PT1222929E

PT1222929E - Método e composição farmacêutica para prevenir e/ou tratar síndrome da resposta inflamatória sistémica

Info

Publication number: PT1222929E
Application number: PT02447005T
Authority: PT
Inventors: Marc G Jacquemin; Jean-Marie R Saint-Remy
Original assignee: Life Sciences Res Partners Vzw
Priority date: 2001-01-11
Filing date: 2002-01-11
Publication date: 2010-08-18
Also published as: EP1222929B8; EP1222929B1; DE60236386D1; ATE468136T1; ES2346189T3; EP1222929A3; CY1110781T1; DK1222929T3; EP1222929A2

Description

11 ΡΕ1222929 organisms com o número de acesso LMBP 5089CB, ou um anticorpo que possui pelo menos 80% de homologia de sequência com este nas regiões CDR, ou um seu fragmento de ligação ao antigénio.

De acordo com uma forma de realização alternativa, o inibidor parcial é um anticorpo monoclonal que possui uma capacidade de reacção idêntica à dos anticorpos monoclonais humanos obtidos a partir da linha celular KRIX-1 depositada na Belgian Coordinated Collections of Micro-organisms com o número de acesso LMBP 5089CB, ou um seu fragmento de ligação ao antigénio.

De acordo com outra forma de realização particular, o fragmento do anticorpo é um fragmento Fab, Fab' ou F(ab')2, um fragmento variável de cadeia simples solúvel ou ancorado à membrana, ou um domínio variável simples ou uma combinação destes.

Numa forma de realização alternativa o medicamento compreende ainda uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente antitrombótico, tal como a heparina.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 apresenta a produção de anticorpos monoclonais humanos derivados de um doente com hemofilia A, expressos na forma de anticorpo IgG de ligação ao factor VIII em ELISA. ΡΕ1222929 12 A Figura 2 apresenta a inibição da actividade do factor VIII pelo anticorpo monoclonal B02C11. A Figura 3 apresenta a inibição da actividade do factor VIII pelo anticorpo monoclonal produzido a partir da linha celular KRIX 1. A Figura 4 apresenta a inibição de ligação do factor VIII activado em fosfatidil-L-serina pelo anticorpo monoclonal produzido a partir da linha celular KRIX 1. A Figura 5 apresenta a influência de certos anticorpos policlonais na dissociação do factor VIII activado do factor von Willebrand. A Figura 6 apresenta a inibição parcial da trombina pelo anticorpo monoclonal produzido a partir da linha celular KRIX 1. A Figura 7 apresenta as concentrações no plasma do inibidor da activação do plasminogénio tipo-I em ratinhos C57B1/6 selvagens e em ratinhos com factor VIII desactivado após injecção de lipopolissacáridos. A Figura 8 apresenta concentrações no plasma de a2-antiplasmina em ratinhos C57B1/6 selvagens e em ratinhos com o factor VIII desactivado, após injecção de lipopolissacárido. A Figura 9 apresenta as concentrações de fibrinogénio no plasma em ratinhos C57B1/6 selvagens e em ratinhos com o factor VIII desactivado após injecção de lipopolissacárido. A Figura 10 apresenta a sequência de aminoácidos ΡΕ1222929 13 SEQ.ID.N°.2 (linhas inferiores) e a sequência de nucleótidos SEQ.ID.N°.l (linhas superiores) para as regiões variáveis VH das cadeias pesadas dos anticorpos monoclonais humanos B02C11. São também apresentadas as três regiões determinantes de complementaridade de cada cadeia. A Figura 11 apresenta a sequência de aminoácidos SEQ.ID.N°.4 (linhas inferiores) e a sequência de nucleótidos SEQ.ID.N°.3 (linhas superiores) para as regiões variáveis VL das cadeias leves dos anticorpos monoclonais humanos B02C11. São também apresentadas as três regiões determinantes de complementaridade de cada cadeia. A Figura 12 apresenta a sequência de aminoácidos SEQ.ID.N°.6 (linhas inferiores) e a sequência de nucleótidos SEQ.ID.N°.5 (linhas superiores) para as regiões variáveis VH das cadeias pesadas dos anticorpos monoclonais KRIX 1. São também apresentadas as três regiões determinantes de complementaridade de cada cadeia. A Figura 13 apresenta a sequência de aminoácidos SEQ.ID.N°.8 (linhas inferiores) e a sequência de nucleótidos SEQ.ID.N°.7 (linhas superiores) para as regiões variáveis VL das cadeias leves dos anticorpos monoclonais KRIX 1. São também apresentadas as três regiões determinantes de complementaridade de cada cadeia.

DEFINIÇÕES 14 ΡΕ1222929 0 termo "ligando" é aqui utilizado com o significado dado na página 127 de "The Molecular Biology of the Cell" (1983), Garland Publishing Inc., New-York, i.e., uma molécula que é capaz de interagir eficazmente com uma proteina através da formação simultânea de várias ligações fracas entre elas. 0 termo "anticorpo", como aqui utilizado, refere-se a moléculas intactas que são capazes de se ligar ao determinante do epitopo do factor VIII ou ao domínio relevante do factor VIII. 0 termo "fragmento" refere-se a fragmentos de ligação ao antigénio, tais como Fab, Fab', F(ab')2/ Fv e semelhantes, desses anticorpos. "Anticorpo humanizado" como aqui utilizado refe-re-se a moléculas de anticorpo nas quais os aminoácidos foram substituídos nas regiões de não ligação ao antigénio de modo a parecer-se mais proximamente com um anticorpo humano. "Anticorpo humano reformatado" ou "Anticorpo humano híbrido" referem-se a um anticorpo humano no qual os aminoácidos nas regiões de ligação ao antigénio de um anticorpo humano foram substituídos com sequências, e.g., CDR's, ou outras partes de regiões variáveis que foram derivadas do repertório de anticorpos humanos. 0 termo "homologia" ou "homólogo", como aqui utilizado em relação a ligandos (tais como anticorpos) refere-se a uma molécula que irá competir com, ou inibir a 15 ΡΕ1222929 ligação de um dos referidos ligandos ao sitio alvo. A ligação deve ser especifica, i.e., a ligação da molécula alternativa deve ser tão especifica para o sitio como o ligando. Quando os referidos ligandos incluem sequências de aminoácidos, então, a homologia deve incluir possuir pelo menos 80%, mais preferencialmente 90% e como preferência máxima 95% de identidade de sequência de aminoácidos com o ligando relevante.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO O Factor VIII é uma proteina que proporciona actividade de cofactor coagulante e é um dos factores de coagulação humanos com um peso molecular relativamente elevado (265 000) e uma concentração normal no plasma muito baixa (0,0007 micromol./litro) . Com os seus 2 332 resíduos de aminoácidos, o factor VIII é uma das cadeias de polipéptidos mais longas conhecidas e é sintetizado no fígado, no baço e na placenta. O seu gene demonstrou incluir 186 000 nucleótidos.

O factor VIII circula como proteína inactiva no plasma. Os factores V e VIII são proteínas homólogas que partilham uma configuração estrutural comum dos domínios A triplicados e domínios C duplicados com os domínios B estruturalmente divergentes ligando os domínios A2 e A3. O factor VIII circula numa multiplicidade de espécies fragmentadas num complexo estreitamente associado com o factor von Willebrand a uma concentração de 1 nmol/L. A 16 ΡΕ1222929 activação do factor VIII ocorre através de uma clivagem entre os domínios AI e A2, resultando na molécula de factor VlIIa heterodimérico instável. 0 factor VlIIa liga-se fortemente às membranas que contêm fosfolipidos acídicos. 0 factor VIII contém um sitio de ligação do fosfolipido no dominio C2, entre os aminoácidos 2302 e 2332, de acordo com Arai et al. em J. Clin. Invest. (1989) 83: 1978 . Na mesma região do factor VIII, há também um sitio de ligação do factor von Willebrand que actua em conjunto com os resíduos de aminoácidos 1645-1689 no domínio A3 de acordo com Shima et al. em Throm. Haemost. (1993) 69:240 e J. Biol. Chem. (1994)269:11601. A perda ou insuficiente função do factor VIII resulta em hemofilia A. Doentes sem factor VIII (forma grave da doença) têm hemorragias espontâneas nas articulações e tecidos moles. Na forma moderada da doença, as hemorragias ocorrem apenas após o trauma. A inibição da função do factor VIII deve por isso conduzir a hemorragia espontânea a menos que a referida função seja apenas parcialmente inibida. Tendo isto em consideração, os presentes inventores desenvolveram anticorpos monoclonais anti-factor VIII específicos que inibem a actividade de cofactor do factor VIII apenas numa determinada extensão. São proporcionados anticorpos monoclonais totalmente humanos, assim como humanizados, com afinidade 17 ΡΕ1222929 elevada para o factor VIII que apresentam uma inibição apenas parcial da função do factor VIII, independentemente da dosagem utilizada, prevenindo desse modo o risco de sobredosagem. Estes anticorpos são utilizados nos métodos de tratamento e prevenção e em composições farmacêuticas, como aqui explicado mais abaixo. Os anticorpos são reagentes únicos, uma vez que oferecem especificidade especial para o determinante que eles reconhecem. Anticorpos anti-factor VIII ligam-se ao factor VIII mas não a outras proteínas, mesmo homólogas. Devido à baixa concentração de factor VIII no plasma, são necessárias apenas quantidades limitadas de anticorpos de inibição para neutralizar todas as moléculas de factor VIII. Além disso, esses anticorpos possuem uma semi-vida de cerca de três semanas em seres humanos, que permitem vantajosamente aumentar os intervalos entre a sua administração a um mamifero em necessidade destes. A presente invenção refere-se a um conceito geral de apenas inactivar parcialmente o factor VIII utilizando anticorpos monoclonais humanos ou humanizados ou seus fragmentos ou homólogos, que se ligam a um sítio do factor VIII, ou um complexo envolvendo factor VIII no fabrico de um medicamento para prevenir e/ou tratar a síndrome da resposta inflamatória sistémica (SIRS) associada a infecção e/ou sepsia e/ou choque séptico e/ou septicemia em mamíferos, em particular em humanos. Estes ligandos e composições têm a propriedade vantajosa de a inactivação do factor ser apenas parcial, mesmo quando o ligando está num 18 ΡΕ1222929 excesso molar. Isto significa que mesmo se o ligando for utilizada numa quantidade tal que se espere que inactive completamente o factor alvo, a inactivação é ainda assim incompleta. É aqui revelada uma linha celular particular que produz anticorpos monoclonais humanos que são reactivos com o factor VIII humano e, mais especificamente possuem a capacidade de inactivar a actividade de co-factor do factor VIII humano por interferência com o sitio de clivagem proteolitico ou factor von Willebrand ou reacção do complexo de tenase ou através da indução de uma alteração na conformação tridimensional no factor VIII, em particular direccionando um domínio do factor VIII e reconhecendo epitopos localizados no referido domínio. Um domínio preferido é o domínio Cl do factor VIII. Um sítio no domínio C2 do factor VIII também pode ser parcialmente inibido. São também aqui revelados ligandos diferentes de anticorpos policlonais, em particular anticorpos monoclonais, que reduzem a taxa de libertação do factor VIII do factor von Willebrand. Estes anticorpos monoclonais dirigem-se especificamente ao factor VIII quando ligado ao factor von Willebrand e consequentemente direccionar um epitopo associado com o complexo do factor VIII e factor von Willebrand. A presente revelação também proporciona fragmentos de qualquer um dos anticorpos monoclonais acima, tais como Fab, Fab', F(ab')2, scFv, CDR's, domínios variáveis simples, assim como os seus homólogos e combinações. 19 ΡΕ1222929

Mais particularmente, estes anticorpos monoclo-nais e fragmentos podem dirigir-se a um dominio do factor VIII, em particular o dominio Cl do factor VIII. Eles também podem inibir parcialmente um sitio no dominio C2 do factor VIII. Eles também podem ter como alvo um epitopo associado com o complexo do factor von Willebrand e factor VIII. É aqui proporcionada uma nova utilização de ligandos, diferentes de anticorpos policlonais, que se ligam a um primeiro sitio (e.g., no dominio Cl do factor VIII) remoto em relação a um segundo sitio funcional (e.g., o sitio no dominio C2 do factor VIII que é responsável pela ligação de fosfolípidos) de modo a que a função do segundo sitio é apenas parcialmente dificultada mesmo quando o ligando está num excesso molar e terapêutico. A linha celular denominada KRIX 1 que produz anticorpos monoclonais como utilizados na presente invenção foi depositada em BCCM™/LMBP (Belgian Coordinated Collec-tions of Microrganismos/Plasmid Collection Laboratorium voor Moleculaire Biologie, Universidade de Ghent K.L. Ledeganckstraat 35, B-9000 Ghent, BE com o número de acesso LMBP 5089CB em 1 de Julho de 1999. São aqui descritas linhas celulares que produzem anticorpos monoclonais humanos possuindo uma capacidade de reacção substancialmente semelhante à dos anticorpos monoclonais humanos obtidos a partir da linha celular depositada acima mencionada, assim como os anticorpos monoclonais humanos que se podem obter a partir destas outras linhas 20 ΡΕ1222929 celulares . São aqui ainda descritos anticorpos monoclonais humanos reformulados ou anticorpos monoclonais híbridos humanos contra o factor VIII, que se liqam a, e inactivam apenas parcialmente o factor VIII ou um complexo incluindo factor VIII e que pode compreender elementos derivados a partir do repertório de anticorpos humanos. Por anticorpos monoclonais híbridos humanos entende-se um anticorpo híbrido construído a partir de um anticorpo humano e de regiões variáveis. Convencionalmente na técnica, até agora apenas foi possível obter anticorpos contra factor VIII derivado de animais, e.g., ratinhos, ou para construir anticorpos quiméricos a partir de anticorpos humanos com as porções variáveis derivadas de anticorpos de ratinho.

Por A presente invenção também proporciona uma nova utilização de ligandos, diferentes de anticorpos poli-clonais, possuindo a capacidade de inactivar apenas parcialmente o factor VIII ou um complexo incluindo o factor VIII, através da ligação a um sítio do referido factor ou complexo, também ocorrendo a referida inactivação apenas parcial quando o ligando está num excesso molar em relação ao referido factor. 0 sítio ao qual o ligando se liga pode estar ou não directamente ou substancialmente envolvido numa interacção fisiológica do referido factor ou complexo. Por exemplo, o ligando pode ligar-se a um sítio que está a uma distância predeterminada de um sítio fisiologicamente funcional do referido factor. 21 ΡΕ1222929 inactivação parcial, entende-se aqui uma inactivação de no máximo 99%, preferencialmente uma inactivação de no máximo 95%, como determinado por um método de teste adequado, tal como, por exemplo, o ensaio cromogénico disponível de Coatest™, Kabi Vitrum, Bruxelas (Bélgica) ou de Chromogenix AB, Mõlndal (Suécia) . Por outro lado, de modo a proporcionar utilidade terapêutica, a inactivação do factor VIII deve ser pelo menos cerca de 25%, preferencialmente pelo menos 60% e mais preferencialmente pelo menos cerca de 70%, como determinado pelo mesmo método de teste que acima. A extensão da inibição ou inactivação do factor VIII pode variar de um doente para outro, dependendo da gravidade da sindrome da resposta inflamatória sistémica SIRS e do seu factor de causalidade.

Será apreciado que os inibidores que possuem capacidade de inactivação parcial aqui descritos operam de um modo diferente do mecanismo convencionalmente descrito para anticorpos de tipo II contra o factor VIII. Um mecanismo convencional é aquele para competição com outro factor, e.g., factor von Willebrand. A cinética de um mecanismo de competição significa que se uma espécie está numa concentração elevada em comparação com a outra (e.g., num excesso molar), a inibição é efectivamente completa. Em contraste, os inibidores aqui descritos atingem um efeito de plataforma na inactivação do factor VIII, que é substancialmente independente do excesso do inibidor. O outro mecanismo convencional como descrito para anticorpos de tipo II é o de baixa afinidade, em cujo caso um excesso 22 ΡΕ1222929 conduzirá também a reacção até à inibição completa.

Os inibidores úteis nesta invenção podem ser anticorpos monoclonais humanos que se podem obter a partir da linha celular depositada KRIX 1, sendo preferencialmente da classe IgG, e que possuem a capacidade de inactivar apenas parcialmente a actividade de cofactor do factor VIII. Mais especificamente, são revelados anticorpos monoclonais humanos dessa origem que são capazes de reconhecer epitopos localizados no domínio Cl do factor VIII. Embora os inventores não desejem estar limitados por uma única explicação ou teoria, crê-se que a ligação a esses anticorpos monoclonais humanos resulte na dificuldade parcial da ligação do factor VIII activado a fosfolipidos, um passo necessário para a expressão da actividade de cofactor. A presente invenção proporciona ainda uma nova utilização de anticorpos monoclonais que possuem substancialmente as mesmas características que as acima reveladas e sendo produzidas para um objectivo de imunização em animais, preferencialmente em ratinhos, por exemplo injectando factor VIII humano em ratinhos e depois fundindo os linfócitos de baço com uma linha celular de mieloma de ratinho, seguido pela identificação e clonagem das culturas de célula que produzem anticorpos anti-factor VIII. Os anticorpos monoclonais produzidos em animais são então humanizados, por exemplo associando a região determinante da complementaridade de ligação ("CDR") a partir do 23 ΡΕ1222929 anticorpo monoclonal não humano com regiões de estrutura de humano - em particular a região constante C do gene humano - tal como revelado por Jones et al. em Nature (198 6) 321:522 ou Riechmann em Nature (1988) 332:323. A presente invenção também proporciona uma nova utilização de fragmentos e derivados, em particular regiões determinantes de complementaridade ("CDR's") dos anticorpos monoclonais anti-factor VIII acima descritos, assim como os seus homólogos. Por exemplo, são proporcionados fragmentos de ligação ao antigénio Fab, Fab' e F(ab')2 criados através de digestão proteolitica dos referidos anticorpos monoclonais, utilizando métodos bem conhecidos na técnica, tais como descritos por Stanworth et al., Handbook of Experimental Immunology (1978), vol.l chapter 8 (Blackwell Scientific Publications). Esses fragmentos, que contêm o sitio de ligação ao anticorpo, perderam várias propriedades do anticorpo parental, tal como activação do complemento ou capacidade para se ligar aos receptores Fc gama. São também incluídos variáveis do fragmento da cadeia simples (scFv), fragmentos do dominio variável simples dos anticorpos e combinação destes fragmentos e dos fragmentos acima mencionados. A invenção também proporciona uma nova utilização de partes variáveis da cadeia simples solúveis ou ancoradas à membrana dos anticorpos monoclonais acima e um método para a sua obtenção como se segue. As sequências de DNA das partes variáveis das cadeias pesadas e leves humanas são 24 ΡΕ1222929 amplificadas em reacções separadas e clonadas. Uma sequência ligante de quinze aminoácidos, por exemplo (Gly4 Ser) 3, é inserida entre VH e VL através de uma reacção em cadeia da polimerase em dois passos (PCR), por exemplo de acordo com Dieffenbach e Dveksler, "PCR Primer, a laboratory manual" (1995), Cold Spring Harbour Press, Plainview, NY, EUA. 0 fragmento resultante é então inserido num vector adequado para expressão de da região variável do fragmento de cadeia simples (scFv) como polipéptido solúvel ou apresentado em fago. Isto pode ser alcançado através de métodos bem conhecidos dos especialistas na técnica, tais como os descritos por Gilliland et al., Tissue Antigens (1996) 47:1-20. A presente invenção também inclui utilizações de um ligando compreendendo péptidos representativos de regiões hipervariáveis de um anticorpo mono-clonal que pode ser obtido por síntese utilizando um sintetizador do biossistema aplicado, por exemplo um sintetizador de polipéptidos, tal como o modelo 9050 disponível de Milligen (EUA) ou um modelo de uma tecnologia relacionada, que isoladamente ou em combinação com outras regiões hipervariáveis ou semelhantes irão exercer propriedades semelhantes às do anticorpo parental. É aqui descrita uma composição farmacêutica para a prevenção ou tratamento da síndrome da resposta inflamatória sistémica associada a infecção e/ou sepsia e/ou choque séptico e/ou septicemia em mamíferos, compreendendo como um ingrediente activo um ligando, preferencialmente diferente de um anticorpo policlonal, mais 25 ΡΕ1222929 preferencialmente um anticorpo monoclonal humano tal como aqui revelado acima, misturado com um ou mais veiculos farmaceuticamente aceitáveis. Como preferência máxima, o referido anticorpo monoclonal é um anticorpo monoclonal humano, ou um seu fragmento ou homólogo, que se pode obter a partir da linha celular KRIX 1 depositada em Belgian Co-ordinated Collections of Micro-organisms com o número de acesso LMBP 5089CB. 0 grau de homologia com o referido anticorpo monoclonal é preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente 90% e como preferência máxima 95%, e a homologia é preferencialmente particularmente em relação às regiões determinantes de complementaridade do anticorpo. Um ligando, como utilizado de acordo com a presente invenção também pode incluir um polipéptido sintético de potência equivalente. A composição farmacêutica deve compreender uma quantidade terapeuticamente eficaz do ingrediente activo acima referido, tal como indicado de aqui em diante em relação ao método de tratamento ou prevenção. A composição farmacêutica pode ainda compreender, nomeadamente à luz de um denominado tratamento combinado, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ou mais agentes antitrombóticos. Esses agentes, assim como a sua dosagem normal dependendo da classe à qual eles pertencem, são bem conhecidos dos especialistas na técnica. Entre numerosos exemplos desses agentes que podem ser incluídos nas composições farmacêuticas, pode ser particularmente citada a seguinte lista não limitada: heparina e heparina de baixo peso molecular, antitrombina, heparinóides (tais 26 ΡΕ1222929 como danaparoide ou sulfato de dermatano), análogos derivados da aprotinina, trombomodulina, APC, desfibrótido, TFPI, anticorpos monoclonais contra receptores activados pela protease (PAR-1, PAR-3) e semelhantes.

Veículos farmacêuticos adequados para utilização nas composições farmacêuticas aqui descritas são descritas, por exemplo em Remington's Pharmaceutical Sciences 16th ed. (1980) e a sua formulação é bem conhecida dos especialistas na técnica. Estas incluem qualquer um e todos os solventes, meio de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos (por exemplo fenol, ácido sórbico, cloro-butanol), agentes isotónicos (tais como açúcares ou cloreto de sódio) e semelhantes. Podem ser incluídos ingredientes adicionais de modo a controlar a duração da acção do ingrediente activo do anticorpo monoclonal na composição. Podem ser assim alcançadas composições de libertação controlada, seleccionando veículos de polímero apropriados, tais como por exemplo poliésteres, poliaminoácidos, poli-vinilpirrolidona, copolímeros de acetato de etilenovinilo, metilcelulose, carboximetilcelulose, sulfato de protamina e semelhantes. A taxa de libertação do fármaco e a duração da acção pode também ser controlada através da incorporação do ingrediente activo do anticorpo monoclonal em partículas, e.g., microcápsulas, de uma substância polimérica, tal como hidrogéis, ácido poliláctico, hidroximetilcelulose, meta-crilato de polimetilo e os outros polímeros acima descritos. Esses métodos incluem sistemas de distribuição do fármaco em colóide, como lipossomas, microesferas, 27 ΡΕ1222929 microemulsões, nanoparticulas, nanocápsulas e assim por diante. Dependendo da via de administração, a composição farmacêutica compreendendo o ingrediente activo pode necessitar de revestimentos protectores. A forma farmacêutica adequada para utilização como injecção inclui soluções aquosas estéreis ou dispersões e pós estéreis para a sua preparação extemporânea. Veiculos tipicos incluem por isso tampões aquosos biocompativeis, etanol, glicerol, propilenoglicol, polietilenoglicol e misturas destes. A presente invenção também proporciona a utilização de um inibidor parcial de factor VIII, tal como um anticorpo monoclonal (como aqui revelado acima) para o fabrico de um medicamento ou remédio para prevenir e/ou tratar a sindrome da resposta inflamatória sistémica associada a infecção e/ou sepsia e/ou choque séptico e/ou septicemia em mamíferos, preferencialmente em humanos. 0 referido inibidor parcial do factor VIII pode ser proporcionado a um mamifero em necessidade dessa prevenção e/ou tratamento através de quaisquer meios bem conhecidos do especialista na técnica, i.e., preferencialmente subcutaneamente, intramuscularmente, intradermicamente, intravenosamente, intra-arterialmente, parentericamente ou através de cateterização. De acordo com a presente invenção, o inibidor parcial do factor VIII pode também ser utilizado para o fabrico de um medicamento em conjunção ou associação com outro medicamento, por exemplo um agente anti-trombótico tal como aqui revelado acima nas composições farmacêuticas dos titulos. 28 ΡΕ1222929 É aqui descrito um método de tratamento e/ou prevenção de distúrbios na circulação sanguinea após uma infecção sistémica com microrganismos gram (-) num mamífero, preferencialmente um humano, compreendendo administrar a um mamífero em necessidade desse tratamento ou prevenção uma quantidade terapeuticamente eficaz de um inibidor parcial de factor VIII, diferente de um anticorpo policlonal, tal como um anticorpo monoclonal como aqui revelado acima. Preferencialmente, o referido inibidor parcial de factor VIII é um anticorpo monoclonal humano ou humanizado que se pode obter a partir da linha celular KRIX 1 depositada em Belgian Co-ordinated Collections of Micro-organisms com o número de acesso LMBP 5089CB ou um fragmento de ligação ao antigénio Fab, Fab' ou F(ab'>2, uma região de determinação de complementaridade (CDR), um fragmento variável de cadeia simples solúvel ou ancorada à membrana (scFv), um domínio variável simples ou um derivado ou combinação de qualquer um destes elementos.

Uma quantidade terapeuticamente eficaz, como aqui utilizado, significa desde cerca de 1 micrograma até cerca de 5 miligramas por quilograma de peso corporal, mais preferencialmente desde cerca de 10 microgramas até cerca de 1 miligrama por quilograma de peso corporal do mamífero a ser tratado. Mais geralmente, a quantidade terapeuticamente eficaz pode ser aqui definida como uma quantidade restauradora do nível no plasma de antitrombina e/ou proteína C activada e/ou inibidor da via do factor de 29 ΡΕ1222929 tecido. Esses níveis no plasma podem ser medidos facilmente e directamente pelo especialista na técnica através da utilização de métodos, tais como os revelados em Laboratory Haematology (1989), ed. Chanarin, Churchill Livingstone, e em Laboratory techniques in Thrombosis, a manual (2nd revised edition of ECAT assay procedures, Eds Jespersen et al., Kluwer Academic Publishers (1999). Será entendido que, à luz do tempo de semi-vida longo da maioria dos anticorpos humanos IgG, sendo os inibidores parciais utilizados na presente invenção anticorpos monoclonais da referida classe irão proporcionar, na maioria dos casos, uma prevenção e/ou tratamento eficiente com uma única administração.

Como formas de realização preferidas dos referidos distúrbios a serem prevenidos ou tratados podem ser citadas: síndrome da resposta inflamatória sistémica (SIRS) associada a infecção, sepsia, choque séptico, e septicemia. Preferencialmente, é administrado ao doente um bolus (injectado intravenosamente) numa dosagem determinada pelo médico com uma experiência regular, dependendo dos critérios que estabelecem o estado clínico desse doente em particular.

Os métodos de tratamento e/ou prevenção aqui descritos podem ainda incluir tratamento ou prevenção adicional do mesmo estado patológico através da administração, preferencialmente por administração sequencial, a um doente, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ou mais agentes anti-trombóticos, tal como aqui revelados nas 30 ΡΕ1222929 composições farmacêuticas dos títulos. Sequencialmente, como aqui utilizado, significa que o inibidor parcial da formação da trombina, tal como o inibidor parcial de factor VIII utilizado na presente invenção, e o agente anti-trombótico conhecido são administrados ao doente sequencialmente, mas não simultaneamente. Mais preferencialmente, o inibidor parcial de factor VIII utilizado na presente invenção é administrado em primeiro lugar e o agente anti-trombótico é administrado posteriormente.

Os inibidores parciais de factor VIII utilizados na presente invenção apresentam as seguintes vantagens: - eles inibem eficientemente, mas apenas parcialmente, a actividade de cofactor de factor VIII, mesmo quando utilizados num excesso molar superior a 100 vezes, i.e. eles atingem um efeito de patamar na inactivação de factor VIII, evitando desse modo o risco de sobredosagem do doente. — os anticorpos IgG humanos apresentam um tempo de semi-vida prolongado de três semanas (excepto para IgG3 que é de apenas uma semana) , proporcionando desse modo níveis no plasma muito estáveis do agente terapeuticamente activo e permitindo uma redução drástica na frequência de administração. Além disso, a utilização de anticorpos humanos, fragmentos ou seus homólogos, comporta um risco mínimo de indução de uma resposta imunitária no doente. 31 ΡΕ1222929 — eles inibem a função de FVIII até uma extensão suficiente para reduzir, ou inibir parcialmente, a formação de trombina. A redução, mas não a supressão completa, da formação de trombina previne o desenvolvimento da coagulação intravascular disseminada (DIC), enquanto permite a formação de coágulos normal. Prevenir a DIC mantém a perfusão de órgãos normal e evita a disfunção e falência do órgão. - manter a formação de trombina sob controlo reduz a activação da resposta anti-inflamatória compensatória. Assim, a proteina C activada é criada através de clivagem da trombina directa e o efeito do inibidor da via do factor de tecido está dependente da presença de factor X activado, cuja activação está directamente dependente da actividade de cofactor do factor VIII. A remoção limitada da anti-trombina (AT) da circulação, que combina directamente com a trombina, também ocorre. Por outras palavras, ambas as respostas pró-inflamatória e anti-inflamatória são mantidas sob controlo através da regulação da taxa de formação da trombina.

Para além disso, a manutenção de niveis significativos de factores fisiológicos anti-trombóticos, tais como AT oferece a possibilidade de uma terapia combinada com os inibidores parciais de factor VIII utilizados na presente invenção. Por exemplo, a heparina 32 ΡΕ1222929 exerce a sua principal actividade como agente anti-trombótico combinando-se com AT e aumenta dramaticamente a capacidade deste último para inibir a trombina. Por isso, a administração de heparina juntamente com o composto terapeuticamente activo utilizado nesta invenção ajuda a acertar delicadamente o estado de coagulação do doente. A persistência de niveis de anticorpo anti-factor VIII significativos na circulação após a fase aguda da SIRS não deve impedir a sua utilização. Uma vez que os anticorpos utilizados nesta invenção neutralizam apenas parcialmente o factor VIII, não há um risco inerente de hemorragia espontânea. Pelo contrário, a prevenção anti-trombótica estável persistente é encarada como benéfica em doentes mantidos sob imobilização parcial.

Na maioria dos casos, uma única administração do inibidor parcial de factor VIII deve ser suficiente à luz da semi-vida desses anticorpos humanos. Todavia, em circunstâncias particulares associadas com o estado hipercatabólico de sepsia, a administração pode ter de ser repetida. Nesses casos, a ausência de risco de sobredosagem (como aqui explicado acima) contraria a necessidade de monitorizar os niveis de factor VIII ou anticorpo durante o tratamento.

Uma outra vantagem desta invenção é a falta de imunogenicidade quando o composto terapeuticamente activo a 33 ΡΕ1222929 ser utilizado é de origem totalmente humana. Todavia, dado que o tratamento de SIRS deve ser suficiente apenas uma ou um número limitado de administrações, o desenvolvimento de uma resposta imunitária a um inibidor parcial exógeno do factor VIII tal como um anticorpo é improvável. A invenção estende-se por isso à utilização de anticorpos monoclonais anti-factor VIII de origem heterogénea, tal como anticorpos de origem em murino, e à utilização de anticorpos parcialmente humanizados, desde que esses anticorpos apresentem as mesmas características da inactivação do factor VIII apenas parcial. A presente invenção é ainda descrita através dos exemplos seguintes, que são fornecidos sem intenção de limitar e apenas a titulo ilustrativo. EXEMPLO 1 - produção de anticorpos monoclonais derivados de doentes com hemofilia A.

Os anticorpos monoclonais humanos da especificidade e características desejadas são produzidos por transformação de linfócitos B obtidos a partir do sangue periférico de doentes que sofrem de hemofilia A ou hemofilia adquirida. De modo a originar uma resposta imuno-lógica mais específica, são solicitados os doentes que têm uma função comprometida de uma proteína fisiologicamente activa, e.g., factor VIII. Por "comprometida" entende-se que está disponível alguma função residual, mas que esta é 34 ΡΕ1222929 inferior à que é conhecida na versão silvestre da mesma proteína. A comparação entre a proteína própria e a proteína silvestre deve apresentar uma diferença nas duas proteínas, preferencialmente numa região ou domínio que é de interesse. A diferença pode ser uma deleção ou uma substituição de um ou mais aminoácidos por outros. Os doentes são então administrados com proteina silvestre suficiente para produzir uma resposta imunológica. depois, os linfócitos B são extraídos dos doentes e seleccionados com base na produção de anticorpos que possuem propriedades desejáveis. Embora seja feita referência a "doentes" acima, os métodos descritos podem ser aplicados, de um modo geral, a mamíferos. 0 processo acima resulta numa maior hipótese de obter anticorpos que se dirigem ao domínio que contém o defeito.

As células B são transformadas por infecção com o virus Epstein-Barr e activação de antigénios de superfície utilizando técnicas bem conhecidas dos especialistas na técnica. Os sobrenadantes celulares que contêm anticorpos apropriados são identificados por um processo de ensaio especifico, tal como aqui descrito em maior detalhe abaixo.

Assim, os anticorpos dirigidos ao factor VIII são identificados reagindo o sobrenadante com placas de microtitulação de poliestireno revestidas com factor VIII ou com complexos de factor VlII/factor von Willebrand. A ligação de anticorpos específicos é detectada através da adição de um reagente IgG não humano acoplado a uma enzima. 35 ΡΕ1222929 A adição de um substrato enzimático que é convertido num composto colorido na presença da enzima permite a detecção de anticorpos específicos. Esses métodos referidos como imunoensaios ligados a enzima (ELISA) são bem conhecidos dos especialistas na técnica e são descritos em detalhe e.g., em Current Protocols in Immunology, chapter 2, John Wiley & Sons (1994).

Mais especificamente, no presente caso, a ligação dos anticorpos IgG anti-factor VIII foi detectada através da adição de um anticorpo monoclonal de ratinho marcado com peroxidase de rábano específico para Fcy humana. A subclasse IgG do anticorpo antifactor VIII foi detectada em ELISA, como apresentado na figura 1. A inibição da actividade funcional do factor VIII foi testada num ensaio de coagulação funcional como se segue. Um volume igual do sobrenadante da cultura de células e de uma mistura de plasma normal foram incubados durante duas horas a 37 °C e a actividade residual do factor VIII foi medida posterior-mente. Esses anticorpos que inibem significativamente a actividade do factor VIII são apresentados com um asterisco na figura 1.

As células B (tais como BO 2C11) que produzem anticorpos anti-factor VIII são então expandidas e clonadas por diluição limitante, como descrito por exemplo em Current Protocols in Immunology (ver supra). Os anticorpos anti-factor VIII que possuem a capacidade para inibir a actividade pró-coagulante do factor VIII são identificados 36 ΡΕ1222929 utilizando um kit de ensaio cromogénico, tal como um ensaio cromogénico do factor VIII comercialmente disponível quer de Dade, Dudingen (Alemanha) ou Coatest™ de Kabi Vitrum, Bruxelas (Bélgica) ou Chromogenix AB, Mõlndal (Suécia) (ver figura 2). Volumes iguais de anticorpos monoclonais BO 2C11 e uma mistura de plasma sanguíneo normal foram incubados durante 2 horas a 37 °C. As concentrações de BO 2C11 antes de misturar são apresentadas no eixo dos X. A redução da actividade do factor VIII foi medida num ensaio de coagulação e foi expressa como uma percentagem da actividade obtida na ausência do anticorpo. A actividade residual vai para zero assintoticamente (inibição completa).

Os anticorpos que inibem a função do factor VIII com afinidade suficiente mas não inibem completamente a actividade pró-coagulante do factor VIII, mesmo quando utilizados em grande excesso de anticorpo, foram seleccio-nados. Um exemplo representativo de um tal anticorpo é proporcionado na figura 3, na qual iguais volumes de KRIX 1 e de factor VIII recombinante ou de plasma normal a ser incubado durante duas horas a 37 °C e concentrações (expressas em pg/mL) de KRIX 1 antes de misturar com plasma sendo como indicado, a actividade residual do factor VIII foi medida utilizando o ensaio cromogénico acima mencionado. A Figura 3 apresenta, interessantemente cerca de 60% de inibição de factor VIII a uma concentração de 0,1 pg/mL e mais interessantemente uma inibição assintótica do factor VIII de cerca de 80% no intervalo total de concentrações desde 0,5 até 10 pg/mL. 37 ΡΕ1222929

Os anticorpos assim seleccionados são então produzidos em cultura me massa e purificados por cromato-grafia de afinidade utilizando métodos bem conhecidos dos especialistas na técnica.

Os detalhes de uma técnica de preparação não limitante são como se segue. 0 factor VIII humano recombi-nante (actividade especifica: 4000 IU/mg) foi obtido de Hyland (Glendale, Califórnia) ; complexo fVIII-vWf derivado do plasma purificado por cromatografia de permuta iónica (actividade especifica ± 160 IU/mg de proteina; proporção de 15:1 vWf para fVIII em peso), e vWf sem fVIII purificado (proporção em peso de vWf para fVIII de 4800 : 1) foram obtidos da Cruz Vermelha Belga (Bruxelas, Bélgica).

Foram recolhidas amostras de sangue periférico a partir de dadores gue sofrem de hemofilia e com inibidores. As células mononucleares do sangue periférico (PBMC) foram imortalizadas por infecção com vírus Epstein-Barr concomitantemente com a activação de antigénios de superfície. Foram rastreadas 480 linhas celulares por ELISA para a produção de anticorpos em relação ao factor VIII. Uma linha celular, denominada KRIX 1, foi clonada com sucesso através da diluição limitante. A clonalidade foi verificada por amplificação por RT-PCR do mRNA gue codifica as regiões V das cadeias pesadas e leves do anticorpo: foi obtida uma seguência única a partir de 10 clones de produtos de PCR. Os anticorpos purificados foram obtidos através da passagem 38 ΡΕ1222929 do sobrenadante da cultura de células KRIX 1 em Proteína-A Sepharose. Uma ELISA realizada com anticorpos específicos para a cadeia leve de subclasse IgG identificou KRIX-1 como uma IgG4k.

Os anticorpos monoclonais humanos foram purifi-ados por adsorção em Proteína A imobilizada (hi-Trap Protein A disponível em Pharmacia, Uppsala, Suécia). Foram preparados fragmentos Fab de anticorpo monoclonal humano por digestão com papaína. Foi diluído 1 mg de um anticorpo seleccionado para 500 pg/mL em tampão fosfato (40 mmol/L KH2PO4, 60 mM Na2HP04.2H2O, 0,15 M NaCl) contendo 50 mmol/L de L-cisteína (Sigma), 1 mmol/L de EDTA (Merck) e 10 pg de papaína (Sigma). A mistura foi incubada durante 3 horas a 37 °C com agitação contínua. A reacção foi parada por adição de iodoacetamida para uma concentração final de 75 mmol/L durante 30 minutos à temperatura ambiente. O anticorpo digerido foi dialisado contra soro fisiológico tamponado com fosfato (140 mmol/L NaCl, 67 mmol/L KC1, 20 mmol/L Na2HPC>4, 4,4 mmol/L KH2P04, pH 7,4). Os fragmentos de IgG e Fc não digeridos foram então eliminados através de passagem por proteína A sepharose (Hi Trap Protein A da Pharmacia). O fragmento Fab foi ainda purificado por cromatografia de filtração em gel em Superdex 200 (Pharmacia).

Foram utilizados métodos convencionais para a detecção de anticorpos IgG anti-factor VIII, a determinação da subclasse IgG, e a avaliação da inibição da ligação do 39 ΡΕ1222929 factor VIII a vWf. Para analisar a inibição da ligação de rfVIII a um anticorpo seleccionado por Fab e anticorpo nativo, foram revestidas placas de poliestireno Maxisorb (Nunc) durante 2 horas com 50 pL do anticorpo diluido para 5 pg/mL em soro fisiológico tamponado com glicina (20 mmol/L glicina, 34 mmol/L NaCl, pH 9,2). Após lavagem, foram misturados 50 pL de rfvIII marcado com biotina diluido para 1 pg/mL em Tris-caseína (10 mmol/L tris(hidroximetil)-aminoetano, pH 7,3, contendo 150 mmol/L NaCl e 0,5% caseína) durante 1 hora a 37 °C com 50 pL de IgG humano a várias diluições. Foi adicionada uma fracção de 50 pL da mistura às placas durante 2 horas à temperatura ambiente. Após lavagem, a ligação do rfVIII biotinilado foi detectada através da adição sequencial de avidina-peroxidase e OPD.

Foi incubado rfVIII (concentração final 0,2 pg/mL) com anticorpo IgG humano a diferentes concentrações durante 2 horas a 37 °C e a actividade residual do factor VIII foi avaliada através de um ensaio cromogénico do factor VIII (e.g., Coatest™, ver supra). A inibição de actividade do factor VIII no plasma foi medida pelo método de Bethesda, no qual uma mistura de plasma normal recolhida em citrato trissódico tamponado foi utilizada como fonte do factor VIII. A actividade residual do factor VIII foi avaliada através de um ensaio cromogénico ou por um ensaio de coagulação de um estágio. EXEMPLO 2

Produção de anticorpos monoclonais 40 ΡΕ1222929 por imunização em animais.

Alternativamente, os anticorpos monoclonais que possuem as mesmas características reveladas no exemplo 1 podem ser produzidas por imunização deliberada em animais. Assim, os ratinhos são injectados com factor VIII humano em adjuvante de Freund. São então obtidos anticorpos monoclonais anti-factor VIII humano por fusão de linfócitos do baço com uma linha celular de mieloma de ratinho. Os sobrenadantes da cultura de células que produzem anticorpos anti-factor VIII são identificados e clonados por diluição limitante, utilizando métodos descritos em Current Protocols in Immunology (ver supra). É realizada uma posterior selecção de inibidores que possuem a capacidade desejada de inibir a actividade pró-coagulante de factor VIII, como descrito no exemplo 1.

Os anticorpos monoclonais produzidos em ratinhos são então humanizados. Assim, as sequências das partes variáveis das cadeias leves e pesadas de ratinho são então alinhadas com regiões variáveis de imunoglobulina humana para identificar o anticorpo humano com a maior homologia nas regiões estruturais. Os fragmentos de DNA que codificam regiões variáveis humanizadas são então sintetizados por um método de enxertia de CDR (regiões determinantes de complementaridade) à base de PCR, como descrito por exemplo 41 ΡΕ1222929 em Sato et al., Câncer Research (1993) 53:851-6. 0 produto final da PCR, que codifica para a parte variável da cadeia pesada do anticorpo humanizado é digerido e subclonado a montante do gene C gamma-1 humano num primeiro plasmídeo de expressão. A região variável da cadeia leve humanizada da construção final é inserida a montante do gene C kappa num segundo plasmideo de expressão. As duas construções são então co-transfectadas para um sistema de expressão em células COS. EXEMPLO 3 - Caracterização de anticorpos anti- factor VIII.

Os anticorpos monoclonais de origem humana (exemplo 1) ou animal (exemplo 2) são caracterizados utilizando um sistema de ensaio através do qual a sua capacidade para inibir a ligação do factor VIII a fosfolípidos é avaliada. Deste modo, as placas de microtitulação de poliestireno são revestidas com fosfatidil-L-serina. 0 factor VIII recombinante solúvel a 2 pg/mL de concentração final é misturado durante 30 minutos a 37 °C com várias concentrações do anticorpo sob avaliação. A mistura é então rapidamente activada com trombina e adicionada a placas revestidas com fosfatidil-L-serina. As referidas placas foram então incubadas durante dois minutos a 21 °C e a ligação do factor VIII foi detectada por adição do mAbF14A2 anti-factor VIII domínio Al, durante dois minutos, seguido por uma incubação de dois minutos com Fcy anti-ratinho de cabra conjugado com HRP. Os resultados desta experiência 42 ΡΕ1222929 são apresentados, em relação ao anticorpo monoclonal produzido a partir da linha celular KRIX 1, na figura 4 em que a média da ligação de factor VIII activado na ausência (símbolos a cheio) ou presença (símbolos a branco) do anticorpo, assim como o desvio padrão de triplicados são indicados. Os controlos na ausência de factor VIII produziram DO 490 inferior a 0,05. A Figura 4 demonstrou assim claramente que o anticorpo monoclonal produzido a partir da linha celular KRIX 1 inibiu significativamente a ligação do factor VIII aos fosfolípidos mas produziu uma inibição quase incompleta mesmo quando adicionado em grande excesso.

Para demonstrar que, na ausência de plasma, o KRIX 1 não reconheceu a cadeia leve do factor VIII mutado do dador, foram sintetizados fragmentos de DNA que codificam cadeias leves de factor VIII de tipo silvestre e mutado. As proteínas correspondentes foram expressas em lisados de reticulócito. A dobragem correcta de cadeias leves nativas e mutadas, como determinado por imunopre-cipitação com o anticorpo monoclonal humano B02C11, que reconhece um epitopo conformacional na parte terminal carboxilo da cadeia leve do factor VIII. As experiências de imunoprecipitação indicaram que as cadeias leves ligadas a B02C11 de tipo silvestre e Arg2150His, enquanto que KRIX 1 capturou exclusivamente a cadeia leve de tipo silvestre. A exposição prolongada de géis de SDS-PAGE a uma película de autorradiografia não conseguiu detectar qualquer ligação significativa de KRIX 1 à cadeia leve mutada. As 43 ΡΕ1222929 experiências de controlo não apresentaram ligação aos reagentes de ensaio diferentes dos fragmentos do factor VIII ou factor VIII, e pré-incubação com rfVIII solúvel preveniu a ligação a fragmentos de factor VIII marcados com metionina, confirmando a especificidade de ligação. KRIX 1 não reconheceu o factor VIII em transferência de Western, indicando que o epitopo reconhecido era conformacional. Foi por isso realizado outro mapeamento de epitopo com fragmentos de factor VIII produzidos em lisados de reticulócito. Experiências preliminares indicaram que uma tal abordagem foi eficiente para a síntese de domínios de factor VIII. 0 processo de imunoprecipitação utilizando domínios de factor VIII marcados produzidos em lisado de reticulócito foi validado através do mapeamento do epitopo reconhecido pelo anticorpo monoclonal humano B02C11. Foi observada uma concordância completa entre a ligação aos fragmentos de deleção do factor VIII produzidos em lisados de reticulócito e a ligação a fragmentos recombinantes produzidos em células de E. coli ou COS. KRIX 1 ligou-se à cadeia leve de comprimento total, aos fragmentos correspondentes a A3C1, C1C2 e o domínio Cl isolado. Em contraste, KRIX 1 não se ligou aos domínios Cl ou C1C2 com a substituição Arg2150His, embora numa experiência de controlo, o domínio Arg2150His C1C2 ligou-se por B02C11 como o seu correspondente normal.

Foi realizada uma pesquisa para outras mutações na cadeia leve que podem alterar a ligação de KRIX 1. Como 44 ΡΕ1222929 apresentado na Tabela 1 abaixo, KRIX 1 inibiu a actividade de todas as moléculas de factor VIII mutado testadas até à data, excepto aquelas que comportam a mutação Arq2150His.

Tabela 1 - inibição da actividade de FVIII em plasma de doentes com hemofilia A moderada.

Mutação do Factor Actividade do Inibição de VIII factor VIII (IU/mL) KRIX-1 (%) Argl68 9Leu 0,04 >70 Argl749His 0,39 >70 Glyl750Arg 0,38 >70 Alal824Val 0,16 >70 Aspl825Gly 0,17 >70 Hisl961Tyr 0,24 >70 Argl966Gln 0,08 >70 45 ΡΕ1222929 (continuação)

Mutação do Factor Actividade do Inibição de VIII factor VIII (IU/mL) KRIX-1 (%) Met2010Ile 0 0 >70 Ser2011Asn 0,23 >70 Val2016Ala 0,05 >70 Asn2019ser 0,13 >70 Leu2052Phe 0,23 >70 Asp2074Gly 0,13 >70 Thr2086Ile OO O O >70 Ile2098Ser 0,20 >70 Phe2101 Leu O O >70 Asn2129Ser 0,20 >70 Arg2150His 0, 03 0 Pro2153Gln 0,02 65 Arg2159Leu 0,16 >70 Trp222 9Cys 0,02 >70 Gln224 6Arg 0,08 >70

Na utilização de KRIX 1 como um medicamento para inibir parcialmente o factor VIII, mutações moderadas de factor VIII não irão, consequentemente, afectar a eficiência do tratamento profiláctico ou terapêutico. KRIX 1 inibiu a ligação do factor VIII a vWf de um modo dependente da dose. A concentração de KRIX 1 necessária para alcançar uma inibição de 50% (IC50) da ligação de factor VIII foi de 0,25 pg/mL e foi obtida uma inibição superior a 95% com 20 pg/mL de KRIX 1. Os 46 ΡΕ1222929 fragmentos Fab de KRIX 1 também inibiram a ligação de factor VIII a vWf. Todavia, numa base molar foi necessário 15 vezes mais Fab do que KRIX 1 nativo para inibir 50% da ligação de factor VIII a vWf. Foram realizadas experiências adicionais de modo a excluir que fragmentos Fab de KRIX 1 possam possivelmente conter ainda anticorpo intacto ou parcialmente digerido. A análise de SDS-PAGE dos fragmentos Fab purificados por adsorção a proteína A e cromatografia de filtração por gel apresentou uma banda única. A presença de quantidades vestigiais de fragmentos Fcy que permaneceram ligados aos fragmentos Fab foi excluída em ELISA. Os poços com factor VIII insolúvel foram incubados com KRIX 1 nativo ou Fab. A ligação de ambos os KRIX 1 Fab e nativo foi detectada pela adição de IgG anti-cadeia leve k marcada com peroxidase. Em contraste, a adição de IgG anti-Fcy marcada com peroxidase não revelou qualquer ligação específica mesmo quando foram incubados nos poços 100 pg/mL da preparação de Fab. Por comparação, a adição de 0,1 pg/mL do anticorpo nativa deu origem a uma ligação significativa. Em ELISA, foi necessária uma concentração de Fav 15 vezes mais elevada do que a de anticorpo nativo, para inibir 50% da ligação de KRIX 1 biotinilado ao factor VIII insolúvel, indicando que o fragmento Fab KRIX 1 tinha uma afinidade inferior para factor VIII do que o anticorpo nativo. Consequentemente, a necessidade de concentrações de KRIX 1 Fab mais elevadas do que as de anticorpo nativo para inibir a ligação do factor VIII a vWf deve ser atribuída à afinidade reduzida de fragmentos KRIX 1 Fab para o factor VIII. 47 ΡΕ1222929

Para determinar se KRIX 1 foi representativo dos anticorpos policlonais do dador, foi utilizado um ensaio competitivo. A ligação de KRIX 1 biotinilado ao factor VIII insolúvel foi medida na presença de concentrações crescentes de qualquer um de KRIX 1, IgG policlonal do dador, ou IgG policlonal de controlo. 0 IgG do dador inibiu, de uma forma dependente da dose, a ligação de KRIX 1 ao factor VIII. As concentrações de KRIX 1 e IgG do dador que inibiram 50% de KRIX 1 biotinilado no factor VIII foram respectivamente 0,3 pg/mL e 170 pg/mL, enquanto que não foi observada inibição com o IgG de controlo. EXEMPLO 4 - produção de anticorpos monoclonais derivados de doentes com hemofilia A e que se ligam ao complexo de factor VIII e factor von Willebrand.

Alternativamente, os anticorpos que reduzem a taxa de libertação do factor VIII do factor von Willebrand são identificados como se segue. Placas de microtitulação de poliestireno são revestidas com um anticorpo especifico para o factor von Willebrand (vWF) . Uma solução de factor VIII recombinante biotinilado (0,5 pg/mL) complexado com vWF (5 pg/mL) é misturada com várias concentrações de IgG de um dador (Figura 5 quadrados a cheio), e.g., o mesmo doente descrito acima (do qual foi derivado o KRIX 1), MoAb4HlD7, ou de IgG de um indivíduo não hemofílico (Figura 5 triângulos a cheio). Foi adicionado IgG nas concentrações indicadas a placas de microtitulação revestidas com um 48 ΡΕ1222929 anticorpo de ratinho, MoAb4HlD7 contra vWF durante uma incubação de 2 horas à temperatura ambiente. Após lavagem, o factor VIII foi activado pela trombina durante dois minutos a 37 °C. 0 factor VIII ligado a vWF foi detectado através da adição de peroxidase de avidina. Os controlos incluíram a detecção de factor VIII biotinilado ligado na ausência de digestão com trombina (OD450=460+47,7DP) e de factor VIII recombinante biotinilado após digestão com trombina na ausência de anticorpo (OD450=160+16,ODP).

Os resultados destas experiências para anticorpos policlonais são apresentados na figura 5, em que os valores médios, assim como o desvio padrão de triplicados estão indicados. A Figura 5 apresenta assim, claramente, que permanece uma proporção significativamente mais elevada de factor VIII activado ligada à placa na presença de concentrações crescentes do anticorpo, i.e., demonstra uma redução da dissociação de factor VIII activado de vWF na presença de um anticorpo inibidor que reconhece o factor VIII ligado a vWF. Foram obtidos anticorpos monoclonais a partir destes anticorpos policlonais, de acordo com os métodos aqui descritos. Estes anticorpos apresentam um efeito de "plataforma" em excesso molar, como descrito acima em relação ao anticorpo KRIX 1, indicando assim que a presente invenção pode ser alargada à utilização de anticorpos monoclonais e seus fragmentos e derivados que se ligam a complexos. 49 ΡΕ1222929 EXEMPLO 5 - anticorpos monoclonais derivados de doentes com hemofilia A inibem parcialmente a formação da trombina in vitro.

Os anticorpos monoclonais humanos produzidos de acordo com o exemplo 1 foram testados in vitro contra a taxa de formação de trombina utilizando sangue total. Assim, o sangue total citratado foi recalcifiçado e agitado a 900 rpm a 37 °C em placas de cultura de suspensão de células de 24 poços, evitando activação por contacto. As amostras foram então transferidas a intervalos regulares para uma solução contendo ácido etilenodiaminatetra acético (EDTA) de modo a parar posterior activação de coagulação. Após centrifugação, a formação de trombina foi então determinada por um método bem conhecido na técnica, e.g., medindo a densidade óptica utilizando o substrato cromo-génico S-2238. Os resultados destes testes são proporcionados na figura 6, em que a absorção (expressa em nm) medida através do referido método é indicada como uma função do tempo para a amostra incubada com anticorpos derivados de KRIX 1 (designados KRIX 1) e para o controlo incubado sem esses anticorpos (denominado CTRL). Esta figura apresenta assim claramente que a adição de 2,5 pg/mL de anticorpos monoclonais humanos derivados a partir da linha celular KRIX 1 reduz significativamente (em cerca de 1/3) , mas não abole a taxa de formação de trombina em comparação com o controlo. 50 ΡΕ1222929 EXEMPLO 6 - redução in vivo da formação de trom-bina por niveis diminuídos de factor VIII. A injecção de endotoxina origina a produção de citoquinas pró-inflamatórias entre as quais a IL-6 e TNF-a são importantes para as suas interacções com o sistema de coagulação. Assim, IL-β aumenta a produção de factor de tecido e, consequentemente, a criação de trombina. Também aumenta a produção de fibrinogénio através de um mecanismo independente. TNF-α aumenta os niveis de inibidor de activação de plasminogénio de tipo I (PAI-1) e desse modo reduz a fibrinólise.

Para demonstrar o efeito da presença de factor VIII nas últimas reacções, os grupos de ratinhos que possuem o mesmo fundo genético (C57BI/6) com quaisquer concentrações de factor VIII normal ou da estirpe de factor VIII desactivada correspondente foram comparados.

Foram constituídos três grupos de seis ratinhos para cada uma das duas estirpes. Os ratinhos foram injectados intraperitonealmente com 0,4 pg, 4 pg ou 40 pg de lipopolissacárido (de E. coli serotipo 0:111:B4) por 20 g de peso corporal. 90 minutos mais tarde, foi retirado sangue por punção cardíaca em tampão citrato para avaliação dos níveis de citoquina e factor de coagulação. O plasma foi obtido por centrifugação durante 5 minutos a 5 000 rpm.

Primeiro, para determinar se foram provocadas 51 ΡΕ1222929 alterações inflamatórias comparáveis a ratinhos nas duas estirpes, o nivel de IL-6 foi avaliado. Não foram observadas diferenças entre estirpes para cada uma das três doses diferentes de lipopolissacárido. A extensão até à qual a via fibrinolitica tinha sido activada por uma injecção de lipopolissacárido de 40 pg por 20 g de peso corporal foi então avaliada medindo as concentrações dos dois principais inactivadores da via, nomeadamente PAI-1 e a2-antiplasmina, utilizando uma ELISA de tipo sanduíche com dois anticorpos monoclonais específicos dirigidos a sítios diferentes da molécula a ser avaliada. A Figura 7 demonstra que o aumento nas concentrações de PAI-1 foi semelhante nas duas estirpes de ratinho, e a figura 8 apresenta um comportamento semelhante para a a2-antiplasmina. Isto indica que a actividade fibrinolitica era independente da presença ou ausência de factor VIII. A evolução das concentrações de fibrinogénio no plasma foi utilizada como uma leitura da sua conversão em fibrina. Como apresentado na Figura 9, o nível de fibrinogénio diminuiu em 45% no grupo de ratinhos com nível de factor VIII normal, em comparação com a estirpe correspondente de factor VIII desactivado.

Conclui-se por isso que, para um desencadear inflamatório idêntico exemplificado por níveis aumentados de IL-6, e activação comparável da via fibrinolitica, não 52 ΡΕ1222929 havia uma redução significativa na degradação de fibrinogénio apenas na presença de concentrações normais de factor VIII. Niveis reduzidos ou ausência de factor VIII previne por isso a deposição de fibrina na microvascula-tura, um fenómeno chave na sindrome inflamatória sistémica gue conduz à falência do órgão.

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Arg Giu Phe Gin Gly Ser Vai Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp 85 90 95 ata gee tac atg gag ctg age age ctg aga tet gac gac acg gee gtg 336

Xie Ala Tyr Met GIu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Vai 100 105 110 tat tac tgt gea gtc cct gac cet gat gct ttt gat ate tgg ggc caa 384

Tyr Tyr Cys Ala Vai Pro Asp Pro Asp Ala Phe Asp lie Trp Gly Gin 115 120 125 ggg aca atg gtc acc gtc tet tea gee tcc acc aag ggc cea teg gtc 432

Gly Thr &et Vai Thr Vai Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Vai 130 135 140 ttc cec ctg gga tcc cgt 450

Phe Pro Leu Gly Ser Arg 145 150

<210> 2 <211> 150 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <221> misc_feature <222> (130)..(159) <223> região determinante de complementaridade número um 55 ΡΕ1222929 <22 0> <221> misc_feature <222> (202)..(258) <223> região determinante de complementaridade número dois <22 0> <221> misc_feature <222> (343)..(375) <223> região determinante de complementaridade número três <400> 2

Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Vai Ala Ala Ala Thr Gly 15 10 15

Thr Hís Ala Gin Vai Gin Leu Vai Gin Ser Gly Ala Giu Vai Lys Lys 20 25 30

Pro Gly Ala Ser Vai Lys Vai Ser Cys Lys Vai Ser Gly Tyr Thr Leu 35 40 45

Thr Glu Leu Pro Vai Bis Trp Vai Gly Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60

Glu Trp Vai Gly Ser Phe Asp Pro Glu Ser Gly Glu Ser He Tyr Ala 65 70 75 80 56 ΡΕ1222929

Arg Glu Phe Gin Giy Ser Vai Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp 85 - 90 95

Ile Ala Tyr Mefc Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Vai 100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Vai Pro Asp Pro Asp Ala Phe Asp Ile Trp Giy Gin 115 120 125

Giy Thr Met Vai Thr Vai Ser Ser Ala Ser Thr Lys Giy Pro Ser Vai 130 135 140

Phe Pro Leu Giy Ser Arg 145 150 <210> 3 <211> 426

<212> DNA <213> Homo sapiens <22 0> <221> região V <222> (1)..(426) <223> <22 0> <221> CDS <222> (1)..(426) <223> <22 0> <221> misc_feature <222> (127)..(162) <223> região determinante de complementaridade número um <220> <221> misc_feature <222> (205)..(225) <223> região determinante de complementaridade número dois <220> <221> misc_feature <222> (325)..(351) <223> região determinante de complementaridade número três 57 ΡΕ1222929 <400> 3 atg gaa acc cca 48

Met Glu Thr fro 1 gat acc acc gga 96 Âsp Thr Thr Giy 20 ttg tct cca ggg 144

Leu Ser Pro Gly 35 ttt age age age 192

Phe Ser Ser Ser gct cag ctt ctc Ala Gin Leu Leu 5 gaa att gcg ttg Glu lie Ala Leu gaa aga gee acc Glu Arg Ala Thr 40 tâC ttâ gQç. |.gg

Tyr Leu Ala Trp ttc ctc ctg cta Phe Leu Leu Leu 10 acg cag tct cca Thr Gin Ser Pro 25 ctc tcc tgc agg Leu Ser Cys Arg tat cag cag aaa Tyr Gin Gin lys ctc tgg ctc ccs Leu Trp Leu Prc 15 ggc acc ctg tct Gly Thr Leu Ser 30 gee agt cag agt Ala Ser Gin Ser 45 cet ggc cag gct Pro Gly Gin Ala 50 55 60 58 ΡΕ1222929 ccc agg ctc ctc ate tat ggt gea tce acc agg gee act gge ate cc< 240

Pro Arg Leu Leu lie Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Xle Pre 65 70 75 80 gac agg ttc agt gge agt ggg tet ggg aca gac ttc act ctc acc ate 288

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie 85 90 95 age aga ctg gag cct gaa gat ttt gea gtg tat tac tgt cag aag tat 336

Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys Gin Lys Tyr 100 105 110 ggt acg tea gcg ate acc ttc ggg eaa ggg aca cga ctg gag att aaa 384

Gly Thr Ser Ala II e Thr Phe Gly Gin Gly Thr Arg Leu Glu lie Lys 115 120 125 gga act gtg gct gea cca tet gtc ttc ate ttc ccg cca tet 426

Gly Thr Vai Ala Ala Pro Ser Vai Phe Ile Phe Pro Pro Ser 130 135 140

<210> 4 <211> 142 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <221> misc_feature <222> (127) . . (162) <223> região determinante de complementaridade número um 59 ΡΕ1222929 <22 0> <221> misc_feature <222> (205)..(225) <223> região determinante de complementaridade número dois <22 0> <221> misc_feature <222> (325)..(351) <223> região determinante de complementaridade número três <400> 4

Met Glu Thr Pro Ala Gin Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 1 5 10 15

Asp thr Thr Gly Glu Ile Ala Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser 20 25 30

Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser 35 40 45

Phe Ser Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala 50 55 60

Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro 65 70 75 80

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 60 ΡΕ1222929 85 90 95

Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys Gin Lys Tyr 100 105 110

Gly Thr Ser Ala Ile Thr Phe Gly Gin Gly Thr Arg Leu Glu lie Lys 115 120 125

Gly Thr Vai Ala Ala Pro Ser Vai Phe Ile Phe Pro Pro Ser 130 135 140 <210> 5 <211> 468

<212> DNA <213> Homo sapiens <22 0> <221> região V <222> (1)..(468) <223> <22 0> <221> CDS <222> (1)..(468) <223> <220> <221> misc_feature <222> (124)..(192) <223> região determinante de complementaridade número um <220> <221> misc_feature <222> (232)..(285) <223> região determinante de complementaridade número dois <22 0> <221> misc_feature <222> (282)..(435) <223> região determinante de complementaridade número três <400> 5 ΡΕ1222929 61 atg gac tgg acc 48 Met Asp Trp Thr 1 gcc cac tcc cag 96 Ala His Ser Gin 20 cct ggg gcc tca 144 Pro Gly Ala Ser 35 acc ggc tac tct 192 Thr Gly Tyr Ser 50 tgg gtg cga cag 240 Trp Vai Arg Gin ttc ttg gtg gea Phe Leu Vai Ala 10 caa tct ggg gct Gin Ser Gly Ala 25 tgc aag acc tct Cys Lys Thr Ser ate ttc acc gcc Ile Phe Thr Ala 60 ggg ctt gag tgg Gly Leu Glu Trp tgg agg ate ctc Trp Arg Ile Leu 5 gtg caa ctg gtg Vai Gin Leu Vai gtg aag gtc tcc

Vai Lys Vai Ser 40 gct tct gga cat Ala Ser Gly His 55 gcc cct gga caa Ala Pro Gly Gin gea gcc aca gga Ala Ala Thr Gly 15 gag gtg aag aag Glu Vai Lys Lys 30 gga tac aac ttc Gly Tyr Asn Phe 45 tac tct gtg cac Tyr Ser Vai His atg gga agg ate Met Gly Arg Ile 65 70 75 80 62 ΡΕ1222929 aac cct aac agt ggt gec aca gac 288

Asn Pro Asn Ser Gly Ala Thr Asp 85 gtc acc atg tcc agg gac acg tcc 336

Vai Thr Met Ser Arg Asp Thr Ser 100 age agg ctg aca tet gac gac acg 384

Ser Arg Leu Thr Ser Asp Asp Thr 115 120 gac aac tat ttc gat att gtg act 432

Asp Asn, Tyr Phe Asp Ile Vai Thr 130 135 tat gea cat aaa ttt cag ggc agg Tyr Ala His Lys Phe Gin Gly Arg 90 95 ate age aca gcc tac atg gaa ctg

Ile Ser Thr Ala Tyr Het Glu Leu 105 110 gcc atg tat tac tgt gcg aga gcc Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala 125 ggc tat act tet cat tac ttt gac Gly Tyr Thr Ser Kis Tyr Phe Asp 140 tac tgg ggc cgg gga acc ctg gtc acc gtc tcc tea 468

Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 145 150 155

<210> 6 <211> 156 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <221> misc_feature <222> (124) .. (192) <223> região determinante de complementaridade número um 63 ΡΕ1222929 <220> <221> misc_feature <222> (232)..(285) <223> região determinante de complementaridade número dois <220> <221> misc_feature <222> (282)..(435) <223> região determinante de complementaridade número três <400> 6

Met Asp Trp Thr Trp Arg lie Leu Phe Leu Vai Ala Ala Ala Thr Gly 15 10 IS

Ala His Ser Gin Vai Gin Leu Vai Glrs Ser Gly Ala Giu Vai Lys Lys 20 25 30

Pro Gly Ala Ser Vai Lys Vai Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Asn Phe 35 40 45

Thr Gly Tyr Ser Ala Ser Gly His He Fne Thr Ala Tyr Ser Vai His 50 55 60

Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met Gly Arg He 65 70 75 80 64 ΡΕ1222929

Asn Pro Asn Ser Giy Ala Thr Asp Tyr Ala His Lys Phe Gin Giy Arg 85 90 95

Vai Thr Met Ser Arg Asp Thr Ser lie Ser Thr Ala Tyr Met Glu leu 100 105 110

Ser Arg Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Aia 115 120 125

Asp Asn Tyr Phe Asp Ile Vai Thr Giy Tyr Thr Ser His Tyr Phe Asp 130 135 140

Tyr Trp <31y Arg Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 145 * 150 155 <210> 7 <211> 429

<212> DNA <213> Homo sapiens <22 0> <221> região V <222> (1)..(429) <223> <22 0>

<221> CDS <222> (1) .. (429) <223> <22 0> <221> misc_feature <222> (127)..(162) <223> região determinante de complementaridade número um <22 0> <221> misc_feature <222> (205)..(225) <223> região determinante de complementaridade número dois <22 0> <221> misc_feature <222> (325)..(354) <223> região determinante de complementaridade número três 65 ΡΕ1222929 <400> 7 ata gaa acc cca gct cag ctt etc ttc ctc ctg cta ctc tgg ctc cca 48 Met Glu Thr Pro Ala Gin Leu Leu Pne Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 1 5 10 15 gafc acc acc gga gaa att gtg ttg a cg cag ttc cca ggc acc ctg tct 96 Asp Thr Thr Gly Glu lie Vai Leu Thr Gin Phe Pro Gly Thr Leu Ser 20 25 30 ttg tct cca m<3 gaa aga gcc acc etc tcc tgc agg gcc agt cag agt 144 Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser 35 40 45 gtt gcc age gcc tac tta gcc tgg tac cag caa aaa cct ggc cag gct 192 Vai Ala Ser Ala Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala 50 55 60 66 ΡΕ1222929 ccc agg etc etc ate tat ggt gea tcc agt agg gee acc gac ate cca 240

Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Asp XIe Pre 65 70 75 B0 cac agg ttc agt ggc agt ggg tet ggg aca gac ttc act etc acc ate 288 Hís Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 85 90 95 age aga ctg gag cet gaa gafc ttt gea gtg tac tac tgt cag caa tat 336

Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr 100 105 110 ggt acc tea gee tta cte act ttc ggc gga ggg acc aag gtg gag ate 384

Gly Thr Ser Ala Leu Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Vai Glu Ile 115 120 125 aaa oga act gtg gct gea cca tet gtc ttc ate ttc ccg cca tet 429

Lys Arg Thr Vai Ala Ala Pro Ser Vai Phe Ile Phe Pro Pro Ser 130 135 140

<210> 8 <211> 143 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <221> misc_feature <222> (127)..(162) <223> região determinante de complementaridade número um 67 ΡΕ1222929 <220> <221> misc_feature <222> (205)..(225) <223> região determinante de complementaridade número dois <220> <221> misc_feature <222> (325) .. (354) <223> região determinante de complementaridade número três <400> 8

Met Glu Thr Pro Ala Gin Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 15 10 15

Asp Thr Thr Gly Glu Ile Vai Leu Thr Gin Phe Pro Gly Thr Leu Ser 20 25 30

Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser 3$ 40 45

Vai Ala Ser Ala Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala 50 55 60

Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Asp Ile Pro 65 70 75 80 68 ΡΕ1222929

Bis Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr IIe 85 90 95

Ser Arg Leu Giu Pro Glu Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr 100 105 110

Gly Thr Ser Ala Leu Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Vai Glu Ile 115 120 125

Lys Arg Thr Vai Ala Ala Pro Ser Vai Phe Ile Phe Pro Pro Ser 130 135 140

Lisboa, 11 de Agosto de 2010

Claims

ΡΕ1222929 1 REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de um inibidor parcial de factor VIII para o fabrico de um medicamento para a prevenção e/ou tratamento de sindrome da resposta inflamatória sistémica associada a infecção e/ou sepsia e/ou choque séptico e/ou septicemia em mamíferos, em que o referido inibidor parcial é um anticorpo monoclonal ou a seu fragmento que se liga a um sitio do factor VIII ou de um complexo que envolve o factor VIII, e possuindo a capacidade de inactivar o factor VIII ou um complexo que envolve o factor VIII em pelo menos cerca de 25% e no máximo 95%, como determinado por um ensaio cromogénico, quando o referido anticorpo monoclonal ou fragmento está num excesso molar em relação ao factor VIII .
2. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o referido inibidor parcial é um anticorpo monoclonal ou fragmento que reconhece um epitopo localizado no dominio Cl do factor VIII.
3. Utilização de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o referido inibidor parcial é um anticorpo monoclonal humano que se pode obter a partir da linha celular denominada KRIX-1 depositada em Belgian Coordinated Collections of Micro-organisms com o número de acesso LMBP 5089CB, ou um anticorpo que possui pelo menos 80% de homologia de sequências com este nas regiões CDR, ou um seu fragmento de ligação ao antigénio. 2 ΡΕ1222929
4. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 até 3, em que o referido inibidor parcial é um anticorpo monoclonal que possui a capacidade de reacção idêntica de modo que os anticorpos monoclonais humanos obtidos a partir da linha celular KRIX-1 depositada em Belgian Coordinated Collections of Micro-organisms com o número de acesso LMBP 5089CB, ou um seu fragmento de ligação ao antigénio.
5. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 até 4, em que o referido fragmento do referido anticorpo é um fragmento Fab, Fab' ou F(ab')2/ um fragmento variável solúvel de cadeia simples ou ancorada à membrana, ou um dominio variável único ou uma combinação deste.
6. Utilização de acordo qualquer uma das reivindicações 1 até 5, em que o referido medicamento compreende ainda uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente anti-trombótico.
7. Utilização de acordo com a reivindicação 6, em que o referido agente anti-trombótico é heparina. Lisboa, 11 de Agosto de 2010 PE1222929 1/10 M.gmçio d# áíiftleQrpó I9S á ΈΨΖΧΧ wm ÊLIBÃ

:*ZMMfto â.s a* r#I£t s ®iss» ·&$·§«<' PE1222929 2/10 loíMglo de FvIIl íl) FVIIÍ Residual (!)

Concentração de B02C11 (gg/mL) Fig. 2

Cone. KRIX 1 (gg/mL) ΡΕ1222929 3/10

IgG (gg/mL) Fig. 5 ΡΕ1222929 4/10

Fig. 6 ΡΕ1222929 5/10 Figura 7 iâlTneis ώο plasiaa ΡΛΙ-1 acfcivo e® de tipo silvestre e FVI11 KT! C57BI/6 sís

Figura
8 MimíS plissa de &l fa -â~^fcâpl*«*iss& fe« ss«§adhss m tipo ® F^III BI CSíS-l / 6-

ΡΕ1222929 6/10 Figura
9 Uiveis no plasma de fiferinogérsio em. BQEsmibos de tipo silvestre & FVIII KD C57BI/ê ΡΕ1222929 7/10 VB 80 2C11 1 atg gac tgg acc tgg agg ate etc ttc ttg Met Asp Trp Thr Trp Arg Xle Leu Phe Leu 61 gtc caa erg gta cag tet ggg gct gag gtg Vai Gin Leu Vai Gin Ser Gly Ala Glu Vai 21 121 tgc aag gtt tcc gga tac acc ctc act gas Cys Lys Vai Ser Gly ?yr Thr Leu Thr Glu 41 <----—-----------C0R1“~--------- 181 gga aaa ggg ctt gag tgg gtg gga agt ttt Gly Lys Giy Leu Giu Trp Vai Gly Ser Phe 61 60 gtg gea gea gct aca gqc acc cac gee cag Vai Ala Ãla Ala Thr Glv Thr His Ala Sln 20 120 aag aag eet ggg gee tea gtg aag gtc toe Lys Lys Pro GÍv Ala Ser Vai Lys Vai Ser 40 180 tta ece gtg cac tgg gtc gga cag gct eet Leu Pro Vai Sis Trp Vai Gly Glrs Ala ---------------60 240 gat eet gaa agt gga gaa tea ate tac gea Asp Pro Glu Ser Gly Glu Ser 11® Tyr Ala ---------—-------CDR2.........——--80 241 300 cgg gag ttc cag ggc age gtc acc atg acc gcg gac aca tet aca gac ata gee tac atg Arg Glu Phe Gin Gly Ser Vai Thr Hat Thr Âla Asp Thr Ser Thr Asp lie Ala Tyr Met 8i----------------------—> 100 301 3SC gag ctg age age ctg aga tet gac gac acg gee gtg tat tac tgt çca gtc eet gac eet Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr A.la Vai Tyr Tyr Cys Ala Vai Pro Asp Pro 101 <---·--------C0R3—120 361 gat gct ttt gat ate tgg ggç caa Asp Ala Phe Asp 11¾ Trp Giy Gin 121------------------------1 420 ggg aea atg gtc acc gtc tet tea gee tce acc aag Gly Thr Mac Vai Thr Vai Ser Ser Âla Ser Thr Lys 140 421 450 ggc cca teg gtc ttc ccc ctg gga tcc cgfc Gly Pro Ser Vai Phe Pro Leu Gly Ser Arg 141 ISO FIGURA 10 8/10 ΡΕ1222929 VL SO 2C11 I atg gaa acc cca gct cag ctt etc ttc ctc ctg et» ctc tgg etc cea gat acc Ket Glu Thr Fro Ala Gin Leu Leu Phe L®u Leu Leu Leu Trp Leu fro Asp Thr 1 61 gaa att gcg ttg acg cag ect cca ggc acc ctg tet ttg tefc cca ggg gaa aga Glu Ile Ala Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg 211 121 ctc tcc tgc agg gee agt cag agt fctt age age age tac tta gee tgg tat cag Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Phe Ser Ser Ser Tyr Leu Aia Trp Tyr Gin 181 cct ggc cag gct ccc agg ctc ctc ate tat ggt gea tcc acc agg gee act ggc Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu lie Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly 61 ---------CDH2-------* 241 gac agg ttc agt ggc agt ggg tet ggg aca gac ttc act ctc acc ate age aga Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg 81 301 ect gaa gat ttt gea gtg tat tac tgt cag aag tat ggt acg tea gcg ate acc Pro Glu Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys Gin Lys Tyr Gly Thr Ser Ala Ile Thr 101 ------- CDR3-----------------* 361 caa ggg «ca cga ctg gag att aaa gga act gtg gct ges cca tet gtc ttc ate Gin Gly Thr Arg Leu Glu lie Lys Gly Thr Vai Ala Ala Fro Ser Vai Phe 11« 121 421 426 cca tet Pro Ser 141 142 Figura 11 60 acc gga Thr Gly 20 120 gee acc Ala Thr 40 180 cag aaa Gin Lys 60 240 ate cca Ile Pr© 60 300 ctg gag Leu Glu 100 360 ttc ggg Phe Gly 120 420 ttc ccg Phe Pro 140 ΡΕ1222929 9/10 VH KRÍX -1 1 60 atg gac tgg scc tgg açg ate ccc ttc ttg gtg gea gea gee aca çga gee cac tcc cag Met Asp Trp Thr Tro Arq Ile Leu Phe Leu Vai Ala Ala Ala Thr Gly Ala Mis Ser Gin 1 20 61 20 gtg caa ctg gtg eaa tcc ggg gee gag gtg aag aag cot ggg gee tea gtg aag gtc tcc Vai Gin Leu Vai Gin Ser Gly Ala G.lu Vai Lys Lys Pro Gly Ala Ser Vai Lys Vai Ser 21 40 121 180 tçc aag acc tcc gga tac aac ttc acc ggc tac tet gee tcc gga cat ate ttc acc gee Cys Lys Thr Ser Giy Tyr Asn £Tse Thr Gly Tyr Ser Ala Ser Gly His lie Phe Thr Àla 41 £------------------------------------COR1—---------------------------------—-60 181 240 tac fcct gtg cac tgg gtg ege eag gee cct gga caa ggg ctt gae tgg atg gga agg ate Tyr Ser Vai His Trp Vai Arg ein Ala Pro Giy Gin Gly Leu Gle Trp Hat Giy Arg lie —80 241 300 aac cct aac agt ggt gee a ca gac tat gea cat asa ttt eag ggc agg gtc acc atg tcc hsn Pro Asn Ser Gly Ala Thr Asp Tyr Ala Sis Lys Phe Gin Gly Arg Vai Thr «et Ser 81------------C0R2-------------------------------------------------------» 100 301 agg gac acg tcc Arg Asp Thr Ser 101 360 ate age aca gee tac atg gaa ctg age agg ctg aca tet gac gac acg Ue Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu Thr Ser Asp Asp Thr 120 361 gee atg tat tac tgt gcg aga Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg 121 420 gee gac ase tat ttc gat âtt gtg acfc ggc tat act tet Ala Asp Aso Tyr Phe Asp lie Vsl Thr Gly Tyr Thr Ser *·---------------------- _ . „..—--CDR3-----— - --------—140 421 468 cat tac ttc gac tac tgg ggc egg gga ace ctg gto aec ate tcc tea Ale Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 141"-------------- 156 Figura 12 10/10 ΡΕ1222929 vt mix i α só atg Met 1 «a a Slu acc Thr CCâ Fro gct ala cag Gin ctt Leu etc Leu ttc Phe ctc 1)6« ctc Leu et a Leu ctc Leu tgg Trp ctc Leu c ca ΡϊΓΟ gat Asp ano Thr acc Thr m a Gly 20 61 120 gaa Glu 21 att Ile gtg Val ttg Leu acq Thr cag Gin EtC The CCS Pr© ggc Gly acc Thr ctg Leu tet Ser ttg Leu tC.t Ser CCS Pr© Gly gaa Gin aga Arg gee Ala acc Thr 40 121 ctc tcc tge. agg gee agt cag: agt gtt gee age gee tac tta gee tgg tac cag ca a ISO asa Leu Ser Cvs Arg Ala Ser Gin Ser Val Ale Ser Ala Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys 41 ------ — .............. -CDRl--- — — — 60 191 240 cct ggc cag gct ccc agg ctc ctc ate tat ggt gea tcc agt agg gee acc gac ate CCS Pr o 6iy Gin Ala Fro Arg Leu Leu 11« Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Asp lie Pr© 61 — — CDR2 — — — 80 241 300 c&c agg ttc agt qqc agt m<5 tet «93 a ca gac ttc act ctc acc ate age aga ctg gag Sis Arg Phe Ser Gly Ser Siy Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Xle Ser Arg Leu Glu 81 100 301 360 cct gaa gat tfct gea gtg tac tac tgt cag caa tat sgt acc tea gee tta ctc act ttc Pra Glu Asp Phe Ala val Tyr Tyr Cys GlX: Gin Tyr Gly Thr Ser Ala Leu Leu Thr Pise 101 ~CDS 3----- — — ------ 120 361 ggc ggs 933 acc asg gtg gsg ate aaa cga act gtg gct gea cea tet gtc ttc 420 ate ttc Gly Gly Gly Thr Lys Vai <31« lie Lys Arg Thr val A.la Ala Iro Ser Val Phe Ile Phe .121 140 420 429 ceg cca tet Pro Pro Ser 141 143 FIGURA 13 1 ΡΕ1222929 REFERENCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO Esta lista de referências citadas pelo requerente é apenas para conveniência do leitor. A mesma não faz parte do documento da patente Europeia. Ainda que tenha sido tomado o devido cuidado ao compilar as referências, podem não estar excluídos erros ou omissões e o IEP declina quaisquer responsabilidades a esse respeito. Documentos de patentes citadas na Descrição . WO 8*28010 A * USS02614SSB • WO 0104268 A Literatura que não é de patentes citada na Descrição >: R,:C>S©Be: Cfsasi 188% voi. 131,.184¾¾1 > aCCftesí. 59S7. yci 112,238-43 * hÉo et at, faterr,. kfed. isso. vsfc. 114, 227-242 * EJ*. MamntjiiR. ;Má5síià Ca?® .OMf,, i’§&8, va!v2.4, 643-50 » Makí &1 ai. SpscC, OissM. «at-23,·; 23C24Q » Btauhut st a& Éss,< ilSÍS?. ysi 3É; $1.-88 '* Eiseis et' ai.·, ifihtnme CáM 24, 663-72 * Bsiiter ai ai. 4a?. J Med. 1 S8&, vof. 87,44-48 « ¥!n«zzef. :18§5> I, 62:-65. * Ssi>ssíart et p,,ÁíS.: 4/$$«?;:<' 1S^,: 5f&ÍÍ::S?; 53-60 f J3«qusmÍB e$. si S.fcotf, 2<38&. voi. 85. 156-163 * MvRiiHáftiii Cfsí.. &égàtt 1361? 4': 19S3.127 * Arai et aí. J.Ctji&limsL, 1S8S,. vsí.·-0¾ 1WS * Sfrstaa ®t a!,; ihmx Hsçmísl 1S93, voi 8S, 240 >. vi Bck ChsfTt. 5394. ysi. 263, 11801 * Jonas et ai. Nstuss. 1986 V3l 321.522 » KLieehsfiartt. Nafoir*. 5838. voi 332, 323 * Sís»wortfc st aí, Haodroo* os £s;p«ffeg^teíi Ibistiíl^-c-otegy. Biaciweii Scseotfftr RtásScaiSsis. .iSPSyiíafc 1 * Otaíísnisaffih ; Ovsk&iaí, FC17 Fííftser, a Istoratsíy ííísRuai. CsH SpíCí; Maíbout Press, 1985 * BMand et ai. Tesss» Aíidgssss, 1SSS, voi. 47,1¾ ,*. RersfeigKsns Pítsrrrsaceífiicai Sciences. 1380 * TIbusiíosís. KIcvíSí Acstíesswc PíásSísteís, t383 :* ·:ξίί»3Γβιηί:ί?ϊίΕί^Ι^^ 1934 *.Sis®? «4 ai Cartesf íísseaftTs, 1S33, vÇ 53;. S51-S