVIII y el motivo de reconocimiento de sortasa se fusionan al fragmento de VWF en el N-terminal del fragmento de VWF. Fig. 24C) muestra dos construcciones de ligación, (1) un fragmento de VWF fusionado a un motivo de reconocimiento de sortasa por un enlazador de longitud variable y (2) FVIII fusionado a glicina (n) en el N-terminal. Luego de la reacción con sortasa, el VWF fusionado por un enlazador al motivo de reconocimiento de sortasa se liga al N-terminal de FVIII. Fig. 24D) muestra dos construcciones de ligación, (1) FVIII fusionado por un enlazador de longitud variable a un motivo de reconocimiento de sortasa y (2) un fragmento de VWF fusionado a glicina (n) en su N-terminal. Luego de la reacción con sortasa, el FVIII fusionado por un enlazador al motivo de reconocimiento de sortasa se liga al N-terminal del fragmento de VWF. Fig. 24E) muestra una construcción de ligación que contiene un fragmento de VWF fusionado por un enlazador de longitud variable a un motivo de reconocimiento de sortasa, que también se fusiona a un sitio de escisión de proteasa (por ejemplo, sitio de escisión de trombina) fusionado por un enlazador de longitud variable a una Fe.
La Figura 25 muestra una comparación esquemática de FVIII155 y FVIII198. FVIII155 codifica una proteína de
FVIIIFc de cadena simple. FVIII198 es un dominio B parcial que contiene una molécula 226N6 de FVIIIFc de cadena simple. 226 representa el aminoácido 226 de N-terminal del dominio B de FVIII y N6 representa los seis sitios de glicosilación N en el dominio B.
Figuras 26A-26B: Fig. 26A muestran un ensayo de estabilidad que mide la actividad de relatividad de FVIII155 y FVIII198 en plasma DKO en función del tiempo. Como se puede ver en la figura, la presencia del dominio B parcial en FVIII198 aumentó la estabilidad de FVIIIFc de cadena simple en comparación con FVIII155; Fig.26B) muestra una comparación de las semividas de FVIII198, FVIII155 y de cadena doble (dcFVIIIFc) en ratones DKO. Como se puede ver en la figura, FVIII de cadena simple (FVIII155) tiene un aumento de 1.5 veces en la semivida en comparación con FVIII de cadena doble. FVIII de cadena simple con el dominio B 266N6 (FVIII198) tuvo otro aumento de 1.5 veces en la semivida. La gráfica muestra la recuperación de FVIII en contraste con el valor de 5 minutos (%) en función del tiempo.
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION
DEFINICIONES
Cabe destacar que el término "un" o "una" entidad se refiere a uno o más de esa entidad; por ejemplo, se entiende que "una secuencia de nucleótidos" representa una o más secuencias de nucleótidos. Como tal, los términos "un" (o
"una"), "uno o más" y "al menos uno" se pueden usar de manera intercambiable en la presente.
El término "polinucleótido" o "nucleótido" pretende abarcar un único ácido nucleico así como múltiples ácidos nucleicos y se refiere a una molécula o construcción de ácido nucleico aislada, por ejemplo, ARN mensajero (ARNm) o ADN plásmido (ADNp) . En determinadas modalidades, un polinucleótido comprende un enlace fosfodiéster convencional o un enlace no convencional (por ejemplo, un enlace de amida, tal como el que se encuentra en ácidos nucleicos de péptidos (PNA) ) . El término "ácido nucleico" se refiere a cualesquiera uno o más segmentos de ácido nucleico, por ejemplo, fragmentos de ADN o ARN, presentes en un polinucleótido. Un ácido nucleico o polinucleótido "aislado" se refiere a una molécula de ácido nucleico, ADN o ARN, que se retiró de su ambiente natural. Por ejemplo, un polinucleótido recombinante que codifica un polipéptido de Factor VIII contenido en un vector se considera aislado a efectos de la presente invención. Otros ejemplos de un polinucleótido aislado incluyen polinucleótidos recombinantes mantenidos en células hospedadoras heterólogas o purificados (parcial o sustancialmente) de otros polinucleótidos en una solución. Las moléculas de ARN aislado incluyen transcripciones de ARN in vivo o in vitro de polinucleótidos de la presente invención. Los polinucleótidos o ácidos nucleicos aislados de
acuerdo con la presente invención también incluyen esas moléculas producidas sintéticamente. Además, un polinucleótido o un ácido nucleico puede incluir elementos de regulación tales como promotores, potenciadores , sitios de unión al ribosoma o señales de terminación de transcripción.
Tal como se usa en la presente, una "región codificante" o "secuencia codificante" es una parte de un polinucleótido que consiste en codones que se pueden traducir en aminoácidos. Pese a que un "codón de terminación" (TAG, TGA o TAA) típicamente no se traduce en un aminoácido, se puede considerar parte de una región codificante, pero cualquier secuencia flanqueante, por ejemplo promotores, sitios de unión al ribosoma, terminadores de transcripción, intrones y similares, no son parte de una región codificante. Los límites de una región codificante se determinan típicamente por un codón de inicio en el extremo 51 , que codifica el extremo amino del polipéptido resultante, y un codón de terminación de traducción en el extremo 3', que codifica el C-terminalarboxilo del polipéptido resultante. Dos o más regiones codificantes de la presente invención pueden estar presentes en una única construcción de polinucleótido, por ejemplo, en un único vector o en construcciones de polinucleótido separadas, por ejemplo, en vectores separados (diferentes) . Se deduce de esto, entonces, que un único vector puede contener solo una región codificante o comprende
dos o más regiones codificantes, por ejemplo, un único vector puede codificar por separado un dominio de unión A y un dominio de unión B como se describe a continuación. Además, un vector, polinucleótido o ácido nucleico de la invención puede codificar regiones codificantes heterólogas, ya sea fusionadas o no fusionadas a un ácido nucleico que codifica un dominio de unión de la invención. Las regiones codificantes heterólogas incluyen, de modo no taxativo, elementos o motivos especializados, tal como un péptido de señal de secreción o un dominio funcional heterologo.
Determinadas proteínas secretadas por células de mamífero se asocian con un péptido de señal de secreción que se escinde de la proteína madura una vez que se inició la exportación de la cadena de proteína en crecimiento a través del retículo endoplasmático rugoso. Los expertos en la técnica saben que los péptidos de señal se fusionan generalmente al N-terminal del polipéptido y se escinden del polipéptido completo o de "longitud completa" para producir una forma secretada o "madura" del polipéptido. En determinadas modalidades, se usa un péptido de señal natural, por ejemplo, un péptido de señal de cadena pesada o cadena ligera de inmunoglobulina, o un derivado funcional de esa secuencia que retiene la capacidad de dirigir la secreción del polipéptido que está asociada operativamente con este. De manera alternativa, se puede usar un péptido de señal de
mamífero heterólogo, por ejemplo, un activador de plasminógenos de tejido humano (TPA) o péptido de señal de ß-glucuronidasa de ratón o un derivado funcional de estos.
El término "corriente abajo" se refiere a una secuencia de nucleótidos ubicada 31 respecto de una secuencia de nucleótidos de referencia. En determinadas modalidades, las secuencias de nucleótido corriente abajo se refieren a secuencias que siguen el punto de partida de la transcripción. Por ejemplo, el codón de inicio de traducción de un gen se ubica corriente abajo respecto del sitio de inicio de transcripción.
El término "corriente arriba " se refiere a una secuencia de nucleótidos ubicada 5' respecto de una secuencia de nucleótidos de referencia. En determinadas modalidades, las secuencias de nucleótido corriente arriba se refieren a las secuencias que se ubican en el lado 5' de una región codificante o punto de inicio de transcripción. Por ejemplo, la mayoría de los promotores se ubican antes respecto del sitio de inicio de la transcripción.
Como se usa en la presente, el término "región reguladora" se refiere a secuencias de nucleótidos ubicadas corriente arriba (secuencias no codificantes 5')/ dentro, o corriente abajo (secuencias no codificantes 3') de una región codificante y que influyen la transcripción, procesamiento de ARN, estabilidad o traducción de la región codificante
asociada. Las regiones reguladoras pueden incluir promotores, secuencias líder de traducción, intrones, secuencias de reconocimiento de poliadenilación, sitios de procesamiento de ARN, sitios de unión de efectores y estructuras de tallo y bucle. Si una región codificante se desea para la expresión en una célula eucariota, una señal de poliadenilación y secuencia de terminación de transcripción se ubicarán generalmente 3' respecto de la secuencia codificante.
Un polinucleótido que codifica un producto génico, por ejemplo, un polipéptido, puede incluir un promotor y/u otros elementos de control de transcripción o traducción asociados operativamente con una o más regiones codificantes. En una asociación operativa una región codificante para un producto génico, por ejemplo, un polipéptido, está asociada con una o más regiones reguladoras de forma de colocar la expresión del producto génico bajo la influencia o control de una o más regiones reguladoras. Por ejemplo, una región codificante y un promotor están "operablemente asociados" si la inducción de la función del promotor da como resultado la transcripción de ARNm que codifica el producto génico codificado por la región codificante, y si la naturaleza del enlace entre el promotor y la región codificante no interfiere con la capacidad del promotor de dirigir la expresión del producto génico o no interfiere con la capacidad de la plantilla de ADN de transcribirse. Otros elementos de control de
transcripción, además de un promotor, por ejemplo potenciadores , operadores, represores y señales de terminación de transcripción, también se pueden asociar operativamente con una región codificante para dirigir la expresión del producto génico.
Los expertos en la técnica conocen una variedad de regiones de control de transcripción. Estos incluyen, de modo no taxativo, regiones de control de transcripción que funcionan en células vertebradas tales como, de modo no taxativo, segmentos promotores y potenciadores de citomegalovirus (el promotor temprano inmediato, junto con el intrón A) , virus del simio 40 (el promotor temprano) y retrovirus (tales como virus sarcoma Rous) . Otras regiones de control de transcripción incluyen las derivadas de genes vertebrados tales como actina, proteína de choque de calor, hormona de crecimiento bovino y ß-globina de conejo, así como otras secuencias que pueden controlar la expresión génica en células eucariotas . Las regiones de control de transcripción adecuadas adicionales incluyen promotores y potenciadores específicos del tejido, así como promotores inducibles por linfocina (por ejemplo, promotores inducibles por interferones o interleucinas) .
De manera similar, los expertos en la técnica conocen una variedad de elementos de control de traducción. Estos incluyen, de modo no taxativo, sitios de unión al ribosoma,
codones de inicio y terminación de la traducción y elementos derivados de picornavirus (particularmente un sitio de entrada al ribosoma interno o IRES, también denominado secuencia CITE) .
El término "expresión", tal como se usa en la presente, se refiere a un proceso por el cual un polinucleótido produce un producto génico, por ejemplo, un ARN o un polipéptido. Incluye, de modo no taxativo, la transcripción del polinucleótido en ARN mensajero (ARNm) , ARN de transferencia (ARNt) , ARN horquillado corto (ARNhc) , ARN interferente pequeño (ARNip) o cualquier otro producto de ARN y la traducción de un ARNm en un polipéptido. La expresión produce un "producto génico". Tal como se usa en la presente, un producto génico puede ser un ácido nucleico, por ejemplo, un ARN mensajero producido por la transcripción de un gen o un polipéptido que se traduce desde una transcripción. Los productos génicos descritos en la presente incluyen además ácidos nucleicos con modificaciones postraduccionales , por ejemplo, poliadenilación o corte y empalme, o polipéptidos con modificaciones de postraducción, por ejemplo, metilación, glicosilación, la adición de lípidos, asociación con subunidades de otras proteínas o escisión proteolítica .
Un "vector" se refiere a cualquier vehículo para la clonación y/o transferencia de un ácido nucleico a una célula hospedadora. Un vector puede ser un replicón al que se le puede unir otro segmento de ácido nucleico como para provocar
la replicacion del segmento unido. Un "replicón" se refiere a cualquier elemento génico (por ejemplo, plásmido, fago, cósmido, cromosoma, virus) que funciona como una unidad autónoma de replicacion in vivo, es decir, que puede replicarse en su propio control. El término "vector" incluye tanto vehículos virales como no virales para introducir el ácido nucleico en una célula in vitro, ex vivo o in vivo. En la técnica se conoce y usa una gran cantidad de vectores incluyendo, por ejemplo, plásmidos, virus eucariotas modificados o virus de bacterias modificadas. La inserción de un polinucleótido en un vector adecuado se puede lograr ligando los fragmentos de polinucleótidos apropiados en un vector elegido que tiene extremos cohesivos complementarios.
Los vectores se pueden modificar genéticamente para codificar marcadores o indicadores seleccionables que facilitan la selección o identificación de células que tienen el vector incorporado. La expresión de marcadores o indicadores seleccionables permite la identificación y/o selección de células hospedadoras que incorporan y expresan otras regiones codificantes contenidas en el vector. Ejemplos de genes marcadores seleccionables conocidos y usados en la técnica incluyen: genes que facilitan la resistencia a la ampicilina, estreptomicina, gentamicina, kanamicina, higromicina, herbicida bialaphos, sulfonamida y similares y genes que se usan como marcadores fenotípicos, es decir,
genes reguladores de antocianina, genes de isopentanil transferasa y similares. Ejemplos de indicadores conocidos y usados en la técnica incluyen: luciferasa (Luc) , proteína fluorescente verde (GFP) , acetiltransferasa cloramfenicol (CAT) , -galactosidasa (LacZ) , -glucuronidasa (Gus) y similares. Los marcadores seleccionables también se pueden considerar indicadores .
El término "plásmido" se refiere a un elemento extra cromosómico que con frecuencia tiene un gen que no es parte del metabolismo central de la célula y generalmente está en forma de moléculas de ADN de cadena doble circular. Estos elementos pueden ser secuencias de replicación autónoma, secuencias de integración de genoma, secuencias de fago o nucleótido, lineal, circular o superhelicoidal de un ADN o ARN de cadena simple o doble, derivado de cualquier fuente, donde una cantidad de secuencias de nucleótidos se unieron o recombinaron en una única construcción que puede introducir un fragmento promotor y secuencia de ADN para un producto génico seleccionado junto con una secuencia no traducida 31 apropiada en una célula.
Los vectores virales eucariotas que se pueden usar incluyen, de modo no taxativo, vectores de adenovirus, vectores de retrovirus, vectores de virus adenoasociados , poxvirus, por ejemplo, vectores de virus vaccinia, vectores de baculovirus o vectores de herpesvirus. Los vectores no
virales incluyen plásmidos, liposomas, lípidos con carga eléctrica (citofectinas) , complejos de proteína de ADN y biopolímeros .
Un "vector de clonación" se refiere a un "replicón", que es una longitud de unidad de un ácido nucleico que se replica secuencialmente y que comprende un origen de replicación, tal como un plásmido, fago o cósmido, al que se puede unir otro segmento de ácido nucleico como para provocar la replicación del segmento unido. Determinados vectores de clonación pueden replicarse en un tipo celular, por ejemplo, bacterias y expresarse en otras, por ejemplo, células eucariotas . Los vectores de clonación típicamente comprenden una o más secuencias que se pueden usar para la selección de células que comprenden el vector y/o uno o más sitios de clonación múltiples para la inserción de las secuencias de ácido nucleico de interés.
El término "vector de expresión" se refiere a un vehículo diseñado para permitir la expresión de una secuencia de ácido nucleico insertada luego de la inserción en una célula hospedadora. La secuencia de ácido nucleico insertada se coloca en asociación operativa con regiones reguladoras como se describe anteriormente.
Se introducen vectores en células hospedadoras por métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, transíección, electroporación, microinyección, transducción, fusión
celular, DEAE dextrano, precipitación de fosfato de calcio, lipofección (fusión de lisosoma) , uso de una pistola de genes o un transportador del vector de ADN.
"Cultivo", "cultivar" y "cultivando", como se usan en la presente, significa incubar células en condiciones in vitro que permiten el crecimiento o división celular o para mantener células en un estado vivo. "Células cultivadas", como se usa en la presente, significa células que se propagan in vitro.
Como se usa en la presente, el término "polipéptido" pretende abarcar un único "polipéptido" así como múltiples "polipéptidos " y se refiere a una molécula compuesta por monómeros (aminoácidos) unidos linealmente por enlaces amida (también conocidos como enlaces peptídicos) . El término "polipéptido" se refiere a cualquier cadena o cadenas de dos o más aminoácidos y no se refiere a una longitud específica del producto. Por lo tanto, los péptidos, dipéptidos, tripéptidos, oligopéptidos , "proteína", "cadena de aminoácidos" o cualquier otro término usado para referirse a una cadena o cadenas de dos o más aminoácidos, se incluyen en la definición de "polipéptido" y el término "polipéptido" se puede usar en vez de, o de manera intercambiable con, cualquiera de estos términos. El término "polipéptido" también pretende referirse a los productos de modificaciones corriente abajo a la expresión del polipéptido, incluyendo,
de modo no taxativo, glicosilación, acetilación, fosforilación, amidación, derivación por grupos de protección/bloqueo conocidos, escisión proteolítica o modificación por aminoácidos de origen no natural. Un polipéptido puede derivar de una fuente biológica natural o producirse por tecnología recombinante, pero no se traduce necesariamente de una secuencia de ácido nucleico designada. Se puede generar de cualquier forma, incluyendo por síntesis química .
Un polipéptido "aislado", o un fragmento, variante o derivado de este se refiere a un polipéptido que no está en su entorno natural. No se requiere un nivel de purificación particular. Por ejemplo, un polipéptido aislado simplemente se puede retirar de su ambiente natural. Polipéptidos y proteínas producidos recombinantemente y expresados en células hospedadoras se consideran aislados a efectos de la invención, como son los polipéptidos naturales o recombinantes que se separaron, fraccionaron o purificaron parcial o sustancialmente por cualquier técnica adecuada.
También se incluyen en la presente invención fragmentos o variantes de polipéptidos y cualquier combinación de estos. El término "fragmento" o "variante", cuando se refiere a dominios de unión al polipéptido o moléculas de unión de la presente invención incluyen cualesquiera polipéptidos que retienen al menos algunas de las propiedades (por ejemplo,
afinidad de unión a FcRn para un dominio de unión a FcRn o una variante de Fe, actividad de coagulación para una variante de FVIII o actividad de unión a FVIII para el fragmento de VWF) o el polipéptido de referencia. Los fragmentos de polipéptidos incluyen fragmentos proteolíticos , así como fragmentos de supresión, además de fragmentos de anticuerpos específicos discutidos en otra parte en la presente, pero no incluyen el polipéptido de longitud completa de origen natural (o polipéptido maduro) . Variantes de dominios de unión al polipéptido o moléculas de unión de la presente invención incluyen fragmentos como se describe anteriormente, y también polipéptidos con secuencias de aminoácidos alteradas debido a sustituciones, supresiones o inserciones de aminoácidos. Las variantes pueden ser de origen natural o no ser de origen natural . Las variantes que no son de origen natural se pueden producir usando métodos de mutagénesis conocidos en la técnica. Los polipéptidos variantes pueden comprender sustituciones, supresiones o adiciones de aminoácidos conservadoras o no conservadoras.
El término "fragmento de VWF" o "fragmentos de VWF" usado en la presente significa cualquier fragmento de VWF que interactúa con FVIII y retiene al menos una o más propiedades que el VWF de longitud completa le proporciona normalmente al FVIII, por ejemplo, prevención de la activación prematura a FVIIIa, prevención de la proteólisis prematura, prevención de
la asociación con membranas de fosfolípidos que podrían llevar a una depuración prematura, prevención de unión a receptores de depuración de FVIII que pueden unir FVIII desnudo pero no FVIII unido a VWF y/o estabilización de las interacciones entre cadena pesada y cadena ligera de FVIII. El término "fragmento de VWF" como se usa en la presente no incluye la proteína de VWF de longitud completa o madura. En una modalidad particular, el "fragmento de VWF" como se usa en la presente comprende un dominio D 1 y un dominio D3 de la proteína de VWF, pero no incluye el dominio Al, el dominio A2 , el dominio A3 , el dominio D4 , el dominio Bl, el dominio B2, el dominio B3, el dominio Cl, el dominio C2 y el dominio CK de la proteína de VWF.
El término "factor que limita la semivida" o "factor que limita la semivida de FVIII" como se usa en la presente indica un factor que evita que la semivida de una proteína de FVIII sea más larga que 1.5 veces o 2 veces en comparación con FVIII de tipo salvaje (por ejemplo, ADVATE® o REFACTO®) . Por ejemplo, VWF de longitud completa o maduro puede actuar como un factor que limita la semivida de FVIII induciendo la depuración del complejo de FVIII y VWF del sistema por una o más vías de depuración de VWF. En un ejemplo, un VWF endógeno es un factor que limita la semivida de FVIII. En otro ejemplo, una molécula de VWF recombinante de longitud completa unida no covalentemente a una proteína de FVIII es
un factor que limita la semivida de FVIII.
El término "VWF endógeno" como se usa en la presente indica moléculas de VWF presentes naturalmente en el plasma. La molécula de VWF endógena puede ser un multímero, pero puede ser un monómero o un dímero. VWF endógeno en plasma se une a FVIII y forma un complejo no covalente con FVIII.
Una "sustitución de aminoácido conservadora" es una donde el residuo de aminoácidos se remplaza con un residuo de aminoácidos con una cadena lateral similar. En la técnica se han definido familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares, incluyendo cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina) , cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico) , cadenas laterales polares sin carga (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína) , cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano) , cadenas laterales ramificadas beta (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina) . Por lo tanto, si un aminoácido en un polipéptido se remplaza con otro aminoácido de la misma familia de cadena lateral, la sustitución se considera conservadora. En otra modalidad, una hebra de aminoácidos se
puede remplazar de forma conservadora con una hebra estructuralmente similar que difiere en el orden y/o composición de los miembros de la familia de la cadena lateral .
Como se conoce en la técnica, la "identidad de secuencia" entre dos polipéptidos se determina comparando la secuencia de aminoácidos de un polipéptido con la secuencia de un segundo polipéptido. Cuando se discute en la presente, se puede determinar si cualquier polipéptido particular es al menos alrededor de 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% o 100% idéntico a otro polipéptido usando métodos y programas/software informáticos conocidos en la técnica tales como, de modo no taxativo, programa BESTFIT (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versión 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711) . BESTFIT usa el algoritmo de homología local de Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981), para encontrar el mejor segmento de homología entre dos secuencias. Cuando se usa BESTFIT o cualquier otro programa de alineación de secuencia para determinar si una secuencia particular es, por ejemplo, 95% idéntica a una secuencia de referencia de acuerdo con la presente invención, los parámetros se fijan, por supuesto, de modo que el porcentaje de identidad se calcule durante la longitud completa de la secuencia de polipéptido de
referencia y que se permitan brechas en homología de hasta 5% de la cantidad total de aminoácidos en la secuencia de referencia .
Como se usa en la presente, un "aminoácido que corresponde a" o "aminoácido equivalente" en una secuencia de VWF o una secuencia de proteína de FVIII se identifica por alineación para maximizar la identidad o similitud entre una primera secuencia de VWF o FVIII y una segunda secuencia de VWF o FVIII. La cantidad usada para identificar un aminoácido equivalente en una segunda secuencia de VWF o FVIII se basa en la cantidad usada para identificar los aminoácidos correspondientes en la primera secuencia de VWF o FVIII.
Una proteína "de fusión" o "quimérica" comprende una primera secuencia de aminoácidos enlazada a una segunda secuencia de aminoácidos con la cual no está naturalmente enlazada. Las secuencias de aminoácidos que normalmente existen en proteínas separadas se pueden juntar en el polipéptido de fusión o las secuencias de aminoácidos que normalmente existen en la misma proteína se pueden colocar en una nueva disposición en el polipéptido de fusión, por ejemplo, fusión de un dominio de Factor VIII de la invención con un dominio Fe de inmunoglobulina . Se crea una proteína de fusión, por ejemplo, por síntesis química o creando y traduciendo un polinucleótido en el que las regiones de péptido se codifican en la relación deseada. Una proteína
quimérica también puede comprender una segunda secuencia de aminoácidos asociada con la primera secuencia de aminoácidos por un enlace covalente, no peptídico o un enlace no covalente .
Tal como se usa en la presente, el término "semivida" se refiere a una semivida biológica de un polipéptido particular in vivo. La semivida se puede representar por el tiempo necesario para que la mitad de la cantidad administrada a un sujeto se depure de la circulación y/u otros tejidos del animal. Cuando se construye una curva de depuración de un polipéptido dado en función del tiempo, la curva es generalmente bifásica con una fase a rápida y una fase ß más larga. La fase a típicamente representa un equilibrio del polipéptido Fe administrado entre el espacio intra y extravascular y se determina, en parte, por el tamaño del polipéptido. La fase ß típicamente representa el catabolismo del polipéptido en el espacio intravascular . En algunas modalidades, las proteínas de FVIII y quiméricas que comprenden FVIII son monofásicas y por lo tanto no tienen una fase alfa, sino la única fase beta. Por lo tanto, en algunas modalidades, el término semivida como se usa en la presente se refiere a la semivida del polipéptido en la fase ß. La semivida de fase ß típica de un anticuerpo humano en los seres humanos es de 21 días.
El término "heterólogo" como se aplica a un
polinucleótido o un polipéptido, significa que el polinucleótido o polipéptido deriva de una entidad diferente a la de la entidad con la cual se está comparando. Por lo tanto, un polipéptido heterólogo enlazado a un fragmento de VWF significa una cadena de polipéptidos que está enlazada a un fragmento de VWF y no es una parte de origen natural del fragmento de VWF. Por ejemplo, un polinucleótido o antígeno heterólogo puede derivar de una especie diferente, tipo celular diferente de un individuo o el mismo tipo celular o uno diferente de individuos diferentes.
El término "enlazado" como se usa en la presente se refiere a una primera secuencia de aminoácidos o de nucleótidos unida covalente o no covalentemente a una segunda secuencia de aminoácidos o secuencia de nucleótidos, respectivamente. El término "enlazado covalentemente" o "enlace covalente" se refiere a un enlace covalente, por ejemplo, un enlace disulfuro, un enlace peptídico o uno o más aminoácidos, por ejemplo, un enlazador, entre los dos restos que están enlazados entre sí. La primera secuencia de aminoácidos o nucleótidos se puede unir o yuxtaponer directamente a la segunda secuencia de aminoácidos o nucleótidos o alternativamente una secuencia intermedia puede unir covalentemente la primera secuencia a la segunda secuencia. El término "enlazado" significa no solo una fusión de una primera secuencia de aminoácidos a una segunda
secuencia de aminoácidos en el C-terminal o el N-terminal, sino que también incluye la inserción de toda la primera secuencia de aminoácidos (o la segunda secuencia de aminoácidos) en cualesquiera dos aminoácidos de la segunda secuencia de aminoácidos (o la primera secuencia de aminoácidos, respectivamente) . En una modalidad, la primera secuencia de aminoácidos se puede unir a una segunda secuencia de aminoácidos por un enlace peptídico o un enlazador. La primera secuencia de nucleótidos se puede unir a una segunda secuencia de nucleótidos por un enlazador o un enlace fosfodiéster . El enlazador puede ser un péptido o un polipéptido (para cadenas de polipéptidos) o un nucleótido o una cadena de nucleótidos (para cadenas de nucleótidos) o cualquier resto químico (tanto para cadenas de polipéptidos como de polinucleótidos) . El enlace covalente se indica a veces con (-) o guión.
Tal como se usa en la presente, el término "asociado con" se refiere a un enlace covalente o no covalente formado entre una primera cadena de aminoácidos y una segunda cadena de aminoácidos. En una modalidad, el término "asociado con" significa un enlace covalente, no peptídico o un enlace no covalente. En algunas modalidades, esta asociación se indica por dos puntos, es decir, (:). En otra modalidad, significa un enlace covalente excepto un enlace peptídico. En otras modalidades, el término "asociado covalentemente" como se usa
en la presente significa una asociación entre dos restos por un enlace covalente, por ejemplo, un enlace disulfuro, un enlace peptídico o uno o más aminoácidos (por ejemplo, un enlazador) . Por ejemplo, la cisteína de aminoácidos comprende un grupo tiol que puede formar un enlace o puente disulfuro con un grupo tiol en un segundo residuo de cisteína. En la mayoría de las moléculas de IgG de origen natural, las regiones CH1 y CL están asociadas por un enlace disulfuro y las dos cadenas pesadas están asociadas por dos enlaces disulfuro en posiciones que corresponden a 239 y 242 usando el sistema de numeración Kabat (posición 226 o 229, sistema de numeración EU) . Ejemplos de enlaces covalentes incluyen, de modo no taxativo, un enlace peptídico, un enlace metálico, un enlace de hidrógeno, un enlace disulfuro, un enlace sigma, un enlace pi, un enlace delta, un enlace glicosídico, un enlace agnóstico, un enlace flexionado, un enlace dipolar, un retroenlace Pi, un enlace doble, un enlace triple, un enlace cuádruple, un enlace quíntuple, un enlace séxtuple, conjugación, hiperconjugación, aromaticidad, hapticidad o anti enlace. Ejemplos no taxativos de enlace no covalente incluyen un enlace iónico (por ejemplo, enlace catión-pi o enlace de sal) , un enlace metálico, un enlace de hidrógeno (por ejemplo, enlace de dihidrógeno, complejo de dihidrógeno, enlace de hidrógeno de barrera baja o enlace de hidrógeno simétrico), fuerza van der alls, fuerza de dispersión de
London, un enlace mecánico, un enlace de halógeno, aurofilicidad, intercalado, apilamiento, fuerza entrópica o polaridad química.
El término "híbrido monómero-dímero" usado en la presente se refiere a una proteína quimérica que comprende una primera cadena de polip ptidos y una segunda cadena de polipéptidos , que se asocian entre sí por un enlace disulfuro, donde la primera cadena comprende un factor de coagulación, por ejemplo, Factor VIII y una región Fe y la segunda cadena comprende, consiste esencialmente en o consiste en una región Fe sin el factor de coagulación. La construcción de híbrido monómero-dímero por lo tanto es un híbrido que comprende un aspecto monómero que tiene solo un factor de coagulación y un aspecto dímero que tiene dos regiones Fe .
Tal como se usa en la presente, el término "sitio de escisión" o "sitio de escisión enzimática" se refiere a un sitio reconocido por una enzima. Determinados sitios de escisión enzimática comprenden un sitio de procesamiento intracelular . En una modalidad, un polipéptido tiene un sitio de escisión enzimática escindido por una enzima que se activa durante la cascada de coagulación, de modo que la escisión de tales sitios ocurre en el sitio de formación del coágulo. Ejemplos de tales sitios incluyen, por ejemplo, los reconocidos por la trombina, Factor Xla o Factor Xa. Ejemplos
de sitios de escisión FXIa incluyen, por ejemplo, TQSFNDFTR (SEQ ID NO: 47) y SVSQTSKLTR (SEQ ID NO : 48). Ejemplos de sitios de escisión de trombina incluyen, por ejemplo, DFLAEGGGVR (SEQ ID NO: 49), TTKIKPR (SEQ ID NO : 50), LVPRG (SEQ ID NO: 55) y ALRPR (aminoácidos 1 a 5 de la SEQ ID NO: 51) . Se conocen en la técnica otros sitios de escisión enzimática .
Tal como se usa en la presente, el término "sitio de procesamiento" o "sitio de procesamiento intracelular" se refiere a un tipo de sitio de escisión enzimática en un polipéptido que es la diana de enzimas que funcionan luego de la traducción del polipéptido. En una modalidad, estas enzimas funcionan durante el transporte del lumen de Golgi hasta el compartimiento trans-Golgi. Las enzimas de procesamiento intracelular escinden polipéptidos antes de la secreción de la proteína de la célula. Ejemplos de estos sitios de procesamiento incluyen, por ejemplo, a los que se dirige la familia PACE/furina (donde PACE es una sigla para enzima de escisión de aminoácidos básicos apareados) de endopeptidasas . Estas enzimas se ubican en la membrana Golgi y escinden proteínas en el lado de C-terminalarboxi del motivo de secuencia Arg- [cualquier residuo] - (Lys o Arg) -Arg. Tal como se usa en la presente la familia "furina" de enzimas incluye, por ejemplo, PCSK1 (también denominado PCl/Pc3), PCSK2 (también denominado PC2 ) , PCSK3 (también denominado
furina o PACE) , PCSK4 (también denominado PC4) , PCSK5 (también denominado PC5 o PC6) , PCSK6 (también denominado PACE4) , o PCSK7 (también denominado PC7/LPC, PC8 o SPC7) . En la técnica se conocen otros sitios de procesamiento.
El término "furina" se refiere a las enzimas que corresponden a EC n.° 3.4.21.75. Furina es convertasa proproteína tipo subtilisina, también denominada PACE (Enzima de escisión de aminoácidos básicos apareados) . La furina borra secciones de proteínas de precursor inactivas para convertirlas en proteínas biológicamente activas. Durante su transporte intracelular, el propéptido se escinde de la molécula de VWF madura por una enzima de Furina en el Golgi .
En las construcciones que incluyen más de un sitio de procesamiento o escisión, se entenderá que estos sitios pueden ser iguales o diferentes.
Trastorno hemostático, como se usa en la presente, significa una afección genéticamente heredada o adquirida caracterizada por una tendencia a la hemorragia, ya sea espontánea o como resultado de un traumatismo, debido a una capacidad deteriorada o una incapacidad de formar un coágulo de fibrina. Ejemplos de estos trastornos incluyen las hemofilias. Las tres formas principales son hemofilia A (deficiencia del factor VIII) , hemofilia B (deficiencia del factor IX o "enfermedad de Christmas") y hemofilia C (deficiencia del factor XI, tendencia a sangrado leve). Otros
trastornos hemostáticos incluyen, por ejemplo, enfermedad de Von Willebrand, deficiencia del Factor XI (deficiencia de PTA) , deficiencia del Factor XII, deficiencias o anormalidades estructurales en el fibrinógeno, protrombina, Factor V, Factor VII, Factor X o factor XIII, síndrome de Bernard-Soulier, que es un defecto o deficiencia de GPIb. GPIb, el receptor de VWF, puede ser defectuoso y llevar a una falta de formación de coágulos primaria (hemostasis primaria) y un aumento de la tendencia a sangrar y la trombastenia de Glanzman y Naegeli (trombastenia de Glanzmann) . En la insuficiencia hepática (formas aguda y crónica) , existe una producción insuficiente de factores de coagulación por el hígado; esto puede aumentar el riesgo de sangrado.
Las moléculas quiméricas de la invención se pueden usar profilácticamente. Tal como se usa en la presente, el término "tratamiento profiláctico" se refiere a la administración de una molécula antes de un episodio de sangrado. En una modalidad, el sujeto que necesita un agente hemostático general se está sometiendo, o está por someterse, a cirugía. La proteína quimérica de la invención puede administrarse antes o después de la cirugía como un profiláctico. La proteína quimérica de la invención puede administrarse durante o después de la cirugía para controlar un episodio de sangrado agudo. La cirugía puede incluir, de modo no taxativo, trasplante de hígado, resección de hígado.
procedimientos dentales o trasplante de células madre.
La proteína quimérica de la invención también se usa para el tratamiento a demanda (también denominado "episódico"). El término "tratamiento a demanda" o "tratamiento episódico" se refiere a la administración de una molécula quimérica en respuesta a síntomas de un episodio de sangrado o antes de una actividad que puede provocar un sangrado. En un aspecto, el tratamiento a demanda (episódico) puede proporcionarse a un sujeto cuando comienza el sangrado, tal como después de una lesión, o cuando se espera un sangrado, tal como antes de una cirugía. En otro aspecto, el tratamiento a demanda se puede proporcionar antes de las actividades que aumentan el riesgo de sangrado, tales como deportes de contacto.
Tal como se usa en la presente, el término "sangrado agudo" se refiere a un episodio de sangrado independientemente de la causa subyacente. Por ejemplo, un sujeto puede tener un traumatismo, uremia, un trastorno de sangrado hereditario (por ejemplo, deficiencia del factor VII) , un trastorno de plaquetas o resistencia debida al desarrollo de anticuerpos a factores de coagulación.
Tratar, tratamiento y tratando, como se usan en la presente se refieren a, por ejemplo, la reducción de la gravedad de una enfermedad o afección; la reducción de la duración del transcurso de una enfermedad; la mejora de uno o
más síntomas asociados con una enfermedad o afección; proporcionar efectos beneficios a un sujeto con una enfermedad o afección, sin necesariamente curar la enfermedad o afección, o la profilaxis de uno o más síntomas asociados con una enfermedad o afección. En una modalidad, el término "tratar" o "tratamiento" significa mantener un nivel de depresión de FVIII de al menos alrededor de 1 IU/dL, 2 IU/dL, 3 IU/dL, 4 IU/dL, 5 IU/dL, 6 IU/dL, 7 IU/dL, 8 IU/dL, 9 IU/dL, 10 IU/dL, 11 IU/dL, 12 IU/dL, 13 IU/dL, 14 IU/dL, 15 IU/dL, 16 IU/dL, 17 IU/dL, 18 IU/dL, 19 IU/dL o 20 IU/dL en un sujeto mediante la administración de una proteína quimérica o un fragmento de VWF de la invención. En otra modalidad, tratar o tratamiento significa mantener un nivel de depresión de FVIII entre alrededor de 1 y alrededor de 20 IU/dL, alrededor de 2 y alrededor de 20 IU/dL, alrededor de 3 y alrededor de 20 IU/dL, alrededor de 4 y alrededor de 20 IU/dL, alrededor de 5 y alrededor de 20 IU/dL, alrededor de 6 y alrededor de 20 IU/dL, alrededor de 7 y alrededor de 20 IU/dL, alrededor de 8 y alrededor de 20 IU/dL, alrededor de 9 y alrededor de 20 IU/dL o alrededor de 10 y alrededor de 20 IU/dL. Tratamiento o tratar una enfermedad o afección también puede incluir mantener la actividad de FVIII en un sujeto a un nivel comparable con al menos alrededor de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% o 20% de la actividad de FVIII en un sujeto no
hemofílico. El nivel mínimo de depresión requerido para el tratamiento se puede medir por uno o más métodos conocidos y se puede a ustar (aumentar o disminuir) para cada persona.
Proteínas quiméricas
La presente invención se refiere a extender la semivida de una proteína de Factor VIII evitando o inhibiendo la asociación de un factor que limita la semivida de FVIII (por ejemplo, VWF endógeno) in vivo con la proteína de FVIII. VWF endógeno se asocia con alrededor de 95% a alrededor de 98% de FVIII en complejos no covalentes. El VWF endógeno unido a una proteína de FVIII es conocido por proteger el FVIII de varias formas. Por ejemplo, VWF de longitud completa (como un multímero que tiene alrededor de 250 kDa) puede proteger al FVIII de la escisión de proteasa y la activación de FVIII, estabilizar la cadena pesada y/o cadena ligera de FVIII y evitar la depuración de FVIII por receptores de depurador. Sin embargo, al mismo tiempo, el VWF endógeno limita la semivida de FVIII evitando la pinocitosis y depurando el complejo FVIII-VWF del sistema a través de la vía de depuración de VWF. Se cree, tal como se muestra en los ejemplos, que el VWF endógeno es el factor que limita la semivida que evita que la semivida de una proteína de FVIII fusionada con un extensor de la semivida sea mayor que alrededor de dos veces el FVIII de tipo salvaje. Por lo tanto, la presente invención evita o inhibe la interacción
entre VWF endógeno y una proteína de FVIII usando un resto adjunto, evitando así que la proteína de FVIII se depure a través de la vía de depuración de VWF y/o induzca la pinocitois. En una modalidad, el resto adjunto puede evitar o inhibir la unión de la proteína de FVIII con VWF endógeno y tiene al menos una propiedad de protección de FVIII tipo VWF. Además, el resto adjunto reduce la depuración de FVIII del sistema evitando o inhibiendo la interacción con VWF endógeno. Los restos adjuntos de la presente invención se unen o están asociados con (por ejemplo, mediante un enlace no covalente) una proteína de FVIII y/o bloquean física o químicamente el sitio de unión a VWF en la proteína de FVIII. La proteína de FVIII asociada con el resto adjunto por lo tanto se depura de la circulación más lentamente por uno o más receptores de depuradoción de VWF, en comparación con FVIII de tipo salvaje o FVIII no asociado con un resto adjunto.
Ejemplos de restos adjuntos de la presente invención incluyen, por ejemplo, polipéptidos o modificaciones, adiciones, supresiones o variaciones químicas o físicas de la proteína de FVIII. El resto adjunto útil en la presente invención puede comprender un polipéptido, no resto polipéptido o ambos. Ejemplos no taxativos del polipéptido útil como resto adjunto incluyen, por ejemplo, un fragmento de VWF descrito en la presente, una región constante de
inmunoglobulina o una porción de esta, transferrina o un fragmento de esta, albúmina o un fragmento de esta, un resto de unión a la albúmina, una secuencia HAP, una secuencia PAS o cualesquiera combinaciones de estos. Ejemplos no taxativos del resto no polipéptido incluyen, polietilenglicol (PEG) , ácido polisiálico, almidón de hidroxietilo (HES) , un derivado de estos o cualquier combinación de estos. En la técnica se conocen otros restos de estos útiles en la presente invención.
En una modalidad, el resto adjunto se asocia (o enlaza) con la proteína de FVIII por un enlace covalente o no covalente . En algunos casos, sin embargo, el bloqueo físico o la asociación química (por ejemplo, formación de enlace no covalente) entre el resto adjunto y la proteína de FVIII puede no ser lo suficientemente resistente como para proporcionar un complejo estable que comprende la proteína de FVIII y el resto adjunto en presencia de un VWF endógeno. Por ejemplo, un fragmento de VWF que forma un enlace no covalente con una proteína de FVIII sin ninguna otra conexión puede disociarse fácilmente in vivo de la proteína de FVIII en presencia de VWF endógeno, remplazando el fragmento de VWF (por ejemplo, VWF recombinante, es decir rVWF) con VWF endógeno. Por lo tanto, la proteína de FVIII unida no covalentemente al VWF endógeno se sometería a la vía de depuración de VWF y se depuraría del sistema. Para evitar la
disociación del resto adjunto de la proteína de FVIII, en algunas modalidades, el enlace entre la proteína de FVIII y el resto adjunto es un enlace covalente, por ejemplo, un enlace peptídico, uno o más aminoácidos o un enlace disulfuro. En determinadas modalidades, la asociación (es decir, enlace) entre el resto adjunto y la proteína de FVIII es un enlace peptídico o un enlazador entre la proteína de FVIII y el resto adjunto ("enlazador de FVIII/AM"). Ejemplos no taxativos del enlazador se describen en otras partes en la presente. En algunas modalidades, el resto adjunto es un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en al menos alrededor de 10, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2500, 3000, o 4000 aminoácidos. En otra modalidades, el resto adjunto es un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en alrededor de 100 a alrededor de 200 aminoácidos, alrededor de 200 a alrededor de 300 aminoácidos, alrededor de 300 a alrededor de 400 aminoácidos, alrededor de 400 a alrededor de 500 aminoácidos, alrededor de 500 a alrededor de 600 aminoácidos, alrededor de 600 a alrededor de 700 aminoácidos, alrededor de 700 a alrededor de 800 aminoácidos, alrededor de 800 a alrededor de 900 aminoácidos o alrededor de 900 a alrededor de 1000 aminoácidos. En algunas modalidades, el resto adjunto asociado covalentemente con la proteína de FVIII es un
fragmento de VWF descrito en otra parte en la presente.
En determinadas modalidades, el resto adjunto se une químicamente (por ejemplo, no covalentemente) a o bloquea físicamente uno o más sitios de unión a VWF en una proteína de FVIII. El sitio de unión a VWF en una proteína de FVIII se ubica en el dominio A3 o el dominio C2 de la proteína de FVIII. En aun otras modalidades, el sitio de unión a VWF en una proteína de FVIII se ubica en el dominio A3 y el dominio C2. Por ejemplo, el sitio de unión a VWF en una proteína de FVIII puede corresponder a los aminoácidos 1669 a 1689 y/o 2303 a 2332 de la SEQ ID NO: 16 [FVIII maduro de longitud completa] .
En otras modalidades, una proteína quimérica de la invención comprende una proteína de FVIII enlazada a un resto adjunto, donde el resto adjunto es una molécula de VWF, por ejemplo, un fragmento de VWF que comprende un dominio D' y un dominio D3 , pero que no contiene el sitio de unión al receptor de depuración de VWF y protege el sitio de unión al VWF en la proteína de FVIII, inhibiendo o evitando así la interacción de la proteína de FVIII con el VWF endógeno. En determinadas modalidades, el resto adjunto es un fragmento de VWF. El fragmento de VWF útil para la presente invención contiene el dominio D' y el dominio D3 , e igualmente proporciona una o más ventajas de la propiedad tipo VWF a la proteína de FVIII, pero el fragmento de VWF no se somete a la
vía de depuración de VWF. La proteína de FVIII y el resto adjunto se pueden asociar covalentemente con un enlazador (por ejemplo, un enlazador de FVIII/AM) . En una modalidad, el enlazador puede ser un enlazador escindible. Ejemplos no taxativos de los enlazadores se describen en otras partes en la presente.
En aun otras modalidades, una proteína quimérica de la invención comprende una proteína de FVIII y una región constante de inmunoglobulina o una parte de esta (es decir, un resto ajunto) , donde la región constante de inmunoglobulina o una parte de esta protege el sitio de unión a VWF en la proteína de FVIII, inhibiendo o evitando así la interacción de la proteína de FVIII con el VWF endógeno. En aun otras modalidades, la región constante de inmunoglobulina o una parte de esta es una región Fe .
En un aspecto, la presente invención se refiere a un híbrido o proteína quimérica o de fusión que comprende uno o más de los fragmentos de VWF descritos en la presente y usos de estos. La proteína quimérica o de fusión se puede fusionar o enlazar a uno o más restos heterólogos (a veces indicados en la presente como H o Hl) . En una modalidad, el resto heterólogo (Hl) es un péptido heterólogo o un polipéptido heterólogo que naturalmente no se producirían con el fragmento de VWF y/o no estarían enlazados a este. En otra modalidad, el resto heterólogo (Hl) es un resto no
polipéptido, por ejemplo, modificación química o una combinación de un péptido o polipéptido y un resto no polipéptido. En algunas modalidades, los fragmentos de VWF están enlazados o conectados al resto heterólogo (Hl) por un enlazador (también denominado en la presente "enlazador de VWF")- En una modalidad, el enlazador de VWF es un enlazador escindible. Ejemplos no taxativos del enlazador entre el fragmento de VWF y el resto heterólogo (Hl) se describen en otras partes en la presente.
En una modalidad, el resto heterólogo (Hl) útil en la invención mejora una o más propiedades farmacocinéticas de los fragmentos de VWF sin afectar significativamente la actividad biológica o función de los fragmentos de VWF (por ejemplo, su unión a o asociación con una proteína de FVIII) . En otra modalidad, el resto heterólogo (Hl) enlazado al fragmento de VWF puede extender la semivida de los fragmentos de VWF. Ejemplos no taxativos del resto polipéptido heterólogo comprenden una región constante de inmunoglobulina o una parte de esta, albúmina o un fragmento de esta, un resto de unión a la albúmina, una secuencia PAS, una secuencia HAP, transferrina o un fragmento de esta, o dos o más combinaciones de estos. Ejemplos no taxativos del resto no polipéptido heterólogo incluyen, polietilenglicol (PEG) , ácido polisiálico, almidón de hidroxietilo (HES) , un derivado de estos o cualesquiera combinaciones de estos.
En algunas modalidades, un resto heterólogo (Hl) se puede usar para conectar el fragmento de VWF a la proteína de FVIII por un enlace covalente. Ejemplos del resto heterólogo que pueden proporcionar el enlace covalente incluyen, de modo no taxativo, una región constante de inmunoglobulina o una parte de esta que comprende una región bisagra, por ejemplo, una región Fe o un compañero de unión a FcRn. En un ejemplo específico, la proteína de FVIII está enlazada a una primera región Fe y el fragmento de VWF está enlazado a una segunda región Fe, donde la primera región Fe y la segunda región Fe forman uno o más enlaces disulfuro.
En algunas modalidades, el resto heterólogo (a veces indicado en la presente con "H" o "Hl") es una región constante de inmunoglobulina o una parte de esta. Ejemplos no taxativos de la región constante de inmunoglobulina o una parte de esta se pueden seleccionar del grupo que consiste en un dominio CH1, un dominio CH2 , un dominio CH3 , un dominio CH4 , un dominio bisagra y dos o más combinaciones de estos. En una modalidad, la región constante de inmunoglobulina o una parte de esta comprende al menos un dominio CH1, al menos un dominio CH2 , al menos un dominio CH3 , al menos un dominio CH4 o los fragmentos funcionales de estos. En otra modalidad, la región constante de inmunoglobulina o una parte de esta comprende al menos un dominio bisagra o una parte de este y al menos un dominio CH2 o una parte de este (por ejemplo, en
la orientación bisagra-CH2) . En otras modalidades, el dominio constante de inmunoglobulina o una parte de este comprende al menos un dominio CH2 o una parte de este y al menos un dominio CH3 o una parte de este (por ejemplo, en la orientación CH2-CH3) . Ejemplos de la combinación incluyen, de modo no taxativo, un dominio CH2 , un dominio CH3 y un dominio bisagra, que también se denominan región Fe (o dominio Fe) , por ejemplo, una primera región Fe. En otras modalidades, el resto heterólogo (Hl) está enlazado al fragmento de VWF por un enlazador. En determinadas modalidades, el resto heterólogo (Hl) es un compañero de unión a FcRn como se describe en otras partes en la presente. En otras modalidades, el resto heterólogo (Hl) es una región bisagra.
En determinadas modalidades, la proteína quimérica comprende además un segundo resto heterólogo (o uno adicional) (denominado a veces en la presente "H2") . Cabe destacar que el primer resto heterólogo (Hl) y el segundo resto heterólogo (H2) se pueden usar de manera intercambiable y pueden ser iguales o diferentes. El segundo resto heterólogo (H2) se puede enlazar a la proteína de FVIII o en otras parte en la proteína quimérica por un enlace peptídico, uno o más aminoácidos, o por un enlazador (por ejemplo, enlazador de FVIII si se enlaza a FVIII) . Estas construcciones se pueden denominar a veces heterodímero FVIII/VWF. En una modalidad, el resto heterólogo (H2)
comprende un polipéptido heterólogo. En otra modalidad, el resto heterólogo (H2) comprende un resto no polipéptido. En otras modalidades, el resto heterólogo (H2) comprende una combinación de un resto heterólogo y un resto no polipéptido. El segundo resto heterólogo (H2) puede ser un extensor de la semivida. Ejemplos no taxativos del segundo resto polipéptido heterólogo (H2) incluyen una región constante de inmunoglobulina o una parte de esta, albúmina o un fragmento de esta, un resto de unión a la albúmina, una secuencia PAS, una secuencia HAP, transferrina o un fragmento de esta, o dos o más combinaciones de estos. Ejemplos no taxativos del resto no polipéptido heterólogo incluyen, polietilenglicol (PEG) , ácido polisiálico, almidón de hidroxietilo (HES) , un derivado de estos o cualesquiera combinaciones de estos. En determinadas modalidades, el primer resto heterólogo (Hl) y el segundo resto heterólogo son iguales o diferentes. Cualquiera o ambos del primer resto heterólogo (Hl) y el segundo resto heterólogo (H2) puede otorgar extensión de semivida a la proteína de FVIII en una proteína quimérica, proporcionar una conexión más resistente que una asociación no covalente, es decir, por uno o más enlaces covalentes entre la proteína de FVIII y el fragmento de VWF en una proteína quimérica o ambos. Un fragmento de VWF fusionado o enlazado al primer resto heterólogo (Hl) retira el límite de la semivida evitando o inhibiendo la interacción entre la
proteína de FVIII y la proteína de VWF endógeno, la proteína de FVIII fusionada a los restos heterologos puede desarrollar plenamente su potencial y puede tener una semivida mayor que dos veces en comparación con FVIII de tipo salvaje.
En determinadas modalidades, el primer resto heterólogo
(por ejemplo, una primera región Fe) enlazado al fragmento de VWF y el segundo resto heterólogo (por ejemplo una segunda región Fe) enlazado a la proteína de FVIII están asociados entre sí de modo que la asociación evita el remplazo del fragmento de VWF por VWF endógeno in vivo. En una modalidad, el segundo resto heterólogo es una segunda región Fe, donde la segunda región Fe está enlazada o asociada con el primer resto heterólogo, por ejemplo, la primera región Fe, por un enlace covalente, por ejemplo, un enlace disulfuro, un enlace peptídico o un enlazador (uno o más aminoácidos) . Por ejemplo, el segundo resto heterólogo (por ejemplo la segunda región Fe) enlazado a la proteína de FVIII en un extremo también se puede enlazar al primer resto heterólogo (por ejemplo, la primera región Fe) enlazado al fragmento de VWF por un enlazador (por ejemplo, enlazador scFc) o asociado con el primer resto heterólogo por un enlace covalente o no covalente. En otra modalidad, el segundo resto heterólogo (por ejemplo, la segunda región Fe) está enlazado al fragmento de VWF que ya está enlazado al primer resto heterólogo. En algunas modalidades, la proteína quimérica
comprende una primera cadena de polipéptidos que comprende un fragmento de VWF y un primer resto heterólogo y una segunda cadena de polipéptidos que comprende una proteína de FVIII y un segundo resto heterólogo, donde la primera cadena de polipéptidos y la segunda cadena de polipéptidos están asociadas, donde la asociación entre la primera cadena de polipéptidos que comprende el primer resto heterólogo y la segunda cadena de polipéptidos que comprende el segundo resto heterólogo es un enlace covalente, permitiendo así que el fragmento de VWF y la proteína de FVIII mantengan su interacción entre sí. Al mismo tiempo, VWF endógeno, que puede formar un enlace no covalente con la proteína de FVIII no puede remplazar la cadena de polipéptidos enlazada covalentemente que comprende el fragmento de VWF.
El enlazador entre el primer resto heterólogo (Hl) y el fragmento de VWF (por ejemplo, el enlazador de VWF) puede ser un enlazador escindible, por ejemplo, un enlazador escindible por trombina. Los enlazadores escindibles se pueden escindir por una proteasa que se selecciona del grupo que consiste en factor Xla, factor Xlla, calicreína, factor Vlla, factor IXa, factor Xa, factor lia (trombina), Elastasa-2, Granzima-B, TEV, Enterocinasa, Proteasa 3C, Sortasa A, MMP-12, MMP-13, MMP-17, MMP-20 y cualesquiera combinaciones de estos. Estos enlazadores escindibles permiten que el fragmento de VWF se escinda y disocie de la proteína de FVIII tras la activación
de la cascada de coagulación, lo que da como resultado una proteína de FVIII con un potencial de actividad total.
En otras modalidades, la proteína quimérica se produce como una única cadena de polipéptidos que comprende un fragmento de VWF, un enlazador escindible, un primer resto heterólogo (Hl) , un enlazador procesable, una proteína de FVIII y un segundo resto heterólogo (H2) en cualquier orden. Luego de la síntesis, el enlazador procesable se puede escindir por una enzima de proteasa intracelular antes de la secreción, produciendo así dos cadenas de polipéptidos como se describe anteriormente. En la construcción de cadena simple antes de la secreción, el segundo resto heterólogo (por ejemplo, la segunda región Fe) se puede enlazar al fragmento de VWF por un enlazador procesable. En determinadas modalidades, uno o más enlazadores pueden comprender uno o más sitios de escisión.
En algunas modalidades, la proteína quimérica de la invención comprende además un tercer resto heterólogo (indicado en la presente a veces con "H3") . El tercer resto heterólogo (H3) puede ser un extensor de la semivida. El resto heterólogo (H3) puede comprender un polipéptido heterólogo, un resto no polipéptido o una combinación de ambos. Ejemplos no taxativos del tercer resto heterólogo (H3) incluyen una región constante de inmunoglobulina o una parte de esta, albúmina o un fragmento de esta, un resto de unión a
la albúmina, una secuencia PAS, una secuencia HAP, transferrina o un fragmento de esta, cualesquiera derivados o variantes de estos o dos o más combinaciones de estos. Ejemplos no taxativos del resto no polipéptido incluyen, polietilenglicol (PEG) , ácido polisiálico, almidón de hidroxietilo (HES) , un derivado de estos o cualquier combinación de estos. El primer resto heterólogo (Hl) enlazado al fragmento de VWF, el segundo resto heterólogo (H2) enlazado a la proteína de FVIII y el tercer resto heterólogo (H3) pueden ser iguales o diferentes. En una modalidad, el primer resto heterólogo (Hl) es idéntico al segundo resto heterólogo (H2) , pero es diferente del tercer resto heterólogo (H3). En otra modalidad, el tercer resto heterólogo (H3) se fusiona o enlaza con una proteína de FVIII o un fragmento de VWF de la proteína quimérica. En algunas modalidades, el tercer resto heterólogo se inserta en uno o más dominios de la proteína de FVIII o entre dos dominios de la proteína de FVIII.
En una modalidad, una proteína quimérica comprende una primera cadena de polipéptidos y una segunda cadena de polipéptidos , donde la primera cadena comprende una proteína de FVIII enlazada a un primer resto heterólogo (Hl) , por ejemplo, una primera región Fe, por un enlazador opcional (por ejemplo, un enlazador de FVIII) y la segunda cadena comprende un fragmento de VWF enlazado a un segundo resto
heterólogo (H2) , por ejemplo, una segunda región Fe, por un enlazador opcional (por ejemplo, enlazador de VWF) . La proteína de FVIII también puede comprender un tercer resto heterólogo (H3) , por ejemplo, cualquier resto que extiende la semivida, por ejemplo, albúmina, o una secuencia PAS, entre la cadena pesada de FVIII y la cadena ligera de FVIII (es decir, residuo de aminoácidos 1648 de la SEQ ID NO: 16), siendo así una proteína de FVIII de cadena simple. De manera alternativa, la proteína de FVIII puede ser una proteína de cadena doble, es decir, la cadena pesada de FVIII y la cadena ligera de FVIII asociadas entre sí por un enlace covalente o no covalente (por ejemplo, un enlace metálico) , donde la cadena pesada está enlazada también a un tercer resto heterólogo (H3) , por ejemplo, un polipéptido que extiende la semivida no estructural, albúmina o un fragmento de esta o una secuencia PAS. En otra modalidad, una proteína quimérica comprende una primera cadena de polipéptidos y una segunda cadena de polipéptidos, donde la primera cadena comprende una proteína de FVIII enlazada a un primer resto heterólogo (Hl) , por ejemplo, una primera región Fe, por un enlazador opcional (por ejemplo, un enlazador de FVIII) y la segunda cadena comprende un fragmento de VWF enlazado a un tercer resto heterólogo (H3) , por ejemplo, un polipéptido que extiende la semivida no estructural, albúmina o una secuencia PAS, que está enlazada a un segundo resto heterólogo (H2), por ejemplo, una segunda región Fe, por un
enlazador opcional. En algunas modalidades, el tercer resto heterólogo (H3) (por ejemplo, un polipéptido que extiende la semivida) se puede enlazar al C-terminal o el N-terminal de la proteína de FVIII o se puede insertar entre dos dominios de la proteína de FVIII o entre dos aminoácidos en un dominio de la proteína de FVIII.
En otras modalidades, la proteína quimérica de la invención comprende además un cuarto resto heterólogo (indicado en la presente a veces con "H4") y/o un quinto resto heterólogo (indicado en la presente a veces con "H5"). El cuarto o quinto resto heterólogo también puede ser un extensor de la semivida. El cuarto resto heterólogo y/o el quinto resto heterólogo pueden ser iguales o diferentes del tercer resto heterólogo. El resto heterólogo puede comprender un polipéptido heterólogo, un resto no polipéptido o una combinación de ambos. Ejemplos no taxativos del cuarto o quinto resto heterólogo incluyen una región constante de inmunoglobulina o una parte de esta, albúmina o un fragmento de esta, un resto de unión a la albúmina, una secuencia PAS, una secuencia HAP, transferrina o un fragmento de esta, cualesquiera derivados o variantes de estos o dos o más combinaciones de estos. Ejemplos no taxativos del resto no polipéptido incluyen polietilenglicol (PEG) , ácido polisiálico, almidón de hidroxietilo (HES) , un derivado de estos o cualesquiera combinaciones de estos. El primer resto
heterólogo, el segundo resto heterólogo, el tercer resto heterólogo, el cuarto resto heterólogo y el quinto resto heterólogo pueden ser iguales o diferentes. En algunas modalidades, el cuarto resto heterólogo (por ejemplo, un polipéptido que extiende la semivida) se puede enlazar al C-terminal o el N-terminal de la proteína de FVIII o se puede insertar entre dos dominios de la proteína de FVIII o entre dos aminoácidos en un dominio de la proteína de FVIII. En otras modalidades, el quinto resto heterólogo (por ejemplo, un polipéptido que extiende la semivida) también se puede enlazar al C-terminal o el N-terminal de la proteína de FVIII o se puede insertar entre dos dominios de la proteína de FVIII o entre dos aminoácidos en un dominio de la proteína de FVIII.
En determinadas modalidades, la proteína quimérica comprende una proteína de FVIII, un fragmento de VWF, un primer resto heterólogo, un segundo resto heterólogo, un tercer resto heterólogo, un cuarto heterólogo y un quinto resto heterólogo, donde el primer resto heterólogo y el segundo resto heterólogo forman un enlace (por ejemplo, un enlace covalente) entre la cadena que comprende la proteína de FVIII y la cadena que comprende el fragmento de VWF y el tercer resto heterólogo, el cuarto resto heterólogo y el quinto resto heterólogo son extensores de la semivida, y donde el enlace entre la cadena que comprende la proteína de FVIII y la cadena que comprende el fragmento de VWF es más
resistente que la interacción no covalente entre el fragmento de FVIII y de VWF, evitando así la unión del VWF endógeno a la proteína de FVIII in vivo, in vitro o ex vivo.
En otras modalidades, la proteína quimérica comprende una proteína de FVIII, un fragmento de VWF, un primer resto heterologo, un segundo resto heterologo, un tercer resto heterologo, un cuarto heterologo, un quinto resto heterologo y un sexto resto heterologo (indicados en la presente a veces con "H6") donde el primer resto heterologo y el segundo resto heterologo forman un enlace entre la cadena que comprende la proteína de FVIII y la cadena que comprende el fragmento de VWF y el tercer resto heterologo, el cuarto resto heterologo, el quinto resto heterologo y el sexto resto heterologo son extensores de la semivida, y donde el enlace entre la cadena que comprende la proteína de FVIII y la cadena que comprende el fragmento de VWF es más resistente que la interacción entre el fragmento de FVIII y de VWF, evitando así la unión del VWF endógeno a la proteína de FVIII in vivo, in vitro o ex vivo.
En algunas modalidades, una proteína quimérica comprende una fórmula que se selecciona del grupo que consiste en:
(aa) V-L1-H1-L2-H2,
(bb) H2-L2-H1-L1-V,
(ce) H1-L1-V-L2-H2, y
(dd) H2-L2-V-L1-H1,
donde V comprende un fragmento de VWF descrito en la presente;
Cada uno de Ll y L2 comprende un enlazador opcional; y
Hl comprende un primer resto heterologo; y
H2 comprende un segundo resto heterologo opcional. Cualquiera o los dos del primer resto heterologo y el segundo resto heterologo puede ser un resto que extiende la semivida. En una modalidad, Hl comprende un polipéptido, no resto polipéptido o ambos. El polipéptido útil como Hl puede comprender una región constante de inmunoglobulina o una parte de esta, albúmina o un fragmento de esta, un resto de unión a la albúmina, una secuencia PAS, una secuencia HAP, cualesquiera derivados o variantes o cualesquiera combinaciones de estos. El resto no polipéptido puede comprender polietilenglicol (PEG) , ácido polisiálico y almidón de hidroxietilo (HES) , un derivado o variante de estos o cualesquiera combinaciones de estos. En otra modalidad, H2 comprende un polipéptido, no resto polipéptido o ambos. El polipéptido útil como H2 puede comprender una región constante de inmunoglobulina o una parte de esta, albúmina o un fragmento de esta, un resto de unión a la albúmina, una secuencia PAS, una secuencia HAP, cualesquiera derivados o variantes o cualesquiera combinaciones de estos. El resto no polipéptido puede comprender polietilenglicol
(PEG) , ácido polisiálico, almidón de hidroxietilo (HES) , un derivado o variante de estos o cualesquiera combinaciones de estos. En determinadas modalidades, el enlazador entre Hl y H2 en las fórmulas (aa) y (bb) es un enlazador procesable. En otras modalidades, el enlazador entre el fragmento de VWF y Hl en fórmulas (aa) y (bb) es un enlazador escindible, por ejemplo, un enlazador escindible por trombina que puede ser escindido por trombina.
La orientación de las fórmulas de polipéptido de la presente se enumera desde el N-terminal (izquierda) al C-terminal (derecha) . Por ejemplo, la fórmula H-L-V significa fórmula NH2 -H-L-V-COOH . En una modalidad, las fórmulas descritas en la presente pueden comprender secuencias adicionales entre los dos restos. Por ejemplo, la fórmula V-L1-H1-L2-H2 también puede comprender secuencias en el N-terminal de V, entre V y Ll, entre Ll y Hl, entre Hl o L2, entre L2 o H2 o en el C-terminal de H2 a menos que se especifique de otro modo. En otra modalidad, el guión (-) indica un enlace peptídico o uno o más aminoácidos.
En modalidades específicas, una proteína quimérica comprende, consiste esencialmente en o consiste en una o más fórmulas que se seleccionan del grupo que consiste en (al) V-H, (a2) H-V, (a3) V-L-H, (a4) H-L-V, (a5) V-L1-H1-H2, (a6) H2-H1-L1-V, (a7) V-L1-H1:H2, (a8) H2:H1-L1-V, (a9) V-H1:H2, (bl) H2:H1-V, (b2) V-L1-H1-L2-H2 , (b3) H2-L2-H1-L1-V, (b4)
H1-V-H2, (b5) H1-L1-V-L2-H2, y (b6) H2-L2 -V-Ll-Hl , donde V comprende uno o más de los fragmentos de VWF descritos en la presente, L, Ll o L2 comprende un enlazador, H o Hl comprende un primer resto heterólogo. En una modalidad, el primer resto heterólogo (Hl) puede ser un polipéptido, no resto polipéptido o ambos. El resto polipéptido heterólogo puede comprender una región constante de inmunoglobulina o una parte de esta, albúmina o un fragmento de esta, un resto de unión a la albúmina, una secuencia PAS, una secuencia HAP o cualesquiera combinaciones de estos. Ejemplos no taxativos del resto no polipéptido útil como Hl incluyen polietilenglicol (PEG) , ácido polisiálico, almidón de hidroxietilo (HES) , un derivado de estos o cualesquiera combinaciones de estos. En otra modalidad, H2 comprende un segundo resto heterólogo. El segundo resto heterólogo puede ser un polipéptido, no resto polipéptido o ambos. El resto polipéptido heterólogo puede comprender una región constante de inmunoglobulina o una parte de esta, albúmina o un fragmento de esta, un resto de unión a la albúmina, una secuencia PAS, una secuencia HAP o cualesquiera combinaciones de estos. Ejemplos no taxativos del resto no polipéptido útil como Hl incluyen polietilenglicol (PEG) , ácido polisiálico, almidón de hidroxietilo (HES) , un derivado de estos o cualesquiera combinaciones de estos. En determinadas modalidades, el enlazador entre el primer resto heterólogo y
el segundo resto heterologo es un enlazador procesable. En otras modalidades, el enlazador entre el fragmento de VWF y el primer resto heterologo o el segundo resto heterologo es un enlazador escindible, que comprende uno o más sitios de escisión, por ejemplo, un enlazador escindible por trombina.
La proteína quimérica de la presente invención comprende una fórmula que se selecciona del grupo que consiste en (aa) , (bb) , (ce), (dd) , (al), (a2) , (a3), (a4), (a5) , (a6) , (a7) , (a8), (a9), (bl) , (b2) , (b3) , (b4) , (b5) , y (b6) y una proteína de FVIII, que está covalentemente enlazada a o covalentemente asociada con el fragmento de VWF, el primer resto heterologo (por ejemplo, una primera región Fe) o el segundo resto heterologo (por ejemplo, una segunda región Fe) de la fórmula. En una modalidad, la proteína de FVIII está enlazada a o asociada con el fragmento de VWF por un enlace covalente o no covalente o por un enlazador. En otra modalidad, la proteína de FVIII puede estar enlazada al primer resto heterologo o el segundo resto heterologo por un enlace covalente o no covalente o por un enlazador.
En una modalidad, una proteína quimérica de la presente invención comprende un fragmento de VWF descrito en la presente enlazado covalentemente con una proteína de FVIII. Por ejemplo, la proteína quimérica puede comprender un fragmento de VWF y una proteína de FVIII, donde el fragmento
de VWF y la proteína de FVIII están unidos por un enlace no peptídico covalente, un enlace peptídico, un enlace no covalente o por un enlazador, por ejemplo, un enlazador escindible. En una modalidad específica, el fragmento de VWF y la proteína de FVIII están unidos o interactúan entre sí por uno o más enlaces disulfuro. En otra modalidad específica, el fragmento de VWF está unido a o interactúa con la proteína de FVIII en el dominio A3 de FVIII, el dominio C2 de FVIII o tanto el dominio A3 como el dominio C2 de FVIII por un enlace no covalente. En otra modalidad, el fragmento de VWF unido a o que interactúa con la proteína de FVIII está enlazado o fusionado a un primer resto heterólogo. En otras modalidades, la proteína de FVIII unida a o que interactúa con el fragmento de VWF también está enlazada a un segundo resto heterólogo. En algunas modalidades, el fragmento de VWF unido a o que interactúa con la proteína de FVIII también está enlazado a un primer resto heterólogo y la proteína de FVIII también está enlazada a un segundo resto heterólogo. En determinadas modalidades, la primera cadena de polipéptidos que comprende el fragmento de VWF y el primer resto heterólogo y la segunda cadena de polipéptidos que comprende la proteína de FVIII y el segundo resto heterólogo están asociados entre sí de modo que la asociación no permite la interacción de la proteína de FVIII con otros restos, por ejemplo, VWF endógeno. En una modalidad, la asociación es un
enlace covalente, por ejemplo, un enlace disulfuro.
Cada uno del fragmento de VWF y la proteína de FVIII pueden estar unidos o conectados al primer y segundo restos heterólogos por un enlazador, por ejemplo, un enlazador escindible, por ejemplo, un enlazador escindible por trombina. El enlazador entre el fragmento de VWF y el primer resto heterólogo puede denominarse en la presente enlazador de VWF. El enlazador entre la proteína de FVIII y el segundo resto heterólogo puede denominarse en la presente enlazador de FVIII. 0, tanto el fragmento de VWF o la proteína de FVIII pueden estar unidos o conectados al primer y segundo restos heterólogos por un enlazador, por ejemplo, un enlazador escindible, por ejemplo, un enlazador escindible por trombina. En determinadas modalidades, el primer resto heterólogo enlazado al fragmento de VWF comprende un polipéptido, no resto polipéptido o ambos. Ejemplos no taxativos del primer resto polipéptido heterólogo incluyen una región constante de inmunoglobulina o una parte de esta, albúmina o un fragmento de esta, un resto de unión a la albúmina, una secuencia PAS, una secuencia HAP, transferrina o un fragmento de esta, o dos o más combinaciones de estos. Ejemplos no taxativos del resto no polipéptido incluyen, polietilenglicol (PEG) , ácido polisiálico, almidón de hidroxietilo (HES o HAES) , un derivado o variante de estos o cualquier combinación de estos. En otras modalidades, el
segundo resto heterólogo enlazado a la proteína de FVIII comprende un polipéptido, no resto polipéptido o ambos. Ejemplos no taxativos del segundo resto heterólogo incluyen una región constante de inmunoglobulina o una parte de esta, albúmina o un fragmento de esta, un resto de unión a la albúmina, una secuencia PAS, una secuencia HAP, transferrina o un fragmento de esta, o dos o más combinaciones de estos. Ejemplos no taxativos del resto no polipéptido incluyen, polietilenglicol (PEG) , ácido polisiálico, almidón de hidroxietilo (HES o HAES) , un derivado o variante de estos o cualesquiera combinaciones de estos. En algunas modalidades, el fragmento de VWF está unido al FVIII usando ligación de proteínas in vitro mediada por sortasa. En algunas modalidades, se usa un motivo de reconocimiento de sortasa.
En una modalidad, el primer resto heterólogo es una región constante de inmunoglobulina o una parte de esta. En una modalidad particular, el primer resto heterólogo es una primera región Fe. En algunas modalidades, el segundo resto heterólogo es una región constante de inmunoglobulina o una parte de esta. En una modalidad específica, el segundo resto heterólogo es una segunda región Fe. En una modalidad particular, la proteína quimérica comprende un fragmento de VWF descrito en la presente y una proteína de FVIII, donde el fragmento de VWF está enlazado a una región constante de inmunoglobulina o una parte de esta, que es una región Fe. En
otra modalidad, la proteína quimérica comprende un fragmento de VWF descrito en la presente y una proteína de FVIII, donde la proteína de FVIII está enlazada a una región constante de inmunoglobulina o una parte de esta, que es una región Fe. En otras modalidades, una proteína quimérica comprende un fragmento de VWF descrito en la presente y una proteína de FVIII, donde el fragmento de VWF está enlazado a una primera región constante de inmunoglobulina, que es una primera región Fe y la proteína de FVIII está enlazada a una segunda región constante de inmunoglobulina, que es una segunda región Fe y donde el fragmento de VWF y la proteína de FVIII están unidos o interactúan entre sí por un enlace no covalente o la primera región Fe o la segunda región Fe están asociadas entre sí por un enlace covalente. En aun otras modalidades, el fragmento de VWF enlazado al primer resto heterólogo está enlazado además al segundo resto heterólogo, por e emplo, una segunda región Fe, por un enlazador, por ejemplo, un enlazador procesable. En un aspecto, el fragmento de VWF está enlazado al primer resto heterólogo por un enlazador, por ejemplo, un enlazador de VWF, por ejemplo, un enlazador escindible. En otro aspecto, la proteína de FVIII está enlazada al segundo resto heterólogo por un enlazador, por ejemplo, un enlazador de FVIII, por ejemplo, un enlazador escindible. Ejemplos no taxativos de los restos heterólogos se describen en otras partes de la presente, por ejemplo,
región constante de inmunoglobulina o parte de esta en los párrafos
[0165] -
[0193] , albúmina, fragmento o variante de esta en los párrafos
[0194] -
[0198] , secuencias HAP en el párrafo
[0293] , transíerrina, fragmentos o variantes de esta en los párrafos
[0204] -
[0205] , polímero, por ejemplo, polietilenglicol en los párrafos
[0206] -
[0213] , HES en los párrafos
[0214] -
[0219] o secuencias PSA en el párrafo
[0220] -y PAS en los párrafos
[0199] -
[0202] .
En algunas modalidades, una proteína quimérica de la presente invención comprende, consiste esencialmente en o consiste en una fórmula que se selecciona del grupo que consiste en:
(a) V-Ll-Hl- L3- C-L2-H2,
(b) H2-L2-C- L3- Hl-Ll-V,
(c) C-L2-H2- L3- V-Ll-Hl,
(d) Hl-Ll-V- L3-H2-L2-C,
(e) H1-L1-V-L3-C -L2-H2,
(f) H2-L2-C- L3- V-Ll-Hl,
(g) V-L1-H1-L3- H2-L2-C,
(h) C-L2-H2- L3- Hl-Ll-V,
(i) H2-L3-H1-L1-V-L2-C,
(j) C-L2-V-L1-H1 -L3-H2 ,
(JO V-L2-C-L1-H1 -L3-H2, y
(1) H2-L3-H1-L1-C-L2-V,
donde V es un fragmento de VWF descrito en la
presente ;
cada uno de Ll o L2 es un enlazador opcional, por ejemplo, un enlazador escindible, por ejemplo, un enlazador escindible por trombina;
L3 es un enlazador opcional, por ejemplo, un enlazador procesable;
cada uno de Hl o H2 es un resto heterólogo opcional ;
C es una proteína de FVIII; y
(-) es un enlace peptídico o uno o más aminoácidos.
En otros aspectos, una proteína quimérica de la invención comprende una fórmula que se selecciona del grupo que consiste en:
(m) V-L1-H1: H2-L2-C,
(n) V-L1-H1.C-L2-H2
(o) H1-L1-V:H2-L2-C;
(p) H1-L1-V:C-L2-H2;
(q) V.C-L1-H1 :H2;
(r) V:H1-L1-C:H2;
(s) H2 :H1-L1-C:V,
(t) C:V-L1-H1:H2 y
(u) C:H1-L1-V:H2
donde V es un fragmento de VWF descrito en la presente; cada uno de Ll o L2 es un enlazador opcional, por ejemplo, un enlazador escindible por trombina;
cada uno de Hl o H2 es un resto heterologo opcional;
(-) es un enlace peptídico o uno o más aminoácidos y
C es una proteína de FVIII y (:) es una asociación química o física entre Hl y H2.
En una modalidad, uno o más de los restos heterólogos son un extensor de la semivida . En la técnica se conocen extensores de la semivida y ejemplos no taxativos de estos extensores de la semivida incluyen una región constante de inmunoglobulina o una parte de esta, albúmina o un fragmento de esta, un resto de unión a la albúmina, una secuencia PAS, una secuencia HAP, transferrina o un fragmento de esta, un derivado o variante de estos o dos o más combinaciones de estos. El resto no polipéptido puede comprender polietilenglicol (PEG) , ácido polisiálico, almidón de hidroxietilo (HES) , un derivado de estos o cualesquiera combinaciones de estos.
En una modalidad, ( : ) en las fórmulas (m) a (u) representa una asociación química, por ejemplo, al menos un enlace no peptídico. En determinadas modalidades, la asociación química, es decir, (:) es un enlace covalente. En otras modalidades, la asociación química, es decir, (:) es una interacción no covalente, por ejemplo, una interacción iónica, una interacción hidrofóbica, una interacción hidrofílica, una interacción de Van der Waals, un enlace de hidrógeno. En otras modalidades, (:) es un enlace covalente
no peptídico. En aun otras modalidades, (:) es un enlace peptídico. En aun otras modalidades; (:) en las fórmulas (m) a (u) representa una asociación física entre dos secuencias, donde una parte de una primera secuencia está próxima a una segunda secuencia de modo que la primera secuencia protege o bloquea la interacción de una parte de la segunda secuencia con otro resto, y además que esta asociación física se mantiene sin permitir que la segunda secuencia interactúe con otros restos .
Las fórmulas (a) - (u) se incluyen en la presente simplemente como ejemplos no taxativos de construcciones de la presente invención. La orientación de las fórmulas de polipéptido se muestra desde el N-terminal (izquierda) al C-terminal (derecha) . Por ejemplo, la fórmula V-L1-H1-L3-C-L2-H2 significa fórmula NH2-V-L1-H1-L3-C-L2-H2-COOH. Además, (:) puede ser una asociación o interacción entre dos cadenas de polipéptidos por un enlace covalente o un enlace no covalente entre cualquier parte de la primera cadena y cualquier parte de la segunda cadena a menos que se indique de otro modo. Por ejemplo, la fórmula V-H1:H2-C tiene dos cadenas de polipéptidos, la primera cadena es V-Hl y la segunda cadena es C-H2, donde V en la primera cadena interactúa o se asocia con C en la segunda cadena y/o Hl en la primera cadena interactúa o se asocia con H2 en la segunda cadena. En algunas modalidades, (:) significa un enlace covalente, no
peptídico o enlace no covalente.
En determinadas modalidades, una proteína quimérica, consiste esencialmente en o consiste en una fórmula que se selecciona del grupo que consiste en:
(1) V:C, (2) H-V:C O C :V-H,
(3) V:C-H o H-C :V, (4) V-Hl :H2--C O H1-V:C-H2,
(5) V:C-H1:H2 O H2 :H1-C:V, (6) H2 :H1-V .C o C:V-H1 :H2,
(7) H-L-V:C o C :V-L-H, (8) V:C-L-H O H- L-C:V,
(9) V-C O C-V, (10) H-V-C o C -V-H,
(11) V-H-C o C-H -v, (12) V-C-H o H -C-v,
(13) V-H1-C-H2 o H2-C-H1-V, (14) H1-V-C-H2 o H2-C-V-H1,
(15) H1-V-H2-C o C-H2-V-H1, (16) V-H1-H2 -C o C-H2-H1-V,
(17) V-L-C o C-L -v, (18) H-L-V-C O C-V-L-H,
(19) H-V-L-C o C -L-V-H, (20) V-L-H-C o C-H-L-V,
(21) V-H-L-C o C -L-H-V, (22) V-L-C-H O H- C-L-V,
(23) V-C-L-H o H -L-C-V, (24) H-L1-V-L2 -C o C -L2-V-L1-H,
(25) V-L-Hl :H2-C O C-H2 :H1-L -v,
(26) V-Hl :H2-L-C O C-L-H2:H1 -v,
(27) V:C-H1-H2 o H2-H1-C:V,
(28) H2-H1-V:C O C:V-H1-H2,
(29) V:C-L-H1 :H2 o H2 :H1-L-C :V,
(30) H2 :H1-L-V:C O C:V-L-H1: H2 ,
(31) V-L1-H1-.H2- L2-C o L-L2-H2 :H1-Ll-V,
V:C-L-H1-H2 O H2-H1-L-C:V,
V:C-H1-L-H2 o H2-L-H1-C:V,
V:C-L1-H1-L2-H2 O H2 -L2-Hl-Ll-C :V,
H2-H1-V:C o C:V-H1-H2,
H2-H1-L-V:C o C:V-L-H1-H2,
H2-L-H1-V:C o C:V-H1-L-H2,
H2-L2-H1-L1-V:C o C :V-L1-H1-L2-H2 ,
V-L1-H-L2-C o C-L2-H-L1-V,
V-L1-C-L2-H o H-L2-C-L1-V,
V-L-H1-C-H2 o H2-C-H1-L-V,
V-H1-C-L-H2 o H2-L-C-H1-V,
V-H1-L-C-H2 o H2-C-L-H1-V,
H1-L-V-C-H2 o H2-C-V-L-H1,
H1-V-L-C-H2 o H2-C-L-V-H1,
Hl-V-C-L-H o H-L-C-V-Hl,
H1-L-V-H2-C o C-H2-V-L-H1,
H1-V-L-H2-C o C-H2-L-V-H1,
H1-V-H2-L-C o C-L-H2-V-H1,
V-L-H1-H2-C o C-H2-H1-L-V,
V-H1-L-H2-C o C-H2-L-H1-V,
V-H1-H2-L-C o C-L-H2-H1-V,
V-L1-H1-L2-C-H2 o H2-C-L2-H1-L1-V,
V-L1-H1-C-L2-H2 o H2-L2 -C-Hl-Ll-V,
V-L1-H1-L2-C-L3-H2 o H2 -L3 -C-L2 -Hl-Ll-V,
V-H1-L1-C-L2-H2 O H2-L2-C-L1-H1-V,
(57) H1-L1-V-L2-C-H2 o H2 -C-L2 -V-Ll-Hl ,
(58) H1-L1-V-C-L2-H2 o H2 -L2-C-V-Ll-Hl ,
(59) H1-L1-V-L2-C-L3-H2 o H2 -L3 -C-L2 -V-Ll-Hl ,
(60) H1-V-L1-C-L2-H2 o H2 -L2 -C-L1-V-H1 ,
(61) H1-L1-V-L2-H2-C o C-H2 -L2-V-Ll-Hl ,
(62) H1-L1-V-H2-L2-C o C-L2 -H2 -V-L1-H1 ,
(63) H1-L1-V-L2-H2-L3-C o C-L3 -H2-L2-V-Ll-Hl ,
(64) H1-V-L1-H2-L2-C o C-L2 -H2 -Ll-V-Hl ,
(65) V-L1-H1-L2-H2-C O C-H2-L2-H1-L1-V,
(66) V-L1-H1-H2-L2-C o C-L2-H2-H1-L1-V,
(67) V-L1-H1-L2-H2-L3-C o C-L3 -H2 -L2 -Hl-Ll-V, y
(68) V-H1-L1-H2-L2-C o C-L2 -H2 -Ll-Hl -V,
V es un fragmento de VWF descrito en la presente;
C es una proteína de FVIII;
H o Hl es un resto heterólogo o un primer resto heterólogo;
H2 es un segundo resto heterólogo; el primer y el segundo restos heterólogos pueden ser iguales o diferentes; cada uno de L, Ll o L2 es un enlazador opcional;
(-) es un enlace peptídico o uno o más aminoácidos y
(:) es una asociación química o física. Cada uno de los enlazadores puede ser igual o diferente y cada uno puede ser un enlazador escindible, que comprende uno o más sitios de escisión enzimática. Los restos heterólogos pueden ser una tecnología de extensión de la semivida conocida en la
técnica, un polipéptido, no resto polipéptido o ambos. Un resto polipéptido puede comprender una región constante de inmunoglobulina o una parte de esta, albúmina o un fragmento de esta, un resto de unión a la albúmina, una secuencia PAS, una secuencia HAP, cualesquiera derivados o variantes de estos o cualesquiera combinaciones de estos (por ejemplo, una región Fe) . Un resto no polipéptido puede comprender polietilenglicol (PEG) , ácido polisiálico, almidón de hidroxietilo (HES) , un derivado o variante de estos o cualesquiera combinaciones de estos. Cada uno de H, Hl o H2 se puede seleccionar individualmente en función de las características y pueden ser todos iguales o cada uno diferente. Ejemplos no taxativos de los restos heterologos se describen en otras partes de la presente, por ejemplo, región constante de inmunoglobulina o parte de esta en los párrafos
[0126] -
[0153] , albúmina o fragmento o variante de esta en los párrafos
[0154] -
[0157] , polímero, por ejemplo, polietilenglicol en los párrafos
[0166] -
[0173] y secuencias PAS en los párrafos
[0159] -
[0162] . Las fórmulas (1) - (68) se incluyen en la presente simplemente como ejemplos no taxativos de construcciones de la presente invención.
En una modalidad, (:) representa una asociación química, por ejemplo, al menos un enlace no peptídico. En determinadas modalidades, la asociación química, es decir, (:) es un enlace covalente . En otras modalidades, la asociación
química, es decir, (:) es una interacción no covalente, por ejemplo, una interacción iónica, una interacción hidrofóbica, una interacción hidrofílica, una interacción de Van der Waals, un enlace de hidrógeno. En otras modalidades, (:) es un enlace covalente no peptídico. En aun otras modalidades, (:) es un enlace peptídico. En aun otras modalidades; (:) representa una asociación física entre dos secuencias, donde una parte de una primera secuencia está próxima a una segunda secuencia de modo que la primera secuencia protege o bloquea la interacción de una parte de la segunda secuencia con otro resto, y además que esta asociación física se mantiene sin permitir que la segunda secuencia interactúa con otros restos .
En una modalidad, el primer resto heterólogo (H o Hl) enlazado al fragmento de VWF en la proteína quimérica es una primera región Fe. En otra modalidad, el segundo resto heterólogo (o H2) enlazado a la proteína de FVIII en la proteína quimérica es una segunda región Fe.
En determinadas modalidades, una proteína quimérica de la invención comprende dos cadenas de polipéptidos, una primera cadena comprende, consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de aminoácidos que codifica FVIII (por ejemplo, FVIII de cadena simple) y un primer resto heterólogo (por ejemplo, una primera región Fe) y una segunda cadena comprende, consiste esencialmente en o consiste en una
secuencia de aminoácidos que codifica un fragmento de VWF que comprende el dominio D' y el dominio D3 , un segundo resto heterólogo (por ejemplo, una segunda región Fe) , y un enlazador entre el fragmento de VWF y el segundo dominio de Fe (por ejemplo, enlazador de VWF) . El enlazador entre el fragmento de VWF y el segundo dominio de Fe puede ser un enlazador escindible por trombina. En algunas modalidades, la proteína de FVIII de cadena simple comprende un tercer resto heterólogo, por ejemplo, un extensor de la semivida, que está enlazado al N-terminal, C-terminal o uno o más sitios dentro de la secuencia de FVIII.
En otras modalidades, una proteína quimérica de la invención comprende tres cadenas de polipéptidos , donde una primera cadena comprende, consiste esencialmente en o consiste en una cadena pesada de FVIII, una segunda cadena comprende, consiste esencialmente en o consiste en una cadena ligera de FVIII fusionada a un primer resto heterólogo (por ejemplo, una primera región Fe) , y una tercera cadena de polipéptidos comprende, consiste esencialmente en o consiste en un fragmento de VWF que comprende el dominio D' y el dominio D3 , un segundo resto heterólogo (por ejemplo, una segunda región Fe) , y un enlazador. El enlazador entre el fragmento de VWF y el segundo resto heterólogo puede ser un enlazador escindible por trombina. En algunas modalidades, el FVIII de cadena pesada está enlazado a un tercer resto
heterólogo, por ejemplo, un extensor de la semivida, que puede estar enlazado al N-terminal, C-terminal o uno o más sitios dentro de la secuencia de FVIII.
En aun otras modalidades, una proteína quimérica de la invención comprende dos cadenas de polipéptidos , una primera cadena comprende, consiste esencialmente en o consiste en una cadena pesada de FVIII y una segunda cadena comprende, consiste esencialmente en o consiste en una cadena ligera de FVIII, un primer resto heterólogo (por ejemplo, una primera región Fe) , un primer enlazador (por ejemplo, un sitio de escisión de proteasa que comprende uno o más sitios de procesamiento intracelular) , un fragmento de VWF, un segundo enlazador (por ejemplo, un enlazador escindible por trombina) , y un segundo resto heterólogo (por ejemplo, una segunda región Fe) , donde la cadena ligera de FVIII está enlazada al primer resto heterólogo (por ejemplo, la primera región Fe) , que está además enlazada al fragmento de VWF por el primer enlazador (por ejemplo, un enlazador procesable que tiene un sitio de escisión de proteasa que comprende uno o más sitios de procesamiento intracelular) , y donde el fragmento de VWF está enlazado a la segunda región Fe por el segundo enlazador (por ejemplo, un enlazador escindible por trombina). En determinadas modalidades, el primer enlazador y el segundo enlazador son idénticos o diferentes.
En determinadas modalidades, una proteína quimérica de
la invención comprende una cadena de polipéptidos, que comprende una proteína de FVIII de cadena simple, un primer resto heterólogo (por ejemplo, una primera región Fe) , un primer enlazador (por ejemplo, un enlazador escindible por trombina) , un fragmento de VWF, un segundo enlazador (por ejemplo, un enlazador escindible por trombina) , y un segundo resto heterólogo (por ejemplo, una segunda región Fe), donde la proteína de FVIII de cadena simple está enlazada al primer resto heterólogo que también está enlazada al fragmento de VWF por el primer enlazador, y el fragmento de VWF está enlazado a la segunda región Fe por el segundo enlazador. En una modalidad, el primer enlazador es un enlazador escindible que comprende un primer sitio escindible y un segundo sitio escindible. En otra modalidad, el segundo enlazador es un enlazador escindible que comprende uno o dos sitios escindibles. En una modalidad específica, el segundo enlazador es un enlazador escindible por trombina. El enlazador útil en la invención puede tener cualquier longitud, por ejemplo, al menos 10, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, o 700 aminoácidos. Por ejemplo, el enlazador puede tener 20 aminoácidos, 35 aminoácidos, 42 aminoácidos, 73 aminoácidos, o 98 aminoácidos.
En determinadas modalidades, el fragmento de VWF está enlazado directamente a la proteína de FVIII por un enlace peptídico o un enlazador. Como una forma de enlazar el
fragmento de VWF y la proteína de FVIII directamente o a través de un enlazador, se puede usar una ligadura enzimática (por ejemplo, sortasa) . Por ejemplo, sortasa se refiere a un grupo de enzimas procariotas que modifica proteínas superficiales reconociendo y escindiendo una señal de clasificación de C-terminalarboxilo . Para la mayoría de los sustratos de enzima sortasa, la señal de reconocimiento consiste en el motivo LPXTG (Leu-Pro-any-Thr-Gly (SEQ ID NO: 106) , luego una secuencia transmembrana altamente hidrofóbica, luego un conglomerado de residuos básicos tales como arginina. La escisión ocurre entre el Thr y Gly, con unión transitoria a través del residuo Thr al residuo Cys del sitio activo de un compañero de ligadura, seguido de transpeptidación que une la proteína covalentemente a la pared celular. En algunas modalidades, el compañero de ligadura contiene Gly(n).
En una modalidad, un fragmento de VWF enlazado a un motivo de reconocimiento de sortasa por un enlazador opcional se puede fusionar a una proteína de FVIII enlazada a Gly(n) por una sortasa, donde n puede ser cualquier entero. Una construcción de ligadura comprende el fragmento de VWF (parte de N-terminal de la construcción) y la proteína de FVIII (parte de C-terminal de la construcción) , donde el motivo de reconocimiento de sortasa se inserta entre ellos. Un ejemplo de construcción se muestra en la Figura 24A. Otra
construcción de ligadura comprende el fragmento de VWF (parte de N-terminal de la construcción, el enlazador, el motivo de reconocimiento de sortasa, y la proteína de FVIII (parte de C-terminal de la construcción) (por ejemplo, Figura 24C) . En otra modalidad, una proteína de FVIII enlazada a un motivo de reconocimiento de sortasa por un enlazador opcional se puede fusionar a un fragmento de VWF enlazado a Gly(n) por una sortasa, donde n es cualquier entero. Una construcción de ligadura resultante comprende la proteína de FVIII (parte de N-terminal de la construcción) y el fragmento de VWF (parte de C-terminal de la construcción) , donde el motivo de reconocimiento de sortasa se inserta entre ellos. Un ejemplo de construcción se muestra en la Figura 24B. Otra construcción de ligadura resultante comprende la proteína de FVIII (parte de N-terminal de la construcción) , el enlazador, el motivo de reconocimiento de sortasa, y el fragmento de VWF (parte de C-terminal de la construcción) (por ejemplo, Figura 24D) . En otras modalidades, un fragmento de VWF enlazado a un motivo de reconocimiento de sortasa por un primer enlazador opcional se puede fusionar a un resto heterólogo, por ejemplo, una región constante de inmunoglobulina o una parte de esta, por ejemplo, una región Fe, enlazada a un sitio de escisión de trombina por un segundo enlazador opcional. Una construcción resultante puede comprender el fragmento de VWF (parte de N-terminal) , el primer enlazador, el motivo de reconocimiento de sortasa, el sitio de escisión de proteasa, el segundo
enlazador opcional, y el resto heterólogo (por ejemplo, Figura 24E) . En determinadas modalidades, esta construcción resultante es una parte de una proteína quimérica que comprende una proteína de FVIII y un segundo resto heterólogo, por ejemplo, una región constante de inmunoglobulina o una parte de esta, por ejemplo, una segunda región Fe. En un ejemplo, en otro ejemplo, una quimérica comprende tres cadenas de polipéptidos , la primera cadena comprende un fragmento de VWF, el primer enlazador, el motivo de reconocimiento de sortasa, el sitio de escisión de proteasa, el segundo enlazador opcional, el primer resto heterólogo, la segunda cadena que comprende la cadena ligera de la proteína de FVIII y el segundo resto heterólogo, y la tercera cadena que comprende la cadena pesada de la proteína de FVIII.
En aun otras modalidades, la proteína quimérica de la invención que comprende un fragmento de VWF y una proteína de FVIII, donde el fragmento de VWF y la proteína de FVIII están covalentemente asociados entre sí o covalentemente enlazados entre sí, tiene menos inmunogenicidad que una proteína de FVIII sin el fragmento de VWF. La inmunogenicidad reducida incluye, de modo no taxativo, menor respuesta inmunológica humoral, por ejemplo, menor titulación de anticuerpo neutralizante, o menor respuesta inmunológica mediada por células contra FVIII, por ejemplo, producción de varias citocinas.
En aun otras modalidades, como resultado de la
invención, la semivida de la proteína de FVIII (o una proteína quimérica) se extiende en comparación con una proteína de FVIII sin el fragmento de VWF o FVIII de tipo salvaje. La semivida de la proteína de FVIII es al menos alrededor de 1,5 veces, al menos alrededor de 2 veces, al menos alrededor de 2.5 veces, al menos alrededor de 3 veces, al menos alrededor de 4 veces, al menos alrededor de 5 veces, al menos alrededor de 6 veces, al menos alrededor de 7 veces, al menos alrededor de 8 veces, al menos alrededor de 9 veces, al menos alrededor de 10 veces, al menos alrededor de 11 veces o al menos alrededor de 12 veces más larga que la semivida de una proteína de FVIII sin el fragmento de VWF. En una modalidad, la semivida de FVIII es de alrededor de 1.5 veces a alrededor de 20 veces, alrededor de 1.5 veces a alrededor de 15 veces o alrededor de 1.5 veces a alrededor de 10 veces más larga que la semivida del FVIII de tipo salvaje. En otra modalidad, la semivida del FVIII se extiende alrededor de 2 veces a alrededor de 10 veces, alrededor de 2 a alrededor de 9 veces, alrededor de 2 a alrededor de 8 veces, alrededor de 2 a alrededor de 7 veces, alrededor de 2 a alrededor de 6 veces, alrededor de 2 a alrededor de 5 veces, alrededor de 2 a alrededor de 4 veces, alrededor de 2 veces a alrededor de 3 veces, alrededor de 2.5 a alrededor de 10 veces, alrededor de 2.5 a alrededor de 9 veces, alrededor de 2.5 a alrededor de 8 veces, alrededor de 2.5 a alrededor
de 7 veces, alrededor de 2.5 a alrededor de 6 veces, alrededor de 2.5 a alrededor de 5 veces, alrededor de 2.5 a alrededor de 4 veces, alrededor de 2.5 a alrededor de 3 veces, alrededor de 3 veces a alrededor de 10 veces, alrededor de 3 veces a alrededor de 9 veces, alrededor de 3 veces a alrededor de 8 veces, alrededor de 3 veces a alrededor de 7 veces, alrededor de 3 veces a alrededor de 6 veces, alrededor de 3 veces a alrededor de 5 veces, alrededor de 3 veces a alrededor de 4 veces, alrededor de 4 veces a alrededor de 6 veces, alrededor de 5 veces a alrededor de 7 veces o alrededor de 6 veces a alrededor de 8 veces en comparación con FVIII de tipo salvaje o una proteína de FVIII sin el fragmento de VWF. En otras modalidades, la semivida de FVIII es al menos alrededor de 17 horas, al menos alrededor de 18 horas, al menos alrededor de 19 horas, al menos alrededor de 20 horas, al menos alrededor de 21 horas, al menos alrededor de 22 horas, al menos alrededor de 23 horas, al menos alrededor de 24 horas, al menos alrededor de 25 horas, al menos alrededor de 26 horas, al menos alrededor de 27 horas, al menos alrededor de 28 horas, al menos alrededor de 29 horas, al menos alrededor de 30 horas, al menos alrededor de 31 horas, al menos alrededor de 32 horas, al menos alrededor de 33 horas, al menos alrededor de 34 horas, al menos alrededor de 35 horas, al menos alrededor de 36 horas, al menos alrededor de 48 horas, al menos alrededor de
60 horas, al menos alrededor de 72 horas, al menos alrededor de 84 horas, al menos alrededor de 96 horas o al menos alrededor de 108 horas. En aun otras modalidades, la semivida de FVIII es de alrededor de 15 horas a alrededor de dos semanas, alrededor de 16 horas a alrededor de una semana, alrededor de 17 horas a alrededor de una semana, alrededor de 18 horas a alrededor de una semana, alrededor de 19 horas a alrededor de una semana, alrededor de 20 horas a alrededor de una semana, alrededor de 21 horas a alrededor de una semana, alrededor de 22 horas a alrededor de una semana, alrededor de 23 horas a alrededor de una semana, alrededor de 24 horas a alrededor de una semana, alrededor de 36 horas a alrededor de una semana, alrededor de 48 horas a alrededor de una semana, alrededor de 60 horas a alrededor de una semana, alrededor de 24 horas a alrededor de seis días, alrededor de 24 horas a alrededor de cinco días, alrededor de 24 horas a alrededor de cuatro días, alrededor de 24 horas a alrededor de tres días o alrededor de 24 horas a alrededor de dos días.
En algunas modalidades, la semivida promedio de la proteína de FVIII por sujeto es de alrededor de 15 horas, alrededor de 16 horas, alrededor de 17 horas, alrededor de 18 horas, alrededor de 19 horas, alrededor de 20 horas, alrededor de 21 horas, alrededor de 22 horas, alrededor de 23 horas, alrededor de 24 horas (1 día) , alrededor de 25 horas, alrededor de 26 horas, alrededor de 27 horas, alrededor de 28
horas, alrededor de 29 horas, alrededor de 30 horas, alrededor de 31 horas, alrededor de 32 horas, alrededor de 33 horas, alrededor de 34 horas, alrededor de 35 horas, alrededor de 36 horas, alrededor de 40 horas, alrededor de 44 horas, alrededor de 48 horas (2 días), alrededor de 54 horas, alrededor de 60 horas, alrededor de 72 horas (3 días), alrededor de 84 horas, alrededor de 96 horas (4 días) , alrededor de 108 horas, alrededor de 120 horas (5 días), alrededor de seis días, alrededor de siete días (una semana) , alrededor de ocho días, alrededor de nueve días, alrededor de 10 días, alrededor de 11 días, alrededor de 12 días, alrededor de 13 días o alrededor de 14 días.
En determinadas modalidades, la semivida de la proteína de FVIII enlazada covalentemente al fragmento de VWF se puede extender en ratones con doble inactivación de FVIII/VWF ( "DKO" ) en comparación con un polipéptido que consiste en FVIII o un híbrido monómero-dímero de FVIII.
A) Fragmentos del Factor Von Willebrand (VWF)
VWF (también conocido como F8VWF) es una gran glicoproteína multimérica presente en el plasma sanguíneo y producida constitutivamente en el endotelio (en los cuerpos de Weibel-Palade) , megacariocitos (a-gránulos de plaquetas) , y en el tejido conectivo del subendotelio . El monómero de VWF básico es una proteína de 2813 aminoácidos. Cada monómero contiene una cantidad de dominios específicos con una función
específica, los dominios D1 y D3 (que se unen al Factor VIII) , el dominio Al (que se une al receptor GPIb de plaquetas, heparina, y/o posiblemente colágeno), el dominio A3 (que se une a colágeno), el dominio Cl (donde el dominio GD se une a integrina al lb33 de plaquetas cuando esta se activa) , y el dominio "nudo de cisteína" en el C-terminal de la proteína (que VWF comparte el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) , factor de crecimiento transformante ß (???ß) y gonadotropina coriónica humana ß (ß?03) ) .
La secuencia de 2813 aminoácidos monómeros para VWF humano se reporta con el Número de Acceso_NP_000543.2 en Genbank. La secuencia de nucleótidos que codifica VWF humano se reporta con el Número de Acceso NM_000552.3_ en Genbank. La secuencia de nucleótidos de VWF humano se designa como SEQ ID NO : 1. SEQ ID NO: 2 es la secuencia de aminoácidos codificada por la SEQ ID NO : 1. Cada dominio de VWF se enumera en la Tabla 1.
Tabla 1
Dominios de Secuencia de aminoácidos
VWF
Péptido de 1 MIPARFAGVL LALALILPGT LC 22 señal de VWF
(Aminoácidos 1
a 22 de SEQ ID
NO: 2)
Región D1D2 de 23 AEGTRGRS STARCSLFGS
VWF DFVNTFDGSM
(Aminoácidos 23 51 YSFAGYCSYL LAGGCQKRSF SIIGDFQNGK RVSLSVYLGE a 763 de SEQ ID FFDIHLFVNG
101 TVTQGDQRVS MPYASKGLYL ETEAGYYKLS GEAYGFVARI NO: 2)
DGSGNFQVLL
151 SDRYFNKTCG LCGNFNIFAE DDFMTQEGTL TSDPYDFANS
WALSSGEQWC
201 ERASPPSSSC NISSGEMQKG LWEQCQLLKS TSVFARCHPL
VDPEPFVALC
251 EKTLCECAGG LECACPALLE YARTCAQEGM VLYGWTDHSA
CSPVCPAGME
301 YRQCVSPCAR TCQSLHINEM CQERCVDGCS CPEGQLLDEG
IiCVESTECPC
351 VHSGKRYPPG TSLSRDCNTC ICRNSQWICS NEECPGECLV
TGQSHFKSFD
401 NRYFTFSGIC QYLLARDCQD HSFSIVIETV QCADDRDAVC
TRSVTVRLPG
451 LHNSLVKLKH GAGVAMDGQD IQLPLLKGDL RIQHTVTASV
RLSYGEDLQM
501 DWDGRGRLLV KLSPVYAGKT CGLCGNYNGN QGDDFLTPSG
LAEPRVEDFG
551 NAWKLHGDCQ DLQKQHSDPC ALNPRMTRFS EEACAVLTSP
TFEACHRAVS
601 PLPYLRNCRY DVCSCSDGRE CLCGALASYA AACAGRGVRV
AWREPGRCEL
651 NCPKGQVYLQ CGTPCNLTCR SLSYPDEECN EACLEGCFCP
PGLYMDERGD
701 CVPKAQCPCY YDGEIFQPED IFSDHHTMCY CEDGFMHCTM
SGVPGSLLPD
751 AVLSSPLSHR SKR 763
Dominio D' de 764 SLSCRPP VKLVCPADN LRAEGLECTK
VWF TCONYDLECM
(Aminoácidos 801 SMGCVSGCLC PPGMVRHENR CVALERCPCF HOGKEYAPGE 764 a 866 de TVKIGCNTCV
851 CRDRKW CTD HVCDAT 866 SEQ ID NO: 2)
Dominio D3 de 867 CSTI GMAHYLTFDG LKYLFPGECQ
VWF YVLVQDYCGS
(Aminoácidos 901 NPGTFRILVG NKGCSHPSVK C KRVTILVE GGEIELFDGE 867 a 1240 de V VKRPMKDE
951 THFEWESGR YIILLLGKAL SWWDRHLSI SWLKQTYQE SEQ ID NO: 2)
KVCGLCGNFD
1001 GIQ NDLTSS NLQVEEDPVD FGNSWKVSSQ CADTRKVPLD
SSPATCHNNI
1051 M QTMVDSSC RILTSDVFQD CNKLVDPEPY LDVCIYDTCS
CESIGDCACF
1101 CDTIAAYAHV CAQHGKWTW RTATLCPQSC EERNLRENGY
ECEWRYNSCA
1151 PACQVTCQHP EPLACPVQCV EGCHAHCPPG KILDELLQTC
VDPEDCPVCE
1201 VAGRRFASGK KVTLNPSDPE HCQICHCDW NLTCEACQEP
Dominio Al de VWF 1241 GGLWPPTDA
1251 PVSPTTLYVE DISEPPLHDF YCSRLLDLVF LLDGSSRLSE
(Aminoácidos 1241 AEFEVLKAFV
a 1479 de SEQ ID 1301 VDMMERLRIS QK VRVAWE YHDGSHAYIG LKDRKRPSEL
RRIASQV YA
NO: 2)
1351 GSQVASTSEV L YTLFQIFS KIDRPEASRI ALLLMASQEP
QRMSRNFVRY
1401 VQGLKKKKVI VIPVGIGPHA NLKQIRLIEK QAPENKAFVL
SSVDELEQQR
1451 DEIVSYLCDL APEAPPPTLP PD AQVTVG 1479
1480 P GLLGVSTLGP KRNSMVLDVA
1501 FVLEGSDKIG EADFNRSKEF MEEVIQRMDV GQDSIHVTVL
QYSY VTVEY
1551 PFSEAQSKGD ILQRVREIRY QGGNRTNTGL ALRYLSDHSF
LVSQGDREQA 1600
1601 PNLVYMVTGN PASDEIKRLP GDIQWPIGV GPNANVQELE
RIGWPNAPIL
1651 IQDFETLPRE APDLVLQRCC SGEGLQIPTL SPAPDCSQPL
DVILLLDGSS
1701 SFPASYFDEM KSFAKAFIS ANIGPRLTQV SVLQYGSITT
IDVPWNWPE
1751 KAHLLSLVDV QREGGPSQI GDALGFAVRY LTSEMHGARP
GASKAWILV
1801 TDVSVDSVDA AADAARSNRV TVFPIGIGDR YDAAQLRILA
GPAGDSNWK
1851 LQRIEDLPTM VTLGNSFLHK LCSGFVRICM DEDGNEKRPG
DVWTLPDQCH
1901 TVTCQPDGQT LLKSHRVNCD RGLRPSCPNS QSPVKVEETC
GCRWTCPCVC
1951 TGSSTRHIVT FDGQNFKLTG SCSYVLFQNK EQDLEVILHN
GACSPGARQG
2001 CMKSIEVKHS ALSVEXHSDM EVTVNGRLVS VPYVGGNMEV
NVYGAIMHEV
2051 RFNHLGHIFT FTPQNNEFQL QLSPKTFASK TYGLCGICDE
NGANDFMLRD
2101 GTVTTDWKTL VQEWTVQRPG QTCQPILEEQ CLVPDSSHCQ
VLLLPLFAEC
2151 HKVLAPATFY AICQQDSCHQ EQVCEVIASY AHLCRTNGVC
VDWRTPDFCA
2201 MSCPPSLVYN HCEHGCPRHC DGNVSSCGDH PSEGCFCPPD
KVMLEGSCVP
2251 EEACTQCIGE DGVQHQFLEA WVPDHQPCQI CTCLSGRKVN
CTTQPCPTAK
2301 APTCGLCEVA RLRQNADQCC PEYECVCDPV SCDLPPVPHC
ERGLQPTLTN
2351 PGECRPNFTC ACRKEECKRV SPPSCPPHRL PTLRKTQCCD
EYECACNCVN
2401 STVSCPLGYL ASTATNDCGC TTTTCLPDKV CVHRSTIYPV
GQFWEEGCDV
2451 CTCTDMEDAV MGLRVAQCSQ KPCEDSCRSG FTYVLHEGEC
CGRCLPSACE
2501 WTGSPRGDS QSSWKSVGSQ WASPENPCLI NECVRVKEEV
FIQQRNVSCP
2551 QLEVPVCPSG FQLSCKTSAC CPSCRCERME ACMLNGTVIG
PGKTVMIDVC
2601 TTCRCMVQVG VISGFKLECR KTTCNPCPLG YKEENNTGEC
CGRCLPTACT
2651 IQLRGGQIMT LKRDETLQDG CDTHFCKVNE RGEYFWEKRV
TGCPPFDEHK
2701 CLAEGGKIMK IPGTCCDTCE EPECNDITAR LQYVKVGSCK
SEVEVDIHYC
2751 QGKCASKAMY SIDI DVQDQ CSCCSPTRTE PMQVALHCTN
GSWYHEVLN
2801 AMECKCSPRK CS
Secuencia de nucleótidos
V F de longitud ATGATTCCTG CCAGATTTGC CGGGGTGCTG CTTGCTCTGG CCCTCATTTT
GCCAGGGACC CTTTGTGCAG AAGGAACTCG CGGCAGGTCA TCCACGGCCC
completa
TACTAAGGAC GGTCTAAACG GCCCCACGAC GAACGAGACC GGGAGTAAAA
(SEQ ID NO: 1) CGGTCCCTGG GAAACACGTC TTCCTTGAGC GCCGTCCAGT AGGTGCCGGG
GATGCAGCCT TTTCGGAAGT GACTTCGTCA ACACCTTTGA TGGGAGCATG
TACAGCTTTG CGGGATACTG CAGTTACCTC CTGGCAGGGG GCTGCCAGAA
CTACGTCGGA AAAGCCTTCA CTGAAGCAGT TGTGGAAACT ACCCTCGTAC
ATGTCGAAAC GCCCTATGAC GTCAATGGAG GACCGTCCCC CGACGGTCTT
ACGCTCCTTC TCGATTATTG GGGACTTCCA GAATGGCAAG AGAGTGAGCC
TCTCCGTGTA TCTTGGGGAA TTTTTTGACA TCCATTTGTT TGTCAATGGT
TGCGAGGAAG AGCTAATAAC CCCTGAAGGT CTTACCGTTC TCTCACTCGG
AGAGGCACAT AGAACCCCTT AAAAAACTGT AGGTAAACAA ACAGTTACCA
ACCGTGACAC AGGGGGACCA AAGAGTCTCC ATGCCCTATG CCTCCAAAGG
GCTGTATCTA GAAACTGAGG CTGGGTACTA CAAGCTGTCC GGTGAGGCCT
TGGCACTGTG TCCCCCTGGT TTCTCAGAGG TACGGGATAC GGAGGTTTCC
CGACATAGAT CTTTGACTCC GACCCATGAT GTTCGACAGG CCACTCCGGA
ATGGCTTTGT GGCCAGGATC GATGGCAGCG GCAACTTTCA AGTCCTGCTG
TCAGACAGAT ACTTCAACAA GACCTGCGGG CTGTGTGGCA ACTTTAACAT
TACCGAAACA CCGGTCCTAG CTACCGTCGC CGTTGAAAGT TCAGGACGAC
AGTCTGTCTA TGAAGTTGTT CTGGACGCCC GACACACCGT TGAAATTGTA
CTTTGCTGAA GATGACTTTA TGACCCAAGA AGGGACCTTG ACCTCGGACC
CTTATGACTT TGCCAACTCA TGGGCTCTGA GCAGTGGAGA ACAGTGGTGT
GAAACGACTT CTACTGAAAT ACTGGGTTCT TCCCTGGAAC TGGAGCCTGG
GAATACTGAA ACGGTTGAGT ACCCGAGACT CGTCACCTCT TGTCACCACA
GAACGGGCAT CTCCTCCCAG CAGCTCATGC AACATCTCCT CTGGGGAAAT
GCAGAAGGGC CTGTGGGAGC AGTGCCAGCT TCTGAAGAGC ACCTCGGTGT
CTTGCCCGTA GAGGAGGGTC GTCGAGTACG TTGTAGAGGA GACCCCTTTA
CGTCTTCCCG GACACCCTCG TCACGGTCGA AGACTTCTCG TGGAGCCACA
TTGCCCGCTG CCACCCTCTG GTGGACCCCG AGCCTTTTGT GGCCCTGTGT
GAGAAGACTT TGTGTGAGTG TGCTGGGGGG CTGGAGTGCG CCTGCCCTGC
AACGGGCGAC GGTGGGAGAC CACCTGGGGC TCGGAAAACA CCGGGACACA
CTCTTCTGAA ACACACTCAC ACGACCCCCC GACCTCACGC GGACGGGACG
CCTCCTGGAG TACGCCCGGA CCTGTGCCCA GGAGGGAATG GTGCTGTACG
GCTGGACCGA CCACAGCGCG TGCAGCCCAG TGTGCCCTGC TGGTATGGAG
GGAGGACCTC ATGCGGGCCT GGACACGGGT CCTCCCTTAC CACGACATGC
CGACCTGGCT GGTGTCGCGC ACGTCGGGTC ACACGGGACG ACCATACCTC
TATAGGCAGT GTGTGTCCCC TTGCGCCAGG ACCTGCCAGA GCCTGCACAT
CAATGAAATG TGTCAGGAGC GATGCGTGGA TGGCTGCAGC TGCCCTGAGG
ATATCCGTCA CACACAGGGG AACGCGGTCC TGGACGGTCT CGGACGTGTA
GTTACTTTAC ACAGTCCTCG CTACGCACCT ACCGACGTCG ACGGGACTCC
GACAGCTCCT GGATGAAGGC CTCTGCGTGG AGAGCACCGA GTGTCCCTGC
GTGCATTCCG GAAAGCGCTA CCCTCCCGGC ACCTCCCTCT CTCGAGACTG
CTGTCGAGGA CCTACTTCCG GAGACGCACC TCTCGTGGCT CACAGGGACG
CACGTAAGGC CTTTCGCGAT GGGAGGGCCG TGGAGGGAGA GAGCTCTGAC
CAACACCTGC ATTTGCCGAA ACAGCCAGTG GATCTGCAGC AATGAAGAAT
GTCCAGGGGA GTGCCTTGTC ACTGGTCAAT CCCACTTCAA GAGCTTTGAC
GTTGTGGACG TAAACGGCTT TGTCGGTCAC CTAGACGTCG TTACTTCTTA
CAGGTCCCCT CACGGAACAG TGACCAGTTA GGGTGAAGTT CTCGAAACTG
AACAGATACT TCACCTTCAG TGGGATCTGC CAGTACCTGC TGGCCCGGGA TTGCCAGGAC CACTCCTTCT CCATTGTCAT TGAGACTGTC CAGTGTGCTG TTGTCTATGA AGTGGAAGTC ACCCTAGACG GTCATGGACG ACCGGGCCCT AACGGTCCTG GTGAGGAAGA GGTAACAGTA ACTCTGACAG GTCACACGAC ATGACCGCGA CGCTGTGTGC ACCCGCTCCG TCACCGTCCG GCTGCCTGGC CTGCACAACA GCCTTGTGAA ACTGAAGCAT GGGGCAGGAG TTGCCATGGA TACTGGCGCT GCGACACACG TGGGCGAGGC AGTGGCAGGC CGACGGACCG GACGTGTTGT CGGAACACTT TGACTTCGTA CCCCGTCCTC AACGGTACCT TGGCCAGGAC ATCCAGCTCC CCCTCCTGAA AGGTGACCTC CGCATCCAGC ATACAGTGAC GGCCTCCGTG CGCCTCAGCT ACGGGGAGGA CCTGCAGATG ACCGGTCCTG TAGGTCGAGG GGGAGGACTT TCCACTGGAG GCGTAGGTCG TATGTCACTG CCGGAGGCAC GCGGAGTCGA TGCCCCTCCT GGACGTCTAC GACTGGGATG GCCGCGGGAG GCTGCTGGTG AAGCTGTCCC CCGTCTATGC CGGGAAGACC TGCGGCCTGT GTGGGAATTA CAATGGCAAC CAGGGCGACG CTGACCCTAC CGGCGCCCTC CGACGACCAC TTCGACAGGG GGCAGATACG GCCCTTCTGG ACGCCGGACA CACCCTTAAT GTTACCGTTG GTCCCGCTGC ACTTCCTTAC CCCCTCTGGG CTGGC GAGC CCCGGGTGGA GGACTTCGGG AACGCCTGGA AGCTGCACGG GGACTGCCAG GACCTGCAGA AGCAGCACAG TGAAGGAATG GGGGAGACCC GACCGYCTCG GGGCCCACCT CCTGAAGCCC TTGCGGACCT TCGACGTGCC CCTGACGGTC CTGGACGTCT TCGTCGTGTC CGATCCCTGC GCCCTCAACC CGCGCATGAC CAGGTTCTCC GAGGAGGCGT GCGCGGTCCT GACGTCCCCC ACATTCGAGG CCTGCCATCG TGCCGTCAGC GCTAGGGACG CGGGAGTTGG GCGCGTACTG GTCCAAGAGG CTCCTCCGCA CGCGCCAGGA CTGCAGGGGG TGTAAGCTCC GGACGGTAGC ACGGCAGTCG CCGCTGCCCT ACCTGCGGAA CTGCCGCTAC GACGTGTGCT CCTGCTCGGA CGGCCGCGAG TGCCTGTGCG GCGCCCTGGC CAGCTATGCC GCGGCCTGCG GGCGACGGGA TGGACGCCTT GACGGCGATG CTGCACACGA GGACGAGCCT GCCGGCGCTC ACGGACACGC CGCGGOACCG GTCGATACGG CGCCGGACGC CGGGGAGAGG CGTGCGCGTC GCGTGGCGCG AGCCAGGCCG CTGTGAGCTG AACTGCCCGA AAGGCCAGGT GTACCTGCAG TGCGGGACCC CCTGCAACCT GCCCCTCTCC GCACGCGCAG CGCACCGCGC TCGGTCCGGC GACACTCGAC TTGACGGGCT TTCCGGTCCA CATGGACGTC ACGCCCTGGG GGACGTTGGA GACCTGCCGC TCTCTCTCTT ACCCGGATGA GGAATGCAAT GAGGCCTGCC TGGAGGGCTG CTTCTGCCCC CCAGGGCTCT ACATGGATGA GAGGGGGGAC CTGGACGGCG AGAGAGAGAA TGGGCCTACT CCTTACGTTA CTCCGGACGG ACCTCCCGAC GAAGACGGGG GGTCCCGAGA TGTACCTACT CTCCCCCCTG TGCGTGCCCA AGGCCCAGTG CCCCTGTTAC TATGACGGTG AGATCTTCCA GCCAGAAGAC ATCTTCTCAG ACCATCACAC CATGTGCTAC TGTGAGGATG ACGCACGGGT TCCGGGTCAC GGGGACAATG ATACTGCCAC TCTAGAAGGT CGGTCTTCTG TAGAAGAGTC TGGTAGTGTG GTACACGATG ACACTCCTAC GCTTCATGCA CTGTACCATG AGTGGAGTCC CCGGAAGCTT GCTGCCTGAC GCTGTCCTCA GCAGTCCCCT GTCTCATCGC AGCAAAAGGA GCCTATCCTG CGAAGTACGT GACATGGTAC TCACCTCAGG GGCCTTCGAA CGACGGACTG CGACAGGAGT CGTCAGGGGA CAGAGTAGCG TCGTTTTCCT CGGATAGGAC TCGGCCCCCC ATGGTCAAGC TGGTGTGTCC CGCTGACAAC CTGCGGGCTG AAGGGCTCGA GTGTACCAAA ACGTGCCAGA ACTATGACCT GGAGTGCATG AGCCGGGGGG TACCAGTTCG ACCACACAGG GCGACTGTTG GACGCCCGAC TTCCCGAGCT CACATGGTTT TGCACGGTCT TGATACTGGA CCTCACGTAC AGCATGGGCT GTGTCTCTGG CTGCCTCTGC CCCCCGGGCA TGGTCCGGCA TGAGAACAGA TGTGTGGCCC TGGAAAGGTG TCCCTGCTTC CATCAGGGCA T CGTAC C CGA CACAGAGACC GACGGAGACG GGGGGCCCGT ACCAGGCCGT ACTCTTGTCT ACACACCGGG ACCTTTCCAC AGGGACGAAG GTAGTCCCGT AGGAGTATGC CCCTGGAGAA ACAGTGAAGA TTGGCTGCAA CACTTGTGTC TGTCGGGACC GGAAGTGGAA CTGCACAGAC CATGTGTGTG ATGCCACGTG TCCTCATACG GGGACCTCTT TGTCACTTCT AACCGACGTT GTGAACACAG ACAGCCCTGG CCTTCACCTT GACGTGTCTG GTACACACAC TACGGTGCAC CTCCACGATC GGCATGGCCC ACTACCTCAC CTTCGACGGG CTCAAATACC TGTTCCCCGG GGAGTGCCAG TACGTTCTGG TGCAGGATTA CTGCGGCAGT GAGGTGCTAG CCGTACCGGG TGATGGAGTG GAAGCTGCCC GAGTTTATGG ACAAGGGGCC CCTCACGGTC ATGCAAGACC ACGTCCTAAT GACGCCGTCA AACCCTGGGA CCTTTCGGAT CCTAGTGGGG AATAAGGGAT GCAGCCACCC CTCAGTGAAA TGCAAGAAAC GGGTCACCAT CCTGGTGGAG GGAGGAGAGA TTGGGACCCT GGAAAGCCTA GGATCACCCC TTATTCCCTA CGT CGGTGGG GAGTCACTTT ACGTTCTTTG CCCAGTGGTA GGACCACCTC CCTCCTCTCT
TTGAGCTGTT TGACGGGGAG GTGAATGTGA AGAGGCCCAT GAAGGATGAG ACTCACTTTG AGGTGGTGGA GTCTGGCCGG TACATCATTC TGCTGCTGGG AACTCGACAA ACTGCCCCTC CACTTACACT TCTCCGGGTA CTTCCTACTC TGAGTGAAAC TCCACCACCT CAGACCGGCC ATGTAGTAAG ACGACGACCC CAAAGCCCTC TCCGTGGTCT GGGACCGCCA CCTGAGCATC TCCGTGGTCC TGAAGCAGAC ATACCAGGAG AAAGTGTGTG GCCTGTGTGG GAATTTTGAT GTTTCGGGAG AGGCACCAGA CCCTGGCGGT GGACTCGTAG AGGCACCAGG ACTTCGTCTG TATGGTCCTC TTTCACACAC CGGACACACC CTTAAAACTA GGCATCCAGA ACAATGACCT CACCAGCAGC AACCTCCAAG TGGAGGAAGA CCCTGTGGAC TTTGGGAACT CCTGGAAAGT GAGCTCGCAG TGTGCTGACA CCGTAGGTCT TGTTACTGGA GTGGTCGTCG TTGGAGGTTC ACCTCCTTCT GGGACACCTG AAACCCTTGA GGACCTTTCA CTCGAGCGTC ACACGACTGT CCAGAAAAGT GCCTCTGGAC TCATCCCCTG CCACCTGCCA TAACAACATC ATGAAGCAGA CGATGGTGGA TTCCTCCTGT AGAATCCTTA CCAGTGACGT GGTCTTTTCA CGGAGACCTG AGTAGGGGAC GGTGGACGGT ATTGTTGTAG TACTTCGTCT GCTACCACCT AAGGAGGACA TCTTAGGAAT GGTCACTGCA CTTCCAGGAC TGCAACAAGC TGGTGGACCC CGAGCCATAT CTGGATGTCT GCATTTACGA CACCTGCTCC TGTGAGTCCA TTGGGGACTG CGCCTGCTTC GAAGGTCCTG ACGTTGTTCG ACCACCTGGG GCTCGGTATA GACCTACAGA CGTAAATGCT GTGGACGAGG ACACTCAGGT AACCCCTGAC GCGGACGAAG TGCGACACCA TTGCTGCCTA TGCCCACGTG TGTGCCCAGC ATGGCAAGGT GGTGACCTGG AGGACGGCCA CATTGTGCCC CCAGAGCTGC GAGGAGAGGA ACGCTGTGGT AACGACGGAT ACGGGTGCAC ACACGGGTCG TACCGTTCCA CCACTGGACC TCCTGCCGGT GTAACACGGG GGTCTCGACG CTCCTCTCCT ATCTCCGGGA GAACGGGTAT GAGTGTGAGT GGCGCTATAA CAGCTGTGCA CCTGCCTGTC AAGTCACGTG TCAGCACCCT GAGCCACTGG CCTGCCCTGT TAGAGGCCCT CTTGCCCATA CTCACACTCA CCGCGATATT GTCGACACGT GGACGGACAG TTCAGTGCAC AGTCGTGGGA CTCGGTGACC GGACGGGACA GCAGTGTGTG GAGGGCTGCC ATGCCCACTG CCCTCCAGGG AAAATCCTGG ATGAGCTTTT GCAGACCTGC GTTGACCCTG AAGACTGTCC AGTGTGTGAG CGTCACACAC CTCCCGACGG TACGGGTGAC GGGAGGTCCC TTTTAGGACC TACTCGAAAA CGTCTGGACG CAACTGGGAC TTCTGACAGG TCACACACTC GTGGCTGGCC GGCGTTTTGC CTCAGGAAAG AAAGTCACCT TGAATCCCAG TGACCCTGAG CACTGCCAGA TTTGCCACTG TGATGTTGTC AACCTCACCT CACCGACCGG CCGCAAAACG GAGTCCTTTC TTTCAGTGGA ACTTAGGGTC ACTGGGACTC GTGACGGTCT AAACGGTGAC ACTACAACAG TTGGAGTGGA GTGAAGCCTG CCAGGAGCCG GGAGGCCTGG TGGTGCCTCC CACAGATGCC CCGGTGAGCC CCACCACTCT GTATGTGGAG GACATCTCGG AACCGCCGTT CACTTCGGAC GGTCCTCGGC CCTCCGGACC ACCACGGAGG GTGTCTACGG GGCCACTCGG GGTGGTGAGA CATACACCTC CTGTAGAGCC TTGGCGGCAA GCACGATTTC TACTGCAGCA GGCTACTGGA CCTGGTCTTC CTGCTGGATG GCTCCTCCAG GCTGTCCGAG GCTGAGTTTG AAGTGCTGAA GGCCTTTGTG CGTGCTAAAG ATGACGTCGT CCGATGACCT GGACCAGAAG GACGACCTAC CGAGGAGGTC CGACAGGCTC CGACTCAAAC TTCACGACTT CCGGAAACAC GTGGACATGA TGGAGCGGCT GCGCATCTCC CAGAAGTGGG TCCGCGTGGC CGTGGTGGAG TACCACGACG GCTCCCACGC CTACATCGGG CTCAAGGACC CACCTGTACT ACCTCGCCGA CGCGTAGAGG GTCTTCACCC AGGCGCACCG GCACCACCTC ATGGTGCTGC CGAGGGTGCG GATGTAGCCC GAGTTCCTGG GGAAGCGACC GTCAGAGCTG CGGCGCATTG CCAGCCAGGT GAAGTATGCG GGCAGCCAGG TGGCCTCCAC CAGCGAGGTC TTGAAATACA CACTGTTCCA CCTTCGCTGG CAGTCTCGAC GCCGCGTAAC GGTCGGTCCA CTTCATACGC CCGTCGGTCC ACCGGAGGTG GTCGCTCCAG AACTTTATGT GTGACAAGGT AATCTTCAGC AAGATCGACC GCCCTGAAGC CTCCCGCATC GCCCTGCTCC TGATGGCCAG CCAGGAGCCC CAACGGATGT CCCGGAACTT TGTCCGCTAC TTAGAAGTCG TTCTAGCTGG CGGGACTTCG GAGGGCGTAG CGGGACGAGG ACTACCGGTC GGTCCTCGGG GTTGCCTACA GGGCCTTGAA ACAGGCGATG GTCCAGGGCC TGAAGAAGAA GAAGGTCATT GTGATCCCGG TGGGCATTGG GCCCCATGCC AACCTCAAGC AGATCCGCCT CATCGAGAAG CAGGCCCCTG CAGGTCCCGG ACTTCTTCTT CTTCCAGTAA CACTAGGGCC ACCCGTAACC CGGGGTACGG TTGGAGTTCG TCTAGGCGGA GTAGCTCTTC GTCCGGGGAC AGAACAAGGC CTTCGTGCTG AGCAGTGTGG ATGAGCTGGA GCAGCAAAGG GACGAGATCG TTAGCTACCT CTGTGACCTT GCCCCTGAAG CCCCTCCTCC
TCTTGTTCCG GAAGCACGAC TCGTCACACC TACTCGACCT CGTCGTTTCC CTGCTCTAGC AATCGATGGA GACACTGGAA CGGGGACTTC GGGGAGGAGG TACTCTGCCC CCCGACATGG CACAAGTCAC TGTGGGCCCG GGGCTCTTGG GGGTTTCGAC CCTGGGGCCC AAGAGGAACT CCATGGTTCT GGATGTGGCG ATGAGACGGG GGGCTGTACC GTGTTCAGTG ACACCCGGGC CCCGAGAACC CCCAAAGCTG GGACCCCGGG TTCTCCTTGA GGTACCAAGA CCTACACCGC TTCGTCCTGG AAGGAT CGGA CAAAATTGGT GAAGCCGACT TCAACAGGAG CAAGGAGTTC ATGGAGGAGG TGATTCAGCG GATGGATGTG GGCCAGGACA AAGCAGGACC TTCCTAGCCT GTTTTAACCA CTTCGGCTGA AGTTGTCCTC GTTCCTCAAG TACCTCCTCC ACTAAGTCGC CTACCTACAC CCGGTCCTGT GCATCCACGT CACGGTGCTG CAGTACTCCT ACATGGTGAC CGTGGAGTAC CCCTTCAGCG AGGCACAGTC CAAAGGGGAC ATCCTGCAGC GGGTGCGAGA CGTAGGTGCA GTGCCACGAC GTCATGAGGA TGTACCACTG GCACCTCATG GGGAAGTCGC TCCGTGTCAG GTTTCCCCTG TAGGACGTCG CCCACGCTCT GATCCGCTAC CAGGGCGGCA ACAGGACCAA CACTGGGCTG GCCCTGCGGT ACCTCTCTGA CCACAGCTTC TTGGTCAGCC AGGGTGACCG GGAGCAGGCG CTAGGCGATG GTCCCGCCGT TGTCCTGGTT GTGACCCGAC CGGGACGCCA TGGAGAGACT GGTGTCGAAG AACCAGTCGG TCCCACTGGC CCTCGTCCGC CCCAACCTGG TCTACATGGT CACCGGAAAT CCTGCCTCTG ATGAGATCAA GAGGCTGCCT GGAGACATCC AGGTGGTGCC CATTGGAGTG GGCCCTAATG GGGTTGGACC AGATGTACCA GTGGCCTTTA GGACGGAGAC TACTCTAGTT CTCCGACGGA CCTCTGTAGG TCCACCACGG GTAACCTCAC CCGGGATTAC CCAACGTGCA GGAGCTGGAG AGGATTGGCT GGCCCAATGC CCCTATCCTC ATCCAGGACT TTGAGACGCT CCCCCGAGAG GCTCCTGACC TGGTGCTGCA GGTTGCACGT CCTCGACCTC TCCTAACCGA CCGGGTTACG GGGATAGGAG TAGGTCCTGA AACTCTGCGA GGGGGCTCTC CGAGGACTGG ACCACGACGT GAGGTGCTGC TCCGGAGAGG GGCTGCAGAT CCCCACCCTC TCCCCTGCAC CTGACTGCAG CCAGCCCCTG GACGTGATCC TTCTCCTGGA TGGCTCCTCC CTCCACGACG AGGCCTCTCC CCGACGTCTA GGGGTGGGAG AGGGGACGTG GACTGACGTC GGTCGGGGAC CTGCACTAGG AAGAGGACCT ACCGAGGAGG AGTTTCCCAG CTTCTTATTT TGATGAAATG AAGAGTTTCG CCAAGGCTTT CATTTCAAAA GCCAATATAG GGCCTCGTCT CACTCAGGTG TCAGTGCTGC TCAAAGGGTC GAAGAATAAA ACTACTTTAC TTCTCAAAGC GGTTCCGAAA GTAAAGTTTT CGGTTATATC CCGGAGCAGA GTGAGTCCAC AGTCACGACG AGTATGGAAG CATCACCACC ATTGACGTGC CATGGAACGT GGTCCCGGAG AAAGCCCATT TGCTGAGCCT TGTGGACGTC ATGCAGCGGG AGGGAGGCCC TCATACCTTC GTAGTGGTGG TAACTGCACG GTACCTTGCA CCAGGGCCTC TTTCGGGTAA ACGACTCGGA ACACCTGCAG TACGTCGCCC TCCCTCCGGG CAGCCAAATC GGGGATGCCT TGGGCTTTGC TGTGCGATAC TTGACTTCAG AAATGCATGG TGCCAGGCCG GGAGCCTCAA AGGCGGTGGT CATCCTGGTC GTCGGTTTAG CCCCTACGGA ACCCGAAACG ACACGCTATG AACTGAAGTC TTTACGTACC ACGGTCCGGC CCTCGGAGTT TCCGCCACCA GTAGGACCAG ACGGACGTCT CTGTGGATTC AGTGGATGCA GCAGCTGATG CCGCCAGGTC CAACAGAGTG ACAGTGTTCC CTATTGGAAT TGGAGATCGC TACGATGCAG TGCCTGCAGA GACACCTAAG TCACCTACGT CGTCGACTAC GGCGGTCCAG GTTGTCTCAC TGTCACAAGG GATAACCTTA ACCTCTAGCG ATGCTACGTC CCCAGCTACG GATCTTGGCA GGCCCAGCAG GCGACTCCAA CGTGGTGAAG CTCCAGCGAA TCGAAGACCT CCCTACCATG GTCACCTTGG GCAATTCCTT GGGTCGATGC CTAGAACCGT CCGGGTCGTC CGCTGAGGTT GCACCACTTC GAGGTCGCTT AGCTTCTGGA GGGATGGTAC CAGTGGAACC CGTTAAGGAA CCTCCACAAA CTGTGCTCTG GATTTGTTAG GATTTGCATG GATGAGGATG GGAATGAGAA GAGGCCCGGG GACGTCTGGA CCTTGCCAGA CCAGTGCCAC GGAGGTGTTT GACACGAGAC CTAAACAATC CTAAACGTAC CTACTCCTAC CCTTACTCTT CTCCGGGCCC CTGCAGACCT GGAACGGTCT GGTCACGGTG ACCGTGACTT GCCAGCCAGA TGGCCAGACC TTGCTGAAGA GTCATCGGGT CAACTGTGAC CGGGGGCTGA GGCCTTCGTG CCCTAACAGC CAGTCCCCTG TGGCACTGAA CGGTCGGTCT ACCGGTCTGG AACGACTTCT CAGTAGCCCA GTTGACACTG GCCCCCGACT CCGGAAGCAC GGGATTGTCG GTCAGGGGAC TTAAAGTGGA AGAGACCTGT GGCTGCCGCT GGACCTGCCC CTGYGTGTGC ACAGGCAGCT CCACTCGGCA CATCGTGACC TTTGATGGGC AGAATTTCAA
AATTTCACCT TCTCTGGACA CCGACGGCGA CCTGGACGGG GACRCACACG TGTCCGTCGA GGTGAGCCGT GTAGCACTGG AAACTACCCG TCTTAAAGTT GCTGACTGGC AGCTGTTCTT ATGTCCTATT TCAAAACAAG GAGCAGGACC TGGAGGTGAT TCTCCATAAT GGTGCCTGCA GCCCTGGAGC AAGGCAGGGC CGACTGACCG TCGACAAGAA TACAGGATAA AGTTTTGTTC CTCGTCCTGG ACCTCCACTA AGAGGTATTA CCACGGACGT CGGGACCTCG TTCCGTCCCG TGCATGAAAT CCATCGAGGT GAAGCACAGT GCCCTCTCCG TCGAGSTGCA CAGTGACATG GAGGTGACGG TGAATGGGAG ACTGGTCTCT GTTCCTTACG ACGTACTTTA GGTAGCTCCA CTTCGTGTCA CGGGAGAGGC AGCTCSACGT GTCACTGTAC CTCCACTGCC ACTTACCCTC TGACCAGAGA CAAGGAATGC TGGGTGGGAA CATGGAAGTC AACGTTTATG GTGCCATCAT GCATGAGGTC AGATTCAATC ACCTTGGTCA CATCTTCACA TTCACTCCAC AAAACAATGA ACCCACCCTT GTACCTTCAG TTGCAAATAC CACGGTAGTA CGTACTCCAG TCTAAGTTAG TGGAACCAGT GTAGAAGTGT AAGTGAGGTG TTTTGTTACT GTTCCAACTG CAGCTCAGCC CCAAGACTTT TGCTTCAAAG ACGTATGGTC TGTGTGGGAT CTGTGATGAG AACGGAGCCA ATGACTTCAT GCTGAGGGAT CAAGGTTGAC GTCGAGTCGG GGTTCTGAAA ACGAAGTTTC TGCATACCAG ACACACCCTA GACACTACTC TTGCCTCGGT TACTGAAGTA CGACTCCCTA GGCACAGTCA CCACAGACTG GAAAACACTT GTTCAGGAAT GGACTGTGCA GCGGCCAGGG CAGACGTGCC AGCCCATCCT GGAGGAGCAG TGTCTTGTCC CCGTGTCAGT GGTGTCTGAC CTTTTGTGAA CAAGTCCTTA CCTGACACGT CGCCGGTCCC GTCTGCACGG TCGGGTAGGA CCTCCTCGTC ACAGAACAGG CCGACAGCTC CCACTGCCAG GTCCTCCTCT TACCACTGTT TGCTGAATGC CACAAGGTCC TGGCTCCAGC CACATTCTAT GCCATCTGCC AGCAGGACAG GGCTGTCGAG GGTGACGGTC CAGGAGGAGA ATGGTGACAA ACGACTTACG GTGTTCCAGG ACCGAGGTCG GTGTAAGATA CGGTAGACGG TCGTCCTGTC TTGCCACCAG GAGCAAGTGT GTGAGGTGAT CGCCTCTTAT GCCCACCTCT GTCGGACCAA CGGGGTCTGC GTTGACTGGA GGACACCTGA TTTCTGTGCT AACGGTGGTC CTCGTTCACA CACTCCACTA GCGGAGAATA CGGGTGGAGA CAGCCTGGTT GCCCCAGACG CAACTGACCT CCTGTGGACT AAAGACACGA ATGTCATGCC CACCATCTCT GGTCTACAAC CACTGTGAGC ATGGCTGTCC CCGGCACTGT GATGGCAACG TGAGCTCCTG TGGGGACCAT CCCTCCGAAG TACAGTACGG GTGGTAGAGA CCAGATGTTG GTGACACTCG TACCGACAGG GGCCGTGACA CTACCGTTGC ACTCGAGGAC ACCCCTGGTA GGGAGGCTTC GCTGTTTCTG CCCTCCAGAT AAAGTCATGT TGGAAGGCAG CTGTGTCCCT GAAGAGGCCT GCACTCAGTG CATTGGTGAG GATGGAGTCC AGCACCAGTT CGACAAAGAC GGGAGGTCTA TTTCAGTACA ACCTTCCGTC GACACAGGGA CTTCTCCGGA CGTGAGTCAC GTAACCACTC CTACCTCAGG TCGTGGTCAA CCTGGAAGCC TGGGTCCCGG ACCACCAGCC CTGTCAGATC TGCACATGCC TCAGCGGGCG GAAGGTCAAC TGCACAACGC AGCCCTGCCC CACGGCCAAA GGACCTTCGG ACCCAGGGCC TGGTGGTCGG GACAGTCTAG ACGTGTACGG AGTCGCCCGC CTTCCAGTTG ACGTGTTGCG TCGGGACGGG GTGCCGGTTT GCTCCCACGT GTGGCCTGTG TGAAGTAGCC CGCCTCCGCC AGAATGCAGA CCAGTGCTGC CCCGAGTATG AGTGTGTGTG TGACCCAGTG AGCTGTGACC CGAGGGTGCA CACCGGACAC ACTTCATCGG GCGGAGGCGG TCTTACGTCT GGTCACGACG GGGCTCATAC TCACACACAC ACTGGGTCAC TCGACACTGG TGCCCCCAGT GCCTCACTGT GAACGTGGCC TCCAGCCCAC ACTGACCAAC CCTGGCGAGT GCAGACCCAA CTTCACCTGC GCCTGCAGGA AGGAGGAGTG ACGGGGGTCA CGGAGTGACA CTTGCACCGG AGGTCGGGTG TGACTGGTTG GGACCGCTCA CGTCTGGGTT GAAGTGGACG CGGACGTCCT TCCTCCTCAC CAAAAGAGTG TCCCCACCCT CCTGCCCCCC GCACCGTTTG CCCACCCTTC GGAAGACCCA GTGCTGTGAT GAGTATGAGT GTGCCTGCAA CTGTGTCAAC GTTTTCTCAC AGGGGTGGGA GGACGGGGGG CGTGGCAAAC GGGTGGGAAG CCTTCTGGGT CACGACACTA CTCATACTCA CACGGACGTT GACACAGTTG TCCACAGTGA GCTGTCCCCT TGGGTACTTG GCCTCAACCG CCACCAATGA CTGTGGCTGT ACCACAACCA CCTGCCTTCC CGACAAGGTG TGTGTCCACC AGGTGTCACT CGACAGGGGA ACCCATGAAC CGGAGTTGGC GGTGGTTACT GACACCGACA TGGTGTTGGT GGACGGAAGG GCTGTTCCAC ACACAGGTGG GAAGCACCAT CTACCCTGTG GGCCAGTTCT GGGAGGAGGG CTGCGATGTG TGCACCTGCA CCGACATGGA GGATGCCGTG ATGGGCCTCC GCGTGGCCCA CTTCGTGGTA GATGGGACAC CCGGTCAAGA CCCTCCTCCC GACGCTACAC ACGTGGACGT GGCTGTACCT CCTACGGCAC TACCCGGAGG CGCACCGGGT
GTGCTCCCAG AAGCCCTGTG AGGACAGCTG TCGGTCGGGC TTCACTTACG
TTCTGCATGA AGGCGAGTGC TGTGGAAGGT GCCTGCCATC TGCCTGTGAG CACGAGGGTC TTCGGGACAC TCCTGTCGAC AGCCAGCCCG AAGTGAATGC AAGACGTACT TCCGCTCACG ACACCTTCCA CGGACGGTAG ACGGACACTC GTGGTGACTG GCTCACCGCG GGGGGACTCC CAGTCTTCCT GGAAGAGTGT CGGCTCCCAG TGGGCCTCCC CGGAGAACCC CTGCCTCATC AATGAGTGTG CACCACTGAC CGAGTGGCGC CCCCCTGAGG GTCAGAAGGA CCTTCTCACA GCCGAGGGTC ACCCGGAGGG GCCTCTTGGG GACGGAGTAG TTACTCACAC TCCGAGTGAA GGAGGAGGTC TTTATACAAC AAAGGAACGT CTCCTGCCCC CAGCTGGAGG TCCCTGTCTG CCCCTCGGGC TTTCAGCTGA GCTGTAAGAC AGGCTCACTT CCTCCTCCAG AAATATGTTG TTTCCTTGCA GAGGACGGGG GTCGACCTCC AGGGACAGAC GGGGAGCCCG AAAGTCGACT CGACATTCTG CTCAGCGTGC TGCCCAAGCT GTCGCTGTGA GCGCATGGAG GCCTGCATGC TCAATGGCAC TGTCATTGGG CCCGGGAAGA CTGTGATGAT CGATGTGTGC GAGTCGCACG ACGGGTTCGA CAGCGACACT CGCGTACCTC CGGACGTACG AGTTACCGTG ACAGTAACCC GGGCCCTTCT GACACTACTA GCTACACACG ACGACCTGCC GCTGCATGGT GCAGGTGGGG GTCATCTCTG GATTCAAGCT GGAGTGCAGG AAGACCACCT GCAACCCCTG CCCCCTGGGT TACAAGGAAG TGCTGGACGG CGACGTACCA CGTCCACCCC CAGTAGAGAC CTAAGTTCGA CCTCACGTCC TTCTGGTGGA CGTTGGGGAC GGGGGACCCA ATGTTCCTTC AAAATAACAC AGGTGAATGT TGTGGGAGAT GTTTGCCTAC GGCTTGCACC ATTCAGCTAA GAGGAGGACA GATCATGACA CTGAAGCGTG ATGAGACGCT TTTTATTGTG TCCACTTACA ACACCCTCTA CAAACGGATG CCGAACGTGG TAAGTCGATT CTCCTCCTGT CTAGTACTGT GACTTCGCAC TACTCTGCGA CCAGGATGGC TGTGATACTC ACTTCTGCAA GGTCAATGAG AGAGGAGAGT ACTTCTGGGA GAAGAGGGTC ACAGGCTGCC CACCCTTTGA TGAACACAAG GGTCCTACCG ACACTATGAG TGAAGACGTT CCAGTTACTC TCTCCTCTCA TGAAGACCCT CTTCTCCCAG TGTCCGACGG GTGGGAAACT ACTTGTGTTC TGTCTTGCTG AGGGAGGTAA AATTATGAAA ATTCCAGGCA CCTGCTGTGA CACATGTGAG GAGCCTGAGT GCAACGACAT CACTGCCAGG CTGCAGTATG ACAGAACGAC TCCCTCCATT TTAATACTTT TAAGGTCCGT GGACGACACT GTGTACACTC CTCGGACTCA CGTTGCTGTA GTGACGGTCC GACGTCATAC TCAAGGTGGG AAGCTGTAAG TCTGAAGTAG AGGTGGATAT CCACTACTGC CAGGGCAAAT GTGCCAGCAA AGCCATGTAC TCCATTGACA TCAACGATGT AGTTCCACCC TTCGACATTC AGACTTCATC TCCACCTATA GGTGATGACG GTCCCGTTTA CACGGTCGTT TCGGTACATG AGGTAACTGT AGTTGCTACA GCAGGACCAG TGCTCCTGCT GCTCTCCGAC ACGGACGGAG CCCATGCAGG TGGCCCTGCA CTGCACCAAT GGCTCTGTTG TGTACCATGA GGTTCTCAAT CGTCCTGGTC ACGAGGACGA CGAGAGGCTG TGCCTGCCTC GGGTACGTCC ACCGGGACGT GACGTGGTTA CCGAGACAAC ACATGGTACT CCAAGAGTTA GCCATGGAGT GCAAATGCTC CCCCAGGAAG TGCAGCAAGT GA
La presente invención se refiere a un fragmento de factor von Willebrand (VWF) que comprende un dominio D' y un dominio D3 de VWF, donde el fragmento de VWF inhibe la unión de VWF endógeno (VWF de longitud completa) a una proteína de FVIII. En una modalidad, el fragmento de VWF se une o está asociado a una proteína de FVIII. Mediante la unión o asociación a una proteína de FVIII, un fragmento de VWF de la invención protege FVIII de la escisión de proteasa y activación de FVIII, estabiliza la cadena pesada y la cadena
ligera de FVIII, y evita la depuración de FVIII mediante receptores depuradores. En otra modalidad, el fragmento de VWF se une o está asociado a una proteína de FVIII y bloquea o evita la unión de la proteína de FVIII al fosfolípido y la Proteína C activada. Mediante la prevención o inhibición de la unión de la proteína de FVIII con VWF endógeno de longitud completa, el fragmento de VWF de la invención reduce la depuración de FVIII por receptores de depuración de VWF y por lo tanto extiende la semivida de FVIII. La extensión de la semivida de una proteína de FVIII por lo tanto se debe a la unión o asociación con el fragmento de VWF que carece de un sitio de unión al receptor de depuración de VWF a la proteína de FVIII y a la protección de la proteína de FVIII por el fragmento de VWF de VWF endógeno que contiene el sitio de unión al receptor de depuración de VWF. La proteína de FVIII unida a o protegida por el fragmento de VWF también puede permitir reciclar una proteína de FVIII. Por lo tanto, el fragmento de VWF no puede ser VWF maduro de longitud completa. Mediante la supresión de los sitios de unión del receptor de vía de depuración de VWF contenidos en la molécula de VWF de longitud completa, los heterodímeros FVIII/VWF de la invención no están unidos a la vía de depuración de VWF, lo que permite la extensión adicional de la semivida de FVIII.
El fragmento de VWF que comprende el dominio D' y el dominio D3 puede comprender además un dominio de VWF que se selecciona del grupo que consiste en un dominio Al, un dominio A2 , un dominio A3 , un dominio DI , un dominio D2 , un dominio D4 , un dominio Bl, un dominio B2 , un dominio B3 , un dominio Cl, un dominio C2 , un dominio CK, uno o más fragmentos de estos y cualesquiera combinaciones de estos. En una modalidad, un fragmento de VWF comprende, consiste esencialmente en o consiste en: (1) los dominios D1 y D3 de VWF o fragmentos de estos; (2) los dominios DI, D', y D3 de VWF o fragmentos de estos; (3) los dominios D2 , D', y D3 de VWF o fragmentos de estos; (4) los dominios DI, D2 , D', y D3 de VWF o fragmentos de estos; o (5) los dominios DI, D2 , D', D3, y Al de VWF o fragmentos de estos. El fragmento de VWF descrito en la presente no contiene un sitio que se une a un receptor de depuración de VWF. En otra modalidad, el fragmento de VWF descrito en la presente no es aminoácidos 764 a 1274 de la SEQ ID NO: 2. El fragmento de VWF de la presente invención puede comprender cualesquiera otras secuencias enlazadas o fusionadas al fragmento de VWF, pero no es el VWF de longitud completa. Por ejemplo, un fragmento de VWF descrito en la presente puede comprender además un péptido de señal.
En una modalidad, un fragmento de VWF de la presente invención comprende el dominio D' y el dominio D3 de VWF,
donde el dominio D' es al menos 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 100% idéntico a aminoácidos 764 a 866 de la SEQ ID NO: 2, donde el fragmento de VWF se une a la proteína de FVIII, protege, inhibe o evita la unión del fragmento de VWF endógeno a una proteína de FVIII. En otra modalidad, un fragmento de VWF comprende el dominio D' y el dominio D3 de VWF, donde el dominio D3 es al menos 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 100% idéntico a aminoácidos 867 a 1240 de la SEQ ID NO: 2, donde el fragmento de VWF se une a la proteína de FVIII o inhibe o evita la unión del fragmento de VWF endógeno a una proteína de FVIII. En algunas modalidades, un fragmento de VWF descrito en la presente comprende, consiste esencialmente en o consiste en el dominio D' y el dominio D3 de VWF, que son al menos 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 100% idéntico a aminoácidos 764 a 1240 de la SEQ ID NO: 2, donde el fragmento de VWF se une a la proteína de FVIII o inhibe o evita la unión del fragmento de VWF endógeno a una proteína de FVIII. En otras modalidades, un fragmento de VWF comprende, consiste esencialmente en o consiste en los dominios DI, D2 , D' y D3 al menos 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 100% idéntico a aminoácidos 23 a 1240 de la SEQ ID NO: 2, donde el fragmento de VWF se une a la proteína de FVIII o inhibe o evita la unión del fragmento de VWF endógeno a una proteína de FVIII. En aun otras
modalidades, el fragmento de VWF comprende además un péptido de señal enlazado operativamente a este.
En algunas modalidades, un fragmento de VWF de la invención consiste esencialmente en o consiste en (1) el dominio D'D3, el dominio D1D'D3, el dominio D2D'D3, o el dominio D1D2D' D3 y (2) una secuencia adicional de VWF hasta alrededor de 10 aminoácidos (por ejemplo, cualesquiera secuencias de aminoácidos 764 a 1240 de la SEQ ID NO: 2 a aminoácidos 764 a 1250 de la SEQ ID NO: 2) , hasta alrededor de 15 aminoácidos (por ejemplo, cualesquiera secuencias de aminoácidos 764 a 1240 de la SEQ ID NO: 2 a aminoácidos 764 a 1255 de la SEQ ID NO: 2) , hasta alrededor de 20 aminoácidos (por ejemplo, cualesquiera secuencias de aminoácidos 764 a 1240 de la SEQ ID NO : 2 a aminoácidos 764 a 1260 de la SEQ ID NO: 2) , hasta alrededor de 25 aminoácidos (por ejemplo, cualesquiera secuencias de aminoácidos 764 a 1240 de la SEQ ID NO: 2 a aminoácidos 764 a 1265 de la SEQ ID NO: 2), o hasta alrededor de 30 aminoácidos (por ejemplo, cualesquiera secuencias de aminoácidos 764 a 1240 de la SEQ ID NO: 2 a aminoácidos 764 a 1260 de la SEQ ID NO: 2) . En una modalidad particular, el fragmento de VWF que comprende o consiste esencialmente en el dominio D' y el dominio D3 no es aminoácidos 764 a 1274 de la SEQ ID NO: 2 ni VWF maduro de longitud completa.
En otras modalidades, el fragmento de VWF que comprende los dominios D'D3 enlazados a los dominios D1D2 comprende además un sitio de escisión intracelular, por ejemplo, (un sitio de escisión por PACE o PC5) , permitiendo la escisión de los dominios D1D2 de los dominios D'D3 tras la expresión. Los ejemplos no taxativos del sitio de escisión intracelular se describen en otras partes en la presente.
En aun otras modalidades, un fragmento de VWF comprende el dominio D' y el dominio D3 , pero no comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en (1) aminoácidos 1241 a 2813 de la SEQ ID NO: 2,
(2) aminoácidos 1270 a aminoácidos 2813 de la SEQ ID NO: 2,
(3) aminoácidos 1271 a aminoácidos 2813 de la SEQ ID NO: 2,
(4) aminoácidos 1272 a aminoácidos 2813 de la SEQ ID NO : 2, (5) aminoácidos 1273 a aminoácidos 2813 de la SEQ ID NO : 2,
(6) aminoácidos 1274 a aminoácidos 2813 de la SEQ ID NO: 2.
En aun otras modalidades, un fragmento de VWF de la presente invención comprende, consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de aminoácidos que corresponde al dominio D' , dominio D3 y dominio Al, donde la secuencia de aminoácidos es al menos 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 100% idéntica a aminoácidos 764 a 1479 de la SEQ ID NO : 2, donde el VWF se une a FVIII. En una modalidad particular, el fragmento de VWF no es aminoácidos 764 a 1274 de la SEQ ID NO: 2.
En algunas modalidades, un fragmento de VWF de la invención comprende el dominio D' y el dominio D3 , pero no comprende al menos un dominio de VWF que se selecciona del grupo que consiste en (1) un dominio Al, (2) un dominio A2, (3) un dominio A3 , (4) un dominio D4 , (5) un dominio Bl, (6) un dominio B2 , (7) un dominio B3 , (8) un dominio Cl, (9) un dominio C2 , (10) un dominio CK, (11) un dominio CK y un dominio C2 , (12) un dominio CK, un dominio C2 , y un dominio Cl, (13) un dominio CK, un dominio C2 , un dominio Cl, un dominio B3, (14) un dominio CK, un dominio C2, un dominio Cl, un dominio B3 , un dominio B2 , (15) un dominio CK, un dominio C2 , un dominio Cl, un dominio B3 , un dominio B2 , y un dominio Bl, (16) un dominio CK, un dominio C2 , un dominio Cl, un dominio B3 , un dominio B2 , un dominio Bl, y un dominio D4, (17) un dominio CK, un dominio C2 , un dominio Cl, un dominio B3 , un dominio B2 , un dominio Bl, un dominio D4 , y un dominio A3 , (18) un dominio CK, un dominio C2 , un dominio Cl, un dominio B3 , un dominio B2 , un dominio Bl, un dominio D4 , un dominio A3 , y un dominio A2 , (19) un dominio CK, un dominio C2, un dominio Cl, un dominio B3 , un dominio B2, un dominio Bl, un dominio D4 , un dominio A3 , un dominio A2 , y un dominio Al, y (20) cualesquiera combinaciones de estos.
En aun otras modalidades, el fragmento de VWF comprende los dominios D'D3 y uno o más dominios o módulos. Los ejemplos de los dominios o módulos incluyen, de modo no
taxativo, los dominios y módulos descritos en Zhour et ál . , Blood publicado en línea el 6 de abril de 2012: DOI 10.1182/blood-2012-01-405134. Por ejemplo, el fragmento de VWF puede comprender el dominio D'D3 y uno o más dominios o módulos que se seleccionan del grupo que consiste en el dominio Al, dominio A2, dominio A3, módulo D4N, módulo VWD4, módulo C8-4, módulo TIL-4, módulo Cl, módulo C2 , módulo C3, módulo C4 , módulo C5 , módulo C5, módulo C6 , y cualesquiera combinaciones de estos.
En aun otras modalidades, el fragmento de VWF está enlazado a un resto heterologo, donde el resto heterólogo está enlazado al N-terminal o el C-terminal del fragmento de VWF o insertado entre dos aminoácidos en el fragmento de VWF. Por ejemplo, los sitios de inserción para el resto heterólogo en el fragmento de VWF pueden estar en el dominio D' , el dominio D3 , o ambos . El resto heterólogo puede ser un extensor de la semivida.
En determinadas modalidades, un fragmento de VWF de la invención forma un multímero, por ejemplo, dímero, trímero, tetrámero, pentámero, hexámero, heptámero, o los multímeros de orden mayor. En otras modalidades, el fragmento de VWF es un monómero que tiene solo un fragmento de VWF. En algunas modalidades, el fragmento de VWF de la presente invención puede tener una o más sustituciones, supresiones, adiciones o modificaciones de aminoácidos. En una modalidad, el fragmento de VWF puede incluir sustituciones, supresiones, adiciones o
modificaciones de aminoácidos de modo que el fragmento de VWF no es capaz de formar una unión disulfuro o formar un dímero o un multímero. En otra modalidad, la sustitución de aminoácidos se encuentra dentro del dominio D' y el dominio D3. En una modalidad particular, un fragmento de VWF de la invención contiene al menos una sustitución de aminoácidos en un residuo que corresponde al residuo 1099, residuo 1142 o ambos residuos 1099 y 1142 de la SEQ ID NO : 2. La al menos una sustitución de aminoácidos puede ser cualquier aminoácidos que no sea de origen natural en el VWF de tipo salvaje. Por ejemplo, la sustitución de aminoácidos puede ser cualquier aminoácido que no sea cisteína, por ejemplo, Isoleucina, Alanina, Leucina, Asparagina, Lisina, Ácido aspártico, Metionina, Fenilalanina, Ácido glutámico, Treonina, Glutamina, Triptófano, Glicina, Valina, Prolina, Serina, Tirosina, Arginina, o Histidina. En otro ejemplo, la sustitución de aminoácidos tiene uno o más aminoácidos que evitan o inhiben que el fragmento de VWF forme multímeros.
En determinadas modalidades, el fragmento de VWF útil en la presente se puede modificar además para mejorar su interacción con FVIII, por ejemplo, para mejorar la afinidad de unión a FVIII. Como un ejemplo no taxativo, el fragmento de VWF comprende un residuo de serina en el residuo que corresponde al aminoácido 764 de la SEQ ID NO: 2 y un residuo de lisina en el residuo que corresponde al aminoácido 773 de
la SEQ ID NO: 2. Los residuos 764 y/o 773 pueden contribuir a la afinidad de unión de los fragmento de VWF con FVIII. En otras modalidades, el fragmento de VWF puede tener otras modificaciones, por ejemplo, el fragmento puede estar pegilado, glicosilado, hesilado o polisialilado .
B) Restos heterólogos
El resto heterologo puede ser un polipéptido heterologo o un resto no polipéptido heterologo. En determinadas modalidades, el resto heterologo es una molécula que extiende la semivida que se conoce en la técnica y comprende un polipéptido, un resto no polipéptido, o una combinación de estos. El resto polipéptido heterologo puede comprender una región constante de inmunoglobulina o una parte de esta, albúmina o un fragmento de esta, un resto de unión a la albúmina, transferrina o un fragmento de esta, una secuencia PAS, una secuencia HAP, un derivado o variante de estos o cualesquiera combinaciones de estos. En algunas modalidades, el resto de enlace no polipéptido comprende polietilenglicol (PEG) , ácido polisiálico, almidón de hidroxietilo (HES) , un derivado de estos o cualesquiera combinaciones de estos. En determinadas modalidades, puede haber uno, dos, tres o más restos heterólogos, que pueden ser moléculas iguales o diferentes.
1) Región constante de inmunoglobulina o parte de esta Una región constante de inmunoglobulina comprende dominios denominados dominios CH (pesados constantes) (CH1,
CH2, etc.). Dependiendo del isotipo, (es decir, IgG, IgM, IgA IgD, o IgE) , la región constante puede comprender tres o cuatro dominios CH. Algunas regiones constantes de isotipos (por ejemplo, IgG) también contienen una región bisagra. Véase Janeway et ál . 2001, Immunobiology, Garland Publishing, N.Y., N.Y.
Una región constante de inmunoglobulina o una parte de esta para producir la proteína quimérica de la presente invención se puede obtener a partir de una cantidad de fuentes diferentes. En modalidades preferidas, una región constante de inmunoglobulina o una parte de esta deriva de una inmunoglobulina humana. Sin embargo, se entiende que la región constante de inmunoglobulina o una parte de esta puede derivar de una inmunoglobulina de otra especie de mamífero, que incluye por ejemplo, un roedor (por ejemplo, un ratón, rata, conejo, cobayo) o una especie de primate no humano (por ejemplo, chimpancé, monos rhesus) . Asimismo, la región constante de inmunoglobulina o una parte de esta puede derivar de cualquier clase de inmunoglobulina, que incluye IgM, IgG, IgD, IgA e IgE, y cualquier isotipo de inmunoglobulina, que incluye IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4. En una modalidad, se usa el isotipo humano IgGl.
Se encuentra disponible una variedad de secuencias génicas de la región constante de inmunoglobulina (por ejemplo, secuencias génicas de la región constante humana) en
la forma de depósitos accesibles públicamente. Se puede seleccionar una secuencia de dominios de la región constante que tenga una función efectora particular (o que carezca de una función efectora particular) o con una modificación particular para reducir inmunogenicidad . Se han publicado muchas secuencias de anticuerpos y genes que codifican anticuerpos y pueden derivar secuencias de región constante Ig adecuadas (por ejemplo, secuencias bisagra, CH2 y/o CH3 , o partes de estas) de estas secuencias usando técnicas conocidas en la técnica. El material genético obtenido usando cualquiera de los métodos anteriores luego se puede alterar o sintetizar para obtener polipéptidos de la presente invención. Se apreciará además que el alcance de esta invención comprende alelos, variantes y mutaciones de secuencias de ADN de la región constante.
Las secuencias de la región constante de inmunoglobulina o una parte de esta se puede clonar, por ejemplo, usando la reacción en cadena de la polimerasa y cebadores que se seleccionan para amplificar el dominio de interés. Para clonar una secuencia de la región constante de inmunoglobulina o una parte de esta a partir de un anticuerpo, se puede aislar mRNA a partir de células de hibridoma, bazo o linfáticas, transcribir de forma inversa en ADN, y amplificar genes de anticuerpo por PCR. Los métodos de amplificación por PCR se describen en detalle en las patentes
estadounidenses n.° 4,683,195; 4,683,202; 4,800,159; 4,965,188; y en, por ejemplo, "PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications" Innis et ál . eds . , Academic Press, San Diego, CA (1990); Ho et ál . 1989. Gene 77:51; Horton et ál . 1993. Methods Enzymol . 217:270). Se puede iniciar PCR por cebadores de la región constante de consenso o por cebadores más específicos basados en las secuencias de aminoácidos y ADN de cadena pesada y ligera publicadas. Tal como se describe anteriormente, PCR también se puede usar para aislar clones de ADN que codifican las cadenas ligera y pesada de anticuerpo. En este caso las bibliotecas se pueden analizar por cebadores de consenso o sondas homologas más grandes, tales como sondas de región constante de ratón. Se conocen en la técnica varios conjuntos de cebadores adecuados para la amplificación de genes de anticuerpo (por ejemplo, cebadores 5' basados en la secuencia de N-terminal de anticuerpos purificados (Benhar and Pastan. 1994. Protein Engineering 7:1509); amplificación rápida de extremos ADNc (Ruberti, F. et ál . 1994. J. Immunol . Methods 173:33); secuencias líder de anticuerpo (Larrick et ál . 1989 Biochem. Biophys . Res. Commun. 160:1250) . La clonación de las secuencias de anticuerpo se describe además en Newman et ál . , patente estadounidense n.° 5,658,570, presentada el 25 de enero de 1995, que se incorpora a la presente mediante esta referencia.
Una región constante de inmunoglobulina usada en la presente puede incluir todos los dominios y la región bisagra o partes de esta. En una modalidad, la región constante de inmunoglobulina o una parte de esta comprende el dominio CH2, dominio CH3 , y una región bisagra, es decir, una región Fe o un compañero de unión a FcRn.
Tal como se usa en la presente, el término "región Fe" se define como la parte de un polipéptido que corresponde a la región Fe de inmunoglobulina natural, es decir, tal como se forma por la asociación dimérica de los dominios de Fe correspondientes de sus dos cadenas pesadas. Una región Fe natural forma un homodímero con otra región Fe. Por el contrario, el término "región Fe fusionado genéticamente" o "región Fe de cadena simple" (región scFc) , tal como se usa en la presente, se refiere a una región Fe dimérica sintética que comprende dominios de Fe enlazados genéticamente dentro de una cadena de polipéptidos simple (es decir, codificada en una secuencia genética contigua simple) .
En una modalidad, la "región Fe" hace referencia a la parte de una cadena pesada de inmunoglobuli a simple que comienza en la región bisagra justo corriente arriba del sitio de escisión de papaína (es decir, residuo 216 en IgG, considerando que el primer residuo de la región constante de cadena pesada es 114) y que termina en el C-terminal-terminal del anticuerpo. Por consiguiente, un dominio de Fe completo
comprende al menos un dominio bisagra, un dominio CH2 y un dominio CH3.
La región Fe de una región constante de inmunoglobulina, dependiendo del isotipo de inmunoglobulina, puede incluir los dominios CH2, CH3 , y CH , así como la región bisagra. Las proteínas quiméricas que comprenden una región Fe de una inmunoglobulina imponen varias propiedades deseables sobre una proteína quimérica que incluyen estabilidad aumentada, semivida en suero aumentada (véase Capón et ál . , 1989, Nature 337:525) así como unión a receptores Fe tales como el receptor Fe neonatal (FcRn) (patente estadounidense n.° 6,086,875, 6,485,726, 6,030,613; O 03/077834; US2003-0235536A1) , que se incorporan a la presente mediante esta referencia en su totalidad.
Una región constante de inmunoglobulina o una parte de esta puede ser un compañero de unión a FcRn. FcRn es activo en tejidos epiteliales adultos y se expresa en el lumen de los intestinos, vías respiratorias, superficies nasales, superficies vaginales, colon y superficies rectales (patente estadounidense n.° 6,485,726). Un compañero de unión a FcRn es una parte de una inmunoglobulina que se une a FcRn.
El receptor FcRn se aisló a partir de varias especies de mamífero que incluyen humanos. Se conocen las secuencias de FcRn humano, FcRn de mono, FcRn de rata, y FcRn de ratón (Story et ál . 1994, J. Exp. Med. 180:2377). El receptor FcRn
se une a IgG (pero no a otras clases de inmunoglobulina tales como IgA, IgM, IgD, y IgE) a pH relativamente bajo, transporta activamente el IgG de forma transcelular en una dirección luminal a serosal, y luego libera el IgG a pH relativamente mayor en los fluidos intersticiales. Se expresa en tejido epitelial adulto (patente estadounidense n.° 6,485,726, 6,030,613, 6,086,875; WO 03/077834; US2003-0235536A1) que incluye epitelio de pulmón e intestinal (Israel et ál . 1997, Immunology 92:69) epitelio tubular próximo renal (Kobayashi et ál . 2002, Am. J. Physiol . Renal Physiol. 282:F358) así como epitelio nasal, superficies vaginales, y superficies del árbol biliar.
Los compañeros de unión a FcRn útiles en la presente invención comprenden moléculas que se pueden unir específicamente por el receptor FcRn que incluye IgG completa, el fragmento Fe de IgG, y otros fragmentos que incluyen la región de unión completa del receptor FcRn. La región de la parte Fe de IgG que se une al receptor FcRn se ha descrito en función de cristalografía de rayos X (Burmeister et ál . 1994, Nature 372:379). El área de contacto fundamental de la Fe con FcRn es cerca de la unión de los dominios CH2 y CH3. Los contactos entre Fc-FcRn se encuentran dentro de una cadena pesada de Ig simple. Los compañeros de unión a FcRn incluyen IgG completa, el fragmento Fe de IgG, y otros fragmentos de IgG que incluyen la región de unión
completa de FcRn. Los sitios de contacto fundamentales incluyen residuos de aminoácidos 248, 250-257, 272, 285, 288, 290-291, 308-311, y 314 del dominio CH2 y residuos de aminoácidos 385-387, 428, y 433-436 del dominio CH3. Las referencias a la numeración de los aminoácidos de inmunoglobulinas o fragmentos o regiones de inmunoglobulina se basan en Kabat et ál . 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Public Health, Bethesda, d.
Las regiones Fe o compañeros de unión a FcRn unidos a
FcRn pueden transportarse de manera eficaz a través de las barreras del epitelio por FcRn, proporcionando así un medio no invasivo para administrar sistémicamente una molécula terapéutica deseada. De manera adicional, las proteínas de fusión que comprenden una región Fe o un compañero de unión a FcRn están endocitosados por células que expresan el FcRn. Pero en vez de estar marcados para degradación, estas proteínas de fusión se reciclan en circulación nuevamente, aumentando así la semivida in vivo de estas proteínas. En determinadas modalidades, las partes de las regiones constantes de inmunoglobulina son una región Fe o un compañero de unión a FcRn que se asocia típicamente, mediante enlaces disulfuro y otras interacciones no específicas, con otra región Fe u otro compañero de unión a FcRn para formar dimeros y multímeros de orden mayor.
Dos receptores FcRn se pueden unir a una molécula de Fe simple. Los datos cristalográficos sugieren que cada molécula de FcRn se une a un polipéptido simple del homodímero de Fe. En una modalidad, enlazar el compañero de unión a FcRn, por ejemplo, un fragmento Fe de un IgG a una molécula biológicamente activa proporciona un medio para administrar la molécula biológicamente activa de forma oral, bucal, sublingual, rectal, vaginal, como un aerosol administrado de forma nasal o mediante una vía pulmonar o mediante una vía ocular. En otra modalidad, la proteína quimérica se puede administrar de forma invasiva, por ejemplo, de forma subcutánea, intravenosa.
Una región de compañero de unión a FcRn es una molécula o una parte de esta que puede estar unida específicamente por el receptor FcRn con transporte activo consiguiente por el receptor FcRn de la región Fe. Unido especí icamente se refiere a dos moléculas que forman un complejo que es relativamente estable en condiciones fisiológicas. La unión específica se caracteriza por una alta afinidad y una capacidad baja a moderada según se distingue de la unión no específica que normalmente tiene una baja afinidad con una capacidad moderada a alta. Típicamente, la unión se considera específica cuando la constante de afinidad KA es mayor que 106 M"1, o mayor que 108 M"1. Si fuera necesario, la unión no específica se puede reducir sin afectar sustancialmente la
unión específica modificando las condiciones de unión. Las condiciones de unión apropiadas tales como concentración de moléculas, fuerza iónica de la solución, temperatura, tiempo permitido para la unión, concentración de un agente de bloqueo (por ejemplo, albúmina en suero, caseína de leche) , etc., pueden optimizarse por un experto en la técnica usando técnicas de rutina.
En determinadas modalidades, una proteína quimérica de la invención comprende una o más regiones Fe truncadas que son sin embargo suficientes para conferir propiedades de unión al receptor Fe (FcR) a la región Fe. Por ejemplo, la parte de una región Fe que se une a FcRn (es decir, la parte de unión a FcRn) comprende de alrededor de aminoácidos 282-438 de IgGl, numeración EU (siendo los sitios de contacto primario los aminoácidos 248, 250-257, 272, 285, 288, 290-291, 308-311, y 314 del dominio CH2 y los residuos de aminoácidos 385-387, 428, y 433-436 del dominio CH3. Por lo tanto, una región Fe de la invención puede comprender o consistir en una parte de unión a FcRn. Las partes de unión a FcRn pueden derivar de cadenas pesadas de cualquier isotipo, que incluyen IgGl, IgG2 , IgG3 e IgG4. En una modalidad, se usa una parte de unión a FcRn de un anticuerpo del isotipo humano IgGl. En otra modalidad, se usa una parte de unión a FcRn de un anticuerpo del isotipo humano IgG4.
En otra modalidad, la "región Fe" incluye una secuencia de aminoácidos de un dominio Fe o derivada de un dominio Fe . En determinadas modalidades, una región Fe comprende al menos uno de: dominio bisagra (por ejemplo, región bisagra superior, media y/o inferior) (alrededor de aminoácidos 216-230 de una región Fe de anticuerpo de acuerdo con la numeración EU) , un dominio CH2 (alrededor de aminoácidos 231-340 de una región Fe de anticuerpo de acuerdo con la numeración EU) ,un dominio CH3 (alrededor de aminoácidos 341-438 de una región Fe de anticuerpo de acuerdo con la numeración EU) , un dominio CH , o una variante, parte o fragmento de este. En otras modalidades, una región Fe comprende un dominio Fe completo (es decir, un dominio bisagra, un dominio CH2 y un dominio CH3) . En algunas modalidades, una región Fe comprende, consiste esencialmente en o consiste en un dominio bisagra (o una parte de este) fusionado a un dominio CH3 (o una parte de este) , un dominio bisagra (o una parte de este) fusionado a un dominio CH2 (o una parte de este) , un dominio CH2 (o una parte de este) fusionado a un dominio CH3 (o una parte de este) , un dominio CH2 (o una parte de este) fusionado tanto a un dominio bisagra (o una parte de este) como a un dominio CH3 (o una parte de este) . En aun otras modalidades, una región Fe carece al menos de una parte de un dominio CH2 (por ejemplo, todo o parte de un domino CH2) . En una modalidad particular,
una región Fe comprende o consiste en aminoácidos que corresponden a números EU 221 a 447.
Las regiones Fe indicadas como F, Fl, o F2 en la presente se pueden obtener a partir de una cantidad de diferentes fuentes. En una modalidad, una región Fe del polipéptido deriva de una inmunoglobulina humana. Sin embargo, se entiende que una región Fe puede derivar de una inmunoglobulina de otra especie de mamífero, que incluye por ejemplo, un roedor (por ejemplo, un ratón, rata, conejo, cobayo) o una especie de primate no humano (por ejemplo, chimpancé, monos rhesus) . Asimismo, el polipéptido de los dominios Fe o partes de estos pueden derivar de cualquier clase de inmunoglobulina, que incluye IgM, IgG, IgD, IgA e IgE, y cualquier isotipo de inmunoglobulina, que incluye IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4. En otra modalidad, se usa el isotipo humano IgGl .
En determinadas modalidades, la variante Fe confiere un cambio en al menos una función efectora impartida por una región Fe que comprende el dominio Fe de tipo salvaje (por ejemplo, una mejora o reducción en la capacidad de la región Fe de unirse a receptores Fe (por ejemplo, FcyRI, FcyRII, o FCYRIII) O proteínas complementarias (por ejemplo, Clq) , o para provocar citotoxicidad dependiente de anticuerpo (ADCC) , fagocitosis, o citotoxicidad dependiente de complemento (CDCC) ) . En otras modalidades, la variante de Fe proporciona
un residuo de cisteína modificado.
Las regiones Fe de la invención pueden emplear variantes de Fe reconocidas en la técnica que se sabe imparten un cambio (por ejemplo, una mejora o reducción) en función efectora y/o unión a FcR o FcRn. Específicamente, una molécula de unión de la invención puede incluir, por ejemplo, un cambio (por ejemplo, una sustitución) en una o más posiciones de aminoácidos descritas en las publicaciones PCT internacionales WO88/07089A1 , W096/14339A1 , WO98/05787A1 , W098/23289A1, W099/51642A1 , W099/58572A1 , WO00/09560A2 , WO00/32767A1, WO00/42072A2 , O02/44215A2 , WO02/060919A2 , WO03/074569A2, WO04/016750A2 , WO04/029207A2 , WO04/035752A2 , O04/063351A2, WO04/074455A2 , WO04/099249A2 , WO05/040217A2 , WO04/044859, WO05/070963A1 , WO05/077981A2 , WO05/092925A2 , WO05/123780A2, WO06/019447A1 , WO06/047350A2 , y WO06/085967A2 ; publicación de patente estadounidense n. ° US2007/0231329 , US2007/0231329, US2007/0237765 , US2007/0237766 ,
US2007/0237767, US2007/0243188 , US20070248603 , US20070286859 , US20080057056 ; o patentes estadounidenses 5,648,260; 5,739,277; 5,834,250; 5,869,046; 6,096,871; 6,121,022; 6,194,551; 6,242,195; 6,277,375; 6,528,624; 6,538,124; 6,737,056; 6,821,505; 6,998,253; 7,083,784; 7,404,956, y 7,317,091, cada una de las cuales se incorpora a la presente mediante esta referencia. En una modalidad, el cambio específico (por ejemplo, la sustitución específica de uno o
más aminoácidos descritos en la técnica) se puede hacer en una o más de las posiciones de aminoácidos descritas. En otra modalidad, se puede hacer un cambio diferente en uno o más de las posiciones de aminoácidos descritas (por ejemplo, la sustitución diferente de una o más posiciones de aminoácidos descritas en la técnica) .
La región Fe o compañero de unión a FcRn de IgG se puede modificar de acuerdo con procedimientos conocidos tales como mutagénesis dirigida al sitio y similares para proporcionar fragmentos de IgG o Fe modificados o partes de estos que se unirán por FcRn. Las modificaciones incluyen modificaciones remotas de los sitios de contacto de FcRn así como modificaciones dentro de los sitios de contacto que conservan o hasta potencian la unión al FcRn. Por ejemplo, los siguientes residuos de aminoácidos simples en la Fe de IgGl humana (Fe ??) se pueden sustituir sin pérdida significativa de afinidad de unión a Fe por FcRn: P238A, S239A, K246A,
K248A, D249A, M252A, T256A, E258A, T260A, D265A, S267A,
H268A, E269A, D270A, E272A, L274A, N276A, Y278A, D280A,
V282A, E283A, H285A, N286A, T289A, K290A, R292A, E293A,
E294A, Q295A, Y296F, N297A, S298A, Y300F, R301A, V303A,
V305A, T307A, L309A, Q311A, D312A, N315A, K317A, E318A,
K320A, K322A, S324A, K326A, A327Q, P329A, A330Q, P331A,
E333A, K334A, T335A, S337A, K338A, 340A, Q342A, R344A,
E345A, Q347A, R355A, E356A, M358A, T359A, K360A, N361A,
Q362A, Y373A, S375A, D376A, A378Q, E380A, E382A, S383A,
N384A, Q386A, E388A, N389A, N390A, Y391F, K392A, L398A,
S400A, D401A, D413A, K414A, R416A, Q418A, Q419A, N421A,
V422A, S424A, E430A, N434A, T437A, Q438A, K439A, S440A, S444A, y K447A, donde por ejemplo P238A representa prolina de tipo salvaje sustituido por alanina en la posición número 238. Como un ejemplo, una modalidad específica incorpora la mutación N297A, removiendo un sitio de N-glicosilación altamente conservado. Además de alanina otros aminoácidos pueden sustituirse por los aminoácidos de tipo salvaje en las posiciones especificadas anteriormente. Se pueden introducir mutaciones por separado en Fe provocando más de cien regiones Fe distintas de la Fe natural. De manera adicional, se puede introducir a la vez combinaciones de dos, tres, o más de estas mutaciones individuales, provocando cientos más de regiones Fe. Además, una de las regiones Fe de una construcción de la invención puede estar mutada y la otra región Fe de la construcción no estar mutada, o ambas pueden estar mutadas pero con diferentes mutaciones.
Algunas de las mutaciones anteriores pueden conferir nueva funcionalidad a la región Fe o el compañero de unión a FcRn. Por ejemplo, una modalidad incorpora N297A, removiendo un sitio de N-glicosilación altamente conservado. El efecto de esta mutación es reducir la inmunogenicidad, potenciando así la semivida circulante de la región Fe, y hacer que la
región Fe sea incapaz de unirse a FCYRI, FCYRIIA, FCYRIIB, y FCYRIIIA, sin comprometer la afinidad por FcRn (Routledge et ál . 1995, Transplantation 60:847; Friend et ál . 1999, Transplantation 68:1632; Shields et ál . 1995, J. Biol . Chem. 276:6591). Como un ejemplo adicional de la nueva funcionalidad que surge de mutaciones descritas anteriormente la afinidad por FcRn se puede aumentar más allá de la del tipo salvaje en algunos casos. Esta afinidad aumentada puede reflejar una velocidad "de asociación" aumentada, una velocidad "de disociación" reducida o una velocidad "de asociación" aumentada y una velocidad "de disociación" reducida. Ejemplos de mutaciones que se cree imparten una afinidad aumentada por FcRn incluyen, de modo no taxativo, T256A, T307A, E380A, y N434A (Shields et ál . 2001, J. Biol. Chem. 276.6591) .
De manera adicional, al menos tres receptores Fe gamma humanos parecen reconocer un sitio de unión en IgG dentro de la región bisagra inferior, por lo general aminoácidos 234-237. Por lo tanto, otro ejemplo de nueva funcionalidad e inmunogenicidad potencial reducida puede surgir de mutaciones de esta región, como por ejemplo remplazando aminoácidos 233-236 de IgGl humano "ELLG" por la secuencia correspondiente de IgG2 "PVA" (con una supresión de aminoácido) . Se ha mostrado que FcyRI, FCYRII, y FcyRIII, que median varias funciones efectoras no se unirán a IgGl cuando se hayan introducido las
mutaciones. Ward and Ghetie 1995, Therapeutic Immunology 2:77 y Armour et ál . 1999, Eur. J. Immunol . 29:2613.
En una modalidad, la región constante de inmunoglobulina o una parte de esta, por ejemplo, una región Fe, es un polipéptido que incluye la secuencia PK SS ISNTP (SEQ ID NO: 3) y opcionalmente incluye además una secuencia que se selecciona de HQSLGTQ (SEQ ID NO: 4), HQNLSDGK (SEQ ID NO: 5), HQNISDGK (SEQ ID NO: 6), o VISSHLGQ (SEQ ID NO: 7) patente estadounidense n.° 5,739,277).
En otra modalidad, la región constante de inmunoglobulina o una parte de esta comprende una secuencia de aminoácidos en la región bisagra o una parte de esta que forma uno o más enlaces disulfuro con otra región constante de inmunoglobulina o una parte de esta. En enlace disulfuro por la región constante de inmunoglobulina o una parte de esta coloca el primer polipéptido que comprende FVIII y el segundo polipéptido que comprende el fragmento de VWF juntos de modo que el VWF endógeno no remplace el fragmento de VWF y no se una al FVIII. Por lo tanto, el enlace disulfuro entre la primera región constante de inmunoglobulina o una parte de esta y una segunda región constante de inmunoglobulina o una parte de esta evita la interacción entre el VWF endógeno y la proteína de FVIII. Esta inhibición de interacción entre el VWF y la proteína de FVIII permite que la semivida de la proteína de FVIII exceda el límite de dos veces. La región
bisagra o una parte de esta puede adicionalmente estar enlazada a uno o más dominios de CH1, CH2, CH3 , un fragmento de estos y cualesquiera combinaciones de estos. En un ejemplo particular, una región constante de inmunoglobulina o una parte de esta comprende una región bisagra y región CH2 (por ejemplo, aminoácidos 221-340 de una región Fe) .
En determinadas modalidades, la región constante de inmunoglobulina o una parte de esta está hemi-glicosilada . Por ejemplo, la proteína quimérica que comprende dos regiones Fe o compañeros de unión a FcRn puede contener una primera región Fe glicosilada (por ejemplo, una región CH2 glicosilada) o compañero de unión a FcRn y una segunda región Fe aglicosilada (por ejemplo, una región CH2 aglicosilada) o compañero de unión a FcRn. En una modalidad, un enlazador se puede interponer entre las regiones Fe glicosiladas y aglicosiladas . En otra modalidad, la región Fe o compañero de unión a FcRn está completamente glicosilada, es decir, todas las regiones Fe están glicosiladas. En otras modalidades, la región Fe puede estar aglicosilada, es decir, ninguno de los restos Fe están glicosilados .
En determinadas modalidades, una proteína quimérica de la invención comprende una sustitución de aminoácidos a una región constante de inmunoglobulina o una parte de esta (por ejemplo, variantes de Fe) , que altera las funciones efectoras independientes de antígeno de la región constante de Ig, en
particular la semivida circulante de la proteína.
Las proteínas exhiben una unión ya sea aumentada o reducida a FcRn en comparación a las proteínas sin estas sustituciones y, por lo tanto, tienen una semivida en suero aumentada o disminuida, respectivamente. Se anticipa que las variantes de Fe con afinidad mejorada por FcRn tienen semividas en suero más prolongadas, y las moléculas tienen aplicaciones útiles en métodos para tratar mamíferos donde se desea una semivida larga del polipéptido administrado, por ejemplo, para tratar una enfermedad o trastorno crónico (véase, por ejemplo, patentes estadounidenses 7,348,004, 7,404,956, y 7,862,820). Por el contrario, se espera que las variantes de Fe con afinidad de unión a FcRn reducida tengan semividas más cortas, y las moléculas también son útiles, por ejemplo, para la administración a un mamífero donde puede ser ventajoso un tiempo de circulación acortado, por ejemplo, para imaginología de diagnóstico in vivo o en situaciones donde el polipéptido de partida tenga efectos secundarios tóxicos cuando está presente en la circulación durante períodos prolongados. Es menos probable que las variantes de , Fe con afinidad de unión a FcRn reducida también atraviesen la placenta, y por lo tanto también son útiles en el tratamiento de enfermedades o trastornos en mujeres embarazadas. Además, otras aplicaciones donde se puede desear la afinidad de unión a FcR reducida incluyen aquellas
aplicaciones donde se desea la localización en el cerebro, riñon, y/o hígado. En un ejemplo de modalidad, la proteína quimérica de la invención exhibe transporte reducido a través del epitelio de los glomérulos del riñon de la vasculatura. En otra modalidad, la proteína quimérica de la invención exhibe transporte reducido a través de la barrera hematoencefálica (BBB, por sus siglas en inglés) del cerebro hacia el espacio vascular. En una modalidad, una proteína con unión a FcRn alterada comprende al menos una región Fe o compañero de unión a FcRn (por ejemplo, una o dos regiones Fe o compañeros de unión a FcRn) que tiene una o más sustituciones de aminoácidos dentro del "bucle de unión a FcRn" de una región constante de Ig. El bucle de unión a FcRn comprende residuos de aminoácidos 280-299 (de acuerdo con la numeración EU) de una región Fe de longitud completa de tipo salvaje. En otras modalidades una región constante de Ig o una parte de esta en una proteína quimérica de la invención que tiene afinidad de unión a FcRn alterada comprende al menos una región Fe o compañero de unión a FcRn que tiene una o más sustituciones de aminoácidos dentro de la "zona de contacto" de 15 Á con FcRn. Tal como se usa en la presente, el término "zona de contacto" de 15 Á con FcRn incluye residuos en las siguientes posiciones de un resto de Fe de longitud completa de tipo salvaje: 243-261, 275-280, 282-293, 302-319, 336- 348, 367, 369, 372-389, 391, 393, 408, 424,
425-440 (numeración EU) . En otras modalidades, una región constante de Ig o una parte de esta de la invención que tiene afinidad de unión a FcRn alterada comprende al menos una región Fe o compañero de unión a FcRn que tiene una o más sustituciones de aminoácidos en una posición de aminoácido que corresponde a cualquiera de las siguientes posiciones de EU: 256, 277-281, 283-288, 303-309, 313, 338, 342, 376, 381, 384, 385, 387, 434 (por ejemplo, N434A o N434K) y 438. Ejemplos de sustituciones de aminoácidos que alteraron la actividad de unión a FcRn se describen en la publicación PCT internacional n. ° WO05/047327 que se incorpora a la presente mediante esta referencia.
Una región Fe o compañero de unión a FcRn usado en la invención también puede comprender una sustitución de aminoácido reconocido en la técnica que altera la glicosilación de la proteína quimérica. Por ejemplo, la región Fe o el compañero de unión a FcRn de la proteína quimérica enlazada a un fragmento de VWF o una proteína de FVIII puede comprender una región Fe que tiene una mutación que lleva a una glicosilación reducida (por ejemplo, glicosilación enlazada a N u 0) o puede comprender una glicoforma alterada del resto Fe de tipo salvaje (por ejemplo, un glicano con poca fucosa o sin fucosa) .
En una modalidad, una proteína quimérica no procesada de la invención puede comprender una región Fe fusionada
genéticamente (es decir, región scFc) que tiene dos o más de sus regiones constantes Ig constituyentes o una parte de estas que se seleccionan independientemente de la región constante Ig o una parte de esta descrita en la presente. En una modalidad, las regiones Fe de una región Fe dimérica son iguales. En otra modalidad, al menos dos de las regiones Fe son diferentes. Por ejemplo, las regiones Fe o los compañeros de unión a FcRn de las proteínas de la invención comprenden la misma cantidad de residuos de aminoácidos o pueden diferir en longitud por uno o más residuos de aminoácidos (por ejemplo, alrededor de 5 residuos de aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, o 5 residuos de aminoácidos), alrededor de 10 residuos, alrededor de 15 residuos, alrededor de 20 residuos, alrededor de 30 residuos, alrededor de 40 residuos, o alrededor de 50 residuos) . En aun otras modalidades, las regiones Fe o los compañeros de unión a FcRn de la proteína de la invención pueden diferir en secuencia en una o más posiciones de aminoácidos. Por ejemplo, al menos dos de las regiones Fe o compañeros de unión a FcRn pueden diferir en alrededor de 5 posiciones de aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, o 5 posiciones de aminoácidos), alrededor de 10 posiciones, alrededor de 15 posiciones, alrededor de 20 posiciones, alrededor de 30 posiciones, alrededor de 40 posiciones, o alrededor de 50 posiciones) .
2) Albúmina o fragmento o variante de esta
En determinadas modalidades, el resto heterólogo enlazado al fragmento de VWF o enlazado a una proteína de FVIII es albúmina o un fragmento funcional de esta. En otras modalidades, una proteína quimérica de la invención comprende una proteína de FVIII y albúmina o un fragmento de esta, donde la albúmina o un fragmento de esta protege el sitio de unión a VWF en la proteína de FVIII, así inhibiendo o evitando la interacción de la proteína de FVIII con el VWF endógeno .
La albúmina sérica humana (HSA, o HA) , una proteína de 609 aminoácidos en su forma de longitud completa, es la responsable de una proporción significativa de presión osmótica del suero y también funciona como portador de ligandos endógenos y exógenos . El término "albúmina" tal como se usa en la presente incluye albúmina de longitud completa o un fragmento, variante, derivado o análogo funcional de esta.
En una modalidad, la proteína quimérica comprende el fragmento de VWF descrito en la presente y albúmina, fragmento o variante de esta, donde el fragmento de VWF está enlazado a albúmina o un fragmento o variante de esta. En otra modalidad, la proteína quimérica comprende el fragmento de VWF y una proteína de FVIII, que están unidos entre sí, donde el fragmento de VWF está enlazado a albúmina o un fragmento o variante de esta, la proteína que tiene actividad
VIII está enlazada a albúmina o un fragmento o variante de esta, o tanto el fragmento de VWF como la proteína que tienen actividad VIII están enlazadas a albúmina o un fragmento o variante de esta. En otras modalidades, la proteína quimérica comprende el fragmento de VWF enlazado a albúmina o un fragmento o variante de esta y está enlazada además a un resto heterólogo que se selecciona del grupo que consiste en una región constante de inmunoglobulina o una parte de esta (por ejemplo, una región Fe) , una secuencia PAS, HES y PEG. En aun otras modalidades, la proteína quimérica comprende el fragmento de VWF y una proteína de FVIII, unidos entre sí, donde la proteína de FVIII está enlazada a albúmina o un fragmento o variante de esta y está enlazada además a un resto heterólogo que se selecciona del grupo que consiste en una región constante de inmunoglobulina o una parte de esta (por ejemplo, una región Fe), una secuencia PAS, HES y PEG. En aun otras modalidades, la proteína quimérica comprende el fragmento de VWF enlazado a albúmina o un fragmento o variante de esta y una proteína de FVIII enlazada a albúmina o un fragmento o variante de esta, que están unidos entre sí, donde la actividad del fragmento de VWF está además enlazado a un primer resto heterólogo que se selecciona del grupo que consiste en una región constante de inmunoglobulina o una parte de esta (por ejemplo, una región de Fe) , una secuencia PAS, HES, y PEG y donde la actividad de la proteína de FVIII
está además enlazada a un segundo resto heterólogo que se selecciona del grupo que consiste en una región constante de inmunoglobulina o una parte de esta (por ejemplo, una región Fe) , una secuencia PAS, HES, y PEG.
En otras modalidades, el resto heterólogo enlazado al fragmento de VWF o la proteína de FVIII es albúmina o un fragmento o variante de esta, que extiende (o es capaz de extender) la semivida del fragmento de VWF o la proteína de FVIII. Otros ejemplos de albúmina o los fragmentos o variantes de esta se describen en las publicaciones de patente estadounidense n. ° 2008/0194481A1, 2008/0004206 Al, 2008/0161243 Al, 2008/0261877 Al, o 2008/0153751 Al o publicaciones de solicitud de patente PCT n. ° 2008/033413 A2 , 2009/058322 Al, o 2007/021494 A2.
3) Resto de unión a albúmina
En determinadas modalidades, el resto heterólogo enlazado al fragmento de VWF o la proteína de FVIII es un resto de unión a albúmina, que comprende un péptido de unión a albúmina, un dominio de unión a albúmina bacteriana, un fragmento de anticuerpo de unión a albúmina o cualesquiera combinaciones de estos. Por ejemplo, la proteína de unión a albúmina puede ser una proteína de unión a albúmina bacteriana, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que incluye anticuerpos de dominio (véase la patente estadounidense n. ° 6,696,245). Una proteína de unión a
albúmina, por ejemplo, puede ser un dominio de unión a albúmina bacteriana, tal como el de la proteína G streptococo (Konig, T. and Skerra, A. (1998) J. Immunol . Methods 218, 73-83) . Otros ejemplos de péptidos de unión a albúmina que se pueden usar como compañero de conjugación son, por ejemplo, los que tienen una secuencia de consenso Cys-Xaa i -Xaa 2 -Xaa 3 -Xaa 4 -Cys, donde Xaa es Asp, Asn, Ser, Thr, o Trp; Xaa 2 es Asn, Gln, H es, lie, Leu, o Lys Xaa 3 es Ala, Asp, Phe, Trp, o Tyr; y Xaa 4 es Asp, Gly, Leu, Phe, Ser, o Thr tal como se describe en la solicitud de patente estadounidense 2003/0069395 o Dennis et ál . (Dennis et ál . (2002) J. Biol . Chem. 277, 35035-35043) .
4) Secuencia PAS
En otras modalidades, el resto heterólogo enlazado al fragmento de VWF o a la proteína de FVIII es una secuencia PAS. En una modalidad, la proteína quimérica comprende un fragmento de VWF descrito en la presente y una secuencia PAS, donde el fragmento de VWF está enlazado a la secuencia PAS. En otra modalidad, una proteína quimérica de la invención comprende una proteína de FVIII y una secuencia PAS, donde la secuencia PAS protege el sitio de unión a VWF en la proteína de FVIII, así inhibiendo o evitando la interacción de la proteína de FVIII con el VWF endógeno.
Una secuencia PAS, tal como se usa en la presente, se
refiere a una secuencia de aminoácidos que comprende principalmente residuos de alanina y serina, o que comprende principalmente residuos de alanina, serina y prolina, la secuencia de aminoácidos forma una conformación de bobina aleatoria en condiciones fisiológicas. Por consiguiente, la secuencia PAS es un bloque de construcción, un polímero de aminoácido o un cásete de secuencia que comprende, consiste esencialmente en o consiste en alanina, serina y prolina que se pueden usar como parte del resto heterólogo en la proteína quimérica. Además, el experto en la técnica está al tanto de que un polímero de aminoácido también puede formar una conformación de bobina aleatoria cuando los residuos distintos de alanina, serina y prolina se agregan como un constituyente menor en la secuencia PAS. El término "constituyente menor" tal como se usa en la presente se refiere a que los aminoácidos diferentes de alanina, serina y prolina se pueden agregar a la secuencia PAS en cierta medida, por ejemplo, hasta alrededor de 12%, es decir alrededor de 12 de 100 aminoácidos de la secuencia PAS, hasta alrededor de 10%, es decir alrededor de 10 de 100 aminoácidos de la secuencia PAS, hasta alrededor de 9%, es decir alrededor de 9 de 100 aminoácidos, hasta alrededor de 8%, es decir alrededor de 8 of 100 aminoácidos, alrededor de 6%, es decir alrededor de 6 de 100 aminoácidos, alrededor de 5%, es decir alrededor de 5 de 100 aminoácidos, alrededor de 4%, es
decir alrededor de 4 de 100 aminoácidos, alrededor de 3%, es decir alrededor de 3 de 100 aminoácidos, alrededor de 2%, es decir alrededor de 2 de 100 aminoácidos, alrededor de 1%, es decir alrededor de 1 de 100 de los aminoácidos. Los aminoácidos diferentes de alanina, serina y prolina se pueden seleccionar del grupo que consiste en Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, lie. Leu, Lys, Met, Phe, Thr, Trp, Tyr, y Val .
En condiciones fisiológicas, la extensión de la secuencia PAS forma una conformación de bobina aleatoria y así puede mediar una estabilidad in vivo y/o in vitro aumentada al factor VWF o la proteína de la actividad de coagulación. Debido a que el dominio de bobina aleatorio no adopta una estructura o función estable por sí mismo, la actividad biológica mediada por el fragmento de VWF o la proteína de FVIII a la que está fusionado se conserva esencialmente. En otras modalidades, las secuencias PAS que forman el dominio de bobina aleatorio son biológicamente inertes, especialmente con relación a la proteólisis en plasma sanguíneo, inmunogenicidad, punto isoeléctrico/comportamiento electroestático, unión a receptores de superficie celular o internalización, pero todavía son biodegradables , lo que proporciona ventajas claras sobre los polímeros sintéticos tales como PEG.
Ejemplos no taxativos de las secuencias PAS que forman
una conformación de bobina aleatoria comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en ASPAAPAPASPAAPAPSAPA (SEQ ID NO: 8), AAPASPAPAAPSAPAPAAPS (SEQ ID NO: 9), APSSPSPSAPSSPSPASPSS (SEQ ID NO: 10), APSSPSPSAPSSPSPASPS (SEQ ID NO: 11), SSPSAPSPSSPASPSPSSPA (SEQ ID NO: 12), AAS AAPSAPPAAASPAAPSAPPA (SEQ ID NO: 13) y ASAAAPAAASAAASAPSAAA (SEQ ID NO: 14) o cualesquiera combinaciones de estos. Ejemplos adicionales de secuencias PAS se conocen de publicación de patente estadounidense n.° 2010/0292130 Al y publicación de solicitud PCT n. ° WO 2008/155134 Al.
5) Secuencia HAP
En determinadas modalidades, el resto heterólogo enlazado al fragmento de VWF o a la proteína de FVIII es un polímero homo-aminoácido rico en glicina (HAP) . La secuencia HAP puede comprender una secuencia repetitiva de glicina, que tiene al menos 50 aminoácidos, al menos 100 aminoácidos, 120 aminoácidos, 140 aminoácidos, 160 aminoácidos, 180 aminoácidos, 200 aminoácidos, 250 aminoácidos, 300 aminoácidos, 350 aminoácidos, 400 aminoácidos, 450 aminoácidos, o 500 aminoácidos de longitud. En una modalidad, la secuencia HAP es capaz de extender la semivida de un resto fusionado o enlazado a la secuencia HAP. Ejemplos no taxativos de la secuencia HAP incluyen de modo no taxativo (Gly)n, (Gly4Ser)n o S(GlySer)n, donde n es 1, 2, 3, 4, 5, 6,
7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20. En una modalidad, n es 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 26, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, o 40. En otra modalidad, n es 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, o 200. Véase, por ejemplo, Schlapschy M et ál., Protein Eng. Design Selection, 20: 273-284 (2007).
6) Transferrina o fragmento de esta
En determinadas modalidades, el resto heterólogo enlazado al fragmento de VWF o la proteína de FVIII es transferrina o un fragmento de esta. Se puede usar cualquier transferrina para hacer las proteínas quiméricas de la invención. Como ejemplo, Tf humano de tipo salvaje (Tf) es una proteína de 679 aminoácidos, de aproximadamente 75 KDa (sin contar la glicosilacion), con dos dominios principales, N (alrededor de 330 aminoácidos) y C (alrededor de 340 aminoácidos) , que parecen originarse a partir de una duplicación genética. Véase números de acceso GenBank NM001063, X 002793, M12530, XM039845, XM 039847 y S95936 (www.ncbi.nlm.nih.gov/), que se incorporan a la presente en su totalidad mediante esta referencia. La transferrina comprende dos dominios, dominio N y dominio C. El dominio N comprende dos subdominios, dominio NI y dominio N2 , y el dominio C comprende dos subdominios, dominio Cl y dominio C2.
En una modalidad, la parte de transferrina de la proteína quimérica incluye una variante de empalme de
transferrina . En un ejemplo, una variante de empalme de transferrina puede ser una variante de empalme de transferrina humana, por ejemplo, acceso Genbank AAA61140. En otra modalidad, la parte de transferrina de la proteína quimérica incluye uno o más dominios de la secuencia de transferrina, por ejemplo, dominio N, dominio C, dominio NI, dominio N2 , dominio Cl, dominio C2 o cualesquiera combinaciones de estos.
7) Polímero, por ejemplo, Polietilenglicol (PEG)
En otras modalidades, el resto heterólogo unido al fragmento de VWF o la proteína que tiene actividad de coagulación, por ejemplo, actividad de FVIII, es un polímero soluble conocido en la técnica, que incluye de modo no taxativo, copolímeros de polietilenglicol, etilenglicol/propilenglicol, carboximetilceulosa, dextrano, o alcohol polivinílico . El resto heterólogo tal como polímero soluble puede estar unido a cualesquiera posiciones dentro del fragmento de VWF o la proteína de FVIII o el N-terminal o C. En aun otras modalidades, una proteína quimérica de la invención comprende una proteína de FVIII y PEG, donde PEG protege el sitio de unión a VWF en la proteína de FVIII, así inhibiendo o evitando la interacción de la proteína de FVIII con el VWF endógeno.
En determinadas modalidades, la proteína quimérica comprende el fragmento de VWF descrito en la presente y PEG,
donde el fragmento de VWF está enlazado a PEG. En otra modalidad, la proteína quimérica comprende el fragmento de VWF y una proteína de FVIII, que están unidos entre sí, donde el fragmento de VWF está enlazado a PEG, la proteína de FVIII está enlazada a PEG, o el fragmento de VWF y la proteína de FVIII están ambos enlazados a PEG. En otras modalidades, la proteína quimérica que comprende el fragmento de VWF enlazado a PEG está enlazada además a un resto heterólogo que se selecciona del grupo que consiste en una región constante de inmunoglobulina o una parte de esta (por ejemplo, una región Fe) , una secuencia PAS, HES y albúmina, fragmento o variante de esta. En aun otras modalidades, la proteína quimérica comprende el fragmento de VWF y una proteína de FVIII, unidos entre sí, donde la proteína de FVIII está enlazada además a un resto heterólogo que se selecciona del grupo que consiste en una región constante de inmunoglobulina o una parte de esta (por ejemplo, una región Fe) , una secuencia PAS, HES y albúmina, fragmento o variante de esta. En aun otras modalidades, la proteína quimérica comprende el fragmento de VWF enlazado a PEG y una proteína de FVIII enlazada a PEG, que están unidos entre sí, donde la actividad del fragmento de VWF está además enlazado a un primer resto heterólogo que se selecciona del grupo que consiste en una región constante de inmunoglobulina o una parte de esta (por ejemplo, una región de Fe) , una secuencia PAS, HES, y albúmina, fragmento
o variante de esta y donde la actividad de la proteína de FVIII está además enlazada a un segundo resto heterólogo que se selecciona del grupo que consiste en una región constante de inmunoglobulina o una parte de esta (por ejemplo, una región Fe) , una secuencia PAS, HES, y albúmina, fragmento o variante de esta.
También la invención proporciona derivados químicamente modificados de la proteína quimérica de la invención que puede proporcionar ventajas adicionales tales como solubilidad, estabilidad y tiempo de circulación del polipéptido aumentados o inmunogenicidad reducida (véase la patente estadounidense n.° 4,179,337). Los restos químicos para modificación se pueden seleccionar del grupo que consiste en polímeros solubles en agua que incluyen de modo no taxativo, copolímeros de polietilenglicol, etilenglicol/propilenglicol , carboximetilcelulosa , dextrano, y alcohol polivinílico . La proteína quimérica se puede modificar en posiciones aleatorias dentro de la molécula o en los N-terminal o C o en posiciones predeterminadas dentro de la molécula y puede incluir uno, dos, tres o más restos químicos unidos.
El polímero puede ser de cualquier peso molecular y puede estar ramificado o no ramificado. Para polietilenglicol, en una modalidad, el peso molecular es entre alrededor de 1 kDa y alrededor de 100 kDa para el fácil
manejo y fabricación. Se pueden usar otros tamaños, dependiendo del perfil deseado (por ejemplo, la duración de la liberación sostenida deseada, los efectos, si hubiera, sobre la actividad biológica, la facilidad en el manejo, el grado o falta de antigenicidad y otros efectos conocidos del polietilenglicol a la proteína o análogo) . Por ejemplo, el polietilenglicol puede tener un peso molecular promedio de alrededor de 200, 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 9500, 10,000, 10,500, 11,000, 11,500, 12,000, 12,500, 13,000, 13,500, 14,000, 14,500, 15,000, 15,500, 16,000, 16,500, 17,000, 17,500, 18,000, 18,500, 19,000, 19,500, 20,000, 25,000, 30,000, 35,000, 40,000, 45,000, 50,000, 55,000, 60,000, 65,000, 70,000, 75,000, 80,000, 85,000, 90,000, 95,000, o 100,000 kDa .
En algunas modalidades, el polietilenglicol puede tener una estructura ramificada. Se describen polietilenglicoles ramificados por ejemplo en la patente estadounidense n.° 5,643,575; Morpurgo et ál . , Ap l . Biochem. Biotechnol . 56:59-72 (1996); Vorobjev et ál . , Nucleosides Nucleotides 18:2745-2750 (1999); y Caliceti et ál . , Bioconjug. Chem. 10:638-646 (1999) , que se incorporan a la presente en su totalidad mediante esta referencia.
La cantidad de restos de polietilenglicol unidos a cada proteína quimérica, el fragmento de V F o la proteína de
FVIII de la invención (es decir, el grado de sustitución) también puede variar. Por ejemplo, las proteínas pegiladas de la invención pueden estar enlazadas, en promedio a l, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 17, 20, o más moléculas de polietilenglicol . De manera similar, el grado promedio de sustitución varía tal como 1-3, 2-4, 3-5, 4-6, 5-7, 6-8, 7-9, 8-10, 9-11, 10-12, 11-13, 12-14, 13-15, 14-16, 15-17, 16-18, 17-19, o 18-20 restos de polietilenglicol por molécula de proteína. Los métodos para determinar el grado de sustitución se describen, por ejemplo, en Delgado et ál . , Crit . Rev. Thera. Drug Carrier Sys . 9:249-304 (1992).
En algunas modalidades, la proteína de FVIII puede estar PEGilada. El Factor VIII PEGilado se puede referir a un conjugado formado entre el Factor VIII y al menos una molécula de polietilenglicol (PEG) .
En otras modalidades, una proteína de FVIII usada en la invención está conjugada con uno o más polímeros. El polímero puede ser soluble en agua y estar unido covalente o no covalentemente al Factor VIII u otros restos conjugados al Factor VIII. Ejemplos no taxativos del polímero pueden ser óxido de poli (aquileno) , poli (vinilpirrolidona) , alcohol poli (vinílico) , polioxazolina, o poli (acriloilmorfolino) . Tipos adicionales de FVIII conjugado con el polímero se describen en la patente estadounidense n. ° 7,199,223.
8) Almidón de hidroxietilo (HES)
En determinadas modalidades, el resto heterólogo enlazado al fragmento de VWF o la proteína de FVIII es un polímero, por ejemplo, almidón de hidroxietilo (HES) o un derivado de este. En una modalidad, una proteína quimérica comprende un fragmento de VWF descrito en la presente y HES, donde el fragmento de VWF está enlazado a HES. En otras modalidades, una proteína quimérica de la invención comprende una proteína de FVIII fusionada a almidón de hidroxietilo (HES) , donde el almidón de hidroxietilo o un derivado de este protege el sitio de unión a VWF en la proteína de FVIII del VWF endógeno, así inhibiendo o evitando la interacción de la proteína de FVIII con el VWF endógeno.
El almidón de hidroxietilo (HES) es un derivado de amilopectina de origen natural y se degrada por alfa-amilasa en el cuerpo. HES es un derivado sustituido de amilopectina de polímero de carbohidrato que está presente en almidón de maíz en una concentración de hasta 95% en peso. HES exhibe propiedades biológicas ventajosas y se usa como agente de remplazo de volumen sanguíneo y en terapia de hemodilucion en la medicina (Sommermeyer et ál . , Krankenhauspharmazie , 8(8), 271-278 (1987); y Weidler et ál . , Arzneim. -Forschung/Drug Res., 41, 494-498 (1991)).
Amilopectina contiene restos de glucosa, donde en la cadena principal están presentes enlaces alfa-1,4-
glicosídicos y se encuentran enlaces alfa-1, 6-glicosídicos en los sitios de ramificación. Las propiedades físico-químicas de esta molécula se determinan principalmente por el tipo de enlaces glicosídicos. Debido al enlace alfa-1, 4-glicosídico fragmentado, se producen estructuras helicoidales con alrededor de seis monómeros de glucosa por vuelta. Las propiedades físico-químicas así como las bioquímicas del polímero se pueden modificar por sustitución. La introducción de un grupo hidroxietilo se puede alcanzar mediante hidroxietilación alcalina. Adaptando las condiciones de reacción es posible explotar la reactividad diferente del grupo hidroxilo correspondiente en el monómero de glucosa insustituido con relación a una hidroxietilación. Debido a esto, el experto es capaz de influir el patrón de sustitución hasta una medida limitada.
HES está caracterizado principalmente por la distribución en peso molecular y el grado de sustitución. El grado de sustitución indicado como DS se refiere a la sustitución molar es conocido por el experto en la técnica. Véase Sommermeyer et ál . , Krankenhauspharmazie, 8(8), 271-278 (1987), tal como se cita anteriormente, en particular p. 273.
En una modalidad, el almidón de hidroxietilo tiene un peso molecular promedio (promedio de peso) de 1 a 300 kD, de 2 a 200 kD, de 3 a 100 kD, o de 4 a 70 kD. El almidón de hidroxietilo puede además exhibir un grado molar de
sustitución de 0.1 a 3, preferentemente 0.1 a 2, más preferentemente, 0.1 a 0.9, preferentemente 0.1 a 0.8, y una relación de sustitución C2:C6 en el intervalo de 2 a 20 respecto de los grupos hidroxietilo . Un ejemplo no taxativo de HES que tiene un peso molecular promedio de alrededor de 130 kD es un HES con un grado de sustitución de 0.2 a 0.8 tal como 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, o 0.8, preferentemente de 0.4 a 0.7 tal como 0.4, 0.5, 0.6, o 0.7. En una modalidad específica, HES con un peso molecular promedio de alrededor de 130 kD es VOLUVEN® de Fresenius . VOLUVEN® es un coloide artificial, empleado, por ejemplo, para el remplazo de volumen usado en la indicación terapéutica para terapia y profilaxis de hipovolemia. Las características de VOLUVEN® son un peso molecular promedio de 130.000+/-20.000 D, una sustitución molar de 0.4 y una relación de C2:C6 de alrededor de 9:1. En otras modalidades, los intervalos del peso molecular promedio de almidón de hidroxietilo son, por ejemplo, 4 a 70 kD o 10 a 70 kD o 12 a 70 kD o 18 a 70 kD o 50 a 70 kD o 4 a 50 kD o 10 a 50 kD o 12 a 50 kD o 18 a 50 kD o 4 a 18 kD o 10 a 18 kD o 12 a 18 kD o 4 a 12 kD o 10 a 12 kD o 4 a 10 kD. En aun otras modalidades, el peso molecular promedio de almidón de hidroxietilo empleado está en el intervalo de más de 4 kD a menos de 70 kD, tal como alrededor de 10 kD, o en el intervalo de 9 a 10 kD o de 10 a 11 kD o de 9 a 11 kD, o alrededor de 12 kD, o en el intervalo de 11 a 12
kD) o de 12 a 13 kD o de 1 1 a 13 kD, o alrededor de 18 kD, o en el intervalo de 17 a 18 kD o de 18 a 19 kD o de 17 a 19 kD, o alrededor de 30 kD, o en el intervalo de 29 a 30, o de 30 a 31 kD, o alrededor de 50 kD, o en el intervalo de 49 a 50 kD o de 50 a 51 kD o de 49 a 51 kD.
En determinadas modalidades, el resto heterólogo pueden ser mezclas de almidones de hidroxietilo que tienen diferentes pesos moleculares promedio y/o diferentes grados de sustitución y/o diferentes relaciones de sustitución C2 : C6. Por lo tanto, se pueden emplear las mezclas de almidones de hidroxietilo que tienen diferentes pesos moleculares promedio y diferentes grados de sustitución y diferentes relaciones de sustitución C2 : C6 , o que tienen diferentes pesos moleculares promedio y diferentes grados de sustitución y la misma o casi la misma relación de sustitución C2:C6, o que tienen diferentes pesos moleculares promedio y el mismo o casi el mismo grado de sustitución y diferentes relaciones de sustitución C2:C6, o que tienen el mismo o casi el mismo peso molecular promedio y diferentes grados de sustitución y diferentes relaciones de sustitución C2:C6, o que tienen diferentes pesos moleculares promedio y el mismo o casi el mismo grado de sustitución y la misma o casi la misma relación de sustitución C2-.CS, o que tienen el mismo o casi el mismo peso molecular promedio y diferentes grados de sustitución y la misma o casi la misma relación de
sustitución C2:C6, o que tienen el mismo o casi el mismo peso molecular promedio y el mismo o casi el mismo grado de sustitución y diferentes relaciones de sustitución C2:C6, o que tienen casi el mismo peso molecular promedio y casi el mismo grado de sustitución y casi la misma relación de sustitución C2:C6.
9) Ácidos Polisiálicos (PSA)
En determinadas modalidades, el resto heterólogo no polipéptido enlazado al fragmento de V F o la proteína de FVIII es un polímero, por ejemplo, ácidos polisiálicos (PSA) o un derivado de este. Los ácidos polisiálicos (PSA) son polímeros no ramificados de origen natural de ácido siálico producido por determinadas cepas bacterianas y en mamíferos en determinadas células Roth J. , et ál . (1993) in Polysialic Acid: From icrobes to Man, eds Roth J. , Rutishauser U. , Troy F. A. (Birkháuser Verlag, Basilea, Suiza), pp 335-348. Se pueden producir en varios grados de polimerización de n=alrededor de 80 o más residuos de ácido siálico hasta n=2 por hidrólisis de ácido limitado o por digestión con neuraminidasas , o por fraccionamiento de las formas derivadas bacterias naturales del polímero. La composición de diferentes ácidos polisiálicos también varía de modo que hay formas homopoliméricas , es decir, el ácido polisiálico enlazado a alfa-2,8 que comprende el polisacárido capsular de la cepa E. coli Kl y el meningococo de grupo B, que también
se encuentra en la forma embrionaria de la molécula de adhesión celular neuronal (N-CAM) . También existen formas heteropoliméricas , tales como el ácido polisi lico alfa-2,8 alfa-2,9 alterno de la cepa E. coli K92 y polisacáridos de grupo C de N. meningitidis . El ácido siálico también se puede encontrar en copolímeros alternos con monómeros diferentes de ácido siálico como grupo W135 o grupo Y de N. meningitidis. Los ácidos polisiálicos tienen importantes funciones biológicas que incluyen la evasión de los sistemas inmunitarios y complementarios por bacterias patogénicas y la regulación de adhesividad glial de neuronas inmaduras durante el desarrollo fetal (donde el polímero tiene una función antiadhesiva) Cho and Troy, P.N.A.S., USA, 91 (1994) 11427-11431, aunque no hay receptores para ácidos polisiálicos conocidos en mamíferos. El ácido polisiálico enlazado a alfa-2,8 de la cepa E. coli Kl también se conoce como 'ácido colomínico' y se usa (en varias longitudes) para ejemplificar la presente invención. Se han descrito varios métodos para unir o conjugar ácidos polisiálicos a un polipéptido (por ejemplo, véase patente estadounidense n.° 5,846,951; WO-A-0187922, y US 2007/0191597 Al, que se incorporan a la presente en su totalidad mediante esta referencia.
C) Proteína de FVIII
"Una proteína de FVIII" tal como se usa en la presente se refiere a un polipéptido de FVIII funcional en su función
normal en la coagulación, salvo que se especifique lo contrario. El término proteína de FVIII incluye un fragmento, variante, análogo funcional o derivado de este que retiene la función de Factor VIII de tipo salvaje de longitud completa en la vía de coagulación. "Una proteína de FVIII" se usa de forma intercambiable con el polipéptido (o proteína) de FVIII o FVIII. Ejemplos de funciones de FVIII incluyen, de modo no taxativo, una capacidad de activar la coagulación, una capacidad de actuar como un cofactor para el factor IX, o una capacidad de formar un complejo de tenasa con el factor IX en presencia de Ca2+ y fosfolípidos, que luego convierte el Factor X en la forma activada Xa. La proteína de FVIII puede ser la proteína de FVIII humana, porcina, canina, de rata o murina . Además, las comparaciones entre FVIII de humanos y otras especies tienen residuos conservados identificados que posiblemente se requieren para funcionar (Cameron et ál . , Thromb. Haemost . 79:317-22 (1998); US 6,251,632).
Una cantidad de pruebas están disponibles para evaluar la función del sistema de coagulación: prueba de tiempo de tromboplastina parcial activada (aPTT) , ensayo cromogénico, ensayo ROTEM, prueba de tiempo de protrombina (PT) (también usada para determinar INR) , pruebas de fibrinógeno (por lo general mediante el método Clauss) , conteo de plaquetas, pruebas de función de plaquetas (por lo general por PFA-100) , TCT, tiempo de sangrado, prueba de mezcla (si se corrige o no
una anormalidad si se mezcla el plasma del paciente con plasma normal) , ensayos de factores de coagulación, anticuerpos antifosfolípidos , D-dímero, pruebas genéticas
(por ejemplo, factor V Leiden, mutación de protrombina G20210A) , ensayo del veneno de la víbora de Rusell diluido
(dRWT) , pruebas diversas de función de plaquetas, tromboelastografía (TEG o Sonoclot) , tromboelastometría
(TEM®, por ejemplo, ROTEM°) , o tiempo de lisis de euglobulina
(ELT) .
La prueba de aPTT es un indicador de rendimiento que mide la eficacia de vías de coagulación "intrínsecas" (también conocidas como la vía de activación de contacto) y comunes. Esta prueba se usa normalmente para medir la actividad de coagulación de factores de coagulación recombinante comercialmente disponibles, por ejemplo, FVIII o FIX. Se usa junto con el tiempo de protrombina (PT) que mide la vía extrínsica.
El análisis ROTEM proporciona información sobre toda la cinética de hemostasia: tiempo de coagulación, formación de coágulos, estabilidad y lisis del coágulo. Los diferentes parámetros en la tromboelastometría dependen de la actividad del sistema de coagulación plasmática, función de plaquetas, fibrinólisis o muchos factores que influyen en estas interacciones. Este ensayo puede proporcionar una vista completa de hemostasia secundaria.
Las secuencias de polinucleótidos y polipéptidos de FVIII son conocidas al igual que muchos fragmentos, mutantes y versiones funcionales modificadas. Ejemplos de secuencias de FVIII humanas (longitud completa) se muestran como subsecuencias en la SEQ ID NO: 16 o 18.
Tabla 2. El FVIII de longitud completa (péptido de señal de FVIII está subrayado; la cadena pesada de FVIII tiene doble subrayado; el dominio B está en cursiva; y la cadena ligera de FVIII está en texto normal) .
Péptido de SEÑAL : (SEQ ID NO: 15)
MQIELSTCFFLCLLRFCFS
Factor MADURO VIII (SEQ ID NO: 16)*
ATRRYYLGAVELS DYMOSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSWYKKTLFVEFTD HLF IAKPRPP MGLLGPTIOAEVYDTWITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDDQ TSOREKEDDKVFPGGSHTYVWQVLKENGPMASDPLCLTYSYLSHVDLVKDLNSGLIGALLV CREGSLAKEKTOTLHKFILLFAVFDEGKSWHSETKNSLMQDRDAASARAWPKMHTVNGYVN RSLPGLIGCHRKSVYWHVIGMGTTPEVHSIFLEGHTFLVRNHROASLEISPITFLTAQTLL MDLGOFLLFCHISSHOHDGMEAYVKVDSCPEEPOLRMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDWRFD DDNSPSFIOIRSVAKKHPKTWVHYIAAEEEDWDYAPLVLAPDDRSYKSOYLNNGPORIGRK YKKVRFMAYTDETFKTREAIOHESGILGPLLYGEVGDTLLIIFKNOASRPYNIYPHGITDV RPLYSRRLPKGVKHLKDFPILPGEIFKY WTVTVEDGPTKSDPRCLTRYYSSFVNMERDLA SGLIGPLLICYKESVDORGNOIiyiSDKRNVILFSVFDENRSWYLTENIORFLPNPAGVQLED PEFQASNIMHSINGYVFDSLQLSVCLHEVAYWYILSIGAOTDFLSVFFSGYTFKHKMVYED
TLTLFPFSGETVFMSMENPGLWILGCHNSDFRNRGMTALLKVSSCDKNTGDYYEDSYEDIS AYLLSKNNAIEPRSFSQNSRHPSTRQKQFNATTIPENDIEKTDPWFAHRTPMPKIQNVSSS
DLLMLLRQSPTPHGLSLSDLQEAKYETFSDDPSPGAIDSNNSLSEMTHFRPQLHHSGDMVF TPESGLQLRLNEKLGTTAATELKKLDFKVSSTSNNLISTIPSDNLAAGTDNTSSLGPPSMP VHYDSQLDTTLFGKKSSPLTESGGPLSLSEENNDSKLLESGLMNSQESSWGKNVSSTESGR LFKGKRAHGPALLTKDNALFKVSISLLKTNKTSNNSATNRKTHIDGPSLLIENSPSVWQNI LESDTEFKKVTPLIHDRMLMDKNATALRLNHMSNKTTSSKNMEMVQQKKEGPIPPDAQNPD MSFFKMLFLPESARWIQRTHGKNSLNSGQGPSPKQLVSLGPEKSVEGQNFLSEKNKWVGK GEFTKDVGLKEMVFPSSRNLFLTNLDNLHENNTHNQEKKIQEEIEKKETLIQENWLPQIH TVTGTKNFMKNLFLLSTRQNVEGSYDGAYAPVLQDFRSLNDSTNRTKKHTAHFSKKGEEEN LEGLGNQTKQIVEKYACTTRISPNTSQQNFVTQRSKRALKQFRLPLEETELEKR11VDDTS TQWSKNMKHLTPSTLTQIDYNEKEKGAITQSPLSDCLTRSHSIPQANRSPLPIAKVSSFPS IRPIYLTRVLFQDNSSHLPAASYRKKDSGVQESSHFLQGAKKNNLSLAILTLEMTGDQREV GSLGTSATNSVTYKKVENTVLPKPDLPKTSGKVELLPKVHIYQKDLFPTETSNGSPGHLDL VEGSLLQGTEGAIKNNEANRPGKVPFLRVATESSAKTPSKLLDPLANDNHYGTQIPKEENK SQEKSPEKTAFKKKDTILSLNACESNHAIAAINEGQNKPEIEVTWAKQGRTERLCSQNPPV LKRHQREITRTTLQSDQEEIDYDDTISVEMKKEDFDIYDEDENQSPRSFQKKTRHYFIAAV ERLWDYGMSSSPHVLRNRAQSGSVPQFKKWFQEFTDGSFTQPLYRGELNEHLGLLGPYIR AEVED IMVTFR QASRPYSFYSSLISYEEDQRQGAEPRK FVKPNETKTYFWKVQHHMAP TKDEFDCKA AYFSDVDLEKDVHSGLIGPLLVCHTNTLNPAHGRQVTVQEFALFFTIFDET KSWYFTENMER CRAPCNIQMEDPTFKENYRFHAINGYIMDTLPGLVMAQDQRIRWYLLSM GSNENIHSIHFSGHVFTVRKKEEYKMALY LYPGVFETVEMLPSKAGIWRVECLIGEHLHA GMSTLFLVYSNKCQTPLGMASGHIRDFQITASGQYGQ APKLARLHYSGSINAWSTKEPFS WIKVDLLAPM11HGIKTQGARQKFSSLYISQF11 YSLDGKKWQTYRGNSTGTLMVFFGNV DSSGIKHNIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTLRMELMGCDLNSCSMPLGMESKAISDAQIT ASSYFTNMFATWSPSKARLHLQGRSNAWRPQV NPKEWLQVDFQKTMKVTGVTTQGVKSLL TSMYVKEFLISSSQDGHQ TLFFQNGKV VFQGNQDSFTPWNSLDPPLLTRYLRIHPQSW
VHQIALRMEVLGCEAQDLY
Tabla 3. Secuencia de nucleótidos que codifica FVIII de longitud completa (SEQ ID NO: 17)*
661 ATG
CAAATAGAGC TCTCCACCTG
721 CTTCTTTCTG TGCCTTTTGC GATTCTGCTT TAGTGCCACC
AGAAGATACT ACCTGGGTGC
781 AGTGGAACTG TCATGGGACT ATATGCAAAG TGATCTCGGT
GAGCTGCCTG TGGACGCAAG
841 ATTTCCTCCT AGAGTGCCAA AATCTTTTCC ATTCAACACC
TCAGTCGTGT ACAAAAAGAC
901 TCTGTTTGTA GAATTCACGG ATCACCTTTT CAACATCGCT
AAGCCAAGGC CACCCTGGAT
961 GGGTCTGCTA GGTCCTACCA TCCAGGCTGA GGTTTATGAT
ACAGTGGTCA TTACACTTAA
1021 GAACATGGCT TCCCATCCTG TCAGTCTTCA TGCTGTTGGT
GTATCCTACT GGAAAGCTTC
1081 TGAGGGAGCT GAATATGATG ATCAGACCAG TCAAAGGGAG
AAAGAAGATG ATAAAGTCTT
1141 CCCTGGTGGA AGCCATACAT ATGTCTGGCA GGTCCTGAAA
GAGAATGGTC CAATGGCCTC
1201 TGACCCACTG TGCCTTACCT ACTCATATCT TTCTCATGTG
GACCTGGTAA AAGACTTGAA
1261 TTCAGGCCTC ATTGGAGCCC TACTAGTATG TAGAGAAGGG
AGTCTGGCCA AGGAAAAGAC
1321 ACAGACCTTG CACAAATTTA TACTACTTTT TGCTGTATTT GATGAAGGGA AAAGTTGGCA
1381 CTCAGAAACA AAGAACTCCT TGATGCAGGA TAGGGATGCT GCATCTGCTC GGGCCTGGCC
14 1 TAAAATGCAC ACAGTCAATG GTTATGTAAA CAGGTCTCTG CCAGGTCTGA TTGGATGCCA
1501 CAGGAAATCA GTCTATTGGC ATGTGATTGG AATGGGCACC ACTCCTGAAG TGCACTCAAT
1561 ATTCCTCGAA GGTCACACAT TTCTTGTGAG GAACCATCGC
CAGGCGTCCT TGGAAATCTC
1621 GCCAATAACT TTCCTTACTG CTCAAACACT CTTGATGGAC CTTGGACAGT TTCTACTGTT
1681 TTGTCATATC TCTTCCCACC AACATGATGG CATGGAAGCT TATGTCAAAG TAGACAGCTG
17 1 TCCAGAGGAA CCCCAACTAC GAATGAAAAA TAATGAAGAA GCGGAAGACT ATGATGATGA
1801 TCTTACTGAT TCTGAAATGG ATGTGGTCAG GTTTGATGAT GACAACTCTC CTTCCTTTAT
1861 CCAAATTCGC TCAGTTGCCA AGAAGCATCC TAAAACTTGG
GTACATTACA TTGCTGCTGA
1921 AGAGGAGGAC TGGGACTATG CTCCCTTAGT CCTCGCCCCC GATGACAGAA GTTATAAAAG
1981 TCAATATTTG AACAATGGCC CTCAGCGGAT TGGTAGGAAG TACAAAAAAG TCCGATTTAT
2041 GGCATACACA GATGAAACCT TTAAGACTCG TGAAGCTATT CAGCATGAAT CAGGAATCTT
2101 GGGACCTTTA CTTTATGGGG AAGTTGGAGA CACACTGTTG ATTATATTTA AGAATCAAGC
2161 AAGCAGACCA TATAACATCT ACCCTCACGG AATCACTGAT
GTCCGTCCTT TGTATTCAAG
2221 GAGATTACCA AAAGGTGTAA AACATTTGAA GGATTTTCCA ATTCTGCCAG GAGAAATATT
2281 CAAATATAAA TGGACAGTGA CTGTAGAAGA TGGGCCAACT AAATCAGATC CTCGGTGCCT
2341 GACCCGCTAT TACTCTAGTT TCGTTAATAT GGAGAGAGAT CTAGCTTCAG GACTCATTGG
2401 CCCTCTCCTC ATCTGCTACA AAGAATCTGT AGATCAAAGA GGAAACCAGA TAATGTCAGA
2461 CAAGAGGAAT GTCATCCTGT TTTCTGTATT TGATGAGAAC
CGAAGCTGGT ACCTCACAGA
2521 GAATATACAA CGCTTTCTCC CCAATCCAGC TGGAGTGCAG CTTGAGGATC CAGAGTTCCA
2581 AGCCTCCAAC ATCATGCACA GCATCAATGG CTATGTTTTT GATAGTTTGC AGTTGTCAGT
2641 TTGTTTGCAT GAGGTGGCAT ACTGGTACAT TCTAAGCATT GGAGCACAGA CTGACTTCCT
2701 TTCTGTCTTC TTCTCTGGAT ATACCTTCAA ACACAAAATG GTCTATGAAG ACACACTCAC
2761 CCTATTCCCA TTCTCAGGAG AAACTGTCTT CATGTCGATG
GAAAACCCAG GTCTATGGAT
2821 TCTGGGGTGC CACAACTCAG ACTTTCGGAA CAGAGGCATG ACCGCCTTAC TGAAGGTTTC
2881 TAGTTGTGAC AAGAACACTG GTGATTATTA CGAGGACAGT TATGAAGATA TTTCAGCATA
2941 CTTGCTGAGT AAAAACAATG CCATTGAACC AAGAAGCTTC TCCCAGAATT CAAGACACCC
3001 TAGCACTAGG CAAAAGCAAT TTAATGCCAC CACAATTCCA GAAAATGACA TAGAGAAGAC
3061 TGACCCTTGG TTTGCACACA GAACACCTAT GCCTAAAATA
CAAAATGTCT CCTCTAGTGA
3121 TTTGTTGATG CTCTTGCGAC AGAGTCCTAC TCCACATGGG CTATCCTTAT CTGATCTCCA
3181 AGAAGC CAAA TATGAGACTT TTTCTGATGA TCCATCACCT GGAGCAATAG ACAGTAATAA
3241 CAGCCTGTCT GAAATGACAC ACTTCAGGCC ACAGCTCCAT CACAGTGGGG ACATGGTATT
3301 TACCCCTGAG TCAGGCCTCC AATTAAGATT AAATGAGAAA CTGGGGACAA CTGCAGCAAC
3361 AGAGTTGAAG AAACTTGATT TCAAAGTTTC TAGTACATCA
AATAATCTGA TTTCAACAAT
3421 TCCATCAGAC AATTTGGCAG CAGGTACTGA TAATACAAGT TCCTTAGGAC CCCCAAGTAT
3481 GCCAGTTCAT TATGATAGTC AATTAGATAC CACTCTATTT GGCAAAAAGT CATCTCCCCT
3541 TACTGAGTCT GGTGGACCTC TGAGCTTGAG TGAAGAAAAT AATGATTCAA AGTTGTTAGA
3601 ATCAGGTTTA ATGAATAGCC AAGAAAGTTC ATGGGGAAAA AATGTATCGT CAACAGAGAG
3661 TGGTAGGTTA TTTAAAGGGA AAAGAGCTCA TGGACCTGCT
TTGTTGACTA AAGATAATGC
3721 CTTATTCAAA GTTAGCATCT CTTTGTTAAA GACAAACAAA ACTTCCAATA ATTCAGCAAC
3781 TAATAGAAAG ACTCACATTG ATGGCCCATC ATTATTAATT GAGAATAGTC CATCAGTCTG
3841 GCAAAATATA TTAGAAAGTG ACACTGAGTT TAAAAAAGTG ACACCTTTGA TTCATGACAG
3901 AATGCTTATG GACAAAAATG CTACAGCTTT GAGGCTAAAT CATATGTCAA ATAAAACTAC
3961 TTCATCAAAA AACATGGAAA TGGTCCAACA GAAAAAAGAG
GGCCCCATTC CACCAGATGC
4021 ACAAAATCCA GATATGTCGT TCTTTAAGAT GCTATTCTTG CCAGAATCAG CAAGGTGGAT
4081 ACAAAGGACT CATGGAAAGA ACTCTCTGAA CTCTGGGCAA GGCCCCAGTC CAAAGCAATT
4141 AGTATCCTTA GGACCAGAAA AATCTGTGGA AGGTCAGAAT TTCTTGTCTG AGAAAAACAA
4201 AGTGGTAGTA GGAAAGGGTG AATTTACAAA GGACGTAGGA CT C AAAGAGA TGGTTTTTCC
4261 AAGCAGCAGA AACCTATTTC TTACTAACTT GGATAATTTA
CATGAAAATA ATACACACAA
4321 TCAAGAAAAA AAAATTCAGG AAGAAATAGA AAAGAAGGAA ACATTAATCC AAGAGAATGT
4381 AGTTTTGCCT CAGATACATA CAGTGACTGG CACTAAGAAT TTCATGAAGA ACCTTTTCTT
4441 ACTGAGCACT AGGCAAAATG TAGAAGGTTC ATATGACGGG GCATATGCTC CAGTACTTCA
4501 AGATTTTAGG TCATTAAATG ATTCAACAAA TAGAACAAAG AAACACACAG CTCATTTCTC
4561 AAAAAAAGGG GAGGAAGAAA ACTTGGAAGG CTTGGGAAAT
CAAACCAAGC AAATTGTAGA
4621 GAAATATGCA TGCACCACAA GGATATCTCC TAATACAAGC CAGCAGAATT TTGTCACGCA
4681 ACGTAGTAAG AGAGCTTTGA AACAATTCAG ACTCCCACTA GAAGAAACAG AACTTGAAAA
4741 AAGGATAATT GTGGATGACA CCTCAACCCA GTGGTCCAAA AACATGAAAC ATTTGACCCC
4801 GAGCACCCTC ACACAGATAG ACTACAATGA GAAGGAGAAA GGGGCCATTA CTCAGTCTCC
4861 CTTATCAGAT TGCCTTACGA GGAGTCATAG CATCCCTCAA
GCAAATAGAT CTCCATTACC
4921 CATTGCAAAG GTATCATCAT TTCCATCTAT TAGACCTATA TATCTGACCA GGGTCCTATT
4981 CCAAGACAAC TCTTCTCATC TTCCAGCAGC ATCTTATAGA AAGAAAGATT CTGGGGTCCA
5041 AGAAAGCAGT CATTTCTTAC AAGGAGCCAA AAAAAATAAC CTTTCTTTAG CCATTCTAAC
5101 CTTGGAGATG ACTGGTGATC AAAGAGAGGT TGGCTCCCTG GGGACAAGTG CCACAAATTC
5161 AGTCACATAC AAGAAAGTTG AGAACACTGT TCTCCCGAAA
CCAGACTTGC CCAAAACATC
5221 TGGCAAAGTT GAATTGCTTC CAAAAGTTCA CATTTAT CAG AAGGACCTAT TCCCTACGGA
5281 AACTAGCAAT GGGTCTCCTG GCCATCTGGA TCTCGTGGAA GGGAGCCTTC TTCAGGGAAC
5341 AGAGGGAGCG ATTAAGTGGA ATGAAGCAAA CAGACCTGGA AAAGTTCCCT TTCTGAGAGT
5401 AGCAACAGAA AGCTCTGCAA AGACTCCCTC CAAGCTATTG GATCCTCTTG CTTGGGATAA
5461 CCACTATGGT ACTCAGATAC CAAAAGAAGA GTGGAAATCC
CAAGAGAAGT CACCAGAAAA
5521 AACAGCTTTT AAGAAAAAGG ATACCATTTT GTCCCTGAAC GCTTGTGAAA GCAATCATGC
5581 AATAGCAGCA ATAAATGAGG GACAAAATAA GCCCGAAATA GAAGTCACCT GGGCAAAGCA
5641 AGGTAGGACT GAAAGGCTGT GCTCTCAAAA CCCACCAGTC TTGAAACGCC ATCAACGGGA
5701 AATAACTCGT ACTACTCTTC AGTCAGATCA AGAGGAAATT GACTATGATG ATACCATATC
5761 AGTTGAAATG AAGAAGGAAG ATTTTGACAT TTATGATGAG
GATGAAAATC AGAGCCCCCG
5821 CAGCTTTCAA AAGAAAACAC GACACTATTT TATTGCTGCA GTGGAGAGGC TCTGGGATTA
5881 TGGGATGAGT AGCTCCCCAC ATGTTCTAAG AAACAGGGCT CAGAGTGGCA GTGTCCCTCA
5941 GTTCAAGAAA GTTGTTTTCC AGGAATTTAC TGATGGCTCC TTTACTCAGC CCTTATACCG
6001 TGGAGAACTA AATGAACATT TGGGACTCCT GGGGCCATAT ATAAGAGCAG AAGTTGAAGA
6061 TAATATCATG GTAACTTTCA GAAATCAGGC CTCTCGTCCC
TATTCCTTCT ATTCTAGCCT
6121 TATTTCTTAT GAGGAAGATC AGAGGCAAGG AGCAGAACCT AGAAAAAACT TTGTCAAGCC
6181 TAATGAAACC AAAACTTACT TTTGGAAAGT GCAACATCAT ATGGCACCCA CTAAAGATGA
6241 GTTTGACTGC AAAGCCTGGG CTTATTTCTC TGATGTTGAC CTGGAAAAAG ATGTGCACTC
6301 AGGCCTGATT GGACCCCTTC TGGTCTGCCA CACTAACACA CTGAACCCTG CTCATGGGAG
6361 ACAAGTGACA GTACAGGAAT TTGCTCTGTT TTTCACCATC
TTTGATGAGA CCAAAAGCTG
6421 GTACTTCACT GAAAATATGG AAAGAAACTG CAGGGCTCCC TGCAATATCC AGATGGAAGA
6481 TCCCACTTTT AAAGAGAATT ATCGCTTCCA TGCAATCAAT GGCTACATAA TGGATACACT
6541 ACCTGGCTTA GTAATGGCTC AGGATCAAAG GATTCGATGG TATCTGCTCA GCATGGGCAG
6601 CAATGAAAAC ATCCATTCTA TTCATTTCAG TGGACATGTG TTCACTGTAC GAAAAAAAGA
6661 GGAGTATAAA ATGGCACTGT ACAATCTCTA TCCAGGTGTT
TTTGAGACAG TGGAAATGTT
6721 ACCATCCAAA GCTGGAATTT GGCGGGTGGA ATGCCTTATT GGCGAGCATC TACATGCTGG
6781 GATGAGCACA CTTTTTCTGG TGTACAGCAA TAAGTGTCAG ACTCCCCTGG GAATGGCTTC
6841 TGGACACATT AGAGATTTTC AGATTACAGC TTCAGGACAA TATGGACAGT GGGCCCCAAA
6901 GCTGGCCAGA CTTCATTATT CCGGATCAAT CAATGCCTGG AGCACCAAGG AGCCCTTTTC
6961 TTGGATCAAG GTGGATCTGT TGGCACCAAT GATTATTCAC
GGCATCAAGA CCCAGGGTGC
7021 CCGTCAGAAG TTCTCCAGCC TCTACATCTC TCAGTTTATC ATCATGTATA GTCTTGATGG
7081 GAAGAAGTGG CAGACTTATC GAGGAAATTC CACTGGAACC TTAATGGTCT TCTTTGGCAA
71 1 TGTGGATTCA TCTGGGATAA AACACAATAT TTTTAACCCT CCAATTATTG CTCGATACAT
7201 CCGTTTGCAC CCAACTCATT ATAGCATTCG CAGCACTCTT CGCATGGAGT TGATGGGCTG
7261 TGATTTAAAT AGTTGCAGCA TGCCATTGGG AATGGAGAGT
AAAGCAATAT CAGATGCACA
7321 GATTACTGCT TCATCCTACT TTACCAATAT GTTTGCCACC
TGGTCTCCTT CAAAAGCTCG
7381 ACTTCACCTC CAAGGGAGGA GTAATGCCTG GAGACCTCAG
GTGAATAATC CAAAAGAGTG
7441 GCTGCAAGTG GACTTCCAGA AGACAATGAA AGTCACAGGA
GTAACTACTC AGGGAGTAAA
7501 ATCTCTGCTT ACCAGCATGT ATGTGAAGGA GTTCCTCATC
TCCAGCAGTC AAGATGGCCA
7561 TCAGTGGACT CTCTTTTTTC AGAATGGCAA AGTAAAGGTT
TTTCAGGGAA ATCAAGACTC
7621 CTTCACACCT GTGGTGAACT CTCTAGACCC ACCGTTACTG
ACTCGCTACC TTCGAATTCA
7681 CCCCCAGAGT TGGGTGCACC AGATTGCCCT GAGGATGGAG
GTTCTGGGCT GCGAGGCACA
7741 GGACCTCTAC
*Los ácidos nucleicos subrayados codifican un péptido de señal .
Los polipéptidos de FVIII incluyen FVIII de longitud completa, FVIII de longitud completa menos Met en el N-terminal , FVIII maduro (menos la secuencia de señal), FVIII maduro con un Met adicional en el N-terminal, y/o FVIII con una supresión total o parcial del dominio B. En determinadas modalidades, las variantes de FVIII incluyen supresiones del dominio B, ya sea supresiones parciales o totales.
El gen de FVIII humano se aisló y expresó en células de mamíferos (Toóle, J. J. , et ál . , Nature 312:342-347 (1984); Gitschier, J. , et ál . , Nature 312:326-330 (1984); ood, W. I., et ál., Nature 312:330-337 (1984); Venar, G. A., et él., Nature 312:337-342 (1984); WO 87/04187; O 88/08035; WO 88/03558; y patente estadounidense n.° 4,757,006). La secuencia de aminoácidos de FVIII se dedujo a partir de ADNc tal como se muestra en la patente estadounidense n.° 4,965,199. Además, se muestra el FVIII con el dominio B parcial o totalmente eliminado en la patente estadounidense n.° 4,994,371 y 4,868,112. En algunas modalidades, el dominio B de FVIII humano se remplaza con el dominio B del Factor V humano como se muestra en la patente estadounidense n.° 5,004,803. La secuencia de ADNc que codifica el Factor VIII humano y la secuencia de aminoácidos se muestran en las SEQ ID NO: 17 y 16, respectivamente, de la publicación de solicitud estadounidense n.° 2005/0100990.
La secuencia de FVIII porcino se publica en Toóle, J. J., et ál., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 83:5939-5942 (1986). Además, la secuencia de ADNc porcina completa obtenida a partir de la amplificación por PCR de secuencias de FVIII de una biblioteca de ADNc de bazo de cerdo, se reporta en Healey, J. F . , et ál . , Blood 88:4209-4214 (1996). El FVIII humano/porciño híbrido que tiene sustituciones de todos los dominios, todas las subunidades y secuencias de aminoácidos
específica se describen en la patente estadounidense n.° 5,364,771 por Lollar and Runge, y en WO 93/20093. Más recientemente, el nucleótido y las secuencias de aminoácidos correspondientes de los dominios Al y A2 de FVIII porcino y un FVIII quimérico con dominios Al y/o A2 porcinos sustituidos por los dominios humanos correspondientes, se reportaron en WO 94/11503. Patente estadounidense n.° 5,859,204, Lollar, J. S., también describe el ADNc porcino y secuencias de aminoácidos deducidas. Patente estadounidense n.° 6,458,563 describe un FVIII porcino con el dominio B eliminado .
Patente estadounidense n.° 5,859,204 a Lollar, J. S. reporta mutantes funcionales de FVIII que tienen antigenicidad reducida e inmunorreactividad reducida. Patente estadounidense n.° 6,376,463 a Lollar, J. S. también reporta mutantes de FVIII que tienen inmunorreacti idad reducida. La publicación de solicitud estadounidense n. ° 2005/0100990 a Saenko et ál . reporta mutaciones funcionales en el dominio A2 de FVIII.
En una modalidad, el FVIII (o parte de FVIII de una proteína quimérica) puede ser al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 100% idéntico a la secuencia de aminoácidos de FVIII de aminoácidos 1 a 1438 de la SEQ ID NO: 18 o aminoácidos 1 a 2332 de la SEQ ID NO: 16 (sin una secuencia de señal) o una secuencia de aminoácidos de FVIII
de aminoácidos -19 a 1438 de la SEQ ID NO: 15 y la SEQ ID NO: 18 o aminoácidos -19 a 2332 de la SEQ ID NO: 15 y la SEQ ID NO: 16 (con una secuencia de señal) , donde el FVIII tiene una actividad de coagulación, por ejemplo, activa el Factor IX como un cofactor para convertir el Factor X en el Factor X activado. El FVIII (o la parte de FVIII de una proteína quimérica) puede ser idéntico a una secuencia de aminoácidos de FVIII de aminoácidos 1 a 1438 de la SEQ ID NO: 18 o aminoácidos 1 a 2332 de la SEQ ID NO: 16 (sin una secuencia de señal) . El FVIII puede comprender además una secuencia de señal .
El "dominio B" de FVIII, tal como se usa en la presente, es igual al dominio B conocido en la técnica que se define por la identidad de secuencia de aminoácidos interna y sitios de escisión proteolítica, por ejemplo, residuos Ser741-Argl648 de FVIII humano de longitud completa. Los otros dominios de FVIII humano se definen por los siguientes residuos de aminoácidos: Al, residuos Alal-Arg372 ,- A2 , residuos Ser373-Arg740 ; A3 , residuos Serl690-Asn2019 ; Cl, residuos Lys2020-Asn2172 ; C2 , residuos Ser2173-Tyr2332. La secuencia A3-C1-C2 incluye residuos Serl690-Tyr2332. La secuencia restante, los residuos Glul649-Argl689 , se refiere generalmente como la región ácida a3. Las ubicaciones de los límites para todos los dominios, que incluyen los dominios B, para FVIII de porcino, ratón y canino también se conocen en
la técnica. En una modalidad, el dominio B de FVIII se elimina ("factor VIII con el dominio B eliminado" o "BDD FVIII") . Un ejemplo de un BDD FVIII es REFACTO® (BDD FVIII recombinante) , que tiene la misma secuencia que la parte del Factor VIII de la secuencia en la Tabla 4. (La cadena pesada de BDD FVIII se tiene doble subrayado; el dominio B está en cursiva; y la cadena ligera de BDD FVIII está en texto normal) .
Tabla 4
BDD FVIII (SEQ ID NO: 18)
ATRRYYLGAVELSWDYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSWYKKTLFVEFTD HLFNIAKPRPPWMGLLGPTIOAEVYDTWITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDDO TSOREKEDDKVFPGGSHTYV OVLKENGPMASDPLCLTYSYLSHVDLVKDLNSGLIGALLV CREGSLAKEKTOTLHKFILLFAVFDEGKSWHSETKNSLMQDRDAASARAWPKMHTVNGYV RSLPGLIGCHRKSVYWHVIG GTTPEVHSIFLEGHTFLVRNHRQASLEISPITFLTAQTLL MDLGQFLLFCHISSHQHDGMEAYVKVDSCPEEPQLR KNNEEAEDYDDDLTDSEMDWRFD DDNSPSFIQIRSVAKKHPKTWVHYIAAEEEDWDYAPLVLAPDDRSYKSOYLNNGPORIGRK YKKVRFMAYTDETFKTREAIOHESGILGPLLYGEVGDTLLIIFKNOASRPYNIYPHGITDV RPLYSRRLPKGVKHLKDFPILPGEIFKYKWTVTVEDGPTKSDPRCLTRYYSSFVNMERDLA SGLIGPLLICYKESVDORGNOIMSDKRNVILFSVFDENRSWYLTENIORFLPNPAGVOLED PEFOASNIMHSINGYVFDSLQLSVCLHEVAY YILSIGAQTDFLSVFFSGYTFKHKMVYED TLTLFPFSGETVFMSMENPGLWILGCHNSDFRNRGMTALLKVSSCDKNTGDYYEDSYEDIS AYLLSKmAIEPRSFSQ-VPPVLK^HOREITRTTLOSDOEEIDYDDTISVE KKEDFDIYDE DENQSPRSFQKKTRHYFIAAVERL DYGMSSSPHVLRNRAQSGSVPQFKKWFQEFTDGSF TQPLYRGELNEHLGLLGPYIRAEVEDNIMVTFRNQASRPYSFYSSLISYEEDQRQGAEPRK
NFVKPNETKTYFWKVQHHMAPTKDEFDCKAWAYFSDVDLEKDVHSGLIGPLLVCHTNTLNP AHGRQVTVQEFALFFTIFDETKSWYFTENMERNCRAPCNIQMEDPTFKENYRFHAINGYIM DTLPGLVAQDQRIRWYLLSMGSNENIHSIHFSGHVFTVRKKEEY ALYNLYPGVFETVE MLPSKAGI RVECLIGEHLHAGMSTLFLVYSNKCQTPLGMASGHIRDFQITASGQYGQ AP KIARLHYSGSINA STKEPFSWIKVDLLAPMIIHGIKTQGARQKFSSLYISQFIIMYSLDG KKWQTYRGNSTGTLMVFFGNVDSSGIKHNIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTLRMELMGCD LNSCSMPLGMESKAISDAQITASSYFTNMFATWSPSKARLHLQGRSNAWRPQVNNPKEWLQ VDFQKTMKVTGVTTQGVKSLLTSMYVKEFLISSSQDGHQWTLFFQNGKVKVFQGNQDSFTP WNSLDPPLLTRYLRIHPQSWVHQIALRMEVLGCEAQDLY
Tabla 5. Secuencia de nucleótidos que codifica BDD FVIII
(SEQ ID NO: 19) *
661 A TGCAAATAGA GCTCTCCACC TGCTTCTTTC 721 TGTGCCTTTT GCGATTCTGC TTTAGTGCCA CCAGAAGATA CTACCTGGGT GCAGTGGAAC
781 TGTCATGGGA CTATATGCAA AGTGATCTCG GTGAGCTGCC
TGTGGACGCA AGATTTCCTC
841 CTAGAGTGCC AAAATCTTTT CCATTCAACA CCTCAGTCGT GTACAAAAAG ACTCTGTTTG
901 TAGAATTCAC GGATCACCTT TTCAACATCG CTAAGCCAAG GCCACCCTGG ATGGGTCTGC
961 TAGGTCCTAC CATCCAGGCT GAGGTTTATG ATACAGTGGT CATTACACTT AAGAACATGG
1021 CTTCCCATCC TGTCAGTCTT CATGCTGTTG GTGTATCCTA CTGGAAAGCT TCTGAGGGAG
1081 CTGAATATGA TGATCAGACC AGTCAAAGGG AGAAAGAAGA
TGATAAAGTC TTCCCTGGTG
1141 GAAGCCATAC ATATGTCTGG CAGGTCCTGA AAGAGAATGG TCCAATGGCC TCTGACCCAC
1201 TGTGCCTTAC CTACTCATAT CTTTCTCATG TGGACCTGGT AAAAGACTTG AATTCAGGCC
1261 TCATTGGAGC CCTACTAGTA TGTAGAGAAG GGAGTCTGGC CAAGGAAAAG ACACAGACCT
1321 TGCACAAATT TATACTACTT TTTGCTGTAT TTGATGAAGG GAAAAGTTGG CACTCAGAAA
1381 CAAAGAACTC CTTGATGCAG GATAGGGATG CTGCATCTGC
TCGGGCCTGG CCTAAAATGC
1441 ACACAGTCAA TGGTTATGTA AACAGGTCTC TGCCAGGTCT GATTGGATGC CACAGGAAAT
1501 CAGTCTATTG GCATGTGATT GGAATGGGCA CCACTCCTGA AGTGCACTCA ATATTCCTCG
1561 AAGGTCACAC ATTTCTTGTG AGGAACCATC GCCAGGCGTC CTTGGAAATC TCGCCAATAA
1621 CTTTCCTTAC TGCTCAAACA CTCTTGATGG ACCTTGGACA GTTTCTACTG TTTTGTCATA
1681 TCTCTTCCCA CCAACATGAT GGCATGGAAG CTTATGTCAA
AGTAGACAGC TGTCCAGAGG
1741 AACCCCAACT ACGAATGAAA AATAATGAAG AAGCGGAAGA CTATGATGAT GATCTTACTG
1801 ATTCTGAAAT GGATGTGGTC AGGTTTGATG ATGACAACTC TCCTTCCTTT ATCCAAATTC
1861 GCTCAGTTGC CAAGAAGCAT CCTAAAACTT GGGTACATTA CATTGCTGCT GAAGAGGAGG
1921 ACTGGGACTA TGCTCCCTTA GTCCTCGCCC CCGATGACAG AAGTTATAAA AGTCAATATT
1981 TGAACAATGG CCCTCAGCGG ATTGGTAGGA AGTACAAAAA
AGTCCGATTT ATGGCATACA
2041 CAGATGAAAC CTTTAAGACT CGTGAAGCTA TTCAGCATGA ATCAGGAATC TTGGGACCTT
2101 TACTTTATGG GGAAGTTGGA GACACACTGT TGATTATATT TAAGAATCAA GCAAGCAGAC
2161 CATATAACAT CTACCCTCAC GGAATCACTG ATGTCCGTCC TTTGTATTCA AGGAGATTAC
2221 CAAAAGGTGT AAAACATTTG AAGGATTTTC CAATTCTGCC AGGAGAAATA TTCAAATATA
2281 AATGGACAGT GACTGTAGAA GATGGGCCAA CTAAATCAGA
TCCTCGGTGC CTGACCCGCT
2341 ATTACTCTAG TTTCGTTAAT ATGGAGAGAG ATCTAGCTTC AGGACTCATT GGCCCTCTCC
2401 TCATCTGCTA CAAAGAATCT GTAGATCAAA GAGGAAACCA GATAATGTCA GACAAGAGGA
2461 ATGTCATCCT GTTTTCTGTA TTTGATGAGA ACCGAAGCTG GTACCTCACA GAGAATATAC
2521 AACGCTTTCT CCCCAATCCA GCTGGAGTGC AGCTTGAGGA TCCAGAGTTC CAAGCCTCCA
2581 ACATCATGCA CAGCATCAAT GGCTATGTTT TTGATAGTTT
GCAGTTGTCA GTTTGTTTGC
26 1 ATGAGGTGGC ATACTGGTAC ATTCTAAGCA TTGGAGCACA GACTGACTTC CTTTCTGTCT
2701 TCTTCTCTGG ATATACCTTC AAACACAAAA TGGTCTATGA AGACACACTC ACCCTATTCC
2761 CATTCTCAGG AGAAACTGTC TTCATGTCGA TGGAAAACCC AGGTCTATGG ATTCTGGGGT
2821 GCCACAACTC AGACTTTCGG AACAGAGGCA TGACCGCCTT ACTGAAGGTT TCTAGTTGTG
2881 ACAAGAACAC TGGTGATTAT TACGAGGACA GTTATGAAGA
TATTTCAGCA TACTTGCTGA
29 1 GTAAAAACAA TGCCATTGAA CCAAGAAGCT TCTCTCAAAA CCCACCAGTC TTGAAACGCC
3001 ATCAACGGGA AATAACTCGT ACTACTCTTC AGTCAGATCA AGAGGAAATT GACTATGATG
3061 ATACCATATC AGTTGAAATG AAGAAGGAAG ATTTTGACAT TTATGATGAG GATGAAAATC
3121 AGAGCCCCCG CAGCTTTCAA AAGAAAACAC GACACTATTT TATTGCTGCA GTGGAGAGGC
3181 TCTGGGATTA TGGGATGAGT AGCTCCCCAC ATGTTCTAAG
AAACAGGGCT CAGAGTGGCA
3241 GTGTCCCTCA GTTCAAGAAA GTTGTTTTCC AGGAATTTAC TGATGGCTCC TTTACTCAGC
3301 CCTTATACCG TGGAGAACTA AATGAACATT TGGGACTCCT GGGGCCATAT ATAAGAGCAG
3361 AAGTTGAAGA TAATATCATG GTAACTTTCA GAAATCAGGC CTCTCGTCCC TATTCCTTCT
3421 ATTCTAGCCT TATTTCTTAT GAGGAAGATC AGAGGCAAGG AGCAGAACCT AGAAAAAACT
3481 TTGTCAAGCC TAATGAAACC AAAACTTACT TTTGGAAAGT
GCAACATCAT ATGGCACCCA
3541 CTAAAGATGA GTTTGACTGC AAAGCCTGGG CTTATTTCTC TGATGTTGAC CTGGAAAAAG
3601 ATGTGCACTC AGGCCTGATT GGACCCCTTC TGGTCTGCCA CACTAACACA CTGAACCCTG
3661 CTCATGGGAG ACAAGTGACA GTACAGGAAT TTGCTCTGTT TTTCACCATC TTTGATGAGA
3721 CCAAAAGCTG GTACTTCACT GAAAATATGG AAAGAAACTG CAGGGCTCCC TGCAATATCC
3781 AGATGGAAGA TCCCACTTTT AAAGAGAATT ATCGCTTCCA
TGCAATCAAT GGCTACATAA
3841 TGGATACACT ACCTGGCTTA GTAATGGCTC AGGATCAAAG GATTCGATGG TATCTGCTCA
3901 GCATGGGCAG CAATGAAAAC ATCCATTCTA TTCATTTCAG TGGACATGTG TTCACTGTAC
3961 GAAAAAAAGA GGAGTATAAA ATGGCACTGT ACAATCTCTA TCCAGGTGTT TTTGAGACAG
4021 TGGAAATGTT ACCATCCAAA GCTGGAATTT GGCGGGTGGA ATGCCTTATT GGCGAGCATC
4081 TACATGCTGG GATGAGCACA CTTTTTCTGG TGTACAGCAA
TAAGTGTCAG ACTCCCCTGG
41 1 GAATGGCTTC TGGACACATT AGAGATTTTC AGATTACAGC TTCAGGACAA TATGGACAGT
4201 GGGCCCCAAA GCTGGCCAGA CTTCATTATT CCGGATCAAT CAATGCCTGG AGCACCAAGG
4261 AGCCCTTTTC TTGGATCAAG GTGGATCTGT TGGCACCAAT GATTATTCAC GGCATCAAGA
4321 CCCAGGGTGC CCGTCAGAAG TTCTCCAGCC TCTACATCTC TCAGTTTATC ATCATGTATA
4381 GTCTTGATGG GAAGAAGTGG CAGACTTATC GAGGAAATTC
CACTGGAACC TTAATGGTCT
4441 TCTTTGGCAA TGTGGATTCA TCTGGGATAA AACACAATAT TTTTAACCCT CCAATTATTG
4501 CTCGATACAT CCGTTTGCAC CCAACTCATT ATAGCATTCG CAGCACTCTT CGCATGGAGT
4561 TGATGGGCTG TGATTTAAAT AGTTGCAGCA TGCCATTGGG AATGGAGAGT AAAGCAATAT
4621 CAGATGCACA GATTACTGCT TCATCCTACT TTACCAATAT GTTTGCCACC TGGTCTCCTT
4681 CAAAAGCTCG ACTTCACCTC CAAGGGAGGA GTAATGCCTG
GAGACCTCAG GTGAATAATC
4741 CAAAAGAGTG GCTGCAAGTG GACTTCCAGA AGACAATGAA AGTCACAGGA GTAACTACTC
4801 AGGGAGTAAA ATCTCTGCTT ACCAGCATGT ATGTGAAGGA GTTCCTCATC TCCAGCAGTC
4861 AAGATGGCCA TCAGTGGACT CTCTTTTTTC AGAATGGCAA AGTAAAGGTT TTTCAGGGAA
4921 ATCAAGACTC CTTCACACCT GTGGTGAACT CTCTAGACCC ACCGTTACTG ACTCGCTACC
4981 TTCGAATTCA CCCCCAGAGT TGGGTGCACC AGATTGCCCT
GAGGATGGAG GTTCTGGGCT
5041 GCGAGGCACA GGACCTCTAC
*Los ácidos nucleicos subrayados codifican un péptido de señal .
Un "FVIII con el dominio B eliminado" puede tener las supresiones totales o parciales descritas en las patentes estadounidenses n. ° 6,316,226, 6,346,513, 7,041,635, 5,789,203, 6,060,447, 5,595,886, 6,228,620, 5,972,885, 6,048,720, 5,543,502, 5,610,278, 5,171,844, 5,112,950, 4,868,112, y 6,458,563. En algunas modalidades, una secuencia de FVIII con el dominio B eliminado de la presente invención comprende cualesquiera supresiones descritas en la col. 4, línea 4 a col. 5, línea 28 y Ejemplos 1-5 de la patente estadounidense n.° 6,316,226 (también en US 6,346,513). En otra modalidad, un Factor VIII con el dominio B eliminado es el Factor VIII con el dominio B eliminado S743/Q1638 (SQ BDD FVIII) (por ejemplo, el Factor VIII que tiene una supresión de aminoácido 744 a aminoácido 1637, por ejemplo, Factor VIII que tiene aminoácidos 1-743 y aminoácidos 1638-2332 de la SEQ ID NO: 16, es decir, la SEQ ID NO: 18) . En algunas
modalidades, un FVIII con el dominio B eliminado de la presente invención tiene una supresión descrita en col. 2, líneas 26-51 y ejemplos 5-8 de la patente estadounidense n.° 5,789,203 (también US 6,060,447, US 5,595,886, y US 6,228,620). En algunas modalidades, un Factor VIII con el dominio B eliminado tiene una supresión descrita en la col.
1, línea 25 a col. 2, línea 40 de la patente estadounidense 5,972,885; col. 6, líneas 1-22 y ejemplo 1 de la patente estadounidense n.° 6,048,720; col. 2, líneas 17-46 de la patente estadounidense n.° 5,543,502; col. 4, línea 22 a col. 5, línea 36 de la patente estadounidense n.° 5,171,844; col.
2, líneas 55-68, figura 2, y ejemplo 1 de la patente estadounidense n.° 5,112,950; col. 2, línea 2 a col. 19, línea 21 y tabla 2 de la patente estadounidense n.° 4,868,112; col. 2, línea 1 a col. 3, línea 19, col. 3, línea 40 a col. 4, línea 67, col. 7, línea 43 a col. 8, línea 26, y col. 11, línea 5 a col. 13, línea 39 de la patente estadounidense n.° 7,041,635; o col. 4, líneas 25-53, de la patente estadounidense n.° 6,458,563.
En algunas modalidades, un FVIII con el dominio B eliminado tiene una supresión de la mayoría del dominio B, pero todavía contiene las secuencias del extremo amino del dominio B que son esenciales para el procesamiento proteolítico in vivo del producto de traducción primario en dos cadenas de polipéptidos, tal como se describe en O
91/09122. En algunas modalidades, un FVIII con el dominio B eliminado se construye con una supresión de aminoácidos 747-1638, es decir, virtualmente una supresión completa del dominio B. Hoeben R.C., et ál . J. Biol . Chem. 265 (13): 7318-7323 (1990) . Un Factor FVIII con el dominio B eliminado también puede contener una supresión de aminoácidos 771-1666 o aminoácidos 868-1562 de FVIII. Meulien P., et ál . Protein Eng. 2(4): 301-6 (1988). Las supresiones del dominio B adicionales que son parte de la invención incluyen: supresión de aminoácidos 982 hasta 1562 o 760 hasta 1639 (Toóle et ál . , Proc. Nati. Acad. Sci . U.S.A. (1986) 83, 5939-5942)), 797 hasta 1562 (Eaton, et ál . Biochemistry (1986) 25:8343-8347)), 741 hasta 1646 (Kaufman (solicitud publicada PCT n.° WO 87/04187)), 747-1560 (Sarver, et ál . , DNA (1987) 6:553-564)), 741 hasta 1648 (Pasek (solicitud PCT n. ° 88/00831)), o 816 hasta 1598 o 741 hasta 1648 (Lagner (Behring Inst . Mitt. (1988) No 82:16-25, EP 295597)). En otras modalidades, BDD FVIII incluye un polipéptido de FVIII que contiene fragmentos del dominio B que retienen uno o más sitios de glicosilación enlazados a N, por ejemplo, residuos 757, 784, 828, 900, 963, u opcionalmente 943, que corresponden a la secuencia de aminoácidos de la secuencia de FVIII de longitud completa. Ejemplos de fragmentos del dominio B incluyen 226 aminoácidos o 163 aminoácidos del dominio B tal como se describe en Miao, H.Z., et ál., Blood 103(a): 3412-3419 (2004), Kasuda, A, et
ál., J. Thromb. Haemost. 6: 1352-1359 (2008), y Pipe, S.W., et ál., J. Thromb. Haemost. 9: 2235-2242 (2011) (es decir, se retienen los primeros 226 aminoácidos o 163 aminoácidos del dominio B) . En algunas modalidades, el FVIII con un dominio B parcial es FVIII198 (SEQ ID NO: 105) . FVIII198 es un dominio B parcial que contiene una molécula 226N6 de FVIIIFc de cadena simple. 226 representa el aminoácido 226 de N-terminal del dominio B de FVIII y N6 representa los seis sitios de glicosilación N en el dominio B. En aun otras modalidades, BDD FVIII comprende además una mutación puntual en el residuo 309 (de Phe a Ser) para mejorar la expresión de la proteína de BDD FVIII. Véase Miao, H.Z., et ál . , Blood 103(a): 3412-3419 (2004) . En aun otras modalidades, el BDD FVIII incluye un polipéptido de FVIII que contiene una parte de un dominio B, pero que no contiene uno o más sitios de escisión de furina (por ejemplo, Argl313 y Arg 1648). Véase Pipe, S.W., et ál., J. Thromb. Haemost. 9: 2235-2242 (2011). Cada una de las supresiones anteriores se puede realizar en cualquier secuencia de FVIII.
Una proteína de FVIII útil en la presente invención puede incluir FVIII que tiene una o más secuencias heterólogas adicionales o modificaciones químicas o físicas allí, que no afectan la actividad de coagulación de FVIII. Las secuencias heterólogas o modificaciones químicas o físicas se pueden fusionar al C-terminal o N-terminal de la
proteína de FVIII o se pueden insertar entre uno o más de los dos residuos de aminoácidos en la proteína de FVIII. Las inserciones en la proteína de FVIII no afectan la actividad de coagulación de FVIII o función de FVIII. En una modalidad, las inserciones mejoran las propiedades farmacocinéticas de la proteína de FVIII (por ejemplo, semivida) . En otra modalidad, las inserciones puede ser más de dos, tres, cuatro, cinco o seis sitios.
En una modalidad, FVIII se escinde inmediatamente después de Arginina en el aminoácido 1648 (en el Factor VIII de longitud completa o la SEQ ID NO: 16), aminoácido 754 (en el Factor VIII con el dominio B eliminado S743/Q1638 o la SEQ ID NO: 16) , o el residuo de Arginina correspondiente (en otras variantes) , así dando como resultado una cadena pesada y una cadena ligera. En otra modalidad, FVIII comprende una cadena pesada y una cadena ligera que están enlazadas o asociadas por un enlace no covalente mediado por ion metálico .
En otras modalidades, FVIII es FVIII de cadena simple que no fue escindido inmediatamente después de Arginina en el aminoácido 1648 (en FVIII de longitud completa o la SEQ ID NO: 16) , aminoácido 754 (en FVIII con el dominio B eliminado S743/Q1638 o la SEQ ID NO: 18) , o el residuo de Arginina correspondiente (en otras variantes) . Un FVIII de cadena simple puede comprender una o más sustituciones de
aminoácidos. En una modalidad, la sustitución de aminoácido está en un residuo que corresponde al residuo 1648, residuo 1645, o ambos polipéptidos del Factor VIII maduro de longitud completa (SEQ ID NO : 16) o residuo 754, residuo 751, o ambos SQ BDD Factor VIII (SEQ ID NO: 18) . La sustitución de aminoácido puede ser cualquier aminoácido diferente de Arginina, por ejemplo, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, treonina, triptófano, valina, alanina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutámico, glutamina, glicina, prolina, selenocisteína, serina, tirosina, histidina, omitina, pirrolisina, o taurina.
FVIII puede estar escindido adicionalmente por trombina y luego activado como FVIIIa, que sirve como coEactor para el Factor IX activado (FlXa) . Y el FIX activado junto con FVIII activado forman un complejo Xasa y convierten el Factor X en Factor X activado (FXa) . Para la activación, FVIII se escinde por trombina luego de tres residuos de Arginina, en los aminoácidos 372, 740, y 1689 (correspondientes a los aminoácidos 372, 740, y 795 en la secuencia de FVIII eliminada del dominio B) , la escisión que genera FVIIIa que tiene las cadenas 50kDa Al, 43kDa A2 , y 73kDa A3-C1-C2. En una modalidad, la proteína de FVIII útil para la presente invención es FVIII no activo. En otra modalidad, la proteína de FVIII es FVIII activado.
La proteína que tiene polipéptido de FVIII enlazado o
asociado al fragmento de VWF puede comprender una secuencia al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 100% idéntica a la SEQ ID NO: 16 o 18, donde la secuencia tiene la actividad de coagulación de FVIII, por ejemplo, Factor IX de activación como un cofactor para convertir el Factor X en el Factor X activado (FXa) .
Los polipéptidos y proteínas "híbridos", tal como se usa en la presente, se refieren a una combinación de una primera cadena de polipéptidos, por ejemplo, el fragmento de VWF, opcionalmente fusionada a un primer resto heterólogo, con una segunda cadena de polipéptidos, por ejemplo, una proteína de FVIII, opcionalmente fusionada a un segundo resto heterólogo, formando así un heterodímero . En una modalidad, el primer polipéptido y el segundo polipéptido en un híbrido están asociados entre sí mediante interacciones proteína-proteína, tales como interacciones carga-carga o hidrofóbicas . En otra modalidad, el primer polipéptido y el segundo polipéptido en un híbrido están asociados entre sí mediante enlaces disulfuro u otros enlaces covalentes . Los híbridos se describen, por ejemplo, en US 2004/101740 y US 2006/074199. El segundo polipéptido puede ser una copia idéntica del primer polipéptido o un polipéptido no idéntico. En una modalidad, el primer polipéptido es un fragmento de VWF-proteína de fusión a Fe, y el segundo polipéptido es un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o
consiste en un dominio de unión a FcRn, donde el primer polipéptido y el segundo polipéptido están asociados entre sí. En otra modalidad, el primer polipéptido comprende un fragmento de VWF-proteína de fusión a Fe y el segundo polipéptido comprende un FVIII-proteína de fusión a Fe, que convierten el híbrido en un heterodímero . El primer polipéptido y el segundo polipéptido pueden estar asociados a través de un enlace covalente, por ejemplo, un enlace disulfuro, entre la primera región Fe y la segunda región Fe. El primer polipéptido y el segundo polipéptido pueden estar asociados además entre sí por la unión entre el fragmento de VWF y la proteína de FVIII.
D) Enlazadores
La proteína quimérica de la presente invención comprende además un enlazador. Pueden estar presentes uno o más enlazadores entre cualesquiera dos proteínas, por ejemplo, entre el resto adjunto y la proteína de FVIII (a veces referido también como "enlazador de FVIII/AM"), entre el fragmento de VWF y un primer resto heterólogo (a veces referido también como "enlazador de VWF"), por ejemplo, una primera región Fe, entre una proteína de FVIII y un segundo resto heterólogo (a veces referido también como "enlazador de FVIII"), por ejemplo, una segunda región Fe, entre el fragmento de VWF y una proteína de FVIII (por ejemplo, enlazador de FVIII/AM) , entre el fragmento de VWF y el
segundo resto heterologo, y/o entre una proteína de FVIII y un primer resto heterologo. Cada uno de los enlazadores puede tener la misma secuencia o una diferente. En una modalidad, en enlazador es un enlazador polipéptido. En otra modalidad, en enlazador es un enlazador no polipéptido.
El enlazador útil en la presente invención puede comprender cualquier molécula orgánica. En una modalidad, el enlazador es un polímero, por ejemplo, polietilenglicol (PEG) o almidón de hidroxietilo (HES) . En otra modalidad, el enlazador es una secuencia de aminoácidos (por ejemplo, un enlazador polipéptido) . El enlazador polipéptido puede comprender alrededor de al menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900 o 2000 aminoácidos. El enlazador puede comprender 1-5 aminoácidos, 1-10 aminoácidos, 1-20 aminoácidos, 10-50 aminoácidos, 50-100 aminoácidos, 100-200 aminoácidos, 200-300 aminoácidos, 300-400 aminoácidos, 400-500 aminoácidos, 500-600 aminoácidos, 600-700 aminoácidos, 700-800 aminoácidos, 800-900 aminoácidos, o 900-1000 aminoácidos.
Ejemplos de enlazadores polipéptido se conocen en la técnica. En una modalidad, el enlazador comprende la secuencia Gn. El enlazador puede comprender la secuencia (GA)n. El enlazador puede comprender la secuencia (GGS)n. En otras modalidades, el enlazador comprende (GGGS)n (SEQ ID NO:
20) . En aun otras modalidades, el enlazador comprende la secuencia (GGS) n (GGGGS) n (SEQ ID NO: 21) . En estos casos, n puede ser un entero de 1-100. En otros casos, n puede ser un entero de 1-20, es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20. Ejemplos de enlazadores incluyen, de modo no taxativo, GGG, SGGSGGS (SEQ ID NO: 22) , GGSGGSGGSGGSGGG (SEQ ID NO : 23), GGSGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 24), GGSGGSGGSGGSGGSGGS (SEQ ID NO: 25), GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 26), los enlazadores en la Tabla 13 (SEQ ID NO: 92, 93, y 94), y los enlazadores en la Tabla 14A (SEQ ID NO: 95, 96 y 97) . El enlazador no elimina o disminuye la actividad del fragmento de VWF o la actividad de coagulación del Factor VIII. Opcionalmente, el enlazador potencia la actividad del fragmento de VWF o la actividad de coagulación de la proteína del Factor VIII, por ejemplo, disminuyendo adicionalmente los efectos del impedimento estérico y haciendo que el fragmento de VWF o parte del Factor VIII sea más accesible a su sitio de unión a la diana.
En una modalidad, el enlazador útil para la proteína quimérica tiene 15-25 aminoácidos de longitud. En otra modalidad, el enlazador útil para la proteína quimérica tiene 15-20 aminoácidos de longitud. En algunas modalidades, el enlazador útil para la proteína quimérica tiene 10-25 aminoácidos de longitud. En otras modalidades, el enlazador útil para la proteína quimérica tiene 15 aminoácidos de
longitud. En aun otras modalidades, el enlazador para la proteína quimérica es (GGGGS) n (SEQ ID NO: 27) donde G representa glicina, S representa serina y n es un entero de 1-20.
E) Sitios de escisión
El enlazador también puede incorporar un resto capaz de estar escindido ya sea química (por ejemplo, hidrólisis de un enlace éster) , enzimática (es decir, incorporación de una secuencia de escisión de proteasa) , o fotolíticamente (por ejemplo, un cromóforo tal como ácido 3-amino-3- (2 -nitrofenil) propriónico (A P) ) para liberar una molécula de otra.
En una modalidad, el enlazador es un enlazador escindible. Los enlazadores escindibles pueden comprender uno o más sitios de escisión en el N-terminal o C-terminal o ambos. En otra modalidad, el enlazador escindible consiste esencialmente en o consiste en uno o más sitios escindibles. En otras modalidades el enlazador escindible comprende secuencias enlazadoras de aminoácidos heterólogos descritas en la presente o polímeros y uno o más sitios escindibles.
En determinadas modalidades, un enlazador escindible comprende uno o más sitios de escisión que se pueden escindir en una célula hospedadora (es decir, sitios de procesamiento intracelular) . Ejemplos no taxativos del sitio de escisión incluyen RRRR (SEQ ID NO: 52), RKRRKR (SEQ ID NO: 53), y RRRRS (SEQ ID NO : 54) .
En otras modalidades, un enlazador escindible comprende uno o más sitios de escisión que están escindidos por una proteasa luego de que se administra una proteína quimérica que comprende el enlazador escindible al sujeto. En una modalidad, el sitio de escisión está escindido por una proteasa que se selecciona del grupo que consiste en el factor Xla, factor Xlla, calicreína, factor Vlla, factor IXa, factor Xa, factor lia (trombina) , Elastasa-2, MMP-12, MMP-13, MP-17 y MMP-20. En otra modalidad, el sitio de escisión se selecciona del grupo que consiste en un sitio de escisión FXIa (por ejemplo, KLTR^AET (SEQ ID NO: 29)), un sitio de escisión de FXIa (por ejemplo, DFTRjWG (SEQ ID NO: 30)) , un sitio de escisión de FXIIa (por ejemplo, TMTRi IVGG (SEQ ID NO: 31)), un sitio de escisión de calicreína (por ejemplo, SPFRiSTGG (SEQ ID NO: 32)), un sitio de escisión de FVIIa (por ejemplo, LQVR; IVGG (SEQ ID NO: 33)) , un sitio de escisión de FlXa (por ejemplo, PLGR¿ IVGG (SEQ ID NO: 34)), un sitio de escisión de FXa (por ejemplo, IEGR¿TVGG (SEQ ID NO: 35) ) , un sitio de escisión de Fila (trombina) (por ejemplo, LTPR; SLLV (SEQ ID NO: 36)), un sitio de escisión de Elastasa-2 (por ejemplo, LGPV¿SGVP (SEQ ID NO: 37)), una escisión de Granzima B (por ejemplo, VAGDiSLEE (SEQ ID NO: 38)), un sitio de escisión de MMP-12 (por ejemplo, GPAG ; LGGA (SEQ ID NO: 39) ) , un sitio de escisión de MMP-13 (por ejemplo, GPAG¿ LRGA (SEQ ID NO: 40)) , un sitio de escisión de MMP-17 (por
ejemplo, APLGiLRLR (SEQ ID NO: 41)), un sitio de escisión de MMP-20 (por ejemplo, PALP;LVAQ (SEQ ID NO: 42)), un sitio de escisión de TEV (por ejemplo, ENLYFQ iG (SEQ ID NO: 43)), un sitio de escisión de Enterocinasa (por ejemplo, DDDK IVGG (SEQ ID NO: 44)), un sitio de escisión de Proteasa 3C (PRESCISSION™) (por ejemplo, LEVLFQj,GP (SEQ ID NO: 45)), y un sitio de escisión de Sortasa A (por ejemplo, LPKTiGSES) (SEQ ID NO: 46) . En determinadas modalidades, los sitios de escisión de FXIa incluyen de modo no taxativo, por ejemplo, TQSFNDFTR (SEQ ID NO: 47) y SVSQTSKLTR (SEQ ID NO: 48) . Ejemplos no taxativos de sitios de escisión de trombina incluyen, por ejemplo, DFLAEGGGVR (SEQ ID NO: 49), TTKIKPR (SEQ ID NO: 50), o LVPRG (SEQ ID NO: 55), y una secuencia que comprende, consiste esencialmente en o consiste en ALRPR (por ejemplo, ALRPRWGGA (SEQ ID NO: 51)).
En una modalidad específica, el sitio de escisión es TLDPRSFLLRNPNDKYEPFWEDEEK (SEQ ID NO : 56) .
Polinucleótidos , vectores, células hospedadoras y métodos para su fabricación
También se proporciona en la invención un polinucleótido que codifica un fragmento de VWF descrito en la presente, una proteína quimérica que comprende el fragmento de VWF y un resto heterólogo, una proteína quimérica que comprende una proteína de FVIII y un resto adjunto, o una proteína quimérica que comprende un fragmento de VWF y una proteína de
FVIII. Cuando un fragmento de VWF está enlazado a un resto heterólogo o una proteína de FVIII en una proteína quimérica como una cadena de polipéptidos simple, la invención se refiere a un polinucleótido que codifica el fragmento de VWF enlazado al resto heterólogo o la proteína de FVIII. Cuando la proteína quimérica comprende una primera y una segunda cadena de polipéptidos, la primera cadena de polipéptidos comprende un fragmento de VWF y un primer resto heterólogo (por ejemplo, una primera región Fe) y la segunda cadena de polipéptidos comprende un segundo resto heterólogo (por ejemplo, una segunda región Fe) , donde la primera cadena de polipéptidos y la segunda cadena de polipéptidos están asociadas entre sí, un polinucleótido puede comprender la primera secuencia de nucleótidos y la segunda secuencia de nucleótidos. En una modalidad, la primera secuencia de nucleótidos y la segunda secuencia de nucleótidos están en el mismo polinucleótido. En otra modalidad, la primera secuencia de nucleótidos y la segunda secuencia de nucleótidos están en dos polinucleótidos diferentes (por ejemplo, diferentes vectores) . En determinadas modalidades, la presente invención se refiere a un conjunto de polinucleótidos que comprende una primera cadena de nucleótidos y una segunda cadena de nucleótidos, donde la primera cadena de nucleótidos codifica el fragmento de VWF de la proteína quimérica y la segunda cadena de nucleótidos codifica la proteína de FVIII.
En otras modalidades, el conjunto de los polinucleótidos comprende además una cadena de nucleótidos adicional (por ejemplo, una segunda cadena nucleótidos cuando el polipéptido quimérico está codificado por una cadena de polinucleótidos simple o una tercera cadena de nucleótidos cuando la proteína quimérica está codificada por dos cadenas de polinucleótidos) que codifica una proteína convertasa. La proteína convertasa se puede seleccionar del grupo que consiste en proproteína convertasa subtilisina/kexina tipo 5 (PCSK5 o PC5) , proproteína convertasa subtilisina/kexina tipo 7 (PCSK7 o PC5) , una levadura Kex 2, proproteína convertasa subtilisina/kexina tipo 3 (PACE o PCSK3) , y dos o más combinaciones de estos. En algunas modalidades, la proteína convertasa es PACE, PC5, o PC7. En una modalidad específica, la proteína convertasa es PC5 o PC7. Véase solicitud internacional n. ° PCT/US2011/043568 , que se incorpora a la presente mediante esta referencia. En otra modalidad, la proteína convertasa es PACE/Furina.
En determinadas modalidades, la invención incluye un conjunto de los polinucleótidos que comprenden una primera secuencia de nucleótidos que codifica un fragmento de VWF que comprende un dominio D' y un dominio D3 de VWF, una segunda secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de FVIII, y una tercera secuencia de nucleótidos que codifica un dominio DI y un dominio D2 de VWF. En esta modalidad, el
dominio DI y el dominio D2 se expresan por separado (no enlazados al dominio D'D3 del fragmento de VWF) para la formación del enlace disulfuro y el plegamiento adecuados de los dominios D'D3. La expresión del dominio D1D2 puede estar en cis o trans .
Tal como se usa en la presente, un vector de expresión se refiere a cualquier construcción de ácido nucleico que contiene los elementos necesarios para la transcripción y traducción de una secuencia codificante insertada, o en el caso de un vector viral de ARN, los elementos necesarios para replicación y traducción cuando se introducen en una célula hospedadora apropiada. Los vectores de expresión pueden incluir plásmidos, fagémidos, virus y derivados de estos.
Los vectores de expresión de la invención incluirán polinucleótidos que codifican el fragmento de VWF o la proteína quimérica que comprende el fragmento de VWF.
En una modalidad, una secuencia codificante para el fragmento de VWF, el segundo resto heterólogo (por ejemplo, una segunda región Fe) o la proteína de FVIII está enlazado operativamente a una secuencia de control de expresión. Tal como se usa en la presente, dos secuencias de ácido nucleico están enlazadas operativamente cuando están enlazadas covalentemente de modo tal que permiten que cada secuencia de ácido nucleico componente retenga su funcionalidad. Se dice que una secuencia codificante y una secuencia de control de
expresión génica están enlazadas operativamente cuando están enlazadas covalentemente de modo tal que se coloque la expresión o transcripción y/o traducción de la secuencia codificante bajo la influencia o control de la secuencia de control de expresión génica. Se dice que dos secuencias de ADN están enlazadas operativamente si la inducción de un promotor en la secuencia de expresión génica 51 da como resultado la transcripción de la secuencia codificante y si la naturaleza del enlace entre las dos secuencias de ADN no (1) da como resultado la introducción de una mutación del marco de lectura, (2) interfiere con la capacidad de la región del promotor de dirigir la transcripción de la secuencia codificante, o (3) interfiere con la capacidad de la transcripción de ARN correspondiente de ser traducido en una proteína. Por lo tanto, una secuencia de expresión génica estaría enlazada operativamente a una secuencia de ácido nucleico codificante si la secuencia de expresión génica fuera capaz de efectuar la transcripción de esa secuencia de ácido nucleico codificante de modo que la transcripción resultante se traduzca en la proteína o el polipéptido deseado .
Una secuencia de control de expresión génica tal como se usa en la presente es cualquier secuencia de nucleótido reguladora, tal como una secuencia promotora o combinación de promotor-potenciador, que facilita la transcripción y
traducción eficientes del ácido nucleico codificante al que está enlazado operativamente. La secuencia de control de expresión génica puede ser, por ejemplo, un promotor mamífero o viral, tal como un promotor constitutivo o inducible. Los promotores mamíferos constitutivos incluyen de modo no taxativo, los promotores para los siguientes genes: hipoxantina fosforribosiltransferasa (HPRT) , adenosina deaminasa, piruvato cinasa, promotor beta-actina, y otros promotores constitutivos. Ejemplos de promotores virales que funcionan de forma constitutiva en células eucariotas incluyen, por ejemplo, promotores de citomegalovirus (CMV) , virus de simio (por ejemplo, SV40) , virus del papiloma, adenovirus, virus de inmunodeficiencia humano (HIV) , virus de sarcoma Rous, citomegalovirus, las repeticiones terminales largas (LTR) del virus de leucemia Moloney, y otros retroviruses , y el promotor de timidina cinasa del virus del herpes simple. Los expertos en la técnica conocen otros promotores constitutivos. Los promotores útiles como secuencias de expresión génica de la invención también incluyen promotores inducibles. Los promotores inducibles se expresan en presencia de un agente de inducción. Por ejemplo, el promotor de metalotioneína se induce para promover la transcripción y traducción en presencia de determinados iones metálicos. Los expertos en la técnica conocen otros promotores inducibles.
En general, la secuencia de control de expresión génica incluirá, según sea necesario, secuencias que no trascriben 5' y que no traducen 5' implicadas en el inicio de la transcripción y traducción, respectivamente, tales como una caja TATA, una secuencia de protección, una secuencia CAAT, y similares. Especialmente, las secuencias que no trascriben 5' incluirán una región promotora que incluye una secuencia promotora para el control transcripcional del ácido nucleico codificante unido operativamente. Las secuencias de expresión génica incluyen opcionalmente secuencias potenciadoras o secuencias activadoras corriente arriba según se desee.
Los vectores virales incluyen de modo no taxativo, secuencias de ácido nucleico de los siguientes virus: retrovirus, tales como virus de leucemia murina Moloney, virus de sarcoma murino Harvey, virus del tumor mamario murino, y virus de sarcoma Rous ; adenovirus, virus adeno-asociado; virus de tipo SV40; poliomavirus ; virus Epstein-Barr; virus del papiloma; virus del herpes; virus de vaccinia; virus de la polio; y virus de ARN tal como retrovirus. Se pueden emplear fácilmente otros vectores conocidos en la técnica. Determinados vectores virales se basan en virus eucariotas no citopáticos donde los genes no esenciales fueron remplazados con genes de interés. Los virus no citopáticos incluyen retrovirus, cuyo ciclo de vida incluye transcripción inversa de ARN viral genómico en ADN
con corriente abajo integración proviral en ADN celular hospedador. Los retrovirus fueron aprobados para pruebas de terapia génica en humanos. Los más útiles son aquellos retrovirus que carecen de replicación (es decir, capaces de dirigir la síntesis de las proteínas deseadas, pero incapaces de fabricar una partícula infecciosa) . Los vectores de expresión retroviral alternados genéticamente tienen utilidad general para la transducción de alta eficacia de genes in vivo. Los protocolos estándar para la producción de retrovirus que carecen replicación (que incluyen los pasos de incorporación de material genético exógeno en un plásmido, transfección de una línea celular de envoltura con plásmido, producción de retrovirus recombinante por la línea celular de envoltura, recolección de partículas virales de medio de cultivo celular, e infección de las células diana con partículas virales) se proporcionan en Kriegler, M. , Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, .H. Freeman Co., New York (1990) and Murry, E. J. , Methods in Molecular Biology, Vol. 7, Humana Press, Inc., Cliffton, N.J. (1991).
En una modalidad, el virus es un virus adeno-asociado, un virus de ADN de cadena doble. El virus adeno-asociado se puede diseñar para carecer de replicación y es capaz de infectar una amplia variedad de tipos y especies celulares. También tiene ventajas tales como estabilidad de solvente de lípido y calor; altas frecuencias de transducción en células
de diferentes linajes que incluyen células hemopoyéticas ; y falta de inhibición de superinfección permitiendo así múltiples series de transducciones . Según se informa, el virus adeno-asociado se puede integrar ADN celular humano de forma específica en el sitio minimizando así la posibilidad de mutagénesis insercional y variabilidad de expresión génica insertada característica de infección retroviral. Además, se ha realizado un seguimiento de infecciones con virus adeno-asociado de tipo salvaje en el cultivo tisular por más de 100 pasajes en la ausencia de presión selectiva implicando que la integración genómica del virus adeno-asociado es un evento relativamente estable. El virus adeno-asociado también puede funcionar de forma extracromosómica .
Otros vectores incluyen vectores plásmidos . Los vectores plásmidos se han descrito ampliamente en la técnica y son conocidos por los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook et ál . , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. En los últimos años, se ha descubierto que los vectores plásmidos son particularmente ventajosos para la administración de genes a células in vivo debido a su incapacidad de replicarse en e integrarse en un genoma hospedador. Sin embargo, estos plásmidos que tienen un promotor compatible con la célula hospedadora, pueden expresar un péptido a partir de un gen codificado
operativamente dentro del plásmido. Algunos plásmidos usados normalmente disponibles de proveedores comerciales incluyen pBR322, pUC18, pUC19, varios plásmidos pcDNA, pRC/CMV, varios plásmidos pCMV, pSV40, y pBlueScript . Ejemplos adicionales de plásmidos específicos incluyen pcDNA3.1, número de catálogo V79020; pcDNA3. l/hygro, número de catálogo V87020; pcDNA4/myc-His , número de catálogo V86320; y pBudCE4.1, número de catálogo V53220, todos de Invitrogen (Carlsbad, CA. ) . Los expertos en la técnica conocen otros plásmidos. Además, los plásmidos pueden diseñarse a medida usando técnicas de biología molecular estándar para remover y/o agregar fragmentos específicos de ADN.
En un sistema de expresión de insectos que se puede usar para producir las proteínas de la invención, se usa el virus de polihdrosis nuclear Autographa californica (AcNPV) como vector para expresar los genes extraños. Este virus crece en células de Spodoptera frugiperda . Una secuencia codificante se puede clonar en regiones no esenciales (por ejemplo, el gen poliedro) del virus y se puede colocar bajo el control de un promotor de ACNPV (por ejemplo, el promotor poliedro) . La inserción exitosa de una secuencia codificante dará como resultado la inactivación del gen poliedro y la producción de virus recombinantes no ocluidos (es decir, virus que carece de recubrimiento proteináceo codificado por el gen poliedro) . Estos virus recombinantes luego se usan para infectar células
de Spodoptera frugiperda donde se expresa el gen insertado, (véase, por ejemplo, Smith et ál . (1983) J Virol 46:584; patente estadounidense n.° 4,215,051). Otros ejemplos de este sistema de expresión se pueden encontrar en Ausubel et ál . , eds . (1989) Current Protocols in Molecular Biology, Vol . 2, Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience .
Otro sistema que se puede usar para expresar las proteínas de la invención es el sistema de expresión génica de glutamina sintetasa, también se refiere como "sistema de expresión de GS" (Lonza Biologics PLC, Berkshire UK) . Este sistema de expresión se describe en detalle en las patentes estadounidenses n.° 5,981,216.
En las células hospedadoras de mamífero, se pueden utilizar una cantidad de sistemas de expresión basados en virus . En casos en que se usa un adenovirus como un vector de expresión, una secuencia codificante puede estar ligada a un complejo de control de transcripción/traducción de adenovirus, por ejemplo, la secuencia líder tripartita y promotor tardío. Este gen quimérico luego se puede insertar en el genoma de adenovirus por recombinación in vitro o in vivo. La inserción en una región no esencial del genoma viral (por ejemplo, región El o E3) dará como resultado un virus recombinante que es viable y capaz de expresar péptidos en hospedadores infectados. Véase, por ejemplo, Logan & Shenk (1984) Proc Nati Acad Sci USA 81:3655). De manera
alternativa, se puede usar el promotor vaccinia 7.5 K. Véase, por ejemplo, Mackett et ál. (1982) Proc Nati Acad Sci USA 79:7415; Mackett et ál . (1984) J Virol 49:857; Panicali et ál. (1982) Proc Nati Acad Sci USA 79:4927.
Para aumentar la eficacia de la producción, los polinucleótidos se pueden diseñar para codificar múltiples unidades de la proteína de la invención separadas por sitios de escisión enzimática. El polipéptido resultante puede se puede escindir (por ejemplo, por tratamiento con la enzima apropiada) para recuperar las unidades de polipéptidos . Esto puede aumentar el rendimiento de los polipéptidos dirigidos por un promotor simple. Cuando se usa en sistemas de expresión viral apropiados, la traducción de cada polipéptido codificado por el mRNA se dirige internamente en la transcripción, por ejemplo, por un sitio de entrada de ribosoma interno, I ES . Por lo tanto, la construcción policistrónica dirige la transcripción de un mRNA policistrónico simple grande que a su vez dirige la traducción de múltiples polipéptidos individuales. Este enfoque elimina la producción y procesamiento enzimático de poliproteínas y puede aumentar significativamente el rendimiento de polipéptidos dirigidos por un promotor simple.
Los vectores usados en la transformación contendrán normalmente un marcador seleccionable usado para identificar transformadores. En sistemas bacterianos, esto puede incluir
un gen de resistencia antibiótica tal como ampicilina o kanamicina. Los marcadores seleccionables para su uso en células de mamífero cultivadas incluyen genes que confieren resistencia a fármacos, tales como neomicina, higromicina y metotrexato. El marcador seleccionable puede ser un marcador seleccionable que se puede ampliar. Un marcador seleccionable que se puede ampliar es el gen reductasa dihidrofolato (DHFR) . Simonsen C C et ál . (1983) Proc Nati Acad Sci USA 80:2495-9. Los marcadores seleccionables se revisan en Thilly (1986) Mammalian Cell Technology, Butterworth Publishers, Stoneham, Mass., y la elección de marcadores seleccionables se encuentra dentro de la experiencia en la técnica.
Los marcadores seleccionables se pueden introducir en la célula en un plásmido separado al mismo tiempo que el gen de interés o se pueden introducir en el mismo plásmido. Si es en el mismo plásmido, el marcador seleccionable y el gen de interés pueden estar bajo el control de diferentes promotores o el mismo promotor, la última disposición produce un mensaje dicistrónico . Las construcciones de este tipo son conocidas en la técnica (por ejemplo, patente estadounidense n.° 4, 713, 339) .
Los vectores de expresión pueden codificar etiquetas que permitan la fácil purificación de la proteína producida recombinantemente . Ejemplos incluyen de modo no taxativo, vector pUR278 (Ruther et ál . (1983) EMBO J 2:1791), donde las
secuencias codificantes para la proteína a ser expresada pueden estar ligadas en el vector en el mismo marco con la región codificante lac z de modo que se produzca una proteína de fusión etiquetadas; los vectores pGEX se pueden usar para expresar proteínas de la invención con una etiqueta de glutationa S- ransíerasa (GST) . Estas proteínas son normalmente solubles y pueden purificarse fácilmente a partir de células por adsorción a cuentas de glutationa-agarosa seguida de la elución en presencia de glutationa libre. Los vectores incluyen sitios de escisión (trombina o proteasa de Factor Xa o PRESCISSION PROTEASETM (Pharmacia, Peapack, N.J.)) para la fácil remoción de la etiqueta luego de la purificación.
El vector o los vectores de expresión luego se transfectan o cotransfectan en una célula diana adecuada que expresará los polipéptidos . Las técnicas de transfección conocidas en la técnica incluyen de modo no taxativo, precipitación de fosfato de calcio (Wigler et ál . (1978) Cell 14:725), electroporación (Neumann et ál . (1982) EMBO J 1:841), y reactivos basados en liposoma. Una variedad de sistemas de vectores de expresión de hospedador se puede utilizar para expresar las proteínas descritas en la presente que incluyen células procariotas y eucariotas . Estos incluyen, de modo no taxativo, microorganismos tales como bacterias (por ejemplo, E. coli) transformadas con vectores
de expresión de ADN plásmido o ADN de bacteriófago recombinante que contienen una secuencia codificante apropiada; levadura u hongos filamentosos transformados con vectores de expresión de levadura recombinante u hongos que contienen una secuencia codificante apropiada; sistemas de células de insectos infectados con vectores de expresión de virus recombinante (por ejemplo, baculovirus) que contienen una secuencia codificante apropiada; sistemas de células vegetales infectados con vectores de expresión de virus recombinante (por ejemplo, virus del mosaico de coliflor o virus del mosaico de tabaco) o transformados con vectores de expresión de plásmido recombinante (por ejemplo, plásmido Ti) que contienen una secuencia codificante apropiada; o sistemas de células animales, que incluye células de mamífero (por ejemplo, células HEK 293, CHO, Cos, HeLa, HKB11, y BHK) .
En una modalidad, la célula hospedadora es una célula eucariota. Tal como se usa en la presente, la célula eucariota se refiere a cualquier célula animal o vegetal que tiene un núcleo definitivo. Las células eucariotas de animales incluyen células de vertebrados, por ejemplo, mamíferos, y células de invertebrados, por ejemplo, insectos. Las células eucariotas de plantas pueden incluir específicamente, de modo no taxativo, células de levadura. Una célula eucariota es distinta de una célula procariota por ejemplo, bacteria.
En determinadas modalidades, la célula eucariota es una célula de mamífero. Una célula de mamífero es cualquier célula derivada de un mamífero. Las células de mamífero incluyen específicamente, de modo no taxativo, líneas celulares de mamífero. En una modalidad, la célula de mamífero es una célula humana. En otra modalidad, la célula de mamífero es una célula HEK 293, que es una línea de células de riñon embrionarias humanas. Las células HEK 293 están disponibles como CRL-1533 de American Type Culture Collection, Manassas, VA, y como células 293-H, n.° de catálogo 11631-017 o células 293-F, n.° de catálogo 11625-019 de Invitrogen (Carlsbad, Calif.). En algunas modalidades, la célula de mamífero es una célula PER.C6°, que es una línea celular humana derivada de retina. Las células PER.C6° está disponibles en Crucell (Leiden, Los Países Bajos) . En otras modalidades, la célula de mamífero es una célula de ovario de hámster chino (CHO) . Las células CHO están disponibles en American Type Culture Collection, Manassas, VA. (por ejemplo, CH0-K1; CCL-61) . En aun otras modalidades, la célula de mamífero es una célula de riñon de hámster bebé (BHK) . Las células BHK están disponibles en American Type Culture Collection, Manassas, VA. (por ejemplo, CRL-1632) . En algunas modalidades, la célula de mamífero es una célula HKB11, que es una línea celular híbrida de una célula HEK293 y una línea de células B humanas. Mei et ál . , Mol. Biotechnol. 34(2): 165-78 (2006).
En una modalidad, un plásmido que codifica el fragmento de VWF o la proteína quimérica de la invención incluye adicionalmente un marcador seleccionable , por ejemplo, resistencia a zeocina, y se transfecta en células HEK 293 para la producción del fragmento de VWF o la proteína quimérica .
En otra modalidad, un primer plásmido que comprende una secuencia codificante de fusión al Factor VIII-Fc y un primer marcador seleccionable, por ejemplo, un gen de resistencia a zeocina, y un segundo plásmido que comprende una secuencia codificante de fragmento de VWF-Fc y un segundo marcador seleccionable, por ejemplo, un gen de resistencia a neomicina, se cotransfectan en células HEK 293, para la producción del híbrido de Factor VIII-Fe y VWF-Fc. El primer y el segundo plásmido se pueden introducir en cantidades iguales (es decir, relación 1:1) o se pueden introducir en cantidades desiguales.
En algunas modalidades, un primer plásmido que incluye una secuencia codificante de fusión Factor VIII -Fe y un primer marcador seleccionable, por ejemplo, un gen de resistencia a zeocina, y un segundo plásmido que incluye una secuencia codificante de fragmento de VWF-Fc y un segundo marcador seleccionable, por ejemplo, un gen de resistencia a neomicina, y un tercer plásmido que incluye una secuencia codificante de proteína convertasa (por ejemplo, PC5 o Furina) y un tercer marcador seleccionable, por ejemplo, un
gen de resistencia a higromicina, se cotransfectan en células HEK 293, para la producción del híbrido de Factor VIII-fragmento de VWF . El primer y el segundo plásmido se pueden introducir en cantidades iguales (es decir, relación molar 1:1) o se pueden introducir en cantidades desiguales. En determinadas modalidad, un primer plásmido que incluye una secuencia codificante de fusión al Factor VIII -Fe, una secuencia codificante de fragmento de V F-Fc y un primer marcador seleccionable, por ejemplo, un gen de resistencia a zeocina, y un segundo plásmido que incluye una secuencia codificante de proteína convertasa (por ejemplo, PC5 o Furina) y un segundo marcador seleccionable, por ejemplo, un gen de resistencia a higromicina, se cotransfectan en células HEK 293, para la producción del híbrido de Factor VIII-VWF. En una modalidad, la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia FVIII-Fc y la secuencia fragmento de VWF-Fc se pueden conectar para codificar un polipéptido simple. En otra modalidad, la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia FVIII-Fc y la secuencia fragmento de VWF-Fc se pueden codificar como dos cadenas de polipéptidos . Los promotores para la secuencia codificante de fusión Factor VIII -Fe y la secuencia codificante de fragmento de VWF-Fc pueden ser diferentes o pueden ser iguales.
En algunas modalidades, un plásmido que comprende Furina se contransfecta con el plásmido que contiene la secuencia
codificante de Factor VIII-Fc y/o la secuencia codificante de fragmento de VWF-Fc. En algunas modalidades, la proteína Furina está en el mismo plásmido que comprende la secuencia codificante de fusión de Factor VIII -Fe. En algunas modalidades, la proteína Furina está en el mismo plásmido que comprende la secuencia codificante de fragmento de VWF-Fc. En algunas modalidades, la proteína Furina está en un plásmido separado .
En aun otras modalidad, las células transíectadas se transfectan de forma estable. Estas células se pueden seleccionar y mantener como una línea celular estable usando técnicas convencionales conocidas para los expertos en la técnica .
Las células hospedadoras que contienen construcciones de ADN de la proteína se cultivan en un medio de crecimiento apropiado. Tal como se usa en la presente, el término "medio de crecimiento apropiado" se refiere a un medio que contiene nutrientes necesarios para el crecimiento de las células. Los nutrientes necesarios para el crecimiento de células pueden incluir una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, aminoácidos esenciales, vitaminas, minerales y factores de crecimiento. Opcionalmente , el medio puede contener uno o más factores de selección. Opcionalmente el medio puede contener suero bovino o suero fetal bovino (FCS) . En una modalidad, el medio no contiene sustancialmente IgG. El medio de
crecimiento generalmente seleccionará células que contienen la construcción de ADN mediante, por ejemplo, selección o falta de fármaco en un nutriente esencial que se complementa con el marcador seleccionable en la construcción de ADN o se contransfecta con la construcción de ADN. Las células de mamífero cultivadas se cultivan generalmente en un medio sin suero o que contiene suero disponible comercialmente (por ejemplo, MEM, DMEM, DMEM/F12) . En una modalidad, el medio es CD293 (Invitrogen, Carlsbad, CA. ) . En otra modalidad, el medio es CD17 (Invitrogen, Carlsbad, CA.) . La selección de un medio apropiado para la línea celular particular usada se encuentra dentro de la experiencia en la técnica.
Para coexpresar el fragmento de V F y un segundo resto heterólogo o una proteína de FVIII, las células hospedadoras se cultivan en condiciones que permiten la expresión del fragmento de VWF y un segundo resto heterólogo o una proteína de FVIII. Tal como se usa en la presente, el cultivo se refiere a mantener células vivas in vitro durante al menos un tiempo definido. Mantener puede pero no necesariamente incluye un aumento en la población de células vivas. Por ejemplo, las células mantenidas en cultivo pueden estar estáticas en la población pero todavía viables y capaces de producir un producto deseado, por ejemplo, una proteína recombinante o proteína de fusión recombinante . Las condiciones adecuadas para cultivar células eucariotas son
conocidas en la técnica e incluyen la selección apropiada de medio de cultivo, complementos del medio, temperatura, pH, saturación de oxígeno, y similares. Con fines comerciales, el cultivo puede incluir el uso de cualquier tipo de sistemas de escala que incluyen matraces de agitación, botellas de rodillo, biorreactores de fibra hueca, biorreactores de tanque de agitación, biorreactores de ventilación, biorreactores ave y otros .
Las condiciones de cultivo de células también se seleccionan para permitir la asociación del fragmento de V F con el segundo resto heterólogo o una proteína de FVIII. Las condiciones que permiten la expresión del fragmento de VWF y/o la proteína de FVIII, pueden incluir la presencia de una fuente de vitamina . Por ejemplo, en una modalidad, las células HEK 293 transfectadas establemente se cultivan en un medio CD293 (Invitrogen, Carlsbad, CA) o medio OptiCHO (Invitrogen, Carlsbad, CA) complementado con 4 mM de glutamina .
En un aspecto, la presente invención se dirige a un método para expresar, hacer o producir el fragmento de VWF de la invención que comprende a) transfectar una célula hospedadora con un polinucleótido que codifica el fragmento de VWF y b) cultivar la célula hospedadora en un medio de cultivo en una condición adecuada para expresar el fragmento de VWF donde el fragmento de VWF se expresa. En una
modalidad, la invención se refiere a un método para producir una proteína de VWF madura o un fragmento de esta que comprende a) transfectar una célula hospedadora con un primer polinucleótido que codifica la proteína de VWF o un fragmento de esta, que está fusionada a un propéptido de VWF, y un segundo polinucleótido que codifica una proteína convertasa, por ejemplo, PC5, PC7 , o Furina y b) cultivar la célula hospedadora en un medio de cultivo en una condición adecuada para expresar la proteína de VWF madura o fragmento de esta. El polinucleótido que codifica la proteína de VWF o un fragmento de esta también se puede fusionar a un prepéptido de VWF. La secuencia de prepéptidos se puede escindir durante la inserción en el retículo endoplasmático antes de la secreción .
En otro aspecto, la invención se dirige a un método para expresar, hacer o producir una proteína quimérica que comprende el fragmento de VWF enlazado o asociado a un resto heterólogo o una proteína de FVIII que comprende a) transfectar una o más células hospedadoras con un polinucleótido o un conjunto de polinucleótidos que codifica la proteína quimérica y b) cultivar la célula hospedadora en un medio de cultivo en condiciones adecuadas para expresar la proteína quimérica. En una modalidad, la invención se refiere a un método para expresar, hacer o producir una proteína quimérica que comprende a) transfectar una célula hospedadora
con un primer polinucleótido que codifica un fragmento de VWF enlazado a un resto heterólogo y un segundo polinucleótido que codifica una proteína de FVIII enlazada a un resto heterólogo y b) cultivar la célula hospedadora en un medio de cultivo en condiciones adecuadas para expresar la proteína quimérica. El primer polinucleótido y el segundo polinucleótido pueden estar en un vector o dos vectores. En otra modalidad, la invención se refiere a un método para expresar, hacer o producir una proteína quimérica que comprende a) transfectar una célula hospedadora con un primer polinucleótido que codifica un fragmento de VWF enlazado a un resto heterólogo, un segundo polinucleótido que codifica una proteína de FVIII enlazada a un resto heterólogo y un tercer polinucleótido que codifica una proteína convertasa y b) cultivar la célula hospedadora en un medio de cultivo en condiciones adecuadas para expresar la proteína quimérica. En otras modalidades, la invención se refiere a un método para expresar, hacer o producir una proteína quimérica que comprende a) transfectar una célula hospedadora con un primer polinucleótido que codifica un fragmento de VWF que comprende un dominio D1 y un dominio D3 enlazado a un resto heterólogo, un segundo polinucleótido que codifica una proteína de FVIII enlazada a un resto heterólogo y un tercer polinucleótido que codifica un dominio DI y un dominio D2 de VWF, y b) cultivar la célula hospedadora en un medio de cultivo en condiciones
adecuadas para expresar la proteína quimérica. En una modalidad, el primer polinucleótido, el segundo polinucleótido y el tercer polinucleótido pueden estar en un vector o vectores separados. En otra modalidad, el primer polinucleótido y el segundo polinucleótido pueden estar en un vector, y el tercer polinucleótido pueden estar en otro vector. En otras modalidades, el primer polinucleótido y el tercer polinucleótido pueden estar en un vector, y el segundo polinucleótido puede ser otro vector. En algunas modalidades, el segundo polinucleótido y el tercer polinucleótido pueden estar en un vector, y el primer polinucleótido puede estar en otro vector.
En modalidades adicionales, el producto de proteína que contiene el fragmento de VWF o la proteína quimérica que comprende el fragmento de VWF se secreta en el medio. El medio se separa de las células, se concentra, filtra y luego se pasa a través de dos o tres columnas de afinidad, por ejemplo, una columna de proteína A y una o dos columnas de intercambio de aniones.
En determinados aspectos, la presente invención se refiere al fragmento de VWF o el polipéptido quimérico producido por los métodos descritos en la presente.
La producción in vitro le permite al aumento proporcionar grandes cantidades de los polipéptidos alterados deseados de la invención. Las técnicas para el cultivo de células de mamífero en condiciones de cultivo tisular son
conocidas en la técnica e incluyen cultivo de suspensión homogénea, por ejemplo, en un reactor de ventilación o en un reactor de agitación continua o cultivo celular inmovilizado o atrapado, por ejemplo, en fibras huecas, microcápsulas en microperlas de agarosa o cartuchos de cerámica. Si fuera necesario y/o deseable, las soluciones de polipéptidos se pueden purificar por métodos de cromatografía habitual, por ejemplo, filtración en gel, cromatografía de intercambio de iones, cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC) , cromatografía sobre DEAE-celulosa o cromatografía por afinidad.
Composición farmacéutica
Las composiciones que contienen el fragmento de VWF o la proteína quimérica de la presente invención pueden contener un portador farmacéuticamente aceptable adecuado. Por ejemplo, pueden contener excipientes y/o auxiliares que facilitan el procesamiento de los compuestos activos en preparaciones diseñadas para la administración al sitio de acción .
La composición farmacéutica se puede formular para la administración parenteral (es decir, intravenosa, subcutánea, o intramuscular) por inyección en bolo. Las formulaciones para inyección se presentan en forma de dosificación unitaria, por ejemplo, en ampollas o en recipientes de múltiples dosis, con un conservante agregado. Las composiciones pueden adoptar formas de suspensiones,
soluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos y contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilizantes y/o dispersantes. De manera alternativa, el ingrediente activo puede estar en forma de polvo para la constitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua sin pirógeno.
Las formulaciones adecuadas para la administración parenteral también incluyen soluciones acuosas de los compuestos activos en forma soluble en agua, por ejemplo, sales solubles en agua. Además, se pueden administrar suspensiones de los compuestos activos como suspensiones de inyección oleosas apropiadas. Los solventes o vehículos lipofílicos adecuados incluyen aceites grasos, por ejemplo, aceite de sésamo o esteres de ácido graso sintético, por ejemplo, oleato de etilo o triglicéridos . Las suspensiones de inyección acuosas pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión, que incluyen, por ejemplo, carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol y dextrano. Opcionalmente , la suspensión también puede contener estabilizantes. También se pueden usar liposomas para encapsular las moléculas de la invención para la administración a las células o espacios intersticiales. Los ejemplos de portadores farmacéuticamente aceptables son solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos , agentes isotónicos y retardantes de absorción, agua, solución salina, solución
salina tamponada con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol fisiológicamente aceptables, y similares. En algunas modalidades, la composición comprende agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol o cloruro de sodio. En otras modalidades, las composiciones comprenden sustancias farmacéuticamente aceptables tales como agentes de humectación o menores cantidades de sustancias auxiliares tales como agentes de humectación o emulsionantes, conservantes o amortiguadores, que potencian la vida útil o la eficacia de los ingredientes activos.
Las composiciones de la invención pueden estar en diversas formas, que incluyen, por ejemplo, soluciones líquidas (por ejemplo, inyectables e infusibles) , dispersiones, suspensiones, formas de dosificación sólidas y semisólidas. La forma preferida depende del modo de administración y aplicación terapéutica.
La composición puede formularse como una solución, microemulsión, dispersión, liposoma u otra estructura ordenada adecuada para una concentración alta de fármaco. Las soluciones inyectables estériles se pueden preparar mediante la incorporación del ingrediente activo en la cantidad necesaria en un solvente adecuado con un ingrediente o una combinación de estos enumerados anteriormente, según sea necesario, seguido de esterilización filtrada. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el ingrediente
activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y otros ingredientes necesarios de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son el secado al vacío y liofilización que proporcionan un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional de una solución previamente filtrada estérilmente. Puede mantenerse la fluidez adecuada de una solución, por ejemplo, por el uso de un recubrimiento tal como lecitina, por el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de la dispersión y por el uso de tensioactivos . Se puede provocar la absorción prolongada de composiciones inyectables al incluir en la composición un agente que retrasa la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina.
El ingrediente activo puede formularse con una formulación o dispositivo de liberación controlada. Ejemplos de tales formulaciones y dispositivos incluyen implantes, parches transdérmicos y sistemas de administración microencapsulada . Se pueden usar polímeros biodegradables, biocompatibles , por ejemplo, acetato de etilenvinilo, polianhídridos , ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Los métodos para la preparación de tales formulaciones y dispositivos son conocidos en la técnica. Véase por ejemplo, Sustained and
Controlled Reléase Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed. , Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1978.
Pueden crearse formulaciones inyectables de depósito formando matrices microencapsuladas del fármaco en polímeros biodegradables tales como polilactida-poliglicólido . Según la relación de fármaco a polímero, y la naturaleza del polímero empleado, puede controlarse la velocidad de liberación de fármaco. Otros ejemplos de polímeros biodegradables son poliortoésteres y polianhídridos . Las formulaciones inyectables de depósito pueden también prepararse reteniendo el fármaco en liposomas o microemulsiones .
Se pueden incorporar compuestos activos complementarios a las composiciones. En una modalidad, el fragmento de V F o la proteína quimérica de la invención se formula con otro factor de coagulación, o una variante, fragmento, análogo o derivado de este. Por ejemplo, el factor de coagulación incluye, de modo no taxativo, factor V, factor VII, factor VIII, factor IX, factor X, factor XI, factor XII, factor XIII, protrombina, fibrinógeno, factor de von Willebrand o factor tisular soluble recombinante (rsTF) o formas activadas de cualquiera de los que anteceden. El factor de coagulación de agente hemostático puede también incluir fármacos anti-fibrinolíticos, por ejemplo, ácido epsilon-amino-caproico, ácido tranexámico.
Los regímenes de dosificación pueden ajustarse para proporcionar la respuesta deseada óptima. Por ejemplo, puede
administrarse un solo bolo, pueden administrarse varias dosis divididas a lo largo del tiempo, o la dosis puede reducirse o aumentarse proporcionalmente según lo indiquen las exigencias de la situación terapéutica. Es ventajoso formular composiciones parenterales en forma de dosificación unitaria para facilitar la administración y uniformidad de la dosificación. Véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub . Co . , Easton, Pa . 1980).
Además del compuesto activo, la forma de dosificación líquida puede contener ingredientes inertes tales como agua, alcohol de etilo, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol de bencilo, benzoato de bencilo, propilengilcol, 1,3-butilenglicol , dimetilformamida, aceites, glicerol, alcohol de tetrahidrofurfurilo, polietilenglicoles y esteres de ácido graso de sorbitán.
Ejemplos no taxativos de portadores farmacéuticos adecuados se describen también en Remington's Pharmaceutical Sciences by E. W. Martin. Algunos ejemplos de excipientes incluyen almidón, glucosa, lactosa, sucrosa, gelatina, malta, arroz, harina, tiza, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche descremada deshidratada, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol y similares. La composición puede también contener reactivos amortiguadores de pH y agentes humectantes o emulsionantes.
Para la administración oral, la composición farmacéutica
puede adoptar la forma de comprimidos o cápsulas preparadas por medios convencionales. La composición puede prepararse también como un líquido, por ejemplo un jarabe o una suspensión. El líquido puede incluir agentes de suspensión (por ejemplo, jarabe de sorbitol, derivados de celulosa o grasas comestibles hidrogenadas) , agentes emulsionantes (lecitina o acacia) , vehículos no acuosos (por ejemplo, aceite de almendra, esteres oleosos, alcohol de etilo, o aceites vegetales fraccionados) , y conservantes (por ejemplo, metil o propil-p-hidroxibenzoatos o ácido sórbico) . Las preparaciones pueden también incluir agentes saborizantes , colorantes y endulzantes. De manera alternativa, la composición puede presentarse como un producto seco para componer con agua u otro vehículo adecuado.
Para la administración bucal, la composición puede adoptar la forma de comprimidos o pastillas de acuerdo con los protocolos convencionales.
Para la administración por inhalación, los compuestos para usar de acuerdo con la presente invención se administran de manera conveniente en forma de un aerosol nebulizado con o sin excipientes o en forma de un spray en aerosol de un paquete presurizado o nebulizador, con opcionalmente un propulsor, por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluorometano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol
presurizado, la unidad de dosificación puede determinarse proporcionando una válvula para administrar una cantidad medida. Las cápsulas y cartuchos de, por ejemplo, gelatina para usar en un inhalador o insuflador pueden formularse de forma que contengan una mezcla de polvo del compuesto y una base de polvo adecuada tal como lactosa o almidón.
La composición farmacéutica puede también formularse para administración rectal como supositorio o enema de retención, por ejemplo, que contiene bases de supositorio convencionales tales como manteca de cacao u otros glicéridos .
Terapia génica
Un fragmento de V F o proteína quimérica de este de la invención puede producirse in vivo en un mamífero, por ejemplo, un paciente humano, usando un enfoque de terapia génica para el tratamiento de una enfermedad o trastorno de sangrado seleccionado del grupo que consiste en un trastorno de coagulación de sangrado, hemartrosis, sangrado muscular, sangrado oral, hemorragia, hemorragia en los músculos, hemorragia oral, traumatismo, trauma capitis, sangrado gastrointestinal, hemorragia intracraneal, hemorragia intraabdominal , hemorragia intratorácica, fractura ósea, sangrado del sistema nervioso central, sangrado en el espacio retrofaríngeo, sangrado en el espacio retroperitoneal , y sangrado en la vaina del iliopsoas sería terapéuticamente
beneficioso. En una modalidad, la enfermedad o trastorno de sangrado es hemofilia. En otra modalidad, la enfermedad o trastorno de sangrado es hemofilia A. Esto implica la administración de un fragmento de VWF adecuado o ácido nucleico que codifica una proteína quimérica enlazado operativamente a secuencias de control de expresión adecuadas. En determinada modalidad, estas secuencias se incorporan a un vector viral. Los vectores virales adecuados para tal terapia génica incluyen vectores adenovirales , vectores lentivirales , vectores baculovirales , vectores virales de Epstein Barr, vectores papovavirales , vectores virales de vaccinia, vectores virales de herpes simple y vectores de virus adeno asociados (AAV) . El vector viral puede ser un vector viral sin capacidad de replicación. En otras modalidades, un vector adenoviral tiene una supresión en su gen El o gen E3. Cuando se usa un vector adenoviral, el mamífero no puede exponerse a un ácido nucleico que codifica un gen marcador seleccionable . En otras modalidades, las secuencias se incorporan a un vector no viral conocido por los expertos en la técnica.
Métodos para usar un fragmento de VWF o proteína quimérica
Un aspecto de la presente invención se refiere a evitar o inhibir la interacción de FVIII con VWF endógeno bloqueando o protegiendo el sitio de unión a VWF en FVIII de VWF
endógeno. En una modalidad, la invención se refiere a un método para construir una proteína de FVIII que tiene semivida más larga que la FVIII de tipo salvaje o un híbrido monómero-díme o FVIII, el método comprende asociar covalentemente un resto adjunto con la proteína de FVIII, haciendo así una proteína quimérica que comprende la proteína de FVIII y el resto adjunto, donde el resto adjunto protege o evita la interacción de la proteína de FVIII con VWF endógeno. La proteína quimérica útil en el método incluye cualquiera de una o más proteínas quiméricas descritas en la presente .
Otro aspecto de la invención incluye un método para administrar a un sujeto que lo necesita una proteína de FVIII que tiene semivida más larga que la FVIII de tipo salvaje o un híbrido monómero-dímero FVIII, que consiste en dos cadenas de polipéptidos , una primera cadena consiste en una secuencia de aminoácidos que codifica FVIII y una región Fe y una segunda cadena que consiste en una región Fe, donde el método comprende administrar el fragmento de VWF descrito en la presente o la proteína quimérica descrita en la presente al sujeto. La secuencia de aminoácidos de FVIII en el híbrido monómero-dímero puede ser SQ FVIII o FVIII de tipo salvaje.
En una modalidad, la invención se refiere a un método para usar un resto adjunto, por ejemplo, un fragmento de VWF descrito en la presente o una proteína quimérica que
comprende el fragmento de VWF, para evitar o inhibir la interacción de VWF endógeno con una proteína de FVIII. En otra modalidad, una proteína de FVIII que es capaz de interactuar con el fragmento de VWF es FVIII endógeno. En otras modalidades, una proteína de FVIII que es capaz de interactuar con el fragmento de VWF es una composición de FVIII administrada por separado a un sujeto antes o después o simultáneamente con el fragmento de VWF o la proteína quimérica que comprende el fragmento de VWF. En otras modalidades, una proteína de FVIII que es capaz de unirse al fragmento de VWF es una composición de FVIII administrada a un sujeto junto con el fragmento de VWF o la proteína quimérica. En aun otras modalidades, una proteína de FVIII que es capaz de unirse al fragmento de VWF es FVIII presente con el fragmento de VWF o asociada con el fragmento de VWF en la proteína quimérica. El fragmento de VWF o la proteína quimérica que comprende el fragmento de VWF se une a, o está asociado con, la proteína de FVIII y por ende extiende la semivida de la proteína de FVIII unida al fragmento de VWF o la proteína quimérica. La proteína de FVIII unida al fragmento de VWF o la proteína quimérica se protege de la vía de depuración de VWF y por ende tiene menos depuración en comparación con la proteína de FVIII no unida al fragmento de VWF o la proteína quimérica. Por lo tanto la proteína de FVIII protegida tiene una semivida más larga que una proteína
de FVIII no unida o asociada con el fragmento de VWF o la proteína quimérica. En determinadas modalidades, la proteína de FVIII asociada con o protegida por un fragmento de VWF o una proteína quimérica de la invención no se depura con un receptor de depuración de VWF. En otras modalidades, la proteína de FVIII asociada con o protegida por un fragmento de VWF o una proteína quimérica se depura del sistema más lento que la proteína de FVIII que no está asociada con o protegida por el fragmento de VWF.
En un aspecto, el fragmento de VWF de esta invención o la proteína quimérica que comprende a este tiene menos depuración de la circulación ya que el fragmento de VWF o la proteína quimérica no contiene un sitio de unión al receptor de depuración de VWF. El fragmento de VWF evita o inhibe la depuración de FVIII unido o asociado al fragmento de VWF del sistema a través de la vía de depuración de VWF. Los fragmentos de VWF útiles para la presente invención pueden también proporcionar al menos una o más propiedades de protección de FVIII tipo VWF que se proporcionan por VWF endógeno. En determinadas modalidades, los fragmentos de VWF pueden también enmascarar uno o más sitios de unión de receptores de depuración de FVIII, evitando así la depuración de FVIII por su propia vía de depuración.
En otro aspecto, el fragmento de VWF o proteína quimérica de la invención puede usarse para tratar o evitar
una enfermedad o trastorno asociado con una enfermedad von Willebrand tipo 2N (VWD) . La VWD tipo 2N es un defecto de VWF cualitativo que resulta de la unión de VWF defectuosa a FVIII y que posteriormente resulta en bajos niveles de FVIII circulante. Por lo tanto, el fragmento de VWF o proteína quimérica de la invención al unirse o estar unido a la proteína de FVIII no solo estabiliza la proteína de FVIII, sino también evita la depuración de la proteína de FVIII de la circulación.
En algunas modalidades, la prevención o inhibición de una unión de la proteína de FVIII a VWF endógeno por el fragmento de VWF o proteína quimérica puede ser in vitro o in vivo .
También se proporciona un método para aumentar la semivida de una proteína de FVIII que comprende administrar el fragmento de VWF o la proteína quimérica que comprende el fragmento de VWF y una proteína de FVIII a un sujeto que lo necesita. La semivida de FVIII no activada unida o asociada a VWF de longitud completa es de alrededor de 12 a 14 horas en plasma. En VWD tipo 3, cuando no hay casi VWF en circulación, la semivida de FVIII tiene solo alrededor de seis horas, provocando síntomas de hemofilia A leve a moderada en tales pacientes debido a las concentraciones reducidas de FVIII. La semivida de la proteína de FVIII enlazada o asociada al fragmento de VWF de la presente invención puede aumentar al
menos alrededor de 1.5 veces, 1.6 veces, 1.7 veces, 1.8 veces, 1.9 veces, 2.0 veces, 2.1 veces, 2.2 veces, 2.3 veces, 2.4 veces, 2.6 veces, 2.7 veces, 2.8 veces, 2.9 veces, 3.0 veces, 3.1 veces, 3.2 veces, 3.3 veces, 3.4 veces, 3.5 veces, 3.6 veces, 3.7 veces, 3.8 veces, 3.9 veces, o 4.0 veces más que la semivida del FVIII no activada unida o asociada al VWF de longitud completa. En una modalidad, la semivida de la proteína de FVIII enlazada o asociada al fragmento de VWF en la proteína quimérica aumenta al menos alrededor de 2 veces, 2.5 veces, 3.0 veces, 3.5 veces, 4.0 veces, 4.5 veces, 5.0 veces, 5.5 veces, 6.0 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, o 10 veces más que la semivida de la FVIII no activada unida o asociada al VWF de longitud completa. En otra modalidad, la semivida de la proteína de FVIII enlazada o asociada al fragmento de VWF en la proteína quimérica aumenta alrededor de 2 a alrededor de 5 veces, alrededor de 3 a alrededor de 10 veces, alrededor de 5 a alrededor de 15 veces, alrededor de 10 a alrededor de 20 veces, alrededor de 15 a alrededor de 25 veces, alrededor de 20 a alrededor de 30 veces, alrededor de 25 a alrededor de 35 veces, alrededor de 30 a alrededor de 40 veces, alrededor de 35 a alrededor de 45 veces más que la semivida de la FVIII no activada unida o asociada al VWF de longitud completa. En una modalidad específica, la semivida de la proteína de FVIII enlazada o asociada al fragmento de VWF en la proteína quimérica aumenta al menos alrededor de
30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 o 40 veces más que la semivida de la FVIII de tipo salvaje en un ratón con doble inactivación de VWF y FVIII. En algunas modalidades, la semivida de la proteína quimérica que comprende el fragmento de VWF fusionado a un primer resto heterólogo, por ejemplo, una primera región Fe, y una proteína de FVIII enlazada a un segundo resto heterólogo, por ejemplo, una segunda región Fe es más larga que la semivida de una proteína quimérica que comprende una proteína de FVIII y dos regiones Fe, donde la proteína de FVIII está enlazada a una de las dos regiones Fe (es decir, híbrido monómero-dímero de FVIII) . En otras modalidades, la semivida de la proteína quimérica que comprende el fragmento de VWF fusionado a un primer resto heterólogo, por ejemplo, una primera región Fe, y una proteína de FVIII enlazada a un segundo resto heterólogo, por ejemplo, una segunda región Fe es al menos alrededor de 1.5 veces, 2 veces, 2.5 veces, 3.5 veces, 3.6 veces, 3.7 veces, 3.8 veces, 3.9 veces, 4.0 veces, 4.5 veces, o 5.0 veces la semivida de una proteína quimérica que comprende una proteína de FVIII y dos regiones Fe, donde la proteína de FVIII está enlazada a una de las dos regiones Fe (es decir, híbrido monómero-dímero de FVIII) .
En algunas modalidades, como resultado de la invención, la semivida de la proteína de FVIII se extiende en comparación con una proteína de FVIII sin el fragmento de VWF
o FVIII de tipo salvaje. La semivida de la proteína de FVIII es al menos alrededor de 1.5 veces, al menos alrededor de 2 veces, al menos alrededor de 2.5 veces, al menos alrededor de 3 veces, al menos alrededor de 4 veces, al menos alrededor de 5 veces, al menos alrededor de 6 veces, al menos alrededor de 7 veces, al menos alrededor de 8 veces, al menos alrededor de
9 veces, al menos alrededor de 10 veces, al menos alrededor de 11 veces o al menos alrededor de 12 veces más larga que la semivida de una proteína de FVIII sin el fragmento de VWF. En una modalidad, la semivida de FVIII es de alrededor de 1.5 veces a alrededor de 20 veces, alrededor de 1.5 veces a alrededor de 15 veces o alrededor de 1.5 veces a alrededor de
10 veces más larga que la semivida del FVIII de tipo salvaje. En otra modalidad, la semivida del FVIII se extiende alrededor de 2 veces a alrededor de 10 veces, alrededor de 2 a alrededor de 9 veces, alrededor de 2 a alrededor de 8 veces, alrededor de 2 a alrededor de 7 veces, alrededor de 2 a alrededor de 6 veces, alrededor de 2 a alrededor de 5 veces, alrededor de 2 a alrededor de 4 veces, alrededor de 2 veces a alrededor de 3 veces, alrededor de 2.5 a alrededor de 10 veces, alrededor de 2.5 a alrededor de 9 veces, alrededor de 2.5 a alrededor de 8 veces, alrededor de 2.5 a alrededor de 7 veces, alrededor de 2.5 a alrededor de 6 veces, alrededor de 2.5 a alrededor de 5 veces, alrededor de 2.5 a alrededor de 4 veces, alrededor de 2.5 a alrededor de 3
veces, alrededor de 3 veces a alrededor de 10 veces, alrededor de 3 veces a alrededor de 9 veces, alrededor de 3 veces a alrededor de 8 veces, alrededor de 3 veces a alrededor de 7 veces, alrededor de 3 veces a alrededor de 6 veces, alrededor de 3 veces a alrededor de 5 veces, alrededor de 3 veces a alrededor de 4 veces, alrededor de 4 veces a alrededor de 6 veces, alrededor de 5 veces a alrededor de 7 veces o alrededor de 6 veces a alrededor de 8 veces en comparación con FVIII de tipo salvaje o una proteína de FVIII sin el fragmento de VWF. En otras modalidades, la semivida de FVIII es al menos alrededor de 17 horas, al menos alrededor de 18 horas, al menos alrededor de 19 horas, al menos alrededor de 20 horas, al menos alrededor de 21 horas, al menos alrededor de 22 horas, al menos alrededor de 23 horas, al menos alrededor de 24 horas, al menos alrededor de 25 horas, al menos alrededor de 26 horas, al menos alrededor de 27 horas, al menos alrededor de 28 horas, al menos alrededor de 29 horas, al menos alrededor de 30 horas, al menos alrededor de 31 horas, al menos alrededor de 32 horas, al menos alrededor de 33 horas, al menos alrededor de 34 horas, al menos alrededor de 35 horas, al menos alrededor de 36 horas, al menos alrededor de 48 horas, al menos alrededor de 60 horas, al menos alrededor de 72 horas, al menos alrededor de 84 horas, al menos alrededor de 96 horas o al menos alrededor de 108 horas. En aun otras modalidades, la semivida
de FVIII es de alrededor de 15 horas a alrededor de dos semanas, alrededor de 16 horas a alrededor de una semana, alrededor de 17 horas a alrededor de una semana, alrededor de 18 horas a alrededor de una semana, alrededor de 19 horas a alrededor de una semana, alrededor de 20 horas a alrededor de una semana, alrededor de 21 horas a alrededor de una semana, alrededor de 22 horas a alrededor de una semana, alrededor de
23 horas a alrededor de una semana, alrededor de 24 horas a alrededor de una semana, alrededor de 36 horas a alrededor de una semana, alrededor de 48 horas a alrededor de una semana, alrededor de 60 horas a alrededor de una semana, alrededor de
24 horas a alrededor de seis días, alrededor de 24 horas a alrededor de cinco días, alrededor de 24 horas a alrededor de cuatro días, alrededor de 24 horas a alrededor de tres días o alrededor de 24 horas a alrededor de dos días.
En algunas modalidades, la semivida promedio de la proteína de FVIII por sujeto es de alrededor de 15 horas, alrededor de 16 horas, alrededor de 17 horas, alrededor de 18 horas, alrededor de 19 horas, alrededor de 20 horas, alrededor de 21 horas, alrededor de 22 horas, alrededor de 23 horas, alrededor de 24 horas (1 día), alrededor de 25 horas, alrededor de 26 horas, alrededor de 27 horas, alrededor de 28 horas, alrededor de 29 horas, alrededor de 30 horas, alrededor de 31 horas, alrededor de 32 horas, alrededor de 33 horas, alrededor de 34 horas, alrededor de 35 horas,
alrededor de 36 horas, alrededor de 40 horas, alrededor de 44 horas, alrededor de 48 horas (2 días) , alrededor de 54 horas, alrededor de 60 horas, alrededor de 72 horas (3 días) , alrededor de 84 horas, alrededor de 96 horas (4 días), alrededor de 108 horas, alrededor de 120 horas (5 días), alrededor de seis días, alrededor de siete días (una semana), alrededor de ocho días, alrededor de nueve días, alrededor de 10 días, alrededor de 11 días, alrededor de 12 días, alrededor de 13 días o alrededor de 14 días.
En una modalidad específica, una semivida de la proteína quimérica de la invención es alrededor de dos veces más larga que la semivida de FVIII de tipo salvaje o BDD FVIII. En otra modalidad, una semivida de la proteína quimérica es alrededor de tres veces más larga que la semivida de FVIII de tipo salvaje o BDD FVIII.
Asimismo, la invención proporciona un método para tratar o evitar una enfermedad o trastorno de sangrado que comprende administrar una cantidad eficaz del fragmento de VWF o la proteína quimérica (por ejemplo, una proteína quimérica que comprende el fragmento de VWF enlazado a un primer resto heterólogo, por ejemplo, una primera región Fe, y una proteína de FVIII enlazada a un segundo resto heterólogo, por ejemplo, una segunda región Fe, donde el fragmento de VWF está unido o asociado a la proteína de FVIII) . En una modalidad, la enfermedad o trastorno de sangrado se
selecciona del grupo que consiste en un trastorno de coagulación de sangrado, hemartrosis, sangrado muscular, sangrado oral, hemorragia, hemorragia en los músculos, hemorragia oral, traumatismo, trauma capitis, sangrado gastrointestinal, hemorragia intracraneal, hemorragia intraabdominal , hemorragia intratorácica, fractura ósea, sangrado del sistema nervioso central, sangrado en el espacio retrofaríngeo, sangrado en el espacio retroperitoneal , y sangrado en la vaina del iliopsoas. En una modalidad específica, la enfermedad o trastorno de sangrado es hemofilia A.
El fragmento de VWF y la proteína quimérica que comprende un resto adjunto, por ejemplo, el fragmento de VWF descrito en la presente y una proteína de FVIII preparada por la invención tiene varios usos como lo reconocerá un experto en la técnica, que incluyen, de modo no taxativo, métodos para tratar un sujeto que tiene un trastorno hemostático y métodos para tratar un sujeto que necesita un agente hemostático general. En una modalidad, la invención se refiere a un método para tratar un sujeto que tiene un trastorno hemostático que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz del fragmento de VWF o la proteína quimérica .
La parte de proteína de FVIII en la proteína quimérica trata o evita un trastorno hemostático sirviendo como
cofactor al Factor IX en una superficie de fosfolípidos cargada negativamente, formando así un complejo Xasa. La unión de factores de coagulación activados a una superficie de fosfolípidos localiza este proceso en sitios de daño vascular. En una superficie de fosfolípidos, el Factor Villa aumenta la velocidad máxima de la activación del Factor X por el Factor IXa, en aproximadamente 200,000 veces, provocando la segunda gran liberación abrupta de generación de trombina.
La proteína quimérica que comprende un resto adjunto, por ejemplo, un fragmento de VWF, y una proteína de FVIII puede usarse para tratar cualquier trastorno hemostático. Los trastornos hemostáticos que pueden tratarse por la administración de la proteína quimérica de la invención incluyen, de modo no taxativo, hemofilia A, así como también deficiencias o anormalidades estructurales con relación al Factor VIII. En una modalidad, el trastorno hemostático es hemofilia A.
La proteína quimérica que comprende un resto adjunto, por ejemplo, un fragmento de VWF, y una proteína de FVIII puede usarse profilácticamente para tratar un sujeto con un trastorno hemostático. La proteína quimérica de la invención puede usarse para tratar un episodio de sangrado agudo en un sujeto con un trastorno hemostático. En otra modalidad, el trastorno hemostático puede ser el resultado de un factor de coagulación defectuoso, por ejemplo, el factor de von
Willebrand. En una modalidad, el trastorno hemostático es un trastorno heredado. En otra modalidad, el trastorno hemostático es un trastorno adquirido. El trastorno adquirido puede resultar de una enfermedad o afección secundaria subyacente. La afección no relacionada puede ser, por ejemplo, de modo no taxativo, cáncer, una enfermedad autoinmunitaria o embarazo. El trastorno adquirido puede resultar de la vejez o de medicación para tratar un trastorno secundario subyacente (por ejemplo quimioterapia para el cáncer) .
La invención también se refiere a métodos para tratar un sujeto que no tiene un trastorno hemostático congénito, pero que tiene una enfermedad o afección secundaria que resulta en la adquisición de un trastorno hemostático, por ejemplo, debido al desarrollo de un anticuerpo anti-FVIII o cirugía. La invención se refiere por ende a un método para tratar un sujeto que necesita un agente hemostático general que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de la proteína quimérica que comprende el fragmento de VWF y una proteína de FVIII preparada por los presentes métodos.
La presente invención también se refiere a métodos para reducir la inmunogenicidad de FVIII o inducir menos inmunogenicidad contra FVIII que comprenden administrar una cantidad eficaz del fragmento de VWF, las proteínas quiméricas descritas en la presente, o los polinucleótidos que las codifican.
En una modalidad, el sujeto que necesita un agente hemostático general se está sometiendo o está por someterse a cirugía. La proteína quimérica que comprende el fragmento de VWF y una proteína de FVIII puede administrarse antes, durante o después de la cirugía como régimen profiláctico. La proteína quimérica que comprende el fragmento de VWF y una proteína de FVIII puede administrarse antes, durante o después de la cirugía para controlar un episodio de sangrado agudo.
La proteína quimérica que comprende el fragmento de VWF y una proteína de FVIII puede usarse para tratar un sujeto que tiene un episodio de sangrado agudo que no tiene un trastorno hemostático. El episodio de sangrado agudo puede resultar de un traumatismo grave, por ejemplo, cirugía, un accidente automovilístico, herida, laceración por arma de fuego o cualquier otro evento traumático que provoque un sangrado incontrolable. Ejemplos no taxativos de episodios de sangrado incluyen un trastorno de coagulación de sangrado, hemartrosis, sangrado muscular, sangrado oral, hemorragia, hemorragia en los músculos, hemorragia oral, traumatismo, trauma capitis, sangrado gastrointestinal, hemorragia intracraneal, hemorragia intraabdominal , hemorragia intratorácica, fractura ósea, sangrado del sistema nervioso central, sangrado en el espacio retrofaríngeo, sangrado en el espacio retroperitoneal , sangrado en la vaina del iliopsoas y cualquier combinación de estos.
En aplicaciones profilácticas, una o más composiciones que contienen la proteína quimérica o el fragmento de VWF de la invención o un cóctel de estos se administran a un paciente que todavía no está en el estado de enfermedad para potenciar la resistencia del paciente o reducir los síntomas asociados a una enfermedad o trastorno. Se define que tal cantidad es una "dosis profiláctica eficaz". En aplicaciones terapéuticas, a menudo es necesaria una dosificación relativamente alta (por ejemplo, de alrededor de 1 a 400 mg/kg de polipéptido por dosis, con dosificaciones de 5 a 25 mg más comúnmente usadas para radioinmunoconjugados y dosis más altas para polipéptidos modificados con fármaco citotoxina) a intervalos relativamente cortos, hasta que la evolución de la enfermedad se reduce o termina, y hasta que el paciente muestra una mejora parcial o completa de los síntomas de la enfermedad. Luego de esto, al paciente puede administrársele un régimen profiláctico.
En algunas modalidades, una proteína quimérica, un fragmento de VWF o una composición de la invención se usa para tratamiento a demanda, que incluye el tratamiento para un episodio de sangrado, hemartrosis, sangrado muscular, sangrado oral, hemorragia, hemorragia en los músculos, hemorragia oral, traumatismo, trauma capitis (traumatismo de cabeza), sangrado gastrointestinal, hemorragia intracraneal, hemorragia intraabdominal , hemorragia intratorácica , fractura
ósea, sangrado del sistema nervioso central, sangrado en el espacio retrofaríngeo, sangrado en el espacio retroperitoneal , o sangrado en la vaina del iliopsoas. El sujeto puede necesitar profilaxis quirúrgica, gestión perioperativa o tratamiento para cirugía. Tales cirugías incluyen, por ejemplo, cirugía menor, cirugía mayor, extracción de piezas dentales, amigdalectomía, herniotomía inguinal, sinovectomía, remplazo total de rodilla, craneotomía, osteosíntesis, cirugía para traumatismos, cirugía intracraneal, cirugía intraabdominal , cirugía intratorácica o cirugía de remplazo de la articulación.
En una modalidad, la proteína quimérica que comprende el fragmento de VWF y una proteína de FVIII se administra por vía intravenosa, subcutánea, intramuscular o a través de cualquier superficie mucosa, por ejemplo, por vía oral, sublingual, bucal, nasal, rectal, vaginal o pulmonar. La proteína quimérica que comprende el fragmento de VWF y una proteína de FVIII puede implantarse en o enlazarse a un soporte sólido de biopolímero que permite la liberación lenta de la proteína quimérica al sitio de sangrado o implantarse en un venda/vendaj e . La dosis de la proteína quimérica que comprende el fragmento de VWF y una proteína de FVIII variará según el sujeto y la vía de administración particular usada. Las dosificaciones pueden variar de 0.1 a 100,000 pg/kg de peso corporal. En una modalidad, el intervalo de dosificación
es 0.1-1.000 yg/kg. En otra modalidad, el intervalo de dosificación es 0.1-500 ug/kg. La proteína puede administrarse de forma continua o a intervalos regulares específicos. Los ensayos in vitro pueden emplearse para determinar intervalos y/o esquemas de dosis óptimos de administración. Los ensayos in vitro que miden la actividad del factor de coagulación son conocidos en la técnica, por ejemplo, ensayo de coagulación STA-CLOT VIIa-rTF o ensayo de coagulación ROTEM. De manera adicional, las dosis eficaces pueden extrapolarse de curvas de respuesta a la dosis obtenidas de modelos animales, por ejemplo, un perro hemofílico (Mount et ál . 2002, Blood 99(8):2670).
Habiendo descrito la presente invención en detalle, esta se entenderá más claramente mediante referencia a los siguientes ejemplos, que se incluyen en esta a efectos ilustrativos únicamente y no pretenden limitar la invención. Todas las patentes y publicaciones mencionadas en la presente se incorporan expresamente mediante referencia.
Ej emplos
A lo largo de los ejemplos, se utilizan los siguientes materiales y métodos, salvo que se indique de otro modo.
Materiales y métodos
En general, la práctica de la presente invención emplea, salvo que se indique de otro modo, técnicas convencionales de química, biofísica, biología molecular, tecnología de ADN
recombinan e , inmunología (especialmente, por ejemplo, tecnología de anticuerpos) y técnicas estándar en electroforesis . Véase, por ejemplo, Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) ; Antibody Engineering Protocols (Methods in Molecular Biology) , 510, Paul, S., Humana Pr (1996); Antibody Engineering: A Practical Approach (Practical Approach Series, 169), McCafferty, Ed., Irl Pr (1996); Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow et ál . , CS.H.L. Press, Pub. (1999); and Current Protocols in Molecular Biology, eds . Ausubel et ál., John Wiley & Sons (1992) .
Ejemplo 1: Clonación de diferentes dominios de VWF (Figuras 1A-1F)
(a) Clonación de pSYN-VWF- 001 , 002, 003 y 004 pSYN-VWF-001 hasta 004 contienen secuencias de nucleótidos que codifican fragmentos de VWF, que son los aminoácidos 1-276 (001) , aminoácidos 1-477 (002) , aminoácidos 1-511 (003) y aminoácidos 1-716 (004) de secuencia de proteínas VWF-D'D3A. La numeración de aminoácidos representa la secuencia de VWF madura sin propéptidos y corresponde a los aminoácidos 764-1039 (001) , aminoácidos 764-1240 (002) , aminoácidos 764-1274 (003) y aminoácidos 764-1479 (004) de la SEQ ID NO: 2, respectivamente. Las cuatro construcciones tienen el péptido de señal de FVIII en el N-terminal, lo que permite la secreción adecuada de la proteína sintetizada y
seguido por una etiqueta 6xHis en el C-terminal, que se usa para la purificación de proteínas. Las construcciones anteriores se sintetizaron usando las siguientes combinaciones de cebadores :
pSYN V F- 001:
ESC48- Fwd - V F-D 1 D3 con señal de VIII y sitio BsiWl
TCGOGACXJTAGSGCCGCCACCATC^
CTmOGGATTCTGCrCT (SEQ ID NO: 57)
ESC50- Rev- VWF- D'D3 parcial (aminoácido 1-276) con sitio 6 His y Notl
TCAGCACACTG (SEQ ID NO: 58)
pSYN VWF- 002:
ESC48- Fwd - VWF - D ' D3 con señal de VIII y sitio BsiWl
TCm-lAO rACGGCCGC^
lT OCGATTCTGCmAGC (SEQ ID NO: 59)
ESC51- Rev- VWF D'D3 (aminoácido 1-477) con sitio 6His y Not 1
CAGGTGAGGTTGACAAC (SEQ ID NO : 60)
pSYN VWF- 003 :
ESC48- Fwd - VWF-D' D3 con señal de VIII y sitio BsiWl TCGCGACGTACGGCCGCCACCATGCAAATAGAGCTCTCCACCTGCTTCTTTCTGTG
C
LTlTlGOMTCroCTra^ (SEQ ID NO: 61)
ESC52- Rev-VWF-D'D3 Al parcial (aminoácido 1-511) con sitio 6His
y Notl
TGCAACGGCGGTTC (SEQ ID NO : 62)
pSYN VWF- 004:
ESC48- Fwd - VWF-D'D3 con señal de VIII y sitio BsiWl
C ITIGOGATTCIX TrAGCC^ (SEQ ID NO:63)
ESC53-Rev- VWF-D1D3A1 (aminoácido 1-716) con sitio 6His y Notl G-¾CCTOG-¾GCGGCO^
ATGTGGGG (SEQ ID NO : 64)
Se supone que las proteínas de las construcciones VWF-001, 002, 003 y 004 existen como monómero.
Se llevó a cabo una reacción de PCR de 50 µ? con combinaciones de cebadores ESC 48/ESC50, ESC 48/ESC 51, ESC 48/ESC52, ESC48/ESC53 y plásmido de VWF de longitud completa como la plantilla, usando el ciclo de amplificación de PCR de 2 pasos: 94 °C 2 minutos; 21 ciclos de (96 °C 30 segundos, 68 °C 2 minutos) . Las bandas de tamaño correcto (~960bp para VWF 001; 1460 para VWF 002, 1520bp para VWF 003; y 2150bp para VWF 004) se purificaron con gel con un kit de Extracción de Gel (Qiagen, Valencia, Calif.) y se clonaron en los sitios de restricción BsiWI y Notl de pcDNA 4 para generar pSYN-VWF 001,002,003 y 004, respectivamente.
(b) Clonación de pSYN-VWF-006
pSYN-VWF-006 contiene dominio D1D2D'D3-CK (nudo de cisteína) de VWF. Para clonar esta construcción, se externalizó una síntesis de fragmento de ADN que contenía una parte de dominio D3 y dominio CK (número de id. de secuencia Genscript 122026, que se muestran a continuación) . Un fragmento de construcción Genscript se subclonó en pSYN-V F 008 digerido con BamHl/EcoRV, es decir, el vector que codifica VWF de longitud completa.
Número de secuencia Genscript 122026 (SEQ ID NO: 65) GGATCCTAGTGGGGAATAAGGGATGCAGCCACCCCTCAGTGAAATGCAAGAAACGG GTCACCATCCTGGTGGAGGGAGGAGAGATTGAGCTGTTTGACGGGGAGGTGAATGTGAAGA GGCCCATGAAGGATGAGACTCACTTTGAGGTGGTGGAGTCTGGCCGGTACATCATTCTGCT GCTGGGCAAAGCCCTCTCCGTGGTCTGGGACCGCCACCTGAGCATCTCCGTGGTCCTGAAG CAGACATACCAGGAGAAAGTGTGTGGCCTGTGTGGGAATTTTGATGGCATCCAGAACAATG ACCTCACCAGCAGCAACCTCCAAGTGGAGGAAGACCCTGTGGACTTTGGGAACTCCTGGAA AGTGAGCTCGCAGTGTGCTGACACCAGAAAAGTGCCTCTGGACTCATCCCCTGCCACCTGC CATAACAACATCATGAAGCAGACGATGGTGGATTCCTCCTGTAGAATCCTTACCAGTGACG TCTTCCAGGACTGCAACAAGCTGGTGGACCCCGAGCCATATCTGGATGTCTGCATTTACGA CACCTGCTCCTGTGAGTCCATTGGGGACTGCGCCTGCTTCTGCGACACCATTGCTGCCTAT GCCCACGTGTGTGCCCAGCATGGCAAGGTGGTGACCTGGAGGACGGCCACATTGTGCCCCC AGAGCTGCGAGGAGAGGAATCTCCGGGAGAACGGGTATGAGTGTGAGTGGCGCTATAACAG CTGTGCACCTGCCTGTCAAGTCACGTGTCAGCACCCTGAGCCACTGGCCTGCCCTGTGCAG TGTGTGGAGGGCTGCCATGCCCACTGCCCTCCAGGGAAAATCCTGGATGAGCTTTTGCAGA CCTGCGTTGACCCTGAAGACTGTCCAGTGTGTGAGGTGGCTGGCCGGCGTTTTGCCTCAGG AAAGAAAGTCACCTTGAATCCCAGTGACCCTGAGCACTGCCAGATTTGCCACTGTGATGTT
GTCAACCTCACCTGTGAAGCCTGCCAGGAGCCGGGAGGCCTGGTGGTGCCTCCCACAGATG CCCCGGTGAGCCCCACCACTCTGTATGTGGATGAGACGCTCCAGGATGGCTGTGATACTCA CTTCTGCAAGGTCAATGAGAGAGGAGAGTACTTCTGGGAGAAGAGGGTCACAGGCTGCCCA CCCTTTGATGAACACAAGTGTCTTGCTGAGGGAGGTAAAATTATGAAAATTCCAGGCACCT GCTGTGACACATGTGAGGAGCCTGAGTGCAACGACATCACTGCCAGGCTGCAGTATGTCAA GGTGGGAAGCTGTAAGTCTGAAGTAGAGGTGGATATC
(c) Clonación de pSY -VWF- 009 , 010, 011, 012 y 013 La construcción pSYN VWF 008 contiene la secuencia de VWF de longitud completa en pcDNA 3.1 (aminoácidos 1-2813 de la SEQ ID NO: 2) . Incluye el propéptido de aminoácido 763 (es decir, los dominios D1D2) seguido por la secuencia de aminoácidos 2050 restante de VWF maduro. pSYN-VWF-009, 010, 011 y 012 contienen las mismas secuencias de codificación que VWF 001, 002, 003 y 004, respectivamente, pero además tienen los dominios D1D2 (propéptido de VWF) en el N-terminal en vez del péptido de señal de FVIII. pSYN-VWF- 008 tiene un sitio BamHl en el sitio Arg907 y Notl en el extremo de la región codificante (luego del codón de terminación) . pSYN- VWF- 008, 001, 002, 003 y 004 se digirieron con enzimas de restricción BamHl y Notl. Los insertos de pSYN-VWF-001 (423 bp) , pSYN-VWF-002 (1026 bp) , pSYN-VWF- 003 (1128 bp) y pSYN-VWF-004 (1743 bp) se ligaron a pSYN-VWF- 008 digerido con bamHl/Notl (8242bp) para obtener pSYN-VWF-009 (D1D2D'D3: aminoácido 1-1039 de la SEQ ID NO: 2); pSYN-VWF -010 (D1D2D'D3: aminoácido 1-1240 de la SEQ ID NO: 2); pSYN-VWF-011 (D1D2DO3:
aminoácido 1-1274 de la SEQ ID NO: 2) ; pSYN-VWF-012 (D1D2D'D3: aminoácido 1-1479). Todas las 4 construcciones tienen etiqueta 6xHis en el C-terminal. En las células transfectadas, pSYN-VWF- 009 , 010, 011, y 012 se sintetizan con el propéptido, pero debido al procesamiento intracelular, los productos secretados no contienen ningún propéptido (D1D2) . La proteína expresada de la construcción VWF-009 existe como monómero y se supone que las proteínas expresadas de las construcciones VWF-010, 011 y 012 existen como dímeros, tal como se muestra en la figura 6 y la figura 7 usando VWF-009 y VWF-010 como ejemplos, respectivamente.
pSYN-VWF-010 se usó para generar pSYN-VWF- 013 , que tiene dos mutaciones puntuales en C336A y C379A correspondientes a la SEQ ID NO: 73 (la numeración de los aminoácidos representa la secuencia de VWF madura sin dominio D1D2 -secuencia de VWF 2) . Se predice que estas mutaciones evitan la dimerización del dominio D'D3 de VWF.
(d) Clonación de pSYN-VWF-025 y 029
pSYN-VWF-025 contiene secuencias D1D2D'D3 de tipo salvaje de VWF de longitud completa en el vector pLIVE mientras que pSYN-VWF-029 contiene dominios D1D2D'D3 con mutaciones C336A/C379A en el vector pLIVE. Para la clonación de pSYN-VWF-025 y 029, se usó la siguiente combinación de cebadores:
ESC 89-fwd con sitio Nhel= CTCACTATAGGGAGACC^ (SEQ ID NO: 66)
ESC 91-rev con Sall=
CTGCMaXXX3GBGK^ (SEQ ID NO: 67)
Una reacción de PCR de 50 µ? se llevó a cabo con combinaciones de cebadores ESC 89/ESC91 y ya sea plásmido pSYN-VWF-010 (para pSYN-V F- 025 ) o pSYN-VWF-013 (para pSYN-VWF-029) como la plantilla usando el ciclo de amplificación por PCR de 3 pasos: 94 °C -2 minutos; 21 ciclos de (96 °C -30 segundos, 55 °C-30 segundos, 68 °C-4 minutos) . La banda de tamaño esperado (~3800bp) fue purificada con gel con un kit de Extracción de Gel (Qiagen, Valencia, Calif.) y se clonó en los sitios de restricción Nhel y Salí del vector pLIVE- irus (Invitrogen, Carlsbad, Calif.) para generar pSYN-VWF-025 y 029.
(e) Clonación de pSYN-VWF-031
pSYN-VWF-031 es una construcción de D1D2D'D3 (C336A/C379A) -Fe que tiene un enlazador escindible por trombina de 48 aminoácidos de largo (8x GGGGS (SEQ ID NO: 110)+ sitio de trombina) entre las secuencias VWF D1D2D 1 D3 (C336A/C379A) y Fe. Para realizar esta construcción, la región V F-Fc se amplificó de la construcción pSYN-FVIII-064 (refiérase a la construcción FVIII-VWF más adelante) . pSYN-FVIII-VWF se digirió con Xbal y Nhel. La región de inserto resultante de 4165bp, que contenía el fragmento de VWF y la región Fe, se usó como plantilla para amplificar la región WF y Fe por combinaciones de cebadores LW 22/LW23.
LW 22-FWD-VWF-D 1 D3 con secuencia de señal de FVIII y
sitio BsiWl
GCX^mK!OTAGGAGCAAATAGAGCTCT
GATICTGC TTAGCCT^^ (SEQ ID NO: 68)
LW 23-Rev- Fe con codón de terminación y sitio Notl
TCATCAAGTATOTATCA^ (SEQ ID NO:
69)
Secuencia de nucleótidos de VWF 031 (SEQ ID NO: 108)
1 A GATTCCTG CCAGATITCC GGG0GTG D3 TFG TCTGG OCCCATITT 51 GCCAGGGACC CI TGTGCAG AAGGAACTCG CGGCAGGTCA TCCACGGCCC 101 GATGCAGCCT TTTCGGAAGT GACITGGTCA ACACC ITGiA TCO-1AGCATG
151 TACAGCTI G OGGGATACTG CAGTTACCTC CGGCAGGGG GCGCCAGAA 201 AGGCTCCI C TCGATTATTG GGGACTTCCA GAATGGCAAG AGACTGAGCC 251 TCTCÜGTCTA TCTTGGGGAA TITTTTGACA TCCATTTGTT TGTCAATGGT 301 ACOCTGACAC AGGGGGACCA AAGAGTCTCC ATGCCCTATG CXTTCCAAAGG 351 GCIUTATCTA GAAACIGAGG CIOGGTACTA CAAGCTGTCC GGTGAGGCCT
401 ATGGCTTTGT GGCCAGGATC GATCGCAGCG GCAACTTTCA AGTCOOCTG 451 TCAGACAGAT ACTTCAACAA GACCTGCGGG CICTGTGGCA ACTTTAACAT 501 C TTGCTGAA GATCACTTTA TGACCCAAGA AGGC^CO G ACCTGGGACC 551 CTTATGACTT TGCPACTCA TGGGCTCTGA GCAGTGGAGA ACAGTGGTGT 601 GAAOGGGCAT CTCCTCCCAG CAGCTCATGC AACATCTCCT CTCGGGAAAT
651 GCA3AAGGGC CTGTGGGAGC AGTGCCAGCT TCTGAAGAGC ACCTCGGTGT 701 TTOCOCTG CCACCCTCTG CTOGACCOCG AGCC'lTi'iGT GGCC TGJXJT 751 GAGAAGACTT TGTGGAGTG IGCTGGGGGG CTGGAGTGCG C GCTCTGC 801 CCTCCTGGAG TACX3CCCGGA CCTGTGCCCA GGAGGGAATG GTGCTGTAGG 851 GCTGGACCGA CXACAGCGOG TGCAGCCCAG TC^GCCCTGC TGGTATGGAG
901 TATAGGCAGT G CTGTCX IC TIGCGCCAGG ACCTGCCAGA GCCTGCACAT
951 CAATGAAA G GTCAGGAGC GATGCG GGA GGCTGCAGC TGCCCTGAGG
1001 GACAGCTCCT GGA GAAGGC CTCTGGGTGG AGAGCACGGA GTCTCCCTGC
1051 GTGCATTCCG GAAAGQGCTA CCCTCCCGGC ACCTCCCTCT CICGAC4ACTG 1101 CAACACCTGC ATTTGCCGAA ACAGCCAGTG GATUTGCAGC AATGAAGAAT
1151 GTCCAGGGGA GTG TTGT ACTGGTCAAT CCCACTTCAA GAGCTTTGAC
1201 AACAGATACT TCACCTTCAG TCGGATCTGC CAGTACCTGC TGGCCCGGGA
1251 TO CAGGAC CACTCCTTCT CCATTCTCAT TG-¾GACTGTC CAG1GTGCTG
1301 ATGACCGCGA CGCTGTCTGC ACCCGCTCCG TCACOGTCCG GCTCCCTGGC 1351 CTGCACAACA C CTTGTGAA ACTGAAGCAT GGGGCAGGAG TTGCCATGGA
1401 IGGCCAGGAC ATCCftGCTCC (XCTCCTGAA ACCTGACCTC OC^CATCCAGC
1451 ATAC.AGTGAC GGCCTCCGTG CX^CCTCAGCT AC03GGAGGA CCIGCAGA!TG
1501 GACTGGGATG GCCGCGGGP& GCTGCTGGTG AAGCTGTCCC CXDGTCTATGC
1551 CGGGAAGACC TGCGGCCTGT GTCGGAATTA CAA 3GCAAC CAGGGCGACG 1601 ACITCCTTAC CCC!CTCTGGG CTGGCGGAGC CCCX2 3GTGGA GGACTTCGGG
1651 AAQGCCTGGA AGCTGCACGG C^CTOCCAG GACCT3CAGA AGCAGCACAG
1701 O^TCCCTGC GCCCTCAACC CGCGCATGAC CAGGTTCTCC GAGGAGGCGT
1751 GC!GCGGTCCr GACCTCCCCC ACATTCGAGG CCTGCCATCG TCCCXJTCAGC
1801 CXX3CTGCCCT ACCTGCGGAA K3CO-3CTAC GACXJDGTGCT CCGCTCGGA 1851 CX2X3CCGCGAG TGCCTGTGCG GCGC TGGC CAGCTATGCC GCGGCCTGCG
1901 CX3GGGAGAGG CGTGCGCXJTC GCGTGGCGCG AGCCAGGCCG CTGTGAGCTG
1951 AACTGCCCGA AAGGCCAGGT GTACCTGCAG TGCGGGACCC CCTGCAACCT
2001 C^CCTGCCGC TCrCTCTCTT ACCCGGATGA GGAATGCAAT GAGGCCTGCC
2051 TGGAGOGCTG CITCrGCCCC CC!AGGGCTCT ACATGGATGA GAGGQ3GGAC 2101 TC GTGCCCA AGGCCCAGTG CCCCTGTTAC TATGACGGTG AGATCTTCCA
2151 GCCAGAAGAC ATCITCTCAG ACCATCACAC CA G GCIAC TGTGAGGATG
2201 GCITCATGCA C GTACCATG AGTGGAGTCC CCGGAAGCIT GCT1 XTGAC
2251 GOTJTCCTCA GCAGTCCCCT GTCTCATCGC AGCAAAAGGA GCCTATCCTG
2301 TOGGCCCCCC A GGTCAAGC TGGTGTGTCC GGCTGACAAC CTGCX3GGCTG 2351 AAGGGCTCGA GTCTACCAAA ACGTGCCAGA ACTATGACCT GGAGTGCATG
2401 AGCATGGGCT GTCTCTCTGG CIGC TCTGC CCCCCGGGCA TGGTCCGGCA
2451 TGAGAACAGA TGTGTGGCCC TGGAAAGGTG TCCCTGCTTC CATCAGGGCA
2501 AGGAGTATGC CX TGGAGAA ACAGTGAAGA TTGGCTGCAA CAC TGTGTC
2551 TGTCGGGACC GGAAGTGGAA CTGCACAGAC CATGTGTGTG ATOXACGTG 2601 CTCCACGATC GGCATGGCCC ACTACCTCAC CI CGACGGG CTCAAATACC
2651 TGTTCCCCGG GGAGTGCCAG TACXJTTCTGG TGCAGGATTA CTGCGGCAGT
2701 AACCCTGGGA CCTTTCGGAT CCTAGTGGGG AATAAGGGAT GCAGCCACCC
2751 CTCAGTGAAA TGCAAGAAAC GOnCACCAT CCTGGTGGAG GGAGGAGAGA
2801 TTGAG TGTT TGACGGGGAG GTCAATGTGA AGAGGCCCAT GAAGGATGAG 2851 ACTCACTTTG AGGTGGTGGA GTCTGGCCGG TACATCATTC TGCTOCTGGG
2901 CAAAGCCCTC TCOGTGGTCT GGGACCGCCA C GAGCATC TCCCTGGTCC
2951 TGAAGCAGAC ATACCAGGAG AAAGTGTGTG GCCTGTGTGG GAATTTTGAT
3001 GGCATCCAGA ACAATGACCT CACCAGCAGC AACCTCCAAG TGGAGGAAGA
3051 CCCTGTGGAC TTTGGGAACT CCTGGAAAGT GAGCTCGCAG TGT - TGACA 3101 CCAGAAAAGT GCCTCTGGAC TCATCCCCTG CmCCTGCCA TAACAACATC
3151 ATGAAGCAGA CGATGGTGGA TICCTCCTGT AGAATCCTTA CCAGTGACGT
3201 CTTCCAGGAC TGCAACAAGC TGGTGGACCC CGAGCCATAT CTXKATGTCT
3251 GCATTTACGA CACCTGCTCC TGTGAGTCCA TTGGGGACTG CGCCGCATTC
3301 TGCGACACCA TTQCIGC TGCCCACGTG TGIG AG ATGGCAAGGT 3351 GGTGACCTGG AGGACGGCCA CATTGTG C CCAGAGCTGC GAGGAGAGGA
3401 ATC CCGGGA GAAGGGGTAT GAGGCTGAGT GGCGCTATAA CAG!CTGTGCA
3451 CCTGCCTGTC AAGTCAQG G TCAGCACCCT GAGCCACTGG CCT3CCCTGT
3501 GCAGTGTGTG GAGGGCTGCC ATGCCCACTG CCCTCCAGGG AAAATCCTGG
3551 A GAGCITIT GCAGACCTGC GTTGACCCTG AAGAf-TCTCC AGTGTGTGAG 3601 GTGGCTGGCC GGOJl'lTIGC CTCAGGAAAG AAAGTCACCT TGAATCCCAG
3651 TGACCCTGAG CACTGCCAGA TTTGCCACTG TGA GTTGTC AACCTCACCT
3701 GTGAAGCCTG CCAGGAGCCG ATATCTGGCG GTGGAGGTTC CGGTGGCGGG
3751 GGATCCGGCG GTGGAGGTTC CK3GQGGTGGA GGTTO333TG GCGGGGGATC
3801 CGGTGGCGGG GGATCCCTGG TCCCCCGGGG CAGCGGCGGT GGAGGTTCCG 3851 GTGGCGGGGG ATC GACAAA ACTCACACAT GCCCACCGTG CK AGCTCCA
3901 GAACTCCTGG GCGGACCGTC AGTCITCCTC TTCmXCAA AACCCAAGGA
3951 CACCCTCA G ATCTCCCGGA CCCCTGAGGT CACA GCG G GTX3GTGGACG
4001 TGAGCCACGA AGACCCTGAG GTCAAGTTCA ACTGGTACGT GGACX3GCGTG
4051 GAGGTGCATA ATGCCAAGAC AAAGCCGCGG GAGGAGCAGT ACAACAGCAC 4101 GTACCGTGTG GTCAGCGTCC TCACCGTCCT GCACCAGGAC TGGCTGAATG
4151 GCAAGGAGTA CAAGTGCAAG GTCTCCAACA AAGCCCTCCC AGOXCCLATC
4201 GAGAAAACCA TCTCCAAAGC CAAAGGGCAG CCCCGAGAAC CACAGGTGTA
4251 CACCCTGCCC CCATCCCGGG ATCAGCTGAC CAAGAACCAG G CAGCCTGA
4301 CCTGCCTGGT CAAAGGCTTC TATCCCAGCG ACATCGCCGT GGAGTGGGAG 4351 AGCAATGGGC AGCCGGAGAA CAACTACAAG ACCACGCCTC CCX3TGTTGGA
4401 CTCCGACGGC TCCITC TCC TCTACAGCAA GCTO^CCGTG GACAAGAGCA
4451 GGTGGCAGCA GGGGAACGTC TTCTCATGCT CCGTGATGCA TGAGGCTCTG
4501 CACAACCACT ACACGCAGAA GAGCCTCTCC CTGTCTCCGG GTAAATGA Secuencia de proteínas de VWF 031 (SEQ ID NO : 109)
1 MIPARFAGVL LALALILPGT LCAEGTRGRS STARCSLPGS DFVNTFDGSM
51 YSFAGYCSYL LAGGCQKRSF SIIGDFQNGK RVSLSVYLGE FFDIHLFVNG
101 TVTQGDQRVS MPYASKGLYL ETEAGYYKLS GEAYGFVARI DGSGNFQVLL
151 SDRYFN TCG LCGNFNIFAE DDFMTQEGTL TSDPYDFANS WALSSGEQWC 201 ERASPPSSSC NISSGEMQKG LWEQCQLLKS TSVFARCHPL VDPEPFVALC
251 EKTLCECAGG LECACPALLE YARTCAQEGM VLYGWTDHSA CSPVCPAGME
301 YRQCVSPCAR TCQSLHINEM CQERCVDGCS CPEGQLLDEG LCVESTECPC
351 VHSGKRYPPG TSLSRDCNTC ICRNSQWICS NEECPGECLV GQSHFKSFD
401 NRYFTFSGIC QYLLARDCQD HSFSIVIETV QCADDRDAVC TRSVTVRLPG 451 LHNSLVKLKH GAGVAMDGQD IQLPLLKGDL RIQHTVTASV RLSYGEDLQM
501 DWDGRGRLLV KLSPVYAG T CGIJCGNYNGN QGDDFLTPSG LAEPRVEDPG
551 NAWKLHGDCQ DLQKQHSDPC ALNPRMTRFS EEACAVLTSP TFEACHRAVS
601 PLPYLRNCRY DVCSCSDGRE OJC!GALASYA AAO^GRGVRV AWREPGRCEL
651 NCPKGQVYLQ CGTPCNLTCR SLSYPDEECN EACLEGCFCP PGLY DERGD 701 CVPKAQCPCY YDGEIFQPED IFSDHHTMCY CEDGFMHCTM SGVPGSLLPD
751 AVLSSPLSHR SKRSLSCRPP MV LVCPADN LRAEGLECTK TCQNYDLECM
801 SMGCVSGCLC PPGMVRHENR C^ALERCPCF HQGKEYAPGE TVKIGCNTCV
851 CIRDRKWNCTD HVCDATCSTI GMAHYLTFDG L YLFPGECQ YVLVQDYCGS
901 NPGTFRILVG N GCSHPSVK CKKRVTILVE GGEIELFDGE VNVKRH4KDE 951 THFEWESGR YIILLLGKAL SWWDRHLSI SVVLKQTYQE KVCGLCGNFD
1001 GIQ NDLTSS NLQVEEDPVD PG S VSSQ CADTRVPLD SSPATCHNNI
1051 MKQTMVDSSC RILTSDVFQD CNKLVDPEPY LDVCIYDTCS CESIGDCAAF
1101 CDTIAAYAHV CAQHG WTW RTATLCPQSC EERNLRENGY EAEWRYNSCA
1151 PACQVTCQHP EPLACPVQCV EGCHAHCPPG KI-JDELLQTC VDPEDCPVCE 1201 VAGRRFASGK KVTLNPSDPE HCQICHCDW NLTCEACQEP ISGGGGSGGG
1251 GSGGGGSGGG GSGGGGSGGG GSLVPRGSGG GGSGGGGSDK TH CPPCPAP
1301 ELLGGPSVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV WDVSHEDPE VKFNWYVDGV
1351 EVHNAKTKPR EEQY STYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK VSNKALPAPI
1401 EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSRDELTKNQ VSLTCLVKGF YPSDIAVEWE
1451 SNGQPENNYK TTPVLDSDG SFFLYSKLTV DKSRWQQGNV FSCSVMHEAL
1501 HNHYTQKSLS LSPGK*
Construcción
de ADN Enlazador entre VWF y Fe
VWF035 73 aa= IS { 11X (GGGGS ) } LVPRGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 96)
VWF036 98 aa= IS { 16X (GGGGS ) } LVPRGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 97)
VWF= D'D3 (1-477aa con C33SA/C379A)
El producto de PCR obtenido de la amplificación de LW22/LW23 (~2300bp) se clonó en pSYN-VWF-002 digerido con BsiWl/Notl para obtener el intermedio pSYN-VWF-014. pSYN-VWF-014 contiene péptido de señal de FVIII -D' D3 -enlazador escindible por trombina de 20 aminoácidos seguido por la región Fe.
Para generar la construcción D1D2D'D3-Fc, la región D1D2D' D3 se amplificó de pSYN-VWF-013 usando la combinación de cebadores LW24/LW27 por método de PCR estándar.
Clonación de LW24- Fwd- VWF D1D2D'D3 oligo con sitio BsiWl
GaGCm-ODCTACEAT^ (SEQ ID NO: 70)
LW27-Rev-VWF D 1 D3 oligo con EcoRV
CCACCGCCAGATATCGGCTCCTGGCAGGCTTCACAGGTGAG (SEQ ID NO: 71)
El producto de PCR obtenido de la amplificación LW22/LW23 (~3750bp) se clonó en pSYN-VWF-014 digerido con BsiWl/EcoRV para obtener el intermedio pSYN-VWF- 015. La longitud de enlazador entre el fragmento de VWF y la región Fe se cambió para obtener pSYN-VWF-031.
La secuencia de proteínas de VWF de longitud completa se muestra en la Tabla 1.
Secuencia de proteínas VWF-D1D2D'D3 Ib (SEQ ID NO: 72)
1 MIPARFAGVL LALALILPGT LCAEGTRGRS STARCSLFGS DFVTFDGSM
51 YSFAGYCSYL LAGGCQRSF SIIGDFQNGK RVSLSVYLGE FFDIHLFVNG
101 TVTQGDQRVS MPYASKGLYL ETEAGYYKLS GEAYGFVARI DGSGNFQVLL
151 SDRYFNTGG imíFNIFAE DDFMTQEGTL TSDPYDFANS WALSSGEQWC
201 ERASPPSSSC NISSGEMQKG LWEQCQLLKS TSVFARCHPL VDPEPFVALC
251 EKTLCECAGG LECACPATiTiK YARTCAQEGM VLYGWTDHSA CSPVCPAGME
301 YRQCVSPCAR TCQSLHINEM OQERCVDGCS CPEGQLLDEG LCVESTECPC
351 VHSGKRYPPG TSI.SRDCNTC ICRNSQWICS NEECPGECLV TGQSHFKSFD
401 NRYtTFSGIC QYLLARDCQD HSFSIVIETV QCADDRDAVC TRSVTVRLPG
451 LHNSLVKLKH GAGVAMDGQD IQLPLLKGDL RIQHTVTASV RLSYGEDLOM
501 DWDGRGRLLV KLSPVYAGKT CGIJCGNYNGN QGDDFLTPSG LAEPRVEDFG
551 NAWKLHGDCQ DLQKQHSDPC ALNPRMTRFS EEACAVLTSP TFEACHRAVS
601 PLPYLRNCRY DVCSCSDGRE O XIIALASYA AACAGRGVRV AWREPGRCEL
651 NCPKGQVYLQ CGTPC LTCR SLSYPDEECN EACLEGCFCP PGLYMDERGD
701 CVPAQCPCY YDGEIFQPED IFSDHHTMCY CEDGFMHCTM SGVPGSLLPD
751 AVLSSPLSHR SKRSLSCRPP MVKLVCPADN LRAEGLECTK TCQYDLECM
801 SMGCVSGCLC PPGMVRHENR CVALERCPCF HQGKEYAPGE TVKIGCNTCV
851 CRDRKWNCTD HVCDATCSTI GMAHYLTFDG LKYLFPGECQ YVLVQDYCGS 901 PGTFRILVG NKGCSHPSVK CKKRVTILVE GGEIELFDGE VNVKRPMKDE 951 THFEWESGR YIILUJGKAL SWWDRHLSI SVVLKQ YQE CG EaSIFD 1001 GIQ NDLTSS NLQVEEDPVD PGNSW VSSQ CADTRKVPLD SSPATCHN I 1051 MKQTMVDSSC RILTSDVPQD CMCLVDPEPY LDVCIYDTCS CESIGDCACF
1101 CDTIAAYAHV CAQHGKWT RTATLCPQSC EERNLRENGY ECEWRYNSCA 1151 PACQVTOQHP EPLACPVQCV EGCHAHCPPG ??G-DEILJjQTC VDPEDCPVCE 1201 VAGRRFASGK KVTLNPSDPE HCQICHCDW NLTCEACQEP* Secuencia de proteínas VWF-D'D3 2 (SEQ ID NO: 73)
1 SLSCRPPMVK LVCPADNLRA EGLECTKTCQ NYDLEC SM3 CVSGCLCPPG
51 MVRHENRCVA LERCPCEHQG KEYAPGETVK IGCNTCVCRD RK NCTDHVC 101 DATCSTIGMA HYLTFDGLKY LFPGECQYVL VQDYCGSNPG TFRILVGN G 151 CSHPSVKCKK RVTILVEGGE IELFDGEVNV KRPMKDETHF EWESGRYII 201 LLLGKALSW WDRHLSISW IiKQTYQEKVC GLQGNFDGIQ NNDLTSSNLQ 251 VEEDPVDFGN SWKVSSQCAD TRKVPLDSSP ATCHNNIMK3 TMVDSSCRIL
301 TSDVPQDCNK LVDPEPYLDV CIYDTCSCES IGDCACFCDT IAAYAHVCAQ 351 HGKWTWRTA TLCPQSCEER NLRENGYECE WRYNSCAPAC QVTGQHPEPL 401 ACPVQCVEGC HAHCPPGKIL DELLQTCVDP EDCPVCEVAG RRFASGKKVT 451 LNPSDPEHCQ ICHCDWNLT CEACQEP
Ejemplo 2: Las Construcciones Heterodiméricas que comprenden dominio FVIII-Fc y VWF-D'D3 en el extremo amino de la segunda cadena Fe (heterodímero FVIII-VWF-Fc, Figuras 2A-2b)
(a) Clonación de pSYN-FVIII - 064
El plásmido FVII 1-064 comprende un andamiaje de cadena
Fe simple (scFc) con sitios de escisión de enzimas que se procesan durante la síntesis en una célula. La construcción tiene un dominio de unión a FVIII de VWF de longitud completa (D'D3) .
El plásmido (pSYN-FVIII-064) se diseñó para el heterodímero VWF-Fc y FVIII-Fc de expresión, donde los dominios D'D3 se unen a FVIII y evitan la interacción de FVIII con fosfolípidos y proteína C activada y/o evitan o inhiben la unión a VWF endógeno. La proteína de pSYN-FVIII-064 se expresa en la célula como un polipéptido simple donde el C-terminal de la subunidad FVIII-Fc se enlaza con el N-terminal de la subunidad VWF D'D3-Fc por un enlazador de polipéptido 6x (GGGGS) (SEQ ID NO: 74) . Asimismo, las secuencias RRRRS (SEQ ID NO: 75) y RKKR R (SEQ ID NO: 76) se insertaron en el extremo 5' y 3' del enlazador de polipéptido, respectivamente, para depuración intracelular por proproteínas convertasas siguiendo el último Arg en cada secuencia. Por lo tanto, las células pueden expresar un heterodímero FVIII-Fc/D'D3-Fc de cadena doble donde la cadena FVIII-Fc tiene una secuencia RRRRS (SEQ ID NO: 75) en el C-terminal, pero el resto de la secuencia enlazadora se retiró. Otro enlazador de polipéptido 3x (GGGGS) (SEQ ID NO: 28) junto con un sitio de escisión de trombina se introduce entre los dominios VWF y la región Fe para facilitar la liberación del fragmento de VWF de FVIII una vez que la proteína heterodimérica de FVIII-VWF se activa mediante trortibina permitiendo la interacción de FVIII con otros factores de coagulación.
La síntesis de los fragmentos de ADN que contienen una parte de
la primera región Fe seguido por 6x (GGGGS) (SBQ ID NO: 74), el dominio V F-D'D3 (l-477aa; mutación C336A/C379A) , 3x (GGGGS) (SEQ ID NO:28), el sitio de escisión de trombina y una parte de la segunda Fe se externalizaron (número de secuencia Genscript 103069, tal como se muestra más adelante) . Un fragmento de la construcción Genscript se subclonó en pSYN-FVIII-049 digerido con Sall/RsRII, que es una construcción FVIII-Fc con un enlazador escindible entre dos dominios Fe.
Número de secuencia Genscript 103069 (SEQ ID NO: 82) : CCGTCGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCAT GAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAACGGCGCC GCCGGAGCGGTGGCGGCGGATCAGGTGGGGGTGGATCAGGCGGTGGAGGTTCCGGTGGCGG GGGATCCGGCGGTGGAGGTTCCGGTGGGGGTGGATCAAGGAAGAGGAGGAAGAGAAGCCTA TCCTGTCGGCCCCCCATGGTCAAGCTGGTGTGTCCCGCTGACAACCTGCGGGCTGAAGGGC TCGAGTGTACCAAAACGTGCCAGAACTATGACCTGGAGTGCATGAGCATGGGCTGTGTCTC TGGCTGCCTCTGCCCCCCGGGCATGGTCCGGCATGAGAATCGATGTGTGGCCCTGGAAAGG TGTCCCTGCTTCCATCAGGGCAAGGAGTATGCCCCTGGAGAAACAGTGAAGATTGGCTGCA ACACTTGTGTCTGTCGGGACCGGAAGTGGAACTGCACAGACCATGTGTGTGATGCCACGTG CTCCACGATCGGCATGGCCCACTACCTCACCTTCGACGGGCTCAAATACCTGTTCCCCGGG GAGTGCCAGTACGTTCTGGTGCAGGATTACTGGGGCACTA GAATAAGGGATGCAGCCACCCCIÜ^
TTGAGCTCITIGACGGGGAGG
CGTGGTCCTGAAGCAGACATACC^^
AGACCTCACCAGCAGCAACCTCCAAGIGG^
CX¾GimGCTGA^^
GCAGACGATGGTGGA!^^
TTCTGOGACAO-MTGCTGC^
CACATTGTGCCCCC¾G^
AC-AGCIUTCCAOT^CICTC-A^
GTGGAGGGCTGCCATGCCCACTGCCCTCCAGGGAAAATCCTGGATGAGCTTTTGCAGACCT GCGTTGACCCTGAAGACTGTCCAGTGTGTGAGGTGGCTGGCCGGCGTTTTGCCTCAGGAAA GAAAGTCACCTTGAATCCCAGTGACCCTGAGCACTGCCAGATTTGCCACTGTGATGTTGTC AACCTCACCTGTGAAGCCTGCCAGGAGCCGATCGATGGCGGTGGAGGTTCCGGTGGCGGGG GATCCCTGGTCCCCCGGGGCAGCGGAGGCGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGC TCCAGAACTCCTGGGCGGACCGTCA
(b) Clonación de pSYN-FVIII-065
El plásmido FVIII-065 comprende los primeros 276 aminoácidos del dominio D'D3 de VWF unidos a una segunda región Fe. El fragmento de VWF se amplificó por PCR a partir de plásmido de VWF pSYN-VWF-008 de longitud completa usando combinaciones de los cebadores ESC17 y ESC41.
Clonación de ESC17-Fwd- VWF oligo con Clal
GTCCGGCATGAGAATCGATGTGTG (SEQ ID NO: 77)
ESC41- Rev-VWF con EcoRV
CCTCCACCGCCAGATATCAGAGGCACTTTTC (SEQ ID NO: 78)
La banda de tamaño esperado (~692bp) se purificó con gel con un kit de Extracción de Gel (Qiagen, Valencia, Calif.) y se clonó en los sitios Clal y EcoRV de pSYN-FVIII-064 para
generar pSYN-FVIII-065.
Ejemplo 3: Clonación de pSYN-FVIII-159, 160, 178, 179 (Figura 3)
Para variar la longitud del enlazador entre el fragmento de VWF y la región Fe, un sitio EcoRV se introdujo en la unión de VWF y el comienzo del enlazador de 20 aminoácidos en pSYN-FVIII-064 , los enlazadores de tamaños variables se usaron luego para remplazar el enlazador de 20 aa en PSYN-FVIII-064. Las nuevas construcciones de ADN son: pSYN-FVIll-159, 160, 178, y 179 que contiene enlazadores de 35 aa, 48 aa, 73 aa y 98 aa, respectivamente.
Para insertar un enlazador de 35 aminoácidos en pSYN-FVIII-159, se encargaron dos óligos (ESC78- 105bp y ESC79 -107bp) a Integrated DNA Technologies, Inc (Coralville, IA) . Los óligos se templaron y extendieron usando un método de PCR estándar :
Cebadores :
ESC78- F d con sitio EcoRV
GGATCCXJCTGG^^ (SEQ ID
NO: 79)
ESC79- Rev con sitio RsRII
(.^GAGGAGCTK-í&C^
GTGAGITITCTa_C^ (SEQ ID
NO: 80)
Una reacción de templado y extensión de oligo PCR de 50 µ? se llevó a cabo con combo de cebadores ESC78/ESC79 usando el ciclo de amplificación de PCR de 3 pasos: 25 ciclos de (96° C 30 segundos, 55° C 30 segundos, 68° C 30 segundos) . La banda de tamaño esperado (~186bp) se purificó con gel con un kit de Extracción de Gel (Qiagen, Valencia, Calif.) y se clonó en los sitios de restricción de EcoRV y RsRII de pSYN-FVIII-064 para generar pSYN-FVIII-159.
(b) Clonación de pSYN-FVIII- 160 , 178, y 179 pSY -VIII-160 tiene un enlazador de 48 aminoácidos entre el fragmento de VWF y la región Fe. La síntesis del fragmento de ADN que codifica el enlazador de 48 aminoácidos (ISGG GGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSLVPRGSGGGGSGGGGS) (SEQ ID NO : 81) y una parte de la región Fe se externalizaron (número de secuencia Genscript 132601, que se muestra más adelante) . Un fragmento de la construcción Genscript se subclonó en pSYN-FVIII-0159 digerido con EcoRV/RsRII (mencionado anteriormente) .
Número de secuencia Genscript 132601 (SEQ ID NO: 83) AAAGTGCCTCTGATATCTGGCGGTGGAGGTTCCGGTGGCGGGGGATCCGGCGGTGG AGGTTCCGGCGGTGGAGGTTCCGGTGGCGGGGGATCCGGTGGCGGGGGATCCCTGGTCCCC CGGGGCAGCGGCGGTGGAGGTTCCGGTGGCGGGGGATCCGACAAAACTCACACATGCCCAC CGTGCCCAGCTCCAGAACTCCTGGGCGGACCGTCAGTCTTCC
pSYN-VIII-178 tiene un enlazador de 73 aminoácidos entre el fragmento de VWF y la región Fe. La síntesis del fragmento
de ADN que codifica el enlazador de 73 aminoácidos (ISGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSLVP RGSGGGGSGGGGS) (SEQ ID NO: 84) y una parte de la región Fe se externalizaron (número de secuencia Genscript 144849, que se muestra más adelante) . Un fragmento de la construcción Genscript se subclonó en pSYN-FVIII-0159 digerido con EcoRV/RsRII (mencionado anteriormente) .
Número de secuencia Genscript 144849 (SEQ ID NO: 85) GCCTGCCAGGAGCCGATATCTGGCGGTGGAGGTTCCGGTGGCGGGGGATCCGGCGG TGGAGGTTCCGGCGGTGGAGGTTCCGGTGGCGGGGGATCCGGCGGTGGAGGTTCCGGTGGC GGGGGATCCGGCGGTGGAGGTTCCGGCGGTGGAGGTTCCGGTGGCGGGGGATCCGGTGGCG GGGGATCCCTGGTCCCCCGGGGCAGCGGCGGTGGAGGTTCCGGTGGCGGGGGATCCGACAA AACTCACACATGCCCCCGTGCCCAGCTCCAGAACTCCTGGGCGGACCGTCAGTCTTCCTC
pSYN-VIII-179 tiene un enlazador de 98 aminoácidos entre el fragmento de VWF y la región Fe. La síntesis del fragmento de ADN que codifica el enlazador de 98 aminoácidos (ISGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGG GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSLVPRGSGGGGSGGGGS) (SEQ ID NO: 86) y una parte de la región Fe se externalizaron (número de secuencia Genscript 144849, que se muestra más adelante) . Un fragmento de la construcción Genscript se subclonó en pSYN-FVIII-0159 digerido con EcoRV/RsRII (mencionado anteriormente) .
Número de secuencia Genscript 144849 (SEQ ID NO: 87) GCCTGCCAGGAGCCGATATCTGGCGGTGGAGGTTCCGGTGGCGGGGGATCCGGCGG TGGAGGTTCCGGCGGTGGAGGTTCCGGTGGCGGGGGATCCGGCGGTGGAGGTTCCGGTGGC
GGGGGATCCGGCGGTGGAGGTTCCGGCGGTGGAGGTTCCGGTGGCGGGGGATCCGGCGGTG GAGGTTCCGGTGGCGGGGGATCCGGCGGTGGAGGTTCCGGCGGTGGAGGTTCCGGTGGCGG GGGATCCGGTGGCGGGGGATCCCTGGTCCCCCGGGGCAGCGGCGGTGGAGGTTCCGGTGGC GGGGGATCCGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCTCCAGAACTCCTGGGCGGAC CGTCAGTCTTCCTCTTCCC
Clonación de pSYN-FVIII - 180 , 181, y 182
pSYN-FVIII-180 , 181, y 182 se construyeron a partir de pSYN-FVIII-160. Las mutaciones K2093A o F2093A o K2093A/F2093A se introdujeron en el dominio Cl de FVIII en pSYN-FVIII-160 para formar pSY -FVIII - 180 , pSYN-FVIII -181 y pSYN-FVIII-182 respectivamente.
Secuencia de proteínas heterodiméricas de FVIII -VWF-Fc (SEQ ID NO: 88)
(secuencia de aminoácido FVIII posición 1-1457; la región subrayada representa la región Fe; el subrayado curvo representa el enlazador escindible entre la primera Fe y el fragmento de VWF; la región con subrayado doble representa el fragmento de VWF; la región en negrita representa el enlazador escindible de longitud variable entre el fragmento de VWF y Fe . La longitud del enlazador varía en las construcciones FVIII-064, 159, 160, 178, y 179) .
1 MQIELSTCFF IJOLIÍRFCFSA TRRYYLGAVE LSWDYMQSDL GELPVDARFP
51 PRVPKSFPFN TSWYKKTLF VEFTDHLFNI AKPRPFWMGL LGPTIQAEVY 101 DTVV1TLK VI ASHPVSLHAV GVSYWKASEG AEYDDOTSQR EKEDDKVFPG 151 GSHTYVWQVL KF-NGPMASDP LCLTYSYLSH VDLVKDLNSG LIGALLVCRE
201 GSLAKEKTQT LHKFILLFAV FDEGKSWHSE TKNSLMQDRD AASARAWP M
251 mVNGYVNRS LPGLIGCHRK SVYWHVIGM3 TTPEVHSIFL EGHTFLVRNH
301 RQASLEISPI TFLTAQTLLiM DLGQFLLFCH ISSHQHDG E AYVKVDSCPE
351 EPQILRM E EAEDYDDDLT DSE DWRFD DDNSPSFIQI RSVAKKHPKT 401 WVHYIAAEEE DWDYAPLVLA PDDRSYKSQY L GPQRIGR KYKKVRFMAY
451 TDETFKTREA IQHESGILGP LLYGEVGDTL LIIFK QASR PYNIYPHGIT
501 DVRPLYSRRL PKGVKHL DF PILPGEIFKY WATTVTVEDGP TKSDPRCLTR
551 YYSSFVMMER DLASGLIGPL LICYKESVDQ RGNQI SDKR VILFSVFDE
601 RSWYLTE I QRFLPNPAGV QLEDPEFQAS NIMHSINGYV FDSLQLSVCL 651 HEVAYWYILS IGAQTDFLSV FFSGYTFKHK MVYEDTLTLF PFSGETVFMS
701 MENPGLWILG CHNSDFRNRG OTALLKVSSC DKNTGDYYED SYEDISAYLL
751 SKNNAIEPRS FSQNPPVLKR HQREITRTTL QSDQEEIDYD DTISVEMKKE
801 DFDIYDEDEN QSPRSFQKKT RHYFIAAVER LWDYGMSSSP HVLRNRAQSG
851 SVPQFKKWF QEFTDGSFTQ PLYRGEL EH LGLLGPYIRA EVEDNIMVTF 901 R OASRPYSF YSSLISYEED QRQGAEPRKN FVKP ETKTY FWKVQHHMAP
951 TKDEFDCKAW AYFSDVDLEK DVHSGLIGPL LVCMOTLNP AHGRQVTVQE
1001 FALFFTIFDE TKSWYFTENM ER CRAPCNI QVEDPTFKE YRFHAINGYI
1051 MDTLPGLVMA QDQRIRWYLL SMGS ENIHS IHFSGHVFTV RKKEEYKMAL
1101 YNLYPGVFET VEMLPSKAGI WRVECLIGEH LHAGMSTLFL VYS KGQTPL 1151 GMASGHIRDF QITASGQYGQ WAPKLARLHY SGSI AWSTK EPFSWIKVDL
1201 LAPMIIHGIK TQGARQKFSS LYISQFIIMY SLDGKKWQTY RG STGTLMV
1251 FFGNVDSSGI KHNIENPPII ARYIRLHPTH YSIRSTLRME LM3CDL SCS
1301 MPLGMESKAI SDAQITASSY FMVIFATWSP SKARLHLQGR S1SLAWRPQV N
1351 PKEWLQVDFQ KTMKVTGVTT QGVKSLLTSM YVKEFLISSS QDGHQWTLFF 1401 QNGKVKVPQG NQDSFTPWN SLDPPLLTRY LRIHPQSVA7H QIALRMEVLG
1451 CEAQDLYDKT HTCPPCPAPE LLGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCW
1501 VDVSHEDPEV KFISIWYVDGVE VHSLAKTKPRE EQYSTYRW SVLTVLHQDW
1551 LNGKEYKCKV SKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP SRDELTKNQV
1601 SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD
1651 KSRWQQG VF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGKRRRRSG GGGSGGGGSG
1701 GGGSGGGGSG GGGSGGGGSR KRRKRSLSCR PPMVKLVCPA DLRAEGLEC
1751 TKTCONYDLE C S GCVSGC LCPPG VRHE ERCVALERCP CFHOGKEYAP
1801 GETVKIGCT CVCRDRKWNC TDHVCDATCS TIGMAHYLTF DGLKYLFPGE
1851 COYVLVODYC GSNPGTFRIL VGNKGCSHPS VKCKKRVTIL VEGGEIELFD
1901 GEV VKRPMK DETHFEWES GRYIILLLGK ALSWDRHL SISVVLKCTY
1951 OEKVCGLCGN FDGIQ DLT SS LQVEEDP VDFGNSWKVS SQCADTR VP
2001 LDSSPATCHN NIMKOTVDS SCRILTSDVF ODCNKLVDPE PYLDVCIYDT
2051 CSCESIGDCA AFCDTIAAYA HVCAOHGKW TWRTATLCPO S^ERNLREN
2101 GYEAEWRYS C-^ACQVTCO HPEPLACPVQ CVEGCHAHCP PGKILDELLO
2151 TCVDPEDCPV CEVAGRRFAS GKKVTLNPSD PEHCOICHCD WLTCEACO
2201 EPHX3GGGSG GGGSLVPRGS GGDKTHTCPP CPAPELLGGP SVFLFPPKPK
2251 DTLMISRTPE VTCVWDVSH EDPEVKFWY VDGVEVHNAK TKPREEQYS
2301 TYRWSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PAPIEKTISK AKGQPREPQV
2351 YTLPPSRDEL TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE ]SDSm TPPVL
2401 DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ QG VFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSPGK
Ejemplo 4: Ejemplo de construcciones de ADN de FVIII-VWF (Figuras
4A-4H)
El fragmento de VWF y la proteína de FVIII pueden enlazarse juntos por un enlazador u otra proteína o un polipéptido usando técnicas de ADN recombinante
convencionales, tal como se muestra en las Figuras 4A-4H. En la Figura 4A, los dominios D1D2D'D3 de VWF se enlazan a la proteína de FVIII por un enlazador de 48aa ISGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSLVPRGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 89) y protegen a FVIII de depuración prematura. Para potenciar más la actividad protectora de FVIII de D'D3, puede incorporarse otra proteína o polipéptido que tiene el potencial de extensión de semivida tal como albúmina o una secuencia PAS (restos heterólogos) a la construcción. El resto heterólogo, por ejemplo, proteína de albúmina o secuencia PAS, puede incorporarse en diferentes posiciones de la molécula de FVIII; unos pocos ejemplos se mostraron en las Figuras 4B-4D: en los extremos N de FVIII (fig. 4B) , en los extremos C de FVIII (fig. 4C) , o en la región B (fig. 4D) . En esas construcciones, las secuencias de proteína adicionales pueden potenciar la actividad protectora de D'D3 y además extender la semivida de FVIII.
Asimismo, también puede incorporarse un resto heterólogo, por ejemplo, albúmina o secuencia PAS, en las construcciones de heterodímeros FVIII/VWF tal como se muestra en las figuras 4E-4G. En la figura 4E, se incorpora un resto heterólogo, por ejemplo, albúmina o secuencia PAS, a la región de dominio B FVIII de FVIII-148. En la figura 4F, se incorpora un resto heterólogo, por ejemplo, albúmina o secuencia PAS, en la región de dominio B FVIII de FVIII-136.
En la figura 4G, se incorpora un resto heterólogo, por ejemplo, albúmina o secuencia PAS, se usa como enlazador para conectar el fragmento D'D3 y Fe. En esas configuraciones, se espera un efecto sinérgico de D'D3, Fe, y resto heterólogo que es un extensor de la semivida (por ejemplo, albúmina/secuencia PAS) en la extensión de la semivida de FVIII .
Ejemplo 5: La construcción de plásmido del sistema de cotransfección para el Heterodímero FVIIIFc-VWF (Figura 5) Se generó un sistema de cotransfección para la producción de heterodímero FVIIIFc-VWF, que contiene tres construcciones de ADN. La primera construcción de ADN de pSYN-FVIH-155 está codificando una proteína de fusión FVIII-Fc donde una proteína de FVIII de cadena simple se fusionó directamente a un fragmento Fe simple, y la segunda construcción de ADN es pSYN-VWF- 031 , que codifica una proteína de fusión D'D3-Fc (mencionada anteriormente en el ejemplo 1) . Las células HEK293F se transíectaron con los dos plásmidos junto con un tercer plásmido (PC5) en una relación 80:15:5. La cotransfección con PC5 es para asegurar el procesamiento de propéptidos completo de las regiones DI y D2 de modo que haya dominios D'D3 maduros. Las proteínas sintetizadas se secretaron como heterodímero FVIIIFc/D' D3Fc y homodímero D'D3Fc y el heterodímero FVIIIFc/D' D3Fc se separó del homodímero D'D3Fc por purificación de proteínas.
Secuenciación de proteínas maduras pSYN-FVIII-155 (SEQ ID NO: 90) :
ATRRYYLGAVELSWDYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSWYKKTLFVEFTD HLFNIAKPRPPWMGLLGPTIQAEVYDTWITLKNMASHPVSLHAVGVSY KASEGAEYDDQ TSQREKEDD VFPGGSHTYV QVLKENGPMASDPLCLTYSYLSHVDLVKDLNSGLIGALLV CREGSLAKEKTQTLHKFILLFAVFDEGKSWHSETKNSLMQDRDAASARAWPKMHTVNGYVN RSLPGLIGCHRKSVYWHVIGMGTTPEVHSIFLEGHTFLVRNHRQASLEISPITFLTAQTLL MDLGQFLLFCHISSHQHDGMEAYVKVDSCPEEPQLRM NNEEAEDYDDDLTDSEMDVVRFD DDNSPSFIQIRSVAKKHPKTWVHYIAAEEEDWDYAPLVLAPDDRSYKSQYLNNGPQRIGRK YKKVRFMAYTDETFKTREAIQHESGILGPLLYGEVGDTLLIIFKNQASRPYNIYPHGITDV RPLYSRRLPKGVKHLKDFPILPGEIFKYK TVTVEDGPTKSDPRCLTRYYSSFVNMERDLA SGLIGPLLICYKESVDQRGNQIMSDKR VILFSVFDENRSWYLTENIQRFLPNPAGVQLED PEFQASNIMHSINGYVFDSLQLSVCLHEVAYWYILSIGAQTDFLSVFFSGYTFKHKMVYED TLTLFPFSGETVFMSMENPGLWILGCHNSDFRNRGMTALLKVSSCDKNTGDYYEDSYEDIS AYLLSKNNAIEPRSFSQNPPVLKAHQAEITRTTLQSDQEEIDYDDTISVEMKKEDFDIYDE DENQSPRSFQKKTRHYFI AVERLWDYGMSSSPHVLRNRAQSGSVPQFKKWFQEFTDGSF TQPLYRGELNEHLGLLGPYIRAEVEDNIMVTFRNQASRPYSFYSSLISYEEDQRQGAEPR NFVKPNETKTYF VQHHMAPTKDEFDCKAWAYFSDVDLEKDVHSGLIGPLLVCHTNTLNP AHGRQVTVQEFALFFTIFDETKSWYFTENMERNCRAPCNIQMEDPTFKENYRFHAINGYIM DTLPGLVMAQDQRIRWYLLSMGSNENIHSIHFSGHVFTVRKKEEYKMALYNLYPGVFETVE MLPSKAGIWRVECLIGEHLHAGMSTLFLVYSNKCQTPLGMASGHIRDFQITASGQYGQWAP KLARLHYSGSINA STKEPFSWIKVDLLAPMIIHGIKTQGARQKFSSLYISQFIIMYSLDG KKWQTYRGNSTGTLMVFFGNVDSSGIKHNIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTLRMELMGCD LNSCSMPLGMESKAISDAQITASSYFTNMFATWSPSKARLHLQGRSNAWRPQVNNPKEWLQ VDFQKT KVTGVTTQGVKSLLTSMYVKEFLISSSQDGHQWTLFFQNGKVKVFQGNQDSFTP
VWSLDPPLLTRYLRIHPQSWVHQIALRMEVLGCEAQDLYDKTHTCPPCPAPELLGGPSVF LFPPKP DTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQV SLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEN YKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFS CSVMHEALHNHYTQ SLSLSPGK
Secuenciación de ADN de pSYN-FVIII-155 (SEQ ID NO : 91) : ATGCAAATAGAGCTCTCCACCTGCTTCTTTCTGTGCCTTTTGCGATTCTGCTTTAG TGCCACCAGAAGATACTACCTGGGTGCAGTGGAACTGTCATGGGACTATATGCAAAGTGAT CTCGGTGAGCTGCCTGTGGACGCAAGATTTCCTCCTAGAGTGCCAAAATCTTTTCCATTCA ACACCTCAGTCGTGTACAAAAAGACTCTGTTTGTAGAATTCACGGATCACCTTTTCAACAT CGCTAAGCCAAGGCCACCCTGGATGGGTCTGCTAGGTCCTACCATCCAGGCTGAGGTTTAT GATACAGTGGTCATTACACTTAAGAACATGGCTTCCCATCCTGTCAGTCTTCATGCTGTTG GTGTATCCTACTGGAAAGCTTCTGAGGGAGCTGAATATGATGATCAGACCAGTCAAAGGGA GAAAGAAGATGATAAAGTCTTCCCTGGTGGAAGCCATACATATGTCTGGCAGGTCCTGAAA GAGAATGGTCCAATGGCCTCTGACCCACTGTGCCTTACCTACTCATATCTTTCTCATGTGG ACCTGGTAAAAGACTTGAATTCAGGCCTCATTGGAGCCCTACTAGTATGTAGAGAAGGGAG TCTGGCCAAGGAAAAGACACAGACCTTGCACAAATTTATACTACTTTTTGCTGTATTTGAT GAAGGGAAAAGTTGGCACTCAGAAACAAAGAACTCCTTGATGCAGGATAGGGATGCTGCAT CTGCTCGGGCCTGGCCTAAAATGCACACAGTCAATGGTTATGTAAACAGGTCTCTGCCAGG TCTGATTGGATGCCACAGGAAATCAGTCTATTGGCATGTGATTGGAATGGGCACCACTCCT GAAGTGCACTCAATATTCCTCGAAGGTCACACATTTCTTGTGAGGAACCATCGCCAGGCGT CCTTGGAAATCTCGCCAATAACTTTCCTTACTGCTCAAACACTCTTGATGGACCTTGGACA GTTTCTACTGTTTTGTCATATCTCTTCCCACCAACATGATGGCATGGAAGCTTATGTCAAA GTAGACAGCTGTCCAGAGGAACCCCAACTACGAATGAAAAATAATGAAGAAGCGGAAGACT ATGATGATGATCTTACTGATTCTGAAATGGATGTGGTCAGGTTTGATGATGACAACTCTCC
TTCCTTTATCCAAATTCGCTCAGTTGCCAAGAAGCATCCTAAAACTTGGGTACATTACATT GCTGCTGAAGAGGAGGACTGGGACTATGCTCCCTTAGTCCTCGCCCCCGATGACAGAAGTT ATAAAAGTCAATATTTGAACAATGGCCCTCAGCGGATTGGTAGGAAGTACAAAAAAGTCCG ATTTATGGCATACACAGATGAAACCTTTAAGACTCGTGAAGCTATTCAGCATGAATCAGGA ATCTTGGGACCTTTACTTTATGGGGAAGTTGGAGACACACTGTTGATTATATTTAAGAATC AAGCAAGCAGACCATATAACATCTACCCTCACGGAATCACTGATGTCCGTCCTTTGTATTC AAGGAGATTACCAAAAGGTGTAAAACATTTGAAGGATTTTCCAATTCTGCCAGGAGAAATA TTCAAATATAAATGGACAGTGACTGTAGAAGATGGGCCAACTAAATCAGATCCTCGGTGCC TGACCCGCTATTACTCTAGTTTCGTTAATATGGAGAGAGATCTAGCTTCAGGACTCATTGG CCCTCTCCTCATCTGCTACAAAGAATCTGTAGATCAAAGAGGAAACCAGATAATGTCAGAC AAGAGGAATGTCATCCTGTTTTCTGTATTTGATGAGAACCGAAGCTGGTACCTCACAGAGA ATATACAACGCTTTCTCCCCAATCCAGCTGGAGTGCAGCTTGAGGATCCAGAGTTCCAAGC CTCCAACATCATGCACAGCATCAATGGCTATGTTTTTGATAGTTTGCAGTTGTCAGTTTGT TTGCATGAGGTGGCATACTGGTACATTCTAAGCATTGGAGCACAGACTGACTTCCTTTCTG T CTT CTTCT CTGGATATAC CTTCAAACACAAAATGGTCTATGAAGACACACTCACC CTATT CCCATTCTCAGGAGAAACTGTCTTCATGTCGATGGAAAACCCAGGTCTATGGATTCTGGGG TGCCACAACTCAGACTTTCGGAACAGAGGCATGACCGCCTTACTGAAGGTTTCTAGTTGTG ACAAGAACACTGGTGATTATTACGAGGACAGTTATGAAGATATTTCAGCATACTTGCTGAG TAAAAACAATGCCATTGAACCAAGAAGCTTCTCTCAAAACCCACCAGTCTTGAAAGCCCAT CAGGCGGAAATAACTCGTACTACTCTTCAGTCAGATCAAGAGGAAATTGACTATGATGATA CCATATCAGTTGAAATGAAGAAGGAAGATTTTGACATTTATGATGAGGATGAAAATCAGAG CCCCCGCAGCTTTCAAAAGAAAACACGACACTATTTTATTGCTGCAGTGGAGAGGCTCTGG GATTATGGGATGAGTAGCTCCCCACATGTTCTAAGAAACAGGGCTCAGAGTGGCAGTGTCC CTCAGTTCAAGAAAGTTGTTTTCCAGGAATTTACTGATGGCTCCTTTACTCAGCCCTTATA CCGTGGAGAACTAAATGAACATTTGGGACTCCTGGGGCCATATATAAGAGCAGAAGTTGAA
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ATGGCAAAGTAAAGGTTTTTCAGGGAAATCAAGACTCCTTCACACCTGTGGTGAACTCTCT AGACCCACCGTTACTGACTCGCTACCTTCGAATTCACCCCCAGAGTTGGGTGCACCAGATT GCCCTGAGGATGGAGGTTCTGGGCTGCGAGGCACAGGACCTCTACGACAAAACTCACACAT GCCCACCGTGCCCAGCTCCAGAACTCCTGGGCGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAA ACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTG AGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATG CCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCAC CGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCC CTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGG TGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCT GGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAG AACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGTTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCA AGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCA TGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
A continuación se enumeran fragmentos de V F y heterodímeros FVIIIFC-VWF adicionales que se construyeron.
Tabla 6. Fragmentos de VWF y construcciones heterodímeros FVIII/VWF
Ejemplo 6: Purificación de proteínas
Purificación de proteínas de fragmentos de VWF
Los fragmentos de VWF se purificaron mediante un método de purificación de dos pasos. Se usó una columna IMAC (Cromatografía de Afinidad por Metales Inmovilizados) cargada con sulfato de níquel para la purificación primaria, y se usó una columna de intercambio de iones Fractogel DEAE para la
purificación final. A continuación se describe en detalle el método de purificación.
(a) Purificación primaria de fragmento de VWF en IMAC con níquel
Una columna HP Sepharose IMAC con níquel de 14 mL
[XK26/3] se equilibró con 25 mM de HEPES, 500 mM de NaCl, 10 mM de Imidazol y 0.05% de Tween-20 a pH 7.5. Se ajustó aproximadamente 7.2 L de medio condicionado VWF con 100 mL de HEPES 1M a pH 7.5 y 600 mL de NaCl 5M. Luego se agregó 80 mL de imidazol 1M (a pH 7.5) a una concentración final de 10 mM. Los 7.8 L del medio condicionado VWF ajustado se cargó luego en la columna a 2-8°C a 10 mL/min [113 cm/hora] . Los pasos de lavado se llevaron a cabo a 13.3 mL/minuto [150 cm/hora]. En primer lugar, se realizó un lavado 2xVolumen de Columna (CV) con 25 mM de HEPES, 500 mM de NaCl, 10 mM de Imidazol y 0.05% Tween-20 a pH 7.5 en flujo normal {"FlujoDescendente"}. Luego, se realizó un lavado 3xCV con 25 mM de HEPES, 500 mM de NaCl, 10 mM de Imidazol y 0.05% de Tween-20 a pH 7.5 en flujo inverso { "FlujoAscendente" } . Por último, se realizó un lavado 3xCV con 25 M de HEPES, 500 mM de NaCl, 10 mM de Imidazol y 0.05% de Tween-20 a pH 7.5 en flujo normal {"FlujoDescendente"}. La elusión se llevó a cabo como un gradiente lOxCV a Bl 50% (25 mM de HEPES, 500 mM de NaCl, 500 mM de Imidazol y 0,05% de Tween-20 a pH 7.5) . El volumen de fracción se estableció en 10 mL. Luego, la columna se retiró con Bl 100%. A continuación se lavó con 25 mM de HEPES, 500 mM de NaCl, 10
mM de Imidazol y 0.05% de Tween-20 a pH 7.5. Una segunda remoción se llevó a cabo con NaOH 1N. Luego la columna se enjuagó con TRIS 1M, NaCl 1M a pH 7.8, seguido por 25 mM de HEPES , 500 mM de NaCl, 10 mM de Imidazol, y 0.05% de Tween-20 a pH 7.5. Finalmente, la columna se enjuagó con 5 CV de DPBS + Etanol 20% y se almacenó a 4°C.
(b) Purificación secundaria de fragmento de VWF en Fractogel DEAE
La purificación secundaria de fragmento de VWF se llevó a cabo en Fractogel DEAE a pH 7.5. En primer lugar, 20 mL de eluído de IMAC en níquel VWF (correspondiente al pico de fragmento de VWF) se ajustó con 200 mg de detergente zwitteriónico Zwittergent 3-14 en un intento de alterar las especies agregadas sin usar excipientes desnaturalizantes o reductores. Luego de que el detergente se disolvió, la proteína se dejó a TA durante aproximadamente 15 minutos. Luego, la proteína se ajustó con 4 gramos de trehalosa, 1 mL de 10% Tween-20, 5 mL de 1M HEPES a pH 7.5 y 174 mL de agua "Milli-Q". El amortiguador de equilibrio "A12" fue 25 mM de HEPES, 50 mM de NaCl, 1% de Trehalosa, 0.05% de Tween-20 a pH 7.5. El amortiguador de elusión "Bl" fue 25 mM de HEPES, 1000 mM de NaCl, 1% de Trehalosa, 0.05% de Tween-20 a pH 7.5. La elución se llevó a cabo como un gradiente 10 CV a 50% Bl, manteniendo 5+ CV seguido por un paso hasta 100% Bl . Luego la columna se retiró con 0.85% de ácido fosfórico, seguido por
TRIS 1M, NaCl 1M a pH 7.5. Luego la columna se retiró con NaOH 1N, NaCl 2M seguido por TRIS 1M, NaCl 1M a pH 7.5. Luego la columna se enjuagó con 25 mM de HEPES , 100 mM de NaCl + 20% de Etanol a pH 7.5 para almacenamiento.
(c) Purificación de proteínas de heterodímero
FVIII-VWF
El heterodímero FVIII-VWF se purificó en primer lugar por una columna de afinidad (GE VlIISelect) , luego siguió una columna de intercambio de iones Fractogal TMAE. (McCue JT, Selvitelli K, Walker J, J Chromatogr A. 2009 Nov 6; 1216 (45) : 7824-30. Epub 2009 Sep 23.)
Para la purificación de FVIII-155/VWF-31 , se usó un paso de filtración de flujo tangencial (TFF) para intercambiar por amortiguadores el medio condicionado clarificado. Las proteínas diana en el filtrado se capturaron luego usando cromatografía de afinidad. Se llev a cabo un paso de cromatografía de intercambio de aniones débiles para reducir las especies HMW. Se accedió a la pureza y al tamaño de la molécula por HPLC-SEC y SDS-PAGE. La presencia de diferentes dominios de FVIII-155/VF-31 se confirmó además por transferencia western. La actividad específica de la molécula fue comparable con FVIII con dominio B eliminado.
(d) Digestión de trombina de heterodímero FVIII-VWF (Figura 8)
El heterodímero FVIII-VWF-Fc o FVIII-Fc (control) se mezcló con trombina en una relación 1:10 en amortiguador de
escisión de trombina (50 mM de Tris, pH 7.4, 150 mM de NaCl, 2 mM de CaCl2, 5% de Glicerol) . La reacción se incubó a 37 'C durante 20 minutos. El producto digerido se ejecutó en 4-12% de gel tris-glicina reductor. La proteína no digerida se usó como control. Las bandas se visualizaron por tinción con Coomassie.
(e) Evaluación de la capacidad de unión a VWF de FVIII-155/VWF-031 por Ensayo Octet
La capacidad de unión a VWF de FVIII-155/VWF-031 se determinó por mediciones basadas en Interf erometría de biocapa (BLI) (ensayo Octet) a 25 °C con un instrumento ForteBio Octet 384 usando amortiguador de unión Tris (50 mM de Tris, pH 7.2, 150 mM de NaCl, 5 mM de CaCl2) . El ensayo Octet para determinar la unión a FVIII se basó en la inmovilización hidrofóbica de Factor von Willebrand humano (hVWF) (Haematologic Technologies n.° de catálogo HCVWF-0191) en el APS Biosensor, seguido por la unión de 1.0% de Albúmina en suero bovino ( Jackson ImmunoResearch n. ° de catálogo 001-000-161). Brevemente, hVWF (38.5 nM) se diluyó en amortiguador Tris y se cargó con Biosensores APS durante 600 seg., proporcionando aproximadamente 3.0 - 3.5 nra de unión en las sondas de reacción. Las sondas de control APS se cargaron con 1.0% de BSA en ausencia de hVWF para la sustracción de referencia. Luego de cargarse, todas las sondas se incubaron en amortiguador Tris durante 300 seg. para establecer una nueva referencia. Posteriormente, las sondas de biosensores se incubaron en soluciones de FVIII-
155/VWF-031, sustancia de fármaco FVIIIFe o rFVIII (60 nM) durante 5 min a temperatura ambiente, seguido por un paso de disociación de 5 min. Usando el software de análisis de datos Octet, la respuesta a la unión (nm) surgió de los datos sustraídos (sonda de reacción menos sonda de referencia) . Tal como se muestra en la Figura 15, en comparación con la afinidad de unión a VWF de rFVIIIFc y rFVIII, la afinidad de unión a VWF de FVIII-155/VWF-031 se deterioró gravemente. Esto indica la protección satisfactoria de FVIII de VWF de longitud completa por el fragmento D'D3 en el heterodímero FVIIIFc/VWF.
Ejemplo 7. La interacción de VWF-FVIII es un factor limitante para la extensión de la semivida de FVIII
La mayoría de la FVIII circulante existe como un complejo FVIII-VWF (>95% de FVIII en plasma) . Esta interacción de FVIII -VWF promueve la depuración de FVIII a través de la vía de depuración de VWF, haciendo de la semivida de VWF (Tl/2) una limitante de la extensión de la semivida de FVIII. Para evaluar esta hipótesis, la limitación de la extensión de la semivida de FVIII por tecnología Fe se probó en ratones con deficiencia de FVIII (ratones HemA, que tienen el gen VWF intacto) y ratones con deficiencia de FVIII/VWF (con doble inactivación (DKO) de FVIII -VWF) .
Los ratones HemA o ratones FVIII-VWF DKO se trataron con una dosis intravenosa simple de rFVIII o rFVIIIFc a 125 IU/kg en ratones HemA o 200 IU/kg en ratones DKO. Las muestras de
sangre se recogieron hasta 72hr en los ratones HemA o hasta 8hr en los ratones FVIII/VWF DKO. La actividad de FVIII de la muestra de plasma se midió luego por ensayo cromogénico de FVIII. El perfil farmacocinético (PK) de las dos variaciones de rFVIII se analizó usando el programa WinNonline.
Tal como se muestra en la Tabla 7 y en la Figura 9, en ratones FVIII /VWF DKO, rFVIIIFc mostró ?1 2 de alrededor de 4,8 veces más larga (es decir, ^ de 1.2hr) en comparación con Ti/2 de rFVIII (es decir, ??2 de 0.25hr) . Por el contrario, cuando se analizó en ratones HemA, rFVIIIFc tuvo únicamente T/2 1.8 veces más larga en comparación con rFVIII . La Tx/2 de rFVIIIFc fue 13.7hr, que está en línea con la semivida de VWF de murino endógeno. Esto indica que la interacción de FVIII-VWF es un factor limitante para la extensión de la semivida de FVIII. Para lograr una extensión de la semivida de FVIII de más de 2 veces, la interacción de FVIII- VWF tendrá que eliminarse.
Tabla 7: FVIII PK en ratones HemA y FVIIII/VWF DKO
Ensayo cromogénico de FVIII
La actividad de FVIII se midió usando el kit COATEST SP FVIII DiaPharma (lote# N089019) y todas las incubaciones se llevaron a
cabo en un calentador de placa de 37 °C con agitación.
El intervalo de rFVIII estándar fue de 100 mlU/mL a 0.78 mlU/mL. Un control de ensayo de plasma humano normal agrupado y muestras en plasma (diluidas con amortiguador IX Coatest) se agregaron en placas de 96 pocilios Immulon 2HB en duplicado (25 yL/pocillo) . La mezcla recientemente preparada de IXa/FX/fosfolípidos (50 \iL) , 25 ih de 25mM CaCl2, y 50 }iL de sustrato FXa se agregaron secuencialmente en cada pocilio con 5 minutos de incubación entre cada adición. Luego de incubar con el sustrato, se agregaron 25 \iL de 20% ácido acético para terminar la reacción de color, y la absorbancia de OD405 se midió con un instrumento Spectra AX plus (Molecular Devices) . Los datos se analizaron con software SoftMax Pro (versión 5.2) . El nivel más bajo de cuantificación (LLOQ) es 7.8 mlU/mL.
Ejemplo 8. El dímero V F D'D3 protege FVIII de proteólisis y depuración de FVIII (Figuras 10A-10B)
La actividad de protección de FVIII de los fragmentos de VWF se evaluó por su capacidad de proteger FVIII murino endógeno FVIII de su depuración en ratones con deficiencia de VWF. Diferentes fragmentos de VWF tal como se enumera en la Tabla 8 Columna 1 (Figuras 1A-1F, Ejemplo 1) se introdujeron en la circulación sanguínea de los ratones con deficiencia de VWF por inyección hidrodinámica de sus correspondientes construcciones de ADN a 100µg/ratón. Las muestras de plasma
se recogieron a las 48hr después de la inyección, y la actividad en plasma FVIII de murino se midió con el ensayo cromogénico de FVIII. El nivel de expresión de VWF se midió por ELISA VWF.
Cuatro longitudes diferentes de los fragmentos de VWF que se probaron son 276, 477, 511 y 716 aminoácidos. El intervalo de aminoácido 276 a 716 se probó para averiguar la longitud de los fragmentos de VWF necesaria para la unión a FVIII (276aa) sin dominio de unión de los receptores de depuración de VWF (716aa) . El VWF de longitud completa y el multímero D1D2D'D3CK se usaron como control positivo para la protección de FVIII. En la circulación sanguínea, los fragmentos de VWF sintetizados con el dominio D1D2 existen como un dímero y existen como monómeros cuando se sintetizan sin el dominio D1D2.
El aumento de la actividad de FVIII de murino en plasma después de la inyección hidrodinámica mide el efecto de protección de FVIII de los fragmentos de VWF. Tal como se muestra en la Tabla 8 y en las Figuras 10A-10B, los primeros 276aa del fragmento D'D3 no tuvieron ninguna actividad de protección de FVIII tal como lo demuestra el nivel de FVIII en plasma antes/después de la inyección similar (Figura 10A) . Sin embargo, la introducción de los otros fragmentos de VWF indujo un aumento significativo en el nivel de FVIII en plasma, indicando que esos fragmentos de VWF pueden proteger
FVIII de su vía de depuración.
Tabla 8: Nivel de FVIII en plasma de murino en ratones DKO FVIII/VWF antes/después de la introducción de fragmentos de VWF (las construcciones de ADN se ilustraron en las Figuras 1A.-1F)
La relación de la actividad FVIII en plasma después de la inyección y el nivel de antígenos en plasma de los fragmentos de VWF que contienen el dominio D'D3 de VWF de longitud completa se enumeraron en la Tabla 8. Se observó una relación FVIII/VWF después de la inyección similar de VWF de longitud completa y las dos formas de dímeros de los fragmentos de VWF, lo que implica que los dos dímeros de fragmentos de VWF proporcionan la misma protección de FVIII que el VWF de longitud completa. Asimismo, se observó una relación FVIII/VWF tres veces mayor de las isoformas de dímero de fragmento de VWF en comparación con sus
correspondientes monómeros : el dímero D'D3 (477aa) tiene la relación FVIII/VWF de 38.7 mlU/nmol; el monómero D'D3 (477aa) tiene la relación FVIII/VWF de 11.6 mlU/nmol : el dímero D"D3A1 (511aa) tiene la relación FVIII/VWF de 32.9 mlU/nmol; y el monómero D 1 D3 (511aa) tiene la relación FVIII/VWF de 13.8 mlU/nmol, lo que indica que las isoformas de dímeros de los fragmentos de VWF proporcionan mejores protecciones de FVIII en comparación con sus correspondientes monómeros.
Tabla 9: Efecto de protección de FVIII del fragmento D'D3 de longitud completa
Inyección hidrodinámica:
La inyección hidrodinámica es un método de administración génica no viral eficaz y seguro al hígado en animales pequeños, tales como ratones y ratas. Originalmente se describió como una inyección rápida de un ADN de plásmido sin tratamiento/solución salina libre de endotoxina a un décimo volumen del peso corporal del animal en alrededor de 5-7 segundos. El ADN de plásmido sin tratamiento contiene el
gen de interés y la proteína diana producida en el hígado del ADN inyectado puede detectarse en 24 horas después de la inyección. Las muestras de plasma se recogieron luego para estudiar la propiedad terapéutica de la proteína expresada.
Para todas las inyecciones hidrodinámicas que se llevaron a cabo en la presente en esta solicitud de patente, se administraron 2 mi de ADN de plásmido en 0.9% de solución salina estéril vía inyección intravenosa en la vena de la cola en alrededor de 4-7 segundos a ratones que pesan 20-35 gramos. Los ratones se monitorearon atentamente durante las primeras dos horas hasta que se retomó la actividad normal. Luego de recogerse las muestras de sangre por recolección de sangre retro orbital, las muestras de plasma se obtuvieron luego y se almacenaron a -80 °C para análisis adicional.
ELISA de V F:
El anticuerpo VWF de cabra anti-humano (afinidad purificada, Affinity Biologicals, GAVWF-AP) se usó como el anticuerpo de captura a 0 , 5ug/pocillo y VWF-EIA-D (Affinity Biologicals, VWF-EIA-D, dilución 1:100) se usó como el anticuerpo de detección para el ELISA de VWF. El ensayo ELISA se llevó a cabo siguiendo el procedimiento ELISA estándar, se usó TMB como el sustrato HRP, PBST/l.5% BSA/amortiguador NaCl 0.5M se usó como amortiguador de bloqueo y unión. El intervalo de ensayo estándar es lOOng a 0.78ng, y el límite más bajo del ensayo de cuantificación (LLOQ) es 7.8ng/mL.
Ejemplo 9: La coadministración de fragmento D'D3 de VWF de longitud completa extiende la semivida de rBDD-FVIII en ratones DKO FVIII-VWF (Figuras 11A-11B)
El Ejemplo 8 demostró que el fragmento D'D3 de longitud completa puede proteger el FVIII endógeno de su vía de depuración. Para evaluar adicionalmente la actividad de protección de FVIII de la proteína D'D3, a los ratones DKO FVIII-VWF se les coadministró FVIII con dominio B eliminado (rBDD-FVIII) y dímero D'D3 (VWF-010) o rBDD-FVIII y monómero D'D3 (VWF-002) , por inyección intravenosa a 200 IU/kg para rBDD-FVIII, 770 ug/kg para el dímero D'D3 y 590 pg/kg para el monómero D'D3. El perfil de PK de rBDD-FVIII se monitoreó luego por su actividad en plasma después de la inyección. Debido a la corta semivida in vivo de los fragmentos D'D3, a las tres horas después de la coinyección inicial, se administró otra dosis de D'D3 a través de la misma vía para mantener un nivel de D'D3 en plasma deseable.
Para el análisis de PK, se obtuvo una muestra en plasma mediante recolección de sangre retro-orbital a 5min, 30min, 1 hora, 2 horas, 4 horas y 6 horas después de la inyección, se analizó la actividad de FVIII en plasma y se analizó el nivel de antígeno D'D3 por ensayo cromogénico de FVIII y ELISA de VWF.
Tal como se muestra en las Figuras 11A-11B y en la Tabla 10, el monómero D'D3 prolongó la semivida de rBDD-FVIII 2.5 veces y mejoró su recuperación 1.8 veces. El dímero D'D3
prolongó la semivida de rBDD-FVIII 4.1 veces y mejoró su recuperación 3.5 veces. También se observaron tiempo de permanencia promedio, depuración y AUC mejorados para ambas isoformas D'D3. El dímero D'D3, sin embargo, obtuvo mejores resultados en todos los parámetros PK en comparación con su forma de monómero .
En resumen, la coinyección de D'D3 de longitud completa protege FVIII de su vía de depuración, tal como se muestra en el perfil de PK mejorado de rBDD-FVIII. El potencial valor clínico de este resultado debe evaluarse adicionalmente .
Tabla 10: Parámetro PK BDD-FVIII en ratones DKO FVI VWF al coadministrárseles fragmentos D'D3
Ejemplo 10. El monómero D'D3 sintetizado con el dominio D1D2 y su isoforma de dímero tienen la misma actividad de protección de FVIII y además extendieron la semivida FVIIIFc ~4 veces en ratones FVIII -VWF DKO (Figura 12)
Para cuantificar la capacidad de protección de FVIII de los dominios D'D3 y determinar si la dimerización de D'D3 es necesaria para su actividad de protección de FVIII, cada una
de las dos construcciones de ADN (es decir, VWF-025 (que contiene secuencia de ADN que codifica D1D2D'D3) y VWF-029 (que contiene ADN de codón D1D2D'D3 con mutación C336A y C379A) ) se administró en ratones DKO FVIII/VWF por inyección hidrodinámica. Esta inyección resultó en la expresión de dímero D'D3 (VWF-025) o monómero (VWF-029) en los ratones DKO FVIII/VWF. Al día 5 después de la inyección hidrodinámica, se administró una única dosis intravenosa de rFVIIIFc a 200 IU/kg, y se recogieron muestras de plasma a los 5min, 4, 8, 16, 24, 31, 40, 55, 66hr después de la inyección IV de rFVIIIFc. Un estudio de PK de rFVIIIFc que se llevó a cabo en ratones DKO FVIII-VWF sin tratamiento a la misma dosis se usó como la referencia de la semivida de rFVIIIFc. La actividad de FVIII en plasma se analizó por ensayo cromogénico de FVIII. El nivel de D'D3 en plasma se midió por ELISA de VWF, y el perfil de PK de rFVIIIFc se analizó usando el programa WinNonlin.
Tal como se muestra en la Tabla 11 y la Figura 12, con los fragmentos VWF D'D3 en la circulación, la recuperación inicial de rFVIIIFc aumentó de 42% a 75% con dímero D'D3 y 60% con monómero D'D3. Ti/2 de rFVIIIFc aumentó también de 2.5 hr a 9.3 hr y 9.2hr, respectivamente. De forma similar a Ti/2, también se observaron el tiempo de permanencia promedio, depuración y distribución del volumen mejorados de los ratones que expresan monómero D'D3 y dímero. En general, se observan mejoras de alrededor de 8 veces en la semivida de
rFVIIIFc y mejoras de 6 veces en AUC en los ratones que expresan monómero D'D3 y dímero. Al igual que su isoforma de dímero, el monómero D'D3 de VWF de longitud completa que se sintetizó con el propéptido (D1D2) de VWF es suficiente para proporcionar el efecto de protección FVIII completo como la molécula de VWF de longitud completa.
En los ratones DKO FVIII /VWF, WT-FVIII tiene una Ti/2 de 0.25hr. La tecnología de fusión de Fe aumentó la Ti/2 de FVIII a 1.2 horas, que es un aumento de alrededor de 4.8 veces. Cuando la tecnología de fusión de Fe se combinó con los dominios D'D3, la Ti/2 de FVIII aumentó a 9.3hr (dímero D'D3) y 9.2hr (monómero D'D3), que son aumentos de alrededor de 37 veces en total. (Tabla 10) Este resultado demostró el efecto sinérgico de la fusión de Fe y el fragmento de D'D3 VWF en la extensión de la semivida de FVIII.
Tabla 11: parámetro de PK de rFVIIIFc con/sin fragmento de D'D3 en la circulación sanguínea
Ejemplo 11: PK de Heterodímero FVIII -VWF en ratones HemA El perfil de PK de los candidatos principales del heterodímero FVIII -VWF (tal como FVIII-155/VWF-031) se analizará en ratones HemA para evaluar su capacidad de proteger el FVIII del VWF endógeno y su capacidad de extender la semivida de FVIII.
Los ratones HemA se tratarán con una única dosis intravenosa de los candidatos principales a 200 IU/kg, las muestras de plasma se recogerán luego a los 5min, 4hr, 8hr, 24hr, 48hr, 72hr, 96hr y 120hr, la actividad plasmática se analizará por ensayo cromogénico de FVIII, y la semivida de la varianza de FVIII se calculará con el programa Win onlin.
En una configuración de heterodímeros FVIII/VWF óptima, la unión de FVIII al VWF endógeno se inhibirá completamente, por ende la semivida de referencia de rFVIII disminuirá de 7.6 hr a 0.25 hr tal como se muestra en el ejemplo 7. Cuando el fragmento D'D3 no se asoció covalentemente con FVIII, se observó un beneficio de la semivida de alrededor de 8 veces (ejemplo 9) . En los candidatos principales del heterodímero FVIII/VWF, el fragmento de VWF está covalentemente asociado a la molécula de FVIII, podría lograrse una mejor protección de FVIII. La invención de esta solicitud abrió la puerta a una mayor extensión de la semivida de FVIII más allá del límite de dos veces, con la combinación de las tecnologías de extensión de la semivida disponibles, los pacientes HemA
pueden esperar una mejor varianza de FVTII de larga duración en el futuro cercano.
El perfil de PK de FVIII-155/VWF-031 se analizó en ratones HemA y DKO FVIII/VWF para evaluar la capacidad del fragmento de D'D3 de proteger el resto de FVIII del VWF endógeno. Los ratones HemA o DKO FVIII/VWF se trataron con una única dosis intravenosa de FVIII-155/VWF-031 a 200 IU/kg, las muestras de plasma se recogieron luego a los 5min, 8hr, 24hr y 48 horas después de la dosificación. La actividad de FVIII de la muestra de plasma se analizó por ensayo cromogénico de FVIII, y la semivida de FVIII-155/VWF-031 se calculó usando el programa WinNonlin.
Se detectó una unión gravemente alterada al VWF inmovilizado por interferometría de biocapa (Figura 15, Octet; ForteBio Inc., Menlo Park, CA) para FVIII-155/VWF-031 en comparación con rFVIIIFc y rFVIII. Esto muestra que el dominio D'D3 en la molécula bloqueó satisfactoriamente la unión de FVIII a las moléculas de VWF nativas. Por lo tanto, se esperó una semivida similar de rFVIII-155/VWF-031 en las dos cepas diferentes de ratones. Los resultados del estudio se enumeran en la Figura 16 y la Tabla 12A. Tal como se predice, rFVIII-155/VWF-031 tuvo un perfil de PK comparable en ambos ratones HemA y DKO FVIII/VWF, lo que indica que la semivida del heterodímero FVIIIFc/VWF es independiente de la semivida del VWF endógeno. Los resultados muestran que la
inhibición de la interacción entre rFVIIIFc con VWF endógeno por los dominios VWF D'D3 permite la supresión del límite de la semivida de FVIII y ofrece la posibilidad de extender la semivida de FVIII más allá de la semivida que se puede alcanzar sin los dominios VWF D'D3 (alrededor de dos veces del FVIII de tipo salvaje) .
Tabla 12A. PK de FVIII-155/VWF-031 en ratones DKO FVIII/VWF y ratones HemA
La capacidad protectora de FVIII de los dominios D'D3 se evaluó comparando la ti/2 de FVIII-155/VWF-031 con FVIIIFe en ratones DKO FVIII/VWF. Luego de una única administración IV, se recogieron muestras de sangre a los 5min, 8hr, 24hr y 48 hr para FVIII-155/VWF-031, y a los 5min, 1 hr, 2hr, 4hr, 6hr y 8hr para FVIIIFc. La actividad de FVIII de la muestra de plasma se analizó por ensayo cromogénico de FVIII, y la semivida de FVIII-155/VWF-031 se calculó usando el programa WinNonlin .
La Figura 16B y Tabla 12B muestran un perfil de PK significativamente mejorado para FVIII - 155/VWF- 031 en comparación con rFVIIIFc en ratones DKO: aumentos de
alrededor de 6 veces en ti/2; y aumentos de alrededor de 5 veces en depuración y AUC. Este resultado demuestra que el dominio D'D3 en el heterodímero FVIIIFc/VWF protege el resto FVIII de algunas vías de depuración, proporcionando así algo de la protección normalmente provista por el VWF de longitud completa. Esta conclusión también se confirma en ratones HemA. Al compararse con rFVTIIFc en ratones HemA, rFVIII-155/VWF-031 mostró menor ti/2 y menor AUC, lo que significa en esta configuración que los dominios D'D3 (VWF-031) evitan de forma satisfactoria la unión de la proteína de FVIII (rFVIII-155) al VWF endógeno, que tiene propiedades que extienden la semivida en algún grado, así como también una propiedad que limita la semivida del FVIII. El VWF de longitud completa tiene 250 kDa, y forma multímeros de forma que el VWF endógeno puede tener hasta 2 Da, y por lo tanto es coherente con esta hipótesis que la región D'D3 de 55 kDa de VWF no provee la misma protección normalmente proporcionada por el VWF endógeno mucho más largo en este contexto. Debido a que el fragmento de VWF evita que el VWF endógeno se una a rFVlII-155/VWF-031, en esta construcción particular la semivida disminuye en el ratón HemA. Por lo tanto, los resultados de la Tabla 12B indican que la molécula rFVIII-155/VWF-031 es capaz de evitar que el extensor de la semivida de FVIII (VWF endógeno) se una a rFVIII-155/VWF-031. Sin embargo, el experimento muestra que la remoción del factor limitante de la semivida de FVIII ofreció la
posibilidad de extender una semivida de la proteína de FVIII más de 1,5 veces o 2 veces tal como se muestra anteriormente. Cuando el FVIII se combina con otros elementos de extensión de la semivida tal como se muestra en la Figura 4, podría lograrse un avance del límite de la extensión de la semivida de 2 veces de FVIII.
Tabla 12B. PK de FVIII-155/VWF-031 y FVIIIFc en ratones DKO FVIII/VWF
Ejemplo 12: Optimización del enlazador de D'D3-Fc del heterodímero FVIII/D'D3 (Figura 13)
Para permitir que rFVIIIFc escape de la vía de depuración de VWF y elimine el límite de extensión de la semivida de FVIII de 2 veces, el fragmento de VWF D'D3 se incorporó en la molécula rFVIIIFc (Figuras 2A-2B) , resultando en un heterodímero FVIIIFc/VWF. Para eliminar la interacción entre rFVIIIFc y el VWF endógeno y maximizar la potencial protección de D'D3 FVIII, el enlazador entre el dominio D'D3 y la región Fe se ajustó para permitir la unión óptima a FVIII/D'D3. Un enlazador más óptimo permitirá que el dominio D'D3 tenga mayor protección de FVIII que una construcción de
enlazador menos óptimo. Esto puede probarse por inyección hidrodinámica de las construcciones de ADN en ratones DKO FVIII/VWF. Una construcción más óptima proporcionará una mayor expresión de proteína en estado estacionario del heterodímero FVIIIFc/D' D3.
Se modificaron tres heterodímeros FVIIIFc/D'D3 diferentes (Figura 3, Ejemplo 3) para una selección óptima de enlazadores. Los posibles enlazadores entre los dominios D'D3 y la región Fe se enumeraron en la Tabla 13. Esas construcciones de ADN se administraron en ratones DKO FVIII/VWF por inyección hidrodinámica ( "HDI" ) a 100 µg/ratón, y las muestras de plasma se recogieron 48hr después de HDI . La actividad del heterodímero FVIIIFc/D'D3 circulante se analizó por ensayo cromogénico de FVIII.
El resultado del estudio se mostró en la Figura 13. 48 horas después de HDI, se logró un nivel de expresión similar por parte de FVIII -064 y FVIII-159, lo que indica que el enlazador de 20aa y el enlazador de 35aa promueven un nivel similar de interacción FVIII/D'D3. Por otra parte, FVIII-160 mostró una expresión significativamente mayor que FVIII-064, lo que significa que el enlazador de 48aa permite una mejor unión de FVIII/D'D3 en comparación con el enlazador de 20aa y 35aa.
Un enlazador óptimo entre el fragmento de VWF y la región Fe es uno de los elementos clave del heterodímero FVIIIFc/VWF. Encontrar el mejor enlazador permitirá la
interacción óptima entre FVIII y el fragmento de VWF, evitará la unión de FVIII a VWF endógeno, permitirá que FVIII escape de la vía de depuración de VWF, y extenderá la semivida de FVIII más allá de la semivida de VWF en plasma.
Tabla 13: Diferentes enlazadores entre D'D3 y el fragmento Fe
Ejemplo 13: Estabilidad de FVIII de cadena simple
La proteína de FVIII de cadena simple puede ser más estable que su isoforma de cadena doble. Para analizar esta hipótesis, se realizaron dos construcciones de ADN: FVIII-136 (FVIIIFc procesable con el dominio D'D3) y FVIII-148 (FVIIIFc de cadena simple (SC) con el dominio D'D3, que contiene la mutación R1645A/R1648A para evitar la escisión entre la cadena pesada y la cadena ligera de FVIII) .
Ambos plásmidos se administraron a ratones DKO FVIII/VWF por inyección hidrodinámica. Las muestras de plasma se recogieron 24hr y 48hr después de las inyecciones para medir el nivel de expresión de las dos isoformas de FVIIIFc/D' D3. Tal como se muestra en la Figura 14, en ambos puntos de tiempo, se observó una tendencia de mejor expresión por la construcción SC-FVIIIFc/D' D3 (FVIII-148) (p=0,12, p=0,19), lo
que indica que FVIII de cadena simple puede ser más estable o mejor expresado que su isoforma de cadena doble (FVIII-136) . El perfil de PK de las dos isoformas de FVIII y sus niveles de expresión de cultivo celular se investigarán adicionalmente . La isoforma de FVIII de cadena simple puede usarse potencialmente para remplazar la isoforma de cadena doble convencional para lograr una mejor protección de proteínas y mejor semivida de FVIII in vivo.
Ejemplo 14. PEGilación
Una o más moléculas de polietilenglicol (PEG) pueden unirse en cualesquiera regiones de la proteína de FVIII, el fragmento de VWF, o ambos. Debido a que FVIII no tiene una cisterna libre en su superficie según la estructura de cristal (PDB:2R7E, Shen et ál . , Blood 111:1240 (2008); PDB:3CDZ, Ngo, Structure, 16:597-606 (2008)), un enfoque es insertar un péptido que contiene cisteína (por ejemplo, GGGSGCGGGS) (SEQ ID NO: 107) en o unirlo a la proteína de FVIII, el fragmento de VWF, o ambos. Las moléculas PEG que contienen maleimida pueden conjugarse específicamente a la cisteína introducida en la proteína de FVIII recombinante . Brevemente, la proteína de FVIII recombinante que contiene la inserción de Cys puede construirse por tecnología molecular estándar, y la proteína de FVIII recombinante expresada en el sistema de expresión mamífero (por ejemplo, células HEK293, CHO, BHK21, PER.C6 y CAP) puede purificarse por cromatografía
por afinidad y de intercambio de iones. La proteína de FVIII recombinante purificada se reduce con Tris ( 2 -carboxietil) fosfina (TCEP) para exponer el grupo tiol de la cisteína introducida y luego se hace reaccionar con maleimida PEG. La proteína de FVIII recombinante resultante se analiza para detectar actividad procoagulante y semivida extendida.
PEG se une a al menos una de las ubicaciones descritas en la solicitud estadounidense n. ° 61/670,553, que se incorpora a la presente mediante esta referencia en su totalidad, u otros sitios de inserción. La actividad de FVIII de la proteína de FVIII recombinante PEGilada se analiza usando un ensayo cromogénico de FVIII. La PK de la proteína de FVIII recombinante PEGilada se analiza en ratones HemA y ratones DKO FVIII -VWF tal como se describe anteriormente.
Ejemplo 15: Estabilidad de FVIII en plasma con doble inactivación (DKO) de FVIII/VWF y HemA
Se analizó la estabilidad en plasma de diferentes fusiones de FVIIIFc en plasma con doble inactivación (DKO) de FVIII/VWF o HemA. Para el ensayo de estabilidad, se incubaron 5 IU/ml de varias proteínas de FVIIIFc con plasma de ratón HemA o DKO a 37°C. Las alícuotas se recogieron en diferentes puntos de tiempo para medir la actividad del ensayo cromogénico de FVIII. La actividad en cada punto de tiempo se midió en duplicado y se gráfico la actividad promedio en función del tiempo.
Para el ensayo de inmunoprecipitación de FVIIIFc, se incubaron 5µ9 de FVIIIFc con 250µ1 de PBS o plasma de ratón DKO durante 24hr a 37°C. FVIIIFc se inmunoprecipitó agregando 5µg de anticuerpo policlonal de oveja anti-FVIII (ab61370) durante lhr a temperatura ambiente y ???µ? de perlas de proteína A. Luego de 4xlml lavados con PBS, las perlas se volvieron a suspender en 50µ1 lx de amortiguador SDS-PAGE reductor. Luego de hervir, 20µ1 de muestra (es decir ~ ^g de FVIIIFc) se cargaron en 4-15% de gel libre de tinción Bio-Rad. Se tomaron imágenes del gel con el sistema Bio-rad seguido por análisis estern con anticuerpo anti cadena pesada de FVIII (GMA012) .
La actividad de FVIIIFc (molécula de FVIII de cadena doble, que tiene cadenas ligera y pesada separadas de FVIII, mantenidas juntas por interacciones no covalentes) disminuye con el tiempo en los plasmas de HemA y DKD (Figura 18A) . Debido a la falta de protección mediada por VWF, la pérdida de actividad de FVIIIFc fue más notoria en el plasma de DKD. Esta pérdida de actividad de FVIII se debió principalmente a la disociación o degradación de la cadena pesada (HC) de FVIII. Se observó una reducción de alrededor del 75% en la cadena pesada de FVIIIFc luego de una incubación de 24hr en plasma de DKO (Figura 18B) . No se observó una reducción significativa para ninguna de FVIIIFc de cadena ligera (LC) (no se muestran datos) o cadena simple/sin procesar (es decir la molécula de FVIII donde la cadena ligera y la cadena
pesada están aun juntas covalentemente - banda superior en la foto del gel) (Figura 18B) .
Ya que el VWF se propone para aumentar la estabilidad de FVIII in vivo, se probó si la proteína quimérica-heterodímero FVIII-VWF (FVIII155 :VWF31 , que unió covalentemente VWF D'D3 a FVIII a través de Fe) fue más estable en plasma de Hem A y DKO. De los datos de la estabilidad en plasma mostrados en las Figuras 19A-19B, la presencia de D'D3 aumentó la estabilidad de FVIIIFc, en plasma de HemA y DKO. Se usó FVIIIFc de cadena simple sin D'D3 como control en estos experimentos (scFVIII) . En la Figura 19, el FVIII de cadena simple fue más estable que el FVIIIFc de cadena doble; sin embargo la presencia de D'D3 aumentó significativamente la estabilidad en plasma de la molécula de FVIIIFc de cadena simple. Esto sugiere que D'D3 estabiliza FVIII, no solo manteniendo las cadenas ligera y pesada juntas sino también mediante algunos mecanismos desconocidos .
Ejemplo 16: Uso de Furina/PAGE para procesamiento de VWF VWF es una proteína única en el sentido de que contiene un propéptido muy grande (es decir dominio D1D2 de VWF, ~85kDa) . El propéptido de VWF sirve como una chaperona interna para el plegamiento adecuado de la molécula de VWF. Se analizaron dos enzimas para el procesamiento de VWF- PC5 y Furina (PACE) . La construcción de VWF031 (DlD2D'D3Fc) se
cotransfectó transitoriamente en células HEK293 con varias concentraciones ya sea de PC5 o PACE. Luego de cuatro días, el medio de cultivo tisular se recogió y sometió a desplegamiento de proteína A. Incluso a una menor concentración (2.5%), la furina (PACE) fue más eficaz que 10% PC5, para retirar el propéptido (D1D2) de D'D3Fc (Figura 20) . La remoción de D1D2 es importante, debido a que la presencia de D1D2 se vio implicada en la prevención de la interacción de D'D3 con FVIII.
Ejemplo 17: El fragmento de VWF en el heterodímero FVIII-VWF evita la interacción de FVIII con VWF de longitud completa
Se usó un instrumento ForteBio octet para analizar la unión del heterodímero 155/V F31 de construcción de FVIII al VWF de longitud completa (Figura 21A) . Para el ensayo de unión, se capturó un VWF de longitud completa usando un sensor APS, seguido por bloqueo con 1% BSA. Luego del bloqueo, se analizaron diferentes construcciones de FVIII para la unión de VWF. Tal como se predijo, FVIII de tipo salvaje y FVIIIFc se unieron fuertemente a los sensores de VWF. El mutante FVIII Y1680F, que se sabe tiene poca o ninguna afinidad con VWF mostró una unión a VWF significativamente reducida. El heterodímero FVIII155/VWF31 no se unió para nada al VWF de longitud completa, confirmando la protección de FVIII con D'D3 en el heterodímero FVIII-VWF.
El mismo experimento se llevó a cabo en orientación inversa para determinar si la parte de D'D3 en el
heterodímero FVIII-VWF puede interactuar con otras moléculas de FVIII no covalentemente unidas a D'D3. Tal como se muestra en la Figura 21B, la construcción de VWF31 (D'D3Fc) sola cuando está inmovilizada en el sensor de proteína G puede unirse fuertemente a FVIII, sin embargo D'D3 en el heterodímero FVIII155 : WF31 no mostró ninguna unión a FVIII. La proteína G sola con FVIII se usó como control. Estos experimentos de unión confirmaron que D'D3 en el heterodímero puede interactuar con solo una molécula de FVIII que está covalentemente unida a este y evitar que FVIII interactúe con las moléculas de VWF de tipo salvaje de longitud completa.
Para determinar la afinidad de unión exacta de VWF D'D3 para la molécula de FVIII, los experimentos de resonancia de plasma superficial se llevaron a cabo con VWF031 (Figura 22) . La construcción VWF031 (D'D3Fc) se capturó usando IgG anti-humano y se pasó FVIII con dominio B eliminado sobre chip que contenía D'D3Fc. Se observó una K de alrededor de ???? para FVIII. Esta afinidad es alrededor de 25 veces menor en comparación con la molécula de VWF de tipo salvaje de longitud completa y es similar a lo reportado previamente en la bibliografía.
Ejemplo 18: Efecto de diferente longitud de enlazadores entre D'D3 y Fe en la actividad de heterodímeros y PK
Para verificar si la variación de la longitud del enlazador escindible por trombina entre D'D3 y Fe tiene algún efecto en PK y la actividad del heterodímero FVIII-VWF, las
diferentes construcciones de VWF se coexpresaron junto con FVIII 155. Se probaron tres construcciones de longitudes de enlazadores diferentes enumeradas en la Tabla 14A (V F031, VWF035 y VWF036) . Cada plásmico se mezcló con plásmido FVIH155 (Ejemplo 5) y se transfectó en células HEK293. Al día cuatro después de la transfección, el medio de cultivo celular se cultivó y concentró a 10 IU/ml de actividad cromogénica de FVIII.
El medio celular concentrado se administró luego en ratones DKO FVIII/VWF de 8-12 semanas a una dosis de 100 IU/10 mL/kg. Las muestras de plasma se recogieron a los 5min, 8hr, 16hr, 24hr, 32hr y 48hr después de la dosificación. La actividad de FVIII de las muestras de plasma se analizó por ensayo cromogénico de FVIII, y la semivida se calculó usando el programa WinNonlin-Phoenix.
Tal como se muestra en la Figura 23, cuando la longitud del enlazador entre D'D3 y el fragmento de Fe aumentó de 48 aa a 73aa o 98aa, la semivida del heterodímero FVIIIFc/VWF correspondiente aumentó y alcanzó 12.2hr y 13.3hr respectivamente. Esto representa un aumento de 1.5 a 1.6 veces sobre una variante de 48aa de largo. A la fecha, el enlazador de 98aa es el enlazador más óptimo para utilizar la actividad de protección de FVIII del fragmento D'D3, y se incorporará en el heterodímero FVIIIFc/VWF para mejorar adicionalmente su semivida.
Para comparar el efecto del enlazador en la actividad de
FVIII, los ensayos aPTT y cromogénico de FVIII se llevaron a cabo en medio de cultivo tisular de células que expresan diferentes heterodímeros de FVIII -V F. A pesar de que la actividad de aPTT se redujo 2 veces en comparación con la actividad cromogénica para construcciones de heterodímeros, no se observó ninguna diferencia significativa entre varios enlazadores, excepto cuando el enlazador también contiene un sitio PARI próximo al sitio de trombina (Tabla 14B) .
Tabla 14A. Secuencia de enlazador variable entre VWF D'D3 y Fe
Tabla 14B: Actividad de heterodímeros con diferentes longitudes de enlazadores
Ejemplo 19: Enlace de FVIII con fragmento de VWF usando enzima sortasa
En otro aspecto, un fragmento de VWF (por ejemplo dominio D1D2D'D3 o D'D3) se enlaza a FVIII usando un método de ligación de proteína in vitro mediada por sortasa. En un ejemplo, el motivo de reconocimiento Staphylococcus aureus sortasa A (LPXTG) se introdujo en el C-terminal del fragmento de VWF y el residuo Gly(n) en el N-terminal de FVIII (cuando la cantidad de residuos de glicina es variable) . La molécula de FVIII usada puede ser ya sea cadena simple o cadena doble. La reacción de transpeptidación catalizada con sortasa enlazará covalentemente el fragmento de VWF a FVIII. La orientación inversa de motivo de reconocimiento puede también usarse para enlazar estas dos proteínas, donde tenemos FVIII en el N-terminal con motivo LPXTG y fragmento de VWF en el C-terminal con Gly(n) (Véase la Figura 24- ejemplo de ligación de sortasa para referencia) . El motivo LPXTG y residuos de glicina pueden remplazarse por otras secuencias de reconocimiento de sortasa.
El fragmento de VWF que contiene proteína de fusión a Fe de secuencia de reconocimiento de sortasa A también se llevó a cabo. Para las construcciones de fusión Fe, el fragmento de VWF D1D2D' D3 se fusionó con la región Fe de IgG a través de un enlazador GS que contiene una secuencia de reconocimiento de sortasa y un sitio de escisión de trombina (Tabla 15 y 16) . Una vez que la proteína se expresa y purifica en la columna de Proteína A, la región Fe puede retirarse por
escisión de trombina. El fragmento de VWF resultante con sitio de reconocimiento de sortasa A puede luego usarse para la ligación con molécula de FVIII (Figura 24- Ejemplo de ligación de sortasa para referencia - fila E) .
pSYN-VWF-051 tiene un enlazador de 54 aminoácidos con sortasa y sitio de trombina entre el fragmento de VWF y la región Fe. La síntesis del fragmento de ADN que codifica el enlazador de 54 aminoácidos (ISGGGGSGGG GSGGGGSGGG GSGGGGSGGG GSLPETGALR PRWGGGGSG GGGS) (SEQ ID NO: 98) y una parte de la región Fe se externalizaron (número de secuencia Genewiz 10-210746313, que se muestra más adelante). Un fragmento de la construcción Genewiz se subclonó en pSYN-VWF-031 digerido con EcoRV/RsRII .
n.° de secuencia Genewiz 10-210746313 (SEQ ID NO: 99) AGGAGCCGATATCTGGCGGTGGAGGTTCCGGTGGCGGGGGATCCGGCGGTGGAGGT TCCGGCGGTGGAGGTTCCGGTGGCGGGGGATCCGGTGGCGGGGGATCCTTACCTGAAACTG GAGCCCTGCGGCCCCGGGTCGTCGGCGGTGGAGGTTCCGGTGGCGGGGGATCCGACAAAAC TCACACATGCCCACCGTGCCCAGCTCCAGAACTCCTGGGCGGACCGTCAGTCTT
La secuencia de la pentaglicina de N-terminal que contiene FVIII de cadena simple se muestra en la Tabla 17 y 18.
Tabla 15: Secuencia de nucleótidos de pSYN-VWF051 (VWF DlD2D'D3Fc con motivo de reconocimiento de sortasa A y enlazador escindible por trombina entre el fragmento de VWF y Fe) (SEQ ID NO: 100)
1 ATGATTCCTG CCAGA.TI GC CGGGGTGCTG CI GCTCTGG CCCTCATTIT
51 GCCAGGGACC C ITCTGCAG AAGGAACTCG OGGCAGGTCA TCCA03GCTC
101 GA GCAGCCT TTTO3GAAGT GACTICCTCA ACACC TTGA TGCIGAGGA. G
151 TACAGCTI G CGGGATACTG CACOTACCTC CTGGCAGGGG GCTGCCAGAA 201 A03CTCCTTC TCGATTA1TG GGGACTTCCA GAATGGCAAG AGAGTGAGCC
251 TCTCCGTCTA TC TGGGGAA TTITrTGACA TCCATTTGTT GTCAATGGT
301 ACCGTGACAC AGGGGGACCA AAGAGTCTCC ATCCCCTATG CCTCCAAAGG
351 CXnGTATCTA GAAACTGAGG CTCGGTACTA CAAGCTGTCC GGTGAGGCCT
401 ATGGCTTTGT GGCCAQGATC GATGGCAGCG GCAACTTTCA AGTCCTGCTG 451 TCAGACAGAT ACTTCAACAA GACC GOGGG CICTCTGGCA ACTTTAACAT
501 CITIOCTGAA GATGACTTTA TGACCCAAGA AGGGACCTTG ACCTCGGACC
551 C TATGACTT TOCX AACTCA TCGGCTCTGA GCAGTGGAGA ACAGTGGTGT
601 GAACGGGCAT CTCCTCCCAG CMCTCATGC AA(_ATCTCCT CTGGGGAAAT
651 GCAGAAGGGC IGIGGGPG AGIOCCAGCT TCTCAAGAGC ACX CGGTGT 701 TTGCOX3CTG CC^CCCTCTG GTGGACCCCG AGCOTTTGT GGCXTIGTGT
751 GAGAAGACTT TCTGTGAGTG TGCTGGGGGG CTGGAGTGOG CXJIX^CCTGC
801 CCTCCTGGAG TACGCCCGGA OTIX5IOCCCA GGAGGGAATG GTGCTGTACG
851 GCraGACCGA CCACAGCGOG TGCAGCCCAG TGTGCCCTGC TGGTATGGAG
901 TATAGGCAGT GTGTCICCCC T1OGGCCAGG ACCTGCCAGA GCC GCACAT 951 CAATGAAATG lOTCAGGAGC GATGCGTGGA TGGCTGCAGC TGCCC GAGG
1001 GACAGCTCCT GGATGAAGGC CTCTGCGTGG AGAGCACCGA GTGTCCCTGC
1051 GTGCATTCCG GAAAGCGCTA CD rcCOGGC ACCICCCTCT CTCGAGACTG
1101 CAACACCTGC ATTTCCCGAA ACAGCCAGTG GATCTGCAGC AATGAAGAAT
1151 CflCClAGGGGA CTTC CTTGTC AOTGGTCAAT CCCACTTCAA GACK TTGAC 1201 AACAGATACT TCACC TCAG TGGGATCTGC CACTACCTGC TGGCCCGGGA
1251 T GCCAGGAC CACTCCITCr CCATTGTCAT TGAGACTGTC CAGTCTGCIG
1301 ATGACCGCGA CGCTGTG GC AC8GCTCCG TCACCX3TCCG GCTGCCTGGC
1351 CIOCACAACA GCC TG GAA ACTGAAGCAT GGGGCAGGAG TTGCCATGGA
1401 GGCCAGGAC ATCCAG TCC CCCTCCTOAA AGGTGACCTC OGCATCCAGC 1451 ATACACTGAC GGCCTCCGTG CGCCICAGCT ACX3GGGAGGA COTGCAGA G
1501 GACTCGGATG GCQGOGGGAG &CTGCTGGTG AAGCTGTCCC CCX3 TA GC
1551 QGQGAAGACC TGC3GCCTGT GTGGGAATTA CAA QGCAAC CAQOGGGAGG
1601 ACTTCCI AC CCCSZTCTGGG CTGGCGGAGC CCCX3GGTGGA GGACTTOGGG
1651 AACGCCIGGA AGCIGCACGG GGACTGCCAG GACCTGCAGA AGCAGCACAG 1701 CX3ATCCCTGC GCCCTCAACC OGCGCATGAC CAGGTTCTCC GAGGAGGOGT
1751 GCGGGGTCCT GACCTCCCCC ACATTCGAGG C!CIOCCATCG GCGGTCAGC
1801 CnXTCCCCT ACCTGOGGAA CTGCCGCTAC GACGTGTGCT CCTGCTCGGA
1851 OGGCCGGGAG GCC G GCG GCX3CCCTGGC CAGCTATGCC GCGGCCTGCG
1901 CGGGGAGAGG QGTGCGGGTC GCGTGGCGCG AGCCAGGCGG TG GAGCTG 1951 AACTGCCCGA AAGGCCAGGT GTACCTGCAG TGG3GGACCC COGCAACCr
2001 GACCTGCOGC TCTCTCTCTT ACCC3GGATGA GGAATGCAAT GAGGCCTGCC
2051 TGGAGGGCTG CITCrGCCCC CCAGGGCTCT ACATGGA GA GAGGGGGGAC
2101 TGCGTGCCCA AGGCCCAG G CCCCTGTTAC TATGACGGTG AGATCI CCA
2151 GCCAGAAGAC ATCTTCTCAG ACCATCACAC CATG GCTAC TGTGAGGATG 2201 GCITCA GCA CTG ACCA G AG GGAGTCC CGGGAAGCIT GCIGCCTGAC
2251 GCIGTCCTCA GCAGTCXTCCT GTCTCATQGC AGCAAAAGGA GCCTATCCTG
2301 TGGGCCCCCC A GGTCAAGC GG GTGTCC CX3CTGACAAC CIGCGGGCTG
2351 AAGGGCIOGA G GTACCAAA AGG GCCAGA ACTATGACCT GGAG GCA G
2401 AGCATGGGCT GTGTCTCTGG CIGCCTCTGC CCnXGGGCA TGGTCGGGCA 2451 TGAGAACAGA TCTGTGGCCC TGGAAAGGTG TCCCTGCTTC CATCAGGGCA
2501 AGGAGTA GC CCCTGGAGAA ACACTGAAGA TTGGCTGCAA CACTTGTGTC 2551 TGTOGGGACC GGAAGTGGAA CTGCACAGAC CATGTGTGTG ATGCCACGTG 2601 CTCCACGATC GGCATGGCCC ACTACCTCAC CTTGGACGGG CTCAAATACC 2651 TGTTCCCCGG GGAGTGCCAG TAOGTTCTGG TGCAGGATTA CIGGGGCAGT 2701 AACCCTGGGA CCTTTC3GGAT GCTAGTGGGG AATAAGGGAT GCAGC-ACCC 2751 CTCAGTGAAA TGCAAGAAAC GGGTCACCAT CCTGGTGGAG GGAGGAGAGA 2801 T GAGCIGTT TGAOGGGGAG GTGAATGTGA AGAGGCCCAT GAAGGATGAG 2851 ACTCACTTTG AGGTCGTGGA GTCTGGCCGG TAC_¾TCATTC TGCTGCTGGG 2901 CAAAGCCCTC TCCGTGGTCT GGGACGGCCA CCTGAGCATC TCCXJTGGTCC 2951 TGAAGCAGAC ATACCAGGAG AAAGTGTGTG GCCTGTGTGG GAATITTGAT 3001 GGCATCCAGA ACAATGACCT CACX^LGCAGC AACCTCCAAG TOGAGGAAGA 3051 CCCTG GGAC TTTGGGAACT CCTGGAAAGT GAGCTGGCAG TGTGCTGACA 3101 CCAGAAAAGT GCCTCTGGAC TCATCCCCTG C ^CCTGCCA TAACAACATC 3151 ATGAAGCAGA CGAIGGTGGA TTCCTCCTGT AGAATCCTTA CC33TOAOGT 3201 C TCCAGGAC TGCAACAAGC TGGTGGACCC GGAGCCATAT CTGGATGTCT 3251 GCAITTACGA CACCTGCTCC TGTGACTCCA TTGGGGACTG GGCCX3CATTC 3301 TGCGACACCA T GCTGCCTA TGCCCAGGTG TGTGCCCAGC ATGGCAAGGT 3351 GGTGACCTGG AGGAGGGCCA CATIGTGCCC CCAGAGCTGC GAGGAGAGGA 3401 ATCTCCXJGGA GAACGGGTAT G GGCTGAGT GGGGCTATAA CAGCTCTGCA 3451 CCTGCCTGTC AAGTCACGTG TCAGCACCCT GAGCCACTGG CC GCCCTGT 3501 GCAG GTG G GAGGGCTGCC ATGCCCACTG CCCTCCAGGG AAAATCCIGG 3551 ATGAGCriTT GGAGACCTGC GTTGACCCTG AAGACTGTCC AGTGTGTGAG 3601 GTGGCTGGCC GGOGTTTTGC CTCAGGAAAG AAAGTCAGCT TGAATCCCAG 3651 GACCCTGAG CACTGCCAGA TTTGCCACTG T^TGT TC AACCTCACCT 3701 G GAAGCC G Cra_X2L¾GCOG ATATCTGGGG GTGGAGGTTC GGGTGGCGGG
3751 GGATCCGGCG G GGAGGTTC OGGOGCTGGA GGT CCGG G GCGGGGGA C
3801 CGGTGGGGGG GGATCCTTAC CTGAAACTGG AGCCCTGCGG CCCCGGGTCG
3851 TCGGCGCTGG AGGTTCGGCT GGGGGGGGAT CCGACAAAAC TCACACATGC
3901 CCACCGTGCC C¾GCTC!CAGA ACTCCTGGGC GGACOG CAG TC TCCTCTT 3 51 CCCCeCAAAA CCCAAGGACA CCCTCA GAT CT(XH3GACC CTTGAGGTCA
4001 CATGCG GGT GG GGAGGTG AGCCACGAAG ACCCTGAGGT CAAGTTCAAC
4051 TGGTACGTGG ACQGCG GGA GG GCATAAT GCCAAGACAA AGCGG03GGA
4101 GGAGCAGTAC AACAGCAQGT ACCG GTGGT CAGOG CCTC AC!CGTCCTGC
4151 ACCAGGACTG GCTGAATGGC AAGGAGTACA AGTGCAAGGT CTCCAACAAA 4201 GCOCTCCCAG CCCCCATCGA GAAAACCATC TCCAAAGCCA AAGGGCAGCC
4251 CCGAGAACCA CAGGTGTACA CXTCTGCCCCC ATCCCGGGAT GACCTGACCA
4301 AGAACCAGGT CAGCCTGACC TGCCTGGTCA AAGGCTTCTA TCCCAGCGAC
4351 ATCGC -JTGG AGTGGGAGAG CAATC^GGCAG CCGGAGAACA ACTACAAGAC
4401 C^CGCCTCCC GIUTTGGACT CO3A03G TC LTIUITCCTC TACAGCAAGC 4451 TCACICGTGGA CAAGAGCAGG TGGCAGCAGG GGAACGTCTT CTCATGCTCC
4501 GTGATGCATG AGGCTCTGCA CAACCACTAC ACX3CAGAAGA GCCTCTCCCT
4551 GTCnXXGGGT AAATGA
Tabla 16: Secuencia de proteínas de VWF051 (VWF DlD2D'D3Fc con motivo de reconocimiento de sortasa A y enlazador escindible por trombina entre el fragmento de VWF y
Fe; sitio de sortasa A mostrado en negrita) (SEQ ID NO: 101)
1 MIPARFAGVL LALALILPGT I1CAEGTRGRS STARCSLFGS DFV TFDGSM
51 YSFAGYCSYL LAGGCQKRSF SIIGDFONGK RVSLSVYLGE FFDIHLFVNG
101 TVTQGDQRVS MPYASKGLYL ETEAGYYKLS GEAYGFVARI DGSGNFQVLL 151 SDRYF KTCG IJCX3NF IFAE DDFMTQEGTL TSDPYDFANS WALSSGEQWC
201 ERASPPSSSC NISSGEMQG LWEQCQLLKS TSVFARCHPL VDPEPFVALC
251 EKTLCECAGG LECACPALLE YARTCAQEGM VLYGWTDHSA CSPVCPAGME
301 YRQCVSPCAR TCQSLHINEM QQERCVDGCS CPEGQLLDEG LCVESTECPC
351 VHSGKRYPPG TSLSRDCNTC ICRNSQWICS NEECPGECLV TGQSHFKSFD 401 NRYFTFSGIC QYLLARDCQD HSFSIVIETV QCADDRDAVC TRSVTVRLPG
451 LHNSLVKLKH GAGVAMDGQD IQLPLLKGDL RIQHTVTASV RLSYGEDLQ
501 DWDGRGRLLV KLSPVYAGKT CGLCGNYNGN QGDDFLTPSG LAEPRVEDPG
551 NAWKLHGDCQ DLQKQHSDPC ALPRMTRFS EEACAVLTSP TFEACHRAVS
601 PLPYLRNCRY DVCSCSDGRE CLCGALASYA AACAGRGVRV AWREPGRCEL 651 NCPKGQVYLQ CGTPCLTCR SLSYPDEEC EACLEGCFCP PGLYMDERGD
701 CVP AQCPCY YDGEIPQPED IFSDHHTMCY CEDGFHCIM SGVPGSLLPD
751 AVLSSPLSHR SKRSLSCRPP MVKLVCPADN IRAEGLECTK TCQNYDLECM
801 SMGCVSGCLC PPGMVRHENR CVALERCPCF HQGKEYAPGE TVKIGCNTCV
851 CRDRKNCTD HVCDATCSTI GMAHYLTFDG LKYLFPGECQ YVLVQDYCGS 901 NPGTFRILVG NKGCSHPSVK CKKRVTILVE GGEIELFDGE VNVKRPMKDE
951 THFEWESGR YIILLLGKAL SWWDRHLSI SVVLKQTYQE KVCGLCGNFD
1001 GIQNNDLTSS NLQVEEDPVD FGNSWKVSSQ CADTRKVPLD SSPATCHN I
1051 MKQTMVDSSC RILTSDVPQD CNKLVDPEPY LDVCIYDTCS CESIGDCAAF
1101 CDTIAAYAHV CAQHGKVVTW RTATLCPQSC EERNLRENGY EAEWRYNSCA 1151 PACQVTCQHP EPLACPVQCV EGCHAHCPPG KILDELLQTC VDPEDCPVCE
1201 VAGRRFASGK KVTLNPSDPE HCQICHCDW NLTCEACQEP ISGGGGSGGG
1251 GSGGGGSGGG GSGGGGSGGG GSLPETGALR PRWGGGGSG GGGSDKTHTC
1301 PPCPAPELLG GPSVFLFPPK PKDTLMISRT PEVTCVWDV SHEDPEVKFN
1351 WYVDGVEVHN AKTKPREEQY NSTYRWSVL TVLHQDWLNG KEYKCKVSNK 1401 ALPAPIEKTI SKAKGQPREP QVYTLPPSRD ELTKNQVSLT CLVKGFYPSD
1451 IAVEWES GQ ?? ??G??? VLDSDGSFFL YSKLTVDKSR WQQGNVFSCS
1501 VMHEALH HY TQKSLSLSPG K*
Tabla 17: Secuencia de nucleótidos de FVIII 265 (molécula de cadena simple de FVIII con pentaglicinas en el N-terminal) (SEQ ID NO: 102)
1 ATGCAAATAG AGCTCTCCAC CIGC TCTTT CIGTGCCTTT TGCGATTCTG
51 CITTAGTGGA GGAGGAGGAG GAGCCACCAG AAGATACTAC CTGQG GCAG
101 TGGAACTGTC ATGGGACTAT ATGCAAAGTG ATCTC3GG GA GCTGCCTGTG
151 GLACGCAAGAT ITCCTCCTAG AGTGCCAAAA TCTTITCCAT TCAACACCTC 201 AGTQGTGTAC AAAAAGACTC TGTTTGTAGA ATTCACGGAT CACOTTTCA
251 ACATCGCTAA GCCAAGGCCA CCCTGGATGG GTCTGCTAGG TCCTACCATC
301 CAGGCTGAGG TTTAGATAC AGTGGTCATT ACACTTAAGA ACATGGCTTC
351 CCATCCTGTC AGTCTTCAG CIOTTGGTGT ATCC ACTGG AAAGCTTCTG
401 AGGGAGCTGA ATATCATGAT CAGACXZACTC AAAGGGAGAA AGLAAGATGAT 451 AAAGTCrrcC CTGGTGGAAG CGATACATAT GTCTGGCAGG TCCTGAAAGA
501 GAATGGTCCA ATGGCCTCTG ACCCACTGTG CCTTACCTAC TCATATCTTT
551 CTCATGTGGA CCTGGTAAAA GAC TGAATT CAGGCCTCAT TGGAGCCCTA
601 CTAGTATGTA GAGAAGGGAG TCTGGCCAAG GAAAAGACAC AGACCTTGCA
651 CAAATTTATA CTACTITTTG CTGTATTTGA TGAAGGGAAA AGTTGGCACT 701 CAGAAACAAA GAACTCCTTG ATGCAGGATA GGGATGCTGC ATCTGCTCGG
751 GCCTGGCCTA AAATGCACAC AGTCAATGGT TATGTAAACA GGTCTCTGCC
801 AGGTCTGATT GGATGCCACA GGAAATCAGT CTATTGGCAT GTGATTGGAA
851 TGGGCACCAC TCCTGAAGTG CACTCAATAT TCCTCGAAQG TCACACATTT
901 CTIGTGAGGA AC(_ATCGCCA GGCGTCCTTG GAAATCTCGC CAATAACTTT 951 CCTTACTGCT (^ ^CACTC TGATGGACCT TGGACAGTTT CTAC GTTTT
1001 GTCATATCTC TTO ACCAA CATGATGGCA TGGAAGCTTA TGTCAAAGTA 1051 GACAGCDGTC CAGAGGAACC CCAACTACGA ATGAAAAATA ATGAAGAAGC 1101 GGAAGACTAT GATGATGATC TTACTGATTC TGAAATGGAT GTGGTCAGGT 1151 ITGATGATGA CAACTCTGCT TCCITTATCC AAATTCGCTC AGTTGCCAAG 1201 AAGCATCCTA AAACTIGGGT ACATTACATT GCTGCTGAAG AGGAGGACTG 1251 GGACTAGCT CCCTTAGTCC TCGCCCCCGA TGACAGAAGT TATAAAAGTC 1301 AATATTTGAA CAATGGCCCT CAGCGGATTG GTAGGAAGTA CAAAAAAGTC 1351 C3GATI ATGG CATACACAGA TG&AACCTTT AAGACTCGTG AAGCTATTCA 1401 GCAGAATCA GGAATCTTGG GACCTTTACT TTATGGGGAA GTTGGAGACA 1451 CACTGTTGAT TATATTTAAG AATCAAGCAA GCAGACCATA TAACATCTAC 1501 CCICACGGAA TCACIOATGT CCCKXTTTG TATTCAAGGA GATTACCAAA 1551 AGGTGTAAAA CATTTGAAGG ATITTCCAAT TCTGCCAGGA GAAATATTCA 1601 AATATAAATG GACAGTGACT GTAGAAGATG GGCCAACTAA ATCAGATCCT 1651 OGGIXXCTGA CCGGCTATTA CTCTAGTTTC GTTAATATGG AGAGAGATCT 1701 AGTTCAGGA CTCATTGGCC CTCTCCTCAT CTGCTACAAA GAATCTGTAG 1751 ATCAAAGAGG AAACCAGATA ATGTCAGACA AGAGGAATGT CAT(XTGTTT 1801 TCTGTATTTG ATGAGAACCG AAGCTGGTAC CTCACAGAGA ATATACAACG 1851 CTTICTCCCC AATCCAGCTG GAGTGCAGCT TGACGATCCA GAGTTCCAAG 1901 CCTCCAACAT CATGCACAGC ATCAATGGCT ATGTTITTGA TACf TGCAG 1951 TTGTCAGTTT GTTTGCATGA GGTGGCATAC TGGTACATTC TAAGCATTGG 2001 AGCACAGACT GACTTCCTTT CTGTLTIL I' CTCIOGATAT ACCTTCAAAC 2051 ACAAAATGGT CTATGAAGAC ACACTCACCC TATTCCCATT CTCAGGAGAA 2101 ACTGTCTTCA TGTCGATGGA AAACCCAGGT CTATGGATTC TGGGGTGCCA 2151 CAACTCAGAC TTTCGGAACA GAGGCATGAC CGCCTTACTG AAGGTTTCTA 2201 GTGTGACAA GAACACTGGT GATTATTACG AGGACAGTTA TGAAGATATT
2251 TCAGCATACT TGCTGAGTAA. AAACAATGCC ATIGAACCAA GAAGCITCTC
2301 TCAAAACCCA CX^GTCI GA AGGCCCATCA GGGGGAAATA ACTGGTACTA
2351 CTCTTCAGTC AGATCAAGAG GAAATTGACT AGAGATAC CATATCAGTT
2401 GAAAGAAGA AGGAAGATTT TGACATTTAT GATGAGGAG AAAATCAGAG 2451 CCCCQGGAGC I TCAAAAGA AAACACGACA CTATTTTATT GCTGCAGTGG
2501 AGAGGCTCG GGATTAGGG AGAGTAGCT CCCCACATGT TCTAAGAAAC
2551 AGGGCTCAGA GTCGGAGGT ( CTCAGTTC AAGAAAGTTG TTTTCCAGGA
2601 ATTTACTGAT GGCTCCTI A CTCAGCCCIT ATAC03TGGA GAACTAAATG
2651 AACATITGGG CCTCCTGGGC CCATATATAA GAGCAGAAGT GAAGATAAT 2701 ATCATGGTAA CITrCAGAAA TCAGGCCTCT GGTCGCTATT CCTTCTATTC
2751 TAGCCTTATT TCTTAGAGG AAGATCAGAG GGAAGGAGCA GAACCTAGAA
2801 AAAACTITGT CAAGCCTAAT GAAACCAAAA CTTACTTTTG GAAAGTGCAA
2851 CATCATATGG CACCCACTAA AGATGAGTTT GACTGCAAAG CCTX3GGCTTA
2901 TTTCTCTGAT GTTGACCTGG AAAAAGATGT GCACTCAGGC CIGATTGGAC 2951 CCCTTCIGGT CTGCCACACT AACACACTGA ACCCTGCTCA TQGGAGACAA
3001 GTGACAGTAC AGGAATTTGC TCTGTTTTTC ACCATCTTTG ATGAGACCAA
3051 AAGCTGGTAC TTCACTGAAA ATATGGAAAG AAACTGCAGG G TCCCTGCA
3101 ATATCCAGAT GGAAGATCCC ACTTTTAAAG AGAATTATCG CTTCCATGCA
3151 ATCAATGGCT ACATAATGGA TACACTACCT GGCTTAGTAA TGGCTCAGGA 3201 TCAAAGGATT CGATGGTATC TGCTCAGCAT GGGCAGCAAT GAAAACATCC
3251 ATTCTATTCA TTTCAGTGGA CATGTGTTCA CTCTACGAAA AAAAGAGGAG
3301 TATAAAATGG CACTGTACAA TCTCTATCCA GGTGTTTTTG AGACAGTGGA
3351 AATGTTACCA TCCAAAGCTG GAATTTGGCG GGTGGAATGC CTTATTGGCG
3401 AGCATCTACA TGCTCGGATG AGCACACTTT TTCK3GTGTA CAGCAATAAG 3451 TCTCAGACTC CCCTGGGAAT GG YTCTGGh CACATTAGAG ATTTTCAGAT
3501 TACAGC TCA GGACAATAG GACAGTGGGC CCCAAAGCTG GCCAGA.CTC
3551 ATTATTCCGG ATCAATCAAT GCCTGGAGCA CO^GGAGCC CTITK TGG
3601 ATCAAGGTGG ATCTGTTQGC ACCAATGA.TT ATTCACGGCA TCAAGACCCA
3651 GGGTGCCCGT CAGAAGTTCT CX_AGCCTCTA CATCTCTCAG TITATCATCA 3701 TGTATAGTCT TGATGGGAAG AAGTGGCAGA CTTATCGAGG AAATTCCACT
3751 GGAACCTTAA TGGTCTTCTT TGC<!AATGTG GATTCATCTG GGATAAAACA
3801 CAATA'LTL'LT AACCCTCCAA TTATTGCTCG ATACATCCGT TTGCACCCAA
3851 CTCAT ATAG CATTOI ^GC ACIX-TTOGCA TGGAGTTGAT GGCCTGTGAT
3901 TTAAATAGTT GCAGCATGCC ATTGGGAATG GAGAGTAAAG CAATATCAGA 3951 TGCACAGATT ACTGCTTCAT CCTACTTTAC CAATATGTTT G< 1ACCTGGT
4001 CTCCTTCAAA AGCTCGACTT (^CCTCCAAG GGAGGAGTAA TGCCTGGAGA
4051 CCTCAGGTGA ATAATCCAAA AGAGTGGCTG CAAGTGGACT TCCAGAAGAC
4101 AATGAAAGTC ACAGGAGTAA CTACTCAGGG AGTAAAATCT CTGCTTACCA
4151 GCATGTATGT GAAGGAGTTC CTCATCTCCA GCAGTCAAGA TGGCCATCAG 4201 TGGACTCTCT TTTTTCAGAA TGGCAAAGTA AAGGTTTTTC AGGGAAATCA
4251 AGACTCCTTC ACACCTGTGG TGAACTCTCT AGAC AOG TTACTGACTC
4301 GCTACCTTCG AATTCACCCC CAGAGTTGGG TGCACCAGAT TGOX GAGG
4351 ATGGAGGTTC TGGGCTGCGA GGCACAGGAC CT TACTGA
Tabla 18: Secuencia de proteínas de FVIII 265 (molécula de cadena simple de FVIII con pentaglicinas en el N-terminal; la pentaglicina se muestra en negrita) (SEQ ID NO: 103)
1 MQIELSTCFF LCLI-RFCFSG GGGGATRRYY LGAVELSWDY MQSDLGELPV
51 DAFPPRVPK SFPFNTSWY KKTLFVEFTD HLFNIAKPRP PMV LLGPTI
101 OAEVYDT I TLKNMASHPV SLHAVGVSYW KASEGAEYDD CTSQREKEDD 151 KVFPGGSHTY VWQVL EGP MASDPLCLTY SYLSHVDLVK DLNSGLIGAL
201 LVCREGSLAK EKTQTLHKFI LLFAVFDEGK SHSETKNSL MQDRDAASAR
251 APKMHTV G YV RSLPGLI GCHRKSVYWH VIGMGTTPEV IKIFLEGHTF
301 LVRNHRQASL EISPITFLTA Q LLMDLGQF LLFCHISSHQ HDGMEAYVKV
351 DSCPEEPQLR MKNNEEAEDY DDDLTDSEMD WRFDDDNSP SFIQIRSVAK 401 KHPKTWVHYI AAEEEDWDYA PLVLAPDDRS YKSQYLNNGP QRIGRKYKKV
451 RFMAYTDETF KTREAIQHES GILGPLLYGE VGDTLLIIFK NQASRPYNIY
501 PHGITDVRPL YSRRLPKGVK HLKDFPILPG EIFKYKWTVT VEDGPTKSDP
551 RCLTRYYSSF VNMERDLASG LIGPLLICYK ESVDQRGNQI MSDKRNVILF
601 SVFDENRS Y LTENIQRFLP NPAGVQLEDP EFQASNIMHS I GYVFDSLQ 651 LSVCLHEVAY WYILSIGAQ DFLSVFFSGY TFKHKMVYED TLTLFPFSGE
701 TVFMSMENPG LWILGCHNSD FRNRCMTALL KVSSCDKN G DYYEDSYEDI
751 SAYLLSKNNA IEPRSFSQNP FVLKAHQAEI TRTTLQSDQE EIDYDDTISV
801 EMKKEDFDIY DEDENQSPRS FQK TRHYFI AAVERLWDYG MSSSPHVLRN
851 RAQSGSVPQF KKWFQEFTD GSFQPLYRG ELNEHLGLLG PYIRAEVEDN 901 IMVTFRNQAS RPYSFYSSLI SYEEDQRQGA EPRKNFVKPN ETKTYFWKVQ
951 HHMAPTKDEF DCKAWAYFSD VDLEKDVHSG LIGPLLVCHT NTLNPAHGRQ
1001 VTVQEFALFF TIFDETKSWY FTENMERNCR APCNIQMEDP TFKENYRFHA
1051 INGYIMDTLP GLVMAQDQRI RWYLLSMGSN ENIHSIHFSG HVFTVRKKEE
1101 YKMALYNLYP GVFETVEMLP SKAGIWRVEC LIGEHLHAGM STLFLVYSNK 1151 CQTPLGMASG HIRDFQITAS GQYGQWAPKL ARLHYSGSIN AWSTKEPFSW
1201 IKVDLLAPMI IHGIKTQGAR QKFSSLYISQ FIIMYSLDGK IWQTYRGNST
1251 GTLMVFFGNV DSSGIKHNIF NPPIIARYIR LHPTHYSIRS TIJ^LMGCD
1301 LNSCSMPLGM ESKAISDAQI TASSYFTNMF ATWSPSKARL HLQGRSNAWR
1351 PQVNNPKEWL QVDFQKTMKV TGVTTQGVKS LLTSMYVKEF LISSSQDGHQ 1401 WTLFFQNGKV KVPQGNQDSF TPWNSLDPP LLTRYLRIHP QSWVHQIALR
1451 MEVLGCEAQD LY*
Ejemplo 20: Estabilidad en plasma y PK de FVIII198 en plasma con doble inactivación (DKO) de FVIII/VWF y HemA
La estabilidad en plasma de FVIII 198 (que es un dominio B parcial que contiene molécula-226N6 de FVIIIFc de cadena simple; donde 226 representa 226 aminoácidos de N-terminal de dominio B de FVIII y N6 representa seis sitios de N-glicosilación en el dominio B) se comparó con FVIIIFc de cadena simple (FVIII 155/Fc) en plasma con doble inactivación (DKO) de FVIII/VWF. La representación esquemática de FVIII155 y FVIII198 puede verse en la Figura 25.
Para el ensayo de estabilidad, se incubaron 5 IU/ml de proteínas FVIII 198 o FVIIIFc con ratón o plasma DKO a 37°C. Las alícuotas se recogieron en diferentes puntos de tiempo para medir la actividad del ensayo cromogénico de FVIII. La actividad en cada punto de tiempo se midió en duplicado y se gráfico la actividad promedio en función del tiempo. En el ensayo de estabilidad, la presencia de dominio B parcial aumentó la estabilidad de FVIIIFc de cadena simple (Figura 26A) .
La semivida de FVIII 198 (B226N6 de cadena simple) también se comparó con FVIII155 (FVIII con dominio B eliminado de cadena simple) en ratones DKO. FVIII 198 tiene una semivida al menos alrededor de 1.5 veces más larga en comparación con FVIII155 (Figura 26B) . Estos experimentos
sugieren que puede haber una correlación entre la estabilidad de FVIII y su semivida in vivo.
Secuencia de nucleótidos de FVIII198 (FVIIIFc con dominio B parcial, 226N6) (SEQ ID NO: 104)
1 AGCAAAAG AGCTCTCCAC CTG l L'l'lT TGTGC T T TCCGATTCTG
51 C TTAGGCC ACCAGAAGAT ACTAOCTGGG TGCAG GGAA CTGTCAGGG
101 ACTATAGCA AAGTGATCTC GGTGAGCTGC CTGGGACGC AAGATI CCT
151 CCTAGAGGC C-AAAATCTTT TCCAITCAAC ACCTCAGTOG TGACAAAAA
201 GACTCIGTTT GTAGAATTCA CX-GATCACCT TITCAACATC GCTAAGCCAA 251 GGCCACCCTG GAGGGTCTG CTAGGTCCTA CCATCCAGGC TGAGGTTTAT
301 GATACAGGG TCATTACACT TAAGAACAG GCTTCCCATC TGTAGT
351 TCAIGCTGTT GGGTATCCT ACTGGAAAGC TTCTGAGGGA GCIGAATATG
401 AGATCAGAC CAGTCAAAGG GAGAAAGAAG ATGATAAAGT CTTCX-CTGGT
451 GGAAGCCATA CATAGTCTG GCAGGTCCTG AAAGAGAATG GTCCAATGGC 501 CTCIGACCCA CIGTGCCTTA CCTACTCATA TC I CTCAT GTGGACCTGG
551 TAAAAGA TT GAATTCAGGC CTCATTGGAG CCCTACTAGT AGAGAGAA
601 GGGAGTCTGG CCAAGGAAAA GACACAGACC T GCACAAAT TTATACTACT
651 TITTGCTGTA TTGAGAAG GGAAAAGTG GCACTCAGAA ACAAAGAACT
701 CCTTGATGCA GGATAGGGAT GCIGCATCTG CTCX3GGCCTG GCCTAAAATG 751 CACACAGTCA ATGGTTAGT AAACAGGTCT CIGCCAGGTC TGATTGGATG
801 CCACAGGAAA TC!AGTCTATT GGCAGTGAT GGAAGGGC ACCACTCCTG
851 AAGTGCACTC AATATTCCTC GAAGGTCACA CA ITCTTGT GAGGAACCAT
901 CGCCAGGGGT CCTTGGAAAT CTCGCCAATA ACTTTCCTTA CGCTCAAAC
951 ACTCTTGATG GACCTTGGAC AGTTTCTACT Gl'll'lGTCAT ATCTCTTCCC 1001 ACCAACATGA TGGCATGGAA GCTTATGTCA AAGTAGACAG CTGTCCAGAG
1051 GAACCCCAAC TACGAATGAA AAATAATGAA GAAGCGGAAG ACTATGATGA 1101 TOATCTTACT GA TCTGAAA TGGATCTGGT CAGGTTTGAT GATGACAACT 1151 rc rc n TATCCAAATT Q3CK2nTTG CCAAGAAGCA TCCTAAAACT 1201 TGGGTACATT AC^TTGCTGC TGAAGAGGAG GtACIGGGACT ATGCTCCCTT 1251 AGTCCTCGCC CCCGATGACA GAAGTTATAA AAGTCAATAT TTGAACAATG 1301 GCCCTCAGCG GATTGGTAGG AAGTACAAAA AAGTCCGATT TATGGCATAC 1351 ACAGA GAAA CCTTTAAGAC TCGTGAAGCT ATTCAGCATG AATCAGGAAT 1401 CITGGGACCT TTACTTTATG GGGA GTTGG AGACACACTG TTGATTATAT 1451 TTAAGAATCA AGCAAGCAGA CCATATAACA TCTACCCTCA CGGAATCACT 1501 GATGTCCGTC CTTTGTATTC AAGGAGATTA C ^AAAGGTG TAAAACATTT 1551 GAAGGATn CC^TTCTGC CAGGAGAAAT ATTCAAATAT AAATGGACAG 1601 TGACTGTAGA AGATCGGCCA ACTAAATCAG ATCCTCGGTG CCTGACCCGC 1651 TATTACTCTA GI TCGTTAA TATGGAGAGA GATCTAGCTT CAGGACTCAT 1701 TGGCCCTCTC C CATCTGCT ACAAAGAATC TCTAGATCAA AGAQGAAACC 1751 AGATAA GTC AGACAAGAGG AATGTCATCC TG I ICTGT ATTTGATGAG 1801 AACCGAAGCT GGTACCTCAC AGAGAATATA CAACGCTTTC TO CAATCC 1851 AGCTGGAGTG CAGCTTGAGG ATCCAGAGTT CCAAGCSCTCC AACATCATGC 1901 ACAGCATCAA TGGCTATGTT TTTGATAGTT TGCAGTTGTC AGTTTGTTTG 1951 CATGAGGTGG CATACTGGTA CATTCTAAGC ATTGGAGCAC AGACTGACTT 2001 CCTTTCTGTC TTCTTCTCTG GATATACCTT CAAACACAAA ATGGTCTATG 2051 AAGACACACT CACCCTATTC CCATTCTCAG GAGAAACTGT C TCATGTCG 2101 ATGGAAAACC CAGGTCTATG GATTCTGGGG TGCCACAACT CAGIAC ITCG 2151 GAACAGAGGC ATGACCGCCT TACTGAAGGT TTCTAGTTGT GACAAGAACA 2201 CIGGTGATTA TTACGAGGAC AGTTATGAAG ATATTTCAGC ATACTTGCTG 2251 AGTAAAAACA ATGCCATTGA ACCAAGAAGC TTCTCTCAGA ATTCAAGACA
2301 CCCTAGCACT AGGCAAAAGC AATT AATGC CACCACAATT CCAGAAAATG
2351 ACATAGAGAA GACTGACCCT GGTI GCAC ACAGAACACC TATGCCTAAA
2401 ATACAAAATG TCTCCTCTAG GA'ITI IG AGCTCTTGC GACAGAGTCC
2451 TACTCCACAT GGGCTATCCT TATCTGATCT CC¾AGAAGCC AAATATGAGA 2501 CITTI CTGA TGATCCATCA CCTGGAGCAA TAGACAGTAA TAACAGCCTG
2551 TCTGAAATGA CACAC TCAG GCCACP£CTC CATCACAGTG GGGACAGGT
2601 ATITACCCCT GAGTCAGGCC TCCAATTAAG ATTAAATGAG AAACTGGGGA
2651 CAACTGCAGC AACAGAGTTG AAGAAACTTG ATTTCAAAGT TTCTAGTACA
2701 TCAAATAATC TGATTTCAAC AATTCCATCA GACAATTTGG CAGCAGGTAC 2751 TGATAATACA AGTTCCTTAG GACCCCCAAG TATGCCAGTT CATTATGATA
2801 GTCAATTAGA TACCACTCTA TTTGGCAAAA AGTCATCTCC OZ TACTGAG
2851 TCTGGTGGAC CTCTGAGCTT GAGTGAAGAA AATAATGATT CAAAGTTGTT
2901 AGAATCAGGT TTAATGAATA GCCAAGAAAG TTCATGGGGA AAAAATGTAT
2951 CGTCAGAAAT AACTCGTACT ACTCITCAGT CAGATCAAGA GGAAATTGAC 3001 TATGATGATA CXZATATCAGT TGAAATGAAG AAGGAAGATT TTGACATTTA
3051 TGATGAGGAT GAAAATCAGA GCCCCCGCAG CTITCAAAAG AAAACACGAC
3101 ACTATTTTAT TGCTGCAGTG GAGAGGCTCT GGGATTATGG GATGAGTAGC
3151 TCCCCACATG TTCTAAGAAA CAGGGCTCAG AGTGGCAGTG TCCCTCAGTT
3201 CAAGAAAGTT GTITTCCAGG AAITTACTGA ?? ? ?? ACTCAGCCCT 3251 TATACCGTGG AGAACTAAAT G-AACATTTGG G^CTCCTGGG GCCATATATA
3301 AGAGCAGAAG TTGAAGATAA TATCATGGTA ACTTTCAGAA ATCAGGCCTC
3351 TGGTCCCTAT TCCTTCTATT CTAGCCTTAT TTCTTATGAG GAAGATCAGA
3401 GGCAAGGAGC AGAACCTAGA AAAAACTITG TCAAGCCTAA TGAAACCAAA
3451 ACTTACTTTT GGAAAGTGCA ACATCATATG GCACCCACTA AAGATGAGTT 3501 TGACTGCAAA GCCIGGGCTT ATTTCICTGA TGTTGACCTG GAAAAAGATG
3551 GCACTCAGG C TGATTGGA CCCCITCTGG TCTGCCACAC TAACACACTG
3601 CCXTGCTC ATQGGAGACA AGTGACAGTA CAGGAATTTG CTCTGTTTTTT
3651 CACCATCTTT GATGAGACCA AAAGCTGGTA CTTCACTGAA AATATGCAAA
3701 GAAACTGCAG GGCTCXXJPGC AATATCCACA TGGAAGATCC CACTTTTAAA 3751 CAGAATTATC GCTTCCATGC AATCAATGGC TACATAATGG ATACACTACC
3801 TGGCTTAGTA ATQGCTCAGG ATCAAAGGAT TCGATGGTAT CTOCTCAGCA
3851 TGGC^CAGCA TGAAAACATC CATTCTATTC ATTTCAGTGG ACATGTGTTC
3901 ACTGTACGAA AAAAAGAGGA GTATAAAATG GCACTGTACA ATCTCTATCC
3951 AGGTGTTTTT GAGACAGTGG AAATGTTACC ATCCAAAGCT GGAATTTGGC 4001 GGGTGGAATG CCITATTGGC GAGCATCTAC ATG!CTCGGAT GAGCACACTT
4051 TITCTGGTGT ACAGCAATAA GTGTCAGACT O CTOGGAA TC4GCITCTGG
4101 ACACATTAGA GATITTCAGA TTACAGCTTC AGGACAATAT GGACAGTGGG
4151 CXXX-AAAGCT GGCCAGACTT CATTATTCCG GATCAATCAA TGCCTGGAGC
4201 ACCAAGGAGC (? ??G?G?? GATCAAGGTG GATCTGTTGG CACCAATGAT 4251 TATTCACGGC ATCAAGACCC AGGGTGCCCG TCAGAAGTTC TCCASXTCT
4301 ACATCTCTCA GTTTATCATC ATGTATAGTC TTGATCGGAA GAACTGGCAG
4351 ACTTATCGAG GAAATTCCAC TGGAACCTTA ATCGTCTTCT TI03CAATGT
4401 GGATTCATCT GGGATAAAAC ACAATATITT TAACCCTCCA ATTATTGCTC
4451 GATACATCCG TITGCACCCA ACTCATTATA GCATTOGCAG CACTCTTCGC 4501 ATC^GAGTTGA TGGGCTGTGA TTTAAATAGT TGCAGCATGC CATTGGGAAT
4551 GGAGAGTAAA GCAATATCAG ATGCACAGAT TACTCCTTCA TOTTACTTTA
4601 CCAATATGTT TCC ^CCTGG TCTCCTTCAA AAGCTCGACT TCACCTCCAA
4651 GGGAGGAGTA ATGCCTGGAG ACCTCAGGTG AATAATCCAA AAGAGTGGCT
4701 GCAAGTGGAC TTCCAGAAGA CAATGAAAGT CACAGGAGTA ACTACTCAGG 4751 GAGTAAAATC ICTGCTTACC AGCATGTATG TGAAGGAGTT CCTCATCTCC
4801 AGCAGTCAAG ATGGCCATCA GTGGACTCTC 'iTlTlTCAGA A GGCAAAG
4851 AAAGGTTTTT CAGGGAAATC AAGACTCCIT CACACCTG G GTGAACTCTC
4901 TAGACCCACC GTTACTGACT OGCIACCITC GLAATTCACCC CX^GAGTTGG
4951 G GCACCAGA TTGCCCTGAG GATGGAGGTT OT3GGCTGOG AGGCACAGGA 5001 CCTCTACGAC AAAACTCACA CA GCCCACC G GCCCAGCT CCAGAACTCC
5051 TGGGCGGACC GTCAGTCTTC CTCI CQCCC CAAAACCCAA GGACACCCTC
5101 A GATCTCCC GGACCXXTDGA GGTCACA GC GTGGTGGTGG ACGTGAGCCA
5151 CGAAGACCCT GAGGTCAAGT TCAACTGGTA CGTGGAQGGC GTGGAGGTGC
5201 ATAATGCCAA GACAAAGCQG CGGGAGGAGC AGTACAACAG CAGGTAC03T 5251 GTGGTCAGGG TCCTCACCGT CCTGCACCAG GACTGGCTGA ATGGCAAGGA
5301 GTACAAGTGC AAGGTCTCCA ACAAAGCCCT CCCAGCCCCC ATCGAGAAAA
5351 OCATC OCAA AGCCAAAQGG CAGCCCCGAG AACCACAGGT GTACACCCTG
5401 OXXr-ATCCC GGGATGAGCT GACCAAGAAC CAGGTCAGCC TGAC GCCT
5451 GGTCAAAGGC TICTATCCCA GCGACATCGC CGTGGAGTGG GLAGAGCAATG 5501 G¾--AGCCGGA GAACAACTAC AAGACCACGC CTCCCGTGTT GGACTCCGAC
5551 GG TCCYTCT TCCTCTACAG CAAGCTCACC GTGGACAAGA GCAGGTGGCA
5601 GCAGGGGAAC GTCITCTCAT GCTCOGTGAT GCATGAGGCT CTGCACAACC
5651 ACTACAOGCA GAAGAGCCTC TCCCTGTCTC CGGGTAAATG A
Secuencia de proteínas FVIII 198 (SEQ ID NO: 105)
1 MQIELSTCFF LCLIi¾FCFSA TRRYYLGAVE LS DYMQSDL GELPVDARFP
51 PRVPKSFPFN TSWY KTLF VEFTDHLFNI AKPRPPWM3L LGPTIQAEVY
101 DTVVITLKNM ASHPVSLHAV GVSYWKASEG AEYDDQTSQR E EDDKVFPG
151 GSHTYV QVL KENGP ASDP LCLTYSYLSH VDLVKDLNSG LIGALLVCRE
201 GSLAKEKTQT LHKFILLFAV FDEGKSWHSE TKNSIiMQDRD AASARA PKM 251 HTV GYV RS LPGLIGCHRK SVYWHVIGMG TTPEVHSIFL EGHTFLVRH
301 RQASLEISPI TFLTAQTLLM DLGQFLLFCH ISSHQHDGME AYVKVDSCPE
351 EPQIJRM NE EAEDYDDDLT DSEMDWRFD DDNSPSFIQI RSVA KHPK
401 WVHYIAAEEE DWDYAPLVLA PDDRSYKBQY LNNGPQRIGR KYKKVRFMAY
451 TDETFKTREA IQHESGILGP LLYGEVGDTL LIIFKNQASR PY IYPHGIT 501 DVRPLYSRRL PKGVKHLKDF PILPGEIFKY KWTVTVEDGP TKSDPRCLTR
551 YYSSFVNMER DLASGLIGPL LICYKESVDQ RGQIMSDKR NVILFSVFDE
601 NRSWYLTENI QRFLPNPAGV QLEDPEPQAS NIMHSINGYV FDSLQLSVCL
651 HEVAYWYILS IGAQDFLSV FFSGYTFHK MVYEDTLTLF PFSGETVFMS
701 MENPGL ILG CHNSDFRRG MTAIIiKVSSC DKN GDYYED SYEDISAYLL 751 SKNAIEPRS FSQNSRHPST RQKQFNATTI PEMDIEK DP WFAHRTPMPK
801 IQVSSSDLL MLLRQSPTPH GLSLSDLQEA KYETFSDDPS PGAIDS SL
851 SEMTHFRPQL HHSGDMVFTP ESGLQLRLNE KLGTTAATEL KKLDFKVSST
901 SNNLISTIPS DNLAAGDT SSLGPPSMPV HYDSQLDTTL FGKKSSPLTE
951 SGGPLSLSEE NNDSKLLESG LMSTSQESSWG KNVSSEITRT TLQSDQEEID 1001 YDDTISVEMK KEDFDIYDED EQSPRSFQK KTRHYFIAAV ERLWDYGMSS
1051 SPHVLRNRAQ SGSVPQFKKV VFQEFTDGSF QPLYRGELN EHLGLLGPYI
1101 RAEVEDNIMV TFRNQASRPY SFYSSLISYE EDQRQGAEPR KNFVKPNETK
1151 TYFWKVQHHM APTKDEFDCK AWAYFSDVDL EKDVHSGLIG PLLVCHTNTL
1201 NPAHGRQVTV QEFALFFTIF DETKSWYFTE NMERNCRAPC NIQMEDPTFK 1251 ENYRFHAING YIMDTLPGLV MAQDQRIRWY LLSMGSNENI HSIHFSGHVF
1301 TVRKKEEYKM ALYLYPGVF ETVEMLPSKA GIWRVECLIG EHLHAGMSTL
1351 FLVYSNKCQT PLGMASGHIR DFQITASGQY GQWAPKLARL HYSGSINAWS
1401 TKEPFSWIKV DLLAPMIIHG IKTQGARQKF SSLYISQFII MYSLDGKKQ
1451 TYRGNSTGTL MVFFGNVDSS GIKHNIFNPP IIARYIRLHP THYSIRSTLR 1501 MELMGCDLNS CSMPLGMESK AISDAQITAS SYFTNMFATW SPSKARLHLQ
1551 GRSNAWRPQV NNPKEWLQVD PQKI VTGV TTQGVKSLLT SMYVKEFLIS 1601 SSQDGHQWTL FPQNGKVKVF QGNQDSFTPV VNSLDPPLLT RYLRIHPQSW 1651 VHQIALRMEV LGCEAQDLYD KTHTCPPCPA PELLGGPSVF LFPPKPKDTL 1701 MISRTPEVTC VWDVSHEDP EVKFNWYVDG VEVHNAKTKP REEQYNSTYR 1751 WSVLTVLHQ DWLNGKEYKC KVSNKALPAP IEKTISKAKG QPREPQVYTL
1801 PPSRDELTKN QVSLTCLVKG FYPSDIAVEW ESNGQPENNY KTTPPVLDSD 1851 GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL SLSPGK* Ejemplo 21. Expresión de proteína D1D2 de V F
El plegamiento adecuado del dominio D'D3 es esencial para su unión a FVIII. El propéptido de VWF (D1D2 -aminoácidos 1-763) es necesario para la formación del enlace de disulfuro y el plegamiento de D'D3 eficaces. Actúa como una chaperona interna para el plegamiento de D'D3. Las construcciones de VWF que hacen fragmentos de VWF pueden expresarse cuando el propéptido de VWF (es decir, el dominio D1D2) está directamente enlazado al dominio D'D3 y retirarse durante el procesamiento intracelular regular de D'D3 (es decir, en cis) o, puede expresarse a partir de otro plásmido, es decir, en trans. Diseñamos el heterodímero FVIII -VWF de forma tal que D1D2 pueda expresarse en cis o trans.
Clonación de VWF 053: El clon F 053 expresa el propéptido de VWF (dominio D1D2) para la expresión en trans de D1D2. El propéptido de VWF se amplificó por PCR de longitud completa usando ESC 54 y ESC124.
ESC54-VWF directo con sitio BsiWl (SEQ ID NO: 111)
(CGCTTCGCGACGTACGGCCGCCACCATGATTCCTGCCAGATTTGCCGGGGTGCTG CTTGCTC)
Clonación de ESC 124 - D1D2 oligo con sitio inverso Notl (SEQ ID NO: 112)
(CTAGACTCGAGCGGCCGCTCACCTTTTGCTGCGATGAGACAGGGGACTGCTGAGG ACAGC)
El producto PCR se digirió con BsiWl y Notl y se ligó en pCDNA 4 digerido con BsiWl/Notl.
Secuencia de nucleótidos de VWF 053 (propéptido VWF D1D2) (SEQ ID NO: 113)
1 A GATTCC G CCAG-ATITCC OGGGG GCTG CITCCTCTGG CCXTTCAT i 51 GCCAGGGACC C ITGTGCAG AAGGAACTCG CGGCAGGTCA TCXZACGGCCC 101 GA GCAGCCT TTTCGGAAGT GACTTCGTCA ACACCTT GA TGGGAGCATG 151 TACAGCTT G CGGGATACTG CAGTTACCTC CTGGCAGGGG GCTGCCAGAA 201 AOGCTCCTTC TOGATTATTG GGGACTTCCA GAATGGCAAG AGAGTGAGCC 251 TCICGG GTA TC TGGGGAA TITITIGACA TCCA'i IUlT TGTCAATGGT 301 ACCG GACAC AGGGGGACCA AAGAGTCTCC ATOCCCTATG CCTCCAAAGG 351 GCTGTATCTA GAAACTGAGG CTGGGTACTA CLAAGC GTCC GGTGAGGCCT 401 ATGGCTTTGT GGCCAGGATC GATGGCAGCG GCAACTTTCA AGTCCTGCTG 451 TCAGACAGAT ACTTCAACAA GACCTGCGGG CTGTGTGGCh ACTTTAACAT 501 (HTTGCTGAA GATGACTTTA TGACCCAAGA AGGGACCTTG ACCTCGGACC 551 CTTATGACTT TGCCAACTCA TGGGC CTGA GCAGTGGAGA ACAGTGGTGT 601 GAACGGGCAT CTCCTCCCAG CAGCTCATGC AACATCTCCT CHX3GGGAAAT 651 G<-AGAAGGGC C GTGGGAGC AGTGCCñGCT TCTGAAGAGC ACCECGGTGT
701 TTGCCCX3CIG CCACCCTCTG GIGGACCCCG AGCC I IGT CGCCCTGTGT
751 GAGAAGACTT TGTCTGACTG GCTGGGGGG CTOGAG GCG CCT3CCCTGC
801 CCTCCTGGAG TACGCCCGGA CCTGTGCCCA GGAGGGAA G GIGCTGTACG
851 GCTGGACCX-A CCAGAGCX3CG TGGAGCCCAG G GCCCTGC GG ATGGAG 901 TATAGGCAGT G G GTCCCC TIGCGCCAGG ACCTGCCAGA GCC GCACAT
951 CZAA GAAA G GTCAGGAGC GA GCG GGA TGGCTGCAGC GCCCTGAGG
1001 GACAGCTCCT GGA GAAGGC CTCTOCGTGG AGAGCACCGA G GTCCCTGC
1051 GTCCATTCQG GAAAGGGCTA CXXTCCQGGC ACCTCCCTCT CIO3AGACTG
1101 CAACACCTGC A1TIGCCGAA ACAGO2AGTG GATCTGCAGC AATGAAGAAT 1151 GTCCAGGGGA G GCCTTGTC ACIGGTCAAT CCCACITCAA GAGCTITGAC
1201 AACAGATACT TCACCITCAG T3GGATCIGC CAGTACCIGC TCGCCCGGGA
1251 TTGCCAGGAC CACTCCTTCT (XATIGTCAT TGAGACTGTC CAGTCTGCTG
1301 ATGACCGCGA CGC1GTGTGC ACmSCTCCG TCACOGTCCG GCTGCCTGGC
1351 C GCACAACA GCC IG GAA ACTGAAGCAT GGGGCAGGAG TIGCCKTGGh 1401 GGCCAGGAC ATCCAGCTCC CCCTCCIGAA AGGTGACCTC GGCATCCAGC
1451 ATACAG GAC GGCCTCCG G CGCCTCAGCT AGGGGGAGGA (JTGCNIATG
1501 GACTGGGA G GCCGCQGGAG GCIGC GG G AAGC GTCCC CGGTCTAIGC
1551 GGGGAAGACC TGGGGCCTGT GTGGGAATTA CAA GGCAAC CAGGGCGACG
1601 ACTTCCI AC CCCCTCTGGG CTGGGGGAGC CCCm3TGGA GGACTTCGGG 1651 AACGGCTGGA AGCTGCACGG C^CIGCCAG GACCTGCAGA AGCAGCACAG
1701 GGATCCCTGC GCCCTCAACC CGCGCATGAC CAGGTTCTCC G C^03CGT
1751 GCGCGG CCT GACGTCCCCC ACATTCGAGG CCTGCCATCG IGCCGTCAGC
1801 COXnOCCCT ACCTGCGGAA CTGC03CTAC GAaJTG GCT CCTGCTCGGA
1851 CGGCCX3CGAG TGCCTGTGCG GCGCCC GGC CAGCTATGCC GCGGCCTGCG 1901 CGGGGAGAGG aJEGCGCGTC GCXSIGGCGCG AGCCAGGCCG C1GTGAGCTG
1951 AACTGCCCGA. AAGGCCAGGT GTACCTGCAG TGOGGGACCC CCTGCAACCT
2001 GACCTGCCGC TCTCTCTCTT ACCCGGATGA GGAATGCAAT GAGGCCTGCC
2051 TGGAGGGCTG CITCTGCCCC CCAGH3CTCT ACATGGATGA GAGCGGGGAC
2101 TCOJrcCCCA AGGCCCAGTG CCCXJPGTTAC TATIACGGTG AGATCTTCCA 2151 C1CAGAAGAC ATCTTCTCAG ACCATCACAC CATGTGCTAC TGTGAGGATG
2201 CTTCATGCA CTGTACCATG AGTGGAGTCC CCGGAAGCTT GCTGCCTGAC
2251 GCTGTCCTCA CAGTCCCCT CTCTCATCGC AGCAAAAGG
Secuencia de proteínas de VF 053 (propéptido VWF D1D2) (SEQ ID 4)
1 MIPARFAGVL LALALILPGT LCABGTRGRS STARCSLPGS DFVNTFDGSM
51 YSFAGYCSYL LAGGCQKRSF SIIGDFONGK RVSLSVYLGE FFDIHLFVNG
101 TVTQGDQRVS PYASKGLYL ETEAGYYKLS GEAYGFVARI DGSGNPQVLL
151 SDRYFNTOG LCGNFNIFAE DDFMTQEGTL TSDPYDFANS WALSSGEQWC
201 ERASPPSSSC NISSGFJVIQG LWEQCQIiLKS TSVFARCHPL VDPEPFVALC 251 ETLCECAGG LECACPAIiLE YARTCAQEG VLYGWTDHSA CSFVCPAGE
301 YROCVSPCAR TCQSLHINEM OQERCVDGCS CPEGQLLDEG LCVESTECPC
351 VHSGKRYPPG TSLSRDCNTC ICRNSQWICS NEECPGECLV TGQSHFKSFD
401 NRYFTFSGIC QYLLARDCQD HSFSIVIETV QCADDRDAVC TRSVTVRLPG
451 LHNSLVLH GAGVAMDGQD IQLPLLKGDL RIQHTVTASV RLSYGEDLOM 501 DDGRGRLLV KLSPVYAGKT CGLOG.Sn.NGN QGDDFLTPSG LAEPRVEDFG
551 NAWLHGDGQ DLQQHSDPC ALNPRMTRFS EEACAVLTSP TFEACHRAVS
601 PLPYLRNCRY DVCSCSDGRE CLCGALASYA AACAGRGVRV AWREPGRCEL
651 NCPGQVYLQ CGTPCNLTCR SLSYPDEECN EACLEGCFCP PGLYMDERGD
701 CVPKAQCPCY YDGEIFQPED IFSDHHTCY CEDGFMHCIM SGVPGSLLPD 751 AVLSSPLSHR SKR
La descripción anterior de las modalidades específicas también describirá completamente la naturaleza general de la invención que otros pueden, aplicando el conocimiento en la experiencia en la técnica, modificar y/o adaptar fácilmente para varias aplicaciones tales modalidades específicas, sin experimentación indebida, sin apartarse del concepto general de la presente invención. Por lo tanto, se pretende que tales adaptaciones y modificaciones estén incluidas en el significado y intervalo de equivalentes de las modalidades descritas, según las enseñanzas y directrices presentadas en la presente. Debe entenderse que la fraseología o terminología en la presente es a efectos descriptivos y no limitantes, de modo que la terminología o fraseología de la presente memoria descriptiva debe interpretarse por el experto en la técnica en luz de las enseñanzas y directrices .
Otras modalidades de la invención serán evidentes para los expertos en la técnica a partir de la consideración de la memoria descriptiva y la práctica de la invención descrita en la presente. Se pretende que la memoria descriptiva y los ejemplos se consideren solamente a modo de ejemplo, donde un verdadero alcance y espíritu de la invención solo se indica por las reivindicaciones a continuación.
Todas las patentes y publicaciones que se citan en la presente se incorporan a la presente mediante esta referencia .
Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.
Claims (147)
1. Una proteína quimérica caracterizada porque comprende una proteína de Factor VIII ("FVIII") y un resto adjunto (AM) , que están unidos por un enlace covalente, donde el resto adjunto inhibe o evita que el V F endógeno se una a la proteína de FVIII.
2. La proteína quimérica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el enlace covalente evita la disociación del resto adjunto de la proteína de FVIII en presencia de VWF endógeno.
3. La proteína quimérica de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizada porque el enlace covalente es un enlace peptídico.
4. La proteína quimérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque el enlace covalente es un enlace disulfuro.
5. La proteína quimérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque el enlace covalente es un enlazador entre la proteína de FVIII y el resto adjunto.
6. La proteína quimérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizada porque el resto adjunto evita que la proteína de FVIII se depure a través de una vía de depuración de VWF.
7. La proteína quimérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque el resto adjunto inhibe o evita la unión del VWF endógeno a la proteína de FVIII protegiendo o bloqueando un sitio de unión a VWF en la proteína de FVIII.
8. La proteína quimérica de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque el sitio de unión a VWF está ubicado en el dominio A3 o el dominio C2 de la proteína de FVIII o tanto el dominio A3 como el dominio C2.
9. La proteína quimérica de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque el sitio de unión a VWF es la secuencia de aminoácidos que corresponde a los aminoácidos 1669 a 1689 y 2303 a 2332 de la SEQ ID NO: 16.
10. La proteína quimérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizada porque la proteína quimérica no comprende un factor limitante de la semivida de FVIII.
11. La proteína quimérica de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque el factor limitante de la semivida de FVIII comprende una proteína de VWF de longitud completa o una proteína de VWF madura.
12. La proteína quimérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizada porque la semivida de la proteína de FVIII se puede extender más allá de la limitación de la semivida de la proteína de FVIII en presencia de VWF endógeno.
13. La proteína quimérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizada porque el resto adjunto tiene al menos una propiedad protectora de FVIII tipo VWF.
14. La proteína quimérica de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque la propiedad de protección de FVIII tipo VWF comprende proteger la proteína de FVIII de una o más escisiones de proteasa, proteger la proteína de FVIII de la activación, estabilizar la cadena pesada y/o la cadena ligera de la proteína de FVIII o evitar la depuración de la proteína de FVIII por uno o más receptores depuradores.
15. La proteína quimérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizada porque el resto adjunto comprende un polipéptido, un resto no polipéptido o ambos .
16. La proteína quimérica de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos de al menos alrededor de 40, al menos alrededor de 50, al menos alrededor de 60, al menos alrededor de 70, al menos alrededor de 80, al menos alrededor de 90, al menos alrededor de 100, al menos alrededor de 110, al menos alrededor de 120, al menos alrededor de 130, al menos alrededor de 140, al menos alrededor de 150, al menos alrededor de 200, al menos alrededor de 250, al menos alrededor de 300, al menos alrededor de 350, al menos alrededor de 400, al menos alrededor de 450, al menos alrededor de 500, al menos alrededor de 550, al menos alrededor de 600, al menos alrededor de 650, al menos alrededor de 700, al menos al ededor de 750, al menos alrededor de 800, al menos alrededor de 850, al menos alrededor de 900, al menos alrededor de 950 o al menos alrededor de 1000 aminoácidos de longitud.
17. La proteína quimérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizada porque el resto adjunto comprende un fragmento de VWF, una región constante de inmunoglobulina o una parte de esta, albúmina o un fragmento de esta, un resto de unión a la albúmina, una secuencia PAS, una secuencia HAP, transferrina o un fragmento de esta, o cualesquiera combinaciones de estos.
18. La proteína quimérica de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque el resto no polipéptido comprende polietilenglicol (PEG) , ácido polisiálico, almidón de hidroxietilo (HES) , un derivado de estos o cualesquiera combinaciones de estos.
19. La proteína quimérica de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque el resto adjunto comprende un fragmento de VWF que comprende un dominio D' y un dominio D3 de VWF, donde el fragmento de VWF está asociado con la proteína de FVIII por un enlace no covalente además del enlace covalente.
20. La proteína quimérica de conformidad con la reivindicación 17 o 19, caracterizada porque el fragmento de VWF es un monómero.
21. La proteína quimérica de conformidad con la reivindicación 19 o 20, caracterizada porque el fragmento de VWF comprende dos, tres, cuatro, cinco o seis fragmentos de VWF enlazados a uno o más de estos .
22. La proteína quimérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-21, caracterizada porque el fragmento de VWF comprende al menos un resto heterólogo (Hl) y un enlazador opcional entre el fragmento de VWF y el resto heterólogo (Hl) .
23. La proteína quimérica de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada porque el al menos un resto heterólogo (Hl) enlazado al fragmento de VWF comprende un polipéptido, un resto no polipéptido o ambos.
24. La proteína quimérica de conformidad con la reivindicación 22 o 23, caracterizada porque el resto heterólogo (Hl) comprende un resto que extiende la semivida de la proteína de FVIII.
25. La proteína quimérica de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada porque el resto heterólogo (Hl) comprende una región constante de inmunoglobulina o una parte de esta, albúmina o un fragmento de esta, un resto de unión a la albúmina, una secuencia PAS, una secuencia HAP, transferrina o un fragmento de esta, o cualesquiera combinaciones de estos.
26. La proteína quimérica de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada porque el resto no polipéptido comprende polietilenglicol (PEG) , ácido polisiálico, almidón de hidroxietilo (HES) , un derivado de estos o cualesquiera combinaciones de estos.
27. La proteína quimérica de conformidad con la reivindicación 25, caracterizada porque el resto heterólogo (Hl) comprende una primera región Fe.
28. La proteína quimérica de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada porque el resto heterólogo (Hl) comprende una secuencia de aminoácidos que comprende al menos alrededor de 50 aminoácidos, al menos alrededor de 100 aminoácidos, al menos alrededor de 150 aminoácidos, al menos alrededor de 200 aminoácidos, al menos alrededor de 250 aminoácidos, al menos alrededor de 300 aminoácidos, al menos alrededor de 350 aminoácidos, al menos alrededor de 400 aminoácidos, al menos alrededor de 450 aminoácidos, al menos alrededor de 500 aminoácidos, al menos alrededor de 550 aminoácidos, al menos alrededor de 600 aminoácidos, al menos alrededor de 650 aminoácidos, al menos alrededor de 700 aminoácidos, al menos alrededor de 750 aminoácidos, al menos alrededor de 800 aminoácidos, al menos alrededor de 850 aminoácidos, al menos alrededor de 900 aminoácidos, al menos alrededor de 950 aminoácidos o al menos alrededor de 1000 aminoácidos .
29. La proteína quimérica de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada porque la proteína quimérica comprende un enlazador entre el fragmento de VWF y el resto heterólogo (Hl) , que es un enlazador escindible.
30. La proteína quimérica de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada porque el enlazador escindible comprende uno o más sitios escindibles.
31. La proteína quimérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 29 o 30, caracterizada porque el enlazador escindible es capaz de escindirse por una proteasa que se selecciona del grupo que consiste en el factor Xla, factor Xlla, calicreína, factor Vlla, factor IXa, factor Xa, factor lia (trombina) , Elastasa-2, Granzima-B, TEV, Enterocinasa, Proteasa 3C, Sortasa A, MMP-12, MMP-13, MMP-17 y MMP-20.
32. La proteína quimérica de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada porque el enlazador escindible comprende TLDPRSFLLRNPNDKYEPF EDEEK (SEQ ID NO: 56) .
33. La proteína quimérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 29 a 32, caracterizada porque el enlazador escindible comprende uno o más sitios de escisión que comprenden una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en RRRR (SEQ ID NO: 52), RKRRKR (SEQ ID NO: 53), RRRS (SEQ ID NO: 54), TQSFNDFTR (SEQ ID NO: 47), SVSQTSKLTR (SEQ ID NO: 48), DFLAEGGGVR (SEQ ID NO: 49), TTKIKPR (SEQ ID NO: 50), LVPRG (SEQ ID NO: 55), ALRPRWGGA (SEQ ID NO: 51), KLTRAET (SEQ ID NO: 29), DFTRWG (SEQ ID NO: 30), TMTRIVGG (SEQ ID NO: 31), SPFRSTGG (SEQ ID NO: 32), LQVRIVGG (SEQ ID NO: 33), PLGRIVGG (SEQ ID NO: 34), IEGRTVGG (SEQ ID NO: 35), LTPRSLLV (SEQ ID NO: 36), LGPVSGVP (SEQ ID NO: 37), VAGDSLEE (SEQ ID NO: 38), GPAGLGGA (SEQ ID NO: 39), GPAGLRGA (SEQ ID NO : 40), APLGLRLR (SEQ ID NO: 41), PALPLVAQ (SEQ ID NO: 42), ENLYFQG (SEQ ID NO : 43), DDDKIVGG (SEQ ID NO: 44), LEVLFQGP (SEQ ID NO: 45), y LPKTGSES (SEQ ID NO: 46) .
34. La proteína quimérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 33, caracterizada porque la proteína de FVIII comprende FVIII y al menos un resto heterólogo (H2) .
35. La proteína quimérica de conformidad con la reivindicación 34, caracterizada porque el resto heterólogo (H2) es capaz de extender la semivida de la proteína de FVIII .
36. La proteína quimérica de conformidad con la reivindicación 34 o 35, caracterizada porque el resto heterólogo (H2) comprende un polipéptido, un resto no polipéptido o ambos.
37. La proteína quimérica de conformidad con la reivindicación 34 o 35, caracterizada porque el resto heterólogo (H2) comprende una región constante de inmunoglobulina o una parte de esta, albúmina o un fragmento de esta, un resto de unión a la albúmina, una secuencia PAS, una secuencia HAP, transferrina o un fragmento de esta, o cualesquiera combinaciones de estos.
38. La proteína quimérica de conformidad con la reivindicación 34 o 35, caracterizada porque el resto no polipéptido comprende polietilenglicol (PEG) , ácido polisiálico, almidón de hidroxietilo (HES) , un derivado de estos o cualesquiera combinaciones de estos.
39. La proteína quimérica de conformidad con la reivindicación 34, caracterizada porque el resto heterólogo (H2) comprende una segunda región Fe.
40. La proteína quimérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 39, caracterizada porque comprende una primera cadena de polipéptidos que comprende el fragmento de VWF, un primer resto heterólogo y un enlazador y una segunda cadena de polipéptidos que comprende la proteína de FVIII y un segundo resto heterólogo, donde la primera cadena de polipéptidos y la segunda cadena de polipéptidos están enlazadas entre si por un enlace covalente.
41. La proteina quimérica de conformidad con la reivindicación 40, caracterizada porque el primer resto heterólogo y el segundo resto heterólogo están enlazados entre si por el enlace covalente, donde el enlace covalente evita el remplazo del fragmento de VWF en la primera cadena de polipéptidos con VWF endógeno in vivo.
42. La proteina quimérica de conformidad con la reivindicación 41, caracterizada porque el enlace covalente es un enlace disulfuro.
43. La proteina quimérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 34 a 42, caracterizada porque la proteina de FVIII está enlazada al segundo resto heterólogo (H2) por un enlazador.
44. La proteina quimérica de conformidad con la reivindicación 43, caracterizada porque el enlazador entre la proteina de FVIII y el segundo resto heterólogo es un enlazador escindible.
45. La proteina quimérica de conformidad con la reivindicación 34 a 44, caracterizada porque el primer resto heterólogo (Hl) y el segundo resto heterólogo (H2) están enlazados por un enlazador.
46. La proteina quimérica de conformidad con la reivindicación 45, caracterizada porque el enlazador es un enlazador scFc .
47. La proteína quimérica de conformidad con la reivindicación 46, caracterizada porque el enlazador scFc es un enlazador procesable.
48. La proteína quimérica de las reivindicaciones 1-47, caracterizada porque comprende una fórmula que se selecciona del grupo que consiste en: (a) V-L1-H1-L3-C-L2-H2, (b) H2-L2-C-L3-H1-L1-V, (c) C-L2-H2-L3-V-L1-H1, (d) H1-L1-V-L3-H2-L2-C, (e) H1-L1-V-L3-C-L2-H2, (f) H2-L2-C-L3-V-L1-H1, (g) V-L1-H1-L3-H2-L2-C, (h) C-L2-H2-L3-H1-L1-V, (i) H2-L3-H1-L1-V-L2-C, (j) C-L2-V-L1-H1-L3-H2, (k) V-L2-C-L1-H1-L3-H2, y (1) H2-L3-H1-L1-C-L2-V, donde V comprende un fragmento de WF que comprende dominio D' y el dominio D3 de VWF; Ll es un enlazador opcional; L2 es un enlazador opcional; L3 en (a) a (f) es un enlazador opcional, L3 en (g) a (1) es un enlazador scFc opcional, Cada uno de Hl y H2 comprende un resto heterólogo opcional ; C comprende una proteína de FVIII; y (-) es un enlace peptídico o uno o más aminoácidos.
49. La proteína quimérica de las reivindicaciones 1-47, caracterizada porque comprende una fórmula que se selecciona del grupo que consiste en: (m) V-Ll-Hl: H2-L2-C, (n) V-Ll-Hl :C-L2-H2; (o) H1-L1-V:H2-L2-C; (P) H1-L1-V:C-L2-H2; (q) V:C-L1-H1:H2; (r) V:H1-L1-C:H2; (s) H2 :H1-L1-C:V, (t) C:V-L1-H1 :H2 , y (u) C:H1-L1-V:H2, donde V es un fragmento de VWF que comprende el dominio D' y el dominio D3 de VWF; Ll es un enlazador opcional; L2 es un enlazador opcional; Hl es un primer resto heterólogo; H2 es un segundo resto heterólogo; C es una proteína de FVIII; (-) es un enlace peptídico o uno o más aminoácidos y ( : ) es un enlace covalente entre Hl y H2.
50. La proteína quimérica de conformidad con la reivindicación 48 y 49, caracterizada porque el fragmento de VWF y la proteína de FVIII están asociados entre sí por un enlace no covalente además del enlace covalente, el enlace peptídico o uno o más aminoácidos.
51. La proteína quimérica de conformidad con la reivindicación 48 y 49, caracterizada porque el fragmento de VWF inhibe o evita la unión de VWF endógeno a la proteína de FVIII.
52. La proteína quimérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 49 a 51, caracterizada porque el enlace covalente entre Hl y H2 es un enlace disulfuro.
53. La proteína quimérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 48 a 52, caracterizada porque Hl comprende un polipéptido, un resto no polipéptido o ambos.
54. La proteína quimérica de conformidad con la reivindicación 53, caracterizada porque Hl comprende una región constante de inmunoglobulina o una parte de esta, albúmina o un fragmento de esta, un resto de unión a la albúmina, una secuencia PAS, una secuencia HAP, transferrina o un fragmento de esta, o cualesquiera combinaciones de estos .
55. La proteína quimérica de conformidad con la reivindicación 53 o 54, caracterizada porque Hl comprende una primera región Fe.
56. La proteína quimérica de conformidad con la reivindicación 53, caracterizada porque el resto no polipéptido comprende polietilenglicol (PEG) , ácido polisiálico, almidón de hidroxietilo (HES) , un derivado de estos o cualesquiera combinaciones de estos.
57. La proteína quimérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 48 a 56, caracterizada porque H2 comprende un polipéptido, un resto no polipéptido o ambos.
58. La proteína quimérica de conformidad con la reivindicación 57, caracterizada porque H2 comprende una región constante de inmunoglobulina o una parte de esta, albúmina o un fragmento de esta, un resto de unión a la albúmina, una secuencia PAS, una secuencia HAP, transferrina o un fragmento de esta, o cualquier combinación de estos.
59. La proteína quimérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 48 a 58, caracterizada porque H2 comprende una segunda región Fe .
60. La proteína quimérica de conformidad con la reivindicación 59, caracterizada porque el resto no polipéptido comprende polietilenglicol (PEG) , ácido polisiálico, almidón de hidroxietilo (HES) , un derivado de estos o cualesquiera combinaciones de estos.
61. La proteína quimérica de conformidad con la reivindicación 60, caracterizada porque el enlace covalente es un enlace disulfuro.
62. La proteína quimérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 61, caracterizada porque la proteína de FVIII comprende un tercer resto heterologo (H3) .
63. La proteína quimérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 62, caracterizada porque la proteína de FVIII comprende un cuarto resto heterologo (H4) .
64. La proteína quimérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 63, caracterizada porque la proteína de FVIII comprende un quinto resto heterologo (H5) .
65. La proteína quimérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 64, caracterizada porque la proteína de FVIII comprende el sexto resto heterologo (H6) .
66. La proteína quimérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 61 a 65, caracterizada porque uno o más del tercer resto heterologo (H3), el cuarto resto heterologo (H4) , el quinto resto heterologo (H5) , el sexto resto heterologo (H6) pueden extender la semivida de la proteína de FVIII.
67. La proteína quimérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 66, caracterizada porque el tercer resto heterologo (H3) , el cuarto resto heterologo (H4) , el quinto resto heterologo (H5) y el sexto resto heterologo (H6) se enlazan al C-terminal o al N-terminal de FVIII o se insertan entre dos aminoácidos de FVIII.
68. La proteína quimérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 67, caracterizada porque uno o más del tercer resto heterólogo (H3) , el cuarto resto heterologo (H4), el quinto resto heterólogo (H5) y el sexto resto heterólogo (H6) comprende una secuencia de aminoácidos que comprende al menos alrededor de 50 aminoácidos, al menos alrededor de 100 aminoácidos, al menos alrededor de 150 aminoácidos, al menos alrededor de 200 aminoácidos, al menos alrededor de 250 aminoácidos, al menos alrededor de 300 aminoácidos, al menos alrededor de 350 aminoácidos, al menos alrededor de 400 aminoácidos, al menos alrededor de 450 aminoácidos, al menos alrededor de 500 aminoácidos, al menos alrededor de 550 aminoácidos, al menos alrededor de 600 aminoácidos, al menos alrededor de 650 aminoácidos, al menos alrededor de 700 aminoácidos, al menos alrededor de 750 aminoácidos, al menos alrededor de 800 aminoácidos, al menos alrededor de 850 aminoácidos, al menos alrededor de 900 aminoácidos, al menos alrededor de 950 aminoácidos o al menos alrededor de 1000 aminoácidos.
69. La proteína quimérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 68, caracterizada porque la semivida de FVIII se extiende al menos alrededor de 1.5 veces, al menos alrededor de 2 veces, al menos alrededor de 2.5 veces, al menos alrededor de 3 veces, al menos alrededor de 4 veces, al menos alrededor de 5 veces, al menos alrededor de 6 veces, al menos alrededor de 7 veces, al menos alrededor de 8 veces, al menos alrededor de 9 veces, al menos alrededor de 10 veces, al menos alrededor de 11 veces o al menos alrededor de 12 veces más larga que la FVIII de tipo salvaje.
70. La proteína quimérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 69, caracterizada porque la semivida de la proteína de FVIII es al menos alrededor de 10 horas, al menos alrededor de 11 horas, al menos alrededor de 12 horas, al menos alrededor de 13 horas, al menos alrededor de 14 horas, al menos alrededor de 15 horas, al menos alrededor de 16 horas, al menos alrededor de 17 horas, al menos alrededor de 18 horas, al menos alrededor de 19 horas, al menos alrededor de 20 horas, al menos alrededor de 21 horas, al menos alrededor de 22 horas, al menos alrededor de 23 horas, al menos alrededor de 24 horas, al menos alrededor de 36 horas, al menos alrededor de 48 horas, al menos alrededor de 60 horas, al menos alrededor de 72 horas, al menos alrededor de 84 horas, al menos alrededor de 96 horas o al menos alrededor de 108 horas.
71. La proteína quimérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 22 a 70, caracterizada porque el enlazador entre la proteína de FVIII y el segundo resto heterólogo o el enlazador entre el fragmento de VWF y el primer resto heterólogo comprenden además un primer sitio de escisión (Pl) en la región de N-terminal del enlazador, un segundo sitio de escisión (P2) en la región de C-terminal del enlazador, o ambos.
72. La proteína quimérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 22 a 71, caracterizada porque el enlazador entre la proteína de FVIII y el segundo resto heterólogo, el enlazador entre el fragmento de VWF y el primer resto heterólogo, o ambos comprenden TLDPRSFLLRNPNDKYEPFWEDEEK (SEQ ID NO: 56) .
73. La proteína quimérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 22 a 71, caracterizada porque el enlazador entre la proteína de FVIII y el segundo resto heterólogo, el enlazador entre el fragmento de VWF y el primer resto heterólogo, o ambos se escinden por una proteasa que se selecciona del grupo que consiste en el factor Xla, factor Xlla, calicreína, factor Vlla, factor IXa, factor Xa, factor lia (trombina) , Elastasa-2, Granzima-B, TEV, Enterocinasa, Proteasa 3C, Sortasa A, MMP-12, MMP-13, MMP-17 y MMP-20.
74. La proteína quimérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 22 a 73, caracterizada porque el enlazador entre la proteína de FVIII y el segundo resto heterólogo, el enlazador entre el fragmento de VWF y el primer resto heterólogo, o ambos comprenden una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en RRRR (SEQ ID NO: 52), RKRRKR (SEQ ID NO: 53), RRRRS (SEQ ID NO: 54), TQSFNDFTR (SEQ ID NO : 47), SVSQTSKLTR (SEQ ID NO: 48), DFLAEGGGVR (SEQ ID NO: 49), TTKIKPR (SEQ ID NO: 50), LVPRG (SEQ ID NO: 55), ALRPRWGGA (SEQ ID NO : 51), KLTRAET (SEQ ID NO: 29), DFTRWG (SEQ ID NO: 30), TMTRIVGG (SEQ ID NO: 31), SPFRSTGG (SEQ ID NO: 32), LQVRIVGG (SEQ ID NO: 33), PLGRIVGG (SEQ ID NO : 34), IEGRTVGG (SEQ ID NO : 35), LTPRSLLV (SEQ ID NO: 36), LGPVSGVP (SEQ ID NO: 37), VAGDSLEE (SEQ ID NO: 38), GPAGLGGA (SEQ ID NO: 39), GPAGLRGA (SEQ ID NO: 40), APLGLRLR (SEQ ID NO: 41), PALPLVAQ (SEQ ID NO: 42), ENLYFQG (SEQ ID NO: 43), DDDKIVGG (SEQ ID NO : 44), LEVLFQGP (SEQ ID NO: 45), y LPKTGSES (SEQ ID NO : 46).
75. La proteína quimérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 71 a 74, caracterizada porque el primer sitio de escisión enzimático y el segundo sitio de escisión enzimático son idénticos o diferentes.
76. La proteína quimérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 75, caracterizada porque uno o más del enlazador entre la proteína de FVIII y el resto adjunto, el enlazador entre la proteína de FVIII y el segundo resto heterólogo y el enlazador entre el fragmento de V F y el primer resto heterólogo tienen una longitud de alrededor de 1 a alrededor de 2000 aminoácidos.
77. La proteína quimérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 75, caracterizada porque uno o más del enlazador entre la proteína de FVIII y el resto adjunto, el enlazador entre la proteína de FVIII y el segundo resto heterólogo, y el enlazador entre el fragmento de VWF y el primer resto heterólogo tienen una longitud de al menos alrededor de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1200, 1400, 1600, 1800 o 2000 aminoácidos .
78. La proteína quimérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 77, caracterizada porque uno o más del enlazador entre la proteína de FVIII y el resto adjunto, el enlazador entre la proteína de FVIII y el segundo resto heterólogo y el enlazador entre el fragmento de VWF y el primer resto heterólogo comprenden un péptido gly/ser.
79. La proteína quimérica de conformidad con la reivindicación 78, caracterizada porque el péptido gly/ser tiene una fórmula de (Gly4Ser)n o S(Gly4Ser)n, donde n es un entero positivo que se selecciona del grupo que consiste en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 o 100.
80. La proteína quimérica de conformidad con la reivindicación 79, caracterizada porque el enlazador (Gly4Ser)n es (Gly4Ser) 3 o (Gly4Ser)4.
81. La proteína quimérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 80, caracterizada porque el enlazador entre la proteína de FVIII y el resto adjunto es un enlazador escindible.
82. La proteína quimérica de conformidad con la reivindicación 81, caracterizada porque el enlazador escindible comprende uno o más sitios de escisión de trombina .
83. La proteína quimérica de conformidad con la reivindicación 81 u 82, caracterizada porque el enlazador escindible comprende TLDPRSFLLRNPNDKYEPFWEDEEK (SEQ ID NO: 56) .
84. La proteína quimérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 81 a 83, caracterizada porque el enlazador escindible se escinde por una proteasa que se selecciona del grupo que consiste en el factor Xla, factor Xlla, calicreína, factor Vlla, factor IXa, factor Xa, factor lia (trombina), Elastasa-2, Granzima-B, TEV, Enterocinasa , Proteasa 3C, Sortasa A, MMP-12, MMP-13, MMP-17 y MMP-20.
85. La proteína quimérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 81 a 83, caracterizada porque el enlazador escindible comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en RRRR (SEQ ID NO: 52) , RKRRKR (SEQ ID NO: 53), RRRRS (SEQ ID NO: 54), TQSFNDFTR (SEQ ID NO: 47), SVSQTSKLTR (SEQ ID NO: 48), DFLAEGGGVR (SEQ ID NO: 49) , TTKIKPR (SEQ ID NO: 50) , LVPRG (SEQ ID NO: 55), ALRPRWGGA (SEQ ID NO : 51) , KLTRAET (SEQ ID NO : 29), DFTRWG (SEQ ID NO: 30), TMTRIVGG (SEQ ID NO: 31), SPFRSTGG (SEQ ID NO: 32), LQVRIVGG (SEQ ID NO: 33), PLGRIVGG (SEQ ID NO: 34), IEGRTVGG (SEQ ID NO: 35), LTPRSLLV (SEQ ID NO: 36), LGPVSGVP (SEQ ID NO: 37), VAGDSLEE (SEQ ID NO: 38), GPAGLGGA (SEQ ID NO: 39), GPAGLRGA (SEQ ID NO: 40), APLGLRLR (SEQ ID NO: 41), PALPLVAQ (SEQ ID NO: 42), ENLYFQG (SEQ ID NO : 43), DDDKIVGG (SEQ ID NO: 44), LEVLFQGP (SEQ ID NO: 45), y LPKTGSES (SEQ ID NO: 46) .
86. La proteína quimérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 85, caracterizada porque el enlazador entre la proteína de FVIII y el resto adjunto comprende además un motivo de reconocimiento de sortasa.
87. La proteína quimérica de conformidad con la reivindicación 86, caracterizada porque el motivo de reconocimiento de sortasa comprende la secuencia de LPXTG (SEQ ID NO: 106) .
88. La proteína quimérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 87, caracterizada porque el fragmento de VWF comprende el dominio D' y el dominio D3 de VWF.
89. La proteína quimérica de conformidad con la reivindicación 88, caracterizada porque el fragmento de VWF inhibe o evita la unión de VWF endógeno a una proteína de FVIII .
90. La proteína quimérica de conformidad con la reivindicación 88 u 89, caracterizada porque la secuencia de aminoácidos del dominio D' del fragmento de V F es al menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a aminoácidos 764 a 866 de la SEQ ID NO: 2.
91. La proteína quimérica de cualquiera de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 88 a 90, caracterizada porque la secuencia de aminoácidos del dominio D3 del fragmento de VWF es al menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a aminoácidos 867 a 1240 de la SEQ ID NO: 2.
92. La proteína quimérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 88 a 91, caracterizada porque el fragmento de VWF contiene al menos una sustitución de aminoácidos en un residuo que corresponde al residuo 1099, residuo 1142 o ambos residuos 1099 y 1142 de la SEQ ID NO: 2.
93. La proteína quimérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 88 a 91, caracterizada porque en la secuencia del fragmento de VWF, un aminoácido distinto de cisteína se sustituye por un residuo que corresponde al residuo 1099, residuo 1142 o ambos residuos 1099 y 1142 de la SEQ ID NO: 2.
94. La proteína quimérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 88 a 93, caracterizada porque la secuencia del fragmento de VWF comprende los aminoácidos 764 a 1240 de la SEQ ID NO: 2.
95. La proteína quimérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 88 a 94, caracterizada porque el fragmento de VWF comprende además el dominio DI, el dominio D2 o los dominios DI y D2 de VWF.
96. La proteína quimérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 88 a 95, caracterizada porque el fragmento de VWF comprende además un dominio de VWF que se selecciona del grupo que consiste en el dominio Al, el dominio A2 , el dominio A3 , el dominio D4 , el dominio Bl, el dominio B2, el dominio B3 , el dominio Cl, el dominio C2 , el dominio CK, uno o más fragmentos de estos y cualesquiera combinaciones de estos.
97. La proteína quimérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 88 a 95, caracterizada porque el fragmento de VWF consiste esencialmente en o consiste en: (1) los dominios D1 y D3 de VWF o fragmentos de estos; (2) los dominios DI, D1, y D3 de VWF o fragmentos de estos; (3) los dominios D2 , D', y D3 de VWF o fragmentos de estos; (4) los dominios DI, D2 , D', y D3 de VWF o fragmentos de estos; o (5) los dominios DI, D2 , D1, D3 , y Al de VWF o fragmentos de estos.
98. La proteína quimérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 88 a 97, caracterizada porque comprende además un péptido de señal de VWF, que está operativamente enlazado a este.
99. La proteína quimérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 98, caracterizada porque el fragmento de V F es pegilado, glicosilado, hesilado o polisialilado .
100. La proteína quimérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 99, caracterizada porque la proteína de FVIII comprende uno o más dominios de FVIII que se seleccionan del grupo que consiste en el dominio Al, el dominio A2 , el dominio B, el dominio A3 , el dominio Cl, el dominio C2 , uno o más fragmentos de estos y cualesquiera combinaciones de estos.
101. La proteína quimérica de conformidad con la reivindicación 100, caracterizada porque la proteína de FVIII comprende el dominio Al, el dominio A2, el dominio A3 y el dominio Cl, y el dominio C2 opcional.
102. La proteína quimérica de conformidad con la reivindicación 100 o 101, caracterizada porque la proteína de FVIII comprende el dominio B o una parte de este.
103. La proteína quimérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 100 a 102, caracterizada porque comprende una secuencia de aminoácidos al menos 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 100% idéntica a la SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 18.
104. La proteína quimérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 100 a 103, caracterizada porque la proteína de FVIII es FVIII con dominio B SQ eliminado.
105. La proteína quimérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 100 a 104, caracterizada porque la proteína de FVIII comprende FVIII de cadena simple.
106. La proteína quimérica de conformidad con la reivindicación 105, caracterizada porque FVIII de cadena simple contiene al menos una sustitución de aminoácidos en un residuo que corresponde al residuo 1648, residuo 1645 o ambos de polipéptido de Factor VIII maduro de longitud completa (SEQ ID NO: 16) o el residuo 754, residuo 751, o ambos de Factor VIII SQ BDD (SEQ ID NO : 18) .
107. La proteína quimérica de conformidad con la reivindicación 106, caracterizada porque la sustitución de aminoácidos es un aminoácido distinto de Arginina.
108. La proteína quimérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 107, caracterizada porque la proteína de FVIII comprende una primera cadena y una segunda cadena, la primera cadena comprende una cadena pesada de FVIII y la segunda cadena comprende una cadena ligera del Factor VIII, donde la cadena pesada y la cadena ligera están asociadas con un enlace de metal.
109. Un polinucleótido caracterizado porque codifica la proteína quimérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 108.
110. El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 109, caracterizado porque comprende además una secuencia de polinucleotidos adicional, que codifica PC5, PC7 o furina .
111. El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 109 o 110, caracterizado porque comprende además una secuencia de polinucleotidos adicional, que codifica un dominio DI y un dominio D2 de VWF.
112. Un vector o vectores caracterizado porque comprende el polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 109 a 111 y uno o más promotores operativamente unidos al polinucleótido o conjunto de polinucleotidos .
113. El vector o vectores de conformidad con la reivindicación 112, que comprenden además un vector adicional, caracterizado porque comprende una segunda cadena de polinucleotidos que codifica PC5, PC7 o furina.
114. El vector o vectores de conformidad con la reivindicación 112 o 113, caracterizado porque comprende además un vector adicional, que comprende una secuencia de polinucleotidos que codifica un dominio DI y un dominio D2 de VWF.
115. Una célula hospedadora caracterizada porque comprende el polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 109 a 111 o el vector de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 112 a 114.
116. La célula hospedadora de conformidad con la reivindicación 115, caracterizada porque comprende un vector adicional que codifica PC5 , PC7 o furina.
117. La célula hospedadora de conformidad con la reivindicación 115 o 116, caracterizada porque comprende además un vector adicional, que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica un dominio DI y un dominio D2 de VWF.
118. La célula hospedadora de conformidad con la reivindicación 115 o 118, caracterizada porque es una célula de mamífero.
119. La célula hospedadora de conformidad con la reivindicación 118, caracterizada porque la célula de mamífero se selecciona del grupo que consiste en célula HEK293, célula CHO y célula BHK.
120. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende la proteína quimérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 108, el polinucleótido de conformidad con la reivindicación 109 o 111, el vector de conformidad con la reivindicación 112 o 114, o la célula hospedadora de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 115 y 118 y un portador farmacéuticamente aceptable .
121. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 120, caracterizada porque la semivida de la proteína de FVIII de la proteína quimérica se extiende en ratones con doble inactivación ( "DKO" ) de FVIII/VWF en comparación con la semivida de la proteína de FVIII de la proteína quimérica sin el fragmento de WF.
122. La composición de conformidad con la reivindicación 120 o 121, caracterizada porque la semivida de FVIII se extiende al menos alrededor de 1.5 veces, al menos alrededor de 2 veces, al menos alrededor de 2.5 veces, al menos alrededor de 3 veces, al menos alrededor de 4 veces, al menos alrededor de 5 veces, al menos alrededor de 6 veces, al menos alrededor de 7 veces, al menos alrededor de 8 veces, al menos alrededor de 9 veces, al menos alrededor de 10 veces, al menos alrededor de 11 veces, al menos alrededor de 12 veces, al menos 20 veces, al menos 30 veces o al menos 40 veces más larga que la FVIII de tipo salvaje.
123. La composición de conformidad con la reivindicación 120 o 122, caracterizada porque la semivida del Factor VIII es al menos 6 horas, al menos 7 horas, al menos 9 horas, al menos 10 horas, al menos 11 horas, al menos 12 horas, al menos 15 horas, al menos alrededor de 17 horas, al menos alrededor de 18 horas, al menos alrededor de 19 horas, al menos alrededor de 20 horas, al menos alrededor de 21 horas, al menos alrededor de 22 horas, al menos alrededor de 23 horas, al menos alrededor de 24 horas, al menos alrededor de 25 horas, al menos alrededor de 26 horas, al menos alrededor de 27 horas, al menos alrededor de 28 horas, al menos alrededor de 29 horas, al menos alrededor de 30 horas, al menos alrededor de 31 horas, al menos alrededor de 32 horas, al menos alrededor de 33 horas, al menos alrededor de 34 horas, al menos alrededor de 35 horas, al menos alrededor de 36 horas, al menos alrededor de 48 horas, al menos alrededor de 60 horas, al menos alrededor de 72 horas, al menos alrededor de 84 horas, al menos alrededor de 96 horas o al menos alrededor de 108 horas.
12 . La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 120 a 123, caracterizada porque se administra por una vía que se selecciona del grupo que consiste en administración tópica, administración intraocular, administración parenteral, administración intratecal, administración subdural y administración oral.
125. La composición de conformidad con la reivindicación 124, caracterizada porque la administración parenteral es administración intravenosa o subcutánea.
126. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 120 a 125, caracterizada porque se usa para tratar una enfermedad o afección de sangrado en un sujeto que lo necesita.
127. La composición de conformidad con la reivindicación 126, caracterizada porque la enfermedad o trastorno de sangrado se selecciona del grupo que consiste en un trastorno de coagulación de sangrado, hemartrosis, sangrado muscular, sangrado oral, hemorragia, hemorragia en los músculos, hemorragia oral, traumatismo, trauma capitis, sangrado gastrointestinal, hemorragia intracraneal, hemorragia intraabdominal , hemorragia intratorácica, fractura ósea, sangrado del sistema nervioso central, sangrado en el espacio retrofaríngeo, sangrado en el espacio retroperitoneal , sangrado en la vaina del iliopsoas y cualquier combinación de estos .
128. La composición de conformidad con la reivindicación 126 o 127, caracterizada porque se programa que el sujeto se someta a una cirugía.
129. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 126 o 127, caracterizada porque el tratamiento es profiláctico o episódico.
130. Un método para evitar o inhibir la interacción de una proteína de FVIII con VWF endógeno caracterizado porque comprende agregarle a un sujeto que lo necesita una cantidad eficaz de la proteína quimérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 108, el polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 109 a 111, el vector de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 112 a 114, la células hospedadoras de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 115 a 119, o la composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 120 a 129, donde el fragmento de VWF inhibe o evita la interacción de la proteína de FVIII con VWF endógeno .
131. Un método para retirar o reducir un factor limitante de la semivida de una proteína de FVIII, caracterizado porque comprende agregar una cantidad eficaz de la proteína quimérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 108, el polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 109 a 111, el vector de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 112 a 114, la células hospedadoras de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 115 a 119, o la composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 120 a 129, donde la proteína quimérica o la proteína quimérica codificada por el polinucleótido, el vector o expresado por la célula hospedadora evita o inhibe la interacción de la proteína de FVIII con VWF endógeno.
132. Un método para extender o aumentar la semivida de una proteína de FVIII, caracterizado porque comprende agregar una cantidad eficaz de la proteína quimérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 108, el polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 109 a 111, el vector de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 112 a 114, la células hospedadoras de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 115 a 119, o la composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 120 a 129, donde el fragmento de WF de la proteína quimérica evita o inhibe la interacción de la proteína de FVIII con VWF endógeno.
133. El método de conformidad con la reivindicación 132, caracterizado porque la semivida de la proteína de FVIII se extiende al menos alrededor de 1.5 veces, al menos alrededor de 2 veces, al menos alrededor de 2.5 veces, al menos alrededor de 3 veces, al menos alrededor de 4 veces, al menos alrededor de 5 veces, al menos alrededor de 6 veces, al menos alrededor de 7 veces, al menos alrededor de 8 veces, al menos alrededor de 9 veces, al menos alrededor de 10 veces, al menos alrededor de 11 veces o al menos alrededor de 12 veces más larga que la FVIII de tipo salvaje.
134. El método de conformidad con la reivindicación 133, caracterizado porque la semivida del Factor VIII es al menos alrededor de 17 horas, al menos alrededor de 18 horas, al menos alrededor de 19 horas, al menos alrededor de 20 horas, al menos alrededor de 21 horas, al menos alrededor de 22 horas, al menos alrededor de 23 horas, al menos alrededor de 24 horas, al menos alrededor de 26 horas, al menos alrededor de 27 horas, al menos alrededor de 28 horas, al menos alrededor de 29 horas, al menos alrededor de 30 horas, al menos alrededor de 31 horas, al menos alrededor de 32 horas, al menos alrededor de 33 horas, al menos alrededor de 34 horas, al menos alrededor de 35 horas, al menos alrededor de 36 horas, al menos alrededor de 48 horas, al menos alrededor de 60 horas, al menos alrededor de 72 horas, al menos alrededor de 84 horas, al menos alrededor de 96 horas o al menos alrededor de 108 horas.
135. Un método para tratar una enfermedad o afección de sangrado en un sujeto que lo necesita caracterizado porque comprende administrar una cantidad eficaz de la proteína quimérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 108, el polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 109 a 111, el vector de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 112 a 114, la célula hospedadora de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 115 a 119, o la composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 120 a 129, donde la enfermedad o trastorno de sangrado se selecciona del grupo que consiste en un trastorno de coagulación de sangrado, hemartrosis, sangrado muscular, sangrado oral, hemorragia, hemorragia en los músculos, hemorragia oral, traumatismo, trauma capitis, sangrado gastrointestinal, hemorragia intracraneal, hemorragia intraabdominal , hemorragia intratorácica, fractura ósea, sangrado del sistema nervioso central, sangrado en el espacio retrofaríngeo, sangrado en el espacio retroperitoneal , sangrado en la vaina del iliopsoas y cualquier combinación de estos.
136. El método de conformidad con la reivindicación 135, caracterizado porque el tratamiento es profiláctico o a demanda (episódico) .
137. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 130 a 136, caracterizado porque la cantidad eficaz es 0.1 ug/kg a 500 mg/kg.
138. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 130 a 137, caracterizado porque la proteína quimérica, el polinucleótido, la célula hospedadora o la composición se administra por una vía que se selecciona del grupo que consiste en administración tópica, administración intraocular, administración parenteral, administración intratecal, administración subdural y administración oral.
139. El método de conformidad con la reivindicación 138, donde la administración parenteral se selecciona del grupo caracterizado porque que consiste en administración intravenosa, administración subcutánea, administración intramuscular y administración intradérmica .
140. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 130 a 139, caracterizado porque el sujeto es un humano.
141. El método de conformidad con la reivindicación 140, caracterizado porque el sujeto padece hemofilia A.
142. Un método para realizar una proteína quimérica, caracterizado porque comprende transfectar una o más células hospedadoras con el polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 109 a 111 o el vector de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 112 a 114, y expresar el fragmento de VWF o la proteína quimérica en la célula hospedadora .
143. El método de conformidad con la reivindicación 142, caracterizado porque el vector comprende adicionalmente un polinucleótido que codifica una enzima de procesamiento.
144. El método de conformidad con la reivindicación 143, caracterizado porque la enzima de procesamiento es PACE.
145. El método de conformidad con la reivindicación 144, caracterizado porque PACE escinde los dominios D1D2 del fragmento de VWF.
146. El método de conformidad con la reivindicación 142 y 143, caracterizado porque comprende además transfectar una o más células hospedadoras con una secuencia de polinucleótidos que expresa un dominio DI y un dominio D2 de VWF.
147. Un método para construir la proteína quimérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 108, caracterizado porque comprende ligar el resto adjunto con la proteína de FVIII por un enlace covalente en presencia de una enzima sortasa.
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