RS63548B1 - Optimizovani geni faktora viii - Google Patents

Optimizovani geni faktora viii

Info

Publication number
RS63548B1
RS63548B1 RS20220841A RSP20220841A RS63548B1 RS 63548 B1 RS63548 B1 RS 63548B1 RS 20220841 A RS20220841 A RS 20220841A RS P20220841 A RSP20220841 A RS P20220841A RS 63548 B1 RS63548 B1 RS 63548B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
fviii
seq
nucleic acid
sequence
polypeptide
Prior art date
Application number
RS20220841A
Other languages
English (en)
Inventor
Siyuan Tan
Tongyao Liu
Original Assignee
Bioverativ Therapeutics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bioverativ Therapeutics Inc filed Critical Bioverativ Therapeutics Inc
Publication of RS63548B1 publication Critical patent/RS63548B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A61K48/0016—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the nucleic acid is delivered as a 'naked' nucleic acid, i.e. not combined with an entity such as a cationic lipid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/31—Fusion polypeptide fusions, other than Fc, for prolonged plasma life, e.g. albumin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/16043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/22—Vectors comprising a coding region that has been codon optimised for expression in a respective host

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Opis
POZADINA OTKRIVANJA
[0001] Put koagulacije krvi, delimično, uključuje formiranje enzimskog kompleksa faktora VIIIa (FVIIIa) i faktora IXa (FIXa) (Xaza kompleks) na površini trombocita. FIXa je serinska proteaza sa relativno slabom katalitičkom aktivnošću bez njegovog kofaktora FVIIIa. Xaza kompleks cepa faktor X (FX) cepa faktor Xa (FXa), koji zauzvrat stupa u interakciju sa faktorom Va (FVa) da bi cepao protrombin i stvarao trombin. Hemofilija A je poremećaj krvarenja uzrokovan mutacijama i/ili delecijama gena FVIII (FVIII) što dovodi do nedostatka aktivnosti FVIII (Peyvandi i dr.2006). U nekim slučajevima, pacijenti imaju smanjen nivo FVIII zbog prisustva inhibitora FVIII, kao što su anti-FVIII antitela.
[0002] Hemofiliju A karakteriše spontano krvarenje i obilno krvarenje. Vremenom, opetovano krvarenje u mišiće i zglobove, koje često počinje u ranom detinjstvu, rezultuje hemofilnom artropatijom i nepovratnim oštećenjem zglobova. Ovo oštećenje je progresivno i može dovesti do ozbiljno ograničene pokretljivosti zglobova, atrofije mišića i hroničnog bola (Rodriguez-Merchan, E.C., Semin. Thromb. Hemost.29:87-96 (2003), koji je ovde uključeno kao referenca u celosti).
[0003] Bolest se može lečiti zamenskom terapijom koja cilja na obnavljanje aktivnosti FVIII na 1 do 5 % normalnih nivoa da bi se sprečilo spontano krvarenje (videti, npr., Mannucci, P.M., i dr., N. Engl. J. Med.344:1773-9 (2001), ovde uključeno kao referenca u celosti). Postoje i rekombinantni FVIII proizvodi dobijeni iz plazme za lečenje epizoda krvarenja na zahtev ili za sprečavanje pojave epizoda krvarenja profilaktičkim lečenjem. Na temelju vremena poluraspada ovih proizvoda (10-12 h) (White G.C., i dr.,Thromb. Haemost. 77:660-7 (1997); Morfini, M., Haemophilia 9 (dodatak 1):94-99; diskusija 100 (2003)), režimi lečenja zahtevaju čestu intravensku primenu, obično dva do tri puta nedeljno za profilaksu i jedan do tri puta dnevno za tretman na zahtev (Manco-Johnson, M.J., i dr.,N. Engl. J. Med. 357:535544 (2007)), od kojih je svaki u celosti ovde uključen kao referenca. Takva česta primena je nezgodna i skupa.
[0004] Glavna prepreka u obezbeđivanju jeftinog rekombinantnog proteina FVIII pacijentima je visoka cena komercijalne proizvodnje. Protein FVIII se slabo eksprimira u heterolognim sistemima ekspresije, dva do tri reda veličine niže od proteina slične veličine. (Lynch i dr., Hum. Gene. Ther.; 4:259-72 (1993). Slaba ekspresija FVIII delimično je posledica prisustva elemenata koji deluju na cis u kodirajućoj sekvenci FVIII koji inhibiraju ekspresiju FVIII, kao što su elementi prigušivača transkripcije (Hoeben i dr., Blood 85:2447-2454 (1995)), sekvence slične vezivanju matriksa (MAR) (Fallux i dr., Mol. Cell. Biol. 16:4264-4272 (1996)), i elementi koji inhibiraju elongaciju transkripcije (Koeberl i dr., Hum. Gene. Ther.; 6:469-479 (1995)).
[0005] Napredak u našem razumevanju biologije ekspresije FVIII doveo je do razvoja snažnijih varijanti FVIII. Na primer, biohemijske studije su pokazale da je FVIII B-domen neophodan za aktivnost kofaktora FVIII. Delecija B-domena je dovela do 17-strukog povećanja nivoa mRNK u odnosu na FVIII divljeg tipa pune dužine i 30% povećanja izlučenog proteina. (Toole i dr., Proc Natl Acad Sci SAD 83:5939-42 (1986)). Ovo je dovelo do razvoja koncentrata FVIII proteina sa izbrisanim domenom B (BDD), koji se sada široko koristi u klinici. Nedavne studije, međutim, pokazuju da se puna dužina i BDD hFVIII pogrešno savijaju u lumenu ER, što dovodi do aktivacije nesavijenog proteinskog odgovora (UPR) i apoptoze mišjih hepatocita.
[0006] Prema tome, u tehnici postoji potreba za sekvencama FVIII koje se efikasno eksprimiraju u heterolognim sistemima.
[0007] Dokumenti WO 2014/127215 i WO 2011/005968 otkrivaju kodonom optimizovane sekvence faktora VIII. WO 2016/004113 otkriva kodonom optimizovane sekvence faktora IX.
SUŠTINA PRONALASKA
[0008] Ovaj pronalazak je definisan u nezavisnim zahtevima, a određene njegove opcione karakteristike su definisane u zavisnim zahtevima. U meri u kojoj se ovde koriste termini "pronalazak", "primer" i "realizacija", ovo će se tumačiti na takav način da je jedina tražena zaštita za pronalazak kako je traženo u zahtevima.
[0009] Ovaj pronalazak obezbeđuje izolovani molekul nukleinske kiseline kao što je definisano u priloženim zahtevima. Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje vektor koji sadrži molekul nukleinske kiseline kao što je definisano u priloženim zahtevima. Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje ćeliju domaćina koja sadrži molekul nukleinske kiseline ili vektor kao što je definisano u priloženim zahtevima.
[0010] Štaviše, ovaj pronalazak obezbeđuje postupak za proizvodnju polipeptida sa aktivnošću FVIII, koji obuhvata: kultivisanje ćelije domaćina kao što je definisano u priloženim zahtevima pod uslovima u kojima se proizvodi polipeptid sa aktivnošću FVIII i sakupljanje polipeptida sa aktivnošću FVIII.
[0011] Dalje, ovaj pronalazak obezbeđuje molekul nukleinske kiseline ili vektor kao što je definisano u priloženim zahtevima za upotrebu u postupku lečenja poremećaja krvarenja.
[0012] Tehničke informacije navedene u nastavku mogu u nekim aspektima prevazići obim pronalaska, koji je definisan isključivo priloženim zahtevima. Dodatne tehničke informacije su date da bi se stvarni pronalazak stavio u širi tehnički kontekst i da bi se ilustrovala moguća srodna tehnička rešenja.
[0013] Pored toga, usputne reference na postupke za lečenje ljudskog ili životinjskog tela hirurškim ili terapijskim putem i dijagnostičke metode koje se primenjuju na ljudskom ili životinjskom telu ne treba tumačiti kao zahtevanje zaštite za takve postupke kao takve, već se umesto toga može se tumačiti kao da se odnose na proizvode, posebno supstance ili kompozicije, za korišćenje u bilo kojem od ovih postupaka.
KRATAK OPIS CRTEŽA
[0014]
Slike 1A-1J daju kodonom optimizovane nukleotidne sekvence koje kodiraju sa B domenom-izbrisan faktor VIII (SEQ ID NO: 17). Slika 1A prikazuje nukleotidnu sekvencu za coFVIII-3 (SEQ ID NO:1). Slika 1B prikazuje nukleotidnu sekvencu za coFVIII-4 (SEQ ID NO: 2). Slika 1C prikazuje nukleotidnu sekvencu za coFVIII-5 (SEQ ID NO: 70). Slika 1D prikazuje nukleotidnu sekvencu za coFVIII-6 (SEQ ID NO: 71). Slika 1E prikazuje nukleotidnu sekvencu za coFVIII-52 (SEQ ID NO: 3). Slika 1F prikazuje nukleotidnu sekvencu za coFVIII-62 (SEQ ID NO: 4). Slika 1G prikazuje nukleotidnu sekvencu za coFVIII-25 (SEQ ID NO: 5). Slika 1H prikazuje nukleotidnu sekvencu za coFVIII-26 (SEQ ID NO: 6). Slike 1I i 1J prikazuju nukleotidne i aminokiselinske sekvence, redom, za B domenom-izbrisan faktor (BDD-FVIII) (SEQ ID NOs: 16 i 17, redom).
Slike 2A-2J pokazuju podešavanja sklonosti upotrebe kodona u kodonskim optimizovanim nukleotidnim sekvencama koje kodiraju BDD-FVIII. Slika 2A prikazuje relativnu frekvenciju kodona u nukleotidnoj sekvenci divljeg tipa (pre optimizacije kodona) koja kodira BDD-FVIII, npr., ne optimizovani BDD-FVIII. indeks adaptacije humanog kodona (CAI) za ne optimizovanu sekvencu BDD-FVIII je 74%. Slika 2B prikazuje relativnu frekvenciju kodona u sekvenci varijante coFVIII-1, koja ima humani CAI od 88%. Slika 2C prikazuje relativnu frekvenciju kodona u sekvenci varijante coFVIII-3, koja ima humani CAI od 91%. Slika 2D prikazuje relativnu frekvenciju kodona u sekvenci varijante coFVIII-4, koja ima humani CAI od 97%. Slika 2E prikazuje relativnu frekvenciju kodona u sekvenci varijante coFVIII-5, koja ima humani CAI od 83%. Slika 2F prikazuje relativnu frekvenciju kodona u sekvenci varijante coFVIII-6, koja ima humani CAI od 83%. Slika 2G prikazuje relativnu frekvenciju kodona u sekvenci varijante coFVIII-52, koja ima humani CAI od 91%. Slika 2H prikazuje relativnu frekvenciju kodona u sekvenci varijante coFVIII-62, koja ima humani CAI od 91%. Slika 21 prikazuje relativnu frekvenciju kodona u sekvenci varijante coFVIII-25, koja ima humani CAI od 88%. Slika 2J prikazuje relativnu frekvenciju kodona u sekvenci varijante coFVIII-26, koja ima humani CAI od 88%.
Slika 3 prikazuje plazmidnu mapu od FVIII-303, koja obuhvata coFVIII-1 u okosnici pcDNK3 pod kontrolom ET-pojačanog transtiretinskog promotera, koji je pozicioniran uzvodno od mesta početka translacije coFVIII-1 i koji sadrži sintetički pojačivač, mTIR pojačivač, i mTIR promotor.
Slika 4 prikazuje grafički prikaz aktivnosti u plazmi FVIII kod HemA miševa nakon hidrodinamičke injekcije 5 µg FVIII-303 (coFVIII-1; krugovi) ili 5 µg FVIII-311 (BDD-FVIII; kvadrati). Aktivnost plazme FVIII je određena FVIII specifičnom hromogenom analizom 24, 48 i 72 sata nakon injekcije. Prikazani su relativni nivoi aktivnosti na 72 sata, normalizovani na nivo ekspresije FVIII-311.
Slika 5 prikazuje plazmidnu mapu od pLV-coFVIII-52, koja obuhvata coFVIII-52 u lentivirusnom plazmidu pod kontrolom ET promotera, koji je pozicioniran uzvodno od mesta početka translacije coFVIII-52 i koji sadrži sintetički pojačivač, mTTR pojačivač, i mTTR promotor.
Slike 6A-6C prikazuju grafičke prikaze aktivnosti u plazmi FVIII kod HemA miševa nakon hidrodinamičke injekcije različitih nukleotida koji kodiraju FVIII. Aktivnost plazme FVIII je određena FVIII specifičnom hromogenom analizom 24, 48 i 72 sata posle injekcije. Slika 6A prikazuje aktivnost FVIII u plazmi kod HemA miševa nakon hidrodinamičke injekcije 5 µg LV-coFVIII-1 (popunjeni krugovi), 5 µg LV-coFVIII-3 (trouglovi), 5 µg LV-coFVIII-4 (obrnuti trouglovi), 5 µg LV-coFVIII-5 (dijamanti), ili 5 µg LV-coFVIII-6 (otvoreni krugovi). Slika 6B prikazuje aktivnost FVIII u plazmi kod HemA miševa nakon hidrodinamičke injekcije 5 µg LV-coFVIII-1 (krugovi), 5 µg LV-coFVIII-25 (trouglovi), ili 5 µg LV-coFVIII-26 (obrnuti trouglovi). Slika 6C prikazuje aktivnost FVIII u plazmi kod HemA miševa nakon hidrodinamičke injekcije 20 µg LV-2116 (nekodonski optimizovana (WT) BDD-FVIII nukleotidna sekvenca; otvoreni krugovi), 20 µg LV-coFVIII-1 (trouglovi), 20 µg LV-coFVIII-52 (kvadrati), ili 20 µg LV-coFVIII-62 (popunjeni krugovi). Relativni nivoi aktivnosti na 72 sata su prikazani za svaki plazmid, normalizovani na nivoe ekspresije LV-coFVIII-1 (Slike 6A, 6B, i 6C) i/ili LV-2116 (Slika 6C), kao što je naznačeno.
Slika 7 prikazuje aktivnost FVIII u plazmi kod HemA miševa 24 dana nakon injekcije sa 1E8 TU/mišjim lentivirusnim vektorom koji sadrži coFVIII-1, coFVIII-5, coFVIII-52, coFVIII-6, ili coFVIII-62 u poređenju sa LV-2116 (BDD-FVIII) kontrolom, i kao što je mereno FVIII-specifičnim hromogenim testom. Trake grešaka označavaju standardne devijacije.
Slike 8A-8C daju različite kodonske optimizovane nukleotidne sekvence koje kodiraju BDD-FVIII fuzionisane sa XTEN. Slika 8A prikazuje nukleotidnu sekvencu za coFVIII-52-XTEN (SEQ ID NO: 19), pri čemu je nukleotidna sekvenca koja kodira XTEN koja ima 144 aminokiseline ("XTEN144"; SEQ ID NO: 18; podvučena) insertovana unutar coFVIII-52 nukleotidne sekvence. Slika 8B prikazuje nukleotidnu sekvencu za coFVIII-1-XTEN (SEQ ID NO: 20), pri čemu je nukleotidna sekvenca koja kodira XTEN koja ima 144 aminokiseline ("XTEN144"; SEQ ID NO: 18; podvučena) insertovana unutar coFVIII-1 nukleotidne sekvence. Slika 8C prikazuje nukleotidnu sekvencu za coFVIII-6-XTEN (SEQ ID NO: 72), pri čemu je nukleotidna sekvenca koja kodira XTEN koja ima 144 aminokiseline ("XTEN144"; SEQ ID NO: 18; podvučena) insertovana unutar coFVIII-6 nukleotidne sekvence (npr., aminokiselinski ostatak 745 koji odgovara zreloj sekvenci FVIII).
Slika 9 daje plazmidnu mapu od pLV-coFVIII-52-XTEN, koja obuhvata coFVIII-52-XTEN u lentivirusnom vektoru pod kontrolom ET promotera. Lentivirusni vektori koji sadrže svaki od preostalih kodonom optimizovanih molekula nukleinske kiseline koji kodiraju polipeptid sa aktivnošću FVIII, kao što je ovde opisano, konstruisani su na isti način kao pLV-coFVIII-52-XTEN, u koji je ista XTEN sekvenca umetnuta da zameni B-domen od FVIII.
Slike 10A i 10B pokazuju aktivnost FVIII kod HemA miševa posle injekcije sa plazmidnom DNK (Slika 10A) ili lentivirusnim vektorom (Slika 10B) koji sadrži različite kodonske optimizovane nukleotidne sekvence koje kodiraju BDD-FVIII. Slika 10A prikazuje grafički prikaz aktivnosti u plazmi FVIII kod HemA miševa nakon hidrodinamičke injekcije sa 5 µg FVIII-311 (nekodonski optimizovan, nukleotidna sekvenca koja kodira BDD-FVIII; kvadrati), 5µg FVIII-303 (coFVIII-1; mali krugovi), ili FVIII-306 (coFVIII-1-XTEN144; veliki krugovi). Relativna aktivnost na 72 sata, normalizovana na FVIII-311, prikazana je za svaki plazmid. Slika 10B prikazuje aktivnost FVIII u plazmi kod HemA miševa 21 dan posle injekcije sa 1E8 TU/miš lentivirusnog vektora koji sadrži coFVIII-52 ili coFVIII-52-XTEN u poređenju sa LV-2116 (BDD-FVIII) kontrolom, i izmereno pomoću FVIII -specifičnog hromogenog testa. Trake grešaka označavaju standardne devijacije.
Slika 11A prikazuje sekvencu aminokiseline pune dužine zrelog humanog faktora VIII. Slika 11B prikazuje sekvencu aminokiseline pune dužine humanog von Willebrandovog faktora (SEQ ID NO: 44). Slike 11C i 11D prikazuju sekvence aminokiselina i nukleotida XTEN polipeptida koji ima 42 aminokiseline (XTEN AE42-4; SEQ ID NOs: 46 i 47, redom Aminokiselinske sekvence različitih XTEN polipeptida koji imaju 144 aminokiseline su prikazane na slikama 11E, 11G, 111, 11K, 11M, 110, 11Q, 11S, 11U, i 11W (SEQ ID NOs: 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, i 66, redom), a odgovarajuće nukleotidne sekvence su prikazane na slikama 11F, 11H, 11J, 11L, 11N, 11P, 11R, 11T, 11V, i 11X (SEQ ID NOs.49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, i 67, redom). Slika 11Y prikazuje nukleotidnu sekvencu za ET promotor (SEQ ID NO: 69). Slika 11Z prikazuje nukleotidnu sekvencu za coFVIII-1 (SEQ ID NO: 68)
Slika 12A je grafički prikaz aktivnosti u plazmi (IU/mL) kod 14-dnevnih HemA miševa posle IV primene oko 1.5 E10 TU/kg LV-wtBDD-FVIII (krugovi), LVcoFVIII-6 (kvadrati), ili LV-coFVIII-6XTEN (trouglovi). Slika 12B je grafički prikaz broja kopija vektora (VCN) 150 dana posle tretmana 14-dnevnih HemA miševa kojima je IV davano oko 1.5 E10 TU/kg lentivirusnih vektora koji eksprimiraju wtBDD-FVIII, coFVIII-1, coFVIII-3, coFVIII-4, coFVIII-5, coFVIII-6, coFVIII-52, coFVIII-62, coFVIII-25, ili coFVIII-26. Slika 12C je grafički prikaz aktivnosti u plazmi FVIII (IU/mL) 21 dan posle tretmana 14-dnevnih HemA miševa kojima je IV davano oko 1.5 E10 TU/kg lentivirusnih vektora koji eksprimiraju wtBDD-FVIII, coFVIII-1, coFVIII-3, coFVIII-4, coFVIII-5, coFVIII-6, coFVIII-52, coFVIII-62, coFVIII-25, ili coFVIII-26.
Slike 13A i 13B su grafički prikazi koji ilustruju nivoe aktivnosti FVIII u plazmi (Slika 13A) i nivoe anti-FVIII antitela (Slika 13B) kod pet HemA miševa tretiranih lentivirusom koji eksprimira varijantu coFVIII-5. Četrnaest dana starim HemA leglima je dato približno 1.5 E10 TU/kg lentivirusa koji eksprimira varijantu coFVIII-5 intravenskom injekcijom. Svaki miš je označen brojem (tj., 1, 2, 3, 4, i 5; Slike 13A i 13B).
Slika 14 je grafički prikaz korelacije između nivoa ekspresije LV-FVIII, što je dokazano aktivnošću FVIII u plazmi 21 dan posle lentivirusnog tretmana, i prisustva anti-FVIII antitela. Svaka tačka podataka odgovara jednom HemA mišu. Svaki miš je primio dozu od 1.5 E10 TU/kg intravenskom injekcijom lentivirusa koji eksprimira jednu od varijanti coFVIII koje su ovde otkrivene. Horizontalne linije pokazuju prosečnu aktivnost FVIII u plazmi.
Slika 15 je grafički prikaz korelacije između broja kopija vektora (VCN) po ćeliji 150 dana posle lentivirusnog tretmana i prisustva anti-FVIII antitela. Svaka tačka podataka odgovara jednom HemA mišu. Svaki miš je primio dozu od a 1.5 E10 TU/kg intravenskom injekcijom lentivirusa koji eksprimira jednu od varijanti coFVIII koje su ovde otkrivene. Horizontalne linije označavaju prosečan VCN.
Slike 16A i 16B su grafički prikazi koji ilustruju nivoe aktivnosti FVIII u plazmi (Slika 16A) i nivoe anti-FVIII antitela (Slika 16B) kod dva HemA miša (coFVIII-52-A i coFVIII-52-B) tretirana sa lentivirusom koji eksprimira varijantu coFVIII-52. Četrnaest dana starim HemA leglima je dato približno 1.5 E10 TU/kg lentivirusa koji eksprimira varijantu coFVIII-52 putem intravenske injekcije. Slike 16C i 16D su slike koje prikazuju RNK in situ hibridizaciono bojenje za ekspresiju FVIII (tamno bojenje) u tkivu jetre sakupljeno od coFVIII-52-A (Slika 16C) i coFVIII-52-B (Slika 16D) miševa sa slike 16A i 16B.
Slika 17 je grafički prikaz koji prikazuje dugotrajnu ekspresiju FVIII kod HemA novorođenih miševa tretiranih lentivirusom koji eksprimira divlji tip FVIII sa izbrisanim B domenom (wtBDD-FVIII; trouglovi), coFVIII-52XTEN (krugovi), ili varijantu coFVIII-6XTEN (obrnuti trougao). Novorođenim HemA miševima je davana intravenska injekcija sa približno 1.5 A10 TU/kg lentivirusa koji eksprimira wtBDD-FVIII, coFVIII-52XTEN, ili coFVIII-6XTEN. Aktivnost FVIII u plazmi je merena tokom približno 16 nedelja.
Slika 18 je grafički prikaz nivoa FVIII u cirkulaciji kod HemA novorođenčadi pasa (S3 ili K4) posle primene 1.3 × 10<9>transdukcionih jedinica/kg lentivirusnog vektora koji sadrži faktor VIII koji kodira nukleotide fuzionisan sa XTEN (SEQ ID NO: 72; LV-coFVIII-6-XTEN). Kvadrati povezani punom linijom predstavljaju aPTT-S3 uzorke, a trouglovi povezani isprekidanom linijom predstavljaju aPTT-K4 uzorke. Y-osa prikazuje aktivnost FVIII u plazmi kao procenat normalnog, pri čemu je normalna aktivnost FVIII kod ljudi 100%. X-osa prikazuje dane posle lečenja lentivirusom, pri čemu se lečenje lentivirusom primenjuje na dan 0.
Slike 19A-19C su grafički prikazi hemostaze pune krvi praćene testom rotacione tromboelastometrije (ROTEM) za naivnog HemA psa (Slika 19A), psa S32 nedelje posle tretmana lentivirusom (Slika 19B) i psa K4 na 2 nedelje posle tretmana lentivirusom (Slika 19C). Vreme zgrušavanja (CT) je prikazano kao sekunde (s), vreme formiranja ugruška (CFT) je prikazano kao sekunde (s), ugao alfa (α) je prikazan kao stepeni (°), amplituda 5 minuta posle CT (A5) prikazana je kao milimetri (mm), amplituda 20 minuta posle CT (A20) prikazana je kao milimetri (mm), a maksimalna čvrstoća ugruška (MCF) prikazana je kao milimetri (mm) za svaku od Slika 19A-19C. Slika 19D je tabela koja sumira normalni raspon za svaki od parametara CT, CFT, α, A5, A2, i MCF prikazanih na Slikama 19A-19C.
DETALJAN OPIS PRONALASKA
[0015] Ovo otkriće opisuje kodon-optimizovane gene koji kodiraju polipeptide sa aktivnošću Faktora VIII (FVIII). Ovo otkriće je usmereno na molekule nukleinske kiseline optimizovane kodonom koji kodiraju polipeptide sa aktivnošću Faktora VIII, vektore i ćelije domaćina koje sadrže optimizovane molekule nukleinske kiseline, polipeptide kodirane optimizovanim molekulima nukleinske kiseline i metode za proizvodnju takvih polipeptida. Ovo otkriće je takođe usmereno na optimizovanu sekvencu nukleinske kiseline Faktora VIII, vektor koji sadrži optimizovanu sekvencu nukleinske kiseline, ili polipeptid koji je time kodiran za upotrebu u postupku lečenja poremećaja krvarenja kao što je hemofilija. Ovo otkriće ispunjava važnu potrebu u tehnici obezbeđivanjem optimizovanih sekvenci Faktora VIII koje pokazuju povećanu ekspresiju u ćelijama domaćinima, poboljšani prinos proteina Faktora VIII u metodama za proizvodnju rekombinantnog Faktora VIII, i potencijalno rezultiraju većom terapijskom efikasnošću kada se koriste u postupcima genske terapije. U nekim realizacijama, otkriće opisuje izolovani molekul nukleinske kiseline koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja ima homologiju sekvence sa nukleotidnom sekvencom iz SEQ ID NO: 71.
[0016] Primeri konstrukata iz pronalaska su ilustrovani na priloženim slikama i spisku sekvenci. Da bi se obezbedilo jasno razumevanje specifikacije i zahteva, sledeće definicije su date u nastavku.
I. Definicije
[0017] Treba napomenuti da se termin jedan entitet odnosi na jedan ili više tih entiteta: na primer, "nukleotidna sekvenca" se podrazumeva da predstavlja jednu ili više nukleotidnih sekvenci. Kao takvi, termini "jedan ili više" i "najmanje jedan" mogu se ovde koristiti naizmenično.
[0018] Termin "oko" se ovde koristi da znači približno, otprilike, oko ili u regionima od. Kada se termin „oko“ koristi u kombinaciji sa numeričkim rasponom, on modifikuje taj obim tako što proširuje granice iznad i ispod pomenutih numeričkih vrednosti. Uopšteno govoreći, termin "oko" se ovde koristi za modifikovanje numeričke vrednosti iznad i ispod pomenute vrednosti za varijansu od 10 procenata, naviše ili naniže (više ili manje).
[0019] Termin "izolovan" za potrebe ovog pronalaska označava biološki materijal (ćeliju, polipeptid, polinukleotid, ili njegov fragment, varijantu ili derivat) koji je uklonjen iz svog prvobitnog okruženja (sredine u kojoj se nalazi prirodno prisutan). Na primer, polinukleotid prisutan u prirodnom stanju u biljci ili životinji nije izolovan, međutim isti polinukleotid odvojen od susednih nukleinskih kiselina u kojima je prirodno prisutan, smatra se „izolovanim“. Nije potreban poseban nivo prečišćavanja. Rekombinantno proizvedeni polipeptidi i proteini eksprimirani u ćelijama domaćinima smatraju se izolovanim u svrhu pronalaska, kao i prirodni ili rekombinantni polipeptidi koji su odvojeni, frakcionisani ili delimično ili suštinski prečišćeni bilo kojom pogodnom tehnikom.
1
[0020] Nukleinske kiseline“, „molekuli nukleinske kiseline“, „oligonukleotid“ i „polinukleotid“ se koriste naizmenično i odnose se na polimernu formu fosfatnog estra ribonukleozida (adenozin, gvanozin, uridin ili citidin) „RNK; deoksiribonukleozidi (deoksiadenozin, deoksigvanozin, deoksitimidin ili deoksicitidin; "molekuli DNK"), ili bilo koji njihovi analozi fosfoestara, kao što su fosforotioati i tioestri, u jednolančanom obliku ili u dvolančanom heliksu. Moguće su dvolančane DNK-DNK, DNK-RNK i RNK-RNK spirale. Termin molekul nukleinske kiseline, a posebno molekul DNK ili RNK, odnosi se samo na primarnu i sekundarnu strukturu molekula i ne ograničava je na bilo koje posebne tercijarne forme. Dakle, ovaj termin obuhvata dvolančanu DNK koja se nalazi, između ostalog, u linearnim ili kružnim molekulima DNK (npr. restrikcioni fragmenti), plazmidima, supernamotanoj DNK i hromozomima. U diskusiji o strukturi određenih dvolančanih molekula DNK, sekvence se ovde mogu opisati u skladu sa uobičajenom konvencijom davanja samo sekvence u pravcu od 5' do 3' duž ne transkribovanog lanca DNK (tj. lanac koji ima sekvencu homolognu sa mRNK). "Rekombinantni DNK molekul" je molekul DNK koji je prošao molekularno-biološku manipulaciju. DNK obuhvata, ali nije ograničena na, cDNK, genomsku DNK, plazmidnu DNK, sintetičku DNK i polu-sintetičku DNK. "Sastav nukleinske kiseline" prema pronalasku sadrži jednu ili više nukleinskih kiselina kao što je ovde opisano.
[0021] Kako se ovde koristi, "kodirajući region" ili "kodirajuća sekvenca" je deo polinukleotida koji se sastoji od kodona koji se mogu prevoditi u aminokiseline. Iako se „stop kodon“ (TAG, TGA ili TAA) obično ne prevodi u aminokiselinu, može se smatrati da je deo kodirajućeg regiona, ali sve prateće sekvence, na primer promoteri, mesta vezivanja ribozoma, terminatori transkripcije, introni i slično, nisu deo kodirajućeg regiona. Granice kodirajućeg regiona su tipično određene početnim kodonom na 5' terminusu, koji kodira amino terminus rezultujućeg polipeptida, i translacionim stop kodonom na 3' terminusu, koji kodira karboksilni kraj rezultujućeg polipeptida. Dva ili više kodirajućih regiona mogu biti prisutni u jednom polinukleotidnom konstruktu, na primer, na jednom vektoru, ili u odvojenim polinukleotidnim konstruktima, npr. na odvojenim (različitim) vektorima. Iz toga sledi da jedan vektor može da sadrži samo jedan kodirajući region, ili da sadrži dva ili više kodirajućih regiona.
[0022] Određeni proteini koje luče ćelije sisara su povezani sa sekretornim signalnim peptidom koji se cepa od zrelog proteina kada se pokrene izvoz rastućeg proteinskog lanca preko grubog endoplazmatskog retikuluma. Stručnjaci u ovoj oblasti su svesni da su signalni peptidi generalno fuzionisani sa N-terminusom polipeptida, i da se odvajaju od kompletnog polipeptida ili polipeptida „pune dužine“ da bi se proizveo izlučeni ili „zreli“ oblik polipeptida. U nekim realizacijama, nativni signalni peptid ili funkcionalni derivat te sekvence koji zadržava sposobnost da usmerava sekreciju polipeptida koji je operativno povezan sa njim. Alternativno, može se koristiti heterologni signalni peptid sisara, npr. aktivator plazminogena ljudskog tkiva (TPA) ili signalni peptid mišje β-glukuronidaze, ili njegov funkcionalni derivat.
[0023] Termin "nizvodno" odnosi se na nukleotidnu sekvencu koja se nalazi 3' od referentne nukleotidne sekvence. U određenim realizacijama, nizvodne nukleotidne sekvence se odnose na sekvence koje prate početnu tačku transkripcije. Na primer, kodon inicijacije translacije gena se nalazi nizvodno od početnog mesta transkripcije.
[0024] Termin "uzvodno" odnosi se na nukleotidnu sekvencu koja se nalazi 5' od referentne nukleotidne sekvence. U određenim realizacijama, uzvodne nukleotidne sekvence se odnose na sekvence koje se nalaze na 5' strani kodirajućeg regiona ili početne tačke transkripcije. Na primer, većina promotera se nalazi uzvodno od početnog mesta transkripcije.
[0025] Kako se ovde koristi, termin "regulatorni region gena" ili "regulatorni region" odnosi se na nukleotidne sekvence locirane uzvodno (5' nekodirajuće sekvence), unutar ili nizvodno (3' nekodirajuće sekvence) kodirajućeg regiona, i koji utiču na transkripciju, obradu RNK, stabilnost ili translaciju pridruženog regiona kodiranja. Regulatorni regioni mogu uključivati promotere, translacione liderske sekvence, introne, sekvence za prepoznavanje poliadenilacije, mesta za obradu RNK, mesta vezivanja efektora i strukture petlje stabla. Ako je kodirajući region namenjen za ekspresiju u eukariotskoj ćeliji, signal poliadenilacije i sekvenca terminacije transkripcije obično će biti locirani 3' od kodirajuće sekvence.
[0026] Polinukleotid koji kodira proizvod gena, npr. polipeptid, može uključiti promoter i/ili druge kontrolne elemente ekspresije (npr. transkripciju ili translaciju) koji su operativno povezani sa jednim ili više kodirajućih regiona. U operabilnoj asocijaciji, kodirajući region za genski proizvod, na primer, polipeptid, povezan je sa jednim ili više regulatornih regiona na takav način da stavlja ekspresiju genskog proizvoda pod uticaj ili kontrolu regulatornog(ih) regiona(a). Na primer, kodirajući region i promoter su „operativno povezani“ ako indukcija funkcije promotera rezultira transkripcijom mRNK koja kodira genski proizvod koji je kodiran kodirajućim regionom, i ako priroda veze između promotera i kodirajućeg regiona ne ometa sposobnost promotera da usmerava ekspresiju genskog proizvoda ili ometa sposobnost DNK šablona da se transkribuje. Drugi elementi kontrole ekspresije, pored promotera, na primer pojačivači, operateri, represori i signali terminacije transkripcije, takođe mogu da budu operativno povezani sa kodirajućim regionom za usmeravanje ekspresije proizvoda gena.
[0027] "Kontrolne sekvence transkripcije" se odnose na DNK regulatorne sekvence, kao što su promoteri, pojačivači, terminatori i slično, koji obezbeđuju ekspresiju kodirajuće sekvence u ćeliji domaćinu. Stručnjacima su poznati različiti regioni za kontrolu transkripcije. Ovo obuhvata, bez ograničenja, regione kontrole transkripcije koji funkcionišu u ćelijama kičmenjaka, kao što su, ali ne ograničavajući se na, segmente promotera i pojačivača iz citomegalovirusa (neposredni rani promoter, u vezi sa intronom-A), majmunski virus 40 (rani promoter ), i retro viruse (kao što je virus Rousovog sarkoma). Drugi regioni za kontrolu transkripcije obuhvataju one koji potiču od gena kičmenjaka kao što su aktin, protein toplotnog šoka, goveđi hormon rasta i zečji β-globin, kao i druge sekvence sposobne da kontrolišu ekspresiju gena u eukariotskim ćelijama. Dodatni pogodni regioni za kontrolu transkripcije obuhvataju tkivno specifične promotere i pojačivače, kao i promotere inducibilne limfokinom (npr. promotere inducibilne interferonima ili interleukinom).
[0028] Slično, stručnjacima sa uobičajenim iskustvom u ovoj oblasti su poznati različiti elementi kontrole translacije. Oni obuhvataju, ali nisu ograničeni na mesta vezivanja ribozoma, kodone inicijacije i terminacije translacije, i elemente izvedene iz pikornavirusa (posebno interno ulazno mesto ribozoma, ili IRES, koje se takođe naziva CITE sekvenca).
[0029] Termin "ekspresija" kako se ovde koristi odnosi se na proces kojim polinukleotid proizvodi genski proizvod, na primer, RNK ili polipeptid. Obuhvata bez ograničenja transkripciju polinukleotida u RNK (mRNK), transfernu RNK (tRNK), malu RNK ukosnicu (shRNK), malu interferirajuću RNK (siRNK) ili bilo koji drugi RNK proizvod, i prevođenje mRNK u polipeptid. Ekspresija proizvodi "genski proizvod". Kao što se ovde koristi, genski proizvod može biti ili nukleinska kiselina, npr. RNK koja se proizvodi transkripcijom gena, ili polipeptid koji je preveden iz transkripta. Genski proizvodi koji su ovde opisani dalje obuhvataju nukleinske kiseline sa post-transkripcionim modifikacijama, npr. poliadenilacijom ili spajanjem, ili polipeptide sa posttranslacionim modifikacijama, npr. metilacijom, glikozilacijom, dodavanjem lipida, povezivanjem sa drugim proteinskim podjedinicama ili
1
proteolitičkim cepanjem. Termin "prinos", kako se ovde koristi, odnosi se na količinu polipeptida proizvedenog ekspresijom gena.
[0030] "Vektor" se odnosi na bilo koji nosač za kloniranje i/ili transfer nukleinske kiseline u ćeliju domaćina. Vektor može biti replikon za koji se može vezati drugi segment nukleinske kiseline kako bi se ostvarila replikacija vezanog segmenta. "Replikon" se odnosi na bilo koji genetski element (npr. plazmid, fag, kozmid, hromozom, virus) koji funkcioniše kao autonomna jedinica replikacije in vivo, tj. sposoban za replikaciju pod sopstvenom kontrolom. Termin "vektor" obuhvata i virusne i ne virusne nosače za uvođenje nukleinske kiseline u ćeliju in vitro, ex vivo ili in vivo. Veliki broj vektora je poznat i korišćen u tehnici uključujući, na primer, plazmide, modifikovane eukariotske viruse ili modifikovane bakterijske viruse. Umetanje polinukleotida u odgovarajući vektor može se postići ligiranjem odgovarajućih polinukleotidnih fragmenata u izabrani vektor koji ima komplementarne kohezivne terminuse.
[0031] Vektori se mogu veštački konstruisati da kodiraju selektivne markere ili reportere koji obezbeđuju selekciju ili identifikaciju ćelija koje su inkorporirale vektor. Ekspresija selektivnih markera ili reportera omogućava identifikaciju i/ili selekciju ćelija domaćina koje obuhvataju i eksprimiraju druge kodirajuće regione sadržane u vektoru. Primeri selektivnih markerskih gena poznatih i korišćenih u tehnici obuhvataju: gene koji obezbeđuju otpornost na ampicilin, streptomicin, gentamicin, kanamicin, higromicin, herbicid bialafos, sulfonamid i slično; i geni koji se koriste kao fenotipski markeri, tj. regulatorni geni za antocijanin, gen za izopentanil transferazu i slično. Primeri reportera poznatih i korišćenih u tehnici obuhvataju: luciferazu (Luc), zeleni fluorescentni protein (GFP), hloramfenikol acetiltransferazu (CAT), βgalaktozidazu (LacZ), β-glukuronidazu (Gus) i slično. Markeri koji se mogu birati se takođe mogu smatrati reporterima.
[0032] Termin "selektivni marker" se odnosi na identifikacioni faktor, obično gen otpornosti na antibiotike ili hemijske supstance, za koji se može izabrati na osnovu efekta markerskog gena, tj. otpornost na antibiotik, otpornost na herbicid, kolorimetrijski markeri, enzimi, fluorescentni markeri i slično, pri čemu se efekat koristi za praćenje nasleđa nukleinske kiseline od interesa i/ili za identifikaciju ćelije ili organizma koji je nasledio nukleinsku kiselinu od interesa. Primeri selektivnih markerskih gena poznatih i korišćenih u tehnici obuhvataju: gene koji obezbeđuju otpornost na ampicilin, streptomicin, gentamicin, kanamicin, higromicin, bialafos herbicid, sulfonamid i slično; i geni koji se koriste kao fenotipski markeri, tj. regulatorni geni za antocijanin, gen za izopentanil transferazu i slično.
[0033] Termin "reporterski gen" se odnosi na nukleinsku kiselinu koja kodira identifikacioni faktor koji se može identifikovati na osnovu efekta reporterskog gena, pri čemu se efekat koristi za praćenje nasleđa nukleinske kiseline od interesa, za identifikaciju ćelija ili organizma koji je nasledio nukleinsku kiselinu od interesa, i/ili za merenje indukcije genske ekspresije ili transkripcije. Primeri reporterskih gena poznatih i korišćenih u tehnici obuhvataju: luciferazu (Luc), zeleni fluorescentni protein (GFP), hloramfenikol acetiltransferazu (CAT), βgalaktozidazu (LacZ), β-glukuronidazu (Gus) i slično. Selektivni markerski geni se takođe mogu smatrati reporterskim genima.
[0034] "Promoter" i "promoterska sekvenca" se koriste naizmenično i odnose se na DNK sekvencu sposobnu da kontroliše ekspresiju kodirajuće sekvence ili funkcionalne RNK. Generalno, kodirajuća sekvenca se nalazi 3' od sekvence promotera. Promoteri mogu biti izvedeni u celini iz prirodnog gena, ili mogu biti sastavljeni od različitih elemenata izvedenih iz različitih promotera koji se nalaze u prirodi, ili čak sadržati sintetičke DNK segmente. Stručnjaci u ovoj oblasti razumeju da različiti promoteri mogu da usmeravaju ekspresiju gena u različitim tkivima ili tipovima ćelija, ili u različitim fazama razvoja, ili kao odgovor na različite životne ili fiziološke uslove. Promoteri koji izazivaju ekspresiju gena u većini tipova ćelija u većini slučajeva se obično nazivaju „konstitutivni promoteri“. Promoteri koji izazivaju ekspresiju gena u specifičnom tipu ćelije se obično nazivaju „promoteri specifični za ćeliju“ ili „promoteri specifični za tkivo“.
[0035] Promoteri koji izazivaju ekspresiju gena u specifičnoj fazi razvoja ili ćelijske diferencijacije se obično nazivaju "promoteri specifični za razvoj" ili "promoteri specifični za ćelijsku diferencijaciju". Promoteri koji se indukuju i uzrokuju ekspresiju gena posle izlaganja ili tretmana ćelije agensom, biološkim molekulom, hemikalijom, ligandom, svetlošću ili sličnim koji indukuje promoter obično se nazivaju „inducibilni promoteri“ ili „regulisani promoteri“. Dalje je poznato da pošto u većini slučajeva tačne granice regulatornih sekvenci nisu u potpunosti definisane, fragmenti DNK različitih dužina mogu imati identičnu aktivnost promotera.
1
[0036] Promoterska sekvenca je tipično ograničena na svom 3' terminusu mestom inicijacije transkripcije i proteže se uzvodno (smer 5') da bi uključila minimalni broj baza ili elemenata neophodnih za iniciranje transkripcije na nivoima koji se mogu detektovati iznad pozadine. Unutar sekvence promotera će se naći mesto inicijacije transkripcije (pogodno definisano, na primer, mapiranjem sa nukleazom S1), kao i domeni za vezivanje proteina (konsenzus sekvence) odgovorni za vezivanje RNK polimeraze.
[0037] Termini "restrikciona endonukleaza" i "restrikcioni enzim" se koriste naizmenično i odnose se na enzim koji se vezuje i seče unutar specifične nukleotidne sekvence unutar dvolančane DNK.
[0038] Termin "plazmid" se odnosi na ekstrahromozomski element koji često nosi gen koji nije deo centralnog metabolizma ćelije, i obično u obliku kružnih dvolančanih DNK molekula. Takvi elementi mogu biti autonomno replicirajuće sekvence, sekvence koje integrišu genom, sekvence faga ili nukleotida, linearne, kružne ili superzamotane, jednolančane ili dvolančane DNK ili RNK, izvedene iz bilo kog izvora, u kojima je određeni broj nukleotidnih sekvenci spojen ili rekombinovan u jedinstveni konstrukt koji je sposoban da uvede fragment promotera i DNK sekvencu za izabrani genski proizvod zajedno sa odgovarajućom 3' ne prevedenom sekvencom u ćeliju.
[0039] Eukariotski virusni vektori koji se mogu koristiti obuhvataju, ali nisu ograničeni na, vektore adenovirusa, retrovirusne vektore, adeno povezane virusne vektore, poksviruse, npr. vektore virusa vakcinije, vektore bakulovirusa ili vektore herpesvirusa. Nevirusni vektori obuhvataju plazmide, lipozome, električno naelektrisane lipide (citofektine), komplekse DNK-protein i biopolimere.
[0040] „Vektor za kloniranje“ se odnosi na „replikon“, koji je jedinična dužina nukleinske kiseline koja se replicira sekvencijalno i koja sadrži izvor replikacije, kao što je plazmid, fag ili kozmid, na koji drugi segment nukleinske kiseline može biti prikačen tako da dovede do replikacije prikačenog segmenta. Određeni vektori za kloniranje su sposobni za replikaciju u jednom tipu ćelije, npr. bakterije, i ekspresiju u drugom, na primer, eukariotskim ćelijama. Vektori za kloniranje obično sadrže jednu ili više sekvenci koje se mogu koristiti za selekciju ćelija koje sadrže vektor i/ili jedno ili više višestrukih mesta za kloniranje za inserciju sekvenci nukleinske kiseline od interesa.
1
[0041] Termin "ekspresioni vektor" odnosi se na vehikulum dizajniran da omogući ekspresiju insertovane sekvence nukleinske kiseline posle insercije u ćeliju domaćina. Insertovana sekvenca nukleinske kiseline se postavlja u operativnu vezu sa regulatornim regionima kao što je gore opisano.
[0042] Vektori se unose u ćelije domaćina metodama dobro poznatim u tehnici, npr. transfekcija, elektroporacija, mikroinjekcija, transdukcija, ćelijska fuzija, DEAE dekstran, taloženje kalcijum fosfata, lipofekcija (fuzija lizozoma), upotreba genskog pištolja ili transporterom DNK vektora.
[0043] "Kultura" i "kultivisanje", kako se ovde koriste, znači inkubiranje ćelija u in vitro uslovima koji omogućavaju rast ili deobu ćelija ili održavanje ćelija u živom stanju. "Kultivisane ćelije", kako se ovde koristi, označava ćelije koje se razmnožavaju in vitro.
[0044] Kako se ovde koristi, termin "polipeptid" treba da obuhvati jedninu "polipeptid" kao i množinu "polipeptidi" i odnosi se na molekul sastavljen od monomera (aminokiselina) linearno povezanih amidnim vezama (takođe poznatim kao peptidne veze). Termin "polipeptid" se odnosi na bilo koji lanac ili lance od dve ili više aminokiselina, i ne odnosi se na specifičnu dužinu proizvoda. Dakle, peptidi, dipeptidi, tripeptidi, oligopeptidi, "protein", "lanac aminokiselina" ili bilo koji drugi termin koji se koristi za označavanje lanca ili lanaca od dve ili više aminokiselina, obuhvaćeni su u definiciju "polipeptida" i termin "polipeptid" se može koristiti umesto, ili naizmenično sa bilo kojim od ovih termina. Termin "polipeptid" je takođe namenjen da se odnosi na proizvode post-ekspresionih modifikacija polipeptida, uključujući bez ograničenja glikozilaciju, acetilaciju, fosforilaciju, amidaciju, derivatizaciju poznatim zaštitnim/blokirajućim grupama, proteolitičko cepanje ili modifikaciju pomoću ne-prirodno prisutnih aminokiselina. Polipeptid može biti izveden iz prirodnog biološkog izvora ili proizveden rekombinantnom tehnologijom, ali nije nužno preveden iz određene sekvence nukleinske kiseline. Može se proizvesti na bilo koji način, uključujući hemijsku sintezu.
[0045] Termin "aminokiselina" obuhvata alanin (Ala ili A); arginin (Arg ili R); asparagin (Asn ili N); asparaginsku kiselinu (Asp ili D); cistein (Cis ili C); glutamin (Gln ili Q); glutaminsku kiselinu (Glu ili E); glicin (Gly ili G); histidin (His ili H); izoleucin (Ile ili I): leucin (Leu ili L); lizin (Lys ili K); metionin (Met ili M); fenilalanin (Phe ili F); prolin (Pro ili P); serin (Ser
1
ili S); treonin (Thr ili T); triptofan (Trp ili W); tirozin (Tyr ili Y); i valin (Val ili V). Netradicionalne aminokiseline su takođe u okviru ovog otkrića i obuhvataju norleucin, omitin, norvalin, homoserin i druge analoge aminokiselinskih ostataka kao što su oni opisani u Ellman i dr. Meth. Enzym.202:301-336 (1991). Da bi se generisali takvi ostaci aminokiselina koji se ne pojavljuju u prirodi, mogu se koristiti postupci iz Noren i dr. Science 244:182 (1989) i Ellman i dr., gore. Ukratko, ovi postupci obuhvataju hemijsku aktivaciju supresorske tRNK sa ostatkom aminokiseline koji se ne pojavljuje u prirodi, posle čega sledi in vitro transkripcija i prevođenje RNK. Uvođenje netradicionalne aminokiseline se takođe može postići korišćenjem hemija peptida poznatih u tehnici. Kako se ovde koristi, termin "polarna aminokiselina" obuhvata aminokiseline koje imaju neto nulti naboj, ali imaju delimične naboje različite od nule u različitim delovima svojih bočnih lanaca (npr., M, F, W, S, Y, N, Q, C). Ove aminokiseline mogu učestvovati u hidrofobnim interakcijama i elektrostatičkim interakcijama. Kako se ovde koristi, termin "naelektrisana aminokiselina" obuhvata aminokiseline koje mogu imati neto naelektrisanje koje nije nula na svojim bočnim lancima (npr., R, K, H, E, D). Ove aminokiseline mogu učestvovati u hidrofobnim interakcijama i elektrostatičkim interakcijama.
[0046] Takođe uključeni u ovo otkriće su fragmenti ili varijante polipeptida, i bilo koja njihova kombinacija. Termin "fragment" ili "varijanta" kada se odnosi na domene za vezivanje polipeptida ili vezujuće molekule iz ovog pronalaska obuhvata sve polipeptide koji zadržavaju bar neka svojstva (npr. afinitet vezivanja FcRn za FcRn vezujući domen ili Fc varijantu, aktivnost koagulacije za varijantu FVIII, ili aktivnost vezivanja FVIII za VWF fragment) referentnog polipeptida. Fragmenti polipeptida obuhvataju proteolitičke fragmente, kao i delecione fragmente, pored specifičnih fragmenata antitela o kojima se ovde govori, ali ne obuhvataju prirodni polipeptid pune dužine (ili zreli polipeptid). Varijante domena za vezivanje polipeptida ili vezujućih molekula iz ovog pronalaska obuhvataju fragmente kao što je gore opisano, kao i polipeptide sa izmenjenim sekvencama aminokiselina usled supstitucija, delecija ili insercija aminokiselina. Varijante mogu biti prirodne ili neprirodne. Varijante koje se ne pojavljuju u prirodi mogu se proizvesti korišćenjem tehnika mutageneze poznatih u tehnici. Varijantni polipeptidi mogu da sadrže konzervativne ili nekonzervativne aminokiselinske supstitucije, delecije ili dodavanja.
[0047] "Konzervativna aminokiselinska supstitucija" je ona u kojoj je aminokiselinski ostatak zamenjen aminokiselinskim ostatkom koji ima sličan bočni lanac. Porodice aminokiselinskih ostataka koji imaju slične bočne lance su definisane u tehnici, uključujući bazične bočne lance
1
(npr. lizin, arginin, histidin), kisele bočne lance (npr. asparaginska kiselina, glutaminska kiselina), nenaelektrisane polarne bočne lance (npr. glicin, asparagin, glutamin, serin, treonin, tirozin, cistein), nepolarne bočne lance (npr. alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenilalanin, metionin, triptofan), beta-razgranate bočne lance (npr., valin, treonin izoleucin) i aromatične bočne lance (npr. tirozin, fenilalanin, triptofan, histidin). Dakle, ako je aminokiselina u polipeptidu zamenjena sa drugom aminokiselinom iz iste porodice bočnih lanaca, zamena se smatra konzervativnom. U drugom aspektu, niz aminokiselina može se konzervativno zameniti strukturno sličnim nizom koji se razlikuje po redosledu i/ili sastavu članova porodice bočnih lanaca.
[0048] Termin "procenat identičnosti" kako je poznat u tehnici, je odnos između dve ili više polipeptidnih sekvenci ili dve ili više polinukleotidnih sekvenci, kao što je određeno poređenjem sekvenci. U tehnici, "identitet" takođe označava stepen srodnosti sekvence između polipeptidnih ili polinukleotidnih sekvenci, u zavisnosti od slučaja, kao što je određeno poklapanjem između nizova takvih sekvenci. "Identitet" se može lako izračunati poznatim metodama, uključujući, ali ne ograničavajući se na one opisane u: Computational Molecular Biology (Lesk, A. M., ed.) Oxford University Press, New York (1988); Biocomputing: Informatics i Genome Projects (Smith, D. W., ed.) Academic Press, New York (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part I (Griffin, A. M., i Griffin, H. G., eds.) Humana Press, New Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G., ed.) Academic Press (1987); i Sequence Analysis Example (Gribskov, M. i Devereux, J., eds.) Stockton Press, New York (1991). Preferirane metode za određivanje identiteta su dizajnirane da daju najbolje podudaranje između testiranih sekvenci. Metode za utvrđivanje identiteta su kodifikovane u javno dostupnim kompjuterskim programima. Poravnavanje sekvenci i izračunavanje procenta identiteta mogu se izvršiti korišćenjem softvera za analizu sekvenci kao što je program Megalign iz LASERGENE bioinformatičkog računarskog paketa (DNKSTAR Inc., Madison, WI), GCG paket programa (Wisconsin Package verzija 9.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, WI), BLASTP, BLASTN, BLASTX (Altschul i dr., J. Mol. Biol.
215:403 (1990)), i DNKSTAR (DNKSTAR, Inc.1228 S. Park St. Madison, WI 53715 SAD). U kontekstu ove prijave podrazumevaće se da kada se za analizu koristi softver za analizu sekvenci, da će rezultati analize biti zasnovani na „podrazumevanim vrednostima“ referenciranog programa, osim ako nije drugačije naznačeno. Kako se ovde koristi, „podrazumevane vrednosti“ će značiti bilo koji skup vrednosti ili parametara koji se prvobitno učitavaju sa softverom kada se prvi put inicijalizuju. Za potrebe određivanja procenta identiteta
1
između optimizovane BDD FVIII sekvence iz pronalaska i referentne sekvence, samo nukleotidi u referentnoj sekvenci koji odgovaraju nukleotidima u optimizovanoj BDD FVIII sekvenci pronalaska se koriste za izračunavanje procenta identiteta. Na primer, kada se uporedi sekvenca nukleotida FVIII pune dužine koja sadrži B domen sa optimizovanom sekvencom nukleotida FVIII sa izbrisanim B domenom (BDD) iz otkrića, deo poravnanja uključujući A1, A2, A3, C1 i C2 domen će se koristiti za izračunavanje procenta identiteta. Nukleotidi u delu FVIII sekvence pune dužine koja kodira B domen (što će rezultirati velikim "prazninom" u poravnanju) neće se računati kao nepodudaranje. Pored toga, pri određivanju procenta identiteta između optimizovane BDD FVIII sekvence iz pronalaska, ili njenog označenog dela (npr. nukleotida 58-2277 i 2320-4374 SEQ ID NO:3), i referentne sekvence, procenat identiteta će biti izračunat poređanim deljenjem broja podudarnih nukleotida sa ukupnim brojem nukleotida u kompletnoj sekvenci optimizovane BDD-FVIII sekvence, ili njenog označenog dela, kao što je ovde navedeno.
[0049] Kako se ovde koristi, "nukleotidi koji odgovaraju nukleotidima u optimizovanoj BDD FVIII sekvenci iz pronalaska" se identifikuju poravnavanjem optimizovane sekvence BDD FVIII iz pronalaska da bi se maksimizirao identitet sa referentnom sekvencom FVIII. Broj koji se koristi za identifikaciju ekvivalentne aminokiseline u referentnoj FVIII sekvenci je zasnovan na broju koji se koristi za identifikaciju odgovarajuće aminokiseline u optimizovanoj BDD FVIII sekvenci iz pronalaska.
[0050] "Fuzioni" ili "himerni" protein obuhvata prvu sekvencu aminokiseline povezanu sa drugom sekvencom aminokiseline sa kojom nije prirodno vezan u prirodi. Aminokiselinske sekvence koje normalno postoje u odvojenim proteinima mogu se spojiti u fuzioni polipeptid, ili sekvence aminokiselina koje normalno postoje u istom proteinu mogu biti postavljene u novi raspored u fuzionom polipeptidu, npr. fuzija domena faktora VIII iz pronalaska sa Ig Fc domenom. Fuzioni protein se stvara, na primer, hemijskom sintezom, ili stvaranjem i translacijom polinukleotida u kome su peptidni regioni kodirani u željenom odnosu. Himerni protein može dalje da sadrži drugu sekvencu aminokiseline povezanu sa prvom sekvencu aminokiseline kovalentnom, nepeptidnom vezom ili nekovalentnom vezom.
[0051] Kako se ovde koristi, termin "mesto insercije" odnosi se na poziciju u FVIII polipeptidu, ili njegovom fragmentu, varijanti ili derivatu, koje je neposredno uzvodno od pozicije na koju se može insertovati heterologni deo. "Mesto insercije" je specificirano kao broj, pri čemu broj
2
je broj aminokiseline u zrelom prirodnom FVIII (SEQ ID NO: 15; Slika 11A) kome odgovara mesto insercije, koje je odmah na N-terminalnom mestu do položaja umetanja. Na primer, fraza "a3 sadrži heterologni deo na mestu insercije koji odgovara aminokiselini 1656 iz SEQ ID NO: 15" označava da se heterologni deo nalazi između dve aminokiseline koje odgovaraju aminokiselini 1656 i aminokiselini 1657 iz SEQ ID NO: 15.
[0052] Fraza "neposredno nizvodno od aminokiseline" kako se ovde koristi odnosi se na poziciju odmah pored terminalne karboksilne grupe aminokiseline. Slično, fraza "neposredno uzvodno od aminokiseline" odnosi se na poziciju odmah pored terminalne aminske grupe aminokiseline.
[0053] Termini "insertovati", "insertovano", "insertovanje u" ili gramatički povezani termini, kako se ovde koriste, odnose se na položaj heterolognog dela u rekombinantnom FVIII polipeptidu, u odnosu na analognu poziciju u prirodnom zrelom humanom FVIII. Kako se ovde koriste, termini se odnose na karakteristike rekombinantnog polipeptida FVIII u odnosu na nativni zreli humani FVIII, i ne ukazuju, impliciraju ili zaključuju bilo koje metode ili procese pomoću kojih je napravljen rekombinantni polipeptid FVIII.
[0054] Kako se ovde koristi, termin "vreme poluraspada" se odnosi na biološki vreme poluraspada određenog polipeptida in vivo. Vreme poluraspada se može predstaviti vremenom potrebnim da se polovina količine date subjektu oslobodi iz cirkulacije i/ili drugih tkiva u životinji. Kada se kriva klirensa datog polipeptida konstruiše kao funkcija vremena, kriva je obično dvofazna sa brzom α-fazom i dužom β-fazom. α-faza tipično predstavlja ekvilibraciju primenjenog Fc polipeptida između intra i ekstravaskularnog prostora i delimično je određena veličinom polipeptida. β-faza tipično predstavlja katabolizam polipeptida u intravaskularnom prostoru. U nekim realizacijama, FVIII i himerni proteini koji sadrže FVIII su monofazni, i stoga nemaju alfa fazu, već samo jednu beta fazu. Prema tome, u određenim realizacijama, termin vreme poluraspada kako se ovde koristi odnosi se na vreme poluraspada polipeptida u β-fazi.
[0055] Termin "povezan" kako se ovde koristi odnosi se na prvu aminokiselinsku sekvencu ili nukleotidnu sekvencu koja je kovalentno ili nekovalentno povezana sa drugom sekvencom aminokiseline ili sekvencom nukleotida, redom. Prva aminokiselinska ili nukleotidna sekvenca može se direktno spojiti ili suprotstaviti sa drugom sekvencom aminokiseline ili nukleotidnom sekvencom ili alternativno sekvenca koja interveniše može kovalentno spojiti prvu sekvencu sa drugom sekvencom. Termin "povezan" znači ne samo fuziju prve sekvence aminokiseline sa drugom sekvencom aminokiseline na C-terminusu ili N-terminusu, već takođe obuhvata umetanje cele prve sekvence aminokiseline (ili druge sekvence aminokiseline) u bilo koje dve aminokiseline u drugoj sekvenci aminokiseline (ili prvoj sekvenci aminokiseline, redom). U jednom aspektu, prva sekvenca aminokiseline može biti povezana sa drugom sekvencom aminokiseline pomoću peptidne veze ili linkera. Prva nukleotidna sekvenca može biti povezana sa drugom nukleotidnom sekvencom pomoću fosfodiestarske veze ili linkera. Linker može biti peptid ili polipeptid (za polipeptidne lance) ili nukleotid ili nukleotidni lanac (za nukleotidne lance) ili bilo koji hemijski deo (za polipeptidne i za polinukleotidne lance). Termin „povezano“ je takođe označen crticom (-).
[0056] Kako se ovde koristi termin "povezan sa" odnosi se na kovalentnu ili nekovalentnu vezu formiranu između prvog lanca aminokiseline i drugog lanca aminokiseline. U jednoj realizaciji, termin "povezan sa" označava kovalentnu, nepeptidnu vezu ili nekovalentnu vezu. Ova asocijacija se može označiti dvotačkom, tj., (:).U drugoj realizaciji, to znači kovalentnu vezu osim peptidne veze. Na primer, aminokiselina cistein sadrži tiolnu grupu koja može da formira disulfidnu vezu ili most sa tiol grupom na drugom cisteinskom ostatku. U većini IgG molekula koji se javljaju u prirodi, regioni CH1 i CL su povezani disulfidnom vezom, a dva teška lanca su povezana sa dve disulfidne veze na pozicijama koje odgovaraju pozicijama 239 i 242 koristeći Kabat sistem numerisanja (pozicija 226 ili 229, sistem numeracije EU ). Primeri kovalentnih veza obuhvataju, ali nisu ograničeni na, peptidnu vezu, metalnu vezu, vodoničnu vezu, disulfidnu vezu, sigma vezu, pi vezu, delta vezu, glikozidnu vezu, agnostičku vezu, savijenu vezu, dipolarnu vezu, pi povratnu vezu, dvostruku vezu, trostruku vezu, četvorostruku vezu, petostruku vezu, šestostruku vezu, konjugaciju, hiperkonjugaciju, aromatičnost, haptičnost ili antivezivanje. Neograničavajući primeri nekovalentne veze obuhvataju jonsku vezu (npr. katjon-pi vezu ili vezu soli), metalnu vezu, vodoničnu vezu (npr. dihidrogen vezu, dihidrogen kompleks, vodoničnu vezu niske barijere ili simetričnu vodoničnu vezu), van der Valsovu silu, Londonsku disperzionu silu, mehaničku vezu, halogenu vezu, aurofilnost, interkalaciju, slaganje, entropijsku silu ili hemijski polaritet.
[0057] Termin "hibrid monomer-dimer " koji se ovde koristi odnosi se na himerni protein koji sadrži prvi polipeptidni lanac i drugi polipeptidni lanac, koji su međusobno povezani disulfidnom vezom, pri čemu prvi lanac sadrži faktor zgrušavanja, npr., faktor VIII, i prvi Fc region i drugi lanac sadrži, sastoji se u suštini od, ili se sastoji od drugog Fc regiona bez faktora zgrušavanja. Hibridni konstrukt monomer-dimer je stoga hibrid koji sadrži monomerni aspekt koji ima samo jedan faktor zgrušavanja i dimerni aspekt koji ima dva Fc regiona.
[0058] Hemostaza, kako se ovde koristi, označava zaustavljanje ili usporavanje krvarenja ili krvarenja; ili zaustavljanje ili usporavanje protoka krvi kroz krvni sud ili deo tela.
[0059] Hemostatski poremećaj, kako se ovde koristi, označava genetski nasleđeno ili stečeno stanje koje karakteriše sklonost krvarenju, bilo spontano ili kao rezultat traume, usled smanjene sposobnosti ili nemogućnosti formiranja fibrinskog ugruška. Primeri takvih poremećaja obuhvataju hemofiliju. Tri glavna oblika su hemofilija A (nedostatak faktora VIII), hemofilija B (nedostatak faktora IX ili „Božićna bolest“) i hemofilija C (nedostatak faktora XI, blaga sklonost krvarenju). Drugi hemostatski poremećaji obuhvataju, na primer, von Villebrandovu bolest, nedostatak faktora XI (PTA nedostatak), nedostatak faktora XII, nedostatke ili strukturne abnormalnosti fibrinogena, protrombina, faktora V, faktora VII, faktora X ili faktora XIII, Bernard-Soulierov sindrom, koji je defekt ili nedostatak GPIb. GPIb, receptor za vWF, može biti defektan i dovesti do nedostatka primarnog formiranja ugrušaka (primarne hemostaze) i povećane sklonosti krvarenju), i Glanzmanove i Naegelove trombastenije (Glancmanova trombastenija). Kod insuficijencije jetre (akutni i hronični oblici), jetra ne proizvodi dovoljne faktore koagulacije; ovo može povećati rizik od krvarenja.
[0060] Izolovani molekuli nukleinske kiseline, izolovani polipeptidi ili vektori koji sadrže izolovani molekul nukleinske kiseline prema pronalasku mogu se koristiti profilaktički. Kako se ovde koristi termin "profilaktički tretman" odnosi se na primenu molekula pre epizode krvarenja. U jednom aspektu, subjekat kome je potreban opšti hemostatski agens je podvrgnut operaciji ili će biti podvrgnut operaciji. Polinukleotid, polipeptid ili vektor prema pronalasku se može primeniti pre ili posle operacije kao profilaktičko sredstvo. Polinukleotid, polipeptid ili vektor prema pronalasku se može primeniti tokom ili posle operacije da bi se kontrolisala epizoda akutnog krvarenja. Operacija može uključivati, ali nije ograničena na, transplantaciju jetre, resekciju jetre, stomatološke procedure ili transplantaciju matičnih ćelija.
[0061] Izolovani molekuli nukleinske kiseline, izolovani polipeptidi ili vektori iz ovog pronalaska se takođe koriste za tretman na zahtev. Termin "tretman na zahtev" odnosi se na primenu izolovanog molekula nukleinske kiseline, izolovanog polipeptida ili vektora kao
2
odgovor na simptome epizode krvarenja ili pre aktivnosti koja može izazvati krvarenje. U jednom aspektu, tretman na zahtev se može dati subjektu kada krvarenje počne, kao što je posle povrede, ili kada se očekuje krvarenje, kao što je pre operacije. U drugoj realizaciji, tretman na zahtev se može primeniti pre aktivnosti koje povećavaju rizik od krvarenja, kao što su kontaktni sportovi.
[0062] Kako se ovde koristi termin "akutno krvarenje" odnosi se na epizodu krvarenja bez obzira na osnovni uzrok. Na primer, subjekt može imati traumu, uremiju, nasledni poremećaj krvarenja (npr. nedostatak faktora VII), poremećaj trombocita, ili rezistenciju usled razvoja antitela na faktore zgrušavanja.
[0063] Lečenje, i srodni termini kako se ovde koristi, odnosi se na, na primer, smanjenje težine bolesti ili stanja; smanjenje trajanja bolesti; ublažavanje jednog ili više simptoma povezanih sa bolešću ili stanjem; pružanje korisnih efekata subjektu sa bolešću ili stanjem, bez nužnog izlečenja bolesti ili stanja, ili profilaksa jednog ili više simptoma povezanih sa bolešću ili stanjem. U jednoj realizaciji, termin "lečenje" ili "tretman" znači održavanje najnižeg nivoa FVIII na najmanje oko 1 IU/dL, 2 IU/dL, 3 IU/dL, 4 IU/dL, 5 IU/dL, 6 IU/dL, 7 IU/dL, 8 IU/dL, 9 IU/dL, 10 IU/dL, 11 IU/dL, 12 IU/dL, 13 IU/dL, 14 IU/dL, 15 IU/dL, 16 IU/dL, 17 IU/dL, 18 IU/dL, 19 IU/dL, ili 20 IU/dL kod subjekta davanjem izolovanog molekula nukleinske kiseline, izolovanog polipeptida ili vektora prema pronalasku. U drugoj realizaciji, lečenje ili tretman znači održavanje najnižeg nivoa FVIII između oko 1 i oko 20 IU/dL, oko 2 i oko 20 IU/dL, oko 3 i oko 20 IU/dL, oko 4 i oko 20 IU/dL, oko 5 i oko 20 IU/dL, oko 6 i oko 20 IU/dL, oko 7 i oko 20 IU/dL, oko 8 i oko 20 IU/dL, oko 9 i oko 20 IU/dL, ili oko 10 i oko 20 IU/dL. Lečenje ili tretman bolesti ili stanja takođe može uključivati održavanje aktivnosti FVIII kod subjekta na nivou koji se može uporediti sa najmanje oko 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, ili 20% aktivnosti FVIII kod nehemofiličnog subjekta. Minimalni najniži nivo potreban za lečenje može se meriti jednom ili više poznatih metoda i može se podesiti (povećati ili smanjiti) za svaku osobu.
[0064] "Davanje" ili „primena“, kako se ovde koristi, znači davanje farmaceutski prihvatljivog molekula nukleinske kiseline koji kodira Faktor VIII, polipeptida Faktora VIII ili vektora koji sadrži molekul nukleinske kiseline koji kodira Faktor VIII iz pronalaska subjektu putem farmaceutski prihvatljive rute. Načini primene mogu biti intravenozni, npr. intravenska injekcija i intravenska infuzija. Dodatni putevi primene obuhvataju, npr., subkutanu, intramuskularnu, oralnu, nazalnu i plućnu primenu. Molekuli nukleinske kiseline, polipeptidi i vektori mogu se davati kao deo farmaceutske kompozicije koja sadrži najmanje jedan ekscipijent.
[0065] Kao što se ovde koristi, fraza "subjekt kom je to potrebno" obuhvata subjekte, kao što su subjekti sisari, koji bi imali koristi od primene molekula nukleinske kiseline, polipeptida ili vektora iz pronalaska, npr., radi poboljšanja hemostaze. U jednom aspektu, subjekti obuhvataju, ali nisu ograničeni na, osobe sa hemofilijom. U drugoj realizaciji, subjekti obuhvataju, ali nisu ograničeni na, pojedince koji su razvili inhibitor FVIII i stoga im je potrebna bajpas terapija. Subjekt može biti odrasla osoba ili maloletna osoba (npr. mlađa od 12 godina).
[0066] Kako se ovde koristi, termin "faktor zgrušavanja" odnosi se na molekule, ili njihove analoge, koji se javljaju u prirodi ili su proizvedeni rekombinantno, a koji sprečavaju ili smanjuju trajanje epizode krvarenja kod subjekta. Drugim rečima, to znači da su molekuli koji imaju aktivnost pro-zgrušavanja, tj. odgovorni su za pretvaranje fibrinogena u mrežu nerastvorljivog fibrina što dovodi do koagulacije ili zgrušavanja krvi. "Aktivirajući faktor zgrušavanja" je faktor zgrušavanja u neaktivnom obliku (npr. u njegovoj zimogenoj formi) koji je sposoban da se konvertuje u aktivni oblik.
[0067] Aktivnost zgrušavanja, kako se ovde koristi, označava sposobnost učešća u kaskadi biohemijskih reakcija koja kulminira formiranjem fibrinskog ugruška i/ili smanjuje težinu, trajanje ili učestalost krvarenja ili epizode krvarenja.
[0068] Kako se ovde koristi, termini "heterologni" ili "egzogeni" odnose se na takve molekule koji se normalno ne nalaze u datom kontekstu, npr. u ćeliji ili u polipeptidu. Na primer, egzogeni ili heterologni molekuli mogu biti uvedeni u ćeliju i prisutni su samo posle manipulacije ćelijom, npr. transfekcijom ili drugim oblicima genetskog inženjeringa ili heterologna aminokiselinska sekvenca može biti prisutna u proteinu u kome nije prirodno pronađena.
[0069] Kako se ovde koristi, termin "heterologna nukleotidna sekvenca" odnosi se na nukleotidnu sekvencu koja se prirodno ne javlja sa datom polinukleotidnom sekvencom. U jednom aspektu, heterologna nukleotidna sekvenca kodira polipeptid sposoban da produži
2
vreme poluraspada FVIII. U drugoj realizaciji, heterologna nukleotidna sekvenca kodira polipeptid koji povećava hidrodinamički radijus FVIII. U drugim realizacijama, heterologna nukleotidna sekvenca kodira polipeptid koji poboljšava jedno ili više farmakokinetičkih svojstava FVIII bez značajnog uticaja na njegovu biološku aktivnost ili funkciju (npr. njegovu prokoagulantnu aktivnost). U nekim realizacijama, FVIII je vezan ili povezan sa polipeptidom koji je kodiran heterolognom nukleotidnom sekvencom pomoću linkera. Neograničavajući primeri polipeptidnih delova kodiranih heterolognim nukleotidnim sekvencama obuhvataju konstantni region imunoglobulina ili njegov deo, albumin ili njegov fragment, deo koji se vezuje za albumin, transferin, PAS polipeptide iz američke patentne prijave br.2010029213 , HAP sekvencu, transferin ili njegov fragment, C-terminalni peptid (CTP) β podjedinice humanog horionskog gonadotropina, mali molekul koji se vezuje za albumin, XTEN sekvencu, FcRn vezujuće delove (npr. kompletni Fc regioni ili njihovi delovi koji se vezuju za FcRn), jednolančane Fc regione (ScFc regione, npr. kao što je opisano u US 2008/0260738, WO 2008/012543, ili WO 2008/1439545), poliglicinske linkere, poliserinske linkere, peptide i kratke polipeptide sa 6-40 aminokiselina od dve vrste aminokiselina izabranih od glicina (G), alanina (A), serina (S), treonina (T), glutamata (E) i prolina (P) sa različitim stepenom sekundarne strukture od manje od 50% do veće od 50%, između ostalog, ili dve ili više njihovih kombinacija. U nekim realizacijama, polipeptid kodiran heterolognom nukleotidnom sekvencom je vezan za ne-polipeptidni deo. Neograničavajući primeri ne-polipeptidnih delova obuhvataju polietilen glikol (PEG), male molekule koji vezuju albumin, polisijalnu kiselinu, hidroksietil skrob (HES), njihov derivat ili bilo koju njihovu kombinaciju.
[0070] Kako se ovde koristi, termin "Fc region" je definisan kao deo polipeptida koji odgovara Fc regionu prirodnog Ig, tj. formiran dimernom asocijacijom odgovarajućih Fc domena njegova dva teška lanca. Prirodni Fc region formira homodimer sa drugim Fc regionom. Nasuprot tome, termin "genetski spojeni Fc region" ili "jednolančani Fc region" (scFc region), kako se ovde koristi, odnosi se na sintetički dimerni Fc region koji se sastoji od Fc domena genetski povezanih unutar jednog polipeptidnog lanca (tj. kodiranog u jednoj uzastopnoj genetskoj sekvenci).
[0071] U jednoj realizaciji, "Fc region" se odnosi na deo jednog Ig teškog lanca koji počinje u zglobnom regionu neposredno uzvodno od mesta cepanja papaina (tj. ostatak 216 u IgG, uzimajući prvi ostatak konstantnog regiona teškog lanca da bude 114) i završava se na C-
2
terminusu antitela. Shodno tome, kompletan Fc domen sadrži najmanje zglobni domen, CH2 domen i CH3 domen.
[0072] Fc region Ig konstantnog regiona, u zavisnosti od Ig izotipa, može obuhvatati CH2, CH3 i CH4 domene, kao i zglobni region. Himerni proteini koji sadrže Fc region Ig daju nekoliko poželjnih svojstava himernom proteinu uključujući povećanu stabilnost, produženo vreme poluraspada u serumu (videti Capon i dr., 1989, Nature 337:525) kao i vezivanje za Fc receptore kao što je neonatalni Fc receptor (FcRn) (američki patenti br.6,086,875, 6,485,726, 6,030,613; WO 03/077834; US2003-0235536A1)
[0073] Referentna nukleotidna sekvenca," kada se ovde koristi kao poređenje sa nukleotidnom sekvencom iz pronalaska, je polinukleotidna sekvenca suštinski identična nukleotidnoj sekvenci iz pronalaska osim što delovi koji odgovaraju FVIII sekvenci nisu optimizovani. Na primer, referentna nukleotidna sekvenca za molekul nukleinske kiseline koji se sastoji od kodonom optimizovanog BDD FVIII iz SEQ ID NO: 1 i heterologne nukleotidne sekvence koja kodira jednolančani Fc region vezan za SEQ ID NO: 1 na njezinom 3' kraju je molekul nukleinske kiseline koji se sastoji od originalnog (ili "roditeljskog") BDD FVIII iz SEQ ID NO: 16 (Slika 1I) i identične heterologne nukleotidne sekvence koja kodira jednolančani Fc region povezan sa SEQ ID NO: 16 na njezinom 3' kraju.
[0074] "Indeks adaptacije kodona", kako se ovde koristi, odnosi se na meru sklonosti upotrebe kodona. Indeks adaptacije kodona (CAI) meri odstupanje date sekvence gena za kodiranje proteina u odnosu na referentni skup gena (Sharp PM i Li WH, Nucleic Acids Res.15(3):1281-95 (1987)). CAI se izračunava određivanjem geometrijske sredine težine povezane sa svakim kodonom preko dužine sekvence gena (mereno u kodonima):
[0075] Za svaku aminokiselinu, težina svakog od njenih kodona, u CAI, se izračunava kao odnos između uočene frekvencije kodona (fi) i frekvencije sinonimnog kodona (fj) za tu aminokiselinu:
Formula 2:
2
[sinonimni kodoni za aminokiselinu]
[0076] Kako se ovde koristi, termin "optimizovan", u pogledu nukleotidnih sekvenci, odnosi se na polinukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid, pri čemu je polinukleotidna sekvenca mutirana da bi se poboljšala karakteristika te polinukleotidne sekvence. U nekim realizacijama, optimizacija se vrši da bi se povećali nivoi transkripcije, povećali nivoi translacije, povećali nivoi mRNK u stabilnom stanju, povećalo ili smanjilo vezivanje regulatornih proteina kao što su opšti faktori transkripcije, povećalo ili smanjilo spajanje ili povećao prinos polipeptida proizvedenog polinukleotidnom sekvencom. Primeri promena koje se mogu napraviti u polinukleotidnoj sekvenci da bi se ona optimizovala obuhvataju optimizaciju kodona, optimizaciju G/C sadržaja, uklanjanje ponavljajućih sekvenci, uklanjanje elemenata bogatih sa AT, uklanjanje kriptičnih mesta spajanja, uklanjanje elemenata koji deluju na cis koji potiskuju transkripciju ili translaciju, dodavanje ili uklanjanje poli-T ili poli-A sekvenci, dodavanje sekvenci oko mesta početka transkripcije koje poboljšavaju transkripciju, kao što su Kozak konsenzus sekvence, uklanjanje sekvenci koje bi mogle da formiraju strukture matične petlje, uklanjanje destabilizujućih sekvenci i dve ili više njihovih kombinacija.
Polinukleotidna sekvenca koja kodira FVIII protein
[0077] Ovaj pronalazak opisuje izolovanu nukleinsku kiselinu koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid sa FVIII aktivnošću, pri čemu nukleotidna sekvenca sadrži najmanje 95% identičnosti sekvence sa nukleotidima 58-2277 i 2320-4374 iz SEQ ID NO: 71 kako je definisano u nezavisnim patentnim zahtevima, a određene njihove opcione karakteristike su definisane u zavisnim patentnim zahtevima.
[0078] U nekim realizacijama, ovo otkriće je usmereno na molekule nukleinske kiseline optimizovane kodonom koji kodiraju polipeptid sa aktivnošću FVIII. U nekim realizacijama, polinukleotid kodira FVIII polipeptid pune dužine. U drugim realizacijama, molekul nukleinske kiseline kodira polipeptid FVIII sa izbrisanim B domenom (BDD), pri čemu je ceo ili deo B domena FVIII obrisan. U jednoj posebnoj realizaciji, molekul nukleinske kiseline kodira polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 86%, najmanje oko 87%, najmanje oko 88%, najmanje oko 89%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 96%, najmanje oko 97%, najmanje oko
2
98%, ili najmanje oko 99% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO: 17 (Slika 1J) ili njezinim fragmentom. U jednoj realizaciji, molekul nukleinske kiseline kodira polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO: 17 ili njezin fragment.
[0079] U nekim realizacijama, molekul nukleinske kiseline prema pronalasku kodira FVIII polipeptid koji sadrži signalni peptid ili njegov fragment. U drugim realizacijama, molekul nukleinske kiseline kodira FVIII polipeptid kome nedostaje signalni peptid. U nekim realizacijama, signalni peptid sadrži aminokiseline 1-19 iz SEQ ID NO: 17.
[0080] U drugim realizacijama, nukleotidna sekvenca sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja ima najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili najmanje 99% identičnosti sekvence sa nukleotidima 58-2277 i 2320-4374 iz SEQ ID NO: 71 (tj., nukleotidima 58-4374 iz SEQ ID NO: 71 bez nukleotida koji kodiraju B domen ili fragment B domena). U drugim realizacijama, nukleotidna sekvenca obuhvata nukleotide 58-2277 i 2320-4374 iz SEQ ID NO: 71 (tj., nukleotide 58-4374 iz SEQ ID NO: 71 bez nukleotida koji kodiraju B domen ili fragment B domena) ili nukleotide 58 do 4374 iz SEQ ID NO: 71. U još drugim realizacijama, nukleotidna sekvenca obuhvata nukleotide 1-2277 i 2320-4374 iz SEQ ID NO: 71 (tj., nukleotide 1-4374 iz SEQ ID NO: 71 bez nukleotida koji kodiraju B domen ili fragment B domena) ili nukleotide 1 do 4374 iz SEQ ID NO: 71.
[0081] U nekim realizacijama, nukleotidna sekvenca sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira signalni peptid. U nekim realizacijama, signalni peptid je signalni peptid FVIII. U nekim realizacijama, sekvenca nukleinske kiseline koja kodira signalni peptid je optimizovana kodonom. U jednoj posebnoj realizaciji, sekvenca nukleinske kiseline koja kodira signalni peptid ima najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, na najmanje 98%, najmanje 99%, ili 100% identičnosti sekvence sa (i) nukleotidima 1 do 57 iz SEQ ID NO: 1; (ii) nukleotidima 1 do 57 iz SEQ ID NO: 2; (iii) nukleotidima 1 do 57 iz SEQ ID NO: 3; (iv) nukleotidima 1 do 57 iz SEQ ID NO: 4; (v) nukleotidima 1 do 57 iz SEQ ID NO: 5; (vi) nukleotidima 1 do 57 iz SEQ ID NO: 6; (vii) nukleotidima 1 do 57 iz SEQ ID NO: 70; (viii) nukleotidima 1 do 57 iz SEQ ID NO: 71; ili (ix) nukleotidima 1 do 57 iz SEQ ID NO: 68.
[0082] SEQ ID NOs: 1-6, 70, i 71 su optimizovane verzije SEQ ID NO: 16, početne ili "roditeljske" ili "divljeg tipa" FVIII nukleotidne sekvence. SEQ ID NO: 16 kodira humani
2
FVIII sa obrisanom B domenom. Dok su SEQ ID NOs: 1-6, 70, i 71 dobijene iz specifičnog oblika FVIII sa izbrisanim B domenom (SEQ ID NO: 16), treba razumeti da je ovaj pronalazak takođe usmeren na optimizovane verzije nukleinskih kiselina koje kodiraju druge verzije FVIII. Na primer, druge verzije FVIII mogu obuhvatati FVIII pune dužine, druge delecije FVIII B-domena (opisane u nastavku) ili druge fragmente FVIII koji zadržavaju aktivnost FVIII.
[0083] " Polipeptid sa aktivnošću FVIII" kako se ovde koristi označava funkcionalni polipeptid FVIII u njegovoj normalnoj ulozi u koagulaciji, osim ako nije drugačije naznačeno. Termin polipeptid sa aktivnošću FVIII obuhvata funkcionalni fragment, varijantu, analog ili njegov derivat koji zadržava funkciju divljeg faktora VIII pune dužine u putu koagulacije. "Polipeptid sa aktivnošću FVIII" se koristi naizmenično sa FVIII proteinom, FVIII polipeptidom ili FVIII. Primeri funkcija FVIII obuhvataju, ali nisu ograničeni na, sposobnost aktiviranja koagulacije, sposobnost da deluje kao kofaktor za faktor IX, ili sposobnost formiranja tenaznog kompleksa sa faktorom IX u prisustvu Ca<2+>i fosfolipida, koji zatim pretvara faktor X u aktiviranu formu Xa. U jednoj realizaciji, polipeptid koji ima FVIII aktivnost obuhvata dva polipeptidna lanca, prvi lanac koji ima teški lanac FVIII i drugi lanac koji ima laki lanac FVIII. U drugoj realizaciji, polipeptid koji ima FVIII aktivnost je jednolančani FVIII. Jednolančani FVIII može da sadrži jednu ili više mutacija ili supstitucija na aminokiselinskom ostatku 1645 i/ili 1648 koji odgovara zreloj sekvenci FVIII. Videti međunarodnu prijavu br. PCT/US2012/045784. FVIII protein može biti humani, svinjski, pseći, pacovski ili mišji protein FVIII. Pored toga, poređenja između FVIII kod ljudi i drugih vrsta su identifikovala očuvane ostatke koji su verovatno potrebni za funkciju (Cameron i dr., Thromb. Haemost. 79:317-22 (1998); US 6,251,632).
[0084] B domen" FVIII, kako se ovde koristi, je isti kao B domen poznat u tehnici koji je definisan internim identitetom sekvence aminokiselina i mestima proteolitičkog cepanja trombinom, npr. ostaci Ser741-Arg1648 od humanog FVIII pune dužine. Ostali humani domeni FVIII su definisani sledećim aminokiselinskim ostacima: A1, ostacima Ala1-Arg372; A2, ostacima Ser373-Arg740; A3, ostacima Ser1690-Ile2032; C1, ostacima Arg2033-Asn2172; C2, ostacima Ser2173-Tyr2332. A3-C1-C2 sekvenca obuhvata ostatke Ser1690-Tyr2332. Preostala koja sekvenca, obuhvata ostatke Glu1649-Arg1689, se obično naziva peptidom za aktivaciju lakog lanca FVIII. Lokacije granica za sve domene, uključujući B domene, za FVIII svinja, miševa i pasa su takođe poznate u tehnici. Jedan primer BDD FVIII je BDD FVIII je REFACTO<®>rekombinantni BDD FVIII (od Wyeth Pharmaceuticals, Inc.).
[0085] "FVIII sa izbrisanim B domenom" može imati pune ili delimične delecije objavljene u američkim patentnima br.6,316,226, 6,346,513, 7,041,635, 5,789,203, 6,060,447, 5,595,886, 6,228,620, 5,972,885, 6,048,720, 5,543,502, 5,610,278, 5,171,844, 5,112,950, 4,868,112, i 6,458,563 U nekim realizacijama, sekvenca FVIII sa obrisanom B domenom iz predmetnog pronalaska sadrži bilo koju od delecija otkrivenih u koloni 4, red 4 do kolone 5, red 28 i primerima 1-5 iz američkog patenta br. 6,316,226 (takođe u US 6,346,513). U nekim realizacijama, FVIII sa izbrisanim B domenom iz predmetnog pronalaska ima deleciju otkrivenu u koloni 2, linije 26-51 i primerima 5-8 iz američkog patenta br.
5,789,203 (takođe US 6,060,447, US 5,595,886, i US 6,228,620). U nekim realizacijama, FVIII sa izbrisanim B domenom ima deleciju opisanu u stubac 1, redovi 25 do stubac 2, red 40 iz američkog patenta br.5,972,885; stubac 6, redovi 1-22 i primeru 1 iz američkog patenta br.
6,048,720; stubac 2, redovi 17-46 iz američkog patenta br.5,543,502; stubac 4, red 22 do stubac 5, red 36 iz američkog patenta br. 5,171,844; stubac 2, redovi 55-68, slika 2, i primer 1 iz američkog patenta br.5,112,950; stubac 2, red 2 do stubac 19, red 21 i tabela 2 iz američkog patenta br.4,868,112; stubac 2, red 1 do stubac 3, red 19, stubac 3, red 40 do stubac 4, red 67, stubac 7, red 43 do stubac 8, red 26, i stubac 11, red 5 do stubac 13, red 39 iz američkog patenta br. 7,041,635; ili stubac 4, redovi 25-53, iz američkog patenta br. 6,458,563. U nekim realizacijama, FVIII sa izbrisanim B domenom ima deleciju većine B domena, ali i dalje sadrži aminoterminalne sekvence B domena koje su neophodne za in vivo proteolitičku obradu primarnog translacionog proizvoda u dva polipeptidna lanca, kao što je otkriveno u dokumentu WO 91/09122; U nekim realizacijama, FVIII sa izbrisanim B domenom je konstruisan delecijom aminokiselina 747-1638, tj., praktično potpunom delecijom B domena. Hoeben R.C., i dr. J. Biol. Chem.265 (13): 7318-7323 (1990). FVIII sa izbrisanim B domenom takođe može sadržati deleciju aminokiselina 771-1666 ili aminokiselina 868-1562 od FVIII. Meulien P., i dr. Protein Eng.2(4): 301-6 (1988) Dodatne delecije B domena koje su deo pronalaska obuhvataju, npr.,: deleciju aminokiselina od 982 do 1562 ili 760 do 1639 (Toole i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1986) 83, 5939-5942)), 797 do 1562 (Eaton, i dr. Biochemistry (1986) 25:8343-8347)), 741 do 1646 (Kaufman (PCT objavljena prijava br. WO 87/04187)), 747-1560 (Sarver, i dr., DNK (1987) 6:553-564)), 741 do 1648 (Pasek (PCT prijava No.88/00831)), 816 do 1598 ili 741 do 1689 (Lagner (Behring Inst. Mitt. (1988) No 82:16-25, EP 295597) . Svaka od prethodnih delecija se može izvršiti u bilo kojoj sekvenci FVIII.
1
[0086] Brojni funkcionalni molekuli FVIII, koji uključuju delecije B-domena, su otkriveni u sledećim patentima US 6,316,226 i US 6,346,513, oba dodeljena Baxteru; US 7,041,635 dodeljen In2Gen; US 5,789,203, US 6,060,447, US 5,595,886, i US 6,228,620 dodeljen Chironu; US 5,972,885 i US 6,048,720 dodeljen Biovitrumu, US 5,543,502 i US 5,610,278 dodeljen Novo Nordisku; US 5,171,844 dodeljen Immuno Ag; US 5,112,950 dodeljen Transgene S.A.; US 4,868,112 dodeljen Genetics Institutu.
Optimizacija kodona
[0087] U jednoj realizaciji, ovaj pronalazak obezbeđuje izolovani molekul nukleinske kiseline koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid sa aktivnošću FVIII, pri čemu je sekvenca nukleinske kiseline optimizovana kodonom. U drugoj realizaciji, početna sekvenca nukleinske kiseline koja kodira polipeptid sa aktivnošću FVIII i koja je predmet optimizacije kodona je SEQ ID NO: 16. U nekim realizacijama, sekvenca koja kodira polipeptid sa aktivnošću FVIII je kodon optimizovan za humanu ekspresiju. sekvenca koja kodira polipeptid sa aktivnošću FVIII je kodon optimizovan za ekspresiju kod miša. SEQ ID NOs: 1-6, 70, i 71 su kodonom optimizovane verzije SEQ ID NO: 16, optimizovane za humanu ekspresiju.
[0088] Termin "optimizovan kodonom" pošto se odnosi na gene ili kodirajuće regione molekula nukleinske kiseline za transformaciju različitih domaćina, odnosi se na promenu kodona u genu ili kodirajućim regionima molekula nukleinske kiseline da bi odražavali tipično korišćenje kodona od strane organizma domaćina bez promene polipeptida kodiranog sa DNK. Takva optimizacija obuhvata zamenu najmanje jednog, ili više od jednog, ili značajnog broja kodona sa jednim ili više kodona koji se češće koriste u genima tog organizma.
[0089] Odstupanja u nukleotidnoj sekvenci koja sadrže kodone koji kodiraju aminokiseline bilo kog polipeptidnog lanca dozvoljavaju varijacije u sekvenci koja kodira gen. Pošto se svaki kodon sastoji od tri nukleotida, a nukleotidi koji sadrže DNK su ograničeni na četiri specifične baze, postoje 64 moguće kombinacije nukleotida, od kojih 61 kodira aminokiseline (preostala tri kodona kodiraju signale koji završavaju translaciju). "Genetski kod" koji pokazuje koji kodoni kodiraju koje aminokiseline je ovde prikazan kao Tabela 1. Kao rezultat, mnoge aminokiseline su označene sa više od jednog kodona. Na primer, aminokiseline alanin i prolin su kodirane sa četiri tripleta, serin i arginin sa šest, dok su triptofan i metionin kodirani sa samo jednim tripletom. Ova degeneracija omogućava da sastav DNK baze varira u širokom obimu bez promene sekvence aminokiselina proteina kodiranih sa DNK.
2
Tabela 1: Standardni genetski kod
[0090] Mnogi organizmi pokazuju sklonost za korišćenje određenih kodona za kodiranje insercije određene aminokiseline u rastući peptidni lanac. Preferencija kodona, ili sklonost kodona, razlike u upotrebi kodona među organizmima, omogućena je degeneracijom genetskog koda i dobro je dokumentovana među mnogim organizmima. Sklonost kodona često korelira sa efikasnošću translacije RNK (mRNK), za koju se veruje da zavisi, između ostalog, od svojstava kodona koji se prevode i dostupnosti određenih molekula transfer RNK (tRNK). Preovlađivanje izabranih tRNK u ćeliji je generalno odraz kodona koji se najčešće koriste u sintezi peptida. Shodno tome, geni se mogu prilagoditi za optimalnu ekspresiju gena u datom organizmu na temelju optimizacije kodona.
[0091] Obzirom na veliki broj genskih sekvenci dostupnih za širok spektar životinjskih, biljnih i mikrobnih vrsta, izračunate su relativne frekvencije upotrebe kodona. Tabele korišćenja kodona su dostupne, na primer, u „Bazi podataka o upotrebi kodona“ dostupnoj na www.kazusa.or.jp/codon/ (posećeno June 18, 2012). Videti Nakamura, Y., i dr. Nucl. Acids Res. 28:292 (2000).
[0092] Nasumično dodeljivanje kodona na optimizovanoj frekvenciji za kodiranje date polipeptidne sekvence može da se uradi ručno izračunavanjem frekvencija kodona za svaku aminokiselinu, a zatim nasumičnim dodeljivanjem kodona polipeptidnoj sekvenci. Dodatno, za izračunavanje optimalne sekvence mogu se koristiti različiti algoritmi i kompjuterski softverski programi.
[0093] U nekim realizacijama, molekul nukleinske kiseline sadrži jednu ili više karakteristika: (a) molekul nukleinske kiseline ili njegov deo ima povećan indeks adaptacije humanog kodona u odnosu na SEQ ID NO: 16; (b) nukleotidna sekvenca ili njen deo ima povećanu frekvenciju optimalnih kodona u odnosu na SEQ ID NO: 16; (c) nukleotidna sekvenca ili njen deo sadrži veći procenat G/C nukleotida u poređenju sa procentom G/C nukleotida u SEQ ID NO: 16; (d) nukleotidna sekvenca ili njen deo ima povećanu relativnu upotrebu sinonimnog kodona u odnosu na SEQ ID NO: 16; (e) nukleotidna sekvenca ili njen deo ima smanjen efektivni broj kodona u odnosu na SEQ ID NO: 16; (f) nukleotidna sekvenca sadrži manje MARS/ARS sekvenci (SEQ ID NOs: 21 i 22) u odnosu na SEQ ID NO: 16; (g) nukleotidna sekvenca sadrži manje destabilizujućih elemenata (SEQ ID NOs: 23 i 24) u odnosu na SEQ ID NO: 16; (i) nukleotidna sekvenca ne sadrži poli-T sekvencu, (j) nukleotidna sekvenca ne sadrži poli-A sekvencu; ili (k) bilo koju njihovu kombinaciju. U nekim realizacijama, molekuli nukleinske kiseline sadrže najmanje dve, najmanje tri, najmanje četiri, najmanje pet, najmanje šest, najmanje sedam, najmanje osam, najmanje devet ili deset karakteristika (a) do (j).
Indeks adaptacije kodona
[0094] U jednoj realizaciji, ovaj pronalazak obezbeđuje izolovani molekul nukleinske kiseline koji sadrži ovde opisanu nukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid sa aktivnošću FVIII, pri čemu je indeks adaptacije humanog kodona povećan u odnosu na SEQ ID NO: 16. Na primer, nukleotidna sekvenca može imati indeks adaptacije humanog kodona koji je najmanje oko 0.75 (75%), najmanje oko 0.76 (76%), najmanje oko 0.77 (77%), najmanje oko 0.78 (78%), najmanje oko 0.79 (79%), najmanje oko 0.80 (80%), najmanje oko 0.81 (81%), najmanje oko 0.82 (82%), najmanje oko 0.83 (83%), najmanje oko 0.84 (84%), najmanje oko 0.85 (85%), najmanje oko 0.86 (86%), najmanje oko 0.87 (87%), najmanje oko 0.88 (88%), najmanje oko 0.89 (89%), najmanje oko 0.90 (90%), najmanje oko 0.91 (91%), najmanje oko
4
0.92 (92%), najmanje oko 0.93 (93%), najmanje oko 0.94 (94%), najmanje oko 0.95 (95%), najmanje oko 0.96 (96%), najmanje oko 0.97 (97%), najmanje oko 0.98 (98%), ili najmanje oko 0.99 (99%). U nekim realizacijama, indeks adaptacije humanog kodona koji je najmanje oko .88 (88%). U drugim realizacijama, nukleotidna sekvenca ima indeks adaptacije humanog kodona koji je najmanje oko .91 (91%). U drugim realizacijama, nukleotidna sekvenca ima indeks adaptacije humanog kodona koji je najmanje oko .91 (97%).
[0095] ovaj pronalazak obezbeđuje izolovani molekul nukleinske kiseline koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid sa aktivnošću FVIII, pri čemu nukleotidna sekvenca sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja ima najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili najmanje 99% identičnosti sekvence sa nukleotidima 58-2277 i 2320-4374 iz SEQ ID NO: 71 (tj., nukleotidima 58-4374 iz SEQ ID NO: 71 bez nukleotida koji kodiraju B domen ili fragment B domena); i pri čemu je indeks adaptacije humanog kodona nukleotidne sekvence povećan u odnosu na SEQ ID NO: 16. U nekim realizacijama, nukleotidna sekvenca ima indeks adaptacije humanog kodona koji je najmanje oko 0.75 (75%), najmanje oko 0.76 (76%), najmanje oko 0.77 (77%), najmanje oko 0.78 (78%), najmanje oko 0.79 (79%), najmanje oko 0.80 (80%), najmanje oko 0.81 (81%), najmanje oko 0.82 (82%), najmanje oko 0.83 (83%), najmanje oko 0.84 (84%), najmanje oko 0.85 (85%), najmanje oko 0.86 (86%), najmanje oko 0.87 (87%), ili najmanje oko 0.88 (88%). U jednoj konkretnoj realizaciji nukleotidna sekvenca ima indeks adaptacije humanog kodona koji je najmanje oko .75 (75%). U drugoj realizaciji, nukleotidna sekvenca ima indeks adaptacije humanog kodona koji je najmanje oko .83 (83%). U drugoj realizaciji, nukleotidna sekvenca ima indeks adaptacije humanog kodona koji je najmanje oko .88 (88%). U drugoj realizaciji, nukleotidna sekvenca ima indeks adaptacije humanog kodona koji je najmanje oko .91 (91%). U drugoj realizaciji, nukleotidna sekvenca ima indeks adaptacije humanog kodona koji je najmanje oko .97 (97%).
[0096] U nekim realizacijama, izolovani molekul nukleinske kiseline iz predmetnog pronalaska im povećanu frekvenciju optimalnih kodona (FOP) u odnosu na SEQ ID NO: 16. U nekim realizacijama, FOP izolovanog molekula nukleinske kiseline je najmanje oko 40, najmanje oko 45, najmanje oko 50, najmanje oko 55, najmanje oko 60, najmanje oko 64, najmanje oko 65, najmanje oko 70, najmanje oko 75, najmanje oko 79, najmanje oko 80, najmanje oko 85, ili najmanje oko 90.
[0097] U drugim realizacijama, izolovani molekul nukleinske kiseline iz predmetnog pronalaska ima povećanu relativnu upotrebu sinonimnog kodona (RCSU) u odnosu na SEQ ID NO: 16. U nekim realizacijama, RCSU izolovanog molekula nukleinske kiseline je veći od 1.5. U drugim realizacijama, RCSU izolovanog molekula nukleinske kiseline je veći od n 2.0. U nekim realizacijama, RCSU izolovanog molekula nukleinske kiseline je najmanje oko 1.5, najmanje oko 1.6, najmanje oko 1.7, najmanje oko 1.8, najmanje oko 1.9, najmanje oko 2.0, najmanje oko 2.1, najmanje oko 2.2, najmanje oko 2.3, najmanje oko 2.4, najmanje oko 2.5, najmanje oko 2.6, ili najmanje oko 2.7.
[0098] U još drugim realizacijama, izolovani molekul nukleinske kiseline iz predmetnog pronalaska ima smanjen efektivni broj kodona u odnosu na SEQ ID NO: 16. U nekim realizacijama, izolovani molekul nukleinske kiseline ima efektivni broj kodona manji od oko 50, manji od oko 45, manji od oko 40, manji od oko 35, manji od oko 30, ili manji od oko 25. U jednoj posebnoj realizaciji, izolovani molekul nukleinske kiseline ima efektivni broj kodona od oko 40, oko 35, oko 30, oko 25, ili oko 20.
Optimizacija G/C sadržaja
[0099] U nekim realizacijama, ovaj pronalazak obezbeđuje izolovani molekul nukleinske kiseline koji sadrži ovde opisanu nukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid sa aktivnošću FVIII, pri čemu nukleotidna sekvenca sadrži veći procenat G/C nukleotida u poređenju sa procentom G/C nukleotida u SEQ ID NO: 16. U drugim realizacijama, nukleotidna sekvenca koja kodira polipeptid sa aktivnošću FVIII ima G/C sadržaj koji je najmanje oko 45%, najmanje oko 46%, najmanje oko 47%, najmanje oko 48%, najmanje oko 49%, najmanje oko 50%, najmanje oko 51%, najmanje oko 52%, najmanje oko 53%, najmanje oko 54%, najmanje oko 55%, najmanje oko 56%, najmanje oko 57%, najmanje oko 58%, najmanje oko 59%, ili najmanje oko 60%.
[0100] U drugim realizacijama, ovaj pronalazak obezbeđuje izolovani molekul nukleinske kiseline koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid sa FVIII aktivnošću, pri čemu nukleotidna sekvenca sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja ima najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili najmanje 99% identičnosti sekvence sa nukleotidima 58-2277 i 2320-4374 iz SEQ ID NOs: 71 (tj., nukleotidima 58-4374 iz SEQ ID NO: 71 bez nukleotida koji kodiraju B domen ili fragment B domena); i pri čemu nukleotidna sekvenca sadrži veći procenat G/C nukleotida u poređenju sa procentom G/C nukleotida u SEQ ID NO: 16. U drugim realizacijama, nukleotidna sekvenca koja kodira polipeptid sa aktivnošću FVIII ima G/C sadržaj koji je najmanje oko 45%. U jednoj posebnoj realizaciji, nukleotidna sekvenca koja kodira polipeptid sa aktivnošću FVIII ima G/C sadržaj koji je najmanje oko 52%. U drugoj realizaciji, nukleotidna sekvenca koja kodira polipeptid sa aktivnošću FVIII ima G/C sadržaj koji je najmanje oko 55%. U drugoj realizaciji, nukleotidna sekvenca koja kodira polipeptid sa aktivnošću FVIII ima G/C sadržaj koji je najmanje oko 57%. U drugoj realizaciji, nukleotidna sekvenca koja kodira polipeptid sa aktivnošću FVIII ima G/C sadržaj koji je najmanje oko 58%. U još jednoj realizaciji, nukleotidna sekvenca koja kodira polipeptid sa aktivnošću FVIII ima G/C sadržaj koji je najmanje oko 60%.
[0101] "G/C sadržaj" (ili sadržaj gvanin-citozina), ili "procenat G/C nukleotida", odnosi se na procenat azotnih baza u molekulu DNK koje su ili gvanin ili citozin. Sadržaj G/C se može izračunati korišćenjem sledeće formule:
[0102] Ljudski geni su veoma heterogeni u svom G/C sadržaju, pri čemu neki geni imaju G/C sadržaj od čak 20%, a drugi geni imaju sadržaj G/C čak 95%. Generalno, geni bogati sa G/C su izraženiji. U stvari, pokazano je da povećanje G/C sadržaja gena može dovesti do povećane ekspresije gena, uglavnom zbog povećanja transkripcije i viših nivoa mRNK u stabilnom stanju. Videti Kudla i dr., PLoS Biol., 4(6): e180 (2006).
Sekvence nalik na region vezivanja matrice
[0103] U nekim realizacijama, ovaj pronalazak obezbeđuje izolovani molekul nukleinske kiseline koji sadrži ovde opisanu nukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid sa aktivnošću FVIII, pri čemu nukleotidna sekvenca sadrži manje MARS/ARS sekvenci u odnosu na SEQ ID NO: 16. U drugim realizacijama, nukleotidna sekvenca koja kodira polipeptid sa aktivnošću FVIII sadrži najviše 6, najviše 5, najviše 4, najviše 3, ili najviše 2 MARS/ARS sekvence. U drugim realizacijama, nukleotidna sekvenca koja kodira polipeptid sa aktivnošću FVIII sadrži najviše 1 MARS/ARS sekvencu. U još drugim realizacijama, nukleotidna sekvenca koja kodira polipeptid sa aktivnošću FVIII ne sadrži MARS/ARS sekvencu.
[0104] U drugim realizacijama, ovaj pronalazak obezbeđuje izolovani molekul nukleinske kiseline koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid sa aktivnošću FVIII, pri čemu nukleotidna sekvenca sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja ima najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili najmanje 99% identičnosti sekvence sa nukleotidima 58-2277 i 2320-4374 iz SEQ ID NO: 71 (tj., nukleotidima 58-4374 iz SEQ ID NO: 71 bez nukleotida koji kodiraju B domen ili fragment B domena); i pri čemu nukleotidna sekvenca sadrži manje MARS/ARS sekvenci u odnosu na SEQ ID NO: 16. U drugim realizacijama, nukleotidna sekvenca koja kodira polipeptid sa aktivnošću FVIII sadrži najviše 6, najviše 5, najviše 4, najviše 3, ili najviše 2 MARS/ARS sekvence. U drugim realizacijama, nukleotidna sekvenca koja kodira polipeptid sa aktivnošću FVIII sadrži najviše 1 MARS/ARS sekvencu. U još drugim realizacijama, nukleotidna sekvenca koja kodira polipeptid sa aktivnošću FVIII ne sadrži MARS/ARS sekvencu.
[0105] Identifikovani su AT-bogati elementi u sekvenci nukleotida humanog FVIII koji dele sličnost sekvence sa Saccharomyces cerevisiae autonomno replicirajućim sekvencama (ARSs) i regionima vezivanja nuklearne matrice (MARs). (Fallux i dr., Mol. Cell. Biol.16:4264-4272 (1996). Pokazalo se da jedan od ovih elemenata vezuje nuklearne faktore in vitro i da potiskuje ekspresiju reporterskog gena hloramfenikol acetiltransferaze (CAT) reporter gene. Id. Pretpostavlja se da ove sekvence mogu doprineti transkripcionoj represiji humanog FVIII gena. Dakle, u jednoj realizaciji, sve MAR/ARS sekvence su ukinute u FVIII genu iz predmetnog pronalaska. Postoje četiri MAR/ARS ATATTT sekvence (SEQ ID NO: 21) i tri MAR/ARS AAATAT sekvence (SEQ ID NO: 22) u roditeljskoj sekvenci FVIII (SEQ ID NO: 16). Sva ova mesta su mutirana tako da unište MAR/ARS sekvence u optimizovanoj sekvenci FVIII (SEQ ID NOs: 1-6). Lokacija svakog od ovih elemenata i sekvenca odgovarajućih nukleotida u optimizovanim sekvencama prikazani su u tabeli 2, ispod.
a
enat
eleih ivnresep ar en
pro e
ezi
2:R ael ab T
Destabilizujuće sekvence
[0106] U nekim realizacijama, ovaj pronalazak obezbeđuje izolovani molekul nukleinske kiseline koji sadrži ovde opisanu nukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid sa FVIII aktivnošću, pri čemu nukleotidna sekvenca sadrži manje destabilizujućih elemenata u odnosu na SEQ ID NO: 16. U drugim realizacijama, nukleotidna sekvenca koja kodira polipeptid sa aktivnošću FVIII sadrži najviše 9, najviše 8, najviše 7, najviše 6 ili najviše 5 destabilizujućih elemenata. U drugim realizacijama, nukleotidna sekvenca koja kodira polipeptid sa aktivnošću FVIII sadrži najviše 4, najviše 3, najviše 2 ili najviše 1 destabilizujući element. U još drugim realizacijama, nukleotidna sekvenca koja kodira polipeptid sa aktivnošću FVIII ne sadrži destabilizujući element.
[0107] U drugim realizacijama, ovaj pronalazak obezbeđuje izolovani molekul nukleinske kiseline koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid sa aktivnošću FVIII, pri čemu nukleotidna sekvenca sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja ima najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili najmanje 99% identičnosti sekvence sa (i) nukleotidima 58-2277 i 2320-4374 iz SEQ ID NO: 71 (tj., nukleotidima 58-4374 iz SEQ ID NO: 71 bez nukleotida koji kodiraju B domen ili fragment B domena); i pri čemu nukleotidna sekvenca sadrži manje destabilizujućih elemenata u odnosu na u odnosu na SEQ ID NO: 16. U drugim realizacijama, nukleotidna sekvenca koja kodira polipeptid sa aktivnošću FVIII sadrži najviše 9, najviše 8, najviše 7, najviše 6, ili na najviše 5 destabilizujućih elemenata. U drugim realizacijama, nukleotidna sekvenca koja kodira polipeptid sa aktivnošću FVIII sadrži najviše 4, najviše 3, najviše 2 ili najviše 1 destabilizujući element. U još drugim realizacijama, nukleotidna sekvenca koja kodira polipeptid sa aktivnošću FVIII ne sadrži destabilizujući element.
[0108] Postoji deset destabilizujućih elemenata u roditeljskoj FVIII sekvenci (SEQ ID NO: 16): šest ATTTA sekvenci (SEQ ID NO: 23) i četiri TAAAT sekvence (SEQ ID NO: 24). U jednoj realizaciji, sekvence ovih mesta su mutirane da unište destabilizujuće elemente u optimizovanom FVIII SEQ ID NO: 71. Lokacija svakog od ovih elemenata i sekvenca odgovarajućih nukleotida u optimizovanim sekvencama prikazani su u Tabeli 2.
Vezujuće lokacije potencijalnog promotera
[0109] U nekim realizacijama, ovaj pronalazak obezbeđuje izolovani molekul nukleinske kiseline koji sadrži ovde opisanu nukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid sa FVIII aktivnošću, pri čemu nukleotidna sekvenca sadrži manje potencijalnih mesta vezivanja promotera u odnosu na SEQ ID NO: 16. U drugim realizacijama, nukleotidna sekvenca koja kodira polipeptid sa aktivnošću FVIII sadrži najviše 9, najviše 8, najviše 7, najviše 6, ili najviše 5 potencijalnih mesta vezivanja promotera. U drugim realizacijama, nukleotidna sekvenca koja kodira polipeptid sa aktivnošću FVIII sadrži najviše 4, najviše 3, najviše 2 ili najviše 1 potencijalna mesta vezivanja promotera. U još drugim realizacijama, nukleotidna sekvenca koja kodira polipeptid sa aktivnošću FVIII ne sadrži potencijalno mesto vezivanja promotera.
[0110] U drugim realizacijama, ovaj pronalazak obezbeđuje izolovani molekul nukleinske kiseline koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid sa aktivnošću FVIII, pri čemu nukleotidna sekvenca sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja ima najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili najmanje 99% identičnosti sekvence sa nukleotidima 58-2277 i 2320-4374 iz SEQ ID NO: 71 (tj., nukleotidima 58-4374 iz SEQ ID NO: 71 bez nukleotida koji kodiraju B domen ili fragment B domena); i pri nukleotidna sekvenca sadrži manje potencijalnih mesta vezivanja promotera u odnosu na SEQ ID NO: 16. U drugim realizacijama, nukleotidna sekvenca koja kodira polipeptid sa aktivnošću FVIII sadrži najviše 9, najviše 8, najviše 7, najviše 6, ili najviše 5 potencijalnih mesta vezivanja promotera. U drugim realizacijama, nukleotidna sekvenca koja kodira polipeptid sa aktivnošću FVIII sadrži najviše 4, najviše 3, najviše 2 ili najviše 1 potencijalna mesta vezivanja promotera. U još drugim realizacijama, nukleotidna sekvenca koja kodira polipeptid sa aktivnošću FVIII ne sadrži potencijalno mesto vezivanja promotera.
[0111] TATA kutije su regulatorne sekvence koje se često nalaze u promoterskim regionima eukariota. One služe kao mesto vezivanja TATA vezujućeg proteina (TBP), opšteg transkripcionog faktora. TATA kutije obično sadrže sekvencu TATAA (SEQ ID NO: 28) ili blisku varijantu. TATA kutije unutar kodirajuće sekvence, međutim, mogu inhibirati translaciju proteina pune dužine. Postoji deset potencijalnih sekvenci za vezivanje promotera u sekvenci divljeg tipa BDD FVIII (SEQ ID NO: 16): pet TATAA sekvenci (SEQ ID NO: 28) i pet TTATA sekvenci (SEQ ID NO: 29). U nekim realizacijama, najmanje 1, najmanje 2, najmanje 3, ili najmanje 4 mesta vezivanja promotera su ukinuta u genima FVIII predmetnog pronalaska. U nekim realizacijama, najmanje 5 mesta vezivanja promotera je ukinuto u genima FVIII predmetnog pronalaska. U drugim realizacijama, najmanje 6, najmanje 7 ili najmanje 8 mesta vezivanja promotera su ukinuta u genima FVIII predmetnog pronalaska. U jednoj realizaciji, najmanje 9 mesta vezivanja promotera je ukinuto u genima FVIII predmetnog pronalaska. U jednoj posebnoj realizaciji, sva mesta vezivanja promotera su ukinuta u genima FVIII ovog pronalaska. Lokacija svakog potencijalnog mesta vezivanja promotera i sekvenca odgovarajućih nukleotida u optimizovanim sekvencama prikazani su u tabeli 2.
Ostali negativni regulatorni elementi koji deluju na Cis
[0112] Pored MAR/ARS sekvenci, destabilizujućih elemenata i potencijalnih promoterskih mesta opisanih gore, nekoliko dodatnih potencijalno inhibitornih sekvenci se može identifikovati u sekvenci divljeg tipa BDD FVIII (SEQ ID NO: 16). Dva elementa sekvence bogate sa AU (ARE) se mogu identifikovati (ATTTTATT (SEQ ID NOs: 30); i ATTTTTAA (SEQ ID NO: 31), zajedno sa poli-A mestom (AAAAAAA; SEQ ID NO: 26), poli-T mestom (TTTTTT; SEQ ID NO: 25), i mestom spajanja (GGTGAT; SEQ ID NO: 27) u ne optimizovanoj sekvenci BDD FVIII. Jedan ili više ovih elemenata može biti uklonjeno iz optimizovanih sekvenci FVIII. Lokacija svakog od ovih mesta i sekvenca odgovarajućih nukleotida u optimizovanim sekvencama prikazani su u tabeli 2.
[0113] U drugim realizacijama, ovaj pronalazak obezbeđuje izolovani molekul nukleinske kiseline koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid sa aktivnošću FVIII, pri čemu nukleotidna sekvenca sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja ima najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili najmanje 99% identičnosti sekvence sa nukleotidima 58-2277 i 2320-4374 iz SEQ ID NO: 71 (tj., nukleotidima 58-4374 iz SEQ ID NO: 71 bez nukleotida koji kodiraju B domen ili fragment B domena); i pri čemu nukleotidna sekvenca ne sadrži jedan ili više negativnih regulatornih elemenata koji deluju na cis, na primer, mesto spajanja, poli-T sekvencu, poli-A sekvencu, ARE sekvencu ili bilo koje njihove kombinacije.
[0114] U nekim realizacijama, ovaj pronalazak obezbeđuje izolovani molekul nukleinske kiseline koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid sa aktivnošću FVIII, pri čemu nukleotidna sekvenca sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja ima najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili najmanje 99% identičnosti sekvence sa nukleotidima 58-2277 i 2320-4374 iz SEQ ID NO: 71(tj., nukleotidima 58-4374 iz SEQ ID NO: 71 bez nukleotida koji kodiraju B domen ili fragment B domena); i pri čemu nukleotidna sekvenca ne sadrži mesto spajanja GGTGAT (SEQ ID NO: 27). U nekim realizacijama, ovaj pronalazak obezbeđuje izolovani molekul nukleinske kiseline koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid sa aktivnošću FVIII, pri čemu nukleotidna sekvenca sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja ima najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili najmanje
4
99% identičnosti sekvence sa nukleotidima 58-2277 i 2320-4374 iz SEQ ID NOs: 71 (tj., nukleotidima 58-4374 iz SEQ ID NO: 71 bez nukleotida koji kodiraju B domen ili fragment B domena); i pri čemu nukleotidna sekvenca ne sadrži poli-T sekvencu (SEQ ID NO: 25). U nekim realizacijama, ovaj pronalazak obezbeđuje izolovani molekul nukleinske kiseline koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid sa aktivnošću FVIII, pri čemu nukleotidna sekvenca sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja ima najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili najmanje 99% identičnosti sekvence sa nukleotidima 58-2277 i 2320-4374 iz SEQ ID NOs: 71 (tj., nukleotidima 58-4374 iz SEQ ID NO: 71 bez nukleotida koji kodiraju B domen ili fragment B domena); i pri čemu nukleotidna sekvenca ne sadrži poli-A sekvencu (SEQ ID NO: 26). U nekim realizacijama, ovaj pronalazak obezbeđuje izolovani molekul nukleinske kiseline koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid sa aktivnošću FVIII, pri čemu nukleotidna sekvenca sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja ima najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili najmanje 9% identičnosti sekvence sa nukleotidima 58-2277 i 2320-4374 iz SEQ ID NO: 71 (tj., nukleotidima 58-4374 iz SEQ ID NO: 71 bez nukleotida koji kodiraju B domen ili fragment B domena); i pri čemu nukleotidna sekvenca ne sadrži ARE element (SEQ ID NO: 30 ili SEQ ID NO: 31).
[0115] U drugim realizacijama, optimizovana FVIII sekvenca iz pronalaska ne sadrži jedan ili više antivirusnih motiva, struktura petlje stabla i sekvenci ponavljanja.
[0116] U još drugim realizacijama, nukleotidi koji okružuju mesto početka transkripcije se menjaju u kozak konsenzus sekvencu (GCCGCCACCATGC (SEQ ID NO: 32), pri čemu su podvučeni nukleotidi početni kodon). U drugim realizacijama, restrikciona mesta se mogu dodati ili ukloniti da bi se olakšao proces kloniranja.
Heterologne nukleotidne sekvence
[0117] U nekim realizacijama, izolovani molekuli nukleinske kiseline prema pronalasku dalje sadrže heterolognu nukleotidnu sekvencu U nekim realizacijama, izolovani molekuli nukleinske kiseline prema pronalasku dalje sadrže najmanje jednu heterolognu nukleotidnu sekvencu. Heterologna nukleotidna sekvenca može biti povezana sa optimizovanim BDD-FVIII nukleotidnim sekvencama iz pronalaska na 5' kraju, na 3' kraju, ili umetnuta u sredinu optimizovane BDD-FVIII nukleotidne sekvence. Prema tome, u nekim realizacijama, heterologna aminokiselinska sekvenca kodirana heterolognom nukleotidnom sekvencom je povezana sa N-terminusom ili C-terminusom aminokiselinske sekvence FVIII koja je kodirana nukleotidnom sekvencom ili je umetnuta između dve aminokiseline u sekvenci aminokiseline FVIII. U nekim realizacijama, heterologna aminokiselinska sekvenca može biti umetnuta između dve aminokiseline na jednom ili više mesta umetanja izabranih iz tabele 3. U nekim realizacijama, heterologna aminokiselinska sekvenca može biti umetnuta unutar FVIII polipeptida koji je kodiran molekulom nukleinske kiseline prema pronalasku na bilo kom mestu otkrivenom u međunarodnoj publikaciji br. WO 2013/123457 A1, WO 2015/106052 A1 ili publikaciji američkog patenta 2015/0158929 A1.
[0118] U nekim realizacijama, heterologna aminokiselinska sekvenca kodirana heterolognom nukleotidnom sekvencom je umetnuta unutar B domena ili njegovog fragmenta. U nekim realizacijama, heterologna aminokiselinska sekvenca je umetnuta unutar FVIII neposredno nizvodno od aminokiseline koja odgovara aminokiselini 745 zrelog humanog FVIII (SEQ ID NO:15). U jednoj posebnoj realizaciji, FVIII sadrži deleciju aminokiselina 746-1646, što odgovara zrelom humanom FVIII (SEQ ID NO:15), i heterologna aminokiselinska sekvenca kodirana heterolognom nukleotidnom sekvencom je umetnuta odmah nizvodno od aminokiseline 745 , što odgovara zrelom humanom FVIII (SEQ ID NO:15).
TABELA 3: mesta insercije heterolognog dela
4
Beleška: Mesta insercije označavaju poziciju aminokiselina koji odgovara poziciji
aminokiselina zrelog humanog FVIII (SEQ ID NO: 15).
[0119] U drugim realizacijama, izolovani molekuli nukleinske kiseline prema pronalasku dalje sadrže dve, tri, četiri, pet, šest, sedam ili osam heterolognih nukleotidnih sekvenci. U nekim realizacijama, sve heterologne nukleotidne sekvence su identične. U nekim realizacijama, najmanje jedna heterologna nukleotidna sekvenca se razlikuje od drugih heterolognih nukleotidnih sekvenci. U nekim realizacijama, otkrivanje može da sadrži dve, tri, četiri, pet, šest ili više od sedam heterolognih nukleotidnih sekvenci u tandemu.
[0120] U nekim realizacijama, heterologna nukleotidna sekvenca kodira sekvencu aminokiseline. U nekim realizacijama, sekvenca aminokiseline kodirana heterolognom nukleotidnom sekvencom je heterologni deo koji može da poveća vreme poluraspada ("produživač vremena poluraspada") molekula FVIII.
[0121] U nekim realizacijama, heterologni deo je peptid ili polipeptid sa bilo ne strukturiranim ili strukturiranim karakteristikama koje su povezane sa produženjem in vivo vremena poluraspada kada se inkorporira u protein iz pronalaska. Neograničavajući primeri obuhvataju albumin, fragmente albumina, Fc fragmente imunoglobulina, C-terminalni peptid (CTP) β podjedinice humanog horionskog gonadotropina, HAP sekvencu, XTEN sekvencu, transferin ili njegov fragment, polipeptid PAS , poliglicinske linkere, poliserinske linkere, delove koji se vezuju za albumin, ili bilo koji fragmenti, derivati, varijante ili kombinacije ovih polipeptida. U jednoj posebnoj realizaciji, heterologna aminokiselinska sekvenca je konstantni region imunoglobulina ili njegov deo, transferin, albumin ili PAS sekvenca. U nekim aspektima, heterologni deo obuhvata von Villebrandov faktor ili njegov fragment. U drugim srodnim aspektima, heterologni deo može obuhvatati mesto vezivanja (npr., cisteinsku aminokiselinu)
4
za ne-polipeptidni deo kao što je polietilen glikol (PEG), hidroksietil skrob (HES), polisijalnu kiselinu ili bilo koji derivat, varijante ili kombinacije ovih elemenata. U nekim aspektima, heterologni deo obuhvata cisteinsku aminokiselinu koja funkcioniše kao mesto vezivanja za ne-polipeptidni deo kao što je polietilen glikol (PEG), hidroksietil skrob (HES), polisijalna kiselina ili bilo koji derivat, varijante ili kombinacije ovih elemenata.
[0122] U jednom specifičnom izvođenju, prva heterologna nukleotidna sekvenca kodira prvi heterologni deo koji je molekul koji produžava vreme poluraspada koji je poznat u tehnici, a druga heterologna nukleotidna sekvenca kodira drugi heterologni deo koji takođe može biti molekul koji produžava vreme poluraspada koji je poznat u tehnici. U određenim realizacijama, prvi heterologni deo (npr., prvi Fc deo) i drugi heterologni deo (npr., drugi Fc deo) su povezani jedan sa drugim da bi formirali dimer. U jednoj realizaciji, drugi heterologni deo je drugi Fc deo, pri čemu je drugi Fc deo vezan ili povezan sa prvim heterolognim delom, npr., prvim Fc delom. Na primer, drugi heterologni deo (npr., drugi Fc deo) može biti vezan za prvi heterologni deo (npr., prvi Fc deo) pomoću linkera ili povezan sa prvim heterolognim delom kovalentnom ili nekovalentnom vezom.
[0123] U nekim realizacijama, heterologni deo je polipeptid koji se sastoji, u suštini se sastoji od, ili se sastoji od najmanje oko 10, najmanje oko 100, najmanje oko 200, najmanje oko 300, najmanje oko 400, najmanje oko 500, najmanje oko 600, najmanje oko 700, najmanje oko 800, najmanje oko 900, najmanje oko 1000, najmanje oko 1100, najmanje oko 1200, najmanje oko 1300, najmanje oko 1400, najmanje oko 1500, najmanje oko 1600, najmanje oko 1700, najmanje oko 1800, najmanje oko 1900, najmanje oko 2000, najmanje oko 2500, najmanje oko 3000, ili najmanje oko 4000 aminokiselina. U drugim realizacijama, heterologni deo je polipeptid koji sadrži, sastoji se u suštini od, ili se sastoji od oko 100 do oko 200 aminokiselina, oko 200 do oko 300 aminokiselina, oko 300 do oko 400 aminokiselina, oko 400 do oko 500 aminokiselina, oko 500 do oko 600 aminokiselina, oko 600 do oko 700 aminokiselina, oko 700 do oko 800 aminokiselina, oko 800 do oko 900 aminokiselina, ili oko 900 do oko 1000 aminokiselina.
[0124] U nekim realizacijama, heterologni deo poboljšava jedno ili više farmakokinetičkih svojstava FVIII proteina bez značajnog uticaja na njegovu biološku aktivnost ili funkciju.
4
[0125] U nekim realizacijama, heterologni deo povećava in vivo i/ili in vitro vreme poluraspada FVIII proteina iz pronalaska. U drugim realizacijama, heterologni deo olakšava vizualizaciju ili lokalizaciju FVIII proteina iz pronalaska ili njegovog fragmenta (npr. fragmenta koji sadrži heterologni deo posle proteolitičkog cepanja proteina FVIII). Vizualizacija i/ili lokalizacija FVIII proteina iz pronalaska ili njegovog fragmenta može biti in vivo, in vitro, ex vivo, ili njihove kombinacije.
[0126] U drugim realizacijama, heterologni deo povećava stabilnost proteina FVIII prema pronalasku ili njegovog fragmenta (npr., fragment koji sadrži heterologni deo posle proteolitičkog cepanja proteina FVIII). Kako se ovde koristi, termin "stabilnost" se odnosi na u struci priznatu meru održavanja jednog ili više fizičkih svojstava proteina FVIII kao odgovor na uslove okoline (npr. povišena ili snižena temperatura). U određenim aspektima, fizičko svojstvo može biti održavanje kovalentne strukture proteina FVIII (npr., odsustvo proteolitičkog cepanja, neželjena oksidacije ili deamidacija). U drugim aspektima, fizičko svojstvo takođe može biti prisustvo proteina FVIII u pravilno savijenom stanju (npr., odsustvo rastvorljivih ili nerastvorljivih agregata ili precipitata). U jednom aspektu, stabilnost proteina FVIII se meri ispitivanjem biofizičke karakteristike proteina FVIII, na primer termičke stabilnosti, pH profila odvijanja, stabilnog uklanjanja glikozilacije, rastvorljivosti, biohemijske funkcije (npr., sposobnost vezivanja za protein, receptor ili ligand), itd., i/ili njihove kombinacije. U drugom aspektu, biohemijska funkcija se pokazuje afinitetom vezivanja interakcije. U jednom aspektu, mera stabilnosti proteina je termička stabilnost, tj. otpornost na termičke izazove. Stabilnost se može meriti korišćenjem metoda poznatih u tehnici, kao što su HPLC (tečna hromatografija visokih performansi), SEC (hromatografija isključivanja veličine), DLS (dinamičko rasejanje svetlosti), itd. Metode za merenje termičke stabilnosti obuhvataju, ali nisu ograničene na diferencijalnu skenirajuću kalorimetriju (DSC), diferencijalnu skenirajuću fluorometriju (DSF), kružni dihroizam (CD) i test termičkog izazova.
[0127] U određenim aspektima, protein FVIII kodiran molekulom nukleinske kiseline prema pronalasku sadrži najmanje jedan produžetak vremena poluraspada, tj., heterologni deo koji povećava in vivo vreme poluraspada proteina FVIII u odnosu na in vivo vreme poluraspada odgovarajućeg proteina FVIII kome nedostaje takav heterologni deo. Vreme poluraspada FVIII proteina in vivo se može odrediti bilo kojim metodama poznatim stručnjacima u ovoj oblasti,
4
na primer, testovima aktivnosti (hromogeni test ili jednostepeni aPTT test zgrušavanja), ELISA, ROTEM<™>, itd.
[0128] U nekim realizacijama, prisustvo jednog ili više agenasa za produžavanje vremena poluraspada dovodi do povećanja vremena poluraspada proteina FVIII u poređenju sa vremenom poluraspada odgovarajućeg proteina kojem nedostaje jedan ili više agenasa za produžavanje vremena poluraspada. Poluvreme raspada proteina FVIII koji sadrži agens za produžavanje vremena poluraspada je najmanje oko 1.5 puta, najmanje oko 2 puta, najmanje oko 2.5 puta, najmanje oko 3 puta, najmanje oko 4 puta, najmanje oko 5 puta, najmanje oko 6 puta, najmanje oko 7 puta, najmanje oko 8 puta, najmanje oko 9 puta, najmanje oko 10 puta, najmanje oko 11 puta, ili najmanje oko 12 puta duže od in vivo in vivo vremena poluraspada odgovarajućeg proteina FVIII kome nedostaje takav agens za produžavanje vremena poluraspada.
[0129] U jednoj realizaciji, poluvreme raspada proteina FVIII koji sadrži agens za produžavanje vremena poluraspada je oko 1.5-puta do oko 20-puta, oko 1.5 puta do oko 15 puta, ili oko 1.5 puta do oko 10 puta duže od in vivo vremena poluraspada odgovarajućeg proteina kome nedostaje agens za produžavanje vremena poluraspada. U drugoj realizaciji, vreme poluraspada proteina FVIII koji sadrži agens za produžavanje vremena poluraspada je produženo oko 2-puta do oko 10-puta, oko 2-puta do oko 9-puta, oko 2-puta do oko 8-puta, oko 2-puta do oko 7-puta, oko 2-puta do oko 6-puta, oko 2-puta do oko 5-puta, oko 2-puta do oko 4-puta, oko 2-puta do oko 3-puta, oko 2.5-puta do oko 10-puta, oko 2.5-puta do oko 9-puta, oko 2.5-puta do oko 8-puta, oko 2.5-puta do oko 7-puta, oko 2.5-puta do oko 6-puta, oko 2.5-puta do oko 5-puta, oko 2.5-puta do oko 4-puta, oko 2.5-puta do oko 3-puta, oko 3-puta do oko 10-puta, oko 3-puta do oko 9-puta, oko 3-puta do oko 8-puta, oko 3-puta do oko 7-puta, oko 3-puta do oko 6-puta, oko 3-puta do oko 5-puta, oko 3-puta do oko 4-puta, oko 4-puta do oko 6 puta, oko 5-puta do oko 7-puta, ili oko 6-puta do oko 8 puta u poređenju sa in vivo vremenom poluraspada odgovarajućeg proteina kome nedostaje takav agens za produžavanje vremena poluraspada.
[0130] U drugim realizacijama, poluvreme raspada proteina FVIII koji sadrži agens za produžavanje vremena poluraspada je najmanje oko 17 sati, najmanje oko 18 sati, najmanje oko 19 sati, najmanje oko 20 sati, najmanje oko 21 sat, najmanje oko 22 sata, najmanje oko 23 sata, najmanje oko 24 sata, najmanje oko 25 sati, najmanje oko 26 sati, najmanje oko 27 sati,
4
najmanje oko 28 sati, najmanje oko 29 sati, najmanje oko 30 sati, najmanje oko 31 sat, najmanje oko 32 sata, najmanje oko 33 sata, najmanje oko 34 sata, najmanje oko 35 sati, najmanje oko 36 sati, najmanje oko 48 sati, najmanje oko 60 sati, najmanje oko 72 sata, najmanje oko 84 sata, najmanje oko 96 sati, ili najmanje oko 108 sati.
[0131] U još drugim realizacijama, poluvreme raspada proteina FVIII koji sadrži agens za produžavanje vremena poluraspada je oko 15 sati do oko dve nedelje, oko 16 sati do oko jedne nedelje, oko 17 sati do oko jedne nedelje, oko 18 sati do oko jedne nedelje, oko 19 sati do oko jedne nedelje, oko 20 sati do oko jedne nedelje, oko 21 sat do oko jedne nedelje, oko 22 sata do oko jedne nedelje, oko 23 sata do oko jedne nedelje, oko 24 sata do oko jedne nedelje, oko 36 sati do oko jedne nedelje, oko 48 sati do oko jedne nedelje, oko 60 sati do oko jedne nedelje, oko 24 sata do oko šest dana, oko 24 sata do oko pet dana, oko 24 sata do oko četiri dana , oko 24 sata do oko tri dana, ili oko 24 sata do oko dva dana.
[0132] U nekim realizacijama, prosečno vreme poluraspada po subjektu proteina FVIII koji sadrži agens za produžavanje vremena poluraspada je oko 15 sati, oko 16 sati, oko 17 sati, oko 18 sati, oko 19 sati, oko 20 sati, oko 21 sat, oko 22 sata, oko 23 sata, oko 24 sata (1 dan), oko 25 sati, oko 26 sati, oko 27 sati, oko 28 sati, oko 29 sati, oko 30 sati, oko 31 sat, oko 32 sata , oko 33 sata, oko 34 sata, oko 35 sati, oko 36 sati, oko 40 sati, oko 44 sata, oko 48 sati (2 dana), oko 54 sata, oko 60 sati, oko 72 sata (3 dana), oko 84 sata, oko 96 sati (4 dana), oko 108 sati, oko 120 sati (5 dana), oko šest dana, oko sedam dana (jedna nedelja), oko osam dana, oko devet dana, oko 10 dana, oko 11 dana , oko 12 dana, oko 13 dana ili oko 14 dana.
[0133] Jedan ili više agenasa za produžavanje vremena poluraspada mogu biti spojeni sa C-terminusom ili N-terminusom FVIII ili insertovani unutar FVIII.
1. Konstantni region imunoglobulina ili njegov deo
[0134] U drugom aspektu, heterologni deo obuhvata jedan ili više konstantnih regiona imunoglobulina ili njihovih delova (npr., Fc region). U jednoj realizaciji, izolovani molekul nukleinske kiseline prema pronalasku dalje sadrži heterolognu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira konstantni region imunoglobulina ili njegov deo. U nekim realizacijama, konstantni region imunoglobulina ili njegov deo je Fc region.
[0135] Konstantni region imunoglobulina se sastoji od domena označenih CH (konstantni teški) domeni (CH1, CH2, itd.). U zavisnosti od izotipa, (tj. IgG, IgM, IgA IgD, ili IgE), konstantni region se može sastojati od tri ili četiri CH domena. Neki izotipovi (npr. IgG) konstantni regioni takođe sadrže zglobni region. Videti Janeway i dr. 2001, Immunobiology, Garland Publishing, N.Y., N.Y.
[0136] Konstantni region imunoglobulina ili njegov deo za proizvodnju FVIII proteina prema ovom pronalasku može se dobiti iz više različitih izvora. U jednoj realizaciji, konstantni region imunoglobulina ili njegov deo je izveden iz humanog imunoglobulina. Podrazumeva se, međutim, da konstantni region imunoglobulina ili njegov deo može biti izveden iz imunoglobulina druge vrste sisara, uključujući na primer, glodara (npr. miša, pacova, zeca, zamorca) ili primata koji nije čovek (npr., šimpanza, makaki). Štaviše, konstantni region imunoglobulina ili njegov deo može biti izveden iz bilo koje klase imunoglobulina, uključujući IgM, IgG, IgD, IgA i IgE, i bilo koji izotip imunoglobulina, uključujući IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4. U jednoj realizaciji, koristi se ljudski izotip IgG1.
[0137] Različite sekvence gena konstantnog regiona imunoglobulina (npr., sekvence gena humanog konstantnog regiona) su dostupne u obliku javno dostupnih depozita. Sekvenca domena konstantnog regiona može biti izabrana sa određenom efektorskom funkcijom (ili bez određene efektorske funkcije) ili sa određenom modifikacijom da bi se smanjila imunogenost. Objavljene su mnoge sekvence antitela i gena koji kodiraju antitela i pogodne sekvence konstantnog regiona Ig (npr., zglobovi, CH2, i/ili CH3 sekvence, ili njihovi delovi) mogu biti izvedene iz ovih sekvenci korišćenjem tehnika priznatih u struci. Genetski materijal dobijen korišćenjem bilo koje od prethodnih metoda može se zatim izmeniti ili sintetizovati da bi se dobili polipeptidi iz predmetnog pronalaska. Dalje će biti cenjeno da obim predmetnog pronalaska obuhvata alele, varijante i mutacije sekvenci DNK konstantnog regiona.
[0138] Sekvence konstantnog regiona imunoglobulina ili njegov deo mogu biti klonirane, npr., korišćenjem reakcije lančane polimeraze i prajmera koji su izabrani da pojačaju domen od interesa. Da bi se klonirala sekvenca konstantnog regiona imunoglobulina ili njegovog dela iz antitela, mRNK se može izolovati iz hibridoma, slezine ili limfnih ćelija, reverzno transkribovati u DNK i geni antitela amplificirati PCR-om. Metode PCR amplifikacije su detaljno opisane u američkim patentima br. 4,683,195; 4,683,202; 4,800,159; 4,965,188; i u, npr., "PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications" Innis i dr. eds., Academic
1
Press, San Diego, CA (1990); Ho i dr.1989. Gene 77:51; Horton i dr.1993. Methods Enzymol.
217:270). PCR se može započeti konsenzusnim prajmerima konstantnog regiona ili specifičnijim prajmerima na osnovu objavljenih DNK teškog i lakog lanca i sekvenci aminokiselina. PCR se takođe može koristiti za izolovanje DNK klonova koji kodiraju lake i teške lance antitela. U ovom slučaju biblioteke se mogu pregledati konsenzusnim prajmerima ili većim homolognim sondama, kao što su sonde konstantnog regiona miša. Brojni setovi prajmera pogodni za amplifikaciju gena antitela su poznati u tehnici (npr., 5' prajmeri zasnovani na N-terminalnoj sekvenci prečišćenih antitela (Benhar i Pastan. 1994. Protein Engineering 7:1509); brza amplifikacija krajeva cDNK (Ruberti, F. i dr. 1994. J. Immunol. Methods 173:33); vodeće sekvence antitela (Larrick i dr. 1989 Biochem. Biophys. Res. Commun. 160:1250). Kloniranje sekvenci antitela je dalje opisano u Newman i dr., američkom patentu broj 5,658,570, podnetom 25. januara 1995. godine.
[0139] Konstantni region imunoglobulina koji se ovde koristi može obuhvatati sve domene i zglobni region ili njihove delove. U jednoj realizaciji, konstantni region imunoglobulina ili njegov deo obuhvata CH2 domen, CH3 domen i zglobni region, tj. Fc region ili FcRn vezujući partner.
[0140] Kako se ovde koristi, termin "Fc region" je definisan kao deo polipeptida koji odgovara Fc regionu prirodnog Ig, tj. formiran dimernom asocijacijom odgovarajućih Fc domena njegova dva teška lanca. Nativni Fc region gradi homodimer sa drugim Fc regionom. Nasuprot tome, termin „genetski fuzionisani Fc region“ ili „jednolančani Fc region“ (scFc region), kako se ovde koristi, odnosi se na sintetički dimerni Fc region koji se sastoji od Fc domena genetski povezanih unutar jednog polipeptidnog lanca (tj. kodirani u jednoj neprekidnoj genetskoj sekvenci). Videti međunarodnu publikaciju br. WO 2012/006635.
[0141] U jednoj realizaciji, "Fc region" se odnosi na deo jednog teškog lanca Ig koji počinje u zglobnom regionu neposredno uzvodno od mesta cepanja papaina (tj. ostatak 216 u IgG, uzimajući prvi ostatak konstantnog regiona teškog lanca da bude 114) i završava se na C-terminusu antitela. Shodno tome, kompletan Fc region sadrži najmanje zglobni domen, CH2 domen i CH3 domen.
[0142] Konstantni region imunoglobulina ili njegov deo može biti FcRn vezujući partner. FcRn je aktivan u epitelnim tkivima odraslih i eksprimiran je u lumenu creva, plućnim disajnim
2
putevim, nazalnim površinama, vaginalnim površinama, debelom crevu i rektalnim površinama (američki patent br. 6,485,726). Partner koji se vezuje za FcRn je deo imunoglobulina koji se vezuje za FcRn.
[0143] FcRn receptor je izolovan iz nekoliko vrsta sisara uključujući ljude. Poznate su sekvence ljudskog FcRn, FcRn majmuna, FcRn pacova i FcRn miša (Story i dr.1994, J. Exp. Med. 180:2377). FcRn receptor vezuje IgG (ali ne i druge klase imunoglobulina kao što su IgA, IgM, IgD, i IgE) pri relativno niskom pH, aktivno transportuje IgG transcelularno u pravcu od lumina do seroze, a zatim oslobađa IgG pri relativno višim pH vrednostima u intersticijske tečnosti. Eksprimira se u epitelnom tkivu odraslih (američki patent br.
6,485,726, 6,030,613, 6,086,875; WO 03/077834; US2003-0235536A1) uključujući pluća i crevni epitel (Israel i dr. 1997, Immunology 92:69) bubrežnom proksimalnom tubularnom epitelu (Kobayashi i dr.2002, Am. J. Physiol. Renal Physiol.282:F358) kao i nazalnom epitelu, vaginalnim površinama i površinama žučnih vodova.
[0144] FcRn vezujući partneri korisni u ovom pronalasku obuhvataju molekule koje mogu biti specifično vezane za FcRn receptor uključujući ceo IgG, Fc fragment IgG i druge fragmente koji obuhvataju kompletan region vezivanja FcRn receptora. Region Fc dela IgG koji se vezuje za FcRn receptor je opisan na temelju rendgenske kristalografije (Burmeister i dr.1994, Nature 372:379). Glavna kontaktna površina Fc sa FcRn je blizu spoja CH2 i CH3 domena. Fc-FcRn kontakti su svi unutar jednog teškog lanca Ig. Partneri za vezivanje FcRn obuhvataju ceo IgG, Fc fragment IgG i druge fragmente IgG koji obuhvataju kompletan region vezivanja FcRn. Glavna kontaktna mesta obuhvataju aminokiselinske ostatke 248, 250-257, 272, 285, 288, 290-291, 308-311 i 314 za CH2 domen i aminokiselinske ostatke 385-387, 428-4363 za CH3 domen. Reference date na numerisanje aminokiselina imunoglobulina ili fragmenata imunoglobulina, ili regiona, sve su zasnovane na dokumentu Kabat i dr. 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Public Health, Bethesda, Md.
[0145] Fc regioni ili FcRn vezujući partneri vezani za FcRn mogu se efikasno prebaciti preko epitelnih barijera pomoću FcRn, čime se obezbeđuju neinvazivni načini za sistemsko davanje željenog terapeutskog molekula. Pored toga, fuzioni proteini koji sadrže Fc region ili FcRn vezujući partner su endocitozirane sa ćelijama koje eksprimiraju FcRn. Ali umesto da budu označeni za degradaciju, ovi fuzioni proteini se ponovo recikliraju u cirkulaciju, čime se produžava in vivo vreme poluraspada ovih proteina. U određenim realizacijama, delovi konstantnih regiona imunoglobulina su Fc region ili FcRn vezujući partner koji se tipično povezuje, preko disulfidnih veza i drugih nespecifičnih interakcija, sa drugim Fc regionom ili drugim FcRn vezujućim partnerom da gradi dimere i multimere višeg reda.
[0146] Dva FcRn receptora mogu da vežu jedan Fc molekul. Kristalografski podaci sugerišu da svaki molekul FcRn vezuje jedan polipeptid Fc homodimera. U jednoj realizaciji, povezivanje FcRn vezujućeg partnera, npr., Fc fragmenta za IgG, na biološki aktivan molekul obezbeđuje sredstvo za isporuku biološki aktivnog molekula oralno, bukalno, sublingvalno, rektalno, vaginalno, kao aerosol koji se primenjuje nazalno ili plućnim putem, ili okularnim putem. U drugoj realizaciji, protein FVIII se može primeniti invazivno, npr., subkutano, intravenozno.
[0147] Partnerski region koji se vezuje za FcRn je molekul ili njegov deo koji može biti specifično vezan za FcRn receptor sa posledičnim aktivnim transportom preko FcRn receptora Fc regiona. Specifično vezan se odnosi na dva molekula koji grade kompleks koji je relativno stabilan u fiziološkim uslovima. Specifično vezivanje se karakteriše visokim afinitetom i malim do umerenim kapacitetom za razliku od nespecifičnog vezivanja koje obično ima nizak afinitet sa umerenim do visokim kapacitetom. Tipično, vezivanje se smatra specifičnim kada je konstanta afiniteta KA viša od 10<6>M<-1>, ili viša od 10<8>M<-1>. Ako je potrebno, nespecifično vezivanje se može smanjiti bez suštinskog uticaja na specifično vezivanje variranjem uslova vezivanja. Odgovarajući uslovi vezivanja, kao što su koncentracija molekula, jonska snaga rastvora, temperatura, vreme dozvoljeno za vezivanje, koncentracija blokirajućeg agensa (npr., serumski albumin, mlečni kazein), itd., mogu biti optimizovani od strane kvalifikovanog stručnjaka u oblasti koristeći rutinske tehnike.
[0148] U nekim realizacijama protein FVIII kodiran molekulom nukleinske kiseline prema pronalasku sadrži jedan ili više skraćenih Fc regiona koji su ipak dovoljni da Fc regionu daju svojstva vezivanja Fc receptora (FcR) na Fc region. Na primer, deo Fc regiona koji se vezuje za FcRn (tj., FcRn vezujući deo) sadrži od oko aminokiselina 282-438 od IgG1, EU numeracija (sa primarnim kontaktnim mestima koja su aminokiseline 248, 250-257, 272, 285, 288, 290-291, 308-311, i 314 od CH2 domena i aminokiselinskih ostataka 385-387, 428, i 433-436 od CH3 domena. Prema tome, Fc region iz pronalaska može sadržati ili se sastojati od FcRn vezujućeg dela. Delovi koji se vezuju za FcRn mogu biti izvedeni iz teških lanaca bilo kog izotipa, uključujući IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4. U jednoj realizaciji, koristi se deo koji se vezuje
4
za FcRn iz antitela humanog izotipa IgG1. U drugoj realizaciji, koristi se deo koji se vezuje za FcRn iz antitela humanog izotipa IgG4.
[0149] Fc region se može dobiti iz više različitih izvora. U jednoj realizaciji, Fc region polipeptida je izveden iz humanog imunoglobulina. Podrazumeva se, međutim, da Fc deo može biti izveden iz imunoglobulina druge vrste sisara, uključujući na primer, glodara (npr., miš, pacov, zec, zamorac) ili primata koji nije čovek (npr., šimpanza, makaki). Štaviše, polipeptid Fc domena ili njihovih delova može biti izveden iz bilo koje klase imunoglobulina, uključujući IgM, IgG, IgD, IgA i IgE, i bilo kog izotipa imunoglobulina, uključujući IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4. U drugoj realizaciji, koristi se ljudski izotip IgG1.
[0150] U određenim realizacijama, Fc varijanta daje promenu u najmanje jednoj efektorskoj funkciji koju daje Fc deo koji sadrži pomenuti divlji tip Fc domena (npr., poboljšanje ili smanjenje sposobnosti Fc regiona da se veže na Fc receptore (npr. FcyRI, FcyRII, ili FcyRIII) ili proteine komplementa (npr. C1q), ili da izazove citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC), fagocitozu ili citotoksičnost zavisnu od komplementa (CDCC)). U drugim realizacijama, varijanta Fc obezbeđuje projektovani cisteinski ostatak.
[0151] Fc region iz pronalaska može da koristi varijante Fc priznate u struci za koje je poznato da daju promenu (npr., poboljšanje ili smanjenje) efektorske funkcije i/ili vezivanja i/ili FcR ili vezivanja FcRn. Konkretno, Fc region iz pronalaska može obuhvatati, na primer, promenu (npr., supstituciju) na jednoj ili više pozicija aminokiselina otkrivenih u međunarodnim PCT objavama WO88/07089A1,WO96/14339A1, WO98/05787A1, WO98/23289A1, WO99/51642A1, WO99/58572A1, WO00/09560A2, WO00/32767A1, WO 00/42072A2, WO02/44215A2, WO02/060919A2, WO03/074569A2, WO04/016750A2, WO 04/029207A2, WO04/035752A2, WO04/063351A2, WO04/074455A2, WO04/099249A2, W O05/040217A2, WO04/044859, WO05/070963A1, WO05/077981A2, WO05/092925A2, W O05/123780A2, WO06/019447A1, WO06/047350A2, i WO06/085967A2; objavi američkog patenta br. US2007/0231329, US2007/0231329, US2007/0237765, US2007/0237766, US2007/0237767, US2007/0243188, US20070248603, US20070286859, US20080057056; ili američkih patenata br. 5,648,260; 5,739,277; 5,834,250; 5,869,046; 6,096,871; 6,121,022; 6,194,551; 6,242,195; 6,277,375; 6,528,624; 6,538,124; 6,737,056; 6,821,505; 6,9 98,253; 7,083,784; 7,404,956, i 7,317,091. U jednoj realizaciji, specifična promena (npr., specifična supstitucija jedne ili više aminokiselina otkrivena u stanju tehnike) može da se izvrši na jednoj ili više otkrivenih pozicija aminokiselina. U drugoj realizaciji, može se napraviti drugačija promena na jednoj ili više otkrivenih pozicija aminokiselina (npr., različita supstitucija jedne ili više aminokiselinskih pozicija otkrivenih u tehnici).
[0152] Fc region ili FcRn vezujući partner IgG može biti modifikovan prema dobro poznatim procedurama kao što je mutageneza usmerena na mesto i slično da bi se dobili modifikovani IgG ili Fc fragmenti ili njihovi delovi koji će biti vezani pomoću FcRn. Takve modifikacije obuhvataju modifikacije udaljene od kontaktnih mesta FcRn, kao i modifikacije unutar kontaktnih mesta koje čuvaju ili čak poboljšavaju vezivanje za FcRn. Na primer, sledeći pojedinačni aminokiselinski ostaci u humanom IgG1 Fc (Fc γ1) mogu biti supstituisani bez značajnog gubitka afiniteta vezivanja Fc za FcRn: P238A, S239A, K246A, K248A, D249A, M252A, T256A, E258A, T260A, D265A, S267A, H268A, E269A, D270A, E272A, L274A, N276A, Y278A, D280A, V282A, E283A, H285A, N286A, T289A, K290A, R292A, E293A, E294A, Q295A, Y296F, N297A, S298A, Y300F, R301A, V303A, V305A, T307A, L309A, Q311A, D312A, N315A, K317A, E318A, K320A, K322A, S324A, K326A, A327Q, P329A, A330Q, P331A, E333A, K334A, T335A, S337A, K338A, K340A, Q342A, R344A, E345A, Q347A, R355A, E356A, M358A, T359A, K360A, N361A, Q362A, Y373A, S375A, D376A, A378Q, E380A, E382A, S383A, N384A, Q386A, E388A, N389A, N390A, Y391F, K392A, L398A, S400A, D401A, D413A, K414A, R416A, Q418A, Q419A, N421A, V422A, S424A, E430A, N434A, T437A, Q438A, K439A, S440A, S444A, i K447A, gde na primer P238A predstavlja prolin divljeg tipa zamenjen alaninom na poziciji broj 238. Kao primer, specifična realizacija obuhvata mutaciju N297A, uklanjajući visoko očuvano mesto N-glikozilacije. Pored alanina, druge aminokiseline mogu biti supstituisane za aminokiseline divljeg tipa na gore navedenim pozicijama. Mutacije se mogu uvesti pojedinačno u Fc što dovodi do više od sto Fc regiona različitih od prirodnog Fc. Pored toga, kombinacije dve, tri ili više ovih pojedinačnih mutacija mogu se uvesti zajedno, što dovodi do još stotina Fc regiona.
[0153] Određene od gore navedenih mutacija mogu dati novu funkcionalnost Fc regionu ili FcRn vezujućem partneru. Na primer, jedna realizacija obuhvata N297A, uklanjajući visoko konzervirano mesto N-glikozilacije. Efekat ove mutacije je da smanji imunogenost, čime se produžava vreme poluraspada Fc regiona u cirkulaciji i da se Fc region učini nesposobnim da se veže za FcyRI, FcyRIIA, FcyRIIB, i FcyRIIIA, bez ugrožavanja afiniteta za FcRn (Routledge i dr. 1995, Transplantation 60:847; Friend i dr. 1999, Transplantation 68:1632; Shields i dr.1995, J. Biol. Chem.276:6591). Kao dalji primer nove funkcionalnosti koja proizilazi iz gore opisanih mutacija, afinitet za FcRn može biti povećan iznad onog divljeg tipa u nekim slučajevima. Ovaj povećani afinitet može odražavati povećanu stopu „uključenja“, smanjenu stopu „isključenja“ ili i povećanu stopu „uključenja“ i smanjenu stopu „isključenja“. Primeri mutacija za koje se veruje da daju povećan afinitet za FcRn obuhvataju, ali ne ograničavajući se na, T256A, T307A, E380A, i N434A (Shields i dr. 2001, J. Biol. Chem.
276:6591).
[0154] Dodatno, izgleda da najmanje tri humana Fc gama receptora prepoznaju mesto vezivanja na IgG unutar donjeg zglobnog regiona, generalno aminokiseline 234-237. Stoga, još jedan primer nove funkcionalnosti i potencijalno smanjene imunogenosti može nastati iz mutacija ovog regiona, kao na primer zamenom aminokiselina 233-236 humanog IgG1 "ELLG" (SEQ ID NO: 45) u odgovarajuću sekvencu iz IgG2 "PVA" (sa delecijom jedne aminokiseline). Pokazalo se da se FcyRI, FcyRII, i FcyRIII, koji posreduju u različitim efektorskim funkcijama, neće vezati za IgG1 kada se uvedu takve mutacije. Ward i Ghetie 1995, Therapeutic Immunology 2:77 i Armour i dr.1999, Eur. J. Immunol.29:2613.
[0155] U drugoj realizaciji, konstantni region imunoglobulina ili njegov deo sadrži aminokiselinsku sekvencu u zglobnom regionu ili njegovom delu koji gradi jednu ili više disulfidnih veza sa drugim konstantnim regionom imunoglobulina ili njegovim delom. Drugi konstantni region imunoglobulina ili njegov deo može biti vezan za drugi polipeptid, dovodeći protein FVIII i drugi polipeptid zajedno. U nekim realizacijama, drugi polipeptid je pojačivač. Kako se ovde koristi, termin "pojačivački deo" odnosi se na molekul, njegov fragment ili komponentu polipeptida koji je sposoban da pojača prokoagulantnu aktivnost FVIII. Pojačivač može biti ko-faktor, kao što je rastvorljivi tkivni faktor (sTF) ili prokoagulantni peptid. Prema tome, posle aktivacije FVIII, deo pojačivača je dostupan da pojača aktivnost FVIII.
[0156] U nekim realizacijama, protein FVIII kodiran molekulom nukleinske kiseline prema pronalasku sadrži aminokiselinsku supstituciju konstantnog regiona imunoglobulina ili njegovog dela (npr. Fc varijante), koji menja efektorske funkcije nezavisne od antigena Ig konstantnog regiona, posebno vreme poluraspada proteina u cirkulaciji.
2. scFc Regioni
[0157] U drugom aspektu, heterologni deo obuhvata scFc region (Fc pojedinačnog lanca). U jednoj realizaciji, izolovani molekul nukleinske kiseline prema pronalasku dalje sadrži heterolognu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira scFc region. scFc region sadrži najmanje dva imunoglobulinska konstantna regiona ili njihova dela (npr., Fc delove ili domene (npr., 2, 3, 4, 5, 6, ili više Fc delova ili domena)) unutar istog linearnog polipeptidnog lanca koji su sposobni da se savijaju (npr., intramolekularno ili intermolekularno savijanje) tako da grade jedan funkcionalni scFc region koji je povezan Fc peptidnim linkerom. Na primer, u jednoj realizaciji, polipeptid iz pronalaska je sposoban da se veže, preko svog scFc regiona, za najmanje jedan Fc receptor (npr., FcRn, FcyR receptor (npr., FcγRIII), ili protein komplementa (npr., C1q)) u cilju poboljšanja vremena poluraspada ili pokretanja efektorske funkcije imunog sistema (npr., citotoksičnosti zavisne od antitela (ADCC), fagocitoze ili citotoksičnosti zavisne od komplementa (CDCC) i/ili za poboljšanje proizvodnosti).
3. CTP
[0158] U drugom aspektu, heterologni deo obuhvata jedan C-terminalni peptid (CTP) β podjedinice humanog horionskog gonadotropina ili njegov fragment, varijantu ili derivat. Poznato je da jedan ili više CTP peptida ubačenih u rekombinantni protein povećavaju vreme poluraspada tog proteina in vivo. Videti, npr., američki patent br.5,712,122.
[0159] Primeri CTP peptida obuhvataju DPRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPIL (SEQ ID NO: 33) ili SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ (SEQ ID NO: 34). Videti, npr., američku objavljenu prijavu patenta US 2009/0087411 A1.
4. XTEN sekvenca
[0160] U nekim realizacijama, heterologni deo sadrži jednu ili više XTEN sekvenci, fragmenata, varijanti ili njihovih derivata. Kako se ovde koristi, "XTEN sekvenca" se odnosi na polipeptide produžene dužine sa sekvencama koje se ne pojavljuju u prirodi, suštinski se ne ponavljaju, a koje se sastoje uglavnom od malih hidrofilnih aminokiselina, sa sekvencom koja ima nizak stepen ili nikakvu sekundarnu ili tercijarnu strukturu u fiziološkim uslovima. Kao heterologni deo, XTEN-ovi mogu poslužiti kao deo za produženje vremena poluraspada. Pored toga, XTEN može da obezbedi poželjne karakteristike uključujući, ali nije ograničeno na, poboljšane farmakokinetičke parametre i karakteristike rastvorljivosti.
[0161] Inkorporacija heterolognog dela koji sadrži XTEN sekvencu u protein prema pronalasku može dati proteinu jednu ili više od sledećih prednosti: fleksibilnost konformacije, poboljšanu rastvorljivost u vodi, visok stepen otpornosti na proteazu, nisku imunogenost, nisko vezivanje za receptore sisara, ili povećane hidrodinamičke(ili Stoksove) radijuse.
[0162] U određenim aspektima, XTEN sekvenca može povećati farmakokinetička svojstva kao što je duže vreme poluraspada in vivo ili povećana površina ispod krive (AUC), tako da protein iz pronalaska ostaje in vivo i ima prokoagulantnu aktivnost tokom produženog perioda vremena u poređenju sa proteinom sa istim, ali bez XTEN heterolognog dela.
[0163] U nekim realizacijama, XTEN sekvenca je korisna za otkrivanje da li je peptid ili polipeptid koji ima više od oko 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1200, 1400, 1600, 1800, ili 2000 aminokiselinskih ostataka. U nekim realizacijama, XTEN je peptid ili polipeptid koji ima više od oko 20 do oko 3000 aminokiselinskih ostataka, više od 30 do oko 2500 ostataka, više od 40 do oko 2000 ostataka, više od 50 do oko 1500 ostataka, više od 600 do oko 1000 ostataka, više od 70 do oko 900 ostataka, više od 80 do oko 800 ostataka, više od 90 do oko 700 ostataka, više od 100 do oko 600 ostataka, više od 110 do oko 500 ostataka, ili više od 120 do oko 400 ostataka. U jednoj posebnoj realizaciji, XTEN sadrži aminokiselinsku sekvencu dužu od 42 aminokiseline i kraću od 144 aminokiseline.
[0164] XTEN sekvenca iz pronalaska može da sadrži jedan ili više motiva sekvence od 5 do 14 (npr.9 do 14) aminokiselinskih ostataka ili aminokiselinsku sekvencu od koja je najmanje 80%, 90%, 91%, 92%, 93 %, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična motivu sekvence, pri čemu motiv sadrži, sastoji se u suštini od, ili se sastoji od 4 do 6 tipova aminokiselina (npr.
5 aminokiselina kiseline) izabrane iz grupe koju čine glicin (G), alanin (A), serin (S), treonin (T), glutamat (E) i prolin (P). Videti dokument US 2010-0239554 A1.
[0165] U nekim realizacijama, XTEN sadrži nepreklapajuće motive sekvence u kojima se oko 80%, ili najmanje oko 85%, ili najmanje oko 90%, ili oko 91%, ili oko 92%, ili oko 93%, ili oko 94%, ili oko 95%, ili oko 96%, ili oko 97%, ili oko 98%, ili oko 99% ili oko 100% sekvence sastoji od više jedinica sekvenci koje se ne preklapaju izabranih iz jednog motiva porodica izabranih iz tabele 4, što rezultira porodičnom sekvencom. Kako se ovde koristi, "porodica" znači da XTEN ima motive odabrane samo iz jedne kategorije motiva iz tabele 4; tj., AD, AE, AF, AG, AM, AQ, BC, ili BD XTEN, i da su sve druge aminokiseline u XTEN koje nisu iz porodičnog motiva odabrane da bi se postigla potrebna osobina, kao što je omogućavanje ugradnje mesta ograničenja sa kodirajućim nukleotidima, ugradnju sekvence cepanja, ili za postizanje bolje veze sa FVIII. U nekim realizacijama XTEN porodica, XTEN sekvenca se sastoji od više jedinica nepreklapajućih motiva sekvenci iz porodice motiva AD, ili porodice motiva AE, ili porodice motiva AF, ili porodice motiva AG, ili porodice motiva AM, ili porodice motiva AK, ili porodice BC, ili porodice BD, sa rezultujućim XTEN koji pokazuje gore opisan obim homologije. U drugim realizacijama, XTEN sadrži više jedinica sekvenci motiva iz dve ili više porodica motiva iz Tabele 2A. Ove sekvence se mogu odabrati da bi se postigle željene fizičke/hemijske karakteristike, uključujući svojstva kao što su neto naelektrisanje, hidrofilnost, nedostatak sekundarne strukture ili nedostatak repetitivnosti koja se daje aminokiselinskim sastavom motiva, potpunije opisanim u nastavku.. U realizacijama koje su gore opisane u ovom paragrafu, motivi ugrađeni u XTEN mogu biti izabrani i sastavljeni korišćenjem metoda opisanih ovde da bi se dobio XTEN od oko 36 do oko 3000 aminokiselinskih ostataka.
Tabela 4. Motivi XTEN sekvence 12 aminokiselina i porodice motiva
<∗>Označava pojedinačne sekvence motiva koji, kada se koriste zajedno u različitim permutacijama, rezultiraju "porodičnom sekvencom"
[0166] Primeri XTEN sekvenci koje se mogu koristiti kao heterologni delovi u himernim proteinima iz predmetnog pronalaska su otkriveni, npr., u američkim objavama prijava patenta 2010/0239554 A1, 2010/0323956 A1, 2011/0046060 A1, 2011/0046061 A1, 2011/0077199 A1, ili 2011/0172146 A1, ili međunarodnim objavama prijava patenata WO 2010091122 A1, WO 2010144502 A2, WO 2010144508 A1, WO 2011028228 A1, WO 2011028229 A1, ili WO 2011028344 A2.
[0167] XTEN može imati različite dužine za umetanje ili povezivanje sa FVIII. U jednoj realizaciji, dužina XTEN sekvence(i) se bira na osnovu svojstva ili funkcije koja se postiže u fuzionom proteinu. U zavisnosti od predviđenog svojstva ili funkcije, XTEN može biti sekvenca kratkih ili srednjih dužina ili duža sekvenca koja može poslužiti kao nosilac. U određenim realizacijama, XTEN obuhvata kratke segmente od oko 6 do oko 99 aminokiselinskih ostataka, srednje dužine od oko 100 do oko 399 aminokiselinskih ostataka i duže dužine od oko 400 do oko 1000 i do oko 3000 aminokiselinskih ostataka. Dakle, XTEN umetnut ili povezan sa FVIII može imati dužine od oko 6, oko 12, oko 36, oko 40, oko 42, oko 72, oko 96, oko 144, oko 288, oko 400, oko 500, oko 576, oko 600, oko 700, oko 800, oko 864, oko 900, oko 1000, oko 1500, oko 2000, oko 2500, ili sve do oko 3000 aminokiselinskih
1
ostataka. U drugim realizacijama, XTEN sekvence su oko 6 do oko 50, oko 50 do oko 100, oko 100 to 150, oko 150 to 250, oko 250 to 400, oko 400 do oko 500, oko 500 do oko 900, oko 900 to 1500, oko 1500 to 2000, ili oko 2000 do oko 3000 aminokiselinskih ostataka u dužini. Precizna dužina XTEN-a koji je umetnut ili povezan sa FVIII može da varira bez negativnog uticaja na aktivnost FVIII. U jednoj realizaciji, jedan ili više XTEN koji se ovde koriste imaju 42 aminokiseline, 72 aminokiseline, 144 aminokiseline, 288 aminokiselina, 576 aminokiselina ili 864 aminokiseline u dužini i mogu biti izabrani iz jednog ili više XTEN-ova porodične sekvence; tj., AD, AE, AF, AG, AM, AQ, BC ili BD.
[0168] U nekim realizacijama, XTEN sekvenca korišćena u pronalasku je najmanje 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa sekvencom izabranom iz grupe koju čine AE42, AG42, AE48, AM48, AE72, AG72, AE108, AG108, AE144, AF144, AG144, AE180, AG180, AE216, AG216, AE252, AG252, AE288, AG288, AE324, AG324, AE360, AG360, AE396, AG396, AE432, AG432, AE468, AG468, AE504, AG504, AF504, AE540, AG540, AF540, AD576, AE576, AF576, AG576, AE612, AG612, AE624, AE648, AG648, AG684, AE720, AG720, AE756, AG756, AE792, AG792, AE828, AG828, AD836, AE864, AF864, AG864, AM875, AE912, AM923, AM1318, BC864, BD864, AE948, AE1044, AE1140, AE1236, AE1332, AE1428, AE1524, AE1620, AE1716, AE1812, AE1908, AE2004A, AG948, AG1044, AG1140, AG1236, AG1332, AG1428, AG1524, AG1620, AG1716, AG1812, AG1908, AG2004, i bilo koja njihova kombinacija. Videti dokument US 2010-0239554 A1. U jednoj posebnoj realizaciji, XTEN obuhvata AE42, AE72, AE144, AE288, AE576, AE864, AG 42, AG72, AG144, AG288, AG576, AG864, ili bilo koju njihovu kombinaciju.
[0169] Primeri XTEN sekvenci koje se mogu koristiti kao heterologni delovi u himernom proteinu prema pronalasku obuhvataju XTEN AE42-4 (SEQ ID NO: 46, kodirana sa SEQ ID NO: 47; Slike 11C i 11D, redom), XTEN 144-2A (SEQ ID NO: 48, kodirana sa SEQ ID NO: 49; Slike 11E i 11F, redom), XTEN A144-3B (SEQ ID NO: 50, kodirana sa SEQ ID NO: 51; Slike 11G i 11H, redom), XTEN AE144-4A (SEQ ID NO: 52, kodirana sa SEQ ID NO: 53; Slike 11I i 11J, redom), XTEN AE144-5A (SEQ ID NO: 54, kodirana sa SEQ ID NO: 55; Slike 11K i 11L, redom), XTEN AE144-6B (SEQ ID NO: 56, kodirana sa SEQ ID NO: 57; Slike 11M i 11N, redom), XTEN AG144-1 (SEQ ID NO: 58, kodirana sa SEQ ID NO: 59; Slike 11O i 11P, redom), XTEN AG144-A (SEQ ID NO: 60, kodirana sa SEQ ID NO: 61; Slike 11Q i 11R, redom), XTEN AG144-B (SEQ ID NO: 62, kodirana sa SEQ ID NO: 63; Slike 11S i 11T,
2
redom), XTEN AG144-C (SEQ ID NO: 64, kodirana sa SEQ ID NO: 65; Slike 11U i 11V, redom), i XTEN AG144-F (SEQ ID NO: 66, kodirana sa SEQ ID NO: 67; Slike 11W i 11X, redom). U jednoj posebnoj realizaciji, XTEN je kodirana sa SEQ ID NO:18.
[0170] U nekim realizacijama, manje od 100% aminokiselina XTEN-a se bira između glicina (G), alanina (A), serina (S), treonina (T), glutamata (E) i prolina (P), ili manje od 100% sekvence se sastoji od motiva sekvence iz Tabele 2A ili ovde date XTEN sekvence. U takvim realizacijama, preostali aminokiselinski ostaci XTEN-a se biraju između bilo koje od ostalih 14 prirodnih L-aminokiselina, ali mogu biti izabrani između hidrofilnih aminokiselina tako da XTEN sekvenca sadrži najmanje oko 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili najmanje oko 99% hidrofilnih aminokiselina. Sadržaj hidrofobnih aminokiselina u XTEN-u koji se koristi u konstruktima konjugacije može biti manji od 5%, ili manji od 2%, ili manji od 1% sadržaja hidrofobnih aminokiselina. Hidrofobni ostaci koji su manje poželjni u konstrukciji XTEN obuhvataju triptofan, fenilalanin, tirozin, leucin, izoleucin, valin i metionin. Pored toga, XTEN sekvence mogu sadržati manje od 5% ili manje od 4% ili manje od 3% ili manje od 2% ili manje od 1% ili nijednu od sledećih aminokiselina: metionin (na primer, da bi se izbegla oksidacija) ili asparagin i glutamin (da bi se izbegla dezamidacija).
[0171] Jedna ili više XTEN sekvenci mogu biti insertovane na C-terminusu ili na N-terminusu aminokiselinske sekvence kodirane nukleotidnom sekvencom ili insertovane između dve aminokiseline u aminokiselinskoj sekvenci koju kodira nukleotidna sekvenca. Na primer, XTEN se može insertovati između dve aminokiseline na jednom ili više mesta insercije izabranih iz tabele 3. Primeri mesta unutar FVIII koja su dozvoljena za inserciju XTEN mogu se naći u, npr., objavi međunarodnog patenta br. WO 2013/123457 A1 ili objavi američkog patenta br.2015/0158929 A1.
5. Albumin ili njegov fragment, derivat ili varijanta
[0172] U nekim realizacijama, heterologni deo sadrži albumin ili njegov funkcionalni fragment. Humani serumski albumin (HSA, ili HA), protein od 609 aminokiselina u svom punom obliku, odgovoran je za značajan deo osmotskog pritiska seruma i takođe funkcioniše kao nosilac endogenih i egzogenih liganda. Termin "albumin" kako se ovde koristi obuhvata albumin pune dužine ili funkcionalni fragment, njegovu varijantu, derivat ili analog. Primeri albumina ili njegovih fragmenata ili varijanti su otkriveni u objavi američkog patenta br. 2008/0194481A1, 2008/0004206 A1, 2008/0161243 A1, 2008/0261877 A1, ili 2008/0153751 A1 ili objavi PCT prijave patenta br.2008/033413 A2, 2009/058322 A1, ili 2007/021494 A2.
[0173] U jednoj realizaciji, protein FVIII kodiran molekulom nukleinske kiseline prema pronalasku sadrži albumin, njegov fragment ili njegovu varijantu koji je dalje vezan za drugi heterologni deo izabran iz grupe koja se sastoji od konstantnog regiona ili njegovog dela imunoglobulina (npr., Fc region), PAS sekvenca, HES, i PEG.
6. Deo koja vezuje albumin
[0174] U određenim realizacijama, heterologni deo je deo koji se vezuje za albumin, koji sadrži peptid koji se vezuje za albumin, domen koji vezuje bakterijski albumin, fragment antitela koji se vezuje za albumin, ili bilo koju njihovu kombinaciju.
[0175] Na primer, protein koji vezuje albumin može biti bakterijski protein koji vezuje albumin, antitelo ili fragment antitela uključujući antitela domena (videti američki patent br.
6,696,245 ). Protein koji vezuje albumin, na primer, može biti bakterijski domen koji vezuje albumin, kao što je onaj streptokoknog proteina G (Konig, T. i Skerra, A. (1998) J. Immunol. Methods 218, 73-83). Drugi primeri peptida koji se vezuju za albumin koji se mogu koristiti kao partner za konjugaciju su, na primer, oni koji imaju konsenzus sekvencu Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys, pri čemu Xaa1je Asp, Asn, Ser, Thr, ili Trp; Xaa2je Asn, Gln, H je, Ile, Leu, ili Lys; Xaa3je Ala, Asp, Phe, Trp, ili Tyr; i Xaa4je Asp, Gly, Leu, Phe, Ser, ili Thr kao što je opisano u američkoj patentnoj prijavi 2003/0069395 ili Dennis i dr. (Dennis i dr. (2002) J. Biol. Chem.277, 35035-35043).
[0176] Domen 3 iz streptokoknog proteina G, kako su otkrili Kraulis i dr., FEBS Lett.378:190-194 (1996) i Linhult i dr., Protein Sci.11:206-213 (2002) je primer bakterijskog domena koji vezuje albumin. Primeri peptida koji vezuju albumin obuhvataju seriju peptida koji imaju jezgro sekvence DICLPRWGCLW (SEQ ID NO: 35). Videti, npr., Dennis i dr., J. Biol. Chem.
2002, 277: 35035-35043 (2002). Primeri fragmenata antitela koji vezuju albumin su otkriveni u Muller i Kontermann, Curr. Opin. Mol. Ther. 9:319-326 (2007); Roovers i dr., Cancer Immunol. Immunother. 56:303-317 (2007), i Holt i dr., Prot. Eng. Design Sci., 21:283-288 (2008). Primer takvog dela koji vezuje albumin je 2-(3-maleimidopropanamido)-6-(4-(4-jodofenil)butanamido) heksanoat ("Albu" oznaka) kako su otkrili Trussel i dr., Bioconjugate Chem. 20:2286-2292 (2009).
4
[0177] Masne kiseline, posebno masne kiseline dugog lanca (LCFA) i jedinjenja koja vezuju albumin slična masnim kiselinama dugog lanca, mogu se koristiti za produženje in vivo vremena poluraspada za proteine FVIII iz pronalaska. Primer jedinjenja koje vezuje albumin slično LCFA je 16-(1-(3-(9-(((2,5-dioksopirrolidin-1-iloksi)karboniloksi)-metil)-7-sulfo-9H-fluoren-2-ilamino)-3-oksopropil)-2,5-dioksopirolidin-3-iltio) heksadekanska kiselina (videti, npr., WO 2010/140148).
7. PAS sekvenca
[0178] U drugim realizacijama, heterologni deo je PAS sekvenca. PAS sekvenca, kako se ovde koristi, označava aminokiselinsku sekvencu koja se sastoji uglavnom od ostataka alanina i serina ili sadrži uglavnom ostatke alanina, serina i prolina, pri čemu aminokiselinska sekvenca formira nasumičnu konformaciju namotaja u fiziološkim uslovima. Shodno tome, PAS sekvenca je građevni blok, polimer aminokiseline ili kasetna sekvenca koja se sastoji, suštinski se sastoji od, ili se sastoji od alanina, serina i prolina koji se mogu koristiti kao deo heterolognog dela u himernom proteinu. Ipak, stručnjak je svestan da polimer aminokiseline takođe može da formira nasumične konformacije namotaja kada se dodaju ostaci koji nisu alanin, serin i prolin kao manji sastojak u PAS sekvenci. Termin "manji sastojak" kako se ovde koristi znači da se aminokiseline osim alanina, serina i prolina mogu dodati u PAS sekvencu do određenog stepena, npr. do oko 12%, tj., oko 12 od 100 aminokiselina PAS sekvence, do oko 10%, tj. oko 10 od 100 aminokiselina PAS sekvence, do oko 9%, tj. oko 9 od 100 aminokiselina, do oko 8%, odnosno oko 8 od 100 aminokiselina kiseline, oko 6%, tj., oko 6 od 100 aminokiselina, oko 5%, odnosno, oko 5 od 100 aminokiselina, oko 4%, odnosno, oko 4 od 100 aminokiselina, oko 3%, odnosno oko 3 od 100 aminokiselina, oko 2%, tj. oko 2 od 100 aminokiselina, oko 1%, tj. oko 1 od 100 aminokiselina. Aminokiseline različite od alanina, serina i prolina mogu se izabrati iz grupe koju čine Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Thr, Trp, Tyr, i Val.
[0179] U fiziološkim uslovima, rastezanje PAS sekvence formira nasumičnu konformaciju zavojnice i na taj način može posredovati povećanu in vivo i/ili in vitro stabilnost proteina FVIII. Pošto domen nasumične spirale ne usvaja stabilnu strukturu ili funkciju sam po sebi, biološka aktivnost posredovana proteinom FVIII je u suštini očuvana. U drugim realizacijama, PAS sekvence koje formiraju nasumični domen zavojnice su biološki inertne, posebno u pogledu proteolize u krvnoj plazmi, imunogenosti, izoelektrične tačke/elektrostatičkog ponašanja, vezivanja za receptore na površini ćelije ili internalizacije, ali su i dalje biorazgradive, što obezbeđuje jasne prednosti u odnosu na sintetičke polimere kao što je PEG.
[0180] Neograničavajući primeri PAS sekvenci koje formiraju nasumične konformacije zavojnice obuhvataju aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine ASPAAPAPASPAAPAPSAPA (SEQ ID NO: 36), AAPASPAPAAPSAPAPAAPS (SEQ ID NO: 37), APSSPSPSAPSSPSPASPSS (SEQ ID NO: 38), APSSPSPSAPSSPSPASPS (SEQ ID NO: 39), SSPSAPSPSSPASPSPSSPA (SEQ ID NO: 40), AASPAAPSAPPAAASPAAPSAPPA (SEQ ID NO: 41) i ASAAAPAAASAAASAPSAAA (SEQ ID NO: 42) ili bilo koje njihove kombinacije. Dodatni primeri PAS sekvenci poznati su iz, npr., objave američkog patenta br. 2010/0292130 A1 i objave PCT prijave br. WO 2008/155134 A1.
8. HAP sekvenca
[0181] U nekim realizacijama, heterologni deo je polimer homo-aminokiseline bogat glicinom (HAP). HAP sekvenca može da sadrži repetitivnu sekvencu glicina, koja ima dužinu od najmanje 50 aminokiselina, najmanje 100 aminokiselina, 120 aminokiselina, 140 aminokiselina, 160 aminokiselina, 180 aminokiselina, 200 aminokiselina, 250 aminokiselina, 300 aminokiselina, 350 aminokiselina, 400 aminokiselina, 450 aminokiselina, ili 500 aminokiselina. U jednoj realizaciji, HAP sekvenca je sposobna da produži vreme poluraspada ostatka spojenog ili vezanog za HAP sekvencu. Neograničavajući primeri HAP sekvence obuhvataju, ali nisu ograničeni na (Gly)n, (Gly4Ser)nili S(Gly4Ser)n, pri čemu n je 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ili 20. U jednoj realizaciji, n je 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 26, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, ili 40. U drugoj realizaciji, n je 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, ili 200.
9. Transferin ili njegov fragment
[0182] U određenim realizacijama, heterologni deo je transferin ili njegov fragment. Bilo koji transferin se može koristiti za pravljenje proteina FVIII prema pronalasku. Kao primer, ljudski TF divljeg tipa (TF) je protein od 679 aminokiselina, od približno 75 KDa (ne uzimajući u obzir glikozilaciju), sa dva glavna domena, N (oko 330 aminokiselina) i C (oko 340 aminokiselina), za koje se čini da potiču od duplikacije gena. Pogledajte pristupne brojeve GenBank NM001063, XM002793, M12530, XM039845, XM 039847 i S95936 (www.ncbi.nlm.nih.gov/). Transferin se sastoji od dva domena, N domena i C domena. N domen obuhvata dva poddomena, N1 domen i N2 domen, a C domen obuhvata dva poddomena, C1 domen i C2 domen.
[0183] U jednoj realizaciji, heterologni deo transferina obuhvata varijantu spajanja transferina. U jednom primeru, varijanta spajanja transferina može biti varijanta spajanja humanog transferina, npr., Genbank pristupni broj AAA61140. U drugoj realizaciji, transferinski deo himernog proteina obuhvata jedan ili više domena transferinske sekvence, npr. N domen, C domen, N1 domen, N2 domen, C1 domen, C2 domen ili bilo koju njihovu kombinaciju.
10. Receptori za klirens
[0184] U nekim realizacijama, heterologni deo je receptor za klirens, njegov fragment, varijanta ili derivat. LRP1 je integralni membranski protein od 600 kDa koji je uključen u klirens koji posreduje receptorima različitih proteina, kao što je faktor X. Videti, npr., Narita i dr., Blood 91:555-560 (1998).
11. von Willebrandov faktor ili njegovi fragmenti
[0185] U nekim realizacijama, heterologni deo je von Willebrandovog faktora (VWF) ili jedan ili više njegovih fragmenata.
[0186] VWF (takođe poznat kao F8VWF) je veliki multimerni glikoprotein prisutan u krvnoj plazmi i proizveden konstitutivno u endotelijumu (u Veibel-Paladeovim telima), megakariocitima (a-granule trombocita) i subendotelnom vezivnom tkivu. Osnovni VWF monomer je protein od 2813 aminokiselina. Svaki monomer sadrži određeni broj specifičnih domena sa specifičnom funkcijom, D' i D3 domene (koji se zajedno vezuju za Faktor VIII), A1 domen (koji se vezuje za GPIb-receptor trombocita, heparin, i/ili eventualno kolagen), A3 domen (koji se vezuje za kolagen), C1 domen (u kome se RGD domen vezuje za integrin trombocita αIIbβ3 kada je ovaj aktiviran), i domen „cisteinskog čvora“ na C-terminalnom kraju proteina (koji VWF deli sa trombocitnim faktorom rasta (PDGF), transformišućim faktorom rasta-β (TGFβ) i β-humanim horionskim gonadotropinom (βHCG)).
[0187] 2813 monomerna aminokiselinska sekvenca za humani VWF prijavljena je kao pristupni broj NP000543.2 u Genbank-u. Nukleotidna sekvenca koja kodira ljudski VWF je prijavljena kao pristupni broj NM000552.3 u Genbank-u. SEQ ID NO: 44 (Slika 11B) je aminokiselinska sekvenca kodirana sa SEQ ID NO: 43. D' domen obuhvata aminokiseline 764 do 866 iz SEQ ID NO: 44. D3 domen obuhvata aminokiseline od 867 do 1240 iz SEQ ID NO: 44.
[0188] U plazmi, 95-98% FVIII cirkuliše u čvrstom nekovalentnom kompleksu sa VWF pune dužine. Formiranje ovog kompleksa je važno za održavanje odgovarajućih nivoa FVIIII u plazmi in vivo. Lenting i dr., Blood. 92(11): 3983-96 (1998); Lenting i dr., J. Thromb. Haemost. 5(7): 1353-60 (2007). Kada se FVIII aktivira usled proteolize na pozicijama 372 i 740 u teškom lancu i na poziciji 1689 u lakom lancu, VWF vezan za FVIII se uklanja iz aktiviranog FVIII.
[0189] U nekim realizacijama, heterologni deo je von Willebrandov faktora pune dužine. U drugim realizacijama, heterologni deo je fragment von Willebrandovog faktora. Kako se ovde koristi, termin "VWF fragment" ili "VWF fragmenti" ovde korišćeni označava sve VWF fragmente koji stupaju u interakciju sa FVIII i zadržavaju najmanje jedno ili više svojstava koja se normalno obezbeđuju FVIII preko VWF-a pune dužine, npr., sprečavanje prerane aktivacije na FVIIIa, sprečavanje preuranjene proteolize, sprečavanje povezivanja sa fosfolipidnim membranama koje bi mogle da dovedu do preranog klirensa, sprečavanje vezivanja za receptore klirensa FVIII koji mogu da vežu goli FVIII, ali ne i FVIII vezan za VWF, i/ili stabilizaciju interakcije teškog lanca i lakog lanca FVIII. U specifičnoj realizaciji, heterologni deo je (VWF) fragment koji sadrži D' domen i D3 domen VWF. VWF fragment koji sadrži D' domen i D3 domen može dalje da sadrži VWF domen izabran iz grupe koju čine A1 domen, A2 domen, A3 domen, D1 domen, D2 domen, D4 domen, B1 domen, B2 domen, B3 domen, C1 domen, C2 domen, CK domen, jedan ili više njihovih fragmenata i bilo koje njihove kombinacije. Dodatni primeri polipeptida koji imaju aktivnost FVIII fuzionisan sa VWF fragmentom su otkriveni u američkoj privremenoj prijavi patenta br.61/667,901, podnetoj 3. jula 2012 , i američkoj objavi prijave patenta br.2015/0023959 A1.
12. Linker delovi
[0190] U nekim realizacijama, heterologni deo je peptidni linker.
[0191] Kako se ovde koristi, termini "peptidni linkeri" ili "linker delovi" se odnose na peptidnu ili polipeptidnu sekvencu (npr. sintetičku peptidnu ili polipeptidnu sekvencu) koja povezuje dva domena u linearnoj aminokiselinskoj sekvenci polipeptidnog lanca.
[0192] U nekim realizacijama, heterologne nukleotidne sekvence koje kodiraju peptidne linkere mogu biti insertovane između optimizovanih FVIII polinukleotidnih sekvenci iz pronalaska i heterologne nukleotidne sekvence koja kodira, na primer, jedan od heterolognih delova opisanih gore, kao što je albumin. Peptidni linkeri mogu obezbediti fleksibilnost himernom polipeptidnom molekulu. Linkeri se tipično ne cepaju, međutim takvo cepanje može biti poželjno. U jednoj realizaciji, ovi linkeri se ne uklanjaju tokom obrade.
[0193] Tip linkera koji može biti prisutan u himernom proteinu prema pronalasku je linker koji se može cepati proteazom i koji sadrži mesto cepanja (tj. supstrat mesta cepanja proteaze, npr. faktor XIa, Xa ili mesto cepanja trombina) i koji mogu uključiti dodatne linkere bilo na N-terminusu C-terminusa ili na obe strane mesta cepanja. Ovi linkeri koji se cepaju kada se inkorporiraju u konstrukt pronalaska rezultiraju himernim molekulom koji ima heterologno mesto cepanja.
[0194] U jednoj realizaciji, FVIII polipeptid kodiran molekulom nukleinske kiseline prema ovom pronalasku sadrži dva ili više Fc domena ili delova povezanih preko cscFc linkera da bi se formirao Fc region sadržan u jednom polipeptidnom lancu. cscFc linker je okružen najmanje jednim intracelularnim procesnim mestom, tj. mestom koje je cepao intracelularni enzim. Cepanje polipeptida na najmanje jednom mestu intracelularne obrade rezultira polipeptidom koji sadrži najmanje dva polipeptidna lanca.
[0195] Drugi peptidni linkeri mogu opciono da se koriste u konstruktu iz predmetnog pronalaska, npr., za povezivanje proteina FVIII sa Fc regionom. Neki primeri linkera koji se mogu koristiti u vezi sa otkrivanjem obuhvataju, npr., polipeptide koji sadrže GlySer aminokiseline opisane detaljnije u nastavku.
[0196] U jednoj realizaciji, peptidni linker je sintetički, tj. ne postoji u prirodi. U jednoj realizaciji, peptidni linker obuhvata peptide (ili polipeptide) (koji se mogu ili ne mogu pojaviti u prirodi) koji sadrže sekvencu aminokiselina koja povezuje ili genetski spaja prvu linearnu sekvencu aminokiselina sa drugom linearnom sekvencom aminokiselina sa kojom nije prirodno povezan ili genetski spojen u prirodi. Na primer, u jednoj realizaciji peptidni linker može da sadrži polipeptide koji se ne pojavljuju u prirodi koji su modifikovani oblici polipeptida koji se javljaju u prirodi (npr., koji sadrže mutaciju kao što je dodavanje, supstitucija ili delecija) . U drugoj realizaciji, peptidni linker može da sadrži aminokiseline koje se ne pojavljuju u prirodi. U drugoj realizaciji, peptidni linker može da sadrži prirodne aminokiseline koje se javljaju u linearnoj sekvenci koja se ne javlja u prirodi. U još jednoj realizaciji, peptidni linker može da sadrži prirodnu polipeptidnu sekvencu..
[0197] Na primer, u određenim realizacijama, peptidni linker se može koristiti za spajanje identičnih Fc delova, čime se formira homodimerni scFc region. U drugim realizacijama, peptidni linker se može koristiti za spajanje različitih Fc delova (npr. Fc deo divljeg tipa i varijanta Fc dela), čime se formira heterodimerni scFc region.
[0198] U drugoj realizaciji, peptidni linker sadrži ili se sastoji od gly-ser linkera. U jednoj realizaciji, scFc ili cscFc linker sadrži najmanje deo imunoglobulinskog zgloba i gly-ser linker. Kako se ovde koristi, termin "gly-ser linker" se odnosi na peptid koji se sastoji od ostataka glicina i serina. U određenim realizacijama, pomenuti gly-ser linker može biti insertovan između dve druge sekvence peptidnog linkera. U drugim realizacijama, gly-ser linker je vezan za jedan ili oba kraja druge sekvence peptidnog linkera. U još drugim realizacijama, dva ili više gly-ser linkera su ugrađeni u seriju u peptidni linker. U jednoj realizaciji, peptidni linker prema pronalasku sadrži najmanje deo gornjeg zglobnog regiona (npr., izveden iz IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4 molekula), najmanje deo srednjeg zglobnog regiona (npr., dobijen iz molekula IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4) i serije gly/ser aminokiselinskih ostataka.
[0199] Peptidni linkeri iz pronalaska su dužine najmanje jedne aminokiseline i mogu biti različitih dužina. U jednoj realizaciji, peptidni linker prema pronalasku je dugačak od oko 1 do oko 50 aminokiselina. Kako se koristi u ovom kontekstu, termin "oko" označava /- dva aminokiselinska ostatka. Pošto dužina linkera mora biti pozitivan ceo broj, dužina od oko 1 do oko 50 aminokiselina u dužini, znači dužinu od 1-3 do 48-52 aminokiseline u dužini. U drugoj realizaciji, peptidni linker prema pronalasku ima dužinu od oko 10 do oko 20 aminokiselina. U drugoj realizaciji, peptidni linker prema pronalasku ima dužinu od oko 15 do oko 50 aminokiselina. U sledećoj realizaciji, peptidni linker prema pronalasku ima dužinu od oko 20 do oko 45 aminokiselina. U drugoj realizaciji, peptidni linker prema pronalasku je od oko 15 do oko 35 ili oko 20 do oko 30 aminokiselina u dužini. U drugoj realizaciji, peptidni linker iz pronalaska ima dužinu od oko 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 , 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 500, 1000 ili 2000 aminokiselina. U jednoj realizaciji, peptidni linker pronalaska je dugačak 20 ili 30 aminokiselina.
[0200] U nekim realizacijama, peptidni linker može da sadrži najmanje dve, najmanje tri, najmanje četiri, najmanje pet, najmanje 10, najmanje 20, najmanje 30, najmanje 40, najmanje 50, najmanje 60, najmanje 70, najmanje 80, najmanje 90 ili najmanje 100 aminokiselina. U drugim realizacijama, peptidni linker može da sadrži najmanje 200, najmanje 300, najmanje 400, najmanje 500, najmanje 600, najmanje 700, najmanje 800, najmanje 900 ili najmanje 1000 aminokiselina. U nekim realizacijama, peptidni linker može da sadrži najmanje oko 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, ili 2000 aminokiselina. Peptidni linker može da sadrži 1-5 aminokiselina, 1-10 aminokiselina, 1-20 aminokiselina, 10-50 aminokiselina, 50-100 aminokiselina, 100-200 aminokiselina, 200-300 aminokiselina, 300-400 aminokiseline, 400-500 aminokiselina, 500-600 aminokiselina, 600-700 aminokiselina, 700-800 aminokiselina, 800-900 aminokiselina ili 900-1000 aminokiselina.
[0201] Peptidni linkeri se mogu uvesti u polipeptidne sekvence korišćenjem tehnika poznatih u tehnici. Modifikacije se mogu potvrditi analizom sekvence DNK. Plazmidna DNK se može koristiti za transformaciju ćelija domaćina za stabilnu proizvodnju proizvedenih polipeptida.
Hibridi monomer-dimer
[0202] U nekim realizacijama, izolovani molekuli nukleinske kiseline prema pronalasku koji dalje sadrže heterolognu nukleotidnu sekvencu kodiraju hibridni molekul monomer-dimer koji sadrži FVIII.
[0203] Termin "hibrid monomer-dimer" koji se ovde koristi odnosi se na himerni protein koji sadrži prvi polipeptidni lanac i drugi polipeptidni lanac, koji su međusobno povezani disulfidnom vezom, pri čemu prvi lanac sadrži faktor VIII i prvi Fc region i drugi lanac obuhvataju, u suštini se sastoje od, ili se sastoje od drugog Fc regiona bez FVIII. Hibridni konstrukt monomer-dimer je stoga hibrid koji sadrži monomerni aspekt koji ima samo jedan faktor zgrušavanja i dimerni aspekt koji ima dva Fc regiona.
Element kontrole ekspresije
[0204] U nekim realizacijama, molekul ili vektor nukleinske kiseline prema pronalasku dalje sadrži najmanje jednu kontrolnu sekvencu ekspresije. Sekvence za kontrolu ekspresije kako se ovde koriste su bilo koja regulatorna nukleotidna sekvenca, kao što je promoterska sekvenca
1
ili kombinacija promoter-pojačivač, koja olakšava efikasnu transkripciju i translaciju kodirajuće nukleinske kiseline za koju je operativno povezana. Na primer, izolovani molekul nukleinske kiseline prema pronalasku može biti operativno vezan za najmanje jednu kontrolnu sekvencu transkripcije. Kontrolna sekvenca ekspresije gena može, na primer, da bude promoter sisara ili virusni promoter, kao što je konstitutivni ili inducibilni promoter. Konstitutivni promoteri sisara obuhvataju, ali nisu ograničeni na, promotere za sledeće gene: hipoksantin fosforibozil transferazu (HPRT), adenozin deaminazu, piruvat kinazu, beta-aktin promoter i druge konstitutivne promotere. Primeri virusnih promotera koji konstitutivno funkcionišu u eukariotskim ćelijama obuhvataju, na primer, promotere iz citomegalovirusa (CMV), majmunskog virusa (npr., SV40), papiloma virusa, adenovirusa, virusa humane imunodeficijencije (HIV), virusa Rousovog sarkoma, citomegalovirusa, duga terminalna ponavljanja (LTR) virusa Molonei leukemije i druge retroviruse, i promoter timidin kinaze virusa herpes simpleksa. Drugi konstitutivni promoteri su poznati prosečnom stručnjaku u ovoj oblasti. Promoteri korisni kao sekvence genske ekspresije prema pronalasku takođe obuhvataju inducibilne promotere. Inducibilni promoteri se eksprimiraju u prisustvu indukcionog agensa. Na primer, promoter metalotioneina je indukovan da promoviše transkripciju i translaciju u prisustvu određenih metalnih jona. Drugi inducibilni promoteri su poznati prosečnom stručnjaku u ovoj oblasti.
[0205] U jednoj realizaciji, pronalazak obuhvata ekspresiju transgena pod kontrolom tkivno specifičnog promotera i/ili pojačivača. U drugoj realizaciji, promoter ili druga kontrolna sekvenca ekspresije selektivno pojačava ekspresiju transgena u ćelijama jetre. Primeri promotera specifičnih za jetru obuhvataju, ali nisu ograničeni na, mišji promoter tiretina (mTTR), promoter endogenog humanog faktora VIII (F8), humani alfa-1-antitripsin promoter (hAAT), promoter minimalnog humanog albumina i mišji promoter albumina. U posebnom izvođenju, promoter sadrži mTTR promoter. Promoter mTTR je opisan u R. H. Costa i dr., 1986, Mol. Cell. Biol.6:4697. F8 promoter je opisan u Figueiredo i Brownlee, 1995, J. Biol. Chem. 270: 11828-11838.
[0206] Nivoi ekspresije mogu se dalje povećati da bi se postigla terapeutska efikasnost korišćenjem jednog ili više pojačivača. Jedan ili više pojačivača se mogu obezbediti ili sami ili zajedno sa jednim ili više promoterskih elemenata. Tipično, sekvenca za kontrolu ekspresije se sastoji od mnoštva elemenata pojačivača i promotera specifičnog za tkivo. U jednoj realizaciji, pojačivač sadrži jednu ili više kopija pojačivača α-1-mikroglobulina/bikunina (Rouet i dr.,
2
1992, J. Biol. Chem. 267:20765-20773; Rouet i dr., 1995, Nucleic Acids Res. 23:395-404; Rouet i dr., 1998, Biochem. J. 334:577-584; Ill i dr., 1997, Blood Coagulation Fibrinolysis 8:S23-S30). U drugoj realizaciji, pojačivač je dobijen iz mesta vezanja faktora transkripcije specifičnih za jetru, kao što su EBP, DBP, HNF1, HNF3, HNF4, HNF6, sa Enh1, koji sadrži HNF1, (sense)-HNF3, (sense)-HNF4, (antisens)-HNF1, (antisens)-HNF6, (sense)-EBP, (antisens)-HNF4 (antisens).
[0207] U posebnom primeru, promoter koristan za ovo otkriće sadrži SEQ ID NO: 69 (tj., ET promotor; Slika 11Y), koji je takođe poznat kao GenBank br. AY661265. Videti takođe Vigna i dr., Molecular Therapy 11(5):763 (2005). Primeri drugih pogodnih vektora i regulatornih elemenata gena su opisani u WO 02/092134, EP1395293, ili američkim patentima br.
6,808,905, 7,745,179, ili 7,179,903.
[0208] Generalno, sekvence za kontrolu ekspresije će obuhvatati, po potrebi, 5' netranskribujuće i 5' netranslacione sekvence uključene u inicijaciju transkripcije i translacije, respektivno, kao što je TATA kutija, sekvenca za zatvaranje, CAAT sekvenca , i slično. Naročito, takve 5' netranskribujuće sekvence će obuhvatati promoterski region koji obuhvata promotersku sekvencu za kontrolu transkripcije operativno spojene kodirajuće nukleinske kiseline. Sekvence ekspresije gena opciono obuhvataju sekvence pojačivača ili uzvodne aktivatorske sekvence po želji.
Vektorski sistemi
[0209] Ovaj pronalazak opisuje vektor koji sadrži molekul nukleinske kiseline kao što je definisano u priloženim zahtevima, ćeliju domaćina koja sadrži vektor kao što je definisano u priloženim zahtevima, i vektor kao što je definisano u priloženim zahtevima za upotrebu u postupku lečenja poremećaja krvarenja. Ova pronalazak zadovoljava važnu potrebu u tehnici obezbeđivanjem vektora koji sadrži optimizovanu sekvencu FVIII koja pokazuje povećanu ekspresiju kod subjekta i potencijalno rezultira većom terapijskom efikasnošću kada se koristi u metodama genske terapije.
[0210] U nekim realizacijama, ovaj pronalazak obezbeđuje vektor koji sadrži izolovani molekul nukleinske kiseline koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid sa aktivnošću FVIII, pri čemu nukleotidna sekvenca sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja ima najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili najmanje 99% identičnosti sekvence sa nukleotidima 58-2277 i 2320-4374 iz SEQ ID NO: 71 i operativno je vezana za promoter, ciljnu sekvencu ili oboje. U drugim realizacijama, sekvenca nukleinske kiseline sadrži (i) nukleotide 58-4374 iz SEQ ID NO: 71 ili (ii) nukleotide 58-2277 i 2320-4374 iz SEQ ID NO: 71.
[0211] Pogodni vektori za ovaj pronalazak obuhvataju ekspresione vektore, virusne vektore i plazmidne vektore. U jednoj realizaciji, vektor je virusni vektor.
[0212] Kako se ovde koristi, ekspresioni vektor se odnosi na bilo koji konstrukt nukleinske kiseline koji sadrži neophodne elemente za transkripciju i translaciju umetnute kodirajuće sekvence, ili u slučaju RNK virusnog vektora, neophodne elemente za replikaciju i translaciju, kada se unese u odgovarajuću ćeliju domaćina. Ekspresioni vektori mogu obuhvatati plazmide, fagemide, viruse i njihove derivate.
[0213] Ekspresioni vektori iz pronalaska će obuhvatati optimizovane polinukleotide koji kodiraju ovde opisan BDD FVIII protein. U jednoj realizaciji, optimizovane sekvence kodiranja za BDD FVIII protein su operativno povezane sa sekvencom za kontrolu ekspresije. Kako se ovde koristi, dve sekvence nukleinske kiseline su operativno povezane kada su kovalentno povezane na takav način da dozvoljava svakoj komponenti sekvence nukleinske kiseline da zadrži svoju funkcionalnost. Za kodirajuću sekvencu i sekvencu za kontrolu ekspresije gena se kaže da su operativno povezane kada su kovalentno povezane na takav način da stavljaju ekspresiju ili transkripciju i/ili translaciju kodirajuće sekvence pod uticaj ili kontrolu sekvence za kontrolu ekspresije gena. Za dve DNK sekvence se kaže da su operativno povezane ako indukcija promotera u sekvenci ekspresije 5' gena rezultira transkripcijom kodirajuće sekvence i ako priroda veze između dve DNK sekvence ne rezultira (1) uvođenjem mutacije pomeranja okvira, (2) ometanjem sposobnosti regiona promotera da usmeri transkripciju kodirajuće sekvence, ili (3) ometanjem sposobnosti odgovarajućeg RNK transkripta da se translatira u protein. Prema tome, sekvenca genske ekspresije bi bila operativno povezana sa sekvencom kodirajuće nukleinske kiseline ako bi sekvenca ekspresije gena bila sposobna da izvrši transkripciju te sekvence kodirajuće nukleinske kiseline tako da se rezultujući transkript translatira u željeni protein ili polipeptid.
[0214] Virusni vektori obuhvataju, ali nisu ograničeni na, sekvence nukleinske kiseline iz sledećih virusa: retrovirus, kao što je Molonei virus mišje leukemije, Harvey virus mišjeg
4
sarkoma, virus tumora mišjih mlečnih žlezda i virus Rousovog sarkoma; lentivirus; adenovirus; adeno-povezan virus; virusi tipa SV40; poliomavirusi; Epstein-Barr virusi; papiloma virusi; virus herpesa; virus vakcinije; polio virus; i RNK virus kao što je retrovirus. Mogu se lako koristiti drugi vektori dobro poznati u tehnici. Određeni virusni vektori su zasnovani na necitopatskim eukariotskim virusima u kojima su ne esencijalni geni zamenjeni genom od interesa. Necitopatski virusi obuhvataju retroviruse, čiji životni ciklus obuhvata reverznu transkripciju genomske virusne RNK u DNK sa naknadnom provirusnom integracijom u ćelijsku DNK domaćina. Retrovirusi su odobreni za ispitivanja humane genske terapije. Najkorisniji su oni retrovirusi koji nemaju replikaciju (tj., sposobni su da usmeravaju sintezu željenih proteina, ali nisu u stanju da proizvedu infektivnu česticu). Takvi genetski izmenjeni retrovirusni ekspresioni vektori imaju opštu korist za visoko efikasnu transdukciju gena in vivo. Standardni protokoli za proizvodnju retrovirusa sa nedostatkom replikacije (uključujući korake inkorporacije egzogenog genetskog materijala u plazmid, transfekciju ćelijske linije za pakovanje plazmidom, proizvodnju rekombinantnih retrovirusa putem ćelijske linije za pakovanje, sakupljanje virusnih čestica iz medija kulture tkiva, i infekciju ciljnih ćelija virusnim česticama) dati su u Kriegler, M., Gene Transfer i Expression, A Laboratory Manual, W.H. Freeman Co., New York (1990) i Murry, E. J., Methods in Molecular Biology, Vol. 7, Humana Press, Inc., Cliffton, N.J. (1991).
[0215] U jednoj realizaciji, virus je adeno-povezan virus, dvolančani DNK virus. Adenopovezan virus može biti konstruisan tako da ima nedostatak replikacije i da može da inficira širok spektar tipova i vrsta ćelija. Dalje ima prednosti kao što su stabilnost toplote i lipidnog rastvarača; visoke frekvencije transdukcije u ćelijama različitih linija, uključujući hematopoetske ćelije; i nedostatak inhibicije superinfekcije, što omogućava višestruke serije transdukcija. Navodno, adeno-povezani virus može da se integriše u ljudsku ćelijsku DNK na način specifičan za mesto, čime se minimizuje mogućnost insercione mutageneze i varijabilnost ekspresije umetnutog gena karakteristične za retrovirusnu infekciju. Pored toga, adeno-povezane virusne infekcije divljeg tipa su praćene u kulturi tkiva za više od 100 prolaza u odsustvu selektivnog pritiska, što implicira da je genomska integracija adeno-povezanog virusa relativno stabilan događaj. Adeno-povezani virus takođe može funkcionisati na ekstrahromozomski način.
[0216] U drugoj realizaciji, virusni vektor je adeno-povezan virus (AAV) kojim je manipulisano da nosi polinukleotid koji kodira FVIII protein kao što je ovde otkriveno.
Otkrivene su Opšte metode za dobijanje rekombinantnih AAV (rAAV). Videti, na primer, USP 8,734,809 , 2013/0195801 kao i reference koje su tamo citirane. U nekim realizacijama, rAAV vektor sadrži jedan ili više AAV invertovanih terminalnih ponavljanja (ITR) i transgen od interesa (npr. optimizovanu FVIII polinukleotidnu sekvencu). U određenim realizacijama, metode dobijanja rAAV obuhvataju kultivisanje željene ćelije domaćina koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira AAV kapsidni protein ili njegov fragment; funkcionalni rep gen; rAAV vektor sastavljen od AAV invertovanih terminalnih ponavljanja (ITR) i transgena od interesa; i dovoljne pomoćne funkcije koje dozvoljavaju pakovanje rekombinantnog AAV vektora u AAV kapsidne proteine. Materijali i metode za izvođenje ovih i srodnih procedura otkriveni su, na primer, u američkim patentima 8,734,809, 2013/0195801, PCT/US1997/015692, PCT/US2002/033692, PCT/US2002/033630, WO2007/148971, WO0 0/20561, WO03/042361, i WO2007/04670.
[0217] Jedna ili više različitih AAV vektorskih sekvenci dobijenih iz skoro bilo kog serotipa mogu se koristiti u skladu sa ovim otkrićem. Izbor određene AAV vektorske sekvence biti će vođen poznatim parametrima kao što su tropizam od interesa, potrebni prinosi vektora, itd. Generalno, AAV serotipovi imaju genomske sekvence značajne homologije na nivoima aminokiselina i nukleinskih kiselina, obezbeđuju srodan skup genetskih funkcija, proizvode virione koji su povezani, i repliciraju se i okupljaju na sličan način. Za genomsku sekvencu različitih AAV serotipova i pregled genomskih sličnosti videti, npr., GenBank pristupni broj U89790; GenBank pristupni broj J01901; GenBank pristupni broj AF043303; GenBank pristupni broj AF085716; Chlorini i dr. (1997, J. Vir.71: 6823-33); Srivastava i dr. (1983, J. Vir. 45:555-64); Chlorini i dr. (1999, J. Vir. 73:1309-1319); Rutledge i dr. (1998, J. Vir.
72:309-319); i Wu i dr. (2000, J. Vir.74: 8635-47). AAV serotipovi 1, 2, 3, 4 i 5 su ilustrativni izvor AAV nukleotidnih sekvenci za upotrebu u kontekstu predmetnog pronalaska. AAV6, AAV7, AAV8 ili AAV9 ili novo razvijene čestice slične AAV-u dobijene npr. tehnikama mešanja kapsida i bibliotekama AAV kapsida, ili iz novo dizajniranih, razvijenih ili razvijenih ITR-a takođe su pogodne za određene primene otkrića. Videti Dalkara, D i dr. (2013), Sci. Transl. Med.5(189): 189ra76; Kotterman, MA Nat. Rev. Genet. (2014) 15(7):455.
[0218] Međutim, u određenim realizacijama, AAV vektori sa značajnim tropizmom prema jetri i srodnim tkivima biti će od interesa za ekspresiju proteina FVIII koji su ovde otkriveni. Neograničavajući primeri obuhvataju AAV serotipove 1, 2, 6 i 8. Videti, npr., Torres-Torranteras i dr. (2014) 22: 901 i tamo citirane reference.
[0219] U drugim realizacijama, vektor je izveden iz lentivirusa. U određenim realizacijama, vektor je vektor rekombinantnog lentivirusa sposobnog da inficira ćelije koje se ne dele.
[0220] Lentivirusni genom i provirusna DNK tipično imaju tri gena koja se nalaze u retrovirusima: gag, pol i env, koji su okruženi sa dve sekvence dugog terminalnog ponavljanja (LTR). Gag gen kodira unutrašnje strukturne proteine (matriks, kapsid i nukleokapsid); pol gen kodira RNK-usmerenu DNK polimerazu (reverznu transkriptazu), proteazu i integrazu; a env gen kodira glikoproteine omotača virusa. 5' i 3' LTR služe za promovisanje transkripcije i poliadenilacije virionske RNK. LTR sadrži sve druge cis-delujuće sekvence, neophodne za replikaciju virusa. Lentivirusi imaju dodatne gene uključujući vif, vpr, tat, rev, vpu, nef i vpx (kod HIV-1, HIV-2 i/ili SIV) .
[0221] Pored 5' LTR su sekvence neophodne za reverznu transkripciju genoma (mesto vezivanja prajmera tRNK) i za efikasnu inkapsidaciju virusne RNK u čestice (Psi mesto). Ako sekvence neophodne za inkapsidaciju (ili pakovanje retrovirusne RNK u infektivne virione) nedostaju u virusnom genomu, cis defekt sprečava inkapsulaciju genomske RNK.
[0222] Međutim, dobijeni mutant ostaje sposoban da usmerava sintezu svih virionskih proteina. Otkrivanje obezbeđuje metod za proizvodnju rekombinantnog lentivirusa sposobnog da inficira ćeliju koja se ne deli, koji obuhvata transfekciju pogodne ćelije domaćina sa dva ili više vektora koji nose funkcije pakovanja, naime gag, pol i env, kao i rev i tat. Kao što će biti otkriveno u nastavku, vektori kojima nedostaje funkcionalni tat gen su poželjni za određene primene. Tako, na primer, prvi vektor može da obezbedi nukleinsku kiselinu koja kodira virusni gag i virusni pol, a drugi vektor može da obezbedi nukleinsku kiselinu koja kodira virusni env za proizvodnju ćelije za pakovanje. Uvođenje vektora koji obezbeđuje heterologni gen, koji je ovde identifikovan kao vektor za prenos, u tu ćeliju za pakovanje daje ćeliju proizvođača koja oslobađa infektivne virusne čestice koje nose strani gen od interesa.
[0223] Prema gore navedenoj konfiguraciji vektora i stranih gena, drugi vektor može da obezbedi nukleinsku kiselinu koja kodira gen virusnog omotača (env). Env gen može biti dobijen iz skoro svakog pogodnog virusa, uključujući retroviruse. U nekim realizacijama, env protein je amfotropni protein omotača koji omogućava transdukciju ćelija ljudskih i drugih vrsta.
[0224] Primeri env gena dobijenih iz retrovirusa obuhvataju, ali nisu ograničeni na: Molonei virus mišje leukemije (MoMuLV ili MMLV), Harvey virus mišjeg sarkoma (HaMuSV ili HSV), virus tumora mišjih mlečnih žlezda (MuMTV ili MMTV), virus leukemije majmuna gibona (GaLV ili GALV), virus humane imunodeficijencije (HIV) i virus Rousovog sarkoma (RSV). Takođe se mogu koristiti i drugi env geni kao što je virus vezikularnog stomatitisa (VSV) protein G (VSV G), geni virusa hepatitisa i influence.
[0225] Vektor koji obezbeđuje sekvencu virusne env nukleinske kiseline je operativno povezan sa regulatornim sekvencama opisanim ovde negde drugde.
[0226] U nekim realizacijama, vektor obuhvata lentivirusni vektor u kome su geni virulencije HIV env, vif, vpr, vpu i nef obrisani bez ugrožavanja sposobnosti vektora da transdukuje ćelije koje se ne dele.
[0227] U nekim realizacijama, vektor obuhvata lentivirusni vektor koji sadrži deleciju U3 regiona od 3' LTR. Brisanje regiona U3 može biti potpuna ili delimična delecija.
[0228] U nekim realizacijama, lentivirusni vektor iz pronalaska koji sadrži FVIII nukleotidnu sekvencu opisanu ovde može biti transfektovan u ćeliji sa (a) prvom nukleotidnom sekvencom koja sadrži gag, pol, ili gag i pol gene i (b) drugu nukleotidnu sekvencu koja sadrži heterologni env gen; pri čemu lentivirusnom vektoru nedostaje funkcionalni tat gen. U drugim realizacijama, ćelija se dalje transfektuje sa četvrtom nukleotidnom sekvencom koja sadrži rev gen. U nekim realizacijama, lentivirusnom vektoru nedostaju funkcionalni geni izabrani od vif, vpr, vpu, vpx i nef, ili njihove kombinacije.
[0229] U nekim realizacijama, lentivirusni vektor sadrži jednu ili više nukleotidnih sekvenci koje kodiraju gag protein, element Rev-odgovora, centralnu polipurinsku stazu (cPPT), ili bilo koju njihovu kombinaciju.
[0230] Primeri lentivirusnih vektora su otkriveni u dokumentima WO9931251, WO9712622, WO9817815, WO9817816, i WO981893.
[0231] Drugi vektori obuhvataju plazmidne vektore. Plazmidni vektori su opširno opisani u tehnici i dobro su poznati stručnjacima u ovoj oblasti. Videti, npr., Sambrook i dr., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. U poslednjih nekoliko godina, ustanovljeno je da su plazmidni vektori posebno korisni za isporuku gena ćelijama in vivo zbog njihove nesposobnosti da se repliciraju unutar i integrišu u genom domaćina. Ovi plazmidi, međutim, koji imaju promoter kompatibilan sa ćelijom domaćinom, mogu da eksprimiraju peptid iz gena koji je operativno kodiran unutar plazmida. Neki obično korišćeni plazmidi dostupni od komercijalnih dobavljača obuhvataju pBR322, pUC18, pUC19, različite pcDNK plazmide, pRC/CMV, različite pCMV plazmide, pSV40, i pBlueScript. Dodatni primeri specifičnih plazmida obuhvataju pcDNK3.1, kataloški broj V79020; pcDNK3.1/hygro, kataloški broj V87020; pcDNK4/myc-His, kataloški broj V86320; i pBudCE4.1, kataloški broj V53220, svi iz Invitrogena (Carlsbad, CA). Drugi plazmidi su dobro poznati stručnjacima iz oblasti tehnike. Pored toga, plazmidi se mogu posebno dizajnirati korišćenjem standardnih tehnika molekularne biologije za uklanjanje i/ili dodavanje specifičnih fragmenata DNK.
Ekspresija specifična za tkivo
[0232] U određenim realizacijama, biti će korisno uključiti u vektor jednu ili više ciljnih sekvenci miRNK koje su, na primer, operativno povezane sa optimizovanim transgenom FVIII. Prema tome, pronalazak takođe obezbeđuje najmanje jednu metu sekvence miRNK koja je operativno povezana sa optimizovanom sekvencom nukleotida FVIII ili na drugi način insertovana u vektor. Više od jedne kopije ciljne sekvence miRNK uključene u vektor može povećati efikasnost sistema. Takođe su uključene različite ciljne sekvence miRNK. Na primer, vektori koji eksprimiraju više od jednog transgena mogu imati transgen pod kontrolom više od jedne ciljne sekvence miRNK, koja može biti ista ili različita. Ciljne sekvence miRNK mogu biti u tandemu, ali su uključeni i drugi aranžmani. Kaseta za ekspresiju transgena, koja sadrži ciljne sekvence miRNK, takođe može da se ubaci u vektor u antisens orijentaciji. Antisens orijentacija može biti korisna u proizvodnji virusnih čestica kako bi se izbegla ekspresija genskih proizvoda koji inače mogu biti toksični za ćelije proizvođače. U drugim realizacijama, vektor sadrži 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ili 8 kopija iste ili različite ciljne sekvence miRNK. Međutim, u nekim drugim realizacijama, vektor neće obuhvatati nijednu ciljnu sekvencu miRNK. Izbor da li da se uključi miRNK ciljna sekvenca (i koliko) biti će vođen poznatim parametrima kao što su ciljana meta tkiva, potreban nivo ekspresije itd.
[0233] U jednoj realizaciji, ciljna sekvenca je miR-223 meta za koju je objavljeno da najefikasnije blokira ekspresiju u progenitorima koji su povezani sa mijeloidom i bar delimično u primitivnijem HSPC. miR-223 meta može blokirati ekspresiju u diferenciranim mijeloidnim ćelijama uključujući granulocite, monocite, makrofage, mijeloidne dendritske ćelije. Cilj miR-223 takođe može biti pogodan za primene genske terapije koje se oslanjaju na robusnu ekspresiju transgena u limfoidnoj ili eritroidnoj liniji. Cilj miR-223 takođe može veoma efikasno da blokira ekspresiju u humanom HSC.
[0234] U drugoj realizaciji, ciljna sekvenca je miR142 meta (tccataaagt aggaaacact aca (SEQ ID NO: 43)). U jednoj realizaciji, vektor sadrži 4 kopije ciljnih sekvenci miR-142. U nekim realizacijama, komplementarna sekvenca mikroRNK specifičnih za hematopoezu, kao što je miR-142 (142T), je ugrađena u 3' ne translatirani region vektora, npr. lentivirusni vektori (LV), čineći transkript koji kodira transgen podložnim miRNK-posredovanoj regulaciji prema dole. Ovim postupkom se može sprečiti ekspresija transgena u ćelijama koje predstavljaju antigen hematopoetske loze (APC), dok se održava u ne-hematopoetskim ćelijama (Brown i dr., Nat Med 2006). Ova strategija može da nametne strogu post-transkripcionu kontrolu ekspresije transgena i na taj način omogući stabilnu isporuku i dugoročnu ekspresiju transgena. U nekim realizacijama, miR-142 regulacija sprečava imunski posredovan klirens transdukovanih ćelija i/ili indukuje antigen-specifične regulatorne T ćelije (Tregs) i posreduje robusnu imunološku toleranciju na antigen kodiran transgenom.
[0235] U nekim realizacijama, ciljna sekvenca je miR181 meta. Chen C-Z i Lodish H, Seminars in Immunology (2005) 17(2):155-165 otkriva miR-181, otkriva miR-181, miRNK specifično eksprimiranu u B ćelijama unutar koštane srži miša (Chen i Lodish, 2005). Takođe otkriva da su neke ljudske miRNK povezane sa leukemijama.
[0236] Ciljna sekvenca može biti potpuno ili delimično komplementarna sa miRNK. Termin "potpuno komplementaran" znači da ciljna sekvenca ima sekvencu nukleinske kiseline koja je 100% komplementarna sekvenci miRNK koja je prepoznaje. Termin "delimično komplementaran" znači da je ciljna sekvenca samo delimično komplementarna sekvenci miRNK koja je prepoznaje, pri čemu delimično komplementarnu sekvencu još uvek prepoznaje miRNK. Drugim rečima, delimično komplementarna ciljna sekvenca u kontekstu predmetnog pronalaska je efikasna u prepoznavanju odgovarajuće miRNK i utiče na prevenciju ili smanjenje ekspresije transgena u ćelijama koje eksprimiraju tu miRNK. Primeri ciljnih sekvenci miRNK su opisani u WO2007/000668, WO2004/094642, WO2010/055413, ili WO2010/125471.
Ćelije domaćina
[0237] Ovaj pronalazak opisuje ćeliju domaćina koja sadrži molekul nukleinske kiseline ili vektor kao što je definisano u priloženim zahtevima. Kako se ovde koristi, termin "transformacija" će se koristiti u širem smislu da se odnosi na uvođenje DNK u ćeliju domaćina primaoca koja menja genotip i posledično dovodi do promene u ćeliji primaocu.
[0238] "Ćelije domaćini" se odnose na ćelije koje su transformisane vektorima konstruisanim korišćenjem tehnika rekombinantne DNK i koji kodiraju najmanje jedan heterologni gen. Ćelije domaćini prema ovom pronalasku su poželjno poreklom od sisara; najpoželjnije ljudskog ili mišjeg porekla. Stručnjacima se pripisuje sposobnost da preferencijalno odrede određene ćelijske linije domaćina koje su najpogodnije za njihovu namenu. Primeri ćelijskih linija domaćina obuhvataju, ali nisu ograničeni na, CHO, DG44 i DUXB11 (linije jajnika kineskog hrčka, DHFR minus), HELA (karcinom grlića materice čoveka), CVI (linija bubrega majmuna), COS (derivat CVI sa SV40 T antigenom), R1610 (fibroblast kineskog hrčka) BALBC/3T3 (mišji fibroblast), HAK (linija bubrega hrčka), SP2/O (mijelom miša), P3.times.63-Ag3.653 (mijelom miša), BFA-1c1BPT (goveđe endotelne ćelije), RAJI (humani limfocit), PER.C6<®>, NS0, CAP, BHK21, i HEK 293 (humani bubreg). U jednoj posebnoj realizaciji, ćelija domaćin je izabrana iz grupe koju čine: CHO ćelija, HEK293 ćelija, BHK21 ćelija, PER.C6<®>ćelija, NS0 ćelija, i CAP ćelija. Ćelijske linije domaćina su obično dostupne u komercijalnim službama, u Američkoj kolekciji za kulturu tkiva ili iz objavljene literature.
[0239] iz pronalaska u ćeliju domaćina može se postići različitim tehnikama koje su dobro poznate stručnjacima u ovoj oblasti. Ovo obuhvata, ali nije ograničeno na, transfekciju (uključujući elektroforezu i elektroporaciju), fuziju protoplasta, precipitaciju kalcijum fosfata, fuziju ćelija sa omotanom DNK, mikroinjekciju i infekciju netaknutim virusom. Videti, Ridgway, A. A. G. "Mammalian Expression Vectors" Chapter 24.2, pp. 470-472 Vectors, Rodriguez i Denhardt, Eds. (Butterworths, Boston, Mass. 1988). Najpoželjnije je uvođenje plazmida u domaćina putem elektroporacije. Transformisane ćelije se uzgajaju u uslovima odgovarajućim za proizvodnju lakih lanaca i teških lanaca, i testiraju se na sintezu proteina teškog i/ili lakog lanca. Primeri tehnika ispitivanja obuhvataju enzimski
1
imunosorbentni test (ELISA), radioimunoesej (RIA) ili fluorescentno aktiviranu analizu sortiranih ćelija (FACS), imunohistohemiju i slično.
[0240] Ćelije domaćini koje sadrže izolovane molekule nukleinske kiseline ili vektore prema pronalasku se uzgajaju u odgovarajućem medijumu za rast. Kako se ovde koristi, termin "odgovarajući medijum za rast" označava medijum koji sadrži hranljive materije potrebne za rast ćelija. Nutrijenti potrebni za rast ćelija mogu obuhvatati izvor ugljenika, izvor azota, esencijalne aminokiseline, vitamine, minerale i faktore rasta. Opciono, medij može da sadrži jedan ili više faktora za selekciju. Opciono, medijum može da sadrži goveđi teleći serum ili fetalni teleći serum (FCS). U jednoj realizaciji, medijum suštinski ne sadrži IgG. Medijum za rast će generalno birati ćelije koje sadrže DNK konstrukt, na primer, selekcijom leka ili nedostatkom esencijalnog hranljivog materija koji je dopunjen selektivnim markerom na DNK konstruktu ili ko-transficiran sa DNK konstruktom. Kultivisane ćelije sisara se generalno uzgajaju u komercijalno dostupnim medijumima koji sadrže serum ili bez seruma (npr., MEM, DMEM, DMEM/F12). U jednoj realizaciji, medijum je CDoptiCHO (Invitrogen, Carlsbad, CA.). U drugoj realizaciji, medijum je CD17 (Invitrogen, Carlsbad, CA.). Biranje medijuma koji je prikladan za određenu ćelijsku liniju koja se koristi je u okviru nivoa onih koji su obični stručnjaci u ovoj oblasti.
Priprema polipeptida
[0241] Pronalazak takođe obezbeđuje polipeptid koji je kodiran molekulom nukleinske kiseline iz pronalaska. U drugim realizacijama, polipeptid iz pronalaska je kodiran vektorom koji sadrži izolovane nukleinske molekule iz pronalaska. U još drugim realizacijama, polipeptid prema pronalasku je proizveden od strane ćelije domaćina koja sadrži izolovane nukleinske molekule iz pronalaska.
[0242] Ovaj pronalazak obezbeđuje postupak za proizvodnju polipeptida sa aktivnošću FVIII, koji obuhvata: kultivisanje ćelije domaćina kao što je definisano u priloženim zahtevima pod uslovima u kojima se proizvodi polipeptid sa aktivnošću FVIII, i dobivanje polipeptida sa aktivnošću FVIII. U nekim realizacijama, ekspresija polipeptida sa aktivnošću FVIII je povećana u odnosu na ćeliju domaćina kultivisanu pod istim uslovima, ali koja sadrži referentnu nukleotidnu sekvencu koja sadrži SEQ ID NO: 16, roditeljsku sekvencu gena FVIII.
2
[0243] U drugim realizacijama, pronalazak obezbeđuje metod povećanja ekspresije polipeptida sa aktivnošću FVIII koji obuhvata kultivisanje ćelije domaćina prema pronalasku pod uslovima u kojima se polipeptid sa aktivnošću FVIII eksprimira molekulom nukleinske kiseline, pri čemu je ekspresija polipeptida sa aktivnošću FVIII povećana u odnosu na ćeliju domaćina kultivisanu pod istim uslovima koja sadrži referentni molekul nukleinske kiseline koji sadrži SEQ ID NO: 16.
[0244] U drugim realizacijama, pronalazak obezbeđuje metod za poboljšanje prinosa polipeptida sa aktivnošću FVIII koji obuhvata kultivisanje ćelije domaćina pod uslovima u kojima se polipeptid sa aktivnošću FVIII proizvodi od strane molekula nukleinske kiseline, pri čemu je prinos polipeptida sa aktivnošću FVIII povećan u odnosu na ćeliju domaćina kultivisanu pod istim uslovima koja sadrži referentnu sekvencu nukleinske kiseline koja sadrži SEQ ID NO: 16.
[0245] U drugim realizacijama, pronalazak obezbeđuje metod za poboljšanje prinosa polipeptida sa aktivnošću FVIII koji obuhvata kultivisanje ćelije domaćina koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid, pri čemu je indeks adaptacije kodona 3' dela nukleotidne sekvence povećan u odnosu na 5' deo nukleotidne sekvence; pri čemu je prinos polipeptida sa aktivnošću FVIII povećan u odnosu na ćeliju domaćina kultivisanu pod istim uslovima koja sadrži referentnu sekvencu nukleinske kiseline koja sadrži SEQ ID NO: 16. U nekim realizacijama, indeks adaptacije kodona 5' dela nukleotidne sekvence je povećan, smanjen ili nepromenjen u odnosu na indeks optimizacije kodona iz SEQ ID NO: 16.
[0246] U drugim realizacijama, pronalazak obezbeđuje metod za poboljšanje prinosa polipeptida sa aktivnošću FVIII koji obuhvata kultivisanje ćelije domaćina koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid, pri čemu je indeks adaptacije kodona 5' dela nukleotidne sekvence povećan u odnosu na 3' deo nukleotidne sekvence; pri čemu je prinos polipeptida sa aktivnošću FVIII povećan u odnosu na ćeliju domaćina kultivisanu pod istim uslovima koja sadrži referentnu sekvencu nukleinske kiseline koja sadrži SEQ ID NO: 16. U nekim realizacijama, indeks adaptacije kodona 3' dela nukleotidne sekvence je povećan, smanjen ili nepromenjen u odnosu na indeks optimizacije kodona iz SEQ ID NO: 16.
[0247] U drugim realizacijama, pronalazak obezbeđuje metod za poboljšanje prinosa polipeptida sa aktivnošću FVIII koji obuhvata kultivisanje ćelije domaćina koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid, pri čemu je indeks adaptacije kodona dela nukleotida koji kodira C-terminal deo polipeptida povećan u odnosu na deo nukleotida koji kodira N-terminalni deo polipeptida; pri čemu je prinos polipeptida sa aktivnošću FVIII povećan u odnosu na ćeliju domaćina kultivisanu pod istim uslovima koja sadrži referentnu sekvencu nukleinske kiseline koja sadrži SEQ ID NO: 16. U nekim realizacijama, indeks adaptacije kodona dela nukleotida koji kodira N-terminalni deo polipeptida je povećan, smanjen ili nepromenjen u odnosu na indeks optimizacije kodona iz SEQ ID NO: 16.
[0248] U drugim realizacijama, pronalazak obezbeđuje metod za poboljšanje prinosa polipeptida sa aktivnošću FVIII koji obuhvata kultivisanje ćelije domaćina koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid, pri čemu je indeks adaptacije kodona dela nukleotida koji kodira N-terminalni deo polipeptida je povećan u odnosu na deo nukleotida koji kodira C-terminalni deo polipeptida; pri čemu je prinos polipeptida sa aktivnošću FVIII povećan u odnosu na ćeliju domaćina kultivisanu pod istim uslovima koja sadrži referentnu sekvencu nukleinske kiseline koja sadrži SEQ ID NO: 16. U nekim realizacijama, indeks adaptacije kodona dela nukleotida koji kodira C-terminalni deo polipeptida je povećan, smanjen ili nepromenjen u odnosu na indeks optimizacije kodona iz SEQ ID NO: 16.
[0249] U drugim realizacijama, polipeptid kodiran 5' delom nukleotida, kada je pravilno poravnat, odgovara oko aminokiselina 1-497 iz SEQ ID NO: 17, aminokiselinama 20-497 iz SEQ ID NO: 17, ili njihovom fragmentu. U drugim realizacijama, polipeptid kodiran 3' delom nukleotida, kada je pravilno poređan, odgovara aminokiselinama 498-1458 iz SEQ ID NO: 17, ili njihovom fragmentu.
[0250] U nekim realizacijama, ekspresija FVIII polipeptida je povećana za najmanje oko 1.5-puta, najmanje oko 2-puta, najmanje oko 3-puta, najmanje oko 4-puta, najmanje oko 5-puta, najmanje oko 6-puta, najmanje oko 7-puta, najmanje oko 8-puta, najmanje oko 9-puta, najmanje oko 10-puta, najmanje oko 11-puta, najmanje oko 12-puta, najmanje oko 13-puta, najmanje oko 14-puta, najmanje oko 15-puta, najmanje oko 20-puta, najmanje oko 25-puta, najmanje oko 30-puta, najmanje oko 35-puta, najmanje oko 40-puta, najmanje oko 50-puta, najmanje oko 60-puta, najmanje oko 70-puta, najmanje oko 80-puta, najmanje oko 90-puta, najmanje oko 100-puta, najmanje oko 150-puta, ili najmanje oko 200-puta u odnosu na ćeliju domaćina kultivisanu pod istim uslovima koja sadrži referentnu sekvencu nukleinske kiseline koja sadrži SEQ ID NO: 16.
4
[0251] Dostupni su različiti postupci za rekombinantnu proizvodnju proteina FVIII iz optimizovanog molekula nukleinske kiseline prema pronalasku. Polinukleotid željene sekvence može se proizvesti de novo sintezom DNK u čvrstoj fazi ili PCR mutagenezom ranije pripremljenog polinukleotida. Mutageneza posredovana oligonukleotidom je jedan metod za pripremu supstitucije, insercije, delecije ili alteracije (npr., izmenjeni kodon) u nukleotidnoj sekvenci. Na primer, početna DNK se menja hibridizacijom oligonukleotida koji kodira željenu mutaciju u jednolančani DNK šablon. Nakon hibridizacije, DNK polimeraza se koristi za sintezu čitavog drugog komplementarnog lanca šablona koji obuhvata oligonukleotidni prajmer. U jednoj realizaciji, genetski inženjering, npr., PCR mutageneza zasnovana na prajmeru, dovoljna je da inkorporira promenu, kao što je ovde definisano, za proizvodnju polinukleotida iz pronalaska.
[0252] Za proizvodnju rekombinantnog proteina, optimizovana polinukleotidna sekvenca iz pronalaska koja kodira protein FVIII se ubacuje u odgovarajući ekspresioni nosač, tj. vektor koji sadrži neophodne elemente za transkripciju i translaciju insertovane kodirajuće sekvence, ili u slučaju RNK virusnog vektora, neophodne elemente za replikaciju i translaciju.
[0253] Polinukleotidna sekvenca iz pronalaska je insertovana u vektor u odgovarajućem okviru za čitanje. Ekspresioni vektor se zatim transfektuje u odgovarajuću ciljnu ćeliju koja će eksprimirati polipeptid. Tehnike transfekcije poznate u tehnici obuhvataju, ali nisu ograničene na, precipitaciju kalcijum fosfatom (Wigler i dr. 1978, Cell 14 : 725) i elektroporaciju (Neumann i dr. 1982, EMBO, J. 1 : 841). Različiti vektorski sistemi za ekspresiju domaćina mogu se koristiti za ekspresiju proteina FVIII opisanih ovde u eukariotskim ćelijama. U jednoj realizaciji, eukariotska ćelija je životinjska ćelija, uključujući ćelije sisara (npr. ćelije HEK293, PER.C6<®>, CHO, BHK, Cos, HeLa ćelije). Polinukleotidna sekvenca prema pronalasku takođe može kodirati signalnu sekvencu koja će dozvoliti lučenje proteina FVIII. Stručnjak u ovoj oblasti će razumeti da dok se protein FVIII translatira, signalna sekvenca se cepa od strane ćelije da bi se formirao zreli protein. U struci su poznate različite signalne sekvence, npr., signalna sekvenca prirodnog faktora VII, signalna sekvenca prirodnog faktora IX i mišja signalna sekvenca lakog lanca IgK. Alternativno, tamo gde signalna sekvenca nije uključena, protein FVIII se može dobiti lizom ćelija.
[0254] Protein FVIII prema pronalasku može biti sintetizovan u transgenoj životinji, kao što je glodar, koza, ovca, svinja ili krava. Termin "transgene životinje" se odnosi na životinje koje nisu ljudi koje su ugradile strani gen u svoj genom. Pošto je ovaj gen prisutan u tkivima zametne linije, prenosi se sa roditelja na potomstvo. Egzogeni geni se unose u jednoćelijske embrione (Brinster i dr. 1985, Proc. Natl. Acad.Sci. SAD 82:4438). Metode proizvodnje transgenih životinja su poznate u tehnici, uključujući transgene koji proizvode molekule imunoglobulina (Wagner i dr. 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. SAD 78: 6376; McKnight i dr. 1983, Cell 34 : 335; Brinster i dr.1983, Nature 306: 332; Ritchie i dr. 1984, Nature 312: 517; Baldassarre i dr. 2003, Theriogenology 59 : 831 ; Robl i dr. 2003, Theriogenology 59: 107; Malassagne i dr. 2003, Xenotransplantation 10 (3): 267).
[0255] Ekspresioni vektori mogu da kodiraju oznake koje omogućavaju lako prečišćavanje ili identifikaciju rekombinantno proizvedenog proteina. Primeri obuhvataju, ali nisu ograničeni na, vektor pUR278 (Ruther i dr.1983, EMBO J.2: 1791) u kome protein FVIII opisan ovde kodirajuća sekvenca može biti vezana u vektor u okviru sa lac Z regionom kodiranja tako da proizvodi se hibridni protein; pGEX vektori se mogu koristiti za ekspresiju proteina sa oznakom glutation S-transferaze (GST). Ovi proteini su obično rastvorljivi i mogu se lako prečistiti iz ćelija adsorpcijom na perle glutation-agaroze, posle čega sledi eluiranje u prisustvu slobodnog glutationa. Vektori obuhvataju mesta cepanja (npr., PreCission Protease (Pharmacia, Peapack, N. J.)) za lako uklanjanje oznake posle prečišćavanja.
[0256] Za potrebe predmetnog pronalaska, mogu se koristiti brojni ekspresioni vektorski sistemi. Ovi ekspresioni vektori se tipično mogu replicirati u organizmima domaćinima ili kao epizomi ili kao sastavni deo hromozomske DNK domaćina. Ekspresioni vektori mogu uključiti sekvence za kontrolu ekspresije uključujući, ali ne ograničavajući se na, promotere (npr., prirodno povezane ili heterologne promotere), pojačivače, signalne sekvence, signale spajanja, elemente pojačivača i sekvence za završetak transkripcije. Poželjno, sekvence za kontrolu ekspresije su eukariotski promoterski sistemi u vektorima sposobnim za transformaciju ili transfekciju eukariotskih ćelija domaćina. Ekspresioni vektori takođe mogu da koriste DNK elemente koji su izvedeni iz životinjskih virusa kao što su virus papiloma goveda, virus polioma, adenovirus, virus vakcinije, bakulovirus, retrovirusi (RSV, MMTV ili MOMLV), citomegalovirus (CMV) ili SV40 virus. Drugi obuhvataju upotrebu policistroničkih sistema sa unutrašnjim mestima vezivanja ribozoma.
[0257] Uobičajeno, ekspresioni vektori sadrže markere za selekciju (npr., otpornost na ampicilin, otpornost na higromicin, rezistenciju na tetraciklin ili rezistenciju na neomicin) da bi se omogućilo otkrivanje onih ćelija transformisanih sa željenim DNK sekvencama (videti, npr., Itakura i dr., US Patent 4,704,362). Ćelije koje su integrisale DNK u svoje hromozome mogu biti odabrane uvođenjem jednog ili više markera koji omogućavaju selekciju transficiranih ćelija domaćina. Marker može obezbediti prototrofiju auksotrofnog domaćina, rezistenciju na biocide (npr. antibiotici) ili otpornost na teške metale kao što je bakar. Selektabilni markerski gen može biti ili direktno vezan za DNK sekvence koje treba da se eksprimiraju, ili uvedenu u istu ćeliju kotransformacijom.
[0258] Primer vektora korisnog za ekspresiju optimizovane sekvence FVIII je NEOSPLA (američki patent br. 6,159,730). Ovaj vektor sadrži promoter/pojačivač citomegalovirusa, glavni promoter beta globina miša, SV40 poreklo replikacije, sekvencu poliadenilacije goveđeg hormona rasta, egzon 1 i egzon 2 neomicin fosfotransferaze, gen dihidrofolat reduktaze i lidersku sekvencu. Utvrđeno je da ovaj vektor dovodi do veoma visokog nivoa ekspresije antitela posle inkorporacije gena varijabilnog i konstantnog regiona, transfekcije u ćelijama, praćene selekcijom u G418 koji sadrži medijum i amplifikaciju metotreksata. Vektorski sistemi se takođe navode u američkim patentima br. 5,736,137 i 5,658,570. Ovaj sistem obezbeđuje visoke nivoe ekspresije, npr.> 30 pg/ćeliji/dan. Drugi primeri vektorskih sistema su otkriveni npr., u američkom patentu br.6,413,777.
[0259] U drugim realizacijama, polipeptidi iz pronalaska mogu biti eksprimirani korišćenjem policistronskih konstrukata. U ovim ekspresionim sistemima, višestruki genski proizvodi od interesa kao što su višestruki polipeptidi multimernog vezujućeg proteina mogu se proizvesti iz jednog policistronskog konstrukta. Ovi sistemi pogodno koriste unutrašnje mesto ulaska u ribozom (IRES) da obezbede relativno visoke nivoe polipeptida u eukariotskim ćelijama domaćinima. Kompatibilne IRES sekvence su otkrivene u američkom patentu br.6,193,980.
[0260] Uopštenije, kada je vektor ili DNK sekvenca koja kodira polipeptid pripremljena, ekspresioni vektor se može uvesti u odgovarajuću ćeliju domaćina. To jest, ćelije domaćina se mogu transformisati. Uvođenje plazmida u ćeliju domaćina može se postići različitim tehnikama koje su dobro poznate stručnjacima, kao što je gore diskutovano. Transformisane ćelije se uzgajaju u uslovima odgovarajućim za proizvodnju FVIII polipeptida i testiraju na sintezu FVIII polipeptida. Primeri tehnika ispitivanja obuhvataju enzimski imunosorbentni test (ELISA), radioimunoesej (RIA) ili fluorescentno aktiviranu analizu sortiranih ćelija (FACS), imunohistohemiju i slično.
[0261] U opisima procesa za izolovanje polipeptida iz rekombinantnih domaćina, termini "ćelija" i "ćelijska kultura" se koriste naizmenično za označavanje izvora polipeptida osim ako nije jasno drugačije naznačeno. Drugim rečima, dobivanje polipeptida iz "ćelija" može značiti ili iz prevučenih celih ćelija, ili iz ćelijske kulture koja sadrži i medijum i suspendovane ćelije.
[0262] Ćelijska linija domaćina koja se koristi za ekspresiju proteina je poželjno poreklom od sisara; najpoželjnije humanog ili mišjeg porekla, pošto su izolovane nukleinske kiseline iz predmetnog pronalaska optimizovane za ekspresiju u ljudskim ćelijama. Primeri ćelijskih linija domaćina su opisani gore. U jednoj realizaciji postupka za proizvodnju polipeptida sa aktivnošću FVIII, ćelija domaćina je ćelija HEK293. U drugoj realizaciji postupka za proizvodnju polipeptida sa aktivnošću FVIII, ćelija domaćina je ćelija CHO.
[0263] Geni koji kodiraju polipeptide iz pronalaska takođe mogu biti eksprimirani u ćelijama nesisara kao što su bakterije ili ćelije kvasca ili biljke. Sa tim u vezi, biti će cenjeno da se različiti jednoćelijski mikroorganizmi nesisara, kao što su bakterije, takođe mogu transformisati; tj. oni koje mogu da se uzgajaju u kulturama ili fermentaciji. Bakterije, koje su podložne transformaciji, obuhvataju članove enterobakterija, kao što su sojevi Escherichia coli ili Salmonella; Bacillaceae, kao što je Bacillus subtilis; Pneumococcus; Streptococcus, i Haemophilus influenzae. Dalje će biti cenjeno da, kada se eksprimiraju u bakterijama, polipeptidi tipično postaju deo inkluzijskih tela. Polipeptidi moraju biti izolovani, prečišćeni i zatim sastavljeni u funkcionalne molekule.
[0264] Alternativno, optimizovane nukleotidne sekvence iz predmetnog pronalaska mogu biti ugrađene u transgene za uvođenje u genom transgene životinje i naknadnu ekspresiju u mleku transgene životinje (videti, npr., Deboer i dr., US 5,741,957, Rosen, US 5,304,489, i Meade i dr., US 5,849,992). Pogodni transgeni obuhvataju kodirajuće sekvence za polipeptide u operativnoj vezi sa promoterom i pojačivačem iz gena specifičnog za mlečnu žlezdu, kao što je kazein ili beta laktoglobulin Proizvodnja in vitro omogućava povećanje veličine da bi se dobile velike količine željenih polipeptida. Tehnike za kultivaciju ćelija sisara u uslovima kulture tkiva su poznate u tehnici i obuhvataju homogenu suspenziju kulture, npr., u vazdušnom reaktoru ili u reaktoru sa kontinuiranim mešanjem, ili imobilisanu ili zarobljenu ćelijsku kulturu, npr., u šupljim vlaknima, mikrokapsulama, na mikroperlama agaroze ili keramičkim patronama agaroze. Ako je potrebno i/ili poželjno, rastvori polipeptida se mogu prečistiti uobičajenim metodama hromatografije, na primer gel filtracijom, hromatografijom sa izmenom jona, hromatografijom preko DEAE-celuloze ili (imuno)afinitetnom hromatografijom, npr., posle preferencijalne biosinteze polipeptida sintetičkog zglobnog regiona ili pre ili posle koraka HIC hromatografije koji je ovde opisan. Sekvenca afinitetne oznake (npr. His(6) oznaka) može opciono biti pričvršćena ili uključena u polipeptidnu sekvencu da bi se olakšalo nizvodno prečišćavanje.
[0266] Jednom eksprimiran, protein FVIII se može prečistiti u skladu sa standardnim procedurama u struci, uključujući precipitaciju amonijum sulfatom, hromatografiju na afinitetnoj koloni, HPLC prečišćavanje, gel elektroforezu i slično (videti uopšteno Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, N.Y., (1982)). Za farmaceutsku upotrebu poželjni su suštinski čisti proteini sa najmanje oko 90 do 95% homogenosti, a najpoželjniji od 98 do 99% ili više homogenosti.
Farmaceutska kompozicija
[0267] Kompozicije koje sadrže izolovani molekul nukleinske kiseline, polipeptid koji ima FVIII aktivnost kodiranu molekulom nukleinske kiseline, vektor ili ćeliju domaćina prema ovom pronalasku mogu sadržati pogodan farmaceutski prihvatljiv nosač. Na primer, oni mogu da sadrže ekscipijente i/ili pomoćne supstance koje olakšavaju preradu aktivnih jedinjenja u preparate dizajnirane za isporuku na mesto delovanja.
[0268] Farmaceutska kompozicija se može formulisati za parenteralnu primenu (tj. intravenozno, subkutano ili intramuskularno) sa bolusnom injekcijom. Formulacije za injekcije mogu biti predstavljene u obliku jedinične doze, npr. u ampulama ili u kontejnerima sa više doza sa dodatkom konzervansa. Kompozicije mogu imati takve oblike kao što su suspenzije, rastvori ili emulzije u uljanim ili vodenim nosačima, i sadrže sredstva za formulaciju kao što su agensi za suspendovanje, stabilizaciju i/ili disperziju. Alternativno, aktivni sastojak može biti u obliku praha za konstituisanje sa odgovarajućim nosačem, npr., voda bez pirogena.
[0269] Pogodne formulacije za parenteralnu primenu takođe obuhvataju vodene rastvore aktivnih jedinjenja u obliku rastvorljivom u vodi, na primer soli rastvorljive u vodi. Pored toga, mogu se davati suspenzije aktivnih jedinjenja kao odgovarajuće uljane suspenzije za injekcije.
Pogodni lipofilni rastvarači ili nosači obuhvataju masna ulja, na primer, susamovo ulje, ili sintetičke estre masnih kiselina, na primer, etil oleat ili trigliceride. Vodene suspenzije za injekcije mogu da sadrže supstance koje povećavaju viskozitet suspenzije, uključujući, na primer, natrijum karboksimetil celulozu, sorbitol i dekstran. Opciono, suspenzija može da sadrži i stabilizatore. Lipozomi se takođe mogu koristiti za inkapsulaciju molekula iz predmetnog pronalaska za isporuku u ćelije ili intersticijske prostore. Primeri farmaceutski prihvatljivih nosača su fiziološki kompatibilni rastvarači, disperzioni medijumi, obloge, antibakterijska i antifungalna sredstva, izotonični agensi i agensi za odlaganje apsorpcije, voda, fiziološki rastvor, fosfatno puferovani fiziološki rastvor, dekstroza, glicerol, etanol i slično. U nekim realizacijama, kompozicija sadrži izotonične agense, na primer, šećere, polialkohole kao što su manitol, sorbitol ili natrijum hlorid. U drugim realizacijama, kompozicije sadrže farmaceutski prihvatljive supstance kao što su sredstva za vlaženje ili manje količine pomoćnih supstanci kao što su sredstva za vlaženje ili emulgatori, konzervansi ili puferi, koji produžavaju rok trajanja ili efikasnost aktivnih sastojaka.
[0270] Kompozicije iz pronalaska mogu biti u različitim oblicima, uključujući, na primer, tečne (npr. rastvore za injektiranje i infuziju), disperzije, suspenzije, polučvrste i čvrste dozne oblike. Poželjni oblik zavisi od načina primene i terapeutske primene.
[0271] Kompozicija se može formulisati kao rastvor, mikro emulzija, disperzija, lipozom ili druga uređena struktura pogodna za visoku koncentraciju leka. Sterilni rastvori za injekcije se mogu pripremiti ugradnjom aktivnog sastojka u potrebnoj količini u odgovarajući rastvarač sa jednim ili kombinacijom sastojaka nabrojanih iznad, prema potrebi, posle čega sledi filtrirana sterilizacija. Generalno, disperzije se pripremaju ugrađivanjem aktivnog sastojka u sterilni nosač koji sadrži osnovni disperzioni medijum i potrebne druge sastojke od gore nabrojanih. U slučaju sterilnih praškova za pripremu sterilnih rastvora za injekcije, poželjne metode pripreme su sušenje u vakuumu i sušenje zamrzavanjem koje daje prah aktivnog sastojka plus bilo koji dodatni željeni sastojak iz prethodno sterilno filtriranog rastvora. Odgovarajuća tečnost rastvora može se održati, na primer, upotrebom premaza kao što je lecitin, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzije i upotrebom surfaktanata. Produžena apsorpcija kompozicija za injekcije može se postići uključivanjem u kompoziciju sredstva koje odlaže apsorpciju, na primer, soli monostearata i želatina.
[0272] Aktivni sastojak se može formulisati sa formulacijom ili uređajem sa kontrolisanim oslobađanjem. Primeri takvih formulacija i uređaja obuhvataju implantate, transdermalne flastere i mikrokapsulirane sisteme za isporuku. Mogu se koristiti biorazgradivi, biokompatibilni polimeri, na primer, etilen vinil acetat, polianhidridi, poliglikolna kiselina, kolagen, poliortoestri i polimlečna kiselina. Postupci za pripremu takvih formulacija i uređaja su poznati u tehnici. Videti, npr., Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.
[0273] Injekcione depo formulacije se mogu napraviti formiranjem mikrokapsuliranih matrica leka u biorazgradivim polimerima kao što je polilaktid-poliglikolid. U zavisnosti od odnosa leka prema polimeru i prirode korišćenog polimera, brzina oslobađanja leka se može kontrolisati. Drugi primeri biorazgradivih polimera su poliortoestri i polianhidridi. Formulacije za depo injekcije se takođe mogu pripremiti hvatanjem leka u lipozome ili mikroemulzije.
[0274] Dodatna aktivna jedinjenja se mogu ugraditi u kompozicije. U jednoj realizaciji, himerni protein prema pronalasku je formulisan sa drugim faktorom zgrušavanja, ili njegovom varijantom, fragmentom, analogom ili derivatom. Na primer, faktor zgrušavanja obuhvata, ali nije ograničen na, faktor V, faktor VII, faktor VIII, faktor IX, faktor X, faktor XI, faktor XII, faktor XIII, protrombin, fibrinogen, von Willebrandov faktor ili rekombinantni faktor rastvorljivog tkiva (rsTF) ili aktivirane forme bilo kog od prethodno navedenih. Faktor zgrušavanja hemostatskog agensa može takođe uključiti anti-fibrinolitičke lekove, npr., epsilon-amino-kaproičnu kiselinu, tranegzamsku kiselinu.
[0275] Režimi doziranja se mogu podesiti da bi se obezbedio optimalan željeni odgovor. Na primer, može se primeniti jedan bolus, može se primeniti nekoliko podeljenih doza tokom vremena, ili doza može biti proporcionalno smanjena ili povećana kao što je naznačeno zahtevima terapijske situacije. Pogodno je formulisati parenteralne kompozicije u obliku jedinične doze radi lakše primene i uniformnosti doziranja. Videti, npr., Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., Easton, Pa. 1980).
[0276] Pored aktivnog jedinjenja, tečni oblik doziranja može da sadrži inertne sastojke kao što su voda, etil alkohol, etil karbonat, etil acetat, benzil alkohol, benzil benzoat, propilen glikol, 1,3-butilen glikol, dimetilformamid, ulja, glicerol, tetrahidrofurfuril alkohol, polietilen glikoli i estri masnih kiselina sorbitana.
1
[0277] Neograničavajući primeri pogodnih farmaceutskih nosača su takođe opisani u Remington's Pharmaceutical Sciences od E. W. Martina. Neki primeri ekscipijenata obuhvataju skrob, glukozu, laktozu, saharozu, želatin, slad, pirinač, brašno, kredu, silika gel, natrijum stearat, glicerol monostearat, talk, natrijum hlorid, sušeno obrano mleko, glicerol, propilen, glikol, vodu, etanol, i slično. Kompozicija takođe može da sadrži reagense za puferovanje pH i agense za vlaženje ili emulgovanje.
[0278] Za oralnu primenu, farmaceutska kompozicija može biti u obliku tableta ili kapsula pripremljenih na konvencionalne načine. Kompozicija se takođe može pripremiti kao tečnost, na primer sirup ili suspenzija. Tečnost može obuhvatati suspendovane agense (npr. sorbitol sirup, derivate celuloze ili hidrogenizovane jestive masti), emulgatore (lecitin ili bagrem), ne vodene nosače (npr. bademovo ulje, uljane estre, etil alkohol ili frakcionisana biljna ulja), i konzervanse (npr. metil ili propil-p-hidroksibenzoati ili sorbinska kiselina). Preparati takođe mogu obuhvatati arome, boje i zaslađivače. Alternativno, kompozicija se može predstaviti kao suv proizvod za konstituisanje sa vodom ili drugim pogodnim nosačem.
[0279] Za bukalnu primenu, kompozicija može biti u obliku tableta ili pastila u skladu sa konvencionalnim protokolima.
[0280] Za davanje inhalacijom, jedinjenja za upotrebu u skladu sa ovim otkrićem se obično isporučuju u obliku nebulizovanog aerosola sa ili bez ekscipijensa ili u obliku aerosolnog spreja iz pakovanja pod pritiskom ili nebulizatora, sa opciono potisnim gasom, npr. dihlorodifluorometanom, trihlorofluorometanom, dihlorotetrafluorometanom, ugljen dioksidom ili drugim pogodnim gasom. U slučaju aerosola pod pritiskom, jedinica doziranja se može odrediti obezbeđivanjem ventila za isporuku odmerene količine. Kapsule i kertridži od, na primer, želatina za upotrebu u inhalatoru ili insuflatoru mogu se formulisati tako da sadrže mešavinu praha jedinjenja i pogodne praškaste baze kao što je laktoza ili skrob.
[0281] Farmaceutska kompozicija se takođe može formulisati za rektalnu primenu kao supozitorija ili retencioni klistir, npr., koji sadrže konvencionalne baze supozitorija kao što su kakao puter ili drugi gliceridi.
2
[0282] U jednoj realizaciji, farmaceutska kompozicija sadrži polipeptid koji ima aktivnost faktora VIII, optimizovani molekul nukleinske kiseline koji kodira polipeptid koji ima aktivnost faktora VIII, vektor koji sadrži molekul nukleinske kiseline, ili ćeliju domaćina koja sadrži vektor, i farmaceutski proizvod prihvatljiv nosač. U nekim realizacijama, kompozicija se primenjuje putem odabranim iz grupe koja se sastoji od lokalne primene, intraokularne primene, parenteralne primene, intratekalne primene, subduralne primene i oralne primene. Parenteralna primena može biti intravenska ili subkutana.
[0283] U drugim realizacijama, kompozicija se koristi za lečenje bolesti ili stanja krvarenja kod subjekta kome je to potrebno. Bolest ili stanje krvarenja je izabrano iz grupe koju čine poremećaj koagulacije krvarenja, hemartroza, mišićno krvarenje, oralno krvarenje, krvarenje, krvarenje u mišiće, oralno krvarenje, trauma, trauma capitis, gastrointestinalno krvarenje, intrakranijalno krvarenje, intra-arabdominalna hemoragija, intratorakalno krvarenje, prelom kostiju, krvarenje iz centralnog nervnog sistema, krvarenje u retrofaringealnom prostoru, krvarenje u retroperitonealnom prostoru, krvarenje u iliopsoasnoj ovojnici i bilo koje njihove kombinacije. U još nekim realizacijama, subjektu je predviđena operacija. U još drugim realizacijama, tretman je profilaktički ili na zahtev.
Metode lečenja
[0284] Ovaj pronalazak obezbeđuje molekul nukleinske kiseline ili vektor kao što je definisano u priloženim zahtevima za upotrebu u postupku lečenja poremećaja krvarenja. U nekim realizacijama, poremećaj krvarenja karakteriše nedostatak FVIII. U nekim realizacijama, poremećaj krvarenja je hemofilija. U nekim realizacijama, poremećaj krvarenja je hemofilija A. U nekim realizacijama aktivnost FVIII u plazmi 24 sata posle primene je povećana u odnosu na subjekt kome je primenjen referentni molekul nukleinske kiseline koji sadrži SEQ ID NO: 16, vektor koji sadrži referentni molekul nukleinske kiseline, ili polipeptid kodiran referentnim molekulom nukleinske kiseline.
[0285] U nekim realizacijama, aktivnost FVIII u plazmi se povećava na oko 6 sati, na oko 12 sati, na oko 18 sati, na oko 24 sata, na oko 36 sati, na oko 48 sati, na oko 3 dana, na oko 4 dana, na oko 5 dana, na oko 6 dana, na oko 7 dana, na oko 8 dana, na oko 9 dana, na oko 10 dana, na oko 11 dana, na oko 12 dana, na oko 13 dana, na oko 14 dana, na oko 15 dana, na oko 16 dana, na oko 17 dana, na oko 18 dana, na oko 19 dana, na oko 20 dana, na oko 21 dana, na oko 22 dana, na oko 23 dana, na oko 24 dana, na oko 25 dana, na oko 26 dana, na oko 27 dana, ili na oko 28 dana posle primene u odnosu na subjekt kome je dat referentni molekul nukleinske kiseline koji sadrži SEQ ID NO: 16, virusni vektor koji sadrži referentni molekul nukleinske kiseline ili polipeptid kodiran referentnim molekulom nukleinske kiseline. U određenim realizacijama, aktivnost FVIII u plazmi je povećana oko 24 sata posle primene u odnosu na subjekt kome je primenjen referentni molekul nukleinske kiseline koji sadrži SEQ ID NO: 16, virusni vektor koji sadrži referentni molekul nukleinske kiseline ili polipeptid kodiran referentnim molekulom nukleinske kiseline. U drugoj realizaciji, aktivnost FVIII u plazmi je povećana oko 21 dan posle davanja u odnosu na subjekt kome je dat referentni molekul nukleinske kiseline koji sadrži SEQ ID NO: 16, virusni vektor koji sadrži referentni molekul nukleinske kiseline ili polipeptid kodiran referentnim molekulom nukleinske kiseline.
[0286] U nekim realizacijama, aktivnost FVIII u plazmi posle primene se povećava za najmanje oko 1.5-puta, najmanje oko 2-puta, najmanje oko 3-puta, najmanje oko 4-puta, najmanje oko 5-puta, najmanje oko 6-puta, najmanje oko 7-puta, najmanje oko 8-puta, najmanje oko 9-puta, najmanje oko 10-puta, najmanje oko 11-puta, najmanje oko 12-puta, najmanje oko 13-puta, najmanje oko 14-puta, najmanje oko 15-puta, najmanje oko 20-puta, najmanje oko 25-puta, najmanje oko 30-puta, najmanje oko 35-puta, najmanje oko 40-puta, najmanje oko 50-puta, najmanje oko 60-puta, najmanje oko 70-puta, najmanje oko 80-puta, najmanje oko 90-puta, najmanje oko 100-puta, najmanje oko 150-puta, najmanje oko 200-puta, najmanje oko 250-puta, najmanje oko 300-puta, najmanje oko 350-puta, najmanje oko 400-puta, najmanje oko 450-puta, ili najmanje oko 500-puta u odnosu na subjekt kome je primenjen referentni molekul nukleinske kiseline koji sadrži SEQ ID NO: 16, virusni vektor koji sadrži referentni molekul nukleinske kiseline, ili polipeptid kodiran referentnim molekulom nukleinske kiseline. U nekim realizacijama, aktivnost FVIII u plazmi posle primene se povećava za najmanje oko 150%, najmanje oko 200%, najmanje oko 250%, najmanje oko 300%, najmanje oko 350%, najmanje oko 400%, najmanje oko 450%, najmanje oko 500%, najmanje oko 550%, najmanje oko 600%, najmanje oko 650%, najmanje oko 700%, najmanje oko 750%, najmanje oko 800%, najmanje oko 850%, najmanje oko 900%, najmanje oko 950%, najmanje oko 1000%, najmanje oko 1500%, najmanje oko 2000%, najmanje oko 2500%, najmanje oko 3000%, najmanje oko 3500%, najmanje oko 4000%, najmanje oko 4500%, najmanje oko 5000%, najmanje oko 5500%, najmanje oko 6000%, najmanje oko 7000%, najmanje oko 8000%, najmanje oko 9000%, najmanje oko 10,000% u odnosu na fiziološki normalne nivoe FVIII u cirkulaciji. U jednoj realizaciji, aktivnost FVIII u plazmi posle primene se povećava za najmanje oko 3000 do oko 5000% u odnosu na fiziološki normalne nivoe FVIII
4
u cirkulaciji. U nekim realizacijama, 24 sata posle primene plazmida koji sadrži kodonomoptimizovan gen koji kodira polipeptide sa aktivnošću faktora VIII (FVIII) kako je ovde opisano, ili 21 dan posle primene lentivirusnog ili AAV vektora koji sadrži polipeptide koji kodiraju ovde opisan kodonom-optimizovani gen sa aktivnošću faktora VIII (FVIII), aktivnost FVIII u plazmi je povećana za najmanje oko 6-puta u odnosu na subjekt kome je primenjen referentni molekul nukleinske kiseline koji sadrži SEQ ID NO: 16, vektor koji sadrži referentni molekul nukleinske kiseline, ili polipeptid kodiran referentnim molekulom nukleinske kiseline. U nekim realizacijama, 24 sata posle primene plazmida koji sadrži kodonom-optimizovan gen koji kodira polipeptide sa aktivnošću faktora VIII (FVIII) kako je ovde opisano, ili 21 dan posle primene lentivirusnog ili AAV vektora koji sadrži kodonom-optimizovan gen koji kodira polipeptide sa aktivnošću faktora VIII (FVIII) kako je ovde opisano, aktivnost FVIII u plazmi je povećana za najmanje oko 10-puta u odnosu na subjekt kome je primenjen referentni molekul nukleinske kiseline koji sadrži SEQ ID NO: 16, vektor koji sadrži referentni molekul nukleinske kiseline, ili polipeptid kodiran referentnim molekulom nukleinske kiseline. U nekim realizacijama, 24 sata posle primene plazmida koji sadrži kodonom-optimizovan gen koji kodira polipeptide sa aktivnošću faktora VIII (FVIII) kako je ovde opisano, ili 21 dan posle primene lentivirusnog ili AAV vektora koji sadrži kodonom-optimizovan gen koji kodira polipeptide sa aktivnošću faktora VIII (FVIII) kako je ovde opisano, aktivnost FVIII u plazmi je povećana za najmanje oko 23-puta u odnosu na subjekt kome je primenjen referentni molekul nukleinske kiseline koji sadrži SEQ ID NO: 16, vektor koji sadrži referentni molekul nukleinske kiseline, ili polipeptid kodiran referentnim molekulom nukleinske kiseline. U nekim realizacijama, 24 sata posle primene plazmida koji sadrži kodonom-optimizovan gen koji kodira polipeptide sa aktivnošću faktora VIII (FVIII) kako je ovde opisano, ili 21 dan posle primene lentivirusnog ili AAV vektora koji sadrži kodonom-optimizovan gen koji kodira polipeptide sa aktivnošću faktora VIII (FVIII) kako je ovde opisano, aktivnost FVIII u plazmi je povećana za najmanje oko 18-puta u odnosu na subjekt kome je primenjen referentni molekul nukleinske kiseline koji sadrži SEQ ID NO: 16, vektor koji sadrži referentni molekul nukleinske kiseline, ili polipeptid kodiran referentnim molekulom nukleinske kiseline. U nekim realizacijama, 24 sata posle primene plazmida koji sadrži kodonom-optimizovan gen koji kodira polipeptide sa aktivnošću faktora VIII (FVIII) kako je ovde opisano, ili 21 dan posle primene lentivirusnog ili AAV vektora koji sadrži kodonom-optimizovan gen koji kodira polipeptide sa aktivnošću faktora VIII (FVIII) kako je ovde opisano, aktivnost FVIII u plazmi je povećana za najmanje oko 30-puta u odnosu na subjekt kome je primenjen referentni molekul nukleinske kiseline koji sadrži SEQ ID NO: 16, vektor koji sadrži referentni molekul nukleinske kiseline, ili polipeptid kodiran referentnim molekulom nukleinske kiseline. U nekim realizacijama, 24 sata posle primene plazmida koji sadrži kodonom-optimizovan gen koji kodira polipeptide sa aktivnošću faktora VIII (FVIII) kako je ovde opisano, ili 21 dan posle primene lentivirusnog ili AAV vektora koji sadrži kodonom-optimizovan gen koji kodira polipeptide sa aktivnošću faktora VIII (FVIII) kako je ovde opisano, aktivnost FVIII u plazmi je povećana za najmanje oko 50-puta u odnosu na subjekt kome je primenjen referentni molekul nukleinske kiseline koji sadrži SEQ ID NO: 16, vektor koji sadrži referentni molekul nukleinske kiseline, ili polipeptid kodiran referentnim molekulom nukleinske kiseline. U nekim realizacijama, 24 sata posle primene plazmida koji sadrži kodonom-optimizovan gen koji kodira polipeptide sa aktivnošću faktora VIII (FVIII) kako je ovde opisano, ili 21 dan posle primene lentivirusnog ili AAV vektora koji sadrži kodonom-optimizovan gen koji kodira polipeptide sa aktivnošću faktora VIII (FVIII) kako je ovde opisano, aktivnost FVIII u plazmi je povećana za najmanje oko 100-puta u odnosu na subjekt kome je primenjen referentni molekul nukleinske kiseline koji sadrži SEQ ID NO: 16, vektor koji sadrži referentni molekul nukleinske kiseline, ili polipeptid kodiran referentnim molekulom nukleinske kiseline.
[0287] Pronalazak se takođe odnosi na izolovani molekul nukleinske kiseline koji je ovde otkriven ili polipeptid koji ima FVIII aktivnost kodiranu nukleinskom kiselinom za upotrebu u postupku lečenja, ublažavanja ili prevencije hemostatskog poremećaja kod subjekta, a postupak obuhvata davanje terapeutski efikasne količine izolovanog molekula nukleinske kiseline ili polipeptida. Lečenje, poboljšanje i prevencija izolovanim molekulom nukleinske kiseline ili kodiranim polipeptidom može biti bajpas terapija. Subjekt koji prima bajpas terapiju može već da ima inhibitor faktora zgrušavanja, npr. FVIII, ili je podložan razvoju inhibitora faktora zgrušavanja.
[0288] Molekuli nukleinske kiseline, vektori ili polipeptidi prema pronalasku leče ili sprečavaju hemostatski poremećaj tako što promovišu formiranje fibrinskog ugruška. Polipeptid koji ima FVIII aktivnost kodiran molekulom nukleinske kiseline prema pronalasku može aktivirati člana kaskade koagulacije. Faktor zgrušavanja može biti učesnik u spoljašnjem putu, unutrašnjem putu ili oba.
[0289] Molekuli nukleinske kiseline, vektori ili polipeptidi prema pronalasku mogu se koristiti za lečenje hemostatskih poremećaja za koje je poznato da se mogu lečiti sa FVIII. Hemostatski poremećaji koji se mogu lečiti primenom metoda iz pronalaska obuhvataju, ali nisu ograničeni na, hemofiliju A, hemofiliju B, von Willebrandovu bolest, nedostatak faktora XI (nedostatak PTA), nedostatak faktora XII, kao i nedostatke ili strukturne abnormalnosti u fibrinogenu, protrombinu, faktoru V, faktoru VII, faktoru X ili faktoru XIII, hemartrozu, mišićno krvarenje, oralno krvarenje, hemoragiju, krvarenje u mišiće, oralno krvarenje, trauma, trauma capitis, gastrointestinalno krvarenje, intrakranijalno krvarenje, intra-abdominalno krvarenje, intratorakalno krvarenje, prelom kostiju, krvarenje iz centralnog nervnog sistema, krvarenje u retrofaringealnom prostoru, krvarenje u retroperitonealnom prostoru i krvarenje u iliopsoasnoj ovojnici. Kompozicije za davanje subjektu obuhvataju molekule nukleinske kiseline koji sadrže optimizovanu sekvencu nukleotida prema pronalasku koja kodira faktor zgrušavanja FVIII (za primene u genskoj terapiji) kao i molekule polipeptida FVIII.
[0290] U nekim realizacijama, hemostatski poremećaj je nasledni poremećaj. U jednoj realizaciji, subjekt ima hemofiliju A. U drugim realizacijama, hemostatski poremećaj je rezultat nedostatka FVIII. U drugim realizacijama, hemostatski poremećaj može biti rezultat defektnog faktora zgrušavanja FVIII.
[0291] U drugoj realizaciji, hemostatski poremećaj može biti stečeni poremećaj. Stečeni poremećaj može biti rezultat osnovne sekundarne bolesti ili stanja. Nepovezano stanje može biti, kao primer, ali ne i ograničenje, rak, autoimuna bolest ili trudnoća. Stečeni poremećaj može biti posledica starosti ili uzimanja lekova za lečenje osnovnog sekundarnog poremećaja (npr., hemoterapija raka).
[0292] Pronalazak se takođe odnosi na lečenje subjekta koji nema hemostatski poremećaj ili sekundarnu bolest ili stanje koje dovodi do sticanja hemostatskog poremećaja. Pronalazak se stoga odnosi na izolovani molekul nukleinske kiseline, vektor ili FVIII polipeptid koji je ovde otkriven za upotrebu u postupku lečenja subjekta kome je potreban opšti hemostatski agens koji se sastoji od primene terapeutski efikasne količine izolovanog molekula nukleinske kiseline, vektora ili polipeptida FVIII. Na primer, subjekt kome je potreban opšti hemostatski agens je podvrgnut operaciji ili će biti podvrgnuti operaciji. Izolovani molekul nukleinske kiseline, vektor ili polipeptid FVIII prema pronalasku može se primeniti pre ili posle operacije kao profilaktički agens. Izolovani molekul nukleinske kiseline, vektor ili FVIII polipeptid prema pronalasku može se primeniti tokom ili posle operacije da bi se kontrolisala epizoda akutnog krvarenja. Operacija može obuhvatati, ali nije ograničena na, transplantaciju jetre, resekciju jetre ili transplantaciju matičnih ćelija.
[0293] U drugoj realizaciji, izolovani molekul nukleinske kiseline, vektor ili polipeptid FVIII prema pronalasku može se koristiti za lečenje subjekta koji ima epizodu akutnog krvarenja koji nema hemostatski poremećaj. Epizoda akutnog krvarenja može biti posledica teške traume, npr., operacija, automobilska nesreća, rana, rana od pištolja ili bilo koji drugi traumatski događaj koji dovodi do nekontrolisanog krvarenja.
[0294] Izolovani molekul nukleinske kiseline, vektor ili protein FVIII mogu se koristiti za profilaktički tretman subjekta sa hemostatskim poremećajem. Izolovani molekul nukleinske kiseline, vektor ili protein FVIII mogu se koristiti za lečenje epizode akutnog krvarenja kod subjekta sa hemostatskim poremećajem.
[0295] U drugoj realizaciji, ekspresija FVIII proteina primenom izolovanog molekula nukleinske kiseline ili vektora prema pronalasku ne indukuje imuni odgovor kod subjekta. U nekim realizacijama, imuni odgovor obuhvata razvoj antitela protiv FVIII. U nekim realizacijama, imuni odgovor obuhvata lučenje citokina. U nekim realizacijama, imuni odgovor obuhvata aktivaciju B ćelija, T ćelija ili i B ćelija i T ćelija. U nekim realizacijama, imuni odgovor je inhibitorni imuni odgovor, pri čemu imuni odgovor kod subjekta smanjuje aktivnost proteina FVIII u odnosu na aktivnost FVIII kod subjekta koji nije razvio imuni odgovor. U određenim realizacijama, ekspresija proteina FVIII primenom izolovanog molekula nukleinske kiseline ili vektora, prema pronalasku, sprečava inhibitorni imuni odgovor protiv proteina FVIII ili proteina FVIII koji se eksprimira iz izolovanog molekula nukleinske kiseline ili vektora.
[0296] U nekim realizacijama, izolovani molekul nukleinske kiseline, vektor ili proteinska kompozicija FVIII prema pronalasku se primenjuje u kombinaciji sa najmanje jednim drugim agensom koji promoviše hemostazu. Navedeno drugo sredstvo koje promoviše hemostazu u terapiji sa pokazanom aktivnošću zgrušavanja. Kao primer, ali ne kao ograničenje, hemostatsko sredstvo može obuhvatati Faktor V, Faktor VII, Faktor IX, Faktor X, Faktor XI, Faktor XII, Faktor XIII, protrombin ili fibrinogen ili aktivirane oblike bilo kog od prethodnih. Faktor zgrušavanja ili hemostatski agens može takođe uključiti anti-fibrinolitičke lekove, npr., epsilon-aminokaproičnu kiselinu, tranegzamsku kiselinu.
[0297] U jednoj realizaciji iz pronalaska, kompozicija (npr., izolovani molekul nukleinske kiseline, vektor ili polipeptid FVIII) je ona u kojoj je FVIII prisutan u obliku koji se može aktivirati kada se daje subjektu. Takav aktivirajući molekul može biti aktiviran in vivo na mestu zgrušavanja posle davanja subjektu.
[0298] Izolovani molekul nukleinske kiseline, vektor ili polipeptid FVIII se može primeniti intravenozno, subkutano, intramuskularno ili preko bilo koje površine sluzokože, npr. oralno, sublingvalno, bukalno, sublingvalno, nazalno, rektalno, vaginalno ili plućnim putem. Protein FVIII može biti implantiran unutar ili povezan sa biopolimernim čvrstim nosačem koji omogućava sporo oslobađanje himernog proteina na željeno mesto.
[0299] Za oralnu primenu, farmaceutska kompozicija može biti u obliku tableta ili kapsula pripremljenih na konvencionalne načine. Kompozicija se takođe može pripremiti kao tečnost, na primer sirup ili suspenzija. Tečnost može da sadrži agense za suspendovanje (npr. sorbitol sirup, derivate celuloze ili hidrogenizovane jestive masti), emulgatore (lecitin ili bagrem), ne vodene vehikule (npr. bademovo ulje, uljane estre, etil alkohol ili frakcionisana biljna ulja) i konzervanse (npr. metil ili propil-p-hidroksibenzoati ili sorbinska kiselina). Preparati takođe mogu obuhvatati arome, boje i zaslađivače. Alternativno, kompozicija se može predstaviti kao suv proizvod za konstituisanje sa vodom ili sa drugim pogodnim nosačem.
[0300] Za bukalnu i sublingvalnu primenu kompozicija može biti u obliku tableta, pastila ili filmova koji se brzo rastvaraju u skladu sa konvencionalnim protokolima.
[0301] Za davanje inhalacijom, polipeptid koji ima FVIII aktivnost za upotrebu u skladu sa ovim otkrićem se prikladno isporučuje u obliku aerosol spreja iz pakovanja pod pritiskom ili nebulizatora (npr. u PBS), sa pogodnim potisnim gasom, npr. dihlorodifluorometanom, trihlorofluorometanom, dihlorotetrafluorometanom, ugljen-dioksidom ili drugim pogodnim gasom. U slučaju aerosola pod pritiskom, jedinica doze se može odrediti obezbeđivanjem ventila za isporuku odmerene količine. Kapsule i kertridži od, na primer, želatina za upotrebu u inhalatoru ili insuflatoru mogu se formulisati tako da sadrže mešavinu praha jedinjenja i pogodne praškaste baze kao što je laktoza ili skrob.
[0302] U jednoj realizaciji, put primene izolovanog molekula nukleinske kiseline, vektora ili FVIII polipeptida je parenteralni. Termin parenteralno kako se ovde koristi obuhvata intravensku, intraarterijsku, intraperitonealnu, intramuskularnu, subkutanu, rektalnu ili vaginalnu primenu. Poželjan je intravenski oblik parenteralne primene. Dok se jasno smatra da su svi ovi oblici davanja unutar obima otkrivanja, oblik za davanje bi bio rešenje za injekcije, posebno za intravensku ili intraarterijsku injekciju ili kap po kap. Obično, pogodna farmaceutska kompozicija za injekcije može da sadrži pufer (npr. acetatni, fosfatni ili citratni pufer), surfaktant (npr. polisorbat), opciono stabilizator (npr. humani albumin), itd. Međutim, u drugim metodama kompatibilnim sa ovde otkrivenim, izolovani molekul nukleinske kiseline, vektor ili polipeptid FVIII mogu biti dostavljeni direktno na mesto štetne ćelijske populacije čime se povećava izloženost obolelog tkiva terapeutskom agensu.
[0303] Preparati za parenteralnu primenu obuhvataju sterilne vodene ili ne-vodene rastvore, suspenzije i emulzije. Primeri ne-vodenih rastvarača su propilen glikol, polietilen glikol, biljna ulja kao što je maslinovo ulje i organski estri za injekcije kao što je etil oleat. Vodeni nosači obuhvataju vodu, alkoholne/vodene rastvore, emulzije ili suspenzije, uključujući fiziološki rastvor i puferovane medijume. U predmetnom pronalasku, farmaceutski prihvatljivi nosači obuhvataju, ali nisu ograničeni na, 0.01-0.1M i poželjno 0.05M fosfatni pufer ili 0.8% fiziološki rastvor. Drugi uobičajeni parenteralni nosači obuhvataju rastvore natrijum fosfata, Ringerovu dekstrozu, dekstrozu i natrijum hlorid, laktatni Ringer ili fiksna ulja. Intravenska sredstva obuhvataju dopunjače tečnosti i hranljivih materija, dopunjače elektrolita, kao što su oni na bazi Ringerove dekstroze i slično. Takođe mogu biti prisutni konzervansi i drugi aditivi, kao što su na primer antimikrobni lekovi, antioksidansi, helatni agensi, inertni gasovi i slično.
[0304] Tačnije, farmaceutske kompozicije pogodne za injektabilnu upotrebu obuhvataju sterilne vodene rastvore (gde su rastvorljive u vodi) ili disperzije i sterilne prahove za upotrebu bez pripreme sterilnih rastvora ili disperzija za injekcije. U takvim slučajevima, kompozicija mora biti sterilna i treba da bude tečna u meri u kojoj postoji lako ubrizgavanje. Treba da bude stabilna u uslovima proizvodnje i skladištenja i poželjno je da bude sačuvana od kontaminirajućeg dejstva mikroorganizama, kao što su bakterije i gljivice. Nosač može biti rastvarač ili disperzioni medijum koji sadrži, na primer, vodu, etanol, poliol (npr. glicerol, propilen glikol i tečni polietilen glikol i slično), i njihove pogodne smeše. Odgovarajuća tečnost se može održavati, na primer, upotrebom premaza kao što je lecitin, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzije i korišćenjem surfaktanata..
1
[0305] Prevencija delovanja mikroorganizama može se postići različitim antibakterijskim i antifungalnim agensima, na primer, parabenima, hlorobutanolom, fenolom, askorbinskom kiselinom, timerosalom i slično. U mnogim slučajevima, biti će poželjno u kompoziciju uključiti izotonične agense, na primer, šećere, polialkohole, kao što su manitol, sorbitol ili natrijum hlorid. Produžena apsorpcija kompozicija za injekcije može se postići uključivanjem u kompoziciju agensa koji odlaže apsorpciju, na primer, aluminijum monostearata i želatina.
[0306] U svakom slučaju, sterilni rastvori za injekcije se mogu pripremiti ugradnjom aktivnog jedinjenja (npr. polipeptida samog ili u kombinaciji sa drugim aktivnim agensima) u potrebnoj količini u odgovarajućem rastvaraču sa jednim ili kombinacijom ovde nabrojanih sastojaka po potrebi, posle čega sledi filtrirana sterilizacija. Generalno, disperzije se pripremaju ugrađivanjem aktivnog jedinjenja u sterilni nosač, koji sadrži osnovni disperzioni medijum i potrebne druge sastojke od gore nabrojanih. U slučaju sterilnih praškova za pripremu sterilnih rastvora za injekcije, poželjne metode pripreme su sušenje u vakuumu i sušenje zamrzavanjem, koje daje prah aktivnog sastojka plus bilo koji dodatni željeni sastojak iz prethodno sterilno filtriranog rastvora istog. Preparati za injekcije se obrađuju, pune u kontejnere kao što su ampule, kese, boce, špricevi ili bočice, i zatvaraju u aseptičnim uslovima prema metodama poznatim u tehnici. Dalje, preparati se mogu pakovati i prodavati u obliku kompleta. Takvi proizvodni artikli će poželjno imati etikete ili umetke za pakovanja koji ukazuju na to da su pridružene kompozicije korisne za lečenje subjekta koji pati od, ili je predisponiran na poremećaje zgrušavanja.
[0307] Farmaceutska kompozicija se takođe može formulisati za rektalnu primenu kao supozitorija ili retencioni klistir, npr., koji sadrže konvencionalne baze supozitorija kao što su kakao puter ili drugi gliceridi.
[0308] Efektivne doze kompozicija iz predmetnog pronalaska, za lečenje stanja variraju u zavisnosti od mnogo različitih faktora, uključujući način primene, ciljno mesto, fiziološko stanje pacijenta, da li je pacijent čovek ili životinja, druge lekove koji se primenjuju i da li je lečenje profilaktičko ili terapeutsko. Obično je pacijent čovek, ali se mogu lečiti i sisari koji nisu ljudi uključujući transgene sisare. Doze za lečenje mogu da se titriraju korišćenjem rutinskih metoda poznatih stručnjacima da bi se optimizovala bezbednost i efikasnost.
1 1
[0309] Doze za davanje plazmida koji sadrži kodonom optimizovan gen koji kodira polipeptide sa aktivnošću faktora VIII (FVIII), kao što je ovde opisano, ili polipeptida kodiranog kodonom optimizovanim genom mogu se kretati od 1000 µg/kg do 0.1 ng/kg telesne težine. U jednoj realizaciji, raspon doziranja je od 1 µg/kg do 100 µg/kg. Doze za primenu lentivirusnog vektora koji sadrži kodonom optimizovan gen koji kodira polipeptide sa aktivnošću faktora VIII (FVIII), kao što je ovde opisano, mogu da se kreću od 10<3>do 10<15>TU/kg. Doze za primenu AAV vektora koji sadrži kodonom optimizovan gen koji kodira polipeptide sa aktivnošću faktora VIII (FVIII), kao što je ovde opisano, mogu da se kreću od 10<5>do 10<18>VG/kg.
[0310] Izolovani molekul nukleinske kiseline, plazmid, vektor ili FVIII polipeptid se može primeniti kao pojedinačna doza ili kao višestruke doze, pri čemu se višestruke doze mogu davati kontinuirano ili u određenim vremenskim intervalima. In vitro testovi se mogu koristiti za određivanje optimalnih raspona doza i/ili rasporeda za davanje. In vitro testovi koji mere aktivnost faktora zgrušavanja su poznati u tehnici. Pored toga, efikasne doze se mogu ekstrapolirati iz krive doza-odgovor dobijenih na životinjskim modelima, na primer, pas sa hemofilijom (Mount i dr.2002, Blood 99 (8): 2670).
[0311] Međuprodukt doza u gornjem obimu takođe treba da budu unutar obima pronalaska. Subjektima se takve doze mogu davati dnevno, alternativnim danima, nedeljno ili prema bilo kom drugom rasporedu koji je utvrđen empirijskom analizom. Primer lečenja podrazumeva davanje u više doza tokom dužeg perioda, na primer, od najmanje šest meseci. U nekim metodama, dva ili više polipeptida se mogu davati istovremeno, u kom slučaju doza svakog primenjenog polipeptida spada u naznačene raspone.
[0312] Izolovani molekul nukleinske kiseline, vektor ili FVIII polipeptidi iz pronalaska mogu se davati u više navrata. Intervali između pojedinačnih doza mogu biti dnevni, nedeljni, mesečni ili godišnji. Intervali takođe mogu biti nepravilni, na šta ukazuje merenje nivoa modifikovanog polipeptida ili antigena u krvi kod pacijenta. Alternativno, polipeptidi se mogu davati kao formulacija sa produženim oslobađanjem, u kom slučaju je potrebna ređa primena. Doziranje i učestalost variraju u zavisnosti od vremena poluraspada polipeptida ili polinukleotida kod pacijenta.
[0313] Doziranje i frekvencija primene mogu da variraju u zavisnosti od toga da li je tretman profilaktički ili terapeutski. U profilaktičkim primenama, preparati koji sadrže izolovani
1 2
molekul nukleinske kiseline, vektor, ili FVIII polipeptid ili njihov koktel se daju pacijentu koji nije već u bolesnom stanju da bi se povećala rezistencija pacijenta ili minimizirali efekti bolesti. Takva količina je definisana kao „profilaktički efektivna doza“. Relativno niska doza se primenjuje u relativno retkim intervalima tokom dužeg vremenskog perioda. Neki pacijenti nastavljaju da se leče do kraja njihovih života.
[0314] Izolovani molekul nukleinske kiseline, vektor ili polipeptidi FVIII prema pronalasku mogu opciono da se daju u kombinaciji sa drugim agensima koji su efikasni u lečenju poremećaja ili stanja kojima je potrebno lečenje (npr., profilaktički ili terapeutski).
[0315] Kako se ovde koristi, primena izolovanih molekula nukleinske kiseline, vektora ili FVIII polipeptida prema pronalasku u vezi ili kombinaciji sa dodatnom terapijom označava sekvencijalnu, simultanu, koekstenzivnu, istovremenu, istovremenu ili istovremenu primenu ili primenu terapije i opisani polipeptidi. Stručnjaci će razumeti da se primena ili primena različitih komponenti kombinovanog terapijskog režima može vremenski odrediti kako bi se poboljšala ukupna efikasnost lečenja. Stručnjak (npr., lekar) bi lako mogao da uoči efikasne kombinovane terapijske režime bez nepotrebnog eksperimentisanja na osnovu odabrane dodatne terapije i učenja predmetnog opisa.
[0316] Dalje će biti cenjeno da izolovani molekul nukleinske kiseline, vektor ili FVIII polipeptid iz predmetnog pronalaska mogu da se koriste u sprezi ili kombinaciji sa agensom ili agensima (npr. da bi se obezbedio kombinovani terapeutski režim). Primeri agensa sa kojima se polipeptid ili polinukleotid prema pronalasku može kombinovati obuhvataju agense koji predstavljaju trenutni standard nege za određeni poremećaj koji se leči. Takvi agensi mogu biti hemijske ili biološke prirode. Termin "biološki" ili "biološki agens" odnosi se na bilo koji farmaceutski aktivan agens napravljen od živih organizama i/ili njihovih proizvoda koji je namenjen za upotrebu kao terapeutik.
[0317] Količina agensa koja se koristi u kombinaciji sa polinukleotidima ili polipeptidima iz predmetnog pronalaska može varirati od subjekta ili se može primeniti u skladu sa onim što je poznato u oblasti tehnike. Videti, npr., Bruce A Chabner i dr., Antineoplastic Agents, in GOODMAN & GILMAN'S THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS 1233-1287 ((Joel G. Hardman i dr., eds., 9th ed.1996). U drugoj realizaciji, primenjuje se količina takvog agensa u skladu sa standardom nege.
1
[0318] Kao što je prethodno diskutovano, polinukleotidi i polipeptidi iz predmetnog pronalaska, mogu se davati u farmaceutski efikasnoj količini za in vivo tretman poremećaja zgrušavanja. Sa tim u vezi, biće cenjeno da se polipeptidi ili polinukleotidi prema pronalasku mogu formulisati da olakšaju primenu i unaprede stabilnost aktivnog sredstva. Poželjno, farmaceutske kompozicije u skladu sa ovim pronalaskom sadrže farmaceutski prihvatljiv, netoksičan, sterilni nosač kao što je fiziološki rastvor, netoksični puferi, konzervansi i slično. Naravno, farmaceutske kompozicije prema ovom pronalasku mogu se davati u jednoj ili višestrukim dozama da bi se obezbedila farmaceutski efikasna količina polipeptida.
[0319] Dostupni su brojni testovi za procenu funkcije koagulacionog sistema: test aktiviranog parcijalnog tromboplastinskog vremena (aPTT), hromogeni test, ROTEM<®>test, test protrombinskog vremena (PT) (koji se takođe koristi za određivanje INR), ispitivanje fibrinogena (često Klausovom metodom), broj trombocita, testiranje funkcije trombocita (često pomoću PFA-100), TCT, vreme krvarenja, test mešanja (da li se abnormalnost ispravlja ako je plazma pacijenta pomešana sa normalnom plazmom), testovi faktora koagulacije, antifofolipidna antitela, D-dimer, genetski testovi (npr., faktor V Leiden, mutacija protrombina G20210A), vreme razblaženog Raselovog otrova zmije (dRVVT), razni testovi funkcije trombocita, tromboelastografija (TEG ili Sonoclot), tromboelastometrija (TEM<®>, npr., ROTEM<®>), ili vreme lize euglobulina (ELT).
[0320] aPTT test je indikator učinka koji meri efikasnost i "intrinzičnog" (takođe nazvanog kontaktnim aktivacionim putem) i uobičajenog puta koagulacije. Ovaj test se obično koristi za merenje aktivnosti zgrušavanja komercijalno dostupnih rekombinantnih faktora zgrušavanja, npr. FVIII ili FIX. Koristi se u kombinaciji sa protrombinskim vremenom (PT), koje meri spoljašnji put.
[0321] ROTEM<®>analiza obezbeđuje informacije o celokupnoj kinetici hemostaze: vremenu zgrušavanja, formiranju ugruška, stabilnosti ugruška i lizi. Različiti parametri u tromboelastometriji zavise od aktivnosti sistema plazmatske koagulacije, funkcije trombocita, fibrinolize ili mnogih faktora koji utiču na ove interakcije. Ovaj test može obezbediti potpunu sliku sekundarne hemostaze.
1 4
Genska terapija
[0322] Pronalazak obezbeđuje metod povećanja ekspresije polipeptida sa FVIII aktivnošću kod subjekta koji se sastoji od davanja izolovanog molekula nukleinske kiseline iz pronalaska subjektu kome je to potrebno, pri čemu je ekspresija polipeptida povećana u odnosu na referentni molekul nukleinske kiseline koja sadrži SEQ ID NO: 16. Pronalazak takođe obezbeđuje metod povećanja ekspresije polipeptida sa aktivnošću FVIII kod subjekta koji se sastoji od davanja vektora otkrivenog subjektu kome je to potrebno, pri čemu je ekspresija polipeptida povećana u odnosu na vektor koji sadrži referentni molekul nukleinske kiseline.
[0323] Somatska genska terapija je istražena kao mogući tretman za hemofiliju A. Genska terapija je posebno privlačan tretman za hemofiliju zbog svog potencijala da izleči bolest kroz kontinuiranu endogenu proizvodnju FVIII posle jedne primene vektora. Hemofilija A je veoma pogodna za pristup zamene gena jer se njene kliničke manifestacije u potpunosti mogu pripisati nedostatku jednog genskog proizvoda (FVIII) koji u plazmi cirkuliše u malim količinama (200 ng/ml).
[0324] Protein FVIII prema pronalasku može se proizvesti in vivo kod sisara, na primer, čoveka, korišćenjem pristupa genske terapije u lečenju bolesti krvarenja ili poremećaja izabranog iz grupe koju čine poremećaj koagulacije krvarenja, hemartroza, mišićno krvarenje, oralno krvarenje, hemoragija, krvarenje u mišiće, oralno krvarenje, trauma, trauma capitis, gastrointestinalno krvarenje, intrakranijalno krvarenje, intraabdominalno krvarenje, intratorakalno krvarenje, fraktura kostiju, krvarenje iz centralnog nervnog sistema, krvarenje u retrofaringealnom prostoru, krvarenje u retroperitonealnom prostoru, krvarenje u iliopsoas ovojnici gde bi to bilo terapeutski korisno. U jednoj realizaciji, bolest ili poremećaj krvarenja je hemofilija. U drugoj realizaciji, bolest ili poremećaj krvarenja je hemofilija A. Ovo obuhvata primenu optimizovane nukleinske kiseline koja kodira FVIII koja je operativno povezana sa pogodnim sekvencama za kontrolu ekspresije. U određenom izvođenju, ove sekvence su ugrađene u virusni vektor. Pogodni virusni vektori za takvu gensku terapiju obuhvataju adenovirusne vektore, lentivirusne vektore, bakulovirusne vektore, Epstein Barr virusne vektore, papovirusne vektore, virusne vektore vakcinije, virusne vektore herpes simpleksa, i vektore adeno povezanog virusa (AAV). Virusni vektor može biti virusni vektor sa defektom replikacije. U drugim realizacijama, adenovirusni vektor ima deleciju u svom E1 genu ili E3 genu. U drugim realizacijama, sekvence su ugrađene u ne-virusni vektor poznat stručnjacima u oblasti.
1
[0325] Svi različiti aspekti, realizacije i ovde opisane opcije mogu se kombinovati u bilo kojoj i svim varijacijama.
[0326] Pošto je uopšteno opisan ovaj pronalazak, dalje razumevanje se može dobiti pozivanjem na ovde date primere. Ovi primeri služe samo u svrhu ilustracije i nemaju nameru da budu ograničavajući.
PRIMERI
Primer 1. Strategija optimizacije kodona
[0327] Osam varijanti BDD FVIII optimizovanih kodonom je kreirano kontrolom sklonosti korišćenja kodona, uključujući coFVIII-3 (SEQ ID NO: 1; Slika 1A), coFVIII-4 (SEQ ID NO: 2; Slika 1B), coFVIII-5 (SEQ ID NO: 70; Slika 1C), coFVIII-6 (SEQ ID NO: 71; Slika 1D), coFVIII-52 (SEQ ID NO: 3; Slika 1E), coFVIII-62 (SEQ ID NO: 4; Slika 1F), coFVIII-25 (SEQ ID NO: 5; Slika 1G), i coFVIII-26 (SEQ ID NO: 6; Slika 1H). Online alatka Eugene je korišćena za olakšavanje optimizacije kodona kao što je prethodno opisano (videti Gaspar i dr., "EuGene: maximizing synthetic gene design for heterologous expression," Bioinformatics 28:2683-84 (2012)), a praćeno je nekoliko parametara upotrebe kodona, kao što su indeks adaptacije kodona (CAI) i relativna upotreba sinonimnih kodona (RSCU) (Tabela 5). Sve varijante su prilagođene na CAI ≥ 83% i RSCU ≥ 1.63, dok sekvenca FVIII sa obrisanim roditeljskim B-domenom, pre optimizacije, ima CAI od 74% i RSCU od 1.12 (Tabela 5).
1
6 5 4 3 71 70 na do ko je ci iza
opti
etri
Para5: la
abeT
[0328] Pored ukupnog povećanja CAI, osam varijanti je dizajnirano u tri klase zasnovane na distribuciji CAI preko regiona kodiranja, kao što je ilustrovano na slici 2, u odnosu na ne optimizovanu BDD FVIII sekvencu (Slika 2A). Prva klasa obuhvata varijante BDD FVIII sa ravnomernom distribucijom visokog CAI u celom regionu kodiranja (videti SLIKE 2C-2F). Prva klasa obuhvata coFVIII-3 (slika 2C), coFVIII-4 (slika 2D), coFVIII-5 (slika 2E), coFVIII-6 (slika 2F), kao i prethodno opisani coFVIII-1 (SLIKA 2B). Druga klasa obuhvata varijante BDD-FVIII sa nižim CAI na N-terminalnoj polovini kodirajuće sekvence i višim CAI na C-terminalnoj polovini kodirajuće sekvence (videti SLIKE 2G i 2H). Druga klasa obuhvata coFVIII-52 (Slika 2G) i coFVIII-62 (Slika 2H). Treća klasa obuhvata varijante BDD FVIII sa višim CAI-om na N-terminalnoj polovini kodirajuće sekvence i nižim CAI-om na C-terminalnoj polovini kodirajuće sekvence (videti slike 21 i 2J). Treća klasa obuhvata coFVIII-25 (Slika 21) i coFVIII-26 (Slika 2J).
[0329] Bez vezivanja bilo kakvom teorijom, spekulisalo se da bi veći CAI mogao da korelira sa bržom translacijom proteina, a ove tri klase mogu predstavljati različite stope sinteze proteina od početka do kraja. Na primer, translacija regiona koji ima niži CAI može da se odvija sporo u odnosu na translaciju regiona koji ima veći CAI. Ako je tako, translacija, npr., N-terminalne polovine coFVIII-52 od coFVIII-62, koja ima niži CAI, bi u početku mogla da se odvija sporo, praćeno bržom translacijom C-terminalne polovine, koja ima viši CAI. Ovo bi moglo biti poželjno za savijanje proteina i posttranslacionu modifikaciju tokom translacije bez usporavanja ukupne sinteze proteina. Suprotan efekat se može videti za varijante coFVIII-25 i coFVIII-26, koje imaju veći CAI na polovini N-terminusa i niži CAI na polovini C-terminusa.
[0330] Da bi se obezbedila stabilnost mRNK, sve varijante optimizovane za FVIII kodon su prilagođene da bi se izbegla brojna mesta, uključujući kriptična mesta spajanja, preuranjena poliA mesta, motive nestabilnosti RNK (ARE) i ponavljajuće sekvence, i da bi se prilagodio GC sadržaj (videti tabelu 2).
Primer 2. Kloniranje i ekspresija varijanti coFVIII iz pcDNA3 plazmida
[0331] Ekspresioni plazmidi koji sadrže različite varijante FVIII su dizajnirani za in vivo ekspresiju. Ne optimizovani polinukleotidi BDD FVIII (Slika 1I; SEQ ID NO: 16) i coFVIII-1 (Slika 11Z; SEQ ID NO: 68) su klonirani u pcDNA3 kičmu (Invitrogen), pri čemu je CMV promoter zamenjen sa ET promoterom (videti sliku 3). Dobijeni plazmidi, FVIII-311 (BDD
1
FVIII) i FVIII-303 (coFVIII-1), pokreću ekspresiju ne optimizovanog BDD FVIII i coFVIII-1, redom.
[0332] In vivo ekspresija FVIII-311 i FVIII-303 je procenjena kod Hem A miševa hidrodinamičkom injekcijom 5 µg DNK/mišu sa FVIII-303 ili FVIII-311. Uzorci plazme su sakupljeni 24, 48 i 72 sata posle injekcije, a aktivnost FVIII je određena hromogenim testom specifičnim za FVIII.
[0333] Kao što je prikazano na Slici 4, aktivnost FVIII u plazmi kod miševa tretiranih sa FVIII-311 (BDD FVIII; kvadrati) bila je 74 ± 43 mU/mL 72 sata posle injekcije, dok je aktivnost FVIII u plazmi kod miševa tretiranih sa FVIII-303 (coFVIII-1; krugovi) bila 452 ± 170 mU/mL 72 sata posle injekcije (Slika 4). Ovo predstavlja približno šestostruko povećanje ekspresije coFVIII-1 u odnosu na ne optimizovani BDD FVIII.
Primer 3. Kloniranje i ekspresija varijanti coFVIII korišćenjem lentivirusnog vektorskog sistema
[0334] Da bi se dalje procenio nivo ekspresije kodonom optimizovanih BDD FVIII varijanti, kodirajuće sekvence su klonirane u lentivirusne plazmide pod kontrolom ET promotera (videti Amendola i dr., "Coordinate dual-gene transgenesis by lentiviral vectors carrying synthetic bidirectional promoters," Nature Biol.23:108-16 (2005); međunarodna objava patenta br. WO 2000/066759 A1). Plazmidna mapa pLV-coFVIII-52 je prikazana na Slici 5; i plazmidi koji sadrže ne optimizovani BDD FVIII (LV-2116), coFVIII-1 (LV-coFVIII-1), coFVIII-3 (LV-coFVIII-3), coFVIII-4 (LV-coFVIII-4), coFVIII-5 (LV-coFVIII-5), i coFVIII-6 (LV-coFVIII-6), coFVIII-62 (LV-coFVIII-62), coFVIII-25 (LV-coFVIII-25), i coFVIII-26 (LV-coFVIII-26) su konstruisani na isti način, osim što je fragment coFVIII-52 zamenjen svakom naznačenom kodirajućom sekvencom korišćenjem Nhel i SalI mesta (Tabela 6).
Tabela 6: Ekspresioni plazmidi koji kodiraju varijante FVIII
1
[0335] Varijante FVIII optimizovane za lentivirusni kodon su procenjene kod HemA miševa hidrodinamičkom injekcijom u dozi od 5 µg DNK/mišu (Slike 6A, 6B) ili 20 µg DNK/mišu (Slika 6C). Kao što je prikazano na slici 6, svaki od coFVIII-3 (Slika 6A; trouglovi), coFVIII-4 (Slika 6A; obrnuti trouglovi), coFVIII-5 (Slika 6A; dijamanti), coFVIII-6 (Slika 6A; otvoreni krugovi), coFVIII-25 (Slika 6B; trouglovi), coFVIII-26 (Slika 6B; obrnuti trouglovi), coFVIII-52 (Slika 6C; kvadrati), i coFVIII-62 (Slika 6C; popunjeni krugovi) je pokazao veću aktivnost FVIII nego coFVIII-1 (Slika 6A, krugovi; Slika 6B, krugovi; i Slika 6C, trouglovi). Konkretno, coFVIII-25 i coFVIII-26 su pokazali sličan nivo ekspresije 72 sata posle injekcije, dostižući oko 3 puta veću aktivnost od coFVIII-1 (Slika 6B), što znači 24 puta veću FVIII aktivnost u poređenju sa ne optimizovanim, roditeljskim BDD FVIII (videti Slika 4). Oba coFVIII-52 (kvadrati) i coFVIII-62 (popunjeni krugovi) postigli su još veću ekspresiju 72 sata posle injekcije, pokazujući 6 puta i 4 puta veću ekspresiju, redom, nego coFVIII-1 (trouglovi), i 50-puta i 30-puta veću ekspresiju, redom, od ne optimizovanog, roditeljskog BDD FVIII (otvoreni krugovi) (Slika 6C). Ovi podaci ukazuju da bi kombinacija nižeg CAI na N-terminalnoj polovini kodirajuće sekvence i višeg CAI na C-terminalnoj polovini kodirajuće sekvence mogla biti korisnija za ekspresiju FVIII u poređenju sa obrnutom distribucijom CAI.
Primer 4: Dugoročna lentivirusna ekspresija kodonom optimizovanih FVIII varijanti kod HemA miševa
[0336] Varijante identifikovane da izazivaju visoku ekspresiju FVIII kod HemA miševa 72 sata posle hidrodinamičke injekcije procenjene su na dugotrajnu ekspresiju FVIII prenosom gena posredovanim lentivirusnim vektorima. Lentivirusni vektori su proizvedeni u 293T ćelijama prolaznom transfekcijom i koncentrisani ultracentrifugiranjem do oko 5E9 TU/ml. Lentivirusni vektori su zatim davani HemA miševima starim 12-14 dana retro-orbitalnom
11
injekcijom u dozi od 1E8 TU/mišu. 21 dan posle lentivirusne injekcije, prosečna aktivnost FVIII u plazmi bila je oko 0,04 IU/ml za miševe kojima je davan LV-2116 (BDD FVIII; Slika 7). Svaki od coFVIII-1, coFVIII-5, coFVIII-52, coFVIII-6, i coFVIII-62 rezultirao je višim nivoom FVIII u cirkulaciji 21 dan posle injekcije u odnosu na LV-2116 (ne optimizovani FVIII sa izbrisanim B domenom) kontrolu. Konkretno, injekcija, coFVIII-1 i coFVIII-5 je dala nivoe aktivnosti FVIII u plazmi od oko 1.8 IU/mL, coFVIII-52 je dala nivo aktivnosti FVIII u plazmi od oko 4.9 IU/mL, coFVIII-6 je dala nivo aktivnosti FVIII u plazmi od oko 4.6 IU/mL, i coFVIII-62 je dala nivo aktivnosti FVIII u plazmi od oko 2.5 IU/mL 21 dan posle injekcije (Slika 7). Nivoi FVIII u plazmi uočeni kod miševa kojima je ubrizgan LV-coFVIII-6 i LV-coFVIII-52, 4.6 IU/ml i 4.9 IU/ml, redom, su više od 100 puta viši od nivoa u plazmi uočenih kod miševa kojima je ubrizgana kontrola LV-2116 (ne optimizovani BDD-FVIII).
Primer 5. coFVIII-XTEN fuzijski konstrukti
[0337] Ispitana je sposobnost XTEN-a da poboljša ekspresiju FVIII u stabilnom stanju. Prvo, kodirajuća sekvenca za XTEN od 144 aminokiseline ("XTEN144"; SEQ ID NO: 18) je umetnuta na nukleotid 1193 (ili posle prvih 764 aminokiseline kodiranog polipeptida) od coFVIII-52 i coFVIII-1 da generiše coFVIII-52-XTEN (Slika 8A; SEQ ID NO: 19) i coFVIII-1-XTEN (Slika 8B; SEQ ID NO: 20), redom. Sekvenca coFVIII-1-XTEN je zatim klonirana u pcDNA3 kičmu (Invitrogen) pod kontrolom ET promotera, kao što je gore opisano, da bi se stvorio ekspresioni plazmid FVIII-306; i sekvenca coFVIII-52-XTEN je klonirana u lentivirusni plazmid pod kontrolom ET promotera, kao što je otkriveno gore, da bi se stvorio pLV-coFVIII-52-XTEN (Slika 9). FVIII-306 (coFVIII-1-XTEN) je primenjen HemA miševima u količini od 5 µg DNK/mišu sa hidrodinamičkom injekcijom. U poređenju sa FVIII-303 (coFVIII-1; Slika 10A, mali krugovi) i FVIII-311 (BDD FVIII; Slika 10A, kvadrati), fuzija XTEN144sa coFVIII-1 (FVIII-306; Slika 10A, veliki krugovi) rezultirala je sa oko 5 puta i 33 puta većom ekspresijom FVIII, redom, kod HemA miševa 72 sata posle injekcije. Efekat XTEN insercije na ekspresiju FVIII je takođe procenjen korišćenjem lentivirusnog vektora kod HemA miševa (Slika 10B). LV-coFVIII-52-XTEN je primenjen HemA miševima starim 12-14 dana pri 1E8 TU/mišu sa retro orbitalnom injekcijom. U poređenju sa LV-coFVIII52 i LV-2116 (BDD-FVIII), fuzija XTEN144sa coFVIII-52 (Slika 10B) rezultirala je oko 4 puta i 450 puta većom ekspresijom FVIII, redom, kod HemA miševa 21. dana posle injekcije.
[0338] Lentivirusni vektori koji sadrže svaki od coFVIII-3, co-FVIII-4, coFVIII-5, coFVIII-6, coFVIII-62, coFVIII-25 i coFVIII-26 fuzionisani sa XTEN144i fuzionisani sa ET promoterom biće napravljeni kako je gore opisano. Vektori će biti testirani na njihovu ekspresiju proteina FVIII.
Primer 6. Ekspresija coFVIII konstrukata
[0339] Kodonom optimizovane varijante FVIII su klonirane u lentivirusne plazmide, kao što je ilustrovano na slici 9, standardnim tehnikama molekularnog kloniranja. Lentivirusni vektori su zatim proizvedeni u ćelijama HEK293 kroz prolaznu transfekciju i izolovani ultracentrifugiranjem.
[0340] FVIII lentivirusni vektori su davani 14-dnevnim HemA miševima intravenskom injekcijom u dozi od 1.5E<10>TU/kg LV-FVIII varijante. Aktivnost plazme FVIII je merena 21. dana posle tretmana sa LV-FVIII, a broj vektorskih kopija (VCN) po ćeliji je meren u uzorcima nekropsije jetre prikupljenim od životinja tretiranih sa LV-FVIII 150 dana posle tretmana sa LV-FVIII. Dok su vrednosti VCN bile slične kod svih životinja bez obzira na primenjene varijante LV-FVIII (Slika 12B), nivoi aktivnosti FVIII kod životinja tretiranih sa varijantama coFVIII bili su 30 do 100 puta veći nego kod životinja tretiranih sa wtBDD-FVIII (Slike 12A i 12C; Table 7). Ovi podaci pokazuju da optimizacija kodona FVIII poboljšava ekspresiju FVIII u postavci lentivirusnog vektora.
Tabela 7: Relativna ekspresija kodonom optimizovanih FVIII konstrukata
Primer 7. Imuni odgovor posredovan ekspresijom FVIII transgena kod HemA miševa posle lentivirusnog tretmana
[0341] Miševi tretirani sa LV-FVIII iz Primera 6 su procenjeni na dugotrajnu ekspresiju FVIII i formiranje anti-FVIII antitela. Ekspresija FVIII, kao što je dokazano aktivnošću FVIII plazme, varirala je među životinjama unutar iste grupe za lečenje (Slika 13A). Na primer, tri miša (označena kao 1, 2 i 3) tretirana lentivirusnim vektorom koji eksprimira varijantu coFVIII-5 pokazala su doslednu ekspresiju FVIII tokom približno 16 nedelja, dok su tri legla (označena kao 4, 5 i 6), koja su tretirana sa istim lentivirusnim vektorom, pokazala oštar pad nivoa aktivnosti FVIII u plazmi za oko 10 nedelja posle tretmana (Slika 13A). Konzistentna aktivnost FVIII plazme primećena kod miševa 1, 2 i 3 je u korelaciji sa nedetektabilnim ili veoma niskim nivoima anti-FVIII antitela (Slika 13B; miševi 1, 2 i 3). Suprotno tome, miševi koji su ispoljili oštar pad aktivnosti plazme FVIII takođe su pokazali povećane nivoe anti-FVIII antitela (Slika 13B; miševi 4, 5 i 6). Ovi podaci sugerišu da ekspresija transgena FVIII indukuje formiranje anti-FVIII antitela u podgrupi životinja, a rezultujuća anti-FVIII antitela eliminišu transgeni protein FVIII iz cirkulacije.
[0342] Procenjen je odnos između ekspresije FVIII i formiranja anti-FVIII antitela. Miševi tretirani sa LV-FVIII iz Primera 6 podeljeni su u dve grupe: miševi koji su bili negativni na anti-FVIII antitela i miševi koji su bili pozitivni na anti-FVIII antitela. Kao što je prikazano na Sl. 14, ekspresija transgenog FVIII na fiziološkim nivoima ne indukuje imuni odgovor na transgeni FVIII (Slika 14, krugovi) Međutim, izgleda da supra fiziološki nivoi ekspresije FVIII indukuju formiranje anti-FVIII antitela, tako da što je viši nivo ekspresije FVIII, veća je šansa za indukciju anti-FVIII antitela. Ovi podaci sugerišu da bi moglo biti korisno održavati fiziološke nivoe ekspresije FVIII kod pacijenata koji su podvrgnuti tretmanu genske terapije FVIII.
[0343] Da bi se utvrdilo da li imuni odgovor izazvan ekspresijom FVIII rezultira gubitkom ćelija jetre koje eksprimiraju transgen, procenjeni su broj kopija vektora (Slika 15) i nivo transkripcije FVIII RNK (Slika 16) u uzorcima nekropsije jetre iz pozitivnih i negativnih miševa na anti-FVIII antitela. Kao što je prikazano na Sl.15, distribucija broja kopija vektora bila je ista kod pozitivnih i negativnih miševa na anti-FVIII antitela, što ukazuje da su ćelije sa integracijom LV-FVIII održane uprkos razvoju anti-FVIII antitela. Ovo sugeriše da doza ekspresije transgena FVIII posredovana sa LV-FVIII ne indukuje odgovor citotoksičnih T limfocita (CTL) protiv ćelija jetre koje eksprimiraju FVIII. Da bi se ovi rezultati dodatno potvrdili, transkripcija FVIII RNK je procenjena pomoću RNK in situ hibridizacije (Slike 16C i 16D). U vreme sakupljanja jetre, mišji coFVIII-52-B nije imao detektabilan FVIII u cirkulaciji
11
i visok nivo anti-FVIII antitela (Slike 16A i 16B). Međutim, signal RNK transkripcije i broj FVIII-RNK pozitivnih ćelija u tkivu jetre kod coFVIII-52-B miša bili su uporedivi sa FVIII-52-A mišem, koji je imao oko 4 IU/ml FVIII u cirkulaciji u vreme nekropsije. Zbog toga ekspresija FVIII nije izazvala CTL odgovor kod eksperimentalnih HemA miševa.
Primer 8. Dugotrajna ekspresija FVIII kod novorođenih HemA miševa tretiranih sa LV-FVIII
[0344] Da bi se procenila efikasnost korišćenja lentivirusnog sistema za lečenje pedijatrijskih pacijenata sa HemA putem ciljanja na jetru, 2-dnevnim HemA miševima je davana injekcija u slepoočnicu u venu sa oko 1.5 E10 TU/kg LV-coFVIII-52XTEN, LV-coFVIII6-XTEN, ili lentivirusni vektor koji eksprimira wtBDD-FVIII. Konzistentna dugoročna ekspresija FVIII je primećena za obe varijante i za kontrolu, pokazujući da se integrisana kaskada ekspresije FVIII održava kod tretiranih miševa u ćelijama jetre koje se dele (Slika 17). Ovi podaci sugerišu da bi LV-FVIII potencijalno mogao da se koristi za lečenje i pedijatrijskih i odraslih HemA pacijenata.
Primer 9. Procena LV-FVIII kod novorođenih HemA pasa
[0345] Da bi se dalje procenila efikasnost LV-FVIII na većim životinjskim modelima, dva jednonedeljna novorođenčeta HemA psa (označeni S3 i K4) je davano intravenskom injekcijom 1.3 x 10<9>TU/kg LV-coFVIII-6-XTEN. Ova doza je bila više od 10 puta niža od doze koja je ranije korišćena u HemA modelima miša. Posle primene lentivirusnih vektora, aktivnost FVIII u plazmi je praćena jednostepenim testom zgrušavanja (aPTT) (Slika 18) i hemostaza cele krvi je praćena testom rotacione tromboelastometrije (ROTEM) (Slike 19A-19D). Pre tretmana sa LV-FVIII, nivo FVIII za S3 je bio 0.7% normalnog (Slika 18). Nakon tretmana lentivirusnim vektorom, nivo FVIII S3 se povećao na 79% i 103% od normale na dan 7 i dan 14, redom (Slika 18). Za K4, nivo FVIII pre primene bio je 1.4% od normalnog (Slika 18). Posle tretmana lentivirusnim vektorom, nivo FVIII se povećao na 22% i 25% od normalnog 6. i 14. dana, redom (Slika 18).
[0346] U korelaciji sa nivoom FVIII, normalizovan ROTEM je primećen za obe životinje 2 nedelje posle tretmana (Slike 19A-19C), pokazujući terapeutsku korist posredovanu sa LV-FVIII. Terapeutski koristan nivo ekspresije FVIII koji je postigao LV-FVIII kod HemA psa, potvrđuje potencijalnu upotrebu LV-FVIII za lečenje hemofilije A.
Primer 10. Procena LV-FVIII kod novorođenčadi HemA miševa
[0347] Ex vivo genska terapija lentivirusnim vektorima (LV) za zamenu gena pokazala je kliničku efikasnost za više indikacija i sa višegodišnjim praćenjem kod lečenih pacijenata koji ne pokazuju dokaze tumorigenezu. Sistemska isporuka LV-FIX posreduje upornu ekspresiju FIX i dobro se toleriše na modelima životinja sa hemofilijom. Veliki kapacitet pakovanja, sposobnost da se održi dugoročna ekspresija transgena putem integracije gena, nedostatak već postojećih anti-LV antitela (abs) u ljudskoj populaciji i ohrabrujući in vivo profili demonstrirani u pretkliničkim i kliničkim uslovima, čine LV obećavajućim nosačem za in vivo isporuku gena, posebno za genske kandidate sa velikom veličinom cDNK kao što je FVIII.
[0348] Da bi se procenila potencijalna upotreba LV-FVIII za lečenje hemofilije A (HemA), varijante humanog FVIII (hFVIII) optimizovane kodonom stavljene ispod promotera specifičnog za hepatocite ugrađene su u LV sistem koji sadrži više kopija mikroRNK-142 ciljne sekvence kako bi se minimizirala ekspresija FVIII u ćelijama koje predstavljaju antigen i smanjila verovatnoća indukovanja anti-FVIII antitela. Vektori LV-hFVIII su proizvedeni prolaznom transfekcijom 293T ćelija, praćeno 1000-strukom koncentracijom ultracentrifugiranjem i procenjeni na HemA modelima miša. Posle intravenske primene LV-hFVIII, nivo hFVIII u cirkulaciji je praćen aktivnošću FVIII i testovima antigena, efikasnost transdukcije LV u jetri je procenjena merenjem kopija LV DNK putem kvantitativne PCR i transgenske RNK putem in situ hibridizacije, anti-hFVIII antitela merena su ELISA testom ukupnog anti-hFVIII antitela.
[0349] Perzistentna ekspresija FVIII je primećena za sve varijante LV-hFVIII kod HemA miševa koji su lečeni u neonatalnoj fazi. Pri dozi od 1.5E<10>transducirajućih jedinica/kg, LV koji kodira kodonom optimizovan hFVIII (LV-cohFVIII) rezultirao je 30 do 100 puta većim FVIII u cirkulaciji od LV koji kodira divlji tip hFVIII (Slika 12C), dok je broj kopija vektora u ćelijama jetre i procenat FVIII RNK pozitivnih ćelija bio uporediv u svim testiranim grupama (Slika 12B). Kombinacija optimizacije kodona sa XTEN (LV-cohFVIII-XTEN), nestrukturiranim hidrofilnim polipeptidom koji verovatno poboljšava vreme poluraspada u cirkulaciji povećanjem hidrodinamičke veličine korisnog opterećenja, rezultirala je sa 30-50 IU/mL aktivnosti FVIII u plazmi, što predstavlja 3,000 to 5,000% normalnog nivoa FVIII u cirkulaciji (Slika 12A, Slika 17). Štaviše, anti-hFVIII antitela su otkrivena samo kod miševa sa supra fiziološkim nivoom hFVIII (Slika 14), ali nikakav citotoksični T limfocitni odgovor na LV transdukovane ćelije nije primećen kod miševa pozitivnih na anti-hFVIII antitela (Slike 15
11
i 16A-16D). Naš rezultat podržava dalji razvoj LV-FVIII za in vivo gensku terapiju hemofilije A.
SPISAK SEKVENCI
[0350]
11
11
11
11
��
12
12
12
��
12
��
1
11
12
1
14
�
1
1
1
1
14
��
��
��
��
��
��
�
11
��
1
��
�
�
�
�
1
1
11
12
1
��
1
1
1
1
1
1
11
��
�
��
�
�
�
�
�
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
1
11
12
�
��
1
1
�
1
�
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
21
21
21
21

Claims (15)

Patentni zahtevi
1. Izolovana nukleinska kiselina koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid sa aktivnošću FVIII, naznačena time što nukleotidna sekvenca sadrži najmanje 95% identičnosti sekvence sa nukleotidima 58-2277 i 2320-4374 iz SEQ ID NO: 71.
2. Izolovani molekul nukleinske kiseline prema zahtevu 1, naznačen time što nukleotidna sekvenca sadrži najmanje 99% identičnosti sekvence sa nukleotidima 58-2277 i 2320-4374 iz SEQ ID NO: 71.
3. Izolovani molekul nukleinske kiseline prema zahtevu 1, naznačen time što nukleotidna sekvenca sadrži nukleotide 58-2277 i 2320-4374 iz SEQ ID NO: 71.
4. Izolovani molekul nukleinske kiseline prema bilo kom od zahteva 1 do 3, naznačen time što nukleotidna sekvenca dalje sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira signalni peptid, pri čemu sekvenca nukleinske kiseline koja kodira signalni peptid ima najmanje 60%, najmanje 70% , najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99%, ili 100% identičnosti sekvence sa:
(i) nukleotidima 1 do 57 iz SEQ ID NO: 1;
(ii) nukleotidima 1 do 57 iz SEQ ID NO: 2;
(iii) nukleotidima 1 do 57 iz SEQ ID NO: 3;
(iv) nukleotidima 1 do 57 iz SEQ ID NO: 4;
(v) nukleotidima 1 do 57 iz SEQ ID NO: 5;
(vi) nukleotidima 1 do 57 iz SEQ ID NO: 6;
(vii) nukleotidima 1 do 57 iz SEQ ID NO: 70;
(viii) nukleotidima 1 do 57 iz SEQ ID NO: 71; ili
(ix) nukleotidima 1 do 57 iz SEQ ID NO: 68.
5. Izolovani molekul nukleinske kiseline prema bilo kom od zahteva 1 do 4, naznačen time što molekul nukleinske kiseline sadrži jednu ili više karakteristika izabranih iz grupe koju čine:
(a) indeks adaptacije humanog kodona, molekul nukleinske kiseline ili njegov deo je povećan u odnosu na SEQ ID NO: 16;
(b) frekvencija optimalnih kodona nukleotidne sekvence ili njenog dela je povećana u odnosu na SEQ ID NO:16;
(c) nukleotidna sekvenca ili njen deo sadrži veći procenat G/C nukleotida u poređenju sa procentom G/C nukleotida u SEQ ID NO: 16;
(d) relativna upotreba sinonima kodona nukleotidne sekvence ili njenog dela je povećana u odnosu na SEQ ID NO: 16;
(e) efektivni broj kodona nukleotidne sekvence ili njenog dela je smanjen u odnosu na SEQ ID NO: 16;
(f) nukleotidna sekvenca sadrži manje MARS/ARS sekvenci (SEQ ID NOs: 21 i 22) u odnosu na SEQ ID NO: 16;
(g) nukleotidna sekvenca sadrži manje destabilizujućih elemenata (SEQ ID NOs: 23 i 24) u odnosu na SEQ ID NO: 16; i
(h) bilo koja njihova kombinacija.
6. Izolovani molekul nukleinske kiseline prema bilo kom od zahteva 1 do 5, naznačen time što dalje sadrži heterolognu nukleotidnu sekvencu koja kodira heterolognu sekvencu aminokiseline.
7. Izolovani molekul nukleinske kiseline prema zahtevu 6, naznačen time što je heterologna aminokiselinska sekvenca konstantni region imunoglobulina ili njegov deo, XTEN, transferin, albumin ili PAS sekvenca.
8. Izolovani molekul nukleinske kiseline prema zahtevu 7, naznačen time što nukleotidna sekvenca sadrži SEQ ID NO: 72.
9. Izolovani molekul nukleinske kiseline prema zahtevu 6 ili 7, naznačen time što je heterologna aminokiselinska sekvenca vezana za N-terminus ili C-terminus aminokiselinske sekvence kodirane nukleotidnom sekvencom ili insertovana između dve aminokiseline u sekvenci aminokiseline koja je kodirana sa nukleotidnom sekvencom na jednom ili više mesta insercije izabranih iz tabele 3.
10. Izolovani molekul nukleinske kiseline prema bilo kom od zahteva 1 do 9, naznačen time što je polipeptid FVIII, FVIII pune dužine ili FVIII sa izbrisanim B domenom.
11. Vektor naznačen time što sadrži molekul nukleinske kiseline prema bilo kom od zahteva 1 do 10.
12. Vektor prema zahtevu 11, naznačen time što je vektor lentivirusni vektor.
13. Ćelija domaćina koja sadrži molekul nukleinske kiseline prema bilo kom od zahteva 1 do 10 ili vektor prema zahtevu 11 ili 12.
14. Postupak za proizvodnju polipeptida sa aktivnošću FVIII, koji obuhvata: kultivisanje ćelije domaćina prema zahtevu 13 pod uslovima u kojima se proizvodi polipeptid sa aktivnošću FVIII, i preuzimanje polipeptida sa aktivnošću FVIII.
15. Molekul nukleinske kiseline prema bilo kom od zahteva 1 do 10, ili vektor prema zahtevu 11 ili 12 za upotrebu u postupku lečenja poremećaja krvarenja.
21
RS20220841A 2016-02-01 2017-01-31 Optimizovani geni faktora viii RS63548B1 (sr)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662289696P 2016-02-01 2016-02-01
US201662409739P 2016-10-18 2016-10-18
PCT/US2017/015879 WO2017136358A1 (en) 2016-02-01 2017-01-31 Optimized factor viii genes
EP17705236.2A EP3411478B1 (en) 2016-02-01 2017-01-31 Optimized factor viii genes

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS63548B1 true RS63548B1 (sr) 2022-09-30

Family

ID=58044178

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20220841A RS63548B1 (sr) 2016-02-01 2017-01-31 Optimizovani geni faktora viii

Country Status (23)

Country Link
US (2) US11753461B2 (sr)
EP (2) EP3411478B1 (sr)
JP (3) JP7217630B2 (sr)
KR (1) KR20180118659A (sr)
CN (2) CN109072214B (sr)
AU (3) AU2017214378B2 (sr)
CA (1) CA3012695A1 (sr)
CL (1) CL2018002054A1 (sr)
CO (1) CO2018009120A2 (sr)
DK (1) DK3411478T3 (sr)
ES (1) ES2926585T3 (sr)
HR (1) HRP20221089T1 (sr)
HU (1) HUE059941T2 (sr)
IL (2) IL320404A (sr)
LT (1) LT3411478T (sr)
MX (2) MX2018009375A (sr)
PH (1) PH12018501628B1 (sr)
PL (1) PL3411478T3 (sr)
PT (1) PT3411478T (sr)
RS (1) RS63548B1 (sr)
SG (2) SG11201806398YA (sr)
SI (1) SI3411478T1 (sr)
WO (1) WO2017136358A1 (sr)

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK2956477T4 (da) 2013-02-15 2024-04-15 Bioverativ Therapeutics Inc Optimeret faktor viii-gen
US11008561B2 (en) 2014-06-30 2021-05-18 Bioverativ Therapeutics Inc. Optimized factor IX gene
KR20180118659A (ko) 2016-02-01 2018-10-31 바이오버라티브 테라퓨틱스 인크. 최적화된 viii 인자 유전자
TWI904068B (zh) * 2017-08-09 2025-11-11 美商生物化學醫療公司 核酸分子及其用途
SG11202007114VA (en) * 2018-02-01 2020-08-28 Bioverativ Therapeutics Inc Use of lentiviral vectors expressing factor viii
KR102245539B1 (ko) 2018-02-12 2021-04-29 주식회사 지앤피바이오사이언스 코어-쉘 구조의 마이크로 입자를 유효성분으로 포함하는 성장인자 유전자 발현 증가용 조성물
US12162994B2 (en) 2018-03-02 2024-12-10 Sigilon Therapeutics, Inc. Biocompatible hydrogel capsules and process for preparing same
MX2020010369A (es) 2018-04-04 2020-10-22 Sigilon Therapeutics Inc Particulas implantables y metodos relacionados.
WO2020033863A1 (en) * 2018-08-09 2020-02-13 Bioverativ Therapeutics Inc. Nucleic acid molecules and uses thereof for non-viral gene therapy
AU2019393880A1 (en) * 2018-12-06 2021-07-15 Bioverativ Therapeutics Inc. Use of lentiviral vectors expressing factor IX
US10654911B1 (en) * 2019-04-02 2020-05-19 Beijing Neoletix Biological Technology Co., Ltd. Vector co-expressing truncated von Willebrand factor and factor VIII
AU2020258483A1 (en) 2019-04-17 2021-11-11 Evox Therapeutics, Ltd. Compositions of exosomes and AAV
TW202126284A (zh) * 2019-09-30 2021-07-16 美商百歐維拉提夫治療公司 慢病毒載體配製物
CN111647625A (zh) * 2019-12-25 2020-09-11 深圳三智医学科技有限公司 一种提高人凝血因子ix表达水平的方法
CN111808863B (zh) * 2020-06-23 2021-05-28 康霖生物科技（杭州）有限公司 一种密码子优化的凝血因子viii基因及其构建体
WO2021262963A1 (en) 2020-06-24 2021-12-30 Bioverativ Therapeutics Inc. Methods for the removal of free factor viii from preparations of lentiviral vectors modified to express said protein
EP4392444A1 (en) 2021-08-23 2024-07-03 Bioverativ Therapeutics Inc. Engineered itr sequences and methods of use
KR20240049332A (ko) * 2021-08-23 2024-04-16 바이오버라티브 테라퓨틱스 인크. 최적화된 인자 viii 유전자
CA3229668A1 (en) 2021-08-23 2023-03-02 Bioverativ Therapeutics Inc. Baculovirus expression system
EP4408874A1 (en) * 2021-09-30 2024-08-07 Bioverativ Therapeutics Inc. Nucleic acids encoding factor viii polypeptides with reduced immunogenicity
US20250276093A1 (en) * 2022-04-20 2025-09-04 AskBio Inc. Therapeutic adeno-associated virus using codon optimized nucleic acid encoding factor viii
JP2025515356A (ja) * 2022-04-28 2025-05-14 ジョイント・ストック・カンパニー “バイオキャド” Ｆｖｉｉｉ－ｂｄｄおよび異種シグナルペプチドに基づく融合タンパク質をコードする単離された核酸
WO2025219525A1 (en) 2024-04-19 2025-10-23 Fondazione Telethon Combinations, inhibitors, viral vectors, methods, and uses for in vivo gene therapy and gene editing

Family Cites Families (193)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4704362A (en) 1977-11-08 1987-11-03 Genentech, Inc. Recombinant cloning vehicle microbial polypeptide expression
US4965188A (en) 1986-08-22 1990-10-23 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
JPH0788399B2 (ja) 1985-04-12 1995-09-27 ジェネティックス・インスチチュ−ト・インコ−ポレ−テッド 新規プロコアギュラント蛋白質
KR910006424B1 (ko) 1985-08-21 1991-08-24 인코텍스 비.브이 편성브리프(brief) 제조방법
WO1987004187A1 (en) 1986-01-03 1987-07-16 Genetics Institute, Inc. METHOD FOR PRODUCING FACTOR VIII:c-TYPE PROTEINS
US5595886A (en) 1986-01-27 1997-01-21 Chiron Corporation Protein complexes having Factor VIII:C activity and production thereof
US4800159A (en) 1986-02-07 1989-01-24 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences
US5543502A (en) 1986-06-24 1996-08-06 Novo Nordisk A/S Process for producing a coagulation active complex of factor VIII fragments
EP0832981A1 (en) 1987-02-17 1998-04-01 Pharming B.V. DNA sequences to target proteins to the mammary gland for efficient secretion
AU600575B2 (en) 1987-03-18 1990-08-16 Sb2, Inc. Altered antibodies
US6060447A (en) 1987-05-19 2000-05-09 Chiron Corporation Protein complexes having Factor VIII:C activity and production thereof
US5171844A (en) 1987-06-12 1992-12-15 Gist-Brocades N.W. Proteins with factor viii activity: process for their preparation using genetically-engineered cells and pharmaceutical compositions containing them
US6346513B1 (en) 1987-06-12 2002-02-12 Baxter Trading Gmbh Proteins with factor VIII activity: process for their preparation using genetically-engineered cells and pharmaceutical compositions containing them
DE3720246A1 (de) 1987-06-19 1988-12-29 Behringwerke Ag Faktor viii:c-aehnliches molekuel mit koagulationsaktivitaet
FR2619314B1 (fr) 1987-08-11 1990-06-15 Transgene Sa Analogue du facteur viii, procede de preparation et composition pharmaceutique le contenant
US6780613B1 (en) 1988-10-28 2004-08-24 Genentech, Inc. Growth hormone variants
AU648020B2 (en) 1989-02-21 1994-04-14 Washington University Modified forms of reproductive hormones
US5633076A (en) 1989-12-01 1997-05-27 Pharming Bv Method of producing a transgenic bovine or transgenic bovine embryo
SE465222C5 (sv) 1989-12-15 1998-02-10 Pharmacia & Upjohn Ab Ett rekombinant, humant faktor VIII-derivat och förfarande för dess framställning
MX9204374A (es) 1991-07-25 1993-03-01 Idec Pharma Corp Anticuerpo recombinante y metodo para su produccion.
US5736137A (en) 1992-11-13 1998-04-07 Idec Pharmaceuticals Corporation Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma
DE669986T1 (de) 1992-11-13 1996-10-10 Idec Pharma Corp Völlig unfunktionelle konsensus-kozak-sequenzen zur säugetier-exprimierung.
SE504074C2 (sv) 1993-07-05 1996-11-04 Pharmacia Ab Proteinberedning för subkutan, intramuskulär eller intradermal administrering
US5827690A (en) 1993-12-20 1998-10-27 Genzyme Transgenics Corporatiion Transgenic production of antibodies in milk
GB9422383D0 (en) 1994-11-05 1995-01-04 Wellcome Found Antibodies
US6818439B1 (en) * 1994-12-30 2004-11-16 Chiron Corporation Methods for administration of recombinant gene delivery vehicles for treatment of hemophilia and other disorders
US6030613A (en) 1995-01-17 2000-02-29 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of therapeutics
US6485726B1 (en) 1995-01-17 2002-11-26 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of therapeutics
US6086875A (en) 1995-01-17 2000-07-11 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of immunogens
US6096871A (en) 1995-04-14 2000-08-01 Genentech, Inc. Polypeptides altered to contain an epitope from the Fc region of an IgG molecule for increased half-life
US5739277A (en) 1995-04-14 1998-04-14 Genentech Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6121022A (en) 1995-04-14 2000-09-19 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
SE9503380D0 (sv) 1995-09-29 1995-09-29 Pharmacia Ab Protein derivatives
US6013516A (en) 1995-10-06 2000-01-11 The Salk Institute For Biological Studies Vector and method of use for nucleic acid delivery to non-dividing cells
GB9524973D0 (en) 1995-12-06 1996-02-07 Lynxvale Ltd Viral vectors
US6458563B1 (en) 1996-06-26 2002-10-01 Emory University Modified factor VIII
WO1998005787A1 (en) 1996-08-02 1998-02-12 Bristol-Myers Squibb Company A method for inhibiting immunoglobulin-induced toxicity resulting from the use of immunoglobulins in therapy and in vivo diagnosis
CN1233291A (zh) 1996-09-06 1999-10-27 宾西法尼亚大学托管会 重组腺伴随病毒定向基因治疗的方法
GB9621680D0 (en) 1996-10-17 1996-12-11 Oxford Biomedica Ltd Lentiviral vectors
WO1998017815A1 (en) 1996-10-17 1998-04-30 Oxford Biomedica (Uk) Limited Retroviral vectors
GB9622500D0 (en) 1996-10-29 1997-01-08 Oxford Biomedica Ltd Therapeutic gene
WO1998023289A1 (en) 1996-11-27 1998-06-04 The General Hospital Corporation MODULATION OF IgG BINDING TO FcRn
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
CA2225189C (en) 1997-03-06 2010-05-25 Queen's University At Kingston Canine factor viii gene, protein and methods of use
PL191251B1 (pl) 1997-03-14 2006-04-28 Idec Pharma Corp Sposób wprowadzania żądanego DNA w docelowe miejsce w genomie ssaka i układ wektorów
US6207455B1 (en) 1997-05-01 2001-03-27 Lung-Ji Chang Lentiviral vectors
WO1999003496A1 (en) 1997-07-21 1999-01-28 The University Of North Carolina At Chapel Hill Factor ix antihemophilic factor with increased clotting activity
GB9722131D0 (en) 1997-10-20 1997-12-17 Medical Res Council Method
US5994136A (en) 1997-12-12 1999-11-30 Cell Genesys, Inc. Method and means for producing high titer, safe, recombinant lentivirus vectors
US6242195B1 (en) 1998-04-02 2001-06-05 Genentech, Inc. Methods for determining binding of an analyte to a receptor
DE69937291T2 (de) 1998-04-02 2008-07-10 Genentech, Inc., South San Francisco Antikörpervarianten und fragmente davon
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
US6528624B1 (en) 1998-04-02 2003-03-04 Genentech, Inc. Polypeptide variants
GB9809951D0 (en) 1998-05-08 1998-07-08 Univ Cambridge Tech Binding molecules
US20020142374A1 (en) 1998-08-17 2002-10-03 Michael Gallo Generation of modified molecules with increased serum half-lives
US6924365B1 (en) 1998-09-29 2005-08-02 Transkaryotic Therapies, Inc. Optimized messenger RNA
US20090017533A1 (en) 1998-09-29 2009-01-15 Shire Human Genetic Therapies, Inc., A Delaware Corporation Optimized messenger rna
US6103526A (en) 1998-10-08 2000-08-15 Protein Sciences Corporation Spodoptera frugiperda single cell suspension cell line in serum-free media, methods of producing and using
EP1006183A1 (en) 1998-12-03 2000-06-07 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Recombinant soluble Fc receptors
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
KR101077001B1 (ko) 1999-01-15 2011-10-26 제넨테크, 인크. 효과기 기능이 변화된 폴리펩티드 변이체
WO2000066759A1 (en) 1999-04-29 2000-11-09 Cell Genesys, Inc. Method and means for producing high titer, safe, recombinant lentivirus vectors
CA2401327C (en) 2000-03-03 2014-05-06 Valentis, Inc. Nucleic acid formulations comprising poly-amino acids for gene delivery and methods of use
JP2003530838A (ja) 2000-04-12 2003-10-21 ヒューマン ゲノム サイエンシズ インコーポレイテッド アルブミン融合タンパク質
AU2002226028A1 (en) 2000-11-14 2002-05-27 Board Of Regents, Unversity Of Texas Systems Mutant human factor ix with an increased resistance to inhibition by heparin
GB0029407D0 (en) 2000-12-01 2001-01-17 Affitech As Product
PT1355919E (pt) 2000-12-12 2011-03-02 Medimmune Llc Moléculas com semivida longa, composições que as contêm e suas utilizações
US20020159978A1 (en) 2001-02-06 2002-10-31 James Allen Muscle-directed gene transfer by use of recombinant AAV-1 and AAV-6 virions
US6888319B2 (en) 2001-03-01 2005-05-03 Palomar Medical Technologies, Inc. Flashlamp drive circuit
CA2440582A1 (en) 2001-03-09 2002-10-03 Dyax Corp. Serum albumin binding moieties
US20040106794A1 (en) 2001-04-16 2004-06-03 Schering Corporation 3,4-Di-substituted cyclobutene-1,2-diones as CXC-chemokine receptor ligands
US6808905B2 (en) 2001-05-14 2004-10-26 Cell Genesys, Inc. Lentiviral vectors encoding clotting factors for gene therapy
MXPA04001982A (es) 2001-09-04 2004-06-07 Merck Patent Gmbh Factor ix modificado.
WO2003042361A2 (en) 2001-11-09 2003-05-22 Government Of The United States Of America, Department Of Health And Human Services Production of adeno-associated virus in insect cells
CN103555677B (zh) 2001-11-13 2018-01-30 宾夕法尼亚大学托管会 检测和/或鉴定腺伴随病毒(aav)序列以及分离所鉴定的新型序列的方法
WO2003052051A2 (en) 2001-12-17 2003-06-26 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Adeno-associated virus (aav) serotype 8 sequences
ES2425738T3 (es) 2001-12-21 2013-10-17 Human Genome Sciences, Inc. Proteínas de fusión de la albúmina
US20080194481A1 (en) 2001-12-21 2008-08-14 Human Genome Sciences, Inc. Albumin Fusion Proteins
KR101271635B1 (ko) 2001-12-21 2013-06-12 휴먼 게놈 사이언시즈, 인코포레이티드 알부민 융합 단백질
US6899917B2 (en) 2001-12-27 2005-05-31 3M Innovative Properties Company Powdered epoxy composition
US20040002587A1 (en) 2002-02-20 2004-01-01 Watkins Jeffry D. Fc region variants
US20040132101A1 (en) 2002-09-27 2004-07-08 Xencor Optimized Fc variants and methods for their generation
CA2478011C (en) 2002-03-01 2013-05-21 Immunomedics, Inc. Bispecific antibody point mutations for enhancing rate of clearance
US7317091B2 (en) 2002-03-01 2008-01-08 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
AU2002316574B2 (en) 2002-03-15 2008-05-01 Brandeis University Central airway administration for systemic delivery of therapeutics
US6615782B1 (en) 2002-04-12 2003-09-09 Delphi Technologies, Inc. Two-step finger follower rocker arm
WO2003100053A1 (en) 2002-05-22 2003-12-04 The Children's Hospital Of Philadelphia Compositions and methods for the treatment of hemophilia a
US7425620B2 (en) 2002-08-14 2008-09-16 Scott Koenig FcγRIIB-specific antibodies and methods of use thereof
WO2004029207A2 (en) 2002-09-27 2004-04-08 Xencor Inc. Optimized fc variants and methods for their generation
DK1562972T3 (da) 2002-10-15 2010-12-06 Facet Biotech Corp Modifikation af FcRn-bindingsaffiniteter eller serumhalveringstider for antistoffer ved mutagenese
GB2395337B (en) 2002-11-14 2005-12-28 Gary Michael Wilson Warning Unit
EP2368578A1 (en) 2003-01-09 2011-09-28 Macrogenics, Inc. Identification and engineering of antibodies with variant Fc regions and methods of using same
US7041635B2 (en) 2003-01-28 2006-05-09 In2Gen Co., Ltd. Factor VIII polypeptide
US20090010920A1 (en) 2003-03-03 2009-01-08 Xencor, Inc. Fc Variants Having Decreased Affinity for FcyRIIb
US8388955B2 (en) 2003-03-03 2013-03-05 Xencor, Inc. Fc variants
US9715692B1 (en) 2003-04-11 2017-07-25 Facebook, Inc. System for managing bids for pay-per-click search engines
DK1616012T3 (da) 2003-04-24 2008-04-21 San Raffaele Centro Fond Lentivirale vektorer bærende syntetiske bidirektionelle promotorer og anvendelser deraf
TWI353991B (en) 2003-05-06 2011-12-11 Syntonix Pharmaceuticals Inc Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
WO2005013901A2 (en) 2003-07-31 2005-02-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds and compositions for use in modulation of small non-coding rnas
GB0324368D0 (en) 2003-10-17 2003-11-19 Univ Cambridge Tech Polypeptides including modified constant regions
GB0325379D0 (en) 2003-10-30 2003-12-03 Oxford Biomedica Ltd Vectors
WO2005077981A2 (en) 2003-12-22 2005-08-25 Xencor, Inc. Fc POLYPEPTIDES WITH NOVEL Fc LIGAND BINDING SITES
EP1706424B1 (en) 2004-01-12 2009-07-22 Applied Molecular Evolution, Inc. Fc region variants
US7276585B2 (en) 2004-03-24 2007-10-02 Xencor, Inc. Immunoglobulin variants outside the Fc region
WO2005123780A2 (en) 2004-04-09 2005-12-29 Protein Design Labs, Inc. Alteration of fcrn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
WO2006007539A1 (en) 2004-07-01 2006-01-19 Virxsys Corporation Vector packaging cell line
WO2006085967A2 (en) 2004-07-09 2006-08-17 Xencor, Inc. OPTIMIZED ANTI-CD20 MONOCONAL ANTIBODIES HAVING Fc VARIANTS
CN103172731A (zh) 2004-07-15 2013-06-26 赞科股份有限公司 优化的Fc变体
ES2436741T3 (es) 2004-09-22 2014-01-07 St. Jude Children's Research Hospital Expresión mejorada de Factor IX en vectores de terapia génica
WO2006047350A2 (en) 2004-10-21 2006-05-04 Xencor, Inc. IgG IMMUNOGLOBULIN VARIANTS WITH OPTIMIZED EFFECTOR FUNCTION
SG162726A1 (en) 2005-05-27 2010-07-29 San Raffaele Centro Fond Gene vector comprising mi-rna
JP5193600B2 (ja) 2005-07-05 2013-05-08 株式会社カネカ メタクリル系樹脂組成物
AU2006280312A1 (en) 2005-08-12 2007-02-22 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
EP2311967B1 (en) 2005-10-20 2017-09-20 UniQure IP B.V. Improved AAV vectors produced in insect cells
US8476234B2 (en) 2006-02-03 2013-07-02 Prolor Biotech Inc. Long-acting coagulation factors and methods of producing same
US8048848B2 (en) 2006-02-03 2011-11-01 Prolor Biotech Ltd. Long-acting interferons and derivatives thereof and methods thereof
CN101406105B (zh) 2006-03-13 2010-11-10 皇家飞利浦电子股份有限公司 用于固态照明系统的自适应控制装置和方法
EP2037892B1 (en) 2006-06-19 2015-03-18 Asklepios Biopharmaceutical, Inc. Modified factor viii and factor ix genes and vectors for gene therapy
US8383388B2 (en) 2006-06-19 2013-02-26 Catalyst Biosciences, Inc. Modified coagulation factor IX polypeptides and use thereof for treatment
KR101589259B1 (ko) 2006-06-21 2016-02-01 유니큐어 아이피 비.브이. 곤충세포 내 ａａｖ의 생산에 유용한 ａａｖ-ｒｅｐ78의 번역을 위한 변형된 개시 코돈을 갖는 벡터
GB0614780D0 (en) 2006-07-25 2006-09-06 Ucb Sa Biological products
AU2007294805A1 (en) 2006-09-14 2008-03-20 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
US8167585B2 (en) 2006-09-28 2012-05-01 Siemens Industry, Inc. Devices and/or systems for mounting an auxiliary blower
US7700734B2 (en) 2007-01-09 2010-04-20 Shu-Wha Lin Recombinant human factor IX and use thereof
EP2144930A1 (en) 2007-04-18 2010-01-20 ZymoGenetics, Inc. Single chain fc, methods of making and methods of treatment
KR20100021601A (ko) 2007-05-14 2010-02-25 바이오겐 아이덱 엠에이 인코포레이티드 단일-쇄 Ｆｃ(ＳｃＦｃ) 부분, 이를 포함하는 결합 폴리펩타이드, 및 이에 관련된 방법
HRP20110368T1 (hr) 2007-06-21 2011-06-30 Technische Universitt Mnchen Biološki aktivni proteini s povećanom stabilnošću in vivo i/ili in vitro
AU2008311973B2 (en) 2007-10-15 2013-10-03 Cangene Corporation Human Factor IX variants with an extended half life
WO2009075772A1 (en) 2007-12-06 2009-06-18 Wyeth Crystal structure of human factor viii and uses thereof
WO2009140015A2 (en) 2008-04-16 2009-11-19 Bayer Healthcare Llc Site-directed modification of factor ix
RU2010146387A (ru) 2008-04-16 2012-05-27 БАЙЕР ХЕЛСКЕР ЛЛСи (US) Модифицированные полипептиды фактора ix и их применение
EP2811017A2 (en) 2008-04-21 2014-12-10 Novo Nordisk Health Care AG Hyperglycosylated human coagulation factor IX
DK3192874T3 (da) 2008-06-18 2019-12-16 Oxford Biomedica Ltd Virusoprensning
US10273502B2 (en) 2008-06-18 2019-04-30 Oxford Biomedica (Uk) Limited Virus purification
EP2149603A1 (en) 2008-07-28 2010-02-03 DRK-Blutspendedienst Baden-Württemberg-Hessen gGmbH Factor IX variants with clotting activity in absence of their cofactor and their use for treating bleeding disorders
EP2337849B1 (en) 2008-09-15 2018-06-13 uniQure biopharma B.V. Factor ix polypeptide mutant, its uses and a method for its production
WO2010055413A1 (en) 2008-11-12 2010-05-20 Fondazione Centro San Raffaele Del Monte Tabor Gene vector for inducing transgene-specific immune tolerance
US20110046060A1 (en) 2009-08-24 2011-02-24 Amunix Operating, Inc., Coagulation factor IX compositions and methods of making and using same
US8680050B2 (en) 2009-02-03 2014-03-25 Amunix Operating Inc. Growth hormone polypeptides fused to extended recombinant polypeptides and methods of making and using same
US8703717B2 (en) 2009-02-03 2014-04-22 Amunix Operating Inc. Growth hormone polypeptides and methods of making and using same
SI2393828T1 (sl) 2009-02-03 2017-01-31 Amunix Operating Inc. Podaljšani rekombinantni polipetidi in sestavki, ki jih obsegajo
US9050269B2 (en) 2009-03-10 2015-06-09 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Protection of virus particles from phagocytosis by expression of CD47
JP5770161B2 (ja) 2009-04-06 2015-08-26 ノヴォ ノルディスク アー／エス 血小板への第ｖｉｉｉ因子タンパク質の標的送達
AU2010243276B2 (en) 2009-04-30 2016-09-15 Fondazione Telethon Ets Gene vector
WO2010138263A2 (en) 2009-05-28 2010-12-02 University Of Massachusetts Novel aav 's and uses thereof
US20120134977A1 (en) 2009-06-01 2012-05-31 Yeda Research And Development Co. Ltd. Prodrugs containing albumin binding probe
AU2010258898B8 (en) 2009-06-08 2015-02-05 Amunix Operating Inc. Glucose-regulating polypeptides and methods of making and using same
JP5805634B2 (ja) 2009-06-08 2015-11-04 アムニクス オペレーティング インコーポレイテッド 成長ホルモンポリペプチド並びにその作成及び使用方法
GB0911870D0 (en) 2009-07-08 2009-08-19 Ucl Business Plc Optimised coding sequence and promoter
WO2011028344A2 (en) 2009-08-25 2011-03-10 Amunix Operating Inc. Interleukin-1 receptor antagonist compositions and methods of making and using same
RU2012115480A (ru) 2009-09-18 2013-10-27 Микромет Аг РЕЖИМ ДОЗИРОВАНИЯ ПРИ ВВЕДЕНИИ БИСПЕЦИФИЧЕСКОГО АНТИТЕЛА EpCAMxCD3
US8326547B2 (en) 2009-10-07 2012-12-04 Nanjingjinsirui Science & Technology Biology Corp. Method of sequence optimization for improved recombinant protein expression using a particle swarm optimization algorithm
BR112012013502A2 (pt) 2009-12-06 2017-01-10 Biogen Idec Hemophilia Inc "polipeptídeos quiméricos e híbridos de fator viii-fc, e métodos de uso dos mesmos".
KR101712820B1 (ko) 2010-02-23 2017-03-22 사노피 항-알파2 인테그린 항체 및 그 용도
DK2826860T3 (en) 2010-04-23 2018-12-03 Univ Massachusetts CNS targeting AAV vectors and methods for their use
SG10201913700SA (en) 2010-07-09 2020-03-30 Bioverativ Therapeutics Inc Factor ix polypeptides and methods of use thereof
ES2739503T3 (es) 2010-07-09 2020-01-31 Bioverativ Therapeutics Inc Moléculas de cadena simple procesables y polipéptidos producidos usándolas
US9611310B2 (en) 2010-07-09 2017-04-04 Bioverativ Therapeutics Inc. Systems for factor VIII processing and methods thereof
US20130017997A1 (en) 2010-08-19 2013-01-17 Amunix Operating Inc. Factor VIII Compositions and Methods of Making and Using Same
EP2714909A4 (en) 2011-06-03 2014-12-17 Univ Michigan PROCESS FOR THE PREPARATION OF FACTOR VIII PROTEINS BY RECOMBINATION PROCEDURES
DK2729161T3 (en) 2011-07-08 2019-04-08 Bioverativ Therapeutics Inc FACTOR VIII CHEMICAL AND HYBRID POLYPEPTIDES AND PROCEDURES FOR USE THEREOF
WO2013093760A2 (en) 2011-12-19 2013-06-27 Grifols, S.A. Compositions, methods, and kits for preparing sialylated recombinant proteins
CN111499761A (zh) 2012-01-12 2020-08-07 比奥贝拉蒂治疗公司 嵌合因子viii多肽及其用途
CN111548418A (zh) * 2012-02-15 2020-08-18 比奥贝拉蒂治疗公司 因子viii组合物及其制备和使用方法
NZ628014A (en) 2012-02-15 2016-09-30 Biogen Ma Inc Recombinant factor viii proteins
CN103316356B (zh) 2012-03-22 2016-08-17 北京三诺佳邑生物技术有限责任公司 一种重组慢病毒载体制剂
EP2834259A4 (en) 2012-04-02 2016-08-24 Moderna Therapeutics Inc MODIFIED POLYNUCLEOTIDES
US10202595B2 (en) * 2012-06-08 2019-02-12 Bioverativ Therapeutics Inc. Chimeric clotting factors
AU2013290173B2 (en) 2012-07-11 2018-02-15 Bioverativ Therapeutics Inc. Factor VIII complex with XTEN and von Willebrand Factor protein, and uses thereof
RU2500816C1 (ru) 2012-07-19 2013-12-10 Общество с ограниченной ответственностью "Международный биотехнологический центр "Генериум" ("МБЦ "Генериум") РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК рАК380, КОДИРУЮЩАЯ ПОЛИПЕПТИД РЕКОМБИНАНТНОГО ФАКТОРА IХ СВЕРТЫВАЕМОСТИ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА, ЛИНИЯ КЛЕТОК Cricetulus griseus CHO 1E6 - ПРОДУЦЕНТ РЕКОМБИНАНТНОГО ФАКТОРА IХ СВЕРТЫВАЕМОСТИ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИПЕПТИДА, ОБЛАДАЮЩЕГО АКТИВНОСТЬЮ РЕКОМБИНАНТНОГО ФАКТОРА IХ
DK2911687T3 (da) * 2012-10-26 2019-05-13 Univ Brussel Vrije Vektor til levermålrettet genterapi af hæmofili og fremgangsmåder og anvendelse deraf
DK2956477T4 (da) * 2013-02-15 2024-04-15 Bioverativ Therapeutics Inc Optimeret faktor viii-gen
GB201304973D0 (en) * 2013-03-19 2013-05-01 Profactor Pharma Ltd Recombinant protein
US10548953B2 (en) 2013-08-14 2020-02-04 Bioverativ Therapeutics Inc. Factor VIII-XTEN fusions and uses thereof
EP2881463A1 (en) 2013-12-09 2015-06-10 DRK-Blutspendedienst Baden-Württemberg-Hessen gGmbH Factor IX variants with clotting activity in absence of their cofactor and/or with increased F.IX clotting activity and their use for treating bleeding disorders
PH12016501323B1 (en) 2014-01-10 2022-04-29 Bioverativ Therapeutics Inc Factor viii chimeric proteins and uses thereof
US11008561B2 (en) 2014-06-30 2021-05-18 Bioverativ Therapeutics Inc. Optimized factor IX gene
GB201412494D0 (en) 2014-07-14 2014-08-27 Ospedale San Raffaele And Fond Telethon Vector production
TWI707951B (zh) 2015-04-08 2020-10-21 美商健臻公司 過大腺相關載體之製造
EP3626274B1 (en) 2015-04-16 2025-01-22 Emory University Recombinant promoters and vectors for protein expression in liver and use thereof
AU2016301303B2 (en) 2015-08-03 2021-10-07 Bioverativ Therapeutics Inc. Factor IX fusion proteins and methods of making and using same
PL3377618T3 (pl) 2015-11-19 2021-05-31 Novartis Ag Bufory do stabilizacji preparatów lentiwirusowych
KR20180118659A (ko) 2016-02-01 2018-10-31 바이오버라티브 테라퓨틱스 인크. 최적화된 viii 인자 유전자
WO2019152557A1 (en) 2018-01-30 2019-08-08 Modernatx, Inc. Compositions and methods for delivery of agents to immune cells
SG11202007114VA (en) 2018-02-01 2020-08-28 Bioverativ Therapeutics Inc Use of lentiviral vectors expressing factor viii
WO2020113197A1 (en) 2018-11-30 2020-06-04 Vaccine Stabilization Institute Viral formulations containing amino acids
AU2019393880A1 (en) 2018-12-06 2021-07-15 Bioverativ Therapeutics Inc. Use of lentiviral vectors expressing factor IX
TW202126284A (zh) 2019-09-30 2021-07-16 美商百歐維拉提夫治療公司 慢病毒載體配製物
WO2021262963A1 (en) 2020-06-24 2021-12-30 Bioverativ Therapeutics Inc. Methods for the removal of free factor viii from preparations of lentiviral vectors modified to express said protein
BR112023002395A2 (pt) 2020-08-23 2023-03-21 Bioverativ Therapeutics Inc Sistema de baculovírus modificado para produção aprimorada de dna com extremidades fechadas (cedna)

Also Published As

Publication number Publication date
JP2022089920A (ja) 2022-06-16
US20190185543A1 (en) 2019-06-20
CN109072214B (zh) 2023-02-17
IL260796B1 (en) 2025-11-01
EP3411478A1 (en) 2018-12-12
AU2023202218B2 (en) 2025-10-30
HUE059941T2 (hu) 2023-01-28
AU2017214378B2 (en) 2023-05-04
DK3411478T3 (da) 2022-09-12
JP7217630B2 (ja) 2023-02-03
PT3411478T (pt) 2022-09-13
ES2926585T3 (es) 2022-10-27
CN109072214A (zh) 2018-12-21
AU2026200420A1 (en) 2026-02-12
PH12018501628B1 (en) 2023-11-10
AU2023202218A1 (en) 2023-05-04
CN116218863A (zh) 2023-06-06
LT3411478T (lt) 2022-09-26
WO2017136358A1 (en) 2017-08-10
AU2017214378A1 (en) 2018-09-20
NZ745831A (en) 2025-07-25
IL320404A (en) 2025-06-01
EP4137570A1 (en) 2023-02-22
HK1257078A1 (en) 2019-10-11
BR112018015659A2 (en) 2018-12-26
IL260796A (en) 2018-10-31
SG10201913278PA (en) 2020-02-27
US20240124555A1 (en) 2024-04-18
PH12018501628A1 (en) 2019-06-03
PL3411478T3 (pl) 2022-10-03
KR20180118659A (ko) 2018-10-31
HRP20221089T1 (hr) 2022-11-25
JP2019506166A (ja) 2019-03-07
EP3411478B1 (en) 2022-06-08
CA3012695A1 (en) 2017-08-10
SI3411478T1 (sl) 2022-10-28
MX2018009375A (es) 2018-09-05
CL2018002054A1 (es) 2019-01-25
SG11201806398YA (en) 2018-08-30
MX2023001394A (es) 2023-03-03
CO2018009120A2 (es) 2018-10-22
JP2024114805A (ja) 2024-08-23
US11753461B2 (en) 2023-09-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20240124555A1 (en) Optimized factor viii genes
US20250154489A1 (en) Optimized factor ix gene
AU2019215063B2 (en) Use of lentiviral vectors expressing Factor VIII
EP3889173B1 (en) Optimized factor viii gene
HK40088478A (en) Optimized factor viii genes
RU2803163C2 (ru) Применение лентивирусных векторов, экспрессирующих фактор viii
HK1257078B (en) Optimized factor viii genes
HK40061500B (en) Optimized factor viii gene
BR122024018474A2 (pt) Molécula de ácido nucleico isolado, vetor, célula hospedeira, polipeptídeo, e seu método de produção
BR112018015659B1 (pt) Molécula de ácido nucleico isolada, vetor e método para a produção de um polipeptídeo com atividade de fviii