CN115873099B - 一种改造的重组凝血因子viii及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，更具体地，涉及一种改造的重组凝血因子VIII及其应用。所述重组凝血因子VIII的B结构域包括SQ序列，且所述SQ序列中插入有一个或多个特定的vWF结合位点序列。该改造策略显著提高了FVIII蛋白在细胞和体内的分泌后水平及凝血活性，并且改造后的重组凝血因子VIII在大小上仍能够被rAAV载体包装。相比于原始的FVIII‑SQ蛋白，改造的重组凝血因子VIII在被rAAV载体递送后，动物体内的FVIII浓度有着显著的提高。这将有效地提高药物的治疗效果，解决高剂量带来的毒性等问题，对于血友病基因治疗邻域具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，更具体地，涉及一种改造的重组凝血因子VIII及其应用。
背景技术
血友病A(Hemophilia A,HA)，又称凝血八因子(FVIII)缺乏症，是一种伴X染色体隐性遗传出血性疾病；患者由于FVIII编码基因突变或缺失，导致功能性FVIII蛋白缺失，进而凝血功能异常。血友病A的发病率没有地区和种族差异。在男性人群中，血友病A的发病率约为1/5000，约占血友病患者的80％～85％，其中2/3为重度；女性血友病患者则较为罕见。患者出生即可发病，伴随终生；症状上常见为受伤后持续缓慢出血，无明显诱因的关节和肌肉出血。如果血友病A患者得不到标准规范的治疗，将有很高的致残和致死率。
现在用于血友病A治疗的药物主要有三类：外源性FVIII蛋白注射液、艾美赛珠单抗(Emicizumab)和rAAV基因药物。外源性FVIII蛋白注射液，需要每周注射2-3次，且仅能维持重度血友病A患者(体内FVIII活性小于1％)体内FVIII活性大于1％；艾美赛珠单抗也需要每周注射一次，其仅能维持重度血友病A患者体内FVIII活性为5-10％。两者频繁的日常注射给患者带来的很大的不便和副作用，且维持的FVIII活性水平不高。当体内FVIII活性在1％-5％时，患者仍有自发性组织出血的风险；而体内FVIII活性在5％-25％时，创伤和术后会明显出血。患者仍受疾病所带来的困扰。相比于前两种药物，2022年8月份上市的rAAV药物Roctavian(valoctocogene roxaparvovec)只需一次注射，就能在1年内维持患者体内平均41.9％的FVIII活性，在5年内仍能维持体内超过5％的FVIII活性(参见M.C Ozelo etal,Valoctocogene Roxaparvovec Gene Therapy for Hemophilia A,New EnglandJournal of Medicine,2022,386(11),1013-1025)。这不仅从治疗手段上减轻了患者的痛苦，在效果上也明显优于其他药物。
腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)属于细小病毒科，是一类病毒颗粒小、复制缺陷、无包膜的病毒，迄今尚未发现野生型AAV对人体致病。经人工改造的重组型AAV(recombinant AAV，rAAV)具备安全性好、免疫原性低、组织嗜性广泛、不整合到宿主细胞基因组等优点。近年来，用rAAV作基因治疗载体递送治疗性核酸，已成为基因治疗研究的热点。自2012年第一款AAV药物(Glybera)上市以来，截至2022年11月，已有6款AAV基因治疗药物被批准上市，发展迅猛。但是rAAV作为基因治疗载体也存在明显缺点：其装载外源基因的容量较小，单链基因组AAV装载外源基因的上限为4.7kb，装载外源基因长度的进一步增加，病毒颗粒包装的完整性随之下降。由于装载量的限制，一些较大的基因并不适合用rAAV载体进行递送，如天然的FVIII基因，其cDNA大小为7056bp，编码2351aa的FVIII前体蛋白，远超出rAAV的装载容量。
FVIII前体蛋白是由A1-a1-A2-a2-B-a3-A3-C1-C2九个结构域组成，剪切后构成功能性FVIII蛋白的重链(A1-a1-A2-a2-B)和轻链(A3-C1-C2)(图1)。其中B结构域(741–1648aa)对于FVIII的活性没有直接贡献，却占据FVIII前体蛋白38％的长度。为了满足rAAV药物的容量需求，Lind等人通过用14个氨基酸衔接肽(SQ序列)替换FVIII前体蛋白的B结构域，得到改造后的FVIII-SQ蛋白(图2)，将需要用载体递送的基因大小降至4.4kb。目前BioMarin公司新上市血友病A药物Roctavian(授权专利：CN105636981B)及Spark公司在临床实验阶段的药物SPK-8011(专利申请公布号：CN113226352A)均是使用rAAV载体表达FVIII-SQ蛋白。
虽然Roctavian作为药物有着不错的效果，但是目前利用FVIII-SQ进行基因治疗时，仍存在蛋白分泌和功能较低的情况。这不仅影响了rAAV药物治疗的效果，还要求较高的给药剂量，比如Roctavian需要6E+13vg/kg的注射剂量，才能使重度血友病A患者达到体内平均49.1％的FVIII凝血活性，且随着时间推移患者体内的FVIII表达的量以及FVIII活性会逐步降低。高剂量的rAAV药物不但增加了个人和社会的经济负担，还会引起一系列不良反应，比如，转氨酶升高、肝细胞凋亡、炎症反应等(参见Radoslaw Kaczmarek,Genetherapy–are we ready now？,Haemophilia,2022,28,35-43)。因此，如何提高rAAV药物的药效，降低给药剂量，是rAAV药物重点的研究领域之一。
发明内容
针对现有技术的缺陷，本发明提供了一种重组凝血因子VIII及其应用，所述重组凝血因子VIII的B结构域被替换为含有一个或多个vWF结合位点的SQ序列。该改造策略显著提高了FVIII蛋白在细胞和体内的分泌后水平及凝血活性，并且改造后的重组凝血因子VIII在大小上仍能够被rAAV载体包装。相比于原始的FVIII-SQ蛋白，改造的重组凝血因子VIII在被rAAV载体递送后，动物体内的FVIII浓度有着显著的提高。
为实现上述目的，本发明提供了一种重组凝血因子VIII，所述重组凝血因子VIII的B结构域包括SQ序列，且所述SQ序列中含有一个或多个vWF结合位点；所述vWF结合位点具有：
(1)如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；或
(2)与SEQ ID NO.4或SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；或
(3)与SEQ ID NO.4或SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列。
优选地，所述SQ序列包括前端SQa部分和后端SQb部分，所述前端SQa部分的序列为SFS，所述后端SQb部分的序列为QNPPVLKRHQR；所述一个或多个vWF结合位点被插入至所述SQ序列的前端SQa部分和后端SQb部分之间。
优选地，所述SQ序列中含有1-5个所述vWF结合位点。
优选地，所述vWF结合位点为SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列的全长或部分。
进一步优选地，所述SQ序列中含有3-5个所述vWF结合位点，所述vWF结合位点为SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列的全长或部分。
优选地，所述的重组凝血因子VIII，其编码基因中包括：
(1)由SEQ ID NO：3所示的核酸序列；或
(2)与序列SEQ ID NO：3限定的核酸序列同源性在80％至100％编码相同功能蛋白质的核酸序列；或
(3)SEQ ID NO：3所示的核酸序列经增加、缺失或替换一个或多个氨基酸密码子具有同等活性的由(1)衍生的序列。
按照本发明的另一个方面，提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体用于表达所述的重组凝血因子VIII，其包括编码所述的重组凝血因子VIII的核酸序列。
优选地，所述载体为病毒载体或质粒载体。
优选地，所述病毒载体为重组腺相关病毒载体。
按照本发明的另一个方面，提供了一种重组腺相关病毒，所述重组腺相关病毒含有编码所述的重组凝血因子VIII的编码基因。
按照本发明的另一个方面，提供了一种重组细胞，所述重组细胞含有所述的重组凝血因子VIII的编码基因。
优选地，所述重组细胞含有所述的重组表达载体。
按照本发明的另一个方面，提供了一种药物组合物，其特在于，所述药物组合物包括所述的重组凝血因子VIII、所述的重组表达载体、所述的重组腺相关病毒、所述的重组细胞中的任意一种或多种的组合。
优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或多种的组合。
按照本发明的另一个方面，提供了一种所述的重组凝血因子VIII、所述的重组表达载体、所述的重组腺相关病毒、所述的重组细胞或所述的药物组合物在制备治疗血友病药物中的应用。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：
(1)本发明通过在FVIII-SQ的SQ序列中插入了一条或多条vWF结合位点，极大地提高了改造后载体在体外细胞环境或体内表达后FVIII的有效浓度。
(2)本发明通过优化FVIII-SQ的基因序列，提高了载体对于FVIII的表达效率。
(3)本发明中，利用改造后的FVIII序列和腺相关病毒载体，能够成功在小鼠体内表达，相比于BioMarin所采用的原始FVIII-SQ分子，改造后的FVIII序列，表现出更高含量的FVIII浓度，具有显著差异。这对于有效地提高血友病A治疗效果，解决高剂量带来的毒性等问题具有重要意义。
附图说明
图1为天然FVIII的结构示意图及vWF的结合位点。
图2为FVIII-SQ蛋白的结构图。
图3为本发明实施例1中改造的含有vWF结合位点的FVIII蛋白结构示意图。
图4为本发明实施例2中293F转染改造的FVIII质粒后细胞上清凝血活性检测结果图。
图5为本发明实施例2中293F转染改造的FVIII质粒后细胞上清中FVIII含量检测结果图。
图6为载体GT-0102的质粒图谱。
图7为本发明实施例3中使用rAAV载体在C57小鼠中递送不同FVIII后，小鼠血浆中FVIII含量检测结果图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
术语解释
术语“vWF结合位点”是指天然FVIII蛋白上存在的两个与vWF因子结合的肽段。FVIII蛋白在体内主要通过与vWF蛋白结合维持稳定性，当与vWF蛋白分离后前者便会很快降解。如图1所示，成熟的FVIII蛋白由A1-a1-A2-a2-B-a3-A3-C1-C2九个结构域构成：A1(残基1–336),a1(残基337-376),A2(残基373–710),a2(残基711-740),B(残基741–1648)，a3(残基1649-1689),A3(残基1690–2019),C1(残基2020–2172)and C2(残基2173–2332)。据文献报道，第一个vWF结合位点是位于a3段的残基1672-1689，第二个vWF结合位点是位于C2段的残基2303-2332。图1为天然FVIII的结构示意图及vWF的结合位点，图1中残基1672-1689和残基2303-2332为vWF因子的结合位点，FVIII在表达后会被Furin酶剪切为重链和轻链产生作用。
术语“FVIII-SQ”是指使用SQ序列代替B结构域后得到的B结构域缺陷型FVIII蛋白(图2)。图2为FVIII-SQ蛋白的结构图。其中使用SQ序列替换了天然FVIII中的B结构域。SQ序列由14个氨基酸残基组成：“SFSQNPPVLKRHQR”，序列来自原始B结构域的N端和C端；其中前端SQa部分是B结构域N端的起始序列：“SFS”，后端SQb部分是B结构域C端的末尾序列：“QNPPVLKRHQR”，包含furin酶切位点“RHQR”。
术语“表达盒”是指包含引入宿主细胞时可操作连接的编码序列和调控序列的核酸构建体，分别导致RNA或多肽的转录和/或翻译。表达盒应理解为包括允许转录开始的启动子、目的基因开放阅读框和转录终止子。通常，启动子序列置于目的基因上游，与目的基因的距离与表达控制相容。启动子是RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA序列，它含有RNA聚合酶特异性结合和转录起始所需的保守序列，多数位于结构基因转录起始点的上游，启动子本身不被转录。
术语“载体”是指设计用于转运、转移和/或存储遗传物质，以及表达遗传物质和/或将遗传物质整合到宿主细胞染色体DNA中的核酸分子，例如质粒载体、粘粒载体、人工染色体、噬菌体载体和其他病毒载体。载体通常由至少三个基本单元组成，即复制源、选择标记和多克隆位点。
术语“重组腺相关病毒载体”是指重组非复制型的腺相关病毒，重组腺相关病毒(rAAV)载体包括血清型蛋白衣壳，并包裹着重组的基因组，基因组包括功能性的5’和3’反向末端重复序列(inverted terminal repeats，ITR)，两端ITR之间连接外源基因表达盒替代野生型AAV的rep基因表达盒和/或cap基因表达盒。ITR序列提供对rAAV功能性拯救、复制、包装。如果突变去除AAV两端ITR中的任一段序列，导致无法正确地剪切ssDNA，就会使得基因组二聚体显著增加，在复制时形成双链反向重复序列，最终包装进入AAV衣壳形成双链AAV(scAAV)。一些实施例中，ITR序列来自AAV2。外源基因表达盒通常由一系列表达调控元件和编码区组成。
除了筛选出更具组织亲和性的AAV衣壳和高效启动子元件外，对递送的FVIII蛋白进行分子改造，从而提高药效也是可用的策略。成熟的FVIII蛋白在体内稳定性较差，半衰期一般为8-12h。在体内时，FVIII蛋白通过与范威氏因子(von willebrand factor，vWF)结合来维持其稳定性。申请人发现，通过在FVIII-SQ蛋白中添加与vWF结合的特定的氨基酸位点序列，能显著提高FVIII分泌后的浓度，并提高凝血活性。但是并非添加任意的vWF结合位点或者以任意形式的添加，都能提高FVIII分泌后的浓度。本发明采用的第一个vWF结合位点(记作v1位点)，其v1序列是FVIII的1672-1690残基，见SEQ ID NO：4；第二个vWF结合位点是位于C2段的残基2303-2332，记作v2位点，见SEQ ID NO：5。实验发现，本发明改造方式能有效地提高rAAV药物的治疗效果，并降低给药剂量。此外，改造后的FVIII蛋白在尺寸上仍能满足能够被载体递送的要求。
具体来说，FVIII-SQ为成熟的FVIII凝血因子A1-a1-A2-a2-B-a3-A3-C1-C2九个结构域中的B结构域被替换为SQ序列得到的凝血因子VIII，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明提供的一种重组凝血因子VIII，其以SEQ ID NO.1所示的FVIII-SQ序列作为改造对象，本发明重组凝血因子VIII的B结构域包括SQ序列，且所述SQ序列中还含有一个或多个vWF结合位点；所述vWF结合位点具有(1)如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；或(2)与SEQ ID NO.4或SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；或(3)与SEQ ID NO.4或SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列。本发明所述同一性至少80％，较佳为90％以上，更佳为95％以上，最佳为98％以上。
SQ序列包括前端SQa部分和后端SQb部分，前端SQa部分的序列为“SFS”，后端SQb部分的序列为“QNPPVLKRHQR”；一些实施例中，本发明一个或多个vWF结合位点被插入至所述SQ序列的前端SQa部分和后端SQb部分之间。
较佳实施例中，所述SQ序列中含有1-5个vWF结合位点。vWF结合位点为SEQ IDNO.4所示的氨基酸序列的全长或部分。含有多个vWF结合位点时，多个vWF结合位点对应的序列重复连续排列在SQ序列的前端SQa部分和后端SQb部分之间。
更佳地，所述SQ序列中含有3-5个vWF结合位点，最佳地，SQ序列中含有3-4个vWF结合位点。所述vWF结合位点为SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列的全长或部分。
实验证实，本发明在SQ序列中插入上述vWF结合位点后，能够显著地提高体外细胞培养环境或体内表达后FVIII的有效浓度，从而提高药物地治疗效果，降低给药剂量。
为了满足rAAV载体递送的需求并提高表达后FVIII的有效浓度，本发明以SEQIDNO.1所示的FVIII-SQ作为改造对象，在FVIII-SQ的SQ序列(SQ序列为：“SFSQNPPVLKRHQR”的14个氨基酸)前端SQa部分和后端SQb部分之间插入一个或多个vWF结合位点。本发明上述重组凝血因子VIII的编码基因，包括FVIII-SQ的编码基因，还包括SQ序列中插入的一个或多个vWF结合位点的编码基因。本发明一些实施例中，针对FVIII-SQ进行密码子优化，提供了一种密码子优化后的FVIII-SQ的编码基因，能有效地提高FVIII蛋白的表达效率，所述优化后的FVIII-SQ编码基因为SEQ ID NO：3所示的核酸序列，因此本发明提出的重组凝血因子VIII，其编码基因中包括：(1)由SEQ ID NO：3所示的核酸序列；或(2)与序列SEQ ID NO：3限定的核酸序列同源性在80％至100％编码相同功能蛋白质的核酸序列；或(3)SEQ ID NO：3所示的核酸序列经增加、缺失或替换一个或多个氨基酸密码子具有同等活性的由(1)衍生的序列。一个或多个vWF结合位点的编码基因可单独进行密码子优化，一些实施例中，SEQID NO.4所示的v1位点的编码基因核酸序列为(1)SEQ ID NO.7所示的核酸序列；或(2)与序列SEQ ID NO：7限定的核酸序列同源性在80％至100％编码相同功能蛋白质的核酸序列；或(3)SEQ ID NO：7所示的核酸序列经增加、缺失或替换一个或多个氨基酸密码子具有同等活性的由(1)衍生的序列；SEQ ID NO.5所示的v2位点的编码基因核酸序列为(1)SEQ ID NO.8所示的核酸序列；或(2)与序列SEQ ID NO：8限定的核酸序列同源性在80％至100％编码相同功能蛋白质的核酸序列；或(3)SEQ ID NO：8所示的核酸序列经增加、缺失或替换一个或多个氨基酸密码子具有同等活性的由(1)衍生的序列。本发明所述同源性在80％至100％，较佳为90％以上，更佳为95％以上，最佳为98％以上。
本发明还提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体用于表达本发明所述的重组凝血因子VIII，其包括编码所述的重组凝血因子VIII的核酸序列。
一些实施例中，本发明所述重组表达载体包括目的基因表达盒和位于编码区两端的AAV反向末端重复序列，所述目的基因表达盒包含从5’至3’的可操作连接的启动子和编码本发明所述重组凝血因子VIII的核酸序列，所述表达载体用于细胞转染或制备重组双链腺相关病毒。较佳实施例中，所述AAV反向末端重复序列来自AAV2。所述启动子为CMV启动子或ATh2启动子(专利申请公布号：CN111218446A,序列参见SEQ ID NO.6)。
一些实施例中，所述载体为病毒载体或质粒载体。所述病毒载体较佳为重组腺相关病毒载体。
本发明还提供了一种重组腺相关病毒，所述重组腺相关病毒含有编码本发明所述的重组凝血因子VIII的编码基因。其可通过上述表达载体参与转染宿主细胞而制得。一些实施例中，所述重组腺相关病毒的衣壳蛋白为AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8或AAV9血清型衣壳蛋白。较佳为AAV8血清型衣壳蛋白。
本发明还提供了一种重组细胞，所述重组细胞含有本发明所述的重组凝血因子VIII的编码基因。较佳实施例中，所述重组细胞含有如上所述的重组表达载体。
本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括本发明如上所述的重组凝血因子VIII、所述的重组表达载体、所述的重组腺相关病毒、所述的重组细胞中的任意一种或多种的组合。较佳实施例中，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或多种的组合。所述药物组合物可以制成注射剂，用于静脉注射或输液。
本发明还提供了所述的重组凝血因子VIII、所述的重组表达载体、所述的重组腺相关病毒、所述的重组细胞或所述的药物组合物在制备治疗血友病药物中的应用。较佳实施例中，所述血友病为血友病A。
本发明提供的一种重组凝血因子VIII，能够增加递送后体内FVIII的有效浓度，将有效地提高治疗效果，解决高剂量带来的毒性等问题，对于血友病基因治疗邻域具有重要意义。
实施例中未注明具体技术或条件处，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买的常规产品。
实施例1FVIII蛋白的优化和细胞实验载体构建
1、FVIII-SQ蛋白的密码子优化
BioMarin公司的血友病A治疗药物Roctavian的FVIII-SQ基因序列如SEQ IDNO.2。发明人委托武汉天一辉远生物技术有限公司进行人源优化，调整碱基比例偏好性和CG含量，获得优化的opt-FVIII-SQ基因序列，如SEQ ID NO.3所示。
2、质粒构建
采用通用的质粒构建手段(酶切、连接、同源重组等)，在pFD载体上分别构建好表达Roctavian原始FVIII-SQ和optFVIII-SQ的质粒GT-0239和GT-0236(表1)，表达盒从5’端到3’端为：CMV启动子、不同的FVIII蛋白、WPRE序列个hGH polyA序列(图3展示了GT-0236的表达盒情况；GT-0239与之类似)。
两种vWF结合位点v1和v2以不同的数量插入SQa和SQb段之间，获得新的改造后FVIII蛋白。其中v1的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，v2的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。v1的序列相对较短，我们设计了1-4段v1序列插入的分子改造；而v2的序列较长，考虑到rAAV载体的包装限制，我们只测试了插入一段v2的分子改造。具体的FVIII蛋白结构如图3所示，包括分别插入1-4段v1序列的optFVIII-SQ-v1、optFVIII-SQ-2v1、optFVIII-SQ-3v1、optFVIII-SQ-4v1；1段v2序列的optFVIII-SQ-v2。其中2v1表示v1+v1，即在SQa和SQb段之间连续插入两个v1的序列，依次类推。
上述这些蛋白的表达质粒载体，是在质粒GT-0236的基础上，替换需要表达的改造后FVIII蛋白得到的，如表1所示。改造后的FVIII蛋白分子，在FVIII-SQ段核酸序列使用优化后的optFVIII-SQ序列，v1和v2位点的基因序列则单独进行密码子优化，表1中v1位点的核酸序列为SEQ ID NO.7，v2位点的核酸序列为SEQ ID NO.8。
表1不同质粒载体信息
| 质粒编号 | 质粒信息 |
| GT-0239 | pFD-rAAV-ITR-CMV-FVIII-SQ-WPRE-hGHpA |
| GT-0236 | pFD-rAAV-ITR-CMV-optFVIII-SQ-WPRE-hGHpA |
| GT-0290 | pFD-rAAV-ITR-CMV-optFVIII-SQ-v1-WPRE-hGHpA |
| GT-0291 | pFD-rAAV-ITR-CMV-optFVIII-SQ-2v1-WPRE-hGHpA |
| GT-0238 | pFD-rAAV-ITR-CMV-optFVIII-SQ-3v1-WPRE-hGHpA |
| GT-0237 | pFD-rAAV-ITR-CMV-optFVIII-SQ-4v1-WPRE-hGHpA |
| GT-0293 | pFD-rAAV-ITR-CMV-optFVIII-SQ-v2-WPRE-hGHpA |
| GT-1316 | pFD-rAAV-ITR-CMV-EGFP-WPRE-hGHpA |
实施例2FVIII改造蛋白在悬浮HEK293F细胞中的筛选
将实施例1中构建的各种FVIII改造蛋白质粒(见表1)在HEK293F细胞中进行表达。具体方法如下：使用48深孔板(洁特)进行蛋白表达实验，每孔加入1mL的HEK293F细胞悬液(2E+6cells/mL)，放入37℃、8％ CO2浓度的培养箱中进行悬浮培养。使用转染试剂聚乙烯亚胺溶液(PEI，1μg/μL)转染待测质粒进入HEK293F细胞中，按照PEI(μg)：DNA(μg)＝2:1的加样比例，每孔转入2μg的待测质粒。同时使用表达EGFP蛋白的质粒GT-1316作为对照。
转染24h后收取每孔中的细胞悬液离心后，更换1mL新鲜的培养基继续培养48h。48h后离心3000rpm，10min收集每孔内的培养上清，检测上清中与FVIII相关的凝血活性和上清中实际FVIII蛋白的含量。
细胞上清的凝血活性采用活化部分凝血活酶时间(APTT)测试法进行测量，采用法国Stago公司的试剂盒，在37℃条件下，在50μL受检血浆中加入50μL细胞上清液，再加入100μLAPTT检测试剂，孵育后用血凝仪检测凝血时间，之后根据标曲计算出FVIII凝血活性，结果以IU/mL作为单位。
上清中FVIII蛋白的含量使用人FVIII Elisa检测试剂盒(Abcam)按照说明书的方法进行测量，结果以IU/mL作为单位。
图4为APTT法检测细胞上清凝血活性的结果图，每组n＝8。与阴性对照组相比，除了FVIII-SQ-v2外，各种转入FVIII质粒载体的实验组均能通过分泌FVIII蛋白提高细胞上清的凝血活性。相比于BioMarin使用的原始FVIII-SQ序列，密码子优化的optFVIII-SQ能在一定程度上提高上清的凝血活性，从0.2972IU/mL增加到0.3722IU/mL，因此optFVIII-SQ的密码子优化是有一定效果的。
至于vWF位点的插入，插入一段v1或v2序列，相比于optFVIII-SQ而言细胞上清的凝血活性没有增强，插入一段的optFVIII-SQ-v2反而显著降低了上清的凝血活性，这可能与v2也是磷脂(PL)结合位点等有关。当提高v1段插入的数量时，细胞上清的凝血活性有着明显的提高，特别optFVIII-SQ-3v1(**,p<0.01)和optFVIII-SQ-4v1(****,p<0.0001)的改造相比于FVIII-SQ和optFVIII-SQ有着十分显著的提高。其中optFVIII-SQ-4v1的细胞上清凝血活性能达到1.0865IU/mL，是BioMarin公司的原始FVIII-SQ分子的3.66倍，优化后的optFVIII-SQ分子的2.92倍，是optFVIII-SQ-3v1的1.63倍。
针对上述优选的FVIII改造分子，我们还检测了各自上清中FVIII的含量。如图5所示，Elisa检测的结果与上清APTT检测的结果相一致。optFVIII-SQ组的上清中FVIII的含量为0.3269IU/mL高于FVIII-SQ组的0.2421IU/mL。optFVIII-SQ-3v1组和optFVIII-SQ-4v1组的上清FVIII含量也显著高于FVIII-SQ组和optFVIII-SQ组，其中optFVIII-SQ-4v1组的FVIII含量最高为0.8687IU/mL。
综上，我们的optFVIII-SQ密码子优化效果要优于原始的FVIII-SQ核酸序列，在SQ序列中插入多段重复的vWF位点(优选4段重复的v1位点)能显著提高细胞分泌的FVIII含量，从而提高凝血能力。
实施例3改造的FVIII蛋白在小鼠中的表达实验
对于上述优选的optFVIII-SQ-3v1和optFVIII-SQ-4v1，我们将进一步验证其在动物实验中的效果。首先我们将实施例1中的质粒GT-0239、GT-0238和GT-0237中的启动子替换为我们优选过的肝特异启动子ATh2(专利申请公布号：CN111218446A，序列信息见SEQ IDNO.6)，获得质粒GT-0102、GT-0211和GT-0212，如表2。GT-0102的结构如图6所示，GT-0211和GT-0212为在GT-0102的基础上替换了目的基因optFVIII-SQ。
表2AAV包装质粒载体信息
| 质粒编号 | 质粒信息 | 长度 |
| GT-0102 | pFD-rAAV-ITR-ATh2-FVIII-SQ-WPRE-hGHpA | 5041bp |
| GT-0211 | pFD-rAAV-ITR-ATh2-optFVIII-SQ-4v1-hGHpA | 5269bp |
| GT-0212 | pFD-rAAV-ITR-ATh2-optFVIII-SQ-3v1-hGHpA | 5212bp |
通过sf9 One-bac系统将上述表2中构建的质粒包装为AAV2/8血清型病毒。将不同AAV病毒以相同剂量5E+12vg/kg尾静脉注射到C57小鼠(n＝6)体内，注射病毒后5，8，11，14周后眼眶静脉丛取血，ELISA检测小鼠血浆中FVIII表达水平，其中以注射等量的PBS组作为对照。使用人FVIII Elisa检测试剂盒(Abcam)按照说明书的方法进行测量，结果以NHP％作为单位(NHP：normal human plasma)NHP％表示相当于正常人体中FVIII的含量百分比。
如图7所示，使用AAV2/8载体递送的optFVIII-SQ分子相比于PBS组，C57小鼠的血浆中有明显的FVIII因子表达，且optFVIII-SQ-3v1和optFVIII-SQ-4v1组的表达效果在5-14周均要显著优于optFVIII-SQ组(****，p＜0.0001)。计算4组时间的平均FVIII含量，相比于optFVIII-SQ组的FVIII平均含量为6.37％，optFVIII-SQ-3v1组为10.04％，optFVIII-SQ-4v1组为10.05％。两种改造均使动物血浆中的FVIII含量提高近57.7％。这说明多位点v1插入的FVIII蛋白，其核酸长度(表2)不但能够被rAAV载体包装，且显著改善了FVIII蛋白在体内的含量水平。
综上所述，本发明在对FVIII-SQ基因进行密码子优化的基础上，在SQ序列中插入多段vWF结合位点，优选3-4段v1位点，提高FVIII蛋白在细胞上清或是动物体内的表达量，从而提高凝血活性。这对保障血友病A基因治疗的有效性，降低给药剂量和药物毒性，实现更快的血友病A病症缓解及全面更持久的基因治疗奠定了基础。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种重组凝血因子VIII，其特征在于，所述重组凝血因子VIII的B结构域被替换为SQ序列，且所述SQ序列中含有3或4个vWF结合位点；所述vWF结合位点的氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示；
所述SQ序列包括前端SQa部分和后端SQb部分，所述前端SQa部分的序列为SFS，所述后端SQb部分的序列为QNPPVLKRHQR；所述3或4个vWF结合位点被插入至所述SQ序列的前端SQa部分和后端SQb部分之间。
2.如权利要求1所述的重组凝血因子VIII，其特征在于，所述重组凝血因子VIII的B结构域被替换为SQ序列后，其编码基因的核酸序列如SEQ ID NO：3所示。
3.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体用于表达如权利要求1或2所述的重组凝血因子VIII，其包括编码如权利要求1或2所述的重组凝血因子VIII的核酸序列。
4.如权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，所述载体为病毒载体或质粒载体。
5.如权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述病毒载体为重组腺相关病毒载体。
6.一种重组腺相关病毒，其特征在于，所述重组腺相关病毒含有编码如权利要求1或2所述的重组凝血因子VIII的编码基因。
7.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞含有如权利要求1或2所述的重组凝血因子VIII的编码基因。
8.如权利要求7所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞含有如权利要求3至5任一项所述的重组表达载体。
9.一种药物组合物，其特在于，所述药物组合物包括如权利要求1或2所述的重组凝血因子VIII、如权利要求3至5任一项所述的重组表达载体、如权利要求6所述的重组腺相关病毒、如权利要求7或8所述的重组细胞中的任意一种或多种的组合。
10.如权利要求1或2所述的重组凝血因子VIII、如权利要求3至5任一项所述的重组表达载体、如权利要求6所述的重组腺相关病毒、如权利要求7或8所述的重组细胞或如权利要求9所述的药物组合物在制备治疗血友病药物中的应用。
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