WO2017119508A1 - 採血管、試薬及びそれらを利用した血液性状分析方法 - Google Patents

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analyzing
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細川　和也
和田　朋子
寿代 金子
喬彬 長谷川
朋香 永里
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藤森工業株式会社
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    • G01N2333/96441—Serine endopeptidases (3.4.21) with definite EC number
    • G01N2333/96458—Factor XII (3.4.21.38)

Definitions

  • the present invention relates to a blood collection tube and a reagent that can be suitably used for blood property analysis such as platelet thrombus formation ability and mixed white thrombus formation ability, and a blood property analysis method using them.
  • Blood tests often cannot be performed immediately after blood collection, and blood clots over time, so blood collection tubes with anticoagulants such as heparin and sodium citrate added in advance It is used to collect blood.
  • blood collection tubes using heparin as an anticoagulant include those disclosed in Patent Document 1.
  • the thrombus formation or hemostasis reaction in vivo progresses simultaneously with primary hemostasis consisting of platelet adhesion and agglutination reaction on collagen and subsequent secondary hemostasis of fibrin gel produced by activation of blood coagulation factors.
  • primary hemostasis mainly consisting of platelet aggregation reaction is dominant.
  • secondary hemostasis consisting of blood coagulation reaction is dominant over primary hemostasis, and a thrombus containing more fibrin is formed.
  • a blood property analyzer using a microchip having a flow channel simulating blood vessels for evaluating platelet thrombus formation ability and mixed white thrombus formation ability using a minute amount of blood.
  • Patent Documents 2 to 5 As a device for analyzing in detail the blood coagulation reaction under non-blood flow, a thromboelastograph (TEG), ROTEM (trademark) or the like is used.
  • blood collection tubes that contain an anticoagulant such as heparin were known, but when the blood contacts the blood collection tube cap, an activation reaction of the coagulation cascade contact factor occurs, There is room for improvement in known blood collection tubes. Further, in evaluating the collected blood using the blood property analyzer as described above, a more customized blood collection tube has been desired. In addition, even when a conventional blood collection tube containing citric acid is used, it has been desired to develop a reagent that can analyze mixed white blood clot formation ability and perform blood coagulation tests with higher sensitivity.
  • the present inventors have discovered that even a vacuum blood collection tube containing a commonly used anticoagulant such as heparin or sodium citrate activates a contact factor and promotes blood coagulation in whole blood.
  • a commonly used anticoagulant such as heparin or sodium citrate activates a contact factor and promotes blood coagulation in whole blood.
  • the inventors have found that the promotion of coagulation can be suppressed by adding a small amount of a contact factor inhibitor such as a blood coagulation factor XII (FXII) inhibitor or a kallikrein inhibitor to the blood collection tube in advance.
  • a contact factor inhibitor such as a blood coagulation factor XII (FXII) inhibitor or a kallikrein inhibitor
  • heparin preferably low molecular heparin
  • sodium citrate preferably sodium citrate
  • a contact factor inhibitor preferably sodium citrate
  • ROTEM conventional blood coagulation tests
  • the reagent when using a conventionally used blood collection tube containing citric acid, is an FXII inhibitor such as corn-derived trypsin inhibitor (CTI) and a kallikrein inhibitor, and preferably a smaller amount of heparin and / or By adding heparan sulfate, it was found that it can be suitably used for analysis of mixed white thrombus formation ability and conventional blood coagulation tests (ROTEM, TEG, etc.), and the present invention has been completed.
  • CTI corn-derived trypsin inhibitor
  • a kallikrein inhibitor preferably a smaller amount of heparin and / or
  • the present invention provides a blood collection tube containing heparin or sodium citrate and a contact factor inhibitor such as a blood coagulation factor XII (FXII) inhibitor and a kallikrein inhibitor.
  • a contact factor inhibitor such as a blood coagulation factor XII (FXII) inhibitor and a kallikrein inhibitor.
  • FXII blood coagulation factor XII
  • a kallikrein inhibitor such as a blood coagulation factor XII (FXII) inhibitor and a kallikrein inhibitor.
  • FXII blood coagulation factor XII
  • Heparin is preferable, and low molecular weight heparin is applied to the inside of the blood collection tube in an amount of 0.1 to 10 units / mL (0.1 to 10 IU (international units) / mL) with respect to blood at the time of blood collection. Preferably it is. Further, heparan sulfate may be used as an alternative to heparin.
  • the FXII inhibitor is preferably corn-derived trypsin inhibitor (CTI), and CTI is preferably applied to the inside of the blood collection tube in an amount of 5 to 50 ⁇ g / mL with respect to the blood at the time of blood collection.
  • the kallikrein inhibitor is preferably aprotinin, and it is preferable that aprotinin is applied to the blood collection tube in an amount of 1 to 50 ⁇ g / mL with respect to the blood at the time of blood collection.
  • Contact factor inhibitors such as FXII inhibitors and kallikrein inhibitors are preferably applied to the inside of the blood collection tube and in a dry state.
  • the present invention uses fibrin and activated platelets that measure blood clot formation ability after adding heparinase to blood collected using a blood collection tube containing heparin and a contact factor inhibitor.
  • heparinase is preferably added at a concentration of 1 to 10 units / mL (1 to 10 IU (international units) / mL), and CTI of 25 ⁇ g / mL or less and / or 1
  • An embodiment in which ⁇ 50 ⁇ g / mL aprotinin is contained and heparinase is added together with 10 ⁇ g / mL or more of CTI may be employed.
  • a more preferable analysis method is a method in which a microchip having a channel imitating a blood vessel is provided and blood is flowed into the channel for analysis.
  • the microchip has collagen and tissue factor (tissue) on the channel. It is preferable to have a site coated with factor (tissue thromboplastin). However, it can also be used for other blood coagulation tests such as ROTEM (trademark: rotation thromboelastometry) and TEG (trademark: Thromboelastography). In that case, coagulation is initiated by adding heparinase and a low concentration of tissue factor (eg, 0.1 nM to 10 nM) to blood containing heparin and a contact factor inhibitor.
  • the present invention uses the blood collected using the blood collection tube, and is provided with a flow channel imitating a blood vessel inside thereof, and further has a flow channel dividing portion on the flow channel.
  • the present invention provides a method for analyzing platelet thrombus-forming ability mainly composed of activated platelets, which measures the thrombus formation by flowing it into a tube.
  • the present invention uses blood collected by a conventional blood collection tube having a rubber stopper and adds heparin (or heparan sulfate) to the contact factor inhibitor (FXII inhibitor, kallikrein inhibitor) and heparin sulfate.
  • the present invention provides a method for analyzing the formation of blood clots below, and a method for analyzing blood coagulation using ROTEM or TEG by adding heparin and tissue factor to a contact factor inhibitor.
  • Anticoagulated and stored blood with heparin preferably low molecular weight heparin
  • contact factor inhibitors such as FXII inhibitors (such as corn-derived trypsin inhibitor (CTI)) and / or kallikrein inhibitors (such as aprotinin) Is suitable for measuring the platelet thrombus formation ability in a microchip coated with collagen, in which the platelet function is well maintained.
  • FXII inhibitors such as corn-derived trypsin inhibitor (CTI)
  • CTI corn-derived trypsin inhibitor
  • kallikrein inhibitors such as aprotinin
  • heparin is added to blood that has been anticoagulated and stored with heparin and a contact factor inhibitor, and heparin is decomposed into fibrin and activated platelets in a microchip coated with collagen and tissue factor. It is suitable for measuring mixed white blood clot formation ability as a main component. Also, for example, when heparinase and CTI are added to blood that has been anticoagulated and stored with heparin and a kallikrein inhibitor, and heparinase and CTI are added at the time of measurement. It can be inhibited and is suitable for mixed white blood clot formation ability measurement and blood coagulation measurement such as ROTEM and TEG.
  • a particularly preferred form is to coat the blood collection tube with a small molecule of heparin and / or aprotinin and / or a small amount of CTI (25 ⁇ g / mL or less). It is desirable to measure by adding a mixture (for example, 10 to 50 ⁇ g / mL).
  • sodium citrate can be used instead of heparin.
  • blood can be collected with a blood collection tube containing sodium citrate (preferably about 11 mM) and a kallikrein inhibitor, and calcium (for example, calcium chloride; hereinafter the same) or calcium and CTI can be added for measurement.
  • sodium citrate preferably about 11 mM
  • a kallikrein inhibitor for example, calcium chloride; hereinafter the same
  • calcium and CTI can be added for measurement.
  • CTI for example, 10 to 50 ⁇ g / mL
  • a kallikrein inhibitor for example, By adding 10 to 50 ⁇ g / mL aprotinin) and calcium at the time of measurement, it is possible to suppress the activation of the contact factor and the promotion of blood coagulation at the time of measurement, and to correctly measure the thrombus formation ability.
  • CTI kallikrein inhibitor and calcium
  • heparin with a low concentration 0.5 units (U) / mL or less
  • low molecular heparin or danaparoid sodium heparan sulfate as the main component
  • CTI, a kallikrein inhibitor, and calcium are added to a blood sample collected in a blood collection tube containing sodium citrate, preferably a lower concentration of heparin or heparan sulfate, more preferably a lower concentration.
  • blood coagulation in vivo is not simplified as an extrinsic system or an intrinsic system, but is initiated by a small amount of tissue factor expressed on the cell surface, and the activity of coagulation factors XI, VIII, and V by a small amount of thrombin produced It is said that it will be amplified by conversion.
  • Cell based coagulation model Journal of Veterinary Emergency and Critical Care 19 (1) 2009, pp 3-10 Therefore, in the above assay, while suppressing the non-physiological blood coagulation activation derived from rubber plugs, A measurement that initiates blood coagulation with a small amount of tissue factor is considered to be close to in vivo blood coagulation.
  • coagulation factor VII Novoseven
  • tissue factor pathway inhibitor TFPI: BAX4919
  • TFPI tissue factor pathway inhibitor
  • blood anticoagulated with heparin and a contact factor inhibitor can be used for measurement of both platelet thrombi and mixed white thrombi, and can also be used for blood coagulation measurements such as ROTEM and TEG.
  • tissue factor is added to start blood coagulation, so that blood coagulation analysis using ROTEM, TEG, etc. can be performed well.
  • blood coagulation is initiated by a small amount of tissue factor in an environment in which the activation of contact factor is inhibited by CTI, and feedback to coagulation factors XI, VIII, and V by the small amount of thrombin generated Upon activation, the coagulation cascade is amplified and analysis of the coagulation reaction closer to physiological is possible.
  • the tissue factor used may be tissue thromboplastin extracted from animal tissue or soluble (extracellular domain) tissue factor produced by genetic recombination techniques.
  • tissue factor for genetic recombination commercially available Dadeinobin (Siemens), Hemoth AI (IEL Japan), etc., which are commercially available as recombinant PT reagents, can be used.
  • the amount of tissue factor to be added is not particularly limited. When the amount of heparin or heparan sulfate to be added is large, the amount of tissue factor also increases, but for the analysis of blood coagulation, the start of blood coagulation in normal blood may be between 3 and 30 minutes. desirable. When blood coagulation is started within 3 minutes, the influence of exogenous blood coagulation due to tissue factor is large, the contribution of the intrinsic system is small, and may not be suitable for diagnosis of hemophilia, etc. This is because it takes too much time for inspection when the start of the test exceeds 30 minutes. When using tissue factor prepared by genetic recombination, it is desirable to add in the range of 0.1 nM to 10 nM.
  • heparinase / thrombin inhibitor eg, hirudin, argatroban or BAPA (benzylsulfonyl-D-Arg-Pro-4- amidinobenzylamide)
  • BAPA benzylsulfonyl-D-Arg-Pro-4- amidinobenzylamide
  • the heparinase / thrombin inhibitor mixed reagent is also useful for analyzing the platelet thrombus formation ability of blood collected by a widely used heparin-coated blood collection tube.
  • cardiac surgery using an auxiliary heart-lung machine mainly needs to monitor the reduction of the hemostatic function due to blood dilution and the recovery of the hemostatic function by a hemostatic preparation (transfusion of a plasma fraction preparation, a platelet preparation, etc.).
  • a patient undergoing surgery basically has a blood collection route using a catheter from an artery, and in such a patient, it is not necessary to use a vacuum blood collection tube.
  • a large amount of heparin is administered during the use of auxiliary heart-lung machine.
  • a mixture of heparinase and thrombin inhibitor is used.
  • Reagent preferably container pre-coated with mixed reagent
  • heparinase and CTI mixed reagent preferably mixed reagent pre-coated
  • fibrin and platelet thrombus primary hemostasis secondary hemostasis
  • the above reagents may be used with Disodium4,4'-Dinitrostilbene-2,2'-disulfonate (DNDS) It is possible to analyze thrombus formation ability and hemostasis function while suppressing blood sedimentation.
  • DNDS Disodium4,4'-Dinitrostilbene-2,2'-disulfonate
  • the concentration of DNDS is preferably 20 to 200 ⁇ g / mL.
  • FIG. 1 shows the results of ROTEM measurement performed using blood collected using various blood collection tubes containing sodium citrate and adding calcium chloride or calcium chloride and CTI.
  • FIG. 1 to Example 2 showing the results of ROTEM measurement performed using blood collected using a blood collection tube containing low molecular heparin and adding heparinase or heparinase and CTI.
  • FIG. 3 shows the results of white thrombus formation measurement performed using blood collected using various blood collection tubes containing sodium citrate and adding calcium chloride and CTI.
  • FIG. 4 shows the results of measurement of platelet thrombus formation using blood collected in a vacuum blood collection tube containing hiparin and CTI, hirudin blood collection tube and BAPA blood collection tube.
  • FIG. 5 shows the results of measurement of platelet thrombus formation by using blood collected in a BD company blood collected in a parin blood collection tube and adding a heparinase / BAPA mixed reagent.
  • FIG. 6 shows the results of ROTEM measurement using blood collected in a sodium citrate blood collection tube of BD and adding each reagent.
  • FIG. 7 shows the results of ROTEM measurement using blood collected in a sodium citrate blood collection tube of BD and adding each reagent.
  • Figure 8 shows the results of measurement of white blood clot formation performed by adding sodium heparin and sodium.
  • FIG. 10 shows the results of ROTEM measurement using blood collected in a sodium citrate blood collection tube of BD and adding each reagent.
  • a comparative example showing the results of ROTEM measurement using blood collected in a sodium citrate blood collection tube of BD and adding each reagent.
  • FIG. 11 shows the results of white thrombus formation measurement performed using blood collected using a sodium citrate blood collection tube of BD and adding calcium chloride, CTI, aprotinin and sodium danapaloid.
  • FIG. 13 shows the results of ROTEM measurement using blood collected in a sodium citrate blood collection tube of BD and adding calcium chloride, CTI, aprotinin, and danaparoid sodium.
  • FIG. 13 shows the results of ROTEM measurement using blood collected in a sodium citrate blood collection tube of BD and adding calcium chloride, CTI, aprotinin and danaparoid sodium.
  • the blood collection tube of the present invention contains low-molecular-weight heparin or sodium citrate and a contact factor inhibitor (for example, FXII inhibitor or kallikrein inhibitor) inside.
  • a contact factor inhibitor for example, FXII inhibitor or kallikrein inhibitor
  • Heparin is a mucopolysaccharide having a molecular weight of about 5,000 to 30,000, which is composed of sulfated D-glucosamine, D-glucuronic acid and L-iduronic acid forming a polymer.
  • the heparin used in the present invention is preferably a low molecular weight heparin having a mass average molecular weight of 4500 to 6500.
  • the heparin may be a metal salt such as heparin sodium or lithium heparin. Heparin is generally used safely from cattle, but can also be used from animals such as pigs and dogs or from humans.
  • FXII inhibitors include synthetic inhibitors such as CTI, COU254, and RD12. Among them, CTI is preferred. CTI is disclosed in, for example, the following literature, and a commercially available product may be used, or it may be prepared from corn itself and used.
  • kallikrein inhibitor examples include aprotinin, but other low molecular weight kallikrein inhibitors may be used.
  • the shape of the blood collection tube of the present invention is not particularly limited and can be the same shape as a known blood collection tube, but as a blood collection tube of one embodiment of the present invention, The thing with which the stopper which seals the opening part of a blood-collecting-tube main body was attached is mentioned.
  • the inside of the blood collection tube to which the plug is attached is decompressed.
  • the degree of pressure reduction may be set as appropriate according to the amount of blood collected.
  • the bottomed tube in the blood collection tube of the present invention includes glass, homopolymers or copolymers such as polyethylene terephthalate / polybutylene terephthalate / polyethylene naphthalate / polyethylene isophthalate, acrylic resin, polyethylene, polypropylene, polycarbonate, polyacetal, polyamide, polyurethane, etc. Is preferred.
  • rubber, elastomer or aluminum vapor deposition film is preferable.
  • the rubber include chlorinated butyl rubber, brominated butyl rubber, isoprene rubber, and natural rubber.
  • the elastomer include olefin, polyester, and polyurethane.
  • an aluminum vapor deposition film the form which provides rubber buttons, such as isoprene, on the aluminum vapor deposition film so that a needle
  • heparin or sodium citrate and contact factor inhibitors such as FXII inhibitor and kallikrein inhibitor
  • spray a solution of heparin or sodium citrate and contact factor inhibitor on the inner wall of the blood collection tube is illustrated.
  • heparin or sodium citrate and a contact factor inhibitor are sealed in the blood collection tube, and the open end of the bottomed tube is sealed with a stopper, and then sealed with an aluminum vapor deposited film or plastic packaging material, for a longer period of time.
  • Protected from heat, moisture can increase the stability of heparin or sodium citrate and contact factor inhibitors.
  • abnormal blood coagulation and adhesion can be prevented by applying a silicone coating to the inner surface of the bottomed tube.
  • the low molecular weight heparin encapsulated in the blood collection tube as an anticoagulant is preferably 1 to 10 units (anti-FXa unit: international unit) (1 to 10 IU / mL) per 1 mL of blood to be collected. More preferred is 3 to 8 units (3 to 8 IU / mL).
  • the sodium citrate encapsulated in the blood collection tube as an anticoagulant is 3.2 to 3.8% sodium citrate in 1/10 of the blood to be collected.
  • the amount of the FXII inhibitor encapsulated in the blood collection tube may be an amount that can inhibit blood coagulation factor XII, but in the case of CTI, it is preferably 5 to 50 ⁇ g per mL of blood to be collected. .
  • the amount of CTI may be added only in an amount necessary to prevent contact factor activation in the blood collection tube. For example, the amount is 25 ⁇ g / mL or less, preferably 5 to 20 ⁇ g / mL.
  • the amount of the kallikrein inhibitor encapsulated in the blood collection tube may be an amount that can inhibit kallikrein, but in the case of aprotinin, it is preferably 1 to 50 ⁇ g per 1 mL of blood to be collected.
  • both aprotinin and CTI may be enclosed in the blood collection tube. In that case, the amount of CTI may be only an amount necessary to prevent contact factor activation in the blood collection tube, for example, 1 to 10 ⁇ g / mL. May be the amount.
  • the method for analyzing the thrombus formation ability is not particularly limited as long as it is an in vitro method, but preferably, the analysis of thrombus formation ability under blood flow using a microchip in which a microchannel imitating a blood vessel is provided. A method is mentioned. In addition, it can be used for coagulation ability analysis of conventional ROTEM, TEG and the like.
  • the present inventors have included a microchip for platelet thrombus analysis having a channel dividing part in the middle of a channel, collagen and tissue in the middle of the channel.
  • a microchip for mixed white blood clot analysis that has a thrombus monitoring part coated with a factor.
  • Reservoirs (blood storage containers) 106 and 116 are connected to the first inlet 104 and the second inlet 114 of the microchip A in an inverted manner, respectively. 117 is connected. Pressure sensors 108 and 118 are connected to the liquid feed pumps 107 and 117. Immediately before the measurement, blood collected by the blood collection tube of the present invention is introduced into the reservoirs 106 and 116, and measurement is performed.
  • the liquid of the liquid feeding pumps 107 and 117 is a liquid having a specific gravity smaller than that of blood such as mineral oil or physiological saline, and the liquid feeding pumps 107 and 117 introduce the liquid into the reservoirs 106 and 116 filled with blood in advance.
  • the liquid is layered on the blood, and the liquid is pushed out by the pumps 107 and 117, whereby the blood is introduced into the flow paths 101 and 111.
  • the inflow pressure of the blood into the flow path can be indirectly measured.
  • mineral oil is press-fitted into the reservoirs 106 and 116 from the liquid feed pumps 107 and 117, is layered on the blood, and pushes the blood into the channels 101 and 111 of the microchip 1.
  • the blood passes through the flow paths 101 and 111 and reaches the reaction units 102 and 112.
  • Collagen is applied to the first reaction part and the second reaction part, and further extends along the direction of blood flow as disclosed in Patent Documents 2 and 3, and the width of the flow path is divided into a plurality of parts.
  • a plurality of flow path dividing walls are provided, and the clogging due to thrombus formation proceeds faster than the other parts at the dividing wall.
  • the interval between the flow path dividing walls is preferably 200 ⁇ m or less.
  • the width of the flow path is preferably divided into five or more by the flow path dividing wall.
  • the shape of the flow path dividing wall is not particularly limited as long as the width of the flow path can be divided into a plurality of widths.
  • the flow path dividing wall may be treated so that the surface roughness (Ra) is 10 to 200 nm. Thrombus formation by platelets occurs when passing through the reaction part, and an increase in inflow pressure based on this thrombus formation is observed. By detecting and comparing these pressure increase patterns with a pressure sensor, it is possible to evaluate blood properties, that is, platelet thrombus formation ability.
  • the blood subjected to the test reaches the waste liquid storage sections 103 and 113 from the end of the flow paths 101 and 111, is stored, and is discharged from the waste liquid ports 105 and 115. If a blood absorbing material such as a sponge impregnated with EDTA is placed in the waste liquid storage part, the blood waste liquid is absorbed by the blood absorbing material, but it does not coagulate, which may adversely affect pressure measurement. There is no.
  • a reservoir (blood storage container) 206 is invertedly connected to the inlet 204 of the microchip B, and a liquid feed pump 207 is connected to the reservoir 206.
  • a pressure sensor 208 is connected to the liquid feed pump 207.
  • heparin is decomposed by adding heparinase to the blood collected by the blood collection tube of the present invention, and then introduced into the reservoir 206 for measurement.
  • heparinase depends on the amount of heparin in the collected blood sample, it is preferably 0.1 to 10 units (0.1 to 10 IU / mL) per mL of blood, and 0.2 to 5 units ( 0.2-5 IU / mL) is more preferable.
  • the amount of CTI present in the blood collection tube is only the amount necessary for preventing contact factor activation in the blood collection tube, it is preferable for mixed white blood clot analysis to add CTI together with heparinase.
  • the amount of CTI inside the blood collection tube is set to 25 ⁇ g / mL or less (for example, 5 to 20 ⁇ g / mL), and immediately before the measurement, 10 ⁇ g / mL or more of CTI is added together with heparinase and subjected to mixed white blood clot analysis. It is preferable.
  • the liquid of the liquid feed pump 207 is a liquid having a specific gravity smaller than that of blood such as mineral oil or physiological saline, and the liquid pump 207 introduces the liquid into a reservoir 206 prefilled with blood, and the liquid is placed on the blood.
  • the layers are stacked and the liquid is pushed out by the pump 207, whereby blood is introduced into the channel 201.
  • the inflow pressure of the blood into the flow path can be indirectly measured.
  • mineral oil is press-fitted into the reservoir 206 from the liquid feed pump 207, layered on the blood, and pushes the blood into the channel 201 of the microchip B.
  • the blood passes through the constricted portion 209 provided in the middle of the flow path and reaches the reaction portion 202.
  • Collagen and tissue factor are applied to the reaction part, and thrombus formation occurs here. Inclusion of collagen and tissue factor induces a phenomenon related to thrombus formation such as platelet adhesion and aggregation on collagen and activation of the coagulation system by tissue factor. An increase in inflow pressure due to thrombus formation is observed. By detecting and comparing these pressure increase patterns with a pressure sensor, the blood properties, that is, the mixed white thrombus formation ability can be evaluated.
  • the blood subjected to the test reaches the waste liquid storage unit 203 from the end of the flow path 201. Then, it is mixed with the blood coagulation inhibitor injected from the blood coagulation inhibitor inlet 211 through the blood coagulation agent flow path 210 and discharged from the outlet 205.
  • Anticoagulants are used for the purpose of preventing clogging and pressure rise due to blood coagulation of waste liquid, such as chelating agents such as EDTA and citric acid, acids, alkaline solutions, alcohols or guanidine, urea, SDS, etc.
  • a denaturing agent can be used.
  • Sodium citrate contained in a generally used blood collection tube is adjusted to 0.32 to 0.38% of blood.
  • concentration of calcium chloride to be added is not particularly limited as long as the chelating action by sodium citrate can be canceled, but it is preferably 11 to 12 mM.
  • Contact factor inhibitors include FXII inhibitors and kallikrein inhibitors.
  • the FXII inhibitor is not particularly limited as long as it is a substance having FXII inhibitory activity, but CTI can be used. In the case of CTI, it is preferably 5 to 200 ⁇ g, more preferably 10 to 50 ⁇ g per mL of blood.
  • the kallikrein inhibitor is not particularly limited, but aprotinin is desirable. In the case of aprotinin, it is preferably 1 to 100 ⁇ g per mL of blood.
  • the combined use of an FXII inhibitor and a kallikrein inhibitor is desirable because it enables more complete inhibition of contact factor activation.
  • aprotinin inhibits plasmin in addition to kallikrein.
  • Plasmin also has relatively low substrate specificity and activates blood clotting factors. Therefore, by inhibiting kallikrein, it is possible to completely inhibit the activation of the contact factor, and simultaneously inhibit plasmin, thereby inhibiting the activation of the blood coagulation factor by a more complete non-specific pathway.
  • the fibrinolytic reaction is suppressed, which is suitable for the diagnosis of blood coagulation in patients, for example, diagnosis of hemophilia and evaluation of anticoagulants.
  • a small amount of heparin that does not affect mixed thrombus formation low molecular heparin and / or heparan sulfate (for example, danaparoid sodium) can be added to the container. This is desirable because blood coagulation due to contact with the blood is completely suppressed. 0.01-0.2 U / mL for heparin, 0.01-0.5 IU / mL for low molecular heparin, 0.01-0.5 U for danaparoid sodium (anti-FXa unit ) / ML is desirable.
  • heparin or low molecular weight heparin or heparan sulfate
  • tissue factor it is possible to analyze a more physiological blood coagulation reaction.
  • the exogenous system is exogenous by tissue factor in a state in which blood coagulation by the blood collection tube or measurement container is completely suppressed by calcium chloride, contact factor inhibitor, and a small amount of heparin (or low molecular heparin or heparan sulfate) Blood coagulation is started, and a small amount of thrombin generated starts endogenous blood coagulation, and the blood coagulation reaction is amplified.
  • the concentration of the tissue factor to be used is not particularly limited, but in the case of genetically modified soluble tissue factor, it is preferably 100 nM to 0.1 nM. If heparin is added in a large amount, it is necessary to add more tissue factor.
  • the blood coagulation analyzer to be used is not particularly limited, but a blood coagulation analyzer under non-blood flow such as ROTEM, TEG, and sonoclot is desirable.
  • the present invention provides a reagent for analyzing thrombus formation ability or blood coagulation ability, which contains calcium, a blood coagulation factor XII (FXII) inhibitor and a kallikrein inhibitor.
  • the analysis reagent preferably further contains heparin or heparan sulfate, and more preferably contains tissue factor.
  • the analysis reagent can be provided as a reagent kit containing each of these components separately.
  • Example 1 Blood collection tube A (butyl rubber rubber stopper, 3.2% sodium citrate containing, Sunphoria product) and blood collection tube B (sealed with a film seal, without rubber stopper; 3.2% sodium citrate containing, Terumo Corporation product) Blood was collected and ROTEM measurement was performed. The following different reagents were used to start the reaction.
  • Example 2 After blood (sample A) collected in blood collection tube C (Butyl rubber rubber stopper, Sunphoria Inc. containing 2 IU / mL of low molecular weight parin) and aprotinin (final concentration 10 ⁇ g / mL) before blood collection in blood collection tube C ROTEM analysis using collected blood (sample B) and blood collected after adding aprotinin (final concentration 10 ⁇ g / mL) and CTI (final concentration 10 ⁇ g / mL) to blood collection tube C before blood collection Carried out. The reaction was started with the following reagents.
  • Example 3 Calcium chloride (final concentration 12 mM) and CTI (final concentration 50 ⁇ g / mL) are added to blood collected in blood collection tube A and blood collected after aprotinin (final concentration 10 ⁇ g / mL) is added to blood collection tube A before blood collection.
  • the thrombus formation ability was analyzed using the apparatus of FIG. The analysis was performed at a flow rate of 10 ⁇ L / min.
  • thrombus formation can be analyzed by adding heparinase to a blood collection tube (including low molecular heparin and CTI). Met.
  • Example 4 Vacuum blood collection tube containing low molecular heparin (final concentration 2IU / mL) and CTI (final concentration 50 ⁇ g / mL), hirudin blood collection tube (Roche Diagnostic, hirudin final concentration 50 ⁇ g / mL) and BAPA blood collection tube (BAPA final concentration) Using blood collected at 100 ⁇ M), platelet thrombus formation was measured using the apparatus shown in FIG. Any vacuum blood collection tube uses a rubber stopper of butyl rubber.
  • the blood in each blood collection tube could be similarly analyzed for platelet thrombus formation.
  • platelet thrombus formation is also measured when heparinase / BAPA reagent (final concentration: 0.17 IU / mL, 100 ⁇ M) is added to blood of blood collection tubes containing low molecular weight heparin and CTI 30 minutes after blood collection. was possible.
  • Example 5 Blood was collected into a heparin blood collection tube manufactured by BD, and 30 minutes later, a heparinase / BAPA mixed reagent was added to the blood so that the final concentrations were 0.17 IU / mL and 100 ⁇ M, respectively, to obtain a blood sample.
  • a blood sample collected in a hirudin blood collection tube (Roche Diagnostic) was used.
  • the measurement flow rate of platelet thrombus formation was performed using the apparatus shown in FIG. Blood was run at 18 ⁇ L / min. Any vacuum blood collection tube uses a rubber stopper of butyl rubber.
  • Example 6 ROTEM measurement was performed by adding the following reagents to a blood sample collected in a sodium citrate blood collection tube (containing 1/10 volume of 3.2% sodium citrate with respect to blood) manufactured by BD.
  • (1) STARTEM reagent (2) Calcium chloride (final concentration 12mM) and CTI (final concentration 50 ⁇ g / mL) (3) Calcium chloride (final concentration 12mM), CTI (final concentration 50 ⁇ g / mL) and aprotinin (final concentration 20 ⁇ g / mL) (4) Calcium chloride (final concentration 12 mM), CTI (final concentration 50 ⁇ g / mL), aprotinin (final concentration 20 ⁇ g / mL) and danaparoid sodium (final concentration 0.25 U / mL)
  • results are shown in FIG.
  • the results are (1), (2), (3), and (4) from the left (from the earlier coagulation start).
  • the addition of aprotinin suppressed the initiation of clotting, and the addition of a low concentration of danaparoid sodium completely suppressed blood clotting.
  • Similar results were obtained with the addition of (3) and (4) in the formation of mixed white thrombus in the microchip coated with tissue factor and collagen.
  • Example 7 ROTEM measurement was performed by adding the following reagents to a blood sample collected in a sodium citrate blood collection tube (containing 1/10 volume of 3.2% sodium citrate with respect to blood) manufactured by BD.
  • STARTEM reagent calcium chloride reagent
  • Calcium chloride final concentration 12mM
  • CTI final concentration 50 ⁇ g / mL
  • aprotinin final concentration 20 ⁇ g / mL
  • Calcium chloride final concentration 12 mM
  • CTI final concentration 50 ⁇ g / mL
  • aprotinin final concentration 20 ⁇ g / mL
  • heparin sodium Mochida Pharmaceutical: final concentration 0.15 U / mL
  • the results are shown in FIG.
  • the results are (1), (2), (3), and (4) from the left (from the earlier coagulation start).
  • the addition of aprotinin suppressed the onset of blood clotting, and the addition of a low concentration of sodium heparin completely suppressed blood clotting.
  • Example 8 Calcium chloride (final concentration: 12 mM) and CTI (final concentration: 50 ⁇ g / mL) are collected in blood collection tube B (sealed with a film seal and do not use a rubber stopper; contains 3.2% sodium citrate, Terumo Corporation product) Blood sample collected with BD sodium citrate blood collection tube (containing 1/10 volume of 3.2% sodium citrate to blood), calcium chloride (final concentration 12mM), CTI (final concentration 50 ⁇ g / mL), blood samples added with aprotinin (final concentration 20 ⁇ g / mL) and heparin sodium (final concentration 0.15 U / mL) were used to analyze the thrombus formation ability using the apparatus of FIG. The analysis was performed at a flow rate of 10 ⁇ L / min.
  • Example 9 Blood collected in a blood collection tube B (sealed with a film seal and not using a rubber stopper; containing 3.2% sodium citrate, Terumo Corporation), calcium chloride (final concentration 12 mM) and CTI (final concentration 50 ⁇ g / mL) and B) blood collected in a BD sodium citrate blood collection tube (containing 1/10 volume of 3.2% sodium citrate to the blood), calcium chloride (final concentration 12 mM), CTI ( 2) Analyze thrombus formation ability using the blood sample body with the addition of aprotinin (final concentration 20 ⁇ g / mL) and heparin sodium (final concentration 0.15U / mL). It was. The analysis was performed at a flow rate of 10 ⁇ L / min (FIG. 12A).
  • Example 10 ROTEM measurement was performed by adding the following reagents to a blood sample collected in a sodium citrate blood collection tube (containing 1/10 volume of 3.2% sodium citrate with respect to blood) manufactured by BD.
  • Calcium chloride final concentration 12 mM
  • CTI final concentration 50 ⁇ g / mL
  • aprotinin final concentration 20 ⁇ g / mL
  • heparin sodium final concentration 0.15 U / mL
  • prothrombin reagent Heimos Recombin plastin
  • Calcium chloride final concentration 12 mM
  • CTI final concentration 50 ⁇ g / mL
  • aprotinin final concentration 20 ⁇ g / mL
  • heparin sodium final concentration 0.15 U / mL
  • Novo Seven final concentration 2 ⁇ g / mL
  • Prothrombin reagent Hemos Air Recombin Plastin added to a
  • Comparative example ROTEM measurement was performed by adding the following reagents to a blood sample collected in a sodium citrate blood collection tube (containing 1/10 volume of 3.2% sodium citrate with respect to blood) manufactured by BD.
  • STARTEM reagent and EXTEM reagent Trademark: Reagent for examination mainly composed of tissue factor
  • STARTEM Reagent, EXTEM Reagent, and Novo Seven Novo Nordisk Pharma: final concentration 2 ⁇ g / mL
  • STARTEM reagent, EXTEM reagent, and TFPI final concentration 10 ⁇ g / mL
  • Example 11 Blood collected in a BD sodium citrate blood collection tube (containing 1/10 volume of 3.2% sodium citrate to the blood), calcium chloride (final concentration 12 mM), CTI (final concentration 50 ⁇ g / mL), aprotinin (final concentration)
  • a blood sample added with a concentration of 20 ⁇ g / mL) and danaparoid sodium (final concentration of 0.05 U / mL) was used to analyze the thrombus formation ability using the apparatus of FIG. The analysis was performed at a flow rate of 10 ⁇ L / min.
  • a similar experiment was performed using the above blood further added with dabigatran (1000 nM) or Abciximab (antiplatelet agent: trade name Leopro) (2 ⁇ g / mL). The results are shown in FIG. Measurement of white blood clot formation ability and evaluation of anticoagulant and antiplatelet agent were possible with a blood collection tube using a rubber plug of butyl rubber manufactured by BD.
  • Example 12 Blood samples collected in a BD sodium citrate blood collection tube (containing 1/10 volume of 3.2% sodium citrate to the blood) were mixed with calcium chloride (final concentration 12 mM), CTI (final concentration 50 ⁇ g / mL), and aprotinin ( ROTEM was measured by adding danaparoid sodium (final concentration 0.05 U / mL) and final concentration 20 ⁇ g / mL). Furthermore, blood to which recombinant Factor VIIa (trade name Novo Seven) (0.5 ⁇ g / mL), TFPI (50 ⁇ g / mL) and a combination thereof were added was measured. The results are shown in FIG. In FIG.
  • Example 13 Blood samples collected in a BD sodium citrate blood collection tube (containing 1/10 volume of 3.2% sodium citrate to the blood) were mixed with calcium chloride (final concentration 12 mM), CTI (final concentration 50 ⁇ g / mL), and aprotinin ( ROTEM was measured by adding danaparoid sodium (final concentration 0.05 U / mL) and final concentration 20 ⁇ g / mL). Furthermore, measurement of blood to which anti-FVIII polyclonal antibody (FVIII inhibitory activity; 96 ⁇ g / mL; 218 BU (FVIII inhibitory activity unit)) and Novo Seven (0.5 ⁇ g / mL), TFPI (50 ⁇ g / mL) and combinations thereof were added went.
  • anti-FVIII polyclonal antibody FVIII inhibitory activity; 96 ⁇ g / mL; 218 BU (FVIII inhibitory activity unit)
  • Novo Seven 0.5 ⁇ g / mL
  • TFPI 50
  • FIG. 17 (1) is anti-FVIII polyclonal antibody only, (2) is anti-FVIII polyclonal antibody + Novoseven, (3) is FVIII polyclonal antibody + TFPI, (4) is FVIII polyclonal antibody + Novoseven + TFPI. It was possible to measure the ROTEM and determine the effect of the hemostatic preparation using a sodium citrate blood collection tube manufactured by BD.

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Abstract

クエン酸ナトリウム含有採血管で採血された血液を用い、該血液にカルシウム、血液凝固第XII因子（FXII）阻害剤およびカリクレイン阻害剤を添加して血液凝固反応を開始させることを特徴とする、血栓形成能または血液凝固能の分析方法が提供される。好ましくは、前記血液にはさらにヘパリン、ヘパラン硫酸および組織因子が添加され、血栓形成能または血液凝固能の分析が行われる。

Description

採血管、試薬及びそれらを利用した血液性状分析方法
　本発明は、血小板血栓形成能や混合白色血栓形成能などの血液性状分析に好適に使用できる採血管、試薬及びそれらを用いた血液性状分析方法に関する。
　血液検査においては、採血後すぐに検査を行うことができない場合が多く、時間が経つと血液が凝固してしまうため、ヘパリンやクエン酸ナトリウムなどの抗凝固剤をあらかじめ加えておいた採血管を用いて採血することが行われている。ヘパリンを抗凝固剤として利用した採血管としては特許文献１に開示されたものが例示される。
　一方、生体内における血栓形成または止血反応は、コラーゲン上への血小板粘着と凝集反応よりなる一次止血と、それに続く血液凝固因子の活性化により産生されるフィブリンゲルの二次止血が同時に進行する。動脈条件下においては血小板凝集反応を主体とする一次止血が優位となり、静脈条件下においては血液凝固反応からなる二次止血が一次止血に対し優位となり、フィブリンをより多く含む血栓が形成される。これまでに、本発明者らは、微量血液を用いて血小板血栓形成能や混合白色血栓形成能を評価するための血管を模した流路を有するマイクロチップを用いた血液性状分析装置を開発してきた（特許文献２～５）。
　また、非血流下における血液凝固反応を詳細に解析する装置としては、トロンボエラストグラフ（ＴＥＧ）、ＲＯＴＥＭ（商標）等が用いられている。
特開平4‐9143号公報 再表2010/018833号公報 再表2011/99569号公報 再表2009/69656号公報 再表2007/46450号公報
　上記のように、ヘパリンなどの抗凝固剤を内部に含んだ採血管が知られていたが、血液が採血管のキャップに接触することで、凝固カスケードの接触因子の活性化反応が起こるなど、公知の採血管には改善の余地があった。また、採血した血液を上記のような血液性状分析装置を用いて評価するにあたり、よりカスタマイズされた採血管が望まれていた。
　また、従来の汎用されているクエン酸を含む採血管を用いる場合にも、より感度よく混合白色血栓形成能の分析、および血液凝固検査を行うことのできる試薬の開発が望まれていた。
　本発明者らは、一般に汎用されているヘパリンやクエン酸ナトリウムなどの抗凝固剤を含んだ真空採血管であっても、接触因子を活性化し、全血における血液凝固を促進するということを発見し、その凝固促進は、少量の血液凝固第XII因子（FXII）阻害剤やカリクレイン阻害剤などの接触因子阻害剤を予め採血管に加えておくことで抑制することができることを見出した。さらに、そのようなヘパリン（好ましくは低分子へパリン）またはクエン酸ナトリウムと接触因子阻害剤を内部に含んだ採血管によって採取された血液は血小板血栓形成能や混合白色血栓形成能の分析、および従来の血液凝固検査（ROTEM、TEGなど）に好適に使用できることを見出した。
　また、従来の汎用されているクエン酸を含む採血管を用いる場合には、試薬にコーン由来トリプシンインヒビター（CTI）等のFXII阻害剤及びカリクレイン阻害剤と、好ましくはさらに少量のへパリン及び／又はヘパラン硫酸を添加することで好適に混合白色血栓形成能の分析、および従来の血液凝固検査（ROTEM、TEGなど）に使用出来ることを見出し、本発明を完成させるに至った。
　本発明は、へパリンまたはクエン酸ナトリウムと、血液凝固第XII因子（FXII）阻害剤およびカリクレイン阻害剤などの接触因子阻害剤を内部に含む採血管を提供する。
　ここで、用いるへパリンは、低分子へパリン、ペンタサッカライド（アンチトロンビンのXa阻害を促進するへパリン内の５糖構造）を用いることができるが、ヘパリンが質量平均分子量４５００～６５００の低分子ヘパリンであることが好ましく、低分子へパリンは採血時に血液に対して０．１～１０単位／ｍＬ(０．１～１０ＩＵ（国際単位）／ｍＬ)となる量で採血管内部に塗布されていることが好ましい。また、へパリンの代替として、ヘパラン硫酸を用いてもよい。また、FXII阻害剤がコーン由来トリプシンインヒビター（CTI）であることが好ましく、CTIが採血時に血液に対して５～５０μg／ｍＬとなる量で採血管内部に塗布されていることが好ましい。
　カリクレイン阻害剤は、アプロチニンであることが好ましく、アプロチニンが採血時に血液に対して１～50μg／ｍＬとなる量で採血管に塗布されていることが好ましい。
　FXII阻害剤およびカリクレイン阻害剤などの接触因子阻害剤は、採血管内部へ塗布され乾燥状態であることが望ましい。
　また、本発明は、前記へパリンと接触因子阻害剤を内部に含む採血管を用いて採血された血液を用い、これにヘパリナーゼを添加した後に血栓形成能を測定する、フィブリンと活性化血小板を主成分とする混合白色血栓形成能の分析方法を提供する。ここで、へパリナーゼが１～１０単位／ｍＬ（１～１０ＩＵ（国際単位）／ｍＬ）の濃度で添加されることが好ましく、また、採血管の内部に25μg／ｍＬ以下のCTIおよび／または1～50μg／ｍＬのアプロチニンが含まれており、へパリナーゼが１０μg／ｍＬ以上のCTIとともに添加される態様でもよい。より好ましい分析方法は、内部に血管を模した流路が設けられたマイクロチップを用い、流路に血液を流入させて分析する方法であり、マイクロチップは、流路上にコラーゲンと組織因子（tissue factor:組織トロンボプラスチン）をコートされた部位を有することが好ましい。ただし、ROTEM（商標：rotation thromboelastometry）、 TEG（商標：Thromboelastography）などのその他の血液凝固検査にも使用することができる。その場合は、へパリンと接触因子阻害剤を含む血液に、へパリナーゼと低濃度（例えば、０．１ｎＭ～１０ｎＭ）の組織因子を加えることにより凝固が開始される。
　また、本発明は、前記採血管を用いて採血された血液を用い、これを、内部に血管を模した流路が設けられ、さらに、流路上に流路分割部を有するマイクロチップの流路に流して血栓形成を測定する、活性化血小板を主体とする血小板血栓形成能の分析方法を提供する。
　また、本発明は、従来のゴム栓を有する採血管で採取された血液を用い、接触因子阻害剤（FXII阻害剤、カリクレイン阻害剤）とへパリン（またはヘパラン硫酸）を添加することで血流下における血栓形成を解析する方法、および、接触因子阻害剤とへパリンおよび組織因子を添加することでROTEMやTEGを用いて血液凝固の解析を行う方法を提供する。
　へパリン（好ましくは低分子へパリン）と、FXII阻害剤（コーン由来トリプシンインヒビター（CTI）など）および／またはカリクレイン阻害剤（アプロチニンなど）などの接触因子阻害剤によって抗凝固処理され保存された血液は、血小板機能が良好に保持され、コラーゲンをコートされたマイクロチップ内で血小板血栓形成能を測定するのに適している。
　さらにヘパリンと接触因子阻害剤によって抗凝固処理され保存された血液にヘパリナーゼを添加して、へパリンを分解した血液は、コラーゲンと組織因子がコートされたマイクロチップ内でのフィブリンと活性化血小板を主成分とする混合白色血栓形成能を測定するのに適している。
　また、例えば、へパリンとカリクレイン阻害剤で抗凝固処理され保存された血液に、測定時にへパリナーゼとCTIを添加して測定すると、測定時にはカリクレイン阻害剤とCTIの両方でより強力に接触因子の阻害が可能であり、混合白色血栓形成能測定およびROTEM、TEGなどの血液凝固測定に適している。
　アプロチニンに比べCTIは高価であるため、特に好ましい形態としては、採血管に低分子へパリンと、アプロチニンおよび／または少量のCTI（25μg/mL以下）をコートし、測定時にさらに、へパリナーゼとCTI(例えば、10～50μg/mL)の混合物を添加して測定することが望ましい。
　また、血液凝固を主体とする検査のみに用いる場合には、へパリンの代わりにクエン酸ナトリウムを用いることも可能である。その場合には、クエン酸ナトリウム（好ましくは約１１ｍM）とカリクレイン阻害剤を含む採血管で採血し、カルシウム（例えば、塩化カルシウム；以下、同じ）またはカルシウムとCTIを加えて測定することができる。
　一方、一般に入手可能な3.2～3.8％のクエン酸ナトリウムを含む真空採血管で採血された血液を用いて測定する場合には、CTI（例えば、10～50μg/mL）とカリクレイン阻害剤（例えば、10～50μg/mLのアプロチニン)及びカルシウムを測定時に加えることでも、測定時の接触因子の活性化及び血液凝固の促進を抑制し、正しく血栓形成能を測定することが可能である。その場合には、CTIとカリクレイン阻害剤とカルシウムに加え、低濃度（０．５単位（U）/mL以下）のへパリン、低分子へパリンやダナパロイドナトリウム（へパラン硫酸を主成分とする低分子へパリノイド）の添加によりさらに良好な血液凝固の抑制が可能となり、前記混合白色血栓形成能測定に適する。
　また、クエン酸ナトリウムを含む採血管に採血した血液検体に、CTI、カリクレイン阻害剤、カルシウムを添加すること、好ましくはさらに低濃度のへパリンまたはヘパラン硫酸を添加すること、より好ましくはさらに低濃度の組織因子を添加すること、によって血液凝固を開始した場合、ROTEM、TEG等の血液凝固検査においてより生理的な血液凝固反応の解析が可能である。
　一般に生体内の血液凝固は、外因系、内因系と単純化されておらず、細胞表面に発現された少量の組織因子によって開始され、少量生産されたトロンビンによる凝固XI,VIII,V因子の活性化によって増幅されるといわれている。（cell based coagulation model; Journal of Veterinary Emergency and Critical Care 19(1) 2009, pp 3～10）よって、上記のアッセイで、ゴム栓に由来する非生理的な血液凝固の活性化を抑制しつつ、少量の組織因子によって血液凝固を開始する測定は、生体内の血液凝固に近いと考えられる。さらに、近年、凝固VII因子（ノボセブン）や組織因子経路の阻害剤（TFPI:BAX499）等が止血用製剤として使用（又は開発中）されており、これら薬剤の効果を評価する上でも、有用と考えられる。
　以上より、へパリンと接触因子阻害剤によって抗凝固処理された血液は、血小板血栓と混合白色血栓の両方の測定に使用でき、さらにはROTEM、TEGなどの血液凝固測定にも使用できる。
　また、一般に入手可能なゴム栓をキャップに用いた3.2～3.8% クエン酸を含む採血管で採血された場合には、カルシウム、FXII阻害剤及びカリクレイン阻害剤、好ましくはさらに少量のへパリン又はヘパラン硫酸を測定時に添加することで混合白色血栓の測定や血液凝固の測定が可能である。
　FXII因子阻害剤としてはCTIが好ましく、カリクレイン阻害剤としてはアプロチニンが好ましい。さらにCTI、アプロチニン、塩化カルシウムに加えて少量のへパリンまたはヘパラン硫酸が添加されていることがより好ましい。この混合物を用いることで、組織因子とコラーゲンが塗布された流路を用いた血流下における混合白色血栓の解析を好適に行うことが可能である。
　また、CTI、アプロチニン、へパリンに加えて、少量の組織因子を添加し、血液凝固を開始することで、ROTEM、TEG等を用いた血液凝固解析が良好に行うことが出来る。
　これら試薬を用いることで、CTIによって接触因子の活性化が阻害された環境下で、少量の組織因子によって、血液凝固が開始され、生成された少量のトロンビンによる凝固XI,VIII,V因子に対するフィードバック活性化で、凝固カスケードが増幅され、より生理的に近い凝固反応の解析が可能となる。
　用いる組織因子は、動物組織より抽出した組織トロンボプラスチンまたは遺伝子組み換え技術によって作製された可溶性（細胞外ドメイン）の組織因子であってもよい。遺伝子組み換えの組織因子としては、リコンビナントＰＴ試薬として市販されているデイドイノビン（シーメンス）、ヒーモスアイエル（アイ・エル・ジャパン）等を用いることができる。
　加える組織因子の量は、特に制限されない。添加するヘパリン又はヘパラン硫酸の量が多い場合には組織因子の量も多くなるが、血液凝固の解析の為には正常な血液において血液凝固の開始が、３分から３０分の間になることが望ましい。血液凝固が３分以内に開始される場合には、組織因子による外因系の血液凝固の影響が大きく、内因系の寄与がわずかとなり、血友病等の診断に適さないことがあり、血液凝固の開始が３０分を超えるような場合には、検査として時間がかかりすぎるからである。
　遺伝子組み換えによって作成された組織因子を用いる場合は、０．１ｎＭ～１０ｎＭの範囲で加えることが望ましい。
　へパリンとCTIまたはカリクレイン阻害剤を用いて患者血液検体の血小板血栓形成を分析する場合には、患者がヘパリン又は低分子へパリンの投与を受けている場合には、分析される血小板血栓形成能は影響を受ける。そのような場合には、へパリナーゼ/トロンビン阻害剤（例えば、ヒルジン、アルガトロバンやBAPA（ベンジルスルホニル-D-Arg-Pro-4- アミジノベンジルアミド）など）の試薬を添加して、低分子へパリンを分解し、トロンビン阻害剤に置き換えることで、患者のへパリンによる治療の影響を受けず、血小板血栓形成能を分析することが可能である。
　また、へパリナーゼ/トロンビン阻害剤混合試薬は、広く汎用されているヘパリンがコートされた採血管によって採取された血液の、血小板血栓形成能を分析するのにも有用である。
　一般に、補助人工心肺を使用した心臓外科手術は、主として血液希釈による止血機能の低下および止血製剤（血漿分画製剤や血小板製剤などの輸血）による止血機能の回復をモニタリングすることが必要である。手術を受ける患者は、基本的に動脈からカテーテルによる採血経路が確保されており、このような患者においては真空採血管を用いる必要はない。特に補助人工心肺の使用中には、多量のへパリンが投与されており、このような患者の血液検体の血小板血栓（一次止血能）を分析する場合には、へパリナーゼとトロンビン阻害剤の混合試薬（好ましくは、混合試薬が予めコートされた容器）を、フィブリンと血小板血栓（一次止血二次止血総合）の分析には、へパリナーゼとCTIの混合試薬（好ましくは混合試薬が予めコートされた容器）を用いて分析することが好ましい。上記試薬が予めコートされた容器を用いる場合には、血液採取後、容器に添加し転倒混和するのみで測定に使用できるので簡便である。特に、感染症のある患者血液検体や失血や血液希釈によってヘマトクリットの低下が著しい患者の血液を分析する場合には、上記の試薬にDisodium4,4'-Dinitrostilbene-2,2'-disulfonate（DNDS）を添加することで血沈を抑制しつつ、血栓形成能や止血機能を分析することが可能である。その場合のDNDSの濃度は20～200μg/mLであることが望ましい。
本発明の採血管によって採取された血液を用いて血栓形成能を評価するためのマイクロチップの第一の態様を示す図。 本発明の採血管によって採取された血液を用いて血栓形成能を評価するためのマイクロチップの第二の態様を示す図。 クエン酸ナトリウムを含む各種採血管を用いて採取された血液を用い、塩化カルシウムまたは塩化カルシウムとCTIを添加して行ったROTEM測定の結果を示す図～実施例１。 低分子へパリンを含む採血管を用いて採取された血液を用い、ヘパリナーゼまたはヘパリナーゼとCTIを添加して行ったROTEM測定の結果を示す図～実施例２。 クエン酸ナトリウムを含む各種採血管を用いて採取された血液を用い、塩化カルシウムとCTIを添加して行った白色血栓形成測定の結果を示す図～実施例３。 クエン酸ナトリウムを含む各種採血管を用いて採取された血液を用い、塩化カルシウムとCTIを添加して行った白色血栓形成測定の結果および低分子へパリンを含む各種採血管を用いて採取された血液を用い、ヘパリナーゼを添加して行った白色血栓形成測定の結果を示す図～参考例。 低分子へパリンとCTIを含む真空採血管、ヒルジン採血管及びBAPA採血管に採血した血液を用い、血小板血栓形成の測定を行った結果を示す図～実施例４。 BD社へパリン採血管に採血した血液を用い、へパリナーゼ・BAPA混合試薬を添加して、血小板血栓形成の測定を行った結果を示す図～実施例５。 BD社クエン酸ナトリウム採血管に採血した血液を用い、各試薬を添加してROTEMの測定を行った結果を示す図～実施例６。 BD社クエン酸ナトリウム採血管に採血した血液を用い、各試薬を添加してROTEMの測定を行った結果を示す図～実施例７。 採血管Bを用いて採取された血液を用い、塩化カルシウムとCTIを添加して行った白色血栓形成測定の結果およびBD社採血管を用いて採取された血液を用い、塩化カルシウムとCTIとアプロチニンとヘパリンナトリウムを添加して行った白色血栓形成測定の結果を示す図～実施例８。 採血管Bを用いて採取された血液を用い、塩化カルシウムとCTIを添加して行った白色血栓形成測定の結果およびBD社採血管を用いて採取された血液を用い、塩化カルシウムとCTIとアプロチニンとヘパリンナトリウムを添加して行った白色血栓形成測定の結果を示す図。（ａ）は抗凝固薬無しの結果、（ｂ）はリバロキサバンを各濃度で添加したときの結果、（ｃ）はダビガトランを各濃度で添加したときの結果を示す～実施例９。 BD社クエン酸ナトリウム採血管に採血した血液を用い、各試薬を添加してROTEMの測定を行った結果を示す図～実施例１０。 BD社クエン酸ナトリウム採血管に採血した血液を用い、各試薬を添加してROTEMの測定を行った結果を示す図～比較例。 BD社クエン酸ナトリウム採血管を用いて採取された血液を用い、塩化カルシウムとCTIとアプロチニンとダナパロイドナトリウムを添加して行った白色血栓形成測定の結果を示す図～実施例１１。 BD社クエン酸ナトリウム採血管に採血した血液を用い、塩化カルシウムとCTIとアプロチニンとダナパロイドナトリウムを添加してROTEMの測定を行った結果を示す図～実施例１２。 BD社クエン酸ナトリウム採血管に採血した血液を用い、塩化カルシウムとCTIとアプロチニンとダナパロイドナトリウムを添加してROTEMの測定を行った結果を示す図～実施例１３。
　本発明の採血管は、低分子ヘパリンまたはクエン酸ナトリウムと接触因子阻害剤（例えば、FXII阻害剤またはカリクレイン阻害剤）を内部に含む。
　ヘパリンは硫酸化Ｄ－グルコサミン、Ｄ－グルクロン酸、Ｌ－イズロン酸がポリマーを形成して構成される分子量約５，０００～３０，０００のムコ多糖類である。本発明で使用されるヘパリンは質量平均分子量４５００～６５００の低分子ヘパリンが好ましい。また、ヘパリンはヘパリンナトリウム又はヘパリンリチウムなどの金属塩でもよい。ヘパリンは、一般に牛由来のものが安全に使用されるが、その他、ブタ、犬等の動物あるいは人由来等も使用することができる。
　FXII阻害剤としては、CTI、COU254、RD12などの合成阻害剤が挙げられるが、その中ではCTIが好ましい。CTIは例えば、以下の文献に開示されており、市販のものを使用してもよいし、自らコーンより調製して使用してもよい。
J Biol Chem. 1977 Nov 25;252(22):8105-7.
Thromb Res. 1980 Oct 15;20(2):149-62.
Blood. 1996 Nov 1;88(9):3432-45.
　COU254, RD12は例えば、下記の文献に記載されている。
Exp Transl Stroke Med. 2010; 2: 5. Published online 2010 Feb 15. doi: 10.1186/2040-7378-2-5
ACS Chem Biol. 2015 Aug 21;10(8):1861-70. doi: 10.1021/acschembio.5b00103. Epub 2015 May 19.
A Synthetic Factor XIIa Inhibitor Blocks Selectively Intrinsic Coagulation Initiation.
Baeriswyl V1, Calzavarini S2,3, Chen S1, Zorzi A1, Bologna L2,3, Angelillo-Scherrer A2,3, Heinis C1.
　カリクレイン阻害剤としてはアプロチニンがあげられるが、その他の低分子のカリクレイン阻害剤を用いてもよい。
Expert Opin Investig Drugs. 2006 Sep;15(9):1077-90
　本発明の採血管の形状は特に制限されず、公知の採血管と同様の形状にすることができるが、本発明の一実施態様の採血管としては、有底筒状の採血管本体に、採血管本体の開口部を密封する栓体が取り付けられたものが挙げられる。
　また、上記栓体が取り付けられる採血管本体内が減圧されていることが望ましい。採血管内を減圧しておくことにより、採血を速やかに行うことができる。なお、減圧の程度は、採血量に応じて適宜設定すればよい。
　本発明の採血管における有底管としては、ガラス、ポリエチレンテレフタレート・ポリブチレンテレフタレート・ポリエチレンナフタレート・ポリエチレンイソフタレート等のホモポリマーあるいはコポリマー、アクリル樹脂、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリアセタール、ポリアミド、ポリウレタン等が好ましい。
　本発明の採血管における有底管の開口部を密封する栓体としては、ゴム、エラストマーまたはアルミ蒸着フィルム等が好ましい。ゴムとしては、塩素化ブチルゴム、臭素化ブチルゴム、イソプレンゴム、天然ゴム等が挙げられ、エラストマーとしてはオレフィン系、ポリエステル系、ポリウレタン系等が挙げられる。またアルミ蒸着フィルムとしては、針が穿刺可能なようにアルミ蒸着フィルム上にイソプレン等のゴムボタンを設けて有底管と接着するような形態が挙げられる。
　ヘパリンまたはクエン酸ナトリウムおよびFXII阻害剤、カリクレイン阻害剤等の接触因子阻害剤の採血管内部への導入方法としては、ヘパリンまたはクエン酸ナトリウムおよび接触因子阻害剤の溶液を採血管の内壁にスプレーし、乾燥させることで、内壁に付着させる方法が例示される。また、採血管内にヘパリンまたはクエン酸ナトリウムおよび接触因子阻害剤を封入し、栓体で有底管の開口端を密封した後、アルミ蒸着フィルムあるいはプラスチック包装材料で密封することにより、さらに長期間、熱、水分から保護され、ヘパリンまたはクエン酸ナトリウムおよび接触因子阻害剤の安定性を増すことができる。また本発明の採血管にヘパリンまたはクエン酸ナトリウムおよび接触因子阻害剤を存在させる前に、有底管内面にシリコーンコーティングを施すことにより血液の異常凝固、付着などを防止することができる。
　本発明において、抗凝固剤として採血管内に封入される低分子ヘパリンは、採血すべき血液１mLあたり、１～１０単位（抗FXa単位:国際単位）（1～10IU/mL）であることが好ましく、３～８単位（3～8IU/mL）であることがより好ましい。
　本発明において、抗凝固剤として採血管内に封入されるクエン酸ナトリウムは、採血すべき血液に対し、1/10量の３．２～３．８％のクエン酸ナトリウムであることが望ましい。
　本発明において、採血管内に封入されるFXII阻害剤の量は血液凝固第XII因子を阻害できる量であればよいが、CTIの場合、採血すべき血液１mLあたり、5～50μgであることが好ましい。なお、CTIの量は採血管内での接触因子活性化を防ぐのに必要な量のみ加えてもよい。例えば、25μg/mL 以下、好ましくは5～20μg/mLの量が挙げられる。
　本発明において、採血管内に封入されるカリクレイン阻害剤の量はカリクレインを阻害できる量であればよいが、アプロチニンの場合、採血すべき血液１mLあたり、1～50μgであることが好ましい。なお、アプロチニンとCTIの両方を採血管内に封入してもよく、その場合、CTIの量は採血管内での接触因子活性化を防ぐのに必要な量のみでよく、例えば、1～10μg/mLの量でもよい。
　このような採血管を用いて採取された血液を用いて血栓形成能の分析を行う。血栓形成能の分析方法は、インビトロの方法であれば特に制限されないが、好ましくは、内部に血管を模した微小流路が設けられたマイクロチップを用いた血流下での血栓形成能の分析方法が挙げられる。なお、従来のROTEM、TEG等の凝固能解析に用いることも可能である。
　このようなマイクロチップを使用した血栓形成能の分析方法として、本発明者らは、流路の途中に流路分割部を有する血小板血栓分析用のマイクロチップと、流路の途中にコラーゲンと組織因子が塗布された血栓観測部を有する混合白色血栓分析用のマイクロチップを報告している。
　まずは、血小板血栓分析用のマイクロチップＡを用いた、血小板血栓形成能の分析方法について、図１を参照して説明する。なお、図１の例では流路が平行に２本設けられているが、あくまでも例示であり、当然ながら、流路は１本でもよいし、別の態様でもよい。
　マイクロチップAの第一の流入口１０４および第二の流入口１１４には、リザーバー（血液収容容器）１０６，１１６がそれぞれ倒立して接続されており、リザーバー１０６、１１６には送液ポンプ１０７、１１７が接続されている。送液ポンプ１０７、１１７には圧力センサー１０８、１１８が接続されている。
　測定直前に、本発明の採血管により採血された血液を、リザーバー１０６、１１６に導入し、測定を行う。
　送液ポンプ１０７、１１７の液体はミネラルオイル又は生理食塩水などの血液より比重の小さい液体とし、送液ポンプ１０７、１１７で当該液体を血液があらかじめ充填されたリザーバー１０６、１１６のそれぞれに導入し、該液体を血液の上に重層し、該液体をポンプ１０７、１１７で押し出すことで、血液が流路１０１、１１１へ導入される。該液体の流入圧を測定することで血液の流路への流入圧を間接的に測定することができる。
　具体的には、送液ポンプ１０７、１１７から、ミネラルオイルがリザーバー１０６、１１６内に圧入され、血液の上に重層され、血液をマイクロチップ１の流路１０１、１１１内に押し出す。血液は流路１０１、１１１を通過し、反応部１０２、１１２に到達する。第一反応部および第二反応部にはコラーゲンが塗布されており、さらに、特許文献２，３に開示されたような血液の流れる方向に沿って延在し、流路の幅を複数に分割する複数の流路分割壁が設けられており、分割壁の部分で血栓形成による閉塞が、他の部分よりも早く進む。流路分割壁の間隔は200μｍ以下であることが望ましい。また、流路分割部において、流路の幅は流路分割壁によって５つ以上に分割されていることが望ましい。流路分割壁の形状は、流路の幅を複数に分割できさえすれば特に制限されない。また、特許文献３に記載されたように、流路分割壁は表面粗さ（Ra）が１０～２００ｎｍになるような処理が施されていてもよい。
　反応部を通過する際に血小板による血栓形成が生じ、この血栓形成に基づく流入圧の上昇が観測される。これらの圧力上昇パターンを圧力センサーで検知し、比較することで、血液の性状、すなわち、血小板血栓形成能を評価することができる。
　検査に供した血液は、流路１０１、１１１の終端から廃液貯留部１０３、１１３に到達し、貯留され、廃液口１０５，１１５から排出される。なお、廃液貯留部内にEDTAなどを含浸させたスポンジなどの血液吸収材が配置されていると、血液廃液は血液吸収材に吸収されるが、凝固はしないので、圧力の測定に悪影響を与えることはない。
　次に、混合白色血栓分析用のマイクロチップＢを用いた、混合白色血栓形成能の分析方法について、図２を参照して説明する。なお、図２の例では、流路通過後の血液に血液凝固防止剤を加える態様であるが、あくまでも例示であり、当然ながら、別の態様でもよい。
　マイクロチップＢの流入口２０４には、リザーバー（血液収容容器）２０６が倒立して接続されており、リザーバー２０６には送液ポンプ２０７が接続されている。送液ポンプ２０７には圧力センサー２０８が接続されている。
測定直前に、本発明の採血管により採血された血液に対し、ヘパリナーゼを添加してヘパリンを分解した後、リザーバー２０６に導入し、測定を行う。ヘパリナーゼは、採血された血液試料中のヘパリンの量にもよるが、血液１ｍＬあたり、０．１～１０単位(０．１～１０ＩＵ／ｍＬ)であることが好ましく、０．２～５単位（０．２～５ＩＵ／ｍＬ）であることがより好ましい。
　なお、採血管内部に存在させるCTIの量は採血管内での接触因子活性化を防ぐのに必要な量のみとした場合、ヘパリナーゼとともに、追加でCTIを加えることが混合白色血栓分析にとっては好ましい。例えば、採血管の内部のCTIの量を２５μg／ｍＬ以下（例えば、５～２０μg／ｍＬ）とし、測定直前に、へパリナーゼとともに、１０μg／ｍＬ以上のCTIを添加して混合白色血栓分析に供することが好ましい。
　送液ポンプ２０７の液体はミネラルオイル又は生理食塩水などの血液より比重の小さい液体とし、送液ポンプ２０７で当該液体を血液があらかじめ充填されたリザーバー２０６に導入し、該液体を血液の上に重層し、該液体をポンプ２０７で押し出すことで、血液が流路２０１へ導入される。該液体の流入圧を測定することで血液の流路への流入圧を間接的に測定することができる。
　具体的には、送液ポンプ２０７から、ミネラルオイルがリザーバー２０６内に圧入され、血液の上に重層され、血液をマイクロチップＢの流路２０１内に押し出す。血液は流路の途中に設けられた狭窄部２０９を通過し、反応部２０２に到達する。狭窄部を設けておくことで高ずり応力惹起血小板凝集も観測することができ、アテローム血栓症の血栓生成を再現することもできるので好ましい。反応部にはコラーゲン及び組織因子（Tissue factor）が塗布されており、ここで血栓形成が生じる。コラーゲンと組織因子を含むことでコラーゲン上で血小板の粘着及び凝集ならびに組織因子による凝固系の活性化など総合的に血栓形成に関与する現象が誘発される。この血栓形成に基づく流入圧の上昇が観測される。これらの圧力上昇パターンを圧力センサーで検知し、比較することで、血液の性状、すなわち、混合白色血栓形成能を評価することができる。
　検査に供した血液は、流路２０１の終端から廃液貯留部２０３に到達する。そして、血液凝固防止剤流入口２１１から血液凝固防止剤流路２１０を通じて注入される血液凝固防止剤と混合され、排出口２０５から排出される。血液凝固防止剤としては、廃液の血液凝固によるつまりや圧力上昇を防止する目的で用いられるもので、EDTA、クエン酸等のキレート剤、酸、アルカリ溶液、アルコール類またはグアニジン、尿素、SDS等の変性剤を用いることが可能である。
　また、汎用されているクエン酸ナトリウムを含む採血管を用いて、混合白色血栓形成を解析する場合には、カルシウム（好ましくは塩化カルシウム）、接触因子阻害剤（ＦＸＩＩ因子阻害剤、カリクレイン阻害剤）を添加して凝固反応を開始することで良好な測定が可能である。
　一般に汎用されている採血管に含まれるクエン酸ナトリウムは、血液に対し0.32～0.38%になるように調整されている。
　添加する塩化カルシウムの濃度は、クエン酸ナトリウムによるキレート作用を解除できれば特に制限されないが１１～１２ｍＭが望ましい。
　接触因子阻害剤はＦＸＩＩ阻害剤及びカリクレイン阻害剤が挙げられる。
　ＦＸＩＩ阻害剤は、ＦＸＩＩ阻害活性を有する物質であれば特に制限されないが、ＣＴＩを使うことができる。ＣＴＩの場合は血液１ｍＬあたり、5～200μｇが好ましく、10～50μgがより好ましい。
　カリクレイン阻害剤は、特に制限されないがアプロチニンが望ましい。アプロチニンの場合には、血液１ｍＬあたり、1～100μgであることが好ましい。
　ＦＸＩＩ阻害剤とカリクレイン阻害剤を併用することで、より完全な接触因子の活性化阻害が可能となるので望ましい。
　特に、アプロチニンはカリクレインに加えてプラスミンも阻害する。また、プラスミンは、比較的基質特異性が低く、血液凝固因子を活性化する。
　よって、カリクレインを阻害することで、接触因子の活性化を完全に抑制しつつ、同時にプラスミンを阻害することで、より完全な非特異的な経路による血液凝固因子の活性化を抑制可能である。また、プラスミンを抑制した場合には、線溶反応が抑制されるので、患者の血液凝固の状態、例えば血友病の診断や抗凝固薬の評価に適している。
　さらに、混合白色血栓の解析を行う場合には、混合血栓形成に影響を与えない少量のへパリン、低分子へパリン及び／又はヘパラン硫酸（例えば、ダナパロイドナトリウム）を添加することで、容器との接触による血液凝固が完全に抑制されるため望ましい。
　へパリンであれば０．０１～０．２Ｕ／ｍＬ、低分子へパリンであれば０．０１～０．５ＩＵ／ｍＬ、ダナパロイドナトリウムであれば０．０１～０．５Ｕ（抗FXa単位）／ｍＬ程度が望ましい。
　上記の血液を、コラーゲンと組織因子がコートされたマイクロチップに流すと、血小板の活性化（粘着・凝集反応）と同時に、コ―ティングされている組織因子による外因系凝固の活性化が起こり、その後、マイクロ流路内でコラーゲン上の活性化血小板表面で、内因系凝固が促進され、血流下における混合白色血栓が形成される。
　また、汎用されているクエン酸ナトリウムを含む採血管を用いて、血液凝固の解析をする場合には、塩化カルシウム、上記接触因子阻害剤、少量のへパリン（又は低分子へパリン又はヘパラン硫酸）に加えて、少量の組織因子を添加して血液凝固を開始することで、より生理的な血液凝固反応を解析することが可能である。
　この場合、塩化カルシウム、接触因子阻害剤、少量のへパリン（又は低分子へパリン又はヘパラン硫酸）によって、完全に採血管や測定容器による血液凝固が抑制された状態で、組織因子によって外因系の血液凝固が開始され、生じた微量のトロンビンが内因系の血液凝固を開始し、血液凝固反応が増幅される。
　用いる組織因子の濃度は特に制限されないが、遺伝子組み換え可溶性組織因子の場合、100nM～0.1nMであることが望ましい。添加するへパリンが多い場合は、組織因子も多めに添加する必要がある。健常人の血液を用いた場合に、血液凝固の開始が3～30分の間であると測定がし易く望ましい。
　用いる血液凝固解析装置は、特に制限されないが、ＲＯＴＥＭ、ＴＥＧ、ソノクロットなどの非血流下における血液凝固の解析装置が望ましい。
　したがって、本発明は、カルシウム、血液凝固第XII因子（FXII）阻害剤およびカリクレイン阻害剤を含有する、血栓形成能または血液凝固能の分析試薬を提供する。当該分析試薬はさらにへパリンまたはヘパラン硫酸を含有することが好ましく、さらに組織因子を含有することがより好ましい。当該分析試薬はこれらの各成分を別々に含む試薬キットとして提供されうる。
実施例１
採血管A（ブチルゴム製ゴム栓、3.2％クエン酸ナトリウム含有、Sunphoria社製品）及び採血管B（フィルムシールでシールし、ゴム栓を用いない；3.2％クエン酸ナトリウム含有、テルモ株式会社製品）に採血を行い、ROTEMの測定を実施した。
反応開始は、以下の異なる試薬を用いた。
（１）採血管Aの血液にSTARTEM（商標）試薬（塩化カルシウム；終濃度12mM）を添加
（２）採血管Aの血液にCTI(終濃度50μg/mL)と塩化カルシウム(終濃度12mM)を添加
（３）採血管Aに採血前にアプロチニン（終濃度10μg/mL）を添加して採血を行い、CTI（終濃度50μg/mL）と塩化カルシウム(終濃度12mM)を添加
（４）採血管Aに採血前にアプロチニン（終濃度10μg/mL）とCTI（終濃度10μg/mL）を添加して採血を行い、STARTEM試薬（塩化カルシウム；終濃度12ｍM）を添加
（５）採血管Aに採血前にアプロチニン（終濃度10μg/mL）とCTI（終濃度10μg/mL）を添加して採血を行い、CTI(終濃度50μg/mL)とSTARTEM試薬（塩化カルシウム；終濃度12mM)を添加
（６）採血管Bの血液にSTARTEM試薬（塩化カルシウム、終濃度12ｍM）を添加
（７）採血管Bの血液にCTI(終濃度50μg/mL)と塩化カルシウム(終濃度12mM)を添加
結果を図３に示す。
ブチルゴムのゴム栓の採血管に採血した血液は、フィルムシールの採血管と比べて、塩化カルシウム添加時に、早く血液凝固が起こった。さらに、フィルムシールの採血管の血液は、CTIを添加することで塩化カルシウム誘発血液凝固が抑制されたのに対し、ブチルゴムのゴム栓の採血管では、CTIを添加することによる塩化カルシウム誘発血液凝固の抑制は限定的であった。しかし、ブチルゴムのゴム栓の採血管にアプロチニン及び比較的低濃度のCTIを添加して採血された血液に塩化カルシウムを添加した場合には、血液凝固が顕著に抑制され、さらに塩化カルシウムとCTIの混合物を添加して血液凝固を開始した場合には、より強く血液凝固が抑制された。アプロチニンと低濃度のCTIを事前に添加して採血し、測定時にCTIを再度添加するのが最もよく血液凝固を抑制する。
実施例２
採血管C（ブチルゴム製ゴム栓、低分子へパリン２IU/mL含有Sunphoria社製）に採血した血液（検体A）と、採血管Cに採血前にアプロチニン（終濃度10μg/mL）を添加した後に採血した血液（検体B）と、採血管Cに採血前にアプロチニン（終濃度10μg/mL）とCTI（終濃度10μg/mL）を添加した後に採血した血液（検体C）を用いてROTEMの解析を実施した。反応の開始は以下の試薬で行った。
（１）検体Aにへパリナーゼ（終濃度0.17IU/ｍL）を添加
（２）検体Bにへパリナーゼ（終濃度0.17IU/ｍL）とCTI(終濃度50μg/mL)を添加
（３）検体Bにへパリナーゼ（終濃度0.17IU/ｍL）とCTI(終濃度50μg/mL)を添加
結果を図４に示す。
低分子へパリンを含むゴム栓の採血管に採血し、へパリナーゼを添加した場合、血液凝固は早期に始まった。また、（１）のケースでへパリナーゼに加えてCTI 50μg/mLを測定開始時に添加した場合にも、血液凝固は抑制されなかった。
一方、低分子へパリンとアプロチニン及びCTIを事前に添加して採血し、測定開始時にへパリナーゼとCTIを添加した場合には、顕著に血液凝固が抑制された。
実施例３
採血管Aに採血した血液および採血管Aに採血前にアプロチニン（終濃度10μg/mL）を添加した後に採血した血液に塩化カルシウム（終濃度12mM）とCTI(終濃度50μg/mL)を添加して、図２の装置を用いて血栓形成能の解析を行った。流速は10μL/minで解析を実施した。
結果を図５に示す。
クエン酸に加えてアプロチニンを添加して採血した場合にも、血流下の血栓形成能の評価でデータに影響は無かった。しかし、実施例1の結果より、リザーバー内での非血流下における血液凝固(クロット形成)は抑制されると考えられ、アプロチニンを添加することで、リザーバー内で血液凝固を抑制しつつ非血流下の白色血栓形成の評価が可能であると考えられる。
参考例
採血管Bで採取された血液に塩化カルシウム(終濃度12mM)とCTI(終濃度50μg/mL) を添加、および採血管Cで採取された血液にへパリナーゼ(終濃度0.17IU/mL)を添加して、それぞれ図２の装置を用いて血栓形成能の解析を行った。
結果を図６に示す。
クエン酸処理血液に塩化カルシウムとCTIを添加した場合と同様に、ゴム栓の採血管（低分子へパリンとCTIを含む）にへパリナーゼを添加して測定しても血栓形成能の解析が可能であった。
実施例４
低分子へパリン（終濃度2IU/mL）とCTI(終濃度50μg/mL)を含む真空採血管、ヒルジン採血管（Roche Diagnostic社製、ヒルジン終濃度 50μg/mL）及びBAPA採血管(BAPA終濃度100μM)に採血した血液を用い、図1に示される装置を用いて血小板血栓形成の測定を行った。
何れの真空採血管もブチルゴムのゴム栓を用いたものである。
その結果、図７に示すように、各採血管の血液は、同様に血小板血栓形成を解析することが可能であった。また、低分子へパリンとCTIを含む採血管の血液に採血30分後にへパリナーゼ・BAPA試薬（終濃度；各0.17IU/ｍL, 100μM）を添加した場合においても、同様に血小板血栓形成の測定が可能であった。
実施例５
BD社製へパリン採血管に採血し、その30分後に、当該血液に、へパリナーゼ・BAPA混合試薬を、それぞれ終濃度が0.17IU/mLと100μMになるように添加し、血液試料とした。
一方、比較として、ヒルジン採血管（Roche Diagnostic社）に採血した血液試料を用いた。
これらの血液試料を用い、図1に示される装置を用いて血小板血栓形成の測定流速を行った。血液は18μL/minで実施した。
何れの真空採血管もブチルゴムのゴム栓を用いたものである。
結果を図８に示す。
へパリン採血管に採血した血液にへパリナーゼ・BAPA混合試薬を添加することで、ヒルジン採血管で採血した場合と同様に血小板血栓形成の解析を行うことが可能であった。
一方、へパリン採血管に採血した血液をそのまま同様の測定を行った場合には、血小板血栓形成による圧力上昇は、ほとんど見られなかった。
実施例６
BD社製クエン酸ナトリウム採血管（3.2％クエン酸ナトリウムを血液に対し1/10容量含む）に採血した血液検体に、以下の試薬を添加してROTEMの測定を実施した。
（１）STARTEM試薬
（２）塩化カルシウム（終濃度12mM）とCTI（終濃度50μg/mL）
（３）塩化カルシウム（終濃度12mM）とCTI(終濃度50μg/mL)とアプロチニン(終濃度20μg/mL)
（４）塩化カルシウム（終濃度12mM）とCTI(終濃度50μg/mL)とアプロチニン(終濃度20μg/mL)とダナパロイドナトリウム(終濃度0.25U/mL)
結果を図９に示す。
結果は、左より(凝固開始の早い方より)、（１）、（２）、（３）、（４）である。
塩化カルシウムとCTIに加えて、アプロチニンの添加で凝固開始が抑制され、さらに低濃度のダナパロイドナトリウムを添加することで血液凝固が完全に抑制された。
尚、（３）、（４）の添加によっても組織因子とコラーゲンを塗布したマイクロチップにおける混合白色血栓形成は、同様の結果が得られた。
実施例７
BD社製クエン酸ナトリウム採血管（3.2％クエン酸ナトリウムを血液に対し1/10容量含む）に採血した血液検体に、以下の試薬を添加してROTEMの測定を実施した。
（１）STARTEM試薬(塩化カルシウム試薬)
（２）塩化カルシウム（終濃度12mM）とCTI（終濃度50μg/mL）
（３）塩化カルシウム（終濃度12mM）とCTI(終濃度50μg/mL)とアプロチニン(終濃度20μg/mL)
（４）塩化カルシウム（終濃度12mM）とCTI(終濃度50μg/mL)とアプロチニン(終濃度20μg/mL)とへパリンナトリウム(持田製薬：終濃度0.15U/mL)
結果を図１０に示す。
結果は、左より(凝固開始の早い方より)、（１）、（２）、（３）、（４）である。
塩化カルシウムとCTIに加えて、アプロチニンの添加で血液凝固の開始が抑制され、さらに低濃度のへパリンナトリウムを添加することで血液凝固が完全に抑制された。
実施例８
採血管B（フィルムシールでシールし、ゴム栓を用いない；3.2％クエン酸ナトリウム含有、テルモ株式会社製品）に採血した血液に、塩化カルシウム（終濃度12mM）とCTI（終濃度50μg/mL）を添加した血液検体及びBD社製クエン酸ナトリウム採血管（3.2％クエン酸ナトリウムを血液に対し1/10容量含む）に採血した血液に、塩化カルシウム（終濃度12mM）、CTI（終濃度50μg/mL）、アプロチニン（終濃度20μg/mL）及びへパリンナトリウム(終濃度0.15U/mL)を添加した血液検体を用い、図２の装置を用いて血栓形成能の解析を行った。流速は10μL/minで解析を実施した。
結果を図１１に示す。
テルモ社製フィルムシールの採血管と同様に、ＢＤ社製のブチルゴムのゴム栓を用いた採血管により白色血栓形成能の測定が可能であった。
実施例９
Ａ）採血管B（フィルムシールでシールし、ゴム栓を用いない；3.2％クエン酸ナトリウム含有、テルモ株式会社製品）に採血した血液に、塩化カルシウム（終濃度12mM）とCTI（終濃度50μg/mL）を添加した血液検体及びＢ）BD社製クエン酸ナトリウム採血管（3.2％クエン酸ナトリウムを血液に対し1/10容量含む）に採血した血液に、塩化カルシウム（終濃度12mM）、CTI（終濃度50μg/mL）、アプロチニン（終濃度20μg/mL）及びへパリンナトリウム(終濃度0.15U/mL)を添加した血液検体体を用い、図２の装置を用いて血栓形成能の解析を行った。流速は10μL/minで解析を実施した（図１２（ａ））。
さらに、上記Ａ）、Ｂ）２種類の検体に、抗凝固薬であるリバロキサバン及びダビガトランをそれぞれ0nＭ、500nＭ及び1000nＭ添加して同様の測定を行った。
リバロキサバン及びダビガトランの結果をそれぞれ図１２の（ｂ）および（ｃ）に示す。
その結果、検体Ｂ）は検体Ａ）と同様に、抗凝固薬の抗血栓効果を感度良く測定出来た。
実施例１０
BD社製クエン酸ナトリウム採血管（3.2％クエン酸ナトリウムを血液に対し1/10容量含む）に採血した血液検体に、以下の試薬を添加してROTEMの測定を実施した。
（１）塩化カルシウム（終濃度12mM）とCTI(終濃度50μg/mL)とアプロチニン(終濃度20μg/mL)とへパリンナトリウム(終濃度0.15U/mL)とプロトロンビン試薬（ヒーモスアイエル　リコンビプラスチン（15μｇ/mL）を終濃度で約0.04％になるように添加）
（２）塩化カルシウム（終濃度12mM）とCTI(終濃度50μg/mL)とアプロチニン(終濃度20μg/mL)とへパリンナトリウム(終濃度0.15U/mL)とノボセブン（終濃度2μｇ/mL）とプロトロンビン試薬（ヒーモスアイエル　リコンビプラスチンを終濃度で0.04％になるように添加）
（３）塩化カルシウム（終濃度12mM）とCTI(終濃度50μg/mL)とアプロチニン(終濃度20μg/mL)とへパリンナトリウム(終濃度0.15U/mL)と組織因子経路阻害剤（TFPI）（Ac-FQSKpNVHVDGYFERLXAKL-NH2；N末端アセチル化, C末端アミド化,5番目 p= D体Pro残基, 17番目X= Aib(α-methyl alanine）；J Biol Chem. 2014 Jan 17;289(3):1732-41；終濃度10μｇ/mL）とプロトロンビン試薬（ヒーモスアイエル　リコンビプラスチンを終濃度で0.04％になるように添加）
結果を図１３に示す。左から（２）、（３）、（１）の順で凝固は早く起きた。
比較例
BD社製クエン酸ナトリウム採血管（3.2％クエン酸ナトリウムを血液に対し1/10容量含む）に採血した血液検体に、以下の試薬を添加してROTEMの測定を実施した。
（１）STARTEM試薬とEXTEM試薬（商標：組織因子を主体とする検査用試薬）
（２）STARTEM試薬とEXTEM試薬とノボセブン（ノボノルディスクファーマ：終濃度2μｇ/mL）
（３）STARTEM試薬とEXTEM試薬とＴＦＰＩ（終濃度10μｇ/mL）
結果を図１４に示す。（１）、（２）、（３）が同じ波形を示した。
実施例と比較例より、塩化カルシウムとアプロチニンとへパリンに組織因子を添加した系でノボセブン、ＴＦＰＩなどの止血製剤の効果が評価出来たのに対し、EXTEM試薬の系では、評価することが出来なかった。
実施例１１
BD社製クエン酸ナトリウム採血管（3.2％クエン酸ナトリウムを血液に対し1/10容量含む）に採血した血液に、塩化カルシウム（終濃度12mM）、CTI（終濃度50μg/mL）、アプロチニン（終濃度20μg/mL）及びダナパロイドナトリウム(終濃度0.05U/mL)を添加した血液検体を用い、図２の装置を用いて血栓形成能の解析を行った。流速は10μL/minで解析を実施した。
上記血液に、さらにダビガトラン（1000ｎＭ）またはAbciximab（抗血小板剤：商品名レオプロ）（2μｇ/mL）を添加した血液を用い同様の実験を実施した。
結果を図１５に示す。ＢＤ社製のブチルゴムのゴム栓を用いた採血管により白色血栓形成能の測定及び抗凝固剤、抗血小板剤の評価が可能であった。
実施例１２
BD社製クエン酸ナトリウム採血管（3.2％クエン酸ナトリウムを血液に対し1/10容量含む）に採血した血液検体に、塩化カルシウム（終濃度12mM）とCTI(終濃度50μg/mL)とアプロチニン(終濃度20μg/mL)とダナパロイドナトリウム(終濃度0.05U/mL)を添加してＲＯＴＥＭを測定した。
さらに、組換え第VIIa因子（商品名ノボセブン）(0.5μg/mL)、TFPI（50μg/mL）及びそれらの組み合わせを添加した血液の測定を行った。
結果を図１６に示す。図１６の（１）はノボセブン、TFPIともに添加せず、（２）はノボセブンのみ、（３）はTFPIのみ、（４）はノボセブン＋TFPIである。
その結果、BD社製クエン酸ナトリウム採血管によりＲＯＴＥＭの測定及び止血製剤の効果の判定が可能であった。
実施例１３
BD社製クエン酸ナトリウム採血管（3.2％クエン酸ナトリウムを血液に対し1/10容量含む）に採血した血液検体に、塩化カルシウム（終濃度12mM）とCTI(終濃度50μg/mL)とアプロチニン(終濃度20μg/mL)とダナパロイドナトリウム(終濃度0.05U/mL)を添加してＲＯＴＥＭを測定した。
さらに、抗FVIIIポリクローナル抗体（FVIII阻害活性；96μｇ/mL;218 BU（FVIII阻害活性単位））ならびにノボセブン(0.5μg/mL)、TFPI（50μg/mL）及びそれらの組み合わせを添加した血液の測定を行った。
結果を図１７に示す。図１７の（１）は抗FVIIIポリクローナル抗体のみ、（２）は抗FVIIIポリクローナル抗体＋ノボセブン、（３）はFVIIIポリクローナル抗体＋TFPI、（４）はFVIIIポリクローナル抗体＋ノボセブン＋TFPIである。
　BD社製クエン酸ナトリウム採血管によりＲＯＴＥＭの測定及び止血製剤の効果の判定が可能であった。
　A・・・マイクロチップ；１０１、１１１・・・流路；１０２，１１２・・・反応部；１０３、１１３・・・廃液貯留部；１０４、１１４・・・流入口；１０５、１１５・・・廃液口；１０６、１１６・・・リザーバー；１０７、１１７・・・送液ポンプ；１０８、１１８・・・圧力センサー
B・・・マイクロチップ；２０１・・・流路；２０２・・・反応部；２０３・・・廃液貯留部；２０４・・・流入口；２０５・・・廃液口；２０６・・・リザーバー；２０７・・・送液ポンプ；２０８・・・圧力センサー；２０９・・・狭窄部；２１０・・・血液凝固防止剤流路；２１１・・・血液凝固防止剤流入口

Claims (36)

  1. クエン酸ナトリウム含有採血管で採血された血液を用い、該血液にカルシウム、血液凝固第XII因子（FXII）阻害剤およびカリクレイン阻害剤を添加して血液凝固反応を開始させることを特徴とする、血栓形成能または血液凝固能の分析方法。
  2. FXII阻害剤がコーン由来トリプシンインヒビター（CTI）である、請求項１に記載の血栓形成能または血液凝固能の分析方法。
  3. CTIの濃度が５～２００μg／ｍＬである、請求項２に記載の血栓形成能または血液凝固能の分析方法。
  4. カリクレイン阻害剤がアプロチニンである、請求項１～３のいずれか一項に記載の血栓形成能または血液凝固能の分析方法。
  5. アプロチニンの濃度が１～１００μｇ／ｍＬである、請求項４に記載の血栓形成能または血液凝固能の分析方法。
  6. 前記血液に、さらに、へパリンまたはヘパラン硫酸を添加して凝固反応を開始させることを特徴とする、請求項１～５のいずれか一項に記載の血栓形成能または血液凝固能の分析方法。
  7. へパリンの濃度が０．０１～０．２単位（Ｕ）／ｍＬである、請求項６に記載の血栓形成能または血液凝固能の分析方法。
  8. ヘパリンが質量平均分子量４５００～６５００の低分子へパリンである、請求項６に記載の血栓形成能または血液凝固能の分析方法。
  9. 低分子へパリンの濃度が０．０１～０．５単位（ＩＵ）／ｍＬである、請求項８に記載の血栓形成能または血液凝固能の分析方法。
  10. ヘパラン硫酸がダナパロイドナトリウムである、請求項６～９のいずれか一項に記載の血栓形成能または血液凝固能の分析方法。
  11. ダナパロイドナトリウムの濃度が０．０１～０．５単位（Ｕ）／ｍＬである、請求項１０に記載の血栓形成能または血液凝固能の分析方法。
  12. 前記血液に、さらに、組織因子を添加することを特徴とする、請求項１～１１のいずれか一項に記載の血栓形成能又は血液凝固能の分析方法。
  13. 組織因子が、動物組織由来のトロンボプラスチン又は遺伝子組み換え可溶性組織因子である、請求項１２に記載の血栓形成能または血液凝固能の分析方法。
  14. 遺伝子組み換え可溶性組織因子の濃度が０．１ｎＭ～１０ｎＭである、請求項１３に記載の血栓形成能または血液凝固能の分析方法。
  15. 内部に血管を模した流路が設けられたマイクロチップを用い、流路に血液を流入させて混合白色血栓形成能を分析する、請求項１～１４のいずれか一項に記載の血栓形成能または血液凝固能の分析方法。
  16. ROTEMにより血液凝固能を分析する、請求項１～１４のいずれか一項に記載の血栓形成能または血液凝固能の分析方法。
  17. カルシウム、血液凝固第XII因子（FXII）阻害剤およびカリクレイン阻害剤を含有する、血栓形成能または血液凝固能の分析試薬。
  18. さらに、へパリンまたはヘパラン硫酸を含有する、請求項１７に記載の血栓形成能または血液凝固能の分析試薬。
  19. さらに、組織因子を含有する、請求項１７または１８に記載の血栓形成能または血液凝固能の分析試薬。
  20. へパリンまたはクエン酸ナトリウムと接触因子阻害剤を内部に含む採血管。
  21. へパリンと接触因子阻害剤を内部に含む、請求項２０に記載の採血管。
  22. ヘパリンが質量平均分子量４５００～６５００の低分子ヘパリンである、請求項２０または２１に記載の採血管。
  23. 前記低分子へパリンが、採血時に血液に対して１～１０単位(ＩＵ)／ｍＬとなる量で内部に塗布されている、請求項２２に記載の採血管。
  24. 接触因子阻害剤が血液凝固第XII因子（FXII）阻害剤である、請求項２０～２３のいずれか一項に記載の採血管。
  25. FXII阻害剤がコーン由来トリプシンインヒビター（CTI）である、請求項２４に記載の採血管。
  26. 前記CTIが、採血時に血液に対して５～５０μg／ｍＬとなる量で内部に塗布されている、請求項２５に記載の採血管。
  27. 接触因子阻害剤がカリクレイン阻害剤である、請求項２０～２３のいずれか一項に記載の採血管。
  28. カリクレイン阻害剤がアプロチニンである、請求項２７に記載の採血管。
  29. 請求項２１～２８のいずれか一項に記載の採血管を用いて採血された血液を用い、これにヘパリナーゼを添加した後に血栓形成能を測定する、混合白色血栓形成能の分析方法。
  30. へパリナーゼが１～１０単位(ＩＵ)／ｍＬの濃度で添加される、請求項２９に記載の混合白色血栓形成能の分析方法。
  31. 採血管の内部に２５μg／ｍＬ以下のCTIおよび／または１～５０μg／ｍＬのアプロチニンが含まれており、へパリナーゼが１０μg／ｍＬ以上のCTIとともに添加される、請求項２９または３０に記載の混合白色血栓形成能の分析方法。
  32. 内部に血管を模した流路が設けられたマイクロチップを用い、流路に血液を流入させて分析する、請求項２９～３１のいずれか一項に記載の混合白色血栓形成能の分析方法。
  33. 前記マイクロチップは、流路上にコラーゲンと組織因子がコートされた部位を有する、請求項３２に記載の混合白色血栓形成能の分析方法。
  34. 請求項２０～２８のいずれか一項に記載の採血管を用いて採血された血液を用い、これを、内部に血管を模した流路が設けられ、さらに、流路上に流路分割部を有するマイクロチップの流路に流して血栓形成を測定する、血小板血栓形成能の分析方法。
  35. 請求項２０、２４～２８のいずれか一項に記載の採血管であって、クエン酸ナトリウムと接触因子阻害剤を内部に含む採血管を用いて採血された血液を用い、これにカルシウムを添加した後に血栓形成能または血液凝固能を測定する、混合白色血栓形成能または血液凝固能の分析方法。
  36. 請求項２１～２８のいずれか一項に記載の採血管を用いて採血された血液を用い、これにヘパリナーゼを添加した後に血液凝固能を測定する、血液凝固能の分析方法。
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