CN108623695B - 一种白蛋白结合肽-人睫状神经营养因子融合蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents

一种白蛋白结合肽-人睫状神经营养因子融合蛋白及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种白蛋白结合肽‑人睫状神经营养因子融合蛋白及其制备方法和应用，所述融合蛋白包括白蛋白结合肽、人睫状神经营养因子和柔性肽段，所述融合蛋白不仅延长了重组人睫状神经营养因子的体内半衰期，还维持其活性。所述融合蛋白可在大肠杆菌中高效表达，纯化工艺简单，可用于大规模工业化生产制备药用级的融合蛋白纯品。与重组同源人睫状神经营养因子(rhCNTF)本身相比较，本发明所获得的ABD‑CNTF融合蛋白表现出血清半衰期显著延长，且保持人睫状神经营养因子的体外生物活性，从而改善了药物动力学和药效。

Description

一种白蛋白结合肽-人睫状神经营养因子融合蛋白及其制备 方法和应用
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种长效生物药物开发领域，具体涉及一种白蛋白结合肽-人睫状神经营养因子融合蛋白及其制备方法和应用。
背景技术
睫状神经营养因子(Cilinary Neuronotrophic Factor,CNTF)是一种多功能细胞因子。天然CNTF含200个氨基酸，分子量23KDa，等电点5.8左右，无N-糖基化位点和信号肽。CNTF可以促进包括运动神经元、感觉神经元、交感神经元、海马神经元等多种神经细胞和神经胶质细胞的生长和分化。临床试验表明，CNTF有望成为治疗帕金森(Parkinson disease,PD)、阿尔茨海默(Alzheimer's disease,AD)、肌萎缩性脊髓侧索硬化(AmyotrophicLateral Sclertosis,ALS)等神经退化性疾病的药物。
最近研究表明CNTF可作用于位于下丘脑区域的受体，抑制机体对食物摄取的欲望，能使肥胖实验小鼠(ob/ob mice)脂肪减少，进而体重降低。对于具有瘦蛋白(leptin)抵抗能力的食物诱导肥胖小鼠(diet-induced obesity,DIO)模型，CNTF也能起到减少摄食、减轻体重的作用。针对这一结果进行在肥胖症领域进行实验，结果表明CNTF在体内可与下丘脑的特异性受体结合，抑制进食欲望且不会产生饥饿感，从而使体重减轻。研究发现，CNTF具有多种功能，能促使多种神经细胞的存活、营养肌肉、促进糖、脂代谢和调节能量平衡以及摄食行为。在神经系统、肌肉系统、肥胖症及其相关疾病的治疗中具有重要意义和广阔的临床前景。
由于CNTF在治疗或预防肥胖症及其相关疾病中存在半衰期短的缺陷，限制了其在临床上的使用。因此，为了开发长效型CNTF制剂，目前现有技术使用PEG类聚合物对CNTF进行修饰，延长药物在体内作用的时间。以PEG修饰技术作为基础的长效策略存在修饰过程复杂、修饰产物分离困难和修饰后蛋白活性显著降低等问题。
人血清白蛋白(HSA)是血液中最丰富的蛋白质，在人体内半衰期为19天。人血清白蛋白的长半衰期及稳定性为长效药物的设计提供了一种理想的载体。CN 101200503A公开了一种血清白蛋白与干扰素的融合蛋白，该融合蛋白既有干扰素的特性，半衰期又得到了延长。当前基于白蛋白的长效策略主要是与白蛋白直接融合表达或通过化学偶联的方法与白蛋白结合在一起，基于这些策略已经取得良好的研究进展，并且相关产品已经相继被FDA批准。
白蛋白结合肽(albumin binding domain，ABD)是一种与白蛋白具有高亲和力的多肽，包括源自微生物天然蛋白序列筛选获得的结构域，如链球菌G蛋白中与白蛋白结合的结构域以及人为设计获得的白蛋白抗体中抗原结合结构域。通过噬菌体展示技术筛选出的多种ABD肽均具备白蛋白结合位点，且具有极高的白蛋白亲和性能，在血浆循环中可与血浆白蛋白特异性结合，从而借助白蛋白在体内的长效性实现长时循环。通过融合表达或者化学修饰引入这种能与白蛋白结合的结构域，利用内源性的白蛋白作为载体可实现药物的长效性。
ABD是一个小分子的肽段，与其它蛋白融合后仍然可以在原核表达系统中进行表达。因此，与直接融合或交联完整白蛋白分子相比，融合或交联ABD可以避免使用复杂的CHO等表达系统，同时也可避免外源性白蛋白所带来的安全隐患。
发明内容
针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供一种白蛋白结合肽-人睫状神经营养因子融合蛋白及其制备方法和应用，所述融合蛋白具有高生物活性，体外活性保持较好，且具明显延长的体内半衰期。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种白蛋白结合肽-人睫状神经营养因子融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括白蛋白结合肽、人睫状神经营养因子和柔性肽段。
本发明中，蛋白结合肽-人睫状神经营养因子融合蛋白通过柔性肽段将白蛋白结合肽与人睫状神经营养因子进行融合，两个蛋白起到了协同增效的作用，不仅保持了原人睫状神经营养因子的活性，还延长了融合蛋白在血清中的半衰期。
根据本发明，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1-4之一所示，所述SEQ IDNO.1-4所示的氨基酸序列如下：
SEQ ID NO.1：AFTEHSPLTP HRRDLCSRSI WLARKIRSDL TALTESYVKH QGLNKNINLDSADGMPVAST DRWSELTEAE RLQENLQAYR TFHVLLARLL EDQQVHFTPT EGDFHQAIHT LLLQVAAFAYQIEELMILLE YKIPRNEADG MPINVGDGGL FEKKLWGLKV LQELSQWTVR SIHDLRFISS HQTGGGGGSGGGGSGGGGS LAEAKVLANR ELDKYGVSDF YKRLINKAKT VEGVEALKLH ILAALP；
SEQ ID NO.2：AFTEHSPLTP HRRDLCSRSI WLARKIRSDL TALTESYVKH QGLNKNINLDSADGMPVAST DRWSELTEAE RLQENLQAYR TFHVLLARLL EDQQVHFTPT EGDFHQAIHT LLLQVAAFAYQIEELMILLE YKIPRNEADG MPINVGDGGL FEKKLWGLKV LQELSQWTVR SIHDLRFISS HQTGGGGGSGGGGSGGGGS LAEAKVLANR ELDKYGV-SD YYKNLINNAK TVEGVKALID EILAALP；
SEQ ID NO.3：AFTEHSPLTP HRRDLCSRSI WLARKIRSDL TALTESYVKH QGLNKNINLDSADGMPVAST DRWSELTEAE RLQENLQAYR TFHVLLARLL EDQQVHFTPT EGDFHQAIHT LLLQVAAFAYQIEELMILLE YKIPRNEADG MPINVGDGGL FEKKLWGLKV LQELSQWTVR SIHDLRFISS HQTGGGGGSGGGGSGGGGS LKNAKEDAIAELKKAGITSD FYFNAINKAK TVEEVNALKN EILKAHA；
SEQ ID NO.4：AFTEHSPLTP HRRDLCSRSI WLARKIRSDL TALTESYVKH QGLNKNINLDSADGMPVAST DRWSELTEAE RLQENLQAYR TFHVLLARLL EDQQVHFTPT EGDFHQAIHT LLLQVAAFAYQIEELMILLE YKIPRNEADG MPINVGDGGL FEKKLWGLKV LQELSQWTVR SIHDLRFISS HQTGGGGGSGGGGSGGGGS LAEAKVLALR ELDKYGV-SD YYKDLIDKAK TVEGVKALID EILAA.
根据本发明，所述融合蛋白是通过柔性肽段将白蛋白结合肽的N末端连接到人睫状神经营养因子的C末端。
根据本发明，所述白蛋白结合肽为能够特异性的结合人血清白蛋白都是可行的，本申请优选的氨基酸序列如SEQ ID NO.5-8之一所示，所述SEQ ID NO.5-8之一所示的氨基酸与人睫状神经营养因子结合的融合蛋白不仅保持了人睫状神经营养因子的活性，还延长了其在体内的半衰期，所述SEQ ID NO.5-8所示的氨基酸序列如下：
SEQ ID NO.5：LAEAKVLANR ELDKYGVSDF YKRLINKAKT VEGVEALKLH ILAALP；
SEQ ID NO.6：LAEAKVLANR ELDKYGV-SD YYKNLINNAK TVEGVKALID EILAALP；
SEQ ID NO.7：LKNAKEDAIA ELKKAGITSD FYFNAINKAK TVEEVNALKN EILKAHA；
SEQ ID NO.8：LAEAKVLALR ELDKYGV-SD YYKDLIDKAK TVEGVKALID EILAA.
根据本发明，所述人睫状神经营养因子的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列如下：
SEQ ID NO.9：AFTEHSPLTP HRRDLCSRSI WLARKIRSDL TALTESYVKH QGLNKNINLDSADGMPVAST DRWSELTEAE RLQENLQAYR TFHVLLARLL EDQQVHFTPT EGDFHQAIHT LLLQVAAFAYQIEELMILLE YKIPRNEADG MPINVGDGGL FEKKLWGLKV LQELSQWTVR SIHDLRFISS HQTG.
根据本发明，所述人睫状神经营养因子还可以采用人睫状神经营养因子突变体，所述人睫状神经营养因子突变体的氨基酸序列与SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列有90％以上的相似度，所述人睫状神经营养因子突变体在所述SEQ ID NO.9所示的氨基酸的基础上进行改善稳定性、增强活性和受体作用亲和力方面进行了突变改造。
根据本发明，所述柔性肽段含有1-30个氨基酸，所述氨基酸为甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸或苏氨酸中的任意一种或至少两种的组合。
根据本发明，所述柔性肽段为GGGGS，(GGGGS)2，(GGGGS)3，(GGGGS)4，GSGGGS(GGGGS)n中的任意一种，其中，n为1-4的整数，优选为GSGGGS(GGGGS)2。
第二方面，本发明提供一种核酸片段，所述核酸片段编码如第一方面所述的融合蛋白。
第三方面，本发明提供一种表达载体，所述表达载体含有至少一个拷贝的如第二方面所述的核酸片段。
第四方面，本发明提供一种重组的宿主细胞，所述宿主细胞含有第三方面所述的表达载体。
第五方面，本发明提供一种如第一方面所述的融合蛋白的制备方法，包括如下步骤：
(1)以PCR重叠扩增法构建第一方面所述的融合蛋白的表达载体；
(2)将重组载体转化到克隆菌种，筛选含有所述融合蛋白基因序列的阳性转化菌；
(3)从所述阳性转化菌中提取所述重组载体，并转化到表达菌中，得到含有所述融合蛋白的基因序列的阳性表达菌，对所述阳性表达菌扩大培养，诱导所述融合蛋白表达；
(4)融合蛋白的表达及纯化。
优选地，所述表达载体为在pET-28a的基础上构建。
优选地，所述的纯化为疏水层析和亲和层析。
优选地，所述疏水层析柱为辛基层析柱(Octyl FF)，所述洗脱条件为10-60％B，例如可以是10％B、12％B、15％B、16％B、18％B、20％B、22％B、25％B、26％B、28％B、30％B、32％B、35％B、36％B、38％B、40％B、42％B、45％B、46％B、48％B、50％B、52％B、55％B、56％B、58％B或60％B。
本发明中，进行疏水层析时加入的硫酸铵溶液的浓度为0.1-2M，例如可以是0.1M、0.2M、0.3M、0.5M、0.6M、0.8M、1M、1.2M、1.3M、1.5M、1.6M、1.8M或2M。
优选地，所述亲和层析为Ni亲和层析，所述洗脱条件为2-50％B，例如可以是2％B、3％B、5％B、6％B、8％B、10％B、12％B、15％B、16％B、18％B、20％B、22％B、25％B、26％B、28％B、30％B、32％B、35％B、36％B、38％B、40％B、42％B、45％B、46％B、48％B或50％B。
本发明中，所述亲和层析的洗脱咪唑的浓度为0.1-2M，例如可以是0.1M、0.2M、0.3M、0.5M、0.6M、0.8M、1M、1.2M、1.3M、1.5M、1.6M、1.8M或2M。
第六方面，本发明提供一种药物组合物，所述组合物包括如第一方面所述的融合蛋白、如第二方面所述的核酸片段、如第三方面所述的表达载体或如第四方面所述的重组的宿主细胞。
优选地，所述药物组合物包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
第七方面，本发明提供如第一方面所述的融合蛋白、如第二方面所述的核酸片段、如第三方面所述的表达载体、如第四方面所述的重组的宿主细胞或如第五方面所述的药物组合物在制备治疗神经退化性疾病和/或肥胖疾病的药物中的应用。
优选地，所述神经退化性疾病为帕金森、阿尔茨海默或肌萎缩性脊髓侧索硬化中的任意一种或至少两种的组合。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明白蛋白结合肽-人睫状神经营养因子融合蛋白通过柔性肽段将白蛋白结合肽与人睫状神经营养因子进行融合，两个蛋白起到了协同增效的作用，不仅保持了原人睫状神经营养因子的活性，还延长了融合蛋白在血清中的半衰期；
(2)本发明白蛋白结合肽-人睫状神经营养因子融合蛋白与同源的重组睫状神经营养因子有相似的体外促进TF.1CN5a.1细胞增殖活性，活性保持了90％以上，在药物动力学方面，本发明的融合蛋白注射到小鼠体内的半衰期比CNTF延长了10倍以上；
(3)本发明融合蛋白的制备方法简单，操作方便，可进行大规模的产业化生产。
附图说明
图1是本发明实施例1中构建ABD-CNTF的质粒示意图；
图2是本发明实施例3中疏水层析纯化ABD-CNTF结果图，其中，图2(A)为疏水层析结果图，图2(B)为SDS-PAGE表征纯度结果图；
图3是本发明实施例4中Ni亲和层析纯化ABD-CNTF结果图，其中，图3(A)为Ni亲和层析结果图，图3(B)为SDS-PAGE表征纯度结果图；
图4是本发明实施例5中制备的ABD-CNTF和CNTF圆二色光谱结构表征对比图；
图5是本发明实施例6中制备的ABD-CNTF和CNTF荧光光谱结构表征对比图；
图6是本发明实施例7中ABD-CNTF与人血清白蛋白结合能力的结果图；
图7是本发明实施例8的体外细胞增殖实验的结果图；
图8是本发明实施例9的动物药物动力学实验的结果图。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1 ABD-CNTF的分子构建
首先将人工化学合成CNTF编码基因序列，克隆到pET-28a质粒载体(购自英俊公司Invitrogen，Carlsbad，USA)中，得到pET-28a-CNTF。以该质粒中的CNTF编码序列为模板，用重叠PCR方法在其C-末端加入ABD编码序列及连接序列。pET-28a质粒是大肠杆菌高效表达质粒。ABD-CNTF编码序列克隆到该质粒的NdeI和XhoI酶切位点处。因此，用重叠PCR方法分2步将ABD、连接肽(G4S)3以及酶切位点的编码序列与编码CNTF的质粒连接，得到ABD-CNTF融合蛋白编码序列，并使其重新克隆到pET-28a表达载体中。
所述ABD-CNTF融合蛋白的核酸序列如SEQ ID NO.1-4所示：
SEQ ID NO.1：AFTEHSPLTP HRRDLCSRSI WLARKIRSDL TALTESYVKH QGLNKNINLDSADGMPVAST DRWSELTEAE RLQENLQAYR TFHVLLARLL EDQQVHFTPT EGDFHQAIHT LLLQVAAFAYQIEELMILLE YKIPRNEADG MPINVGDGGL FEKKLWGLKV LQELSQWTVR SIHDLRFISS HQTGGGGGSGGGGSGGGGS LAEAKVLANR ELDKYGVSDF YKRLINKAKT VEGVEALKLH ILAALP；
SEQ ID NO.2：AFTEHSPLTP HRRDLCSRSI WLARKIRSDL TALTESYVKH QGLNKNINLDSADGMPVAST DRWSELTEAE RLQENLQAYR TFHVLLARLL EDQQVHFTPT EGDFHQAIHT LLLQVAAFAYQIEELMILLE YKIPRNEADG MPINVGDGGL FEKKLWGLKV LQELSQWTVR SIHDLRFISS HQTGGGGGSGGGGSGGGGS LAEAKVLANR ELDKYGV-SD YYKNLINNAK TVEGVKALID EILAALP；
SEQ ID NO.3：AFTEHSPLTP HRRDLCSRSI WLARKIRSDL TALTESYVKH QGLNKNINLDSADGMPVAST DRWSELTEAE RLQENLQAYR TFHVLLARLL EDQQVHFTPT EGDFHQAIHT LLLQVAAFAYQIEELMILLE YKIPRNEADG MPINVGDGGL FEKKLWGLKV LQELSQWTVR SIHDLRFISS HQTGGGGGSGGGGSGGGGS LKNAKEDAIA ELKKAGITSD FYFNAINKAK TVEEVNALKN EILKAHA；
SEQ ID NO.4：AFTEHSPLTP HRRDLCSRSI WLARKIRSDL TALTESYVKH QGLNKNINLDSADGMPVAST DRWSELTEAE RLQENLQAYR TFHVLLARLL EDQQVHFTPT EGDFHQAIHT LLLQVAAFAYQIEELMILLE YKIPRNEADG MPINVGDGGL FEKKLWGLKV LQELSQWTVR SIHDLRFISS HQTGGGGGSGGGGSGGGGS LAEAKVLALR ELDKYGV-SD YYKDLIDKAK TVEGVKALID EILAA；
由于上述多个融合蛋白的效果都类似，后续的实验选取其中一个实验进行具体的效果验证，选取的融合蛋白为：
SEQ ID NO.1：AFTEHSPLTP HRRDLCSRSI WLARKIRSDL TALTESYVKH QGLNKNINLDSADGMPVAST DRWSELTEAE RLQENLQAYR TFHVLLARLL EDQQVHFTPT EGDFHQAIHT LLLQVAAFAYQIEELMILLE YKIPRNEADG MPINVGDGGL FEKKLWGLKV LQELSQWTVR SIHDLRFISS HQTGGGGGSGGGGSGGGGS LAEAKVLANR ELDKYGVSDF YKRLINKAKT VEGVEALKLH ILAALP；
将测序正确的质粒通过热击法转化进E.coli BL21(DE3)感受态细胞中(Cwbiotech,Beijing,China)进行高效表达，构建示意图如图1所示。
上游引物(SEQ ID NO.10)：
5’-GGAATTCCATATGGCATTCACTGAGCACAGT-3’；
下游引物(SEQ ID NO.11)：5’-CGCTCGAGTGGCAAAGCTGCCAGGAT-3’。
25μL PCR扩增反应体系如下：
Figure BDA0001254504320000111
反应条件如下：
Figure BDA0001254504320000112
所获得PCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定并用胶回收试剂盒回收纯化，得到重组载体。
实施例2 ABD-CNTF的高效表达
菌种活化：含有ABD-CNTF质粒的重组工程菌保种液在洁净操作台下接种于100mL含100μg/mL卡那霉素的LB培养基。摇瓶在37℃，180rpm过夜活化(12h)。
菌种扩培：将活化菌液按2％(v/v)的比例接种到500mL含100μg/m卡那霉素的LB培养基中，在37℃，200rpm下摇晃3h以上至OD600nm达到2.0以上。
发酵罐培养：将上述500ml扩培菌液转入含有12L发酵培养基的20L发酵罐中，卡那霉素浓度100μg/mL，同时加入5ml灭菌后的植物油(消泡剂)。发酵前期温度控制在37，pH值维持在7.0±0.2。调节发酵罐通气量,转速等参数使发酵液中溶氧指数始终高于15％。当发酵液达到OD600nm 6.0-7.0左右后，加入终浓度约1.0mmol/L IPTG诱导目标蛋白表达。诱导前一次性补料200ml，诱导后同时以5ml/min的速度给予补料。诱导4h后收集发酵液，4000rpm离心30min。
实施例3 ABD-CNTF的疏水层析纯化及鉴定
样品处理：将实施例2收集到的湿菌体按照1:10(m：v)加入破菌液(20mM Tris-HCl，pH8.0)进行超声破碎，10000rpm离心30min后收集上清液；将破菌液的上清部分加入终浓度为0.8M的硫酸铵，10000rpm离心10min后准备上样。
层析过程：选用辛基层析柱(Octyl FF)(XK 16×100mm ID,GE Healthcare)层析柱，用buffer A平衡液(20mM Tris-HCl,0.8M AS,pH 7.0)平衡层析柱；通过泵头，以3ml/min的流速上样；用10％的buffer B洗脱液(20mM Tris-HCl,pH7.0)淋洗至UV280基线走平；用100％buffer B洗脱，收集样品峰。层析过程如图2(A)所示，在100％buffer B洗脱后绝大部分蛋白收集。
SDS-PAGE分析：用12％分离胶分析样品的纯度，鉴定结果如图2(B)所示，其中泳道1：上样样品；泳道2：100％B洗脱峰；泳道M：蛋白质分子量Marker；ABD-CNTF分子量在27.1kDa，由电泳图可以看出经过一步疏水层析，蛋白纯度有了较高提升。
实施例4 ABD-CNTF的Ni亲和层析纯化及鉴定
层析过程：将实施例3中100％B洗脱下来的样品峰上样至Ni FF亲和层析柱(XK 26×600mm ID,GE Healthcare)，用buffer A平衡液(20mM Tris-HCl,pH 7.0)平衡层析柱；通过上样环，以1.5ml/min的流速上样；用1％的buffer B洗脱液(20mM Tris-HCl,0.5M NaCl,1M咪唑，pH7.0)淋洗至UV280基线走平；用10％buffer B洗脱，收集样品峰。层析过程如图3(A)所示，在10％buffer B洗脱收集到绝大部分蛋白。
SDS-PAGE分析：用12％分离胶分析样品的纯度，电泳结果如图3(A)所示，泳道1：上样样品；泳道2：穿透峰；泳道3：10％B洗脱峰；泳道M：蛋白质分子量marker；经过Ni FF层析纯化后纯度可以达到95％以上。
实施例5 ABD-CNTF的圆二色光谱表征
蛋白的圆二色分析是在Jasco J-710光谱仪上完成。首先将含有ABD-CNTF的蛋白样品液置换buffer至5mM PB，pH7.0中，浓缩至浓度为0.2-0.3mg/ml，用注射器将样品吸入0.1cm厚度的样品池中，扫描波长间隔为1.0nm，扫描重复次数为5次，扫描波长范围190-260nm，样品扫描速度为1200nm/min。用Origin 8.0软件分析数据，结果如图4所示，由图中光谱结果可以看出ABD-CNTF的二级结构与CNTF没有发生显著变化。
实施例6 ABD-CNTF的荧光光谱表征
蛋白样品的内源性荧光分析主要是通过F-4500荧光光谱仪(Hitachi，日本)完成。样品ABD-CNTF所在的缓冲液是PBS，蛋白样品浓度约为0.1mg/ml，扫描样品光程厚度为1.0cm，激发波长为280nm或295nm，荧光发射波长扫描范围290-400nm，扫描重复次数为3次。结果如图5所示，由图中荧光光谱结果可以看出ABD-CNTF的三级结构与CNTF没有发生显著变化，其结构保持较好。
实施例7 ABD-CNTF与人血清白蛋白的结合能力
ABD-CNTF与人血清白蛋白(HSA)结合能力的确认是利用Superdex 200凝胶过滤柱分析的。首先，取0.5ml浓度为1mg/ml的ABD-CNTF置于EP管中，分别加入相同体积的不同浓度的人血清白蛋白，按照1:0,1:0.5,1:1,1:2,0:1摩尔比例混合10min后进行Superdex 200分析；上样量为500μl，分析的流动相为20mM Tris-HCl,0.1M Na2SO4,pH 7.0，波长为230nm。结果如图6所示，当把ABD-CNTF和HSA按照摩尔比1:1混合在一起的时候，峰的保留体积会前移0.5ml；且当摩尔比为1:2时，HSA会在原来位置15.5ml处有一个肩峰，说明剩余一部分HSA；而当摩尔比为1:0.5时，ABD-CNTF会在原来位置18ml有一个肩峰，说明剩余了一部分ABD-CNTF，通过这些数据说明ABD与CNTF融合表达后仍然可以和HSA结合。
实施例8 细胞实验证实ABD-CNTF的体外活性
TF-1.CN5a.l人红细胞白血病淋巴细胞，源于美国ATCC(atcc number：CRL-2512)，为GM-CSF依赖的传代细胞系，TF-1细胞被转入了含人CNTF-α亚单位的pCR3.1载体，能够短暂稳定地表达CNTF-α受体，成为TF-1.CN5a.l细胞，G-418抗性。生长状态是悬浮生长。一定量的CNTF能够促进TF-1.CN5a.1细胞增殖和生长，故通过此方法测定ABD-CNTF的体外活性。细胞的培养条件是：RPMI 1640培养基，10％(v/v)的FBS，1％双抗，0.4mg/mL G-418，2ng/mLGM-CSF，在37℃和5％CO2的培养箱中进行培养。细胞实验时的培养条件是：RPMI 1640培养基，10％(v/v)的FBS，1％双抗，0.4mg/mL G-418，系列浓度的CNTF和ABD-CNTF，在37℃和5％CO2的培养箱中进行培养。
取传代约30h的细胞转移至细胞离心管内，1500rpm 10min离心后小心倾去上层细胞培养液。用RPMI 1640基础培养重悬洗涤三次(离心参数同上)，再用适量基础培养液重悬，使用Countess(Invitrogen)细胞计数器进行细胞浓度测定，并最终调整至4.0×105cell/ml。使用基础培养基将不同形式的CNTF和ABD-CNTF样品分别稀释至5000、1000、200、40、8、1.6、0.32、0.064ng/ml的浓度后(稀释过程中避免产生气泡)，取两块无菌无热原的96孔细胞培养板并做好标记(板A、板B)，然后使用多通道移液器将稀释好的各种形式样品加入相应的预先设计好的板孔中，每100μL，每个样品浓度重复三孔，并做好对照(细胞液和培养基)。然后使用移液器每孔分别加入50μL的细胞重悬液(细胞浓度约4.0×105cell/ml)。将标记好的细胞板放置于37℃，5.0％CO2的细胞培养箱中3天(约72h)后取出。使用单通道20μL量程移液器向每孔中加入10μL的CCK-8工作液后继续放置在培养箱中。2.0h后取出使用SpectraMax M3酶标仪测定每孔在450nm的吸光值，参考波长设置为630nm。每种药物的药效是通过下列公式计算的：
Effectdrug％＝(ODdrug-ODmedia)/(ODGM-CSF-ODmedia)*100％
其中，ODdrug,指的是实验组(含有CNTF或ABD-CNTF)系列浓度下的吸光度值，数值是由(OD450nm-OD630nm)计算而来；
ODGM-CSF,指的是对照组(含有2ng/mL GM-CSF)培养条件下的吸光度值，数值是由(OD450nm-OD630nm)计算而来；
ODmedia,指的是空白组(只含有基础培养基)的吸光度值数值是由(OD450nm-OD630nm)计算而来；
最高生物活性的CNTF(5000ng/mL)进行归一化处理，其他数据以此为标准计算其活性；EC50的计算是利用GraphPad Prism v5.0进行的。结果如图7所示，ABD-CNTF的EC50是0.51±0.18ng/ml；而CNTF的EC50是0.48±0.12ng/ml；由此计算而来的ABD-CNFT细胞活性保持了原有CNTF的94.1％。
实施例9 动物实验测定ABD-CNTF的循环半衰期
体重约250g(250g±30g，6～8周)雄性SD大鼠9只，随机分配为3组，每3只。按数字依次从1-9号做好标记(第一组：PBS对照组，二CNTF组，第三：ABD-CNTF组)。将纯化后的ABD-CNTF和CNTF按1.0mg/kg的剂量尾静脉注入相应组的大鼠体内。并在注射后15min、30min、60min、1h、2h、4h、8h、16、24h、48h等既定时间点通过1.0mm直径毛细电泳管从大鼠眼眶静脉丛每次采集约500μL的血液。取出在4℃放置2～3h后，6000rpm离心10min，吸取上层血清并保存于-70℃。使用双抗夹心ELISA法(抗CNTF抗体)测定血清样品中注射蛋白的浓度。结果如图8所示，CNTF的半衰期仅有34.28min，经过与ABD融合表达借助HSA的长效载体作用，半衰期延长至483.89min；由此计算而来的延长半衰期约有14.1倍。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国科学院过程工程研究所
<120> 一种白蛋白结合肽-人睫状神经营养因子融合蛋白及其制备方法和应用
<130> 2017
<160> 11
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工合成序列
<400> 1
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<213> 人工合成序列
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<213> 人工合成序列
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<213> 人工合成序列
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Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Ala Glu Ala Lys Val Leu Ala Leu
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<213> 人工合成序列
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Leu Thr Glu Ser Tyr Val Lys His Gln Gly Leu Asn Lys Asn Ile Asn
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Leu Gln Val Ala Ala Phe Ala Tyr Gln Ile Glu Glu Leu Met Ile Leu
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Val Gly Asp Gly Gly Leu Phe Glu Lys Lys Leu Trp Gly Leu Lys Val
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Leu Gln Glu Leu Ser Gln Trp Thr Val Arg Ser Ile His Asp Leu Arg
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180
<210> 10
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<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 10
ggaattccat atggcattca ctgagcacag t 31
<210> 11
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 11
cgctcgagtg gcaaagctgc caggat 26

Claims (11)

1.一种白蛋白结合肽-人睫状神经营养因子融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括白蛋白结合肽、人睫状神经营养因子和柔性肽段；
所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述白蛋白结合肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
3.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述人睫状神经营养因子的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。
4.一种核酸片段，其特征在于，所述核酸片段编码如权利要求1-3中任一项所述的融合蛋白。
5.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有至少一个拷贝的如权利要求4所述的核酸片段。
6.一种重组的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求5所述的表达载体。
7.一种如权利要求1-3中任一项所述的融合蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)以PCR重叠扩增法构建权利要求1-3中任一项所述的融合蛋白的表达载体；
(2)将重组载体转化到克隆菌种，筛选含有所述融合蛋白基因序列的阳性转化菌；
(3)从所述阳性转化菌中提取所述重组载体，并转化到表达菌中，得到含有所述融合蛋白的基因序列的阳性表达菌，对所述阳性表达菌扩大培养，诱导所述融合蛋白表达；
(4)融合蛋白的表达及纯化。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述表达载体为在pET-28a的基础上构建；
所述的纯化为疏水层析和亲和层析；
所述疏水层析的层析柱为辛基层析柱；
所述亲和层析为Ni亲和层析。
9.一种药物组合物，其特征在于，所述组合物包括如权利要求1-3中任一项所述的融合蛋白、如权利要求书4所述的核酸片段、如权利要求5所述的表达载体或如权利要求6所述的重组的宿主细胞；
10.根据权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
11.如权利要求1-3中任一项所述的融合蛋白、如权利要求书4所述的核酸片段、如权利要求5所述的表达载体、如权利要求6所述的重组的宿主细胞或如权利要求9或10所述的药物组合物在制备治疗神经退化性疾病和/或肥胖疾病的药物中的应用；
所述神经退化性疾病为帕金森、阿尔茨海默或肌萎缩性脊髓侧索硬化中的任意一种或至少两种的组合。
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