JP2017031218A - 延長組換えポリペプチドおよび延長組換えポリペプチドを含む組成物 - Google Patents

延長組換えポリペプチドおよび延長組換えポリペプチドを含む組成物 Download PDF

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Abstract

【課題】生物活性タンパク質の生物学的、薬学的、安全性および／または治療特性を増強するのに有用であり得る組成物および方法を提供すること。
【解決手段】本発明は、延長組換えポリペプチド（ＸＴＥＮ）に連結された生物活性タンパク質を含む組成物、組成物をコードする単離核酸ならびにそれを含有するベクターおよび宿主細胞、ならびにグルコース関連疾患、代謝性疾患、凝固障害、ならびに成長ホルモン関連障害および症状の処置におけるこのような組成物の使用方法に関するものである。一態様において、本発明は延長組換えポリペプチド（ＸＴＥＮ）の組成物を提供し、該組成物は生物活性タンパク質に連結されたときに、得られた融合タンパク質の薬物動態特性を増強し、ならびに／または得られた融合タンパク質の溶解性および安定性を増加させて、一方では生物活性タンパク質の全体的な生物学的活性および／または治療活性を増強する。
【選択図】なし

Description

政府支援の研究に関する陳述
本発明は、国立衛生研究所により授与されたＳＢＩＲ助成金２Ｒ４４ＧＭ０７９８７３−０２の下、政府支援により成された。合衆国政府は本発明に一定の権利を有する。
関連出願への相互参照
本願は、すべて係属中である、２００９年２月３日に出願された米国仮特許出願第６１／１４９，６６９号、２００９年６月８日に出願された米国仮特許出願第６１／２６８，１９３号、２００９年６月８日に出願された米国仮特許出願第６１／１８５，１１２号、２００９年８月２４日に出願された米国仮特許出願第６１／２３６，４９３号、２００９年８月２５日に出願された米国仮特許出願第６１／２３６，８３６号、２００９年９月１８日に出願された米国仮特許出願第６１／２４３，７０７号、２００９年９月２４日に出願された米国仮特許出願第６１／２４５，４９０号、２００９年１１月１０日に出願された米国仮特許出願第６１／２８０，９５５号、２００９年１１月１０日に出願された米国仮特許出願第６１／２８０，９５６号、２００９年１１月１２日に出願された米国仮特許出願第６１／２８１，１０９号の優先権の利益を主張する。これらの米国仮特許出願は、それらの全体が、本明細書中に参考として援用される。
発明の分野
生物活性タンパク質は、治療薬としての生物活性タンパク質を包含して、特に水性溶液において調合されるときに短い貯蔵寿命を示す、通例不安定な分子である。さらに多くの生物活性ペプチドおよびタンパク質は、限定された溶解性を有するか、または組換え産生中に凝集するようになり、複雑な可溶化および再折畳み手順が必要である。各種の化学ポリマーをこのようなタンパク質に付着させて、その特性を改変することができる。特に興味深いのは、柔軟な高次構造を有し、水溶液中で十分に水和されている親水性ポリマーである。頻繁に使用されるポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。これらのポリマーは、その分子量に対して大きい流体力学半径を有する傾向があり（非特許文献１）、薬物動態特性の増強をもたらすことができる。付着点によっては、ポリマーは、ポリマー改変タンパク質がその関連機能を保持するようにポリマーが付着されたタンパク質との相互作用が制限される傾向がある。しかしポリマーのタンパク質への化学的コンジュゲーションは、複雑な複数ステップのプロセスを必要とする。通例、タンパク質構成要素は、化学的コンジュゲーションステップの前に産生および精製される必要がある。さらにコンジュゲーションステップは、分離する必要のある異種生成物の混合物の形成をもたらし、かなりの生成物損失につながり得る。あるいはこのような混合物は、最終的な薬学的生成物として使用することができるが、標準化することが困難である。いくつかの例は、最近販売されている、混合物として使用されるＰＥＧ化インターフェロン−アルファ生成物である（非特許文献２；非特許文献３）。このような混合物は、治療活性の低下したまたは治療活性のない異性体を含有するために、再現性の良い製造および特徴付けが困難である。
アルブミンおよび免疫グロブリンフラグメント、たとえばＦｃ領域は、他の生物活性タンパク質をコンジュゲートするのに使用されてきたが、貯蔵寿命または免疫原性の増加に関する成果は予測できない。運の悪いことに、Ｆｃドメインは組換え発現の間に効率的に折畳まれず、封入体として公知の不溶性沈殿を形成する傾向がある。これらの封入体を可溶化する必要があり、機能性タンパク質を復元する必要がある。これは時間がかかり、非効率的であり、費用のかかるプロセスであり、追加の製造ステップおよびしばしば複雑な
精製手順を必要とする。
それゆえ、生物活性タンパク質の生物学的、薬理学的、安全性、および／または薬学的特性を改善する組成物および方法へのかなりの必要性が残されている。
Ｋｕｂｅｔｚｋｏ，Ｓ．ら（２００５）Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，６８：１４３９−５４ Ｗａｎｇ，Ｂ．Ｌ．ら（１９９８）Ｊ Ｓｕｂｍｉｃｒｏｓｃ Ｃｙｔｏｌ Ｐａｔｈｏｌ，３０：５０３−９ Ｄｈａｌｌｕｉｎ，Ｃ．ら（２００５）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ，１６：５０４−１７
本開示は、生物活性タンパク質の生物学的、薬学的、安全性および／または治療特性を増強するのに有用であり得る組成物および方法に関するものである。組成物および方法は、半減期などの薬物動態特性を増強するためおよび生物活性タンパク質の治療ウインドウ内で費やされる時間を増加するために、ならびにこのような生物活性タンパク質の産生プロセスおよび薬学的特性、たとえば溶解性を単純化するために特に有用である。
本開示は、一部は、融合タンパク質を含む薬学的組成物および疾患、障害または状態を処置するためのその使用に関する。処置される特定の疾患は、生物活性タンパク質の選定に依存する。いくつかの実施形態において、組成物および方法は、代謝疾患および心血管疾患（これに限定されるわけではないが、グルコースまたはインスリン関連疾患を包含する）、凝固障害および出血障害、ならびに成長ホルモン関連障害を処置するのに有用である。
一態様において、本発明は延長組換えポリペプチド（ＸＴＥＮ）の組成物を提供し、該組成物は生物活性タンパク質に連結されたときに、得られた融合タンパク質の薬物動態特性を増強し、ならびに／または得られた融合タンパク質の溶解性および安定性を増加させて、一方では生物活性タンパク質の全体的な生物学的活性および／または治療活性を増強する。このような組成物は、本明細書に記載するような、特定の疾患、障害または状態を処置する有用性を有し得る。得られた融合タンパク質は、より良好な安全性プロフィールを示し、より頻度の低い投薬を可能にするので、今度はより良好な患者コンプライアンスに導くことができる。本発明は、ＸＴＥＮおよびＸＴＥＮと連結された生物活性タンパク質の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、ならびにＸＴＥＮおよびＸＴＥＮと連結された生物活性タンパク質の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドに相補的であるポリヌクレオチドも提供する。
別の態様において、本発明は、生物活性タンパク質（ＢＰ）に連結されて、単量体ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質を生じることができる融合パートナーとして有用である、延長組換えポリペプチド（ＸＴＥＮ）の組成物を提供する。
一実施形態において、本発明は約４００超〜約３０００のアミノ酸残基を含む単離延長組換えポリペプチド（ＸＴＥＮ）を提供し、該ＸＴＥＮは、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）およびプロリン（Ｐ）残基の和が該ＸＴＥＮの全アミノ酸配列の約８０％超、または約８５％、または約９０％、または約９５％、または約９６％、または約９７％、または約９８％、または約９９％を構
成することを特徴とし、該ＸＴＥＮ配列は実質的に非反復であり、該ＸＴＥＮ配列は、ＴＥＰＩＴＯＰＥアルゴリズムによって解析されたときに予測されたＴ細胞エピトープを欠いており、該ＸＴＥＮ配列内エピトープに対する該ＴＥＰＩＴＯＰＥアルゴリズム予測は、−５、または−６、または−７、または−８、または−９またはそれより多くのスコアに基づき、該ＸＴＥＮ配列は、ＧＯＲアルゴリズムによって決定されたように、９０％超の、または９１％超の、または９２％超の、または９３％超の、または９４％超の、または９５％超の、または９６％超の、または９６％超の、または９８％超の、または９９％超のランダムコイル形成物を有し、ならびに該ＸＴＥＮ配列は、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴリズムによって決定されたように、２％未満のアルファらせんおよび２％のベータシートを有する。
別の実施形態において、本発明は約４００超〜約３０００のアミノ酸残基を含むＸＴＥＮを提供し、該ＸＴＥＮは、アスパラギンおよびグルタミン残基の和が該ＸＴＥＮの全アミノ酸配列の１０％未満であり、メチオニンおよびトリプトファン残基の和が該ＸＴＥＮの全アミノ酸配列の２％未満であることを特徴とし、該ＸＴＥＮ配列は５％未満の、正電荷を有するアミノ酸残基を有し、該ＸＴＥＮ配列は、ＧＯＲアルゴリズムによって決定されたように、９０％超のランダムコイル形成物を有し、ならびに該ＸＴＥＮ配列は、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴリズムによって決定されたように、２％未満のアルファらせんおよび２％のベータシートを有する。
別の実施形態において、本発明は約４００超〜約３０００のアミノ酸残基を含むＸＴＥＮを提供し、該ＸＴＥＮは、少なくとも約８０％の、または少なくとも約９０％の、または少なくとも約９１％の、または少なくとも約９２％の、または少なくとも約９３％の、または少なくとも約９４％の、または少なくとも約９５％の、または少なくとも約９６％の、または少なくとも約９７％の、または少なくとも約９８％のまたは、少なくとも約９９％のＸＴＥＮ配列が非重複配列モチーフから成り、該配列モチーフそれぞれが約９〜約１４個のアミノ酸残基を有し、任意の２個の連続アミノ酸残基の配列が該配列モチーフそれぞれにおいて３回以上出現せず、該配列モチーフがグリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）およびプロリン（Ｐ）から選択される４〜６種類のアミノ酸から成り、該ＸＴＥＮは、生物活性タンパク質に連結されたときに生物活性タンパク質の薬物動態特性を増強して、該薬物動態特性は、生物活性タンパク質に連結され、同程度の用量で被験体に投与されたＸＴＥＮと比較して、被験体に投与された生物活性タンパク質の最終半減期を測定することによって確認される。
上述の実施形態のいくつかの場合では、いずれの１種類のアミノ酸もＸＴＥＮ配列の３０％超を構成することはない。上述の実施形態の他の場合において、ＸＴＥＮはアミノ酸がセリンでない限り、３個の連続アミノ酸が同一でない配列を有することができ、この場合、３個以下の連続アミノ酸がセリン残基である。上述の実施形態の他の場合において、ＸＴＥＮ配列は１０未満の、または９の、または８の、または７の、または６のサブ配列スコアを有する。上述の実施形態のまた他の場合において、ＸＴＥＮ配列の少なくとも約８０％の、または約９０％の、または約９５％の、または約９６％の、または約９７％の、または約９８％の、または約９９％の、または１００％は非重複配列モチーフから成り、該配列モチーフそれぞれは１２のアミノ酸残基を有する。一実施形態において、ＸＴＥＮ配列は非重複配列モチーフから成り、該配列モチーフは表１の１個以上の配列からである。
いくつかの実施形態において、得られた融合タンパク質の増強された薬物動態特性は、少なくとも約２倍の、または少なくとも約３倍の、または少なくとも約４倍の、または少なくとも約５倍の、または少なくとも約６倍の、または少なくとも約８倍の、または少なくとも約１０倍の最終半減期の増加を含む。いくつかの場合において、薬物動態特性の増
強は、融合タンパク質の治療ウインドウ内で所与の期間にわたって残存する血液濃度が、ＸＴＥＮに連結されていない対応するＢＰと比較して、少なくとも約２倍、または少なくとも約３倍の、または少なくとも約４倍の、または少なくとも約５倍の、または少なくとも約６倍の、または少なくとも約８倍の、または少なくとも約１０倍の長さであるという事実によって示される。半減期および治療ウインドウ内で費やされる時間の増加により、ＸＴＥＮに連結されていない対応するＢＰと比較して、被験体に投与される融合タンパク質のより低頻度の投薬および量の減少（モル当量で）が可能になる。一実施形態において、治療的有効用量レジメンによって、融合タンパク質の血中濃度の少なくとも２つの連続するＣｍａｘピーク値および／またはＣｍｉｎトラフ値の間で、融合タンパク質に連結されておらず、同程度の用量のレジメンを使用して被験体に投与された対応するＢＰと比較して、少なくとも２倍の、または少なくとも３倍の、または少なくとも４倍の、または少なくとも５倍の、または少なくとも６倍の、または少なくとも８倍の、または少なくとも１０倍の時間の増大がもたらされる。
一実施形態において、ＸＴＥＮの少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約９９％が表１の１個以上の配列から選択されるモチーフを含む。別の実施形態において、ＸＴＥＮは、表２から選択された配列に対して、少なくとも約８０％の、または少なくとも約９０％の、または少なくとも約９１％の、または少なくとも約９２％の、または少なくとも約９３％の、または少なくとも約９４％の、または少なくとも約９５％の、または少なくとも約９６％の、または少なくとも約９７％の、または少なくとも約９８％の、または少なくとも約９９％または１００％の配列同一性を示す。
いくつかの場合において、ＸＴＥＮは、生物活性タンパク質に連結させた場合、該生物活性タンパク質の熱安定性を増強し、ここで、該熱安定性は、生物活性タンパク質を少なくとも約７日間にわたる約３７℃の温度への曝露した後に、生物活性タンパク質に連鎖されたＸＴＥＮと比較した、生物活性の保持を測定することによって確認される。上述の一実施形態において、生物活性の保持は、ＸＴＥＮからなるＸＴＥＮに連結されていないＢＰと比較して、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、または約１５０％、少なくとも約２００％、少なくとも約３００％の、または約５００％長く増加される。
別の態様において、本発明は、生物活性タンパク質（ＢＰ）に連結された上述の実施形態の任意のＸＴＥＮを含む、単離融合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態において、融合タンパク質のＢＰは、表３、表４、表５、表６、表７、および表８から選択される配列に対して少なくとも約８０％の、または少なくとも約９０％の、または少なくとも約９１％の、または少なくとも約９２％の、または少なくとも約９３％の、または少なくとも約９４％の、または少なくとも約９５％の、または少なくとも約９６％の、または少なくとも約９７％の、または少なくとも約９８％の、または少なくとも約９９％または１００％配列同一性を示す。上述の別の実施形態において、単離融合タンパク質は第２のＸＴＥＮ配列をさらに含み、該ＸＴＥＮ配列のアミノ酸残基の累積合計は約４００超〜約３０００残基である。
いくつかの場合において、上述の実施形態の１つのＸＴＥＮを有する単離融合タンパク質はＢＰを含み、該ＢＰはグルコース調節ペプチドである。上述の一実施形態において、グルコース調節ペプチドはエキセンジン−４である。上述の他の実施形態において、グルコース調節ペプチドはグルカゴンである。
他の場合において、単離融合タンパク質はＢＰを含み、該ＢＰは代謝タンパク質である。上述の一実施形態において、代謝タンパク質はＩＬ−１ｒａである。
なお他の場合において、単離融合タンパク質はＢＰを含み、該ＢＰは凝固因子である。上述の一実施形態において、凝固因子は第ＩＸ因子である。上述の別の実施形態において、凝固因子は第ＶＩＩ因子である。
他の場合において、単離融合タンパク質はＢＰを含み、該ＢＰは成長ホルモンである。
一実施形態において、単離融合タンパク質はＸＴＥＮに連結されていない生物活性タンパク質と比較して免疫原性が低くあり得、免疫原性は、被験体に同程度の用量を投与した後に、生物活性タンパク質に選択的に結合するＩｇＧ抗体の産生を測定することによって確認される。
上述の実施形態のＸＴＥＮおよびＢＰを含む融合タンパク質はＢＰとＸＴＥＮとの間にスペーサ配列を含むことができ、該スペーサ配列は、場合により切断配列を含む約１〜約５０のアミノ酸残基を含む。一実施形態において、切断配列はプロテアーゼによる切断を受けやすい。このようなプロテアーゼの非限定的な例は、ＦＸＩａ、ＦＸＩＩａ、カリクレイン、ＦＶＩＩａ、ＦＩＸａ、ＦＸａ、トロンビン、エラスターゼ−２、グランザイムＢ、ＭＭＰ−１２、ＭＭＰ−１３、ＭＭＰ−１７またはＭＭＰ−２０、ＴＥＶ、エンテロキナーゼ、ライノウイルス３Ｃプロテアーゼ、およびソルターゼＡを包含する。
いくつかの場合において、単離融合タンパク質は、融合タンパク質に連結されていない対応するＢＰと比較して、対応するＢＰの標的受容体に対する結合親和性の低下を有するように構成される。一実施形態において、融合タンパク質は、融合タンパク質に連結されていない対応するＢＰの結合能力の約０．０１％〜３０％の、または約０．１％〜約２０％の、または約１％〜約１５％の、または約２％〜約１０％の範囲で、ＢＰの標的受容体に対する結合を示す。関連する実施形態において、親和性が低下した融合タンパク質は、融合タンパク質に連結されていない対応するＢＰと比較して、受容体媒介クリアランスの低下および少なくとも約５０％の、または少なくとも約６０％の、または少なくとも約７０％の、または少なくとも約８０％の、または少なくとも約９０％の、または少なくとも約１００％の、または少なくとも約１５０％の、または少なくとも約２００％の、または少なくとも約３００％の、または少なくとも約５００％の対応する半減期の増加を有することができる。
一実施形態において、本発明は、表４０、表４１、表４２、表４３、および表４４から選択される配列に対して少なくとも約８０％の、または少なくとも約９０％の、または少なくとも約９１％の、または少なくとも約９２％の、または少なくとも約９３％の、または少なくとも約９４％の、または少なくとも約９５％の、または少なくとも約９６％の、または少なくとも約９７％の、または少なくとも約９８％の、または少なくとも約９９％の、または１００％の配列同一性を示す単離融合タンパク質を提供する。
一実施形態において、本発明は融合タンパク質を含む組成物を提供し、該融合タンパク質は、表３〜８のいずれか１つからの配列に対して少なくとも約８０％の配列同一性を、または８１％の、８２％の、８３％の、８４％の、８５％の、８６％の、８７％の、８８％の、８９％の、９０％の、９１％の、９２％の、９３％の、９４％の、９５％の、９６％の、９７％の、９８％の、９９％の、または１００％の配列同一性を示す配列を含む少なくとも第１のＢＰを含み、該ＢＰは約１００超〜約３０００のアミノ酸残基、さらに好ましくは約４００超〜約３０００のアミノ酸残基をそれぞれ含む１つ以上の延長組換えポリペプチド（ＸＴＥＮ）に実質的に非反復の配列によって連結され、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）およびプロリン（Ｐ）残基の和は、該ＸＴＥＮの全アミノ酸配列の約８０％超、または約８５％、または約
９０％、または約９５％、または約９６％、または約９７％、または約９８％、または約９９％を構成する。ＢＰＸＴＥＮのＸＴＥＮ構成要素は、ＴＥＰＩＴＯＰＥアルゴリズムによって解析したときに予測されるＴ細胞エピトープを欠くことがあり、ＸＴＥＮ配列内のエピトープのＴＥＰＩＴＯＰＥアルゴリズム予測は、−７以上の、または−８以上の、または−９以上のスコアに基づく。ＢＰＸＴＥＮのＸＴＥＮ構成要素は、ＧＯＲアルゴリズムによって決定されたように８０％超の、または約８５％の、または約９０％の、または約９１％の、または約９２％の、または約９３％の、または約９４％の、または約９５％の、または約９６％の、または約９７％の、または約９８％の、または約９９％ランダムコイル構造物を有する配列を有し得；およびＸＴＥＮ配列は、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴリズムによって決定されたように２％未満のアルファらせんおよび２％のベータシートを有することができる。
いくつかの実施形態において、本発明はＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質を提供し、被験体に投与された該ＢＰＸＴＥＮは、融合タンパク質に連結されていない対応するＢＰと比較して、少なくとも約２倍の長さのＢＰＸＴＥＮの最終半減期の増加を、または融合タンパク質に連結されていないＢＰと比較して、少なくとも約３倍の、または少なくとも約４倍の、または少なくとも約５倍の、または少なくとも約６倍の、または少なくとも約７倍の、または少なくとも約８倍の、または少なくとも約９倍の、または少なくとも約１０倍の、または少なくとも約１５倍の、または少なくとも２０倍のまたはそれより多くのの最終半減期の増加を示す。
いくつかの実施形態において、本発明はＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質を提供し、該ＢＰＸＴＥＮは、融合タンパク質に連結されていないＢＰと比較して、生理的条件にて、少なくとも３倍の、または少なくとも約４倍の、または少なくとも約５倍の、または少なくとも約６倍の、または少なくとも約７倍の、または少なくとも約８倍の、または少なくとも約９倍の、または少なくとも約１０倍の、または少なくとも約１５倍の、または少なくとも２０倍の、または少なくとも４０倍の、または少なくとも６０倍の溶解度の増加を示す。
いくつかの実施形態において、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質は、サイズ排除クロマトグラフィーによって決定されるように、実際の分子量と比較して見かけの分子量の増加を示し、該見かけの分子量は、少なくとも約１００ｋＤ、または少なくとも約１５０ｋＤ、または少なくとも約２００ｋＤ、または少なくとも約３００ｋＤ、または少なくとも約４００ｋＤ、または少なくとも約５００ｋＤ、または少なくとも約６００ｋＤ、または少なくとも約７００ｋＤであるが、融合タンパク質の各ＢＰ構成要素の実際の分子量は約２５ｋＤ未満である。したがって、該ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質は、融合タンパク質の実際の分子量よりも約４倍の大きさの、または約５倍の大きさの、または約６倍の大きさの、または約７倍の大きさの、または約８倍の大きさの見かけの分子量を有することができる。いくつかの場合において、上述の実施形態の単離融合タンパク質は、約４を超える、または約５の、または約６の、または約７の、または約８の、生理的条件下での見かけの分子量係数（ａｐｐａｒｅｎｔ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｆａｃｔｏｒ）を示す。
本発明は、ＢＰが、ＸＴＥＮに連結されていない対応するＢＰの生物活性の少なくとも一部を保持する、各種の配置のＢＰＸＴＥＮを提供する。一実施形態において、該ＢＰＸＴＥＮは、式Ｉの配置のＸＴＥＮに連結されたＢＰを含み
（ＢＰ）−（Ｓ）ｘ−（ＸＴＥＮ） Ｉ
式中、各出現について、独立して、ＢＰは本明細書で上記のような生物活性タンパク質であり；Ｓは、（上記のような）切断配列を場合により包含できる１〜約５０のアミノ酸残基を有するスペーサ配列であり；ｘは０または１のどちらかであり；およびＸＴＥＮは（
本明細書に記載するような）延長組換えポリペプチドである。該実施形態は、ＢＰが所望の生物活性のために遊離Ｎ末端を必要とする、またはＢＰのＣ末端の融合タンパク質への連結によって生物活性が低下して、投与したＢＰＸＴＥＮの生物活性および／または副作用を低下させることが所望される、特別の有用性を有する。
ＢＰＸＴＥＮ配置の別の実施形態において、本発明は、式ＩＩの配置（上記のような構成要素）の融合タンパク質を提供する：
（ＸＴＥＮ）−（Ｓ）ｘ−（ＢＰ） ＩＩ
該実施形態は、ＢＰが所望の生物活性のために遊離Ｃ末端を必要とする場合に、またはＢＰのＮ末端の融合タンパク質への連結によって生物活性が低下して、投与したＢＰＸＴＥＮの生物活性および／または副作用を低下させることが所望である場合に、特に有用である。
別の態様において、本発明は、ＢＰの２個の分子を含み、ならびに第２のＸＴＥＮおよび／またはスペーサ配列を場合により含む、単離ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質を提供し、該融合タンパク質は、式ＩＩＩ、式ＩＶ、および式Ｖから選択される配置を有する：
（ＢＰ）−（Ｓ）ｗ−（ＸＴＥＮ）−（Ｓ）ｘ−（ＢＰ）−（Ｓ）ｙ（ＸＴＥＮ）ｚ ＩＩＩ
（ＸＴＥＮ）−（Ｓ）ｗ−（ＢＰ）−（Ｓ）ｘ−（ＸＴＥＮ）ｙ−（ＢＰ） ＩＶ
（ＢＰ）−（Ｓ）ｘ−（ＢＰ）−（Ｓ）ｙ−（ＸＴＥＮ） Ｖ
式中、各出現について、独立して、ＢＰは本明細書で上記のような生物活性タンパク質であり、Ｓは、切断配列を場合により含む１〜約５０のアミノ酸残基を有するスペーサ配列であり；ｗは０または１のどちらかであり；ｘは０または１のどちらかであり；ｙは０または１のどちらかであり；ｚは０または１のどちらかであり；およびＸＴＥＮは、ＸＴＥＮアミノ酸残基の累積合計が４００超〜約３０００残基である、（本明細書に記載するような）延長組換えポリペプチドである。
別の態様において、本発明は、１分子のＢＰおよび２分子のＸＴＥＮならびに場合により１または２のスペーサ配列を含む単離融合タンパク質を提供し、該融合タンパク質は、式ＶＩの融合タンパク質であり：
（ＸＴＥＮ）−（Ｓ）ｘ−（ＢＰ）−（Ｓ）ｙ−（ＸＴＥＮ） ＶＩ
式中、各出現について、独立して、ＢＰは生物活性タンパク質であり、Ｓは、切断配列を場合により含む１〜約５０のアミノ酸残基を有するスペーサ配列であり；ｗは０または１のどちらかであり；ｘは０または１のどちらかであり；ｙは０または１のどちらかであり；ｚは０または１のどちらかであり；およびＸＴＥＮは、ＸＴＥＮアミノ酸残基の累積合計が４００超〜約３０００残基である、（本明細書に記載するような）延長組換えポリペプチドである。
それゆえ融合タンパク質は、これに限定されるわけではないが、ＸＴＥＮ−ＢＰ、ＢＰ−ＸＴＥＮ、ＸＴＥＮ−Ｓ−ＢＰ、ＢＰ−Ｓ−ＸＴＥＮ、ＸＴＥＮ−ＢＰ−ＸＴＥＮ、ＢＰ−ＢＰ−ＸＴＥＮ、ＸＴＥＮ−ＢＰ−ＢＰ、ＢＰ−Ｓ−ＢＰ−ＸＴＥＮ、およびＸＴＥＮ−ＢＰ−Ｓ−ＢＰを包含して、ＢＰ、ＸＴＥＮ、および場合によりスペーサ配列の異なる配置、Ｎ→Ｃ末端を有するように設計することができる。配置（ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）の選択は、本明細書で開示するように、特別な薬物動態、物理的／化学的、または薬理学的特性を与えることができる。
一実施形態において、上記の式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、またはＶ、またはＶＩのＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質は、融合タンパク質に連結されていないＢＰの生物活性と比較して、少なくとも約４０％の、または少なくとも約５０％の、または少なくとも約６０％の、または少なくとも約７０％の、または少なくとも約８０％の、または少なくとも約９０
％の、または少なくとも約９５％の生物活性を示す。別の実施形態において、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、またはＶのＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質は、融合タンパク質に共有結合的に連結されていない対応する親の生物活性タンパク質と同じ受容体またはリガンドを結合する。
本発明は、（ａ）上述の実施形態の任意の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、または（ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドの相補体から選択されるポリヌクレオチド配列を含む、単離核酸を提供する。上述の一実施形態において、該単離核酸は、（ａ）表４０、表４１、表４２、表４３、および表４４から選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列；または（ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドの相補体に対して、少なくとも８０％の配列同一性の、または約８５％の、または少なくとも約９０％の、または約９１％の、または約９２％の、または約９３％の、または約９４％の、または約９５％の、または約９６％の、または約９７％の、または約９８％の、または約９９％〜約１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む。本発明は、本段落の上で記載した上記の実施形態の任意の核酸を含む発現ベクターを提供する。一実施形態において、上述の発現ベクターは、ポリヌクレオチド配列に操作可能に連結された組換え制御配列をさらに含む。別の実施形態において、上述の発現ベクターのポリヌクレオチド配列は、原核生物シグナル配列であることが可能な分泌シグナル配列をコードするポリヌクレオチドにインフレームで融合される。一実施形態において、分泌シグナル配列は、ＯｍｐＡ、ＤｓｂＡ、およびＰｈｏＡシグナル配列から選択される。
本発明は、上述の段落で開示された発現ベクターを含むことができる宿主細胞を提供する。一実施形態において、宿主細胞は原核細胞である。別の実施形態において、宿主細胞は大腸菌である。
一実施形態において、本発明は、上述の実施形態の任意の融合タンパク質および少なくとも１つの薬学的に許容され得るキャリアを含む薬学的組成物を提供する。別の実施形態において、本発明は、包材と、上述の実施形態の薬学的組成物ならびに、該薬学的組成物および保管・取扱い条件を明示したラベルを含む少なくとも第１の容器と、該薬学的組成物の再構成および／または被験体への投与に関する説明シートとを含むキットを提供する。
本発明は、薬学的組成物の使用であって、疾患症状の処置を必要とする被験体における疾患症状を処置するための薬剤の調製における上述の実施形態の任意の融合タンパク質を含む薬学的組成物の使用をさらに提供する。上述の一実施形態において、上記の薬学的組成物を、それを必要とする被験体に投与することを含む、疾患、障害または状態。上述の一実施形態において、疾患、障害または状態は、１型糖尿病、２型糖尿病、肥満、高血糖、高インスリン血症、病的インスリン産生、インスリン抵抗性、シンドロームＸ、冬眠心筋または糖尿病性心筋症、食欲亢進、不十分な飽満感（ｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ ｓａｔｉｅｔｙ）、代謝性障害、グルカゴノーマ、多嚢胞性卵巣症候群、異常脂血症、冬眠心筋、不十分な尿中ナトリウム排泄、過剰尿中カリウム濃度、毒性血液量過多（ｔｏｘｉｃ
ｈｙｐｅｒｖｏｌｅｍｉａ）に関連付けられた状態または障害、糖尿病性心筋症、および網膜神経変性プロセスから選択される。いくつかの場合において、薬学的組成物は皮下に、筋肉内に、または静脈内に投与することができる。一実施形態において、薬学的組成物は治療的有効用量で投与される。上述のいくつかの場合において、治療的有効用量は、融合タンパク質に連結されておらず、同程度の用量で被験体に投与された融合タンパク質の対応するＢＰと比較して、融合タンパク質の治療ウインドウ内で費やされる時間の増大を生じる。治療ウインドウ内で費やされる時間の増大は、融合タンパク質に連結されていない対応するＢＰよりも少なくとも３倍の長さ、または、あるいは融合タンパク質に連結されていない対応するＢＰよりも少なくとも４倍の、または５倍の、または６倍の、また
は７倍の、または８倍の、または９倍の、または少なくとも１０倍の、または少なくとも２０倍の長さであることが可能である。
別の実施形態において、本発明は、上記の薬学的組成物を、治療的有効用量レジメンを使用して投与される複数連続用量の薬学的組成物を使用して、被験体に投与することを含む、疾患、障害または状態を処置する方法を提供する。上述の一実施形態において、治療的有効用量レジメンによって、融合タンパク質の血中濃度の少なくとも２つの連続するＣｍａｘピーク値および／またはＣｍｉｎトラフ値の間で、融合タンパク質に連結されておらず、同程度の用量のレジメンで被験体に投与された対応する融合タンパク質のＢＰと比較して少なくとも３倍の、または少なくとも４倍の、または５倍の、または６倍の、または７倍の、または８倍の、または９倍の、または少なくとも１０倍の、または少なくとも２０倍の時間の増大をもたらすことができる。上述の別の実施形態において、融合タンパク質の投与により、融合タンパク質に連結されておらず、被験体に対する治療的有効レジメンを使用して被験体ｄに投与される対応する生物活性タンパク質構成要素（複数可）と比較して、薬学的組成物の融合タンパク質のより低い頻度の投薬またはより少ない総投薬量（モル数で）を使用する少なくとも１個の測定パラメータの同程度の改善が生じる。パラメータは、空腹時グルコースレベル、経口グルコース負荷試験に対する応答、食後グルコースのベースラインからのピーク変化、ＨＡ１Ｃ、カロリー摂取、飽満、胃排出速度、インスリン分泌、末梢インスリン感受性、インスリンチャレンジに対する応答、ベータ細胞量、体重、プロトロンビン時間、出血時間、トロンビン−抗トロンビンＩＩＩ複合体（ＴＡＴ）、Ｄ−ダイマー、出血エピソードの生成、赤血球沈降速度（ＥＳＲ）、Ｃ反応性タンパク質、骨密度、筋肉量、血圧、血漿トリグリセリド、ＨＤＬ、コレステロール、ＬＤＬコレステロール、アンギナの生成、および心拍出量から選択することができる。
別の態様において，本発明は、生物活性タンパク質の特性を改善する方法であって、生物活性タンパク質を上述の実施形態の任意のＸＴＥＮに連結して（ａ）ＸＴＥＮに連結された生物活性タンパク質の最終半減期が、ＸＴＥＮに連結されていない生物活性タンパク質の最終半減期と比較してより長いこと；（ｂ）ＸＴＥＮに連結された生物活性タンパク質の貯蔵寿命が、ＸＴＥＮに連結されていない生物活性タンパク質の貯蔵寿命と比較してより長く、貯蔵寿命はベースライン試料と比較したインターバル後の生物活性の保持によって確認されること；（ｃ）ＸＴＥＮに連結された生物活性タンパク質の生理的条件下での溶解度がＸＴＥＮに連結されていない生物活性タンパク質の溶解度と比較して増大すること；（ｄ）被験体に投与されるときに、ＸＴＥＮに連結されている生物活性タンパク質に選択的に結合するＩｇＧ抗体の産生が、ＸＴＥＮに連結されていない生物活性タンパク質が同程度の用量で被験体に投与されるときのＩｇＧの産生と比較して低下すること；および／または（ｅ）被験体に投与されるときの、ＸＴＥＮに連結された生物活性タンパク質の治療ウインドウ内で費やされる時間が、被験体に投与されるときの、ＸＴＥＮに連結されていない生物活性タンパク質と比較してより長いことを特徴とする特性を達成するステップを含む、生物活性タンパク質の特性を改善する方法を提供する。
参照による組み入れ
本明細書に挙げるすべての刊行物、特許、および特許出願は、個々の刊行物、特許、または特許出願が参照により組み入れられることが具体的および個々に示されるのと同程度に、参照により本明細書に組み入れられている。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
約４００超〜約３０００のアミノ酸残基を含む単離延長組換えポリペプチド（ＸＴＥＮ）であって：
（ａ）グリシン（Ｇ）残基、アラニン（Ａ）残基、セリン（Ｓ）残基、トレオニン（Ｔ）残基、グルタメート（Ｅ）残基およびプロリン（Ｐ）残基の和が該ＸＴＥＮの全アミノ
酸配列の約８０％超を構成することと；
（ｂ）該ＸＴＥＮ配列が実質的に非反復性であることと；
（ｃ）該ＸＴＥＮ配列が、ＴＥＰＩＴＯＰＥアルゴリズムによって解析したときに予測されるＴ細胞エピトープを欠き、ここで、該ＸＴＥＮ配列内のエピトープの該ＴＥＰＩＴＯＰＥアルゴリズム予測が−９以上のスコアに基づくことと；
（ｄ）該ＸＴＥＮ配列がＧＯＲアルゴリズムによって決定されたように、９０％超のランダムコイル形成物を有することと；
（ｅ）該ＸＴＥＮ配列が、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴリズムによって決定されたように、２％未満のアルファらせんおよび２％のベータシートを有することと；
を特徴とするＸＴＥＮ。
（項目２）
約４００超〜約３０００のアミノ酸残基を含む単離延長組換えポリペプチド（ＸＴＥＮ）であって：
（ａ）アスパラギン残基およびグルタミン残基の和が該ＸＴＥＮの全アミノ酸配列の１０％未満であることと；
（ｂ）メチオニン残基およびトリプトファン残基の和が該ＸＴＥＮの全アミノ酸配列の２％未満であること；
（ｃ）該ＸＴＥＮ配列が５％未満の、正電荷を有するアミノ酸残基を有することと；
（ｄ）該ＸＴＥＮ配列がＧＯＲアルゴリズムによって決定されたように、９０％超のランダムコイル形成物を有することと；
（ｅ）該ＸＴＥＮ配列が、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴリズムによって決定されたように、２％未満のアルファらせんおよび２％のベータシートを有することと；
を特徴とするＸＴＥＮ。
（項目３）
約４００超〜約３０００のアミノ酸残基を含む単離延長組換えポリペプチド（ＸＴＥＮ）であって：
（ａ）該ＸＴＥＮ配列の少なくとも約８０％が非重複配列モチーフから成り、該配列モチーフそれぞれが約９〜約１４アミノ酸残基を有し、任意の２つの連続アミノ酸残基の配列が該配列モチーフの各々において３回以上出現しないことと；
（ｂ）該配列モチーフがグリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）およびプロリン（Ｐ）から選択される４〜６種類のアミノ酸から成ることと；
（ｃ）該ＸＴＥＮが生物活性タンパク質に連結されたときに生物活性タンパク質の薬物動態特性を増強し、該薬物動態特性が、該生物活性タンパク質に連結された該ＸＴＥＮと比較して、該生物活性タンパク質の最終半減期を測定することによって確認されることと；
を特徴とするＸＴＥＮ。
（項目４）
生物活性タンパク質に連結された前記ＸＴＥＮが、同程度の条件下で投与された該生物活性タンパク質と比較して、被験体において少なくとも約２倍長い最終半減期を有する、項目３に記載の単離ＸＴＥＮ。
（項目５）
前記ＸＴＥＮが生物活性タンパク質に連結されたときに、該ＸＴＥＮが該生物活性タンパク質の熱安定性を増強し、ここで、少なくとも約７日間にわたる約３７℃の温度への曝露後、該生物活性タンパク質の生物活性の保持を、該生物活性タンパク質に連結された該ＸＴＥＮと比較して、測定することによって、該熱安定性が確認される、項目１から４のうちのいずれか１項に記載の単離ＸＴＥＮ。
（項目６）
ＸＴＥＮに連結された際に、前記生物活性タンパク質および前記ＸＴＥＮを含む得られた融合物が、前記ＸＴＥＮに連結されていない生物活性タンパク質の前記生物活性の少なく
とも８０％を保持する、項目５に記載の単離ＸＴＥＮ。
（項目７）
グリシン（Ｇ）残基、アラニン（Ａ）残基、セリン（Ｓ）残基、トレオニン（Ｔ）残基、グルタメート（Ｅ）残基またはプロリン（Ｐ）残基の前記和が前記ＸＴＥＮの全アミノ酸配列の約９０％超を構成する、項目１から６のうちのいずれか１項に記載の単離ＸＴＥＮ。
（項目８）
いずれの１種類のアミノ酸も前記ＸＴＥＮ配列の３０％超を構成しない、項目１から７のうちのいずれか１項に記載の単離ＸＴＥＮ。
（項目９）
３個の連続アミノ酸が、該アミノ酸（単数）がセリンでない限り、同一ではない配列を含み、この場合、３個以下の連続アミノ酸がセリン残基である、項目１から８のうちのいずれか１項に記載の単離ＸＴＥＮ。
（項目１０）
前記ＸＴＥＮ配列が１０未満のサブ配列スコアを有する、項目１から９のうちのいずれか１項に記載の単離ＸＴＥＮ。
（項目１１）
前記ＸＴＥＮ配列の少なくとも約８０％が非重複配列モチーフから成り、該配列モチーフ各々が１２のアミノ酸残基を有する、項目１から１０のうちのいずれか１項に記載の単離ＸＴＥＮ。
（項目１２）
前記ＸＴＥＮ配列が非重複配列モチーフから成り、各々の配列モチーフが１２のアミノ酸残基を有する、項目１から１１のうちのいずれか１項に記載の単離ＸＴＥＮ。
（項目１３）
前記ＸＴＥＮ配列の少なくとも約８０％が非重複配列モチーフから成り、該配列モチーフが表１の１個以上の配列からのものである、項目１から１２のうちのいずれか１項に記載の単離ＸＴＥＮ。
（項目１４）
項目１から１３のうちのいずれか１項に記載の単離ＸＴＥＮおよび生物活性タンパク質を含み、該ＸＴＥＮが該生物活性タンパク質に連結されている、単離融合タンパク質。
（項目１５）
前記生物活性タンパク質が表３〜８から選択される配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を示す、項目１４に記載の単離融合タンパク質。
（項目１６）
前記融合タンパク質が、前記ＸＴＥＮに連結されていない前記生物活性タンパク質と比較して少なくとも約２倍長い最終半減期を有する、項目１４に記載の単離融合タンパク質。（項目１７）
前記融合タンパク質が、前記ＸＴＥＮに連結されていない前記生物活性タンパク質と比較して免疫原性が低く、免疫原性が、被験体に同程度の用量を投与した後に、該生物活性タンパク質に選択的に結合するＩｇＧ抗体の産生を測定することによって確認される、項目１４に記載の単離融合タンパク質。
（項目１８）
前記融合タンパク質が生理的条件下で約６を超える見かけの分子量係数を示す、項目１４に記載の単離融合タンパク質。
（項目１９）
少なくとも第２の生物活性タンパク質をさらに含む、項目１４に記載の単離融合タンパク質。
（項目２０）
少なくとも第２のＸＴＥＮポリペプチドをさらに含み、ＸＴＥＮアミノ酸残基の累積合計が約４００超〜約３０００の残基である、項目１５に記載の単離融合タンパク質。
（項目２１）
前記融合タンパク質が被験体において循環血中濃度を達成または維持するために、同程度の様式で被験体に投与される前記ＸＴＥＮに連結されていない生物活性タンパク質と比較して、より低い頻度の投薬または低下した同程度の投薬量を必要とする、項目１４に記載の単離融合タンパク質。
（項目２２）
前記生物活性タンパク質がグルコース調節ペプチドである、項目１４に記載の単離融合タンパク質。
（項目２３）
前記グルコース調節ペプチドがエキセンジン−４である項目２２に記載の単離融合タンパク質。
（項目２４）
前記グルコース調節ペプチドがグルカゴンである、項目２２に記載の単離融合タンパク質。
（項目２５）
前記生物活性タンパク質が代謝タンパク質である、項目１４に記載の単離融合タンパク質。
（項目２６）
前記代謝タンパク質がＩＬ−１ｒａである、項目２５に記載の単離融合タンパク質。
（項目２７）
前記生物活性タンパク質が凝固因子である、項目１４に記載の単離融合タンパク質。
（項目２８）
前記凝固因子が第ＩＸ因子である、項目２７に記載の単離融合タンパク質。
（項目２９）
前記凝固因子が第ＶＩＩ因子である、項目２７に記載の単離融合タンパク質。
（項目３０）
前記生物活性タンパク質が成長ホルモンである、項目１４に記載の単離融合タンパク質。（項目３１）
項目１４〜３０のいずれか１項に記載の単離融合タンパク質および少なくとも１つの薬学的に許容され得るキャリアを含む組成物。
（項目３２）
項目３１に記載の組成物の使用であって、疾患症状の処置を必要とする被験体における疾患症状を処置するための薬剤の調製における、組成物の使用。
（項目３３）
前記疾患が１型糖尿病、２型糖尿病、肥満、高血糖、高インスリン血症、異常インスリン産生、インスリン抵抗性、シンドロームＸ、食欲過多、不十分な飽満感、グルカゴノーマ、脂質異常症、網膜神経変性プロセス、第ＶＩＩ因子欠損、第Ｘ因子欠損、第ＸＩＩ因子欠損、血友病Ａ、血友病Ｂ、フォン・ウィルブラント病、高血圧、急性冠動脈症候群、関節リウマチ、虚血後再灌流傷害、成長ホルモン欠損、ターナー症候群、プラーダー−ヴィリ症候群、特発性低身長、ＡＩＤＳによるるい痩、多発性硬化症、クローン病、潰瘍性大腸炎、または筋ジストロフィーから選択される、項目３２に記載の使用。
（項目３４）
生物活性タンパク質の特性を改善する方法であって、生物活性タンパク質を項目１〜１３に記載のＸＴＥＮに連結して（ａ）該ＸＴＥＮに連結された該生物活性タンパク質の最終半減期が、該ＸＴＥＮに連結されていない該生物活性タンパク質の該最終半減期と比較してより長いこと；（ｂ）該ＸＴＥＮに連結された該生物活性タンパク質の貯蔵寿命が、該ＸＴＥＮに連結されていない該生物活性タンパク質の該貯蔵寿命と比較してより長く、貯蔵寿命はベースライン試料と比較したインターバル後の生物活性の保持によって確認されること；（ｃ）該ＸＴＥＮに連結された該生物活性タンパク質の生理的条件下での溶解度が該ＸＴＥＮに連結されていない該生物活性タンパク質の該溶解度と比較して増加される
こと；（ｄ）被験体に投与されるときに、該ＸＴＥＮに連結されている該生物活性タンパク質に選択的に結合するＩｇＧ抗体の産生が、該ＸＴＥＮに連結されていない該生物活性タンパク質が同程度の用量で被験体に投与されるときの該ＩｇＧの産生と比較して低下すること；および／または（ｅ）被験体に投与されるときの該ＸＴＥＮに連結された該生物活性タンパク質の治療ウインドウ内で費やされる時間が、被験体に投与されるときの該ＸＴＥＮに連結されていない該生物活性タンパク質と比較してより長いことを特徴とする特性を達成するステップを含む、生物活性タンパク質の特性を改善する方法。
本発明の特徴および利点は、例証的な実施形態を説明する以下の詳細な記述および添付図面を参照することによってさらに説明され得る。
図１は、すべてＮ末端からＣ末端方向に描かれている、例示的なＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質の概略図（図１Ａ〜Ｇ）である。図１Ａは、それぞれ単一の生物活性タンパク質（ＢＰ）およびＸＴＥＮを含む、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質の２つの異なる配置（１００）を示し、第１の配置はＢＰ（１０３）のＣ末端に付着したＸＴＥＮ分子（１０２）を有し、第２の配置はＢＰ（１０３）のＮ末端に付着したＸＴＥＮ分子を有する。図１Ｂは、それぞれ単一のＢＰ、スペーサ配列およびＸＴＥＮを含む、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質の２つの異なる配置（１００）を示し、第１の配置はスペーサ配列（１０４）のＣ末端に付着したＸＴＥＮ分子（１０２）を有し、該スペーサ配列はＢＰ（１０３）のＣ末端に付着し、第２の配置はスペーサ配列（１０４）のＮ末端に付着したＸＴＥＮ分子を有し、該スペーサ配列はＢＰ（１０３）のＮ末端に付着している。図１Ｃは、それぞれ単一のＢＰの分子２個およびＸＴＥＮの分子１個を含む、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質の２つの異なる配置（１０１）を示し、第１の配置は第１のＢＰのＣ末端に連結されたＸＴＥＮを有し、そのＢＰが第２のＢＰのＣ末端に連結され、第２の配置は、ＸＴＥＮが第１のＢＰのＮ末端に連結されているのと反対の向きであり、そのＢＰが第２のＢＰのＮ末端に連結されている。図１Ｄは、それぞれ単一のＢＰの分子２個、スペーサ配列およびＸＴＥＮの分子１個を含む、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質の２つの異なる配置（１０１）を示し、第１の配置はスペーサ配列のＣ末端に連結されたＸＴＥＮを有し、該スペーサ配列は、第２のＢＰのＣ末端に連結された第１のＢＰのＣ末端に連結され、第２の配置はＸＴＥＮがスペーサ配列のＮ末端に連結されているのと反対の向きであり、該スペーサ配列は、第１のＢＰのＮ末端に連結され、そのＢＰは第２のＢＰのＮ末端に連結されている。図１Ｅは、それぞれ単一のＢＰの分子２個、スペーサ配列およびＸＴＥＮの分子１個を含む、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質の２つの異なる配置（１０１）を示し、第１の配置は第１のＢＰのＣ末端に連結されたＸＴＥＮを有し、該第１のＢＰは、第２のＢＰ分子のＣ末端に連結されているスペーサ配列のＣ末端に連結され、第２の配置は、スペーサ配列のＮ末端に連結された第１のＢＰのＮ末端に連結されたＸＴＥＮと反対の配置であり、スペーサ配列のＮ末端は今度は、ＢＰの第２の分子のＮ末端に連結されている。図１Ｆは、それぞれ単一のＢＰの分子２個、およびＸＴＥＮの分子２個を含む、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質の２つの異なる配置（１０５）を示し、第１の配置は、ＢＰの第２の分子のＣ末端に連結されている第２のＸＴＥＮのＣ末端に連結されている第１のＢＰのＣ末端に連結された第１のＸＴＥＮを有し、第２の配置は、第２のＢＰのＮ末端に連結された第２のＸＴＥＮのＮ末端に連結された第１のＢＰのＮ末端に連結されたＸＴＥＮの反対の配置にある。図１Ｇは、ＢＰのＮ末端およびＣ末端にて２個のＸＴＥＮに連結された単一のＢＰの配置（１０６）を示す。 図２は、図１の対応するＢＰＸＴＥＮポリペプチドをコードするＢＰＸＴＥＮ遺伝子の例示的なポリヌクレオチド構築物の概略図（図２Ａ〜Ｇ）を示す；すべて５’→３’方向で描く。これらの例証的な例において、遺伝子は、ＢＰ１個およびＸＴＥＮ１個（１００）；またはＢＰ２個、スペーサ配列１個およびＸＴＥＮ１個（２０１）；ＢＰ２個およびＸＴＥＮ２個（２０５）；またはＢＰ１個およびＸＴＥＮ２個（２０６）を備えたＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質をコードする。これらの描写で、ポリヌクレオチドは、以下の構成要素：ＸＴＥＮ（２０２）、ＢＰ（２０３）、および切断配列（２０４）を包含することができるスペーサアミノ酸をコードして、すべての配列はインフレームで連結される。 図３は、内因的に利用可能なプロテアーゼによって作用される例示的な単量体ＢＰＸＴＥＮおよび単量体融合タンパク質または反応生成物が細胞表面の標的受容体に結合する能力、続いての細胞シグナル伝達の概略図である。図３Ａは、ＢＰ（１０３）およびＸＴＥＮ（１０２）が切断可能な配列（１０４）を含有するスペーサ配列により連結されているＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質（１０１）を示し、切断可能な配列（１０４）はＭＭＰ−１３プロテアーゼ（１０５）に対して感受性である。図３Ｂは、遊離ＢＰ、スペーサ配列およびＸＴＥＮの反応生成物を示す。図３Ｃは、反応生成物の遊離ＢＰ（１０３）またはＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質（１０１）とＢＰに対する標的受容体（１０６）との細胞表面（１０７）での相互作用を示す。この場合、ＢＰが遊離Ｃ末端を有するときに、遊離ＢＰ（１０３）の受容体への結合によって証明されるように、受容体への所望の結合が提示されるが、未切断融合タンパク質は受容体に堅く結合しない。図３Ｄは、高い結合親和性を有する遊離ＢＰ（１０３）が受容体（１０６）に結合したままであるが、無傷のＢＰＸＴＥＮ（１０１）が受容体から離れるのを示す。図３Ｅは、結合ＢＰが細胞（１０７）内のエンドソーム（１０８）に内部移行したことを示し、結合ＢＰの受容体媒介クリアランスおよび点描された細胞質として描かれた細胞シグナル伝達（１０９）の誘発が示されている。 図３は、内因的に利用可能なプロテアーゼによって作用される例示的な単量体ＢＰＸＴＥＮおよび単量体融合タンパク質または反応生成物が細胞表面の標的受容体に結合する能力、続いての細胞シグナル伝達の概略図である。図３Ａは、ＢＰ（１０３）およびＸＴＥＮ（１０２）が切断可能な配列（１０４）を含有するスペーサ配列により連結されているＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質（１０１）を示し、切断可能な配列（１０４）はＭＭＰ−１３プロテアーゼ（１０５）に対して感受性である。図３Ｂは、遊離ＢＰ、スペーサ配列およびＸＴＥＮの反応生成物を示す。図３Ｃは、反応生成物の遊離ＢＰ（１０３）またはＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質（１０１）とＢＰに対する標的受容体（１０６）との細胞表面（１０７）での相互作用を示す。この場合、ＢＰが遊離Ｃ末端を有するときに、遊離ＢＰ（１０３）の受容体への結合によって証明されるように、受容体への所望の結合が提示されるが、未切断融合タンパク質は受容体に堅く結合しない。図３Ｄは、高い結合親和性を有する遊離ＢＰ（１０３）が受容体（１０６）に結合したままであるが、無傷のＢＰＸＴＥＮ（１０１）が受容体から離れるのを示す。図３Ｅは、結合ＢＰが細胞（１０７）内のエンドソーム（１０８）に内部移行したことを示し、結合ＢＰの受容体媒介クリアランスおよび点描された細胞質として描かれた細胞シグナル伝達（１０９）の誘発が示されている。 図４は、ＸＴＥＮの構築（ａｓｓｅｍｂｌｙ）、産生および評価の各ステップの概略フローチャートである。 図５は、融合タンパク質をコードするＢＰ−ＸＴＥＮポリヌクレオチド構築物の構築の各ステップの概略フローチャートである。個々のオリゴヌクレオチド５０１は配列モチーフ５０２、たとえば１２アミノ酸モチーフ（「１２マー」）にアニーリングされ、配列モチーフ５０２は続いてＢｂｓＩおよびＫｐｎＩ制限部位５０３を含有するオリゴとライゲーションされる。所望の長さのＸＴＥＮ遺伝子５０４が達成されるまで、ライブラリからの追加の配列モチーフがアニーリングされ１２マーとなる。ＸＴＥＮ遺伝子は、スタッファベクターにクローニングされる。そのベクターはＦｌａｇ配列５０６を、続いてＢｓａＩ、ＢｂｓＩ、およびＫｐｎＩ部位５０７ならびにエキセンジン−４遺伝子５０８がフランキングするストッパ配列をコードして、ＢＰＸＴＥＮの組み合わせへの組み入れのためのＢＰ−ＸＴＥＮ融合物をコードする遺伝子５００を生じる。 図６は、生物活性タンパク質（ＢＰ）およびＸＴＥＮを含む融合タンパク質をコードする遺伝子の構築、融合タンパク質としてのその発現および回収、ならびに候補ＢＰＸＴＥＮ生成物としてのその評価における各ステップの概略フローチャートである。 図７は、様々な処理戦略を用いた、ＩＬ−１ｒａＸＴＥＮ発現ベクターの設計の概略図である。図７Ａは、生物活性タンパク質ＩＬ−１ｒａをコードする配列の３’端に融合されたＸＴＥＮをコードする発現ベクターを示す。このベクターには追加のリーダー配列が必要ないことに注目する。図７Ｂは、ＣＢＤリーダー配列およびＴＥＶプロテアーゼ部位を有する、ＩＬ−１ｒａをコードする配列の５’端に融合されたＸＴＥＮをコードする発現ベクターを描く。図７Ｃは、ＣＢＤおよびＴＥＶプロセシング部位が最適化Ｎ末端リーダー配列（ＮＴＳ）によって置き換えられた、図７Ｂと同じ発現ベクターを描く。図７Ｄは、ＮＴＳ配列をコードする発現ベクター、ＸＴＥＮ、ＩＬ−１ｒａをコードする配列、および次に（ｔｈａｎ）ＸＴＥＮをコードする第２の配列を描く。 図８は、ＧＦＰおよびＸＴＥＮ配列を含む示された構築物についての発現アッセイの結果を示す。発現培養物を蛍光プレートリーダ（励起３９５ｎｍ、発光５１０ｎｍ）を用いてアッセイして、存在するＧＦＰレポータの量を決定した。ボックスおよびウィスカープロットとしてグラフ作成された結果によって、中央値発現レベルが「ベンチマーク」ＣＢＤＮ末端ヘルパードメインと比べて、発現レベルのおおよそ半分であったが、ライブラリからの最良のクローンがベンチマークにはるかに近いことが示され、これらの配列の周囲でのさらなる最適化が保証されたことを示している。結果は、アミノ酸ＭＡで開始するライブラリがＭＥで始まるライブラリよりも良好な発現レベルを有したことも示す（実施例１４を参照）。 図９は、ＬＣＷ５４６、ＬＣＷ５４７およびＬＣＷ５５２からクローンのＮ末端配列の第３および第４のコドンに使用される３つの無作為化ライブラリを示す。示したような許容され得るＸＴＥＮコドンのすべての組み合わせがこれらの位置に存在するように改変された第３および第４の残基を用いて、ライブラリを設計した。許容され得るすべてのＸＴＥＮコドンを各ライブラリに包含するために、第３および第４の残基のコドン多様性を有する１２アミノ酸をコードする９対のオリゴヌクレオチドを設計、アニーリングして、ＮｄｅＩ／ＢｓａＩ制限酵素で消化したスタッファベクターｐＣＷ０５５１（Ｓｔｕｆｆｅｒ−ＸＴＥＮ＿ＡＭ８７５−ＧＦＰ）にライゲーションして、大腸菌ＢＬ２１Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）コンピテント細胞に形質変換して、３つのライブラリＬＣＷ０５６９（配列番号１，７０８および１，７０９）、ＬＣＷ０５７０（配列番号１，７１０および１，７１１）、およびＬＣＷ０５７１（配列番号１，７１２および１，７１３）のコロニーを得た。 図１０は、ベンチマークＣＢＤ＿ＡＭ８７５構築物に対する、ＧＦＰ蛍光シグナルについての、実施例１５に記載したような最適化ステップ後の上位７５のクローンの再試験のヒストグラムを示す。結果により、図１０に見られるように、数個のクローンが今やベンチマーククローンより優位であることが示された。 図１１は、Ｎ末端４８アミノ酸の２つの領域についてのコドン最適化選択性の組合せ（ｕｎｉｏｎ ｏｆ ｃｏｄｏｎ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）に対して行われたコンビナトリアル手法の概略図である。該手法により、発現の最適化を評価するための、ＸＴＥＮタンパク質のＮ末端の位置に新規の４８マーを生成させ、それにより、ＸＴＥＮがＢＰに対してＮ末端側にあるＸＴＥＮタンパク質発現のための解決策（ｓｏｌｕｔｉｏｎ）であり得るリーダー配列をもたらした。 図１２は、構築物の配列のＮ末端にＣＢＤリーダー配列を含むベンチマークＸＴＥＮクローンと比較した、ＸＴＥＮのＮ末端コドン最適化実験から得た好ましいクローンの発現を確認するＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。 図１３は、ＧＦＰのＮ末端に融合されたＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４の融合タンパク質の安定性試験による試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す（実施例２１を参照）。ＧＦＰ−ＸＴＥＮは、カニクイザル血漿およびラット腎臓溶解物中３７℃にて最長７日間インキュベートした。さらにカニクイザルに投与したＧＦＰ−ＸＴＥＮも評価した。試料を第０、１および７日に採取して、ＳＤＳ ＰＡＧＥによって分析し、ウェスタン分析による検出およびＧＦＰに対する抗体による検出を続けた。 図１４は、実施例２３に記載したように非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを受けさせた、ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４に連結されたＩＬ−１ｒａの２ｍｃｇおよび１０ｍｃｇの最終精製タンパク質の２つの試料を示す。結果は、約１６０ｋＤａのおおよその分子量を有するＩＬ−１ｒａＸＴＥＮ組成物がプロセスによって回収されたことを示す。 図１５は、実施例２３に記載したように行った代表的なサイズ排除クロマトグラフィー分析の結果を示す。破線で示す校正標準は、マーカーのサイログロブリン（６７０ｋＤａ）、ウシガンマグロブリン（１５８ｋＤａ）、ニワトリ卵白アルブミン（４４ｋＤａ）、ウマミオグロビン（１７ｋＤａ）およびビタミンＢ１２（１．３５ｋＤａ）を包含する。ＸＴＥＮ＿ＡＭ８７５に連結されたＩＬ−１ｒａのＢＰＸＴＥＮ構成要素融合タンパク質を実線として示す。データは、ＢＰＸＴＥＮ構築物の見かけの分子量が、球状タンパク質で予想される分子量よりも著しく大きく（同じアッセイの標準タンパク質の泳動との比較により示されるように）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定された分子量（データは示さず）よりも顕著に大きい見かけの分子量を有することを示す。 図１６は、精製ＩＬ−１ｒａ＿ＸＴＥＮ＿ＡＭ８７５の逆相Ｃ１８分析を示す。吸光度の出力対時間の結果は、最終生成物の融合タンパク質の純度を実証する。 図１７は、結合等温線を作成するためにＩＬ−１ｒａ−ＸＴＥＮ＿ＡＭ８７５またはＩＬ−１ｒａの濃度の関数としてプロットされた、ＩＬ−１受容体結合アッセイの結果を示す。ＩＬ−１受容体に対する各融合タンパク質の結合親和性を推定するために、結合データをＳ字状用量反応曲線に当てはめた。データの当てはめから、実施例２３に記載するように、各構築物のＥＣ５０（シグナルが最大半量であるＩＬ−１ｒａまたはＩＬ−１ｒａ−ＸＴＥＮの濃度）を決定した。陰性対照ＸＴＥＮ＿ＡＭ８７５−ｈＧＨ構築物は、実験条件下で結合を示さなかった。 図１８は、実施例２３に記載するように、ＩＬ−１ｒａを、ＸＴＥＮ＿ＡＭ８７５に連結されたＩＬ−１ｒａのＢＰＸＴＥＮと比較する、熱安定性試験のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。ＩＬ−１ｒａの試料およびＸＴＥＮに連結されたＩＬ−１ｒａの試料を２５℃および８５℃にて１５分間インキュベートして、その時点であらゆる不溶性のタンパク質を遠心分離によって迅速に除去した。次に可溶性画分を図１８に示すようにＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析すると、加熱後にＩＬ−１ｒａ−ＸＴＥＮのみが可溶性のままであるが、これに対して（融合パートナーとしてのＸＴＥＮがない）組換えＩＬ−１ｒａは加熱後に完全に沈殿したことが示される。 図１９は、図１９に示す試料に行ったＩＬ−１ｒａ受容体結合アッセイの結果を示す。実施例２３に記載するように、熱処理によって完全に変性した組換えＩＬ−１ｒａは、熱処理後のその受容体活性の０．１％未満を保持した。しかしＸＴＥＮに連結されたＩＬ−１ｒａは、その受容体結合活性のおおよそ４０％を保持した。 図２０は、実施例２４に記載するように、カニクイザルに別々に皮下投与された、異なるＸＴＥＮ配列に連結されたＩＬ−１ｒａの３つの異なるＢＰＸＴＥＮ組成物の単回皮下投薬後の薬物動態プロフィール（血漿濃度）を示す。 図２１は、２つの融合タンパク質；すなわちＹ２８８に連結されたグルカゴン（Ｇｃｇ−ＸＴＥＮ）およびＡＥ８６４に連結されたエキセンジン−４（Ｅｘ４−ＸＴＥＮ）の組み合わせを使用する、薬力学的試験および代謝試験からの体重の結果、マウスの食餌誘発肥満モデルにおける組み合わせ効能（実験の詳細については実施例２６を参照）を示す。グラフは、２８日間の連続薬物投与の間の、食餌誘発肥満マウスの体重変化を示す。示した値は、１群当り動物１０匹（プラセボ群は動物２０匹）の平均±ＳＥＭである。 図２２は、食餌誘発肥満マウスモデルにおける、２つのＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質；すなわちＹ２８８に連結されたグルカゴン（Ｇｃｇ−ＸＴＥＮ）およびＡＥ８６４に連結されたエキセンジン−４（Ｅｘ４−ＸＴＥＮ）を単独でおよび組み合わせて使用する、薬力学的および代謝試験からの空腹時グルコースレベルの変化を示す（実験の詳細については実施例２６を参照）。群は以下の通りである：群１ トリスビヒクル；群２ Ｅｘ４−ＡＥ５７６、１０ｍｇ／ｋｇ；群３ Ｅｘ４−ＡＥ５７６，２０ｍｇ／ｋｇ；群４ ビヒクル、５０％ＤＭＳＯ；群５ エクセナチド、３０μｇ／ｋｇ／日；群６ エクセナチド、３０ｕＬ／ｋｇ／日＋Ｇｃｇ−Ｙ２８８ ２０μｇ／ｋｇ；群７ Ｇｃｇ−Ｙ２８８、２０μｇ／ｋｇ；群８ Ｇｃｇ−Ｙ２８８、４０μｇ／ｋｇ；群９ Ｅｘ４−ＡＥ５７６ １０ｍｇ／ｋｇ＋Ｇｃｇ−Ｙ２８８ ２０μｇ／ｋｇ；群１０ Ｇｃｇ−Ｙ２８８ ４０μｇ／ｋｇ＋Ｅｘ４−ＡＥ５７６ ２０ｍｇ／ｋｇ。グラフは、２８日間の連続薬物投与の間の、食餌誘発肥満マウスの空腹時血中グルコースレベルの変化を示す。示した値は、１群当り動物１０匹（プラセボ群は動物２０匹）の平均±ＳＥＭである。 図２３は、実施例２０に記載するように、皮下または静脈内のどちらかで投与された、可変長の非構造化ポリペプチドに連結されたＧＦＰの異なる組成物の単回投与後のカニクイザルにおける薬物動態プロフィール（血漿濃度）を示す。組成物はＧＦＰ−Ｌ２８８、ＧＦＰ−Ｌ５７６、ＧＦＰ−ＸＴＥＮ＿ＡＦ５７６、ＧＦＰ−Ｙ５７６およびＸＴＥＮ＿ＡＤ８３６−ＧＦＰであった。注射後の各種の時点で血液試料を分析して、血漿中のＧＦＰの濃度は、捕捉のためのＧＦＰに対するポリクローナル抗体および検出のための同じポリクローナル抗体のビオチン化調製物を用いたＥＬＩＳＡによって測定した。結果は、投薬後の血漿濃度対時間（時間）として表示され、特に、最長の配列長のＸＴＥＮを有する組成物であるＸＴＥＮ＿ＡＤ８３６−ＧＦＰで半減期のかなりの増加が示されている。最短配列長の構築物のＧＦＰ−Ｌ２８８は、半減期が最も短かった。 図２４は、実施例３０に記載するように行った、Ｅｘ４−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４の近紫外円偏光二色性スペクトルを示す。 図２５は、皮下および静脈内経路でカニクイザルに投与されたＥｘ４−ＡＥ８６４の薬物動態結果を示す（実験の詳細については実施例２７を参照）。 図２６は、４つの動物種；すなわちマウス、ラット、カニクイザルおよびイヌによる測定結果に基づく、Ｅｘ４−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４に対する予測されたヒト応答の相対スケーリング結果を例証する。図２６Ａは、測定した最終半減期対体重を示し、ヒトでの予測Ｔ１／２は１３９時間である。図２６Ｂは、測定した薬物クリアランス対体重を示し、ヒトでの予測クリアランス速度の値は３０ｍｌ／時である。図２６Ｃは、測定した分布容積対体重を示し、ヒトでの予測値は５９７０ｍｌである。 図２７は、グルカゴンとＹ２８８に連結されたグルカゴンを比較する、グルカゴン活性のインビトロ細胞アッセイの結果を示す（実験の詳細については実施例３１を参照）。 図２８は、未処理細胞（黒ひし形）を陰性対照として用いる、２つの市販元からのエキセンジン−４（黒三角形）とＹ２８８に連結されたエキセンジン−４（黒正方形）を比較する、ＧＬＰ−１活性のインビトロ細胞アッセイの結果を示す（実験の詳細については実施例３１を参照）。ＥＣ５０は破線によって示されている。 図２９は、ｈＧＨおよびＡＭ８６４−ｈＧＨの安定性に対する熱処理の効果を示す。図２９Ａは、２５℃および８０℃で１５分間処理した２つの調製物のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。図２９Ｂは、２５℃処理に対する８０℃試料の受容体結合活性の対応するパーセンテージを示す。

図３０は、ｈＧＨＲ−Ｆｃに対するｈＧＨ−ＡＭ８６４（円）およびＡＭ８６４−ｈＧＨ（逆三角形）のインビトロ結合親和性アッセイの結果を示す。比較のために未改変組換えｈＧＨ（正方形）が示されている。 図３１は、ｈＧＨＲ−Ｆｃに結合する、未改変ｈＧＨと比較した、ｈＧＨのＮ末端およびＣ末端に連結されたＸＴＥＮ配列を有する成長ホルモン融合タンパク質のインビトロ結合親和性アッセイの結果を示す。ＡＥ９１２＿ｈＧＨ＿ＡＥ１４４（円）および未改変組換えｈＧＨ（正方形）について、各化合物の見かけのＥＣ５０値を示す。 図３２は、未改変組換えｈＧＨと比較した、皮下経路によってラットに投与された４種類のｈＧＨ ＢＴＸＥＮ融合タンパク質の薬物動態結果を示す。 図３３は、カニクイザルへの皮下投与後の、３種類のｈＧＨ ＸＴＥＮ構築物の濃度プロフィールを示す。 図３４は、低酸素症（ｈｙｐｏｘ）ラットモデルにおける、体重に対する、示された用量でのｈＧＨまたはＡＭ８６４−ｈＧＨの投与の効果を示す。結果は、有効性がｈＧＨと同等であるＢＰＸＴＥＮ構築物による、またより低い頻度の投薬での生物活性の保持を示す。 図３５は、処置９日後の脛骨の組織断面で示した、低酸素症ラットの脛骨骨端軟骨の成長に対するプラセボ、ｈＧＨ、およびＡＭ８６４−ｈＧＨの投与の効果比較を示す（群は図３４によって使用された群であった）。 図３６は、例示的なＦＩＸおよびＦＩＸ−ＸＴＥＮ融合タンパク質の概略図を示す。図３６Ａは、天然ＦＩＸのドメイン構造物を、ガンマ−カルボキシグルタメートドメイン、ＥＧＦ１およびＥＧＦ２ドメイン、活性化ペプチド、ならびにプロテアーゼドメインで示す。矢印は、活性化ペプチドドメインの切断部位を示す。図３６は、ＸＴＥＮポリペプチドがＣ末端に付着したＦＩＸ分子を示し、ＸＴＥＮを放出するタンパク質分解切断の部位を表示する。 図３７は、ＦＩＸ−ＸＴＥＮ配置および関連するプロテアーゼ切断部位の数種の例を例証する。図３７Ａは、融合タンパク質のＦＩＸの部分の近位側にて、ＸＴＥＮ内に２個のタンパク質分解切断部位（矢印）を有するＦＩＸ−ＸＴＥＮを示す。図３７Ｂは、自己触媒的に活性化でき、同時にＸＴＥＮを放出するＦＩＸ−ＸＴＥＮを示す。図３７Ｃは、ＸＴＥＮがＦＩＸの各種ドメインの間に組込まれた、ＦＩＸ−ＸＴＥＮの４種類の配置を示す。図３７Ｄは、ＦＩＸのタンパク質分解活性化の際にＸＴＥＮを放出する、ＸＴＥＮ部分が活性化ペプチドに挿入されたＦＩＸ−ＸＴＥＮを示す。図３７Ｅは、異なるドメイン間に挿入された複数のＸＴＥＮ配列を含有するＦＩＸ−ＸＴＥＮを例証する。図３７Ｆは、ＸＴＥＮがＦＩＸのドメイン内に挿入されているＦＩＸ−ＸＴＥＮを例証する。図３７Ｇは、ＸＴＥＮがＦＩＸのＣ末端に連結され、ＸＴＥＮのＮ末端付近の複数の切断部位を含有する、ＦＩＸ−ＸＴＥＮを例証する。 ＦＩＸ−ＸＴＥＮからのＸＴＥＮの放出の概略図である。関連付けられたＸＴＥＮを有するＦＩＸ−ＸＴＥＮは、半減期が増加しているが、たいてい不活性なプロドラッグ形態で存在する。ＸＴＥＮ放出部位（矢印）でのタンパク質分解切断の後に、ＦＩＸ部分は凝固カスケードによって活性化することができるが、短い半減期を有する。 外因性経路および内因性経路の両方を示す、凝固カスケードの概略図である。 ＦＩＸをコードする遺伝子内のエキソン位置を使用する、ＦＩＸ−ＸＴＥＮ設計手法の戦略を例証して、エキソン境界の間のＸＴＥＮ挿入のための例示的な部位を矢印によって示す。 図４１Ａは、３種類の代表的なＦＩＸ−ＸＴＥＮ構築物ＡＣ２９６、ＡＣ２９９、およびＡＣ３００の概略図である。ＦＩＸ配列の２個の矢印は、ＦＸＩ活性化部位を示す。ＡＣ２９９およびＡＣ３００の追加の矢印は、ＸＴＥＮ放出部位を示す。図４１Ｂは、トロンビン処理タンパク質ＡＣ２９６、ＡＣ２９９、およびＡＣ３００のウェスタンブロットであり、円内の、ウェスタンブロットの左側のＦＩＸの陽性対照と同様の位置において、ＦＩＸがＸＴＥＮ部分から放出されたことを示す。 図４２は、ＦＩＸ−ＸＴＥＮ遺伝子を含有するＦＩＸ−ＸＴＥＮ発現ベクターｐＣＷ０５９０の設計の概略図を示す。 図４３Ａは、発現生成物である未処理ＦＩＸポリペプチド鎖、およびＦＩＸ分泌中に出現するＮ末端での翻訳後切断を包含する成熟ＦＩＸポリペプチド鎖の図である。図８Ｂは、未処理形態および成熟形態の両方における除去された活性化ペプチドの残基数を示すＦＩＸａのマッチング概略図である。 図４４は、ＦＩＸａへのタンパク質分解切断および活性化の後の、ＦＩＸ−ＸＴＥＮ構築物ＦＩＸ−ＣＦＸＩａ−ＡＧ８６４（配列番号１８１９）、プレＦＸＩａ切断物、ならびに得られたフラグメント１、２、３および４（配列番号１８２０〜１８２３、それぞれ出現順）の配列を示すチャートである。 ＦＶＩＩアッセイの結果のグラフを、ＦＶＩＩ標準の各種濃度の反応プロフィールおよびＦＶＩＩ−ＸＴＥＮの反応プロフィールと共に示す。ＦＶＩＩ−ＸＴＥＮのアッセイの結果をグラフの下の表に示す。 図４６は、ＦＶＩＩ−ＸＴＥＮ遺伝子を含有する発現ベクターｐＣＷ０５９０のプラスミドマップである。 図４７は、分子量が既知のタンパク質標準に対して測定したグルカゴン−ＸＴＥＮ構築物試料のサイズ排除クロマトグラフィー分析の結果を、吸光度対保持容量のグラフの結果と共に示す。グルカゴン−ＸＴＥＮ構築物は、１）グルカゴン−Ｙ２８８；２）グルカゴンＹ−１４４；３）グルカゴン−Ｙ７２；および４）グルカゴン−Ｙ３６である。結果によって、見かけの分子量がＸＴＥＮ部分の長さの増加と共に増加することが示される。
本発明の実施形態を説明する前に、このような実施形態が例示のためのみに提供されることと、本明細書に記載する本発明の実施形態の各種の代替が本発明の実施で用いられ得ることが理解されるべきである。当業者は、本発明から逸脱せずに、多くの変形、変更および置換をここで想到する。
別途定義しない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本発明の実施または試験では、本明細書に記載する方法および材料と同様または同等の方法および材料を使用することができるが、好適な方法および材料は以下に記載される。矛盾がある場合には、定義を包含して本特許明細書が優先する。さらに材料、方法および実施例は例証のためだけであり、制限を意図するものではない。当業者は、本発明から逸脱せずに、多くの変形、変更および置換をここで想到する。
定義
本明細書で使用する場合、以下の用語は、別途規定しない限り、その用語に属する意味を有する。
本明細書および特許請求の範囲で使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が別途明確に指示しない限り、複数の参照物を包含する。たとえば「細胞」という用語は、その混合物を包含して、複数の細胞を包含する。
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、本明細書で互換的に使用されて、いずれかの長さのアミノ酸のポリマーを指す。ポリマーは直鎖または分枝であり得て、ポリマーは改変アミノ酸を含み得て、およびポリマーは非アミノ酸によって割り込まれ得る。該用語は、たとえばジスルフィド結合形成、グリコシレーション、脂質化（ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ）、アセチル化、リン酸化、またはその他の操作、たとえば標識成分によるコンジュゲーションによって改変されたアミノ酸ポリマーも含む。
本明細書で使用する場合、「アミノ酸」という用語は、これに限定されるわけではないが、グリシンおよびＤおよびＬの両方の光学異性体、ならびにアミノ酸類似体およびペプチドミメティックを包含する、天然および／または非天然もしくは合成アミノ酸のいずれかを指す。標準の１文字または３文字コードを使用して、アミノ酸を命名する。
「天然Ｌ−アミノ酸」という用語は、グリシン（Ｇ）、プロリン（Ｐ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、メチオニン（Ｍ）、システイン（Ｃ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ），グルタミン（Ｑ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン酸（Ｄ）、セリン（Ｓ）、およびトレオニン（Ｔ）の
Ｌ光学異性体形態を意味する。
「天然に存在しない」という用語は、配列に適用される場合および本明細書で使用する場合、哺乳動物で見出される野生型または天然に存在する配列に対する対応物を有さない、相補的でないまたは高度の相同性を有さないポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列を意味する。たとえば天然に存在しないポリペプチドは、好適に整列させるときに天然に存在する配列と比較して、９９％、９８％、９５％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％以下またはなお低いアミノ酸配列同一性を共有し得る。
「親水性」および「疎水性」という用語は、物質が有する水との親和性の程度を指す。親水性物質は、水に対して強い親和性を有し、水に溶解する、水と混合する、または水に湿潤化される傾向があるが、疎水性物質は、水に対する親和性が実質的になく、水をはじくおよび吸収しない傾向があり、水に溶解しない、水と混合しないまたは水により湿潤化しない傾向がある。アミノ酸は、その疎水性に基づいて特徴付けることができる。いくつかのスケールが開発されている。１つの例は、Ｈｏｐｐ，ＴＰら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９８１）７８：３８２４に挙げられているＬｅｖｉｔｔ，Ｍ，ら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ（１９７６）１０４：５９によって開発されたスケールである。「親水性アミノ酸」の例は、アルギニン、リジン、トレオニン、アラニン、アスパラギン、およびグルタミンである。特に興味深い親水性アミノ酸は、アスパルテート、グルタメート、およびセリン、およびグリシンである。「疎水性アミノ酸」の例は、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、メチオニン、ロイシン、イソロイシン、およびバリンである。
「フラグメント」は、治療活性および／または生物活性の少なくとも一部を保持する、天然生物活性タンパク質（ｎａｔｉｖｅ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）の切断型である。「変異体」は、生物活性タンパク質の治療活性および／または生物活性の少なくとも一部を保持する、天然生物活性タンパク質に対して配列相同性を有するタンパク質である。たとえば変異体タンパク質は、参照生物活性タンパク質と少なくとも７０％の、７５％の、８０％の、８５％の、９０％の、９５％の、９６％の、９７％の、９８％のまたは９９％のアミノ酸配列同一性を共有し得る。本明細書で使用する場合、「生物活性タンパク質部分」という用語は、たとえば部位特異的変異誘発、挿入によって意図的に、または変異によって偶発的に改変されたタンパク質を包含する。
「宿主細胞」は、対象ベクターのレシピエントであり得る、またはレシピエントであった個々の細胞または細胞培養物を包含する。宿主細胞は、単一の宿主細胞の子孫を包含する。子孫は、天然の、偶発的、または意図的な変異のために、元の親細胞と必ずしも（ＤＮＡ相補体全体の形態またはゲノムが）完全に同一でないことがある。宿主細胞は、本発明のベクターによってインビボで形質移入することができる。
「単離された」は、本明細書で開示する各種のポリペプチドを説明するために使用する場合に、その天然環境の構成要素から同定ならびに分離および／または回収されたポリペプチドを意味する。その天然環境の夾雑物質構成要素は、ポリペプチドの診断または治療用途を通例妨害する物質であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性溶質を包含し得る。当業者に明らかなように、天然に存在しないポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、またはそのフラグメントは、それをその天然に存在する対応物から区別するための「単離」を必要としない。さらに、「濃縮された」、「分離された」または「希釈された」ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、またはそのフラグメントは、体積当たりの分子の濃度または数が概してその天然に存在する対応物よりも大きいという点で、その天然に存在する対応物から区別できる。一般に、組換え手段によって作られ、宿主細胞にて発現されたポリペプチ
ドは、「単離」されると見なされる。
「単離」ポリヌクレオチドもしくはポリペプチドコード核酸または他のポリペプチドコード核酸は、同定され、ポリペプチドコード核酸の天然源において通常それが、関連する少なくとも１つの夾雑物質核酸分子から分離される核酸分子である。単離ポリペプチドコード核酸分子は、該核酸分子が自然界で見出される形または状態以外である。それゆえ、単離ポリペプチドコード核酸分子は、該核酸分子が天然細胞に存在するときに、特異的ポリペプチドコード核酸分子から区別される。しかし単離ポリペプチドコード核酸分子は、普通、たとえば核酸分子が天然細胞のものとは異なる染色体位置または染色体外の位置にあるポリペプチドを発現する細胞に含有されたポリペプチドコード核酸分子を包含する。
「キメラ」タンパク質は、自然界で出現する配列内の位置とは異なる配列内の位置に領域を含む、少なくとも１つの融合ポリペプチドを含有する。その領域は、典型的には別個の複数のタンパク質に存在し得、融合ポリペプチドではそれらが合わせられる；またはそれらの領域は典型的には、同じタンパク質に存在し得るが、融合ポリペプチドでは新たな配置で置かれる。キメラタンパク質は、たとえば化学合成によって、またはそれらのペプチド領域がその所望の関係でコードされるポリヌクレオチドを生成および翻訳することによって生成され得る。
「コンジュゲートされた」、「連結された」、「融合された」、および「融合」は、本明細書では互換的に使用される。これらの用語は、化学コンジュゲーションまたは組換え手段を包含するどの手段によっても、さらにもう２つの化学元素または構成要素を結合させることを指す。たとえば、プロモータまたはエンハンサは、該プロモータまたはエンハンサが配列の転写に影響を及ぼす場合に、コード配列に作動可能に連結される。概して、「作動的に連結された」は、連結されているＤＮＡ配列が隣接して、読み取り相またはインフレームにあることを意味する。「インフレーム融合」は、２個以上の読み取り枠（ＯＲＦ）を結合して（ｊｏｉｎｉｎｇ）、元のＯＲＦの正しい読み取り枠を維持する様式で、連続したより長いＯＲＦを形成することを指す。それゆえ、得られた組換え融合タンパク質は、元のＯＲＦによってコードされたポリペプチドに対応する２個以上のセグメント（該セグメントは自然界では通常は、このように結合されない）を含有する単一のタンパク質である。
ポリペプチドの文脈では、「直鎖配列」または「配列」は、アミノ末端→カルボキシ末端の方向でのポリペプチドにおけるアミノ酸の順序であり、配列内の相互に隣り合う残基は、ポリペプチドの１次構造において隣接している。「部分配列」は、１方向または両方向で追加の残基を含むことが公知であるポリペプチドの一部の直鎖配列である。
「異種の」は、実体が、それが比較されている実体の残りの部分とは遺伝子型が異なる実体に由来することを意味する。たとえばその天然コード配列から除去されて、天然配列以外のコード配列に作動的に連結されたグリシンリッチ配列は、異種グリシンリッチ配列である。「異種の」という用語は、ポリヌクレオチド、ポリペプチドに適用される場合、該ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、それが比較されている実体の残りのポリヌクレオチドまたはポリペプチドとは遺伝子型が異なる実体に由来することを意味する。
「ポリヌクレオチド」、「核酸」、「ヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」という用語は、互換的に使用される。これらの用語は、任意の長さのデオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド、またはその類似体の任意のヌクレオチドのポリマー形態である。ポリヌクレオチドは、いずれかの３次元構造を有し得て、既知または未知のいずれかの機能を果たし得る。以下は、ポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子または遺伝子フラグメントのコード領域または非コード領域、連結解析から定義された複数の
遺伝子座（単数の遺伝子座）、エキソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、いずれかの配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマ。ポリヌクレオチドは、改変ヌクレオチド、たとえばメチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体を含み得る。ヌクレオチド構造物に対する改変は、存在する場合、ポリマーの構築（ａｓｓｅｍｂｌｙ）の前または後に与えられ得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド構成要素によって割り込まれ（ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｅｄ）得る。ポリヌクレオチドは、たとえば標識成分を用いたコンジュゲーションによって重合後にさらに改変され得る。
「ポリヌクレオチドの相補体」という用語は、ポリヌクレオチド分子であって、相補的塩基配列と、該ポリヌクレオチド分子が参照配列を完全な忠実度でハイブリダイズできるように、参照配列と比較して逆の向きとを有するポリヌクレオチド分子を示す。
ポリヌクレオチドに適用されるような「組換え」は、インビトロクローニング、制限および／またはライゲーションステップ、および宿主細胞にて潜在的に発現させることができる構築物を生じる他の手順の各種の組み合わせの生成物であることを意味する。
「遺伝子」または「遺伝子フラグメント」の用語は、本明細書では互換的に使用される。これらは、転写および翻訳された後に、特定のタンパク質をコードすることができる少なくとも１つの読み取り枠を含有するポリヌクレオチドを指す。遺伝子または遺伝子フラグメントは、ポリヌクレオチドが、コード領域全体またはそのセグメントを対象とし得る、少なくとも１つの読み取り枠を含有する限り、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡであり得る。「融合遺伝子」は、共に連結されている少なくとも２個の異種ポリヌクレオチドから成る遺伝子である。
「相同性」または「相同の」は、２個以上のポリヌクレオチド配列または２個以上のポリペプチド配列の間の配列類似性または互換性を指す。ＢｅｓｔＦｉｔなどのプログラムを使用して２つの異なるアミノ酸配列の間の配列同一性、類似性または相同性を決定するときに、デフォルト設定が使用され得るか、または適切なスコアリングマトリクス、たとえばｂｌｏｓｕｍ４５もしくはｂｌｏｓｕｍ８０が選択されて同一性、類似性または相同性スコアが最適化され得る。好ましくは、相同であるポリヌクレオチドは、これらの配列に、本明細書で定義するように厳密性条件下でハイブリダイズして、少なくとも７０％の、好ましくは少なくとも８０％の、さらに好ましくは少なくとも９０％の、さらに好ましくは９５％の、さらに好ましくは９７％の、さらに好ましくは９８％の、およびなおさらに好ましくは９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチドである。
「厳密性条件」または「厳密性ハイブリダイゼーション条件」という用語は、ポリヌクレオチドがその標的配列に、他の配列よりも検出可能な高い程度まで（たとえばバックグラウンドの少なくとも２倍）ハイブリダイズする条件への参照を包含する。概して、ハイブリダイゼーションの厳密性は一部は、洗浄ステップが行われる温度および塩濃度に関連して表される。通例、厳密性条件は、 塩濃度がｐＨ７．０〜８．３にて約１．５Ｍ未満のＮａイオン、通例、約０．０１〜１．０ＭのＮａイオン濃度（または他の塩）であり、温度は、短いポリヌクレオチド（たとえば１０〜５０のヌクレオチド）では少なくとも約３０℃および長いポリヌクレオチド（たとえば５０超のヌクレオチド）では少なくとも約６０℃である条件である。たとえば「厳密性条件」は、５０％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ ＳＤＳにおける、３７℃でのハイブリダイゼーション、および６０〜６５℃における０．１×ＳＳＣ／１％ＳＤＳにおいてそれぞれ１５分間の洗浄３回を包含することができる。あるいは、約６５℃、６０℃、５５℃、または４２℃の温度が使用され得る。ＳＳＣ濃度は約０．１〜２×ＳＳＣで変動され得て、ＳＤＳは約０．１％で存在する。
このような洗浄温度は通例、定義されたイオン強度およびｐＨにて特異的配列の熱融点（ｃ）よりも約５℃〜２０℃低くなるように選択される。Ｔｍは、（定義されたイオン強度およびｐＨの下で）標的配列の５０％が完全に一致するプローブにハイブリダイズする温度である。核酸ハイブリダイゼーションのためのＴｍおよび条件を計算する式は公知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，ｖｏｌ．１−３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ Ｎ．Ｙ．に見出される；特にｖｏｌｕｍｅ ２およびｃｈａｐｔｅｒ ９を参照。通例、ブロッキング試薬を使用して非特異的ハイブリダイゼーションをブロックする。このようなブロッキング試薬はたとえば、約１００〜２００μｇ／ｍｌの剪断および変性サケ精子ＤＮＡを包含する。有機溶媒、たとえば約３５〜５０％ｖ／ｖの濃度のホルムアミドも、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリダイゼーションなどの特定の状況下で使用され得る。これらの洗浄条件に対する有用な変形は、当業者にただちに明らかとなる。
「パーセント同一性」および「％同一性」という用語は、ポリヌクレオチド配列に適用される場合、標準化アルゴリズムを使用して配置された（ａｌｉｇｎｅｄ）少なくとも２個のポリヌクレオチド配列の残基一致のパーセンテージをいう。このようなアルゴリズムは、２個の配列の間のアライメントを最適化して、したがって２個の配列のより意味のある比較を達成するために、標準化された再現可能な方法で、比較されている配列にギャップを挿入し得る。パーセント同一性は、たとえば特定の配列番号によって定義された場合、定義されたポリヌクレオチド配列全体の長さにわたって測定され得るか、またはより短い長さにわたって、たとえばより大型の定義されたポリヌクレオチド配列から得たフラグメントの長さ、たとえば少なくとも４５連続残基の、少なくとも６０連続残基の、少なくとも９０連続残基の、少なくとも１２０連続残基の、少なくとも１５０連続残基の、少なくとも２１０連続残基のまたは少なくとも４５０連続残基のフラグメントにわたって測定され得る。このような長さは例示のためだけであり、本明細書、表、図または配列リストによって裏付けられる任意のフラグメント長を使用して、パーセンテージ同一性が測定され得る長さが説明され得ることが理解される。
「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、本明細書で同定されるポリペプチド配列に関して、該配列を配置して、最大パーセント配列同一性を達成するために必要な場合にはギャップを導入した後に、いずれの保存的置換も配列同一性の一部と見なさずに、第２の参照ポリペプチド配列またはその一部のアミノ酸残基と同一であるクエリ配列のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定するための配列比較は、当分野の技術の範囲に含まれる各種の方法、たとえば公に利用可能なコンピュータソフトウェア、たとえばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアを使用して達成することができる。当業者は、比較されている配列の全長にわたる最大配列比較を達成するのに必要ないずれのアルゴリズムも包含して、配列比較を測定するための適切なパラメータを決定することができる。パーセント同一性は、たとえば特定の配列番号によって定義された場合、定義されたポリペプチド配列全体の長さにわたって測定され得るか、またはより短い長さにわたって、たとえばより大型の定義されたポリペプチド配列から得たフラグメントの長さ、たとえば少なくとも１５連続残基の、少なくとも２０連続残基の、少なくとも３０連続残基の、少なくとも４０連続残基の、少なくとも５０連続残基の、少なくとも７０連続残基のまたは少なくとも１５０連続残基のフラグメントにわたって測定され得る。このような長さは例示のためだけであり、本明細書、表、図または配列リストによって裏付けられる任意のフラグメント長を使用して、パーセンテージ同一性が測定され得る長さが説明され得ることが理解される。
「非反復性」という用語は、ポリペプチドの文脈において本明細書で使用する場合、ペ
プチドまたはポリペプチド配列の内部相同性の欠如または制限された程度を示す。「実質的に非反復性」のという用語は、たとえば同一の種類のアミノ酸である、配列内の４連続アミノ酸の例がほとんどもしくは全くないこと、またはポリペプチドが１０以下のサブ配列スコア（下で定義）を有すること、またはポリペプチド配列を構成する配列モチーフの、Ｎ末端からＣ末端の順序でのパターンがないことを意味し得る。「反復性」という用語は、ポリペプチドの文脈において本明細書で使用する場合、ペプチドまたはポリペプチド配列の内部相同性の程度を示す。これに対して、「反復性」配列は、短いアミノ酸配列の複数の同一のコピーを含有し得る。たとえば、目的のポリペプチド配列はｎマー配列に分割され得て、同一配列の数をカウントすることができる。高反復性配列は、高い割合で同一配列を含有するが、非反復性配列は同一配列をほとんど含有しない。ポリペプチドの文脈において、配列は、定義された長さまたは可変長のより短い配列の複数のコピー、すなわちモチーフを含有することができ、モチーフ自体は非反復性配列を有し、全長ポリペプチド実質的に非反復性にする。非反復性がその中で測定されるポリペプチドの長さは、３アミノ酸〜約２００アミノ酸、約６〜約５０アミノ酸、または約９〜約１４アミノ酸で変化することができる。ポリヌクレオチド配列の文脈で使用される「反復性」は、所与の長さの同一ヌクレオチド配列の頻度などの、配列における内部相同性の程度を示す。反復性は、たとえば同一配列の頻度を分析することによって測定できる。
「ベクター」は、挿入された核酸分子を宿主細胞に、および／または宿主細胞間に移入する、適切な宿主において好ましくは自己複製する、核酸分子である。該用語は、主にＤＮＡもしくはＲＮＡの細胞への挿入のために機能するベクター、主にＤＮＡもしくはＲＮＡの複製のために機能するベクターの複製、ならびにＤＮＡもしくはＲＮＡの転写および／または翻訳のために機能する発現ベクターを包含する。上の機能の２つ以上を提供するベクターも包含される。「発現ベクター」は、適切な宿主細胞に導入されたときに、ポリペプチド（複数可）に転写および翻訳することができるポリヌクレオチドである。「発現系」は通常、所望の発現生成物を産するように機能できる発現ベクターから成る好適な宿主細胞を意味する。
「血清分解耐性」は、ポリペプチドに適用される場合、血清または血漿中にプロテアーゼを通例包含する血液またはその構成要素において、ポリペプチドが分解に耐える能力を指す。血清分解耐性は、通例一連の日数（たとえば０．２５、０．５、１、２、４、８、１６日間）にわたって、通例約３７℃にてタンパク質をヒト（または必要に応じてマウス、ラット、サル）血清または血漿と組み合わせることによって測定することができる。これらの時点の試料でウェスタンブロットアッセイを行うことが可能であり、抗体によりタンパク質が検出される。抗体は、そのタンパク質においてタグ化することができる。そのタンパク質がウェスタンで単一のバンドを示す場合、該タンパク質のサイズが注入したタンパク質のサイズと同一であるならば、分解はおこっていない。この例示的な方法では、ウェスタンブロットまたは同等の技法によって判定されるように、タンパク質の５０％が分解されている時点が、タンパク質の血清分解半減期または「血清半減期」である。
「ｔ１／２」という用語は、本明細書で使用する場合、ｌｎ（２）／Ｋｅｌとして計算される最終半減期を意味する。Ｋｅｌは、ｌｏｇ濃度対時間曲線の最終直線部分の線形回帰によって計算された最終消失速度定数である。半減期は通例、正常な生物学的プロセスによって代謝または消失される、生体（ｌｉｖｉｎｇ ｏｒｇａｎｉｓｍ）内に沈着した投与済み物質の量の半分にとって必要な時間を示す。「ｔ１／２」、「最終半減期」、「消失半減期」および「循環半減期」という用語は、本明細書では互換的に使用される．
「見かけの分子量係数」または「見かけの分子量」は、特定のアミノ酸配列によって提示された見かけの分子量の相対的増加または減少の尺度を示す関連用語である。該見かけの分子量は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）および同様の方法を使用して球状タンパク質標準と比較して決定され、「見かけのｋＤ」単位で測定される。見かけの分子
量係数は、見かけの分子量と実際の分子量との間の比である；実際の分子量は、アミノ酸組成に基づいて、その組成の各種類のアミノ酸の計算された分子量を加算することによって予測される。
「流体力学半径」または「ストークス半径」は、溶液中の分子の有効半径（Ｒｈ（ｎｍ））であって、分子が溶液中を移動して、溶液の粘度による抵抗を受ける物体であると仮定することによって測定される有効半径である。本発明の実施形態において、ＸＴＥＮ融合タンパク質の流体力学半径測定値は、より直観的な尺度である「見かけの分子量係数」と相関している。タンパク質の「流体力学半径」は、水溶液中でのその拡散速度ならびに高分子のゲルにおいて移動するその能力に影響を及ぼす。タンパク質の流体力学半径は、その分子量によって、ならびに形状および緻密性を包含するその構造によって決定される。Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏｓ．６，４０６，６３２および７，２９４，５１３に記載されているような、たとえばサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）の使用による流体力学半径を決定する方法は、当分野で周知である。大半のタンパク質は球状構造を有し、球状構造はタンパク質が最小の流体力学半径によって取ることができる最も小型の３次元構造である。いくつかのタンパク質は、ランダムで開いた、非構造化、または「直鎖」高次構造を取り、結果として、同様の分子量の通例の球状タンパク質と比較してはるかに大きい流体力学半径を有する。
「生理的条件」は、生体被験体のこのような状態を模倣する温度、塩濃度、ｐＨを包含する、生体宿主における一連の条件ならびにインビトロ条件を示す。インビトロアッセイで使用するための生理的に関連する条件の宿主が確立されている。概して、生理的バッファーは、生理的濃度の塩を含有し、約６．５〜約７．８に、および好ましくは約７．０〜約７．５に及ぶ中性ｐＨに調整される。多種多様の生理的バッファーがＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）に記載されている。生理的に関連する温度は、約２５℃〜約３８℃に、好ましくは約３５℃〜約３７℃に及ぶ。
「反応基」は、第２の反応性基に連結できる化学構造物である。反応基の例は、アミノ基、カルボキシ基、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基、アルデヒド基、アジド基である。いくつかの反応基を活性化させて、第２の反応基との連結を促進することができる。活性化の例は、カルボキシ基とカルボジイミドとの反応、カルボキシ基の活性化エステルへの変換、またはカルボキシ基のアジド機能への変換である。
「制御放出剤」、「低速放出剤」、「デポー調合物」または「持続放出剤」は互換的に使用されて、ポリペプチドが薬剤の非存在下で投与されるときの放出期間と比較して、本発明のポリペプチドの放出期間を延長することができる薬剤を示す。本発明の異なる実施形態は、異なる放出速度を有し、異なる治療量をもたらし得る。
「抗原」、「標的抗原」または「免疫原」という用語は本明細書では互換的に使用されて、抗体フラグメントまたは抗体フラグメントに基づく治療薬が結合する、または特異性を有する構造物または結合決定基を示す。
「ペイロード」という用語は本明細書で使用する場合、生物活性または治療活性を有するタンパク質またはペプチド配列；小型分子のファルマコフォアの対応物を示す。ペイロードの例は、これに限定されるわけではないが、サイトカイン、酵素、ホルモン、ならびに血液因子および成長因子を包含する。ペイロードは、遺伝子的に融合または化学的にコンジュゲートされた部分、たとえば化学療法剤、抗ウイルス化合物、毒素または造影剤をさらに含むことができる。これらのコンジュゲートされた部分は、切断可能または切断不能であり得るリンカーによってポリペプチドの残りの部分に結合することができる。
「アンタゴニスト」という用語は、本明細書で使用する場合、本明細書で開示する天然ポリペプチドの生物活性を部分的または完全に遮断、阻害、または中和する任意の分子を包含する。ポリペプチドのアンタゴニストを同定する方法は、天然ポリペプチドを候補アンタゴニスト分子と接触させることと、正常には天然ポリペプチドに関連付けられた１つ以上の生物活性の検出可能な変化を測定することとを含み得る。本発明の文脈において、アンタゴニストは、タンパク質、核酸、炭水化物、抗体または生物活性タンパク質の効果を減少させる任意のその他の分子を包含し得る。
「アゴニスト」という用語は最も広い意味で使用され、本明細書で開示する天然ポリペプチドの生物活性を模倣する任意の分子を包含する。好適なアゴニスト分子は、具体的にアゴニスト抗体または抗体フラグメント、天然ポリペプチド、ペプチド、小型有機分子などのフラグメントまたはアミノ酸配列変異体を包含する。天然ポリペプチドのアゴニストを同定する方法は、天然ポリペプチドを候補アゴニスト分子と接触させることと、正常には天然ポリペプチドに関連付けられた１つ以上の生物活性の検出可能な変化を測定することとを含み得る。
本明細書の目的のための「活性」は、対応する天然生物活性タンパク質の作用または効果と一致する、融合タンパク質の構成要素の作用または効果を示し、「生物活性」は、これに限定されるわけではないが受容体結合、拮抗物質活性、アゴニスト活性、または細胞応答もしくは生理的応答を包含する、インビトロまたはインビボ生物機能または効果を示す。
本明細書で使用する場合、「処置」または「処置すること」または「軽減すること（ｐａｌｌｉａｔｉｎｇ）」または「緩和すること」は、本明細書では互換的に使用される．これらの用語は、これに限定されるわけではないが、治療利益および／または予防利益を包含する、有益または所望の結果を得るための手法を示す。治療利益とは、根底にある処置する障害の根絶または緩和を意味する。また治療利益は、被験体が根底にある障害になお罹患しているかもしれないかにかかわらず被験体に改善が観察されるように、根底にある障害に関連付けられた生理的異常の１つ以上の根絶または緩和によって達成される。予防利益では、組成物は、特定の疾患を発症するリスクにある被験体に、または疾患の生理的異常の１つ以上を、この疾患の診断が行われていなくても、報告している被験体に投与され得る。
「治療効果」は本明細書で使用する場合、これに限定されるわけではないが、生物活性タンパク質が所有する抗原エピトープに対する抗体産生を誘導する能力以外の、本発明の融合ポリペプチドによって引き起こされる、ヒトもしくは他の動物における疾患の治癒、軽減、緩和、もしくは防止、またはそうでなければヒトもしくは動物の身体的もしくは精神的健康を包含する、生理的効果のことをいう。治療的有効量の決定は、とりわけ本明細書で提供された詳細な開示を考慮して、十分に当業者の能力の範囲内である。
「治療的有効量」および「治療的有効用量」という用語は、本明細書で使用する場合、疾患状態または病状のいずれかの状態、態様、測定パラメータまたは特徴に対する任意の検出可能な有益な効果を有することができる、被験体に単回または反復用量で投与したときに、融合タンパク質組成物の単独またはその一部としてのいずれかの、生物活性タンパク質の量をいう。このような効果は、絶対に有益である必要はない。
「治療的有効用量レジメン」という用語は、本明細書で使用する場合、用量が治療的有効量で投与されて疾患状態または病状の任意の症状、態様、測定パラメータまたは特徴に対する持続的な有益な効果をもたらす、融合タンパク質組成物の単独またはその一部としてのいずれかの、生物活性タンパク質の連続投与用量のスケジュールを指す。
Ｉ）一般技法
本発明の実施は、別途示さない限り、当該技術の範囲内である、免疫学、生化学、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、ゲノミクスおよび組換えＤＮＡの従来の技法を用いる。その内容が全体として参照により本明細書に組み入れられている、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，”３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２００１；”Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ
ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら ｅｄｓ．，１９８７；ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，”Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ．；“ＰＣＲ ２：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ”，Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｇ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ ｅｄｓ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９５；“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ”Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ｄ．ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８；”Ｇｏｏｄｍａｎ ＆ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ
Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，”１１ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，２００５；およびＦｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．，“Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，”４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｓｏｍｅｒｓｅｔ，ＮＪ，２０００を参照。
ＩＩ）延長組換えポリペプチド
本発明は、延長組換えポリペプチド（「ＸＴＥＮ」または「ＸＴＥＮｓ」）を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態において、ＸＴＥＮは概して、主に小型親水性アミノ酸から成る天然に存在しない実質的に非反復性の配列を有する延長された長さのポリペプチドであり、該配列は生理的条件下では、低い程度で２次もしくは３次構造を有するか、または２次もしくは３次構造を有さない。
本発明の一態様において、生物活性タンパク質（「ＢＰ」）に連結されて、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質（たとえば単量体融合物）をもたらすことができる融合パートナーとして有用であるＸＴＥＮポリペプチド組成物が開示される。ＸＴＥＮは、生物活性タンパク質に連結されて融合タンパク質を生成するときに、特定の化学的および薬学的特性を与えることができるという点で、融合タンパク質パートナーとしての有用性を有することができる。このような所望の特性は、下記の他の特性の中でも、これに限定されるわけではないが、増強された薬物動態パラメータおよび溶解性の特徴を包含する。このような融合タンパク質の組成物は、本明細書に記載するような、特定の疾患、障害または状態を処置する有用性を有し得る。本明細書で使用する場合、「ＸＴＥＮ」は、抗体または抗体フラグメント、たとえば単鎖抗体、軽鎖または重鎖のＦｃフラグメントを特異的に排除する。
いくつかの実施形態において、ＸＴＥＮは、単一の配列として使用されるときには約１００超〜約３０００のアミノ酸残基、好ましくは４００超〜約３０００残基を有し、単一の融合タンパク質またはコンジュゲートにおいて１を超えるＸＴＥＮ単位として使用されるときには約４００超〜約３０００のアミノ酸残基を累積的に有する、長いポリペプチドである。融合タンパク質の半減期の増加が不要であるが、生物活性タンパク質融合パートナーの溶解度または他の物理的／化学的特性が所望である、他の場合において、１００アミノ酸残基より短い、たとえば約９６、または約８４、または約７２、または約６０、または約４８、または約３６アミノ酸残基のＸＴＥＮ配列は、融合タンパク質組成物にＢＰと共に組み入れられて特性を及ぼし得る。
生物活性タンパク質に連結されて本発明の融合タンパク質を生成するＸＴＥＮの選択基準は概して、ＸＴＥＮの、物理的／化学的特性および高次構造の構造物の属性に関連しており、この属性は今度は、薬学的および薬物動態特性の向上を融合タンパク質に与えることができる。本発明のＸＴＥＮは、以下の有利な特性：高次構造の柔軟性、水溶性の増強、高度のプロテアーゼ耐性、低い免疫原性、哺乳動物受容体への弱い結合、および流体力学半径（またはストークス半径）の増加；融合タンパク質パートナーとしてＸＴＥＮを特に有用にすることができる特性の１つ以上を提示し得る。ＸＴＥＮによって増強され得る、ＢＰを含む融合タンパク質の特性の非限定的な例は、全体的な溶解度および／または代謝安定性の増加、タンパク質分解に対する感受性の低下、免疫原性の低下、皮下または筋肉内投与したときの吸収速度の低下、ならびに最終半減期および曲線下面積（ＡＵＣ）などの薬物動態特性の増強を包含し、皮下または筋肉内注射後の（ＸＴＥＮに連結されていないＢＰと比較して）より低速の吸収によって、Ｃｍａｘがより低くなり、これにより今度はＢＰの有害作用の低下が引き起こされ、全体として、被験体に投与されたＢＰＸＴＥＮ組成物の融合タンパク質が、ＸＴＥＮに連結されていない対応するＢＰ構成要素と比較して、治療ウインドウ内に残存する期間の増加を引き起こすことができる。
本発明のＸＴＥＮを含む融合タンパク質組成物などのタンパク質の物理的／化学的特性；２次または３次構造、溶解度、タンパク質凝集、融解特性、夾雑および含水量などの特性を決定する多種多様の方法およびアッセイが、当分野で公知である。このような方法は、分析用遠心分離、ＥＰＲ、ＨＰＬＣ−イオン交換、ＨＰＬＣ−サイズ排除、ＨＰＬＣ−逆相、光散乱、キャピラリー電気泳動、円偏光二色性、示差走査熱量測定、蛍光、ＨＰＬＣ−イオン交換、ＨＰＬＣ−サイズ排除、ＩＲ、ＮＭＲ、ラマン分光法、屈折率測定および紫外／可視分光法を包含する。追加の方法は、Ａｒｎａｕら、Ｐｒｏｔ Ｅｘｐｒ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆ（２００６）４８，１−１３に開示されている。これらの方法の発明への適用は、当業者の理解の範囲内である。
通例、融合タンパク質のＸＴＥＮ構成要素は、ポリマーの延長した長さにかかわらず、生理的条件下で変性ペプチド配列のように挙動するよう設計されている。変性した（ｄｅｎａｔｕｒｅｄ）とは、ペプチド主鎖の高次構造の自由度が大きいことを特徴とする、溶解したペプチドの状態を説明する。大半のペプチドおよびタンパク質は、高濃度の変性剤の存在下でまたは高温にて、変性した高次構造を取る。変性した高次構造のペプチドは、たとえば特徴的な円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルを有し、ＮＭＲによって決定される長距離（ｌｏｎｇ−ｒａｎｇｅ）相互作用の欠如を特徴とする。「変性した高次構造」および「非構造化高次構造」は、本明細書では同義語として使用される。いくつかの場合において，本発明は、生理的条件下で、２次構造を大部分欠く変性した配列に似せることができるＸＴＥＮ配列を提供する。他の場合では、ＸＴＥＮ配列は、生理的条件下で２次構造を実質的に欠くことができる。「大部分欠く」は、本文脈で使用する場合、本明細書に記載する手段によって測定または決定されるように、ＸＴＥＮ配列のＸＴＥＮアミノ酸残基の５０％未満が２次構造に寄与することを意味する。「実質的に欠く」は、本文脈で使用する場合、本明細書に記載する手段によって測定または決定されるように、ＸＴＥＮ配列のＸＴＥＮアミノ酸残基の少なくとも約６０％、または約７０％、または約８０％、または約９０％、または約９５％、または少なくとも約９９％が２次構造に寄与しないことを意味する。
所与のポリペプチドにおける２次および３次構造の存在または非存在を識別するための多種多様の方法が、当分野で確立されてきた。特に２次構造は、「遠紫外」スペクトル領域（１９０〜２５０ｎｍ）において、たとえば円偏光二色性分光法によって分光光度法で測定することができる。２次構造要素、たとえばアルファらせんおよびベータシートはそれぞれ、ＣＤスペクトルの特徴的な形状および大きさを生じる。ポリペプチド配列の２次構造は、特定のコンピュータプログラムまたはアルゴリズム、たとえばＵＳ Ｐａｔｅｎ
ｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．２００３０２２８３０９Ａ１に記載されているような、周知のＣｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴリズム（Ｃｈｏｕ，Ｐ．Ｙ．ら（１９７４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１３：２２２−４５）およびＧａｒｎｉｅｒ−Ｏｓｇｕｔｈｏｒｐｅ−Ｒｏｂｓｏｎ（「ＧＯＲ」）アルゴリズム（Ｇａｒｎｉｅｒ Ｊ，Ｇｉｂｒａｔ ＪＦ，Ｒｏｂｓｏｎ Ｂ．（１９９６），ＧＯＲ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｆｒｏｍ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ ２６６：５４０−５５３）によっても予測することができる。所与の配列では、アルゴリズムは、２次構造がいくつか存在するかまたは全く存在しないかを予測することができ、２次構造の存在はたとえばアルファらせんもしくはベータシートを形成する配列の残基の総数および／もしくはパーセンテージ、または（２次構造を欠いた）ランダムコイル形成物を生じることが予測される配列の残基のパーセンテージとして表される。
いくつかの場合において、本発明の融合タンパク質組成物で使用されるＸＴＥＮ配列は、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴリズムによって決定されるように、０％から約５％未満に及ぶアルファらせんのパーセンテージを有することができる。他の場合において、融合タンパク質組成物のＸＴＥＮ配列は、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴリズムによって決定されるように、０％から約５％未満に及ぶベータシートのパーセンテージを有することができる。いくつかの場合において，融合タンパク質組成物のＸＴＥＮ配列は、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴリズムによって決定されるように、０％から約５％未満に及ぶアルファらせんのパーセンテージおよび０％から約５％未満に及ぶベータシートのパーセンテージを有することができる。好ましい実施形態において、融合タンパク質組成物のＸＴＥＮ配列は、約２％未満のアルファらせんのパーセンテージおよび約２％未満のベータシートのパーセンテージを有する。他の場合において、融合タンパク質組成物のＸＴＥＮ配列は、ＧＯＲアルゴリズムによって決定されるように、高度のランダムコイルパーセンテージを有することができる。いくつかの実施形態において、ＸＴＥＮ配列は、ＧＯＲアルゴリズムによって決定されるように、少なくとも約８０％の、さらに好ましくは少なくとも約９０％の、さらに好ましくは少なくとも約９１％の、さらに好ましくは少なくとも約９２％の、さらに好ましくは少なくとも約９３％の、さらに好ましくは少なくとも約９４％の、さらに好ましくは少なくとも約９５％の、さらに好ましくは少なくとも約９６％の、さらに好ましくは少なくとも約９７％の、さらに好ましくは少なくとも約９８％の、および最も好ましくは少なくとも約９９％のランダムコイルを有することができる。
１．非反復性配列
主題の組成物のＸＴＥＮ配列は、実質的に非反復性であることができる。一般に、反復性アミノ酸配列は、天然反復性配列、たとえばコラーゲンおよびロイシンジッパーによって例示されるように、凝集するもしくは高次構造物（ｈｉｇｈｅｒ ｏｒｄｅｒ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）を形成する、または接触物を形成して結晶構造物もしくは偽結晶構造物を生じる傾向を有する。これに対して、非反復性配列は凝集する傾向が低いために、配列がそうでなければ反復性である場合には凝集しやすい荷電アミノ酸を比較的低頻度で有する、長い配列のＸＴＥＮが設計できるようになる。通例、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質は、約１００超〜約３０００のアミノ酸残基、好ましくは４００超〜約３０００の残基のＸＴＥＮ配列を含み、該配列は実質的に非反復性である。一実施形態において、ＸＴＥＮ配列は、約１００超〜約３０００のアミノ酸残基、好ましくは４００超〜約３０００のアミノ酸残基を有し得、該配列において、配列内の連続する３個のアミノ酸が同じ種類のアミノ酸であることはなく（該アミノ酸（単数）がセリンでない限り）、この場合、３個以下の連続アミノ酸はセリン残基である。上述の実施形態において、ＸＴＥＮ配列は実質的に非反復性である。
ポリペプチドまたは遺伝子の反復度は、コンピュータプログラムもしくはアルゴリズムによって、または当分野で公知の他の手段によって測定することができる。ポリペプチド配列の反復性は、たとえば所与の長さのより短い配列がポリペプチド内で出現する回数を決定することによって評価できる。たとえば２００のアミノ酸残基のポリペプチドは、１９２の重複９−アミノ酸配列（すなわち９マー「フレーム」）および１９８の３マーフレームを有するが、独自の９マー配列または３マー配列の数は、配列内の反復の量に依存する。ポリペプチド配列全体におけるサブ配列の反復度を反映するスコア（以下「サブ配列スコア」）を生成させることができる。本発明の文脈において、「サブ配列スコア」は、２００アミノ酸配列内の独自の３マーサブ配列の絶対数で割った、ポリペプチドの２００連続アミノ酸配列全治にわたる独自の３マーフレームそれぞれの出現数の和を意味する。反復性および非反復性ポリペプチドの最初の２００アミノ酸に由来するこのようなサブ配列スコアの例を実施例７３に表示する。いくつかの実施形態において、本発明はＸＴＥＮをそれぞれ含むＢＰＸＴＥＮを提供し、該ＸＴＥＮは、１２未満の、さらに好ましくは１０未満の、さらに好ましくは９未満の、さらに好ましくは８未満の、さらに好ましくは７未満の、さらに好ましくは６未満の、および最も好ましくは５未満のサブ配列スコアを有することができる。本段落の上で記載した上記の実施形態において、約１０未満（すなわち９、８、７など）のサブ配列スコアを有するＸＴＥＮが「実質的に非反復性」である。
ＸＴＥＮの非反復性の特徴は、反復性配列を有するポリペプチドと比較して、溶解度がより高く、凝集する傾向がより低いＢＰ（複数可）を融合タンパク質に与えることができる。これらの特性は、いくつかの場合において１００ｍｇ／ｍｌを超える非常に高い薬物濃度を含有する、ＸＴＥＮを含む薬学的調製物の調合を容易にすることができる。
さらに、本実施形態のＸＴＥＮポリペプチド配列は、哺乳動物に投与されるときに免疫原性を低下または実質的に消失させるために、低度の内部反復性を有するように設計される。３種類のアミノ酸、たとえばグリシン、セリンおよびグルタメートに大部分限定された短い反復モチーフから構成されたポリペプチド配列は、哺乳動物に投与されたときに、これらの配列に予測されたＴ細胞エピトープが存在しないにもかかわらず、比較的高い抗体力価を生じ得る。これは、ポリペプチドの反復性の性質によって引き起こされ得る。なぜなら、タンパク質凝集体を包含する、反復エピトープを有する免疫原、架橋免疫原、および反復性炭水化物が高い免疫原性であり、たとえばＢ細胞活性化を引き起こすＢ細胞受容体の架橋を生成できることが示されているためである。（Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ，Ｊ．ら（２００７）Ｖａｃｃｉｎｅ，２５：１６７６−８２；Ｙａｎｋａｉ，Ｚ．ら（２００６）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ，３４５：１３６５−７１；Ｈｓｕ，Ｃ．Ｔ．ら（２０００）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，６０：３７０１−５）；Ｂａｃｈｍａｎｎ ＭＦら、Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９５）２５（１２）：３４４５−３４５１）。
２．例示的な配列モチーフ
本発明は、より短い配列の複数の単位、すなわちモチーフを含むことができるＸＴＥＮを含み、ここで該モチーフのアミノ酸配列は非反復性である。ＸＴＥＮ配列の設計において、多量体化されてＸＴＥＮ配列を生成する配列モチーフのライブラリを使用する「ビルディングブロック」手法の使用にもかかわらず、非反復性基準が満たされ得ることが見出された。それゆえＸＴＥＮ配列がわずか４つの異なる種類の配列モチーフの複数単位から成り得るのは、モチーフ自体が概して非反復性アミノ酸配列から成り、ＸＴＥＮ配列全体が実質的に非反復性にされるためである。
一実施形態において、ＸＴＥＮは約１００超〜約３０００のアミノ酸残基の、好ましくは４００超〜約３０００の残基の非反復性配列を有することができ、該ＸＴＥＮ配列の少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少な
くとも約９５％、または少なくとも約９７％、または約１００％は、非重複配列モチーフから成り、該モチーフそれぞれが約９〜３６のアミノ酸残基を有する。他の実施形態において、ＸＴＥＮ配列の少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または約１００％は、非重複配列モチーフから成り、該モチーフそれぞれが９〜１４のアミノ酸残基を有する。なお他の実施形態において、ＸＴＥＮ配列構成要素の少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または約１００％は、非重複配列モチーフから成り、該モチーフはそれぞれ１２のアミノ酸残基を有する。これらの実施形態において、配列全体が非構造化の柔軟な特徴を有するように、配列モチーフは小型親水性アミノ酸から主に構成されることが好ましい。ＸＴＥＮに包含されることができるアミノ酸の例は、たとえばアルギニン、リジン、トレオニン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、アスパルテート、グルタメート、セリン、およびグリシンである。試験変数、たとえばコドン最適化、配列モチーフをコードする構築ポリヌクレオチド、タンパク質の発現、発現されたタンパク質の電荷分布および溶解度、ならびに２次および３次構造の結果として、増強された特徴を備えたＸＴＥＮ組成物は主にグリシン（Ｇ）残基、アラニン（Ａ）残基、セリン（Ｓ）残基、トレオニン（Ｔ）残基、グルタメート（Ｅ）残基およびプロリン（Ｐ）残基を包含し、該配列が実質的に非反復性となるように設計されることが見出された。好ましい実施形態において、ＸＴＥＮ配列は、長さが約１００超〜約３０００のアミノ酸残基、好ましくは４００超〜約３０００残基である実質的に非反復性の配列に配置されている、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）またはプロリン（Ｐ）から選択される４〜６種類のアミノ酸を主として有する。いくつかの実施形態において、ＸＴＥＮは約１００超〜約３０００のアミノ酸残基の、好ましくは４００超〜約３０００の残基の配列を有することができ、該配列の少なくとも約８０％が非重複配列モチーフから成り、該モチーフの各々は９〜３６のアミノ酸残基を有し、該モチーフの各々はグリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）およびプロリン（Ｐ）から選択される４〜６種類のアミノ酸から成り、全長ＸＴＥＮの任意の１種類のアミノ酸の含有量が３０％を超えない。他の実施形態において、ＸＴＥＮ配列の少なくとも約９０％が非重複配列モチーフから成り、該モチーフの各々は９〜３６のアミノ酸残基を有し、該モチーフの各々はグリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）およびプロリン（Ｐ）から選択される４〜６種類のアミノ酸から成り、全長ＸＴＥＮの任意の１種類のアミノ酸の含有量が３０％を超えない。他の実施形態において、ＸＴＥＮ配列の少なくとも約９０％が非重複配列モチーフから成り、該モチーフの各々は、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）およびプロリン（Ｐ）から選択される４〜６種類のアミノ酸から成る１２アミノ酸残基を有し、全長ＸＴＥＮの任意の１種類のアミノ酸の含有量が３０％を超えない。また他の実施形態において、ＸＴＥＮ配列の少なくとも約９０％が、または約９１％が、または約９２％が、または約９３％が、または約９４％が、または約９５％が、または約９６％が、または約９７％が、または約９８％が、または約９９％〜約１００％が非重複配列モチーフから成り、該モチーフはそれぞれグリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）およびプロリン（Ｐ）から成る１２アミノ酸残基を有し、全長ＸＴＥＮの任意の１種類のアミノ酸の含有量が３０％を超えない。
なお他の実施形態において、ＸＴＥＮは約１００超〜約３０００のアミノ酸残基の、好ましくは４００超〜約３０００のアミノ酸残基の非反復性配列を含み、該配列の少なくとも約８０％が、または少なくとも約９０％が、または約９１％が、または約９２％が、または約９３％が、または約９４％が、または約９５％が、または約９６％が、または約９７％が、または約９８％が、または約９９％が９〜１４個のアミノ酸残基の非重複配列モチーフから成り、該モチーフがグリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオ
ニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）およびプロリン（Ｐ）から選択される４〜６種類のアミノ酸から成り、任意の１つのモチーフの任意の２個の連続アミノ酸残基の配列が該配列モチーフにおいて２回を超えて反復されない。他の実施形態において、ＸＴＥＮ配列の少なくとも約９０％が、または約９１％が、または約９２％が、または約９３％が、または約９４％が、または約９５％が、または約９６％が、または約９７％が、または約９８％が、または約９９％が１２個のアミノ酸残基の非重複配列モチーフから成り、該モチーフがグリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）およびプロリン（Ｐ）から選択される４〜６種類のアミノ酸から成り、任意の１つの配列モチーフの任意の２個の連続アミノ酸残基の配列が該配列モチーフにおいて２回を超えて反復されない。他の実施形態において、ＸＴＥＮ配列の少なくとも約９０％が、または約９１％が、または約９２％が、または約９３％が、または約９４％が、または約９５％が、または約９６％が、または約９７％が、または約９８％が、または約９９％が１２個のアミノ酸残基の非重複配列モチーフから成り、該モチーフがグリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）およびプロリン（Ｐ）から成り、任意の１つの配列モチーフの任意の２個の連続アミノ酸残基の配列が該配列モチーフにおいて２回を超えて反復されない。また他の実施形態において、ＸＴＥＮは１２アミノ酸配列モチーフから成り、該アミノ酸はグリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）およびプロリン（Ｐ）から選択され、任意の１つの配列モチーフの任意の２個の連続アミノ酸残基の配列が該配列モチーフにおいて２回を超えて反復されず、全長ＸＴＥＮの任意の１種類のアミノ酸の含有量が３０％を超えない。本段落の上で記載した上述の実施形態において、ＸＴＥＮ配列は実質的に非反復性である。
いくつかの場合において、本発明は、約１００超〜約３０００のアミノ酸残基の、好ましくは４００超〜約３０００の残基の非反復性ＸＴＥＮ配列を含む組成物を提供し、配列の少なくとも約８０％が、または少なくとも約９０％が、または約９１％が、または約９２％が、または約９３％が、または約９４％が、または約９５％が、または約９６％が、または約９７％が、または約９８％が、または約９９％〜約１００％が、表１のアミノ酸配列から選択される２個以上の非重複配列モチーフの複数の単位から成る。いくつかの場合において、ＸＴＥＮは、配列の約８０％が、または少なくとも約９０％が、または約９１％が、または約９２％が、または約９３％が、または約９４％が、または約９５％が、または約９６％が、または約９７％が、または約９８％が、または約９９％〜約１００％が、表１の単一モチーフファミリから選択される２個以上の非重複配列から成り、該配列全体が実質的に非反復性のままである「ファミリ」配列を生じる非重複配列モチーフを含む。したがって、これらの実施形態において、ＸＴＥＮ配列は、表１の配列のＡＤモチーフファミリの、またはＡＥモチーフファミリの、またはＡＦモチーフファミリの、またはＡＧモチーフファミリの、またはＡＭモチーフファミリの、またはＡＱモチーフファミリの、またはＢＣファミリの、またはＢＤファミリの非重複配列モチーフの複数の単位を含むことができる。他の場合において、ＸＴＥＮは、表１のモチーフファミリの２つ以上からのモチーフ配列を含む。
Figure 2017031218
他の場合において、ＢＰＸＴＥＮ組成物は約１００超〜約３０００のアミノ酸残基の、好ましくは４００超〜約３０００の残基の非反復性ＸＴＥＮ配列を含む組成物を含むことができ、配列の少なくとも約８０％が、または少なくとも約９０％が、または約９１％が、または約９２％が、または約９３％が、または約９４％が、または約９５％が、または約９６％が、または約９７％が、または約９８％が、または約９９％〜約１００％が、表１２〜１５のポリペプチド配列の１つ以上から選択される非重複３６アミノ酸配列モチーフから成る。
ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質のＸＴＥＮ構成要素が、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）およびプロリン（Ｐ）から選択される４〜６種類のアミノ酸から成るそのアミノ酸の１００％未満を、または表１の配列モチーフもしくは表１２〜１５のポリペプチド配列から成る配列の１００％未満を、または表２からのＸＴＥＮとの１００％未満の配列同一性を有するこのような実施形態において、残りのアミノ酸残基は、任意のその他の１４種類の天然Ｌ−アミノ酸から選択することができる。残りのアミノ酸は、ＸＴＥＮ配列全体に散在され得るか、配列モチーフの中もしくは配列モチーフの間に位置し得るか、またはＸＴＥＮ配列の１個以上の短いストレ
ッチに集中し得る。ＢＰＸＴＥＮのＸＴＥＮ構成要素がグリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）およびプロリン（Ｐ）以外のアミノ酸を含むような場合、アミノ酸が疎水性残基でなく、ＸＴＥＮ構成要素について２次構造を実質的に与えるべきでないことが望ましい。それゆえ上述の好ましい実施形態において、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）およびプロリン（Ｐ）に加えて他のアミノ酸を含むＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質のＸＴＥＮ構成要素は、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴリズムによって測定されるように、アルファらせんおよびベータシートに寄与する残基が５％未満の配列を有し、ＧＯＲアルゴリズムによって測定されるように、少なくとも９０％のランダムコイル形成物を有する。
３．配列の長さ
詳細な特徴において、本発明は、延長した長さの配列を有するＸＴＥＮポリペプチドを含むＢＰＸＴＥＮ組成物を含む。本発明は、非反復性の非構造化ポリペプチドの長さを増大させることにより、ＸＴＥＮの非構造化の性質ならびにＸＴＥＮを含む融合タンパク質の生物および薬物動態特性が増強されるという発見を利用する。実施例でさらに十分に記載するように、ＸＴＥＮの長さの比例的増加は、単一ファミリの配列モチーフ（たとえば表１の４種類のＡＥモチーフ）の固定反復順序によって生成された場合でも、ＧＯＲアルゴリズムによって決定されるように、より短いＸＴＥＮ長と比較して、より高いパーセンテージのランダムコイル形成物を有する配列を生じることができる。さらに実施例に記載するように、非構造化ポリペプチド融合パートナーの長さを増加させることにより、配列長がより短い非構造化ポリペプチドパートナーを有する融合タンパク質と比較して、最終半減期が非比例的に増加した融合タンパク質を得られることが見出された。
本発明のＢＰＸＴＥＮへの包含が意図されたＸＴＥＮの非限定的な例を表２に表示する。したがって本発明は、融合タンパク質（複数可）のＸＴＥＮ配列長が約１００超〜約３０００のアミノ酸残基であり、いくつかの場合において４００超〜約３０００のアミノ酸残基であるＢＰＸＴＥＮ組成物を提供し、該ＸＴＥＮは、ＸＴＥＮに連結されていないペイロードと比較して、ＢＰＸＴＥＮにおいて増強された薬物動態特性を与える。いくつかの場合において、本発明のＢＰＸＴＥＮ組成物のＸＴＥＮ配列は、長さが約１００の、または約１４４の、または約２８８の、または約４０１の、または約５００の、または約６００の、または約７００の、または約８００の、または約９００の、または約１０００の、または約１５００の、または約２０００の、または約２５００の、または約３０００までのアミノ酸残基であることができる。他の場合において、ＸＴＥＮ配列は、長さが約１００〜１５０の、約１５０〜２５０の、約２５０〜４００の、４０１〜約５００の、約５００〜９００の、約９００〜１５００の、約１５００〜２０００の、または約２０００〜約３０００のアミノ酸残基であることができる。一実施形態において、ＢＰＸＴＥＮは、配列が表２から選択したＸＴＥＮに対して、少なくとも約８０％の配列同一性を、またはあるいは８１％の、８２％の、８３％の、８４％の、８５％の、８６％の、８７％の、８８％の、８９％の、９０％の、９１％の、９２％の、９３％の、９４％の、９５％の、９６％の、９７％の、９８％の、９９％、もしくは１００％の配列同一性を示すＸＴＥＮ配列を含むことができる。いくつかの場合において、ＸＴＥＮ配列は、ＢＰＸＴＥＮのＮ末端構成要素の最適化発現のために設計される。上述の一実施形態において、ＸＴＥＮ配列は、ＡＥ９１２またはＡＭ９２３の配列に対して、少なくとも９０％配列同一性を有する。上述の別の実施形態において、ＸＴＥＮは実施例１４〜１７に記載されたＮ末端残基を有する。
他の場合において、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質は第１および第２のＸＴＥＮ配列を含むことができ、ＸＴＥＮ配列の残基の累積合計は、約４００超〜約３０００のアミノ酸残基である。上述の実施形態において、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質は、配列がそれぞれ、
表２から選択された少なくとも第１のまたはその上第２のＸＴＥＮに対して、少なくとも約８０％の配列同一性を、またはあるいは８１％の、８２％の、８３％の、８４％の、８５％の、８６％の、８７％の、８８％の、８９％の、９０％の、９１％の、９２％の、９３％の、９４％の、９５％の、９６％の、９７％の、９８％の、９９％、もしくは１００％の配列同一性を示す第１および第２のＸＴＥＮ配列を含むことができる。１個を超えるＸＴＥＮがＢＰＸＴＥＮ組成物で使用される例は、これに限定されるわけではないが、少なくとも１個のＢＰのＮ末端およびＣ末端の両方にＸＴＥＮが連結された構築物を包含する。
以下でさらに十分に記載するように、本発明は、ＢＰＸＴＥＮが、ＸＴＥＮの長さを選択することによって被験体に投与された融合タンパク質に標的半減期を与えるように設計される方法を提供する。一般に、ＢＰＸＴＥＮ組成物に組み入れられるＸＴＥＮの長さがより長いと、より短いＸＴＥＮと比較して、より長い半減期が生じる。しかし、別の実施形態において、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質は、被験体への皮下または筋肉内投与後のより低い全身吸収速度を与えるために選択される、より長い配列長のＸＴＥＮを含むように設計することができる。このような場合、Ｃｍａｘは、ＸＴＥＮに連結していないＢＰの同程度の用量と比較して低下して、これによりＢＰＸＴＥＮを組成物の治療ウインドウ内に維持する能力に寄与する。それゆえＸＴＥＮは、投与されたＢＰＸＴＥＮに、本明細書に記載する残りの物理的／化学的特性に加えて、デポー特性を与える。
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４．正味電荷
他の場合において、ＸＴＥＮポリペプチドは、ＸＴＥＮ配列への正味電荷を有するアミノ酸残基の組み入れおよび／または疎水性アミノ酸の割合の低下によって与えられた非構造化特徴を有することができる。全体の正味電荷および正味電荷密度は、ＸＴＥＮ配列の荷電アミノ酸の含有量を改変することによって制御され得る。いくつかの場合において、組成物のＸＴＥＮの正味電荷密度は、＋０．１超の電荷／残基または−０．１未満の電荷／残基であり得る。他の場合において、ＸＴＥＮの正味電荷は、約０％、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％、または約２０％以上であることができる。
ヒトまたは動物の大半の組織および表面は負の正味電荷を有するので、ＸＴＥＮ配列は、ＸＴＥＮ含有組成物と各種の表面、たとえば血管、健常組織、または各種の受容体との間の非特異的相互作用を最小化するために負の正味電荷を有するように設計することができる。特定の理論に縛られるものではないが、ＸＴＥＮは、高い負の正味電荷を個々に担持して、ＸＴＥＮポリペプチドの配列全体にわたって分布されたＸＴＥＮポリペプチドの個々のアミノ酸の間の静電反発力により、開放高次構造（ｏｐｅｎ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を取ることができる。ＸＴＥＮの延長された配列長における負の正味電荷のこのような分布は、非構造化高次構造をもたらすことができ、今度は流体力学半径の効果的な増加を生じさせることができる。したがって、一実施形態において、本発明は、ＸＴＥＮ配列が約８％の、１０％の、１５％の、２０％の、２５％の、またはなお約３０％のグルタミン酸を含有する、ＸＴＥＮを提供する。本発明の組成物のＸＴＥＮは概して、正に荷電したアミノ酸を全く含まない、または低い含有量で含む。いくつかの場合において、ＸＴＥＮは、約１０％未満の、正電荷を持つアミノ酸残基、または約７％未満の、または約５％未満の、または約２％未満の、正電荷を持つアミノ酸残基を有し得る。しかし、本発明は、制限された数の正電荷を持つアミノ酸、たとえばリジンがＸＴＥＮに包含されて、リジンのイプシロンアミンとペプチドの反応基、リンカーブリッジ、またはＸＴＥＮ主鎖にコンジュゲートされる薬物または小型分子の反応基との間のコンジュゲーションを可能にし得る構築物を意図する。上述において、ＸＴＥＮ、生物活性タンパク質、さらに代謝性疾患または障害の処置で有用な化学療法剤を含む融合タンパク質を構築することができ、ＸＴＥＮ構成要素に組み入れられる薬剤の分子の最大数は、ＸＴＥＮに組み入れられたリジンまたは反応性側鎖を持つ他のアミノ酸（たとえばシステイン）の数によって決定さ
れる。
いくつかの場合において、ＸＴＥＮ配列は、他の残基、たとえばセリンまたはグリシンによって離された荷電残基を含み得て、このことによりさらに良好な発現または精製挙動がもたらされ得る。主題の組成物のＸＴＥＮは、正味電荷に基づいて、１．０の、１．５の、２．０の、２．５の、３．０の、３．５の、４．０の、４．５の、５．０の、５．５の、６．０の、またはなお６．５の等電点（ｐＩ）を有し得る。好ましい実施形態において、ＸＴＥＮは１．５〜４．５の等電点を有する。これらの実施形態において、本発明のＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質組成物に組み入れられたＸＴＥＮは生理的条件下で、非構造化高次構造およびＸＴＥＮ構成要素の哺乳動物タンパク質および組織への結合の低減に寄与し得る、負の正味電荷を担持する。
疎水性アミノ酸は構造をポリペプチドに与えることができるため、本発明は、ＸＴＥＮの疎水性アミノ酸の含有量が通例、５％未満、または２％未満、または１％未満の疎水性アミノ酸含有量であることを条件とする。一実施形態において、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質のＸＴＥＮ構成要素のメチオニンおよびトリプトファンのアミノ酸含有量は通例、５％未満、または２％未満、および最も好ましくは１％未満である。別の実施形態において、ＸＴＥＮは１０％未満の、正電荷を持つアミノ酸残基、または約７％未満の、または約５％未満の、または約２％未満の、正電荷を持つアミノ酸残基を有する配列を有し、メチオニンおよびトリプトファン残基の和は２％未満であり、アスパラギンおよびグルタミン残基の和はＸＴＥＮ配列全体の１０％未満である。
５．低い免疫原性
別の態様において、本発明は、ＸＴＥＮ配列が低度の免疫原性を有するか、または実質的に非免疫原性である組成物を提供する。いくつかの因子、たとえば非反復性配列、非構造化高次構造、高度の溶解度、低度のまたは欠如した自己凝集、低度のまたは欠如した配列内のタンパク質分解部位、および低度のまたは欠如したＸＴＥＮ配列のエピトープが、ＸＴＥＮの低い免疫原性に寄与することができる。
高次構造エピトープは、タンパク質抗原の複数の不連続アミノ酸配列から構成されるタンパク質表面の領域によって形成される。タンパク質の正確な折畳みによって、これらの配列は明確で安定した空間配置、すなわちエピトープをもたらし、エピトープは宿主体液性免疫系によって「異物」として認識されることが可能であり、タンパク質に対する抗体の産生が生じるか、または細胞媒介免疫応答が誘発される。後者の場合では、個体のタンパク質に対する免疫応答は、その個体のＨＬＡ−ＤＲアロタイプのペプチド結合特異性の関数である、Ｔ細胞エピトープ認識によって大きく左右される。Ｔ細胞表面の同族Ｔ細胞受容体によるＭＨＣクラスＩＩペプチド複合体の結合（ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ）は、特定の他の共受容体、たとえばＣＤ４分子の交差結合と共に、Ｔ細胞内で活性化状態を誘導することができる。活性化は、サイトカインの放出をもたらし、他のリンパ球、たとえばＢ細胞をさらに活性化して抗体を産生するか、または十分な細胞免疫応答としてＴキラー細胞を活性化する。
ＡＰＣ（抗原提示細胞）の表面での提示のためにペプチドが所与のＭＨＣクラスＩＩ分子を結合する能力は、いくつかの因子；最も顕著にはその１次配列に依存する。一実施形態において、より低度の免疫原性は、抗原提示細胞での抗原プロセシングに抵抗するＸＴＥＮ配列を設計すること、および／またはＭＨＣ受容体を良好に結合しない配列を選択することによって達成され得る。本発明は、ＭＨＣＩＩ受容体との結合を低下するように、ならびにＴ細胞受容体または抗体結合のためのエピトープの形成を回避して、低度の免疫原性を生じるように設計された、実質的に非反復性のＸＴＥＮポリペプチドを有するＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質を提供する。免疫原性の回避は一部は、ＸＴＥＮ配列の高次構造
柔軟性の直接の結果；すなわちアミノ酸残基の選択および順序により２次構造が欠如していることである。たとえば特に興味深いのは、高次構造エピトープを生じることができる、水溶液中または生理的条件下で小型に折り畳まれた高次構造を取る傾向が低い配列である。従来の治療実践および投薬を用いる、ＸＴＥＮを含む融合タンパク質の投与は、概してＸＴＥＮ配列に対する中和抗体の形成をもたらさず、ＢＰＸＴＥＮ組成物のＢＰ融合パートナーの免疫原性も低下し得る。
一実施形態において、主題の融合タンパク質で利用されるＸＴＥＮ配列は、ヒトＴ細胞によって認識されるエピトープを実質的に含まないことができる。免疫原性のより低いタンパク質を生成する目的での、このようなエピトープの消失は、以前に開示されている；たとえば、参照により本明細書に組み入れられているＷＯ ９８／５２９７６、ＷＯ ０２／０７９２３２、およびＷＯ ００／３３１７を参照。ヒトＴ細胞エピトープのアッセイが記載されている（Ｓｔｉｃｋｌｅｒ，Ｍ．ら（２００３）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２８１：９５−１０８）。特に興味深いのは、Ｔ細胞エピトープまたは非ヒト配列を生成せずにオリゴマー化することができるペプチド配列である。これは、Ｔ細胞エピトープの存在についてならびに６〜１５マー、および特にヒトでない９マー配列の出現についてこれらの配列の直接反復を試験することによって、次にエピトープ配列を消失または破壊するようにＸＴＥＮ配列の設計を改変することによって達成できる。いくつかの場合において、ＸＴＥＮ配列は、ＭＨＣ受容体に結合することが予測されたＸＴＥＮのエピトープの数を制限することよって、実質的に非免疫原性である。ＭＨＣ受容体を結合することができるエピトープの数を減少させることにより、Ｔ細胞活性化ならびにＴ細胞ヘルパー機能の能力の同時低下、Ｂ細胞活性化または上方制御の低下および抗体産生の低下が起こる。低度の予測Ｔ細胞エピトープは、実施例７４で示すような、ＴＥＰＩＴＯＰＥ（Ｓｔｕｒｎｉｏｌｏ，Ｔ．ら（１９９９）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１７：５５５−６１）のようなエピトープ予測アルゴリズムによって決定することができる。タンパク質内の所与のペプチドフレームのＴＥＰＩＴＯＰＥスコアは、Ｓｔｕｒｎｉｏｌｏ，Ｔ．ら（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７：５５５）に開示されているように、そのペプチドフレームの複数の最も一般的なヒトＭＨＣ対立遺伝子への結合のＫｄのｌｏｇ（解離定数、親和性、オフレート）である。スコアは、約１０〜約−１０の少なくとも２０対数（１０ｅ１０Ｋｄ〜１０ｅ−１０Ｋｄの結合拘束に対応）に及び、Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｆなどの、ＭＨＣにおけるペプチド提示の間にアンカー残基として働くことができる疎水性アミノ酸を回避することによって低下させることができる。いくつかの実施形態において、ＢＰＸＴＥＮに組み入れられたＸＴＥＮ構成要素は、約−５以上の、もしくは−６以上の、もしくは−７以上の、もしくは−８以上のＴＥＰＩＴＯＰＥスコアにて、または−９以上のＴＥＰＩＴＯＰＥスコアにて予測Ｔ細胞エピトープを有さない。本明細書で使用する場合、「−９以上の」のスコアは、１０〜−９（１０および−９を包含する）のＴＥＰＩＴＯＰＥスコアを含むが、−１０は−９より小さいため、−１０のスコアは含まない。
別の実施形態において、主題のＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質に組み入れられたＸＴＥＮ配列を包含する、本発明のＸＴＥＮ配列は、ＸＴＥＮの配列からの公知のタンパク質分解部位の制限によって実質的に非免疫原性にすることができ、ＭＨＣＩＩ受容体に結合可能である小型ペプチドへのＸＴＥＮのプロセシングを低下させる。別の実施形態において、ＸＴＥＮ配列は、実質的に２次構造を含まない配列を使用することによって実質的に非免疫原性にすることができ、構造物の高いエントロピーのために多くのプロテアーゼに対する耐性を与える。したがって、ＴＥＰＩＴＯＰＥスコアの低下およびＸＴＥＮからの公知のタンパク質分解部位の消失によって、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質組成物のＸＴＥＮを包含するＸＴＥＮ組成物は、免疫系の哺乳動物受容体を包含する、哺乳動物受容体によって実質的に結合できないようになり得る。一実施形態において、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質のＸＴＥＮは、哺乳動物受容体に対して１００ｎＭ超のＫｄの結合、または哺乳動物
細胞表面もしくは循環ポリペプチド受容体に対して５００ｎＭ超のＫｄ、もしくは１μＭ超のＫｄを有することができる。
その上、非反復性配列およびＸＴＥＮのエピトープの対応する欠如によって、Ｂ細胞がＸＴＥＮを結合するまたはＸＴＥＮによって活性化される能力を制限することができる。反復性配列は認識されて、さらには少数のＢ細胞とも多価接触物を形成することができ、複数のＴ細胞非依存性受容体の架橋の結果として、Ｂ細胞増殖および抗体産生を刺激することができる。これに対して、ＸＴＥＮはその延長配列にわたって多くの異なるＢ細胞と接触することができるが、個々のＢ細胞はそれぞれ、配列の反復性の欠如のために、個々のＸＴＥＮとの１個のみまたは少数の接触物を作り得る。結果として、ＸＴＥＮは通例、Ｂ細胞の増殖およびそれゆえ免疫応答を刺激する、はるかに低い傾向を有し得る。一実施形態において、ＢＰＸＴＥＮは、融合されていない対応するＢＰと比較して、免疫原性の低下を有し得る。一実施形態において、ＢＰＸＴＥＮの３回までの非経口用量の哺乳動物への投与により、１：１００の血清希釈度では検出可能な抗ＢＰＸＴＥＮ ＩｇＧが生じ得るが、１：１０００の希釈度では生じ得ない。別の実施形態において、ＢＰＸＴＥＮの３回までの非経口用量の哺乳動物への投与により、１：１００の血清希釈度では検出可能な抗ＢＰ ＩｇＧが生じ得るが、１：１０００の希釈度では生じ得ない。別の実施形態において、ＢＰＸＴＥＮの３回までの非経口用量の哺乳動物への投与により、１：１００の血清希釈度では検出可能な抗ＸＴＥＮ ＩｇＧが生じ得るが、１：１０００の希釈度では生じ得ない。上述の実施形態において、哺乳動物はマウス、ラット、ウサギ、またはカニクイザルであることができる。
高い反復度を有する配列に対する、非反復性配列を有するＸＴＥＮの追加の特色は、非反復性ＸＴＥＮが抗体とより弱い接触物を形成することであり得る。抗体は多価分子である。たとえばＩｇＧは２個の同一の結合部位を有し、ＩｇＭは１０個の同一の結合部位を有する。反復性配列に対する抗体は、このような反復性配列と高いアビディティで多価接触物を形成することができ、高いアビディティはこのような反復性配列の有効性および／または消失に影響を及ぼすことができる。これに対して、非反復性ＸＴＥＮに対する抗体は１価相互作用を産し、免疫クリアランスをもたらす可能性がより少ないので、ＢＰＸＴＥＮ組成物が、増加した期間にわたって循環中に残存することができる。
６．流体力学半径の増加
別の態様において、本発明により、ＸＴＥＮポリペプチドが、ＸＴＥＮを組み入れたＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質に対して対応する見かけの分子量の増加を与える高い流体力学半径を有することができるＸＴＥＮを提供される。実施例１９で詳述するように、ＸＴＥＮのＢＰ配列への連結によって、ＸＴＥＮに連結していないＢＰと比較して、流体力学半径の増大、見かけの分子量の増加、および見かけの分子量係数の増加を有することができる、ＢＰＸＴＥＮ組成物を生じることができる。たとえば半減期の延長が所望である治療用途において、高い流体力学半径を有するＸＴＥＮが１個以上のＢＰを含む融合タンパク質に組み入れられた組成物は、組成物の流体力学半径をおおよそ３〜５ｎｍの糸球体孔サイズを超えて効果的に拡大させることができ（約７０ｋＤＡの見かけの分子量に相当）（Ｃａｌｉｃｅｔｉ．２００３．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ ａｎｄ ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）−ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ．Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ ５５：１２６１−１２７７）、循環タンパク質の腎クリアランスの低下を生じる。タンパク質の流体力学半径は、その分子量によって、ならびに形状および緻密性を包含するその構造物によって決定される。特定の理論に縛られるものではないが、ＸＴＥＮは、ペプチドの個々の電荷の間の静電反発力または２次構造を与える能力が欠如した配列における特定のアミノ酸によって与えられた固有の柔軟性のために、開放立体配置を取ることができる。ＸＴＥＮポリペプチドの開放、延長および非構造化高次構造物は、２次およ
び／または３次構造、たとえば代表的な球状タンパク質を有する、同程度の配列長および／または分子量のポリペプチドと比較して、より大きい比例的流体力学半径を有することができる。Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏｓ．６，４０６，６３２および７，２９４，５１３に記載されているような、たとえばサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）の使用による流体力学半径を決定する方法は、当分野で周知である。実施例１９の結果が証明するように、ＸＴＥＮの増加長の追加により、流体力学半径、見かけの分子量、および見かけの分子量係数のパラメータの比例的増大が生じて、ＢＰＸＴＥＮを所望の特徴的なカットオフの見かけの分子量または流体力学半径に適応させることが可能となる。したがって、ある実施形態において、融合タンパク質が少なくとも約５ｎｍの、または少なくとも約８ｎｍの、または少なくとも約１０ｎｍの、または１２ｎｍの、または少なくとも約１５ｎｍの流体力学半径を有することができるようなＸＴＥＮを用いて、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質を構成することができる。上述の実施形態において、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質のＸＴＥＮによって与えられた大きい流体力学半径は、得られた融合タンパク質の腎クリアランスの低下をもたらし、最終半減期の対応する増加、平均滞留時間の増加、および／または腎クリアランス速度の減少をもたらすことができる。
別の実施形態において、選んだ長さおよび配列のＸＴＥＮは、ＢＰＸＴＥＮに選択的に組み入れられて、生理的条件下で、少なくとも約１５０ｋＤａの、または少なくとも約３００ｋＤａの、または少なくとも約４００ｋＤａの、または少なくとも約５００ｋＤＡの、または少なくとも約６００ｋＤａの、または少なくとも約７００ｋＤＡの、または少なくとも約８００ｋＤａの、または少なくとも約９００ｋＤａの、または少なくとも約１０００ｋＤａの、または少なくとも約１２００ｋＤａの、または少なくとも約１５００ｋＤａの、または少なくとも約１８００ｋＤａの、または少なくとも約２０００ｋＤａの、または少なくとも約２３００ｋＤａ以上の見かけの分子量を有する融合タンパク質を生成することができる。別の実施形態において、選んだ長さおよび配列のＸＴＥＮは、ＢＰに選択的に連結されて、生理的条件下で、少なくとも３の、あるいは少なくとも４の、あるいは少なくとも５の、あるいは少なくとも６の、あるいは少なくとも８の、あるいは少なくとも１０の、あるいは少なくとも１５の見かけの分子量係数を、または少なくとも２０以上の見かけの分子量係数を有するＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質を生じることができる。別の実施形態において、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質は、生理的条件下で、融合タンパク質の実際の分子量に対して、約４〜約２０である、または約６〜約１５である、または約８〜約１２である、または約９〜約１０である見かけの分子量係数を有する。
ＩＩＩ）ＢＸＴＥＮ融合タンパク質組成物の生物活性タンパク質
本発明は一部は、生物活性タンパク質およびＸＴＥＮを含む融合タンパク質組成物ならびに被験体の疾患、障害または状態の処置のためのその使用に関するものである。
一態様において、本発明は、１個以上の延長組換えポリペプチド（「ＸＴＥＮ」）を含む融合タンパク質に共有結合的に連結して、ＸＴＥＮ融合タンパク質組成物（以下「ＢＰＸＴＥＮ」）を生じる、少なくとも第１の生物活性タンパク質（以下「ＢＰ」）を提供する。以下でさらに十分に記載するように、融合タンパク質は、プロテアーゼによって作用を受けたときに融合タンパク質からＢＰを放出する切断配列をさらに含むことができる、スペーサ配列を場合により包含することができる。
「ＢＰＸＴＥＮ」という用語は、本明細書で使用する場合、１つ以上の生物活性または治療活性を媒介する生物活性タンパク質をそれぞれ含む１つ以上のペイロード領域および少なくとも１つのＸＴＥＮポリペプチドを含む少なくとも１つの他の領域を含む、融合ポリペプチドを含むことを意味する。
主題の組成物のＢＰ、特に表３から８に開示したものは、その対応する核酸およびアミ
ノ酸配列と共に当分野で周知であり、説明および配列は、公共データベース、たとえばＣｈｅｍｉｃａｌ Ａｂｓｔｒａｃｔｓ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ Ｄａｔａｂａｓｅｓ（たとえばｔｈｅ ＣＡＳ Ｒｅｇｉｓｔｒｙ）、ＧｅｎＢａｎｋ、Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ（ＵｎｉＰｒｏｔ）およびサブスクリプション提供データベース、たとえばＧｅｎＳｅｑ（たとえばＤｅｒｗｅｎｔ）で入手できる。ポリヌクレオチド配列は、所与のＢＰをコードする野生型ポリヌクレオチド配列（たとえば全長または成熟のどちらか）であり得るか、またはいくつかの例において、配列は野生型ポリヌクレオチド配列の変異体（たとえば野生型生物活性タンパク質をコードするポリヌクレオチドであり、前記ポリヌクレオチドのＤＮＡ配列は、たとえば特定の種での発現のために最適化されている；または野生型タンパク質の変異体、たとえば部位特異的変異体（ｍｕｔａｎｔ）または対立遺伝子変異体（ｖａｒｉａｎｔ）をコードするポリヌクレオチドであり得る。当分野で公知の方法を使用することによって、ならびに／または本明細書で提供され、実施例でさらに詳細に記載されたガイダンスおよび方法と併せて、ＢＰの野生型もしくはコンセンサスｃＤＮＡ配列またはコドン最適化変異体を使用して本発明で意図されるＢＰＸＴＥＮ構築物を生成することは、十分に当業者の能力の範囲内である。
本発明のＢＰＸＴＥＮへの包含のためのＢＰは、生物的、治療的、予防的、もしくは診断的重要性もしくは機能がある、または被験体に投与したときに、生物活性を媒介するもしくは疾患、障害もしくは状態を防止もしくは改善するのに有用である、任意のタンパク質を包含することができる。特に興味深いのは、薬物動態パラメータの増加、溶解度の増加、安定性の増加、またはいくつかのその他の薬学的特性の増強が求められているＢＰ、または最終半減期の増加によって有効性、安全性が改善され、もしくは投薬頻度の低下が生じ、および／もしくは患者コンプライアンスが改善されるＢＰである。それゆえＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質組成物は、たとえば被験体への投与のときに、ＸＴＥＮに連結されていないＢＰと比較して、インビボ曝露またはＢＰＸＴＥＮが治療ウインドウ内に残存する長さを増大させることによって、生物活性化合物の治療有効性を改善させることを包含する、各種の目的を念頭に置いて調製される。
本発明のＢＰは、天然全長タンパク質であることができるか、または天然タンパク質の生物活性の少なくとも一部を保持する生物活性タンパク質のフラグメントもしくは配列変異体であることができる。
一実施形態において、主題の組成物に組み入れられたＢＰは、自然界で見出されるタンパク質に対応する配列を有する組換えポリペプチドであることができる。別の実施形態において、ＢＰは、天然ＢＰの生物活性の少なくとも一部を保持する天然配列の配列変異体、フラグメント、ホモログ、およびミメティックであることができる。非限定的な例において、ＢＰは、表３〜８から選択されるタンパク質配列に対して、少なくとも約８０％の配列同一性を、またはあるいは８１％の、８２％の、８３％の、８４％の、８５％の、８６％の、８７％の、８８％の、８９％の、９０％の、９１％の、９２％の、９３％の、９４％の、９５％の、９６％の、９７％の、９８％の、９９％、もしくは１００％の配列同一性を示す配列であることができる。一実施形態において、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質は、ＸＴＥＮに連結された単一のＢＰ分子を含むことができる（以下でさらに十分に記載するように）。別の実施形態において、ＢＰＸＴＥＮは、第１のＢＰおよび同じＢＰの第２の分子を含み、１つ以上のＸＴＥＮに連結された２つのＢＰ（たとえばグルカゴン２分子、またはｈＧＨ２分子）を含む融合タンパク質を生じることができる。
一般に、ＢＰは、インビボで使用されるときまたはインビトロアッセイで利用されるときに、所与の標的に対する結合特異性または別の所望の生物学的特徴を示す。たとえばＢＰは、アゴニスト、受容体、リガンド、アンタゴニスト、酵素、またはホルモンであることができる。特に興味深いのは、比較的短い最終半減期を有し、薬物動態パラメータの増
加（必要に応じて、スペーサ配列の切断により融合タンパク質から放出させることができる）がより低い頻度の投薬または薬理学的効果の増強を可能にする、疾患もしくは障害に使用されるまたは疾患もしくは障害に有用であることが公知のＢＰである。また興味深いのは、最小有効用量または最小血中濃度（Ｃｍｉｎ）と最大許容投与量または最大血中濃度（Ｃｍａｘ）との間の狭い治療ウインドウを有するＢＰである。このような場合、選択ＸＴＥＮ配列（複数可）を含む融合タンパク質へのＢＰの連結によってこれらの特性の改善を生じさせて、ＸＴＥＮに連結されていないＢＰと比較して、これらのＢＰを治療剤または防止剤としてより有用にすることができる。
本発明の組成物に含まれるＢＰは、これに限定されるわけではないが、グルコース障害およびインスリン障害、代謝性障害、心血管疾患、凝固／出血障害、成長障害または状態、腫瘍形成症状、炎症症状、自己免疫症状などを包含する各種の治療カテゴリまたは疾患カテゴリの処置で有用性を有することができる。
（ａ）グルコース調節ペプチド
内分泌および肥満関連疾患または障害は、大半の先進国で流行規模に達して、大半の先進国で相当な増加しつつある保健管理上の重荷となり、体の臓器、組織、および循環系に影響を及ぼす多種多様の症状を包含する。特に関心があるのは、内分泌および肥満関連疾患および障害であり、これらの中で最重要なのは、米国で主要な死亡原因の１つである糖尿病である。糖尿病は、２つの主要なサブクラス−若年性糖尿病、すなわちインスリン依存型糖尿病（ＩＤＤＭ）としても公知のＩ型、および成人発症糖尿病、すなわちインスリン非依存型糖尿病（ＮＩＤＤＭ）としても公知の、ＩＩ型に分けられる。Ｉ型糖尿病は、このような被験体における膵臓のインスリン産生細胞を完全にまたは一部破壊する自己免疫疾患の形態であり、その生涯の間、外因性インスリンの使用が必要である。十分に管理された被験体においても、偶発性合併症が出現する可能性があり、そのいくつかは生命を脅かすものである。
ＩＩ型糖尿病患者では、食後の血中グルコースレベルの上昇が、膵臓によるインスリン産生を適正に刺激しない。その上、末梢組織は概して、インスリンの効果に対して抵抗性であり、このような被験体は、体がそのインスリン抵抗性の克服を試みるため、正常よりも高い血漿インスリン値を有する（高インスリン血症）。病状が進行すると、インスリン分泌も損なわれる。
インスリン抵抗性および高インスリン血症は、かなりの健康上のリスクをもたらす他の２種類の代謝性障害：グルコース寛容減損および代謝性肥満にも関連している。グルコース寛容減損は、摂食前の正常なグルコースレベルが、食事後にレベルが上昇する（高血糖）傾向を有する特徴がある。このような個体は、糖尿病および冠動脈疾患のより高いリスクにあると見なされる。肥満も、高血圧、冠動脈疾患（動脈硬化症）、および乳酸アシドーシス、ならびに関連疾患状態と同様に、インスリン抵抗症候群、すなわち「シンドロームＸ」と呼ばれる状態の群にとってのリスク因子である。肥満の病因は多因子性であると考えられるが、根底にある問題は、過剰な脂肪組織が存在するまで、肥満（ｔｈｅ ｏｂｅｓｅ）において栄養素利用性およびエネルギー消費が均衡していないことである。他の関連する疾患または障害は、これに限定されるわけではないが、妊娠性糖尿病、若年性糖尿病、肥満、食欲亢進、不十分な飽満感、代謝性障害、グルカゴノーマ、網膜神経変性プロセス、およびＩ型糖尿病の「ハネムーン期間」を包含する。
脂質異常症は、糖尿病患者の間で頻繁に出現し；通例、血漿トリグリセリドの上昇、低いＨＤＬ（高密度リポタンパク質）コレステロール、正常〜高レベルのＬＤＬ（低密度リポタンパク質）コレステロールおよび小型高密度ＬＤＬ粒子の血中レベル増加を特徴とする。脂質異常症は、糖尿病被験体の間での冠動脈イベントおよび死亡の生成率増加の主要
な寄与因子である。
グルコース恒常性およびインスリン応答における大半の代謝プロセスは、複数のペプチドおよびホルモンによって調節され、このような多くのペプチドおよびホルモン、ならびにその類似体は、代謝性疾患および障害の処置に有用性を見出している。これらのペプチドの多くは、それらが反対の生物機能を所有するときでさえ、相互に相同性が高い傾向にある。グルコース上昇ペプチドはペプチドホルモンのグルカゴンによって例示されるが、グルコース低下ペプチドは、エキセンジン−４、グルカゴン様ペプチド１、およびアミリンを包含する。しかし、治療用ペプチドおよび／またはホルモンの使用は、小型分子薬の使用によって増強されるときでも、このような疾患および障害の管理の成功は限定されていた。特に用量最適化は、代謝性疾患の処置に使用される薬物および生物製剤、とりわけ狭い治療ウインドウを有するものにとっては重要である。一般に、グルコース恒常性に関与するホルモン、およびペプチドは、狭い治療ウインドウを有することが多い。狭い治療ウインドウは、このようなホルモンおよびペプチドが通例、臨床利益を達成するために頻繁な投薬が必要となる短い半減期を有するという事実と組み合されて、このような患者の管理に困難を生じる。治療タンパク質に対する化学改変、たとえばペグ化は、そのインビボクリアランス速度および続いての血清半減期を改変することができるが、それは追加の製造ステップを必要とし、不均質の最終生成物を生じる。さらに、慢性投与からの許容されない副作用が報告されている。あるいは、Ｆｃドメインを治療タンパク質またはペプチドへの融合による遺伝子改変によって、治療タンパク質のサイズが増加して、腎臓経由のクリアランス速度が低下し、ＦｃＲｎ受容体によるリソソームからの再利用が促進される。運の悪いことに、Ｆｃドメインは組換え発現の間に効率的に折畳まれず、封入体として公知の不溶性沈殿物を形成する傾向がある。これらの封入体を可溶化する必要があり、機能性タンパク質を再生する必要があり；時間がかかり、非効率的であり、費用のかかるプロセスである。
それゆえ本発明の一態様は、グルコース恒常性、インスリン抵抗性および肥満に関与するペプチド（集合的に、「グルコース調節ペプチド」）のＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質への組み入れることによる、グルコース障害、疾患および関連状態、インスリン障害、疾患および関連状態、および肥満障害、疾患および関連状態の処置に有用性を有する組成物を生成することである。グルコース調節ペプチドは、グルコース恒常性またはインスリン抵抗性または肥満を有する疾患、障害または状態を防止、処置、媒介（ｍｅｄｉａｔｉｎｇ）、または改善するのに有用である、生物的、治療的、または予防的重要性または機能のある任意のタンパク質を包含することができる。ＸＴＥＮに連結されてＢＰＸＴＥＮを生成することができる好適なグルコース調節ペプチドは、膵臓ベータ細胞によるインスリンのグルコース依存性分泌を増加させる、またはインスリンの作用を強化するすべての生物活性ポリペプチドを包含する。グルコース調節ペプチドは、膵臓ベータ細胞のプロインスリン遺伝子転写を刺激するすべての生物活性ポリペプチドも包含することができる。さらに、グルコース調節ペプチドは、胃排出時間を低速化させ、食物取り込みを低下させるすべての生物活性ポリペプチドも包含することができる。グルコース調節ペプチドは、ランゲルハンス島のアルファ細胞からのグルカゴン放出を抑制するすべての生物活性ポリペプチドを包含することができる。表３は、本発明のＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質に含まれるグルコース調節ペプチドの配列の非限定的なリストを提供する。本発明のＢＰＸＴＥＮ組成物のグルコース調節ペプチドは、表３から選択されるタンパク質配列に対して、少なくとも約８０％の配列同一性を、またはあるいは８１％の、８２％の、８３％の、８４％の、８５％の、８６％の、８７％の、８８％の、８９％の、９０％の、９１％の、９２％の、９３％の、９４％の、９５％の、９６％の、９７％の、９８％の、９９％、もしくは１００％の配列同一性を示すペプチドであることができる。
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「アドレノメデュリン」または「ＡＤＭ」は、ヒトアドレノメデュリンペプチドホルモンならびに成熟ＡＤＭの生物活性の少なくとも一部を有するその種および配列変異体を意味する。ＡＤＭは、１８５アミノ酸プレプロホルモンから連続酵素切断およびアミド化によって生成し、２２分の測定血漿半減期を有する５２アミノ酸の生物活性ペプチドを生じる。本発明のＡＤＭ含有融合タンパク質は、膵島細胞からのインスリン分泌に対する刺激効果ゆえにグルコース調節の必要な糖尿病において、または持続性低血圧の被験体において、特定の用途を見出し得る。ヒトＡＭの完全なゲノムインフラストラクチャが報告されており（Ｉｓｈｉｍｉｔｓｕら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ ２０３：６３１−６３９（１９９４））、およびＡＤＭペプチドの類似体は、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．６，３２０，０２２に記載されるようにクローニングされている。
「アミリン」は、アミリン、プラムリンチドと呼ばれるヒトペプチドホルモン、およびＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，２３４，９０６に記載されているように、成熟アミリンの生物活性の少なくとも一部を有する、その種の変形を意味する。
アミリンは、栄養素取り込みに応答して、膵臓ベータ細胞によってインスリンと同時分泌される、３７アミノ酸ポリペプチドホルモンであり（Ｋｏｄａら、Ｌａｎｃｅｔ ３３９：１１７９−１１８０．１９９２）、グルコースのグリコーゲンへの組み入れを包含する、炭水化物代謝の数種の重要経路を調整することが報告されている。本発明のアミリン含有融合タンパク質は、胃排出を調節して、グルカゴン分泌および食物取り込みを抑止し、それにより循環中でのグルコース出現の速度に影響を及ぼすので、糖尿病および肥満に特定の用途を見出し得る。それゆえ融合タンパク質は、循環からのグルコース消滅速度お
よび末梢組織によるその取り込みを調節するインスリンの作用を補完し得る。アミリン類似体は、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏｓ．５，６８６，４１１および７，２７１，２３８に記載されるようにクローニングされている。生物活性を保持するアミリンミメティックを生成することができる。たとえばプラムリンチドは配列ＫＣＮＴＡＴＣＡＴＮＲＬＡＮＦＬＶＨＳＳＮＮＦＧＰＩＬＰＰＴＮＶＧＳＮＴＹ（配列番号４３）を有し、ここでラットアミリン配列からのアミノ酸は、ヒトアミリン配列のアミノ酸に代えて置換されている。一実施形態において、本発明は、配列ＫＣＮＴＡＴＣＡＴＸ１ＲＬＡＮＦＬＶＨＳＳＮＮＦＧＸ２ＩＬＸ２Ｘ２ＴＮＶＧＳＮＴＹ（配列番号４４）（ここでＸ１は独立して、ＮまたはＱであり、Ｘ２は独立して、Ｓ、ＰまたはＧである）のアミリンミメティックを含む融合タンパク質を意図する。一実施形態において、ＢＰＸＴＥＮに組み入れられたアミリンミメティックは、配列ＫＣＮＴＡＴＣＡＴＮＲＬＡＮＦＬＶＨＳＳＮＮＦＧＧＩＬＧＧＴＮＶＧＳＮＴＹ（配列番号４５）を有することができる。アミリンミメティックがＢＰＸＴＥＮのＣ末端で使用される別の実施形態において、該ミメティックは、配列ＫＣＮＴＡＴＣＡＴＮＲＬＡＮＦＬＶＨＳＳＮＮＦＧＧＩＬＧＧＴＮＶＧＳＮＴＹ（ＮＨ２）（配列番号４６）を有することができる。
「カルシトニン」（ＣＴ）は、ヒトカルシトニンタンパク質ならびに成熟ＣＴの生物活性の少なくとも一部を有する、サケカルシトニン（「ｓＣＴ」）を包含する、その種および配列変異体を意味する。ＣＴは、神経系および脈管系で機能するようにみえる甲状腺のより大型のプロホルモンから切断された３２アミノ酸ペプチドであるが、飽満反射の強力なホルモンメディエータであることも報告されている。ＣＴは、誘発された高カルシウム血症に応答したその分泌およびその迅速なカルシウム低下効果にちなんで命名されている。ＣＴは、Ｃ細胞と呼ばれる甲状腺の神経内分泌細胞で産生および分泌される。ＣＴは破骨細胞に対する効果を有し、ＣＴによる破骨細胞機能の抑制によって骨吸収の減少が生じる。ＣＴのインビトロ効果は、波状縁（ｒｕｆｆｌｅｄ ｂｏｒｄｅｒ）の迅速な損失およびリソソーム酵素の放出減少を包含する。ＣＴ（１−３２）の主な機能は、非常事態での急性高カルシウム血症に対抗すること、ならびに／または「カルシウムストレス」たとえば成長、妊娠、および授乳の間に骨格を保護することである。（Ｂｅｃｋｅｒ，ＪＣＥＭ，８９（４）：１５１２−１５２５（２００４）およびＳｅｘｔｏｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ６：１０６７−１０９３（１９９９）に総説されている）。本発明のカルシトニン含有融合タンパク質は、骨粗鬆症の処置に、および骨のパジェット病の療法として特定の用途を見出し得る。合成カルシトニンペプチドは、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏｓ．５，１７５，１４６および５，３６４，８４０に記載されるように生成されている。
「カルシトニン遺伝子関連ペプチド」または「ＣＧＲＰ」は、ヒトＣＧＲＰペプチドならびに成熟ＣＧＲＰの生物活性の少なくとも一部を有するその種および配列変異体を意味する。カルシトニン遺伝子関連ペプチドは、ペプチドのカルシトニンファミリのメンバであり、ヒトでは２つの形態、α−ＣＧＲＰ（３７アミノ酸ペプチド）およびβ−ＣＧＲＰで存在する。ＣＧＲＰは、ヒトアミリンと４３〜４６％の配列同一性を有する。本発明のＣＧＲＰ含有融合タンパク質は、糖尿病に関連付けられた罹患率の低下、高血糖およびインスリン欠損の改善、膵島へのリンパ球浸潤の抑制、ならびに自己免疫破壊に対するベータ細胞の保護に特定の用途を見出し得る。合成ＣＧＲＰおよび組換えＣＧＲＰを作る方法は、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，３７４，６１８に記載されている。
「コレシストキニン」または「ＣＣＫ」は、ヒトＣＣＫペプチドならびに成熟ＣＣＫの生物活性の少なくとも一部を有するその種および配列変異体を意味する。ＣＣＫ−５８は成熟配列であるが、ヒトで最初に同定されたＣＣＫ−３３アミノ酸配列は、ペプチドの主な循環形態である。ＣＣＫファミリは、８−アミノ酸インビボＣ末端フラグメント（「ＣＣＫ−８」）、Ｃ末端ペプチドＣＣＫ（２９−３３）であるペンタガストリンまたはＣＣ
Ｋ−５、およびＣ末端テトラペプチドＣＣＫ（３０−３３）であるＣＣＫ−４も包含する。ＣＣＫは、脂肪およびタンパク質の消化の刺激を担当する、胃腸管系のペプチドホルモンである。本発明のＣＣＫ−３３およびＣＣＫ−８含有融合タンパク質は、食事摂取の循環グルコースの増加の低下および循環インスリン増加の増強に特定の用途を見出し得る。ＣＣＫ−８の類似体は、Ｕ．Ｓ．Ｎｏ．５，６３１，２３０に記載されるように調製されている。
「エキセンジン−３」は、メキシコドクトカゲ（Ｈｅｌｏｄｅｒｍａ ｈｏｒｒｉｄｕｍ）から単離されたグルコース調節ペプチドおよび成熟エキセンジン−３の生物活性の少なくとも一部を有するその配列変異体を意味する。エキセンジン−３アミドは、膵臓ｃＡＭＰの増加、ならびにインスリンおよびアミラーゼの放出を媒介する特異的エキセンジン受容体アンタゴニストである。本発明のエキセンジン−３含有融合タンパク質は、糖尿病およびインスリン抵抗性障害の処置に特定の用途を見出し得る。配列およびそのアッセイ方法は、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐａｔｅｎｔ５，４２４２，８６に記載されている。
「エキセンジン−４」は、アメリカドクトカゲ（Ｇｉｌａ−ｍｏｎｓｔｅｒ Ｈｅｌｏｄｅｒｍａ ｓｕｓｐｅｃｔｕｍ）の唾液に見出されたグルコース調節ペプチド、ならびにその種および配列変異体を意味して、天然３９アミノ酸配列Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ（配列番号４７）ならびにその相同配列およびペプチドミメティック、および変異体；成熟エキセンジン−４の生物活性の少なくとも一部を有する、たとえば霊長類からの天然配列、および非天然配列を包含する。エキセンジン−４は、血中グルコースを減少させ、インスリン分泌を促進して、胃排出を減速させ、飽満感を改善して、食後高血糖の顕著な改善を提供するインクレチンポリペプチドホルモンである。エキセンジンは、グルカゴン様ペプチドファミリのメンバに一部配列類似性を有し、最大の同一性はＧＬＰ−１に対してである（Ｇｏｋｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８：１９６５０−５５（１９９３））。多種多様の相同配列は、天然エキセンジン−４およびＧＬＰ−１と機能的に同等であることが可能である。異なる種からのＧＬＰ−１配列の保存は、Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ２００１ ９８
ｐ．１−１２に表示されている。表４は多岐にわたる種からの配列を示すが、表５は、合成ＧＬＰ−１類似体のリストを示す；そのすべては、本明細書に記載するＢＰＸＴＥＮでの使用を意図する。エキセンジン−４は、ＧＬＰ−１受容体にてインスリン分泌βＴＣ１細胞に結合して、また摘出胃でソマトスタチン放出を刺激して、ガストリン放出を抑制する（Ｇｏｋｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１９６５０−５５，１９９３）。エキセンジン−４は、ＧＬＰ−１のミメティックとして同様の広い範囲の生物活性を呈するが、平均最終半減期が２．４時間という、ＧＬＰ−１よりも長い半減期をなお有する。エクセナチドは、Ｂｙｅｔｔａによって販売されているエキセンジン−４の合成版である。しかしその短い半減期のために、エクセナチドは現在、１日２回投与され、その有用性が制限されている。本発明のエキセンジン−４含有融合タンパク質は、糖尿病およびインスリン抵抗性障害の処置に特定の用途を見出し得る。
「線維芽細胞増殖因子２１」、または「ＦＧＦ−２１」は、ＦＧＦ２１遺伝子によってコードされたヒトタンパク質、または成熟ＦＧＦ２１の生物活性の少なくとも一部を有するその種および配列変異体を意味する。ＦＧＦ−２１は、他の細胞型ではなくて、脂肪細胞へのグルコース取り込みを刺激する；効果は、インスリンの活性に相加的である。ｏｂ／ｏｂマウスへのＦＧＦ−２１注射によって、脂肪組織でのＧｌｕｔ１の増加が生じる。ＦＧＦ２１はまた、トランスジェニックマウスで過剰発現されるときに動物を食餌誘発性
肥満から保護して、糖尿病げっ歯動物に投与されたときに血中グルコースおよびトリグリセリドレベルを低下させる（Ｋｈａｒｉｔｏｎｅｎｋｏｖ Ａら、（２００５）“ＦＧＦ−２１ ａｓ ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ”．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１５：１６２７−３５）。本発明のＦＧＦ−２１含有融合タンパク質は、エネルギー消費、脂肪利用および脂質排泄の増加を引き起こすことを包含する、糖尿病の処置に特定の用途を見出し得る。ＦＧＦ−２１は、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．６，７１６，６２６に開示されるようにクローニングされている。
「ＦＧＦ−１９」、または「線維芽細胞増殖因子１９」は、ＦＧＦ１９遺伝子によってコードされたヒトタンパク質、または成熟ＦＧＦ−１９の生物活性の少なくとも一部を有するその種および配列変異体を意味する。ＦＧＦ−１９は、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）ファミリのタンパク質メンバである。ＦＧＦファミリメンバは、広範な分裂誘発性の活性および細胞生存活性を所有し、多種多様の生物プロセスに関与する。ＦＧＦ−１９は、肥満マウスモデルにおいて、レプチン受容体の肝臓での発現、代謝速度を増加させ、脂肪細胞へのグルコース取り込みを刺激して、減量をもたらす（Ｆｕ，Ｌら 本発明のＦＧＦ−１９含有融合タンパク質は、代謝速度の上昇および食餌性およびレプチン欠損糖尿病の逆転での特定の用途を見出し得る。ＦＧＦ−１９は、ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．２００２００４２３６７に記載されるように、クローニングおよび発現されている。
「ガストリン」は、切断版のヒトガストリンペプチド、ならびに成熟ガストリンの生物活性の少なくとも一部を有するその種および配列変異体を意味する。ガストリンは、十二指腸のＧ細胞によって産生されるまたは胃の幽門洞における直鎖ペプチドホルモンであり、血流中に分泌される。ガストリンは主として３つの形態：ガストリン−３４（「ビッグガストリン」）；ガストリン−１７（「リトルガストリン」）；およびガストリン−１４（「ミニガストリン」）で見出される。ガストリンはＣＣＫと相同性の配列を共有する。本発明のガストリン含有融合タンパク質は、グルコース調節の必要な肥満および糖尿病の処置に特定の用途を見出し得る。ガストリンは、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，８４３，４４６に記載されるように合成されている。
「グレリン」は、飽満を誘発するヒトホルモン、または天然の、処理された２７もしくは２８アミノ酸配列および相同配列を包含する、その種および配列変異体を意味する。グレリンは主に、ヒト胃基底部の内側を覆うＰ／Ｄ１細胞および飢餓を刺激する膵臓のイプシロン細胞によって産生され、レプチンに対応するホルモンと見なされる。グレリンレベルは、食前に増加して、食後に減少し、視床下部におけるレベルで働く作用によって食物取り込みの増加および脂肪質量の増加を引き起こすことができる。グレリンは、成長ホルモンの放出も刺激する。グレリンは、セリン残基にて、ｎ−オクタン酸によってアシル化される；このアシル化は、ＧＨＳ１ａ受容体への結合およびグレリンのＧＨ放出能力にとって不可欠である。本発明のグレリン含有融合タンパク質はアゴニストとして、たとえば胃腸管運動障害においてＧＩ管の運動性を選択的に刺激すること、胃排出を加速すること、または成長ホルモンの放出を刺激することに特定の用途を見出し得る。たとえばＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．７，３８５，０２６に記載されるような配列置換のあるグレリン類似体または切断変異体は、グルコース恒常性の改善、インスリン抵抗性の処置および肥満の処置のためのアンタゴニストとして使用するための、ＸＴＥＮの融合パートナーとして、特定の用途を見出し得る。グレリンの単離およびキャラクタリゼーションが報告されており（Ｋｏｊｉｍａ Ｍ，ら、Ｇｈｒｅｌｉｎ ｉｓ ａ ｇｒｏｗｔｈ−ｈｏｒｍｏｎｅ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ａｃｙｌａｔｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ｆｒｏｍ ｓｔｏｍａｃｈ．Ｎａｔｕｒｅ．１９９９；４０２（６７６２）：６５６−６６０．）および、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．６，９６７，２３７に記載されるように、合成類似体がペプチド合成によって調製されている。
「グルカゴン」は、ヒトグルカゴングルコース調節ペプチド、または天然２９アミノ酸配列および相同配列を包含する、その種および配列変異体；成熟グルカゴンの生物活性の少なくとも一部を有する、たとえば霊長類からの天然配列変異体、および非天然配列変異体を意味する。「グルカゴン」という用語は、本明細書で使用する場合、グルカゴンのペプチドミメティックも包含する。天然グルカゴンは、膵臓によって産生され、血中グルコースレベルがあまりに低下したときに放出されて、肝臓に貯蔵されたグリコーゲンをグルコースに変換して血流中に放出させるようにする。グルカゴンの作用は、体の細胞に血中からグルコースを取り込むようにシグナルを出すインスリンの作用と反対であるが、グルカゴンもインスリンを放出を刺激するので、血流中の新たに利用できるグルコースは、インスリン依存性組織によって取り込まれ、使用され得る。本発明のグルカゴン含有融合タンパク質は、現存する肝臓グリコーゲン貯蔵を有する個体の血中グルコースレベルを上昇させることおよび糖尿病でのグルコース恒常性を維持することに特定の用途を見出し得る。グルカゴンは、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，８２６，７６３に記載されるようにクローニングされている。
「ＧＬＰ−１」は、ヒトグルカゴン様ペプチド−１および成熟ＧＬＰ−１の生物活性の少なくとも一部を有するその配列変異体を意味する。「ＧＬＰ−１」という用語は、ヒトＧＬＰ−１（１−３７）、ＧＬＰ−１（７−３７）、およびＧＬＰ−１（７−３６）アミドを包含する。ＧＬＰ−１はインスリン分泌を刺激するが、高血糖の期間中のみである。インスリンに比較したＧＬＰ−１の安全性は、この特性によって、およびインスリンの分泌量が高血糖の規模に比例して分泌されるという観察結果によって増強される。ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨの生物学的半減期は、わずか３〜５分である（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，１１８，６６６）。本発明のＧＬＰ−１含有融合タンパク質は、グルコース調節の必要な糖尿病およびインスリン抵抗性障害の処置に特定の用途を見出し得る。ＧＬＰ−１は、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，１１８，６６６に記載されるようにクローニングされ、誘導体が調製されている。広範な種からのＧＬＰ−１配列の非限定的な例が表４に示されているが、表５は、いくつかの合成ＧＬＰ−１類似体の配列を示す；そのすべては、本明細書に記載するＢＰＸＴＥＮ組成物での使用を意図する。
Figure 2017031218
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ＧＬＰ天然配列は、以下に表示されている数種の配列モチーフによって記載され得る。カッコ内の文字は、各配列位置での許容され得るアミノ酸を表す：［ＨＶＹ］［ＡＧＩＳＴＶ］［ＤＥＨＱ］［ＡＧ］［ＩＬＭＰＳＴＶ］［ＦＬＹ］［ＤＩＮＳＴ］［ＡＤＥＫＮＳＴ］［ＡＤＥＮＳＴＶ］［ＬＭＶＹ］［ＡＮＲＳＴＹ］［ＥＨＩＫＮＱＲＳＴ］［ＡＨＩＬＭＱＶＹ］［ＬＭＲＴ］［ＡＤＥＧＫＱＳ］［ＡＤＥＧＫＮＱＳＹ］［ＡＥＩＫＬＭＱＲ］［ＡＫＱＲＳＶＹ］［ＡＩＬＭＱＳＴＶ］［ＧＫＱＲ］［ＤＥＫＬＱＲ］［ＦＨＬＶＷＹ］［ＩＬＶ］［ＡＤＥＧＨＩＫＮＱＲＳＴ］［ＡＤＥＧＮＲＳＴＷ］［ＧＩＬＶＷ］［ＡＩＫＬＭＱＳＶ］［ＡＤＧＩＫＮＱＲＳＴ］［ＧＫＲＳＹ］。さらに、ＧＬＰ−１の合成類似体は、グルコース関連障害の処置で有用な生物活性を有するＢＰＸＴＥＮを生成するための、ＸＴＥＮに対する融合パートナーとして有用であることができる。エキセンジン−４またはＧＬＰ−１に相同性のさらなる配列は、標準相同性検索技法によって見出され得る。
Figure 2017031218
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「ＧＬＰ−２」は、ヒトグルカゴン様ペプチド−２および成熟ＧＬＰ−２の生物活性の少なくとも一部を有するその配列変異体を意味する。”さらに詳細には、ＧＬＰ−２は、小腸および大腸の腸内分泌細胞からＧＬＰ−１と共に同時分泌される、３３アミノ酸ペプチドである。
「ＩＧＦ−１」または「インスリン様成長因子１」は、ヒトＩＧＦ−Ｉタンパク質ならびに成熟ＩＧＦ−１の生物活性の少なくとも一部を有するその種および配列変異体を意味する。かつてソマトメジンＣと呼ばれたＩＧＦ−１は、インスリンに分子構造が類似しており、成長ホルモンの作用を調整するポリペプチドタンパク質同化ホルモンである。ＩＧＦ−１は、７０アミノ酸で構成され、内分泌ホルモンとして主に肝臓によってならびに標的組織において、パラクリン／オートクリン方式で産生される。本発明のＩＧＦ−１含有融合タンパク質は、グルコース調節の必要な糖尿病およびインスリン抵抗性障害の処置に特定の用途を見出し得る。ＩＧＦ−１は、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，３２４，６３９に記載されるように、大腸菌および酵母でクローニングされ、発現されている。
「ＩＧＦ−２」または「インスリン様成長因子２」は、ヒトＩＧＦ−２タンパク質ならびに成熟ＩＧＦ−２の生物活性の少なくとも一部を有するその種および配列変異体を意味する。ＩＧＦ−２は、インスリンに分子構造が類似しており、妊娠中に成長促進ホルモンとしての主な役割を備えたポリペプチドタンパク質ホルモンである。ＩＧＦ−２は、Ｂｅｌｌ ＧＩら、Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｇｅｎｅｓ：ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ＩＩ ａｎｄ ｉｎｓｕｌｉｎ ｇｅｎｅｓ ａｒｅ ｃｏｎｔｉｇｕｏｕｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．１９８５．８２（１９）：６４５０−４に記載されるようにクローニングされている。
「ＩＮＧＡＰ」、または「膵島新生随伴タンパク質」、または「膵臓ベータ細胞成長因子」は、ヒトＩＮＧＡＰペプチドならびに成熟ＩＮＧＡＰの生物活性の少なくとも一部を有するその種および配列変異体を意味する。ＩＮＧＡＰは、膵島新生の必要条件である、導管細胞増殖の開始が可能である。本発明のＩＮＧＡＰ含有融合タンパク質は、糖尿病およびインスリン抵抗性障害の処置または防止に特定の用途を見出し得る。ＩＮＧＡＰは、Ｒ Ｒａｆａｅｌｏｆｆ Ｒら、Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ
ｔｈｅ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｉｓｌｅｔ ｎｅｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＩＮＧＡＰ）ｇｅｎｅ ａｎｄ ｉｔｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｉｓｌｅｔ ｎｅｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｈａｍｓｔｅｒｓ．Ｊ Ｃｌｉｎ
Ｉｎｖｅｓｔ．１９９７．９９（９）：２１００−２１０９に記載されるように、クロ
ーニングおよび発現されている。
「インターメジン」または「ＡＦＰ−６」は、ヒトインターメジンペプチドならびに成熟インターメジンの生物活性の少なくとも一部を有するその種および配列変異体を意味する。インターメジンは、カルシトニン受容体様受容体のリガンドである。インターメジン処置は、正常被験体および高血圧被験体の両方での血圧低下、ならびに胃排出活性の抑止をもたらし、グルコース恒常性に関係している。本発明のインターメジン含有融合タンパク質は、糖尿病、インスリン抵抗性障害、および肥満の処置に特定の用途を見出し得る。インターメジンペプチドおよび変異体は、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．６，９６５，０１３に記載されるように、クローニングされている。
「レプチン」は、任意の種からの天然に存在するレプチン、ならびに生物活性Ｄアイソフォーム、またはそのフラグメントおよび配列変異体を意味する。レプチンは、食欲および代謝を包含する、エネルギー取り込みおよびエネルギー消費を調節するのに主要な役割を果たす。本発明のレプチン含有融合タンパク質は、グルコース調節の必要な糖尿病、インスリン抵抗性障害、および肥満の処置に特定の用途を見出し得る。レプチンは、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐａｔｅｎｔ Ｐｕｂ．Ｎｏ．ＷＯ ９６／０５３０９に記載されるように、ｏｂ遺伝子のポリペプチド生成物である。レプチンはＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．７，１１２，６５９に、ならびにレプチン類似体およびフラグメントはＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，５２１，２８３、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，５３２，３３６、ＰＣＴ／ＵＳ９６／２２３０８およびＰＣＴ／ＵＳ９６／０１４７１に記載されるように、クローニングされている。
「ニューロメジン」は、ニューロメジンＵおよびＳペプチドを包含するペプチドのニューロメジンファミリ、ならびにその配列変異体を意味する。天然活性ヒトニューロメジンＵペプチドホルモンは、ニューロメジン−Ｕ２５、特にそのアミド形態である。特に興味深いのは、その処理された活性ペプチドホルモンならびにその類似体、誘導体およびフラグメントである。ニューロメジンＵファミリには、各種の切断変異体またはスプライス変異体、たとえばＦＬＦＨＹＳＫＴＱＫＬＧＫＳＮＶＶＥＥＬＱＳＰＦＡＳＱＳＲＧＹＦＬＦＲＰＲＮ（配列番号１８０）が包含される。例示的なニューロメジンＳファミリは、配列ＩＬＱＲＧＳＧＴＡＡＶＤＦＴＫＫＤＨＴＡＴＷＧＲＰＦＦＬＦＲＰＲＮ（配列番号１８１）を有するヒトニューロメジンＳ、特にそのアミド形態である。本発明のニューロメジン融合タンパク質は、肥満、糖尿病の処置、食物取り込みの低減、本明細書に記載するような他の関連症状および障害の処置に特定の用途を見出し得る。特に興味深いのは、アミリンファミリペプチド、エキセンジンペプチドファミリまたはＧＬＰＩペプチドファミリモジュールと組み合わされたニューロメジンモジュールである。
「オキシントモジュリン」、または「ＯＸＭ」は、ヒトオキシントモジュリンならびに成熟ＯＸＭの生物活性の少なくとも一部を有するその種および配列変異体を意味する。ＯＸＭは、８アミノ酸カルボキシ末端延長が続くグルカゴンの２９アミノ酸配列を含有する、結腸で産生される３７アミノ酸ペプチドである。ＯＸＭは食欲を抑えることが見出されている。本発明のＯＸＭ含有融合タンパク質は、グルコース調節の必要な糖尿病、インスリン抵抗性障害、肥満の処置に特定の用途を見出し得て、減量処置薬として使用することができる。
「ＰＹＹ」は、ヒトペプチドＹＹポリペプチドならびに成熟ＰＹＹの生物活性の少なくとも一部を有するその種および配列変異体を意味する。ＰＹＹは、ＰＰ折畳み構造モチーフを有する、ヒト全長３６アミノ酸ペプチドＰＹＹ１−３６およびＰＹＹ３−３６の両方を包含する。ＰＹＹは、胃運動性を抑制して、結腸での水および電解質の吸収を増加させる。ＰＹＹは、膵臓分泌も抑え得る。本発明のＰＰＹ含有融合タンパク質は、グルコース
調節の必要な糖尿病、インスリン抵抗性障害、および肥満の処置に特定の用途を見出し得る。ＰＹＹの類似体は、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏｓ．５，６０４，２０３、５，５７４，０１０および７，１６６，５７５に記載されるように調製されている。
「ウロコルチン」は、ヒトウロコルチンペプチドホルモンおよび成熟ウロコルチンの生物活性の少なくとも一部を有するその配列変異体を意味する。３種類のヒトウロコルチン：Ｕｃｎ−１、Ｕｃｎ−２およびＵｃｎ−３がある。さらなるウロコルチンおよび類似体は、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．６，２１４，７９７に記載されている。ウロコルチンＵｃｎ−２およびＵｃｎ−３は、食物取り込み抑止特性、抗高血圧特性、心臓保護特性、および変力特性を有する。Ｕｃｎ−２およびＵｃｎ−３は、ストレス刺激、たとえば規定食摂取／絶食後の慢性ＨＰＡ活性化を抑止する能力を有し、ＣＲＦ２型受容体に特異的であり、ＡＣＴＨ放出を媒介するＣＲＦ−Ｒ１を活性化しない。ウロコルチン、たとえばＵｃｎ−２またはＵｃｎ−３を含むＢＰＸＴＥＮは、血管拡張に、およびそれゆえ心血管用途、たとえば慢性心不全に有用であり得る。本発明のウロコルチン含有融合タンパク質は、ＡＣＴＨ放出刺激、血管拡張効果による高血圧、ＡＣＴＨ上昇以外によって媒介された炎症、高体温、食欲障害、うっ血性心不全、ストレス、不安、および乾癬に関連付けられた状態の処置または防止にも特定の用途を見出し得る。ウロコルチン含有融合タンパク質はまた、ナトリウム排泄増加ペプチドモジュール、アミリンファミリ、およびエキセンジンファミリ、またはＧＬＰ１ファミリモジュールと組み合わされて、心血管利益の増強、たとえ
ば有益な血管拡張効果を提供することによるＣＨＦの処置を提供し得る。
（ｂ）代謝性疾患および心血管タンパク質
代謝性疾患および心血管疾患は、大半の先進国で相当な保健管理上の重荷となり、心血管疾患は、米国および大半の欧州諸国で死亡および障害（ｄｉｓａｂｉｌｉｔｙ）の第１の原因に今なおなっている。代謝性疾患および代謝性障害は、体の臓器、組織、および循環系に影響を及ぼす多種多様の症状を包含する。これらの中で最重要なのが、米国で主要な死亡原因の１つの糖尿病であるのは、糖尿病が脈管構造、中枢神経系、主要臓器、および末梢組織に病態および代謝障害の両方を生じるためである。インスリン抵抗性および高インスリン血症は、かなりの健康上のリスク引き起こす他の２種類の代謝性障害：グルコース寛容減損および代謝性肥満にも連結してきた。グルコース寛容減損は、摂食前の正常グルコースレベルを特徴として、食事後のグルコースレベルが上昇する（高血糖）傾向がある。このような個体は、糖尿病および冠動脈疾患のより高いリスクに瀕していると見なされる。肥満も、高血圧、冠動脈疾患（動脈硬化症）、および乳酸アシドーシス、ならびに関連疾患状態と同様に、インスリン抵抗症候群、すなわち「シンドロームＸ」と呼ばれる状態の群にとってのリスク因子である。肥満の病因は多因子性であると考えられるが、根底にある問題は、過剰な脂肪組織が存在するまで、肥満において栄養素利用性およびエネルギー消費が均衡していないことである。
脂質異常症は、糖尿病患者および心血管疾患を有する被験体の間で頻繁に出現し；通例、血漿トリグリセリドの上昇、低いＨＤＬ（高密度リポタンパク質）コレステロール、正常〜高レベルのＬＤＬ（低密度リポタンパク質）コレステロールおよび小型高密度ＬＤＬ粒子の血中レベル増加などのパラメータを特徴とする。脂質異常症および高血圧は、糖尿病および心血管疾患のような代謝性疾患を有する被験体の間で、冠動脈イベント、腎疾患、および死亡の発生率の増加の主要な寄与因子（ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｏｒ）である。
心血管疾患は、特に動脈瘤、狭心症、アテローム性動脈硬化、脳血管障害（発作）、脳血管疾患、うっ血性心不全、冠動脈疾患、心筋梗塞、心拍出量減少および末梢血管疾患、高血圧、低血圧、血液マーカー（たとえばＣ反応性タンパク質、ＢＮＰ、および酵素、たとえばＣＰＫ、ＬＤＨ、ＳＧＰＴ、ＳＧＯＴ）などを包含する、全身に及ぶ心臓、脈管および臓器系を含む、臨床パラメータの多くの障害、状態および変化によって明らかである
ことができる。
大半の代謝プロセスおよび多くの心血管パラメータは、複数のペプチドおよびホルモン（「代謝タンパク質」）によって調節され、多くのこのようなペプチドおよびホルモン、ならびにその類似体は、このような疾患および障害の処置に有用性を見出している。しかし、治療用ペプチドおよび／またはホルモンの使用は、小型分子薬の使用によって増強されるときでも、このような疾患および障害の管理の成功は限定されていた。特に用量最適化は、代謝性疾患の処置に使用される薬物および生物製剤、とりわけ狭い治療ウインドウを有するものにとっては重要である。一般に、グルコース恒常性に関与するホルモン、およびペプチドは、狭い治療ウインドウを有することが多い。狭い治療ウインドウは、このようなホルモンおよびペプチドが通例、臨床利益を達成するために頻繁な投薬が必要となる短い半減期を有するという事実と組み合されて、このような患者の管理に困難を生じる。したがって、代謝性疾患の処置での有効性および安全性が増加した治療薬に対する要求が依然として存在している。
それゆえ本発明の一態様は、このような障害、疾患および関連症状の処置での有用性を有する組成物を生成するための、代謝疾患および心血管疾患ならびに障害の処置に関与するまたは使用される生物活性代謝タンパク質の、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質への組み入れである。代謝タンパク質は、代謝性疾患または心血管疾患、障害または状態を防止、処置、媒介または緩和するのに有用である、生物的、治療的、または予防的重要性または機能のある任意のタンパク質を包含することができる。表６は、本発明のＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質に含まれる代謝性ＢＰのこのような配列の非限定的なリストを提供する。本発明のＢＰＸＴＥＮ組成物の代謝タンパク質は、表６から選択されるタンパク質配列に対して、少なくとも約８０％の配列同一性を、またはあるいは８１％の、８２％の、８３％の、８４％の、８５％の、８６％の、８７％の、８８％の、８９％の、９０％の、９１％の、９２％の、９３％の、９４％の、９５％の、９６％の、９７％の、９８％の、９９％、もしくは１００％の配列同一性を示すタンパク質であることができる。
Figure 2017031218
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「抗ＣＤ３」は、ＯＫＴ３（ムロモナブとも呼ばれる）およびヒト化抗ＣＤ３モノクローナル抗体（ｈＯＫＴ３１（Ａｌａ−Ａｌａ））を包含する、Ｔ細胞表面タンパク質ＣＤ３に対するモノクローナル抗体、その種および配列変異体、ならびにフラグメントを意味する（ＫＣ Ｈｅｒｏｌｄら、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３４６：１６９２−１６９８．２００２） 抗ＣＤ３は、すべての分化Ｔ細胞に存在するＴ細胞受容体複合体を結合することによって、Ｔ細胞の活性化および増殖を防止する。本発明の抗ＣＤ３含有融合タンパク質は、治療エフェクタとしての抗ＣＤ３ならびにＢＰＸＴＥＮ組成物の第２の治療ＢＰの標的部分の使用を包含して、初発の１型糖尿病を遅らせることに特定の用途を見出し得る。可変領域の配列および抗ＣＤ３の生成は、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏｓ ５，８８５，５７３および６，４９１，９１６に記載されている。
「ＩＬ−１ｒａ」は、ヒトＩＬ−Ｉ受容体アンタゴニストタンパク質ならびに、成熟ＩＬ−１ｒａの生物活性の少なくとも一部を有する、配列変異体のアナキンラ（Ｋｉｎｅｒｅｔ（登録商標））を包含する、ヒトＩＬ−Ｉ受容体アンタゴニストタンパク質の種およ
び配列変異体を意味する。ヒトＩＬ−１ｒａは、１５２アミノ酸残基の成熟糖タンパク質である。ＩＬ−１ｒａの抑制作用は、Ｉ型ＩＬ−１受容体へのその結合から生じる。該タンパク質は２５ｋＤａの天然分子量を有し、該分子は、ＩＬ−１α（１９％）およびＩＬ−１β（２６％）に対して制限された配列相同性を示す。アナキンラは、非グリコシレーション組換えヒトＩＬ−１ｒａであり、Ｎ末端メチオニンの付加により内因性ヒトＩＬ−１ｒａとは異なる。アナキンラの市販品は、Ｋｉｎｅｒｅｔ（登録商標）として販売されている。アナキンラは、天然ＩＬ−１ｒａおよびＩＬ−Ｉｂと同じアビディティでＩＬ−Ｉ受容体に結合するが、ＩＬ−１αおよびＩＬ−１β上のこのような２つのモチーフに対してＩＬ−１ｒａ上の唯一の受容体結合モチーフの存在に起因する効果である、受容体活性化（シグナル伝達）を生じない。アナキンラは、１５３のアミノ酸および１７．３ｋＤのサイズを有し、おおよそ４〜６時間の半減期が報告されている。
ＩＬ−Ｉ産生の増加は、各種のウイルス、細菌、真菌、および寄生虫感染症；血管内凝固；高用量ＩＬ−２療法；固形腫瘍；白血病；アルツハイマー病；ＨＩＶ−１感染症；自己免疫障害；外傷（外科手術）；血液透析；虚血性疾患（心筋梗塞）；非感染性肝炎；喘息；紫外線照射；閉鎖性頭部外傷；膵炎；腹膜炎；対宿主性移植片病；移植片拒絶を有する患者において；および激しい運動後の健常被験体において報告されている。アルツハイマー病患者におけるＩＬ−１β産生の増加とアミロイド前駆体タンパク質の放出におけるＩＬ １の考えられる役割の間に関連がある。ＩＬ−１は、疾患、たとえば２型糖尿病、肥満、高血糖、高インスリン血症、１型糖尿病，インスリン抵抗性、網膜神経変性プロセス、インスリン抵抗性を特徴とする疾患状態および症状、急性心筋梗塞（ＡＭＩ）、急性冠動脈症候群（ＡＣＳ）、アテローム性動脈硬化、慢性炎症障害、関節リウマチ、椎間円板変性症、サルコイドーシス、クローン病、潰瘍性大腸炎、妊娠性糖尿病、食欲亢進、不十分な飽満感、代謝性障害、グルカゴノーマ、気道の分泌障害、骨粗鬆症、中枢神経系疾患、再狭窄、神経変性疾患、腎不全、うっ血性心不全、ネフローゼ症候群、肝硬変、肺水腫、高血圧、食物取り込みの低下が所望である障害、過敏性腸症候群、心筋梗塞、発作、術後異化作用変化、冬眠心筋、糖尿病性心筋症、不十分な尿中ナトリウム排泄、過剰な尿中カリウム濃度、毒性血液量過多に関連付けられた症状または障害、多嚢胞性卵巣症候群、呼吸窮迫、慢性皮膚潰瘍、腎症、左心室収縮不全、消化管下痢、術後ダンピング症候群、過敏性腸症候群、重症疾患多発ニューロパチー（ＣＩＰＮ）、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、脂質異常症、虚血後再灌流傷害、および冠動脈心疾患リスクファクター（ＣＨＤＲＦ）症候群にも関連付けられてきた。本発明のＩＬ−１ｒａ含有融合タンパク質は、上述の疾患および障害の任意の処置に特定の用途を見出し得る。ＩＬ−１ｒａは、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏｓ．５，０７５，２２２および６，８５８，４０９に記載されるようにクローニングされている。
「ナトリウム排泄増加ペプチド」は、心房ナトリウム排泄増加ペプチド（ＡＮＰ）、脳ナトリウム排泄増加ペプチド（ＢＮＰまたはＢ型ナトリウム排泄増加ペプチド）およびＣ型ナトリウム排泄増加ペプチド（ＣＮＰ）；成熟した対応するナトリウム排泄増加ペプチドの生物活性の少なくとも一部を有する、ヒトおよび非ヒトの両方のその種および配列変異体を意味する。アルファ心房ナトリウム排泄増加ペプチド（ａＡＮＰ）または（ＡＮＰ）および脳ナトリウム排泄増加ペプチド（ＢＮＰ）およびＣ型ナトリウム排泄増加ペプチド（ＣＮＰ）は、体液および電解質の恒常性の調節に関与する相同ポリペプチドホルモンである。ナトリウム排泄増加ペプチドの有用な形態の配列は、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ２００１００２７１８１に開示されている。ＡＮＰの例は、ヒトＡＮＰ（Ｋａｎｇａｗａら、ＢＢＲＣ １１８：１３１（１９８４））またはブタおよびラットＡＮＰを包含する、各種の種からのＡＮＰ（Ｋａｎｇａｗａら、ＢＢＲＣ １２１：５８５（１９８４））を包含する。配列解析によって、プレプロＢＮＰは１３４残基から成り、１０８アミノ酸ＰｒｏＢＮＰに切断されることが明らかになる。ＰｒｏＢＮＰのＣ末端からの３２アミノ酸配列の切断によって、循環中の生理的活性形態のヒトＢＮＰ（
７７−１０８）が生じる。３２アミノ酸ヒトＢＮＰは、ジスルフィド結合の形成に関与する（Ｓｕｄｏｈら、ＢＢＲＣ １５９：１４２０（１９８９））ならびにＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏｓ．５，１１４，９２３、５，６７４，７１０、５，６７４，７１０、および５，９４８，７６１。ＢＰＸＴＥＮ含有の１つ以上のナトリウム排泄増加機能は、高血圧の処置、利尿誘導、ナトリウム排泄増加誘導、血管拡張または弛緩、ナトリウム排泄増加ペプチド受容体（たとえばＮＰＲ−Ａ）結合、腎臓からのａｐｉｄａ分泌抑止、副腎からのアルドステロン（ａｌｄｏｓｔｒｅｒｏｎｅ）分泌抑止、心血管疾患および障害の処置、心イベント後のまたはうっ血性心不全の結果としての心臓リモデリングの低減、停止または逆転、腎疾患および障害の処置；虚血性発作の処置または防止、ならびに喘息の処置に有用であり得る。
「ＦＧＦ−２」またはへパリン結合成長因子２は、ヒトＦＧＦ−２タンパク質、ならびに成熟対応物（ｍａｔｕｒｅ ｃｏｕｎｔｅｒｐａｒｔ）の生物活性の少なくとも一部を有するその種および配列変異体を意味する。ＦＧＦ−２は、線条体様ニューロンに分化した神経幹細胞の増殖を刺激して、ハンチントン舞踏病の毒素誘発モデルにおける線条体ニューロンを保護することが示され、心再灌流傷害の処置での有用性も有し得て、内皮細胞成長、抗脈管形成特性および腫瘍抑止特性、創傷治癒、ならびに骨の骨折治癒の促進を有し得る。ＦＧＦ−２は、Ｂｕｒｇｅｓｓ，Ｗ．Ｈ．ａｎｄ Ｍａｃｉａｇ，Ｔ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５８：５７５−６０６（１９８９）；Ｃｏｕｌｉｅｒ，Ｆ．ら、１９９４，Ｐｒｏｇ．Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｓ．５：１；およびＰＣＴ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ＷＯ ８７／０１７２８に記載されるようにクローニングされている。
「ＴＮＦ受容体」は、ヒトＴＮＦ受容体、ならびに成熟ＴＮＦＲの生物受容体活性の少なくとも一部を有するその種および配列変異体を意味する。Ｐ７５ ＴＮＦ受容体分子は、ｐ５５ ＴＮＦ受容体を包含する構造的に相同な受容体のファミリ由来である、ｐ７５
ＴＮＦ受容体の細胞外ドメインである。ＴＮＦαおよびＴＮＦβ（ＴＮＦリガンド）は、ｐ５５ ＴＮＦ受容体およびｐ７５ ＴＮＦ受容体への結合に関して競合する。ヒトｐ５５ ＴＮＦ受容体の細胞外ドメインおよびＴＮＦβによって形成された複合体のｘ線結晶構造が決定されている（参照により本明細書に組み入れられている、Ｂａｎｎｅｒら、Ｃｅｌｌ ７３：４３１，１９９３）。
（ｃ）凝固因子
血友病では、特定の血漿凝固因子の欠如によって、血液の凝固が妨げられる。ヒト第ＩＸ因子（ＦＩＸ）は、血液凝固カスケードの内因性経路の重要な構成要素である、セリンプロテアーゼのチモーゲンである。ＦＩＸ欠損のない個体では、ＦＩＸの平均半減期は短く、おおよそ１８〜２４時間である。男性３０，０００人のうち約１人に出現する、Ｘ連鎖障害による機能性ＦＩＸの欠乏によって、クリスマス病としても公知の血友病Ｂが生じる。第ＩＸ因子の１００を超える変異が記載されている；いくつかは症状を引き起こさないが、多くは顕著な出血障害をもたらす。未処置のときには、血友病Ｂは筋肉、関節、および体腔への制御不能の出血を伴い、死をもたらすことがある。以前には本疾患の処置は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）およびＣ型肝炎（ＨＣＶ）ウイルスを包含する血液媒介ウイルスによる感染という付帯リスクを有する、ドナープールに由来するヒト血漿から調製されたＦＩＸの投与を包含していた。つい最近では、組換えＦＩＸ生成物が市販されるようになった。外因的に供給された第ＩＸ因子のインビボ活性は、タンパク質半減期および抗トロンビンＩＩＩを包含する凝固抑制因子の両方によって制限される。第ＩＸ因子組成物は通例、半減期が短く、注射が頻繁に必要である。また最新のＦＩＸに基づく治療薬は、生物学的利用能が不十分であるため、静脈内投与が必要である。それゆえ血友病Ｂの防止および／または治療レジメンの一部として投与されるときに、半減期が延長され、活性が保持されている第ＩＸ因子組成物への要求がある。
凝固の生理的引き金となるものは、正常には脈管構造の外部に位置する、ＴＦ発現細胞の表面での、組織因子（ＴＦ）と第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）との間の複合体の形成である。これにより、第ＩＸ因子および第Ｘ因子の活性化がもたらされ、最終的にトロンビンが一部生成される。今度はトロンビンが血液凝固カスケードのいわゆる「内因性の」アームである第ＶＩＩＩ因子および第ＩＸ因子を活性化して、それゆえ十分なトロンビンのバーストが生成して完全な止血を達成するために必要である、第Ｘａ因子の生成を増幅させる。続いて、高濃度の第ＶＩＩａ因子を投与することにより、特定の出血障害における第ＶＩＩＩａ因子および第ＩＸａ因子への要求が回避され、止血を達成できることが示された。凝固障害および出血障害は、プロトロンビン時間、部分プロトロンビン時間、出血時間、凝固時間、血小板数、プロトロンビンフラグメント１＋２（Ｆ１＋２）、トロンビン−抗トロンビンＩＩＩ複合体（ＴＡＴ）、Ｄ−ダイマー、出血エピソードの生成率、赤血球沈降速度（ＥＳＲ）、Ｃ反応性タンパク質、および凝固因子の血中濃度などのパラメータの変化を生じることができる。
それゆえ第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）タンパク質は、ＦＶＩＩＩまたはＦＩＸに対する抑制因子を有する血友病ＡまたはＢ患者および後天性血友病患者における出血エピソードの処置、ならびにＦＶＩＩＩまたはＦＩＸに対する抑制因子を有する血友病ＡまたはＢ患者における外科的介入または侵襲的手順での出血の防止に有用性が見出されている。さらに第ＶＩＩａ因子は、先天性第ＶＩＩ因子欠損患者における出血エピソードの処置および先天性ＦＶＩＩ欠乏患者における外科的介入または侵襲的手順での出血の防止で利用できる。しかし、ＦＶＩＩａを含有する生成物の静脈内投与は、血栓イベント、発熱および注射部位反応を包含する副作用をもたらし得る。さらに第ＶＩＩａ因子のおおよそ２時間の短い半減期によってその適用が制限され、止血を達成するために２〜４時間ごとの反復注射が必要となり得る。それゆえ血友病Ｂの防止レジメンおよび／または治療レジメンの一部として投与されるときに、半減期が延長され、活性が保持されている第ＩＸ因子組成物および第ＶＩＩａ因子組成物、ならびに副作用を低下させて、静脈内および皮下経路の両方で投与できる調合物への要求が今なお存在している。
本発明のＢＰＸＴＥＮに包含するための凝固因子は、血液凝固障害、疾患、または欠損を防止、処置、媒介または改善するのに有用である、生物的、治療的、または予防的重要性または機能のあるタンパク質を包含することができる。好適な凝固タンパク質は、基質、酵素または補因子として凝固カスケードに関与する生物活性ポリペプチドを包含する。
表７は、本発明のＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質に含まれる凝固因子の配列の非限定的なリストを提供する。本発明のＢＰＸＴＥＮへの包含のための凝固因子は、表７から選択されるタンパク質配列に対して、少なくとも約８０％の配列同一性を、またはあるいは８１％の、８２％の、８３％の、８４％の、８５％の、８６％の、８７％の、８８％の、８９％の、９０％の、９１％の、９２％の、９３％の、９４％の、９５％の、９６％の、９７％の、９８％の、９９％、もしくは１００％の配列同一性を示すタンパク質であることができる。
Figure 2017031218
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「第ＩＸ因子」（「ＦＩＸ」）は、ヒト第ＩＸ因子タンパク質ならびに成熟第ＩＸ因子の生物受容体活性の少なくとも一部を有するその種および配列変異体を包含する。ＦＩＸは、血液凝固第ＩＸ因子の代表的な特徴を備えた任意の形態の第ＩＸ因子分子であるものとする。ＦＩＸは、血漿からのＦＩＸおよびたとえばＦＩＸの欠損（たとえば血友病Ｂ）によって引き起こされた患者の出血障害を治癒することができる任意の形態の組換えＦＩＸを包含するものとする。いくつかの実施形態において、ＦＩＸペプチドは、表７の配列を包含する、本明細書に記載するＦＩＸペプチドの任意の構造類似体またはペプチドミメティックである。ポリペプチドの生物活性を無効にしない（すなわちその活性を野生型形態（＝１００％）の１０％未満またはなお５％未満に低下させること）、ＦＩＸのポリペプチド配列のアミノ酸の軽度の欠損、付加および／または置換も、生物活性誘導体、とりわけ改善された比活性を有するもの（野生型形態の１００％の活性を超える）として本出願に包含される。本発明によるＦＩＸは、任意の脊椎動物、たとえば哺乳動物に由来し得る。
いくつかの実施形態において、ＦＩＸペプチドは、表７の配列を包含する、本明細書に記載するＦＩＸペプチドの任意の構造類似体またはペプチドミメティックである。ポリペプチドの生物活性を無効にしない（すなわちその活性を野生型形態（＝１００％）の１０％未満またはなお５％未満に低下させること）、ＦＩＸのポリペプチド配列のアミノ酸の軽度の欠損、付加および／または置換も、生物活性誘導体、とりわけ改善された比活性を有するもの（野生型形態の１００％の活性を超える）として本出願に包含される。本発明によるＦＩＸは、任意の脊椎動物、たとえば哺乳動物に由来し得る。本発明の詳細な１例において、ＦＩＸはヒトＦＩＸである。別の実施形態において、ＦＩＸは、表７からのポリペプチド配列である。
ヒト第ＩＸ因子（ＦＩＸ）は、Ｘ染色体のｑ２７．１に存在するシングルコピー遺伝子によってコードされる。ヒトＦＩＸｍＲＮＡは、５’非翻訳領域の２０５塩基、プレプロ第ＩＸ因子の１３８３塩基、停止コドンおよび３’非翻訳領域の１３９２塩基で構成される。ＦＩＸポリペプチドは、５５ｋＤａであり、３つの領域：２８アミノ酸のシグナルペプチド、グルタミン酸残基のガンマカルボキシル化に必要である、１８アミノ酸のプロペ
プチド、および４１５アミノ酸の成熟第ＩＸ因子から構成されるプレプロポリペプチド鎖として合成される。成熟第ＩＸ因子はドメインで構成される。ドメインはＮ→Ｃ末端配置では、Ｇｌａドメイン、ＥＧＦ１ドメイン、ＥＧＦ２ドメイン、活性化ペプチドドメイン、およびプロテアーゼ（または触媒）ドメインである。プロテアーゼドメインは、ＦＩＸのＦＩＸａへの活性化時に、ＦＩＸの触媒活性を提供する。活性化後に、単鎖ＦＩＸは２本鎖分子となり、この分子で２本の鎖は、酵素をＧｌａドメインに付着するジスルフィド結合によって連結される。活性化された第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩａ）は、ＦＩＸａ活性の完全発現のための特異的補因子である。本明細書で使用する場合、「第ＩＸ因子」および「ＦＩＸ」は、ドメインＧ１ａ、ＥＧＦ１、ＥＧＦ２、活性化ペプチド、およびプロテアーゼ含むポリペプチド、または当分野で公知のこれらのドメインの同義語を含むポリペプチドを含むことを意図する。
ＦＩＸは、活性ＦＩＸを産するために、翻訳後プロセシングを必要とする前駆体ポリペプチドとして発現される。特に、ＦＩＸの前駆体ポリペプチドは、いわゆるガンマ−カルボキシグルタメートドメインにおける特定のグルタミン酸残基のガンマカルボキシル化およびプロペプチドの切断を必要とする。プロペプチドは、ガンマ−カルボキシグルタメートドメインのＮ末端の１８アミノ酸残基配列である。プロペプチドは、ビタミンＫ依存性ガンマカルボキシラーゼを結合して、次に内因性プロテアーゼ、たいていは、フューリンまたはＰＣＳＫ３としても公知である、ＰＡＣＥ（対合塩基性アミノ酸切断酵素）によってＦＩＸの前駆体ポリペプチドから切断される。Ｇｌａドメインは、ガンマカルボキシル化がないと、カルシウムを結合してタンパク質を負に荷電したリン脂質表面に固定するために必要な正しい高次構造を取ることができず、これにより第ＩＸ因子は機能しなくなる。Ｇｌａドメインが、カルボキシル化されている場合でも正しく機能するためにプロペプチドの切断に依存するのは、残存するプロペプチドがカルシウムおよびリン脂質への最適な結合に必要なＧｌａドメインの高次構造変化を妨害するためである。得られた成熟第ＩＸ因子は、おおよそ１７重量％の炭水化物を含有する４１５アミノ酸残基の単鎖タンパク質である（Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ａ．Ｅ．ら（２００３）Ｔｒｅｎｄｓ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｍｅｄ，１３：３９）。
成熟ＦＩＸは、第ＩＸａ因子を産するために、活性化された第ＸＩ因子によって活性化される必要がある。凝固カスケードの内因性経路において、ＦＩＸは活性化された第ＶＩＩＩ因子、第Ｘ因子、カルシウム、およびリン脂質の複合体と会合する。複合体において、ＦＩＸは第Ｘｉａ因子によって活性化される。第ＩＸ因子の活性化は、分子からの活性化ペプチド（Ａｌａ １４６−Ａｒｇ １８０）の２ステップ除去によって達成される。（Ｂａｊａｊら、“Ｈｕｍａｎ ｆａｃｔｏｒ ＩＸ ａｎｄ ｆａｃｔｏｒ ＩＸａ，”ｉｎ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ．１９９３）。第１の切断は、第Ｘｉａ因子または第ＶＩｌａ因子／組織因子のどちらかによってＡｒｇ１４５−Ａｌａ１４６部位にて行われる。第２の律速切断は、Ａｒｇ１８０−Ｖａｌ１８１にて行われる。活性化によって３５残基が除去される。活性化されたヒト第ＩＸ因子は、重鎖および軽鎖のジスルフィド連結ヘテロダイマーとして存在する。第ＩＸa因子は今度は、活性化され
た第ＶＩＩＩ因子と協調して第Ｘ因子を活性化する。あるいは、第ＩＸ因子および第Ｘ因子はどちらも、外因性経路を介して生成した、ａｐｉｄａｔｅｄ組織因子と複合体化された第ＶＩＩａ因子によって活性化することができる。第Ｘａ因子は次に、プロトロンビンはトロンビンに変換され、トロンビンは今度はフィブリノーゲンをフィブリンに変換してクロットを形成する、最終共通経路に関与する。
いくつかの場合において、凝固因子は、第ＩＸ因子、第ＩＸ因子の配列変異体、または第ＩＸ因子部分、たとえば表７の例示的な配列、ならびにその生物学的特性が第ＩＸ因子の活性をもたらす、第ＩＸ因子に実質的に相同である任意のタンパク質またはポリペプチドである。本明細書で使用する場合、「第ＩＸ因子部分」という用語は、たとえば部位特
異的変異誘発によって意図的に、または変異によって偶発的に改変された、少なくともいくらかの第ＩＸ因子活性を保持する第ＩＸ因子配列を生じるタンパク質を包含する。「第ＩＸ因子部分」という用語は、タンパク質のＮ末端またはカルボキシ末端にまたは第ＩＸ因子部分の配列の内部に少なくとも１個の追加のアミノ酸を有する誘導体も包含する。第ＩＸ因子部分の非限定的な例は、以下：第ＩＸ因子；第ＩＸａ因子；第ＩＸ因子の切断版；第ＩＸ因子活性を有するハイブリッドタンパク質および第ＩＸ因子活性を有するペプチドミメティックを包含する。少なくともある程度の第ＩＸ因子活性または活性化の潜在力を保持する上述の任意の生物活性フラグメント、欠失変異体、置換変異体または付加変異体は、第ＩＸ因子配列として働くことができる。
「第ＶＩＩ因子」（ＦＶＩＩ）は、ヒトタンパク質、ならびに活性化された第ＶＩＩ因子の生物活性の少なくとも一部を有するその種および配列変異体を意味する。第ＶＩＩ因子および組換えヒトＦＶＩＩａは、補充凝固因子に対して抑制因子を発達させた血友病患者（第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子が欠損した）における制御不能な出血で使用するために導入されている。第ＶＩＩ因子は、トロンビン、第ＩＸａ因子、第Ｘａ因子または第ＸＩＩａ因子によって第ＦＶＩＩａ因子に活性化され得る。ＦＶＩＩは、Ａｒｇ１５２−Ｉｌｅ１５３における単一ペプチド結合のタンパク質分解によってその活性型の第ＶＩＩａ因子に変換されて、１個のジスルフィド架橋によってひとまとめにされている２本のポリペプチド鎖、Ｎ末端軽鎖（２４ｋＤａ）およびＣ末端重鎖（２８ｋＤａ）の形成をもたらす。他のビタミンＫ依存性凝固因子とは対照的に、これらの他のビタミンＫ依存性凝固因子の活性化の間に切断される活性化ペプチドは、ＦＶＩＩについては、記載されていない。Ａｒｇ１５２−Ｉｌｅ１５３切断部位およびいくつかの下流アミノ酸は、他のビタミンＫ依存性ポリペプチドの活性化切断部位に対する相同性を示している。組換えヒト第ＶＩＩａ因子は、補充凝固因子に対して抑制因子を発達させた血友病患者を包含する、血友病患者（第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子が欠損した）における制御不能な出血の処置に有用性を有する。ＦＶＩＩは、血液凝固第ＶＩＩ因子の代表的な特徴を備えた任意の形態の第ＶＩＩ因子分子であるものとする。ＦＶＩＩは、血漿からのＦＶＩＩおよびたとえばＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａの欠損によって引き起こされた患者の出血障害を改善することができる任意の形態の組換えＦＶＩＩを包含するものとする。いくつかの実施形態において、ＦＶＩＩペプチドは、表７の配列を包含する、本明細書に記載するＦＶＩＩペプチドの任意の活性型（ＦＶＩＩａ）、構造類似体またはペプチドミメティックである。第ＶＩＩ因子および第ＶＩＩａ因子は、ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．６，８０６，０６３およびＵＳ
Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．２００８０２６１８８６に記載されるようにクローニングされている。
一態様において、本発明は、キメラ分子を生成するためにＸＴＥＮに共有結合的に連結された、表７のＦＩＸ配列を包含する、ＦＩＸの全長配列、または活性フラグメント、または配列変異体、または任意の生物活性誘導体を含むＦＩＸの単量体ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質を提供する。いくつかの場合において、ＦＩＸなどの凝固因子を含む融合タンパク質は、１個以上のタンパク質分解切断部位配列をさらに含む。別の実施形態において、融合タンパク質は第１および第２の異なる切断配列を含む。上述の実施形態において、切断配列（複数可）は表１０から選択される。ＸＴＥＮの存在によってＦＩＸ活性化形態（以下「ＦＩＸａ」）へのＦＩＸの活性化が抑制される場合には（たとえばＸＴＥＮはＦＩＸのＣ末端に付着されている場合）、以下でさらに十分に記載するように、プロテアーゼによって作用を受けたときに１個以上のタンパク質分解切断部位がＸＴＥＮ配列の放出を可能にする。上述の特色において、無傷のＦＩＸ−ＸＴＥＮ組成物はプロドラッグとして働き、タンパク質分解によるＦＩＸ−ＸＴＥＮ分子からのＸＴＥＮの放出が、放出されたＦＩＸ配列のＦＩＸａへの変換を可能にする。一実施形態において、１個以上の切断配列は、表１０からの配列に対して少なくとも約８０％の配列同一性を、または表１０からの配列に対して少なくとも約８５％の、または少なくとも約９０％の、または少なくとも約
９５％の、または少なくとも約９６％の、または少なくとも約９７％の、または少なくとも約９８％の、または少なくとも約９９％の、または１００％の配列同一性を有する配列であることができる。
ＦＩＸ−ＸＴＥＮ融合タンパク質は、異なる配置で設計することができる。図３７Ａに例証されるような一実施形態において、融合タンパク質は以下の順序（Ｎ→Ｃ末端）で構成要素：ＦＩＸ；およびＸＴＥＮを含み、該ＸＴＥＮは、ＸＴＥＮ配列の内部に切断配列を含み得る。図３７Ｂに例証されるような別の実施形態において、融合タンパク質は、以下の順序（Ｎ→Ｃ末端）で構成要素：ＦＩＸ；切断配列；およびＸＴＥＮを含む。いくつかの場合において、図３７Ｃおよび３７Ｄに例証されるように、融合タンパク質は、ＸＴＥＮがＦＩＸドメインの間に挿入されてＦＩＸポリペプチドの内部に位置する構成要素を含む。一実施形態において、図３７Ｃに示すように、ＸＴＥＮのＮ末端はＦＩＸ Ｇ１ａドメインのＣ末端に連結され、ＸＴＥＮのＣ末端はＦＩＸのＥＧＦ１ドメインのＮ末端に連結されて、追加の切断配列が導入されていないＦＩＸ−ＸＴＥＮを生じる。別の実施形態において、図３７Ｃに示すように、ＸＴＥＮのＮ末端はＦＩＸ ＥＧＦ１ドメインのＣ末端に連結され、ＸＴＥＮのＣ末端はＦＩＸのＥＧＦ２ドメインのＮ末端に連結されて、追加の切断配列が導入されていないＦＩＸ−ＸＴＥＮを生じる。第ＩＸ因子配列がＰＤＶＤＹＶＮＳＴＥＡＥＴＩＬＤＮＩＴＱＳＴＱＳＦＮＤＦ（配列番号１７４８）配列を含む活性化ペプチドドメインを含む別の実施形態において、ＸＴＥＮ配列のＮ末端およびＣ末端は、活性化ペプチドドメイン配列の任意の２個の連続アミノ酸または任意の２個の非連続アミノ酸の間に挿入され、そして活性化ペプチドドメイン配列の任意の２個の連続アミノ酸または任意の２個の非連続アミノ酸に連結することができ、該ＸＴＥＮは場合により、同一であり得るまたは異なり得る第１および第２の切断配列を両方含む。上述の別の実施形態において、ＸＴＥＮは、ＸＴＥＮのＮ末端がＴアミノ酸のＣ末端に連結され、ＸＴＥＮのＣ末端がＩアミノ酸のＮ末端に連結されている、上述の配列の連続するＴおよびＩアミノ酸の間に挿入することができる。
図３７Ｅに例証されるような別の実施形態において、融合タンパク質は、２個のＸＴＥＮ分子：上述のようにＦＩＸの２個のドメイン間に位置する第１のＸＴＥＮ、および第２のＸＴＥＮであって、ＸＴＥＮのＮ末端がＦＩＸのＣ末端に連結され、または第２のＸＴＥＮのＮ末端が、ＦＩＸのＣ末端に連結されている切断配列のＣ末端に連結されている、第２のＸＴＥＮを含む。
図３７Ｆに例証されるような他の場合において、ＦＩＸ−ＸＴＥＮ融合タンパク質は、ＸＴＥＮがＦＩＸドメインの配列内に位置して、既存の構造ループの一部としてドメインに挿入されるか、またはドメイン構造物の外部にループを生成する構成要素を含む。ＦＩＸが、ＫＮＳＡＤＮＫ（配列番号１７４９）ループを含むＥＧＦ２ドメインを含む一実施形態において、ＸＴＥＮ配列は、ＸＴＥＮのＮ末端がＳのＣ末端に連結され、ＸＴＥＮのＣ末端がＡのＮ末端に連結されたループ配列のＳアミノ酸とＡアミノ酸の間に挿入されて、ＸＴＥＮポリペプチドが球状凝固タンパク質の外側に延長するループ配列が生じ、該ＸＴＥＮは（場合により）、同一であり得るまたは異なり得る第１および第２の切断配列の両方を含む。別の実施形態において、ＸＴＥＮは、ＫＮＳＡＤＮＫループ配列の任意の２個の連続または非連続アミノ酸の間に挿入されることができる。ＦＩＸが、ＬＡＥＮループを含むＥＧＦ２ドメインを含む別の実施形態において、ＸＴＥＮ配列はＬＥＡＮループの連続するＡアミノ酸とＥアミノ酸との間に挿入されることができ、ＸＴＥＮのＮ末端がＡのＣ末端に連結され、ＸＴＥＮのＣ末端がＥのＮ末端に連結され、ループ配列ＬＡ−ＸＴＥＮ−ＥＮが生じ、該ＸＴＥＮは（場合により）、同一であり得るまたは異なり得る第１および第２の切断配列の両方を含むことができる。ＦＩＸがＧｌａドメインを含む別の実施形態において、ＸＴＥＮは、ＸＴＥＮがループ構造物を形成するＧｌａ配列の２個の連続アミノ酸の間に挿入および連結されることができ、該ループ構造物はＧｌａ構造物の
実質的に外部であり、該ＸＴＥＮは（場合により）、同じであり得るまたは異なり得る第１および第２の切断配列の両方を含むことができる。ＦＩＸがＥＧＦ１ドメインを含む別の実施形態において、ＸＴＥＮは、ＸＴＥＮがループ構造物を形成するＥＧＦ１配列の２個の連続アミノ酸の間に挿入および連結されることができ、該ループ構造物はＥＧＦ１構造物の実質的に外部であり、該ＸＴＥＮは（場合により）同じであり得るまたは異なり得る第１および第２の切断配列の両方を含むことができる。
図３７Ｇに例証されるような別の実施形態において、融合タンパク質は、ＦＩＸ；およびＸＴＥＮの順序で構成要素を含み、該ＸＴＥＮは、ＸＴＥＮのＮ末端付近に、好ましくはＸＴＥＮの最初の１４４アミノ酸残基内に、さらに好ましくはＸＴＥＮ配列のＮ末端の最初の約８０アミノ酸内に、さらに好ましくはＸＴＥＮ配列のＮ末端の最初の約４２アミノ酸内に、さらに好ましくはＸＴＥＮ配列のＮ末端の最初の約１８アミノ酸内に、およびなおさらに好ましくはＸＴＥＮ配列のＮ末端の最初の１２アミノ酸内に、複数の切断配列を含む。
他の実施形態において、ＦＩＸ−ＸＴＥＮは、配置（Ｎ→Ｃ末端）ＸＴＥＮ−ＦＩＸで、あるいはＸＴＥＮ−ＦＩＸ−ＸＴＥＮで、あるいはＸＴＥＮ−ＣＳ−ＦＩＸで、あるいはＦＩＸ−ＸＴＥＮ−ＦＩＸで、あるいはＦＩＸ−ＣＳ−ＸＴＥＮ−ＣＳ−ＸＴＥＮで、または上述のマルチマーで存在することができる。
一実施形態において、ＦＩＸ−ＸＴＥＮは、ＦＩＸ−ＸＴＥＮ組成物のＦＩＸを、ＸＴＥＮの一部または全部を放出させずに凝固プロテアーゼによってＦＩＸａに活性化できるように構成される。ＦＩＸ−ＸＴＥＮが少なくとも２個のＸＴＥＮを含む別の実施形態において、ＦＩＸ−ＸＴＥＮは、ＦＩＸ−ＸＴＥＮ組成物のＦＩＸを、ＸＴＥＮの１個を放出させずに凝固プロテアーゼによってＦＩＸａに活性化できるように構成される。ＦＩＸのＦＩＸａへの活性化前、またはＦＩＸのＦＩＸａへの活性化と同時のどちらかにおいてＸＴＥＮがＦＩＸ−ＸＴＥＮから放出される別の実施形態において、任意の残存するＸＴＥＮまたは切断配列残基がＦＩＸの活性化を認められるほどには妨害せず、またプロテアーゼへの十分なアクセスを提供して対応する切断配列の切断に作用するように、切断配列はＦＩＸの任意の部分に連結されたＸＴＥＮの端に十分に接近して位置する。ＸＴＥＮがＦＩＸのＣ末端に連結されている（上記のように）一実施形態において、１個以上の切断部位は、ＸＴＥＮのＮ末端の最初の約１００アミノ酸以内に、さらに好ましくはＸＴＥＮのＮ末端の最初の８０アミノ酸以内に、さらに好ましくはＸＴＥＮのＮ末端の最初の５４アミノ酸以内に、さらに好ましくはＸＴＥＮのＮ末端の最初の４２アミノ酸以内に、さらに好ましくはＸＴＥＮのＮ末端の最初の３０アミノ酸以内に、さらに好ましくはＸＴＥＮのＮ末端の最初の１８アミノ酸以内に、および最も好ましくはＸＴＥＮのＮ末端の最初の６アミノ酸以内に位置することができる。２個のＦＩＸドメインの間かもしくはＦＩＸドメインの外部ループ内かまたはドメイン配列の内部のいずれかで、ＸＴＥＮがＦＩＸ配列の内部へ連結されている（上記のように）別の実施形態において、ＸＴＥＮは、少なくとも１個の切断部位がＸＴＥＮのＮ末端の最初の約１００アミノ酸以内に、ＸＴＥＮのＮ末端の８０アミノ酸以内に、ＸＴＥＮのＮ末端の５４アミノ酸以内に、ＸＴＥＮのＮ末端の４２アミノ酸以内に、ＸＴＥＮのＮ末端の３０アミノ酸以内に、ＸＴＥＮのＮ末端の１８アミノ酸以内に、またはＸＴＥＮのＮ末端の６アミノ酸以内に位置することができる２個以上の切断配列を含むことができ、ＸＴＥＮは、ＸＴＥＮのＣ末端の最後の１００アミノ酸以内に、ＸＴＥＮのＣ末端の８０アミノ酸以内に、ＸＴＥＮのＣ末端の５４アミノ酸以内に、ＸＴＥＮのＣ末端の４２アミノ酸以内に、ＸＴＥＮのＣ末端の３０アミノ酸以内に、ＸＴＥＮのＣ末端の１８アミノ酸以内に、またはＸＴＥＮのＣ末端の６アミノ酸以内に位置する少なくとも第２の切断部位を含むことができる。
いくつかの場合において、融合タンパク質のプロテアーゼ切断によって、続いてＦＩＸ
配列を活性化できるように、被験体においてＦＩＸ配列からＸＴＥＮが放出される。他の場合において、融合タンパク質のプロテアーゼ切断は、ＦＩＸのＦＩＸａへのプロセシングおよび活性化と同時にＸＴＥＮが放出されるような、凝固カスケードのプロテアーゼの作用の結果である。それゆえいくつかの実施形態の特定の特色において、ＦＩＸ−ＸＴＥＮ融合タンパク質のＸＴＥＮおよび関連付けられている切断部位（複数可）は、ＸＴＥＮがタンパク質分解切断によって融合タンパク質から放出されるまでＦＩＸ配列が活性化されないように、位置することができる。このような実施形態において、ＦＩＸ−ＸＴＥＮは、一旦被験体に投与されると、活性化されることができるプロドラッグとして使用することができる。一実施形態において、特にＦＩＸ−ＸＴＥＮが２個のＸＴＥＮ配列を含むときに、放出されたＦＩＸポリペプチドはＸＴＥＮの全部または一部を含有することができる。あるいは、放出されたＦＩＸポリペプチドはＸＴＥＮを、またはＸＴＥＮの実質的にすべてを含まないことができる。
他の実施形態において、切断部位は融合タンパク質の合成手順の間に使用される。たとえば融合タンパク質は、組換え産生後の融合タンパク質の単離のために親和性タグをさらに含有することができる。融合タンパク質の切断部位を認識するプロテアーゼはタグを除去して、それによりＸＴＥＮに連結されたＦＩＸである最終生成物をもたらすことができる。
それゆえ融合タンパク質は切断部位を有することができ、該切断部位は、注射前、注射後（プロテアーゼによって血液循環または組織で）に切断することができ、ＸＴＥＮが内因性プロテアーゼによって放出されるまで治療生成物と共にとどまって、治療生成物を凝固カスケードによって活性化させるか、またはＸＴＥＮが凝固カスケードのプロテアーゼによって放出されるかのどちらかとなるように位置することができる。
いくつかの実施形態において、ＦＩＸの融合タンパク質は、循環中または体組織内もしくは体腔内のいずれかにおいて、部位特異的プロテアーゼによって不活性タンパク質から活性タンパク質（たとえばＦＩＸａ）に変換される。この切断は、薬学的活性ドメイン（プロドラッグ活性化）の有効性の増加を誘発し得るか、または切断生成物のその標的への結合を増強し得る。そのためたとえばＦＩＸ−ＸＴＥＮ融合タンパク質は被験体の血液中で切断されることができ、ＦＩＸ配列は凝固カスケードによって、または本明細書で開示する別のプロテアーゼによって活性化させることができる。ＦＩＸ融合タンパク質の活性形態は、ＸＴＥＮの少なくともフラグメントを含有し得るか、または含有し得ない。ＦＩＸ−ＸＴＥＮプロドラッグ実施形態の特色において、従来のＦＩＸ治療薬と比較してより多い投薬量のＦＩＸ−ＸＴＥＮ組成物が投与され得るのは、活性化可能であるＦＩＸの放出が、切断配列の選択、または活性化可能であるＦＩＸの形態の放出前に切断する必要のある切断部位の数の変更によって制御できるためである。当業者が認めるように、本明細書で開示する切断部位の任意の配列が、タンパク質分解切断の動態を改変して、それによりＦＩＸ放出および続いての活性化の動態に影響を及ぼすために、アミノ酸変形を切断配列に導入することによって改変できる。
本発明は、凝固タンパク質およびＸＴＥＮを含む．ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質を提供する。いくつかの場合において、ＢＰＸＴＥＮは、表７から選択される凝固タンパク質に対して、少なくとも約８０％の配列同一性を、またはあるいは８１％の、８２％の、８３％の、８４％の、８５％の、８６％の、８７％の、８８％の、８９％の、９０％の、９１％の、９２％の、９３％の、９４％の、９５％の、９６％の、９７％の、９８％の、９９％、もしくは１００％の配列同一性を示す凝固タンパク質を含む。上述の一実施形態において、ＢＰＸＴＥＮは、表２から選択されるＸＴＥＮに対して、少なくとも約８０％の配列同一性を、またはあるいは８１％の、８２％の、８３％の、８４％の、８５％の、８６％の、８７％の、８８％の、８９％の、９０％の、９１％の、９２％の、９３％の、９４
％の、９５％の、９６％の、９７％の、９８％の、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＸＴＥＮ配列をさらに含む。別の実施形態において、ＢＰＸＴＥＮは、表４３から選択される配列に対して、少なくとも約８０％の配列同一性を、またはあるいは８１％の、８２％の、８３％の、８４％の、８５％の、８６％の、８７％の、８８％の、８９％の、９０％の、９１％の、９２％の、９３％の、９４％の、９５％の、９６％の、９７％の、９８％の、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有する配列を含む。本発明は、表７からの任意のＦＩＸ配列の、表２からの任意のＸＴＥＮの、および表１０からの任意の切断配列の、表４３のそれぞれの構成要素、または上述したものに対して少なくとも９０％配列同一性を有する配列に代えての置換も意図する。
別の実施形態において、ＢＰＸＴＥＮ凝固タンパク質は表７のＦＶＩＩ配列であり、ＸＴＥＮはＡＥ８６４およびＡＭ８７５から選択される。上述の一実施形態において、ＢＰＸＴＥＮはＮ→Ｃ末端配置のＦＶＩＩ−ＡＥ８６４を含む。別の実施形態において、ＢＰＸＴＥＮは、Ｎ→Ｃ末端でＦＶＩＩ−ＡＭ８７５として構成される。別の実施形態において、構成されたＢＰＸＴＥＮは、少なくとも約７０％、または８０％、または９０％、または少なくとも約９５％以上が活性化ＦＶＩＩａ形態である、ＦＶＩＩを含む。別の実施形態において、ＦＶＩＩおよびＸＴＥＮを含むＢＰＸＴＥＮは、表１０から選択される配列を包含し得る、切断配列をさらに含むことができる。
（ｄ）成長ホルモンタンパク質
「成長ホルモン」または「ＧＨ」は、ヒト成長ホルモンタンパク質ならびにその種および配列変異体を意味して、これに限定されるわけではないが、ＧＨの１９１単鎖アミノ酸ヒト配列を包含する。それゆえＧＨは、天然の全長タンパク質であることができるか、または天然タンパク質の生物活性の少なくとも一部を保持する切断フラグメントもしくは配列変異体であることができる。体の組織に対するＧＨの効果は概して、同化作用として説明される。他の大半のタンパク質ホルモンと同様に、ＧＨは、成長ホルモン受容体と呼ばれる特異的原形質膜受容体と相互作用することによって働く。下垂体に由来する公知の２種類のヒトＧＨ（以下「ｈＧＨ」）：約２２，０００ダルトンの分子量を有するｈＧＨ（２２ｋＤ ｈＧＨ）および約２０，０００ダルトンの分子量を有するｈＧＨ（２０ｋＤ
ｈＧＨ）が存在する。２０ｋＤＨＧＨは、２２ｋＤ ｈＧＨの３２番目から４６番目の１５アミノ酸残基が消失していることを除いて、１９１アミノ酸から成る２２ｋＤ ｈＧＨのアミノ酸配列に一致するアミノ酸配列を有する。いくつかの報告は、２０ｋＤ ｈＧＨが２２ｋＤ ｈＧＨよりも低いリスクおよび高い活性を示すことが見出されたことを示している。本発明は、本明細書のＢＰＸＴＥＮ組成物の生物活性ポリペプチドとして使用するのに適切である２０ｋＤ ｈＧＨの使用も意図する。
本発明は、たとえば霊長類、哺乳動物（家畜を包含する）由来の天然配列変異体である任意のＧＨ相同配列、配列フラグメント、ならびにＧＨの生物活性もしくは生物機能の少なくとも一部を保持するＧＨおよび／またはＧＨ関連疾患、欠損、障害また症状を防止、処置、媒介、もしくは改善するのに有用である非天然配列変異体の、ＢＰＸＴＥＮへの包含を意図する。非哺乳動物ＧＨ配列は文献に十分に記載されている。たとえば魚類ＧＨの配列アラインメントは、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２００３ ２６ ｐ．２９５−３００に見出すことができる。トリＧＨ配列の進化の解析は、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２００６
１９ｐ．８４４−８５４に表示されている。さらにヒトＧＨに相同性の天然配列は、標準相同性検索技法、たとえばＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴによって見出され得る。
一実施形態において、主題の組成物に組み入れられたＧＨは、自然界で見出されるタンパク質に一致する配列を有する組換えポリペプチドであることができる。別の実施形態において、ＧＨは、天然ＧＨの生物活性の少なくとも一部を保持する天然配列の配列変異体
、フラグメント、ホモログ、またはミメティックであることができる。表８は、本発明のＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質に含まれる多種多様の哺乳類種からのＧＨの非限定的な配列のリストを提供する。これらのＧＨ配列または種もしくはファミリ間の個々の変異を組み替える（ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ ）ことによって構築された相同誘導体のいずれも、本発明の融合タンパク質に有用であり得る。ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質に組み入れることができるＧＨは、表８から選択されるタンパク質配列に対して、少なくとも約８０％の配列同一性を、またはあるいは８１％の、８２％の、８３％の、８４％の、８５％の、８６％の、８７％の、８８％の、８９％の、９０％の、９１％の、９２％の、９３％の、９４％の、９５％の、９６％の、９７％の、９８％の、９９％、もしくは１００％の配列同一性を示すタンパク質を包含することができる。
Figure 2017031218
Figure 2017031218
Figure 2017031218
ＩＶ）ＢＰＸＴＥＮ構造物配置および特性
主題の組成物のＢＰは、天然の全長ポリペプチドに限定されないが、組換えポリペプチドならびにその生物活性変異体またはフラグメントおよび／または薬理活性変異体またはフラグメントも包含する。たとえば、各種のアミノ酸置換がＧＰにて行われて、ＢＰの生物活性または薬理特性に関して、本発明の精神から逸脱することなく変異体を生成できることが認められる。ポリペプチド配列中のアミノ酸の保存的置換の例を表９に示す。しかし、本明細書で開示する特異的配列と比較して、ＢＰの配列同一性が１００％未満であるＢＰＸＴＥＮの実施形態において、本発明は、隣接アミノ酸残基を包含する、ＢＰの配列内の任意の位置であり得る、他の１９の天然Ｌ−アミノ酸のいずれかによる所与のＢＰの所与のアミノ酸残基の置換を意図する。任意の１個の置換によって生物活性の所望でない変化が生じた場合、次に、本明細書に記載する方法によって、またはその内容が全体として参照により組み入れられている、たとえばＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，３６４，９３４に記載された保存的および非保存的変異の技法およびガイドラインのいずれかを使用して、または当業者に概して公知の方法を使用して、代わりのアミノ酸１個を用いて、構築物を評価することができる。さらに、変異体はたとえば、天然ペプチドの生物活性の少なくとも一部を保持する、１個以上のアミノ酸残基がＢＰの全長天然アミノ酸配列のＮ末端またはＣ末端にて付加または欠失されたポリペプチドも包含することができる。
Figure 2017031218
（ａ）ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質配置
本発明は、グルコース恒常性、インスリン抵抗性、または肥満に関連する疾患、障害または状態を防止、処置、媒介、または改善するのに有用な、１個以上のＸＴＥＮポリペプ
チドに連結されたＢＰを含むＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質組成物を提供する。いくつかの場合において、ＢＰＸＴＥＮは、１個以上のＸＴＥＮポリペプチドに連結されたＢＰを有する単量体融合タンパク質である。他の場合において、ＢＰＸＴＥＮ組成物は、１個以上のＸＴＥＮポリペプチドに連結された２個のＢＰ分子を含むことができる。本発明は、これに限定されるわけではないが、表３〜８より選択されたＢＰ（またはそのフラグメントもしくは配列変異体）、および表２より選択されたＸＴＥＮまたはその配列変異体を含むＢＰＸＴＥＮを意図する。いくつかの場合において、それぞれのＢＰの生物活性の少なくとも一部は無傷のＢＰＸＴＥＮによって保持される。他の場合において、ＢＰ構成要素は、以下でさらに十分に記載するように、スペーサ配列に組み入れられた必要に応じた切断配列の切断によるＸＴＥＮのＢＰＸＴＥＮへのその放出の際に、生物活性となるか、または活性の増加を有するかのどちらかである。
ＢＰＸＴＥＮ組成物の一実施形態において、本発明は式Ｉの融合タンパク質を提供する：
（ＢＰ）−（Ｓ）ｘ−（ＸＴＥＮ） Ｉ
式中、各出現について、独立して、ＢＰは本明細書で上記のような生物活性タンパク質であり；Ｓは、（以下でさらに十分に記載するような）切断配列を場合により包含することができる１〜約５０のアミノ酸残基を有するスペーサ配列であり；ｘは０または１のどちらかであり；およびＸＴＥＮは本明細書で上記のような延長組換えポリペプチドである。該実施形態は、ＢＰが所望の生物活性のために遊離Ｎ末端を必要とする、またはＢＰのＣ末端の融合タンパク質への連結によって生物活性が低下して、投与したＢＰＸＴＥＮの生物活性および／または副作用を低下させることが所望である、特別の有用性を有する。
ＢＰＸＴＥＮ組成物の別の実施形態において、本発明は式ＩＩの融合タンパク質（上記の構成要素）を提供する：
（ＸＴＥＮ）−（Ｓ）ｘ−（ＢＰ） ＩＩ
式中、各出現について、独立して、ＢＰは本明細書で上記のような生物活性タンパク質であり；Ｓは、（以下でさらに十分に記載するような）切断配列を場合により包含することができる１〜約５０のアミノ酸残基を有するスペーサ配列であり；ｘは０または１のどちらかであり；およびＸＴＥＮは本明細書で上記のような延長組換えポリペプチドである。該実施形態は、ＢＰが所望の生物活性のために遊離Ｃ末端を必要とする場合に、またはＢＰのＮ末端の融合タンパク質への連結によって生物活性が低下して、投与したＢＰＸＴＥＮの生物活性および／または副作用を低下させることが所望である場合に、特定の有用性を有する。
それゆえ単一のＢＰおよび単一のＸＴＥＮを有するＢＰＸＴＥＮは、Ｎ→Ｃ末端方向でそれぞれ挙げられた、少なくとも以下の配置の順列を有することができる：ＢＰ−ＸＴＥＮ；ＸＴＥＮ−ＢＰ；ＢＰ−Ｓ−ＸＴＥＮ；またはＸＴＥＮ−Ｓ−ＢＰ。
別の実施形態において、本発明は単離融合タンパク質を提供し、該融合タンパク質は式ＩＩＩの融合タンパク質であり：
（ＢＰ）−（Ｓ）ｘ−（ＸＴＥＮ）−（Ｓ）ｙ−（ＢＰ）−（Ｓ）ｚ−（ＸＴＥＮ）ｚ ＩＩＩ
式中、各出現について、独立して、ＢＰは本明細書で上記のような生物活性タンパク質であり；Ｓは、（以下でさらに十分に記載するような）切断配列を場合により包含することができる１〜約５０のアミノ酸残基を有するスペーサ配列であり；ｘは０または１のどちらかであり；ｙは０または１のどちらかであり；ｚは０または１のどちらかであり；およびＸＴＥＮは本明細書で上記のような延長組換えポリペプチドである。
別の実施形態において，本発明は単離融合タンパク質を提供し、該融合タンパク質は式
ＩＶの融合タンパク質（上記のような構成要素）である：
（ＸＴＥＮ）ｘ−（Ｓ）ｙ−（ＢＰ）−（Ｓ）ｚ−（ＸＴＥＮ）−（ＢＰ） ＩＶ 別の実施形態において、本発明は単離融合タンパク質を提供し、該融合タンパク質は式Ｖの融合タンパク質（上記のような構成要素）である：
（ＢＰ）ｘ−（Ｓ）ｘ−（ＢＰ）−（Ｓ）ｙ−（ＸＴＥＮ） Ｖ
別の実施形態において、本発明は単離融合タンパク質を提供し、該融合タンパク質は式ＶＩの融合タンパク質（上記のような構成要素）である：
（ＸＴＥＮ）−（Ｓ）ｘ−（ＢＰ）−（Ｓ）ｙ−（ＢＰ） ＶＩ
別の実施形態において、本発明は単離融合タンパク質を提供し、該融合タンパク質は式ＶＩＩの融合タンパク質（上記のような構成要素）である：
（ＸＴＥＮ）−（Ｓ）ｘ−（ＢＰ）−（Ｓ）ｙ−（ＢＰ）−（ＸＴＥＮ） ＶＩＩ
式Ｉ〜ＶＩＩの融合タンパク質の上述の実施形態において、実施形態の治療的有効用量の融合タンパク質のそれを必要とする被験体への投与によって、ＸＴＥＮに連結されておらず、同程度の用量で被験体に投与された対応するＢＰと比較して、少なくとも２倍、または少なくとも３倍、または少なくとも４倍、または少なくとも５倍以上の、治療ウインドウ内で費やされる時間の増大をもたらすことができる。
いずれのスペーサ配列基も、本発明に含まれる融合タンパク質において任意選択である。スペーサは、宿主細胞からの融合タンパク質の発現を増強するために、またはＢＰ構成要素がその所望の３次構造を取り得るおよび／もしくはその標的分子と適切に相互作用し得るように立体障害を減少させるために提供され得る。スペーサおよび所望のスペーサを同定する方法については、たとえば参照により詳細に本明細書に組み入れられている、Ｇｅｏｒｇｅら（２００３）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １５：８７１−８７９を参照。一実施形態において、スペーサは、長さが１〜５０アミノ酸残基、または長さが約１〜２５残基、もしくは約１〜１０残基である１個以上のペプチド配列を含む。スペーサ配列は、切断部位を除いて、２０種類の天然Ｌアミノ酸のいずれかを含むことができ、これに限定されるわけではないが、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）およびプロリン（Ｐ）を包含することができる、立体障害のない親水性アミノ酸を含む。いくつかの場合において、スペーサはポリグリシンまたはポリアラニンであることができ、または主としてグリシン残基アラニン残基の組み合わせの混合物である。切断配列を除くスペーサポリペプチドは、大部分から実質的に２次構造が存在しない。一実施形態において、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質組成物の一方または両方のスペーサ配列はそれぞれ、同一であり得るまたは異なり得る切断配列をさらに含有し得て、該切断配列は融合タンパク質においてプロテアーゼによる作用を受けて、融合タンパク質からＢＰを放出し得る。
いくつかの場合において、ＢＰＸＴＥＮへの切断配列の組み入れは、ＸＴＥＮからのＢＰの放出の際に活性にまたはより活性になるＢＰの放出を可能にするように設計される。切断後にＢＰに付着しているいずれの残存残基もＢＰの活性（たとえば受容体への結合）を認められるほどには妨害しないが、プロテアーゼへの十分なアクセスを提供して切断配列の切断を行うように、切断配列はＢＰ配列に十分接近して、概してＢＰ配列末端の１８アミノ酸以内に、または１２アミノ酸以内に、または６アミノ酸以内に、または２アミノ酸以内に位置する。いくつかの実施形態において、ＢＰＸＴＥＮが被験体への投与後に切断できるように、切断部位は、哺乳動物被験体に内因性のプロテアーゼによって切断できる配列である。このような場合、ＢＰＸＴＥＸはプロドラッグまたはＢＰの循環デポーとして働くことができる。本発明で意図される切断部位の例は、これに限定されるわけではないが、ＦＸＩａ、ＦＸＩＩａ、カリクレイン、ＦＶＩＩａ、ＦＩＸａ、ＦＸａ、ＦＩＩａ（トロンビン）、エラスターゼ−２、グランザイムＢ、ＭＭＰ−１２、ＭＭＰ−１３、ＭＭＰ−１７もしくはＭＭＰ−２０から選択される哺乳動物内因性プロテアーゼによって、または非哺乳動物プロテアーゼ、たとえばＴＥＶ、エンテロキナーゼ、ＰｒｅＳｃｉｓ
ｓｉｏｎ（商標）プロテアーゼ（ライノウイルス３Ｃプロテアーゼ）およびソルターゼＡによって切断できるポリペプチド配列を包含する。上述のプロテアーゼによって切断されることが知られている配列は、当分野で公知である。例示的な切断配列および配列内のカット部位を配列変異体と共に表１０に表示する。たとえばトロンビン（活性化凝固第ＩＩ因子）は、配列の４位のアルギニンの後でカットされる、配列ＬＴＰＲＳＬＬＶ（配列番号２２２）に作用する［Ｒａｗｌｉｎｇｓ Ｎ．Ｄ．ら（２００８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３６：Ｄ３２０］。活性ＦＩＩａは、リン脂質およびカルシウムの存在下でのＦＸａによるＦＩＩの切断によって産生され、凝固経路の第ＩＸ因子から下流にある。いったん活性化されると、凝固におけるその天然の役割はフィブリノーゲンを切断することであり、これにより次に、今度はクロット形成が開始する。ＦＩＩａ活性は厳重に制御され、適正な止血のために凝固が必要なときにのみ出現する。しかし凝固は、ＢＰＸＴＥＮのＢＰとＸＴＥＮとの間への、ＬＴＰＲＳＬＬＶ（配列番号２２３）配列の組み入れによる、哺乳動物における進行中のプロセスであるため、ＸＴＥＮドメインは、凝固が生理的に必要とされるときに外因性または内因性のどちらかの凝固経路の活性化と同時に、隣のＢＰから除去されて、それにより経時的にＢＰが放出される。同様に、内因性プロテアーゼによる作用を受けるＢＰＸＴＥＮへの他の配列の組み入れは、特定の場合には、より高度の活性をＢＰＸＴＥＮの「プロドラッグ」形態からのＢＰに提供し得る、ＢＰの持続放出を提供する。
いくつかの場合において、カット部位の両側にフランキングするわずか２または３のアミノ酸（合計４〜６アミノ酸）が切断配列に組み入れられる。他の場合において、公知の切断配列は、１個以上の欠失もしくは挿入を有し得るかまたは公知の配列任意の１個もしくは２個もしくは３個のアミノ酸に代えての１個もしくは２個もしくは３個のアミノ酸による置換を有することができ、欠失、挿入または置換は、プロテアーゼに対する感受性の非存在ではなく、感受性の低下または増強を生じて、ＸＴＥＮからのＢＰの放出速度を適応させる能力を生じる。例示的な置換を表１０に示す。
Figure 2017031218
一実施形態において、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質に組み入れられたＢＰは、表３〜８からの配列に対して少なくとも約８０％配列同一性を、あるいは表３〜８からの配列と比較して少なくとも約８１％の、または約８２％の、または約８３％の、または約８４％の、または約８５％の、または約８６％の、または約８７％の、または約８８％の、または約８９％の、または約９０％の、または約９１％の、または約９２％の、または約９３％の、または約９４％の、または約９５％の、または約９６％の、または約９７％の、または約９８％の、または約９９％の、または約１００％の配列同一性を示す配列を有することができる。上述の実施形態のＢＰは、本明細書に記載するアッセイまたは測定もしくは決定されたパラメータを使用して、活性について評価することができ、対応する天然ＢＰ配列と比較して、少なくとも約４０％の、または約５０％の、または約５５％の、または約６０％の、または約７０％の、または約８０％の、または約９０％の、または約９５％以上の活性を保持する配列は、主題のＢＰＸＴＥＮへの包含に好適と見なされる。好適な活性レベルを保持することが見出されたＢＰは、本明細書で上記の１個以上のＸＴＥＮポリペプチドに連結させることができる。一実施形態において、好適な活性レベルを保持することが見出されたＢＰは、表２からの配列に対して少なくとも約８０％の配列同一性を、あるいは表２の配列と比較して少なくとも約８１％の、８２％の、８３％の、８４％の、８５％の、８６％の、８７％の、８８％の、８９％の、９０％の、９１％の、９２％の、９３％の、９４％の、９５％の、９６％の、９７％の、９８％の、９９％の、または約１００％の配列同一性を有する１個以上のＸＴＥＮポリペプチドに連結させて、キメラ融合タンパク質を生じることができる。
単一のＸＴＥＮに連結された単一のＢＰを含有する融合タンパク質の配列の非限定的な例を表４０、４２、４３、および４４に表示する。一実施形態において、ＢＰＸＴＥＮ組成物は、表４０、４２、４３の、または４４からのＢＰＸＴＥＮに少なくとも約８０％配列同一性を、あるいは表４０、４２、４３、または４４からのＢＰＸＴＥＮと比較して少なくとも約８１％の、８２％の、８３％の、８４％の、８５％の、８６％の、８７％の、８８％の、８９％の、９０％の、９１％の、９２％の、９３％の、９４％の、９５％の、９６％の、９７％の、９８％の、９９％の、または約１００％の配列同一性を有する融合タンパク質を含む。１個以上のＸＴＥＮに連結された同じＢＰの分子２個を含有する融合タンパク質の配列の非限定的な例を表４１に表示するが、本発明は、表２から選択された同じであり得るまたは異なり得る、１個または２個のＸＴＥＮに連結された表３〜８から選択される他のＢＰの置換も意図する。本段落における本明細書で上記の、上述の融合タンパク質において、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質は、表１０からの切断配列をさらに含むことができる；該切断配列は、ＢＰとＸＴＥＮとの間にまたは隣接ＢＰ間に位置する。いくつかの場合において、切断配列を含むＢＰＸＴＥＮは、ＢＰと切断配列との間にまたはＸＴＥＮと切断配列との間に１個以上のスペーサ配列アミノ酸も有し、プロテアーゼのアクセスを促進する；任意の天然アミノ酸を含む該スペーサアミノ酸は、好ましいアミノ酸としてグリシンおよびアラニンを包含する。ＢＰ、ＸＴＥＮ、切断配列（複数可）およびスペーサアミノ酸を含むＢＰＸＴＥＮの非限定的な例を表４２および４３に表示する。しかし、本発明は、表３〜８のＢＰ配列のいずれかによる表４２または４３のＢＰ配列に代えての置換、表２の任意のＸＴＥＮ配列による表４２または４３のＸＴＥＮ配列に代えての置換、および表１０の任意の切断配列による表４２または４３の切断配列に代えての置換も意図する。
（ｂ）ＢＰＸＴＥＮの薬物動態特性
本発明は、本明細書に記載する方法によって組成物に対して決定された用量で使用されるときに、薬理学的効果を生じるが、ＸＴＥＮに連結されていないＢＰの同程度の用量と比較して延長された期間にわたって組成物の生物活性構成要素の安全範囲内になおとどまる循環濃度を達成することができる、ＸＴＥＮに連結されていないＢＰと比較して薬物動態が増強されたＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質を提供する。このような場合、ＢＰＸＴＥＮは、延長された期間にわたって融合タンパク質組成物の治療ウインドウ内に依然として存在する。本明細書で使用する場合、「同程度の用量」は、同程度の様式で被験体に投与される活性ＢＰのファルマコフォアと等価のモル／ｋｇを有する用量を意味する。ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質の「同程度の投薬量」は、薬剤のより大きい重量を表すが、融合タンパク質の用量におけるＢＰの本質的に同じモル当量を有するおよび／またはＢＰに対して同じおおよそのモル濃度を有することが、当分野で理解される。
所与のＸＴＥＮをＢＰに連結することによって増強することができるＢＰの薬物動態特性は、最終半減期、曲線下面積（ＡＵＣ）、Ｃｍａｘ分布容積、および生物学的利用能を包含する。
ＸＴＥＮを含む融合タンパク質の薬物動態特徴に関する実施例でさらに十分に記載するように、ＸＴＥＮ配列の長さの増加が、ＸＴＥＮを含む融合タンパク質の最終半減期の不均衡な増加を与え得ることが驚くべきことに発見された。したがって本発明は、被験体に投与されるＢＰＸＴＥＮ組成物に対する標的とする半減期を提供するようにＸＴＥＮを選択することができる、ＸＴＥＮを含むＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、ＸＴＥＮを含む単量体融合タンパク質を提供し、ここで、ＸＴＥＮが、融合タンパク質に連結されていない対応するＢＰと比較して、投与したＢＰＸＴＥＮの最終半減期において少なくとも約２倍の長さの増加を、または少なくとも約３倍の、または少なくとも約４倍の、または少なくとも約５倍の、または少なくとも約６
倍の、または少なくとも約７倍の、または少なくとも約８倍の、または少なくとも約９倍の、または少なくとも約１０倍の、または少なくとも約１５倍の、または少なくとも２０倍以上の、融合タンパク質に連鎖されていないＢＰと比較した最終半減期の増加を与えるように選択される。同様に、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質は、融合タンパク質に連結されていない対応するＢＰと比較して、少なくとも約５０％のＡＵＣの増加を、または少なくとも約６０％の、または少なくとも約７０％の、または少なくとも約８０％の、または少なくとも約９０％の、または少なくとも約１００％の、または少なくとも約１５０％の、または少なくとも約２００％の、または少なくとも約３００％のＡＵＣの増加を有することができる。ＢＰＸＴＥＮの薬物動態パラメータは、投与量（ｄｏｓｉｎｇ）、時間間隔での血液試料の採取、およびＥＬＩＳＡ、ＨＰＬＣ、放射能定量、または当分野で公知のもしくは本明細書に記載するような他の方法を使用するタンパク質のアッセイを含む標準方法、続いての半減期および他の薬物動態パラメータを導出するデータの標準計算によって決定することができる。
本発明は、切断配列をさらに含み得るスペーサ配列によって場合により離された、または第２のＸＴＥＮ配列によって離された、第１および第２のＢＰ分子を含むＢＰＸＴＥＮをさらに提供する。一実施形態において、ＢＰは、融合タンパク質に連結されていない対応するＢＰと比較して、融合タンパク質に連結されたときにより低い活性を有する。このような場合、図３８に例証されるように、被験体への投与の際にＢＰ構成要素が切断配列（複数可）の切断によって徐々に放出され、その上、ＢＰ構成要素が活性またはその標的受容体もしくはリガンドに結合する能力を回復するように、ＢＰＸＴＥＮを設計することができる。したがって上述のＢＰＸＴＥＮはプロドラッグまたは循環デポーとして働き、融合タンパク質に連結されていないＢＰと比較して、より長い最終半減期を生じる。
（ｃ）ＢＰＸＴＥＮの薬理特性および薬学的特性
本発明は、ＸＴＥＮに連結されていないＢＰと比較して増強された特性を有することができる、ＸＴＥＮに共有結合的に連結されたＢＰを含むＢＰＸＴＥＮ組成物、ならびに組成物の２つのそれぞれのＢＰ構成要素の治療活性または効果および／もしくは生物活性または効果を増強する方法を提供する。さらに本発明は、免疫グロブリンポリペプチドパートナー、より短い長さのポリペプチドおよび／または反復性配列を有するポリペプチドパートナーを含有する当分野で公知の融合タンパク質と比較して、増強された特性を有するＢＰＸＴＥＮ組成物を提供する。さらにＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質は、化学コンジュゲート、たとえばＰＥＧ化構築物に勝る顕著な利点、注目すべきは、生成物の研究および開発段階ならびに製造段階の両方で時間および費用を低下させて、ならびにＰＥＧ化コンジュゲートと比較してＢＰＸＴＥＮの生成物および代謝産物の両方についてより毒性の低い、より均質で明確な生成物を生じることが可能な細菌細胞発現系において、組換えＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質を作製することができるという事実を提供する。
治療剤として、ＢＰＸＴＥＮはたとえば溶解度の増加、熱安定性の増加、免疫原性の低下、見かけの分子量の増加、腎クリアランスの低下、タンパク質分解の低下、代謝の低下、治療効率の増強、有効治療用量の低減、生物学的利用能の増加、ＢＰの治療ウインドウ内で血中濃度を維持する投薬間の時間の増加、「適応された（ｔａｉｌｏｒｅｄ）」吸収速度、凍結乾燥安定性の増強、血清／血漿安定性の増強、最終半減期の増加、血流中での溶解度の増加、中和抗体による結合の減少、受容体媒介クリアランスの低下、副作用の低下、受容体／リガンド結合親和性または受容体／リガンド活性化の保持、分解に対する安定性、凍結−解凍に対する安定性、プロテアーゼに対する安定性、ユビキチン化に対する安定性、投与の容易さ、他の薬学的賦形剤またはキャリアとの適合性、被験体においての残留性、貯蔵安定性の増加（たとえば貯蔵寿命の増加）、生物または環境における毒性の低下などを包含する、ＸＴＥＮを含まない治療剤に勝るいくつかの利点を所有し得る。増強された特性の正味の効果は、ＢＰＸＴＥＮが、代謝性疾患または障害を有する被験体に
投与されたときに、治療効果および／または生物学的効果の増強を生じ得ることである。
ＢＰの薬学的または物理化学特性（たとえば水溶解度または安定性の程度）の増強が所望である他の場合において、第１および第２の融合タンパク質の第１および第２のＸＴＥＮ配列の長さおよび／またはモチーフファミリ組成物は、ＢＰＸＴＥＮ組成物の薬学的特性全体が増強されるように、異なる程度の溶解度および／または安定性をそれぞれの融合タンパク質に与えるようにそれぞれ選択され得る。ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質は、本明細書に記載する方法を使用して構築およびアッセイされて、物理化学特性および所望の特性を生じるために必要に応じて調整されたＸＴＥＮを確認することができる。一実施形態において、ＢＰＸＴＥＮのＸＴＥＮ配列は、融合タンパク質が融合タンパク質に連結されていないＢＰと比較して少なくとも２５％まで大きい、または融合タンパク質に連結されていない対応するＢＰよりも少なくとも約３０％、または少なくとも約４０％、または少なくとも約５０％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約１００％、または少なくとも約２００％、または少なくとも約３００％、または少なくとも約４００％、または少なくとも約５００％、または少なくとも約１０００％大きい水溶解度を有するように選択される。本段落の上で記載した上記の実施形態において、融合タンパク質のＸＴＥＮは、表２から選択されたＸＴＥＮに対して少なくとも約８０％の配列同一性を、または約９０％の、または約９１％の、または約９２％の、または約９３％の、または約９４％の、または約９５％の、または約９６％の、または約９７％の、または約９８％の、または約９９％の、または約１００％の配列同一性を有することができる。
一実施形態において，本発明は、ＸＴＥＮに連結されていない対応するＢＰの同程度の投薬量と比較して、より長期間にわたって治療ウインドウ内にＢＰ構成要素を維持することができるＢＰＸＴＥＮ組成物を提供する。ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質の「同程度の投薬量」は、薬剤のより大きい重量を表すが、融合タンパク質の用量にＢＰの同じおおよそのモル当量を有するおよび／またはＢＰに対して同じおおよそのモル濃度を有することが、当分野で理解される。
本発明は、用量の選択と適合したときに、延長された期間にわたって治療ウインドウ内にＢＰの循環濃度を維持することによって投与された組成物の有効性の増加を可能にする、所望の薬物動態特性を提供するためのコンジュゲーションに適切なＸＴＥＮを選択する方法も提供する。本明細書で使用する場合、「治療ウインドウ」は、許容されない毒性を伴わずに、時間の経過とともに、疾患または症状に対する有効性または所望の薬理学的効果を提供する、血中または血漿濃度範囲としての薬物または生物製剤の量；任意の正の治療効果を達成する最小量と、被験体に対する毒性の直前の応答である（より高い用量または濃度における）応答を生じる最大量との間の循環血中濃度の範囲を意味する。その上、治療ウインドウは概して、時間の側面；許容されない毒性または有害事象を生じない、経時的に所望の薬理学的効果を生じる最大および最小濃度を含む。被験体に対する治療ウインドウ内にとどまっている投薬された組成物は、「安全性範囲」内にあると言うことができる。
用量最適化は、すべての薬物、とりわけ狭い治療ウインドウを有する薬物にとっては重要である。たとえばグルコース恒常性に関与する多くのペプチドは、狭い治療ウインドウを有する。狭い治療ウインドウを有するＢＰ、たとえばグルカゴンまたはグルカゴン類似体では、多種多様の症状を示すすべての患者について標準化された単回用量は、常に有効ということでないこともある。異なるグルコース調節ペプチドは糖尿病被験体の処置で共に使用されることが多いため、それらを共に組み合わせるおよび投薬することによって達成される、それぞれの効果および相互作用効果もまた考慮する必要がある。許容されない毒性を生じ、該毒性を安全性範囲外に置くことになる量と対比してＢＰＸＴＥＮの治療的または薬理学的有効量を決定する目的でのこれらの因子の考慮は、十分に通常の技術を有
する臨床医の範囲内である。
多くの場合において、主題の組成物のＢＰ構成要素の治療ウインドウは確立されており、公開された文献で入手できるか、またはＢＰを含有する承認された生成物の薬物ラベルに明示されている。他の場合において、治療ウインドウを確立することができる。所与の組成物について治療ウインドウを確立する方法は、当業者に公知である（たとえばＧｏｏｄｍａｎ ＆ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，１１ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ（２００５）を参照）。たとえば有効性または所望の薬理学的効果を決定するための標的疾患または障害を有する被験体における用量増加試験を用いることによって、有害事象の出現、および循環血中濃度の決定、所与の被験体または被験体集団の治療ウインドウを、所与の薬物もしくは生物製剤、または生物製剤もしくは薬物の組み合わせについて決定することができる。用量増加試験によって、当分野で公知であるような、または代謝性疾患もしくは障害に関連付けられている１個以上のパラメータについて本明細書で記載するような生理学的または生化学的パラメータ、または観察結果と共に、特定の適応症についての有益な結果に関連する臨床パラメータおよび／または決定されたまたは得られた循環血中濃度を確立する薬物動態パラメータの測定と共に、無作用量、有害事象、最大許容投与量などを決定する測定パラメータを監視する被験体または被験体群での代謝試験を通じて、ＢＰＸＴＥＮの活性を評価することができる。結果は次に、投与された用量および上述の決定されたパラメータまた効果レベルと一致する治療剤の血中濃度と相関させることができる。これらの方法により、一連の用量および血中濃度を最小有効用量ならびに最大用量および所望の効果が出現して、それを超えると毒性が生じる血中濃度と相関させて、これにより投薬された治療薬の治療ウインドウを確立することができる。最大を超える融合タンパク質の（またはＢＰ構成要素によって測定されたような）血中濃度は、治療ウインドウ外または安全性範囲外と見なされる。それゆえ上述の方法により、Ｃｍｉｎ血中濃度が確立され、該Ｃｍｉｎより下ではＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質は所望の薬理学的効果を有さず、許容されない副作用、毒性または有害事象を引き出す濃度に達する前に最高循環濃度を示し、その濃度をＢＰＸＴＥＮの安全範囲外におくＣｍａｘ血中濃度が確立される。このような濃度が確立されると、投薬頻度および投薬量は、ＣｍａｘおよびＣｍｉｎの測定によってさらに精密化されて、融合タンパク質（複数可）を治療ウインドウ内に保つための適切な用量および投薬頻度を提供することができる。当業者は、本明細書で開示する手段によってまたは当分野で公知の他の方法によって、投与されたＢＰＸＴＥＮが所望の間隔にわたって治療ウインドウに残存することを、またはＸＴＥＮの用量もしくは長さもしくは配列の調整を必要とすることを確認することができる。さらにＢＰＸＴＥＮを治療ウインドウ内に保つための適切な用量および用量頻度の決定によって、治療的有効用量レジメン；治療ウインドウ内に残存する連続Ｃｍａｘピークおよび／またはＣｍｉｎトラフを生じる、治療的有効用量の融合タンパク質を使用する、それを必要とする被験体への複数回連続用量の投与のスケジュールが確立され、標的疾患、障害または状態に関係する少なくとも１個の測定されたパラメータの改善が生じる。いくつかの場合において、適切な用量で被験体に投与されたＢＰＸＴＥＮは、ＸＴＥＮに連結されておらず、同程度の用量で投与された対応するＢＰと比較して少なくとも２倍長い期間にわたって；あるいは、ＸＴＥＮに連結されておらず、同程度の用量で投与された対応するＢＰと比較して、少なくとも約３倍長い；あるいは少なくとも約４倍長い；あるいは少なくとも約５倍長い；あるいは少なくとも約６倍長い；あるいは少なくとも約７倍長い；あるいは少なくとも約８倍長い；あるいは少なくとも約９倍長いまたは少なくとも約１０倍以上長い期間にわたって、治療ウインドウ内に残存するＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質の血中濃度を生じ得る。本明細書で使用する場合、「適切な用量」は、被験体に投与したときに所望の治療効果または薬理学的効果ならびに治療ウインドウ内の血中濃度を生じる、薬物または生物製剤の用量を意味する。
一実施形態において、治療的有効用量レジメンで投与されるＢＰＸＴＥＮは、融合タンパク質に連結されておらず、同程度の用量レジメンで被験体に投与される融合タンパク質の対応する生物活性タンパク質と比較して、融合タンパク質の血中濃度の少なくとも２つの連続するＣｍａｘピークおよび／またはＣｍｉｎトラフの間に、少なくとも約３倍長い；あるいは少なくとも約４倍長い；あるいは少なくとも約５倍長い；あるいは少なくとも約６倍長い；あるいは少なくとも約７倍長い；あるいは少なくとも約８倍長い；あるいは少なくとも約９倍長いまたは少なくとも約１０倍長い、時間の増大を生じる。別の実施形態において、治療的有効用量レジメンで投与されるＢＰＸＴＥＮは、融合タンパク質に連結されておらず、ＢＰの治療的有効用量レジメンを使用して被験体に投与される、対応する生物活性タンパク質構成要素（複数可）と比較して、薬学的組成物の融合タンパク質のより低い頻度の投薬またはより少ない総投薬量（モル）を使用する１個、または２個、または３個以上の測定パラメータの類似した改良を生じる。測定パラメータは、本明細書で開示する臨床パラメータ、生化学パラメータ、もしくは生理学的パラメータのいずれか、またはグルコースもしくはインスリン関連障害、代謝性疾患もしくは障害、凝固（ｃｏａｇｕａｔｉｏｎ）もしくは出血障害、または成長ホルモン関連障害を有する被験体を評価するための当分野で公知の他のパラメータを包含し得る。
機能特徴または生物活性および薬理学的活性および生じるパラメータを包含する本発明のＢＰＸＴＥＮ組成物活性は、所望の特徴を測定するための当分野で公知の任意の好適なスクリーニングアッセイによって決定され得る。ＢＰ構成要素を含むＢＰＸＴＥＮポリペプチドの活性および構造物は、本明細書に記載するアッセイ；たとえば表３９から選択される１つ以上のアッセイ、実施例のアッセイによって、または溶解度、構造物および生物活性の保持の程度を解明するための当分野で公知の方法によって測定され得る。結合定数（Ｋｄ）、ＥＣ５０値、ならびにリガンド−受容体複合体の解離のその半減期（Ｔ１／２）を包含する、ＢＰ受容体またはリガンドに対するＢＰＸＴＥＮの結合特徴の決定を可能にするアッセイを行うことができる。結合親和性は、受容体またはリガンドに特異的に結合する能力の変化を検出する競合型結合アッセイによって測定することができる。その上、技法、たとえばフローサイトメトリーまたは表面プラズモン共鳴を使用して結合イベントを検出することができる。アッセイは、可溶性受容体分子を含み得るか、または細胞発現受容体への結合を決定し得る。このようなアッセイは、増殖、細胞死、アポトーシスおよび細胞遊走のアッセイを含む細胞に基づくアッセイを包含し得る。他の可能なアッセイは、発現ポリペプチドの受容体結合を決定し得て、該アッセイは可溶性受容体分子を含み得るか、または細胞発現受容体への結合を決定し得る。対応するＢＰの標的受容体またはリガンドに対するＢＰＸＴＥＮの結合親和性は、結合アッセイまたは競合結合アッセイ、たとえばＵＳ Ｐａｔｅｎｔ ５，５３４，６１７に記載されるようなチップ結合受容体もしくは結合タンパク質を用いるＢｉａｃｏｒｅアッセイまたはＥＬＩＳＡアッセイ、本明細書の実施例に記載されるアッセイ、放射受容体アッセイ、または当分野で公知の他のアッセイを使用してアッセイすることができる。さらにＢＰ配列変異体（単一構成要素としてまたはＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質としてアッセイされる）は、競合的ＥＬＩＳＡ結合アッセイを使用して天然ＢＰと比較して、ＢＰ配列変異体がＢＰＸＴＥＮへの包含に好適であるように、ＢＰ配列変異体が天然ＢＰ、またはいくつかのその一部と同じ結合特異性および親和性を有するか否かを決定することができる。
本発明は、ＢＰＸＴＥＮによるＢＰ標的受容体またはリガンドに対する結合親和性がＸＴＥＮに結合されていない天然ＢＰの標的受容体またはリガンドに対する親和性の少なくとも約１０％、または少なくとも約２０％、または少なくとも約３０％、または少なくとも約４０％、または少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％、または少なくとも約１００％以上であることができる単離ＢＰＸＴＥＮを提供する。いくつかの場合において、主題ＢＰＸＴＥＮとＢＰＸＴ
ＥＮの天然受容体またはリガンドとの間の結合親和性Ｋｄは、ＢＰＸＴＥＮと天然受容体またはリガンドとの間の親和性の少なくとも約１０−４Ｍ、あるいは少なくとも約１０−５Ｍ、あるいは少なくとも約１０−６Ｍ、または少なくとも約１０−７Ｍである。
他の場合において、本発明は、融合タンパク質が高い親和性で標的受容体に結合して、それにより天然リガンドに対する拮抗活性を生じるように設計されている単離ＢＰＸＴＥＮを提供する。このようなＢＰＸＴＥＮの非限定的な例はＩＬ−１ｒａＸＴＥＮであり、該ＩＬ−１ｒａＸＴＥＮは結合組成物がＩＬ−１αおよび／またはＩＬ−１βのＩＬ−１受容体への結合を実質的に妨害するように、ＩＬ−１受容体に結合するために構成されている。特定の場合において、アンタゴニストＢＰＸＴＥＮ（たとえばこれに限定されるわけではないがＩＬ−１ｒａＸＴＥＮ）による天然リガンドの標的受容体への結合の妨害は、少なくとも約１％、または約１０％、または約２０％、または約３０％、または約４０％、または約５０％、または約６０％、または約７０％、または約８０％、または約９０％、または約９５％、または約９９％、または約１００％であることができる。他の実施形態において、本発明は、単離ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質の細胞受容体への結合が、天然リガンドによって誘起されたものと比較して２０％未満の、または１０％未満の、または５％未満の、結合されたＢＰＸＴＥＮアンタゴニストを有する細胞のシグナル伝達経路の活性化を引き出す、単離ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質（たとえばこれに限定されるわけではないが、ＩＬ−１ｒａＸＴＥＮ）を提供する。他の場合において、拮抗性ＢＰＸＴＥＮ組成物は標的受容体に約１０ｎＭ以下の、約５ｎＭ以下の、約１ｎＭ以下の、約５００ｐＭ以下の、約２５０ｐＭ以下の、約１００ｐＭ以下の、約５０ｐＭ以下の、または約２５ｐＭ以下の解離定数で結合する。拮抗性ＢＰＸＴＥＮの特異的構築物の非限定的な例は、ＩＬ−１ｒａ−ＡＭ８７５、ＩＬ−１ｒａ−ＡＥ８６４、またはＩＬ−１ｒａ−ＡＭ １２９６を包含することができる。
いくつかの場合において、本発明のＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質は、公知のまたは代謝性症状および障害の処置および防止での天然ＢＰの使用と関連付けられているインビトロ生物活性または薬理学的効果に関する、該融合タンパク質に連結されていない対応するＢＰの生物活性の、少なくとも約１０％、または約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％パーセントを保持する。上述の実施形態のいくつかの場合において、ＢＰ構成要素の活性は無傷のＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質によって明らかであり得るが、他の場合においてＢＰ構成要素の活性は、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質に組み入れられた切断配列に作用するプロテアーゼの作用による融合タンパク質からのＢＰの切断および放出の際にに主に明らかになる。上述において、図３に例証されるように、ＢＰＸＴＥＮは、上でさらに十分に記載したように、ＸＴＥＮに連結されているときには受容体またはリガンドに対するＢＰ構成要素の結合親和性を低下させるが、ＢＰＸＴＥＮ配列に組み入れられた切断配列（複数可）の切断によるＸＴＥＮから放出されるときには親和性の増加を有するように設計することができる。
他の場合において、ＢＰＸＴＥＮは、ＸＴＥＮに連結されているときにＢＰ構成要素の結合親和性を低下させて、たとえば受容体媒介クリアランスを低下させることによって被験体に投与されたＢＰＸＴＥＮの最終半減期を増加するか、または投与された組成物による毒性もしくは副作用を低下させる。ＸＴＥＮに連結されていないＢＰの毒物学的無作用量または血中濃度が低い場合（天然ペプチドが副作用を生じる高い可能性を有することを意味する）、本発明はＢＰ構成要素の生物有効性または活性を低下させるように構成されているＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質を提供する。
いくつかの場合において、ＢＰＸＴＥＮの配置により対応するＢＰ構成要素の結合親和性の低下を生じないＢＰＸＴＥＮの活性と比較して、結合親和性の実質的な低下（Ｋｄとして発現される）および対応する生物活性の低下を有するように構成できること、ならび
にこのような配置が長い最終半減期を呈すると共に十分な程度の生物活性を保持する組成物を有する点で好都合であることが見出されている。１例において、単一のＸＴＥＮのグルカゴンのＣ末端への連結によってその標的受容体への顕著な結合親和性の保持が生じるが（実施例３１を参照）、ＸＴＥＮのＮ末端への連結によって、ＸＴＥＮがＣ末端に結合されている構築物と比較して、その結合親和性および対応する生物活性が低下することが見出されている。別の例において、実施例に記載されるように、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）のＸＴＥＮ分子のＣ末端への連結によってｈＧＨ受容体への結合が実質的に妨害されないが、同じ分子のＣ末端への第２のＸＴＥＮの付加（第２のＸＴＥＮのｈＧＨのＣ末端への配置）によって、ｈＧＨ受容体に対する分子の親和性が低下して、ＸＴＥＮ−ｈＧＨ配置と比較してＸＴＥＮ−ｈＧＨ−ＸＴＥＮ配置の最終半減期の増加も生じたことが見出されている。ＢＰのその標的受容体への結合親和性を低下させる能力は、特定のＢＰが遊離Ｎ末端またはＣ末端を有する必要条件に依存し得る。したがって本発明は、少なくとも第１の生物活性タンパク質および１個以上のＸＴＥＮを含む、構成要素の特異的Ｎ→Ｃ末端配置を有する単鎖融合タンパク質構築物を産生することによってＢＰＸＴＥＮの最終半減期を増加する方法を提供し、生物活性タンパク質およびＸＴＥＮ構成要素の第１のＮ→Ｃ末端配置にある該融合タンパク質は、第２のＮ→Ｃ末端配置のＢＰＸＴＥＮと比較して受容体媒介クリアランス（ＲＭＣ）の低下および対応する最終半減期の増加を有する。上述の一実施形態において、ＢＰＸＴＥＮは、Ｎ→Ｃ末端でＢＰ−ＸＴＥＮとして構成される。上述の別の実施形態において、ＢＰＸＴＥＮは構成されたＸＴＥＮ−ＢＰである。上述の別の実施形態において、ＢＰＸＴＥＮは構成されたＸＴＥＮ−ＢＰ−ＸＴＥＮである。後者の実施形態において、２個のＸＴＥＮ分子は同一であることができるか、または該ＸＴＥＮ分子は異なる配列組成物または長さであり得る。単一のＢＰに連結された２個のＸＴＥＮを有する上述の実施形態の非限定的な例は、構築物ＡＥ９２１−ｈＧＨ−ＡＥ１４４（配列番号１８１７）、ＡＥ９２１−ｈＧＨ−ＡＥ２８８（配列番号１８１８、ＡＥ８６４−ｈＧＨ−ＡＥ１４４、ＡＭ８７５−ｈＧＨ−ＡＥ１４４、およびＡＭ８７５−ｈＧＨ−ＡＥ２８８を包含する。１個のＸＴＥＮに連結された１個のＢＰを有する上述の実施形態の非限定的な例は、ＡＥ１４４−グルカゴン（配列番号８２７）、ＡＥ２８８−グルカゴン（配列番号８２８）、ＡＤ５７６−グルカゴン（配列番号８３１）、ＡＭ９２３−グルカゴン（配列番号８４０）、Ｙ７２−グルカゴン（配列番号８２３）、ＡＭ８７５−ＩＬ−１ｒａまたはＡＥ８６４−ＩＬ−ｌｒａを包含する。本発明は、表３〜８からのＢＰおよび表２からのＸＴＥＮによって上述の例のそれぞれの構成要素が置換され、それぞれの構成要素の代替配置と比較して、構築物が受容体媒介クリアランスの低下を有するように構成されている、他の構築物を意図する。
いくつかの場合において、該方法は、受容体媒介クリアランスの低下が、ＲＭＣが低下していない第２の配置のＢＰＸＴＥＮの半減期と比較して、少なくとも２倍の、または少なくとも３倍の、または少なくとも４倍の、または少なくとも５倍の最終半減期の増加を生じることができる、構成されたＢＰＸＴＥＮを提供する。本発明は、オンレートの減少またはオフレートの増加のどちらかの結果としての受容体に対する結合親和性の低下が、Ｎ末端またはＣ末端のどちらかの障害、および別のＢＰ、ＸＴＥＮ、またはスペーサ配列のいずれにせよ、組成物の別のポリペプチドへの連結としてその末端を使用することによって成し遂げられ得る、ＢＰリガンドを利用する。ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質の特定の配置を選定することにより、受容体媒介クリアランスの速度低下が達成されるように受容体に対する結合親和性の程度を低下させることができる。概して、受容体の活性化は、活性化を伴わないポリペプチドのその受容体の結合によってＲＭＣがもたらされないが、受容体の活性化によってＲＭＣがもたらされるように、ＲＭＣに連結されている。しかし、特にリガンドがオフレートを増加させたいくつかの場合において、リガンドはそれにもかかわらず、受容体媒介クリアランスを誘発せずに細胞シグナル伝達を開始するのに十分に結合し得て、ＢＰＸＴＥＮが生物学的に利用可能なままであるという最終結果を伴う。このような場合、構成されたＢＰＸＴＥＮは、より高度のＲＭＣをもたらす配置と比較して
、半減期の増加を有する。
受容体媒介クリアランスを低下させるために結合親和性の低下が所望であるが、生物活性の少なくとも一部の保持が所望である場合、所望の受容体活性化を得るのに十分な結合親和性がそれにもかかわらず維持される必要があることが明らかになる。それゆえ一実施形態において、本発明は、標的受容体に対するＢＰＸＴＥＮの結合親和性が、結合親和性が低下していない配置の対応するＢＰＸＴＥＮと比較した結合親和性の約０．０１％〜４０％の、または約０．１％〜３０％の、または約１％〜２０％の範囲にあるように構成されたＢＰＸＴＥＮを提供する。構成されたＢＸＴＥＮの結合親和性はそれゆえ好ましくは、同程度の条件下で決定された、標的受容体に対するＢＰ構成要素の結合親和性が、低下していない配置の対応するＢＰＸＴＥＮの結合親和性と比較して、または融合タンパク質に連結されていないＢＰと比較して、少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％、または少なくとも約９９．９％、または少なくとも約９９．９９％低下する。別様に表現すれば、構成されたＢＰＸＴＥＮのＢＰ構成要素は、ＢＰ構成要素の結合親和性が低下していない配置でのＢＰＸＴＥＮの対応するＢＰ構成要素の結合親和性の、わずか約０．０１％、または少なくとも約０．１％、または少なくとも約１％、または少なくとも約２％、または少なくとも約３％、または少なくとも約４％、または少なくとも約５％、または少なくとも約１０％、または少なくとも約２０％の結合親和性を有し得る。本段落の上で記載した上述の実施形態において、標的受容体に対する構成されたＢＰＸＴＥＮの結合親和性は、対応するＢＰ構成要素の結合親和性が低下していない配置を有する、対応する天然ＢＰまたはＢＰＸＴＥＮと比較して、「実質的に低下して」いる。したがって、本発明は、所望のインビボ生物応答を得るのに十分な数の受容体を結合および活性化するが、このような応答を得るのに必要なものより多くの受容体の活性化を回避することができるように、ＢＰＸＴＥＮを構成することによって、ＲＭＣの低下を有する組成物およびＲＭＣの低下を有する組成物を産生する方法を提供する。一実施形態において、ＢＰＸＴＥＮは主題ＢＰがＢＰＸＴＥＮのＮ末端にあるように構成され、投与されたＢＰＸＴＥＮのＲＭＣはＸＴＥＮのＣ末端に連結された主題ＢＰによって構成されたＢＰＸＴＥＮと比較して低下しており、天然ＢＰの生物活性の少なくとも一部が保持される。別の実施形態において、ＢＰＸＴＥＮは主題ＢＰがＢＰＸＴＥＮのＣ末端にあるように構成され、投与されたＢＰＸＴＥＮのＲＭＣは、主題ＢＰがＢＰＸＴＥＮのＮ末端にあるように構成されたＢＰＸＴＥＮと比較して低下しており、天然ＢＰの生物活性の少なくとも一部が保持される。別の実施形態において、ＢＰＸＴＥＮはＮ→Ｃ末端でＸＴＥＮ−ＢＰ−ＸＴＥＮとして構成され、投与されたＢＰＸＴＥＮのＲＭＣは１個のＸＴＥＮによって構成されたＢＰＸＴＥＮと比較して低下しており、天然ＢＰの生物活性の少なくとも一部が保持されている。この特性を達成する他の配置が、たとえばＢＰの第２の分子またはスペーサ配列の付加が本発明によって意図されることが、当業者に明らかになる。本段落の上で記載した上述の実施形態において、ＢＰＸＴＥＮの半減期は、ＢＰ構成要素の結合親和性およびＲＭＣが低下していない構成されたＢＰＸＴＥＮと比較して、少なくとも約５０％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約１００％、または少なくとも約１５０％、または少なくとも約２００％、または少なくとも約３００％増加することができる。本段落の上で記載した上述の実施形態において、半減期の増加によって、ＸＴＥＮに連結されていないＢＰと比較してまたはＢＰ構成要素が天然ＢＰと同程度の受容体に対する結合親和性を保持するＢＰＸＴＥＮ配置と比較して、投薬量の上昇または投薬頻度の低下が可能となる。
特異的インビボおよびエクスビボ生物アッセイも、各構成されたＢＰＸＴＥＮおよび／またはＢＰＸＴＥＮに組み入れられるＢＰ構成要素の生物活性を評価するために使用され得る。たとえば膵臓ベータ細胞からのインスリン分泌および／または転写の増加は、当分野で公知の方法によって測定することができる。組織によるグルコース取り込みも、例えばグルコース・クランプ・アッセイなどの方法によって評価できる。代謝性疾患および障
害の処置で投与されたＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質の活性を評価するのに好適な他のインビボおよびエクスビボパラメータは、空腹時グルコースレベル、ピーク食後グルコースレベル、グルコース恒常性、経口グルコース負荷試験に対する応答、インスリンチャレンジに対する応答、ＨＡ１Ｃ、カロリー取り込み、飽満、胃排出速度、膵臓分泌、インスリン分泌，末梢組織インスリン感受性、ベータ細胞量（ｂｅｔａ ｃｅｌｌ ｍａｓｓ）、ベータ細胞破壊、血中脂質レベルもしくプロフィール、ボディマスインデックス、または体重を包含する。これらのアッセイまたは当分野で公知の他のアッセイの結果に基づいて、ＢＰＸＴＥＮ配置または組成物を確認することができる、または必要な場合は、調整および再アッセイして標的結合親和性または生物活性を確認することができる。
例えば、タンパク質凝集、溶解度、２次および３次構造、融解特性、夾雑物質および水の含有量などを決定する方法を包含する、発現されたタンパク質の物理特性および構造特性を測定するための特異的アッセイおよび方法は、当分野で公知である。このような方法は、分析用遠心分離、ＥＰＲ、ＨＰＬＣ−イオン交換、ＨＰＬＣ−サイズ排除、ＨＰＬＣ−逆相、光散乱、キャピラリー電気泳動、円偏光二色性、示差走査熱量測定、蛍光、ＨＰＬＣ−イオン交換、ＨＰＬＣ−サイズ排除、ＩＲ、ＮＭＲ、ラマン分光法、屈折率測定および紫外／可視分光法を包含する。追加の方法は、Ａｒｎａｕら、Ｐｒｏｔ Ｅｘｐｒ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆ（２００６）４８，１−１３に開示されている。これらの方法の発明への適用は、当業者の理解の範囲内である。
Ｖ）本発明の組成物の使用
別の態様において、本発明は、ＢＰに媒介される疾患、障害または状態において有益な効果を達成するための方法を提供する。本発明は、比較的短い最終半減期および／または最小有効用量と最大許容投与量との間の狭い治療ウインドウを有するＢＰの欠点および／または制限に対処する。
一実施形態において，本発明は、被験体に治療または予防有効量のＢＰＸＴＥＮを投与するステップを含む、被験体において有益な効果（ａｆｆｅｃｔ）を達成する方法を提供する。有効量は、疾患または障害の処置を助けるのに有益な効果をもたらすことができる。いくつかの場合において、有益な効果を達成するための方法は、これに限定されるわけではないが、１型糖尿病，２型糖尿病、シンドロームＸ、インスリン抵抗性，高インスリン血症，アテローム性動脈硬化、糖尿病性ニューロパシー、脂質異常症、肥満、摂食障害、妊娠性糖尿病、高コレステロール血症、高血圧、膵臓ベータ細胞量の不足、肺高血圧、または網膜神経変性プロセスを包含する、グルコース関連疾患、障害、または状態または代謝性疾患、障害、または状態を有する被験体を処置するために、治療的有効量のＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質組成物を投与することを包含することができる。本発明のＢＰＸＴＥＮ組成物による処置から利益を得ることがあるグルコース関連疾患または代謝性疾患または臨床障害の他の例は、これに限定されるわけではないが、Ｉ型糖尿病の「ハネムーン期間」、若年性糖尿病、食欲亢進、不十分な飽満感、代謝性障害、グルカゴノーマ、クローン病、潰瘍性大腸炎、腎不全、うっ血性心不全、ネフローゼ症候群、食物取り込みの低下が所望である障害、術後異化作用変化、冬眠心筋もしくは糖尿病性心筋症，不十分な尿中ナトリウム排泄、過剰な尿中カリウム濃度、毒性血液量過多に関連付けられた症状または障害、多嚢胞性卵巣症候群、腎症、胃腸管障害、たとえば下痢、術後ダンピング症候群、過敏性腸症候群、重症疾患多発ニューロパチー（ＣＩＰＮ）、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、脂質異常症、発作、虚血後再灌流傷害、および冠動脈心疾患リスクファクター（ＣＨＤＲＦ）症候群、または食物取り込みの低下が所望である障害を包含する。
いくつかの場合において、有益な効果を達成する方法は、これに限定されるわけではないが、第ＶＩＩ因子欠損、第Ｘ因子欠損、第ＸＩＩ因子欠損、血友病Ａ、血友病Ｂ（クリスマス疾患）、血友病Ｃ、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、フォン・ウィルブラン
ト病（Ｉ型およびＩＩ型）、外傷に関連付けられた出血、または外科的出血を包含する、凝固タンパク質欠損または出血障害を有する被験体を処置するために、治療的有効量のＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質組成物を投与することを包含することができる。
他の場合において、有益な効果を達成する方法は、これに限定されるわけではないが、成人および小児の成長ホルモン欠損、ターナー症候群、プラーダー・ヴィリ症候群、慢性腎不全、子宮内発育遅延、特発性低身長、ＡＩＤＳによるるい痩、肥満、多発性硬化症、加齢、線維筋痛症、クローン病、潰瘍性大腸炎、筋ジストロフィーまたは筋肉量（たとえば筋肉増強）の低下、低骨密度、または成長ホルモンが利用されるその他の任意の適応症を包含することができる、成長ホルモン関連障害または状態を有する被験体を治療するために、治療的有効量のＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質組成物を投与することを含むことができる。
一実施形態において、方法は、ＸＴＥＮに連結されていないＢＰを含み、同程度の用量で投与される薬学的組成物の投与によって媒介された効果と比較して、ＢＰ構成要素（複数可）によって媒介された少なくとも１つのパラメータ、生理的条件、または臨床結果のより大きな改善を生じる、治療的有効量の、ＸＴＥＮ配列（複数可）に連結されたＢＰを含むＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質組成物および少なくとも１つの薬学的に許容され得るキャリアを含む薬学的組成物をそれを必要とする被験体に投与することを含む。１実施形態において、薬学的組成物は治療的有効用量で投与される。別の実施形態において、薬学的組成物は、投薬期間の長さにわたって治療的有効用量レジメン（本明細書で定義するような）を用いて、複数連続用量を使用して投与される。
本明細書に記載するように、ＢＰＸＴＥＮの薬物動態パラメータの増強の結果として、ＢＰは、代謝性疾患、障害もしくは状態の症状もしくは臨床異常を防止、処置、軽減、逆転もしくは緩和する、または処置されている被験体の生存を延ばすために、ＸＴＥＮに連結されていない対応するＢＰと比較して、用量間のより長い間隔を使用して投与され得る。
本発明の方法は、所望のパラメータまたは臨床効果を達成および／または維持するのに十分な期間にわたる治療的有効量のＢＰＸＴＥＮの連続用量の投与を包含し得て、このような治療的有効量の連続用量によって、ＢＰＸＴＥＮの治療的有効用量レジメン；すなわち用量が治療的有効量で投与されて、これに限定されるわけではないが、本明細書に記載するものを包含する、代謝性疾患状態または状態の任意の臨床徴候または症状、側面、測定パラメータまたは特徴に対する持続した有益な効果を生じる、融合タンパク質組成物の連続投与用量のスケジュールが確立される。
ＢＰＸＴＥＮの治療的有効量は、個体の疾患状態、年齢、性別、および体重、ならびに抗体または抗体部分が個体における所望の応答を引き出す能力などの因子によって変化し得る。治療的有効量は、ＢＰＸＴＥＮの任意の毒性または有害作用を治療的に有益な効果が上回る量でもある。予防的有効量は、所望の予防結果を達成するために必要な期間に必要とされるＢＰＸＴＥＮの量を指す。
本発明の方法では、患者の利便性を改善するために、用量間の間隔を増加するために、および持続効果を達成するために必要とされる薬物の量を低下させるために、より長期間作用するＢＰＸＴＥＮ組成物が好ましい。一実施形態において、処置方法は、融合タンパク質に連結されておらず、同程度の用量で被験体に投与される対応する構成要素（複数可）と比較して、組成物の融合タンパク質について確立された治療ウインドウ内で費やされる時間の増大を生じる、治療的有効用量のＢＰＸＴＥＮのそれを必要とする被験体への投与を含む。いくつかの場合において、治療ウインドウ内で費やされる時間の増大は、融合
タンパク質に連結されておらず、同程度の用量で被験体に投与される対応するＢＰ構成要素と比較して、少なくとも約３倍、または少なくとも約４倍、または少なくとも約５倍、または少なくとも約６倍、または少なくとも約８倍、または少なくとも約１０倍、または少なくとも約２０倍、または少なくとも約４０倍である。その方法によりさらに、治療的有効用量レジメンを使用して投与される複数連続用量のＢＰＸＴＥＮのそれを必要とする被験体への投与が、融合タンパク質に連結されておらず、そのＢＰについて確立された用量レジメンを使用して投与される対応するＢＰ（複数可）と比較して、融合タンパク質の血中濃度の連続Ｃｍａｘピークおよび／またはＣｍｉｎトラフ間の時間の増大をもたらし得ることが提供される。上述の実施形態において、連続Ｃｍａｘピークおよび／またはＣｍｉｎトラフの間に費やされた時間の増大は、融合タンパク質に連結されておらず、そのＢＰについて確立された用量レジメンを使用して投与される対応するＢＰ構成要素（複数可）と比較して、少なくとも約３倍、または少なくとも約４倍、または少なくとも約５倍、または少なくとも約６倍、または少なくとも約８倍、または少なくとも約１０倍、または少なくとも約２０倍、または少なくとも約４０倍であることができる。本段落の上で記載した上記の実施形態において、融合タンパク質の投与は、融合タンパク質に連結されておらず、同程度の単位用量または用量レジメンで被験体に投与される対応するＢＰ構成要素（複数可）と比較して、融合タンパク質のより低い単位用量（モル）を使用して、（被験体の疾患、状態または障害を評価するのに有用であるとして本明細書で開示された）パラメータの少なくとも１つの改善を生じることができる。
一実施形態において、ＢＰＸＴＥＮは、同じアッセイを使用して、または測定された臨床パラメータに基づいて決定された、ＸＴＥＮに連結されていないＢＰ構成要素の活性より大きい、臨床パラメータ、生化学パラメータまたは生理学的パラメータの１つの改善を生じる活性を有することができる。別の実施形態において、ＢＰＸＴＥＮは、同じアッセイを使用して、または測定された臨床パラメータに基づいて決定された、ＸＴＥＮに連結されていないＢＰ構成要素と比較して、集合的に増強効果を生じる異なるＢＰの１つによってそれぞれ媒介される、２つ以上の臨床または代謝性関連パラメータ（たとえば糖尿病被験体におけるグルコース恒常性および体重管理、または血友病被験体におけるプロトロンビンおよび出血回数の低下、または成長ホルモン欠損被験体における筋肉量および骨密度の増加）の活性を有することができる。別の実施形態において、ＢＰＸＴＥＮの投与は、同じアッセイを使用して、または測定された臨床パラメータに基づいて決定された、ＸＴＥＮに連結されていない単一のＢＰ構成要素の１つの活性よりも長期間である、臨床パラメータまたは生化学パラメータまたは生理学的パラメータの１つ以上において活性を生じる。
一実施形態において、処置方法は、糖尿病またはインスリン抵抗性に関連付けられた１個以上のパラメータの改善を及ぼす治療的有効用量レジメンを使用する、ＢＰＸＴＥＮの投与を含む。上述の実施形態において、改善は、主要な有効性または臨床エンドポイント、たとえばヘモグロビンＡ１ｃの改善によって評価され得る（ＨｂＡ１ｃ、たとえばＲｅｙｎｏｌｄｓら、ＢＭＪ，３３３（７５６８）：５８６−５８９，２００６を参照）。治療有効性を示すＨｂＡ１ｃの改善は、患者における初期ベースライン測定によって変化し得て、より大きい減少はより高い初期ベースラインに相当することが多く、より小さい減少はより低い初期ベースラインに相当することが多い。いくつかの実施形態において、方法は、投薬前レベルと比較して、少なくとも約０．５％、またはあるいは少なくとも約１％、またはあるいは少なくとも約１．５％、またはあるいは少なくとも約２％、またはあるいは少なくとも約２．５％、またはあるいは少なくとも約３％、またはあるいは少なくとも約３．５％、または少なくとも約４％以上のＨｂＡ１ｃの減少を生じることができる。他の実施形態において、処置方法は、１３０ｍｇ／ｄＬ未満までの、あるいは１２５ｍｇ／ｄＬ未満の、あるいは１２０ｍｇ／ｄＬ未満の、あるいは１１５ｍｇ／ｄＬ未満の、あるいは１１０ｍｇ／ｄＬ未満の、あるいは１０５ｍｇ／ｄＬ未満の空腹時血糖（たとえ
ばグルコース）レベルを、または１００ｍｇ／ｄＬ未満の空腹時血糖レベルを生じることができる。他の実施形態において、方法は、投薬前レベルと比較して、約２０％超の、さらに好ましくは約３０％超の、さらに好ましくは約４０％超の、さらに好ましくは約５０％超の、さらに好ましくは約６０％超の、さらに好ましくは約７０％超の、さらに好ましくは約８０％超の、最も好ましくは約９０％超の空腹時血糖（たとえばグルコース）レベルの低下を生じることができる。他の実施形態において、方法は、約２００ｍｇ／ｄＬ未満の、さらに好ましくは約１９０ｍｇ／ｄＬ未満の、さらに好ましくは約１８０ｍｇ／ｄＬ未満の、さらに好ましくは約１７０ｍｇ／ｄＬ未満の、さらに好ましくは約１６０ｍｇ／ｄＬ未満の、さらに好ましくは約１５０ｍｇ／ｄＬ未満の、最も好ましくは約１４０ｍｇ／ｄＬ未満の１２０分間経口グルコース負荷試験（ＯＧＴＴ）のグルコースレベルを生じることができる。血友病被験体のプロトロンビン（ｐｒｏｔｈｒｏｍｉｎ）時間を改善すること；たとえばＦＩＸを含むＢＰＸＴＥＮを投与することを包含する、パラメータによって評価される処置方法の他の例は、正常被験体と比較して、少なくとも約４０％、さらに好ましくは少なくとも約５０％、さらに好ましくは少なくとも約６０％、さらに好ましくは少なくとも約７０％、さらに好ましくは少なくとも約８０％、さらに好ましくは少なくとも約９０％、またはさらに好ましくは少なくとも約９５％であるプロトロンビン時間を生じることができる。
本発明は、本明細書で提供された方法に従って使用されるＢＰＸＴＥＮが、糖尿病、インスリン抵抗性、代謝性障害、出血障害、または成長障害の処置に有用な他の処置方法および薬学的組成物と併せて投与され得ることをさらに意図する。このような組成物は、たとえばＤＰＰ−ＩＶ抑制因子、インスリン、インスリン類似体、ＰＰＡＲガンマアゴニスト、二重作用ＰＰＡＲアゴニスト、ＧＬＰ−１アゴニストもしくは類似体、ＰＴＰ１Ｂ抑制因子、ＳＧＬＴ抑制因子、インスリン分泌促進物質、ＲＸＲアゴニスト、グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３抑制因子、インスリン増感剤、免疫調節物質、ベータ−３アドレナリン作動性受容体アゴニスト、Ｐａｎ−ＰＰＡＲアゴニスト、１１ベータ−ＨＳＤ１抑制因子、ビグアニド、アルファ−グルコシダーゼ抑制因子、メグリチニド、チアゾリジンジオン、スルホニル尿素および当分野で公知の他の糖尿病薬、または抗高血圧薬物、カルシウムチャネルブロッカ、または凝固因子および関連生成物を包含し得る。いくつかの場合において、ＢＰＸＴＥＮの投与により、被験体の疾患、障害または状態に対する同程度の臨床効果または測定パラメータを達成するために、より少ない投薬量の同時投与薬学的組成物の使用が可能になり得る。
上述にもかかわらず、特定の実施形態において、本発明の方法によって使用されるＢＰＸＴＥＮは、グルコース関連疾患、代謝性疾患もしくは障害、凝固障害、または成長ホルモン欠損もしくは成長障害を有する被験体における追加の処置方法または薬物もしくは他の薬学的組成物の使用に対する必要性を防止または遅延し得る。他の実施形態において、ＢＰＸＴＥＮは、根底にある疾患、障害または状態を処置するのに必要とされる追加の処置方法または薬物もしくは他の薬学的組成物の量、頻度または継続期間を低下させ得る。
別の態様において，本発明は、所望の薬理学的特性または薬学的特性を有するＢＰＸＴＥＮ組成物を設計する方法を提供する。ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質は（融合タンパク質に連結されていないＢＰ構成要素と比較して）、代謝性疾患または障害の処置のための治療有効性の改善、ＢＰと比較した融合タンパク質の薬物動態特徴の増強、薬理学的効果を達成するために必要とされる用量の低減または投薬頻度の低減、薬学的特性の増強、および延長された期間にわたって治療ウインドウ内に残存するＢＰ構成要素の能力の増強を包含する、各種の目的を念頭に置いて設計および調製される。
一般に、融合タンパク質および本発明の組成物の設計および産生のステップは、図４〜６に例証されるように：（１）特定の疾患、障害または状態を処置するためのＢＰ（たと
えば天然タンパク質，ペプチドホルモン、活性を有するペプチド類似体または誘導体、ペプチドフラグメントなど）の選択；（２）所望のＰＫおよび物理化学特徴を、得られたＢＰＸＴＥＮに与えるＸＴＥＮの選択（たとえば被験体への組成物の投与は、ＸＴＥＮに連結されていないＢＰと比較してより長期間にわたって治療ウインドウ内に維持される融合タンパク質を生じる）；（３）所望の有効性またはＰＫパラメータを達成するための、ＢＰＸＴＥＮの所望のＮ→Ｃ末端配置の確立；（４）構成されたＢＰＸＴＥＮをコードする発現ベクターの設計の確立；（５）発現ベクターを有する好適な宿主の形質転換；ならびに（６）得られた融合タンパク質の発現および回収を包含し得る。半減期の増加（１６時間を超える）または治療ウインドウ内で費やされる期間の延長が所望であるＢＰＸＴＥＮでは、組み入れのために選ばれたＸＴＥＮは概して、単一のＸＴＥＮがＢＰＸＴＥＮに組み入れられる、少なくとも約５００、または約５７６、または約８６４、または約８７５、または約９１３、または約９２４アミノ酸残基を有する。別の実施形態において、ＢＰＸＴＥＮは、上述の長さの第１のＸＴＥＮ、および約１４４、または約２８８、または約５７６、または約８６４、または約８７５、または約９１３、または約９２４アミノ酸残基の第２のＸＴＥＮを含むことができる。
半減期の増加が必要とされないが、薬学的特性（たとえば溶解度）の増加が所望である他の場合において、ＢＰＸＴＥＮは、より短い長さのＸＴＥＮを有するように設計することができる。上述のいくつかの実施形態において、ＢＰＸＴＥＮは少なくとも約２４、または約３６、または約４８、または約６０、または約７２、または約８４、または約９６アミノ酸残基を有するＸＴＥＮに連結されたＢＰを含むことができ、生理的条件下での該融合タンパク質の溶解度は、ＸＴＥＮに連結されていない対応するＢＰよりも少なくとも３倍大きく、またはあるいはＸＴＥＮに連結されていないグルカゴンよりも、少なくとも４倍、または５倍、または６倍、または７倍、または８倍、または９倍、または少なくとも１０倍、または少なくとも２０倍、または少なくとも３０倍、または少なくとも５０倍、または少なくとも６０倍またはそれより多い。上述の一実施形態において、ＢＰはグルカゴンである。上述の別の実施形態において、ＢＰＸＴＥＮは、グルカゴンおよび表１２〜１５から選択されるポリペプチド配列を含むことができる。グルカゴン含有ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質に２〜６時間の半減期が所望である（たとえば夜間低血糖の処置において）なお他の場合において、融合タンパク質は、グルカゴン含有ＢＰＸＴＥＮのＸＴＥＮ構成要素の、中間長の、たとえば約１００アミノ酸、または約１４４アミノ酸、または約１５６アミノ酸、または約１６８アミノ酸、または約１８０アミノ酸、または約１９６アミノ酸のＸＴＥＮを用いて設計することができる。
別の態様において、本発明は、天然ＢＰと比較して、製造の容易さを改善して、安定性の増加、水溶解度の増加、および／または調合の容易さを生じるための、ＢＰＸＴＥＮ組成物を作製する方法を提供する。一実施形態において、本発明は、非融合状態のＢＰと比較して、得られたＢＰＸＴＥＮの可溶性形態での高濃度が生理的条件下で達成できるように、ＢＰを１個以上のＸＴＥＮに連結するステップを含む、ＢＰの水溶解度を上昇させる方法を包含する。融合タンパク質に組み入れられたときに、ＢＰの水溶解度の増加を与えるＸＴＥＮの特性に寄与する因子は、ＸＴＥＮ融合パートナーの高い溶解度および溶解した分子とＸＴＥＮとの間の低度の自己凝集を包含する。いくつかの実施形態において、方法は、生理的条件下での水溶解度が、非融合ＢＰと比較して、少なくとも約５０％の、または少なくとも約６０％大きい、または少なくとも約７０％大きい、または少なくとも約８０％大きい、または少なくとも約９０％大きい、または少なくとも約１００％大きい、または少なくとも約１５０％大きい、または少なくとも約２００％大きい、または少なくとも約４００％大きい、または少なくとも約６００％大きい、または少なくとも約８００％大きい、または少なくとも約１０００％大きい、または少なくとも約２０００％大きい、または少なくとも約４０００％大きい、または少なくとも約６０００％大きいＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質を生じる。
別の実施形態において、本発明は、得られたＢＰＸＴＥＮの貯蔵寿命が非融合状態のＢＰと比較して延長されるように選択された１個以上のＸＴＥＮとＢＰとを連結するステップを含む、ＢＰの貯蔵寿命を増強する方法を包含する。本明細書で使用する場合、貯蔵寿命は、溶解状態のまたはその他の貯蔵調合物のＢＰまたはＢＰＸＴＥＮの機能活性が、過度の活性消失を伴わずに安定なままである期間を指す。本明細書で使用する場合、「機能活性」は、当分野で公知であるような薬理学的効果または生物活性、たとえば受容体もしくはリガンドを結合する能力、または酵素活性、またはＢＰに関連付けられた１つ以上の公知の機能活性を呈することを示す。分解または凝集するＢＰは概して、溶解状態のままであるＢＰと比較して、機能活性の低下または生物学的利用能の低下を有する。融合タンパク質に組み入れられたときに、該方法の、ＢＰの貯蔵寿命を延長する能力に寄与する因子は、ＸＴＥＮ融合パートナーの水溶解度の増加、溶解状態での自己凝集の低下、および熱安定性の増加を包含する。特に、ＸＴＥＮの低い凝集傾向によって、より高い薬物濃度のＢＰを含有する薬学的調製物の調合方法が容易となり、ＸＴＥＮの熱安定性は、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質が延長された期間にわたって可溶性および機能活性のままである特性に寄与する。一実施形態において、方法は、同じ貯蔵および取扱い条件を受けた標準と比較してより大きい活性を示す、「引き延ばされた」または「延長された」貯蔵寿命を有するＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質を生じる。標準は、非融合全長ＢＰであり得る。一実施形態において、方法は、ＸＴＥＮがその非構造化高次構造を保持する能力およびＢＰＸＴＥＮが対応する非融合ＢＰよりも長い時間にわたって調合物において可溶性のままである能力を増強する、１つ以上の薬学的に許容され得る賦形剤を有する単離ＢＰＸＴＥＮを調合するステップを包含する。一実施形態において、方法は、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質を生成するためにＸＴＥＮにＢＰを連結することを含み、所与の時点で比較したときにおよび標準と同じ貯蔵および取扱い条件を受けたときに、約１００％を超える機能活性を、または標準の機能活性の約１０５％、１１０％、１２０％、１３０％、１５０％または２００％を超えて保持する溶液を生じて、それによりその貯蔵寿命を増強する。
貯蔵寿命は、貯蔵後に残存する機能活性に関しても評価され得て、貯蔵が開始したときに機能活性に正規化される。延長または延長された機能活性によって提示されるような、引き延ばされたまたは延長された貯蔵寿命を有する本発明のＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質は、同じ条件を同じ期間にわたって受けたときに、ＸＴＥＮに連結されていない同等のＢＰの機能活性の約５０％以上の機能活性を、または約６０％、７０％、８０％、または９０％以上の機能活性を保持し得る。たとえばＸＴＥＮ配列に融合されたエキセンジン−４またはグルカゴンを含む本発明のＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質は、各種の温度条件下で最大５週間以上の期間にわたって、溶解状態でその元の活性の約８０％以上を保持し得る。いくつかの実施形態において、ＢＰＸＴＥＮは、８０℃にて１０分間加熱したときに、溶解状態でその元の活性の少なくとも約５０％、または約６０％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％の、および最も好ましくは少なくとも約９０％以上を保持する。他の実施形態において、ＢＰＸＴＥＮは、３７℃にて約７日間にわたって加熱または維持したときに、溶解状態でその元の活性の少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％、またはあるいは少なくとも約９０％以上を保持する。別の実施形態において、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質は、約１時間〜約１８時間の期間にわたって約３０℃〜約７０℃の温度への曝露後に、その機能活性の少なくとも約８０％以上を保持する。本段落の上で記載した上述の実施形態において、ＢＰＸＴＥＮの保持された活性は、融合タンパク質に連結されていない対応するＢＰの活性よりも、所与の時点において少なくとも約２倍の、または少なくとも約３倍、または少なくとも約４倍、または少なくとも約５倍、または少なくとも約６倍大きい。
ＶＩ）本発明のＤＮＡ配列
本発明は、相同変異体を含むＢＰＸＴＥＮキメラポリペプチドをコードするポリ核酸分
子に相補的なＢＰＸＴＥＮキメラポリペプチドおよび配列をコードする、単離ポリ核酸を提供する。別の態様において、本発明は、相同変異体を含むＢＰＸＴＥＮキメラポリペプチドをコードするポリ核酸分子に相補的なＢＰＸＴＥＮキメラポリペプチドおよび配列をコードするポリ核酸を産生する方法を含む。一般に、および図４〜６に例証されるように、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を産生して、得られた遺伝子産物を発現する方法は、ＢＰおよびＸＴＥＮをコードするヌクレオチドを構築することと、フレーム内の構成要素を連結することと、コード遺伝子を適切な発現ベクターに組み入れることと、適切な宿主細胞を発現ベクターによって形質転換することと、および形質転換された宿主細胞で融合タンパク質を発現させることと、それにより生物活性ＢＰＸＴＥＮポリペプチドを産生することとを含む。分子生物学における標準組換え技法を使用して、本発明のポリヌクレオチドおよび発現ベクターを作製することができる。
本発明により、ＢＰＸＴＥＮをコードする核酸配が使用されて、適切な宿主細胞においてＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質の発現を誘導する組換えＤＮＡ分子が生成され得る。数種のクローニング戦略が本発明を行うために好適であることが想定され、その多くを使用して本発明のＢＰＸＴＥＮ組成物の融合タンパク質をコードする遺伝子、またはその相補体を含む構築物を生成することができる。一実施形態において、クローニング戦略が使用されて、少なくとも第１のＢＰおよび少なくとも第１のＸＴＥＮポリペプチド、またはその相補体を含む単量体ＢＰＸＴＥＮをコードする遺伝子が生成される。別の実施形態において、クローニング戦略が使用されて、ＢＰＸＴＥＮ組成物を調合するために使用される融合タンパク質の発現のために宿主細胞を形質転換するのに使用される、１個のＢＰの第１および第２の分子および少なくとも第１のＸＴＥＮ（またはその相補体）を含む単量体ＢＰＸＴＥＮをコードする遺伝子が生成される。本段落の上で記載した上述の実施形態において、遺伝子は、切断配列（複数可）もコードし得るスペーサ配列をコードするヌクレオチドをさらに含むことができる。
所望のＸＴＥＮ配列の設計において、本発明の組成物のＸＴＥＮの非反復性の性質が、ＸＴＥＮコード配列の生成における「ビルディングブロック」分子手法の使用にもかかわらず達成可能であることが見出された。これは、次に多量体化されてＸＴＥＮ配列をコードする遺伝子を生成する配列モチーフをコードする、ポリヌクレオチドのライブラリの使用によって達成された（図４および５を参照）。それゆえ、発現されたＸＴＥＮがわずか４つの異なる配列モチーフの複数単位から成り得るのは、モチーフ自体が非反復性アミノ酸配列から成り、ＸＴＥＮ配列全体が非反復性にされるためである。したがって，一実施形態において、ＸＴＥＮコードポリヌクレオチドは、インフレームで操作可能に連結され、そこで得られた発現ＸＴＥＮアミノ酸配列が非反復性である、非反復性配列をコードする複数のポリヌクレオチド、またはモチーフを含む。
１つの手法において、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質に対応するＤＮＡ配列を含有する構築物が最初に調製される。組成物のＢＰをコードするＤＮＡは、ＢＰｍＲＮＡを所有して、検出可能なレベルでそれを発現すると考えられる組織または単離細胞から、標準方法を使用して調製されたｃＤＮＡライブラリから得られ得る。必要な場合は、コード配列をＳａｍｂｒｏｏｋら、上掲に記載されるように、従来のプライマ延長手順を使用して得て、ｃＤＮＡに逆転写されていない場合があるｍＲＮＡの前駆体およびプロセシング中間体を検出することができる。したがってＤＮＡは、このような源から調製したｃＤＮＡライブラリから都合よく得ることができる。ＢＰコード遺伝子（複数可）は、ゲノムライブラリからも得られ得るか、または当分野で公知の標準合成手順（たとえば自動化核酸合成）によって、公に利用可能なデータベース、特許、または参考文献から得たＤＮＡ配列を使用しても生成され得る。このような手順は当分野で周知であり、科学文献および特許文献に十分に記載されている。配列はたとえば、ＢＡＰのアミノ酸配列、またはＢＡＰのフラグメントもしくは変異体のアミノ酸配列を含有するＣＡＳ ＲｅｇｉｓｔｒｙまたはＧｅｎ
Ｂａｎｋデータベースへのエントリに一致するｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖのワールド・ワイド・ウェブで利用できる、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）ウェブページを通じて利用できる、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｂｓｔｒａｃｔｓ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（ＣＡＳ）登録番号（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙにより公開）および／またはＧｅｎＢａｎｋ受託番号（たとえばＬｏｃｕｓ ＩＤ、ＮＰ＿ＸＸＸＸＸ、およびＸＰ＿ＸＸＸＸＸ）モデルタンパク質識別子から得ることができる。本明細書で提供するこのような配列識別子では、これらのＣＡＳおよびＧｅｎＢａｎｋおよびＧｅｎＳｅｑ受託番号ならびに引用ジャーナル刊行物（たとえばＰｕｂＭｅｄ ＩＤ番号（ＰＭＩＤ））のそれぞれに関連付けられた要約ページは、特に本明細書に記載するアミノ酸配列に関して、参照によりその全体がそれぞれ組み入れられている。一実施形態において、ＢＰコード遺伝子は、表３〜８の任意の１つからのタンパク質、またはそのフラグメントもしくは変異体をコードする。
主題ＢＰＸＴＥＮタンパク質のＢＰ部分をコードする遺伝子またはポリヌクレオチドは、単一ＢＰを含む発現融合タンパク質の場合、次に、構築物にクローニングすることができ、該構築物は、生物系での高レベルタンパク質発現に適切な転写配列および翻訳配列の制御下でのプラスミドまたは他のベクターであることができる。後のステップにおいて、ＸＴＥＮをコードする第２の遺伝子またはポリヌクレオチドは、ＢＰをコードする遺伝子（複数可）に隣接し、その遺伝子とインフレームの構築物に、該遺伝子またはポリヌクレオチドをクローニングすることによって、ＢＰ遺伝子のＮ末端および／またはＣ末端をコードするヌクレオチドに遺伝子的に融合される。この第２のステップは、ライゲーションまたは多量体化ステップを通じて出現することができる。本段落の上で記載した上述の実施形態において、生成される遺伝子構築物があるいは、それぞれの融合タンパク質をコードするそれぞれの遺伝子の相補体であることができることが理解される。
ＸＴＥＮをコードする遺伝子は、完全合成、または酵素プロセスと組み合わせた合成、たとえば制限酵素媒介クローニング、ＰＣＲおよび重複延長のどちらかによって、１つ以上のステップで作製することができる。ＸＴＥＮポリペプチドは、ＸＴＥＮ−コード遺伝子が低い反復性を有するが、コードされたアミノ酸配列がある程度の反復性を有するように構築することができる。非反復性配列を有する、ＸＴＥＮをコードする遺伝子は、遺伝子合成の標準技法を使用して、オリゴヌクレオチドから構築することができる。遺伝子設計は、コドン使用（ｕｓａｇｅ）およびアミノ酸組成を最適化するアルゴリズムを使用して行うことができる。本発明の１つの方法において、図４および５に例証されるように、比較的短いＸＴＥＮコードポリヌクレオチド構築物のライブラリが生成され、次に構築される。これは、各ライブラリメンバが同じアミノ酸配列を有するが、多くの異なるコード配列が可能であるように、純粋なコドンライブラリであることができる。このようなライブラリは、部分的に無作為化されたオリゴヌクレオチドから構築され、配列モチーフを含むＸＴＥＮセグメントの大型ライブラリを生成させるために使用することができる。無作為化スキームは、各位置でのアミノ酸の選定ならびにコドン使用を制御するために最適化できる。
ポリヌクレオチドライブラリ
別の態様において、本発明は、所望の長さおよび配列のＸＴＥＮをコードする遺伝子を構築するために使用できるＸＴＥＮ配列をコードするポリヌクレオチドのライブラリを提供する。
ある実施形態において、ＸＴＥＮコードライブラリ構築物は、固定長のポリペプチドセグメントをコードするポリヌクレオチドを含む。初期ステップとして、９〜１４アミノ酸残基のモチーフをコードするオリゴヌクレオチドのライブラリを構築することができる。
好ましい実施形態において、１２アミノ酸のモチーフをコードするオリゴヌクレオチドのライブラリが構築される。
ＸＴＥＮコード配列セグメントは、より長いコード配列に２量体化または多量体化することができる。２量体化または多量体化は、ライゲーション、重複延長、ＰＣＲ構築または当分野で公知の同様のクローニング技法によって行うことができる。得られたＸＴＥＮコード配列が配列の組織化および所望の長さに達して、ＸＴＥＮコード遺伝子を提供するまで、このプロセスを複数回反復することができる。認められるように、１２アミノ酸をコードするポリヌクレオチドのライブラリは、３６アミノ酸をコードするポリヌクレオチドのライブラリに２量体化することができる。今度は、３６アミノ酸をコードするポリヌクレオチドのライブラリは、ＸＴＥＮ配列をコードする連続したより長いポリヌクレオチドを含有するライブラリに、連続的に２量体化することができる。いくつかの実施形態において、特異的配列ＸＴＥＮファミリ；たとえば表１のＡＤ、ＡＥ、ＡＦ、ＡＧ、ＡＭ、またはＡＱ配列に限定されるアミノ酸をコードするポリヌクレオチドのライブラリを構築することができる。他の実施形態において，ライブラリは、表１からの２つ以上のモチーフファミリ配列をコードする配列を含むことができる。３６マーをコードするライブラリの代表的な非限定的なポリヌクレオチド配列の名称および配列を表１２〜１５に表示し、これらを生成するために使用される方法を実施例でさらに十分に記載する。ライブラリを今度は、連続２量体化またはライゲーションに使用して、たとえば７２、１４４、２８８、５７６、８６４、９１２、９２３、１２９６アミノ酸の、または全長約３０００までのアミノ酸の、ならびに中間長の、ＸＴＥＮ配列をコードするポリヌクレオチド配列ライブラリを達成することができる。いくつかの場合において、ポリヌクレオチドライブラリ配列は、以下でさらに十分に記載する、「シーケンシングアイランド」として使用される追加の塩基も包含し得る。
図５は、本発明の実施形態における、ＸＴＥＮポリヌクレオチド構築物およびＢＰＸＴＥＮポリヌクレオチド構築物の構築における代表的な非限定的なステップの概略フローチャートである。個々のオリゴヌクレオチド５０１は配列モチーフ５０２、たとえば１２アミノ酸モチーフ（「１２マー」）にアニーリングされ、１２マーは続いてＢｂｓＩおよびＫｐｎＩ制限部位５０３を含有するオリゴとライゲーションすることができる。所望の長さのＸＴＥＮ遺伝子５０４が達成されるまで、ライブラリからの追加の配列モチーフがアニーリングされ１２マーとなる。ＸＴＥＮ遺伝子は、スタッファベクターにクローニングされる。ベクターは場合により、Ｆｌａｇ配列５０６と、それに続くＢｓａＩ、ＢｂｓＩ、およびＫｐｎＩ部位５０７ならびに、この場合は、単一のＢＰ遺伝子（この例ではエキセンジン−４をコードする）５０８が隣接するスタッファ配列とをコードして、単一のＢＰ５００を含むＢＰＸＴＥＮをコードする遺伝子を生じることができる。ＸＴＥＮをコードするポリヌクレオチドおよび前駆体配列のＸＴＥＮ名および配列番号の非網羅的なリストを表１１に提供する。
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ＸＴＥＮ−コード遺伝子のライブラリを、当分野で公知の１個以上の発現ベクターにクローニングされ得る。十分に発現するライブラリメンバの同定を容易にするために、リポータータンパク質への融合物としてライブラリを構築することができる。好適なリポーター遺伝子の非制限的な例は、緑色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、およびベータ−ガラクトシダーゼである。スクリーニングすることによって、好ましい宿主生物にて高濃度で発現できる短いＸＴＥＮ配列を同定することができる。続いて、ランダムＸＴＥＮダイマーのライブラリを生成させて、高レベル発現のスクリーニングを反復することができる。続いて、得られた構築物をいくつかの特性、たとえば発現レベル、プロテアーゼ安定性、または抗血清への結合についてスクリーニングすることができる。
本発明の一態様は、融合タンパク質の構成要素をコードするポリヌクレオチド配列を提供することであり、該配列の生成はコドン最適化を受けている。特に興味深いのは、ポリ
ペプチド組成物の発現を改善する、および産生宿主におけるコード遺伝子の遺伝的安定性を改善する目標を有するコドン最適化である。たとえばコドン最適化は、グリシンが豊富である、または非常に反復性のアミノ酸配列を有するＸＴＥＮ配列にとって特に重要である。コドン最適化はコンピュータプログラム（Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ，Ｃら（２００４）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２２：３４６−５３）を使用して行うことができ、コンピュータプログラムのいくつかはリボソーム停止を最小化する（Ｃｏｄａ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｉｎｃ．）。一実施形態において、ライブラリのすべてのメンバが同じアミノ酸配列をコードするが、コドン使用が多様であるコドンライブラリを構築することによって、コドン最適化を行うことができる。このようなライブラリは、ＸＴＥＮ含有生成物の大規模産生に特に好適である、高発現で遺伝的に安定なメンバについてスクリーニングすることができる。ＸＴＥＮ配列を設計するときに、いくつかの特性を考慮することができる。コードＤＮＡ配列の反復性を最小化することができる。さらに産生宿主によってまれにしか使用されないコドン（たとえば大腸菌におけるＡＧＧおよびＡＧＡのアルギニンコドンならびに１個のロイシンコドン）の使用を回避または最小化することができる。大腸菌の場合、２個のグリシンコドン、ＧＧＡおよびＧＧＧは、高発現されたタンパク質ではまれにしか使用されない。それゆえＸＴＥＮ配列をコードする遺伝子のコドン最適化は、非常に所望であり得る。高レベルのグリシンを有するＤＮＡ配列は、不安定性または低発現レベルをもたらすことができる高いＧＣ含有量を有する傾向がある。それゆえ可能な場合、ＸＴＥＮコード配列のＧＣ含有量がＸＴＥＮを製造するために使用される産生生物に好適であるように、コドンを選定することが好ましい。
場合により、全長ＸＴＥＮ−コード遺伝子は、１個以上のシーケンシングアイランドを含み得る。本文脈において、シーケンシングアイランドは、ＸＴＥＮライブラリ構築物配列とは別個であり、全長ＸＴＥＮ−コード遺伝子に存在しない、または存在することが予想されない制限部位を包含する、短ストレッチ配列である。一実施形態において、シーケンシングアイランドは、配列５’−ＡＧＧＴＧＣＡＡＧＣＧＣＡＡＧＣＧＧＣＧＣＧＣＣＡＡＧＣＡＣＧＧＧＡＧＧＴ−３’（配列番号２６１）である。別の実施形態において、シーケンシングアイランドは、配列５’−ＡＧＧＴＣＣＡＧＡＡＣＣＡＡＣＧＧＧＧＣＣＧＧＣＣＣＣＡＡＧＣＧＧＡＧＧＴ−３’（配列番号２６２）である。
代替として、ライブラリのすべてのメンバがアミノ酸配列をコードするが、コドン使用が多様であるコドンライブラリを構築することができる。このようなライブラリは、ＸＴＥＮ含有生成物の大規模産生に特に好適である、高発現で遺伝的に安定なメンバについてスクリーニングすることができる。
場合により、望ましくない配列を含有する単離体を消失させるためのライブラリのクローンを配列決定することができる。短いＸＴＥＮ配列の初期ライブラリによって、アミノ酸配列のいくつかの変形が可能となる。たとえば、いくつかの親水性アミノ酸が特定の位置に出現できるように、いくつかのコドンを無作為化することができる。
繰返し多量体化のプロセスの間に、得られたライブラリメンバを高レベル発現のスクリーンに加えて、溶解度またはプロテアーゼ抵抗性などの他の特徴についてスクリーニングすることができる。
所望の長さおよび特性のＸＴＥＮをコードする遺伝子がいったん選択されると、その遺伝子は、ＢＰをコードする遺伝子と隣接して、その遺伝子とインフレームの、またはスペーサ配列に隣接した構築物に該遺伝子をクローニングすることによって、ＢＰ遺伝子（複数可）のＮ末端および／またはＣ末端をコードするヌクレオチドに遺伝子的に融合される。本発明は、コードされるＢＰＸＴＥＮに応じて、上述の各種の順列を提供する。たとえば、上に描いたように、式ＩＩＩまたはＩＶによって実現されるような、２個のＢＰを含
むＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質をコードする遺伝子では、該遺伝子は２個のＢＰをコードするポリヌクレオチド、少なくとも第１のＸＴＥＮ、および場合により第２のＸＴＥＮおよび／またはスペーサ配列を有する。ＢＰ遺伝子をＸＴＥＮ構築物にクローニングするステップは、ライゲーションまたは多量体化ステップを通じて出現できる。図２に示すように、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質をコードする構築物は、構成要素のＸＴＥＮ２０２、ＢＰ２０３、およびスペーサ配列２０４の異なる配置で設計することができる。一実施形態において、図２Ａに例証されるように、構築物は、以下の順序（５’→３’）ＢＰ２０３およびＸＴＥＮ２０２で、または逆順で、構成要素の単量体ポリペプチドに相補的であるポリヌクレオチド配列、または該単量体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。別の実施形態において、図２Ｂに例証されるように、構築物は、以下の順序（５’→３’）ＢＰ２０３、スペーサ配列２０４、およびＸＴＥＮ２０２で、または逆順で、構成要素の単量体ポリペプチドに相補的であるポリヌクレオチド配列、または該単量体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。別の実施形態において、図２Ｃに例証されるように、構築物２０１は、以下の順序（５’→３’）：ＢＰ２０３の２個の分子およびＸＴＥＮ２０２で、または逆順で、構成要素に相補的であるポリヌクレオチド配列、または構成要素をコードするポリヌクレオチド配列を含む単量体ＢＰＸＴＥＮをコードする。別の実施形態において、図２Ｄに例証されるように、構築物は、以下の順序（５’→３’）：２個のＢＰ２０３の分子、スペーサ配列２０４、およびＸＴＥＮ２０２、または逆順で、構成要素の単量体ポリペプチドに相補的であるポリヌクレオチド配列、または該単量体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。別の実施形態において、図２Ｅに例証されるように、構築物は、以下の順序（５’→３’）：ＢＰ２０３、スペーサ配列２０４、ＢＰ２０３の第２の分子、およびＸＴＥＮ２０２、または逆順で、構成要素の単量体ポリペプチドに相補的であるポリヌクレオチド配列、または該単量体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。別の実施形態において、図２Ｆに例証されるように、構築物は、以下の順序（５’→３’）：ＢＰ２０３、ＸＴＥＮ２０２、ＢＰ２０３、および第２のＸＴＥＮ２０２、または逆順で、構成要素の単量体ポリペプチドに相補的であるポリヌクレオチド配列、または該単量体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。スペーサポリヌクレオチドは、切断配列をコードする配列を場合により包含することができる。当業者に明らかになるように、上述の他の順列も可能である。
本発明は、（ａ）表１１からのポリヌクレオチド配列、または（ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドに相補的である配列に対する高いパーセンテージの配列同一性を有する、ＸＴＥＮコードポリヌクレオチド変異体を含む。高いパーセンテージの配列同一性を有するポリヌクレオチドは、上述の（ａ）または（ｂ）に対して、少なくとも約８０％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８１％の、あるいは少なくとも約８２％の、あるいは少なくとも約８３％の、あるいは少なくとも約８４％の、あるいは少なくとも約８５％の、あるいは少なくとも約８６％の、あるいは少なくとも約８７％の、あるいは少なくとも約８８％の、あるいは少なくとも約８９％の、あるいは少なくとも約９０％の、あるいは少なくとも約９１％の、あるいは少なくとも約９２％の、あるいは少なくとも約９３％の、あるいは少なくとも約９４％の、あるいは少なくとも約９５％の、あるいは少なくとも約９６％の、あるいは少なくとも約９７％の、あるいは少なくとも約９８％の、およびあるいは少なくとも約９９％の核酸配列同一性を有する、または厳密性条件下で標的ポリヌクレオチドもしくはその相補体とハイブリダイズできる、ポリヌクレオチドである。
ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の相同性、配列類似性または配列同一性も、公知のソフトウェアまたはコンピュータプログラム、たとえばＢｅｓｔＦｉｔまたはＧａｐ対比較プログラム（ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，
Ｗｉｓ．５３７１１）を使用することによって都合よく決定され得る。ＢｅｓｔＦｉｔ
は、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの局所相同性アルゴリズム（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ．１９８１．２：４８２−４８９）を使用して、２個の配列間の同一性または類似性が最良のセグメントを発見する。Ｇａｐは、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈの方法（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．１９７０．４８：４４３−４５３）を使用して、１個の配列すべての、別の類似配列すべてとのグローバルアラインメントを行う。配列相同性、類似性または同一性の程度を決定するために、ＢｅｓｔＦｉｔなどの配列アラインメントプログラムを使用するとき、デフォルト設定が使用され得るか、または適切なスコアリングマトリクスが選択されて同一性、類似性または相同性スコアが最適化され得る。
「相補的」である核酸配列は、標準Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ相補性規則に従って塩基対合可能である核酸配列である。本明細書で使用する場合、「相補的配列」という用語は、上記の同じヌクレオチド比較によって評価され得るように、または本明細書に記載する条件のような厳密性条件下でＢＰＸＴＥＮ配列をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズできるとして定義されるような、実質的に相補的である核酸配列を意味する。
ＢＰＸＴＥＮキメラ組成物をコードする得られたポリヌクレオチドは次に、発現ベクターに個々にクローニングすることができる。核酸配列は、多種多様の手順によってベクターに挿入され得る。一般に、ＤＮＡは、適切な制限エンドヌクレアーゼ部位（複数可）に当分野で公知の技法を使用して挿入される。ベクター構成要素は概して、これに限定されるわけではないが、１つ以上のシグナル配列、複製起点、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサ要素、プロモータ、および転写終結配列を包含する。これらの構成要素の１つ以上を含有する好適なベクターの構築は、当業者に公知である標準ライゲーション技法を用いる。このような技法は当分野で周知であり、科学文献および特許文献に十分に記載されている。
各種のベクターが公に利用可能である。ベクターはたとえば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子、またはファージの形態で存在する。発現ベクターおよびクローニングベクターはどちらも、ベクターが１つ以上の選択された宿主細胞において複製できるようにする核酸配列を含有する。多種多様の細菌、酵母、およびウイルスのこのようなベクター配列は、周知である。使用できる有用な発現ベクターは、たとえば染色体、非染色体および合成ＤＮＡ配列のセグメントを包含する。好適なベクターは、これに限定されるわけではないが、ＳＶ４０およびｐｃＤＮＡの誘導体ならびに公知の細菌プラスミド、たとえばｃｏｌ ＥＩ、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭａｌ−Ｃ２、ｐＥＴ、ｐＧＥＸ（Ｓｍｉｔｈら、Ｇｅｎｅ ５７：３１−４０（１９８８）に記載されたような）、ｐＭＢ９およびその誘導体、プラスミド、たとえばＲＰ４、ファージＤＮＡ、たとえばファージＩの多数の誘導体、たとえばＮＭ９８９、ならびに他のファージＤＮＡ、たとえばＭ１３および線維状１本鎖ファージＤＮＡ；酵母プラスミド、たとえば２ミクロンプラスミドまたは２ｍプラスミドの誘導体、ならびにセントメリック（ｃｅｎｔｏｍｅｒｉｃ）シャトルベクターおよび組込み酵母シャトルベクター；真核細胞で有用なベクター、たとえば昆虫細胞または哺乳動物細胞で有用なベクター；プラスミドおよびファージＤＮＡの組み合わせから誘導されたベクター、たとえばファージＤＮＡまたは発現制御配列を用いるように改変されているプラスミド；などを包含する。必要条件は、ベクターが好ましい宿主細胞において複製可能および生存可能であることである。低または高コピー数ベクターは所望通りに使用され得る。
原核生物宿主による発現ベクターでの使用に好適なプロモータは、β−ラクタマーゼおよびラクトースプロモータ系［Ｃｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ，２７５：６１５（１９７８）；Ｇｏｅｄｄｅｌら、Ｎａｔｕｒｅ，２８１：５４４（１９７９）］、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモータ系［Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，８：４０５７（１９８０）；ＥＰ３６，７７６］、およびハイブリッドプロモータ、たとえばｔａｃプロモータ［ｄｅＢｏｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８０：２１−２５（１９８３）］を包含する。細菌系で使用するためのプロモータは、ＢＰＸＴＥＮポリペプチドをコードするＤＮＡに操作可能に連結されたシャイン・ダルガノ（Ｓ．Ｄ．）配列も含有することができる。
たとえばバキュロウイルス発現系において、非融合移入ベクター、たとえばこれに限定されるわけではないが、ｐＶＬ９４１（ＢａｍＨＩクローニング部位、Ｓｕｍｍｅｒｓら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８４：３９０−４０２（１９７８）から利用可能）、ｐＶＬ１３９３（ＢａｍＨＩ、Ｓｍａｌ、Ｘｂａｌ、ＥｃｏＲＩ、ＩＶｏｔｌ、Ｘｍａｌｌｌ、ＢｇＩＩＩおよびＰｓｔｌクローニング部位；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＶＬ１３９２（ＢｇＩＩＩ、Ｐｓｔｌ、ＮｏｔＩ、ＸｍａＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ、Ｘｂａｌｌ、ＳｍａｌおよびＢａｍＨＩクローニング部位；Ｓｕｍｍｅｒｓら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８４：３９０−４０２（１９７８）およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ（ＢａｍＨＩ、ＢｇＩＩＩ、Ｐｓｔｌ、ＮｃｏｌおよびＨｉｎｄｉＩＩクローニング部位、青色／白色組換えスクリーニングによる、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、および融合移入ベクター、たとえばこれに限定されるわけではないが、ｐＡｃ７００（ＢａｍＨＩ認識部位が開始コドンではじまる、ＢａｍＨＩおよびＫｐｎＩクローニング部位；Ｓｕｍｍｅｒｓら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８４：３９０−４０２（１９７８））、ｐＡｃ７０１およびｐＡｃ７０−２（ｐＡｃ７００と同じ、異なる読み取り枠を有する）、ｐＡｃ３６０［ポリヘドリン開始コドンの３６塩基対下流の、ＢａｍＨＩクローニング部位；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（１９９５））およびｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓＡ、Ｂ、Ｃ（ＢａｍＨＩ、ＢｇＩＩＩ、Ｐｓｔｌ、Ｎｃｏ１およびＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位を有する３つの異なる読み取り枠、ＰｒｏＢｏｎｄ精製およびプラークの青色／白色組換えスクリーニングのためのＮ末端ペプチド；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（２２０）のどちらも使用できる。
哺乳動物発現ベクターは、複製起点、好適なプロモータおよびエンハンサ、ならびに任意の必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよびアクセプタ部位、転写終結配列、ならびに５’フランキング非転写配列も含むことができる。ＳＶ４０スプライス、およびポリアデニル化部位から誘導されたＤＮＡ配列は、必要とされる非転写遺伝要素を提供するために使用され得る。本発明で使用のために意図される哺乳動物発現ベクターは、誘導性プロモータを有するベクター、たとえばジヒドロ葉酸還元酵素プロモータ、ＤＨＦＲ発現カセットを有する任意の発現ベクターまたはＤＨＦＲ／メトトレキサート同時増幅ベクター、たとえばｐＥＤ（Ｐｓｔｌ、Ｓａｉｌ、Ｓｂａｌ、ＳｍａｌおよびＥｃｏＲＩクローニング部位、クローン化遺伝子およびＤＨＦＲの両方を発現するベクターを有する；Ｒａｎｄａｌ Ｊ．Ｋａｕｆｍａｎ，１９９１，Ｒａｎｄａｌ Ｊ．Ｋａｕｆｍａｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１６，１２（１９９１））を包含する。あるいはグルタミンシンテターゼ／メチオニンスルホキシミン同時増幅ベクター、たとえばｐＥＥ１４（ベクターがグルタミンシンテターゼおよびクローン化遺伝子を発現する、Ｈｉｎｄｌｌｌ、Ｘｂａｌｌ、Ｓｍａｌ、Ｓｂａｌ、ＥｃｏＲＩおよびＳｅｌｌクローニング部位；Ｃｅｌｌｔｅｃｈ）。エプスタイン・バー・ウイルス（ＥＢＶ）または核抗原（ＥＢＮＡ）の制御下でエピソーム発現を誘導するベクター、たとえばｐＲＥＰ４（ＢａｍＨＩ ｒ ＳｆＨ、Ｘｈｏｌ、ＮｏｔＩ、Ｎｈｅｌ、Ｈｉｎｄｉ ＩＩ、ＮｈｅＩ、ＰｖｕＩＩおよびＫｐｎ１クローニング部位、構成的ＲＳＶ−ＬＴＲプロモータ、ハイグロマイシン選択可能マーカー；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＣＥＰ４（ＢａｍＨＩ、ＳｆＨ、Ｘｈｏｌ、ＮｏｔI、Ｎｈｅ
ｌ、Ｈｉｎｄｌｌｌ、Ｎｈｅｌ、ＰｖｕＩＩおよびＫｐｎ１クローニング部位、構成的ｈＣＭＶ最初期遺伝子プロモータ、ハイグロマイシン選択可能マーカー；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＭＥＰ４（Ｋｐｎｌ、Ｐｖｕｌ、Ｎｈｅｌ、Ｈｉｎｄｌｌｌ、ＮｏｔＩ、Ｘｈｏｌ、Ｓｆｉｌ、ＢａｍＨＩクローニング部位、誘導性メタロチオネイン（ｍｅｔｈａｌ
ｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ）Ｈａ遺伝子プロモータ、ハイグロマイシン選択可能マーカー、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＲＥＰ８（ＢａｍＨＩ、Ｘｈｏｌ、ＮｏｔＩ、Ｈｉｎｄｌｌｌ、ＮｈｅｌおよびＫｐｎｌクローニング部位、ＲＳＶ−ＬＴＲプロモータ、ヒスチジノール選択可能マーカー；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＲＥＰ９（Ｋｐｎｌ、Ｎｈｅｌ、Ｈｉｎｄｌｌｌ、ＮｏｔＩ、Ｘｈｏ１、Ｓｆｉ１、ＢａｍＨＩクローニング部位、ＲＳＶ−ＬＴＲプロモータ、Ｇ４１８選択可能マーカー；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびｐＥＢＶＨｉｓ（ＲＳＶ−ＬＴＲプロモータ、ハイグロマイシン選択可能マーカー、ＰｒｏＢｏｎｄ樹脂によって精製可能であり、エンテロキナーゼによって切断されたＮ末端ペプチド；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が使用できる。
本発明で使用するための選択可能哺乳動物発現ベクターは、これに限定されるわけではないが、ｐＲｃ／ＣＭＶ（Ｈｉｎｄ １１１、ＢｓｔＸＩ、ＮｏｔＩ、ＳｂａｌおよびＡｐａｌクローニング部位、Ｇ４１８選択、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＲｃ／ＲＳＶ（Ｈｉｎｄ ＩＩ、Ｓｐｅｌ、ＢｓｔＸＩ、ＮｏｔＩ、Ｘｂａｌクローニング部位、Ｇ４１８選択、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などを含む。本発明で使用できるワクシニアウイルス哺乳動物発現ベクター（たとえばＲａｎｄａｌｌ Ｊ．Ｋａｕｆｍａｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １６．１２（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら、編、Ｗｉｌｅｙ １９９１を参照）は、これに限定されるわけではないが、ｐＳＣｌ１（Ｓｍａｌクローニング部位、ＴＫ−およびベータ−ｇａｌ選択）、ｐＭＪ６０１（Ｓａｌ １、Ｓｍａ １、Ａ ｆｌＩ、Ｎａｒｌ、ＢｓｐＭｌＩ、ＢａｍＨＩ、Ａｐａｌ、Ｎｈｅｌ、ＳａｃＩＩ、Ｋｐｎ１およびＨｉｎｄｌｌｌクローニング部位；ＴＫ−および−ｇａｌ選択）、ｐＴＫｇｐｔＦ１Ｓ（ＥｃｏＲＩ、Ｐｓｔｌ、ＳａＩＩＩ、Ａｃｃｌ、ＨｉｎｄＩＩ、Ｓｂａｌ、ＢａｍＨＩおよびＨｐａクローニング部位、ＴＫまたはＸＰＲＴ選択）などを包含する。
本発明でまた使用できる酵母発現系は、これに限定されるわけではないが、非融合ｐＹＥＳ２ベクター（ＸＪｂａｌ、Ｓｐｈｌ、Ｓｈｏｌ、ＮｏｔＩ、ＧｓｔＸＩ、ＥｃｏＲＩ、ＢｓｔＸＩ、ＢａｍＨＩ、Ｓａｄ、Ｋｐｎ１およびＨｉｎｄｌｌｌクローニング部位、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、融合ｐＹＥＳＨｉｓＡ、Ｂ、Ｃ（Ｘｂａｌｌ、Ｓｐｈｌ、Ｓｈｏｌ、ＮｏｔＩ、ＢｓｔＸＩ、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、Ｓａｄ、ＫｐｎｌおよびＨｉｎｄｉＩＩクローニング部位、ＰｒｏＢｏｎｄ樹脂によって精製され、エンテロキナーゼによって切断されたＮ末端ペプチド；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＲＳベクターなどを包含する。
さらにキメラＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質コードポリヌクレオチド分子を含有する発現ベクターは、薬物選択マーカーを包含し得る。このようなマーカーは、クローニングならびにキメラＤＮＡ分子を含有するベクターの選択または同定を補助する。たとえばネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）抑制因子、グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＧＰＴ）、ゼオシン、およびヒスチジノールに抵抗性を与える遺伝子は、有用な選択可能マーカーである。あるいは酵素、たとえば単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼ（ｔｋ）またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）が用いられ得る。免疫マーカーも用いることができる。いずれの公知の選択可能マーカーも、遺伝子産物をコードする核酸と同時に発現可能である限り用いられ得る。選択可能マーカーのさらなる例は当業者に周知であり、リポーター、たとえば増強緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、ベータ−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）を包含する。
一実施形態において、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質組成物をコードするポリヌクレオチドは、発現宿主系に適切なＮ末端シグナル配列のＣ末端側に融合することができる。シグナル配列は、トランスロケーションおよび分泌プロセスの間に通例タンパク質分解により
タンパク質から除去されて、限定した（ｄｅｆｉｎｅｄ）Ｎ末端が生じる。細菌系、酵母系、昆虫系および哺乳動物系を包含する大半の発現系で、多岐にわたるシグナル配列が記載されている。各発現系の好ましい例の非限定的なリストは、本明細書に従う。好ましいシグナル配列は、大腸菌発現のためのＯｍｐＡ、ＰｈｏＡ、およびＤｓｂＡである。酵母発現に好ましいシグナルペプチドは、ｐｐＬ−アルファ、ＤＥＸ４、インベルターゼシグナルペプチド、酸性ホスファターゼシグナルペプチド、ＣＰＹ、またはＩＮＵ１である。昆虫細胞発現に好ましいシグナル配列は、タバコスズメガ脂肪動員ホルモン前駆体、ＣＰ１、ＣＰ２、ＣＰ３、ＣＰ４、ＴＰＡ、ＰＡＰ、またはｇｐ６７である。哺乳動物発現に好ましいシグナル配列は、ＩＬ２Ｌ、ＳＶ４０、ＩｇＧカッパおよびＩｇＧラムダである。
別の実施形態において、十分に発現された非依存性タンパク質ドメインを潜在的に含むリーダー配列は、プロテアーゼ切断部位によって離された、ＢＰＸＴＥＮ配列のＮ末端に融合させることができる。設計されたタンパク質分解部位での切断を抑制しないいずれのリーダーペプチド配列も使用できるが、好ましい実施形態の配列は、組成物全体の発現および折畳みが著しく悪影響を及ぼされず、好ましくは発現、溶解度、および／または折畳み効率が著しく改善されるように、安定な十分に発現された配列を含む。多岐にわたる好適なリーダー配列が文献に記載されている。好適な配列の非限定的なリストは、マルトース結合タンパク質、セルロース結合ドメイン、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、６ｘＨｉｓタグ（配列番号２６３）、ＦＬＡＧタグ、ヘマグルチニン（ｈｅｍａｇｌｕｔｉｎｉｎ）タグ、および緑色蛍光タンパク質を包含する。リーダー配列は、文献および本明細書の上で十分に記載された方法による、とりわけＡＴＧ開始コドンの後の第２コドン位置におけるコドン最適化によって、さらに改善することもできる。
特定の部位にてタンパク質を切断する各種のインビトロ酵素方法が公知である。このような方法は、エンテロキナーゼ（ＤＤＤＫ（配列番号２６４））、第Ｘａ因子（ＩＤＧＲ（配列番号２６５））、トロンビン（ＬＶＰＲＧＳ（配列番号２６６））、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ（商標）（ＬＥＶＬＦＱＧＰ（配列番号２６７））、ＴＥＶプロテアーゼ（ＥＱＬＹＦＱＧ（配列番号２６８））、３Ｃプロテアーゼ（ＥＴＬＦＱＧＰ（配列番号２６９））、ソルターゼＡ（ＬＰＥＴＧ）、グランザイムＢ（Ｄ／Ｘ、Ｎ／Ｘ、Ｍ／ＮまたはＳ／Ｘ）、インテイン、ＳＵＭＯ、ＤＡＰａｓｅ（ＴＡＧＺｙｍｅ（商標））、Ａｅｒｏｍｏｎａｓアミノペプチダーゼ、アミノペプチダーゼＭ、ならびにカルボキシペプチダーゼＡおよびＢの使用を包含する。追加の方法は、Ａｒｎａｕら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ４８：１−１３（２００６）に開示されている。
他の実施形態において、ＸＴＥＮ特徴を有する少なくとも約２０〜約６０アミノ酸をコードする最適化ポリヌクレオチド配列は、ＸＴＥＮ配列のＮ末端で包含されて、翻訳の開始を促進し、ヘルパードメインの存在なしでタンパク質のＮ末端でのＸＴＥＮ融合物の発現を可能にできる。上述の利点において、配列は続いての切断を必要とせず、そのためにＸＴＥＮ含有組成物を製造するステップの数が低減される。実施例でさらに詳細に記載されるように、最適化Ｎ末端配列は、非構造化タンパク質の属性を有するが、翻訳の開始および増強された発現を促進するその能力のために選択されたアミノ酸をコードするヌクレオチド塩基を包含し得る。上述の一実施形態において、最適化ポリヌクレオチドは、ＡＥ９１２（配列番号２１７）に対して少なくとも約９０％の配列同一性を有するＸＴＥＮ配列をコードする。上述の別の実施形態において、最適化ポリヌクレオチドは、ＡＭ９２３（配列番号２１８）に対して少なくとも約９０％の配列同一性を有するＸＴＥＮ配列をコードする。
別の実施形態において、リーダー配列構築物のプロテアーゼ部位は、該部位がインビボ
プロテアーゼによって認識されるように選定される。本実施形態において、タンパク質は、適切なプロテアーゼとの接触を回避することによってリーダーを保持しながら、発現系から精製される。全長構築物は次に、患者に注射される。注射の際に、構築物は切断部位に特異的なプロテアーゼと接触して、プロテアーゼによって切断される。未切断タンパク質が切断形態よりも実質的に活性が低い場合、本方法は、活性形態がインビボでゆっくりと生じるため、毒性を回避しながら、より高い初期用量を可能にする有益な効果を有する。本用途に有用であるインビボプロテアーゼのいくつかの非限定的な例は、組織カリクレイン、血漿カリクレイン、トリプシン、ペプシン、キモトリプシン、トロンビン、およびマトリクスメタロプロテイナーゼ、または表１０のプロテアーゼを包含する。
本方式では、単量体ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質をコードするキメラＤＮＡ分子が構築物内で生じる。場合により、本キメラＤＮＡ分子は、さらに適切な発現ベクターである別の構築物へ移行またはクローン化され得る。この時点で、キメラＤＮＡ分子を発現できる宿主細胞をキメラＤＮＡ分子によって形質転換することができる。目的のＤＮＡセグメントを含有するベクターは、宿主細胞に、周知の方法によって、細胞宿主の種類に応じて移行することができる。たとえば、塩化カルシウム形質移入は普通、原核細胞に利用されるのに対して、リン酸カルシウム処理、リポフェクション、または電気穿孔は他の細胞宿主に使用され得る。哺乳動物細胞を形質変換するために使用される他の方法は、ポリブレンの使用、プロトプラスト融合、リポソーム、電気穿孔、およびマイクロインジェクションを包含する。概してＳａｍｂｒｏｏｋら、上掲を参照。
形質転換は、キャリア、たとえば発現ベクターを利用して、または利用せずにおこり得る。次に、形質転換された宿主細胞は、ＢＰＸＴＥＮをコードするキメラＤＮＡ分子の発現に好適な条件下で培養される。
本発明は、本明細書で開示する単量体融合タンパク質組成物を発現する宿主細胞も提供する。好適な真核宿主細胞の例は、これに限定されるわけではないが、哺乳動物細胞、たとえばＶＥＲＯ細胞、ＨＥＬＡ細胞、たとえばＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ２、ＣＨＯ細胞系統、ＣＯＳ細胞、ＷＩ３８細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、３Ｔ３細胞、Ａ５４９細胞、ＰＣ１２細胞、Ｋ５６２細胞、２９３細胞、Ｓｆ９細胞およびＣｖＩ細胞を包含する。好適な非哺乳動物真核細胞の例は真核微生物を包含し、たとえば糸状菌または酵母は、ベクターをコードするのに好適なクローニング宿主または発現宿主である。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、普通に使用される低級真核宿主微生物である。他はＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ（Ｂｅａｃｈ ａｎｄ Ｎｕｒｓｅ，Ｎａｔｕｒｅ，２９０：１４０［１９８１］；１９８５年５月２日に公開されたＥＰ １３９，３８３）；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ宿主（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，９４３，５２９；Ｆｌｅｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：９６８−９７５（１９９１））たとえば、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ（ＭＷ９８−８Ｃ，ＣＢＳ６８３，ＣＢＳ４５７４；Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，７３７［１９８３］）、Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ（ＡＴＣＣ １２，４２４）、Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ（ＡＴＣＣ １６，０４５）、Ｋ．ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ（ＡＴＣＣ ２４，１７８）、Ｋ．ｗａｌｔｉｉ（ＡＴＣＣ ５６，５００）、Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ（ＡＴＣＣ
３６，９０６；Ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８：１３５（１９９０）），Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、およびＫ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ；ｙａｒｒｏｗｉａ（ＥＰ ４０２，２２６）；Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ（ＥＰ １８３，０７０；Ｓｒｅｅｋｒｉｓｈｎａら、Ｊ．Ｂａｓｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２８：２６５−２７８ ［１９８８］）；Ｃａｎｄｉｄａ；Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ
ｒｅｅｓｉａ（ＥＰ ２４４，２３４）；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ（Ｃａｓｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７６：５２５９−５２６３［１９７９］）；Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ、たとえばＳｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ
ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ（１９９０年１０月３１日に公開されたＥＰ ３９４，５３８）；および糸状菌、たとえばＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ，Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ（１９９１年１月１０日に公開されたＷＯ ９１／００３５７）、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ宿主、たとえばＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓ（Ｂａｌｌａｎｃｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１１２：２８４−２８９［１９８３］；Ｔｉｌｂｕｒｎら、Ｇｅｎｅ，２６：２０５−２２１［１９８３］；Ｙｅｌｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：１４７０−１４７４［１９８４］）およびＡ．ｎｉｇｅｒ（Ｋｅｌｌｙ ａｎｄ Ｈｙｎｅｓ，ＥＭＢＯ
Ｊ．，４：４７５−４７９［１９８５］）を包含する。メチロトローフ酵母は、本明細書で好適であり、これに限定されるわけではないが、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ、およびＲｈｏｄｏｔｏｒｕｌａから成る属より選択されるメタノールでの増殖が可能な酵母を包含する。このクラスの酵母を例示する具体的な種のリストは、Ｃ．Ａｎｔｈｏｎｙ，Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｓ，２６９（１９８２）に見出され得る。
本発明で使用できる他の好適な細胞は、これに限定されるわけではないが、原核宿主細胞株、たとえば大腸菌（たとえばＤＨ５−α株）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ，Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ，ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓおよびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属の株を包含する。好適な原核生物の非制限的な例は、属：Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ；Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ；Ｂｄｅｌｌｏｖｉｂｒｉｏ；Ｂｏｒｒｅｌｉａ；Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ；Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ；Ｌｉｓｔｅｒｉａ；Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ；Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ；Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ；Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ；およびＶｉｂｒｉｏからの原核生物を包含する。具体的な株の非制限的な例は：Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ；Ｂｄｅｌｌｏｖｉｂｒｉｏ ｂａｃｔｅｒｉｏｖｏｒｕｓ；Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ；Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ；Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ；Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ；Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ；Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ；Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ；Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｈｅｙｅｎｓｉｓ；Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｅｖａｌｏｎｉｉ；Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ；Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ；Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ
ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｏｌｏｓｐｏｒｅｕｓ；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ；Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ；Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ｖｏｌｃａｎｉｕｍ；Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ；Ｖｉｂｒｉｏ ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ；およびＶｉｂｒｉｏ ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓを包含する。
目的のポリヌクレオチドを含有する宿主細胞は、プロモータの活性化、形質転換体の選択または遺伝子の増幅に適切に改変された従来の栄養媒体（たとえばＨａｍの栄養混合物）で培養することができる。培養条件、たとえば温度、ｐＨなどは、発現に選択された宿主細胞を用いて以前使用された条件であり、当業者に明らかになる。細胞は通例、遠心分離によって収集して、物理的または化学的手段によって破壊し、得られた粗抽出物はさらなる精製のために保持する。宿主細胞によって分泌された組成物では、遠心分離からの上
清を分離して、さらなる精製のために保持する。タンパク質の発現で用いられる微生物細胞は、凍結−解凍サイクリング、超音波処理、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用を包含する、任意の便利な方法によって破壊することができ、そのすべては当業者に周知である。細胞溶解を包含する実施形態は、キメラＤＮＡ分子の発現後に分解を制限するプロテアーゼ抑制因子を含有するバッファーの使用を伴い得る。好適なプロテアーゼ抑制因子は、これに限定されるわけではないが、ロイペプチン、ペプスタチンまたはアプロチニンを包含する。上清は次に、連続した増加濃度の飽和硫酸アンモニウムに沈殿され得る。
遺伝子発現は、たとえば従来のサザンブロッティング、ｍＲＮＡの転写を定量するノーザンブロッティング（［Ｔｈｏｍａｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：５２０１−５２０５（１９８０）］）、ドットブロッティング（ＤＮＡ分析）、またはインサイチュハイブリダイゼーションによって、適切に標識されたプローブを使用して本明細書で提供する配列に基づいて、試料において直接測定され得る。あるいは、ＤＮＡ２本鎖、ＲＮＡ２本鎖、およびＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド２本鎖またはＤＮＡ−タンパク質２本鎖を含む、特定の２本鎖を認識できる抗体が用いられ得る。抗体は今度は標識され得て、アッセイは、２本鎖が表面に結合されているところで実施され得、その結果、表面での２本鎖の形成の際に２本鎖に結合された抗体の存在を検出できる。
遺伝子発現は、あるいは、遺伝子産物の発現を直接定量するための免疫蛍光法、たとえば細胞もしくは組織切片の免疫組織化学染色および細胞培養物もしくは体液のアッセイまたは選択可能マーカーの検出によって測定され得る。免疫組織化学染色および／または試料流体のアッセイに有用な抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルのどちらでもよく、任意の哺乳動物で調製され得る。好都合にも、抗体は、天然配列ＢＰポリペプチドに対して、または本明細書で提供されるＤＮＡ配列に基づく合成ペプチドに対して、またはＢＰに融合され、特異的抗体エピトープをコードする外因性配列に対して調製され得る。選択可能マーカーの例は当業者に周知であり、リポーター、たとえば増強緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、ベータ−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）を包含する。
発現されたＢＰＸＴＥＮポリペプチド生成物（複数可）は、当分野で公知の方法を介して、または本明細書で開示する方法によって精製され得る。それぞれの宿主細胞によって産生される融合タンパク質を回収および精製するようにそれぞれ適応させた手順、たとえばゲル濾過、親和性精製、塩分画、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイト吸着クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーおよびゲル電気泳動が使用され得る。いくつかの発現されたＢＰＸＴＥＮは、単離および精製の間に再折畳みを必要とし得る。精製方法は、Ｒｏｂｅｒｔ Ｋ．Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒ．Ｃａｓｔｏｒ（ｅｄ．），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ １９９４、およびＳａｍｂｒｏｏｋら、上掲に記載されている。複数ステップ精製分離もＢａｒｏｎら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０：１７９−９０（１９９０）およびＢｅｌｏｗら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ．６７９：６７−８３（１９９４）に記載されている。
ＶＩＩ）薬学的組成物
本発明は、ＢＰＸＴＥＮを含む薬学的組成物を提供する。一実施形態において、薬学的組成物は、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質および少なくとも１つの薬学的に許容され得るキャリアを含む。本発明のＢＰＸＴＥＮポリペプチドは、公知の方法に従って調合されて、薬学的に有用な組成物を調製することができ、これによりポリペプチドは薬学的に許容され得るキャリアビヒクル、たとえば水溶液またはバッファー、薬学的に許容され得る懸濁物およびエマルションと混合して組み合わされる。非水性溶媒の例は、プロピルエチレン
グリコール、ポリエチレングリコールおよび植物油を包含する。治療調合物は貯蔵のために、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に記載されるように、所望の純度を有する活性成分を任意選択の生理的に許容され得るキャリア、賦形剤または安定剤と混合することによって、凍結乾燥調合物または水溶液の形態で調製される。
薬学的組成物は、経口で、鼻内に、非経口で、または吸入療法によって投与することができ、錠剤、ロゼンジ剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、アンプル剤、坐剤またエアゾール形態の形態を取り得る。薬学的組成物は、水性または非水性希釈剤における活性剤の懸濁剤、液剤およびエマルジョン、シロップ、顆粒剤または粉剤の形態も取り得る。さらに、薬学的組成物は他の薬学的活性化合物または複数の本発明の化合物も含有することができる。
さらに詳細には、本薬学的組成物は、経口、直腸、鼻、局所（経皮、エアゾール、口腔（ｂｕｃｃａｌ）および舌下を包含する）、膣、非経口（皮下、輸液ポンプによる皮下、筋肉内、静脈内および皮内を包含する）、硝子体内、および肺を包含する任意の好適な経路による治療のために投与され得る。好ましい経路がレシピエントの状態および年齢、ならびに処置される疾患によって変化することも認められる。
一実施形態において、薬学的組成物は皮下投与される。本実施形態において、組成物は、投与前に再構成される凍結乾燥粉剤として供給され得る。組成物は、患者に直接投与することができる液体形態でも供給され得る。一実施形態において、組成物は、患者が容易に組成物を自分で投与できるように、プレフィルドシリンジ中の液剤として供給される。
本発明で有用な徐放調合物は、マトリクスおよびコーティング組成物を含む、経口調合物であり得る。好適なマトリクス材料は、ロウ（たとえばカルナウバ（ｃａｍａｕｂａ）、ミツロウ、パラフィンロウ、セレシン、シェラックロウ、脂肪酸および脂肪アルコール）、油、硬化油または脂（たとえば硬化ナタネ油、ヒマシ油、牛脂、パーム油、およびダイズ油）、およびポリマー（たとえばヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、およびポリエチレングリコール）を包含し得る。他の好適なマトリクス打錠材料は、他のキャリア、または充填剤を含む、微結晶性セルロース、粉末セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、エチルセルロースである。錠剤は、顆粒、コート粉末、またはペレットも含有し得る。錠剤は複数層（ｍｕｌｔｉ−ｌａｙｅｒｅｄ）でもあり得る。複数層錠剤は、活性成分が顕著に異なる薬物動態プロフィールを有するときにとりわけ好ましい。場合により、完成錠剤はコーティングされ得るか、未コーティングであり得る。
コーティング組成物は、不溶性マトリクスポリマーおよび／または水溶性材料を含み得る。水溶性材料は、ポリマー、たとえばポリエチレングリコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、または単量体材料、たとえば糖（たとえばラクトース、スクロース、フルクトース、マンニトールなど）、塩（たとえば塩化ナトリウム、塩化カリウムなど）、有機酸（たとえばフマル酸、コハク酸、乳酸、および酒石酸）、およびその混合物であることができる。場合により、腸溶ポリマーがコーティング組成物に組み入れられ得る。好適な腸溶ポリマーは、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アセテートスクシネート（ａｃｅｔａｔｅ ｓｕｃｃｉｎａｔｅ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、フタレート、ポリビニルアセテートフタレート、セルロースアセテートフタレート、セルロースアセテートトリメリテート、シェラック、ゼイン、およびカルボキシ基を含有するポリメタクリレートを包含する。コーティング組成物は好適な可塑剤、たとえばフタル酸ジエチル、クエン酸エステル、ポリエチレングリコール、グリセロール、アセチル化グリセリド、アセ
チル化クエン酸エステル、セバシン酸ジブチル、およびヒマシ油などを添加することによって可塑化され得る。コーティング組成物は充填剤も包含し得て、該充填剤は不溶性材料、たとえば２酸化ケイ素、２酸化チタン、タルク、カオリン、アルミナ、デンプン、粉末セルロース、ＭＣＣ、またはポラクリリンカリウムであることができる。コーティング組成物は、有機溶媒また水性溶媒またはその混合物による溶液またはラテックスとして利用され得る。溶媒、たとえば水、低級アルコール、低級塩素化炭化水素、ケトン、またはその混合物が使用され得る。
本発明の組成物は、多種多様の賦形剤を使用して調合され得る。好適な賦形剤は、微結晶性セルロース（たとえばＡｖｉｃｅｌ ＰＨ１０２、Ａｖｉｃｅｌ ＰＨ１０１）、ポリメタクリレート、ポリ（エチルアクリレート、メチルメタクリレート、トリメチルアンモニオエチルメタクリレートクロライド）（たとえばＥｕｄｒａｇｉｔ ＲＳ−３０Ｄ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（Ｍｅｔｈｏｃｅｌ Ｋ１００Ｍ、Ｐｒｅｍｉｕｍ ＣＲ Ｍｅｔｈｏｃｅｌ Ｋ１００Ｍ、Ｍｅｔｈｏｃｅｌ Ｅ５、Ｏｐａｄｒｙ（登録商標））、ステアリン酸マグネシウム、タルク、クエン酸トリエチル、水性エチルセルロース分散物（スレレアーゼ（登録商標））、および硫酸プロタミンを包含する。低速放出剤はキャリアも含み得て、該キャリアはたとえば溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤を含むことができる。薬学的に許容され得る塩、たとえば無機塩、たとえば塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、または硫酸塩、ならびに有機酸の塩、たとえば酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、または安息香酸塩もこれらの低速放出剤で使用できる。組成物は、液体、たとえば水、食塩水、グリセロール、およびエタノール、ならびに物質、たとえば湿潤剤、乳化剤、またはｐＨ緩衝剤も含有し得る。リポソームもキャリアとして使用され得る。
別の実施形態において、本発明の組成物はリポソーム内にカプセル化され、これは延長された期間にわたって制御された方式で有益な活性剤を送達する有用性を証明している。リポソームは、封入した水性容量を含有する閉じた２重層膜である。リポソームは、単膜２重層を所有する単層ベシクル、またはそれぞれ次の層から水層によって離された多重膜２重層を備えた多層状ベシクルであり得る。得られた膜２重層の構造物は、脂質の疎水性（非極性）テールが２重層の中心に向けられているが、親水性（極性）ヘッドが水相に向くようになっている。一実施形態において、リポソームは、単核食細胞系の臓器、主に肝臓および脾臓による取り込みを回避する軟性水溶性ポリマーによってコーティングされ得る。リポソームを包囲するのに好適な親水性ポリマーは制限なく、その内容が全体として参照により組み入れられているＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏｓ．６，３１６，０２４；６，１２６，９６６；６，０５６，９７３；６，０４３，０９４に記載されているような、ＰＥＧ、ポリビニルピロリドン、ポリビニルメチルエーテル、ポリメチルオキサゾリン、ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、ポリヒドロキシプロピルメタクリレート、ポリヒドロキシ（ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘ）エチルアクリレート、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ポリエチレングリコール、ポリアスパルタミドおよび親水性ペプチド配列を包含する。
リポソームは、当分野で公知のいずれの脂質または脂質の組み合わせからも成り得る。たとえばベシクル形成脂質は、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏｓ．６，０５６，９７３および５，８７４，１０４に開示されているように、リン脂質、たとえばホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、およびスフィンゴミエリンを包含する天然に存在する脂質または合成脂質であり得る。ベシクル形成脂質は、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．６，０５６，９７３にも開示されているような、糖脂質、セレブロシド、またはカチオン性脂質、たとえば１，２−ジオレイルオキシ−３−（トリメチルアミノ）プロパン
（ＤＯＴＡＰ）；Ｎ−［１−（２，３，−ジテトラデシルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）；Ｎ−［１［（２，３，−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＯＲＩＥ）；Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＴＭＡ）；３［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）カルバモイル（ｃａｒｂａｍｏｌｙ）］コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）；またはジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡＢ）でもあり得る。コレステロールも、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏｓ．５，９１６，５８８および５，８７４，１０４に開示されているように、ベシクルに安定性を付与する適正な範囲内で存在し得る。
さらなるリポソーム技術は、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏｓ．６，７５９，０５７；６，４０６，７１３；６，３５２，７１６；６，３１６，０２４；６，２９４，１９１；６，１２６，９６６；６，０５６，９７３；６，０４３，０９４；５，９６５，１５６；５，９１６，５８８；５，８７４，１０４；５，２１５，６８０；および４，６８４，４７９に記載されており、その内容は参照により本明細書に組み入れられている。これらはリポソームおよび脂質コートマイクロバブル、ならびにその製造方法について記載している。それゆえ、本発明の開示およびこれらの他の特許の開示の両方を考慮している当業者は、本発明のポリペプチドの徐放のためのリポソームを産生できる。
液体調合物では、所望の特性は、該調合物が静脈内、筋肉内、関節内、または皮下投与のために２５、２８，３０、３１、３２ゲージ針を通過できる形態で供給されることである。
経皮調合物による投与は、概してたとえば、参照によりその全体が本明細書に組み入れられている、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏｓ．５，１８６，９３８および６，１８３，７７０、４，８６１，８００、６，７４３，２１１、６，９４５，９５２、４，２８４，４４４、およびＷＯ ８９／０９０５１に記載されているものを包含する、また当分野で公知の方法を使用して行うことができる。経皮パッチは、吸収の問題を有するポリペプチドを用いた特に有用な実施形態である。パッチは、皮膚浸透性活性成分の放出を１２時間、２４時間、３日間、および７日間の期間にわたって制御するように作製することができる。１例において、本発明のポリペプチドの２倍の１日過剰量が不揮発性流体に置かれる。本発明の組成物は粘性不揮発性液体の形態で提供される。特定の調合物の皮膚を通じた浸透は、当分野の標準方法によって測定され得る（たとえばＦｒａｎｚら、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍ．６４：１９４−１９５（１９７５））。好適なパッチの例は、受動移行皮膚パッチ、イオン導入皮膚パッチ、またはニコダームなどのマイクロニードルを用いたパッチである。
他の実施形態において、組成物は鼻内、口腔、または舌下経路を介して脳に送達されて、活性剤の嗅覚路を通じたＣＮＳへの移行を可能とし、全身投与を低下させ得る。この投与経路で普通に使用される器具は、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．６，７１５，４８５に包含されている。この経路を介して送達される組成物は、ＣＮＳ投薬の増加または全身負荷の低下を可能にして、特定の薬物に関連付けられた全身毒性リスクを低下させ得る。皮下に移植可能な器具での送達のための薬学的組成物の調製は、当分野で公知の方法、たとえばＵ．Ｓ．Ｎｏｓ．３，９９２，５１８；５，６６０，８４８；および５，７５６，１１５に記載された方法を使用して行うことができる。
浸透圧ポンプは、錠剤、丸剤、カプセル剤または移植可能な器具の形態で低速放出剤として使用され得る。浸透圧ポンプは、当分野で周知であり、徐放薬物送達用の浸透圧ポンプの提供に経験がある会社から、当業者が容易に利用することができる。例はＡＬＺＡの
ＤＵＲＯＳ（商標）；ＡＬＺＡのＯＲＯＳ（商標）；Ｏｓｍｏｔｉｃａ ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌのＯｓｍｏｄｅｘ（商標）システム；Ｓｈｉｒｅ ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓのＥｎＳｏＴｒｏｌ（商標）システム；およびＡｌｚｅｔ（商標）である。浸透圧ポンプ技術について記載した特許は、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏｓ．６，８９０，９１８；６，８３８，０９３；６，８１４，９７９；６，７１３，０８６；６，５３４，０９０；６，５１４，５３２；６，３６１，７９６；６，３５２，７２１；６，２９４，２０１；６，２８４，２７６；６，１１０，４９８；５，５７３，７７６；４，２００，０９８４；および４，０８８，８６４であり、その内容は参照により本明細書に組み入れられている。本発明の開示およびこれらの他の特許の開示の両方を考慮している当業者は、本発明のポリペプチドの徐放のための浸透圧ポンプを産生できる。
シリンジポンプも低速放出剤（ｓｌｏｗ ｒｅｌｅａｓｅ ａｇｅｎｔ）として使用され得る。このような器具は、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏｓ．４，９７６，６９６；４，９３３，１８５；５，０１７，３７８；６，３０９，３７０；６，２５４，５７３；４，４３５，１７３；４，３９８，９０８；６，５７２，５８５；５，２９８，０２２；５，１７６，５０２；５，４９２，５３４；５，３１８，５４０；および４，９８８，３３７に記載されており、その内容は参照により本明細書に組み入れられている。本発明の開示およびこれらの他の特許の開示の両方を考慮している当業者は、本発明の組成物の徐放のためのシリンジポンプを産生できる。
ＶＩＩＩ）薬学的キット
別の態様において、本発明は、ＢＰＸＴＥＮポリペプチドの使用を容易にするキットを提供する。一実施形態において、キットは、少なくとも第１の容器に、すぐに注射できる調合物として合わせてまたは滅菌水、バッファー、もしくはデキストロースによる再構成の準備ができている調合物として合せた：（ａ）それを必要とする被験体への投与の際に疾患、状態または障害を処置するのに十分な量のＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質組成物；および（ｂ）ある量の薬学的に許容され得るキャリアを；ＢＰＸＴＥＮ薬物ならびに貯蔵およびに取扱い条件を明記したラベル、ならびに該薬物の承認された適応症、承認された適応症の防止および／または処置に使用するためのＢＰＸＴＥＮ薬物の再構成および／または投与の説明、適切な投薬情報および安全性情報、ならびに薬物のロットおよび有効期限（ｅｘｐｉｒａｔｉｏｎ）を明示した情報を共に含む。上述の別の実施形態において、キットは、被験体に送達されるＢＰＸＴＥＮの適切な濃度を使用者に提供する、ＢＰＸＴＥＮ組成物に好適な希釈剤を収容できる第２の容器を含むことができる。
（実施例１）
ＸＴＥＮ＿ＡＤ３６モチーフセグメントの構築
以下の実施例は、３６アミノ酸のモチーフ配列をコードするコドン最適化遺伝子のコレクションの構築について記載する。第１のステップとして、スタッファベクターｐＣＷ０３５９を、ｐＥＴベクターおよびＴ７プロモータを含むｐＥＴベクターに基づいて構築した。ｐＣＷ０３５９は、セルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）およびＴＥＶプロテアーゼ認識部位、それに続くＢｓａＩ、ＢｂｓＩ、およびＫｐｎＩ部位がフランキングするスタッファ配列をコードする。ＢｓａＩおよびＢｂｓＩ部位は、これらが消化後に適合性の突出部を生じるように挿入された。スタッファ配列には、切断型のＧＦＰ遺伝子およびＨｉｓタグが続く。スタッファ配列は停止コドンを含有し、それゆえスタッファプラスミドｐＣＷ０３５９を担持する大腸菌細胞は非蛍光コロニーを形成する。スタッファベクターｐＣＷ０３５９はＢｓａＩおよびＫｐｎＩによって消化されて、スタッファセグメントを除去して、得られたベクターフラグメントをアガロースゲル精製によって単離する。配列はモチーフのＡＤファミリを反映して、ＸＴＥＮ＿ＡＤ３６と命名した。そのセグメントはアミノ酸配列［Ｘ］３を有し、ここでＸは、配列：ＧＥＳＰＧＧＳＳＧＳＥＳ（配列番号２
７０）、ＧＳＥＧＳＳＧＰＧＥＳＳ（配列番号２７１）、ＧＳＳＥＳＧＳＳＥＧＧＰ（配列番号２７２）、またはＧＳＧＧＥＰＳＥＳＧＳＳ（配列番号２７３）を有する１２マーペプチドである。以下の対のリン酸化合成オリゴヌクレオチド対をアニーリングすることによって、インサートを得た：
Figure 2017031218
本発明者らは、リン酸化オリゴヌクレオチド３ＫｐｎＩｓｔｏｐｐｅｒＦｏｒ：ＡＧＧＴＴＣＧＴＣＴＴＣＡＣＴＣＧＡＧＧＧＴＡＣ（配列番号２８１）および非リン酸化オリゴヌクレオチドｐｒ＿３ＫｐｎＩｓｔｏｐｐｅｒＲｅｖ：ＣＣＴＣＧＡＧＴＧＡＡＧＡＣＧＡ（配列番号２８２）もアニーリングした。アニーリングされたオリゴヌクレオチド対をライゲーションすると、１つのＢｂｓＩ／ＫｐｎＩセグメントにライゲーションされた可変数の１２マー反復を表す可変長を有する生成物の混合物が生じた。３６アミノ酸の長さに相当する生成物は、分取アガロースゲル電気泳動によって混合物から単離して、ＢｓａＩ／ＫｐｎＩ消化スタッファベクターｐＣＷ０３５９にライゲーションした。ＬＣＷ０４０１と命名した得られたライブラリのクローンの大半は誘導後に緑色蛍光を示し、これはＸＴＥＮ＿ＡＤ３６の配列がインフレームでＧＦＰ遺伝子とライゲーションされて、ＸＴＥＮ＿ＡＤ３６の大半の配列が良好な発現レベルを有したことを示している。
本発明者らは高レベルの蛍光についてライブラリＬＣＷ０４０１からの９６の単離体を、ＩＰＴＧを含有する寒天プレートに単離体をスタンプすることによってスクリーニングした。同じ単離体をＰＣＲによって評価して、３６アミノ酸ならびに強い蛍光を有するセグメントを含有する４８の単離体を同定した。これらの単離体を配列決定して、正しいＸＴＥＮ＿ＡＤ３６セグメントを含有する３９のクローンを同定した。ヌクレオチドおよびアミノ酸構築物のファイル名ならびにこれらのセグメントの配列番号を表１２に挙げる。
Figure 2017031218
Figure 2017031218
Figure 2017031218
（実施例２）
ＸＴＥＮ＿ＡＥ３６セグメントの構築
３６アミノ酸長のＸＴＥＮ配列をコードするコドンライブラリを構築した。ＸＴＥＮ配列をＸＴＥＮ＿ＡＥ３６と命名した。そのセグメントはアミノ酸配列［Ｘ］３を有し、ここでＸは、配列：ＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥ（配列番号３５９）、ＧＳＥＰＡＴＳＧＳＥＴＰ（配列番号３６０）、ＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰ（配列番号３６１）、またはＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰ（配列番号３６２）を有する１２マーペプチドである。以下の対のリン酸化合成オリゴヌクレオチド対をアニーリングすることによって、インサートを得た：
Figure 2017031218
本発明者らは、リン酸化オリゴヌクレオチド３ＫｐｎＩｓｔｏｐｐｅｒＦｏｒ：ＡＧＧＴＴＣＧＴＣＴＴＣＡＣＴＣＧＡＧＧＧＴＡＣ（配列番号３７１）および非リン酸化オリゴヌクレオチドｐｒ＿３ＫｐｎＩｓｔｏｐｐｅｒＲｅｖ：ＣＣＴＣＧＡＧＴＧＡＡＧＡＣＧＡ（配列番号３７２）もアニーリングした。アニーリングされたオリゴヌクレオチド対をライゲーションすると、１つのＢｂｓＩ／ＫｐｎＩセグメントにライゲーションされた可変数の１２マー反復を表す可変長を有する生成物の混合物が生じた。３６アミノ酸の長さに相当する生成物は、分取アガロースゲル電気泳動によって混合物から単離して、ＢｓａＩ／ＫｐｎＩ消化スタッファベクターｐＣＷ０３５９にライゲーションした。ＬＣＷ０４０２と命名した得られたライブラリのクローンの大半は誘導後に緑色蛍光を示し、これはＸＴＥＮ＿ＡＥ３６の配列がインフレームでＧＦＰ遺伝子とライゲーションされて、ＸＴＥＮ＿ＡＥ３６の大半の配列が良好な発現を示すことを示している。
本発明者らは高レベルの蛍光についてライブラリＬＣＷ０４０２からの９６の単離体を、ＩＰＴＧを含有する寒天プレートに単離体をスタンプすることによってスクリーニングした。同じ単離体をＰＣＲによって評価して、３６アミノ酸ならびに強い蛍光を有するセグメントを含有する４８の単離体を同定した。これらの単離体を配列決定して、正しいＸＴＥＮ＿ＡＥ３６セグメントを含有する３７のクローンを同定した。ヌクレオチドおよびアミノ酸構築物のファイル名ならびにこれらのセグメントの配列番号を表１３に挙げる。
Figure 2017031218
Figure 2017031218
Figure 2017031218
Figure 2017031218
（実施例３）
ＸＴＥＮ＿ＡＦ３６セグメントの構築
３６アミノ酸長の配列をコードするコドンライブラリを構築した。配列をＸＴＥＮ＿ＡＦ３６と命名した。そのセグメントはアミノ酸配列［Ｘ］３を有し、ここでＸは、配列：ＧＳＴＳＥＳＰＳＧＴＡＰ（配列番号４４７）、ＧＴＳＴＰＥＳＧＳＡＳＰ（配列番号４４８）、ＧＴＳＰＳＧＥＳＳＴＡＰ（配列番号４４９）、またはＧＳＴＳＳＴＡＥＳＰＧＰ（配列番号４５０）を有する１２マーペプチドである。以下の対のリン酸化合成オリゴヌクレオチド対をアニーリングすることによって、インサートを得た：
Figure 2017031218
本発明者らは、リン酸化オリゴヌクレオチド３ＫｐｎＩｓｔｏｐｐｅｒＦｏｒ：ＡＧＧＴＴＣＧＴＣＴＴＣＡＣＴＣＧＡＧＧＧＴＡＣ（配列番号４５９）および非リン酸化オリゴヌクレオチドｐｒ＿３ＫｐｎＩｓｔｏｐｐｅｒＲｅｖ：ＣＣＴＣＧＡＧＴＧＡＡＧＡＣＧＡ（配列番号４６０））もアニーリングした。アニーリングされたオリゴヌクレオチド対をライゲーションすると、１つのＢｂｓＩ／ＫｐｎＩセグメントにライゲーションされた可変数の１２マー反復を表す可変長を有する生成物の混合物が生じた。３６アミノ酸の長さに相当する生成物は、分取アガロースゲル電気泳動によって混合物から単離して、ＢｓａＩ／ＫｐｎＩ消化スタッファベクターｐＣＷ０３５９にライゲーションした。ＬＣＷ０４０３と命名した得られたライブラリのクローンの大半は誘導後に緑色蛍光を示し、これはＸＴＥＮ＿ＡＦ３６の配列がインフレームでＧＦＰ遺伝子とライゲーションされて、
ＸＴＥＮ＿ＡＦ３６の大半の配列が良好な発現を示すことを示している。
本発明者らは高レベルの蛍光についてライブラリＬＣＷ０４０３からの９６の単離体を、ＩＰＴＧを含有する寒天プレートに単離体をスタンプすることによってスクリーニングした。同じ単離体をＰＣＲによって評価して、３６アミノ酸ならびに強い蛍光を有するセグメントを含有する４８の単離体を同定した。これらの単離体を配列決定して、正しいＸＴＥＮ＿ＡＦ３６セグメントを含有する４４のクローンを同定した。ヌクレオチドおよびアミノ酸構築物のファイル名ならびにこれらのセグメントの配列番号を表１４に挙げる。
Figure 2017031218
Figure 2017031218
Figure 2017031218
Figure 2017031218
（実施例４）
ＸＴＥＮ＿ＡＧ３６セグメントの構築
３６アミノ酸長の配列をコードするコドンライブラリを構築した。配列をＸＴＥＮ＿ＡＧ３６と命名した。そのセグメントはアミノ酸配列［Ｘ］３を有し、ここでＸは、配列：ＧＴＰＧＳＧＴＡＳＳＳＰ（配列番号５４９）、ＧＳＳＴＰＳＧＡＴＧＳＰ（配列番号５５０）、ＧＳＳＰＳＡＳＴＧＴＧＰ（配列番号５５１）、またはＧＡＳＰＧＴＳＳＴＧＳＰ（配列番号５５２）を有する１２マーペプチドである。以下の対のリン酸化合成オリゴヌクレオチド対をアニーリングすることによって、インサートを得た：
Figure 2017031218
本発明者らは、リン酸化オリゴヌクレオチド３ＫｐｎＩｓｔｏｐｐｅｒＦｏｒ：ＡＧＧＴＴＣＧＴＣＴＴＣＡＣＴＣＧＡＧＧＧＴＡＣ（配列番号５６１）および非リン酸化オリゴヌクレオチドｐｒ＿３ＫｐｎＩｓｔｏｐｐｅｒＲｅｖ：ＣＣＴＣＧＡＧＴＧＡＡＧＡＣＧＡ（配列番号５６２）もアニーリングした。アニーリングされたオリゴヌクレオチド対をライゲーションすると、１つのＢｂｓＩ／ＫｐｎＩセグメントにライゲーションされた可変数の１２マー反復を表す可変長を有する生成物の混合物が生じた。３６アミノ酸の長さに相当する生成物は、分取アガロースゲル電気泳動によって混合物から単離して、ＢｓａＩ／ＫｐｎＩ消化スタッファベクターｐＣＷ０３５９にライゲーションした。ＬＣＷ０４０４と命名した得られたライブラリのクローンの大半は誘導後に緑色蛍光を示し、これはＸＴＥＮ＿ＡＧ３６の配列がインフレームでＧＦＰ遺伝子とライゲーションされて、ＸＴＥＮ＿ＡＧ３６の大半の配列が良好な発現を示すことを示している。
本発明者らは高レベルの蛍光についてライブラリＬＣＷ０４０４からの９６の単離体を、ＩＰＴＧを含有する寒天プレートに単離体をスタンプすることによってスクリーニングした。同じ単離体をＰＣＲによって評価して、３６アミノ酸ならびに強い蛍光を有するセグメントを含有する４８の単離体を同定した。これらの単離体を配列決定して、正しいＸＴＥＮ＿ＡＧ３６セグメントを含有する４４のクローンを同定した。ヌクレオチドおよびアミノ酸構築物のファイル名ならびにこれらのセグメントの配列番号を表１５に挙げる。
Figure 2017031218
Figure 2017031218
Figure 2017031218
Figure 2017031218
（実施例５）
ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４セグメントの構築
ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４をＸＴＥＮ＿ＡＥ３６のＡＥ７２、１４４，２８８、５７６および８６４への連続２量体化から構築した。ＸＴＥＮ＿ＡＥ７２セグメントのコレクションをＸＴＥＮ＿ＡＥ３６の３７の異なるセグメントから構築した。３７すべての異なる３６アミノ酸セグメントを内部に持つ大腸菌の培養物を混合して、プラスミドを単離した。このプラスミドプールをＢｓａＩ／Ｎｃｏｌで消化して、小型フラグメントをインサートとして生成させた。同じプラスミドプールをＢｂｓＩ／Ｎｃｏｌで消化して、大型フラグメントをベクターとして生成させた。インサートフラグメントおよびベクターフラグメントをライゲーションすると、長さの倍増が生じ、ライゲーション混合物をＢＬ２１Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）細胞に形質転換させて、ＸＴＥＮ＿ＡＥ７２のコロニーを得た。
ＸＴＥＮ＿ＡＥ７２セグメントのこのライブラリをＬＣＷ０４０６と命名した。ＬＣＷ０４０６からのすべてのクローンを組み合わせて、上記と同じプロセスを使用して再度２量体化して、ＸＴＥＮ＿ＡＥ１４４のライブラリＬＣＷ０４１０を産した。ＬＣＷ０４１０からのすべてのクローンを組み合わせて、上記と同じプロセスを使用して再度２量体化して、ＸＴＥＮ＿ＡＥ２８８のライブラリＬＣＷ０４１４を産した。２つの単離体ＬＣＷ０４１４．００１およびＬＣＷ０４１４．００２をライブラリからランダムに選び出し、配列決定して同一性を検証した。ＬＣＷ０４１４からのすべてのクローンを組み合わせて、上記と同じプロセスを使用して再度２量体化して、ＸＴＥＮ＿ＡＥ５７６のライブラリＬＣＷ０４１８を産した。本発明者らは高レベルのＧＦＰ蛍光についてライブラリＬＣＷ０４１８から９６の単離体をスクリーニングした。ＰＣＲおよび強蛍光によって正しいサイズのインサートを有する８つの単量体を配列決定し、２つの単離体（ＬＣＷ０４１８．０１８およびＬＣＷ０４１８．０５２）を将来使用するために配列決定および発現データに基づいて選定した。
ＸＴＥＮ＿ＡＥ５７６のＬＣＷ０４１８．０１８およびＸＴＥＮ＿ＡＥ２８８のＬＣＷ０４１４．００２を組み合わせることによって、上記と同じ２量体化プロセスを使用して、ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４の特異的クローン（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｌｏｎｅ）ｐＣＷ０４３２を構築した。
（実施例６）
ＸＴＥＮ＿ＡＭ１４４の構築
ＸＴＥＮ＿ＡＥ３６の３７の異なるセグメント、ＸＴＥＮ＿ＡＦ３６の４４のセグメン
ト、およびＸＴＥＮ＿ＡＧ３６の４４のセグメントから開始して、ＸＴＥＮ＿ＡＭ１４４セグメントのコレクションを構築した。
１２５すべての異なる３６アミノ酸セグメントを内部に持つ大腸菌の培養物を混合して、プラスミドを単離した。このプラスミドプールをＢｓａＩ／ＮｃｏＩで消化して、小型フラグメントをインサートとして生成させた。同じプラスミドプールをＢｂｓＩ／ＮｃｏＩで消化して、大型フラグメントをベクターとして生成させた。インサートフラグメントおよびベクターフラグメントをライゲーションすると、長さの倍増が生じ、ライゲーション混合物をＢＬ２１Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）細胞に形質転換させて、ＸＴＥＮ＿ＡＭ７２のコロニーを得た。
ＸＴＥＮＡＭ７２セグメントのこのライブラリをＬＣＷ０４６１と命名した。ＬＣＷ０４６１からのすべてのクローンを組み合わせて、上記と同じプロセスを使用して再度２量体化して、ライブラリＬＣＷ０４６２を産した。ライブラリＬＣＷ０４６２からの１５１２の単離体をタンパク質発現についてスクリーニングした。個々のコロニーを９６ウェルプレートに移して、スターター培養物として一晩培養した。これらのスターター培養物を新たな自己誘導媒体に希釈して、２０〜３０時間培養した。蛍光プレートリーダを励起３９５ｎｍおよび発光５１０ｎｍにて使用して、発現を測定した。１９２の単離体が高レベルの発現を示し、それらにつきＤＮＡ配列決定を行った。ライブラリＬＣＷ０４６２の大半のクローンが良好な発現および同様の物理化学特性を示し、ＸＴＥＮ＿ＡＭ３６セグメントの大半の組み合わせが有用なＸＴＥＮ配列を産することが示唆された。複数のＸＴＥＮセグメントを含有する多機能性タンパク質の構築のための、ＸＴＥＮ＿ＡＭ１４４セグメントの好ましいコレクションとして、ＬＣＷ０４６２からの３０の単離体を選定した。ヌクレオチドおよびアミノ酸構築物のファイル名ならびにこれらのセグメントの配列番号を表１６に挙げる。
Figure 2017031218
Figure 2017031218
Figure 2017031218
Figure 2017031218
Figure 2017031218
Figure 2017031218
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Figure 2017031218
Figure 2017031218
Figure 2017031218
（実施例７）
ＸＴＥＮ＿ＡＭ２８８の構築
ライブラリＬＣＷ０４６２全体を実施例６に記載するように２量体化して、得られたＸＴＥＮ＿ＡＭ２８８クローンのライブラリをＬＣＷ０４６３と命名した。ライブラリＬＣＷ０４６３からの１５１２の単離体を実施例６に記載したプロトコルを使用してスクリーニングした。１７６の高発現クローンを配列決定して、２８８アミノ酸残基を有する複数のＸＴＥＮセグメントを含有する多機能性タンパク質の構築のために、４０の好ましいＸＴＥＮ＿ＡＭ２８８セグメントを選定した。
（実施例８）
ＸＴＥＮ＿ＡＭ４３２の構築
本発明者らは、ＸＴＥＮ＿ＡＭ１４４セグメントのライブラリＬＣＷ０４６２からのセグメントおよびＸＴＥＮ＿ＡＭ２８８セグメントのライブラリＬＣＷ０４６３からのセグメントを組み換えることより、ＸＴＥＮ＿ＡＭ４３２セグメントのライブラリを生成させた。ＸＴＥＮ＿ＡＭ４３２セグメントのこの新たなライブラリをＬＣＷ０４６４と命名した。プラスミドは、ＬＣＷ０４６２およびＬＣＷ０４６３を内部に持つ大腸菌の培養物からそれぞれを単離した。ライブラリＬＣＷ０４６４からの１５１２の単離体を実施例６に記載したプロトコルを使用してスクリーニングした。１７６の高発現クローンを配列決定して、より長いＸＴＥＮの構築のためにおよび４３２アミノ酸残基を有する複数のＸＴＥ
Ｎセグメントを含有する多機能性タンパク質の構築のために、３９の好ましいＸＴＥＮ＿ＡＭ４３２セグメントを選定した。
並行して本発明者らは、ＸＴＥＮ＿ＡＭ１４４およびＸＴＥＮ＿ＡＭ２８８の好ましいセグメントを使用して、ＸＴＥＮ＿ＡＭ４３２セグメントのライブラリＬＭＳ０１００を構築した。このライブラリのスクリーニングは、さらなる構築のために選択される４の単離体を産した。
（実施例９）
ＸＴＥＮ＿ＡＭ８７５の構築
スタッファベクターｐＣＷ０３５９をＢｓａＩおよびＫｐｎＩによって消化して、スタッファセグメントを除去して、得られたベクターフラグメントをアガロースゲル精製によって単離した。
本発明者らは、アミノ酸ＧＡＳＡＳＧＡＰＳＴＧ（配列番号７１９）をコードして、制限酵素ＡｓｃＩ認識ヌクレオチド配列ＧＧＣＧＣＧＣＣを内部に有するシーケンシングアイランドＡ（ＳＩ−Ａ）を導入するために、リン酸化オリゴヌクレオチドＢｓａＩ−ＡｓｃＩ−ＫｐｎＩｆｏｒＰ：ＡＧＧＴＧＣＡＡＧＣＧＣＡＡＧＣＧＧＣＧＣＧＣＣＡＡＧＣＡＣＧＧＧＡＧＧＴＴＣＧＴＣＴＴＣＡＣＴＣＧＡＧＧＧＴＡＣ（配列番号７１７）および非リン酸化オリゴヌクレオチドＢｓａＩ−ＡｓｃＩ−ＫｐｎＩｒｅｖ：ＣＣＴＣＧＡＧＴＧＡＡＧＡＣＧＡＡＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＴＧＧＣＧＣＧＣＣＧＣＴＴＧＣＧＣＴＴＧＣ（配列番号７１８）をアニーリングした。アニーリングしたオリゴヌクレオチド対を上で調製したＢｓａＩおよびＫｐｎＩ消化スタッファベクターｐＣＷ０３５９とライゲーションして、ＳＩ−Ａを含有するｐＣＷ０４６６を産した。本発明者らは次に、実施例５に記載したのと同じ２量体化プロセスを使用して、実施例８からの４３の好ましいＸＴＥＮ＿ＡＭ４３２セグメントおよびｐＣＷ０４６６からのＳＩ−ＡセグメントをＣ末端にて組み換えることによって、ＸＴＥＮ＿ＡＭ４４３セグメントのライブラリを生成させた。ＸＴＥＮ＿ＡＭ４４３セグメントのこの新たなライブラリをＬＣＷ０４７９と命名した。
本発明者らは、実施例５に記載したのと同じ２量体化プロセスを使用して、ＸＴＥＮ＿ＡＭ４４３セグメントのライブラリＬＣＷ０４７９からのセグメントおよび実施例８からの４３の好ましいＸＴＥＮ＿ＡＭ４３２セグメントを組み換えることによって、ＸＴＥＮ＿ＡＭ８７５セグメントのライブラリを生成させた。ＸＴＥＮ＿ＡＭ８７５のセグメントのこの新たなライブラリをＬＣＷ０４８１と命名した。
（実施例１０）
ＸＴＥＮ＿ＡＭ１３１８の構築
本発明者らは、アミノ酸ＧＰＥＰＴＧＰＡＰＳＧ（配列番号７２２）をコードして、制限酵素ＦｓｅＩ認識ヌクレオチド配列ＧＧＣＣＧＧＣＣを内部に有するシーケンシングアイランドＢ（ＳＩ−Ｂ）を導入するために、リン酸化オリゴヌクレオチドＢｓａＩ−ＦｓｅＩ−ＫｐｎＩｆｏｒＰ：ＡＧＧＴＣＣＡＧＡＡＣＣＡＡＣＧＧＧＧＣＣＧＧＣＣＣＣＡＡＧＣＧＧＡＧＧＴＴＣＧＴＣＴＴＣＡＣＴＣＧＡＧＧＧＴＡＣ（配列番号７２０）および非リン酸化オリゴヌクレオチドＢｓａＩ−ＦｓｅＩ−ＫｐｎＩｒｅｖ：ＣＣＴＣＧＡＧＴＧＡＡＧＡＣＧＡＡＣＣＴＣＣＧＣＴＴＧＧＧＧＣＣＧＧＣＣＣＣＧＴＴＧＧＴＴＣＴＧＧ（配列番号７２１）をアニーリングした。アニーリングしたオリゴヌクレオチド対を実施例９で使用したようなＢｓａＩおよびＫｐｎＩ消化スタッファベクターｐＣＷ０３５９とライゲーションして、ＳＩ−Ｂを含有するｐＣＷ０４６７を産した。本発明者らは次に、実施例５に記載したのと同じ２量体化プロセスを使用して、実施例８からの４３の好ましいＸＴＥＮ＿ＡＭ４３２セグメントおよびｐＣＷ０４６７からのＳＩ−ＢセグメントをＣ末端にて組み換えることによって、ＸＴＥＮ＿ＡＭ４４３セグメントのライブラリを
生成させた。ＸＴＥＮ＿ＡＭ４４３セグメントのこの新たなライブラリをＬＣＷ０４８０と命名した。
本発明者らは、実施例５に記載の２量体化プロセスと同様の２量体化プロセスを使用して、ＸＴＥＮ＿ＡＭ４４３セグメントのライブラリＬＣＷ０４８０およびＸＴＥＮ＿ＡＭ８７５セグメントのライブラリＬＣＷ０４８１を組み換えることにより、ＸＴＥＮ＿ＡＭ１３１８セグメントのライブラリを生成させた。ＸＴＥＮ＿ＡＭ１３１８セグメントのこの新たなライブラリをＬＣＷ０４８７と命名した。
（実施例１１）
ＸＴＥＮ＿ＡＤ８６４の構築
本発明者らは２量体化を数回連続して使用して、実施例１に挙げたＸＴＥＮ＿ＡＤ３６のセグメントから開始してＸＴＥＮ＿ＡＤ８６４配列のコレクションを構築した。これらの配列を実施例５に記載したように構築した。ＸＴＥＮ＿ＡＤ８６４からの数個の単離体を評価して、生理的条件下で良好な発現および優れた溶解性を示すことを見出した。ＸＴＥＮ＿ＡＤ５７６の１つの中間構築物を配列決定した。このクローンをカニクイザルのＰＫ実験で評価して、約２０時間の半減期を測定した。
（実施例１２）
ＸＴＥＮ＿ＡＦ８６４の構築
本発明者らは２量体化を数回連続して使用して、実施例３に挙げたＸＴＥＮ＿ＡＦ３６のセグメントから開始してＸＴＥＮ＿ＡＦ８６４配列のコレクションを構築した。これらの配列を実施例５に記載したように構築した。ＸＴＥＮ＿ＡＦ８６４からの数個の単離体を評価して、生理的条件下で良好な発現および優れた溶解性を示すことを見出した。ＸＴＥＮ＿ＡＦ５４０の１つの中間構築物を配列決定した。このクローンをカニクイザルのＰＫ実験で評価して、約２０時間の半減期を測定した。ＸＴＥＮ＿ＡＦ８６４の全長クローンはカニクイザルにおいて、優れた溶解性を有し、６０時間を超える半減期を示した。実施例９に記載したようなシーケンシングアイランドを含むＸＴＥＮ＿ＡＦ配列の第２のセットを構築した。
（実施例１３）
ＸＴＥＮ＿ＡＧ８６４セグメントの構築
本発明者らは２量体化を数回連続して使用して、実施例１に挙げたＸＴＥＮ＿ＡＤ３６のセグメントから開始してＸＴＥＮ＿ＡＧ８６４配列のコレクションを構築した。これらの配列を実施例５に記載したように構築した。ＸＴＥＮ＿ＡＧ８６４からの数個の単離体を評価して、生理的条件下で良好な発現および優れた溶解性を示すことを見出した。ＸＴＥＮ＿ＡＧ８６４の全長クローンはカニクイザルにおいて、優れた溶解性を有し、６０時間を超える半減期を示した。
（実施例１４）
ＸＴＥＮのＮ末端延長物の構築−１２マー付加ライブラリの構築およびスクリーニング
本実施例は、翻訳の開始を促進し、ヘルパードメインの存在なしで融合タンパク質のＮ末端でのＸＴＥＮ融合物の発現を可能にするための、ＸＴＥＮタンパク質のＮ末端の最適化ステップについて詳述する。コドンレベルで多様性を生成するために、７アミノ酸配列を選択して、多様なコドンを用いて調製した。コドン多様性を有する１２アミノ酸をコードする７対のオリゴヌクレオチドを設計、アニーリングして、ＮｄｅＩ／ＢｓａＩ制限酵素消化スタッファベクターｐＣＷ０５５１（Ｓｔｕｆｆｅｒ−ＸＴＥＮ＿ＡＭ８７５−ＧＦＰ）にライゲーションし、大腸菌ＢＬ２１Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）コンピテント細胞に形質転換して、７つのライブラリのコロニーを得た。得られたクローンは、ＸＴＥＮ＿ＡＭ８７５−ＧＦＰにインフレームで融合されたＮ末端ＸＴＥＮ１２マーを有し、発現のスクリ
ーニングのためにＧＦＰ蛍光を使用できるようにする。生成した７つのライブラリから個々のコロニーを選び出し、９６深ウェルプレート内のスーパーブロス媒体５００μｌ中で一晩、飽和になるまで生育させた。選び出されたコロニーの数は、ライブラリの理論的多様性の約半分から３分の１に及んだ（表１７を参照）。
Figure 2017031218
一晩飽和させた培養物を使用して、新鮮な培養物５００μｌを自己誘導媒体に接種し、そこで培養物を２６℃にて一晩生育させた。次にこれらの発現培養物を蛍光プレートリーダ（励起３９５ｎｍ、発光５１０ｎｍ）を用いてアッセイして、存在するＧＦＰレポータの量を決定した。結果により、中央値発現レベルがＣＢＤのＮ末端ヘルパードメインによる発現レベルのおおよそ半分であることが示される。しかしライブラリからの最良のクローンがベンチマークにはるかに近く、これらの配列の周囲でのさらなる最適化が保証されたことが示された。アミノ酸ＭＡで開始するライブラリがＭＥで始まるライブラリよりも良好な発現を産生したことも明白であった。このことは、最良のクローン（ベンチマークにより近い）がたいていＭＡで開始するので、その最良のクローンを見れば最も明らかであった。ＣＢＤ−ＡＭ８７５ベンチマークの３３％以内の１７６クローンのうち８７％がＭＡで始まり、上記ライブラリにおける配列の７５％のみがＭＡで始まるので、ＭＡで始まるそれらのクローンが最高レベルでの発現を表すことは明らかであった。最良のクローンのうち９６を配列決定して同一性を確認し、ＬＣＷ５４６から４つ、ＬＣＷ５４７から４つおよびＬＣＷ５５２から４つの１２配列（表１８を参照）をさらなる最適化のために選択した。
Figure 2017031218
Figure 2017031218
（実施例１５）
ＸＴＥＮのＮ末端延長物の構築−コドン３および４を最適化するライブラリの構築およびスクリーニング
本実施例は、翻訳の開始を促進し、ヘルパードメインの存在なしでタンパク質のＮ末端でのＸＴＥＮ融合物の発現を可能にするための、ＸＴＥＮタンパク質のＮ末端の最適化ステップについて詳述する。確立された最初の２つのコドンに対する選択性（上の例を参照）を用いて、第３および第４のコドンを無作為化して選択性を決定した。許容されるＸＴＥＮコドンのすべての組合せがこれらの位置に存在するように改変された第３および第４の残基を用いて、ＬＣＷ５４６、ＬＣＷ５４７およびＬＣＷ５５２による最良のクローンに基づく３つのライブラリを設計した。許容されるすべてのＸＴＥＮコドンを各ライブラリに含めるために、第３および第４の残基のコドン多様性を有する１２アミノ酸をコードする９対のオリゴヌクレオチドを設計、アニーリングして、ＮｄｅＩ／ＢｓａＩ制限酵素で消化したスタッファベクターｐＣＷ０５５１（Ｓｔｕｆｆｅｒ−ＸＴＥＮ＿ＡＭ８７５−ＧＦＰ）にライゲーションして、大腸菌ＢＬ２１Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）コンピテント細胞に形質変換して、３つのライブラリＬＣＷ０５６９−５７１のコロニーを得た。２４ＸＴＥＮコドンでは、各ライブラリの理論的多様性は５７６のユニークなクローンである。生成した３つのライブラリから合計５０４の個々のコロニーを選び出し、９６深ウェルプレート内のスーパーブロス媒体５００μｌ中で一晩、飽和になるまで生育させた。これにより相対的なライブラリの性能および配列選択性を理解するために十分な適用範囲が提供される。一晩飽和させた培養物を使用して、新しい培養物５００μｌを自己誘導媒体に接種して、そこで培養物を２６℃にて一晩生育させた。次に、これらの発現培養物を蛍光プレートリーダ（励起３９５ｎｍ、発光５１０ｎｍ）を用いてアッセイして、存在するＧＦＰレポータの量を決定した。スクリーニングによる上位７５のクローンを配列決定して、ＧＦＰリポーター発現をベンチマーク試料に対して再試験した。５２のクローンが使用可能な配列決定データを産し、続いての分析に使用した。結果はライブラリによって分類され、ＬＣＷ５４６が優位なライブラリであることを示した。結果を表１９に表示する。
Figure 2017031218
第３位および第４位の特定のコドンに対する選択性を示すさらなる傾向がデータに見られた。ＬＣＷ５６９ライブラリ内では、表２０に見られるように、第３位のグルタメートコドンＧＡＡおよびトレオニンコドンＡＣＴがより高い発現に関連付けられた。
Figure 2017031218
その上、上位７５のクローンの再試験により、数個がベンチマーククローンより優位であることが示された。
（実施例１６）
ＸＴＥＮのＮ末端延長物の構築−コンビナトリアル１２マーおよび３６マーライブラリの構築およびスクリーニング
本実施例は、翻訳の開始を促進し、ヘルパードメインの存在なしでタンパク質のＮ末端でのＸＴＥＮ融合物の発現を可能にするための、ＸＴＥＮタンパク質のＮ末端の最適化ステップについて詳述する。確立された最初の２つのコドンに対する選択性（上の例を参照）を用いて、まさにＮ末端にある選択した１２の１２マー配列（上掲の実施例を参照）とそれに続く以前に構築した１２５の３６マーセグメント（上掲の実施例を参照）をコンビナトリアル方式で組み合わせることによって、より広い状況でＮ末端を検査した。これによりＸＴＥＮタンパク質のＮ末端に新規４８マーが生成され、より長い配列の発現に対するＮ末端におけるより長い範囲の相互作用の影響の評価が可能となった（図１１）。３６マーを構築するために使用した２量体化手順（上の実施例を参照）と同様に、選択した１２５の３６マーセグメントを含有するプラスミドを制限酵素ＢｂｓＩ／ＮｃｏＩで消化して、適切なフラグメントをゲル精製した。クローンＡＣ９４（ＣＢＤ−ＸＴＥＮ＿ＡＭ８７５−ＧＦＰ）からのプラスミドをＢｓａＩ／ＮｃｏＩで消化して、適切なフラグメントをゲル精製した。これらのフラグメントを共にライゲーションして、大腸菌ＢＬ２１Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）コンピテント細胞に形質転換し、ライブラリＬＣＷ０５７９のコロニーを得て、該コロニーはまさにＮ末端において選択された１２の１２マーのさらなるクローニングのためのベクターとしての役割も果たした。ＬＣＷ０５７９のプラスミドをＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩ／ＢｓａＩで消化して、適切なフラグメントをゲル精製した。選択した１２の１２マー配列をコードするオリゴヌクレオチドの１２対を設計、アニーリングし、ＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩ／ＢｓａＩ消化ＬＣＷ０５７９ベクターによってライゲーションして、大腸菌ＢＬ２１Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）コンピテント細胞に形質転換し、ライブラリＬＣＷ０
５８０のコロニーを得た。１５００のユニークなクローンの理論的多様性を用いて、生成されたライブラリから合計１５１２の個々のコロニーを選び出し、９６深ウェルプレート内のスーパーブロス媒体５００μｌ中で一晩、飽和になるまで生育させた。これにより相対的なライブラリの性能および配列選択性を理解するために十分な適用範囲が提供される。一晩飽和させた培養物を使用して、新しい培養物５００μｌを自己誘導媒体に接種して、そこで培養物を２６℃にて一晩生育させた。次に、これらの発現培養物を蛍光プレートリーダ（励起３９５ｎｍ、発光５１０ｎｍ）を用いてアッセイして、存在するＧＦＰレポータの量を決定した。上位９０のクローンを配列決定して、ＧＦＰリポーター発現を再試験した。８３のクローンが使用可能な配列決定データを産し、続いての分析に使用した。配列決定データを使用して各クローンに存在するリード１２マーを決定して、各１２マーの発現に対する影響を評価した。クローンＬＣＷ５４６＿０６およびＬＣＷ５４６＿０９は優れたＮ末端として突出していた（表２１を参照）。
Figure 2017031218
配列決定および再試験によって、同じ結果を産生するデータにおける同じ配列の非依存性複製物の数個の例も明らかとなり、それゆえアッセイの信頼度が増加した。その上、６つユニークな配列を有する１０のクローンはベンチマーククローンより優位であった。これを表２２に表示する。これらのクローンがこれらの配列の唯一の出現であることに注目され、いかなる場合もこれらの配列のうちの１つが出現して、ベンチマーククローンに勝てないことがなかった。この６つの配列でさらなる最適化を進めた。
Figure 2017031218
Figure 2017031218
（実施例１７）
ＸＴＥＮのＮ末端延長物の構築−ＸＴＥＮ−ＡＭ８７５およびＸＴＥＮ−ＡＥ８６４のコンビナトリアル１２マーおよび３６マーライブラリの構築およびスクリーニング
本実施例は、翻訳の開始を促進し、ヘルパードメインの存在なしでタンパク質のＮ末端でのＸＴＥＮ融合物の発現を可能にするための、ＸＴＥＮタンパク質のＮ末端の最適化ステップについて詳述する。最初の４つのコドンに対する（上掲の実施例を参照、ならびに
確立されたＮ末端１２マーおよび３６マーの最良の対合に対する（上掲の実施例を参照）選択性を用いて、コンビナトリアル手法に着手して、これらの選択性の組合せ（ｕｎｉｏｎ）を検査した。これによりＸＴＥＮタンパク質のＮ末端に新規４８マーが生成され、以前の結果のコンフルエンスの試験が可能となった。その上、これらのリーダー配列がすべてのＸＴＥＮタンパク質にとって普遍的な解決策となる能力を、ＸＴＥＮ−ＡＥ８６４およびＸＴＥＮ−ＡＭ８７５の両方の前に新しい４８マーを置くことによって評価した。３６マーセグメントの１２５のクローンすべてを使用するあるいは、コンビナトリアルライブラリで最良のＧＦＰ発現を有する３６マーセグメントの選択した６つのクローンからのプラスミドをＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩ／ＢｓａＩで消化して、適切なフラグメントをゲル精製した。クローンＡＣ９４（ＣＢＤ−ＸＴＥＮ＿ＡＭ８７５−ＧＦＰ）およびＡＣ１０４（ＣＢＤ−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４−ＧＦＰ）からのプラスミドをＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩ／ＢｓａＩで消化して、適切なフラグメントをゲル精製した。これらのフラグメントを共にライゲーションして、大腸菌ＢＬ２１Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）コンピテント細胞に形質転換し、ライブラリＬＣＷ０５８５（−ＸＴＥＮ＿ＡＭ８７５−ＧＦＰ）およびＬＣＷ０５８６（−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４−ＧＦＰ）のコロニーを得て、該コロニーはまさにＮ末端において選択された８つの１２マーのさらなるクローニングのためのベクターとしての役割も果たし得た。ＬＣＷ０５８５およびＬＣＷ０５８６のプラスミドをＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩ／ＢｓａＩで消化して、適切なフラグメントをゲル精製した。以前の（第２世代）スクリーニングで最良のＧＦＰ発現を有する８つの選択された１２マー配列をコードするオリゴヌクレオチドの８対を設計、アニーリングし、ＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩ／ＢｓａＩ消化ＬＣＷ０５８５およびＬＣＷ０５８６ベクターによってライゲーションして、大腸菌ＢＬ２１Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）コンピテント細胞に形質転換し、最終ライブラリＬＣＷ０５８７（ＸＴＥＮ＿ＡＭ９２３−ＧＦＰ）およびＬＣＷ０５８８（ＸＴＥＮ＿ＡＥ９１２−ＧＦＰ）のコロニーを得た。４８のユニークなクローンの理論的多様性を用いて、生成したライブラリから２５２の個々のコロニーを選び出し、９６深ウェルプレート内のスーパーブロス媒体５００μｌ中で一晩、飽和になるまで生育させた。これにより相対的なライブラリの性能および配列選択性を理解するために十分な適用範囲が提供された。一晩飽和させた培養物を使用して、新しい培養物５００μｌを自己誘導媒体に接種して、そこで培養物を２６℃にて一晩生育させた。次に、これらの発現培養物を蛍光プレートリーダ（励起３９５ｎｍ、発光５１０ｎｍ）を用いてアッセイして、存在するＧＦＰレポータの量を決定した。上位３６のクローンを配列決定して、ＧＦＰリポーター発現を再試験した。３６のクローンが使用可能な配列決定データを産し、これらの３６のクローンを続いての分析に使用した。配列決定データにより、クローンに存在する１２マー、第３コドン、第４コドンおよび３６マーが決定され、それらのクローンの多くが同じ配列の非依存性複製物であることが明らかにされた。その上、これらのクローンの再試験結果は値が近接しており、スクリーニングプロセスが頑強であったことが示される。Ｎ末端における特定の組み合わせに対する選択性が見られ、ベンチマーク対照よりも高い蛍光値を一貫して産していた（表２３および２４を参照）。
Figure 2017031218
Figure 2017031218
顕著にはＸＴＥＮ−ＡＭ８７５のＮ末端の好ましい組み合わせおよびＸＴＥＮ−ＡＥ８６４の好ましい組み合わせは同じではなく（表２３および２４）、開始部位からの１５０を超えるさらに複雑な相互作用が発現レベルを左右することが示される。好ましいヌクレオチド配列についての配列は表２５に挙げられており、好ましいクローンをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析して独立して発現を確認した。ＸＴＥＮ＿ＡＭ９２３およびＸＴＥＮ＿ＡＥ９１２の完全配列をさらなる分析のために選択した。
Figure 2017031218
（実施例１８）
ＢＰＸＴＥＮ；例としてＸＴＥＮ−Ｅｘ４を産生および評価する方法
ＢＰＸＴＥＮ組成物を産生および評価するための一般スキームが図６に表示され、本実施例の概要の基礎を形成する。開示した方法および当業者に公知の方法を例証的な実施例で提供したガイダンスと共に使用すると、当業者は当分野で公知のＸＴＥＮ、ＢＰおよびＢＰの変異体を含む一連のＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質を生成および評価することができる。したがって、本実施例は、方法の単なる例証であり、いかなるやり方でも決して方法を制限するものではないと解釈される；当業者には多くの変形が明らかとなる。本実施例において、モチーフのＡＥファミリのＸＴＥＮに連結されたエキセンジン−４（「Ｅｘ４」）のＢＰＸＴＥＮが生成される。
ＸＴＥＮをコードするポリヌクレオチドを産生する一般スキームを図４および５に表示する。図５は、本発明の実施形態の１つにおけるＸＴＥＮポリヌクレオチド構築物の構築
における代表的なステップの概略フローチャートである。個々のオリゴヌクレオチド５０１は配列モチーフ５０２、たとえば１２アミノ酸モチーフ（「１２マー」）にアニーリングされ、１２アミノ酸モチーフは続いてＢｂｓＩおよびＫｐｎＩ制限部位５０３を含有するオリゴとライゲーションされる。モチーフライブラリは、特異的配列ＸＴＥＮファミリ；たとえば表１のＡＤ、ＡＥ、ＡＦ、ＡＧ、ＡＭ、またはＡＱ配列に限定することができる。この場合、ＡＥファミリ（配列番号１８６−１８９）のモチーフはモチーフライブラリとして使用され、１２マーにアニーリングされて「ビルディングブロック」長；たとえば３６アミノ酸をコードするセグメントを生成する。ＸＴＥＮ遺伝子５０４の所望の長さが達成されるまで「ビルディングブロック」のライゲーションおよび多量体化によって、ＸＴＥＮ配列をコードする遺伝子を構築することができる。図５に示すように、この場合のＸＴＥＮ長は４８アミノ酸残基であるが、より長い長さが本プロセスによって達成できる。たとえば、多量体化は、ライゲーション、重複延長、ＰＣＲ構築または当分野で公知の同様のクローニング技法によって行うことができる。ＸＴＥＮ遺伝子は、スタッファベクターにクローニングすることができる。図５に例証する実施例において、ベクターはＦｌａｇ配列５０６を、続いてＢｓａＩ、ＢｂｓＩ、およびＫｐｎＩ部位５０７がフランキングするスタッファ配列ならびにＢＰ遺伝子（たとえばエキセンジン−４）５０８をコードして、ＢＰＸＴＥＮ５００をコードする遺伝子を生じることができ、この場合、該遺伝子は配置Ｎ→Ｃ末端にて融合タンパク質ＸＴＥＮ−Ｅｘ４をコードする。
Ｅｘ４（または別の候補ＢＰ）をコードするＤＮＡ配列は、ゲノムライブラリからの、適切な細胞源から調製されたｃＤＮＡライブラリから当分野で公知の標準手順によって都合よく得ることができるか、または公に利用可能なデータベース、特許、もしくは参考文献から得たＤＮＡ配列を使用して合成的に（たとえば自動化核酸合成）生成され得る。タンパク質のＥｘ４部分をコードする遺伝子またはポリヌクレオチドは次に、構築物、たとえば本明細書に記載する構築物にクローニングすることができ、該構築物は、生物系での高レベルタンパク質発現に適切な転写配列および翻訳配列の制御下でのプラスミドまたは他のベクターであることができる。（４８アミノ酸残基を有するＡＥとして例証された図５の場合）ＸＴＥＮ部分をコードする第２の遺伝子またはポリヌクレオチドは、ライゲーションまたは多量体化ステップにより、Ｅｘ４をコードする遺伝子に隣接して、該遺伝子とインフレームの構築物に該第２の遺伝子またはポリヌクレオチドをクローニングすることによって、Ｅｘ４遺伝子のＮ末端をコードするヌクレオチドに遺伝子的に融合させることができる。本方式では、ＸＴＥＮ−Ｅｘ４ ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質をコードする（またはＸＴＥＮ−Ｅｘ４ ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質に相補的な）キメラＤＮＡ分子が構築物内に生成される。構築物を異なる配置で設計して、単量体ポリペプチドとしての融合パートナーを各種の順列でコードすることができる。たとえば順序（Ｎ→Ｃ末端）：Ｅｘ４−ＸＴＥＮ；ＸＴＥＮ−Ｅｘ４；Ｅｘ４−ＸＴＥＮ−Ｅｘ４；ＸＴＥＮ−Ｅｘ４−ＸＴＥＮの融合タンパク質；ならびに上述の多量体をコードするための、遺伝子を生成することができる。場合により、本キメラＤＮＡ分子は、さらに適切な発現ベクターである別の構築物へ移行またはクローン化され得る。この時点で、キメラＤＮＡ分子を発現できる宿主細胞はキメラＤＮＡ分子によって形質転換される。目的のＤＮＡセグメントを含有するベクターは、上記のように、適切な宿主細胞に周知の方法によって、細胞宿主の種類に応じて移行することができる。
ＸＴＥＮ−Ｅｘ４発現ベクターを含有する宿主細胞は、プロモータを活性化するために適切に改変された従来の栄養媒体で培養される。培養条件、たとえば温度、ｐＨなどは、発現に選択された宿主細胞によって以前使用された条件であり、当業者には明らかである。融合タンパク質の発現後に、細胞は下記のように、遠心分離によって収集され、物理的または化学的手段によって破壊され、得られた粗抽出物は融合タンパク質の精製のために保持される。宿主細胞によって分泌されたＢＰＸＴＥＮ組成物では、遠心分離からの上清が分離され、さらなる精製のために保持される。
遺伝子発現は、たとえば従来のサザンブロッティング、ｍＲＮＡの転写を定量するノーザンブロッティング［Ｔｈｏｍａｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：５２０１−５２０５（１９８０）］、ドットブロッティング（ＤＮＡ分析）、またはインサイチュハイブリダイゼーションによって、適切に標識されたプローブを使用して本明細書で提供する配列に基づいて、試料において直接測定する。あるいは、遺伝子発現は、免疫蛍光方法、例えば遺伝子産物の発現を直接定量するための細胞の免疫組織化学染色によって測定される。免疫組織化学染色および／または試料流体のアッセイに有用な抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルのどちらでもよく、任意の哺乳動物で調製され得る。便利には、抗体は、本明細書で提供された配列に基づく合成ペプチドを使用するＥｘ４配列ポリペプチドに対して、またはＥｘ４に融合され、特異的抗体エピトープをコードする外因性配列に対して調製され得る。選択可能マーカーのさらなる例は当業者に周知であり、リポーター、たとえば増強緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、ベータ−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）を含む。
ＸＴＥＮ−Ｅｘ４ポリペプチド生成物は、当分野で公知の方法によって精製される。ゲル濾過、親和性精製、塩分画、イオン交換クロマトグラフィー，サイズ排除クロマトグラフィー，ヒドロキシアパタイト吸着クロマトグラフィー，疎水性相互作用クロマトグラフィーまたはゲル電気泳動などの手順は、すべてが精製で使用され得る技法である。精製の具体的な方法は、Ｒｏｂｅｒｔ Ｋ．Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒ．Ｃａｓｔｏｒ，ｅｄ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ １９９４、およびＳａｍｂｒｏｏｋら、上掲に記載されている。複数ステップ精製分離もＢａｒｏｎら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０：１７９−９０（１９９０）およびＢｅｌｏｗら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ．６７９：６７−８３（１９９４）に記載されている。
図６に例証されるように、単離ＸＴＥＮ−Ｅｘ４融合タンパク質は次に、その化学特性および活性特性についてキャラクタリゼーションされる。単離融合タンパク質は、たとえば配列、純度、見かけの分子量、溶解度および安定性について、当分野で公知の標準方法を使用してキャラクタリゼーションされる。予想された標準を満足する融合タンパク質は次に、本明細書で開示する１つ以上のアッセイ；たとえば実施例または表３９のアッセイを使用してインビトロまたはインビボで測定することができる活性について、評価される。
さらにＸＴＥＮ−Ｅｘ４融合タンパク質は、実施例２５に記載されるように、１つ以上の動物種に投与されて標準薬物動態パラメータが決定される。
ＸＴＥＮ−Ｅｘ４構築物の産生、発現および回収の繰返しプロセス、それに続く本明細書で開示する方法または当分野で公知の他の方法を使用するそのキャラクタリゼーションによって、Ｅｘ４およびＸＴＥＮを含むＢＰＸＴＥＮ組成物が当業者によって産生および評価されて、対応する未融合Ｅｘ４と比較して増強された全体の治療活性につながる、予想された特性、たとえば溶解度の増強、安定性の増強、薬物動態の改善および免疫原性の低下を確認することができる。所望の特性を所有しないこれらの融合タンパク質では、このような特性を有する組成物を得るためにこれらの方法によって異なる配列を構築、発現、単離および評価することができる。
（実施例１９）
ＸＴＥＮ融合タンパク質の分析サイズ排除クロマトグラフィー
サイズ排除クロマトグラフィー分析を、増加する長さの各種の治療タンパク質および非
構造化組換えタンパク質を含有する融合タンパク質に対して行った。例示的なアッセイはＴＳＫＧｅｌ−Ｇ４０００ ＳＷＸＬ（７．８ｍｍ×３０ｃｍ）カラムを使用して、該カラム内で４０μｇの、濃度１ｍｇ／ｍｌの精製グルカゴン融合タンパク質を２０ｍＭリン酸塩ｐＨ６．８、１１４ｍＭ ＮａＣｌにおいて流速０．６ｍｌ／分にて分離した。ＯＤ２１４ｎｍおよびＯＤ２８０ｎｍを使用して、クロマトグラムプロフィールを監視した。すべてのアッセイのカラム校正は、ＢｉｏＲａｄからのサイズ排除校正標準を使用して行った；マーカーは、サイログロブリン（６７０ｋＤａ）、ウシガンマグロブリン（１５８ｋＤａ）、ニワトリ卵白アルブミン（４４ｋＤａ）、ウマミオグロビン（１７ｋＤａ）およびビタミンＢ１２（１．３５ｋＤａ）を含む。グルカゴン−Ｙ２８８、グルカゴン−Ｙ１４４、グルカゴン−Ｙ７２、グルカゴン−Ｙ３６の代表的なクロマトグラフィープロフィールは、図１５にオーバーレイとして示す。データは、各化合物の見かけの分子量が付着したｒＰＥＧ配列の長さに比例することを示す。しかしデータは、各構築物の見かけの分子量が球状タンパク質で予想される分子量よりも顕著に大きい（同じアッセイの標準タンパク質泳動との比較により示されるように）ことも示す。評価したすべての構築物のＳＥＣ分析に基づいて、見かけの分子量、見かけの分子量係数（見かけの分子量の計算した分子量に対する比として表現される）および流体力学半径（ｎＭでのＲＨ）を表２６に示す。結果は、５７６以上のアミノ酸の異なるＸＴＥＮの組み入れが、融合タンパク質のおおよそ３３９ｋＤａ〜７６０ｋＤａの見かけの分子量を与えることと、８６４以上のアミノ酸のＸＴＥＮがおおよそ８００ｋＤＡ超の見かけの分子量を与えることとを示している。実際の分子量に対する見かけの分子量の比例的増加の結果は、少なくとも４倍の増加および約１７倍もの高い比を有する、複数の異なるモチーフファミリ；すなわちＡＤ、ＡＥ、ＡＦ、ＡＧ、およびＡＭからのＸＴＥＮを有する生成された融合タンパク質に一致していた。その上、５７６以上のアミノ酸を有するＸＴＥＮ融合パートナーのグルコース調節ペプチドを有する融合タンパク質への組み入れは、おおよそ３〜５ｎｍの糸球体孔径を十分に超える７ｎｍ以上の流体力学半径によって生じた。したがって、グルコース調節ペプチドおよびＸＴＥＮを含む融合タンパク質が腎クリアランスを低下させて、対応する未融合生物活性タンパク質と比べて、最終半減期の増加および治療または生物製剤効果の改善に寄与することが結論付けられる。
Figure 2017031218
（実施例２０）
カニクイザルにおけるＧＦＰに融合された延長ポリペプチドの薬物動態
カニクイザルにおけるＧＦＰ−Ｌ２８８、ＧＦＰ−Ｌ５７６、ＧＦＰ−ＸＴＥＮ＿ＡＦ５７６、ＧＦＰ−ＸＴＥＮ＿Ｙ５７６およびＸＴＥＮ＿ＡＤ８３６−ＧＦＰの薬物動態を試験して、非構造化ポリペプチドの組成および長さのＰＫパラメータに対する効果を決定した。注射後の各種の時点で血液試料を分析して、血漿中のＧＦＰの濃度を、捕捉のためのＧＦＰに対するポリクローナル抗体および検出のための同じポリクローナル抗体のビオチン化調製物を用いたＥＬＩＳＡによって測定した。結果を図２３にまとめる。結果は、ＸＴＥＮ配列の長さの増加と共に、半減期の驚くべき増加を示す。たとえばＧＦＰ−ＸＴＥＮ＿Ｌ２８８（ＸＴＥＮに２８８アミノ酸残基を有する）では、１０時間の半減期が決定された。５７６アミノ酸に対する非構造化ポリペプチド融合パートナーの長さが２倍になると、複数の融合タンパク質構築物、すなわちＧＦＰ−ＸＴＥＮ＿Ｌ５７６、ＧＦＰ−ＸＴＥＮ＿ＡＦ５７６、ＧＦＰ−ＸＴＥＮ＿Ｙ５７６で半減期が２０〜２２時間に増加した。８３６残基に対する非構造化ポリペプチド融合パートナーの長さのさらなる増加は、ＸＴＥＮ＿ＡＤ８３６−ＧＦＰで７２〜７５時間の半減期を生じた。それゆえ２８８残基から５７６残基への２８８残基のポリマー長の増加は、インビボ半減期を約１０時間増加させた。しかし、５７６残基から８３６残基への２６０残基のポリペプチド長の増加は半減期を５０時間超増加させた。これらの結果は、インビボ半減期の比例的増大よりも大きい増大を生じる、非構造化ポリペプチド長の驚くべき閾値があることを示す。それゆえ、延長非構造化ポリペプチドを含む融合タンパク質は、より短い長さのポリペプチドと比較して薬物動態増強特性を有することが予想される。
（実施例２１）
ＸＴＥＮの血清安定性
ＧＦＰのＮ末端に融合されたＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４を含有する融合タンパク質をサル血漿およびラット腎臓溶解物中３７℃にて最長７日間インキュベートした。図１３に示すように、試料を第０、１および７日に採取して、ＳＤＳ ＰＡＧＥによって分析し、ウェス
タン分析による検出およびＧＦＰに対する抗体による検出を続けた。ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４の配列は、血漿中での７日間にわたって、分解の徴候は無視できるものであった。しかし、ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４はラット腎臓溶解物中で３日間にわたって迅速に分解された。融合タンパク質のインビボ安定性を上記のように、ＧＦＰ＿ＡＥ８６４が免疫沈降された血漿試料で試験して、ＳＤＳ ＰＡＧＥで分析した。注射後最大７日まで採取した試料は、分解の徴候をほとんど示さなかった。結果によって、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質の薬物動態特性の増強における因子である血清プロテアーゼによる分解に対する、ＢＰＸＴＥＮの抵抗性を証明する。
（実施例２２）
ＢＰＸＴＥＮ構成要素ＸＴＥＮ＿ＩＬ−１ｒａ遺伝子およびベクターの構築
１５３ａａのヒトＩＬ−１ｒａをコードする遺伝子をプライマ５’−ＡＴＡＡＡＧＧＧＴＣＴＣＣＡＧＧＴＣＧＴＣＣＧＴＣＣＧＧＴＣＧＴＡＡＡＴＣ（配列番号７５６）および５’−ＡＡＣＴＣＧＡＡＧＣＴＴＴＴＡＴＴＣＧＴＣＣＴＣＣＴＧＧＡＡＧＴＡＡＡＡ（配列番号７５７）を用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅して、これによりＸＴＥＮデスティネーションベクターのスタッファにフランキングするＢｂｓＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位と適合性である、フランキングＢｓａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ（下線）制限部位を導入した（図７Ｃ）。ＸＴＥＮデスティネーションベクターは、カナマイシン抵抗性遺伝子を含有して、セルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）−ＸＴＥＮ−緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の形式の、ＮｏｖａｇｅｎからのｐＥＴ３０誘導体であり、ＧＦＰはＣ末端にてペイロードをクローニングするためのスタッファである。ＸＴＥＮデスティネーションベクターのＧＦＰをＩＬ−１ｒａコードフラグメントで置き換えることによって、構築物を生成させた（図７）。ＸＴＥＮデスティネーションベクターは、ＣＢＤの上流のＴ７プロモータ、それに続くスタッファＧＦＰ配列の上流にてインフレームで融合されたＸＴＥＮ配列を特色とする。用いたＸＴＥＮ配列は、それぞれ８７５、１３１８、８７５および８６４アミノ酸の長さを有するＡＭ８７５、ＡＭ１３１８、ＡＦ８７５およびＡＥ８６４である。ＢｂｓＩおよびＨｉｎｄＩＩＩエンドヌクレアーゼを使用する制限消化によって、スタッファＧＦＰフラグメントを除去した。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを使用して、ＢｓａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限消化ＩＬ−１ｒａ ＤＮＡフラグメントをＢｂｓＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ消化ＸＴＥＮデスティネーションベクターにライゲーションして、ライゲーション混合物を電気穿孔によって大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｇｏｌｄ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換した。抗生物質カナマイシンを含有するＬＢプレートで成長する能力によって、形質転換体を同定した。プラスミドＤＮＡを選択したクローンから単離して、制限分析およびＤＮＡ配列決定によって確認した。最終ベクターはＴ７プロモータの制御下でＣＢＤ ＸＴＥＮ＿Ｌ−１ｒａ遺伝子を産し、ＣＢＤは改変（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）ＴＥＶ切断部位によって末端で切断されてＸＴＥＮ＿ＩＬ１−ｒａを生じる。Ｃ末端にて異なるＸＴＥＮに融合されたＩＬ−１ｒａを有する各種の構築物は、ＡＣ１７２３（ＣＢＤ−ＸＴＥＮ＿ＡＭ８７５−ＩＬ−１ｒａ）、ＡＣ１７５（ＣＢＤ−ＸＴＥＮ＿ＡＭ１３１８−ＩＬ−１ｒａ）、ＡＣ１８０（ＣＢＤ−ＸＴＥＮ＿ＡＦ８７５−ＩＬ−１ｒａ）、およびＡＣ１８２（ＣＢＤ−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４−ＩＬ−１ｒａ）を含む。
（実施例２３）
ＸＴＥＮ＿ＡＭ８７５およびＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４に融合されたヒトインターロイキン−１受容体アゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）の発現、精製、およびキャラクタリゼーション
細胞培養物の産生
スターター培養物は、ＡＥ８６４、ＡＭ８７５、またはＡＭ１２９６に融合されたＩＬ−１ｒａをコードするプラスミドを担持する大腸菌のグリセロールストックを、４０ｕｇ／ｍＬカナマイシンを含有する１００ｍＬの２ｘＹＴ媒体に接種することによって調製した。培養物を次に３７℃にて一晩振とうした。１００ｍＬのスターター培養物を使用して
、４０μｇ／ｍＬカナマイシンを含有する２５リットルの２ｘＹＴに接種し、３７℃にてＯＤ６００が約１．０に達するまで（５時間にわたって）振とうした。温度を次に２６℃まで低下させて、１．０ｍＭの最終濃度のＩＰＴＧによってタンパク質発現を誘導した。培養物を次に２６℃にて一晩振とうした。細胞を遠心分離によって収集して、合計２００グラムの細胞ペーストを産した。ペーストは使用するまで−８０℃にて凍結貯蔵した。
ＩＬ−１ｒａ−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４またはＩＬ−１ｒａ−ＡＭ８７５を含むＢＰＸＴＥＮの精製
細胞ペーストを２０ｍＭトリスｐＨ６．８、５０ｍＭ ＮａＣｌに、細胞ペースト１グラム当たり４ｍｌのバッファーの比で懸濁させた。細胞ペーストを次に、トップスターラーを使用してホモジナイズした。２００００ｐｓｉにてマイクロフルイダイザに試料を１回通過させることによって、細胞溶解を達成した。Ｓｏｒｖａｌｌ Ｇ３Ａロータで１２０００ｒｐｍにて２０分間遠心分離することにより、溶解物を清澄にした。
２０ｍＭトリスｐＨ６．８、５０ｍＭ ＮａＣｌで平衡させた８００ｍｌのＭａｃｒｏｃａｐ Ｑアニオン交換樹脂（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に、清澄溶解物を直接適用した。カラムを５０ｍＭ、１００ｍＭ、および１５０ｍＭ ＮａＣｌを含有するトリスｐＨ６．８バッファーによって続けて洗浄した。生成物を２０ｍＭトリスｐＨ ６．８、２５０ｍＭ ＮａＣｌによって溶出させた。
２５０ｍＬオクチルセファロースＦＦカラムを平衡化バッファー（２０ｍＭトリスｐＨ６．８、１．０Ｍ Ｎａ２ＳＯ４）によって平衡化した。固体Ｎａ２ＳＯ４をＭａｃｒｏｃａｐ Ｑ溶出物プールに添加して、１．０Ｍの最終濃度を達成した。結果として生じる溶液を濾過して（０．２２ミクロン）、ＨＩＣカラムにロードした。カラムを次に、１０ＣＶの平衡化バッファーで洗浄して、未結合のタンパク質および宿主細胞ＤＮＡを除去した。生成物を次に、２０ｍＭトリスｐＨ６．８、０．５Ｍ Ｎａ２ＳＯ４によって溶出させた。
プールしたＨＩＣ溶出物画分を次に、２０ｍＭトリスｐＨ７．５によって希釈して、５．０ミリオーム未満の導電率を達成した。希薄生成物を、２０ｍＭトリスｐＨ７．５、５０ｍＭ ＮａＣｌによって平衡化した３００ｍｌ ＱセファロースＦＦアニオン交換カラムにロードした。
バッファー交換タンパク質を次に、Ｐｅｌｌｉｃｏｎ ＸＬ Ｂｉｏｍａｘ ３００００ｍｗｃｏカートリッジを使用して限外濾過／ダイアフィルトレーション（ＵＦ／ＤＦ）によって３０ｍｇ／ｍｌ超まで濃縮した。０．２２ミクロンのシリンジフィルタを使用して、濃縮物を滅菌濾過した。最終溶液を等分割して−８０℃で貯蔵し、以下に続く実験に使用した。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
２および１０ｍｃｇの最終精製タンパク質に、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのＮｕＰＡＧＥ４−１２％ビス−トリスゲルを製造者の仕様書に従って使用して、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを受けさせた。結果（図１４）は、約１６０ｋＤａの適切なＭＷを有するＩＬ−１ｒａ−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４組成物が、上で詳述したプロセスによって回収されたことを示す。
分析サイズ排除クロマトグラフィー
Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ ＢｉｏＳＥＰ ＳＥＣ Ｓ４０００（７．８×３００ｍｍ）カラムを使用して、サイズ排除クロマトグラフィー分析を行った。１ｍｇ／ｍｌの濃度の、２０μｇの精製タンパク質を２０ｍＭトリス−Ｃｌ ｐＨ ７．５、３００ｍＭ ＮａＣ
ｌにおいて０．５ｍｌ／分の流速で分離した。２１４ｎｍおよび２８０ｎｍにおける吸光度によって、クロマトグラムプロフィールを監視した。カラム校正は、ＢｉｏＲａｄによるサイズ排除校正標準を使用して行い、マーカーは、サイログロブリン（６７０ｋＤａ）、ウシガンマグロブリン（１５８ｋＤａ）、ニワトリ卵白アルブミン（４４ｋＤａ）、ウマミオグロビン（１７ｋＤａ）およびビタミンＢ１２（１．３５ｋＤａ）を含む。ＩＬ−１ｒａ−ＸＴＥＮ＿ＡＭ８７５の代表的なクロマトグラフプロフィールを図１５に示し、校正標準を破線で示し、ＩＬ−１ｒａ−ＸＴＥＮ＿ＡＭ８７５を実線によって示す。データは、上記のように、各構築物の見かけの分子量が、球状タンパク質で予想される分子量よりも著しく大きく（同じアッセイの標準タンパク質泳動との比較により示されるように）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定された分子量よりも顕著に大きい見かけの分子量を有することを示す。
分析ＲＰ−ＨＰＬＣ
Ｖｙｄａｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃ４（４．６×１５０ｍｍ）カラムを使用して、分析ＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラフィー分析を行った。カラムをＨＰＬＣグレードの水中の０．１％トリフルオロ酢酸によって１ｍｌ／分の流速にて平衡化した。０．２ｍｇ／ｍｌの濃度の１０マイクログラムの精製タンパク質を別個に注射した。タンパク質を０．１％ＴＦＡ中５％〜９０％アセトニトリルの直線勾配で溶出させた。ＯＤ２１４ｎｍおよびＯＤ２８０ｎｍを使用して、クロマトグラムプロフィールを監視した。ＩＬ−１ｒａ−ＸＴＥＮ＿ＡＭ８７５の代表的なバッチのクロマトグラムを図１６に示す。
ＩＬ−１受容体結合
ＩＬ−Ｉｒａ−含有ＸＴＥＮ融合タンパク質の活性を評価するために、ＥＬＩＳＡに基づく受容体結合アッセイを使用した。ここでＣｏｓｔａｒ ３６９０アッセイプレートのウェルをウェル当り５０ｎｇの、ヒトＩｇＧのＦｃドメインに融合されたマウスＩＬ−１受容体（ＩＬ−１Ｒ／Ｆｃ，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）で一晩コーティングした。続いてウェルを３％ＢＳＡでブロッキングして、固相との非特異的相互作用を防止した。ウェルを十分に洗浄した後、ＩＬ−１ｒａ−ＸＴＥＮ＿ＡＭ８７５、ＸＴＥＮ＿ＡＭ８７５−ＩＬ−１ｒａ、またはＩＬ−１ｒａ（アナキンラ）の任意の希釈系列をウェルに適用した。結合反応を室温にて２時間進行させた。未結合Ｉｌ−１ｒａを反復洗浄によって除去した。結合ＩＬ−１ｒａおよびＩＬ−１ｒａ−ＸＴＥｎ融合物をビオチン化抗ヒトＩＩ−１ｒａ抗体およびホースラディッシュペルオキシダーゼ結合体化ストレプトアビジンによって検出した。反応物をＴＭＢ基質によって室温にて２０分間展開させた（ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ）。０．２Ｎ硫酸の添加によって色展開を停止させた。４５０ｎｍおよび５７０ｎｍにおける各ウェルの吸光度をＳｐｅｃｔｒＭａｘ ３８４Ｐｌｕｓ分光光度計で記録した。補正吸光度シグナル（Ａｂｓｃｏｒｒ＝Ａｂｓ４５０ｎｍ−Ａｂｓ５７０ｎｍ）をＩＬ−１ｒａ−ＸＴＥＮまたはＩＬ−Ｉｒａ濃度の関数としてプロットして、図１７に示すように結合等温線を産生した。
ＩＬ−１受容体に対する各融合タンパク質の結合親和性を推定するために、結合データをＳ字状用量反応曲線に当てはめた。データの当てはめから、各構築物のＥＣ５０（シグナルが最大半量であるＩＬ−１ｒａまたはＩＬ−１ｒａ−ＸＴＥＮの濃度）を決定した。図１７に示すように、ペイロードがＸＴＥＮのＮ末端に付着されたＩＬ−１ｒａ−ＸＴＥＮ＿ＡＭ８７５のＥＣ５０は、未改変ＩＬ−１ｒａと同程度であった（アナキンラＥＣ５０＝０．０１３ｎＭ、ＩＬ−１ｒａ−ＸＴＥＮ＿ＡＭ８７５ＥＣ５０＝０．０１９ｎＭ）。ペイロードがＸＴＥＮのＣ末端に付着されたＸＴＥＮ＿ＡＭ８７５−ＩＬ−１ｒａは、ＩＬ−１ｒａよりもおおよそ１５倍高いＥＣ５０（０．２０４ｎＭ）を有するより弱い結合を提示した。陰性対照ＸＴＥＮ＿ｈＧＨ構築物は、実験条件下で結合を示さなかった。
ＸＴＥＮによるＩＬ−１ｒａの熱安定性
タンパク質治療薬の血清半減期を延長することに加えて、ＸＴＥＮポリペプチドは、それが融合されるペイロードの熱安定性を改善する特性を有する。たとえばＸＴＥＮポリペプチドの親水性の性質は、凝集を低下または防止し、それゆえペイロードタンパク質の再折畳みに有利であり得る。ＸＴＥＮのこの特色は、多種多様のタンパク質治療薬のための室温で安定な調合物の開発を補助し得る。
ＸＴＥＮコンジュゲーションによって与えられたＩＬ−１ｒａの熱安定性を証明するために、１リットル当たり２００マイクロモルのＩＬ−１ｒａ−ＸＴＥＮおよび組換えＩＬ−１ｒａを２５℃および８５℃にて１５分間インキュベートして、その時点であらゆる不溶性のタンパク質は遠心分離によって迅速に除去した。次に可溶性画分を図１８に示すようにＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。加熱後にＩＬ−１ｒａ−ＸＴＥＮのみが可溶性のままであるが、これに対して組換えＩＬ−１ｒａ（融合パートナーとしてのＸＴＥＮがない）は加熱後に完全に沈殿したことに注目する。
ＩＬ−１ｒａ−ＸＴＥＮのＩＬ−１受容体結合活性を上記の熱処理後に評価した。上記のように受容体結合を行った。熱処理によって完全に変性した組換えＩＬ−１ｒａは、熱処理後のその受容体活性の０．１％未満を保持した。しかしＩＬ−１ｒａ−ＸＴＥＮは、その受容体結合活性のおおよそ４０％を保持した（図１９）。これらのデータは共に、ＸＴＥＮポリペプチドがそのペイロード融合パートナーの熱誘導変性を防止できることを証明して、ＸＴＥＮが安定化特性を有するという結論を裏付けている。
（実施例２４）
ＩＬ−１ｒａおよびＸＴＥＮを含む融合タンパク質のＰＫ分析
各融合タンパク質のインビボ薬物動態パラメータを決定するために、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質ＩＬ−１ｒａ＿ＡＥ８６４、ＩＬ−１ｒａ＿ＡＭ８７５、およびＩＬ−１ｒａ＿ＡＭ１２９６をカニクイザルにおいて評価した。すべての組成物を水性バッファー中で得て、皮下（ＳＣ）経路で個々の動物（ｎ＝４／群）に１ｍｇ／ｋｇおよび／または１０ｍｇ／ｋｇ単回用量を使用して投与した。血漿試料を投与後の各種の時点で採取して、被験物質（ｔｅｓｔ ａｒｔｉｃｌｅ）の濃度を分析した。分析はサンドイッチＥＬＩＳＡ形式を使用して行った。ウサギポリクローナル抗ＸＴＥＮ抗体をＥＬＩＳＡプレートのウェルにコーティングした。ウェルをブロッキング、洗浄して、血漿試料を次に様々な希釈度で、ウェル中でインキュベートして、コート抗体による化合物の捕捉を可能にした。ウェルを広範囲に洗浄して、ポリクローナル抗ＩＬ−１ｒａ抗体のビオチン化調製物およびストレプトアビジンＨＲＰを使用して、結合タンパク質を検出した。各血清希釈度での比色反応を標準曲線に対して比較することによって、被験物質の濃度を各時点で計算した。薬物動態パラメータは、ＷｉｎＮｏｎＬｉｎソフトウェアパッケージを使用して計算した。
図２０は４つのＩＬ−１ｒａ含有構築物の濃度プロフィールを示し、計算したＰＫパラメータを表２７に示す。皮下投与の後、最終半減期は、３３６時間の期間にわたる各種の調製物について、おおよそ１５〜２８時間であると計算された。参考のために、未改変ＩＬ−１ｒａの公開されている半減期は、文献にはヒト成人で４〜６時間として十分に記載されている。
結論：ＩＬ−１ｒａを含むＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質への異なるＸＴＥＮ配列の組み入れによって、霊長類モデルで証明されたように、３つすべての組成物で薬物動態パラメータの顕著な増強が生じ、このような融合タンパク質組成物の有用性が証明される。
Figure 2017031218
（実施例２５）
エキセンジン−４およびＸＴＥＮを含む融合タンパク質のＰＫ分析
単回皮下投薬後の融合タンパク質のインビボ薬物動態パラメータを決定するために、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質Ｅｘ４＿ＡＥ８６４をカニクイザルにおいて評価した。
方法：ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質を２０ｍＭトリス、ｐＨ７．５、１３５ｍＭ ＮａＣｌ中で２種類の濃度；８ｍｇ／ｍＬおよび４０ｍｇ／ｍＬに調合した。サル４頭（オス２頭およびメス２頭、２〜６ｋｇ）の３群それぞれに１ｍｇ／ｋｇ（１群、０．１２５ｍＬ／ｋｇ）、１ｍｇ／ｋｇ（２群、０．０２５ｍＬ／ｋｇ）、または５ｍｇ／ｋｇ（３群、０．１２５ｍＬ／ｋｇ）を、各動物の背中の肩甲部における皮膚と組織の基底層との間へのボーラス注入によって投薬した。連続血液試料（１ｍｌ±０．５ｍｌ）を以前に順応させた動物の大腿静脈または動脈から、１４日間にわたって、麻酔（ａｅｓｔｈｅｓｉａ）を用いずにチェア拘束を利用してシリンジによって採取した。必要な場合は、チェア拘束を最大３０分間利用した。すべての動物を投薬前の一晩および血液試料採取の最初の４時間を通して絶食させた（食物は、適用可能な場合、４時間の採取間隔の最後の血液試料の採取後３０分以内に戻した）。各血液試料をへパリン血漿セパレータに採取して、遠心分離まで氷（２℃〜８℃）でおおよそ５分間保管した。血液試料を遠心分離して（８，０００ｘｇで５分間）、血漿をポリプロピレンチューブに移した。血漿試料を急速凍結させて、アッセイまでおおよそ−７０℃にて貯蔵した。分析はサンドイッチＥＬＩＳＡ形式を使用して行った。
結果：サルの薬物動態パラメータを計算して、結果を表２８で表にした。すべての動物の実験未使用の（ｎａｉｖｅ）プーリングの両方を使用して、および標準２段階分析を使用して、薬物動態パラメータ分析した。結果は、Ｔｍａｘ、Ｃｍａｘ、ＡＵＣおよび分布容積（Ｖｚ）の値によって明示されるように、１群対２群の投与された用量体積に基づく融合タンパク質の吸収の差を示す。しかし、計算した半減期値は３つの群で同程度であり、２．４時間のエクセナチドの報告された最終半減期を大きく超えている。
Figure 2017031218
結論：ＢＰＸＴＥＮ融合物を生成するためのエキセンジン−４のＸＴＥＮへの連結によって、霊長類モデルで証明されたように、３つすべての調合物で、半減期の少なくとも３０倍の増加と共に薬物動態パラメータの顕著な増強が生じ、このような融合タンパク質組成物の有用性が証明される。
（実施例２６）
食餌誘発性肥満マウスモデルにおけるＢＰＸＴＥＮの使用
ＸＴＥＮに連結されたグルコース調節ペプチド併用療法の効果を食餌誘発性肥満のマウスモデルにおいて評価して、単一ＢＰＸＴＥＮ組成物としての単量体融合タンパク質の固定併用の有用性を確認した。
方法：Ｙ−２８８−ＸＴＥＮに連結されたグルカゴン（「Ｇｃｇ−ＸＴＥＮ」）およびＡＥ５７６−ＸＴＥＮに連結されたエクセナチド（「Ｅｘ４−ＸＴＥＮ」）の併用療法またはエクセナチド単独の効果を、１０週齢のオスＣ５７ＢＬ／６Ｊ食餌誘発性肥満（ＤＩＯ）マウスで試験した。６０％高脂肪食で飼育したマウスを処置群（群当りｎ＝１０）Ｅｘ４−ＸＴＥＮ８６４（１０ｍｇ／ｋｇ ＩＰ Ｑ２Ｄ）、Ｅｘ４−ＸＴＥＮ８６４（２０ｍｇ／ｋｇ ＩＰ Ｑ４Ｄ）、Ｅｘ４−ＸＴＥＮ８６４（１０ｍｇ／ｋｇ ＩＰ Ｑ２Ｄ）プラスＧｃｇ−ＸＴＥＮ２８８（２０μｇ／ｋｇ ＩＰ ＢＩＤ）、およびＥｘ４−ＸＴＥＮ８６４（２０ｍｇ／ｋｇ ＩＰ Ｑ４Ｄ）プラスＧｃｇ−ＸＴＥＮ２８８（４０μｇ／ｋｇ ＩＰ ＱｌＤ）に無作為化した。２０ｍＭトリスｐＨ７．５、１３５ｍＭ ＮａＣｌ ＩＰ Ｑ１Ｄで処置したプラセボ群（ｎ＝１０）を並行して試験した。すべての群に２８日間続けて投薬した。試験を通じて体重を定期間隔で監視して、空腹時血中グルコースを処置期間の前後に測定した。群には、２８日間の処置期間にわたって続けて投薬した。試験を通じて体重を続けて監視して、空腹時血中グルコースを処置期間の前後に測定し、脂質レベルを処置期間後に決定した。
結果：結果を図２１〜２２に示す。データは、１ヶ月にわたる連続投薬が、試験の経過にわたって、プラセボと比べて、Ｇｃｇ−ＸＴＥＮ単独およびＥｘ４−ＸＴＥＮ単独で処置した動物において体重増加の顕著な低下を産することを示している。さらにＥｘ４−ＸＴＥＮを、またはＧｃｇ−ＸＴＥＮおよびＥｘ４−ＸＴＥＮを同時に投薬された動物は、Ｇｃｇ−ＸＴＥＮを単独で投与された動物と比較しておよびプラセボを投与された動物と比較して、統計的に有意なより大きい体重減少を示した。グルカゴン投与の毒性作用は、十分に記録されている。ラットおよびビーグル犬における、１ｍｇ／ｋｇ／日として最近報告されたグルカゴンの最大無作用量は、両方の種で明確な無毒性影響量と見なされた（Ｅｉｓｔｒｕｐ Ｃ，Ｇｌｕｃａｇｏｎ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ｒｅｃｏｍｂｉｎａ
ｎｔ ＤＮＡ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： ｒｅｐｅａｔｅｄ ｄｏｓｅ ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｓｔｕｄｉｅｓ，ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｔｏ ＣＤ ｒａｔｓ ａｎｄ ｂｅａｇｌｅ ｄｏｇｓ ｆｏｒ ｆｏｕｒ ｗｅｅｋｓ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｏｘｉｃｏｌ．１９９３ Ａｕｇ；７３（２）：１０３−１０８）。
データは、１ヶ月にわたる連続投薬が、プラセボに比べてＥｘ４−ＸＴＥＮ単独で処置された動物では空腹時血中グルコースの顕著な低下を産したが、Ｇｃｇ−ＸＴＥＮ単独で処置した動物では産しなかったことも示す。しかし、Ｇｃｇ−ＸＴＥＮおよびエクセナチドの両方を同時に投薬した動物は、単独で投与されたどちらかのグルコース調節ペプチドと比較して、空腹時血中グルコースレベルの統計的有意なより大きな低下を示した。注目すべきは、Ｅｘ４−ＸＴＥＮと併用されて有益な効果を生じたＧｃｇ−ＸＴＥＮ組成物の用量が、げっ歯動物種においてグルカゴン単独について報告された無作用量の少なくとも２５分の１である、２０および４０μｇ／ｋｇであったことである（完全融合タンパク質組成物の重量）。
結論：データは、ＸＴＥＮに連結されたグルコース調節ペプチドの２つの融合タンパク質による併用療法が、単一のグルコース調節ペプチドで見られるよりも有益な相乗効果をもたらし得ることを裏付けており、それゆえ、単一の生物製剤の投与と比較して、組み合わせ組成物の投与により、投薬頻度または投薬量を低下させることができ、毒性または許容されない副作用の脅威を低下させることができる。
（実施例２７）
カニクイザルにおけるＥｘ４−ＸＴＥＮ ＢＰＸＴＥＮのＰＫ分析
Ｅｘ４−ＡＥ８６４ ＢＰＸＴＥＮの薬物動態を、０．５ｍｇ／ｋｇのＢＰＸＴＥＮの１分間にわたる皮下または静脈内注射によってＢＰＸＴＥＮを投与されたカニクイザル（１群あたり３頭）において決定した。血漿試料を注射１４日後までの各種の時点で採取して、被験物質の血清濃度および免疫原性の両方を決定するためにＥＬＩＳＡで分析した。Ｅｘ４−ＡＥ８６４の抗被験物質抗体反応は、投与後にいずれの動物でも観察されなかった。サンドイッチＥＬＩＳＡを１００ｎｇ捕捉抗体（ウサギ抗エクセナチド、Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓａｎ Ｃａｒｌｏｓ， ＣＡ）のポリスチレン・マイクロタイター・プレート（Ｃｏｓｔａｒ ３６９０，Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ、Ｃｏｒｎｉｎｇ， Ｎ．Ｙ．）の各ウェルへの１２時間超の動員、それに続く３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）によるブロッキングによって行った。ＰＢＳによる３回の洗浄後、血漿試料を、１％ＢＳＡおよび０．５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ中でプレート全体にわたって連続滴定した。２時間のインキュベーションおよび洗浄後に、試料をビオチン化ＩｇＧ（インハウスでビオチン化したウサギ抗エクセナチド、Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓａｎ Ｃａｒｌｏｓ， ＣＡ）の各ウェルへの添加によってプローブした。インキュベーションおよび洗浄の後、プレートをホースラディッシュペルオキシダーゼ結合体化ストレプトアビジン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）、それに続くテトラメチルベンジン基質（Ｎｅｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ， ＫＹ）で展開させて、次に０．２Ｎ Ｈ２ＳＯ４によって反応停止して、４５０ｎｍにて読み取った。ノンコンパートメント薬物動態パラメータは、ＷｉｎＮｏｎＬｉｎプログラム、Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．１（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｔ．Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を使用して計算した。
結果を図２５に描く。構築物の本調合物の最終半減期は６０時間であり、皮下注射による生物学的利用能は８０％であった。これは市販版のエキセンジン−４であるＢｙｅｔｔａ（登録商標）で報告された２．４時間の半減期と同程度である。重要なことに、ＸＴＥ
Ｎ融合タンパク質の特徴であるとみなされる低速吸収期（ｓｌｏｗ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｐｈａｓｅ）は皮下注射後に認められた。吸収期は、注射後の２４〜４８時間のＣｍａｘおよび線形消失期に達する前の約１００時間にわたる本質的に平坦な血清濃度プロフィールを生じた。
結論：結果から、グルコース調節ペプチド、たとえばエキセンジン−４へのＸＴＥＮの付加は、ＸＴＥＮに連結されていないペプチドと比較して最終半減期を大きく増加させて、他の薬物動態パラメータも同様に増強できることが結論付けられる。
（実施例２８）
複数の種でのＥｘ４−ＸＴＥＮ ＢＰＸＴＥＮのＰＫ分析および予測ヒト半減期
ＸＴＥＮに融合された治療タンパク質のヒトにおける予測薬物動態プロフィールを決定するために、単一の融合ポリペプチドとしてＡＥ８６４ ＸＴＥＮに融合されたエキセンジン−４を使用して試験を行った。このＥｘ４−ＸＴＥＮ構築物を４つの異なる動物種に０．５〜１．０ｍｇ／ｋｇにて皮下および静脈内投与した。投与後に間隔を置いて血清試料を採取し、標準方法を使用して血清濃度を決定した。各種の半減期を決定して、表２９で表にした。結果を使用して、最終半減期の相対スケーリング、分布容積、および平均体重に基づくクリアランス速度を用いて、ヒト半減期を予測した。図２６Ａは、動物種における測定した最終半減期対体重のプロットを示し、７５ｋｇヒトでの予測Ｔ１／２は、エクセナチドで報告された２．４時間の半減期と比較して１４０時間である（Ｂｏｎｄ，Ａ．Ｐｒｏｃ（Ｂａｙｌ Ｕｎｉｖ Ｍｅｄ Ｃｅｎｔ）１９（３）：２８１−２８４．（２００６））。図２６Ｂは、測定した薬物クリアランス対体重を示し、７５ｋｇのヒトでの予測クリアランス速度値は３０ｍｌ／時間である。図２６Ｃは、測定した分布容積対体重を示し、７５ｋｇのヒトでの予測値は５９７０ｍｌである。
結論：結果から、グルコース調節ペプチド、たとえばエキセンジン−４へのＸＴＥＮの付加は、ＸＴＥＮに連結されていないペプチドと比較して最終半減期を大きく増加させられることと、同程度の半減期を有するＢＰＸＴＥＮ調合物が、毎週の、１週おきの、またはなお１ヶ月間隔での投薬による、グルコース調節ペプチドの市販製品で現在用いられるよりもかなり低い頻度の投薬を可能にすることが結論付けられる。
Figure 2017031218
（実施例２９）
ＸＴＥＮへの連結によるＢＰの溶解度および安定性の増加
ＸＴＥＮが溶解度および安定性の物理／化学特性を増強する能力を評価するために、より短い長さのＸＴＥＮを含むグルカゴンの融合タンパク質を調製して評価した。この被験物質を中性ｐＨのトリス緩衝食塩水で調製して、Ｇｃｇ−ＸＴＥＮ溶液のキャラクタリゼーションは逆相ＨＰＬＣおよびサイズ排除クロマトグラフィーによって、タンパク質は溶
液中で均質であり、凝集していないことを確認した。データを表３０に表示する。比較の目的で同じバッファーにおける未改変グルカゴンの溶解度限界を６０μＭ（０．２ｍｇ／ｍＬ）にて測定して、結果により、付加したＸＴＥＮのすべての長さで溶解度の実質的な増加が獲得されたことが証明される。重要なことに、大半の場合でグルカゴン−ＸＴＥＮ融合タンパク質は、標的濃度を達成するように調製され、所与の構築物の最大溶解度限界を決定するように評価されなかった。しかし、ＡＦ−１４４ ＸＴＥＮに連結されたグルカゴンの場合、溶解度限界が決定され、結果として、ＸＴＥＮに連結されていないグルカゴンと比較して、６０倍の溶解度の増加が達成された。さらにグルカゴン−ＡＦ１４４ ＢＰＸＴＥＮは、安定性について評価され、液体調合物において冷蔵条件下で少なくとも６ヶ月間および３７℃でおおよそ１ヶ月間安定であることが見出された（データは示さず）。
結論：データは、グルカゴンなどの生物活性タンパク質への短い長さのＸＴＥＮポリペプチドの連結が、得られた融合タンパク質によってタンパク質の溶解性特性を顕著に増強し、ならびにより高いタンパク質濃度において安定性を与えられるという結論を裏付けている。
Figure 2017031218
Figure 2017031218
（実施例３０）
ＢＰＸＴＥＮの２次構造のキャラクタリゼーション
ＢＰＸＴＥＮ Ｅｘ４−ＡＥ８６４を円偏光二色性分光法によって２次構造の程度について評価した。ＣＤ分光法は、Ｊａｓｃｏ Ｐｅｌｔｉｅｒ温度コントローラ（ＴＰＣ−３４８ＷＩ）を装備したＪａｓｃｏ Ｊ−７１５（Ｊａｓｃｏ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｔｏｋｙｏ， Ｊａｐａｎ）分光偏光計で行った。タンパク質濃度を２０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０、５０ｍＭ ＮａＣｌ中で０．２ｍｇ／ｍＬに調整した。実験は、光路長０．１ｃｍのＨＥＬＬＭＡ石英セルを使用して行った。ＣＤスペクトルを５℃、２５℃、４５℃、および６５℃にて取得して、Ｊ−７００ ｖｅｒｓｉｏｎ １．０８．０１（Ｂｕｉｌｄ １）Ｊａｓｃｏ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｆｏｒ Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）を使用して処理した。ＣＤ測定を行う前に、試料を各温度にて５分間平衡化した。すべてのスペクトルは帯域幅１ｎｍおよび時間定数２秒を使用して、走査速度１００ｎｍ／分にて３００ｎｍ〜１８５ｎｍまでを２連で記録した。図２４に示すＣＤスペクトルは、安
定な２次構造の証拠を示さず、非構造化ポリペプチドと一致している。
（実施例３１）
グルカゴンおよびＥｘ４ ＢＰＸＴＥＮ構築物の生物活性
ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質としてそれぞれＹ２８８に連結された精製グルカゴンおよびエキセンジン−３を生物活性について、インビトロ細胞アッセイを使用してアッセイした。簡潔には、ＣｈｅｍｉＳｃｒｅｅｎ安定カルシウム最適化グルカゴン受容体細胞系統を、グルカゴンおよびグルカゴン−ＸＴＥＮ構築物のリアルタイムカルシウム動員アッセイに使用して、天然ＧＬＰ−１受容体を発現する最適化エキセンジン−４受容体細胞系統をエキセンジン−４およびＥｘ４構築物に使用した。本系において、細胞は天然受容体を発現して、本受容体の活性化は、ＦＬＩＰＲ装置を使用して検出できる細胞内でのカルシウム流動を生じる。図２７に示すように、天然グルカゴンは、用量依存方式でシグナルの増加を生じる。本系における天然グルカゴンのＥＣ５０は、４．１ｎＭであることが見出された。グルカゴン−Ｙ２８８構築物の滴定は、同程度の応答曲線を産し、ＥＣ５０は７２ｎＭであった。図２８に示すように、２つの異なる市販元（ＡｎａｓｐｅｃおよびＴｏｃｒｉｓ）からの天然エキセンジン−４は、用量依存方式でシグナルの増加を生じ、ＥＣ５０（破線で示す）はそれぞれ７５ｐＭおよび１１０ｐＭであった。エキセンジン−４−Ｙ５７６構築物の滴定は、同程度の応答曲線を産し、ＥＣ５０は９８ｐＭであり、補助タンパク質の融合が全生物活性を保持することが示された。
結論：結果により、非構造化組換えタンパク質へのグルコース調節ペプチドの融合が生物活性を保持する組成物を生じることが示される。
（実施例３２）
ｈＧＨ＿ＸＴＥＮ−ＡＥ遺伝子およびｈＧＨ＿ＸＴＥＮ−ＡＭ遺伝子およびベクターの構築
ｈＧＨをコードする遺伝子をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅して、これによりＸＴＥＮデスティネーションベクターのスタッファにフランキングするＮｄｅＩおよびＢｓａＩ部位と適合性である、ＮｄｅＩおよびＢｂｓＩ制限部位を導入した。ｐＸＴＥＮプラスミドは、スタッファ−ＸＴＥＮの形式のＮｏｖａｇｅｎからのｐＥＴ３０誘導体であり、スタッファは緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）またはＣＢＤのどちらかであることができ、ＸＴＥＮは３６〜５７６以上の任意の長さであることができる。ｐＸＴＥＮのスタッファ配列をｈＧＨコードフラグメントで置き換えることによって、構築物を生成させた。ｐＸＴＥＮは、スタッファ配列の上流のＴ７プロモータ、およびスタッファ配列の下流にてインフレームで融合されたＸＴＥＮ配列を特色とする。用いたＸＴＥＮ配列は、ファミリＸＴＥＮ＿ＡＥまたはＸＴＥＮ＿ＡＭに属し、３６、７２、１４４、２８８、５７６、８６４、８７５および１２９６アミノ酸を含む長さをコードする。ＮｄｅＩおよびＢｓａＩエンドヌクレアーゼを使用する制限消化によって、スタッファフラグメントを除去した。Ｔ４ＤＮＡリガーゼを使用して、制限消化ｈＧＨ ＤＮＡフラグメントを切断ｐＸＴＥＮベクターにライゲーションし、ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｇｏｌｄ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中へと電気穿孔した。形質転換体をＤＮＡミニプレップによってスクリーニングして、所望の構築物をＤＮＡ配列決定によって確認した。最終ベクターはＴ７プロモータの制御下でｈＧＨ＿ＸＴＥＮ遺伝子を産する。
（実施例３３）
ＸＴＥＮ−ＡＥ＿ｈＧＨ遺伝子およびＸＴＥＮ−ＡＭ＿ｈＧＨ遺伝子およびベクターの構築
ｈＧＨをコードする遺伝子をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅して、これによりＸＴＥＮデスティネーションベクターのスタッファにフランキングするＢｂｓＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位と適合性である、ＢｂｓＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を導入
した。ｐＣＢＤ−ＸＴＥＮプラスミドは、セルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）−ＸＴＥＮ−スタッファの形式のＮｏｖａｇｅｎからのｐＥＴ３０誘導体であり、スタッファは緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）であり、ＸＴＥＮは３６〜５７６以上の任意の長さであることができる。ｐＣＢＤ−ＸＴＥＮのスタッファ配列をｈＧＨコードフラグメントで置き換えることによって、構築物を生成させた。ｐＣＢＤ−ＸＴＥＮは、ＣＢＤの上流のＴ７プロモータ、それに続くスタッファ配列の上流にてインフレームで融合されたＸＴＥＮ配列を特色とする。用いたＸＴＥＮ配列は、ファミリＸＴＥＮ＿ＡＥおよびＸＴＥＮ＿ＡＭに属し、３６、７２、１４４、２８８、５７６、８６４、８７５および１２９６アミノ酸を含む長さをコードする。ＢｂｓＩおよびＨｉｎｄＩＩＩエンドヌクレアーゼを使用する制限消化によって、スタッファフラグメントを除去した。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを使用して、制限消化ｈＧＨ ＤＮＡフラグメントを切断ｐＣＢＤ−ＸＴＥＮベクターにライゲーションし、ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｇｏｌｄ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中へと電気穿孔した。形質転換体をＤＮＡミニプレップによってスクリーニングして、所望の構築物をＤＮＡ配列決定によって確認した。最終ベクターはＴ７プロモータの制御下でＣＢＤ＿ＸＴＥＮ＿ｈＧＨ遺伝子を産する。
（実施例３４）
ＸＴＥＮ−ＡＥ＿ｈＧＨ＿ＸＴＥＮ−ＡＥ＿ｈＧＨ遺伝子およびベクターの構築
ｈＧＨをコードする遺伝子をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅して、これによりＸＴＥＮデスティネーションベクターのスタッファにフランキングするＢｂｓＩおよびＢｓａＩ部位に適合性である、ＢｂｓＩおよびＢｓａＩ制限部位を導入した。ｐＮＴＳ−ＸＴＥＮプラスミドは、４８アミノ酸のＮ末端ＸＴＥＮ発現配列の形式のＮｏｖａｇｅｎからのｐＥＴ３０誘導体であり、スタッファは緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）であり、ＸＴＥＮは３６〜５７６以上の任意の長さであることができる。ｐＣＢＤ−ＸＴＥＮのスタッファ配列をｈＧＨコードフラグメントで置き換えることによって、構築物を生成させた。ｐＮＴＳ−ＸＴＥＮは、ＮＴＳの上流のＴ７プロモータ、それに続くスタッファ配列の上流にてインフレームで融合されたＸＴＥＮ配列を特色とする。用いたＸＴＥＮ配列は、ファミリＸＴＥＮ＿ＡＥに属し、３６、７２、１４４、２８８、５７６、８６４、および１２９６アミノ酸を含む長さをコードする。ＢｂｓＩおよびＢｓａＩエンドヌクレアーゼを使用する制限消化によって、スタッファフラグメントを除去した。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを使用して、制限消化ｈＧＨ ＤＮＡフラグメントを切断ｐＮＴＳ−ＸＴＥＮベクターにライゲーションし、ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｇｏｌｄ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中へと電気穿孔した。いくつかの場合において、１４４または２８８アミノ酸の第２のＸＴＥＮ＿ＡＥ配列をｈＧＨ遺伝子のＣ末端にライゲーションした。形質転換体をＤＮＡミニプレップによってスクリーニングして、所望の構築物をＤＮＡ配列決定によって確認した。最終ベクターはＴ７プロモータの制御下でＮＴＳ＿ＸＴＥＮ＿ｈＧＨ遺伝子またはＮＴＳ＿ＸＴＥＮ＿ｈＧＨ＿ＸＴＥＮ遺伝子を産する。
（実施例３５）
ＧＨ＿ＸＴＥＮ構築物の精製
タンパク質発現
上記のプラスミドをＢＬ２１（ＤＥ３）−Ｇｏｌｄ大腸菌株（Ｎｏｖａｇｅｎ）に形質転換して、適切な抗生物質を含むＬＢ寒天プレートに蒔き、３７℃にて一晩生育させた。単一のコロニーを５ｍｌのＴＢ１２５媒体に接種して、３７℃にて一晩生育させた。翌日、接種物を、５００ｍｌのＴＢ１２５を有する２Ｌ容器中へと変え（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ）、ＯＤ＝Ｏ．６に達するまで生育させて、続いて０．１ｍＭ ＩＰＴＧを用いて２６℃にて１６時間にて引き続き生育させた。
細胞を遠心分離によって採取して、細胞ペレットを５ｍＭトリスｐＨ＝８．０、１００ｍＭ ＮａＣｌを含有する５０ｍｌバッファーに再懸濁させた。超音波処理細胞破壊器を
使用して細胞を破壊して、細胞片を１５０００ＲＰＭの遠心分離で４℃にて除去した。次に溶解物のｐＨを酢酸によってｐＨ４．５に調整して、夾雑宿主細胞タンパク質を沈殿させ、続いて遠心分離により清澄にした。清澄になった酸処理溶解物を次にＤＥ５２アニオン交換クロマトグラフィーカラムに適用して、ＮａＣｌで溶解させた。溶出した画分を次に、ｐＨ４．０までさらに酸性化して、ＭａｃｒｏＣａｐＳＰカチオン交換クロマトグラフィーカラムに適用した。生成物をＮａＣｌによる連続溶出を使用して溶出させた。
タンパク質純度は９８％超と推定された。溶出した融合タンパク質の量をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって、および総タンパク質濃度の測定によって決定した。溶出した融合タンパク質の量が多いことは、ｈＧＨ単独に比べて融合タンパク質のより溶解性が高いことを反映している。
最終調合物および貯蔵
次にバッファー交換タンパク質を１０Ｋ ＭＷＣＯ Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ濃縮器を使用して２ｍＬの最終体積まで濃縮した。０．２２ｕｍのシリンジフィルタを使用して、濃縮物を滅菌濾過した。最終溶液を等分割して−８０℃で貯蔵した。
（実施例３６）
ＥＬＩＳＡに基づく結合アッセイ
ＧＨへのＸＴＥＮ融合物を標準ＥＬＩＳＡに基づくアッセイで試験して、ＧＨ受容体へ結合するその能力を評価した。アッセイは、組換えｈＧＨ受容体（ｈＧＨＲ−Ｆｃ）がＥＬＩＳＡプレートのウェルにコーティングされているサンドイッチＥＬＩＳＡ形式を使用して行った。次にウェルをブロッキングし、洗浄し、ＢＰＸＴＥＮ試料を次にさまざまな希釈度のウェルにてインキュベートして、ＢＰＸＴＥＮの捕捉を可能にした。ウェルを広範囲に洗浄して、ポリクローナルまたはモノクローナル抗ＧＨ抗体または抗ＸＴＥＮ抗体のビオチン化調製物およびストレプトアビジンＨＲＰを使用して、結合タンパク質を検出した。各血清希釈度での比色反応を未改変ＧＨの標準曲線に対して比較することによって、結合タンパク質の割合を計算した。図３０に示した結果により、見かけのＥＣ５０値は天然ｈＧＨで０．０７０１ｎＭ、ＡＭ８６４＿ｈＧＨで０．３９０５、およびｈＧＨ＿ＡＭ８６４で２．７３３であることが示される。
結論：結果により、ＸＴＥＮ融合物は融合後に顕著な量の受容体結合活性を保持して、Ｃ末端にｈＧＨを有するＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質は、Ｎ末端にｈＧＨを有する融合タンパク質と比較して、より大きな結合親和性を保持することが示される。
（実施例３７）
ラットにおけるｈＧＨ ＸＴＥＮ融合ポリペプチドのＰＫ分析
ｈＧＨＸＴＥＮポリペプチドのインビボ薬物動態パラメータを決定するために、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質ＡＥ９１２−ｈＧＨ、ＡＭ８６４−ｈＧＨ（本実施例および以下の実施例でＡＭ８７５−ｈＧＨの同義語）、ＡＥ９１２−ｈＧＨ−ＡＥ１４４およびＡＥ９１２−ｈＧＨ−ＡＥ２８８をラットで評価した。すべての組成物を水性バッファーにおいて提供して、皮下（ＳＣ）経路で個々の動物に１．５ｍｇ／ｋｇ単回用量を使用して投与した。血漿試料を投与後の各種の時点で採取して、被験物質の濃度を分析した。分析はサンドイッチＥＬＩＳＡ形式を使用して行った。組換えｈＧＨＲ−ＦｃをＥＬＩＳＡプレートのウェルにコーティングした。ウェルをブロッキングし、洗浄し、血漿試料を次に様々な希釈度でウェルにてインキュベートして、コート抗体による化合物の捕捉を可能にした。ウェルを広範囲に洗浄して、ポリクローナル抗ｈＧＨ抗体のビオチン化調製物およびストレプトアビジンＨＲＰを使用して、結合タンパク質を検出した。各血清希釈度での比色反応を標準曲線に対して比較することによって、被験物質の濃度を各時点で計算した。薬物動態パラメータは、ＷｉｎＮｏｎＬｉｎソフトウェアパッケージを使用して計算した。
図３２は、皮下投与後の４つのｈＧＨ ＸＴＥＮ構築物の濃度プロフィールを示す。計算した最終半減期は、ＡＥ９１２−ｈＧＨで７．５時間、ＡＭ８６４−ｈＧＨ（ＡＭ８７５−ｈＧＨの同義語）で６．８時間、ＡＥ９１２−ｈＧＨ−ＡＥ１４４で１２．４時間およびＡＥ９１２−ｈＧＨ−ＡＥ２８８で１３．１時間であった。比較のために、未改変ｈＧＨについて並行して同じ実験を行うと、劇的により短い血漿半減期を示した。
結論：ｈＧＨを含む融合タンパク質への異なるＸＴＥＮ配列の組み入れによって、げっ歯類モデルで証明されたように、未改変ｈＧＨと比較して、４つすべての組成物で薬物動態パラメータの顕著な増強が生じ、このような融合タンパク質組成物の有用性が証明される。ＡＥ−ｈＧＨ構築物のＣ末端への第２のＸＴＥＮタンパク質の付加により、おそらく受容体媒介クリアランスの低下のために、単一のＸＴＥＮを有する構築物と比較して、最終半減期のさらなる増強が生じる。
（実施例３８）
カニクイザルにおけるｈＧＨ ＸＴＥＮ融合ポリペプチドのＰＫ分析
ｈＧＨＸＴＥＮポリペプチドのインビボ薬物動態パラメータに対する第２のＸＴＥＮの包含の効果を決定するために、１個または２個のＸＴＥＮ分子を含有するＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質（ＡＥ９１２−ｈＧＨ、ＡＭ８６４−ｈＧＨ、およびＡＥ９１２−ｈＧＨ−ＡＥ１４４）をカニクイザルにおいて評価した。すべての組成物を水性バッファーにおいて提供して、皮下（ＳＣ）経路で個々の動物に１．５ｍｇ／ｋｇ単回用量を使用して投与した。血漿試料を投与後の各種の時点で収集して、被験物質の濃度を分析した。分析はサンドイッチＥＬＩＳＡ形式を使用して行った。組換えｈＧＨＲ−ＦｃをＥＬＩＳＡプレートのウェルにコーティングした。ウェルをブロッキングし、洗浄し、血漿試料を次に様々な希釈度でウェルにてインキュベートして、コート抗体による化合物の捕捉を可能にした。ウェルを広範囲に洗浄して、ポリクローナル抗ｈＧＨ抗体のビオチン化調製物およびストレプトアビジンＨＲＰを使用して、結合タンパク質を検出した。各血清希釈度での比色反応を標準曲線に対して比較することによって、被験物質の濃度を各時点で計算した。薬物動態パラメータは、ＷｉｎＮｏｎＬｉｎソフトウェアパッケージを使用して計算した。融合タンパク質の平均最終半減期は、ＡＭ８６４−ｈＧＨで３３時間、ＡＥ９１２−ｈＧＨで４４時間、およびＡＥ９１２−ｈＧＨ−ＡＥ１４４（ｈＧＨのＮ末端およびＣ末端に連結された２個のＸＴＥＮを含有）で１１０時間であった。
図３３は、皮下投与後の３つのｈＧＨ ＸＴＥＮ構築物の濃度プロフィールを示し、計算したＰＫパラメータを示す。皮下投与の後、最終半減期は、３３６時間の期間にわたる各種の調製物について、おおよそ３３〜１１０時間であると計算された。
結論：ｈＧＨを含む融合タンパク質への異なるＸＴＥＮ配列の組み入れによって、カニクイザルモデルで証明されたように、３つすべての組成物で薬物動態パラメータの顕著な増強が生じ、このような融合タンパク質組成物の有用性が証明され、ｈＧＨのＣ末端に連結された第２のＸＴＥＮを含有する構築物は、最終半減期について２倍の増強を示した。
（実施例３９）
体重増大に対するｈＧＨおよびＡＭ８６４−ｈＧＨの効果の比較
ＢＰＸＴＥＮ ＡＭ８６４−ｈＧＨが薬理学的効力を保持する能力を、投与した化合物に応答した低酸素症ラットにおける体重増大についての測定パラメータを使用して評価した。図３４は、示した用量および投与頻度でのｈＧＨまたはＡＭ８６４−ｈＧＨの投与の低酸素症ラットの体重に対する効果を示す。結果は、ｈＧＨの同程度の投薬量と効力が同等であるＢＰＸＴＥＮ構築物による、またより低い頻度の投薬での生物活性の保持を示す。ＡＭ８６４−ｈＧＨの用量レベルの増加は、実験の期間にわたって体重増大の増加をも
たらす。
（実施例４０）
骨軟骨に対するｈＧＨおよびＡＭ８６４−ｈＧＨの効果の比較
ｈＧＨに連結されたＡＭ８６４のＢＰＸＴＥＮが薬理学的効力を保持する能力を、低酸素症ラットにおける脛骨端板（ｔｉｂｉａｌ ｅｐｉｐｈｙｓｅａｌ ｐｌａｔｅ）幅の増加についての測定パラメータを使用して評価した。図３５は、処置９日後のラットからの脛骨の組織断面に示す、プラセボ、ｈＧＨ、およびＡＭ８６４−ｈＧＨの投与の効果の比較を示し、縁（ｍａｒｇｉｎ）は点線で記されている。群は図３５で示すものと同じである。図３５Ａは、プラセボ群が９日後に３４４±３８．６μｍの脛骨端板の平均断面幅を有したことを示す。図３５Ｂは、ｈＧＨ群（毎日１０μｇ）が９日後に５９８±８．５μｍの平均断面幅を有したことを示す。図３５Ｃは、ＡＭ８６４−ｈＧＨ（１５ｍｇ／ｋｇ ｑ３ｄ）が９日後に９４４±８．５μｍの平均断面幅を有したことを示す。結果によって、より頻繁でない間隔で投薬されたにもかかわらず、ＧＨＵＰＲ構築物による活性の増強が示される。
（実施例４１）
ＦＸＩａによって放出可能なＣ末端ＸＴＥＮ
ＦＩＸのＣ末端に融合されたＸＴＥＮタンパク質から成るＦＩＸ−ＸＴＥＮ融合タンパク質は、図３６Ｂに描くように、ＦＩＸ構成要素およびＸＴＥＮ構成要素の間に配置されたＸＴＥＮ放出部位切断配列によって生成することができる。例示的な配列を表４３に提供する。この場合には、放出部位切断配列は、ＦＸＩａプロテアーゼ（ＥＣ３．４．２１．２７，Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０３９５１）によって認識および切断されるアミノ酸配列を含有するＦＩＸ−ＸＴＥＮに組み入れることができる。特にアミノ酸配列ＫＬＴＲ↓ＶＶＧＧ（配列番号２２４）［Ｒａｗｌｉｎｇｓ Ｎ．Ｄら（２００８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３６：Ｄ３２０］は、配列のアルギニンの後でＦＸＩａプロテアーゼによって切断される。ＦＸＩは、内因性凝固経路または接触活性化凝固経路においてＦＩＸの直前に位置する凝固促進プロテアーゼである。活性ＦＸＩａは、ＦＸＩＩａによるチモーゲンのタンパク質分解切断によりＦＸＩから産生される。いったん活性化されると、凝固におけるその天然の役割は、ＦＩＸの位置Ｒ１９１およびＲ２２６にてタンパク質を切ることによりチモーゲンからペプチドを切除してＦＩＸを活性化して、次に、今度は凝固経路を永続化させることである。ＦＸＩａの産生は厳重に制御され、適正な止血のために凝固が必要なときにのみ出現する。それゆえ、切断配列の組み入れにより、ＸＴＥＮドメインのみが、内因性凝固経路の活性化と同時に、および凝固が生理的に必要とされるときにＦＩＸから除去される。これにより、ＦＩＸ−ＸＴＥＮ融合タンパク質が内因性経路の活性化の間に１つの追加の方式で処理される状況が生じる。ＦＸＩａによりＦＩＸドメインのＲ１９１およびＲ２２６にて起こる天然の切断（ｎａｔｕｒａｌ ｃｌｅａｖａｇｅ）に加えて、ＸＴＥＮタンパク質から今や活性化されたＦＩＸａを分離する（ｄｅｃｏｕｐｌｅ）第３の切断が、ＸＴＥＮ放出部位に出現する。本発明の組成物の所望の特色では、これにより凝固の活性化までＦＩＸ−ＸＴＥＮがプロドラッグとして無傷のままである状況が生じ、凝固の活性化のときにその分子が処理されて、それを必要とする被験体において凝固機能を再構成または増進させる遊離ＦＩＸａを産生する。
（実施例４２）
ＦＸＩＩａによって放出可能なＣ末端ＸＴＥＮ
ＦＩＸのＣ末端に融合されたＸＴＥＮタンパク質から成るＦＩＸ−ＸＴＥＮ融合タンパク質は、図３６Ｂに描くように、ＦＩＸ構成要素およびＸＴＥＮ構成要素の間に配置されたＸＴＥＮ放出部位切断配列によって生成することができる。例示的な配列を表４３に提供する。この場合には、ＸＴＥＮ放出部位配列は、ＦＸＩＩａプロテアーゼ（ＥＣ３．４．２１．３８，Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ００７４８）によって認識および切断されるアミノ酸
配列を含有できる。具体的に配列ＴＭＴＲ↓ＩＶＧＧ（配列番号２２５）は、配列の位置４のアルギニンの後で切られる。ＦＸＩＩは、内因性凝固経路または接触活性化凝固経路においてＦＩＸの前に位置する凝固促進プロテアーゼである。活性ＦＸＩＩａは、非自己表面との接触によって、およびカリクレインによる切断によって、ＦＸＩＩから産生される。いったん活性化されると、凝固におけるその天然の役割は、チモーゲンのタンパク質分解切断によりＦＸＩを活性化して、次に、今度は凝固経路を永続化させることである。ＦＸＩＩａの産生は厳重に制御され、適正な止血のために凝固が必要なときにのみ出現する。それゆえ、切断配列の組み入れにより、ＸＴＥＮドメインのみが、内因性凝固経路の活性化と同時に、および凝固が生理的に必要とされるときにＦＩＸから除去される。これにより、ＦＩＸ−ＸＴＥＮ融合物が内因性経路の活性化の間に１つの追加の方式で処理される状況が生じる。ＦＸＩａによりＦＩＸドメインのＲ１９１およびＲ２２６にておこる天然の切断に加えて、ＸＴＥＮタンパク質から今や活性化されたＦＩＸａを分離する第３の切断が、ＸＴＥＮ放出部位におこる。本発明の組成物の所望の特色では、これにより凝固の活性化までＦＩＸ−ＸＴＥＮがプロドラッグとして無傷のままである状況が生じ、凝固の活性化のときにその分子が処理されて、それを必要とする被験体において凝固機能を再構成または増進させる遊離ＦＩＸａを産生する。
（実施例４３）
カリクレインによって放出可能なＣ末端ＸＴＥＮ
ＦＩＸのＣ末端に融合されたＸＴＥＮタンパク質から成るＦＩＸ−ＸＴＥＮ融合タンパク質は、図３６Ｂに描くように、ＦＩＸ構成要素およびＸＴＥＮ構成要素の間に配置されたＸＴＥＮ放出部位切断配列によって生成することができる。例示的な配列を表４３に提供する。この場合には、ＸＴＥＮ放出部位配列は、カリクレインプロテアーゼ（ＥＣ３．４．２１．３４，Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０３９５２）によって認識および切断されるアミノ酸配列を含有できる。具体的に配列ＳＰＦＲ↓ＳＴＧＧ（配列番号２２６）［Ｒａｗｌｉｎｇｓ Ｎ．Ｄ．ら（２００８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３６：Ｄ３２０］は、配列の位置４のアルギニンの後で切られる。カリクレインは、内因性凝固経路または接触活性化凝固経路においてＦＩＸの前に位置する凝固促進プロテアーゼである。活性カリクレインは、非自己表面との接触によって、血漿カリクレイン（Ｋａｌｌｉｒｉｅｎ）から産生される。いったん活性化されると、凝固におけるその天然の役割は、チモーゲンのタンパク質分解切断によりＦＸＩＩ（図３９）を活性化して、次に、今度は凝固経路を永続化させることである。カリクレインの産生は厳重に制御され、適正な止血のために凝固が必要なときにのみ出現する。それゆえ、切断配列の組み入れにより、ＸＴＥＮドメインのみが、内因性凝固経路の活性化と同時に、および凝固が生理的に必要とされるときにＦＩＸから除去される。これにより、ＦＩＸ−ＸＴＥＮ融合物が内因性経路の活性化の間に１つの追加の方式で処理される状況が生じる。ＦＸＩａによりＦＩＸドメインのＲ１９１およびＲ２２６にておこる天然の切断に加えて、ＸＴＥＮタンパク質から今や活性化されたＦＩＸａを分離する第３の切断が、ＸＴＥＮ放出部位におこる。本発明の組成物の所望の特色では、これにより凝固の活性化までＦＩＸ−ＸＴＥＮがプロドラッグとして無傷のままである状況が生じ、凝固の活性化のときにその分子が処理されて、それを必要とする被験体において凝固機能を再構成または増進させる遊離ＦＩＸａを産生する。
（実施例４４）
ＦＶＩＩａによって放出可能なＣ末端ＸＴＥＮ
ＦＩＸのＣ末端に融合されたＸＴＥＮタンパク質から成るＦＩＸ−ＸＴＥＮ融合タンパク質は、図３６Ｂに描くように、ＦＩＸ構成要素およびＸＴＥＮ構成要素の間に配置されたＸＴＥＮ放出部位切断配列によって生成することができる。例示的な配列を表４３に提供する。この場合には、放出部位配列は、ＦＶＩＩａプロテアーゼ（ＥＣ３．４．２１．２１，Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０８７０９）によって認識および切断されるアミノ酸配列を含有する。具体的に配列ＬＱＶＲ↓ＩＶＧＧ（配列番号２２７）［Ｒａｗｌｉｎｇｓ Ｎ．
Ｄ．ら（２００８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３６：Ｄ３２０］は、配列の位置４のアルギニンの後で切られる。ＦＶＩＩａは、外因性凝固経路または細胞傷害活性化凝固経路においてＦＩＸの前に位置する凝固促進プロテアーゼである。活性ＦＶＩＩａは、組織因子、リン脂質およびカルシウムへの結合によって補助される自己触媒プロセスにおいてＦＶＩＩから産生される。いったん活性化されると、凝固におけるその天然の役割は、チモーゲンのタンパク質分解切断によりＦＩＸおよびＦＸ（図３９）を活性化して、次に、今度は凝固経路を永続化させることである。ＦＶＩＩａ活性は厳重に制御され、適正な止血のために凝固が必要なときにのみ出現する。それゆえ、切断配列の組み入れにより、ＸＴＥＮドメインのみが、内因性凝固経路の活性化と同時に、および凝固が生理的に必要とされるときにＦＩＸから除去される。これにより、ＦＩＸ−ＸＴＥＮ融合物が内因性経路の活性化の間に１つの追加の方式で処理される状況が生じる。ＦＶＩＩａによりＦＩＸドメインのＲ１９１およびＲ２２６にておこる天然の切断に加えて、ＸＴＥＮタンパク質から今や活性化されたＦＩＸａを分離する第３の切断が、ＸＴＥＮ放出部位におこる。本発明の組成物の所望の特色では、これにより凝固の活性化までＦＩＸ−ＸＴＥＮがプロドラッグとして無傷のままである状況が生じ、凝固の活性化のときにその分子が処理されて、それを必要とする被験体において凝固機能を再構成または増進させる遊離ＦＩＸａを産生する。
（実施例４５）
ＦＩＸａによって放出可能なＣ末端ＸＴＥＮ
ＦＩＸのＣ末端に融合されたＸＴＥＮタンパク質から成るＦＩＸ−ＸＴＥＮ融合タンパク質は、図３６Ｂに描くように、ＦＩＸ構成要素およびＸＴＥＮ構成要素の間に配置されたＸＴＥＮ放出部位切断配列によって生成することができる。例示的な配列を表４３に提供する。この場合には、放出部位切断配列は、ＦＩＸａプロテアーゼ（ＥＣ３．４．２１．２２，Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ００７４０）によって認識および切断されるアミノ酸配列を含有する。具体的に配列ＰＬＧＲ↓ＩＶＧＧ（配列番号２２８）［Ｒａｗｌｉｎｇｓ Ｎ．Ｄ．ら（２００８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３６：Ｄ３２０］は、配列の位置４のアルギニンの後で切られる。活性ＦＩＸａは、リン脂質およびカルシウムの存在下でのＦＸＩａまたはＦＶＩＩａのどちらかによるＦＩＸの切断によって産生される。いったん活性化されると、凝固におけるその天然の役割は、チモーゲンのタンパク質分解切断によりＦＸ（図３９）を活性化して、次に、今度は凝固経路を永続化させることである。ＦＩＸａ活性は厳重に制御され、適正な止血のために凝固が必要なときにのみ出現する。それゆえ、切断配列の組み入れにより、ＸＴＥＮドメインのみが、外因性凝固経路または内因性凝固経路の活性化と同時に、および凝固が生理的に必要とされるときにＦＩＸから除去される。これにより、ＦＩＸ−ＸＴＥＮ融合物が内因性経路の活性化の間に１つの追加の方式で処理される状況が生じる。ＦＶＩＩａまたはＦＸＩａによりＦＩＸドメインのＲ１９１およびＲ２２６にておこる天然の切断に加えて、ＸＴＥＮタンパク質から今や活性化されたＦＩＸａを分離する第３の切断が、ＸＴＥＮ放出部位におこる。本発明の組成物の所望の特色では、これにより凝固の活性化までＦＩＸ−ＸＴＥＮがプロドラッグとして無傷のままである状況が生じ、凝固の活性化のときにその分子が処理されて、それを必要とする被験体において凝固機能を再構成または増進させる遊離ＦＩＸａを産生する。
（実施例４６）
ＦＸａによって放出可能なＣ末端ＸＴＥＮ
ＦＩＸのＣ末端に融合されたＸＴＥＮタンパク質から成るＦＩＸ−ＸＴＥＮ融合タンパク質は、図３６Ｂに描くように、ＦＩＸ構成要素およびＸＴＥＮ構成要素の間に配置されたＸＴＥＮ放出部位切断配列によって生成することができる。例示的な配列を表４３に提供する。この場合には、放出部位は、ＦＸａプロテアーゼ（ＥＣ３．４．２１．６，Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ００７４２）によって認識および切断されるアミノ酸配列を含有する。具
体的に配列ＩＥＧＲ↓ＴＶＧＧ（配列番号２２９）［Ｒａｗｌｉｎｇｓ Ｎ．Ｄ．ら（２００８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３６：Ｄ３２０］は、配列の位置４のアルギニンの後で切られる。活性ＦＸａは、リン脂質およびカルシウムの存在下でのＦＩＸａによるＦＸの切断によって産生され、凝固経路の第ＩＸ因子からすぐ下流のステップである。いったん活性化されると、凝固におけるその天然の役割は、チモーゲンのタンパク質分解切断によりＦＩＩ（図３９）を活性化して、次に、今度は凝固経路を永続化させることである。ＦＸａ活性は厳重に制御され、適正な止血のために凝固が必要なときにのみ出現する。それゆえ、切断配列の組み入れにより、ＸＴＥＮドメインのみが、外因性凝固経路または内因性凝固経路の活性化と同時に、および凝固が生理的に必要とされるときにＦＩＸから除去される。これにより、ＦＩＸ−ＸＴＥＮ融合物が凝固の活性化の間に１つの追加の方式で処理される状況が生じる。ＦＶＩＩａまたはＦＸＩａによりＦＩＸドメインのＲ１９１およびＲ２２６にておこる天然の切断に加えて、ＸＴＥＮタンパク質から今や活性化されたＦＩＸａを分離する第３の切断が、ＸＴＥＮ放出部位におこる。本発明の組成物の所望の特色では、これにより凝固の活性化までＦＩＸ−ＸＴＥＮがプロドラッグとして無傷のままである状況が生じ、凝固の活性化のときにその分子が処理されて、それを必要とする被験体において凝固機能を再構成または増進させる遊離ＦＩＸａを産生する。
（実施例４７）
ＦＩＩａ（トロンビン）によって放出可能なＣ末端ＸＴＥＮ
ＦＩＸのＣ末端に融合されたＸＴＥＮタンパク質から成るＦＩＸ−ＸＴＥＮ融合タンパク質は、図３６Ｂに描くように、ＦＩＸ構成要素およびＸＴＥＮ構成要素の間に配置されたＸＴＥＮ放出部位切断配列によって生成することができる。例示的な配列を表４３に提供する。この場合には、放出部位は、ＦＩＩａプロテアーゼ（ＥＣ３．４．２１．５，Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ００７３４）によって認識および切断されるアミノ酸配列を含有する。具体的に配列ＬＴＰＲ↓ＳＬＬＶ（配列番号２３０）［Ｒａｗｌｉｎｇｓ Ｎ．Ｄ．ら（２００８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３６：Ｄ３２０］は、配列の位置４のアルギニンの後で切られる。活性ＦＩＩａは、リン脂質およびカルシウムの存在下でのＦＸａによるＦＩＩの切断によって産生され、凝固経路の第ＩＸ因子から下流にある。いったん活性化されると、凝固におけるその天然の役割はフィブリノーゲン（ｆｉｂｒｉｎｇｉｎ）（図３９）を切断することであり、これにより次に、今度はクロット形成が開始する。ＦＩＩａ活性は厳重に制御され、適正な止血のために凝固が必要なときにのみ出現する。それゆえ、切断配列の組み入れにより、ＸＴＥＮドメインのみが、外因性凝固経路または内因性凝固経路の活性化と同時に、および凝固が生理的に必要とされるときにＦＩＸから除去される。これにより、ＦＩＸ−ＸＴＥＮ融合物が凝固の活性化の間に１つの追加の方式で処理される状況が生じる。ＦＶＩＩａまたはＦＸＩａによりＦＩＸドメインのＲ１９１およびＲ２２６にておこる天然の切断に加えて、ＸＴＥＮタンパク質から今や活性化されたＦＩＸａを分離する第３の切断が、ＸＴＥＮ放出部位におこる。本発明の組成物の所望の特色では、これにより凝固の活性化までＦＩＸ−ＸＴＥＮがプロドラッグとして無傷のままである状況が生じ、凝固の活性化のときにその分子が処理されて、それを必要とする被験体において凝固機能を再構成または増進させる遊離ＦＩＸａを産生する。
（実施例４８）
エラスターゼ−２によって放出可能なＣ末端ＸＴＥＮ
ＦＩＸのＣ末端に融合されたＸＴＥＮタンパク質から成るＦＩＸ−ＸＴＥＮ融合タンパク質は、図３６Ｂに描くように、ＦＩＸ構成要素およびＸＴＥＮ構成要素の間に配置されたＸＴＥＮ放出部位切断配列によって生成することができる。例示的な配列を表４３に提供する。この場合には、放出部位は、エラスターゼ−２プロテアーゼ（ＥＣ３．４．２１．３７，Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０８２４６）によって認識および切断されるアミノ酸配列を含有する。具体的に配列ＬＧＰＶ↓ＳＧＶＰ（配列番号２３１）［Ｒａｗｌｉｎｇｓ Ｎ
．Ｄ．ら（２００８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３６：Ｄ３２０］は、配列の位置４の後で切られる。エラスターゼは好中球によって構成的に発現され、循環中に常時存在する。その活性はセルピンによって厳重に制御され、それゆえ、ほぼ常に最小限に活性である。それゆえ、長寿命ＦＩＸ−ＸＴＥＮが循環するときに、その一部が切断されて、凝固に使用されるより短寿命のＦＩＸのプールを生成する。本発明の組成物の所望の特色では、これにより予防量のＦＩＸを絶えず放出する循環プロドラッグデポーが生成される。
（実施例４９）
ＭＭＰ−１２によって放出可能なＣ末端ＸＴＥＮ
ＦＩＸのＣ末端に融合されたＸＴＥＮタンパク質から成るＦＩＸ−ＸＴＥＮ融合タンパク質は、図３６Ｂに描くように、ＦＩＸ構成要素およびＸＴＥＮ構成要素の間に配置されたＸＴＥＮ放出部位切断配列によって生成することができる。例示的な配列を表４３に提供する。この場合には、放出部位は、ＭＭＰ−１２プロテアーゼ（ＥＣ３．４．２４．６５，Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ３９９００）によって認識および切断されるアミノ酸配列を含有する。具体的に配列ＧＰＡＧ↓ＬＧＧＡ（配列番号２３３）［Ｒａｗｌｉｎｇｓ Ｎ．Ｄ．ら（２００８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３６：Ｄ３２０］は、配列の位置４の後で切られる。ＭＭＰ−１２は全血中で構成的に発現される。それゆえ、長寿命ＦＩＸ−ＸＴＥＮが循環するときに、その一部が切断されて、凝固に使用されるより短寿命のＦＩＸのプールを生成する。本発明の組成物の所望の特色では、これにより予防量のＦＩＸを絶えず放出する循環プロドラッグデポーが生成される。
（実施例５０）
ＭＭＰ−１３によって放出可能なＣ末端ＸＴＥＮ
ＦＩＸのＣ末端に融合されたＸＴＥＮタンパク質から成るＦＩＸ−ＸＴＥＮ融合タンパク質は、図３６Ｂに描くように、ＦＩＸ構成要素およびＸＴＥＮ構成要素の間に配置されたＸＴＥＮ放出部位切断配列によって生成することができる。例示的な配列を表４３に提供する。この場合には、放出部位は、ＭＭＰ−１３プロテアーゼ（ＥＣ３．４．２４．−，Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ４５４５２）によって認識および切断されるアミノ酸配列を含有する。具体的に配列ＧＰＡＧ↓ＬＲＧＡ（配列番号２３４）［Ｒａｗｌｉｎｇｓ Ｎ．Ｄ．ら（２００８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３６：Ｄ３２０］は、位置４の後で切られる（矢印で示す）。ＭＭＰ−１３は全血中で構成的に発現される。それゆえ、長寿命ＦＩＸ−ＸＴＥＮが循環するときに、その一部が切断されて、凝固に使用されるより短寿命のＦＩＸのプールを生成する。本発明の組成物の所望の特色では、これにより予防量のＦＩＸを絶えず放出する循環プロドラッグデポーが生成される。
（実施例５１）
ＭＭＰ−１７によって放出可能なＣ末端ＸＴＥＮ
ＦＩＸのＣ末端に融合されたＸＴＥＮタンパク質から成るＦＩＸ−ＸＴＥＮ融合タンパク質は、図３６Ｂに描くように、ＦＩＸ構成要素およびＸＴＥＮ構成要素の間に配置されたＸＴＥＮ放出部位切断配列によって生成することができる。例示的な配列を表４３に提供する。この場合には、放出部位は、ＭＭＰ−２０プロテアーゼ（ＥＣ．３．４．２４．−，Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ９ＵＬＺ９）によって認識および切断されるアミノ酸配列を含有する。具体的に配列ＡＰＬＧ↓ＬＲＬＲ（配列番号２３５）［Ｒａｗｌｉｎｇｓ Ｎ．Ｄら（２００８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３６：Ｄ３２０］は、配列の位置４の後で切られる。ＭＭＰ−１７は全血中で構成的に発現される。それゆえ、長寿命ＦＩＸ−ＸＴＥＮが循環するときに、その一部が切断されて、凝固に使用されるより短寿命のＦＩＸのプールを生成する。本発明の組成物の所望の特色では、これにより予防量のＦＩＸを絶えず放出する循環プロドラッグデポーが生成される。
（実施例５２）
ＭＭＰ−２０によって放出可能なＣ末端ＸＴＥＮ
ＦＩＸのＣ末端に融合されたＸＴＥＮタンパク質から成るＦＩＸ−ＸＴＥＮ融合タンパク質は、図３６Ｂに描くように、ＦＩＸ構成要素およびＸＴＥＮ構成要素の間に配置されたＸＴＥＮ放出部位切断配列によって生成することができる。例示的な配列を表４３に提供する。この場合には、放出部位は、ＭＭＰ−２０プロテアーゼ（ＥＣ．３．４．２４．−，Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｏ６０８８２）によって認識および切断されるアミノ酸配列を含有する。具体的に配列ＰＡＬＰ↓ＬＶＡＱ（配列番号２３６）［Ｒａｗｌｉｎｇｓ Ｎ．Ｄ．ら（２００８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３６：Ｄ３２０］は、位置４の後で切られる（矢印で示す）。ＭＭＰ−２０は全血中で構成的に発現される。それゆえ、長寿命ＦＩＸ−ＸＴＥＮが循環するときに、その一部が切断されて、凝固に使用されるより短寿命のＦＩＸのプールを生成する。本発明の組成物の所望の特色では、これにより予防量のＦＩＸを絶えず放出する循環プロドラッグデポーが生成される。
（実施例５３）
ＫＮＳＡＤＫループへの内部ＸＴＥＮ融合物
ＦＩＸのループに挿入されたＸＴＥＮタンパク質から成るＦＩＸ−ＸＴＥＮ融合タンパク質は、図３７Ｆに描くように生成することができる。具体的にＸＴＥＮ配列は、公知の血友病Ｂ変異を有さず、ＦＩＸ結晶構造物で高度に構造化されていないＥＧＦ２ドメイン（残基１４６−１５２）のＫＮＳＡＤＮＫ（配列番号１７４９）ループに、融合物として挿入される。この場合には、挿入は、ループ配列のＳＡ結合にて天然配列を分割して、ＸＴＥＮ配列をギャップに融合することによって作られる。これにより、ＸＴＥＮがＦＩＸ配列に対して内部であるが、球状タンパク質に対して外部であるループ配列が生まれる。本発明の組成物の所望の特色では、これにより凝固の活性化までＦＩＸ−ＸＴＥＮがプロドラッグとして無傷のままである状況が生じ、凝固の活性化のときにその分子が処理されて、それを必要とする被験体において凝固機能を再構成または増進させるＦＩＸａ−ＸＴＥＮを産生する。
（実施例５４）
ＬＡＥＮループへの内部ＸＴＥＮ融合物
ＦＩＸのループに挿入されたＸＴＥＮタンパク質から成るＦＩＸ−ＸＴＥＮ融合タンパク質は、図３７Ｆに描くように生成することができる。具体的にＸＴＥＮ配列は、公知の血友病Ｂ変異を有さず、ＦＩＸ結晶構造物で高度に構造化されていないＥＧＦ２ドメイン（残基１６３−１６６）のＬＡＥＮ（配列番号１７７８）ループに、融合物として挿入される。この場合には、挿入は、配列のＡＥ結合にて天然配列を分割して、ＸＴＥＮ配列をギャップに融合することによって作られる。これによりループ配列ＬＡ−ＸＴＥＮ−ＥＮが生まれる。本発明の組成物の所望の特色では、これにより凝固の活性化までＦＩＸ−ＸＴＥＮがプロドラッグとして無傷のままである状況が生じ、凝固の活性化のときにその分子が処理されて、それを必要とする被験体において凝固機能を再構成または増進させるＦＩＸａ−ＸＴＥＮを産生する。
（実施例５５）
活性化ペプチドへの内部ＸＴＥＮ融合物
ＦＩＸのループに挿入されたＸＴＥＮタンパク質から成るＦＩＸ−ＸＴＥＮ融合タンパク質は、図３７Ｄに描くように生成することができる。具体的にＸＴＥＮ融合物は、２つの天然ＦＸＩａ切断部位がどちらも破壊されないように、活性化ペプチド（残基１９２−２２６）に配置される。挿入は、配列のＴ２０９−Ｉ２１０結合（↓によって示す）にて天然配列を分割して、ＸＴＥＮ配列をギャップに融合することによって作られる。これにより活性化ペプチドの残基１８８にて開始する、ＸＴＥＮが挿入された配列が生まれる。ＦＸＩは、内因性凝固経路または接触活性化凝固経路においてＦＩＸの直前に位置する凝
固促進プロテアーゼである。活性ＦＸＩａは、ＦＸＩＩａによるチモーゲンのタンパク質分解切断によりＦＸＩから産生される。いったん活性化されると、凝固におけるその天然の役割は、位置Ｒ１９１およびＲ２２６にてタンパク質を切ることによりＦＩＸチモーゲンから活性化ペプチドを切除してＦＩＸ（図３９）を活性化することである。これらのカット部位は矢印によって描かれ、配列は、Ｐ４−Ｐ４’部位を変化させずに残して、凝固カスケードの間の天然の切断活性を可能とするように設計される。それゆえ、ＸＴＥＮドメインのみが、内因性凝固経路内の正常な活性化プロセスの一部としてＦＩＸから除去される。
（実施例５６）
ＦＩＸ ＥＧＦドメインの間の内部ＸＴＥＮ融合物
ＦＩＸのループに挿入されたＸＴＥＮタンパク質から成るＦＩＸ−ＸＴＥＮ融合タンパク質は、図３７Ｃに描くように生成することができる。具体的にＸＴＥＮ融合物は、ＦＩＸの２つのＥＧＦ様ドメインの間に配置される（結合部は残基１２９と１３０の間である）。挿入は、Ｅ１２９−Ｌ１３０結合にて天然配列を分割して、ＸＴＥＮ配列をギャップに融合することによって作られる。これにより残基１２１にて開始する、ＸＴＥＮが挿入された配列が生まれる。実際に、これにより凝固の活性化までＦＩＸ−ＸＴＥＮが無傷で循環する状況が生じ、凝固の活性化のときにその分子が処理されて、個体において凝固機能を再構成または増進させるＦＩＸａ−ＸＴＥＮを産生する。
（実施例５７）
Ｃ末端ＸＴＥＮの放出速度の最適化
Ｃ末端ＸＴＥＮの放出速度が変化する上述の実施例４１〜５７の変異体を生成することができる。ＸＴＥＮ放出プロテアーゼによるＸＴＥＮ放出の速度はＸＴＥＮ放出部位の配列に依存しているため、ＸＴＥＮ放出部位のアミノ酸配列を変更することによって、ＸＴＥＮ放出の速度を制御することができる。多くのプロテアーゼの配列特異性は当分野で周知であり、数種のデータベースに記録されている。この場合には、プロテアーゼのアミノ酸特異性は基質のコンビナトリアルライブラリを使用して［Ｈａｒｒｉｓ，Ｊ．Ｌ．ら（２０００）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９７：７７５４］または［Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｖ．ら（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２：４３４４］に例証されるように基質混合物の切断に従ってマップされる。代替は、ファージディスプレイによる所望のプロテアーゼ切断配列の同定である［Ｍａｔｔｈｅｗｓ，Ｄ．ら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６０：１１１３］。構築物は変異体配列を用いて作られ、ＸＴＥＮポリペプチド検出のための標準アッセイを使用してＸＴＥＮ放出についてアッセイされる。
（実施例５８）
ＦＩＸ−ＸＴＥＮのトロンビン活性化
ＦＸＩに特異的なＸＴＥＮ放出部位をＦＩＸ−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４に挿入して、構築物ＡＣ２９９をもたらした。トロンビンに特異的なＸＴＥＮ放出部位をＦＩＸ−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４に挿入して、構築物ＡＣ３００をもたらした。ＸＴＥＮ放出部位が欠損した構築物ＡＣ２９６を対照として使用した。ＦｕＧｅｎｅ６形質移入試薬（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、発現プラスミドをＢＨＫ−２１細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎによる１０ｍｌのＯｐｔｉＭＥＭ媒体の１．２×１０ｅ６細胞）に形質移入した。４日後に媒体を収集して、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ遠心分離フィルタ（Ｕｌｔｒａｃｅｌ＿３０Ｋ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）濃縮器を使用して４０倍に濃縮した。６７μｌの濃縮媒体を１０×トロンビンバッファーで希釈して、２５μｌの固定トロンビン（Ｔｈｒｏｍｂｉｎ ＣｌｅａｎＣｌｅａｖｅキット、ＲＥＣＯＭ−Ｔ，Ｓｉｇｍａ）を用いて室温にて８時間インキュベートした。すべての試料におけるＦＩＸ濃度を、抗体（ｃａｔ＃ ＦＩＸ−ＥＩＡ，Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ ｉｎｃ．Ｃａｎａｄａ）を使用してＥＬＩＳＡによ
って決定した。凝固活性をａＰＰＴアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐａｃｉｆｉｃ Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ，Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して決定し、１ｍＵのＦＩＸが４．５ｎｇ／ｍｌに等しいと仮定して活性をＦＩＸの濃度に変換した。結果を下の表３１でまとめる。データは、トロンビンインキュベーションがＡＣ２９６およびＡＣ２９９のＥＬＩＳＡシグナルおよび凝固活性に対して顕著な効果を有さなかったことを示し、このことは両方の構築物がトロンビン部位を欠損しているという事実に一致する。これに対して、トロンビン処理により、ＡＣ３００の凝固活性の２７倍の増加が生じた。トロンビン処理は、ＡＣ３００の凝固活性を遊離ＦＩＸの８０％まで回復した。これらのデータは、ＦＩＸのＣ末端へのＸＴＥＮの融合が凝固活性の５０分の１〜１００分の１までの低下をもたらすことを証明する。ＸＴＥＮのタンパク質分解放出は、これらのＣ末端ＦＩＸ−ＸＴＥＮ構築物のプロドラッグ特性の概念を裏付けて、凝固活性の大半を回復した。
Figure 2017031218
（実施例５９）
エキソン構造物に基づくＦＩＸへのＸＴＥＮ挿入
タンパク質のエキソン構造物は、哺乳動物タンパク質へのＸＴＥＮの挿入を導くことができるドメイン境界に関する貴重な情報を提供する［Ｋｏｌｋｍａｎ，Ｊ．Ａ．ら（２００１）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１９：４２３］。図４０は、この手法がＦＩＸ−ＸＴＥＮ組成物の生成に適用される方法の数種の例を、示されたエキソン境界の間のＸＴＥＮ挿入のための例示的な位置と共に例証する。
（実施例６０）
設計製作したＦＩＸ配列に基づくＦＩＸ−ＸＴＥＮ
活性の改善のためにＦＩＸの多くの変異体（ｍｕｔａｎｔ）が設計製作されてきた（ｈａｖｅ ｂｅｅｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）。特に有用なのは、プロテアーゼ活性の増加を有する変異体である。しかしＧｌａおよび／またはＥＧＦドメインに改良を有する変異体は、実験臨床評価の後に天然ＦＩＸ配列のあるいは該変異体を使用できるように、血友病Ｂの処置にも有用であることができる。有用なＦＩＸ変異体の例を表７に表示する。
（実施例６１）
ＦＩＸ−ＸＴＥＮの産生
ＦＩＸ−ＸＴＥＮ融合タンパク質を多種多様の哺乳動物発現ベクターにおいて発現させることができる。ｐＳｅｃＴａｇ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に基づく例示的なベクターｐＣＷ０５０９０を図４２に例証する。発現構築物は、ＣＭＶプロモータ、ＦＩＸのシグナルペプチド、ＦＩＸのプロペプチド、ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４をコードする遺伝子に融合した成熟ＦＩＸ遺伝子、それに続くポリアデニル化部位を含む発現カセットを含有する。ベクターは、哺乳動物細胞における選択のためのゼオシン（ｚｅｏｓｉｎ）マーカー、大腸菌のｐＵＣ複製起点、および大腸菌における選択のためのアンピシリンマーカーを含有する。発現ベクターは発現のためにＣＨＯ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、またはＢＨＫ細胞に形質移入することができる。発現はＥＬＩＳＡまたは凝固アッセイによって監視することができる。ＦＩＸ−ＸＴＥＮ融合タンパク質はイオン交換、特にアニオン交換によって精製することができる。本実験の目的のために、ＦＩＸ−ＸＴＥＮ融合タンパク質をＣＨＯ
細胞に形質移入した。
アニオン交換クロマトグラフィーによる初期プロセス捕捉
形質移入細胞の培養物からの細胞培養媒体を２０ｍＭトリスｐＨ６．８、５０ｍＭ ＮａＣｌで平衡化した８００ｍｌのＭａｃｒｏｃａｐ Ｑアニオン交換樹脂（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に直接適用した。カラムを５０ｍＭ、１００ｍＭ、および１５０ｍＭ ＮａＣｌを含有するトリスｐＨ６．８バッファーによって続けて洗浄した。生成物を２０ｍＭトリスｐＨ６．８、２５０ｍＭ ＮａＣｌによって溶出させた。
オクチルセファロースＦＦを使用する疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）
２５０ｍＬオクチルセファロースＦＦカラムを平衡化バッファー（２０ｍＭトリスｐＨ６．８、１．０Ｍ Ｎａ２ＳＯ４）によって平衡化した。固体Ｎａ２ＳＯ４をＭａｃｒｏｃａｐ Ｑ溶出物プールに添加して、１．０Ｍの最終濃度を達成した。結果として生じる溶液を濾過して（０．２２ミクロン）、ＨＩＣカラムにロードした。カラムを次に、１０ＣＶの平衡化バッファーで洗浄して、未結合のタンパク質および宿主細胞ＤＮＡを除去した。生成物を次に、２０ｍＭトリスｐＨ６．８、０．５Ｍ Ｎａ２ＳＯ４によって溶出させた。
アニオン交換クロマトグラフィーによる生成物の仕上げ
プールしたＨＩＣ溶出物画分を次に、２０ｍＭトリスｐＨ７．５によって希釈して、５．０ミリオーム未満の導電率を達成した。希薄生成物を、２０ｍＭトリスｐＨ７．５、５０ｍＭ ＮａＣｌによって平衡化した３００ｍｌ ＱセファロースＦＦアニオン交換カラムにロードした。
最終調合物および貯蔵
バッファー交換タンパク質を次に、Ｐｅｌｌｉｃｏｎ ＸＬ Ｂｉｏｍａｘ ３００００ ｍｗｃｏカートリッジを使用して限外濾過／ダイアフィルトレーション（ＵＦ／ＤＦ）によって３０ｍｇ／ｍｌ超まで濃縮した。０．２２ミクロンのシリンジフィルタを使用して、濃縮物を滅菌濾過した。最終溶液を等分割して−８０℃で貯蔵した。
（実施例６２）
ＦＩＸ−ＸＴＥＮのコドン最適化
コドン最適化を適用してＦＩＸ−ＸＴＥＮの発現を増加させることができる。コドン最適化は、ヒト遺伝子のコドン選択性（ｃｏｄｏｎ ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）、ＲＮＡ構造予測ならびに内部反復の予測を考慮に入れるコンピュータアルゴリズムを使用して行うことができる。
（実施例６３）
ＦＩＸ−ＸＴＥＮのデポー調合物
ＸＴＥＮは、注射部位でデポーを形成する調合物のための特定の特性によって選定することができる。これは注射部位からのＦＩＸ−ＸＴＥＮの低速放出をもたらし、投薬間隔の間の時間を増加させる。デポー調合物はＦＩＸ−ＸＴＥＮを、ＦＩＸ−ＸＴＥＮと相互作用して複合体または凝集体の形成をもたらす賦形剤と共に調合することによって容易にすることができる。有用な賦形剤の例は亜鉛、プロタミン、ＰＥＧ、ポリカチオン、ポリマー、ポリアルギニン、ポリリジンである。デポーは、ＦＩＸ−ＸＴＥＮを粒子、たとえばアルギン酸塩、キチン、ポリ乳酸、ＰＬＧＡ、ヒアルロン酸、ヒドロキシアパタイトまたは当業者に公知の他のポリマーにロードすることによっても形成することができる。
（実施例６４）
安定性の増加を有するＦＩＸ−ＸＴＥＮ
遊離ＦＩＸは凝集しやすく、凝集はタンパク質の調合を複雑にする。この特徴は、ｓｃ注射に必要な少量注射体積を可能にする高濃度調合物の開発も妨げる。融合パートナーの凝集を低下させるＸＴＥＮの特性のために、１）ＦＩＸの凝集を防止する；および２）皮下または筋肉内投与を可能にする、ＦＩＸ−ＸＴＥＮの組成物を生成することができる。
（実施例６５）
ＦＶＩＩ−ＸＴＥＮ＿ＡＧ８６４
第ＶＩＩ因子（「ＦＶＩＩ」）をコードする遺伝子をインフレームでＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４に融合して、発現ベクターｐＣＷ０５９０に挿入した．ＣＨＯ−Ｋ１細胞に発現ベクターを形質移入して、ゼオシンを使用して安定なプールを選択し、発現したタンパク質を回収した。発現した第ＶＩＩ因子−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４のアミノ酸配列を表４３に挙げる。１５９ｎｇ／ｍｌのＦＶＩＩ等価物の発現レベルをＥＬＩＳＡによって検出して、２１４ｎｇ／ｍｌのＦＶＩＩ等価物はＰＰＴ凝固アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐａｃｉｆｉｃ Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ，Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して検出した。このことは、ＢＰＸＴＥＮを生成するＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４のＦＶＩＩへの融合がＦＶＩＩの凝固活性を保持する融合タンパク質を生じることを証明する。
（実施例６６）
ＦＶＩＩａ−ＸＴＥＮの製造
ＦＩＸ−ＸＴＥＮについて実施例６１で記載されるのと本質的に同様に、ＦＶＩＩａ−ＸＴＥＮを製造することができる。ＦＶＩＩ−ＸＴＥＮをＦＶＩＩａ−ＸＴＥＮに変換するために、活性化ステップが追加される。あるいは、ＦＶＩＩａの両方のタンパク質鎖が別々に発現され、活性化ＦＶＩＩａ−ＸＴＥＮに直接構築されるように、バイシストロニックベクターを使用することができる。
（実施例６７）
第ＶＩＩ因子−ＦＶＩＩ−ＸＴＥＮ融合ポリペプチドの活性の評価
標準曲線は、正常対照血漿（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ １００５９５）をＦＶＩＩ欠損血漿（１０００７０）によって１０倍に希釈して、次に第ＶＩＩ因子欠損血漿によって４、５倍の連続希釈を再度行うことによって調製した。これにより活性の１００、２０、４、０．８および０．１６ｍＵｎｉｔｓ／ｍｌに点（ｐｏｉｎｔｓ）を有する標準曲線が生成され、１ユニット（ｕｎｉｔ）の活性は、１ｍｌの正常ヒト血漿におけるＦＶＩＩ活性の量として定義される。ゼロ血漿（ｎｕｌｌ ｐｌａｓｍａ）での活性のバックグラウンドレベルを決定するために、ＦＶＩＩ欠損血漿も含めた。試料は、ＦＶＩＩ−ＸＴＥＮコード配列を含有するベクターを一過性に形質移入されたＨＥＫ２９３細胞によって、該細胞の成育により馴化媒体（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｍｅｄｉｕｍ）中に分泌されたＦＶＩＩ−ＸＴＥＮを、ＦＶＩＩ欠損血漿に対して１：１０の体積比で添加することによって調製した。馴化媒体の可能な干渉を補正するために、空のベクターによる形質移入ＨＥＫ２９３細胞からの馴化媒体を標準曲線試料に対して１：１０の体積比で添加した。以下のようにプロトロンビン時間アッセイを使用して、試料を試験した。試料をｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｖｉｃｅｓプレートリーダ分光光度計で３７℃にて３分間インキュベートして、この時点で試料１体積当りトロンボプラスチン（Ｄａｄｅ Ｉｎｎｏｖｉｎ，Ｂ４２１２−５０）２体積の添加により、凝固反応を開始させた。濁度を４０５ｎｍにて５分間監視して、反応プロフィールを生成した。ＰＴ時間、すなわち凝固活性の開始までの時間をＯＤ４０５ｎｍがベースラインを超えて０．０６増加した第１の時間として定義した。ＰＴ時間に線形に関連する活性の対数によって、対数−線形標準曲線を生成した。これからプレートウェル内の試料の活性を決定して、次にＦＶＩＩ欠損血漿への希釈度に相当する１１を掛けることによって、試料の活性を決定した。２回の測定に基づいて、ＦＶＩＩ−ＸＴＥＮ融合物の活性は２０３ｍＵｎｉｔｓ／ｍｌであった。反応プロフィールを図９に表示し、ここではＦＶＩＩ欠損血漿が太破線で示され、標準からの３つの
試料が破線で示され、ＦＶＩＩ−ＸＴＥＮ試料が太線で示されている。
（実施例６８）
第ＶＩＩ因子−ＸＴＥＮ融合タンパク質精製
ＦＶＩＩ−ＸＴＥＮ融合タンパク質を多種多様の哺乳動物発現ベクターにおいて発現させることができる。ｐＳｅｃＴａｇ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に基づくベクターｐＣＷ０５０９０を図４６に例証する。発現構築物は、ＣＭＶプロモータ、ＦＶＩＩのシグナルペプチド、ＦＶＩＩのプロペプチド、ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４をコードする遺伝子に融合した成熟ＦＶＩＩ遺伝子、それに続くポリアデニル化部位を含む発現カセットを含有する。ベクターは、哺乳動物細胞における選択のためのゼオシン（ｚｅｏｓｉｎ）マーカー、大腸菌のｐＵＣ複製起点、および大腸菌における選択のためのアンピシリンマーカーを含有する。発現ベクターは発現のためにＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、またはＢＨＫ細胞に形質移入することができる。発現はＥＬＩＳＡまたは凝固アッセイによって監視することができる。ＦＶＩＩ−ＸＴＥＮ融合タンパク質はイオン交換、特にアニオン交換によって精製することができる。
アニオン交換クロマトグラフィーによる初期プロセス捕捉
２０ｍＭトリスｐＨ６．８、５０ｍＭ ＮａＣｌで平衡化した８００ｍｌのＭａｃｒｏｃａｐ Ｑアニオン交換樹脂（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に、細胞培養媒体を直接適用した。カラムを５０ｍＭ、１００ｍＭ、および１５０ｍＭ ＮａＣｌを含有するトリスｐＨ６．８バッファーによって続けて洗浄した。生成物を２０ｍＭトリスｐＨ６．８、２５０ｍＭ ＮａＣｌによって溶出させ、実施例６７の方法を使用して検証した。
（実施例６９）
ＦＩＸ活性決定のためのａＰＴＴアッセイ
第ＩＸ因子は、内因性凝固経路または接触活性化凝固経路にある。活性化部分トロンボプラスチン時間アッセイ（ａＰＴＴ）を使用してＦＩＸ−ＸＴＥＮおよびタンパク質分解副生成物の活性を評価するために、この凝固経路の活性を使用する。ＦＩＸ活性を以下のように具体的に測定し、標準曲線は、正常対照血漿（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ ｃａｔ＃ １００５９５）をＦＩＸ欠損血漿（ｃａｔ＃ １００９００）によって２倍に希釈して、次に第ＩＸ因子欠損血漿によって６、４倍の連続希釈を再度行うことによって作成した。これにより活性の５００、１３０、３１、７．８、２．０、０．５および０．１ｍＵｎｉｔｓ／ｍｌに点を有する標準曲線が生成され、１ユニットの活性は、１ｍｌの正常ヒト血漿におけるＦＩＸ活性の量として定義される。ゼロ血漿での活性のバックグラウンドレベルを決定するために、ＦＩＸ欠損血漿も含めた。試料は、ＦＶＩＩ−ＸＴＥＮコード配列を含有するベクターを一過性に形質移入されたＨＥＫ２９３細胞によって、該細胞の成育により馴化媒体（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｍｅｄｉｕｍ）中に分泌されたＦＶＩＩ−ＸＴＥＮを、ＦＶＩＩ欠損血漿に対して１：１０の体積比で添加することによって調製した。馴化媒体の可能な干渉を補正するために、空のベクターによる形質移入ＣＨＯ細胞からの馴化媒体を標準曲線試料に１：１０の体積比で添加した。以下のようにａＰＴＴアッセイを使用して、試料を試験した。試料をｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｖｉｃｅｓプレートリーダ分光光度計で３７℃にて２分間インキュベートして、この時点で等しい体積のａＰＴＴ試薬（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ ｃａｔ＃ １００４０２）を添加して、追加の３分間の３７℃でのインキュベーションを行った。インキュベーション後、１体積の塩化カルシウム（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ ｃａｔ＃ １００３０４）を添加することによって、アッセイを活性化した。濁度を４５０ｎｍにて５分間監視して、反応プロフィールを生成した。ａＰＰＴ時間、すなわち凝固活性の開始までの時間をＯＤ４５０ｎｍがベースラインを超えて０．０６増加した第１の時間として定義した。ａＰＰＴ時間に線形に関連する活性の対数によって、対数−線形標準曲線を生成した。これからプレートウェル内の試料の活性を決定して、次にＦＩＸ欠損血漿へ
の希釈度に相当する１１を掛けることによって、試料の活性を決定した。
（実施例７０）
ＦＩＸ濃度決定のためのＥＬＩＳＡアッセイ
各種のＦＩＸ−ＸＴＥＮ組成物およびタンパク質分解副生成物の第ＩＸ因子濃度を、検出を簡単にするために検出抗体がＨＲＰにコンジュゲートされた抗体の特異的適合対を用いる、ＥＬＩＳＡアッセイを使用して決定した（Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ ｃａｔ＃ ＦＩＸ−ＥＩＡ）。捕捉抗体を高結合９６ウェルアッセイプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ ３６９０）に、４℃にて一晩コーティングした。プレートをＰＢＳ中の３％ＢＳＡによって室温にて１時間ブロッキングした。プレートをＰＢＳＴでプレート洗浄器によって６回洗浄した。ＰＢＳＴで希釈した試料または標準を次に、適切なウェルにおいて室温にて２時間結合させた。標準曲線は２５ｎｇ／ｍｌ〜＜１ｐｇ／ｍｌに及び、既知の濃度の市販ＦＩＸ（Ａｂｃａｍ Ｃａｔ＃ ａｂ６２５４４）をＰＢＳＴで連続希釈して調製した。プレートをＰＢＳＴでプレート洗浄器によって再度、６回洗浄した。ＦＩＸを次に、３７℃にて１時間結合された検出抗体を使用して検出した。プレートをＰＢＳＴでプレート洗浄器によって再度、６回洗浄して、水によってさらに１回洗浄した。シグナル次に、ＴＭＢ基質によって展開させて、ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｖｉｃｅｓプレートリーダ分光光度計で４０５ｎｍにて読み取ることにより定量した。次に標準に対して４パラメータフィットを行って、試料の濃度を標準曲線との比較によって決定した。
（実施例７１）
ＢＰＸＴＥＮを評価するためのヒト臨床試験設計
臨床試験は、単一の生物製剤に対するＢＰＸＴＥＮ組成物の有効性および利点をヒトにおいて検証できるように設計することができる。たとえば上の実施例に記載されるように、グルカゴンおよびエクセナチドの両方を含むＢＰＸＴＥＮ融合構築物は、組成物の有効性をキャラクタリゼーションする臨床試験で使用することができる。該臨床試験は、グルカゴンおよびエクセナチドの投与によって改善、緩和、または抑制される１つ以上の代謝性疾患、障害、または状態に行うことができる。成人患者におけるこのような試験は３つの相を含む。成人患者における第１の第Ｉ相安全性および薬物動態試験は、ヒト（正常被験体または代謝性疾患もしくは症状を有する患者のどちらか）における最大許容投与量ならびに薬物動態および薬力学を決定するために、ならびに将来の試験で追跡される潜在毒性および有害事象を定義するために行われる。該試験は、単一漸増用量の、グルカゴンおよびエクセナチドに連結されたＸＴＥＮの融合タンパク質の組成物が投与される該試験が行われ、生化学、ＰＫ、および臨床パラメータが測定される。これにより最大許容投与量の決定が可能となり、それぞれの構成要素の治療ウインドウを構成する投与量および循環薬物の閾値および最大濃度が確立される。その後、臨床試験は疾患、障害または状態を有する患者において行われる。
糖尿病における臨床試験
糖尿病、インスリン抵抗性および肥満症状に対して適切な血清グルコースの薬力学的パラメータならびに他の生理学的パラメータ、ＰＫパラメータ、安全性パラメータおよび臨床パラメータ（下に挙げるような）がグルカゴンおよびエクセナチドに連結されたＸＴＥＮを含む融合タンパク質の投薬の関数として測定される第ＩＩ相投薬試験は、糖尿病患者に行われ、有害事象に関連する安全性データを収集することに加えて、第ＩＩＩ相試験に適切な用量に関する用量範囲情報を産する。ＰＫパラメータは生理学的、臨床および安全性パラメータデータに相関して、ＢＰＸＴＥＮ組成物の各構成要素の治療ウインドウを確立し、臨床医が、１つのグルコース調節ペプチドをそれぞれ含む２つの構成要素融合タンパク質の適切な比を確立できるようにするか、または２つのグルコース調節ペプチドを含むモノマーＢＰＸＴＥＮの単一用量を決定できるようにする。最後に、糖尿病患者がＢＰＸＴＥＮ組成物、陽性対照、またはプラセボのいずれかを毎日、隔週、または毎週（また
はＢＰＸＴＥＮ組成物の薬物動態および薬力学的特性を考慮して、適切と考えられる他の投薬スケジュールで）延長された期間にわたって投与される、第ＩＩＩ相有効性試験が行われる。有効性の１次結果指標はＨｂＡ１ｃ濃度を含むことができるが、２次結果指標は、試験の間のインスリン必要条件、シミュレートされたＣペプチドおよびインスリン濃度、空腹時血漿グルコース（ＦＰＧ）、血清サイトカインレベル、ＣＲＰレベル、ならびにインスリンおよびグルコース測定値を用いたＯＧＴＴから誘導されたインスリン分泌およびインスリン感受性指数、ならびに体重、食物消費、およびプラセボまたは陽性対照群に対して追跡される他の許容される糖尿病マーカーを含むことができる。有効性結果は標準統計方法を使用して決定される。毒性および有害事象マーカーも本試験で追跡されて、記載した方式で使用されたときに化合物が安全であることを検証する。
関節炎における臨床試験
ヒト患者の第ＩＩ相臨床試験は、ＩＬ−１ｒａおよび／もしくは抗ＩＬ−２、抗ＣＤ３または好適な抗炎症タンパク質に連結されたＸＴＥＮを含むＢＰＸＴＥＮを投与された関節炎患者において行われ、関節腫脹、関節圧痛、炎症、朝のこわばり、および疼痛を低下させることを含む、関節リウマチに関連付けられた少なくとも１つの症状を和らげるのに適切な用量、または赤血球沈降速度、ならびにＣ反応性タンパク質および／またはＩＬ２受容体の血清レベルの低下を含む、関節リウマチに関連付けられた少なくとも１つの生物学的代用マーカーを決定する。さらに有害事象に関連する安全性データが収集される。関節炎患者がＢＰＸＴＥＮ、陽性対照、またはプラセボのいずれかを毎日、隔週、または毎週（または化合物の薬物動態および薬力学的特性を考慮して、適切と考えられる他の投薬スケジュールで）延長された期間にわたって投与される、第ＩＩＩ相有効性試験が行われる。患者は、関節腫脹、関節圧痛、炎症、朝のこわばり、患者および医師によって評価された疾患活性、ならびにたとえば標準化健康調査評価（Ｈｅａｌｔｈ Ｑｕｅｓｔｉｏｎｎａｉｒｅ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ）（ＨＡＱ）によって評価される障害、および疼痛を含む、いずれかの処置を受ける前の疾患活性のベースライン症状について評価される。追加のベースライン評価は、赤血球沈降速度（ＥＳＲ）、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）および可溶性ＩＬ−２受容体（ＩＬ−２ｒ）の血清レベルを含むことができる。処置に対する臨床応答は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ（ＡＣＲ）によって確立された基準、例えばＡＣＲ２０基準；すなわち圧痛および腫張関節カウントに２０パーセントの改善ならびに測定した５つの残存する症状、たとえば患者の全般的疾患変化（ｇｌｏｂａｌ ｄｉｓｅａｓｅ ｃｈａｎｇｅ）および医師の全般的疾患変化、疼痛、障害、および急性期反応物質のうち３つの２０パーセントの改善があるかどうかを使用して評価できる（Ｆｅｌｓｏｎ，Ｄ．Ｔ．ら、１９９３ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ ３６：７２９−７４０；Ｆｅｌｓｏｎ，Ｄ．Ｔ．ら、１９９５ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ ３８：１−９）。同様に、被験体は、圧痛および腫張関節カウントそれぞれの５０または７０パーセント改善ならびに測定した５つの残存する症状、たとえば患者の全般的疾患変化および医師の全般的疾患変化、疼痛、障害、および急性反応物質、たとえばＣＲＰまたはＥＳＲそれぞれの５０または７０パーセントの改善があるかどうかという、ＡＣＲ５０またはＡＣＲ７０基準を満足する。さらにリウマチ因子、ＣＲＰ、ＥＳＲ、可溶性ＩＬ−２Ｒ、可溶性ＩＣＡＭ−Ｉ、可溶性Ｅ−セレクチン、およびＭＭＰ−３を含む、疾患活性の潜在的バイオマーカーを測定することができる。有効性結果は標準統計方法を使用して決定される。毒性および有害事象マーカーも本試験で追跡されて、記載した方式で使用されたときに化合物が安全であることを検証する。
急性冠動脈症候群および急性心筋梗塞における臨床試験
急性冠動脈症候群（ＡＣＳ）および／または急性心筋梗塞（ＡＭＩ）と診断された患者がたとえばＩＬ−１ｒａおよびＢＮＰを含むＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質、陽性対照、ＢＰＸＴＥＮ融合タンパク質と陽性対照物質との組み合わせ、またはプラセボのいずれかを
毎日、隔週、または毎週（または化合物の薬物動態および薬力学的特性を考慮して、適切と考えられる他の投薬スケジュールで）延長された期間にわたって投与される、ＡＣＳおよび／またはＡＭＩにおける第ＩＩＩ相試験が行われる。該試験は、最近の急性冠動脈症候群を有する被験体における心血管による死亡、非致死性心筋梗塞、または虚血性発作を防止する他の処置レジメンよりも優れているか否かを決定するために行われる。患者は、不安定狭心症、左腕および顎左側に放散する胸部絞扼感として経験される胸部痛、人為的発汗（発汗）、悪心および嘔吐、息切れの徴候または症状、ならびに非Ｑ波心筋梗塞およびＱ波心筋梗塞の心電図（ＥＣＧ）による証拠を含む、いずれかの処置を受ける前の疾患活性のベースライン症状について評価される。追加のベースライン評価は、虚血修飾アルブミン（ＩＭＡ）、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）、グリコーゲンホスホリラーゼアイソエンザイムＢＢ−（ＧＰＢＢ）、トロポニン、ナトリウム排泄増加ペプチド（Ｂ型ナトリウム排泄増加ペプチド（ＢＮＰ）およびＮ末端Ｐｒｏ ＢＮＰの両方）、および単球化学誘引活性タンパク質（ＭＣＰ）−１を含む、バイオマーカーの測定を含むことができる。処置に対する臨床応答は心血管による死亡、心筋梗塞、または虚血性発作の最初の出現までの時間を１次結果指標として使用して評価することができ、最初の不安定狭心症、出血性発作、または致死性出血の出現またはそれまでの時間は２次結果指標として作用することができる。有効性結果は標準統計方法を使用して決定される。毒性および有害事象マーカーも本試験で追跡されて、記載した方式で使用されたときに化合物が安全であることを検証する。
（実施例７２）
予測アルゴリズムによる２次構造についての配列の分析
アミノ酸配列の２次構造は、特定のコンピュータプログラムまたはアルゴリズム、たとえば周知のＣｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴリズム（Ｃｈｏｕ，Ｐ．Ｙ．ら（１９７４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１３：２２２−４５）およびＧａｒｎｉｅｒ−Ｏｓｇｕｔｈｏｒｐｅ−Ｒｏｂｓｏｎ、すなわち「ＧＯＲ」法（Ｇａｒｎｉｅｒ Ｊ，Ｇｉｂｒａｔ ＪＦ，Ｒｏｂｓｏｎ Ｂ．（１９９６）．ＧＯＲ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｆｒｏｍ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ ２６６：５４０−５５３）によって評価することができる。所与の配列では、上記アルゴリズムは、２次構造がいくつか存在するかまたは全く存在しないかを予測することができ、２次構造の存在はたとえばアルファらせんもしくはベータシートを形成する配列の残基の総数および／もしくはパーセンテージ、またはランダムコイル形成物をもたらすことが予測される配列の残基のパーセンテージとして表される。
これらの配列の２次構造の程度を評価するＣｈｏｕ−ＦａｓｍａｎおよびＧＯＲ法のための２つのアルゴリズムツールを使用して、ＸＴＥＮ「ファミリ」からの数種の代表的な配列が評価されている。このＣｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎツールは、Ｗｉｌｌｉａｍ Ｒ．ＰｅａｒｓｏｎおよびＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｖｉｒｇｉｎｉａによって、．ｆａｓｔａ．ｂｉｏｃｈ．Ｖｉｒｇｉｎｉａ．ｅｄｕ／ｆａｓｔａ＿ｗｗｗ２／ｆａｓｔａ＿ｗｗｗ．ｃｇｉ？ｒｍ＝ｍｉｓｃｌのワールド・ワイド・ウェブ上に位置するＵＲＬの「Ｂｉｏｓｕｐｐｏｒｔ」インターネットサイトにて、２００９年６月１９日にそれが存在したときに提供された。ＧＯＲツールは、Ｐｏｌｅ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｑｕｅ Ｌｙｏｎｎａｉｓによって、．ｎｐｓａ−ｐｂｉｌ．ｉｂｃｐ．ｆｒ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｓｅｃｐｒｅｄ＿ｇｏｒ４．ｐｌのワールド・ワイド・ウェブ上に位置するＵＲＬのＮｅｔｗｏｒｋ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓインターネットサイトにて、２００８年６月１９日にそれが存在したときに提供された。
分析の最初のステップとして、単一のＸＴＥＮ配列を２つのアルゴリズムによって分析した。ＡＥ８６４組成物は、アミノ酸Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｅ、Ｐ、およびＡから成る４つの１２
アミノ酸配列モチーフの複数のコピーから生成された８６４アミノ酸残基を有するＸＴＥＮである。配列モチーフは、任意の１つの１２アミノ酸モチーフ内でいずれの２つの連続アミノ酸の配列も２回を超えて反復されない、および全長ＸＴＥＮの３個の連続アミノ酸が同一でないという点で、モチーフ内および配列全体内の反復性が制限されているという事実を特徴とする。Ｎ末端からのＡＦ８６４配列の連続したより長い部分をＣｈｏｕ−ＦａｓｍａｎアルゴリズムおよびＧＯＲアルゴリズムによって分析した（後者は１７アミノ酸の最低長を必要とする）。ＦＡＳＴＡ形式配列を予測ツールに入力して、分析を実行することによって、配列を分析した。分析による結果を表３２に表示する。
その結果から、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ計算により、ＡＥファミリの４個のモチーフ（表１）がアルファらせんもベータシートも有さないことが示される。２８８残基までの配列は同様に、アルファらせんもベータシートも有さないことが判明した。４３２残基配列は、少量の２次構造を有し、２個のアミノ酸のみが全体のパーセンテージで０．５％のアルファらせんに寄与することが予測される。全長ＡＦ８６４ポリペプチドは、全体のパーセンテージで０．２％のアルファらせんに寄与する同じ２個のアミノ酸を有する。ランダムコイル形成物の計算によって、長さが増加すると、ランダムコイル形成物のパーセンテージが増加することが明らかになった。配列の最初の２４アミノ酸は９１％のランダムコイル形成物を有し、これは長さの増加と共に全長配列で９９．７７％の値まで増加した。
他のモチーフファミリからの５００以上の長さのアミノ酸の多数のＸＴＥＮ配列も分析され、大多数が９５％を超えるランダムコイル形成物を有することが明らかにされた。例外は、予測されたベータシート形成物をもたらす、３つの連続セリン残基の１つ以上の例を有する配列であった。しかし、これらの配列でもおおよそ９９％のランダムコイル形成物をなお有した。
これに対して、Ａ、Ｓ、およびＰアミノ酸に限定された８４残基のポリペプチド配列を、高度の予測アルファらせんが予測されるＣｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴリズムによって評価した。複数反復「ＡＡ」および「ＡＡＡ」配列を有する配列は、６９％のアルファらせん構造物の全体の予測パーセンテージを有した。ＧＯＲアルゴリズムは、本実施例で分析された、アミノ酸Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｅ、Ｐから成る１２アミノ酸配列モチーフから成るいずれの配列よりはるかに少ない、７８．５７％のランダムコイル形成物を予測した。
結論：分析は：１）連続アミノ酸に関して限定された反復性を有するＧ、Ｓ、Ｔ、Ｅ、Ｐ、およびＡの複数の配列モチーフから生成されたＸＴＥＮは、非常に少ない量のアルファらせんおよびベータシートを有することが予測されること；２）ＸＴＥＮの長さの増加は、アルファらせんまたはベータシート形成物の確率を認められるほどには増加させないこと；および３）アミノ酸Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｅ、Ｐ、およびＡから成る非反復性１２マーの付加によるＸＴＥＮ配列の長さの漸増によって、ランダムコイル形成物のパーセンテージの増加をもたらすという結論を裏付けている。これに対して、より高度の内部反復性を有する、Ａ、ＳおよびＰに限定されたアミノ酸から生成されたポリペプチドは、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴリズムによって決定されたように、高いパーセンテージのアルファらせん、ならびにランダムコイル形成物を有することが予測される。これらの方法によって評価された多数の配列に基づいて、長さが約４００アミノ酸残基を超える限定された反復性（任意の１個のモチーフに２個以下の同一の連続アミノ酸として定義される）を有するＧ、Ｓ、Ｔ、Ｅ、Ｐ、およびＡの配列モチーフから生成されたＸＴＥＮが非常に限定された２次構造を有すると予想されることは概して事実である。３個の連続セリンを含有するモチーフを除いて、表１からの配列モチーフの任意の順序または組合せを使用して、２次構造が実質的にないＸＴＥＮ配列をもたらす約４００残基を超える長さのＸＴＥＮポリペプチドを生成できると考えられる。このような配列は、本明細書で開示する本発明のＢＰＸＴＥＮ実施形態に記載された特徴を有することが予想される。
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（実施例７３）
反復性についてのポリペプチド配列の分析
より短いサブ配列がポリペプチド全体内に出現する回数を定量することによって、ポリ
ペプチドアミノ酸配列を反復性について評価することができる。たとえば２００のアミノ酸残基のポリペプチドは、１９２の重複９−アミノ酸サブ配列（すなわち９マー「フレーム」）を有するが、独自の９マーサブ配列の数は、配列内の反復の量に依存する。本分析において、２００アミノ酸配列以内の独自の３マーサブ配列の絶対数で割ったポリマー部分の最初の２００アミノ酸全体にわたる各３−アミノ酸フレームについての独自の３マーサブ配列すべての出現を合計することによって、異なる配列を反復性について評価した。得られたサブ配列スコアは、ポリペプチド内の反復度の反映である。
表３３に示した結果は、２または３のアミノ酸タイプから成る非構造化ポリペプチドが高いサブ配列スコアを有するが、低度の内部反復性を有する６種類のアミノ酸Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｅ、Ｐ、およびＡの１２アミノ酸モチーフから成る非構造化ポリペプチドは１０未満の、いくつかの場合においては５未満のサブ配列スコアを有することを示している。たとえばＬ２８８配列は、２つのアミノ酸タイプを有し、短い高反復性配列を有し、５０．０のサブ配列スコアをもたらす。ポリペプチドＪ２８８は３つのアミノ酸タイプを有するが、また短い反復性配列を有し、３３．３のサブ配列スコアをもたらす。Ｙ５７６も３つのアミノ酸タイプを有するが、内部反復から作られておらず、最初の２００アミノ酸にわたって１５．７のサブ配列スコアに反映されている。Ｗ５７６は４タイプのアミノ酸から成るが、より高度の内部反復性、たとえば「ＧＧＳＧ」（配列番号７８２）を有し、２３．４のサブ配列スコアをもたらす。ＡＤ５７６は、それぞれ４タイプのアミノ酸から成る、４タイプの１２アミノ酸モチーフからなる。個々のモチーフの低度の内部反復性のために、最初の２００アミノ酸にわたるサブ配列全体のスコアは１３．６である。これに対して、４つのモチーフから成るＸＴＥＮは６タイプのアミノ酸を含有し、低度の内部反復性を有するそれぞれはより低いサブ配列スコア；すなわちＡＥ８６４（６．１）、ＡＦ８６４（７．５）、およびＡＭ８７５（４．５）を有する。
結論：結果は、本質的に非反復性である４〜６のアミノ酸タイプからそれぞれ成る１２アミノ酸サブ配列モチーフの、より長いＸＴＥＮポリペプチドへの組み合わせによって、非反復性である全体配列がもたらされることを示す。これは、各サブ配列モチーフが配列全体にわたって複数回使用され得るという事実にもかかわらずである。これに対して、より少ない数のアミノ酸タイプから生成されたポリマーによってより高いサブ配列スコアがもたらされたが、実際の配列を調整して反復度を低下させて、より低いサブ配列スコアをもたらすことができる。
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（実施例７４）
ＴＥＰＩＴＯＰＥスコアの計算
９マーペプチド配列のＴＥＰＩＴＯＰＥスコアは、Ｓｔｕｒｎｉｏｌｏ［Ｓｔｕｒｎｉｏｌｏ，Ｔ．ら（１９９９）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１７：５５５］によって記載されたポケットポテンシャルを加えることによって計算できる。本実施例において、個々のＨＬＡ対立遺伝子について個々のＴｅｐｉｔｏｐｅスコアを計算した。表３４は、例として、白人集団にて高頻度で出現するＨＬＡ＊０１０１Ｂのポケットポテンシャルを示す。配列Ｐ１−Ｐ２−Ｐ３−Ｐ４−Ｐ５−Ｐ６−Ｐ７−Ｐ８−Ｐ９のペプチドのＴＥＰＩＴＯＰＥスコアを計算するために、表３４の対応する個々のポケットポテンシャルを加えた。配列ＦＤＫＬＰＲＴＳＧ（配列番号８００）を有する９マーペプチドのＨＬＡ＊０１０１Ｂスコアは、０、−１．３、０、０．９、０、−１．８、０．０９、０、０の和である。
長いペプチドのＴＥＰＩＴＯＰＥスコアを評価するために、配列の９マーサブ配列すべてに対してプロセスを反復することができる。本プロセスは、他のＨＬＡ対立遺伝子によってコードされたタンパク質に対して反復することができる。表３５〜３８は、白人集団にて高頻度で出現するＨＬＡ対立遺伝子のタンパク質生成物のポケットポテンシャルを与える。
本方法によって計算されたＴＥＰＩＴＯＰＥスコアは、おおよそ−１０〜＋１０に及ぶ。しかし、Ｐ１位置に疎水性アミノ酸（ＦＫＬＭＶＷＹ（配列番号８０１））を欠いた９マーペプチドは、−１００９〜−９８９の範囲の計算されたＴＥＰＩＴＯＰＥスコアを有する。この値は、生物学的に意味がなく、疎水性アミノ酸がＨＬＡ結合のアンカー残基として働き、Ｐ１に疎水性残基を欠いたペプチドがＨＬＡに対する非バインダーと見なされるという事実を反映している。大半のＸＴＥＮ配列は疎水性残基を欠いているので、９マ
ーサブ配列の組合せはすべて、−１００９〜−９８９の範囲にＴＥＰＩＴＯＰＥを有する。本方法は、ＸＴＥＮポリペプチドが予測されたＴ細胞エピトープをほとんどまたは全く有し得ないことを確認する。
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Claims (1)

  1. 明細書に記載の発明。
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